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CN111132733A - 含有IL-15/IL-15Rα和抗原结合结构域的靶向异源二聚体Fc融合蛋白 - Google Patents

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CN111132733A
CN111132733A CN201880052777.9A CN201880052777A CN111132733A CN 111132733 A CN111132733 A CN 111132733A CN 201880052777 A CN201880052777 A CN 201880052777A CN 111132733 A CN111132733 A CN 111132733A
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amino acid
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human
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M·J·伯内特
J·德斯加利艾斯
R·瓦尔玛
S·斯库波尔特
J·迪亚斯
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Xencor Inc
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Abstract

本发明涉及一种新颖的靶向异源二聚体Fc融合蛋白，其包含IL‑15/IL‑15RαFc融合蛋白和抗原结合结构域Fc融合蛋白。在一些例子中，所述抗原结合结构域与CD8、NKG2A或NKG2D结合。

Description

含有IL-15/IL-15Rα和抗原结合结构域的靶向异源二聚体Fc 融合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年6月30日提交的美国临时申请第62/527,898号的优先权，所述申请以全文引用的方式明确并入本文中，尤其是对其中的图式、图例和权利要求书的引用。
背景技术
IL-2和IL-15有助于B细胞、T细胞和NK细胞的增殖和分化。这两种细胞因子均通过与三聚复合物结合而发挥其细胞信号传导功能，所述三聚复合物由两个共有受体，即共同γ链(γc；CD132)和IL-2受体B链(IL-2Rβ；CD122)，以及每种细胞因子特有的α链受体：IL-2受体α(IL-2Rα；CD25)或IL-15受体α(IL-15Rα；CD215)组成。这两种细胞因子均被认为是肿瘤学中潜在有价值的治疗剂，并且IL-2已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。尽管正在进行几项临床试验，但目前尚未批准使用重组IL-15。
IL-2优先增殖展现高亲和力受体复合物(即IL-2Rα/β/γ复合物)的T细胞。因为调节性T细胞(Treg；CD4+CD25高Foxp3+)组成性表达IL-2Rα(CD25)，所以IL-2的T细胞增殖倾向于Treg，Treg抑制免疫反应，并且因此不利于肿瘤治疗。这种不平衡产生高剂量IL-2的概念；然而，由于IL-2介导的毒性，这种方法形成另外的问题，例如血管渗漏综合症。
相反，IL-15主要呈递为在单核细胞和树突状细胞上与IL-15Rα的膜结合异源二聚体复合物，并且其作用是通过将IL-15/IL-15Rα复合物反式呈递到例如在NK细胞和CD8+T细胞上发现的中等亲和力受体复合物(即IL-2Rβ/γ复合物)来实现的。然而，尽管IL-15/IL-15Rα复合物并不倾向于Treg，但所述复合物仍有助于Treg增殖，如上所述，这对于肿瘤治疗是不利的。因此，在肿瘤治疗中仍存在对倾向于CD8+T细胞增殖和活化的治疗策略的未满足的需求。此外，TIL中的CD8/CD4 T细胞比率高通常被认为是肿瘤疗法的良好预后指标。与CD8效应子相比，CD4效应T细胞的刺激和增殖也被认为有助于更多量的细胞因子释放，并且减少这种效应可以使IL-15治疗更安全，同时副作用更少。本发明通过提供将IL-15优先导向CD8+T细胞的新颖的靶向IL-15的(例如，双功能)蛋白来满足这一需求。
发明内容
本发明提供双功能异源二聚体Fc融合蛋白，其含有IL-15/IL-15Rα复合物和一个或多个与一种或多种抗原(例如人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D)结合的抗原结合结构域。如本文所用，术语“双功能”和“靶向”可以互换使用。
一方面，本文提供一种双功能异源二聚体蛋白，其包含
a)IL-15/IL-15Rα融合蛋白，其包含IL-15Rα蛋白、IL-15蛋白和第一Fc结构域，
其中IL-15Rα蛋白使用第一结构域连接子共价连接于IL-15蛋白的N端，并且IL-15蛋白使用第二结构域连接子共价连接于第一Fc结构域的N端，或
其中IL-15蛋白使用第一结构域连接子共价连接于IL-15Rα蛋白的N端，并且IL-15Rα蛋白使用第二结构域连接子共价连接于第一Fc结构域的N端；和
b)包含重链和轻链的抗原结合结构域单体，所述重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是可变重链并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述轻链包含可变轻链(VL)和轻链恒定结构域(CL)，
其中根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L368D/K370S:S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；
T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，并且其中抗原结合结构域单体结合选自由以下组成的群组的抗原：人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D。
在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。在各种实施例中，所述IL-15蛋白具有SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)或SEQ IDNO:2(成熟人类IL-15)的氨基酸序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)或SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域(sushi domain))的氨基酸序列。在各种例子中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。IL-15蛋白可具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N4D、D61N、N65D和Q108E。在一些情况下，IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。双功能异源二聚体蛋白可以是XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145或XENP27146。
在一些实施例中，上文所述的异源二聚体蛋白可进一步包含使用结构域连接子共价连接于所述IL-15蛋白或IL-15Rα蛋白的N端的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域。双功能异源二聚体蛋白可以是XENP24548。
在一些实施例中，本文提供一种核酸组合物，其包含编码上文所阐述的IL-15/IL-15Rα融合蛋白的第一核酸、编码上文所阐述的抗原结合结构域单体的第二核酸以及编码使用结构域连接子共价连接于IL-15蛋白或IL-15Rα蛋白的N端的抗原结合结构域的任选的第三核酸。在一些实施例中，本文提供一种表达载体组合物，其包含：包含第一核酸的第一表达载体、包含第二核酸的第二表达载体和任选的包含第三核酸的第三表达载体。在一些实施例中，宿主细胞包含表达载体组合物。本文还提供一种制造任何一种双功能异源二聚体蛋白的方法。所述方法包含在其中双功能异源二聚体蛋白被表达的条件下培养上文所阐述的宿主细胞，并且回收所述异源二聚体蛋白。
又另一方面，本文提供一种双功能异源二聚体蛋白，其包含：
a)包含第一蛋白结构域和第一Fc结构域的融合蛋白，其中所述第一蛋白结构域使用结构域连接子共价连接于第一Fc结构域的N端；
b)与第一蛋白结构域非共价连接的第二蛋白结构域；和
c)包含重链和轻链的抗原结合结构域单体，所述重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是可变重链并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述轻链包含可变轻链和轻链恒定结构域；
其中根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L368D/K370S:S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q。
其中第一蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白，并且第二蛋白结构域包含IL-15蛋白，或第一蛋白结构域包含IL-15蛋白，并且第二蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白，并且其中抗原结合结构域单体结合选自由以下组成的群组的抗原：人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D。
在一些实施例中，IL-15Rα蛋白包含半胱氨酸残基，并且IL-15蛋白包含半胱氨酸残基，从而形成二硫键。
在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。在各种实施例中，所述IL-15蛋白具有SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)或SEQ IDNO:2(成熟人类IL-15)的氨基酸序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)或SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)的氨基酸序列。在各种例子中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。IL-15蛋白可具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N4D、D61N、N65D和Q108E。在一些情况下，IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。双功能异源二聚体蛋白可以是XENP25137。
在一些实施例中，上文所述的异源二聚体蛋白可进一步包含使用一个或多个结构域连接子共价连接于所述IL-15蛋白或IL-15Rα蛋白的N端的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域。
在一些实施例中，本文提供一种核酸组合物，其包含编码上文所阐述的融合蛋白的第一核酸、编码上文所阐述的第二蛋白结构域的第二核酸、编码上文所阐述的抗原结合结构域的第三核酸以及编码使用一个或多个结构域连接子共价连接于IL-15蛋白和/或IL-15Rα蛋白的N端的抗原结合结构域的任选的第四核酸。在一些实施例中，本文提供一种表达载体组合物，其包含：包含第一核酸的第一表达载体、包含第二核酸的第二表达载体、包含第三核酸的第三表达载体以及任选的包含第四核酸的第四表达载体。在一些实施例中，宿主细胞包含表达载体组合物。本文还提供一种制造任何一种双功能异源二聚体蛋白的方法。所述方法包含在其中双功能异源二聚体蛋白被表达的条件下培养上文所阐述的宿主细胞，并且回收所述异源二聚体蛋白。
又另一方面，本文提供一种双功能异源二聚体蛋白，其包含：
a)包含第一重链和第一轻链的第一抗原结合结构域单体，所述第一重链包含第一VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第一可变重链，并且CH2-CH3是第一Fc结构域，所述第一轻链包含第一可变轻链和第一轻链恒定结构域；
b)包含第二重链、第二轻链和第一蛋白结构域的第二抗原结合结构域单体，所述第二重链包含第二VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第二可变重链，并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述第二轻链包含第二可变轻链和第二轻链恒定结构域，所述第一蛋白结构域使用第一结构域连接子共价连接于所述第二Fc结构域的C端；和
c)第二蛋白结构域，其连接或非共价连接于第二抗原结合结构域单体的第一蛋白结构域，
其中第一蛋白结构域是IL-15Rα蛋白，并且第二蛋白结构域是IL-15Rα蛋白，或者第一蛋白结构域是IL-15蛋白，并且第二蛋白结构域是IL-15Rα蛋白，
其中根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：L368D/K370S:S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，并且
其中第一抗原结合结构域单体和第二抗原结合结构域单体结合选自由以下组成的群组的抗原：人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D。
在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。在各种实施例中，所述IL-15蛋白具有SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)或SEQ IDNO:2(成熟人类IL-15)的氨基酸序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)或SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)的氨基酸序列。在各种例子中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。IL-15蛋白可具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N4D、D61N、N65D和Q108E。在一些情况下，IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。双功能异源二聚体蛋白可以是XENP24546。
在一些实施例中，本文提供一种核酸组合物，其包含编码上文所阐述的第一抗原结合结构域单体的第一核酸、编码上文所阐述的第二抗原结合结构域单体的第二核酸和编码上文所阐述的第二蛋白结构域的第三核酸。在一些实施例中，本文提供一种表达载体组合物，其包含：包含第一核酸的第一表达载体、包含第二核酸的第二表达载体和包含第三核酸的第三表达载体。在一些实施例中，宿主细胞包含表达载体组合物。本文还提供一种制造任何一种双功能异源二聚体蛋白的方法。所述方法包含在其中双功能异源二聚体蛋白被表达的条件下培养上文所阐述的宿主细胞，并且回收所述异源二聚体蛋白。
一方面，本文提供一种双功能异源二聚体蛋白，其包含
a)IL-15融合蛋白，其包含IL-15蛋白、第一抗原结合结构域和第一Fc结构域，
其中第一抗原结合结构域使用第一结构域连接子共价连接于IL-15蛋白的N端，IL-15蛋白使用第二结构域连接子共价连接于第一Fc结构域的N端，并且抗原结合结构域包含第一可变重链结构域和第一可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域；和
b)IL-15Rα融合蛋白，其包含IL-15Rα蛋白、第二抗原结合结构域和第二Fc结构域，
其中第二抗原结合结构域使用第三结构域连接子共价连接于IL-15Rα蛋白的N端，IL-15Rα蛋白使用第四结构域连接子共价连接于第二Fc结构域的N端，第二抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域。
其中根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，并且
其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域结合选自由以下组成的群组的抗原：人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D。
在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。在各种实施例中，所述IL-15蛋白具有SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)或SEQ IDNO:2(成熟人类IL-15)的氨基酸序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)或SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)的氨基酸序列。在各种例子中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。IL-15蛋白可具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N4D、D61N、N65D和Q108E。在一些情况下，IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。双功能异源二聚体蛋白可以是XENP24547。
在一些实施例中，本文提供一种核酸组合物，其包含编码上文所阐述的IL-15融合蛋白的第一核酸和编码上文所阐述的IL-15Rα融合蛋白的第二核酸。在一些实施例中，本文提供一种表达载体组合物，其包含：包含第一核酸的第一表达载体和包含第二核酸的第二表达载体。在一些实施例中，宿主细胞包含表达载体组合物。本文还提供一种制造任何一种双功能异源二聚体蛋白的方法。所述方法包含在其中双功能异源二聚体蛋白被表达的条件下培养上文所阐述的宿主细胞，并且回收所述异源二聚体蛋白。
另一方面，本发明提供一种选自由以下组成的群组的双功能异源二聚体蛋白：XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24543、XENP24546、XENP24547、XENP24548、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145和XENP27146。
一方面，本发明提供一种核酸组合物，其包含一种或多种编码选自由以下组成的群组的双功能异源二聚体蛋白的核酸：XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24543、XENP24546、XENP24547、XENP24548、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145和XENP27146。
又另一方面，本发明提供一种表达载体组合物，其包含一种或多种表达载体，每种表达载体包含核酸，使得所述一种或多种表达载体编码选自由以下组成的群组的双功能异源二聚体蛋白：XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24543、XENP24546、XENP24547、XENP24548、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145和XENP27146。
还提供包含本文所述的任何核酸组合物的宿主细胞或包含本文所述的任何表达载体组合物的宿主细胞。
一方面，本发明提供一种产生本文所述的双功能异源二聚体蛋白中的任一种的方法。所述方法包含(a)在其中所述双功能异源二聚体蛋白被表达的合适条件下培养本文所述的宿主细胞，和(b)回收所述蛋白。
一方面，本发明提供一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包含向所述患者施用治疗有效量的本文所述的双功能异源二聚体蛋白中的任一种。
额外的IL-15/IL-15Rα异源二聚体Fc融合蛋白详细描述于以下中：例如2018年6月12日提交的美国序列第62/684,143号、2018年4月18日提交的美国序列第62/659,563号、2016年10月14日提交的美国序列第62/408,655号、2016年11月1日提交的美国序列第62/416,087号、2017年1月6日提交的美国序列第62/443,465号、2017年3月28日提交的美国序列第62/477,926号、2017年10月16日提交的美国专利申请第15/785,401号和2017年10月16日提交的PCT国际申请第PCT/US2017/056829号，所述文献以全文引用的方式明确地并入，尤其参考其中的图式、图例和权利要求书。
本文提供本发明的其它方面。
附图说明
图1A-1E描绘异源二聚变体组的有用对(包括偏斜和pI变体)。有些变体没有相应的“单体2”变体；这些是pI变体，可以单独用于任一单体。
图2描绘等排变体抗体恒定区和其各自的取代的列表。pI_(-)表示较低的pI变体，而pI_(+)表示较高的pI变体。这些可以任选地和独立地与本发明的其它异源二聚变体(以及如本文所概述的其它变体类型)组合。
图3描绘有用消融变体，其消融FcγR结合(有时被称为“敲除”或“KO”变体)。通常，在两种单体上都发现了消融变体，尽管在一些情况下其可能仅在一种单体上。
图4A-4D展示本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的“非细胞因子”组分的有用的实施例。
图5A-5F展示本发明的靶向CD8的、靶向NKG2A的和靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的“非细胞因子”/“非Fv”组分的特别有用的实施例。
图6描绘用于IL-15/Rα-Fc融合蛋白的多种例示性可变长度的连接子。在一些实施例中，这些连接子可用于将IL-15和/或IL-15Rα(寿司)的C端连接于Fc区的N端。在一些实施例中，这些连接子可用于将IL-15与IL-15Rα(寿司)融合。
图7描绘许多带电荷的scFv连接子，其可用于增加或减少利用一个或多个scFv作为组分的异源二聚体抗体的pI。(+H)阳性连接子在本文中特别有用。根据Whitlow等人,《蛋白质工程(Protein Engineering)》6(8):989-995(1993)，具有单一电荷的单个现有技术scFv连接子被称为“Whitlow”。应该注意，这个连接子用于减少scFv中的聚集和增强蛋白水解稳定性。
图8A-8D展示基于人类IgG1的几个有用的IL-15/Rα-Fc形式主链序列，而无细胞因子序列(例如，Il-15和/或IL-15Rα(寿司))。重要的是要注意，这些主链也可用于靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的某些实施例中。主链1基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K:L368E/K370S偏斜变体、具有L368E/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链4基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、D401K:K360E/Q362E/T411E偏斜变体、具有K360E/Q362E/T411E偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链5基于人类IgG1(356D/358L同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链6基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体以及两条链上的N297A变体。除了突变是N297S之外，主链7与6相同。主链6和7的替代形式可以不含两条链中的消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。主链8基于人类IgG4，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体，其消融如所属领域已知的Fab臂交换。主链9基于人类IgG2，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体。主链10基于人类IgG2，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S267K变体。主链11与主链1相同，除了其包括M428L/N434S Xtend突变。主链12基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条相同链上的C220S、两条相同链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链13基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的P217R/P229R/N276K pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。
如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何IL-15和IL-15Rα(寿司)对一起使用，包括但不限于IL-15/Rα-异源Fc、ncIL-15/Rα和scIL-15/Rα，如图16A-16G和30A-30D中示意性描绘。另外，任何IL-15和/或IL-15Rα(寿司)变体可以任何组合并入这些图8A-8D主链中。
在这些主链的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％一致(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与图的“亲本”相比，如所属领域技术人员将理解，与亲本人类IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，其已含有多个氨基酸修饰)。也就是说，除了这个图的主链内所含的偏斜、pI和消融变体之外，所列举的主链还可以含有额外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图9展示基于人类IgG1的几个有用的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物形式主链序列，而无细胞因子序列(例如，IL-15和/或IL-15Rα(寿司))或VH，并且进一步排除图10中所描绘的轻链主链。主链1基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的C220S和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、具有S364K/E357Q变体的链上的C220S和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、具有S364K/E357Q变体的链上的Q196K/I199T/P217R/P228R/N276K pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。
在某些实施例中，这些序列可以是356D/358L同种异型。在其它实施例中，这些序列可包括N297A或N297S取代。在一些其它实施例中，这些序列可包括M428L/N434S Xtend突变。在其它实施例中，这些序列可以替代地基于人类IgG4，并且包括两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体，其消融如所属领域已知的Fab臂交换。在又其它实施例中，这些序列可以替代地基于人类IgG2。此外，这些序列可以替代地利用图1A-1E、2和3中描绘的其它偏斜变体、pI变体和消融变体。
如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何IL-15和IL-15Rα(寿司)对一起使用，包括但不限于scIL-15/Rα、ncIL-15/Rα和dsIL-15Rα，如图70中示意性描绘。此外，如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，任何IL-15和/或IL-15Rα(寿司)变体可以并入这些主链中。此外，如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何VH和VL对一起使用，包括scFv或Fab。
在这些主链的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％一致(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与图的“亲本”相比，如所属领域技术人员将理解，与亲本人类IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，其已含有多个氨基酸修饰)。也就是说，除了这个图的主链内所含的偏斜、pI和消融变体之外，所列举的主链还可以含有额外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。还应该注意，本文中所描绘的主链也适用于本发明的靶向NKG2A和靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白。
图10描绘可用于本发明的靶向CD8、靶向NKG2A和靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的轻链(即恒定轻链)的“非Fv”主链。
图11描绘XENP15074，作为本文所述的许多实例中使用的对照的基于莫维珠单抗(motavizumab)(
Figure BDA0002383970270000151
)的可变区的抗RSV mAb的序列。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图12描绘XENP16432，基于纳武单抗(nivolumab)(
Figure BDA0002383970270000152
)可变区的抗PD-1mAb的序列。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图13描绘XENP26007，在本文所述的许多实例中用作对照的“靶向RSV的”IL-15/Rα-Fc融合物的序列。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子，可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图14描绘与其受体IL-15Rα(CD215)、IL-15Rβ(CD122)和共同γ链(CD132)的复合物中IL-15的结构。
图15描绘IL-15和其受体的序列。
图16A-16G描绘用于本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的几种形式。IL-15Rα异源二聚体Fc融合物或“IL-15/Rα-异源Fc”(图16A)包含以重组方式与异源二聚体Fc的一侧融合的IL-15和以重组方式与异源二聚体Fc的另一侧融合的IL-15Rα(寿司)。IL-15和IL-15Rα(寿司)可以在Fc区的C端与N端之间具有可变长度的Gly-Ser连接子。单链IL-15/Rα-Fc融合物或“scIL-15/Rα-Fc”(图16B)包含通过可变长度的连接子与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)(称为“单链”IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物或“scIL-15/Rα”)，其随后与异源二聚体Fc区的N端融合，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。非共价IL-15/Rα-Fc或“ncIL-15/Rα-Fc”(图16C)包含与异源二聚体Fc区融合的IL-15Rα(寿司)，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。二价非共价IL-15/Rα-Fc融合物或“二价ncIL-15/Rα-Fc”(图16D)包含与同源二聚体Fc区的N端融合的IL-15Rα(寿司)，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。二价单链IL-15/Rα-Fc融合物或“二价scIL-15/Rα-Fc”(图16E)包含通过可变长度的连接子与IL-15Rα(寿司)融合的IL-15(称为“单链”IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物或“scIL-15/Rα”)，其随后与同源二聚体Fc区的N端融合。Fc-非共价IL-15/Rα融合物或“Fc-ncIL-15/Rα”(图16F)包含与异源二聚体Fc区的C端融合的IL-15Rα(寿司)，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。Fc-单链IL-15/Rα融合物或“Fc-scIL-15/Rα”(图16G)包含通过可变长度的连接子与IL-15Rα(寿司)融合的IL-15(称为“单链”IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物或“scIL-15/Rα”)，其随后与异源二聚体Fc区的C端融合，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。
图17描绘XENP20818和XENP21475，“IL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图18描绘XENP21478和XENP21993，“scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图19A-19B描绘XENP21479、XENP22366和XENP24348，“ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图20描绘XENP21978，“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图21描绘“二价scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图22描绘XENP22637和XENP22638，“Fc-ncIL-15/Rα”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图23描绘“Fc-scIL-15/Rα”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图24A-24C描绘通过具有如由FACS测量的基于Ki67表达的不同连接子长度的形式A的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白，(图24A)NK(CD56+/CD16+)细胞、(图24B)CD4+T细胞和(图24C)CD8+T细胞增殖的诱导。
图25A-25C描绘通过如由FACS测量的基于Ki67表达的scIL-15/Rα-Fc形式(XENP21478)和ncIL-15/Rα-Fc形式(XENP21479)的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白，(图25A)NK(CD56+/CD16+)细胞、(图25B)CD4+T细胞和(图25C)CD8+T细胞增殖的诱导。
图26描绘展示工程化的二硫键对位置的IL-15/Rα异源二聚体的结构模型。
图27描绘为了充当工程化的半胱氨酸残基的骨架，用C端处的额外残基工程化的说明性IL-15Rα(寿司)变体的序列。
图28描绘为了与用半胱氨酸工程化的IL-15Rα(寿司)变体形成共价二硫键，用半胱氨酸工程化的说明性IL-15变体的序列。
图29描绘为了与用半胱氨酸工程化的IL-15变体形成共价二硫键，用半胱氨酸工程化的说明性IL-15Rα(寿司)变体的序列。
图30A-30D描绘具有工程化的二硫键的本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的额外形式。二硫键键结的IL-15/Rα异源二聚体Fc融合物或“dsIL-15/Rα-异源Fc”(图30A)与“IL-15/Rα-异源Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。二硫键键结的IL-15/RαFc融合物或“dsIL-15/Rα-Fc”(图30B)与“ncIL-15/Rα-Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。二价二硫键键结的IL-15/Rα-Fc或“二价dsIL-15/Rα-Fc”(图30C)与“二价ncIL-15/Rα-Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。Fc-二硫键键结的IL-15/Rα融合物或“Fc-dsIL-15/Rα”(图30D)与“Fc-ncIL-15/Rα”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。
图31A-31B描绘XENP22013、XENP22014、XENP22015和XENP22017，“dsIL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图32A-32B描绘XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22684和XENP22361，“dsIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图33描绘XENP22634、XENP22635、XENP22636和XENP22687，“二价dsIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图34描绘XENP22639和XENP22640，“Fc-dsIL-15/Rα”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图35描绘具有和不具有如由CEF测定的工程化的二硫键的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的纯度和均匀性。
图36A-36C描绘通过具有和不具有如由FACS测量的基于Ki67表达的工程化的二硫键的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白，(图36A)NK(CD56+/CD16+)细胞、(图36B)CD8+T细胞和(图36C)CD4+T细胞增殖的诱导。
图37描绘与IL-15Rα、IL-2Rβ和共同γ链复合的IL-15的结构。展示被设计成降低效能的取代位置。
图38A-38C描绘为效能降低而工程化的说明性IL-15变体的序列。在这些变体IL-15序列的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％一致(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列。在一非限制性实例中，所列举的序列可以含有额外的氨基酸修饰，例如有助于形成如实例3B中所述的共价二硫键的氨基酸修饰。
图39A-39E描绘XENP22821、XENP22822、XENP23343、XENP23554、XENP23557、XENP23561、XENP24018、XENP24019、XENP24045、XENP24051、XENP24052和XENP24306，为效能降低而工程化的“IL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图40A-40d描绘XENP24013、XENP24014、XENP24015、XENP24050、XENP24294、XENP24475、XENP24476、XENP24478、XENP24479和XENP24481，为效能降低而工程化的“scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图41A-41B描绘XENP24349、XENP24890和XENP25138，为效能降低而工程化的“ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图42描绘XENP22801和XENP22802，为效能降低而工程化的说明性ncIL-15/Rα异源二聚体的序列。重要的是要注意这些序列在IL-15Rα(寿司)的C端使用聚组氨酸(His6或HHHHHH)C端标签产生。
图43描绘XENP24342，为效能降低而工程化的“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图44描绘XENP23472和XENP23473，为效能降低而工程化的“dsIL-15/Rα-Fc的”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图83中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图45A-45C描绘通过如由测量的基于Ki67表达的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白，A)NK细胞、B)CD8+(CD45RA-)T细胞和C)CD4+(CD45RA-)T细胞增殖的诱导。
图46描绘通过变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白，和相对于XENP20818 EC50的折叠减少，NK和CD8+T细胞增殖的诱导的EC50。
