DE69233254T2

DE69233254T2 - Humanisierter Heregulin Antikörper

Info

Publication number: DE69233254T2
Application number: DE69233254T
Authority: DE
Inventors: J. Paul Carter; G. Leonard PRESTA
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-15
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2012-06-16
Also published as: JP2006083180A; EP0590058A1; CA2103059C; LU91067I2; DE122004000008I1; US5821337A; AU2250992A; JP4836147B2; US6639055B1; CY2006001I2; EP1400536A1; GEP20074141B; ATE255131T1; NL300145I1; US6407213B1; DE69233254D1; JP2008291036A; CA2103059A1; EP0590058B1; JP4124480B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft variante Antikörper. Die Anwendung der Erfindung erfolgt insbesondere auf dem Gebiet der Immunologie und der Diagnose und Therapie von Krebs.
Hintergrund der Erfindung
Natürlich vorkommende Antikörper (Immunoglobuline) umfassen zwei schwere Ketten, die mit Disulfidbindungen miteinander verknüpft sind, und zwei leichte Ketten, wobei mit jeder der schweren Ketten durch Disulfidbindungen eine leichte Kette verknüpft ist.
Jede schwere Kette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_H) auf, gefolgt von einer Anzahl von konstanten Domänen. Die einzelnen leichten Ketten weisen an einem Ende eine variable Domäne (V_L) und am anderen Ende eine konstante Domäne auf. Die konstante Domäne der leichten Kette ist mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette ausgerichtet. Die variable Domäne der leichten Kette ist mit der variablen Domäne der schweren Kette ausgerichtet. Man nimmt an, dass sich spezielle Aminosäurereste an der Grenzfläche zwischen den variablen Domänen der leichten und der schweren Ketten befinden; vergl. z. B. Chothia et al., J. Mol. Biol., Bd. 186 (1985), S. 651–663; Novotny und Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 4592–4596.
Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung des Antikörpers an ein Antigen beteiligt, sie sind jedoch an verschiedenen Effektorfunktionen beteiligt, z. B. Teilnahme des Antikörpers an der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität. Die variablen Domänen eines jeden Paars von leichten und schweren Ketten sind direkt an der Bindung des Antikörpers an das Antigen beteiligt. Die Domänen von natürlichen leichten und schweren Ketten weisen die gleiche allgemeine Struktur auf. Jede Domäne umfasst vier Rahmenregionen (FR), deren Sequenzen in gewissem Umfang konserviert sind und die durch drei hypervariable oder komplementäre Bestimmungsregionen (CDRs) verbunden sind (vergl. E. A. Kabat. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1987)). Die vier Rahmenregionen nehmen weitgehend eine β-Blattkonformation an und die CDRs bilden Schleifen, die die β-Blattstruktur verbinden (und in einigen Fällen Bestandteil davon sind). Die CDRs in jeder Kette werden durch die Rahmenregionen in enger Nähe gehalten und tragen zusammen mit den CDRs von der anderen Kette zur Bildung der Antigen-Bindungsstelle bei.
Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern ist weit verbreitet, insbesondere von Antikörpern, die sich von Nagetieren, einschließlich Mäusen, ableiten, jedoch sind sie bei der klinischen Anwendung am Menschen häufig antigen. Beispielsweise besteht eine Haupteinschränkung der klinischen Verwendung von monoklonalen Nagetier-Antikörpern in einer anti-Globulin-Reaktion während der Therapie (R. A. Miller et al., Blood, Bd. 62 (1983), S. 988–995; R. W. Schroff et al., Cancer Res., Bd. 45 (1985), S. 879–885).
Man hat versucht, dieses Problem durch Konstruktion von "chimären" Antikörpern zu überwinden, bei denen eine variable, antigenbindende Domäne eines Tiers an eine humane konstante Domäne gekuppelt ist (Cabilly et al., US-Patent 4 816 567; S. L. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 6851– 6855; G. L. Boulianne et al., Nature, Bd. 312 (1984), S. 643–646; M. S. Neuberger et al., Nature, Bd. 314 (1985), S. 268–270). Der Ausdruck "chimärer" Antikörper wird hier zur Beschreibung eines Polypeptids verwendet, das mindestens den Antigen-Bindungsbereich eines Antikörpermoleküls in Verknüpfung mit mindestens einem Teil eines weiteren Proteins (typischerweise einer konstanten Immunoglobulin-Domäne) umfasst.
Der Isotyp der humanen konstanten Domäne kann so gewählt werden, dass der chimäre Antikörper zur Teilnahme an der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) und der komplementabhängigen Zytotoxizität maßgeschneidert ist (vergl. z. B. M. Brüggemann et al., J. Exp. Med., Bd. 166 (1987), S. 1351–1361; L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323–327; Love et al., Methods in Enzymology, Bd. 178 (1989), S. 515–527; Bindon et al., J. Exp. Med., Bd. 168 (1988), S. 127–142).
In einer typischen Ausführungsform enthalten derartige chimäre Antikörper etwa ein Drittel der Sequenz eines Nagetiers (oder einer anderen nicht-humanen Spezies) und sind dazu befähigt, beim Menschen eine erhebliche anti-Globulin-Reaktion hervorzurufen. Beispielsweise ist im Fall des murinen anti-CD3-Antikörpers, OKT3, ein Großteil der sich ergebenden anti-Globulin-Reaktion gegen die variable Region, statt gegen die konstante Region gerichtet (G. J. Jaffers et al., Transplantation, Bd. 41 (1986), S. 572–578).
Im Rahmen weiterer Bemühungen zur Aufklärung der Antigen-Bindungsfunktionen von Antikörpern und zur Minimierung der Verwendung von heterologen Sequenzen in humanen Antikörpern haben Winter et al. (P. T. Jones et al., Nature, Bd. 321 (1986), S. 522–525; L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323–327; M. Verhoeyen et al., Science, Bd. 239 (1988), S. 1534–1536) Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen an die Stelle der entsprechenden Segmente eines humanen Antikörpers gesetzt. Der hier verwendete Ausdruck "humanisierter" Antikörper betrifft eine Ausführungsform von chimären Antikörpern, bei denen ein erheblich geringerer Teil als bei einer intakten variablen Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-humanen Spezies ersetzt ist. In der Praxis handelt es sich bei humanisierten Antikörpern typischerweise um humane Antikörper, bei denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern ersetzt sind.
Die therapeutischen Aussichten dieses Weges werden durch die klinische Wirksamkeit eines humanen Antikörpers, der spezifisch für das CAMPATH-1-Antigen ist, bei zwei Nicht-Hodgkin-Lymphompatienten gestützt, von denen einer vorher eine anti-Globulin-Reaktion auf den parentalen Ratten-Antikörper entwickelte (L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323–327; G. Hale et al., Lancet, Bd. 1 (1988), S. 1394–1399). Ein muriner Antikörper gegen den Interleukin 2-Rezeptor wurde ebenfalls kürzlich als potentielles immunosuppressives Reagenz humanisiert (C. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 10029–10033). Zu weiteren Literaturstellen, die sich mit der Humanisierung von Antikörpern befassen, gehören Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88 (1991), S. 2869–2873; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88 (1991), S. 4181–4185; Daugherty et al., Nucleic Acids Research, Bd. 19(9) (1991), S. 2471–2476; Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88 (1991), S. 2663–2667; Junghans et al., Cancer Research, Bd. 50 (1990), S. 1495–1502.
In einigen Fällen reicht der Ersatz von humanen CDRs in humanen Rahmen durch CDRs aus Nagetier-Antikörpern aus, um eine hohe Antigen-Bindungsaffinität zu übertragen (P. T. Jones et al., Nature, Bd. 321 (1986), S. 522–525; M. Verhoeyen et al., Science, Bd. 239 (1988), S. 1534–1536), während es in anderen Fällen notwenig ist, eine weitere (L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323–327) oder mehrere (C. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 10029– 10033) Rahmenregionen-Reste (FR-Reste) zu ersetzen, vergl. auch Co et al., a. a. O.
Für einen gegebenen Antikörper wird angenommen, dass eine kleine Anzahl an FR-Resten für die Antigenbindung wichtig ist. Zunächst wurde beispielsweise von bestimmten Antikörpern gezeigt, dass sie einige FR-Reste enthalten, die das Antigen in Kristallstrukturen von Antikörper-Antigen-Komplexen direkt kontaktieren (beispielsweise im Übersichtsartikel von D. R. Davies et al., Ann. Rev. Biochem., Bd. 59 (1990), S. 439–473). Zweitens wurde eine Anzahl von FR-Resten von Chothia, Lesk und Mitarbeitern (C. Chothia & A. M. Lesk, J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 901– 917; C. Chothia et al., Nature, Bd. 342 (1989), S. 877–883; A. Tramontano et al., J. Mol. Biol., Bd. 215 (1990), S. 175–182) als kritisch für die Beeinflussung der Konformation von speziellen CDRs und somit für ihren Beitrag an der Antigen-Bindung postuliert; vergl. auch Margolies et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 72 (1975), S. 2180–2184.
Ferner ist es bekannt, dass in einigen Fällen eine variable Antikörper-Domäne (entweder V_H oder V_L) Glycosylierungsstellen enthalten kann und dass diese Glycosylierung die Antigenbindung verbessern oder beseitigen kann; Pluckthun, Biotechnology, Bd. 9 (1991), S. 545–551; Spiegelberg et al., Biochemistry, Bd. 9 (1970), S. 4217–4223; Wallic et al., J. Exp. Med., Bd. 168 (1988), S. 1099–1109; Sox et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 66 (1970), S. 975–982; Margni et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 6 (1988), S. 535–554. Üblicherweise hat jedoch die Glycosylierung keinen Einfluss auf die Antigen-Bindungseigenschaften eines Antikörpers; Pluckthun, a. a. O. (1991).
Die dreidimensionale Struktur von Immunoglobulinketten wurde untersucht und Kristallstrukturen für intakte Immunoglobuline, für eine Reihe von Immunoglobulin-Fragmenten und für Antikörper-Antigen-Komplexe wurden veröffentlicht (vergl. z. B. Saul et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 25 (1978), S. 585–97; Sheriff et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 8075–8079; Segal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 71 (1974), S. 4298–4302; Epp et al., Biochemistry, Bd. 14(22) (1975), S. 4943–4952; Marquart et al., J. Mol. Biol., Bd. 141 (1980), S. 369–391; Furey et al., J. Mol. Biol., Bd. 167 (1983), S. 661–692; Snow and Amzel, Protein: Structure, Function, and Genetics, Bd. 1 (1986), S. 267–279, Herausg. Alan R. Liss, Inc.; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 901–917; Chothia et al., Nature, Bd. 342 (1989), S. 877–883; Chothia et al., Science, Bd. 233 (1986), S. 755– 758; Huber et al., Nature, Bd. 264 (1976), S. 415–420; Bruccoleri et al., Nature, Bd. 335 (1988), S. 564–568 und Nature, Bd. 336 (1988), S. 266; Sherman et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 263 (1988), S. 4064–4074; Amzel and Poljak, Ann. Rev. Biochem., Bd. 48 (1979), S. 961–967; Silverton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5140–5144; und Gregory et al., Molecular Immunology, Bd. 24 (1987), S. 821–829. Es ist bekannt, dass die Funktion eines Antikörpers von seiner dreidimensionalen Struktur abhängt und dass Aminosäuresubstitutionen die dreidimensionale Struktur eines Antikörpers verändern können; Snow und Amzel, a. a. O. Es wurde gezeigt, dass die Antigen-Bindungsaffinität eines humanisierten Antikörpers durch Mutagenese auf der Grundlage einer Molekül-Modellbildung verstärkt werden kann (L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323-327; C. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 10029–10033).
Die Humanisierung eines Antikörpers unter Beibehaltung einer hohen Affinität für Antigeneigenschaften und andere angestrebte biologische Wirkungen ist derzeit mit den heutzutage verfügbaren Verfahrensweisen schwer zu erreichen. Man benötigt Verfahren zum Rationalisieren der Auswahl von Substitutionsstellen bei der Herstellung derartiger Antikörper, um dadurch die Effizienz der Antikörper-Humanisierung zu erhöhen.
Das Proto-onkogen HER2 (humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2) kodiert für eine Protein-tyrosin-kinase (p185^HER2), die mit dem humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor verwandt und in gewissem Umfang homolog ist (vergl. L. Coussens et al., Science, Bd. 230 (1985), S. 1132–1139; T.
Yamamoto et al., Nature, Bd. 319 (1986), S. 230–234; C. R. King et al., Science, Bd. 229 (1985), S. 974–976. HER2 ist auf dem Fachgebiet auch als c-erbB-2 bekannt und wird gelegentlich mit dem Namen des Ratten-Homologen, neu, bezeichnet. Eine Amplifikation und/oder Überexpression von HER2 ist mit multiplen humanen malignen Erkrankungen verbunden und scheint bei der Progression von 25–30% von humanen Brust- und Ovarialkarzinomen einen integrierenden Faktor darzustellen (D. J. Slamon et al., Science, Bd. 235 (1987), S. 177–182; D. J. Slamon et al., Science, Bd. 244 (1989), S. 707–712). Ferner besteht eine umgekehrte Korrelation zwischen dem Ausmaß der Amplifikation und der beobachteten mittleren Überlebenszeit der Patienten (Slamon, a. a. O., Science (1989)).
Der murine monoklonale Antikörper, der als muMAb4D5 bekannt ist (B. M. Fendly et al., Cancer Res., Bd. 50 (1990), S. 1550–1558) und gegen die extrazelluläre Domäne (ECD) von p185^HER2 gerichtet ist, hemmt spezifisch das Wachstum von Tumorzelllinien, die p185^HER2 überexprimieren, in einer Monolayer-Kultur oder in Weichagar (R. M. Hudziak et al., Molec. Cell. Biol., Bd. 9 (1989), S. 1165–1172; R. Lupu et al., Science, Bd. 249 (1990), S. 1552–1555). muMAb4D5 besitzt auch das Potential zur Verstärkung der Tumorzellen-Empfindlichkeit gegenüber dem Tumor-Nekrosefaktor, einem wichtigen Effektormolekül bei der durch Makrophagen vermittelten Tumorzellen-Zytotoxizität (Hudziak, a. a. O. (1989); H. M. Shepard und G. D. Lewis, J. Clinical Immunology, Bd. 8 (1988), S. 333–395). Somit weist muMAb4D5 das Potential für klinische Interventionen bei Karzinomen, bei denen p185^HER2 überexprimiert wird, und bei deren Abbildung auf. muMAb4D5 und dessen Verwendungsmöglichkeiten werden in der PCT-Anmeldung WO-89/06692 (veröffentlicht am 27. Juli 1989) beschrieben. Dieser murine Antikörper wurde bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC CRL 10463. Jedoch kann dieser Antikörper bei Menschen immunogen sein.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, humanisierte Antikörper bereitzustellen, die zur Bindung von p185^HER2 befähigt sind.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Studium der folgenden Beschreibung und der beigefügten Ansprüche.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die Erfindung betrifft neuartige Polypeptide gemäß der Definition in den Ansprüchen 1 und 2 und insbesondere neuartige humanisierte Antikörper gemäß der Definition in den Ansprüchen 3 bis 10.
Die Erfindung betrifft ferner die Immunotoxine von Anspruch 11 und die Arzneimittel der Ansprüche 12 und 13.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Polypeptide, humanisierten Antikörper und Immunotoxine bei der Herstellung eines Arzneimittels und die Verwendung der humanisierten Antikörper in diagnostischen Tests.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1A zeigt den Vergleich der V_L-Domänen-Aminosäurereste von muMAb4D5, huMAb4D5 und einer Consensus-Sequenz (1A, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID NO. 3). 1B zeigt den Vergleich zwischen den V_H-Domänen-Aminosäureresten von muMAb4D5, huMAb4D5 und einer Consensus-Sequenz (1B, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 2 bzw. SEQ ID NO. 4). Beide 1A und 1B bedienen sich des allgemein anerkannten Nummerierungsschemas von E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologicol Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)). In beiden 1A und 1B sind die CDR-Reste, die gemäß einer üblichen Sequenzdefinition bestimmt werden (gemäß E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologicol Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)), durch die erste Unterstreichung unterhalb der Sequenzen gekennzeichnet. Die CDR-Reste, die gemäß einer Strukturdefinition bestimmt wurden (gemäß C. Chothia & A. M. Lesk, J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 901–917), sind durch die zweite, tiefere Unterstreichung gekennzeichnet. Die Übereinstimmungsfehler (Mismatches) zwischen den Genen sind durch senkrechte Linien dargestellt.
2 zeigt ein Schema für die Humanisierung von muMAb4D5-V_L und -V_H durch Gen-Umwandlungsmutagenese.
3 zeigt die Hemmung der SK-BR-3-Vermehrung durch MAb4D5-Varianten. Die relative Zellvermehrung wurde gemäß R. M. Hudziak et al., Molec. Cell. Biol., Bd. 9 (1989), S. 1165–1172, bestimmt. Die Daten (Mittelwert von drei Bestimmungen) sind als prozentualer Anteil der Ergebnisse mit unbehandelten Kulturen für muMAb4D5 (I), huMAb4D5-8 (n) und huMAb4D5-1 (I) dargestellt.
4 zeigt eine Stereodarstellung des α-Kohlenstoff-Tracings für ein Modell von huMAb4D5-8-V_L und -V_H. Die CDR-Reste (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)) sind in Fettdruck dargestellt. Seitenketten von V_H-Resten A71, T73, A78, S93, Y102 und V_L-Resten Y55 plus R66 (vergl. Tabelle 3) sind dargestellt.
5 zeigt einen Aminosäuresequenz-Vergleich von V_L-Domänen (oberes Feld) und V_H-Domänen (unteres Feld) des murinen monoklonalen anti-CD3-Ab UCHT1 (muxCD3, Shalaby et al., J. Exp. Med., Bd. 175 (1992), S. 217–225) mit einer humanisierten Variante dieses Antikörpers (huxCD3v1). Ferner sind die Consensus-Sequenzen (besonders häufig vorkommende Reste oder Paare von Resten) der meisten reichlich vorkommenden humanen Untergruppen dargestellt, nämlich V_L κ 1 und V_H III, auf denen die humanisierten Sequenzen beruhen (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflg., National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (1991)). Die Sequenzen der leichten Kette muxCD3, huxCD3v1 und hu κ 1 entsprechen SEQ ID NO. 16, 17 bzw. 18. Die Sequenzen der schweren Kette weisen folgende Entsprechungen auf: muxCD3 (SEQ ID NO. 19), huxCD3v1 und hu III (SEQ ID NO. 21). Reste, die zwischen muxCD3 und huxCD3v1 unterschiedlich sind, sind mit einem Stern gekennzeichnet, während Reste, die sich zwischen humanisierten und Consensus-Sequenzen unterscheiden, durch ein Kreuzzeichen (#) identifiziert. Ein fetter Punkt (•) gibt an, dass für einen Rest an dieser Position festgestellt wurde, dass er in einer oder mehreren kristallographischen Strukturen von Antikörper/Antigen-Komplexen das Antigen kontaktiert (Kabat et al., 1991; I. S. Mian et al., J. Mol. Biol., Bd. 217 (1991), S. 133– 151). Die Stellung von CDR-Resten gemäß einer Sequenzdefinition (Kabat et al., (1991)) und einer strukturellen Definition (Chothia und Lesk, a. a. O. (1987)) sind durch eine Linie bzw. durch Zirkumflexzeichen (^) unterhalb der Sequenzen dargestellt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Im allgemeinen haben die in der Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen verwendeten Bezeichnungen oder Ausdrücke die folgenden Bedeutungen.
Der murine monoklonale Antikörper, der als muMAb4D5 bekannt ist (B. M. Fendly et al., Cancer Res., Bd. 50 (1990), S. 1550–1558) ist gegen die extrazelluläre Domäne (ECD) von p185^HER2 gerichtet. muMAb4D5 und seine Anwendungsmöglichkeiten sind in der PCT-Anmeldung WO-89/06692 (Veröffentlichungstag 27. Juli 1989) beschrieben. Dieser murine Antikörper wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 10463 hinterlegt. In der Beschreibung und den Ansprüchen bedeuten die Ausdrücke muMAb4D5, chMAb4D5 und huMAb4D5 murine, chimärisierte bzw. humanisierte Versionen des monoklonalen Antikörpers 4D5.
Bei einem humanisierten Antikörper handelt es sich für die vorliegenden Zwecke um eine Immunoglobulin-Aminosäuresequenz-Variante oder ein Fragment davon, das zur Bindung an ein vorbestimmtes Antigen befähigt ist und das eine FR-Region mit im wesentlichen der Aminosäuresequenz eines humanen Immunoglobulins und eine CDR mit im wesentlichen der Aminosäuresequenz eines nicht-humanen Immunoglobulins umfasst.
Im allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer nicht-humanen Quelle in den Antikörper eingeführt worden sind. Diese nicht-humanen Aminosäurereste werden hier als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer "Import"-Antikörperdomäne entnommen sind, insbesondere einer variablen Domäne. Ein "Import"-Rest, -Sequenz oder -Antikörper weist eine angestrebte Affinität und/oder Spezifität oder eine andere angestrebte biologische Antikörper-Aktivität gemäß den hier angestellten Erörterungen auf.
Im allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im wesentlichen die Gesamtheit von mindestens einer und typischerweise zwei variablen Domänen (Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc, Fv), in denen alle oder im wesentlichen alle CDR-Regionen den Regionen eines nicht-humanen Immunoglobulins entsprechen und es sich bei allen oder im wesentlichen allen FR-Regionen um Regionen einer humanen Immunoglobulin-Consensus-Sequenz handelt. Der humanisierte Antikörper umfasst ferner in optimaler Weise mindestens einen Bereich einer konstanten Immunoglobulin-Region (Fc), typischerweise die eines humanen Immunoglobulins. Üblicherweise enthält der Antikörper sowohl die leichte Kette als auch mindestens die variable Domäne einer schweren Kette. Der Antikörper kann auch die CH1-, Gelenk-, CH2-, CH3- und CH4-Regionen der schweren Kette umfassen.
Der humanisierte Antikörper wird aus einer beliebigen Klasse von Immunoglobulinen ausgewählt, einschließlich IgM, IgG, IgD, IgA und IgE und beliebige Isotypen, einschließlich IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4. Üblicherweise handelt es sich bei der konstanten Domäne um eine konstante Komplementfixierungsdomäne, wenn es erwünscht ist, dass der humanisierte Antikörper eine zytotoxische Aktivität aufweist. Er gehört typischerweise der Klasse IgG1 an. Sofern eine derartige zytotoxische Aktivität nicht erwünscht ist, kann die konstante Domäne der IgG2-Klasse angehören. Der humanisierte Antikörper kann Sequenzen aus mehr als einer Klasse oder einem Isotyp umfassen. Die Auswahl von speziellen konstanten Domänen zur Optimierung der angestrebten Effektorfunktionen liegt im üblichen Können des Fachmanns.
Die FR- und CDR-Regionen des humanisierten Antikörpers müssen nicht genau den parentalen Sequenzen entsprechen, z. B. kann die Import-CDR oder die Consensus-FR durch Substitution, Insertion oder Deletion von mindestens einem Rest so einer Mutagenese unterworfen worden sein, dass der CDR- oder FR-Rest an dieser Stelle weder dem Consensus- noch dem Import-Antikörper entspricht. Derartige Mutationen sind jedoch nicht umfangreich. Üblicherweise entsprechen mindestens 75% der humanisierten Antikörperreste den Resten der parentalen FR- und CDR-Sequenzen, häufiger 90% und ganz besonders mehr als 95%.
Im allgemeinen werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte humanisierte Antikörper durch ein Verfahren unter Analyse der parentalen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Anwendung dreidimensionaler Modelle der parentalen und humanisierten Sequenzen erzeugt. Dreidimensionale Immunoglobulinmodelle sind allgemein zugänglich und dem Fachmann geläufig. Es stehen Computerprogramme zur Verfügung, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen von ausgewählten, in Frage kommenden Immunoglobulinsequenzen erläutern und darstellen. Eine Betrachtung dieser Darstellungen ermöglicht eine Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der Funktionsweise der in Frage stehenden Immunoglobulinsequenz, d. h. bei der Analyse der Reste, die die Fähigkeit des in Frage stehenden Immunoglobulins zur Bindung von dessen Antigen beeinflussen.
Reste, die die Antigenbindung beeinflussen, sind als Reste definiert, die im wesentlichen für die Antigen-Affinität oder Antigen-Spezifität eines in Frage stehenden Immunoglobulins verantwortlich sind, und zwar in positivem oder negativem Sinn. Die Erfindung ist darauf abgestellt, FR-Reste aus der Consensus- und Import-Sequenz so auszuwählen und zu kombinieren, dass die angestrebten Immunoglobulin-Eigenschaften erreicht werden. Zu derartigen angestrebten Eigenschaften gehört eine Zunahme der Affinität und eine höhere Spezifität in Bezug auf das Zielantigen, obgleich es denkbar ist, dass unter Umständen auch die entgegengesetzten Wirkungen erwünscht sein könnten. Im allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und in besonders erheblichem Umfang an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt (obgleich nicht alle CDR-Reste daran beteiligt sind und somit nicht notwendigerweise in die Consensus-Sequenz eingesetzt werden müssen). Jedoch weisen FR-Reste ebenfalls eine erhebliche Wirkung auf und können ihren Einfluss auf mindestens drei Wegen ausüben: sie können nicht-kovalent direkt an das Antigen binden, sie können mit CDR-Resten in Wechselwirkung treten und sie können die Grenzfläche zwischen den schweren und leichten Ketten beeinflussen.
Ein Rest, der in nicht-kovalenter Weise direkt an ein Antigen bindet, ist ein Rest, von dem aufgrund einer dreidimensionalen Analyse vernünftigerweise erwartet werden kann, dass er in nicht-kovalenter Weise direkt an ein Antigen bindet. Typischerweise ist es erforderlich, aus der räumlichen Stellung benachbarter CDRs und den Abmessungen und der Struktur des Zielantigens auf die Position des Antigens zu schließen. Im allgemeinen besteht nur bei den humanisierten Antikörperresten, die zur Bildung von Salzbrücken, Wasserstoffbrückenbindungen oder hydrophoben Wechselwirkungen befähigt sind, die Wahrscheinlichkeit, dass sie an einer nicht-kovalenten Antigenbindung beteiligt sind, jedoch können auch Reste, die Atome aufweisen, die um 3,2 Å oder weniger räumlich vom Antigen getrennt sind, eine nicht-kovalente Wechselwirkung mit dem Antigen eingehen. Bei derartigen Resten handelt es sich typischerweise um die relativ größeren Aminosäuren, deren Seitenketten das größte Volumen aufweisen, wie Tyrosin, Arginin und Lysin. Antigenbindende FR-Reste weisen ferner typischerweise Seitenketten auf, die auf eine Umhüllung, die die lösungsmittelorientierte Fläche eines CDR umgibt, orientiert sind, wobei sich diese Fläche etwa 7 Å aus der CDR-Domäne in das Lösungsmittel und etwa 7 Å auf beiden Seiten der CDR-Domäne erstreckt, was ebenfalls durch Bildung eines dreidimensionalen Modells sichtbar gemacht werden kann.
Bei einem Rest, der mit einer CDR in Wechselwirkung tritt, handelt es sich im allgemeinen um einen Rest, der entweder die Konformation des CDR-Polypeptidgerüstes beeinflusst oder eine nicht-kovalente Bindung mit einer CDR-Rest-Seitenkette bildet. Bei Resten, die die Konformation beeinflussen, handelt es sich üblicherweise um Reste, die die räumliche Position beliebiger CDR-Gerüstatome (N, Cα, C, O, Cβ) um mehr als etwa 0,2 Å verändern. Gerüstatome von CDR-Sequenzen werden beispielsweise durch Reste verlagert, die organisierte Strukturen, wie β-Blätter, Helices oder Schleifen, unterbrechen oder modifizieren. Zu Resten, die einen ausgeprägten Einfluss auf die Konformation von benachbarten Sequenzen ausüben, gehören Prolin und Glycin, die beide zur Einführung von Biegungen in das Gerüst befähigt sind. Bei weiteren Resten, die Gerüstatome verlagern können, handelt es sich um Reste, die zur Teilnahme an Salzbrücken und Wasserstoffbrückenbindungen befähigt sind.
Bei einem Rest, der mit einer CDR-Seitenkette in Wechselwirkung tritt, handelt es sich um einen Rest, von dem vernünftigerweise erwartet wird, dass er eine nicht-kovalente Bindung mit einer CDR-Seitenkette bildet, im allgemeinen entweder eine Salzbrücke oder eine Wasserstoffbrückenbindung. Derartige Reste werden durch eine dreidimensionale Positionierung ihrer Seitenketten identifiziert. Die Bildung einer Salz- oder lonenbrücke lässt sich zwischen zwei Seitenketten erwarten, die in einem Abstand im Bereich von etwa 2,5–3,2 Å voneinander angeordnet sind und entgegengesetzte Ladungen tragen, z. B. ein Lysinyl- und Glutamyl-Paar. Die Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung lässt sich zwischen den Seitenketten von Restepaaren, wie Seryl oder Threonyl mit Aspartyl oder Glutamyl (oder anderen wasserstoffaufnehmenden Resten) erwarten. Derartige Paarbildungen sind auf dem Gebiet der Proteinchemie bekannt und ergeben sich für den Fachmann bei der Erstellung eines dreidimensionalen Modells des in Frage stehenden Immunoglobulins.
