TW201446794A

TW201446794A - 利用抗－ｃｄ１２３嵌合抗原受體工程化ｔ細胞之初級人類白血病有效靶向

Info

Publication number: TW201446794A
Application number: TW103105727A
Authority: TW
Inventors: Jennifer Brogdon; Saar Gill; Carl H June; Michael D Kalos; Andreas Loew; John Scholler
Original assignee: Novartis Ag; Univ Pennsylvania
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2014-12-16
Also published as: EP3744736A1; WO2014130635A1; WO2014130635A8; US9573988B2; EP2958942B1; ES2814962T3; US11028177B2; US20170183415A1; EP2958942A1; UY35340A; US20140322212A1

Abstract

本發明提供用於治療白血病(例如急性骨髓樣白血病(AML)及B細胞急性淋巴樣白血病(B-ALL))之組合物及方法。本發明亦係關於至少一種特異性針對CD123之嵌合抗原受體(CAR)、包括該受體之載體及包括該CD123 CAR之重組T細胞。本發明亦包含投與表現包括CD123結合結構域之CAR之遺傳修飾T細胞之方法。本發明亦包含用於需要骨髓重調理或移植之治療之骨髓清除的方法。

Description

利用抗-CD123嵌合抗原受體工程化T細胞之初級人類白血病有效靶向

本申請案主張於2013年8月14日提出申請的美國第61/865,856號及於2013年2月20日提出申請的美國第61/767,058號之優先權，該等申請案中每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中。

序列表

本申請案含有以ASCII格式以電子方式提交之序列表且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII複本在2014年2月13日創建，命名為N2067-7001WO_SL.txt且大小為264,024個位元組。

本發明概言之係關於經工程化以表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞及其例如治療與介白素3受體α鏈(IL-3Rα，CD123)之表現相關之疾病或病況的用途。

大多數急性骨髓樣白血病(AML)患者利用標準療法不可治癒(Mrozek等人，2012,J Clin Oncol,30：4515-23)，且患有復發性或難治性AML(RR-AML)之彼等具有尤差預後(Kern等人，2003,Blood 2003,101：64-70；Wheatley等人，1999,Br J Haematol,107：69-79)。

遺傳工程可賦予T細胞針對選擇靶之特異性。T細胞可使用編碼抗體之單鏈可變片段(scFv)之遺傳材料結合信號傳導分子來轉導，由此利用互補決定區(CDR)以非MHC限制方式識別細胞表面抗原。該等細胞稱為嵌合抗原受體(CAR)T細胞。靶向多種惡性腫瘤中至少20種不同表面分子之臨床前及臨床嘗試已顯示一些活性，但通常受限於所輸注CAR T細胞產物之較差持久性(Sadelain等人，2009,Curr Opin Immunol 2009,21：215-23)。在晚期CLL及ALL患者中使用抗-CD19重定向T細胞之最新成果(Porter等人，2011,N Engl J Med,365：725-33；Kalos等人，2011,Science Transl Med,3：95ra73；Grupp及Kalos，2013,N Engl J Med,368：1509-18)展示，單次輸注該等細胞後可消滅大量腫瘤負荷，其中緩解狀況持續3年至今，此突出顯示CAR T細胞療法之巨大潛能。在動物模型中靶向AML之臨床前嘗試極少(Marin等人，2010,Haematologica,95：2144-52；Tettamanti等人，2013,Br J Haematol,161：389-401)，但最近公開的小型臨床試驗展示，產生T細胞且將其輸注至侵襲性惡性腫瘤患者係可行的(Ritchie等人，2013,Mol Ther，刊載前之電子版PMID 23831595)。

本發明尤其提供包括以下之組合物：至少一種特異性針對CD123之嵌合抗原受體(CAR)(稱為CAR123或CD123 CAR)、包括該受體之載體及包括CD123 CAR之重組T細胞。本發明亦包含製造表現CAR之遺傳修飾T細胞(CART)之方法，其中所表現之CAR包括抗-CD123結合結構域。

本發明概言之亦係關於利用經工程化以表現CAR之T細胞治療與介白素3受體α鏈(IL-3Rα，CD123)之表現相關之疾病。在一態樣中，疾病係與CD123之表現相關之癌症。在一態樣中，癌症係血液癌。

本發明CAR亦可用於利用工程化CART123細胞來消滅表現CD123之正常細胞之方法。

因此，在一態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中CAR包括包含以下結構域之抗體或抗體片段：抗-CD123結合結構域(例如與CD123特異性結合之人類化抗體或抗體片段)、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域(例如包括共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域)。在一實施例中，CAR包括包含以下結構域之抗體或抗體片段：本文所闡述之抗-CD123結合結構域(例如與如本文所闡述之CD123特異性結合之人類化抗體或抗體片段)、本文所闡述之跨膜結構域及本文所闡述之細胞內信號傳導結構域(例如包括共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域)。

在一實施例中，所編碼之抗-CD123結合結構域包括本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如所有3個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，以及本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如所有3個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗-CD123結合結構域包括一或多個(例如所有3個)LC CDR及一或多個(例如所有3個)HC CDR。在一實施例中，所編碼之抗-CD123結合結構域包括本文所闡述之輕鏈可變區(例如在表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中)及/或本文所闡述之重鏈可變區(例如在表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中)。在一實施例中，所編碼之抗-CD123結合結構域係包括表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括：輕鏈可變區，其包括具有表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101 之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包括具有表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之重鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，編碼抗-CD123結合結構域之核酸序列包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：79，或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，所編碼之抗-CD123結合結構域為scFv，且包括本文所闡述胺基酸序列之輕鏈可變區(例如在表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中)經由連接體(例如本文所闡述之連接體)附接至包括本文所闡述胺基酸序列之重鏈可變區(例如在表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中)。在一實施例中，所編碼之抗-CD123結合結構域包含(Gly₄-Ser)n連接體，其中n為1、2、3、4、5或6，較佳為4(SEQ ID NO：126)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。

在一實施例中，所編碼之CAR包含包括選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一實施例中，所編碼之跨膜結構域包括序列SEQ ID NO：5。在一實施例中，所編碼之跨膜結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：5之至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於20、10或5個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，編碼跨膜結構域之核酸序列包括SEQ ID NO：12之序列或與其具有95%至99%一致性之序列。

在一實施例中，所編碼之抗-CD123結合結構域藉由鉸鏈區(例如本文所闡述之鉸鏈區)連接至跨膜結構域。在一實施例中，所編碼之鉸鏈區包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：124或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，編碼鉸鏈區之核酸序列包括序列SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：123或SEQ ID NO：125或與其具有95%至99%一致性之序列。

在一實施例中，經分離核酸分子進一步包括編碼共刺激結構域(例如本文所闡述之共刺激結構域)之序列。在一實施例中，所編碼之共刺激結構域包括選自由以下組成之群之蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。在一實施例中，所編碼之共刺激結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23。在一實施例中，所編碼之共刺激結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23之至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於20、10或5個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，編碼共刺激結構域之核酸序列包括序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：27或與其具有95%至99%一致性之序列。

在一實施例中，經分離核酸分子進一步包括編碼細胞內信號傳導結構域(例如本文所闡述之細胞內信號傳導結構域)之序列。在一實施例中，所編碼之細胞內信號傳導結構域包括4-1BB之功能信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能信號傳導結構域。在一實施例中，所編碼之細胞內信號傳導結構域包括CD27之功能信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能信號傳導結構域。在一實施例中，所編碼之細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或胺基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98之至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於20、10或5個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或胺基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，所編碼之細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98，其中包括細胞內信號傳導結構域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈表現。在一實施例中，編碼細胞內信號傳導結構域之核酸序列包括序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：27或與其具有95%至99%一致性之序列，及/或序列SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：99或與其具有95%至99%一致性之序列。

在另一態樣中，本發明係關於編碼CAR構築物之經分離核酸分子，該CAR構築物包括前導序列，例如本文所闡述之前導序列，例如前導序列SEQ ID NO：3；本文所闡述之抗-CD123結合結構域，例如本文所闡述包括LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3之抗-CD123結合結構域，例如表1或SEQ ID NO：2中所闡述之抗-CD123結合結構域或與其具有95%至99%一致性之序列；本文所闡述之鉸鏈區，例如鉸鏈區SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：124；本文所闡述之跨膜結構域，例如具有序列SEQ ID NO：5；及細胞內信號傳導結構域(例如本文所闡述之細胞內信號傳導結構域)。在一實施例中，所編碼之細胞內信號傳導結構域包括共刺激結構域，例如本文所闡述之共刺激結構域，例如具有序列SEQ ID NO：6之4-1BB共刺激結構域；及/或初級信號傳導結構域，例如本文所闡述之初級信號傳導結構域，例如具有序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98之CD3 ζ刺激結構域。在一實施例中，所編碼之細胞內信號傳導結構域包括共刺激結構域，例如本文所闡述之共刺激結構域，例如具有序列SEQ ID NO：23之CD27共刺激結構域；及/或初級信號傳導結構域，例如本文所闡述之初級信號傳導結構域，例如具有序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98之CD3 ζ刺激結構域。在一實施例中，編碼CAR構築物之經分離核酸分子包含由核酸序列SEQ ID NO：3或與其具有95%至99%一致性之序列編碼之前導序列。在一實施例中，編碼CAR構築物之經分離核酸分子包含由以下核酸序列編碼之抗-CD123結合結構域序列：SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：79或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，編碼CAR構築物之經分離核酸分子包含由核酸序列SEQ ID NO：12或與其具有95%至99%一致性之序列編碼之跨膜序列。在一實施例中，編碼CAR構築物之經分離核酸分子包含由以下核酸序列編碼之細胞內信號傳導結構域序列：SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：27或與其具有95%至99%一致性之序列，及/或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：99或與其具有95%至99%一致性之序列。

在一實施例中，經分離核酸分子包括編碼以下CAR胺基酸序列之核酸(例如由其組成)：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：83，或具有胺基酸序列SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：83的至少1個、2個、3個、4個、 5個、10個、15個、20個或30個修飾(例如取代)但不大於60、50或40個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：83具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一實施例中，經分離核酸分子包括編碼以下CAR胺基酸序列之核酸(例如由其組成)：SEQ ID NO：1，或具有胺基酸序列SEQ ID NO：1的至少1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個或30個修飾(例如取代)但不大於60、50或40個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。

在一實施例中，經分離核酸分子包括以下核酸序列(例如由其組成)：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：80，或與核酸序列SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：80具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。在一實施例中，經分離核酸分子包括以下核酸序列(例如由其組成)：SEQ ID NO：8，或與核酸序列SEQ ID NO：8具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。

在一態樣中，本發明係關於編碼抗-CD123結合結構域之經分離核酸分子，其中抗-CD123結合結構域包括本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如所有3個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，以及本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如所有3個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗-CD123結合結構域包括一或多個(例如所有3個)LC CDR及一或多個(例如所有3個)HC CDR。在一實施例中，所編碼之抗-CD123結合結構域包括本文所闡述之輕鏈可變區(例如在SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中)及/或本文所闡述之重鏈可變區(例如在SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中)。在一實施例中，所編碼之抗-CD123結合結構域係包括胺基酸序列SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78之輕鏈及重鏈之scFv。在實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括：輕鏈可變區，其包括具有SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78具有95%至99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包括具有SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中所提供之重鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78，或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，編碼抗-CD123結合結構域之核酸序列包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：79，或與其具有95%至99%一致性之序列。

在另一態樣中，本發明係關於由核酸分子編碼之經分離多肽分子。在一實施例中，經分離多肽分子包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：83，或與其具有95%至99%一致性之序列。

在另一態樣中，本發明係關於經分離嵌合抗原受體(CAR)分子，其包括抗-CD123結合結構域(例如與CD123特異性結合之人類化抗體或抗體片段)、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域(例如包括共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域)。在一實施例中，CAR包括包含以下結構域之抗體或抗體片段：本文所闡述之抗-CD123結合結構域(例如如本文所闡述與CD123特異性結合之人類化抗體或抗體片段)、本文所闡述之跨膜結構域及本文所闡述之細胞內信號傳導結構域(例如本文所闡述包括共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域)。

在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如所有3個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，以及本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如所有3個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗-CD123結合結構域包括一或多個(例如所有3個)LC CDR及一或多個(例如所有3個)HC CDR。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括本文所闡述之輕鏈可變區(例如在表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中)及/或本文所闡述之重鏈可變區(例如在表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中)。在一實施例中，抗-CD123結合結構域係包括表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括：輕鏈可變區，其包括具有表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表1或 SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包括具有表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之重鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，抗-CD123結合結構域為scFv，且包括本文所闡述胺基酸序列之輕鏈可變區(例如在表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中)經由連接體(例如本文所闡述之連接體)附接至包括本文所闡述胺基酸序列之重鏈可變區(例如在表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中)。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包含(Gly₄-Ser)n連接體，其中n為1、2、3、4、5或6，較佳為4(SEQ ID NO：126)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。

在一實施例中，經分離CAR分子包括包括選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一實施例中，跨膜結構域包括SEQ ID NO：5之序列。在一實施例中，跨膜結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：5的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有95%至99%一致性之序列。

在一實施例中，抗-CD123結合結構域藉由鉸鏈區(例如本文所闡述之鉸鏈區)連接至跨膜結構域。在一實施例中，所編碼之鉸鏈區包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：124或與其具有95%至99%一致性之序列。

在一實施例中，經分離CAR分子進一步包括編碼共刺激結構域(例如本文所闡述之共刺激結構域)之序列。在一實施例中，共刺激結構域包括選自由以下組成之群之蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。在一實施例中，共刺激結構域包括SEQ ID NO：6之序列。在一實施例中，共刺激結構域包括SEQ ID NO：23之序列。在一實施例中，共刺激結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23具有95%至99%一致性之序列。

在一實施例中，經分離CAR分子進一步包括編碼細胞內信號傳導結構域(例如本文所闡述之細胞內信號傳導結構域)之序列。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括4-1BB之功能信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能信號傳導結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6及/或序列SEQ ID NO：7。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6及/或序列SEQ ID NO：98。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括CD27之功能信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能信號傳導結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：23及/或序列SEQ ID NO：7。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：23及/或序列SEQ ID NO：98。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或胺基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或胺基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98，其中包括細胞內信號傳導結構域之序列在同一框架中且以單一多肽鏈表現。

在一實施例中，經分離CAR分子進一步包括前導序列，例如本文所闡述之前導序列。在一實施例中，前導序列包括胺基酸序列SEQ ID NO：3或與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%至99%一致性之序列。

在另一態樣中，本發明係關於經分離CAR分子，其包括前導序列，例如本文所闡述之前導序列，例如前導序列SEQ ID NO：3或與其具有95%至99%一致性；本文所闡述之抗-CD123結合結構域，例如本文所闡述包括LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3之抗-CD123結合結構域，例如表1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所闡述之抗-CD123結合結構域或與其具有95%至99%一致性之序列；鉸鏈區，例如本文所闡述之鉸鏈區，例如鉸鏈區SEQ ID NO：4或與其具有95%至99%一致性；跨膜結構域，例如本文所闡述之跨膜結構域，例如具有序列SEQ ID NO：5或與其具有95%至99%一致性之序列之跨膜結構域；細胞內信號傳導結構域，例如本文所闡述之細胞內信號傳導結構域(例如包括共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域)。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括共刺激結構域，例如本文所闡述之共刺激結構域，例如具有序列SEQ ID NO：6之4-1BB共刺激結構域或具有SEQ ID NO：23或與其具有95%至99%一致性之序列之CD27共刺激結構域；及/或初級信號傳導結構域，例如本文所闡述之初級信號傳導結構域，例如具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98或與其具有95%至99%一致性之序列之CD3 ζ刺激結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括共刺激結構域，例如本文所闡述之共刺激結構域，例如具有序列SEQ ID NO：6之4-1BB共刺激結構域或具有序列SEQ ID NO：23之CD27共刺激結構域；及/初級信號傳導結構域，例如本文所闡述之初級信號傳導結構域，例如具有序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98之CD3 ζ刺激結構域。

在一實施例中，經分離CAR分子包括以下胺基酸序列(例如由其組成)：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：83，或具有胺基酸序列SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：83的至少1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個或30個修飾(例如取代)但不大於60、50或40個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：83具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一實施例中，經分離CAR分子包括以下胺基酸序列(例如由其組成)：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：121，或具有胺基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：121的至少1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個或30個修飾(例如取代)但不大於60、50或40個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119或SEQ ID NO：121具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。

在一態樣中，本發明係關於抗-CD123結合結構域，其包括本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如所有3個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，以及本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如所有3個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗-CD123結合結構域包括一或多個(例如所有3個)LC CDR及一或多個(例如所有3個)HC CDR。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括本文所闡述之輕鏈可變區(例如在SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78中)及/或本文所闡述之重鏈可變區(例如在SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78中)。在一實施例中，抗-CD123結合結構域係包括以下胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78。在實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括：輕鏈可變區，其包括具有SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78中之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包括具有 SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78中所提供之重鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78中之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列。

在另一態樣中，本發明係關於包括本文所闡述核酸分子(例如編碼本文所闡述CAR之核酸分子)之載體。在一實施例中，載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。

在一實施例中，載體為慢病毒載體。在一實施例中，載體進一步包括啟動子。在一實施例中，啟動子為EF-1啟動子。在一實施例中，EF-1啟動子包括SEQ ID NO：106之啟動子序列之序列。

在一實施例中，載體係活體外轉錄之載體，例如轉錄本文所闡述核酸分子之RNA之載體。在一實施例中，載體中之核酸序列進一步包括聚(A)尾，例如本文所闡述之聚A尾，例如包括約150個三磷酸腺苷鹼基(SEQ ID NO：127)。在一實施例中，載體中之核酸序列進一步包括3’UTR，例如本文所闡述之3’UTR，例如包括源自人類β-球蛋白之3’UTR之至少一個重複序列，例如存在於SEQ ID NO：94中之3’UTR。在一實施例中，載體中之核酸序列進一步包括啟動子，例如T2A啟動子，例如存在於SEQ ID NO：94中之T2A啟動子。

在另一態樣中，本發明係關於包括本文所闡述載體之細胞。在一實施例中，細胞係本文所闡述之細胞，例如人類T細胞，例如本文所闡述之人類T細胞。在一實施例中，人類T細胞為CD8+ T細胞。

在另一態樣中，本發明係關於製造細胞之方法，其包括使用包括編碼CAR(例如本文所闡述之CAR)之核酸的載體轉導本文所闡述之細胞(例如本文所闡述之T細胞)。

本發明亦提供產生瞬時表現外源RNA之RNA工程化細胞(例如本文所闡述之細胞，例如T細胞)群之方法。該方法包括將活體外轉錄RNA或合成RNA引入細胞中，其中該RNA包括編碼本文所闡述CAR分子之核酸。

在另一態樣中，本發明係關於在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫之方法，其包括向哺乳動物投與有效量之表現CAR分子之細胞(例如表現本文所闡述CAR分子之細胞)。在一實施例中，細胞為自體T細胞。在一實施例中，細胞為同種異體T細胞。在一實施例中，哺乳動物為人類。

在另一態樣中，本發明係關於治療患有與CD123之表現相關之疾病或病症(例如與CD123之表現相關之增生性疾病、癌前病況及非癌症相關適應症)之哺乳動物之方法，其包括向哺乳動物投與有效量之表現CAR分子(例如本文所闡述之CAR分子)之細胞。

在一實施例中，表現CAR分子(例如本文所闡述之CAR分子)之細胞係與增加表現CAR分子之細胞功效之藥劑(例如本文所闡述之藥劑)組合投與。

在一實施例中，表現CAR分子(例如本文所闡述之CAR分子)之細胞係與改善一或多種與表現CAR分子之細胞的投與相關之副作用之藥劑(例如本文所闡述之藥劑)組合投與。

在一實施例中，表現CAR分子(例如本文所闡述之CAR分子)之細胞係與治療CD123相關疾病之藥劑(例如本文所闡述之藥劑)組合投與。

在一實施例中，表現CAR分子(例如本文所闡述之CAR分子)之細胞係以本文所闡述之劑量及/或給藥方案來投與。

在一實施例中，表現CAR分子(例如本文所闡述之CAR分子)之細胞係作為疾病(例如癌症，例如本文所闡述之癌症)之第一線治療來投與。在另一實施例中，表現CAR分子(例如本文所闡述之CAR分子)之細胞係作為疾病(例如癌症，例如本文所闡述之癌症)的第二、第三、第四線治療來投與。

在一實施例中，哺乳動物(例如人類個體)先前已接受抗-CD19療法(例如CD19 CART療法)之治療。在實施例中，哺乳動物(例如人類個體)經歷使用抗-CD19療法之復發。

在一實施例中，投與本文所闡述之細胞群。

在另一態樣中，本發明係關於消滅表現CD123之正常細胞之方法，其包括投與表現本文所闡述CAR分子之細胞。在一態樣中，消滅係在個體中投與表現CD123-CAR分子之細胞，以使該方法適於用作細胞移植前之細胞調理療法。在一實施例中，表現CD123之正常細胞係表現CD123之幹細胞，且細胞移植包括幹細胞移植。例如，在一實施例中，例如本文所闡述表現CD123 CAR分子之細胞係用於骨髓清除以自個體消除現有骨髓之至少一部分。可在例如需要骨髓移植之個體中利用表現CD123 CAR分子之細胞來實施骨髓清除。例如，在一實施例中，表現CD123 CAR分子(例如CART123)之細胞係用於骨髓或幹細胞移植前之細胞調理方案。在一實施例中，表現CD123 CAR分子之細胞係作為疾病治療之至少一部分用於骨髓清除，該疾病包含(但不限於)血液癌症、實體腫瘤、血液疾病、代謝病症、HIV、HTLV、溶酶體儲積症及免疫缺陷。

在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明CAR之經分離核酸分子、本發明CAR之經分離多肽分子、包括本發明CAR之載體及用作例如如本文所闡述之藥劑之包括本發明CAR之細胞。

在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明CAR之經分離核酸分子、本發明CAR之經分離多肽分子、包括本發明CAR之載體及用於治療表現CD123之疾病(例如表現如本文所闡述CD123之疾病)的包括本發明CAR之細胞。

在一態樣中，本發明之CD123 CAR係用於針對與CD123表現相關之疾病、病症或病況之療法中。在一態樣中，疾病、病症或病況係與CD123表現相關之癌症，包含(但不限於)AML、骨髓發育不良症候群、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、多毛細胞白血病、前淋巴球性白血病、慢性骨髓樣白血病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤及諸如此類。

在一態樣中，表現CD123 CAR之細胞係用於針對表現CD123之癌症之癌症療法。在一實施例中，癌症為血液癌，例如急性骨髓樣白血病(AML)。

本發明概言之亦係關於利用細胞輸注來治療患有與CD123之表現相關之癌症或具有患與CD123之表現相關之癌症風險的患者。在一實施例中，細胞輸注包括至少一種表現CD123 CAR之細胞。與CD123之表現相關之癌症之實例包含(但不限於)AML、骨髓發育不良症候群、ALL、多毛細胞白血病、前淋巴球性白血病、慢性骨髓樣白血病、霍奇金氏淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤及諸如此類。

在一實施例中，利用淋巴球輸注(例如同種異體淋巴球輸注)來治療癌症，其中淋巴球輸注包括至少一種表現CD123 CAR之細胞。在一實施例中，利用自體淋巴球輸注來治療癌症，其中自體淋巴球輸注包括至少一種表現CD123之細胞。在另一實施例中，可利用本發明之表現CD123 CAR之細胞來消滅表現CD123之正常細胞，由此可適於用作細胞移植前之細胞調理療法。在一實施例中，表現CD123之正常細胞係表現CD123之幹細胞，且細胞移植包括幹細胞移植。

在一態樣中，本發明係關於在個體中進行骨髓清除之方法，其包括在需要骨髓移植之個體中利用例如本文所闡述表現CD123 CAR之細胞來消除至少一部分天然骨髓。在一實施例中，本發明包含治療患有骨髓移植可能有益之疾病或病症之個體的方法，其包括向需要骨髓移植之個體投與例如本文所闡述表現CD123 CAR之細胞。其中利用表現CD123 CAR之細胞進行骨髓清除之本發明方法可用作治療之至少一部分的實例性疾病包含(但不限於)血液癌症、實體腫瘤、血液疾病、代謝病症、HIV、HTLV、溶酶體儲積症及免疫缺陷。

在一實施例中，例如利用活體外轉錄將CD123 CAR引入T細胞中，且個體(例如人類)接受包括CD123 CAR分子之細胞之初始投與及包括CD123 CAR分子之細胞之一或多次隨後投與，其中一或多次隨後投與係在先前投與後小於15天(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)時投與。在一實施例中，向個體(例如人類)每週投與一次以上包括CD123 CAR分子之細胞，例如每週投與2次、3次或4次包括CD123 CAR分子之細胞。在一實施例中，向個體(例如人類個體)每週投與一次以上(例如每週投與2次、3次或4次)包括CD123 CAR分子之細胞(在本文中亦稱為一個循環)，隨後一週不投與包括CD123 CAR分子之細胞，且然後向個體一或多次額外投與包括CD123 CAR分子之細胞(例如每週投與一次以上包括CD123 CAR分子之細胞)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受一個以上包括CD123 CAR分子之細胞的循環，且每一循環之間之時間小於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一實施例中，包括CD123 CAR分子之細胞係以每週3次每隔一天來投與。在一實施例中，將包括CD123 CAR分子之細胞持續投與至少2、3、4、5、6、7、8週或更多週。

在一態樣中，本發明包含經包括編碼例如如本文所闡述CD123-CAR分子之核酸分子的載體轉染或轉導之自體細胞群。在一實施例中，載體為逆轉錄病毒載體。在一實施例中，載體係如本文在別處闡述之自失活慢病毒載體。在一實施例中，將載體遞送(例如藉由轉染或電穿孔)至細胞(例如T細胞)，其中載體包括編碼如本文所闡述之CD123 CAR分子之核酸分子，該核酸分子轉錄成mRNA分子，且CD123 CAR分子自RNA分子翻譯並在細胞表面上表現。

在一實施例中，編碼例如如本文所闡述之CD123 CAR分子之核酸分子表現為mRNA分子。在一實施例中，可藉由將編碼期望CAR(例如不含載體序列)之RNA分子轉染或電穿孔至細胞中來產生經遺傳修飾之表現CD123 CAR之細胞(例如T細胞)。在一實施例中，一旦CD123 CAR分子納入重組細胞且在重組細胞表面上表現即自RNA分子翻譯。

圖1繪示以下實驗之結果：(圖1A)初級患者AML樣品通常為CD123⁺。利用標準側散射^低CD45^暗特性對母細胞進行設門。(圖1B)不同初級樣品內CD123之表現不均一但始終存在，如藉由對母細胞設門且利用殘餘正常淋巴球或同種型匹配之對照所揭露，以確定對CD123之正確設門。(圖1C)自初級AML樣本對CD123^亮及CD123^暗子群進行流式分選，且利用Taqman RTqPCR來量化CD123 RNA之表現。採用黑素瘤細胞系(A375)作為陰性對照。(圖1D)脫粒及細胞介素產生分析之結果。(圖1E)CART123細胞而非CART19細胞因應MOLM14(CD123⁺ AML細胞系)或初級AML產生細胞介素。利用抗-個體基因型抗-小鼠CAR19或山羊抗-小鼠Fab(對於CD123 CAR)完成CAR染色。細胞內細胞介素為IFNγ、MIP1β及TNFα。(圖1F)用CFSE對 CART123、CART19或未轉導T細胞進行標記且於初級AML細胞下暴露96小時。顯示CART123細胞群之增殖及富集。(圖1G)基於過夜螢光細胞計數之殺死分析展示CART123而非CART19細胞殺死初級AML母細胞。(圖1H)在將CART123(黑色)或CART19(白色)與MOLM14 AML一起培育24小時後所指示細胞介素之詳細說明。

圖2繪示展示在人類AML異種移植模型中CD123 CAR T細胞之臨床前功效之實驗的結果。(圖2A)異種移植模型之示意圖，IV：靜脈內注射；BLI：生物發光成像。使用BLI輻射之量化作為AML負荷之替代量度。(圖2B)僅在經CART123細胞治療之異種移植小鼠中出現MOLM14之消滅，如藉由BLI輻射所量測且以色度方式所展示。(圖2C)來自三個MOLM14異種移植實驗之BLI匯總數據。(圖2D)具有MOLM14之異種移植小鼠之存活率分析展示，與經媒劑及CART19治療之小鼠相比，經CART123治療之小鼠大量存活。(圖2E)再激發模型之示意圖。(圖2F)對照小鼠(未繪示於圖2E中，該等小鼠接受1×10⁶ gfp/螢光素酶⁺ MOLM14而非之前的CART123)、第一次激發小鼠(圖2E之頂部列)或先前已清除MOLM14之第二次激發小鼠(圖2E之底部列)之BLI的匯總。虛線指示無螢光素酶⁺疾病之小鼠中之基線BLI。(圖2G)經歷MOLM14再激發(第二次激發)之小鼠展示外周CART123細胞比經受初級MOLM14激發之小鼠更顯著的增加。(圖2H)代表性小鼠顯示MOLM14之初始成功植入與較低PB CART123數相關，且後期排斥伴隨有CART123細胞增多。

