[go: up one dir, main page]

RS58621B1 - Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba - Google Patents

Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba

Info

Publication number
RS58621B1
RS58621B1 RS20190430A RSP20190430A RS58621B1 RS 58621 B1 RS58621 B1 RS 58621B1 RS 20190430 A RS20190430 A RS 20190430A RS P20190430 A RSP20190430 A RS P20190430A RS 58621 B1 RS58621 B1 RS 58621B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
cgrp
pain
antibody
sequence
Prior art date
Application number
RS20190430A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Robert Kovacevich
Leon F Garcia-Martinez
Katie Olson
Benjamin H Dutzar
Jens J Billgren
John A Latham
Danielle M Mitchell
Patricia Dianne Mcneill
Nicole M Janson
Maria-Cristina Loomis
Original Assignee
Alderbio Holdings Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47175055&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58621(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Alderbio Holdings Llc filed Critical Alderbio Holdings Llc
Publication of RS58621B1 publication Critical patent/RS58621B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/485—Morphinan derivatives, e.g. morphine, codeine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OSNOVA PRONALASKA
Oblast pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antitela koja imaju specifičnost vezivanja za humani peptid povezan sa kalcitonin genom (nadalje "CGRP"). Pronalazak se takođe odnosi na postupke skrininga bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP, i antitela zs upotrebu u postupcima prevencije ili tretiranja bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP primenom pomenutih antitela ili njihovih fragmenata.
Opis srodne tehnike
[0002] Peptid povezan sa kalcitotnin genom (CGRP) je proizveden kao multifunkcionalnni neuropeptid dužine od 37 aminokiselina. Dva oblika CGRP, CGRP-alfa i CGRP-beta oblici, postoje kod ljudi i imaju slične aktivnosti. CGRP-alfa i CGRP-beta razlikuju se kod ljudi u tri aminokiseline, i izvedeni su iz različitih gena. CGRP familija peptida uključuje amilin, adrenomedullin, i kalcitonin, iako svaki od njih ima različite receptore i biološke aktivnosti. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001).
[0003] CGRP se oslobađa iz brojnih tkiva kao što su trigeminalni nervi, koji kada su aktivirani oslobađaju neuropeptide unutar meningi, posredujući u neurogenoj inflamaciji koja se karakteriše vazodilatacijom, curenjem iz sudova, i degradacijom mast-ćelija. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Biološki efekti CGRP su posredovani preko CGRP receptora (CGRP-R), koji se sastoji od sedam-transmembranske komponente, zajedno sa receptor-povezanim membranskim proteinom (RAMP). CGRP-R dodatno zahteva aktivnost proteinske komponente receptora (RCP), koja je esencijalna za efikasno vezivanje za adenilat ciklazu preko G proteina i proizvodnje cAMP. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001).
[0004] Migrena je neurovaskularni poremećaj koji pogađa približno 10% odrasle populacije u SAD, i tipično je praćena intenzivnim glavoboljama. Približno 20-30% onih koji pate od migrene imaju auru, koja je fokalni neurološki fenomen koji prethodni i/ili prati događaj. Veruje se da CGRP igra izraženu ulogu u razvoju migrene. Na primer, identifikovane su koncentracije CGRP u plazmi povećane u jugularnoj venskoj krvi tokom faze glavobolje migrene, do isključivanja drugih neuropeptida. Dodatno, prema Arulmozhi et al, sledeće je identifikovano kod osoba koje pate od migrene: (1) snažna korelacija između koncentracije CGRP u plazmi i migrena; (2) infuzija CGRP proizvela je glavobolju sličnu migreni; (3) osnovni CGRP nivoi su bili povišeni; i (4) promene u CGRP nivoima u plazmi tokom napada migrene značajno su korelisani sa intenzitetom glavobolje. Arulmozhi, D.K., et al., Vas. Pharma., 43: 176-187 (2005).
[0005] Jedan efikasan tretman za migrene je primena triptana, koji su familija triptaminzasnovanih lekova, uključujući sumatriptan i rizatriptan. Članovi ove familije imaju afinitet za više serotoninskih receptora, uključujući 5-HT1B, 5-HT1D, i 5-HT1F. Članovi ove familije lekova selektivno vrše konstrikciju cerebralnih sudova, ali takođe izazivaju vazokonstriktivne efekte na koronarne sudove. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Postoji teoretski rizik koronarnog spazma kod pacijenata sa ustanovljenom srčanom bolešću nakon primene, i srčani događaji nakon uzimanja triptana mogu se retko pojaviti. Treba napomenuti da su kontraindikovani za pacijente sa koronarnom vaskularnom bolešću.
[0006] Slično tome, bol se može često rešiti primenom određenih narkotika ili nesteroidnih antiinflamatornih lekova (NSAIDs). Međutim, primena ovih tretmana može se izvesti uz cenu određenih negativnih posledica. NSAIDs imaju potencija da izazovu insuficijenciju bubrega, intestinalno krvarenje, i disfunkciju jetre. Narkotici imaju potencijal da izazovu mučninu, povraćanje, oslabljenu metalnu funkciju, i zavisnost. Stoga, poželjno je identifikovati alternativne tretmane za bol da bi se izbegle određene od ovih negativnih posledica.
[0007] Smatra se da CGRP ima ulogu u većem broju bolesti i poremećaja, uključujući, ali se ne ograničavajući na migrene, glavobolje, i bol.
[0008] Na primer, CGRP navodno može biti u korelaciji sa ili čak imati uzročnu ulogu u hiperaktivnoj mokraćnoj bešici. Dokazi da CGRP može biti korelisan sa stanjem hiperaktivne bešike uključuje činjenicu da je CGRP prisutan u urinarnom traktu, DRG i kičmenoj moždini - (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727) i takođe da su aferentna C-vlakna kritična za prenos impulsa u kičmenu moždinu uključena u mokrenje (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112):128). Dodatno, objavljeno je da intravezikularna primena botoksa suprimira CGRP i značajno smanjuje interkontrakcioni interval u modelu bola u bešici izavanog sa sirćetnom kiselinom (Chuang et al., 2004 J Urol (172):1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182):786).
[0009] Dokazi da CGRP može imati uzročnu ulogu u ovom stanju je nedavno objavljena patentna prijava koja sadrži podatke koji navodno sugerišu da anti-CGRP Ab otkriveno u njoj smanjuje broj kontrakcija bešike u modelu hiperaktivne bešike izazvane sa terpentin uljem (Pfizer WO 2011/024113)).
[0010] WO 2007/076336 A1 otkriva tretman migrene sa anti-CGRP antitelima. WO 2007/054809 A2 otkriva antagonistička antitela usmerena protiv peptida povezanog sa kalcitonin genom i postupcima za korišćenje istog. WO 2009109911 A1 otkriva postupke za tretiranje hroničnog bola. WO 2009/109908 A1 otkriva postupke za tretiranje inflamatornog bola. Zeller et al., otkriva da antitela koja blokiraju funkciju CGRP inhibiraju neurogenu vazodilataciju bez uticaja na puls ili arterijski krvni pritisak kod pacova (British Journal of Pharmacology, vol. 155, 8 September 2008, strane 1093-1103).
[0011] Usled uočene uloge CGRP u ovim i drugim poremećajima, ostaje potreba u tehnici za kompozicijama i postupcima korisnim za prevenciju ili tretiranje bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP, uz izbegavanje sporednih efekata. Ostaje potreba u tehnici za kompozicijama ili postupcima koji smanjuju ili inhibiraju bolesti ili poremećaje povezane sa CGRP, kao što su migrene, glavobolje, heperaktivnu bešiku, i bol.
REZIME PRONALASKA
[0012] Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmakološku ili dijagnostičku kompoziciju kao što je opisano u patentnom zahtevu 15.
[0013] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje: sekvencu nukleinske kiseline ili sevence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6; vektor prema patentnom zahtevu 7; i kultivisanu ili rekombinantnu ćeliju prema patentnom zahtevu 8. Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje u patentnom zahtevu 14 postupak za stvaranje antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5.
[0014] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, za upotrebu prema patentnim zahtevima 9 do 12, i 16.
[0015] Dodatno predmetni pronalazak obezbeđuje postupak in vivo vizuelizacije prema patentnom zahtevu 13.
[0016] Pronalazak takođe predviđa konjugate anti-CGRP antitela konjugovane sa jednom ili više funkcionalnih ili detektabilnih grupa.
[0017] Primeri izvođenja pronalaska pripadaju anti-CGRP antitelima za upotrebu u dijagnozi, proceni i tretmanu bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP ili njegovom aberantnom ekspresijom. Drugi primeri izvođenja pronalaska odnose se na proizvodnju anti-CGRP antitela ili njihovih fragmenata u rekombinaantnim ćelijama domaćinima, na primer sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ili ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca.
KRATAK OPIS NEKIH IZGLEDA CRTEŽA
[0018]
Slika 1 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab1.
Slika 2 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab2.
Slika 3 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab3.
Slika 4 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab4.
Slika 5 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab5.
Slika 6 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab6.
Slika 7 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab7.
Slika 8 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab8.
Slika 9 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab9.
Slika 10 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab10.
Slika 11 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab11.
Slika 12 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab12.
Slika 13 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab13.
Slika 14 obezbeđuje polinukleotidne i polipeptidne sekvence koje odgovaraju punoj dužini Antitela Ab14.
Slika 15 obezbeđuje CGRP-alfa ELISA podatke vezivanja dobijene praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu za antitela Ab1, Ab2, Ab3, i Ab4.
Slika 16 obezbeđuje CGRP-alfa ELISA podatke vezivanja dobijene praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu za antitela Ab5, Ab6, Ab7, i Ab8.
Slika 17 obezbeđuje CGRP-alfa ELISA podatke vezivanja dobijene praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu za antitela Ab9, Ab10, i Ab14.
Slika 18 obezbeđuje CGRP-alfa ELISA podatke vezivanja dobijene praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu za antitela Ab11, Ab12, i Ab13.
Slika 19 prikazuje inhibiciju CGRP-alfa-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab1, Ab2, i Ab4, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 20 prikazuje inhibiciju CGRP-alfa-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab3, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu..
Slika 21 prikazuje inhibiciju CGRP-alfa-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab5, i Ab6, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 22 prikazuje inhibiciju CGRP-alfa-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab7, Ab8, Ab9 i Ab10, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 23 prikazuje inhibiciju CGRP-alfa-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab11, Ab12, i Ab13, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 24 prikazuje inhibiciju CGRP-alfa-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab14, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 25 prikazuje inhibiciju CGRP-beta-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab1, Ab2, i Ab4, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 26 prikazuje inhibiciju CGRP-beta-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab4, Ab5, i Ab6, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 27 prikazuje inhibiciju CGRP-beta-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab7, i Ab8, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 28 prikazuje inhibiciju CGRP-beta-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab9, Ab10, i Ab14, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 29 prikazuje inhibiciju CGRP-beta-vođene cAMP proizvodnje sa antitelima Ab11, Ab12, i Ab13, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 30 prikazuje inhibiciju CGRP-vođene cAMP proizvodnje kod pacova sa antitelima Ab1, Ab2, Ab4 i Ab5, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 31 prikazuje inhibiciju CGRP-vođene cAMP proizvodnje kod pacova sa antitelima Ab3 i Ab6, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 32 prikazuje inhibiciju CGRP-vođene cAMP proizvodnje kod pacova sa antitelima Ab7 i Ab8, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 33 prikazuje inhibiciju CGRP-vođene cAMP proizvodnje kod pacova sa antitelima Ab9, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 34 prikazuje inhibiciju CGRP-vođene cAMP proizvodnje kod pacova sa antitelima Ab10, Ab2, Ab4 i Ab5, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 35 prikazuje inhibiciju CGRP-vođene cAMP proizvodnje kod pacova sa antitelima Ab11, i Ab12, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 36 prikazuje inhibiciju CGRP-vođene cAMP proizvodnje kod pacova sa antitelima Ab13, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 37 prikazuje inhibiciju CGRP-vođene cAMP proizvodnje kod pacova sa antitelima Ab14, dobijenu praćenjem protokola u Primeru 1 u daljem tekstu.
Slika 38 prikazuje inhibiciju vezivanja radioobeleženog CGRP sa CGRP-R sa antitelima Ab1-Ab13, dobijenu praćenjem protokola iz Primera 6 u daljem tekstu.
Slika 39 prikazuje redukciju vazodilatacije dobijene primenom antitela Ab3 i Ab6 nakon primene kapsaicina u modelu pacova, u odnosu na kontrolno telo, dobijenu praćenjem protokola iz Primera 7 u daljem tekstu.
Slika 40 prikazuje redukciju vazodilatacije dobijenu primenom antitela Ab6 na različitim koncentracijama nakon primene kapsaicina u modelu pacova, u odnosu na kontrolno antitelo, dobijenu praćenjem protokola iz Primera 7 u daljem tekstu..
Sl. 41A-C prikazuje korisni efekat Ab3 na kapacitet bešike tokom infuzije fiziološkim rastvorom. Na životinje je primenjeno Ab3 ili negativna kontrola antitelo, zatim su praćene tokom infuzije fiziološkog rastvora u bešiku. ICI (panel A) je povećan i MF (panel B) je smanjen, ukazujući na povećani kapacitet bešike. Razlike u AM (panel C) bile su unutar standardne devijacije i nisu bile statistički značajne. Asterisk ukazuje na statistički značajno poboljšanje (p < 0.05 Student t-test za nezavisne uzorke, u poređenju sa negativnom kontrolom Ab). Legenda: ispunjene kolone: Ab3 tretirane (10 mg/kg); prazne kolone: negativno kontrolno antitelo (10 mg/kg). Linije greške označavaju standardnu devijaciju. Skraćenice: ICI : interkontrakcioni interval; MF : frekvencija mokrenja; AM : Amplituda mokrenja.
SL. 42 prikazuje efekat Ab2 u modelu neuropatskog bola. Mehanička alodinija je indukovana sa Chung hirurškim zahvatom (ligacija L5/L6 spinalnog nerva), i stepen osetljivosti je poređen između Ab2 tretiranih (isprekidane kolone) i kontrolnih životinja (ispunjene kolone). Više vrednosti označavaju manju osetljivost. Prosečna osetljivost bila je slična na dan 13 (pre Ab2 primene) ali je popravljena na dane 14 i 17. Linije greške označavaju standardnu grešku srednje vrednosti.
SL. 43 prikazuje analgetički efekat Ab2 i morfina. Osetljivost na bol je procenjena vremenom povlačenja repa (y-osa, sekunde) za životinje na koje je primenjen morfin (prazni kvadrati), Ab2 (10 mg/kg, puni trouglovi), ili vehikulum (negativna kontrola, prazni krugovi). Životinje su razvile toleranciju na morfin i pokazale vremena povlačenja repa slična kontrolnim životinjama do dana 4. Nasuprot tome, Ab2-tretirane životinje pokazale su produženo poboljšanje u vremenu povlačenja repa tokom eksperimenta (do dana 7). Poboljšanje Ab2-tretiranih životinja bilo je statistički značajno (p < 0.05 jednofaktorska ANOVA sa Dunnett testom, poređenje sa vehikulumom, označeno sa asteriskom). Linije greške označavaju standardnu grešku srednje vrednosti.
SL. 44 prikazuje dozno-zavisni analgetički efekat Ab2. Na dan 0 (nakon prvog testa povlačenja repa), na pacove je primenjeno antitelo Ab2 u dozi od 1 mg/kg (puni kvadrati), 3 mg/kg (puni trouglovi usmereni na dole), ili 10 mg/kg (puni trouglovi usmereni na gore), ili vehikulum (prazni krugovi) ili negativna kontrola antitela (prazni kvadrati). Vreme povlačenja repa pacova kao odgovor na bolni termalni stimulus procenjivano je dnevno (veća vremena označavaju relativnu neosetljivost na bol). Vreme povlačenja repa je povećano na dozno zavisan način primenom Ab2. Asterisk označava statistički značajna povećanja u vremenu povlačenja repa (p < 0.05 jednofaktorska ANOVA sa Dunnett testom, poređenje sa vehikulumom). Linije greške označavaju standardnu grešku srednje vrednosti.
SL. 45 prikazuje analgetički efekat Ab2 u kombinaciji sa morfinom, i kada je morfin povučen nakon nastupanja tolerancije na morfin. Na dan 0 (nakon prvog testa povlačenja repa), na pacove je primenjeno antitelo Ab2 u dozi od 10 mg/kg (puni kvadrati i pun trouglovi ) ili vehikulum (prazni krugovi). Pacovima je zatim dnevno primenjivan morfin na dane 1 do 10 (puni kvadrati) ili samo na dane 1 do 4 (puni trouglovi). Vreme povlačenja repa inicijalno je veoma povećano kod miševa tretiranih morfinom, ali je smanjeno narednih dana ukazujući na toleranciju na morfin. Međutim, kod miševa kod kojih je morfin povučen nakon dana 4, vreme povlačenja repa se povećalo i ostalo povećano između dana 5 i 8. Linije greške ukazuju na standardnu grešku srednje vrednosti.
SL. 46 prikazuje efekat Ab2 u modelu visceralnog bola kod pacova. Visceralni bol je kvantifikovan merenjem praga distenzije debelog creva (veće vrednosti označavaju manju osetljivost) za naivne životinje (prazne kolone) ili životinje tretirane sa TNBS da bi se provocirala hronična preosetljivost debelog creva ili sa primljenom negativnom kontrolom antitela (pune kolone) ili Ab2 (isprekidane linije). Preosetljivost je ublažena sa 27% kod Ab2-tretiranih životinja, i prag distenzije je značajno popravljen primenom Ab2 (p < 0.05 Student t-test, poređenje sa TNBS negativna kontrolna grupa). Linije greške označavaju standardnu grešku srednje vrednosti.
DETALJAN OPIS POŽELJNIH PRIMERA IZVOĐENJA
Definicije
[0019] Podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole, ćelijske linije, vrste ili rodove životinja, i opisane reagense, jer oni mogu varirati. Takođe se podrazumeva da ovde korišćena terminologija ima svrhu opisivanja samo određenih primera izvođenja, i nije namera da se ograničava obim predmetnog pronalaska koji će biti ograničen samo sa priključenim patentnim zahtevima. Kao što je ovde korišćeno oblici jednine na engleskom jeziku "a", "and", i "the" uključuju množinu osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pominjanje "ćelija" uključuje množinu takvih ćelija i pominjanje "protein" uključuje jedan ili više proteina i njihovih ekvivalenata poznatih stručnjacima, i tako dalje. Svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje kao što se uobičajeno podrazumevaju od strane stručnjaka iz oblasti pronalaska osim ukoliko nije jasno naznačeno drugačije.
[0020] Peptid povezan sa kalcitonin genom (CGRP): Kao što je ovde korišćeno, CGRP obuhvata ne samo sledeće Homo sapiens CGRP-alfa i Homo sapiens CGRP-beta aminokiselinske sekvence dostupne od American Peptides (Sunnyvale CA) i Bachem (Torrance, CA): CGRP-alfa: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 281), naznačeno time da je N-terminalni fenilalanin amidovan; CGRP-beta: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 282), naznačeno time da je N-terminalni fenilalanin amidovan; ali takođe bilo koji od membranskivezanih oblika ovih CGRP aminokiselinskih sekvenci, kao i mutanti (mutiens), splajs varijante, izoforme, ortolozi, homolozi i varijante ove sekvence.
[0021] Vrste kvasca kompetentne za parenje: U predmetnom pronalasku namera je da ovaj termin u širokom smislu obuhvata bilo koji diploidni ili tetraploidni kvasac koji se može uzgajati u kulturi. Takve vrste kvasca mogu postojati u haploidnom, diploidnom, ili drugom poliploidnom obliku. Ćelije date ploidije mogu, pod odgovarajućim uslovima, proliferisati neograničen broj generacija u tom obliku. Diploidne ćelije mogu takođe sporulisati da bi formirale haploidne ćelije. Sekvencijalno parenje može rezultovati u tetraploidnim sojevima preko daljeg parenja ili fuzije diploidnih sojeva. Predmetni pronalazak predviđa korišćenje haploidnog kvasca, kao i diploidnih ili drugih poliploidnih ćelija kvasca proizvedene, na primer, parenjem ili fuzijom sferoplasta.
[0022] U jednom primeru pronalaska, kvasac kompetentan u odnosu na parenje je član familije Saccharomycetaceae, koja uključuje rodove Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; i Zygosaccharomyces. Drugi tipovi kvasaca potencijalno korisnih u pronalasku uključuju Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium i Filobasidella.
[0023] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, kvasac kompetentan u odnosu na parenje je član roda Pichia. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska, kvasac kompetentan u odnosu na parenje roda Pichia je jedna od sledećih vrsta: Pichia pastoris, Pichia methanolica, i Hansenula polymorpha (Pichia angusta). U naročito poželjnom primeru izvođenja pronalaska, kvasac kompetentan u odnosu na parenje iz roda Pichia je vrsta Pichia pastoris.
[0024] Haploidna ćelija kvasca: Ćelija koja ima jednu kopiju svakog gena njegovog normalnog genomskog (hromozomskog) komplementa.
[0025] Poliploidna ćelija kvasca: Ćelija koja ima više od jedne kopije njenog normalnog genomskog (hromozomskog) komplementa.
[0026] Diploidna ćelija kvasca: Ćelija koja ima dve kopije (alele) suštinski svakog gena svog normalnog genomskog komplementa, tipično formirana procesom fuzije (parenja) dve haploidne ćelije.
[0027] Tetraploidna ćelija kvasca: Ćelija koja ima četiri kopije (alela) suštinski svakog gena njegovog noramlnog genomskog komplementa, tipično formirana procesom fuzije (parenja) dve haploidne ćelije. Tetraploidi mogu nositi dve, tri, četiri ili više različitih ekspresionih kaseta. Takvi tetraploidi se mogu dobiti u S. cerevisiae selektivnim parenjem homozigotnih heterotalusnih a/a i alfa/alfa diploida i u Pichia sekvencijalnim parenjem haploida da bi se dobili auksotrofni diploidi. Na primer, [met his] haploid se može pariti sa [ade his] haploidom da bi se dobio diploid [his]; i [met arg] haploid se može pariti sa [ade arg] haploidom da bi se dobio diploid [arg]; zatim diploid [his] x diploid [arg] da bi se dobio tetraploid prototrof. Podrazumeva se da će stručnjaci shvatiti da pominjanje koristi i upotreba diploidnih ćelija se takođe može primeniti na tetraploidne ćelije.
[0028] Parenje kvasaca: Proces kojim se dve haploidne ćelije kvasca prirodno fuzionišu da bi formirale jednu diploidnu ćeliju kvasca.
[0029] Mejoza: Proces kojim diploidna ćelija kvasca podleže redukcionoj deobi da bi se stvorile četiri haploidne spore. Sve spore mogu zatim germinirati i stvoriti haploidnu vegetativno rastuću ćelijsku liniju.
[0030] Selektabilni marker: Selektabilni marker je gen ili fragment gena koji daje fenotip rasta (fizička karakteristika rasta) na ćeliji koja prima taj gen kao, na primer preko događaja transformacije. Selektabilni marker omogućava toj ćeliji da preživi i raste u selektivnom medijumu za rast pod uslovima u kojima ćelije koje ne primaju taj selektabilni marker ne mogu rasti. Selektabilni marker geni generalno spadaju u nekoliko tipova, uključujući pozitivne selektabilne marker gene kao što je gen koji daje ćeliji rezistenciju na antibiotik ili drugi lek, temperaturu kada su dva temperaturno senzitivna ("ts") mutanta ukrštena ili je ts mutant transformisan; negativni selektabilni marker geni kao što je biosintetički gen koji daje ćeliji sposobnost da raste u medijumu bez specifičnog nutrijenta koji je potreban svim ćelijama koje nemaju taj biosintetički gen, ili mutagenezom dobijeni biosintetički gen kji onemogućava rast ćelije sa ćelijma koje nemaju gen divljeg tipa; i slično. Pogodni markeri uključuju ali nisu ograničeni na: ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; i slično.
[0031] Ekspresioni vektor: Ovi DNK vektori sadrže elemente koji olakšavaju manipulaciju za ekspresiju stranog proteina unutar ciljne ćelije domaćina. Pogodno, manipulacija sekvenci i proizvodnja DNK za transformaciju je prvo izvedena u bakteriji domaćinu, npr. E. coli, i obično će vektori uključivati sekvence da se olakšaju takve manipulacije, uključujući bakterijski oridžin replikacije i odgovarajući bakterijski selekcioni marker. Selekcioni markeri kodiraju proteine neophodne za preživljavanje ili rast transformisanih ćelija domaćina u selektivnom medijumu kulture. Ćelije domaćini koje nisu transformisane sa vektorom koji sadrži selekcioni gen neće preživeti u medijumu kulture. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) daju rezistenciju na antibiotike ili druge toksine, (b) nadopunjuju auksotrofne deficijencije, ili (c) obezbeđuju kritične nutrijente koji nisu dostupni iz kompleksa medijuma. Primeri vektora i postupaka za transformaciju kvasaca su opisani, na primer, u Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[0032] Ekspresioni vektori za upotrebu u postupcima pronalaska će dalje uključivati specifične sekvence kvasca, uključujući selektabilne auksotrofne ili markere za lek za identifikaciju transformisanih sojeva kvasca. Marker leka može biti dodatno korišćen za umnožavanje broja kopija vektora u ćeliji domaćinu kvasca.
[0033] Sekvenca koja kodira polipeptid od interesa je operativno vezana za transkripcione i translacione regulatorne sekvence koje omogućavaju ekspresiju polipeptida u ćelijama kvasca. Ove vektorske komponente mogu uključivati, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: enhanser element, promotor, i terminacionu sekvencu transkripcije. Sekvence za sekreciju polipeptida mogu se takođe uključiti, npr. signalna sekvenca, i slično. Oridžin replikacije kvasca je izborni, jer se ekspresioni vektori često integrišu u genom kvasca. U jednom primeru izvođenja pronalaska, polipeptid od interesa je operativno vezan, ili fuzionisan, za sekvence koje obezbeđuju optimizovano izlučivanje polipeptida iz diploidnih ćelija kvasca.
[0034] Nukleinske kiseline su "operativno vezane" kada su stavljene u funkcionalni odnos sa sekvencom druge nukleinske kiseline. Na primer, DNK za signalnu sekvencu je operativno povezana sa DNK za polipeptid ukoliko je eksprimirana kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili enhanser je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ukoliko utiče na transkripciju sekvence. Genralno, "operativno vezan" označava da DNK sekvence koje su vezane su neprekidne, i, u slučaju sekretornog lidera, neprekidne i u okviru čitanja. Međutim, enhanseri ne moraju biti neprekidni. Vezivanje je postignuto ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima ili alterantivno preko PCR/rekombinacionog postupka poznatog stručnjacima (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Ukoliko takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa konvencionalnom praksom.
[0035] Promotori su neprevedene sekvence locirane ushodno (5’) od start kodona strukturnog gena (generalno unutar oko 100 do 1000 bp) koji kontrolišu transkripciju i translaciju određenih sekvenci nukleinske kiseline za koje su operativno vezani. Takvi promotori spadaju u nekoliko klasa: inducibilni, konstitutivni, i represibilni promotori (koji povećavaju nivo transkripcije kao odgovor na nedostatak represora). Inducibilni promotori mogu inicirati povećane nivoe transkripcije DNK pod njihovom kontrolom kao odgovor na neku promenu u uslovima kulture, npr., prisustvo ili odsustvo nutrijenta ili promenu temperature.
[0036] Promotor fragment kvasca može takođe služiti kao mesto za homologu rekombinaciju i integraciju ekspresionog vektora u isto mesto u genom kvasca; alternativno korišćen je selektabilni marker kao mesto za homologu rekombinaciju. Pichia transformacija je opisana u Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol.5:3376-3385.
[0037] Primeri pogodnih promotora iz Pichia uključuju AOX1 i promotor (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); ICL1 promotor (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13):1097-108); gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza promotor (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); i FLD1 promotor (Shen et al. (1998) Gene 216(1):93-102). GAP promotor je snažan konstitutivni promotor i AOX i FLD1 promotori su inducibilni.
[0038] Drugi promotori kvasca uključuju ADH1, alkohol dehidrogenaza II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk, i himerne promotore izvedene iz njih. Dodatno, ne-kvasac promotori mogu se koristiti u pronalasku kao što su promotori sisarsa, insekata, biljni, gmizavaca, vodozemaca , virusni, i ptičiji. Najtipičnije promotor će sadržati promotor sisara (potencijalno endogeni za eksprimirane gene) ili će sadržati promotor kvasca ili virusa koji obezbeđuje efikasnu transkripciju u sistemima kvasca.
[0039] Polipeptidi od interesa mogu se proizvesti rekombinantno ne samo direktno, već takođe kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipeptidom, npr. signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Generalno, signalna sekvenca može biti komponenta vektora, ili može biti deo kodirajuće sekvence polipeptida koja je ubačena u vektor. Izabrana heterologna signalna sekvenca je ona koja je prepoznata i obrađena preko jednog od standardnih puteva dostupnih unutar ćelije domaćina. Dodakazno je da je S. cerevisiae alfa faktor pre-pro signal efikasna u sekreciji različitih rekombinantnih proteina iz P. pastoris. Druge signalne sekvence kvasca uključuju signalnu sekvencu alfa faktora parenja, signalnu sekvencu invertaze, i signalnu sekvencu izvedenu iz drugih izlučenih polipeptida kvasca. Dodatno, ove signalne peptidne sekvence mogu biti napravljene inženjeringom da bi obezbedile pojačanu sekreciju u ekspresionim sistemima diploidnog kvasca. Drugi sekrecioni signali od interesa takođe uključuju sisarske signalne sekvence, koje mogu biti heterologne u odnosu na protein koji se izlučuje, ili mogu biti nativna sekvenca za sekrecioni protein. Signalne sekvence uključuju pre-peptid sekvence, i u nekim slučajevima mogu uključiti propeptid sekvence. Mnoge takve signalne sekvence su poznate u tehnici, uključujući signalne sekvence koje se nalaze u imunoglobulinskim lancima, npr., K28 preprotoksin sekvenca, PHA-E, FACE, humani MCP-1, signalna sekvenca humanog serum albumina, humanog Ig teškog lanca, humanog Ig lakog lanca, i slično. Na primer, videti Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); i Kobayashi et. al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).
[0040] Transkripcija može biti povećana ubacivanjem sekvence transkripcione aktivacije u vektor. Ovi aktivatori su cis-delujući elementi DNK, obično oko od 10 do 300 bp, koji deluju na promotor da bi se povećala njegova transkripcija. Transkripcioni enhanseri su relativno nezavisni u odnosu na orijentaciju i položaj, nalazeći se 5’ i 3’ u odnosu na transkripcionu jedinicu, unutar introna, kao i unutar same kodirajuće sekvence. Enhanser može biti splajsovan u ekspresioni vektor na položaju 5’ ili 3’ u odnosu na kodirajuću sekvencu, ali je poželjno lociran na mestu 5’ od promotora.
[0041] Ekspresioni vektori korišćeni u eukariotskim ćelijama domaćinima mogu takođe sadržati sekvence neophodne za terminaciju transkripcije i za stabilizaciju iRNK. Takve sekvence su uobičajno dostupne od 3’ do kodona za translacione terminacije, u neprevedenim regionima eukariotskih ii virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovane fragmente u neprevedenom delu iRNK.
