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KR20140016230A - 암의 진단 및 치료를 위한 방법 및 화합물 - Google Patents

암의 진단 및 치료를 위한 방법 및 화합물 Download PDF

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KR20140016230A
KR20140016230A KR1020137005620A KR20137005620A KR20140016230A KR 20140016230 A KR20140016230 A KR 20140016230A KR 1020137005620 A KR1020137005620 A KR 1020137005620A KR 20137005620 A KR20137005620 A KR 20137005620A KR 20140016230 A KR20140016230 A KR 20140016230A
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KR
South Korea
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ciz1
polypeptide
cancer
antibody
biological sample
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Application number
KR1020137005620A
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Inventor
던 앨리슨 커벌리
Original Assignee
시즐 바이오테크놀로지 리미티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 암의 진단 및 예후예측에 사용하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 이러한 방법에 사용하기 위한 결합제 및 키트를 제공한다. 본 발명은 추가로, 조성물, 상기 조성물의 제조 방법, 및 상기 조성물의 사용 방법에 관한 것이고, 이는 폐암, 림프종, 간암, 갑상선암 및 방광암을 포함한 암의 치료 및 진단시의 용도를 포함한다. 암의 치료에 유용한 본 발명의 조성물은 안티센스 및 소형 억제 RNA(siRNA)를 포함한다.

Description

진단 및 치료를 위한 방법 및 화합물{METHODS AND COMPOUNDS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF}
관련 출원
본 출원은 2010년 8월 4일에 출원된 미국 가출원 제61/370,479호, 2010년 8월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/372,981호, 및 2011년 2월 15일에 출원된 제61/442,823호에 대한 우선권 이익을 주장한다. 또한, 본 출원은 2010년 2월 5일에 출원된 제PCT/GB2010/000204호의 일부-계속-출원이고, 이는 2009년 2월 5일에 출원된 영국 출원 제0901837.5호에 대한 우선권 이익을 주장한다.
참조에 의한 인용
미국 가출원 제61/370,479호, 제61/372,981호, 및 제61/442,823호, PCT 출원 제PCT/GB2010/000204호 및 영국 출원 제0901837.5호는 이들의 전문이 참조에 의해 본원에 인용된다.
Cip1-상호작용 징크 핑거 단백질 1(Cip1-interactin zinc finger protein 1)(Ciz1)(NCBI 참조 서열: NM_001131016.1)이 세포 증식에 요구된다. Ciz1은 초기 S 상 동안 DNA 복제의 부위를 형성하고 사이클린 A/CDK2, 사이클린 E/CDK2 및 p21cip1을 포함한 세포 주기 조절인자와 관련하여 DNA 복제의 개시를 촉진하는 핵 기질 결합 포커스(nuclear matrix bound foci)를 국소화시킨다. 전사의 맥락에서, CIZ1은 그 자체가 크로마틴을 표적화하기 위해 에스트로겐 수용체(ER)의 점증(recruitment)을 향상시킬 수 있는 에스트로겐 수용체의 포지티브 보조인자인, 에스트로겐 반응성 유전자이다. Ciz1은 대안으로 스플라이싱되어 마우스 및 사람에서의 보존된 이소형을 생성한다. 정상 Ciz1 단백질은 적어도 2개의 정의된 기능성 도메인, '복제' 도메인 및 '고정화' 도메인을 포함한다.
본 발명은 부분적으로, 소세포 폐암(SCLC), 비-소세포 폐암(NSCLC), 림프종, 갑상선암, 신장암 및 간암을 포함한 암에서의 Ciz1 엑손 14의 대안의 슬플라이싱의 발견에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 NSCLC, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 방광암 및 갑상선암을 포함한 암에서의 복제 또는 고정화 도메인 중 어느 하나의 과도한 발현, 및 암의 병기에 따른 도메인 발현의 상호관계의 발견에 관한 것이다. 본 발명은 진단 시험, 및 신규 바이오마커 및 Ciz1 유전자 발현에 있어서의 이들 분자 이상에 기초한 표적을 통해 폐암 등의 암을 앓고 있는 환자의 생존률을 향상시키는 치료를 개발에 대한 지속적 요구에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은, 피험체에서 암을 진단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 상기 피험체가 암을 갖는다는 것을 나타낸다.
한 실시형태에서, 상기 암은 폐암, 림프종, 신장암, 유방암, 간암, 방광암, 및 갑상선암으로부터 선택된다.
한 양상에서, 본 발명은 피험체에서 폐암을 조기 검출하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 샘플 중의 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 상기 피험체가 암을 갖는다는 것을 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 폐암에 대해 예전에 치료된 피험체에서 폐암의 재발을 검출하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 샘플 중의 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 상기 피험체에서의 폐암의 재발을 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 폐 결절을 갖는 피험체에서 암을 진단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
iii) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
iv) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 샘플 중의 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 피험체가 암을 갖는다는 것을 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 폐렴 또는 폐암을 갖는 것으로 의심되는 피험체에서 폐렴으로부터 폐암을 구별하여 진단하는 방법에 관한 것이고,
상기 방법은:
i) 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 샘플 중의 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 피험체가 암을 갖는다는 것을 나타낸다.
본 발명의 방법의 한 실시형태에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 다른 실시형태에서, 폐암은 소세포 폐암(SCLC)이다. 다른 실시형태에서, 폐암은 0기의 NSCLC이다. 다른 실시형태에서, 폐암의 IA기의 NSCLC이다. 다른 실시형태에서, 폐암은 IB기의 NSCLC이다. 다른 실시형태에서, 폐암은 제한기의 SCLC이다.
당해 방법의 한 실시형태에서, 폐 결절은 직경 약 20mm 미만이다. 다른 실시형태에서, 폐 결절은 약 15mm 미만이다. 다른 실시형태에서, 폐 결절은 약 10mm 이하이다. 다른 실시형태에서, 폐 결절은 약 7.5mm 미만이다. 다른 실시형태에서, 폐 결절은 약 5mm 내지 약 10mm 사이이다.
한 실시형태에서, 당해 방법은 피험체의 폐를 영상화하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 영상화는 흉부 X선, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 자기 공명 영상(MRI) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영(PET) 스캔을 행하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 영상화 단독으로는 상기 암을 진단하기에 불충분하다. 다른 실시형태에서, 영상화는 흉부 X선을 행하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 영상화는 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔을 행하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, CT 스캔은 저선량 나선형 컴퓨터 단층촬영 CT 스캔이다. 다른 실시형태에서, 영상화는 MRI 스캔을 행하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 영상화는 PET 스캔을 행하는 단계를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 폐암에 대해 치료된 피험체에서의 암 세포 사멸을 나타내는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 상기 치료 전 및 후에, 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 치료 전 및 후에, 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양을 측정하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 치료 후 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양의 증가는 종양 세포 사멸을 나타낸다.
당해 방법의 한 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDIS(서열번호 8)를 포함한다. 다른 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
당해 방법의 한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직, 혈액, 혈장, 타액, 기관지폐포 세척액 또는 뇨이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직이다. 다른 실시형태에서, 조직은 폐 조직이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 분리된 CTC이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈장이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 타액이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 기관지폐포 세척액이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 뇨이다. 본 발명의 방법의 한 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드는 세포외 폴리펩타이드이다.
당해 방법의 한 실시형태에서, 100㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 50㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 25㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 10㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 5㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 1㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 0.5 내지 5㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 0.25 내지 5㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 0.25 내지 2㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 0.5 내지 1.5㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다. 다른 실시형태에서, 약 1㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험된다.
한 실시형태에서, 당해 방법은 상기 생물학적 샘플을 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 실시형태에서, 항체는 폴리클로날이다. 다른 실시형태에서, 항체는 모노클로날이다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 sdAb로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 핵산 앱타머이다. 다른 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 펩타이드 앱타머이다. 다른 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 펩타이도미메틱이다.
당해 방법의 한 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 엑손 14b 및 15에 걸친 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합제는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 100배 큰 친화성으로, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합제는, 상기 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 1,000배 큰 친화성으로, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합제는, 상기 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 10,000배 큰 친화성으로, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합제는 서열번호 23의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 실시형태에서, 당해 방법은 상기 생물학적 샘플을 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 엑손 14b 및 15에 걸친 에피토프 이외의 에피토프를 인식한다. 다른 실시형태에서, 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 실시형태에서, 항체는 폴리클로날이다. 다른 실시형태에서, 항체는 모노클로날이다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 sdAb로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 핵산 앱타머이다. 다른 실시형태에서, 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 펩타이드 앱타머이다. 다른 실시형태에서, 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 펩타이도미메틱이다.
한 실시형태에서, 당해 방법은 고체 지지체 상에 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드를 고정화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 다른 실시형태에서, 고체 지지체는 미세적정 플레이트이다. 다른 실시형태에서, 당해 방법은 고체 지지체 상에 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제를 고정화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는, 결합시, 상기 고체 지지체 상에 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드를 고정화시킨다. 다른 실시형태에서, 당해 방법은 샌드위치 검정이다. 다른 실시형태에서, 당해 방법은 샌드위치 면역분석이다. 다른 실시형태에서 당해 방법은 ELISA이다.
한 양상에서, 본 발명은 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제에 관한 것이다.
한 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, Ciz1 b-변이 폴리페타이드 결합제는 엑손 1b 및 15에 걸친 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합제는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 100배 큰 친화성으로, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합제는 상기 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 1,000배 큰 친화성으로, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합제는, 상기 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 10,000배 큰 친화성으로, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합제는 서열번호 23의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 결합제는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 실시형태에서, 항체는 폴리클로날이다. 다른 실시형태에서, 항체는 모노클로날이다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 sdAb로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 결합제는 핵산 앱타머이다. 다른 실시형태에서, 결합제는 펩타이드 앱타머이다. 다른 실시형태에서, 결합제는 펩타이도미메틱이다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제를 발현하는 분리된 세포에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 사람 자가항체에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 피험체에서 암을 진단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
ii) 상기 생물학적 샘플 중에 Ciz1 b-변이 전사체가 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 Ciz1 b-변이 전사체의 존재는 상기 생물학적 샘플 중의 암 세포의 존재를 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 Ciz1 고정화 도메인에 대해 Ciz1 복제 도메인의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계;
iii) Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계; 및
iv) 상기 Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA에 대해 상기 Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRAN의 상대적 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 적어도 2배의 상대적 발현의 차이가 암 세포의 존재를 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 Ciz1 고정화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 Ciz1 복제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 Ciz1 복제 도메인 및 상기 Ciz1 고정화 도메인을 검출하는 단계; 및
iii) 상기 샘플 중에 존재하는 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대해 상기 Ciz1 복제 도메인의 상대적 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대한 Ciz1 복제 도메인의 상대적 수준의 2배 이상의 차이가 암의 존재를 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 Ciz1 고정화 도메인에 대해 Ciz1 복제 도메인의 발현을 비교함으로써 암 환자의 예후를 나타내는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 시험될 분리된, 고형 종양에 인접한 생물학적 고형 조직 샘플을 제공하는 단계;
ii) Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계;
iii) Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계; 및
iv) 상기 Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA에 대해 상기 Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA의 상대적 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 2배 이상의 상대적 발현의 차이가 보다 불량한 예후를 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 Ciz1 고정화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 Ciz1 복제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 비교함으로써 암 환자의 예후를 나타내는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
i) 시험될 분리된, 고형 종양에 인접한 생물학적 고형 조직 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 조직 샘플 중에서 상기 Ciz1 복제 도메인 및 상기 Ciz1 고정화 도메인을 검출하는 단계; 및
iii) 상기 샘플 중에 존재하는 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대해 상기 Ciz1 복제 도메인의 상대적 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대한 Ciz1 복제 도메인의 상대적 수준의 2배 이상의 차이가 보다 불량한 예후를 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 피험체에서의 암의 진단 또는 예후예측 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
(a) 피험체로부터 유도된 생물학적 샘플 중의 Ciz1 단백질을 정량적으로 검출하는 단계; 및
(b) 대조군 샘플에서 검출된 단백질의 수준에 대해 피험체 샘플에서 검출된 상기 Ciz1 단백질의 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 대조군 샘플에 비교하여 피험체의 샘플에서 검출된 Ciz1 단백질의 수준의 증가는 암을 지닌 피험체의 지표이다.
한 양상에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 항-Ciz1 항체를 검출하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
(a) 면역특이적 항원-항체 결합 반응이 발생할 수 있는 조건 하에 항-Ciz1 항체를 함유한 샘플을 Ciz1 단백질 항원을 함유한 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(b) 샘플 중의 Ciz1 단백질에 대한 항-Ciz1 항체의 면역특이적 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시형태에서, 당해 방법은 샘플 중의 항-Ciz1 항체를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 단계는 샘플 중의 항-Ciz1 항체에 대해 특이적인 항체에 결합된 신호-생성 성분을 이용하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 샘플 중의 항-Ciz1 항체의 존재는: (a) 고체 기판 상에 하나 이상의 Ciz1 단백질을 고정화하는 단계; (b) 상기 고체 기판을 상기 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 샘플 중의 Ciz1 단백질에 대해 특이적인 항-Ciz1 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 면역분석에 의해 측정된다.
한 양상에서, 본 발명은 피험체에서의 암의 진단 및 예후예측을 위한 키트에 관한 것이고, 상기 키트는 생물학적 샘플 중의 Ciz1 폴리펩타이드의 존재를 검출하기 위한 성분을 포함한다. 당해 키트의 한 실시형태에서, Ciz1 폴리펩타이드의 존재를 검출하기 위한 성분은 Ciz1 결합제이다. 다른 실시형태에서, Ciz1 폴리펩타이드는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, Ciz1 폴리펩타이드를 검출하기 위한 성분은 항-Ciz1 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-Ciz1 항체는 표지된다. 다른 실시형태에서, 표지는 방사성 표지, 형광성 표지, 측색성 표지 또는 효소 표지이다. 다른 실시형태에서, 당해 키트는 항-Ciz1 항체에 면역특이적으로 결합하는 표지된 제2 항체를 포함한다.
한 양상에서, 상기 생물학적 샘플 중의 상기 항-Ciz1 항체의 존재를 검출하기 위한 성분을 포함하는 생물학적 샘플 중의 항-Ciz1 자가항체의 존재를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 당해 키트의 한 실시형태에서, 당해 성분은 Ciz1 항원이다. 다른 실시형태에서, Ciz1 항원은 표지된다. 다른 실시형태에서, Ciz1 항원은 고체상(solid phase)에 연결된다.
본 발명은 추가로, 조성물, 상기 조성물의 제조 방법, 및 상기 조성물의 사용 방법에 관한 것이고, 이는 암의 치료 및 진단시의 용도를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에 엑손 14b(서열번호 3)으로서 나타낸 엑손 14의 변이체를 포함하는 Ciz1의 mRNA를 표적화하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 siRNA 또는 shRNA에 관한 것이다. Ciz1 엑손 14b에는, 엑손 14a(서열번호 1)로서 나타낸 전장 엑손 14에 비교하여 3' 말단에 24개의 뉴클레오타이드가 결여되어 있다. 엑손 14a(a-변이체)보다는 오히려 엑손 14b를 발현하는 Ciz1 전사체는 Ciz1 b-변이체 또는 간략하게 b-변이체로서 나타낸다.
본 발명의 각종 양상은 세포 중에서 b-변이 전사체의 발현을 감소시키는데 적합한 화합물을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 엑손 14b 및 15의 접합부에 걸친 Ciz1의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드 25-26)을 통해 Ciz1 b-변이 전사체를 표적화하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 엑손 14b 및 15의 접합부에 걸친 Ciz1의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드 25-26)을 통해 Ciz1 b-변이 전사체를 표적화하는, siRNA 또는 shRNA를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 siRNA 또는 shRNA, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 b-변이 전사체를 발현하는 세포를 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA의 양을 감소시키는 b-변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 중의 Ciz1 b-변이 mRNA의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 포유동물에게 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양을 감소시키는 b-변이체를 투여하는 단계를 포함하는, 비-사람 포유동물에서 b-변이 전사체의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 사람에게 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양을 감소시키는 b-변이체를 투여하는 단계를 포함하는, 사람에서 b-변이 전사체의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA는 사람 또는 사람 세포에서 Ciz1 b-변이 전사체의 발현을 감소시키지만, 엑손 14a를 포함한 Ciz1 전사체의 발현은 감소시키지 않는다. 다른 양상에서, 본 발명은 b-변이 전사체를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, b-변이 전사체를, b-변이 전사체와 핵산 사이의 하이브리드화가 발생하기에 적합한 조건 하에 상기 b-변이 전사체의 전부 또는 일부에 상보성인 핵산과 접촉시키는 단계, 및 상기 b-변이 전사체에 결합된 상기 핵산을 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 핵산은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드이거나, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 b-변이 전사체에 대해 상보성인 핵산은 엑손 14b와 15의 접합부에 걸친 Ciz1의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드 25-26)을 포함하는 상기 b-변이 전사체의 전부 또는 일부를 하이브리드화한다. 한 실시형태에서, 상기 b-변이 전사체에 대해 상보성인 핵산은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 25-26을 포함한 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 하이브리드화한다. 한 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 b-변이 전사체를 하이브리드화하지만, a-변이 전사체는 하이브리드화하지 않는다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 엑손 14a로서 나타낸 전장 Ciz1 엑손 14의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 2는 엑손 14a로서 나타낸 전장 Ciz1 엑손 14의 폴리펩타이드 서열이다.
서열번호 3은 본원에 엑손 14b로서 나타낸 엑손 14의 3'-말단에 24개의 뉴클레오타이드가 결여된 Ciz1 엑손 14의 변이체의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 4는 엑손 14b로서 나타낸 엑손 14의 COOH-말단에 8개의 아미노산 잔기가 결여된 변이 Ciz1 엑손 14의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 Ciz1 엑손 15의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 6은 Ciz1 엑손 15의 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 엑손 14b와 15의 스플라이스 접합부에 걸친 Ciz1 b-변이 전사체 일부의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 8은 엑손 14b와 15의 스플라이스 접합부에 걸친 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 일부의 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 복제 도메인(엑손 9의 말단에 엑손 3에서 만남)의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 복제 도메인(엑손 5-9)의 일부의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 복제 도메인(엑손 5-9, 엑손 8 내부 일부 제외)의 추가의 한정된 일부의 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 복제 도메인(엑손 3 내지 엑손 9의 말단에서 만남)의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 13은 복제 도메인(엑손 5-9)의 일부의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 14는 복제 도메인(엑손 5-9, 엑손 8의 내부 일부 제외)의 추가의 한정된 일부의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 15는 고정화 도메인의 아미노산 서열이고, 서열번호 16은 고정화 도메인의 일부의 아미노산 서열이다.
서열번호 17은 고정화 도메인의 추가의 한정된 일부의 아미노산 서열이다.
서열번호 18은 고정화 도메인의 뉴클레오타이드 서열이고, 서열번호 19는 고정화 도메인의 일부의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 20은 고정화 도메인의 추가의 한정된 일부의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 21은 엑손 14a 및 15의 아미노산 서열이다.
서열번호 22는 엑손 14b 및 15의 아미노산 서열이다.
서열번호 23은 엑손 14a와 15의 스플라이스 접합부에 걸친 Ciz1 a-변이 폴리펩타이드의 일부의 아미노산 서열이다.
도 1은 다음을 설명한다: 엑손 구조를 보여주는 Ciz1 유전자의 도식. DNA 복제에 관여하는 기능성 도메인을 암호화하는 영역3, 및 핵 기질에 대한 부착점은 상기 검은 선에 의해 지적된다. 점선은 도메인 경계선에 대한 불확실성을 지적한다. 갭은 시험관내에서 완전한 활성을 갖는 변이체로부터 스플라이싱 제거되는 서열을 지적한다. PCR 프라이머 및 프로브의 위치는 공지된 기능성 도메인과 관련하여 나타낸다. 분홍 막대: 엑손 5 중에 프로브 T5, 녹색 막대: 엑손 6과 7의 사이의 접합부에서 프로브 T7, 황색 막대: 엑손 14중에 프로브 T4, 청색 막대: 엑손 16중에 프로브 T3. 도 1b) 폐 암종 및 정상의 인접 조직으로부터 유래된 46개 cDNA(Origene cDNA 어레이 HLRT504)를 거쳐 도 1a에 나타낸 프로브를 사용하는 Ciz1 발현의 정량(액틴으로 표준화시킨 후 dCT 값). Ciz1 복제 도메인(RD)내 서열을 증폭시키는 2개의 시약 세트는 어레이를 거쳐 유사한 프로필을 나타낸다. 역으로, 핵 기질 앵커 도메인(AD)내 서열을 증폭시키는 시약 세트는 서로 매우 유사한 프로필을 나타내지만 이는 RD와는 명백히 상이하다. 도 1c) IA기, IB기, IIA기, IIB기, IIIA기, 또는 IIIB기의 종양을 갖는 23명 환자 기원의 인접한 대조군 조직에서 및 도 1d) 종양 자체에서 Ciz1 발현의 정량 (액틴으로 표준화시킨 후 dCT 값). 그래프는 선형 회귀 트렌드 라인을 포함한다. 도 1e) 복제와 앵커 도메인 발현간의 균형이, 일치하는 대조군과 비교하여 종양에서 변화된 정도의 단일 수치적 지시기를 나타내기 위해. 2개의 복제 도메인 프로브 또는 2개이 앵커 도메인 프로브에 대한 RQ(샘플 세트 1/2에서 대조군 조직에 대해 계산됨)의 평균을 구하였다. 상기 종양 샘플에 대한 평균 RQ 는 이의 일치하는 대조군에 대한 평균 RQ로 나누어서 각각의 도메인에 대한 주변 조직에 상대적인 개별 변화에 대해 측정한다. 값은 복제 도메인중에 변화를 앵커 도메인 중에서의 변화로 나누어 합하여, 예를 들어, 앵커 도메인의 증가된 발현과 균형을 이루는 복제 도메인의 증가된 발현이 1의 근사치가 된다. 역으로, 앵커 도메인의 감소된 발현에 의해 악화된 복제 도메인의 증가된 발현은 1을 상당히 초과하는 값을 수득하게 한다. 결과는 로그 스케일로 나타낸다. 2배 미만의 변화(회색 영역에 의해 나타냄)는 중요하지 않은 것으로 고려된다. 이러한 분석은 Ciz1이 균형을 이룬 하향 또는 상향 발현을 밝히지 않고 단지 주변 조직에 상대적인 발현이 변화를 밝힌다. RD와 AD 불균형이 정도는 종양 단계와 함께 증가한다.
도 2는 지적된 바와 같이 고형 종양의 범위에서 DNA 복제와 핵 기질 앵커 도메인의 커플링되지 않은 발현을 나타낸다. 히스토그램은 cDNA 어레이 CSRT1에서 나타낸 샘플 세트에서 Ciz1 엑손 7(RD, 백색 막대) 및 Ciz1 엑손 16(AD, 검은 막대)의 상대적 정량(RQ)를 보여준다. 각각의 조직 유형에 대해, 증가하는 단계(좌측에서 우측으로)의 9개의 독립적인 종양의 분석은 암 환자 기원의 겉보기 정상 조직으로부터 유래된 3개의 일치하지 않는 대조군 샘플(대조군으로서 동정됨)을 따라 나타낸다. 2개의 프로브에 대한 결과는 RD에 대해 회색 암영의 대조군(C)의 평균으로 표준화하여 RQ = 2-( Ct 엑손 시험- ct ex 7 평균 대조군)가 되도록 한다. 폐 종양 I기 내지 III기에 대한 결과는 도 1에 분석된 샘플 세트에 상응하고 회색 암영으로 나타낸다. 모든 종양 유형에 대해, IV기의 종양의 예가 또한 포함된다. RD의 상기 발현 대부분은 RD와 균등하거나 초과한다(*로 지적됨). 도 2b) 우측 패널은 좌측에서 우측으로 증가하는 단계와 함께 AD와 RD의 발현 비율(비율=Ct 엑손 16/Ct 엑손 7)을 보여준다. 제1 데이터 포인트는 평균 대조군을 나타내고 마지막 데이터 포인트는 IV기의 샘플을 나타낸다. 2차 회귀 트렌드 라인은 엑셀을 사용하여 작성하였다. 간을 제외한 모든 종양 유형에 대해 상기 트렌드는 대조군과 비교하여 조기 병기 종양에서 RD에 상대적인 AD의 비례적 증가 및 후기 단계에서 상기 트렌드의 역전을 나타내어 대부분이 IV기의 종양에 대한 RD는 흔히 AD를 초과한다.
도 3의 A) 도 2에서와 같은 분석은 대조군 샘플과 비교하여 40개의 악성 흑색종에서 AD를 선호하는 변화된 발현을 지적한다. 2개의 검출 도구 세트에 대한 결과는 제1 대조군 샘플에 대해 1로 표준화시킨다. 우측 패널, I, II 및 IV기의 종양에 대한 요약은 앵커 도메인 발현이 복제 도메인의 발현을 초과하는 샘플의 %를 지적한다.
도 4a) Ciz1 복제 도메인(검은선) 및 핵 기질 앵커 도메인(황색 원형)의 커플링되지 않은 발현이 Ciz1의 고정화 및 이의 DNA 복제 활성의 준-핵 위치화에 영향을 미칠 수 있는 방식. 회색 통은 복제 오리진에서 어셈블리된 DNA 복제 단백질을 나타내고, 회색 탄원형은 Ciz1에 대한 핵 기질 관련 도킹 부위를 나타낸다. 상기 모델은 핵 기질 관련 도킹 부위가 제한적임을 추정한다. 우측 패널은 핵 기질로 어셈블리되는 손상된 능력을 갖는 Ciz1의 변이체를 보여준다. 도 4b) 사람 종양에서 나타난 Ciz1의 잘못 발현된 2개의 유형의 요약, i) 대부분의 통상적인 고형 종양에서 나타내고 도 1 내지 3에 기재된 바와 같은 커플링되지 않은 발현, ii) 높은 비율의 소세포 폐 암, 갑상선 암 및 림프종에서 나타난 바와 같은 b-변이체.