圖3繪示以下實驗之結果：(圖3A)初級AML異種移植模型之示意圖，(圖3B)接受T細胞後15天(實驗D29)之外周血顯示循環母細胞之消滅或顯著減少。(圖3C)來自三個獨立實驗之小鼠之複合存活率。在D15時注射T細胞。(圖3D)在活體內母細胞使CD123上調。初級AML之未設門代表(UPN34)顯示CD123之低量表現及CD33之高量表現。在注射至經對照未轉導T細胞治療之NSGS小鼠後，UPN34使CD123表現上調，如利用注射T細胞之前(D13，左側)與注射T細胞之後(D27，右側)的比較所顯示。所有接受對照T細胞之小鼠隨後皆死於疾病，且所有接受CART123細胞之小鼠皆展現長期存活。(圖3E)CD123表現量與增殖呈負相關，且大多數AML母細胞增殖出現在BM中。在對CD45^暗母細胞中之CD123進行表面染色後，針對增殖標記Ki67之細胞內表現對自垂死小鼠分離之血液、BM及脾進行染色。

圖4繪示以下實驗之結果：(圖4A)健康骨髓祖細胞群展現中等至較亮的CD123表現。FMO：螢光扣除對照。(圖4B)在半固體培養物中CD123^暗/陰性BM祖細胞分化成CD123⁺。(圖4C)CART123細胞顯著損害造血功能。(圖4D)循環BM細胞使CD123上調。(圖4E)用於CART123細胞之骨髓去除潛能之異種移植模型。(圖4F)在CART123小鼠中可見循環的人類B細胞逐漸減少(左側)，且伴隨有T細胞增加(右側)。(圖4G)人類BM在CART123小鼠中之骨髓清除。

圖5繪示展示母細胞可離體生長而與基線CD123表現無關之實驗的結果。

圖6繪示展示如初級AML細胞之CD34//CD38所定義CD123以等效量表現而與白血病幹細胞、祖細胞或整體母細胞群無關之實驗的結果。

圖7繪示不同CD123 CAR構築物之示意圖(圖7A)及一種CD123 CAR分子之載體圖(圖7B)。

圖8繪示展示選擇最佳CD123 CAR構築物之實驗的結果。

圖9繪示展示在異種移植小鼠中於人類白血病下暴露後在CART123細胞中形成記憶細胞群之實驗的結果。向先前經AML激發之小鼠(第二次激發組)或先前未經激發之小鼠(第一次激發組)注射CART123細胞且連續採血用於外周血T細胞數量及表型。

圖10繪示在不同實驗中將四個初級AML樣本注射至免疫缺陷NSGS小鼠中之實驗的結果。可觀察到CD123之量改變。

圖11繪示針對正常骨髓前體之設門策略。

圖12繪示展示CD123在正常循環B細胞及骨髓樣單核細胞上表現之實驗的結果。

圖13繪示展示在將CART123細胞輸注至「人類化免疫系統」小鼠中後28天時骨髓中實際上缺乏流式細胞術定義之普通骨髓樣祖細胞、顆粒球-單核球前體或普通淋巴樣祖細胞之實驗的結果。

圖14係展示CD123在初級ALL骨髓樣品表面上表現之影像，該表現對於CD34+標記亦呈陽性。頂圖顯示點圖，底圖顯示在相同樣品中CD34+細胞對CD34陰性群表現之直方圖。

圖15係展示CART123細胞選擇性識別CD123陽性B-ALL母細胞並由其引發之影像。

圖16係展示CART123細胞殺死B-ALL母細胞之影像。

圖17係顯示在(A)成人及(B)小兒ALL樣本中CD19、CD22及CD123表現之圖。

圖18係顯示在CART19療法後在CD19-ALL復發之患者中CD123表現之圖。

圖19係顯示在CART19療法後在另一CD19-ALL復發患者中CD123表現之圖。

圖20係顯示於B-ALL細胞系下暴露後CART19及CART123 T細胞增殖之圖。

圖21係顯示於初級B細胞ALL樣品下暴露後CART19及CART123 T細胞增殖之圖。

圖22係顯示因應NALM6 B-ALL、MOLM14、初級ALL及初級AML之CD123細胞脫粒之圖。

圖23係顯示因應CART19及CART123 T細胞於初級ALL樣品下暴露之可溶細胞介素分泌之圖。與初級ALL樣品實施共培養。

圖24係顯示4小時時細胞毒性之圖。測試CART123及CART19 T細胞殺死NALM6 B-ALL細胞之能力。

圖25係顯示在D0時注射有1×10⁶個Nalm6叩頭蟲綠色螢光素酶細胞之NSG小鼠存活率之圖。在D7時，向小鼠注射UTD T細胞、CART19細胞、CART123細胞或CART19與CART123之50：50混合群至1×10⁶之總細胞劑量(組合組)。

圖26係顯示人類化抗-CD123之VH序列之表(按編排順序分別為SEQ ID NO 93及33-34)。

圖27係顯示人類化抗-CD123之VL序列之表(按編排順序分別為SEQ ID NO 92及31-32)。

圖28係顯示人類化抗-CD123 scFv變體之表現之影像，該等變體在HEK293細胞中瞬時表現且經由C端6×His標籤(SEQ ID NO：128)純化至接近同質。

圖29係顯示人類化抗-CD123 scFv變體之表現之影像，該等變體在HEK293細胞中瞬時表現且經由C端6×His標籤(SEQ ID NO：128)純化至接近同質。

圖30係顯示藉由ELISA測定之人類化抗-C123 scFv變體與經固定CD123結合之圖。

圖31係顯示利用差示掃描螢光測定(DSF)量測之人類化抗-CD123 scFv變體之熔融溫度的圖。

圖32係顯示在擴增第10天時轉導T細胞中表面CAR表現之影像。

圖33係顯示轉導有不同人類化CAR構築物或對照小鼠抗-人類CD123 CAR之T細胞之功能研究的影像。

圖34係顯示使用轉導有不同人類化CAR構築物或對照小鼠抗-人類CD123 CAR之T細胞進行之殺死分析之結果的圖。

圖35係顯示在標準脫粒分析中電穿孔人類T細胞之分析之影像，其中將該等細胞靜置過夜，然後與靶標在抗-CD107a、抗-CD49d及抗-CD28以及孟寧素(monensin)存在下共培育2小時。

圖36係顯示在將T細胞注射至腫瘤植入小鼠中後D21及D28時生物發光之影像。

圖37係顯示在免疫缺陷動物中可使用RNA電穿孔T細胞來誘導活體內抗腫瘤反應之圖。

圖38係顯示藉助注射有CD123 CART T細胞之腫瘤植入小鼠之生物發光成像的腫瘤負荷之影像。

定義

除非另有定義，否則本文所使用所有技術及科學術語皆具有與熟習此項技術者所通常理解相同之含義。

在本文中使用術語「一」(「a」及「an」)係指一個或一個以上(即指至少一個)的該冠詞之文法受詞。舉例而言，「一要素」意指一個要素或一個以上的要素。

如本文所使用之術語「約」在提及諸如量、時間長度及諸如此類等可量測值時意欲涵蓋自指定值±20%、或在一些情況下為±10%、或在一些情況下為±5%、或在一些情況下為±1%、或在一些情況下為±0.1%的變化，只要該等變化適於實施所揭示之方法即可。

如本文所使用，術語「IL-3受體之α亞單位」、「IL3Rα」、「CD123」、「IL3Rα鏈」及「IL3Rα亞單位」可互換地指已知可在白血病前體細胞上檢測之抗原決定簇。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如GenBank、UniProt及Swiss-Prot。例如，人類IL3Rα之胺基酸序列可參見登錄號NP 002174，且人類IL3Rα之核苷酸序列編碼可參見登錄號NM 005191。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD123蛋白之細胞外結構域內之抗原。在一態樣中，CD123蛋白係在癌細胞上表現。

如本文所使用，術語「嵌合抗原受體」或另一選擇「CAR」係指包括以下結構域之重組多肽構築物：至少一個細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包括源自如本文所定義之刺激分子之功能信號傳導結構域之細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「細胞內信號傳導結構域」)。在一態樣中，刺激分子係與T細胞受體複合物締合之ζ鏈。在一態樣中，細胞內信號傳導結構域進一步包括一或多個源自至少一個如本文所定義之共刺激分子之功能信號傳導結構域。在一態樣中，共刺激分子係選自4-1BB(即CD137)、CD27及/或CD28。在一態樣中，CAR包括包含以下結構域之嵌合融合蛋白：細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及包括源自刺激分子之功能信號傳導結構域之細胞質信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包括包含以下結構域之嵌合融合蛋白：細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域，該細胞質信號傳導結構域包括源自共刺激分子之功能信號傳導結構域及源自刺激分子之功能信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包括包含以下結構域之嵌合融合蛋白：細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包括兩個源自一或多個共刺激分子之功能信號傳導結構域及源自刺激分子之功能信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包括包含以下結構域之嵌合融合蛋白：細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包括至少兩個源自一或多個共刺激分子之功能信號傳導結構域及源自刺激分子之功能信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包括位於CAR融合蛋白胺基端(N-ter)之可選前導序列。在一態樣中，CAR進一步包括位於細胞外抗原識別結構域N端之前導序列，其中該前導序列視情況在細胞處理及CAR至細胞膜定位期間自抗原識別結構域(例如scFv)裂解。如本文所使用，術語細胞內及細胞質可互換使用。

術語「信號傳導結構域」係指蛋白質之藉由在細胞內傳送資訊經由所定義信號傳導途徑藉由產生第二信使或藉由因應該等信使發揮效應子作用來起調控細胞活性作用的功能部分。

如本文所使用，術語「抗體」係指與抗原以例如非共價、可逆及特異性方式特異性結合之源自免疫球蛋白分子之蛋白質或多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整免疫球蛋白，且可源自天然來源或重組來源。抗體可為免疫球蛋白分子之四聚體。例如，天然IgG抗體係包括由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈與兩條輕(L)鏈的四聚體。每一重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為V_H)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個結構域：CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為V_L)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域CL。可將V_H及V_L區進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及較為保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。每一V_H及V_L由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可調介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包含免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(C1q))的結合。術語「抗體」包含(但不限於)單株抗體、人類抗體、人類化抗體、駱駝科抗體及嵌合抗體。抗體可為任何同種型/類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)或子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。

術語「抗體片段」係指完整抗體之至少一部分或其重組變體，且係指足以使抗體片段識別並特異性結合至靶標(例如抗原)之抗原結合結構域，例如完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包含(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、單鏈或「scFv」抗體片段、直鏈抗體、單一結構域抗體(例如sdAb(V_L或V_H))、駱駝科V_HH結構域及自抗體片段形成之多特異性抗體。術語「scFv」係指包括至少一個包括輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包括重鏈可變區之抗體片段之融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區經由短撓性多肽連接體以鄰接方式連接，且能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留衍生出其之完整抗體之特異性。除非有說明，否則如本文所使用scFv可具有呈任一順序之V_L及V_H可變區，例如對於多肽之N端及C端，scFv可包括V_L-連接體-V_H或可包括V_H-連接體-V_L。

包括抗體或其抗體片段之本發明CAR組合物之部分可以多種形式存在，其中抗原結合結構域表現為鄰接多肽鏈之部分，包含例如單一結構域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)及人類化抗體(Harlow等人，1999，Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人，1989，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988,Science 242：423-426)。在一態樣中，本發明CAR組合物之抗原結合結構域包括抗體片段。在又一態樣中，CAR包括包含scFv之抗體片段。

如本文所使用術語「重組抗體」意指利用重組DNA技術產生之抗體，例如藉助噬菌體或酵母菌表現系統表現之抗體。該術語亦應理解為意指已藉由合成編碼抗體之DNA分子產生且該DNA分子表現抗體蛋白或指定該抗體之胺基酸序列的抗體，其中DNA或胺基酸序列已利用業內可用且熟知之重組或合成DNA或胺基酸序列技術獲得。

術語「抗體重鏈」係指以其天然構象存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較大者，且該抗體重鏈通常決定抗體所屬之類別。

術語「抗體輕鏈」係指以其天然構象存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。Kappa(κ)及lambda(λ)輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同種型。

術語「重組抗體」係指利用重組DNA技術產生之抗體，例如藉助噬菌體或酵母菌表現系統表現之抗體。該術語亦應理解為意指已藉由合成編碼抗體之DNA分子產生且該DNA分子表現抗體蛋白或指定該抗體之胺基酸序列的抗體，其中DNA或胺基酸序列已利用業內可用且熟知之重組DNA或胺基酸序列技術獲得。

如本文所使用術語「抗原」或「Ag」定義為引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或二者皆有。熟習此項技術者將理解，包含幾乎所有蛋白質或肽在內之任何大分子皆可用作抗原。此外，抗原可源自重組或基因組DNA。熟習此項技術者將理解，任何包括編碼誘發免疫反應之蛋白質之核苷酸序列或部分核苷酸序列之DNA因此編碼如本文所使用之該術語「抗原」。此外，熟習此項技術者將理解，抗原無需僅由基因之全長核苷酸序列編碼。容易地明瞭，本發明包含(但不限於)一個以上基因之部分核苷酸序列之使用及該等核苷酸序列以多種組合排列來編碼誘發期望免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者將理解，抗原完全不必由「基因」編碼。容易地明瞭，抗原可產生、合成或可源自生物樣品，或其可係未必為多肽之大分子。該生物樣品可包含(但不限於)組織樣品、腫瘤樣品、細胞或具有其他生物組份之流體。

如本文所使用術語「抗腫瘤效應」係指可以多種方式呈現之生物效應，包含(但不限於)例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數減少、轉移數減少、預期壽命增加、腫瘤細胞增殖減少、腫瘤細胞存活率減小或與癌性病況相關之各種生理學症狀改善。「抗腫瘤效應」亦可呈現為本發明之肽、多核苷酸、細胞及抗體在第一時間預防腫瘤發生之能力。

如本文所使用，術語「自體」欲指源自同一個體且後來再引入該個體中之任何材料。

「同種異體」係指源自與材料欲引入之個體同一物種之不同動物之任何材料。當一或多個基因座處之基因不同時，認為兩個或更多個個體互為同種異體。在一些態樣中，來自同一物種之個體之同種異體材料可在遺傳學上足夠不同以在抗原上相互作用。

「異種」係指源自不同物種之動物之移植物。

如本文所使用術語「癌症」定義為特徵在於異常細胞之快速及不受控生長之疾病。癌細胞可在局部擴散或通過血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。各種癌症之實例包含(但不限於)乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及諸如此類。

如本文所使用片語「與CD123之表現相關之疾病」包含(但不限於)與CD123之表現相關之疾病或與表現CD123之細胞相關之病況，包含例如增生性疾病(例如癌症或惡性腫瘤)或癌前病況(例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期)；或與表現CD123之細胞相關之非癌症相關適應症。在一態樣中，與CD123之表現相關之癌症為血液癌症。在一態樣中，血液癌症包含(但不限於)AML、骨髓發育不良症候群、ALL、多毛細胞白血病、前淋巴球性白血病、慢性骨髓樣白血病、霍奇金氏淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤及諸如此類。與CD123表現之表現相關之其他疾病包含(但不限於)例如非典型及/或非經典癌症、惡性腫瘤、癌前病況或與CD123之表現相關之增生性疾病。亦可包含與CD123之表現相關之非癌症相關適應症。

如本文所使用，術語「保守序列修飾」欲指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特性的胺基酸修飾。該等保守修飾包含胺基酸取代、添加及缺失。修飾可藉由業內已知之標準技術(例如定點誘變及PCR介導之誘變)引入本發明抗體或抗體片段中。保守胺基酸取代係其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基替代者。業內已定義具有相似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包含具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，本發明CAR內之一或多個胺基酸殘基可經來自同一側鏈家族之其他胺基酸殘基替代，且可利用本文所闡述之功能分析來測試經改變CAR結合CD123之能力。

術語「刺激」意指藉由刺激分子(例如TCR/CD3複合物)與其同源配體結合由此調介信號轉導事件(例如(但不限於)藉助TCR/CD3複合物之信號轉導)引起之初級反應。刺激可調介某些分子改變其表現，例如TGF-β之下調及/或細胞骨架結構之重組及諸如此類。

如本文所使用之術語「刺激分子」意指由提供初級細胞質信號傳導序列之T細胞表現之分子，該(等)信號傳導序列以刺激T細胞信號傳導途徑之至少一些態樣之方式調控TCR複合物之初級活化。在一態樣中，初級信號係由例如TCR/CD3複合物與加載有肽之MHC分子之結合起始，且該結合引起T細胞反應之調介，包含(但不限於)增殖、活化、分化及諸如此類。以刺激方式起作用之初級細胞質信號傳導序列(亦稱為「初級信號傳導結構域」)可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM之信號傳導基序。尤其用於本發明中之含有初級細胞質信號傳導序列之ITAM的實例包含(但不限於)源自以下之彼等：TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(亦稱為「ICOS」)及CD66d。在本發明之特異性CAR分子中，本發明之任一個或多個CAR分子中之細胞內信號傳導結構域包括細胞內信號傳導序列，例如CD3-ζ之初級信號傳導序列。在本發明之特異性CAR中，CD3-ζ之初級信號傳導序列係人類序列(SEQ ID NO：98)或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。

如本文所使用「抗原呈送細胞」或「APC」意指在其表面上展示與主要組織相容性複合物(MHC)複合之外源抗原之免疫系統細胞(例如輔助細胞，例如B細胞、樹突細胞及諸如此類)。T細胞可利用其T細胞受體(TCR)來識別該等複合物。APC處理抗原且將其呈送至T細胞。

如本文所使用術語「細胞內信號傳導結構域」係指分子之細胞內部分。細胞內信號傳導結構域產生促進含有CAR之細胞(例如CART細胞)之免疫效應子功能之信號。例如CART細胞中之免疫效應子功能之實例包含細胞溶解活性及協助細胞活性，包含細胞介素之分泌。

在實施例中，細胞內信號傳導結構域可包括初級細胞內信號傳導結構域。實例性初級細胞內信號傳導結構域包含源自負責初級刺激或抗原依賴性刺激之分子之彼等。在實施例中，細胞內信號傳導結構域可包括共刺激細胞內結構域。實例性共刺激細胞內信號傳導結構域包含源自負責共刺激信號或抗原非依賴性刺激之分子之彼等。例如，在CART情形下，初級細胞內信號傳導結構域可包括T細胞受體之細胞質序列，且共刺激細胞內信號傳導結構域可包括來自共受體或共刺激分子之細胞質序列。

初級細胞內信號傳導結構域可包括稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM之信號傳導基序。含有初級細胞質信號傳導序列之ITAM之實例包含(但不限於)源自以下之彼等：CD3 ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b以及CD66dDAP10及DAP12。

如本文所使用「ζ」或另一選擇「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」定義為以GenBan登錄號BAG36664.1提供之蛋白質，或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基，且「ζ刺激結構域」或另一選擇「CD3-ζ刺激結構域」或「TCR-ζ刺激結構域」定義為來自ζ鏈之細胞質結構域之足以發揮傳送T細胞活化所需初始信號功能之胺基酸殘基。在一態樣中，ζ之細胞質結構域包括GenBank登錄號BAG36664.1之殘基52至164或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之為其功能直向同源物之等效殘基。在一態樣中，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」係以SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：98提供之序列。

「共刺激分子」係指T細胞上之特異性結合共刺激配體、由此調介T細胞之共刺激反應(例如(但不限於)增殖)之同源結合伴侶。共刺激分子係為有效免疫反應所必需之除抗原受體或其配體外之細胞表面分子。共刺激分子包含(但不限於)MHC I類分子、BTLA及Toll配體受體以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。

共刺激細胞內信號傳導結構域可源自共刺激分子之細胞內部分。共刺激分子可表示於以下蛋白家族中：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球活化分子(SLAM蛋白)及活化NK細胞受體。該等分子之實例包含CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、 SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3及特異性結合CD83之配體及諸如此類。

細胞內信號傳導結構域可包括衍生出其之分子或其功能片段之整個細胞內部分或整個天然細胞內信號傳導結構域。

如本文所使用「4-1BB」係指具有以GenBank登錄號AAA62478.2提供之胺基酸序列或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基之TNFR超家族成員；且「4-1BB共刺激結構域」定義為GenBank登錄號AAA62478.2之胺基酸殘基214-255或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。在一態樣中，「4-1BB共刺激結構域」為人類序列或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。在一態樣中，「4-1BB共刺激結構域」係以SEQ ID NO：6提供之序列或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。

「編碼」係指多核苷酸中核苷酸之特異性序列(例如基因、cDNA或mRNA)用作合成生物過程中具有所定義核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或所定義胺基酸序列之其他聚合物及大分子的模板之固有性質及源自其之生物性質。因此，在細胞或其他生物系統中，若對應於基因、cDNA或RNA之mRNA之轉錄及翻譯產生蛋白質，則該基因、cDNA或RNA編碼蛋白質。編碼鏈(與mRNA序列一致且通常提供於序列列表中之核苷酸序列)及非編碼鏈(用作基因或cDNA轉錄之模板)二者皆可稱為該基因或cDNA之編碼蛋白或其他產物。

除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包含彼此為簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。就編碼蛋白質之核苷酸序列可在某一形式中含有內含子而言，編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包含內含子。

「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且係指化合物、調配物、材料或組合物之如本文所闡述可有效地達成具體生物結果之量。

如本文所使用「內源」係指來自有機體、細胞、組織或系統內部或自其產生之任何材料。

如本文所使用，術語「外源」係指自有機體、細胞、組織或系統外部引入或產生之任何材料。

如本文所使用之術語「表現」定義為藉由調控序列(例如啟動子)驅動之具體核苷酸序列之轉錄及/或翻譯。

術語「轉移載體」係指包括經分離核酸且可用於將經分離核酸遞送至細胞內部之物質的組合物。業內已知多種載體，包含(但不限於)直鏈多核苷酸、與離子化合物或兩親性化合物締合多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包含自主複製質體或病毒。該術語亦應理解為進一步包含幫助核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體及諸如此類。病毒轉移載體之實例包含(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及諸如此類。

「表現載體」係指包括重組多核苷酸之載體，該多核苷酸包括可操作地連接至欲表現核苷酸序列之表現控制序列。表現載體包括用於表現之充分順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞或活體外表現系統來供應。表現載體包含所有彼等業內已知者，包含納入重組多核苷酸之黏質體、質體(例如裸質體或含於脂質體中)及病毒(例如慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

如本文所使用之術語「同源」或「一致」係指兩個聚合物分子之間、例如兩個核酸分子(例如兩個DNA分子或兩個RNA分子)之間或兩個多肽分子之間之亞單位序列一致性。當兩個分子二者中之亞單位位置經相同單體亞單位佔據時；例如若在兩個DNA分子中每一者中之位置經腺嘌呤佔據，則其在該位置處同源或一致。兩條序列之間之同源性係匹配或同源位置數之直接函數；例如若兩條序列中之一半(例如聚合物10個亞單位長度上之5個位置)位置同源，則該兩條序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩條序列為90%同源。

非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其它抗原結合子序列)，其含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列。在極大程度上，人類化抗體及其抗體片段係人類免疫球蛋白(接受者抗體或其片段)，其中來自接受者互補決定區(CDR)之殘基經來自諸如小鼠、大鼠或兔等非人類物種(供體抗體)之CDR且具有期望特異性、親和力及能力的殘基替代。在一些情況下，人類免疫球蛋白Fv框架區(FR)殘基經相應的非人類殘基替代。此外，人類化抗體或抗體片段可包括在接受者抗體或抗體片段與導入之CDR或框架序列中皆未發現之殘基。該等修飾可進一步完善且最佳化抗體或抗體片段性能。通常，人類化抗體或其抗體片段將包括實質上所有的至少一個、且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且FR區之全部或重要部分為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體或抗體硼片段亦可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。其他細節可參見Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Riechmann等人，Nature 332：323-329,1988；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596,1992。

術語「人類」抗體係指全人類抗體以及有效人類抗體。「全人類」係指免疫球蛋白，例如抗體或片段，其中整個分子為人類來源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致之胺基酸序列組成。「有效人類」抗體係包含足夠數量之人類胺基酸位置以使抗體在正常人類中無法誘發免疫原性反應之抗體。

如本文所使用，「教學材料」包含出版物、錄音、圖或可用於傳達本發明組合物及方法之有用性之任何其他表現媒介。本發明套組之教學材料可附加至例如含有本發明之核酸、肽及/或組合物之容器，或與含有核酸、肽及/或組合物之容器一起運輸。另一選擇為，教學材料可與容器分開運輸以使接受者協同使用教學材料與化合物。

術語「經分離」意指自天然狀態改變或移除。例如，天然存在於活動物中之核酸或肽未「經分離」，但部分或全部自其天然狀態之共存材料分離之相同核酸或肽為「經分離」。經分離核酸或蛋白質可以實質上純化之形式存在，或可存在於非天然環境(例如宿主細胞)中。

在本發明中使用普遍存在核酸鹼基之以下縮寫。「A」係指三磷酸腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸腺嘧啶，且「U」係指尿嘧啶。

如本文所使用之「慢病毒」係指逆轉錄病毒家族之屬。慢病毒在逆轉錄病毒中之獨特之處在於能夠感染未分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其係基因遞送載體之最有效方法之一。HIV、SIV及FIV皆係慢病毒之實例。

「慢病毒載體」係源自慢病毒基因組之至少一部分之載體，尤其包含如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中所提供之自失活慢病毒載體。可用於臨床之其他實例或慢病毒載體包含(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX^TM載體系統及諸如此類。非臨床類型之慢病毒載體亦可用且為熟習此項技術者已知。

術語「可操作地連接」或另一選擇「轉錄控制」係指調控序列與異源核酸序列之間之功能連接，以使後者表現。例如，當第一核酸序列置於與第二核酸序列之功能關係中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接且例如在需要連接兩個蛋白編碼區時位於同一讀碼框中。

免疫原性組合物之「非經腸」投與包含例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌內(i.m.)或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。

術語「核酸」或「多核苷酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另有限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物之核酸，該等類似物具有與參考核酸相似之結合性質且以與天然核苷酸相似之方式進行代謝。除非另有說明，否則具體核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如，簡併密碼子取代)、對偶基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定而言，藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列可達成簡併密碼子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res 19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

如本文所使用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指包括藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且對可包括蛋白質或肽序列之胺基酸之最大數量無限制。多肽包含包括藉由肽鍵彼此連接之兩個或更多個胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所使用，術語係指例如兩條短鏈(業內亦通常稱為肽、寡肽及寡聚物)及較長鏈(業內通常稱為蛋白質，其具有許多類型)。「多肽」尤其包含例如生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包含天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

如本文所使用之術語「啟動子」定義為由細胞之合成機構或所引入合成機構所識別之起始多核苷酸序列之特定轉錄所需之DNA序列。

如本文所使用，術語「啟動子/調控序列」意指為表現可操作地連接至啟動子/調控序列之基因產物所必需之核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下此序列亦可包含增強子序列及為表現基因產物所必需之其他調控元件。啟動子/調控序列可係例如以組織特異性方式表現基因產物之序列。

「組成型」啟動子係當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞中在細胞之大多數或所有生理學條件下產生基因產物之核苷酸序列。

「誘導型」啟動子係當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞中實質上僅在對應於啟動子之誘導劑存在於細胞中時產生基因產物之核苷酸序列。

「組織特異性」啟動子係當與由基因編碼或指定之多核苷酸可操作地連接時，實質上僅在細胞係對應於啟動子之組織類型之細胞時在細胞中產生基因產物之核苷酸序列。

如在scFv背景下使用之「撓性多肽連接體」係指將可變重鏈與可變輕鏈區連接在一起之由單獨或以組合使用之諸如甘胺酸及/或絲胺酸等胺基酸殘基組成之肽連接體。在一實施例中，撓性多肽連接體係Gly/Ser連接體且包括胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)_n(SEQ ID NO：129)，其中n係等於或大於1之正整數。例如，n=1，n=2，n=3，n=4，n=5且n=6，n=7，n=8，n=9且n=10。在一實施例中，撓性多肽連接體包含(但不限於)(Gly₄ Ser)₄(SEQ ID NO：130)或(Gly₄ Ser)₃(SEQ ID NO：131)。在另一實施例中，連接體包含(Gly₂Ser)、(GlySer)或(Gly₃Ser)(SEQ ID NO：129)之多個重複序列。WO2012/138475中所闡述之連接體亦包含在本發明範疇內，該專利之全文以引用方式併入本文中。

如本文所使用，5'帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m⁷G帽)係在轉錄起始後不久即添加至真核信使RNA之「前面」或5'末端之經修飾鳥嘌呤核苷酸。5'帽係由連接至第一個轉錄核苷酸之端基組成。其存在對於核糖體之識別及針對RNA酶之保護至關重要。帽添加與轉錄偶合且以共轉錄方式發生，以使其相互影響。轉錄起始後不久，所合成mRNA之5'末端藉由與RNA聚合酶締合之帽合成複合物結合。此酶複合物催化為mRNA加帽所必需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應進行。加帽部分可經修飾以調節mRNA之功能，例如其穩定性或翻譯效率。

如本文所使用，「活體外轉錄RNA」係指已在活體外合成之RNA，較佳為mRNA。通常，活體外轉錄RNA係自活體外轉錄之載體產生。活體外轉錄之載體包括用於產生活體外轉錄RNA之模板。

如本文所使用，「聚(A)」係一系列藉助多腺苷酸化附接至mRNA之三磷酸腺苷。在用於瞬時表現之構築物之較佳實施例中，聚A係介於50與5000(SEQ ID NO：132)之間，較佳大於64，更佳大於100，最佳大於300或400。聚(A)序列可經化學或酶促修飾以調節諸如定位、穩定性或翻譯效率等mRNA功能。

