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CN120077071A - 抗vista构建体及其用途 - Google Patents

抗vista构建体及其用途 Download PDF

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CN120077071A
CN120077071A CN202380074211.7A CN202380074211A CN120077071A CN 120077071 A CN120077071 A CN 120077071A CN 202380074211 A CN202380074211 A CN 202380074211A CN 120077071 A CN120077071 A CN 120077071A
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CN
China
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amino acid
acid sequence
seq
vista
chain variable
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Pending
Application number
CN202380074211.7A
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English (en)
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陈梓榕
F·韩
J·李
A·诺顿
Z·夏
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Dangkang Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Dangkang Biotechnology Co ltd
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Application filed by Dangkang Biotechnology Co ltd filed Critical Dangkang Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请提供了与VISTA结合的抗VISTA构建体(例如，抗VISTA抗体)、编码所述抗VISTA的氨基酸序列的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、含有所述载体的宿主细胞、制备所述抗VISTA构建体的方法、含有所述抗VISTA构建体的药物组合物以及所述抗VISTA构建体或组合物的使用方法。

Description

抗VISTA构建体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年9月7日提交的美国临时申请63/404,470的优先权，该临时申请的内容以引用的方式整体并入用于所有目的。
对电子序列表的引用
电子序列表(193852000740SEQLIST.xml；大小：60,285字节；创建日期：2023年9月6日)的内容以引用的方式全文并入本文。
技术领域
本公开涉及抗VISTA构建体(诸如抗VISTA抗体)及其用途。
背景技术
VISTA(也称为程序性死亡-1同源物、PD-1H、VSIR、Dies1、DD1α、Gi24)是在T细胞和骨髓细胞上表达的B7/CD28基因家族的细胞表面抑制性分子。VISTA可以作为抗原呈递细胞(APC)上的抑制性配体发挥作用，并且通过未知受体来调节T细胞反应。此外，VISTA还可以作为T细胞上的抑制性受体发挥作用。例如，激动性VISTA单克隆抗体(mAb)显著调节抗原特异性CD4+T细胞反应，并且保护小鼠免受移植物抗宿主病(GVHD)和实验性肝炎的侵害。在C57BL/6背景下VISTA缺陷的小鼠(B6 PD-1H KO)在与易患狼疮的品系回交时更容易受到自身免疫诱导(诸如实验性自身免疫性脑脊髓炎和系统性狼疮)的影响。研究表明，VISTA涉及外周免疫耐受性并且负向调节T细胞活化。参见例如，Sci Transl Med.2019年12月11日；11(522)。
本文所提及的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。
发明内容
本申请在一个方面提供了一种抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)VH包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的LC-CDR3，其中VH包含SEQ ID NO:53-57中的任一者的氨基酸序列，并且其中VL包含SEQ ID NO:58-62中的任一者的氨基酸序列；或者b)VH包含含有SEQ ID NO:1-3中的任一者的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:4-6中的任一者的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:8-10中的任一者的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:11-13中的任一者的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3，其中VH包含SEQ ID NO:16-30中的任一者的氨基酸序列，并且其中VL包含SEQ ID NO:32-44中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:53-57中的任一者的氨基酸序列，并且其中VL包含SEQ ID NO:58-62中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQID NO:55的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，VH包含SEQ IDNO:16-30中的任一者的氨基酸序列，并且其中VL包含SEQ ID NO:32-44中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且VL包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQID NO:17的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且VL包含SEQID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQID NO:23的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且VL包含SEQID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，抗体部分是选自由以下各项组成的组的抗体或其抗原结合片段：全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双抗体、三抗体和四抗体。在一些实施方案中，抗体部分是全长抗体。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，抗体部分具有选自由以下Fc片段形式组成的组的Fc片段：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM以及它们的组合和杂合体。在一些实施方案中，Fc片段选自由以下组成的组：来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4以及它们的组合和杂合体的Fc片段。在一些实施方案中，Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有降低的效应子功能。在一些实施方案中，Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有延长的半衰期。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，抗VISTA构建体的抗体部分活化VISTA的下游信号传导通路。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，抗VISTA构建体是VISTA的激动性抗体。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，抗VISTA构建体的抗体部分活化或增加VISTA的下游信号传导通路至少约20％。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，抗VISTA构建体是VISTA的拮抗性抗体。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，VISTA是人VISTA。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，抗VISTA构建体抑制PBMC和/或T细胞活化至少20％。
在根据上文所述的抗VISTA构建体中的任一种的一些实施方案中，抗VISTA构建体减少IL-17A的产生至少30％。
本申请在另一个方面提供了药物组合物，所述药物组合物包含上文所述的抗VISTA构建体中的任一种和药学上可接受的载剂。
本申请在另一个方面提供了分离的核酸，所述分离的核酸编码上文所述的抗VISTA构建体中的任一种。
本申请在另一个方面提供了载体，所述载体包含上文所述的分离的核酸中的任一种。
本申请在另一个方面提供了分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含上文所述的分离的核酸和/或载体中的任一种。
本申请在另一个方面提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物包含连接至治疗剂或标记的上文所述的抗VISTA构建体中的任一种。
本申请在另一个方面提供了产生抗VISTA构建体的方法，其中所述方法包括a)在可有效表达抗VISTA构建体的条件下培养上文所述的分离的宿主细胞中的任一种；以及b)从宿主细胞获得表达的抗VISTA构建体。
本申请在另一个方面提供了治疗个体的疾病或疾患的方法，所述方法包括向个体施用有效量的上文所述的抗VISTA构建体中的任一种，或上文所述的药物组合物中的任一种。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患与活化的T细胞有关。在一些实施方案中，活化的T细胞是CD3+CD25+T细胞和/或CD45+T细胞。在一些实施方案中，疾病或疾患与VISTA阳性细胞有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，抗VISTA构建体静脉内或皮下施用于个体。在一些实施方案中，抗VISTA构建体以约0.001mg/kg至约100mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，抗VISTA结构与第二剂一起施用。在一些实施方案中，第二剂是VISTA激动剂。在一些实施方案中，第二剂是VISTA配体。在一些实施方案中，第二剂是多肽。在一些实施方案中，VISTA配体包含VSIG3或其片段。在一些实施方案中，VSIG3或其片段与Fc结构域融合。
本申请在另一个方面提供了试剂盒，所述试剂盒包括上文所述的抗VISTA构建体中的任一种。
附图说明
图1显示了示例性抗VISTA抗体VH/VL组合的SDS-PAGE凝胶。凝胶在非还原条件下运行。
图2A-2E显示了使用荧光激活细胞分选术(FACS)检测的9E9和20E4亲本和人源化抗VISTA抗体针对表达人VISTA的Jurkat细胞的结合活性。
图3A-3F显示了使用荧光激活细胞分选术(FACS)检测的9E9和20E4亲本和人源化抗VISTA抗体针对表达小鼠VISTA的Jurkat细胞的结合活性。
图4A-4B显示了通过Octet检测的人源化9F9抗VISTA抗体与人VISTA的结合。
图4C显示了通过Octet检测的人源化20E4抗VISTA抗体与人VISTA的结合。
图5A-5B显示了通过Octet检测的人源化9F9抗VISTA抗体与小鼠VISTA的结合。
图5C显示了通过Octet检测的人源化20E4抗VISTA抗体与小鼠VISTA的结合。
图6A-6C描绘了在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞(人VISTA与hCD3z融合，hCD3z在细胞上表达)中，在存在抗CD3抗体(OKT3)的情况下，不同浓度的人源化9F9抗VISTA抗体对VISTA信号传导通路的活化。
图6D描绘了在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞中，在存在抗CD3抗体(OKT3)的情况下，不同浓度的人源化20E4抗VISTA抗体对VISTA下游通路的活化。人VISTA与hCD3z融合；VISTA通路的活化刺激细胞FITC信号。
图7描述了小鼠移植物抗宿主治疗模型中的实验方案的汇总。
图8显示了用同种型对照治疗的移植物抗宿主小鼠模型小鼠与用9F9或20E4抗VISTA抗体治疗的小鼠的体重随时间推移的变化。
图9显示了用同种型对照注射的移植物抗宿主小鼠模型小鼠与用9F9或20E4抗VISTA抗体治疗的小鼠的皮肤剥落程度。
图10显示了用同种型对照治疗的移植物抗宿主小鼠模型小鼠与用9F9或20E4抗VISTA抗体治疗的小鼠的血液中的人CD45+细胞的水平。在第14天和第37天收集样品。
图11显示了用同种型对照注射的小鼠与用人源化9E9或20E4抗VISTA抗体治疗的小鼠的血液中染色的CD45+细胞的前向和侧向散射。在第14天和第37天收集样品。
图12描述了小鼠移植物抗宿主治疗模型中的实验方案的汇总。
图13显示了用同种型对照与20E4 VH3/VL3抗VISTA抗体注射的移植物抗宿主小鼠模型小鼠的皮肤剥落程度。
图14A显示了第13天不同的治疗组中的人CD45+细胞的百分比。
图14B显示了第22天不同的治疗组中的人CD45+细胞的百分比。
图15A显示了9F9抗VISTA抗体对PBMC和T细胞活化的抑制。
图15B显示了20E4抗VISTA抗体对PBMC和T细胞活化的抑制。*表示p<0.05；**表示p<0.01。
图16显示了9F9和20E4 hIgG1和hIgG2抗体在咪喹莫特(imiquimod)(IMQ)诱导的银屑病样BALB/c-hVISTA小鼠模型中的功效。*表示p<0.05。
具体实施方式
本申请提供了特异性结合至VISTA的新型抗VISTA构建体、制备所述抗VISTA构建体的方法、使用所述构建体的方法(例如，治疗疾病或疾患的方法)。示例性抗VISTA构建体包括能够结合和活化VISTA的激动性抗体。
I.定义
术语“抗体”以其最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们展现所需抗原结合活性即可。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。
全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常含有被称为互补决定区(CDR)的三个高度可变的环(轻链(LC)CDR，包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；重链(HC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可由Kabat、Chothia或Al-Lazikani惯例(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia1989；Kabat1987；Kabat 1991)定义或鉴定。重链或轻链的三个CDR被间插在称为框架区(FR)的侧翼区段之间，该框架区比CDR更高度保守，并形成支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列分类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要抗体类别被分为亚类，诸如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。本文还设想了嵌合Fc区(诸如IgG2/4混合物)。
如本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫化物稳定的双抗体(ds双抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的部分形成的多特异性抗体、骆驼科单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、或结合至抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合至亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scFv)所结合的相同抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段可包含被移植到来自一种或多种不同人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个CDR。
“Fv”是含有完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由处于紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠产生六个高变环(从重链和轻链各自产生3个环)，该高变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基并且赋予抗体抗原结合特异性。然而，虽然亲和力通常比整个结合位点低，但即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的一半Fv)也能够识别并结合抗原。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”是包含连接成单条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，scFv多肽进一步包含在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构。关于scFv的综述，参见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意图是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原组合位点。这些特定区已由以下文献描述：Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人,U.S.Dept.of Health and HumanServices,“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指抗体或其接枝抗体或变体的CDR意图处于如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖由上述参考文献中每一者定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中作为比较。CDR预测算法和接口是本领域已知的，包括例如Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人,NucleicAcids Res.,38:D301-D307(2010)；以及Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。此段落中引用的参考文献的内容以引用的方式整体并入本文以供在本申请中使用并且可能包含在本文的一项或多项权利要求中。在一些实施方案中，本文提供的CDR序列是基于IMGT定义。例如，CDR序列可由VBASE2工具确定(http://www.vbase2.org/vbase2.php，还参见Retter I,Althaus HH,Münch R,Müller W:VBASE2,an integrative V gene database.Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(Databaseissue):D671-4，其以引用的方式整体并入本文)。