[0042] Konstrukcija pogodnih vektora koji sadrže jedan ili više prethodno navedenih komponenti upotrebljava standardne tehnike vezivanja ili PCR/rekombinantne postupke. Izolovani plazmidi ili fragmenti DNK su isečeni, iskrojeni, i ponovo vezani u obliku poželjnom da se generišu neophodni plazmidi ili preko rekombinantnih postupaka. Za analizu potvrde tačne sekvence u konstruisanom plazmidzu, vezujuće smeše su korišćene za transformaciju ćelija domaćina, i uspešni transformanti su selektovani preko rezistencije na antibiotike (npr. ampicillin ili Zeocin) gde je odgovarajuće. Plazmidi iz transformanata su pripremljeni, analizirani digestijom restrikcionim endonukleazama i/ili sekvencionirani.
[0043] Kao alternativa restrikciji i ligaciji fragmenata, mogu se koristiti rekombinantni postupci na osnovu att mesta i rekombinacioni enzimi da se ubace DNK sekvence u vektor. Takvi postupci su opisani, na primer, od strane Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949; i poznati su stručnjacima. Takvi postupci koriste intermolekulsku DNK rekombinaciju koja je posredovana smešom lambda i E.coli –kodiranih rekombinantnih proteina. Rekombinacija se odigrava između specifičnih mesta vezivanja (att) interagujućih DNK molekula. Za opis att mesta videti Weisberg i Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed.(Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250. DNK segmenti koji flankiraju rekombinantna mesta su zamenjeni, tako da nakon rekombinacije, att mesta su hibridne sekvence koje se sastoje od sekvence donirane od strane svakog roditeljskog vektora. Rekombinacija se može desiti između DNK bilo koje topologije.
[0044] Att mesta se mogu introdukovati u sekvencu od interesa vezivanjem sekvence od interesa u odgovarajući vektor; generisanjem PCR proizvoda koji sadrži att B mesta preko upotrebe specifičnih prajmera; generisanjem cDNK biblioteke klonirane u odgovarajuća att mesta koja sadrže vektor; i slično.
[0045] Savijanje, kao što je ovde korišćeno, odnosi se na trodimezionalnu strukturu polipeptida i proteina, gde interakcije između aminokiselinskih ostataka deluju u cilju stabilizacije strukture. Dok su ne-kovalentne interakcije važne u određivanju strukture, obično proteini od interesa će imati intra- i/ili intermolekularne kovalentne disulfidne veze formirane od dva cisteinska ostatka. Za prirodne proteine i polipeptide ili njihove derivate ili varijante, ispravno savijanje je tipično aranžman koji rezultuje u optimalnoj biološkoj aktivnosti, i može se pogodno pratiti testovima aktivnosti, npr. vezivanja liganda, enzimske aktivnosti, itd.
[0046] U nekim slučajevima, na primer gde je željeni proizvod sintetičkog porekla, testovi zasnovani na biološkoj aktivnosti imaće manje smisla. Ispravno savijanje takvih molekula može se odrediti na osnovu fizičkih osobina, energetskih razmatranja, studija modelovanja, i slično.
[0047] Ekspresioni domaćin može se dodatno modifikovati introdukcijom sekvenci koje kodiraju jedan ili više enzima koji poboljšavaju savijanje i formiranje disulfidnih veza, tj. foldaze, šaperonini, itd. Takve sekvence mogu biti konstitutivno ili inducibilno eksprimirane u ćeliji domaćinu kvasca, korišćenjem vektora, markera, itd. kao što je poznato u tehnici. Poželjno sekvence, uključujući transkripcione regulatorne elemente dovoljne za željeni obrazac ekspresije, su stabilno integrisane u genom kvasca preko ciljanih postupaka.
[0048] Na primer, eukariotski PDI nije samo efikasan katalizator cisteinske oksidacije proteina i izomerizacije disulfidne veze, već takođe pokazuje šaperon aktivnost. Koekspresijaa PDI može olakšati proizvodnju aktivnih proteina koji imaju više disulfidnih veza. Takođe je od interesa ekspresija BIP (vezujućeg proteina teškog lanca imunoglobulina); ciklofilina; i slično. U jednom primeru izvođenja pronalaska, svaki od haploidnih roditeljskih sojeva eksprimira različit enzim savijanja, npr. jedan soj može eksprimirati BIP, i drugi soj može eksprimirati PDI ili njihovu kombinaciju.
[0049] Termini "željeni protein" ili "željeno antitelo" korišćeni su naizmenično i generalno se odnose na roditeljsko antitelo specifično za ciljno mesto, tj., CGRP ili himerno ili humanizovano antitelo ili njegov vezujući deo izveden iz njih kao što je ovde oppisano. Termin "antitelo" uključuje bilo koju polipeptidni lanac koji sadrži molekulsku strukturu sa specifičnim oblikom koji se uklapa i prepoznaje epitop, gde jedna ili više ne-kovalentnih vezujućih interakcija stabilizuje kompleks između molekulske strukture i epitopa. Arhetipski molekul antitela je imunoglobulin, i svi tipovi imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, itd., iz svih izvora, npr. humanog, glodarskog, zeca, krave, ovce, svinje, psa, drugih sisara, kokoške, drugih ptica, itd., smatraju se "antitelima." Poželjna izvor za proizvodnju antitela koristan ako početni materijal su zečevi. Opisane su broje sekvence koje kodiraju antitelo; i druga mogu biti izazvana postupcima dobro poznatim u tehnici. Njihovi primeri uključuju himerna antitela, humana antitela i druga ne-humana sisarska antitela, humanizovana antitela, jednolančana antitela (kao što su scFvs), antitela kamila, nanotela, IgNAR (jednolančana antitela izvedena iz ajkula), mali-modularni imunofarmaceutici (SMIPs), i fragmenti antitela kao što su Fabs, Fab’, F(ab’)2i slično. Videti Streltsov VA, et al., Structure of a shark IgNAR antitelo variable domain i modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci. 2005 Nov;14(11):2901-9. Epub 2005 Sep 30; Greenberg AS, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement i extensive somatic diversification in sharks, Nature.
1995 Mar 9;374(6518):168-73; Nuttall SD, et al., Isolation of new antigen receptor from wobbegong sharks, i use as a scaffold for display of protein loop libraries, Mol Imunol.2001 Aug;38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antitela devoid of light chains, Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446-8; Gill DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 Dec; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct 19.
[0050] Na primer, antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu se proizvesti genetičkim inženjeringom. U ovoj tehnici, kao i sa drugim postupcima, ćelije koje proizvode antitelo su senzitizovane na željeni antigen ili imunogen. Informaciona RNK izolovana iz ćelija koje proizvode antitelo korišćena je kao šablon za stvaranje cDNK korišćenjem PCR amplifikacije. Biblioteka vektora, pri čemu svaki sadrži gen jednog teškog lanca i gen jednog lakog lanca koji zadržavaju inicijalnu antigensku specifičnost, proizveden je insercijom odgovarajućih sekcija amplifikovane cDNK imunoglobulina u ekspresione vektore. Kombinatorna biblioteka je konstruisana kombinovanjem biblioteke gena teškog lanca sa bibliotekom gena lakog lanca. Ovo rezultuje u biblioteci klonova koji ko-eksprimiraju teški i laki lanac (podseća na Fab fragment ili antigen vezujući fragment molekula antitela). Vektori koji nose ove gene su kotransfektovani u ćeliju domaćina. Kada je indukovana sinteza gena antitela u transfektovanom domaćinu, proteini teškog i lakog lanca se samostalno sastavljaju da bi proizveli aktivna antitela koja se mogu detektovati skriningom sa antigenom ili imunogenom.
[0051] Kodirajuće sekvence antitela od interesa uključuju one kodirane sa nativnom sekvencom, kao i nukleinske kiseline koje, zahvaljujući izrođenosti genetičkog koda, nisu identične po sekvenci sa otkrivenim nukleinskim kiselinama, i njihovim varijantama.
Varijanta polipeptida može uključiti aminokiselinske (aa) supstitucije, adicije ili delecije. Aminokiselinske supstitucije mogu biti konzervativne aminokiselinske supstitucije ili supstitucije za eliminisanje neesencijalnih aminokiselina, kao što je da se izmeni glikozilaciono mesto, ili da se minimizuje pogrešno savijanje supstitucijom ili delecijom jednog ili više cisteinskih ostataka koji nisu neophodni za funkciju. Varijante mogu biti dizajnirane tako da zadrže ili imaju poboljšanu biološku aktivnost određenog regiona proteina (npr., funkcionalnog domena, katalitičkih aminokiselinskih ostataka, itd). Varijante takođe uključuju fragmente polipeptida otkrivenih ovde, naročito biološki aktivne fragmente i/ili fragmente koji odgovaraju funkcionalnim domenima. Pozante su tehnike za in vitro mutagenezu kloniranih gena. U predmetni pronalazak su takođe uključeni polipeptidi koji su modifikovani korišćenjem uobičajenih tehnika molekularne biologije da bi se popravila njihova rezistencija na proteolitičku degradaciju ili da se optimizuju osobine rastvorljivosti ili da bi se učinili pogodnijim kao terapeutsko sredstvo.
[0052] Himerna antitela se mogu napraviti rekombinantnim načinima kombinovanjem varijabilnih regiona lakog i teškog lanca (VL i VH), dobijenih iz ćelija koje proizvode antitela jedne vrste sa konstantnim regionima lakog i teškog lanca iz druge vrste. Tipično himerna antitela koriste varijabilne regione glodara ili zeca i humane konstantne regione, da bi se proizvelo antitelo sa pretežno humanim domenima. Proizvodnja takvih himernih antitela je dobro poznata u tehnici, i može se postići standardnim načinima (kao što je opisano, npr., u U.S. Patent No. 5,624,659). Dodatno je predviđeno da se humani konstantni regioni himernih antitela mogu izabrati od IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4 konstantnih regiona.
[0053] Humanizovana antitela su konstruisana da sadrže još više imunoglobulinskih domena sličnih humanim, i inkorporišu samo regione koji određuju komplementarnost antitela izvedenog iz životinje. Ovo je postignuto pažljivim ispitivanjem sekvence hipervarijabilnih petlji varijabilnih regiona monoklonskog antitela, i njihovim smeštanjem u strukturu lanaca humanog antitela. Iako je površinski kompleksan, proces je jednostavan u praksi. Videti, npr., U.S. Patent No.6,187,287.
[0054] Dodatno celim imunoglobulinima (ili njihovim odgovarajućim rekombinantnim delovima), mogu se sintetisati fragmenti imunoglobulina koji sadrže mesto vezivanja epitopa (npr., Fab’, F(ab’)2, ili druge fragmente). "Fragment," ili minimalni imunoglobulini mogu se dizajnirati korišćenjem tehnika rekombinantnih imunoglobulina. Na primer "Fv" imunoglobulini za upotrebu u predmetnom opisu mogu se proizvesti sintezom fuzionisanog varijabilnog regiona lakog lanca i varijabilnog regiona teškog lanca. Kombinacije antitela su takođe od interesa, npr. diatela, koja sadrže dve reazličite Fv specifičnosti. U drugom primeru, SMIPs (imunofarmaceutici sa malim molekulima), antitela kamila, nanotela, i IgNAR su obuhvaćena fragmentima imunoglobulina.
[0055] Imunoglobulini i njihovi fragmenti mogu se modifikovati nakon translacije, npr. da bi se dodale efektorne grupe kao što su hemijski linkeri, detektabilne grupe, kao što su fluorescentne boje, enzimi, toksini, supstrati, bioluminescentni materijali, radioaktivni materijali, hemiluminescentne grupe i slično, ili specifične vezujuće grupe, kao što su streptavidin, avidin, ili biotin, i slično mogu se koristiti u postupcima i kompozicijama predmetnog pronalaska. Primeri dodatnih efektornih molekula su obezbeđeni u daljem tekstu.
[0056] Polinukleotidna sekvenca "odgovara" polipeptidnoj sekvenci ukoliko translacija polinukleotidne sekvence u skladu sa genetičkim kodom daje polipeptidnu sekvencu (tj., polinukleotidna sekvenca "kodira" polipeptidnu sekvencu), jedna polinukleotidna sekvenca "odgovara" drugoj polinukleotidnoj sekvenci ukoliko dve sekvence kodiraju istu polipeptidnu sekvencu.
[0057] "Heterologni" region ili domen DNK konstrukta je segment DNK koji se može identifikovati unutar većeg DNK molekula koji nije u asocijaciji sa većim molekulom u prirodi. Stoga, kada heterologni region kodira sisarski gen, gen će obično biti flankiran sa DNK koja ne flankira sisarsku genomsku DNK u genomu izvornog organizma. Sledeći primer heterolognog regiona je konstrukt gde sama kodirajuća sekvenca nije pronađena u prirodi (npr., cDNK gde genomska kodirajuća sekvenca sadrži introne, ili sintetičke sekvence koje imaju kodone različite od nativnog gena). Alelne varijacije ili mutacioni događaji koji se odigravaju prirodno ne dovode do heterolognog regiona DNK kao što je ovde definisano.
[0058] "Kodirajuća sekvenca" je sekvenca kodona u okviru koja (u odnosu na genetički kod) odgovara ili kodira sekvencu proteina ili peptida. Dve kodirajuće sekvence odgovaraju jedna drugoj ukoliko sekvence ili njihove komplementarne sekvence kodiraju iste aminokiselinske sekvence. Kodirajuća sekvenca zajedno sa odgovarajućom regulatornom sekvencom može bitri transkribovana i prevedena u polipeptid. Poliadenilaciona signalna sekvenca za terminaciju transkripcije će se obično nalaziti 3’ od kodirajuće sekvence. "Promotor sekvenca" je DNK regulatorni region sposoban da veže RNK polimerazu u ćeliji i inicira transkripciju nishodne (3’ smer) kodirajuće sekvence. Promotor sekvence tipično sadrži dodatna mesta za vezivanje regulatornih molekula (npr., transkripcionih faktora) koji utiču na transkripciju kodirajuće sekvence. Kodirajuća sekvenca je "pod kontrolom" promotor sekvence ili "operativno vezana" za promotor kada RNK polimeraza vezuje promotor sekvencu u ćeliji i transkribuje kodirajuću sekvencu u iRNK, koja je zatim prevedena u protein kodiran sa kodirajućom sekvencom.
[0059] Vektori su korišćeni da introdukuju stranu supstancu, kao što je DNK, RNK ili protein, u organizam ili ćeliju domaćina. Tipični vektori uključuju rekombinantne viruse (za polinukleotide) i lipozome (za polipeptide). "DNK vektor" je replikon, kao što je plazmid, fag ili kozmid, za koji može biti vezan drugi polinukleotidni segment tako da se omogući replikacija vezanog segmenta. "Ekspresioni vektor" je DNK vektor koji sadrži regulatornu sekvencu koja će usmeriti sintezu polipeptida od strane odgovarajuće ćelije domaćina. Ovo obično znači da promotor vezuje RNK polimerazu i inicira transkripciju iRNK, kao i mesta vezivanja ribozoma i inicijacione signale da bi se usmerila translacija iRNK u polipeptid(e). Inkorporacija polinukleotidne sekvence u ekspresioni vektor na ispravnom mestu i u korektnom okviru čitanja, praćena transformacijom odgovarajuće ćelije domaćina sa vektorom, omogućuje proizvodnju polipeptida kodiranog sa pomenutom polinukleotidnom sekvencom.
[0060] "Amplifikacija" polinukleotidnih sekvenci je in vitro proizvodnja više kopija određene sekvence nukelinske kiseline. Amplifikovana sekvenca je obično u obliku DNK. Različite tehnike za izvođenje takve amplifikacije su opisane u preglednom radu od strane Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291-294). Lančana reakcija polimeraze ili PCR je prototip amplifikacije nukleinske kiseline, i korišćenje PCR ovde treba smatrati primerom drugih pogodnih amplifikacionih tehnika.
[0061] Opšta struktura antitela kod kičmenjaka je sada dobro poznata (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Aca. Sci., 190: 5 (1971)). Antitela se sastoje od dva identična laka polipeptidna lanca molekulske težine približno 23,000 daltona ("laki lanac"), i dva identična lanca molekulske težine 53,000-70,000 ("težak lanac"). Četiri lanca su spojena disulfidnim vezama u "Y" konfiguraciji naznačeno time da da laki lanci račvaju teške lance počevši od usta "Y" konfiguracije. Deo "grane" "Y" konfiguracije je označen kao Fab region; deo stabla "Y" konfiguracije je označen kao FC region. Orijantacija aminokiselinske sekvence ide od N terminalnog kraja na vrhu "Y" konfiguracije do C-terminalnog kraja na dnu svakog lanca. N-terminalni kraj poseduje varijabilni region koji ima specifičnost za antigen koji ga izaziva, i priblićno je dužine 100 aminokiselina, sa blagim varijacijama između lakog i teškog lanca i do antitela do antitela.
[0062] Varijabilni region je vezan u svakom lancu za konstantni region koji se pruža preostalom dužinom lanca i koji unutar određene klase antitela ne variara sa specifičnošću antitela (tj., antigena koji ga izaziva). Postoji pet poznatih glavnih klasa konstantnih regiona koji određuju klasu imunoglobulinskog molekula (IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE koji odgovaraju γ, m, α, δ, i ε (gama, mu, alfa, delta, ili epsilon) konstantnim regionima teškog lanca).
Konstantni region ili klasa određuje poseldične efektorne funkcije antitela, uključujući aktivaciju komplementa (Kabat, E. A., Structural Concepts in Imunology i Imunochemistry, 2nd Ed., p.413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), i druge ćelijske odgovore (Andrews, D. W., et al., Clinical Imunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Imunology, 48: 187 (1983)); dok varijabilni variable region određuje antigen sa kojim će reagovati. Laki lanci su kalsifikovani ili kao κ (kapa) ili λ (lambda). Svaka klasa teškog lanca može se pripremiti ili sa kapa ili lambda lakim lancem. Laki i teški lanac su međusobno kovalentno vezani, i delovi "repa" dva teška lanca su međusobno vezani kovalentnim disulfidnim vezama kada su imunoglobulini stvoreni ili u hibridomima ili u B ćelijama.
[0063] Izraz "varijabilni region" ili "VR" odnosi se na domene unutar svakog para lakih i teških lanca u antitelu koji su direktno uključeni u vezivanje antitela sa antigenom. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) praćen brojnim konstantnim domenima. Svaki laki lanac ima varijabilni domen (VL) na jednom kraju i konstantni domen na njegovom drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, i varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca.
[0064] Izrazi "region koji određuje komplementarnost," "hipervarijabilni region," ili "CDR" odnose se na jedan ili više hipervarijabilnih ili regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) koji se nalaze u varijabilnim regionima lakih ili teških lanaca antitela (Videti Kabat, E. A. et al., Sekvence of Proteins of Imunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Ovi izrazi uključuju hipervarijabilne regione kao što su definisani od strane Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Imunological Interest," Kabat E., et al., US Dept. of Health i Human Services, 1983) ili hipervarijabilne petlje u 3-dimenzionalnim strukturama antitela (Chothia i Lesk, J Mol. Biol.196 901-917 (1987)). CDRs u svakom lancu se drže blisko preko okvirnih regiona i, sa CDRs iz drugog lanca, doprinose formiranju antigen vezujućeg mesta. Unutar CDRs postoje selektivne aminokiseline koje su opisane kao regioni koji određuju selektivnost (SDRs) koji predstavljaju kritične kontaktne ostatke korišćene od strane CDR u antitelo-antigen interakciji (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
[0065] Izrazi "okvirni region" ili "FR" odnosi se na jedan ili više okvirnih regiona unutar varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela (Videti Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Ovi izrazi uključuju one regione aminokiselinske sekvence umetnute između CDRs unutar varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela.
Anti-CGRP Antitela i njihovi vezujući fragmenti koji imaju vezujuću aktivnost za CGRP
Antitelo Ab1
[0066] Jedan primer predmetnog opisa uključuje himerna antitela koja imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži sekvencu datu u nastavku:
[0067] Opis takođe uključuje himerna antitela koja imaju specifičnost vezivanja sa CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca koja sadrži sekvencu u nastavku:
[0068] Opis dodatno uključuje himerna antitela koja imaju specifičnost vezivanja sa CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži sekvencu u nastavku:
[0069] Opis takođe uključuje himerna antitela koja imaju specifičnost vezivanja sa CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca koja sadrži sekvencu u nastavku:
[0070] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više polipeptidnih sekvenci prema SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; i SEQ ID NO: 7 koje odgovaraju regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 1 ili sekvenci lakog lanca od SEQ ID NO: 2, i/ili jednoj ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; i SEQ ID NO: 10 koji odgovaraju regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 3 ili sekvenci teškog lanca od SEQ ID NO: 4, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru opisa, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više CDRs, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvence teškog i lakog lanca datih prethodno, uključujući sve njih.
[0071] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru opisa, fragmenti antitela prema opisu obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO: 4.
[0072] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; i SEQ ID NO: 7 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 1 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 2.
[0073] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; i SEQ ID NO: 10 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 3 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 4.
[0074] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 1; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 3; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; i SEQ ID NO: 7) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 1; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; i SEQ ID NO: 10) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 3.
[0075] U naročito poželjnom primeru prema opisu, himerno anti- CGRP antitelo je Ab1, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0076] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab1, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 1 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 3. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: 3 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0077] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab1. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab1 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab2
[0078] U jednom primeru, opis uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0079] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0080] Opis dodatno uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0081] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0082] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; i SEQ ID NO: 17 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 11 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 12, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; i SEQ ID NO: 20 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 13 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 14, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0083] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 11 ili SEQ ID NO: 12. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 13 ili SEQ ID NO: 14.
[0084] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; i SEQ ID NO: 17 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 11 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 12.
[0085] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; i SEQ ID NO: 20 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 13 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 14.
[0086] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 11; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 13; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; i SEQ ID NO: 17) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; i SEQ ID NO: 20) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 13.
[0087] U naročito poželjnom primeru prema opisu, humanizovano anti- CGRP antitelo je Ab2, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 14, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0088] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenti koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab2, Fab fragment uključuju sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 11 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 13. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 11 i/ili SEQ ID NO: 13 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja za CGRP.
[0089] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti mogu se proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab2. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab2 ili njegovi Fab fragmenti mogu se proizvesti via ekspresijom u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab3
[0090] U jednom primeru, opis uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca datu u nastavku:
[0091] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca koja sadrži sekvencu datu u nastavku:
[0092] Opis dodatno uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0093] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0094] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; i SEQ ID NO: 27 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 21 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 22, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; i SEQ ID NO: 30 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 23 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 24, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacije od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0095] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 22. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24.
[0096] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; i SEQ ID NO: 27 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 21 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 22.
[0097] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; i SEQ ID NO: 30 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 23 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 24.
[0098] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 21; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 23; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; i SEQ ID NO: 27) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 21; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; i SEQ ID NO: 30) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 23.
[0099] U naročito poželjnom primeru prema opisu, himerno anti-CGRP antitelo je Ab3, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 24, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0100] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab3, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 21 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 23. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 21 i/ili SEQ ID NO: 23 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0101] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) od Ab3. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab3 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugih sojeva kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab4
[0102] U jednom primeru, opis uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0103] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0104] Opis dodatno uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0105] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0106] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; i SEQ ID NO: 37 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 31 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 32, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; i SEQ ID NO: 40 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 33 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 34, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0107] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 31 ili SEQ ID NO: 32. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 34.
[0108] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; i SEQ ID NO: 37 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 31 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 32.
[0109] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; i SEQ ID NO: 40 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 33 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 34.
[0110] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 31; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 33; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; i SEQ ID NO: 37) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 31; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; i SEQ ID NO: 40) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 33.
[0111] U naročito poželjnom primeru prema opisu, humanizovano anti-CGRP antitelo je Ab4, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 32 i SEQ ID NO: 34, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0112] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab4, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 31 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 33. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 31 i/ili SEQ ID NO: 33 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0113] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab4. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab4 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab5
[0114] U jednom primeru, opis uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0115] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0116] Opis dodatno uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0117] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0118] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; i SEQ ID NO: 47 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 41 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 42, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; i SEQ ID NO: 50 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 43 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 44, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0119] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 41 ili SEQ ID NO: 42. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 43 ili SEQ ID NO: 44.
[0120] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; i SEQ ID NO: 47 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 41 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 42.
[0121] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; i SEQ ID NO: 50 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 43 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 44.
[0122] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 41; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 43; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; i SEQ ID NO: 47) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 41; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; i SEQ ID NO: 50) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 43.
[0123] U naročito poželjnom primeru prema opisu, himerno anti-CGRP antitelo je Ab5, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 44, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0124] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab5, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 41 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 43. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 41 i/ili SEQ ID NO: 43 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0125] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab5. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab5 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab6
[0126] Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-humano CGRP antitelo koje sadrži polipeptid lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 52 i polipeptid teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 54. U jednom primeru, opis uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0127] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0128] Opis dodatno uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0129] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0130] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; i SEQ ID NO: 57 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 51 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 52, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; i SEQ ID NO: 60 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 53 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 54, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0131] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 52. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 53 ili SEQ ID NO: 54.
[0132] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; i SEQ ID NO: 57 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 51 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 52.
[0133] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; i SEQ ID NO: 60 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 53 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 54.
[0134] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 51; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 53; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; i SEQ ID NO: 57) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 51; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; i SEQ ID NO: 60) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 53.
[0135] Prema primeru izvođenja pronalaska, humanizovano anti- CGRP antitelo je Ab6, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 54, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0136] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab6, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 51 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 53. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 51 i/ili SEQ ID NO: 53 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0137] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab6. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab6 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab7
[0138] U jednom primeru, opis uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0139] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0140] Opis dodatno uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0141] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0142] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; i SEQ ID NO: 67 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 61 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 62, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; i SEQ ID NO: 70 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 63 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 64, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0143] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 61 ili SEQ ID NO: 62. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 63 ili SEQ ID NO: 64.
[0144] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; i SEQ ID NO: 67 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 61 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 62.
[0145] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; i SEQ ID NO: 70 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 63 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 64.
[0146] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 61; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 63; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; i SEQ ID NO: 67) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 61; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; i SEQ ID NO: 70) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 63.
[0147] U naročito poželjnom primeru prema opisu, himerno anti-CGRP antitelo je Ab7, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 62 i SEQ ID NO: 64, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0148] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab7, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 61 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 63. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 61 i/ili SEQ ID NO: 63 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0149] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab7. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab7 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab8
[0150] U jednom primeru, opis uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0151] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0152] Opis dodatno uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0153] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0154] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; i SEQ ID NO: 77 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 71 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 72, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; i SEQ ID NO: 80 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 73 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 74, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0155] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 71 ili SEQ ID NO: 72. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 73 ili SEQ ID NO: 74.
[0156] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; i SEQ ID NO: 77 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 71 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 72.
[0157] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; i SEQ ID NO: 80 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 73 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 74.
[0158] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 71; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 73; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; i SEQ ID NO: 77) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 71; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; i SEQ ID NO: 80) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 73.
[0159] U naročito poželjnom primeru prema opisu, humanizovano anti-CGRP antitelo je Ab8, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 72 i SEQ ID NO: 74, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0160] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab8, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 71 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 73. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 71 i/ili SEQ ID NO: 73 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0161] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab8. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab8 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab9
[0162] U jednom primeru, opis uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0163] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0164] Opis dodatno uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0165] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0166] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; i SEQ ID NO: 87 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 81 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 82, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; i SEQ ID NO: 90 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 83 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 84, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0167] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 81 ili SEQ ID NO: 82. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 83 ili SEQ ID NO: 84.
[0168] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; i SEQ ID NO: 87 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 81 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 82.
[0169] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; i SEQ ID NO: 90 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 83 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 84.
[0170] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 81; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 83; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; i SEQ ID NO: 87) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 81; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; i SEQ ID NO: 90) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 83.
[0171] U naročito poželjnom primeru prema opisu, himerno anti-CGRP antitelo je Ab9, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 82 i SEQ ID NO: 84, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0172] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab9, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 81 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 83. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 81 i/ili SEQ ID NO: 83 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0173] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab9. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab9 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab10
[0174] U jednom primeru, opis uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0175] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0176] Opis dodatno uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0177] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0178] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; i SEQ ID NO: 97 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 91 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 92, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; i SEQ ID NO: 100 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 93 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 94, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0179] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 91 ili SEQ ID NO: 92. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 93 ili SEQ ID NO: 94.
[0180] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; i SEQ ID NO: 97 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 91 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 92.
[0181] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; i SEQ ID NO: 100 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 93 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 94.
[0182] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 91; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 93; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; i SEQ ID
[0183] NO: 97) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 91; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; i SEQ ID NO: 100) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 93.
[0184] U naročito poželjnom primeru prema opisu, humanizovano anti-CGRP antitelo je Ab10, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 92 i SEQ ID NO: 94, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0185] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab10, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 91 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 93. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 91 i/ili SEQ ID NO: 93 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0186] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab10. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab10 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab11
[0187] U jednom primeru, opis uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0188] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0189] Opis dodatno uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0190] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0191] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; i SEQ ID NO: 107 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 101 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 102, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; i SEQ ID NO: 110 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 103 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 104, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0192] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 102. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 103 ili SEQ ID NO: 104.
[0193] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; i SEQ ID NO: 107 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 101 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 102.
[0194] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; i SEQ ID NO: 110 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 103 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 104.
[0195] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 101; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 103; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; i SEQ ID NO: 107) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 101; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; i SEQ ID NO: 110) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 103.
[0196] U naročito poželjnom primeru prema opisu, himerno anti-CGRP antitelo je Ab11, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 102 i SEQ ID NO: 104, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0197] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab11, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 101 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 103. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 101 i/ili SEQ ID NO: 103 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0198] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab11. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab11 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab12
[0199] U jednom primeru, opis uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0200] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0201] Opis dodatno uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0202] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0203] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; i SEQ ID NO: 117 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 111 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 112, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; i SEQ ID NO: 120 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 113 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 114, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0204] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 111 ili SEQ ID NO: 112. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 113 ili SEQ ID NO: 114.
[0205] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; i SEQ ID NO: 117 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 111 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 112.
[0206] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; i SEQ ID NO: 120 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 113 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 114.
[0207] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 111; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 113; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; i SEQ ID NO: 117) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 111; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; i SEQ ID NO: 120) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 113.
[0208] U naročito poželjnom primeru prema opisu, humanizovano anti-CGRP antitelo je Ab12, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO: 114, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0209] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab12, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 111 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 113. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 111 i/ili SEQ ID NO: 113 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0210] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab12. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab12 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab13
[0211] U jednom primeru, opis uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0212] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0213] Opis dodatno uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0214] Opis takođe uključuje himerna antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0215] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; i SEQ ID NO: 127 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 121 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 122, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; i SEQ ID NO: 130 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 123 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 124, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0216] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 121 ili SEQ ID NO: 122. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 123 ili SEQ ID NO: 124.
[0217] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; i SEQ ID NO: 127 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 121 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 122.
[0218] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; i SEQ ID NO: 130 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 123 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 124.
[0219] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 121; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 123; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; i SEQ ID NO: 127) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 121; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; i SEQ ID NO: 130) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 123.