如本文所使用，「多腺苷酸化」係指將多腺苷醯基部分或其經修飾變體共價連接至信使RNA分子。在真核有機體中，大多數信使RNA(mRNA)分子在3'末端經多腺苷酸化。3'聚(A)尾係經由酶(多腺苷酸化聚合酶)之作用添加至mRNA前體之長腺嘌呤核苷酸序列(通常數百個)。在高等真核生物中，聚(A)尾添加至含有特異性序列(多腺苷酸化信號)之轉錄本上。聚(A)尾及其結合之蛋白質幫助保護mRNA免於外切酶降解。多腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自核之輸出及翻譯亦至關重要。多腺苷酸化在核中DNA轉錄成RNA後立即發生，但此外亦可後來在細胞質中發生。在轉錄終止後，mRNA鏈經由與RNA聚合酶締合之內切酶複合物之作用裂解。裂解位點之特性通常在於在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA。在mRNA裂解後，三磷酸腺苷殘基添加至裂解位點處之游離3'末端。「信號轉導途徑」係指在信號自細胞之一部分傳遞至細胞之另一部分中起作用之多種信號轉導分子之間之生物化學關係。片語「細胞表面受體」包含能夠接收信號且穿過細胞膜傳送信號之分子及分子複合物。

術語「個體」意欲包含其中可誘發免疫反應之活的有機體(例如哺乳動物，包含人類)。

如本文所使用，「實質上純化」之細胞係基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上純化之細胞亦指已與在其天然狀態下與其天然締合之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，實質上純化之細胞群係指細胞之同源群。在其他情況下，此術語僅僅指已與在其天然狀態下與其天然締合之細胞分離之細胞。在一些態樣中，細胞係在活體外培養。在其他態樣中，細胞並非在活體外培養。

術語「合成」在提及核酸或多肽(包含抗體)時意指藉由通常在細胞內未發現之機制產生之核酸、多肽(包含抗體)。在一些情況下，術語「合成」可包含術語「重組」且因此與其重疊，且在其他情況下，術語「合成」意指藉由純化學或其他方式產生之核酸、多肽(包含抗體)。

如本文所使用之術語「治療(therapeutic)」意指治療(treatment)。治療效應係藉由減輕、阻抑、緩解或消滅疾病狀態來獲得。

如本文所使用之術語「預防」意指疾病或疾病狀態之預防或保護性治療。

如本文所使用之術語「轉染」或「轉化」或「轉導」係指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中之過程。「轉染」或「轉化」或「轉導」細胞係經外源核酸轉染、轉化或轉導之細胞。該細胞包含初級個體細胞及其子代。

如本文所使用，「瞬時」係指非整合轉基因經數小時、數天或數週時段之表現，其中該表現時間段小於基因在宿主細胞中整合至基因組中或含於穩定質體複製子內時表現之時間段。如本文所使用之片語「在轉錄控制下」或「可操作地連接」意指啟動子處於相對於多核苷酸之正確位置及定向中以控制RNA聚合酶對轉錄之起始及多核苷酸之表現。

「載體」係包括經分離核酸且可用於將經分離核酸遞送至細胞內部之物質的組合物。業內已知多種載體，包含(但不限於)直鏈多核苷酸、與離子化合物或兩親性化合物締合之多核苷酸、質體及病毒。

如本文所使用之術語「特異性結合」意指識別並結合存在於樣品中之同源結合伴侶(例如存在於T細胞上之刺激及/或共刺激分子)蛋白之抗體或其抗原結合片段或配體，但該抗體、其抗原結合片段或配體實質上並不識別或結合樣品中之其他分子。

範圍：在整個本揭示內容中，本發明之各個態樣可以範圍格式呈現。應理解，呈範圍格式之描述僅出於方便及簡潔之目的，且不應理解為對本發明範疇之硬性限制。因此，範圍之描述應視為特定揭示所有可能的子範圍以及該範圍內之個別數值。例如，諸如1至6等範圍之描述應視為特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子範圍以及該範圍內之個別數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95%至99%一致性之範圍包含具有95%、96%、97%、98%或99%一致性之範圍，且包含諸如96%至99%、96% 至98%、96%至97%、97%至99%、97%至98%及98%至99%一致性等子範圍。此無論範圍之寬度如何皆適用。

描述

本文提供利用抗-CD123嵌合抗原受體(CAR)及包括CD123 CAR分子之T細胞治療疾病(例如癌症)之組合物及方法。

在一態樣中，本發明提供包括與在細胞表面上表現之CD123蛋白特異性結合之抗體或抗體片段之CD123 CAR構築物。在一態樣中，本發明提供經工程化以表現CAR之細胞(例如T細胞)，其中CAR T細胞(「CART」)展現抗腫瘤性質。在一態樣中，細胞經CAR轉化，且CAR在該細胞表面上表現。在一些實施例中，細胞(例如T細胞)經編碼CAR之病毒載體轉導。在一些實施例中，病毒載體為逆轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為慢病毒載體。在一些該等實施例中，細胞可穩定表現CAR。在另一實施例中，細胞(例如T細胞)經編碼CAR之核酸(例如mRNA、cDNA、DNA)轉染。在一些該等實施例中，細胞可瞬時表現CAR。

在一態樣中，CD123 CAR之抗-CD123蛋白結合部分為scFv抗體片段。在一態樣中，該等抗體片段之功能在於，其保留等效結合親和力，例如其以與衍生出其之IgG抗體相當之功效結合相同抗原。在一態樣中，該等抗體片段之功能在於其提供生物反應，該生物反應可包含(但不限於)免疫反應之活化、源自其靶抗原之信號轉導之抑制、激酶活性之抑制及諸如此類，如熟習此項技術者所理解。

在一態樣中，CAR之CD123抗原結合結構域為鼠類scFv抗體片段。在另一態樣中，CAR之CD128抗原結合結構域係與衍生出其之鼠類scFv序列相比經人類化之scFv抗體片段。在一態樣中，鼠類scFv序列包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101。此小鼠scFv之人類化可能為臨床環境所期望，其中小鼠特異性殘基可在接受CD123治療(例如經轉導有CD123構築物之T細胞治療)之患者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。

在一態樣中，CAR之抗-CD123結合結構域部分係由序列已經密碼子最佳化以在哺乳動物細胞中表現之轉基因編碼。在一態樣中，本發明之整個CAR構築物係由整個序列已經密碼子最佳化以在哺乳動物細胞中表現之轉基因編碼。密碼子最佳化係指以下發現：同義密碼子(即編碼相同胺基酸之密碼子)在編碼DNA中之出現頻率在不同物種中有所不同。該密碼子簡併性使得相同多肽經多條核苷酸序列編碼。多種密碼子最佳化方法為業內已知，且包含例如至少美國專利第5,786,464號及第6,114,148號中所揭示之方法。

在一態樣中，CAR之抗-CD123結合結構域係人類化抗-CD123結合結構域。例如，在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括SEQ ID NO：36中所提供之scFv部分。在一態樣中，人類化抗-CD123結合結構域包括SEQ ID NO：42中所提供之scFv部分。在一態樣中，人類化抗-CD123結合結構域包括SEQ ID NO：48中所提供之scFv部分。在一態樣中，人類化抗-CD123結合結構域包括SEQ ID NO：54中所提供之scFv部分。在一態樣中，人類化抗-CD123結合結構域包括SEQ ID NO：60中所提供之scFv部分。在一態樣中，人類化抗-CD123結合結構域包括SEQ ID NO：66中所提供之scFv部分。在一態樣中，人類化抗-CD123結合結構域包括SEQ ID NO：72中所提供之scFv部分。在一態樣中，人類化抗-CD123結合結構域包括SEQ ID NO：80中所提供之scFv部分。

在一態樣中，本文所揭示之CAR包含具有細胞內信號傳導結構域之特異性抗體之抗原結合結構域。例如，在一些態樣中，細胞內信號傳導結構域包含(但不限於)CD3-ζ鏈、4-1BB、CD27及CD28信號傳導模組及其組合。在一態樣中，抗原結合結構域與CD123結合。在一態樣中，CAR包括SEQ ID NO：1中所顯示之多肽序列。在一態樣中， CAR包括SEQ ID NO：41中所顯示之多肽序列。在一態樣中，CAR包括SEQ ID NO：47中所顯示之多肽序列。在一態樣中，CAR包括SEQ ID NO：53中所顯示之多肽序列。在一態樣中，CAR包括SEQ ID NO：59中所顯示之多肽序列。在一態樣中，CAR包括SEQ ID NO：65中所顯示之多肽序列。在一態樣中，CAR包括SEQ ID NO：71中所顯示之多肽序列。在一態樣中，CAR包括SEQ ID NO：77中所顯示之多肽序列。在一態樣中，CAR包括SEQ ID NO：83中所顯示之多肽序列。

此外，本發明提供抗-CD123CAR組合物及其在重組工程化T細胞(在本文中亦稱為「CART123細胞」)中之用途，其用於治療涉及表現CD123之細胞或組織之疾病、尤其癌症或任何惡性腫瘤或自體免疫疾病之方法中。

在另一態樣中，包括本發明CAR之CART123細胞可用於消滅表現CD123之正常細胞，且可適於用作細胞移植前之細胞調理療法。在一態樣中，表現CD123之正常細胞係表現CD123之正常幹細胞，且細胞移植為幹細胞移植。例如，在一態樣中，本發明CAR係用於骨髓清除，例如以自個體消除現有骨髓之至少一部分。可在例如需要骨髓移植之個體中利用本發明之CAR來實施骨髓清除。例如，在某些情況下，血液惡性腫瘤(例如AML)之治療將受益於包括抗癌療法及骨髓移植或重調理療法之組合療法。然而，本發明並不限於骨髓清除來治療癌症。而是，本發明CAR可用作在骨髓或幹細胞移植之前清除現有骨髓來治療其中骨髓移植將有益之任何疾病、病症或病況之細胞調理方案。在一態樣中，本發明CAR係作為疾病治療之至少一部分用於骨髓清除，該疾病包含(但不限於)血液癌症、實體腫瘤、血液疾病、代謝病症、HIV、HTLV、溶酶體儲積症及免疫缺陷。

在一態樣中，本發明提供經工程化以表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞(例如T細胞)，其中CAR T細胞展現抗腫瘤性質。較佳抗原為 CD123。在一態樣中，CAR之抗原識別結構域包括全人類抗-CD123抗體或抗體片段。因此，本發明提供工程化至T細胞中之全人類抗-CD123-CAR及其用於過繼性療法之方法。

在一態樣中，抗-CD123-CAR包括至少一個選自以下之群之細胞內結構域：CD137(4-1BB)信號傳導結構域、CD28信號傳導結構域、CD3ζ信號結構域、CD27信號傳導結構域及其任何組合。在一態樣中，抗-CD123-CAR包括至少一個來自以下各項之細胞內信號傳導結構域：一或多個共刺激分子以及CD137(4-1BB)或CD28、CD3ζ信號結構域及其任何組合。

嵌合抗原受體(CAR)

本發明涵蓋包括編碼CAR之多核苷酸序列之重組DNA構築物，其中CAR包括與CD123特異性結合之抗體片段，例如與CD123特異性結合之人類抗體片段。在一態樣中，CD123係人類CD123，且編碼抗體片段之核酸序列與編碼細胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且位於同一讀碼框中。細胞內信號傳導結構域可包括共刺激信號傳導結構域及/或初級信號傳導結構域，例如ζ鏈部分。共刺激信號傳導結構域係指包括共刺激分子細胞內結構域之至少一部分的CAR之一部分。

在一態樣中，本發明涵蓋包括CAR序列之經分離嵌合核酸構築物，其中該序列包括可操作地連接至細胞內結構域之核酸序列之抗-CD123結合結構域之核酸序列。可用於CAR中之實例性細胞內結構域包含(但不限於)CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之細胞內結構域。在一些情況下，CAR可包括CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之任何組合。

在特定態樣中，本發明之CAR構築物包括選自由以下組成之群之scFv結構域：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78，其中scFv之前可為例如SEQ ID NO：3中所提供之可選前導序列，且之後為例如SEQ ID NO：4中所提供之可選鉸鏈序列、例如SEQ ID NO：5中所提供之跨膜區、包含SEQ ID NO：6及CD3 ζ序列(包含SEQIDNO：7或SEQIDNO：98)之細胞內信號傳導結構域，其中該等結構域與鄰接且位於同一讀碼框中以形成單一融合蛋白。本發明亦包含編碼以下各項之多肽的核苷酸序列：選自由以下組成之群之每一scFv片段：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78；及SEQ ID NO：3-7中之每一結構域。本發明亦包含編碼以下各項之多肽的核苷酸序列：選自由以下組成之群之每一scFv片段：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78；及SEQ ID NO：3-6及SEQ ID NO：98中之每一結構域。在一態樣中，CD123 CAR構築物包括可選前導序列、特異性結合CD123之細胞外抗原結合結構域、鉸鏈、跨膜結構域及細胞內刺激結構域。在一態樣中，CD123 CAR構築物包括可選前導序列、特異性結合CD123之細胞外抗原結合結構域、鉸鏈序列、跨膜結構域、包含共刺激結構域及初級刺激結構域之細胞內信號傳導結構域。含有人類化scFv結構域之特異性CD123CAR構築物提供於SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：83中。含有鼠類scFv結構域之特異性CD123 CAR構築物提供於SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119及SEQ ID NO：121中。

實例性前導序列以SEQ ID NO：3提供。實例性鉸鏈/間隔體序列以SEQ ID NO：4提供。實例性跨膜結構域序列以SEQ ID NO：5提供。 4-1BB蛋白共刺激結構域之實例性序列以SEQ ID NO：6提供。CD27蛋白共刺激結構域之實例性序列以SEQ ID NO：23提供。CD3ζ結構域序列之實例性初級信號傳導結構域以SEQ ID NO：7提供。CD3ζ結構域序列之另一實例性初級信號傳導結構域以SEQ ID NO：98提供。

在一態樣中，本發明涵蓋包括編碼CAR之核酸分子之重組核酸構築物，其中該核酸分子包括編碼例如本文所闡述抗-CD123結合結構域之核酸序列，該核酸序列與編碼細胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且位於同一讀碼框中。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係選自以下中之一或多者：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由選自由以下組成之群之序列中所提供之核苷酸序列編碼：SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：79。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由SEQ ID NO：37編碼。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由SEQ ID NO：43編碼。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由SEQ ID NO：49編碼。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由SEQ ID NO：55編碼。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由SEQ ID NO：61編碼。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由SEQ ID NO：67編碼。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由SEQ ID NO：73編碼。在一態樣中，抗-CD123結合結構域係由SEQ ID NO：80編碼。

在一態樣中，本發明涵蓋包括編碼CAR之核酸分子之重組核酸構築物，其中該核酸分子包括選自由以下組成之群之編碼抗-CD123結合結構域之核酸序列：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：76及SEQ ID NO：82，其中該序列與編碼細胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且位於同一讀碼框中。可用於CAR中之實例性細胞內信號傳導結構域包含(但不限於)例如CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類中之一或多個細胞內信號傳導結構域。在一些情況下，CAR可包括CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之細胞內信號傳導結構域之任何組合。在一態樣中，核酸構築物包括SEQ ID NO：40。在一態樣中，CAR構築物之核酸序列為SEQ ID NO：46。在一態樣中，核酸構築物包括SEQ ID NO：52。在一態樣中，核酸構築物包括SEQ ID NO：58。在一態樣中，核酸構築物包括SEQ ID NO：64。在一態樣中，核酸構築物包括SEQ ID NO：70。在一態樣中，核酸構築物包括SEQ ID NO：76。在一態樣中，核酸構築物包括SEQ ID NO：82。

編碼期望分子之核酸序列可利用業內已知之重組方法來獲得，例如利用標準技術藉由自表現該基因之細胞篩選文庫、自已知包含該基因之載體衍生出基因或自含有該基因之細胞及組織直接分離來獲得。另一選擇為，所關注核酸可以合成方式而非選殖來產生。

本發明包含可直接轉導至細胞中之表現CAR之逆轉錄病毒及慢病毒載體構築物。

本發明亦包含可直接轉染至細胞中之RNA構築物。產生用於轉染之mRNA之方法涉及使用特殊設計之引子在活體外轉錄(IVT)模板，然後添加聚A，以產生長度通常為50-2000個鹼基之含有以下各項之構築物(SEQ ID NO：133)：3'及5'非翻譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾。如此產生之RNA可有效地轉染不同類型之細胞。在一態樣中，模板包含CAR之序列。在實施例中，藉由電穿孔將RNA CAR載體轉導至T細胞中。

抗原結合結構域

在一態樣中，本發明CAR包括靶特異性結合元件，亦稱為抗原結合部分。部分之選擇端視定義靶細胞表面之配體之類型及數量而定。例如，抗原結合結構域可經選擇以識別用作與具體疾病狀態相關之靶細胞上之細胞表面標記的配體。因此，可用作本發明CAR中抗原結合結構域配體之細胞表面標記之實例包含與病毒、細菌及寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌細胞相關之彼等。

在一態樣中，可藉助將期望抗原特異性結合至CAR之抗原結合結構域工程化來使CAR介導之T細胞反應針對所關注抗原。在本發明背景下，「腫瘤抗原」或「過度增生性病症抗原」或「與過度增生性病症相關之抗原」係指為特異性過度增生性病症常見之抗原。在某些態樣中，過度增生性病症抗原係源自癌症，包含(但不限於)初級或轉移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌(例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌及諸如此類)。

在一態樣中，本發明之腫瘤抗原包括一或多個由源自哺乳動物癌瘤之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)免疫識別之抗原癌症表位。

在一態樣中，CAR之抗原結合部分包括靶向CD123(包含(但不限於)人類CD123)之抗原結合結構域。實例性人類CD123 mRNA序列係以GenBank登錄號M74782提供。實例性CD123蛋白序列可以UniProtKB登錄號P26951獲得。在一些實施例中，抗原結合結構域靶向於CD123細胞外結構域中發現之表位，例如人類CD123細胞外結構域內之表位；例如包括UniProtKB登錄號P26951之一或多個胺基酸殘基19-305之表位。

抗原結合結構域可係與抗原結合之任何結構域，包含(但不限於)單株抗體、多株抗體、重組抗體、合成抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包含(但不限於)單一結構域抗體(例如重鏈可變結構域 (VH)、輕鏈可變結構域(VL)及駱駝科源性奈米抗體之可變結構域(VHH)以及業內已知用作抗原結合結構域(例如重組纖連蛋白結構域及諸如此類)之替代支架。在一些情況下，使抗原結合結構域源自其中最終將使用CAR之同一物種有益。例如，對於人類中之使用，CAR之抗原結合結構域包括人類抗體或其片段可能有益。因此，在一態樣中，抗原結合結構域包括人類抗體或抗體片段。在另一態樣中，抗原結合結構域包括人類化抗體或抗體片段。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如1個、2個或所有3個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，以及本文所闡述抗-CD123結合結構域之一或多個(例如1個、2個或所有3個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。在一實施例中，抗-CD123結合結構域包括本文所闡述之輕鏈可變區及/或本文所闡述之重鏈可變區。在一實施例中，抗-CD123結合結構域係包括胺基酸序列之輕鏈可變區及重鏈可變區(例如本文所闡述之輕鏈可變區及重鏈可變區)之scFv。在實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括：輕鏈可變區，其包括具有本文所提供輕鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與本文所提供胺基酸序列具有85%至99%(例如90%至99%或95%至99%)一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包括具有本文所提供重鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與本文所提供胺基酸序列具有85%至99%(例如90%至99%或95%至99%)一致性之序列。在一態樣中，抗原結合結構域包括一或多個選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78。在一態樣中，人類化CAR係選自一或多個選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：83。

在一些態樣中，非人類抗體或其片段經人類化，其中抗體或其片段之特異性序列或區域經修飾以增加與在人類中天然產生之抗體之相似性。在一態樣中，抗原結合結構域部分經人類化。

人類化抗體或其片段可利用多種業內已知技術來產生，包含(但不限於)CDR-移植(例如，參見歐洲專利第EP 239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號，該等專利中每一者之全文皆以引用方式併入本文中)、鑲飾或表面重塑(例如，參見歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994,Protein Engineering,7(6)：805-814；及Roguska等人，1994,PNAS,91：969-973，該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中)、鏈改組(例如，參見美國專利第5,565,332號，其全文以引用方式併入本文中)及例如以下專利中所揭示之技術：美國專利申請公開案第US2005/0042664號；美國專利申請公開案第US2005/0048617號；美國專利第6,407,213號；美國專利第5,766,886號；國際公開案第WO 9317105號；Tan等人，J.Immunol.,169：1119-25(2002)；Caldas等人，Protein Eng.,13(5)：353-60(2000)；Morea等人，Methods,20(3)：267-79(2000)；Baca等人，J.Biol.Chem.,272(16)：10678-84(1997)；Roguska等人，Protein Eng.,9(10)：895-904(1996)；Couto等人，Cancer Res.,55(增刊23)：5973s-5977s(1995)；Couto等人，Cancer Res.,55(8)：1717-22(1995)；Sandhu J S,Gene,150(2)：409-10(1994)；及Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3)：959-73 (1994)，該等專利中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。通常，框架區中之框架殘基可經CDR供體抗體之相應殘基取代以改變、例如改良抗原結合。該等框架取代係藉由業內熟知之方法來鑑別，例如藉由對CDR與框架殘基之相互作用建模以鑑別對抗原結合至關重要之框架殘基，及比較序列以鑑別具體位置處之不尋常框架殘基。(例如，參見Queen等人，美國專利第5,585,089號；及Riechmann等人，1988,Nature,332：323，該等專利之全文皆以引用方式併入本文中)。

人類化抗體或其片段具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱為「導入」殘基，其通常取自「導入」可變結構域。如本文所提供，人類化抗體或抗體片段包括一或多個來自非人類免疫球蛋白分子之CDR及其中包括框架之胺基酸殘基全部或大部分係源自人類種系之框架區。人類化抗體或抗體片段之多種技術為業內所熟知且基本上可遵循Winter及同事之方法(Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988))藉由用齧齒類動物CDR或CDR序列來取代人類抗體之相應序列，即CDR移植(EP 239,400；PCT公開案第WO 91/09967號；及美國專利第4,816,567號；第6,331,415號；第5,225,539號；第5,530,101號；第5,585,089號；第6,548,640號，該等專利之全部內容皆以引用方式併入本文中)來實施。在該等人類化抗體中，實質上少於完整的人類可變結構域已經非人類物種之相應序列取代。人類化抗體通常為人類抗體，其中一些CDR殘基及可能的一些框架(FR)殘基經來自齧齒類動物抗體中類似位點的殘基取代。抗體之人類化亦可藉由鑲飾或表面重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6)：805-814(1994)；及Roguska等人，PNAS,91：969-973(1994))或鏈改組(美國專利第5,565,332號)來達成，該等專利之全部內容皆以引用方式併入本文中。

用於製造人類化抗體之人類可變結構域(輕鏈及重鏈二者)之選擇係用於降低抗原性。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變結構域序列之整個文庫篩選齧齒類動物抗體之可變結構域之序列。最接近齧齒類動物序列之人類序列則公認為人類化抗體之人類框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196：901(1987)，該等文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中)。另一方法利用源自輕鏈或重鏈之具體亞組之所有人類抗體共有序列之具體框架。同一框架可用於若干不同的人類化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993)，該等文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中)。

在一些態樣中，抗體或抗體片段經人類化且保留對靶抗原之高親和力及其他有利生物性質。根據本發明之一態樣，人類化抗體或抗體片段係利用親代及人類化序列之三維模型藉由分析親代序列及各種概念型人類化產物之製程來製備。三維免疫球蛋白模型通常可購得且為彼等熟習此項技術者所熟悉。可使用可闡釋並展示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構象結構之電腦程式。藉由檢查該等展示內容可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能發揮中之可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合靶抗原之能力的殘基。以此方式，可自接受序列及導入序列中選擇並組合FR殘基以達成期望抗體特性，例如對靶抗原之親和力增加。通常，CDR殘基直接且最為實質性地參與影響抗原結合。

人類化抗體或其片段可保留與原始抗體相似之抗原特異性，例如在本發明中結合人類CD123之能力。然而，利用某些人類化方法，可利用如Wu等人，J.Mol.Biol.,294：151(1999)所闡述之「定向演化」方法增加抗體或其片段對人類CD123結合之親和力及/或特異性，該文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中。

在一態樣中，抗原結合部分之特徵在於抗體之具體功能特徵或性質。例如，抗原結合部分與CD123(包含(但不限於)人類CD123)特異性結合。在一態樣中，本發明係關於包括抗體或其功能(例如抗原結合)片段之抗原結合部分，其中該抗體或其功能片段與CD123蛋白或其片段特異性結合，其中該抗體或其功能片段係由包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列編碼。在另一態樣中，抗原結合部分包括由核酸序列SEQ ID NO：9編碼之胺基酸序列。

在一態樣中，抗-CD123結合結構域係單鏈可變片段(scFv)。在另一態樣中，抗-CD123結合結構域係例如Fv、Fab及或(Fab')₂或雙功能(例如雙特異性)雜合抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一態樣中，本發明之抗體或抗體片段以野生型或增強的親和力結合CD123蛋白。在一些情況下，scFv可根據業內已知之方法來製備(例如，參見Bird等人，(1988)Science 242：423-426及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。ScFv分子可利用撓性多肽連接體藉由將VH及VL區連接在一起來產生。scFv分子包括具有最佳化長度及/或胺基酸組合物之連接體(例如Ser-Gly連接體)。連接體長度可極大地影響scFv可變區之摺疊及相互作用方式。實際上，若採用短多肽連接體(例如介於5-10個胺基酸之間)，可防止鏈內摺疊。亦需要鏈間摺疊以使兩個可變區一起形成功能表位結合位點。關於連接體定向及大小之實例參見例如Hollinger等人1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448；美國專利申請公開案第2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號以及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號，該等公開案皆以引用方式併入本文中。

scFv可包括在其VL區與VH區之間至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個或更多個胺基酸殘基之連接體。連接體序列可包括任何天然胺基酸。在一些實施例中，連接體序列包括胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中，連接體序列包括多組甘胺酸及絲胺酸重複序列，例如(Gly₄Ser)n(SEQ ID NO：35)，其中n係等於或大於1之正整數。在一實施例中，連接體可為(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO：130)或(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO：131)。連接體長度之變化可保留或增強活性，從而在活性研究中產生優異功效。

在一態樣中，包括抗體或抗體片段之本發明CAR組合物之一部分進一步包括包含與本文所闡述抗-CD123抗體之胺基酸序列同源之胺基酸序列的重鏈及輕鏈可變區，且其中該抗-CD123結合部分保留抗-CD123抗體之期望功能性質。

在一些態樣中，本發明之CD123 CAR組合物進一步包括一或多個與本文所揭示之V_H及/或V_L序列(例如可用作起始材料來工程化經修飾抗體片段部分之序列)相比經改變之殘基，該經修飾抗-CD123結合部分可具有與起始抗體相比經改變之性質。在多個態樣中，包括本發明CAR組合物之抗體或抗體片段之部分係藉由修飾一或兩個可變區(例如V_H及/或V_L)內(例如一或多個CDR區及/或一或多個框架區內)之一或多個胺基酸來工程化。在一特定態樣中，本發明之CAR組合物包括抗體片段。在又一態樣中，該抗體片段包括scFv。

穩定性及突變

抗-CD123結合結構域(例如scFv分子(例如可溶性scFv))之穩定性可參考習用對照scFv分子或全長抗體之生物物理性質(例如熱穩定性)來評估。在一實施例中，人類化scFv在所闡述分析中具有比對照結合分子(例如習用scFv分子)大約0.1℃、約0.25℃、約0.5℃、約0.75℃、約1℃、約1.25℃、約1.5℃、約1.75℃、約2℃、約2.5℃、約3℃、約3.5℃、約4℃、約4.5℃、約5℃、約5.5℃、約6℃、約6.5℃、約7℃、約7.5℃、約8℃、約8.5℃、約9℃、約9.5℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃或約15℃之熱穩定性。

隨後將抗-CD123結合結構域(例如scFv)經改良之熱穩定性賦予整個CD123 CAR構築物，從而改良CD123 CAR構築物之治療性質。與習用抗體相比，抗-CD123結合結構域(例如scFv)之熱穩定性可改良至少約2℃或3℃。在一實施例中，與習用抗體相比，抗-CD123結合結構域(例如scFv)之熱穩定性改良1℃。在另一實施例中，與習用抗體相比，抗-CD123結合結構域(例如scFv)之熱穩定性改良2℃。在另一實施例中，與習用抗體相比，抗-CD123結合結構域(例如scFv)之熱穩定性改良4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃。可比較例如本文所揭示之scFv分子與衍生出scFv VH及VL之抗體之scFv分子或Fab片段。熱穩定性可利用業內已知之方法來量測。例如，在一實施例中，可量測Tm。用於量測Tm之方法及決定蛋白質穩定性之其他方法更詳細闡述於下文中。

scFv中之突變(經由可溶性scFv之人類化或定向誘變產生)改變scFv之穩定性且改良scFv及CD123 CAR構築物之整體穩定性。利用諸如Tm、溫度變性及溫度聚集等量度比較人類化scFv與鼠類scFv之穩定性。突變體scFv之結合能力可利用實例中所闡述之分析來測定。

在一實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括至少一個源自人類化過程之突變，以使得突變scFv賦予CD123構築物經改良之穩定性。在另一實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個源自人類化過程之突變，以使得突變scFv賦予CD123構築物經改良之穩定性。