表1：CDR定义
1残基编号遵循Kabat等人，同上的命名法
2残基编号遵循Chothia等人，同上的命名法
3残基编号遵循MacCallum等人，同上的命名法
4残基编号遵循Lefranc等人，同上的命名法
5残基编号遵循Honegger和Plückthun，同上的命名法
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指Kabat等人(同上)中用于抗体编辑的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有较少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或高变区(HVR)的缩短或向其中的插入。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给予的抗体，残基的Kabat编号可以通过将抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定。
除非本文另有说明，免疫球蛋白重链中残基的编号是如Kabat等人(同上)中的EU索引的编号。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除如本文定义的CDR残基外的那些可变结构域残基。
“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物)抗体为含有来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(HVR)的残基被来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基所替换，该非人物种是诸如具有所需抗体特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在一些情况下，该人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体中或供体抗体中的残基。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个以及通常两个可变结构域，其中所有的或者基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有的或者基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。更多详细信息，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人抗体”是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体，和/或使用如本文公开的任何用于制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域中已知的各种技术包括噬菌体展示文库来产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,77(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中所述的方法。也参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过将抗原施用至转基因动物来制备人抗体，该转基因动物已被修饰成响应于抗原激发产生此类抗体，但其内源性基因座已被失能，例如经免疫异种小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利第6,075,181和6,150,584号)。关于通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，也参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
关于本文鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为在比对序列并且考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所比较的多肽中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的比对可以以在本领域技术人员的能力内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括为在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE生成氨基酸序列同一性值％(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMCBioinformatics5(1):113,2004)。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个被比较序列二者中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个DNA分子中的位置被腺嘌呤占据，则这些分子在该位置处是同源的。两个序列之间同源性的百分比是该两个序列共有的匹配或同源位置的数目除以所比较的位置的数目的函数乘以100。例如，如果两个序列中10个位置中有6个位置是匹配或同源的，则这两个序列为60％同源性。例如，氨基酸序列TKLEIK和TALGIE共有50％同源性。一般而言，当对两个序列进行比对以给出最大同源性时进行比较。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的相对于该免疫球蛋白的另一部分(可变结构域)(其包含抗原结合位点)具有更保守的氨基酸序列的部分。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以根据它们的恒定结构域的氨基酸序列被分配至两种明显不同的类型(称为卡帕(“κ”)和兰姆达(“λ”))之一。
“CH1结构域”(也称为“H1”结构域的“C1”)通常从大约氨基酸118延伸至大约氨基酸215(EU编号系统)。
“铰链区”通常被定义为对应于人IgG1的Glu216至Pro230的IgG中的区域(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。可通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置而将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列对齐。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“C2”结构域)通常从大约氨基酸231延伸至大约氨基酸340。CH2结构域是独特的，因为其不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N连接的支链碳水化合物链间插在完整原生IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可提供结构域-结构域配对的替代物，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3结构域”(也称为“C2”结构域)包含Fc区中残基C末端至CH2结构域的延伸(即从抗体序列的大约氨基酸残基341至C末端(通常在IgG的氨基酸残基446或447处))。
本文的术语“Fc区”或“可结晶片段区域”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括原生序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常定义为从位置Cys226处或从位置Pro230处的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统残基447)可以例如在生产或纯化抗体期间或通过重组工程化编码抗体重链的核酸除去。在一些情况下，Fc区的后续的C-末端甘氨酸(根据EU编号系统残基446)也可以被移除。因此，完整抗体的组合物可包含所有K447残基被去除的抗体群体、没有K447残基被去除的抗体群体以及具有含或不含K447残基的抗体混合物的抗体群体。用于本文所述的抗体的合适的原生序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是原生序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于它们的细胞质结构域。活化性受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文涵盖了新生儿Fc受体(FcRN)。本文的术语“FcR”也涵盖其它FcR，包括将来鉴定的FcR。
如本文所用的术语“表位”是指抗体或抗体部分所结合至的抗原上的特定原子或氨基酸组。如果两个抗体或抗体部分表现出对抗原的竞争性结合，则它们可结合抗原内的同一表位。
如本文所用，当在等摩尔浓度的第一抗体或其片段存在下第一抗体或其片段抑制第二抗体或其片段的靶抗原结合至少约50％(诸如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任一者)时，该第一抗体或其片段与该第二抗体或其片段“竞争”与靶抗原的结合，或者反之亦然。PCT公布号WO 03/48731中描述了基于抗体的交叉竞争对抗体进行“分箱”的高通量方法。
如本文中所用，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”和“对......具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，诸如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其决定了在包括生物分子在内的异质分子群体存在的情况下靶标的存在。例如，特异性地识别靶标(其可以是表位)的抗体或抗体部分是以比其与其它靶标的结合更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合此靶标的抗体或抗体部分。在一些实施方案中，抗体与无关靶标结合的程度小于该抗体与靶标结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量。在一些实施方案中，特异性地结合靶标的抗体具有≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10- 9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(KD)。在一些实施方案中，抗体特异性地结合蛋白质上的表位，该表位在来自不同物种的蛋白质中是保守的。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。可通过本领域已知的方法通过实验方式确定抗体或抗原结合结构域的结合特异性。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA、BIACORETM-测试和肽扫描。
“经分离的”抗体(或构建体)是已经从其产生环境的组分中鉴定、分开和/或回收的抗体(例如，天然的或重组的)。优选地，经分离的多肽不与来自其产生环境的所有其他组分相关联。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“经分离的”核酸分子是这样的核酸分子，该核酸分子是从通常在产生其的环境中与其相关联的至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离的。优选地，经分离的核酸不与同产生环境相关的所有组分相关联。编码本文所述的多肽和抗体的经分离的核酸分子的形式不同于其在自然界中被发现的形式或环境。因此，经分离的核酸分子与天然存在于细胞中的编码本文所述的多肽和抗体的核酸不同。经分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列，例如，包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸为“经可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌前导序列的DNA与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子与该序列可操作地连接；或者，如果核糖体结合位点被定位成便于翻译，则该核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是毗连的，并且在分泌前导序列的情况下，是毗连的并且位于阅读框中。然而，增强子并非必须是毗连的。连接是通过在方便的限制性位点处连结来完成的。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一核酸繁殖的核酸分子。该术语包括呈自我复制性核酸结构形式的载体以及并入至它已被引入至其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们所操作性地连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
如本文使用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入到宿主细胞的过程。“经转染的”或“经转化的”或“经转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代主题细胞和它的子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指已经引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此衍生的后代，而不考虑传代的次数。后代的核酸含量不可能与亲代细胞完全同一，并且可能含有突变。本文包括所筛选的或所选择的与初始转化的细胞具有相同功能或生物活性的突变体后代。
术语“免疫缀合物”包括对治疗剂或可检测标记与抗体(诸如本文所述的抗体部分)的共价连接的提及。连接可以是直接的，也可以是通过接头(诸如肽接头)的间接连接。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的途径。出于本申请的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于以下中的一项或多项：缓和由疾病引起的一种或多种症状、降低疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或完全)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、提高或改善生活质量、提高体重增加和/或延长存活期。本申请的方法设想了治疗的这些方面中的任一个或多个方面。
术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”是指任何表型特征的减少或停止，或者指该特征的发生率、程度或可能性的减少或停止。“减少”或“抑制”是指如与参考相比降低、减少或遏制活性、功能和/或量。在某些实施方案中，“减少”或“抑制”意指能够引起20％或更大的总体减少。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”意指能够引起50％或更大的总体减少。在又另一实施方案中，“减少”或“抑制”意指能够引起75％、85％、90％、95％或更大的总体减少。
如本文使用的“参考”是指用于比较目的的任何样本、标准或水平。参考可以从健康和/或未患病的样本获得。在一些实例中，参考可以从未经处理的样本获得。在一些实例中，参考是从个体的未患病或未处理的样本获得的。在一些实例中，参考是从不是个体或患者的一名或多名健康个体获得的。
如本文所用，“延迟疾病的发展”是指推迟、阻碍、减缓、阻滞、稳定、压制和/或延缓疾病的发展。此延迟可能具有不同的时间长度，具体取决于疾病史和/或接受治疗的个体。如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体没有发展疾病。
如本文所用的“预防”包括针对可能易患疾病但尚未被诊断患有该疾病的个体中的疾病的发生或复发提供防预。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换用于指代哺乳动物，包括但不限于人类、牛科动物、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人。
剂的“有效量”是指以必要的剂量在必要的时间段内有效达到所需治疗或防预结果的量。具体的剂量可取决于以下一项或多项而变化：所选的特定剂、遵循的给药方案、是否是与其它化合物组合施用、施用时间安排、待成像的组织和携带其的物理递送系统。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指呈允许一种或多种活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有对将施用制剂的个体产生不可接受的毒性的额外组分的制备物。此类制剂可以是无菌的。
“药学上可接受的载剂”是指本领域常规无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、制剂助剂或载剂，它们用于与治疗剂一起构成用于施用给个体的“药物组合物”。药学上可接受的载剂在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且与制剂的其他成分相容。药学上可接受的载剂适合于所采用的制剂。
“无菌”制剂是无菌的或基本上不含活微生物体及其孢子。
与一种或多种此外的治疗剂“组合”施用包括以任何顺序同时(并行)和连续或顺序施用。
术语“并行”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，其中该施用的至少一部分在时间上重叠或者其中一种治疗剂的施用相对于另一种治疗剂的施用落在较短时间段内。例如，该两种或更多种治疗剂以不超过约60分钟的时间间隔，诸如不超过约30分钟、15分钟、10分钟、5分钟或1分钟中的任一者的时间间隔施用。
术语“顺序地”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，其中一种或多种剂的施用在停止施用一种或多种其他剂后继续进行。例如，该两种或更多种治疗剂的施用以超过约15分钟的时间间隔，诸如约20、30、40、50或60分钟、1天、2天、3天、1周、2周、1个月或更长时间中的任一者的时间间隔施用。
如本文所用，“与……联合”是指除了一种治疗方式之外还施用另一种治疗方式。因此，“与……联合”是指一种治疗方式在另一种治疗方式施用之前、期间或之后施用于个体。
术语“包装插页(package insert)”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明，其含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“制品”是包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或病症的药剂，或用于特异性地检测本文所述的生物标志物的探针的任何制品(例如，包装或容器)或药盒。在某些实施方案中，制品或药盒呈用于执行本文所描述的方法的单位被推广、分发或销售。
应理解，本文所述的本申请的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
在本文中提及“约”某一值或参数包括(并且描述)涉及那个值或参数本身的变化形式。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所用，提及“非”某一值或参数通常意指并且描述“不同于”某一值或参数。例如，方法不用于治疗X类型的疾病意指方法用于治疗不同于X的类型的疾病。
本文所用的术语“约X-Y”与“约X至约Y”具有相同含义。
除非上下文另外明确规定，否则如本文中以及随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)”、“或”和“这个(种)”包括复数个(种)指示物。
II.抗VISTA构建体
