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CN115916827A - 免疫活化Fc结构域结合分子 - Google Patents

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CN115916827A CN202180043364.6A CN202180043364A CN115916827A CN 115916827 A CN115916827 A CN 115916827A CN 202180043364 A CN202180043364 A CN 202180043364A CN 115916827 A CN115916827 A CN 115916827A
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Abstract

本发明整体上涉及用于活化免疫细胞和重定向至特定靶细胞的新型免疫活化Fc结构域结合分子。此外，本发明涉及编码此类分子的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法，以及使用这些双特异性抗原结合分子治疗疾病的方法。

Description

免疫活化Fc结构域结合分子
技术领域
本发明整体上涉及用于活化免疫细胞和重定向至特定靶细胞的新型免疫活化Fc结构域结合分子。此外，本发明涉及编码此类分子的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法，以及使用这些双特异性抗原结合分子治疗疾病的方法。
背景技术
在多种临床环境中，通常需要选择性摧毁单个细胞或特定细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标是特异性地摧毁肿瘤细胞，同时保持健康细胞和组织完好无损，或摧毁由特定表面抗原鉴定的某些细胞亚群。
实现这一目标的一种有吸引力的方法是通过募集免疫效应细胞(诸如自然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL))来攻击和摧毁肿瘤细胞，从而诱导针对目标细胞的免疫应答。
诱导免疫效应细胞介导的靶细胞杀伤或消耗的一种方法是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCP)，经由IgG1同种型的ADCC感受态抗体以及具有增强的ADCC效应子功能的抗体进行(Zahavi等人，AntibodyTherapeutics,1,7-12(2018))。替代性地，可以经由(T细胞)双特异性抗体募集T细胞以杀伤靶细胞，该抗体经设计为与靶细胞上的表面抗原结合，并具有与T细胞受体(TCR)复合物的活化、不变组分结合的第二结合部分(Clynes和Desjarlais，Annu Rev Med 70:427-450(2019))。已经开发了几种双特异性形式，包括BiTE(双特异性T细胞接合物)(Nagorsen和
Figure BDA0004003174050000011
ExpCell Res 317,1255-1260(2011))双体(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))，DART(双亲和力重定向)(Moore等人，Blood 117,4542-51(2011))或所谓2+1 T细胞双特异性抗体(TCB)(Bacac等人，Clin Cancer Res 24,4785-4797(2018))，并研究了它们对T细胞介导的免疫疗法的适用性。
正在开发的多种形式显示了免疫细胞重定向和活化在免疫疗法中的巨大潜力。迄今为止，开发的双特异性抗体总是直接与所需的目标抗原接合，从而将靶细胞与CTL连接起来，导致靶细胞裂解。这些双特异性抗体形式面临着与毒性、适用性和可生产性相关的挑战。此外，对于每个单靶(组合)，需要生成对每个靶具有特异性的单个分子。抗体及其衍生物的治疗效用不仅限于作为T细胞接合物的功能，还可以在抑制性或活化性检查点的调节中找到指示。示例性地，使用免疫检查点抑制抗体在几种适应症中显示出持久的应答(Hodie等人N Engl J Med.；363(8):711-23.(2010)；Prieto PA,等人Clin cancer Res.；18:2039–2047(2012))。此外，最近，已经表明T细胞双特异性抗体的活性可以通过双特异性药物来进一步增强，该双特异性药物经由CD28(Skokos等人，Sci Trans Med 12(525):1-14(2020))或4-1BB信号传导(Claus等人，Sci Trans Med 11(496),eaav5989(2019))的活化来活化T细胞上的所谓共刺激途径。
除了目前的成功之外，疗法在靶向多种不同抗原的灵活性方面受到限制，并且在一种应用中选择性地利用NK或CTL功能的能力方面也受到限制。
发明内容
本文提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)Fc结构域结合部分，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，和
(b)免疫活化部分。
在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合且/或降低效应子功能。
在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含
(c)延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在一个实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含第二组至少一个氨基。在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代降低与Fc的结合。在一个实施例中，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成。
在一个实施例中，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域是IgG Fc结构域，特别是IgG1或IgG4 Fc结构域。
在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，靶Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，延长半衰期的Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，并且其中第二组至少一个氨基酸取代包括在与第一组至少一个氨基酸取代相同的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代，其中与第一组至少一个氨基酸取代相比，第二组至少一个氨基酸取代中的氨基酸在相同的位置处被不同的氨基酸取代。
在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。
在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代包括在选自由233、234、235、238、253、265、269、270、297、310、331、327、329和435(根据Kabat EU索引编号)组成的列表的位置处的至少一个氨基酸取代。
在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代包括在选自由233、234、235、238、253、265、269、270、297、310、331、327、329和435(根据Kabat EU索引编号)组成的列表的位置处的至少一个氨基酸取代。
在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代包括氨基酸取代P329G(根据KabatEU索引编号)，并且其中第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由除甘氨酸(G)以外的氨基酸进行的取代。
在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由精氨酸(R)进行的取代。
附图说明
图1.本发明概念的说明。将包含至少一个能够与靶细胞特异性结合的抗原结合部分的靶向抗体与免疫活化Fc结构域结合分子组合以生成用于人类疗法的多用途现成分子组。靶向抗体在其Fc结构域(本文称为靶Fc结构域)中包含至少一个氨基酸取代，并且免疫活化Fc结构域结合分子能够与包含此类氨基酸取代(后文中称为第一组至少一个氨基酸取代)的Fc结构域特异性结合。免疫活化Fc结构域结合分子能够经由抗原结合部分(后文中称为Fc结构域结合部分)与靶向抗体(包含第一组至少一个氨基酸取代)特异性结合。免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含免疫活化部分(例如，能够与CD3、CD28或4-1BB特异性结合的抗原结合部分)和/或细胞因子(例如IL2)和/或共刺激配体(例如4-1BBL)。免疫活化Fc结构域结合分子能够经由该免疫活化部分来活化免疫细胞(例如，T细胞)。免疫活化Fc结构域结合分子还可以包含Fc结构域，此类Fc结构域在后文中称为延长半衰期的Fc结构域(以区别于靶Fc结构域)。延长半衰期的Fc结构域还可以包含至少一个氨基酸取代(例如，以减少效应子功能)，此类氨基酸取代在后文中称为第二组至少一个氨基酸取代(以区别于第一组至少一个氨基酸取代)。为了避免免疫活化Fc结构域结合分子与其他(相同的)免疫活化Fc结构域结合分子结合，Fc结构域结合部分不能与延长半衰期的Fc结构域特异性结合。有了该概念，调用免疫细胞的抗体疗法可以根据所需的效应子功能和/或在治疗期间随时间进行特定调整。图43示出后文所提供的示例性治疗工具箱的图示。
图2.本发明的(多特异性)抗体的示例性配置。(A，D)“1+1CrossMab”分子示意图。(B，E)“2+1IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(C，F)“2+1IgG Crossfab”分子示意图。(G，K)“1+1IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(H，L)“1+1IgG Crossfab”分子示意图。(I，M)具有两个CrossFab的“2+1IgG Crossfab”分子的示意图。(J，N)具有两个CrossFab的“2+1IgGCrossfab”分子的示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(O，S)“Fab-Crossfab”分子示意图。(P，T)“Crossfab-Fab”分子示意图。(Q，U)“(Fab)2-Crossfab”分子示意图。(R，V)“Crossfab-(Fab)2”分子示意图。(W，Y)“Fab-(Crossfab)2”分子示意图。(X，Z)“(Crossfab)2-Fab”分子示意图。++、--：任选地引入CH1和CL结构域中的具有相反电荷的氨基酸。Crossfab分子被描述为包含VH区和VL区的交换，但是可以-在其中在CH1和CL结构域中不引入电荷修饰的方面中-可替代地包含CH1和CL结构域的交换。
图3.huIgG1 P329x变体与捕获的重组人Fcg受体的结合。(A)设置；重组FcgR被固定在芯片表面的抗His抗体捕获。在第二步中，以150、300和600nM的浓度注入huIgG1 P329x变体并分析其与FcgR的相互作用。(B)显示huIgG1 P329x变体与huFcgRIa结合的传感图。(C)显示huIgG1 P329x变体与huFcgRIIa结合的传感图。(D)显示huIgG1 P329x变体与huFcgRIIb结合的传感图。(E)显示huIgG1 P329x变体与huFcgRIIIa结合的传感图。
图4.huIgG1 P329x LALA变体与抗P329G抗体的结合。(A)测定的设置；将抗P329G(M-1.7.24)抗体与传感器芯片表面偶联。在第二步中，以500nM的浓度注入huIgG1 P329x变体(以三个重复进行)。HuIgG1P329G抗体用作阳性对照。(B)显示huIgG1 P329L与抗P329G(M-1.7.24)抗体相互作用的传感图(三个重复)。(C)显示huIgG1 P329I与抗P329G(M-1.7.24)抗体相互作用的传感图(以三个重复进行)。(D)显示huIgG1P329R与抗P329G(M-1.7.24)抗体相互作用的传感图(以三个重复进行)。(E)显示huIgG1 P329A与抗P329G(M-1.7.24)抗体相互作用的传感图(以三个重复进行)。
图5.(A)用于实例中的T细胞双特异性(TCB)抗体分子的示意图。所有测试的TCB抗体分子均作为带有电荷修饰的“2+1IgG CrossFab，倒置”生产(在CD3结合物中的VH/VL交换，在靶细胞抗原结合物中的电荷修饰，EE＝147E、213E；RK＝123R、124K)。(B至E)用于组装TCB的成分：在CH1和CL中具有电荷修饰的抗TYRP1 Fab分子的轻链(B)、抗CD3交叉Fab分子的轻链(C)、在Fc区中具有杵和PG LALA突变的重链(D)、在Fc区中具有臼和PG LALA突变的重链(E)。
图6.实例3中使用的表面等离子体共振(SPR)设置的示意图。抗PG抗体与C1传感器芯片偶联。使人和食蟹猴CD3(融合至Fc区)在表面上方经过以分析TCB中的抗CD3抗体与CD3的相互作用。
图7.在以CHO-K1 TYRP1克隆物76作为靶细胞的Jurkat NFAT报告基因测定中测试了含有优化的抗CD3抗体的TCB。与含有CD3orig的TCB进行比较。通过测量在处理4小时后(A)和24小时后(B)的发光来确定Jurkat NFAT报告细胞的活化。
图8.当用含有优化的抗CD3抗体或亲本结合物CD3orig的TCB处理时，评估了来自健康供体的PBMC对黑色素瘤细胞系M150543的肿瘤细胞杀伤。通过对24小时后(A)和48小时后(B)的LDH释放进行定量来测量肿瘤细胞杀伤。
图9.在存在M150543黑色素瘤细胞系作为靶细胞的情况下，针对用含有优化的抗CD3抗体或亲本结合物CD3orig的TCB处理的来自健康供体的PBMC，分析了在CD8 T细胞(A、B)上和CD4 T细胞(C、D)上的CD25和CD69上调。48小时后，通过流式细胞术进行分析。
图10.在不存在肿瘤靶细胞的情况下，针对用含有优化的抗CD3抗体或亲本结合物CD3orig的TCB处理的来自健康供体的PBMC，分析了在CD8(A)上和CD4 T细胞(B)上的CD25表达。48小时后，通过流式细胞术进行分析。
图11.(A)实例19中生成的单价IgG分子的示意图。单价IgG分子作为人IgG1生产，在CD3结合物中具有VH/VL交换。(B至E)用于组装单价IgG的成分：抗CD3交叉Fab分子的轻链(B)、在Fc区中具有杵和PG LALA突变的重链(C)、在Fc区中具有臼和PG LALA突变的重链(D)。
图12.(A)本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子(TCB)的示例性配置。抗P329G x CD3 1+1通用TCB(uTCB)的图示。(B)1+1uTCB与肿瘤靶向IgG的P329G突变和T细胞上的T细胞受体(TCR)的结合模式的示例性配置。++、--：将具有相反电荷的氨基酸引入CH和CL结构域中。
图13.(A)本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子(TCB)的示例性配置。抗P329G x CD3 2+1通用TCB(uTCB)的图示。(B)2+1uTCB与肿瘤靶向IgG的P329G突变和T细胞上的T细胞受体(TCR)的结合模式的示例性配置。2+1uTCB形式能够同时结合两种具备P32G突变的肿瘤靶向抗体。++、--：将具有相反电荷的氨基酸引入CH和CL结构域中。
图14描绘了具有抗CD3效应子部分的不同免疫活化Fc结合分子的示意图(其他效应子部分可以以相同的形式使用，即替换抗CD3效应子部分，例如抗CD28、抗4-1BB)。延长半衰期的Fc结构域包含P329x突变，其中x是除甘氨酸(G)以外的氨基酸。14A：1+1形式，抗P329G，交叉的抗CD3，电荷变体KK/EE，P329x，LALA，杵/臼。14B:经典2+1形式，抗P329G，交叉的抗CD3，带电，P329x，LALA，杵/臼。14C、14D：倒置2+1形式，抗P329G，交叉的抗CD3，带电，P329x，LALA，杵/臼。
图15.A)抗P329G(VH3VL1)x CD3(CH2527)1+1 TCB可以同时与固定化的人CD3ε-δ-Fc结合并且与hu Fc(P329G)结合；B)抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)1+1 TCB可以同时与固定化的人CD3ε-δ-Fc结合并且与hu Fc(P329G)结合；C)抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB可以同时与固定化的人CD3ε-δ-Fc结合并且与hu Fc(P329G)结合。三个重复进行注入。
图16.不同浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与不同浓度的抗FolR1(6D5)P329G LALA huIgG1抗体组合对T细胞的动力学活化。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是三个重复的技术平均值，误差线指示SD
图17:不同浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与不同浓度的抗CD20(GA101)P329G LALA huIgG1抗体组合对T细胞的动力学活化。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是来自三个重复的技术平均值，误差线指示SD。
图18.不同浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与不同浓度的抗FAP(4B9)P329G LALA huIgG1抗体组合对T细胞的动力学活化。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是来自三个重复的技术平均值，误差线指示SD。
图19.不同浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与抗CD20(GA101)P329G LALA huIgG1抗体组合对T细胞的活化。使用CD20+z-138(图6A)或CD20+SU-DHL-4细胞作为靶细胞。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是来自三个重复的技术平均值，误差线指示SD。
图20.在存在具有P329G突变的肿瘤靶向抗CD20(GA101)抗体与抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB组合的情况下，T细胞的特异性、剂量依赖性活化。抗CD20野生型huIgG1或抗CD20 LALA突变的huIgG1不会活化T细胞。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是来自三个重复的技术平均值，误差线指示SD。
图21.在存在抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与肿瘤靶向抗EpCAM(图21A)、抗STEAP(图21B)或抗FAP(4B9)(图21C)P329G LALA huIgG1组合的情况下，粘附肿瘤细胞的靶细胞计数的降低。通过将随着时间推移的红核细胞计数定量来评估。描绘的是来自三个重复的技术平均值，误差线指示SD。
图22.通过不同的uTCB形式活化T细胞。1+1uTCB或2+1uTCB与鼠或人源化P329G结合物和不同的CD3结合物。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。使用FolR1+HeLa细胞(图22A)或CD19+SU-DHL-4细胞(图22B)作为靶细胞。描绘的是来自三个重复的技术平均值，误差线指示SD。
图23.使用人PBMC，以具有人源化P329G结合物(E:T比率5:1)的1+1uTCB或2+1uTCB形式的uTCB进行FolR1+HeLa靶细胞裂解。uTCB与P329G LALA IgG1的比率为1:2。在5.5小时、20小时和42小时后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的量热定量来评估肿瘤细胞裂解。描绘的是来自三个重复的技术平均值，误差线指示SD。
图24.使用人PBMC，以具有人源化P329G结合物(E:T比5:1)和CD3结合物P035.093的1+1uTCB或2+1uTCB形式的uTCB进行CD19+Nalm 6靶细胞裂解。uTCB与P329G LALA IgG1的比率为1:2。在5.5小时、20小时和42小时后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的量热定量来评估肿瘤细胞裂解。描绘的是来自三个重复的技术平均值，误差线指示SD。
图25.包含抗PG部分和抗CD28部分的免疫活化Fc结合分子的图示。
图26.固定化的抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1可同时与人IgG(P329G)结合并且与人CD28-Fc结合。一式两份进行注入。
图27.双特异性抗原结合分子与在CHO转染子细胞上过表达的人CD28的结合分析。描绘的是来自三个重复的相对中位荧光值(MFI)和SD。通过GraphPadPrism计算结合的EC50值。
图28.孵育4小时后的IL2报告细胞测定，通过发光确定。在存在或不存在递增浓度的PG-CD28(8.4pM至34.4nM)的情况下，将25,000个IL2报告效应细胞与固定浓度的625pMCD3 IgG(含PGLALA的Fc)一起孵育。作为对照，在存在同种型对照(具有含有PGLALA的Fc)的情况下包括PG-CD28，相应的肿瘤靶向CD28分子在该测定设置中由于不存在肿瘤靶而未交联。相对发光(RLU)被确定为4小时后Jurkat活化的直接测量值。描绘的是来自三个重复的RLU值和SD。
图29.(A)描绘具有IL2v(细胞因子)效应子部分的免疫活化Fc结合分子的示意图(B)抗P329G(M-1.7.24)x IL2v hugG1可以同时与固定化的huIL2R-Fc和hu Fc(P329)结合。三个重复进行注入(C)IL-2信号传导(STAT5-P)描述为暴露于基于IL-2v的分子12分钟后，人PD1+CD4 T细胞中STAT5-P的频率。2个供体的平均值±SEM。(D)IL-2信号传导(STAT5-P)描述为暴露于基于IL-2v的分子12分钟后，人PD1+CD4 T细胞中STAT5-P的MFI。2个供体的平均值±SEM。
图30.用于组装单价P329G靶向的分裂三聚人4-1BB配体的成分。A)二聚配体融合至人IgG1-CL结构域。B)单体配体融合至人IgG1-CH1结构域。
图31.含有具有带电残基的CH-CL交叉的单价P329G靶向的分裂三聚4-1BB配体Fc(kih)LALA融合物，也称为抗P329G x 4-1BBL huIgG1。*带电残基
图32.抗P329G(M-1.7.24)x 4-1BBL huIgG1与hu4-1BB和huIgG1-P329G同时结合。a)设置；b)抗P329G(M-1.7.24)x 4-1BBL huIgG1与hu4-1BB-Fc(kih)和在Fc中含有P329G突变的人IgG1的同时结合。显示了重复测定结果。
图33.在存在格菲妥单抗(glofitamab)(CD20-TCB,1nM)、抗P329G x 4-1BBL(1nM)或两者的组合的情况下下，将B细胞耗尽的PBMC与WSU DLCL2一起孵育3天。肿瘤细胞裂解通过LDH释放确定(左)，而T细胞活化通过流式细胞术确定(右，示例：CD4+T细胞，第3天，中值荧光强度)。
图34.双特异性抗原结合分子为huIgG1 LALA形式，其包含两个抗4-1BB Fab片段(与4-1BB二价结合)和一个抗P329G交叉Fab片段(Fab片段，其中VH与VL区交换)，该交叉Fab片段在其重链的C末端处融合至4-1BB Fab片段中的一个片段的重链的N末端。这种形式在本文中称为2+1形式。大黑点表示突起进入孔突变，而CH1/CL结构域中的小黑点表示氨基酸突变，其改善重链与抗4-1BB轻链的正确配对。
图35.将不同的测定设置彼此进行比较。使用Jurkat报告细胞系测定法测试了抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1分子的功能。因此，在存在或不存在抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1的情况下，将表达肿瘤靶(Her2、CEACAM5、FAP)的细胞(KPL4、MKN45、NIH/3T3-huFAP克隆物19)与表达人4-1BB受体的Jurkat报告细胞(Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2)和不同浓度的肿瘤靶(TT)特异性人IgG1 P329G LALA抗体共孵育5小时。然后通过添加检测溶液(One-Glo)并测量荧光素酶介导的氧化期间释放的光发射来测量荧光素酶活性(图5A)。该活性直接与作为阳性对照的直接肿瘤靶向TT-4x1BBL huIgG1进行比较(图5B)。
图36.测试抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1与肿瘤靶特异性huIgG1P329GLALA之间的不同比率。使用Jurkat报告细胞系测定法测试抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBLhuIgG1分子的功能性，其中分子要么保持在溶液中，要么通过添加Her2+KPL4人乳腺癌细胞而交联(图6A)。将直接肿瘤靶向的Her2x4-1BBL huIgG1与间接交联的抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1进行比较。因此，抗Her2 huIgG1 P329G LALA充当肿瘤靶Her2与抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1之间的接头，从而抗Her2 huIgG1P329G LALA与抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1之间的比率保持稳定(图6A)。还用CEACAM5+MKN45胃癌细胞和CEACAM5特异性抗体测试相同的设置(图6B)。
图37.使用Jurkat报告细胞系测定法测试抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1分子的功能性，其中分子要么保持在溶液中，要么通过添加Her2+KPL4人乳腺癌细胞而交联(图7A)。将直接肿瘤靶向的Her2x4-1BBL huIgG1与间接交联的抗P329G(M-1.7.24)x4-1BBLhuIgG1进行比较，后者通过抗Her2特异性huIgG1 P329G LALA连接，保持稳定的1:2比率。进一步包括非结合(DP47)分子作为对照。用CEACAM5+MKN45胃癌细胞(图7B)和FAP+NIH/3T3-huFAP克隆物19成纤维细胞(图7C)重复相同的操作。
图38.(A)能够与肿瘤靶向分子(例如IgG1、SM)的P329G突变(抗P329G IgG1)结合的ADCC感受态IgG1效应分子的示例性图示。(B)抗P329G IgG1效应分子与肿瘤靶向IgG的P329G突变和免疫效应细胞上的FcγIII的结合模式的示例性配置。
图39.在存在具有P329G LALA突变的肿瘤靶向IgG1的情况下，由抗P329G(VH3VL1)huIgG1和糖工程化的Fc(GE)介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。通过将靶细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放定量来评估。描绘的是技术性三个重复的平均值，误差线指示SD。作为统计分析，进行了具有Bonferroni校正的单因素方差分析。作为p值，使用GraphPadPrism 7中列出的新英格兰医学杂志(New England Journal of Medicine)样式。含义*＝P≤0,033；**＝P≤0,002；***＝P≤0,001。
图40.用抗P329G(VH3VL1)huIgG1与具有P329G LALA突变的肿瘤靶向IgG1组合进行活化后，NK细胞上CD16受体的下调。通过流式细胞术评估。描绘的是来自技术性三个重复的平均值，误差线指示SD。作为统计分析，进行了具有Bonferroni校正的单因素方差分析。作为p值，使用GraphPadPrism 7中列出的新英格兰医学杂志(New England Journal ofMedicine)样式。含义*＝P≤0,033；**＝P≤0,002；***＝P≤0,001。
图41.用抗P329G(VH3VL1)huIgG1与具有P329G LALA突变的肿瘤靶向IgG1组合进行活化后，NK细胞上CD107a的上调。通过流式细胞术评估。描绘的是来自技术性三个重复的平均值，误差线指示SD。作为统计分析，进行了具有Bonferroni校正的单因素方差分析。作为p值，使用GraphPadPrism 7中列出的新英格兰医学杂志(New England Journal ofMedicine)样式。含义*＝P≤0,033；**＝P≤0,002；***＝P≤0,001。
图42.只有抗FAP(克隆物4B9)人IgG1 P329GLALA与抗P329G人IgG1 mAb的组合在Jurkat FcγRIIIa报告细胞中诱导剂量依赖性NFAT活化，这是ADCC感受态的衡量标准。每个点代表一个实验的一式两份的技术平均值。平均值的标准误差由误差线指示。
(A)固定浓度(10μg/mL)的抗FAP(4B9)P329G LALA huIgG1与抗P329G huIgG1 mAB的8倍递减连续滴定组合使用。(B)抗FAP(4B9)P329G LALA huIgG1的8倍递减连续滴定与固定浓度(10μg/mL)的抗P329G huIgG1组合使用。作为完全岩藻糖基化(三角形)和无岩藻糖基化(圆形)人IgG1同种型而测试抗P329G huIgG1。
图43.后文提供示例性治疗工具箱的图示。将能够与靶细胞特异性结合的(治疗性)靶向抗体与能够与该靶向抗体的Fc结构域中的P329G突变特异性结合的不同免疫活化Fc结构域结合部分组合。所提供的效应子功能包括糖工程化的Fc结构域(例如，ADCC)、抗CD3(例如，T细胞活化)、4-1BBL和/或抗4-1BB(例如，T细胞共刺激)、抗CD28(例如，T细胞共刺激)和IL2v(例如T细胞增殖)。可以组合和/或随时间推移而将效应子功能滴定至最佳浓度以最大化治疗益处。
图44.用于PD-1阳性T细胞的顺式靶向的示例性配置的图示。将能够与PD1特异性结合并包含P329G突变的靶向抗体与包含IL2v免疫活化部分的免疫活化Fc结构域结合分子组合。
图45.不同浓度的抗FOLR1 P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB、P329R LALA Fc(摩尔比IgG:TCB2:1)对T细胞的动力学活化。使用的TCB浓度：0nM(图45A)、0.05nM(图45B)、5nM(图45C)。HeLa(FOLR1+)细胞用作靶细胞。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
图46.通过抗FOLR1 P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1TCB LALA Fc(摩尔比IgG:TCB 2:1)在几个FOLR1+靶细胞系上进行T细胞的活化。作为靶细胞，使用了HeLa(图46A)、JAR(图46B)、OVCAR-3(图46C)、SKOV-3(图46D)。HeLa(FOLR1+)细胞用作靶细胞。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
图47.通过抗FOLR1 P329G LALA huIgG1与含有LALA Fc或P329R LALA Fc的抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB(摩尔比IgG:TCB 2:1)进行T细胞的活化。HeLa(FOLR1+)细胞用作靶细胞。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
图48.在存在抗FOLR1 P329G LALA huIgG1与含有LALA Fc或P329R LALA Fc的抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB(摩尔比IgG:TCB 2:1)的情况下，通过CD8+T细胞上的CD25上调来测量原代人T细胞活化。作为效应细胞，使用来自健康供体的泛T细胞(图48A、48C)或PBMC(图48B、48D)。使用SKOV-3(FOLR1+)(图48A、48B)或不使用靶细胞(图48C、48D)。48小时后，通过流式细胞术进行分析。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
图49.通过靶向肿瘤的P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3 2+1 TCBP329R LALA Fc(摩尔比IgG:TCB 2:1)进行T细胞的活化，其中P035.093、CH2527或克隆物22作为CD3结合物。对几种靶和几种靶细胞进行。作为靶和靶细胞对，使用以下：CD19+SU-DHL-8细胞(图49A)、FOLR1+HeLa细胞(图49B)、CEA+MKN-45细胞(图49C)、HER2+LNCaP细胞(图49D)、STEAP1+LNCaP细胞(图49E)。通过使用Jurkat-NFAT报告基因测定法对CD3下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
图50.在存在抗FOLR1(图50A)或抗CEA(图50B)P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB P329R LALA Fc的情况下，通过原代人泛T细胞进行的肿瘤细胞裂解的动力学。使用HeLa NLR(FOLR1+)(图50A)和MKN-45NLR(图50B)作为靶细胞。通过将随着时间推移的红核细胞计数定量来评估。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
图51.在存在抗FOLR1 P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3 2+1 TCBP329R LALA Fc(摩尔比IgG:TCB 2:1)的情况下，通过原代人泛T细胞进行的肿瘤细胞裂解的动力学，其中P035.093、CH2527或克隆物22作为CD3结合物。使用HeLa NLR(FOLR1+)作为靶细胞。通过将随着时间推移的红核细胞计数定量来评估。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
图52.在存在抗FOLR1 P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3 2+1 TCBP329R LALA Fc(摩尔比IgG:TCB 2:1)的情况下，通过CD8+T细胞上的CD69上调来测量原代人T细胞活化，其中P035.093、CH2527或克隆物22作为CD3结合物。作为效应细胞，使用来自三个健康供体的泛T细胞：供体A(图52A)、供体B(图52B)、供体C(图52C)。HeLa(FOLR1+)用作靶细胞。48小时后，通过流式细胞术进行分析。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
图53.在存在100nM抗CEA P329G LALA huIgG1和0.5nM抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB P329R LALA Fc的情况下，通过共刺激分子抗P329G(VH3VL1)x 4-1BBLLALA huIgG1,1+1和抗P329G(VH3VL1)x CD28 LALA huIgG1,1+1进行4-1BB报告T细胞的活化。SKOV-3huCEA(CEA+)细胞用作靶细胞。通过使用Jurkat-NFκB报告基因测定法对4-1BB下游信号传导的强度定量来进行评估。描绘的是三个重复的技术平均值；误差线指示SD。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广泛意义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物，例如其片段。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些方面，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在一些方面，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。
如本文所用，“活化性T细胞抗原”是指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞表面表达的抗原决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。在一特定实施例中，活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3的ε亚基(参见UniProt编号P07766(版本130)、NCBI RefSeq编号NP_000724.1；或UniProt编号Q95LI5(版本49)、NCBI GenBank编号BAB71849.1)。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价交互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1交互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性方法。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如减少的与Fc受体的结合，或增加的与另一肽的缔合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如Fc区域的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology23:1126-1136(2005)。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施例中，抗原结合部分能够将其所附接的实体(例如第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至带有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。在另一个实施例中，抗原结合部分能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)活化信号传导。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施例中，抗原结合部分可包含如本文进一步定义且在本领域中已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种：κ和λ。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中称为抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。在某些方面，抗体是IgG1同种型。在某些方面，抗体是具有P329G、L234A和L235A突变以降低Fc区效应子功能的IgG1同种型。在其他方面，抗体是IgG2同种型。在某些方面，抗体是在铰链区具有S228P突变的IgG4同种型，以改善IgG4抗体的稳定性。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
如本申请中所用的术语“源自人源的恒定区”或“人恒定区”表示亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链kappa或lambda区。此类恒定区可用于人抗体或人源化抗体中，并且在现有技术中是众所周知的并且例如，通过以下描述的：Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)(还参见，例如Johnson，G.，和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。除非本文另外规定，否则恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为Kabat的EU索引，如在Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。
所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域发生交换(即互相替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1组成的肽链(VL-CH1，在N末端至C末端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL组成的肽链(VH-CL，在N末端至C末端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为交叉Fab分子的“重链”。
药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
如本文所用，关于Fab分子等的术语“第一”、“第二”或“第三”在每种类型的部分多于一种时用于方便区分。除非明确说明，否则使用这些术语并不旨在赋予免疫活化Fc结构域结合分子特定的顺序或取向。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
所谓“融合”，意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或更多个肽接头通过肽键链接。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性链接的氨基酸单体的分子。在某些实施例中，抗原结合部分中的一个是单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接以形成单肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施例中，单链Fab分子中Fab轻链的C末端连接至Fab重链的N末端。
与之相比，所谓“常规”Fab分子，意指处于其天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变结构域和恒定结构域组成的重链(VH-CH1，在N端至C端方向)，以及由轻链可变结构域和恒定结构域组成的轻链(VL-CL，在N端至C端方向)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“经切割的变体重链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc结构域(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一个实施例中，包括如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。本发明的组合物，诸如本文所述的药物组合物，包含本发明的抗原结合分子群体。该抗原结合分子群体可包含具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子。该抗原结合分子群体可以由具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子的混合物组成，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的该抗原结合分子具有经切割的变体重链。在本发明的一个实施例中，包含本发明的抗原结合分子群体的组合物包含抗原结合分子，该抗原结合分子包含重链，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含本发明的抗原结合分子群体的组合物包含免疫活化Fc结构域结合分子，该免疫活化Fc结构域结合分子包含重链，该重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，此类组合物包含抗原结合分子群体，该抗原结合分子群体由以下分子构成：包含包括如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链的分子；包含包括如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)的重链的分子；以及包含包括如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)的重链的分子。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
如本文所用的“Fc结构域结合部分”是能够与Fc结构域结合的抗原结合部分。
如本文所用的“延长半衰期的Fc”是包含在本发明的免疫活化Fc结构域结合分子中的Fc结构域(如果存在)。如本文所用的“靶Fc”是包含在本发明的靶向抗体中的Fc结构域。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经将外源核酸引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个方面，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在一个方面，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。
如本文所用的“免疫活化部分”是指在与免疫细胞上的抗原、受体或配体(或诱导活化的细胞的其他元件)相互作用时诱导该免疫细胞(例如T细胞)活化的一种或多种多肽。免疫活化部分的一个示例是抗原结合分子，其能够与活化T细胞抗原结合，触发T细胞受体复合物的信号传导级联。在特定实施例中，免疫活化部分是能够与CD3(特别是CD3的ε亚基)结合的抗原结合部分(参见UniProt编号P07766(版本130)、NCBI RefSeq编号NP_000724.1；或UniProt编号Q95LI5(版本49)、NCBI GenBank编号BAB71849.1)。其他示例性免疫活化部分是细胞因子(例如IL2)、能够与共刺激T细胞抗原(例如CD28、4-1BB)或共刺激配体(例如4-1BBL)结合的抗原结合部分，如本文所述。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。
“经分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备的生产过程中出现，此类变体通常以少量形式存在)之外，包含该群体的单个抗体是相同的及/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端至C端，每条重链均具有可变结构域(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变区，随后为三个恒定重链结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链均具有可变结构域(VL)，亦称为可变轻链结构域或轻链可变区，随后为恒定轻链(CL)结构域。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，2017年6月12日在线发表，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比”被定义为在对序列进行比对并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比，出于比对的目的而不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。。用于确定氨基酸序列相同的百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成相同的百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且如WO 2001/007611所述。
除非另外指明，否则出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列同一性百分比值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36创作，并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。可替代地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。氨基酸同一性百分比在输出比对中给出。如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一者使用，或与这些术语中的任何一者可互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
“特异性结合”意为结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，抗原结合部分与不相关蛋白质的结合程度小于该抗原结合部分与抗原的结合程度的约10％，如例如通过SPR所测得的。在某些实施例中，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
如本文所用，“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子能够诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定法是本文中描述的本领域已知的。
如本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。在特定实施例中，靶细胞抗原是CD20，特别是人CD20(参见UniProt编号P11836)。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞介素-2”或“IL-2”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-2，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括未加工的IL-2以及通过细胞中加工产生的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-2的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:166中。未加工的人IL-2包含具有N末端20氨基酸信号肽，该信号肽在成熟IL-2分子中不存在。
如本文所用的术语“IL-2突变体”或“突变IL-2多肽”旨在涵盖各种形式的IL-2分子的任何突变形式，包括全长IL-2、截短形式的IL-2，以及IL-2与另一分子诸如通过融合或化学缀合连接的形式。当关于IL-2使用时，“全长”旨在表示成熟的天然长度IL-2分子。例如，全长人IL-2是指具有133个氨基酸的分子(参见例如SEQ ID NO:166)。各种形式的IL-2突变体表征为具有至少一种影响IL-2与CD25相互作用的氨基酸突变。该突变可涉及对通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。通过氨基酸取代获得的突变体是优选的。除非另外指明，否则IL-2突变体在本文中可称为突变IL-2肽序列、突变IL-2多肽、突变IL-2蛋白质或突变IL-2类似物。
本文中关于SEQ ID NO:19所示的序列进行了对各种形式的IL-2的命名。本文可使用各种名称来指示相同的突变。例如，42位从苯丙氨酸到丙氨酸的突变可以表示为42A、A42、A42、F42A或Phe42Ala。
如本文所用的“人IL-2分子”是指一种包含氨基酸序列的IL-2分子，该氨基酸序列与如SEQ ID NO:166所示的人IL-2氨基酸序列至少约90％、至少约91％，至少约有92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％，或至少约96％相同。具体地，序列同一性为至少约95％，更特别地至少约96％。在特定实施例中，人IL-2分子是全长IL-2分子。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“CD25”或“IL-2受体的α亚基”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD25，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工CD25，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD25。该术语还涵盖天然存在的CD25变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施例中，CD25是人CD25。人CD25的氨基酸序列见于例如UniProt登录号P01589(第185版)。
如本文所用的术语“高亲和力IL-2受体”是指异源三聚形式的IL-2受体，其由受体γ亚基(也称为共同细胞因子受体γ亚基、γc或CD132，参见UniProt登录号P14784(第192版))、受体β亚基(也称为CD122或p70，参见UniProt登录号P31785(第197版))和受体α亚基(也称为CD25或p55，参见UniProt登录号P01589(第185版))组成。相比之下，术语“中间亲和力IL-2受体”是指仅包含γ亚基和β亚基，而不含α亚基的IL-2受体(综述请参见例如Olejniczak和Kasprzak，Med Sci Monit 14,RA179-189(2008))。
术语“TNF配体家族成员”或“TNF家族配体”是指促炎细胞因子。一般而言，细胞因子，且特别是TNF配体家族的成员，在免疫系统的刺激和协调中起着至关重要的作用。目前，基于序列、功能和结构的相似性，已将十九种细胞因子鉴定为TNF(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是II型跨膜蛋白，具有C端细胞外结构域(胞外域)、N端细胞内结构域和单个跨膜结构域。C端细胞外结构域，称为TNF同源结构域(THD)，在超家族成员之间具有20-30％的氨基酸同一性，并且负责与受体结合。TNF胞外域还负责使TNF配体形成被其特定受体识别的三聚复合物。TNF配体家族的成员选自由以下所组成的组：淋巴毒素 (也称为LTA或TNFSF1)、TNF(也称为TNFSF2)、LT(也称为TNFSF3)、OX40L(也称为TNFSF4)、CD40L(也称为CD154或TNFSF5)、FasL(也称为CD95L、CD178或TNFSF6)、CD27L(也称为CD70或TNFSF7)、CD30L(也称为CD153或TNFSF8)、4-1BBL(也称为TNFSF9)、TRAIL(也称为APO2L、CD253或TNFSF10)、RANKL(也称为CD254或TNFSF11)、TWEAK(也称为TNFSF12)、APRIL(也称为CD256或TNFSF13)、BAFF(也称为CD257或TNFSF13B)、LIGHT(也称为CD258或TNFSF14)、TL1A(也称为VEGI或TNFSF15)、GITRL(也称为TNFSF18)、EDA-A1(也称为外异蛋白A1)和EDA-A2(也称为外异蛋白A2)。除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族配体，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。
术语“共刺激TNF配体家族成员”或“共刺激TNF家族配体”是指TNF配体家族成员的一个亚组，其能够协同刺激T细胞的增殖和细胞因子生产。这些TNF家族配体可以在与其相应的TNF受体相互作用后共同刺激TCR信号，并且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集，从而启动导致T细胞活化的信号级联反应。共刺激TNF家族配体选自由4-1BBL、OX40L、GITRL、CD70、CD30L和LIGHT组成的组，更特别地，共刺激TNF配体家族成员为4-1BBL。
如前文所述，4-1BBL为一种II型跨膜蛋白，并且是TNF配体家族的一个成员。已经描述了具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的完整或全长4-1BBL在细胞表面形成三聚体。三聚体的形成是由4-1BBL胞外域的特异性基序促成的。所述基序在本文中被指定为“三聚化区域”。人4-1BBL序列的氨基酸50-254形成了4-1BBL的细胞外结构域，但即使是其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施例中，术语“4-1BBL胞外域或其片段”是指具有选自SEQID NO:120(人4-1BBL的氨基酸52-254)、SEQ ID NO:117(人4-1BBL的氨基酸71-254)、SEQID NO:119(人4-1BBL的氨基酸80-254)和SEQ ID NO:118(人4-1BBL的氨基酸85-254)的氨基酸序列的多肽，或者具有选自SEQ ID NO:121(人4-1BBL的氨基酸71-248)、SEQ ID NO:124(人4-1BBL的氨基酸52-248)、SEQ ID NO:123(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ ID NO:122(人4-1BBL的氨基酸85-248)的氨基酸序列的多肽，但能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
“胞外域”是延伸到细胞外空间(即靶细胞外的空间)的膜蛋白的结构域。胞外域通常是蛋白质的启动与表面接触从而导致信号转导的部分。因此，本文定义的TNF配体家族成员的胞外域是指TNF配体蛋白的延伸到细胞外空间中的部分(细胞外结构域)，但也包括其负责三聚化和用于与相应的TNF受体结合的较短部分或片段。因此，术语“TNF配体家族成员的胞外域或其片段”是指形成细胞外结构域的TNF配体家族成员的细胞外结构域或其仍然能够与受体结合的部分(受体结合结构域)。
如本文所用，术语“PD1”、“人PD1”、“PD-1”或“人PD-1”(也称为程序性细胞死亡蛋白1，或程序性死亡1)是指人蛋白质PD1。还参见UniProt登录号Q15116(第156版)。如本文所用，“与PD-1结合”、“与PD-1特异性地结合”、“结合至PD-1”的抗体或“抗PD-1抗体”是指一种抗体，该抗体能够以足够的亲和力结合PD-1，尤其是在细胞表面上表达的PD-1多肽，使得该抗体可用作靶向PD-1的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中，抗PD-1抗体与不相关的非PD-1蛋白质的结合程度小于所测量的所述抗体与PD-1的结合的约10％，例如通过放射性免疫测定(radioimmunoassay，RIA)或流式细胞术(flow cytometry，FACS)或通过使用生物传感器系统(诸如
Figure BDA0004003174050000331
系统)进行表面等离子体共振测定法测定。在某些实施例中，结合至PD-1的抗体与人PD-1结合的结合亲和力的KD值为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)。在一个实施例中，使用人PD-1的细胞外结构域(ECD)作为抗原，以表面等离振子共振测定法测定结合亲和力的KD值。
具体实施方式
本发明提供一种基于模块化抗体的平台，用于灵活的抗原靶向和个体免疫细胞刺激，可以适应于所需的适应症。与直接与其目标靶接合的常规双特异性形式和检查点调节物相比，本发明由两个成分组成，这两个成分可以单个地调整并以即插即用的方式使用。该模块化平台主要关注两个部分：(i)一种靶向抗体，用于经由易于生产的靶向分子进行精确和选择性的抗原靶向，如果需要，该分子具有刺激免疫细胞的能力，和(ii)一种特异性地识别该靶向抗体的Fc部分的免疫活化(Fc结构域结合)分子，从而募集免疫效应细胞并活化它们，例如经由建立免疫突触来重定向CTL并启动靶细胞的后续裂解(参见图1和43)。通过靶向抗体与免疫活化(Fc结构域结合)分子的组合，用来刺激单个免疫细胞的个性化、可定制的现成方法是可能的，而无需为每个独特的表面抗原生成不同的效应分子。
因此，在一个方面，本发明提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子。
在本发明的一个方面，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)Fc结构域结合部分，和
(b)免疫活化部分。
在一些方面，免疫活化Fc结构域结合分子不包含Fc结构域，例如，如果免疫活化Fc结构域结合分子的短半衰期是优选的。因此，本发明提供没有Fc结构域的免疫活化Fc结构域结合分子(示例性形式参见图2O至2Z)。
然而，在许多情况下，优选在本发明的免疫活化Fc结构域结合分子中包括Fc结构域。Fc结构域赋予抗体有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。
因此，在本发明的优选方面，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含(c)延长半衰期的Fc结构域。值得注意的是，可能需要确保Fc结构域结合部分不能与延长半衰期的Fc结合。Fc结构域结合部分与延长半衰期的Fc结构域的结合可导致免疫活化Fc结构域结合分子的自结合，即一个免疫活化Fc结构域结合分子经该延长半衰期Fc结构域与另一个(相同的)Fc结构域结合分子结合。自结合可导致多个免疫活化Fc结构域结合分子的交联，这可能是不希望的。
因此，在本发明的优选方面，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)免疫活化部分，和
(c)延长半衰期的Fc，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
由于Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合，因此不会发生自结合或交联，即免疫活化Fc结构域结合分子将(仅)识别包含第一组至少一个氨基酸取代的Fc结构域并与该Fc结构域结合。包含第一组至少一个氨基酸取代的Fc结构域在本文中称为靶Fc结构域。包含在免疫活化Fc结构域结合分子中的Fc结构域在本文中称为延长半衰期的Fc结构域。不受理论束缚，本领域技术人员将清楚靶Fc结构域还可以延长靶向抗体的半衰期。然而，为了清楚地区分靶Fc结构域与包含在本发明的免疫活化Fc结构域结合分子中的Fc结构域，如本文所述的延长半衰期的Fc结构域将总是指包含在免疫活化Fc结构域结合分子中的Fc结构域。
如本文所述的Fc结构域(例如，靶Fc结构域或延长半衰期的Fc结构域)由一对多肽链组成，所述多肽链包含免疫球蛋白分子的重链结构域。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含不超过一个Fc结构域。
如前所述，Fc结构域赋予抗体有利的药代动力学特性，包括长血清半衰期。然而，同时，其可能导致不希望地靶向至表达Fc受体的细胞，而不是优选的带有抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，所述细胞因子释放与T细胞活化特性和免疫活化Fc结构域结合分子的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。由于对T细胞的潜在摧毁(例如通过NK细胞)，除T细胞以外的(带有Fc受体的)免疫细胞的活化甚至可能降低免疫活化Fc结构域结合分子的功效。
如本文所述，在优选的实施例中，靶Fc结构域包含第一组至少一个氨基酸取代。在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合且/或降低效应子功能。此外，在其中免疫活化Fc结构域结合分子包含延长半衰期的Fc结构域的实施例中，该延长半衰期的Fc结构域可包含第二组至少一个氨基酸取代。在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合且/或降低效应子功能。
因此，本发明的一个特定方面是降低靶向抗体和/或免疫活化抗体的效应子功能。在此类实施例中，Fc结构域结合部分与包含第一组至少一个氨基酸取代的Fc结构域(靶Fc结构域)特异性地结合，但不与包含第二组至少一个氨基酸取代的Fc结构域(延长半衰期的Fc结构域)特异性地结合。下文描述了具有此类所需特异性的Fc结构域结合部分，并且生成具有所需特异性的其他Fc结构域结合部分的方法也在下文中描述(例如，用包含第一组至少一个氨基酸取代的Fc结构域进行哺乳动物免疫系统的免疫并筛选不与包含第二组至少一个氨基酸取代的Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，其中第一组和/或第二组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合且/或降低效应子功能)。