評估蛋白質穩定性之方法

抗原結合結構域之穩定性可利用例如下文所闡述之方法來評價。該等方法可測定多個熱去摺疊轉變，其中最不穩定結構域首先去摺疊或限制協同去摺疊之多結構域單元(例如展現單一去摺疊轉變之多結構域蛋白)之整體穩定性臨限值。最不穩定結構域可以多種其他方式來鑑別。可對結構域限制整體穩定性之探針實施誘變。此外，可在已知最不穩定結構域固有地去摺疊之條件下經由DSC或其他光譜學方法實施多結構域蛋白之蛋白酶抗性(Fontana，等人，(1997)Fold.Des.,2：R17-26；Dimasi等人(2009)J.Mol.Biol.393：672-692)。一旦鑑別出最不穩定結構域，即可採用編碼此結構域(或其部分)之序列作為該等方法中之測試序列。

a)熱穩定性

組合物之熱穩定性可利用多種業內已知之非限制性生物物理或生物化學技術來分析。在某些實施例中，熱穩定性係藉由分析型光譜來評估。

實例性分析型光譜方法為差示掃描量熱(DSC)。DSC採用對伴隨大多數蛋白質或蛋白質結構域之去摺疊之吸熱度敏感之量熱計(例如，參見Sanchez-Ruiz等人，Biochemistry,27：1648-52,1988)。為測定蛋白質之熱穩定性，將蛋白質樣品插入量熱計中且升高溫度直至Fab或scFv去摺疊。蛋白質去摺疊時之溫度指示蛋白質整體穩定性。

另一實例性分析型光譜方法係圓二色性(CD)光譜。CD光譜量測組合物隨溫度增加變化之光學活性。圓二色性(CD)光譜量測因結構不對稱產生之左旋偏振光對右旋偏振光吸收之差。無序或去摺疊結構使得CD光譜與有序或摺疊結構之CD光譜非常不同。CD光譜反映蛋白質對溫度增加之變性效應之敏感性，且因此指示蛋白質之熱穩定性(參見van Mierlo及Steemsma，J.Biotechnol.,79(3)：281-98,2000)。

用於量測熱穩定性之另一實例性分析型光譜方法係螢光發射光譜(參見van Mierlo及Steemsma，參見上文)。用於量測熱穩定性之又一實例性分析型光譜方法係核磁共振(NMR)光譜(例如，參見van Mierlo及Steemsma，參見上文)。

組合物之熱穩定性可以生物化學方式來量測。用於評價熱穩定性之實例性生物化學方法係熱激發分析。在「熱激發分析」中，使組合物於一系列高溫下經歷所設定時間段。例如，在一實施例中，使測試scFv分子或包括scFv分子之分子經歷一系列增加之溫度並持續(例如)1-1.5小時。然後藉由相關生物化學分析來分析蛋白質之活性。例如，若蛋白質係結合蛋白(例如scFv或含有scFv之多肽)，則可藉由功能或量化型ELISA來測定結合蛋白之結合活性。

該分析可以高通量格式及實例中所揭示之彼等利用大腸桿菌(E.coli)及高通量篩選來進行。抗-CD123結合結構域(例如scFv)變體之文庫可利用業內已知之方法來產生。可誘導抗-CD123結合結構域(例如scFv)表現且可使抗-CD123結合結構域(例如scFv)經歷熱激發。可分析所激發測試樣品之結合，且可按比例放大且進一步表徵彼等穩定抗-CD123結合結構域(例如scFv)。

熱穩定性係利用任一上述技術(例如分析型光譜技術)藉由量測組合物之熔融溫度(Tm)來評估。熔融溫度係熱轉變曲線中點處之溫度，其中組合物中50%的分子處於摺疊狀態(參見例如Dimasi等人(2009)J.Mol Biol.393：672-692)。在一實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87 ℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一實施例中，IgG之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一實施例中，多價抗體之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。

熱穩定性亦係利用分析型量熱技術(例如DSC)藉由量測組合物之比熱或比熱容(Cp)來評估。組合物之比熱係使1mol水之溫度升高1℃所需要之能量(例如以千卡/mol表示)。較大Cp係變性或無活性蛋白質組合物之標誌。組合物熱容之變化(△Cp)係藉由測定組合物熱轉變之前及之後之比熱來量測。熱穩定性亦可藉由量測或測定其他熱力學穩定性參數(包含去摺疊之吉布斯自由能(Gibbs free energy，△G)、去摺疊焓(△H)或去摺疊熵(△S))來評估。使用一或多個上述生物化學分析(例如熱激發分析)來測定50%組合物保留其活性(例如結合活性)時之溫度(例如T_C值)。

此外，與未經突變之抗-CD123結合結構域(例如scFv)相比，抗-CD123結合結構域(例如scFv)之突變改變抗-CD123結合結構域(例如 scFv)之熱穩定性。當將人類化抗-CD123結合結構域(例如scFv)納入抗-CD123 CAR構築物中時，抗-CD123結合結構域(例如人類化scFv)賦予整體抗-CD123 CAR構築物熱穩定性。在一實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括賦予抗-CD123結合結構域(例如scFv)熱穩定性之單一突變。在另一實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)包括賦予抗-CD123結合結構域(例如scFv)熱穩定性之多個突變。在一實施例中，抗-CD123結合結構域(例如scFv)中之多個突變對抗-CD123結合結構域(例如scFv)之熱穩定性具有加和效應。

b)聚集%

組合物之穩定性可藉由量測其聚集傾向來測定。聚集可藉由多種非限制性生物化學或生物物理技術來量測。例如，組合物之聚集可利用層析(例如粒徑排阻層析(SEC))來評估。SEC係基於大小來分離分子。使用容許離子及小分子進入其內部但不容許較大分子進入之聚合型凝膠之半固體珠粒來填充管柱。當將蛋白質組合物施加至管柱頂部時，緊湊摺疊之蛋白質(例如非聚集蛋白質)經由比較大蛋白質聚集物可用之溶劑大之體積來分佈。因此，較大聚集物更快速移動通過管柱，且可以此方式將混合物分離或分級分離成其組份。每一流份可在其自凝膠溶析時單獨量化(例如藉由光散射)。因此，組合物之聚集%可藉由比較流份之濃度與施加至凝膠之蛋白質總濃度來測定。穩定組合物以基本上單一之流份自管柱溶析，且在溶析曲線或層析圖中呈現為基本上單一之峰。

c)結合親和力

組合物之穩定性可藉由測定其靶結合親和力來評價。業內已知眾多種用於測定結合親和力之方法。用於測定結合親和力之實例性方法採用表面電漿子共振。表面電漿子共振係可例如利用BIAcore系統藉由檢測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來實時分析生物特異性相互作用之光學現象(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。關於其他描述，參見Jonsson,U.等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson,U.,i(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson,B.等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；及Johnnson,B.等人(1991)Anal.Biochem.198：268-277。

在一態樣中，CAR之抗原結合結構域包括與本文所闡述之抗原結合結構域胺基酸序列同源之胺基酸序列，且抗原結合結構域保留本文所闡述抗-CD123抗體片段之期望功能性質。在一特定態樣中，本發明之CAR組合物包括抗體片段。在又一態樣中，該抗體片段包括scFv。

在多個態樣中，CAR之抗原結合結構域係藉由修飾一或兩個可變區(例如VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內及/或一或多個框架區內)之一或多個胺基酸來工程化。在一特定態樣中，本發明之CAR組合物包括抗體片段。在又一態樣中，該抗體片段包括scFv。

熟習此項技術者應理解，本發明之抗體或抗體片段可進一步經修飾以改變其胺基酸序列(例如來自野生型)但不改變期望活性。例如，可對蛋白質進行其他核苷酸取代以取代「非必需」胺基酸殘基處之胺基酸。例如，可使用來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基替代分子中之非必需胺基酸殘基。在另一實施例中，可使用側鏈家族成員之順序及/或組成不同之結構相似之串來替代(例如保守取代)胺基酸串，其中可使胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基替代。

業內已定義具有相似側鏈之胺基酸殘基的家族，包含具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。

一致性%在兩個或更多個核酸或多肽序列背景下係指兩個或更多個相同之序列。在比較窗口或指定區內如利用以下序列比較演算法中之一者或藉由人工比對及目視檢查所量測針對最大對應比較及比對時，若兩個序列具有相同胺基酸殘基或核苷酸之指定百分比(例如，在指定區內或在未指定時在整個序列內60%一致，視情況70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致)，則該兩個序列「實質上一致」。視情況，一致性存在於長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域內或更佳存在於長度為100至500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)之區域內。

就序列比較而言，一個序列通常將作為參考序列與測試序列進行比較。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列坐標，並指定序列算法程式參數。可使用缺省程式參數，或可指定替代參數。然後，序列比較算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分數。對序列實施比對以供比較之方法為業內所熟知。可藉由(例如)以下方式對序列實施最佳比對以供比較：Smith及Waterman，(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源性演算法；Needleman及Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443之同源性比對演算法；Pearson及Lipman，(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444之對相似性方法之研究；該等演算法之電腦化執行方案(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)或人工比對及目視檢查(例如，參見Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。

適用於測定序列一致性及序列相似性百分數之演算法之兩個實例係BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別闡述於Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402及Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用於實施BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。

兩個胺基酸序列之間之一致性%亦可利用已併入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller，(1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)之演算法利用PAM120權重殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4來測定。此外，兩個胺基酸序列之間之一致性%可利用已併入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：444-453)演算法利用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及間隙權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。

在一態樣中，本發明涵蓋起始抗體或片段(例如scFv)胺基酸序列之產生功能上等效之分子之修飾。例如，CAR中所包括之抗-CD123結合結構域(例如scFv)之VH或VL可經修飾以保留與抗-CD123結合結構域(例如scFv)之起始VH或VL框架區至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性。本發明涵蓋整個CAR構築物之修飾，例如CAR構築物之各個結構域之一或多個胺基酸序列之修飾，以產生功能上等效之分子。CAR構築物可經修飾以保留與起始CAR構築物至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性。

跨膜結構域

關於跨膜結構域，在各個實施例中，CAR可經設計以包括附接至CAR之細胞外結構域之跨膜結構域。跨膜結構域可包含一或多個毗鄰跨膜區之其他胺基酸，例如一或多個與衍生出跨膜之蛋白質之細胞外區域締合之胺基酸(例如細胞外區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個直至15個胺基酸)及/或一或多個與衍生出跨膜蛋白的蛋白質之細胞內區域締合之其他胺基酸(例如細胞內區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15個胺基酸)。在一態樣中，跨膜結構域係與所使用CAR之其他結構域中之一者締合之結構域。在一些情況下，跨膜結構域可藉由胺基酸取代來選擇或修飾以避免該等結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域結合，例如以最小化與受體複合物其他成員之相互作用。在一態樣中，跨膜結構域能夠與CART細胞表面上之另一CAR同源二聚化。在不同態樣中，跨膜結構域之胺基酸序列可經修飾或取代以最小化與存在於同一CART中之天然結合伴侶之結合結構域的相互作用。

跨膜結構域可源自天然或重組來源。當來源為天然來源時，結構域可源自任何膜結合或跨膜蛋白。具體用於本發明中之跨膜區可包含至少例如以下各項之跨膜區：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些情況下，跨膜結構域可經由鉸鏈(例如來自人類蛋白質之鉸鏈)附接至CAR之細胞外區域，例如CAR之抗原結合結構域。例如，在一實施例中，鉸鏈可係人類Ig(免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈)或CD8a鉸鏈。在一實施例中，鉸鏈或間隔體包括胺基酸序列SEQ ID NO：4(例如由其組成)。在一態樣中，跨膜結構域包括跨膜結構域SEQ ID NO：5或12(例如由其組成)。

在一態樣中，鉸鏈或間隔體包括IgG4鉸鏈。例如，在一實施例中，鉸鏈或間隔體包括以下胺基酸序列之鉸鏈： (SEQ ID NO：104)。在一些實施例中，鉸鏈或間隔體包括由以下核苷酸序列編碼之鉸鏈： (SEQ ID NO：105)。

在一態樣中，鉸鏈或間隔體包括IgD鉸鏈。例如，在一實施例中，鉸鏈或間隔體包括以下胺基酸序列之鉸鏈： (SEQ ID NO：122)。在一些實施例中，鉸鏈或間隔體包括由以下核苷酸序列編碼之鉸鏈： (SEQ ID NO：123)。

在一態樣中，跨膜結構域可為重組結構域，在該情形下其將主要包括諸如白胺酸及纈胺酸等疏水性殘基。在一態樣中，可發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體位於重組跨膜結構域之每一末端。

視情況，例如長度介於2個與10個胺基酸之間之短寡肽或多肽連接體可在CAR之跨膜結構域與細胞質區域之間形成連接。甘胺酸-絲胺酸係適宜連接體之實例。例如，在一態樣中，連接體包括胺基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：124)。在一些實施例中，連接體係由核苷酸序列GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO：125)編碼。

細胞質結構域

CAR之細胞質結構域或區域包含細胞內信號傳導結構域。細胞內信號傳導結構域通常負責活化其中已引入CAR之免疫細胞之至少一種正常效應子功能。術語「效應子功能」係指細胞之特殊功能。例如，T細胞之效應子功能可為細胞溶解活性或協助細胞活性，包含分泌細胞介素。因此，術語「細胞內信號傳導結構域」或另一選擇「細胞質信號傳導結構域」係指蛋白質之轉導效應子功能信號且定向細胞以實施特殊功能之部分。儘管通常可採用整個細胞內信號傳導結構域，但在許多情形下無需使用整條鏈。就使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言，可使用該截短部分來替代完整鏈，只要其轉導效應子功能信號即可。因此，術語細胞內信號傳導結構域意欲包含細胞內信號傳導結構域之足以轉導效應子功能信號之任何截短部分。

用於本發明CAR中之細胞內信號傳導結構域之實例包含T細胞受體(TCR)及在抗原受體參與後協同起起始信號轉導作用之共受體之細胞質序列以及該等序列之任何衍生物或變體及具有相同功能性能力之任何重組序列。

已知僅經由TCR產生之信號不足以完全活化T細胞，且亦需要第二次或共刺激信號。因此，可認為T細胞活化係藉由兩類不同的細胞質信號傳導序列來調介：經由TCR(初級細胞內信號傳導結構域)起始抗原依賴性初級活化之彼等，及以抗原非依賴性方式起提供第二次或共刺激信號(第二次細胞質信號傳導結構域，例如共刺激結構域)作用之彼等。

初級信號傳導結構域以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物之初級活化。以刺激方式起作用之初級細胞內信號傳導結構域可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM之信號傳導基序。

具體用於本發明中之含有ITAM之初級細胞內信號傳導結構域之實例包含彼等TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d。在一實施例中，本發明CAR(例如選自由以下組成之群之CAR：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：83)包括CD3-ζ之細胞內信號傳導結構域，例如初級信號傳導結構域。在一實施例中，初級信號傳導結構域包括經修飾之ITAM結構域，例如與天然ITAM結構域相比活性已改變(例如增加或降低)之突變ITAM結構域。在一實施例中，初級信號傳導結構域包括含有ITAM之經修飾初級細胞內信號傳導結構域，例如含有最佳化及/或截短ITAM之初級細胞內信號傳導結構域。在實施例中，初級信號傳導結構域包括1個、2個、3個、4個或更多個ITAM基序。

CAR之細胞內信號傳導結構域可包括CD3-ζ信號傳導結構域本身，或其可與在本發明CAR背景下使用之任何其他期望細胞內信號傳導結構域組合。例如，CAR之細胞內信號傳導結構域可包括CD3 ζ鏈部分及共刺激信號傳導結構域。共刺激信號傳導結構域係指CAR之包括共刺激分子之細胞內結構域之一部分。共刺激分子係淋巴球有效因應抗原所需之除抗原受體或其配體外之細胞表面分子。該等分子之實例包含CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及與CD83特異性結合之配體及諸如此類。例如已展示，CD27共刺激增強活體外人類CART細胞之擴增、效應子功能及存活率，且增加活體內人類T細胞持久性及抗腫瘤活性(Song等人Blood.2012；119(3)：696-706)。

本發明CAR之細胞質部分內之細胞內信號傳導序列可以隨機或指定順序來彼此連接。視情況，例如長度介於2個與10個胺基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)之間之短寡肽或多肽連接體可在細胞內信號傳導序列之間形成連接。在一實施例中，可使用甘胺酸-絲胺酸雙聯體作為適宜連接體。在一實施例中，可使用單一胺基酸(例如丙胺酸、甘胺酸)作為適宜連接體。

在一態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包括兩個或更多個(例如2、3、4、5個或更多個)共刺激信號傳導結構域。在實施例中，兩個或更多個(例如2、3、4、5個或更多個)共刺激信號傳導結構域係藉由連接體分子(例如本文所闡述之連接體分子)分開。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括兩個共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，連接體分子係甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接體係丙胺酸殘基。

在一態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包括CD3-ζ之信號傳導結構域及CD28之信號傳導結構域。在一態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包括CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域。在一態樣中，CD3-ζ之信號傳導結構域係SEQ ID NO：7或14之信號傳導結構域。在一態樣中，4-1BB之信號傳導結構域係SEQ ID NO：6或13之信號傳導結構域。

在一態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包括CD3-ζ之信號傳導結構域及CD27之信號傳導結構域。在一態樣中，CD27之信號傳導結構域包括胺基酸序列QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：23)。在一態樣中，CD27之信號傳導結構域係由以下核酸序列編碼： (SEQ ID NO：27)。

在一態樣中，本文所闡述表現CAR之細胞可進一步包括另一CAR，例如包含例如與相同靶(CD123)或不同靶(例如CD19)不同之抗原結合結構域之另一CAR。

在另一態樣中，本發明提供表現CAR之細胞(例如CART細胞)群。在一些實施例中，表現CAR之細胞群包括表現不同CAR之細胞之混合物。例如，在一實施例中，CART細胞群可包含第一細胞，其表現具有本文所闡述抗-CD123結合結構域之CAR；及第二細胞，其表現具有與第一細胞所表現之CAR中之抗-CD123結合結構域不同之不同抗-CD123結合結構域(例如本文所闡述之抗-CD123結合結構域)的CAR。作為另一實例，表現CAR之細胞群可包含第一細胞，其表現包含例如如本文所闡述之抗-CD123結合結構域之CAR；及第二細胞，其表現包含針對除CD123外之靶之抗原結合結構域(例如針對在癌細胞上表現之靶或在正常組織上表現之靶的抗原結合結構域)之CAR。在一實施例中，表現CAR之細胞群包含例如第一細胞，其表現包含初級細胞內信號傳導結構域之CAR；及第二細胞，其表現包含第二次信號傳導結構域之CAR。

在另一態樣中，本發明提供群中之至少一個細胞表現具有本文所闡述抗-CD123結合結構域之CAR之細胞與表現另一藥劑(例如增強表現CAR之細胞活性之藥劑)的第二細胞之群。例如，在一實施例中，藥劑係抑制抑制分子之藥劑。在一些實施例中，抑制分子(例如PD1)可降低表現CAR之細胞引起免疫效應子反應之能力。抑制分子之實例包含PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。增強表現CAR之細胞活性之藥劑可係例如包括第一結構域及第二結構域之融合蛋白，其中第一結構域為抑制分子或其片段，且第二結構域為與陽性信號相關之多肽，例如，與陽性信號相關之多肽為CD28、ICOS及其片段，例如CD28及/或ICOS之細胞內信號傳導結構域。在一實施例中，融合蛋白係由表現CAR之相同細胞來表現。在另一實施例中，融合蛋白係由不表現抗-CD123 CAR之細胞(例如T細胞)表現。

RNA轉染

本文揭示用於產生活體外轉錄RNA CAR之方法。本發明亦包含可直接轉染至細胞中之編碼CAR之RNA構築物。產生用於轉染之mRNA之方法涉及使用特殊設計之引子在活體外轉錄(IVT)模板，然後添加聚A，以產生長度通常為50-2000個鹼基之含有以下各項之構築物(SEQ ID NO：133)：3'及5'非翻譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾。如此產生之RNA可有效地轉染不同類型之細胞。在一態樣中，模板包含CAR之序列。

在一態樣中，CD123 CAR係由信使RNA(mRNA)編碼。在一態樣中，將編碼CD123 CAR之mRNA引入T細胞中以產生CART細胞。

在一實施例中，可將活體外轉錄RNA CAR以瞬時轉染形式引入細胞中。該RNA係利用聚合酶鏈反應(PCR)產生之模板藉由活體外轉錄產生。可利用適宜引子及RNA聚合酶藉由PCR將來自任何來源之所關注DNA直接轉化成模板以供活體外mRNA合成。DNA之來源可係例如基因組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或DNA之任何其他適宜來源。用於活體外轉錄之期望模板係本發明CAR。例如，用於RNA CAR之模板包括細胞外區域，其包含抗腫瘤抗體之單鏈可變結構域；鉸鏈區；跨膜結構域(例如CD8a之跨膜結構域)；及細胞質區域，其包含細胞內信號傳導結構域，例如包括CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域。

在一實施例中，欲用於PCR之DNA含有開放讀碼框。DNA可來自有機體基因組之天然DNA序列。在一實施例中，核酸可包含一些或所有5'及/或3'非翻譯區(UTR)。核酸可包含外顯子及內含子。在一實施例中，欲用於PCR之DNA係人類核酸序列。在另一實施例中，欲用於PCR之DNA係包含5'及3' UTR之人類核酸序列。另一選擇為，DNA可係在天然有機體中通常不表現之人工DNA序列。實例性人工DNA序列係含有基因之連接在一起形成編碼融合蛋白之開放讀碼框之部分。DNA之連接在一起之部分可來自單一有機體或一種以上的有機體。

PCR係用於產生用於轉染之mRNA活體外轉錄之模板。用於實施PCR之方法為業內所熟知。用於PCR之引子經設計以具有實質上與用作PCR模板之DNA區域互補之區域。如本文所使用，「實質上互補」係指其中引子序列中之大部分或全部鹼基互補或一或多個鹼基不互補或錯配之核苷酸序列。實質上互補之序列能夠在PCR所使用之退火條件下退火或與目的DNA靶雜交。引子可經設計以實質上與DNA模板之任何部分互補。例如，引子可經設計以擴增核酸之通常在細胞(開放讀碼框)中轉錄之部分，包含5'及3' UTR。引子亦可經設計以擴增核酸之編碼所關注具體結構域之部分。在一實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區，包含全部或部分5'及3' UTR。可用於PCR之引子可藉由業內所熟知之合成方法來產生。「前置引子」係在欲擴增DNA序列上游之含有實質上與DNA模板上核苷酸互補之核苷酸區域的引子。在本文中使用「上游」係指欲擴增DNA序列相對於編碼鏈之位置5。「後置引子」係在欲擴增DNA序列下游之含有實質上與雙鏈DNA模板互補之核苷酸區域之引子。在本文中使用「下游」係指欲擴增DNA序列相對於編碼鏈之位置3'。

可在本文所揭示之方法中使用可用於PCR之任何DNA聚合酶。試劑及聚合酶可自多種來源獲得。

亦可使用具有促進穩定性及/或翻譯效率能力之化學結構。RNA較佳具有5'及3' UTR。在一實施例中，5' UTR之長度介於1個與3000個核苷酸之間。欲添加至編碼區中之5'及3' UTR序列之長度可藉由不同方法來改變，該等方法包含(但不限於)設計退火至UTR不同區域之用於PCR之引子。利用此方式，熟習此項技術者可改變在轉錄RNA轉染後達成最佳翻譯效率所需要之5'及3' UTR長度。

5'及3' UTR可係用於所關注核酸之天然、內源性5'及3' UTR。另一選擇為，不為所關注核酸內源之UTR序列可藉由將UTR序列納入前置及後置引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加。可使用不為所關注核酸內源之UTR序列來改變RNA之穩定性及/或翻譯效率。例如，已知3' UTR序列中富含AU之元件可降低mRNA之穩定性。因此，可基於業內熟知UTR之性質來選擇或設計3' UTR以增加轉錄RNA之穩定性。

在一實施例中，5' UTR可含有內源核酸之Kozak序列。另一選擇為，當藉由如上文所闡述之PCR添加不為所關注核酸內源之5' UTR時，可藉由添加5' UTR序列重新設計共有Kozak序列。Kozak序列可增加一些RNA轉錄本之翻譯效率，但似乎並不為所有RNA能夠有效翻譯所必需。業內已知對許多mRNA之Kozak序列之要求。在其他實施例中，5' UTR可係RNA基因組在細胞中穩定之RNA病毒之5’UTR。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5'UTR中以阻礙外切酶降解mRNA。

在一實施例中，載體中之核酸序列進一步包括3’UTR，例如本文所闡述之3’UTR，例如包括源自人類β-球蛋白之3’UTR之至少一個重複序列，例如存在於SEQ ID NO：94中之3’UTR。在一實施例中，載體中之核酸序列進一步包括可裂解肽，例如T2A自裂解肽，例如存在於SEQ ID NO：94中之T2A自裂解肽。

為能夠在不需要基因選殖的情況下自DNA模板合成RNA，應將轉錄之啟動子附接至欲轉錄序列之DNA模板上游。當將用作RNA聚合酶啟動子之序列添加至前置引子之5'末端時，RNA聚合酶啟動子被納入欲轉錄開放讀碼框之PCR產物上游中。在一較佳實施例中，啟動子係如本文在別處闡述之T7聚合酶啟動子。其他有用啟動子包含(但不限於)T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。業內已知T7、T3及SP6啟動子之共有核苷酸序列。

在較佳實施例中，mRNA在5'末端及3'聚(A)尾上皆具有決定細胞中之核糖體結合、mRNA翻譯起始及穩定性之帽。在環形DNA模板(例如質體DNA)上，RNA聚合酶產生不適於在真核細胞中表現之長多聯產物。3' UTR末端線性化之質體DNA之轉錄產生正常大小之mRNA，該mRNA即使在轉錄後經多腺苷酸化仍在真核轉染中無效。

在直鏈DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄本之3'末端延伸超出模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf，Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)；Nacheva及Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003)。

將聚A/T段整合至DNA模板中之習用方法係分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可使質體不穩定，此係自細菌細胞獲得之質體DNA模板通常經缺失及其他畸變高度污染之原因。此使得選殖程序不僅費力且耗時，且通常使其不可靠。此係在不選殖情況下構築具有聚A/T 3'段之DNA模板之方法高度合意之原因。

轉錄DNA模板之聚A/T區段可藉由以下方式來產生：在PCR期間藉由利用含有聚T尾(例如100T尾(SEQ ID NO：134))之後置引子(大小可為50-5000 T(SEQ ID NO：135))，或在PCR後藉助任何其他方法(包含(但不限於)DNA連接或活體外重組)。聚(A)尾亦為RNA提供穩定性且減少其降解。通常，聚(A)尾之長度與轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一實施例中，聚(A)尾介於100個與5000個三磷酸腺苷之間(SEQ ID NO：136)。

RNA之聚(A)尾可在活體外轉錄後利用聚(A)聚合酶(例如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))進一步延伸。在一實施例中，將聚(A)尾之長度自100個核苷酸增加至介於300個與400個核苷酸之間(SEQ ID NO：90)使得RNA翻譯效率增加約兩倍。此外，不同化學基團至3'末端之附接可增加mRNA穩定性。該附接可含有經修飾/人工核苷酸、適配體及其他化合物。例如，可利用聚(A)聚合酶將ATP類似物納入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步增加RNA之穩定性。

5'帽亦為RNA分子提供穩定性。在較佳實施例中，藉由本文所揭示方法產生之RNA包含5'帽。5'帽係利用業內已知及本文所闡述之技術提供(Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)；Stepinski等人，RNA,7：1468-95(2001)；Elango等人，Biochim. Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005))。

藉由本文所揭示方法產生之RNA亦可含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。IRES序列可係起始帽非依賴性核糖體與mRNA之結合且幫助翻譯起始之任何病毒、染色體或人工設計之序列。可包含任何適用於細胞電穿孔之溶質，該等溶質可含有促進細胞滲透及活力之因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及表面活性劑。

可利用多種不同方法中之任一者(例如市售方法)將RNA引入靶細胞中，該等方法包含(但不限於)電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、利用脂質轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或生物彈射粒子遞送系統(例如「基因槍」)(例如，參見Nishikawa等人Hum Gene Ther.,12(8)：861-70(2001)。

編碼CAR之核酸構築物

本發明提供編碼一或多個本文所闡述之CAR構築物之核酸分子。在一態樣中，核酸分子係以信使RNA轉錄本提供。在一態樣中，核酸分子係以DNA構築物提供。

因此，在一態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中CAR包括抗-CD123結合結構域(例如人類化抗-CD123結合結構域)、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包括刺激結構域，例如共刺激信號傳導結構域及/或初級信號傳導結構域，例如ζ鏈。在一實施例中，抗-CD123結合結構域係本文所闡述之抗-CD123結合結構域，例如包括選自由以下組成之群之序列之抗-CD123結合結構域：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，經分離核酸分子進一步包括編碼共刺激結構域之序列。在一實施例中，共刺激結構域係選自由以下組成之群之蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。在一實施例中，共刺激結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，跨膜結構域係選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一實施例中，跨膜結構域包括序列SEQ ID NO：5或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括4-1BB之功能信號傳導結構域及CD3 ζ之功能信號傳導結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括功能CD27之信號傳導結構域及CD3 ζ之功能信號傳導結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23或與其具有95%至99%一致性之序列，及序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98或與其具有95%至99%一致性之序列，其中包括細胞內信號傳導結構域之序列在同一框架中且以單一多肽鏈表現。在一實施例中，抗-CD123結合結構域藉由鉸鏈區(例如本文所闡述之鉸鏈區)連接至跨膜結構域。在一實施例中，鉸鏈區包括SEQ ID NO：4或與其具有95%至99%一致性之序列。在一實施例中，鉸鏈區包括SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：124或與其具有95%至99%一致性之序列。