本申请提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含如本文所述的特异性结合至VISTA的抗VISTA抗体部分。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：VH包含含有SEQID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的LC-CDR3，其中VH包含SEQ ID NO:53-57中的任一者的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:58-62中的任一者的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：VH包含含有SEQID NO:1-3中的任一者的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:4-6中的任一者的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ IDNO:8-10中的任一者的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:11-13中的任一者的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3，其中VH包含SEQ ID NO:16-30中的任一者的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:32-44中的任一者的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含含有SEQID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
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在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，与参考抗VISTA构建体相比，抗VISTA构建体活化或增加VISTA的下游信号传导通路至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，参考抗VISTA构建体是1E8。在一些实施方案中，参考抗VISTA构建体是亲本抗体(例如，本文公开的9F9或20E4)。
在一些实施方案中，构建体包括或者是选自由以下各项组成的组的抗体或其抗原结合片段：全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双抗体、三抗体和四抗体。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是全长抗体。
在一些实施方案中，上文所述的抗VISTA抗体部分包含选自由以下各项组成的组的免疫球蛋白的Fc片段：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM以及它们的组合和杂合体。在一些实施方案中，上文所述的抗VISTA抗体部分或全长抗体包含选自由以下各项组成的组的免疫球蛋白的Fc片段：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4以及它们的组合和杂合体。在一些实施方案中，Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有降低的效应子功能。在一些实施方案中，Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有增强的效应子功能。在一些实施方案中，Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有延长的半衰期。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体的抗VISTA抗体部分活化VISTA的下游信号传导通路。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是VISTA的激动性抗体。在一些实施方案中，抗VISTA构建体的抗体部分活化或增加VISTA的下游信号传导通路至少约20％。在一些实施方案中，与参考构建体相比，抗VISTA构建体的抗体部分活化或增加VISTA的下游信号传导通路至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％(例如，不活化VISTA的对应的构建体，例如，包含参考激动性抗VISTA抗体(诸如亲本VISTA抗体)的对应的构建体)。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是VISTA的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分结合至人VISTA和小鼠VISTA两者。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分结合至人VISTA。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分结合至小鼠VISTA。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分不结合至小鼠VISTA。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包括或者是抗VISTA融合蛋白。在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分(例如，抗VISTA scFv)和第二部分。在一些实施方案中，第二部分包含半衰期延长部分。在一些实施方案中，半衰期延长部分是白蛋白结合部分(例如，白蛋白结合抗体部分)。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分和半衰期延长部分通过接头(诸如肽接头，诸如GS接头)连接。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包括或者是抗VISTA免疫缀合物，所述抗VISTA免疫缀合物包含抗VISTA抗体部分(诸如本文所述的VISTA抗体部分中的任一种)和第二剂。在一些实施方案中，第二剂是治疗剂。在一些实施方案中，第二剂是标记。
VISTA
T细胞活化V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)(也称为PD-1H、Gi24、Dies-1或DD1α)是最近发现的CD28/B7基因家族的细胞表面共抑制性分子。据报道，VISTA可以作为抗原呈递细胞的抑制性配体发挥作用并且调节T细胞反应，并且通过基因敲除或拮抗性抗体消除VISTA可以增强小鼠模型中针对肿瘤的T细胞免疫反应。VISTA还可以在炎症和自身免疫性疾病的调节方面发挥关键作用，如移植物抗宿主病(GVHD)、急性肝炎、脑炎、狼疮、哮喘和银屑病的小鼠模型所证实。VISTA还可以作为T细胞上的共抑制性受体发挥作用。VISTA激动性mAb显著调节抗原特异性CD4 T细胞反应，并且保护小鼠免受GVHD、急性肝炎和哮喘的侵害。参见Files等人,J.Immunol.187,1537–1541(2011)；Files等人,J.Clin.Invest.124,1966–1975(2014)；和Liu等人,Cell.Mol.Immunol.15,838–845(2018)。研究还表明，前列腺癌患者中VISTA的上调与对伊匹单抗(CTLA-4mAb)的耐受性有关。此外，研究表明，靶向VISTA可以与其他非冗余途径(如PD-1阻断)发生协同作用，以在实验小鼠模型中实现最佳肿瘤清除功效。参见Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,6682–6687(2015)。因此，VISTA可以是调节免疫反应的重要分子和免疫疗法的潜在靶标。
VISTA基因定位于10q22.1上，它在黑猩猩、奶牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼和蛙中是保守的。人VISTA序列可见于NCBI参考号NM_022153。人VISTA蛋白具有311个氨基酸(NCBI参考号:NP_071436.1，SEQ ID NO:59)。
a)抗体亲和力
可通过本领域已知的方法通过实验方式确定抗体部分的结合特异性。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIACORETM测试和肽扫描。
在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间的结合的KD为约10-7M至约10-12M、约10- 7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M或约10-7M至约10-9M。在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间的结合的KD大于约10-7M、10-8M、10- 9M、10-10M、10-11M或10-12M中的任一者。在一些实施方案中VISTA是人VISTA。
在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间的结合的Kon为约103M-1s-1至约108M-1s-1、约103M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约105M-1s-1、约105M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1或约107M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间的结合的Kon为约103M-1s-1至约105M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约106M-1s-1至约108M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1或约105M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间的结合的Kon不超过约103M-1s-1、104M-1s-1、105M-1s-1、106M-1s-1、107M-1s-1或108M-1s-1中的任一者。在一些实施方案中，VISTA是人VISTA。
在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间的结合的Koff为约1s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-3s-1、约10-3s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-5s-1、约10-2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1或约10-3s-1至约10-5s-1。在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间的结合的Koff为至少约1s-1、10-2s-1、10-3s-1、10-4s-1、10-5s-1或10-6s-1中的任一者。在一些实施方案中，VISTA是人VISTA。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分或抗VISTA构建体的结合亲和力高(例如，具有较小的KD值)于现有的抗VISTA抗体(例如，抗人VISTA抗体，例如，1E8)。
b)嵌合抗体或人源化抗体
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是嵌合抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体为“经类别转换(class switched)的”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基来源于其中的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和它们的制备方法被综述于例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人,Methods36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall’Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“导向选择(guided selection)”途径)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如,Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如,Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如,Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
应当理解，小鼠来源的抗体的人源化是常见且常规使用的技术。因此，应当理解，序列表中公开的任何和所有抗VISTA抗体的人源化形式都可以用于临床前或临床环境。在任何所提及的抗VISTA抗体或其抗原结合区的人源化形式被用于此种临床前或临床环境的情况下，则预期该人源化形式具有与原始非人源化形式相同或相似的生物活性和谱。
c)人抗体
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是人抗体(称为人结构域抗体或人DAb)。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来生产。人抗体通常描述于van Dijk和van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)、Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)和Chen,Mol.Immunol.47(4):912-21(2010)。能够产生完全人单结构域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见，例如，US20090307787A1、美国专利第8,754,287号、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
可以通过将免疫原施用于已被修饰成响应于抗原激发产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备人抗体(例如，人DAb)。此类动物通常含有全部或一部分的人免疫球蛋白基因座，该基因座替换内源免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。也可参见，例如，美国专利第6,075,181号和第6,150,584号，描述了XENOMOUSETM技术；美国专利第5,770,429号，描述了技术；美国专利第7,041,870号，描述了K-M技术和美国专利申请公开号US 2007/0061900，描述了技术)。来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体(例如，人DAb)。用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系已被描述(参见，例如,Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也描述于Li等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。额外方法包括描述于例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆的可变结构域序列来生成人抗体(例如，人DAb)。然后此类可变结构域序列可与期望的人恒定结构域组合。用于从抗体文库选择人抗体的技术如下所述。
d)文库来源的抗体
可以通过筛选具有所需的一种或多种活性的抗体的组合文库来分离本文所述的抗VISTA抗体部分。例如，本领域已知多种方法用于生成噬菌体展示文库和筛选具有所需结合特性的抗体的此类文库。此类方法综述于例如Hoogenboom等人.in Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien等人,编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)并进一步描述于例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury等人,in Methodsin Molecular Biology 248:161-175(Lo,编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。用于构建单结构域抗体文库的方法已被描述，例如，参见美国专利第7371849号。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的库(repertoire)通过聚合酶链式反应(PCR)被单独地克隆，并且在噬菌体文库中被随机重组，然后可以用来筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常以scFv片段或以Fab片段展示抗体片段。来自免疫源的文库给免疫原提供高亲和力抗体而不需要构建杂交瘤。替代地，可以克隆(例如，从人)初始库(naive repertoire)以给多种非自体抗原也和没有任何免疫作用的自体抗原提供单一来源的抗体，如Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，还可以通过克隆来自干细胞的未重排的V基因片段和使用含有编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的随机序列的PCR引物来通过合成制备初始文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利第5,750,373号和美国专利公布第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被认为本文的人抗体或人抗体片段。
e)取代、插入、缺失和变体
在一些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代突变的目标位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代显示在表2中“优选取代”的标题下。更实质的变化在表2中在“示例性取代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别来进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表2.氨基酸取代
可根据共同侧链性质将氨基酸分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别中的一个类别的成员更换成另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将具有某些生物学特性的修改(例如，改善)(例如，升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类改变，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经描述于例如Hoogenboom等，在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人，编著，Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸指导的诱变)的任何一种将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的途径，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定涉及抗原结合的HVR残基。具体地说，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生取代、插入或缺失，只要此类改变不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出不实质性降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。此类改变可以在HVR“热点”或CDR的外部。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代展现出功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的取代。替代地或另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代的候选者。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如，对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合。