一种示例性Fc结构域结合部分，其与靶Fc结构域(其中第一组至少一个氨基酸取代包含P329G取代)特异性地结合但不与延长半衰期的Fc结构域(其中第二组至少一个氨基酸取代不包含P329G取代，即在P329位置处是野生型或在P329位置处包含除甘氨酸以外的氨基酸取代)特异性地结合，是包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的CDR序列的抗P329G(M-1.7.24)huIgG1结合物(根据Kabat EU索引编号)并在WO2017/072210中进一步描述。
与靶Fc结构域特异性地结合但不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合的另一个示例性Fc结构域结合部分是包含SEQ ID NO:168、169、170、171、172、173的CDR序列的抗AAA结合物(根据Kabat EU索引编号)并在WO2017/072210中进一步描述。
优选地，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域分别赋予靶向抗体和/或免疫活化Fc结构域结合分子增加的效应子功能。因此，在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代增加与Fc受体的结合且/或增加效应子功能。在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代增加与Fc受体的结合且/或增加效应子功能。可以如本文所述生成具有此类所需特异性的Fc结构域结合部分，例如，通过用包含第一组至少一个氨基酸取代的Fc结构域进行哺乳动物免疫系统的免疫并筛选不与包含第二组至少一个氨基酸取代的Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，其中第一组和/或第二组至少一个氨基酸取代增加与Fc受体的结合和/或增加效应子功能。
赋予与Fc受体的此类结合和/或效应子功能的Fc突变(例如氨基酸取代)是本领域已知的并且在下文中描述。在一个实施例中，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域是IgG Fc结构域，特别是IgG1或IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个此类实施例中，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域(或包含所述Fc结构域的分子)各自表现出与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的分子)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的与Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的分子)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的效应子功能。在一个实施例中，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域(或包含所述Fc结构域的分子)基本上不与Fc受体结合和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。在一个实施例中，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种效应子功能。在一个特定实施例中，效应子功能是ADCC。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域各自表现出基本相似的与新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域(或包含所述Fc结构域的分子)各自表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的分子)与FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施例中，与非工程化的Fc结构域相比，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域单个地经工程化以具有降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域各自包含一个或多个氨基酸突变，该一个或多个氨基酸突变降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。通常，相同的一个或多个氨基酸取代存在于靶Fc结构域的两个亚基的每一个中和/或延长半衰期的Fc结构域的两个亚基的每一个中。然而，如果应确保Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域结合，则靶Fc结构域中的氨基酸取代与延长半衰期的Fc结构域中的氨基酸取代不能相同。在此类实施例中，第一组至少一个氨基酸取代和第二组至少一个氨基酸取代设想为如下文所述，每组各自包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代降低与Fc受体的结合和/或效应子功能。在一个实施例中，氨基酸取代降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中，氨基酸取代将Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在超过一个降低靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域与Fc受体的结合亲和力的氨基酸取代的实施例中，这些氨基酸取代的组合可以将Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施例中，包含经工程化的Fc结构域的免疫活化Fc结构域结合分子表现出与包含非工程化的Fc结构域的分子相比小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％的与Fc受体的结合亲和力。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些实施例中，对补体组分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的分子)表现出非工程化形式的Fc结构域(或包含所述非工程化形式的所述Fc结构域的分子)与FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域，或包含所述Fc结构域的本发明的分子可各自表现出此类亲和力的大于约80％或甚至大于约90％。在某些实施例中，与非工程化的Fc结构域相比，靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域单个地经工程化以具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个实施例中，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种的降低的效应子功能。在一个特定实施例中，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个实施例中，降低的ADCC为由非工程化的Fc结构域(或包含非工程化的Fc结构域的分子)诱导的ADCC的小于20％。
第一组至少一个氨基酸取代
如图1所示，第一组至少一个氨基酸取代包括在靶向抗体中(在靶Fc结构域中)。因此，在本发明的一个方面，如本文所述的靶Fc结构域包含第一组至少一个氨基酸取代。在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代包含至少一个氨基酸取代，该至少一个氨基酸取代降低靶Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。在一个实施例中，靶Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更具体的实施例中，靶Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一些实施例中，靶Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施例中，靶Fc结构域是IgG1Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，靶Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别地是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，靶Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，和在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，所述进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，靶Fc结构域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更特定的实施例中，靶Fc结构域包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”)。在一个此类实施例中，靶Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在通过引用而整体并入本文的PCT公开号WO 2012/130831中所述。WO2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，靶向抗体的靶Fc结构域是IgG4 Fc结构域，特别是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4靶Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P(根据Kabat EU索引编号)。为了进一步降低其与Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4靶Fc结构域包含在位置L235处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代L235E(根据Kabat EU索引编号)。在另一实施例中，IgG4靶Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)。在特定实施例中，IgG4靶Fc结构域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat EU索引编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在特定实施例中，表现出与天然IgG1 Fc结构域相比降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的靶Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A且任选地包含P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P、L235E且任选地包含P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat EU索引编号)。
在某些实施例中，已消除了靶Fc结构域的N-糖基化。在一个此类实施例中，靶Fc结构域包含在位置N297处的氨基酸取代，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
除了上文所述的靶Fc结构域外，具有降低的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的靶Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat EU索引编号)。此类靶Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327处中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变靶Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。替代性地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评价靶Fc结构域或包含靶Fc结构域的靶向抗体与Fc受体的结合亲和力。
靶Fc结构域或包含此类靶Fc结构域的靶向抗体的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定法。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl AcadSci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0004003174050000421
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad SciUSA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些实施例中，靶Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合降低。因此，在一些实施例中，其中靶Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定靶向抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
第二组至少一个氨基酸取代
如图1所示，第二组至少一个氨基酸取代包括在免疫活化Fc结构域结合分子的延长半衰期的Fc结构域中。因此，在本发明的一个方面，如本文所述的延长半衰期的Fc结构域包含第二组至少一个氨基酸取代。在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代包含至少一个氨基酸取代，该至少一个氨基酸取代降低延长半衰期的Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。在一个实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更具体的实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一些实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施例中，延长半衰期的Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别地是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，和在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，所述进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
在优选实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含氨基酸取代L234A、L235A(“LALA”，根据Kabat EU索引编号)。在更特定实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施例中，延长半衰期的Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在通过引用而整体并入本文的PCT公开号WO 2012/130831中所述。WO 2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
在优选实施例中，延长半衰期的Fc结构域是IgG1并且第二组至少一个氨基酸取代包括P329G取代。在一个特定的此类实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
然而，在其中Fc结构域结合部分能够与包含P329G取代的靶Fc结构域结合的一些实施例中，优选地，延长半衰期的Fc结构域包含在位置P329处由除甘氨酸(G)以外的氨基酸进行的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，如上文所述的第一组至少一个氨基酸取代包括氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)，并且第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由除甘氨酸(G)以外的氨基酸进行的取代。在一个实施例中，第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由除甘氨酸(G)以外的氨基酸进行的取代，其中此类氨基酸不能在Fcγ受体内(特别是在FcgRIIIa内)的两个保守色氨酸侧链之间形成脯氨酸夹心。
在优选的此类实施例中，第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据KabatEU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。在更优选的此类实施例中，第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由精氨酸(R)进行的取代。如本文所述，“P329R”、“P329L”、“P329I”和“P329A”氨基酸取代各自单个地与“LALA”氨基酸取代组合几乎完全消除了Fcγ受体(以及补体)。在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子包含延长半衰期的Fc结构域，该延长半衰期的Fc结构域包含与选自由SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在优选实施例中，延长半衰期的Fc结构域是IgG1并且第二组至少一个氨基酸取代包括P329L取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个特定的此类实施例中，包含P329L取代(根据Kabat EU索引编号)的延长半衰期的Fc结构域包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一优选实施例中，延长半衰期的Fc结构域是IgG1并且第二组至少一个氨基酸取代包括P329I取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个特定的此类实施例中，包含P329I取代(根据Kabat EU索引编号)的延长半衰期的Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一优选实施例中，延长半衰期的Fc结构域是IgG1并且第二组至少一个氨基酸取代包括P329R取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个特定的此类实施例中，包含P329R取代(根据Kabat EU索引编号)的延长半衰期的Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一优选实施例中，延长半衰期的Fc结构域是IgG1并且第二组至少一个氨基酸取代包括P329A取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个特定的此类实施例中，包含P329A取代(根据Kabat EU索引编号)的延长半衰期的Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子的延长半衰期的Fc结构域是IgG4Fc结构域，特别是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4延长半衰期的Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P(根据Kabat EU索引编号)。为了进一步降低其与Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4延长半衰期的Fc结构域包含在位置L235处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代L235E(根据Kabat EU索引编号)。在另一实施例中，IgG4延长半衰期的Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)。在特定实施例中，IgG4延长半衰期的Fc结构域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat EU索引编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在特定实施例中，表现出与天然IgG1 Fc结构域相比降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的延长半衰期的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A且任选地包含P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P、L235E且任选地包含P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat EU索引编号)。
在某些实施例中，已消除了延长半衰期的Fc结构域的N-糖基化。在一个此类实施例中，延长半衰期的Fc结构域包含在位置N297处的氨基酸取代，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
除了上文所述的延长半衰期的Fc结构域外，具有降低的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的延长半衰期的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat EU索引编号)。此类延长半衰期的Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327处中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变(取代的)延长半衰期的Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。替代性地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评价延长半衰期的Fc结构域或包含延长半衰期的Fc结构域的免疫活化Fc结构域结合分子与Fc受体的结合亲和力。
延长半衰期的Fc结构域或包含此类延长半衰期的Fc结构域的免疫活化Fc结构域结合分子的效应子功能可以通过本领域已知的方法测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定法。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0004003174050000461
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些实施例中，延长半衰期的Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合降低。因此，在一些实施例中，其中延长半衰期的Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定免疫活化Fc结构域结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含不同的Fab分子和免疫活化部分(例如，Fab分子、细胞因子、配体)，融合至延长半衰期的Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个，因此延长半衰期的Fc结构域的两个亚基通常包含在两条不同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中改善免疫活化Fc结构域结合分子的产率和纯度，因此将有利的是在免疫活化Fc结构域结合分子的Fc结构域(即延长半衰期的Fc结构域)中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在特定实施例中，根据本发明的延长半衰期的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO 2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与经互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于实现改善的重链异源二聚化的不同方法被认为是与根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子中的重-轻链修饰(在一个结合臂中进行VH和VL交换/替换并且在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的带电氨基酸的取代)组合的不同替代方案，所述不同替代方案减少轻链错配和Bence Jones型副产物。
在一个具体实施例中，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“杵入臼”修饰，所述修饰包含在延长半衰期的Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和在延长半衰期的Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述突起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在特定实施例中，在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内生成突起，所述突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内生成空腔，第一亚基的CH3结构域内的该突起可定位在该空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体实施例中，在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)的CH3结构域中，在位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)，并且在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)的CH3结构域中，在位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施例中，在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基中，另外，在位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且在位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。
在又一实施例中，在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基中，另外，在位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或在位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)，并且在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基中，另外，在位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定所述二聚体(Carter,J ImmunolMethods 248,7-15(2001))。
在特定实施例中，延长半衰期的Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且延长半衰期的Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定实施例中，免疫活化部分融合至延长半衰期的Fc结构域的第一亚基(包括“杵”修饰)。不希望受理论束缚，免疫活化部分与延长半衰期的Fc结构域的含杵亚基的融合将(进一步)最小化包含两个免疫活化部分的免疫活化Fc结构域结合分子的生成(两个含杵多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替代方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个实施例中，替代性地使用EP 1870459 A1中描述的异源二聚化方法。该方法基于在延长半衰期的Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的带电氨基酸。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的一个优选实施例是氨基酸突变R409D；在(延长半衰期的Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个中的K370E，和氨基酸突变D399K；在延长半衰期的Fc结构域的另一个CH3结构域中的E357K(根据KabatEU索引编号)。
在另一实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及，另外，氨基酸突变R409D；在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，和氨基酸突变D399K；在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述免疫活化Fc结构域结合分子包含在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及，另外，氨基酸突变R409D；在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，和氨基酸突变D399K；在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(全部根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代性地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(根据Kabat EU索引编号)。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步包含氨基酸突变L351K。在另一实施例中，第二CH3结构域进一步包含选自由Y349E、Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代性地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自由以下项组成的组：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e)N390R、N390K或N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(编号根据Kabat EU索引)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域进一步包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，替代性地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述杵入臼技术。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，延长半衰期的Fc结构域是IgG2亚类，并且替代性地使用在WO2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在替代性实施例中，促进延长半衰期的Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如，如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个此类实施例中，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K、E356K、D356K或E357K，更优选D399K和E356K)。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步或替代地包含用带负电荷的氨基酸对K439和/或K370进行的氨基酸取代，(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))(所有根据Kabat的EU索引编号)。
在又一实施例中，替代性地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat EU索引编号)。
在又一实施例中，替代性地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat编号EU指数)。
Fc结构域结合部分
如图1所示，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含至少一个与靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分。
因此，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子能够与靶向抗体(即治疗性抗体)特异性结合的靶Fc结构域。如本文所述，本发明提供通用平台以将特定效应子功能引导至靶细胞。靶向抗体识别靶细胞并与其结合。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子识别包含在靶向抗体中的靶Fc结构域并与其结合。靶Fc结构域赋予靶向抗体(即治疗性抗体)有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，同时，其可能导致治疗性抗体不期望地靶向至表达Fc受体的细胞，而不是优选的带有抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可能导致细胞因子释放，从而导致细胞因子受体的过度活化和治疗性抗体全身施用时的严重副作用。由于对免疫细胞的潜在摧毁，除T细胞以外的(带有Fc受体的)免疫细胞的活化甚至可能降低(多特异性)抗体的功效。因此，与例如天然IgG1 Fc结构域相比，本领域已知的治疗性抗体可以经工程化或突变以表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
在本发明的优选方面，靶向抗体经工程化或突变以表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。如上文所述，靶Fc结构域可以包含第一组至少一个氨基酸取代。因此，在优选实施例中，靶向抗体具有降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。同时，第一组至少一个氨基酸取代中的氨基酸取代用于经由Fc结构域结合部分特异性地靶向靶Fc结构域。下文描述了具有所需特异性的Fc结构域结合部分，并且生成具有所需特异性的其他Fc结构域结合部分的方法也在下文描述(例如用包含第一组至少一个氨基酸取代的Fc结构域进行哺乳动物免疫系统的免疫，参见例如通过引用并入本文的WO2017/072210)。
在优选实施例中，Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合(以避免两个或更多个本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的交联)。在此类实施例中，可能需要在靶Fc结构域中和延长半衰期的Fc结构域中的相同氨基酸位置处并入氨基酸取代。在一个此类实施例中，如前文所述的第一组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，并且如前文所述的第二组至少一个氨基酸取代包括在与第一组至少一个氨基酸取代相同的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代，其中与第一组至少一个氨基酸取代相比，第二组至少一个氨基酸取代中的氨基酸在相同的位置处被不同的氨基酸取代。在优选实施例中，Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域结合。可以如本文所述生成具有此类所需特异性的Fc结构域结合部分，例如，通过用包含第一组至少一个氨基酸取代的Fc结构域进行哺乳动物免疫系统的免疫并筛选不与包含第二组至少一个氨基酸取代的Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，其中第一组和/或第二组至少一个氨基酸取代增加与Fc受体的结合和/或增加效应子功能。
一种示例性Fc结构域结合部分，其与靶Fc结构域(其中第一组至少一个氨基酸取代包含P329G取代)特异性地结合但不与延长半衰期的Fc结构域(其中第二组至少一个氨基酸取代不包含P329G取代，即在P329位置处是野生型或在P329位置处包含除甘氨酸以外的氨基酸取代)特异性地结合，是包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的CDR序列的抗P329G(M-1.7.24)huIgG1结合物(根据Kabat EU索引编号)并在WO2017/072210中进一步描述。与靶Fc结构域特异性地结合但不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合的另一个示例性Fc结构域结合部分是包含SEQ ID NO:168、169、170、171、172、173的CDR序列的抗AAA结合物(根据Kabat EU索引编号)并在WO2017/072210中进一步描述。
在本发明的优选实施例中，提供包含能够与包含氨基酸取代P329G的突变Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分的免疫活化Fc结构域结合分子。P329G突变降低与Fcγ受体的结合和相关的效应子功能。因此，与非取代的Fc结构域相比，包含P329G取代的突变Fc结构域以降低的或消除的亲和力与Fcγ受体结合。在优选实施例中，Fc结构域结合部分不能与包含在位置P329处由除甘氨酸(G)以外的氨基酸取代的Fc结构域结合(根据KabatEU索引编号)。在一个实施例中，Fc结构域结合部分不能与包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由除甘氨酸(G)以外的氨基酸进行的取代的Fc结构域结合，其中此类氨基酸不能在Fcγ受体内(特别是在FcgRIIIa内)的两个保守色氨酸侧链之间形成脯氨酸夹心。在优选实施例中，Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸突变P329G的Fc结构域结合，但不能与包含在位置P329处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的氨基酸取代的Fc结构域结合。
在特定实施例中，第一组至少一个氨基酸取代包括在位置P329处的氨基酸取代(在IgG1 Fc中)。在优选实施例中，第一组至少一个氨基酸取代包括在IgG1 Fc中的氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合。
在一个实施例中，能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:11、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:21组成的组的至少一个重链互补决定区；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:26组成的组的至少一个轻链互补决定区。
在一个实施例中，能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)、EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)和EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)组成的组；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
在一个特定实施例中，能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
在一个特定实施例中，能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
在一个实施例中，能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
在一个实施例中，能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一个实施例中，能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一个实施例中，能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQID NO:8的轻链可变。
在优选实施例中，能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含SEQ ID NO:12的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
在另一优选实施例中，能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含SEQ ID NO:17的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
在另一优选实施例中，能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
在另一实施例中，Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)的Fc结构域结合。在一个实施例中，Fc结构域结合部分不能与包含在位置I253、H310和H435处由除丙氨酸(A)以外的氨基酸取代的Fc结构域结合(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代I253A、H310A和H435A的Fc结构域结合，但不能与包含在位置I253、H310和H435处由除丙氨酸(A)以外的氨基酸进行的氨基酸取代的Fc结构域结合(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代包括在IgG1 Fc中的位置I253A、H310A和H435A处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，第一组至少一个氨基酸取代包括在IgG1 Fc中的氨基酸取代I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合。
在另一实施例中，能够与包含氨基酸突变I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列SYGMS(SEQ ID NO:168)；
(b)CDR H2氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:169)；和
(c)CDR H3氨基酸序列LGMITTGYAMDY(SEQ ID NO:170)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSQTIVHSTGHTYLE(SEQ ID NO:171)；
(e)CDR L2氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:172)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV FQGSHVPYT(SEQ ID NO:173)。
在一个实施例中，能够与包含氨基酸突变I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含：与SEQ ID NO:174的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ IDNO:175的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，能够与包含所述氨基酸突变I253A、H310A和H435A(根据KabatEU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合的Fc结构域结合部分包含SEQ ID NO:174的重链可变区序列和SEQ ID NO:175的轻链可变。
本发明的双特异性免疫活化Fc结构域结合分子
在又一方面，本发明提供双特异性免疫活化Fc结构域结合分子，即免疫活化部分是抗原结合部分(例如Fab分子)。
因此，本发明提供一种免疫活化Fc结构域结合分子，其包含
(a)如本文所述的与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)免疫活化部分，其是Fab分子、scFv分子或scFab分子，和
(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合，如本文所述。
免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子的组分可以多种构型彼此融合。示例性配置在图2中描述。在一些实施例中，免疫活化部分是Fab分子，其在Fab重链的C末端处融合至延长半衰期的Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。在一个此类实施例中，Fc结构域结合部分是Fab分子，其在Fab重链的C末端处融合至免疫活化部分(其是第二Fab分子)的Fab重链的N末端。在具体的此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一和第二Fab分子、由第一和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至延长半衰期的Fc结构域第一或第二亚基的N末端。此类配置在图2G和2K中示意性地描绘。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一具体的此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由Fc结构域(其是Fab分子)和免疫活化部分(其是第二Fab分子)、由第一和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域、以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第一和第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。此类配置在图2A和2D中示意性地描绘。第一Fab分子和第二Fab分子可以直接或通过肽接头与延长半衰期的Fc结构域融合。在一个特定实施例中，所述第一Fab分子和所述第二Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1Fc结构域的情况下。
在其他实施例中，Fc结构域结合部分是Fab分子，其在Fab重链的C末端处融合至延长半衰期的Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。在一个此类实施例中，免疫活化部分是Fab分子，其在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。在具体的此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一和第二Fab分子、由第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。此类配置在图2H和2L中示意性地描绘。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
Fab分子可以直接或通过肽接头融合至延长半衰期的Fc结构域或彼此融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2至20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个实施例中，所述肽接头的长度为至少5个氨基酸，在一个实施例中长度为5至100个氨基酸，在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个实施例中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)，在一个实施例中，x＝4并且n＝2或3，在另一实施例中，x＝4并且n＝2。在一个实施例中，所述肽接头是(G4S)2。用于使第一Fab分子和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽接头是(G4S)2。适于连结第一和第二Fab片段的Fab重链的一种示例性肽接头包含序列(D)-(G4S)2。适于连结第一和第二Fab片段的Fab重链的另一种示例性肽接头包含序列(G4SG5)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
在一些情况下，具有包含两个或更多个如本文所述的Fc结构域结合部分的免疫活化Fc结构域结合分子对于例如优化对靶Fc结构域的靶向或对于允许靶分子的交联将是有利的(参见图2B、2C、2E、2F、2I、2J、2M或2N中所示的示例)。
因此，在特定实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第三Fab分子，所述第三Fab分子与如本文所述的包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合。在一个实施例中，第三Fab分子是常规Fab分子。在一个实施例中，第三Fab分子与第一Fab分子相同(即第一和第三Fab分子包含相同的重链和轻链氨基酸序列并且具有相同的结构域排列(即常规或交叉))。在一个特定实施例中，第二Fab分子与免疫活化抗原(特别是CD3)特异性地结合，并且第一和第三Fab分子与如本文所述的包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合。
在替代性实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第三Fab分子，所述第三Fab分子与免疫活化抗原(特别是CD3)特异性地结合。在一个此类实施例中，第三Fab分子是交叉Fab分子(其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子)。在一个此类实施例中，第三Fab分子与第二Fab分子相同(即第二和第三Fab分子包含相同的重链和轻链氨基酸序列并且具有相同的结构域排列(即常规或交叉))。在一个此类实施例中，第一Fab分子与免疫活化抗原(特别是CD3)特异性地结合，并且第二和第三Fab分子与如本文所述的包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合。
在一个实施例中，第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在特定实施例中，第二和第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。在具体的此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子、由第一和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的N末端，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的N末端。此类配置在图2B和2E(特定实施例，其中第三Fab分子是常规Fab分子并且优选与第一Fab分子相同)和图2I和2M(替代性实施例，其中第三Fab分子是交叉Fab分子并且优选与第二Fab分子相同)中示意性地描绘。第二和第三Fab分子可以直接或通过肽接头与延长半衰期的Fc结构域融合。在特定实施例中，第二和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区融合至延长半衰期的Fc结构域。在具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在延长半衰期的Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一实施例中，第一和第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至延长半衰期的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。在具体的此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子、由第一和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一亚基的N末端，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。此类配置在图2C和2F(特定实施例，其中第三Fab分子是常规Fab分子并且优选与第一Fab分子相同)和图2J和2N(替代性实施例，其中第三Fab分子是交叉Fab分子并且优选与第二Fab分子相同)中示意性地描绘。第一和第三Fab分子可以直接或通过肽接头与延长半衰期的Fc结构域融合。在特定实施例中，第一和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区融合至延长半衰期的Fc结构域。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在免疫活化Fc结构域结合分子的配置中，其中Fab分子在Fab重链的C末端处通过免疫球蛋白铰链区融合至延长半衰期的Fc结构域的亚基中的每个亚基的N末端，两个Fab分子、铰链区和延长半衰期的Fc结构域基本上形成了免疫球蛋白分子。在一个特定实施例中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更特定的实施例中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施例中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一具体实施例中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他实施例中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
在本发明的一些免疫活化Fc结构域结合分子中，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合，任选地经由肽接头融合。根据第一和第二Fab分子的构型，第一Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第二个Fab分子的Fab轻链的N末端，或第二Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N末端。第一和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步降低了未匹配Fab重链和轻链的错配，并且还降低了表达本发明的一些免疫活化Fc结构域结合分子所需的质粒数量。
在某些实施例中，根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))，以及一种多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子还包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，第一Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在这些实施例中的一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第二Fab分子的交叉Fab轻链多肽，在该多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在这些实施例中的其他实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1))，或其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))，视情况而定。
根据这些实施例的免疫活化Fc结构域结合分子可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些方面，免疫活化Fc结构域结合分子不包含Fc结构域，例如，如果免疫活化Fc结构域结合分子的短半衰期是优选的。因此，本发明提供没有Fc结构域的免疫活化Fc结构域结合分子(示例性形式参见图2O至2Z)。在一些实施例中，第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。在某些此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子不包含Fc结构域。在某些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一和第二Fab分子以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。此类配置在图2O和2S中示意性地描绘。在其他实施例中，第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。在某些此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子不包含Fc结构域。在某些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一和第二Fab分子以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。此类配置在图2P和2T中示意性地描绘。在一些实施例中，第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。在特定的此类实施例中，所述第三Fab分子是常规Fab分子。在其他此类实施例中，所述第三Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在某些此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。此类配置在图2Q和2U中示意性地描绘(特定实施例，其中第三Fab分子是常规Fab分子并且优选与第一Fab分子相同)。在一些实施例中，第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的N末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的C末端。在特定的此类实施例中，所述第三Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在其他此类实施例中，所述第三Fab分子是常规Fab分子。在某些此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的N末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的C末端。此类配置在图2W和2Y中示意性地描绘(特定实施例，其中第三Fab分子是交叉Fab分子并且优选与第二Fab分子相同)。在一些实施例中，第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的N末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的C末端。在特定的此类实施例中，所述第三Fab分子是常规Fab分子。在其他此类实施例中，所述第三Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在某些此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的N末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的C末端。此类配置在图2R和2V中示意性地描绘(特定实施例，其中第三Fab分子是常规Fab分子并且优选与第一Fab分子相同)。在一些实施例中，第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。在特定的此类实施例中，所述第三Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在其他此类实施例中，所述第三Fab分子是常规Fab分子。在某些此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地存在的一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。此类配置在图2X和2Z中示意性地描绘(特定实施例，其中第三Fab分子是交叉Fab分子并且优选与第一Fab分子相同)。
在某些实施例中，根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子还包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子还包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子还包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子还包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，而第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子还包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含一种多肽，在该多肽中，第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含一种多肽，在该多肽中，第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，第三Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子还包含一种多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子进一步包含一种多肽，在该多肽中，第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
根据以上实施例中的任一项，免疫活化Fc结构域结合分子的组分(例如Fab分子、Fc结构域)可以直接融合或通过在本文中描述或在本领域中已知的各种接头(特别是包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽接头)融合。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常是1至10的整数，通常是2至4。
荷电改性
在一些方面，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子是双特异性的，即它包含至少两个能够与两个不同抗原决定簇特异性结合的抗原结合部分。在一些方面，抗原结合部分是Fab分子(即由重链和轻链组成的抗原结合结构域，每条链包含可变结构域和恒定结构域)。在一个实施例中，所述Fab分子是人Fab分子。在另一方面，所述Fab分子是人源化Fab分子。在又一实施例中，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定结构域。