图47A-47D描绘用指定变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白培育四天的人类PBMC的细胞增殖。图47A-47C展示增殖NK细胞(CD3-CD16+)(图47A)、CD8+T细胞(CD3+CD8+CD45RA-)(图47B)和CD4+T细胞(CD3+CD4+CD45RA-)(图47C)的百分比。图47D展示相对于对照(XENP20818)，各种IL15/IL15RαFc异源二聚体的EC50的倍数变化。
图48A-48B描绘在与XENP22821一起培育人类PBMC之前(图55A)和之后(图55B)的CD69和CD25表达。
图49A-49D描绘用指定变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白培育三天的人类PBMC的细胞增殖。图54A-C展示增殖CD8+(CD45RA-)T细胞(图49A)、CD4+(CD45RA-)T细胞(图49B)、γδT细胞(图49C)和NK细胞(图49D)的百分比。
图50A-50C描绘在用额外IL-15/Rα变体处理之后(图50A)CD8+T细胞、(图50B)CD4+T细胞和(图50C)NK细胞上的Ki67表达的百分比。
图51A-51E描绘在用IL-15/Rα变体处理之后(图51A)CD8+(CD45RA-)T细胞、(图51B)CD4+(CD45RA-)T细胞、(图51C)γδT细胞、(图51D)NK(CD16+CD8α-)细胞和(图51E)NK(CD56+CD8α-)细胞上的Ki67表达的百分比。
图52A-52E描绘在用IL-15/Rα变体处理之后(图52A)CD8+(CD45RA-)T细胞、(图52B)CD4+(CD45RA-)T细胞、(图52C)γδT细胞、(图52D)NK(CD16+CD8α-)细胞和(图52E)NK(CD56+CD8α-)细胞上的Ki67表达的百分比。
图53A-53D描绘在用额外IL-15/Rα变体处理之后(图53A)CD8+T细胞、(图53B)CD4+T细胞、(图53C)γδT细胞和(图53D)NK(CD16+)细胞上的Ki67表达的百分比。
图54描绘在用额外IL-15/Rα变体处理之后(图54A)CD8+T细胞、(图54B)CD4+T细胞、(图54C)γδT细胞和(图54D)NK(CD16+)细胞上的Ki67表达的百分比。
图55描绘在0.1mg/kg单次剂量下的C57BL/6小鼠中各种IL-15/RαF融合蛋白或对照的IV-TV剂量PK。
图56描绘在用为效能较低而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理之后半衰期对比NK细胞效能的相关性。
图57A-57K描绘本发明的靶向X的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的几种形式。X可以是但不限于CD8、NKG2A和NKG2D。“scIL-15/Rα×scFv”形式(图57A)包含通过可变长度的连接子与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)(称为“scIL-15/Rα”)，其随后与异源二聚体Fc区的N端融合，scFv与异源二聚体Fc的另一侧融合。“scFv×ncIL-15/Rα”形式(图57B)包含与异源二聚体Fc区的N端融合的scFv，IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。“scFv×dsIL-15/Rα”形式(图57C)与“scFv×ncIL-15/Rα”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15共价连接。“scIL-15/Rαx Fab”形式(图57D)包含通过可变长度的连接子与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)(称为“scIL-15/Rα”)，其随后与异源二聚体Fc区的N端融合，可变重链(VH)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。“ncIL-15/Rα×Fab”形式(图57E)包含与异源二聚体Fc区的N端融合的VH，IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。“dsIL-15/Rα×Fab”形式(图57F)与“ncIL-15/Rα×Fab”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15共价连接。“mAb-scIL-15/Rα”形式(图57G)包含与第一和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，IL-15与随后与异源二聚体Fc区中的一个的C端进一步融合的IL-15Rα(寿司)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。“mAb-ncIL-15/Rα”形式(图57H)包含与第一和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc区中的一个的C端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。“mAb-dsIL-15/Rα”形式(图57I)与“mAb-ncIL-15/Rα”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15共价连接。“中心-IL-15/Rα”形式(图57J)包含以重组方式与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15的N端融合的VH和以重组方式与随后与异源二聚体Fc的另一侧进一步融合的IL-15Rα(寿司)的N端融合的VH，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。“中心-scIL-15/Rα”形式图57K)包含与IL-15Rα(寿司)的N端融合的VH和与异源二聚体Fc的另一侧融合的VH，所述IL-15Rα(寿司)与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。
图58描绘基于作为嵌合mAb(XENP24542)并且作为人类化mAb(XENP24542)的莫纳珠单抗(monalizumab)(如2014年12月2日发布的美国专利第8,901,283号中所公开)的说明性抗NKG2A mAb的序列。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图59描绘基于MS(公开于2011年2月1日发布的美国专利第7,879,985号中)的说明性抗NKG2D mAb的序列。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图60A-60B描绘XENP24531、XENP24532和XENP27146，scIL-15/Rα×Fab形式的说明性的靶向NKG2A的IL-15/Rα-Fc融合物的序列。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图61描绘XENP24533、XENP24534和XENP27145，scIL-15/Rα×Fab形式的说明性的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合物的序列。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图62A-62C描绘在用靶向NKG2A的效能降低的IL-15/Rα-Fc融合物(和对照scIL-15/Rα-Fc)处理之后(图62A)CD4+T细胞、(图62B)CD8+T细胞和(图62C)NK细胞上的Ki67表达的百分比。
图63A-63C描绘在用指定测试品处理的人类PBMC中，(图63A)CD8+CD45RA-T细胞、(图63B)CD4+CD45RA-T细胞和(图63C)表达Ki-67(一种与细胞增殖严格相关的蛋白质)的CD16+NK细胞的百分比。
图64A-64D描绘在用指定测试品处理的人类PBMC中(图64A)CD8+CD45RA-CD25-T细胞、(图64B)CD4+CD45RA-CD25-T细胞、(图64C)Treg(CD25+FoxP3+)和(图64D)CD56+NK细胞上的STAT5磷酸化。
图65A-65B描绘基于形式化为嵌合mAb(XENP15076)、人类化mAb(15251)、人类化Fab(XENP23647)和人类化单臂mAb(XENP24317)的人类化mAb(如先前描述于2010年2月2日发布的美国专利第7,657,380号中)的说明性CD8结合分子的序列。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图66A-66B描绘scIL-15/Rα×Fab形式的说明性的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表X中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图67A-67C描绘在用靶向CD9的IL-15/Rα-Fc融合物(对照组抗CD8 mAb和scIL-15/Rα-Fc)处理之后(图67A)CD8+T细胞、(图67B)CD4+T细胞和(图67C)NK细胞上的Ki67表达的百分比。
图68A-68C描绘在用靶向CD8的效能降低的IL-15/Rα-Fc融合物处理之后(图68A)CD8+T细胞、(图68B)CD4+T细胞和(图68C)NK细胞上的Ki67表达的百分比。
图69A-69B描绘在用靶向CD8的IL-15(N65D)/Rα-Fc融合物以及对照组处理之后来自(图69A)供体21和(图69B)供体23的富含雷帕霉素(rapamycin)的CD4+T细胞上的Ki67表达的百分比。
图70描绘在用靶向CD8的IL-15(N65D)/Rα-Fc融合物以及对照组处理之后来自(图70A)供体21和图70A)供体23的富含的Treg的CD4+细胞计数。
图71A-71B描绘在用靶向CD8的IL-15(N65D)/Rα-Fc融合物以及对照组处理之后来自(图71A)供体21和(图71B)供体23的富含雷帕霉素的CD4+T细胞上的CD25 MFI。
图72A-72C描绘在Treg存在下用靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理PBMC之后增殖(图72A)CD8应答T细胞、(图72B)CD4应答T细胞和(图72C)NK细胞的百分比。
图73描绘在不同量的Treg存在下用靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理PBMC之后的Treg计数。
图74A-74C描绘在Treg(1:2的Treg:PBMC比例)存在下用靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物和对照组处理PBMC之后增殖(图74A)CD8记忆T细胞和(图74B)CD4应答T细胞和(图74C)Treg计数的百分比。
图75描绘在不存在PBMC下用靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物和对照组处理之后的Treg计数。
图76A-76D描绘在用靶向CD8的效能降低的IL-15/Rα-Fc融合物和IL-15/Rα-Fc融合物变体处理之后在第4天移植huPBMC的小鼠的全血中的(图76A)CD4+T细胞事件、(图76B)CD8+T细胞事件、(图76C)CD8+T细胞与CD4+T细胞事件之间的相关性和(图76D)CD8+T细胞/CD4+T细胞比例。
图77A-77D描绘在用靶向CD8的效能降低的IL-15/Rα-Fc融合物和IL-15/Rα-Fc融合物变体处理之后在第7天移植huPBMCd小鼠的全血中的(图77A)CD4+T细胞事件、(图77B)CD8+T细胞事件、(图77C)CD8+T细胞与CD4+T细胞事件之间的相关性和(图77D)CD8+T细胞/CD4+T细胞比例。
图78A-78D描绘在用靶向CD8的效能降低的IL-15/Rα-Fc融合物和IL-15/Rα-Fc融合物变体处理之后在第8天移植huPBMC的小鼠的脾脏中的(图78A)CD4+T细胞事件、(图78B)CD8+T细胞事件、(图78C)CD8+T细胞与CD4+T细胞事件之间的相关性和(图78D)CD8+T细胞/CD4+T细胞比例。
图79A-79B描绘呈替代形式(如图57所描绘)的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物的说明性序列。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图80A-80F描绘在用替代形式的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理之后CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞上的Ki67表达的百分比。
图81描绘噬菌体衍生的抗CD8抗体序列。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图82描绘重新形式化为单臂Fab-Fc抗体的例示性噬菌体命中与CD4+和CD8+T细胞的结合。
图83A-83C示出CD8+T细胞上的CD8和TCR与靶细胞上的pMHCI的结合。
图84描绘在相对于对照与抗CD8抗体一起预培育(不与抗CD8抗体一起预培育)之后，通过对pp65(NLVPMVATV)肽具有特异性的HLA2:01限制的MHC四聚体结合到对HLA2:01限制的pp65(NLVPMVATV)肽具有特异性的T细胞的部分。
图85描绘在与负载有HLA-A2*0201受限CMV pp65(NLVPMVATV)肽或NY-ESO-1肽的T2细胞一起培育之后对HLA2:01受限pp65(NLVPMVATV)肽(与各种抗CD8抗体一起预培育)具有特异性的T细胞的IFNγ释放。
图86描绘IFNγ释放与T细胞的四聚体结合之间的相关性。
图87描绘XENP24736，基于噬菌体衍生的1C11B3的具有抗CD8 Fab臂的说明性的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物的序列。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图88描绘在用指定测试品处理的人类PBMC中(图88A)CD8+CD45RA-T细胞和(图88B)表达Ki67的CD4+CD45RA-T细胞的百分比。
图89描绘如所指示的鼠类或人类化的OKT8可变区。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图90描绘人类化抗OKT8 mAb XENP15075的序列。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表1中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图91描绘如图89中所描绘，基于人类化OKT8可变区的具有Fab臂的说明性单臂抗CD8 mAb。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图92A-92C描绘如图89中所描绘，基于鼠类或人类化OKT8可变区的具有抗CD8 Fab臂的说明性的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图93A-93B描绘在用具有人类化OKT8结合结构域的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理的人类PBMC中(图93A)CD8+CD45RA-T细胞和(图93B)表达Ki67的CD4+CD45RA-T细胞的百分比。
图94A-94C描绘第7天在移植人类PBMC的NSG小鼠的血液中(图94A)CD8+CD45RA-T细胞计数、(图94B)CD4+CD45RA-T细胞计数和(图94C)CD8+/CD4+T细胞比例。
图95A-95B描绘如图89中所描绘的基于OKT8_H2(人类化可变重链V2)的变体可变重链区和如图89中所描绘的基于OKT8_H1(人类化可变轻链V1)的变体可变轻链区。本文中所描绘的每个可变重链区可以与这个图中所描绘的可变轻链区中的任一个以及89中所描绘的可变轻链区组合。本文中所描绘的每个可变轻链区可以与这个图中所描绘的可变重链区中的任一个以及图89中所描绘的可变重链区组合。CDR加下划线。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图96描绘对于人类和猕猴CD8的说明性猕猴CD8亲和力工程化的OKT8_H2L1的解离常数(KD)、解离速率(kd)和缔合速率(ka)。本文描绘的分子是使用具有空-Fc和Fab的单臂mAb，其中Fab臂包含如图89和95中所描绘的可变区。举例来说，XENP26009的Fab臂具有OKT8_H2.152可变重链和OKT8_L1.103可变轻链。
图97描绘具有基于如图95中所描绘的猕猴亲和力工程化的(HuCy)OKT8可变区的抗CD8 Fab臂的说明性的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图98A-98B描绘在用具有猕猴亲和力工程化的人类化OKT8结合结构域的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理的人类PBMC中(图98A)CD8+CD45RA-T细胞和(图98B)表达Ki67的CD4+CD45RA-T细胞的百分比。
图99A-99B描绘在用具有猕猴亲和力工程化的人类化OKT8结合结构域的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理的人类PBMC中(图99A)CD8+CD45RA-T细胞和(图99B)CD4+CD45RA-T细胞上的STAT5磷酸化。
图100A-100D描绘在用具有cyno亲和力工程化的人类化OKT8结合结构域的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物给药后第7天移植人类PBMC的NSG小鼠的血液中的(图100A)CD45+细胞计数、(图100B)CD4+T细胞计数、(图100C)CD8+T细胞计数和(图100D)CD8+/CD4+T细胞比例。
图101A-101B描绘在用具有猕猴亲和力工程化的人类化OKT8结合结构域的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理的食蟹猕猴PBMC中(图101A)CD8+CD45RA-T细胞和(图101B)表达Ki67的CD4+CD45RA-T细胞的百分比。
图102描绘具有Xtend Fc的说明性的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物。CDR加粗。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图6和7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子、可变区与恒定/Fc区之间的边界。
图103A-103F描绘通过各种浓度的重组IL-15、WT IL-15/Rα-Fc(XENP20818)和说明性的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物(XENP26585)随着时间的推移，(图103A)CD4+CD45RA-T细胞、(图103B)CD4+CD45RA+T细胞、(图103C)CD8+CD45RA-T细胞、(图103D)CD8+CD45RA+T细胞、(图103E)Treg和(图103F)CD56-NK细胞上的STAT5磷酸化。
图104A-104B描绘在用XENP24050或XENP26223给药之后食蟹猕猴外周血液中的(图104A)CD8+T细胞和(图104B)CD4+T细胞计数随时间的倍数变化。
图105A-105B描绘在用XENP24050或XENP26223给药之后食蟹猕猴外周血液中的(图105A)CD8+T细胞和(图105B)表达Ki67的CD4+T细胞的百分比。
图106描绘在用XENP24050或XENP26223给药之后食蟹猕猴淋巴结中的表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞的百分比。
图107A-107B描绘在用具有Xtend Fc的效能降低的单臂IL-15/Rα-Fc融合物(XENP24294)和具有Xtend Fc的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物(XENP26585)给药之后(图107A)CD8+T细胞计数、(图107B)CD4+T细胞计数和C)CD8+/CD4+T细胞比例。
图108A-108B描绘在(图108A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)和(图108B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)中Ki67阳性的CD8+T细胞的百分比。
图109A-109B描绘在(图109A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)和(图109B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)中IFNγ阳性的CD8+T细胞的百分比。
图110A-110-B描绘在(图110A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)和(图110B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)中Ki67和IFNγ阳性的CD8+T细胞的百分比。
图111A-111B描绘在(图111A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)和(图111B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)中Ki67阳性的CD4+T细胞的百分比。
图112A-112B描绘在(图112A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)和(图112B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)中IFNγ阳性的CD4+T细胞的百分比。
图113A-113B描绘在(图113A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)和(图113B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试品一起培育的纯化的T细胞)中Ki67和IFNγ阳性的CD4+T细胞的百分比。
图114A-114B描绘在与纯化的T细胞和指定测试品一起培育之后其余的靶细胞[图114A：亲本MCF-7肿瘤细胞；图114B：表达pp65的MCF-7肿瘤细胞]。
图115A-115B描绘在移植有pp65反应性huPBMC和用指定测试品处理之后(图115A)平均肿瘤体积和(图115B)移植有表达pp65的MCF-7细胞的NSG小鼠中的肿瘤体积变化。
图116A-116E描绘在移植有pp65反应性huPBMC和用指定测试品处理之后在移植有表达pp65的MCF-7细胞的NSG小鼠的全血中(图116A)CD45+细胞、(图116B)CD4+T细胞、(图116C)CD8+T细胞和(图116D)NK细胞计数以及(图116E)CD8+/CD4+T细胞比例。
具体实施方式
I.概述
本发明的双功能异源二聚体Fc融合蛋白适用于治疗多种类型的癌症。如所属领域技术人员将理解，重组产生的IL-15/IL-15Rα异源二聚体可以有效活化T细胞。然而，其短的半衰期阻碍了有利的给药。本发明的靶向IL-15/IL-15Rα×抗原结合结构域异源二聚体Fc融合蛋白可以引起T细胞活化，这继而可以导致对癌细胞的更大的免疫应答和因此更有效的治疗。因此，可以预期这类靶向异源二聚体Fc融合蛋白可用于治疗多种肿瘤类型。
如下所述，存在可以测量T细胞活化的多种方式。双特异性检查点抗体对NK和T细胞的功能作用可以通过测量以下参数的变化在体外(并且在一些情况下在体内，如下文更充分地描述)评定：增殖、细胞因子释放和细胞表面标志物。关于NK细胞，细胞增殖、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力，如通过CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的增加，或通过直接测量靶细胞杀伤所测量)、细胞因子产生(例如，IFN-γ和TNF)和细胞表面受体表达(例如，CD25)的增加指示免疫调节，例如癌细胞杀伤增强。关于T细胞，增殖增加、细胞表面活化标志物(例如，CD25、CD69、CD137和PD1)的表达增加、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)增加以及细胞因子产生(例如，IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-17A)增加指示免疫调节，例如癌细胞杀伤增强。因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδT细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)IL-2分泌的增加；(viii)干扰素-γ产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi)调节性T细胞和细胞中的至少一种的细胞数量和/或活性的减少；(xii)肿瘤免疫浸润的增加。
在一些实施例中，本发明提供双功能IL-15/IL-15Rα×抗原结合结构域异源二聚体Fc融合蛋白在有需要的个体中进行以下中的一个或多个的用途：(a)上调促炎性细胞因子；(b)增加T细胞增殖、扩增或肿瘤浸润；(c)增加干扰素-γ、TNF-α和T细胞的其它细胞因子产生；(d)增加IL-2分泌；(e)刺激抗体反应；(f)抑制癌细胞生长；(g)促进抗原特异性T细胞免疫；(h)促进CD4+和/或CD8+T细胞活化；(i)缓解T细胞抑制；(j)促进NK细胞活性；(k)促进癌细胞的凋亡或裂解；和/或(l)对癌细胞的细胞毒性或细胞生长抑制作用。
双功能异源二聚体Fc融合蛋白构筑体基于抗体的重链的两种Fc结构域(例如，组装成“二聚体”的两种“单体”)的自组装性质。如下文更充分地论述，异源二聚体Fc融合蛋白通过改变每种单体的氨基酸序列来产生。因此，本发明一般涉及异源二聚体Fc融合蛋白的形成，所述异源二聚体Fc融合蛋白可以几种方式共同接合抗原，这依赖于每条链上不同的恒定区中的氨基酸变体，以促进异源二聚体形成和/或允许异源二聚体比同源二聚体易于纯化。
形成双功能异源二聚体Fc融合蛋白的主要障碍是难以从同源二聚体融合蛋白中纯化异源二聚体融合蛋白和/或相对于形成同源二聚体难以偏向于形成异源二聚体。为了解决这个问题，存在可以用于产生本发明的异源二聚体的多种机制。另外，如所属领域技术人员将理解，可以组合这些机制以确保高异源二聚化。因此，导致产生异源二聚体抗体的氨基酸变体被称为“异源二聚化变体”。如下文所论述，异源二聚化变体可以包括空间变体(例如下文所述的“杵和臼”或“偏斜”变体以及下文所述的“电荷对”变体)以及“pI变体”，其允许从异源二聚体中纯化同源二聚体。
还可以任选地使用一种机制，在所属领域通常称为“杵和臼”("KIH")或在本文中有时称为“偏斜”变体，指的是形成空间和/或静电影响以利于异源二聚体形成和不利于同源二聚体形成的氨基酸工程，如在Ridgway等人,《蛋白质工程》9(7):617(1996)；Atwell等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》1997270:26；美国专利第8,216,805号、美国公开案第2012/0149876号中所述，所有这些都以全文引用的方式并入本文中。图式标识了许多“单体A-单体B”，其包括“杵和臼”氨基酸取代。另外，如Merchant等人,《自然·生物技术(NatureBiotech)》16:677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以使形成偏向异源二聚化。在在本发明中使用的是与T366W配对的T366S/L368A/Y407V以及具有桥接二硫键的这个变体、与T366W/S354C配对的T366S/L368A/Y407V/Y349C，尤其是与包括如下文所概述的pI变体的其它异源二聚化变体组合。
一种用于产生异源二聚体抗体的另一种机制有时称为“静电转向”或“电荷对”，如Gunasekaran等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》285(25):19637(2010)中所述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。这有时在本文中称为“电荷对”。在这个实施例中，静电用于使形成偏向异源二聚化。如所属领域技术人员将了解，这些还可以影响pI，并且因此影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些是为了强制发生异源二聚化而产生并且不是作为纯化工具使用，因此其被分类为“空间变体”。这些包括但不限于与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如这些是“单体对应组”)和与C220R/E224R/P228R/K409R和图中所示的其它者配对的C220E/P228E/368E。
在本发明中，在一些实施例中，pI变体用于改变一种或两种单体的pI，并且因此允许对A-A、A-B和B-B二聚体蛋白进行等电分离。
在本发明中，存在可以易于纯化异源二聚体蛋白的几种基础机制；一种依赖于pI变体的使用，以便每种单体具有不同pI，因此允许对A-A、A-B和B-B二聚体蛋白进行等电纯化。可替代地，一些骨架形式(例如“三重F”形式)也允许基于尺寸实现分离。如下面进一步概述，还可以“偏斜”形成异源二聚体而非同源二聚体。因此，空间异源二聚化变体与pI或电荷对变体的组合在本发明中特别有用。
在使用pI作为分离机制以允许对异源二聚体蛋白纯化的本发明中，可以将氨基酸变体引入一个或两个单体多肽中；即，一种单体(为了简单起见，本文中称为“单体A”)的pI可以加以工程化以与单体B分离，或单体A和B两者都可以改变，其中单体A的pI增加，而单体B的pI降低。如下文更充分地概述，任一种或两种单体的pI变化可以如下进行：除去或添加带电荷的残基(例如用带正或负电荷的氨基酸残基置换中性氨基酸，例如甘氨酸置换成谷氨酸)、将带电荷的残基从正或负电荷变为相反电荷(例如天冬氨酸变为赖氨酸)或将带电荷的残基变为中性残基(例如电荷的失去；赖氨酸变为丝氨酸)。许多这些变体展示于图中。另外，用于形成本文中的异源二聚体抗体的合适pI变体是同型的变体，例如从不同IgG同型导入pI变体以使得pI变化而不引入显著免疫原性；参见来自美国公开案第20140288275号的图29，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
因此，本发明的这个实施例使得至少一种单体的pI产生了足够的变化，以使得可以将异源二聚体与同源二聚体分离。如所属领域技术人员将了解，并且如下文进一步所论述，这可通过使用“野生型”重链恒定区和已经工程化成以增加或降低其pI的变体区进行(wt A:B+或wt A:B-)，或通过增加一个区并且减少另一区进行(A+:B-或A-:B+)。
因此，通常，本发明的一些实施例的组分是抗体恒定区中的氨基酸变体，其涉及改变二聚体蛋白的至少一种(如果不是两种)单体的等电点(pI)，以通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入一种或两种单体中形成“pI异源二聚体”(当蛋白质是抗体时，这些称作“pI抗体”)。如本文中所示，如果两种单体的pI相差小到0.1个pH单位(0.2、0.3、0.4和0.5或更大pH单位都能适用于本发明中)，那么可以实现异源二聚体与两种同源二聚体的分离。
如所属领域技术人员将理解，为了获得良好分离而包括在每种或两种单体上的pI变体的数量将部分取决于相关scFv和Fab的起始pI。即，为了确定对哪种单体进行工程化或以哪个“方向”(例如更正或更负)，计算两种靶抗原的Fv序列并且据此作出决定。如所属领域中已知，不同的Fv将具有用于本发明中的不同起始pI。一般来说，如本文中所概述，pI经过工程化而使得每种单体的总pI差异达到至少约0.1log，如本文中所概述优选0.2到0.5。
此外，如所属领域技术人员将了解并且如本文中所概述，在一些情况下(视形式而定)，可以基于尺寸(例如分子重量)将异源二聚体与同源二聚体分离。如图57A-57K中所示，一些形式产生尺寸不同的异源二聚体。
另外，如图57A-57K中所描绘，将认识到一些抗原有可能二价结合(例如两个抗原结合位点结合到单个抗原上)。如将了解，Fab和scFv的任何组合可用于实现所期望的结果和组合。
在pI变体用于实现纯化的异源二聚体而非同源二聚体的情况下，通过使用重链的恒定区，提供设计和纯化多特异性蛋白质，包括抗体的更模块化方法。因此，在一些实施例中，可变区中不包括异源二聚化变体(包括偏斜和纯化异源二聚化变体)，因此必须对每种个别抗体进行工程化。另外，在一些实施例中，通过导入来自不同IgG同型的pI变体以便在不引入显著免疫原性的情况下改变pI来显著降低pI变体导致免疫原性的可能性。因此，待解决的另一个问题是阐明具有高人类序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置的非人类残基。
这种pI工程化可以得到的额外益处也是血清半衰期延长和FcRn结合增加。即，如美国专利第8,637,641号(以全文引用的方式并入本文中)中所述，降低抗体恒定结构域(包括在抗体和Fc融合物中发现的那些)的pI可导致体内更长的血清滞留。这些用于增加血清半衰期的pI变体也促进用于纯化的pI变化。
另外，应该注意异源二聚化变体的pI变体具有用于双特异性抗体的分析和质量控制方法中的额外益处，因为当存在同源二聚体时，消除、最小化和区分的能力是显著的。类似地，可靠地测试异源二聚体蛋白产生再现性的能力是重要的。
如所属领域技术人员将了解并且下文更充分地论述，本发明的异源二聚体融合蛋白可以采用多种多样的构形，如图57A-57K中大体所描绘。一些图描绘“单端”构形，其中分子的一个“臂”上存在一种类型的特异性并且另一个“臂”存在不同特异性。其它图描绘“双端”构形，其中分子的“顶部”存在至少一种类型的特异性并且分子的“底部”存在一或多种不同特异性。本发明涉及接合抗原并且含有IL-15/IL-15Rα复合物的新颖免疫球蛋白组合物。
此外，如本文中所概述，可以将额外氨基酸变体引入本发明的双功能异源二聚体Fc融合蛋白中以添加额外功能。举例来说，可以添加Fc区内的氨基酸变化(到一种单体或两种)以促进增加的ADCC或CDC(例如与Fcγ受体的变化结合)以及增加与FcRn的结合和/或增加所得分子的血清半衰期。如本文中进一步描述并且如所属领域技术人员将了解，本文概述的任何和所有变体可任选地和独立地与其它变体组合。
类似地，另一类功能变体是“Fcγ消融变体”或“Fc基因敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施例中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或全部Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合以避免其它作用机制。即，举例来说，一般期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著减少ADCC活性。合适的消融变体展示于图29中。
II.命名法
本发明的双特异性抗体以几种不同形式列出。每个多肽被给予唯一的“XENP”编号，但是如在所属领域中将了解的，较长序列可能含有较短编号。一些分子具有三个多肽，因此使用XENP编号与组分作为名称。因此，呈开瓶器形式的分子XENP24116包含三个序列，通常称作“XENP24116_人类IL15Rα(寿司结构域)_(GGGGS)5_人类IL15(N65D；单链)-Fc”、“XENP24116_51.1[CD8]_H1L1 Fab-Fc重链”和“XENP24116_51.1[CD8]_H1L1Fab-Fc轻链”或等效物，但所述领域技术人员将能够通过序列比对容易地鉴别这些。这些XENP编号出现在序列表以及标识符中，并且用于图中。另外，一个包含三种组分的分子产生多个序列标识符。举例来说，Fab单体的序列表具有全长序列、可变重链序列以及可变重链序列的三个CDR；轻链具有全长序列、可变轻链序列以及可变轻链序列的三个CDR；并且scFv-Fc结构域具有全长序列、scFv序列、可变轻链序列、3个轻链CDR、scFv连接子、可变重链序列以及3个重链CDR；应该注意具有scFv结构域的本文中所有分子使用单个带电荷的scFv连接子(+H)，尽管可使用其它者。另外，特定可变结构域的术语命名使用“Hx.xx_Ly.yy”类形式，其中编号作为特定可变链序列的唯一标识符。因此，XENP26229的Fab侧的可变结构域是“OKT8_H2.166_L1.103”，其表示重链可变结构域H2.166与轻链结构域L1.103组合。在这些序列按scFv形式使用的情况下，名称“OKT8_H2.166_L1.103”表示重链可变结构域H2.166与轻链结构域L1.103组合，并且由N端到C端呈vh-连接子-vl定向。具有与重链和轻链可变结构域一致但呈相反顺序的序列的这种分子将命名为“OKT8_L1.103_H2.166”。类似地，不同构筑体可能“混合和匹配”重链和轻链，如从序列表和图中将显而易见的。
III.定义
为了能更全面地了解本申请，下文阐述几种定义。这类定义意味着涵盖语法等效物。
“消融”在本文中意指结合和/或活性的减少或去除。因此，举例来说，“消融FcγR结合”意指初始结合比不含有特定变体的Fc区小50％的Fc区氨基酸变体，其中优选小于70-80-90-95-98％的结合损失，并且一般来说，结合低于在Biacore分析中可检测到的结合水平。在FcγR结合的消融中特别有用的是在图29所示的那些。然而，除非另外指出，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合。
如本文所用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞的裂解。ADCC与FcγRIIIa的结合相关；与FcγRIIIa的结合增加导致ADCC活性增加。如本文所论述，本发明的许多实施例完全消融ADCC活性。
本文所用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的吞噬作用。
本文的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或与蛋白质化学连接的部分的改变。举例来说，修饰可以是连接于蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。本文的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外指出，否则氨基酸修饰始终是由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施例中，取代是针对并非天然存在于特定位置、并非天然存在于生物体内或任何生物体内的氨基酸。举例来说，取代E272Y或272Y是指在位置272处的谷氨酸被酪氨酸替换的变体多肽，在这种情况下是Fc变体。为清楚起见，已经工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍然编码精氨酸)以提高宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，不管形成编码相同蛋白质的新型基因，但如果蛋白质在其起始的特定位置处具有相同的氨基酸，那么其不是氨基酸取代。取代可包括天然存在的氨基酸，并且在一些情况下，可包括合成氨基酸。实例包括美国专利第6,586,207号；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO05/74524A2；J.W.Chin等人,(2002),《美国化学学会杂志(Journal of the AmericanChemical Society)》124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),《化学生物化学(ChemBioChem)》11:1135-1137；J.W.Chin等人,(2002),PICAS美国(United States ofAmerica)99:11020-11024；和L.Wang和P.G.Schultz,(2002),《化学(Chem.)》1-10，所有所述文献以引用的方式整体并入本文中。
如本文所用的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列的特定位置处添加氨基酸残基或序列。举例来说，-233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列的特定位置处去除氨基酸残基或序列。举例来说，E233-、E233#、E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233开始的序列GluAspAla的缺失。
如本文所用的“变体蛋白”或“蛋白质变体”或“变体”是指通过至少一个修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码其的氨基酸序列或编码其的DNA序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白质相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，约1个到约70个氨基酸修饰，并且优选约1个到约5个氨基酸修饰。修饰可以是添加、缺失或取代。
如下所述，在一些实施例中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽，是人类野生型序列，例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定结构域或Fc区，尽管具有变体的人类序列也可以充当“亲本多肽”，例如可包括美国公开案第2006/0134105号的IgG1/2杂合物。本文的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白序列具有至少约80％的一致性，并且最优选至少约90％的一致性，更优选至少约95-98-99％的一致性。