[0220] U naročito poželjnom primeru prema opisu, himerno anti-CGRP antitelo je Abl3, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 122 i SEQ ID NO: 124, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0221] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Abl3, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 121 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 123. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 121 i/ili SEQ ID NO: 123 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0222] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Abl3. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab13 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab14
[0223] U jednom primeru, opis uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0224] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu lakog lanca kao što je dato u nastavku:
[0225] Opis dodatno uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu varijabilnog teškog lanca datu u nastavku:
[0226] Opis takođe uključuje humanizovana antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i poseduju sekvencu teškog lanca datu u nastavku:
[0227] Opis dodatno predviđa antitela koja sadrže jednu ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; i SEQ ID NO: 137 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 131 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 132, i/ili jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; i SEQ ID NO: 140 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 133 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 134, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci. U sledećem primeru prema opisu, antitela prema opisu ili njihovi fragmenti sadrže, ili se alternativno sastoje od, kombinacija od jednog ili više od CDRs, sekvenci varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog i lakog lanca date prethodno, uključujući sve njih.
[0228] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 131 ili SEQ ID NO: 132. U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence od SEQ ID NO: 133 ili SEQ ID NO: 134.
[0229] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; i SEQ ID NO: 137 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 131 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 132.
[0230] U sledećem primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više od polipeptidnih sekvenci od SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; i SEQ ID NO: 140 koja odgovara regionima koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvenci varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 133 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 134.
[0231] Opis takođe predviđa fragmente antitela koji uključuju jedan ili više fragmenata antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, fragmenti antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih fragmenata antitela: varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 131; varijabilni region teškog lanca od SEQ ID NO: 133; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; i SEQ ID NO: 137) varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 131; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; i SEQ ID NO: 140) varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 133.
[0232] U naročito poželjnom primeru prema opisu, humanizovano anti-CGRP antitelo je Abl4, koje sadrži, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 132 i SEQ ID NO: 134, i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti datih ovde.
[0233] U sledećem naročito poželjnom primeru prema opisu, fragmenti antitela sadrže, ili se alternativno sastoje od, Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Abl4, Fab fragment sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca od SEQ ID NO: 131 i sekvencu varijabilnog teškog lanca od SEQ ID NO: 133. Ovaj primer prema opisu dodatno predviđa adicije, delecije, i varijante od SEQ ID NO: 131 i/ili SEQ ID NO: 133 u pomenutom Fab uz zadržavanje specifičnosti vezivanja CGRP.
[0234] U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Abl4. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Abl4 ili njihovi Fab fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije, gljiva, insekata, ili mikrobnih sistema kao što su ćelije kvasca (na primer diploidnog kvasca kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
[0235] U sledećem primeru, fragmenti antitela mogu biti prisutni u jednom ili više od sledećih neograničavajućih oblika: Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv i jednolančano Fv antitelo oblicima. U poželjnom primeru izvođenja, anti-CGRP antitela opisana ovde dodatno sadrže sekvencu kapa konstantnog lakog lanca koja sadrži sekvencu datu u nastavku:
[0236] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, anti-CGRP antitela opisana ovde dodatno sadrže polipeptidnu sekvencu gama-1 konstantnog teškog lanca koja sadrži sekvencu datu u nastavku:
[0237] U sledećem primeru, opis predviđa izolovano anti-CGRP antitelo koje sadrži VH polipeptidnu sekvencu izabranu od: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ili 133, ili njenu varijantu; i koje sadrži VL polipeptidnu sekvencu izabranu od: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ili 131, ili njenu varijantu, naznačeno time da jedan ili više okvirnih ostataka (FR ostaci) u pomenutom VH ili VL polipeptidu je zamenjen sa drugim aminokiselinskim ostatakom što rezultuje u anti-CGRP antitelu koje specifično vezuje CGRP. Opis predviđa humanizovane i himerne oblike ovih antitela. Himerna antitela mogu uključivati Fc izveden iz IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 ili IgG19 konstantnih regiona.
[0238] U jednom primeru prema opisu, antitela ili VH ili VL polipeptidi su poreklom originate ili su izabrani iz jedne ili više populacija B ćelija zeca pre iniciranja procesa humanizacije koji je ovde pomenut.
[0239] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela nemaju specifičnost vezivanja za CGRPR. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela inhibiraju asocijaciju CGRP sa CGRP-R. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela inhibiraju asocijaciju CGRP sa CGRP-R i/ili njegovim dodatnim proteinima i/ili multimerima, i/ili antagonizuju njihove biološke efekte.
[0240] Kao što je navedeno u pasusu [0127] ovde, antitela i njihovi fragmenti mogu se modifikovati posle translacije da bi se dodale efektorne grupe kao što su hemijski linkeri, detektabilne grupe kao što su na primer fluorescentne boje, enzimi, supstrati, bioluminescentni materijali, radioaktivni materijali, i hemiluminescentne grupe, ili funkcionalne grupe kao što su na primer streptavidin, avidin, biotin, citotoksin, citotoksično sredstvo, i radioaktivni materijali.
[0241] Antitela ili njegovi fragmenti mogu takođe biti hemijski modifikovani da bi obezbedili dodatne prednosti kao što su povećana rastvorljivost, stabilnost i vreme u cirkulaciji (in vivo polu-život) polipeptida, ili smanjena imunogenost (Videti U.S. Pat. No.4,179,337). Hemijske grupe za derivatizaciju mogu se izabrati od polimera rastvorljivih u vodi kao što su polietilen glikol, etilen glikol/propilen glikol kopolimeri, karboksimetilceluloza, dekstran, polivinil alkohol i slično. Antitela i njegovi fragmenti mogu se modifikovati na randomizovanim položajima unutar molekula, ili na prethodno određenim položajima unutar molekula i mogu uključivati jednu, dve, tri ili više vezanih hemijskih grupa.
[0242] Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i mogu biti granati ili negranati. Za polietilen glikol, poželjna molekulska težina je između oko 1 kDa i oko 100 kDa (termin "oko" označava da u preparatima polietilen glikola, neki molekuli će biti teži, neki lakši, od navedene molekulske težine) za lakoću rukovanja i proizvodnje. Mogu se koristiti druge veličine, u zavisnosti od željenog terapeutskog profila (npr., željene dužine produženog oslobađanja, efekata, ukoliko ima bilo kakvih na biološku aktivnost, lakoće rukovanja, stepena ili nedostatka antigenosti i drugih poznatih efekata polietilen glikola na terapeutski protein ili analog). Na primer, polietilen glikol može imati prosečnu molekulsku težinu od oko 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, ili 100,000 kDa. Granati polietilen glikoli su opisani, na primer, u U.S. Pat. No. 5,643,575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol.
56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); i Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999).
[0243] Postoje brojni postupci vezivanja dostupni stručnjacima, Videti npr., EP 0 401 384, (kuplovanje PEG sa G-CSF), Videti takođe Malik et al., Exp. Hematol.20:1028-1035 (1992) (objavljuje pegilaciju GM-CSF korišćenjem trezil hlorida). Na primer, polietilen glikol može biti kovalentno vezan preko aminokiselinskih ostataka preko reaktivne grupe, kao što je, slobodna ili karboksilna grupa. Reaktivne grupe su one za koje se može vezati aktivirani molekul polietilen glikola. Aminokiselinski ostaci koji imaju slobodnu amino grupu mogu uključiti lizinske ostatke i N-terminalne aminokiselinske ostatke; oni koji imaju slobodnu karboksilnu grupu mogu uključivati ostatke asparaginske kiseline i ostatke glutaminske kiseline i C-terminalni aminokiselinski ostatak. Sulfhidril grupe se mogu takođe koristiti kao reaktivna grupa za vezivanje polietilen glikol molekula. Za terapeutske svrhe je poželjno vezivanje na amino grupi, kao što je vezivanje na N terminusu ili lizin grupi.
[0244] Kao što je prethodno sugerisano, polietilen glikol se može vezati preko proteina preko veze za bilo koji broj aminokiselinskih ostataka. Na primer, polietilen glikol se može vezati za polipeptide preko kovalentnih veza sa ostacima lizina, histidina, asparaginske kiseline, glutaminske kiseline, ili cisteina. Može se upotrebiti jedna ili više hemijskih reakcija za vezivanje polietilen glikola za specifične aminokiselinske ostatke (npr., lizin, histidin, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, ili cistein) ili za više od jednog tipa aminokiselinskog ostatka (npr., lizin, histidin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, cistein i njihove kombinacije).
[0245] Alternativno, antitela ili njegovi fragmenti mogu imati povećane in vivo polu-živote preko fuzije sa albuminom (uključujući ali se ne ograničavajući na rekombinantni humani serum albumin ili njegovi fragmenti ili varijante (videti, npr., U.S. Pat. No. 5,876,969, izdat Mar. 2, 1999, EP Patent 0413 622, i U.S. Pat. No.5,766,883, izdat Jun. 16, 1998)) ili drugim cirkulišućim proteinima krvi kao što je transferin ili feritin. U poželjnom primeru izvođenja, polipeptidi i/ili antitela predmetnog pronalaska su fuzionisani sa zrelim oblikom humanog serum albumina (tj., aminokiselinsama 1-585 humanog serum albumina kao što je prikazano na SL. 1 i 2 EP Patent 0 322 094). Polinukleotidi koji kodriaju fuzione proteine su takođe obuhvaćeni pronalaskom.
[0246] U pogledu deetektabilnih grupa, dodatni primeri enzima uključuju, ali nisu ograničeni na, peroksidazu rena, acetilholinesterazu, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu i luciferazu. Dodatni primeri fluorescentnih materijala uključuju, ali nisu ograničeni na, rodamin, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, umbelliferon, dihlorotriazinilamin, fikoeritrin i danzil hlorid. Dodatni primeri hemiluminescentnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, luminol. Dodatni primeri bioluminescentnih materijala uključuju, ali nisu ograničeni na, luciferin i ekvorin. Dodatni primeri radioaktivnih materijala uključuju, ali nisu ograničeni na, Jod 125 (125I), Ugljenik 14 (14C), Sumpor 35 (35S), Tricijum (3H) i Fosfor 32 (32P).
[0247] U odnosu na funkcionalne grupe, primeri citotoksičnih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na, metotreksat, aminopterin, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin; alkilujuća sredstva kao što je mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), mitomicin C, lomustin (CCNU), 1-metilnitrozourea, ciklofosfamid, mehloretamin, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, cisdihlorodiamine platina (II) (DDP) cisplatin i karboplatin (paraplatin); antraciklini ukuljučuju daunorubicin (ranije daunomicin), doksorubicin (adriamicin), detorubicin, karminomicin, idarubicin, epirubicin, mitoksantron i bizantren; antibiotici uključuju daktinomicin (aktinomicin D), bleomicin, kalihemicin, mitramicin, i antramicin (AMC); i antimitotička sredstva kao što su vinka alkaloidi, vinkristin i vinblastin. Druga citotoksična sredstva uključuju paklitaksel (taksol), ricin, egzotoksin pseudomonasa, gemcitabin, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, etoposid, tenoposid, kolhicin, dihidroksi antracin dion, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin, prokarbazin, hidroksiurea, asparaginaza, kortikosteroidi, mitotan (O,P’-(DDD)), interferoni, i smeše ovih citotoksičnih sredstava.
[0248] Dodatna citotoksična sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, hemoterapeutska sredstva kao što je karboplatin, cisplatin, paklitaksel, gemcitabin, kaliheamicin, doksorubicin, 5-fluorouracil, mitomicin C, aktinomicin D, ciklofosfamid, vinkristin i bleomicin. Toksični enzimi iz biljaka i bakterija kao što je ricin, toksin difterije i toksin Pseudomonas mogu se konjugovati sa humanizovanim ili himernim antitelima, ili njegovim vezujućim fragmentima, da bi se generisali reagensi za ubijanje specifičnog ćelijskog tipa (Youle, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
[0249] Druga citotoksiča sredstva uključuju citotoksične ribonukleaze kao što je opisan od strane Goldenberg u U.S. Pat. No. 6,653,104. Primeri izvođenja pronalaska takođe se odnose na radioimunokonjugate gde je radionuklid koji emituje alfa ili beta čestice stabilno kuplovan sa antitelom, ili njegovim vezujućim fragmentima, sa ili ili bez upotrebe sredstva koje formira kompleks. Takvi radionuklidi ukljućuju beta-emitere kao što je Fosfor-32 (<32>P), Skandijum-47 (<47>Sc), Bakar-67 (<67>Cu), Galijum-67 (<67>Ga), Itrijum-88 (<88>Y), Itrijum-90 (<90>Y), Jod-125 (<125>I), Jod-131 (<131>I), Samarijum-153 (<153>Sm), Lutecijum-177 (<177>Lu), Renijum-186 (<186>Re) ili Renijum-188 (<188>Re), i alfa-emiteri kao što je Astatin-211 (<211>At), Olovo-212 (<212>Pb), Bizmut-212 (<212>Bi) ili -213 (<213>Bi) ili Aktinijum-225 (<225>Ac).
[0250] U tehnici su poznati postupci za konjugovanje antitela ili njegovih vezujućih fragmenata za detektabilnu grupu i slično, kao što su na primer oni postupci opisani sa Hunter et al, Nature 144:945 (1962); David et al, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al, J. Imunol. Meth. 40:219 (1981); i Nygren, J., Histochem. i Cytochem.30:407 (1982).
[0251] Primeri opisani ovde dodatno uključuju varijante i ekvivalente koji su suštinski homologi antitelima, fragmentima antitela, diatelima, SMIPs, antitelima kamila, nanotelima, IgNAR, polipeptidima, varijabilnim regionima i CDRs datim ovde. Oni mogu sadržati, npr., mutacije konzervativne supstitucije, (tj., supstitucije jedne ili više aminokiselina sa sličnim aminokiselinama). Na primer, konzervativna supstitucija se odnosi na supstituciju aminokiseline sa drugom u istoj opštoj klasi, npr., jedne kisele aminokiseline sa drugom kiseliom aminokiselinom, jedne bazne aminokiseline sa drugom baznom aminokiselinom, ili jednom neutralnom aminokiselinom sa drugom neutralnom aminokiselinom. Šta je nameravano sa konzervativnom substitucijom aminokiselina je dobro poznato u tehnici.
[0252] U sledećem primeru, opis predviđa polipeptidne sekvence koj eimaju najmanje 90% ili veću homologiju sekvence sa jednom ili više od polipeptidnih sekvenci fragmenata antitela, varijabilnih regiona i CDRs datih ovde. Poželjnije, opis predviđa polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 95% ili veću homologiju sekvence, još poželjnije najmanje 98% ili veću homologiju sekvence, i još poželjnije 99% ili veću homologiju sekvence sa bilo kojom ili više od polipeptidnih sekvenci fragmenata antitela, varijabilnih regiona i CDRs datih ovde. Postupci za određivanje homologije između sekvence nukleinske kiseline i aminokiseline su dobro poznati stručnjacima.
[0253] U sledećem primeru, opis dodatno predviđa prethodno navedene homologe polipeptida fragmenata antitela, varijabilnih regiona i CDRs datih ovde koji dodatno imaju anti-CGRP aktivnost. Neograničavajući primeri anti-CGRP aktivnosti su dati ovde, na primer, u pasusima [0329]-[0350] u daljem tekstu.
[0254] U sledećem primeru, opis dodatno predviđa generisanje i upotrebu anti-idiotipskih antitela koja vezuju bilo koju od prethodnih sekvenci. U jednom primeru, takvo antiidiotipsko antitelo moglo bi se primeniti na subjekta koji je primenio anti-CGRP antitelo da modulira, smanji, ili neutrališe, efekat anti-CGRP antitela. Takva anti-idiotipska antitela bi takođe mogla biti korisna za tretman autoimune bolesti karakterisane prisustvom anti-CGRP antitela. Dodatni primer upotrebe takvih anti-idiotipskih antitela je za detekciju anti-CGRP antitela predmetnog pronalaska, na primer da bi se pratili nivoi anti-CGRP antitela prisutni u krvi subjekta ili drugim telesnim tečnostima.
[0255] Predmetni opis takođe predviđa anti-CGRP antitela koja sadrže bilo koje polipeptidne ili polinukleotidne sekvence opisane ovde supstituisane sa bilo kojom drugom polinukleotidnom sekvencom opisanom ovde. Na primer, bez ograničenja na njih, predmetni opis predviđa antitela koja sadrže kombinaciju bilo koje sekvence varijabilnog lakog lanca i varijabilnog teškog lanca opisane ovde, i dodatno predviđa antitela koja su rezultat supstitucije bilo koje od CDR sekvenci opisanih ovde sa bilo kojim drugim CDR sekvencama opisanim ovde.
Dodatni primeri izvođenja pronalaska
[0256] U sledećem primeru, opis predviđa jedno ili više anti-humanih CGRP antitela ili njhovih fragmenata antitela koji se specifično vezuju za isti preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili je u kompeticiji za vezivanje za isti preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na intaktnom humanom CGRP polipeptidu ili njegovom fragmentu kao anti-humano CGRP antitelo izabrano od Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ili Ab14. U poželjnom primeru izvođenja, anti-humano CGRP antitelo ili njegov fragment specifično se vezuje za isti preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili je u kompeticiji za vezivanje za isti preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na intaktnom humanom CGRP polipeptidu ili njegovom fragmentu kao Ab3, Ab6, Abl3, ili Abl4.
[0257] Poželjan primer prema opisu je usmeren na himerna ili humanizovana antitela i njegove fragmente (uključujući Fab fragmente) koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP i inhibiraju biološke aktivnosti posredovane sa vezivanjem CGRP za CGRP receptor. U naročito poželjnom primeru prema opisu, himerna ili humanizovana anti-CGRP antitela su izabrana od Ab3, Ab6, Abl3, ili Abl4.
[0258] U sledećem primeru prema opisu je predviđen postupak za smanjenje, tretiranje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja povezanih sa CGRP uticajem na one biološke aktivnosti posredovane preko CGRP, čime se izbegavaju biološke aktivnosti posredovane preko vezivanja CGRP za CGRP-R. U jednom primeru, bolest ili poremećaj povezan sa CGRP je migrena ili drugi poremećaj naznačeno time da CGRP izaziva bol, glavobolju, bol, kancer, hiperaktivnu bešiku, ili gubitak težine. Dodatni neograničavajući spisak bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP je obezbeđen ovde.
[0259] Sledeći poželjan primer prema opisu predviđa upotrebu Fab polipeptidnih sekvenci za tretman migrena i glavobolja kjod pacijenata. Neograničavajući tipovi migrena i glavobolja koji se mogu tretirati korišćenjem Fab polipeptidnih sekvenci su obezbeđeni ovde na drugim mestima u otkriću.
[0260] U sledećem primeru prema opisu, anti-humano CGRP antitelo je antitelo koje se specifično vezuje za iste preklapajuće linearne ili konformacione epitope na intaktnom CGRP polipeptidu ili njegovom fragmentu koji je (su) specifično vezani sa Ab3, Ab6, Ab13, ili Ab14 kao što je procenjeno sa mapiranjem epitopa korišćenjem preklapajućih linearnih fragmenata peptida koji se protežu celom dužinom nativnog humanog CGRP polipeptida.
[0261] Opis je takođe usmeren na anti-CGRP antitelo koje se vezuje sa istim CGRP epitopom i/ili je u kompeticiji sa anti-CGRP antitelom za vezivanje za CGRP kao antitelo ili fragment antitela otkriven ovde, uključujući ali se ne ograničavajući na anti-CGRP antitelo izabrano od Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab1, Ab12, Ab13, ili Ab14.
[0262] U sledećem primeru, opis je takođe usmeren na izolovano anti-CGRP antitelo ili fragment antitela koji sadrži jedan ili više od CDRs sadržanih u VH polipeptidnim sekvencama izabranim od: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ili 133, ili njenu varijantu, i/ili jednog ili više od CDRs sadržanih u VL polipeptidnim sekvencama izabranim od: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ili 131, ili njene varijante.
[0263] U jednom primeru prema opisu, anti-humano CGRP antitelo razmatrano u dva prethodna pasusa sadrži najmanje 2 regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) u svakim varijabilnim lakim i varijabilnim teškim regionima koji su identični onima koji se sadrže u anti-humanom CGRP antitelu izabranom od Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ili Ab14.
[0264] U poželjnom primeru izvođenja, anti-humano CGRP antitelo razmatrano prethodno sadrži najmanje 2 regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) u svakim varijabilnim lakim i varijabilnim teškim regionima koji su identični onima sadržanim u Ab3 ili Ab6. U sledećem primeru, svi od CDRs anti-humanog CGRP antitela razmatranog prethodno su identični sa CDRs koji se sadrže u anti-humanom CGRP antitelu izabranom od Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, ili Ab14. U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, svi od CDRs anti-humanog CGRP antitela razmatranog prethodno su identični sa CDRs sadržanim u anti-humanom CGRP antitelu izabranom od Ab3 ili Ab6.
[0265] Pronalazak dalje predviđa da su anti-humana CGRP antitela aglikozilovana; da sadrže Fc region koji je modifikovan da bi se izmenila efektorna funkcija, polu-život, proteoliza, i/ili glikozilacija; humana su, humanizovana, jednolančana ili himerna; i humanizovano antitelo je izvedeno iz anti-humanog CGRP antitela zeca (roditeljsko).
[0266] Opis dodatno predviđa jedno ili više anti-humanih CGRP antitela naznačeno time da okvirni regioni (FRs) u varijabilnim regionima lakog lanca i varijabilnim regionima teškog lanca pomenutog antitela respektivno su humani FRs koji su nemodifikovani ili koji su modifikovani supstitucijom sa jednim ili više humanih FR ostataka u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca sa odgovarajućim FR ostacima roditeljskog zečjeg antitela, i naznačeno time da pomenuti humani FRs su izvedeni iz humanih sekvenci varijabilnog teškog i lakog lanca antitela koje su izabrane iz bibilioteke sekvence antitela humane klicine linije na osnovu njihovog visokog nivoa homologije sa odgovarajućim varijabilnim regionima teškog ili lakog lanca zeca u odnosu na druge sekvence antitela humane klicine linije sadržane u biblioteci.
[0267] U jednom primeru izvođenja pronalaska, anti-humano CGRP antitelo se specifično vezuje za CGRP eksprimirajuće humane ćelije i/ili za cirkulišuće rastvorljive CGRP molekule in vivo, uključujući CGRP eksprimiran na ili od strane humane ćelije kod pacijenta sa bolešću povezanom sa ćelijama koje eksprimiraju CGRP.
[0268] U sledećem primeru izvođenja, bolest je izabrana od migrena (sa ili bez aure), gubitka težine, kancera ili tumora, angiogeneze povezane sa kancerom ili rastom tumora, angiogeneze povezane sa preživljavanjem kancera ili tumora, hemiplegičnih migrena, klaster glavobolja, migrenozne neuralgije, hroničnih glavobolja, tenzionih glavobolja, opštih glavobolja, talasa vrućine, hronične paroksizmalne hemikranije, sekundarnih glavobolja usled strukturnih problema u glavi ili vratu kao uzroka, kranijalne neuralgije, sinusnih glavobolja (kao što je na primer povezano sa sinuzitisom), glavobolja ili migrena izazvanih alergijom, bola, inflamatornog bola, post-operativnog bola na mestu incizije, sindroma kompleksnog regionalnog bola, bola kod kancera, bola kod primarnog ili metastazirajućeg kancera kosti, bola kod frakture, hroničnog bola, bola kod osteoporozne frakture, bola usled opekotina, osteoporoze, bola kod gihta zglobova, abdominalnog bola, bola povezanog sa krizama kod srpaste anemije, i drugog nociceptivnog bola, kao i hepatocelularnog karcinoma, kancera dojke, ciroze jetre, neurogenog bola, neuropatskog bola, nociceptivnog bola, trigeminalne neuralgije, post herpetičke neuralgije, bola fantomskog uda, fibromijalgije, menstrualnog bola, avarialgije, refleksne simpatičke distrofije, neurogenog bola, osteoartritisa ili bola kod reumatoidnog artritisa, bola u donjem delu kičme, dijabetičke neuropatije, išijasa, ili bola ili visceralnog bola povezanog sa: gastro-ezofagijalnim refluksom, dispepsijom, sindromom iritabilnog creva, iritabilnog debelog creva, spastičnog debelog creva, mukoznog koliltisa, bolesti inflamatornog creva, Crohn bolesti, ileitisa, ulcerativnog kolitisa, renalnih kolika, dismenoreje, cistitisa, menstrualnog perioda, porođaja, menopauze, prostatitisa, pankreatitisa, renalnih kolika, dismenoreje, cistitisa, uključujući intersticijalni cistitis (IC), operacije povezane sa tankim crevom, divertikulitisom, peritonitisom, perikarditisom, hepatitisom, upalom slepog creva, kolitisom, holecistitisom, endometriozom, hroničnim i/ili akutnim pankreatitisom, infarktom miokarda, bolom u bubregu, pleuralnim bolom, prostatitisom, bolom u karlici, traumom organa, hroničnim nociciptivnim bolom, hroničnim neuropatskim bolom, hroničnim inflamatornim bolom, fibromijalgijom, prodirućim bolom i stalnim bolom.
[0269] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, bolest je bol kod kancera koji potiče od maligniteta ili od kancera poželjno izabranog od jednog ili više od: adenokarcinoma u žlezdanom tkivu, blastoma u embrionalnom tkivu organa, karcinoma u epitelnom tkivu, leukemije u tkivima koja formiraju krvne ćelije, limfoma u limfatičnom tkivu, mijeloma u kostnoj srži, sarkoma u vezivnom ili potpornom tkivu, adrenalnog kancera, AIDS-povezanog limfoma, anemije, kancera bešike, kancera kosti, kancera mozga, kancera dojke, karcinoidnih tumora, cervikalnog kancera, hemnoterapije, kancera debelog creva, citopenije, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, kancera želudca, kancera glave, kancera vrata, hepatobilijranog kancera, kancera bubrega, leukemije, kancera jetre, kancera pluća, limfoma, Hodgkin bolesti, limfoma, ne-Hodgkin, tumora nervnog sistema, oralnog kancera, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera prostate, kancera rektuma, kancera kože, kancera želudca, kancera testisa, kancera tiroidee, kancera uretre, kancera kosti, sarkom kancera vezivnog tkiva, kancera tkiva kosti, kancera ćelija koje formiraju krv, kancer kostne srži, multiplog mijeloma, leukemije, primarnog ili sekundarnog kancera kosti, tumora koji metastaziraju u kosti, tumora koji infiltriraju nerv i šuplje visceralne strukture, tumora blizu nervnih struktura. Dodatni poželjni bol kod kancera sadrži visceralni bol, poželjno visceralni bol koji nastaje od kancera pankreasa i/ili metastaza u abdomenu. Dodatni poželjni bol kod kancera sadrži somatski bol, poželjno somatski bol usled jednog ili više od kancera kosti, metastaze u kosti, postoperativnog bola, sarkom kancera vezivnog tkiva, kancera tkiva kosti, kancera ćelija kostne srži koje formiraju krv, multiplog mijeloma, leukemije, primarnog ili sekundarnog kancera kosti.
[0270] Pronalazak dodatno predviđa anti-humana CGRP antitela direktno ili indirektno vezana za detektabilni obeleživač ili terapeutski agens.
[0271] Pronalazak takođe predviđa jednu ili više sekvenci nukleinske kiseline koje rezultuju u ekspresiji antihumanog CGRP antitela prema pronalasku, uključujući one koje sadrže, ili se alternativno sastoje od, poželjnih kodona kvasca ili čoveka. Pronalazak takođe predviđa vektore (uključujući plazmide ili rekombinantne virusne vektore) koji sadrže pomenutu sekvencu (sekvence) nukleinske kiseline. Pronalazak takođe predviđa ćelije domaćine ili rekombinantne ćelije domaćine koje eksprimiraju najmanje jedno od antitela prema pronalasku, uključujući ćelije sisara, kvasca, bakterije, i insekta. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija domaćin je ćelija kvasca. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ćelijakvasca je diploidna ćelija kvasca. U poželjnijem primeru izvođenja, ćelija kvasca je kvasac Pichia.
[0272] Opis takođe predviđa postupak tretmana koje sadrži primenu na pacijenta sa bolešću ili stanjem povezanim sa CGRP eksprimirajućim ćelijama terpapeutski efikasne količine najmanje jednog anti-humanog CGRP antitela ili fragmenta opisanog ovde. Opis takođe predviđa da postupak tretmana može uključivati primenu dva ili više anti-CGRP antitela ili njegovih fragmenata i otkrivenih ovde. Ukoliko je više od jednog antitela primenjeno na pacijenta, više antitela može se primeniti istovremeno ili zajedno, ili njihova može primena može biti u razmacima. Bolesti koje se mogu tretirati su predstavljene u neograničavajućem spisku datom prethodno i ovde na drugim mestima. U poželjnom primeru izvođenja, bolest je izabrana od migrene, glavobolje, gubitka težine, bola, bola kod kancera ili neuropatskog bola. U sledećem primeru tretman dodatno uključuje primenu drugog terapeutskog sredstva ili režima izabranog od hemoterapije, radioterapije, primene citokina ili genske terapije.
[0273] U neograničavajućem primeru prema opisu, drugo terapeutsko sredstvo ili režim uključuje Taksol (paklitaksel) ili njegove derivate, jedinjenjja platine kao što je karboplatin ili cisplatin, antrocikline kao što je doksorubicin, alkilujuća sredstva kao što je ciklofosfamid, anti-metabolite kao što je 5-fluorouracil, ili etoposid.
[0274] Pronalazak dodatno predviđa postupak za in vivo vizuelizaciju koja detektuje prisustvo ćelija koje eksprimiraju CGRP koji sadrži primenu dijagnostički efikasne količine najmanje jednog anti-humanog CGRP antitela. U jednom primeru izvođenja, pomenuta primena dodatno uključuje primenu radionuklida ili fluorofora koji olakšavaju detekciju antitela na CGRP eksprimirajućim bolesnim mestima. U dodatnom primeru izvođenja, rezultati in vivo postupka vizuelizacije su korišćeni da bi se olakšao dizajn odgovarajućeg terapeutskog režima, uključujući terapeutske režime uključujući radioterapiju, hemoterapiju ili njihovu kombinaciju.
[0275] Anti-CGRP aktivnost anti-CGRP antitela prema predmetnom pronalasku, koja imaju specifičnost vezivanja za CGRP, mogu se takođe opisati preko njihove snage vezivanja ili njihvog afiniteta za CGRP. U jednom primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela predmetnog pronalaska, koja imaju specifičnost vezivanja za CGRP, vezuju se za CGRP sa konstantnom disocijacije (KD) manjom ili jednakom 5x10<-7>M, 10<-7>M, 5x10<-8>M, 10<-8>M, 5x10<-9>M, 10<-9>M, 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, 10<-12>M, 5x10<-13>M, ili 10<-13>M. Poželjno, anti-CGRP antitela vezuju CGRP sa konstantom disocijacije manjom od ili jednakom 10<-11>M, 5x10<-12>M, ili 10<-12>M. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela prema predmetnom pronalasku, koja imaju specifičnost vezivanja za CGRP, vezuju se za linearni ili konformacioni CGRP epitop.
