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TW202509065A - 經ｐｄ－１調節之ｉｌ－２免疫結合物及其用途 - Google Patents

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TW202509065A
TW202509065A TW113117723A TW113117723A TW202509065A TW 202509065 A TW202509065 A TW 202509065A TW 113117723 A TW113117723 A TW 113117723A TW 113117723 A TW113117723 A TW 113117723A TW 202509065 A TW202509065 A TW 202509065A
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大衛 雷納德 比恩維諾
柯恩 馬汀 包爾登
東尼 克里斯多派特
迪克 蘿拉 柯達瑞
黛安 路易斯 荷藍包格
俊 沙賓 因霍夫
賈斯汀 理查 基爾布魯
克里斯汀 克萊
約翰 湯瑪斯 穆利甘
尼可利尼 瑪麗亞 維樂瑞雅 岡薩雷斯
夏儂 李 岡田
帕洛 尤瑪那
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瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
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Abstract

本發明提供經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物及其組成物。本發明的特徵還在於多核苷酸、載體、宿主細胞、生產方法、醫藥組成物、治療疾病或病症諸如癌症之方法、相關用途與使用之組成物、及用於與一種或多種方法一起使用之套組。

Description

經　PD-1　調節之　IL-2　免疫結合物及其用途
本發明提供經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物及其組成物。本發明的特徵還在於多核苷酸、載體、宿主細胞、生產方法、醫藥組成物、治療疾病或病症諸如癌症之方法、相關用途與使用之組成物、及用於與一種或多種方法一起使用之套組。
介白素 2 (IL-2) 係一種有效的細胞激素，在全身性投予時表現出毒性。需要一種可全身性遞送但可以調節以在有效 T 細胞亞群上表現出治療活性的 IL-2 型式。
本發明尤其提供經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分)、包含該免疫結合物及/或抗體的組成物 (例如，醫藥組成物)、編碼該免疫結合物及/或抗體的多核苷酸、載體、宿主細胞、生產方法、及其方法及用途。
在一個態樣中，本發明提供免疫結合物，其包含：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽；(ii) 連接子；及 (iii) 雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中該 DBA 部分包含重鏈可變區 (VH) 及輕鏈可變區 (VL)，其中該 IL-2 多肽、該連接子及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端，並且其中第一結合域係經組態以使得：(i) 當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且 (ii) 當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，DBA 部分係實質上經阻斷與 IL-2 多肽結合，且 IL-2 多肽能夠與 IL-2 受體結合；以及 (b) 第二結合域，其包含含有 VH 及 VL 之抗 PD-1 抗體部分。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分實質上不與 IL-2 多肽結合。
在一些態樣中，DBA 部分包含 Fab 分子。在一些態樣中，DBA 部分包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及重鏈恆定域 1 (CH1)；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈恆定域 (CL)，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。在一些態樣中，DBA 部分為習知 Fab 分子。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含 Fab 分子。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。
在一些態樣中，(a) DBA 部分為習知 Fab 分子；且 (b) 抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。
在一些態樣中，(a) DBA 部分為習知 Fab 分子；且 (b) 抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
在一些態樣中，(a) DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且 (b) 抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
在一些態樣中，(a) DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈 CL，其中 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且 (b) 抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為單鏈可變片段 (scFv)。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體為 scFv，其中 VH 及 VL 係以下列方向連接：N-VH-VL-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。在其他態樣中，抗 PD-1 抗體為 scFv，其中 VH 及 VL 係以下列方向連接：N-VL-VH-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。在一些態樣中，scFv 之 VH 及 VL 係藉由連接子連接。在一些態樣中，VH、VL 及連接子係以下列方向連接：N-VH-連接子-VL-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。在其他態樣中，抗 PD-1 抗體為 scFv，其中 VH 及 VL 係以下列方向連接：N-VL-連接子-VH-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
在一些態樣中，免疫結合物進一步包含含有第一次單元及第二次單元的 Fc 域。在一些態樣中，(a) DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端；且/或 (b) 抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係以下列方向連接：N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
在一些態樣中，Fc 域為 IgG Fc 域。在一些態樣中，IgG Fc 域為 IgG 1Fc 域。在一些態樣中，Fc 域為人 IgG Fc 域。
在一些態樣中，第一次單元包含選自第一 CH2 (CH2 1) 域及/或第一 CH3 (CH3 1) 域的一個或多個 CH 域；且第二次單元包含選自第二 CH2 (CH2 2) 域及/或第二 CH3 (CH3 2) 域的一個或多個 CH 域。在一些態樣中，該一個或多個 CH 域中之至少一者與另一 CH 域配對。在一些態樣中，CH3 1和 CH3 2結構域各自包含一個隆凸或腔窩，且其中，CH3 1結構域中的隆凸或腔窩分別位於 CH3 2結構域的腔窩或隆凸中。在一些態樣中，該 CH3 1域及該 CH3 2域在該隆凸與腔窩之間的界面處相接。在一些態樣中，CH2 1和 CH2 2結構域各自包含一個隆凸或腔窩，且其中，CH2 1結構域中的隆凸或腔窩分別位於 CH2 2結構域的腔窩或隆凸中。在一些態樣中，該 CH2 1域及該 CH2 2域在該隆凸與腔窩之間的界面處相接。
在一些態樣中，(a) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (b) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。在一些態樣中，第一次單元及/或第二次單元包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一些態樣中，DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 的不同抗原決定基結合。在一些態樣中，DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 的相同抗原決定基結合。
在一些態樣中，DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合且/或抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。在一些態樣中，DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，或抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。在一些態樣中，(a) DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合；或 (b) DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。在一些態樣中，DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。在一些態樣中，DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。
在一些態樣中，DBA 部分包含下列六個互補決定區 (CDR)：(a) CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；或 (b) CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列。
在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(b) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (d) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。