抗原结合部分中的至少一个抗原结合部分是交叉Fab分子。此类修饰降低了来自不同Fab分子的重链与轻链的错配，从而改善了重组生产中本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的产率和纯度。在可用于本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的特定交叉Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域(分别为VL和VH)交换。然而，即使进行该结构域交换，由于错配的重链与轻链之间的所谓Bence Jones型相互作用，免疫活化Fc结构域结合分子的制备物可能包含某些副产物(参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步降低来自不同Fab分子的重链和轻链的错配并因此增加所需免疫活化Fc结构域结合分子的纯度和产率，根据本发明，可以在与靶细胞抗原特异性地结合的Fab分子或与免疫活化抗原特异性地结合的Fab分子中的任一者的CH1和CL结构域找给你的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的带电氨基酸。在包含在免疫活化Fc结构域结合分子中的常规Fab分子中(诸如在例如图2A至2C、2G至2J中所示)，或在包含在免疫活化Fc结构域结合分子中的交叉Fab分子中(诸如在例如图2D至2F、2K至2N中所示)(而不是在两者中)进行电荷修饰。在特定实施例中，在包含在免疫活化Fc结构域结合分子中的常规Fab分子(其在特定实施例中与靶细胞抗原特异性地结合)中进行电荷修饰。
CD3结合免疫活化Fc结构域结合分子
在根据本发明的特定实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子能够同时与Fc结构域结合部分(其与如上文所述的包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合)和活化T细胞抗原(特别是CD3)结合。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子与包含Fc结构域(其包含第一组至少一个氨基酸取代)和至少一个能够与靶细胞上的抗原特异性结合的抗原结合部分的靶向抗体组合。在此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子能够通过在靶向抗体与靶细胞结合时同时与靶Fc结构域和活化T细胞抗原结合来交联T细胞和靶细胞。在甚至更特定的实施例中，此类同时结合导致靶细胞(特别是肿瘤细胞)的裂解。在一个实施例中，这种同时结合导致T细胞的活化。在其它实施例中，这种同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子与活化T细胞抗原(特别是CD3)结合而不同时交联至靶细胞，不会导致T细胞活化。
在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子与靶向抗体组合能够将T细胞的细胞毒活性重新导向靶细胞。在一具体实施例中，所述重新导向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别地，根据本发明的任何实施例的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
因此，在本发明的一个方面，免疫活化部分是能够与活化T细胞抗原(特别是CD3)特异性结合的抗原结合部分。
在一个实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含至少一种与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子(在本文中也称为“活化T细胞抗原结合Fab分子”)。在特定实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子包含不超过一个能够与活化T细胞抗原特异性结合的Fab分子(或其他Fab分子)。在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子提供与活化T细胞抗原的单价结合。
在特定实施例中，与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施例中，与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。在存在超过一种与包含在免疫活化Fc结构域结合分子中的靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子的实施例中，与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子优选是交叉Fab分子，并且与靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。
在替代性实施例中，与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。在此类实施例中，与靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。
在特定实施例中，活化T细胞抗原是CD3，特别是人CD3。在特定实施例中，活化T细胞抗原结合Fab分子与人和食蟹猴CD3具有交叉反应性(即特异性地结合)。在一些实施例中，活化T细胞抗原是CD3的ε亚基(CD3ε)。
在一些实施例中，活化T细胞抗原结合Fab分子与CD3(特别是CD3ε)特异性地结合，并且包含选自由SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:43组成的组的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自由SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55的组的至少一个轻链CDR。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:35的重链CDR1、SEQ ID NO:37的重链CDR2和SEQ ID NO:43的重链CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:53的轻链CDR1、SEQ ID NO:54的轻链CDR2和SEQ ID NO:55的轻链CDR3。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：与SEQ ID NO:49至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO:56至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在一些实施例中，活化T细胞抗原结合Fab分子与CD3(特别是CD3ε)特异性地结合，并且包含选自由SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41组成的组的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自由SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55的组的至少一个轻链CDR。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:34的重链CDR1、SEQ ID NO:37的重链CDR2和SEQ ID NO:41的重链CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:53的轻链CDR1、SEQ ID NO:54的轻链CDR2和SEQ ID NO:55的轻链CDR3。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：与SEQ ID NO:47至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO:56至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在一些实施例中，活化T细胞抗原结合Fab分子与CD3(特别是CD3ε)特异性地结合，并且包含选自由SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:176组成的组的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自由SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55的组的至少一个轻链CDR。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:35的重链CDR1、SEQ ID NO:37的重链CDR2和SEQ ID NO:176的重链CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:53的轻链CDR1、SEQ ID NO:54的轻链CDR2和SEQ ID NO:55的轻链CDR3。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：与SEQ ID NO:177至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO:56至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，CD3结合Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含与SEQ ID NO:89至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(b)第二轻链，其包含与SEQ ID NO:70至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(c)第一重链，其包含与SEQ ID NO:178至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和
(d)第二重链，其包含与SEQ ID NO:179至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含与SEQ ID NO:89至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(b)第二轻链，其包含与SEQ ID NO:68至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(c)第一重链，其包含与SEQ ID NO:178至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和
(d)第二重链，其包含与SEQ ID NO:179至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含与SEQ ID NO:89至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(b)第二轻链，其包含与SEQ ID NO:180至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(c)第一重链，其包含与SEQ ID NO:178至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和
(d)第二重链，其包含与SEQ ID NO:179至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列。
在另一实施例中，提供如上文所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子中的任一种，其进一步包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
CD28结合免疫活化Fc结构域结合分子
在根据本发明的特定实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子能够同时与Fc结构域结合部分(其与如上文所述的包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合)和共刺激T细胞抗原(特别是CD28)结合。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子与包含Fc结构域(其包含第一组至少一个氨基酸取代)和至少一个能够与靶细胞上的抗原特异性结合的抗原结合部分的靶向抗体组合。在此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子能够通过在靶向抗体与靶细胞结合时同时与靶Fc结构域和共刺激T细胞抗原结合来交联T细胞和靶细胞。在甚至更特定的实施例中，此类同时结合导致靶细胞(特别是肿瘤细胞)的裂解。在一个实施例中，此类同时结合导致T细胞的活化或增加的T细胞的活化。在其他实施例中，此类同时结合导致T淋巴细胞(特别是细胞毒性T淋巴细胞)的(增加的)细胞应答，选自以下的组：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子与共刺激T细胞抗原(特别是CD28)结合而不同时交联至靶细胞，不会导致(增加的)T细胞活化。
在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子与靶向抗体组合能够增加T细胞对于靶细胞的细胞毒活性。在一具体实施例中，所述重新导向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别地，根据本发明的任何实施例的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
因此，在本发明的一个方面，免疫活化部分是能够与共刺激T细胞抗原(特别是CD28)特异性结合的抗原结合部分。
在一个实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含至少一种与共刺激T细胞抗原特异性地结合的Fab分子(在本文中也称为“共刺激T细胞抗原结合Fab分子”)。在特定实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子包含不超过一个能够与共刺激T细胞抗原特异性结合的Fab分子(或其他Fab分子)。在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子提供与共刺激T细胞抗原的单价结合。
在特定实施例中，与共刺激T细胞抗原特异性地结合的Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施例中，与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。在存在超过一种与包含在免疫活化Fc结构域结合分子中的靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子的实施例中，与共刺激T细胞抗原特异性地结合的Fab分子优选是交叉Fab分子，并且与靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。
在替代性实施例中，与共刺激T细胞抗原特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。在此类实施例中，与靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。
在特定实施例中，共刺激T细胞抗原是CD28，特别是人CD28。在特定实施例中，共刺激T细胞抗原结合Fab分子与人和食蟹猴CD28具有交叉反应性(即特异性地结合)。
在一些实施例中，共刺激T细胞抗原结合Fab分子与CD28特异性地结合，并且包含选自由SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96组成的组的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自由SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99的组的至少一个轻链CDR。
在一个实施例中，CD28结合Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:94的重链CDR1、SEQ ID NO:95的重链CDR2和SEQ ID NO:96的重链CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:97的轻链CDR1、SEQ ID NO:98的轻链CDR2和SEQ IDNO:99的轻链CDR3。
在一些实施例中，共刺激T细胞抗原结合Fab分子与CD28特异性地结合，并且包含选自由SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:102组成的组的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自由SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99的组的至少一个轻链CDR。
在另一实施例中，CD28结合Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:94的重链CDR1、SEQ ID NO:95的重链CDR2和SEQ ID NO:102的重链CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:103的轻链CDR1、SEQ ID NO:98的轻链CDR2和SEQ IDNO:99的轻链CDR3。
在一个实施例中，CD28结合Fab分子包含：与SEQ ID NO:100至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO:101至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，CD28结合Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
在一个实施例中，CD28结合Fab分子包含SEQ ID NO:104的重链可变区序列和SEQID NO:105的轻链可变区序列。
在一个实施例中，CD28结合Fab分子包含：与SEQ ID NO:104至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO:105至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，CD28结合Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。
在一个实施例中，CD28结合Fab分子包含SEQ ID NO:104的重链可变区序列和SEQID NO:105的轻链可变区序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。
在另一实施例中，提供如上文所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子中的任一种，其进一步包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
4-1BB结合免疫活化Fc结构域结合分子
在根据本发明的特定实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子能够同时与Fc结构域结合部分(其与如上文所述的包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合)和4-1BB结合。因此，在本发明的一个方面，免疫活化部分是能够与共刺激T细胞抗原(特别是4-1BB)特异性结合的抗原结合部分。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子与包含Fc结构域(其包含第一组至少一个氨基酸取代)和至少一个能够与靶细胞上的抗原特异性结合的抗原结合部分的靶向抗体组合。在此类实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子能够通过在靶向抗体与靶细胞结合时同时与靶Fc结构域和共刺激T细胞抗原结合来交联T细胞和靶细胞。在甚至更特定的实施例中，此类同时结合导致靶细胞(特别是肿瘤细胞)的裂解。在一个实施例中，此类同时结合导致T细胞的活化或增加的T细胞的活化。在其他实施例中，此类同时结合导致T淋巴细胞(特别是细胞毒性T淋巴细胞)的(增加的)细胞应答，选自以下的组：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子与共刺激T细胞抗原(特别是4-1BB)结合而不同时交联至靶细胞，不会导致(增加的)T细胞活化。
在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子与靶向抗体组合能够增加T细胞对于靶细胞的细胞毒活性。在一具体实施例中，所述重新导向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别地，根据本发明的任何实施例的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
在一个实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子包含至少一种与共刺激T细胞抗原特异性地结合的Fab分子(在本文中也称为“共刺激T细胞抗原结合Fab分子”)。在特定实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子包含不超过一个能够与共刺激T细胞抗原特异性结合的Fab分子(或其他Fab分子)。在一个实施例中，免疫活化Fc结构域结合分子提供与共刺激抗原的单价结合。
在特定实施例中，与共刺激T细胞抗原特异性地结合的Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施例中，与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。在存在超过一种与包含在免疫活化Fc结构域结合分子中的靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子的实施例中，与共刺激T细胞抗原特异性地结合的Fab分子优选是交叉Fab分子，并且与靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。
在替代性实施例中，与共刺激T细胞抗原特异性地结合的Fab分子是常规Fab分子。在此类实施例中，与靶Fc结构域特异性地结合的Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。
在特定实施例中，共刺激T细胞抗原是4-1BB，特别是人CD28。在特定实施例中，共刺激T细胞抗原结合Fab分子与人和食蟹猴4-1BB具有交叉反应性(即特异性地结合)。
在一些实施例中，共刺激T细胞抗原结合Fab分子与4-1BB特异性地结合，并且包含选自由SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135组成的组的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自由SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138的组的至少一个轻链CDR。
在一个实施例中，4-1BB结合Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:133的重链CDR1、SEQ ID NO:134的重链CDR2和SEQ ID NO:135的重链CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:136的轻链CDR1、SEQ ID NO:137的轻链CDR2和SEQID NO:138的轻链CDR3
在一个实施例中，4-1BB结合Fab分子包含：与SEQ ID NO:139至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO:140至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，4-1BB结合Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。
在一个实施例中，CD28结合Fab分子包含SEQ ID NO:139的重链可变区序列和SEQID NO:140的轻链可变区序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列。
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在另一实施例中，提供如上文所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子中的任一种，其进一步包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
包含细胞因子的免疫活化Fc结构域结合分子
在一个实施例中，免疫活化部分是细胞因子。在一个实施例中，细胞因子选自由IL2、IL7、IL15、IL18、IFNa和IFNg组成的组。在特定的此类实施例中，本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子包含具有免疫疗法有利特性的突变IL-2多肽。具体地，在突变IL-2多肽中消除了IL-2的有助于毒性而对IL-2的功效不是必需的药理学性质。此类突变IL-2多肽详细描述于WO 2012/107417中，该专利以引用方式整体并入本文。如上所述，不同形式的IL-2受体由不同的亚基组成，并且表现出不同的IL-2亲和力。由β和γ受体亚基组成的中等亲和力IL-2受体在静息效应细胞上表达，并且足以用于IL-2信号传导。另外包含该受体的α亚基的高亲和力IL-2受体，主要在调节性T(Treg)细胞上以及活化的效应细胞上表达，其中该受体与IL-2的接合可分别促进Treg细胞介导的免疫抑制或活化诱导的细胞死亡(AICD)。因此，不受理论的束缚，降低或消除IL-2对该IL-2受体的α亚基的亲和力应当减少IL-2诱导的调节性T细胞对效应细胞功能的下调和通过AICD过程实现的肿瘤耐受性的发展。在另一方面，保持对中等亲和力IL-2受体的亲和力应该保持IL-2对如NK和T细胞等效应细胞的增殖和活化的诱导。
包含在根据本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子中的突变白细胞介素-2(IL-2)多肽包含至少一个氨基酸突变，该至少一个氨基酸突变消除或降低突变IL-2多肽与IL-2受体的α亚基的亲和力并且保留突变IL-2多肽与中等亲和力IL-2受体的亲和力，各自与野生型IL-2多肽相比。
具有降低的CD25亲和力的人IL-2(hIL-2)的突变体可以例如通过氨基酸位置35、38、42、43、45或72或它们的组合处的氨基酸取代产生(对应于如SEQ ID NO:166所示的人IL-2氨基酸序列编号)。示例性氨基酸取代包括K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R，以及L72K。可用于本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子的特定IL-2突变体包含在与人IL-2的残基42、45或72或它们的组合相对应的氨基酸位置处的氨基酸突变。在一个实施例中，所述氨基酸突变是选自由以下项组成的组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K，更具体地是选自F42A、Y45A和L72G的组的氨基酸取代。与IL-2突变体的野生型形式相比，这些突变体表现出对中等亲和力的IL-2受体基本上相似的结合亲和力，并且对IL-2受体的α亚基和高亲和力IL-2受体具有大幅降低的亲和力。
有用突变体的其他特征可包括诱导携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞增殖的能力，在携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞中诱导IL-2信号传导的能力，使NK细胞产生干扰素(IFN)-γ作为次级细胞因子的能力，降低的诱导外周血单核细胞(PBMC)对次级细胞因子(特别是IL-10和TNF-α)进行加工(elaboration)的能力，降低的活化调节性T细胞的能力，降低的诱导T细胞凋亡的能力，以及降低的体内毒性特征。
可用于本发明的特定突变IL-2多肽包含三个氨基酸突变，该三个氨基酸突变消除或降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力，但保留突变IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变位于与人IL-2的残基42、45和72对应的位置处。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，所述三个氨基酸突变是选自以下项的组的氨基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R，以及L72K。在一个具体实施例中，所述三个氨基酸突变是氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(对应于如SEQ ID NO:166所示的人IL-2氨基酸序列编号)。
在某些实施例中，所述氨基酸突变使突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少5倍，具体地至少10倍，更具体地至少25倍。在存在多于一个降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可使突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少30倍、至少50倍，或甚至至少100倍。在一个实施例中，所述氨基酸突变或氨基酸突变的组合消除了突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力，使得通过表面等离子体共振检测不到结合。
当IL-2突变体表现出大于该IL-2突变体的野生型形式对中等亲和力IL-2受体的亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与中等亲和力受体的结合，即保留突变IL-2多肽对所述受体的亲和力。本发明的IL-2突变体可表现出大于约80％，甚至大于约90％的此种亲和力。
降低IL-2对IL-2受体的α亚基的亲和力与消除IL-2的O糖基化的组合产生了具有改善性质的IL-2蛋白质。例如，当突变IL-2多肽在诸如CHO或HEK细胞之类的哺乳动物细胞中表达时，消除O糖基化位点导致更均质的产物。
因此，在某些实施例中，突变IL-2多肽包含另外的氨基酸突变，该另外的氨基酸突变消除了在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O糖基化位点。在一个实施例中，消除与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O糖基化位点的所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代。示例性氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K，以及T3P。在一个具体实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代T3A。
在某些实施例中，突变IL-2多肽基本上是全长IL-2分子。在某些实施例中，突变IL-2多肽是人IL-2分子。在一个实施例中，突变IL-2多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:166所示氨基酸序列，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:166所示氨基酸序列的IL-2多肽相比，该至少一个氨基酸突变消除或降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在另一个实施例中，突变IL-2多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:167所示氨基酸序列，与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:167所示氨基酸序列的IL-2多肽相比，该至少一个氨基酸突变消除或降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。
在一个具体实施例中，突变IL-2多肽可以引发选自由以下项组成的组的细胞反应中的一种或多种细胞反应：活化T淋巴细胞的增殖、活化T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、活化B细胞的增殖、活化B细胞的分化、自然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、活化T细胞或NK细胞进行细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞活化杀伤(LAK)抗肿瘤细胞毒性。
在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，突变IL-2多肽具有降低诱导调节性T细胞中IL-2信号传导的能力。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，突变IL-2多肽在T细胞中诱导较少的活化诱导细胞死亡(AICD)。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，突变IL-2多肽具有降低的体内毒性特征。在一个实施例中，与野生型IL-2多肽相比，突变IL-2多肽具有延长的血清半衰期。
可用于本发明的特定突变IL-2多肽在与人IL-2的残基3、42、45和72对应的位置处包含四个氨基酸取代。具体的氨基酸取代是T3A、F42A、Y45A和L72G。如WO 2012/107417中所证实的，所述四重突变IL-2多肽表现为没有可检测的与CD25的结合、降低的诱导T细胞凋亡的能力、降低的诱导Treg细胞中IL-2信号传导的能力，以及降低的体内毒性特征。然而，它保留了在效应细胞中活化IL-2信号传导、诱导效应细胞增殖，以及通过NK细胞产生IFN-γ作为次级细胞因子的能力。
此外，如WO 2012/107417中所述，所述突变IL-2多肽具有进一步有利的性质，诸如降低的表面疏水性、良好的稳定性和良好的表达产率。出乎意料的是，与野生型IL-2相比，所述突变IL-2多肽还提供延长的血清半衰期。
用于本发明的IL-2突变体，除了在形成IL-2与CD25或糖基化位点的界面的IL-2区域中具有突变外，还可以在这些区域之外的氨基酸序列中具有一个或多个突变。人IL-2中的此类另外突变可提供额外的优点，诸如增强的表达或稳定性。例如，如在美国专利号4,518,584中所述，125位的半胱氨酸可以用中性氨基酸(诸如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸或缬氨酸)替代，从而分别产生C125S IL-2、C125A IL-2、C125T IL-2或C125V IL-2。如其中所述，还可以使IL-2的N末端丙氨酸残基缺失，从而产生诸如des-A1 C125S或des-A1 C125A之类的突变。另选地或结合地，IL-2突变体可包括这样的突变，通过所述突变通常在野生型人IL-2的104位存在的甲硫氨酸被诸如丙氨酸之类的中性氨基酸替代(参见美国专利号5,206,344)。所得突变体，例如des-A1 M104A IL-2、des-A1 M104A C125S IL-2、M104A IL-2、M104A C125A IL-2、des-A1 M104A C125A IL-2、或M104A C125S IL-2(这些和其他突变体可见于美国专利号5,116,943中和Weiger等人，Eur J Biochem 180,295-300(1989)中)可以与本发明的特定IL-2突变结合使用。
因此，在某些实施例中，突变IL-2多肽在与人IL-2的残基125对应的位置处包含另外的氨基酸突变。在一个实施例中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代C125A。
技术人员将能够确定哪些另外的突变可以为本发明的目的提供额外的优点。例如，将理解IL-2序列中的降低或消除IL-2对中等亲和力的IL-2受体的亲和力的氨基酸突变，诸如D20T、N88R或Q126D(参见例如US 2007/0036752)，可能不适合包括在根据本发明的突变IL-2多肽中。
在一个实施例中，与相应的野生型IL-2序列(例如如SEQ ID NO:166所示的人IL-2氨基酸序列)相比，突变IL-2多肽包含不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个，或不超过5个氨基酸突变。在一个特定实施例中，与相应的野生型IL-2序列(例如如SEQ ID NO:166所示的人IL-2氨基酸序列)相比，突变IL-2多肽包含不超过5个氨基酸突变。
在一个实施例中，突变IL-2多肽包含SEQ ID NO:167所示氨基酸序列。在一个实施例中，突变IL-2多肽由SEQ ID NO:167所示氨基酸序列组成。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-2的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)如本文所述的与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)免疫活化部分，它是一种突变IL-2多肽，其中突变IL-2多肽是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:166编号)的人IL-2分子；和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-2的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)如本文所述的与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)免疫活化部分，它是一种突变IL-2多肽，其中突变IL-2多肽是包含氨基酸取代T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:166编号)的人IL-2分子；和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在一个方面，本发明提供一种包含突变IL-2的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)如本文所述的与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)免疫活化部分，它是一种突变IL-2多肽，其中突变型IL-2多肽包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在上述实施例中的任一项中，突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处通过接头肽融合至延长半衰期的Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸
在一个方面，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)轻链，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个方面，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)轻链，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。
在优选的方面，免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子与能够与T细胞抗原(特别是CD8或PD-1)特异性结合的靶向抗体组合。在一个优选的实施例中，靶向抗体能够与PD-1特异性结合。此类组合可用于T细胞的顺式活化(参见图44)。在特定实施例中，免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子与靶向抗体组合，该靶向抗体包含：包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第一轻链和包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的重链。
在另一实施例中，提供如上文所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子中的任一种，其进一步包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
含有4-1BBL三聚体的免疫活化Fc结构域结合分子
在本发明的一个方面，免疫活化部分是共刺激T细胞配体，特别是4-1BBL。因此，在另一方面，本发明还提供新颖的含有4-1BBL三聚体的免疫活化Fc结构域结合分子。
在第一方面，本发明提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中免疫活化Fc结构域结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且特征在于，第二多肽包含4-1BBL的一个胞外域或其片段，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在又一方面，提供如前文所定义的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中，免疫活化Fc结构域结合分子的特征在于
(i)分别地，第一多肽含有CH1或CL结构域并且第二多肽含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH1或CL结构域的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域或其片段，或
(ii)分别地，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH3结构域的C末端的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CH3结构域的C末端的所述4-1BBL的仅一个胞外域或其片段，或
(iii)分别地，第一多肽含有VH-CL或VL-CH1结构域并且第二多肽含有VL-CH1结构域或VH-CL结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至VH或VL的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的VL或VH的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在另一方面，提供如前文所定义的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中，免疫活化Fc结构域结合分子的特征在于
(i)分别地，第一多肽含有CH1或CL结构域并且第二多肽含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH1或CL结构域的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域或其片段，或
(ii)分别地，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH3结构域的C末端的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CH3结构域的C末端的所述4-1BBL的仅一个胞外域或其片段，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在一个方面，4-1BBL胞外域包含选自由SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124组成的组的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:121的氨基酸序列。更特别地，4-1BBL胞外域包含SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:121的氨基酸序列。最特别地，4-1BBL胞外域包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。特别地，提供一种如前文所定义的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中4-1BBL的所有三个胞外域或其片段是相同的。
在又一方面，本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含选自由SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128组成的组的氨基酸序列，并且特征在于，所述第二多肽包含选自由SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120组成的组的氨基酸序列，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在一个方面，本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中抗原结合分子的特征在于第一多肽包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列并且特征在于第二多肽包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在又一方面，本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中抗原结合分子的特征在于第一多肽包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列并且特征在于第二多肽包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在另一方面，本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)分别含有CH1或CL结构域的第一多肽和含有CL或CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，
并且其中该抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连结以及连结至CH1或CL结构域的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，第二多肽包含通过肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连结的仅一个4-1BBL胞外域或其片段。
在一个方面，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，
(b)含有CH1结构域的第一多肽和含有CL结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，
并且其中该抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连结以及连结至CH1结构域的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL结构域连结的一个4-1BBL胞外域或其片段。
在另一方面，本发明提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在又一方面，本发明提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)超过一个与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中免疫活化Fc结构域结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且特征在于，第二多肽包含4-1BBL的一个胞外域或其片段，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在一个方面，本发明提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)两个与本文所述的靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分，和
(b)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键彼此连接，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结的两个4-1BBL胞外域或其片段，并且特征在于，所述第二多肽包含一个4-1BBL胞外域或其片段，和
(c)如本文所述的由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
在又一方面，本发明提供如前文定义的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中与靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分选自由抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白组成的组。
在一个方面，提供一种如前文所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中与靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分选自由抗体片段、Fab分子、交叉Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单结构域抗体或aVH和支架抗原结合蛋白组成的组。
在一个方面，与靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分是aVH或支架抗原结合蛋白。
在特定方面，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，与靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分是Fab分子或交叉Fab分子。特别地，与靶Fc结构域特异性地结合的Fc结构域结合部分是Fab。
在又一方面，提供一种根据本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段的肽在其C末端处通过第二肽接头融合至重链的CH1结构域，并且其中所述4-1BBL的一个胞外域或其片段在其C末端处通过第三肽接头融合至轻链上的CL结构域。
在另一方面，提供一种根据本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段的肽在其C末端处通过第二肽接头融合至重链的CL结构域，并且其中所述4-1BBL的一个胞外域或其片段在其C末端处通过第三肽接头融合至轻链上的CH1结构域。
在又一方面，本发明涉及一种根据本发明的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段的肽在其C末端处通过第二肽接头融合至轻链的CL结构域，并且其中所述4-1BBL的一个胞外域或其片段在其C末端处通过第三肽接头融合至重链的CH1结构域。
在特定方面，本发明涉及如上定义的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中肽接头是(G4S)2。
在另一方面，如前文所定义的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子包含由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在一个实施例中，提供一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，
(b)第二轻链，其包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。
(c)第一重链，其包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列；和
(d)第二重链，其包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列。
在另一实施例中，提供如上文所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子中的任一种，其进一步包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
包含Fc受体免疫活化部分的免疫活化Fc结构域结合分子
在本发明的一个方面，免疫活化部分是Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个实施例中，免疫活化部分诱导ACDD。在一个实施例中，Fc受体选自由FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)组成的列表。在特定实施例中，免疫活化部分是FcγRIIIa(CD16a)或其片段。
在特定实施例中，免疫活化部分是FcγRIIa(CD32)或其片段。在特定实施例中，免疫活化部分是FcαRI(CD89)或其片段。
根据本发明的另一特异性免疫活化Fc结构域结合分子
提供一种免疫活化Fc结构域结合分子，其包含
(a)Fab分子，其包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)、EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)和EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)组成的组；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
(b)IgG1 Fc结构域，其包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)
处由精氨酸(R)进行的取代，和
(c)如前所述的免疫活化部分。
提供一种免疫活化Fc结构域结合分子，其包含(a)Fab分子，其包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
(b)IgG1 Fc结构域，其包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由精氨酸(R)进行的取代，和
(c)如前所述的免疫活化部分。
提供一种免疫活化Fc结构域结合分子，其包含(a)Fab分子，其包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
(b)IgG1 Fc结构域，其包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由精氨酸(R)进行的取代，和
(c)如前所述的免疫活化部分。
提供一种免疫活化Fc结构域结合分子，其包含
(a)Fab分子，其包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
(b)IgG1 Fc结构域，其包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由精氨酸(R)进行的取代，和
(c)如前所述的免疫活化部分。
靶向抗体
靶向抗体能够与靶细胞结合(如43所示)。如前所述，靶向抗体包含靶Fc结构域，所述靶Fc结构域包含第一组至少一个氨基酸取代。靶向抗体可包含上文所述的任何修饰和/或取代，特别是如上文所述的第一组至少一个氨基酸取代。根据本发明的概念并且如前文所述，靶向抗体桥接/连接/连结本发明的免疫活化Fc结构域结合分子和靶细胞(参见例如图1、12、13、38和43)。
在一个方面，本发明提供与靶细胞上的靶抗原结合的靶向抗体。在一个方面，本发明提供与靶细胞上的靶抗原结合的分离的靶向抗体。在一个方面，本发明提供与选自由PD-L1、CD20、FolR1、CD25、FAP、EpCAM、STEAP1、Her2和CEA组成的列表的抗原特异性地结合的抗体。
在另一方面，靶向抗体能够与免疫细胞(特别是T细胞)结合。在优选实施例中，靶向抗体能够与PD-1结合。靶向PD-1对于将细胞因子靶向(递送)至T细胞特别有用。在一个实施例中，靶向抗体能够与PD-1结合。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体是IgG1同种型/亚类。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:146的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:147的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:148的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:149的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:150的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:151的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:152的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:153的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:154的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:155的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:156的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:157的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:158的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:159的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:160的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:161的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:162的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:163的轻链或其恒定部分。
在又一方面，如本文所述的靶向抗体包含SEQ ID NO:164的重链或其恒定部分。在另一方面，根据任何上述方面的抗体包含SEQ ID:165的轻链或其恒定部分。
在一个方面，C末端甘氨酸(Gly446)另外存在于上文所述的重链序列中。在一个方面，另外地存在C末端甘氨酸(Gly446)和C末端赖氨酸(Lys447)。
多核苷酸
本发明进一步提供编码如本文所述的免疫活化Fc结构域结合分子或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施例中，所述片段是抗原结合片段。
编码本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的多核苷酸可以表达为编码完整免疫活化Fc结构域结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性免疫活化Fc结构域结合分子。例如，Fab分子的轻链部分可以由单独的多核苷酸编码，该单独的多核苷酸来自包含Fab分子的重链部分、Fc结构域亚基和任选地存在的另一Fab分子(的一部分)的免疫活化Fc结构域结合分子的部分。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成Fab分子。在另一示例中，包含两个Fc结构域亚基中的一个亚基和任选地存在的一个或多个Fab分子(的一部分)的免疫活化Fc结构域结合分子的部分可以由与免疫活化Fc结构域结合分子的包含该两个Fc结构域亚基中的另一个和任选地存在的Fab分子(的一部分)的部分分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些实施例中，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的整个免疫活化Fc结构域结合分子。在其他实施例中，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子中的多肽。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
本发明的免疫活化Fc结构域结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码免疫活化Fc结构域结合分子(片段)的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个实施例中，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有免疫活化Fc结构域结合分子(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码免疫活化Fc结构域结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的免疫活化Fc结构域结合分子(片段)的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔a珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌免疫活化Fc结构域结合分子，可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的免疫活化Fc结构域结合分子或其片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。另选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记免疫活化Fc结构域结合分子的DNA可包含在免疫活化Fc结构域结合分子(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一实施例中，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个此类实施例中，宿主细胞包含一种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染)，该载体包含编码本发明免疫活化Fc结构域结合分子(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以经工程化以生成本发明的免疫活化Fc结构域结合分子或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持免疫活化Fc结构域结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的免疫活化Fc结构域结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，NatBiotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(HepG2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.AcadSci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含抗原结合结构域例如抗体的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化，以便也表达另一条抗体链，使得表达的产物为具有重链和轻链的抗体。