[0276] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP aktivnost anti-CGRP antitela prema predmetnom pronalasku, koja imaju specifičnost vezivanja za CGRP, vezuju se za CGRP sa off-stopom manjom ili jednakom 10<-4>S<-1>, 5x10<-5>S<-1>, 10<-5>S<-1>, 5x10<-6>S<-1>, 10<-6>S<-1>, 5x10<-7>S<-1>, ili 10<-7>S<-1>.
[0277] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP aktivnost anti-CGRP antitela prema predmetnom pronalasku, koja imaju specifičnost vezivanja za CGRP, pokazuju anti-CGRP aktivnost prevencijom, ublažavanjem ili smanjivanjem simptoma, ili alternativno lečenjem, bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP. Neograničavajući primeri bolesti i poremećaja sa CGRP su dati ovde.
Polinukleotidi koji kodiraju polipeptide anti-CGRP antitela
Antitelo Ab1
[0278] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 1:
[0279] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 2:
[0280] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 3:
[0281] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 4:
[0282] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; i SEQ ID NO: 147 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 1 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 2.
[0283] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; i SEQ ID NO: 150 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 3 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 4.
[0284] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence kojeu uključuju jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 141 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 1; polinukleotid SEQ ID NO: 142 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 2; polinukleotid SEQ ID NO: 143 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 3; polinukleotid SEQ ID NO: 144 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 4; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; i SEQ ID NO: 147) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 1 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 2; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; i SEQ ID NO: 150) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 3 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 4.
[0285] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab1, polinukleotidi koji kodiraju Ab1 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 142 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 2 i polinukleotida SEQ ID NO: 144 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 4.
[0286] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ili u ćelijama gljiva, insekata, ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasca kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab1 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab1 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti ekspresijom Ab1 polinukleotida u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab2
[0287] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 11:
[0288] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 12:
[0289] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 13:
[0290] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 14:
[0291] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; i SEQ ID NO: 157 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 12.
[0292] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; i SEQ ID NO: 160 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 13 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 14.
[0293] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više od polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 151 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11; polinukleotid SEQ ID NO: 152 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 12; polinukleotid SEQ ID NO: 153 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 13; polinukleotid SEQ ID NO: 154 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 14; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; i SEQ ID NO: 157) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 12; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; i SEQ ID NO: 160) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 13 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 14.
[0294] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab2, polinukleotidi koji kodiraju Ab2 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotid SEQ ID NO: 152 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 12 i polinukleotid SEQ ID NO: 154 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 14.
[0295] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab2 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti- CGRP antitela kao što je Ab2 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab2 polinukleotida u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab3
[0296] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 21:
[0297] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 22:
[0298] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 23:
[0299] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 24:
[0300] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; i SEQ ID NO: 167 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 21 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 22.
[0301] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; i SEQ ID NO: 170 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 23 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 24.
[0302] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 161 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 21; polinukleotid SEQ ID NO: 162 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 22; polinukleotid SEQ ID NO: 163 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 23; polinukleotid SEQ ID NO: 164 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 24; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; i SEQ ID NO: 167) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 21 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 22; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; i SEQ ID NO: 170) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 23 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 24.
[0303] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab3, polinukleotidi koji kodiraju Ab3 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 162 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 22 i polinukleotida SEQ ID NO: 164 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 24.
[0304] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab3 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti- CGRP antitela kao što je Ab3 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab3 polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab4
[0305] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 31:
[0306] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 32:
[0307] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 33:
[0308] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 34:
[0309] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; i SEQ ID NO: 177 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 31 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 32.
[0310] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; i SEQ ID NO: 180 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 33 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 34.
[0311] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 171 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 31; polinukleotid SEQ ID NO: 172 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 32; polinukleotid SEQ ID NO: 173 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 33; polinukleotid SEQ ID NO: 174 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 34; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; i SEQ ID NO: 177) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 31 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 32; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; i SEQ ID NO: 180) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 33 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 34.
[0312] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab4, polinukleotidi koji kodiraju Ab4 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 172 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 32 i polinukleotida SEQ ID NO: 174 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 34.
[0313] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab4 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab4 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab4 polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab5
[0314] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 41:
[0315] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 42:
[0316] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 43:
[0317] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 44:
[0318] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; i SEQ ID NO: 187 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 41 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 42.
[0319] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; i SEQ ID NO: 190 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 43 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 44.
[0320] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 181 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 41; polinukleotid SEQ ID NO: 182 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 42; polinukleotid SEQ ID NO: 183 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 43; polinukleotid SEQ ID NO: 184 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 44; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; i SEQ ID NO: 187) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 41 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 42; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; i SEQ ID NO: 190) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 43 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 44.
[0321] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab5, polinukleotidi koji kodiraju Ab5 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 182 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 42 i polinukleotid SEQ ID NO: 184 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 44.
[0322] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab5 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab5 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab5 polinukleotida u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab6
[0323] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 51:
[0324] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 52:
[0325] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 53:
[0326] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 54:
[0327] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; i SEQ ID NO: 197 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 51 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 52.
[0328] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; i SEQ ID NO: 200 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 53 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 54.
[0329] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 191 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 51; polinukleotid SEQ ID NO: 192 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 52; polinukleotid SEQ ID NO: 193 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 53; polinukleotid SEQ ID NO: 194 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 54; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; i SEQ ID NO: 197) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 51 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 52; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; i SEQ ID NO: 200) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 53 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 54.
[0330] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab6, polinukleotidi koji kodiraju Ab6 antitelo prema pronalasku sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 192 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 52 i polinukleotida SEQ ID NO: 194 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 54.
[0331] Pronalazak predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab6 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, anti-CGRP antitela kao što je Ab6 mogu se proizvesti preko ekspresije Ab6 polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab7
[0332] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 61:
[0333] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 62:
[0334] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 63:
[0335] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 64:
[0336] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; i SEQ ID NO: 207 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 61 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 62.
[0337] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; i SEQ ID NO: 210 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 63 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 64.
[0338] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 201 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 61; polinukleotid SEQ ID NO: 202 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 62; polinukleotid SEQ ID NO: 203 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 63; polinukleotid SEQ ID NO: 204 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 64; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; i SEQ ID NO: 207) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 61 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 62; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; i SEQ ID NO: 210) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 63 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 64.
[0339] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab7, polinukleotidi koji kodiraju Ab7 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 202 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 62 i polinukleotid SEQ ID NO: 204 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 64.
[0340] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab7 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab7 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab7 polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab8
[0341] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 71:
[0342] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 72:
[0343] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 73:
[0344] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 74:
[0345] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; i SEQ ID NO: 217 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 71 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 72.
[0346] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; i SEQ ID NO: 220 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 73 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 74.
[0347] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 211 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 71; polinukleotid SEQ ID NO: 212 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 72; polinukleotid SEQ ID NO: 213 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 73; polinukleotid SEQ ID NO: 214 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 74; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; i SEQ ID NO: 217) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 71 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 72; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; i SEQ ID NO: 220) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 73 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 74.
[0348] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab8, polinukleotidi koji kodiraju Ab8 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 212 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 72 i polinukleotid SEQ ID NO: 214 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 74.
[0349] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab8 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab8 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab8 polinukleotida u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab9
[0350] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 81:
[0351] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 82:
[0352] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 83:
[0353] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 84:
[0354] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; i SEQ ID NO: 227 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 81 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 82.
[0355] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; i SEQ ID NO: 230 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 83 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 84.
[0356] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 221 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 81; polinukleotid SEQ ID NO: 222 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 82; polinukleotid SEQ ID NO: 223 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 83; polinukleotid SEQ ID NO: 224 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 84; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; i SEQ ID NO: 227) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 81 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 82; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; i SEQ ID NO: 230) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 83 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 84.
[0357] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab9, polinukleotidi koji kodiraju Ab9 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 222 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 82 i polinukleotid SEQ ID NO: 224 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 84.
[0358] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab9 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab9 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab9 polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab10
[0359] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 91:
[0360] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 92:
[0361] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 93:
[0362] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 94:
[0363] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; i SEQ ID NO: 237 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 91 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 92.
[0364] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; i SEQ ID NO:240 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 93 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 94.
[0365] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 231 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 91; polinukleotid SEQ ID NO: 232 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 92; polinukleotid SEQ ID NO: 233 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 93; polinukleotid SEQ ID NO: 234 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 94; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; i SEQ ID NO: 237) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 91 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 92; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; i SEQ ID NO: 240) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 93 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 94.
[0366] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab10, polinukleotidi koji kodiraju Ab10 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 232 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 92 i polinukleotid SEQ ID NO: 234 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 94.
[0367] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab10 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab10 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije AblO polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab11
[0368] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 101:
[0369] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 102:
[0370] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 103:
[0371] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 104:
[0372] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; i SEQ ID NO: 247 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 101 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 102.
[0373] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; i SEQ ID NO: 250 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 103 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 104.
[0374] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 241 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 101; polinukleotid SEQ ID NO: 242 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 102; polinukleotid SEQ ID NO: 243 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 103; polinukleotid SEQ ID NO: 244 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 104; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; i SEQ ID NO: 247) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 101 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 102; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; i SEQ ID NO: 250) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 103 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 104.
[0375] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab11, polinukleotidi koji kodiraju Ab11 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 242 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 102 i polinukleotid SEQ ID NO: 244 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 104.
[0376] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab11 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab11 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab11 polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab12
[0377] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 111:
[0378] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 112:
[0379] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 113:
[0380] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 114:
[0381] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; i SEQ ID NO: 257 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 111 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 112.
[0382] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; i SEQ ID NO: 260 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 113 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 114.
[0383] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 251 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 111; polinukleotid SEQ ID NO: 252 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 112; polinukleotid SEQ ID NO: 253 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 113; polinukleotid SEQ ID NO: 254 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 114; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; i SEQ ID NO: 257) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 111 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 112; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; i SEQ ID NO: 260) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 113 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 114.
[0384] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab12, polinukleotidi koji kodiraju Ab12 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 252 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 112 i polinukleotid SEQ ID NO: 254 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 114.
[0385] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab12 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab12 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab12 polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab13
[0386] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 121:
[0387] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 122:
[0388] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 123:
[0389] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 124:
[0390] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; i SEQ ID NO: 267 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 121 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 122.
[0391] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; i SEQ ID NO: 270 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 123 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 124.
[0392] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 261 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 121; polinukleotid SEQ ID NO: 262 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 122; polinukleotid SEQ ID NO: 263 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 123; polinukleotid SEQ ID NO: 264 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 124; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; i SEQ ID NO: 267) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 121 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 122; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; i SEQ ID NO: 270) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 123 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 124.
[0393] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab13, polinukleotidi koji kodiraju Ab13 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 262 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 122 i polinukleotid SEQ ID NO: 264 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 124.
[0394] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab13 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab13 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab13 polinukleotidi u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
Antitelo Ab14
[0395] Opis je dalje usmeren na polinukleotide koij kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca od SEQ ID NO: 131:
[0396] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 132:
[0397] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca od SEQ ID NO: 133:
[0398] U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 134:
[0399] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; i SEQ ID NO: 277 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 131 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 132.
[0400] U sledećem primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jedne ili više polinukleotidnih sekvenci od SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; i SEQ ID NO: 280 koji odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 133 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 134.
[0401] Opis takođe predviđa polinukleotidne sekvence uključujući jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente antitela opisanih ovde. U jednom primeru prema opisu, polinukleotidi koji kodiraju fragmente antitela koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP sadrže, ili se alternativno sastoje od, jednog, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju fragmente antitela: polinukleotid SEQ ID NO: 271 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 131; polinukleotid SEQ ID NO: 272 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 132; polinukleotid SEQ ID NO: 273 koji kodira sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 133; polinukleotid SEQ ID NO: 274 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 134; polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; i SEQ ID NO: 277) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 131 ili sekvence lakog lanca od SEQ ID NO: 132; i polinukleotidi koji kodiraju regione koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; i SEQ ID NO: 280) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 133 ili sekvence teškog lanca od SEQ ID NO: 134.
[0402] U poželjnom primeru izvođenja prema opisu, polinukleotidi prema opisu sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab (antigen vezujući fragment) fragmenata koji imaju specifičnost vezivanja za CGRP. U odnosu na antitelo Ab14, polinukleotidi koji kodiraju Ab14 antitelo pune dužine sadrže, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida SEQ ID NO: 272 koji kodira sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 132 i polinukleotid SEQ ID NO: 274 koji kodira sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 134.
[0403] Sledeći primer prema opisu predviđa ove polinukleotide inkorporisane u ekspresioni vektor za ekspresiju u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO, HEK-293, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što je kvasac Pichia. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom primeru prema opisu opisanom ovde (u daljem tekstu), Fab fragmenti se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab14 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U sledećem primeru prema opisu, anti-CGRP antitela kao što je Ab14 ili Fab njegovi fragmenti mogu se proizvesti preko ekspresije Ab14 polinukleotida u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, ćelije gljiva, insekata, ili mikrobni sistemi kao što su ćelije kvasca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasca. Pogodne vrste Pichia uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
[0404] U jednom primeru, opis je usmeren na izolovani polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji kodira aminokiselinsku sekvencu anti-CGRP VH antitela izabranu od SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, ili 133, ili kodira njenu varijantu naznačeno time da je najmanje jedan ostatak okvirnog regiona (FR ostatak) supstituisan sa aminokiselinom prisutnom na odgovarajućem položaju kod VH polipeptdida anti-CGRP antitela zeca ili konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom.
[0405] U sledećem primeru, opis je usmeren na izolovani polinukleotid koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu anti-CGRP VL antitela od 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, ili 131, ili kodira njenu varijantu naznačeno time da je najmanje jedan ostatak okvirnog regiona (FR ostatak) supstituisan sa aminokiselinom prisutnom na odgovarajućem položaju kod VL polipeptdida anti-CGRP antitela zeca ili konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom.
[0406] U sledećem primeru, opis je usmeren na jedan ili više heterolognih polinukleotida koji sadrže sekvencu koja kodira polipeptide sadržane u SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:31 i SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:41 i SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:51 i SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61 i SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:71 i SEQ ID NO:73; SEQ ID NO:81 i SEQ ID NO:83; SEQ ID NO:91 i SEQ ID NO:93; SEQ ID NO:101 i SEQ ID NO:103; SEQ ID NO:111 i SEQ ID NO:113; SEQ ID NO:121 i SEQ ID NO:123; ili SEQ ID NO:131 i SEQ ID NO:133.
[0407] U sledećem primeru, opis je usmeren na izolovani polinukleotid koji eksprimira polipeptid koji sadrži najmanje jedan CDR polipeptid izveden iz anti-CGRP antitela naznačeno time da sam pomenuti eksprimirani polipeptid specifično vezuje CGRP ili specifično vezuje CGRP kada je eksprimiran zajedno sa drugom polinukleotidnom sekvencom koja eksprimira polipeptid koji sadrži najmanje jedan CDR polipeptid izveden iz anti-CGRP antitela naznačeno time da pomenuti najmanje jedan CDR je izabran od onih VL ili VH polipeptida od SEQ ID NO: 1, 3, 11, 13, 21, 23, 31, 33, 41, 43, 51, 53, 61, 63, 71, 73, 81, 83, 91, 93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131, ili SEQ ID NO:133.
[0408] Ćelije domaćini i vektori koji sadrže pomenute polinukleotide su takođe predviđeni.
[0409] Opis dodatno predviđa vektore koji sadrže polinukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence polipeptida varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, kao i pojedinačne regione koji određuju komplementarnost (CDRs, ili hipervarijabilni regioni), kao što su dati ovde, kao i ćelije domaćini koji sadrže pomenute sekvence vektora. U jednom primeru prema opisu, ćelija domaćin je ćelija kvasca. U sledećem primeru prema opisu, ćelija domaćina kvasca pripada rodu Pichia.
Skrining i izolacija B-ćelija
[0410] U jednom primeru, predmetni opis predviđa pripremu i izolaciju klonske populacije antigen-specifične B ćelije koja se može koristiti za izolaciju najmanje jedne CGRP antigenspecifične ćelije, koja se može koristiti za proizvodnju monoklonskog antitela protiv CGRP, koje je specifično za željeni CGRP antigen, ili sekvenca nukleinske kiseline koja odgovara takvom antitelu. Postupci za pripremu i izolovanje pomenute klonske populacije antigenspecifičnih B ćelija su dati, na primer, u U.S. patent publication no. US 2007/0269868 od strane Carvalho-Jensen et al. Postupci za pripremu i izolovanje pomenute klonske populacije antigen-specifičnih B ćelija su takođe dati ovde u primerima. Postupci "obogaćivanja" ćelijske populacije po veličini ili gustini su poznati u tehnici. Videti, npr., U.S. Patent 5,627,052. Ovi koraci se mogu koristiti dodatno obogaćivanju populacija ćelija na osnovu antigen-specifičnosti.
Postupci za humanizaciju antitela
[0411] U sledećem primeru, predmetni opis predviđa postupke za humanizaciju teških i lakih lanaca antitela. Postupci za humanizaciju teških i lakih lanaca antitela koji se mogu primeniti na anti-CGRP antitela su dati, na primer, u U.S. patent application publication no. US 2009/0022659 od strane Olson et al., i u U.S. patent no.7,935,340 od strane Garcia-Martinez et al.
Postupci za proizvodnju antitela i njihovih fragmenata
[0412] U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak predviđa postupke za proizvodnju anti-CGRP antitela prema pronalasku. Postupci za proizvodnju anti-CGRP antitela i njihovih fragmenata izlučenih iz poliploidnih, poželjno diploidnih ili tetraploidnih sojeva kvasaca kompetentnih u odnosu na parenje su dati, na primer, u U.S. patent application publication no. US 2009/0022659 od strane Olson et al., i u U.S. patent no. 7,935,340 od strane Garcia-Martinez et al.
[0413] Drugi postupci za proizvodnju antitela su dobro poznati stručnjacima. Na primer, postupci proizvodnje himernih antitela su sada dobro poznati u tehnici (Videti, na primer, U.S. Patent No. 4,816,567 od Cabilly et al.; Morrison et al., P.N.A.S. USA, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-46 (1984)).
[0414] Slično tome, drugi postupci za proizvodnju humanizovanih antitela su sada dobro poznati u tehnici (Videti, na primer, U.S. Patent Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,762, i 6,180,370 od Queen et al; U.S. Patent Nos.5,225,539 i 6,548,640 od Winter; U.S. Patent Nos.
6,054,297, 6,407,213 i 6,639,055 od Carter et al; U.S. Patent No. 6,632,927 od Adair; Jones, P.T. et al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al, Science, 239:1534-36 (1988).
[0415] Polipeptidi antitela prema pronalasaku koji imaju CGRP vezujuću specifičnost mogu se takođe proizvesti konstrukcijom, korišćenjem konvencionalnih tehnika dobro poznatih stručnjacima, ekspresionog vektora koji sadrži operon i DNK sekvencu koja kodira težak lanac antitela u kojem je DNK sekvenca koja kodira CDRs neophodna za specifičnost antitela izvedena iz ne-humanog ćelijskog izvora, poželjno B-ćelijskog izvora zeca, dok je DNK sekvenca koja kodira preostale delove lanca antitela izvedena iz humanog ćelijskog izvora.
[0416] Drugi ekspresioni vektor je proizveden korišćenjem istih konvencionalnih načina dobro poznatih stručnjacima, pri čemu pomenuti ekspresioni vektor koji sadrži operon i DNK sekvencu koja kodira laki lanac antitela u kojem je DNK sekvenca koja kodira CDRs neophodna za specifičnost antitela izvedena iz ne-humanog ćelijskog izvora, poželjno B-ćelijskog izvora zeca, dok je DNK sekvenca koja kodira preostale delove lanca antitela izvedena iz humanog ćelijskog izvora.
[0417] Ekspresioni vektori su transfektovani u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama dobro poznatim stručnjaku da bi se proizvela transfektovana ćelija domaćin, pomenuta transfektovana ćelija domaćin kultivisana konvencionalnim postupcima dobro poznatim stručnjacima da bi se proizveli pomenuti polipeptidi antitela.
[0418] Ćelija domaćin može biti transfektovana sa dva prethodno opisana ekspresiona vektora, prvim ekspresionim vektorom koji sadrži DNK koja kodira operon i poplipeptid izveden iz lakog lanca i drugim vektorom koji sadrži DNK koja kodira operon i polipeptid izveden iz treškog lanca. Dva vektora sadrže različite selektabilne markere, ali poželjno postižu u značajnom stepenu jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno, može se koristiti jedan vektor, vektor koji uključuje DNK koja kodira polipeptide i teškog i lakog lanca. Kodirajuća sekvenca za teđak i laki lanac može sadržati cDNK, genomsku DNK, ili obe.
[0419] Ćelije domaćini korišćene za ekspresiju polipeptida antitela mogu biti ili bakterijska ćelija kao što je E. coli, ili eukariotska ćelija kao što je P. pastoris. U jednom primeru izvođenja pronalaska, može se koristiti sisarska ćelija dobro definisanog tipa za ovu svrhu, kao što je ćelija mijeloma, ćelijska linija ovarijuma kineskog hrčka (CHO), NSO ćelijska linija, ili HEK293 ćelijska linija.
[0420] Opšti postupci preko kojih se mogu konstruisati vektori, postupci transfektovanja neophodni za proizvodnju ćelije domaćina i postupci kultivisanja neophodni da se proizvedu polipeptidi antitela iz pomenute ćelije domaćina svi uključuju konvencionalne tehnike. Iako je poželjno da ćelijska linija korišćena za proizvodnju antitela je sisarska ćelijska linija, bilo koja druga pogodna ćelijska linija, kao što je bakterijska ćelijska linija kao što je E. coli-izvedeni bakterijski soj, ili ćelijska linija kvasca, može se alternativno koristiti.
[0421] Slično, proizvedeni polipeptidi antitela mogu se prečistiti prema standardnim procedurama u tehnici, kao što je na primer filtracija ukrštenog toka, precipitacija amonijum sulfatom, afinitetna hromatografija na koloni i slično.
[0422] Polipeptidi antitela opisani ovde mogu se takođe koristiti za dizajn i sintezu ili peptidnih ili ne-peptidnih mimetika koji će biti korisni za iste terapeutske primene kao polipeptidi antitela prema pronalasku. Videti, na primer, Saragobi et al, Science, 253:792-795 (1991).
Skrining testovi
[0423] Opis takođe uključuje skrining testove dizajnirane da se pomogne u identifikaciji bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP kod pacijenata koji pokazuju simptome CGRP povezane bolesti ili poremećaja.
[0424] U jednom primeru prema opisu, anti-CGRP antitela prema opisu, ili njegovi CGRP vezujući fragmenti, korišćeni su za detekciju prisustva CGRP u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta koji pokazuje simptome bolesti ili poremećaja povezanog sa CGRP. Prisustvo CGRP, ili njegovih povišenih nivoa u poređenju sa nivoima CGRP pre bolesti u biološkom uzorku koji se može porediti, mogu biti korisni u dijagnostici bolesti ili poremećaja povezanog sa CGRP.
[0425] Drugi primer prema opisu obezbeđuje dijagnostički ili skrining test za pomoć u dijagnozi bolesti ili poremećaja povezanih sa CGRP kod pacijenata koji pokazuju simptome CGRP povezane bolesti ili poremećaja identifikovanih ovde, koje sadrže testiranje nivoa CGRP ekspresije u biološkom uzorku iz pomenutog pacijenta korišćenjem post-translaciono modifikovanog anti-CGRP antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta. Anti-CGRP antitelo ili njegov vezujući fragment može biti post-translaciono modifikovan da uključuje detektabilnu grupu kao što je prethodno dato u otkriću.
[0426] Nivo CGRP u biološkom uzorku je određen korišćenjem modifikovanog anti-CGRP antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta kao što je ovde dato, i poređenjem nivoa CGRP u biološkom uzorku sa standardnim nivoom CGRP (npr., nivo u normalnim biološkim uzorcima). Stručnjak sa kliničkim iskustvom će shvatiti da može postojati neka varijabilnost među normalnim biološkim uzorcima, i uzeće to u obzir pri proceni rezultata. U jednom primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela prema pronalsku mogu se koristiti za korelisanje CGRP ekspresionih nivoa sa određenim stadijumom razvoja kancera. Stručnjak će moći da meri CGRP kod brojnih subjekata da bi ustanovio opseg CGRP ekspresije koji odgovara klinički definisanim satdijumima razvoja kancera. Ovi opseci će omogućiti stručnjaku da meri CGRP kod subjekta dijagnostifikovanog sa kancerom i koreliše nivoe kod svakog subjekta sa opsegom koji odgovara stadijumu pomenutog kancera. Stručnjak će shvatiti da se putem merenja CGRP kod pacijenta u različitim intervalima, može odrediti napredovanje kancera.
[0427] Prethodno navedeni test može takođe biti koristan za praćenje bolesti ili poremećaja, gde nivo CGRP dobijen u biološkom uzorku od pacijenta za koga se smatra da ima CGRP povezanu bolest ili poremećaj je poređen sa nivoom CGRP u prethodnim biološkim uzorcima od istog pacijenta, da bi se procenilo da li je CGRP nivo u pomenutom pacijentu promenjen sa, na primer, režimom tretmana.
[0428] Pronalazak je takođe usmeren na postupak in vivo vizuelizacije koja detektuje prisustvo ćelija koje eksprimiraju CGRP koji sadrži primenu dijagnostički efikasne količine dijagnostičke kompozicije. Pomenuta in vivo vizuelizacija je korisna za detekciju ili vizuelizaciju CGRP eksprimirajućih tumora ili metastaza, na primer, i može biti korisna kao deo planiranog režima za dizajn efikasnog protokola tretmana kancera. Protokol tretmana može uključiti, na primer, jedno ili više od zračenja, hemoterapije, terapije citokinima, genske terapije, i terapije antitelom, kao i anti-CGRP antitelom ili njegovim fragmentom.
[0429] Predmetni opis dalje obezbeđuje komplet za detekciju vezivanja anti-CGRP antitela prema pronalasku za CGRP. Naročito, komplet se može koristiti za detekciju prisustva CGRP specifično reaktivnog sa anti-CGRP antitelom prema pronalasku ili njegovim imunoreaktivnim fragmentom. Komplet može takođe uključivati antitelo vezano za supstrat, sekundarno antitelo reaktivno sa antigenom i reagens za detekciju reakcije sekundarnog antitela sa antigenom. Takav komplet može biti ELISA komplet i može sadržati supstrat, primarna i sekundarna antitela kada je odgovarajuće, i bilo koje druge neophodne reagense kao što su detektabilne grupe, supstrati enzima, i reagensi boje, na primer kao što je opisano ovde. Dijagnostički komplet može takođe biti u obliku imunoblot kompleta. Dijagnostički komplet može biti takođe u obliku hemiluminescentnog kompleta (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Dijagnostički komplet može takođe biti komplet za detekciju zasnovan na lantanoidima (PerkinElmer, San Jose, CA).
[0430] Stručnjak sa kliničkim iskustvom će shvatiti da biološki uzorak uključuje, ali nije ograničen na, serum, plazmu, urin, pljuvačku, mukus, pleuralnu tečnost, sinovijalnu tečnost i spinalnu tečnost.
Postupci za ublažavanje ili smanjivanje simptoma, ili tretiranje, ili prevenciju, bolesti i poremećaja povezanih sa, CGRP
[0431] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela opisana ovde, su korisna za ublažavanje ili smanjivanje simptoma, ili tretiranje, ili prevenciju, bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP. Anti-CGRP antitela opisana ovde, ili njihovi fragmenti, kao i kombinacije, takođe se mogu primeniti u terapeutski efikasnoj količini na pacijente kojima je potreban tretman bolesti i poremećaja povezanih sa CGRP u obliku farmaceutske kompozicije kao što je detaljnije napisano u nastavku.
[0432] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela opisana ovde, su korisna za ublažavanje ili smanjenje simptoma, ili tretiranje, ili prevenciju, migrena (sa ili bez aure), gubitka težine, kancera ili tumora, angiogeneze povezane sa kancerom ili rastom tumora, angiogeneze povezane sa preživljavanjem kancera ili tumora, bola, hemiplegičnih migrena, klaster glavobolja, migrenozne neuralgije, hroničnih glavobolja, tenzionih glavobolja, opštih glavobolja, talasa vrućine, hronične paroksizmalne hemikranije, sekundarnih glavobolja usled strukturnih problema u glavi ili vratu kao uzroka, kranijalne neuralgije, sinusnih glavobolja (kao što je na primer povezano sa sinuzitisom) i glavobolja ili migrena izazvanih alergijom.
[0433] U jednom primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela opisana ovde, ili njegovi fragmenti i/ili sa drugim sredstvom, korisni su za ublažavanje ili smanjenje simptoma, ili tretiranje, ili prevenciju, sledećeg neograničavajućeg spiska bolesti i poremećaja: bola, inflamatornog bola, post-operativnog bola na mestu incizije, sindroma kompleksnog regionalnog bola, bola kod kancera, bola kod primarnog ili metastazirajućeg kancera kosti, bola kod frakture, hroničnog bola, bola kod osteoporozne frakture, bola usled opekotina, osteoporoze, bola kod gihta zglobova, abdominalnog bola, bola povezanog sa krizama kod srpaste anemije, i drugog nociceptivnog bola, kao i hepatocelularnog karcinoma, kancera dojke, ciroze jetre, neurogenog bola, neuropatskog bola, nociceptivnog bola, trigeminalne neuralgije, post herpetičke neuralgije, bola fantomskog uda, fibromijalgije, menstrualnog bola, avarialgije, refleksne simpatičke distrofije, neurogenog bola, osteoartritisa ili bola kod reumatoidnog artritisa, bola u donjem delu kičme, dijabetičke neuropatije, išijasa, ili bola ili visceralnog bola povezanog sa: gastro-ezofagijalnim refluksom, dispepsijom, sindromom iritabilnog creva, iritabilnog debelog creva, spastičnog debelog creva, mukoznog koliltisa, bolesti inflamatornog creva, Crohn bolesti, ileitisa, ulcerativnog kolitisa, renalnih kolika, dismenoreje, cistitisa, menstrualnog perioda, porođaja, menopauze, prostatitisa, pankreatitisa, renalnih kolika, dismenoreje, cistitisa, uključujući intersticijalni cistitis (IC), operacije povezane sa tankim crevom, divertikulitisom, peritonitisom, perikarditisom, hepatitisom, upalom slepog creva, kolitisom, holecistitisom, endometriozom, hroničnim i/ili akutnim pankreatitisom, infarktom miokarda, bolom u bubregu, pleuralnim bolom, prostatitisom, bolom u karlici, traumom organa, hroničnim nociciptivnim bolom, hroničnim neuropatskim bolom, hroničnim inflamatornim bolom, fibromijalgijom, prodirućim bolom i stalnim bolom i bol kod kancera koji potiče od maligniteta ili od kancera poželjno izabranog od jednog ili više od: adenokarcinoma u žlezdanom tkivu, blastoma u embrionalnom tkivu organa, karcinoma u epitelnom tkivu, leukemije u tkivima koja formiraju krvne ćelije, limfoma u limfatičnom tkivu, mijeloma u kostnoj srži, sarkoma u vezivnom ili potpornom tkivu, adrenalnog kancera, AIDS-povezanog limfoma, anemije, kancera bešike, kancera kosti, kancera mozga, kancera dojke, karcinoidnih tumorra, cervikalnog kancera, hemnoterapije, kancera debelog creva, citopenije, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, kancera želudca, kancera glave, kancera vrata, hepatobilijranog kancera, kancera bubrega, leukemije, kancera jetre, kancera pluća, limfoma, Hodgkin bolesti, limfoma, ne-Hodgkin, tumora nervnog sistema, oralnog kancera, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera prostate, kancera rektuma, kancera kože, kancera želudca, kancera testisa, kancera tiroidee, kancera uretre, kancera kosti, sarkom kancera vezivnog tkiva, kancera tkiva kosti, kancera ćelija koje formiraju krv, kancer kostne srži, multiplog mijeloma, leukemije, primarnog ili sekundarnog kancera kosti, tumora koji metastaziraju u kosti, tumora koji infiltriraju nerv i šuplje visceralne strukture, tumora blizu nervnih struktura. Dodatni poželjni bol kod kancera sadrži visceralni bol, poželjno visceralni bol koji nastaje od kancera pankreasa i/ili metastaza u abdomenu. Dodatni poželjni bol kod kancera sadrži somatski bol, poželjno somatski bol usled jednog ili više od kancera kosti, metastaze u kosti, postoperativnog bola, sarkoma kancera vezivnog tkiva, kancera tkiva kosti, kancera ćelija kostne srži koje formiraju krv, multiplog mijeloma, leukemije, primarnog ili sekundarnog kancera kosti.