Immunoglobulinreste, die die Grenzfläche zwischen den variablen Regionen von schweren und leichten Ketten ("die V_L-V_H-Grenzfläche") beeinflussen, sind solche Reste, die die Nähe oder Orientierung der beiden Ketten in Bezug zueinander beeinflussen. Von bestimmten Resten ist bereits bekannt, dass sie an Wechselwirkungen zwischen den Ketten beteiligt sind. Hierzu gehören die V_L-Reste 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 und 98 und die V_H-Reste 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 und 103 (unter Anwendung der Nomenklatur von Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)). Weitere Reste wurden von den Erfindern neu identifiziert. Hierzu gehören 43L, 85L, 43H und 60H. Während diese Reste nur für IgG angegeben sind, gelten sie auch über die Spezies hinweg. In der erfindungsgemäßen Praxis werden Import-Antikörperreste, von denen vernünftigerweise eine Beteiligung an Wechselwirkungen zwischen den Ketten zu erwarten ist, für die Substitution in die Consensus-Sequenz ausgewählt. Es wird angenommen, dass bisher kein humanisierter Antikörper mit einem Rest mit Einfluss innerhalb der Kette (Intraketten-Einfluss), der aus einer Import-Antikörpersequenz ausgewählt ist, hergestellt worden ist.
Da die genaue Auswirkung einer gegebenen Substitution nicht vollständig vorhergesagt werden kann, ist es erforderlich, die Substitution durchzuführen und den in Frage stehenden Antikörper auf die angestrebte Eigenschaft zu testen. Diese Stufen stellen jedoch per se Routinemaßnahmen dar und fallen unter das allgemeine Fachwissen.
CDR- und FR-Reste werden gemäß einer üblichen Sequenzdefinition (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda MD (1987)) und einer strukturellen Definition (gemäß Chothia und Lesk, J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 901–917) festgelegt. Sofern diese beiden Methoden zu leicht unterschiedlichen Identifikationen einer CDR führen, wird die strukturelle Definition bevorzugt, wobei aber die durch die Sequenzdefinition identifizierten Reste als wichtige FR-Reste für die Festlegung, welche Rahmenreste in eine Consensus-Sequenz zu importieren sind, angesehen werden.
In der gesamten Beschreibung wird auf das Nummerierungsschema von E. A. Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) und (1991), Bezug genommen. In diesen Abhandlungen listet Kabat zahlreiche Aminosäuresequenzen für Antikörper der einzelnen Unterklassen auf sowie die am häufigsten auftretenden Aminosäuren für jede Restposition in dieser Unterklasse. Kabat bedient sich eines Verfahrens, bei dem er jeder Aminosäure in einer Sequenzliste eine Restnummer zuordnet. Dieses Verfahren zur Zuordnung von Restnummern ist auf dem einschlägigen Gebiet zum Standard geworden. In der vorliegenden Beschreibung wird das Kabat-Nummerierungsschema eingehalten.
Für die Zwecke der Erfindung wird bei der Zuordnung von Nummern für Reste einer in Frage stehenden Antikörper-Aminosäuresequenz, die nicht in der Kabat-Abhandlung enthalten ist, einer der folgenden Schritte ergriffen. Im allgemeinen wird die in Frage stehende Sequenz mit einer Immunoglobulin-Sequenz oder einer Consensus-Sequenz von Kabat ausgerichtet. Die Ausrichtung kann von Hand oder mittels eines Computers unter Verwendung allgemein anerkannter Computerprogramme durchgeführt werden. Ein Beispiel für ein derartiges Programm ist das in der Beschreibung erörterte Align 2-Programm. Die Ausrichtung lässt sich erleichtern, indem man einige Aminosäurereste heranzieht, die die meisten Fab-Sequenzen gemeinsam haben. Beispielsweise weisen die leichten und schweren Ketten jeweils typischerweise zwei Cysteinreste auf, die die gleichen Restnummern tragen: in der V_L-Domäne befinden sich die beiden Cysteine typischerweise bei den Restnummern 23 und 88 und in der V_H-Domäne sind die beiden Cysteinreste typischerweise mit 22 und 92 nummeriert. Rahmenreste weisen im allgemeinen (jedoch nicht immer) etwa die gleiche Anzahl an Resten auf, jedoch variieren die CDRs in ihrer Größe. Beispielsweise werden im Fall einer CDR aus einer in Frage stehenden Sequenz, die eine größere Länge als die CDR in der Sequenz bei Kabat, mit der sie ausgerichtet ist, aufweist, typischerweise mit Suffixen zur Restnummer versehen, die die Insertion von zusätzlichen Resten angeben (vergl. beispielsweise die Reste 100abcde in 5). Für in Frage stehende Sequenzen, bei denen beispielsweise für die Reste 34 und 36 eine Ausrichtung mit einer Kabat-Sequenz gegeben ist, die jedoch dazwischen keinen Rest zur Ausrichtung mit dem Rest 35 aufweisen, wird es einfach unterlassen, die Nummer 35 einem Rest zuzuordnen.
Somit kann bei der Humanisierung einer variablen Import-Sequenz, bei der man eine gesamte humane oder Consensus-CDR ausschneidet und sie durch eine Import-CDR-Sequenz ersetzt, folgendes durchgeführt werden: (a) die genaue Anzahl an Resten kann ausgetauscht werden, wobei die Nummerierung gleich bleibt, (b) im Vergleich zum ausgeschnittenen Bereich können weniger Import-Aminosäurereste eingeführt werden, wobei in diesem Fall in den Restnummern eine Lücke bleibt, oder (c) eine im Vergleich zum ausgeschnittenen Bereich größere Anzahl an Aminosäureresten kann eingeführt werden, wobei in diesem Fall die Nummerierung die Verwendung von Suffixen, wie 100abcde, umfasst.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Consensus-Sequenz" und "Consensus-Antikörper" beziehen sich auf eine Aminosäuresequenz, die die am häufigsten auftretenden Aminosäurereste an den einzelnen Stellungen in sämtlichen Immunoglobulinen von beliebigen speziellen Unterklassen- oder Untereinheitstrukturen umfasst. Die Consensus-Sequenz kann auf Immunoglobulinen einer bestimmten Spezies oder von zahlreichen Spezies beruhen. Die Ausdrücke "Consensus"-Sequenz, -Struktur oder -Antikörper sollen eine humane Consensus-Sequenz gemäß den Angaben in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfassen und sollen sich auf eine Aminosäuresequenz beziehen, die die am häufigsten auftretenden Aminosäurereste an den einzelnen Stellen in sämtlichen humanen Immunoglobulinen von beliebigen speziellen Unterklassen- oder Untereinheitstrukturen umfassen. Die verwendeten Consensus-Sequenzen umfassen humane Consensus-Strukturen sowie Consensus-Strukturen, die neben dem Menschen auch andere Spezies berücksichtigen.
Die Untereinheit-Strukturen der fünf Immunoglobulinklassen beim Menschen sind nachstehend aufgeführt.
In bevorzugten Ausführungsformen einer humanen IgGγ1-Consensus-Sequenz sind die variablen Consensus-Domänensequenzen von den häufigsten Unterklassen in der Sequenzaufstellung von Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda MD (1987), nämlich der V_L-κ-Untergruppe I und der V_H-Gruppe III abgeleitet. In derartigen bevorzugten Ausführungsformen weist die V_L-Consensus-Domäne die folgende Aminosäuresequenz auf:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASS LESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSLPYTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO. 3);
und die V_H-Consensus-Domäne weist die folgende Aminosäuresequenz auf:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVAVI SENGSDTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGGAYSY FDVWGQGTLVTVSS:
Diese Sequenzen umfassen Consensus-CDRs sowie Consensus-FR-Reste (vergl. z. B. 1).
Ohne Festlegung auf irgendwelche speziellen Theorien, könnte es der Fall sein, dass bei diesen bevorzugten Ausführungsformen die Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie in einem Individuum weniger immunogen sind als weniger häufige Unterklassen. Jedoch wird in anderen Ausführungsformen die Consensus-Sequenz von anderen Unterklassen von humanen variablen Immunoglobulin-Domänen abgeleitet. In weiteren Ausführungsformen wird die Consensus-Sequenz von humanen konstanten Domänen abgeleitet.
Eine Identität oder Homologie bezüglich einer speziellen Aminosäuresequenz wird hier definiert als prozentualer Anteil an Aminosäureresten in einer in Frage stehenden Sequenz, die mit den angegebenen Resten identisch sind, und zwar nach Ausrichtung der Sequenzen und gegebenenfalls Einführung von Lücken, um die maximale prozentuale Homologie zu erreichen, wobei etwaige konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität berücksichtigt werden. Keine der N-terminalen, C-terminalen oder internen Erweiterungen, Deletionen oder Insertionen in der angegebenen Sequenz soll als Beeinflussung der Homologie angesehen werden. Bei sämtlichen erfindungsgemäß verlangten Sequenzausrichtungen handelt es sich um derartige Ausrichtungen mit maximaler Homologie. Während derartige Ausrichtungen von Hand unter Anwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden können, besteht ein geeignetes Computerprogramm im "Align 2"-Programm, für das Schutz im U.S. Register of Copyrights angestrebt wird (Align 2, Genentech, Inc., Anmeldetag 9. Dezember 1991).
"Nicht-homologe" Import-Antikörperreste sind solche Reste, die nicht identisch mit dem Aminosäurerest an der analogen oder entsprechenden Stelle in einer Consensus-Sequenz sind, nachdem die Import- und Consensus-Sequenzen ausgerichtet worden sind.
Eine "biologische Eigenschaft", beispielsweise bezüglich anti-p185^HER2, bedeutet für die vorliegenden Zwecke eine in vivo-Effektor- oder -Antigenbindungs-Funktion oder -Aktivität, die direkt oder indirekt durch huMAb4D5 (in seiner nativen oder denaturierten Konformation) ausgeübt wird. Zu Effektorfunktionen gehören die p185^HER2-Bindung, beliebige hormonelle oder hormonantagonistische Aktivitäten, beliebige mitogene oder agonistische oder antagonistische Aktivitäten und beliebige zytotoxische Aktivitäten. Unter einer antigenen Funktion ist das Vorliegen eines Epitops oder einer antigenen Stelle zu verstehen, die zur Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen die Polypeptidsequenz von huMAb4D5 befähigt sind.
Biologisch aktives huMAb4D5 ist hier als ein Polypeptid definiert, das eine Effektorfunktion von huMAb4D5 aufweist. Eine hauptsächliche bekannte Effektorfunktion von huMAb4D5 ist die Fähigkeit zur Bindung an p185^HER2.
Somit umfassen die biologisch aktiven und antigenmäßig aktiven huMAb4D5-Polypeptide, die Gegenstand bestimmter Ausführungsformen der Erfindung sind, die Sequenz der gesamten translatierten Nucleotidsequenz von huMAb4D5; reifes huMAb4D5; Fragmente davon mit einer konsekutiven Sequenz von mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäureresten, umfassend Sequenzen aus muMAb4D5 plus Reste aus der humanen FR von huMAb4D5; Aminosäuresequenz-Varianten von huMAb4D5, wobei ein Aminosäurerest N- oder C-terminal oder innerhalb von huMAb4D5 oder ein Fragment davon gemäß der vorstehenden Definition inseriert worden ist; Aminosäuresequenz-Varianten von huMAb4D5 oder von einem Fragment davon gemäß der vorstehenden Definition, wobei ein Aminosäurerest von huMAb4D5 oder von einem Fragment davon gemäß der vorstehenden Definition durch einen anderen Rest substituiert ist, einschließlich vorgegebene Mutationen beispielsweise durch positionsgerichtete oder PCR-Mutagenese; Derivate von huMAb4D5 oder von Fragmenten davon gemäß der vorstehenden Definition, wobei huMAb4D5 oder dessen Fragmente durch Substitution, chemische, enzymatische oder andere geeignete Maßnahmen kovalent mit einem Rest, der von einer natürlich vorkommenden Aminosäure abweicht, modifiziert worden sind; und Glycosylierungsvarianten von huMAb4D5 (Insertion einer Glycosylierungsstelle oder Deletion einer etwaigen Glycosylierungsstelle durch Deletion, Insertion oder Substitution von geeigneten Resten). Derartige Fragmente und Varianten schließen alle bisher identifizierten Polypeptide, einschließlich muMAb4D5 oder beliebige bekannte Polypeptidfragmente davon, aus.
Unter einem "isolierten" Polypeptid ist ein Polypeptid zu verstehen, das aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Bei verunreinigenden Komponenten aus der natürlichen Umgebung handelt es sich um Materialien, die zu einer Störung der diagnostischen oder therapeutischen Anwendung des Polypeptids führen würden, wobei hierzu Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige gelöste Stoffe gehören können. In bevorzugten Ausführungsformen wird beispielsweise ein Polypeptidprodukt, das huMAb4D5 umfasst, aus einer Zellkultur oder einer anderen synthetischen Umgebung folgendermaßen gereinigt: (1) auf einen Proteingehalt von mehr als 95 Gew.-%, bestimmt nach dem Lowry-Verfahren, und insbesondere auf mehr als 99 Gew.-%, (2) in einem Ausmaß, das ausreicht, dass mindestens 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz unter Verwendung eines in der Gasphase oder flüssigen Phase arbeitenden Sequenators (z. B. die handelsüblichen Sequenatormodelle 470, 477 oder 473 der Fa. Applied Biosystems) erhalten werden, oder (3) bis zur homogenen Beschaffenheit bei Anwendung von SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise unter Silberfärbung. Isoliertes huMAb4D5 umfasst in situ-huMAb4D5 innerhalb rekombinanter Zellen, da mindestens eine Komponente der natürlichen huMAb4D5-Umgebung nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird jedoch isoliertes huMAb4D5 durch mindestens eine Reinigungsstufe hergestellt.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei huMAb4D5-Nucleinsäure um RNA oder DANN, die mehr als 10 Basen enthält, die für biologisch oder antigenmäßig aktives huMAb4D5 kodieren, komplementär zur Nucleinsäuresequenz, die für ein derartiges huMAb4D5 kodiert, ist oder die mit einer Nucleinsäuresequenz, die für ein derartiges huMAb4D5 kodiert, hybridisiert und unter stringenten Bedingungen stabil gebunden bleibt sowie Nucleinsäure aus einer muMAb4D5-CDR und einer humanen FR-Region umfasst.
Vorzugsweise kodiert die huMAb4D5-Nucleinsäure für ein Polypeptid, das mindestens 75% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 80%, ganz besonders mindestens 85%, besonders bevorzugt 90% und ganz besonders bevorzugt 95% mit der huMAb4D5-Aminosäuresequenz aufweist. Vorzugsweise handelt es sich um ein Nucleinsäuremolekül, das mit der huMAb4D5-Nucleinsäure hybridisiert, die mindestens 20, vorzugsweise 40 und insbesondere 90 Basen enthält.
Bei stringenten Bedingungen handelt es sich um folgende Bedingungen: (1) Anwendung einer geringen Ionenstärke und einer hohen Temperatur zum Waschen, z. B. 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0/1% NaDodSO₄ bei 50°C; (2) während der Hybridisierung Verwendung eines Denaturierungsmittels, wie Formamid, z. B. 50% (Vol./Vol.) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0/1% Ficoll/0/1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhard-Lösung, mit Ultraschall behandelte Lachssperma-DNA (50 g/ml), 0.1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C unter Waschen bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS.
Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer funktionell verknüpften Kodierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die für Prokaryonten geeigneten Kontrollsequenzen umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise weitere Sequenzen, über die man bisher wenig weiß. Von eukaryontischen Zellen ist bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Eine Nucleinsäure ist "funktionell verknüpft", wenn sie sich in funktioneller Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz befindet. Beispielsweise ist eine DNA für eine Präsequenz oder sekretorischen Leader funktionell mit einer DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist. Ein Promotor oder Enhancer ist funktionell mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn sie die Transkription der Sequenz beeinflusst. Eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionell mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn sie so angeordnet ist, dass die Translation erleichtert wird. Im allgemeinen bedeutet der Ausdruck "funktionell verknüpft", dass DNA-Sequenzen, die verknüpft werden, nahe benachbart sind und im Fall eines sekretorischen Leaders nahe benachbart sind und sich in der Lesephase befinden. Jedoch müssen Verstärker nicht nahe benachbart sein. Eine Verknüpfung wird durch Verknüpfung an zweckmäßigen Restriktionsstellen vorgenommen. Wenn derartige Stellen nicht existieren, so werden synthetische Oligonucleotid-Adaptoren oder -Linker gemäß herkömmlicher Praxis eingesetzt.
Ein "exogenes" Element ist so definiert, dass es eine Nucleinsäuresequenz bedeutet, die für die Zelle fremd ist oder die für die Zelle homolog ist, sich jedoch in einer Position innerhalb der Wirtszellen-Nucleinsäure befindet, in der das Element üblicherweise nicht auftritt.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" sind untereinander austauschbar. Alle diese Bezeichnungen umfassen auch die Nachkommenschaft. Somit umfassen die Ausdrücke "Transformanten" und "transformierte Zellen" die primäre Zelle sowie davon abgeleitete Kulturen ohne Berücksichtigung der Anzahl der Übertragungen. Es ist ferner darauf hinzuweisen, dass sämtliche Nachkommen möglicherweise in ihrem DNA-Gehalt nicht genau identisch sind, was auf absichtliche oder unabsichtliche Mutationen zurückzuführen ist. Mutante Nachkommen, die die gleiche Funktion oder biologische Aktivität, wie sie für die ursprünglich transformierte Zelle ausgesucht worden sind, aufweisen, werden umfasst. Sofern unterscheidende Bezeichnungen beabsichtigt sind, geht dies klar aus dem Zusammenhang hervor.
Bei "Oligonucleotiden" handelt es sich um kurzkettige, einzelsträngige oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die chemisch nach bekannten Verfahren synthetisiert werden (z. B. durch chemische Phosphotriester, Phosphit- oder Phosphoramidit-Verfahren unter Anwendung von Festphasentechniken gemäß EP-266 032 (veröffentlicht am 4. Mai 1988) oder über Desoxynucleosid-H-phosphonat-Zwischenprodukte gemäß Froehler et al., Nucl. Acids Res., Bd. 14 (1986), S. 5399– 5407). Sie werden dann an Polyacrylamidgelen gereinigt.
Die Technik der "Polymerase-Kettenreaktion" oder "PCR", die hier verwendet wird, bezieht sich allgemein auf ein Verfahren, bei dem winzige Mengen eines bestimmten Stückes von Nucleinsäure, RNA und/oder DNA gemäß US-Patent 4 683 195 (Ausgabetag 28. Juli 1987) amplifiziert werden. Im allgemeinen müssen Sequenzinformationen von den Enden der in Frage stehenden Region oder darüber hinaus verfügbar sein, so dass Oligonucleotid-Primer konstruiert werden können. Diese Primer weisen bezüglich ihrer Sequenz Identität oder Ähnlichkeit zu gegenüberliegenden Strängen der zu amplifizierenden Matrize auf. Die 5'-terminalen Nucleotide der beiden Primer können mit den Enden des amplifizierten Materials zusammenfallen. PCR kann zur Amplifikation spezieller RNA-Sequenzen, spezieller DNA-Sequenzen aus der gesamten genomischen DNA und cDNA, die aus der gesamten zellulären RNA, Bacteriophagen- oder Plasmidsequenzen und dergl. transkribiert worden ist, herangezogen; vergl. allgemein Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Bd. 51 (1987), S. 263; Erlich, Hrsg., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Der Ausdruck "PCR" wird hier als ein Beispiel (aber nicht das einzige) eines Nucleinsäure-Polymerasereaktionsverfahrens zur Amplifikation einer Nucleinsäure-Testprobe angesehen, das die Verwendung einer bekannten Nucleinsäure (DNA oder RNA) als Primer umfasst und sich einer Nucleinsäure-polymerase zur Amplifikation oder Erzeugung eines speziellen Stückes von Nucleinsäure oder zur Amplifikation oder Erzeugung eines speziellen Stückes einer Nucleinsäure, die komplementär zu einer bestimmten Nucleinsäure ist, bedient.
Geeignete Verfahren zur praktischen Duchführung der Erfindung
Einige Aspekte der Erfindung umfassen die Bereitstellung einer nicht-humanen, variablen Import-Antikörper-Domäne, die Herstellung einer angestrebten humanisierten Antikörper-Sequenz und die Humanisierung einer Antikörper-Gensequenz gemäß den nachstehenden Ausführungen. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Veränderung einer Gensequenz, wie eine Genumwandlung aus einer nicht-humanen oder Consensus-Sequenz in eine humanisierte Nucleinsäuresequenz besteht in dem in Beispiel 1 beschriebenen Kassetten-Mutagenese-Verfahren. Ferner werden allgemein Verfahren zur Bereitstellung und Erzeugung von Antikörpern angegeben, die gleichermaßen für native, nicht-humane Antikörper sowie für humanisierte Antikörper gelten.
Im allgemeinen werden die Antikörper und variablen Antikörper-Domänen der Erfindung auf herkömmliche Weise in rekombinanter Zellkultur gemäß der ausführlichen nachstehenden Beschreibung hergestellt. Eine rekombinante Synthese wird aus Gründen der Sicherheit und der Wirtschaftlichkeit bevorzugt, wobei es jedoch auch bekannt ist, Peptide durch chemische Synthese herzustellen sowie sie aus natürlichen Quellen zu reinigen. Derartige Präparate fallen unter die hier gegebene Definition von Antikörpern.
Bildung von Molekülmodellen
Ein Bestandteil unserer Vorgehensweise zur Humanisierung von Antikörpern besteht in der Konstruktion von Computer-Grafikmodellen der Import- und humanisierten Antikörper. Diese Modelle werden verwendet, um festzustellen, ob die sechs Regionen zur Bestimmung der komplementären Beschaffenheit (CDRs) in erfolgreicher Weise aus dem Import-Rahmen in einen humanen Rahmen transplantiert werden können, und um festzustellen, welche Rahmenreste aus dem Import-Antikörper (sofern vorhanden) in den humanisierten Antikörper eingebaut werden müssen, um die CDR-Konformation aufrechtzuerhalten. Ferner kann eine Analyse der Sequenzen der Import- und humanisierten Antikörper und eine Bezugnahme auf die Modelle die Unterscheidung erleichtern, welche Rahmenreste unüblich sind und somit an der Antigenbindung oder Aufrechterhaltung einer einwandfreien Antikörperstruktur beteiligt sein könnten.
Sämtliche erfindungsgemäßen humanisierten Antikörper-Modelle beruhen auf einer einzigen dreidimensionalen Computer-Grafikstruktur, die nachstehend als Consensus-Struktur bezeichnet wird. Diese Consensus-Struktur stellt ein Schlüssel-Merkmal zur Unterscheidung von der Vorgehensweise bisheriger Bearbeiter auf dem einschlägigen Gebiet dar, die typischerweise mit einer Auswahl einer humanen Antikörper-Struktur beginnen, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die ähnlich mit der Sequenz ihres Import-Antikörpers ist.
Die Consensus-Struktur einer Ausführungsform der Erfindung wurde in den nachstehend beschriebenen 5 Stufen aufgebaut.
Stufe 1: Sieben Fab-Röntgenkristallstrukturen der Brookhaven Protein Data Bank wurden verwendet (2FB4, 2RHE, 3FAB und 1REI, die humane Strukturen darstellen, und 2MCP, 1FBJ und 2HFL, die murine Strukturen darstellen). Für jede Struktur wurden eine Protein-Hauptkettengeometrie und Wasserstoffbrücken-Bindungsmuster verwendet, um jedem Rest eine der drei sekundären Strukturtypen zuzuordnen: alpha-Helix, beta-Strang oder eine andere Struktur (d. h. nicht-Helix und nicht-Strang). Die Immunoglobulinreste, die bei der Überlagerung verwendet wurden und die in der Consensus-Struktur enthalten sind, sind in Tabelle I aufgeführt.
Tabelle I Bei der Überlagerung verwendete Immunoglobulinreste und Reste in der Consensus-Struktur
Stufe 2: Nach Identifikation der alpha-Helices und der beta-Stränge in jedem der sieben Strukturen wurden die Strukturen unter Verwendung des INSIGHT-Computerprogramms (Biosym Technologies, San Diego, CA) auf folgende Weise gegenseitig überlagert. Die 2FB4-Struktur wurde willkürlich als Matrizenstruktur (oder Referenzstruktur) ausgewählt. Das 2FB4 wurde räumlich fixiert gehalten und die übrigen sechs Strukturen wurden im Raum einer Rotations- und Translationsbewegung unterzogen, so dass ihre gemeinsamen sekundären Strukturelemente (d. h. alpha-Helices und beta-Stränge) so orientiert waren, dass sich diese gemeinsamen Elemente zu einer zueinander möglichst nahe benachbarten Position befanden. (Diese Überlagerung wurde unter Verwendung anerkannter mathematischer Formeln anstelle einer tatsächlichen physikalischen Bewegung von Strukturen von Hand durchgeführt.)
Stufe 3: Nach der auf diese Weise vorgenommenen Überlagerung der sieben Strukturen wurde für jeden Rest im Matrizen (2FB4)-Fab der Abstand vom Matrizen-alpha-Kohlenstoffatom (Cα) zum analogen Cα-Atom in jedem der übrigen sechs überlagerten Strukturen berechnet. Dies führt zu einer Tabelle von Cα-Cα-Abständen für die Position der einzelnen Reste in der Sequenz. Eine derartige Tabelle ist erforderlich, um festzustellen, welche Restpositionen in das Consensus-Modell aufgenommen werden. Im allgemeinen wurde diese Position dann, wenn sämtliche Cα-Cα-Abstände für eine gegebene Restposition ≤ 1,0 Å betrugen, in die Consensus-Struktur aufgenommen. Wenn für eine gegebene Position nur eine Fab-Kristallstruktur > 1,0 Å war, wurde die Position aufgenommen, jedoch wurde die außerhalb liegende Kristallstruktur nicht in die nächste Stufe aufgenommen (nur für diese Position). Im allgemeinen wurden die sieben β-Stränge in die Consensus-Struktur aufgenommen, während einige der Schleifen, die die β-Stränge verbinden, z. B. die Regionen, die die komplementäre Beschaffenheit festlegen (CDRs), nicht in eine Darstellung der Cα-Divergenz aufgenommen wurden.
Stufe 4: Für jeden Rest, der nach Stufe 3 in die Consensus-Struktur aufgenommen wurde, wurde der Mittelwert der Koordinaten für die einzelnen Hauptkettenatome N, Cα, C, O und Cβ berechnet. Aufgrund des Mittelungsverfahrens sowie aufgrund der Variation der Bindungslänge, des Bindungswinkels und des Diederwinkels unter den Kristallstrukturen enthielt diese „gemittelte" Struktur einige Bindungslängen und Winkel, die von der Standardgeometrie abwichen. Für die Zwecke der Erfindung wird unter "Standardgeometrie" verstanden, dass sie Geometrien umfasst, die üblicherweise als typisch anerkannt werden, z. B. die Zusammenstellung von Bindungslängen und Winkeln aus Strukturen von kleinen Molekülen gemäß S. J. Weiner et. al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 106 (1984), S. 765–784.
Stufe 5: Um diese Abweichungen zu korrigieren bestand die letzte Stufe darin, die "gemittelte" Struktur 50 Zyklen der Energieminimierung (DISCOVER-Programm, Biosym Technologies) unter Anwendung des AMBER-Satzes von Parametern (S. J. Weiner et. al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 106 (1984), S. 765–784) zu unterwerfen, wobei nur die Cα-Koordinaten fixiert sind (d. h. sämtliche übrigen Atome dürfen sich bewegen) (die Energieminimierung wird nachstehend beschrieben). Dies macht es möglich, dass etwaige abweichende Bindungslängen und Winkel eine Standardgeometrie (chemisch akzeptable Geometrie) annehmen; vergl. Tabelle II.
Tabelle II Durchschnittliche Bindungslängen und Winkel für "gemittelte" (vorher) und energieminimierte Consensus-Strukturen (nach 50 Zyklen)
Werte in Klammern geben die Standardabweichungen an. Es ist darauf hinzuweisen, dass sich zwar die Mittelwerte einiger Bindungslängen und Winkel nach Energieminimierung nicht merklich veränderten, dass aber die entsprechenden Standardabweichungen sich aufgrund der abweichenden Geometrien unter Heranziehung der Standardwerte nach der Energieminimierung verringerten. Die Werte für die Standardgeometrie entstammen dem AMBER-Kräftefeld gemäß DISCOVER (Biosym Technologies).