在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；(b) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；或 (d) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含下列六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列；(b) CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列；或 (c) CDR-H1，其包含 SYWMS (SEQ ID NO: 10) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGSGGSRYYAESVKG (SEQ ID NO: 11) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 SPLQWIDV (SEQ ID NO: 12) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 1) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 EASSLQS (SEQ ID NO: 2) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQANQFPFT (SEQ ID NO: 3) 之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(b) VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；(b) VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。
在一些態樣中，(a) (i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列；(b) (i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列；或 (c) (i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列。
在一些態樣中，(a) (i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(b) (i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(c) (i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (d) (i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。
在一些態樣中，(a) (i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；(b) (i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；(c) (i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；或 (d) (i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列。
在一些態樣中，連接子的長度為介於 5 至 30 個胺基酸之間。在一些態樣中，連接子的長度為 20 個胺基酸。在一些態樣中，連接子包含胺基酸序列 (G 2SG 2) x，其中 x 為在 1 至 6 之間的整數 (SEQ ID NO: 149 至 154)。在一些態樣中，x 為 2 (SEQ ID NO: 150) 或 4 (SEQ ID NO: 152)。
在一些態樣中，IL-2 多肽係透過連接子連接至 DBA 部分之 VH。在一些態樣中，IL-2 多肽係以下列方向連接至 DBA 部分之 VH：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[VH]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。
在其他態樣中，IL-2 多肽係透過連接子連接至 DBA 部分之 VL。在一些態樣中，IL-2 多肽係以下列方向連接至 DBA 部分之 VL：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[VL]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。
在一些態樣中，IL-2 多肽為突變型人 IL-2 多肽，其包含在位置 3 處的丙胺酸殘基、在位置 42 處的丙胺酸殘基、在位置 45 處的丙胺酸殘基、在位置 72 處的甘胺酸殘基及/或在位置 125 處的丙胺酸殘基 (相對於 SEQ ID NO: 147 的人 IL-2 序列編號)。在一些態樣中，IL-2 多肽為突變型人 IL-2 多肽，其包含在位置 3 處的丙胺酸殘基、在位置 42 處的丙胺酸殘基、在位置 45 處的丙胺酸殘基、在位置 72 處的甘胺酸殘基、在位置 125 處的丙胺酸殘基及/或在位置 126 處的蘇胺酸殘基 (相對於 SEQ ID NO: 147 的人 IL-2 序列編號)。在一些態樣中，突變型人 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列。在一些態樣中，突變型人 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列。在一些態樣中，PD-1 為人 PD-1。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列；(ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 150 或 152 之胺基酸序列；及 (iii) DBA 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，其中 IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，且當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合；(b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元，其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，其中抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且其中：(a) DBA 部分為習知 Fab 分子；且抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換；或 (b) DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈 CL，其中 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列；(ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 152 之胺基酸序列；及 (iii) DBA 部分，其與以 PD-1 及 IL-2 多肽相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，其中 IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，且當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合；(b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元，其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，其中抗 PD-1 抗體部分及第二次單元根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且其中 DBA 部分為習知 Fab 分子；且抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列；(ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 150 或 152 之胺基酸序列；及 (iii) 雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，其中 IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，且當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合；(b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為包含 VH 及 VL 之 scFv；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元，其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
在一些態樣中，免疫結合物包含：(a) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(b) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(c) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(d) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(e) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(f) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(g) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；(h) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (i) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。
在一些態樣中，免疫結合物包含：(a) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列；(b) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列；(c) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列；(d) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列；(e) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列；(f) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列；(g) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列；(h) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列；或 (i) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之多核苷酸或一組經分離之多核苷酸，其編碼本文所述之免疫結合物中之任一者。
在一個態樣中，本發明提供一種載體或一組載體，其包含本文所述之任一種經分離之多核苷酸或任一組經分離之多核苷酸。
在一個態樣中，本發明提供一種宿主細胞或一組宿主細胞，其包含 (i) 本文所述之任一種經分離之多核苷酸或任一組經分離之多核苷酸，或 (ii) 本文所述之載體或一組載體。