f)糖基化变体
在一些实施方案中，改变抗VISTA抗体部分以提高或降低构建体糖基化的程度。向抗体添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使得创建或除去一个或多个糖基化位点来便利地实现。
在抗体部分包含Fc区的情况下，可以改变与其附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的原生抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其通常通过N键联附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对抗体部分中的寡糖做出修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分具有缺乏附接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附接至Asn 297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，例如如描述于WO 2008/077546。Asn297是指位于Fc区中的约位置297(Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变化而位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即在位置294与位置300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的公开/出版物的实例包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等人，尤其是在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8、敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biot echnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；and WO2003/085107)。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分具有两分型寡糖(bisectedoligosaccharide)，例如其中附接至抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供在附接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)。
g)Fc区变体
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分包含Fc片段。
术语“Fc区”、“Fc结构域”、“Fc片段”或“Fc”是指含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端非抗原结合区。该术语包括原生Fc区和变体Fc区。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在，而不影响Fc区的结构或稳定性。除非本文另有具体说明，否则IgG或Fc区中氨基酸残基的编号是根据抗体的EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
在一些实施方案中，Fc片段来自选自由以下各项组成的组的免疫球蛋白：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM以及它们的组合和杂合体。在一些实施方案中，Fc片段来自选自由以下各项组成的组的免疫球蛋白：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4以及它们的组合和杂合体。
在一些实施方案中，与相应的野生型Fc片段相比，Fc片段具有降低的效应子功能(诸如如通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)水平所测量，降低至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的效应子功能)。
在一些实施方案中，Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，IgG1 Fc片段包含L234A突变和/或L235A突变。在一些实施方案中，IgG1 Fc片段包含L235A突变和/或G237A突变。在一些实施方案中，Fc片段是IgG2或IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，Fc片段是包含S228P、F234A和/或L235A突变的IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，Fc片段包含N297A突变。在一些实施方案中，Fc片段包含N297G突变。
在一些实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入到抗体部分的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一些实施方案中，Fc片段具有一些但不是所有效应子功能，这些效应子功能使该Fc片段成为用于如下应用的期望候选物，其中抗体部分的体内半衰期是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的减少/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表2中。用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号(参见，例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。替代地，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。对于此类测定有用的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。替代地或另外，可以在体内例如在动物模型中评估感兴趣的分子的ADCC活性，诸如公开于Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中的动物模型。也可以进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法来执行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如,Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。在一些实施方案中，Fc片段包含N297A突变。在一些实施方案中，Fc片段包含N297G突变。
与FcR的结合改善或减弱的某些抗体变体已被描述。(参见，例如，美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312，以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些实施方案中，Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，IgG1 Fc片段包含L234A突变和/或L235A突变。在一些实施方案中，IgG1 Fc片段包含L235A突变和/或G237A突变。在一些实施方案中，Fc片段是IgG2或IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，Fc片段是包含S228P、F234A和/或L235A突变的IgG4 Fc片段。
在一些实施方案中，抗体部分包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸取代，例如位于Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的取代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642以及Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述的。
在一些实施方案中，Fc片段具有在Thr250、Met252、Ser254、The256、Thr307、Glu380、Met428、His433和/或Asn 434处的一个或多个突变。
在一些实施方案中，抗体部分变体包含变体Fc区，该变体Fc区包含改变半衰期和/或改变与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的一处或多处氨基酸取代。具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿)(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含其中具有一处或多处取代的Fc区，该取代改变Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括具有位于Fc区残基中的一个或多个Fc区残基处的取代(例如Fc区残基434的取代(美国专利第7,371,826号))的那些变体。
还参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351，其涉及Fc区变体的其它实例。
h)经半胱氨酸工程化的抗体变体
在一些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程化的抗体部分，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体的实施方案中，被取代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它部分(诸如药物部分或连接子-药物部分)偶联，以创建免疫缀合物，如本文进一步所描述。在一些实施方案中，可以用半胱氨酸取代下列残基中的任一者或多者：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以如例如美国专利第7,521,541号所述生成经半胱氨酸工程化的抗体部分。
i)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分可以被进一步修饰成包含本领域已知的且易于获得的额外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物(prolypropylene oxide/ethylene oxide co-polymer)、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造方面可能具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。连接到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果连接了一个以上的聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可基于包括但不限于以下的考虑因素来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型：要改进的抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在限定条件下用于诊断等。
在一些实施方案中，抗体部分可以被进一步修饰成包含一种或多种生物活性蛋白质、多肽或其片段。“生物活性的”或“生物学活性的”在本文中可互换使用，意指在身体内表现出执行特定功能的生物活性。例如，它可以意指与特定的生物分子诸如蛋白质、DNA等组合，然后促进或抑制此类生物分子的活性。在一些实施方案中，生物活性蛋白或其片段包括作为活性药物物质施用于患者以预防或治疗疾病或疾患的蛋白质和多肽，以及出于诊断目的使用的蛋白质和多肽，诸如用于诊断测试或体外测定的酶，以及施用于患者以预防疾病的蛋白质和多肽，诸如疫苗。
III.制备方法
在一些实施方案中，提供了一种制备特异性结合至VISTA的抗VISTA构建体或抗体部分的方法，以及一种在制备抗VISTA构建体或抗体部分期间产生的组合物，诸如多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞或培养基。本文所述的抗VISTA构建体或抗体部分或组合物可以通过如下文一般性描述并且在实施例中更具体地描述的多种方法来制备。
抗体表达和生产
本文所述的抗体可使用本领域任何已知的方法制备，所述方法包括下文和实施例中所述的方法。
单克隆抗体
单克隆抗体是从基本上同质的抗体群体获得的，即，构成该群体的各个抗体除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外是同一的。因此，修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为不是离散(discrete)抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以用首先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以用重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)制备。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物，诸如仓鼠或美洲驼，以引发产生或能够产生将特异性地结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。替代地，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986)。另请参阅实施例1中的骆驼的免疫接种。
免疫剂通常将包括抗原蛋白或其融合变体。一般而言，如果需要人类起源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人类哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),第59-103页。
永生化细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛科动物和人类起源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常会包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们是阻止缺乏HGPRT的细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持产生选定抗体的细胞稳定高水平产生抗体、并且对培养基诸如HAT培养基敏感的细胞。其中，优选的是鼠骨髓瘤系(诸如来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些骨髓瘤系，它们可从Salk Institute CellDistribution Center,San Diego,Calif.USA获得)和SP-2细胞(及其衍生物，例如，X63-Ag8-653)(可从American Type Culture Collection,Manassas,Va.USA获得)。还描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定杂交瘤细胞正在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性是通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来确定。
可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对所需抗原的单克隆抗体的存在。优选地，该单克隆抗体的结合亲和力和特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联测定法(ELISA)来确定。此类技术和测定是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆并通过标准方法使该克隆生长(Goding，同上)。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。还可以使用细胞分选仪。此外，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中作为肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱适当地将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中分离。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法，诸如美国专利第4,816,567号中所描述和如上所描述的那些来制备。容易分离编码单克隆抗体的DNA并使用常规程序(例如，通过使用能够特异性地结合至编码小鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)对其进行测序。杂交瘤细胞充当此种DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA放入表达载体中，然后转染到诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、HEK细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞的宿主细胞中，以便在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码该抗体的DNA的细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人,Curr.Opinion inImmunol.,5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在进一步的实施方案中，可以从使用McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术生成的抗体噬菌体文库中分离抗体。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库对鼠和人抗体进行的分离。随后的出版物描述了通过链改组进行的高亲和力(nM范围)人类抗体生产(Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及作为用于构建非常大的噬菌体文库的策略的组合的感染和体内重组(Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))。因此，这些技术为用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的适宜替代方案。
DNA还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利第4,816,567号；Morrison,等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))或通过将非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列共价联接至免疫球蛋白编码序列来进行修饰。通常，用此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者用它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以创建包含一个对抗原具有特异性的抗原组合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原组合位点的嵌合二价抗体。