도 5. Ciz1 복제 도메인(RD) 및 앵커 도메인(AD) 항체의 제조 및 입증 및 RD 및 AD 단백질 발현의 분석. 도 5a) 폴리클로날 항체(상부 패널) 및 모노클로날 항체(하부 패널)에 대한 면역원으로서 사용되는 영역을 보여주는 Ciz1 엑손(암영의 삼각형)의 도식. 도 5b) 0.1% 트리톤 X100의 존재하에 가용성 단백질 추출후 ('세제 내성') 및 DNAse 1과 항온처리 후('DNase 내성') 고정화 전 처리('추출되지 않음') 없이, 지적된 바와 같이 정상의 태아 폐 세포(WI38) 및 2개의 대표적인 신생물 세포주에서 Ciz1-RD 항체(적색)으로 검출된 내인성 Ciz1의 대표적인 면역 형광 이미지. 이미지는 표준화된 노출 시간과 함께 동일한 조건하에서 수거하여 세포주내 및 세포주간에 Ciz1 및 DNA의 강도가 상이한 조건하에서 세포에 남아있는 Ciz1 및 DNA 수준을 반영하도록 한다. 전체 DNA를 Hoechst 33258 (청색)으로 염색시킨다. 막대는 10마이크론이다. 유사한 결과는 상이한 기원의 다른 암세포주에 대해 수득하였다. 도 5c) 검출이 Ciz1-AD 항체(녹색)으로 수행되는 것외에는 B에서와 같이, 결과는 i) 단백질 수준에서 Ciz1-RD 및 Ciz1-AD의 커플링되지 않고 불균형의 발현, ii) 암 세포에서 고정화되지 않은 상승된 Ciz1-RD 단백질, iii) Ciz1-AD 단백질 대부분의 고정화를 도시한다. 도 5d) 내인성 Ciz1의 고정화에 대한 재조합 AD 단백질의 효과. 쥐 AD 단백질을 암호화하는 재조합 GFP-C275(녹색)의 발현 없이(좌측 패널) 또는 발현과 함께(우측 패널) NIH3T3에서 내인성 Ciz1-RD(적색)의 DNAse-내성 분획의 고해상 이미지. 전체 DNA는 Hoechst 33258 (청색)으로 염색시킨다. GFP-C275로 형질감염된 세포에서 감소된 초점 염색을 주목한다. 도 5e) 이미지는 세제를 사용한 추출 후 GFP-Ciz1의 초점 패턴, GFP-C275이 비초점 패턴을 갖는 NIH3T3 핵 및 2개의 벡터로 동시 형질감염된 세포를 보여준다. 녹색은 GFP이고, 청색은 Hoecsht 33258로 염색된 핵을 나타낸다. GFP-C275는 GFP-Ciz1 준핵 초점의 형성을 방해한다.
도 6a) 프라이머를 포괄하는 b형 전사체 접합부(적색 화살표)와 접합부-포괄 타크만 프로브의 위치(적색선)을 지적하는 도식. 도 6b) SCLC 세포주로부터 b-변이체 엑손을 갖는 클로닝된 생성물 및 정상 세포주 기원의 전장 생성물에 관찰되는 이동성 변화. 도 6c) 접합부-포괄 프라이머는 정상적인 전사체(클론 19) 또는 b형 전사체(클론 20)를 발현하는 리포터 플라스미드를 사용하여 입증하였다. 겔은 선택적 프라이머 쌍 P3/4 또는 비선택적인 Ciz1 프라이머 쌍 P1/2로부터의 플라스미드 유래된 PCR 생성물을 보여준다. 도 6d) 프라이머 세트 P11/P12(액틴, 하부 패널), 프라이머 세트 P1/P2(Ciz1, 상부 패널) 또는 b형 전사체 접합부 포괄 프라이머 세트 P4/P3(중간 패널)을 사용하여, 2개의 신경엔도크린 폐 암 세포주(L95, SBC5) 및 하나의 정상적인 태아 폐 세포 주(HFL1)으로부터 제조된 cDNA로부터 작제된 PCR 생성물. 생성물은 서열 입증되었고 주형의 대조군 레인이 없다. 도 6e) 가변 영역의 어느 측면 기원의 프라이머(P1/P2 또는 P6/P7)를 b형 전사체에서 유일한 접합부를 포괄하는 타크만 프로브(T2) 또는 다르게 스플라이싱되지 않는 영역을 인지하는 타크만 프로브(T4 및 T3)와 커플링시켰다. 100, 75, 50, 25, 또는 0 % 클론 20을 함유하는, 플라스미드 클론 19 및 20의 혼합물로의 적용은 b형 전사체의 선택적 검출을 입증한다. 그래프는 역치에 도달하기에 요구되는 사이클 수가 비선택적 검출 도구에 대해서는 일정하지만 변이체 선택적 도구에 대한 플라스미드 혼합물 조성에 의해서는 영향받음을 보여준다.
도 7a) 3개의 정상적인 배아 폐 세포주 및 3개의 신경엔도크린 폐 종양 세포주, 및 하나의 신경엔도크린 카르시노이드 기원의 주형을 사용하는 b-변이체의, 도 1 내지 3에서와 같이 RD(좌측 패널) 또는 AD(중앙 패널)에 대한 QPCR. 결과는 액틴으로 표준화하고 IMR90 RD로 보정한다. 도 7b) 사람 폐 암 조직. 상기 동일한 검출 도구는 3명의 SCLC 환자 기원이 cDNA, 및 동일한 개체 기원의 3개의 정상적인 인접 조직에 적용하였다. b형 전사체의 발현은 이들 신경엔도크린 종양에서 급격히 상승한다.
도 8a) 등급 I에서 등급 III의 범위에 이르는 23명의 폐 암 환자(도 1에서의 세트와 동일함) (Origene cDNA 어레이 HLRT504) 기원의 일치된 샘플 세트에서 b형 전사체(검은 막대)의 발현. 발현은 액틴으로 표준화시키고 각각의 쌍에서 "정상" 샘플(백색 막대)에 상대적으로 표현하고, 이는 1의 절대값으로 주어진다. 도 8b) 상기 단계로부터 비-소세포 폐 종양 및 일치되지 않는 대조군의 별도의 세트의 유사한 분석을 나타내었다(Origene 어레이 CSRT303). 히스토그램은 액틴으로 표준화시킨 후의 b-변이체 RQ를 보여준다. 도 8c) 간 종양에 대한 상응하는 결과 및 도 8d) CSRT303으로부터 또한 유래된 신장 종양. 결과는 회색 블록으로 지적된 대조군 조직 샘플의 평균으로 보정한다. 도 8에 나타낸 모든 샘플 세트에 대해, b-변이체는 소수의 무작위 사례에서 상승한다.
도 9는 림프종, 갑상선, 방광, 간 및 신장 암에 대해 도 8에서와 같은 분석을 설명한다.
도 10 엑손 14b-변이체 단백질 검출 도구의 제조 및 입증. 도 10a) 16개 아미노산 펩타이드(하부 라인) 및 접합부 플랭킹 에피토프와 반응하는 항체 종을 제거하기 위해 사용되는 전장 펩타이드(상향 라인)내 독특한 EEIEVRSR 접합부를 제조하기 위해 삽입 서열(회색)이 없는 면역원성 펩타이드. 폴리클로날 혈청 및 하이브리도마는 고정화된 전장 펩타이드에 대해 음으로 스크리닝하고 친화성 정제된 폴리클로날 항체(항체 2B)를 제조하기 위해 14b 접합부 함유 펩타이드를 사용하여 양으로 선택하거나 친화성 정제하였다. 도 10b) GFP-hCiz1 또는 GFP-hCiz1 b-변이체를 발현하는 NIH3T3 세포를 사용한 항-b-변이체 항체와의 면역 형광(녹색). 재조합 14b 단백질은 적색으로 검출되고 DNA는 청색으로 염색된다. 도 10c) 웨스턴 블롯은 14b 엑손 접합부를 함유하는 과발현된 GFP-Ciz1 단백질의 선택적 검출을 보여준다. 항-b-변이체 혈청, 면역전 혈청 및 항-Ciz 폴리클로날 항체를 사용한 결과를 나타낸다. 도 10d) 지적된 바와 같이 SCLC 세포 및 대표적인 정상 세포에서 친화성 정제된 항-b-변이체 폴리클로날 항체를 사용한 내인성 4b 단백질의 면역 검출. SCLC 세포는 항-b-변이체와 반응하지만 정상 세포는 반응하지 않는다. 도 10e) 동일한 세포에서 Ciz1의 검출은 비교를 위해 나타낸다. 도 10f) D에서와 같이 SCLC 세포의 고확대 (600x) 이미지는 크기가 유사하지만 DNA 복제 초점 보다는 수적으로 적은 핵내 구분된 초점을 밝힌다.
도 11 b형 전사체 선택적 RNA 간섭 도구의 개발. 도 11a) 상부 패널, 유일한 엑손 접합부를 포괄하는 siRNA 서열의 패널을 보여주는 도식. 하부 패널은 SCLC 세포로 순간적 형질감염시킨 후 Ciz1 AD 전사체 수준 및 b형 전사체 수준에 대한 이들의 효과를 보여준다. 결과는 액틴으로 표준화하고 대조군 siRNA(Dcon)으로 형질감염된 세포 기원이 샘플로 보정한다. 도 11b) 결과는 b형 전사체에 대한 AD이 비율로서 나타내고 여기서, 대조군 siRNA는 1의 비율을 갖는다. 가장 효과적이고 선택적인 siRNA 서열은 추가의 시험을 위해 선택하였다(별표). 도 11c). 재조합 Ciz1 단백질의 발현에 대한 변이체 선택적 효과. 클론 19 및 20은 지적된 바와 같이 b형 전사체 선택적 siRNA 또는 대조군 siRNA를 사용하여 마우스 3T3 세포에 동시 형질감염시켰다. B형 전사체 siRNA는 발현 클론 20 기원이 단백질의 발현을 억제하지만 발현 클론 19 기원이 내인성 마우스 Ciz1 또는 사람 Ciz1을 억제하지 않는다.
도 12 배양중에 SCLC 세포 증식에 대한 b변이체 선택적 shRNA의 유도성 발현의 효과. 도 12a) dox-조절된 shRNA 벡터(Clonetech) 기원의 선택된 b형 선택적 서열 및 대조군 서열(루시페라제에 대한)의 안정한 발현. 결과는 4일에 걸쳐 세포 수의 증가를 보여준다. Dox를 0일째 및 3일째에 샘플을 시험하기 우해 첨가하였다(검은 화살 헤드). 대조군 세포(루시퍼라제 shRNA를 발현하는 SCLC)는 유도에 의해 크게 영향받지 않지만 시험 세포(b형 선택적 서열을 발현하는 SCLC)는 정상 비율로 증식하지 못하였다. 도 12b) 독시사이클린이 0일째에 첨가되고 세포수가 4일째에 3회 정량된 독립적인 실험. 오류 막대는 SEM을 나타낸다. 도 12c) 겔 이미지는 전체 Ciz1 발현에 대한 b형 전사체에 대해 선택된 서열의 RT-PCR 생성물 및 선택성을 보여준다. 유도후 24시간 까지 b형 전사체 수준이 회복되었고 샘플이 분리되기 1시간 전에 제2 투여는 b형 전사체의 선택적 억제를 밝힌다. 도 12d) 독소사이클린을 사용한 shRNA 발현 유도 48시간 후 b-변이체 폴리클로날 항체로 검출된, SBC5 세포에서 b-변이체 단백질의 억제. 도 12e) 유도 없이 낮은 tet 혈청중에서 배양 1개월 후 유도성 b 변이체 shRNA 벡터 세포를 함유하는 SBC5. 만성 누출 발현은 세포에 대한 가시적이고 점진적인 효과를 갖는다.
도 13 생체내 연구(Southern Research Institute, USA). 도 13a) 15마리의 NOD/SCID 마우스의 2개의 집단에 0일째에 dox-조절된 b형 변이체 선택적 shRNA 벡터를 함유하는 1.5 x 107 세포를 주사하였다. 21일째에 100mg 미만의 종양을 갖는 마우스를 제외시키고 동등한 평균 종양 무게 및 낮은 고유 변화를 갖는 그룹을 제조하였다. Dox는 21일째에 음료수로 그룹 2(검은 원형)에 투여하였고 종양 크기는 이후 주 2회 측정하였다. 그래프는 SEM과 함께 평균 종양 무게를 보여준다. 도 13b) 추가의 10마리의 마우스를 SCLC 세포를 사용한 주사 3일 전에 Dox상에서 유지시켰다. 결과는 dox를 투여받지 않은 15마리의 마우스의 평균 종양 무게와 비교하여 SEM으로 이들의 평균 종양 무게를 보여준다. 도 13c) 그룹 1 기원의 종양을 갖는 2마리의 마우스(도 14a에 개방 원형) 및 그룹 3 기원의 종양이 없는 2마리의 마우스(도 14b에서와 같은 폐쇄된 사각형)의 전혈 유래 cDNA중 b형 전사체의 상대적 수준을 보여주는 정량적 RT-PCR. 히스토그램은 뮤린 액틴으로 표준화시킨 후 2회 분석(각각은 3개 샘플의 평균이다) 및 샘플 SRI-3-8로의 보정을 나타낸다. 4마리의 마우스가 갖는 피하 종양의 평가된 크기를 또한 나타낸다.
도 17a) 엑손을 보여주는 Ciz1 유전자 (번호를 매김) 및 siRNA의 위치(회색 삼각형)의 도식. 도 17b) 개별적으로(A, B, C, D) 또는 혼합물로서 Dharmacon 스마트 풀 항-사람 Ciz1 siRNA 및 Dharmacon 스마트 풀 대조군 siRNA를 사용한 사람 SCLC 세포주 SBC5의 순간적 형질감염 후 사람 Ciz1 전사체의 억제. 히스토그램은 지정된 시점에서 프라이머 P1P2 및 프로브 T4로 검출된, Ciz1 앵커 도메인 저사체의 상대적 정량(RQ)을 보여준다. 결과는 액틴으로 표준화하고 대조군 siRNA로 형질감염된 세포에 대한 결과로 보정하고 절대값 1이 부여된다. 도 17c) 형질감염 24시간 후에 수거된 SBC5 세포 기원이 세제 가용성 상등액(SN) 및 세제 내성 펠렛(P)의 웨스턴 블롯에서 Ciz1 단백질에 대한 siRNA B 및 siRNA의 효과. Ciz1 단백질은 항-마우스 Ciz1 RD 폴리클로날 항체 1793으로 검출하였다. 다중 Ciz1 이소형은 NIH3T3 세포 및 U20S 세포에 대해 이전에 보고된 바와 같이 검출한다. 도 17d) 단일 순간적 형질감염 후 5일 동안 SBC5 세포의 증식에 대한 항-사람 Ciz1 siRNA B (회색 사각형), 및 Ciz1 siRNA 1 (회색 원형), Ciz1 siRNA 3 (회색 삼각형), 및 대조군 siRNA (개방 원형)의 효과. 결과는 3개의 독립적인 집단 유래의 SD와 함께 1일에 걸친 세포수의 배수 증가로서 나타낸다.
도 18 폐암 환자 혈장에서 B-변이체 Ciz1 단백질. 도 18a) 바로 아래 엑손 14의 일부가 없는 Ciz1 b 변이체의 도시와 함게 엑손을 보여주는 Ciz1 유전자(번호를 매김), DNA 복제 도메인 및 핵 기질 앵커 도메인. 도 18b) SCLC 및 NSCLC를 갖는 환자 기원의 1㎕의 혈장 및 어떠한 진단된 질환을 갖지 않고 항체 2B(보충된 도 10에 기재됨)로 검출된 개체로부터의 5개의 샘플중에서 b-변이체 단백질을 보여주는 웨스턴 블롯. 내인성 면역글로불린을 사용하여 로딩에 대해 표준화하였다(대조군). 도 18c) 지적된 유형 및 질환 단계를 갖는 암 환자 기원의 총 119개의 전처리 샘플 및 어떠한 질환을 갖지 않는 개체 및 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 천식 또는 빈혈을 앓는 환자 기원의 51개 샘플에 대한 결과를 보여주는 웨스턴 블롯의 밀도측정에 의해 결정된 평균 b변이체 단백질 수준(SEM과 함께). 비-암 샘플(+1 SD)의 평균에서의 역치 세트를 사용하여, 상기 시험은 제한기의 SCLC 및 1기의 NSCLC 환자의 93%를 올바르게 분류하였다. 도 18d) 연속적으로 분포된 데이터의 ROC 분석(AUC는 0.985이다)에 대한 웹 기반 계산기를 사용하는 모든 170개 샘플에 대해 생성된 95% 신뢰 간격으로 수용자 작동 특징 곡선. 웹 기반의 계산기(웹 주소: http://www.jrocfit.org (연속적으로 분포된 데이터에 대해 포맷 5))를 상기 계산을 위해 사용하였다.
본 발명은 화합물 및 조성물뿐만 아니라 상기 화합물 및 조성물 제조 방법 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 화합물 및 조성물은 예를 들어, 폐암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암 및 림프종을 포함하는 암의 치료 및 진단에 유용하다.
한 양상에서, 본 발명은 Ciz1의 b-변이 전사체만을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 Ciz1의 b-변이 전사체만을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 Ciz1 b-변이 전사체의 발현 수준을 감소시키기 위해 siRNA 또는 shRNA을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "사일런스(silence)" 또는 "녹다운(knock-down)"은 유전자 발현을 나타내는 경우, 유전자 발현의 감소를 의미한다. 용어 "전사체"는 전사의 RNA 생성물을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 전사체는 mRNA이다.
본 발명은 추가로 화학적 합성에 의한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 Ciz1 b-변이 전사체의 발현을 검출하는데 적합하다. 한 양상에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포유동물 세포에서 Ciz1 b-변이 전사체의 수준을 감소시키는데 적합하다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 추가로 mRNA의 수준에서 유전자 발현을 저하시킴으로써 Ciz1 b-변이 mRNA에 의해 암호화된 Ciz1 b-변이 단백질의 발현을 저하시키는데 적합하다.
본 발명의 siRNA 또는 shRNA는 Ciz1 b-변이 전사체의 수준을 감소시키는데 적합하다. 본 발명에 따른 siRNA 또는 shRNA는 추가로 mRNA의 수준에서 유전자 발현을 저하시킴으로써 Ciz1 b-변이 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 발현을 저하시키는데 적합하다.
안티센스 디자인: Ciz1 b-변이 전사체의 수준을 감소시키는데 적합한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 서열번호 7의 25 내지 26 위치에서의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열번호 7에 대해 상보성인 적어도 8개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하는, 길이가 12 내지 50개의 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이다.
하나의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 서열번호 7 사이의 상보성은, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가, 엄중한 하이브리드화(stringent hybridization) 조건 하에 서열번호 7의 25 내지 26 위치에서 뉴클레오타이드를 포함하는 서열번호 7의 서열에 대해 하이브리드화할 수 있게 하는 것이다(여기서, '엄중한 하이브리드화'는 다음의 하이브리드화 조건들로서 본원에서 정의된다: 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 70℃).
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 리보뉴클레오타이드 또는 이의 조합일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 RNaseH를 통해 mRNA를 열화(degrade)시키는데 사용되는 경우, 일반적으로 뉴클레오타이드의 적어도 일부가 데옥시리보뉴클레오타이드이다.
siRNA 디자인: 본 발명의 siRNA는 핵산의 두 가닥, 제1 안티센스 가닥 및 제2 센스 가닥을 포함한다. 핵산은 일반적으로 리보뉴클레오타이드 또는 변형된 리보뉴클레오타이드로 이루어지지만, 핵산은 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA)를 포함할 수 있다. siRNA는 추가로 이중-가닥 핵산 부분 또는 안티센스 가닥의 전부 또는 일부 및 센스 가닥의 전부 또는 일부에 의해 형성된 듀플렉스 영역을 포함한다. 센스 가닥으로 듀플렉스 영역을 형성하는 안티센스 가닥의 일부는 안티센스 가닥 듀플렉스 영역 또는 간단하게, 안티센스 듀플렉스 영역이고, 안티센스 가닥으로 듀플렉스 영역을 형성하는 센스 가닥의 일부는 센스 가닥 듀플렉스 영역 또는 간단하게, 센스 듀플렉스 영역이다. 상기 듀플렉스 영역은 포괄적으로 안티센스 가닥 및 센스 가닥 사이에 형성되는 첫 염기쌍으로 시작하여 안티센스 가닥 및 센스 가닥 사이에 형성되는 마지막 염기쌍으로 끝나는 것으로 정의된다. 듀플렉스 영역의 양쪽 상의 siRNA의 일부는 플랭킹 영역(flanking region)이다. 안티센스 듀플렉스 영역의 양쪽 상의 안티센스 가닥의 일부는 안티센스 플랭킹 영역이다. 안티센스 가닥 5' 내지 안티센스 듀플렉스 영역의 일부는 안티센스 5' 플랭킹 영역이다. 안티센스 가닥 3' 내지 안티센스 듀플렉스 영역의 일부는 안티센스 3' 플랭킹 영역이다. 센스 듀플렉스 영역의 양쪽 상의 센스 가닥의 일부는 센스 플랭킹 영역이다. 센스 가닥 5' 내지 센스 듀플렉스 영역의 일부는 센스 5' 플랭킹 영역이다. 센스 가닥 3' 내지 센스 듀플렉스 영역의 일부는 센스 3' 플랭킹 영역이다.
상보성: 한 양상에서, 안티센스 듀플렉스 영역 및 센스 듀플렉스 영역은 완전히 상보성일 수 있고, 적어도 서로에 대해 부분적으로 상보성이다. 이러한 상보성은 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairing)(즉, A:U 및 G:C 염기쌍)에 기초한다. siRNA의 길이에 따른 안티센스 및 센스 듀플렉스 영역 사이의 염기 상보성에 관하여 완전한 매치(match)는 필수적으로 요구되는 것은 아니지만, 안티센스 및 센스 가닥은 생리학적 조건하에 하이브리드화가 가능해야만 한다. 한 실시형태에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥 사이의 상보성은 완전하다(어느 가닥에서도 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가의/결실된 뉴클레오타이드는 없다). 하나의 양상에서, 안티센스 듀플렉스 영역 및 센스 듀플렉스 영역 사이의 상보성은 완전하다(어느 가닥의 듀플렉스 영역에서도 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가의/결실된 뉴클레오타이드는 없다). 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역 및 센스 듀플렉스 영역 사이의 상보성은 완전하지 않다.
본 발명의 siRNA 또는 shRNA 또는 기타 관련된 디자인을 사용한 RNAi는, 안티센스 가닥의 전부 또는 일부 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열의 일부(25 내지 26 위치에서의 뉴클레오타이드를 포함한다) 사이의 듀플렉스 영역의 형성을 포함한다('표적 핵산' 또는 '표적 서열'). 보다 구체적으로, '표적 서열'은, 서열번호 7의 일부(안티센스 가닥 및 서열번호 7 사이에서 형성된 첫 염기쌍으로 시작하여 안티센스 가닥 및 서열번호 7 사이에서 형성된 마지막 염기쌍으로 끝나는 것으로 정의되는, 안티센스 가닥으로 듀플렉스 영역을 형성하는, 25 내지 26 위치에서의 뉴클레오타이드를 포함한다)이다.
안티센스 가닥 및 센스 가닥 사이에서 형성된 듀플렉스 영역은 안티센스 가닥 및 표적 서열 사이에서 형성된 듀플렉스 영역과 동일할 수 있으나 동일할 필요는 없다. 즉, 센스 가닥은 표적 핵산과 상이한 서열을 가질 수 있으나, 안티센스 가닥은 센스 가닥 및 표적 핵산 둘 다를 이용한 생리학적 조건 하에 듀플렉스 구조를 형성할 수 있어야만 한다.
하나의 실시형태에서, 안티센스 가닥 및 표적 핵산 사이의 상보성은 완전하다(어느 핵산에서도 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가의/결실된 뉴클레오타이드는 없다). 하나의 실시형태에서 안티센스 듀플렉스 영역(센스 가닥으로 듀플렉스 영역을 형성하는 안티센스 가닥의 일부) 및 표적 핵산 사이의 상보성은 완전하다(어느 핵산에서도 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가의/결실된 뉴클레오타이드는 없다). 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역 및 표적 핵산 사이의 상보성은 완전하지 않다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 siRNA는 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 안티센스 듀플렉스 영역은 센스 듀플렉스 영역에서 뉴클레오타이드에 염기-쌍이 아닌 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 siRNA는 b-변이 전사체의 발현을 감소시키는데 적합하다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥은 센스 가닥에 염기-쌍을 형성하지 않는 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드를 가지며, 여기서 상기 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 b-변이 전사체의 발현을 감소시키는데 적합하다. 염기-쌍의 결여는 염기들 사이의 상보성의 결여(즉, 왓슨-크릭 염기쌍이 없다) 때문이거나 벌지(bulge) 또는 오버행(overhang)이 생성되는 것과 같은 상응하는 뉴클레오타이드가 없기 때문이다.
다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역 및 센스 듀플렉스 영역은 엄중한 하이브리드화 조건하에 하이브리드화되며, 여기서 '엄중한 하이브리드화 조건'은 다음과 같이 정의된다: 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 70℃. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역 및 표적 핵산은 엄중한 하이브리드화 조건하에 하이브리드화된다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역 및 센스 듀플렉스 영역과 표적 핵산 둘 다는 엄중한 하이브리드화 조건하에 하이브리드화된다.
본 발명의 siRNA와 같이, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산에 완전히 상보성일 수 있고 적어도 부분적으로 상보성이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산 사이의 염기 상보성에 관하여 완전한 매치가 필수적으로 요구되는 것은 아니지만, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산은 생리학적 조건하에 하이브리드화가 가능해야만 한다. 하나의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산 사이의 상보성은 완전하다(어느 가닥에서도 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가의/결실된 뉴클레오타이드는 없다). 다른 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산 사이의 상보성은 완전하지 않다. 다른 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산 서열은 엄중한 하이브리드화 조건하에 하이브리드화된다.
길이: 본 발명의 양상은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA를 형성하는 핵산 및 특정 영역의 길이에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 7에 상보성인 적어도 8개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하여 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 뉴클레오타이드인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50인 서열번호 7에 상보성인 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50인 서열번호 7에 상보성인 연속하는 뉴클레오타이드로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 30 뉴클레오타이드와 동일하거나 보다 적고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 16개의 연속하는 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드들은 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 동일한 뉴클레오타이드 길이를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 30 뉴클레오타이드와 동일하거나 보다 적고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 18개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 동일한 뉴클레오타이드 길이를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 25 뉴클레오타이드와 동일하거나 보다 적고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 16개의 연속하는 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 길이가 동일한 뉴클레오타이드를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 25 뉴클레오타이드와 동일하거나 보다 적고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 18개의 연속하는 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 길이가 동일한 뉴클레오타이드를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 18 내지 25 뉴클레오타이드이고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 16개의 연속하는 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 길이가 동일한 뉴클레오타이드를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 18 내지 25 뉴클레오타이드이고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 18개의 연속하는 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 길이가 동일한 뉴클레오타이드를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 19 내지 23 뉴클레오타이드이고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 18개의 연속하는 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 길이가 동일한 뉴클레오타이드를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 길이가 19 내지 25 뉴클레오타이드이고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 19개의 연속하는 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 길이가 동일한 뉴클레오타이드를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하는 siRNA에 관한 것이며;
여기서, 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 각각 길이가 19 내지 23 뉴클레오타이드이고;
여기서, 상기 센스 가닥은 센스 듀플렉스 영역을 포함하며;
여기서, 상기 센스 듀플렉스 영역은 서열번호 7의 적어도 19개의 연속하는 뉴클레오타이드들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 연속하는 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 25 내지 26 뉴클레오타이드를 포함하며;
여기서, 상기 안티센스 가닥은 안티센스 듀플렉스 영역을 포함하고;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역과 길이가 동일한 뉴클레오타이드를 가지며;
여기서, 상기 안티센스 듀플렉스 영역은 상기 센스 듀플렉스 영역에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 siRNA 또는 shRNA의 안티센스 가닥은 하기로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
5' AAGAAGAGAUCGAGGUGAGGU 3';
5' AAGAGAUCGAGGUGAGGUCCA 3';
5' AGAAGAGAUCGAGGUGAGGUC 3';
5' GAAGAGAUCGAGGUGAGGUCC 3'; 또는
5' AGAGAUCGAGGUGAGGUCCAG 3'.