在一個態樣中，本發明提供一種生產免疫結合物之方法，該方法包含步驟 (a) 在適合於該免疫結合物表現的條件下培養本文所述之任一種宿主細胞或任一組宿主細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含回收免疫結合物。
在一些態樣中，宿主細胞表現第一結合域及第二結合域。在一些態樣中，第一宿主細胞表現第一結合域，且第二宿主細胞表現第二結合域。
在一些態樣中，該方法進一步包含回收第一結合域及第二結合域。在一些態樣中，該方法進一步包含使經回收之第一結合域與經回收之第二結合域接觸。
在一個態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其藉由本文所述之方法中之任一者生產。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本文所述之免疫結合物中之任一者及醫藥上可接受之載劑。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之免疫結合物或醫藥組成物中之任一者，其用為藥物。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之免疫結合物或醫藥組成物中之任一者在製造藥物中之用途。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之免疫結合物或醫藥組成物中之任一者，其使用於治療有需要之個體的癌症。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之免疫結合物或醫藥組成物中之任一者在製造用於治療有需要之個體的癌症的藥物中之用途。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之免疫結合物或醫藥組成物中之任一者用於治療有需要之個體的癌症之用途。
在一個態樣中，本發明提供一種治療個體的癌症之方法，該方法包含向個體投予有效量之本文所述之免疫結合物或醫藥組成物中之任一者。
在一些態樣中，癌症為 PD-1 陽性癌症。
在一些態樣中，本文所述之使用之免疫結合物、使用之醫藥組成物、用途或方法中之任一者進一步包含向個體投予額外治療劑。
序列表
本申請包含序列表，該序列表已經以 XML 格式以電子方式提交，並以引用方式以其全部內容併入本文。該 XML 複本創建於 2024 年 5 月 2 日，命名為 51177-047TW2_Sequence_Listing_5_2_24，且大小為 197,852 位元組。
本發明至少部分地基於申請人的發現，即如本文所揭示之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物對於將 IL-2 媒介之細胞毒性靶向富含 PD-1 的細胞環境 (例如，表現 PD-1 的細胞) 具有出乎意料之優勢。IL-2 係一種有效的細胞激素，在全身性投予時展現毒性。然而，本文所述之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物允許靶向投予 IL-2 以治療例如癌症。特定而言，本發明之免疫結合物在存在與不存在 PD-1 的情況下對指引 IL-2 傳訊表現出令人驚訝的敏感性及辨別力。因此，本發明提供用於癌症之靶向治療的改善的治療選項。
本發明亦至少部分地基於申請人的發現，即與其他所測試之免疫結合物的結構及方向相比，如本文所揭示之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的結構及方向展現傑出的治療效應。
例如，如本文所揭示之免疫結合物可包括：第一結合域，其包括 IL-2 多肽及例如與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合之雙重結合抗體 (DBA) 部分；以及第二結合域，其包括抗 PD-1 抗體。在一些實例中，與僅包含與 PD-1 及 IL-2 多肽結合之 DBA 之構建體 (例如，包括兩個 DBA 部分之二價構建體) 相比，在如本文所揭示之免疫結合物的第二結合域中使用單特異性抗 PD-1 抗體部分 (例如，作為靶向臂) 可導致傑出的功效 (例如，就抗腫瘤活性而言) 及安全性。例如，就 IL-2 曝露而言，如本文所揭示之此類構建體可具有減少的滲漏性，導致較低的毒性。
本發明亦至少部分地基於申請人的發現，即與其他所測試之免疫結合物的結構及方向相比，如本文所揭示之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的結構及方向可允許改善的可開發性且易於製造。例如，與其他免疫結合物的結構及方向相比，如本文所揭示之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物可更不易聚集。 I. 定義
「受體人框架」為本文中之目的是如下述定義的衍生自人免疫球蛋白框架或人共通框架、包含輕鏈可變域 (VL) 框架或重鏈可變域 (VH) 框架的胺基酸序列之框架。「衍生自 (derived from)」人免疫球蛋白框架或人共通框架的受體人框架可包含與此等為相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列的變更。在一些態樣中，胺基酸變更數目為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。在一些態樣中，VL 受體人框架與 VL 人免疫球蛋白框架序列或人共通框架序列的序列相同。
「投予」係指向個體給予一定劑量的化合物 (例如，本文所揭示之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體) 或組成物 (例如，醫藥組成物，例如，包括本文所揭示之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體之醫藥組成物)。例如，本文所述之方法中所用的組成物可藉由例如肌內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、外用、腫瘤內、腹膜、皮下、結膜下、囊內、黏膜、心包內、臍內、眼內、口服、外用、局部、經吸入、經注射、經輸注、經連續輸注、經局部直接灌注浴靶細胞、經導管、經灌洗、經乳脂或脂質組成物進行投予。投予方法可根據多種因素而變 (例如，所投予之化合物或組成物以及待治療之病況、疾病或疾患的嚴重程度)。
「親和力」是指分子 (例如，抗體) 之單一結合位點與其結合搭配物 (例如，抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力 (binding affinity)」指代反映結合對成員 (例如，抗體與抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (K D) 來表示。可以藉由本領域已知的習知方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。本文描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和例示性方法。
術語「親和力成熟」之抗體是指在一或多個互補決定區 (CDR) 中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，此類變化引起該抗體對抗原之親和力的改善。
術語「抗 PD-1 抗體」及「結合至 PD-1 之抗體」是指能夠以足夠親和力結合 PD-1，從而使得該抗體可用作靶向 PD-1 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個態樣中，抗 PD-1 抗體與無關、非 PD-1 蛋白質結合之程度低於該抗體與 PD-1 結合約 10%，其藉由例如表面電漿子共振 (SPR) 所量測。在某些態樣中，結合至 PD-1 之抗體之解離常數 (K D) 是 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或 ≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更少，例如 10 -13M 至 10 -8M，例如 10 -13M 至 10 -9M)。 在某些態樣中，與 PD-1 結合之抗體具有約 1 × 10 -12M 至約 1 × 10 -10M、約 1 × 10 -12M 至約 1 × 10 -11M、或約 1 × 10 -11M 至約 5 × 10 -11M 之 K D。當抗體具有 1 μM 或更小之 K D時，該抗體係稱為與 PD-1「特異性結合」。
術語「雙重結合抗體」或「DBA」係指能夠與兩種不同抗原 (例如，PD-1 及 IL-2) 以相互排斥方式以足夠的親和力結合之抗體。在一個實施例中，DBA 與不相關的非標靶蛋白質 (例如，除了兩種標靶抗原之外) 之結合程度小於抗體與兩種標靶抗原 (例如，PD-1 及 IL-2) 之結合的約 10%，如例如藉由放射免疫測定法 (RIA) 所測量。在某些實施例中，DBA 具有 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或 ≤ 0.001 nM (例如，10 -8M 或更小，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如，10 -9M 至 10 -13M) 之解離常數 (Kd)。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 ( 例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括 但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F (ab') 2；雙抗體 (diabody)、線性抗體；單鏈抗體分子 (例如，scFv 及 scFab)；單域抗體 (dAb)；及由抗體片段所形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Holliger 及 Hudson, Nature Biotechnology(2005) 23:1126-1136。
「結合域」或「結合部分」意指與標靶抗原決定基、抗原、配體或受體特異性結合之化合物或分子的一部分。特徵在於結合部分的分子包括但不限於抗體 (例如，單株、多株、重組、人源化及嵌合抗體)、抗體片段或其部分 (例如，Fab 片段，Fab' 2、scFv 抗體、SMIP、域抗體、雙抗體、微抗體、scFv-Fc、親合體、奈米抗體及抗體之 VH 域及/或 VL 域)、受體、配體、適體、及具有確定結合配偶體的其他分子。在特定態樣中，特徵在於結合域的分子包括免疫結合物，例如經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物。
如本文中所用，關於 Fc 次單元的術語「第一」、「第二」或「第三」，係用於方便在存在多於一個時區分每一類型之部分。除非明確說明，否則使用此等術語無意賦予免疫結合物特定的順序或方向。
「Fab 分子」係指包括重鏈 (「Fab 重鏈」)之 VH 及 CH1 域及免疫球蛋白之輕鏈 (「Fab 輕鏈」)之 VL 及 CL 域或由其組成之蛋白質。
「融合」或「連接」意指兩個部分 (例如，DBA 部分及 IL-2 多肽、或者 scFv 之 VH 及 VL) 係藉由共價鍵 (例如藉由肽鍵) 或直接或經由一個或多個肽連接子連接。如本文所用，「連接子」係指短的多肽 (例如，包含 5 至 40 個胺基酸；例如，包含 5 至 30 個胺基酸；例如，包含 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個胺基酸)，用於連接兩個其他部分 (例如，DBA 部分及 IL-2 多肽、或者 scFv 之 VH 及 VL)。
如本文所用，術語「單鏈」指代包含藉由肽鍵線性連接之胺基酸單體的分子。在某些實施例中，免疫結合物之結合域 (例如，抗 PD-1 抗體部分) 中之一者包括單鏈 Fab 分子，亦即，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈係藉由肽連接子連接以形成單肽鏈的 Fab 分子。在一個特定的該等實施例中，在單鏈 Fab 分子中，Fab 輕鏈的 C 端與 Fab 重鏈的 N 端連接。