因此，如本文所用的“抗体变体”或“变体抗体”意指通过至少一个氨基酸修饰与亲本抗体不同的抗体，如本文所用的“IgG变体”或“变体IgG”意指通过至少一个氨基酸修饰与亲本IgG(同样，在许多情况下，来自人类IgG序列)不同的抗体，并且如本文所用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指通过至少一个氨基酸修饰与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。如本文所用的“Fc变体”或“变体Fc”意指包含与人类IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域相比，Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。
本发明的Fc变体是根据构成其的氨基酸修饰来定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在位置434处具有丝氨酸的取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样地，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的身份标识可以是未指定的，在这种情况下，前述变体称为428L/434S。应该注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如N434S/M428L与M428L/N434S是相同的Fc变体，以此类推。对于本发明中讨论的与抗体有关的所有位置，除非另有说明，否则氨基酸位置编号是根据EU索引。EU索引或如在Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号。Kabat等人收集了重链和轻链可变区的许多一级序列。基于序列的保守度，其将单个一级序列分类为CDR和框架并且列出其列表(参见《免疫学相关序列(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》,第5版,NIH公开案第91-3242号,E.A.Kabat等人，其以引用的方式整体并入本文中)。还参见Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》63:78-85，其以引用的方式整体并入本文中。修饰可以是添加、缺失或取代。
如本文所用，“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。此外，构成本发明的抗体的多肽可包括一个或多个侧链或末端的合成衍生作用、糖基化、PEG化、环形排列、环化、与其它分子的连接子、蛋白质或蛋白结构域的融合以及肽标签或标记的添加。当生物功能分子包含两种或更多种蛋白质时，每种蛋白质可称为“单体”或称为“子单元”或称为“结构域”；并且生物功能分子可称为“复合物”。
如本文所用的“残基”意指蛋白质中的位置和其相关的氨基酸身份标识。举例来说，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人类抗体IgG1的位置297处的残基。
如本文所用的“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL以及CL免疫球蛋白结构域的多肽，所述结构域通常位于两个不同的多肽链上(例如VH-CH1位于一个链上而VL-CL位于另一个链上)。Fab可指隔离情况下的这种区或在本发明的双特异性抗体的上下文中的这种区。在Fab的上下文中，Fab除CH1结构域和CL结构域以外还包含Fv区。
如本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含ABD的VL结构域和VH结构域的多肽。Fv区可被设计成Fab(如上文所论述，通常是还包括如上文所概述的恒定区的两个不同的多肽)和scFv形式，其中vl域和vh结构域组合(通常与如本文所论述的连接子)以形成scFv。
本文中的“单链Fv”或“scFv”是指通常重链可变结构域使用如本文所讨论的scFv连接子共价连接于轻链可变结构域，以形成scFv或scFv结构域。scFv结构域由N端到C端可呈任一定向(vh-连接子-vl或vl-连接子-vh)。在序列表和图中所描绘的序列中，vh和vl结构域的顺序在名称中指示，例如，H.X_L.Y意指N端到C端是vh-连接子-vl，并且L.Y_H.X是vl-连接子-vh。
如本文所用的“IgG亚类修饰”或“同型修饰”意指将一种IgG同型的一个氨基酸转化为不同的比对IgG同型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。举例来说，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸并且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
如本文所用的“非天然存在的修饰”意指不是同型的氨基酸修饰。举例来说，因为没有IgG在位置434处包含丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂合体)中的取代434S被认为是非天然存在的修饰。
如本文所用的“氨基酸”和“氨基酸身份标识”意指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文所用的“效应功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文所用的“IgG Fc配体”或“Fc配体”意指与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子，优选多肽。Fc配体包括但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人,2002,《免疫评论(Immunological Reviews)》190:123-136，其以引用的方式整体并入本文中)。Fc配体可包括结合Fc的未发现分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。
如本文所用的“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcγR(FcgammaR)”意指结合IgG抗体Fc区并且由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,《免疫学快报(Immunol Lett)》82:57-65，其以引用的方式整体并入本文中)，以及任何未发现的人类FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
如本文所用的“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区，并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。如所属领域所知，功能性FcRn蛋白包含两个多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2微球蛋白(β2微球蛋白)，并且重链由FcRn基因编码。除非本文另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2微球蛋白的复合物。多种Fc变体可用于增加与FcRn的结合，并且在一些情况下，增加血清半衰期。“FcRn变体”增加与FcRn的结合，并且合适的FcRn变体在下文中展示。通常，除非另外指出，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合(并且如下所只指出，可包括氨基酸变体以增加与FcRn的结合)。
如本文所用的“亲本多肽”意指随后经过修饰来产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程化版本。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码其的氨基酸序列。因此，如本文所用的“亲本抗原结合结构域”是指未修饰的抗原结合结构域多肽，其被修饰以产生变体，并且如本文所用的“亲本免疫球蛋白”是指未修饰的免疫球蛋白多肽，其被修饰以产生变体，并且如本文所用的“亲本抗体”意指未修饰的抗体，其被修饰以产生变体抗体。应该注意，“亲本抗体”包括如下概述的已知的商业重组产生的抗体。
如本文所用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包含IgG分子的CH2-CH3结构域，并且在一些情况下包括铰链的多肽。在人类IgG1的EU编号中，CH2-CH3结构域包含氨基酸231到447，并且铰链是216到230。因此“Fc结构域”的定义包括氨基酸231-447(CH2-CH3)或216-447(铰链-CH2-CH3)或其片段。在此上下文中“Fc片段”可能含有较少来自N端和C端中任一个或两个的氨基酸但仍保留与另一Fc结构域或Fc片段形成二聚体的能力，如可使用通常基于尺寸的标准方法(例如，非变性色谱、尺寸排阻色谱等)检测。人类IgG Fc结构域特别适用于本发明中，并且可以是来自人类IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域。如本文所用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包含抗体的恒定区，在一些情况下排除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1)或其一部分的全部或一部分，并且在一些情况下进一步排除铰链的全部或一部分的多肽。因此，Fc可指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH2和CH3)，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及任选地这些结构域的柔性铰链N端的全部或一部分。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)，以及任选地在CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的全部或部分铰链区。尽管Fc区的边界可以变化，但是人类IgG重链Fc区通常被定义为包括其羧基端的残基E216、C226或A231，其中编号根据如Kabat中的EU索引。在一些实施例中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一种或多种FcγR或FcRn的结合。
如所属领域技术人员将理解，重链恒定区结构域的确切编号和放置在不同编号系统之间可以是不同的。根据EU和Kabat编号的重链恒定区的有用比较如下，参见Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊》63:78-85和Kabat等人,1991,《免疫学相关蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版,美国公共卫生服务部(United States Public Health Service),美国国家卫生研究院(National Institutesof Health),贝塞斯达(Bethesda)，其以引用的方式整体并入本文中。
表1
<u>EU编号</u> <u>Kabat编号</u>
CH1 118-215 114-223
铰链 216-230 226-243
CH2 231-340 244-360
CH3 341-447 361-478
与亲本Fc结构域相比，“变异Fc结构域”含有氨基酸修饰。因此，与人类IgG1 Fc结构域相比，“变体人类IgG1 Fc结构域”是含有氨基酸修饰(一般是氨基酸取代，但在消融变体的情况下包括氨基酸缺失)的结构域。一般来说，变体Fc结构域具有与对应的亲本人类IgG Fc结构域的至少约80、85、90、95、97、98或99％一致性(使用下文论述的一致性算法，其中一个实施例利用如所属领域中已知的BLAST算法，使用默认参数)。可替代地，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。此外，如本文所论述，本文中的变体Fc结构域仍保留与另一Fc结构域形成二聚体的能力，如使用如本文所述的已知技术(例如非变性凝胶电泳)所测量。
本文中的“重链恒定区”意指抗体(或其片段)的CH1-铰链-CH2-CH3部分，排除重链可变结构域；在人类IgG1的EU编号中，例如氨基酸118-447。本文中的“重链恒定区片段”意指含有较少来自N端和C端中任一个或两个的氨基酸但仍保留与另一重链恒定区形成二聚体的能力的重链恒定区。
如本文所用的“融合蛋白”意指至少两种蛋白质的共价接合。融合蛋白可包含人工序列，例如如本文所述的结构域连接子。本文中的“Fc融合蛋白”或“免疫粘附素”意指包含通常与一种或多种不同的蛋白质(任选通过如本文所述的结构域连接子)，例如与如本文所述的IL-15和/或IL-15R连接的Fc区的蛋白质。在一些例子中，两种Fc融合蛋白可以形成同源二聚体Fc融合蛋白或异源二聚体Fc融合蛋白，后者是优选的。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白的一种单体包含单独的Fc结构域(例如，空Fc结构域)，并且另一种单体是Fc融合物，其包含变体Fc结构域和蛋白结构域，例如受体、配体或其它结合搭配物。
如本文所用的“位置”意指蛋白序列中的位置。位置可以顺序编号，或根据确定的形式(例如用于抗体编号的EU索引)编号。
在本发明的异源二聚体蛋白中的单体的上下文中，“链型”在本文中意指类似于DNA中的“匹配”的两条链，将异源二聚化变体并入每种单体中以保持、形成和/或增强“匹配”以形成异源二聚体的能力。举例来说，如果将一些pI变体工程化为单体A(例如使pI更高)，那么还可以利用的“电荷对”的空间变体不会干扰pI变体，例如将使pI更高的电荷变体放在相同的“链”或“单体”上以保持两种功能。类似地，对于组中成对出现的“偏斜”变体，如下面更全面概述，所属领域技术人员在决定将进入合并一组对的哪一条链或单体时将考虑pI，使得也使用偏斜的pI使pI分离最大化。
如本文所用的“靶抗原”意指由给定抗原结合结构域或抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、脂质或其它化学化合物。下面描述多种合适的靶抗原。
如本文使用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
在产生根据本发明的双特异性抗体的上下文中，本文中的“宿主细胞”意指含有编码双特异性抗体的组分的外源核酸并且能够在合适的条件下表达双特异性抗体的细胞。下面讨论合适的宿主细胞。
如本文所用的“可变区”意指免疫球蛋白的区域，其包含一个或多个基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因中的任一种编码的Ig结构域。
“野生型或WT”在本文中意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变体。WT蛋白质具有未经过有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
相对于蛋白序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列和(如果需要)引入缺口以实现最大序列一致性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列一致性的一部分之后，候选序列中氨基酸残基与特定(亲本)序列中的氨基酸残基一致的百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对可以所属领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。一个特定的程序是在美国公开第20160244525号的第[0279]到[0280]段中概述的ALIGN-2程序，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
本发明提供许多与人类抗体结构域具有序列一致性的抗原结合结构域。两个类似序列(例如抗体可变域)之间的序列一致性可通过如以下文献中的算法测量：Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)“生物序列对比(Comparison Of Biosequences)”，《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482[局部同源算法]；Needleman,S.B.和Wunsch,CD.(1970)“适用于在两个蛋白质的氨基酸序列中搜索类似性的通用方法(A General Method Applicable ToThe Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins)”,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443[同源比对算法]；Pearson,W.R.和Lipman,D.J.(1988)“生物序列比较的改良工具(Improved Tools For Biological SequenceComparison)”《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))》85:2444[类似性搜索方法]；或Altschul,S.F.等人,(1990)“基础局部比对搜索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool)”,《分子生物学杂志》215:403-10，即“BLAST”算法，参见https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。当使用前述算法中的任一种时，使用默认参数(用于窗口长度、空位罚分等)。在一个实施例中，使用BLAST算法，使用默认参数测定序列一致性。
本发明的氨基酸序列(“本发明序列”)与亲本氨基酸序列之间的一致性程度计算为两个序列比对中的精确匹配数除以“本发明序列”的长度或亲本序列的长度，以最短者为准。结果以一致性百分比表示。
在一些实施例中，两个或更多个氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％或90％一致。在一些实施例中，两个或更多个氨基酸序列至少95％、97％、98％、99％或甚至100％一致。
本发明的异源二聚体Fc融合蛋白通常是分离的或重组的。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”意指多肽已经从表达其的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收。通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。“分离的异源二聚体Fc融合蛋白”意指基本上不含来自细胞培养物的其它蛋白质的蛋白质，例如宿主细胞蛋白。“重组”意指在外源宿主细胞中使用重组核酸技术产生抗体，并且所述抗体也可被分离。
“抗原结合结构域”或“ABD”在本文中意指对抗原决定簇赋予其结合特异性的抗原结合分子的部分。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广泛的意义上是指特异性结合到抗原决定簇的任何分子。抗原结合分子可以是蛋白质、碳水化合物、脂质或其它化合物。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白和其衍生物或片段，例如Fab和scFv。抗原结合分子的额外实例是受体和配体。
特异性结合的强度或亲和力可以根据相互作用的解离常数(KD)表示，其中较小的KD表示较大的亲和力，并且较大的KD表示较低的亲和力。结合特性可以通过所属领域众所周知的方法，例如生物层干涉测量法和基于表面等离振子共振的方法来确定。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原或受体/配体复合物缔合和解离的速率，其中速率取决于复合物搭配物的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可以确定缔合速率(ka)和解离速率(kd)，并且kd/ka的比例等于解离常数KD(《自然(Nature)》361:186-187(1993)和Davies等人(1990)《生物化学年鉴(Annual RevBiochem)》59:439-473)。
针对特定分子或表位的特异性结合可以例如通过抗原或表位的KD为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M、或更大的抗原结合分子来展现。通常，特异性结合抗原的抗原结合分子的KD是对照分子相对于抗原或表位大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
另外，可以例如通过抗原或表位的ka或缔合速率对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的抗原结合分子来展现对特定分子或表位的特异性结合。
“表位”在本文中意指与特定抗原结合结构域，例如抗体分子的可变区(称为互补位)相互作用的决定子。表位是例如氨基酸或糖侧链的分子的分组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个分子可具有超过一个表位。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。表位可以是构象的也可以是线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗原结合分子可以在简单的免疫分析中验证，显示一种抗原结合分子阻断另一种抗原结合分子与靶抗原结合的能力，例如“装箱”。如下所概述，本发明不仅包括本文中所列举的抗原结合分子和抗原结合结构域，还包括与所列举的抗原结合分子或抗原结合结构域结合的表位竞争结合的抗原结合分子和抗原结合结构域。
“融合”或“共价连接”在本文中意指组分(例如，IL-15蛋白和Fc结构域)通过肽键直接或经由本文概述的结构域连接子连接。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施例中，单链IL-15/IL-15Rα复合物或“scIL-15/Rα”，即IL-15和IL-15Rα寿司结构域融合以形成单肽链。在一些实施例中，IL-15的C端连接于IL-15Rα寿司结构域的N端。在一些实施例中，单体直接连接。在其它实施例中，单体通过本文概述的结构域连接子连接。
“特异性结合”或“特异性结合于”特定抗原或表位，或“对”特定抗原或表位“具有特异性”意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。举例来说，可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定特异性结合。
针对特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过抗原或表位的KD为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、或者至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M、或更大的抗体来展现，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性结合抗原的抗体的KD对于对照分子相对于抗原或表位大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
另外，可以例如通过抗原或表位的KA或Ka对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的抗体来展现对特定抗原或表位的特异性结合，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。通常使用Biacore SPR或BLI分析测量结合亲和力。
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，并且因此当然可以变化。还应了解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不希望具有限制性，原因是本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
IV.靶向IL-15/IL-15Rα×抗原结合结构域异源二聚体Fc融合蛋白
本文提供异源二聚体融合蛋白，其可以与抗原结合并且可以与共同γ链(γc；CD132)和IL-2受体β链(IL-2Rβ；CD122)复合。异源二聚体融合蛋白可含有IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白和抗原结合结构域。IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白可包括与IL-15Rα共价连接的IL-15蛋白和Fc结构域。任选地，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白是非共价连接的。抗原结合结构域特异性结合于靶抗原，例如但不限于CD8、NKG2A和NKG2D。
Fc结构域可以衍生自IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域，其中IgG1 Fc结构域在本发明中特别有用。以下描述可用于IL-15/IL-15RαFc融合单体的Fc结构域和本发明的双功能异源二聚体蛋白的抗原结合结构域。
每条链的羧基端部分限定了主要负责效应功能的恒定区。Kabat等人收集了重链和轻链可变区的许多一级序列。基于序列的保守度，其将单个一级序列分类为CDR和框架并且列出其列表(参见《免疫学相关序列》,第5版,NIH公开案第91-3242号,E.A.Kabat等人，其以引用的方式整体并入本文中)。在整个本发明说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统并且Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人,同上(1991))。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在几种免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。本发明相关的是重链结构域，包括重链恒定(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的上下文中，IgG同型各自具有三个CH区。因此，IgG的上下文中的“CH”结构域如下：“CH1”根据如Kabat中的EU索引是指位置118-215。“铰链”根据如Kabat中的EU索引是指位置216-230。“CH2”根据如Kabat中的EU索引是指位置231-340，并且“CH3”根据如Kabat中的EU索引是指位置341-447。如表1中所示，在不同的编号系统中，重链结构域的确切编号和放置可能有所不同。如本文所示和下文所述，pI变体可以在一个或多个CH区以及下文讨论的铰链区中。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意指包含抗体的第一与第二重链恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置231处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置216(IgG1中的E216)到230(IgG1中的P230)，其中编号根据如Kabat中的EU索引。在一些实施例中，例如在Fc区的上下文中，包括铰链，通常是指位置216-230。如本文中所指出，pI变体也可以在铰链区中制备。
因此，本发明提供不同的抗体结构域,例如不同Fc结构域。如本文所述和所属领域已知，本发明的异源二聚体蛋白包含不同结构域，其也可以重叠。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域和重链恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)。
因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域和任选的铰链结构域。在一些实施例中，Fc结构域还包括CH1结构域的一部分。在本文中的一些实施例中，当蛋白质片段(例如IL-15或IL-15Rα)连接于Fc结构域时，IL-15或IL-15Rα构筑体的C端连接于Fc结构域的全部或部分铰链；例如其通常连接于作为铰链起点的序列EPKS。在其它实施例中，当蛋白质片段(例如IL-15或IL-15Rα)连接于Fc结构域时，IL-15或IL-15Rα构筑体的N端连接于Fc结构域的CH3结构域的C端。
在Fc结构域蛋白的一些本文概述的构筑体和序列中，IL-15或IL-15Rα蛋白片段的C端连接于结构域连接子的N端，其C端连接到恒定Fc结构域的N端(N-IL-15或IL-15Rα蛋白片段-连接子-Fc结构域-C)，但其可以转换(N-Fc结构域-连接子-IL-15或IL-15Rα蛋白片段-C)。在本文概述的其它构筑体和序列中，任选地第一蛋白质片段的C端通过结构域连接子连接于第二蛋白质片段的N端，任选地第二蛋白质片段的C端通过结构域连接子连接于恒定Fc结构域的N端。在本文概述的又其它构筑体和序列中，提供不与第一蛋白质片段或第二蛋白质片段连接的恒定Fc结构域。异源二聚体Fc融合蛋白可含有两种或更多种本文所述的例示性单体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文概述的任何两个结构域连接在一起，其中一些描绘于图6中。虽然可以使用任何合适的连接子，但许多实施例使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一的整数(并且通常为1到2到3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，连接子是带电荷的结构域连接子。因此，在一些实施例中，本发明提供异源二聚体Fc融合蛋白，其依赖于使用两种不同的重链变体Fc序列，其将自组装以形成异源二聚体Fc结构域融合多肽。
在一个实施例中，异源二聚体Fc融合蛋白含有至少两个恒定结构域，其可以被工程化以产生异源二聚体，例如pI工程化。可以使用的其它Fc结构域包括含有一个或多个已经过pI工程化的本发明的CH1、CH2、CH3和铰链结构域的片段。特别地，图57A-57K中所描绘的形式是异源二聚体Fc融合蛋白，意指所述蛋白质具有自组装成异源二聚体Fc结构域和至少一种蛋白质片段(例如，1、2或更多种蛋白质片段)的两个相关联的Fc序列。在一些情况下，第一蛋白质片段与第一Fc序列连接，并且第二蛋白质片段与第二Fc序列连接。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白含有与第二蛋白质片段连接的第一蛋白质片段，其与第一Fc序列连接，和第二Fc序列，其不与第一或第二蛋白质片段连接。
本发明涉及新的构筑体，以提供允许与一种或多种结合搭配物、配体或受体结合的异源二聚体Fc融合蛋白。异源二聚体Fc融合构筑体基于抗体重链的两个Fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。异源二聚体Fc融合物通过改变如下面更充分讨论的每种单体的氨基酸序列来制备。因此，本发明一般涉及异源二聚体Fc融合蛋白的形成，其可以几种方式共同接合结合搭配物或配体或受体，这依赖于每条链上不同的恒定区中的氨基酸变体，以促进异源二聚体形成和/或允许异源二聚体比同源二聚体更易于纯化。
有许多机制可用于产生本发明的异源二聚体。另外，如所属领域技术人员将理解，可以组合这些机制以确保高异源二聚化。因此，导致产生异源二聚体的氨基酸变体被称为“异源二聚化变体”。如下所论述，异源二聚化变体可包括空间变体(例如下文所述的“杵和臼”或“偏斜”变体和下文描述的“电荷对”变体)以及允许从异源二聚体中纯化同源二聚体的“pI变体”。正如WO2014/145806(以全文引用的方式并入本文中)中大体所述，并且如下文关于“异源二聚化变体”的论述具体所述，适用的异源二聚化机制包括“杵和臼”(“KIH”；本文中有时称为“偏斜”变体)(参见WO2014/145806中的论述)、如WO2014/145806中所述的“静电转向”或“电荷对”、如WO2014/145806中所述的pI变体，以及如WO2014/145806和下文中所概述的一般其它Fc变体。
在本发明中，存在可以产生易于纯化异源二聚体蛋白的几种基础机制；一种依赖于pI变体的使用，以便每种单体和后续每种二聚体物质具有不同pI，因此允许对A-A、A-B和B-B二聚体蛋白进行等电纯化。可替代地，某些形式还允许基于尺寸进行分离。如下面进一步概述，还可以“偏斜”形成异源二聚体而非同源二聚体。因此，空间异源二聚化变体与pI或电荷对变体的组合在本发明中特别有用。
一般来说，本发明中特定使用的实施例依赖于包括偏斜变体的变体组，其相对于同源二聚化形成促进异源二聚化形成，与pI变体偶联，这增加两种单体与每种二聚体物质之间的pI差异。
另外，如下面更全面概述，取决于异源二聚体Fc融合蛋白的形式，pI变体可以含于单体的恒定和/或Fc结构域内，或者可以使用结构域连接子。也就是说，本发明还提供在一种或两种单体上的pI变体，和/或带电荷的结构域连接子。另外，用于替代功能的额外氨基酸工程化也可赋予pI变化，例如Fc、FcRn和KO变体。
在使用pI作为分离机制以允许对异源二聚体蛋白纯化的本发明中，可以将氨基酸变体引入一个或两个单体多肽中；即，一种单体(为了简单起见，本文中称为“单体A”)的pI可以加以工程化以与单体B分离，或单体A和B两者都可以改变，其中单体A的pI增加，而单体B的pI降低。如所论述，任一种或两种单体的pI变化可以如下进行：除去或添加带电荷的残基(例如用带正或负电荷的氨基酸残基置换中性氨基酸，例如谷氨酰胺置换成谷氨酸)、将带电荷的残基从正或负电荷变为相反电荷(例如天冬氨酸变为赖氨酸)或将带电荷的残基变为中性残基(例如电荷的失去；赖氨酸变为丝氨酸)。
许多这些变体展示于图中。
因此，在本发明的这一实施例中，提供在至少一种单体中形成足够的pI变化，使得异源二聚体可以与同源二聚体分离。如所属领域技术人员将了解，并且如下文进一步所论述，这可通过使用“野生型”重链恒定区和已经工程化成以增加或降低其pI的变体区进行(wt A:B+或wt A:B-)，或通过增加一个区并且减少另一区进行(A+:B-或A-:B+)。
因此，通常，本发明的一些实施例的组分是恒定区中的氨基酸变体，其涉及通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入一种或两种单体中来改变二聚体蛋白的至少一种(如果不是两种)单体的等电点(pI)。如果两种单体的pI相差小到0.1个pH单位(0.2、0.3、0.4和0.5或更大pH单位都能适用于本发明中)，那么可以实现异源二聚体与两种同源二聚体的分离。
如所属领域技术人员将理解，为了获得良好分离而包括在每种或两种单体上的pI变体的数量将部分取决于组分的起始pI。也就是说，为了确定要工程化哪种单体或在哪种“方向”(例如更正或更负)，计算Fc结构域、并且在一些情况下，连接于Fc结构域的蛋白结构域的序列，并且据此作出决定。如所属领域所知，不同的Fc结构域和/或蛋白结构域将具有在本发明中利用的不同起始pI。一般来说，如本文中所概述，pI经过工程化而使得每种单体的总pI差异达到至少约0.1log，如本文中所概述优选0.2到0.5。
此外，如所属领域技术人员将理解和本文概述，在一些实施例中，异源二聚体可以基于尺寸与同源二聚体分离。如图中所示，例如，几种形式允许基于尺寸分离异源二聚体和同源二聚体。
在使用pI变体实现异源二聚化的情况下，通过使用Fc结构域的恒定区，提供设计和纯化异源二聚体Fc融合蛋白的更模块化方法。因此，在一些实施例中，必须工程化异源二聚化变体(包括偏斜和纯化异源二聚化变体)。另外，在一些实施例中，通过导入来自不同IgG同型的pI变体以便在不引入显著免疫原性的情况下改变pI来显著降低pI变体导致免疫原性的可能性。因此，要解决的另一个问题是阐明具有高人类序列含量的低pI恒定结构域，例如在任何特定位置最小化或避免非人类残基。
这种pI工程化可以得到的额外益处也是血清半衰期延长和FcRn结合增加。也就是说，如USSN 13/194,904(以全文引用的方式并入本文中)中所述，降低抗体恒定结构域(包括在抗体和Fc融合物中发现的那些)的pI可导致体内更长的血清滞留。这些用于增加血清半衰期的pI变体也促进用于纯化的pI变化。
另外，应该注意的是，异源二聚化变体的pI变体为Fc融合蛋白的分析和质量控制方法提供额外的益处，因为消除、最小化和区分同源二聚体何时存在的能力是显著的。类似地，可靠地测试异源二聚体Fc融合蛋白产生的再现性的能力是重要的。
A.异源二聚化变体
本发明提供异源二聚体蛋白，包括呈多种形式的异源二聚体Fc融合蛋白，其利用异源二聚体变体以允许异源二聚体形成和/或从同源二聚体纯化。异源二聚体融合构筑体基于两个Fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。
存在许多合适的异源二聚化偏斜变体组的对。这些变体以“组”的“对”出现。即，将所述对的一组并入第一单体中并且所述对的另一组并入第二单体中。应该注意，这些组不一定表现为“臼包杵”型变体，其中一种单体上的残基与另一种单体上的残基之间存在一对一对应；即，组中的这些对形成了两种单体之间的界面，促进了异源二聚体形成并且阻碍了同源二聚体体形成，从而使在生物学条件下自发形成异源二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同源二聚体A/A:50％异源二聚体A/B:25％同源二聚体B/B)。
B.空间变体
在一些实施例中，可通过添加空间变体来促进异源二聚体的形成。也就是说，通过改变每条重链中的氨基酸，相比于形成具有相同Fc氨基酸序列的同源二聚体，不同的重链更可能缔合以形成异源二聚体结构。合适的空间变体包括在USSN 15/141,350的图29中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中，以及图1A-1E中。
一种机制在所属领域通常称为“杵和臼”，是指形成空间影响以利于异源二聚体形成和不利于同源二聚体形成的氨基酸工程化，如在USSN 61/596,846,Ridgway等人,《蛋白质工程》9(7):617(1996)；Atwell等人,《分子生物学杂志》1997 270:26；美国专利第8,216,805号中所述，所有这些都以全文引用的方式并入本文中。附图标识了许多依赖于“杵和臼”的“单体A-单体B”对。另外，如Merchant等人,《自然·生物技术》16:677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以使形成偏向异源二聚化。
一种用于产生异源二聚体抗体的另一种机制有时称为“静电转向”，如Gunasekaran等人,《生物化学杂志》285(25):19637(2010)中所述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。这有时在本文中称为“电荷对”。在这个实施例中，静电用于使形成偏向异源二聚化。如所属领域技术人员将理解，这些也可能对pI有影响，因此对纯化也有影响，并且因此在一些情况下也可以认为是pI变体。然而，由于这些是为了强制发生异源二聚化而产生并且不是作为纯化工具使用，因此其被分类为“空间变体”。这些包括但不限于与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如这些是“单体对应组”)和与C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。
其它单体A和单体B变体可以任选地和独立地以任何量与其它变体(例如本文中概述的pI变体或US 2012/0149876的图37中所示的其它空间变体，其所有以引用的方式明确并入本文中)组合。
在一些实施例中，本文中概述的空间变体可以任选地和独立地与任何pI变体(或其它变体，例如Fc变体、FcRn变体等)一起并入一种或两种单体中，并且可以独立地和任选地包括于本发明的蛋白质中或从本发明的蛋白质中排除。
合适的偏斜变体的列表发现于图1A-1E中。在许多实施例中特别有用的是成对的组，包括但不限于S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括桥接二硫化物、T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。就命名而言，对“S364K/E357Q:L368D/K370S”意指其中一种单体具有双变体组S364K/E357Q，并且另一种单体具有双变体组L368D/K370S；如上所述，这些对的“链型”取决于起始pI。
C.异源二聚体的pI(等电点)变体
一般来说，如所属领域技术人员将理解，pI变体有两大类：增加蛋白质pI的那些(碱性变化)和降低蛋白质pI的那些(酸性变化)。如本文所述，可以使用这些变体的所有组合：一种单体可以是野生型，或者不显示与野生型显著不同的pI的变体，并且另一种可以是更碱性或更酸性的。可替代地，可以改变每种单体，一种更碱性，并且一种更酸性。
pI变体的优选组合展示于USSN 15/141,350的图30中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中。如本文所概述和图中所示，这些变化相对于IgG1展示，但所有同型可以这种方式改变，以及同型杂合体。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。
在一个实施例中，如果Fc单体之一包括CH1结构域，那么pI变体的优选组合具有包含208D/295E/384D/418E/421D变体(当相对于人类IgG1时为N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一种单体。在一些例子中，第二单体包含带正电荷的结构域连接子，包括(GKPGS)4。在一些情况下，第一单体包括CH1结构域，包括位置208。因此，在不包括CH1结构域的构筑体中(例如对于在其中一个结构域上不利用CH1结构域的异源二聚体Fc融合蛋白)，优选的负pI变体Fc组包括295E/384D/418E/421D变体(当相对于人类IgG1时为Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