말단(오버행 및 블런트 말단): 다른 양상은 siRNA의 말단 디자인에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA는 오버행을 포함할 수 있거나 블런트 말단일 수 있다. 본원에 사용된 "오버행"은 당해 분야에서 이의 일반적 및 통상적인 의미를 가지며, 즉, 이중 가닥 핵산에서 상보성 가닥의 말단 뉴클레오타이드(terminal nucleotide)까지 확장되는 핵산의 단일 가닥 일부이다. 용어 "블런트 말단"은 말단 뉴클레오타이드(들)이 염기쌍인지의 여부에 상관없이 동일한 위치에서 가닥들 둘 다 종료되는 이중 가닥 핵산을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 블런트 말단의 말단 뉴클레오타이드는 염기쌍이다.
다른 실시형태에서, 블런트 말단의 말단 뉴클레오타이드는 쌍이 아니다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 siRNA는 하나의 말단에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 오버행 및 다른 말단에서 블런트 말단을 갖는다.
다른 실시형태에서, siRNA는 말단 둘 다에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 오버행을 갖는다.
하나의 실시형태에서, siRNA는 말단 둘 다에서 블런트 말단이다.
다른 실시형태에서, siRNA는 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 3'-말단에 의해 정의되는 말단에서 블런트 말단이다.
다른 실시형태에서, siRNA는 센스 가닥의 3'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 의해 정의되는 말단에서 블런트 말단이다.
다른 실시형태에서, siRNA는 센스 및 안티센스 가닥들 둘 다 또는 한 쪽 상에서 3'- 또는 5'-말단에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다.
하나의 실시형태에서, siRNA는 안티센스 가닥 상에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 3'-오버행을 가지고 다른 말단에서 블런트 말단이다.
하나의 실시형태에서, siRNA는 센스 가닥 상에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 3'-오버행을 가지고 다른 말단에서 블런트 말단이다.
하나의 실시형태에서, siRNA는 안티센스 가닥 상에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 5'-오버행을 가지고 다른 말단에서 블런트 말단이다.
하나의 실시형태에서, siRNA는 센스 가닥 상에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 5'-오버행을 가지고 다른 말단에서 블런트 말단이다.
하나의 실시형태에서, siRNA는 안티센스 가닥 상에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 3'-오버행을 가지고 센스 가닥 상에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 3'-오버행을 갖는다.
하나의 실시형태에서, siRNA는 안티센스 가닥 상에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 5'-오버행을 가지고 센스 가닥 상에서 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 5'-오버행을 갖는다.
염기 모이어티(moiety)에 대한 변형: 다른 양상은 염기 모이어티에 대한 변형에 관한 것이다. 본 발명의 핵산의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. "변형된 염기"는 1' 위치에서 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실 이외의 뉴클레오타이드 염기를 의미한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA는 변형된 염기를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 변형된 뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함하고, 여기서 변형된 염기는, 2-아미노아데노신, 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실(pseudouracil), 2,4,6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디하이드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘(예를 들어, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘(예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘(예를 들어, 6-메틸우리딘), 프로핀, 퀴소신(quesosine), 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 와이부토신, 와이부톡소신, 4-아세틸시티딘, 5-(카복시하이드록시메틸)우리딘, 5'-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우리딘, 베타-D-갈락토실퀴오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, 베타-D-만노실퀴오신, 우리딘-5-옥시아세트산, 2-티오시티딘N4-에타노시토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데닌, 4-아세틸시토신, 5-플루오로우라실; 5-브로모우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5 카복시메틸아미노메틸 우라실, 디하이드로우라실, N6-이소펜틸-아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 5-메톡시 아미노 메틸-2-티오우라실, β-D-만노실퀴오신, 5-메톡시카보닐메틸우라실, 2 메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 슈도우라실, 2-티오시토신, 5-메틸-2 티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실 5-옥시아세트산, 퀴오신, 2-티오시토신, 5-프로필우라실, 5-프로필시토신, 5-에틸우라실, 5-에틸시토신, 5-부틸우라실, 5-펜틸우라실, 5-펜틸시토신, 및 2,6,-디아미노퓨린, 메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸시토신으로부터 선택된다.
다른 양상에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA는 무염기(abasic) 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "무염기"는 염기가 결여되거나 1' 위치에서 염기를 대신해서 다른 화학 그룹을 갖는(예를 들어, 3',3'-연결된 또는 5',5'-연결된 데옥시무염기 리보오스 유도체) 모이어티를 의미한다. 본원에 사용된 것으로서, '변형된 염기'를 갖는 뉴클레오타이드는 무염기 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
당 모이어티에 대한 변형: 다른 두번째 양상은 당 모이어티에 대한 변형에 관한 것이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형된 리보오스 모이어티를 포함할 수 있다.
2'-OH가 치환된 2'-위치에서의 변형은, 알킬, 치환된 알킬, 알카릴-, 아랄킬-, -F, -Cl, -Br, -CN, -CF3, -OCF3, -OCN, -O-알킬, -S-알킬, -O-알릴, -S-알릴, HS-알킬-O, -O-알케닐, -S-알케닐, -N-알케닐, -SO-알킬, -알킬-OSH, -알킬-OH, -O-알킬-OH, -O-알킬-SH, -S-알킬-OH, -S-알킬-SH, -알킬-S-알킬, -알킬-O-알킬, -ON02, -N02, -N3, -NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노-, 아미노알킬-, 아미노알콕시, 아미노산, 아미노아실-, -ONH2, -O-아미노알킬, -O-아미노산, -O-아미노아실, 헤테로사이클로알킬-, 헤테로사이클로알카릴-, 아미노알킬아미노-, 폴리알킬릴아미노-, 치환된 실릴-, 메톡시에틸- (MOE), 알케닐 및 알키닐로부터 선택되는 비제한적인 예를 포함한다. 예를 들어, 메틸렌 브릿지에 의해 2' 하이드록실이 동일한 리보오스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠금(locked)" 핵산(LNA)은 추가로 본 발명의 2' 변형으로서 포함된다. 바람직한 치환체들은 2'-메톡시에틸, 2'-OCH3, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 및 2'-플루오로이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 siRNA는 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 및 17 및 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16에서의 2'-OCH3 변형을 포함하며, 여기서 상기 안티센스 가닥은 5'-3'으로 번호가 붙고 상기 센스 가닥은 3'-5'로 번호가 붙는다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 siRNA는 안티센스 가닥 상에서 뉴클레오타이드 7, 9, 11 및 13 및 센스 가닥 상에서 뉴클레오타이드 8, 10 및 12에서 2'-OCH3 변형을 포함하며, 여기서 상기 안티센스 가닥은 5'-3'으로 번호가 붙고 상기 센스 가닥은 3'-5'로 번호가 붙는다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 siRNA는 안티센스 가닥 상에서 뉴클레오타이드 7, 9 및 11 및 센스 가닥 상에서 뉴클레오타이드 8, 10 및 12에서 2'-OCH3 변형을 포함하며, 여기서 상기 안티센스 가닥은 5'-3'으로 번호가 붙고 상기 센스 가닥은 3'-5'로 번호가 붙는다.
다른 실시형태에서, 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 안티센스 가닥에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 가닥에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 가닥에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 가닥에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 가닥에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 가닥에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 가닥에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 센스 듀플렉스 플랭킹 영역에서 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 퓨린 뉴클레오타이드이다.
포스페이트 골격(backbone)에 대한 변형: 다른 두번째 양상은 포스페이트 골격에 대한 변형이다. 본 발명의 핵산의 뉴클레오타이드의 전부 또는 일부는 변형되지 않은 핵산에서 발견되는 것으로서 포스포디에스테르 결합을 통해 연결될 수 있다. 그러나, 본 발명의 핵산은 변형된 포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 포스포디에스테르 연결 또는 siRNA의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 중 어느 하나는 질소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 독립적으로 포함하도록 변형될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 리보뉴클레오타이드와 인접한 리보뉴클레오타이드를 연결하는 포스포에스테르 그룹은 변형된 그룹에 의해 대체된다. 하나의 실시형태에서, 리보뉴클레오타이드와 인접한 리보뉴클레오타이드를 연결하는 하나 이상의 포스포에스테르 그룹(들)은 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 포스페이트 에스테르, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카바메이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 펩타이드, 또는 카복시메틸 에스테르에 의해 대체된다. 하나의 실시형태에서, 포스포에스테르 그룹을 대체하는 변형된 그룹은 포스포티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 포스포르아미데이트 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 포스포에스테르 그룹을 대체하는 변형된 그룹은 포스포티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 포스포르아미데이트 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, siRNA의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 듀플렉스 영역의 모든 뉴클레오타이드들은 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들은 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 센스 듀플렉스 영역의 모든 뉴클레오타이드들은 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형된 포스포에스테르 그룹을 포함한다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 듀플렉스 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형된 포스포에스테르 그룹을 포함한다. 다른 실시형태에서, siRNA의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형된 포스포에스테르 그룹을 포함한다. 다른 실시형태에서, siRNA의 센스 듀플렉스 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형된 포스포에스테르 그룹을 포함한다.
5' 및 3' 말단 변형: 다른 두번째 양상은 5' 및 3' 변형에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 말단 5'- 또는 3'-말단에서 또는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥 둘 다에서 또는 어느 하나 상에서 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 비사이클릭 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, siRNA의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다의 5'- 및 3'-말단 뉴클레오타이드는 변형되지 않는다. 다른 실시형태에서, siRNA의 센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 변형된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 변형된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 변형된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드 및 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 변형된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드 및 siRNA의 센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 변형된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드 및 siRNA의 센스 가닥의 5'- 및 3'-말단 뉴클레오타이드 둘 다는 변형된다.
다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 포스포릴화된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 포스포릴화된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 5'-말단 뉴클레오타이드는 포스포릴화된다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 포스포릴화되고 센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 유리(free) 하이드록실 그룹(5'-OH)을 갖는다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 포스포릴화되고 센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 변형된다.
5'- 및 3'-말단 뉴클레오타이드에 대한 변형은 이들 말단 뉴클레오타이드들 상에서의 5' 및 3' 위치들에 제한되지 않는다. 말단 뉴클레오타이드들에 대한 변형의 예는, 특히, 예를 들어, 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 PCT 특허 출원 제 WO 99/54459호, 유럽 특허 제EP 0 586 520 B1호 또는 EP 0 618 925 B1호에 기재된 것들 중에서 비오틴, 전환된 (데옥시) 무염기, 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF, 메톡시, 이미다졸, 카복실레이트, 티오에이트, C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬, OCF3, OCN, O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노 또는 치환된 실릴을 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 것으로서, "알킬"은 C1-C12-알킬을 의미하고 "저급 알킬"은 C1-C6-알킬을 의미하며, 이는 C1-, C2-, C3-, C4-, C5- 및 C6-알킬을 포함한다.
다른 양상에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단, 센스 가닥의 5'-말단, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단, 안티센스 가닥의 3'-말단 또는 센스 가닥의 3'-말단은 프로드럭 모이어티에 공유적으로 연결된다. 하나의 실시형태에서, 상기 모이어티는 엔도솜에서 절단(cleaved)된다. 다른 실시형태에서, 상기 모이어티는 세포질에서 절단된다.
다른 실시형태에서, 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 중 어느 하나 상의 말단 3' 뉴클레오타이드 또는 둘 다에서 2개의 말단 3'-뉴클레오타이드는 2'-데옥시뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 2'-데옥시뉴클레오타이드는 2'-데옥시-피리미딘이다. 다른 실시형태에서, 2'-데옥시뉴클레오타이드는 2' 데옥시-티미딘이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 중 어느 하나 상의 말단 3' 뉴클레오타이드 또는 둘 다에서 2개의 말단 3'-뉴클레오타이드는 염기쌍이 아니며, 즉, 이들은 하나 또는 2개의 뉴클레오타이드 오버행이다. 하나의 실시형태에서, 안티센스 및 센스 가닥 둘 다의 3' 말단은 -TT 디뉴클레오타이드 오버행을 갖는다.
본 발명의 양상은 갭머(gapmer)를 형성하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 변형에 관한 것이다. "갭머"는 비-데옥시올리고뉴클레오타이드 분절에 의해 플랭킹되는 2'-데옥시올리고뉴클레오타이드 영역을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서 정의된다. 중심 영역은 "갭"으로 나타낸다. 플랭킹 분절은 "윙(wing)"으로 나타낸다. 각 윙은 하나 이상의 비-데옥시올리고뉴클레오타이드 단량체일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 갭머는 5개의 비-데옥시뉴클레오타이드 윙들에 의해 플랭킹되는 10개의 데옥시뉴클레오타이드 갭이다. 이는 5-10-5 갭머로 나타낸다. 다른 구성이 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 인지된다. 하나의 실시형태에서, 윙은 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-MOE) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 갭머는 포스포로티오에이트 골격을 갖는다. 다른 실시형태에서, 갭머는 2'-MOE 윙 및 포스포로티오에이트 골격을 갖는다. 기타 적절한 변형은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 인지될 수 있다.
shRNA 및 연결된 siRNA: 다른 양상은 shRNA 및 연결된 siRNA에 관한 것이다. 이중-가닥 구조가 2개의 별도의 가닥들, 즉, 안티센스 가닥 및 센스 가닥에 의해 형성된다는 것이 본 발명에 포함된다. 그러나, 안티센스 가닥 및 센스 가닥이 공유적으로 서로 연결된다는 것도 본 발명에 포함된다. 이러한 연결은 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 각각 형성하는 임의의 뉴클레오타이드들 사이에서 발생할 수 있다. 이러한 연결은 공유 연결 또는 비-공유 연결에 의해 형성될 수 있다. 공유 연결은 둘 다의 가닥들의 한 회 이상의 연결에 의해 형성될 수 있으며, 하나 이상의 위치에서 각각 메틸렌 블루 및 이기능성 그룹을 포함하는 그룹으로부터 바람직하게 선택되는 화합물에 의해 형성될 수 있다. 이러한 이기능성 그룹은 비스(2-클로로에틸)아민, N-아세틸-N'-(p-글리옥시벤조일)시스타민, 4-티오우라실 및 소랄렌을 포함하는 그룹으로부터 바람직하게 선택된다.
하나의 양상에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 루프 구조(loop structure)에 의해 연결된다. 하나의 실시형태에서, 루프 구조는 비-핵산 중합체로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 비-핵산 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥의 5'-말단은 센스 가닥의 3'-말단에 연결된다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥의 3'-말단은 센스 가닥의 5'-말단에 연결된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 핵산으로 이루어진 루프에 의해 연결된다. 본원에 사용된 것으로서, 잠금 핵산(LNA)[참조: 문헌(Elayadi and Corey (2001) Curr Opin Investig Drugs. 2(4):558-61)] 및 펩타이드 핵산(PNA)[문헌(Faseb J. (2000) 14:1041-1060)에 검토됨]은 핵산으로 간주되고, 또한 중합체를 형성하는 루프로서 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 핵산은 리보핵산이다. 하나의 실시형태에서, 핵산은 데옥시리보핵산이다. 하나의 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단은 siRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 연결되어 shRNA를 형성한다. 다른 실시형태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단은 siRNA의 센스 가닥의 5'-말단에 연결되어 shRNA를 형성한다. 루프는 최소 길이 4개의 뉴클레오타이드들 또는 뉴클레오타이드 유사체들로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 루프는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 뉴클레오타이드들 또는 뉴클레오타이드 유사체들로 이루어진다. 하나의 실시형태에서, 루프 뉴클레오타이드 서열은 안티센스 가닥의 일부이다. 다른 실시형태에서, 루프 뉴클레오타이드 서열은 센스 가닥의 일부이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥 둘 다의 일부는 루프 뉴클레오타이드 서열을 형성한다. 다른 실시형태에서, 루프 뉴클레오타이드 서열은 이종(heterologous) 서열, 즉, 표적 서열에 대해 동일하지 않거나 상보성이 아니다.
리보핵산 작제물은 적절한 발현 벡터 시스템내로 도입될 수 있다. 바람직하게는 상기 벡터는 RNAi의 발현을 위한 프로모터를 포함한다. 바람직하게는 각각의 프로모터는 pol III이고 보다 바람직하게는 프로모터는 문헌(참조: Good et al. (1997) Gene Ther, 4, 45-54)에 기재된 것으로서 U6, H1, 7SK 프로모터이다.
제조 방법: 본 발명의 핵산은 화학적 합성 또는 시험관내(예를 들어, 유출전사법(run off transcription)) 또는 생체내 핵산을 발현을 포함하는 당해 분야의 통상적 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA는 고체상 화학적 합성을 사용하여 제조된다. 다른 실시형태에서, 핵산은 발현 벡터를 사용하여 제조된다. 하나의 실시형태에서, 발현 벡터는 표적 세포에서 본 발명의 핵산을 제조했다. 따라서, 이러한 벡터는 의약의 제조에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자의 합성 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
다른 실시형태에서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 진핵세포 발현에 적응된 발현 벡터의 부분이며; 바람직하게는 상기 siRNA 또는 shRNA는 적어도 하나의 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 카세트에는 상기 핵산 분자의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 번역하는 적어도 두 개의 프로모터들이 제공된다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 카세트는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 상기 분자는 제2 부분에 연결되는 제1 부분을 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 부분들은 이들의 서열의 적어도 부분에 걸쳐 상호 보완적이고, 추가로 여기서 상기 핵산 분자의 전사는, 상기 제1 및 제2 부분들의 상호 보완적 염기쌍에 의해 이중 가닥 영역을 형성함으로써 shRNA를 형성하는 RNA 분자를 생성한다.
"프로모터"는 당해 분야에서 인지되는 용어이며, 명확성을 위해, 실시예에 의해서만 제공되는 하기 특징들을 포함한다. 인핸서 요소들은 유전자의 전사 개시 부위에 5'에서 주로 발견되는 시스 작용 핵산 서열이다(인핸서는 유전자 서열 또는 인트론 서열에도 위치하는 3'에서도 발견될 수 있다). 인핸서는 인핸서가 연결된 유전자의 전사 속도를 증가시키는 기능을 한다. 인핸서 활성은 인핸서 요소들에 특이적으로 결합되는 것으로 밝혀진 트랜스 작용 전사 인자에 반응한다. 전사 인자[참조: 문헌(Eukaryotic Trancription Factors, by David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego)]의 결합/활성은 다수의 생리학적/환경적 신호들에 반응한다.
프로모터 요소는 또한 전사 개시의 부위를 선택하는 기능을 하는 소위 TATA 박스 및 RNA 폴리머라제 개시 선택 서열을 포함한다. 이러한 서열들은 또한 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시 선택을 특히 용이하게 기능하는 폴리펩타이드에 결합한다.
적응(adaptation)은 또한 선택가능한 마커 및 진핵 세포 또는 원핵세포 숙주에서 상기 벡터의 유지를 용이하게 하는 자율 복제 서열의 제공을 포함한다. 자율적으로 유지되는 벡터는 에피좀 벡터를 나타낸다.
암호화된 유전자의 발현을 용이하게 하는 적응은 전사 종결/폴리아데닐화 서열의 제공을 포함한다. 발현 제어 서열은 또한 소위 유전자좌 제어 영역(locus control region: LCR)을 포함한다. 이들은 형질전환 작제물로서 분석할 경우 연결된 유전자에 위치-독립적, 카피수-의존적 발현을 부여하는 조절 요소들이다. LCR은 인접 이질염색질(heterochromatin)의 침묵(silencing) 효과로부터 이식유전자를 격리시키는 조절 요소들을 포함한다[참조: 문헌(Grosveld et al., Cell (1987), 51: 975-985)].
발현 벡터 작제물 및 통상적인 재조합 DNA 기술에 관한 유의한 양의 공개된 문헌이 있다. 참조[문헌(Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY 및 이의 참조들; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994))].
치료용 제제로서 바이러스 또는 "바이러스 벡터"의 용도는 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 또한, 다수의 바이러스들은 통상적으로 외인성 유전자의 전달을 위한 벡터로서 사용된다. 통상적으로 사용되는 벡터는, 바람직하게는 레트로비리다에 바큘로비리디아에(retroviridae baculoviridiae), 파르보비리디아에(parvoviridiae), 피코르노비리디아에(picornoviridiae), 헤르페스베리디아에(herpesveridiae), 폭스비리다에(poxviridae), 아데노비리디아에(adenoviridiae), 또는 피코르나비리디아에(picornnaviridiae)로부터 선택되는 재조합적으로 변형된 피복된 또는 비-피복된 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 키메라 벡터는 또한 각각의 모 벡터(parent vector) 특성들의 유리한 요소들을 이용하여 사용될 수 있다[참조: 문헌(Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870)]. 이러한 바이러스 벡터는 야생형일 수 있거나 복제 결함, 조건부로 복제하는 컴피턴트(competent) 또는 복제 컴피턴트가 되는 재조합 DNA 기술에 의해 변형될 수 있다.
바람직한 벡터는 레트로바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스) 및 아데노-관련 바이러스로부터 유래한 것들을 포함한다. 바이러스 벡터는 조건부로 복제하는 컴피턴트 또는 복제 컴피턴트일 수 있다. 조건부로 복제하는 바이러스 벡터는 의도하지 않은 광역 스펙트럼 감염을 피하는 동안 특정 세포 유형에서 선택적 발현을 성취하는데 사용된다. 조건부로 복제하는 벡터의 예는 문헌[참조(Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343; Russell, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8): 1165-1171)]에 기재되어 있다. 선택적으로 복제하는 벡터의 추가의 예는, 바이러스의 복제를 위해 필수적인 유전자가 이러한 유전자의 발현의 부재에서 특정 세포 유형 또는 세포 상태에서만 활성화되는 프로모터에 의해 제어되어, 바이러스가 복제되지 않을 것인, 이러한 벡터들을 포함한다. 이러한 벡터의 예는 문헌[참조(Henderson, et al., 1997년 12월 16일에 발행된 미국 특허 공보 제5,698,443호 및 Henderson, et al.; 1999년 2월 16일에 발행된 미국 특허 공보 제5,871 ,726호), 상기 참조의 전문은 본원에 참조로서 포함된다]에 기재되어 있다.
또한, 바이러스 게놈은 특정 조건하에서만 복제 또는 발현이 성취되는 유도할 수 있는 프로모터를 포함하도록 변형될 수 있다. 유도할 수 있는 프로모터의 예는 과학 문헌[예를 들어, 참조: 문헌(Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; lida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol 71 (9):7128-7131 ; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; and Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371)]에 공지되어 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 벡터는 실질적으로 폐 또는 암 특이적인 프로모터를 포함하고; 바람직하게는 상기 프로모터는 폐암 세포에서 우선적으로 활성화된다.
전달/제형: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA는, 직접 세포와 접촉("네이키드(naked)" 전달)을 포함하는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다양한 방법에 의해, 또는 세포내로 표적화 또는 전달을 용이하게 하는 하나 이상의 제제와 조합하여 시험관내 및 생체내 둘 다에서 세포로 전달될 수 있다. 이러한 제제 및 방법은 리포플렉스, 리포좀, 이온토포레시스, 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 나노캡슐, 마이크로- 및 나노구(nanosphere) 및 단백질성 벡터를 포함한다(예를 들어, 문헌(Bioconjugate Chem. (1999) 10:1068-1074) 및 국제 특허 공보 제WO 00/53722호).
핵산 조성물은 정맥내, 피하, 근육내 또는 피내 주사 또는 흡입을 포함하는 다양한 방식들에 의해 국소적 또는 전신으로 생체내 전달시킬 수 있다.
본 발명의 분자는 약제학적 제제로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 제제는 피험체에서 질환 상태의 발생율을 방지, 조정하거나, 치료(증상의 어느 정도까지, 바람직하게는 증상 전부를 완화시킴)한다. 암 치료의 경우에는, 치료는 피험체에서 종양 크기 또는 종양 덩어리를 감소시킨다.
폴리(에틸렌 글리콜) 지질을 함유하는 표면-변형된 리포좀(PEG-변형된, 또는 장시간-순환하는 리포좀 또는 스텔스 리포좀(stealth liposome))을 포함하는 조성물의 용도가 또한 제공된다. 이들 제형은 리포좀 또는 리포플렉스 용액의 응집 및 융합을 방지함으로써 이들의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 제형은 또한 단핵 식세포 시스템(MPS 또는 RES)에 의해 옵소닌화 및 제거에 저항함으로써 더 긴 혈액순환 시간을 가능하게 하고 캡슐화된(encapsulated) 약물에 대한 조직 노출을 향상시키는 생체내 부가적 이득을 갖는다. 이러한 리포좀은, 아마도 신혈관 생성되는 표적 조직에서 혈관외유출 및 포획에 의해 종양에서 선택적으로 축적되는 것으로 나타났다[참조: 문헌(Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90)]. 장시간-순환 리포좀은 특히 MPS의 조직에서 축적되는 것으로 알려진 일반적인 양이온 리포좀과 비교하여 DNA 및 RNA의 약동학 및 약력학을 향상시킨다[참조: 문헌(Liu et al., J. Biol. Chem. 1995,42,24864-24780; Choi et al., 국제 PCT 특허 공보 제WO 96/10391호; Ansell et al., 국제 PCT 특허 공보 제WO 96/10390호; Holland et al., 국제 PCT 특허 공보 제WO 96/10392호)]. 장시간-순환 리포좀은 또한 뉴클레아제 열화로부터 siRNA를 보호한다.
본 발명의 핵산은 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 의약으로서 또는 진단제로서 단독으로 또는 기타 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 핵산은 전달 비히클(예를 들어, 리포좀) 및/또는 부형제, 예를 들어, 담체, 희석제와 함께 사용될 수 있다. 용어 "부형제"는 약제학적으로 활성 성분(들)을 위한 담체로서 사용되는 약제학적으로 허용가능한, 약제학적으로 불활성 물질을 가리킨다. 핵산 분자의 전달 방법은 당해 분야에 공지되며 예를 들어, 문헌(Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Memb. Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; 및 Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192, 미국 특허 공보 제6,395,713호 및 PCT 공보 제WO 94/02595호, 이의 전문은 각각 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다. 본 발명의 핵산은 또한 기타 치료용 화합물과 함께 투여될 수 있으며, 예를 들어, 합한 단위 용량으로서 별도로 또는 동시에 투여될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 생리학적으로/약제학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어, 안정화제, 보존제, 희석제, 완충제 등에서 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 핵산을 전달하는데 적절한 전달 제형의 예는 국제 특허 공보 제W028137758호(미국 특허 공보 제US28317839A1호) 및 제WO29046220A2호(이의 전문은 각각 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 것들을 포함한다.