Die Consensus-Struktur könnte vernünftigerweise davon abhängen, welche Kristallstruktur als Matrize, der die übrigen Strukturen überlagert wurden, verwendet wurde. Als Test wurde das gesamte Verfahren unter Verwendung der Kristallstruktur mit der schlechtesten Überlagerung im Verhältnis 2FB4, d. h. die 2HFL-Fab-Struktur, als neuer Matrize (Referenz) wiederholt. Die beiden Consensus-Strukturen stimmen vergleichsweise gut überein (mittlerer quadratischer Fehler von 0,11 Å für alle N-, Cα- und C-Atome).
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Consensus-Struktur nur Hauptketten-Koordinaten (N-, Cα-, C-, O- und Cβ-Atome) ausschließlich für solche Reste umfasst, die Bestandteil einer Konformation sind, die allen sieben Röntgenkristallstrukturen gemeinsam sind. Für die Fab-Strukturen umfassen diese die gemeinsamen β-Stränge (die zwei β-Blätter umfassen) und einige Nicht-CDR-Schleifen, die diese β-Stränge verbinden. Die Consensus-Struktur umfasst keine CDRs oder Seitenketten, die beide in ihrer Konformation unter den sieben Strukturen variieren. Ferner ist darauf hinzuweisen, dass die Consensus-Struktur nur die V_L- und V_H-Domänen einschließt.
Diese Consensus-Struktur wird als Archetyp verwendet. Sie ist für keine der Spezies speziell und weist nur die Grundgestalt ohne Seitenketten auf. Ausgehend von dieser Consensus-Struktur lässt sich das Modell beliebiger Import-, humaner oder humanisierter Fabs auf folgende Weise konstruieren. Unter Verwendung der Aminosäuresequenz der speziellen Antikörper-V_L- und -V_H-Domänen von Interesse wird ein Computer-Grafikprogramm (z. B. INSIGHT, Biosym Technologies) dazu verwendet, Seitenketten und CDRs an die Consensus-Struktur zu addieren. Bei Addition einer Seitenkette wird deren Konformation auf der Grundlage bekannter Fab-Kristallstrukturen (vergl. den Abschnitt über den technischen Hintergrund von Publikationen über derartige Kristallstrukturen) und Rotamer-Bibliotheken (J. W. Ponder & F. M. Richards, J. Mol. Biol., Bd. 193 (1987), S. 775–791) gewählt. Das Modell wird ferner so konstruiert, dass die Atome der Seitenkette so positioniert sind, dass sie nicht mit anderen Atomen im Fab kollidieren.
CDRs werden an das Modell (das nunmehr das Gerüst plus Seitenketten aufweist) auf folgende Weise addiert. Die Größe (d. h. die Anzahl der Aminosäuren) der einzelnen Import-CDRs wird mit kanonischen CDR-Strukturen, die von Chothia et al., Nature, Bd. 342 (1989), S. 877–883) tabellarisch aufgeführt worden sind und die von Fab-Kristallen abgeleitet sind, verglichen. Die einzelnen CDR-Sequenzen werden ferner auf die Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter spezieller Aminosäurereste überprüft, die von Chothia als strukturell wichtig identifiziert wurden: z. B. Reste von leichten Ketten 29 (CDR1) und 95 (CDR3) und Reste von schweren Ketten 26, 27, 29 (CDR1) und 55 (CDR2). Für die leichte Kette CDR2 und die schwere Kette CDR3 wird nur die Größe der CDR mit der kanonischen Struktur gemäß Chothia verglichen. Wenn die Größe und die Sequenz (d. h. das Vorhandensein der spezifischen, strukturell wichtigen Reste gemäß den Angaben von Chothia et al.) der Import-CDR in Bezug auf die Größe übereinstimmt und die gleichen strukturell wichtigen Reste wie eine kanonische CDR aufweist, so wird die Hauptkettenkonformation der Import-CDR im Modell als gleich mit der Konformation der kanonischen CDR angesehen. Dies bedeutet, dass der Importsequenz die strukturelle Konfiguration der kanonischen CDR zugeordnet wird, die dann in das Entwicklungsmodell eingebaut wird.
Wenn jedoch für die Import-CDR keine passende kanonische CDR zugeordnet werden kann, kann eine von zwei Optionen ausgeübt werden. Erstens kann unter Verwendung eines Programms, z. B. INSIGHT (Biosym Technologies) die Brookhaven Protein Data Bank auf Schleifen mit einer Größe, die der der Import-CDR ähnlich ist, abgesucht werden, und diese Schleifen können als mögliche Konformationen für die Import-CDR im Modell gewertet werden. Als Mindestvoraussetzung müssen derartige Schleifen eine Konformation aufweisen, bei der sich kein Schleifenatom mit anderen Proteinatomen überlappt. Zweitens kann man verfügbare Programme heranziehen, die mögliche Schleifenkonformationen berechnen, wobei eine gegebene Schleifengröße angenommen wird und man Verfahren heranzieht, die beispielsweise von Bruccoleri et al., Nature, Bd. 335 (1988), S. 564–568, beschrieben wurden.
Wenn alle CDRs und Seitenketten an die Consensus-Struktur unter Bildung des endgültigen Modells (Import, human oder humanisiert) addiert worden sind, wird das Modell vorzugsweise einer Energieminimierung unterworfen, wobei man handelsübliche Programme verwendet (z. B. DISCOVER, Biosym Technologies). Diese Technik bedient sich komplizierter mathematischer Formeln zur Verfeinerung des Modells, indem man Arbeiten durchführt, z. B. eine Prüfung, dass alle Atome sich innerhalb geeigneter Abstände voneinander befinden, und eine Prüfung, dass die Bindungslängen und Winkel innerhalb chemisch akzeptabler Grenzen liegen.
Modelle einer humanisierten, Import oder humanen Antikörper-Sequenz werden in der erfindungsgemäßen Praxis herangezogen, um den Einfluss ausgewählter Aminosäurereste auf die Aktivität der im Modell darzustellenden Sequenz zu ergründen. Beispielsweise kann ein derartiges Modell Reste zeigen, die bei der Antigenbindung oder für die Aufrechterhaltung der Konformation des Antikörpers wichtig sind, wie nachstehend ausführlicher erläutert wird. Eine Modellbildung kann auch dazu herangezogen werden, den möglichen Einfluss einer Veränderung etwaiger Aminosäurereste in der Antikörpersequenz zu untersuchen.
Verfahren zur Erzielung einer humanisierten Antikörpersequenz
In der erfindungsgemäßen Praxis besteht die erste Stufe bei der Humanisierung eines Import-Antikörpers in der Ableitung einer Consensus-Aminosäuresequenz, in die die Importsequenzen einzubauen sind. Anschließend wird ein Modell für diese Sequenz erzeugt, wobei man sich der vorstehend beschriebenen Verfahren bedient. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden die humanen Consensus-Sequenzen von den häufigsten Unterklassen in der Sequenzzusammenstellung von Kabat et al. (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)) abgeleitet, nämlich von der V_L κ-Untergruppe I und der V_H-Gruppe III, wobei diese die in den vorstehenden Definitionen aufgeführten Sequenzen besitzen.
Obgleich diese Stufen in unterschiedlicher Reihenfolge ausgeführt werden können, wird typischerweise eine Struktur für den in Frage stehenden humanisierten Antikörper geschaffen, indem man mindestens eine CDR aus der nicht-humanen Import-Sequenz in die humane Consensus-Struktur überträgt, nachdem die gesamte entsprechende humane CDR entfernt worden ist. Der humanisierte Antikörper kann humane Ersatzreste für die nicht-humanen Import-Reste an Positionen innerhalb von CDRs gemäß der Definition durch die Sequenzvariabilität (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)) oder gemäß der Definition der Strukturvariabilität (C. Chothia & A. M. Lesk, J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 901–917) enthalten. Beispielsweise enthält huMAb4D5 humane Ersatzreste für die muMAb4D5-Reste an drei Positionen innerhalb der CDRs gemäß der Definition durch die Sequenzvariabilität (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)), jedoch nicht gemäß der Definition durch die Strukturvariabilität (C. Chothia & A. M. Lesk, J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 901– 917): V_L-CDR1 K24R, V_L-CDR2 R54L und V_L-CDR2 T56S.
Unterschiede zwischen den nicht-humanen Importresten und den humanen Consensus-Rahmenresten werden einzeln untersucht, um ihren möglichen Einfluss auf die CDR-Konformation und/oder Bindung an Antigen zu bestimmen. Die Untersuchung von derartigen möglichen Einflüssen wird in wünschenswerter Weise durch Modellbildung unter Prüfung der Eigenschaften der Aminosäuren an speziellen Stellen durchgeführt oder experimentell durch Bewertung der Einflüsse einer Substitution oder Mutagenese von bestimmten Aminosäuren ermittelt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird ein humanisierter Antikörper hergestellt, der eine Aminosäuresequenz eines nicht-humanen Import-Antikörpers und eines humanen Antikörpers enthält, wobei man sich folgender Stufen bedient:

a. die Aminosäuresequenzen von mindestens einem Teil einer variablen Domäne eines Import-Antikörpers und einer humanen variablen Consensus-Domäne werden erhalten;
b. die Aminosäuresequenzen der die komplementäre Beschaffenheit bestimmenden Region (CDR) in den importierten und den humanen variablen Domänensequenzen werden identifiziert;
c. eine Import-CDR-Aminosäuresequenz wird anstelle der entsprechenden humanen CDR-Aminosäuresequenz gesetzt;
d. die Aminosäuresequenzen einer Rahmenregion (FR) des Import-Antikörpers und der entsprechenden FR des Consensus-Antikörpers werden ausgerichtet;
e. Import-Antikörper-FR-Reste in den ausgerichteten FR-Sequenzen, die nicht homolog zu den entsprechenden Consensus-Antikörper-Resten sind, werden identifiziert;
f. es wird festgestellt, ob in vernünftiger Weise zu erwarten ist, dass der nicht-homologe Import-Aminosäurerest mindestens eine der folgenden Wirkungen aufweist:
1. nicht-kovalente direkte Bindung des Antigens;
2. Wechselwirkung mit einer CDR; oder
3. Teilnahme der V_L–V_H-Grenzfläche; etwaige nicht-homologe Import-Antikörper-Aminosäurereste, von denen in vernünftiger Weise zu erwarten ist, dass sie mindestens eine dieser Wirkungen aufweisen, werden anstelle des entsprechenden Aminosäurerestes in der Consensus-Antikörper-FR-Sequenz gesetzt.

Gegebenenfalls bestimmt man, ob irgendwelche nicht-homologe Reste, die in Stufe (e) identifiziert worden sind, auf der Oberfläche der Domäne freiliegen oder sich bedeckt im Innern der Domäne befinden, wobei man dann, wenn der Rest freiliegt, jedoch keine der in Stufe (f) identifizierten Wirkungen besitzt, den Consensus-Rest beibehalten kann.
Zusätzlich werden in bestimmten Ausführungsformen die entsprechenden, in der vorstehenden Stufe (e) identifizierten Consensus-Antikörper-Reste aus folgender Gruppe ausgewählt: 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 46L, 58L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 76H, 78H, 91H, 92H, 93H, und 103H (wobei man sich des Nummerierungssystems von E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987) bedient).
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden zusätzlichen Stufen: Absuchen der variablen importierten, nicht-humanen und/oder Consensus-Domänensequenzen auf Glycosylierungsstellen, bestimmen, ob von der Glycosylierung vernünftigerweise zu erwarten ist, dass sie für die angestrebte Antigenbindung und die biologische Aktivität des Antikörpers von Bedeutung ist (d. h. Bestimmen, ob die Glycosylierungsstelle an Antigen bindet oder eine Seitenkette eines Aminosäurerestes, der an ein Antigen bindet, verändert, oder ob die Glycosylierung die Antigenbindung verstärkt oder schwächt oder für die Aufrechterhaltung der Antikörper-Affinität von Bedeutung ist). Wenn die Importsequenz die Glycosylierungsstelle trägt, ist es bevorzugt, diese Stelle anstelle der entsprechenden Reste in der humanen Consensus-Sequenz zu setzen, wenn in vernünftiger Weise zu erwarten ist, dass die Glycosylierungsstelle von Bedeutung ist. Wenn nur die Consensus-Sequenz und nicht die Import-Sequenz die Glycosylierungsstelle trägt, ist es bevorzugt, diese Glycosylierungsstelle zu beseitigen und an ihrer Stelle die entsprechenden Aminosäurereste aus der Import-Sequenz zu setzen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren umfasst die Ausrichtung der Import-Antikörper- und der Consensus-Antikörper-FR-Sequenzen, das Identifizieren der Import-Antikörper-FR-Reste, die nicht mit der ausgerichteten Consensus-FR-Sequenz homolog sind und für jeden dieser nicht-homologen Import-Antikörper-FR-Reste die Feststellung, ob der entsprechende Consensus-Antikörper-Rest einen Rest darstellt, der hochgradig über sämtliche Spezies hinweg an dieser Stelle konserviert ist und, falls er konserviert ist, das Herstellen eines humanisierten Antikörpers, der den Consensus-Antikörper-Aminosäurerest an dieser Stelle umfasst.
In bestimmten alternativen Ausführungsformen braucht man die vorstehend beschriebenen Modellbildungs- und Bewertungsstufen nicht einzusetzen, statt dessen kann man mit den Stufen zur Gewinnung der Aminosäuresequenz mindestens eines Teils einer variablen importierten, nicht-humanen Antikörper-Domäne mit einer CDR und einer FR fortfahren, die Aminosäuresequenz mindestens eines Teils einer variablen humanen Consensus-Antikörper-Domäne mit einer CDR und FR erhalten und die nicht-humane CDR anstelle der humanen CDR der humanen variablen Consensus-Antikörper-Domäne zu setzen und anschließend einen Aminosäurerest anstelle des Consensus-Aminosäurerestes an mindestens einer der folgenden Stellen zu setzen:

a. (in der FR der variablen Domäne der leichten Kette) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, oder
b. (in der FR der variablen Domäne der schweren Kette) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 76H, 78H, 91H, 92H, 93H und 103H.

Vorzugsweise handelt es sich beim Nicht-CDR-Rest, der an die Consensus-FR-Stelle gesetzt worden ist, um den Rest, der sich an der entsprechenden Position des nicht-humanen Antikörpers befindet. Gegebenenfalls kann man die übrigen, vorstehend beschriebenen Stufen zu der Bestimmung heranziehen, ob von einem speziellen Aminosäurerest in vernünftiger Weise zu erwarten ist, dass er unerwünschte Wirkungen zeigt, wonach man für eine Beseitigung dieser Effekte sorgen kann.
Wenn man nach Herstellung eines humanisierten Antikörpers gemäß den vorstehenden Stufen und nach Testen von dessen Aktivität mit dem humanisierten Antikörper nicht zufriedengestellt ist, prüft man vorzugsweise erneut die möglichen Wirkungen der Aminosäurereste an den vorstehend erwähnten speziellen Positionen. Zusätzlich ist es erwünscht, erneut etwaige zugedeckte Reste zu untersuchen, von denen in vernünftiger Weise zu erwarten ist, dass sie die V_L–V_H-Grenzfläche beeinflussen, jedoch nicht direkt die CDR-Konformation beeinflussen. Ferner ist es wünschenswert, den humanisierten Antikörper einer erneuten Bewertung zu unterziehen, wobei man sich der Stufen der hier beschriebenen Verfahren bedient.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden Aminosäurereste in der humanen Consensus-Sequenz durch andere Aminosäurereste ersetzt. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein Ersatz mit Resten aus einer speziellen, nicht-humanen Import-Sequenz vorgenommen, wobei es jedoch Umstände gibt, bei denen es erwünscht ist, die Wirkungen von anderen Aminosäuren zu bewerten. Wenn man beispielsweise nach Herstellung eines humanisierten Antikörpers gemäß den vorstehenden Stufen und nach Testen von dessen Aktivität mit dem humanisierten Antikörper nicht zufriedengestellt ist, kann man die Sequenzen von anderen Klassen oder Untergruppen von humanen Antikörpern oder von Klassen oder Untergruppen von Antikörpern aus der speziellen nicht-humanen Spezies vergleichen und feststellen, ob andere Aminosäure-Seitenketten und Aminosäurereste an speziellen Positionen gefunden werden, wonach man eine Substitution mit derartigen anderen Resten vornehmen kann.
Antikörper
Bestimmte Aspekte der Erfindung richten sich auf natürliche Antikörper und auf monoklonale Antikörper, wie in den nachstehenden Beispielen dargelegt ist und durch Antikörper-Hybridome, die bei der ATCC (wie nachstehend angegeben) hinterlegt sind, belegt wird. Somit soll in der gesamten Beschreibung eine Bezugnahme auf die Verwendung von monoklonalen Antikörpern so zu verstehen sein, dass die Verwendung von natürlichen oder nativen Antikörpern sowie von humanisierten und chimären Antikörpern eingeschlossen ist. Der hier verwendete Ausdruck "Antikörper" umfasst die variable Antikörper-Domäne und andere abtrennbare Antikörper-Domänen, sofern sie nicht speziell ausgeschlossen sind.
Gemäß bestimmten Aspekten der Erfindung werden zu humanisierende Antikörper (Import-Antikörper) aus kontinuierlichen hybriden Zelllinien, die durch Fusion von mit Antigen behandelten immunen Lymphozyten mit Myelomzellen gebildet worden sind, isoliert.
In bestimmten Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Antikörper durch routinemäßiges Screening erhalten. Polyklonale Antikörper gegen ein Antigen werden im allgemeinen in Tieren durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des Antigens und eines Adjuvans erzeugt. Es kann wertvoll sein, das Antigen oder ein Fragment, das die Ziel-Aminosäuresequenz enthält, mit einem Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor, wobei man sich eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels bedient, z. B. Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N = C = NR, wobei R und R¹ verschiedene Alkylgruppen bedeuten.
Bei den Verfahrensweisen zur Behandlung des Wirtstiers oder von daraus erhaltenen, gezüchteten antikörperbildenden Zellen hält man sich im allgemeinen an eingeführte und herkömmliche Techniken zur Stimulation und Produktion von Antikörpern. Während Mäuse häufig als Testmodell verwendet werden, kommt es in Betracht, beliebige Säugetiersubjekte, einschließlich menschliche Subjekte, oder daraus gewonnene antikörperbildende Zellen gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren so zu manipulieren, dass sie als Basis zur Erzeugung von hybriden Zelllinien von Säugetieren, einschließlich des Menschen, dienen.
Tiere werden typischerweise gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate immunisiert, indem man 1 mg oder 1 μg Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina komplettem Freund-Adjuvans vereinigt und die Lösung intradermal an mehreren Stellen injiziert. 1 Monat später erhalten die Tiere eine Auffrischung mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Konjugatmenge in komplettem Freund-Adjuvans (oder einem anderen geeignete Adjuvans) durch subkutane Injektion an mehreren Stellen. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut entnommen und das Serum wird auf den Antigen-Titer getestet. Die Tiere werden Auffrischungsimmunisierungen unterzogen, bis der Titer einen Plateauwert erreicht. Vorzugsweise erhält das Tier eine Auffrischung mit dem Konjugat des gleichen Antigens, wobei jedoch eine Konjugation mit einem unterschiedlichen Protein und/oder über ein unterschiedliches Vernetzungsmittel vorgenommen worden ist. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Ferner werden Aggregationsmittel, wie Alaun, verwendet, um die Immunreaktion zu verstärken.
Nach der Immunisierung werden monoklonale Antikörper durch Gewinnen von immunen Lymphoidzellen, typischerweise Milzzellen oder Lymphozyten aus Lymphknotengewebe, aus immunisierten Tieren und durch Immortalisierung der Zellen in herkömmlicher Weise, z. B. durch Fusion mit Myelomzellen oder durch Epstein-Barr (EB)-Virus-Transformation und Absuchen auf Klone, die den gewünschten Antikörper exprimieren, hergestellt. Die ursprünglich von Köhler und Milstein, Eur. J. Immunol., Bd. 6 (1976), S. 511, beschriebene Hybridomtechnik wird in breitem Umfang zur Herstellung von hybriden Zelllinien verwendet, die hohe Konzentrationen an monoklonalen Antikörpern gegen zahlreiche spezifische Antigene sezernieren.
Es ist möglich, Zellen einer Spezies mit Zellen einer anderen Spezies zu fusionieren. Es ist jedoch bevorzugt, dass die Quelle für die Zellen, die immunisierte Antikörper bilden, und das Myelom aus der gleichen Spezies stammen.
Die hybriden Zelllinien können in in vitro-Kultur in Zellkulturmedien gehalten werden. Die erfindungsgemäßen Zelllinien können in einer Zusammensetzung ausgewählt und/oder gehalten werden, die die kontinuierliche Zelllinie in Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT)-Medium umfasst. Tatsächlich kann man die Hybridom-Zelllinie nach deren Gewinnung auf einer Vielzahl von ernährungstechnisch geeigneten Medien halten. Außerdem können die hybriden Zelllinien in einer Anzahl von herkömmlichen Wegen gelagert und konserviert werden, einschließlich durch Einfrieren und Lagerung unter flüssigem Stickstoff. Gefrorene Zelllinien können wiederbelebt und unbegrenzt gezüchtet werden, wobei die Synthese und die Sekretion von monoklonalem Antikörper wieder aufgenommen wird. Der sezernierte Antikörper wird aus Gewebekulturüberstand gemäß herkömmlichen Verfahren, wie Fällung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergl., gewonnen. Die hier beschriebenen Antikörper werden auch aus Hybridom-Zellkulturen durch herkömmliche Verfahren zur Reinigung von IgG oder IgM (je nachdem was der Fall ist), die bisher zur Reinigung dieser Immunoglobuline aus gepooltem Plasma herangezogen worden sind, gewonnen, z. B. durch Fällungsverfahren mit Ethanol oder Polyethylenglykol. Die gereinigten Antikörper werden steril filtriert und gegebenenfalls mit einem nachweisbaren Marker, z. B. einem Enzym oder einer Spinmarkierung zur Verwendung in diagnostischen Tests zur Bestimmung des Antigens in Testproben konjugiert.
Während routinemäßig monoklonale Nagetier-Antikörper als Quelle für den Import- Antikörper verwendet werden, ist die Erfindung auf keine Spezies beschränkt. Ferner können Techniken herangezogen werden, die für die Herstellung von chimären Antikörpern (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 81 (1984), S. 6851; Neuberger et al., Nature, Bd. 312 (1984), S. 604; Takeda et al., Nature, Bd. 314 (1985), S. 452) entwickelt wurden, indem man die Gene aus einem Mäuse-Antikörpermolekül von geeigneter Antigen-Spezifität zusammen mit Genen aus einem humanen Antikörpermolekül von geeigneter biologischer Aktivität (z. B. die Fähigkeit zur Aktivierung von humanem Komplement und zur Vermittlung von ADCC) spleißt. Derartige Antikörper fallen unter den Umfang der Erfindung.
Techniken zur Erzeugung von rekombinanten DNA-Versionen der antigenbindenden Regionen von Antikörpermolekülen (bekannt als Fab-Fragmente), die die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern umgehen, fallen unter die erfindungsgemäße Praxis. Man extrahiert antikörperspezifische Messenger-RNA-Moleküle aus immunen Systemzellen, die einem immunisierten Tier entnommen worden sind, transkribiert diese in komplementäre DNA (cDNA) und kloniert die cDNA in ein bakterielles Expressionssystem. Ein Beispiel für eine derartige Technik, die sich für die erfindungsgemäße Praxis eignet, wurde von Entwicklern bei der Fa. Scripps/Stratagene entwickelt. Darin ist ein gesetzlich geschütztes Bacteriophagen-lambda-Vektorsystem enthalten, die eine Leader-Sequenz enthält, die bewirkt, dass das Fab-Protein in den periplasmatischen Raum (zwischen der bakteriellen Zellmembran und der Zellwand) wandert oder sezerniert wird. Man kann rasch eine große Anzahl von funktionellen Fab-Fragmenten erzeugen und bezüglich der Bindung des Antigens einem Screening unterwerfen. Derartige Fab-Fragmente mit Spezifität für das Antigen fallen unter den hier definierten, erörterten und beanspruchten Ausdruck "Antikörper".
Aminosäuresequenz-Varianten
Aminosäuresequenz-Varianten der erfindungsgemäßen Antikörper und Polypeptide (hier als Ziel-Polypeptid bezeichnet) werden hergestellt, indem man geeignete Nucleotid-Änderungen in die für das Ziel-Polypeptid kodierende DNA einführt, oder indem man in vitro das angestrebte Ziel-Polypeptid synthetisiert. Zu derartigen Varianten gehören beispielsweise humanisierte Varianten von nicht-humanen Antikörpern sowie Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb bestimmter Aminosäuresequenzen. Beliebige Kombinationen von Deletionen, Insertionen und Substitutionen können durchgeführt werden, um zu dem endgültigen Konstrukt zu gelangen, vorausgesetzt, dass das endgültige Konstrukt die angestrebten Eigenschaften besitzt. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationale Prozesse des Ziel-Polypeptids verändern, z. B. eine Veränderung der Anzahl oder Position von Glycosylierungsstellen, eine Veränderung etwaiger Membran-Verankerungseigenschaften und/oder eine Veränderung der intrazellulären Position des Ziel-Polypeptids, indem man beliebige Leader-Sequenzen des nativen Ziel-Polypeptids inseriert, deletiert oder anderweitig beeinflusst.
Bei der Konstruktion von Aminosäuresequenz-Varianten von Ziel-Polypeptiden kann die Position der Mutationsstelle und die Art der Mutation von den zu modifizierenden Eigenschaften des Ziel-Polypeptids abhängen. Die Mutationsstellen können einzeln oder in Serie modifiziert werden, z. B. durch (1) zunächst durch Substitution mit konservativ ausgewählten Aminosäuren und anschließend mit einer radikaleren Auswahl, je nach den erreichten Ergebnissen, (2) Deletion des Ziel-Restes oder (3) Insertion von Resten der gleichen oder einer unterschiedlichen Klasse in Nachbarstellung zur lokalisierten Stelle oder Kombinationen der Optionen 1 bis 3. Bei bestimmten Ausführungsformen lässt man sich bei diesen Wahlmöglichkeiten von den Verfahren zur Erzeugung von humanisierten Sequenzen gemäß den vorstehenden Ausführungen leiten.
Ein geeignetes Verfahren zum Identifizieren bestimmter Reste oder Regionen des Ziel-Polypeptids, die bevorzugte Positionen für die Mutagenese sind, wird als "Alanin-Scanning-Mutagenese" bezeichnet; vergl. Cunningham und Wells (Science, Bd. 244 (1989), S. 1081–1085). Dabei werden ein Rest oder eine Gruppe von Ziel-Resten identifiziert (z. B. geladene Reste, wie arg, asp, his, lys und glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umliegenden wässrigen Umgebung innerhalb oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Die Domänen, die eine funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen zeigen, werden sodann verfeinert, indem man weitere oder andere Varianten an oder anstelle der Substitutionsstellen einführt. Während somit die Stelle zum Einführen einer Aminosäure-Sequenzvariation vorbestimmt wird, muss die Art der Mutation an sich nicht vorher festgelegt werden. Beispielsweise kann man zur Optimierung des Verhaltens einer Mutation an einer gegebenen Stelle ein ala-Scanning oder eine willkürliche Mutagenese am Ziel-Codon oder -Region durchführen, und die exprimierten Ziel-Polypeptidvarianten werden in Bezug auf die optimale Kombination der angestrebten Aktivität einem Screening unterworfen.
Es gibt zwei grundlegende Variable bei der Konstruktion von Aminosäure-Sequenzvarianten: die Position der Mutationsstelle und die Art der Mutation. Im allgemeinen hängen die Position und die Art der Mutation von den zu modifizierenden Eigenschaften des Ziel-Polypeptids ab.
Aminosäuresequenz-Deletionen von Antikörpern werden im allgemeinen nicht bevorzugt, da eine Aufrechterhaltung der allgemeinen Konfiguration eines Antikörpers für dessen Aktivität als notwendig angesehen wird. Etwaige Deletionen werden so ausgewählt, dass die Struktur des Ziel-Antikörpers erhalten bleibt.
Aminosäuresequenz-Insertionen umfassen amino- und/oder carboxylendständige Fusionen in einem Längenbereich von einem Rest bis zu Polypeptiden, die 100 oder mehr Reste enthalten, sowie Intrasequenz-Insertionen von einer oder mehreren Aminosäureresten. Intrasequenz-Insertionen (d. h. Insertionen innerhalb der Ziel-Polypeptidsequenz) können im allgemeinen etwa 1 bis 10 Reste, vorzugsweise 1 bis 5 und ganz besonders 1 bis 3 Reste aufweisen. Zu Beispielen für terminate Insertionen gehören das Ziel-Polypeptid mit einem N-terminalen Methionylrest, ein Artefakt der direkten Expression des Ziel-Polypeptids in bakterieller rekombinanter Zellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz mit dem N-Terminus des Ziel-Polypeptidmoleküls zur Erleichterung der Sekretion des reifen Ziel-Polypeptids aus rekombinanten Wirtszellen. Derartige Signalsequenzen werden im allgemeinen aus der beabsichtigten Wirtszellspezies (und somit in Homologie hierzu) erhalten. Geeignete Sequenzen umfassen STII oder Ipp für E. coli, alpha-Faktor für Hefe und virale Signale, wie Herpes gD, für Säugetierzellen.