[0434] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela opisana ovde, i/ili sa drugim sredstvom, korisni su za ublažavanje ili smanjenje simptoma, ili tretiranje, ili prevenciju, sledećeg neograničavajućeg spiska bolesti i poremećaja: kancer ili tumori, angiogeneza povezana sa rastom kancera ili tumora, angiogeneza povezana sa preživljavanjem kancera ili tumora.
[0435] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela opisana ovde, ili njegovi fragmenti i/ili sa drugim sredstvom, su korisni za ublažavanje ili smanjivanje simptoma, ili tretiranje, ili prevenciju, sledećeg neograničavajućeg spiska bolesti i poremećaja: neurogenog, neuropatskog ili nociceptivnog bola. Neuropatski bol može uključivati, ali nije ograničen na, trigeminalnu neuralgiju, post-herpetičku neuralgiju, bol fantomskog uda, fibromijalgiju, menstrualni bol, ovarialgiju, refleksnu simpatičku distrofiju i neurogeni bol. U drugim poželjnim primerima izvođenja, osteoartritisni ili reumatoidni artritis bol, bol u donjem delu kičme, dijabetička neuropatija, išijas, i drugi neuropatski bol.
[0436] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela opisana ovde, i/ili sa drugim sredstvom, korisni su za ublažavanje ili smanjenje simptoma, ili tretiranje, ili prevenciju, sledećeg neograničavajućeg spiska bolesti i poremećaja: hiperaktivna bešika i druga urinarna stanja, gastro-ezofagijalni refluks i visceralni bol povezan sa gastroezofagijalnim refluksom, dispepsija, sindrom iritabilnog creva, inflamatorna bolest creva, Crohn bolest, ileitis, ulcerativni kolitis, renalne kolike, dismenoreja, cistitis, menstruacija, porođaj, menopauza, prostatitis, pruritis, ili pankreatitis. Takođe, predmetna CGRP antitela i fragmenti antitela mogu se koristiti zasebno ili zajedno sa drugim aktivnim sredstvima, npr., opioidnim i ne-opioidnim analgeticima kao što su NSAIDs da bi se izazvala analgezija ili da bi se potencirala efikasnost drugog analgetika ili da se spreči ili poboljša tolerancija na specifični anlgetik kao što je morfin ili srodni opioidni anlagetik. Dokazi za ulogu CGRP u blokiranju/reverziji razvoja morfin-indukovane analgezije: je činjenica da agonist CGRP8-37 i CGRP receptora (BIBN4096BS) navodno sprečava/vrši reverziju razvoja tolerancije na morfin -(Powell et al., 2000 J Brit J Pharmacol (131):875; Menard et al., 1996 J Neurosci (16):2342; Wang et al., 2009 FASEB J (23):2576; Wang et al., 2010 Pain (151):194)
[0437] Predmetna antitela potencijalno mogu biti kombinovana sa bilo kojim opioidnim analgetikom ili NSAID ili drugim analgetikom, potencijalno drugim antitelom, da bi se povećalo ili poboljšalo upravljanje bolom, ili da bi se izvršila reverzija ili suprimirala tolerancija na analgetik kao što je opioidno analgetičko jedinjenje. Ovo može omogućiti da se takva analgetička jedinjenja primenjuju duže ili sa smanjenim dozama čime se potencijalno ublažavaju štetni sporedni efekti povezani sa njima.
[0438] Termin "opioidni analgetik" ovde se odnose na sve lekove, prirodne ili sintetičke, sa dejstvom sličnim morfinom. Sintetički i polu-sintetički opioidni analgetici su derivati pet hemijskih klasa jedinjenja: fenantrene; fenilheptilamine; fenilpiperidine; morfinane; i benzomorfane, pri čemu su svi obuhvaćeni obimom termina . Primeri opioidnih analgetika uključuju kodein, dihidrokodein, diacetilmorfin, hidrokodon, hidromorfon, levorfanol, oksimorfon, alfentanil, buprenorfin, butorfanol, fentanil, sufentanil, meperidin, metadon, nalbufin, propoksifen i pentazocin ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
[0439] Termin "NSAID" odnos i se na ne-steroidno anti-inflammatorno jedinjenje. NSAIDs su kategorizovani na osnovu njihove sposobnosti da inhibiraju cikloksigenazu. Ciklooksigenaza 1 i ciklooksigenaza 2 su dve glavne izoforme ciklooksigenaze i većina standardnih NSAIDs su mešani inhibitori dve izoforme. Većina standardnih NSAIDs spada unutar jedne od sledećih pet strukturnih kategorija: (1) derivati propionske kiseline, kao što je ibuprofen, naproksen, naprosin, diklofenak, i ketoprofen; (2) derivati sirćetne kiseline, kao što je tolmetin i slindak; (3) derivati fenaminske kiseline, kao što je mefenaminska kiselina i meklofenaminska kiselina; (4) derivati bifenolkarboksilne kiseline, kao što je diflunisal i flufenisal; i (5) oksikami, kao što je piroksim, sudoksikam, i izoksikam. Sledeća klasa NSAID je opisana koja selektivno inhibira ciklooksigenazu 2. Cox-2 inhibitori su opisani u, npr., u U.S. Pat. Nos. 5,616,601; 5,604,260; 5,593,994; 5,550,142; 5,536,752; 5,521,213; 5,475,995; 5,639,780; 5,604,253; 5,552,422; 5,510,368; 5,436,265; 5,409,944; i 5,130,311. Određeni primeri COX-2 inhibitora uključuju celekoksib (SC-58635), DUP-697, flosulid (CGP-28238), meloksikam, 6-metoksi-2 naftilsirćetnu kiselinu (6-MNA), rofekoksib, MK-966, nabumeton (prolek za 6-MNA), nimesulid, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; ili njihove kombinacije.
[0440] U nekim primerima izvođenja, aspirin i/ili acetaminofen mogu se uzeti zajedno sa predmetnim CGRP antitelom. Aspirin je drugi tip ne-steroidnog anti-inflamatornog jedinjenja.
[0441] Na primer, neograničavajuće bolesti i poremećaji koji se mogu tretirati i/ili sprečiti sa primenom CGRP antitela prema predmetnom pronalasku uključuju, bol koji je rezultat bilo kog stanja povezanog sa neurogenim, neuropatskim, inflamatornim, termalnim ili nociceptivnim bolom. Poželjno poremećaj će biti povezan sa povećanim CGRP na mestu bola. U određenim primerima izvođenja neuropatski bol, označen kao trigeminalna neuralgija, post-herpetička neuralgija, bol fantomskog uda, fibromijalgija, refleksna simpatička distrofija i stanja neurogenog bola su poželjno tretirani. U drugim primerima izvođenja, bol kod kancera, naročito, bol kod kancera kostiju, osteoartritisni ili reumatoidni artritisni bol, bol u donjem delu leđa, post-operativni incizioni bol, bol usled frakture, bol kod osteoporotične frakture, osteoporoza, bol u zglobovima kod gihta, dijabetička neuropatija, išijas, bolovi povezani sa krizma kod srpaste anemije, migrena, i drugi neuropatični i/ili nociceptivni bol su poželjno tretirani. Stoga, predmetni pronalazak uključuje postupke za tretiranje, prevenciju, i/ili ublažavanje bilo koje bolesti ili poremećaja povezanog sa CGRP aktivnošću ili CGRP ushodnom regulacijom (uključujući bilo koji od prethodno pomenutih primera bolesti, poremećaja i stanja) preko upotrebe antitela prema pronalasku. Teraputski postupci prema predmetnom opisu sadrže primenu na subjekta bilo koj eformulacije koje sadrži anti-CGRP antitelo kao što je otkriveno ovde ili zajedno sa drugim aktivnim sredstvom.
[0442] Subjekat na koji je primenjena farmaceutska formulacija može biti, npr., bilo koja humana ili ne-humana životinja kome je potreban takva tretman, prevencija i/ili ublažavanje, ili koji bi na drugi način imao koristi od inhibicije ili atenuacije CGRP-posredovane aktivnosti. Na primer, subjekat može biti individua koja je dijagnostifikovana sa, ili koja je u riziku da bude pogođena bilo kojim prethodno pomenutim bolestima ili poremećajima. Predmetni opis dodatno uključuje upotrebu bilo koje od farmaceutskih formulacija otkrivenih ovde u proizvodnji medikamenta za tretman, prevenciju i/ili ublažavanje bilo koje bolesti ili poremećaja povezanog sa CGRP aktivnošću (uključujući bilo koju od prethodno navedenih primera bolesti, poremećaja i stanja).
Primena
[0443] U jednom primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela prema pronalasku, kao i kombinacije pomenutih antitela, primenjuju se na subjekta sa koncentracijom od između oko 0.1 i 100.0 mg/kg telesne težine subjekta primaoca. U poželjnom primeru pronalska, anti-CGRP antitela prema pronalasku, kao i kombinacije pomenutih antitela, treba primeniti na subjekta sa koncentracijom od oko 0.4 mg/kg telesne težine subjekta primaoca. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela prema pronalasku, kao i kombinacije pomenutih antitela, treba primeniti na subjekta primaoca sa učestalošću od jednom svakih dvadeset šest nedelja ili manje, kao što je jednom svakih šesnaest nedelja ili manje, jednom svakih osam nedelja ili manje, jednom svake četiri nedelje ili manje, jednom svake dve nedelje ili manje, jednom svake nedelje ili manje, ili jednom dnevno ili manje.
[0444] Fab fragmenti se mogu primeniti svake dve nedelje ili manje, svake nedelje ili manje, jednom dnevno ili manje, više puta na dan, i/ili svakih nekoliko sati. U jednom primeru prema opisu, pacijent prima Fab fragmente od 0.1 mg/kg do 40 mg/kg na dan dato u podeljenim dozama od 1 do 6 puta na dan, ili u obliku za produženo dejstvo, efikasno da se dobiju željeni rezultati.
[0445] Podrazumeva se da koncentracija antitela ili Fab primenjenog na datog pacijenta može biti veća ili manja od primera primenjenih koncentracija datih prethodno.
[0446] Sručnjak će biti u stanju da odredi efikasnu dozu i učestalost primene rutinskim eksperimentisanjem, na primer vođen ovim otkrićem i uputstvima u Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman’s pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C., & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott’s illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; i Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [itd.]: Lippincott Williams & Wilkins.
[0447] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela prema pronalasku, kao i kombinacija pomenutih antitela, primenjuju se na subjekta u farmaceutskoj formulaciji.
[0448] "Farmaceutska kompozicija" se odnosi na hemijsku ili biološku kompoziciju pogodnu za primenu na sisara. Takve kompozicije se mogu specifično formulisati za primenu preko jednog ili više puteva, uključujući ali se ne ograničavajući na bukalno, epikutano, epiduralno, inhalacijom, intraarterijalno, intrakardijalno, intracerebroventrikularno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno, intraokularno, intraperitonealno, intraspinalno, intratekalno, intravensko, oralno, parenteralno, rektalno preko klistira ili supozitorije, subkutano, subdermalno, sublingvalno, transdermalno, i transmukozalno. Dodatno, primena se može ostvariti putem injekcije, praha, tečnosti, gela, kapi, ili drugih načina primene.
[0449] U jednom primeru izvođenja pronalaska, anti-CGRP antitela prema pronalasku, kao i kombinacije pomenutih antitela, mogu se izborno primeniti u kombinaciji sa jednim ili više aktivnih sredstava. Takva aktivna sredstva uključuju analgetike, anti-histaminike, antipiretike, anti-inflamatorna, antibiotike, antivirusna, i anti-citokinska sredstva. Aktivna sredstva uključuju agoniste, antagoniste, i modulatore TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-α, IFN-γ, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, faktora rasta hepatocita (HGF), Hepcidin, uključujući antitela reaktivna protiv bilo čega od prethodnog, i antitela reaktivna protiv bilo kog od njihovih receptora. Aktivna sredstva takođe uključuju ali nisu ograničena na 2-arilpropionske kiseline, Aceklofenak, Acemetacin, acetilsalicilnu kiselinu (Aspirin), Alklofenak, Alminoprofen, Amoksiprin, Ampiron, Arilalkanske kiseline, Azapropazon, Benorilat/Benorilat, Benoksaprofen, Bromfenak, Karprofen, Celekoksib, Holin magnezijum salicilat, Klofezon, COX-2 inhibitore, Deksibuprofen, Deksketoprofen, Diklofenak, Diflunisal, Droksikam, Etenzamid, Etodolak, Etorikoksib, Faislamin, fenaminske kiseline, Fenbufen, Fenoprofen, Flufenaminsku kiselinu, Flunoksaprofen, Flurbiprofen, Ibuprofen, Ibuproksam, Indometacin, Indoprofen, Kebuzon, Ketoprofen, Ketorolak, Lomoksikam, Loksoprofen, Lumirakoksib, Magnezijum salicilat, Meklofenaminsku kiselinu, Mefenaminsku kiselinu, Meloksikam, Meta mizol, Metil salicilat, Mofebutazon, Nabumeton, Naproksen, N-Arilantranilne kiseline, Faktor rasta nerva (NGF), Oksametacin, Oksaprozin, Oksikame, Oksifenbutazon, Parekoksib, Fenazon, Fenilbutazon, Fenilbutazon, Piroksikam, Pirprofen, profene, Proglumetacin, Pirazolidin derivate, Rofekoksib, Salicil salicilat, Salicilamid, Salicilat, Supstanca P, Sulfinpirazon, Sulindak, Suprofen, Tenoksikam, Tiaprofenska kiselina, Tolfenaminska kiselina, Tolmetin, i Valdekoksib.
[0450] Anti-histaminik može biti bilo koje jedinjenje koje ima suprotno delovanje od histamina ili njegovo oslobađanje iz ćelija (npr., mast ćelija). Anti-histaminici uključuju ali nisu ograničeni na akrivastin, astemizol, azatadin, azelastin, betatastin, bromfeniramin, buklizin, cetirizin, analoge cetirizina, hlorfeniramin, klemastin, CS 560, ciproheptadin, desloratadin, dekshlorfeniramin, ebastin, epinastin, feksofenadin, HSR 609, hidroksizin, levokabastin, loratidin, metskopolamin, mizolastin, norastemizol, fenindamin, prometazin, pirilamin, terfenadin, i tranilast.
[0451] Antibiotici uključuju ali nisu ograničeni na Amikacin, Aminoglikozide, Amoksicilin, Ampicilin, Ansamicine, Arsfenamin, Azitromicin, Azlocilin, Aztreonam, Bacitracin, Karbacefem, Karbapeneme, Karbenicilin, Cefaklor, Cefadroksil, Cefaleksin, Cefalotin, Cefalotin, Cefamandol, Cefazolin, Cefdinir, Cefditoren, Cefepim, Cefiksim, Cefoperazon, Cefotaksim, Cefoksitin, Cefpodoksim, Cefprozil, Ceftazidim, Ceftibuten, Ceftizoksim, Ceftobiprol, Ceftriakson, Cefuroksim, Cefalosporine, Hloramfenikol, Cilastatin, Ciprofloksacin, Klaritromicin, Klindamicin, Kloksacilin, Kolistin, Ko-trimoksazol, Dalfopristin, Demeklociklin, Dikloksacilin, Diritromicin, Doripenem, Doksiciklin, Enoksacin, Ertapenem, Eritromicin, Etambutol, Flukloksacilin, Fosfomicin, Furazolidon, Fuzidinska kiselina, Gatifloksacin, Geldanamicin, Gentamicin, Glikopeptide, Herbimicin, Imipenem, Izoniazid, Kanamicin, Levofloksacin, Linkomicin, Linezolid, Lomefloksacin, Lorakarbef, Makrolide, Mafenid, Meropenem, Meticilin, Metronidazol, Mezlocilin, Minociklin, Monobaktame, Moksifloksacin, Mupirocin, Nafcilin, Neomicin, Netilmicin, Nitrofurantoin, Norfloksacin, Ofloksacin, Oksacilin, Oksitetraciklin, Paromomicin, Penicilin, Peniciline, Piperacilin, Platensimicin, Polimiksin B, Polipeptide, Prontosil, Pirazinamid, Hinolone, Hinupristin, Rifampicin, Rifampin, Roksitromicin, Spektinomicin, Streptomicin, Sulfacetamid, Sulfametizol, Sulfanilimid, Sulfasalazin, Sulfizoksazol, Sulfonamid, Teikoplanin, Telitromicin, Tetraciklin, Tetracikline, Tikarcilin, Tinidazol, Tobramicin, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoksazol, Troleandomicin, Trovafloksacin, i Vancomicin.
[0452] Aktivna sredstva takođe uključuju Aldosteron, Beklometazon, Betametazon, Korticosteroid, Kortizol, Kortizon acetat, Dezoksikortikosteron acetat, Deksametazon, Fludrokortizon acetat, Glukokortikoid, Hidrokortizon, Metilprednizolon, Prednizolon, Prednizon, Steroid, i Triamcinolon. Bilo koja pogodna kombinacija ovih aktivnih sredstava je takođe predviđena.
[0453] "Farmaceutski ekscipijent" ili "farmaceutski prihvatljivi ekscipijent" je nosač, obično tečnost, u kojem je formulisano aktivno terapeutsko sredstvo. U jednom primeru izvođenja pronalaska, aktivno terapeutsko sredstvo je humanizovano antitelo prema pronalasku. Ekscipijent generalno ne obezbeđuje bilo kakvu farmakološku aktivnost formulaciji, iako može obezbediti hemijsku i/ili biološku stabilnost, i karakteristike oslobađanja. Primeri formulacija se mogu naći, na primer, u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Grennaro, A., Ed., 1995.
[0454] Kao što je ovde korišćeno "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "ekscipijent" uključuje bilo koji i sve rastvarače, medijume za disperziju, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije koja su fiziološki kompatibilna. U jednom primeru izvođenja, nosač je pogodan za parenteralnu primenu. Alternativno, nosač može biti pogodan za intravensku, intraperitonealnu, intramuskularnu, ili sublingualnu primenu. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ex tempore pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Korišćenje takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznato u tehnici. Osim ukoliko bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo nije kompatibilano sa aktivnim sredstvom, njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama prema pronalasku je predviđena. Suplementna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporisati u kompozicije.
[0455] Farmaceutske kompozicije moraju tipično biti sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Pronalazak predviđa da je farmaceutska kompozicija prisutna u liofilizovanom obliku. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvor ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol), i njihove pogodne smeše. Pronalazak dodatno predviđa uključivanje stabilizatora u farmaceutsku kompoziciju. Ispravna fluidnost se može održati, na primer, održavanjem neophodne veličine čestica u slučaju disperzije i korišćenjem surfaktanata.
[0456] U mnogim slučajevima, biće poželjno uključivanje izotoničnih sredstava, na primer, šećera, polialkohola kao što je manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciji. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearat soli i želatina. Dodatno, alkalni polipeptid se može formulisati u formulaciji sa vremenskim oslobađanjem, na primer u kompoziciji koja uključuje polimer sa sporim oslobađanjem. Aktivna jedinjenja se mogu pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, polilaktična kiselina i polilaktični, poliglikolni kopolimeri (PLG). Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su poznati stručnjacima.
[0457] Za svaki od navedenih primera izvođenja, jedinjenja mogu biti primenjena u različitim doznim oblicima. Predviđen je bilo koji biološki-prihvatljivi dozni oblik poznat stručnjacima, i njegove kombinacije. Primeri takvih doznih oblika uključuju, bez ograničenja, praškove koji se mogu rekonstituisati, eliksire, tečnosti, rastvore, suspenzije, emulzije, praškove, granule, čestice, mikročestice, disperzibilne granule, zapečaćene kapsule, inhalante, aerosolne inhalante, flastere, čestične inhalante, implante, depo implante, injektabilne preparate (uključujući subkutane, intramuskularne, intravenske, i intradermalne), infuzije, i njihove kombinacije.
[0458] Nije nameravano da prethodni opis različitih ilustrovanih primera izvođenja prema pronalasku bude isključujući ili da ograničava pronalazak na tačan otkriveni oblik. Dok su specifični primeri izvođenja, i njihovi primeri, pronalaska opisani ovde u ilustrativne svrhe, različite ekvivalentne modifikacije su moguće unutar obima pronalaska, kao što će stručnjaci prepoznati. Informacije obezbeđene ovde prema pronalasku mogu se primeniti u druge svrhe, različite od ovde datih primera.
[0459] Ove i druge promene mogu se načiniti pronalasku u svetlu prethodnog detaljnog opisa. Generalno, u sledećim patentnim zahtevima, korišćene termine ne treba shvatiti kao ograničavajuće za pronalazak u odnosu na specifične primere izvođenja date u specifikaciji i patentnim zahtevima. Shodno tome, pronalazak nije ograničen otkrićem, već umesto toga obim prema pronalasku treba odrediti u potpunosti sa sledećim patentnim zahtevima.
[0460] Pronalazak može biti izvođen na načine različite od onih ovde naročito opisanih u prethodnom opisu i primerima. Brojne modifikacije i varijacije prema pronalasku su moguće u svetlu prethodnih informacija i, stoga, su unutar obima priključenih patentnih zahteva.
[0461] Određene informacije vezane za humanizaciju monoklonskih antitela izvedenih iz zeca i poželjne modifikacije sekvence da bi se održalo afinitet vezivanja antigena otkriveni su u International Application No. PCT/US2008/064421, koja odgovara International Publication No. WO/2008/144757, pod nazivom "Novel Rabbit Antitelo Humanization Methods and Humanized Rabbit Antitela", podnetoj 21. maja 2008.
[0462] Određene informacije vezane za proizvodnju antitela ili njegovih fragmenata korišćenjem kvasca kompetentnog za parenje i odgovarajući postupci su otkriveni u U.S. Patent application no. 11/429,053, podnetoj 8. maja 2006, (U.S. Patent Application Publication No. US2006/0270045).
[0463] Određeni polinukleotidi i polipeptidi CGRP antitela su otkriveni u listingu sekvenci koji prati ovu podnetu patentnu prijavu.
[0464] Sledeći primeri su dati da bi se stručnjaku obezbedilo kompletno otkriće i opis kako da stvori i koristi predmetni pronalazak, i nije namera da ograničavaju obim onoga što se smatra pronalaskom. Načinjeni su napori da se osigura preciznost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količine, temperatura, koncentracije, itd.) ali treba ostaviti mesta i za neke eksperimentalne greške i devijacije. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa; i pritisak je ili blizu atmosferskog.
PRIMERI
Primer 1 Priprema antitela koja vezuju CGRP
[0465] Korišćenjem protokola za selekciju antitela opisanog ovde, može se stvoriti ekstenzivni panel antitela.
Imunizaciona strategija
[0466] Zečevi su imunizovani sa humanim CGRPα (American Peptides, Sunnyvale CA and Bachem, Torrance CA). Imunizacija se sastoji od prve subkutane (sc) injekcije od 100 µg antigena pomešanog sa 100 µg KLH u kompletnom Freund ađuvantu (CFA) (Sigma) praćeno sa dve inokulacije, u razmaku od dve nedelje pri čemu je svaka sadržala 50 µg antigena pomešan sa 50 µg u nekompletnom Freund ađuvantu (IFA) (Sigma). Životinjama je uzeta krv na dan 55, i titri seruma su određeni sa ELISA (antigen prepoznavanje) i sa inhibicijom CGRP vođenog cAMP povećanja u SK-N-MC.
Procena selekcionog titra antitela
[0467] Da bi se identifikovala i karakterizovala antitela koja se vezuju za humani CGRPα, rastvori koji sadrže antitelo su testirani sa ELISA. Ukratko, neutravidinom obložene ploče (Thermo Scientific), su obložene sa N-terminalnim biotinilovanim humanim CGRPα (50µL po bunarčiću, 1µg/mL) rastvorenim u ELISA puferu (0.5% želatina od riblje kože u PBS pH 7.4,) ili približno 1 č na sobnoj temperaturi ili alternativno preko noći na 4°C. Ploče su zatim dodatno blokirane sa ELISA puferom jedan čas na sobnoj temperaturi i isprane korišćenjem pufera za ispiranje (PBS, 0.05% tween 20). Testirani uzorci seruma su serijski razblaženi korišćenjem ELISA pufera. Pedeset mikrolitara razblaženih uzoraka seruma je preneto na bunarčiće i inkubirano jedan čas na sobnoj temperaturi. Nakon ove inkubacije, ploča je isprana sa puferom za ispiranje. Za razvijanje, anti-zečje specifično Fc-HARP (1:5000 razblaženje u ELISA puferu) je dodato u bunarčiće i inkubirano 45 min na RT. Nakon 3x koraka ispiranja sa rastvorom za ispiranje, ploča je razvijena korišćenjem TMB supstrata sva minuta na sobnoj temperaturi i reakcija je ugašena korišćenjem 0.5M HCl. Apsorbanca bunarčića je očitavana na 450 nm.
Određivanje titra uzoraka seruma sa funkcionalnom aktivnošću (Inhibicija CGRP vođenih cAMP nivoa)
[0468] Da bi se identifikovala i karakterisala antitela sa funkcionalnom aktivnošću, test inhibicije CGRP vođenog povećanja cAMP nivoa je urađen korišćenjem elektrohemiluminescence (Meso Scale Discovery, MSD). Ukratko, pripreme antitela koje se testiraju su serijski razblažene u puferu MSD testa (Hepes, MgCl2, pH 7.3, 1mg/mL bloker A, Meso Scale Discovery) u polistirenskoj ploči sa okruglim dnom sa 96 bunarčića (Costar). Ovoj ploči je dodat humani CGRPα (10ng/mL finalna koncentracija) razblažen u puferu MSD testa i inkubiran jedan čas na 37C. Odgovarajuće kontrole su korišćene kao što je sugerisano od strane proizvođača kompleta za test. Humane neuroepiteliom ćelije (SK-N-MC, ATCC) su odvojene korišćenjem EDTA rastvora (5mM u PBS) i isprane korišćenjem medijuma za rast (MEM, 10% FBS, antibiotici) centrifugiranjem. Broj ćelija je podešen na 2 miliona ćelija po mL u test puferu, i IBMX (3-Izobutil-1Metilksantin, Sigma) je dodat finalnoj koncentraciji od 0.2mM neposredno pre postavljanja ćelija na cAMP test ploču. Nakon što je inkubiran rastvor antitela humanog jedan čas 20 mikrolitara rastvora koji sadrži ćelije je preneto na ploču cAMP testa. Svi testirani uzorci su pušteni u duplikatu sa odgovarajućim kontrolama. Deset mikrolitara ćelija je dodato bunarčićima i ploča je inkubirana 30 minuta uz šejkiranje na sobnoj temperaturi. Dok su ćelije inkubirane sa CGRP rastvorom, rastvor za zaustavljanje reakcije je pripremljen pravljenjem 1:200 rastvora TAG obeleženog cAMP (MSD) u puferu za lizu (MSD). Da bi se zaustavila inkubacija ćelija-CGRP, 20 mikrolitara rastvora za zaustavljanje je dodato ćelijama i ploča je inkubirana jedan čas sa šejkiranjem na sobnoj temperaturi. Pufer za očitavanje (MSD) je razblažen četiri puta sa vodom i 100 mikrolitara je dodato svim bunarčićima na ploči. Ploča je zatim očitana korišćenjem Sector Imager 2400 (MSD) i Prism software je korišćen za fitovanje podataka i određivanje IC50.
Skupljanje tkiva
[0469] Kada su ustanovljeni prihvatljivi titri, zečevi su žrtvovani. Slezina, limfni čvorovi, i cela krv su sakupljeni i obrađeni kao što sledi: slezina i limfni čvorovi su obrađeni u suspenziji pojedinačne ćelije sa disocijacijom tkiva i potiskivanjem kroz sterilnu žičanu mrežu na 70 µm (Fisher) sa klipom šprica od 20 cc. Ćelije su sakupljene u PBS. Ćelije su dva puta isprane centrifugiranjem. Nakon zadnjeg ispiranja, određena je gustina ćelija sa tripan plavim. Ćelije su centrifugirane na 1500 rpm 10 minuta; supernatant je odbačen. Ćelije su resuspendovane u odgovarajućoj zapremini od 10% dimetil sulfoksida (DMSO, Sigma) u FBS (Hyclone) i ispražnjene u 1 ml/vijalici. Vijalice su uskladištene na -70°C u komori za sporo zamrzavanje 24 časa i uskladištene u tečnom azotu.
[0470] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) su izolovane mešanjem cele krvi sa jednakim delovima medijuma sa niskim sadržajem glukoze opisanim prethodno bez FBS. 35 ml smeše cele krvi je pažljivo u slojevima postavljeno u 8 ml Lympholyte Rabbit (Cedarlane) u 45 ml konusnu epruvetu (Coming) i centrifugirano 30 minuta na 2500 rpm na sobnoj temperaturi bez zaustavljanja. Nakon centrifugiranja, PBMC slojevi su pažljivo uklonjeni korišćenjem staklene Pasterove pipete (VWR), kombinovani, i stavljeni u čistu 50 ml vijalicu. Ćelije su isprane dva puta sa modifikovanim medijumom opisanim prethodno centrifugiranjem na 1500 rpm 10 minuta na sobnoj temperaturi, i gustina ćelija je određena sa bojenjem sa tripan plavim. Nakon zadnjeg ispiranja, ćelije su resuspendovane u odgovarajućoj zapremini od 10% DMSO/FBS medijuma i zamrznute kao što je prethodno opisano.