「單鏈變異片段」 或 「scFv」 為抗體之重鏈 (VH) 及輕鏈 (VL) 的可變域之融合蛋白，其藉由連接子連接。特定而言，連接子為通常 10 個至 25 個胺基酸之短多肽，並且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，以及絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解性，並且可將 VH 之 N 端與 VL 之 C 端連接，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接子，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，(Springer-Verlag, New York)，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利號 5,571,894 及 5,587,458。
「單鏈 Fab 片段」或「scFab」是由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體重鏈恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成的多肽，其中該抗體域及該連接子在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL、b) VL-CL-連接子-VH-CH1、c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL。特定而言，該連接子為至少 30 個胺基酸且較佳地 32 至 50 個胺基酸組成之多肽。該單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然雙硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 片段可通過插入半胱胺酸殘基產生鏈間雙硫鍵而得到進一步穩定 ( 例如，根據 Kabat 編號，在變異重鏈之位置 44 和變異輕鏈之位置 100 處插入)。
「交換型」Fab 分子 (亦稱為「Crossfab」) 意指 Fab 分子，其中 Fab 重鏈及 Fab 輕鏈之可變域被交換 (亦即彼此替換)，亦即，交換型 Fab 分子包含由輕鏈可變域 VL 及重鏈恆定域 1 CH1 組成之肽鏈 (VL-CH1，在 N 端至 C 端方向上) 及由重鏈可變域 VH 及輕鏈恆定域 CL 組成之肽鏈 (VH-CL，在 N 端至 C 端方向上)。為清楚起見，在其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域被交換之交換型 Fab 分子中，包含重鏈恆定域 1 CH1 之肽鏈在本文中稱為交換型 Fab 分子之「重鏈」。
與此相反，「習知」Fab 分子意指其自然形式 (亦即包含由重鏈可變域及恆定域組成之重鏈 (VH-CH1，在 N 端至 C 端方向) 及由輕鏈可變域及恆定域組成之輕鏈 (VL-CL，在 N 端至 C 端方向)) 之 Fab 分子。
雙抗體為具有兩個抗原結合位點 (其可為二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人, Nat. Med.9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體和四功能抗體亦在以下文獻中有所描述：Hudson 等人, Nat. Med.9:129-134 (2003)。
單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些態樣中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利號 6,248,516 B1)。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常以不受調控的細胞生長為特徵的生理狀況。癌症方面包括實體瘤癌症和非實體瘤癌症。癌症的實例包括但不限於癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更特定實例包括但不限於膀胱癌 (例如，尿路上皮癌 (UC)，包括轉移性 UC (mUC)；肌肉層浸潤性膀胱癌 (MIBC) 及非肌肉層浸潤性膀胱癌 (NMIBC))；腎臟或腎癌 (例如，腎細胞癌 (RCC))；肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌；泌尿道癌症；乳癌 (例如，HER2+ 乳癌及的三陰性乳癌 (TNBC)，其等呈雌激素受體 (ER-)、黃體素受體 (PR-) 及 HER2 (HER2-) 陰性)；前列腺癌，諸如去勢抵抗性前列腺癌 (CRPC)；腹膜癌；肝細胞癌；胃癌或胃部癌，包括胃腸道癌及胃腸道間質癌；胰臟癌 (例如，胰臟導管腺癌 (PDAC))；膠質母細胞瘤；子宮頸癌；卵巢癌；肝臟癌 (例如，肝細胞癌 (HCC))；肝癌；結腸癌；直腸癌；結腸直腸癌；子宮內膜癌或子宮癌；唾液腺癌；前列腺癌；外陰癌；甲狀腺癌；肝癌；肛門癌；陰莖癌；黑色素瘤，包括表淺擴散性黑色素瘤、雀斑樣惡性黑色素瘤、肢端雀斑樣黑色素瘤及結節性黑色素瘤；多發性骨髓瘤及 B 細胞淋巴瘤 (包括低惡性度/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)；小淋巴球性 (SL) NHL；中惡性度/濾泡性 NHL；中惡心度瀰漫性 NHL；高惡性度免疫母細胞性 NHL；高惡性度淋巴球性 NHL；高惡性度小非裂解細胞 NHL；巨大腫塊 NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS 相關淋巴瘤；及華氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴球性白血病 (CLL)；急性淋巴性白血病 (ALL)；急性骨髓性白血病 (AML)；毛細胞白血病；慢性骨髓性白血病 (CML)；移植後淋巴增生性失調 (PTLD)；及骨髓增生異常症候群 (MDS)，以及與斑狀細胞瘤、水腫 (諸如與腦腫瘤相關聯)、Meigs 氏症候群、腦癌、頭頸癌及相關轉移相關聯之異常血管增生。
如本文所用，術語「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增生，無論惡性或良性，及所有癌前及癌性細胞及組織。如本文中所提及，術語「癌症」、「癌性」、「細胞增生性失調」、「增生性失調」及「腫瘤」不相互排斥。
術語「細胞增生性病症」及「增生性病症」係指與某種程度的異常細胞增生相關之病症。在一個實施例中，細胞增生性病症為癌症。在另一實施例中，細胞增生性失調為腫瘤。
術語「抗原決定基」表示抗原上的位點，或為蛋白性的或為非蛋白性的，本文所述之 DBA 部分、抗 PD-1 抗體部分、經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體與該位點結合。抗原決定位可由連續的胺基酸延伸形成 (線性抗原決定位) 或包含非連續的胺基酸 (構象抗原決定位)， 例如，由於抗原之折疊， 即藉由蛋白抗原之三級折疊而在空間上接近。線性抗原決定基通常在蛋白性抗原曝露於變性劑後仍由 DBA 部分、抗 PD-1 抗體部分、經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體結合，而構象抗原決定基通常在變性劑處理後被破壞。抗原決定基包含至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個、至少 8 個、至少 10 個、至少 15 個、至少 20 個、至少 30 個、或至少 35 個、或 3 個至 25 個、3 個至 20 個、3 個至 15 個、3 個至 10 個、3 個至 5 個、30 個至 40 個、35 個至 40 個或 5 個至 10 個獨特空間構形的胺基酸。
可使用本領域習知方法篩選與特定抗原決定基結合之抗體 (亦即，彼等與相同抗原決定基結合者)，諸如例如但不限於丙胺酸掃描、肽墨點 (參見，例如，Kobeissy 等人, Meth.Mol.Biol.(2004) 248: 443-463)、肽切割分析、抗原決定基切除、抗原決定基提取、抗原的化學修飾 (參見，例如，Hochleitner 等人, Prot.Sci.9 (2000) 487-496) 及交叉阻斷 (參見，例如，「Antibodies」，Harlow 及 Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)。
競爭性結合可用來易於確定抗體或 DBA 是否與 PD-1 的相同抗原決定基結合，或與 PD-1 結合之參考抗 PD-1 抗體或 DBA 競爭性結合。例如，與參考抗 PD-1 抗體或 DBA 的「相同抗原決定基結合之抗體」係指在競爭性測定中阻斷參考抗 PD-1 抗體或 DBA 與其抗原結合 50% 或更多的的抗體或 DBA，且反之，參考抗體在競爭測定中阻斷該抗體與其抗原結合 50% 或更多。又例如，為了判定抗體是否與參考抗 PD-1 抗體或 DBA 結合至相同抗原決定基，使參考抗體或 DBA 在飽和條件下與 PD-1 結合。在去除過量的參考抗體後，評定所討論之抗 PD-1 抗體或 DBA 與 PD-1 結合的能力。如果在參考抗 PD-1 抗體或 DBA 之飽和結合後，抗 PD-1 抗體或 DBA 能夠與 PD-1 結合，則可斷定所討論之抗 PD-1 抗體或 DBA 與參考抗 PD-1 抗體或 DBA 結合至不同的抗原決定基。但是，如果在參考抗 PD-1 抗體或 DBA 之飽和結合後，所討論之抗 PD-1 抗體或 DBA 不能與標靶抗原決定基結合，則所討論之抗 PD-1 抗體或 DBA 可能結合至與參考抗 PD-1 抗體或 DBA 所結合之抗原決定基相同的抗原決定基。
在一些態樣中，如果 1 倍、5 倍、10 倍、20 倍或 100 倍過量的一個抗體或 DBA 將另一抗體的結合抑制至少 50%、至少 75%、至少 90% 或甚至 99% 或更多 (如在由競爭性結合測定中所測量)，則認為兩個抗體與相同或重疊的抗原決定基結合 (參見，例如，Junghans 等人, Cancer Res.50 (1990) 1495-1502)。
在一些態樣中，如果抗原中的降低或消除一個抗體或 DBA 之結合的基本上全部胺基酸突變亦降低或消除另一者之結合，則認為兩個抗體或 DBA 與相同抗原決定基結合。如果只有降低或消除一個抗體或 DBA 之結合的胺基酸突變的子集降低或消除另一抗體之結合，則認為兩種抗體或 DBA 具有「重疊抗原決定基」。
術語「嵌合」抗體是指其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為亞型 (同型 (isotype))，例如 IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及 IgA 2。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG 1同型。在某些態樣中，該抗體屬於 IgG 1同型，具有 P329G、L234A 及 L235A 突變以降低 Fc 區效應功能。在其他態樣中，該抗體是屬 IgG 2同型。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG 4同型，在鉸鏈區中具有 S228P 突變以改善 IgG 4抗體之穩定性。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