Weitere Insertionsvarianten des Ziel-Polypeptids umfassen die Fusion des N- oder C-Terminus des Ziel-Polypeptids von immunogenen Polypeptiden, z. B. bakteriellen Polypeptiden, wie beta-Lactamase oder ein durch den E. coli-trp-Locus kodiertes Enzym, oder Hefeprotein, sowie C-terminate Fusionen mit Proteinen mit einer langen Hallbwertszeit, wie konstante Immunoglobulin-Regionen (oder andere Immunoglobulin-Regionen), Albumin oder Ferritin gemäß WO-89/02922, Veröffentlichungstag 6. April 1989.
Eine weitere Gruppe von Varianten sind Aminosäure-Substitutionsvarianten. Bei diesen Varianten ist mindestens ein Aminosäurerest im Ziel-Polypeptidmolekül entfernt und durch einen anderen Rest ersetzt. Die Stellen von besonders großem Interesse für eine substitutionelle Mutagenese umfassen Stellen, die als aktive Zentren (Stellen) des Ziel-Polypeptids identifiziert worden sind, und Stellen, bei denen sich die Aminosäuren, die im Ziel-Polypeptid auftreten, von verschiedenen Spezies wesentlich in Bezug auf Seitenkettenvolumen, Ladung und/oder Hydrophobizität unterscheiden. Weitere Substitutionsstellen sind nachstehend beschrieben, wobei der Einfluss der Substitution, die Affinität und weitere Eigenschaften eines speziellen Ziel-Antikörpers berücksichtigt werden.
Weitere Stellen von Interesse sind solche, bei denen spezielle Reste der Ziel-Polypeptide, die aus verschiedenen Spezies erhalten worden sind, identisch sind. Diese Positionen können für die biologische Aktivität des Ziel-Polypeptids von Bedeutung sein. Diese Stellen, insbesondere solche, die innerhalb der Sequenz von mindestens drei anderen, in identischer Weise konservierten Stellen liegen, werden in relativ konservativer Weise substituiert. Wenn derartige Substituionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen, werden weitere Veränderungen eingeführt und die Produkte werden einem Screening unterworfen, bis die angestrebte Wirkung erreicht ist.
Erhebliche Modifikationen in der Funktion oder der immunologischen Identität des Ziel-Polypeptids werden durch Auswahl von Substitutionen erreicht, die sich in erheblichem Umfang bezüglich ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüstes im Substitutionsbereich, z. B. eine Blatt- oder helikale Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) des Volumens der Seitenkette unterscheiden. Natürlich auftretende Reste werden auf der Grundlage von gemeinsamen Seitenketteneigenschaften in Gruppen eingeteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nicht-konservative Substitutionen bringen einen Austausch eines Mitglieds eines dieser Klassen gegen ein anderes Mitglied mit sich. Derartige substituierte Reste können in Regionen des Ziel-Polypeptids, die homolog mit anderen Antikörpern der gleichen Klasse oder Unterklasse sind oder vorzugsweise in die nicht-homologen Regionen des Moleküls eingeführt werden.
Etwaige Cysteinreste, die nicht an der Aufrechterhaltung der einwandfreien Konformation des Ziel-Polypeptids beteiligt sind, können ebenfalls substituiert werden, im allgemeinen durch Serin, um die Oxidationsstabilität des Moleküls zu verbessern und um eine fehlerhafte Vernetzung zu verhindern.
DNA, die für Aminosäure-Sequenzvarianten des Ziel-Polypeptids kodiert, wird durch eine Vielzahl von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt. Zu diesen Verfahren gehören (ohne Beschränkung hierauf) eine Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Fall von natürlich vorkommenden Aminosäure-Sequenzvarianten) oder die Herstellung durch eine oligonucleotidvermittelte (oder positionsgerichtete) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassetten-Mutagenese einer früher hergestellten Variante oder einer nicht-varianten Version des Ziel-Polypeptids. Ein besonders bevorzugtes Verfahren der Genumwandlungsmutagenese wird nachstehend in Beispiel 1 beschrieben. Diese Techniken können sich einer Ziel-Polypeptid-Nucleinsäure (DNA oder RNA) oder einer Nucleinsäure, die zur Ziel-Polypeptid-Nucleinsäure komplementär ist, bedienen.
Eine oligonucleotidvermittelte Mutagenese stellt ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten von Ziel-Polypeptid-DNA dar. Diese Technik ist aus der Arbeit von Adelman et al., DNA, Bd. 2 (1983), S. 183, bekannt. Kurz zusammengefasst, die Ziel-Polypeptid-DNA wird verändert, indem man ein Oligonucleotid, das für die angestrebte Mutation kodiert, mit einer DNA-Matrize hybridisiert, wobei es sich bei der Matrize um eine einzelsträngige Form eines Plasmids oder Bacteriophagen, der die unveränderte oder native DNA-Sequenz des Ziel-Polypeptids enthält, handelt. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase dazu herangezogen, einen vollständigen zweiten komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren, die somit den Oligonucleotid-Primer einbaut und für die gewählte Änderung in der Ziel-Polypeptid-DNA kodiert.
Im allgemeinen werden Oligonucleotide mit einer Länge von mindestens 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid weist 12 bis 15 Nucleotide auf, die für die Mutation kodieren, sind. Dies gewährleistet, dass das Oligonucleotid einwandfrei mit dem einzelsträngigen DNA-Matrizenmolekül hybridisiert. Die Oligonucleotide lassen sich leicht nach bekannten Techniken synthetisieren, wie sie beispielsweise von Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 5765) beschrieben worden sind.
Eine einzelsträngige DNA-Matrize kann auch erzeugt werden, indem man doppelsträngige Plasmid-DNA (oder eine andere DNA) unter Anwendung herkömmlicher Techniken denaturiert.
Zur Veränderung der nativen DNA-Sequenz (beispielsweise zur Erzeugung von Aminosäure-Sequenzvarianten) wird das Oligonucleotid mit der einzelsträngigen Matrize unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, üblicherweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, wird sodann zugesetzt, um den komplementären Strang der Matrize unter Verwendung des Oligonucleotids als Primer für die Synthese zu synthetisieren. Ein Heteroduplex-Molekül wird sodann gebildet, so dass ein Strang von DNA für die mutierte Form des Ziel-Polypeptids kodiert und der andere Strang (die ursprüngliche Matrize) für die native, unveränderte Sequenz des Ziel-Polypeptids kodiert. Dieses Heteroduplex-Molekül wird sodann in eine geeignete Wirtszelle transformiert, üblicherweise einen Prokaryonten, wie E. coli JM101. Nach Züchtung der Zellen werden sie auf Agarose-Platten ausgestrichen und unter Verwendung des mit 32-Phosphat radioaktiv markierten Oligonucleotid-Primers einem Screening unterworfen, um die bakteriellen Kolonien, die die mutierte DNA enthalten, zu identifizieren. Die mutierte Region wird sodann entfernt und in einen für die Proteinproduktion geeigneten Vektor gebracht, im allgemeinen einen Expressionsvektor des Typs, der üblicherweise für die Transformation eines geeigneten Wirts herangezogen wird.
Das unmittelbar vorstehend beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, dass ein Homoduplex-Molekül erzeugt wird, bei dem beide Enden des Plasmids die Mutationen) enthalten. Es handelt sich um folgende Modifikationen: Das einzelsträngige Oligonucleotid ist einem Annealing mit der einzelsträngigen Matrize gemäß den vorstehenden Ausführungen unterworfen. Ein Gemisch von drei Desoxyribonucleotiden, nämlich Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP) wird mit einem modifizierten Thiodesoxyribocytosin mit der Bezeichnung dCTP-(aS) (das von der Fa. Amersham Corporation bezogen werden kann) vereinigt. Dieses Gemisch wird zum Matrizen-Oligonucleotid-Komplex gegeben. Nach Zugabe von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch wird ein Strang von DNA, der mit Ausnahme der mutierten Basen mit der Matrize identisch ist, erzeugt. Ferner enthält dieser neue Strang von DNA dCTP-(aS) anstelle von dCTP, das zum Schutz vor einem Verdau durch Restriktionsendonucleasen dient.
Nachdem der Matrizenstrang des doppelsträngigen Heteroduplex einem Einzelstrangbruch mit einem geeigneten Restriktionsenzym unterworfen worden ist, kann der Matrizenstrang mit ExoIII-Nuclease oder einer anderen geeigneten Nuclease hinter der Region, die die zu mutagenisierenden Stellen enthält, verdaut werden. Die Reaktion wird sodann gestoppt, wobei ein Molekül verbleibt, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird sodann unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart sämtlicher vier Desoxyribonucleotid-triphosphate, von ATP und von DNA-Ligase gebildet. Dieses Homoduplex-Molekül kann sodann in eine geeignete Wirtszelle, wie E. coli JM101, transformiert werden, wie vorstehend beschrieben.
DNA, die für Ziel-Polypeptidvarianten mit mehr als einer zu substituierenden Aminosäure kodiert, lassen sich auf einem von zahlreichen Wegen erzeugen. Wenn die Aminosäuren sich nahe beieinander in der Polypeptidkette befinden, so können sie gleichzeitig unter Verwendung eines Oligonucleotids, das für sämtliche angestrebten Aminosäuresubstitutionen kodiert, mutiert werden. Wenn sich die Aminosäuren jedoch in einem gewissen Abstand voneinander befinden (durch mehr als etwa 10 Aminosäuren getrennt), so ist es häufig schwierig, ein einzelnes Oligonucleotid zu erzeugen, das für sämtliche angestrebten Änderungen kodiert. Statt dessen kann eines von zwei alternativen Verfahren herangezogen werden.
Beim ersten Verfahren wird ein separates Oligonucleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonucleotide werden sodann gleichzeitig einem Annealing zur einzelsträngigen Matrizen-DNA unterworfen. Der zweite Strang der DNA, der aus der Matrize synthetisiert worden ist, kodiert für sämtliche angestrebten Aminosäuresubstitutionen.
Das alternative Verfahren beinhaltet zwei oder mehr Runden einer Mutagenese unter Erzeugung der angestrebten Mutante. Die erste Runde entspricht den Angaben für die einzelnen Mutanten: Wildtyp-DNA wird für die Matrize verwendet, ein Oligonucleotid, das für die erste angestrebte Aminosäuresubstituion oder Substitutionen kodiert, wird einem Annealing mit dieser Matrize unterworfen, und anschließend wird das Heteroduplex-DNA-Molekül erzeugt. Die zweite Runde der Mutagenese bedient sich der mutierten DNA, die in der ersten Mutageneserunde hergestellt worden ist, als Matrize. Somit enthält diese Matrize bereits eine oder mehrere Mutationen. Das Oligonucleotid, das für die zusätzlichen angestrebten Aminosäuresubstitutionen kodiert, wird sodann einem Annealing mit dieser Matrize unterworfen. Der erhaltene DNA-Strang kodiert nunmehr für die Mutationen sowohl der ersten als auch der zweiten Mutagenese. Die erhaltene DNA kann als Matrize in einer dritten Mutageneserunde verwendet werden usw.
Eine-PCR-Mutagenese eignet sich auch zur Herstellung von Aminosäurevarianten eines Ziel-Polypeptids. Obgleich sich die nachstehende Diskussion auf DNA bezieht, ist darauf hinzuweisen, dass die Technik auch für RNA Anwendung findet. Die PCR-Technik bezieht sich allgemein auf das folgende Verfahren (vergl. Erlich, a. a. O., von R. Higuchi verfasstes Kapitel, S. 61–70): Wenn in einer PCR geringe Mengen einer Matrizen-DNA als Ausgangsmaterial verwendet werden, können Primer, die sich in ihrer Sequenz von der entsprechenden Region in einer Matrizen-DNA geringfügig unterscheiden, zur Erzeugung relativ großer Mengen eines spezifischen DNA-Fragments verwendet werden, das sich von der Matrizensequenz nur an den Positionen unterscheidet, wo sich die Primer von der Matrize unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer so konstruiert, dass er die Mutationsposition überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muss identisch mit einer Sequenzfolge des entgegengesetzten Plasmidstrangs sein, jedoch kann sich diese Sequenz an einer beliebigen Stelle entlang der Plasmid-DNA befinden. Es ist jedoch bevorzugt, dass sich die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nucleotiden von der Position des ersten Primers befindet, so dass am Ende die gesamte amplifizierte Region von DNA, die durch die Primer gebunden ist, leicht sequenziert werden kann. Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars entsprechend diesen Ausführungen führt zu einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der durch den Primer spezifizierten Mutation und möglicherweise an anderen Positionen, da das Kopieren von Matrizen in gewissem Umfang fehleranfällig ist, unterscheiden.
Wenn das Verhältnis von Matrize zu Produktmaterial äußerst gering ist, werden im weit überwiegenden Teil der Produkt-DNA-Fragmente die angestrebten Mutationen eingebaut. Dieses Produktmaterial wird zum Ersatz der entsprechenden Region im Plasmid, das als PCR-Matrize diente, unter Anwendung üblicher DNA-Techniken verwendet. Mutationen an getrennten Positionen lassen sich gleichzeitig einführen, indem man entweder einen mutanten zweiten Primer verwendet oder indem man eine zweite PCR mit verschiedenen mutanten Primern durchführt und die beiden erhaltenen PCR-Fragmente gleichzeitig mit dem Vektorfragment in einer dreiteiligen (oder mehrteiligen) Ligation verknüpft.
In einem speziellen Beispiel der PCR-Mutagenese wird die Matrizen-Plasmid-DNA (1 μg) durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease, die nur eine Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region enthält, linearisiert. Von diesem Material werden 100 ng zu einem PCR-Gemisch gegeben, das PCR-Puffer enthält, der die vier Desoxynucleotid-triphosphate enthält und der in GeneAmpR-Testpackungen (bezogen von der Fa. Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, und Emeryville, CA) enthalten ist, sowie 25 pmol der einzelnen Oligonucleotidprimer enthält, wobei das Endvolumen 50 μl beträgt. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 μl Mineralöl überschichtet. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten bei 100°C denaturiert, kurz auf Eis gestellt und sodann unterhalb der Mineralölschicht mit 1 μl Thermus aquaticus (Taq)-DNA-Polymerase (5 Einheiten/μl, bezogen von der Fa. Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, und Emeryville, CA) versetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in das DNA-Thermal Cycler-Gerät (bezogen von der Fa. Perkin-Elmer Cetus) eingeführt, wobei das Gerät folgendermaßen programmiert ist: 2 Minuten bei 55°C, anschließend 30 Sekunden bei 72°C, anschließend 19 folgende Zyklen: 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 72°C.
Am Programmende wird das Reaktionsfläschchen aus dem Thermocycler entnommen und die wässrige Phase in ein neues Fläschchen übertragen, mit Phenol/Chloroform (50 : 50 (Vol.)) extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA wird durch übliche Verfahren gewonnen. Dieses Material wird anschließend zur Insertion in einen Vektor auf geeignete Weise behandelt.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassetten-Mutagenese, basiert auf der von Wells et al. beschriebenen Technik (Gene, Bd. 34 (1985), S. 315). Beim Ausgangsmaterial handelt es sich hierbei um das Plasmid (oder einen anderen Vektor), der die zu mutierende Ziel-Polypeptid-DNA enthält. Das oder die Codons in der zu mutierenden Ziel-Polypeptid-DNA werden identifiziert. Es muss eine einzige Restriktionsendonuclease-Stelle auf jeder Seite der identifizierten Mutationsstellen vorliegen. Wenn keine Restriktionsstellen vorhanden sind, können diese unter Anwendung des vorstehend beschriebenen oligonucleotidvermittelten Mutageneseverfahrens zu deren Einführung an entsprechenden Stellen in der Ziel-Polypeptid-DNA erzeugt werden. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, jedoch die angestrebten Mutationen enthält, wird unter Anwendung üblicher Verfahren synthetisiert. Die beiden Stränge werden getrennt voneinander synthetisiert und sodann unter Anwendung üblicher Techniken hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so konstruiert, dass sie 3'- und 5'-Enden aufweist, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie direkt mit dem Plasmid verknüpft werden können. Dieses Plasmid enthält nunmehr die mutierte Ziel-Polypeptid-DNA-Sequenz.
Insertion von DNA in ein Klonierungsvehikel
Die cDNA oder genomische DNA, die für das Ziel-Polypeptid kodiert, wird zur weiteren Klonierung (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor inseriert. Es stehen zahlreiche Vektoren zur Verfügung. Die Auswahl des entsprechenden Vektors hängt von folgenden Faktoren ab: 1) Verwendung für die DNA-Amplifikation oder für die DNA-Expression, 2) Größe der in den Vektor zu inserierenden DNA und 3) mit dem Vektor zu transformierende Wirtszelle. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten, je nach deren Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und der Wirtszelle, mit der er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten umfassen im allgemeinen (ohne Beschränkung hierauf) einen oder mehrere der folgenden Bestandteile: eine Signalsequenz, eine Replikationsursprungsstelle, ein oder mehr Markergene, ein Verstärkerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz:
(a) Signalsequenz-Komponente
Im allgemeinen kann es sich bei der Signalsequenz um eine Komponente des Vektors handeln oder sie kann einen Teil der Ziel-Polypeptid-DNA darstellen, die in den Vektor inseriert wird.
Die erfindungsgemäßen Ziel-Polypeptide lassen sich möglicherweise nicht nur direkt exprimieren, sondern auch in Form einer Fusion mit einem heterologen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids. Im allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder es kann sich um einen Teil der Ziel-Polypeptid-DNA, die in den Vektor inseriert wird, handeln. Unter den Umfang der Erfindung fallen Ziel-Polypeptide, wobei eine beliebige native Signalsequenz deletiert und durch eine heterologe Signalsequenz ersetzt ist. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz soll so beschaffen sein, dass sie durch die Wirtszelle erkannt und prozessiert (d. h. durch eine Signal-peptidase gespalten) wird. Für prokaryontische Wirtszellen, die die native Ziel-Polypeptid-Signalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryontische Signalsequenz ersetzt, die beispielsweise aus der Gruppe alkalische Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabile Enterotoxin II-Leader ausgewählt ist. Für die Hefesekretion kann die native Ziel-Polypeptid-Signalsequenz durch Hefe-Invertase-, alpha-Faktor- oder saure Phosphatase-Leader ersetzt werden. Bei der Expression durch Säugetierzellen ist die native Signalsequenz zufriedenstellend, obgleich auch andere Säugetier-Signalsequenzen geeignet sein können.
(b) Replikationsursprungsstellen-Komponente
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im allgemeinen handelt es sich in Klonierungsvektoren bei dieser Sequenz um eine Sequenz, die dem Vektor eine von der chromosomalen Wirts-DNA unabhängige Replikation ermöglichen und die Replikationsursprungsstellen oder autonom replizierende Sequenzen umfasst.
Derartige Sequenzen sind für eine Reihe von Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Die Replikationsursprungsstelle aus dem Plasmid pBR322 eignet sich für die meisten gram-negativen Bakterien, die 2 μ-Plasmid-Ursprungsstelle eignet sich für Hefen und die verschiedenen viralen Ursprungsstellen (SV40, Polyom, Adenovirus, VSV oder BPV) eignen sich für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen. Im allgemeinen ist die Replikationsursprungsstellen-Komponente für Säugetier-Expressionsvektoren nicht erforderlich (die SV40-Ursprungsstelle kann typischerweise nur verwendet werden, da sie den frühen Promotor enthält).
Bei den meisten Expressionsvektoren handelt es sich um "Shuttle"-Vektoren, d. h. sie sind zur Replikation in mindestens einer Klasse von Organismen befähigt, können aber für die Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert und anschließend wird der gleiche Vektor in Hefe oder Säugetierzellen für die Expression transfiziert, obgleich er zur Replikation unabhängig vom Wirtszellchromosom nicht befähigt ist.
DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Dies wird leicht erreicht, indem man beispielsweise Bacillus-Spezies als Wirte verwendet, wobei man in den Vektor eine DNA-Sequenz einschließt, die komplementär zu einer in genomischer Bacillus-DNA auftretenden Sequenz ist. Eine Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor führt zu einer homologen Rekombination mit dem Genom und zur Insertion der Ziel-Polypeptid-DNA. Jedoch ist die Gewinnung von genomischer DNA, die für das Ziel-Polypeptid kodiert, komplizierter als die eines exogen replizierten Vektors, was darauf zurückzuführen ist, dass ein Restriktionsenzym-Verdau erforderlich ist, um die Ziel-Polypeptid-DNA auszuschneiden.
(c) Selektionsgen-Komponente
Expressions- und Klonierungsvektoren sollen ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird, enthalten. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum von transformierten Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden, erforderlich ist. Wirtszellen, die nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformiert sind, überleben im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Mängel ausgleichen oder (c) kritische Nährstoffe zuführen, die im komplexen Medium nicht verfügbar sind, z. B. das für D-Alanin-racemase kodierende Gen für Bacilli.
Ein Beispiel eines Selektionsschemas bedient sich eines Arzneistoffes, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert worden sind, exprimieren ein Protein, das Arzneistoffresistenz verleiht, und überleben somit die Selektionsmaßnahmen.
Beispiele einer derartigen dominanten Selektion verwenden Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., Bd. 1 (1982), S. 327), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science, Bd. 209 (1980), S. 1422) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 5 (1985), S. 410–413). Die drei vorstehend aufgeführten Beispiele bedienen sich bakterieller Gene unter eukaryontischer Kontrolle, um eine Resistenz gegenüber dem entsprechenden Arzneistoff G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Ein weiteres Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Marker, die die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die befähigt sind, die Ziel-Polypeptid-Nucleinsäure, wie Dihydrofolat-reductase (DHFR) oder Thymidinkinase, aufzunehmen. Die Säugetier-Zell-Transformanten werden unter Selektionsdruck gestellt, den nur Transformanten aufgrund der Aufnahme des Markers überleben können. Ein Selektionsdruck wird ausgeübt, indem man die Transformanten unter Bedingungen züchtet, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium sukzessive verändert wird, wodurch man selektiv zur Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der DNA, die für das Ziel-Polypeptid kodiert, kommt. Eine Amplifikation ist der Vorgang, durch den Gene, für die bei der Erzeugung eines für das Wachstum kritischen Proteins ein größerer Bedarf besteht, in Tandemstellung innerhalb der Chromosomen von aufeinanderfolgenden Generationen von rekombinanten Zellen wiederholt werden. Aus der amplifizierten DNA werden erhöhte Mengen des Ziel-Polypeptids synthetisiert.
Beispielsweise werden Zellen, die mit DHFR-Selektionsgen transformiert sind, zunächst durch Züchten sämtlicher Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Bei einer geeigneten Wirtszelle handelt es sich bei Verwendung von Wildtyp-DHFR um die CHO-Zelllinie (Ovarialzellen des chinesischen Hamsters), denen die DHFR-Aktivität fehlt. Die Herstellung und Vermehrung dieser Zelllinie erfolgt gemäß Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 4216). Die transformierten Zellen werden sodann erhöhten Konzentrationen an Methotrexat ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von Mehrfachkopien des DHFR-Gens und gleichzeitig von Mehrfachkopien von weiterer DNA, die die Expressionsvektoren umfasst, z. B. der DNA, die für das Ziel-Polypeptid kodiert. Diese Amplifikationstechnik kann mit beliebigen, ansonsten geeigneten Wirten, z. B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, angewandt werden, trotz des Vorliegens von endogener DHFR, wenn beispielsweise ein mutantes DHFR-Gen, das hochgradig resistent gegen Mtx ist, verwendet wird (EP-117 060). Alternativ können Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die endogene DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen, die für das Ziel-Polypeptid, Wildtyp-DHFR-Protein und einen weiteren selektierbaren Marker, wie Aminoglycosid-3'-phosphotransferase (APH) kodieren, transformiert oder cotransformiert worden sind, durch Zellwachstum in einem Medium mit einem Gehalt an einem Selektionsmittel für den selektierbaren Marker, wie ein Aminoglycosid-Antibiotikum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder G418, selektiert werden; vergl. US-4 965 199.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature, Bd. 282 (1979), S. 39; Kingsman et al., Gene, Bd. 7 (1979), S. 141; oder Tschemper et al., Gene, Bd. 10 (1980), S. 157). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutanten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, z. B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics, Bd. 85 (1977), S. 12). Die Anwesenheit der tip1-Läsion im Hefewirt-Zellgenom ergibt sodann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation aufgrund von Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. Gleichermaßen werden Hefestämme mit einem Mangel an Leu2 (ATCC 20 622 oder 38 626) durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen tragen, vervollständigt.
(d) Promotor-Komponente
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und funktionell mit der Ziel-Polypeptid-Nucleinsäure verknüpft ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die sich stromaufwärts (5') zum Startcodon eines Strukturgens (üblicherweise innerhalb von 100 bis 1 000 bp) befinden und die Transkription und Translation einer speziellen Nucleinsäuresequenz, die beispielsweise für das Ziel-Polypeptid kodiert, mit der sie funktionell verknüpft sind, steuern. Derartige Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive Promotoren. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Grade der Transkription aus DNA unter ihrer Steuerung in Reaktion auf eine gewisse Veränderung der Züchtungsbedingungen, z. B. die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder eine Veränderung der Temperatur, herbeiführen. Derzeit ist eine große Anzahl an Promotoren, die von verschiedenen potentiellen Wirtszellen erkannt werden, bekannt. Diese Promotoren werden funktionell mit der für das Ziel-Polypeptid kodierenden DNA verknüpft, indem man den Promotor aus der Quellen-DNA durch Verdau mit Restriktionsenzym entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor inseriert. Sowohl die native Ziel-Polypeptid-Promotorsequenz als auch zahlreiche heterologe Promotoren können zur direkten Amplifikation und/oder Expression der Ziel-Polypeptid-DNA verwendet werden. Jedoch werden heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im allgemeinen eine stärkere Transkription und höhere Ausbeuten von exprimiertem Ziel-Polypeptid im Vergleich zum nativen Ziel-Polypeptid-Promotor ermöglichen.
Zu Promotoren, die sich zur Verwendung mit prokaryontischen Wirten eignen, gehören die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, Bd. 275 (1978), S. 615; und Goeddel et al., Nature, Bd. 281 (1979), S. 544), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057 und EP-36 776) und hybride Promotoren, wie der tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 21–25). Jedoch sind auch andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleinsäuresequenzen wurden veröffentlicht, so dass es einem Fachmann möglich ist, sie mit DNA, die für das Ziel-Polypeptid kodiert, zu verknüpfen (Siebenlist et al., Cell, Bd. 20 (1980), S. 269), wobei man Linker oder Adaptoren verwendet, um etwaige erforderliche Restriktionsstellen zu liefern. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten ebenfalls im allgemeinen eine Shine-Dalgarno (S. D.)-Sequenz, die funktionell mit der für das Ziel-Polypeptid kodierenden DNA verknüpft sind.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 2073) oder andere glycolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg., Bd. 7 (1968), S. 149; und Holland, Biochemistry, Bd. 17 (1978), S. 4900), wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase, Pyruvat-kinase, Triosephosphat-isomerase, Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase.
Weitere Hefepromotoren, bei denen es sich um induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch die Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription handelt, sind die Promotorregionen für Alkohol-dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme in Verbindung mit dem Stickstoff-Stoffwechsel, Metallothionein, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase und Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden ferner von Hitzeman et al., EP-73 657A, beschrieben. Ferner werden in vorteilhafter Weise zusammen mit Hefepromotoren Hefe-Enhancer verwendet.
Promotorsequenzen sind für Eukaryonten bekannt. Praktisch sämtliche eukaryontischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich etwa 25 bis 30 Basen stromaufwärts von der Stelle, wo die Transkription eingeleitet wird, befinden. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle zahlreicher Gene befindet, ist eine CXCAAT-Region, wobei X ein beliebiges Nucleotid bedeuten kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryontischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, bei der es sich um das Signal für die Addition des Poly A-Schwanzes am 3'-Ende der kodierenden Sequenz handeln kann. Alle diese Sequenzen eignen sich zur Insertion in Säugetier-Expressionsvektoren.
Die Ziel-Polypeptid-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren, wie Polyomavirus, Geflügelpocken-Virus (GB-2 211 504, Veröffentlichungstag 5. Juli 1989), Adenovirus (z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarcomavirus, Cytomegalovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus und insbesondere Simianvirus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunoglobulin-Promotor, aus Hitzeschock-Promotoren und aus dem normalerweise mit der Ziel-Polypeptidsequenz verbundenen Promotor erhalten werden, vorausgesetzt, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen verträglich sind.