在一个实施例中，提供一种生产根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的方法，其中该方法包括在适于表达免疫活化Fc结构域结合分子的条件下培养本文所提供的包含编码免疫活化Fc结构域结合分子的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该免疫活化Fc结构域结合分子。
本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的组分在基因上彼此融合。可以设计免疫活化Fc结构域结合分子以使其组分彼此直接融合或通过接头序列间接融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试接头的功效。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的不同组分之间的接头序列的示例见于本文提供的序列中。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。
在某些实施例中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的一种或多种抗原结合部分至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并由其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring HarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。
任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可用于本发明的免疫活化Fc结构域结合分子中。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以是鼠、灵长类动物或人来源的。如果免疫活化Fc结构域结合分子旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro and Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332,323-329(1988)；Queen等人,ProcNatl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人,Proc Natl AcadSci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods 36,25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol28,489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36,43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人,Br J Cancer83,252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr OpinPharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并衍生自该抗体(参见，例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,New York,1987))。也可以通过以下方式来制备人抗体和人可变区：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以产生具有对抗原激发作出应答的人可变区的完整人抗体或完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。也可通过以下方式来产生人抗体和人可变区：分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列(参见，例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等人,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；以及McCafferty等人,Nature 348,552-554；Clackson等人,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。
在某些实施例中，根据例如美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法将可用于本发明的抗原结合部分工程化以具有增强的结合亲和力，其全部内容通过引用并入本文。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad,等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。竞争测定法可用于鉴定与参考抗体竞争结合至特定抗原的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变结构域，例如与V9抗体竞争结合至CD3的抗体。在某些实施例中，此类竞争抗体与参考抗体所结合的相同表位(例如，线性或构象表位)结合。关于映射抗体所结合的表位的详细示例性方法提供于Methodsin Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中的Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols”中。在示例性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如CD3)在包含与抗原结合的第一标记抗体(例如，US 6,054,297中所述的V9抗体)和正在检测其与第一抗原结合分子竞争以结合至抗原的能力的第二未标记抗体的溶液中孵育。该第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一标记抗体而非包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在容许第一抗体与抗原结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化抗原缔合的标记的量。如果相对于对照样品，测试样品中与固定化的抗原缔合的标记的量大幅降低，则表明该第二抗体在与该第一抗体竞争以结合至抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所述制备的免疫活化Fc结构域结合分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用免疫活化Fc结构域结合分子与之结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离免疫活化Fc结构域结合分子。免疫活化Fc结构域结合分子的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任一种方法来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。
测定
本文所提供的免疫活化Fc结构域结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。
亲和力测定
免疫活化Fc结构域结合分子对于Fc受体或靶抗原的亲和力可以使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)和诸如可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，根据实例中阐述的方法通过表面等离子体共振(SPR)来确定。替代性地，免疫活化Fc结构域结合分子与不同受体或靶抗原的结合可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估，例如通过流式细胞术(FACS)。下文和下述实例描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
根据一个实施例，在25℃下使用
Figure BDA0004003174050001081
T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量KD。
为了分析Fc部分和Fc受体之间的相互作用，His标记的重组Fc受体被固定在CM5芯片上的抗五组氨酸抗体(Qiagen)捕获，双特异性构建体用作分析物。简而言之，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,GE Healthcare)。将抗五-组氨酸抗体用10mM醋酸钠pH 5.0稀释至40μg/ml，之后以5μl/min的流速进行注射以获得大约6500响应单位(RU)的偶联蛋白。注射配体之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。随后Fc受体在4或10nM下被捕获60秒。对于动力学测量，将双特异性构造体的四倍系列稀释液(范围在500nM与4000nM之间)在25℃以30μl/min的流速持续120秒注入到HBS-EP(GE Healthcare，10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中。
为了确定与靶抗原的亲和力，将双特异性构造体被固定在活化的CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)捕获，如针对抗五组氨酸抗体所述。偶联蛋白的最终量为大约12000RU。双特异性构造体在300nM下被捕获90秒。靶抗原以250到1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池持续180秒。监控解离180秒。
通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。稳态响应用于通过朗缪尔结合等温线的非线性曲线拟合导出解离常数KD。使用简单的一对一朗缪尔结合模型(
Figure BDA0004003174050001091
T100 Evaluation Software 1.1.1版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性测定
本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的生物活性可以通过如实例中所述的各种测定法来测量。生物活性可以例如包括T细胞增殖的诱导、T细胞中信号传导的诱导、T细胞中活化标志物表达的诱导、T细胞细胞因子分泌的诱导、靶细胞(例如肿瘤细胞)裂解的诱导，以及肿瘤消退的诱导和/或提高生存。
组合物、配方和施用途径
在又一方面，本发明提供包含本文提供的免疫活化Fc结构域结合分子中的任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的免疫活化Fc结构域结合分子中的任一者和药用载体。在另一实施例中，药物组合物包含本文提供的免疫活化Fc结构域结合分子中的任一者和如下文所述的至少一种另外的治疗剂。
进一步提供一种以适于体内施用的形式生产本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子，以及(b)用至少一种药用载体配制该免疫活化Fc结构域结合分子，由此配制该分子的制备物以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含溶于或分散于药用载体中的治疗有效量的一种或多种免疫活化Fc结构域结合分子。术语“药用”或“药理学可接受”(pharmaceutical orpharmacologically acceptable)是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当酌情施用于动物(例如人)时不生产不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种免疫活化Fc结构域结合分子和任选地存在的附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington's PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Printing Company,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329页，该文献通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。
该组合物可以包含不同类型的载体，取决于它是以固体、液体或气溶胶形式施用，以及对于注射等施用途径是否需要无菌。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子(和任何另外的治疗剂)可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、黏膜内、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局部、通过吸入(例如气溶胶吸入)、注射、输液、连续输液、局部输液直接沐浴靶细胞、经由导管、经由灌洗、在乳膏中、在脂质组合物(例如脂质体)中施用，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述的任何组合施用(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，Mack Printing Company,1990，其通过引用并入本文)。肠胃外施用，特别是静脉内施用，最常用于施用本发明的免疫活化Fc结构域结合分子。
肠胃外组合物包括设计用于通过注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)施用的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的免疫活化Fc结构域结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，免疫活化Fc结构域结合分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的免疫活化Fc结构域结合分子以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，免疫活化Fc结构域结合分子也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，免疫活化Fc结构域结合分子可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受的油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的药物组合物可借助于常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。
免疫活化Fc结构域结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
治疗方法和组合物
本文提供的免疫活化Fc结构域结合分子中的任一者可用于治疗方法中。本发明的分子可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子将按照符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，将本发明的免疫活化Fc结构域结合分子提供为用作药物。在又一些方面，将本发明的免疫活化Fc结构域结合分子提供为用于治疗疾病。在某些实施例中，提供用于在治疗方法中使用的本发明的免疫活化Fc结构域结合分子。在一个实施例中，本发明提供如本文所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些实施例中，本发明提供一种用于治疗患有疾病的个体的方法中的免疫活化Fc结构域结合分子，该方法包括向个体施用治疗有效量的免疫活化Fc结构域结合分子。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一些实施例中，本发明提供如本文所述的免疫活化Fc结构域结合分子用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施例中，本发明提供用于在个体中诱导靶细胞特别是肿瘤细胞裂解的方法中使用的免疫活化Fc结构域结合分子，所述方法包括向个体施用有效量的免疫活化Fc结构域结合分子以诱导靶细胞的裂解。根据任何上述实施例的“个体”是哺乳动物，优选人。
在又一方面，本发明提供本发明的免疫活化Fc结构域结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施例中，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在另一实施例中，所述药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在一个实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在进一步的实施例中，药物用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在又一实施例中，药物用于在个体中诱导靶细胞特别是肿瘤细胞裂解的方法中，包括向个体施用有效量的药物以诱导靶细胞裂解。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了治疗疾病的方法。在一个实施例中，该方法包括向患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的免疫活化Fc结构域结合分子。在一个实施例中，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药用形式的本发明的免疫活化Fc结构域结合分子。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了一种用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解的方法。在一个实施例中，该方法包括在存在T细胞，特别是细胞毒性T细胞的情况下，使靶细胞与本发明的免疫活化Fc结构域结合分子接触。在另一方面，提供了一种在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个此类实施例中，该方法包括向个体施用有效量的免疫活化Fc结构域结合分子以诱导靶细胞的裂解。在一个实施例中，个体是人。
在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病，特定是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可以使用本发明的免疫活化Fc结构域结合分子治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部，以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。本领域技术人员容易认识到，在许多情况下，免疫活化Fc结构域结合分子可能无法提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些实施例中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施例中，提供生理变化的免疫活化Fc结构域结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一些实施例中，将有效量的本发明的免疫活化Fc结构域结合分子施用于细胞。在其他实施例中，将治疗有效量的本发明的免疫活化Fc结构域结合分子施用于个体以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、该分子的类型、疾病的严重程度和病程、该分子是施用用于预防目的还是治疗目的、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对该分子的应答，以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
免疫活化Fc结构域结合分子适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的免疫活化Fc结构域结合分子可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输液而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。免疫活化Fc结构域结合分子的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1ug/kg体重、约5ug/kg体重、约10ug/kg体重、约50ug/kg体重、约100ug/kg体重、约200ug/kg体重、约350ug/kg体重、约500ug/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5ug/kg体重至约500mg/kg体重等的范围可以基于上述数值施用。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约二至约二十或例如约六个剂量的免疫活化Fc结构域结合分子)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
本发明的免疫活化Fc结构域结合分子将通常以有效实现预期目的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的免疫活化Fc结构域结合分子或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，治疗有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的免疫活化Fc结构域结合分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄入的情况下，免疫活化Fc结构域结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的免疫活化Fc结构域结合分子通常将提供治疗益处而不会引起显著的毒性。免疫活化Fc结构域结合分子的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的免疫活化Fc结构域结合分子是优选的。在一个实施例中，根据本发明的免疫活化Fc结构域结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的免疫活化Fc结构域结合分子治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其他药剂和治疗
本发明的免疫活化Fc结构域结合分子可在治疗中与一种或多种其他药剂联合施用。例如，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个特定实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用免疫活化Fc结构域结合分子的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。免疫活化Fc结构域结合分子通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。
上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，本发明的免疫活化Fc结构域结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。本发明的免疫活化Fc结构域结合分子也可与放疗联合使用。
制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的免疫活化Fc结构域结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)其内含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的免疫活化Fc结构域结合分子；和(b)其内含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另一细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
描述本发明优选方面的编号实施例
1.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)Fc结构域结合部分，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，和
(b)免疫活化部分。
2.根据实施例1所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合且/或降低效应子功能。
3.根据实施例1所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代增加与Fc受体的结合且/或增加效应子功能。
4.根据实施例1至3中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其进一步包含
(c)延长半衰期的Fc，
其中Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
5.根据实施例1至4所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中延长半衰期的Fc结构域包含第二组至少一个氨基酸取代。
6.根据实施例5所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合且/或降低效应子功能。
7.根据实施例6所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二组至少一个氨基酸取代增加与Fc受体的结合且/或增加效应子功能。
8.根据实施例1至7中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基组成。
9.根据实施例1至8中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域是人Fc结构域。
10.根据实施例1至9中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域是IgG Fc结构域，特别是IgG1或IgG4 Fc结构域。
11.根据实施例10所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与天然IgG1 Fc结构域相比，靶Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
12.根据实施例10所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与天然IgG1 Fc结构域相比，延长半衰期的Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
13.根据实施例1至12中任一项所述的免疫活化分子，其中靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域经糖工程化以增加与Fc受体的结合和/或增加效应子功能
14.根据实施例1至13中任一项所述的免疫活化分子，其中靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域具有降低水平的岩藻糖残基且/或靶Fc结构域和/或延长半衰期的Fc结构域被一分为二。
15.根据实施例1至14中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，并且其中第二组至少一个氨基酸取代包括在与第一组至少一个氨基酸取代中相同的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代，其中与第一组至少一个氨基酸取代相比，第二组至少一个氨基酸取代中的氨基酸在相同的位置处被不同的氨基酸取代。
16.根据实施例15所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。
17.根据实施例1至16中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代包括在选自由233、234、235、238、253、265、269、270、297、310、331、327、329和435(根据Kabat EU索引编号)组成的列表的位置处的至少一个氨基酸取代。
18.根据实施例1至17中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二组至少一个氨基酸取代包括在选自由233、234、235、238、253、265、269、270、297、310、331、327、329和435(根据Kabat EU索引编号)组成的列表的位置处的至少一个氨基酸取代。
19.根据实施例1至18中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸取代，或在位置I253、H310和H435(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸取代。
20.根据实施例1至19中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代包括氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)，或氨基酸取代I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)。
21.根据实施例1至20中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代包括氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)，并且其中第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由除甘氨酸(G)以外的氨基酸进行的取代。
22.根据实施例1至21中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二组至少一个氨基酸取代包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由不能够在Fcγ受体内(特别是在FcgRIIIa内)在两个保守的色氨酸侧链之间形成脯氨酸夹心的氨基酸进行的取代。
23.根据实施例1至22中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
24.根据实施例1至23中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合但不能够与亲本非突变的IgG1 Fc结构域特异性结合。
25.根据实施例1至20中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代包括氨基酸取代I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)，并且其中第二组至少一个氨基酸取代包括在位置I253、H310和H435(根据Kabat EU索引编号)处由除丙氨酸(A)以外的氨基酸进行的取代。
26.根据实施例1至20或25中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸突变I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合但不能够与亲本非突变的IgG1 Fc结构域特异性结合。
27.根据实施例1至26中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一组至少一个氨基酸取代包括在选自L234、L235(Kabat EU索引编号)的组的位置处的至少一个氨基酸取代。
28.根据实施例1至27中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二组至少一个氨基酸取代包括在选自L234、L235(Kabat EU索引编号)的组的位置处的至少一个氨基酸取代。
29.根据实施例1至23中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中靶Fc结构域包含三个氨基酸取代，所述氨基酸取代降低与活化Fc受体的结合和/或效应子功能，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
30.根据实施例1至29中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中延长半衰期的Fc结构域包含三个氨基酸取代，所述氨基酸取代降低与活化Fc受体的结合和/或效应子功能，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329X(Kabat EU索引编号)，其中X是除甘氨酸(G)以外的氨基酸。
31.根据实施例1至30中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc受体是Fcγ受体。
32.根据实施例1至31中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
33.根据实施例8至32中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中延长半衰期的Fc包含促进Fc结构域的第一亚基与第二亚基的缔合的修饰。
34.根据实施例33所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内生成突起，所述突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中；而在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内生成空腔，第一亚基的CH3结构域内的该突起可定位在该空腔内。
35.根据实施例34所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)成的组，并且所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
36.根据实施例34或35所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，在位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；而在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，在位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，另外，在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基中，在位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，并且在位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。
37.根据实施例34至36中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中在延长半衰期的Fc结构域的第一亚基中，另外，在位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或在位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)，并且在延长半衰期的Fc结构域的第二亚基中，另外，在位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
38.根据实施例34至37中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中延长半衰期的Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且延长半衰期的Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
39.根据实施例1至38中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分和/或免疫活化部分是Fab分子、scFv分子或scFab分子。
40.根据实施例1至39中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分和/或免疫活化部分是Fab分子。
41.根据实施例1至24和27至40中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)、EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)和EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)组成的组；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
42.根据实施例41所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
43.根据实施例41所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
44.根据实施例41所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
45.根据实施例1至24和27至44中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中Fc结构域结合部分包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
46.根据实施例45所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中Fc结构域结合部分包含
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
47.根据实施例46所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中Fc结构域结合部分包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
48.根据实施例1至20和25至40中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸突变I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列SYGMS(SEQ ID NO:168)；
(b)CDR H2氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:169)；和
(c)CDR H3氨基酸序列LGMITTGYAMDY(SEQ ID NO:170)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSQTIVHSTGHTYLE(SEQ ID NO:171)；
(e)CDR L2氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:172)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV FQGSHVPYT(SEQ ID NO:173)。
49.根据实施例40至48中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fab轻链的可变结构域VL和VH与Fc结构域结合部分的Fab重链彼此替换，或者Fab轻链的可变结构域VL和VH与免疫活化部分的Fab重链彼此替换。
50.根据实施例40至48中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fab轻链的恒定结构域CL和CH1与Fc结构域结合部分的Fab重链彼此替换，或者Fab轻链的恒定结构域CL和CH1与免疫活化部分的Fab重链彼此替换。
51.根据实施例1至50中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分包含第一Fab分子且免疫活化部分包含第二Fab分子。
52.根据实施例51所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中
i)在第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸或在位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)；或
ii)在第二Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在第二Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸或在位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
53.根据实施例51或52所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中在依据a)的第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在依据a)的第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸或在位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)。
54.根据实施例51至53中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中在第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
55.根据实施例51至54中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中在第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且其中在第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
56.根据实施例55所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中在第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
57.根据实施例55所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中在第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且其中在第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
58.根据实施例51至57中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其进一步包含
d)第三Fab分子，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合。
59.根据实施例58所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab分子与第一Fab分子相同。
60.根据实施例58或59所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)、EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)和EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)组成的组；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
61.根据实施例60所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
62.根据实施例60所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
63.根据实施例60所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
64.根据实施例58或59所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
65.根据实施例64所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
66.根据实施例64所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab包含SEQ IDNO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
67.根据实施例58或59所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列SYGMS(SEQ ID NO:168)；
(b)CDR H2氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:169)；和
(c)CDR H3氨基酸序列LGMITTGYAMDY(SEQ ID NO:170)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSQTIVHSTGHTYLE(SEQ ID NO:171)；
(e)CDR L2氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:172)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV FQGSHVPYT(SEQ ID NO:173)。
68.根据实施例47至67中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一和第二Fab分子彼此融合，任选地经由肽接头融合。
69.根据实施例47至68中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。
70.根据实施例47至69中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。
71.根据实施例69或70所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合，任选地经由肽接头融合。
72.根据实施例47至71所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
73.根据实施例47至71所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
74.根据实施例47至71所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一和第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
75.根据实施例47至73中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第三Fab分子在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
76.根据实施例47至71所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第二和第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。
77.根据实施例47至71所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一和第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。
78.根据实施例1至77中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分能够与活化T细胞抗原特异性结合。
79.根据实施例78所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中活化T细胞抗原是CD3。
80.根据实施例78或79所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中活化T细胞抗原是CD3ε。
81.根据实施例78至80中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分与活化T细胞抗原，特别是CD3，更特别是CD3ε特异性地结合。
82.根据实施例78至81中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分是Fab分子。
83.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，
b)第二Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，和
c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域；
其中
(i)第一Fab分子与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，并且第二Fab分子与活化T细胞抗原，特别是CD3，更特别是CD3ε特异性地结合，其中第一Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；或
(ii)第二Fab分子与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，并且第一Fab分子与活化T细胞抗原，特别是CD3，更特别是CD3ε特异性地结合，其中第二Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
其中在依据a)的第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一Fab分子和依据b)的第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
84.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，
b)第二Fab分子，其与活化T细胞抗原，特别是CD3，更特别是CD3ε特异性地结合，并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，
c)第三Fab分子，其与靶Fc结构域特异性地结合，和
d)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中第一和第二Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据b)的第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据a)的第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
85.根据实施例82至84中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε，且与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子包含SEQ ID NO:35的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:37的重链CDR 2、SEQ ID NO:43的重链CDR 3、SEQ IDNO:53的轻链CDR 1、SEQ ID NO:54的轻链CDR 2和SEQ ID NO:55的轻链CDR 3。
86.根据实施例82至85所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε，且与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
87.根据实施例82至84中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε，且与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子包含SEQ ID NO:35的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:33的重链CDR 2、SEQ ID NO:176的重链CDR 3、SEQID NO:53的轻链CDR 1、SEQ ID NO:54的轻链CDR 2和SEQ ID NO:55的轻链CDR 3。
88.根据实施例82至85所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε，且与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:177的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
89.根据实施例82至84中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε，且与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子包含SEQ ID NO:34的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:37的重链CDR 2、SEQ ID NO:41的重链CDR 3、SEQ IDNO:53的轻链CDR 1、SEQ ID NO:54的轻链CDR 2和SEQ ID NO:55的轻链CDR 3。
90.根据实施例82至85所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε，且与活化T细胞抗原特异性地结合的Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
91.根据实施例82至86中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)、EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)和EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)组成的组；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
92.根据实施例82至86中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
93.根据实施例82至92中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
94.根据实施例82至93中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、
97％、98％、99％或100％相同。
95.根据实施例82至93中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
96.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合；
b)第二Fab分子，其与活化T细胞抗原，特别是CD3，更特别是CD3ε特异性地结合，并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)第三Fab分子，其与靶Fc结构域特异性地结合；和
d)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域；
其中
(i)Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
(ii)依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含：SEQ ID NO:1的重链互补决定区(CDR)1，选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16组成的组的重链CDR 2序列，SEQ ID NO:3的重链CDR 3，SEQ ID NO:4的轻链CDR 1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR 3；并且依据b)的第二Fab分子包含SEQ ID NO:35的重链CDR 1、SEQ ID NO:37的重链CDR 2、SEQ ID NO:43的重链CDR 3、SEQ ID NO:53的轻链CDR 1、SEQID NO:54的轻链CDR 2和SEQ ID NO:55的轻链CDR3；
(iii)在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代，特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)；并且
(iv)依据a)的第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据b)的第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
97.根据实施例96所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:16的重链CDR 2序列、SEQ ID NO:3的重链CDR 3、SEQ ID NO:4的轻链CDR 1、SEQ ID NO:5的轻链CDR 2和SEQ ID NO:6的轻链CDR 3。
98.根据实施例96或97所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
99.根据实施例96或97所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
100.根据实施例96至99所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据b)的第二Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
101.根据实施例78至100所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中延长半衰期的Fc结构域包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
102.根据实施例1至77中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分能够与共刺激T细胞抗原特异性结合。
103.根据实施例102所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中共刺激T细胞抗原是CD28。
104.根据实施例102或103所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分与共刺激T细胞抗原特异性地结合。
105.根据实施例102至104中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分与CD28特异性地结合。
106.根据实施例102至105中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分是Fab分子。
107.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，
b)第二Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，和
c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域；
其中
(i)第一Fab分子与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，并且第二Fab分子与共刺激T细胞抗原，特别是CD28特异性地结合，其中第一Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；或
(ii)第二Fab分子与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，并且第一Fab分子与共刺激T细胞抗原，特别是CD28特异性地结合，其中第二Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
其中在依据a)的第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一Fab分子和依据b)的第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
108.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，
b)第二Fab分子，其与共刺激T细胞抗原，特别是CD28特异性地结合，并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，
c)第三Fab分子，其与靶Fc结构域特异性地结合，和
d)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中第一和第二Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据b)的第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据a)的第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
109.根据实施例106至108中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与CD28特异性地结合的Fab分子包含SEQ ID NO:94的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:95的重链CDR 2、SEQ ID NO:96的重链CDR 3、SEQ ID NO:97的轻链CDR 1、SEQ ID NO:98的轻链CDR 2和SEQ ID NO:99的轻链CDR 3；或SEQ ID NO:94的重链互补决定区(CDR)1、SEQ IDNO:95的重链CDR 2、SEQ ID NO:102的重链CDR 3、SEQ ID NO:103的轻链CDR 1、SEQ ID NO:98的轻链CDR 2和SEQ ID NO:99的轻链CDR 3
110.根据实施例106至109中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与CD28特异性地结合的Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:100的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:101的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO:104的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:105的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
111.根据实施例106至110中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)、EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)和EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)组成的组；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
112.根据实施例106至110中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