在另一態樣中，本發明係關於編碼CAR構築物之經分離核酸分子，該CAR構築物包括前導序列SEQ ID NO：3；scFv結構域，其具有選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78(或與其具有95%至99%一致性之序列)；鉸鏈區SEQ ID NO：4(或與其具有95%至99%一致性之序列)；跨膜結構域，其具有序列SEQ ID NO：5(或與其具有95%至99%一致性之序列)；4-1BB共刺激結構域，其具有序列SEQ ID NO：6(或與其具有95%至99%一致性之序列)；或CD27共刺激結構域，其具有序列SEQ ID NO：23(或與其具有95%至99%一致性之序列)；及CD3 ζ刺激結構域，其具有序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98(或與其具有95%至99%一致性之序列)。

在另一態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)分子之核酸分子，該嵌合抗原受體包括抗-CD123結合結構域、跨膜結構域及包括刺激結構域之細胞內信號傳導結構域，且其中該抗-CD123結合結構域包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列。

在一實施例中，所編碼之CAR分子進一步包括編碼共刺激結構域之序列。在一實施例中，共刺激結構域係選自由以下組成之群之蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。在一實施例中，共刺激結構域包括序列SEQ ID NO：6。在一實施例中，共刺激結構域包括序列 SEQ ID NO：23。在一實施例中，跨膜結構域係選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一實施例中，跨膜結構域包括序列SEQ ID NO：5。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括4-1BB之功能信號傳導結構域及ζ之功能信號傳導結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6及序列SEQ ID NO：7，其中包括細胞內信號傳導結構域之序列在同一框架中且以單一多肽鏈表現。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括功能CD27之信號傳導結構域及ζ之功能信號傳導結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：23及序列SEQ ID NO：7，其中包括細胞內信號傳導結構域之序列在同一框架中且以單一多肽鏈表現。在一實施例中，抗-CD123結合結構域藉由鉸鏈區連接至跨膜結構域。在一實施例中，鉸鏈區包括SEQ ID NO：4。在一實施例中，鉸鏈區包括SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：124。

在另一態樣中，本發明係關於所編碼之CAR分子，其包括前導序列SEQ ID NO：3；scFv結構域，其具有選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列；鉸鏈區SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：124；跨膜結構域，其具有序列SEQ ID NO：5；4-1BB共刺激結構域，其具有序列SEQ ID NO：6；或CD27共刺激結構域，其具有序列SEQ ID NO：23；及CD3 ζ刺激結構域，其具有序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98。在一實施例中，所編碼之CAR分子包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：83，或與其具有95%至99%一致性之序列。

編碼期望分子之核酸序列可利用業內已知之重組方法來獲得，例如利用標準技術藉由自表現該基因之細胞篩選文庫、自已知包含該基因之載體衍生出基因或自含有該基因之細胞及組織直接分離來獲得。另一選擇為，所關注基因可以合成方式而非選殖來產生。

本發明亦提供其中插入本發明核酸(例如DNA)之載體。源自逆轉錄病毒(例如慢病毒)之載體係達成長期基因轉移之適宜工具，此乃因其允許轉基因長期穩定整合及其在子細胞中繁殖。慢病毒載體比源自致癌逆轉錄病毒(例如鼠類白血病病毒)之載體的額外優點在於，其可轉導非增殖細胞(例如肝細胞)。其亦具有低免疫原性之額外優點。

在簡述中，編碼CAR之核酸之表現通常係藉由將編碼CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子並將構築物納入表現載體中來達成。載體可適於在真核生物中複製及整合。典型選殖載體含有轉錄及翻譯終止子、起始序列及可用於調控期望核酸序列表現之啟動子。

本發明之表現構築物亦可利用標準基因遞送方案用於核酸免疫及基因療法。用於基因遞送之方法為業內已知。例如，參見美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，該等專利之全文皆以引用方式併入本文中。在另一實施例中，本發明提供基因療法載體。

可將核酸選殖至多種類型之載體中。例如，可將核酸選殖至載體中，該等載體包含(但不限於)質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體。尤其關注之載體包含表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。

此外，表現載體可以病毒載體形式提供至細胞。病毒載體技術為業內所熟知且闡述於例如Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包含(但不限於)逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。通常，適宜載體含有在至少一種有機體中發揮功能之複製起點、啟動子序列、方便的限制性內切酶位點及一或多個選擇標記(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。

已研發多種基於病毒之系統用於至哺乳動物細胞中之基因轉移。例如，逆轉錄病毒提供為基因遞送系統提供方便的平臺。可利用業內已知技術將所選基因插入載體中且封裝在逆轉錄病毒粒子中。然後可以活體內或離體方式將重組病毒分離並遞送至個體細胞中。業內已知多種逆轉錄病毒系統。在一些實施例中，使用腺病毒載體。業內已知多種腺病毒載體。在一實施例中，使用慢病毒載體。

其他啟動子元件(例如增強子)調控轉錄起始之頻率。通常，該等元件位於起始位點上游之30-110 bp區域中，但最近已顯示多種啟動子亦含有位於起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間之間距通常較靈活，以使得在相對於另一者插入或移動元件時保留啟動子功能。在胸腺嘧啶激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間之間距可在活性開始下降之前增加至50 bp。端視啟動子，似乎個別元件可協同或獨立地發揮活化轉錄之功能。

啟動子之實例係立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列係能夠驅動與其可操作地連接之任何多核苷酸序列之高表現量的強組成型啟動子序列。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，包含(但不限於)猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、愛潑斯坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr virus)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子、延伸因子-1α啟動子；以及人類基因啟動子，例如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明不應限於組成型啟動子之使用。亦涵蓋誘導型啟動子作為本發明之一部分。使用誘導型啟動子提供能夠在期望該表現時啟動可操作地連接之多核苷酸序列的表現或在不期望該表現時關閉表現之分子開關。誘導型啟動子之實例包含(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。

為評價CAR多肽或其部分之表現，欲引入細胞中之表現載體亦可含有選擇標記基因或報導基因或二者，以幫助自欲經由病毒載體轉染或感染所尋求之細胞群鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，選擇標記可攜載於DNA之單獨片段上且用於共轉染程序中。選擇標記及報導基因二者可側接有適宜調控序列以使得能夠在宿主細胞中表現。有用選擇標記包含例如抗生素抗性基因，例如neo及諸如此類。

報導基因係用於鑑別潛在轉染之細胞且用於評估調控序列之功能。通常，報導基因係不存在於接受者有機體或組織中或由其表現且編碼其表現係由一些可容易檢測之性質(例如酶活性)呈現之多肽的基因。報導基因之表現係在將DNA引入接受者細胞中後在適宜時間下分析。適宜報導基因可包含編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。適宜表現系統為業內所熟知且可利用已知技術製備或以商業方式獲得。通常，將顯示報導基因之最高表現量之具有最小5'側接區之構築物鑑別為啟動子。可將該等啟動子區域連接至報導基因且用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄之能力。

在一態樣中，載體包括自殺基因，其中該基因之表現導致包括載體之細胞死亡。例如，在一些情況下，不期望本發明CAR之表現延長。在一態樣中，載體中包含自殺基因允許精細控制個體中之CAR表現。在一態樣中，自殺基因之表現為誘導型，例如藉由使用調控自殺基因表現之誘導型啟動子。

業內已知將基因引入細胞中且在細胞中表現之方法。在表現載體之背景下，可藉由業內之任何方法將該載體容易地引入宿主細胞(例如哺乳動物、細菌、酵母菌或昆蟲細胞)中。例如，可藉由物理、化學或生物方式將表現載體轉移至宿主細胞中。

用於將多核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包含硫酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及諸如此類。用於產生包括載體及/或外源核酸之細胞之方法為業內所熟知。例如，參見Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)。在一些實施例中，用於將多核苷酸引入宿主細胞中之方法係硫酸鈣轉染。

用於將所關注多核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包含使用DNA及RNA載體。病毒載體且尤其逆轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入哺乳動物(例如人類細胞)中之方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、皰疹單純型病毒I、腺病毒及腺相關病毒及諸如此類。例如，參見美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。

用於將多核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包含膠質分散系統，例如大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包含水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之實例性膠質系統係脂質體(例如人工膜囊泡)。

在利用非病毒遞送系統之情形下，實例性遞送媒劑係奈米粒子，例如脂質體或其他適宜亞微米大小之遞送系統。涵蓋使用脂質調配物將多核苷酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質締合。與脂質締合之核酸可囊封於脂質體之水性內部，散佈在脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子附接至脂質體，包埋於脂質體中，與脂質體複合，分散在含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有膠束或與其複合或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合之組合物並不限於溶液中之任何具體結構。例如，其可以雙層結構、膠束或「塌陷」結構存在。其亦可簡單地散佈於溶液中，可能形成大小或形狀不均勻之聚集物。脂質係可為天然或合成脂質之脂肪物質。例如，脂質包含天然存在於細胞質中之脂肪小滴以及含有長鏈脂肪族烴及其衍生物之化合物類別，例如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。

適於使用之脂質可自商業來源獲得。例如，雙十四烷基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可自Sigma,St.Louis,MO獲得；磷酸雙十六烷基酯(「DCP」)可自K & K Laboratories(Plainview,NY)獲得；膽固醇(「Choi」)可自Calbiochem-Behring獲得；雙十四烷基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可自Avanti Polar Lipids公司(Birmingham,AL.)獲得。脂質存於氯仿或氯仿/甲醇中之儲備溶液可儲存在約-200℃下。使用氯仿作為唯一溶劑，此乃因其比甲醇更容易蒸發。「脂質體」係涵蓋多種藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成之單一及多層脂質媒劑的一般術語。脂質體之特徵可在於具有磷脂雙層膜及內部水性介質之囊泡狀結構。多層脂質體具有多個藉由水性介質分開之脂質層。其係在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成。脂質組份經受閉合結構形成之前之自我重排且將水及所溶解溶質包埋在脂質雙層之間(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡狀結構不同之結構之組合物。例如，脂質可呈膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋lipofectamine-核酸複合物。

無論將外源核酸引入宿主細胞中所使用之方法抑或以其他方式將細胞暴露於本發明抑制劑下，為確認在宿主細胞中存在重組DNA序列，可實施多種分析。該等分析包含例如彼等熟習此項技術者所熟知之「分子生物學」分析，例如南方墨點(Southern blotting)及北方墨點(Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，例如檢測具體肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點)或藉由本文所闡述之分析，以鑑別屬於本發明範疇內之藥劑。

本發明進一步提供包括編碼CAR之核酸分子之載體。在一態樣中，CAR載體可直接轉導至細胞(例如T細胞)中。在一態樣中，載體係選殖或表現載體，例如包含(但不限於)以下各項之載體：一或多種質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、逆轉錄病毒及慢病毒載體構築物。在一態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞中表現CAR構築物。在一態樣中，哺乳動物T細胞為人類T細胞。

T細胞之來源

在擴增及遺傳修飾之前，自個體獲得T細胞之來源。術語「個體」意欲包含其中可誘發免疫反應之活的有機體(例如哺乳動物)。個體之實例包含人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。T細胞可自多種來源獲得，該等來源包含外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤。在本發明之某些態樣中，可使用業內可獲得之任何數量之T細胞系。在本發明之某些態樣中，T細胞可自利用任何數量之熟習此項技術者已知之技術(例如Ficoll^TM分離)自個體收集之一單位血液獲得。在一較佳態樣中，來自個體循環血液之細胞係藉由血球分離獲得。血球分離產物通常含有淋巴球(包含T細胞)、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球及血小板。在一態樣中，藉由血球分離收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且使細胞置於適宜緩衝液或培養基中用於隨後處理步驟。在本發明之一態樣中，使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在替代態樣中，洗滌溶液缺少鈣且可缺少鎂或可缺少許多但非所有二價陽離子。在鈣不存在下之初始活化步驟可使得活化放大。如彼等熟習此項技術者將容易地瞭解，洗滌步驟可藉由彼等業內已知之方法完成，例如根據製造商之說明書藉由利用半自動「無逆流」離心機(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)來完成。洗滌後，可將細胞重懸於多種生物相容緩衝液中，例如不含Ca之PBS、不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他具或不具緩衝液之鹽水溶液。另一選擇為，可移除血球分離樣品之不期望組份且將細胞直接重懸於培養基中。

在另一態樣中，藉由溶解紅血球且清除單核球自外周血淋巴球分離T細胞，例如藉由PERCOLL^TM梯度離心或藉由逆流離心淘析來分離。可藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離T細胞之特定亞群，例如CD3⁺、CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺及CD45RO⁺T細胞。例如，在一態樣中，T細胞係藉由與抗-CD3/抗-CD28(例如3×28)偶聯之珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以對期望T細胞進行正選擇之時間段來分離。在一態樣中，時間段為約30分鐘。在又一態樣中，時間段介於30分鐘至36小時或更長及其間之所有整數值範圍內。在又一態樣中，時間段係至少1、2、3、4、5或6小時。在又一態樣中，時間段為10小時至24小時。在一態樣中，培育時間段為24小時。在與其他細胞類型相比T細胞極少的任何情況下(例如在自腫瘤組織或自免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴球(TIL)中)，可利用較長培育時間來分離T細胞。此外，利用較長培育時間可增加捕獲CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單地縮短或延長時間可使T細胞與CD3/CD28珠粒結合，及/或藉由增加或減小珠粒對T細胞之比率(如本文進一步闡述)，可在培養起始時或該過程期間之其他時間點優先選擇或不選擇T 細胞亞群。此外，藉由增加或減少珠粒或其他表面上之抗-CD3及/或抗-CD28抗體，可在培養起始時或其他期望時間點優先選擇或不選擇T細胞亞群。熟習此項技術者將意識到亦可在本發明背景下使用多輪選擇。在某些態樣中，可期望在活化及擴增過程中實施選擇程序且使用「未經選擇之」細胞。亦可使「未經選擇之」細胞經歷多輪選擇。

藉助陰性選擇之T細胞群之富集可使用針對陰性選擇細胞所獨有之表面標記之抗體的組合來完成。一種方法係經由負磁免疫黏附或流式細胞術使用針對存在於陰性選擇細胞上之細胞表面標記之單株抗體的混合物之細胞分選及/或選擇。例如，為藉由陰性選擇富集CD4⁺細胞，單株抗體混合物通常包含針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些態樣中，可期望富集或正選擇通常表現CD4⁺、CD25⁺、CD62L^hi、GITR⁺及FoxP3⁺之調控T細胞。另一選擇為，在某些態樣中，T調控細胞係藉由抗-C25偶聯珠粒或其他相似選擇方法來清除。

在一實施例中，可選擇表現以下中之一或多者之T細胞群：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B及穿孔蛋白。可藉由例如PCT公開案第WO 2013/126712號中所闡述之方法來確定用於細胞表現之篩選方法。

為藉由陽性或陰性選擇來分離期望細胞群，可改變細胞及表面(例如粒子，例如珠粒)之濃度。在某些態樣中，可期望顯著減小珠粒及細胞混合在一起之體積(例如增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。例如，在一態樣中，使用20億個細胞/ml之濃度。在一態樣中，使用10億個細胞/ml之濃度。在又一態樣中，使用大於100百萬個細胞/ml。在又一態樣中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/ml之細胞濃度。在又一態樣中，使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，可使用 125或150百萬個細胞/ml之濃度。利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化及細胞擴增。此外，利用高細胞濃度可更有效地捕獲可弱表現所關注靶抗原之細胞，例如CD28陰性T細胞，或來自存在許多腫瘤細胞之樣品(例如白血病血液、腫瘤組織等)。該等細胞群可具有治療價值且將期望獲得。例如，利用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8⁺ T細胞。

在相關態樣中，可期望使用較低濃度之細胞。藉由大量稀釋T細胞與表面(例如粒子，例如珠粒)之混合物，最小化粒子與細胞之間之相互作用。此選擇表現大量與粒子結合之期望抗原之細胞。例如，稀釋濃度之CD4⁺ T細胞比CD8⁺ T細胞表現更高量之CD28且更有效地被捕獲。在一態樣中，所使用細胞之濃度為5×10⁶/ml。在其他態樣中，所使用之濃度可係約1×10⁵/ml至1×10⁶/ml及其間之任何整數值。

在其他態樣中，可在2℃-10℃或在室溫下在旋轉器上以不同速度將細胞培育不同時間長度。

在洗滌步驟後亦可冷凍用於刺激之T細胞。不希望受限於理論，冷凍及隨後解凍步驟藉由在細胞群中移除顆粒球且在一定程度上移除單核球來提供更均勻之產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為業內已知且可用於此背景下，但一種方法涉及利用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO或31.25% PlasmaLyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基或其他含有例如羥乙基澱粉及PlasmaLyte A之適宜細胞冷凍培養基，然後以1°/分鐘之速率將細胞冷凍至-80℃且儲存在液氮儲存罐之氣相中。可使用其他受控冷凍方法以及立即在-20℃下或液氮中之不受控冷凍。

在某些態樣中，如本文所闡述將冷藏保存之細胞解凍且洗滌並在室溫下靜置1小時，然後利用本發明方法進行活化。

本發明亦涵蓋在可能需要如本文所闡述之擴增細胞之前之一定時間段下自個體收集血液樣品或血球分離產物。因此，可在任何所需時間點下收集欲擴增細胞之來源及期望細胞(例如T細胞)，分離且冷凍，以供後期於T細胞療法中用於任何數量之將受益於T細胞療法之疾病或病況(例如本文所闡述之彼等)。在一態樣中，血液樣品或血球分離係取自一般健康個體。在某些態樣中，血液樣品或血球分離物係取自具有罹患疾病之風險但尚未罹患疾病之一般健康個體，且分離並冷凍所關注細胞以供後期使用。在某些態樣中，T細胞可在隨後時間擴增、冷凍及使用。在某些態樣中，樣品係自診斷如本文所闡述之具體疾病後不久但在任何治療之前之患者收集。在又一態樣中，細胞係自在任何數量之相關治療模式之前的個體之血液樣品或血球分離物分離，該等治療模式包含(但不限於)使用以下各項之治療：藥劑，例如那他珠單抗(natalizumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑；化學療法；輻射；免疫阻抑劑，例如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺蝶呤、黴酚酸酯及FK506；抗體或其他免疫清除劑，例如CAMPATH、抗-CD3抗體、環磷醯胺(cytoxan)、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素(rapamycin)、黴酚酸、類固醇、FR901228及輻照。

在本發明之又一態樣中，T細胞係直接自治療後之患者獲得。就此而言，已觀察到，在某些癌症治療後，尤其在使用損害免疫系統之藥物治療後，在治療後不久在患者通常因治療而恢復之時段期間，所獲得T細胞之品質可能最佳或其離體擴增能力得到改良。同樣，利用本文所闡述之方法進行離體操縱後，該等細胞可處於增強植入及活體內擴增之較佳狀態。因此，本發明涵蓋在此恢復期間收集血細胞，包含T細胞、樹突細胞或造血系之其他細胞。此外，在某些態樣中，可使用動員(例如利用GM-CSF之動員)及調理方案以在個體中產生尤其在治療後所定義時間窗期間有利於具體細胞類型之重建、再循環、再生及/或擴增之條件。闡釋性細胞類型包含T細胞、B細胞、樹突細胞及免疫系統之其他細胞。

T細胞之活化及擴增

T細胞通常可利用如例如以下專利中所闡述之方法來活化及擴增：美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國專利申請公開案第20060121005號。

通常，本發明之T細胞可藉由與表面接觸來擴增，該表面具有附接至其之刺激CD3/TCR複合物相關信號之藥劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子之配體。具體而言，T細胞群可如本文所闡述來刺激，例如藉由與固定在表面上之抗-CD3抗體或其抗原結合片段或抗-CD2抗體接觸或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸來刺激。對於T細胞表面上輔助分子之共刺激，使用結合輔助分子之配體。例如，可在適於刺激T細胞增殖之條件下使T細胞群與抗-CD3抗體及抗-CD28抗體接觸。為刺激CD4⁺ T細胞或CD8⁺ T細胞之增殖，使用抗-CD3抗體及抗-CD28抗體。抗-CD28抗體之實例包含9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besançon,France)，其可用作業內通常已知之其他方法(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328,1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63,1999)。

在某些態樣中，針對T細胞之初級刺激信號及共刺激信號可藉由不同方案來提供。例如，提供每一信號之藥劑可在溶液中或偶合至表面。當偶合至表面時，該等藥劑可偶合至相同表面(即呈「順式」形式)或偶合至單獨表面(即呈「反式」形式)。另一選擇為，一種藥劑可偶合至表面且另一藥劑在溶液中。在一態樣中，提供共刺激信號之藥劑與細胞表面結合且提供初級活化信號之藥劑在溶液中或偶合至表面。在某些態樣中，兩種藥劑皆可在溶液中。在另一態樣中，藥劑可呈可溶形式，且然後與表面交聯，例如表現Fc受體之細胞或抗體或將與該等藥劑結合之其他結合劑。就此而言，參見例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號，該等公開案係關於所涵蓋用於活化及擴增本發明T細胞之人工抗原呈送細胞(aAPC)。

在一態樣中，將兩種藥劑固定在珠粒上，固定在同一珠粒上(即「順式」)，或固定在單獨珠粒上(即「反式」)。舉例而言，提供初級活化信號之藥劑係抗-CD3抗體或其抗原結合片段，且提供共刺激信號之藥劑係抗-CD28抗體或其抗原結合片段；且兩種藥劑以等效分子量共固定至同一珠粒。在一態樣中，使用與用於CD4⁺ T細胞擴增與T細胞生長之珠粒結合之每一抗體1：1的比率。在本發明之某些態樣中，使用與珠粒結合之抗CD3：CD28抗體之比率以使得與利用1：1比率觀察到之擴增相比，觀察到T細胞擴增增加。在一態樣中，與利用1：1比率觀察到之擴增相比，觀察到約1倍至約3倍的增加。在一態樣中，與珠粒結合之CD3：CD28抗體之比率介於100：1至1：100及其間所有整數值範圍內。在本發明之一態樣中，與粒子結合之抗-CD28抗體多於抗-CD3抗體，例如CD3：CD28之比率小於1。在本發明之某些態樣中，與珠粒結合之抗CD28抗體對抗CD3抗體之比率大於2：1。在一具體態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：100 CD3：CD28比率。在另一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：75 CD3：CD28比率。在又一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：50 CD3：CD28比率。在另一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：30 CD3：CD28比率。在一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：10 CD3：CD28比率。在另一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：3 CD3：CD28比率。在又一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之3：1 CD3：CD28比率。

可使用1：500至500：1及其間之任何整數值之粒子對細胞之比率來刺激T細胞或其他靶細胞。如彼等熟習此項技術者可容易地瞭解，粒子對細胞之比率可端視粒子相對於靶細胞之大小而定。例如，大小較小之珠粒僅可結合少數細胞，而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中，細胞對粒子之比率介於1：100至100：1及其間之任何整數值範圍內，且在其他態樣中，該比率包括1：9至9：1及其間之任何整數值，亦可用於刺激T細胞。引起T細胞刺激之抗-CD3及抗-CD28偶合粒子對T細胞之比率可如上所述來變化，然而某些較佳值包含1：100、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1及15：1，且一較佳比率為至少1：1粒子/T細胞。在一態樣中，使用粒子對細胞1：1或更小之比率。在一具體態樣中，有利的粒子對細胞比率為1：5。在其他態樣中，粒子對細胞之比率可端視刺激時間而定。例如，在一態樣中，在第一天時粒子對細胞之比率為1：1至10：1，且每天或每隔一天此後保持10天以1：1至1：10之最終比率(基於添加時間之細胞計數)將其他粒子添加至細胞。在一具體態樣中，在第一天刺激時粒子對細胞之比率為1：1，且在第三天及第五天刺激時調節至1：5。在另一態樣中，在第一天時每天或每隔一天基於1：1之最終比率添加粒子，且在第三天及第五天刺激時基於1：5添加。在另一態樣中，在第一天刺激時粒子對細胞之比率為2：1，且在第三天及第五天刺激時調節至1：10。在另一態樣中，在第一天時每天或每隔一天基於1：1之最終比率添加粒子，且在第三天及第五天刺激時基於1：10添加。熟習此項技術者將瞭解，多種其他比率可適用於本發明中。具體而言，比率將端視粒子大小以及細胞大小及類型而變化。在一態樣中，在第一天時所使用之最典型比率為約1：1、2：1或3：1。

在本發明之其他態樣中，組合細胞(例如T細胞)與藥劑包覆之珠粒，隨後分離珠粒與細胞，且然後培養細胞。在替代態樣中，在培養之前，不分離藥劑包覆之珠粒與細胞但一起培養。在又一態樣中，首先藉由施加力(例如磁力)對珠粒及細胞進行濃縮，從而增加細胞表面標記之連接，由此誘導細胞刺激。

舉例而言，可藉由使抗-CD3及抗-CD28所附接之順磁珠粒(3×28個珠粒)與T細胞接觸來連接細胞表面蛋白。在一態樣中，於緩衝液(例如PBS(不含諸如鈣及鎂等二價陽離子))中組合細胞(例如10⁴至10⁹個T細胞)與珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁珠粒，比率為1：1)。而且，彼等熟習此項技術者可容易地瞭解，可使用任何細胞濃度。例如，在樣品中靶細胞可極其稀少且僅佔樣品的0.01%或全部樣品(即100%)可包括所關注靶細胞。因此，任何細胞數量皆在本發明背景內。在某些態樣中，可期望顯著減小珠粒及細胞混合在一起之體積(例如增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。例如，在一態樣中，使用約20億個細胞/ml之濃度。在另一態樣中，使用大於100百萬個細胞/ml。在又一態樣中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/ml之細胞濃度。在又一態樣中，使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125或150百萬個細胞/ml之濃度。利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可更有效地捕獲可弱表現所關注靶抗原之細胞，例如CD28陰性T細胞。在某些態樣中，該等細胞群可具有治療價值且將期望獲得。例如，利用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。

在本發明之一態樣中，可將混合物培養若干小時(約3小時)至約14天或其間之任何小時整數值。在另一態樣中，可將混合物培養21天。在本發明之一態樣中，將珠粒與T細胞一起培養約8天。在另一態樣中，將珠粒與T細胞一起培養2-3天。若干刺激循環亦可能合意以使T細胞之培養時間可為60天或更長。適用於T細胞培養之條件包含可含有增殖及活力所需因子之適宜培養基(例如最小必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15(Lonza))，該等因子包含血清(例如胎牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟習此項技術者已知用於使細胞生長之任何其他添加劑。用於使細胞生長之其他添加劑包含(但不限於)表面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑(例如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇)。培養基可包含RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20，最佳者含有所添加胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，不含血清或補充有適量血清(或血漿)或所定義之激素群及/或對於T細胞生長及擴增足夠之細胞介素量。抗生素(例如青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin))僅包含於實驗培養物而非欲輸注至個體中之細胞培養物中。將靶細胞維持在支持生長所需之條件下，例如適宜溫度(例如37℃)及氣氛(例如空氣加5% CO₂)。

已暴露於多個刺激時間下之T細胞可展現不同特性。例如，典型血液或血球分離之外周血單核細胞產品具有大於細胞毒性或阻抑劑T細胞群(T_C、CD8⁺)之協助細胞T細胞群(T_H、CD4⁺)。T細胞藉助刺激CD3及CD28受體之離體擴增產生在約第8-9天之前主要由T_H細胞組成而在約第8-9天之後T細胞群包括日益增加之T_C細胞群的T細胞群。因此，端視治療之目的，向個體輸注主要包括T_H細胞之T細胞群可能有利。相似地，若已分離T_C細胞之抗原特異性亞群，則在較大程度上擴增此亞群可能有益。

此外，除CD4及CD8標記外，其他表型標記顯著變化，但在很大程度上在細胞擴增過程期間可再生。因此，該可再生性使得可針對特定目的來調適活化T細胞產物。

一旦抗-CD123 CAR經構築，則可在適宜動物模型中使用各種分析來評估分子之活性，例如(但不限於)抗原刺激後使T細胞擴增之能力、在再刺激不存在下使T細胞持續擴增之能力及抗癌活性。評估CD123 CAR效應之分析進一步詳細闡述於下文中：

疾病及病症之治療應用

血液癌病況係侵襲血液、骨髓及淋巴系統之癌症類型，例如白血病及惡性淋巴組織增生性病況。

白血病可歸類為急性白血病及慢性白血病。急性白血病可進一步歸類為急性骨髓性白血病(AML)及急性淋巴樣白血病(ALL)。慢性白血病包含慢性骨髓性白血病(CML)及慢性淋巴樣白血病(CLL)。其他相關病況包含骨髓發育不良症候群(MDS，之前稱為「白血病前期」)，其係由於骨髓樣血細胞之無效產生(或發育不良)及轉化成AML之風險而集合在一起的血液病況之不同集合。

在AML中，異常分化之長壽命骨髓樣祖細胞之惡性轉化及不受控增殖導致高循環數量之未成熟血液形式及惡性細胞對正常骨髓之替代。症狀包含疲勞、蒼白、容易淤血及出血、發熱及感染；白血病浸潤之症狀僅存在於約5%的患者(通常呈皮膚呈現形式)中。外周血塗片及骨髓之檢查具有診斷性。現有治療包含誘導化學療法以達成緩解及緩解後化學治療(具或不具幹細胞移植)來避免復發。