本文所述的单克隆抗体可以是单价的，其制备是本领域众所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任何点处被截短以防止重链交联。替代地，相关的半胱氨酸残基可以被另一个氨基酸残基取代或被删除以防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段，可以使用本领域已知的常规技术来完成。
嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括那些涉及交联剂的方法)在体外制备。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯。
编码抗体部分的核酸分子
在一些实施方案中，提供了编码本文所述的抗VISTA构建体或抗体部分中的任何一种的多核苷酸。在一些实施方案中，提供了使用如本文所述的方法中的任何一种制备的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)的重链的多核苷酸和编码抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)的轻链的多核苷酸二者。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸，并且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
在一些此类实施方案中，重链和轻链是从一个核酸分子表达的，或者是作为两个单独的多肽从两个单独的核酸分子表达的。在一些实施方案中，诸如当抗体是scFv时，单个多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。
在一些实施方案中，编码抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，该前导序列在被翻译时位于重链或轻链的N末端处。如以上所讨论，前导序列可以是原生重链或轻链的前导序列，或者可以是另一种异源前导序列。
在一些实施方案中，多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，RNA是mRNA。
核酸分子可使用本领域常规重组DNA技术构建。在一些实施方案中，核酸分子是适合在选定的宿主细胞中表达的表达载体。
核酸构建体
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的多核苷酸中的任何一种的核酸构建体。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的核酸构建体。
在一些实施方案中，核酸构建体进一步包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。在一些实施方案中，该多核苷酸对应于基因，其中该启动子是该基因的野生型启动子。
载体
在一些实施方案中，提供了包含编码本文描述的抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)或本文所述的核酸构建体中的任一种的重链和/或轻链的任何多核苷酸的载体。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任何方法制备的载体。还提供了包含编码任何抗VISTA构建体(诸如抗体、scFv、融合蛋白或本文所述构建体的其他形式(例如，抗VISTA scFv))的多核苷酸的载体。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，重链和轻链是作为两个单独的多肽从载体表达的。在一些实施方案中，重链和轻链是作为单一多肽的一部分表达的，诸如，例如当抗体为scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸，并且第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体和第二载体以相似的量(诸如相似的摩尔量或相似的质量量)转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，将摩尔比或质量比为5:1至1:5的第一载体和第二载体转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，所使用的编码重链的载体和编码轻链的载体的质量比介于1:1和1:5之间。在一些实施方案中，所使用的编码重链的载体和编码轻链的载体的质量比为1:2。
在一些实施方案中，选择经优化用于在CHO或CHO来源的细胞或NSO细胞中表达多肽的载体。此类示例性载体描述于例如Running Deer等人,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)。
宿主细胞
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何多肽、核酸构建体和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任何方法制备的宿主细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞能够在发酵条件下产生本文所述的任何抗体部分。
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)可以在原核细胞(诸如细菌细胞)中或者在真核细胞(诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达。这种表达可以例如根据本领域已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、CHO-GS、DG44。Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；细胞(Crucell)；HEK细胞和NSO细胞。在一些实施方案中，本文所述的抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)可以在酵母中表达。参见，例如，美国公布号US2006/0270045A1。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞是基于其对抗体部分的重链和/或轻链做出所需翻译后修饰的能力来选择的。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽相较于在293细胞中产生的相同多肽具有更高水平的唾液酸化。
可以通过任何方法将一种或多种核酸引入所需的宿主细胞，该方法包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。描述了非限制性的示例性方法描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning,A LaboratoryManual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。可以根据任何合适的方法将核酸瞬时或稳定转染到所需的宿主细胞中。
本申请还提供了包含本文所述的多核苷酸或载体中的任一者的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含抗VISTA抗体的宿主细胞。任何能够过表达异源DNA的宿主细胞都可以用于分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。还参阅PCT公开号WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))和酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。
在一些实施方案中，抗体部分是在无细胞系统中生产的。例如，Sitaraman等人，Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人，Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中描述了非限制性示例性无细胞系统。
培养基
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何抗体部分、多核苷酸、核酸构建体、载体和/或宿主细胞的培养基。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任何方法制备的培养基。
在一些实施方案中，培养基包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和/或胸苷(例如，HAT培养基)。在一些实施方案中，培养基不包含血清。在一些实施方案中，培养基包含血清。在一些实施方案中，培养基是D-MEM或RPMI-1640培养基。
在一些实施方案中，培养基是化学成分限定的。在一些实施方案中，培养基是针对特定细胞系(例如，CHO GS细胞)特别衍生的。
抗体部分的纯化
抗VISTA构建体可以通过任何合适的方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱。合适的亲和配体包括结合抗体恒定区的ROR1 ECD和配体。例如，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱可用于结合恒定区和纯化包含Fc片段的抗VISTA构建体。疏水相互作用色谱，例如丁基或苯基柱，也可能适合于纯化一些多肽，诸如抗体。离子交换色谱(例如，阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)也可能适合于纯化一些多肽诸如抗体。混合模式色谱(例如，反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可能适合于纯化一些多肽诸如抗体。许多纯化多肽的方法是本领域已知的。
V.治疗方法
本文还提供了治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)或者调节个体的免疫反应(例如，抑制T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的方法。所述方法包括向个体(例如，哺乳动物，诸如人)施用本文所述的抗VISTA构建体。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本文所述的抗VISTA构建体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体(诸如本文公开的抗VISTA构建体中的任一种)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，与不活化VISTA的对应的构建体(例如，同种型对照)相比，用于调节个体的免疫反应或调节免疫细胞(例如，T细胞)的抗VISTA构建体阻止T细胞的增殖至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，与包含参考激动性抗VISTA抗体的对应的构建体(例如，1E8)相比，用于调节个体的免疫反应或调节免疫细胞(例如，T细胞)的抗VISTA构建体阻止T细胞的增殖至少约5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，细胞是VISTA阳性细胞。在一些实施方案中，细胞是CD3+CD25+细胞。在一些实施方案中，细胞是CD45+T细胞。
在一些实施方案中，提供了一种调节细胞(例如，免疫细胞)的方法，所述方法包括使免疫细胞与抗VISTA构建体(诸如本文所述的抗VISTA构建体中的任一种)接触。在一些实施方案中，细胞是T细胞(诸如CD4和/或CD8 T细胞)。在一些实施方案中，细胞是CD3+CD25+细胞。在一些实施方案中，细胞是CD45+T细胞。在一些实施方案中，细胞是中性粒细胞。在一些实施方案中，细胞是树突细胞(例如，浆细胞样树突细胞)。在一些实施方案中，细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞是VISTA阳性细胞。在一些实施方案中，接触发生在体外。
在一些实施方案中，提供了一种对细胞(例如，免疫细胞)进行基因组编辑的方法，所述方法包括向细胞引入：a)包含编码本文所述的抗VISTA构建体中的任一种的核酸序列的供体模板，以及b)DNA核酸酶(例如，CRISPR相关蛋白(Cas))或编码DNA核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述方法还包括将经基因组编辑的细胞施用于患有本文所述疾病或疾患的个体。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(诸如人)。
在一些实施方案中，个体的血清抗核抗体水平升高(例如，血清抗核抗体水平比健康个体高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。在一些实施方案中，个体的血清抗dsDNA抗体水平升高(例如，血清抗dsDNA抗体水平比健康个体高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。在一些实施方案中，个体的血清IFNα水平升高(例如，血清IFNα水平比健康个体高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。在一些实施方案中，个体的尿蛋白水平升高(例如，尿蛋白水平比健康个体高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。
抗VISTA构建体的给药和施用方法
施用于个体、用于治疗如本文所述的疾病或疾患的抗VISTA构建体的给药方案(诸如具体剂量和频率)可以因特定抗VISTA构建体、施用方式和所治疗的疾病或疾患的类型而异。在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是可有效减轻疾病或疾患的至少一种症状的量。在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是足以延长个体(诸如人)总体存活期的量。在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是足以在用抗VISTA构建体治疗的个体群中产生超过约50％、60％、70％、80％或90％中的任一者的临床有益效果的量。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是与未接受治疗的个体相比减缓或抑制疾病或疾患的进展(例如，达至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％)的量。在一些实施方案中，该疾病或疾患是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，该疾病或疾患是感染。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比，抗VISTA构建体的有效量使血清抗核抗体水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比，抗VISTA构建体的有效量使血清抗dsDNA抗体水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比，抗VISTA构建体的有效量使血清IFNα水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比，抗VISTA构建体的有效量使血清IL-17A水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比，抗VISTA构建体的有效量使尿蛋白水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是与未接受治疗的个体相比减少疾患(例如，移植)的副作用(自身免疫反应)(例如，至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％)的量。
在上述方面中的任一个的一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量在约0.001μg/kg至约100mg/kg总体重，例如，约0.005μg/kg至约50mg/kg、约0.01μg/kg至约10mg/kg或约0.01μg/kg至约1mg/kg的范围内。
在上述方面中的任一个的一些实施方案中，用于人的抗VISTA构建体有效量是相当于用于小鼠的0.5mg的剂量。
在上述方面中的任一个的一些实施方案中，抗VISTA构建体每周施用一次。在上述方面中的任一个的一些实施方案中，抗VISTA构建体每两周施用一次。在一些实施方案中，抗VISTA构建体每周施用一次达至少约2周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约14周、约16周、约18周或约20周。
抗VISTA构建体可以通过各种途径施用于个体(诸如人)，所述途径包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、囊内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、透粘膜和透皮。在一些实施方案中，抗VISTA构建体在施用于个体时包含于药物组合物中。在一些实施方案中，可以使用组合物的持续释放制剂。在一些实施方案中，组合物是静脉内施用的。在一些实施方案中，组合物是腹膜内施用的。在一些实施方案中，组合物是静脉内施用的。在一些实施方案中，组合物是腹膜内施用的。在一些实施方案中，组合物是肌内施用的。在一些实施方案中，组合物是皮下施用的。在一些实施方案中，组合物是静脉内施用的。在一些实施方案中，组合物是经口施用的。
组合疗法
本申请还提供了将抗VISTA构建体施用到个体中用于治疗疾病或疾患的方法，其中该方法进一步包括施用第二剂或疗法。在一些实施方案中，第二剂或疗法是用于治疗该疾病或疾患的标准或常用剂或疗法。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体是与第二剂或疗法同时施用的。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是与第二剂或疗法并行施用的。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是与第二剂或疗法顺序施用的。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是在第二剂或疗法之前施用的。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是在第二剂或疗法之后施用的。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是以与第二剂或疗法相同的单位剂型施用的。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是以与第二剂或疗法不同的单位剂型施用的。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是以与第二剂或疗法相同的单位剂型施用的。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是以与第二剂或疗法不同的单位剂型施用的。在一些实施方案中，第二剂或疗法是VISTA的激动剂。在一些实施方案中，第二剂或疗法是VISTA配体。
在一些实施方案中，第二剂或疗法是多肽。在一些实施方案中，多肽包含VSIG3或其片段。VSIG3(含V-Set和免疫球蛋白结构域蛋白3)是VISTA的配体。已知VSIG3可通过抑制功能来抑制T细胞(参见，例如，Xie等人,Front.Immunol.,12:625808(2021))。在一些实施方案中，多肽是VSIG3-Fc融合体。在一些实施方案中，多肽是抗体或其片段。
在一些实施方案中，第二剂或疗法是小分子(例如，小分子抑制剂)。
VI.抗VISTA构建体的使用
本文还提供了如本文公开的抗VISTA构建体用于制造用于治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的药剂，或者调节个体的免疫反应(例如，抑制T细胞的增殖和/或活化)的用途。所述用途包括向个体(例如，哺乳动物，诸如人)施用包含本文所述的抗VISTA构建体的药剂。