적절한 전달 시스템은 이중-가닥 RNA 결합 도먼(Double-stranded RNA Binding Doman: DRBD)에 융합된 펩타이드 형질도입 도먼(Peptide Transduction Doman: PTD)을 포함하는 PTD-DRBD(트라베르사 테라퓨틱스(Traversa Therapeitics), 캘리포니아 샌디에이고 소재)를 포함한다. PTD(세포 침투 펩타이드 또는 CPP라고도 함)는 세포 표면 상에 프로테오글리칸에 결합하는 펩타이드이다. 결합된 PTD는, 모든 세포가 수행하는 유동상 흡수의 특수화된 형태인, 마크로피노사이토시스에 의해 세포내로 흡수된다. 마크로피노사이토시스의 이점은 이것이 리소좀 경로를 포함하지 않으므로 엔도좀에서 탈출하기 위한 siRNA 페이로드(payload)에 대한 필요를 피한다는 것이다. DRBD는 자명하며, 즉, 이중 가닥 RNA에 결합하는 단백질의 결합 도메인이다. PTD-DRBD는 국제 특허 출원 공보 제WO2007095152호(미국 특허 출원 공보 제US20090093026A1호)(캘리포니아의 리젠츠 대학에 배당됨)에 기재되어 있고 문헌(참조: Nature Biotechnology (2009) 27(6): 567-571)에 공개되어 있다(각각 특허원 및 문헌은 이의 전문이 본원에 참조로서 포함된다).
하나의 실시형태에서, PTD는 세번 반복되는 HIV-1 tat 단백질(RKKRRQRRR)의 일부이다. 하나의 실시형태에서, DRBD는 단백질 키나제 RNA-활성화 또는 PKR 단백질(진핵세포 번역 개시 인자 2-알파 키나제 2(EIF2AK2) 및 PRKR로서도 공지됨)의 65 아미노산(FFMEELNTYRQKQGWLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDG REFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKE) 일부를 포함한다. 다른 실시형태에서, PTD는 헤르페스 바이러스 VP22 단백질; 사람 면역결핍 바이러스(HIV) TAT 단백질을 포함하는 폴리펩타이드; 안테나페디아 단백질(Antp HD)의 호메오도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 및 이의 기능적 단편이다. 다른 실시형태에서, DRBD는, 히스톤, RDE-4 단백질, 프로타민, 다음을 포함하는 dsRNA 결합 단백질(괄호에 수탁 번호)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다: PKR(AAA36409, AAA61926, Q03963), TRBP(P97473, AAA36765), PACT(AAC25672, AAA49947, NP609646), Staufen (AAD17531, AAF98119, AAD17529, P25159), NFAR1(AF167569), NFAR2(AF167570, AAF31446, AAC71052, AAA19960, AAA19961, AAG22859), SPNR(AAK20832, AAF59924, A57284), RHA(CAA71668, AAC05725, AAF57297), NREBP(AAK07692, AAF23120, AAF54409, T33856), kanadaptin(AAK29177, AAB88191, AAF55582, NP499172, NP198700, BAB19354), HYLL(NP563850), hyponastic leaves (CAC05659, BAB00641), ADAR1(AAB97118, P55266, AAK16102, AAB51687, AF051275), ADAR2 P78563, P51400, AAK17102, AAF63702), ADAR3(AAF78094, AAB41862, AAF76894), TENR(XP059592, CAA59168), RNaselll (AAF80558, AAF59169, Z81070Q02555/S55784, P05797), 및 Dicer(BAA78691, AF408-401, AAF56056, S44849, AAF03534, Q9884), RDE-4(AY071926), FLJ20399(NP060273, BAB26260), CG1434 (AAF48360, EAA12065, CAA21662), CG13139(XP059208, XP143416, XP110450, AAF52926, EEA14824), DGCRK6(BAB83032, XP110167) CG1800(AAF57175, EAA08039), FLJ20036(AAH22270, XP134159), MRP-L45(BAB14234, XP129893), CG2109(AAF52025), CG12493(NP647927), CG10630(AAF50777), CG17686(AAD50502), T22A3.5(CAB03384) 및 수탁 번호 EAA14308.
다른 적절한 전달 시스템은 RNAi/올리고뉴클레오타이드 나노입자 전달(RONDEL) 기술로 나타내는 칼란도 제약(Calando Pharmaceutical)(이전 삽입된 치료법이고 에로우헤드 리서치 코포레이션 지주 회사의 자회사)의 전달에 기반한 클라이코덱스트린(Clycodextrin)이다.
RONDEL의 선형 사이클로덱스트린은 화학적 연결 그룹을 함유하는 양이온으로 사이클릭 올리고사카라이드를 연결함으로써 형성되는 공-중합체이다. 연결 및 말단 그룹에서 발견되는 아민 및 이미다졸은 엔도좀 방출을 지원한다. 사이클로덱스트린-함유 폴리양이온(CDP)으로 불리우는 중합체는 siRNA 페이로드로 응축된다.
사이클로덱스트린 분자의 내부 환 또는 코어는 소수성이고 소수성 화합물을 포함하기 위해 사용될 수 있다. 형성된 착체는 포함 착체로 불리운다. RONDEL 제형에서, 사이클로덱스트린 서브유닛의 소수성 코어는 아다만틴-PEG 접합체의 앵커(anchor) 분자에 사용된다. PEG는 아다만틴에 접합되어 이후에 PEG-아다만탄 접합체는 선형 사이클로덱스트린(CDP)과 결합된다. 특정 세포 유형에 대해 나노입자를 표적화하기 위해, PEG-아다만탄 분자의 PEG 일부 상에 접합된 리간드는 아다만틴-PEG-리간드 접합체를 형성한다. RONDEL의 경우에는, 사람 트랜스페린 단백질(Tf)은, 대부분의 암세포가 세포 표면 상에서 사람 트랜스페린 수용체를 과발현하기 때문에 사용될 수 있는 리간드의 하나의 예이다.
RONDEL 제형의 예는 문헌(참조: David et al. (2010) Nature 464:1067-1070 및 Heidel et al. PNAS (2007) 104(14):5717-5721(이의 전문은 각각 본원에 참조로서 포함된다)에 기재되어 있다. 선형 사이클로덱스트린 기술은 국제 특허 공보 제WO0001734호(미국 특허 출원 공보 제US20070025952A1호, 제US20020151523A1호, 제US7091192호, 제US6884789호 및 제US6509323호)(이의 전문은 각각 본원에 참조로서 포함된다)에 기재되고 청구된다. 아다만틴-PEG 및 아다만틴-PEG-TF와 함께 포함 착체를 포함하는, 선형 사이클로덱스트린 포함 착체는 국제 특허 공보 제WO0249676호(미국 특허 출원 공보 제US20070128167A1호, 제US20060182795A1호, 제US20030017972A1호, 제US20030008818A1호, 제US7166302호 및 제US7018609호)(이의 전문은 각각 본원에 참조로서 포함된다)에 기재되어 있다.
기타 제형은 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌(Nature Biotechnology (2005) 23(8):1002-1007)에 기재되어 있는 SNALP를 포함한다. SNALP 제형은 국제 특허 공보 제WO05120152호(미국 특허 출원 공보 제US20060083780A1호 및 제US20060008910A1호), 국제 특허 공보 제WO05026372A1호(미국 특허 출원 공보 제US20050175682A1호, 국제 특허 공보 제WO06007712호(미국 특허 출원 공보 제US20060051405A1호 및 제US20060025366A1호)에 기재되어 있으며, 이의 전문은 각각 본원에 참조로서 포함된다. SNALP 제형의 예는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3포스포콜린(DSPC) MW 387, 콜레스테롤 MW 790, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA) MW 616 및 3-N-[ω-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)평균 MW 2000)카바모일]-1,2-디미리스틸옥시-프로필아민(PEG-CDMA) MW 2524이다. 다른 유용한 실시형태에서, 상기 DLinDMA 성분(component)은 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA)으로 대체된다. 이것과 기타 유용한 제형은 이의 전문이 본원에 참조로 각각 포함되는, 국제 특허 출원 공보 제WO2009086558호 및 제WO2009132131호에 기재되어 있다.
기타 유용한 제형은 문헌[참조: Nature Biotechnology (2008) 26:561-569 및 Love et al. PNAS (2010) 107(5): 1864-1869 및 국제 특허 공보 제WO28042973A2호 (미국 특허 출원 공보 제USUS20090023673A1호) 및 국제 특허 공보 제WO28042973A2호(미국 특허 출원 공보 제USUS20090023673A1호)]에 기재된 것으로서 리피도이드(lipidoid)에 기반하며, 이의 전문은 각각 본원에 참조로 포함된다.
기타 유용한 제형은 국제 특허 출원 공보 제WO2010021865호 및 제WO2007086881A2호 및 제WO2007086883호(미국 특허 출원 공보 제US20100063308A1호 제US20090048197A1호 제US20080188675A1호 제US20080020058A1호 제US20060240554A1호 제US7691405호, 제US7641915호, 제US7514099호 및 제US7404969호) 및 국제 특허 출원 공보 제WO2008147438A2호(미국 특허 출원 공보 제US20100048888A1호, 제US20090048197A1호, 제US20080020058A1호 및 제US7691405호, 제US7404969호)에 기재되어 있는 것들이며, 이의 전문은 본원에 각각 참조로 포함된다.
기타 유용한 제형은 문헌[참조: 국제 특허 출원 공보 제WO2007095152호 (미국 특허 출원 공보 제US20090093026A1호) 및 Nature Biotechnology (2009) 27(6): 567-571]에 기재되어 있는 것들을 포함하며, 이의 전문은 본원에 각각 참조로 포함된다.
기타 유용한 제형은 문헌[참조: Rozema et al. (2007) PNAS 104(32): 12982-12987, Heidel et al. PNAS (2007) 104(14):5717-5721), Wakefield et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16 (5): 1204-1208 및 국제 특허 공보 제WO0001734호(미국 특허 출원 공보 제US20070025952A1호, 제US20020151523A1호, 제US7091192호, 제US6884789호 및 제US6509323호), 국제 특허 공보 제WO0249676호(미국 특허 출원 공보 제US20070128167A1호, 제US20060182795A1호, 제US20030017972A1호, 제US20030008818A1호, 제US7166302호 및 제US7018609호, 국제 특허 공보 제WO04090107호(미국 특허 출원 공보 제US20070105804A1호, 제US20070036865A1호 및 제US20040198687A1호), 국제 특허 출원 공보 제WO2008022309호(미국 특허 출원 공보 제US20090048410A1호, 제US20090023890A1호, 제US20080287630A1호, 제US20080287628A1호, 제US20080281074A1호, 제US20080281044A1호, 제US20080281041A1호, 제US20080269450A1호, 제US20080152661A1호]으로부터의 것들을 포함하며, 이의 전문은 본원에 각각 참조로 포함된다.
본 발명의 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 단독 또는 추가 용량으로 함께 목적하는 반응을 생성하도록 하는 조성물의 양이다. 특정 질환, 예를 들어, 암을 치료하는 경우에는, 목적하는 반응은 질환의 진행을 억제하는 것이다. 이는, 비록 질환의 진행을 영구적으로 멈추는 것을 포함하는 것이 보다 더 바람직하지만, 질환의 진행을 일시적으로 지연시키는 것만을 포함할 수 있다. 이는 통상의 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
물론, 이러한 양은 치료되는 특정 병태, 병태의 중증도, 나이를 포함한 환자의 개별적 파라미터, 신체적 조건, 크기 및 체중, 치료 기간, 동시에 진행되는 치료요법의 특성(만약 존재하는 경우), 구체적 투여 경로 및 보건의의 지식 및 전문성 내의 인자들과 같은 것들에 의존할 것이다. 이러한 인자들은 당해 분야의 보통의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며 통상의 실험에서만 검토될 수 있다. 개별적 성분 또는 이의 조합의 최대량, 즉, 안전한 의학적 판단에 따라 최고 안전 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 환자가 의학적 이유, 생리학적 이유 또는 사실상 임의의 기타 이유로 인해 보다 적은 용량 또는 허용 용량으로 주장할 수 있는 것이 당해 분야의 보통의 숙련가에게 이해될 것이다.
상기 방법에서 사용되는 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균이고 환자에 투여하기에 적절한 중량 단위 또는 체적 단위로 목적하는 반응을 생성하기 위해 본 발명에 따른 제제의 유효량을 함유한다.
피험체에 투여되는 본 발명에 따른 siRNA/shRNA의 용량은 상이한 파라미터들에 따라, 특히 투여 방식 및 피험체의 상태에 따라 선택될 수 있다. 기타 인자는 목적하는 치료 기간을 포함한다. 피험체에서의 반응이 적용되는 개시 용량으로 불충분한 경우에는, 보다 고용량(또는 차이에 의해 효과적으로 보다 고용량, 보다 더 국소화된 전달 경로)이 환자 용인 허용량 정도에서 사용될 수 있다.
본 발명의 의약 및 약제학적 조성물에 대한 투여 수준은 통상적 실험에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 하나의 실시형태에서 단위 용량은 핵산의 약 0.01mg/kg 내지 약 100mg/kg 체중을 함유한다. 하나의 실시형태에서, 핵산의 용량은 약 10mg/kg 내지 약 25mg/kg 체중이다. 하나의 실시형태에서, 핵산의 용량은 약 1mg/kg 내지 약 10mg/kg 체중이다. 하나의 실시형태에서, 핵산의 용량은 0.05mg/kg 내지 약 5mg/kg 체중이다. 다른 실시형태에서, 핵산의 용량은 약 0.1mg/kg 내지 5mg/kg 체중이다. 다른 실시형태에서, 핵산의 용량은 약 0.1mg/kg 내지 약 1mg/kg 체중이다. 다른 실시형태에서, 핵산의 용량은 약 0.1mg/kg 내지 약 0.5mg/kg 체중이다. 다른 실시형태에서, 핵산의 용량은 약 0.5mg/kg 내지 약 1mg/kg 체중이다. 다른 실시형태에서, siRNA/shRNA의 용량은 1nM 내지 1μM이다. 특정 실시형태에서, 용량은 1nM 내지 500nM, 5nM 내지 200nM, 및 10nM 내지 100nM으로부터 범위될 수 있다. 용량의 양, 주사 일정, 주사 부위, 투여 방식 및 상기로부터 다양할 수 있으며, 조성물의 투여를 위한 다른 프로토콜은 당해 분야의 보통의 숙련가에게 공지되어 있을 것이다. 사람 외의 포유동물(예를 들어, 시험 목적 또는 수의학적 치료용 목적을 위해)로의 조성물의 투여는 상기에 기재된 바와 실질적으로 동일한 조건하에 수행된다. 본원에 사용되는 것으로서 피험체는 포유동물, 바람직하게는 사람, 및 비-사람 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류를 포함한다.
본 발명의 약제학적 제제가 투여되는 경우, 약제학적으로 허용가능한 양 및 약제학적으로 허용가능한 조성물로 적용된다. 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 간섭하지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 이러한 제제는 통상적으로 염, 완충제, 보존제, 양립가능한 담체, 및 임의로 기타 치료용 제제를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 용이하게 존재할 수 있고 약학 분야에서 익히 공지되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 수성 현탁액 또는 용액이다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 주사가능한 수성 현탁액 또는 용액이다. 하나의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동결건조된 형태이다. 하나의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동결건조된 리포플렉스를 포함하며, 여기서 리포플렉스는 본 발명의 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 리포플렉스의 수성 현탁액을 포함하며, 여기서 리포플렉스는 본 발명의 핵산을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물 및 의약은 포유동물에 투여될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 포유동물은 사람, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 포유동물은 사람이다. 다른 실시형태에서, 포유동물은 비-사람 포유동물이다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "암" 또는 "암의"는 자율적 증식의 능력, 즉, 급속한 세포 성장의 증식에 의해 특징되는 비정상 상태 또는 병태를 갖는 세포를 가리킨다. 상기 용어는, 조직병리학 유형 또는 침습성의 단계에 관계 없이 암의 성장 또는 종양 형성의 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 변형된 세포, 조직, 또는 기관의 모든 유형을 포함하는 것을 의미한다. 상기 용어 "암"은, 예를 들어, 폐, 유방, 갑상선, 림프, 위장, 및 비뇨 생식관에 영향을 미치는 것들, 및 대부분의 결장암, 신장-세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 비-소세포 폐암종, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포하하는 선암종과 같은 다양한 기관계의 악성 종양을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "암 재발율"은 신체내 검출될 수 있는 암 세포가 없는 경우 기간 후에 암의 검출 또는 재발을 가리킨다. 용어 "암종"은 당해 분야에 인지되고 호흡계 암종, 위장관계 암종, 비뇨 생식기계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종, 및 흑색종을 포함하는 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양을 가리킨다. 암종의 예는 자궁, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장 및 난소의 조직으로부터 형성되는 것들을 포함한다. 용어 "암종"은 또한 예를 들어, 암종 및 육종 조직으로 이루어진 악성 종양을 포함하는 암육종을 포함한다. "선암종"은 선상 조직으로부터 유래한 암종 또는 인지가능한 선상 구조를 형성하는 종양 세포를 가리킨다. 용어 "육종"은 당해 분야에 인지되고 간엽성 유래의 악성 종양을 가리킨다. 추가의 예는 폐암, 예를 들어, 소세포 폐암종 또는 비-소세포 폐암을 포함한다. 폐암의 다른 부류는 신경내분비암, 상이한 조직 기원의 육종 및 전이성 암을 포함한다.
본 발명의 다른 양상에 따라서 다음을 포함하는 피험체에서 암을 진단하는 방법이 제공된다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 생물학적 샘플에 Ciz1 b-변이 전사체가 존재하는 지의 여부를 측정하는 단계,
여기서, 상기 Ciz1 b-변이 전사체의 존재는 상기 피험체에서 암의 존재를 가리킨다.
하나의 실시형태에서, 피험체는 사람이다.
하나의 실시형태에서, 암은 암 재발율이다.
Ciz1 b-변이은 폐암(NSCLC 및 SCLC), 유방암, 갑상선암, 방광암, 간암, 신장암, 림프종 및 백혈병을 포함하는 몇몇의 암들에서 검출되었다. 하나의 실시형태에서, 암은 폐암이다. 추가의 실시형태에서, 폐암은 NSCLC이다. 다른 추가의 실시형태에서, 폐암은 SCLC이다. 다른 실시형태에서, 암은 유방암이다. 다른 실시형태에서, 암은 갑상선암이다. 추가의 실시형태에서, 갑상선암은 갑상선수질암이다. 다른 추가의 실시형태에서, 갑상선암은 휘르트레 세포 암종(Hurthle cell carcinoma)이다. 다른 추가의 실시형태에서, 갑상선암은 유두상 갑상선암이다. 다른 추가의 실시형태에서, 갑상선암은 소낭 갑상선암이다. 다른 실시형태에서, 암은 림프종이다. 추가의 실시형태에서, 림프종은 B 세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 호지킨 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 확산된 거대 B-세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 여포성 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 역형성 거대 세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 외부 결절성 가장자리 구역 B-세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 지라의 가장자리 구역 B-세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 외투세포 림프종이다. 다른 실시형태에서, 암은 백혈병이다. 다른 추가의 실시형태에서, 백혈병은 만성 림프성 백혈병이다. 다른 추가의 실시형태에서, 백혈병은 모양 세포성 백혈병이다.
하나의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 다음으로부터 선택된다: 고형 조직 샘플, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨 또는 기관지폐포 세척액. 추가의 실시형태에서, 샘플은 고형 조직 샘플이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 혈액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 혈장이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 혈청이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 타액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 뇨이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 기관지폐포 세척액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 순환성 종양 세포(CTC)이다. 추가의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플에서 Ciz1 b-변이 전사체는 세포외, 즉, 세포 외부에 존재한다.
하나의 실시형태에서, 상기 방법에서는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 Ciz1 b-변이 전사체의 존재를 검출한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드 프라이머는 PCR에서 사용되어 엑손 14b 내지 엑손 15의 접합부에 걸친 핵산의 일부를 증폭시킨다. 다른 실시형태에서, PCR을 사용하여 증폭된 핵산 생성물은 뉴클레오타이드 서열 5' TGGACCTCACCTCGATCTCT 3'을 포함한다. 다른 실시형태에서, PCR을 사용하여 증폭된 핵산은 뉴클레오타이드 5' GATATATCTCTGGACCTCACCTCGATCTCTTCTTCATCCT 3'를 포함한다. 다른 실시형태에서, 노멀(normal)과 함께 증폭된 핵산 생성물은 대조군에 매치되었다.
하나의 실시형태에서, 암은 림프종, 폐암, 유방암, 신장암, 갑상선암 또는 결장암이다. 하나의 실시형태에서, 암은 소세포폐암(SCLC)이다. 다른 실시형태에서, 암은 비-소세포 폐암이다. 다른 실시형태에서, 암은 유방암이다. 다른 실시형태에서, 암은 신장암이다. 다른 실시형태에서, 암은 림프종이다. 다른 실시형태에서, 암은 결장암이다.
하나의 실시형태에서, 상기 증폭된 생성물은 핵산 서열 5'GAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGA3' 을 절단하지 않는 제한 엔도뉴클레아제로 분해된다.
다른 실시형태에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 CAC81이다.
다른 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 핵산 서열 GAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGA를 포함하는 핵산 분자를 특이적으로 증폭시키는데 조정된다.
다른 실시형태에서, 상기 프라이머 쌍에서 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 하나는 핵산 서열: 5' GAAGAGATCGAGGTGAGGTC 3'을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 핵산 서열들:
5' GAAGAGATCGAGGTGAGGTC 3'; 및
5' GAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGA 3'을 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 서열 GAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGA를 함유하는 증폭된 생성물은 핵산 서열: 5' TGGACCTCACCTCGATCTCTTCTTCA 3'을 포함하거나 이로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 프로브로 검출된다.
본 발명의 바람직한 방법에서 상기 생물학적 샘플은 폐 세포를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 진단은 암 진단에 적절한 치료 계획과 조합된다.
다른 실시형태에서, 상기 치료 계획은 항암제의 투여를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 화학치료제는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 시스플라틴, 카보플라틴, 이리노테칸, 토포테칸, 캄프토테신, 에토포시드, 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 젬시타빈 및 비노렐빈.
다른 실시형태에서, 상기 항암제는 본 발명에 따른 siRNA 또는 shRNA이다.
다른 실시형태에서, 상기 치료 계획은 적어도 하나의 siRNA 또는 shRNA의 투여를 포함하며, 화학치료제는 별도로, 동시에 또는 연속적으로 투여된다.
하나의 실시형태에서, 암은 폐암이다. 다른 실시형태에서, 상기 폐암은 소세포 폐 암종이다. 다른 실시형태에서, 상기 폐암은 비-소세포 폐암이다.
본 발명의 하나의 양상에서 암을 가진 사람에서 Ciz1 b-변이 mRNA로부터 번역된 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계.
하나의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈장이다.
하나의 실시형태에서, 암은 폐암이다.
본 발명의 하나의 양상에서 Ciz1 b-변이 mRNA로부터 번역된 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재를 검출함에 의해 피험체에서 암을 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
iii) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
iv) 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계,
여기서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 암의 존재를 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 피험체는 사람이다.
하나의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈장이다.
하나의 실시형태에서, 암은 암 재발율이다.
하나의 실시형태에서, 암은 폐암이다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, Ciz1 b-변이 mRNA로부터 번역된 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재를 검출함에 의해 피험체에서 암을 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 생물학적 샘플을 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
iii) 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편의 존재를 검출하는 단계, 여기서 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 암의 존재를 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 암은 암 재발율이다.
하나의 실시형태에서, 피험체는 사람이다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체는 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지만, 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지 않는다.
하나의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 다음으로부터 선택된다: 고형 조직 샘플, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨 또는 기관지폐포 세척액. 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 고형 조직 샘플이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈장이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 타액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 뇨이다. 다른 추가의 실시형태에서 생물학적 샘플은 기관지폐포 세척액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 순환성 종양 세포(CTC)이다. 추가의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플에서 Ciz1 b-변이 전사체는 세포외, 즉, 세포의 외부에 존재한다.
하나의 실시형태에서, 암은 폐암이다. 추가의 실시형태에서, 폐암은 NSCLC이다. 추가의 실시형태에서, 폐암은 0기의 NSCLC이다. 추가의 실시형태에서, 폐암은 I기의 NSCLC이다. 추가의 실시형태에서, 폐암은 II기의 NSCLC이다. 추가의 실시형태에서, 폐암은 III기의 NSCLC이다. 추가의 실시형태에서, 폐암은 IV기의 NSCLC이다. 다른 추가의 실시형태에서, 폐암은 SCLC이다. 다른 추가의 실시형태에서, 폐암은 제한기(limited stage)의 SCLC이다. 다른 추가의 실시형태에서, 폐암은 확장기 SCLC이다. 다른 실시형태에서, 암은 유방암이다. 다른 실시형태에서, 암은 갑상선암이다. 추가의 실시형태에서, 갑상선암은 갑상선수질암이다. 다른 추가의 실시형태에서, 갑상선암은 휘르트레 세포 암종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 갑상선암은 유두상 갑상선암이다. 다른 추가의 실시형태에서, 갑상선암은 소낭 갑상선암이다. 다른 실시형태에서, 암은 림프종이다. 추가의 실시형태에서 림프종은 B 세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 호지킨 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 확산된 거대 B-세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 여포성 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 역형성 거대 세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 외부결절성 가장자리 구역 B-세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 지라의 가장자리 구역 B-세포 림프종이다. 다른 추가의 실시형태에서, 림프종은 외투세포 림프종이다. 다른 실시형태에서, 암은 백혈병이다. 다른 추가의 실시형태에서, 백혈병은 만성 림프성 백혈병이다. 다른 추가의 실시형태에서, 백혈병은 모양 세포성 백혈병이다. 다른 추가의 실시형태에서, 암은 신장암이다. 다른 추가의 실시형태에서, 암은 간암이다. 다른 추가의 실시형태에서, 암은 방광암이다.