在一些实施例中，突变在Fc结构域的铰链结构域中进行，包括位置216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229和230。因此，pI突变和特别是取代可以在位置216-230中的一个或多个中进行，其中1、2、3、4或5个突变可用于本发明。同样，单独或与其它结构域中的其它pI变体一起考虑所有可能的组合。
可用于降低铰链结构域的pI的特定取代包括但不限于位置221处的缺失、位置222处的非天然缬氨酸或苏氨酸、位置223处的缺失、位置224处的非天然谷氨酸、位置225处的缺失、位置235处的缺失和位置236处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，并且在其它情况下，这些取代以任何组合添加到其它结构域中的其它pI变体。
在一些实施例中，可以在CH2区域中进行突变，包括位置233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。应该注意，可以进行233-236的改变以增加IgG2主链中的效应功能(以及327A)。同样，可以对这14个位置进行所有可能的组合；例如，pI抗体可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CH2 pI取代。
可用于降低CH2结构域的pI的特定取代包括但不限于位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯丙氨酸、位置300处的非天然苯丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸以及CH2和其它结构域内的所有可能组合。
在这个实施例中，突变可以独立地和任选地选自位置355、359、362、384、389,392、397、418、419、444和447。可用于降低CH3结构域的pI的特定取代包括但不限于位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然蛋氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸和位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。图2中提供pI变体的例示性实施例。
D.同型变体
另外，本发明的许多实施例依赖于将pI氨基酸在特定位置从一个IgG同型“导入”到另一个IgG同型，从而减少或消除了将不需要的免疫原性引入变体中的可能性。这些的许多示于美国公开申请第2014/0370013号的图21中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。也就是说，IgG1是治疗性抗体的常见同型，其原因有多种，包括高效应功能。然而，IgG1的重链恒定区具有比IgG2更高的pI(8.10对7.31)。通过将特定位置处的IgG2残基引入IgG1主链，所得单体的pI降低(或增加)并且另外表现出更长的血清半衰期。举例来说，IgG1在位置137处具有甘氨酸(pI 5.97)，并且IgG2具有谷氨酸(pI 3.22)；导入谷氨酸会影响所得蛋白质的pI。如下所述，通常需要许多氨基酸取代来显著影响变体Fc融合蛋白的pI。然而，应该注意，如下文所论述，即使IgG2分子的变化也允许增加血清半衰期。
在其它实施例中，进行非同型氨基酸变化，以减少所得蛋白质的总电荷状态(例如通过将更高的pI氨基酸变为更低的pI氨基酸)，或允许在结构中调节稳定性等等，如下文进一步描述。
此外，通过pI工程化重链和轻链恒定结构域，可以看到异源二聚体的每种单体的显著变化。如本文所讨论，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。
E.计算pI
每种单体的pI可取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，包括变体重链恒定结构域和融合搭配物。因此，在一些实施例中，使用美国公开申请第2014/0370013号的图19中的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI的变化。如本文所讨论，要工程化的单体通常由每种单体的固有pI决定。
F.也赋予更好的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体降低单体的pI的情况下，其可具有改善体内血清滞留的附加益处。
虽然仍处于检查，但是相信Fc区使体内半衰期延长，原因是在核内体中在pH 6下结合于FcRn隔绝了Fc(Ghetie和Ward，1997《今日免疫学(Immunol Today.)》18(12):592-598，其以引用的方式整体并入本文中)。然后，核内体区室将Fc再循环到细胞表面。一旦区室打开到细胞外空间，较高的pH(约7.4)诱导Fc释放回到血液中。Dall'Acqua等人表明，在小鼠中，在pH 6和pH 7.4下的FcRn结合增加的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度以及与野生型Fc相同的半衰期(Dall'Acqua等人,2002,《免疫学杂志》169:5171-5180，其以引用的方式整体并入本文中)。Fc对FcRn的亲和力在pH 7.4下增加被认为是禁止了Fc释放回到血液中。因此，延长Fc体内半衰期的Fc突变理想地增强了较低pH下的FcRn结合，同时仍允许Fc在较高pH下释放。在6.0到7.4的pH范围内，氨基酸组胺酸的电荷状态发生变化。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置找到His残基并不出乎意料。
G.用于额外功能的额外Fc变体
除pI氨基酸变体之外，可以出于多种原因(包括但不限于改变与一种或多种FcγR的结合、改变与FcRn的结合等)而产生多个适用的Fc氨基酸修饰。
因此，本发明的蛋白质可包括氨基酸修饰，包括本文概述的异源二聚化变体，其包括pI变体和空间变体。每组变体可以独立地和任选地包括或不包括任何特定异源二聚体蛋白。
H.FcγR变体
因此，可以进行许多有用的Fc取代以改变与一种或多种Fcγ受体的结合。导致结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。举例来说，已知增加与FcγRIIIa的结合导致ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞的裂解)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb(抑制性受体)的结合减少也是有益的。可用于本发明的氨基酸取代包括USSN 11/124,620(特别是图41)、11/174,287、11/396,495、11/538,406中列出的那些，所有文献以全文和尤其针对其中所公开的变体引用的方式明确并入本文中。可以使用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。
另外，增加对FcγRIIc的亲和力的氨基酸取代也可包括在本文概述的Fc结构域变体中。举例来说，USSN 11/124,620和14/578,305中描述的取代是有用的。
另外，存在额外的Fc取代，其可用于增加与FcRn的结合和增加血清半衰期，如具体公开于USSN 12/341,769中，以全文引用的方式并入本文中，包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I or V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。
I.消融变体
类似地，另一类功能变体是“FcγR消融变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施例中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免其它作用机制。即，例如，在许多实施例中，特别是在使用双功能免疫调节蛋白时，期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性，使得一个Fc结构域包含一个或多个Fcγ受体消融变体。这些消融变体在USSN15/141,350的图31中描绘，所有文献以全文引用的方式并入本文中，并且每一个都可以独立地和任选地被包括或排除，其中优选的方面利用选自由以下组成的群组的消融变体：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应该注意，本文提及的消融变体消融FcγR结合，但通常不消融FcRn结合。
J.异源二聚体变体和Fc变体的组合
如所属领域技术人员将理解，所有所列举的异源二聚化变体(包括偏斜和/或pI变体)可以任选地和独立地以任何方式组合，只要其保持其“链型”或“单体分区”即可。另外，所有这些变体可以组合成任何异源二聚化形式。
在pI变体的情况下，虽然在图中展示特别有用的实施例，但是可以根据改变两种单体之间的pI差异以促进纯化的基本规则产生其它组合。
另外，任何异源二聚化变体、偏斜和pI也可独立地和任选地与如本文一般概述的Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合。
另外，单体Fc结构域可包含一组氨基酸取代，其包括C220S/S267K/L368D/K370S或C220S/S267K/S364K/E357Q。
另外，异源二聚体Fc融合蛋白可包含偏斜变体(例如，如USSN 15/141,350的图1A-1C中所示的一组氨基酸取代，所有文献以全文引用的方式并入本文中)，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的群组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V:T366W；和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括桥接二硫化物，T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选的消融变体、任选的带电荷的结构域连接子；和任选的pI变体。
在一些实施例中，根据EU索引，Fc结构域包含一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：236R、S239D、S239E、F243L、M252Y、V259I、S267D、S267E、S67K、S298A、V308F、L328F、L328R、330L、I332D、I332E、M428L、N434A、N434S、236R/L328R、S239D/I332E、236R/L328F、V259I/V308F、S267E/L328F、M428L/N43S、Y436I/M428L、N436V/M428L、V436I/N434S、Y436V/N434S、S239D/I332E/330L、M252Y/S54T/T256E、V259I/V308F/M428L、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K。
在一个实施例中，可用于本发明的偏斜和pI变体的特定组合是T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括桥接二硫化物，T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，其中一种单体包含Q295E/N384D/Q418E/N481D和另一个带正电荷的结构域连接子。如所属领域所理解，“臼包杵”型变体不改变pI，并且因此可用于任一单体。
V.IL-15/IL-15Rα-Fc融合单体
本发明的双功能异源二聚体融合蛋白包括IL-15/IL-15受体α(IL-15Rα)-Fc融合单体。在一些情况下，IL-15和IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白结构域处于不同的方向。附图(包括但不限于图4A-4E、5A-5D和8A-8D)中提供IL-15/IL-15Rα-Fc融合单体的例示性实施例。
在一些实施例中，人类IL-15蛋白具有NCBI参考序列第NP_000576.1号或SEQ IDNO:1中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人类IL-15的编码序列阐述于NCBI参考序列第NM_000585号中。本文概述的Fc融合异源二聚体蛋白的例示性IL-15蛋白可具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸49-162。在一些实施例中，IL-15蛋白具有与SEQ IDNO:2至少90％、例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在一些实施例中，IL-15蛋白具有SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列和氨基酸取代N72D。在其它实施例中，IL-15蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列和一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：C42S、L45C、Q48C、V49C、L52C、E53C、E87C和E89C。任选地，IL-15蛋白还具有N72D取代。Fc融合蛋白的IL-15蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代。在一些实施例中，Fc融合蛋白的人类IL-15蛋白具有氨基酸取代N4D。在一些实施例中，Fc融合蛋白的人类IL-15蛋白具有氨基酸取代N65D。在一些实施例中，Fc融合蛋白的人类IL-15蛋白具有氨基酸取代N4D/N65D。在一些实施例中，Fc融合蛋白的人类IL-15蛋白具有氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。
在一些实施例中，Fc融合蛋白的人类IL-15蛋白与SEQ ID NO:2的氨基酸序列一致。在一些情况下，人类IL-15蛋白没有氨基酸取代。
氨基酸取代可以是IL-15:IL-2β和IL-15:共同γ链界面处的等排取代。在一些实施例中，人类IL-15蛋白具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D、Q108E和其任何组合。在一些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代Q108E。在一些情况下，IL-15蛋白具有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸取代。IL-15蛋白可以具有N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D或Q108E取代。在一些实施例中，氨基酸取代可包括N1D/D61N、N1D/E64Q、N4D/D61N、N4D/E64Q、D8N/D61N、D8N/E64Q、D61N/E64Q、E64Q/Q108E、N1D/N4D/D8N、D61N/E64Q/N65D、N1D/D61N/E64Q、N1D/D61N/E64Q/Q108E或N4D/D61N/E64Q/Q108E。在一些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代N4D。在某些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代N65D。在一些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代N4D/N65D。在一些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。
在一些实施例中，人类IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白具有NCBI参考序列第NP_002180.1号或SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人类IL-15Rα的编码序列阐述于NCBI参考序列第NM_002189.3号中。本文概述的Fc融合异源二聚体蛋白的IL-15Rα蛋白的例示性可包含SEQ ID NO:3的寿司结构域(例如，SEQ ID NO:3的氨基酸31-95)或由其组成，或换句话说，SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，IL-15Rα蛋白具有SEQID NO:4的氨基酸序列和选自由以下组成的群组的氨基酸插入：D96、P97、A98、D96/P97、D96/C97、D96/P97/A98、D96/P97/C98和D96/C97/A98，其中氨基酸位置是相对于全长人类IL-15Rα蛋白或SEQ ID NO:3。举例来说，可以将例如D(例如Asp)、P(例如Pro)、A(例如Ala)、DP(例如Asp-Pro)、DC(例如Asp-Cys)、DPA(例如Asp-Pro-Ala)、DPC(例如Asp-Pro-Cys)或DCA(例如Asp-Cys-Ala)的氨基酸添加到SEQ ID NO:4的IL-15Rα蛋白的C端。在一些实施例中，IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列和一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：K34C、A37C、G38C、S40C和L42C，其中氨基酸位置是相对于SEQ ID NO:4。IL-15Rα蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸突变(例如，取代、插入和/或缺失)。
SEQ ID NO:1是
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
SEQ ID NO:2是
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
SEQ ID NO:3是
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL。
SEQ ID NO:4是
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR。
在一些实施例中，IL-15蛋白与Fc结构域的N端连接，并且IL-15Rα蛋白与IL-15蛋白的N端连接。在其它实施例中，IL-15Rα蛋白与Fc结构域的N端连接，并且IL-15Rα蛋白与IL-15蛋白非共价连接。在又其它实施例中，IL-15Rα蛋白与Fc结构域的C端连接，并且IL-15Rα蛋白与IL-15蛋白非共价连接。
在一些实施例中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白通过连接子连接在一起。任选地，蛋白质不通过连接子连接。在其它实施例中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白是非共价连接的。在一些实施例中，IL-15蛋白通过连接子与Fc结构域连接。在其它实施例中，IL-15Rα蛋白通过连接子与Fc结构域连接。任选地，IL-15蛋白或IL-15Rα蛋白不使用连接子与Fc结构域连接。
在一些例子中，通过连接子(例如结构域连接子)将免疫检查点ABD与Fc结构域的N端共价连接。
在一些实施例中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文概述的任何两个结构域连接在一起。虽然可以使用任何合适的连接子，但许多实施例使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少1的整数(并且通常为1到2到3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，可以如本文所讨论和图6和7中所示使用带电荷的结构域连接子。
VI.抗原结合结构域单体
专注于CD8+T细胞增殖和活化的治疗策略可以在临床上为癌症治疗提供广阔前景。癌症可以被认为是患者无法识别和消除癌细胞。在许多例子中，这些转化的(例如癌性)细胞抵消免疫监视。存在限制体内T细胞活化的自然控制机制以防止无限制的T细胞活性，其可被癌细胞利用以逃避或抑制免疫反应。恢复免疫效应细胞(尤其是T细胞)识别和消除癌症的能力是免疫疗法的目标。免疫肿瘤学领域，有时被称为“免疫疗法”，正在迅速发展，最近批准了几种T细胞检查点抑制性抗体，例如
Figure BDA0002383970270000701
和
Figure BDA0002383970270000711
通常理解的是，共刺激和共抑制的各种免疫调节信号可用于协调最佳抗原特异性免疫反应。
本发明涉及与免疫细胞结合的双功能异源二聚体蛋白的产生，所述免疫细胞例如CD8+T细胞或NK细胞和/或表达IL-2Rβ和共同γ链(γc；CD132)的细胞。双功能异源二聚体蛋白可以包括可以与免疫抗原或免疫细胞结合的任何有用抗体形式的抗原结合单体。在一些实施例中，抗原结合单体包括与Fc结构域连接的Fab或scFv。
这类抗原结合单体的例示性实施例提供于图66A(XENP24114的链2和3of)、图66A(XENP24115的链2和3)、图66B(XENP24116的链2和3)、图60A(XENP24532的链2和3)、图61A(XENP24533的链2和3)、图61A(XENP24534的链2和3)、图79A(XENP24543的链2和3)、图79A(XENP24546的链2和3)、图79B(XENP24547的链2和3)和图79B(XENP24548的链2和3)中。
A.靶抗原
本发明的靶向异源二聚体蛋白具有至少一个与靶抗原结合的抗原结合结构域(ABD)，所述靶抗原与Fc结构域和不同Fc结构域中融合的IL-15/IL-15Rα蛋白结构域融合。合适的靶抗原包括人类(并且有时是猕猴)CD8、NKG2A和NKG2B。在一些实施例中，以二价双功能形式或三价双功能形式存在与两种不同靶抗原(“靶对”)结合的两种不同ABD。因此，合适的双功能ABD结合CD8和NKG2A、CD8和NKG2D或NKG2A和NKG2D。在又其它实施例中，双功能异源二聚体蛋白具有两个以二价双功能形式或三价双功能形式与相同靶抗原(“靶对”)结合的不同抗原结合结构域(ABD)和与蛋白的Fc结构域中的一个融合的IL-15/IL-15Rα蛋白结构域。
ABD可以呈各种形式，例如Fab形式或scFv形式。用于本发明的例示性ABD公开于US62/353,511中，其内容出于所有目的以其整体并入本文中。
在一些实施例中，ABD之一结合CD8。结合CD8的合适ABD展示于图65A-65F中作为二价抗体(XENP15076和XENP15251)；Fab(XENP23647)；单臂Fab-Fc抗体(XENP24317)；展示于图81中作为二价抗体(XENP24025)；单臂Fab-Fc抗体(XENP24321)；展示于图89中(作为鼠类和人类化可变重链和可变轻链结构域)；展示于图90中作为二价抗体(XENP15075)；展示于图91中作为单臂Fab-Fc抗体(XENP24920)；和展示于图95中(作为变体人类化可变重链和可变轻链结构域)。如所属领域技术人员将理解，如其加下划线，合适的ABD可包含一组如这些图中所描绘的6个CDR。在一些实施例中，含有结合CD8的ABD的单体可以充当非阻断性抗CD8臂。
在一些实施例中，ABD之一结合NKG2A。结合NKG2A的合适ABD展示于图58中作为二价抗体(XENP24541和XENP24542)和Fab(XENP24542)。如所属领域技术人员将理解，如其加下划线，合适的ABD可包含一组如这些图中所描绘的6个CDR。
在一些实施例中，ABD之一结合NKG2D。结合NKG2D的合适ABD展示于图59中(XENP24365)。如所属领域技术人员将理解，如其加下划线，合适的ABD可包含一组如这个图中所描绘的6个CDR。
另外，本发明的抗体包括与本文概述的抗原结合结构域结合于相同表位的抗体，或与本文概述的抗原结合结构域竞争结合。在一些实施例中，双功能检查点抗体可含有本文概述的ABD之一和与本文概述的ABD之一竞争结合的第二ABD。在一些实施例中，两种ABD与本文概述的相应ABD竞争结合。通常使用如本文概述的Biacore分析定来确定结合竞争。
如所属领域技术人员将理解的并且在下文中更全面地讨论，本发明的异源二聚体融合蛋白可具有多种构形，如通常描绘于US 62/353,511的图1中。一些图描绘“单端”构形，其中分子的一个“臂”上存在一种类型的特异性并且另一个“臂”存在不同特异性。其它图描绘“双端”构形，其中分子的“顶部”存在至少一种类型的特异性并且分子的“底部”存在一或多种不同特异性。参见图57A-57K。因此，本发明涉及新型免疫球蛋白组合物，其可共同接合免疫抗原和IL-15/IL-15Rα结合搭配物。
如所属领域技术人员将理解，本发明的异源二聚体形式可以具有不同的化价数并且是双功能的。即，本发明的异源二聚抗体可以是二价和双功能的，其中一个靶抗原与一个结合结构域结合，并且另一靶抗原与第二结合结构域结合。异源二聚抗体也可以是三价和双功能的，其中第一抗原与两个结合结构域结合，并且第二抗原与第二结合结构域结合。
B.抗体
如下所讨论，通常使用术语“抗体”。可用于本发明的抗体可呈现如本文所述的多种形式，包括本文所述和图中所描绘的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。在一些实施例中，本发明提供含有抗原结合结构域和Fc结构域的抗体融合蛋白。在一些实施例中，抗体融合蛋白与本文所述的IL-15/IL-15RαFc融合蛋白形成双功能异源二聚体蛋白。这类双功能异源二聚体蛋白的例示性实施例包括但不限于XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24543、XENP24546、XENP24547和XENP24548。这类双功能异源二聚体蛋白的例示性形式包括但不限于图57A-57K中所描绘的形式。
传统的抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一个“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。人类轻链被分类为κ和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的抗体或抗体片段(抗体单体)，其具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3更频繁地使用。应该注意，IgG1具有不同的同种异型，其在356(D或E)和358(L或M)处具有多态性。本文中所描绘的序列使用356D/358M同种异型，然而本文包括其它同种异型。也就是说，本文包括的包括IgG1 Fc结构域的任何序列可以具有替代356D/358M同种异型的356E/358L。
另外，本文中的许多序列在位置220处的至少一个半胱氨酸被丝氨酸取代；通常，这是在本文中所描绘的大多数序列的“scFv单体”侧，尽管它也可以在“Fab单体”侧或两者上，以减少二硫化物的形成。本文序列中特别包括这些半胱氨酸中的一个或两个被取代(C220S)。
因此，如本文所用的“同型”是指由其恒定区的化学和抗原特征限定的免疫球蛋白的任何亚类。应当理解，治疗性抗体还可以包含同型和/或亚类的杂合体。举例来说，如以引用的方式并入的美国公开申请第2009/0163699号中所示，本发明覆盖IgG1/G2杂合体的pI工程化。
高变区通常涵盖以下氨基酸残基：轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中的约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；Kabat等人,《免疫学相关蛋白质序列》第5版,马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.)(1991)；和/或形成高变环的那些残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)《分子生物学杂志》196:901-917。下面描述本发明的特定CDR。
如所属领域技术人员将理解，CDR的确切编号和放置在不同编号系统之间可以是不同的。然而，应理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开内容包括相关(固有)CDR的公开内容。因此，每个可变重链区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个可变轻链区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人,《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27(1):55-77(2003)。
表2
Figure BDA0002383970270000741
Figure BDA0002383970270000751
在整个本说明书中，当提及可变结构域(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)中的残基以及用于Fc区的EU编号系统时，通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等人,同上(1991))。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“铰链结构域”在本文中是指包含抗体的第一与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置231处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置216(IgG1中的E216)到230(IgG1中的P230)，其中编号根据如Kabat中的EU索引。在一些情况下，使用“铰链片段”，其在铰链结构域的N端和C端的一个或两个处含有较少的氨基酸。如本文中所指出，pI变体也可以在铰链区中制备。
轻链通常包含两个结构域，即可变轻链结构域(含有轻链CDR并且与可变重链结构域一起形成Fv区)和恒定轻链区(通常称为CL或Cκ)。
下文概述的用于其它取代的另一相关区是Fc区。
本发明提供大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻链和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以分别是较大可变轻链结构域或可变重链结构域的一部分。另外，如本文中更全面概述，当使用重链和轻链时(例如当使用Fabs时)，可变重链结构域和可变轻链结构域可以在分开的多肽链上，或者在scFv序列的情况下，可以在单个多肽链上。
CDR有助于形成抗体的抗原结合位点，或更具体地，表位结合位点。“表位”是指与称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是例如氨基酸或糖侧链的分子的分组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有超过一个表位。
表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。
表位可以是构象的也可以是线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。
表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，例如“装箱”。如下所概述，本发明不仅包括所列举的抗原结合结构域和本文中的抗体，但是那些与所列举的抗原结合结构域结合的表位竞争结合的结构域和抗体。
因此，本发明提供不同的抗体结构域。如本文所述和所属领域中已知的，本发明的异源二聚体抗体包含重链和轻链内的不同结构域，其也可以重叠。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重链恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、重链可变结构域、轻链可变结构域、轻链恒定结构域、Fab结构域和scFv结构域。
因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域和任选的铰链结构域(-H-CH2-CH3)。在本文的实施例中，当scFv连接于Fc结构域时，scFv构筑体的C端连接于Fc结构域的全部或部分铰链；例如，其通常连接于是铰链的开始的序列EPKS。重链包含可变重链结构域和恒定结构域，其包括包含CH2-CH3的CH1-任选的铰链-Fc结构域。轻链包含可变轻链和轻链恒定结构域。scFv包含可变重链、scFv连接子和可变轻链结构域。在本文概述的大多数构筑体和序列中，可变重链的C端连接于scFv连接子的N端，scFv连接子的C端连接于可变轻链的N端(N-vh-连接子-vl-C)，尽管这一顺序可以调换(N-vl-连接子-vh-C)。
本发明的一些实施例包含至少一个scFv结构域，其虽然不是天然存在的，但通常包括通过scFv连接子连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构域。如本文所概述，虽然scFv结构域通常由N端到C端定向为vh-scFv连接子-vl，但是针对任一个scFv结构域(或使用Fab的vh和vl序列构筑的那些)这种定向可以逆向，成为vl-scFv连接子-vh，其中取决于形式(一般参见图57A-57K)任选的连接子位于一个末端或两个末端。
如本文中所示，存在多种可用于共价连接所列举的结构域的合适的连接子(用作结构域连接子或scFv连接子)，包括传统肽键，其通过重组技术来产生。在一些实施例中，连接肽可能主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。连接肽应当具有足够以此方式连接两个分子的长度：所述分子假设相对于彼此的正确构象使得其保留所期望的活性。在一个实施例中，连接子在长度上为约1个到50个氨基酸，在长度上优选地为约1个到30个氨基酸。在一个实施例中，可以使用长度为1个到20个氨基酸的连接子，在一些实施例中使用约5个到约10个氨基酸。适用的连接子包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:XX)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:XX)(其中n是至少一(并且通常是3到4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性连接子。说明性结构域连接子描绘于图6中。可替代地，可使用多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚环氧烷或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物作为连接子。
其它连接序列可以包括具有任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但并非CL/CH1结构域的所有残基；例如，CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。连接子可以衍生自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。连接子可以衍生自任何同型的免疫球蛋白重链，包含例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。连接序列还可以衍生自其它蛋白质，例如Ig样蛋白(例如，TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生序列以及来自其它蛋白质的其它天然序列。
在一些实施例中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文概述的任何两个结构域连接在一起。举例来说，可存在将Fab的CH1结构域的C端连接于scFv的N端的结构域连接子，并且另一任选的结构域连接子将scFv的C端连接于CH2结构域(尽管在许多实施例中，使用铰链作为这个结构域连接子)。虽然可使用任何合适的连接子，许多实施例利用甘氨酸-丝氨酸聚合物作为结构域连接子，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n以及(GGGS)n，其中n是至少为一(并且通常3到4到5)的整数，以及允许两个域的重组连接并且具有足够长度和柔性以使得每个结构域保留其生物功能的任何肽序列。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，可以使用如在scFv连接子的一些实施例中使用的带电荷的结构域连接子。
在一些实施例中，连接子是scFv连接子，其用于共价连接如本文所讨论的vh和vl结构域。因此，本发明进一步提供带电荷的scFv连接子，以促进第一单体与第二单体之间的pI分离。也就是说，通过并入带正电荷或负电荷的scFv连接子(或者在对不同单体使用scFv的骨架的情况下为两者)，这允许包含带电荷连接子的单体改变pI而不进一步改变Fc结构域。这些带电荷的连接子可以被取代成任何含有标准连接子的scFv。同样，如所属领域技术人员将理解，根据所期望的pI变化，带电荷的scFv连接子用于正确的“链”或单体上。举例来说，如本文所讨论，为了制备三F形式的异源二聚体抗体，计算每个期望抗原结合结构域的Fv区域的原始pI，并且选择一个制备scFv，并且取决于pI，选择正或负连接子。
带电荷的结构域连接子也可以用来增加本发明的单体的pI分离，并且因此可以用于利用连接子的本文中的任何实施例中。特别地，图57A-57K中描绘的形式包含抗原结合蛋白，通常称为“异源二聚体Fc蛋白”，意指所述蛋白质具有自组装成异源二聚体Fc结构域和至少两个Fv区(无论是作为Fab或作为scFv)的至少两个相关的Fc序列。
C.嵌合和人类化抗体
在一些实施例中，本文的抗体可衍生自来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人类化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人类化抗体”都是指组合来自超过一种物种的区域的抗体。举例来说，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在一些情况下为大鼠)的可变区和来自人类的恒定区。“人类化抗体”通常是指非人类抗体，其具有与人类抗体中发现的序列交换的可变结构域框架区。通常，在人类化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人类来源的聚核苷酸编码或除了在其CDR内之外，与这种抗体相同。CDR(部分或全部由源自非人类生物体的核酸编码)被移植到人类抗体可变区的β-折叠框架中以形成抗体，其特异性由移植的CDR决定。这类抗体的形成描述于例如WO 92/11018，Jones,1986,《自然》321:522-525，Verhoeyen等人,1988,《科学》239:1534-1536中，其以引用的方式整体并入本文中。所选择的受体框架残基“回复突变”到相应的供体残基通常需要重新获得在初始移植构筑体中丧失的亲和力(US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US5821337；US 6054297；US 6407213，其以引用的方式整体并入本文中)。人类化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(通常是人类免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分，并且因此通常包含人类Fc区。人类化抗体也可使用具有基因工程化的免疫系统的小鼠产生。Roque等人,2004,《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》20:639-654，其以引用的方式整体并入本文中。用于人类化和重塑非人类抗体的多种技术和方法是所属领域熟知的(参见Tsurushita和Vasquez,2004,《单克隆抗体的人类化(Humanization of Monoclonal Antibodies)》,《B细胞分子生物学(Molecular Biology of B Cells)》,533-545,爱思唯尔科学公司(Elsevier Science)(美国)和其中引用的参考文献，其以引用的方式整体并入本文中)。人类化方法包括但不限于以下文献中所述的方法：Jones等人,1986,《自然》321:522-525；Riechmann等人,1988,《自然》332:323-329；Verhoeyen等人,1988,《科学》239:1534-1536；Queen等人,1989,《美国国家科学院院刊》86:10029-33；He等人,1998,《免疫学杂志(J.Immunol.)》160:1029-1035；Carter等人,1992,《美国国家科学院院刊》89:4285-9；Presta等人,1997,《癌症研究(Cancer Res.)》57(20):4593-9；Gorman等人,1991,《美国国家科学院院刊》88:4181-4185；O'Connor等人,1998,《蛋白质工程(Protein Eng)》11:321-8，所有这些文献以引用的方式整体并入本文中。降低非人类抗体可变区免疫原性的人类化或其它方法可以包括表面再塑方法，如例如Roguska等人,1994,《美国国家科学院院刊》91:969-973中所述，其以引用的方式整体并入本文中。在某些实施例中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。举例来说，这类抗体可包含人类抗体或由人类抗体组成，所述人类抗体包含作为特定种系序列“的产物”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。通过比较人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择序列与人类抗体序列最接近(即，最大％一致性)的人类种系免疫球蛋白，可以鉴定人类抗体是人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”人类种系免疫球蛋白序列。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”特定人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体与种系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人类化抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列通常至少90％一致，并且与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时，含有将抗体鉴定为衍生自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人类化抗体的氨基酸序列与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95、96、97、98或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％一致。通常，衍生自特定人类种系序列的人类化抗体将显示与人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10-20个氨基酸差异(在本文中在引入任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常较低)。