在一些实施方案中，提供了如本文公开的抗VISTA构建体用于制造用于治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的药剂的用途，所述用途包括向个体施用有效量的本文所述的抗VISTA构建体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，提供了如本文公开的抗VISTA构建体用于制造用于治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的药剂的用途，所述用途包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体(诸如本文公开的抗VISTA构建体中的任一种)。
在一些实施方案中，提供了如本文公开的抗VISTA构建体用于制造用于治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的药剂的用途，所述用途包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，提供了如本文公开的抗VISTA构建体用于制造用于治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的药剂的用途，所述用途包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，提供了如本文公开的抗VISTA构建体用于制造用于治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的药剂的用途，所述用途包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，提供了如本文公开的抗VISTA构建体用于制造用于治疗个体的疾病或疾患或者调节个体的免疫反应(例如，抑制PBMC或T细胞，诸如CD3+CD25+T细胞或CD45+T细胞的增殖和/或活化)的药剂的用途，所述用途包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述构建体包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体，并且其中VL包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，疾病或疾患与免疫系统失调有关。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，与不活化VISTA的对应的构建体(例如，同种型对照)相比，用于调节个体的免疫反应或调节免疫细胞(例如，T细胞)的抗VISTA构建体阻止T细胞的增殖至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，与包含参考激动性抗VISTA抗体的对应的构建体(例如，1E8)相比，用于调节个体的免疫反应或调节免疫细胞(例如，T细胞)的抗VISTA构建体阻止T细胞的增殖至少约5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，细胞是VISTA阳性细胞。在一些实施方案中，细胞是CD3+CD25+细胞。在一些实施方案中，细胞是CD45+T细胞。
在一些实施方案中，提供了抗VISTA构建体(诸如本文所述的抗VISTA构建体中的任一种)用于调节细胞(例如，免疫细胞)的用途，所述用途包括使免疫细胞与抗VISTA构建体接触。在一些实施方案中，细胞是T细胞(诸如CD4+和/或CD8+T细胞)。在一些实施方案中，细胞是CD3+CD25+细胞。在一些实施方案中，细胞是CD45+T细胞。在一些实施方案中，细胞是中性粒细胞。在一些实施方案中，细胞是树突细胞(例如，浆细胞样树突细胞)。在一些实施方案中，细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞是VISTA阳性细胞。在一些实施方案中，接触发生在体外。
在一些实施方案中，提供了一种对细胞(例如，免疫细胞)进行基因组编辑的方法，所述方法包括向细胞引入：a)包含编码本文所述的抗VISTA构建体中的任一种的核酸序列的供体模板，以及b)DNA核酸酶(例如，CRISPR相关蛋白(Cas))或编码DNA核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述方法还包括将经基因组编辑的细胞施用于患有本文所述疾病或疾患的个体。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(诸如人)。
在一些实施方案中，个体的血清抗核抗体水平升高(例如，血清抗核抗体水平比健康个体高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。在一些实施方案中，个体的血清抗dsDNA抗体水平升高(例如，血清抗dsDNA抗体水平比健康个体高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。在一些实施方案中，个体的血清IFNα水平升高(例如，血清IFNα水平比健康个体高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。在一些实施方案中，个体的尿蛋白水平升高(例如，尿蛋白水平比健康个体高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。
抗VISTA构建体的给药和施用方法
施用于个体、用于治疗如本文所述的疾病或疾患的抗VISTA构建体的给药方案(诸如具体剂量和频率)可以因包含特定抗VISTA构建体的药剂、施用方式和所治疗的疾病或疾患的类型而异。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量是可有效减轻疾病或疾患的至少一种症状的量。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量是足以延长个体(诸如人)总体存活期的量。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量是足以在用包含抗VISTA构建体的药剂治疗的个体群中产生超过约50％、60％、70％、80％或90％中的任一者的临床有益效果的量。
在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量是与未接受治疗的个体相比减缓或抑制疾病或疾患的进展(例如，达至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％)的量。在一些实施方案中，该疾病或疾患是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，该疾病或疾患是感染。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用包含抗VISTA构建体的药剂治疗的个体)相比，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量使血清抗核抗体水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用包含抗VISTA构建体的药剂治疗的个体)相比，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量使血清抗dsDNA抗体水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用包含抗VISTA构建体的药剂治疗的个体)相比，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量使血清IL-17A水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，与参考个体(例如，患有相同疾病或疾患但未用包含抗VISTA构建体的药剂治疗的个体)相比，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量使尿蛋白水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂的有效量是与未接受药剂的个体相比减少疾患(例如，移植)的副作用(自身免疫反应)(例如，至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％)的量。
在上述方面中的任一个的一些实施方案中，包含一定量的抗VISTA构建体的药剂的有效量在约0.001μg/kg至约100mg/kg总体重，例如，约0.005μg/kg至约50mg/kg、约0.01μg/kg至约10mg/kg或约0.01μg/kg至约1mg/kg的范围内。
在上述方面中的任一个的一些实施方案中，用于人的药剂的有效量是包含抗VISTA构建体的药剂的剂量，是相当于用于小鼠的0.5mg抗VISTA构建体的剂量。
在上述方面中的任一个的一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂每周施用一次。在上述方面中的任一个的一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂每两周施用一次。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂每周施用一次达至少约2周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约14周、约16周、约18周或约20周。
包含抗VISTA构建体的药剂可以通过各种途径施用于个体(诸如人)，所述途径包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、囊内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、透粘膜和透皮。在一些实施方案中，可以使用药剂的持续释放制剂。在一些实施方案中，药剂是静脉内施用的。在一些实施方案中，药剂是腹膜内施用的。在一些实施方案中，药剂是静脉内施用的。在一些实施方案中，药剂是腹膜内施用的。在一些实施方案中，药剂是肌内施用的。在一些实施方案中，药剂是皮下施用的。在一些实施方案中，药剂是静脉内施用的。在一些实施方案中，药剂是经口施用的。
组合疗法
本申请还提供了抗VISTA构建体用于制造向个体施用以治疗疾病或疾患的药剂的用途，其中方法还包括施用第二剂或疗法。在一些实施方案中，第二剂或疗法是用于治疗该疾病或疾患的标准或常用剂或疗法。在一些实施方案中，该疾病或疾患是银屑病。
在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是与第二剂或疗法同时施用的。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是与第二剂或疗法并行施用的。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是与第二剂或疗法顺序施用的。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是在第二剂或疗法之前施用的。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是在第二剂或疗法之后施用的。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是以与第二剂或疗法相同的单位剂型施用的。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是以与第二剂或疗法不同的单位剂型施用的。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是以与第二剂或疗法相同的单位剂型施用的。在一些实施方案中，包含抗VISTA构建体的药剂是以与第二剂或疗法不同的单位剂型施用的。在一些实施方案中，第二剂或疗法是VISTA的激动剂。在一些实施方案中，第二剂或疗法是VISTA配体。
在一些实施方案中，第二剂或疗法是多肽。在一些实施方案中，多肽包含VSIG3或其片段。VSIG3(含V-Set和免疫球蛋白结构域蛋白3)是VISTA的配体。已知VSIG3可通过抑制功能来抑制T细胞(参见，例如，Xie等人,Front.Immunol.,12:625808(2021))。在一些实施方案中，多肽是VSIG3-Fc融合体。
在一些实施方案中，第二剂或疗法是小分子(例如，小分子抑制剂)。
VII.组合物、药盒和制品
本文还提供了包含本文所述的抗VISTA构建体或抗VISTA抗体部分、编码抗体部分的核酸、包含编码抗体部分的核酸的载体或者包含核酸或载体的宿主细胞中的任一者的组合物(诸如制剂)。
本文所述的抗VISTA构建体的合适的制剂可以通过将具有所期望纯度的抗VISTA构建体或抗VISTA抗体部分与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干制剂或水溶液形式来获得。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801中描述了适于皮下施用的冻干制剂。此类冻干制剂可用合适的稀释剂复溶成高蛋白质浓度，并且可将复溶的制剂皮下施用于本文中待成像、诊断或治疗的个体。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌过滤膜的过滤来实现。
还提供了包含本文所述的抗VISTA构建体或抗VISTA抗体部分中的任一者的试剂盒。该药盒可用于本文描述的任何调节细胞组成或治疗的方法。
在一些实施方案中，提供了包含与VISTA特异性地结合的抗VISTA构建体的药盒。
在一些实施方案中，药盒进一步包含能够将抗VISTA构建体递送至个体中的装置。用于施用诸如肠胃外递送的一类装置是注射器，其用于将组合物注射到受试者身体内。吸入装置也可用于某些应用。
在一些实施方案中，药盒还包含用于治疗疾病或疾患(例如感染性疾病、自身免疫性疾病或移植)的治疗剂。
本申请的药盒处在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。药盒可任选地提供额外的组分，如缓冲剂和解释性信息。
因此，本申请还提供了制品。制品可包括容器和插在容器上或伴随容器的标签或包装。合适的容器包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等。一般而言，容器容纳组合物，并且可具有无菌入口(例如，该容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。标签或包装插页指示该组合物用于成像、诊断或治疗个体的特定疾患。标签或包装插页将进一步包括对于将组合物施用于个体和对于对个体进行成像的说明。标签可指示复溶和/或使用的指南。容纳组合物的容器可以是多用途小瓶，其允许经复溶制剂的重复施用(例如2至6次施用)。包装插页是指通常包含在诊断产品的商业包装中的说明书，其包含关于此类诊断产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或使用警告的信息。另外，制品还可包括第二容器，所述第二容器包括药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。它还可以包括就商业和使用者观点可需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
药盒或制品可包括以足以在药房，例如医院药房和配制药房储存和使用的量包装的多个单位剂量的组合物和使用说明。
本领域技术人员将认识到，若干实施方案在本发明的范围和精神内是可能的。现将通过参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
示例性实施方案
实施方案1.一种抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
a)所述VH包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的LC-CDR3，其中所述VH包含SEQ ID NO:53-57中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:58-62中的任一者的氨基酸序列；或者
b)所述VH包括含有SEQ ID NO:1-3中的任一者的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQID NO:4-6中的任一者的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:8-10中的任一者的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQID NO:11-13中的任一者的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3，其中所述VH包含SEQ ID NO:16-30中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32-44中的任一者的氨基酸序列。
实施方案2.如实施方案1所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含SEQ ID NO:53-57中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:58-62中的任一者的氨基酸序列。
实施方案3.如实施方案2所述的抗VISTA构建体，其中：
1)所述VH包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
2)所述VH包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或者
3)所述VH包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
实施方案4.如实施方案1所述的抗VISTA构建体，其中：
a)所述VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
b)所述VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；或者
c)所述VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
d)所述VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
e)所述VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
f)所述VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
g)所述VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
h)所述VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；或者
i)所述VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方案5.如实施方案1或实施方案4所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含SEQID NO:16-30中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32-44中的任一者的氨基酸序列。
实施方案6.如实施方案5所述的抗VISTA构建体，其中：
1)所述VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
2)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
3)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
4)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
5)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
6)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
7)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