하나의 실시형태에서, 상기 b-변이 폴리펩타이드는 단백질 분해로 절단된 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 단편이다. 추가의 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 엑손 14b 및 15에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDIS를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 단편은 열화 정도에 의존하는, 8% SDS-PAGE 상에서 약 50 내지 60kDa의 분명한 분자량으로 이동한다. 추가의 실시형태에서, 상기 단편은 8% SDS-PAGE 상에서 약 50kDa의 분명한 분자량으로 이동한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14b 및 엑손 15 둘 다에 의해 암호화되는 아미노산 잔기를 포함하는 연속하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지만, 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 10배 더 큰 친화성으로 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드와 비교하여 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 적어도 100배 더 큰 친화성으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드와 비교하여 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 적어도 1000배 더 큰 친화성으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드와 비교하여 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 적어도 10000배 더 큰 친화성으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드와 비교하여 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 적어도 100000배 더 큰 친화성으로 결합한다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDIS에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDIS에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEEEIE, VRSRDIS 또는 DEEEIEVEEELCKQVRSRDIS에 특이적으로 결합하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETY에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKG에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EEDDEDEEEIEVRSRDISREEW에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DDEDEEEIEVRSRDISRE에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEDEEEIEVRSRDISR에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISR에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EDEEEIEVRSRDIS에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDI에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEEEIEVEEELCKQVRSRDI에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EIEVRSR에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EIEVEEELCKQVRSR에 특이적으로 결합하지 않는다.
다른 양상에서 본 발명은 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 폴리클로날 항체이다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지만, 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 10배 더 큰 친화성으로 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드보다 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 적어도 100배 더 큰 친화성으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 번역된 Ciz1 폴리펩타이드보다 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 적어도 1000배 더 큰 친화성으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 엑손 14b 및 엑손 15에 의해 암호화되는 아미노산 잔기를 포함하는 연속하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETY에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKG에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EEDDEDEEEIEVRSRDISREEW에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DDEDEEEIEVRSRDISRE에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEDEEEIEVRSRDISR에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISR에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EDEEEIEVRSRDIS에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDI에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 DEEEIEVEEELCKQVRSRDI에 특이적으로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 EIEVRSR에 특이적으로 결합하지만, 아미노산 서열 EIEVEEELCKQVRSR에 특이적으로 결합하지 않는다.
본 발명의 다른 양상에서 본 발명에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 하이브리도마(hybridoma) 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은, 폐 결절이, 흉부 X-선 촬영, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔(저 용량 나선(나선형) CT 스캔을 포함), 자기공명영상(MRI), 양전자 방출 단층 촬영(PET) 스캔 또는 기타 영상 방법에 의해 관찰되는 것으로서, 암성인지의 여부를 예측 또는 결정하는 방법이다. 폐에서의 조직의 소 덩어리인, 폐 결절은 매우 흔하다. 비록 대부분의 폐 결절이 비암성(양성)이지만, 일부는 폐암 초기 단계를 나타낸다. 폐 결절은 일반적으로 흉부 X-선 촬영 또는 CT 스캔 상에 원형, 백색 음영로서 나타난다. 폐 결절은 크기가 일반적으로 약 1/5인치 내지 1인치, 또는 5밀리미터(mm) 내지 25mm이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재를 검출함으로써 폐 결절이 암성인지의 여부를 예측 또는 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 폐 결절과 사람으로부터 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 상기 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
iii) 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 결합된 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제(항체 또는 항원 결합 단편)의 존재를 검출하는 단계, 여기서 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 폐암의 존재를 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 혈장이다.
본 발명의 다른 양상은 피험체에서 폐암의 조기 검출 방법이며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계;
iii) 여기서 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 암의 존재를 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 폐암은 0기, IA기 또는 IB기의 NSCLC이다. NSCLC는 0기 내지 IV기일 수 있다. 0기는 동일계에서 암종으로서 정의된다. IA기에서, 암은 폐에서만 존재하며, 3cm 이하이다. IB기에서, 암은: (a) 3cm보다 크고 5cm이내, (b) 기관지까지 퍼졌고, 및/또는 (c) 폐 라이닝의 최내층까지 퍼졌다. SCLC에는 두 단계들, 제한기 및 확장기 질환이 있다. 제한기의 SCLC 피험체는 기원의 반측흉곽, 종격, 또는 쇄골상림프절에 국한된 종양을 갖는다. 이는 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는, 기관(National Cancer Institute: NCI, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)에서 공개된 의사 데이터 쿼리(Physician Data Query : PDQ)에 정의되어 있다.
방사선학을 단독으로 사용하여 폐렴과 암성 병변 사이를 구분하여 진단하는 것은 종종 어렵다. 본 발명의 다른 양상은 본 발명의 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재를 검출함으로써 폐렴 또는 폐암으로부터 고통받는 환자를 구분하여 진단하는 수단을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 생물학적 샘플을 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
iii) 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 결합된 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 존재를 검출하는 단계, 여기서 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 암의 존재를 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 다음으로부터 선택된다: 고형 조직 샘플, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨 또는 기관지폐포 세척액. 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 고형 조직 샘플이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 혈액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 혈장이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 혈청이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 타액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 뇨이다. 다른 추가의 실시형태에서, 샘플은 기관지폐포 세척액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 순환성 종양 세포(CTC)이다. 하나의 실시형태에서, 암은 폐암이다. 추가의 실시형태에서, 폐암은 NSCLC이다. 다른 추가의 실시형태에서, 폐암은 SCLC이다.
본원에 기재된 암을 검출하는 방법은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 94%의 1 표준편차(SD)에서 감도를 갖는다. 본원에 기재된 암을 검출하는 방법은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%의 1 표준편차에서 특이성을 갖는다. 감도는 다음과 같이 정의된다: (암을 갖는 것으로 정확히 진단된 피험체의 수)/(암을 갖는 피험체의 총 수)x100(1 SD에서). 특이성은 다음과 같이 정의된다: (암을 갖는 및 갖지 않는 것으로 정확히 진단된 피험체의 수)/(피험체의 총 수)x100(1 SD에서).
ROC(수신자 조작 특성) 곡선은 모든 가능한 간격들에서 원 마이너스 특이성에 대한 감도를 사용하여 플로팅하여 ROC 곡선하에 영역(AUC)을 발생시킨다. 계산기, 예를 들어, 웹사이트(http://www.jrocfit.org)(연속하는 분산 데이터에 대한 포맷 5)에서 이용가능한 계산기에 기반한 웹이 편의를 위해 사용될 수 있다.
대부분 암 치료요법(방사선, 소분자 또는 생물제제인지의 여부에 따라)은 아폽토시스를 유발함으로써 세포를 사멸시키거나, 괴사 또는 두 가지의 조합에 의한 세포독성이다. 또한, 이들 치료요법은 일반적으로 암세포에 전적으로 특이적이지 않고, 특정 치료요법 및 환자에 따라 보다 더 큰 정도 또는 보다 더 적은 정도로 정상 세포를 사멸시킨다. 정상 세포의 비-특이적 사멸은 용량 의존적 부작용을 일으킨다. 정상 세포를 사멸시키는 정도는 환자들 사이에서 각기 다르며, 환자가 용량 한계 독성을 경험하게 될 용량을 예측하는 것을 어렵게 만든다. 환자가 한계 치료용 용량을 가지거나 도달할 경우를 측정 또는 예측하는 능력은 보다 더 나은 환자 치료로 이어질 수 있다. 비-특이적 세포독성 또는 용량 의존적 세포독성의 정도는, 암세포 또는 정상세포가 죽는 경우 방출되는 바이오마커의 양과, 암세포가 죽는 경우 암세포에 의해 방출되는 바이오마커의 양과 비교함으로써 간접적으로 측정할 수 있다. 하나의 양상에서 본 발명은 종양 세포 또는 정상 세포가 죽는 경우 둘 다로부터 방출되는 세포사 바이오마커의 양과, 종양 세포가 죽는 경우 이로부터 방출되는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양을 비교함으로써, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드를 발현하는 암을 치료하기 위해 투여되는 암 치료요법의 결과로서 비-특이성 세포독성을 측정하는 방법을 제공한다. 세포사 바이오마커에 대해 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 비율이 더 적을수록, 비-특이적 세포독성이 더 크다. 하나의 양상에서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 생물학적 샘플에 존재하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양을 측정하는 단계, 여기서 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 암세포 세포독성을 나타낸다;
iii) 세포사 바이오마커의 양을 측정하는 단계, 여기서 세포사 바이오마커는 암세포 및 정상세포 둘 다의 세포독성을 나타낸다;
iv) 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양과 상기 세포사 바이오마커의 양을 비교하는 단계.
하나의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 다음으로부터 선택된다: 고형 조직 샘플, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨 또는 기관지폐포 세척액. 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 고형 조직 샘플이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈장이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 타액이다. 다른 추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 뇨이다. 다른 추가의 실시형태에서 생물학적 샘플은 기관지폐포 세척액이다.
하나의 실시형태에서, 세포사 바이오마커는 아폽토시스에 대한 바이오마커이다. 다른 실시형태에서, 세포사 바이오마커는 괴사에 대한 바이오마커이다. 다른 실시형태에서, 세포사 바이오마커는 아폽토시스 및 괴사에 대한 바이오마커이다. 하나의 실시형태에서, 세포사 바이오마커는 시토케라틴 18(CK18)이다. 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 전장(full length) CK18의 양을 측정한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 카스파제-절단된 CK18의 양을 측정한다. 전장 CK18 및 카스파제-절단된 CK18 둘다를 측정하는 항체 및 키트는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 카스파제-절단된 CK18을 검출하기 위한 M30 APOPTOSENSE, 및 전장 CK18을 검출하기 위한 M65 ELISA는 페비바 AB(Peviva AB, 스웨덴 브롬마 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 다른 실시형태에서, 세포사 바이오마커는 뉴클레오좀 DNA(nDNA)(또한 히스톤-관련 DNA로 나타냄)이다. nDNA를 측정하기 위한 항체 및 키트는 상업적으로 입수 가능하며, 예를 들어, 세포사 측정 ELISA는 로쉐 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 다른 실시형태에서, 세포사 마커는 시클로필린 A이다.
본 발명의 다른 양상은 치료 과정 이전의 상기 Ciz1 b-변이 전사체 또는 폴리펩타이드의 상대량, 및 치료 과정 동안 및 이후에 상기 Ciz1 b-변이 전사체 또는 폴리펩타이드의 상대량 또는 둘 다의 상대량을 측정함으로써 피험체에서 암 치료요법의 효능을 측정하는 방법이다. 본원에 사용된 것으로서 '치료 과정'은 특정 기간 동안 진행되는 정해진 계획을 가리킨다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 상기 암 치료요법으로 치료받기 전에, 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 제1 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 암 치료요법으로의 치료 과정 동안, 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 제2 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
iii) 상기 생물학적 샘플 각각을 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 별도로 접촉시키는 단계;
iv) 상기 생물학적 샘플 각각에서 존재하는 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양을 측정하는 단계, 여기서 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서의 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 양의 증가는 상기 암 치료요법의 효능을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 상기 암 치료요법으로 치료받기 전에, 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 제1 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 암 치료요법으로의 치료 과정 후에, 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 제2 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
iii) 상기 생물학적 샘플 각각을 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 별도로 접촉시키는 단계;
iv) 상기 생물학적 샘플 각각에서 존재하는 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양을 측정하는 단계, 여기서 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서의 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 양의 감소는 상기 암 치료요법의 효능을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드보다는 Ciz1 b-변이 전사체를 검출하도록 변형된다.
본 발명의 추가의 양상에 따라서 핵산 서열 5' GAAGAAGAGAUCGAGGUGAGGUCCAGAGA 3'을 포함하는 mRNA 분자를 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 상기 키트는 핵산 서열들:
5' GAAGAGATCGAGGTGAGGTC 3' 및 5' TGGACCTCACCTCGATCTCTTCTTCA 3'를 포함하거나 이들로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 키트는 추가로 내열성 DNA 중합효소 및 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 키트는 상기 핵산 분자를 선택적으로 증폭시키는데 필요한 설명서를 포함한다.
본 발명의 추가의 양상에 따라서 Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA와 Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 존재를 검출하는 단계;
iii) Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 존재를 검출하는 단계;
iv) 상기 Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA와 상기 Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA의 상대적 발현을 비교하는 단계; 여기서 적어도 2배의 상대적 발현 차이는 암을 나타낸다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA와 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 존재를 검출하는 단계;
iii) 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 존재를 검출하는 단계;
iv) 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA와 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA의 상대적 발현을 비교하는 단계; 여기서 적어도 2배의 상대적 발현의 차이는 암을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA와 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 존재를 검출하는 단계;
iii) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 존재를 검출하는 단계;
iv) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA와 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA의 상대적 발현을 비교하는 단계; 여기서 적어도 2배의 상대적 발현의 차이는 암을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA와 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 존재를 검출하는 단계;
iii) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA의 존재를 검출하는 단계;
iv) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA와 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA의 상대적 발현을 비교하는 단계; 여기서 적어도 2배의 상대적 발현의 차이는 암을 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 상기 방법에서는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 상기 Ciz1 복제 및 고정화 도메인의 존재를 검출한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 다음 단계들을 포함한다: 상기 샘플을 포함하는 제제 및 상기 Ciz1 복제의 전부 또는 일부를 증폭시키는데 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 및 상기 Ciz1 고정화 도메인의 전부 또는 일부를 증폭시키는데 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 형성하는 단계, 및 상기 샘플 상에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계.
하나의 실시형태에서, 상기 암은 폐암, 유방암, 신장암, 갑상선암, 흑색종, 간암, 방광암 또는 결장암이다. 하나의 실시형태에서, 암은 비-소세포 폐암(NSCLC)이다. 다른 실시형태에서, 암은 유방암이다. 다른 실시형태에서, 암은 신장암이다. 다른 실시형태에서, 암은 결장암이다.
하나의 실시형태에서, Ciz1 복제 도메인을 증폭시키는 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
CACAACTGGCCACTCCAAAT 와 CCTCTACCACCCCCAATCG; 및 ACACACCAGAAGACCAAGATTTACC 와 TGCTGGAGTGCGTTTTTCCT.
다른 실시형태에서, 상기 증폭된 복제 도메인은 다음 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 검출된다:
CGCCAGTCCTTGCTGGGACC 또는 CCCTGCCCAGAGGACATCGCC.
다른 실시형태에서, Ciz1 고정화 도메인을 증폭시키는 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
CAGGGGCATAAGGACAAAG 와 GGCTTCCTCAGACCCCTCTG; 및
CGAGGGTGATGAAGAAGAGGA 와 CCCCTGAGTTGCTGTGATA.
다른 실시형태에서, 상기 증폭된 고정화 도메인은 다음 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 검출된다:
TGGTCCTCATCTTGGCCAGCA, CACGGGCACCAGGAAGTCCA 또는 CACTGCAAGTCCCTGGGCCA.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 Ciz1 b-변이 전사체의 발현 분석과 조합된다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 진단 방법은 본 발명에 따른 치료 방법과 조합된다.
본 발명의 하나의 양상에서, Ciz1 복제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현과 Ciz1 고정화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 비교함에 의해 피험체내 암을 진단하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계,
ii) 상기 Ciz1 복제 도메인 및 Ciz1 고정화 도메인의 존재를 검출하는 단계, 및
iii) 상기 샘플 중에 존재하는 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대한 상기 Ciz1 복제 도메인의 상대적 양을 비교하고; 여기서, 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대한 Ciz1 복제 도메인의 상대적 양에 있어서 2배 초과의 차이가 암의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 발현과 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 발현을 비교함에 의해 피험체내 암을 진단하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계,
ii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계, 및
iii) 상기 샘플에 존재하는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드에 대한 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드의 상대적 양을 비교하고; 여기서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드에 대한 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드의 상대적 양에 있어서 2배 초과의 차이가 암의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 발현과 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 발현을 비교함에 의해 피험체내 암을 진단하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계,
ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계, 및
iii) 상기 샘플에 존재하는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드에 대해 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드의 상대적 양을 비교하고; 여기서, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드에 대한 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드의 상대적 양에 있어서 2배 초과의 차이가 암의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 발현과 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 발현을 비교함에 의해 피험체내 암을 진단하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계,
ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계, 및
iii) 상기 샘플에 존재하는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드에 대해 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드의 상대적 양을 비교하고; 여기서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드에 대한 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드의 상대적 양에 있어서 2배 초과의 차이가 암의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, Ciz1 복제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현과 Ciz1 고정화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 비교함에 의해 피험체내 암을 진단하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
ii) 상기 생물학적 샘플을, 상기 Ciz1 폴리펩타이드 복제 도메인과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 접촉시키는 단계;
iii) 상기 생물학적 샘플을, 상기 Ciz1 폴리펩타이드 고정화 도메인과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
iv) 상기 Ciz1 폴리펩타이드 복제 도메인에 결합되고 상기 Ciz1 폴리펩타이드 고정화 도메인에 결합된 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 존재를 검출하는 단계, 및
v) 상기 샘플 중에 존재하는 상기 Ciz1 폴리펩타이드 고정화 도메인에 대해 상기 Ciz1 폴리펩타이드 복제 도메인의 상대적 양을 비교하고; 여기서, 상기 Ciz1 폴리펩타이드 고정화 도메인에 대한 상기 Ciz1 폴리펩타이드 복제 도메인의 상대적 양에 있어서 2배 초과의 차이가 암의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 고정화 도메인보다 2배 이상의 복제 도메인의 존재가 전이성 암을 나타낸다.
본 발명의 추가의 양상에 따라, Ciz1의 복제 도메인 및 Ciz1의 고정화 도메인을 포함하는 핵산 분자를 특이적으로 증폭시키기 위해 구성된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 상기 복제 도메인을 증폭시키는 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머는,
CCTCTACCACCCCCAATCG와 함께 CACAACTGGCCACTCCAAAT이거나;
TGCTGGAGTGCGTTTTTCCT와 함께 ACACACCAGAAGACCAAGATTTACC이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 복제 도메인을 증폭시키는 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머는,
GGCTTCCTCAGACCCCTCTG와 함께 CAGGGGCATAAGGACAAAG이거나;
CCCCTGAGTTGCTGTGATA와 함께 CGAGGGTGATGAAGAAGAGGA이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 키트는
상기 증폭된 Ciz1 복제 도메인을 검출하고 CGCCAGTCCTTGCTGGGACC 또는 CCCTGCCCAGAGGACATCGCC로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 키트는 증폭된 Ciz1 고정화 도메인을 검출하고, TGGTCCTCATCTTGGCCAGCA, CACGGGCACCAGGAAGTCCA 또는 CACTGCAAGTCCCTGGGCCA로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함한다.
본 발명의 추가의 양상에 따라, Ciz1 단백질의 복제 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 Ciz1 단백질의 고정화 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상은 Ciz1 복제 도메인 및 고정화 도메인(또는 이를 암호화하는 mRNA)의 검출을 포함하는 상기 방법의, 암 환자의 예후를 지적하기 위한 용도에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 종양 자체보다는 종양에 인접한 조직내 상대적 수준을 측정하고, 여기서, 고정화 도메인보다 2배 이상의 복제 도메인을 갖는 환자가 2배 차이 미만의 환자와 비교하여 보다 불량한 예후를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 인접한 조직은 종양 가장자리의 20 mm, 15 mm, 10 mm 또는 5 mm 내에 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 바람직하게 단일특이적, 예를 들어, 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 용어 "단일특이적 항체"는 특정 표적, 예를 들어, 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체를 언급한다. 상기 용어는, 예를 들어, 동종의 분리된 세포 집단 기원의 단일 분자 종으로서 생산되는 항체를 언급하는 "모노클로날 항체"를 포함한다. "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 종의 항체를 포함하는 조성물내 항체 또는 이의 단편의 제제를 언급한다. 하나의 실시형태에서, 모노클로날 항체는 포유동물 세포에 의해 생산된다. 하나 이상의 모노클로날 항체 종이 조합될 수 있다. 본 발명의 항체는 재조합체일 수 있거나 하이브리도마 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
상기 Ciz1 폴리펩타이드 결합 항체는 전장(예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (예를 들어, IgA1, IgA2), IgD, 및 IgE)일 수 있거나, 단지 항원 결합 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2 또는 scFv 단편)을 포함할 수 있고, 예를 들어, 이것은 Fc 도메인 또는 CH2, CH3, 또는 CH4 서열을 포함하지 않는다. 상기 항체는 2개의 중쇄 면역글로불린 및 2개의 경쇄 면역글로불린을 포함할 수 있거나, 단일쇄 항체일 수 있다. 상기 항체는 임의로 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 또는 뮤 불변 영역 유전자로부터 선택된 불변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드 결합 항체는 실질적으로 사람 항체 기원의 중쇄 및 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 사람 IgG1 불변 영역 또는 이의 일부, 또는 마우스, 랫트, 개, 고양이, 염소, 양, 소, 말, 닭 또는 기니아 피그를 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 종으로부터 기원하는 것을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체(또는 이의 단편)는 재조합 또는 변형된 항체, 예를 들어, 키메라, 사람화된, 탈면역화된 또는 시험관내 생성된 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합" 또는 "변형된" 항체는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 작제되거나 분리된 모든 항체, 예를 들어, 숙주 세포로 형질감염되는 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현되는 항체, 재조합의 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자 전이성인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체 또는 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱시킴을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 작제되거나 분리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 재조합 항체는 사람화되거나, CDR 접목되거나, 키메라이거나, 탈면역화되거나, 시험관내 생성된 항체를 포함하고, 임의로 사람 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래하는 불변 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 상기 용어 "항체"는 하나 이상의 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질을 언급한다. 예를 들어, 항체는 중쇄(H) 가변 영역(본원에서 VH로 약칭함) 및 경쇄(L) 가변 영역(본원에서 VL로 약칭함)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 항체는 2개의 중쇄(H) 가변 영역 및 2개의 경쇄(L) 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 항체는 낙타 단일 도메인 VH 항체이다. 상기 용어 "항체"는 완전한 항체뿐만 아니라 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, 및 dAb 단편)을 포함한다.
상기 VH 및 VL 영역은 "골격 영역"(FR)으로 칭하는, 보다 보존된 영역과 함께 산재된 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 칭하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 상기 골격 영역 및 CDR의 범위는 정확하게 규명되었다[문헌참조: Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)]. 캐뱃(Kabat) 정의가 본원에 사용된다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되고 하기의 순서로 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
"면역글로불린 도메인"은 면역글로불린 분자의 가변 또는 불변 도메인 기원의 도메인을 언급한다. 면역글로불린 도메인은 전형적으로 약 7개의 베타-가닥으로 형성된 2개의 베타-시트 및 보존된 디설파이드 결합을 함유한다(문헌참조: 예를 들어, A. F. Williams and A. N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6:381-405). 가변 면역글로불린의 초가변 루프의 원형 구조는 문헌[참조: Chothia et al. (1992) J. ol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798); and Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14(18):4628-38]에 기재된 바와 같이 이의 서열로부터 추론될 수 있다.
본원에 사용된 "면역글로불린 가변 도메인 서열"은 면역글로불린 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 언급한다. 예를 들어, 상기 서열은 천연 가변 도메인의 모든 아미노산 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열에는 1개 또는 2개 이상의 N- 또는 C-말단 아미노산, 내부 아미노산이 제거될 수 있거나 하나 이상의 삽입체 또는 부가적 말단 아미노산을 포함할 수 있거나 다른 변형을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 또 다른 면역글로불린 가변 도메인 서열과 연합하여 표적 결합 구조(또는 "항원 결합 부위"), 예를 들어, 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드와 상호작용하는, 예를 들어, 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드에 결합하거나 이를 억제하는 구조(예를 들어, b-변이체)를 형성할 수 있다.
상기 항체의 VH 또는 VL 쇄는 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 전부 또는 이의 일부를 추가로 포함하여 각각 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 쇄를 형성할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 2개의 중쇄 면역글로불린 및 2개의 경쇄 면역글로불린의 4량체이고, 여기서, 상기 중쇄 및 경쇄 면역글로불린은 예를 들어, 디설파이드 결합에 의해 상호연결되어 있다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 CL 도메인을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역은 전형적으로, 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포), 및 전형적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자들로의 상기 항체의 결합을 매개한다. 상기 용어 "항체"는 유형 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (이의 서브타입 뿐만 아니라)의 온전한 면역글로불린을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 IgA이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 IgG이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 IgE이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 IgD이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 IgM이다. 상기 면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다 유형일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 당화된다. 항체는 항체 의존성 세포독성 및/또는 보체 매개 세포독성을 위해 기능할 수 있다.
항체의 하나 이상의 영역은 사람 또는 효과적으로 사람의 것일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역은 사람 또는 효과적으로 사람의 것일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 CDR은 사람의 것, 예를 들어, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3일 수 있다. 경쇄 CDR 각각은 사람의 것일 수 있다. HC CDR3은 사람의 것일 수 있다. 하나 이상의 골격 영역은 사람의 것, 예를 들어, HC 또는 LC의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 모든 골격 영역은 사람 체세포, 예를 들어, 면역글로불린을 생산하는 조혈 세포 또는 비조혈 세포로부터 유래된 사람의 것이다. 하나의 실시형태에서, 상기 사람 서열은 생식선 서열, 예를 들어, 생식선 핵산에 의해 암호화된 서열이다. 하나 이상의 불변 영역은 사람 또는 효과적으로 사람의 것일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 골격 영역(예를 들어, 총체적으로 FR1 , FR2, 및 FR3, 또는 총체적으로 FR1, FR2, FR3, 및 FR4)의 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 또는 98% 이상 또는 전체 항체는 사람 또는 효과적으로 사람의 것일 수 있다. 예를 들어, 총체적으로 FR1, FR2, 및 FR3은 경쇄 또는 중쇄 서열을 암호화하는 유전자좌의 사람 생식선 V 절편에 의해 암호화된 사람 서열과 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98, 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
항체 전부 또는 일부는 면역글로불린 유전자 또는 이의 절편에 의해 암호화될 수 있다. 예시적인 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파 (IgA1 및 IgA2), 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 및 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 전장 면역글로불린 경쇄(약 25 Kd 또는 214개 아미노산)는 NH2-말단(약 110개 아미노산)에서의 가변 영역 유전자 및 COOH-말단에서 카파 또는 람다 불변 영역 유전자에 의해 암호화된다. 전장 면역글로불린 중쇄(약 50 Kd 또는 446개 아미노산)는 유사하게 가변 영역 유전자(약 116개 아미노산) 및 다른 이전에 언급된 불변 영역 유전자중 하나, 예를 들어, 감마(약 330개 아미노산을 암호화함)에 의해 암호화되어 있다. 경쇄는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 언급한다. 중쇄는 중쇄 가변 도메인의 임의의 폴리펩타이드를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 전장 항체의 "항원 결합 단편"(또는 단순히 "항체 일부" 또는 "단편")은 목적하는 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 전장 항체의 하나 이상의 단편을 언급한다. 전장 항체의 용어 "항원 결합 단편"내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌참조: Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 기능을 보유하는 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되어 있지만 이들은 상기 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 단일쇄 Fv(scFv)로서 공지된 1가의 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다[문헌참조: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883].