如本文中所用，術語「衍生自人源的恆定區」或「人類恆定區」表示亞類 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 的人類抗體的恆定重鏈區及/或恆定輕鏈 κ 或 λ 區。此類恆定區係現有技術中習知者，且例如，由以下描述：Kabat, E.A. 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (亦參見例如，Johnson, G. 及 Wu, T.T., Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218；Kabat, E.A., 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72 (1975) 2785-2788)。除非本文另有說明，否則恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統，也稱為 Kabat 之 EU 索引，如 Kabat, E.A.等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 所述。
「效應功能」係指歸因於經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體之 Fc 區的彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合和補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體 (例如 B 細胞受體) 的負調控；以及 B 細胞活化。
化合物，例如本文所揭示之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體 (例如，醫藥組成物) 的「有效量」至少為達成預期治療或預防結果 (諸如特定疾患 (例如，細胞增生性失調，例如癌症) 的可測量之改善或預防) 所需要的最小量。本文中之有效量可根據諸如以下因素而變化：患者之疾病病況、年齡、性別及體重，以及抗體引發個體發生所需反應之能力。有效量亦為該治療之任意毒性或有害效應被治療有益效應超過的量。對於防治用途而言，有益或所需結果包括諸如以下之結果：消除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度，或延緩疾病發作，疾病包括疾病、其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理學表型之生物化學、組織學及/或行為症狀。對於治療用途而言，有益或所需結果包括諸如以下之臨床結果：減少由疾病引起之一種或多種症狀、提高患病者之生活品質、降低治療疾病所需之其他藥物的劑量、增強另一藥劑之作用（諸如經由靶向）、延緩疾病進展及/或延長存活期。就癌症或腫瘤而言，有效量之藥物可具有以下效果：減少癌細胞數；減小腫瘤尺寸；抑制 ( 亦即，在一定程度上減緩或在理想情況下終止) 癌細胞浸潤入周邊器官中；抑制 ( 亦即，在一定程度上減緩或在理想情況下終止) 腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上減輕與該病變相關之症狀中的一者或多者。有效量可於一次或多次投予中投予。出於本發明的目的，藥物、化合物或藥物組成物的有效量為足以直接或間接完成預防性或治療性治療的量。如在臨床背景中理解，藥物、化合物或藥物組成物之有效量可與或不與另一藥物、化合物或醫藥組成物聯合而達成。因此，在投予一種或多種治療劑之上下文中可慮及「有效量」，且若單個藥劑與一種或多種其他藥劑聯合而可實現或已實現所需結果，則該單個藥劑可視為以有效量給出。
本文中的術語「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區域的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異體 Fc 區域。在一個態樣中，人 IgG 重鏈 Fc 區從 Cys226 或從 Pro230 延伸至重鏈的羧基端。但是，由宿主細胞產生的抗體可能經歷重鏈 C 端的一種或多種，特別是一種或兩種胺基酸之轉譯後切割。因此，由宿主細胞透過表現編碼全長重鏈的特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或者可包括全長重鏈的切割變異體。重鏈的最後兩個 C 端胺基酸為甘胺酸 (G446) 及離胺酸 (K447，EU 編號系統)。因此，可以存在或可以不存在 Fc 區域之 C 端離胺酸 (Lys447) 或 C 端甘胺酸 (Gly446) 及離胺酸 (Lys447)。在一個態樣中，包含在根據本發明之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體中的包括如本文所指明之 Fc 區之重鏈包含額外 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，EU 編號系統)。在一個態樣中，包含在根據本發明之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體中的包括如本文所指明之 Fc 區之重鏈包含額外 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 EU 索引編號)。
「框架」或「FR」係指互補決定區 (CDR) 之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，CDR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有含有如本文中所定義之 Fc 區的重鏈之抗體。應理解，全長抗體包含如本文所定義之重鏈可變域及輕鏈可變域，以及如本文所定義之 Fc 區域。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此類細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變子代細胞。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
「人共通框架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 框架序列中最常見的胺基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自可變域序列的次群組。通常，序列之亞組是如 Kabat 等人在 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷 中所述之亞組。在一個態樣中，對於 VL，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 κ I。在一個態樣中，對於 VH，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 III。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 CDR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些態樣中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 ( 例如，非人抗體) 之「人源化形式」涉及已接受人源化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變並決定抗原結合特異性的各個區域，例如「互補決定區」(「CDR」)。
在某些態樣中，抗體包含六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，且三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在某些態樣中，包含六個 CDR 的抗體為全長抗體。在某些態樣中，包含六個 CDR 的抗體為抗體片段。
在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2) 及 96-101 (H3) 處之高度可變環 (Chothia 及 Lesk， J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))； (b) 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3) 處之 CDR (Kabat 等人 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；及 (c) 存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2) 及 93-101 (H3) 處之抗原接觸 (MacCallum 等人 J. Mol.Biol.262: 732-745 (1996))。
除非另有說明，否則 CDR 係根據 Kabat 等人之上述文獻中所述之方法確定。熟習此項技術者將理解，CDR 名稱亦可以根據 McCallum 在上述文獻、Chothia 在上述文獻中所述之方法或任何其他科學上接受之命名系統來確定。
「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些態樣中，個體為人類。
「免疫結合物」係與一種或多種異源分子結合的抗體 (例如，DBA 部分及/或抗 PD-1 抗體部分)，包括但不限於多肽 (例如，IL-2 多肽)。在一特定態樣中，異源分子為 IL-2 多肽，例如人 IL-2 多肽，例如本文所述之突變型人 IL-2 多肽。
「經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物」或「PD-1-reg-IL-2v」為包含 IL-2 多肽之免疫結合物，其中 IL-2 多肽活性 (例如，IL-2R 之活化傳訊) 係由免疫結合物的抗原結合域 (例如，其與 PD-1 結合) 調節。在一些態樣中，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以實質上相互排斥方式或以相互排斥方式結合之 DBA 部分。經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物可進一步包括抗 PD-1 抗體部分，例如，其實質上不與 IL-2 結合或不與 IL-2 結合。
「經分離之」免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物) 或抗體為從其自然環境的組分中分離出來之免疫結合物或抗體。在一些態樣中，將免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物) 或抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，如藉由例如電泳 (例如，SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 方法所判定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見 例如，Flatman 等人, J. Chromatogr.B848:79-87 (2007)。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中該等鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。本文中，術語核酸分子涵蓋：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如，互補 DNA (cDNA) 及基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含此等分子中之兩者或更多者的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。此外，術語核酸分子包括正義股及反義股，以及單股及雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生醣、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。 核酸分子還涵蓋適於在活體外及/或活體內例如在宿主或個體體內直接表現如本文所述之抗體的載體的 DNA 和 RNA 分子。該等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可為未修飾的或經修飾的。例如，mRNA 可經過化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表現，從而可以將 mRNA 注入個體以產生 活體內抗體 (參見 例如，Stadler 等人, Nature Medicine2017, 線上發表於 2017 年 6 月 12 日, doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼免疫結合物的經分離之核酸」或「編碼抗體的經分離之核酸」涉及一種或多種編碼本文所述之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物) 或抗體 (包括重鏈及輕鏈 (或其片段)) 之核酸分子，其包括在單一載體或單獨載體中的此類核酸分子，且此類核酸分子存在於宿主細胞中之一個或多個位置處。