8)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
9)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
10)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
11)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
12)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
13)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
14)所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
15)所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
16)所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
17)所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
18)所述VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
19)所述VH包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
20)所述VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
21)所述VH包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
22)所述VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
23)所述VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
24)所述VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
25)所述VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
26)所述VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
27)所述VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
28)所述VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
29)所述VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
30)所述VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；或者
31)所述VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
实施方案7.如实施方案6所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列。
实施方案8.如实施方案1至7中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分是选自由以下各项组成的组的抗体或其抗原结合片段：全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双抗体、三抗体和四抗体。
实施方案9.如实施方案8所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分是全长抗体。
实施方案10.如实施方案1至9中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分具有选自由以下Fc片段形式组成的组的Fc片段：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM以及它们的组合和杂合体。
实施方案11.如实施方案10所述的抗VISTA构建体，其中所述Fc片段选自由以下组成的组：来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4以及它们的组合和杂合体的Fc片段。
实施方案12.如实施方案10或实施方案11所述的抗VISTA构建体，其中所述Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有降低的效应子功能。
实施方案13.如实施方案10至12中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有延长的半衰期。
实施方案14.如实施方案1至13中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体的所述抗体部分活化VISTA的下游信号传导通路。
实施方案15.如实施方案1至14中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体是VISTA的激动性抗体。
实施方案16.如实施方案14或实施方案15所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体的所述抗体部分活化或增加VISTA的下游信号传导通路至少约20％。
实施方案17.如实施方案1至13中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体是VISTA的拮抗性抗体。
实施方案18.如实施方案1至17中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述VISTA是人VISTA。
实施方案19.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案1至18中任一种所述的抗VISTA构建体，以及药学上可接受的载剂。
实施方案20.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如实施方案1至18中任一项所述的抗VISTA构建体。
实施方案21.一种载体，所述载体包含如实施方案20所述的分离的核酸。
实施方案22.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含如实施方案20所述的分离核酸，或者如实施方案21所述的载体。
实施方案23.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含连接至治疗剂或标记的如实施方案1至18中任一项所述的抗VISTA构建体。
实施方案24.一种产生抗VISTA构建体的方法，所述方法包括：
a)在可有效表达所述抗VISTA构建体的条件下培养如实施方案22所述的分离的宿主细胞；以及
b)从所述宿主细胞获得表达的抗VISTA构建体。
实施方案25.一种治疗个体的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如实施方案1至18中任一项所述的抗VISTA构建体，或者如实施方案19所述的药物组合物。
实施方案26.如实施方案25所述的方法，其中所述疾病或疾患与免疫系统失调有关。
实施方案27.如实施方案25或实施方案26所述的方法，其中所述疾病或疾患与活化的T细胞有关。
实施方案28.如实施方案27所述的方法，其中所述活化的T细胞是CD3+CD25+T细胞和/或CD45+T细胞。
实施方案29.如实施方案25至28中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患与VISTA阳性细胞有关。
实施方案30.如实施方案25至29中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。
实施方案31.如实施方案30所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
实施方案32.如实施方案25至31中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA构建体静脉内或皮下施用于所述个体。
实施方案33.如实施方案25至32中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA构建体以约0.001mg/kg至约100mg/kg的剂量施用。
实施方案34.如实施方案25至33中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
实施方案35.一种试剂盒，所述试剂盒包含如实施方案1至18中任一项所述的抗VISTA构建体。
实施方案36.如实施方案1至18中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体抑制PBMC和/或T细胞活化至少20％。
实施方案37.如实施方案1至19中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体减少IL-17A的产生至少30％。
实施方案38.如实施方案25至34中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA构建体与第二剂一起施用。
实施方案39.如实施方案38所述的方法，其中所述第二剂是VISTA激动剂。
实施方案40.如实施方案38或实施方案39所述的方法，其中所述第二剂是VISTA配体。
实施方案41.如实施方案38至40中任一项所述的方法，其中所述第二剂是多肽。
实施方案42.如实施方案40所述的方法，其中所述VISTA配体包含VSIG3或其片段。
实施方案43.如实施方案42所述的方法，其中所述VSIG3或其片段与Fc结构域融合。
实施例
以下实施例仅意图例示本申请，并且因此不应视为以任何方式限制本申请。通过说明而不是通过限制的方式提供以下实施例和详述。
实施例1.材料
使用标准方案在内部产生His标签标记的人和小鼠VISTA胞外结构域蛋白。hVISTA-mFc购自Adipogen(目录#CHI-HF-211B7H5-C100)。使用Alexa Fluor 647标记的抗人VISTA抗体(BD Biosciences,目录#566670)和APC抗小鼠VISTA抗体(Biolegend,目录#150205)来检测表达人和小鼠VISTA的Jurkat细胞。
用pLenti7.3/TOPO-小鼠VISTA或人VISTA全长序列来转导Jurkat A6细胞，以通过流式细胞术进行结合测定。用携带CMV-人VISTA胞外跨膜以及CD3zeta CAR-EF1-puro的慢病毒来转导Jurkat-nfkb-GFP报告细胞，以通过流式细胞术进行报告细胞活化测定。对于每个构建体，对Jurkat细胞的VISTA阳性群进行两次分选。每个构建体的细胞都是多克隆的。
实施例2.抗VISTA抗体在Expi293细胞中的重组表达和纯化
方法：将抗VISTA可变结构域与mIgG1恒定结构域一起克隆并在Expi293细胞中表达。简而言之，使用来自IDT的人优选密码子对小鼠IgG1可变结构域进行基因合成。然后将基因片段亚克隆至含有鼠抗体信号序列和mIgG1 Fc片段的pcDNA3.4载体中。使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)通过瞬时转染至Expi293细胞中来产生抗体。在转染后五天，收集经转染的细胞的上清液，并使用蛋白G Sepharose(GE)来纯化上清液。使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.7)来洗脱结合的抗体，并用1×PBS(pH7.4)透析过夜。对纯化的抗体进行还原和非还原SDS-PAGE分析以确认纯度和大小。在分光光度计上通过A280来确定重组蛋白的浓度。如本文所述将抗体序列转染至Expi HEK中。
结果：重组蛋白得到纯化(图1)。表E1和E2显示了在第一轮人源化中测试的序列纯化后的蛋白质回收。第一次运行使用30mL培养物。亲本(VH0/VL0)构建体同时产生1.2mg抗体。
表E1：从30mL表达培养物回收9F9人源化抗体(mg)
表E2.从30mL表达培养物回收20E4人源化抗体(mg)
20E4序列 抗体产量(mg)
VH1/VL1 1.3
VH2/VL2 0
VH3/VL3 1.4
VH4/VL4 1.2
第二轮蛋白质产生评估可变链5-9。在本轮中，重链与对应的轻链一起表达(例如VH5/VL5)。表E3提供了在纯化后该轮表达的结果。
表E3.从30mL表达培养物回收9F9人源化抗体
9F9序列 抗体产量(mg)
VH5/VL5 0
VH6/VL6 0
VH7/VL7 0.72
VH8/VL8 0.8
VH9/VL9 0.79
第三轮人源化对一起列出的轻链和重链对中的每一个进行测试。表E4显示了30mLExpiHEK表达培养物的回收。
表E4.从30mL表达培养物回收9F9人源化抗体(mg)
序列 VL7 VL8 VL9
VH10 1.56 1.16 1.24
VH11 0.64 0.94 0.72
表E5显示了重链14和15以及它们对应的轻链的表达结果。
表E5.从30mL表达培养物回收9F9人源化抗体(mg)
亲本和人源化抗VISTA抗体的CDR和VH/VL的SEQ ID NO如表E6、E7、E8和E9所示。
表E6. 9E9亲本和人源化抗VISTA抗体的CDR和VH的SEQ ID NO
表E7. 9E9亲本和人源化抗VISTA抗体的CDR和VL的SEQ ID NO
表E8.20E4亲本和人源化抗VISTA抗体的CDR和VH的SEQ ID NO
表E9.20E4亲本和人源化抗VISTA抗体的CDR和VL的SEQ ID NO
实施例3.人源化重组抗VISTA抗体与表达人和小鼠VISTA Jurkat细胞的Jurkat细胞结合。
方法：在含有10％ FBS的RPMI1640中培养表达人和小鼠的Jurkat细胞。将细胞以1×105个细胞/孔接种于96孔板中。用pLenti7.3/TOPO-小鼠VISTA或人VISTA全长序列来转导Jurkat A6亲本细胞，以通过流式细胞术进行结合测定。用携带CMV-人VISTA胞外跨膜以及CD3zeta CAR-EF1-puro的慢病毒来转导Jurkat-nfkb-GFP报告细胞，以通过流式细胞术评价进行报告细胞活化测定。对于每个构建体，对Jurkat细胞的VISTA阳性群进行两次分选。每个构建体的细胞都是多克隆的。
在含有10％ FBS的RPMI1640中培养表达人和小鼠VISTA的Jurkat细胞。将细胞以1×105个细胞/孔接种于96孔板中。然后将细胞与50μg/mL(或列出的浓度)纯化的抗VISTA抗体在4℃处温育30分钟。在用FACS缓冲液洗涤后，将细胞与Alexa Fluor 647缀合的抗小鼠IgG(H+L；1μg/ml)(Jackson ImmunoResearch,目录#61505214)一起在4℃处温育30分钟。在用FACS缓冲液洗涤两次后，将样品放置于NovoCyte流式细胞仪(Agilent)中运行。使用NovoExpress软件来分析数据。
结果：人源化重组mIgG1抗VISTA抗体(9F9和20E4)均显示出以剂量依赖性方式与表达Jurkat-hVISTA的细胞系有效结合(图2A-D)。使用人源化hIgG1-LALA或IgG2的9E9抗体与表达人VISTA的细胞结合，但是对照非靶向IgG1未显示出结合(图2E)。
与亲本9E9抗体相比，人源化重组mIgG1 9E9抗VISTA抗体未显示出以剂量依赖性方式与表达Jurkat小鼠VISTA的细胞系有效结合(图3A-D)。
使用人源化hIgG1-LALA或IgG2恒定区的9E9 VH15/VL15以剂量依赖性方式与表达小鼠VISTA的细胞结合，但是对照非靶向IgG1未显示出结合(图3E)。
实施例4.通过Octet竞争进行的抗VISTA抗体的表位结合测定
方法：使用Octet QKe(ForteBio)通过生物层干涉测量来确定抗VISTA抗体的结合亲和力。使用EZ-LINK NHS-PEG4生物素(Thermo Fisher Scientificc)对人VISTA重组蛋白(Sino Biological Inc.,目录#13482-H08H)和小鼠VISTA(Sino Biological Inc.,目录#51550-M08H)进行生物素酰化。使用链霉亲和素生物传感器(ForteBio)来上样生物素酰化的VISTA蛋白(5μg/ml，300秒)。将基线测量值在1×动力学缓冲液(ForteBio)中稳定60秒，然后使5μg/ml的抗VISTA抗体与捕获的蛋白质缔合300秒。然后使传感器在1×动力学缓冲液中解离600秒。数据分析在ForteBio Data Analysis HT 11.1软件上进行。
结果：测试的9E9人源化抗体与人VISTA结合的KD与亲本9E9抗体相当(图4A-4C)。
9E9抗VISTA VH7/VL7、VH9/VL9、VH14/VL15、VH15/VL15均以低于亲本的亲和力与小鼠VISTA结合。9E9抗VISTA VH8/VL9以略高于亲本的亲和力与小鼠VISTA结合(图5A-5B)。
与阳性对照(9E9亲本抗体)相比，测试的20E4人源化抗VISTA抗体未显示出与小鼠VISTA蛋白的结合(图5C)。
实施例5.人源化9F9抗体表现出激动剂性质。
使用Jurkat报告细胞测定来检测人源化9F9抗体以评价激动剂性质。
方法：在96孔板中，将Jurkat-nfkb-GFP/人VISTA-hCD3z细胞如上文所述的以1×105/孔接种于200μl含有10％ FBS培养基的RPMI1640中。将重组抗体按所示逐渐增加的抗VISTA浓度添加至培养基中(50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl)。在24小时温育后通过流式细胞术来测量GFP(FITC)。小鼠IgG同种型用作阴性对照；抗CD3(OKT)(3ng/ml)处理的T细胞用作阳性对照。
结果：在存在OKT3(作为阳性对照)的情况下，细胞显示出FITC信号的上调，而在存在对照(不含OKT3)的情况下，细胞则不显示出FITC信号的上调(图6A-B)。亲本9F9(VH0/VL0)抗VISTA和人源化9F9抗体通过在若干抗体浓度下与细胞上的VISTA-hCD3z的结合来刺激FITC信号(图6B)。虽然测试的VH/VL组合是成功的(图6A)，但是VH15/VL15最为成功。
然后使公开的VH/VL组合与人IgG抗体的各种Fc区组合。与亲本9F9抗体相比，9F9VH15/VL15以剂量依赖性方式以及在与hIgG1-LALA和hIgG2配对时成功刺激FITC信号(图6C)。不含VH/VL链的同种型未暴露于OKT3，因此不引发FITC信号(图6C)。
在仅存在OKT3的情况下，细胞显示出明显的FITC信号，而在存在不含VH/VL的对照IgG的情况下，细胞则不会显示出明显的FITC信号(图6D)。亲本20E4(VH0/VL0)抗VISTA和所有测试的人源化20E4 VH/VL对刺激FITC信号(作为VISTA介导的信号传导的代替物)(图6D)。
实施例6.9E9和20E4抗VISTA抗体在移植物抗宿主(GvHD)小鼠模型中是有效的
本研究的目的是评价亲本和人源化9E9和20E4抗VISTA抗体在移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型中的功效。
A.9E9和20E4抗VISTA抗体可有效清除人CD45+GvHD小鼠模型。
通过测量体重和目视评价小鼠皮肤剥落来评价研究的功效。在整个研究过程中，对小鼠的总体活动进行评价。还测量了人CD45+细胞植入的水平，该水平表示血液中GvHD的进展水平。参见，例如，Ali等人,PLoS One.2012；7(8):e44219。
在第0天，通过静脉注射给所有小鼠注射1000万个人PBMC并将所有小鼠分成三组。第1组在第0天接受同种型对照治疗。第2组和第3组分别通过腹腔注射用9F9或20E4治疗。每只小鼠添加0.5mg供试品。每周测量体重。在2周给予第二剂量供试品(图7)。在第2周和第5周采集血液样品进行流式细胞术分析。第37天对小鼠实施安乐死。
使用GraphPad软件Prism来分析作为原始数据收集的测量值。P<0.05被认为具有统计学显著性。
结果：移植物抗宿主病会导致动物体重下降，因为随着疾病的进展，动物会表现出迟钝且活动减少。用亲本9F9和20E4抗VISTA抗体来治疗小鼠，并在研究期间测定体重减少(图8)。与同种型对照组相比，9F9和20E4治疗组的体重变化具有统计学差异(图8)。