113.根据实施例106至112中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQID NO:8和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
114.根据实施例106至113中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
115.根据实施例106至113中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
116.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合；
b)第二Fab分子，其与共刺激T细胞抗原，特别是CD28特异性地结合，并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)第三Fab分子，其与靶Fc结构域特异性地结合；和
d)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域；
其中
(i)Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
(ii)依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含：SEQ ID NO:1的重链互补决定区(CDR)1，选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16组成的组的重链CDR 2序列，SEQ ID NO:3的重链CDR 3，SEQ ID NO:4的轻链CDR 1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR 3；并且依据b)的第二Fab分子包含SEQ ID NO:94的重链CDR 1、SEQ ID NO:95的重链CDR 2、SEQ ID NO:96的重链CDR 3、SEQ ID NO:97的轻链CDR 1、SEQID NO:98的轻链CDR 2和SEQ ID NO:99的轻链CDR3；或SEQ ID NO:94的重链CDR 1、SEQ IDNO:95的重链CDR 2、SEQ ID NO:102的重链CDR 3、SEQ ID NO:103的轻链CDR 1、SEQ ID NO:98的轻链CDR 2和SEQ ID NO:99的轻链CDR 3；
(iii)在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代，特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)；并且
(iv)依据a)的第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据b)的第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
117.根据实施例116所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:16的重链CDR 2序列、SEQ ID NO:3的重链CDR 3、SEQ ID NO:4的轻链CDR 1、SEQ ID NO:5的轻链CDR 2和SEQ ID NO:6的轻链CDR 3。
118.根据实施例116或117所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
119.根据实施例116或117所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
120.根据实施例116至119所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据b)的第二Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQID NO:101的氨基酸序列；或重链可变区，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。
121.根据实施例102至120所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中延长半衰期的Fc结构域包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
122.根据实施例1至77中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分能够与共刺激T细胞抗原特异性结合。
123.根据实施例122所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中共刺激T细胞抗原是4-1BB。
124.根据实施例122或123所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分与共刺激T细胞抗原特异性地结合。
125.根据实施例122至124中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分与4-1BB特异性地结合。
126.根据实施例122至125中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分是Fab分子。
127.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，
b)第二Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，和
c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域；
其中
(i)第一Fab分子与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，并且第二Fab分子与共刺激T细胞抗原，特别是4-1BB特异性地结合，其中第一Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；或
(ii)第二Fab分子与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，并且第一Fab分子与共刺激T细胞抗原，特别是4-1BB特异性地结合，其中第二Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
其中在依据a)的第一Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一Fab分子和依据b)的第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
128.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，
b)第二Fab分子，其与共刺激T细胞抗原，特别是4-1BB特异性地结合，并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，
c)第三Fab分子，其与靶Fc结构域特异性地结合，和
d)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域，
其中第一和第二Fab分子不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据b)的第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据a)的第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
129.根据实施例126至129中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与4-1BB特异性地结合的Fab分子包含SEQ ID NO:133的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:134的重链CDR 2、SEQ ID NO:135的重链CDR 3、SEQ ID NO:136的轻链CDR 1、SEQ ID NO:137的轻链CDR 2和SEQ ID NO:138的轻链CDR 3。
130.根据实施例126至129中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与4-1BB特异性地结合的Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含i)与SEQ ID NO:139的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:140的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
131.根据实施例126至130中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO:2)、EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO:11)和EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)组成的组；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
132.根据实施例126至140中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:16)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:6)。
133.根据实施例126至132中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQID NO:8和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
134.根据实施例116至133中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
135.根据实施例126至133中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中第一Fab分子和/或第三Fab分子包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
136.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
a)第一Fab分子，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合；
b)第二Fab分子，其与共刺激T细胞抗原，特别是4-1BB特异性地结合，并且其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)第三Fab分子，其与靶Fc结构域特异性地结合；和
d)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的延长半衰期的Fc结构域；
其中
(i)Fc结构域结合部分不与延长半衰期的Fc结构域特异性地结合；
(ii)依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含：SEQ ID NO:1的重链互补决定区(CDR)1，选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16组成的组的重链CDR 2序列，SEQ ID NO:3的重链CDR 3，SEQ ID NO:4的轻链CDR 1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR 3；并且依据b)的第二Fab分子包含SEQ ID NO:133的重链CDR1、SEQ ID NO:134的重链CDR 2、SEQ ID NO:135的重链CDR 3、SEQ ID NO:136的轻链CDR 1、SEQ ID NO:137的轻链CDR 2和SEQ ID NO:138的轻链CDR 3；
(iii)在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CL中，在位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且在位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代，特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且其中在依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子的恒定结构域CH1中，在位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且在位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)；并且
(iv)依据a)的第一Fab分子在Fab重链的C末端处融合至依据b)的第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自在Fab重链的C末端处融合至依据d)的Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端。
137.根据实施例136所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:16的重链CDR 2序列、SEQ ID NO:3的重链CDR 3、SEQ ID NO:4的轻链CDR 1、SEQ ID NO:5的轻链CDR 2和SEQ ID NO:6的轻链CDR 3。
138.根据实施例136或137所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
139.根据实施例136或137所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据a)的第一Fab分子和依据c)的第三Fab分子各自包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
140.根据实施例136至139所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中依据b)的第二Fab分子包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。
141.根据实施例122至140所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中延长半衰期的Fc结构域包含在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
142.根据实施例1至48中任一项所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中免疫活化部分是细胞因子。
143.根据实施例142所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中细胞因子选自由IL2、IL7、IL15、IL18、IFNa和IFNg组成的组。
144.根据实施例142或143所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中免疫活化部分是突变白细胞介素-2(IL-2)多肽。
145.根据实施例105所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中突变IL-2多肽是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:166编号)的人IL-2分子。
146.根据实施例145所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中突变IL-2多肽进一步包含氨基酸取代T3A和/或氨基酸取代C125A。
147.根据实施例144至146中任一项所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中突变IL-2多肽包含与SEQ ID NO:167的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中突变IL-2多肽显示与高亲和力IL-2受体的降低的亲和力和与中等亲和力IL-2受体的基本上类似的亲和力，各自与野生型IL-2多肽相比。
148.根据实施例144至147中任一项所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中突变IL-2多肽包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
149.根据实施例143至148中任一项所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分包含Fab分子。
150.根据实施例149所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fab包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQID NO:19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
151.根据实施例149所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fab包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
152.根据实施例151所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fab包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
153.根据实施例1至44中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分包含4-1BBL的三个胞外域或其片段。
154.根据实施例1至44中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分包含第一多肽和第二多肽，其中分别地，第一多肽含有第一重链恒定(CH1)或轻链恒定(CL)结构域，且第二多肽含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1与CL结构域之间的二硫键连接到第一多肽，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至CH1或CL结构域的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的所述CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域或其片段。
155.根据实施例153或154所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中4-1BBL的胞外域或其片段包含选自由SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124组成的组的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
156.根据实施例153至155中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活性部分包含通过二硫键彼此连接的第一多肽和第二多肽，其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自由SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128组成的组的氨基酸序列，并且特征在于，第二多肽包含选自由SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120组成的组的氨基酸序列。
157.根据实施例1至48或153至156中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中该分子包含：第一重链和第一轻链，其包含Fc结构域结合部分，特别是能够与靶Fc结构域特异性结合的Fab分子，以及第二重链和第二轻链，其包含免疫活化部分，其中分别地，第二重链包含第一多肽，所述第一多肽包含通过肽彼此连结并且连结至CH1或CL结构域的4-1BBL的两个胞外域或其片段，且第二轻链包含第二多肽，所述第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域或其片段。
158.根据实施例154至157中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链一部分的CL结构域融合，并且包含所述4-1BBL的一个胞外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CH1结构域融合。
159.根据实施例153至158中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc结构域结合部分包含Fab分子。
160.根据实施例159所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fab包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQID NO:19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
161.根据实施例159或160所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fab包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO:19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
162.根据实施例158或159所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fab包含SEQID NO:19的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变。
163.根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中免疫活化部分能够与Fc受体特异性结合。
164.根据实施例163所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc是Fcγ受体，特别是FcgRIIIa受体。
165.根据实施例163或164所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中Fc受体是CD16。
166.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据实施例1至165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子。
167.一种或多种载体，特别是表达载体，其包含根据实施例166所述的多核苷酸。
168.一种宿主细胞，其包含根据实施例166所述的多核苷酸或根据实施例167所述的载体。
169.一种生产免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子的方法，其包括以下步骤：a)在适用于表达免疫活化Fc结构域结合分子的条件下培养根据实施例168所述的宿主细胞，和b)回收该免疫活化Fc结构域结合分子。
170.一种通过根据实施例169所述的方法生产的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子。
171.一种药物组合物，其包含根据实施例1至165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子和药用载体。
172.根据实施例1至165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子或根据实施例171所述的药物组合物，其用作药物。
173.根据实施例1至165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子或根据实施例171所述的药物组合物，其用于治疗有此需要的个体的疾病。
174.根据实施例173所述的供使用的免疫活化Fc结构域结合分子或药物组合物，其中该疾病是癌症。
175.根据实施例1至165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子或根据实施例171所述的药物组合物，其用于治疗有此需要的个体的疾病，其中免疫活化Fc结构域结合分子与包含靶Fc结构域的靶向抗体组合使用。
176.根据实施例175所述的供使用的免疫活化Fc结构域结合分子或药物组合物，其中该疾病是癌症。
177.根据实施例175或176所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中靶向抗体能够与靶抗原，特别是癌细胞上的靶抗原特异性结合。
178.根据实施例1至165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。
179.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据实施例1至165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子。
180.根据实施例178所述的用途或根据实施例179所述的方法，其中所述疾病是癌症。
181.一种治疗个体的疾病的方法，其包括：
(a)向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据实施例1至165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子；和
(b)向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含靶向抗体，所述靶向抗体包含靶Fc结构域。
182.根据实施例181所述的方法，其中该疾病是癌症。
183.根据实施例181或182所述的方法，其中靶向抗体能够与靶抗原，特别是癌细胞上的靶抗原特异性结合。
184.根据实施例181至183中任一项所述的方法，其中在施用包含靶Fc结构域的抗体之前、同时或之后施用免疫活化Fc结构域结合分子。
185.一种用于诱导细胞裂解的方法，其包括在存在T细胞的情况下使该细胞与根据实施例165中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子且与包含靶Fc结构域的靶向抗体接触，其中该靶向抗体能够与该细胞上的抗原特异性结合。
186.如前所述的发明。
示例性序列
抗P329G抗体
根据Kabat的CDR定义
Figure BDA0004003174050001611
Figure BDA0004003174050001621
Figure BDA0004003174050001631
Figure BDA0004003174050001641
Figure BDA0004003174050001651
P329 IgG1 Fc变体
Figure BDA0004003174050001652
Figure BDA0004003174050001661
改善的CD3结合物
根据Kabat的CDR定义
Figure BDA0004003174050001662
Figure BDA0004003174050001671
Figure BDA0004003174050001681
Figure BDA0004003174050001691
Figure BDA0004003174050001701
Figure BDA0004003174050001711
能够与活化T细胞抗原CD3特异性结合的示例性免疫活化Fc结合分子
Figure BDA0004003174050001712
Figure BDA0004003174050001721
Figure BDA0004003174050001731
Figure BDA0004003174050001741
Figure BDA0004003174050001751
能够与共刺激T细胞抗原CD28特异性结合的示例性免疫活化Fc结合分子
根据Kabat的CDR定义
Figure BDA0004003174050001752
Figure BDA0004003174050001761
Figure BDA0004003174050001771
Figure BDA0004003174050001781
Figure BDA0004003174050001791
Figure BDA0004003174050001801
包含IL2变体的示例性免疫活化Fc结合分子
Figure BDA0004003174050001802
Figure BDA0004003174050001811
Figure BDA0004003174050001821
包含4-1BBL胞外域的示例性免疫活化Fc结合分子
Figure BDA0004003174050001822
Figure BDA0004003174050001831
Figure BDA0004003174050001841
Figure BDA0004003174050001851
能够与共刺激T细胞抗原41BB特异性结合的示例性免疫活化Fc结合分子
根据Kabat的CDR定义
Figure BDA0004003174050001852
Figure BDA0004003174050001861
Figure BDA0004003174050001871
示例性靶向抗体
Figure BDA0004003174050001872
Figure BDA0004003174050001881
Figure BDA0004003174050001891
Figure BDA0004003174050001901
Figure BDA0004003174050001911
示例性IL2序列
Figure BDA0004003174050001912
抗AAA结合物
Figure BDA0004003174050001921
改善的CD3结合物
Figure BDA0004003174050001922
能够与活化T细胞抗原CD3特异性结合的示例性免疫活化Fc结合分子
Figure BDA0004003174050001923
Figure BDA0004003174050001931
Figure BDA0004003174050001941
Figure BDA0004003174050001951
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
通用方法
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication No.91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
在需要时，通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从来源于合适的组织的RNA中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
在HEK293 EBNA或CHO EBNA细胞中产生IgG样蛋白质
通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHO EBNA细胞，形成抗体和双特异性抗体。对细胞进行离心，然后用经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，目录号10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，加入PEI(聚乙烯亚胺，Polysciences，Inc，目录号23966-1)，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞(2Mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％CO2的气氛下于37℃孵育3小时。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后，通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
在CHO K1细胞中产生IgG样蛋白质
替代地，本文所述的抗体和双特异性抗体由Evitria使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术并且使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
IgG样蛋白质的纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0004003174050001971
ULTRA-15(Art.Nr.:UFC903096))浓缩蛋白质，然后利用尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG样蛋白质的分析
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChip GX Touch(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用在运行缓冲液(200mMKH2PO4，250mM KCl pH 6.2，0.02％NaN3)中平衡的分析尺寸排阻柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)在25℃通过HPLC色谱进行聚集含量的确定。
实例1
人源化抗P329G抗体的生成和表征
在HEK细胞中生产亲本和人源化抗P329G抗体，并通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法纯化。所有抗体均以良好质量纯化(表2)。
表2-抗P329G抗体的生化分析。通过分析尺寸排阻色谱法确定单体含量。通过非还原性SDS毛细管电泳确定纯度。
分子 单体[％] 纯度[％]
抗P329G(M-1.7.24)huIgG1 100 85
抗P329G(VH1VL1)huIgG1 100 97
抗P329G(VH2VL1)huIgG1 100 87
抗P329G(VH3VL1)huIgG1 100 97
抗P329G结合物M-1.7.24的亲本和六种人源化变体与人Fc(P329G)的结合
仪器设备： Biacore T200
芯片： CM5(#739)
Fc1至Fc4： 抗人Fab特异性(GE Healthcare 28-9583-25)
捕获： 50nM IgG，持续40秒(来自上清液)
分析物： 200nM人Fc(P329G)(P1AD9000-004)单次注入
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
流速： 30μl/min
缔合： 240秒
解离： 240秒
再生： 10mM甘氨酸pH 2.1，持续2x60秒
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。将抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare 28-9583-25)通过胺偶联直接固定在CM5芯片(GEHealthcare)上。将IgG在50nM下从上清液中捕获40秒。使200nM的人Fc(P329G)以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240秒，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续240s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH 2.1注入60秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。拟合解离阶段的单结合曲线以获得易于比较的koff(Biacore评价软件，GE Healthcare)。
抗P329G结合物M-1.7.24的亲本和三种人源化变体与人Fc(P329G)的亲和力
仪器设备： Biacore T200
芯片： CM5(#772)
Fc1至Fc4： 抗人Fab特异性(GE Healthcare 28-9583-25)
捕获： 50nM IgG，持续60秒
分析物： 人Fc(P329G)(P1AD9000-004)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
稀释： 在HBS-EP中进行2倍稀释，从0.59到37.5nM
流速： 30μl/min
缔合： 240秒
解离： 800秒
再生： 10mM甘氨酸pH 2.1，持续2x60秒
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。将抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare 28-9583-25)通过胺偶联直接固定在CM5芯片(GEHealthcare)上。将IgG在50nM下捕获60秒。使人Fc(P329G)的两倍稀释系列以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240秒，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续800s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH 2.1注入60秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GEHealthcare)拟合至1:1 Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列三个重复进行测量。
分析以下样品与人Fc(P329G)的结合(表3)。
表3：对分析与人Fc(P329G)结合的样品的描述。
结合物 TAPIR ID 形式
抗P329G(M-1.7.24)(亲本) P1AE9963 IgG，上清液/纯化的
抗P329G(VH3VL1) P1AE9957 IgG，上清液/纯化的
抗P329G(VH1VL1) P1AE9955 IgG，上清液/纯化的
抗P329G(VH2VL1) P1AE9956 IgG，上清液/纯化的
抗P329G(VH4VL1) P1AE9958 IgG，上清液
抗P329G(VH1VL2) P1AE9959 IgG，上清液
抗P329G(VH1VL3) P1AE9960 IgG，上清液
人Fc(P329G) P1AD9000-004 用作分析物的抗原
人Fc(P329G)通过人IgG1的纤溶酶消化制备，然后通过蛋白A和尺寸排阻色谱法进行亲和纯化。
抗P329G结合物M-1.7.24的亲本和六种人源化变体与人Fc(P329G)的结合
将解离阶段拟合到单曲线以帮助表征解离率。计算结合与捕获应答水平之间的比率。(表4)。
表4：六种人源化变体与人Fc(P329G)结合的结合评估。
Figure BDA0004003174050002001
抗P329G结合物M-1.7.24的亲本和三种人源化变体与人Fc(P329G)的亲和力
更详细地评估了具有与亲本相似的结合模式的三种人源化变体。表5总结了1:1Langmuir结合的动力学常数。
表5：动力学常数(1:1Langmuir结合)。独立的三个重复(同一运行中的独立稀释系列)的平均值和标准偏差(括号中)。
Figure BDA0004003174050002002
Figure BDA0004003174050002011
结论
生成了六种人源化变体。其中三种(VH4VL1、VH1VL2、VH1VL3)显示出与亲本M-1.7.24相比降低的与人Fc(P329G)的结合。其他三种人源化变体(VH1VL1、VH2VL1、VH3VL1)具有与亲本结合物非常相似的结合动力学，并且不会因人源化而失去亲和力。
实例2
用于消除Fc R与人IgG1 Fc结合的P329x变体
设计具有最小效应子功能的Fc变体，这些变体不被与P329G Fc框架结合的抗体识别。
使用IgG1 Fc框架内的P329G突变(doi:10.1093/protein/gzz027.)特异性抗体作为通用抗体需要对Fc进行工程化以消除与Fcγ受体的结合，同时保持相似的血清持久性。该实例描述人IgG1的脯氨酸329周围的修饰以设计不被P329G特异性抗体识别的沉默的Fc。
考虑了两个参数：a)在位置329处的残基的侧链不应该能够在Fcγ受体内的两个保守色氨酸侧链之间形成所谓的脯氨酸夹心(doi:10.1093/protein/gzw040.)。b)在位置329处的突变不应被抗P329G特异性抗体识别(doi.org/10.1093/protein/gzz027)。
对于与Fc复合的抗P329G抗体(PDB代码：6S5A)的结构分析揭示，Fc(6S5A的H链)的Gly329与抗P329G抗体的重链可变结构域的至少三个残基(H链的Trp33、Pro100和Trp106。残基根据PDB条目编号)紧密接触。因此得出结论，任何比甘氨酸大的侧链都会因为排斥力增加而减少抗体结合。为了避免新的B细胞表位(可能导致宿主防御不必要地识别该抗体)，没有选择通常参与抗体结合的大的、表面暴露的亲水残基，诸如赖氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸(doi:10.1073/pnas.0804851105)。尽管有这些考虑，但估计精氨酸是具有最大排斥潜力的一种并因此被包括在内。较小的残基诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸(doi:10.1073/pnas.0804851105)不包括在内。基于这些考虑选择了四种氨基酸：丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和精氨酸(从最小到最大的侧链列出)。将称为P329A、P329L、P329I和P329R的突变引入huIgG1框架中。
P329x huIgG1变体的制备
将编码对于4-1BB具特异性的结合物的重链和轻链DNA序列的可变区与人IgG1的恒定重链或恒定轻链在框内一起进行亚克隆。
在Fc部分中，在位置329处的脯氨酸被以下氨基酸取代：亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、精氨酸(R)和丙氨酸(A)。Pro329突变以及Leu234Ala和Leu235Ala突变已被引入重链的恒定区以消除与Fcγ受体的结合。含有P329x突变的Fc部分的氨基酸序列是SEQ ID NO:30至33。
抗体通过以相对应的表达载体转染哺乳动物细胞来生产，表达载体比率为1:1(“重链”：“载体轻链”)转染细胞。
表6-抗4-1BB huIgG1 P329x变体的生化分析
Figure BDA0004003174050002021
huIgG1 P329x变体与重组Fc受体的结合
通过表面等离子体共振(SPR)评估与重组Fcγ受体结合的能力。所有SPR实验均在25℃使用HBS-P+作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.30M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，由GE Healthcare提供)在Biacore T200上进行。His标记的人Fc R被偶联到CM5传感器芯片表面的抗His抗体捕获。以20μl/min的流速以150、300和600nM的浓度以单循环方式注入huIgG1 P329x变体。解离阶段被监测长达360秒。通过用甘氨酸pH 1.5溶液以10μl/min的流速洗涤1分钟，使表面再生。通过减去从没有捕获的FcγRI的表面获得的应答来校正本体折射率差异。还减去空白注入(＝双重参照)。作为阳性对照，利妥昔单抗(CHB3026)也用于测定法中，因为可以预期典型的IgG1型与FcγRI结合。设计在图3A中示出。
如图3B至3E的传感图可见，含有P329L、P329I、P329R和P329A的huIgG1不能与人FcR1a、Fc R2a、Fc R2b和Fc R3a结合。
huIgG1 P329x变体与抗P329G抗体的结合
通过表面等离子体共振(SPR)分析huIgG1 P329x变体与抗P329G抗体(克隆物M-1.7.24)结合的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。抗P329G(M-1.7.24)抗体与CM5传感器芯片的表面偶联(固定水平，大约5700RU)。以30μl/min的流速以500nM的浓度注入huIgG1 P329x变体。解离阶段被监测长达600秒。通过用甘氨酸pH2.1溶液以30μl/min的流速洗涤2分钟，使表面再生。通过减去从没有固定化的抗体的表面获得的应答来校正本体折射率差异。设置可以在图4A中看到。
具有P329L、P329I、P329A或P329R突变的huIgG1抗体不被抗P329G结合物M-1.7.24识别，该结合物对携带P329G突变的人Fc具有特异性(图4B至4E)。与P329G类似，P329L/I/A/R突变可用于使得人Fc成为效应子沉默的。与P329G相反，P329L/I/A/R突变不被抗P329G结合物识别。
实例3
制备优化的抗CD3(多特异性)抗体
所有优化的抗CD3抗体(克隆物P033.078、P035.093、P035.064、P021.045、P004.042)均通过噬菌体展示选择活动使用源自先前描述的文库(参见例如WO 2014/131712，通过引用并入本文)的CD3结合物来生成，该CD3结合物在本文中称为“CD3orig”并且分别包含SEQ ID NO 47和56的VH和VL序列。在这些文库中，位于重链CDR3区的位置N97和N100(Kabat编号)被沉默或去除。为了直接比较，使用抗TYRP1抗体作为示例性靶细胞抗原结合部分(SEQ ID NO 57至64)，将所有分子转化为T细胞双特异性抗体(TCB)形式，如图5A所示。
将重链和轻链DNA序列的可变区与预插入各自的受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链在框架中一起亚克隆，如图5B至5E所示。
优化的抗CD3抗体的序列在表7所示的SEQ ID NO中给出。
表7.在本实例中生成的经优化的抗CD3抗体的序列。
克隆 HCDR1 HCDR2 HCDR3 VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 VL
P033.078 35 38 42 48 53 54 55 56
P035.093 35 37 43 49 53 54 55 56
P035.064 36 39 44 50 53 54 55 56
P021.045 35 37 45 51 53 54 55 56
P004.042 36 40 46 52 53 54 55 56
CD3orig 34 37 41 47 53 54 55 56
为了改善轻链与相对应重链的正确配对，将突变引入TYRP1结合Fab分子的人CL(E123R，Q124K)和人CH1(K147E，K213E)中。
为了正确配对重链(形成异源二聚体分子)，在抗体重链的恒定区中引入了杵入臼突变(分别为T366W/S354C和T366S/L368A/Y407V/Y349C)。
此外，将P329G、L234A和L235A突变引入抗体重链的恒定区以消除与Fcγ受体的结合。
所制备的TCB分子的完整序列在SEQ ID NO 65、66、67和69(P033.078)，SEQ ID NO65、66、67和70(P035.093)，SEQ ID NO 65、66、67和71(P035.064)，SEQ ID NO 65、66、67和72(P021.045)，SEQ ID NO 65、66、67和73(P004.042)中给出。
还制备了包含CD3orig作为CD3结合物的相对应分子。
TCB由Evitria(Switzerland)使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术并使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。用相对应的表达载体以1:1:2:1的比率(“载体杵重链”:“载体臼重链”：“载体CD3轻链”:“载体TYRP1轻链”)转染细胞。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH 3.0)从经过滤的细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0004003174050002052
ULTRA-15，#UFC903096)浓缩蛋白质，并且通过尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。利用HPLC色谱法在25℃下测定聚集体含量，该系统使用分析型尺寸排阻色谱柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)，并且在运行缓冲液(分别为25mMK2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸盐酸盐(pH 6.7)或200mM KH2PO4、250mM KCl(pH6.2))中平衡。
表8给出所制备的TCB分子的生化和生物物理分析结果。
所有TCB分子都可以良好质量生产。
表8.TCB形式的抗CD3抗体的生化和生物物理分析。
Figure BDA0004003174050002051
确定优化的抗CD3(多特异性)抗体的热稳定性
实例1中制备的抗CD3抗体(TCB形式)的热稳定性通过动态光散射(DLS)监测并通过下述方式监测：通过使用Optim 2仪器(Avacta Analytical,UK)来施加温度斜坡，从而监测温度依赖性内在蛋白质荧光。
将蛋白质浓度为1mg/ml的10μg过滤蛋白质样品一式两份地施加至Optim 2。温度以0.1℃/min的速度从25℃升至85℃，收集350nm/330nm处的荧光强度与266nm处的散射强度的比率。
结果如表9所示。实例1中生产的所有优化的CD3结合物的聚集温度(Tagg)和观察到的温度诱导的去折叠转换的中点(Tm)与先前描述的CD3结合物CD3orig相当或更高。
表9.TCB形式的抗CD3抗体的热稳定性，通过动态光散射和温度依赖性内在蛋白荧光的变化来测量。
Figure BDA0004003174050002061
通过表面等离子体共振(SPR)对优化的抗CD3(多特异性)抗体进行功能表征
所有表面等离子体共振(SPR)实验均在25℃使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)在Biacore T200上进行。
对于亲和力测量，将TCB分子捕获在C1传感器芯片(GE Healthcare)表面上，该传感器芯片表面具有固定化的抗Fc(P329G)IgG(一种与人IgG1Fc(P329G)特异性地结合的抗体；“抗PG抗体”-参见WO 2017/072210，通过引用并入本文)。实验设置在图6中示意性地描绘。使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare Life Sciences)通过直接固定约400个共振单位(RU)将Capture IgG偶联至传感器芯片表面。
为了分析与CD3的相互作用，在25nM下以10μl/min的流速捕获TCB分子80秒。使人和食蟹猴CD3ε柄-Fc(杵)-Avi/CD3δ柄-Fc(臼)(CD3ε/δ，参见SEQ ID NO 41和42(人)以及SEQ ID NO 43和44(食蟹猴))以0.122nM至125nM的浓度和30μl/min的流速通过流通池300秒。监测解离800秒。
通过减去在参比流通池获得的应答来校正本体折射率差异。此处，抗原与固定化的抗PG抗体一起流过表面，但在该表面上注入了HBS-EP而不是TCB分子。
使用Biacore T200评估软件(GE Healthcare Life Sciences)导出动力学常数，以通过数值积分拟合1:1Langmuir结合的速率方程。使用公式t1/2＝ln2/koff计算相互作用的半衰期(t1/2)。
在表10中列出了优化的抗CD3抗体结合的所有动力学参数，与先前描述的结合物CD3orig相比。优化的抗CD3抗体(TCB形式)与CD3ε/δ结合，且KD值在低nM范围至高pM范围内，其中对于人CD3ε/δ 的KD值为600pM至1.54nM，且对于食蟹猴CD3ε/δ和200pM至为700pM。与CD3orig相比，优化的抗CD3抗体与人CD3ε/δ结合的亲和力增加高达7至10倍，如在相同条件下通过SPR测量的。
抗CD3抗体克隆物P033.078与人CD3ε/δ单价结合的半衰期为11.6分钟，比CD3orig的结合半衰期高了高达6倍。
表10.抗CD3抗体(TCB形式)对人和食蟹猴CD3ε/δ的亲和力。
Figure BDA0004003174050002071
Figure BDA0004003174050002081
在应激后通过表面等离子体共振(SPR)对优化的抗CD3(多特异性)抗体进行表征
为了评估脱酰胺位点去除的效应及其对抗体稳定性的效应，将优化的抗CD3抗体(TCB形式)在37℃、pH 7.4和40℃、pH 6孵育14天，并通过SPR进一步分析它们与人CD3ε/δ的结合能力。使用储存在-80℃pH 6的样品作为参考。参考样品和在40℃在20mM His、140mMNaCl，pH 6.0中应激的样品，以及在37℃在PBS，pH 7.4中应激的样品，浓度均为1.0mg/ml。在应激期(14天)后，将PBS中的样品透析回20mM His、140mM NaCl，pH 6.0以进行进一步分析。
所有SPR实验均在25℃使用HBS-P+(10mM HEPES、150mM NaCl pH 7.4、0.05％表面活性剂P20)作为运行和稀释缓冲液在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上进行。将生物素化的人CD3ε/δ(参见实例3，SEQ ID NO 41和42)和生物素化的抗huIgG(Capture Select，Thermo Scientific，#7103262100)固定在S系列传感器芯片SA(GE Healthcare，#29104992)上，导致表面密度至少为1000个共振单位(RU)。以5μl/min的流速注入2μg/ml的抗CD3抗体，持续30秒，并监测解离120秒。通过注入10mM甘氨酸pH 1.5，持续60秒，使表面再生。通过减去空白注入和减去从空白对照流通池获得的应答来校正本体折射率差异。为了评价，在注入结束后5秒取得结合应答。为了将结合信号归一化，CD3结合除以抗huIgG应答(在固定化的抗huIgG抗体上捕获CD3抗体时获得的信号(RU))。通过将每个温度应激样品与相对应的非应激样品进行比较来计算相对结合活性。
如表11所示，与CD3orig相比，实例1中制备的所有抗CD3抗体在应激时显示出改善的与CD3ε/δ的结合。
表11.在pH 6/40℃或pH 7.4/37℃孵育2周后，抗CD3抗体(TCB形式)与人CD3ε/δ的结合活性。
Figure BDA0004003174050002091
用优化的抗CD3(多特异性)抗体进行Jurkat NFAT报告细胞测定
在存在CHO-K1 TYRP1克隆物76(通过稳定转导CHO-K1细胞生成的细胞)作为靶细胞的情况下，在Jurkat NFAT报告细胞测定法中测试含有优化的抗CD3抗体的(TYRP1靶向)TCB。将Jurkat NFAT报告细胞(Promega)在含有10％FBS、2g/l葡萄糖(Sigma)、2g/l NaHCO3(Sigma)、25mM HEPES(Gibco)、1％GlutaMax(Gibco)、1x NEAA(Sigma)、1％SoPyr(Sigma)的RPMI 1640(Gibco)(Jurkat NFAT培养基)中培养，浓度为0.1-0.5mio细胞/ml。将CHO-K1TYRP1克隆物76细胞在含有10％FBS和6μg/ml嘌呤霉素(Invivogen)的DMEM/F12+GlutaMAX(1x)(Gibco)中培养。该测定法在Jurkat NFAT培养基中进行。
使用胰蛋白酶(Gibco)分离CHO-K1 TYRP1克隆物76细胞。对细胞进行计数并且检查活力。将靶细胞重新悬浮在测定培养基中，并且在白色平底384孔板中，每孔接种10 000个细胞。然后以指定浓度添加TCB。对Jurkat NFAT报告细胞进行计数，检查活力，并且每孔接种20,000个细胞，对应于2:1的效应子与靶(E:T)的比率。此外，将2％终体积的GloSensorcAMP试剂(E1291，Promega)添加到每个孔中。在指定的孵育时间后，使用Tecan Spark10M装置测量发光。
如图7A至7B所示，含有优化的抗CD3抗体的TCB对Jurkat NFAT报告细胞具有与含有亲本结合物CD3orig的TCB相似的功能活性。测试的TCB以浓度依赖性方式诱导CD3活化。
用优化的抗CD3(多特异性)抗体进行原发性黑色素瘤细胞的肿瘤细胞杀伤
在肿瘤细胞杀伤测定法中测试(TYRP1靶向的)TCB形式的优化的抗CD3抗体，使用用新鲜分离的人PBMC，与人黑色素瘤细胞系M150543(原发性黑色素瘤细胞系，从苏黎世大学的皮肤病学细胞库获得)共孵育。肿瘤细胞裂解通过在24小时和48小时后对由凋亡或坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH进行定量来确定。通过48小时后两个细胞亚群上CD69和CD25的上调来分析CD4和CD8 T细胞的活化。
在测定开始前一天，使用胰蛋白酶(Gibco)分离靶细胞(M150543)，用PBS洗涤一次并以0.3mio细胞/ml的密度重新悬浮在生长培养基(含有10％FBS、1％GlutaMax(Gibco)和1％SoPyr(Sigma)的RPMI 1640(Gibco))中。将100μl的该细胞悬浮液(含有30,000个细胞)接种到96孔平底板中。将细胞在37℃在培养箱中孵育过夜。
第二天，从健康供体的血液中分离出PBMC，并检查其活力。从铺板的靶细胞中去除培养基，向孔中添加100μl的测定培养基(RPMI 1640(Gibco)，含有2％FBS和1％GlutaMax(Gibco))。抗体以指定浓度在测定培养基中稀释，并以每孔50μl添加至靶细胞。将测定培养基添加至对照孔。以6mio细胞/ml的密度重新悬浮分离的PBMC，每孔添加50μl，从而导致300,000个细胞/孔(E:T 10:1)。为了确定自发LDH释放(最小裂解＝0％)，仅将PBMC和靶细胞共孵育。为了确定最大LDH释放(最大裂解＝100％)，仅向靶细胞添加测定培养基。在不存在靶细胞的情况下，使用具有PBMC加TCB的对照孔来测试TCB的特异性。为了确定在不存在表达该靶的肿瘤细胞的情况下CD8和CD4 T细胞是否被活化，在48小时后分析CD25的表达。
在第一次LDH测量前几个小时，将50μl含有4％Triton X-100(Bio-Rad)的测定培养基添加到仅含有靶细胞的孔中(导致每孔1％Triton X-100的最终浓度)以获得最大的LDH释放。将该测定在培养箱中在37℃总计孵育48h。第一次LDH测量在测定开始后24小时进行。为此，在测量前将细胞毒性检测试剂盒(LDH)(Roche/Sigma,#11644793001)调整至室温。将测定板以420x g离心4分钟，并将每孔50μl上清液转移至96孔平底板以进行分析。然后制备每孔1.25μl的LDH催化剂和56.25μl LDH底物的反应混合物。随后将50μl LDH反应混合物添加到每个孔中，并立即使用TECAN Infinite F50仪器测量吸光度。测定开始后48小时重复测量。
之后，收获PBMC并通过测量CD25和CD69上调来分析活化。具体而言，向每孔添加100μl FACS缓冲液，将细胞转移至96孔U底板以进行FACS染色。将板以400x g离心4分钟，去除上清液并用每孔150μl FACS缓冲液洗涤细胞。将孔板以400x g离心4分钟，并去除上清液。然后将每孔30μl含有CD4 APC(克隆物RPA-T4，BioLegend)、CD8 FITC(克隆物SK1，BioLegend)、CD25 BV421(克隆物BC96，BioLegend)和CD69 PE(克隆物FN50，BioLegend)的抗体混合物添加至细胞。将细胞在冰箱中孵育30min。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并每孔重悬于含有1％PFA的100μl FACS缓冲液中。测量前，将细胞重新悬浮在150μl FACS缓冲液中。使用BD LSR Fortessa装置进行分析。
与含有亲本结合物CD3orig的TCB相比，用含有抗CD3抗体克隆物P035.093和克隆物P021.045的TCB处理导致最高的肿瘤细胞杀伤，克隆物P033.078和克隆物P035.064导致中等程度的肿瘤细胞杀伤，之后是克隆物P004.042诱导相似的肿瘤细胞杀伤(图8A至8B)。当用含有抗CD3抗体克隆物P035.093和克隆物P021.045的TCB处理时，T细胞的活化最高，而含有其他抗CD3抗体克隆物的TCB导致与含有亲本结合物CD3orig的TCB相似的T细胞活化(图9A至9D)。
如图10A至10B所示，在不存在肿瘤靶细胞的情况下，测试的TCB不会诱导CD8和CD4T细胞上的CD25上调。该结果表明，测试的CD3结合物依赖于交联，例如经由与肿瘤细胞结合来诱导T细胞活化，并且不能以单价形式诱导T细胞活化。
制备优化的抗CD3抗体
将优化的抗CD3抗体克隆物P033.078、P035.093和P004.042转化为单价人IgG1形式，其中在CD3结合部分具有交叉的VH和VL结构域，如图11A所示。
将重链和轻链DNA序列的可变区与预插入各自的受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链在框架中一起亚克隆，如图11B至11D所示。
为了正确配对重链(形成异源二聚体分子)，在抗体重链的恒定区中引入了杵入臼突变(分别为T366W/S354C和T366S/L368A/Y407V/Y349C)。
此外，将P329G、L234A和L235A突变引入抗体重链的恒定区以消除与Fcγ受体的结合。
还制备了包含CD3orig作为CD3结合物的相对应分子。
单价IgG分子在Evitria(Switzerland)制备、纯化和分析，如实例1中针对TCB分子所描述的。对于细胞的转染，以1:1:1的比率(“载体杵重链”:“载体臼重链”:“载体轻链”)施加相对应的表达载体。
表12给出所制备的单价IgG分子的生化和生物物理分析结果。
所有单价IgG分子都可以良好质量生产。
表12单价IgG形式的抗CD3抗体的生化和生物物理分析。
Figure BDA0004003174050002121
确定优化的抗CD3抗体的热稳定性
单价IgG形式的抗CD3抗体的热稳定性通过动态光散射(DLS)监测，并通过监测温度依赖性内在蛋白质荧光来检测，如前所述。
结果如表13所示。单价IgG形式的所有优化的CD3结合物的聚集温度(Tagg)和观察到的温度诱导的去折叠转换的中点(Tm)与先前描述的CD3结合物CD3orig相当或更高。
表13.单价IgG形式的抗CD3抗体的热稳定性，通过动态光散射和温度依赖性内在蛋白荧光的变化来测量。
Figure BDA0004003174050002131
通过表面等离子体共振(SPR)对优化的抗CD3抗体进行功能表征
如前所述，使用如前所述的单价IgG分子进行SPR实验。
为了分析与CD3的相互作用，在50nM下以5μl/min的流速捕获IgG分子240秒。使人和食蟹猴CD3ε柄-Fc(杵)-Avi/CD3δ柄-Fc(臼)以0.061nM至250nM的浓度和30μl/min的流速通过流通池300秒。监测解离800秒。
在表14中列出了优化的抗CD3抗体结合的所有动力学参数，与先前描述的结合物CD3orig相比。优化的抗CD3抗体(单价IgG形式)与CD3ε/δ结合，且KD值在低nM范围至高pM范围内，其中对于人CD3ε/δ的KD值为770pM至1.36nM，且对于食蟹猴CD3ε/δ和200pM至为400pM。与CD3orig相比，优化的抗CD3抗体与人CD3ε/δ结合的亲和力增加高达3.5至15倍，如在相同条件下通过SPR测量的。
抗CD3抗体克隆物P033.078与人CD3ε/δ单价结合的半衰期为8.69分钟，比CD3orig的结合半衰期高超过2倍。
表14抗CD3抗体(单价IgG形式)对人和食蟹猴CD3ε/δ的亲和力。
从三个重复测量获得的数据。
Figure BDA0004003174050002132
Figure BDA0004003174050002141
*由于拟合质量差，动力学和亲和力值可能不完全可靠实例4
包含活化T细胞抗原结合物的免疫活化Fc结合分子
在本实例中，通过在哺乳动物细胞中进行转染并通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法进行纯化来制备以下分子。
具有电荷修饰的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB(CD3结合物中的VH/VL交换)(图2B的形式，SEQ ID NO 86、68、87、88)。
具有电荷修饰的抗P329G(VH3VL1)x CD3(CH2527)1+1 TCB(CD3结合物中的VH/VL交换)(图2A的形式，SEQ ID NO 89、68、90、91)