如本文所用的術語「單株抗體」涉及獲自實質上同源抗體群體之抗體， 即，包含群體的個別抗體是相同的及/或結合相同的抗原決定基，除了 例如含有天然產生之突變或於單株抗體製劑產生過程中產生的可能的變異體抗體之外，該等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本揭露的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體顯示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「多特異性抗原結合分子」及「多特異性抗體」分別為對至少兩個不同位點 ( 即不同抗原上之不同抗原決定位或同一抗原上之不同抗原決定位) 具有結合特異性的單株抗原結合分子或抗體。在特定實施例中，多特異性抗體可為「雙特異性抗體」，其對兩個不同位點 (亦即，兩個不同抗原上的兩個不同抗原決定基或同一抗原上的兩個不同抗原決定基) 具有結合特異性。
「天然抗體」係指具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，Ig 天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體醣蛋白。從 N 端 至 C 端，每條重鏈具有可變域 (VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變區，接著係三個重鏈恆定域 (CH1、CH2及CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變域 (VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區，接著為輕鏈恆定 (CL) 域。
術語「藥品仿單」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、投予途徑、組合療法、禁忌症及/或警告等資訊。
相對於參照多肽序列所述之「胺基酸序列同一性百分比 (%)」，是指候選序列中胺基酸殘基與參照多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟件或 FASTA 程式套件實現。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。可替代地，可使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 生成同一性百分比值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區 20559 的美國著作權局，其已經注冊 (美國版權註冊號 TXU510087) 並在 WO 2001/007611 中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用 FASTA 套件 36.3.8c 版或更高版本的 ggsearch 程式及 BLOSUM50 比較矩陣來生成胺基酸序列同一性百分比值。FASTA 程式包由以下作者開發：W. R. Pearson 及 D. J. Lipman (1988), 「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」, PNAS85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) 「Effective protein sequence comparison」 Meth.Enzymol.266:227- 258；及 Pearson 等人(1997) Genomics 46:24-36，且可從 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 或 ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta 公開獲取。可替代地，可使用透過 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_ www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
術語「醫藥組成物」及「醫藥製劑」在本文可互換使用，且係指以下製劑，其呈允許其中所含之活性成分之生物活性有效的形式，並且不含對醫藥組成物將投予之個體具有不可接受之毒性的額外組分。
「醫藥上可接受之載劑」是指醫藥組成物或調配物中除對個體無毒之活性成分以外的成分。 醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另有說明，否則如本文所用，術語「PD-1」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然 PD-1，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物 ( 例如，人類及食蟹獼猴 (「cyno」)) 及囓齒類動物 ( 例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 PD-1 以及在細胞處理中得到的任何形式的 PD-1。該術語亦涵蓋天然生成之 PD-1 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。在某些態樣中，PD-1 為人 PD-1。例示性的人 PD-1 顯示於 UniProtKB/Swiss-Prot 登錄號 Q15116。
除非另做指示，否則如本文所用，術語「介白素-2」或「IL-2」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然 IL-2，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人) 及囓齒類動物 (例如，小鼠及大鼠)。術語涵蓋「全長」未經加工的 IL-2 以及在細胞中加工所產生的任何形式之 IL-2。該術語亦涵蓋天然生成之 IL-2 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。IL-2 包括例如人 IL-2 (例如，野生型人 IL-2)，其多肽序列為 SEQ ID NO: 147。本文所使用之「突變型」IL-2 係指包含一個或多個胺基酸修飾之 IL-2，如與野生型 IL-2 多肽序列相比。在一特定態樣中，突變型人 IL-2 多肽包含一個或多個胺基酸修飾，如與 SEQ ID NO: 147 之野生型人 IL-2 多肽相比。在一些實施例中，突變型人 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列。在又一實施例中，突變型人 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列。
如本文所用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病 (例如，癌症) 自然病程的臨床干預，並且可進行預防 (「預防性治療過程」或「預防性治療中」) 或在臨床病理 (「治療性治療過程」或「治療性治療中」) 過程中執行。期望之治療性治療效果包括但不限於減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防癌症轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、及緩解或改善預後。期望之預防性治療效果包括但不限於預防疾病之發生或復發。在一些態樣中，如本文所述之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個互補決定區 (CDR)。(參見 例如，Kindt 等人 Kuby Immunology, 第 6 版, W.H.Freeman and Co.，第 91 頁 (2007)。)單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見 例如，Portolano 等人, J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson 等人, Nature352:624-628 (1991)。
如本文所用，術語「載體」係指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。 II. 組成物及方法
在一個態樣中，本揭露提供免疫結合物 (例如，免疫結合物，其包括：至少一個結合域，其與直接或經由連接子與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合 (例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合之雙重結合抗體 (DBA) 部分之結合域)；及至少一個結合域，其包括與 PD-1 結合之抗 PD-1 抗體部分)。在一些實施例中，免疫結合物包括：第一結合域，其包括 IL-2 多肽、連接子及雙重結合抗體 (DBA) 部分；及第二結合域，其包括抗 PD-1 抗體部分。DBA 部分可包括重鏈可變區 (VH) 及輕鏈可變區 (VL)，並且可與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合。在第一結合域中，IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分可以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。抗 PD-1 抗體部分可包括 VH 及 VL。在一些實例中，抗 PD-1 抗體部分為單特異性的。在一些實例中，免疫結合物為經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物。如本文所述之免疫結合物及抗體例如可用於治療癌症。 A. 雙重結合抗體 (DBA) 部分
在一些態樣中，本文所述之免疫結合物及抗體可包括結合域 (例如，第一結合域)，該結合域包括 DBA 部分。在某些態樣中，DBA 部分包括重鏈可變區 (VH) 及輕鏈可變區 (VL)，並且可例如與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合。在某些態樣中，PD-1 為人 PD-1。在某些態樣中，IL-2 多肽為本文所述之人 IL-2 多肽或經修飾之人 IL-2 多肽。在一些情況下，經修飾之人 IL-2 多肽含有本文所述之一個或多個胺基酸 (例如，包含 T3A、F42A、Y45A、L72G 及 C125A 胺基酸取代之人 IL-2)。