Der frühe und späte Promotor des SV40-Virus werden zweckmäßigerweise als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, die auch die virale SV40-Replikationsursprungsstelle enthält; Fiers et al., Nature, Bd. 273 (1978), S. 113; Mulligan und Berg, Science, Bd. 209 (1980), S. 1422–1427; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, Bd. 78 (1981), S. 7398–7402. Der unmittelbare frühe Promotor des humanen Cytomegalovirus wird zweckmäßigerweise als ein HindIII E-Restriktionsfragment erhalten; Greenaway et al., Gene, Bd. 18 (1982), S. 355–360. Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist in US-4 419 446 beschrieben. Eine Modifikation dieses Systems wird in US-4 601 978 beschrieben; vergl. auch Gray et al., Nature, Bd. 295 (1982), S. 503–508, bezüglich der Expression von cDNA, die für Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature, Bd. 297 (1982), S. 598– 601 bezüglich der Expression von humaner beta-Interferon-cDNA in Mäusezellen unter der Steuerung eines Thymidin-kinase-Promotors aus Herpes simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 79 (1982), S. 5166–5170 bezüglich der Expression des humanen Interferon-beta-1-Gens in gezüchteten Mäuse- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 79 (1982), S. 6777-6781, bezüglich der Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Aftennierenzellen, Hühnerembrio-Fibroblasten, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen und Mäuse-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Wiederholungssequenz des Rous-Sarcoma-Virus als Promotor.
(e) Enhancer-Element-Komponente
Die Transkription von DNA, die für das erfindungsgemäße Ziel-Polypeptid kodiert, durch höhere Eukaryonten wird häufig durch Inserieren einer Enhancer-Sequenz in den Vektor verstärkt. Bei Enhancern handelt es sich um cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise mit etwa 10–300 bp, die auf einen Promotor unier Verstärkung von dessen Transkription wirken. Enhancer sind relativ unabhängig in Bezug auf Orientierung und Position. Sie wurden in 5'-Stellung (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78 (1981), S. 993) und in 3'-Stellung (Lusky et al., Mol. Cell Bio., Bd. 3 (1983), S. 1108) zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell, Bd. 33 (1983), S. 729) sowie innerhalb der Kodierungssequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio., Bd. 4 (1984), S. 1293) gefunden. Es sind zahlreiche Enhancer-Sequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, alpha-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man jedoch nur einen Enhancer aus einem eukaryontischen Zellvirus. Zu Beispielen hierfür gehören der SV40-Enhancer auf der späten Seite der Replikationsursprungsstelle (bp 100-270), der frühe Promotor-Enhancer des Cytomegalovirus, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite der Replikationsursprungsstelle und der Adenovirus-Enhancer. Es wird auch auf Yaniv, Nature, Bd. 297 (1982), S. 17–18, bezüglich der Enhancer-Elemente zur Aktivierung von eukaryontischen Promotoren verwiesen. Der Enhancer kann an einer Position in 5'- oder 3'-Stellung zur Ziel-Polypeptid-DNA in den Vektor gespleißt werden, er befindet sich jedoch vorzugsweise auf der 5'-Seite des Promotors.
(f) Transkriptionsterminations-Komponente
In eukaryontischen Wirtszellen (Hefen, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Menschen oder kernhaltige Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendete Expressionsvektoren enthalten ferner Sequenzen, die für die Termination der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise von den 5'- und gelegentlich von den 3'-untranslatierten Regionen von eukaryontischen oder viralen DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente in den untranslatierten Teil der mRNA, die für das Ziel-Polypeptid kodiert, transkribiert werden. Die 3'-untranslatierten Regionen enthalten ferner Transkriptionsterminationsstellen.
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere der vorstehend aufgeführten Komponenten und die gewünschten Kodierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, bedient sich üblicher Ligationstechniken. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
Für eine Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden Ligationsgemische zur Transformation von E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31 446) verwendet. Erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls aufgrund von Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz ausgewählt. Aus den Transformanten werden Plasmide präpariert, durch Restriktionsendonuclease-Verdau analysiert und/oder gemäß dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309, oder gemäß dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology, Bd. 65 (1980), S. 499, sequenziert.
Für die erfindungsgemäße Praxis besonders geeignet sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression in Säugetierzellen von DNA, die für das Ziel-Polypeptid kodiert, sorgen. Im allgemeinen beinhaltet eine vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der zur wirksamen Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist, so dass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors ansammelt und ihrerseits hohe Konzentrationen eines erwünschten Polypeptids, das durch den Expressionsvektor kodiert wird, synthetisiert. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die zweckmäßige positive Identifizierung von Polypeptiden, die durch die klonierten DNAs kodiert werden, sowie ein rasches Screening von derartigen Polypeptiden auf die gewünschten biologischen oder physiologischen Eigenschaften. Somit sind vorübergehende Expressionssysteme erfindungsgemäß besonders wertvoll zu Zwecken der Identifizierung von Analogen und Varianten des Ziel-Polypeptids, die eine ähnliche Aktivität wie das Ziel-Polypeptid aufweisen.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die sich zur Anpassung an die Synthese des Ziel-Polypeptids in rekombinanten Wirbeltier-Zellkulturen eignen, werden in folgenden Literaturstellen beschrieben: Gething et al., Nature, Bd. 293 (1981), S. 620–625; Mantei et al., Nature, Bd. 281 (1979), S. 40–46; Levinson et al., EP-117 060 und EP-117 058. Ein besonders geeignetes Plasmid für die Expression des Ziel-Polypeptids in Säugetierzellkulturen ist pRK5 (EP-307 247) oder pSV16B.
Selektion und Transformation von Wirtszellen
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der vorliegenden Vektoren sind die vorstehend beschriebenen prokaryontischen Hefe- oder höheren eukaryontischen Zellen. Geeignete Prokaryonten umfassen Eubakterien, wie gram-negative oder gram-positive Organismen, z. B. E. coli, Bacilli, wie B. subtilis, Pseudomonas-Spezies, wie P. aeruginosa, Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens. Ein bevorzugter E. coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31 446), obgleich auch andere Stämme, wie E. coli B, E. coli × 1776 (ATCC 31 537) und E. coli W3110 (ATCC 27 325), geeignet sind. Diese Beispiele dienen der Erläuterung und stellen keine Beschränkung dar. Vorzugsweise sezernieren die Wirtszellen minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Alternativ sind auch in vitro-Verfahren zum Klonieren, z. B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerase-Reaktionen, geeignet.
Neben Prokaryonten eignen sich eukaryontische Mikroorganismen, wie filamentöse Pilze oder Hefen, als geeignete Wirte für Vektoren, die für das Ziel-Polypeptid kodieren. Saccharomyces cerevisiae oder übliche Bäckerhefe wird unter den niederen eukaryontischen Wirtsmikroorganismen besonders häufig verwendet. Jedoch steht eine Anzahl von anderen Gattungen, Spezies und Stämmen allgemein zur Verfügung und eignet sich für die vorliegenden Zwecke, wie Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature, Bd. 290 (1981), S. 140; EP-139 383 (Veröffentlichungstag 2. Mai 1985)), Kluyveromyces-Wirte (US- 4 943 529) wie K. lactis [Louvencourt et al., J. Bacteriol., (1983), S. 737), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, K. marxianus, yarrowia (EP-402 226), Pichia pastoris (EP-183 070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., Bd. 28 (1988), S. 265– 278), Candida, Trichoderma reesia (EP-244 234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1979), S. 5259–5263) und filamentöse Pilze, wie Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO-91100357, Veröffentlichungstag 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte, wie A. nidulans (Ballance ei al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 112 (1983), S. 284–289; Tilburn et al., Gene, Bd. 26 (1983), S. 205–221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 1470– 1474) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 475–479).
Geeignete Wirtszellen für die Expression eines glycosylierten Ziel-Polypeptids leiten sich von multizellulären Organismen ab. Derartige Wirtszellen sind befähigt, komplexe Prozessierungs- und Glycosylierungsaktivitäten zu entfalten. Im Prinzip eignen sich beliebige höhere eukaryontische Zellkulturen, unabhängig davon, ob es sich um Wirbeltier- oder Nichtwirbeltier-Kulturen handelt. Zu Beispielen für Nichtwirbeltier-Zellen gehören Pflanzen- und Insektenzellen. Es wurden zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten und entsprechende geeignete Insekten-Wirtszellen aus Wirten, wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori-Wirtszellen identifiziert; vergl. z. B. Luckow et al., Bio/Technology, Bd. 6 (1988), S. 47-55; Miller et al. in Genetic Engineering, Hrsg. J. K. Setlow et al., Bd. 8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277–279; und Maeda et al., Nature, Bd. 315 (1985), S. 592–594. Eine Vielzahl von derartigen viralen Stämmen sind öffentlich zugänglich, z. B, die L-1-Variante von Aufographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV. Derartige Viren können als erfindungsgemäßer Virus, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet werden. Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens, das vorher so manipuliert worden ist, dass es die Ziel-Polypeptid-DNA enthält, transfiziert. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für das Ziel-Polypeptid kodierende DNA auf den Pflanzenzellwirt übertragen, so dass dieser transfiziert wird und unter- geeigneten Bedingungen die Ziel-Polypeptid-DNA exprimiert. Ferner sind regulatorische und Signalsequenzen, die mit Pflanzenzellen verträglich sind, verfügbar, z. B. der Nopalin-synthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen; Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., Bd. 1 (1982), S. 561. Außerdem sind DNA-Segmente, die aus der stromaufwärtigen Region des T-DNA 780-Gens isoliert worden sind, dazu befähigt, die Transkriptionsgrade von in Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinantem, DNA-haltigem Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu erhöhen; vergl. EP-321 196, Veröffentlichungstag 21. Juni 1989.
Von größerem Interesse sind jedoch Wirbeltierzellen. Die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) hat sich in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren entwickelt (Tissue Culture, Academic Press, Hrsg. Kruse und Patterson (1973)). Zu Beispielen für geeignete Säugetier-Wirtszelllinien gehören die durch SV40 transformierte Affennieren-Zelllinie CV1 (COS-7, ATCC CRL 1651); die humane embryonale Nierenzelllinie (293- oder 293-Zellen, die einer Subklonierung zum Wachstum in Suspensionskultur unterzogen worden sind, Graham et al., J. Gen Virol., Bd. 36 (1977), S. 59); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Ovarialzellen des chinesischen Hamsters/-DNFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 4216); Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., Bd. 23 (1980), S. 243–251); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Nierenzellen des grünen afrikanischen Affen (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büftelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Mamma-Tumorzellen (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., Bd. 383 (1982), S. 44–68); MRC 5-Zellen; FS4-Zellen; und eine humane Hepatom-Zelllinie (Hep G2). Bevorzugte Wirtszellen sind die humanen embryonalen Nierenzellen 293 und die Ovarialzellen des chinesischen Hamsters.
Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Expressions- oder Klonierungsvektoren transformiert und in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet, die in geeigneter Weise modifiziert worden sind, um Promotoren zu induzieren, Transformanten auszuwählen oder für die gewünschten Sequenzen kodierende Gene zu amplifizieren.
Der Ausdruck "Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob irgendwelche Kodierungssequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Dem Fachmann sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, z. B. das CaPO₄-Verfahren und die Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion ist im allgemeinen zu erkennen, wenn irgendwelche Anzeichen für die Funktionsfähigkeit dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle vorliegen.
Der Ausdruck "Transformation" bedeutet die Einführung von DNA in einen Organismus, so dass die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder als chromosomaler Bestandteil. Je nach der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Anwendung üblicher Verfahren, die sich für derartige Zellen eignen, durchgeführt. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid gemäß Abschnitt 1.82 der Literaturstelle Sambrook et al., a. a. O., wird allgemein für Prokaryonten oder andere Zellen, die erhebliche Zellwandbarrieren aufweisen, herangezogen. Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation von bestimmten Pflanzenzellen eingesetzt; vergl. Shaw et al., Gene, Bd. 23 (1983), S. 315 und WO-89/05859, Veröffentlichungstag 29. Juni 1989. Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände wird das Calciumphosphat-Fällungsverfahren, das in den Abschnitten 16.30–16.37 von Sambrook et al, a. a. O., beschrieben ist, bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystem-Transformationen werden von Axel im US-Patent 4 399 216 (Ausgabetag 16. August 1983) beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact., Bd. 130 (1977), S. 946, und von Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 76 (1979), S. 3829, durchgeführt. Jedoch können auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen verwendet werden, z. B. eine nukleare Injektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion.
Züchtung der Wirtszellen
Prokaryontische Zellen, die zur Erzeugung des erfindungsgemäßen Ziel-Polypeptids verwendet werden, werden in geeigneten Medien gemäß den Ausführungen bei Sambrook et al., a. a. O., gezüchtet.
Die zur Erzeugung des erfindungsgemäßen Ziel-Polypeptids verwendeten Säugetier-Wirtszellen können in einer Vielzahl von Medien gezüchtet werden. Handelsübliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma), minimales essentielles Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und gemäß Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, Sigma) eignen sich zur Züchtung der Wirtszellen. Ferner können beliebige Medien, die in folgenden Literaturstellen beschrieben sind, als Züchtungsmedien für die Wirtszellen verwendet werden: Ham und Wallace, Meth. Enz., Bd. 58 (1979), S. 44; Barnes und Sato, Anal. Biochem., Bd. 102 (1980), S. 255; US-4 767 704; US-4 657 866; US-4 927 762; US-4 560 655; WO-90/03430; WO-87/00195; US-Re-30 985. Beliebige dieser Medien können je nach den Erfordernissen mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder epidermaler Wachstumsfaktor), Salzen, (z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (z. B. HEPES), Nucleosiden (z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (z. B. Gentamycin^R-Arzneistoff), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder einer gleichwertigen Energiequelle ergänzt sein.
Beliebige weitere erforderliche Ergänzungsstoffe können in den geeigneten Konzentrationen zugesetzt werden, wie es dem Fachmann geläufig ist. Die Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und dergl., entsprechen den Bedingungen, wie sie bisher bei der Wirtszelle für die Expression herangezogen wurden. Derartige Bedingungen sind dem Fachmann geläufig.
Die in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Wirtszellen umfassen Zellen in in vitro-Kulturen sowie Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstiers befinden.
Ferner ist es vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Ziel-Polypeptide durch homologe Rekombination oder mit rekombinanten Herstellungsverfahren erzeugt werden, wobei man Steuerelemente verwendet, in Zellen, die bereits die für das derzeit auf dem einschlägigen Gebiet verwendete Ziel-Polypeptid kodierende DNA enthalten, eingeführt sind. Beispielsweise werden ein leistungsfähiges Promotor/Enhancer-Element, ein Suppressor oder ein exogenes Transkriptionsmodulationselement in das Genom der vorgesehenen Wirtszelle in der Nähe und in einer geeigneten Orientierung, um die Transkription der für das angestrebte Ziel-Polypeptid kodierenden DNA zu beeinflussen, inseriert. Das Kontrollelement kodiert nicht für das erfindungsgemäße Ziel-Polypeptid, vielmehr ist die DNA im Wirtszellgenom vorhanden. Anschließend wird ein Screening auf Zellen, die das erfindungsgemäße Ziel-Polypeptid bilden oder je nach Bedarf erhöhte oder verringerte Expressionsgrade aufweisen, durchgeführt.
Nachweis der Gen-Amplifikation/Expression
Eine Gen-Amplifikation und/oder -Expression kann in einer Probe beispielsweise direkt durch herkömmliches Southern Blotting, Northern Blotting zur quantitativen Bestimmung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 5201–5205), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer in geeigneter Weise markierten Sonde, auf der Grundlage der hier angegebenen Sequenzen, gemessen werden. Es können verschiedene Markierungen verwendet werden, wobei Radioisotope, insbesondere ³²P, besonders üblich sind. Jedoch können auch andere Techniken herangezogen werden, z. B. mit Biotin modifizierte Nucleotide zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient sodann als Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die mit einer Vielzahl von Markierungen markiert sein können, z. B. mit Radionucliden, fluoreszierenden Stoffen, Enzymen oder dergl. Alternativ können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Proteinduplices, erkennen. Die Antikörper können wiederum markiert sein und der Test kann bei Bindung des Duplex an eine Oberfläche durchgeführt werden, so dass bei Bildung des Duplex an der Oberfläche das Vorliegen eines an das Duplex gebundenen Antikörpers nachgewiesen werden kann.
Alternativ kann die Gen-Expression durch immunologische Verfahren gemessen werden, z. B. durch immunohistochemische Färbung von Gewebeschnitten und Test von Zellkulturen oder Körperflüssigkeiten, um quantitativ direkt die Expression des Genprodukts zu bestimmen. Bei immunohistochemischen Färbetechniken wird eine Zellprobe präpariert, typischerweise durch Dehydratisierung und Fixierung, wonach sich eine Umsetzung mit markierten Antikörpern, die spezifisch für das gekuppelte Genprodukt sind, anschließt, wobei die Markierungen üblicherweise visuell erfassbar sind, z. B. enzymatische Markierungen, fluoreszierende Markierungen, lumineszierende Markierungen und dergl. Eine besonders empfindliche Färbetechnik, die sich zur erfindungsgemäßen Anwendung eignet, wurde von Hsu et al., Am. J. Clin. Path., Bd. 75 (1980), S. 734–738, beschrieben.
Antikörper, die sich für eine immunohistochemische Färbung und/oder zum Test von Körperflüssigkeiten eignen, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in beliebigen Säugetieren erzeugt werden. Zweckmäßigerweise können die Antikörper gegen ein natives Ziel-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf der Grundlage der im nachstehenden Abschnitt 4 näher beschriebenen DNA-Sequenzen erzeugt werden.
Reinigung des Ziel-Polypeptids
Das Ziel-Polypeptid wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als sezerniertes Polypeptid gewonnen, obgleich es auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann, wenn es direkt ohne ein sekretorisches Signal exprimiert wird.
Wenn das Ziel-Polypeptid in einer rekombinanten Zelle, die nicht menschlichen Ursprungs ist, exprimiert wird, ist das Ziel-Polypeptid vollständig frei von Proteinen oder Polypeptiden humanen Ursprungs. Es ist jedoch erforderlich, das Ziel-Polypeptid von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im wesentlichen in Bezug auf das Ziel-Polypeptid homogen sind. Als erste Stufe wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um teilchenförmige Zellbruchstücke zu entfernen. Membranfraktionen und lösliche Proteinfraktionen werden sodann abgetrennt. Das Ziel-Polypeptid kann sodann aus der löslichen Proteinfraktion und von der Membranfraktion des Kulturlysats gereinigt werden, je nachdem ob das Ziel-Polypeptid membrangebunden ist. Nachstehend sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren aufgeführt: Fraktionierung an Immunoaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Fällung mit Ethanol; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Siliciumdioxid oder einem Kationenaustauscherharz, wie DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Fällung mit Ammoniumsulfat; Gelfiltration, beispielsweise unter Verwendung von Sephadex G-75; und Protein A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen, wie IgG.
Varianten des Ziel-Polypeptids, bei denen Reste deletiert, inseriert oder substituiert worden sind, werden auf die gleiche Weise gewonnen, wobei man etwaige wesentliche Veränderungen von Eigenschaften, die durch die Variation eingetreten sind, berücksichtigt. Beispielsweise erleichtert bei der Präparation eines Ziel-Polypeptids eine Fusion mit einem anderen Protein oder Polypeptid, z. B. einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung. Eine Immunoaffinitätssäule, die den Antikörper für das Antigen (oder ein Antigen, sofern es sich beim Ziel-Polypeptid um einen Antikörper handelt) enthält, kann zur Adsorption des Fusionsprodukts verwendet werden. Immunoaffinitätssäulen, wie polyklonale Kaninchen-anti-Ziel-Polypeptid-Säulen können zur Absorption der Ziel-Polypeptid-Variante verwendet werden, indem man diese an mindestens ein verbleibendes immunes Epitop bindet. Ein Protease-Inhibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann ferner zur Hemmung des protolytischen Abbaus während der Reinigung geeignet sein. Antibiotika können zugesetzt werden, um das Wachstum von zufälligen Verunreinigungen zu verhindern.
Der Fachmann erkennt, dass Reinigungsverfahren, die sich für das native Ziel-Polypeptid eignen, möglicherweise modifiziert werden müssen, um Veränderungen in den Eigenschaften des Ziel-Polypeptids oder von deren Varianten bei der Expression in rekombinanter Zellkultur zu berücksichtigen.
Kovalente Modifikationen von Ziel-Polypeptiden
Kovalente Modifikationen von Ziel-Polypeptiden fallen unter den Umfang der Erfindung. Ein Typ einer kovalenten Modifikation, der unter den Umfang der Erfindung fällt, ist ein Ziel-Polypeptid-Fragment. Ziel-Polypeptid-Fragmente mit bis zu etwa 40 Aminosäureresten können zweckmäßigerweise durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des Ziel-Polypeptids von voller Länge oder von Ziel-Polypeptid-Varianten hergestellt werden. Weitere Typen von kovalenten Modifikationen des Ziel-Polypeptids oder von Fragmenten davon werden in das Molekül eingeführt, indem man spezielle Aminosäurereste des Ziel-Polypeptids oder von Fragmenten davon mit einem organischen Derivatisierungsmittel umsetzt, das zur Umsetzung mit ausgewählten Seitenketten oder N- oder C-terminalen Resten befähigt ist.
Cysteinylreste werden besonders häufig mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivate zu erhalten. Cysteinylreste werden ferner durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazoyl)-propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat im pH-Bereich von 5,5–7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidyl-Seitenkette ist. Es eignet sich auch p-Bromphenacylbromid, wobei die Umsetzung vorzugsweise in 0,1 M Natriumkakodylat beim pH-Wert 6,0 durchgeführt wird.
Lysinyl und aminoendständige Reste werden mit Bernsteinsäureanhydrid oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Eine Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung der Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Weitere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Aminogruppen enthaltenden Resten sind Imidoester, wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion; und eine durch Transaminase katalysierte Umsetzung mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien, wie Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin, modifiziert. Eine Derivatisierung von Argininresten erfordert die Umsetzung unter alkalischen Bedingungen, und zwar aufgrund des hohen pK_a-Werts der funktionellen Guanidingruppe. Ferner können diese Reagenzien mit Lysingruppen sowie mit der ε-Aminogruppe von Arginin reagieren.
Die spezielle Modifikation von Tyrosylresten kann (insbesondere im Hinblick auf Einführung von spektralen Markierungen bei Tyrosylresten) durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan durchgeführt werden. Besonders gebräuchlich sind N-Acetylimidazol und Tetranitromethan zur Bildung von O-Acetyltyrosyl-Spezies bzw. 3-Nitroderivaten. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in einem Radioimmunoassay herzustellen, wobei auch das vorstehend beschriebene Chloramin T-Verfahren geeignet ist.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') modifiziert, wobei R und R' verschiedene Alkylgruppen bedeuten, z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid. Ferner werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln eignet sich zur Vernetzung des Ziel-Polypeptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder einer Oberfläche zur Verwendung in einem Verfahren zur Reinigung von anti-Ziel-Polypeptid-Antikörpern und umgekehrt. Zu üblicherweise verwendeten Vernetzungsmitteln gehören beispielsweise 1,1-Bis-(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, wie Ester von 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleinimide, wie Bis-N-maleinimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)-dithio]-propioimidat, ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in Gegenwart von Licht zur Bildung von Vernetzungen befähigt sind. Alternativ werden für die Proteinimmobilisierung reaktive, in Wasser unlösliche Matrices, wie mit Bromcyan aktivierte Kohlenhydrate und die in den US-Patenten 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537 und 4 330 440 beschriebenen reaktiven Substrate verwendet.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten desamidiert. Alternativ werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung.
Zu weiteren Modifikationen gehören die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl und Threonylresten, die Methylierung der a-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure und Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, (1983), S. 79–86), die Acetylierung der N-terminalen Amingruppe und die Amidierung von etwaigen C-terminalen Carboxylgruppen.
Ein weiterer Typ einer kovalenten Modifikation des Ziel-Polypeptids, die unter den Umfang der Erfindung fällt, umfasst die Veränderung des nativen Glycosylierungsmusters des Polypeptids. Unter Veränderung ist zu verstehen, dass ein oder mehr Kohlenhydratreste, die im nativen Ziel-Polypeptid auftreten, deletiert werden und/oder eine oder mehrere Glycosylierungsstellen, die nicht im nativen Ziel-Polypeptid vorhanden sind, hinzugefügt werden.
Die Glycosylierung von Polypeptiden erfolgt typischerweise durch N-Verknüpfung oder durch O-Verknüpfung. Die N-Verknüpfung bezieht sich auf die Bindung des Kohlenhydratrestes an die Seitenkette eines Asparaginrestes. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, wobei X eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Prolin bedeutet, stellen die Erkennungssequenzen für die enzymatische Bindung des Kohlenhydratrestes an die Asparagin-Seitenkette dar. Somit wird durch das Vorliegen einer dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine mögliche Glycosylierungsstelle geschaffen. Eine O-verknüpfte Glycosylierung bezieht sich auf die Bindung von einem der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obgleich auch 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin verwendet werden können.
Die Hinzufügung von Glycosylierungsstellen an das Ziel-Polypeptid wird zweckmäßigerweise durch Veränderung der Aminosäuresequenz in der Weise erreicht, dass sie eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen Tripeptidsequenzen (für N-verknüpfte Glycosylierungsstellen) enthält. Die Veränderung kann auch durch Addition oder Substitution von einem oder mehreren Serin- oder Threonionresten an der nativen Ziel-Polypeptidsequenz (für O-verknüpfte Glycosylierungsstellen) vorgenommen werden. Einfachheitshalber wird die Ziel-Polypeptid-Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Veränderungen auf dem DNA-Niveau abgeändert, vorzugsweise durch Mutation der für das Ziel-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die zu den gewünschten Aminosäuren translatiert werden. Die DNA-Mutationen) können gemäß den vorstehend im Abschnitt "Aminosäure-Sequenzvarianten des Ziel-Polypeptids" beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Ein weiteres Mittel zur Erhöhung der Anzahl an Kohlenhydratresten am Ziel-Polypeptid besteht in einer chemischen oder enzymatischen Kupplung von Glycosiden an das Polypeptid. Diese Maßnahmen sind insofern vorteilhaft, als sie nicht die Erzeugung des Polypeptids in einer Wirtszelle erfordern, die zur Glycosylierung für eine N- oder O-verknüpfte Glycosylierung befähigt ist. Je nach der herangezogenen Kupplungsart können die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie die von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie die von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie die von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren sind in WO-87/05330 (Veröffentlichungstag 11. September 1987) und bei Aplin und Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., (1981), S. 259–306) beschrieben.
Die Entfernung von Kohlenhydratresten, die im nativen Ziel-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erreicht werden. Eine chemische Deglycosylierung erfordert die Behandlung des Polypeptids mit Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Behandlung führt zur Spaltung des Großteils oder der Gesamtheit von Zuckern mit Ausnahme des verknüpfenden Zuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während das Polypeptid intakt bleibt. Eine chemische Deglycosylierung wird von Hakimuddin et al. (Arch. Biochem. Biophys., Bd. 259 (1987), S. 52) und von Edge et al. (Anal. Biochem., Bd. 118 (1981), S. 131) beschrieben. Eine enzymatische Spaltung von Kohlenhydratresten an Polypeptiden kann unter Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exoglycosidasen gemäß Thotakura et al. (Meth. Enzymol., Bd. 138 (1987), S. 350) erreicht werden.
Eine Glycosylierung an möglichen Glycosylierungsstellen kann durch Verwendung von Tunicamycin gemäß Duskin et al. (J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 3105) verhindert werden. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glycosid-Verknüpfungen.
Ein weiterer Typ einer kovalenten Modifikation des Ziel-Polypeptids umfasst die Verknüpfung des Ziel-Polypeptids mit verschiedenen nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, gemäß den Angaben in den US-Patenten 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 oder 4 179 337.
Das Ziel-Polypeptid kann auch in Mikrokapseln eingeschlossen werden, die durch Koazervierungstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation (z. B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly-(methylmethacrylat)-Mikrokapseln), hergestellt worden sind, in kolloidalen Arzneistoff-Abgabesystemen (z. B. Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen sind. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflg., Hrsg. A. Osol, (1980), beschrieben.
Ziel-Polypeptid-Präparate eignen sich auch zur Erzeugung von Antikörpern zum Screening auf Bindungspartner, als Standards in Tests für das Ziel-Polypeptid (z. B. durch Markierung des Ziel-Polypeptids zur Verwendung als Standards in einem Radioimmunoassay, einem ELISA-Test oder einem Radiorezeptortest), bei Affinitätsreinigungstechniken und in Rezeptor-Bindungstests vom kompetitiven Typ bei Markierung mit Radioiod, Enzymen, Fluorophoren, Spinmarkierungen und dergl.
Da es häufig schwierig ist, eine Vorhersage über die Eigenschaften eines varianten Ziel-Polypeptids zu machen, ist darauf hinzuweisen, dass ein gewisses Screening der gewonnenen Variante vorgenommen werden muss, um die optimale Variante auszuwählen. Beispielsweise wird eine Veränderung in der immunologischen Beschaffenheit des Ziel-Polypeptidmoleküls, z. B. in Bezug auf die Affinität für ein gegebenes Antigen oder Antikörper, durch einen Immunoassay vom kompetitiven Typ gemessen. Die Variante wird auf Veränderungen der Unterdrückung oder Verstärkung seiner Aktivität im Vergleich zur Aktivität des Ziel-Polypeptids beim gleichen Test bestimmt. Weitere mögliche Modifikationen von Protein- oder Polypeptideigenschaften, wie Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobizität, Empfindlichkeit gegenüber einem proteolytischen Abbau, Stabilität in rekombinanter Zellkultur oder in Plasma oder Tendenz zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren, werden gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt.