具有电荷修饰的抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)1+1 TCB(CD3结合物中的VH/VL交换)(图2A的形式，SEQ ID NO 89、70、90、91)。
具有电荷修饰的抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB(CD3结合物中的VH/VL交换)(图2B的形式，SEQ ID NO 89、70、90、92)。
表15-抗P329G T细胞双特异性物的生化分析。通过分析尺寸排阻色谱法确定单体含量。通过非还原性SDS毛细管电泳确定纯度。
Figure BDA0004003174050002151
抗P329G x CD3 TCB与人CD3ε-δ-Fc的亲和力
仪器设备： Biacore T200
芯片： SA(#786)
Fc4： 人CD3ε-δ-Fc生物素化的(P1AA6127-015)
分析物： 抗P329G x CD3 TCB
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
稀释： 在HBS-EP中进行3倍稀释，从0.41到300nM
流速： 30μl/min
缔合： 240秒
解离： 240秒
再生： 10mM甘氨酸pH 1.5，持续30秒
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。将生物素化的人CD3ε-δ-Fc固定在SA芯片(GE Healthcare)上。使抗P329G x CD3 TCB的三倍稀释系列以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240秒，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续240s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用一次10mM甘氨酸pH1.5注入30秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列三个重复进行测量。
抗P329G x CD3 TCB与固定化的人CD3ε-δ-Fc结合的1:1Langmuir结合的动力学常数总结在表16中。
表16：抗P329G x CD3 TCB与人CD3ε-δ-Fc之间相互作用的动力学常数(1:1Langmuir结合)。独立的三个重复(同一运行中的独立稀释系列)的平均值和标准偏差(括号中)。
Figure BDA0004003174050002161
抗P329G x CD3 TCB与TCB(P329G)的亲和力
仪器设备： Biacore T200
芯片： C1(#784、785)
Fc 2(784)： 抗P329G(VH3VL1)x CD3(CH2527)1+1 TCB
Fc 3(784)： 抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)1+1 TCB
Fc 3(785)： 抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB
分析物： 在Fc上具有P329G的无关TCB(P1AE7925-003)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
稀释： 在HBS-EP中进行3倍稀释，从0.09到600nM
流速： 30μl/min
缔合： 240秒
解离： 800秒
再生： 10mM甘氨酸pH 1.5，持续2x60秒
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。通过胺偶联将抗P329G x CD3 TCB直接固定在C1芯片(GE Healthcare)上。使在Fc上具有P329G的无关TCB的三倍稀释系列以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240秒，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续800s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH 1.5注入60秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列三个重复进行测量。
抗P329G x CD3 TCB与在Fc上带有P329G的构建体的结合的1:1Langmuir结合的动力学常数总结在表17中。
表17：抗P329G x CD3 TCB与在Fc上带有P329G突变的TCB相互作用的动力学常数(1:1Langmuir结合)。独立的三个重复(同一运行中的独立稀释系列)的平均值和标准偏差(括号中)。
Figure BDA0004003174050002171
Figure BDA0004003174050002181
抗P329G x CD3 TCB与人CD3ε-δ-Fc和人Fc(P329G)的同时结合
仪器设备： Biacore T200
芯片： SA(#786)
Fc 2、3、4： 人CD3ε-δ-Fc生物素化的(P1AA6127-015)
分析物： 抗P329G x CD3 TCB，然后是人Fc(P329G)(P1AD9000-004)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
流速： 30μl/min
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。将生物素化的人CD3ε-δ-Fc固定在链霉亲和素芯片上。以30μl/min注入50nM抗P329G x CD3TCB，持续30秒，然后注入500nM人Fc(P329G)，持续60秒。
样品
分析以下样品与人CD3ε-δ-Fc的结合以及与带有P329G突变的人Fc的构建体的结合(表18)。
表18：对分析与人CD3ε-δ-Fc和人Fc(P329G)结合的样品的描述。
Figure BDA0004003174050002182
Figure BDA0004003174050002191
人Fc(P329G)通过人IgG1的纤溶酶消化制备，然后通过蛋白A和尺寸排阻色谱法进行亲和纯化。
每个TCB同时结合的传感图如图15(A至C)所示。
如预期，抗P329G x CD3 TCB与人CD3ε-δ-Fc结合。P035.093结合物的亲和力比CH2527结合物高大约10倍(分别为0.3nM和3nM)。对带有P329G突变的构建体的亲和力在6nM与30nM之间变化，并且可能受分子形式的影响。此外，正如从双特异性分子所预期的那样，两种抗原可以同时结合。
对FolR1+HeLa细胞进行Jurkat NFAT活化测定
Jurkat NFAT活化在10小时内以2小时间隔测量。使用肿瘤抗原阳性靶细胞(HeLa)与Jurkat-NFAT报告细胞(一种表达CD3的人类急性淋巴性白血病报告细胞系，具有NFAT启动子，GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)的共培养物评估肿瘤靶向huIgG1和抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB诱导T细胞交联和随后T细胞活化的能力。当抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与固定化的huIgG1(与肿瘤靶标结合)的P329G突变和CD3抗原(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达)同时结合时，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。发光信号的强度(在添加荧光素酶底物后获得)与CD3活化和信号传导的强度成正比。
作为肿瘤靶向抗体，将抗FolR1(16D5)P329G LALA huIgG1的10倍递减连续滴定与10倍递减浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1TCB(从uTCB的最高终浓度66nM到0.0066nM范围)组合使用。还滴定了肿瘤特异性huIgG1以获得66nM的最高终浓度至0.0066nM。这样，将每个浓度的P329G huIgG1与每一个浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB组合，以获得Jurkat-NFAT报告细胞的最佳活化。
对于该测定，收获了HeLa人肿瘤细胞。因此，去除生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco life technologies)洗涤细胞一次。去除PBS后，对细胞进行胰蛋白酶处理(胰蛋白酶-EDTA(0.05％)、酚红，Gibco)。使用ViCell确定细胞计数和活力。在测定前一天，将大约0.002x106个细胞/孔(10μl/孔)铺板在平底、白壁透明底384孔板(Corning#3826)中的测定培养基(RPMI 1640，10％FBS和1％Glutamax)。在测定当天，收获了Jurkat-NFAT报告细胞。因此对细胞进行计数并使用ViCell评估活力。通过以350g离心5分钟收获所需量。将大约0.01x106个细胞/孔(10μl/孔)铺板在测定培养基中，以获得5:1的靶细胞与效应细胞的最终E:T。并且随后将不同的抗体同时接种到384孔板中，最终体积为40μl。根据制造商方案使用GloSensorTM cAMP Assay(E1290,Promega)作为底物，允许对相对发光单位(RLU)进行动力学测量。使用带有温度控制和加湿气氛的TecanReader每2小时进行一次读出，允许在不干扰培养条件(37℃和5％CO2)的情况下进行自动化测量。图16中的每个点代表一个实验的技术性三个重复的平均值。标准偏差由误差条指示。作为使用抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与P329G huIgG1组合的Jurkat-NFTA报告基因测定的最佳条件，确定66nMuTCB和6.6nM P329G huIgG1的浓度，由此读出应在6至8小时后进行。
对CD20+z-138细胞进行Jurkat NFAT活化测定
Jurkat NFAT活化在10小时内以2小时间隔测量。如上所述进行测定。使用z-138靶细胞代替HeLa细胞。作为肿瘤靶向抗体，将抗CD20P329G LALA huIgG1滴定与不同浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB(uTCB的最终浓度为66nM至0.0066nM范围)组合使用。还滴定了肿瘤特异性huIgG1以获得66nM至0.0066nM的最终浓度。图17中的每个点代表一个实验的技术性三个重复的平均值。标准偏差由误差条指示。作为使用uTCB与P329GhuIgG1组合的Jurkat-NFTA报告基因测定的最佳条件，确定66nM uTCB和6.6nM P329GhuIgG1的浓度，由此读出应在6至8小时后进行。
对FAP+ MV3细胞进行Jurkat NFAT活化测定
Jurkat NFAT活化在10小时内以2小时间隔测量。如上所述进行测定。使用MV3(FAP+)靶细胞代替HeLa细胞。作为肿瘤靶向抗体，将抗FAP P329G LALA huIgG1滴定与不同浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB(TCB的最终浓度为66nM至0.0066nM范围)组合使用。还滴定了肿瘤特异性IgG以获得66nM至0.0066nM的最终浓度。这样，将每个浓度的P329G IgG与每一个浓度的uTCB结合，以获得Jurkat-NFAT报告细胞的最佳活化。
使用肿瘤抗原阳性靶细胞(MV3)与Jurkat-NFAT报告细胞(一种表达CD3的人类急性淋巴性白血病报告细胞系，具有NFAT启动子，GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)的共培养物评估肿瘤靶向huIgG1和抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB诱导T细胞交联和随后T细胞活化的能力。当TCB与固定化的huIgG1(与肿瘤靶标结合)的P329G突变和CD3抗原(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达)同时结合时，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。发光信号的强度(在添加荧光素酶底物后获得)与CD3活化和信号传导的强度成正比。图18中的每个点代表一个实验的技术性三个重复的平均值。标准偏差由误差条指示。作为使用抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1TCB与P329GhuIgG1组合的Jurkat-NFTA报告基因测定的最佳条件，确定66nM TCB和6.6nM P329GhuIgG1的浓度，由此读出应在6至8小时后进行。
对CD20+Z-138细胞和SU-DHL-4细胞进行Jurkat NFAT活化测定
在存在CD20靶向的P329G LALA huIgG1的情况下，使用靶向该靶向抗体的Fc中的P329G突变和T细胞上的CD3的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB测量Jurkat NFAT活化。作为肿瘤靶向抗体，将抗CD20 P329G LALA IgG1滴定与不同浓度的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB(两者均从最高终浓度66nM至0.0066nM范围)组合使用。
Jurkat NFAT报告细胞系是表达CD3的人急性淋巴性白血病报告细胞系，具有NFAT启动子(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)。当TCB与固定化的huIgG1(与肿瘤靶标结合)的P329G突变和CD3抗原(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达)同时结合时，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。发光信号的强度(在添加荧光素酶底物后获得)与CD3活化和信号传导的强度成正比。
对于该测定，使用ViCell对肿瘤靶细胞z-138(CD20+)或SU-DHL-4(20+)计数并检查它们的活力。通过以350g离心5分钟收获所需量的肿瘤靶细胞。将细胞重新悬浮在测定培养基(RPMI1640+10％FBS和1％Glutamax)中，并以0.002x106个细胞/孔(10μl/孔)各自接种在平底、白壁透明底384孔板(Corning#3826)。随后，收获Jurkat-NFAT报告细胞并使用ViCell评估活力。细胞以0.01x106个细胞/孔(10μl/孔)铺板，以获得5:1的最终E:T。在测定培养基中制备uTCB和IgG的系列稀释液。将10μl/孔的IgG和10μl/孔的所需uTCB浓度分别添加到384孔板的各个孔中。最终测定体积为40μl。
在7小时的孵育时间后，添加20％的ONE-GloTM荧光素酶测定读出(Promega，E6120)，并立即使用
Figure BDA0004003174050002221
读板器进行读出，测量相对发光单位(RLU)。每个点代表一个实验的技术性三个重复的平均值。标准偏差由误差条指示。
单独的抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB不显示靶细胞的任何活化，而且其中使用抗FolR1 P329G huIgG1抗体作为一抗的对照条件(FolR1不在靶细胞上表达)也不显示任何Jurkat活化。当使用一级抗CD20 P329G LALA huIgG1抗体与TCB组合时，可以观察到Jurkat NFAT细胞的活化(图19)。该活化是剂量依赖性的。
对CD20+SU-DHL-4细胞进行Jurkat NFAT活化测定
使用肿瘤靶细胞与Jurkat-NFAT报告细胞(一种表达CD3的人类急性淋巴性白血病报告细胞系，具有NFAT启动子，GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)的共培养物评估抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB诱导特异性T细胞交联和随后T细胞活化的能力。如上所述进行测定。使用抗CD20 P329G LALA huIgG1、抗CD20 LALAhuIgG1或抗CD20野生型Fc huIgG1在SU-DHL-4(CD20+)肿瘤细胞和Jurkat-NFAT报告细胞的共培养物中的滴定评估抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与P329G突变的结合特异性。所有抗体均从6.6nM(1:10稀释系列)与抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB组合开始滴定。该测定显示了TCB的特异性，因为只有当具有P329G突变的肿瘤抗原靶向CD20抗体与TCB组合使用时，才能检测到报告细胞系的活化(图20)。
杀伤粘附的肿瘤细胞
使用活细胞成像设备Incucyte，通过对随时间推移的红核细胞计数进行定量来评估对粘附肿瘤细胞的杀伤。收获粘附的靶细胞，计数并使用vicell计数器检查它们的活力。在实验前一天，将细胞在测定培养基中(高级RPMI 1640+10％FBS+1％Glutamax+Pen/Strep)调整到所需的细胞密度，并接种在100μl测定培养基中以确保适当地粘附到孔中。作为测定板，使用来自TPP的平底透明96孔板。作为效应细胞，使用Vicell计数器对人PBMC或抗P329G CAR T细胞(对与抗P329G TCB相同的突变具有特异性)进行计数并检查它们的活力。通过离心(5分钟和350g)收获细胞并调整至所需的细胞密度。将细胞以10:1的E:T比率接种在测定培养基中。将细胞接种在50或测定培养基中。抗体的制备：在测定培养基中稀释抗体，并将50ul IgG和/或抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB添加到各个孔中(抗EpCAM：图21A，抗STEAP：图21B或抗FAP：图21C)，以获得66nM TCB和/或6.6nM肿瘤靶向P329GhuIgG1的最终浓度。将板置于IncuCyte(37℃和5％CO2加湿气氛)中。使用EssenBioScience软件评估每张图像的靶细胞计数。描绘的是一个代表性的图表，显示了随着时间的推移，通过每张图像的红色核计数评估的肿瘤细胞减少(图21A至21C)。可以观察到，当使用抗P329G(M-1.7.24)x CD3(CH2527)2+1 TCB与相应的具备P329G的肿瘤特异性huIgG1组合时，肿瘤细胞生长受损。当使用直接靶向相应抗原的相应TCB或抗P329G CAR T细胞与具备P329G的肿瘤特异性huIgG1的组合时，进一步的肿瘤细胞生长也会受损。
通过不同的T细胞活化Fc结合分子形式进行T细胞活化
使用肿瘤靶细胞与Jurkat-NFAT报告细胞(一种表达CD3的人类急性淋巴性白血病报告细胞系，具有NFAT启动子，GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)的共培养物评估2+1或1+1抗P329G TCB诱导特异性T细胞交联和随后T细胞活化的能力，如上所述。当抗P329G TCB抗体与具备P329G的具有肿瘤易受调理性作用的huIgG1和CD3抗原(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达)同时结合时，Jurkat NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。发光信号的强度与CD3活化和信号传导的强度成正比，并且可以在添加荧光素酶底物后进行测量。对于该测定，肿瘤靶SUDHL-4细胞和TCB的抗体稀释行从最高浓度75nM开始(在1:4稀释系列中)滴定或huIgG1从最高浓度150nM开始(也用稀释系列1:4)滴定。将10μl/孔的每种抗体添加到各个孔中。以1:2的最终TCB与huIgG1比率进行实验。最终测定体积为每孔40μl。进行该测定以比较抗P329G x CD3 2+1 TCB与具有M-1.7.24或人源化VH3VL1 P329G结合物与CD3结合物变体CH2527或P035 039组合的抗P329G x CD3 1+1TCB形式(图22)。已证明，与TCB形式无关，鼠抗P329G(M-1.24)结合物与(CH2527)CD3结合物组合的效力低于具有人源化抗P329G结合物和P035 039CD3结合物的TCB。除了使用SU-DHL-4靶细胞和CD20靶向huIgG1之外，该实验与上一实验类似地进行。图22显示，抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 093)2+1 TCB在EC50和平台值方面表现最佳。
通过人PBMC进行HeLa靶细胞裂解
肿瘤细胞裂解通过在与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 093)2+1通用TCB或抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 093)1+1通用TCB(uTCB)一起孵育后5.5小时、24小时和48小时后释放的LDH的测量来确定。收获靶细胞，计数并检查它们的活力。将0.03x106个细胞/孔置于来自TPP的平底96孔板中的100μl培养基中。
第二天，根据赫尔辛基宣言，从苏黎世献血中心获得的血沉棕黄层中分离出PBMC效应细胞。用PBS以2:1稀释血沉棕黄层，并通过Histopaque-1077(Sigma-Aldrich#10771)上的密度梯度离心(450x g，室温30分钟不间断)来分离人PBMC。从中间相收获PBMC，用PBS以350g洗涤三次，每次10分钟。在洗涤后，将PBMC计数并将所需量以5:1E:T比率接种在测定板的各个孔中的100ul体积的测定培养基中。
uTCB和IgG的系列稀释液在测定培养基中以1:10的稀释步骤制备。uTCB与IgG的比率为1:2，最终uTCB浓度为75nM至0.0000075nM，且最终IgG浓度为150nM至0.0000150nM范围。
在孵育5.5小时、24小时和48小时后，通过将由凋亡/坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH定量(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644 793 001)来评估靶细胞杀伤。靶细胞的最大裂解(＝100％)是通过最终浓度为每对照孔1％Triton X-100的靶细胞孵育(在37℃和5CO2加湿培养箱中1小时)实现的。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共孵育的靶细胞，而没有双特异性抗体。使用多通道移液器，将50ul上清液转移到透明的96孔板中，并根据制造商的方案制备1:1新鲜制备的细胞毒性试剂，并用Tecan Spark读数器以10分钟的间隔测量吸光度。
描绘的来自三个重复的技术平均值的剂量拟合曲线，误差线指示SD，使用GraphPadPrism7计算。图23显示在5.5小时孵育后(图23A)没有诱导肿瘤细胞裂解。在20小时后(图23B)，对于1+1形式和2+1形式的两种形式uTCB，肿瘤溶解开始可检测。42小时后(图23C)，对于两种形式，测量的肿瘤细胞溶解均增加，但抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 093)2+1 TCB形式优于抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 093)1+1 TCB形式。
通过人PBMC进行CD19+Nalm 6靶细胞裂解
肿瘤细胞裂解通过在与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 039)2+1 TCB或抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 039)1+1 TCB形式(uTCB)一起孵育后5.5小时(图14A)、24小时(图14B)和48小时(图14C)后释放的LDH的测量来确定。收获靶细胞，计数并检查它们的活力。将0.03x106个细胞/孔置于来自TPP的平底96孔板中的100μl培养基中。第二天，通过在Histopaque(Sigma)上梯度离心从新鲜血液中分离人PBMC效应细胞，并接种在含有2％FCS和1％GlutaMax的50μl高级RPMI1640(测定培养基)中。uTCB和IgG的系列稀释液在测定培养基中以1:10的稀释步骤制备。uTCB与IgG的比率为1:2，最终uTCB浓度为75nM至0.0000075nM，且最终IgG浓度为150nM至0.0000150nM范围。在5.5小时、20小时和42小时后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的量热定量来评估肿瘤细胞裂解。通过用1％Triton X-100孵育靶细胞来实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共孵育的靶细胞，而没有双特异性抗体。描绘的来自三个重复的技术平均值的剂量拟合曲线，误差线指示SD，使用GraphPadPrism7计算。图24A显示5.5小时后没有可检测的肿瘤细胞溶解。20小时后，对于1+1形式和2+1形式的两种形式uTCB，肿瘤溶解开始可检测(图24B)。42小时后，对于两种形式，测量的肿瘤细胞溶解均增加，但抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 093)2+1 TCB形式优于抗P329G(VH3VL1)x CD3(P 035 093)1+1 TCB形式(图24C)。
实例4
包含共刺激(CD28)免疫活化部分的Fc结合分子
CD28的细胞外结构域的克隆
将编码人CD28(Uniprot：P10747)的细胞外结构域(突变蛋白质的氨基酸1至134)的DNA片段按框插入编码hum IgG1 Fc的片段下游的两个哺乳动物受体载体中，该编码humIgG1 Fc的片段充当溶解性和纯化标签。其中一个表达载体含有在Fc区中的“臼”突变，另一个含有“杵”突变以及C末端avi标签，允许在与Bir A生物素连接酶共表达期间进行特异性生物素化。此外，两个Fc片段都含有PG-LALA突变。将两种载体与编码BirA生物素连接酶的质粒组合共转染，以获得在C末端和Fc杵链具有单价生物素化avi-标签的二聚体CD28-Fc构建体。
靶向CD28构建体的克隆
对于所有表达质粒的生成，使用可变结构域的序列并将其与预插入相应受体哺乳动物表达载体中的相应恒定区按框进行亚克隆。所得分子的示意性描述如图25所示。在指出的情况下，已将Leu234Ala和Leu235Ala突变(LALA)引入人IgG1重链的恒定区以消除与Fcγ受体的结合。为了生成双特异性和三特异性抗体，Fc片段含有“杵”或“臼”突变以避免重链的错配。为了避免所有构建体中轻链的错配，将VH/VL、CH1/CL(κ)或CH1/CL(λ)结构域的交换引入到一个结合部分中(CrossFab技术)。在另一个结合部分，电荷被引入CH1和Cκ或Cλ结构域。
克隆了以下分子；其示意图示于图25：
分子A，抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_变体15_交叉的)1+1，双特异性huIgG1 LALA CrossFab分子，具有在抗P329G结合物M-1.7.24中的电荷修饰和在TGN1412结合物变体15中的VH/VL交换(杵)(图25A，SEQ ID NO:93、106、88、107)。
分子B，抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_变体8_交叉的)1+1，双特异性huIgG1LALA CrossFab分子，具有在抗P329G结合物M-1.7.24中的电荷修饰和在TGN1412结合物变体8中的VH/VL交换(杵)(图25B，SEQ ID NO:93、108、88、109)。
分子C，抗P329G(VH3xVL1)x CD28(TGN1412_变体8_交叉的)1+1，双特异性huIgG1LALA CrossFab分子，具有在人源化抗P329G结合物VH3xVL1中的电荷修饰和在TGN1412结合物变体8中的VH/VL交换(杵)(图25C，SEQ ID NO:89、108、90、109)。
分子D，抗P329G(VH3VL1)x CD28(TGN1412_变体8)1+1，双特异性huIgG1 LALACrossFab分子，具有在TGN1412结合物变体8中的电荷修饰(杵)和在人源化抗P329G结合物VH3xVL1中的VH/VL交换(臼)(图25D，SEQ ID NO:110、111、112、113)。
分子E，抗P329G(VH3VL1)x CD28(TGN1412_变体8)2+1_倒置，2+1huIgG1 LALACrossFab分子，“倒置取向”，具有在TGN1412结合物变体8中的VH/VL交换和在人源化抗P329G结合物VH3VL1中的电荷修饰(图25E，SEQ ID NO:89、108、90、114)。
分子F，抗P329G(VH3VL1)x CD28(TGN1412_变体8)2+1_经典，2+1huIgG1 LALACrossFab分子，“经典取向”，具有在TGN1412结合物变体中的VH/VL交换和在人源化抗P329G结合物VH3VL1中的电荷修饰(图25F，SEQ ID NO:89、108、90、115)。
靶向CD28构建体的生产
上述分子的表达由CMV启动子驱动。多聚腺苷酸化由位于CDS的3'端的合成polyA信号序列启动。此外，每个载体含有用于常染色体复制的EBV OriP序列。
如上所述，通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHO EBNA细胞生成抗体和双特异性抗体，并通过如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
靶向CD28构建体的纯化
参照标准方案且如上所述从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。
靶向CD28构建体的分析
如上所述确定经纯化的蛋白质的浓度。表19给出所有分子的纯化参数的总结。
表19：“抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_变体15_交叉的)1+1”分子的生产和纯化总结
Figure BDA0004003174050002281
PG靶向CD28分子A的SPR分析
样品
分析了表20中描述的样品与人CD28-Fc和与具有带有P329G突变的人Fc的构建体的结合。
表20：对分析与人CD28-Fc和人Fc(P329G)结合的样品的描述。
Figure BDA0004003174050002291
抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1与人CD28-Fc的亲和力
仪器设备： Biacore T200
芯片： C1(#782)
Fc4： 抗人Fc特异性(罗氏内部)
捕获： 25nM CD28-Fc(P1AE1329-007)，持续30秒
分析物： 抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1
(P1AE9465-005)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
稀释： 在HBS-EP中进行3倍稀释，从0.09到200nM
流速： 30μl/min
缔合： 240秒
解离： 1000秒
再生： 10mM甘氨酸pH 2.1，持续2x60秒
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。通过胺偶联将抗人Fc特异性抗体(罗氏内部)直接固定在C1芯片(GE Healthcare)上。将CD28-Fc在25nM下捕获30秒。使抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1的三倍稀释系列以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240秒，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续1000s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH2.1注入60秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列三个重复进行测量。表21总结了1:1Langmuir结合的动力学常数。
表21：抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1与人CD28-Fc之间相互作用的动力学常数(1:1Langmuir结合)。独立的三个重复(同一运行中的独立稀释系列)的平均值和标准偏差(括号中)。
Figure BDA0004003174050002301
抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1与TCB(P329G)的亲和力
仪器设备： Biacore T200
芯片： C1(#787)
Fc 3： 抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1
(P1AE9465-005)
分析物： 在Fc上具有P329G的无关TCB(P1AE7925-003)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
稀释： 在HBS-EP中进行3倍稀释，从0.69到500nM
流速： 30μl/min
缔合： 240秒
解离： 600秒
再生： 10mM甘氨酸pH 1.5，持续2x60秒
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。通过胺偶联将抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1直接固定在C1芯片(GEHealthcare)上。使在Fc上具有P329G的无关TCB的三倍稀释系列以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240秒，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续600s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH 1.5注入60秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列三个重复进行测量。表22总结了1:1Langmuir结合的动力学常数。
表22：抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1与在Fc上携带P329G突变的TCB相互作用的动力学常数(1:1Langmuir结合)。独立的三个重复(同一运行中的独立稀释系列)的平均值和标准偏差(括号中)。
Figure BDA0004003174050002311
抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1与人CD28-Fc和TCB (P329G)的同时结合
仪器设备： Biacore T200
芯片： C1(#787)
Fc 3： 抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1
(P1AE9465-005)
分析物： 人CD28-Fc(P1AE1329-007)，然后是在Fc上具有P329G的无关TCB(P1AE7925-003)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
流速： 30μl/min
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。
使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉)1+1化学固定在C1芯片上。以30μl/min的速度注入600nM人CD28-Fc，持续120秒，然后注入500nM的在Fc上具有P329G突变的无关TCB，持续120秒。重复注入两次。
同时结合的传感图如图26所示。
CD28双特异性抗体与过表达人CD28的细胞的结合
为了测量与人CD28的结合，我们用CHO细胞进行了基于FACS的结合测定，这些细胞经稳定转染以过表达人CD28(亲本细胞系CHO-k1ATCC#CCL-61)。
简而言之，使用细胞解离缓冲液(Gibco)分离粘附的CHO细胞，计数并检查活力。所有后续步骤均在4℃进行。
将细胞以每毫升1Mio细胞重新悬浮在FACS缓冲液中。在圆底96孔板的每孔中接种0.1Mio细胞，离心并弃去上清液。细胞以每孔50ul的总体积和递增浓度的指定CD28双特异性分子(0.12至500nM)在4℃染色30分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤两次并在4℃以每孔总计25ul孵育30分钟，含有预稀释的二抗(PE-AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性，来自Jackson Immunoresearch，109-116-170)，在FACS缓冲液中以1:100稀释。将细胞洗涤两次并在配备有FACS Diva软件的BD Canto流式细胞仪上进行分析。使用GraphPadPrism6获得了结合曲线和EC50值。
图27显示aPG-CD28分子与人CD28的浓度依赖性结合，EC50为19.6nM。
IL-2报告基因测定(T细胞活化的功能表征)
为了评估aPG-CD28支持CD3 IgG介导的T细胞活化的能力，使用IL-2报告细胞(Promega，Ca No J1651)作为效应细胞(Jurkat T细胞系，其表达由IL-2启动子驱动的荧光素酶报告基因)。
简而言之，将2.5x104个IL-2报告细胞添加到白色平底384孔板(353988FalconTM)的孔中，并在存在单独的625pM CD3 IgG(CD3结合物CH2527与含有PGLALA的Fc部分)或其与递减浓度的CD28双特异性分子(34.4nM至8.4pM；1:4稀释步骤)的情况下，在37℃孵育4小时。将测定板在室温孵育5分钟，然后添加20ul底物(ONE-Glo溶液，Promega，Cat NoE6120)。在室温在黑暗中再孵育10分钟后，使用Tecan Spark 10M读板器对发光(计数/秒)进行定量。
如图28所示，在不存在第一T细胞活化刺激物即CD3 IgG的情况下，PG靶向CD28分子不能诱导任何Jurkat活化。然而，在与CD3 IgG的Fc部分的PG突变以及在Jurkt细胞上表达的CD28同时结合时，它能够以浓度依赖性方式增强CD3 IgG诱导的Jurkat细胞的基线活化。因此，在34.4nM的aPG-CD28分子处观察到最强的增强效应。该效应取决于PG-CD28经由两个靶向部分的交联：在存在表现出无关的肿瘤抗原靶向部分而不是PG靶向部分的类似CD28分子的情况下，没有观察到CD3 IgG介导的Jurkat活化的增强。此外，当单独施用或在存在人IgG同种型对照(在其Fc部分中含有PGLALA)时，PG靶向CD28分子不能诱导任何Jurkat T细胞活化。
结论
如预期，抗P329G(M-1.7.24)x CD28(TGN1412_var15_交叉的)1+1与人CD28-Fc结合，亲和力为3nM。与Fc(P329G)的亲和力低于预期，约为40nM而不是5nM。亲和力可能受CD28结合Fab臂的影响。正如从双特异性分子所预期的那样，两种抗原可以同时结合。
抗P329G-抗CD28分子以浓度依赖性方式与P329G突变以及人CD28结合，因此仅在第一T细胞刺激物存在的情况下诱导(Jurkat)T细胞活化。
实例5
包含细胞因子(IL2v)免疫活化部分的Fc结合分子
在本实例中，通过在哺乳动物细胞中进行转染并通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法进行纯化来制备以下分子。
抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1(图29A的形式，SEQ ID NO 86、116、88)。
抗P329G(VH3VL1)x IL2v huIgG1(图29A的形式，SEQ ID NO 15、116、90)。
抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1以良好质量生产(表23)。
表23-抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1的生化分析。通过分析尺寸排阻色谱法确定单体含量。通过非还原性SDS毛细管电泳确定纯度。
Figure BDA0004003174050002341
样品
分析以下样品与人IL2Rβ-γ-Fc的结合以及与带有P329G突变的人Fc的构建体的结合(表24)。
表24：对分析与人IL2Rβ-γ-Fc和人Fc(P329G)结合的样品的描述。
Figure BDA0004003174050002342
人Fc(P329G)通过人IgG1的纤溶酶消化制备，然后通过蛋白A和尺寸排阻色谱法进行亲和纯化。
抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1与人IL2R-Fc的亲和力
仪器设备： Biacore T200
芯片： CM5(#772)
Fc1至Fc4： 抗人Fab特异性(GE Healthcare 28-9583-25)
捕获： 10nM IgG-IL2v，持续120秒
分析物： 人IL2Rβ-γ-Fc(P1AE2657-005)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
稀释： 在HBS-EP中进行3倍稀释，从0.09到200nM
流速： 30μl/min
缔合： 240秒
解离： 800秒
再生： 10mM甘氨酸pH 2.1，持续2x60秒
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。将抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare 28-9583-25)通过胺偶联直接固定在CM5芯片(GEHealthcare)上。以10nM捕获抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1 120秒。使人IL2Rβ-γ-Fc的三倍稀释系列以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240秒，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续800s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH 2.1注入60秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列三个重复进行测量。
表25总结了1:1Langmuir结合的动力学常数。
表25：抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1与人IL2R-Fc之间相互作用的动力学常数(1:1Langmuir结合)。独立的三个重复(同一运行中的独立稀释系列)的平均值和标准偏差(括号中)。
Figure BDA0004003174050002361
抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1与TCB(P329G)的亲和力
仪器设备：Biacore T200
芯片： C1(#785)
Fc 2： 抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1
分析物： 在Fc上具有P329G的无关TCB(P1AE7925-003)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
稀释： 在HBS-EP中进行3倍稀释，从0.09到600nM
流速： 30μl/min
缔合： 240秒
解离： 800秒
再生： 10mM甘氨酸pH 1.5，持续2x60秒
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。通过胺偶联将抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1直接固定在C1芯片(GE Healthcare)上。使在Fc上具有P329G的无关TCB的三倍稀释系列以30μl/min的速度在配体上方经过，持续240秒，以记录缔合阶段。监测解离阶段持续800s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH 1.5注入60秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池1上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列三个重复进行测量。
表26总结了1:1Langmuir结合的动力学常数。
表26抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1与在Fc上带有P329G突变的TCB相互作用的动力学常数(1:1Langmuir结合)。独立的三个重复(同一运行中的独立稀释系列)的平均值和标准偏差(括号中)。
Figure BDA0004003174050002371
抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1与人IL2Rβ-γ-Fc和人Fc(P329G)的同时结合
仪器设备： Biacore T200
芯片： SA(#783)
Fc 2： IL2Rβ-γ-Fc生物素化的(P1AE2657-005)
分析物： 抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1，然后是人Fc(P329G)(P1AD9000-004)
运行缓冲液： HBS-EP
T°： 25℃
流速： 30μl/min
SPR实验均使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69，GE Healthcare))在Biacore T200上进行。将经生物素化的人IL2Rβ-γ-Fc固定在链霉亲和素芯片上。以30μl/min注入200nM抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1，持续240秒，然后注入400nM人Fc(P329G)，持续180秒。重复注入三次。
同时结合的传感图如图29B所示。
结论
如预期，抗P329G(M-1.7.24)x IL2v huIgG1与人IL2Rβ-γ-Fc和人Fc(P329G)结合。正如从双特异性分子所预期的那样，两种抗原可以同时结合。
用递增剂量的aPG-IL2v处理后，在经抗PD-1处理的或未处理的PD-1+CD4 T细胞上的IL-2R信号传导(STAT5-P)
在该实验中，STAT5磷酸化(STAT5-P)用于证明IL-2v将抗PG-IL2v化合物递送至先前用抗PD-1抗体预处理的PD-1+CD4 T细胞的IL-2R。
为此目的，用CD4珠粒(130-045-101，Miltenyi)从健康供体PBMC中分选CD4 T细胞，并在存在1μg/ml板结合抗CD3(过夜预包被，克隆物OKT3，#317315，BioLegend)和1μg/ml可溶性抗CD28(克隆物CD28.2，#302923，BioLegend)抗体的情况下活化3天以诱导PD-1表达。三天后，收获细胞并洗涤数次以去除内源性IL-2。然后，将细胞分成两组，其中一组与饱和浓度的抗PD1抗体(内部分子，10ug/ml)在室温一起孵育30分钟。
在几个洗涤步骤以去除过滤的未结合的抗PD-1抗体后，将经抗PD1预处理的和未处理的细胞(50ul，2*106个细胞/ml)接种到V底板中，然后在37℃用递增浓度的抗体(50ul，1:10稀释步骤，最高浓度为66nM)处理12分钟。为了保持磷酸化状态，在与各种构建体一起孵育12分钟后立即添加等量的Phosphoflow固定缓冲液I(100ul，557870，BD)。然后将细胞在37℃再孵育30分钟，然后在-80℃用Phosphoflow PermBuffer III(558050，BD)透化过夜。第二天，使用抗STAT-5P抗体(47/Stat5(pY694)克隆物，562076，BD)在4℃将磷酸化形式的STAT-5染色30分钟。
这些细胞是在FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)获得的。用FlowJo(V10)确定STAT-5P的荧光强度(MFI)的频率和几何平均值，并用GraphPad Prism作图(图29C和29D)。
该实验表明，aPG-IL2v将IL-2v递送至经抗PD-1预处理的CD4 T细胞，其效力比此处用作阳性对照的PD1-IL2v低大约3倍。在不存在抗PD-1预处理且因此不存在靶向的情况下，PG-IL2v与在此用作评估非靶向IL-2R信号传导的对照FAP-IL2v相当。
实例6
包含共刺激(4-1BBL)免疫活化部分的Fc结合分子
P329G靶向分裂三聚体4-1BB配体Fc融合蛋白的制备
将编码对于P329G Fc突变具有特异性的结合物的重链和轻链DNA序列的可变区与臼的恒定重链或人IgG1的恒定轻链一起按框进行亚克隆。
根据Uniprot数据库的P41273序列，合成了编码人4-1BB配体胞外域(氨基酸71-248)部分的DNA序列。
将含有通过(G4S)2接头隔开的两个4-1BB配体胞外域并且与人IgG1-CL结构域融合的多肽如图30A中所述进行克隆：人4-1BB配体、(G4S)2连结子、人4-1BB配体、(G4S)2连结子、人CL。
将含有一个4-1BB配体胞外域并且与人IgG1-CH结构域融合的多肽，如图30B中所述进行克隆：人4-1BB配体、(G4S)2连结子、人CH。
为了改善正确的配对，已经将以下突变引入到交叉的CH-CL中。在与人CL融合的二聚4-1BB配体中，引入了E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入了K147E和K213E。
已经将Leu234Ala和Leu235Ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚配体-Fc杵链、单体CH1融合物、所靶向的含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗P329G Fc臼链和抗P329G轻链的组合允许生成异源二聚体，该异源二聚体包括组装的三聚4-1BB配体和P329G结合Fab，也称为抗P329G x 4-1BBL huIgG1(图31)。
克隆了以下分子；其示意图示于图31：
抗P329G(M-1.7.24)x 4-1BBL huIgG1 LALA，具有在抗P329G结合物中的电荷修饰(SEQ ID NO:10、129、130、131)。
人源化抗P329G(VH3VL1)x 4-1BBL huIgG1 LALA，具有在抗P329G结合物中的电荷修饰(SEQ ID NO:15、129、130、132)。
双特异性构建体通过以的相应表达载体转染哺乳动物细胞来制备，表达载体比率为1:1:1:1(“载体4-1BBL Fc-杵链”：“载体4-1BBL轻链”：“载体Fc臼链”：“载体轻链”)转染细胞。
在HEK293 EBNA或CHO EBNA细胞中产生IgG样蛋白质
如上所述，通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHO EBNA细胞生成双特异性抗体，并通过如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
IgG样蛋白质的纯化
参照标准方案如上所述从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。
IgG样蛋白质的分析
如上所述确定经纯化的蛋白质的浓度。
表27-抗P329G(M-1.7.24)x 4-1BBL huIgG1的生化分析
Figure BDA0004003174050002401
通过表面等离子体共振对P329G靶向分裂三聚体4-1BB配体Fc融合物进行功能表 征
通过表面等离子体共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和含有P329G突变的人Fc的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。将生物素化的人4-1BB Fc(kih)蛋白直接偶联至SA传感器芯片的流通池。所用的固定水平为约4000RU。
使抗P329G(M-1.7.24)x 4-1BBL huIgG1以200nM的浓度范围以30μL/min的流速历经240秒经过流通池，并且将解离设置为零秒。将在Fc中含有P329G突变的人IgG1抗体作为第二分析物以200nM的浓度以30μL/min的流速历经180秒注入流通池(图32A)。监测解离600秒。通过扣除在蛋白质未固定化的参比流通池中获得的应答，校正本体折射率差异。
如图32B中可见，抗P329G(M-1.7.24)x 4-1BBL huIgG1可以同时结合人4-1BB和在Fc中含有P329G突变的人IgG1。
抗P329G x 4-1BBL huIgG1可以增强CD20-TCB介导的T细胞活化和肿瘤细胞裂解
在WSU DLBCL靶上评估了通过单独的或与抗P329G(M-1.7.24)x 4-1BBL huIgG1组合的CD20-TCB进行的T细胞介导的裂解。人B细胞耗尽的PBMC用作效应细胞，并在与双特异性抗体(1nM CD20-TCB、1nM抗P329G x 4-1BBL huIgG1)孵育3天后测量杀伤以及T细胞活化。
简而言之，将每孔50000WSU DLCL2接种到96孔U底板中。通过对从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)进行Histopaque密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液，并在Histopaque梯度(Sigma,#H8889)上分层。离心分离(450x g，不间断，30分钟，室温)后，弃去含有PBMC的中间相以上的血浆，并将PBMC转移到新的falcon管中，随后用50ml PBS填充。将混合物离心分离(350x g，10分钟，室温)，弃去上清液，并将PBMC沉淀物在红细胞裂解液中在37℃孵育5分钟，然后用无菌PBS洗涤(以300x g离心，10分钟)。将所得PBMC群体重新悬浮在PBS中并自动计数(ViCell)。根据制造商的说明，使用CD20微珠粒(Miltenyi)进行B细胞耗尽。对B细胞耗尽的PBMC进行计数(ViCell)并以5x106/ml重新悬浮于含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中。对于杀伤测定，将250000个B细胞耗尽的PBMC添加到靶中(E:T 5:1)并添加抗体稀释液(1nM终末浓度，三个重复)。在37℃、5％CO2下孵育3天后，通过将由凋亡/坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH定量(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644793 001)来评估靶细胞杀伤。通过用1％Triton X-100孵育靶细胞来实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共孵育的靶细胞，而没有双特异性构建体。去除上清液以进行LDH测量后，对剩余的细胞进行染色，以通过流式细胞术确定T细胞活化。简而言之，用PBS洗涤细胞两次，然后进行活/死染色(Zombie Aqua，RT 20分钟)。先后用PBS和FACS缓冲液重复洗涤后，使用抗人CD4-BV605、抗人CD8-BV711、抗人CD25-PECy7和抗人CD69-BV421(全部来自Biolegend)在4℃在黑暗中染色30分钟。洗涤细胞并且用BD FACS裂解溶液处理，然后使用BD FACS CantoII进行测量。
结果表明，抗P329G(M-1.7.24)x 4-1BBL huIgG1可以增强CD20-TCB介导的T细胞活化和肿瘤细胞裂解(图33)。
具有与4-1BB的二价结合和与含有P329G突变的Fc的单价结合的双特异性抗体的 生成
具有与4-1BB的二价结合和与含有P329G突变的Fc的单价结合的双特异性激动性4-1BB抗体如图34所示制备。该构建体也称为2+1抗4-1BB x抗P329G huIgG1。
构建体的第一重链HC1由以下组分组成：抗4-1BB结合剂(克隆20H4.9)的VHCH1，后接Fc臼。第二重链HC2由以下组成：抗P329G结合物的VLCH1(呈交叉Fab形式)，后接抗4-1BB(克隆物20H4.9)的VHCH1，后接Fc杵。P329G结合物的生成和制备描述于WO2017/072210中，该专利以引用方式并入本文。对于4-1BB结合剂，根据US 7,288,638 B2或US 7,659,384 B2获得克隆20H4.9的VH和VL序列。两条重链结合允许生成异源二聚体，其包括一个P329G结合交叉Fab和两个4-1BB结合Fab(图34)。
为改善正确配对，已在抗4-1BB Fab分子的CH-CL中引入了以下突变：CL中的E123R和Q124K以及CH1中的K147E和K213E。抗P329G结合物的第二轻链LC2由VHCL(交叉Fab)构成。
应用杵臼技术，通过在第一重链HC1(Fc臼重链)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突变并且通过在第二重链HC2(Fc杵重链)中引入S354C/T366W突变以形成异二聚体。
已经将Leu234Ala和Leu235Ala突变引入杵和臼重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
双特异性抗体2+1抗4-1BB(20H4.9)x抗P329G(M-1.7.24)huIgG1的氨基酸序列可见于表4。双特异性抗体2+1抗4-1BB(20H4.9)x抗P329G(VH3VL1)huIgG1的氨基酸序列可见于表5。
克隆了以下分子；其示意图示于图34：
抗4-1BB(20H4.9)x抗P329G(M-1.7.24)2+1，双特异性huIgG1 LALA CrossFab分子，具有在抗P329G结合物中的电荷修饰和在抗P329G结合物中的VH/VL交换(杵)(SEQ IDNO:141、142、143、1442)。
抗4-1BB(20H4.9)x人源化抗P329G(VH3VL1)2+1，双特异性huIgG1LALA CrossFab分子，具有在抗P329G结合物中的电荷修饰和在抗P329G结合物中的VH/VL交换(杵)(SEQ IDNO:110、142、145、144)。
双特异性构建体通过以相对应的表达载体转染哺乳动物细胞来生产，表达载体比率为1:1:1:2(“载体Fc-杵链”：“载体轻链(a-P329G)”：“载体Fc臼链”：“载体轻(20H4.9)链”)。
在HEK293 EBNA或CHO EBNA细胞中产生IgG样蛋白质
如上所述，通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHO EBNA细胞生成双特异性抗体，并通过如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
IgG样蛋白质的纯化
参照标准方案且如上所述从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。
IgG样蛋白质的分析
如上所述确定经纯化的蛋白质的浓度。
体外测定中抗P329G靶向分裂三聚体4-1BB配体Fc融合的功能表征-表达人4-1BB 和NF-κB-荧光素酶报告基因的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NFκB活化
4-1BB(CD137)受体与其配体(4-1BBL)的激动性结合通过活化核因子kappa B(NFkB)诱导4-1BB下游信号传导，并且促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,ChoiBK,Kim HH,Nam KO,Kwon BS.4-1BB promotes the survival of CD8(+)T lymphocytesby increasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。为了监测由抗P329G-4-1BBL双特异性抗体样融合分子介导的NFκB活化，从Promega(Germany)购得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。细胞培养方法如上文所述。在测定中，收获细胞并将其重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的测定培养基RPMI1640培养基中。将10μL含有2×103Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的报告细胞转移至带顶盖的无菌白色384孔平底组织培养板的各个孔中(Corning，目录号3826)。此外，提供10μL单独的或含有1x104个细胞的靶表达细胞的测定培养基，例如CEACAM5(CD66e)+MKN45人胃癌细胞或Her2+KPL4人乳腺癌或成纤维细胞活化蛋白(FAP)+NIH/3T3-huFAP克隆物19基因修饰的小鼠成纤维细胞。作为阳性对照，添加20μL滴定浓度的肿瘤靶向(TT)-4-1BBL，例如Her2(帕妥珠单抗)-4-1BBL、CEA(T84.66-LCHA)-4-1BBL或FAP(4B9)-4-1BBL。在其他孔中添加10μL培养基或滴定浓度的抗P329G-4-1BBL。然后添加10μL滴定浓度的huIgG P329G LALA，它们对Her2(帕妥珠单抗)、CEACAM5(T84.66-LCHA)、FAP(4B9)具有特异性或是非特异性的(DP47，阴性对照)。调整添加的huIgG1 P329G LALA浓度以测试肿瘤特异性huIgG1 P329GLALA与抗P329G-4-1BBL(固定的)之间的不同比率。将板在细胞培养箱中在37℃和5％CO2下培养5小时。向每个孔中添加8μl新鲜解冻的One-Glo荧光素酶测定检测溶液(Promega，目录号E6110)，并且使用Tecan酶标仪(积分时间为500ms，无滤光片，采集所有波长的信号)将发光强度立即测量为所释放的光的单位(URL)。使用未处理的孔的基线荧光素酶活性对值进行基线校正。所述设置在图35中示意性地示出。
如图36所示，测试了aP329G-4-1BBL(固定浓度)与肿瘤靶特异性人IgG1 P329GLALA(可变浓度)之间的不同比率，以评估最佳比率。该评价表明，不同的比率没有改变aP329G-4-1BBL的活性。如果与直接靶向TT-4-1BBL分子相比，间接交联(huIgG1 P329GLALA+aP329G-4-1BBL)的施加导致更高的EC50值。有趣的是，如果与直接靶向Her2(帕妥珠单抗)-4-1BBL相比，aP329G-4-1BBL的活化最大值相似，但如果与CEA(T84.66-LCHA)-4-1BBL相比，则不然。
如图37所示，aP329G-4-1BBL在功能上不依赖于所使用的肿瘤-靶特异性人IgG1P329G LALA。此外，该功能性是针对靶特异性的和浓度依赖性的。拟合EC50值列于表28中。如果与直接肿瘤靶向(TT)-4-1BBL相比，间接靶向aP329G-4-1BBL的EC50值再次降低。但如果分子经由Her2或FAP靶向，则活性最大值相似，由此，如果经由间接交联的aP329G-4-1BBL来活化4-1BB，则经由CEACAM5靶向导致最大值降低，而通过TT-4-1BBL活化则不然。因此，aP329G-4-1BBL与TT-4-1BBL之间的差异是靶依赖性的。
表28：EC50值[nM]和最大活性值[URL]
Figure BDA0004003174050002451
Figure BDA0004003174050002452
Figure BDA0004003174050002453
实例7
ADCC感受态分子
本发明的免疫效应细胞活化Fc结合分子的示例性配置
图38示出能够与肿瘤靶向分子(例如IgG1、SM)的P329G突变结合的IgG1效应分子(抗P329G(VH3VL1)huIgG1)的示例性图示。(B)抗P329G IgG1效应分子与肿瘤靶向IgG的P329G突变和免疫效应细胞上的FcγRIII的结合模式的示例性配置。肿瘤细胞和靶细胞的交联是通过抗P329G huIgG1与相应的肿瘤靶向IgG的结合来诱导的。更详细地说，抗P329GIgG1的两个Fab臂可以结合存在于例如抗原特异性IgG的Fc区中的P329G突变。该抗原特异性IgG能够用两个Fab臂结合靶抗原。抗P329G IgG Fc结合分子的Fc部分能够与存在于免疫效应细胞上的FcγRIII受体结合。抗P329Ghu IgG1+抗原靶向IgG复合物的形成导致免疫效应细胞和肿瘤细胞的交联，导致免疫效应细胞活化和靶细胞裂解。
在存在具有P329G LALA突变的肿瘤抗原靶向IgG1(IgG1TA)的情况下，具有糖工程 化的Fc(IgG1ADCC driver抗体)的IgG1诱导ADCC