Selekcija, obogaćivanje i ulovi kulture B ćelija
[0471] Na dan postavljanja B ćelijske kulture, vijalice sa PBMC, splenocitama, ili limfnim čvorovima su odmrznute za upotrebu. Vijalice su uklonjene iz LN2 rezervoara i stavljene u vodeno kupatilo na 37°C do odmrzavanja. Sadržaj vijalica je prenet u 15 ml konusne epruvete za centrifugu (Corning) i 10 ml modifikovanog RPMI opisanog prethodno je polako dodato u epuvetu. Ćelije su centrifugirane 5 minuta na 2K RPM, i supernatant je odbačen. Ćelije su resuspendovane u 10 ml svežeg medijuma. Gustina i vijabilnost ćelija je određena sa tripan plavim.
a) sledeći protokol je korišćen za Ab1 i Ab13
[0472] Ćelije su prethodno pomešane sa biotinilovanim humanim CGRPα kao što sledi. Ćelije su ponovo isprane i resuspendovane na 1E07 ćelija/80 µL medium. Biotinilovani humani CGRPα je dodat ćelijskoj suspenziji u finalnoj koncentraciji od 5 ug/mL i inkubiran 30 minuta na 4°C. Nevezani biotinilovani humani CGRPα je uklonjen izvođenjem dva 10 ml ispiranja korišćenjem PBF [PBS baz Ca/Mg (Hyclone), 2 mM etilendiamin tetrasirćetne kiseline (EDTA), 0.5% goveđi serum albumin (BSA) (Sigma-bez biotina)]. Nakon drugog ispiranja, ćelije su resuspendovane na 1E07 ćelije/80 µl PBF i 20 µl MACS® streptavidin perli (Miltenyi Biotech, Auburn CA) na 10E7 ćelija je dodato suspenziji ćelija. Ćelije i kuglice su inkubirane na 4°C 15 minuta i isprane jednom sa 2 ml PBF na 10E7 ćelija.
b) sledeći protokol je korišćen za Ab4, Ab7, Ab9 i Ab11:
[0473] Biotinilovani humani CGRPα je prethodno napunjen na streptavidin perle kao što sledi. Sedamdeset pet mikrolitara streptavidin perli (Milteny Biotec, Auburn CA) je pomešano sa N-terminalno biotinilovanim huCGRPα (10ug/ml finalna koncentracija) i 300 µl PBF. Ova smeša je inkubirana na 4°C 30 min i nevezani biotinilovani humani CGRPα je uklonjen korišćenjem MACS® separacione kolone (Miltenyi Biotec, sa 1 ml ispiranjem da bi se uklonio nevezani materijal. Zatim je materijal izbačen, zatim korišćen za resuspendovanje ćelija prethodno pomenutih u 100ul na 1E7 ćelija, smeša je zatim inkubirana na 4°C 30 min i isprana jednom sa 10 ml of PBF.
[0474] Za oba a) i b) protokola sledeće je primenjeno: Nakon ispiranja, ćelije su resuspendovane u 500ml PBF i stavljene sa strane. MACS® MS kolona (Miltenyi Biotec, Auburn CA) je prethodno isprana sa 500 ml PBF na magnetnom postolju (Milteni). Ćelijska suspenzija je primenjena na kolonu preko pre-filtera, i nevezana frakcija je skupljena. Kolona je isprana sa 2.5 ml PBF pufera. Kolona je uklonjena sa magnetnog postolja i stavljena u čistu, sterilnu 1.5 ml ependorf epruvetu. 1 ml PBF pufera je dodat na vrh kolone, i pozitivno selektovane ćelije su sakupljene. Prinos i vijabilnost frakcije pozitivnih ćelija je određena bojenjem sa tripan plavim. Pozitivna selekcija je dala prosečno 1% početne koncentracije ćelija.
[0475] Pilot skrining ćelija je ustanovljen da bi se obezbedila informacija na nivoe sejanja za kulturu. Ploče su zasejane sa 10, 25, 50, 100, ili 200 obogaćenih B ćelija/bunarčiću. Dodatno, svaki bunarčić je sadržao 50K ćelija/bunarčiću ozračenih EL-4.B5 ćelija (5,000 Rads) i odgovarajući nivo aktiviranog zečjeg T ćelijskog supernatanta (Videti U.S. Patent Application Publication No. 20070269868)(u opsegu od 1-5% u zavisnosti od preparata) u RPMI medijumu modifikovanom sa visokim sadržajem glukoze u finalnoj zapremini od 250 µl/well. Kulture su inkubirane 5 do 7 dana na 37°C u 4% CO2.
Skrining B-ćelijske kulture sa prepoznavanjem antigena (ELISA)
[0476] Da bi se identifikovali bunarčići koji proizvode anti-humana CGRPα antitela, korišćen je isti protokol kao što je opisano za određivanje titra uzoraka seruma za antigenprepoznavanje (ELISA) sa sledećim izmenama. Ukratko, neutravidin obložene ploče su obložene sa mešavinom i N- i C- terminalno biotinilovanog humanog CGRPα (50 µL po bunarčiću, 1 µg/mL svaki). Uzorci B-ćelijskog supernatanta (50 µL) su testirani bez prethodnog razblaživanja.
Identifikacija funkcionalne aktivnosti u B-ćelijskim supernatantima korišćenjem CGRP vođene cAMP proizvodnje
[0477] Da bi se odredila funkcionalna aktivnost sadržana u B-ćelijskim supernatantima, slična procedura onoj opisanoj za određivanje funkcionalnog titra uzoraka seruma je korišćena sa sledećim modifikacijama. Ukratko, B-ćelijski supernatant (20 µL) su korišćeni umesto razblaženih uzoraka poliklonskog seruma.
Izolacija antigen-specifične B-ćelije
[0478] Ploče koje sadrže bunarčiće od interesa uklonjene su sa -70 °C, i ćelije iz svakog bunarčića su rekuperovane korišćenjem pet ispiranja od 200 mikrolitara medijuma (10% RPMI kompletan, 55mM BME) po bunarčiću. Rekuperovane ćelije su peletirane sa centrifugiranjem i supernatant je pažljivo uklonjen. Peletirane ćelije su resuspendovane u 100 µl medijuma. Da bi se identifikovale ćelije koje eksprimiraju antitelo, streptavidin obložene magnetne kuglice (M280 dynabeads, Invitrogen) su obložene sa kombinacijom i N- i C-terminalno biotinilovanog humanog CGRPα. Individualni biotinilovani humani CGRPα lotovi su optimizovani serijskim razblaženjem. Sto mikrolitara koji sadrže približno 4x10E7 obloženih perli su zatim pomešane sa resuspendovanim ćelijama. Ovoj smeši je dodato 15 mikrolitara kozjeg anti-zečjeg H&L IgG-FITC (Jackson Imunoresearch) razblaženog 1:100 u medijumu.
[0479] Dvadeset mikrolitara ćelija/perle/anti-zečje H&L suspenzije je uklonjeno i kapljice od 5 mikrolitara su ispražnjene u staklenu pločicu sa jednim bunarčićem prethodno tretiranu sa Sigmacote (Sigma) sa ukupno 35 do 40 kapi po pločici. Nepropustljiva barijera parafinskog ulja (JT Baker) je korišćena za potapanje kapi, i pločica je inkubirana 90 minuta na 37°C u 4% CO2inkubatoru u mraku.
[0480] Specifične B ćelije koje proizvode antitelo mogu se identifikovati sa fluorescentnim prstenom okolo proizvedenim sekrecijom antitela, prepoznavanjem biotinilovanog antigena povezanog sa perlom, i naknadnom detekcijom sa fluorescentnim-IgG detekcionim reagensom. Kada je identifikovana, ćelija od interesa rekuperovana je preko mikromanipulatora (Eppendorf). Pojedinačna ćelija koja sintetiše i eksportuje antitelo preneta je u epruvetu za mikrocentrifugu, zaleđena korišćenjem suvog leda i uskladištena na -70°C. Amplifikacija i određivanje sekvence antitela iz antigen-specifične B ćelije.
[0481] Sekvence antitela su rekuperovane korišćenjem kombinovanog postupka zasnovanog na RT-PCR iz jedne izolovane B-ćelije. Prajmeri koji sadrže restrikcione enzime su dizajnirani za aniling u konzervativnim i konstantnim regionima ciljnih imunoglobulinskih gena (teški i laki), kao što je zečja imunoglobulinska sekvenca, i rekuperacija u dva koraka ugnežđenom PCR je korišćena za amplifikaciju sekvence antitela. Amplikoni iz svakog bunarčića su analizirani u odnosu na rekuperaciju i integritet veličine. Rezultujući fragmenti su zatim digestovani sa AluI da bi se izvršio fingerprint klonalnosti sekvence. Identične sekvence pokazivale su zajednički obrazac fragmentacije u njihovoj elektroforetskoj analizi. Originalni fragmenti amplikona teškog i lakog lanca su zatim digestovani korišćenjem mesta restrikcionih enzima koji se sadrže unutar PCR prajmera i klonirani u ekspresioni vektor. Vektori koji sadrže subklonirane DNK fragmente su amplifikovani i prečišćeni. Sekvenca subkloniranih teških i lakih lanaca je verifikovana pre ekspresije.
Rekombinantna proizvodnja monoklonskog antitela željene antigen specifičnosti i/ili funkcionalnih osobina
[0482] Da bi se odredila antigen specifičnost i funkcionalne osobine rekuperovanih antitela iz specifične B-ćelije, vektori koji vode ekspresiju željenih parnih sekvenci teškog i lakog lanca su transfektovane u HEK-293 ćelije.
Antigen-prepoznavanje rekombinantnog antitela sa ELISA
[0483] Da bi se karakterizovala rekombinantna eksprimirana antitela u odnosu na njihovu sposobnost da se vezuju za humani-CGRPα, rastvori koji sadrže antitelo su testirani sa ELISA. Sve inkubacije su urađene na sobnoj temperaturi. Ukratko, Immulon IV ploče (Thermo Scientific) su obložene sa rastvorom koji sadrži CGRPα (1ut/mL u PBS) 2 časa. CGRPα-obložene ploče su zatim isprane tri puta u puferu za ispiranje (PBS, 0.05% Tween-20). Ploče su zatim blokirane korišćenjem rastvora za blokiranje (PBS, 0.5% želatin iz riblje kože, 0.05% Tween-20) približno jedan čas. Blokirajući rastvor je zatim uklonjen i ploče su zatim inkubirane sa serijama razblaženja antitela koje se testira približno jedan čas. Na kraju ove inkubacije, ploče su isprane tri puta sa puferom za ispiranje i dodatno inkubirane sa rastvorom koji sadrži sekundarno antitelo (peroksidaza konjugovani affinipure F(ab’)2 fragment kozjeg anti-humanog IgG, Fc fragment specifičan (Jackson Imunoresearch) približno 45 minuta i isprano tri puta. U ovo vreme rastvor supstrata (supstrat TMB peroksidaze, BioFx) i inkubirano 3 do 5 minuta u mraku. Reakcija je zaustavljena dodavanjem rastvora koji sadrži HCl (0.5M) i ploča je očitana na 450 nm u čitaču ploča.
[0484] Rezultati: Slike 15-18 pokazuju da se anti-CGRP antitela Ab1-Ab14 vezuju za i prepoznaju CGRPα.
Funkcionalna karakterizacija rekombinantnih antitela modulacijom CGRP vođenih intracelularnih cAMP nivoa i unakrsna reaktivnost sa pacovima
[0485] Da bi se karakterizovala rekombinantna eksprimirana antitela u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju CGRPα posredovane povećane ćelijske nivoe cAMP testa, korišćen je komplet za test elektrohemiluminescencije (Meso Scale Discovery, MSD). Ukratko, preparati antitela koij se testiraju su serijski razblaženi u MSD test puferu (Hepes, MgCl2, pH 7.3, 1mg/mL blocker A, Meso Scale Discovery) u polistirenskoj ploči sa okruglim dnom sa 96 bunarčića (Costar). Ovoj ploči, dodat je humani CGRPα (25ng/mL finalna koncentracija) razblažen u MSD test puferu i inkubiran jedan čas na 37°C. Odgovarajuće kontrole su korišćene kao što je sugerisano od strane proizvođača test kompleta. Ćelije humanog neuroepitelioma (SK-N-MC, ATCC) su odvojene korišćenjem EDTA rastvora (5mM) i isprane korišćenjem medijuma za rast (MEM, 10% FBS, antibiotici) centrifugiranjem. Broj ćelija je podešen na 2 miliona ćelija po mL u test puferu, i IBMX (3-Izobutil-1Metilksantin, 50mM Sigma) je dodat do finalne koncentracije od 0.2mM neposredno pre punjenja ćelija na cAMP test ploču. Rastvor antitela humanog CGRPα je inkubiran jedan čas nakon čega je 20 mikrolitira rastvora koji sadrži ćelije preneto na cAMP test ploču. Svi testirani uzorci su pušteni u duplikatima sa odgovarajućim kontrolama. Deset mikrolitara ćelija je dodato bunarčićima i ploča je inkubirana 30 minuta uz šejkiranje. Dok su ćelije inkubirane sa CGRP rastvorom, rastvor za zaustavljanje je pripremljen stvaranjem 1:200 rastvora TAG obeleženog cAMP (MSD) u puferu za lizu (MSD). Da bi se zaustavila inkubacija ćelija-CGRP, 20 mikrolitara rastvora za zaustavljanje je dodato ćelijama i ploča je inkubirana jedan čas uz šejkirane. Pufer za očitavanje (MSD) je razblažen četiri puta sa vodom i 100 mikrolitara je dodato svim bunarčićima na ploči. Ploča je zatim očitana korišćenjem Sector Imager 2400 (MSD) i Prism software je korišćen za fitovanje podataka i određivanje IC50.
[0486] Da bi se testirala sposobnost rekombinantnog antitela da antagonizuje humani CGRPβ sličan test je izveden sa supstitucijom CGRP agonistom (CGRPβ 10ng/mL finalna koncentracija). Procena rekombinantnih antitela da prepoznaju i inhibiraju stvaranje cAMP posredovano sa CGRP pacova izvedeno je korišćenjem CGRP pacova (5ng/mL finalna koncentracija) i L6 ćelijske linije pacova (ATCC).
[0487] Rezultati: Slike 19-37 pokazuju da anti-CGRP antitela Ab1-Ab14 inhibiraju CGRPα, CGRPβ, i povećane ćelijske nivoe cAMP posredovane sa CGRP pacova.
Primer 2: Enzimska proizvodnja Fab fragmenata
[0488] Digestije papainom su izvedene korišćenjem imobilisanog papaina (Thermo/Pierce) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, prečišćena antitela su inkubirana u puferu koji sadrži cistein/HCl sa imobilisanim papainom na 37°C uz nežno ljuljanje. Digestija je praćena uzimanjem alikvota i analizirana korišćenjem SDS-PAGE za cepanje teškog lanca. Da bi se zaustavila reakcija, imobilisani papain je uklonjen centrifugiranjem i ispran sa 50 mM Tris pH 7.5 i filtrirano. Nedigestovano antitelo pune dužine i Fc fragment su uklonjeni korišćenjem MabSelectSure (GE) kolone.
Primer 3 Ekspresija ćelije kvasca
Konstrukcija Pichia pastoris ekspresionih vektora za teški i laki lanac.
[0489] Humanizovani fragmenti lakog i teškog lanca su komercijalno sintetisani i subklonirani u pGAP ekspresioni vektor. pGAP ekspresioni vektor koristi GAP promotor da bi vodio ekspresiju imunoglobulinskog lanca i lider sekvence humanog serum albumina (HSA) za eksportovanje. Dodatno, ovaj vektor sadrži uobičajene elemente kao što je bakterijski oridžin replikacije, i kopiju gena za rezistenciju na kanamicin koji prenosi rezistenciju na antibiotik G418 kod P. pastoris. G418 obezbeđuje sredstva za selekciju u odnosu na sojeve koji sadrže željeni ekspresioni vektor integrisan u njihov genom. Transformacija ekspresionih vektora u haploidne met1 i lys3 sojeve domaćine Pichia pastoris.
[0490] Svi postupci korišćeni za transformaciju haploidnih P. pastoris sojeva i manipulaciju P. pastoris seksualnog ciklusa su urađeni kao što je opisano u Pichia protokolima (Methods in Molecular Biology Higgings, DR, i Cregg, JM, Eds.1998. Humana Press, Totowa, NJ). Pre transformacije svaki vektor je linearizovan sa GAP promotor sekvencama da bi se usmerila integracija vektora GAP promotor lokusa P. pastoris genoma. Haploidni sojevi su transfektovani korišćenjem elektroporacije i uspešni transformanti su selektovani na YPDS (ekstrakt kvasca, pepton dekstroza sa sorbitolom) G418 agar ploče. Broj kopija gena teškog i lakog lanca su određeni za haploidne sojeve sa Southern blot analizom. Haploidi sojevi su zatim pareni i izabrani u odnosu na njihovu sposobnost da rastu u odsustvu aminokiselinskih markera (tj., Lys i Met). Rezultujući diploidni klonovi su zatim podvrgnuti finalnom Southern blotu da bi se potvrdio broj kopija gena teškog i lakog lanca. Klon koji eksprimira antitelo od interesa je izabran korišćenjem interferometrije biosloja Protein-A biosenzora da bi se pratila ekspresija (Octet, ForteBio).
Primer 4 Ekspresija Ab3, Ab6 i Ab14 u Pichia pastoris
[0491] Napravljena su tri soja Pichia za ekspresiju antitela pune dužine. Za sve sojeve koji eksprimiraju antitelo pune dužine, haploidni sojevi su stvoreni i nakon toga pareni. Jedan haploidni soj eksprimirao je sekvencu lakog lanca pune dužine i drugi haploidni soj eksprimirao je sekvencu teškog lanca pune dužine. Svaki diploidni soj je korišćen da generiše istraživačku banku ćelija i korišćen je za ekspresiju u bioreaktoru.
[0492] Prvo je inokulum ekspandovan korišćenjem istraživačje banke ćelija korišćenjem medijuma koji se sastoji od sledećih nutrijenata (%tež/zapr): ekstrakt kvasca 3%, anhidrovana dekstroza 4%, YNB 1.34%, Biotin 0.004% i 100 mM kalijum fosfat. Da bi se stvorio inokulum za fermentore, banka ćelija je ekspandovana približno 24 časa u šejkiranom inkubatoru na 30°C i 300 rpm. Zatim je dodat 10% inokulum u Labfors sudove 2.5L radne zapremine koji sadrže 1 L sterilnog madijuma za rast. Medijum za rast se sastojao od sledećih nutrijenata: kalijum sulfat 18.2 g/L, jednobazni amonijum fosfat 36.4 g/L, dvobazni kalijum fosfat 12.8 g/L, magnezijum sulfat heptahidrat 3.72 g/L, antrijum citrat dihidrat 10 g/L, glicerol 40 g/L, ekstrakt kvasca 30 g/L, PTM1 meatli u tragovima 4.35 mL/L, i antifoam 204 1.67 mL/L. Rastvor PTM1 tragova metala je sastavljen od sledećih komponenti: bakr sulfat pentahidrat 6 g/L, natrijum jodid 0.08 g/L, mangan sulfat hidrat 3 g/L, natrijum molibdat dihidrat 0.2 g/L, borna kiselina 0.02 g/L, kobalt hlorid 0.5 g/L, cink hlorid 20 g/L, fero sulfat heptahidrat 65 g/L, biotin 0.2 g/L, i sumporna kiselina 5 mL/L.
[0493] Kontrolni parametri procesa bioreaktora su podešeni kao što sledi: agitacija 1000 rpm, protok vazduha 1.35 standard litr po minutu, temperatura 28°C i pH je kontrolisana na šest korišćenjem amonijum hidroksida. Kiseonik nije dodavan.
[0494] Fermentacione kulture su uzgajane približno 12 do 16 časova do potrošnje inicijalnog glicerola što je obeleženo pikom rastvorenog kiseonika. Kulture su izgladnjivane približno tri časova nakon pika rastvorenog kiseonika. Nakon ovog perioda gladovanja, bolus etanola je dodat reaktoru da se postigne 1% etanola (tež/zapr). Dozvoljeno je da se fermentacione kulture ekvilibrišu 15 do 30 minuta. Dodavanje je inicirano 30 minuta postetanol bolusa i podešeno kao konstantna stopa od 1 mL/min 40 minuta, zatim je pumpa za dodavanje kontrolisana sa senzorom za etanol održavajući koncentraciju etanola na 1% u preostalom procesu korišćenjem probe za detektovanje etanola (Raven Biotech). Dodavanje se sastojalo od sledećih komponenti: ekstrakt kvasca 50 g/L, dekstroza 500 g/L, magnezijum sulfat heptahidrat 3 g/L, i PTM1 metali u tragovima 12 mL/L. Za fermentaciju Ab6 i Ab14 pune dužine, takođe je dodavan natrijum citrat dihidrat (0.5g/L). Ukupno vreme fermentacije bilo je približno 90 časova.
Primer 5 Postupci humanizacije antitela
[0495] Postupci humanizacije antitela su prethodno opisani u izdatom U.S. Patent No.
7935340. U nekim slučajevima, neophodno je određivanje da li su neophodni dodatni zečji okvirni ostaci da bi se održala aktivnost. U nekim slučajevima humanizovana antitela i dalje zahtevaju da se zadrže neki kritični zečji okvirni ostaci da bi se minimizovao gubitak afiniteta ili aktivnosti. U ovim slučajevima, neophodno je da se promeni jedan ili više aminokiselina iz okvirnog regiona sekvence humane klicine linije nazad u originalne zečje aminokiseline da bi se imala željena aktivnost. Ove promene su eksperimentalno određene da bi se identifikovali koji zečji ostaci su neophodni da bi se zadržalo afinitet i aktivnost. Ovo je sada kraj humanizovane aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca.
Primer 6 Inhibicija CGRP vezivanja za njegov ćelijski receptor
[0496] Da bi se karakterizovala rekombinantna eksprimirana antitela u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju CGRP vezivanje za njegov ćelijski receptor, izveden je test vezivanja radioliganda kao što je prethodno opisano [Elshourbagy et al, Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al, Peptides, 16:421 (1995)]. Korišćeni su preparati membrane rekombinantnih humanih CGRP receptora, kalcitonin receptoru slični receptor i RAMP1 (Chemiscreen, Millipore). Razblaženja antitela su preinkubirani sa<125>I radioobeleženog humanog CGRPα (0.03 nM) 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nespecifično vezivanje je procenjeno u prisustvu 0.1 mM humanog CGRPα. Membrane su filtrirane i isprane. Zatim su prebrojani filteri da bi se odredio specifično vezani<125>I radioobeleženi humani CGRPα.
[0497] Rezultati: Slika 38 pokazuje da anti-CGRP antitela Ab1-Ab13 inhibiraju CGRP vezivanje za njegov ćelijski receptor.
Primer 7 Inhibicija neurogene vazodilatacije sa anti-CGRP antitela kod pacova
[0498] CGRP je potentni vazodilatator (Nature 313: 54-56 (1985) i Br J. Clin. Pharmacol.
26(6):691-5. (1988)). Farmakodinamski test za merenje aktivnosti antagonista CGRP receptora neinvazivno je korišćen da bi se karakterizovala anti-CGRP antitela. Model se oslanjao na izmene u dermalnom protoku krvi merenom korišćenjem laser Doppler vizuelizacije nakon topikalne primene rastvora kapsaicina. Kapsaicin aktivira prolazni receptorski potencijal receptora vaniloidnog tipa 1 (TRPV-1), proizvodeći neurogenu inflamaciju i vazodilataciju preko lokalnog oslobađanja vazoaktivnih medijatora uključujući CGRP i supstancu P (Br. J. Pharmacol.110: 772-776 (1993)).
[0499] Na dan pre testa vazodilatacije, životinje su dozirane sa test agensom ili kontrolom preko IP (intraperitonealno). Nakon doziranja, životinje su obrijane i depilirane u regionu donjeg dela leđa na njihvoj dorzalnoj strani, na području približno 2x6cm. Životinje su zatim vraćene u njihove kaveze preko noći. Na dan testa, približno 24 časova nakon doziranja, životinje su anestezirane sa izofluran gasom i postavljene na postolje sa zagrevanjem sa kontrolisanom temperaturom i opremljene sa nosnim konusom za neprekidnu isporuku izoflurana. Laser Doppler imager je korišćen za posmatranje vazodilatacije. Zrak koherentnog crvenog svetla generisan sa 633 nm helijum-neon laserom j eusmeren na obrijanu oblast, pravougaonik (2x6 cm), i skenirano na srednjoj rezoluciji. Referentni Doppler sken je prvo dobijen i lokacija za postavljanje O-prstena je predeterminisana identifikacijom dve oblasti sa sličnim sporim fluksom. Dva gumena O-prstena (∼1cm prečnik) su stavljeni u izabrane regione i izveden je referentni sken. Neposredno po završetku skena, 1mg kapsaicina u 5 mL etanol:aceton rastvora (1:1) je primenjen unutar svakog od dva O-prstena. Doppler skenovi su ponovljeni na 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5, 25, 27.5 i 30 minuta naokn primene kapsaicina. Procenat promene od referentne vrednosti koji označava fluks unutar svakog od dva O-prstena, plotovan je kao rezultat vazodilatacije usled kapsaicina.
[0500] Da bi se testirala rekombinantno eksprimirana antitela u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju CGRP vezivanje za njihov ćelijski receptor, izveden je test vezivanja radio ligand-binding kao što je prethodno opisano.
[0501] Rezultati: Slike 39 i 40 pokazuju da su anti-CGRP antitela Ab3 i Ab6 smanjila vazodilataciju u ovom modelu nakon primene kapsaicina.
Referentni Primer 8 Efekat primene CGRP antitela na hiperaktivnu bešiku
[0502] Izvedeni su eksperimenti da bi se procenila potencijalna efikasnost primene anti-CGRP antitela na kontinenciju bešike i hiperaktivnu bešiku. Kontinencija bešike je ravnoteža između uretralnog zatvaranja i aktivnosti detrusor mišića, i hiperaktivna bešika je stanje karakterisano urgentnošću, inkontinencijom, učestalošću i nokturijom. Neki dokazi u vidu anegdota objavljeni u literaturi sugerišu da CGRP može biti uključen u kontinenciju bešike i može biti u korelaciji i možda igrati uzročnu ulogu u patologiji bolesti hiperaktivne bešike. Shodno tome, smatralo se da će inventivna anti-CGRP antitela, naročito uzimajući u obzir njihov visok afinitet prema CGRP, potencijalno pomoći u sprečavanju ili ublažavanju ovog ponekada onesposobljavajućeg stanja. (Dodazi da CGRP može igrati ulogu u hiperaktivnoj bešici uključuje činjenicu da je CGRP prisutan u urinarnom traktu, DRG i kičmenoj moždini (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727) Takođe, aferentna C-vlakna su kritična za prenos impulsa uključenih u mokrenje u kičmenun možedinu (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112):128) i ova vlakna su pogođena sa CGRP. Dodatno, objavljeno je da intravezikularna primena botoksa suprimira CGRP i značajno smanjuje interval interkontrakcije u modelu bola bešike izazvanim sa sirćetnom kiselinom (Chuang et al., 2004 J Urol (172):1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182):786)). Dodatno, nedavno je objavljeno da primena anti-CGRP antitela navodno smanjuje broj kontrakcija bešike u modelu hiperaktivne bešike izazvanom sa terpentin uljem (Pfizer PCT Patent Application WO 2011/024113)).
Materijali i metode
Životinje:
[0503] Ženke Sprague-Dawley pacova (247 - 299 g) (Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, France) su isporučeni u laboratoriju najmanje 5 dana pre eksperimenata da be se aklimatizovali na laboratorijske uslove. Smešteni su po 3 u kavezu (polipropilen kavezi E tipa veličina: 1032 cm<2>) i data im je hrana (Teklad 2016 global rodents, Harlan, 03800 Gannat, France) i voda ad libitum. Piljevina (Souralit 2912 plus, Souralit, 17080 Girona, Spain) prostirka za kaveze glodara menjana je dva puta nedeljno. Sobna temperatura za životinje (20 ± 2 °C) održavana je sa 12/12 časova menjanjem ciklusa svetlomrak (svetla faza 7 pre podne: 7 uveče) i relativna vlažnost je održavana na 40-70%.
Laboratorijska oprema
[0504] Katetri za bešiku su povezani preko T-cevi za merač pritiska MX 860 Novatrans III Gold (Medex Medical SARL, Nantes-Carquefou, France) i špric pumpu (70-2208 Model II plus, Harvard Apparatus, Les Ullis, France i Razel R-99E, Fisher Bioblock, Illkirch, France). Intravezikularni pritisak je beležen kontinuirano korišćenjem PowerLab interface (ADInstruments Pty Ltd, Castle-Hill, Australia) i Chart® software na PC. Podaci su analizirani sa Microsoft Excel ® software.
Test supstance
[0505]
Test Anti-CGRP antitelo (Ab3)
Negativno kontrolno antitelo (Anti-digitoksin antitelo).
Hemijski reagensi
[0506] Fiziološki rastvor (NaCl 0.9%) (batch n° 11043411, CAS n° 7647-14- 5) je kupljen od B-Braun via Centravet (Lapalisse, France).
Anestetičke supstance
[0507] Uretan (batch n° BCBC9294, CAS n° 51-79-6) i natrijum pentobarbital (batch n° 150A1, CAS n°76- 74-4) su obezbeđeni od Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France) i Centravet (Lapalisse, France), respektivno.
Eksperimentalne grupe
[0508] Dve erksperimentalne grupe od 10 pacova su korišćene u eksperimentima. Svakoj grupi je primenjeno 10 mg/kg ili kontrole ili anti-CGRP antitela:
Dizajn studije
Eksperimentalna procedura
[0509] Na ženke pacova je primenjeno test antitelo ili negativno kontrolno antitelo intravenski sa dozom od 10 mg/kg, 18 časova pre eksperimenata korišćenjem injekcije u repnu venu. Petnaest (15) časova kasnije, pacovi su anestezirani sa uretanom (1.2 g/kg, subkutano (s.c.). Tri (3) časa nakon s.c. primene uretana, polietilenski kateter (0.58 i 0.96 mm of unutrašnjeg i spoljašnjeg prečnika, respektivno) je ubačen u bešiku preko svoda i obezbeđen sa hirurškim šavom. Telesna temperatura je održavana na 37 ± 2°C (TCAT-2LV controller, Physitemp, ADInstruments Pty Ltd., Casttle Hill, Australia) tokom eksperimenta.
Cistometrijski eksperiment
[0510] Cistometrijska istraživanja su izvedena kod anesteziranih ženki pacova nakon hirurške operacije. Fiziološki rastvor na sobnoj temperaturi je kontinuirano primenjen infuzijom u bešiku sa konstantnom stopom protoka (2 mL/h) u periodu od najmanje 30 min.
[0511] Na kraju cistometrijskih eksperimenata, životinje su žrtvovane letalnom injekcijom (1 mL) natrijum pentobarbitala (54.7 mg/mL) (CAS n°76-74-4) nakon čega je izvršena cervikalna dislokacija.
Cistometrijski parametri
[0512] Mereni cistometrijski parametri bili su:
Amplituda mokrenja (AM), tj. pritisak između pražnog pritiska i maksimalnog pritiska mokrenja (mmHg), interval između kontrakcija (ICI), tj. vreme između dva mokrenja (sek), učestalost mokrenja (MF), tj. broj kontrakcija mokrenja /15 min (pikovi/15 min).
Kriterijumi za isključivanje
[0513] Dva pacova su isključena tokom eksperimenata: Jedan je isključen jer je pokazivao hiperaktivnost bešike tokom intravezikularne infuzije fiziološkog rastvora, i drugi zbog toga što se dubina anestezije menjala tokom eksperimenta što je indukovalo modifikacije cistometrijskog profila.