"사람화된" 면역글로불린 가변 영역은 상기 면역글로불린 가변 영역이 정상적인 사람에서 면역 반응을 유발하지 않도록 충분한 수의 사람 골격 아미노산 위치를 포함하는 면역글로불린 가변 영역이다. "사람화된" 면역글로불린은 예를 들어, 미국 특허 제6,407,213호 및 미국 특허 제5,693,762호에 기재되어 있다.
"효과적으로 사람" 면역글로불린 가변 영역은 상기 면역글로불린 가변 영역이 정상적인 사람에서 면역원성 반응을 유발하지 않도록 충분한 수의 사람 골격 아미노산 위치를 포함하는 면역글로불린 가변 영역이다. "효과적으로 사람" 항체는 상기 항체가 정상적인 사람에서 면역원성 반응을 유발하지 않도록 충분한 수의 사람 아미노산 위치를 포함하는 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화성"은 겉보기 결합 상수 또는 Ka를 언급한다. 결합 친화성은 Ka의 역수인 해리 상수(Kd)로서 나타낼 수 있다. 항체와 같은 표적 결합제는 예를 들어, 특정 표적 분자에 대해 10~5, 10-6, 10-7 또는 10-8M 미만의 Kd를 갖는다. 결합 친화성(예를 들어, 특이성 또는 다른 비교치에 대해)에 대한 차이는 예를 들어, 1.5, 2, 5, 10, 50, 100, 또는 1000배 이상일 수 있다. 예를 들어, Ciz1 폴리펩타이드 결합 단백질은 14b 대신 엑손 14a에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 또 다른 Ciz1 폴리펩타이드에 결합하는 것 보다 1.5, 2, 5, 10, 50, 100, 1000배 이상으로 Ciz1 b-변이체에 우선적으로 결합할 수 있다. Ciz1 폴리펩타이드 결합 단백질은 또한 종 특이적 또는 종 일반적일 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 종 기원의 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드에 결합할 수 있거나 사람 Ciz1 b-변이체와 같은 사람 Ciz1 폴리펩타이드에 특이적일 수 있다).
결합 친화성은 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라스몬 공명 또는 분광측정기(예를 들어, 형광 분석을 사용하는)를 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 이들 기술은 리간드(또는 표적) 농도의 함수로서 결합되고 유리된 리간드의 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 결합 리간드 ([결합된])의 농도는 유리된 리간드([유리된])의 농도 및 표적 상의 리간드에 대한 결합 부위의 농도와 관련되고, 여기서, (N)은 하기 방정식에 의한 표적 분자당 결합 부위의 수이다:
[결합된]=N[유리된]/((1/Ka)+[유리된])
Ka의 정량적 측정이 통상적인 것이지만 때로는 예를 들어, ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 사용하여 결정되는 친화성의 정량적 측정을 수득하기에 충분하고 Ka에 비례하여 보다 높은 친화성이 표준보다, 예를 들어, 2, 5, 10, 20, 또는 50배 이상인지를 결정하는 것과 같은 비교를 위해 사용될 수 있기 때문에 Ka의 정확한 측정을 항상 수행할 필요는 없다. 결합 친화성은 전형적으로 0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% (v/v) 계면활성제 P20 중에서 평가된다.
단백질 제조. 표준 재조합 핵산 방법이 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재된 기술을 참조한다. 일반적으로, 상기 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 핵산 발현 벡터에 클로닝한다. 상기 단백질이 다중 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 경우, 각각의 쇄를 발현 벡터, 예를 들어, 동일하거나 상이한 세포에서 발현되는 동일하거나 상이한 벡터에 클로닝할 수 있다. 항체를 제조하는 방법은 또한 하기에 제공된다. 일부 항체, 예를 들어, Fab는 세균 세포, 예를 들어, 이. 콜리 세포에서 제조될 수 있다. 항체는 또한 진핵 세포에서 제조될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체(예를 들어, scFv's)는 피치아(Pichia)(문헌참조: 예를 들어, Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251 :123-35), 한세울라(Hanseula), 또는 사카로마이세스(Saccharomyces)와 같은 효모 세포에서 발현된다.
하나의 실시형태에서, 항체는 포유동물 세포에서 제조된다. 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하기 위해 바람직한 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 문헌(Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)에 기재된 바와 같은 DHFR 선별가능한 마커와 함께 사용되는 문헌(Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)에 기재된 dhfr-CHO 세포를 포함함), 림프구 세포주, 예를 들어, NSO 골수종 세포, SP2 세포, COS 세포, HEK 293T 세포, 및 유전자 전이 동물, 예를 들어, 유전자 전이 포유동물 기원의 세포를 포함한다. 예를 들어, 상기 숙주는 포유동물 상피 세포이다.
면역글로불린 도메인을 암호화하는 핵산 서열에 추가로, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 오리진) 및 선별가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 상기 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호). 예를 들어, 전형적으로, 상기 선별가능한 마커 유전자는 상기 벡터가 도입된 숙주 세포에 대해 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대해 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭과 함께 dhfr-숙주 세포에 사용하기 위해) 및 neo 유전자(G418 선별을 위해)를 포함한다. 또 다른 예시적인 발현 시스템은 제조원(Lonza Group Ltd. CH)((문헌참조: 예를 들어, Clark et al. (2004) BioProcess International 2(4):48-52; Barnes et al. (2002) Biotech Bioeng. 81 (6):631-639)으로부터 시판되는 글루타민 신타제(GS) 벡터 시스템이다.
항체 또는 이의 항원 결합부의 재조합 발현을 위한 예시적 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 예를 들어, 인산칼슘 매개된 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터내에서, 상기 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 상기 유전자들의 고수준의 전사를 구동시키기 위해 인핸서/프로모터 조절 요소들(예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된, 예를 들어, CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)에 작동적으로 연결된다. 상기 재조합 벡터는 또한 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선별을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 함유한다. 상기 선택된 형질감염체 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하기 위해 배양하고 온전한 항체는 상기 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체에 대해 선별하고 상기 숙주 세포를 배양하고 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 예를 들어, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.
코돈 사용은 숙주 세포의 코돈 편중에 맞게 조정될 수 있고, 예를 들어, CHO 세포에 대해서, 이것은 코돈 편중의 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) 유전자에 대해 조정될 수 있다. 추가로, 매우 높거나 (>80%) 매우 낮은 (<30%) GC 함량 영역은 경우에 따라 회피될 수 있다. 최적화 동안에, 시스-작용 서열 모티프 후 과정은 회피된다: 내부 TATA-박스; chi-부위 및 리보솜 진입 부위; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치; ARE, INS, CRS 서열 요소; 반복 서열 및 RNA 제2 구조; 및 (크립틱(cryptic)) 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 측쇄점. 2개의 종료 코돈을 사용하여 효율적인 종결을 확실히 할 수 있다. 상기 서열의 코돈 최적화는 문헌[참조: Sharp, P. M., Li, W. H., Nucleic Acids Res. 15 (3), 1987]에 따라 평가할 수 있다. 상기 표준 코돈 적응 지수(CAI)를 사용할 수 있다. 희귀 코돈은 0 내지 40개의 정성적 부류의 것들을 포함한다.
앱타머. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 또한 앱타머와 같은 표적 단백질 결합제를 특징으로 한다. 앱타머는 핵산 앱타머 또는 펩타이드 앱타머일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산 앱타머"는 5개 이상의 뉴클레오타이드의 내부 비-이중나선 구조를 포함하는 형태를 갖는 핵산을 언급한다. 앱타머는 자가 상보성 영역을 갖는 단일가닥의 핵산 분자일 수 있다. "펩타이드 앱타머"는 강한 불활성 단백질 스캐폴드로 제공되고 형태적으로 억압된 짧은 펩타이드 서열이다(문헌참조: Evans et al., Journal of Biology 2008, 7:3; 이의 전체 내용이 인용됨). 상기 단백질 스캐폴드에 의해 적용된, 상기 삽입된 펩타이드의 3차원 형태적 억압은 억압되지 않은 펩타이드 서열의 친화성에 비해 표적에 대한 앱타머의 친화성을 실제로 증가시킨다. 예시적인 앱타머는 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드(예를 들어, b-변이체)에 결합하는 핵산 분자 및 펩타이드를 포함한다. 특정 앱타머는 많은 경우에 항체 대신 사용될 수 있다. 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드에 결합하는 다른 펩타이드가 또한 포함된다. 펩토이드와 같은 펩타이드형 분자가 또한 본 발명에 포함된다. "펩토이드", 또는 폴리-N-치환된 글라이신은 일종의 펩타이도미메틱이고, 이의 측쇄는 α-탄소보다는 펩타이드 골격의 질소 원자에 부착(이들이 아미노산에 존재하고 있는바와 같이)되어 있다. T-세포 수용체는 또한 표적 결합제로서 사용될 수 있다.
용어 "결합제"는 실험 조건하에 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드(예를 들어, Ciz1 b-변이체)에 결합할 수 있는 제제를 언급하고, 항체, 및 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 단일-도메인 항체(sdAb), (또한 나노바디로서 언급됨), 핵산 앱타머 및 펩타이드 앱타머를 포함하지만 이에 제한되지 않는 항원 항체 결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 Ciz1 폴리펩타이드 결합제는 시험관내 및 생체내 진단학적 용도를 갖는다. 예를 들어, 피험체로부터 유래된 샘플에서 Ciz1 폴리펩타이드 수준의 측정은 암과 같은 질환의 진단을 위해 사용될 수 있다. 또한, Ciz1 폴리펩타이드 수준의 모니터링 및 정량은 질환의 진행 단계를 결정하고 암 피험체를 치료하기 위해 사용되는 제제의 효능을 평가하기 위해 예후적으로 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 폐 조직 또는 다른 생물학적 조직과 같이, Ciz1 폴리펩타이드를 함유할 수 있는 생물학적 샘플은 특정 암을 갖는 것으로 의심되거나 암에 걸릴 위험이 있는 피험체로부터 수득한다. 전체 조직, 또는 세포의 적정액을 당업자에게 공지된 다양한 가용화 칵테일 중 어느 하나를 사용하여 가용화시킨다. 예를 들어, 조직은 증류된 탈이온수 중 (리터 당) 8M 우레아, 20 ml의 Nonidet P-40 계면활성제, 20 ml의 양쪽성 전해질(pH 3.5-10), 20 ml의 2-머캅토에탄올, 및 0.2 mM의 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 포함하는 용해 완충액을 첨가하여 가용화시킬 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 시험관내(예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 조직, 생검, 예를 들어, 암성 조직) 또는 생체내(예를 들어, 피험체내 생체내 이미지화)에서 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드의 존재를 검출하기 위한 진단학적 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 샘플을 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드 결합제(예를 들어, 항체, 항원 결합 단편 또는 앱타머)와 접촉시키는 단계; 및 (ii) Ciz1 폴리펩타이드 결합제와 샘플 간의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 표준 샘플(예를 들어, 대조군 샘플)을 상기 결합제와 접촉시키고 상기 표준 샘플에 대한 것과 비교하여 상기 결합제와 샘플간의 복합체 형성 정도를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대조군 샘플 또는 피험체와 비교하여 샘플 또는 피험체내 복합체 형성에 있어서의 변화, 예를 들어, 통계학적으로 유의적인 변화는 샘플 중에 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드(예를 들어, b-변이체)의 존재를 나타내는 것일 수 있다. 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드 결합제는 직간접적으로 검출가능한 물질로 표지시켜 결합되거나 비결합된 항체의 검출을 용이하게 할 수 있다. 적합한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 보족 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사능활성 물질을 포함한다.
본원에 기재된 양상의 몇몇 실시형태에서, Ciz1 폴리펩타이드에 특이적인 제제, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 천연 또는 재조합 리간드, 소분자 또는 변형 잔기는 태그로 직접적으로 표지시켜 변형의 검출을 용이하게 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표지" 또는 "태그"는 생물학적 샘플 중에서 표적의 존재, 예를 들어, 특정 변형의 존재를 지적하는 검출가능한 시그날을 생성시킬 수 있는 조성물을 언급한다. 적합한 표지는 형광 분자, 방사능 동위원소, 뉴클레오타이드 발색단, 효소, 기질, 화학발광 잔기, 자기 입자, 생체발광 잔기, 펩타이드 태그(c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5 또는 HIS) 등을 포함한다. 이와 같이, 표지는 Ciz1 폴리펩타이드를 동정하기 위한 방법을 위해 요구되는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성이다. 본원에 기재된 양상의 몇몇 실시형태에서, 상기 변형 잔기 자체는 직접 표지시킬 수 있다. 예를 들어, 당업자는 상기 단백질 변형이 항체의 사용 없이 직접 (또는 다른 변형과 조합하여) 판독될 수 있도록 방사능활성 표지 또는 형광 표지를 사용할 수 있다.
천연적으로, 또한 항체는 이들의 직접적인 검출을 원조하기 위해 표지시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표지된 항체" 또는 "태그된 항체"는 검출가능한 수단에 의해 표지된 항체를 포함하고 형광적으로, 효소적으로, 방사능활성적으로, 및 화학발광적으로 표지된 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체는 또한 태그에 특이적인 항체, 예를 들어, 항-c-Myc 항체를 사용하여 검출될 수 있는 검출가능한 태그, 예를 들어, c-yc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5, 또는 HIS로 표지시킬 수 있다. 항체는 또한 효소(예를 들어, 알칼린 포스파타제, 산 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 리보뉴클레아제)로 표지시킬 수 있다. 결합제를 표지시키는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있고 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체를 표지시키기 위한 형광 표지 또는 태그의 비제한적인 예는 하이드록시쿠마린, 숙신이미딜 에스테르, 아미노쿠마린, 숙신이미딜 에스테르, 메톡시쿠마린, 숙신이미딜 에스테르, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 하이드라지드, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 말레이미드, 퍼시픽 오렌지, 루시퍼 옐로우, NBD, NBD-X, R-피코에리트린 (PE), PE-Cy5 접합체 (시토크롬, R670, 트리-컬러(Tri-Color), 퀀텀 레드(Quantum Red)), PE-Cy7 접합체, 레드 613, PE-텍사스 레드, PerCP, 페리디닌 클로르필 단백질, TruRed (PerCP-Cy5.5 접합체), FluorX, 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC), BODIPY-FL, TRITC, X-로다민(XRITC), 리스 사민 로다민(Lis samine Rhodamine) B, 텍사스 레드, 알로피코시아닌(APC), APC-Cy7 접합체, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 350, 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 500, 알렉사 플루오르 514, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 610, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700, 알렉사 플루오르 750, 알렉사 플루오르 790, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 또는 Cy7을 포함한다. 다양한 적합한 형광제 및 발색단은 문헌[참조: Stryer (1968) Science, 162:526 and Brand, L. et al. (1972) Annual Review of Biochemistry, 41:843-868]에 기재되어 있다. 상기 결합 단백질은 미국 특허 제3,940,475호, 제4,289,747호, 및 제4,376,110호에 기재된 것들과 같은 통상적인 과정에 의해 형광성 발색단 그룹으로 표지시킬 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 형광제는 플루오레세인 및 로다민을 포함하는 크산텐 안료이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 형광성 화합물은 나프틸아민이다. 일단 형광단 또는 발색단으로 표지되면, 상기 결합 단백질은 예를 들어, 형광 현미경을 사용하여, 샘플중에 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드의 존재 또는 위치를 검출하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 형광 현미경은 공초점 또는 디컨볼루션 현미경이다. 또한, 생체발광 화합물을 사용하여 Ciz1 항체를 표지시킬 수 있다. 생체발광 단백질의 존재는 발광성 존재를 검출함에 의해 결정한다. 표지화 목적을 위해 중요한 생체발광 화합물은 루시페린, 루시퍼라제 및 아에쿠오린이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플중에 Ciz1 폴리펩타이드의 수준은 2차원 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 2차원 전기영동의 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 조직 샘플과 같은 생물학적 샘플은 전하를 토대로 단백질을 분리하는 1차원의 등전점 포커싱 분리를 위해 전기영동 겔상으로 로딩한다. 캐리어 양쪽성 전해질 기반 분리용 튜브 겔 또는 고정화된 성분 기반의 분리를 위한 겔 스트립을 포함하는 다수의 1차원 겔 제제가 사용될 수 있다. 1차원 분리 후, 단백질은 평형화 과정 후 2차원 겔상으로 옮기고 분자량을 기초로 단백질을 분리하는 SDS PAGE를 사용하여 분리시켰다. 상이한 피험체로부터 유래된 생물학적 샘플을 비교하는 경우, 다수의 겔은 개별 생물학적 샘플(정상적인 대조군으로부터 유래된 샘플을 포함하는)로부터 제조한다.
분리 후, 상기 단백질은 2차원 겔로부터 웨스턴 블롯팅을 위해 통상적으로 사용되는 막상으로 이동시킨다. 웨스턴 블롯팅 및 후속적인 단백질의 가시화는 또한 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Sambrook et al, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2.sup.nd Edition, Volume 3, 1989, Cold Spring Harbor). 상기 표준 과정이 사용될 수 있거나, 상기 과정은, 특정 유형의 단백질의 동정을 위해, 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 고도의 염기성 또는 산성 또는 지질 가용성 등을 변형시킬 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ausubel, et al., 1999, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley &Sons, Inc., N.Y.). Ciz1 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 웨스턴 블롯 분석의 과정에서와 같이 항온처리 단계에 사용된다. 제1 항체에 특이적인 제2 항체가 제1 항체와 반응하는 단백질을 가시화하기 위해 웨스턴 블롯 분석 과정에 사용된다.
생물학적 샘플 중에 Ciz1 폴리펩타이드 수준의 검출은 또한 치료 동안에 잠재적인 항암제의 효능을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Ciz1 폴리펩타이드 생성 수준은 치료 전 및 치료동안에 결정될 수 있다. 상기 제제의 효능은 치료 전반에 걸쳐 Ciz1 발현을 비교함에 의해 수행될 수 있다. 효능을 나타내는 제제는 상기 제제를 사용한 치료가 진행됨에 따라 Ciz1 폴리펩타이드의 수준을 감소시키는 것들이다.
Ciz1 폴리펩타이드 결합제와 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드(예를 들어, b-변이체)간의 복합체 형성은 Ciz1 폴리펩타이드에 결합된 결합제 또는 비결합된 결합제를 측정하거나 가시화함에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 분석, 예를 들어, 면역 분석은 경쟁 및 비경쟁("샌드위치") 분석을 포함한다. 본 발명의 면역분석은 일부를 거론하자면, 웨스턴 블롯, 방사선 면역 분석, ELISA (효소 결합된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 프레시피틴 반응, 겔 확산 프레시피틴 반응, 면역확산 분석, 응집화 분석, 보체 고정 분석, 면역방사능측정 분석, 형광성 면역분석, 단백질 A 면역분석, 유동세포측정 또는 조직 면역조직화학과 같은 기술을 사용하는 분석 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Ciz1 폴리펩타이드 결합제를 표지화시키는 것에 추가로, 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드의 존재는 검출가능한 물질로 표지된 표준물과 비표지화된 Ciz1 폴리펩타이드 결합제를 사용하는 경쟁 면역 분석에 의해 샘플중에서 분석될 수 있다. 상기 분석의 하나의 예에서, 상기 생물학적 샘플, 상기 표지된 표준물 및 상기 Ciz1 폴리펩타이드 결합제는 조합되고 비표지화된 결합제에 결합된 표지된 표준물의 양을 측정한다. 샘플중에 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드의 양은 Ciz1 폴리펩타이드 결합제에 결합된 표지된 표준물의 양에 역비례한다.
조직화학적 분석. 면역조직화학은 Ciz1 폴리펩타이드 결합제(예를 들어, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머)를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체의 경우에, 상기 항체는 표지(예를 들어, 정제 또는 에피토프 태그)와 함께 합성될 수 있거나 예를 들어, 표지 또는 표지 결합 그룹을 접합시킴에 의해 검출가능하게 표지될 수 있다. 예를 들어, 킬레이터는 상기 항체에 부탁시킬 수 있다. 상기 항체는 이어서 조직화학적 제제, 예를 들어, 현미경 슬라이드상에 있는 조직의 고정된 부분에 접촉시킨다. 결합을 위해 항온처리한 후, 상기 제제는 세척하여 비결합된 항체를 제거한다. 이어서, 항체가 상기 제제에 결합되었는지를 동정하기 위해, 예를 들어, 현미경을 사용하여 상기 제제를 분석한다. 상기 방법을 사용하여 세포 또는 조직(예를 들어, 암성 세포 또는 고형 종양 조직 샘플)을 평가할 수 있다. 상기 항체(또는 다른 폴리펩타이드 또는 펩타이드)는, 결합시, 비표지화시킬 수 있다. 결합 및 세척 후, 상기 항체를 표지화시켜 이것이 검출가능해지도록 한다.
단백질 분석. 상기 Ciz1 폴리펩타이드-결합제는 또한 어레이(예를 들어, 단백질 어레이 또는 마이크로어레이)상에 고정화시킬 수 있다. 상기 어레이는 예를 들어, 의학적 샘플(예를 들어, 분리된 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 침, 생검 등)을 스크리닝하기 위해 진단 도구로서 사용될 수 있다. 물론, 상기 어레이는 또한 예를 들어, 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드 또는 다른 표적 분자에 결합하는 다른 결합 단백질을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 어레이를 제조하는 방법은 예를 들어, 문헌[참조: De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, l-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; WO 01/40803 and WO 99/51773A1]에 기재되어 있다. 상기 어레이를 위한 폴리펩타이드는 예를 들어, 시판되는 로보트 장치를 사용하여 고속으로 스팟팅할 수 있다. 상기 어레이 기질은 예를 들어, 니트로셀룰로스, 플라스틱, 유리, 예를 들어, 표면 변형된 유리일 수 있다.
상기 어레이는 또한 다공성 매트릭스, 예를 들어, 아크릴아미드, 아가로스 또는 또 다른 중합체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 어레이는 예를 들어, 문헌[참조: De Wildt, supra]에 기재된 바와 같이 항체 어레이일 수 있다. 상기 결합 단백질을 생성하는 세포는 어레이된 포맷으로 필터상에 성장시킬 수 있다. 폴리펩타이드 생성이 유도되고 상기 발현된 폴리펩타이드는 상기 세포의 위치에서 상기 필터에 고정화된다. 단백질 어레이는 표지된 표적과 접촉시켜 각각의 고정화된 폴리펩타이드로의 표적 결합 정도를 결정할 수 있다. 상기 표적이 비표지화되어 있는 경우, 표지화된 프로브를 사용하는 샌드위치 방법을 사용하여 비표지화된 표적의 결합을 검출할 수 있다. 상기 어레이의 각각의 어드레스에서 결합하는 정도에 대한 정보는 예를 들어, 컴퓨터 데이터베이스에 프로파일로서 저장될 수 있다. 상기 단백질 어레이는 다수 제조될 수 있고, 예를 들어, 표적 및 비표적의 결합 프로필을 비교하기 위해 사용된다.
FACS. (형광 활성화된 세포 분류). 상기 Ciz1 폴리펩타이드 결합제를 사용하여 세포 또는 단백질, 예를 들어, 환자 샘플과 같은 생물학적 샘플중의 세포 또는 단백질을 표지시킬 수 있다. 상기 결합 단백질은 또한 형광성 화합물에 부착시킬 수 있거나 부착가능하다. 이어서 상기 세포는 분류된 형광성 활성화된 세포를 사용하여(예를 들어, 제조원(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose Calif.)으로부터 시판되는 분류기를 사용하여; 또한 미국 특허 제5,627,037호; 제5,030,002호; 및 제5,137,809호를 참조) 분류될 수 있다. 세포가 분류기를 통과함에 따라, 레이져 빔이 형광성 화합물을 여기시키고 검출기는 통과하는 세포를 계수하여 형광성 검출에 의해 형광성 화합물이 상기 세포에 부착되어 있는지를 결정한다. 각각의 세포에 결합된 표지의 양을 정량하고 분석하여 샘플의 특성을 분석한다. 상기 분류기는 또한 세포를 굴절시켜 결합되지 않은 세포로부터 결합 단백질에 의해 결합된 세포를 분리시킬 수 있다. 상기 분리된 세포를 배양하고/하거나 이의 특징을 분석할 수 있다.
생체내 이미지화. 여전히 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 생체내 Ciz1 폴리펩타이드(예를 들어, b-변이체)-발현하는 암성 조직 또는 이의 잔류물의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 Ciz1 폴리펩타이드 결합제를 피험체에게 투여하는 단계 및 피험체내 Ciz1 폴리펩타이드 결합제를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출은 복합체의 형성 위치 또는 시간을 결정함을 포함할 수 있다. 상기 방법은 피험체, 예를 들어, 피험체의 신체 영역을 스캐닝하거나 다르게는 이미지화함을 포함할 수 있다. 또 다른 방법은 (i) 피험체(예를 들어, 암 또는 신생물 장애를 갖는 환자)에게 검출가능한 마커에게 접합된 Ciz1 폴리펩타이드 결합 항체를 투여하는 단계; (ii) 상기 피험체를 Ciz1 폴리펩타이드 발현 조직 또는 세포에 대한 상기 검출가능한 마커를 검출하는 수단에 노출시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 환자에서 사멸되었거나 사멸된 암 세포로부터 방출된 Ciz1 b-변이체를 가시화하기 위해 사용될 수 있다. 상기 피험체는 예를 들어, NMR 또는 기타 단층 X선 사진 촬영 장치에 의해 이미지화할 수 있다. 진단적 이미지화를 위해 유용한 표지의 예는 방사능 표지, 예를 들어, 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C, 및 188Rh, 형광성 표지, 예를 들어, 플루오레신 및 로다민, 핵 자기 공명 활성 표지, 양전자 방출 단층 X선 촬영(PET) 스캐너에 의해 검출가능한 양전자 방출 동위원소, 화학발광제, 예를 들어, 루시페린 및 효소 마커, 예를 들어, 퍼옥시다제 또는 포스파타제를 포함한다. 단범위 방사선 방출제, 예를 들어, 단범위 검출기 프로브에 의해 검출가능한 동위원소가 또한 사용될 수 있다. 상기 결합제는 공지된 기술을 사용하여 상기 제제로 표지시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wensel and Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. for techniques relating to the radiolabeling of antibodies and D. Colcher et al. (1986) Meth. Enzymol. 121:802-816.]을 참조한다
방사능표지된 결합제는 또한 시험관내 진단 시험을 위해 사용될 수 있다. 동위원소 표지된 단백질의 비활성(specific activity)은 방사능활성 표지의 반감기, 동위원소 순도 및 상기 표지가 단백질에 어떻게 혼입되어 있는지에 의존한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드에 결합하는 결합제 및 시험관내, 예를 들어, 샘플 중에, 예를 들어, 암 또는 신생물 장애를 갖는 환자 기원의 생검 또는 세포 중에서, 또는 생체내에서 예를 들어, 피험체를 이미지화시킴에 의해 본 발명의 Ciz1 폴리펩타이드를 검출하기 위한 진단학적 용도, 예를 들어, 표적 결합제(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 기타 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 앱타머)의 용도에 대한 지침서를 포함하는 키트를 포함한다. 상기 키트는 추가로 하나 이상의 추가의 시약, 예를 들어, 표지 또는 추가의 진단학적 제제를 함유할 수 있다. 생체내 사용을 위해, 상기 결합 단백질은 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 1 X 10-8 M 미만의 친화성 KD로 본 발명의 사람 Ciz1 폴리펩타이드 또는 항원에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 5 X 10-9 미만의 친화성 KD로 본 발명의 사람 Ciz1 폴리펩타이드 또는 항원에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 1 X 10-9 M미만의 친화성 KD로 본 발명의 사람 Ciz1 폴리펩타이드 또는 항원에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 사람 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 래트 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 래빗 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 기니아 피그 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 염소 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 양 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 소 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 말 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 닭 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 돼지 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 고양이 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 개 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 실시형태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고 재조합체이다.