通过将靶细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放定量来评估抗P329G IgG1ADCC driver抗体与抗CD20 IgG1TA的复合物诱导ADCC的能力。因此，根据赫尔辛基宣言，从苏黎世献血中心获得的血沉棕黄层中分离出PBMC效应细胞。用PBS以2:1稀释血沉棕黄层，并通过Histopaque-1077(Sigma-Aldrich#10771)上的密度梯度离心(450x g，室温30分钟不间断)来分离人PBMC。从中间相收获PBMC，用PBS以350g洗涤三次，每次10分钟。洗涤后，使用Vi-cell对PBMC进行计数。将细胞以12.5Mio/ml制备在RPM11640+2％FBS+1％Glutamax+1％GibcoTMAntibiotic-Antimycotic(100X)(目录号：15240062)(测定培养基)中。将0.625Mio活细胞/孔以50μl/孔接种到透明的96-U孔板(TPP)中。作为靶细胞，将z-138(CD20+)细胞通过Vi-cell计数，并以2500个活细胞/ml接种在50ul的测定培养基中，与相应孔中的PVMC共培养。效应子与靶的比率为25:1。
在测定培养基中以1:10稀释步骤制备不同抗体的系列稀释液，从浓度为450nM的IgG1ADCC dricer抗体抗P329G huIgG1或抗CD20(GA101)huIgG1 GE变体和900nM的IgG1TA抗CD20(GA101)huIgG1 P329G LALA抗原靶向抗体开始。IgG1ADCC driver与IgGTA的最终比率为1:2。对于流式细胞术分析，制备了380μl抗CD107a-PE+3420μl测定培养基，并将10μl/孔稀释的人抗CD107a(biologend)添加至细胞。孔的最终体积为210μl。将板在加湿培养箱中在37℃和5％CO2下孵育5小时。
5小时后，通过将由凋亡/坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH定量(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644 793 001)来评估ADCC。靶细胞的最大裂解(＝100％)是通过最终浓度为每对照孔1％Triton X-100的靶细胞孵育(在37℃和5％CO2加湿培养箱中至少1小时)实现的。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共孵育的靶细胞，而没有抗体。使用多通道移液器，将50μl上清液转移到透明的96孔板中，并根据制造商的方案以1:1添加新鲜制备的细胞毒性试剂，并用Tecan Spark读数器以10分钟的间隔测量吸光度。在图39中描绘了来自三个重复的技术平均值且误差线指示SD。作为p值，使用GraphPadPrism 7中列出的新英格兰医学杂志(New England Journal of Medicine)样式。含义*＝P≤0,033；**＝P≤0,002；***＝P≤0,001。
在图39中，可以观察到抗CD20(GA101)huIgG1 GE变体诱导剂量依赖性ADCC。使用GE变体的抗CD20(GA101)huIgG1 P329G LALA+抗P329G(VH3VL1)huIgG1复合物也介导剂量依赖性ADCC。当ADCC驱动抗体为450nM的最高浓度时，抗CD20(GA101)huIgG1 P329G LALA+抗P329G(VH3VL1)huIgG1野生型复合物诱导ADCC的程度降低，与GE变体相比具有显著差异。
与具有糖工程化的Fc的IgG1(IgG1ADCC driver抗体)共孵育后NK细胞的受体调节
图40和图41所示的实验：建立在图39中描述的实验上。在图39所示的实验中，仅分析了测定的上清液。相反，在下面说明的实验中(图40和图41)，自然杀伤细胞(NK)通过其CD16下调(图40)和CD107a上调(图33)用流式细胞术进行表征。因此将测定板离心并弃去上清液。用PBS洗涤板三次。用于细胞染色的抗体混合物如下制备：400μl CD3-PE/Cy7+400μlCD56-APC+400μl CD16-FITC+18800μl PBS缓冲液(所有抗体均购自biolegend)。细胞在黑暗中在大约4℃至8℃染色30分钟。然后用FACS缓冲液(PBS+2％FCS+5mM EDTA+0.25％酸钠)洗涤板两次，并通过FACSCantoII测量样品并使用FlowJo软件进行分析。在图40和图41中描绘了来自三个重复的技术平均值且误差线指示SD。作为p值，使用GraphPadPrism 7中列出的新英格兰医学杂志(New England Journal of Medicine)样式。含义*＝P≤0,033；**＝P≤0,002；***＝P≤0,001。图40显示在使用抗CD20(GA101)huIgG1 P329G LALA+抗P329G(VH3VL1)huIgG1复合物(该复合物使用GE变体和抗CD20(GA101)huIgG1 GE)进行活化后，CD16的剂量依赖性下调。使用抗CD20(GA101)huIgG1 P329G LALA+抗P329G(VH3VL1)huIgG1野生型复合物未显示CD16受体的下调。在图41中，当使用抗CD20(GA101)huIgG1 P329GLALA+抗P329G(VH3VL1)huIgG1复合物(该复合物使用GE变体或抗CD20(GA101)huIgG1 GE)时，可以观察到NK细胞上CD107a的剂量依赖性上调。对于高浓度的抗体，抗CD20(GA101)huIgG1 P329G LALA+抗P329G(VH3VL1)huIgG1复合物的使用也显示了NK细胞上CD107a受体的上调。抗CD20 IgG1 P329G LALA+抗P329G IgG1 GE复合物和抗CD20(GA101)huIgG1P329G LALA+抗P329G(VH3VL1)huIgG1复合物之间的差异对于高于45nM的浓度是显著的。
肿瘤基质靶向huIgG1(aFAP克隆物4B9)和抗P329G人IgG1 mAb以诱导FcRγIIIa
肿瘤基质靶向huIgG1(aFAP克隆物4B9)和抗P329G人IgG1 mAb诱导FcRγIIIa交联以及随后的NFAT活化和ADCC的能力，使用靶蛋白包被珠粒(人FAP)和Jurkat-NFAT报告细胞(一种表达FcγRIIIA的人急性淋巴性白血病报告细胞系，具有NFAT启动子，Jurkat FcγRIIIa V158_NFAT-RE_luc，Promega，Cat#G9791)的共培养物进行评估。当抗P329G人IgG1抗体与固定化的huIgG1(与FAP结合)的P329G突变和FcRγIIIa(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达)同时结合时，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。发光信号的强度(在添加荧光素酶底物后获得)与CD16活化和信号传导的强度成正比。
测试了两种条件。作为肿瘤靶向抗体，固定浓度(10μg/mL)的抗FAP(4B9)P329GLALA huIgG1与抗P329G huIgG1的8倍递减稀释系列(从最高终浓度20μg/mL至7.6*10-5μg/mL范围)组合使用，范围(图42A)。或者，作为肿瘤靶向抗体，抗FAP(4B9)P329G LALA huIgG1的8倍递减连续滴定(从最高终浓度20μg/mL到7.6*10-5μg/mL范围)与固定浓度(10μg/mL)的抗P329G huIgG1组合使用(图42B)。众所周知，ADCC感受态抗体的效应子功能受该抗体Fc区中的N-连接糖基化的调节。特别地，已显示Fc N-聚糖上不存在核心岩藻糖会增加IgG1Fc与存在于免疫效应细胞(诸如自然杀伤细胞)上的FcγRIIIa的结合亲和力，并导致增强的ADCC活性。因此，作为完全岩藻糖基化和无岩藻糖基化的人IgG1同种型而测试抗P329GhuIgG1。
对于该测定，收获了Jurkat FcγRIIIa V158_NFAT-RE_luc报告细胞。使用CedexHiRes细胞计数器对细胞进行计数并评估活力。通过以300g离心5分钟收获所需量。在白色平底384孔板(Corning#3826)中，将大约2x104个细胞/孔接种在AIM-V测定培养基中。随后，以5x103个珠粒/孔的数量添加FAP包被的珠粒，以达到4比1的效应子与靶的比率。将不同的抗体组合也添加到384个孔中，最终体积为30μl。根据制造商的方案使用ONE-Glo荧光素酶检测系统(E6120,Promega)作为底物，允许对相对发光单位(RLU)进行终点测量。使用TecanSpark 10M发光读板器和500ms积分时间在22小时后进行读出。图42中的每个点代表一个实验的技术性一式两份的平均值。平均值的标准误差由误差线指示。
FAP包被的珠粒由DynabeadsTM M-280链霉亲和素(Invitrogen，#11205D)制备，如制造商的方案中所述，用生物素化的人FAP(罗氏)包被。简而言之，在轻轻旋转(MACSmixTMTube Rotator)下，将经12x106PBS洗涤的珠粒在21.5μL PBS中用2.43μg生物素化的人FAP包被30分钟。
只有抗FAP(克隆物4B9)人IgG1 P329GLALA与抗P329G人IgG1 mAb的组合在JurkatFcγRIIIa V158_NFAT-RE_luc报告细胞中诱导剂量依赖性NFAT活化，这是ADCC感受态的衡量标准。单独的抗FAP(克隆物4B9)人IgG1 P329GLALA和抗P329G人IgG1 mAb都无法做到这一点(剂量应答曲线的第一个数据点)。因此，可以独立选择靶饱和度和ADCC能力的最佳浓度，以优化患者的治疗功效。相较于与完全岩藻糖基化的人IgG1 mAb相同的克隆物，抗P329G人IgG1 mAb的无岩藻糖基化版本显示出优越的ADCC效力。
实例8
Jurkat NFAT Luc动力学T细胞活化测定
在存在HeLa肿瘤细胞的情况下，使用Jurkat NFAT报告细胞历经24小时的时间段以2小时间隔测量由抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALA Fc诱导的T细胞活化动力学。
Jurkat NFAT报告细胞(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)是一种表达CD3的人急性淋巴性白血病报告细胞系，具有控制萤火虫荧光素酶表达的NFAT应答元件。在CD3交联后，NFAT启动子被活化，导致荧光素酶的剂量依赖性表达。添加荧光素酶底物导致发光信号，反映Jurkat NFAT T细胞活化的强度。交联可以由TCB引发，TCB同时结合肿瘤靶和Jurkat细胞上的CD3。
在存在肿瘤靶向P329G LALA huIgG1的情况下，测试了由抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB诱导的Jurkat NFAT活化。
使用肿瘤抗原阳性靶细胞(HeLa)和Jurkat-NFAT报告细胞的共培养物来评估肿瘤靶向抗FOLR1 P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329RLALA Fc诱导T细胞活化的能力。
作为肿瘤靶向抗体，抗FolR1(16D5)P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc以IgG:TCB 2:1的摩尔比组合使用。作为阳性对照，使用直接肿瘤靶向抗FolR1(16D5)x CD3(P035.093)2+1 TCB。
非结合DP47 x CD3(P035.093)2+1 TCB用作阴性对照。测试了三种TCB浓度：0nM、0.05nM、5nM，以评估Jurkat-NFAT报告细胞活化的剂量依赖性。
作为测定的准备工作，收获了HeLa人肿瘤细胞。从细胞培养瓶中去除生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco#20012)洗涤细胞一次。去除PBS后，对细胞进行胰蛋白酶处理(胰蛋白酶-EDTA(0.05％)、酚红，Gibco#25300-054)。使用Countess自动细胞计数器(Invitrogen#C10227)确定细胞计数和活力。在测定前一天，将0.002x106个细胞/孔(10μl/孔)铺板在平底白色384孔板(Corning#353988)中的测定培养基(RPMI1640、10％FBS、1％GlutaMAX)中。在测定当天，收获了Jurkat-NFAT报告细胞。使用Countess装置对细胞进行计数并评估活力。通过以350g离心5分钟收获必需的量。将0.01x106个细胞/孔(10μl/孔)铺板在测定培养基中，以获得5:1的最终效应子与靶细胞比率(E:T)。随后，在测定培养基中制备抗体稀释液，并添加到384孔板中以获得40μl的最终体积。根据制造商方案使用GloSensorTMcAMP Assay(Promega#E1290)作为荧光素酶底物，允许对相对发光单位(RLU)进行动力学测量。使用带有温度和CO2控制(37℃和5％CO2)和加湿气氛的Tecan Spark 10M读数器每2小时自动进行一次读数，因此可以在不干扰培养条件的情况下进行自动化测量。以300ms/孔获得发光信号，并计算以反映RLU/s每孔。
图45表示用0nM(图45A)、0.05nM(图45B)和5nM(图45C)浓度的TCB进行的实验。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。评估了抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1TCB,P329R LALA Fc的动力学活性，并确定Jurkat-NFAT-Luc报告基因测定法的最佳孵育时间为4小时与6小时之间。确定达到与直接TCB相当的效果所需的抗P329G TCB浓度为大约5nM。
对一组FOLR+细胞进行Jurkat NFAT Luc活化测定：HeLa、JAR、OVCAR-3、SKOV-3
用上述Jurkat-NFAT报告细胞(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)评估FOLR1靶向P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1TCB,LALA Fc跨数种FOLR1+肿瘤细胞系的T细胞活化能力。
在存在肿瘤靶向P329G LALA huIgG1的情况下，测试了由抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALA Fc诱导的Jurkat NFAT活化。
作为肿瘤靶向抗体，抗FolR1(16D5)P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALA Fc以IgG:TCB 2:1的摩尔比组合使用。将非结合DP47 P329GLALA huIgG1与抗P329G TCB以IgG:TCB 2:1的摩尔比组合用作阴性对照。作为阳性对照，使用直接肿瘤靶向抗FolR1(16D5)x CD3(P035.093)2+1 TCB。
将抗P329G TCB与最高浓度的相应IgG以IgG:TCB 2:1的摩尔比混合，并一起滴定。所有TCB从75nM的TCB开始连续稀释4倍，生产从75nM到1.12x10-6nM的浓度范围。
实验如前所述进行，使用不同的读出方案，由单个时间点组成。使用HeLa、JAR、OVCAR-3和SKOV-3作为靶细胞。将测定组分在37℃和5％CO2下孵育6小时。孵育时间后，根据制造商的方案使用荧光素酶底物ONE-GloTM荧光素酶检测试剂(Promega#E6120)，允许测量相对发光单位(RLU)。使用Tecan Spark 10M读数器进行读出。以300ms/孔获得发光信号，并计算以反映RLU/s每孔。
图46描绘了用HeLa(图46A)、JAR(图46B)、OVCAR-3(图46C)、SKOV-3(图46D)进行的实验的结果。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。
在存在抗FOLR1 P329G LALA huIgG1的情况下，抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALA Fc跨所有测试的FOLR1+细胞系显示出剂量依赖性T细胞活化能力，验证了IgG1衔接子为可行的策略。在存在DP47 P329G LALA huIgG1的情况下，抗P329GTCB在大多数测试浓度下都无效，在75nM时显示出残留活性。
对HeLa(FOLR1+)细胞进行Jurkat NFAT活化测定；抗P329G TCB 的P329R LALA Fc 和LALA Fc版本的比较
用上述Jurkat-NFAT报告细胞(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)评估抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALA Fc和抗P329G(VH3VL1)xCD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc的T细胞活化能力。
在存在肿瘤靶向P329G LALA huIgG1的情况下，测试了由具有LALA Fc或P329RLALA Fc的抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB诱导的Jurkat NFAT活化。
作为肿瘤靶向抗体，抗FolR1(16D5)P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc或抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALAFc组合使用，摩尔比IgG:TCB 2:1。使用没有P329G LALA huIgG1的抗P329G TCB作为阴性对照。作为阳性对照，使用直接肿瘤靶向抗FolR1(16D5)x CD3(P035.093)2+1 TCB。
将抗P329G TCB与最高浓度的相应IgG以IgG:TCB 2:1的摩尔比混合，并一起滴定。所有TCB从75nM的TCB开始连续稀释10倍，生产从75nM到75x10-9nM的浓度范围。
如前所述进行实验，使用单个时间点测量。使用HeLa作为靶细胞。在添加荧光素酶底物和读出程序之前，将测定组分在37℃和5％CO2中孵育6小时。
图47描绘了用HeLa细胞进行的实验的结果。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。
在存在抗FOLR1 P329G LALA huIgG1的情况下，a-P329G TCB的两个版本，抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALA Fc和抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1TCB,P329R LALA Fc都显示出剂量依赖性的T细胞活化能力。在没有P329G LALA huIgG1的情况下，两种抗P329G TCB在大多数测试浓度下均无效，在75nM时显示出残留活性。抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc显示出较低的非特异性活化。
实例9
对SKOV-3(FOLR1+)细胞进行原代人T细胞活化试验；比较抗P329G TCB的P329R LALA Fc版本与LALA Fc版本；T细胞与PBMC作为效应细胞的比较
用来自健康供体的原代人泛T细胞或PBMC细胞评估抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALA Fc和抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALAFc的T细胞活化能力。
在存在肿瘤靶向P329G LALA huIgG1的情况下，测试了由具有LALA Fc或P329RLALA Fc的抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB诱导的T细胞活化。
作为肿瘤靶向抗体，抗FolR1(16D5)P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc或抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALAFc组合使用，摩尔比IgG:TCB 2:1。将非结合DP47 P329G LALA huIgG1与任一抗P329G TCB以IgG:TCB 2:1的摩尔比组合用作阴性对照。作为阳性对照，使用直接肿瘤靶向抗FolR1(16D5)x CD3(P035.093)2+1 TCB。使用的靶细胞是SKOV-3(FOLR1+)。将抗P329G TCB与最高浓度的相应IgG以IgG:TCB 2:1的摩尔比混合，并一起滴定。所有TCB从50nM的TCB开始连续稀释10倍，生产从50nM到50x10-8nM的浓度范围。
作为测定的准备工作，收获了SKOV-3(FOLR1+)人肿瘤细胞。从细胞培养瓶中去除生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco#20012)洗涤细胞一次。去除PBS后，对细胞进行胰蛋白酶处理(胰蛋白酶-EDTA(0.05％)、酚红，Gibco#25300-054)。使用Countess自动细胞计数器(Invitrogen#C10227)确定细胞计数和活力。在测定前一天，将0.015x106个细胞/孔(30μl/孔)铺板在平底白色384孔板(Corning#353988)中的测定培养基(RPMI 1640、10％FBS、1％GlutaMAX)中。在测定当天，将先前从健康供体的血液中分离的冷冻的PBMC和泛T细胞解冻。使用Countess装置对细胞进行计数并评估活力。通过以350g离心5分钟收获必需的量。将0.75x106个细胞/孔(10μl/孔)铺板在测定培养基中，以获得5:1的最终效应子与靶细胞比率(E:T)。随后，在测定培养基中制备抗体稀释液，并添加到384孔板中以获得100μl的最终体积。
将测定组分在37℃和5％CO2下孵育48小时或72小时。在48小时或72小时时间点，收获PBMC和T细胞并分析CD25和CD69表达作为T细胞活化的标志物。
详细地，从板上去除上清液，将60μl PBS添加到每个孔中，并将细胞转移到96孔U底板中以进行FACS染色。将板以600x g离心3分钟，去除上清液并用每孔200μl PBS洗涤细胞。将孔板以600x g离心3分钟，并去除上清液。随后，将30μl的含有Zombie AquaTM可固定活力试剂盒(Biolegend，#423102)、抗huCD4 PerCP/Cy5.5(Biolegend，#344608)、抗huCD8aBV711(Biolegend，#301044)、抗huCD25 PE(Biolegend，#302606)和抗huCD69 FITC(Biolegend，#310904)的抗体混合物添加到每个孔中。将板在4℃孵育30分钟。之后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次并重新悬浮在每孔60μl FACS缓冲液中。使用BD FACSymphony A3流式细胞仪获取细胞。
图48描述了使用SKOV-3细胞(图48A、图48B)和不使用靶细胞(图48C、图48D)进行的实验的结果。作为效应细胞，使用泛T细胞(图48A、图48C)和PBMC(图48B、图48D)来评估带有FcγR的细胞对具有LALA和P329R LALA Fc的抗P329G TCB的非特异性活化的效应。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。
在存在抗FOLR1 P329G LALA huIgG1的情况下，a-P329G TCB的两个版本，含有LALA Fc或P329R LALA Fc的抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB都显示出剂量依赖性的T细胞活化能力。在没有P329G LALA huIgG1的情况下，抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc无效，没有显示出非特异性。抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,LALA Fc与PBMC显示高度非特异性T细胞活化，无论有无靶细胞。抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc在抑制非特异性活化方面优于LALA Fc版本。
实例10
对一组具有不同靶蛋白的肿瘤细胞进行Jurkat NFAT活化试验；使用不同衔接子 P329G LALA huIgG衔接子分子对TCB活性进行比较
评估了具有三种不同CD3结合物(P035.093、CH2527、克隆物22)的三种a-P329GTCB的T细胞活化能力。用实例8中描述的Jurkat-NFAT报告细胞(GloResponse JurkatNFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)进行测定。测试的TCB如下：抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc、抗P329G(VH3VL1)x CD3(CH2527)2+1 TCB,P329RLALA Fc、抗P329G(VH3VL1)x CD3(克隆物22)2+1 TCB,P329R LALA Fc。
在存在肿瘤靶向P329G LALA huIgG1s的情况下，以IgG:TCB 2:1的摩尔比对一组表达肿瘤靶点的肿瘤细胞系测试了由不同抗P329G TCBs诱导的Jurkat NFAT活化。将非结合DP47 P329G LALA huIgG1与抗P329GTCB以IgG:TCB 2:1的摩尔比组合用作阴性对照。作为阳性对照，使用直接肿瘤靶向2+1 TCB。
将抗P329G TCB与最高浓度的相应IgG以IgG:TCB 2:1的摩尔比混合，并一起滴定。所有TCB从50nM的TCB开始连续稀释10倍，生产从50nM到50x10-8nM的浓度范围。
如实例8中所述进行实验，使用单个时间点测量。在添加荧光素酶底物和读出程序之前，将测定组分在37℃和5％CO2中孵育6小时。
图49描绘了用不同的靶向P329G LALA huIgG1和表达靶的肿瘤细胞系进行的Jurkat NFAT T细胞活化实验的结果。子图显示了靶向CD19(图49A)、FOLR1(图49B)、CEA(图49D)、HER2(图49D)、STEAP1(图49E)的分子的结果。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。例如，图49A显示了使用SU-DHL-8(CD19+)肿瘤细胞和抗CD19 P329G LALA huIgG1作为肿瘤靶向分子进行的测定。-P329G TCB的所有三种CD3结合物版本、抗P329G(VH3VL1)x CD3 2+1 TCB,P329R LALA Fc以剂量依赖性方式活化T细胞。与其他CD3结合物相比，抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc在与DP47P329G LALA huIgG1组合时诱导最非特异性的T细胞活化，使其不如其他克隆物。
实例11
原代人T细胞的肿瘤细胞裂解测定
通过Incucyte杀伤测定来评估抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329RLALA Fc诱导T细胞介导的肿瘤细胞裂解的能力。此外，在该测定中对具有三种不同CD3结合物(P035.3093、CH2527、克隆物22)的三种版本的抗P329G TCB进行比较。该测定利用在具有Incucyte S3装置(Essen Bioscience，#4647)的培养箱(37℃和5％CO2加湿气氛)内对随时间推移表达红色荧光蛋白的肿瘤细胞进行的基于成像的定量。
在存在肿瘤靶向P329G LALA huIgG1和来自健康供体的原代人泛T细胞的情况下，测试了由抗P329G(VH3VL1)x CD3 2+1 TCB,P329R LALA Fc诱导的T细胞活化。测试的TCB是：抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc、抗P329G(VH3VL1)x CD3(CH2527)2+1 TCB,P329R LALA Fc、抗P329G(VH3VL1)x CD3(克隆物22)2+1 TCB,P329RLALA Fc。
作为肿瘤靶向抗体，将抗FolR1(16D5)P329G LALA huIgG1(用于HeLa NLR细胞)或抗CEA(T84.66-LCHA)P329G LALA huIgG1(用于MKN-45NLR细胞)与抗P329G(VH3VL1)x CD32+1 TCB,P329R LALA Fc以摩尔比IgG:TCB 2:1组合使用。将非结合DP47 P329G LALAhuIgG1与任一抗P329G TCB以IgG:TCB 2:1的摩尔比组合用作阴性对照。作为阳性对照，使用直接肿瘤靶向抗FolR1(16D5)x CD3(P035.093)2+1 TCB或抗CEA(T84.66-LCHA)x CD3(CH2527)2+1 TCB。
将抗P329G TCB与相应的huIgG1以IgG:TCB 2:1的摩尔比混合，得到1nM的IgG和0.5nM的TCB。
作为测定的准备工作，收集了HeLa NLR和MKN-45NLR人肿瘤细胞。从细胞培养瓶中去除生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco#20012)洗涤细胞一次。去除PBS后，对细胞进行胰蛋白酶处理(胰蛋白酶-EDTA(0.05％)、酚红，Gibco#25300-054)。使用Countess自动细胞计数器(Invitrogen#C10227)确定细胞计数和活力。在测定前一天，将0.004x106个细胞/孔(100μl/孔)铺板在平底透明底96孔板(TPP#Z707902)中的测定培养基(RPMI 1640、10％FBS、1％GlutaMAX)中。在测定当天，将先前从健康供体的血液中分离的冷冻泛T细胞解冻。使用Countess装置对细胞进行计数并评估活力。通过以350g离心5分钟收获必需的量。将0.02x106个细胞/孔(50μl/孔)铺板在测定培养基中，以获得5:1的最终效应子与靶细胞比率(E:T)。随后，在测定培养基中制备抗体稀释液，并添加到96孔板中以获得200μl的最终体积。将板置于Incucyte培养箱中，并将图像的采集设置为4小时间隔。最终读出由每孔的归一化荧光红色区域组成。
在72小时时间点，收集15μl/孔的上清液以进行细胞因子测量并在-20℃冷冻。在细胞因子读出当天，在测定开始前30分钟解冻上清液。根据制造商的方案，使用Bio-PlexPro人细胞因子8-Plex测定(Bio-Rad，#M50000007A)对进行技术性三个重复提取并分析。使用Bio-Plex 200系统进行读出。
图50描绘了用HeLa NLR(图50A)和MKN-45NLR(图50B)细胞进行的实验的肿瘤细胞裂解结果。显示了原代人泛T细胞的肿瘤细胞动力学。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。唯一有效的疗法是直接肿瘤靶向TCB和抗FolR1(16D5)P329G LALA huIgG1或抗CEA(T84.66-LCHA)P329G LALA huIgG1与抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc组合使用。
图51描绘了用HeLa-NLR进行的实验的肿瘤细胞裂解结果，比较了三种不同的CD3结合物。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。在具有不同CD3结合物的所有a-P329G TCB中，抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329RLALA Fc与抗FOLR1(16D5)P329G LALA huIgG1组合显示出最佳的肿瘤细胞裂解能力。
实例12
对HeLa(FOLR1+)细胞进行原代人T细胞活化试验；抗P329G TCB中CD3结合物的比 较；三个T细胞供体
用来自三个健康供体的原代人泛T细胞或PBMC细胞评估了具有三种不同CD3结合物(P035.093、CH2527、克隆物22)的三种a-P329G TCB的T细胞活化能力。
在存在肿瘤靶向P329G LALA huIgG1的情况下，测试由抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc、抗P329G(VH3VL1)x CD3(CH2527)2+1 TCB,P329RLALA Fc、抗P329G(VH3VL1)x CD3(克隆物22)2+1 TCB,P329R LALA Fc诱导的T细胞活化。
作为肿瘤靶向抗体，抗FolR1(16D5)P329G LALA huIgG1与三种版本(P035.093、CH2527、克隆物22)之一中的抗P329G(VH3VL1)x CD3 2+1 TCB,P329R LALA Fc组合使用，摩尔比IgG:TCB 2:1。将非结合DP47 P329G LALA huIgG1与任一抗P329G TCB以IgG:TCB 2:1的摩尔比组合用作阴性对照。作为阳性对照，使用直接肿瘤靶向抗FolR1(16D5)x CD3(P035.093)2+1 TCB。使用的靶细胞为HeLa(FOLR1+)。将抗P329G TCB与最高浓度的相应IgG以IgG:TCB 2:1的摩尔比混合，并一起滴定。所有TCB从50nM的TCB开始连续稀释10倍，生产从50nM到50x10-8nM的浓度范围。
如实例9中所述进行原代人T细胞活化测定。
图52描绘了用HeLa细胞和来自三个不同健康供体的T细胞进行的实验的T细胞活化结果——供体A(图52A)、供体B(图52B)、供体C(图52C)。评估CD8+T细胞池中CD69+T细胞的百分比作为T细胞活化标志物。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。
在所有三个供体的情况下，当与肿瘤靶向huIgG1即抗P329G(VH3VL1)x CD3(CH2527)2+1 TCB,P329R LALA Fc组合时，具有与具有CH2527和克隆物22CD3结合物的抗P329G TCB版本相比更高的活性。所有三种CD3结合物版本的抗P329G TCB均以剂量依赖性方式诱导CD8+T细胞活化。
实例13
Jurkat NFκB 4-1BB活化测定用于评估共刺激分子
通过Jurkat NFκB 4-1BB(Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2，Promega)报告细胞系评估分子抗P329G(VH2VL1)x 4-1BBL LALA huIgG1 1+1和抗P329G(VH2VL1)x CD28 LALAhuIgG1 1+1在T细胞中诱导共刺激信号传导的能力。该测定遵循与实例8中描述的JurkatNFAT T细胞活化测定法相同的原理。
Jurkat NFκB 4-1BB报告细胞是一种表达4-1BBL的人急性淋巴性白血病报告细胞系，具有控制萤火虫荧光素酶表达的NFκB应答元件。在4-1BB交联后，NFκB启动子被活化，导致荧光素酶的剂量依赖性表达。添加荧光素酶底物导致发光信号，反映Jurkat NFκB T细胞共刺激的强度。交联可以由双特异性抗体引发，该双特异性抗体同时结合肿瘤靶和Jurkat细胞上的4-1BB。此外，CD3交联(由例如TCB诱导)可导致荧光素酶表达，因为NFκB诱导是T细胞中TCR信号传导的下游。
在存在肿瘤靶向CEA(T84.66-LCHA)P329G LALA huIgG1，具有或不具有抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB,P329R LALA Fc的情况下，测试了由抗P329G(VH2VL1)x4-1BBL LALA huIgG1 1+1和抗P329G(VH2VL1)x CD28 LALA huIgG1 1+1诱导的Jurkat NFκB 4-1BB活化。
将非结合DP47 P329G LALA huIgG1与抗P329G TCB或共刺激分子组合用作阴性对照。
抗P329G huIgG1以100nM的固定浓度使用，而抗P329G TCB以0.5nM的固定浓度使用(T细胞活化的次优剂量)。共刺激分子从75nM的TCB开始连续稀释10倍，导致从50nM到50x10-8nM的浓度范围。
将测定组分在37℃和5％CO2下孵育6小时。
如实例8中针对单时间点Jurkat NFAT测定法所述进行读出。
图53描绘了在存在共刺激分子的情况下用Jurkat NFκB 4-1BB报告细胞和SKOV-3huCEA细胞进行的实验的结果。数据点显示一个实验的技术性三个重复的平均值。误差线指示标准偏差。抗P329G(VH2VL1)x 4-1BBL LALA huIgG1 1+1和抗P329G(VH2VL1)x CD28LALA huIgG1 1+1两者均以剂量依赖性方式活化Jurkat NFκB 4-1BB细胞。它们的活性仅在抗P329G(VH3VL1)x CD3(P035.093)2+1 TCB，P329R LALA Fc的次优剂量以及同时存在抗CEA(T84.66-LCHA)P329G LALA huIgG1的情况下存在。用DP47 P329G LALA huIgG取代肿瘤靶向huIgG1不会导致活化，当与TCB结合时也不会导致活化，表明共刺激驱动效应。
***
尽管为了清楚理解的目的既往已经通过说明和实例相当详细地描述了发明，但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容的全部内容以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 免疫活化 Fc 结构域结合分子
<130> P36106
<160> 180
<170> PatentIn 版本 3.5
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 24
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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35 40 45
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
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115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
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100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
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195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
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1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
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130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro
225 230
<210> 30
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro
225 230
<210> 31
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
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Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Ile Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro
225 230
<210> 32
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Arg Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<210> 33
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
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<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
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1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Arg Ile Arg Ser Lys His Asn Gly Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
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1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
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1 5 10
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Phe Val Ser Tyr Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Ala Ser Asn Phe Pro Gln Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 48
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Ser Tyr
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65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Phe Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 49
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 50
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys His Asn Gly Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 51
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 52
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Gln Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<220>
<223> 合成构建体
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Asp Tyr Phe Leu His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Trp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 59
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Arg Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Gln His Phe Trp Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Leu Pro Phe
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
225 230 235 240
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
245 250 255
Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
260 265 270
Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
275 280 285
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
290 295 300
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
305 310 315 320
Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
325 330 335
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
340 345 350
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
355 360 365
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
370 375 380
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
385 390 395 400
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
405 410 415
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
420 425 430
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
435 440 445
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
450 455 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465 470 475 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
485 490 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
500 505 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
515 520 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
530 535 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
545 550 555 560
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
565 570 575
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
580 585 590
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
595 600 605
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
610 615 620
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
625 630 635 640
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
645 650 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
660 665 670
Ser Pro
<210> 66
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 68
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 69
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Phe Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 70
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 71
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys His Asn Gly Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 72
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 73
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Gln Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 74
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
85 90 95
Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser
100 105 110
Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu
340 345 350
Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
355 360
<210> 75
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Arg Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln
65 70 75 80
Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
85 90 95
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
100 105 110
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
115 120 125
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
130 135 140
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
165 170 175
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
180 185 190
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
195 200 205
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
210 215 220
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
225 230 235 240
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
245 250 255
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
260 265 270
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
275 280 285
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
290 295 300
Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
305 310 315 320
Ile Glu Trp His Glu
325
<210> 76
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln
85 90 95
Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr
100 105 110
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
130 135 140
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
145 150 155 160
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
165 170 175
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
180 185 190
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
195 200 205
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
225 230 235 240
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
245 250 255
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
260 265 270
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
275 280 285
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
290 295 300
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
305 310 315 320
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly
325 330 335
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
340 345 350
<210> 77
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Phe Lys Ile Pro Val Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Lys Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Val Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Thr
20 25 30
Asn Asn Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Ala
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Ser Gln Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu
65 70 75 80
Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
85 90 95
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
100 105 110
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
115 120 125
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
130 135 140
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
145 150 155 160
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
165 170 175
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
180 185 190
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
195 200 205
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
210 215 220
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
225 230 235 240
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
245 250 255
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
260 265 270
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
275 280 285
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
290 295 300
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly
305 310 315 320
Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
325 330
<210> 78
<211> 186
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
85 90 95
Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile
100 105 110
Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr
115 120 125
Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly
130 135 140
Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro
145 150 155 160
Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
180 185
<210> 79
<211> 177
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 79
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
85 90 95
Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu
100 105 110
Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys
115 120 125
Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly
130 135 140
Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro
145 150 155 160
Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg
165 170 175
Ile
<210> 80
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 84
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 85
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 86
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Lys Lys Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 87
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu
225 230 235 240
Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly
245 250 255
Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln
260 265 270
Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys
275 280 285
Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly
290 295 300
Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
420 425 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
435 440 445
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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<220>
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<220>
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<400> 90
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
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Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys
275 280 285
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Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu
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Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly
325 330 335
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340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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595 600 605
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
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660 665 670
<210> 93
<211> 216
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
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<223> 合成构建体
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Asp
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
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<210> 106
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
<210> 107
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 108
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Phe Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
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<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