Analiza rezultata
[0514] Za svakog pacova, vrednosti za AM i ICI su izračunate kao srednja vrednost poslednjih četiri ili pet mokrenja tokom infuzije fiziološkog rastvora. Vrednosti za MF su izračunate kao srednja vrednost mokrenja dobijenih za dva intervala od 15 minuta tokom infuzije fiziološkog rastvora.
[0515] Rezultati su predstavljeni kao srednje vrednosti ± standardna greška srednje vrednosti (± sem). Slike i statističke analize su izvedene korišćenjem GraphPad Prism® (Version 4; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).
[0516] Statistička poređenja vrednosti (infuzija fiziološkog rastvora) u anti-CGRP antitelo grupi nasuprot grupe kontrolnog antitela izvedena su korišćenjem Student t-testa za nezavisne uzorke.
[0517] p<0.05 je prihvaćena za statističku značajnost.
Rezultati:
[0518] Kao što je prikazano na SL. 41, ICI je značajno veći i MF je značajno manji u anti-CGRP Ab-tretiranoj grupi (SL. 41A i B respektivno; p<0.05, Student t-test za nezavisne uzorke). Nisu uočene značajne rezlike za AM između grupa (SL. 41C, p>0.05, Student t-test za nezavisne uzorke).
[0519] Ovi rezultati sugerišu da anti-CGRP antitela mogu biti korisna u sprečavanju ili ublažavanju hiperaktivne bešike, poboljšanju urinarne kontinencije i tretmana povezanih urinarnih stanja.
Referentni primer 9 Olakšanje neuropatskog bola kod pacova
[0520] Oštećenje perifernih nerava često dovodi do hroničnog bola koji je neuropatski po poreklu. Ovaj sindrom bola se sastoji od senzitivnosti na spoljašnje stimuluse (npr., mehaničke i/ili termalne) koji normalno nisu štetni. Posledično, neuropatski bol je refraktoran na tradicionalne analgetičke pristupe, otežavajući njegovo lečenje. Eksperimentalno, neuropatski bol može bii modeliran kod životinja preko hirurške traume perifernih nerava. Chung model je jedan takav sistem gde je neuropatski bol indukovan ligacijom spinalnih nerava L5 i L6.
[0521] U ovom Primeru, ligacija spinalnog nerva je izvedena na mužjacima Sprague Dawley pacova. Oni su testirani u odnosu na senzitivnost na bol na dan 13 (potvrda alodinije) i zatim ponovo posle svake primene Ab2 upotrebom von Frey testa mehaničke alodinije za procenu moguće anti-alodinijske aktivnosti.
Metode
[0522] Mužjaci Sprague Dawley pacova (Harlan Laboratories) telesne težine 200-225g prilikok dolaska, su otpakovani i postavljeni u kaveze. Vizuelni pregled zdravstvenog stanja je izveden na svakoj životinji tako što je obuhvaćena procena krzna, ekstremiteta i telesnih otvora. Svaka životinja je takođe pregledana za sve abnormalne znake u držanju ili kretanju. Nađeno je da su sve životinje bile u dobrom zdravstvenom stanju i uključene su u studiju.
[0523] Pacovi su aklimatizovani tokom minimalno dva dana pre početka eksperimentalnih postupaka, sa izuzetkom randomizacije telesnih težina koje su sakupljene dan posle dolaska. Životinje su smeštene pojedinačno u providne polikarbonatne konvencionalne kaveze ili providne polikarbonatne mikroizolatorske kaveze sa sertifikovanim grejanjem kontaktnim prostirkama. Hrana i voda su obezbeđene ad libitum. Sredinske kontrole su postavljene da odražavaju temperature od 18° do 26°C (64° do 79°F) sa relativnom vlažnošću od 30% do 70%. Održavan je 12:12 ciklus svetlosti:mraka.
[0524] Pacovi su testirani za polazni prag upotrebom von Frey filamenata na dane -4 ili -1 aklimatizacije.
[0525] Na dan 0, životinje su podvrgnute postupku ligacije spinalnog nerva. Sve operacije su izvedene pod aseptičkim uslovima. Pre operacija, pacovi su anestezirani. Region leđa je obrijan i pripremljen za aseptičku operaciju. Pacovi su postavljeni u ležeći ventralni položaj i rez je napravljen neposredno levo od srednje linije na L4 - S2 regionu. Levi paraspinalni mišići su odvojeni od kičmenih nastavaka (L4 - S2). L6-S1 zigapofitnog zgloba su uštinuti i poprečni nastavak je pažljivo isečen da bi se obezbedio prostor za procenu L4 & L5 spinalnog nerva. Levi L5 i L6 spinalni nervi su izolovani i ligatirani sa 6.0 svilenim šavovima. Rez je zatim zatvoren odgovarajućim materijalom za šivenje i spojnicama za rane kože. Posle operacije, Ringer laktat rastvor (3.0 - 5.0 mL) je primenjen preko subkutane injekcije na životinje.
[0526] Sve životinje u grupama 1 i 2 primile su von Frey test na dane -4 ili -1, 13, 14 i 17. Merenje na dan 13 je izvedeno pre doziranja. von Frey test za mehaničku alodniju procenjuju anti-nociceptivne osobine analgetičkih jedinjenja. U ovom testu, životinje su prvo naviknute na komoru za testiranje tako da su bile dovoljno smirene za procenu njihovog praga bola. Tehničari slepi u odnosu na grupe tretmana primenili su blagi pritisak na levu zadnju šapu pacova upotrebom serije profilisanih najlonskih filamenata (von Frey filamenti) rastućeg prečnika. Filamenti su pritisnuti uspravno na ventralnu površinu šape sve dok se nisu savili. Kada je osetio bol, pacov odgovara povlačenjem svoje šape. Prag alodinije je određen upotrebom Chaplan gore-dole postupka (Chaplan et al., J Neurosci Methods, 53:55-63, 1994), koji obezbeđuje tačnu silu za povlačenje za svakog pacova upotrebom psihofizičke skale testiranja.
[0527] Životinje su raspoređene u dve grupe tretmana na dan 13, na bazi von Frey ocena. Svaka životinja koja je imala von Frey ocenu veću od 6g isključena je iz studije. Srednje von Frey ocene za svaku grupu su pregledane da bi se osiguralo da su srednje vrednosti i standardna devijacija zadovoljili pretpostavku homogenosti. Doze su primenjivane preko IP injekcije jednom na dan 13 (13 dana posle operacije) za grupu 1 (Ab2) i grupu 2 (negativno kontrolno antitelo) (11 životinja u svakoj grupi; Ab2 i negativno kontrolno antitelo su primenjeni u 10 mg/kg). Grupa 1 je primila dodatni IV bolus (neanestezirani) injekciju Ab2 na dan 17 pre bihejvioralnog testiranja.
[0528] Uzorci krvi za plazmu su uzeti na dan 17 za grupu 1 i analizirani za titar Ab2.
[0529] Izvan očekivanih zapažanja mesta operacije i povlačenja šape sa Chung operacijom, nikakva abnormalna zapažanja nisu dokumentovana. Izgleda da tretman nema štetni efekat na ukupno zdravlje životinje niti je prekinuo normalan dobitak na telesnoj težini očekivan kod pacova ove starosti.
Rezultati
[0530] Sve životinje koje su podvrgnute polaznom testiranju pre operacije na dan 0 imale su von Frey ocenu od 15 (nije prikazano) što ukazuje na normalnu senzitivnost. Na dan 13 (pre primene antitela), sve životinje su imale von Frey ocene niže od 6g, što ukazuje na to da se razvila senzitivnost na spoljašnje mehaničke stimuluse, osim dve životinje koje su uklonjene iz studije. Srednje von Frey ocene na dan 13 bile su manje od 3 g (SL.42, leva grupa stubića). Posle testiranja na dan 13, životinje su primale Ab2 ili negativno kontrolno antitelo (10 mg/kg). Na dane 14 i 17, von Frey ocene su ponovo testirane i bile su više kod životinja tretiranih sa Ab2 nego kod kontrola (SL. 42, srednja grupa stubića i desna grupa stubića, respektivno).
[0531] Ovi rezultati pokazuju da tretman anti-CGRP antitelom kao što je Ab2 može da pomogne ili ublaži neuropatski bol.
Referentni primer 10 Prvi eksperiment za procenu efekta primene anti-CGRP antitela na analgeziju (model povlačenja repa)
[0532] Tri različita eksperimenta (Primeri 10-12) su izvedena za procenu potencijalne efikasnosti primene anti-CGRP antitela na analgeziju ili bol. U svim ovim eksperimentima model odgovora povlačenja repa glodara (takođe označeno kao povlačenje repa) koji je korišćen kao odgovor povlačenja repa glodara na toplotu zračenja je uobičajeno korišćen model za detekciju potencijalno korisnih analgetičkih sredstava. Ova analiza je naročito korisna za razlikovanje centralno delujućih analgetika sličnih morfinu (aktivnih) i neopioidnih ili periferno delujućih anti-inflamatornih sredstava (neaktivnih). Ovaj životinjski model i metode i materijali ovde korišćeni opisani su u daljem tekstu.
Materijal i metode
[0533]
Životinje: Mužjaci Sprague Dawley pacova težine 150 ± 20 g.
Test CGRP antitelo: Ab2
Vehikulum: 15 mM Histidin 250 mM Sorbitol, pH 5.5
Analgetičko jedinjenje: morfin
Postupci odgovora povlačenja repa: Vreme (sekunde) potrebno za izazivanje odgovora povlačenja repa indukovanog fokusiranim toplotnim zračenjem je mereno kao prag bola u grupama 10 Sprague Dawley mužjaka pacova telesne težine 150 ± 20 g. Početno testiranje za odgovor povlačenja repa je izvedeno na dan 0. Pacovi koji imaju odgovor povlačenja repa od 3-5 sekundi su uključeni u studiju i dodeljeni u izbalansirane grupe tretmana na bazi polaznih odgovora povlačenja repa. Granica od 15 sekundi je korišćena za izbegavanje oštećenja tkiva.
Razvoj tolerancije na morfin
[0534] Svaka od 3 grupe od 10 mužjaka Sprague Dawley pacova su dozirane 2 x dnevno preko i.p. primene vehikuluma fiziološkog rastvora (2 ml/kg) ujutrui i uveče. Jedna od 3 grupa je dodatno primila i.p. analgetik (morfin) u dozi od 5 mg/kg 2 x dan u trajanju od 7 uzastopnih dana. Druga od 3 grupe pacova je primala i.p. anti-CGRP antitelo prema opisu (Ab2) u dozi od 10 mg/kg kao jedan bolus na dan 0. Pacovi u različitim grupama su zatim svaka testirane za odgovor povlačenja repa jednom na dan 30 min posle jutarnje doze.
[0535] Jednofaktorska ANOVA praćena Dunnett-ovim t-testom je primenjena za poređenje između grupa tretiranih kontrolom vehikulumom i test jedinjenjem. P<0.05 je smatran značajnim.
[0536] Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 43. Rezultati u njima pokazuju da je test CGRP antitelo kada je primenjeno u 10 mg/kg izazvalo značajan dugotrajan analgetički efekat na stimulus termalnog bola. Terminalni uzorci krvi su uzeti iz svih testiranih pacova preko kardijačne punkture i kasnije su analizirani u odnosu na titar Ab2.
Referentni primer 11: Drugi eksperiment povlačenja repa koji procenjuje efekat CGRP antitela na analgeziju) (Titracija doze antitela)
[0537] Druga grupa eksperimenata povlačenja repa izvedena je za procenu efekata različitih doza anti-CGRP antitela na analgeziju upotrebom anti-CGRP antitela prema opisu (Ab2). Pacovi korišćeni u ovim eksperimentima su istog tipa kao u prethodnom eksperimentu i protokol povlačenja repa je značajno isti. U ovom eksperimentu analgezija je upoređivana u različitim grupama životinja koje su primale različite doze anti-CGRP antitela u cilju procene da li doza ima efekat na analgeziju. U drugoj grupi eksperimenata, pet grupa test životinja su upoređivane na sledeći način. Iz prve kontrolne grupe životinja svaka je primila samo vehikulum (15 mM Histidin 250 mM Sorbitol, pH 5.5), iz 3 grupe životinja svaka je primila različite doze istog anti-CGRP antitela sadržanog u vehikulumu (Ab2, respektivno primenjenog u dozama od 1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg na dan 0), i peta grupa životinja je primila 10 mg/kg negativnog kontrolnog antitela (anti-digitoksin antitela) takođe na dan 0.
[0538] Protokoli povlačenja repa su inače značajno postignuti kao što je opisano u prethodnom tekstu. Rezultati su ponovo procenjivani upotrebom jednofaktorske ANOVA praćene Dunnett-ovim t-testom za poređenje između grupa tretiranih kontrolom vehikulumom, negativnim kontrolnim antitelom i test-CGRP antitelom. P<0.05 je smatran značajnim.
[0539] Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 44. Iz toga se može videti da su više doze antitela test jedinjenja (inventivno Ab2 anti-CGRP antitelo) izazvale bolje analgetičke efekte od nižih doza. Kao što je očekivano negativno kontrolno antitelo nije izazvalo primetan efekat na analgeziju u odnosu na kontrolne grupe.
Referentni primer 12: Treći eksperiment povlačenja repa koji procenjuje efekat ko-primene anti-CGRP antitela/morfina na analgeziju
[0540] Treća grupa eksperimenata povlačenja repa takođe je izvedena za procenu efekata koprimene anti-CGRP antitela/morfina na analgeziju. U ovim eksperimentima prva grupa životinja je primila samo isti vehikulum u dozi od 5 ml/kg. Druga grupa životinja je primila morfin na dane 1-10 u dozi od 5 mg/kg, primenjenu dva puta na dan, pri čemu su takve životinje na dan 0 takođe primile anti-CGRP antitelo Ab2 u dozi od 10 mg/kg. Treća grupa životinja je primila morfin samo na dane 1-4 ponovo u koncentraciji od 5 mg/kg, primenjenoj dva puta na dan, i dalje su primile Ab2 antitelo na dan 0, u dozi od 10 mg/kg. Sve primene su bile i.p.
[0541] Eksperimenti povlačenja repa su izvođeni u svim ovim grupama životinja svaki dan od dana 0-10. Rezultati ovih eksperimenata povlačenja repa su ponovo procenjivani upotrebom jednofaktorske ANOVA praćene Dunnett t-testom za poređenje između grupa tretiranih kontrolom vehikulumom, negativnim kontrolnim antitelom i test anti-CGRP antitelom. P<0.05 je smtrano značajnim.
[0542] Rezultati ovih poređenja su rezimirani na slici 45. Životinje tretirane sa Ab2 koje primaju dnevnu dozu morfina preko eksperimenta ispoljile su toleranciju na morfin, i posle dana 5 vreme povlačenja repa se skratilo skoro do nivoa kontrolnih životinja tretiranih vehikulumom. Nasuprot tome, kod životinja tretiranih Ab2 koje primaju morfin samo do dana 4, vreme povlačenja repa se poboljšalo na dan 5 i ostalo je poboljšano do dana 8. Ovi rezultati sugerišu da primena anti-CGRP antitela može imati analgetičke efekte čak posle početka tolerancije morfina, koja može biti izraženija posle ukidanja morfina.
Referentni primer 13 Olakšanje visceralnog bola kod pacova
[0543] Pacijenti koji pate od sindroma iritabilnog creva (IBS) pokazuju niži visceralni senzorni prag na distenziju kolorektalnog balona (Ritchie, Gut, 1973, 14:125-32). Sugerisano je da kod IBS postoji povećana osetljivost na bol ose mozak-creva, sa normalnim obrascem aktivacije. Prethodno je pokazano da je injekcija trinitrobenzen sulfonske kiseline (TNBS) u proksimalno debelo crevo izazvala hroničnu hipersenzitivnost debelog creva, merenu kod svesnih pacova preko smanjenog praga bola kao odgovor na distenziju debelog creva (Diop et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002, 302:1013-22). Ova hronična hipersenzitivnost je nađena u distalnom neupaljenom debelom crevu i trajala je 21 dan. Ona je imitirala određene karakteristike IBS i tako se može koristiti kao model za eksperimentlano istraživanje patofizioloških aspekata ovog poremećaja. Ova analiza je korišćena za određivanje potencijalnih antihipersenzitivnih efekata jedinjenja za TNBS-indukovanu hipersenzitivnost debelog creva.
[0544] Nekoliko studija je impliciralo CGRP u visceralnom bolu (Friese et al., Regul Pept 1997;70:1-7; Gschossmann et al., Neurogastroenterol Motil 2001;13:229-36; Julia and Bueno, Am J Physiol 1997;272:G141-6; Plourde et al., Am J Physiol 1997; 273:G191-6). CGRP je najobilniji peptid kapsaicin senzitivnih aferentnih vlakana gastrointestinalnog porekla, čineći do 80% ukupne peptidne imunoreaktivnosti (Clague et al., Neurosci Lett 1985;56:63-8; Sternini et al., Gastroenterology 1987;93:852-62). Dodatno, injekcija CGRP indukuje hipersenzitivnost debelog creva u TNBS modelu (Delafoy et al., 2006, Gut 55:940-5), čija je revezija izvršena pomoću CGRP antagonističkog peptida (CGRP 8-37).
[0545] Ovaj primer opisuje testiranje anti-CGRP antitela u modelu visceralnog bola (TNBS-indukovana hronična hipersenzitivnost debelog creva) kod pacova.
Metode
[0546] Mužjaci Sprague-Dawley pacova, težine 390 do 450 g na dan operacije su uključeni u ovu studiju. Oni su smešteni u sobu sa kontrolisanim temperaturom (19.5°C - 24.5°C) i relativnom vlažnošću (45 % - 65 %) sa 12 časovnim – ciklusom svetlosti/mraka. Životinje su smeštene 2 ili 3 po kavezu i period aklimatizacije (najmanje 5 dana) je posmatran pre testiranja. Svaki pacov je identifikovan pomoću obeležavanja repa. Studija je izvedena prema uputstvima Komiteta za istraživanje i etička pitanja I.A.S.P. (1983) i evropskim uputstvima 2010/63/UE.
[0547] Senzitivnost debelog creva je indukovana hirurškom primenom trinitrobenzen sulfonske kiseline (TNBS, 50 mg/kg) 7 dana pre bihejvioralnog testiranja. Životinje koje su gladovale (24 časa) su podvrgnute operaciji. Ukratko, pod anestezijom (acepromazin 5 mg/kg / Ketamin 30 mg/kg), injekcija TNBS (50 mg/kg, 1 ml/kg) je data u proksimalni deo debelog creva (1 cm od cekuma). Posle operacije, životinje su vraćene u njihove kaveze u regulisanoj sredini, i hranjene ad libitum do dana testiranja, 7 dana kasnije. "Naivne" životinje (pacovi bez operacije) su postavljene u iste uslove smeštaja.
[0548] Na životinje je primenjeno anti-CGRP antitelo Ab2 ili negativno kontrolno antitelo (oba u 10 mg/kg) intravenski 24 časa pre određivanja praga debelog creva. Tri grupe pacova su uključene u ovu studiju:
Grupa 1: "Naivna" grupa se sastojala od životinja koje nisu podvrgnute operaciji ili TNBS tretmanu na D-7 i tretirana je kontrolnim antitelom 24 časa pre (tj. D-1) testiranja (tj. merenja praga distenzije debelog creva na D0) (n=7).
Grupa 2: "TNBS" grupa se sastojala od životinja koje nisu podvrgnute operaciji na D-7 i tretirana je kontrolnim antitelom (24 časa pre (tj. D-1) testiranja (tj. merenja praga distenzije debelog creva na D0) (n=8).
Grupa 3: "Tretirana" grupa se sastojala od životinja koje nisu podvrgnute operaciji na D-7 i tretirana je sa Ab2 24 časa pre (tj. D-1) dana testiranja (tj. merenja praga distenzije debelog creva na D0) (n=8).
[0549] Sedam dana (D7) posle TNBS injekcije, senzitivnost debelog creva je procenjivana merenjem pritiska unutar debelog creva potrebnog za indukciju bihejvioralnog odgovora u toku distenzije debelog creva kao posledica naduvavanja balona uvedenog u debelo crevo. Testovi su izvedeni od strane slepog eksperimentatora. Ovaj odgovor je okarakterisan povećanjem zadnjeg dela životinjskog tela i jasno vidljivom abdominalnom kontrakcijom koja odgovara teškim kontrakcijama (Al Chaer et al., Gastroenterology 2000, 119:1276-1285) i korišćen kao marker bola (Bourdu et al., Gastroenterology. 2005:128, 1996-2008). Balon (5 cm) je inseriran intrarektalno na minimalno invanzivan način do 10 cm od anusa budnih životinja koje su gladovale (24 časa), i kateter je zalepljen za bazu repu. Pacovi su zatim postavljeni u sredinu kutije od pleksiglasa i kateter je povezan sa elektronskim barostat aparatom. Posle 30 min-perioda aklimatizacije sa inseriranim balonom, pritisak u debelom crevu je postepeno povećavan za 5 mmHg korake svakih 30 sekundi od 5 do 75 mmHg (granični) sve dok nije zabeleženo ponašanje bola. Izvedena su četiri određivanja, 30 min, 50 min, 70 min i 90 min posle insercije balona.
[0550] Upotrebom podataka iz svakog testa, procenat aktivnosti na hipersenzitivnost debelog creva indukovana primenom TNBS unutar debelog creva je izračunavan na sledeći način.
[0551] Prag distenzije tretiranih je aritmetička sredina vrednosti za "tretiranu" grupu; Prag distenzije TNBS je aritmetička sredina vrednosti za "TNBS" grupu; i Prag distenzije naivnih je aritmetička sredina vrednosti za "naivnu" grupu.
Rezultati
[0552] Sposobnost anti-CGRP antitela da ublaži visceralni bol je testirana u modelu pacova u kome je hronična hipersenzitivnost debelog creva indukovana primenom TNBS. Visceralni bol je kvantitativno određen merenjem praga distenzije debelog creva, tj., količine abdominalnog pritiska koje bi životinje mogle da tolerišu pre ispoljavanja bihejvioralnog odgovora (mišićna kontrakcija). Više vrednosti praga distenzije debelog creva ukazuju na manju senzitivnost. Kao što je očekivano, TNBS tretman rezultovao je u veoma smanjenom pragu distenzije debelog creva u poređenju sa naivnim životinjama (SL. 46, uporediti srednji stubić (TNBS tretirani) i levi stubić (naivni)). Primena Ab2 poboljšala je prag distenzije debelog creva u poređenju sa kontrolnim životinjama (SL.46, uporediti desni stubić (tretirani Ab2) i srednji stubić (kontrola)). Poboljšanje od primene Ab2 bilo je statistički značajno (p < 0.05 Student-ov t-test, poređenje sa TNBS negativnom kontrolnom grupom). Anhipersenzitivna aktivnost Ab2 je izračunata kao 27% (indikativna za stepen ublažavanja TNBS-indukovane hipersenzitivnosti).
[0553] Ovi rezultati sugerišu da anti-CGRP antitela mogu biti korisna u prevenciji ili ublažavanju visceralnog bola.

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Anti-humano CGRP antitelo koje sadrži polipeptid lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 52 i polipeptid teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 54.
2. Anti-humano CGRP antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da je navedeno anti-humano CGRP antitelo proizvedeno preko ekspresije u sisarskim ili ćelijama kvasca.
3. Anti-humano CGRP antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koje: (i) je aglikozilovano;
(ii) je glikozilovano, ali sadrži samo manozne ostatke; ili
(iii) nije N-glikozilovano.
4. Anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koje:
(i) je direktno ili indirektno vezano za detektabilni obeleživač ili terapeutsko sredstvo; ili (ii) dalje sadrži efektornu grupu koja je detektabilna grupa ili funkcionalna grupa, naznačeno time da navedena detektabla grupa je izborno fluorescentna boja, enzim, supstrat, bioluminescentni materijal, radioaktivni materijal ili hemiluminescentni materijal i navedena funkcionalna grupa je izborno streptavidin, avidin, biotin, citotoksin, citotoksično sredstvo ili radioaktivni materijal.
5. Anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koje se specifično vezuje za humane ćelije koje eksprimiraju CGRP i/ili se vezuje za cirkulišuće rastvorljive CGRP molekule in vivo i/ili se specifično vezuje za CGRP eksprimiran na ili od strane humanih ćelija u pacijentu sa bolešću povezanom sa ćelijama koje se vezuju za CGRP, naznačeno time da je bolest izabrana od migrene sa aurom, migrene bez aure, stanja okarakterisanog time da CGRP izaziva bol, gubitka telesne težine, kancera, tumora, hiperaktivne bešike, urinarne inkontinencije, pruritusa, psorijaze, čira, hroničnih migrena, čestih epizodnih migrena, menstrualnih migrena, hemiplegičnih migrena, klaster glavobolja, migrenozne neuralgije, hroničnih glavobolja, tenzionih glavobolja, opštih glavobolja, naleta vrućine, hronične paroksizomalne hemikranije, kranijalne neuralgije, sinusnih glavobolja, glavobolja indukovanih alergijom, migrena indukovanih alergijom, bola, poremećaja temporomandibularne vilice, inflamatornog bola, visceralnog bola, post-operativnog incizionog bola, sindroma složenog regionalnog bola, bola od kancera, bola od primarnog kancera kostiju, bola od metastaziranog kancera kostiju, bola od frakture, bola od osteoporotičke frakture, bola koji je rezultat opekotina, osteoporoze, bola od gihta zglobova, bola povezanog sa bolešću srpastih ćelija, bola povezanog sa hepatoćelijskim karcinomom, bola povezanog sa kancerom dojke, bola povezanog sa cirozom jetre, neurogenog bola, neuropatskog bola, nociceptivnog bola, trigeminalne neuralgije, post-herpetičke neuralgije, bola fantomskog uda, fibromijalgije, menstrualnog bola, ovarialgije, refleksne simpatičke distrofije, osteoartitičkog bola, bola od reumatoidnog artritisa, bola donjeg dela leđa, dijabetičke neuropatije, išijasa, visceralnog bola povezanog sa gastro-ezofagealnim refluksom, dispepsijom, sindroma iritabilnog creva, inflamatorne bolesti creva, Crohn-ove bolesti, ileitisa, ulceroznog kolitisa, bubrežnih kolika, dismenoreje, cistitisa, prostatitisa i pankreatitisa; poželjno naznačeno time da je bolest izabrana od bola, visceralnog bola, sindroma temporomandibularnog zgloba (TMJ), poremećaja temporomandibularne vilice, glavobolje, hiperaktivne bešike, urinarne inkotinencije, klaster glavobolje i migrene; poželjnije, naznačeno time da je bolest izabrana od migrene sa aurom, migrene bez aure, hronične migrene, čestih epizodnih migrena ili menstrualnih migrena.
6. Sekvenca nukleinske kiseline ili sekvenca nukleinske kiseline koja kodira anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time da se sekvenca ili sekvence nukleinske kiseline izborno sastoje od kvaščevih ili humanih poželjnih kodona.
7. Vektor koji sadrži sekvencu ili sekvence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6, naznačen time da je vektor izborno plazmid ili rekombinantni virusni vektor.
8. Kultivisana ili rekombinantna ćelija koja eksprimira antitelo kodirano od strane sekvence ili sekvenci nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6 i/ili vektora prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time da je ćelija izborno izabrana od ćelije kvasca, sisara, bakterije, gljive ili insekta, gde je poželjno ćelija diploidna ćelija kvasca kao što je Pichia kvasac.
9. Anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, za upotrebu u lečenju, poboljšanju i/ili smanjenju simptoma bolesti ili stanja koji se tretiraju primenom terapeutski efikasne količine antagonista CGRP, naznačeno time da je bolest ili stanje izabrano od migrene sa aurom, migrene bez aure, stanja kod koga CGRP izaziva bol, hiperaktivne bešike, urinarne inkontinencije, hroničnih migrena, čestih epizodnih migrena, menstrualnih migrena, hemiplegičnih migrena, klaster glavobolja, migrenoznih neuralgija, hroničnih glavobolja, tenzionih glavobolja, opštih glavobolja, naleta vrućine, hronične paroksizomalne hemikranije, kranijalne neuralgije, sinusnih glavobolja, glavobolja indukovanih alergijom, migrena indukovanih alergijom, bola, sindroma temporomandibularne vilice (TMJ), poremećaja tempomandibularne vilice, inflamatornog bola, visceralnog bola, post-operativnog incizionog bola, sindroma složenog regionalnog bola, bola od kancera, bola od primarnog kancera kostiju, bola od metastaziranog kancera kostiju, bola od frakture, bola od osteoporotičke frakture, bola koji je rezultat opekotina, bola od gihta zglobova, bola povezanog sa bolešću srpastih ćelija, bola povezanog sa hepatoćelijskim karcinomom, bola povezanog sa kancerom dojke, bola povezanog sa cirozom jetre, neurogenog bola, neuropatskog bola, nociceptivnog bola, trigeminalne neuralgije, post-herpetičke neuralgije, bola fantomskog uda, fibromijalgije, menstrualnog bola, ovarialgije, refleksne simpatičke distrofije, osteoartitičkog bola, bola od reumatoidnog artritisa, bola donjeg dela leđa, dijabetičke neuropatije, išijasa, visceralnog bola povezanog sa gastro-ezofagealnim refluksom, pri čemu je bolest poželjno izabrana od hiperaktivne bešike; urinarne inkotinencije; bola; hroničnog bola; neurogene inflamacije i inflamatornog bola; neuropatskog bola; bola u oku; zubobolje; bola polse operacije, bola povezanog sa traumom, pri čemu je bolest poželjnije izabrana od bola, prekomernoa ktivne bešike, urinarne inkotinencije, glavobolje ili migrene.
10. Anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, za upotrebu u lečenju, poboljšanju i/ili redukciji simptoma migrene ili glavobolje.
11. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili patentnom zahtevu 10, naznačeno time se antitelo primenjuje sa drugim terapeutskim sredstvom.
12. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeno time da navedeno drugo terapeutsko sredstvo je izabrano od analgetika, anti-histaminika, anti-inflamatornog sredstva, antibiotika, hemoterapeutika, imunosupresanta, citokina, anti-proliferativnog sredstva, antiemetika ili citotoksina, pri čemu je analgetik izborno NSAID, opioidni analgetik ili antitelo ili fragment antitela, pri čemu je antitelo ili fragment antitela poželjno NGF antitelo ili fragment antitela, pri čemu je NSAID poželjno izabrano od inhibitora ciklooksigenaze 1 i/ili ciklooksigenaze 2; derivata propionske kiselne uključujući ibuprofen, naproksen, naprosin, diklofenak i ketoprofen; derivata sirćetne kiseline uključujući tolmetin i sulindak; derivata fenaminske kiseline uključujući mefenaminsku kiselinu i meklofenaminsku kiselinu; derivata bifenilkarboksilne kiseline uključujući diflunisal i flufenisal; i oksikama uključujući piroksim, sudoksikam i izoksikam, naznačeno time da je analgetik poželjno izabran od fenantrena; fenilheptilamina; fenilpiperidina; morfinana; i jedinjenja benzomorfana i pri čemu je opioidni analgetik poželjno izabran od kodeina, dihidrokodeina, diacetilmorfina, hidrokodona, hidromorfona, levorfanola, oksimorfona, alfentanila, buprenorfina, butorfanola, fentanila, sufentanila, meperidina, metadona, nalbufina, propoksifena, pentazocina ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, i morfina ili derivata morfina ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
13. Dijagnostički efikasna količina najmanje jednog anti-humanog CGRP antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u postupku in vivo vizuelizacije koja detektuje prisustvo ćelija koje eksprimiraju CGRP koji sadrži primenu navedenog najmanje jednog anti-humanog CGRP antitela, pri čemu navedena primena izborno dalje obuhvata primenu radionuklida ili fluorofora koji olakšava detekciju antitela kod stanja bolesti koji eksprimiraju CGRP i pri čemu da su rezultati izborno korišćeni za olakšavanje dizajna odgovarajućeg terapeutskog režima.