AML具有形態、免疫表型及細胞化學特性彼此不同之多種亞型。基於主要細胞類型闡述五種亞型，包含骨髓樣、骨髓樣-單核球、單核球、紅血球及巨核細胞。

緩解誘導率介於50%至85%範圍內。據報導，無長期疾病之存活率出現在20%至40%的患者中，且在經幹細胞移植治療之年輕患者中增加至40%至50%。

預後因子有助於確定治療方案及強度；通常向具有強消極預後特徵之患者給予療法之更強烈形式，此乃因人們認為潛在益處證明增加治療毒性係合理的。最重要的預後因子係白血病細胞核型；有利核型包含t(15；17)、t(8；21)及inv16(p13；q22)。消極因子包含年齡增加、骨髓發育不良前期、繼發性白血病、高WBC計數及不存在奧爾氏桿(Auer rod)。

初始療法嘗試誘導緩解且與ALL最不同之處在於AML因應較少藥物。基本誘導方案包含經5至7天藉由連續IV輸注或高劑量之阿糖胞苷(cytarabine)；在此時間期間經3天IV給予唐黴素(daunorubicin)或艾達黴素(idarubicin)。一些方案包含6-硫鳥嘌呤、依託泊苷(etoposide)、長春新鹼(vincristine)及潑尼松(prednisone)，但其貢獻尚不清楚。治療通常引起顯著骨髓阻抑伴有感染或出血；在骨髓恢復之前存在較長潛伏期。在此時間期間，精心的預防及支持性護理至關重要。

本發明尤其提供用於治療癌症之組合物及方法。在一態樣中，癌症係血液癌，包含(但不限於)白血病(例如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴樣白血病、慢性淋巴樣白血病及骨髓發育不良症候群)；及惡性淋巴組織增生性病況，包含淋巴瘤(例如多發性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)以及小細胞及大細胞濾泡性淋巴瘤)。

本發明亦提供用於抑制或減少表現CD123之細胞群增殖的組合物及方法。實例性方法包含使包括表現CD123之細胞之細胞群與表現CD123之細胞結合之本發明CD123 CART細胞接觸。在特定態樣中，本發明提供用於抑制或減少表現CD123之癌細胞群增殖的方法，該等方法包括使表現CD123之癌細胞群與表現CD123之細胞結合之本發明CD123 CART細胞接觸。在另一態樣中，本發明提供用於抑制或減少表現CD123之癌細胞群增殖的方法，該等方法包括使表現CD123之癌細胞群與表現CD123之細胞結合之本發明CD123 CART細胞接觸。在某些態樣中，在患有骨髓樣白血病或與表現CD123之細胞相關之另一癌症之個體或該等疾病之動物模型中，本發明CD123 CART細胞使細胞及/或癌細胞之量(quantity)、數量、量(amount)或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一態樣中，個體係人類。

本發明亦提供預防、治療及/或管控與表現CD123之細胞相關之病症(例如血液癌)的方法，該等方法包括向有需要之個體投與與表現CD123之細胞結合之本發明CD123 CART細胞。在一態樣中，個體係人類。與表現CD123之細胞相關之病症的非限制性實例包含自體免疫病症(例如狼瘡)、發炎病症(例如過敏及氣喘)及癌症(例如血液癌症)。

本發明亦提供預防、治療及/或管控與表現CD123之細胞相關之疾病的方法，該等方法包括向有需要之個體投與與表現CD123之細胞結合之本發明CD123 CART細胞。在一態樣中，個體係人類。與表現CD123之細胞相關之疾病的非限制性實例包含急性骨髓樣白血病(AML)、骨髓發育不良、B細胞急性淋巴樣白血病、T細胞急性淋巴樣白血病、多毛細胞白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、慢性骨髓樣白血病、霍奇金氏淋巴瘤及諸如此類。

本發明提供預防與表現CD123之細胞相關之癌症復發的方法，該等方法包括向有需要之個體投與與表現CD123之細胞結合之本發明CD123 CART細胞。在另一態樣中，方法包括向有需要之個體投與有效量之與表現CD123之細胞結合之本發明CD123 CART細胞與有效量之另一療法的組合。

在一態樣中，將CD123視為AML中之「癌症幹細胞」標記。因此，本發明CD123 CART細胞可預防AML之復發，或甚至治療幾乎為CD123陰性但具有表現CD123之「幹」細胞群之AML。

在一態樣中，本發明提供用於治療對CD19呈陰性且對CD123呈陽性之疾病或病症之組合物及方法。在另一態樣中，本發明提供用於治療其中部分腫瘤對CD19呈陰性且對CD123呈陽性之疾病或病症之組合物及方法。例如，包括本發明CAR之CART123細胞可用於治療已經受與CD19之表現量增多相關之疾病或病症的治療之個體，其中已經受增多量之CD19治療的個體展現與CD123之量增多相關之疾病或病症。

在一態樣中，B細胞急性淋巴樣白血病(ALL)係利用包括CAR之CART細胞連續靶向之實例。例如，使用CART19之治療有時可導致CD19陰性復發，該復發可使用本發明之CART123細胞來治療。另一選擇為，本發明包含利用包括抗-CD19 CAR及抗-CD123 CAR之CART細胞雙重靶向B-ALL。

骨髓清除

在一態樣中，本發明提供用於骨髓清除之組合物及方法。例如，在一態樣中，本發明提供用於消滅個體中現有骨髓之至少一部分之組合物及方法。本文闡述在某些情況下，本發明之包括CD123 CAR之CART123細胞消滅CD123陽性骨髓骨髓樣祖細胞。

在一態樣中，本發明提供骨髓清除之方法，其包括向需要骨髓清除之個體投與本發明之CD123 CAR T細胞。例如，本發明方法可用於消滅患有其中骨髓移植或骨髓重調理為有益治療策略之疾病或病症之個體的一些或所有現有骨髓。在一態樣中，在個體中在骨髓移植之前實施本發明之骨髓清除方法，其包括投與本文在別處闡述之CD123 CAR T細胞。因此，在一態樣中，本發明方法提供骨髓或幹細胞移植之前之細胞調理方案。在一態樣中，骨髓移植包括幹細胞移植。骨髓移植可包括自體或同種異體細胞之移植。

本發明提供治療疾病或病症之方法，其包括投與本發明CD123 CAR T細胞以消滅現有骨髓之至少一部分。該方法可用作治療其中骨髓移植有益之任何疾病或病症之治療方案的至少一部分。即，本發明方法可用於任何需要骨髓移植之個體中。在一態樣中，包括投與CD123 CAR T細胞之骨髓清除可用於治療AML。在某些態樣中，藉助本發明方法之骨髓清除可用於治療血液癌症、實體腫瘤、血液疾病、代謝病症、HIV、HTLV、溶酶體儲積症及免疫缺陷。

本文所揭示之組合物及方法可用於消滅現有骨髓之至少一部分以治療血液癌症，包含(但不限於)白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、ALL、AML、CLL、CML、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤及多發性骨髓瘤。

本文所揭示之組合物及方法可用於治療血液疾病，尤其包含(但不限於)骨髓發育不良、貧血、陣發性夜間血紅素尿症、再生不良性貧血、獲得性純紅血球貧血、戴-布二氏貧血(Diamon-Blackfan anemia)、范康尼貧血(Fanconi anemia)、血細胞減少症、血小板過低症、骨髓增生性病症、真性紅血球增多症、原發性紅血球增多症、骨髓纖維化、血紅素異常症、鐮形血球疾病、重度β地中海型貧血。

本文所揭示之組合物及方法可用於治療溶酶體儲積症，包含(但不限於)脂質沈積症、鞘脂質過多症、腦白質失養症、黏多糖症、甘油蛋白沈積症、嬰兒型神經元蠟樣質脂褐素沈積症、比-詹二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)、尼-皮二氏病(Niemann-Pick disease)、高雪氏症(Gaucher disease)、腎上腺腦白質失養症、異染性白質退化症、克拉伯病(Krabbe disease)、賀勒氏症候群(Hurler syndrome)、施艾氏症候群(Scheie syndrome)、賀勒-施艾氏症候群、韓特氏症候群(hunter syndrome)、聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo syndrome)、莫奎歐氏症候群(Morquio syndrome)、馬-拉二氏症候群(Maroteaux-Lamy syndrome)、史萊氏症候群(Sly syndrome)、黏脂質症、黏脂質症、門冬醯葡糖胺尿症、α-甘露糖苷儲積症及沃爾曼病(Wolman disease)。

本文所揭示之組合物及方法可用於治療免疫缺陷，包含(但不限於)T細胞缺陷、T細胞與B細胞組合型缺陷、吞噬細胞病症、免疫失調疾病、先天免疫缺陷、共濟失調微血管擴張症候群、狄喬治症候群(DiGeorge syndrome)、嚴重複合型免疫缺陷症(SCID)、偉-爾二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、柯士文症候群(Kostmann syndrome)、舒-戴二氏症候群(Shwachman-Diamond syndrome)、格裏塞利症候群(Griscelli syndrome)及NF-κ-B原發性調節子(NEMO)缺陷。

在一態樣中，本發明提供包括骨髓調理之治療癌症之方法，其中藉由本發明之CD123 CAR T細胞消滅個體骨髓之至少一部分。例如，在某些情況下，個體之骨髓包括可藉由CD123 CAR T細胞之活性靶向並消除之惡性前體細胞。在一態樣中，骨髓調理療法包括消滅天然骨髓後向個體投與骨髓或幹細胞移植物。在一態樣中，組合骨髓重調理療法與一或多種其他抗癌療法，該等其他抗癌療法包含(但不限於)抗腫瘤CAR療法、化學療法、放射及諸如此類。

在一態樣中，在輸注骨髓或幹細胞移植物之前可能需要消滅所投與之CD123 CART細胞。CD 123 CAR T細胞之消滅可利用任何適宜策略或治療來完成，包含(但不限於)使用自殺基因、利用RNA編碼之CAR或包含抗體之抗-T細胞模式或化學療法限制CAR持久性。

治療應用

在一態樣中，本發明係關於包括可操作地連接至啟動子之CD123 CAR之載體，其用於在哺乳動物T細胞中進行表現。在一態樣中，本發明提供表現CD123 CAR之重組T細胞，其用於治療表現CD123之腫瘤，其中表現CD123 CAR之重組T細胞稱為CD123 CART。在一態樣中，本發明之CD123 CART能夠使腫瘤細胞與在其表面上表現之本發明之至少一個CD123 CAR接觸，以使得CD123 CART因應抗原而活化且使CART靶向腫瘤細胞並抑制腫瘤之生長。

在一態樣中，本發明係關於抑制表現CD123之腫瘤細胞生長之方法，其包括使腫瘤細胞與本文所闡述之抗-CD123 CAR T細胞接觸，以使得CART因應抗原而活化且靶向癌細胞，其中抑制腫瘤之生長。

在另一態樣中，本發明係關於治療個體之癌症之方法。該方法包括向個體投與本發明之抗-CD123 CAR T細胞以治療個體之癌症。可藉由本發明抗-CD123 CAR T細胞治療之癌症之實例包含(但不限於)AML、骨髓發育不良症候群、ALL、多毛細胞白血病、前淋巴球性白血病、慢性骨髓樣白血病、霍奇金氏淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤及諸如此類。

本發明包含一種類型之細胞療法，其中T細胞經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)且將CAR T細胞輸注至有需要之接受者。所輸注細胞能夠殺死接受者之腫瘤細胞。在一些實施例中，CAR修飾之T細胞能夠在活體內複製，從而產生可引起持續腫瘤控制之長期持久性。在多個態樣中，在將T細胞投與患者後，投與患者之T細胞或其子代在患者中存留至少4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年或5年。

本發明亦包含一種類型之細胞療法，其中T細胞經例如活體外轉錄之RNA修飾以瞬時表現嵌合抗原受體(CAR)且將CAR T細胞輸注至有需要之接受者。所輸注細胞能夠殺死接受者之腫瘤細胞。因此，在多個態樣中，在將T細胞投與患者後，投與患者之T細胞存在小於1個月，例如3週、2週、1週。

不希望受限於任何具體理論，由CAR修飾之T細胞誘發之抗腫瘤免疫反應可為主動或被動免疫反應。在另一態樣中，CAR轉導之T細胞展現特異性促發炎細胞介素分泌及有效的因應表現CD123之人類癌細胞之細胞溶解活性，抵抗可溶性CD123抑制，介導旁觀者殺死並介導現有人類腫瘤之消退。例如，表現CD123之腫瘤之異質場內的無抗原腫瘤細胞可能易受CD123重定向T細胞間接破壞之影響，該間接破壞係先前抵抗毗鄰抗原陽性癌細胞作出之反應。

在一態樣中，本發明方法提供個體現有骨髓之至少一部分之消滅。如本文所闡述，在某些情況下，本發明之CD123 CAR T細胞消滅表現CD123之骨髓骨髓樣祖細胞。因此，本發明可用作在骨髓移植之前清除現有骨髓之至少一部分之細胞調理方案。該方法可用於治療其中骨髓移植有益或必需之任何疾病或病症，包含(但不限於)血液癌症、實體腫瘤、血液疾病、代謝病症、HIV、HTLV、溶酶體儲積症及免疫缺陷。

在一態樣中，本發明之全人類CAR修飾之T細胞可係用於哺乳動物之離體免疫及/或活體內療法之疫苗類型。在一態樣中，哺乳動物係人類。

關於離體免疫，在將細胞投與哺乳動物之前在活體外進行以下中之至少一者：i)擴增細胞，ii)將編碼CAR之核酸引入細胞，或iii)低溫保藏細胞。

離體程序為業內所熟知且更全面論述於下文中。簡言之，自哺乳動物(例如人類)分離細胞，且用表現本文所揭示CAR之載體進行遺傳修飾(例如活體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與CAR修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可係人類，且CAR修飾之細胞對於接受者而言可為自體。另一選擇為，細胞對於接受者而言可為同種異體、合成或異種的。

用於造血幹細胞及祖細胞之離體擴增程序闡述於美國專利第5,199,942號(以引用方式併入本文中)中，該程序可應用於本發明細胞。業內已知其他適宜方法，因此本發明並不限於細胞離體擴增之任何具體方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增包括：(1)自哺乳動物之外周血收穫物或骨髓外植體收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2)離體擴增該等細胞。除美國專利第5,199,942號中所闡述之細胞生長因子外，可使用其他因子(例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體)來培養及擴增細胞。

除根據離體免疫利用基於細胞之疫苗外，本發明亦提供用於活體內免疫來誘發針對患者中之抗原之免疫反應的組合物及方法。

通常，如本文所闡述活化並擴增之細胞可用於治療及預防在免疫妥協個體中產生之疾病。具體而言，本發明之CAR修飾之T細胞係用於治療與CD123之表現相關之疾病、病症及病況。在某些態樣中，本發明細胞係用於治療具有罹患與CD123之表現相關之疾病、病症及病況風險的患者。因此，本發明提供治療或預防與CD123之表現相關之疾病、病症及病況的方法，其包括向有需要之個體投與治療有效量之本發明之CAR修飾之T細胞。與CD123之表現相關之實例疾病、病症及病況包含(但不限於)AML、骨髓發育不良症候群、ALL、多毛細胞白血病、前淋巴球性白血病、慢性骨髓樣白血病、霍奇金氏淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤及諸如此類。

本發明之CAR修飾之T細胞可單獨投與或作為醫藥組合物與稀釋劑及/或其他組份(例如IL-2或其他細胞介素或細胞群)組合投與。

本發明亦提供用於抑制或減輕表現CD123之細胞群增殖的方法，該等方法包括使包括表現CD123之細胞之細胞群與本文所闡述與表現CD123之細胞結合之CD123CART細胞接觸。在特定態樣中，本發明提供用於抑制或減少表現CD123之癌細胞群增殖的方法，該等方法包括使表現CD123之癌細胞群與本文所闡述與表現CD123之細胞結合之CD123CART細胞接觸。在一態樣中，本發明提供用於抑制或減少表現CD123之癌細胞群增殖的方法，該等方法包括使表現CD123之癌細胞群與本文所闡述與表現CD123之細胞結合之CD123CART細胞接觸。在某些態樣中，在患有與表現CD123之細胞相關之癌症之個體或該疾病之動物模型中，本發明CD123CART細胞使細胞及/或癌細胞之量(quantity)、數量、量(amount)或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一態樣中，個體係人類。

本發明亦提供用於預防、治療及/或管控與表現CD123之細胞相關之疾病(尤其例如AML、骨髓發育不良症候群、ALL、多毛細胞白血病、前淋巴球性白血病、慢性骨髓樣白血病、霍奇金氏淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤)的方法，該等方法包括向有需要之個體投與本文所闡述與表現CD123之細胞結合之CD123CART細胞。在一態樣中，個體係人類。

本發明提供預防與表現CD123之細胞相關之癌症復發的方法，該等方法包括向有需要之個體投與本文所闡述與表現CD123之細胞結合之CD123CART細胞。在一態樣中，方法包括向有需要之個體投與有效量之本文所闡述與表現CD123之細胞結合之CD123CART細胞與有效量之另一療法的組合。在一態樣中，個體在CD19療法(例如使用CD19 CART之療法)後遭受復發或易受其影響。

組合療法

本文所闡述之表現CAR之細胞可與其他已知藥劑及療法組合使用。如本文所使用，「組合」投與意指在個體患病期間將兩種(或更多種)不同治療遞送至個體，例如在個體已經診斷患有病症之後且在病症治癒或消除之前或治療已出於其他原因停止之前遞送兩種或更多種治療。在一些實施例中，一種治療之遞送仍在第二種治療開始遞送之前進行，以使得存在投與重疊。此在本文中有時稱為「同步」或「同時遞送」。在其他實施例中，結束一種治療之遞送，然後開始第二種治療之遞送。在任一情形之一些實施例中，治療因組合投與而更有效。例如，第二種治療更有效，例如使用較少第二種治療即可觀察到等效效應，或第二種治療在較大程度上減輕症狀，該程度大於在不存在第一種治療下投與第二種治療時觀察到之程度或使用第一種治療觀察到之類似情況。在一些實施例中，遞送應使症狀減輕或使與病症相關之其他參數大於在另一者不存在下使用所遞送治療觀察到之參數。兩種治療之效應可為部分加和、完全加和或大於加和。遞送可使在遞送第二種治療時仍可檢測所遞送第一種治療之效應。

本文所闡述之表現CAR之細胞與至少一種其他治療劑可以同一或單獨組合物同步或依序投與。對於依序投與，可首先投與本文所闡述之表現CAR之細胞，且其次可投與其他藥劑，或可顛倒投與順序。

在其他態樣中，本文所闡述之表現CAR之細胞可用於治療方案與以下各項之組合中：手術、化學療法、放射、免疫阻抑劑(例如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺蝶呤、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫清除劑(例如CAMPATH、抗-CD3抗體或其他抗體療法)、細胞毒素、氟達拉濱、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞介素及輻照。

在一實施例中，本文所闡述之表現CAR之細胞可與化學治療劑組合使用。認為用於組合療法中之一般化學治療劑包含阿那曲唑(anastrozole，Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide，Casodex®)、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate，Blenoxane®)、白消安(busulfan，Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine，Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(carboplatin，Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine，BiCNU®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、順鉑(cisplatin，Platinol®)、克拉屈濱(cladribine，Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside，Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴(dacarbazine，DTIC-Dome®)、更生黴素(dactinomycin，放線菌素D(Actinomycin D)、放線菌素D(Cosmegan))、鹽酸唐黴素(Cerubidine®)、檸檬酸唐黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松(dexamethasone)、多西他賽(docetaxel，Taxotere®)、鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride，Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(flutamide，Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(Gemcitabine，雙氟去氧胞苷)、羥基脲(Hydrea®)、艾達黴素(Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康(irinotecan，Camptosar®)、L-門冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲硫四氫葉酸鈣、美法侖(melphalan，Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺蝶呤(Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone，Novantrone®)、滅髓瘤(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel，Taxol®)、菲尼克斯(phoenix，釔90/MX-DTPA)、噴司他丁(pentostatin)、聚苯丙生20(polifeprosan 20)與卡莫司汀植入物(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate，Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide，Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine，Tirazone®)、注射用鹽酸托泊替康(topotecan hydrochloride for injection，Hycamptin®)、長春鹼(vinblastine， Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞濱(vinorelbine，Navelbine®)。

實例性化學治療劑包含蒽環類抗生素(anthracycline)、抗代謝物及靶抗體(例如抗-CD33抗體，例如吉妥單抗(gemtuzumab))。

實例性抗代謝物包含(但不限於)葉酸拮抗劑(在本文中亦稱為抗葉酸藥)、嘧啶類似物、嘌呤相似物及三磷酸腺苷去胺酶抑制劑)：甲胺蝶呤(Rheumatrex®、Trexall®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®、Fluoroplex®)、氟尿苷(FUDF®)、阿糖胞苷(Cytosar-U®、達拉濱PFS(Tarabine PFS))、6-巰基嘌呤(Puri-Nethol®))、6-硫鳥嘌呤(Thioguanine Tabloid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、噴司他丁(Nipent®)、培美曲塞(pemetrexed，Alimta®)、雷替曲塞(raltitrexed，Tomudex®)、克拉屈濱(Leustatin®)、氯法拉濱(clofarabine，Clofarex®、Clolar®)、巰基嘌呤(Puri-Nethol®)、卡培他濱(Xeloda®)、奈拉濱(nelarabine，Arranon®)、阿紮胞苷(azacitidine，Vidaza®)及吉西他濱(Gemzar®)。較佳抗代謝物包含例如5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®、Fluoroplex®)、氟尿苷(FUDF®)、卡培他濱(Xeloda®)、培美曲塞(Alimta®)、雷替曲塞(Tomudex®)及吉西他濱(Gemzar®)。

實例性蒽環類抗生素包含(但不限於)唐黴素(Cerubidine®、Rubidomycin®)、多柔比星(Adriamycin®)、泛艾黴素(epirubicin，Ellence®)、艾達黴素(Idamycin®)、米托蒽醌(Novantrone®)、戊柔比星(valrubicin，Valstar®)。較佳蒽環類抗生素包含唐黴素(Cerubidine®、Rubidomycin®)及多柔比星(Adriamycin®)。

亦可使用抑制鈣依賴性鈣調神經磷酸酶(環孢素及FK506)或抑制對生長因子誘導之信號傳導至關重要之p70S6激酶之藥物(雷帕黴素)(Liu等人，Cell 66：807-815,1991；Henderson等人，Immun.73：316- 321,1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5：763-773,1993)。在又一態樣中，本發明之細胞組合物可利用化學治療劑(例如氟達拉濱)、外部光束放射療法(XRT)、環磷醯胺及/或抗體(例如OKT3或CAMPATH)結合(例如之前、同步或之後)骨髓移植、T細胞清除療法投與患者。在一態樣中，本發明之細胞組合物係在B細胞清除療法(例如與CD20反應之藥劑，例如瑞圖宣(Rituxan))後進行投與。例如，在一實施例中，個體可經受使用高劑量化學療法然後外周血幹細胞移植之標準治療。在某些實施例中，移植後，對個體輸注本發明之擴增免疫細胞。在其他實施例中，擴增細胞係在手術之前或之後投與。

在一實施例中，可向個體投與減輕或改善與投與表現CAR之細胞相關之副作用的藥劑。與投與表現CAR之細胞相關之副作用包含(但不限於)CRS及嗜血性淋巴組織球血症(HLH)(亦稱為巨噬細胞活化症候群(MAS))。CRS之症狀包含高熱、噁心、瞬時低血壓、低氧及諸如此類。因此，本文所闡述之方法可包括向個體投與本文所闡述之表現CAR之細胞且進一步投與管控增多量之可溶性因子的藥劑，從而使用表現CAR之細胞治療。在一實施例中，在個體中增多之可溶性因子係以下中之一或多者：IFN-γ、TNFα、IL-2及IL-6。因此，所投與治療此副作用之藥劑可係中和該等可溶性因子中之一或多者之藥劑。該等藥劑包含(但不限於)類固醇、TNFα抑制劑及IL-6抑制劑。TNFα抑制劑之實例係依那西普(entanercept)。IL-6抑制劑之實例係托西莫單抗(Tocilizumab，toc)。

在一實施例中，可向個體投與增強表現CAR之細胞活性之藥劑。例如，在一實施例中，藥劑可係抑制抑制分子之藥劑。在一些實施例中，抑制分子(例如程式化死亡1(PD1))可降低表現CAR之細胞引起免疫效應子反應之能力。抑制分子之實例包含PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及 TGFR β。抑制分子之抑制(例如藉由抑制DNA、RNA或蛋白質量)可最佳化表現CAR之細胞性能。在實施例中，抑制核酸(例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)可用於抑制抑制分子在表現CAR之細胞中之表現。在實施例中，抑制劑為shRNA。在實施例中，抑制分子在表現CAR之細胞內被抑制。在該等實施例中，抑制抑制分子表現之dsRNA分子連接至編碼CAR之組份(例如所有組份)之核酸。在一實施例中，抑制信號之抑制劑可為例如與抑制分子結合之抗體或抗體片段。例如，藥劑可為與PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4結合之抗體或抗體片段(例如伊匹單抗(亦稱為MDX-010及MDX-101，CAS編號477202-00-9且以Yervoy®出售；Bristol-Myers Squibb；曲美木單抗(Tremelimumab，購自Pfizer之IgG2單株抗體，之前稱為替西莫單抗(ticilimumab)，CP-675,206)。

PD1係抑制CD28家族受體之成員，該家族亦包含CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1在活化B細胞、T細胞及骨髓樣細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol 8：765-75)。已顯示，兩種針對PD1、PD-L1及PD-L2之配體在與PD1結合後下調T細胞活化(Freeman等人2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人2002Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1在人類癌症中較為豐富(Dong等人2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10：5094)。免疫阻抑可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。PD1、PD-L1及PD-L2之抗體、抗體片段及其他抑制劑可於業內獲得且可與本文所闡述之CD123 CAR組合使用。例如，尼沃單抗(nivolumab，亦稱為BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)係特異性阻斷PD-1之全人類IgG4單株抗體。與PD-1特異性結合之尼沃單抗(純系5C4)及其他人類單株抗體揭示於US 8,008,449及 WO2006/121168中。易普利姆瑪(Pidilizumab，CT-011；Cure Tech)係與PD-1結合之人類化IgG1k單株抗體。易普利姆瑪及其他人類化抗-PD1單株抗體揭示於WO2009/101611中。拉波裏單抗(Lambrolizumab，亦稱為MK03475；Merck)係與PD1結合之人類化IgG4單株抗體。拉波裏單抗及其他人類化抗-PD1抗體揭示於US 8,354,509及WO2009/114335中。MDPL3280A(Genentech/Roche)係與PD-L1結合之人類Fc最佳化之IgG1單株抗體。針對PD-L1之MDPL3280A及其他人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。其他抗-PD-L1結合劑包含YW243.55.S70(重鏈及輕鏈可變區顯示於WO2010/077634中之SEQ ID NO 20及21中)及MDX-1 105(亦稱為BMS-936559，及例如WO2007/005874中所揭示之抗-PD-L1結合劑)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827及WO2011/066342中所揭示)係阻斷PD1與B7-H1之間之相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受體。其他抗-PD1抗體包含AMP 514(Amplimmune)，尤其例如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中所揭示之抗-PD1抗體。增強表現CAR之細胞活性之藥劑可係例如包括第一結構域及第二結構域之融合蛋白，其中第一結構域係抑制分子或其片段，且第二結構域係與陽性信號相關之多肽，例如與陽性信號相關之多肽為CD28、ICOS及其片段(例如CD28及/或ICOS之細胞內信號傳導結構域)在一實施例中，融合蛋白係由表現CAR之相同細胞來表現。在另一實施例中，融合蛋白係由不表現抗-CD123CD123 CAR之細胞(例如T細胞)來表現。

醫藥組合物及治療

本發明之醫藥組合物可包括如表現CAR之細胞(例如複數個如本文所闡述之表現CAR之細胞)與一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。該等組合物可包括緩衝液，例如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及諸如此類；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，例如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，例如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。在一態樣中，本發明組合物經調配用於靜脈內投與。

本發明之醫藥組合物可以適用於欲治療(或預防)疾病之方式來投與。投與之量及頻率將由諸如患者之病況以及患者疾病之類型及嚴重程度等要素來確定，但適宜劑量可藉由臨床試驗來確定。

在一實施例中，醫藥組合物實質上不含(例如無可檢測量)之例如選自由以下組成之群之污染物：內毒素、微漿菌(mycoplasma)、複製勝任慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘餘抗-CD3/抗-CD28包覆之珠粒、小鼠抗體、聚人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組份、載體封裝細胞或質體組份、細菌及真菌。在一實施例中，細菌係至少一種選自由以下組成之群之細菌：鹼性糞便菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。

當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投與之本發明組合物之精確量可由醫師根據患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病況之個體差異來確定。通常可陳述，包括本文所闡述T細胞之醫藥組合物可以10⁴至10⁹個細胞/kg體重、在一些情況下10⁵至10⁶個細胞/kg體重(包含彼等範圍內之所有整數值)之劑量來投與。T細胞組合物亦可以該等劑量多次投與。該等細胞可藉由利用免疫療法中通常已知之輸注技術來投與(例如，參見Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。

在某些態樣中，可期望向個體投與活化T細胞，且然後隨後抽取血液(或實施血球分離)，根據本發明活化來自其之T細胞，且向患者再輸注該等活化及擴增之T細胞。此過程可每隔數週實施多次。在某些態樣中，T細胞可自10cc至400cc之血液抽取物活化。在某些態樣中，T細胞係自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc之血液抽取物活化。