在一些態樣中，本發明之 DBA 部分包括含有如 表 1中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR (例如，包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR)。在一些情況下，DBA 部分包含含有如 表 1中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的 VH 及/或 VL。
表 1. DBA 部分的 SEQ ID NO 之列表。
DBA 部分： CDR V
H1 H2 H3 L1 L2 L3 VH VL
AB002345 64 65 66 55 56 57 67 58
AB003637 82 83 84 73 74 75 85 76
AB003637 去免疫化的 82 83 84 73 74 75 85 91
AB003637 去免疫化的 2 82 83 84 73 74 75 111 91
在一些態樣中，本發明提供一種 DBA 部分，其包含下列六個互補決定區 (CDR)：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分為 AB002345。
在一些態樣中，DBA 部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，DBA 部分為 AB002345。
在一些態樣中，本發明提供一種 DBA 部分，其包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分為 AB003637、AB003637 去免疫化的或AB003637 去免疫化的 2。
在一些態樣中，DBA 部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，DBA 部分為 AB003637。
在一些態樣中，DBA 部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 155 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，DBA 部分為AB003637 去免疫化的。
在一些態樣中，DBA 部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 156 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 155 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，DBA 部分為AB003637 去免疫化的 2。
在一些態樣中，DBA 部分為習知 Fab 分子。在一些態樣中，DBA 部分為習知 Fab 分子，其包括由重鏈可變域及恆定域構成之 Fab 重鏈 (VH-CH1，以 N 端至 C 端方向) 及由輕鏈可變域及恆定域構成之 Fab 輕鏈 (VL-CL，以 N 端至 C 端方向)。
在一些態樣中，DBA 部分為 crossFab (亦即，為包括交叉型修飾的 Fab 分子)，其中 DBA 部分包括：Fab 重鏈，其包括 DBA 部分之 VH 及重鏈恆定域 1 (CH1)；及 Fab 輕鏈，其包括 DBA 部分之 VL 及輕鏈恆定域 (CL)，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。在一較佳實施例中，當 DBA 部分為 crossFab 時，Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。 B. 抗 PD-1 抗體部分
在一些態樣中，本文所述之免疫結合物及抗體可包括結合域 (例如，第二結合域)，該結合域包括抗 PD-1 抗體部分。在某些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包括重鏈可變區 (VH) 及輕鏈可變區 (VL)，且與 PD-1 結合。在某些態樣中，PD-1 為人 PD-1。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分實質上不與 IL-2 多肽 (例如，本文所述之 IL-2 多肽) 結合。在一些態樣中，PD-1 抗體部分為單特異性的。
在一些態樣中，本發明之抗 PD-1 抗體部分包括含有如 表 2中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR (例如，包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR)。在一些情況下，抗 PD-1 抗體部分包含含有如 表 2中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的 VH 及/或 VL。
表 2. 抗 PD-1 部分的 SEQ ID NO 之列表。
抗 PD-1 抗體部分： CDR V
H1 H2 H3 L1 L2 L3 VH VL
AB003058 10 11 12 1 2 3 13 4
0376 去免疫化的 28 29 30 19 20 21 31 22
1040 親和力成熟的 46 47 48 37 38 39 49 40
0376 166 167 168 157 158 159 169 160
在一些態樣中，本發明提供一種抗 PD-1 抗體部分，其包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 SYWMS (SEQ ID NO: 10) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGSGGSRYYAESVKG (SEQ ID NO: 11) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 SPLQWIDV (SEQ ID NO: 12) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 1) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 EASSLQS (SEQ ID NO: 2) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQANQFPFT (SEQ ID NO: 3) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 AB003058。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 AB003058。
在一些態樣中，本發明提供一種抗 PD-1 抗體部分，其包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 0376 去免疫化的。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 0376 去免疫化的。
在一些態樣中，本發明提供一種抗 PD-1 抗體部分，其包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 166) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 TISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 167) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 168) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 157) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RSSTLES (SEQ ID NO: 158) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 159) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 0376。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 171 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 172 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 173 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 174 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 162 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 163 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 164 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 165 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 169 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 160 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 169 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 160 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 0376。
在一些態樣中，本發明提供一種抗 PD-1 抗體部分，其包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 1040 親和力成熟的。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 1040 親和力成熟的。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子，其包括由重鏈可變域及恆定域構成之 Fab 重鏈 (VH-CH1，以 N 端至 C 端方向) 及由輕鏈可變域及恆定域構成之 Fab 輕鏈 (VL-CL，以 N 端至 C 端方向)。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為 crossFab (亦即，為包括交叉型修飾的 Fab 分子)，其中 抗 PD-1 抗體部分包括：Fab 重鏈，其包括抗 PD-1 抗體部分之 VH 及重鏈恆定域 1 (CH1)；及 Fab 輕鏈，其包括抗 PD-1 抗體部分之 VL 及輕鏈恆定域 (CL)，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。在一較佳實施例中，當抗 PD-1 抗體部分為 crossFab 時，Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換。