患有GvHD的小鼠会随时间推移病患进展而出现皮肤剥落。第33天，对小鼠进行拍照，以记录在不同组中观察到的皮肤剥落水平。在用同种型对照注射的小鼠中观察到皮肤剥落。用亲本9F9或20E4抗VISTA抗体治疗的小鼠则未显示出明显的皮肤剥落(图9)。
在PBMC转移后第14天和第37天收集血清。收集细胞并进行人和小鼠CD45染色以进行流式细胞术分析。与对照相比，用9F9或20E4抗体治疗的小鼠中的人CD45+细胞减少具有统计学显著性(图10)。
进一步分析样品以确定CD45+细胞来源于小鼠还是人。与对照相比，用9F9或20E4抗体治疗的小鼠中的人CD45+细胞减少具有统计学显著性(图11)。
B.20E4人源化抗VISTA抗体可有效清除人CD45+GvHD小鼠模型。
方法：在第0天，通过静脉注射给所有小鼠注射1000万个人PBMC并将所有小鼠分成七组(图12)。A组在第0天接受同种型对照治疗。B组在第0天和第14天用20E4 VH3/VL3hIgG2治疗。C组在第5天和第14天用20E4 VH3/VL3 IgG2治疗。每只小鼠添加0.5mg供试品。每周测量体重。在第2周和第4周采集血液样品进行流式细胞术分析。在PBMC转移后第13天和第22天收集血清。收集细胞并进行人和小鼠CD45+染色以进行流式细胞术分析。第62天对小鼠实施安乐死。
结果：移植物抗宿主病会导致动物体重下降，因为随着疾病的进展，动物会表现出迟钝且活动减少。用具有IgG2 Fc区的人源化20E4抗VISTA抗体对小鼠进行治疗可以持久地阻止移植物抗宿主症状的进展，并防止小鼠体重减少。
患有GvHD的小鼠会随时间推移病患进展而出现皮肤剥落。第62天，对小鼠进行拍照，以记录在不同组中观察到的皮肤剥落水平。在用同种型对照注射的小鼠中观察到皮肤剥落。用20E4 VH3/VL3人源化抗VISTA hIgG2抗体治疗的小鼠则未显示出明显的皮肤剥落(图13)。
在第22天，与对照相比，用20E4 VH3/VL3 hIgG2抗体治疗的小鼠中的人CD45+细胞减少具有统计学显著性(图14A-B)。
实施例7.9E9和20E4抗VISTA抗体可有效抑制PBMC和T细胞活化。
本研究的目的是评价人源化9E9和20E4抗VISTA抗体在抑制活化的PBMC和T细胞方面的功效。
A.9E9和20E4抗VISTA抗体在激动性抗体介导的PBMC/T细胞活化的抑制方面是有效的。
将人PBMC解冻并在含有抗CD3(2μg/ml)、VSIG-3Fc(4μg/ml)或IgG-Fc的预涂覆平板中培养。第二天，将测试单克隆抗体以3nM浓度添加至培养体系中，并添加或不添加VISTA配体VSIG3。在第3天收获细胞并用抗CD3 PE和抗CD25 PE花青5.5对细胞进行染色。通过对CD3阳性细胞进行设门进行流式细胞术分析，并分析CD25的GFI。CD25表达降低表明这些活化的CD25+CD3+T细胞受到抑制。
结果：结果表明，9F9和20E4 hIgG1增强了VISTA配体VSIG3对活化的PBMC/T细胞的抑制(图15A，图15B)。这些结果表明，示例性9F9和20E4抗VISTA激动性抗体可用于治疗自身免疫性疾病。
B.9E9和20E4抗VISTA抗体在激动性抗体介导的Jurkat细胞增殖的抑制方面是有效的。
方法：
在72小时内用不同剂量的9F9和20E4 hIgG2抗体来处理转染有或未转染人VISTA的IL-2活化的Jurkat细胞。对Jurkat细胞增殖进行测量(使用来自ApexBio目录#K1018的细胞计数试剂盒8，根据供应商的方案)。
结果：预期结果显示，9F9 hIgG2和20E4 hIgG2抗体均抑制转染有人VISTA的Jurkat细胞的增殖。预期抑制效果也是剂量依赖性的。
实施例8.9E9和20E4抗VISTA抗体在银屑病小鼠模型中是有效的。
本研究的目的是评价人源化9E9和20E4抗VISTA抗体在治疗自身免疫性疾病方面的功效。
A.9E9和20E4抗VISTA抗体在银屑病小鼠模型中是有效的激动性抗体。
用咪喹莫特对10-12周龄BALB/c-hVISTA雌性小鼠进行治疗，其中将总共20μL咪喹莫特(TLR7激动剂)施加于右耳前部和后部以诱导鼠银屑病模型。参见例如，Sci Rep.2017年5月3日；7(1):1485。左耳未施用任何药物。将右耳后部的涂抹区域固定在2cm×2cm的范围内。在一周内给予20mg/kg的测试抗体(即，9F9和20E4 hIgG1和hIgG2抗体)两次。取右耳后部患处皮肤进行IL-17A的ELISA检测。对患处皮肤进行活检并放入液氮中冷冻以进行ELISA分析。IL-17AELISA测量使用来自ProteinTech目录#KE00203的小鼠IL-17A双抗体夹心ELISA试剂盒根据供应商的方案进行。
结果：如图16所示，与用9F9 hIgG2或20E4 hIgG2抗体治疗的小鼠相比，用人IgG2治疗的小鼠的患处皮肤的IL-17A水平显著提高。结果再次表明，9F9和20E4激动性抗VISTA抗体可用于治疗自身免疫性疾病。
序列表

Claims (43)

1.一种抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分，所述抗VISTA抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
a)所述VH包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQID NO:48的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的LC-CDR3，其中所述VH包含SEQ ID NO:53-57中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:58-62中的任一者的氨基酸序列；或者
b)所述VH包括含有SEQ ID NO:1-3中的任一者的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ IDNO:4-6中的任一者的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ ID NO:8-10中的任一者的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQID NO:11-13中的任一者的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3，其中所述VH包含SEQ ID NO:16-30中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32-44中的任一者的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含SEQ ID NO:53-57中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:58-62中的任一者的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗VISTA构建体，其中：
1)所述VH包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
2)所述VH包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或者
3)所述VH包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗VISTA构建体，其中：
a)所述VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
b)所述VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；或者
c)所述VH包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
d)所述VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
e)所述VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
f)所述VH包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
g)所述VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；
h)所述VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的LC-CDR3；或者
i)所述VH包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR2以及含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包含含有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的LC-CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR2以及含有SEQID NO:14的氨基酸序列的LC-CDR3。
5.如权利要求1或权利要求4所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含SEQ ID NO:16-30中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32-44中的任一者的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗VISTA构建体，其中：
1)所述VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
2)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
3)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
4)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
5)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
6)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
7)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
8)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
9)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
10)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
11)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
12)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
13)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
14)所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
15)所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
16)所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
17)所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
18)所述VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
19)所述VH包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
20)所述VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
21)所述VH包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
22)所述VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
23)所述VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
24)所述VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
25)所述VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
26)所述VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
27)所述VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
28)所述VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
29)所述VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
30)所述VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；或者
31)所述VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且其中所述VL包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分是选自由以下各项组成的组的抗体或其抗原结合片段：全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双抗体、三抗体和四抗体。
9.如权利要求8所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分是全长抗体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分具有选自由以下Fc片段形式组成的组的Fc片段：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM以及它们的组合和杂合体。
11.如权利要求10所述的抗VISTA构建体，其中所述Fc片段选自由以下组成的组：来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4以及它们的组合和杂合体的Fc片段。
12.如权利要求10或权利要求11所述的抗VISTA构建体，其中所述Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有降低的效应子功能。
13.如权利要求10至12中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述Fc片段与对应的野生型Fc片段相比具有延长的半衰期。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体的所述抗体部分活化VISTA的下游信号传导通路。
15.如权利要求1至14中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体是VISTA的激动性抗体。
16.如权利要求14或权利要求15所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体的所述抗体部分活化或增加VISTA的下游信号传导通路至少约20％。
17.如权利要求1至13中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体是VISTA的拮抗性抗体。
18.如权利要求1至17中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述VISTA是人VISTA。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至18中任一种所述的抗VISTA构建体，以及药学上可接受的载剂。
20.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如权利要求1至18中任一项所述的抗VISTA构建体。
21.一种载体，所述载体包含如权利要求20所述的分离的核酸。
22.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含如权利要求20所述的分离核酸，或者如权利要求21所述的载体。
23.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含连接至治疗剂或标记的如权利要求1至18中任一项所述的抗VISTA构建体。
24.一种产生抗VISTA构建体的方法，所述方法包括：
a)在可有效表达所述抗VISTA构建体的条件下培养如权利要求22所述的分离的宿主细胞；以及
b)从所述宿主细胞获得表达的抗VISTA构建体。
25.一种治疗个体的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至18中任一项所述的抗VISTA构建体，或者如权利要求19所述的药物组合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述疾病或疾患与免疫系统失调有关。
27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述疾病或疾患与活化的T细胞有关。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述活化的T细胞是CD3+CD25+T细胞和/或CD45+T细胞。
29.如权利要求25至28中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患与VISTA阳性细胞有关。
30.如权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植有关的疾患。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、自身免疫性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
32.如权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA构建体静脉内或皮下施用于所述个体。
33.如权利要求25至32中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA构建体以约0.001mg/kg至约100mg/kg的剂量施用。
34.如权利要求25-33中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
35.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1至18中任一项所述的抗VISTA构建体。
36.如权利要求1至18中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体抑制PBMC和/或T细胞活化至少20％。
37.如权利要求1至19中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体减少IL-17A的产生至少30％。
38.如权利要求25至34中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA构建体与第二剂一起施用。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述第二剂是VISTA激动剂。
40.如权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述第二剂是VISTA配体。
41.如权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述第二剂是多肽。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述VISTA配体包含VSIG3或其片段。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述VSIG3或其片段与Fc结构域融合。
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