個別組合物之投與可以任何方便方式實施，包含氣溶膠吸入、注射、攝取、輸液、植入或移植。本文所闡述之組合物可以下列方式投與患者：經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、鼻內、髓內、肌內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內。在一態樣中，本發明之T細胞組合物係藉由皮內或皮下注射投與患者。在另一態樣中，本發明之T細胞組合物係藉由i.v.注射來投與。可將T細胞組合物直接注射至腫瘤、淋巴結或感染位點中。

在具體實例性態樣中，可使個體經受白血球分離，其中以離體方式收集、富集或清除白血球以選擇及/或分離所關注細胞(例如T細胞)。該等T細胞分離物可藉由業內已知之方法來擴增並處理以使得可引入本發明之一或多個CAR構築物，由此產生本發明之CAR T細胞。隨後可使有需要之個體經受使用高劑量化學療法然後外周血幹細胞移植之標準治療。在某些態樣中，移植後或同時，對個體輸注本發明之擴增CAR T細胞。在其他態樣中，擴增細胞係在手術之前或之後投與。

欲投與患者之上述治療之劑量將隨所治療病況之精確性質及治療之接受者而變化。用於人類投與之劑量之放大可根據業內接受之實踐來實施。

實驗實例

藉由參考以下實驗實例進一步詳細闡述本發明。除非另有說明，否則該等實例係僅出於闡釋目的而提供，且並不意欲具有限制性。因此，本發明決不應理解為限制以下實例，而應理解為涵蓋因本文所提供之教示而變得明瞭之任何及所有變化形式。

實例1：用於AML之抗-CD123嵌合抗原受體工程化T細胞

大多數患有急性骨髓樣白血病(AML)之患者使用標準療法不可治癒。不希望受限於任何具體理論，人們認為成功的CART細胞療法取決於適宜的細胞-表面分子。然而迄今為止，尚未發現AML特異性表面抗原，此乃因在未成熟骨髓樣細胞與AML母細胞之間共用許多抗原。

CD123(IL-3受體之跨膜α鏈)在大部分初級AML樣本上表現(Jordan,2010,Science Translational Medicine,2：31ps21；Jin等人，2009,Cell Stem Cell,5：31-42；Munoz等人，2001,Haematologica,86：1261-1269)，且CD123高表現與較差預後相關(Testa等人，2002,Blood,100：2980-8)。此外，可藉由使用抗-CD123抗體治療來消除免疫缺陷小鼠中之AML幹細胞(Yalcintepe等人，2006,Blood,108：3530-7；Jin等人，2009,Cell Stem Cell,5：31-42)。該等觀察表明CD123作為CAR T細胞療法之可能靶。然而，CD123亦在以下細胞上表現：骨髓樣祖細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、肥大細胞、嗜鹼性球、巨核細胞及一些B細胞。

本文展示，在人類化免疫系統小鼠中，人類CD123重定向T細胞(CART123)消滅初級AML及正常骨髓二者。不希望受限於具體理論，由於在人類AML之前可能在正常或「白血病前期」造血幹細胞中進行純系演化(Weissman,2005,JAMA,294：1359-66；Miyamoto等人， 2000,PNAS,97：7521-6；Hong等人，2008,Science,319：336-9；Nilsson等人，2002,Blood,100：259-67；Welch等人，2012,Cell,150：264-78；Walter等人，2012,N Engl J Med,366：1090-8)，本文所呈現之數據支持CART123作為治療AML之可行策略及作為骨髓移植前之細胞調理方案。

材料及方法 T細胞轉導

自白血球分離封裝對正常供體T細胞進行陽性選擇，與抗-CD3/CD28珠粒(Invitrogen)及IL-2(Chiron)一起進行活體外擴增，且使用來自轉染有pELNS抗-CD123-41BB-CD3ζ質體DNA之293T細胞之慢病毒上清液轉導。

細胞

MOLM14細胞系係自ATCC獲得且維持在補充有10%胎牛血清、青黴素及鏈黴素之RPMI培養基(R10)中。為產生生物發光模型，使用luc2-gfp-螢光素酶慢病毒構築物轉導MOLM14細胞且分選兩次至純度較高。

初級AML細胞係自Pennsylvania大學之幹細胞與異種移植核心機構或直接自IRB批準方案之患者血液獲得。將細胞冷凍於90%胎牛血清及10% DMSO中直至需要使用。對於所有功能研究，在分析之前將AML細胞解凍至少12小時且以1×10⁶/ml於R10中靜置過夜。對於所有異種移植研究，將初級細胞解凍，在PBS中洗滌一次，且直接注射至小鼠中。

流式細胞術

自Biolegend、Ebioscience或Becton Dickinson購得抗人類抗體。自活體外培養物或自動物分離細胞，在補充有2%胎牛血清之PBS中洗滌一次，且在阻斷Fc受體後在冰上染色。對於量化，根據製造商之說明書使用Invitrogen Countbright珠粒。在所有分析物中，基於正向對側散射特性對所關注之群設門，然後單重態設門，且利用Live Dead Aqua(Invitrogen)對活細胞設門。如先前所闡述(Betts及Koup，2004,Methods Cell Bio,75：497-512)實施CD107a脫粒分析及細胞內細胞介素產生分析。在四雷射Fortessa(Becton-Dickinson)上實施流式細胞術。

增殖

洗滌T細胞且將其以高達1×10⁷/ml重懸於100μl PBS中，在37℃下用最終濃度為1.25μM之100μl 2.5μM CFSE(Life Sciences)染色5分鐘。用冷R10驟冷反應物且將細胞洗滌3次。以1：1比率將T細胞與靶細胞一起培育。

殺死分析

如先前所闡述(Cao等人，2010,Cytometry A,77：534-45)實施殺死分析。簡言之，以指示比率將CFSE標記之靶與效應子T細胞一起培育16小時。然後收穫細胞，添加Countbright珠粒及7-AAD，且在Accuri C6(Becton-Dickinson)上分析。

細胞介素分泌

在含有10%人類血清之X-Vivo培養基中以1：1比率將效應子與靶細胞一起培育24小時。根據製造商之說明書(Invitrogen)藉由30叢陣列分析上清液。

RT-PCR

對初級細胞進行細胞分選後，提取RNA(Qiagen)，然後利用IL3RA(Life Sciences)之引子進行逆轉錄及RTqPCR。

小鼠

NOD-SCID-γ-鏈^-/-(NSG)小鼠或NSG-S(針對人類IL-3、SCF及GM-CSF轉基因之NSG小鼠)最初係自Jackson Lab獲得。

活體內模型

具體活體內實驗之細節闡述於本文別處。以存於200μl PBS中之5×10⁶/ml之濃度將MOLM14 AML細胞系注射至尾靜脈中，然後如先前所闡述在Xenogen Spectra相機上進行生物發光成像。以存於200μl PBS中之25-50×10⁶/ml之濃度注射初級AML母細胞。以存於200μl PBS中之5×10⁶/ml之濃度將T細胞注射至尾靜脈中。根據方案在垂死時或在罹患早期後肢麻痺後殺死小鼠。

藉由將胎肝CD34⁺細胞注射至新生NSG小鼠中來產生人類化免疫系統(HIS)小鼠。在注射之後5-6週且在使小鼠進行下游實驗之前確認人類造血作用之植入。

甲基纖維素群落

根據製造商之說明書將分選之CD34⁺成人人類骨髓或臍帶血重懸於Methocult Optimum(Stemcell Technologies)中，且平鋪於6孔板中保持14天。在一些實驗中，首先將CD34⁺細胞與CART123或對照T細胞一起培養4小時。14天後，在倒置顯微鏡(Zeiss，4X)上讀取群落，然後在R10培養基中將群落溶解過夜且收穫單細胞懸浮液用於流式細胞術。

結果 人類AML表現CD123且可使用抗-CD123重定向T細胞(CART123)來靶向

設計治療性嵌合抗原受體T細胞(CAR T)之初始步驟係選擇在細胞表面上普遍且均一表現之適宜靶。比較一組初級AML樣本中未成熟骨髓樣標記CD33(圖1A，圓形)、CD123(圖1A，三角形)及CD34(圖1A，正方形)之表現。與先前報導一致，發現CD123在大部分AML中以較高量表現且表現比CD33或CD34更頻繁(Jordan,2010,Sci Transl Med,31：31ps21；Munoz等人，2001,Haematologica,86：1261-1269；Testa等人，2002,Blood,100：2980-8)(圖1A)。少數AML樣品藉助嚴格繪製之門似乎為CD123陰性但展示高於殘餘正常淋巴球之CD123中值螢光強度，此表明存在難以由抗體檢測到之低量CD123表現；此由分選CD123暗群及亮群之RTqPCR確認(圖1B及圖1C)。

此外，CD123^暗及CD123^亮母細胞二者皆可在半固體培養基中形成群落(圖5)。簡言之，將初級AML母細胞分選成CD123^暗及CD123^亮群且平鋪在補充有人類細胞介素之甲基纖維素(Methocult Optimum,Stemcell Technologies)中。14天後，將源自分選細胞之群落溶解且染色用於表面表現CD45、CD34、CD38及CD123。結果顯示於圖5中。儘管與先前公開案相比CD123並未在推定的白血病幹細胞群上選擇性表現(圖6)，但CD123在母細胞上之一致表現表明大多數AML將易受CART123影響。

為評估經由CAR技術靶向CD123之可行性，將呈4種不同組態之針對抗-CD123抗體之單鏈可變片段與CD3ζ鏈及4-1BB共刺激分子一起選殖至慢病毒CAR表現載體中，且基於因應CD123⁺靶之CD123 CAR轉導T細胞(CART123細胞，亦稱為CD123 CART)之細胞介素產生的量及品質來選擇最佳構築物。兩種不同抗-CD123抗體(32716及26292)分別揭示於SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：101中。具體而言，基於來自該兩種不同抗體之與4-1BB信號傳導分子及CD3ζ鏈一起選殖至慢病毒載體中之scFv序列研發出8種不同的CAR-123構築物，如圖7中所顯示。該8種CAR在圖7中有所提及且通篇稱為純系72(或「1172」)、純系73(或「1173」)、純系74(或「1174」)、純系75(或「1175」)、純系76(或「1176」)、純系77(或「1177」)及純系78(或「1178」)。8種不同CAR-123構築物之核苷酸及胺基酸序列提供於下文及SEQ ID NO：107-122中。轉導至初級T細胞中後，基於其靶向表現CD123之AML細胞系MOLM14之能力來選擇最佳構築物(圖8)。如圖8中所顯示，在左圖中，使用不同的CD123 CAR構築物轉導初級人類T細胞且在抗- CD107a存在下將其暴露於MOLM14(表現CD123之人類AML細胞系)下。2小時後，針對CD3對細胞進行染色且藉由流式細胞術分析脫粒作為靶識別及細胞毒性潛能之量度。在右圖中，將轉導有不同CD123 CAR構築物之初級人類T細胞與經照射MOLM14細胞一起培養48小時，然後抽吸培養物上清液用於多重細胞介素分析。

然後展示，控制惡性腫瘤所需要之穩健效應子功能(包含脫粒、細胞介素產生、增殖及細胞毒性)係以CD123特異性方式出現，從而建立CART123作為AML治療劑之潛能(圖1D-圖1G)。例如，利用脫粒及細胞介素產生分析二者展示，工程化CART123 T細胞特異性靶向CD123⁺細胞。重要的是，CART123 T細胞對初級AML之反應比對正常骨髓穩健的多(圖1D)。在抗-CD107a存在下CART123細胞於培養基、CD123-細胞系、正常骨髓(NBM)、初級AML樣本或CD123+細胞系下之暴露揭露CAR+細胞之特異性脫粒(與CAR-細胞相比，左側)，且對AML之脫粒比對NBM更穩健(右側)。此外，CART123細胞產生多個效應子以及自動調節細胞介素及趨化因子，從而強調其協調產生性免疫反應之能力(圖1H)。

CART123細胞消滅活體內AML且顯示穩健的喚醒反應

為測試CART123細胞消滅活體內AML之能力，用CART123、對照(表現抗-CD19 CAR之T細胞，稱為CART19)治療植入有CD123⁺ AML細胞系MOLM14之免疫缺陷小鼠或不使用T細胞治療。觀察到，在此動物模型中CART123治療使得長期存活。簡言之，向免疫缺陷NOD/SCID γ鏈^-/-(NSG)小鼠植入MOLM14，然後投與一次CART123細胞或對照CART19細胞(圖2A)。在第0天對免疫缺陷小鼠進行亞致死照射(200 cGy)，然後在第1天經由尾靜脈注射1×10⁶個GFP/螢光素酶+ MOLM14。在第6天實施生物發光成像(BLI)以量化植入組及隨機治療組。在第7天時IV注射媒劑、CART19細胞(1×10⁶)或CART123(1×10⁶) 細胞，且對小鼠實施連續BLI。使用BLI輻射之量化作為AML負荷之替代量度。與對照小鼠相比，接受CART123之小鼠之腫瘤負荷在1週內開始降低，且在2週內消滅且僅極少數在後期復發(圖2B及圖2C)，從而使得大多數小鼠長期存活(圖2D)。簡言之，圖2D顯示具有MOLM14異種移植小鼠之存活率分析，其展示與經媒劑治療之小鼠(圓形)及經CART19治療之小鼠(三角形)相比，經CART123治療之小鼠(正方形)大量存活。經CART123 T細胞治療之小鼠之損耗主要係由於顏面骨中BLI可檢測之AML進展以及隨後厭食症及體重損失。匯總數據係來自4個實驗。使用表現螢光素酶之MOLM14細胞可對腫瘤負荷進行連續生物發光評價，從而展示CART123細胞以等效動力學消滅腫瘤之能力而與腫瘤負荷無關。圖2C係來自3個MOLM14異種移植實驗之BLI匯總數據，其展示經媒劑治療之小鼠(圓形)及經CART19治療之小鼠(三角形)中的快速白血病進展，而在經CART123治療之小鼠(正方形)中觀察到AML消滅。繪示每一時間點下之平均輻射與平均值之標準偏差(須)。

儘管白血病之初始治療成功，但許多患者仍經歷復發。為對此進行建模，檢查MOLM14「治癒」之小鼠排斥第二次輸注相同白血病之能力(圖2E)。簡言之，在第-8天對免疫缺陷小鼠進行亞致死照射(200 cGy)，然後在第-7天經由尾靜脈注射PBS(頂部列)或1×10⁶個gfp/螢光素酶⁺ MOLM14(底部列)。在第-1天實施生物發光成像(BLI)以量化植入組及隨機治療組。在第0天IV注射CART123細胞(1×10⁶)，且對小鼠實施連續BLI直至AML消滅(此出現在所有小鼠中)。使用BLI輻射之量化作為AML負荷之替代量度。對AML消滅進行基於BLI之評價約2週後，使用1×10⁶ gfp/螢光素酶⁺ MOLM14激發(頂部列)或再激發(底部列)所有小鼠。然後每週對小鼠進行采血用於分析T細胞數且實施BLI用於分析AML負荷。

隨後，先前已清除MOLM14之動物以及先前已接受不含MOLM14之CART123細胞之彼等能夠排斥白血病再激發且具有相似動力學(圖2F)。先前暴露於白血病下之小鼠顯示，在白血病再激發前較高比例之中心記憶T細胞及較低比例效應子記憶T細胞的趨勢(圖9)。儘管先前經歷白血病之組與白血病未治療組相比基線循環CAR⁺ T細胞較少，但(再)激發後，在前一組中觀察到CAR⁺ T細胞之更顯著增加，此與喚醒反應一致(圖2G)。簡言之，在注射MOLM14細胞之前或之後7天對小鼠進行采血。CART123細胞係活的單重態人類CD45⁺ CD3⁺ CAR⁺細胞且使用計數珠粒來量化。重要的是，在具有較差初始CART123反應之偶然動物中存在瞬時腫瘤逃脫(圖2F)，然後CART123細胞增加及隨後AML消除則延遲(圖2H)。

初級AML患者母細胞易受CART123細胞影響

腫瘤細胞系模型之重要缺點在於其重演初級惡性腫瘤之真實生物異質性。AML尤其係純系上異質之疾病(Walter等人，2012,N Engl J Med,366：1090-8)，且因此單一抗原之有效的CART細胞介導之靶向可使得抗原損失復發，如已在經CART19細胞治療之B細胞急性淋巴母細胞性白血病患者中出現(Grupp及Kalos，2013,N Engl J Med,368：1509-18)。為確認CART123細胞在初級AML治療中之有效性，使用最近闡述之促進AML植入之模型(Wunderlich等人，2010,Leukemia 1785-8)。向組成型表現人類幹細胞因子、GM-CSF及IL-3之NOD-SCID-IL2Rγ^-/-小鼠注射患者樣本(圖10)且在約2週時植入。然後用CART123或對照T細胞治療該等小鼠，且進行AML消滅及存活率隨訪(圖3A)。簡言之，在D-1時對NSGS小鼠進行亞致死照射，且在D0時經由尾靜脈注射5-10×10⁶個初級AML母細胞。藉由檢測活的小鼠外周血中之CD45^陰性人類CD45^暗/陽性CD123^陽性細胞來確認植入，其通常發生在約D14時。第二天，向小鼠注射解凍的CART123細胞或對照T細胞 (在一些實驗中注射CART19或未經轉導之T細胞)。然後每週對小鼠采血且分析AML負荷。

循環母細胞在CART123接受者中消滅但在對照中未消滅(圖3B)，從而在治療組中產生存活優點，儘管早期損耗速率相當(圖3C)。在圖3B中應注意，殘餘CD45^亮T細胞在此時間點下在一些CART123小鼠中很難檢測到，此與對在因應並清除AML後PBT細胞之快速增多及減少之觀察有關(如圖2)。重要的是，CART123細胞甚至針對CD123^暗白血病亦有效，此可能與CD123^暗母細胞上CD123隨時間之上調有關(圖3D)。母細胞CD123表現量與如藉由Ki67染色所顯示之增生能力呈負相關(圖3E)。不希望受限於任何具體理論，綜合考慮CD123^暗母細胞使活體外及活體內CD123上調之展示，此可指示隨著CD123^亮母細胞被消除，其經CD123^暗母細胞替代，然後該等CD123^暗母細胞變成CART123細胞之靶。

CART123細胞誘導骨髓清除

在已建立CART123細胞可靶向且消滅AML的情況下，業內尋求評估其對正常造血作用之效應。已注意到CD123在一些正常造血細胞(包含骨髓樣祖細胞、樹突細胞、一些B細胞及巨核細胞)上之表現，且IL-3信號傳導在骨髓樣分化中起重要作用(Pang等人，2011,PNAS,108：20012-20017)。首先，確認CD123在大多數譜系陰性造血祖細胞上表現(圖4A及圖11)。簡言之，針對活的單重態譜系陰性CD45^暗細胞設門後，針對CD123對來自4種正常供體之骨髓進行染色，且利用CD34、CD38、CD45RA及CD90鑑別所指示之祖細胞亞群(設門策略顯示於圖11中)。CD123設門係基於正常淋巴球且係使用螢光扣除對照(FMO)特性來確認。結果顯示於圖4A中。

然後，自正常BM前體分選CD123^-及CD123⁺，並發現兩群皆能夠產生造血群落且該等群落具有等效的CD123表現，從而展示CD123表現係動態而非確定性過程(圖4B)。簡言之，自正常BM分選CD123^暗或CD123^中等CD34⁺細胞(頂圖)，且使其在甲基纖維素中14天培養期間分化。分選培養之群展現相似CD123表現及無法區分之能力以形成骨髓樣或紅血球群落。

此外，臍帶血CD34⁺細胞於CART123細胞下之短期暴露使得骨髓樣群落形成顯著減少，從而展示CART123細胞對骨髓樣祖細胞功能之有效效應(圖4C)。簡言之，以1：10 T：E比率將源自臍帶血之CD34⁺細胞與CART123或未轉導T細胞一起培育4小時，然後在補充有重組人類細胞介素之甲基纖維素培養基中培養14天。藉由人工群落計數或利用Countbright珠粒藉由流式細胞術精確量化所指示之細胞群來評價造血功能。

在針對AML之CART123細胞之任何潛在的將來臨床試驗中，患者可能將接受最新誘導化學療法。為研究化學療法後之骨髓恢復對骨髓祖細胞中CD123表現之效應，使用5-氟尿嘧啶治療植入人類骨髓之小鼠。發現在化學療法後，恢復與循環細胞之增加相關(如預期)，且CD123表現在循環細胞中較高(圖4D)。簡言之，使用5-氟尿嘧啶或媒劑治療先前植入人類CD34⁺細胞之小鼠。14天後，自該等小鼠收穫BM，且分析細胞內增殖標記Ki67及CD123，以針對活的譜系陰性人類細胞設門。

最後，使用CART123細胞或對照未轉導T細胞治療先前植入人類CD34⁺細胞之小鼠(圖4E)。簡言之，向NSG小鼠植入人類胎肝CD34+細胞，且於6-8週後采血以確認植入。在第0天，使小鼠接受CART123、對照未轉導T細胞或媒劑。每週外周血分析細胞數，然後在第28天收穫BM用於分析殘餘人類造血作用。如預期，自在正常循環B細胞及骨髓樣細胞上CD123表現之基線量(圖12)，觀察到該等細胞在外周血中逐漸減少(圖10F)。於活體內暴露1個月後，接受 CART123細胞之小鼠實際上不存在人類造血作用(圖4G及圖13)，從而展示CART123細胞之有效骨髓去除潛能。簡言之，在T細胞注射後第28天時，收穫BM且分析人類祖細胞群，以針對活的單重態人類CD45^暗譜系^-細胞設門。結果顯示於圖4G中。在另一實驗中，向NSG小鼠植入人類胎肝CD34⁺細胞，且在8週後使用CART123、未轉導T細胞(UTD)或媒劑(對照)治療。4週後，收穫骨髓且針對人類CD45、人類譜系混合物、CD34、CD38、CD45RA、CD90及CD123進行染色。利用Countbright珠粒得出絕對細胞計數。結果顯示於圖13中。

CART 123消滅AML及骨髓

本文已顯示，CART123提供消滅AML以及殘餘正常骨髓之有效方式。此方式因其消滅惡性細胞以及可能存在於AML及骨髓發育不良症候群(MDS)中之癌前骨髓前體的能力而具有人類治療應用。此外，此方式提供骨髓移植前之基於非化學療法之新穎細胞調理方案。該等觀察突出顯示基於CAR-之細胞療法之新穎應用，且CD123因IL-3信號傳導在形成骨髓中之重要性而係尤具吸引力之靶(Pang等人，2011,PNAS,108：20012-20017)。在某些實施例中，此模式經由使用例如如本文所揭示之自殺開關或「生物可降解」mRNA CAR技術提供瞬時而非永久的抗-CD123壓力，此顯示實用且有效。在某些實施例中，CART123可用於靶向CD123來治療高風險AML患者。

實例2：針對B-ALL之抗-CD123嵌合抗原受體工程化T細胞

實驗經設計以評估CART123靶向B細胞急性淋巴母細胞性白血病(B-ALL)細胞之能力。觀察到，CART123細胞因應或殺死B-ALL母細胞而脫粒(圖15及圖16)。CART123細胞選擇性識別B-ALL母細胞(圖15)。將CART123細胞單獨培養，使用PMA/離子黴素(ionomycin)作為陽性對照，與已知CD123⁺腫瘤細胞系、CD123^-細胞系或與患者之B-ALL母細胞一起培養，且結果呈現於圖14中。利用CD107a脫粒分析，CART123選擇性因應B-ALL。此外，將初級B-ALL母細胞(靶)與CART123細胞(效應子)一起培育過夜，且第二天利用基於FACS之細胞毒性分析[REF：PMID：20229499]評估剩餘活母細胞細胞數。如圖16中所顯示，效應子對靶之比率增加使母細胞殺死增加。

此外，CD123表現展示於ALL中。具體而言，一組來自復發或難治性ALL(RR-ALL)成人之16個樣本的流式細胞術篩選顯示CD19之高表現量(典型B細胞標記)以及CD123之表現(圖17A)。相似發現發現於小兒樣本中(圖17B)。表現係藉由解凍存庫患者樣本之流式細胞術來顯示，以針對CD45^暗SSC低母細胞設門。CD123表現亦展示於經CTL019治療後之CD19-ve ALL復發中。例如，如圖18及圖19中所顯示，在CART治療後CD19-ALL復發之患者顯示保留CD123之表現。該等結果表明，CART123可用於預防源自CART19療法之CD19復發。

圖20-24展示CART123 1172針對ALL母細胞之活體外活性。於B-ALL細胞系下之暴露引起CART19及CART123細胞二者穩健增殖(圖20)。使用CFSE對CART123或CART19細胞進行染色且與所指示靶一起培育120小時，然後進行FACS分析用於CFSE稀釋。直方圖係針對活的CD3+ T細胞設門。於初級B細胞ALL樣品下之暴露亦引起CART19及CART123細胞二者穩健增殖(圖21)。CART123細胞因應NALM6 B-ALL以及初級ALL而穩健地脫粒，且在初級ALL與AML之間無差異(圖22)。在抗-CD107a、抗-CD49d、抗-CD28及孟寧素存在下將所指示T細胞與所指示靶一起培育4小時，然後進行針對T細胞設門之FACS分析。藉由共培養CART123或CART19細胞與初級ALL樣品於初級ALL樣品下之暴露使得在24小時時分泌多種效應子細胞介素(圖23)。注意到CART19與CART123之間無差異。自24小時共培養物收集上清液，然後在30叢套組中進行分析(顯示所選細胞介素)。在細胞毒性分析中在4小時時，CART123及CART19細胞顯示殺死NALM6 B-ALL細胞之等效能力(圖24)。

圖25展示在ALL鼠類模型中CART123之活體內活性。具體而言，在D0時向NSG小鼠注射1×10⁶個Nalm6叩頭蟲綠色螢光素酶細胞。在D7時，向小鼠注射UTD T細胞、CART19細胞、CART123細胞或50：50CART19與CART123混合群至總細胞劑量為1×10⁶(組合組)。然後對小鼠進行存活率隨訪。如圖25中所顯示，CART123單療法明顯優於未轉導T細胞(UTD)，但在提高動物存活率方面不如CART19單療法有效。與CART19單療法相比，CART123與CART19之組合並不提高存活率。儘管如此，CART19+CART123組合療法可預防如已注意到在患者中發生之抗原損失復發之發生，如圖18及圖19中所闡釋。

本文所呈現之結果再次確認抗-CD123重定向T細胞(CART123)之成功工程化且展示有效的及特異性臨床前活性。該等結果展示利用CART123靶向CD123來治療高風險ALL患者之可行性。此外，該等結果展示，CD123在初級ALL樣本中以較高量表現，且CD19疾病復發之ALL患者保留CD123之表現。與CART19相比，CART123顯示針對初級ALL之等效活體外活性。可使用CART123與CART19之組合輸注經由在惡性腫瘤上引起免疫壓力增加抗原數來預防抗原損失復發。

實例3：CAR序列

CAR構築物中所使用之scFv係基於公開序列獨立地合成(Du等人，2007 Journal of Immunotherapy 30：607)。Du等人中之原始抗體係來自Du等人自Stemline Therapeutics,NY,NY獲得之雜交瘤。scFv序列源自該等抗體26292及32716之重鏈及輕鏈可變區(圖7A)。將每一者沿輕-至-重鏈或重-至-輕鏈方向與連接VL與VH結構域之撓性連接體一起選殖至含有CD8或IgG4鉸鏈區以及4-1BB分子及CD3ζ分子之載體骨架中(圖7A及圖7B)。

標題為CD123 4-1BBCD3z-CAR之純系上之多肽序列係以SEQ ID NO：1之496 aa多肽提供。前導序列包括SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至25，且以SEQ ID NO：3單獨提供。scFv結構域係以SEQ ID NO：2單獨提供且包括包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基26至136之V_L結構域，連接體序列包括SEQ ID NO：1之胺基酸殘基137至151，且V_H結構域序列包括SEQ ID NO：1之胺基酸殘基152至269。鉸鏈區包括SEQ ID NO：1之胺基酸殘基270至318，且以SEQ ID NO：4單獨提供。跨膜結構域包括SEQ ID NO：1之胺基酸殘基319至342，且以SEQ ID NO：5單獨提供。4-1BB細胞內結構域包括SEQ ID NO：1之胺基酸殘基343至384，且以SEQ ID NO：6單獨提供。CD3 ζ結構域包括SEQ ID NO：1之胺基酸殘基385至496，其係以SEQ ID NO：7單獨提供。

編碼SEQ ID NO：1之多肽之核苷酸係以SEQ ID NO：8提供。編碼SEQ ID NO：2之多肽之核苷酸係以SEQ ID NO：9提供。編碼SEQ ID NO：3之多肽之核苷酸係以SEQ ID NO：10提供。編碼SEQ ID NO：4之多肽之核苷酸係以SEQ ID NO：11提供。編碼SEQ ID NO：5之多肽之核苷酸係以SEQ ID NO：12提供。編碼SEQ ID NO：6之多肽之核苷酸係以SEQ ID NO：13提供。編碼SEQ ID NO：7之多肽之核苷酸係以SEQ ID NO：14提供。編碼SEQ ID NO：98之多肽之核苷酸係以SEQ ID NO：99提供。

●CD1234-1BBCD3z-CAR(胺基酸序列)(SEQ ID NO：1)(對應於圖7A中之1172)

●CD123 scFv(胺基酸序列)(SEQ ID NO：2)

●CD8前導(胺基酸序列)(SEQ ID NO：3)

●CD8鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO：4)

●CD8跨膜(胺基酸序列)(SEQ ID NO：5)

●4-1BB細胞內結構域(胺基酸序列)(SEQ ID NO：6)