본 발명의 하나의 양상은 피험체의 생물학적 샘플에서 Ciz1 자가항체 또는 순환 면역 복합체(CIC)의 상승된 검출을 기준으로, 암에 대한 소인을 갖는 피험체를 동정하고 약물 효능의 대용 마커로서 암 치료중인 환자를 모니터링하고 재발을 검출하기 위해, 암의 검출 및 예후적 평가를 위한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 상기 용어 "자가항체" (또는 '자가항체들')는 하나 이상의 피험체 자신의 단백질에 대해 지시된 피험체의 면역계에 의해 제조되는 항체이다. 상기 용어 '항-Cizl 자가항체(들)' 또는 'Ciz1 자가항체(들)'은 Ciz1에 특이적인 자가항체(들)를 언급한다. 본 발명은 또한 암의 진단학적 또는 예후적 지시기로서 Ciz1 자가항체(유리되어 있거나 Ciz1 항원과 복합체로 존재하는)를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 Ciz1 폴리펩타이드는 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드이다.
본 발명은 암을 앓거나 암에 걸릴 위험이 높은 피험체(예를 들어, 흡연자, COPD 및 암에 대한 유전학적 소인을 갖는 환자) 기원의 생물학적 샘플에서 Ciz1 폴리펩타이드 또는 Ciz1 폴리펩타이드 항원에 대한 자가항체를 검출함에 의해 암의 진단학적 평가 및/또는 예후에 관한 것이다. 하나의 실시형태에서, 항-Ciz1 자가항체에 대해 분석된 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 침, 뇨 또는 기관지폐포 세척액으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 샘플은 혈액이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 샘플은 혈장이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 샘플은 혈청이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 샘플은 침이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 샘플은 기관지폐포 세척액이다. 하나의 실시형태에서, 상기 암은 폐암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 간암, 신장암, 림프종 및 백혈병이다. 하나의 실시형태에서, 상기 암은 폐암이다. 추가의 실시형태에서, 상기 폐암은 NSCLC이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 폐암은 SCLC이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 암은 유방암이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 암은 갑상선 암이다. 추가의 실시형태에서, 상기 갑상선 암은 연수 갑상선암이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 갑상선암은 허틀 세포 암종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 갑상선암은 유두상 갑상선암이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 암은 림프종이다. 추가의 실시형태에서, 상기 림프종은 B 세포 림프종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 림프종은 호지킨 림프종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 림프종은 확산 대형 B-세포 림프종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 림프종은 여포성 림프종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 림프종은 역형성 대형 세포 림프종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 림프종은 림프절외 변연 B 세포 림프종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 림프종은 비장 변연 B 세포 림프종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 림프종은 맨틀 세포 림프종이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 암은 림프종이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 백혈병은 만성 림프구성 백혈병이다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 상기 백혈병은 모발 세포 백혈병이다. 상기 생물학적 샘플중에서 Ciz1 폴리펩타이드 또는 Ciz1 폴리펩타이드에 대한 자가항체의 증가된 수준의 검출은 암의 스크리닝, 진단 및 예후예측을 위한 신규한 전략을 구성한다. 하나의 실시형태에서, 상기 Ciz1 폴리펩타이드는 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드이다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 폴리펩타이드에 대한 자가항체는 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드에 대한 항체이다. 하나의 실시형태에서, 상기 자가항체는 엑손 14b 및 엑손 15 둘다에 의해 암호화된 아미노산 잔기를 포함하는 연속 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지만 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 해독된 Ciz1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 해독된 Ciz1 폴리펩타이드에 대한 것 보다 10배 이상의 친화성으로 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 자가항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 해독된 Ciz1 폴리펩타이드와 비교하여 102 이상의 친화성으로 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드에 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 자가항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 해독된 Ciz1 폴리펩타이드와 비교하여 103 이상의 친화성으로 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드에 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 자가항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 해독된 Ciz1 폴리펩타이드와 비교하여 104 이상의 친화성으로 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드에 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 자가항체는 엑손 14a를 포함하는 mRNA로부터 해독된 Ciz1 폴리펩타이드와 비교하여 105 이상의 친화성으로 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드에 결합한다.
하나의 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDIS에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDIS에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 DEEEIE, VRSRDIS 또는 DEEEIEVEEELCKQVRSRDIS에 특이적으로 결합하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETY에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKG에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 EEDDEDEEEIEVRSRDISREEW에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 DDEDEEEIEVRSRDISRE에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 DEDEEEIEVRSRDISR에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 DEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISR에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 EDEEEIEVRSRDIS에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDI에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 DEEEIEVEEELCKQVRSRDI에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자가항체는 아미노산 서열 EIEVRSR에 특이적으로 결합하지만 아미노산 서열 EIEVEEELCKQVRSR에 결합하지 않는다.
본 발명은 Ciz1 폴리펩타이드에 대한 자가항체의 존재를 검출하도록 디자인된 면역분석에서 항원으로서의 Ciz1 폴리펩타이드 또는 이의 펩타이드의 용도를 제공한다. 상기 면역분석은 암의 진단 및 예후예측을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라, 피험체의 뇨, 혈액, 혈장 또는 혈청 등에서 Ciz1 자가항체 수준의 측정은 암의 조기 진단을 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 자가항체 수준의 모니터링은 질환의 진행 및 재발 단계를 결정하기 위해 예후적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 피험체의 생물학적 샘플에서 Ciz1 자가항체를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 분석은 본원에 기재된 바와 같은 면역분석을 포함하고, 여기서, 상기 Ciz1 자가항체는 Ciz1 항원을 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드와의 이의 상호작용에 의해 검출된다. Ciz1 항원은 피험체의 생물학적 샘플중에서 Ciz1 자가항체의 존재 및 양을 정량적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 Ciz1 폴리펩타이드의 증가된 발현 수준을 특징으로 하는 질환을 앓는 환자를 면역화시키기 위한 Ciz1 항원을 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 상기 항원에 대한 면역학적 반응의 자극은 종양 세포에 대해 보다 효과적인 공격(예를 들어, 특히, 종양 세포 성장을 억제하거나 종양 세포의 사멸을 촉진시키는)을 유발하는 것으로 의도된다.
본 발명은 추가로 암을 갖거나 암을 발병할 소인을 갖는 환자를 진단하기 위한 임상적 세팅에서 간편하게 사용될 수 있는 사전에 팩키징된 진단학적 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 암의 치료를 위해 사용되는 제제의 효율을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 상기 키트는 샘플중에 Ciz1 폴리펩타이드 항원에 대해 지시된 자가항체의 수준을 검출하고/하거나 측정하기 위한 성분을 포함한다. 제2 실시형태에서, 본 발명의 키트는 생물학적 샘플중에서 Ciz1 폴리펩타이드 항원을 검출하고/하거나 측정하는 성분을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 피험체 유래의 생물학적 샘플중에서 Ciz1 폴리펩타이드의 수준을 정량적으로 검출하는 단계; (b) 대조군 샘플중에서 Ciz1 폴리펩타이드의 수준을 검출하는 단계; 및 (c) 대조군 샘플중에서 검출된 Ciz1 폴리펩타이드의 수준과 피험체의 샘플중에서 검출된 Ciz1 폴리펩타이드의 수준을 비교하고 피험체의 샘플중에 Ciz1 폴리펩타이드의 수준 증가를 동정함에 의해 암을 갖는 환자를 진단하고, 여기서, 대조군 샘플과 비교하여 피험체의 샘플중에서 검출되는 Ciz1 폴리펩타이드의 수준 증가가 환자가 암이 있음을 지시하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 암은 폐암이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 암은 SCLC이다. 하나의 실시형태에서, 상기 Ciz1 폴리펩타이드는 면역분석을 사용하여 검출된다. 하나의 실시형태에서, 상기 면역분석은 면역침전 분석이다. 하나의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 폐 조직 샘플이다. 하나의 실시형태에서, 상기 Ciz1 폴리펩타이드는 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 피험체 유래의 생물학적 샘플중에서 Ciz1 자가항체의 수준을 정량적으로 검출하는 단계; (b) 대조군 샘플중에서 Ciz1 자가항체의 수준을 검출하는 단계; 및 (c) 대조군 샘플중에서 검출된 Ciz1 자가항체의 수준과 피험체의 샘플중에서 검출된 Ciz1 자가항체의 수준을 비교하고 피험체의 샘플중에 Ciz1 자가항체의 수준 증가를 동정함에 의해 암을 갖는 환자를 진단하고, 여기서, 대조군 샘플과 비교하여 피험체의 샘플중에서 검출되는 Ciz1 자가항체의 수준 증가가 환자가 암이 있음을 지시하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 상기 암은 폐암이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 암은 SCLC이다. 하나의 실시형태에서, 상기 Ciz1 자가항체는 면역분석을 사용하여 검출된다. 하나의 실시형태에서, 상기 면역분석은 면역침전 분석이다. 하나의 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 폐 조직 샘플이다. 하나의 실시형태에서, 상기 Ciz1 자가항체는 Ciz1 b-변이체에 대한 자가항체이다.
본 발명은 피험체에서 Ciz1 자가항체의 검출을 기준으로, 암과 같은 질환에 대한 진단학적 및 예후적 방법을 제공한다. 상기 방법은 예를 들어, 암을 앓는 피험체 기원의 생물학적 샘플의 사용 및 암이 없는 나이 및 성 일치된 대조군 기원의 생물학적 샘플의 사용에 의해 입증될 수 있다. 뇨, 혈청 또는 혈장과 같이, 자가항체를 함유할 수 있는 생물학적 샘플은 특정 암을 갖거나 가질 것으로 의심되거나 암을 발병할 소인이 있는 것으로 의심되는 피험체로부터 수득된다. 상응하는 체액은 예를 들어, 대조군으로서 암을 갖지 않는 피험체로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따라, Ciz1 폴리펩타이드 항원에 대해 반응성인 자가항체의 측정은 암과 같은 질환의 진단을 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 자가항체 수준의 모니터링은 질환의 진행 단계를 결정하고 재발의 검출을 위해 예후적으로 사용될 수 있다. 피험체 기원의 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장 또는 다른 생물학적 액체 샘플중에서 자가항체의 검출은 다수의 임의의 방법에 의해 성취될 수 있다. 상기 방법은 일부 거론하자면 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, ELISA (효소 연결된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 경쟁 면역 분석, 면역침전 분석, 프레시피틴 반응, 겔 확산 프레시피틴 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체 고정 분석, 면역방사선측정 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석 및 유동 세포측정과 같은 기술을 사용하는 분석 시스템을 포함하고 본원의 다른 곳에서 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역분석을 포함한다.
상기 면역분석은 면역특이적 항원 항체 결합이 발생할 수 있도록 하는 조건하에서 Ciz1 폴리펩타이드 항원을 함유하는 샘플과 피험체 기원의 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플을 접촉시키고 자가항체에 의한 임의의 면역특이적 결합의 양을 검출하거나 측정함을 포함하는 방법에 의해 수행된다. 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플중에서 자가항체의 수준은 항원이 존재하지 않거나 상이한 항원이 존재하는 샘플 중에서 장애를 갖지 않는 피험체 기원의 유사 생물학적 샘플에 존재하는 수준과 비교될 수 있다.
상기 면역분석은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 Ciz1 폴리펩타이드/펩타이드를 고형 지지체상으로 고정화시키고 여기에 특이적으로 결합된 항-Ciz1 항체를 검출함을 포함한다. 또 다른 방법은 예를 들어, 항-사람 항체 또는 단백질 A 또는 G를 사용하여, 생물학적 샘플 기원의 자가항체를 고정화시키고 여기에 결합된 Ciz1 폴리펩타이드/펩타이드를, 예를 들어, 상기 Ciz1 폴리펩타이드/펩타이드를 표지시킴에 의해 또는 항체 또는 기타 적당한 수단을 사용하여 Ciz1 폴리펩타이드/펩타이드를 검출함에 의해 검출함을 포함한다. 본 발명의 분석에 사용될 상기 Ciz1 폴리펩타이드/펩타이드 항원은 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 통해 제조될 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, Ciz1 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 DNA 분자는 Ciz1 폴리펩타이드의 대량 제조를 위해 적당한 발현 벡터에 유전자조작될 수 있다. 다른 실시형태에서, Ciz1 항원은 Ciz1 자가항체의 표지화, 고정화 또는 검출을 촉진시킬 수 있는 융합 단백질로서 가공된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y]에 기재된 기술을 참조한다. 또한, Ciz1 폴리펩타이드는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 단백질 분리 기술을 사용을 사용하여 세포로부터 정제될 수 있다. 상기 정제 기술은 분자 체 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 실제로, 미세역가 플레이트, 비드 또는 막은 Ciz1 항원에 대한 고형 지지체로서 간편하게 사용된다. 상기 표면은 미리 제조될 수 있고 저장된다. 하나이 실시형태에서 상기 Ciz1 항원은 또 다른 비드 및 또 다른 막에서 미세역가 플레이트에 결합시킨다. 또 다른 실시형태에서, Ciz1 항원의 결합은 고형 지지체에 결합되어 있지 않아 자가항체로의 Ciz1 항원의 결합은 액체 상에서 발생한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 항원-자가항체 복합체는 항체 또는 앱타머와 같은 표지된 항원 결합 분자를 사용하여 검출된다. 바람직하게, 상기 항원 결합제는 항체이다. 상기 표지된 항원 결합제는 예를 들어, 액체상의 경우에 Ciz1 항원, 또는 자가항체에 특이적일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 표지된 항원 결합제는 항-사람 항체 항체, 즉, 사람 항체에 특이적인 항체이다. 저친화성의 Ciz1 자가항체의 결합을 촉진시키기 위해, 상기 Ciz1 항원은 2량체, 3량체, 4량체 등으로 다량체화될 수 있다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 항원은 스트렙타비딘을 사용하여 사량체로 다량체화된다(문헌참조: McLaughlin, K., et al. Protocol Exchange (Nature Publishing), published online 29 January 2007).
하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 Ciz1 항원은 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETY을 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSET을 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE을 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKG를 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열EEDDEDEEEIEVRSRDISREEW를 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 DDEDEEEIEVRSRDISRE을 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 EDEEEIEVRSRDIS를 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDI를 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 EEIEVRSR을 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 IEVRS를 포함한다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위해 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 EVRS를 포함한다.
하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위한 방법에서 대조군으로서 사용되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 대조군은 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSET를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 대조군은 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSET를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 대조군은 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 대조군은 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 대조군은 아미노산 서열 EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 대조군은 아미노산 서열 DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 대조군은 아미노산 서열 EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS를 포함한다. Ciz1 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 또한 Ciz1 자가항체를 검출하기 위한 분석에서 차단제로서 사용돌 수 있다. 하나의 실시형태에서, Ciz1 자가항체를 검출하기 위한 방법에서 대조군으로서 사용되는 Ciz1 폴리펩아이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열 DEEEIEVEEELCKQVRSRDI를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSET를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSET를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 DEEEIEVEEELCKQVRSRDI를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 VEEELCKQV를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 차단제는 아미노산 서열 EEELCKQ를 포함한다.
본 명세서의 기재 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 단수는 달리 언급되지 않는 경우 복수를 포괄한다. 특히, 규정되지 않은 항목이 사용되는 경우, 본 명세서는 상기 문장이 달리 요구되지 않는 경우 단수 뿐만 아니라 복수를 고려하는 것으로서 이해되어야만 한다.
발명의 특정 양상, 실시형태 또는 예와 연계하여 기재된 특성, 정수, 특징, 화합물, 화학적 잔기 또는 그룹은 이것과 상용성이 없지 않은 경우 본원에 기재된 임의의 다른 양상, 실시형태 또는 예에 적용될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다.
출원인은 고형 종양 샘플에 추가로, Ciz1 b 변이체 폴리펩타이드가 암 환자의 혈장에서 검출될 수 있음을 발견하였다. 상기 발견은 Ciz1이 핵 단백질이고 분비되는 것으로 공지되어 있지 않기 때문에 예상치 않은 놀라운 결과이다. 더욱이, 프로테아제는 많은 단백질을 분해하는 혈중에 존재한다. 보다 더 예상치 않게, 출원인은 종양 하중이 낮은 경우 조기 병기(1기의 NSCLC 및 제한기의 SCLC)의 암 환자의 혈장에서 Ciz1 b-변이체 폴리펩타이드를 발견하였다. 상기 Ciz1 b-변이체 바이오마커는 고도의 민감성 및 특이성 둘다로 암을 검출한다.
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실시예
cDNA 어레이 48개의 상이한 폐 샘플 (HLRT101), 및 동일한 환자(HLRT504) 기원의 24개의 일치환 쌍의 폐 암종 및 인접한 조직 또는 상이한 암(CSRT504) 기원의 10개 세트의 조직 샘플을 제조원[OriGene Technologies, Inc. (Rockville, MD)]으로부터 구입하였다. 폐/정상 일치된 상 조직 어레이에 대한 종양 분류 및 요약된 병리학 보고서는 웹 주소(http:/www.oriqene.com/qeneexpression/disease-panels/products/HLRT504.aspx)에서 보고된 바와 같다. 각각의 웰에서 cDNA의 수준은 도 3b에서의 데이터에 대한 다수의 반응 및 모든 다른 어레이에 대한 단일 반응에서 Ciz1 발현에 대한 결과를 표준화하기 위해 공급자에 의한 *b-액틴 발현 및 *b-액틴 증폭에 대해 표준화하였다. 역치를 설정하고 모든 분석은 ABI 700 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
사람 조직 유래된 RNA. IRB 승인된 프로토콜하에 수거된 조직 기원의 3개 쌍이 폐 종양/정상 RNA를 웹 주소[Cytomyx (http://www.cvtomvx.com/cvtomvx/cYtomvx biorepository.asp)]로부터 구입하였다. 고지된 공여자 동의하에 수거된 사람 폐 조직의 추가의 샘플은 웹 주소[ILSbio (http://www.ilsbio.com/)]로부터 구입하였다. RNA는 제조업자의 지침에 따라 TRIzol를 사용하여 조직으로부터 분리하였고; 조직 파쇄는 RNase 부재 1.5mL의 펠렛 페슬(Anachem)을 사용하여 수행하였다. RNA 샘플을 무작위 프라이머, 또는 하기와 같이 올리고 dT와 무작위 프라이머의 혼합물을 사용하여 역전사시켰다. 대략적으로 1.6 *mg의 총 RNA를 1uL 10mM dNTP, 0.5μL 0.5㎍/μL의 무작위 프라이머(Promega) 및 0.5㎍/μL의 올리고 dT12 -18 프라이머(Invitrogen)와 함께 DEPC 물중 총 12μL 용적으로 항온처리하였다. 또한, 총 RNA를 1μL 500㎍/mL 무작위 프라이머, 1μL 10 mM dNTP와 함께 DEPC 물 중에서 총 13μL의 용적으로 항온처리하였다. 상기 샘플은 PTC-200 펠티어 열 순환기(Peltier Thermal Cycler) (MJ Research)중에서 10분 동안 65℃에서 항온처리 한 다음 5분 동안 빙상에서 항온처리하였다. 상기 무작위 프라임된 반응에 하기의 성분을 20μL의 용적으로 첨가하였다: 1x 제1-가닥 완충액(First-Strand buffer), 5 mM DTT, 200 U Superscript III 및 40 U RNaseOUT (모두 Invitrogen). 반응을 3시간 동안 46℃에서 항온처리함에 이어서 15분 동안 70℃에서 항온처리하였다. 하기 무작위 프라이머/올리고 dT 반응에 하기의 성분을 최종 용적 20μL로 첨가하였다: 1x M-MLV 반응 완충액, 10 mM DTT, 200 U M-MLV 역전사 효소 (모두 Promega) 및 40 U RNaseOUT (Invitrogen). 반응을 52분 동안 42℃에서 항온처리함에 이어서 15분 동안 70℃에서 항온처리하였다.
PCR 및 QPCR 단편 증폭을 위해 사용되는 프라이머 쌍 조합은 Taq 폴리머라제(NEB, Herts, UK), 94℃/5 분 및 이어서 1분 동안 94℃/15초, 55℃/30초 및 68℃ 33회 및 68℃에서 7분동안 최종 단계를 사용하는 p8/p2, 푸션 폴리머라제 (Finnzymes, Espoo, Finland), 98℃/30 초 및 98℃/10초, 62℃/30초 및 40초 동안 72℃ 33회, 및 7분 동안 72/℃에서의 단계를 사용하는 p1/p2 및 Taq 폴리머라제 (NEB, Herts, UK), 94℃/5분에 이어서 94℃/30초, 62℃/30초 및 72℃/40초의 33회에 이어서 7분동안 72℃에서 최종 단계를 사용하는 p4/p3를 포함하였다. PCR 반응은 MJ 열 순환기 PTC-200상에서 수행하였다. 정량적 PCR 반응은 25μL의 총 용적에서 광학 접착제 필름(Applied Biosystems)을 갖는 MicroAmp™ 광학 96-웰 반응 플레이트중에서 수행하였다. 각각의 반응을 위해, cDNA는 1x TaqMan® PCR 혼합물(Applied Biosystems), 0.4 μΜ 정배향 프라이머, 0.4 μΜ 역배향 프라이머 및 0.4 μΜ 프로브로 항온처리하였다. 샘플은 상대적 정량 분석 및 하기의 프로그램을 사용하는 ABI Prism 7000 또는 7300 서열 검출 시스템상에 수행하였다; 50℃[2분], 95℃[10분]에 이어서 95℃ 변성[15초], 60℃ 어닐링 및 연장[1분] 40회. 샘플이 역치 수준을 통과하는 회수가 Ct 값이다. 하나의 샘플은 "보정기" 샘플로서 선택되었고 모든 다른 발현 수치는 이와 상대적으로 나타낸다(RQ). 달리 진술되지 않는 경우, 프라이머는 제조원[Sigma Aldrich]으로부터 입수한 것이고, 프로브는 MWG로 부터 입수한 것이고 클론 및 PCR 생성물의 서열 확인은 MWG에 의해 수행하였다.
세포 배양 및 형질감염 세포주는 기관[European cell culture collection (http://www.ecacc.org.uk/) 또는 the Japanese Collection of Research Bioresource (http://cellbank.nibio.go.jp/)]로부터 구입하였거나 제이. 사우쓰게이트로부터 기증받은 것이다. 모든 세포주는 추천된 바와 같이 배양하였다. NIH3T3 세포는 이전에 기재된 바와 같이 성장시켰고 MIrus 3T3을 사용하여 GFP-Ciz1 또는 GFP-C275로 형질감염시켰다.
핵 분획화 핵 분획화는 필수적으로 기재된 바와 같이 수행한다. 전형적으로, 커버슬립상의 세포는 지적된 바와 같이 세제(0.1% TX100)를 사용하거나 사용하는 것 없이 냉 PBS로 세정함에 이어서 냉 CSK 완충액(10 mM Pipes/KOH PH 6.8, 100mM NaCl, 1mM EGTA, 300mM 슈크로스) 및 1mM DTT, 및 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)로 세정한다. DNase 처리를 위해, 세포는 추가로 추천된 바와 같이(Roche) CSK (지적된 바와 같이 0.1 또는 0.5M NaCl)에 이어서 PBS로 세정하고 이어서 분해 완충액 (10mM Tris [pH 7.6], 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2) 중에서 DNase 1과 25℃에서 20분 동안 항온처리한다. 지적된 경우, DNase 처리된 세포는 고정화 전에 1분 동안 0.5M NaCl로 세정하였다. 모든 제제는 실온에서 20분 동안 새로운 4% 파라포름알데하이드로 고정화시킨다.
면역형광 커버슬립상에 고정된 세포는 PBS로 세척하고 이어서 항체 완충액 (PBS중의 10% 프로테아제-부재 BSA, 0.02% SDS, 0.1 % Triton X-100)으로 차단시켰다. Ciz1-RD는 Ciz1 앵커 도메인 펩타이드 DEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISR를 사용하는 정제된 폴리클로날 항체 2C 친화성과 함께 항-Ciz1 폴리클로날 항체 1793 및 Ciz1-AD로 검출하였다. DNA는 Hoechst 33258(Sigma)로 대비염색시켰다. 이미지는 Zeiss Axiovert 200 및 Openlab 이미지 획득 소프트웨어를 사용하고 하나의 실험내에서 동일한 노출 파라미터, 전형적으로 TRITC-표지된 Ciz1에 대해 300ms, GFP에 대해 400ms, Hoescht에 대해 15ms를 사용하여 수거하였다. 이미지가 배경 형광도를 제거하거나 Adobe 포토샵을 사용한 밝기를 증가시키기 위해 디지탈적으로 증진되는 경우, 동일한 조작이 하나의 실험내에서 이미지화하기 위해 적용되었다. 따라서, 예를들어, 추출 전후 Ciz1 염색의 강도는 치료의 효과를 반영한다. 형광 강도는 Openlab '프로필' 도구를 사용하는 동일한 이미지화 파라미터하에 획득된 가공하지 않은 이미지로부터 정량하였다.
실시예 1
DNA 복제 및 앵커 도메인의 커플링되지 않은 발현 Ciz1의 2개의 잘 특성 분석된 기능(DNA 복제의 사이클린-의존성 자극 및 핵 기질과 연합)은 별도의 단백질 도메인에 의해 암호화되어 있다. 이들은 RD(복제 도메인) 및 AD(앵커 도메인)으로 불리운다. 시험관내, Ciz1은 DNA 복제를 촉진시키기 위해 이의 핵 기질 앵커를 요구하지 않는다. 실제로, AD가 부재인 Ciz1 단편은 핵 기질에 부착된 것들 보다 더 활성인 것으로 나타나고3, 이것은 고정화가 기능에 고유한 것이기 보다는 억압하는 특징임을 의미한다. 여기서, RD 및 AD의 발현이 대부분의 암 세포에서 동시에 일어나지 않는다는, 즉 "커플링되지 않은 발현"이라는 증거가 제공된다. 도메인 중 하나 또는 다른 하나의 발현은 다른 통상적인 고형 종양의 범위 뿐만 아니라 대부분의 폐 암에서 변형되고 불균형화된다.