14. Postupak za pripremu antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, u poliploidnoj kulturi kvasca koja stabilno eksprimira i izlučuje u medijum kulture najmanje 10-25 mg/litru navedenog antitela, koji sadrži:
(i) uvođenje najmanje jednog ekspresionog vektora koji sadrži jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju navedeno antitelo operativno vezano za promotor i signalnu sekvencu u haploidnu ćeliju kvasca;
(ii) proizvodnju parenjem ili fuzijom sferoplasta poliploidnog kvasca od navedene haploidne ćelije kvasca;
(iii) selekciju poliploidnih ćelija kvasca koje stabilno eksprimiraju navedeno antitelo; i (iv) proizvodnju stabilnih poliploidnih kultura kvasca od navedenih poliploidnih ćelija kvasca koje stabilno eksprimiraju navedeno antitelo u medijumu kulture,
pri čemu je navedeni kvasac izborno vrsta Pichia koja je izabrana od Pichia pastoris, Pichia methanolica ili Hansenula polymorpha (Pichia angusta), pri čemu je vrsta Pichia poželjno Pichia pastoris.
15. Farmaceutska ili dijagnostička kompozicija koja sadrži najmanje jedno anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu navedena kompozicija izborno dalje sadrže najmanje jedan stabilizator i izborno je liofilizovana.
16. Anti-humano CGRP antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, za upotrebu u lečenju, poboljšanju i/ili redukciji simptoma bolesti ili poremećaja povezanog sa CGRP primenom terapeutski efikasne količine antagonista CGRP, pri čemu je bolest ili poremećaj onaj kod koga CGRP izaziva bol.
RS20190430A 2011-05-20 2012-05-21 Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba RS58621B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161488660P 2011-05-20 2011-05-20
PCT/US2012/038844 WO2012162243A2 (en) 2011-05-20 2012-05-21 Anti-cgrp compositions and use thereof
EP12789693.4A EP2710039B1 (en) 2011-05-20 2012-05-21 Anti-cgrp compositions and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58621B1 true RS58621B1 (sr) 2019-05-31

Family

ID=47175055

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211095A RS62306B1 (sr) 2011-05-20 2012-05-21 Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba
RS20190430A RS58621B1 (sr) 2011-05-20 2012-05-21 Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba
RS20210554A RS61793B1 (sr) 2011-05-20 2012-05-21 Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211095A RS62306B1 (sr) 2011-05-20 2012-05-21 Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210554A RS61793B1 (sr) 2011-05-20 2012-05-21 Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba

Country Status (38)

Country Link
US (10) US9745373B2 (sr)
EP (5) EP3662932B1 (sr)
JP (3) JP6282584B2 (sr)
KR (1) KR102128627B1 (sr)
CN (5) CN108373502B (sr)
AP (1) AP2013007259A0 (sr)
AR (3) AR086516A1 (sr)
AU (3) AU2012258966C1 (sr)
BR (2) BR112013029932A2 (sr)
CA (3) CA2836649C (sr)
CL (3) CL2013003336A1 (sr)
CO (1) CO6870005A2 (sr)
CY (2) CY1124209T1 (sr)
DK (3) DK3662932T3 (sr)
EA (3) EA031065B1 (sr)
ES (3) ES2873837T3 (sr)
FR (1) FR22C1032I2 (sr)
HR (3) HRP20190640T1 (sr)
HU (4) HUE055505T2 (sr)
IL (4) IL229431B (sr)
LT (4) LT2710039T (sr)
LU (1) LUC00270I2 (sr)
MX (3) MX370749B (sr)
NL (1) NL301181I2 (sr)
NO (1) NO2022029I1 (sr)
NZ (1) NZ733060A (sr)
PE (2) PE20180502A1 (sr)
PH (2) PH12013502405B1 (sr)
PL (3) PL3495392T3 (sr)
PT (3) PT3662932T (sr)
RS (3) RS62306B1 (sr)
SG (2) SG10201604040PA (sr)
SI (3) SI3662932T1 (sr)
SM (3) SMT201900293T1 (sr)
TR (1) TR201904088T4 (sr)
TW (4) TWI685505B (sr)
WO (1) WO2012162243A2 (sr)
ZA (1) ZA201308637B (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1957106B2 (en) 2005-11-14 2019-07-24 Teva Pharmaceuticals International GmbH Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
JP5537441B2 (ja) 2008-03-04 2014-07-02 ファイザー・リミテッド 慢性疼痛を治療する方法
DK2709663T3 (da) * 2011-05-20 2019-05-20 Alderbio Holdings Llc Anvendelse af anti-CGRP-antistoffer og antistoffragmenter til forebyggelse eller inhibering af fotofobi eller aversion mod lys hos individer med behov herfor, især migrænikere
SG10201604040PA (en) 2011-05-20 2016-07-28 Alderbio Holdings Llc Anti-cgrp compositions and use thereof
US9855332B2 (en) 2011-05-20 2018-01-02 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to treat diarrhea in subjects with diseases or treatments that result in elevated CGRP levels
EP3754012A1 (en) 2013-03-15 2020-12-23 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibody purification and purity monitoring
SG10201906172XA (en) * 2013-07-03 2019-08-27 Alder Biopharmaceuticals Inc Regulation of glucose metabolism using anti-cgrp antibodies
US20170114122A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Alderbio Holdings Llc Regulation of glucose metabolism using anti-cgrp antibodies
US10556945B2 (en) 2014-03-21 2020-02-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
SI3119431T1 (sl) 2014-03-21 2024-06-28 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonistična protitelesa, usmerjena proti peptidu, povezanemu z genom za kalcitonin, in postopki za uporabo le-teh
MX2017013113A (es) 2015-04-16 2018-07-06 Alder Biopharmaceuticals Inc Anticuerpos anti-pacap y sus usos.
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
AR104847A1 (es) * 2015-06-17 2017-08-16 Lilly Co Eli Formulación de anticuerpo anti-cgrp
EA201890578A1 (ru) * 2015-09-24 2018-12-28 Тева Фармасьютикалз Интернэшнл Гмбх Предотвращение, лечение и снижение (персистирующей) посттравматической головной боли
TW201725212A (zh) * 2015-12-10 2017-07-16 第一三共股份有限公司 特異性於降鈣素基因相關胜肽的新穎蛋白
KR20180091930A (ko) * 2016-01-28 2018-08-16 일라이 릴리 앤드 캄파니 Cgrp 항체 및 그의 용도
CN108601833B (zh) 2016-02-01 2022-11-15 伊莱利利公司 甲状旁腺激素-抗rankl抗体融合化合物
CA3020839A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-pacap antibodies and uses thereof
PE20191148A1 (es) 2016-09-23 2019-09-02 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Tratamiento de la migrana refractaria
MX2019003338A (es) 2016-09-23 2019-09-26 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Tratamiento de cefalea en racimos.
US10766952B2 (en) 2017-03-02 2020-09-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for reducing migraine frequency in a subject in need thereof
CA3059612A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 John Mansell Compositions and methods for treating pain disorders
JP7339262B2 (ja) 2018-01-12 2023-09-05 アムジェン インコーポレイテッド Ｐａｃ１抗体及びその使用
US11274158B2 (en) * 2018-01-30 2022-03-15 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions for treating inflammatory or autoimmune diseases or conditions using calcitonin receptor activators
EP3755327A4 (en) * 2018-02-23 2021-11-24 REMD Biotherapeutics, Inc. CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE ANTAGONIST ANTIBODIES (CGRP)
WO2019231800A1 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 Eli Lilly And Company Anti-cgrp antibodies for treating menstrual-related migraines
US10899826B1 (en) * 2018-09-13 2021-01-26 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Pharmaceutical compositions for an anti-CGRP antagonist antibody
EP3674418A1 (en) * 2018-12-26 2020-07-01 Life Length S.L. Method for measuring telomere associated variables and uses thereof for the diagnosis and/or prognosis of telomeric-associated diseases
EP3908607A4 (en) * 2019-01-08 2022-10-05 H. Lundbeck A/S TREATMENT OF HEADACHES DUE TO DRUG OVERUSE USING ANTI-CGRP OR ANTI-CGRP-R ANTIBODIES
CR20210373A (es) * 2019-01-08 2021-08-19 H Lundbeck As Tratamiento agudo y tratamiento rápido de la cefalea usando anticuerpos anti-cgrp
CA3168643A1 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 Dandi Bioscience Inc. Polypeptide having antibacterial activity, composition for preventing or treating sepsis comprising same, and antibacterial composition
CA3133571A1 (en) * 2019-05-02 2020-11-05 Roger K. Cady Treatment of headache using anti-cgrp antibodies
CN114127110B (zh) * 2019-05-30 2022-07-01 山东博安生物技术股份有限公司 抗cgrp抗体及其应用
AU2020202454A1 (en) * 2020-04-06 2021-10-21 H. Lundbeck A/S Treatment of most bothersome symptom (MBS) associated with migraine using anti-CGRP antibodies
EP4301362A1 (en) 2021-03-02 2024-01-10 CGRP Diagnostics GmbH Treatment and/or reduction of occurrence of migraine
US20250109188A1 (en) 2021-08-24 2025-04-03 Cgrp Diagnostics Gmbh Preventative treatment of migraine
CN117813325A (zh) 2021-08-27 2024-04-02 H.隆德贝克有限公司 使用抗cgrp抗体治疗丛集性头痛
AU2023223603A1 (en) 2022-02-28 2024-08-22 Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg A CONJUGATE CONSISTING OF OR COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN OR A MANNAN.
EP4570913A1 (en) * 2022-08-11 2025-06-18 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-cgrp antibody and use
IT202300010371A1 (it) * 2023-05-23 2024-11-23 Alberto Chiarugi Inibitori della crescita tumorale
CN120899912A (zh) * 2024-05-07 2025-11-07 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种治疗自身免疫性疾病的方法和应用
CN118271438B (zh) * 2024-05-27 2024-08-30 上海宏成药业有限公司 抗cgrp抗体或其抗原结合片段及其用途
US20260001942A1 (en) 2024-06-21 2026-01-01 H. Lundbeck A/S Treatment of headache disorders and/or psychiatric symptoms using anti-cgrp antibodies, and compositions and methods related thereto

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3662333A (en) 1970-09-08 1972-05-09 Bendix Corp Hydraulic accumulator charge detector and indicating system
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5123197A (ja) 1974-08-21 1976-02-24 Hitachi Ltd Purosesugasukuromatogurafuno ondoseigyohoshiki
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE134631T1 (de) * 1983-06-15 1985-12-05 Roger Kingdom Craig Peptide, pharmazeutische zusammensetzungen, gene, vektoren, wirtorganismen, verfahren zu deren herstellung und diagnostische reagenzien.
JPS62129297A (ja) 1985-08-09 1987-06-11 Toyo Jozo Co Ltd カルシトニン遺伝子関連ペプチド誘導体
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5364841A (en) 1988-01-11 1994-11-15 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of obesity and essential hypertension and related disorders
US5266561A (en) 1988-01-11 1993-11-30 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of type 2 diabetes mellitus
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
FR2669336B1 (fr) 1990-11-20 1993-01-22 Adir Nouveaux derives d'oxazolo pyridines, leurs procedes de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE4227454C1 (de) * 1992-08-19 1994-02-03 Henning Berlin Gmbh Verfahren zur Früherkennung, zur Erkennung des Schweregrads sowie zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung einer Sepsis sowie Mittel zur Durchführung des Verfahrens
US5604260A (en) 1992-12-11 1997-02-18 Merck Frosst Canada Inc. 5-methanesulfonamido-1-indanones as an inhibitor of cyclooxygenase-2
US5409944A (en) 1993-03-12 1995-04-25 Merck Frosst Canada, Inc. Alkanesulfonamido-1-indanone derivatives as inhibitors of cyclooxygenase
AU6445894A (en) 1993-03-19 1994-10-11 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
US5436265A (en) 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
US5474995A (en) 1993-06-24 1995-12-12 Merck Frosst Canada, Inc. Phenyl heterocycles as cox-2 inhibitors
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5475995A (en) 1994-05-16 1995-12-19 Livingston; George G. Truck spare tire locking rod
US5616601A (en) 1994-07-28 1997-04-01 Gd Searle & Co 1,2-aryl and heteroaryl substituted imidazolyl compounds for the treatment of inflammation
ATE306930T1 (de) 1994-08-12 2005-11-15 Immunomedics Inc Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
JPH10504457A (ja) 1994-08-16 1998-05-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド カルシトニンレセプター
US5521213A (en) 1994-08-29 1996-05-28 Merck Frosst Canada, Inc. Diaryl bicyclic heterocycles as inhibitors of cyclooxygenase-2
US5593994A (en) 1994-09-29 1997-01-14 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Prostaglandin synthase inhibitors
US5552422A (en) 1995-01-11 1996-09-03 Merck Frosst Canada, Inc. Aryl substituted 5,5 fused aromatic nitrogen compounds as anti-inflammatory agents
FR2732221B1 (fr) 1995-03-28 1997-04-25 Oreal Utilisation d'un antagoniste de cgrp pour traiter les rougeurs cutanees d'origine neurogene et composition obtenue
US5510368A (en) 1995-05-22 1996-04-23 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl-3-indoleacetic acids as antiinflammatory drugs
US5604253A (en) 1995-05-22 1997-02-18 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US5639780A (en) 1995-05-22 1997-06-17 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl indol-3-yl butanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
JPH11512396A (ja) 1995-09-05 1999-10-26 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 化合物および方法
US5710024A (en) * 1996-07-23 1998-01-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotides that encode the calcitonin gene-related peptide receptor coponent factor (HOUNDC44)
CA2264942A1 (en) 1996-09-09 1998-03-12 Smithkline Beecham Corporation Compounds and methods
SK285631B6 (sk) 1996-09-10 2007-05-03 Dr. Karl Thomae Gmbh Modifikované aminokyseliny, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
WO1998056779A1 (en) 1997-06-13 1998-12-17 Smithkline Beecham Corporation 4-sulfinyl benzamides as calcitonin gene-related peptide receptor antagonists
US6956107B2 (en) 1998-02-20 2005-10-18 Tanox, Inc. Inhibitors of complement activation
AU6211499A (en) 1998-09-30 2000-04-17 Merck & Co., Inc. Benzimidazolinyl piperidines as cgrp ligands
WO2000023579A1 (en) 1998-10-22 2000-04-27 The Regents Of The University Of California Functionally assembled antigen-specific intact recombinant antibody and a method for production thereof
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1031350A1 (en) 1999-02-23 2000-08-30 Warner-Lambert Company Use of a gabapentin-analog for the manufacture of a medicament for preventing and treating visceral pain
US6313097B1 (en) 1999-03-02 2001-11-06 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Antagonists of calcitonin gene-related peptide
US6521609B1 (en) 1999-08-10 2003-02-18 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Use of CGRP antagonists and CGRP release inhibitors for combating menopausal hot flushes
KR100863630B1 (ko) 1999-09-25 2008-10-15 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 면역자극성 핵산
EP2341075A1 (en) 2000-03-01 2011-07-06 MedImmune, LLC Antibodies binding to the f protein of a respiratory syncytial virus (rsv)
US6406863B1 (en) 2000-06-23 2002-06-18 Genetastix Corporation High throughput generation and screening of fully human antibody repertoire in yeast
US20020162125A1 (en) 2001-03-06 2002-10-31 Anne-Marie Salmon Methods and compositions for the modulation of neurogenic inflammatory pain and physical opiate withdrawal
US20030181462A1 (en) 2001-08-17 2003-09-25 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Use of BIBN4096 in combination with other antimigraine drugs for the treatment of migraine
AU2002356469A1 (en) 2001-11-26 2003-06-10 Protemix Corp Ltd Methods of compositions for normalizing lipid levels in mammalian tissues
SI1527100T1 (sl) 2002-03-29 2009-12-31 Schering Corp Humana monoklonska protitelesa proti interlevkinu-5 in postopki in sestavki, ki jih obsegajo
WO2003093472A2 (de) 2002-05-06 2003-11-13 Grünenthal GmbH Cgrp bindende nukleinsäuren
US20040110170A1 (en) 2002-05-18 2004-06-10 The Regents Of The University Of California Cloning and characterization of calcitonin gene related peptide receptors
US7345065B2 (en) 2002-05-21 2008-03-18 Allergan, Inc. Methods and compositions for alleviating pain
DK1539766T3 (en) 2002-06-05 2017-04-03 Bristol Myers Squibb Co CALCITONIN GEN-RELATED PEPTIDE RECEPTOR ANTAGONISTS
EP1600459A3 (en) 2002-06-28 2005-12-07 Domantis Limited Ligand
NZ538615A (en) 2002-08-12 2008-03-28 Actavis Group Hf Use of CGRP antagonist compounds for treatment of psoriasis
UA80447C2 (en) 2002-10-08 2007-09-25 Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic
DE10250082A1 (de) 2002-10-25 2004-05-13 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Ausgewählte CGRP-Antagonisten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
EP1578799B8 (en) 2002-12-02 2011-03-23 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof
EP3539569A1 (en) 2002-12-24 2019-09-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using the same in treating pain associated with musculo-skeletal disorders
AU2004221891B2 (en) 2003-03-14 2009-11-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Monocyclic anilide spirohydantoin CGRP receptor antagonists
US7288559B2 (en) 2003-03-14 2007-10-30 Merck + Co, Inc. Carboxamide spirohydantoin CGRP receptor antagonists
WO2004082605A2 (en) 2003-03-14 2004-09-30 Merck & Co. Inc. Bicyclic anilide spirohydantoin cgrp receptor antagonists
AU2004222328B2 (en) 2003-03-14 2009-10-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Aryl spirohydantoin CGRP receptor antagonists
AU2004226018B2 (en) 2003-03-14 2009-08-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Benzodiazepine spirohydantoin CGRP receptor antagonists
JO2355B1 (en) 2003-04-15 2006-12-12 ميرك شارب اند دوم كوربوريشن Hereditary calcitonin polypeptide receptor antagonists
CN100572379C (zh) 2003-04-15 2009-12-23 麦克公司 Cgrp受体拮抗剂
WO2004097421A2 (en) 2003-04-29 2004-11-11 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with calcitonin receptor-like receptor (calcrl)
JP2007523870A (ja) 2003-07-15 2007-08-23 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド ヒドロキシピリジンｃｇｒｐ受容体拮抗薬
US8268582B2 (en) 2003-10-22 2012-09-18 Keck Graduate Institute Methods of synthesizing heteromultimeric polypeptides in yeast using a haploid mating strategy
US20080070239A1 (en) 2003-10-29 2008-03-20 University Of Rochester Detection of neureopeptides associated with pelvic pain disorders and uses thereof
US20090023644A1 (en) 2004-01-13 2009-01-22 Southard Jeffery L Methods of using cgrp for cardiovascular and renal indications
DE102004015723A1 (de) 2004-03-29 2005-10-20 Boehringer Ingelheim Pharma Ausgewählte CGRP-Antagonisten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
DE102004018794A1 (de) 2004-04-15 2005-10-27 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Ausgewählte CGRP-Antagonisten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
US7279471B2 (en) 2004-04-15 2007-10-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Selected CGRP-antagonists, process for preparing them and their use as pharmaceutical compositions
TWI432196B (zh) 2005-01-18 2014-04-01 Euro Celtique Sa 內臟痛的治療
EP1770091A1 (de) 2005-09-29 2007-04-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG CGRP-Antagonisten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
ITRM20050290A1 (it) 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
US20100144767A1 (en) 2005-08-25 2010-06-10 Wex Pharmaceuticals, Inc. Use of sodium channel blockers for the treatment of visceral pain or pain caused by cancer treatment
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
EP1957106B2 (en) * 2005-11-14 2019-07-24 Teva Pharmaceuticals International GmbH Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
US20070108378A1 (en) 2005-11-14 2007-05-17 Toru Terabayashi High pressure optical cell for a downhole optical fluid analyzer
ATE493412T1 (de) 2005-11-18 2011-01-15 Merck Sharp & Dohme Spirohydantoin-aryl-cgrp-rezeptorantagonisten
WO2007076336A1 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies
US9074352B2 (en) 2006-03-27 2015-07-07 John R. Ramun Universal control scheme for mobile hydraulic equipment and method for achieving the same
DK2021463T3 (en) 2006-05-19 2017-01-16 Alder Biopharmaceuticals Inc Culture method to obtain a cloned population of antigen-specific B cells
BRPI0712492A2 (pt) 2006-06-08 2012-08-21 Boehringer Ingelheim Int uso de antagonistas de cgpr e composição farmacêutica compreendendo antagonistas de cgpr.
CN101516875A (zh) 2006-07-21 2009-08-26 沃泰克斯药物股份有限公司 Cgrp受体拮抗剂
US8075902B2 (en) * 2007-01-03 2011-12-13 Michael Powell Diagnosis and treatment of cancer related to human dormancy
CA2688146C (en) 2007-05-21 2018-03-06 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies to il-6 and use thereof
WO2008144753A2 (en) 2007-05-21 2008-11-27 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies to tnf alpha and use thereof
WO2008144757A1 (en) 2007-05-21 2008-11-27 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
GB0725103D0 (en) * 2007-12-21 2008-01-30 Glaxo Group Ltd Novel compounds
JP5537441B2 (ja) 2008-03-04 2014-07-02 ファイザー・リミテッド 慢性疼痛を治療する方法
CA2716799C (en) 2008-03-04 2018-05-22 Pfizer Limited Methods of treating inflammatory pain
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
KR101519192B1 (ko) 2009-08-28 2015-05-11 리나트 뉴로사이언스 코프. 칼시토닌 유전자-관련된 펩티드에 대해 지시된 길항제 항체의 투여에 의한 내장 통증의 치료 방법
JO3330B1 (ar) 2010-06-10 2019-03-13 Lilly Co Eli الأجسام المضادة cgrp
US11214610B2 (en) * 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
DK2709663T3 (da) 2011-05-20 2019-05-20 Alderbio Holdings Llc Anvendelse af anti-CGRP-antistoffer og antistoffragmenter til forebyggelse eller inhibering af fotofobi eller aversion mod lys hos individer med behov herfor, især migrænikere
SG10201604040PA (en) * 2011-05-20 2016-07-28 Alderbio Holdings Llc Anti-cgrp compositions and use thereof
US9855332B2 (en) 2011-05-20 2018-01-02 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to treat diarrhea in subjects with diseases or treatments that result in elevated CGRP levels
US20170114122A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Alderbio Holdings Llc Regulation of glucose metabolism using anti-cgrp antibodies
EA201890578A1 (ru) 2015-09-24 2018-12-28 Тева Фармасьютикалз Интернэшнл Гмбх Предотвращение, лечение и снижение (персистирующей) посттравматической головной боли
US10766952B2 (en) * 2017-03-02 2020-09-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for reducing migraine frequency in a subject in need thereof
US11752099B2 (en) * 2017-03-27 2023-09-12 W. L. Gore & Associates, Inc. Injectable and biodegradable polymer formulations for controlled release of bioactive agents
EP3641746B1 (en) * 2017-06-19 2024-11-20 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating a microbial infection
TWI754772B (zh) * 2017-09-06 2022-02-11 美商美國禮來大藥廠 用於治療偏頭痛之拉米迪坦(lasmiditan)與cgrp拮抗劑之組合療法
CR20210373A (es) * 2019-01-08 2021-08-19 H Lundbeck As Tratamiento agudo y tratamiento rápido de la cefalea usando anticuerpos anti-cgrp
EP3908607A4 (en) 2019-01-08 2022-10-05 H. Lundbeck A/S TREATMENT OF HEADACHES DUE TO DRUG OVERUSE USING ANTI-CGRP OR ANTI-CGRP-R ANTIBODIES

Also Published As

Publication number Publication date
SI3495392T1 (sl) 2021-11-30
PT3495392T (pt) 2021-09-22
CA2836649A1 (en) 2012-11-29
US10208112B2 (en) 2019-02-19
EP3662932A1 (en) 2020-06-10
CN108373502A (zh) 2018-08-07
AU2012258966B2 (en) 2017-03-09
FR22C1032I2 (fr) 2023-06-02
CA2836649C (en) 2020-06-23
CN103748111A (zh) 2014-04-23
AR086516A1 (es) 2013-12-18
EA039905B1 (ru) 2022-03-25
EP4115905A1 (en) 2023-01-11
TWI685505B (zh) 2020-02-21
HUE055505T2 (hu) 2021-11-29
CN103748111B (zh) 2018-04-27
EP3495392B1 (en) 2021-08-18
NZ717570A (en) 2018-09-28
EA201301295A1 (ru) 2014-04-30
CL2013003336A1 (es) 2014-06-06
US20190092842A1 (en) 2019-03-28
HUE054437T2 (hu) 2021-09-28
AU2019226231A1 (en) 2019-09-26
AU2017203890B2 (en) 2019-06-06
HUS2200031I1 (hu) 2022-07-28
LT3495392T (lt) 2021-09-27
US10214582B2 (en) 2019-02-26
US20180215813A1 (en) 2018-08-02
IL229431A0 (en) 2014-01-30
US10179809B2 (en) 2019-01-15
SMT202100526T1 (it) 2021-11-12
AU2019226231B2 (en) 2021-06-03
JP6952736B2 (ja) 2021-10-20
US11111289B2 (en) 2021-09-07
TW202033559A (zh) 2020-09-16
ES2715001T3 (es) 2019-05-31
NZ733060A (en) 2022-08-26
US20240174738A1 (en) 2024-05-30
TWI646111B (zh) 2019-01-01
IL270382B (en) 2020-11-30
IL261927B (en) 2019-11-28
CO6870005A2 (es) 2014-02-20
US10066009B2 (en) 2018-09-04
US20120294797A1 (en) 2012-11-22
IL229431B (en) 2018-10-31
NL301181I2 (nl) 2022-11-24
US20210047391A1 (en) 2021-02-18
WO2012162243A2 (en) 2012-11-29
JP6527563B2 (ja) 2019-06-05
EA031065B1 (ru) 2018-11-30
NZ618637A (en) 2016-03-31
US10533048B2 (en) 2020-01-14
EP3495392A1 (en) 2019-06-12
EP3662932B1 (en) 2021-04-07
NL301181I1 (sr) 2022-06-15
LT3662932T (lt) 2021-06-10
PL3662932T3 (pl) 2021-09-06
TWI692485B (zh) 2020-05-01
WO2012162243A3 (en) 2013-01-17
EP3875115A1 (en) 2021-09-08
CY1124515T1 (el) 2022-07-22
RS61793B1 (sr) 2021-06-30
PL3495392T3 (pl) 2021-12-13
KR20140042819A (ko) 2014-04-07
ES2893073T3 (es) 2022-02-07
CN108424452B (zh) 2021-08-03
MX2013013535A (es) 2015-08-20
DK3495392T3 (da) 2021-09-13
CY1124209T1 (el) 2022-05-27
PL2710039T3 (pl) 2019-07-31
AU2017203890A1 (en) 2017-06-29
SMT201900293T1 (it) 2019-07-11
PT3662932T (pt) 2021-05-14
EP2710039A2 (en) 2014-03-26
MX2019015745A (es) 2020-02-13
PH12018500521A1 (en) 2019-04-15
AU2012258966C1 (en) 2022-02-03
CA3080000A1 (en) 2012-11-29
HRP20210777T1 (hr) 2021-06-25
US20170174754A1 (en) 2017-06-22
JP2014517699A (ja) 2014-07-24
PT2710039T (pt) 2019-04-23
IL261927A (en) 2018-10-31
NO2022029I1 (no) 2022-07-08
US20190211085A1 (en) 2019-07-11
JP6282584B2 (ja) 2018-02-21
IL268464A (en) 2019-09-26
CN108373502B (zh) 2022-03-22
US20180215816A1 (en) 2018-08-02
EA201592042A1 (ru) 2016-03-31
MX2019008185A (es) 2019-09-09
JP2019150044A (ja) 2019-09-12
ZA201308637B (en) 2022-11-30
TW201936642A (zh) 2019-09-16
EP2710039A4 (en) 2014-11-19
JP2018038391A (ja) 2018-03-15
PH12013502405A1 (en) 2014-02-10
CN107586338A (zh) 2018-01-16
PE20141787A1 (es) 2014-12-07
US20180215815A1 (en) 2018-08-02
CN107602700B (zh) 2021-12-17
SG10201604040PA (en) 2016-07-28
RS62306B1 (sr) 2021-09-30
CN108424452A (zh) 2018-08-21
MX370749B (es) 2019-12-20
CA3079978A1 (en) 2012-11-29
SI3662932T1 (sl) 2021-08-31
TW201811835A (zh) 2018-04-01
PE20180502A1 (es) 2018-03-09
TW201300419A (zh) 2013-01-01
ES2873837T3 (es) 2021-11-04
SI2710039T1 (sl) 2019-05-31
KR102128627B1 (ko) 2020-06-30
HRP20190640T1 (hr) 2019-05-31
BR122022012930B1 (pt) 2023-10-10
TR201904088T4 (tr) 2019-05-21
CN107586338B (zh) 2021-09-17
LTC3495392I2 (sr) 2024-12-10
FR22C1032I1 (fr) 2022-09-09
BR112013029932A2 (pt) 2017-01-31
HRP20211395T1 (hr) 2021-12-10
SG194938A1 (en) 2013-12-30
IL268464B (en) 2020-10-29
US9745373B2 (en) 2017-08-29
LT2710039T (lt) 2019-04-25
AR118605A2 (es) 2021-10-20
TWI719869B (zh) 2021-02-21
DK3662932T3 (da) 2021-05-17
HUE044062T2 (hu) 2019-09-30
LUC00270I2 (sr) 2025-04-25
PH12013502405B1 (en) 2018-11-07
LTPA2022511I1 (sr) 2022-07-11
AR123876A2 (es) 2023-01-18
US10189895B2 (en) 2019-01-29
AP2013007259A0 (en) 2013-11-30
CL2018001452A1 (es) 2018-08-10
US20180215814A1 (en) 2018-08-02
SMT202100274T1 (it) 2021-07-12
CN107602700A (zh) 2018-01-19
EA201891284A1 (ru) 2018-11-30
EP2710039B1 (en) 2019-01-09
CL2017001379A1 (es) 2017-12-29
DK2710039T3 (en) 2019-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240174738A1 (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
AU2012258966A1 (en) Anti-CGRP compositions and use thereof
HK40055862A (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
HK40084193A (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
HK40029921A (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
HK40029921B (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
HK40009778A (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
HK40009778B (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
NZ618637B2 (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
NZ717570B2 (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
OA18167A (en) Anti-CGRP compositions and use thereof
HK1196829B (en) Anti-cgrp compositions and use thereof
HK1196829A (en) Anti-cgrp compositions and use thereof