●CD3 ζ(胺基酸序列)(SEQ ID NO：7)

●CD3 ζ結構域(胺基酸序列；NCBI參考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO：98)

●CD123 4-1BBCD3z-CAR(核酸序列)(SEQ ID NO：8)

●CD123 scFv(核酸序列)(SEQ ID NO：9)

●前導(核酸序列)(SEQ ID NO：10)

●鉸鏈(核酸序列)(SEQ ID NO：11)

●跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO：12)

●4-1BB細胞內結構域(核酸序列)(SEQ ID NO：13)

●CD3 ζ(核酸序列)(SEQ ID NO：14)

●CD3 ζ(核酸序列；NCBI參考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO：99)

CD123 4-1BBCD3z-CAR(26292)(1176)(胺基酸序列)(SEQ ID NO：100)

CD123 scFv(26292)(1176)(胺基酸序列)(SEQ ID NO：101)

CD123 4-1BBCD3z-CAR(26292)(1176)(核苷酸序列)(SEQ ID NO：102)

CD123 scFv(26292)(1176)(核苷酸序列)(SEQ ID NO：103)

IgG4鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO：104)

IgG4鉸鏈(核苷酸序列)(SEQ ID NO：105)

EF1α驅動之CD123 4-1BBCD3z-CAR(32716)(1172)(核苷酸序列)(SEQ ID NO：106)斜體為EF1α啟動子

CD123 CAR 1172(胺基酸序列)(SEQ ID NO：107)

CD123 CAR 1172(核苷酸序列)(SEQ ID NO：108)

CD123 CAR 1173(胺基酸序列)(SEQ ID NO：109)

CD123 CAR 1173(核苷酸序列)(SEQ ID NO：110)

CD123 CAR 1174(胺基酸序列)(SEQ ID NO：111)

CD123 CAR 1174(核苷酸序列)(SEQ ID NO：112)

CD123 CAR 1175(胺基酸序列)(SEQ ID NO：113)

CD123 CAR 1175(核苷酸序列)(SEQ ID NO：114)

CD123 CAR 1176(胺基酸序列)(SEQ ID NO：115)

CD123 CAR 1176(核苷酸序列)(SEQ ID NO：116)

CD123 CAR 1177(胺基酸序列)(SEQ ID NO：117)

CD123 CAR 1177(核苷酸序列)(SEQ ID NO：118)

CD123 CAR 1178(胺基酸序列)(SEQ ID NO：119)

CD123 CAR 1178(核苷酸序列)(SEQ ID NO：120)

CD123 CAR 1179(胺基酸序列)(SEQ ID NO：121)

CD123 CAR 1179(核苷酸序列)(SEQ ID NO：91)

實例4：針對CD123CAR之預測CDR設計

實例3中所論述之根據Kabat之針對SEQ ID NO：1之CD123 CAR之預測CDR設計如下：

●VH： (SEQ ID NO：15)；其中CDR1為NYGMN(SEQ ID NO：16)，CDR2為WINTYTGESTYSADFKG(SEQ ID NO：17)，且CDR3為SGGYDPMDY(SEQ ID NO：18)。

●VL： (SEQ ID NO：19)；其中CDR1為RASESVDNYGNTFMH(SEQ ID NO：20)，CDR2為RASNLES(SEQ ID NO：21)，且CDR3為QQSNEDPPT(SEQ ID NO：22)。

根據Chothia之針對CD123 CAR之預測CDR設計如下：

●VH： (SEQ ID NO：15)；其中CDR1為GYIFTNY(SEQ ID NO：24)，CDR2為NTYTGE(SEQ ID NO：25)，且CDR3為SGGYDPMDY(SEQ ID NO：26)。

●VL： (SEQ ID NO：19)；其中CDR1為SESVDNYGNTF(SEQ ID NO：28)，CDR2為RAS (SEQ ID NO：29)，且CDR3為SNEDPP(SEQ ID NO：30)。

實例3中所揭示之根據Kabat之針對SEQ ID NO：100之CD123 CAR之預測CDR設計如下：

●VH CDR1為SYWMN(SEQ ID NO：84)，CDR2為RIDPYDSETHYNQKFKD(SEQ ID NO：85)，且CDR3為GNWDDY(SEQ ID NO：86)。

●VL CDR1為RASKSISKDLA(SEQ ID NO：87)，CDR2為SGSTLQS(SEQ ID NO：88)，且CDR3為QQHNKYPYT(SEQ ID NO：89)。

實例5：鼠類抗-CD123抗體之人類化

鼠類CD123抗體之人類化可期望用於臨床環境，其中小鼠特異性殘基可在接受轉導有鼠類CAR構築物之T細胞治療之患者中誘導人類-抗-小鼠抗原(HAMA)反應。人類化係藉由將來自SEQ ID NO：2之鼠類CD123抗體之CDR區移植至人類種系受體框架VH1_1-03或VH7_7-4.1以及VK3_L6或VK4_B3(vBASE數據庫)上來完成。除CDR區外，保留鼠類序列之認為支持CDR區之結構完整性之若干框架殘基(即VK3 68號、83號、VK4 4號、68號、VH1 2號、71號及VH7 2號)。此外，人類J元件JH6及JK2分別用於重鏈及輕鏈。設計人類化抗體之所得胺基酸序列，針對輕鏈為VK3_L6/Hz1(SEQ ID NO：31)及VK4_B3/Hz1(SEQ ID NO：32)且針對重鏈為VH1_1-03/Hz1(SEQ ID NO：33)及VH7_4.1/Hz1(SEQ ID NO：34)，並顯示於圖26及圖27中。殘基編號遵循Kabat(Kabat E.A.等人，1991，參見上文)。對於CDR定義，使用Kabat以及Chothia等人，1987，參見上文)二者。陰影顯示自小鼠CD123保留之框架工作殘基。加下劃線處為CDR殘基。框架VH7_7-4.1中位置82a/82b(帶框，原始框架序列為CS)中之PTM基序在最終構築物中突變成NA。

基於如圖26及圖27中所顯示之人類化輕鏈及重鏈序列，使用總共8種框架組合來產生可溶性scFv以供進一步驗證。VL及VH結構域在scFv中出現之順序可變化(即VL-VH或VH-VL定向)，且使用4拷貝之其中每一亞單位皆包括序列GGGGS(SEQ ID NO：35)之「G₄S」(SEQ ID NO：35)亞單位來連接框架。

選殖：

獲得編碼小鼠及人類化VL及VH結構域之DNA序列，且針對在人類細胞中之表現最佳化用於構築物之密碼子。

將編碼VL及VH結構域之序列亞選殖至適於在哺乳動物細胞中分泌之表現載體中。表現載體之元件包含啟動子(巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子)、促進分泌之信號序列、多腺苷酸化信號及轉錄終止子(牛生長激素(BGH)基因)、允許進行附加型複製及在原核生物中複製之元件(例如SV40來源及ColE1或其他業內已知者)以及允許進行選擇之元件(胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因及博來黴素(zeocin)標記)。

表2. 用於活體外轉錄之實例性CD123 CAR序列

在SEQ ID NO：94中，大寫加粗之殘基對應於T2A區；加下劃線之殘基對應於CD123 CAR區；且大寫斜體殘基對應於β球蛋白UTR區。

人類化抗-CD123 scFv變體在HEK293細胞中瞬時表現且經由C端6×His標籤(SEQ ID NO：128)純化至接近同質(圖28及圖29)。藉由UV280測定變體之表現量。與小鼠對照scFv比較表現。藉由ELISA確認變體與經固定CD123之結合，且與親代小鼠scFv(約1.1-2.6nM；圖 30a及b)相比，所估計之EC50介於1nM至10nM範圍內。利用差示掃描螢光測定(DSF)來量測以熔融溫度確定之變體之熱穩定性。如圖31中所顯示，親代小鼠scFv顯示58.5℃之熔融溫度，而人類化抗-CD123 scFv變體具有介於44℃至52℃範圍內之降低的熔融溫度(圖31)。

人類化序列與小鼠序列之比對(按編排順序分別為SEQ ID NO 92、32、31、34、33及93)：

實例6：人類化CD123 CAR之特性

人類化抗-CD123 CAR構築物係基於小鼠抗-人類CD123 scFv 32716且插入pELPS-41BB-CD3z骨架中來產生。在TOP10細胞中利用標準技術藉由細菌轉化擴增每一質體，然後使用Qiagen Plasmid Maxi套組來大量製備。在293T細胞中利用標準技術產生慢病毒上清液。使用慢病毒上清液轉導正常供體T細胞且利用抗-CD3/CD28珠粒及介白素-2擴增。轉導有每一構築物或對照小鼠抗-人類CD123 CAR(C1172)之T細胞之擴增倍數顯示於下表3中：

為檢測每一構築物之轉導效率及表現量，在第10天擴增時使用以下試劑對轉導T細胞進行染色：(i)Alexa fluor 647山羊抗小鼠F(ab)試劑，(ii)FITC山羊抗人類F(ab)，或(iii)初次用人類CD123-Fc，然後用抗人類Fc PE。發現抗小鼠F(ab)及CD123-Fc具有良好關聯，此表明當CAR在表面上表現時，其能夠結合靶(圖32)。抗人類F(ab)試劑無法檢測CAR(數據未顯示)。

將先前已轉導有螢火蟲螢光素酶之表現CD123之靶細胞系MOLM14以5×10⁴個細胞/孔平鋪於96孔板中。在針對CAR表現百分數校正後，以2：1、1：1及0.5：1平鋪轉導有不同人類化CAR構築物或對照小鼠抗-人類CD123 CAR之T細胞。特定而言，將所有T細胞稀釋至40%之CAR表現量，且因此有效E：T比率為2×0.4=0.8：1；1×0.4=0.4：1；0.5×0.4=0.2：1。對照孔僅含有MOLM14細胞(E：T=0：1)或經ETOH殺死(最大殺死)之MOLM14細胞。16小時後，將螢光素添加至每一孔中且經10秒使板成像。結果顯示於圖33中。

殺死分析之結果呈現於圖34中。

除MW89-29GB外之所有構築物皆顯示相似的表面表現及抗腫瘤功效。該等構築物亦顯示與C1172小鼠抗-人類CD123構築物相似之功效。

實例7：針對AML及ALL之抗-CD123 RNA CAR T細胞療法

將抗-CD123 CAR構築物C1172(scFv 32716)及C1176(scFv 26292)選殖至pDA載體中。核苷酸及胺基酸序列以SEQ ID NO：94-97提供於表2中。使構築物經歷活體外轉錄，且將所得mRNA電穿孔至正常供體T細胞中。將人類T細胞靜置過夜，然後在標準脫粒分析中在抗-CD107a、抗-CD49d及抗-CD28以及孟寧素存在下與靶共培育2小時(參見圖35)。對照為慢病毒轉導之CART19、慢病毒轉導之CART123(基於32716 scFv之構築物C1172)及抗-CD3/CD28珠粒。注意到，C1176識別食蟹猴CD123以及人類CD123，而C1172僅識別人類CD123。

該等結果顯示，可使用功能性抗-CD123 CAR成功地對T細胞進行電穿孔。

利用抗-CD3/CD28珠粒及rhIL2對正常供體T細胞進行活體外擴增。在D0時，將表現螢光素酶之MOLM14細胞iv注射(1×10⁶個細胞)至亞致死照射之NSG小鼠中。在D6時使小鼠成像以確認腫瘤植入(BLI)。在D7時，使用RNA CD123 CAR或RNA CAR19質體對T細胞進行電穿孔(EP)，或使其經歷模擬EP(「不處理」)，在37℃下靜置4小時，且然後使用15×10⁶個工程化T細胞治療小鼠。在D13時，使小鼠經受BLI。在D14時，如上對解凍的T細胞進行電穿孔。在D14時，使用60mg/kg環磷醯胺i.v.治療小鼠用於淋巴清除，然後iv注射5×10⁶個EP T細胞。在D20時，使小鼠經受BLI。在D21時，如上對解凍的T細胞進行電穿孔。在D21時，使用60mg/kg環磷醯胺i.v.治療小鼠用於淋巴清除，然後iv注射5×10⁶個EP T細胞。在D34時實施最後成像以記載抗腫瘤反應。T細胞注射後D21及D28時之生物發光顯示於圖36中。展示抗腫瘤效應之數據顯示於圖37中。

該等結果顯示，經RNA電穿孔之CAR細胞可用於在活體內誘導免疫缺陷動物之抗腫瘤反應。

實例8：抗-CD123 CAR T細胞之抗腫瘤功效之活體內比較

使用以下構築物轉導T細胞：C1172(抗-CD123 32716輕-至-重鏈CD8H 4-1BB CD3z；C1176(抗-CD123 26292輕-至-重鏈CD8H 4-1BB CD3z)；在D0時向10隻NSG小鼠注射1×10⁶個MOLM14 Luc。在D7時使動物之腫瘤負荷成像，然後如下注射1×10⁶個T細胞：不使用T細胞n=2；CART123_C1172 n=4(50% CAR+ T細胞)；CART123_C1176 n=4(50% CAR+ T細胞)。對腫瘤負荷連續進行生物發光成像(圖38)。如藉由注射T細胞後7天之生物發光顯示之腫瘤負荷在兩個T細胞組中低於在未治療組中，且CART123_C1172似乎比CART123_C1176略微有效。

本文所引用之每個專利、專利申請案及公開案之揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中。儘管已參考特定實施例揭示本發明，但顯而易見，在不背離本發明之真實精神及範疇下其他熟習此項技術者可設計本發明之其他實施例及變化形式。隨附申請專利範圍意欲理解為包含所有該等實施例及等效變化形式。

<110> 瑞士商諾華公司賓夕法尼亞大學董事會

<120> 利用抗-CD123嵌合抗原受體工程化T細胞之初級人類白血病有效靶向

<130> N2067-7001WO

<150> 61/865,856

<151> 2013-08-14

<150> 61/767,058

<151> 2013-02-20

<160> 136

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 1

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<210> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 6

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 7

<210> 8

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸

<400> 10

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 14

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> DNA

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 56

<210> 57

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 57

<210> 58

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 58

<210> 59

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 59

<210> 60

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 60

<210> 61

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 61

<210> 62

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 62

<210> 63

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 63

<210> 64

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 64

<210> 65

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 65

<210> 66

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 66

<210> 67

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 67

<210> 68

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 68

<210> 69

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 69

<210> 70

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 70

<210> 71

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 71

<210> 72

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 72

<210> 73

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 73

<210> 74

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 74

<210> 75

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 75

<210> 76

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 76

<210> 77

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 77

<210> 78

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 78

<210> 79

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 79

<210> 80

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 80

<210> 81

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 81

<210> 82

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 82

<210> 83

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 83

<210> 84

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 84

<210> 85

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 85

<210> 86

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 86

<210> 87

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 87

<210> 88

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 88

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 89

<210> 90

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(400)

<223> 此序列可能涵蓋100與400個之間之核苷酸

<400> 90

<210> 91

<211> 2019

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 91

<210> 92

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 92

<210> 93

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 93

<210> 94

<211> 2003

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 94

<210> 95

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 95

<210> 96

<211> 2019

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 96

<210> 97

<211> 673

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 97

<210> 98

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 98

<210> 99

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人

<400> 99

<210> 100

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 100

<210> 101

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 101

<210> 102

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 102

<210> 103

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 103

<210> 104

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 104

<210> 105

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 105

<210> 106

<211> 2684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 106

<210> 107

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 107

<210> 108

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 108

<210> 109

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 109

<210> 110

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 110

<210> 111

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 111

<210> 112

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 112

<210> 113

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 113

<210> 114

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 114

<210> 115

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 115

<210> 116

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 116

<210> 117

<211> 673

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 117

<210> 118

<211> 2019

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 118

<210> 119

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 119

<210> 120

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 120

<210> 121

<211> 673

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 121

<210> 122

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 122

<210> 123

<211> 847

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 123

<210> 124

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 124

<210> 125

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸

<400> 125

<210> 126

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 此序列可能涵蓋1、2、3、4、5或6個「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元

<400> 126

<210> 127

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 127

<210> 128

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成6×His標籤

<400> 128

<210> 129

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 129

<210> 130

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 130

<210> 131

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 131

<210> 132

<211> 5000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5000)

<223> 此序列可能涵蓋50與5,000個之間之核苷酸

<400> 132

<210> 133

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2000)

<223> 此序列可能涵蓋50與2,000個之間之核苷酸

<400> 133

<210> 134

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 134

<210> 135

<211> 5000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5000)

<223> 此序列可能涵蓋50與5,000個之間之核苷酸

<400> 135

<210> 136

<211> 5000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5000)

<223> 此序列可能涵蓋100與5,000個之間之核苷酸

<400> 136

Claims

一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中該CAR包括抗-CD123結合結構域、跨膜結構域及包括刺激結構域之細胞內信號傳導結構域，且其中該抗-CD123結合結構域包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123輕鏈結合結構域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，以及表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123重鏈結合結構域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
如請求項1之經分離核酸分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123輕鏈結合結構域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
如請求項1之經分離核酸分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123重鏈結合結構域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
如請求項1之經分離核酸分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123輕鏈結合結構域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，以及表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123重鏈結合結構域胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
如請求項1之經分離核酸分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何輕鏈可變區。
如請求項1之經分離核酸分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何重鏈可變區。
如請求項1之經分離核酸分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何輕鏈可變區及表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何重鏈可變區。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該抗-CD123結合結構域為scFv。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該輕鏈可變區包括具有表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾但不大於30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該重鏈可變區包括具有表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之重鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾但不大於30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該抗-CD123結合結構域包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中編碼該抗-CD123結合結構域之核酸序列包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：79，或與其具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼之CAR包含包括選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中經編碼之跨膜結構域包括序列SEQ ID NO：5。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼之跨膜結構域包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：5之至少1個、2個或3個修飾但不大於20、10或5個修飾之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中編碼該跨膜結構域之核酸序列包括序列SEQ ID NO：12或與其具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼之抗-CD123結合結構域藉由鉸鏈區連接至該跨膜結構域。
如請求項17之經分離核酸分子，其中經編碼之鉸鏈區包括SEQ ID NO：4、104、122或124中任一者之胺基酸序列或與其具有95%至99%一致性之序列。
如請求項17之經分離核酸分子，其中編碼該鉸鏈區之核酸序列包括序列SEQ ID NO：7或與其具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其進一步包括編碼共刺激結構域之序列。
如請求項20之經分離核酸分子，其中該經編碼之共刺激結構域包括選自由以下組成之群之蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、 ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。
如請求項20或21之經分離核酸分子，其中該經編碼之共刺激結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23。
如請求項20或21之經分離核酸分子，其中該經編碼之共刺激結構域包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23之至少1個、2個或3個修飾(例如取代)但不大於20、10或5個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23具有95%至99%一致性之序列。
如請求項20或21之經分離核酸分子，其中編碼該共刺激結構域之該核酸序列包括序列SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：27或與其具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其進一步包括編碼細胞內信號傳導結構域之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼之細胞內信號傳導結構域包括4-1BB之功能信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能信號傳導結構域。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼之細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該細胞內信號傳導結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或胺基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98之至少1個、2個或3個修飾但不大於20、10或5個修飾的胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或胺基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼之細胞內信號傳導結構域包括該序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及該序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98，其中包括該細胞內信號傳導結構域之該等序列在同一框架中且以單一多肽鏈表現。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中編碼該細胞內信號傳導結構域之該核酸序列包括序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：27或與其具有95%至99%一致性之序列，及/或序列SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：99或與其具有95%至99%一致性之序列。
如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其進一步包括前導序列。
如請求項31之經分離核酸分子，其中該前導序列包括SEQ ID NO：3。
一種經分離多肽分子，其係由如請求項1至32中任一項之核酸分子編碼。
如請求項33之經分離多肽分子，其包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：83，或與其具有95%至99%一致性之序列。
如請求項33之經分離多肽分子，其包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119及SEQ ID NO：121，或與其具有95%至99%一致性之序列。
如請求項35之經分離多肽分子，其包括序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：100或與其具有95%至99%一致性之序列。
一種經分離嵌合抗原受體(CAR)分子，其包括抗-CD123結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域。
如請求項37之經分離CAR分子，其中該細胞內信號傳導結構域包括共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域。
如請求項37或38之經分離CAR分子，其中該抗-CD123結合結構域包括包含抗-CD123結合結構域之抗體或抗體片段。
如請求項37至39中任一項之經分離CAR分子，其中該抗-CD123結合結構域包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123結合結構域中之一或多個輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，以及表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123結合結構域中之一或多個重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。
如請求項37至40中任一項之經分離CAR分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123輕鏈結合結構域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
如請求項37至41中任一項之經分離CAR分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123重鏈結合結構域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
如請求項37至42中任一項之經分離CAR分子，其包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123輕鏈結合結構域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，以及表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示之任何抗-CD123重鏈結合結構域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
如請求項37至43中任一項之經分離CAR分子，其中該抗-CD123結合結構域為scFv。
如請求項37至44中任一項之經分離CAR分子，其中該抗-CD123結合結構域包括表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所列示胺基酸序列之輕鏈及重鏈。
如請求項37至45中任一項之經分離CAR分子，其中該抗-CD123結合結構域包括：輕鏈可變區，其包括具有表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾但不大於30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列。
如請求項37至46中任一項之經分離CAR分子，其中該抗-CD123結合結構域包括包含以下序列之重鏈可變區：具有表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之重鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾但不大於30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與表1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：101中所提供之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列。
如請求項37至47中任一項之經分離CAR分子，其中該抗-CD123結合結構域包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72及SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列。
如請求項37至48中任一項之經分離CAR分子，其進一步包括選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。
如請求項49之經分離CAR分子，其中該跨膜結構域包括序列SEQ ID NO：5。
如請求項49或50之經分離CAR分子，其中該跨膜結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：5之至少1個、2個或3個修飾但不大於20、10或5個修飾的胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有95%至99%一致性之序列。
如請求項37至51中任一項之經分離CAR分子，其中該抗-CD123結合結構域藉由鉸鏈區連接至該跨膜結構域。
如請求項52之經分離CAR分子，其中經編碼之鉸鏈區包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124或與其具有95%至99%一致性之序列。
如請求項37至53中任一項之經分離CAR分子，其進一步包括編碼共刺激結構域之序列。
如請求項54之經分離CAR分子，其中該共刺激結構域包括選自由以下組成之群之蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。
如請求項54或55之經分離CAR分子，其中該共刺激結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23。
如請求項54或55之經分離CAR分子，其中該共刺激結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23之至少1個、2個或3個修飾但不大於20、10或5個修飾的胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23具有95%至99%一致性之序列。
如請求項37至57中任一項之經分離CAR分子，其進一步包括編碼細胞內信號傳導結構域之序列。
如請求項58之經分離CAR分子，其中該細胞內信號傳導結構域包括4-1BB之功能信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能信號傳導結構域。
如請求項58或59之經分離CAR分子，其中該細胞內信號傳導結構域包括序列SEQ ID NO：6或SEQ OD NO：23及/或序列SEQ ID NO：7。
如請求項58或59之經分離CAR分子，其中細胞內信號傳導結構域包括該序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或序列SEQ ID NO：98。
如請求項58至61中任一項之經分離CAR分子，其中該細胞內信號傳導結構域包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或胺基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98的至少1個、2個或3個修飾但不大於20、10或5個修飾之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及/或胺基酸序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98具有95%至99%一致性之序列。
如請求項58至61中任一項之經分離CAR分子，其中該細胞內信號傳導結構域包括該序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：23及該序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：98，其中包括該細胞內信號傳導結構域之該等序列在同一框架中且以單一多肽鏈表現。
如請求項37至63中任一項之經分離CAR分子，其進一步包括前導序列。
如請求項64之經分離CAR分子，其中該前導序列包括胺基酸序列SEQ ID NO：3或與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有95%至99%一致性之序列。
一種抗-CD123結合結構域，其包括SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之抗-CD123結合結構域中之一或多個輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，以及SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之抗-CD123結合結構域中之一或多個重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。
如請求項66之抗-CD123結合結構域，其包括SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之抗-CD123輕鏈結合結構域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
如請求項66或67之抗-CD123結合結構域，其包括SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之抗-CD123重鏈結合結構域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
如請求項66至68中任一項之抗-CD123結合結構域，其包括SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之抗-CD123輕鏈結合結構域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，以及SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之抗-CD123重鏈結合結構域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
如請求項66至69中任一項之抗-CD123結合結構域，其包括表1中之輕鏈可變區及SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之重鏈可變區。
如請求項66至70中任一項之抗-CD123結合結構域，其包括具有SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾但不大於30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包括具有SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中所提供之重鏈可變區胺基酸序列的至少1個、2個或3個修飾但不大於30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：36、42、48、54、60、66、72或78中之胺基酸序列具有95%至99%一致性之序列。
如請求項66至71中任一項之抗-CD123結合結構域，其包括選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：78，或與其具有95%至99%一致性之序列。
一種載體，其包括編碼如前述請求項中任一項之CAR之核酸分子。
如請求項73之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。
如請求項73或74之載體，其進一步包括啟動子。
如請求項75之載體，其中該啟動子係EF-1啟動子。
如請求項76之載體，其中該EF-1啟動子包括SEQ ID NO：97之序列。
如請求項73至77中任一項之載體，其中該載體係活體外轉錄之載體。
如請求項73至78中任一項之載體，其中該載體中之核酸序列進一步包括聚(A)尾。
如請求項73至79中任一項之載體，其中該載體中之該核酸序列進一步包括3’UTR。
一種細胞，其包括如請求項73至80中任一項之載體。
如請求項81之細胞，其中該細胞為T細胞。
如請求項82之細胞，其中該T細胞為CD8+ T細胞。
如請求項81或82之細胞，其中該細胞為人類細胞。
一種製造細胞之方法，其包括使用如請求項73至80之載體轉導T細胞。
一種產生RNA工程化細胞群之方法，其包括將活體外轉錄之 RNA或合成RNA引入至細胞中，其中該RNA包括編碼本文所闡述CAR分子之核酸。
一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之表現如請求項37至65之CAR分子之細胞。
如請求項87之方法，其中該細胞為自體T細胞。
如請求項87或88之方法，其中該細胞為同種異體T細胞。
如請求項87至89中任一項之方法，其中該哺乳動物係人類。
一種治療患有與CD123之表現相關疾病之哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之表現如請求項37至65中任一項之CAR分子之細胞。
如請求項91之方法，其中該與CD123相關之疾病係急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴樣白血病(ALL)、骨髓發育不良症候群、多毛細胞白血病、前淋巴球性白血病、慢性骨髓樣白血病、慢性淋巴樣白血病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤及其任何組合。
如請求項91之方法，其中該與CD123相關之疾病係血液癌症(例如白血病)。
如請求項93之方法，其中該血液癌症係選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴樣白血病(ALL)、慢性骨髓樣白血病(CML)、慢性淋巴樣白血病(CLL)及其任何組合以及該等癌症中任一者之轉移。
如請求項91至94中任一項之方法，其中該等表現CAR分子之細胞係與增加表現CAR分子之細胞功效的藥劑組合投與。
如請求項91至94中任一項之方法，其中該等表現CAR分子之細胞係與改善一或多種與表現CAR分子之細胞之投與相關的副作用之藥劑組合投與。
如請求項91至96中任一項之方法，其中該等表現CAR分子之細胞係與治療該與CD123相關之疾病的藥劑組合投與。
如請求項91至97中任一項之方法，其中該哺乳動物先前已接受抗-CD19療法之治療。
如請求項98之方法，其中該抗-CD19療法包括CD19 CART療法。
如請求項98或99之方法，其中該哺乳動物經歷使用該抗-CD19療法之復發。
如請求項1至32中任一項之經分離核酸分子、如請求項33至36中任一項之經分離多肽分子、如請求項37至65中任一項之經分離CAR、如請求項66至72中任一項之抗-CD123結合結構域、如請求項73至80中任一項之載體或如請求項81至84中任一項之細胞，其用作藥劑。
如請求項1至32中任一項之經分離核酸分子、如請求項33至36中任一項之經分離多肽分子、如請求項37至65中任一項之經分離CAR、如請求項66至72中任一項之抗-CD123結合結構域、如請求項73至80中任一項之載體或如請求項81至84中任一項之細胞，其用於治療表現CD123之疾病。
一種消滅個體中現有骨髓之至少一部分的方法，該方法包括向該個體投與有效量之表現如請求項37至65中任一項之CAR分子之細胞。
如請求項103之方法，其中該個體需要骨髓移植。
如請求項103或104中任一項之方法，其中該個體患有可利用骨髓移植治療之疾病、病症或病況。
如請求項105之方法，其中該疾病、病症或病況係選自由以下組成之群：血液癌症、實體腫瘤、血液疾病、代謝病症、HIV、HTLV、溶酶體儲積症及免疫缺陷。
如請求項103至106中任一項之方法，其中該方法係骨髓移植前之細胞調理方法。
一種活體外轉錄之載體，其編碼如請求項37至65中任一項之CAR。
如請求項108之活體外轉錄之載體，其中該載體中之該核酸序列包括聚(A)尾。
如請求項108或109之活體外轉錄之載體，其中該載體中之該核酸序列包括啟動子。
如請求項110之活體外轉錄之載體，其中該啟動子為T2A啟動子。
如請求項108至111中任一項之活體外轉錄之載體，其中該載體中之該核酸序列包括3’UTR。
如請求項112之活體外轉錄之載體，其中該3’UTR係源自人類β-球蛋白。
如請求項108至113中任一項之活體外轉錄之載體，其中該載體包括選自由SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：96或與其具有95%至99%一致性之序列組成之群之核酸分子。