Antikörper für diagnostische Zwecke und verwandte Zwecke
Die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich in diagnostischen Tests zur Bestimmung der Antigen-Expression in spezifischen Zellen oder Geweben. Die Antikörper werden nachweisbar markiert und/oder an einer unlöslichen Matrix immobilisiert.
Die erfindungsgemäßen Antikörper finden ferner Verwendung bei der Affinitätsreinigung des Antigens aus der rekombinanten Zellkultur oder aus natürlichen Quellen. Geeignete diagnostische Tests für das Antigen und dessen Antikörper hängen vom speziellen Antigen oder Antikörper ab. Im allgemeinen umfassen derartige Tests kompetitive und Sandwich-Tests und sterische Hemmtests. Kompetitive und Sandwich-Verfahren bedienen sich einer Phasentrennungsstufe als integrierenden Bestandteil des Verfahrens, während sterische Hemmtests in einem einzigen Reaktionsgemisch durchgeführt werden. Grundlegend werden die gleichen Verfahren für den Test des Antigens und für Substanzen, die das Antigen binden, herangezogen, obgleich bestimmte Verfahren je nach dem Molekülgewicht der zu testenden Substanz bevorzugt werden. Daher wird die zu testende Substanz hier als Analyt bezeichnet, unabhängig von ihrem sonstigen Status als Antigen oder Antikörper. Proteine, die den Analyten binden, werden als Bindungspartner bezeichnet, unabhängig davon, ob es sich um Antikörper, Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene handelt.
Bei analytischen Verfahren für das Antigen oder dessen Antikörper werden durchweg eines oder mehrere der folgenden Reagenzien verwendet: markiertes Analyt-Analoges, immobilisiertes Analyt-Analoges, markierter Bindungspartner, immobilisierter Bindungspartner und sterische Konjugate. Die markierten Reagenzien sind auch als "Tracer" bekannt.
Bei der verwendeten Markierung (und dies gilt auch für die Markierung von antigener Nucleinsäure zur Verwendung als Sonde) handelt es sich um eine beliebige nachweisbare Funktionalität, die die Bindung des Analyten und seines Bindungspartners nicht beeinträchtigen. Es sind zahlreiche Markierungen zur Verwendung in Immunoassays bekannt, wobei zu Beispielen Reste gehören, die direkt nachgewiesen werden können, wie fluorochrome, chemilumineszierende und radioaktive Markierungen, sowie Reste, z. B. Enzyme, die zum Nachweis umgesetzt oder derivatisiert werden müssen. Zu Beispielen für derartige Markierungen gehören die Radioisotopen ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H und ¹³¹I, Fluorophore, wie Seltenerdmetall-Chelate oder Fluorescein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Dansyl, Umbelliferon, Luceriferasen, z. B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase (US-4 737 456), Luciferin, 2,3-Dihydrophthalazindione, Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharid-oxidasen, z. B. Glucose-oxidase, Galactose-oxidase und Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, heterocyclische Oxidasen, wie Uricase und Xanthin-oxidase, gekuppelt mit einem Enzym, das Wasserstoffperoxid zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers, wie HRP, Lactoperoxidase oder Microperoxidase, verwendet, Biotin/Avidin, Spinmarkierungen, Bacteriophagenmarkierungen, stabile freie Radikale und dergl.
Es stehen herkömmliche Verfahren zur kovalenten Bindung dieser Markierungen an Proteine oder Polypeptide zur Verfügung. Beispielsweise können Kupplungsmittel, wie Dialdehyde, Carbodümide, Dimaleinimide, Bisimidate, bisdiazotiertes Benzidin und dergl., zur Markierung der Antikörper mit den vorstehend beschriebenen fluoreszierenden, chemilumineszierenden und Enzym-Markierungen verwendet werden, vergl. z. B. US-3 940 475 (Fluorimetrie) und US-3 645 090 (Enzyme); Hunter et al., Nature, Bd. 144 (1962), S. 945; David et al., Biochemistry, Bd. 13 (1974), S. 1014–1021; Pain et al., J. Immunol. Methods, Bd. 40 (1981), S. 219–230; und Nygren, J. Histochem. and Cytochem., Bd. 30 (1982), S. 407–412). Bei bevorzugten Markierungen handelt es sich um Enzyme, wie Meerrettich-peroxidase und alkalische Phosphatase.
Die Konjugation einer derartigen Markierung, einschließlich der Enzyme, an den Antikörper stellt für den Fachmann auf dem Gebiet der Immunoassaytechnik ein übliches Verfahren dar; vergl. z. B. O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, Hrsg. J. J. Langone und H. Van Vunakis, Bd. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), S. 147–166. Derartige Bindungsverfahren eignen sich zur Verwendung im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Antikörpern und Polypeptiden.
Für bestimmte Testverfahren ist eine Immobilisierung von Reagenzien erforderlich. Eine Immobilisierung bringt die Trennung des Bindungspartners von etwaigen Analyten, die frei in Lösung bleiben, mit sich. Dies wird herkömmlicherweise entweder durch Unlöslichmachen des Bindungspartners oder des Analyt-Analogen vor dem Testverfahren erreicht, z. B. durch Adsorption an eine in Wasser unlösliche Matrix oder Oberfläche (Bennich et al., US-3 720 760), durch kovalente Kupplung (z. B. unter Anwendung von Glutaraldehyd-Vernetzung) oder durch späteres Unlöslichmachen des Partners oder Analogen, z. B. durch Immunopräzipitation.
Weitere Testverfahren, die als kompetitive oder Sandwich-Tests bekannt sind, sind auf dem Gebiet der gewerblichen Diagnostikaindustrie eingeführt und weit verbreitet.
Kompetitive Tests stützen sich auf die Fähigkeit eines Tracer-Analogen zur Konkurrenz mit dem Testproben-Analyten um eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen auf einem gemeinsamen Bindungspartner. Der Bindungspartner wird im allgemeinen vor oder nach der kompetitiven Umsetzung unlöslich gemacht und anschließend werden der Tracer und der Analyt, die an den Bindungspartner gebunden sind, von ungebundenem Tracer und Analyten abgetrennt. Diese Trennung wird durch Dekantieren (sofern der Bindungspartner vorher unlöslich gemacht worden ist) oder durch Zentrifugieren (sofern der Bindungspartner nach der kompetitiven Umsetzung ausgefällt worden ist) erreicht. Die Menge des Testproben-Analyten ist umgekehrt proportional zur Menge des gebundenen Tracers, der durch die Menge einer Markersubstanz gemessen wird. Dosis-Wirkungs-Kurven mit bekannten Mengen des Analyten werden aufgestellt und mit den Testergebnissen verglichen, um eine quantitative Bestimmung der Menge des in der Testprobe vorhandenen Analyten vorzunehmen. Diese Tests werden als ELISA-Systeme bezeichnet, wenn als nachweisbare Marker Enzyme verwendet werden.
Eine weitere Art eines kompetitiven Tests mit der Bezeichnung "homogener" Test benötigt keine Phasentrennung. Dabei wird ein Konjugat eines Enzyms mit dem Analyten hergestellt und so verwendet, dass bei Bindung des anti-Analyten an den Analyten die Gegenwart des anti-Analyten die Enzymaktivität modifiziert. In diesem Fall werden das Antigen oder immunologisch aktive Fragmente davon mit einer bifunktionellen organischen Brücke an ein Enzym, wie Peroxidase, konjugiert. Die Konjugate zur Verwendung mit dem Antikörper werden so gewählt, dass die Bindung des Antikörpers die Enzymaktivität der Markierung hemmt oder verstärkt. Dieses Verfahren an sich ist unter der Bezeichnung EMIT weit verbreitet.
Sterische Konjugate werden bei Verfahren unter sterischer Hinderung für homogene Tests verwendet. Diese Konjugate werden durch kovalente Verknüpfung eines niedermolekularen Haptens mit einem kleinen Analyten so hergestellt, dass der Antikörper für das Hapten im wesentlichen nicht dazu befähigt ist, das Konjugat gleichzeitig mit dem anti-Analyten zu binden. Bei diesem Testverfahren bindet der in der Testprobe vorhandene Analyt den anti-Analyten, wodurch dem anti-Hapten die Bindung des Konjugats ermöglicht wird, was zu einer Veränderung des Charakters des Konjugat-Haptens führt, z. B. zu einer Veränderung der Fluoreszenz, wenn es sich bei dem Hapten um einen Fluorophor handelt.
Sandwich-Tests eignen sich insbesondere zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern. Bei sequenziellen Sandwich-Tests wird ein immobilisierter Bindungspartner zur Adsorption des Testproben-Analyten verwendet, die Testprobe wird durch Waschen entfernt, der gebundene Analyt wird zur Adsorption des markierten Bindungspartners verwendet und gebundenes Material wird sodann von restlichem Tracer abgetrennt. Die Menge des gebundenen Tracers ist direkt proportional zum Testproben-Analyten. Bei "gleichzeitigen" Sandwich-Tests wird die Testprobe vor Zugabe des markierten Bindungspartners nicht abgetrennt. Ein sequenzieller Sandwich-Test unter Verwendung eines monoklonalen anti-Antigen-Antikörpers als ein Antikörper und eines polyklonalen anti-Antigen-Antikörpers als weiterer Antikörper eignet sich zum Testen von Proben insbesondere auf Antigenaktivität.
Die vorstehenden Ausführungen stellen lediglich Beispiele für diagnostische Tests für die erfindungsgemäßen Import-Antikörper und humanisierten Antikörper dar. Weitere bereits jetzt oder später entwickelte Verfahren zur Bestimmung dieser Analyten fallen unter den Umfang der Erfindung, einschließlich die vorstehend beschriebenen biologischen Tests.
Immunotoxine
Die Erfindung ist ferner auf immunochemische Derivate der erfindungsgemäßen Antikörper, wie Immunotoxine (Konjugate des Antikörpers und eines zytotoxischen Restes), abgestellt. Antikörper, die entsprechende Effektorfunktionen, z. B. mit ihren konstanten Domänen, aufweisen, werden ferner verwendet, um eine Lysis durch den natürlichen Komplementvorgang zu induzieren und mit von Antikörpern abhängigen zytotoxischen Zellen, die normalerweise vorhanden sind, in Wechselwirkung zu treten.
Beispielsweise werden gereinigte, steril filtrierte Antikörper gegebenenfalls mit einem Cytotoxin, wie Ricin, zur Verwendung bei der AIDS-Therapie verwendet. Die US-Patentanmeldung SN-07/350 895 erläutert Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung von Immunotoxinen zur Behandlung von HIV-Infektionen. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich beispielsweise zur Gewinnung von humanisierten Antikörper zur Verwendung als Immunotoxine zum Einsatz bei der AIDS-Therapie.
Beim zytotoxischen Rest des Immunotoxins kann es sich um einen zytotoxischen Arzneistoff oder um ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, mykotischen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder um ein enzymatisches aktives Fragment eines derartigen Toxins handeln. Bei den verwendeten enzymatisch aktiven Toxinen und Fragmenten davon handelt es sich um die Diphtherie A-Kette, nicht-bindende aktive Fragmente von Diphtherie-Toxin, Exotoxin A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin A-Kette, Abrin A-Kette, Modeccin A-Kette, alpha-Sarcin, Aleurites fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca amencana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und Tricothecene. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Antikörper mit als kleine Moleküle vorliegenden Antikrebs-Arzneistoffen, wie cis-Platin oder SFU, konjugiert. Konjugate des monoklonalen Antikörpers und derartige zytotoxische Reste werden unter Verwendung einer Vielzahl von bifunktionellen Protein-Kupplungsmitteln hergestellt. Zu Beispielen für derartige Reagenzien gehören SPDP, IT, bifunktionelle Derivate von Imidoestern, wie Dimethyl-adipimidat-HCl, aktive Ester, wie Disuccinimidylsuberat, Aldehyde, wie Glutaraldehyd, Bisazido-Verbindungen, wie Bis-(p-azidobenzoyl)-hexandiamin, Bis-diazonium-Derivate, wie Bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylendiamin, Diisocyanate, wie Tolylen-2,6-diisocyanat und aktive Bis-fluorverbindungen, wie 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol. Der lysierende Teil eines Toxins kann mit dem Fab-Fragment der Antikörper verbunden werden.
Immunotoxine lassen sich nach einer Vielzahl von Wegen, die hier erläutert werden, herstellen. Üblicherweise lassen sich bekannte Vernetzungsmittel verwenden, um stabile Konjugate zu erhalten.
Vorteilhafterweise sind monoklonale Antikörper, die spezifisch die Domäne des Antigens, denen sie an der infizierten Zelloberfläche ausgesetzt sind, binden, mit der Ricin A-Kette konjugiert. In besonders vorteilhafter Weise wird die Ricin A-Kette durch rekombinante Maßnahmen deglycosyliert und erzeugt. Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung eines derartigen Ricin-Immunotoxins wird von Vitetta et al., Science, Bd. 238 (1987), S. 1098, beschrieben.
Bei Verwendung zur in vitro-Abtötung von infizierten humanen Zellen für diagnostische Zwecke werden die Konjugate typischennreise zum Zellkulturmedium in einer Konzentration von mindestens etwa 10 nM gegeben. Die Zubereitung und die Verabreichungsart für die in vitro-Anwendung sind nicht kritisch. Wässrige Zubereitungen, die mit dem Kultur- oder Perfusionsmedium verträglich sind, werden normalerweise verwendet. Die Zytotoxizität kann durch herkömmliche Techniken abgelesen werden.
Zytotoxische Radiopharmazeutika zur Behandlung von infizierten Zellen lassen sich durch Konjugation von radioaktiven Isotopen (z. B. I, Y, Pr) mit den Antikörpern herstellen. Vorteilhafterweise werden Isotope, die alpha-Teilchen emittieren, verwendet. Der hier verwendete Ausdruck "zytotoxischer Rest" soll derartige Isotope einschließen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ricin A-Kette deglycosyliert oder ohne Oligosaccharide erzeugt, um die Clearance durch irrelevante Clearance-Mechanismen (z. B. die Leber) zu vermindern. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird vollständiges Ricin (A-Kette plus B-Kette) mit dem Antikörper konjugiert, wenn die Galactose-Bindungseigenschaft der B-Kette blockiert werden kann ("blockiertes Ricin").
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Toxin-Konjugate mit Fab- oder F(ab')₂-Fragmenten hergestellt. Aufgrund ihrer relativ geringen Größe können diese Fragmente besser in das Gewebe eindringen und die infizierten Zellen erreichen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden fusogene Liposomen mit einem zytotoxischen Arzneistoff gefüllt und die Liposomen werden mit Antikörpern, die spezifisch das spezielle Antigen binden, beschichtet.
Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität
Bestimmte Aspekte der Erfindung beinhalten Antikörper, die (a) gegen ein spezielles Antigen gerichtet sind und (b) zu einer Unterklasse oder einem Isotyp gehören, die zur Vermittlung der Lysis von Zellen, an die das Antikörpermolekül bindet, befähigt sind. Insbesondere sollen diese Antikörper einer Unterklasse oder einem Isotyp angehören, die bei Komplexbildung mit Zelloberflächenproteinen das Serum-Komplement aktivieren und/oder eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) durch Aktivierung von Effektorzellen, wie natürliche Killerzellen oder Makrophagen, vermitteln.
Es ist bekannt, dass die biologische Aktivität von Antikörpern weitgehend durch die konstanten Domänen oder die Fc-Region des Antikörpermoleküls bestimmt wird (Uananue und Benacerraf, Textbook of Immunology, 2. Auflg., Williams & Wilkins, (1984), S. 218). Dies umfasst ihre Fähigkeit zur Aktivierung von Komplement und zur Vermittlung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC), wie sie durch Leukozyten erreicht wird. Antikörper verschiedener Klassen und Unterklassen unterscheiden sich diesbezüglich, ebenso wie Antikörper der gleichen Unterklasse, jedoch aus unterschiedlichen Spezies. Erfindungsgemäß werden Antikörper von derartigen Klassen mit der angestrebten biologischen Aktivität hergestellt. Die Präparation dieser Antikörper beinhaltet die Auswahl von konstanten Antikörper-Domänen und ihren Einbau in den humanisierten Antikörper nach bekannten Techniken. Beispielsweise sind Mäuse-Immunoglobuline der IgG3- und IgG2a-Klasse zur Aktivierung von Serum-Komplement bei Bindung an die Ziel-Zellen, die das verwandte Antigen exprimieren, befähigt. Daher sind humanisierte Antikörper, denen IgG3- und IgG2a-Effektorfunktionen eingebaut sind, für bestimmte therapeutische Anwendungen wünschenswert.
Im allgemeinen können Mäuse-Antikörper der IgG2a- und IgG3-Unterklasse und gelegentlich der IgG1-Unterklasse ADCC vermitteln, und Antikörper der IgG3-, IgG2a- und IgM-Unterklassen binden und aktivieren Serum-Komplement. Die Komplementaktivierung erfordert im allgemeinen die Bindung von mindestens zwei IgG-Molekülen in enger Nähe an der Zielzelle. Jedoch aktiviert die Bindung von nur einem IgM-Molekül das Serum-Komplement.
Die Fähigkeit eines speziellen Antikörpers zur Vermittlung der Lysis der Zielzelle durch Komplement-Aktivierung und/oder ADCC kann bestimmt werden. Die in Frage stehenden Zellen werden in vitro gezüchtet und markiert. Der Antikörper wird zu der Zellkultur in Kombination entweder mit Serum-Komplement oder mit immunen Zellen, die durch die Antigen-Antikörper-Komplexe aktiviert werden können, gegeben. Die Zytolyse der Zielzellen wird durch Freisetzung der Markierung aus den lysierten Zellen nachgewiesen. Tatsächlich lassen sich Antikörper einem Screening unter Verwendung des eigenen Serums des Patienten als Quelle für Komplement und/oder immune Zellen verwenden. Der Antikörper, der zur Aktivierung von Komplement oder zur Vermittlung von ADCC im in vitro-Test befähigt ist, kann sodann bei diesem speziellen Patienten für therapeutische Zwecke eingesetzt werden.
Die Erfindung umfasst speziell Consensus-Fc-Antikörper-Domänen, die gemäß der Lehre der Erfindung hergestellt und verwendet werden.
Therapeutische und andere Anwendungsmöglichkeiten der Antikörper
Bei in vivo-Verwendung für therapeutische Zwecke werden die erfindungsgemäßen Antikörper dem Patienten in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht (d. h. in Mengen, die die gewünschte therapeutische Wirkung aufweisen). Sie werden normalerweise parenteral verabreicht. Die Dosis und das Dosierungsschema hängen vom Grad der Infektion, den Eigenschaften des verwendeten Antikörpers oder Immunotoxins, z. B. von dessen therapeutischem Index, dem Patienten und der Krankengeschichte des Patienten ab. Vorteilhafterweise werden der Antikörper oder das Immunotoxin kontinuierlich über einen Zeitraum von 1 bis 2 Wochen intravenös verabfolgt, und zwar intravenös zur Behandlung des Gefäßsystems und subkutan und intraperitoneal zur Behandlung von regionalen Lymphknoten. Gegebenenfalls wird die Verabreichung während einer unterstützenden Therapie vorgenommen, z. B. in Kombination mit Bestrahlungszyklen, einer therapeutischen Behandlung oder der Verabreichung von Tumor-Nekrosefaktor, Interferon oder anderen zytologischen Schutzmitteln oder immunomodulatorischen Mitteln.
Für die parenterale Verabreichung werden die Antikörper in einer für Injektionszwecke geeigneten Einheitsdosierung (Lösung, Suspension, Emulsion) zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Vehikel zubereitet. Derartige Vehikel sind von Natur aus nicht-toxisch und nicht-therapeutisch. Zu Beispielen für derartige Vehikel gehören Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und 5% Humanserumalbumin. Nicht-wässrige Vehikel, wie fixierte Öle und Ölsäureethylester, können ebenfalls verwendet werden. Liposomen können als Träger eingesetzt werden. Das Vehikel kann untergeordnete Mengen an Additiven enthalten, z. B. Substanzen, die die isotone Beschaffenheit und die chemische Stabilität verstärken; wie Puffer und Konservierungsmittel. Die Antikörper werden typischerweise in derartigen Vehikeln in Konzentrationen von etwa 1 mg/ml bis 10 mg/ml zubereitet.
Die Verwendung von IgM-Antikörpern wird für bestimmte Anwendungszwecke möglicherweise bevorzugt, jedoch können IgG-Moleküle aufgrund ihrer geringeren Größe besser als IgM-Moleküle dazu befähigt sein, bestimmte Typen von infizierten Zellen zu lokalisieren.
Es gibt Anzeichen dafür, dass eine Komplement-Aktivierung in vivo zu einer Vielzahl von biologischen Wirkungen führt, einschließlich einer Induktion einer entzündlichen Reaktion und Aktivierung von Makrophagen (Uananue und Benecerraf, Textbook of Immunology, 2. Auflg., Williams & Wilkins, (1984), S. 218). Die erhöhte Vasodilatation, die von einer Entzündung begleitet ist, kann die Fähigkeit verschiedener Mittel zur Lokalisierung in infizierten Zellen erhöhen. Daher können Antigen-Antikörper-Kombinationen des erfindungsgemäß angegebenen Typs auf zahlreichen Wegen therapeutisch eingesetzt werden. Zusätzlich können gereinigte Antigene (Hakomori, Ann. Rev. Immunol., Bd. 2 (1984), S. 103) oder antüdiotypische Antikörper (Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 81 (1985), S. 2864; Koprowski et al., Proc Natl. Acad. Sci., Bd. 81 (1984), S. 216), die mit derartigen Antigenen in Zusammenhang stehen, zur Induktion einer aktiven Immunreaktion bei humanen Patienten verwendet werden. Eine derartige Reaktion umfasst die Bildung von Antikörpern, die zur Aktivierung von humanem Komplement und zur Vermittlung von ADCC befähigt sind und durch derartige Mechanismen eine Zerstörung von infizierten Zellen hervorrufen.
Gegebenenfalls eignen sich die erfindungsgemäßen Antikörper bei der passiven Immunisierung von Patienten, beispielsweise durch Verabreichung von humanisierten anti-HIV-Antikörpern.
Die therapeutisch verwendeten Antikörper-Zusammensetzungen werden gemäß verantwortungsvoller medizinischer Praxis (GMP) zubereitet und dosiert, wobei die zu behandelnde Störung, der Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle der Abgabe der Zusammensetzung, das Verabreichungsverfahren und andere, dem Fachmann geläufige Faktoren berücksichtigt werden. Die Antikörper-Zusammensetzungen werden für die Verabreichung gemäß den nachstehenden Ausführungen zur Herstellung von Polypeptiden für Verabreichungszwecke zubereitet.
Hinterlegung von Materialien
Wie vorstehend ausgeführt, wurden Kulturen von muMAb4D5 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, (ATCC) hinterlegt.
Diese Hinterlegung wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und gemäß der entsprechenden Ausführungsordnung (Budapester Vertrag) vorgenommen.
Für Benennungen, gemäß denen um ein europäisches Patent nachgesucht wird, wird bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des europäischen Patents bekannt gemacht wird, oder bis zu dem Tag, an dem die Anmeldung zurückgewiesen oder zurückgenommen worden ist oder als zurückgenommen gilt, eine Probe des hinterlegten Mikroorganismus nur durch Herausgabe an einen vom Antragsteller benannten Sachverständigen verfügbar gemacht (Regel 28(4) EPÜ).
Der Inhaber der vorliegenden Anmeldung erklärt sich bereit, dass für den Fall, dass die hinterlegten Kulturen bei Züchtung unter geeigneten Bedingungen absterben, verloren gehen oder zerstört werden sollten, sofort bei entsprechender Benachrichtigung eine lebende Probe der gleichen Kultur als Ersatz geliefert wird. Der Zugang zum hinterlegten Stamm ist nicht als eine Lizenz zur Nutzung der Erfindung unter Verstoß gegen Rechte, die von Regierungsbehörden entsprechend den Patentgesetzen gewährt worden sind, anzusehen.
Die vorstehende Beschreibung wird als hinreichend angesehen, um dem Fachmann die Ausführung der Erfindung zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung ist bezüglich ihres Schutzumfangs nicht auf die hinterlegten Konstrukte beschränkt, da die hinterlegten Ausführungsformen nur bestimmte Aspekte der Erfindung erläutern sollen und beliebige Konstrukte, die funktionell gleichwertig sind, unter den Umfang der Erfindung fallen. Mit der Hinterlegung des Materials wird nicht eingeräumt, dass die hier vorgelegte Beschreibung nicht ausreicht, dem Fachmann die Durchführung sämtlicher Aspekte der Erfindung zu ermöglichen, einschließlich der besten Ausführungsform davon. Ferner ist die Beschreibung auch nicht als eine Beschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche auf bestimmte Erläuterungen zu verstehen.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Anwendung der Lehre der vorliegenden Erfindung auf ein spezielles Problem oder auf eine spezielle Situation zu den Fähigkeiten des Fachmanns bei Kenntnis der vorgestellten Lehre gehört. Beispiele für die erfindungsgemäßen Produkte und repräsentative Verfahren zu deren Isolierung, Verwendung und Herstellung finden sich nachstehend, die jedoch nicht als eine Beschränkung der Erfindung anzusehen sind.
Beispiele
Beispiel 1: Humanisierung von muMAb4D5
Wir berichten hier über die Chimärisierung von muMAb4D5 (chMAb4D5) und die rasche und gleichzeitige Humanisierung von schweren (V_H) und leichten (V_L) Ketten der Gene von variablen Regionen unter Anwendung einer neuartigen "Genumwandlungs-Mutagenese"-Strategie. Acht humanisierte Varianten (huMAb4D5) wurden konstruiert, um die Bedeutung mehrerer FR-Reste, die durch unsere Molekülmodelle identifiziert oder früher als kritisch für die Konformation von bestimmten CDRs vorgeschlagen wurden, zu untersuchen (vergl. C. Chothia & A. M. Lesk, J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 901–917; C. Chothia et al., Nature, Bd. 342 (1989), S. 877–883; A. Tramontano et al., J. Mol. Biol., Bd. 215 (1990), S. 175–182). Eine wirksame vorübergehende Expression von humanisierten Varianten in Nicht-Myelomzellen ermöglichte uns die rasche Untersuchung der Beziehung zwischen der Bindungsaffinität für p185^HER2ECD und der anti-proliferativen Aktivität gegen p185^HER2 überexprimierende Karzinomzellen vorzunehmen.
Materialien und Methoden
Klonierung von Genen variabler Regionen. Die muMAb4D5 V_H- und V_L-Gene wurden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation von mRNA aus dem entsprechenden Hybridom (B. M. Fendly et al., Cancer Res., Bd. 50 (1990), S. 1550–1558) gemäß den Angaben von Orlandi et al. (R. Orlandi et akl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 3833–3837) isoliert. Eine aminoterminale Sequenzierung von muMAb4D5-V_L und -V_H wurde zur Konstruktion der sense-Strang-PCR-Primer verwendet, während die anti-sense-PCR-Primer auf den Consensus-Sequenzen von murinen Rahmenresten (R. Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 3833–3837; E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1987)) beruhten, wobei Restriktionsstellen für die direktionale Klonierung eingebaut wurden, die durch Unterstreichen gekennzeichnet und nach den Sequenzen aufgeführt sind: V_L-sense, 5'-TCCGATATCCAGCTGACCCAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO: 7), EcoRV; V_L-anti-sense, 5'-GTTTGATCTCCAGCTTGGTACCHSCDCCGAA-3' (SEQ ID NO: 8), Asp718; V_H-sense, 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' (SEQ ID NO: 9), Pstl und V_H-anti-sense, 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' (SEQ ID NO: 10), BstEII; wobei H = A oder C oder T, S = C oder G, D = A oder G oder T, M = A oder C, R = A oder G und W = A oder T. Die PCR-Produkte wurden in pUC119 kloniert (J. Vieira & J. Messing, Methods Enzymol., Bd. 153 (1987), S. 3–11) und fünf Klone für jede variable Domäne wurden durch das Didesoxyverfahren (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463–5467) sequenziert.