在某些情况下，人类化抗体可显示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异(再次，在本文中在引入任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常较低)。在一个实施例中，亲本抗体已经亲和力成熟，如所属领域已知的。基于结构的方法可用于人类化和亲和力成熟，例如USSN 11/004,590中所述。基于选择的方法可用于人类化和/或亲和成熟抗体可变区，包括但不限于以下文献中所述的方法：Wu等人,1999,《分子生物学杂志》294:151-162；Baca等人,1997,《生物化学杂志》272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,《生物化学杂志》271(37):22611-22618；Rader等人,1998，《美国国家科学院院刊》95:8910-8915；Krauss等人,2003,《蛋白质工程化》16(10):753-759，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。其它人类化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人,2002,《免疫学杂志》169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,《免疫学杂志》169:3076-3084，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。
VII.本发明的有用实施例
如图57A-57K，有许多对本发明的双特异性异源二聚体融合蛋白的有用的形式。通常，本发明的异源二聚体融合蛋白具有三种功能组分：IL-15/IL-15Rα(寿司)组分、抗原结合结构域组分(例如抗CD8组分、抗NKG2A组分和抗NKG2D组分)和Fc组分，其各自可以采用如本文所概述的不同的形式，并且可以将其中的每一个与呈任何构形的其它组分组合。
根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域可具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：a)S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；b)S364K/E357Q:L368D/K370S；c)L368D/K370S:S364K；d)L368E/K370S:S364K；e)T411T/K360E/Q362E:D401K；f)L368D/K370S:S364K/E357L和g)K370S:S364K/E357Q。
在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
任选地，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
任选地，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有用于半衰期延长的428L/434S变体。
scIL-15/Rα×scFv
一个实施例示于图57A中，并且包含两种单体。第一单体包含由N端到C端的寿司结构域-结构域连接子-IL-15-结构域连接子-CH2-CH3，并且第二单体包含vh-scFv连接子-vl-铰链-CH2-CH3或vl-scFv连接子-vh-铰链-CH2-CH3，尽管在任一定向上，结构域连接子可以取代铰链。这通常被称为“scIL-15/Rα×scFv”，其中“sc”代表“单链”，是指使用共价连接子连接IL-15和寿司结构域。
参看图57A，scIL-15/Rα×scFv形式包含通过可变长度的连接子(称为“scIL-15/Rα”)与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)，然后将其与异源二聚体Fc区的N端融合，其中scFv与异源二聚体Fc的另一侧融合。这类异源二聚体蛋白的说明性实施例可以是XENP25137。
在scIL-15/Rα×scFv形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在scIL-15/Rα×scFv形式中，一个优选实施例利用偏斜变体S364K/E357Q(scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。
在scIL-15/Rα×scFv形式中，如图92C所示，一个优选实施例使用抗CD8ABD，并且具有以下序列：人类_IL15Ra(寿司)_Fc(216)_IgG1_pI(-)_等排_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S IL-15Rα(寿司)-Fc链(链1)、IL15_D30N/E64Q/N65D(链2)、OKT8[CD8]_H2_IgG1_PVA_/S267K/S364K/E357Q重链(链3)和OKT8[CD8]_L1轻链(链4)。
如图92C中所示，一个较佳实施例利用具有人类_IL15Ra(寿司)_Fc(216)_IgG1_pI(-)_等排_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S IL-15Rα(寿司)-Fc链(单链)的序列的scIL-15/Rα复合物。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含由N端到C端的：i)IL-15寿司结构域；ii)第一结构域连接子；iii)变体IL-15结构域；iv)第二结构域连接子；v)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其包含由N端到C端的：i)scFv结构域；ii)第三结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；其中scFv结构域包含第一可变重链结构域、scFv连接子和第一可变轻链结构域，并且scFv结构域结合人类CD8、NKG2A或NKG2D。
scFv×ncIL-15/Rα
这种实施例示于图57B中，并且包含三种单体。第一单体包含由N端到C端的寿司结构域连接子-CH2-CH3，并且第二单体包含vh-scFv连接子-vl-铰链-CH2-CH3或vl-scFv连接子-vh-铰链-CH2-CH3，尽管在任一定向上，结构域连接子可以取代铰链。第三单体是IL-15结构域。这通常被称为“ncIL-15/Rα×scFv”或“scFv×ncIL-15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”，是指IL-15和寿司结构域的自组装非共价连接。
参看图57B，“scFv×ncIL-15/Rα”形式包含与异源二聚体Fc区的N端融合的scFv，其中IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc的另一侧融合，而单独转染IL-15，使得形成非共价IL-15/Rα复合物。
在ncIL-15/Rα×scFv形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在ncIL-15/Rα×scFv形式中，一个优选实施例利用偏斜变体S364K/E357Q(scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含由N端到C端的：i)IL-15寿司结构域；ii)第一结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和b)第二单体，其包含由N端到C端的：i)scFv结构域；ii)第二结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；其中所述scFv结构域包含第一可变重链结构域、scFv连接子和第一可变轻链结构域；和c)包含变体IL-15结构域的第三单体，其中所述scFv结构域结合人类CD8、NKG2A或NKG2D。
scFv×dsIL-15/Rα
这个实施例示于图57C中，并且包含三种单体。第一单体包含由N端到C端的寿司结构域-结构域连接子-CH2-CH3，其中寿司结构域具有工程化的半胱氨酸残基，并且第二单体包含vh-scFv连接子-vl-铰链-CH2-CH3或vl-scFv连接子-vh-铰链-CH2-CH3，尽管在任一定向上，结构域连接子可以取代铰链。第三单体是IL-15结构域，也被工程化成具有半胱氨酸变体氨基酸，因此允许在寿司结构域与IL-15结构域之间形成二硫桥键。这通常称为“scFv×dsIL-15/Rα”或dsIL-15/Rα×scFv，其中“ds”代表“二硫键”。
参看图57C，scFv×dsIL-15/Rα形式包含与异源二聚体Fc区的N端融合的scFv，其中IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc的另一侧融合，而分别转染IL-15以使得由于工程化的半胱氨酸而形成共价IL-15/Rα复合物。
在scFv×dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在sscFv×dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体S364K/E357Q(scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含由N端到C端的：i)具有半胱氨酸残基的变体IL-15寿司结构域；ii)第一结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；b)第二单体，其包含由N端到C端的：i)scFv结构域；ii)第二结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；其中scFv结构域包含第一可变重链结构域、scFv连接子和第一可变轻链结构域；和c)包含有包含半胱氨酸残基的IL-15结构域的第三单体；其中变体IL-15寿司结构域和变体IL-15结构域形成二硫键，并且scFv结构域结合人类CD8、NKG2A或NKG2D。
scIL-15/Rα×Fab
这个实施例示于图57D中，并且包含三种单体。第一单体包含由N端到C端的寿司结构域-结构域连接子-IL-15-结构域连接子-CH2-CH3，并且第二单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是轻链VL-CL。这通常称为“scIL-15/Rα×Fab”，其中“sc”代表“单链”。在图60A、60B、61A、61B、66A、66B、87、92A、92B、92C、97A、97B和102中找到这个实施例的变体的优选组合。
参看图57D，scIL-15/Rα×Fab(或Fab×scIL-15/Rα￡
Figure BDA0002383970270000851
形式包含通过可变长度的连接子(称为“scIL-15/Rα”)与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)，然后将其与异源二聚体Fc区的N端融合，其中可变重链(VH)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。这类异源二聚体蛋白的说明性实施例可以是XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24736、XENP24917、XENP、24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP27145、XENP27145和XENP27146。
在scIL-15/Rα×Fab形式中，一个优选实施例利用具有图102中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，scIL-15/Rα×Fab的Il-15复合物利用图102中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP26585。
在一些实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图97A中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图97A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP26223。
在其它实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图97A中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图97A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP26224。
在各种实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图97B中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图97B中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP26227。
在某些实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图97B中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图97B中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP26229。
在一些实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图92A中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图92A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24917。
在其它实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图92B中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图92B中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24918。
在一些实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图92B中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图92B中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24919。
在一个实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图87中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图87中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24736。
在另一个实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图66A中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图66A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24114。
在又一个实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图66A中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图66A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24115。
在另一个实施例中，scIL-15/Rα×抗CD8异源二聚体蛋白利用具有图66A中描绘的序列的抗CD8 ABD。在一些实施例中，蛋白质的IL-15复合物利用图66A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24116。
在scIL-15/Rα×Fab形式中，一个优选实施例利用具有图61A中描绘的序列的抗NKG2D ABD。在一些实施例中，scIL-15/Rα×Fab的Il-15复合物利用图61A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24533。
在scIL-15/Rα×Fab形式中，一个优选实施例利用具有图61A中描绘的序列的抗NKG2D ABD。在一些实施例中，scIL-15/Rα×Fab的Il-15复合物利用图61A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24534。
在scIL-15/Rα×Fab形式中，一个优选实施例利用具有图61B中描绘的序列的抗NKG2D ABD。在一些实施例中，scIL-15/Rα×Fab的Il-15复合物利用具有图61B中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24535。
在scIL-15/Rα×Fab形式中，一个优选实施例利用具有图60A中描绘的序列的抗NKG2A ABD。在一些实施例中，scIL-15/Rα×Fab的Il-15复合物利用图60A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24531。
在scIL-15/Rα×Fab形式中，一个优选实施例利用具有图60A中描绘的序列的抗NKG2A ABD。在一些实施例中，scIL-15/Rα×Fab的Il-15复合物利用图60A中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP24532。
在另一个实施例中，异源二聚体蛋白利用具有图60B中描绘的序列的抗NKG2AABD。在一些实施例中，scIL-15/Rα×Fab的Il-15复合物利用图60B中描绘的序列。在一些情况下，异源二聚体蛋白是XENP27146。
在scIL-15/Rα×Fab形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在scIL-15/Rα×Fab形式中，一个优选实施例利用偏斜变体S364K/E357Q(抗CD8单体、抗NKG2A单体或抗NKG2D单体上)和L368D/K370S(IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含由N端到C端的：i)IL-15寿司结构域；ii)第一结构域连接子；iii)变体IL-15结构域；iv)第二结构域连接子；v)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和b)包含有包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链的第二单体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)包含VL-CL的轻链；其中VH和VL形成结合人类CD8、NKG2A或NKG2D的抗原结合结构域。
Fab×ncIL-15/Rα
这个实施例示于图57E中，并且包含四种单体。第一单体包含由N端到C端的寿司结构域-结构域连接子-CH2-CH3，并且第二单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是IL-15结构域。第四单体是轻链VL-CL。这通常被称为“Fab×ncIL-15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”，是指IL-15和寿司结构域的自组装非共价连接。对于本实施例的变体的优选组合在图92C中找到。
参看图57E，Fab×ncIL-15/Rα(或ncIL-15/Rα×Fab)包含与异源二聚体Fc区的N端融合的VH，IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。这类异源二聚体蛋白的说明性实施例可以是XENP25137。
在Fab×ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在Fab×ncIL-15/Rα形式，一个优选实施例利用偏斜变体S364K/E357Q(scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。
优选实施例利用抗CD8 ABD，并且具有如图92C中所示的人类_IL15Ra(寿司)_Fc(216)_IgG1_pI(-)_等排_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S IL-15Rα(寿司)-Fc链(链1)、IL15_D30N/E64Q/N65D(链2)、OKT8[CD8]_H2_IgG1_PVA_/S267K/S364K/E357Q重链(链3)和OKT8[CD8]_L1轻链(链4)的序列。
在Fab×ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用具有如图92C中所示的人类_IL15Ra(寿司)_Fc(216)_IgG1_pI(-)_等排_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S IL-15Rα(寿司)-Fc链(链1)和IL15_D30N/E64Q/N65D(链2)的序列的ncIL-15/Rα复合物。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含有包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其包含由N端到C端的：i)IL-15寿司结构域；ii)第一结构域连接子；iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；c)包含变体IL-15结构域的第三单体；和d)包含有包含VL-CL的轻链的第四单体；其中VH和VL形成结合人类CD8、NKG2A或NKG2D的抗原结合结构域。
Fab×dsIL-15/Rα
这个实施例示于图57F中，并且包含四种单体。第一单体包含由N端到C端的寿司结构域-结构域连接子-CH2-CH3，其中寿司结构域被工程化成含有半胱氨酸残基，并且第二单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是IL-15结构域，也被工程化成具有半胱氨酸残基，使得在天然细胞条件下形成二硫桥键。第四单体是轻链VL-CL。这通常被称为“Fab×dsIL-15/Rα”，其中“ds”代表“二硫键”，是指IL-15和寿司结构域的自组装非共价连接。
参看图57F，Fab×dsIL-15/Rα(或dsIL-15/Rα×Fab)形式包含与异源二聚体Fc区的N端融合的VH，IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得由于工程化的半胱氨酸而形成共价IL-15/Rα复合物。
在Fab×ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在Fab×dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体S364K/E357Q(scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)包含有包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链的第一单体，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其包含由N端到C端的：i)具有半胱氨酸残基的变体IL-15寿司结构域；ii)第一结构域连接子；和iii)包含CH2-CH3的第二变体Fc结构域；c)包含有包含半胱氨酸残基的变体IL-15结构域的第三单体；和d)包含有包含VL-CL的轻链的第四单体；并且其中变体IL-15寿司结构域和变体IL-15结构域形成二硫键，并且VH和VL形成结合人类CD8、NKG2A或NKG2D的抗原结合结构域。
mAb-scIL-15/Rα
这个实施例示于图57G中，并且包含三种单体(尽管融合蛋白是四聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有scIL-15复合物的重链、VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-寿司结构域-结构域连接子-IL-15。第三(和第四)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“mAb-scIL-15/Rα”，其中“sc”代表“单链”。对于本实施例的变体的优选组合在图79A中找到。
参看图57G，mAb-scIL-15/Rα形式包含与第一和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，IL-15与随后与异源二聚体Fc区中的一个的C端进一步融合的IL-15Rα(寿司)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。这类异源二聚体蛋白的说明性实施例可以是XENP24546。
在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
优选实施例利用抗CD8 ABD，并且具有如图79A中所示的51.1[CD8]_H1-Fc-IL15Rα(寿司)_(GGGGS)5-IL15(单链)、51.1[CD8]_H1L1Fab-Fc重链(链2)和51.1[CD8]_H1L1轻链(链3)的序列。
在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用如图79A中所示的51.1[CD8]_H1-Fc-IL15Rα(寿司)_(GGGGS)5-IL15(单链)的scIL-15/Rα复合物序列。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)包含有包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链的第一单体，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-IL-15寿司结构域-结构域连接子-IL-15变体的第二单体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)包含有包含VL-CL的轻链的第三单体；其中VH和VL结构域结合人类CD8、NKG2A或NKG2D。
mab-ncIL-15/Rα
这个实施例示于图57H中，并且包含四种单体(虽然异源二聚体融合蛋白是五聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有IL-15Rα(寿司)结构域的重链、VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-寿司结构域。第三单体是IL-15结构域。第四(和第五)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“mAb-ncIL-15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”。对于本实施例的变体的优选组合在图79A中找到。
参看图57H，mAb-ncIL-15/Rα形式包含与第一和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc区中的一个的C端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。这类异源二聚体蛋白的说明性实施例可以是XENP24543。
在mAb-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
优选实施例利用抗CD8 ABD，并且具有如图79A中所示的51.1[CD8]_H1L1_Fab-Fc-重链-IL15Rα(寿司)(链1)、51.1[CD8]_H1L1 Fab-Fc重链(链2)、51.1[CD8]_H1L1 Fab-Fc轻链(链3)和IL15(N65D)(链4)的序列。
在mAb-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用如图79A中所示的51.1[CD8]_H1L1_Fab-Fc-重链-IL15Rα(寿司)(链1)和IL15(N65D)(链4)的ncIL-15/Rα复合物序列。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)包含有包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链的第一单体，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-IL-15寿司结构域的第二单体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)包含变体IL-15结构域的第三单体；和d)包含有包含VL-CL的轻链的第四单体；其中VH和VL结构域结合人类CD8、NKG2A或NKG2D。
mAb-dsIL-15/Rα
这个实施例示于图57I中，并且包含四种单体(虽然异源二聚体融合蛋白是五聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有IL-15Rα(寿司)结构域：VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-寿司结构域的重链，其中寿司结构域被工程化成含有半胱氨酸残基。第三单体是IL-15结构域，其已被工程化成含有半胱氨酸残基，使得IL-15复合物在生理条件下形成。第四(和第五)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“mAb-dsIL-15/Rα”，其中“ds”代表“二硫键”。
参看图57I，mAb-dsIL-15/Rα形式包含与第一和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc区中的一个的C端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得由于工程化的半胱氨酸而形成共价连接的IL-15/Rα复合物。
在mAb-dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)包含有包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链的第一单体，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域连接子-IL-15寿司结构域的第二单体，其中所述变体IL-15寿司结构域包含半胱氨酸残基并且其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；c)包含有包含半胱氨酸残基的变体IL-15结构域的第三单体；和d)包含有包含VL-CL的轻链的第四单体；其中变体IL-15寿司结构域和变体IL-15结构域形成二硫键，并且VH和VL结构域结合人类CD8、NKG2A或NKG2D。
中心-IL-15/Rα
这个实施例示于图57J中，并且包含形成四聚体的四种单体。第一单体包含VH-CH1-[任选的结构域连接子]-IL-15-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3，其中第二任选的结构域连接子有时是铰链结构域。第二单体包含VH-CH1-[任选的结构域连接子]-寿司结构域-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3，其中第二任选的结构域连接子有时是铰链结构域。第三(和第四)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“中心-IL-15/Rα”。对于本实施例的变体的优选组合在图79B中找到。
参看图57J，中心-IL-15/Rα形式包含以重组方式与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15的N端融合的VH和以重组方式与随后与异源二聚体Fc的另一侧进一步融合的IL-15Rα(寿司)的N端融合的VH，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。这类异源二聚体蛋白的说明性实施例可以是XENP24547。
在中心-IL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
优选实施例利用抗CD8 ABD，并且具有如图79B中所示的51.1[CD8]_H1-IL15(N4D/N65D)-Fc(链1)、51.1[CD8]_H1-IL15Rα(寿司)-Fc(链2)、51.1[CD8]_H1L1轻链(链3)的序列。
在中心-IL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用如图79B中所示的51.1[CD8]_H1-IL15(N4D/N65D)-Fc(链1)和51.1[CD8]_H1-IL15Rα(寿司)-Fc的IL-15/Rα复合物序列。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含由N端到C端的VH-CH1-结构域连接子-变体IL-15结构域-结构域连接子-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，其包含由N端到C端的VH-CH1-结构域连接子-变体IL-15寿司结构域-结构域连接子-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；和c)包含有包含VL-CL的轻链的第三单体；其中VH和VL形成结合人类CD8、NKG2A或NKG2D的抗原结合结构域。
中心-scIL-15/Rα
这个实施例示于图57K中，并且包含形成四聚体的四种单体。第一单体包含VH-CH1-[任选的结构域连接子]-寿司结构域-结构域连接子-IL-15-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3，其中第二任选的结构域连接子有时是铰链结构域。第二单体包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三(和第四)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“中心-scIL-15/Rα”，其中“sc”代表“单链”。对于本实施例的变体的优选组合在图79B中找到。
参看图57K，中心-scIL-15/Rα形式包含与IL-15Rα(寿司)的N端融合的VH和与异源二聚体Fc的另一侧融合的VH，所述IL-15Rα(寿司)与随后与异源二聚体Fc的一侧融合的IL-15进一步融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。这类异源二聚体蛋白的说明性实施例可以是XENP24548。
在中心-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施例利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
优选实施例利用抗CD8 ABD，并且具有如图79B中所示的51.1[CD8]_H1-IL15Rα(寿司)_(GGGGS)5-IL15-Fc(链1)、51.1[CD8]_H1L1Fab-Fc重链(链2)、51.1[CD8]_H1L1轻链(链3)的序列。
在中心-scIL-15/Rα中，一个优选实施例利用如图79B中所示的51.1[CD8]_H1-IL15Rα(寿司)_(GGGGS)5-IL15-Fc(链1)的scIL-15复合物序列。
在一些实施例中，异源二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含由N端到C端的VH-CH1-结构域连接子-IL-15寿司结构域-结构域连接子-变体IL-15结构域-结构域连接子-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)包含有包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链的第二单体，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)包含有包含VL-CL的轻链的第三单体；其中VH和VL形成结合人类CD8、NKG2A或NKG2D的抗原结合结构域。
在一些实施例中，抗原结合结构域特异性结合人类CD8(例如CD8α链)。人类CD8α链多肽序列阐述于例如Uniprot寄存编号P01732中。所属领域技术人员将理解，CD8包括所有同种型变体。在一些例子中，本发明的异源二聚体蛋白的抗CD8 ABD具有如图66A和66B所示的51.1[CD8]_H1L1 Fab-Fc重链和51.1[CD8]_H1L1轻链的序列。在一些例子中，本发明的异源二聚体蛋白的抗CD8 ABD具有如图81中所示的XENP24025：1C11B3[CD8]_H1L1重链(链1)和1C11B3[CD8]_H1L1轻链(链2)或XENP24321：1C11B3[CD8]_H1L1 Fab-Fc重链(链1)、1C11B3[CD8]_H1L1轻链(链2)和空Fc(链3)的序列。在其它例子中，异源二聚体蛋白的抗CD8ABD具有如图90所示的XENP15075(OKT8_H1L1_IgG1_PVA_/S267K)的序列。在特定例子中，异源二聚体蛋白的抗CD8 ABD具有如图91所示的XENP24920：OKT8[CD8]_H2_IgG1_PVA_/S267K/S364K/E357Q重链(链2)和OKT8[CD8]_L1轻链(链3)的序列。异源二聚体蛋白的抗CD8ABD具有如图97A中所示的XENP26223：OKT8[CD8]_H2.157_IgG1_PVA_/S267K/S364K/E357Q重链(链2)和OKT8[CD8]_L1.103轻链(链3)的序列。在一些例子中，异源二聚体蛋白的抗CD8ABD具有如图102中所示的XENP26585：OKT8[CD8]_H2.157_IgG1_PVA_/S267K/S364K/E357Q/M428L/N434S重链(链2)和OKT8[CD8]_L1.103轻链(链3)的序列。
在一些实施例中，本发明提供包含一种或多种结合CD8的ABD的异源二聚体Fc融合蛋白和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57A-57F中所示的任何形式。在一个实施例中，异源二聚体Fc融合蛋白包含两种与CD8结合的抗原结合结构域和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57G-57K中所示的任何形式。
在一些实施例中，IL-15/IL-15Rα×抗CD8异源二聚体融合蛋白包含具有偏斜变体的Fc结构域，其中根据EU编号，尤其有用的偏斜变体选自由以下组成的群组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370W:S364K；L368E/L370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V:T366W；和T366W/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C。
在其它实施例中，IL-15/IL-15Rα×抗CD8异源二聚体融合蛋白包含具有pI变体的Fc结构域，其中根据EU编号，尤其有用的pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在另一个实施例中，IL-15/IL-15Rα×抗CD8异源二聚体融合蛋白包含具有消融变体的Fc结构域，其中尤其有用的消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在又一实施例中，IL-15/IL-15Rα×抗CD8异源二聚体融合蛋白包含具有FcRn变体的Fc结构域，其中根据EU编号，尤其有用的FcRn变体是428L/434S。