RD 또는 AD의 발현을 검출하는 정량적 PCR 시약(도 1a)은 46개의 폐 유래된 cDNA를 함유하는 cDNA 어레이를 조사하기 위해 사용되었다(도 1b). 어레이를 가로질러, 둘다의 RD 프로브는 일관된 패턴의 발현을 나타냈다. 유사하게, 둘다의 AD 프로브는 일관된 패턴의 발현을 나타냈다. 그러나, RD 및 AD의 발현은 서로 동일한 것과는 거리가 멀다. 이것은 상기 2개의 도메인이 항상 함께 발현되는 것은 아니고 이들이 Ciz1 단백질에 2개가 항상 존재하는 것이 아님을 입증한다.
폐 종양에서 커플링되지 않은 발현 인접한 대조군 샘플과는 반대로, 종양 자체는 훨씬 덜한 확신 트렌드를 나타낸다. Ciz1 발현이 명백히 커플링되어 있지 않고 불균형화되어 있지만 이것은 RD가 감소하고 다른 경우에 RD가 증가(IA기의 샘플과 상대적으로)함에 따라 불량한 피트와 함께 거의 수평의 트렌드 라인을 유도하는 것이 명확하다.
하나의 도메인의 증가된 발현 및 다른 도메인의 감소된 발현의 조합된 효과가 또한 나타나고 있다. RD 및 AD 발현에 대한 조합된 결과가 각각 개별 인접한 대조군에 상대적으로 제공되는 경우(도 1e), 상기 데이터는 이들 균형 비율의 붕괴가 종양 단계와 관련이 있음을 보여준다. I기의 질환을 앓는 환자 기원의 종양에 대해, 12.5% (8명 중 1명)가 주변 조직과 비교하여 AD와 RD간의 균형에 있어서 2배 초과의 변화를 갖지만 II기의 종양에 대해서 이것은 90%(9/10)이고, III기의 종양에 대해서는 60%(3/5)이다. 이러한 트렌드는 Ciz1 발현이 종양발생과정 동안에 커플링되어 있지 않고 불균형화되어 있다는 결론을 지지한다.
다른 유형의 종양에서 커플링되지 않은 발현 Ciz1 전사체 발현에 대해 고찰하기 위해, RD 및 AD는 다수의 공통된 고형 종양에서 샘플 채취하였다(도 2). AD는 대부분의 종양 유형에 대한 (일치되지 않는) 대조군 샘플에 상대적으로 거의 모든 I, II 및 III기에서 과발현된다. 이것은 유방암, 폐암 및 갑상선암(도 2b에 나타낸 비율 곡선에서의 딥(dip)으로부터 명백한)에 대해서 가장 명백하다.
IV 기의 질환에서 커플링되지 않은 발현 명백하게, 모든 조직 유형 기원의 IV기의 종양의 절반 이상에서, 반대되는 것이 적용된다(도 2a에서 별표로 지적됨). 이들 샘플에서, RD 전사체는 과발현되고, 이것은 발현이 전이되었거나 전이로 진행할 종양 서브세트에서 RD를 선호하여 붕괴됨을 시사한다.
유사한 분석은 IV기의 질환을 앓는 환자 기원의 19개 샘플을 포함하는, 40개 악성 흑색종 샘플에 적용하였다(도 3a). 모든 등급의 대부분의 종양에서, AD 발현은 RD를 초과하지만 모든 3개의 대조군 샘플에 대해서는 이것은 그 경우가 아니다. 따라서, 악성 흑색종은 상기된 트렌드를 따르지 않고, RD의 우성 발현으로의 전환은 이러한 유형의 종양에 대한 전이성 능력을 수반하지 않음을 지적한다.
단백질 수준에서 및 Ciz1 기능에 대해 이미 공지된 것의 양상에서 고려되는 경우, 세포 DNA 복제에 대한 초과 RD 또는 초과 AD의 영향은 중증에 있어서 가능한 차이와 함께 매우 유사할 수 있었다. 구체적으로, 본 출원인은 Ciz1의 복제 도메인이 이의 핵 기질 앵커의 부재하에 DNA 복제의 개시를 자극하는 기능을 할 수 있지만3, 상기 핵 기질 부착은 NIH3T3 세포에서 대다수의 Ciz1에 대해서1 및 본 출원인이 시험한 (나타내지 않음)비-종양 오리진의 대부분의 다른 확립된 세포주에서 통상적인 것이다. 출원인은 이의 핵 기질 앵커의 부재하에 복제 도메인의 발현이 앵커되지 않은 활성을 유도할 것이고 이것이 DNA 복제의 스파티오-일시적 구성에 대한 결과를 갖게할 것임을 시사한다. 유사하게, 촉매 기능을 소유하지 않은 단백질과 관련하여 C-말단 고정화 도메인의 발현은 핵 기질 상에서의 고정화 부위에 대한 전장 단백질과 경쟁함에 의해 우성적 음성 효과를 가질 수 있다(도 4a).
실시예 2
단백질 검출 도구 출원인은 단백질 수준에서 Ciz1 발현을 검출하기 위해, RD 및 AD에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체 세트를 개발했다(도 5a). 이들은 분자 진단학적 도구로서 잠재력을 갖고 현재 암 세포주에서 Ciz1 단백질 기능 및 거동에 대한 질문을 답하기 위해 사용되고 있다. 지금까지 출원인은 Ciz1 RD 및 AD 둘다가 단백질 수준에서 독립적으로 존재하고(도 5b, 5c) AD가 RD가 존재하지 않는 몇몇 암 세포에서 상기 핵 기질에 부착되어 있고(도 5c) AD의 과발현이 내인성 RD의 정상적인 아세포 위치 및 고정화를 붕괴시킴(도 5d, 5e)을 입증하였다. 이들 모든 관찰은 Ciz1 RD와 AD간의 비율 붕괴가 핵 구조를 변형시킨다는 구상과 일치한다.
실시예 3
B형 변이체 출원인은 Ciz1 암호화 서열에서 또 다른 스플라이싱의 입증을 위해 Ciz1 유니진(Unigene) 클러스터 Hs. 212395 (http.7/www.ncbi.nlm.nih.qov/sites/entrez?db=unigene)에 대해 맵핑하는 발현된 서열 태그(EST)를 조사하였다. 이것은 신경엔도크린 폐암(주로 소세포 폐암, SCLC)은 비-암 조직 보다 더 흔하게 또 다르게 스플라이싱(b형 전사체를 생성시키기 위해)되는 Ciz1의 형태를 발현함을 시사하였다(도 4b에서 설명됨). b형 전사체로 다르게 스플라이싱되는 영역을 포괄하는 Ciz1 전사체는 총 23개의 상이한 라이브러리, 10개의 암종 및 13개의 비암종에서 검출되었다. 암종 유래된 전사체에 대해, 40%가 b형 전사체인 것과 비교하여 비-암 라이브러리에서는 단지 3%이다.
선택적 검출 도구 출원인은 b형 전사체를 검출하는 분자 도구를 개발하였다. 이들은 엑손 접합부 어느 한 양상에 위치한 프라이머, 엑손 접합부를 포괄하고 b형 전사체로부터 생성물을 수득하게 하는 프라이머 및 또한 엑손 접합부를 포괄하고 단지 b형 전사체를 인지하는 Q-PCR 프로브이다. 처음에 이들은 a) 도구를 입증하기 위해서 및 b) b형 전사체의 발현에 대한 확인 데이터를 생성하기 위해 폐 암 세포주의 패널에 적용하였다.
SCLC 에서의 발현 선택적 전사 검출 도구의 적용은 SCLC 환자 기원의 세포주가 대조군 세포주 보다 더 흔하게 b형 전사체를 발현함을 보여주었다(도 6, 7a). 신경엔도크린 폐암 환자 기원의 종양 및 또한 동일한 환자 기원의 정상적인 인접한 폐 조직 기원의 종양의 작은 샘플링으로부터 유래된 RNA 샘플로의 적용은 b형 전사체가 우선적으로 모든 3개의 SCLC 환자에서 발현됨을 확인시켜준다(도 7b).
비-소형 세포 폐암에서 B- 변이체 발현 b형 전사체에 대해 선택적인 QPCR 시약은 도 1에 사용된 상기 일치돤 폐 종양/정상 조직 cDNA 어레이에 적용하였다. 샘플 세트 중 6개는 표준 인접한 대조군 조직과 비교하여 종양에서 2배 초과로 b-형 전사체를 발현하였다(도 8a). 이것은 어레이상에 단일 신경엔도크린 종양을 포함한다(세트 9/10). 유사하게, NSCLC 샘플의 별도의 세트내에서 b-변이체가 일치되지 않는 대조군에 비해 작은 서브세트의 경우에서 상승하였다(도 8b). 따라서, b형 전사체의 발현은 신경엔도크린 종양에서 만연되어 있지만 상기 유형의 폐암에 제한되지 않는다.
다른 유형의 암에서 B- 변이체 발현 출원인은 상이한 등급의 종양 및 명백히 표준 조직 기원의 일치되지 않는 샘플 세트를 포함하는, 유사한 cDNA 어레이(Origene)를 사용하여 다른 범위의 공통된 암을 조사하였다. 대조군과 비교하는 경우, 상승된 b-변이체는 간 종양(도 8c) 및 신장 종양(도 8d)의 서브세트에서 검출되었다. 대조적으로 갑상선 종양 및 림프종은 높은 비율의 사례에서 고수준의 b-변이체를 발현한다(도 9). 따라서, 이들 2개의 종양 유형은 Ciz1 b-변이체 선택적 진단학적 및 치료학적 도구의 적용을 위해 강한 또 다른 징후이다.
Ciz1 변이체 단백질 고친화성 변이체 특이적 폴리클로날 항체는 SCLC 세포주에서 재조합 단백질(도 10a, 10b 및 10c) 및 내인성 b-변이체 단백질(도 10d)을 사용하여 생성되었고 입증되었다. 이것은 변이체 전사체가 실제로 폐 암 세포에서 변이체 단백질로 해독되고 본원의 도구는 세포 양상에서 효과적이고 선택적인 검출을 할 수 있음을 시사한다. Ciz1은 또한 동일한 고도의 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 제조 및 확인에 요구된다.
실시예 4
RNA 간섭을 사용한 배양된 마우스 세포로부터 Ciz1의 결실은 세포 주기를 통한 진행을 억제하고 세포 증식을 제한한다3. 따라서, Ciz1을 억제하는 시약은 암 세포의 증식을 제한하는 치료학적 분자로서 잠재력을 갖는다. 출원인은 일반적으로 Ciz1를 표적화함에 의해 또는 폐암 관련된 b형 전사체를 선택적으로 표적화함에 의해 Ciz1 발현을 억제하는 사람 특이적 RNA 간섭 분자를 제조하였고 시험하였다. 둘다는 신경엔도크린 폐암 세포의 증식을 억제한다.
B-형 전사체 억제 본 발명자의 주요 전략은 이것을 발현하는 폐암 세포의 성장을 선택적으로 억제할 목적으로 선택적 방식으로 b형 전사체를 억제하는 것이다. 후보물 b형 전사체 특이적 RNA 간섭 분자는 b형 전사체 발현을 억제하는 이들의 능력과 비교하였고 다른 형태의 Ciz1은 영향받지 않은채로 방치하였다. 대부분의 효과적이고 선택적인 siRNA 서열은 Ciz1 단백질의 선택적 억제에 대해 추가로 시험하였다(도 11). 유도가능한 shRNA 전달 벡터로의 전달 후, 내인성 b형 전사체를 발현하는 SCLC 세포의 증식에 대한 현저한 효과는 b변이체 전사체(도 12b) 및 단백질(도 12c)의 선택적 억젱돠 함께 기록하였다(도 12A). 4일 이상의 시간 과정에 걸쳐, 성장은 유사하게 처리된 대조군 세포의 대략 35%로 억제되었다(도 12d). b변이체 억제와 함께 지속적인 배양 동안에, 세포 형태에서의 두드러진 변화가 관찰되었다(도 12e).
생체내 표적 억제 유도성 shRNA 전달 벡터를 함유하는 동일한 SCLC 세포를 사용하여 피하 주사에 의해 마우스에 종양을 생성시켰다. 세포 주사 일자로부터 활성화되었는지 또는 종양이 형성된 후 개시되었는지와 상관없이 b-형 전사체 선택적 RNAi는 생체내 종양 성장을 효과적으로 억제하였다(도 13a, 13b). 이들 데이터는 SCLC-관련 Ciz1 스플라이스 변이체(b형 변이체)를 표적화하는 것이 이것을 발현하는 종양 유형의 세포 증식의 선택적 억제를 위해 잠재적으로 가능한 전략임을 지적한다. 추가의 확인은 안정화된 siRNA의 림프종계 모델 및 전신성 전달을 포괄하는 것으로 계획된다.
순환 종양 세포의 검출 피하 종양을 함유하는 마우스 서브세트의 전체 말초 혈액으로부터 분리된 RNA를 사용하여 b형 전사체 검출 도구의 민감성을 시험하였다(도 13c). B-변이체는 종양을 갖는 마우스 둘다에서 용이하게 검출되었지만 대조군 그룹의 마우스 둘다에서는 검출되지 않았고 이것은 b-변이체가 SCLC에 대한 혈액 시험의 기반을 형성할 수 있는 가능성을 제시한다.
[서열 목록]
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Claims (121)

  1. 피험체에서 암을 진단하는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 상기 피험체가 암을 갖는다는 것을 나타내는, 피험체에서 암을 진단하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암이 폐암, 림프종, 신장암, 유방암, 간암, 방광암 및 갑상선암으로부터 선택되는, 방법.
  3. 피험체에서 폐암을 조기 검출하기 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 샘플 중의 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 상기 피험체가 암을 갖는다는 것을 나타내는, 피험체에서 폐암을 조기 검출하기 위한 방법.
  4. 폐암에 대해 예전에 치료된 피험체에서 폐암의 재발을 검출하기 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 샘플 중의 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 상기 피험체에서의 폐암의 재발을 나타내는, 폐암에 대해 예전에 치료된 피험체에서 폐암의 재발을 검출하기 위한 방법.
  5. 폐 결절을 갖는 피험체에서 암을 진단하는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 샘플 중의 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 피험체가 암을 갖는다는 것을 나타내는, 폐 결절을 갖는 피험체에서 암을 진단하는 방법.
  6. 폐렴 또는 폐암을 갖는 것으로 의심되는 피험체에서 폐렴으로부터 폐암을 구별하여 진단하는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 샘플 중에 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 샘플 중의 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재는 피험체가 암을 갖는다는 것을 나타내는, 폐렴 또는 폐암을 갖는 것으로 의심되는 피험체에서 폐렴으로부터 폐암을 구별하여 진단하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 비-소세포 폐암(NSCLC)인, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐암이 소세포 폐암(SCLC)인, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 폐암이 0기의 NSCLC인, 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 폐암이 IA기의 NSCLC인, 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 폐암이 IB기의 NSCLC인, 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 폐암이 제한기의 SCLC인, 방법.
  13. 제5항에 있어서, 상기 폐 결절이 직경 약 20mm 미만인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폐 결절이 약 15mm 미만인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폐 결절이 약 10mm 이하인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폐 결절이 약 7.5mm 미만인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 폐 결절이 약 5mm 내지 약 10mm 사이인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 피험체의 폐를 영상화하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 영상화가, 흉부 X선, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 자기 공명 영상(MRI) 스캔 또는 양전자 방출 단층촬영(PET) 스캔을 행하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 영상화 단독으로는 상기 암을 진단하기에 불충분한, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 영상화가, 흉부 X선을 행하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 영상화가, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔을 행하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 CT 스캔이 저선량 나선형 컴퓨터 단층촬영 CT 스캔인, 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 영상화가 MRI 스캔을 행하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 영상화가 PET 스캔을 행하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 폐암에 대해 치료된 피험체에서의 암 세포 사멸을 나타내는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 상기 치료 전 및 후에, 상기 피험체로부터, 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 치료 전 및 후에, 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양을 측정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 치료 후 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 양의 증가는 종양 세포 사멸을 나타내는, 폐암에 대해 치료된 피험체에서의 암 세포 사멸을 나타내는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 아미노산 서열 DEEEIEVRSRDIS(서열번호 8)를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 조직, 혈액, 혈장, 타액, 기관지폐포 세척액, 기관지폐포 브러싱액 또는 뇨인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 조직인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 조직이 폐 조직인, 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 분리된 CTC인, 방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈장인, 방법.
  34. 제28항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 타액인, 방법.
  35. 제28항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 기관지폐포 세척액인, 방법.
  36. 제28항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 뇨인, 방법.
  37. 제1항 내지 제29항 및 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드가 세포외 폴리펩타이드인, 방법.
  38. 제33항에 있어서, 100㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 50㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 25㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 10㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 5㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 1㎕ 미만의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 0.5 내지 5㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  45. 제41항에 있어서, 0.25 내지 5㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  46. 제41항에 있어서, 0.25 내지 2㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  47. 제41항에 있어서, 0.5 내지 1.5㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  48. 제41항에 있어서, 약 1㎕의 상기 생물학적 샘플이 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드의 존재에 대해 시험되는, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 상기 생물학적 샘플을 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날인, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날인, 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 sdAb로부터 선택되는, 방법.
  54. 제49항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 핵산 앱타머인, 방법.
  55. 제49항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 펩타이드 앱타머인, 방법.
  56. 제49항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 펩타이도미메틱인, 방법.
  57. 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 엑손 14b 및 15에 걸친 에피토프에 특이적으로 결합하는, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 결합제가, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 100배 큰 친화성으로, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 결합제가, 상기 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 1,000배 큰 친화성으로, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 결합제가, 상기 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 10,000배 큰 친화성으로, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  63. 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제가 서열번호 23의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하지 않는, 방법.
  64. 제49항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 상기 생물학적 샘플을 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 엑손 14b 및 15에 걸친 에피토프 이외의 에피토프를 인식하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날인, 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날인, 방법.
  68. 제65항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 sdAb로부터 선택되는, 방법.
  69. 제64항에 있어서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 핵산 앱타머인, 방법.
  70. 제64항에 있어서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 펩타이드 앱타머인, 방법.
  71. 제64항에 있어서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 펩타이도미메틱인, 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 고체 지지체 상에 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드를 고정화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 고체 지지체가 비드인, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 고체 지지체가 미세적정 플레이트인, 방법.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 고체 지지체 상에 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제를 고정화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제의 결합이, 결합시, 상기 고체 지지체 상에 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드를 고정화시키는, 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 샌드위치 검정인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 방법이 샌드위치 면역분석인, 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 ELISA인, 방법.
  80. Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제.
  81. 제80항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 결합제.
  82. 제81항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 결합제.
  83. 제80항에 있어서, 상기 Ciz1 b-변이 폴리페타이드 결합제가 엑손 14b 및 15에 걸친 에피토프에 특이적으로 결합하는, 결합제.
  84. 제82항에 있어서, 상기 결합제가, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 100배 큰 친화성으로, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 결합제.
  85. 제84항에 있어서, 상기 결합제가, 상기 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 1,000배 큰 친화성으로, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 결합제.
  86. 제84항에 있어서, 상기 결합제가, 상기 Ciz1 폴리펩타이드보다 적어도 10,000배 큰 친화성으로, 상기 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 결합제.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제가 서열번호 23의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하지 않는, 결합제.
  88. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제가, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제.
  89. 제88항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날인, 항체.
  90. 제88항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날인, 항체.
  91. 제88항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 sdAb로부터 선택되는, 항원 결합 단편.
  92. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 핵산 앱타머인, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제.
  93. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 펩타이드 앱타머인, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제.
  94. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제가 펩타이도미메틱인, Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제.
  95. 제80항 내지 제91항 중 어느 한 항의 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드 결합제를 발현하는, 분리된 세포.
  96. Ciz1 b-변이 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 분리된 사람 자가항체.
  97. 피험체에서 암을 진단하는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 생물학적 샘플 중에 Ciz1 b-변이 전사체가 존재하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 Ciz1 b-변이 전사체의 존재는 상기 생물학적 샘플 중의 암 세포의 존재를 나타내는, 피험체에서 암을 진단하는 방법.
  98. Ciz1 고정화 도메인에 대해 Ciz1 복제 도메인의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    ii) Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계;
    iii) Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계; 및
    iv) 상기 Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA에 대해 상기 Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRAN의 상대적 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서, 적어도 2배의 상대적 발현의 차이가 암 세포의 존재를 나타내는, Ciz1 고정화 도메인에 대해 Ciz1 복제 도메인의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법.
  99. Ciz1 고정화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 Ciz1 복제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 시험될 분리된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    ii) 상기 Ciz1 복제 도메인 및 상기 Ciz1 고정화 도메인을 검출하는 단계; 및
    iii) 상기 샘플 중에 존재하는 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대해 상기 Ciz1 복제 도메인의 상대적 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대한 Ciz1 복제 도메인의 상대적 수준에서의 2배 이상의 차이가 암의 존재를 나타내는, Ciz1 고정화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 Ciz1 복제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 비교함으로써 피험체에서 암을 진단하는 방법.
  100. Ciz1 고정화 도메인에 대해 Ciz1 복제 도메인의 발현을 비교함으로써 암 환자의 예후를 나타내는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 시험될 분리된, 고형 종양에 인접한 생물학적 고형 조직 샘플을 제공하는 단계;
    ii) Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계;
    iii) Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 단계; 및
    iv) 상기 Ciz1 고정화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA에 대해 상기 Ciz1 복제 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 mRNA의 상대적 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서, 2배 이상의 상대적 발현의 차이는 보다 불량한 예후를 나타내는, Ciz1 고정화 도메인에 대해 Ciz1 복제 도메인의 발현을 비교함으로써 암 환자의 예후를 나타내는 방법.
  101. Ciz1 고정화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 Ciz1 복제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 비교함으로써 암 환자의 예후를 나타내는 방법으로서,
    상기 방법은:
    i) 시험될 분리된, 고형 종양에 인접한 생물학적 고형 조직 샘플을 제공하는 단계;
    ii) 상기 조직 샘플 중에서 상기 Ciz1 복제 도메인 및 상기 Ciz1 고정화 도메인을 검출하는 단계; 및
    iii) 상기 샘플 중에 존재하는 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대해 상기 Ciz1 복제 도메인의 상대적 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 Ciz1 고정화 도메인에 대한 Ciz1 복제 도메인의 상대적 수준의 2배 이상의 차이가 보다 불량한 예후를 나타내는, Ciz1 고정화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 Ciz1 복제 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 발현을 비교함으로써 암 환자의 예후를 나타내는 방법.
  102. 피험체에서의 암의 진단 또는 예후예측 방법으로서,
    상기 방법은:
    (a) 피험체로부터 유도된 생물학적 샘플 중의 Ciz1 단백질을 정량적으로 검출하는 단계; 및
    (b) 대조군 샘플에서 검출된 단백질의 수준에 대해 피험체 샘플에서 검출된 상기 Ciz1 단백질의 수준을 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서, 대조군 샘플에 비교하여 피험체의 샘플에서 검출된 Ciz1 단백질의 수준의 증가가 암을 지닌 피험체의 지표인, 피험체에서의 암의 진단 또는 예후예측 방법.
  103. 생물학적 샘플 중에서 항-Ciz1 항체를 검출하는 방법으로서,
    상기 방법이:
    (a) 면역특이적 항원-항체 결합 반응이 발생할 수 있는 조건 하에 항-Ciz1 항체를 함유한 샘플을 Ciz1 단백질 항원을 함유한 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 샘플 중의 Ciz1 단백질에 대한 항-Ciz1 항체의 면역특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 항-Ciz1 항체를 검출하는 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 샘플 중의 항-Ciz1 항체를 검출하는 단계가, 샘플 중의 항-Ciz1 항체에 대해 특이적인 항체에 결합된 신호-발생 성분을 이용하는 것을 포함하는, 방법.
  105. 제103항에 있어서, 샘플 중의 항-Ciz1 항체의 존재가, (a) 고체 기판 상에 하나 이상의 Ciz1 단백질을 고정화시키는 단계; (b) 상기 고체 기판을 상기 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 샘플 중의 Ciz1 단백질에 대해 특이적인 항-Ciz1 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 면역분석에 의해 측정되는, 방법.
  106. 피험체에서의 암의 진단 및 예후예측을 위한 키트로서,
    생물학적 샘플 중의 Ciz1 폴리펩타이드의 존재를 검출하기 위한 성분을 포함하는, 피험체에서의 암의 진단 및 예후예측을 위한 키트.
  107. 제106항에 있어서,
    Ciz1 폴리펩타이드의 존재를 검출하기 위한 상기 성분이 Ciz1 결합제인, 키트.
  108. 제106항에 있어서, 상기 Ciz1 폴리펩타이드가 Ciz1 b-변이 폴리펩타이드인, 키트.
  109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ciz1 폴리펩타이드를 검출하기 위한 성분이 항-Ciz1 항체인, 키트.
  110. 제109항에 있어서, 항-Ciz1 항체가 표지되는, 키트.
  111. 제110항에 있어서, 상기 표지가 방사성 표지, 형광성 표지, 측색성 표지 또는 효소 표지인, 키트.
  112. 제109항에 있어서, 항-Ciz1 항체에 면역특이적으로 결합하는 표지된 제2 항체를 추가로 포함하는, 키트.
  113. 상기 생물학적 샘플 중의 상기 항-Ciz1 항체의 존재를 검출하기 위한 성분을 포함하는 생물학적 샘플 중의 항-Ciz1 자가항체의 존재를 검출하기 위한 키트.
  114. 제113항에 있어서, 상기 성분이 Ciz1 항원인, 키트.
  115. 제114항에 있어서, 상기 Ciz1 항원이 표지되는, 키트.
  116. 제113항 또는 제114항에 있어서, 상기 Ciz1 항원이 고체상(solid phase)에 연결되는, 키트.
  117. Ciz1 b-변이 mRNA를 표적화하는 분리된 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA.
  118. 제117항의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  119. 제118항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA가 엑손 14b 및 15의 접합부에 걸친 Ciz1의 뉴클레오타이드 서열을 통해 Ciz1 b-변이 mRNA를 표적화하는, 약제학적 조성물.
  120. 세포 중의 Ciz1 b-변이 mRNA의 발현을 감소시키는 방법으로서,
    b-변이 mRNA를 발현하는 세포를 제117항의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA의 양을 감소시키는 b-변이 mRNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 중의 Ciz1 b-변이 mRNA의 발현을 감소시키는 방법.
  121. 포유동물에서 b-변이 mRNA의 발현을 감소시키는 방법으로서,
    포유동물에게 제117항의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양을 감소시키는 b-변이 mRNA를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 b-변이 mRNA의 발현을 감소시키는 방법.
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