Molekülmodell. Modelle für die muMAb4D5-V_H- und V_L-Domänen wurden getrennt aus Consensus-Koordinaten auf der Basis von sieben Fab-Strukturen aus der Brookhaven-Protein-Datenbank (1FB4, 2RHE, 2MCP, 3FAB, 1FBJ, 2HFL und 1REI) konstruiert. Das Fab-Fragment KOL (M. Marquart et al., J. Mol. Biol., Bd. 141 (1980), S. 369–391) wurde zunächst als Matrize für V_L- und V_H-Domänen gewählt und zusätzliche Strukturen wurden sodann dieser Struktur überlagert, wobei die Hauptketten-Atomkoordinaten verwendet wurden (INSIGHT-Programm, Biosym Technologies). Der Abstand vom Matrizen-Cα zum analogen Cα in jeder der überlagerten Strukturen wurde für jede Restposition berechnet. Wenn sämtliche (oder nahezu alle) Cα-Cα-Abstände für einen gegebenen Rest ≤ 1 Å waren, so wurde diese Position in die Consensus-Struktur aufgenommen. In den meisten Fällen genügten die β-Blatt-Rahmenreste diesen Kriterien, während dies bei den CDR-Schleifen nicht der Fall war. Für jeden dieser ausgewählten Reste wurden die durchschnittlichen Koordinaten für die einzelnen N-, Cα-, C-, O- und C β-Atome berechnet und sodann auf die erhaltenen Abweichungen von der nichtstandardmäßigen Bindungsgeometrie durch 50 Zyklen der Energieminimierung unter Verwendung des DISCOVER-Programms (Biosym Technologies) mit dem AMBER-Kräftefeld (S. J. Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 106 (1984), S. 765–784) bei fixierten Cα-Koordinaten korrigiert. Die Seitenketten von hochgradig konservierten Resten, wie die mit Disulfid überbrückten Cystein-Reste wurden sodann in die erhaltene Consensus-Struktur eingebaut. Anschließend wurden die Sequenzen von muMAb4D5-V_L und -V_H eingebaut, wobei man mit den CDR-Resten begann und die Tabellen über CDR-Konformationen von Chothia et al. (C. Chothia et al., Nature, Bd. 342 (1989), S. 877–883) als Richtlinie verwendete. Seitenketten-Konformationen wurden auf der Grundlage von Fab-Kristallstrukturen, Rotamer-Bibliotheken (J. W. Ponder & F. M. Richards, J. Mol. Biol., Bd. 193 (1987), S. 775–791) und Packungsgesichtspunkten gewählt. Da V_H-CDR3 unter diesen Kriterien keiner definierten Gerüstkonformation zugeordnet werden konnte, wurden zwei Modelle aus einer Untersuchung von schleifenähnlicher Größe unter Verwendung des INSIGHT-Programms erzeugt. Ein drittes Modell wurde unter Anwendung von Gesichtspunkten der Packung und der Lösungsmitteleinwirkung abgeleitet. Jedes Modell wurde sodann 5 000 Zyklen der Energieminimierung unterzogen.
Bei humanem muMAb4D5 wurden humane Consensus-Sequenzen zunächst von den häufigsten Unterklassen in der Sequenzzusammenstellung von Kabat et al. (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)), nämlich der V_Lκ-Untergruppe I und der V_H-Gruppe III, abgeleitet und unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren wurde für diese Sequenzen ein Molekülmodell erzeugt. Eine Struktur von huMAb4D5 wurde durch Übertragung der CDRs aus dem muMAb4D5-Modell in die humane Consensus-Struktur erzeugt. Sämtliche huMAb4D5-Varianten enthalten humane Ersatzbausteine von muMAb4D5-Resten an drei Positionen innerhalb der CDRs gemäß der Definition durch die Sequenzvariabilität (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)), jedoch nicht gemäß der Definition durch die Strukturvariabilität (C. Chothia & A. M. Lesk, J. Mol. Biol., Bd. 196 (1987), S. 901– 917): V_L-CDR1 K24R, V_L-CDR2 R54L und V_L-CDR2 T56S. Unterschiede zwischen muMAb4D5 und den humanen Consensus-Rahmenresten (1) wurden einer individuellen Modellbildung unterzogen, um ihren möglichen Einfluss auf die CDR-Konformation und/oder die Bindung an das p185^HER2-ECD zu untersuchen.
Konstruktion von chimären Genen. Gene, die für leichte und schwere Ketten von chMAb4D5 kodieren, wurden getrennt in früher beschriebenen Phagemid-Vektoren zusammengebaut, die den humanen Zytomegalovirus-Enhancer und -Promotor, ein 5'-Intron und das SV40-Polyadenylierungssignal enthalten (C. M. Gorman et al., DNA & Prot. Engin. Tech., Bd. 2 (1990), S. 3–10). Kurz zusammengefasst, Gensegmente, die für muMAb4D5-V_L (1A) und die humane REI-κ₁-leichte Kette C_L kodieren (W. Palm & N. Hilschmann, Z. Physiol. Chem., Bd. 356 (1975), S. 167–191) wurden genau verbunden, ebenso die Gene für muMAb4D5-V_H (1B) und die humane konstante γ1-Region (D. J. Capon et al., Nature, Bd. 337 (1989), S. 525–531), und zwar durch einfache Subklonierung (A. Boyle, Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 3 (Hrsg. F. A. Ausubel et al., Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York, 1990)) und positionsgerichtete Mutagenese (P. Carter in Mutagenesis: A Practical Approach, Kapitel 1 (IRL Press, Oxford, UK 1991)). Der γ1-Isotyp wurde gewählt, da es sich herausgestellt hat, dass er zur Aufnahme von ADCC und der komplementabhängigen Zytotoxizität unter Verwendung von angepassten Sets von chimären (M. Brüggemann et al., J. Exp. Med., Bd. 166 (1987), S. 1351–1361) oder humanisierten Antikörpern (L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323–327) bevorzugt ist. Die durch PCR erzeugten V_L- und V_H-Fragmente (1) wurden anschließend so mutagenisiert, dass sie genau die Sequenz von muMAb4D5 (bestimmt auf dem Proteinniveau) wiedergaben: V_H Q1E, V_L V104L und T109A (Varianten werden durch den Aminosäurerest und eine Ziffer nach der Ersatz-Aminosäure bezeichnet). Die humanen konstanten γ1-Regionen sind identisch mit den von Ellison et al. angegebenen Regionen (J. W. Ellison et al., Nucleic Acids Res., Bd. 13 (1982), S. 4071–4079), mit Ausnahme der Mutationen E359D und M361 L (Eu-Nummerierung, gemäß E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)), die wir vornahmen, um den Antikörper von dem in der Natur seltenen A-Allotyp zum häufigeren Nicht-A-Allotyp umzuwandeln (A. Tramontano et al., J. Mol. Biol., Bd. 215 (1990), S. 175–182). Dies stellte einen Versuch dar, um die Gefahr von bei der Therapie störenden anti-Allotyp-Antikörpern zu verringern.
Konstruktion von humanisierten Genen. Gene, die für das leichte und schwere Ketten-Fd-Fragment von chMAb4D5 (V_H- und C_H1-Domänen) kodierten, wurden zusammen mit pUC119 subkloniert (J. Vieira & J. Messing, Methods Enzymol., Bd. 153 (1987), S. 3–11), um pAK1 zu schaffen, und gleichzeitig in einer einzigen Stufe humanisiert (2). Kurz zusammengefasst, Sätze von sechs benachbarten Oligonucleotiden wurden zur Humanisierung von V_H und V_L konstruiert (1). Diese Oligonucleotide weisen eine Länge von 28 bis 83 Nucleotiden auf, enthalten 0 bis 19 Übereinstimmungsfehler zur murinen Antikörper-Matrize und sind so eingezwängt, dass sie 8 oder 9 perfekt passende Reste an jedem Ende aufweisen, um Annealing und Ligation von benachbarten Oligonucleotiden wirksam zu fördern. Die Sätze von V_H- und V_L-Humanisierungsoligonucleotiden (jeweils 5 pmol) wurden mit ATP oder γ³²P-ATP (P. Carter, Methods Enzymol., Bd. 154 (1987), S. 382–403) phosphoryliert und getrennt mit 3,7 pmol pAK1-Matrize in 40 μl 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) und 10 mM MgCl₂ einem Annealing unterworfen, indem man sie innerhalb von etwa 30 Minuten von 100°C auf Raumtemperatur abkühlte. Die dem Annealing unterzogenen Oligonucleotide wurden durch 10-minütige Inkubation bei 14°C mit T4-DNA-Ligase (12 Einheiten, New England Biolabs) in Gegenwart von 2 μl 5 mM ATP und 2 μl 0,1 M DTT verbunden. Nach Elektrophorese an einem 6%-Acrylamid-Sequenzierungsgel wurden die Oligonucleotide durch Autoradiographie lokalisiert und durch Elektroelution gewonnen. Die zusammengesetzten Oligonucleotide (jeweils ~0,3 pmol) wurden gleichzeitig einem Annealing mit 0,1 pmol einzelsträngigem, Desoxyuridin enthaltendem pAK1 (hergestellt gemäß Kunkel et al., (T. A. Kunkel et al., Methods Enzymol., Bd. 154 (1987), S. 367–382)) in 10 μl 40 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 16 mM MgCl₂ gemäß den vorstehenden Angaben unterworfen. Heteroduplex-DNA wurde durch Erweiterung der Primer mit T7-DNA-Polymerase konstruiert und in E. coli BMH 71-18 mutL gemäß früheren Angaben transformiert (P. Carter, in Mutagenesis: A Practical Approach, Kapitel 1 (IRL Press, Oxford, UK 1991)). Der erhaltene Phagemid-DNA-Pool wurde zunächst auf huV_L durch Restriktionsreinigung unter Verwendung von Xhol und anschließend auf huV_H durch Restriktionsselektion unter Verwendung von Stul gemäß den Angaben von P. Carter in Mutagenesis: A Practical Approach, Kapitel 1 (IRL Press, Oxford, UK 1991); und in J. A. Wells et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A, Bd. 317 (1986), S. 415–423, angereichert. Erhaltene Klone, die sowohl huV_L- als auch huV_H-Gene enthielten, wurden durch Nucleotidsequenzierung (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463–5467) identifiziert und erhielten die Bezeichnung pAK2. Weitere humanisierte Varianten wurden durch positionsgerichtete Mutagenese (P. Carter in Mutagenesis: A Practical Approach, Kapitel 1 (IRL Press, Oxford, UK 1991)) erzeugt. Die muMAb4D5-V_L- und -V_H-Gensegmente in den vorstehend beschriebenen vorübergehenden Expressionsvektoren wurden sodann präzise durch ihre humanisierten Versionen ersetzt.
Expression und Reinigung von MAb4D5-Varianten. Geeignete leichte und schwere Ketten-cDNA-Expressionsvektoren von MAb4D5 wurden in eine mit Adenovirus transformierte humane embryonale Nieren-Zelllinie, 293, cotransfiziert (F. L. Graham et al., J. Gen. Virol., Bd. 36 (1977), S. 59–72), wobei ein Verfahren mit hohem Wirkungsgrad herangezogen wurde (C. M. Gorman et al., DNA & Prot. Engin. Tech., Bd. 2 (1990), S. 3–10; C. Gorman in DNA Cloning, Bd. II, S. 143–190 (Hrsg. D. M. Glover, IRL Press, Oxford, UK 1985)). Medien wurden täglich 5 Tage lang geerntet und die Zellen wurden erneut mit serumfreiem Medium versorgt. Antikörper wurden aus den Medien gewonnen und einer Affinitätsreinigung an Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) gemäß den Angaben des Herstellers unterzogen. Der eluierte Antikörper wurde durch G25-Gelfiltration einem Pufferaustausch zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung unterzogen, durch Ultrafiltration eingeengt (Centriprep-30 oder Centricon-100, Amicon), steril filtriert (Millex-GV, Millipore) und bei 4°C gelagert. Die Konzentration des Antikörpers wurde sowohl durch Gesamt-Immunoglobulin- als auch durch Antigenbindungs-ELISAs bestimmt. Beim verwendeten Standard handelte es sich um huMAb4D5-5, dessen Konzentration durch Analyse der Aminosäurezusammensetzung bestimmt worden war.
Zellproliferationstest. Der Einfluss von MAb4D5-Varianten auf die Proliferation der humanen Mamma-Adenokarzinom-Zelllinie SK-BR-3 wurde gemäß früheren Angaben untersucht (B. M. Fendly et al., Cancer Res., Bd. 50 (1990), S. 1550–1558), wobei Sättigungskonzentrationen von MAb4D5 verwendet wurden.
Affinitätsmessungen. Die Antigen-Bindungsaffinität von MAb4D5-Varianten wurde unter Verwendung einer sezernierten Form des p185^HER2-ECD, das gemäß den Angaben von B. M. Fendly et al., J. Biol. Resp. Mod., Bd. 9 (1990), S. 449–455, hergestellt worden war, bestimmt. Kurz zusammengefasst, Antikörper und p185^HER2-ECD wurden in Lösung bis zum Erreichen des Gleichgewichts inkubiert. Die Konzentration des freien Antikörpers wurde sodann durch ELISA unter Verwendung von immobilisiertem p185^HER2-ECD bestimmt und zur Berechnung der Affinität (K_d) gemäß Friguet et al. (B. Friguet et al., J. Immunol. Methods, Bd. 77 (1985), S. 305–319) verwendet.
Ergebnisse
Humanisierung von muMAb4D5. Die muMAb4D5-V_L- und -V_H-Gensegmente wurden zunächst durch PCR kloniert und sequenziert (1). Die variablen Gene wurden sodann gleichzeitig unter Verwendung von vorgefertigten Oligonucleotiden durch Genumwandlungs-Mutagenese humanisiert (2). Ein 311-meres Oligonucleotid mit einem Gehalt an 39 fehlerhaften Übereinstimmungen zur Matrize dirigierte 24 gleichzeitige Aminosäureänderungen, die zur Humanisierung von muMAb4D5-V_L erforderlich waren. Die Humanisierung von muMAb4D5-V_H erforderte 32 Aminosäure-Austauschvorgänge, die mit einem 361-Meren mit einem Gehalt an 59 Übereinstimmungsfehlern zur muMAb4D5-Matrize installiert wurden. 2 von 8 sequenzierten Klonen kodierten genau huMAb4D5-5, obgleich einer dieser Klone eine einzige Nucleotid-Fehlstelle enthielt. Die 6 übrigen Klone wurden im wesentlichen humanisiert, enthielten aber eine geringe Anzahl an Fehlern: < 3 Nucleotid-Austauschvorgänge und < 1 Einzelnucleotid-Deletion pro Kilobase. Weitere humanisierte Varianten (Tabelle 3) wurden durch positionsgerichtete Mutagenese von huMAb4D5-5 konstruiert.
Die Expressionsgrade von huMAb4D5-Varianten lagen im Bereich von 7 bis 15 μg/ml gemäß Feststellung durch ELISA unter Verwendung von immobilisiertem p185^HER2-ECD. Aufeinanderfolgende Ernten von fünf 10 cm-Platten ließen die Erzeugung von 200 μg bis 500 mg der einzelnen Varianten in einer Woche zu. An Protein A affinitätsgereinigte Antikörper ergaben eine einzige Bande an mit Coomassie-Blau gefärbtem SDS-Polyacrylamidgel mit einer Mobilität, die mit dem erwarteten M_rWert von ~150 kDa übereinstimmte. Die Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen ergab zwei Banden, die mit dem erwarteten M_rWert von freien schweren (48 kDa) und leichten (23 kDa) Ketten übereinstimmten (nicht dargestellt). Eine aminoterminale Sequenzanalyse (10-Zyklen) ergab die gemischte Sequenz, die (1) aus einer äquimolaren Kombination von leichten und schweren Ketten (nicht dargestellt) erwartet wurde.
huMAb4D5-Varianten. Im allgemeinen wurden die FR-Reste aus humanen Consensus-Sequenzen ausgewählt (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)) und CDR-Reste aus muMAb4D5 ausgewählt. Zusätzliche Varianten wurden konstruiert, indem man ausgewählte humane Reste in huMAb4D5-1 durch ihre muMAb4D5-Gegenstücke ersetzte. Dabei handelt es sich um die V_H-Reste 71, 73, 78, 93 plus 102 und die V_L-Reste 55 plus 66, die durch unser Molekülmodell identifiziert worden sind. Der V_H-Rest 71 wurde früher von anderen Autoren (A. Tramontano et al., J.
Mol. Biol., Bd. 215 (1990), S. 175–182) als kritisch für die Konformation von V_H-CDR2 vorgeschlagen. Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen varianten huMAb4D5-Molekülen sind in Tabelle 3 aufgeführt, zusammen mit ihrer p185^HER2-ECD-Bindungsaffinität und den maximalen antiproliferativen Aktivitäten gegen SK-BR-3-Zellen. Sehr ähnliche K_d-Werte wurden für die Bindung von MAb4D5-Varianten an SK-BR-3-Zellen oder p185^HER2-ECD erhalten (Tabelle 3). Jedoch waren die geschätzten K_d-Werte, die von der Bindung von MAb4D5-Varianten an p185^HER2-ECD abgeleitet worden waren, bei geringen Fehlern besser reproduzierbar und verbrauchten geringere Mengen an Antikörper als bei Bindungsmessungen mit vollständigen Zellen.
Die durch molekulare Modellbildung konstruierte, wirkungsvollste humanisierte Variante huMAb4D5-8 enthält 5 FR-Reste aus muMAb4D5. Dieser Antikörper bindet das p185^HER2-ECD 3-fach fester als muMAb4D5 selbst (Table 3) und weist eine mit SK-BR-3-Zellen vergleichbare antiproliferative Aktivität auf (3). Im Gegensatz dazu stellt huMAb4D5-1 die am stärksten humanisierte, jedoch am wenigsten wirkungsvollste muMAb4D5-Variante dar, die durch einfache Installation der muMAb4D5-CDRs in die humanen Consensus-Sequenzen erzeugt worden ist. huMAb4D5-1 bindet p185^HER2-ECD 80-fach weniger fest als der murine Antikörper und weist keine nachweisbare antiproliferative Aktivität bei der höchsten untersuchten Antikörperkonzentration (16 μg/ml) auf.
Die antiproliferative Aktivität von huMAb4D5-Varianten gegen p185^HER2 überexprimierende SK-BR-3-Zellen korreliert nicht einfach mit ihrer Bindungsaffinität für das p185^HER2-ECD. Beispielsweise verändert die Installation von drei murinen Resten in die V_H-Domäne von huMAb4D5-2 (D73T, L78A und A93S) zur Erzeugung von huMAb4D5-3 keine Veränderung der Antigen-Bindungsaffinität, verleiht jedoch eine signifikante antiproliferative Aktivität (Tabelle 3).
Die Bedeutung des V_H-Restes 71 (A. Tramontano et al., J. Mol. Biol., Bd. 215 (1990), S. 175–182) wird durch den beobachteten 5-fachen Anstieg der Affinität für p185^HER2-ECD beim Ersatz von R71 in huMAb4D5-1 durch den entsprechenden murinen Rest Alanin (huMAb4D5-2) gestützt. Im Gegensatz dazu verändert ein Ersatz von V_H-L78 in huMAb4D5-4 durch den murinen Rest Alanin (huMAb4D5-5) nicht in signifikanter Weise die Affinität für das p185^HER2-ECD oder verändert nicht in signifikanter Weise die antiproliferative Aktivität, was darauf schließen lässt, dass der Rest 78 nicht von kritischer funktioneller Bedeutung für huMAb4D5 und dessen Fähigkeit zur einwandfreien Wechselwirkung mit der extrazellulären Domäne von p185^HER2 ist.
Beim V_L-Rest 66 handelt es sich in humanen und murinen κ-Kettensequenzen üblicherweise um Glycin (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987)), wobei aber ein Argininrest diese Position in der leichten κ-Kette von muMAb4D5 einnimmt. Die Seitenkette des Restes 66 beeinflusst vermutlich die Konformation von V_L-CDR1 und V_L-CDR2 und die Haarnadelkurve bei 68–69 (4). Übereinstimmend mit der Bedeutung dieses Restes erhöht die Mutation V_L-G66R (huMAb4D5-3 → huMAb4D5-5) die Affinität für p185^HER2-ECD um das 4-fache mit einer gleichzeitigen Zunahme der antiproliferativen Aktivität.
Aus Molekül-Modellversuchen geht hervor, dass die Tyrosyl-Seitenkette des muMAb4D5-V_L-Restes 55 entweder die Konformation von V_H-CDR3 stabilisieren oder für eine Wechselwirkung an der V_L-V_H-Grenzfläche sorgen kann. Die letztgenannte Funktion kann von der Anwesenheit von V_H-Y102 abhängen. Im Zusammenhang mit huMAb4D5-5 verstärken die Mutationen V_L-E55Y (huMAb4D5-6) und V_H-V102Y (huMAb4D5-7) einzeln die Affinität für p185^HER2-ECD um das 5-fache bzw. das 2-fache, während sie zusammen (huMAb4D5-8) die Affinität um das 11-fache erhöhen. Dies stimmt mit beiden vorgeschlagenen Rollen von V_L-Y55 und V_H-Y102 überein.
Sekundäre Immunfunktion von huMAb4D5-8. muMAb4D5 hemmt das Wachstum von humanen Brusttumorzellen, die p185^HER2 überexprimieren (R. M. Hudziak et al., Molec. Cell. Biol., Bd. 9 (1989), S. 1165–1172). Der Antikörper bietet jedoch nicht die Möglichkeit von direkten zytotoxischen Wirkungen auf den Tumor. Diese Möglichkeit ergibt sich in huMAb4D5-8 als Ergebnis seiner hohen Affinität (K_d 0,1 μM) und seiner humanen IgG₁-Subtyp-Beschaffenheit. In Tabelle 4 wird die durch huMAb4D5-8 vermittelte ADCC-Wirkung auf eine normale Lungenepithel-Zelllinie, WI-38, die eine geringe Konzentration an p185^HER2 exprimiert, und auf SK-BR-3, die eine hohe Konzentration an p185^HER2 exprimiert, mit der Wirkung von muMAb4D5 verglichen. Die Ergebnisse belegen folgendes: (1) huMAb4D5 weist im Vergleich zu seinem murinen Ausgangsprodukt eine erheblich verstärkte Fähigkeit zur Durchführung von ADCC auf; und (2) seine Aktivität kann für Zelltypen, die p185^HER2 überexprimieren, selektiv sein.
Diskussion
muMAb4D5 ist potentiell für die Humantherapie geeignet, da es gegenüber humanen Brust- und Ovarial-Tumorlinien, die die durch HER2 kodierte p185^HER2-Rezeptor-artige Tyrosin-kinase überexprimieren, zytostatisch wirkt. Da sowohl Brust-als auch Ovarial-Karzinome chronische Krankheiten darstellen, wird angenommen, dass das optimale variante MAb4D5-Molekül für die Therapie eine geringe Immunogenizität aufweist und zytotoxisch wirkt, anstatt nur eine zytostatische Wirkung auszuüben. Mit der Humanisierung von muMAb4D5 sollten diese Ziele erreicht werden. Wir haben fünf verschiedene huMAb4D5-Varianten identifiziert, die fest an p185^HER2-ECD binden (K_d ≤ 1 nM) und die eine signifikante antiproliferative Aktivität besitzen (Tabelle 3). Ferner vermittelt huMAb4D5-8, jedoch nicht muMAb4D5 eine ADCC-Wirkung gegen humane Tumorzelllinien, die p185^HER2 in Gegenwart von humanen Eftektorzellen überexprimieren (Tabelle 4), wie für einen humanen γ1-Isotyp angenommen wird (M. Brüggemann et al., J. Exp. Med., Bd. 166 (1987), S. 1351–1361; L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323–327).
Eine rasche Humanisierung von huMAb4D5 wurde durch die hier entwickelte Genumwandlungs-Mutagenesestrategie unter Verwendung von langen, vorher zusammengesetzten Oligonucleotiden erleichtert. Bei diesem Verfahren ist im Vergleich zu einer totalen Gensynthese weniger als die Hälfte der Menge an synthetischer DNA erforderlich und es werden keine zweckmäßigen Restriktionsstellen in der Ziel-DNA benötigt. Unser Verfahren ist offensichtlich einfacher und zuverlässiger als eine kürzlich beschriebene Verfahrensvariante (V. M. Rostapshov et al., FEBS Lett., Bd. 249 (1989), S. 379–382). Eine vorübergehende Expression von huMAb4D5 in humanen embryonalen Nierenzellen 293 ermöglichte die Isolierung einiger hundert Mikrogramm von huMAb4D5-Varianten für eine rasche Charakterisierung durch Tests auf Wachstumshemmung und Antigen-Bindungsaftinität. Ferner wurden verschiedene Kombinationen von leichten und schweren Ketten leicht durch Cotransfektion der entsprechenden cDNA-Expressionsvektoren getestet.
Die entscheidende Rolle der Bildung von Molekülmodellen bei der Humanisierung von muMAb4D5 wird durch die konstruierte Variante huMAb4D5-8 erläutert, die das p185^HER2-ECD 250-fach fester bindet als die einfache CDR-Schleifenaustauschvariante huMAb4D5-1. Es wurde früher gezeigt, dass die Antigen-Bindungsaffinität eines humanisierten Antikörpers durch Mutagenese auf der Grundlage von Molekülmodellen verstärkt werden kann (L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323–327; C. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 10029–10033). Diesbezüglich haben wir die früheren Arbeiten anderer Autoren mit einem konstruierten humanisierten Antikörper fortgeführt, der sein Antigen 3-fach fester bindet als der parentale Nagetier-Antikörper. Obgleich dieses Ergebnis erfreulich ist, müssen zur Feststellung des Erfolgs der Molekülmodelle die Ergebnisse der Röntgen-Strukturuntersuchung abgewartet werden. Aus einer Analyse von huMAb4D5-Varianten (Tabelle 3) ist ersichtlich, dass die antiproliferative Aktivität nicht eine einfache Funktion ihrer Bindungsaffinität für p185^HER2-ECD darstellt. Beispielsweise binden die huMAb4D5-8-Varianten p185^HER2 3-fach fester als muMAb4D5, wobei jedoch die humanisierte Variante geringfügig weniger wirkungsvoll bei der Blockierung der Proliferation von SK-BR-3-Zellen ist. Weitere huMAb4D5-Varianten werden derzeit konstruiert, und zwar in dem Bemühen, Reste, die die antiproliferative Aktivität auslösen, zu identifizieren, sowie in dem Bemühen, diese Aktivität zu verstärken.
Neben der Beibehaltung einer festen Rezeptorbindung und der Fähigkeit zur Hemmung von Zellwachstum verleiht huMAb4D5-8 auch eine sekundäre Immunfunktion (ADCC). Dies ermöglicht eine direkte zytotoxische Aktivität des humanisierten Moleküls in Gegenwart von humanen Eftektorzellen. Die offensichtliche Selektivität der zytotoxischen Aktivität für Zelltypen, die p185^HER2 überexprimieren, ermöglicht die Entwicklung einer unkomplizierten klinischen Behandlungsmöglichkeit von humanen Krebsarten, die durch eine Überexpression des HER2-Protooncogens gekennzeichnet sind.
Tabelle 3 p185^HER2-ECD-Bindungsaffinität und antiproliferative Aktivität von MAb4D5-Varianten
Tabelle 4 Selektivität der durch huMAb4D5-8 vermittelten, antikörperabhängigen Tumorzell-Zytotoxizität
Beispiel 2
Konstruktion eines humanisierten bispezifischen F(ab')₂-Fragments
Dieses Beispiel erläutert die Konstruktion eines humanisierten bispezifischen Antikörpers (BsF(ab')₂v1 durch getrennte E. coli-Expression der einzelnen Fab'-Arme unter anschließender direkter chemischer in vitro-Kupplung. Es wurde gezeigt, dass BsF(ab')₂v1 (anti-CD3/anti-p185^HER2) auf die zytotoxische Aktivität von humanem CD3 + CTL in vitro gegen die humane Brusttumor-Zelllinie SK-BR-3, die das- p185^HER2-Produkt des Protooncogens HER2 überexprimiert, abzielt. Dieses Beispiel belegt die minimalistische Humanisierungsstrategie, bei der möglichst wenige murine Reste in einen humanen Antikörper eingebaut werden, um eine Antigen-Bindungsaffinität und biologische Eigenschaften zu erreichen, die mit denen des murinen parentalen Antikörpers vergleichbar sind. Diese Strategie erwies sich als sehr erfolgreich für den anti-p185^HER2-Arm von BsF(ab')₂v1. Im Gegensatz dazu bindet BsF(ab')₂v1 an T-Zellen über seinen anti-CD3-Arm in wesentlich weniger wirksamer Weise als das chimäre BsF(ab')₂, das die variablen Domänen des murinen parentalen anti-CD3-Antikörpers enthält. Wir haben zusätzliche BsF(ab')²-Fragmente konstruiert, die variante anti-CD3-Arme enthalten, wobei ausgewählte murine Reste wiederhergestellt sind, um die Antikörper-Bindung an T-Zellen zu verbessern. Eine derartige Variante, nämlich BsF(ab')₂v9 wurde erzeugt, indem 6 Reste in der zweiten hypervariablen Schleife der variablen Domäne der anti-CD3-schweren Kette von BsF(ab')₂v1 durch ihre Gegenstücke aus dem murinen parentalen anti-CD3-Antikörper ersetzt wurden. BsF(ab')₂v9 bindet an T-Zellen (Jurkat) in wesentlich wirksamerer Weise als BsF(ab')₂v1 und fast ebenso wirksam wie das chimäre BsF(ab')₂. Diese Verbesserung bezüglich des Wirkungsgrads der T-Zellbindung des humanisierten BsF(ab')₂ stellt eine wichtige Stufe bei der Entwicklung eines potentiellen therapeutischen Mittels zur Behandlung von p185^HER2 überexprimierenden Krebsarten dar.