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210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
340 345 350
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
355 360 365
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 110
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
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Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220
Glu Cys
225
<210> 111
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 112
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
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195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
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225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435
<210> 113
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Phe Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 114
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
225 230 235 240
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
245 250 255
His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
260 265 270
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His
275 280 285
Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
290 295 300
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
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450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
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500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
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565 570 575
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
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645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 115
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu
210 215 220
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
225 230 235 240
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
245 250 255
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
260 265 270
Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys
275 280 285
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
290 295 300
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
305 310 315 320
Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr
325 330 335
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
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355 360 365
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
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420 425 430
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465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 116
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245 250 255
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260 265 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro
275 280 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290 295 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
305 310 315 320
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325 330 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340 345 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
355 360 365
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
370
<210> 117
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180
<210> 118
<211> 170
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170
<210> 119
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170 175
<210> 120
<211> 203
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200
<210> 121
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu
<210> 122
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu
<210> 123
<211> 169
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
165
<210> 124
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu
195
<210> 125
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
370 375
<210> 126
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
180 185 190
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
195 200 205
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
210 215 220
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
225 230 235 240
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
245 250 255
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
260 265 270
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
290 295 300
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
325 330 335
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
340 345 350
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
355 360 365
<210> 127
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
180 185 190
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
195 200 205
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
210 215 220
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
245 250 255
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
260 265 270
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
275 280 285
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
290 295 300
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
305 310 315 320
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
325 330 335
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
340 345 350
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
355 360
<210> 128
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro
210 215 220
Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
225 230 235 240
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
245 250 255
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
260 265 270
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
275 280 285
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
290 295 300
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
305 310 315 320
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
340 345 350
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
355 360 365
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
370 375 380
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
385 390 395 400
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
405 410 415
<210> 129
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
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85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys
180 185 190
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
195 200 205
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
210 215 220
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
225 230 235 240
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
245 250 255
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
260 265 270
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro
275 280 285
Lys Ser Cys
290
<210> 130
<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
180 185 190
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
195 200 205
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
210 215 220
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
225 230 235 240
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
245 250 255
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
260 265 270
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
290 295 300
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
325 330 335
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
340 345 350
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
370 375 380
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
385 390 395 400
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
405 410 415
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
420 425 430
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
435 440 445
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
450 455 460
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
465 470 475 480
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
485 490 495
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
500 505 510
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
515 520 525
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
530 535 540
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
545 550 555 560
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
565 570 575
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
580 585 590
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
595 600 605
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
610 615 620
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
625 630 635 640
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
645 650 655
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
660 665 670
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
675 680 685
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
690 695 700
Ser Leu Ser Pro
705
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 132
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
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Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<210> 135
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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100 105
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
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Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
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Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
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Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
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Glu Cys
225
<210> 142
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
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Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
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115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
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Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
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Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 143
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
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85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
210 215 220
Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr
225 230 235 240
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
245 250 255
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
260 265 270
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
275 280 285
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
290 295 300
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
305 310 315 320
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
325 330 335
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
420 425 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
435 440 445
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
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515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 144
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 145
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
210 215 220
Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr
225 230 235 240
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
245 250 255
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
260 265 270
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
275 280 285
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
290 295 300
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
305 310 315 320
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
325 330 335
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
420 425 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
435 440 445
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 146
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 147
<211> 210
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn
210
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 149
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 150
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 151
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 152
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Leu
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Ser Val Ser Gly Thr Leu Val Asp Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro
450
<210> 153
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 154
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 155
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 156
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Leu Trp Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 157
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Thr Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 158
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Glu Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro
450
<210> 159
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 160
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 161
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 162
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 163
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 164
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 165
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 165
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 166
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 167
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 167
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 168
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 168
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 169
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 169
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 170
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 170
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 171
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 172
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 173
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 174
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 174
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 175
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 175
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 176
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆物 22 HCDR3
<400> 176
His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr Gly Tyr
1 5 10
<210> 177
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆物 22 VH
<400> 177
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 178
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Arg Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 179
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu
225 230 235 240
Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly
245 250 255
Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln
260 265 270
Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys
275 280 285
Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly
290 295 300
Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
420 425 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
435 440 445
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Arg Ala Pro Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
<210> 180
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 180
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230

Claims (91)

1.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含
(a)Fc结构域结合部分，其与包含第一组至少一个氨基酸取代的靶Fc结构域特异性地结合，和
(b)免疫活化部分。
2.根据权利要求1所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其进一步包含(c)延长半衰期的Fc，
其中所述Fc结构域结合部分不与所述延长半衰期的Fc结构域特异性地结合。
3.根据权利要求1或2所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述延长半衰期的Fc结构域包含第二组至少一个氨基酸取代。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第一组至少一个氨基酸取代降低与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，并且其中所述第二组至少一个氨基酸取代包括在与所述第一组至少一个氨基酸取代相同的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代，其中与所述第一组至少一个氨基酸取代相比，所述第二组至少一个氨基酸取代中的氨基酸在相同的位置处被不同的氨基酸取代。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第一组至少一个氨基酸取代包括在选自由233、234、235、238、253、265、269、270、297、310、331、327、329和435(根据Kabat EU索引编号)组成的列表的位置处的至少一个氨基酸取代。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第二组至少一个氨基酸取代包括在选自由233、234、235、238、253、265、269、270、297、310、331、327、329和435(根据Kabat EU索引编号)组成的列表的位置处的至少一个氨基酸取代。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第一组至少一个氨基酸取代包括氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第一组至少一个氨基酸取代包括所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)，并且其中所述第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由除甘氨酸(G)以外的氨基酸进行的取代。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引)处由选自由精氨酸(R)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)组成的列表的氨基酸进行的取代。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第二组至少一个氨基酸取代包括在位置P329(根据Kabat EU索引编号)处由精氨酸(R)进行的取代。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分能够与包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合但不能够与亲本未突变的IgG1 Fc结构域特异性结合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第一组至少一个氨基酸取代包括在选自L234、L235(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处的至少一个氨基酸取代。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第二组至少一个氨基酸取代包括在选自L234、L235(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处的至少一个氨基酸取代。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述靶Fc结构域包含三个氨基酸取代，所述氨基酸取代降低与活化Fc受体的结合和/或效应子功能，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述延长半衰期的Fc结构域包含三个氨基酸取代，所述氨基酸取代降低与活化Fc受体的结合和/或效应子功能，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329X(Kabat EU索引编号)，其中X是除甘氨酸(G)以外的氨基酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分和/或所述免疫活化部分是Fab分子。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中所述Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：1)；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO：2)、EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO：11)和EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：16)组成的组；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：6)。
18.根据权利要求17所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中所述Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKD(SEQ ID NO：2)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：6)。
19.根据权利要求17所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中所述Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYTPSLKG(SEQ ID NO：11)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：6)。
20.根据权利要求17所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中所述Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO：1)；
(b)CDR H2氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO：16)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO：3)；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：4)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：6)。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中所述Fc结构域结合部分包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列与选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与选自由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：13组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
22.根据权利要求21所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中所述Fc结构域结合部分包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO：7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO：8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO：12至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO：13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO：17至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO：13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或
(iv)重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO：19至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO：13至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
23.根据权利要求22所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分能够与包含所述氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)的IgG1 Fc结构域特异性结合，其中所述Fc结构域结合部分包含SEQ ID NO：19的重链可变区序列和SEQ ID NO：13的轻链可变区序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc结构域结合部分包含第一Fab分子且所述免疫活化部分包含第二Fab分子。
25.根据权利要求24所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其进一步包含
d)第三Fab分子，其与包含所述第一组至少一个氨基酸取代的所述靶Fc结构域特异性地结合。
26.根据权利要求25所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述第三Fab分子与所述第一Fab分子相同。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分能够与活化T细胞抗原特异性结合。
28.根据权利要求27所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述活化T细胞抗原是CD3。
29.根据权利要求27或28所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述活化T细胞抗原是CD3ε。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分与活化T细胞抗原，特别是CD3，更特别是CD3ε特异性地结合。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分是Fab分子。
32.根据权利要求31所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3，且与所述活化T细胞抗原特异性地结合的所述Fab分子包含SEQ ID NO：35的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO：37的重链CDR 2、SEQ ID NO：43的重链CDR 3、SEQ IDNO：53的轻链CDR 1、SEQ ID NO：54的轻链CDR 2和SEQ ID NO：55的轻链CDR 3。
33.根据权利要求31或32所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3，且与所述活化T细胞抗原特异性地结合的所述Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：49的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
34.根据权利要求31所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3，且与所述活化T细胞抗原特异性地结合的所述Fab分子包含SEQ ID NO：35的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO：33的重链CDR 2、SEQ ID NO：176的重链CDR 3、SEQID NO：53的轻链CDR 1、SEQ ID NO：54的轻链CDR 2和SEQ ID NO：55的轻链CDR 3。
35.根据权利要求31或34所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3，且与所述活化T细胞抗原特异性地结合的所述Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：177的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
36.根据权利要求31所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε，且与所述活化T细胞抗原特异性地结合的所述Fab分子包含SEQ ID NO：34的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO：37的重链CDR 2、SEQ ID NO：41的重链CDR 3、SEQ IDNO：53的轻链CDR 1、SEQ ID NO：54的轻链CDR 2和SEQ ID NO：55的轻链CDR 3。
37.根据权利要求31或36所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述活化T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε，且与所述活化T细胞抗原特异性地结合的所述Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：56的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
38.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含与SEQ ID NO：89至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(b)第二轻链，其包含与SEQ ID NO：70至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(c)第一重链，其包含与SEQ ID NO：178至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和
(d)第二重链，其包含与SEQ ID NO：179至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
39.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含与SEQ ID NO：89至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(b)第二轻链，其包含与SEQ ID NO：68至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(c)第一重链，其包含与SEQ ID NO：178至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和
(d)第二重链，其包含与SEQ ID NO：179至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
40.一种免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其包含：
(a)第一轻链，其包含与SEQ ID NO：89至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(b)第二轻链，其包含与SEQ ID NO：180至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(c)第一重链，其包含与SEQ ID NO：178至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和
(d)第二重链，其包含与SEQ ID NO：179至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
41.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分能够与共刺激T细胞抗原特异性结合。
42.根据权利要求41所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述共刺激T细胞抗原是CD28。
43.根据权利要求41或42所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分与共刺激T细胞抗原特异性地结合。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分与CD28特异性地结合。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分是Fab分子。
46.根据权利要求45所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与CD28特异性地结合的所述Fab分子包含SEQ ID NO：94的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO：95的重链CDR 2、SEQID NO：96的重链CDR 3、SEQ ID NO：97的轻链CDR 1、SEQ ID NO：98的轻链CDR2和SEQ IDNO：99的轻链CDR 3；或SEQ ID NO：94的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO：95的重链CDR2、SEQ ID NO：102的重链CDR 3、SEQ ID NO：103的轻链CDR 1、SEQ ID NO：98的轻链CDR 2和SEQ ID NO：99的轻链CDR 3。
47.根据权利要求45或46所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与CD28特异性地结合的所述Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：100的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：101的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：104的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：105的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
48.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分能够与共刺激T细胞抗原特异性结合。
49.根据权利要求48所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述共刺激T细胞抗原是4-1BB。
50.根据权利要求48或49所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分与共刺激T细胞抗原特异性地结合。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分与4-1BB特异性地结合。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分是Fab分子。
53.根据权利要求52所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与4-1BB特异性地结合的所述Fab分子包含SEQ ID NO：133的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO：134的重链CDR 2、SEQ ID NO：135的重链CDR 3、SEQ ID NO：136的轻链CDR 1、SEQ ID NO：137的轻链CDR 2和SEQ ID NO：138的轻链CDR 3。
54.根据权利要求52或53所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中与4-1BB特异性地结合的所述Fab分子包含：重链可变区，所述重链可变区包含i)与SEQ ID NO：139的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：140的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
55.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中所述免疫活化部分是细胞因子。
56.根据权利要求55所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中所述细胞因子选自由IL2、IL7、IL15、IL18、IFNa和IFNg组成的组。
57.根据权利要求55或56所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中所述免疫活化部分是突变白细胞介素-2(IL-2)多肽。
58.根据权利要求57所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中所述突变IL-2多肽是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO：166编号)的人IL-2分子。
59.根据权利要求58所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中所述突变IL-2多肽进一步包含氨基酸取代T3A和/或氨基酸取代C125A。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中所述突变IL-2多肽包含与SEQ ID NO：167的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述突变IL-2多肽显示与高亲和力IL-2受体的降低的亲和力和与中等亲和力IL-2受体的基本上类似的亲和力，各自与野生型IL-2多肽相比。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子，其中所述突变IL-2多肽包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列。
62.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分包含4-1BBL的三个胞外域或其片段。
63.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分包含第一多肽和第二多肽，其中分别地，所述第一多肽含有第一重链恒定(CH1)结构域或轻链恒定(CL)结构域，且所述第二多肽含有CL或CH1结构域，其中所述第二多肽通过所述CH1与CL结构域之间的二硫键连接到所述第一多肽，并且其中所述第一多肽包含通过肽接头彼此连结并且连结至所述CH1或CL结构域的4-1BBL的两个胞外域或其片段，并且其中所述第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的所述CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域或其片段。
64.根据权利要求62或63所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述4-1BBL的胞外域或其片段包含选自由SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124组成的组的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：121的氨基酸序列。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活性部分包含通过二硫键彼此连接的第一多肽和第二多肽，其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含选自由SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127和SEQ IDNO：128组成的组的氨基酸序列，并且特征在于，所述第二多肽包含选自由SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120组成的组的氨基酸序列。
66.根据权利要求1至23或62至65中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述分子包含：第一重链和第一轻链，其包含所述Fc结构域结合部分，特别是能够与所述靶Fc结构域特异性结合的Fab分子；以及第二重链和第二轻链，其包含所述免疫活化部分，其中分别地，所述第二重链包含所述第一多肽，所述第一多肽包含通过肽彼此连结并且连结至所述CH 1或CL结构域的4-1BBL的两个胞外域或其片段，且所述第二轻链包含所述第二多肽，所述第二多肽包含经由肽接头连结至所述多肽的所述CL或CH1结构域的所述4-1BBL的一个胞外域或其片段。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连结的4-1BBL的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链一部分的CL结构域融合，并且包含所述4-1BBL的一个胞外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CH1结构域融合。
68.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述免疫活化部分能够与Fc受体特异性结合。
69.根据权利要求68所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc是Fcγ受体，特别是FcgRIIIa受体。
70.根据权利要求68或69所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述Fc受体是CD16。
71.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子。
72.一种或多种载体，特别是表达载体，其包含根据权利要求71所述的多核苷酸。
73.一种宿主细胞，其包含根据权利要求71所述的多核苷酸或根据权利要求73所述的载体。
74.一种生产免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子的方法，其包括以下步骤：a)在适用于表达所述免疫活化Fc结构域结合分子的条件下培养根据权利要求73所述的宿主细胞，和b)回收所述免疫活化Fc结构域结合分子。
75.一种通过根据权利要求74所述的方法生产的免疫活化可结晶片段(Fc)结构域结合分子。
76.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子和药用载体。
77.根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子或根据权利要求76所述的药物组合物，其用作药物。
78.根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子或根据权利要求76所述的药物组合物，其用于治疗有此需要的个体的疾病。
79.根据权利要求78所述的供使用的免疫活化Fc结构域结合分子或药物组合物，其中所述疾病是癌症。
80.根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子或根据权利要求76所述的药物组合物，其用于治疗有此需要的个体的疾病，其中所述免疫活化Fc结构域结合分子与包含所述靶Fc结构域的靶向抗体组合使用。
81.根据权利要求80所述的供使用的免疫活化Fc结构域结合分子或药物组合物，其中所述疾病是癌症。
82.根据权利要求80或81所述的免疫活化Fc结构域结合分子，其中所述靶向抗体能够与靶抗原，特别是癌细胞上的靶抗原特异性结合。
83.根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。
84.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子。
85.根据权利要求83所述的用途或根据权利要求84所述的方法，其中所述疾病是癌症。
86.一种治疗个体的疾病的方法，其包括：
(a)向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药用形式的根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子；和
(b)向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含靶向抗体，所述靶向抗体包含所述靶Fc结构域。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述疾病是癌症。
88.根据权利要求85或87所述的方法，其中所述靶向抗体能够与靶抗原，特别是癌细胞上的靶抗原特异性结合。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的方法，其中在施用包含所述靶Fc结构域的所述抗体之前、同时或之后施用免疫活化Fc结构域结合分子。
90.一种用于诱导细胞裂解的方法，其包括在存在T细胞的情况下使所述细胞与根据权利要求1至70中任一项所述的免疫活化Fc结构域结合分子和与包含所述靶Fc结构域的靶向抗体接触，其中所述靶向抗体能够与所述细胞上的抗原特异性结合。
91.如前所述的发明。
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