IL-15/IL-15Rα×抗CD8异源二聚体融合蛋白的例示性实施例可包括以下中的任一种：XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24543、XENP24546、XENP24547、XENP24548、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229和XENP26585。有用的形式在图66A、66B、79A、79B、87、92A、92B、92C、97A和97B中表示。
在其它实施例中，抗原结合结构域特异性结合人类NKG2A。人类NKG2A多肽序列阐述于例如Uniprot寄存编号P26715中。所属领域技术人员将理解，NKG2A包括所有同种型变体。在一些例子中，本发明的异源二聚体蛋白的抗NKG2A ABD具有如图60A和60B中所示的莫纳珠单抗[NKG2A]_H1L1 Fab-Fc重链和莫纳珠单抗[NKG2A]_H1L1轻链的序列。在一些实施例中，本发明提供一种双功能异源二聚体Fc融合蛋白，其包含与NKG2A结合的ABD和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57A-57F中所示的任何形式。在一个实施例中，双功能异源二聚体Fc融合蛋白包含两种与NKG2A结合的抗原结合结构域和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57G-57K中所示的任何形式。IL-15/IL-15Rα×抗NKG2A异源二聚体融合蛋白(例如，scIL-15/Rα×抗NKG2A Fab形式)的例示性实施例可以包括XENP24531、XENP24532和XENP27146中的任一种。
在另一个实施例中，抗原结合结构域特异性结合人类NKG2D。人类NKG2D多肽序列阐述于例如Uniprot寄存编号P26718中。所属领域技术人员将理解，NKG2D包括所有同种型变体。在一些例子中，本发明的异源二聚体蛋白的抗NKG2A ABD具有如图61A和61B中所示的MS[NKG2D]_H0L0 Fab-Fc重链和MS[NKG2D]_H0L0轻链的序列。在一些实施例中，本发明提供一种双功能异源二聚体Fc融合蛋白，其包含与NKG2D结合的ABD和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57A-57F中所示的任何形式。在一个实施例中，双功能异源二聚体Fc融合蛋白包含两种与NKG2D结合的抗原结合结构域和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57G-57K中所示的任何形式。IL-15/IL-15Rα×抗NKG2D异源二聚体融合蛋白(例如，scIL-15/Rα×抗NKG2D Fab形式)的例示性实施例可包括XENP24533、XENP24534和XENP27145中的任一种。
在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域可具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：[S364K/E357Q:L368D/K370S]；[S364K/E357Q:L368E/K370S]；[L368D/K370W:S364K]；[L368D/K370S:S364K]；[L368E/L370S:S364K]；[L368E/K370S:S364K]；[T411T/K360E/Q362E:D401K]；[L368D/K370S:S364K/E357L]；[K370S:S364K/E357Q]；[T366S/L368A/Y407V:T366W]；[T366S/L368A/Y407V/Y394C:T366W/S354C]；和[T366W/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C]。在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在其它例子中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。在一些例子中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由428L/434S(例如M428L/N434S)组成的氨基酸取代。
在其它方面，本文提供选自由以下组成的群组的双功能异源二聚体蛋白：XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24543、XENP24546、XENP24547、XENP24548、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145和XENP27146。
除了制备这些蛋白质和用其治疗患者的方法之外，还提供核酸、表达载体和宿主细胞。
一方面，本文所述的异源二聚体蛋白包含(a)包含IL-15Rα蛋白、IL-15蛋白和第一Fc结构域的IL-15/IL-15Rα融合蛋白，其中IL-15Rα蛋白使用第一结构域连接子共价连接于IL-15蛋白的N端，并且IL-15蛋白使用第二结构域连接子共价连接于第一Fc结构域的N端，或其中IL-15蛋白使用第一结构域连接子共价连接于IL-15Rα蛋白的N端，并且IL-15Rα蛋白使用第二结构域连接子共价连接于第一Fc结构域的N端；和(b)包含重链和轻链的抗原结合结构域单体，所述重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是可变重链并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述轻链包含可变轻链和轻链恒定结构域(例如，VL-CL)；其中根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q在一些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在特定实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。IL-15蛋白可具有选自由SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)和SEQ ID NO:2(截短的人类IL-15)组成的群组的氨基酸序列，并且IL-15Rα蛋白具有选自由SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)和SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)组成的群组的氨基酸序列。在一些实施例中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。IL-15蛋白可具有一个或多个选自由D61N、N65D和Q108E组成的群组的氨基酸取代。在一些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代D61N、N65D或Q108E。在其它实施例中，IL-15蛋白具有D61N/N65D、D61N/Q108E或N65D/Q108E的氨基酸取代。在特定实施例中，IL-15蛋白具有D61N/N65D/Q108E的氨基酸取代。在一些实施例中，抗原结合结构域单体与选自由CD8、NKG2A和NKG2D组成的群组的抗原结合。换句话说，抗原结合结构域单体可以结合CD8。抗原结合结构域单体可以结合NKG2A。在一些情况下，抗原结合结构域单体可以结合NKG2D。在一些实施例中，抗原结合结构域单体是Fab。异源二聚体蛋白在本文中可以称为“scIL-15/Rα(寿司)×Fab b”。在一些实施例中，异源二聚体蛋白是XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533或图66A、图66B、图60A或图61A中描绘的那些。在其它实施例中，上文所述的异源二聚体蛋白也包括使用结构域连接子共价连接于所述IL-15蛋白或IL-15Rα蛋白的N端的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域。这类异源二聚体蛋白可以是XENP24548或图79B中描绘的那些。
另一方面，本文所述的双功能异源二聚体蛋白包含(a)包含第一蛋白结构域和第一Fc结构域的融合蛋白，其中所述第一蛋白结构域使用结构域连接子共价连接于第一Fc结构域的N端；(b)共价连接于第一蛋白结构域非的第二蛋白结构域；和(c)包含重链和轻链的抗原结合结构域单体，所述重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是可变重链并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述轻链包含可变轻链和轻链恒定结构域(例如，VL-CL)。根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域可以具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；
S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，并且第一蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白，并且第二蛋白结构域包含IL-15蛋白，或者第一蛋白结构域包含IL-15蛋白，并且第二蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白。在一些实施例中，根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在某些实施例中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。IL-15蛋白可具有选自由SEQ IDNO:1(全长人类IL-15)和SEQ ID NO:2(截短的人类IL-15)组成的群组的氨基酸序列，并且IL-15Rα蛋白可具有选自由SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)和SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)组成的群组的氨基酸序列。在各种实施例中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。IL-15蛋白可具有一个或多个选自由D61N、N65D和Q108E组成的群组的氨基酸取代。在一些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代D61N、N65D或Q108E。在其它实施例中，IL-15蛋白具有D61N/N65D、D61N/Q108E或N65D/Q108E的氨基酸取代。在特定实施例中，IL-15蛋白具有D61N/N65D/Q108E的氨基酸取代。在一些实施例中，抗原结合结构域单体与选自由CD8、NKG2A和NKG2D组成的群组的抗原结合。换句话说，抗原结合结构域单体可以结合CD8。抗原结合结构域单体可以结合NKG2A。在一些情况下，抗原结合结构域单体可以结合NKG2D。在一些实施例中，抗原结合结构域单体是Fab。这类异源二聚体蛋白在本文中可以被称为“ncIL-15/Rα×Fab”。在一些例子中，异源二聚体蛋白可以是XENP25137或图57E和图92C中描绘的蛋白。在某些实施例中，抗原结合结构域单体是scFv，而不是Fab。这类异源二聚体蛋白在本文中可以称为“ncIL-15/Rα×scFv”，并且描绘于图57B中。
在其它实施例中，异源二聚体蛋白包含使用一个或多个结构域连接子共价连接于IL-15蛋白和/或IL-15Rα蛋白的N端的抗原结合结构域，其中抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域。例如2017年6月30日提交的US62/527,898的图1I、1L或1K中表示的异源二聚体蛋白。
在另一个方面，本文所述的异源二聚体蛋白包含(a)包含第一重链和第一轻链的第一抗原结合结构域单体，所述第一重链包含第一VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第一可变重链，并且CH2-CH3是第一Fc结构域，所述第一轻链包含第一可变轻链和第一光恒定结构域；b)包含第二重链、第二轻链和第一蛋白结构域的第二抗原结合结构域单体，所述第二重链包含第二VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第二可变重链，并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述第二轻链包含第二可变轻链和第二轻链恒定结构域，所述第一蛋白结构域使用第一结构域连接子共价连接于所述第二Fc结构域的C端；和c)连接或非共价连接于第二抗原结合结构域单体的第一蛋白结构域的第二蛋白结构域；其中根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q。根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域可具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域可具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。IL-15蛋白可具有选自由SEQ IDNO:1(全长人类IL-15)和SEQ ID NO:2(截短的人类IL-15)组成的群组的氨基酸序列，并且IL-15Rα蛋白可具有选自由SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)和SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)组成的群组的氨基酸序列。在各种实施例中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。IL-15蛋白可具有一个或多个选自由D61N、N65D和Q108E组成的群组的氨基酸取代。在一些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代D61N、N65D或Q108E。在其它实施例中，IL-15蛋白具有D61N/N65D、D61N/Q108E或N65D/Q108E的氨基酸取代。在特定实施例中，IL-15蛋白具有D61N/N65D/Q108E的氨基酸取代。在优选实施例中，IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。在优选实施例中，IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一些实施例中，第一抗原结合结构域单体和第二抗原结合结构域单体与选自由CD8、NKG2A和NKG2D组成的群组的抗原结合。在其它实施例中，第一抗原结合结构域单体或第二抗原结合结构域单体与选自由CD8、NKG2A和NKG2D组成的群组的抗原结合。换句话说，抗原结合结构域单体可以结合CD8。抗原结合结构域单体可以结合NKG2A。在一些情况下，抗原结合结构域单体可以结合NKG2D。在一些实施例中，第一和第二抗原结合结构域单体形成单克隆抗体(mAb)。这类异源二聚体蛋白在本文中可以被称为“mAb-scIL-15/Rα”。在一些情况下，异源二聚体蛋白可以是XENP25137或图57G和图79A中描绘的那些。
另一方面，本文所述的异源二聚体蛋白包含(a)包含IL-15蛋白、第一抗原结合结构域和第一Fc结构域的IL-15融合蛋白，其中第一抗原结合结构域使用第一结构域连接子共价连接于IL-15蛋白的N端，IL-15蛋白使用第二结构域连接子共价连接于第一Fc结构域的N端，并且抗原结合结构域包含第一可变重链结构域和第一可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域；(b)包含IL-15Rα蛋白、第二抗原结合结构域和第二Fc结构域的IL-15Rα融合蛋白，其中第二抗原结合结构域使用第三结构域连接子共价连接于IL-15Rα蛋白的N端，IL-15Rα蛋白使用第四结构域连接子共价连接于第二Fc结构域的N端，并且第二抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域；其中根据EU编号，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q。根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域可具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域可具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。IL-15蛋白可具有选自由SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)和SEQ ID NO:2(截短的人类IL-15)组成的群组的氨基酸序列，并且IL-15Rα蛋白可具有选自由SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)和SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)组成的群组的氨基酸序列。在各种实施例中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。IL-15蛋白可具有一个或多个选自由D61N、N65D和Q108E组成的群组的氨基酸取代。在一些实施例中，IL-15蛋白具有氨基酸取代D61N、N65D或Q108E。在其它实施例中，IL-15蛋白具有D61N/N65D、D61N/Q108E或N65D/Q108E的氨基酸取代。在特定实施例中，IL-15蛋白具有D61N/N65D/Q108E的氨基酸取代。在优选实施例中，IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。在一些实施例中，第一抗原结合结构域单体和第二抗原结合结构域单体与选自由CD8、NKG2A和NKG2D组成的群组的抗原结合。在其它实施例中，第一抗原结合结构域单体或第二抗原结合结构域单体与选自由CD8、NKG2A和NKG2D组成的群组的抗原结合。换句话说，抗原结合结构域单体可以结合CD8。抗原结合结构域单体可以结合NKG2A。在一些情况下，抗原结合结构域单体可以结合NKG2D。在一些实施例中，异源二聚体蛋白是XENP24547或如图57J和图79B中所示。
本文还提供一种核酸组合物，其包含一种或多种编码本文所述的双功能异源二聚体蛋白中的任一种的核酸。另一方面，本发明提供一种表达载体组合物，其包含一个或多个表达载体，每个载体包含核酸，使得一个或多个表达载体编码本文所述的任何一种异源二聚体蛋白。在其它方面，提供包含任何一种核酸组合物或表达载体组合物的宿主细胞。另一方面，本发明提供一种产生本文所述的任何一种异源二聚体蛋白的方法。所述方法包含(a)在其中异源二聚体蛋白被表达的合适条件下培养这类宿主细胞，和(b)回收异源二聚体蛋白。又另一方面，本发明提供一种治疗患者(例如人类患者)的癌症的方法，其包含向所述患者施用治疗有效量的本文公开的任何一种异源二聚体蛋白。在一些例子中，本文提供一种治疗有需要的患者的癌症的方法。
VIII.本发明的核酸
本发明进一步提供编码本发明的双功能IL-15/IL-15Rα×抗原结合结构域异源二聚体融合蛋白的核酸组合物。
如所属领域技术人员将理解，核酸组合物将取决于双功能异源二聚体融合蛋白的形式。因此，例如，当形式需要三个氨基酸序列时，可以将三个核酸序列并入一个或多个表达载体中以用于表达。类似地，一些形式仅需要两个核酸；再次，其可以被放入一个或两个表达载体中。
如所属领域已知，编码本发明组分的核酸可以如所属领域已知的那样并入表达载体中，并且取决于用于产生本发明的双功能异源二聚体融合蛋白的宿主细胞。通常，核酸与任何数量的调节元件(启动子、复制起点、选择标记、核糖体结合位点、诱导物等)可操作地连接。表达载体可以是染色体外的或整合载体。
然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到所属领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如CHO细胞)在许多实施例中使用。
在一些实施例中，编码每种单体的核酸(取决于形式适用)各自包含在单一表达载体内，通常在不同或相同的启动子控制下。在特别用于本发明的实施例中，不同表达载体上都含有这两种或三种核酸中的每一种。如本文中和美国临时申请第62/025,931号、美国专利申请公开案第2015/0307629号和国际专利公开案第WO 2015/149077号(其所有以引用的方式并入本文中)所示，不同载体比例可用于驱使异源二聚体形成。也就是说，令人惊讶地，尽管蛋白质以1:1:2的比例包含第一单体:第二单体:轻链(例如具有三个包含异源二聚抗体的多肽的实施例)，但这些比例并不是产生最佳结果的比例。
如所属领域所熟知，通过培养包含表达载体的宿主细胞制备本发明的双功能异源二聚体融合蛋白。一旦产生，就进行传统的融合蛋白或抗体纯化步骤，包括离子交换色谱步骤。如本文所讨论，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，将改变每种单体的等电点(pI)的pI取代纳入，使得每种单体具有不同pI并且异二聚体也具有不同pI，从而促进异源二聚体的等电纯化(例如阴离子交换色谱、阳离子交换色谱)。这些取代还有助于确定和监测纯化后任何污染的同源二聚体(例如，IEF凝胶、cIEF和分析IEX柱)。
IX.双功能IL-15/IL-15Rα×抗原结合结构域异源二聚体融合蛋白的生物学和生化功能
通常，向患有癌症的患者施用本发明的双功能IL-15/IL-15Rα×抗原结合结构域异源二聚体融合蛋白，并且以本文所述的多种方式评定功效。因此，虽然可以进行标准的功效分析，例如癌症负荷、肿瘤尺寸、转移的存在或程度的评估等，但是也可以基于免疫状况评估来评定免疫肿瘤学治疗。这可以通过多种方式完成，包括体外和体内分析。举例来说，可以进行免疫状态(例如伊匹单抗(ipilimumab)治疗之后ICOS+CD4+T细胞的存在)以及其它测量值(例如肿瘤负荷、尺寸、侵袭性、淋巴结(LN)受累、转移等)的变化的评估。因此，可以评估以下中的任一个或全部：PVRIG对CD4+T细胞活化或增殖、CD8+T(CTL)细胞活化或增殖、CD8+T细胞介导的细胞毒性活性和/或CTL介导的细胞耗竭、NK细胞活性和NK介导的细胞耗竭的抑制作用；检查点对Treg细胞分化和增殖和Treg或骨髓来源的抑制细胞(MDSC)介导的免疫抑制或免疫耐受性的增强作用；和/或检查点对通过免疫细胞产生的促炎性细胞因子的影响，例如通过T细胞或其它免疫细胞产生的IL-2、IFN-□或TNF-α。
在一些实施例中，通过使用例如CFSE稀释法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色以及3H-胸苷并入法评估免疫细胞增殖来评定治疗。
在一些实施例中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白质含量的增加来进行治疗的评定，所述标志物包括以下中的一个或多个：CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A的表面表达测量的细胞脱粒。
通常，如所属领域已知的那样进行基因表达分析。
通常，也如所属领域已知的那样类似地进行蛋白质表达测量。
在一些实施例中，通过估计众多细胞参数来评定通过靶细胞活力检测测量的细胞毒性活性，从而进行治疗的评定，所述细胞参数例如酶活性(包括蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生以及核苷酸吸收活性。这些分析的具体实例包括但不限于台盼蓝(Trypan Blue)或PI染色、51Cr或35S释放法、LDH活性、MTT和/或WST分析、钙黄绿素-AM分析、基于发光的分析以及其它分析。
在一些实施例中，通过评定由细胞因子产生测量的T细胞活性，使用细胞因子，使用众所周知的技术，细胞内测量培养物上清液来评定治疗，所述细胞因子包括但不限于：IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13。
因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδT细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)IL-2分泌的增加；(viii)干扰素□产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi)减少或消除调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性。。
A.测量功效和效能的分析
在一些实施例中，使用如所属领域已知的混合淋巴细胞反应(MLR)分析来评定T细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量免疫反应的增加或减少，如例如通过不同因子的磷酸化或去磷酸化或通过测量其它翻译后修饰所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞活化的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量细胞毒性T细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量NK和/或NKT细胞活性的增加或减少，如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过如例如CD107a等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量促炎性细胞因子分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量IL-2分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量干扰素□产生的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量Th1反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量Th2反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量M2巨噬细胞细胞数量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量M2巨噬细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量N2嗜中性粒细胞增量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量N2嗜中性粒细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量T细胞活化抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量CTL活化抑制的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞耗竭的增加或减少，如例如通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD45RA、CCR7等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导路径分析测量癌细胞的凋亡或溶解的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、15Cr释放、钙黄绿素AM)或通过基于流式细胞术的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的刺激的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、15Cr释放、钙黄绿素AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量癌细胞的直接杀伤的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、15Cr释放、钙黄绿素AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量Th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、15Cr释放、钙黄绿素AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或活化标志物(例如CD137、CD107a、PD1等)的表达变化来测量T细胞活化。对于T细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如CD25、CD69、CD137、PD1)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过活化标志物(例如CD107a等)的表达变化来测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖、细胞毒性(杀伤靶细胞并且增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如IFNγ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化来测量γδT细胞活化。
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化来测量Th1细胞活化。
相比参考样品或对照样品，例如不含本发明的IL-15/IL-15Rα×抗原结合结构域异源二聚体融合蛋白的测试样品中的信号，活性或反应的适当增加(或如上所述适当减少)是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％到99％的增加。类似地，与参考或对照样品相比，增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍显示功效。
X.治疗
一旦制备，通过治疗癌症，通常通过与本发明的异源二聚体Fc融合蛋白的结合促进T细胞活化(例如不再抑制T细胞)，本发明的组合物可用于许多肿瘤学应用。
因此，本发明的双功能异源二聚体组合物可用于治疗这些癌症。
A.用于体内施用的双功能异源二聚体蛋白组合物
在一些实施例中，本发明的双功能异源二聚体蛋白与单独的抗体共同施用。如所属领域技术人员将理解，共同施用可以同时或依序进行。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本发明使用的抗体的配制物(如《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》第16版,Osol,A.编[1980]中通常概述)，用于以冻干配制物或水溶液形式储存。可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
B.施用方式
向个体施用根据已知方法将本发明的双功能异源二聚体蛋白，例如以推注静脉内施用或通过在一段时间内连续输注。如所属领域技术人员将理解，双功能异源二聚体蛋白和化学治疗剂的施用可以同时或依序进行。
C.治疗方式
在本发明的方法中，疗法用于提供关于疾病或病况的阳性治疗反应。“阳性治疗反应”旨在改善疾病或病况，和/或改善与疾病或病况相关的症状。举例来说，阳性治疗反应是指疾病中的一种或多种以下改善：(1)肿瘤细胞数量的减少；(2)肿瘤细胞死亡增加；(3)抑制肿瘤细胞存活；(5)肿瘤生长的抑制(即，在某种程度上减慢，优选停止)；(6)提高患者生存率；(7)与疾病或病况相关的一种或多种症状有所缓解。
在任何给定疾病或病况中的阳性治疗反应可以通过对所述疾病或病况特异的标准化反应标准来确定。可以使用筛选技术，例如磁共振成像(MRI)扫描、x射线照相术、计算机断层摄影术(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包括骨髓穿刺(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数来评定针对肿瘤形态(即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)变化的肿瘤应答。
除了这些阳性治疗反应之外，接受疗法的个体可以经历改善与疾病相关的症状的有益效果。
根据本发明的治疗包括所用药物的“治疗有效量”。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果的量。
治疗有效量可以根据因素而变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在个体中引发期望的应答的能力。治疗有效量还是双功能异源二聚体蛋白、抗原结合结构域或其部分的任何毒性或有害效果被治疗有益效果超过的量。
用于肿瘤疗法的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。可以在预示人类肿瘤的功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。
可替代地，组合物的这种特性可以通过有经验的医师所知的体外分析检查化合物或组合物的抑制细胞生长或诱导凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物或组合物能减小肿瘤尺寸，或以其它方式改善个体的症状。所属领域普通技术人员将能够基于诸如个体的大小、个体症状的严重性和所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定这样的量。
调整剂量方案以提供最佳的所期望反应(例如，治疗反应)。举例来说，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以单位剂型配制，以便于施用和使剂量均匀。如本文所用的单位剂型是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有预定量的活性化合物，其经过计算可与所期我的药物载体一起产生所期望的治疗效果。
本发明的单位剂型的规格由以下各项指定并且直接取决于以下各项：(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果；和(b)混配这类活性化合物用于治疗个体敏感性在所属领域中固有的限制。
本发明中所用的双功能异源二聚体蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况并且可以由所属领域的技术人员来确定。
所有引用的参考文献以全文引用的方式明确地并入本文中。
尽管以上为了说明的目的描述本发明的特定实施例，但是所属领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可以进行细节的许多变化。
实例
以下提供实例以说明本发明。这些实例并不意味着将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中所论述的所有恒定区位置，根据如Kabat中的EU索引(Kabat等人,1991,《免疫学相关蛋白质序列》第5版,美国公共卫生服务部,美国国家卫生研究院,贝塞斯达，其以引用的方式整体并入本文中)。抗体领域中的技术人员将了解这个规约由以下组成：免疫球蛋白序列的特定区域的非顺序编号、对免疫球蛋白家族中的保守位置实现标准化的称呼。因此，由EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。
在美国公开申请第2015/0307629号和第2014/0288275号以及国际专利公开案第WO2014/145806号中概述了一般和具体的科学技术，所有这些技术都以全文引用的方式明确地并入，并且尤其是其中概述的技术。
实例1：IL-15/IL-15Rα Fc融合蛋白
1A：工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白
为了解决IL-15/IL-15Rα异源二聚体的短半衰期，生成IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物作为Fc融合物(本文中称为IL-15/Rα-Fc融合蛋白)，旨在促进生产和促进FcRn介导的复合物循环和延长半衰期。
通过标准基因合成构筑编码IL-15或IL-15Rα寿司结构域的质粒，然后将其亚克隆到含有Fc融合搭配物(例如，如图8中描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。图16A-16G中描绘说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式的卡通示意图。
IL-15/Rα-异源Fc形式的说明性蛋白质(图16A)包括XENP20818和XENP21475，其序列描绘于图17中。scIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图16B)包括XENP21478和XENP21993，其序列描绘于图18中。ncIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图16C)包括XENP21479、XENP22366和XENP24348，其序列描绘于图19中。二价ncIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图16D)是XENP21978，其序列描绘于图20中。图21中描绘二价scIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质的序列(图16E)。Fc-ncIL-15/Rα形式的说明性蛋白质(图16F)是XENP22637和XENP22638，其序列描绘于图22中。Fc-scIL-15/Rα形式的说明性蛋白质的序列(图16G)描绘于图23中。
蛋白质通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。
在细胞增殖分析中测试如上所述的各种形式的IL-15/Rα-Fc融合蛋白。用指定浓度的测试品处理人类PBMC。处理4天后，PBMC用抗CD8-FITC(RPA-T8)、抗CD4-PerCP/Cy5.5(OKT4)、抗CD27-PE(M-T271)、抗CD56-BV421(5.1H11)、抗CD16-BV421(3G8)和抗CD45RA-BV605(Hi100)染色以便对以下细胞类型进行门控：CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞(CD56+/CD16+)。Ki67是与细胞增殖严格相关的蛋白质，并且使用抗Ki67-APC(Ki-67)和Foxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Mass.))进行细胞内Ki67的染色。使用FACS测量上述细胞类型上的Ki67的百分比(描绘于图24A-24C和25A-25C)。各种IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导CD8+T细胞和NK细胞的强烈增殖。值得注意的是，增殖活性的差异取决于IL-15-Fc侧的连接子长度。特别地，没有连接子(仅铰链)的构筑体，包括XENP21471、XENP21474和XENP21475，表现出较弱的增殖活性。
1B：具有工程化二硫键的IL-15/Rα-Fc融合蛋白
为了进一步提高稳定性并且延长IL-15/Rα-Fc融合蛋白的半衰期，将二硫键工程化到IL-15/Rα界面。通过检查IL-15/Rα复合物的晶体结构，以及通过使用分子操作环境(Molecular Operating Environment(MOE)；加拿大魁北克省蒙特利尔化学计算集团(Chemical Computing Group，Montreal，Quebec，Canada))软件建模，预测IL-15/Rα界面处的残基可以被半胱氨酸取代以形成共价二硫键，如图26中所描绘。另外，在IL-15Rα中的寿司结构域后多达三个氨基酸被添加到IL-15Rα(寿司)的C端，作为工程化的半胱氨酸的骨架(其说明性序列在图27中描绘)。图28和29中分别描绘用半胱氨酸工程化的说明性IL-15和IL-15Rα(寿司)变体的序列。
通过标准基因合成构筑编码IL-15或IL-15Rα(寿司)的质粒，然后亚克隆到含有Fc融合搭配物(例如，如图8中所描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。通过标准诱变技术将如上所述鉴定的残基被半胱氨酸取代。图30A-30D中描绘具有工程化二硫键的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的卡通示意图。
dsIL-15/Rα-异源Fc形式的说明性蛋白质(图30A)包括XENP22013、XENP22014、XENP22015和XENP22017，其序列描绘于图31中。dsIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图30B)包括XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22684和XENP22361，其序列描绘于图32中。dsIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图30C)包括XENP22634、XENP22635、XENP22636和XENP22687，其序列描绘于图33中。Fc-dsIL-15/Rα形式的说明性蛋白质(图30D)包括XENP22639和XENP22640，其序列描绘于图34中。
通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生蛋白质，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。
在纯化蛋白质后，通过毛细管等电聚焦(CEF)表征其纯度和均一性。使用LabChipGXII Touch HT(PerkinElmer,Waltham,Mass.)，使用Protein Express Assay LabChip和Protein Express Assay Reagent Kit，使用制造商的说明书进行CEF。样品一式两份进行，一次在还原条件下(用二硫苏糖醇)，另一次在非还原条件下。正如变性非还原性CEF所示，正确形成了许多二硫键，其中与没有工程化二硫键的对照相比，可以看到共价复合物的较大分子量(图35)。