Bispezifische Antikörper (BsAbs) mit Spezifität für tumorassoziierte Antigene und Oberflächenmarker an Immun-Effektorzellen haben sich als wirksam zum erneuten Abzielen auf Effektorzellen zum Abtöten von Tumorzielen erwiesen, und zwar sowohl in vitro als auch in vivo (Übersichtsartikel von M. W. Fanger et al., Immunol. Today, Bd. 10 (1989), S. 92–99; M. W. Fanger et al., Immunol. Today, Bd. 12 (1991), S. 51–54; und H. Nelson, Cancer Cells, Bd. 3 (1991), S. 163–172). BsF(ab')₂-Fragmente wurden oft gegenüber intakten BsAbs bei gezielter zellulärer Zytotoxizität verwendet, um die Gefahr des Abtötens von harmlosen "Bystander"-Zellen, die an die Fc-Region des Antikörpers binden, zu vermeiden. Ein zusätzlicher Vorteil von BsF(ab')₂ gegenüber intakten BsAbs besteht darin, dass sie im allgemeinen wesentlich einfacher in einer Form, die frei von verunreinigenden monospezifischen Molekülen ist, herzustellen sind (Übersichtsartikel von S. Songsivilai und P. J. Lachmann, Clin. Exp. Immunol., Bd. 79 (1990), S. 315–321; und O. Nolan und R. O'Kennedy, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 1040 (1990), S. 1–11).
BsF(ab')₂-Fragmente werden herkömmlicherweise durch direkte chemische Kupplung von Fab'-Fragmenten konstruiert, die durch begrenzte Proteolyse und milde Reduktion des parentalen monoklonalen Nagetier-Ab erhalten worden sind (M. Brennan et al., Science, Bd. 229 (1985), S. 81–83; und M. J. Glennie et al., J. Immunol., Bd. 139 (1987), S. 2367–2375). Von einem derartigen BsF(ab')₂-Fragment (anti-Gliom-assoziiertes Antigen/anti-CD3) wurde festgestellt, dass es klinisch bei Gliom-Patienten wirkt (T. Nitta et al., Lancet, Bd. 335 (1990), S. 368–371). Ein weiteres BsF(ab')₂(anti-Indium-Chelat/anti-karzinoembryonales Antigen) ermöglichte eine klinische Abbildung eines kolorektalen Karzinoms (D. R. Stickney et al., Antibody, Immunoconj. Radiopharm., Bd. 2 (1989), S. 1–13). Wahrscheinlich lassen sich zukünftig BsF(ab')₂, die für klinische Anwendungen bestimmt sind, aus Antikörpern konstruieren, die entweder human oder zumindest "humanisiert" sind (L. Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323–327), um deren Immunogenizität zu verringern (G. Hale et al., Lancet i: (1988), S. 1394–1399).
Kürzlich wurde ein einfacher Weg zur Gewinnung eines vollständig humanisierten BsF(ab')₂-Fragments, das für die Tumor-Immunotherapie gedacht ist, dargelegt (M. R. Shalaby et al., J. Exp. Med., Bd. 175 (1992), S. 217–225). Dieser Weg beinhaltet eine separate E. coli-Expression der einzelnen Fab'-Arme und eine anschließende direkte chemische in vitro-Kupplung unter Bildung des BsF(ab')₂. Bei einem Arm des BsF(ab')₂ handelte es sich um eine humanisierte Version (P. Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1992a); und P. Carter et al., Bio/Technology, Bd. 10 (1992b), S. 163–167) des murinen monoklonalen Ab 4D5, der gegen das p185^HER2-Produkt des Protooncogens HER2 (c-erbB-2) gerichtet ist (B. M. Fendly et al., Cancer Res., Bd. 50 (1989), S. 1550–1558). Die Humanisierung des Antikörpers 4D5 wird in Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung dargelegt. Beim zweiten Arm handelte es sich um einen minimalistisch humanisierten anti-CD3-Antikörper (Shalaby et al., a. a. O.), der durch Installation der CDR-Schleifen aus den variablen Domänen des murinen, parentalen, monoklonalen Ab UCHT1 (P. C. L. Beverley und R. E. Callard, Eur. J. Immunol., Bd. 11 (1981), S. 329–334) in den humanisierten anti-p185^HER2-Antikörper erzeugt wurde. Vom BsF(ab')₂-Fragment, das die wirkungsstärkste humanisierte anti-CD3-Variante (v1) enthielt, wurde durch Fließzytometrie gezeigt, dass es spezifisch an ein Tumorziel, das p185^HER2 überexprimiert, und an humane periphere mononukleare Blutzellen, die CD3 tragen, bindet. Ferner verstärkte BsF(ab')₂v1 die zytotoxischen Wirkungen des aktivierten humanen CTL auf das 4-fache gegen SK-BR-3-Tumorzellen, die p185^HER2 überexprimieren. Das Beispiel beschreibt Anstrengungen zur Verbesserung der Antigen-Bindungsaffinität des humanisierten anti-CD3-Arms durch gezielte Aufnahme einer kleinen Anzahl an zusätzlichen murinen Resten in die minimalistisch humanisierten variablen anti-CD3-Domänen.
Materialien und Methoden
Konstruktion von Mutationen in den Genen der variablen anti-CD3-Region
Die Konstruktion von Genen, die für die variablen leichten (V_L)- und schweren (V_H)-Kettendomänen der humanisierten anti-CD3-Variante 1 (v1) kodieren, in Phagemid pUC119 wurde beschrieben (Shalaby et al., a. a. O.). Zusätzliche anti-CD3-Varianten wurden unter Anwendung eines wirksamen positionsgerichteten Mutageneseverfahrens erzeugt (P. Carter, Mutagenesis: a Practical Approach, (Hrsg. M. J. McPherson), Kapitel 1, IRL Press, Oxford, UK (1991)), wobei Oligonucleotide mit fehlerhaften Anpassungen verwendet wurden, die entweder besondere Restriktionsstellen installieren oder entfernen. Die verwendeten Oligonucleotide sind nachstehend aufgeführt, wobei Kleinbuchstaben zur Bezeichnung der gezielten Mutationen verwendet werden. Entsprechende Kodierungsänderungen sind mit der Ausgangsaminosäure im Einbuchstabencode bezeichnet, wonach der gemäß E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflg., National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, (1991), nummerierte Rest folgt, sodann die Ersatzaminosäure und schließlich die Identität der anti-CD3-Variante:
HX11, 5' GTAGATAAATCCtctAACACAGCCTAtCTGCAAATG 3' (SEQ ID NO: 11) V_H K75S, v6;
HX12, 5' GTAGATAAATCCAAAtctACAGCCTAtCTGCAAATG 3' (SEQ ID NO: 12) V_H N76S, v7;
HX13, 5' GTAGATAAATCCtcttctACAGCCTAtCTGCAAATG 3' (SEQ ID NO: 13) V_H K75S:N76S, v8;
X14, 5' CTTATAAAGGTGTTtCcACCTATaaCcAgAaatTCAA-GGatCGTTTCACgATAtcCGTAGATAAATCC 3' (SEQ ID NO: 14) V_H T57S:A60N:D61Q:S62K:V63F:G65D, v9;
LX6, 5' CTATACCTCCCGTCTgcatTCTGGAGTCCC 3' (SEQ ID NO: 15) V_L E55H, v11.
Oligonucleotide HX11, HX12 und HX13 entfernen jeweils eine Stelle für BspMl, während LX6 eine Stelle für Xhol entfernt und HX14 eine Stelle für EcoRV (fettgedruckt) installiert. Die anti-CD3-Variante v10 wurde aus v9 durch positionsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Oligonucleotids HX13 konstruiert. Mutanten wurden durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung bestätigt (F.
Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463–5467).
E. coli- Expression von Fab'-Fragmenten
Das Expressionsplasmid pAK19 für die Cosekretion des Fd'-Fragments der leichten Kette und der schweren Kette der besonders bevorzugten humanisierten anti-p185^HER2-Variante huMAb4D5-8 wird von Carter et al., (1992b), a. a. O., beschrieben. Kurz zusammengefasst, die Fab'-Expressionseinheit ist bicistronisch, wobei beide Ketten unter der transkriptionalen Kontrolle des phoA-Promotors stehen. Gene, die für die humanisierten V_L- und V_H-Domänen kodieren, werden präzise an ihrer 5'-Seite an ein Gensegment, das für die wärmestabile Enterotoxin II-Signalsequenz kodiert, und an ihrer 3'-Seite an humane Gene der konstanten Domänen k₁C_L bzw. IgG1 C_H1 fusioniert. Dem C_H1-Gen folgt sofort eine Sequenz, die für die Gelenksequenz CysAlaAla kodiert, wonach sich ein transkriptionaler Bacteriophagen-λt₀-Terminator anschließt. Fab'-Expressionsplasmide für chimäre und humanisierte anti-CD3-Varianten (v1 bis v4, Shalaby et al., a. a. O.; v6 bis v12 gemäß dieser Untersuchung) wurden aus pAK19 erzeugt, indem man präzise anti-p185^HER2-V_L- und -V_H-Gensegmente durch die Segmente, die für murine bzw. entsprechende humanisierte Varianten des anti-CD3-Antikörpers kodierten, ersetzt, und zwar durch Subklonieren und positionsgerichtete Mutagenese. Das Fab'-Expressionsplasmid für die wirkungsstärkste humanisierte anti-CD3-Variante, das in dieser Untersuchung identifiziert wurde (v9), erhält die Bezeichnung pAK22. Das anti-p185^HER2-Fab'-Fragment wurde aus E. coli K12-Stamm 25F2 mit einem Gehalt an dem Plasmid pAK19 sezerniert, der 32 bis 40 Stunden bei 37°C in einem 10 Liter fassenden belüfteten Fermenter gezüchtet wurde. Die endgültige Zelldichte betrug 120 bis 150 OD₅₅₀ und der Titer von löslichem und funktionellem anti-p185^HER2- Fab' betrug 1–2 g/Liter, bestimmt durch Anitigenbindungs-ELISA (Carter et al., (1992b), a. a. O.). anti-CD3-Fab'-Varianten wurden aus E. coli, das die entsprechenden Expressionsplasmide enthielt, sezerniert, wobei sehr ähnliche Fermentationsverfahren herangezogen wurden. Die höchsten Expressionstiter für chimäre und humanisierte anti-CD3-Varianten betrugen 200 mg/Liter bzw. 700 mg/Liter, jeweils bestimmt durch Ermittlung des gesamten Immunoglobulins durch ELISA.
Konstruktion von BsF(ab')₂-Fragmenten
Fab'-Fragmente wurden direkt aus E. coli-Fermentationspasten in der freien Thiolform (Fab'-SH) durch Affinitätsreinigung an Streptococcenprotein G beim pH-Wert 5 in Gegenwart von EDTA gewonnen (Carter et al., (1992b), a. a. O.). Thioetherverknüpfte BsF(ab')₂-Fragmente (anti-p185^HER2/anti-CD3) wurden gemäß dem Verfahren von Glennie et al. (a. a. O.) unter Einhaltung der folgenden Modifikationen konstruiert. anti-p185^HER2-Fab'-SH wurde in 100 mM Tris-acetat, 5 mM EDTA (pH-Wert 5,0) mit 0,1 Vol. 40 mM N,N'-1,2-Phenylendimaleinimid (o-PDM) etwa 1,5 Stunden bei 20°C in Dimethylformamid umgesetzt. Überschüssiges o-PDM wurde durch Protein G-Reinigung des Fab'-Maleinimidderivats (Fab'-mal) und anschließendem Pufferaustausch zu 20 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA (pH-Wert 5,3) (Kupplungspuffer) unter Verwendung von Centriprep-30-Konzentrationsvorrichtungen (Amicon) entfernt. Die Gesamtkonzentration der Fab'-Varianten wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm (huMAb4D5-8-Fab' e^0,1% = 1,56, Carter et al., (1992b), a. a. O.) bestimmt. Der Gehalt an freiem Thiol der Fab'-Präparate wurde durch Umsetzung mit 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (gemäß den Angaben von T. E. Creighton, Protein Structure; a Practical Approach, (Hrsg. T. E. Creighton), Kapitel 7, IRL Press, Oxford, UK (1990), bestimmt. Äquimolare Mengen an anti-p185^HER2-Fab'-mal (unter Annahme einer quantitativen Reaktion von Fab'-SH mit o-PDM) und jeweils der anti-CD3-Fab'-SH-Variante wurden miteinander in einer vereinigten Konzentration von 1 bis 2,5 mg/ml im Kupplungspuffer 14 bis 48 Stunden bei 4°C gekuppelt. Das Kupplungsreaktionsgemisch wurde auf 4 mM Cystein beim pH-Wert 7,0 eingestellt und 15 Minuten bei 20°C inkubiert, um eine Verringerung von etwaigem gebildetem unerwünschten disulfidverknüpften F(ab')₂ zu erreichen. Diese Reduktionsbedingungen reichen zur Reduktion von Interdisulfidbindungen bei schweren Ketten aus, wobei es praktisch zu keiner Reduktion der Disulfidbindungen zwischen leichten und schweren Ketten kommt. Etwaige erzeugte freie Thiole wurden sodann mit 50 mM Iodacetamid blockiert. BsF(ab')₂ wurde aus dem Kupplungsreaktionsgemisch durch Größenausschlusschromatographie an S100-HR (Pharmacia) (2,5 cm × 100 cm) in Gegenwart von PBS isoliert. Die BsF(ab')₂-Proben wurden durch einen 0,2 mm-Filter gegeben, rasch in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70°C aufbewahrt.
Weitere Varianten, die durch Kombination von Mutationen an diesen drei Stellen erzeugt wurden, sind nachstehend beschrieben.
Herstellung von BsF(ab')₂-Fragmenten
Lösliche und funktionelle anti-p185^HER2- und anti-CD3-Fab'-Fragmente wurden direkt aus entsprechenden E. coli-Fermentationspasten mit dem einzigen Gelenk-Cystein vorwiegend in der freien Thiolform (75–100% Fab'-SH) durch Affinitätsreinigung an Streptococcen-Protein G beim pH-Wert 5 in Gegenwart von EDTA gewonnen (Carter et al., (1992b), a. a. O.). Thioetherverknüpfte BsF(ab')₂-Fragmente wurden sodann durch direkte Kupplung unter Verwendung von o-PDM gemäß den Angaben von Glennie et al., a. a. O., konstruiert. Bei einem Arm handelte es sich immer um die wirkungsstärkste humanisierte anti-p185^HER2-Variante huMAb4D5-8 (Carter et al., (1992a), a. a. O.) und beim anderen entweder um eine chimäre oder humanisierte Variante des anti-CD3-Antikörpers. anti-p185^HER2-Fab'-SH wurde mit o-PDM unter Bildung des Maleinimidderivats (Fab'-mal) umgesetzt und sodann für jede anti-CD3-Variante an das Fab'-SH gekuppelt. F(ab')₂ wurde sodann durch Reinigung von nicht-umgesetztem Fab' unter Größenausschluss-Chromatographie gereinigt, wie für ein repräsentatives Präparat (BsF(ab')₂v8) dargelegt (Daten nicht aufgeführt). Das F(ab')₂-Fragment repräsentiert ~54% der Gesamtmenge der Antikörperfragmente (bezogen auf die Masse), wie durch Integration der Chromatographiepeaks festgestellt wurde.
Eine SDS-PAGE-Analyse dieses BsF(ab')₂v8-Präparats unter nicht-reduzierenden Bedingungen ergab eine Hauptbande mit der erwarteten Mobilität (M_r ~96 kD) sowie mehrere sehr kleine Banden (Daten nicht aufgeführt). Eine aminoterminale Sequenzanalyse der Hauptbande nach Elektroblotting auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran (P. Matsudaira, J. Biol. Chem., Bd. 262 (1987), S. 10035-10038) ergab die erwartete gemischte Sequenz aus einem stöchiometrischen 1 : 1-Gemisch aus leichten und schweren Ketten (V_L/V_H: D/E, I/V, Q/Q, M/L, T/V, Q/E, S/S), wie für BsF(ab')₂ erwartet. Die aminoterminalen Regionen beider leichten Ketten sind identisch wie auch die beiden schweren Ketten und entsprechen den humanen Consensus-FR-Sequenzen. Wir haben früher gezeigt, dass F(ab')₂, das durch direkte chemische Kupplung konstruiert worden ist, sowohl anti-p185^HER2- als auch anti-CD3-Antigen-Spezifität aufweist (Shalaby et al., a. a. O.). Der Grad der Verunreinigung des BsF(ab')₂ mit monospezifischem F(ab')₂ ist vermutlich sehr gering, da Mock-Kupplungsreaktionen entweder mit anti-p185^HER2-Fab'-mal oder anti-CD3-Fab'-SH allein keine nachweisbaren Mengen an F(ab')₂ ergaben. Ferner wurde das Kupplungsreaktionsgemisch einer milden Reduktionsstufe und anschließend einer Alkylierung zur Entfernung von Spurenmengen an disulfidverknüpften F(ab')₂, die möglicherweise vorhanden waren, unterzogen. Durch SDS-PAGE des gereinigten F(ab')₂ unter reduzierenden Bedingungen erhielt man zwei Hauptbanden, deren elektrophoretische Beweglichkeit und aminoterminalen Sequenzen den Erwartungen für die freie leichte Kette und thioetherverknüpfte schwere Ketten-Dimere entsprachen.
Eine Messung durch Raster-Laser-Densitometrie des o-PDM-gekuppelten F(ab')₂-Präparats lässt darauf schließen, dass die untergeordnete Spezies zusammen etwa 10% des Proteins ausmachen. Diese untergeordneten Verunreinigungen wurden durch aminoterminale Sequenzanalyse charakterisiert und versuchsweise auf der Grundlage der Stöchiometrie der Sequenzen der leichten und schweren Ketten und ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit (Daten nicht aufgeführt) identifiziert. Diese Daten sind konsistent mit den untergeordneten Verunreinigungen, einschließlich unvollkommenes F(ab')₂, bei dem die Disulfidbindung zwischen leichten und schweren Ketten in einem oder beiden Armen fehlt, Spurenmengen an Fab' und schwere Ketten, die durch Thioetherverknüpfung an leichte Ketten gebunden sind.
Bindung von BsF(ab')₂ an Jurkat-Zellen
Die Bindung von BsF(ab')₂ mit einem Gehalt an verschiedenen anti-CD3-Varianten an Jurkat-Zellen (humane akute T-Zellleukämie) wurde durch Fließzytometrie untersucht (Daten nicht aufgeführt). BsF(ab')₂v9 bindet stärker an Jurkat-Zellen als unser Ausgangsmolekül BsF(ab')₂v1 und fast ebenso wirksam wie chimäres BsF(ab')₂. Die Installation von zusätzlichen murinen Resten in anti-CD3 v9 zur Erzeugung von v10 (V_H K75S : N76S) und v12 (V_H K75S : N76S plus V_L E55H) ergab keine weitere Verbesserung der Bindung von entsprechendem BsF(ab')₂ an Jurkat-Zellen. Auch ein Einbau dieser murinen Reste in anti-CD3 v1 verbesserte die Jurkat-Bindung nicht: V_HK75S (v6), V_HN76S (v7), V_H K75S : N76S (v8), V_L E55H (v11) (nicht aufgeführt). BsF(ab')₂v9 wurde für zukünftige Untersuchungen ausgewählt, da es zu den wirksamsten Varianten bei der Bindung an Jurkat-Zellen gehört und die wenigsten murinen Reste im humanisierten anti-CD3-Arm enthält. Ein monospezifisches anti-p185^HER2-F(ab')₂ zeigte keine signifikante Bindung an Jurkat-Zellen, was damit übereinstimmt, dass die Wechselwirkung durch den anti-CD3-Arm vermittelt wird.
Diskussion
In dieser Untersuchung wurde eine minimalistische Strategie gewählt, um anti-p185^HER2 (Carter et al., (1992a), a. a. O.) und anti-CD3-Arme (Shalaby et al., a. a. O.) des BsF(ab')₂ zu humanisieren, und zwar in dem Versuch, die potentielle Immunogenizität des erhaltenen humanisierten Antikörpers in der klinischen Praxis auf ein Minimum zu beschränken. So versuchten wir die minimale Anzahl an murinen CDR- und FR-Resten im Kontext der humanen variablen Consensus-Domänensequenzen zu installieren, um eine Antigen-Bindungsaktivität und biologische Eigenschaften zu erreichen, die mit denen des murinen parentalen Antikörpers vergleichbar waren. Molekülmodelle wurden erstens dazu herangezogen, eine Vorhersage über murine FR-Reste zu treffen, die für die Antigenbindung wichtig sein könnten, und zweitens, um eine Vorhersage zu treffen, welche murinen CDR-Reste möglicherweise nicht erforderlich sind. Sodann wurde eine geringe Anzahl an humanisierten Varianten konstruiert, um diese Vorhersagen zu prüfen.
Unsere Humanisierungsstrategie war für den anti-p185^HER2-Antikörper sehr erfolgreich, wobei eine von acht humanisierten Varianten (huMAb4D5-8, IgG1) identifiziert wurde, die das p185^HER2-Antigen ~3-fach stärker als der parentale murine Antikörper band (Carter et al., (1992a), a. a. O.). huMAb4D5-8 enthält insgesamt fünf murine FR-Reste und neun murine CDR-Reste, einschließlich V_H-CDR2-Reste 60–65, wurden zugunsten von humanen Gegenstücken ausgeschieden. Im Gegensatz dazu bindet BsF(ab')₂v1, das die wirkungsstärkste humanisierte anti-CD3-Variante der vier ursprünglich konstruierten Varianten enthält (Shalaby et al., a. a. O.) J6-Zellen mit einer Affinität (K_d) von 140 nM, was ~70-fach schwächer als die Affinität des entsprechenden chimären BsF(ab')₂ ist.
Dabei haben wir die T-Zellbindung des humanisierten anti-CD3 sehr ähnlich wie bei der chimären Variante wiederhergestellt, indem wir sechs humane Reste in V_H-CDR2 durch ihre murinen Gegenstücke ersetzten: T57S:A60N:D61Q:S62K:V63F:G65D (anti-CD3-v9, 5). Es erscheint wahrscheinlicher, dass diese murinen Reste die Antigenbindung indirekt durch Beeinflussung der Konformation der Reste im N-terminalen Teil von V_H-CDR2 beeinflussen, anstelle einer direkten Kontaktierung des Antigens. Erstens wurde festgestellt, dass nur N-terminale Reste in V_H-CDR2 (50–58) Antigen in einer oder mehreren von acht kristalllographischen Strukturen von Antikörper/Antigen-Komplexen kontaktierten (Kabat et al., a. a. O.; und I. S. Mian et al., J. Mol. Biol., Bd. 217 (1991), S. 133–151, 5). Zweitens lassen Molekülmodelle darauf schließen, dass Reste im C-terminalen Teil von V_H-CDR2 zumindest teilweise bedeckt sind (5). BsF(ab')₂v9 bindet an SK-BR-3-Brusttumorzellen mit gleicher Wirksamkeit wie BsF(ab')₂v1 und chimäres BsF(ab')₂, wie angenommen wurde, da der anti- p185^HER2-Arm in allen diesen Molekülen identisch ist (Shalaby et al., a. a. O., nicht aufgeführt).
Unser neuer Weg zur Konstruktion von BsF(ab')₂-Fragmenten bedient sich eines E. coli-Expressionssystems, das humanisierte Fab'-Fragmente in Titermengen von Gramm pro Liter sezerniert und ihre direkte Gewinnung als Fab'-SH ermöglicht (Carter et al., (1992b), a. a. O.). Eine traditionelle dirigierte chemische Kupplung von Fab'-SH-Fragmenten wird sodann zur in vitro-Bildung von BsF(ab')₂ herangezogen (Brennan et al., a. a. O.; und Glennie et al., a. a. O.). Dieser Weg zu Fab'-SH vermeidet Probleme, die bei der Erzeugung aus intakten Antikörpern naturgegeben sind: Unterschiede in der Empfindlichkeit gegen Proteolyse und nicht-spezifische Spaltung aufgrund einer heterogenen Beschaffenheit, geringe Ausbeuten sowie eine partielle Reduktion, die für die Gelenk-Disulfidbindungen nicht vollständig selektiv ist. Die Strategie der Verwendung von E. coli-abgeleitetem Fab'-SH mit einem Gehalt an einem einzelnen Gelenk-Cystein beseitigt einige Quellen für eine heterogene Beschaffenheit bei der Herstellung von BsF(ab')₂, wie eine Bildung von Intra-Gelenk-Disulfidbindungen und eine Verunreinigung mit intaktem parentalem Antikörper, wobei andere Probleme weitgehend verringert werden, z. B. die Bildung von F(ab')₃-Fragmenten.
Die hier konstruierten BsF(ab')₂-Fragmente waren thioetherverknüpft, wie ursprünglich von Glennie et al., a. a. O., beschrieben wurde, wobei zukünftige in vivo-Tests dieser Moleküle vorgesehen sind. Thioetherbindungen sind im Gegensatz zu Disulfidbindungen gegenüber einer Spaltung durch Spurenmengen an Thiol nicht empfindlich, was zu dem Vorschlag führte, dass thioetherverknüpftes F(ab')₂ in vivo stabiler sein könnte als disulfidverknüpftes F(ab')₂ (Glennie et al., a. a. O.). Diese Hypothese wird durch unsere vorläufigen pharmakokinetischen Versuche an normalen Mäusen gestützt, die darauf schließen lassen, dass thioetherverknüpftes BsF(ab')₂v1 eine 3-fach längere Plasmaverweilzeit als BsF(ab')₂v1, das durch eine einzige Disulfidbindung verknüpft ist, aufweist. Es wurde festgestellt, dass disulfidverknüpftes und thioetherverknüpftes chimäres BsF(ab')₂ bezüglich der Wirksamkeit der Zellbindung und der Abzielung auf CTL-Zytotoxizität nicht unterscheidbar war, was darauf schließen lässt, dass eine o-PDM-gerichtete Kupplung die Bindung des BsF(ab')₂ an beide Antigene nicht beeinträchtigt (nicht aufgeführt). Trotzdem scheint die Natur der Verknüpfung nicht kritisch zu sein, da kürzlich von anderen Autoren (Nishimura et al., Int. J. Cancer, Bd. 50 (1992), S. 800– 804) gezeigt wurde, dass disulfidverknüpftes BsF(ab')₂ (murines anti-p185^HER2/murines anti-CD3) in Nacktmäusen eine starke Antitumorwirkung besitzt. Unsere frühere Untersuchung (Shalaby et al., a. a. O.) verbessert zusammen mit der vorliegenden Untersuchung und der von T. Nishimura et al., a. a. O., das Potential zur Verwendung von BsF(ab')₂ bei der zielgerichteten Immunotherapie von p185^HER2 überexprimierenden Krebsarten bei Menschen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid umfassend die folgende Sequenz: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLE SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT.
Polypeptid umfassend die folgende Sequenz: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DVWGQGTLVTVSS.
Humanisierter Antikörper umfassend eine V_L-Domäne, umfassend die in Anspruch 1 definierte Polypeptid-Sequenz, und eine V_H-Domäne, umfassend die in Anspruch 2 definierte Polypeptid-Sequenz.
Humanisierter Antikörper umfassend eine V_L-Domäne umfassend die Sequenz: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLE SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT, und eine V_H-Domäne umfassend die Sequenz: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGGDGFYAM DVWGQGTLVTVSS.
Humanisierter Antikörper umfassend eine V_L-Domäne umfassend die Sequenz: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLE SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT; und eine V_H-Domäne umfassend die Sequenz: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DVWGQGTLVTVSS.
Humanisierter Antikörper umfassend eine V_L-Domäne umfassend die Sequenz: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLE SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT; und eine V_H-Domäne umfassend die Sequenz: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DVWGQGTLVTVSS.
Humanisierter Antikörper umfassend eine V_L-Domäne umfassend die Sequenz: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLE SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT; und eine V_H-Domäne umfassend die Sequenz: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DVWGQGTLVTVSS.
Humanisierter Antikörper umfassend eine V_L-Domäne umfassend die Sequenz: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLY SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT; und eine V_H-Domäne umfassend die Sequenz: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DVWGQGTLVTVSS.
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Immuntoxin umfassend ein Konjugat eines humanisierten Antikörpers nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 10 und eine cytotoxische Gruppe.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid, einen humanisierten Antikörper oder ein Immuntoxin nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11.
Polypeptid, humanisierter Antikörper oder Immuntoxin nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Polypeptids, eines humanisierten Antikörpers oder eines Immuntoxins nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Arzneimittels.
Verwendung eines humanisierten Antikörpers nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 10 in einem diagnostischen Assay, mit der Maßgabe, dass der Assay keine diagnostische Methode ist, die am menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt wird.