然后在细胞增殖分析中测试蛋白质。将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化的二硫键)或对照与PBMC一起培育4天。培育后，PBMC用抗CD4-PerCP/Cy5.5(RPA-T4)、抗CD8-FITC(RPA-T8)、抗CD45RA-BV510(HI100)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD56-BV421(HCD56)、抗CD27-PE(O323)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群，并且通过FACS加以分析。图36A-36C中描绘如Ki67表达所指示的NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。每种IL-15/Rα-Fc融合蛋白和IL-15对照都诱导NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的强烈增殖。
1C：为降低效能并且增加PK和半衰期而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白
为了进一步改善PK并且延长半衰期，推断降低IL-15的效能会降低抗原沉降，并且因此增加半衰期。通过检查IL-15:IL-2Rβ和IL-15:共同γ链界面的晶体结构，以及通过使用MOE软体建模，预测这些界面处的残基可以被取代以降低效能。图37描绘展示预测残基的位置的IL-15:受体复合物的结构模型，其中工程化等排取代(以降低免疫原性风险)。图3中描绘为效能降低而设计的说明性IL-15变体的序列。
通过标准基因合成构筑编码IL-15或IL-15Rα(寿司)的质粒，然后亚克隆到含有Fc融合搭配物(例如，如图8A-8D中描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。通过标准诱变技并入如上所述鉴定的取代。图39A-39E中描绘为效能降低而工程化的“IL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图40A-40D中描绘为效能降低而工程化的“scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图41A-41B中描绘为效能降低而工程化的“ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图42中描绘为效能降低而工程化的说明性ncIL-15/Rα异源二聚体的序列。图43中描绘为效能降低而工程化的“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图44中描绘为效能降低而工程化的“dsIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。
通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生蛋白质，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。
1C(a)：为效能降低而工程化的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白的体外活性
在许多细胞增殖分析中测试变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白。
在第一次细胞增殖分析中，将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化取代)或对照与PBMC一起培育4天。培育后，PBMC用抗CD4-Evolve605(SK-3)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD56-eFluor450(TULY56)、抗CD3-FITC(OKT3)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群并且通过FACS分析。图45-46中描绘如Ki67表达所指示的NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的增殖。大多数IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导每个细胞群的增殖；然而，活性根据特定的工程取代而变化。
在第二次细胞增殖分析中，将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化取代)与PBMC一起培育3天。培育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4-Evolve604(SK-3)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD56-eFluor450(TULY56)、抗CD27-PE(O323)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗Ki67-APC(20Raj1)抗体染色以标记各种细胞群。首先基于侧向散射(SSC)和前向散射(FSC)对淋巴细胞进行门控。然后基于CD3表达对淋巴细胞进行门控。基于CD16表达进一步门控CD3表达阴性的细胞以鉴定NK细胞(CD16+)。基于CD4和CD8表达进一步门控CD3+T细胞以鉴定CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδT细胞(CD3+CD4-CD8-)。针对CD45RA表达对CD4+T细胞和CD8+T细胞进行门控。最后，基于Ki67表达百分比确定各种细胞群的增殖，并且数据示于图47A-D中。NK和CD8+T细胞比CD4+T细胞对IL-15/Rα-Fc融合蛋白更敏感，并且如上所述，增殖活性根据特定的工程化取代而变化。图47D显示各种IL-15/Rα-Fc融合蛋白相对于对照XENP20818的EC50倍数变化。图48A和48B进一步描绘在PBEN与XENP22821一起培育之前和之后，通过针对CD69和CD25(T细胞活化标记物)的表达进行门控，用IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后淋巴细胞的活化。
在第三个实验中，在37℃下将额外变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人类PBMC一起培育3天。培育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4-SB600(SK-3)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD25-PE(M-A251)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群并且通过FACS分析。图49A-49D中描绘如Ki67表达所指示的CD8+(CD45RA-)T细胞、CD4+(CD45RA-)T细胞、γδT细胞和NK细胞的增殖。
在第四个实验中，将人类PBMC与指定浓度的额外IL-15/Rα-Fc变体一起培育3天。培育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4(SB600)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD25-PE(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗Ki67-APC(Ki67)染色，并且通过FACS分析。处理后CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞上Ki67的百分比描绘于图50中。
在第五个实验中，在37℃下将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人类PBMC一起培育3天。培育后，细胞用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(SK1)、抗CD8β-APC(2ST8.5H7)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD56-BV605(NCAM16.2)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色并且通过FACS分析。图51A-51E中描绘CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK细胞上Ki67的百分比。
在第六个实验中，在37℃下将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人类PBMC一起培育3天。培育后，细胞用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(SK1)、抗CD8β-APC(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD56-BV605(NCAM16.2)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色并且通过FACS分析。图52A-52E中描绘CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK细胞上Ki67的百分比。
在第七个实验中，在37℃下将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与指定浓度的人类PBMC一起培育3天。培育后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并且通过FACS分析。图53A-D中描绘CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK(CD16+)细胞上的Ki67百分比。数据显示，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21479是CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK(CD16+)细胞和γδT细胞增殖中最有效的诱导物。每种scIL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导增殖方面都不如XENP21479有效，但差异取决于连接子长度以及特定的工程化取代。
在第八个实验中，在37℃下将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与指定浓度的人类PBMC一起培育3天。培育后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并且通过FACS分析。图54A-D中分别描绘CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK(CD16+)细胞上的Ki67百分比。如上所述，数据显示ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21479是CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK(CD16+)细胞和γδT细胞增殖中最有效的诱导物。值得注意的是，与野生型(XENP21479)相比，将Q108E取代引入ncIL-15/Rα-Fc形式(XENP24349)显著降低其增殖活性。
1C(b)：为效能降低而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的PK
为了研究为效能降低而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是否具有改善的半衰期和PK，在C57BL/6小鼠的PK研究中检查了这些变体。在第0天，通过IV-TV向两组小鼠(每组测试品5只小鼠)给药0.1mg/kg指定的测试品。在给药后60分钟收集血清，然后在第2天、第4天和第7天收集血清用于第1组，并且在第1、3和8天用于第2组。在夹心ELISA中使用抗IL-15和抗IL-15Rα抗体测定IL-15/Rα-Fc融合蛋白的血清含量。结果描绘于图55中。图56描绘测试品的效能与半衰期之间的相关性。如预测的那样，效能降低的变体显示出显著更长的半衰期。值得注意的是，与野生型对照XENP20818的0.5天相比，半衰期延长到近9天(参见XENP22821和XENP22822)。
实例2：工程化的靶向NKG2A和NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合物
肿瘤逃避免疫消除的一种策略是通过下调MHC I类以避免T细胞识别(Garrido,F等人,2016)。作为备用，NK细胞可以在不存在MHC I的情况下识别癌细胞，并且实际上可能被肿瘤细胞敏化MHC I类的下调(Zamai,L等人,2007)。但是，已经发现癌症患者的NK细胞计数降低(Levy,EM等人,2011)。因此，产生了靶向NKG2A和NKG2D的构筑体，其目的不仅是使IL-15/Rα-Fc融合物偏离Treg，而且还选择性地靶向和扩增NK细胞。
2A：工程化的靶向NKG2A和NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合物
莫纳珠单抗的VH和VL序列(如2014年12月2日发布的美国专利第8,901,283号中所公开)以Fab形式被人类化和工程化，用作靶向NKG2A的IL-15/Rα-Fc融合物的概念证明的组分。二价形式的莫纳珠单抗(嵌合和人类化的序列)在图58中描绘为XENP24541和XENP24542。
抗NKG2D的VH和VL序列(如在2011年2月1日发布的美国专利第7,879,985号中公开)以Fab形式被工程化，用作靶向原型NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合物的组分。二价mAb形式的序列在图59中描绘为XENP24365。
以如图57D中所描绘的scIL-15/Rα×Fab形式产生靶向NKG2A和NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合物，所述形式包含与异源二聚Fc区的N端融合的VH，另一侧包含通过可变长度的连接子(称为“scIL-15/Rα”)与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)，其与异源二聚体Fc区另一侧的N端融合，而单独转染相应轻链以与VH形成Fab。图60中描绘用于说明性的靶向NKG2A的IL-15/Rα-Fc融合物XENP24531、XENP24532和XENP27146的序列，并且图61A-61B中描绘用于说明性的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合物XENP24533、XENP24534和XENP27145的序列。
通过吉布森(Gibson)组装构筑如上所述的编码VH和VL序列的质粒、IL-15和IL-15Rα(寿司)结构域、轻链恒定区和异源二聚体恒定区(如图9中所描绘)。通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染来产生蛋白质，并且通过两步纯化方法进行纯化，所述方法包含蛋白A色谱，然后是离子交换色谱。
2B：具有IL-15效能变体的靶向NKG2A的IL-15/Rα-Fc融合物的活性
在细胞增殖分析中测试单臂scIL-15/RαFc融合物(XENP21993)、靶向NKG2A的降低效能的scIL-15(N65D)/Rα(XENP24531)和靶向NKG2A的降低效能的scIL-15(Q108E)/Rα(XENP24532)，其具有基于莫纳珠单抗的抗NKG2A Fab臂。
用指定浓度的测试品处理人类PBMC。处理后3天，通过FACS分析PBMC。针对每个测试品，图62A-C中描绘CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞上Ki67的百分比。数据显示，与XENP21993相比，XENP24531和XENP24532在增殖CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞中显示出降低的效能。值得注意的是，与XENP24531相比，XENP24532在增殖CD4+T细胞方面显示出降低的功效，同时保持了在增殖CD8+T细胞方面的功效。这表明，即使具有相同的靶向NKG2A的Fab臂，scIL-15/Rα侧的效能也会影响扩增各种细胞类型的效能。
2C：靶向NKG2A和NKG2D的降低效能的IL-15/Rα-Fc融合物显示NK细胞的选择性增 殖
用指定浓度的测试品处理人类PBMC。处理后3天，PBMC首先用抗CD3-PerCP/Cy5.5(OKT3)、抗CD4-BV786(RPA-T4)、抗CD8-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD56-BV605和抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)染色。再次洗涤细胞，并且使用eBioscienceTMFoxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)用抗FoxP3-AF488(259D)和抗Ki67-APC染色。首先通过基于SSC和FSC的门控来鉴定淋巴细胞。然后根据CD3表达对淋巴细胞进行门控，以鉴定NK细胞(CD3-CD16+)和CD3+T细胞。然后基于CD4和CD8对CD3+T细胞进行门控，以鉴定CD4+T细胞和CD8+T细胞。然后通过基于CD45RA的进一步门控来鉴定CD4+和CD8+记忆T细胞亚群。最后，确定在CD4+T细胞(CD3+CD4+CD45RA-)、CD8+T细胞(CD3+CD8+CD45RA-)和NK细胞上与细胞增殖严格相关的蛋白Ki67的百分比(分别描绘于图63A-C中)。数据显示，与XENP20818(WT IL-15/Rα-Fc)相比，对照“靶向RSV的”降低效能的单臂scIL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc XENP26007在CD8+T细胞和CD4+T细胞以及NK细胞的增殖方面具有显著降低的效能。用抗NKG2A或抗NKG2D Fab臂靶向(如XENP27145和XENP27146中)选择性诱导NK细胞增殖，而对增殖CD8+T细胞和CD4+T细胞的效能没有增强。
细胞因子与其受体结合后，与受体相关的Janus激酶(JAK)使STAT蛋白磷酸化，然后将STAT蛋白转运到细胞核中以调节进一步的下游过程。因此，STAT蛋白(特别是STAT5，其包括STAT5a和STAT5b)的磷酸化是由IL-15与其受体结合触发的最早的信号事件之一。
因此，在另一个实验中，研究了通过靶向NKG2A和NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合物对各种淋巴细胞群的STAT5磷酸化的诱导。在37℃下将人类PBMC与以下测试产品在指定浓度下一起培育15分钟：XENP20818(WT IL-15/Rα-Fc)、XENP24050、XENP27145和XENP27146。为了在培育后门控各种细胞群，在室温下PBMC用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)和抗CD8-Alexa700(SK1)染色30-45分钟。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起培育20-60分钟。甲醇培育后，再次洗涤细胞，并且用抗CD25-BV421(M-A251)、抗CD45RA-BV510(HI100)、抗FoxP3-AF488(249D)、抗CD56-PE和抗pSTAT5-Alexa647(pY687)染色以标记各种细胞群和STAT5磷酸化。图64中描绘在CD8+T细胞、CD4+T细胞、Treg和NK细胞群上描绘诱导STAT5磷酸化的数据。与上述描述Ki67表达的数据一致，本文中的数据表明与XENP20818相比，XENP26007在CD8+和CD4+T细胞以及Treg和NK细胞上诱导STAT5磷酸化的效能大大降低，并且用抗NKG2A或抗NKG2D Fab(如XENP27145和XENP27146中)靶向选择性地靶向NK细胞，而没有表现出对CD8+T细胞、CD4+T细胞或Treg的优选靶向。
实例3：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物
3A：工程化的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物
鼠类抗CD8抗体的亲本可变区(在图65中描绘为XENP15076)被人类化(如先前在2010年2月2日发布的美国专利第7,657,380号中所描述)，并且以Fab形式进行工程化以用作靶向原型CD8的IL-15/Rα-Fc融合物的组分。人类化抗CD8的序列在图65中描绘为二价抗体(XENP15251)和Fab(XENP23647)，以及人类化变体描绘为单臂mAb(XENP24317)。
靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物以如图57D中所描绘的scIL-15/Rα×Fab形式产生，其包含通过可变长度的连接子(称为“scIL-15/Rα”)
与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)，然后将其与异源二聚体Fc区的N端融合，其中可变重链(VH)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。这种形式的说明性靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物包括XENP24114、XENP24115和XENP24116，其序列描绘于图66中。
靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物也以以下形式产生：如图57E中所描绘的Fab×ncIL-15/Rα形式，其包含与异源二聚体Fc区的N端融合的VH，其中IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物；如图57G中所描绘的mAb-scIL-15/Rα形式，其包含与第一异源二聚体Fc和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，其中IL-15与随后与异源二聚体Fc区中的一个的C端进一步融合的IL-15Rα(寿司)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab；如图57H中所描绘的mAb-ncIL-15/Rα形式，其包含与第一异源二聚体Fc和第二异源二聚体Fc的N端融合的VH，其中IL-15Rα(寿司)与异源二聚体Fc区中的一个的C端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物；如图57J中所描绘的中心-IL-15/Rα，其包含以重组方式与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15的N端融合的VH以及以重组方式与随后与异源二聚体Fc的另一侧进一步融合的IL-15Rα(寿司)的N端融合的VH，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab；和如图57K中所描绘的中心-scIL-15/Rα形式，其包含与的IL-15Rα(寿司)的N端融合的VH，所述IL-15Rα(寿司)与随后与异源二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15融合，以及与异源二聚体Fc的另一侧融合的VH，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。这些替代形式的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物的说明性序列描绘于图79中。
通过吉布森组装构筑如上所述的编码VH和VL序列的质粒、IL-15和IL-15Rα(寿司)结构域、轻链恒定区和异源二聚体恒定区(如图9中所描绘)。通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染来产生蛋白质，并且通过两步纯化方法进行纯化，所述方法包含蛋白A色谱，然后是离子交换色谱。
3B：通过靶向CD8的IL-15Fc融合物原型诱导细胞增殖
在细胞增殖试验中测试二价抗CD8抗体(XENP15251)、单臂scIL-15/Rα-Fc融合物(XENP21993)、靶向CD8的scIL-15/Rα-Fc(XENP24114)，其具有基于XENP15251的抗CD8 Fab臂。
用指定浓度的测试品处理人类PBMC。处理后3天，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并且通过FACS分析。首先通过基于SSC和FSC的门控来鉴定淋巴细胞。然后根据CD3表达对淋巴细胞进行门控，以鉴定NK细胞(CD3-CD16+)和CD3+T细胞。然后，基于CD4和CD8对CD3+T细胞进行门控，以鉴定CD4+、CD8+和γδT细胞(CD3+CD4-CD8-)。然后通过基于CD45RA的进一步门控来鉴定CD4+和CD8+记忆T细胞亚群。最后，确定在CD4+T细胞(CD3+CD4+CD45RA-)、CD8+T细胞(CD3+CD8+CD45RA-)和NK细胞上与细胞增殖严格相关的蛋白Ki67的百分比(分别如图67A-C所示)。数据显示，与单臂IL-15/Rα-Fc融合物相比，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物在诱导CD8+T细胞增殖方面更有效。值得注意的是，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物在诱导CD4+T细胞增殖方面比单臂IL-15/Rα-Fc融合物的效能低，这是由于包括Fab臂而导致IL-15活性减弱。
3C：通过靶向CD8的降低效能的IL-15Fc融合物原型诱导细胞增殖
在细胞增殖试验中测试单臂scIL-15/RαFc融合物(XENP21993)、单臂降低效能的scIL-15/RαFc融合物(XENP24014)和靶向CD8的降低效能的scIL-15/Rα-Fc融合物(XENP24116)，其具有基于XENP15251的抗CD8 Fab臂。用指定浓度的测试品处理人类PBMC。处理后3天，通过FACS分析PBMC。图68A-68C中描绘CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK细胞上Ki67的百分比。
数据表明，与XENP21993相比，XENP24014在增殖NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞中显示出降低的效能。与XENP24014相比，XENP24116在增殖CD8+T细胞(与XENP21993相比)中显示出增强的效能，在CD4+T细胞上具有降低的效能，并且在NK细胞上具有相似的效能。
3D：靶向CD8的降低效能的IL-15Fc融合物原型对Treg的作用
研究靶向CD8的效能降低的scIL-15(N65D)/Rα-Fc(XENP24116)以及单臂的效能降低的scIL-15(N65D)/RαFc融合物(XENP24014)、效能降低的IL-15(Q108E)/Rα-Fc异源二聚体(XENP22822)和重组人类IL-15(rhIL-15)对Treg增殖(如由CD4+T细胞上Ki67表达的百分比表示)的作用。
雷帕霉素体外扩增的Treg用于研究靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物的作用。先前已有报道雷帕霉素在体外促进CD4+CD25+FOXP3+T reg的增殖，并且由此产生的扩增的Treg抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖(参见，例如Battaglia等人(2006)，《雷帕霉素促进健康个体和1型糖尿病患者的功能性CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的扩增。(Rapamycin promotesexpansion of functional CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells of both healthysubjects and type1diabetic patients.)》《免疫学杂志》177(12)8338-8347；和Strauss等人(2007)《用雷帕霉素培养的天然存在的人类CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的选择性存活。(Selective survival of naturally occurring human CD4+CD25+Foxp3+regulatoryT cells cultured with rapamycin.)》《免疫学杂志》178(1)320-329)。因此，使用EasySepTM人类CD4+T细胞富集试剂盒(STEMCELL Technologies，加拿大温哥华(Vancouver,Canada))，通过阴性选择从来自两个供体(供体21和23)的人类PBMC中富集CD4+T细胞。使用DynabeadsTM人类Treg膨胀剂(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)在RPMI1640+10％胎牛血清+0.1μg/ml雷帕霉素+500U/ml IL-2中扩增Treg 1-4天。将Treg转移到涂有0.5μg/ml抗CD3(OKT3，Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.))的T75烧瓶中，并且与RPMI1640+10％胎牛血清+0.1μg/ml雷帕霉素+100U/ml IL-2+0.5μg/ml抗CD28 mAb一起培养。在最初从PBMC富集CD4+T细胞后至少8天进行实验。将1.5×105个雷帕霉素培养的Treg与指定浓度的指定测试品在37℃的抗CD3涂布的平板(0.5μg/mL OKT3)上一起培育4天。在第4天，通过FACS分析细胞。图69A-69B中分别描绘供体21和23的CD4+T上Ki67的百分比。图70A-B中分别描绘供体21和23的CD4+细胞计数。图71A-B中分别描绘供体21和23的CD25 MFI。
数据显示重组人类IL-15诱导最强的Treg增殖。尽管与rhIL-15相比，XENP22822和XENP24014诱导的Treg增殖较少，但靶向CD8的效能降低的scIL-15(N65D)/Rα-Fc融合XENP24116是Treg增殖的最弱诱导剂。
3E：在抑制试验中，通过靶向CD8的降低效能的IL-15Fc融合物诱导CD8+T细胞增 殖。
研究靶向CD8的效能降低的scIL-15(N61D)/Rα-Fc融合物(XENP24115)以及单臂的效能降低的scIL-15(N61D)/RαFc融合物(XENP24013)在Treg存在下对CD8+反应性T细胞、CD4+应答T细胞和NK细胞增殖的影响。
将CFSE标记的PBMC与500ng/mL的所示测试品和指定浓度的Tag-it紫色标记Treg(如实例2C中所述进行扩增)在抗CD3涂布的平板(OKT3；100ng/mL)上培育。在37℃下培育4天后，通过FACS分析细胞，并且通过CFSE测量增殖。图72A-72C中分别描绘增殖CD8T细胞、CD4T细胞和NK细胞的百分比数据。图73描绘使用不同Treg:PBMC比例进行的类似实验中的Treg计数。
数据显示，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物可增加CD8+应答性T细胞的增殖，并且需要更多的Treg抑制增殖。数据还表明，XENP24115和XENP24013都不影响CD4+应答性T细胞增殖；然而，两者都诱导NK细胞增殖。值得注意的是，图73显示，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物仍能诱导Treg增殖(与未处理的对照组相比)，但其诱导程度明显少于单臂scIL-15/Rα-Fc。
在进一步的实验中，研究了在存在Treg的情况下，用靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理后，CD8+记忆T细胞、CD4+记忆T细胞和Treg增殖的剂量反应。将1×105个CFSE标记的PBMC和5×104个Tag-it紫色标记的Treg(如实例3D中所述扩增；1：2Treg：PBMC比例)与指定浓度的包括抗RSV二价mAb(XENP15074)作为对照的指定测试品在抗CD3涂布的平板上(OKT3；100ng/mL)一起培育4天。通过CFSE或Tag-it紫色稀释物来测量增殖。图74A-74C中分别描绘CD8+记忆T细胞、CD4+记忆T细胞和Treg的数据。最后，研究了用靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物处理后，在不存在PBMC的情况下，Treg增殖的剂量反应。将1×105个Tag-it紫色标记的Treg与指定浓度的指定测试品在抗CD3涂布的平板(OKT3；100ng/mL)上一起培育4天。通过Tag-it Violet稀释测量如图75中描绘的细胞计数。
数据显示，在所有测试浓度下，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物均比单臂scIL-15/Rα-Fc诱导更大的CD8+记忆T细胞增殖。值得注意的是，与单臂scIL-15/Rα-Fc相比，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合诱导的CD4+记忆T细胞和Treg增殖较少。
3F：GVHD模型中靶向CD8的降低效能的IL-15Fc融合物的活性
在雌性NSG(NOD-SCID-γ)免疫缺陷小鼠中进行的移植物抗宿主病(GVHD)模型中评估了靶向CD8的降低效能的IL-15/Rα-Fc融合物(XENP24116)和其它降低效能的IL-15变体。当向NSG小鼠注射人类PBMC时，人类PBMC发展出针对小鼠细胞的自身免疫应答。注射人类PBMC的NSG小鼠，随后靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合和IL-15变体的处理可以增强植入的T细胞的增殖。
在第-7天通过IV-OSP将1000万个人类PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试品(0.3mg/kg)给药。在第4天和第7天收集全血，并且针对其脾脏在第11天处死小鼠，以使用FACS测量CD4+T细胞和CD8+T细胞计数。图76A-76D中分别描绘第4天全血中的CD4+T细胞事件、CD8+T细胞事件、CD8+T细胞和CD4+T细胞事件之间的相关性以及CD8+T细胞/CD4+T细胞的比例。图77A-77D中分别描绘第7天全血中的CD4+T细胞事件、CD8 T细胞事件、CD8+T细胞和CD4+T细胞事件之间的相关性以及CD8+T细胞/CD4+T细胞的比例。图78A-78D中分别描绘第8天脾脏中的CD4+T细胞事件、CD8T细胞事件、CD8+T细胞和CD4+T细胞事件之间的相关性以及CD8+T细胞/CD4+T细胞的比例。每个点代表一只雌性NSG小鼠。数据显示，与同时扩增CD4+和CD8+T细胞的IL-15变体相比，XENP24116选择性扩增CD8+T细胞。
3G：替代形式的靶向CD8的IL-15Fc融合物
在细胞增殖试验中测试了图57(卡通)和图79(序列)中所描绘的多种替代形式的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物。用XENP24114、XENP24116、XENP24546、XENP24543、XENP24547和XENP24548处理人类PBMC。处理后3天，通过FACS分析PBMC。图80中描绘处理后CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞上Ki67的百分比。
实例4：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物(非阻断CD8结合结构域)
4A：噬菌体展示库和CD8结合剂的筛选
内部产生重组人类CD8α和猕猴CD8α用于噬菌体淘选。通过吉布森组装在pTT5载体中构筑编码抗原的质粒。在瞬时转染HEK293E细胞后，分泌的抗原通过蛋白A亲和色谱纯化。
建立了新的内部噬菌体文库，在噬菌体外壳蛋白pIII上展示Fab变体，并且淘选4轮。在第一轮之前和每一轮之后，将噬菌体添加到对数期XL1-Blue细胞(Agilent,Wilmington,Del.)中，并且在37℃，250rpm下培育过夜。对Fab克隆的VH和VL身份进行测序，然后通过吉布森组装从中构筑质粒，并且将其亚克隆到包含IgG1恒定区编码序列的pTT5表达载体中。在HEK293E中转染DNA以表达，并且使用A蛋白亲和色谱从上清液中纯化得到的二价mAb。例示性克隆1C11B3的氨基酸序列描绘于图81中的二价mAb(XENP24025)和单臂mAb(XENP24321)。
4B：噬菌体展示库和CD8结合剂的筛选
测试重组为单臂Fab-Fc抗体的噬菌体克隆1C11B3(分别为XENP24321)与CD4+和CD8+T细胞的结合。基于XENP15251的变体的单臂Fab-Fc抗体(XENP24317；图65中描绘的序列)用作对照。
使用EasySepTM人类T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies，加拿大温哥华)从人类PBMC中纯化的T细胞与测试品在指定浓度下在冰上一起培育1小时。离心细胞以去除过量的测试品，重悬于抗CD3-FITC(HIT3a)、抗CD4-PE(OKT4)和与APC偶联的二抗，并且在冰上培育45分钟。将细胞洗涤两次，用染色缓冲液重悬并且用FACS分析。图82描绘CD4+T细胞和CD8+T细胞上的MFI。数据显示，XENP24321与CD8+T细胞的结合优于XENP24317。
4B：鉴定不阻止CD8与pMHCI相互作用的抗CD8 mAb
肿瘤细胞表现出主要的组织相容性复合体I类分子(MHCI)，所述分子显示出被TCR(对肽具有特异性)和CD8+T细胞上的CD8识别的肽片段(如图83A中所描绘)。CD8与pMHCI的结合触发T细胞的增殖和活化。抗CD8抗体可能会结合CD8上的一个抗原决定簇，从而对其进行定位，因此阻止CD8与pMHCI的结合，进而阻止CD8+T细胞的活化(图83B)。为了保留活化，有必要在靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物中使用抗CD8臂，所述臂不阻断CD8-MHCI相互作用。
4C(a)：MHC四聚体分析
使用MHC四聚体分析法研究上述抗CD8 mAb克隆是否阻断了CD8与pMHCI的相互作用。将对HLA-A2*0201限制的CMV pp65(NLVPMVATV)肽(供体153，来自Astarte Biologics,Bothell,Wash.)具有特异性的约200k T细胞与指定浓度的指定测试品在冰上一起预培育30分钟。还使用在没有抗CD8抗体的情况下培育的对照样品。培育后，样品用iTAg四聚体/PE-HLA2:01CMV pp65(NLVPMVATV)(MBL,Woburn,Mass.)、抗CD3-BUV395(UCTH-1)和抗CD4-APC/Fire750(OKT4)染色1.5小时，并且通过FACS分析。首先基于CD3和CD4表达门控细胞以鉴定CD8+细胞。MHC四聚体在CD3+细胞上的结合以PE MFI测量。数据在图84中描绘为相对于对照样品的结合分数。
数据显示，与商业OKT8 mAb(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技，内部生产为XENP15075)一起预培育后，MHC四聚体的结合可与对照样品相当，而与其它商业mAb SK-1(BioLegend,加利福尼亚州圣地亚哥)、32-M4(Santa Cruz Biotechnology,德克萨斯州达拉斯(Dallas,Tex.))和DK25(Dako,加利福尼亚州卡平特里亚(Carpinteria,Calif.))的结合减少了15-80％，这与Clement等人报道的结果一致。与XENP15251一起预培育使MHC四聚体结合降低了超过50％。值得注意的是，与XENP24025(1C11B3)一起预培育使MHC四聚体结合降低了约4％，这表明克隆1C11B3是非封闭的。
4C(b)：细胞因子释放分析
如上所述，CD8+T细胞上的TCR和CD8与pMHCI的结合活化了T细胞，导致细胞因子释放。因此，还研究了在细胞因子释放试验中，抗CD8 mAb克隆是否阻断了CD8与pMHCI的相互作用。
在室温下，T2细胞负载有50ng/ml HLA-A2*0201限制的CMV pp65(NLVPMVATV)肽过夜。作为阴性对照，T2细胞负载有NY-ESO-1肽。过夜负载后，将T2细胞用丝裂霉素-C(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)在37℃处理30分钟。将对HLA-A2*0201限制的CMV pp65(NLVPMVATV)肽具有特异性的50k T细胞与100μg/ml的所示测试品进行预培育(一式两份)。然后将负载有10k肽的T2细胞添加到样品中，并且在37℃下培育18小时。未进行抗CD8预培育的对照如下：A)负载有pp65肽的T2细胞与CMV特异性T细胞一起培育，B)负载有NY-ESO-1肽的T2细胞与CMV特异性T细胞一起培育，C)未负载的T2细胞与CMV特异性T细胞一起培育的，以及D)仅CMV特异性T细胞。收集上清液并且用IFNγMSD分析(Meso Scale Discovery,Rockville,Md.)进行分析。
如图85中所描绘的数据展示没有抗CD8抗体预培育的情况下，与OKT8和XENP24025预培育的CMV特异性T细胞释放的IFNγ与CMV特异性T细胞的IFNγ释放相当，而IFNγ降低在与商业抗体SK-1、32-M4和DK25以及XENP15251预培育的CMV特异性T细胞中观察到释放。此外，与XENP24025一起预培育的CMV特异性T细胞释放的IFNγ与不存在抗CD8抗体预培育的CMV特异性T细胞释放的相当。图86中描绘IFNγ释放与四聚体结合MFI之间的相关性。
4D：具有1C11B3的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc选择性诱导CD8+T细胞的增殖超过CD4+T 细胞的增殖
人类PBMC用XENP24736(具有1C11B3的靶向CD8的效能降低的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc；图87中描绘的序列)、XENP24050(单臂的效能降低的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc)、XENP24321(基于1C11B3的单臂的抗CD8 mAb)和XENP20818(WT IL-15/Rα-Fc)在37℃下按指定浓度使用3天。接下来，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(RPAT8或SK1)、抗CD8β-eF660(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗CD56-BV605(5.1H1)在冰上染色45分钟。用前述面板染色后，将细胞在室温下用抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色30分钟，并且通过FACS分析各种细胞群和其Ki67的表达。在图88中描绘描述表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞和CD4+CD45RA-T细胞的百分比的数据。数据显示，与单臂降低效能的IL15/Rα-FcXENP24050相比，具有1C11B3的靶向CD8可以增强CD8+T细胞的增殖。
实例5：靶向CD8的IL-15Fc融合物(基于OKT8)
5A：OKT8的人类化
现有技术抗CD8抗体OKT8(在图89中描绘为OKT8_H0.1和OKT8_L0.1的可变区序列)是在Fab的上下文中工程化的，以用于靶向CD8的IL-15分子。OKT8使用字符串内容优化进行人类化(参见例如，2010年2月2日发布的美国专利第7,657,380号)。图89中描绘说明性人类化OKT8克隆的可变重链和轻链序列。如上所述，使用吉布森构筑的如上所述编码VH和VL序列以及异源二聚体恒定区的编码序列的质粒产生靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物(如图9中所描绘)。通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染来产生蛋白质，并且通过两步纯化方法进行纯化，所述方法包含蛋白A色谱，然后是离子交换色谱。图92中描绘基于鼠类或人类化OKT8可变区的具有抗CD8 Fab臂的说明性靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物的序列。
5A(a)：基于OKT-8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物选择性地增殖CD8+T细胞超过 CD4+T细胞
人类PBMC用具有基于鼠类OKT8或两个版本的人类化OKT8(H1L1和H2L1)的CD8结合结构域的靶向CD8的效能降低的IL-15/Rα-Fc(N4D/N65D双重突变和D30N/E64Q/N65D三重突变)在37℃下在指定浓度下处理3天。处理后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(RPAT8或SK1)、抗CD8β-eF660(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗CD56-BV605(NCAM16.2)在冰上染色45分钟。用面板染色后，将细胞在室温下用抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色30分钟，并且通过FACS分析各种细胞群和其Ki67的表达。图93中描绘描述表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞和CD4+CD45RA-T细胞百分比的数据。数据显示，与对照XENP20818相比，每种靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物相对于CD4+T细胞对CD8+T细胞具有选择性。出乎意料的是，与XENP24919(鼠类OKT8)相比，XENP24917(OKT8_H1L1)在诱导CD8+T细胞增殖方面的效能较低。值得注意的是，XENP24918(具有替代的人类化OKT8_H2L1)已恢复了与XENP24917相似的效能。此外，虽然具有三重突变和OKT_H2L1抗CD8 Fab臂的IL-15/Rα-Fc效能降低的XENP25137在诱导CD8+T细胞增殖方面比XENP24918更有效，但XENP25137在诱导CD4+T细胞增殖方面也比XENP24918更有效。
5A(b)：基于OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物在植入PBMC的NSG小鼠体内增殖 T细胞并且增强体内细胞因子的分泌
在第-8天通过IV-OSP将1000万个人类PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试品给药。图94A-B中分别描绘第7天的CD8+T细胞和CD4+T细胞计数。数据表明，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物选择性增殖CD8+T细胞超过CD4+T细胞，如CD8+/CD4+T细胞比例所描绘。值得注意的是，数据显示CD8+T细胞的选择性是由于靶向IL-15/Rα-Fc融合物，而不是由于IL-15/Rα-Fc融合物和抗CD8的组合作用(如XENP24050和XENP24920的组合所示)。
5B：针对食蟹猕猴CD8亲和力的工程化OKT8
为便于临床开发，评估食蟹猕猴中靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的各种参数(如药效学、药代动力学和毒性)非常有用。然而，与对人类CD8的12nM KD亲和力相比，一种例示性的人类化OKT8变体(H2L1)对食蟹猕猴CD8仅具有200nM KD亲和力。因此，将基于OKT8_H2L1的变体文库(在本文中称为HuCy OKT8)工程化成对人类和猕猴CD8具有相似的亲和力。这个文库是通过定点诱变(QuikChange,Stratagene,Cedar Creek,Tx.)或标准基因合成构筑的。图95中描绘可变重链可变区和可变轻链可变区的序列。产生基于变体可变区的单臂mAb，其具有附着于异源二聚体Fc区的重链可变区和分子的另一侧为“仅Fc”，以及连接于恒定轻区的轻链可变区。图91中描绘这种单臂mAb的说明性序列。
在基于生物层干涉法(BLI)的Octet中评估了基于HuCy OKT8变体的单臂mAb对人类和猕猴CD8的亲和力。Octet的实验步骤通常包括以下内容：固定化(将配体捕获到生物传感器上)；缔合(将配体涂布的生物传感器浸入含有分析物的连续稀释液的孔中)；和解离(将生物传感器返回到含有缓冲液的孔中)以确定测试品的亲和力。在数据处理期间用于背景校正的方法中还包括仅含有缓冲液的参考孔。特别地，捕获人或食蟹猕猴CD8，并且将其浸入多种浓度的OKT8变体中。得到的解离常数(KD)、结合速率(ka)和解离速率(kd)描绘于图96中。数据显示，尽管与OKT_H2L1相比，许多变体对食蟹猕猴CD8的亲和力有所改善，但只有几个变体对人类和食蟹猕猴CD8的亲和力相似。
5C：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物(HuCy OKT8)在人T细胞的增殖中具有活性
如实例5A中一般所述产生基于HuCy OKT8可变区的具有抗CD8 Fab臂的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物，图97和图102中描绘说明性分子的序列。
5C(a)：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc与HuCy OKT8融合在体外具有活性
将人类PBMC用指示性浓度的靶向CD8的降低的效能IL-15/Rα-Fc与说明性的HuCyOKT8结合结构域和单臂降低的效能IL-15/Rα-FcXENP24050(作为对照)在37℃下在指定浓度下处理3天。处理后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(SK1)、抗CD8β-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗CD56-BV605(NCAM16.2)在冰上染色45分钟。用面板染色后，将细胞在室温下用抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色30分钟，并且通过FACS分析各种细胞群和其Ki67的表达。图98中描绘描述表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞和CD4+CD45RA-T细胞百分比的数据。数据显示，每个靶向CD8的分子(包括具有HuCy OKT8结合结构域的分子)在诱导CD8+T细胞增殖方面比XENP24050更有效。
在另一个实验中，将新鲜的PBMC与指定浓度的指定测试品一起培育15分钟。培育后，PBMC在室温下用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)和抗CD8-Alexa700(SK1)染色30-45分钟。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起培育20-60分钟。甲醇培育后，再次洗涤细胞，并且用抗CD25-BV421(M-A251)、抗CD45RA-BV510(HI100)、抗FOXP3-Alexa488(259D)、抗CD56-PE和抗pSTAT5-Alexa647(pY694)在室温下染色1小时，以标记各种细胞群和STAT5磷酸化。首先基于侧向散射(SSC)和前向散射(FSC)对淋巴细胞进行门控。然后基于CD3和CD4表达对CD4+T细胞进行门控。基于CD45RA表达以及Treg的FoxP3和CD25表达，进一步对CD4+T细胞亚群进行门控。根据CD3和CD8表达对CD8+T细胞进行门控，并且根据CD45RA表达进一步对亚群进行门控。图99中展示CD8+CD45RA-T细胞和CD4+CD45RA-T细胞上STAT5磷酸化的数据。与以上描述表达Ki67的细胞百分比的数据一致，基于HuCy OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物对CD8+T细胞的选择性高于CD4+T细胞。
5C(b)：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物(HuCyOKT8)在植入PBMC的NSG小鼠体内选择 性扩增CD8+T细胞
在第-8天通过IV-OSP将1000万个人类PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试品给药。图100描绘第7天小鼠血液中的CD45+细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞计数(以及CD8+/CD4+T细胞比例)。数据显示具有HuCy OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物在扩增CD45+细胞和T细胞方面具有与具有OKT8_H2L1的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc相似的活性。重要的是，具有HuCy OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物保留了CD8+T细胞在CD4+T细胞上的选择性扩增。
5D：基于OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物在食蟹猕猴T细胞的增殖中具有活 性
接下来，研究了上述具有HuCy OKT8结合结构域的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物是否能够增殖食蟹猕猴淋巴细胞。食蟹猕猴PBMC与指定测试品一起培育4天。培育后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(SK1)、抗CD8β-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗CD56-BV605(NCAM16.2)在冰上染色45分钟。用面板染色后，将细胞在室温下用抗Ki67-APC(Ki-67)染色30分钟，并且通过FACS分析各种细胞群和其Ki67的表达。图101展示描绘表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞和CD4+CD45RA-T细胞百分比的数据。数据表明，每个靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物都能增殖猕猴T细胞。与实例5A(a)中描述的数据一致，靶向CD8的分子对CD8+T细胞的选择性高于对CD4+T细胞的选择性。
实例6：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物对CD8+T细胞的选择性高于CD4+T细胞和Treg
6A：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物在体外选择性地使CD8+T细胞超过CD4+T细胞和 Treg
将人类PBMC与指定的测试品在37℃培育2、5、10、15、30、60、180和360分钟。通过在不同时间添加测试品以使所有反应同时停止来实现计时。培育后，PBMC在室温下用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)和抗CD8-Alexa700(SK1)染色30-45分钟。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起培育20-60分钟。甲醇培育后，再次洗涤细胞，并且用抗CD25-BV510(M-A251)、抗CD45RA-BV510(HI100)、抗FOXP3-Alexa488(259D)和抗pSTAT5-Alexa647染色以标记各种细胞群和STAT5磷酸化。首先基于侧向散射(SSC)和前向散射(FSC)对淋巴细胞进行门控。然后基于CD3和CD4表达对CD4+T细胞进行门控。基于CD45RA表达以及Treg的FoxP3和CD25表达，进一步对CD4+T细胞亚群进行门控。根据CD3和CD8表达对CD8+T细胞进行门控，并且根据CD45RA表达进一步对亚群进行门控。图103描绘各种种群上STAT5磷酸化的数据。数据显示，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物活化了CD8+T细胞，同时避免了CD4+T细胞(包括Treg)，这表明与WT IL-15以及IL-15/Rα-Fc融合物相比，靶向CD8的分子对CD8+T细胞也具有选择性。值得注意的是，与重组IL-15和WT IL-15/Rα-Fc融合物XENP20818相比，以靶向CD8的IL-15/Rα-Fc(XENP26585)浓度更高的浓度刺激了CD4+T细胞和Treg中STAT5磷酸化的基线水平。
6B：在猕猴中，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物选择性扩增CD8+T细胞超过CD4+T细胞
接下来，在食蟹猕猴中扩增T细胞时研究了靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物的体内作用。在第0天给食蟹猕猴(每组3只动物)给药指定测试品并且监测3周。图104中描绘描述CD8+T细胞和CD4+T细胞倍数变化的数据。图105展示描述Ki67表达阳性的外周血中CD4+CD45RA-T细胞和CD8+CD45RA-T细胞百分比的数据。图106中描绘描述淋巴结中CD8+CD45RA-T细胞上Ki67百分比的数据。与实例5D中所述的食蟹猕猴PBMCs的体外扩增数据以及移植PBMC的小鼠中人类PBMCs的体内扩增数据一致，此处的数据表明，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物选择性扩增CD8+T细胞超过CD4+T细胞。
实例7：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物演示了增强的药效学
在食蟹猕猴的后续研究中，研究具有Xtend的单臂scIL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc(XENP24294；序列如图40所示)和具有Xtend的靶向CD8的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc(XENP26585；序列描绘于图102中)。在第1天和第16天给食蟹猕猴(每组3只)配以测试品，并且随时间抽血以研究T细胞扩增。图107中描绘描述CD8+T细胞和CD4+T细胞计数以及CD8+/CD4+T细胞比例的数据。与实例6B中描述的研究一致，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物选择性地扩增CD8+T细胞超过CD4+T细胞，从而提高了CD8+/CD4+T细胞的比例。值得注意的是，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物比单臂分子具有更高的药效学，如CD8+T细胞扩增的持续时间更长。
实例8：靶向CD8的IL-15Fc融合物增强CD8+T细胞的同种异体抗肿瘤活性(体外)
根据制造商的说明，使用EasySepTM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL Technologies，加拿大温哥华)从人类PBMC(CMV+HLA-A0201)中纯化T细胞。将纯化的T细胞与CFSE标记的亲本MCF-7肿瘤细胞(在此示例中指定为第1组)或CFSE标记的表达pp65的MCF-7肿瘤细胞(在此示例中指定为第1组)以19:1E:T比和指定测试品一起培育4天。在第3天，将布雷菲德菌素A(BioLegend,加利福尼亚州圣地亚哥)和抗CD107a-PerCP/Cy5.5(LAMP-1)加入细胞中。培育后，将细胞与Zombie AquaTM固定活力试剂盒(BioLegend,加利福尼亚州圣地亚哥)一起培育30分钟。洗涤细胞并且用抗CD4-APC/eFluor780(RPA-T4)、抗CD8b-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD25-PE(M-A251)和抗CD69-BV605(FN50)在冰上染色1小时。再次洗涤细胞，并且使用eBioscienceTMFoxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)用抗IFNγ-BV421(4S.B3)和抗Ki67-APC染色。通过流式细胞术分析各种细胞群的细胞。基于CFSE染色鉴定靶细胞，并且基于僵尸染色鉴定死亡的靶细胞。基于CD4和CD8表达对效应细胞(CFSE-)进行门控。
Ki67是一种与蛋白质增殖严格相关的蛋白质，而T细胞产生的IFNγ则表明细胞溶解活性。图108A-108B分别描绘两组中CD8+T细胞中的IFNγ+级分。图109A-109B分别描绘两组中CD8+T细胞的Ki-67+级分。图110A-110B分别描绘两组中CD8+T细胞的Ki-67+/IFNγ+级分。图111A-111B分别描绘两组中CD4+T细胞中的IFNγ+级分。图112A-112B分别描绘两组中的CD4+T细胞的Ki-67+级分。图113A-113B分别描绘两组中CD4+T细胞的Ki-67+/IFNγ+级分。图114A-114B分别描绘两组中剩余的靶细胞(pp65转导的MCF-7或亲本MCF-7)。总体而言，数据表明，本发明的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物不仅增强了肿瘤细胞的同种异体杀伤，而且靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物选择性地扩增CD8+T细胞超过CD4+T细胞。
实例9：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合物增强T细胞在体内的同种异体抗肿瘤作用， 并且与检查点阻断协同结合
接下来，研究了本发明的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的体内抗肿瘤作用，以及其是否适合与检查点封锁堆叠。使用的检查点阻断抗体是XENP16432(一种基于纳武单抗的二价抗PD-1mAb，具有消融的效应功能；序列描绘于图12中)。在第-14天，将NOD SCIDγ(NSG)小鼠(每组10只)皮下植入3×106个表达pp65的MCF-7细胞。在第0天，将来自HLA匹配的CMV+供体的5×106个人类PBMC腹膜内植入小鼠，所述供体对T细胞pp65反应性(或对照小鼠的PBS)筛选呈阳性。每周用指定测试品或PBS(对于对照小鼠)处理小鼠达4周(总共4次剂量)。通过卡尺测量监测肿瘤体积，图115A-115B中展示其数据(第1次给药后的天数)。如图116A-116E中所描绘，在第7、12、19和26天抽血，并且通过流式细胞术分析以计数各种淋巴细胞的数量。
前面仅说明了本发明的原理。认识到本领域技术人员能够想到各种布置，其尽管未在本文明确描述或显示，但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所列举的所有实例和条件性语言主要希望辅助读者理解本发明的原理，并且不将其限于这类专门列举的实例和条件。并且，引用本发明的原理、方面、以及实施例的所有在此的陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能等效物两者。另外，预期这类等效物包括当前已知的等效物以及有朝一日开发的等效物两者，即不论结构而执行相同功能的发展的任何要素。因此，本发明的范围不旨在限于本文展示和描述的实例实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。提供上文所阐述的实例以向所属领域的普通技术人员提供如何制造和使用本发明的组合物、系统和方法的完整公开和描述，并且不旨在限制诸位发明人视为其发明的范围。对用于实施本发明的以上描述的模式进行的对于所属领域的技术人员来说是显而易见的修改旨在处于所附权利要求的范围内。本说明书中所提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。本公开中引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个参考文献已经以全文引用的方式单独地并入。
使用所有标题和章节命名仅仅是出于清楚和参考的目的并且不应被视为以任何方式进行限制。举例来说，所属领域的技术人员将认识到根据本文所描述的本发明的精神和范围适当地组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。
本文中所引用的所有参考文献以全文引用的方式并入本文中并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地或单独地被指示出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，如对所属领域技术人员而言是明显的。本文描述的具体实施例和实例仅通过举例的方式提供，并且本申请仅受所附权利要求的条款以及权利要求有权获得的等效物的全部范围的限制。

Claims (59)

1.一种双功能异源二聚体蛋白，其包含：
a)IL-15/IL-15Rα融合蛋白，其包含IL-15Rα蛋白、IL-15蛋白和第一Fc结构域，
其中所述IL-15Rα蛋白使用第一结构域连接子共价连接于所述IL-15蛋白的N端，并且所述IL-15蛋白使用第二结构域连接子共价连接于所述第一Fc结构域的N端，或
其中所述IL-15蛋白使用第一结构域连接子共价连接于所述IL-15Rα蛋白的N端，并且所述IL-15Rα蛋白使用第二结构域连接子共价连接于所述第一Fc结构域的N端；和
b)包含重链和轻链的抗原结合结构域单体，所述重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是可变重链并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述轻链包含可变轻链(VL)和轻链恒定结构域(CL)，
其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，并且
其中所述抗原结合结构域单体结合选自由以下组成的群组的抗原：人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D。
2.根据权利要求1所述的双功能异源二聚体蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
3.根据权利要求1或2所述的双功能异源二聚体蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白具有SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)或SEQ ID NO:2(成熟人类IL-15)的氨基酸序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)或SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域(sushi domain))的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白和所述IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N4D、D61N、N65D和Q108E。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述双功能异源二聚体蛋白是XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145和XENP27146。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其进一步包含使用结构域连接子共价连接于所述IL-15蛋白或IL-15Rα蛋白的N端的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域并且不包括Fc结构域。
10.根据权利要求9所述的双功能异源二聚体蛋白，其中双功能异源二聚体蛋白是XENP24548。
11.一种核酸组合物，其包含：
a)第一核酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的IL-15/IL-15Rα融合蛋白；
b)第二核酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合结构域单体；和
c)任选的第三核酸，其编码根据权利要求9所述的抗原结合结构域。
12.一种表达载体组合物，其包含：
a)第一表达载体，其包含根据权利要求11所述的第一核酸；
b)第二表达载体，其包含根据权利要求11所述的第二核酸；和
c)任选的第三表达载体，其包含根据权利要求11所述的第三核酸。
13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求12所述的表达载体组合物。
14.一种制造根据权利要求1至10中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白的方法，其包含在其中所述双功能异源二聚体蛋白被表达的条件下培养根据权利要求13所述的宿主细胞，并且回收所述异源二聚体蛋白。
15.一种双功能异源二聚体蛋白，其包含：
a)包含第一蛋白结构域和第一Fc结构域的融合蛋白，其中所述第一蛋白结构域使用结构域连接子共价连接于所述第一Fc结构域的N端；
b)非共价连接于所述第一蛋白结构域的第二蛋白结构域；和
c)包含重链和轻链的抗原结合结构域单体，所述重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是可变重链并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述轻链包含可变轻链和轻链恒定结构域；
其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，
其中所述第一蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白，并且所述第二蛋白结构域包含IL-15蛋白，或所述第一蛋白结构域包含IL-15蛋白，并且所述第二蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白，并且
其中所述抗原结合结构域单体结合选自由以下组成的群组的抗原：人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D。
16.根据权利要求15所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15Rα蛋白包含半胱氨酸残基，并且所述IL-15蛋白包含半胱氨酸残基，从而形成二硫键。
17.根据权利要求15或16所述的双功能异源二聚体蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白具有SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)或SEQ ID NO:2(成熟人类IL-15)的氨基酸序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)或SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)的氨基酸序列。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白和所述IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N4D、D61N、N65D和Q108E。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白包含所述氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述双功能异源二聚体蛋白是XENP25137。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其进一步包含使用一个或多个结构域连接子共价连接于所述IL-15蛋白和/或IL-15Rα蛋白的N端的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域。
25.一种核酸组合物，其包含：
a)第一核酸，其编码根据权利要求16至23中任一项所述的融合蛋白；
b)第二核酸，其编码根据权利要求16至23中任一项所述的第二蛋白结构域；
c)第三核酸，其编码根据权利要求16至23中任一项所述的抗原结合结构域；
和
d)任选的第四核酸，其编码根据权利要求24所述的抗原结合结构域。
26.一种表达载体组合物，其包含：
a)第一表达载体，其包含根据权利要求25所述的第一核酸；
b)第二表达载体，其包含根据权利要求25所述的第二核酸；
c)第三表达载体，其包含根据权利要求25所述的第三核酸；和
d)任选的第四表达载体，其包含根据权利要求25所述的第四核酸。
27.一种宿主细胞，其包含根据权利要求26所述的表达载体组合物。
28.一种制造根据权利要求15至24中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白的方法，其包含在其中所述双功能异源二聚体蛋白被表达的条件下培养根据权利要求27所述的宿主细胞，并且回收所述异源二聚体蛋白。
29.一种双功能异源二聚体蛋白，其包含：
a)包含第一重链和第一轻链的第一抗原结合结构域单体，所述第一重链包含第一VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第一可变重链，并且CH2-CH3是第一Fc结构域，所述第一轻链包含第一可变轻链和第一轻链恒定结构域；
b)包含第二重链、第二轻链和第一蛋白结构域的第二抗原结合结构域单体，所述第二重链包含第二VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第二可变重链，并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述第二轻链包含第二可变轻链和第二轻链恒定结构域，所述第一蛋白结构域使用第一结构域连接子共价连接于所述第二Fc结构域的C端；和
c)第二蛋白结构域，其连接或非共价连接于所述第二抗原结合结构域单体的所述第一蛋白结构域；
其中所述第一蛋白结构域是IL-15Rα蛋白，并且所述第二蛋白结构域是IL-15R蛋白，或所述第一蛋白结构域是IL-15蛋白，并且所述第二蛋白结构域是IL-15Rα蛋白，
其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，并且
其中所述第一抗原结合结构域单体和所述第二抗原结合结构域单体结合选自由以下组成的群组的抗原：人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D。
30.根据权利要求29所述的双功能异源二聚体蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
31.根据权利要求29或30所述的双功能异源二聚体蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白具有SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)或SEQ ID NO:2(成熟人类IL-15)的氨基酸序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)或SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)的氨基酸序列。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白和所述IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N4D、D61N、N65D和Q108E。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白包含所述氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述双功能异源二聚体蛋白是XENP24546。
37.一种核酸组合物，其包含：
a)第一核酸，其编码根据权利要求29至36中任一项所述的第一抗原结合结构域单体；
b)第二核酸，其编码根据权利要求29至36中任一项所述的第二抗原结合结构域单体；和
c)第三核酸，其编码根据权利要求29至36中任一项所述的第二蛋白结构域。
38.一种表达载体组合物，其包含：
a)第一表达载体，其包含根据权利要求37所述的第一核酸；
b)第二表达载体，其包含根据权利要求37所述的第二核酸；和
c)第三表达载体，其包含根据权利要求37所述的第三核酸。
39.一种宿主细胞，其包含根据权利要求38所述的表达载体组合物。
40.一种制造根据权利要求29至36中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白的方法，其包含在其中所述双功能异源二聚体蛋白被表达的条件下培养根据权利要求39所述的宿主细胞，并且回收所述异源二聚体蛋白。
41.一种双功能异源二聚体蛋白，其包含：
a)IL-15融合蛋白，其包含IL-15蛋白、第一抗原结合结构域和第一Fc结构域，
其中所述第一抗原结合结构域使用第一结构域连接子共价连接于所述IL-15蛋白的N端，所述IL-15蛋白使用第二结构域连接子共价连接于所述第一Fc结构域的N端，并且所述抗原结合结构域包含第一可变重链结构域和第一可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域；和
b)IL-15Rα融合蛋白，其包含IL-15Rα蛋白、第二抗原结合结构域和第二Fc结构域，
其中所述第二抗原结合结构域使用第三结构域连接子共价连接于所述IL-15Rα蛋白的N端，所述IL-15Rα蛋白使用第四结构域连接子共价连接于所述第二Fc结构域的N端，并且所述第二抗原结合结构域包含第二可变重链结构域和第二可变轻链结构域，并且不包括Fc结构域；
其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q，并且
其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合选自由以下组成的群组的抗原：人类CD8、人类NKG2A和人类NKG2D。
42.根据权利要求41所述的双功能异源二聚体蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
43.根据权利要求41或42所述的双功能异源二聚体蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白具有SEQ ID NO:1(全长人类IL-15)和SEQ ID NO:2(成熟人类IL-15)的氨基酸序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:3(全长人类IL-15Rα)或SEQ ID NO:4(人类IL-15Rα的寿司结构域)的氨基酸序列。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白和所述IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C；L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N4D、D61N、N65D和Q108E。
47.根据权利要求41至46中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述IL-15蛋白包含所述氨基酸取代N4D/N65D或D30N/E64Q/N65D。
48.根据权利要求41至47中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白，其中所述异源二聚体蛋白是XENP24547。
49.一种核酸组合物，其包含：
a)第一核酸，其编码根据权利要求41至48中任一项所述的IL-15融合蛋白；和
b)第二核酸，其编码根据权利要求41至48中任一项所述的IL-15Rα融合蛋白。
50.一种表达载体组合物，其包含：
a)第一表达载体，其包含根据权利要求49所述的第一核酸；和
b)第二表达载体，其包含根据权利要求49所述的第二核酸。
51.一种宿主细胞，其包含根据权利要求50所述的表达载体组合物。
52.一种制造根据权利要求41至48中任一项所述的双功能异源二聚体蛋白的方法，其包含在其中所述双功能异源二聚体蛋白被表达的条件下培养根据权利要求51所述的宿主细胞，并且回收所述异源二聚体蛋白。
53.一种双功能异源二聚体蛋白，其选自由以下组成的群组：XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24543、XENP24546、XENP24547、XENP24548、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145和XENP27146。
54.一种核酸组合物，其包含一种或多种编码选自由以下组成的群组的双功能异源二聚体蛋白的核酸：XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24543、XENP24546、XENP24547、XENP24548、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145和XENP27146。
55.一种表达载体组合物，其包含一种或多种表达载体，所述一种或多种表达载体各自包含核酸，使得所述一种或多种表达载体编码选自由以下组成的群组的双功能异源二聚体蛋白：XENP24114、XENP24115、XENP24116、XENP24531、XENP24532、XENP24533、XENP24534、XENP24543、XENP24546、XENP24547、XENP24548、XENP24736、XENP24917、XENP24918、XENP24919、XENP25137、XENP26223、XENP26224、XENP26227、XENP26229、XENP26585、XENP27145和XENP27146。
56.一种宿主细胞，其包含根据权利要求54所述的核酸组合物。
57.一种宿主细胞，其包含根据权利要求57所述的表达载体组合物。
58.一种产生根据权利要求53所述的双功能异源二聚体蛋白的方法，其包含(a)在其中所述双功能异源二聚体蛋白被表达的合适的条件下培养根据权利要求56或57所述的宿主细胞，和(b)回收所述蛋白。
59.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包含向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求53所述的双功能异源二聚体蛋白。
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