在一些態樣中，抗 PD-1 抗體部分為單鏈可變片段 (scFv)。在一些態樣中，抗 PD-1 抗體為 scFv，其中 VH 及 VL 係以下列方向連接：N-VH-VL-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。在其他態樣中，抗 PD-1 抗體為 scFv，其中 VH 及 VL 係以下列方向連接：N-VL-VH-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。在一些態樣中，scFv 之 VH 及 VL 係藉由連接子連接。可使用任何合適的連接子，例如，本文 (例如，在下文 D 節中) 所述之任何連接子。在一些態樣中，VH、VL 及連接子係以下列方向連接：N-VH-連接子-VL-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。在其他態樣中，抗 PD-1 抗體為 scFv，其中 VH 及 VL 係以下列方向連接：N-VL-連接子-VH-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。 C.   IL-2 多肽
本發明之免疫結合物可包括具有針對免疫療法之有利特性的 IL-2 多肽 (例如，人 IL-2 多肽；例如，突變型 IL-2 多肽；例如，突變型人 IL-2 多肽)。特定而言，可消除突變型 IL-2 多肽中可導致毒性、但對 IL-2 多肽之功效並非必需之 IL-2 多肽的藥理特性。此類突變型 IL-2 多肽詳細描述於 WO 2012/107417 中，該專利全文以引用方式併入本文。不同形式的 IL-2 受體由不同的次單元組成，且對 IL-2 具有不同的親和力。由 β 及 γ 受體次單元組成之中等親和力 IL-2 受體靜止效應子細胞上表現，且足以實現 IL-2 信號傳導。另外地包含受體之 α-次單元的高親和力 IL-2 受體主要在調節性 T (T reg) 細胞上以及在經活化之效應細胞上表現，於該處，藉由 IL-2 多肽達成之銜接可分別促進 T reg細胞媒介之免疫抑制或活化誘導之細胞死亡 (AICD)。因此，不希望被理論束縛，降低或消除 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力應藉由調節性 T 細胞降低 IL-2 所誘導之效應細胞功能之負調控，並藉由 AICD 之過程降低腫瘤耐受性之形成。另一方面，保持對中等親和力 IL-2 受體之親和力可保留 IL-2 多肽對 NK 及 T 細胞等效應細胞之增殖及活化的誘導。
包括在本文所述之免疫結合物中的突變型介白素-2 (IL-2) 多肽可包括至少一個胺基酸突變，該胺基酸突變消除或降低該突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α 次單元的親和力並且保留該突變型 IL-2 多肽對中等親和力 IL-2 受體的親和力，各與野生型 IL-2 多肽相比。
對 CD25 之親和力減少的人 IL-2 多肽 (hIL-2 多肽) 之突變體可例如藉由在胺基酸位置 35、38、42、43、45 或 72 或其組合處 (相對於 SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列編號) 進行胺基酸取代來產生。例示性胺基酸取代包括 K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R 及 L72K。可用於本文所述之免疫結合物的特定突變型 IL-2 多肽包括在對應於人 IL-2 多肽之殘基 42、45 或 72 的胺基酸位置處的胺基酸突變或其組合。在一個態樣中，該胺基酸突變為選自 F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R 及 L72K 之群組的胺基酸取代，更具體而言，選自 F42A、Y45A 及 L72G 之群組的胺基酸取代。與野生型形式的 IL-2 多肽相比，此等突變型 IL-2 多肽展現對中等親和力 IL-2 受體的基本上類似的結合親和力，且具有對 IL-2 受體之 α-次單元及高親和力 IL-2 受體的實質性降低的親和力。
有用突變型 IL-2 多肽之其他特徵可包括誘導攜帶 IL-2 受體之 T 細胞及/或 NK 細胞增殖的能力、誘導攜帶 IL-2 受體之 T 細胞及/或 NK 細胞中之 IL-2 傳訊的能力、藉由 NK 細胞產生干擾素 (IFN)-γ 作為次級細胞激素的能力、降低的藉由周邊血液單核球細胞 (PBMC) 誘導次級細胞激素 (特定而言 IL-10 及 TNF-α) 生成的能力、降低的活化調節性 T 細胞的能力、降低的誘導 T 細胞之凋亡的能力及降低的活體內毒性型態。
可用於本發明的特定突變型 IL-2 多肽包括三個胺基酸突變，該等突變消除或降低該突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力，但保留該突變型 IL-2 多肽對中等親和力 IL-2 受體的親和力。在一個態樣中，該等三個胺基酸突變係在對應於野生型 (WT) 人 IL-2 多肽之胺基酸殘基 42、45 及 72 (相對於 SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列編號) 的位置處。在一個態樣中，該等三個胺基酸突變為胺基酸取代。在一個態樣中，該等三個胺基酸突變為選自以下之群組的胺基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R 及 L72K。在一具體態樣中，該等三個胺基酸突變為胺基酸取代 F42A、Y45A 及 L72G (相對於 SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列編號)。
在某些態樣中，該胺基酸突變使突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力降低至少 5 倍，具體而言降低至少 10 倍，更具體而言降低至少 25 倍。在某些態樣中，其中存在多餘一個使突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力降低的胺基酸突變，此等胺基酸突變之組合可使突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力降低至少 30 倍、至少 50 倍或甚至至少 100 倍。在一個態樣中，該胺基酸突變或胺基酸突變之組合消除突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力，使得藉由表面電漿子共振無法檢出結合。
當突變型 IL-2 多肽所展現之親和力大於該突變型 IL-2 多肽之野生型形式對中等親和力 IL-2 受體的親和力的約 70% 時，達成與中等親和力受體的大致類似之結合，亦即，保持該突變型 IL-2 多肽對該受體之親和力。本文所述之突變型 IL-2 多肽可展現大於約 80% 及甚至大於約 90% 的此類親和力。
IL-2 對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力之降低與 IL-2 之 O-醣基化作用的消除組合得到具有改善之特性的 IL-2 蛋白質。例如，當哺乳動物細胞 (例如 CHO 或 HEK 細胞) 中表現突變型 IL-2 多肽時，消除 O-醣基化位點後，得到更均一的產物。
因此，在某些態樣中，突變型 IL-2 多肽包含額外胺基酸突變，該額外胺基酸突變消除在對應於人 IL-2 之殘基 3 的位置處的 IL-2 之 O-醣基化位點。在一個態樣中，消除在對應於人 IL-2 多肽之胺基酸殘基 3 (相對於 SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列編號) 的位置處的 IL-2 之 O-醣基化位點的額外胺基酸突變為胺基酸取代。例示性胺基酸取代包括 T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K 及 T3P。在一具體態樣中，該額外胺基酸突變為胺基酸取代 T3A。
在某些態樣中，突變型 IL-2 多肽為基本上全長 IL-2 多肽。在某些態樣中，突變型 IL-2 多肽為突變型人 IL-2 多肽。在一個實施例中，突變型 IL-2 多肽包括具有至少一個胺基酸突變的 SEQ ID NO: 147 之胺基酸序列，該突變消除或降低該突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力但保留該突變型 IL-2 多肽對中等親和力 IL-2 受體的親和力，與包括沒有該突變的 SEQ ID NO: 147 之胺基酸序列之 IL-2 多肽相比。在另一態樣中，突變型 IL-2 多肽包括 SEQ ID NO: 148 之序列，該序列具有至少一個胺基酸突變，該突變消除或降低突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力但保留突變型 IL-2 多肽對中等親和力 IL-2 受體的親和力，與包含沒有該突變的 SEQ ID NO: 148 之 IL-2 多肽相比。在另一態樣中，突變型 IL-2 多肽包括 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列，該序列具有至少一個胺基酸突變，該突變消除或降低該突變型 IL-2 多肽對 IL-2 受體之 α-次單元的親和力但保留該突變型 IL-2 多肽對中等親和力 IL-2 受體的親和力，與包含沒有該突變的 SEQ ID NO: 199 之 IL-2 多肽相比。
在一具體態樣中，突變型 IL-2 多肽可引發選自由以下所組成之群組的細胞反應中之一者或多者：經活化之 T 淋巴細胞的增殖、經活化之 T 淋巴細胞的分化、細胞毒性 T 細胞 (CTL) 活性、經活化之 B 細胞的增殖、經活化之 B 細胞的分化、自然殺手 (NK) 細胞的增殖、 NK 細胞的分化、經活化之 T 細胞或 NK 細胞的細胞激素分泌、以及 NK/淋巴球活化之殺手 (LAK) 抗腫瘤細胞毒性。
在一個態樣中，與野生型 IL-2 多肽相比，突變型 IL-2 多肽具有降低的在調節性 T 細胞中誘導 IL-2 傳訊的能力。在一個實施例中，與野生型 IL-2 多肽相比，突變型 IL-2 多肽誘導 T 細胞中較少活化誘導之細胞死亡 (AICD)。在一個態樣中，與野生型 IL-2 多肽相比，突變型 IL-2 多肽具有降低的活體內毒性型態。在一個實施例中，與野生型 IL-2 多肽相比，突變型 IL-2 多肽的血清半衰期延長。
可用於本發明中的特定突變型 IL-2 多肽包括在對應於人 IL-2 多肽之胺基酸殘基 3、42、45 及 72 (相對於 SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列編號) 的位置處的四個胺基酸取代。具體胺基酸取代為 T3A、F42A、Y45A 及 L72G。如 WO 2012/107417 中所證明，該四重突變型 IL-2 多肽展現出不可偵測的與 CD25 之結合、降低的誘導 T 細胞凋亡的能力、降低的誘導 T reg細胞中 IL-2 傳訊的能力及降低的活體內毒性型態。然而，該突變型 IL-2 多肽保留了活化效應細胞中之 IL-2 傳訊、誘導效應細胞增殖、及藉由 NK 細胞生成 IFN-γ 作為次級細胞激素的能力。
此外，該四重突變型 IL-2 多肽具有更多有利特性，諸如降低的表面疏水性、良好的穩定性及良好的表現產量，如 WO 2012/107417 中所述。出乎意料地，與野生型 IL-2 相比，該四重突變型 IL-2 多肽亦提供延長的血清半衰期。
可用於本發明中的突變型 IL-2 多肽除具有在形成 IL-2 多肽與 CD25 或醣基化位點的界面的 IL-2 多肽之區內的突變以外，亦可在此等區以外的胺基酸序列中具有一個或多個突變。人 IL-2 多肽中的此類額外的突變可提供額外的優勢，諸如增加的表現或穩定性。例如，在位置 125 處 (相對於 SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 肽序列編號) 的半胱胺酸可用中性胺基酸諸如絲胺酸、丙胺酸、蘇胺酸或纈胺酸替換，分別得到 C125S 突變型 IL-2 多肽、C125A 突變型 IL-2 多肽、C125T 突變型 IL-2 多肽或 C125V 突變型 IL-2 多肽，如美國專利號 4,518,584 所述，該專利之全部內容藉由引用併入本文。如其中所述，可使 IL-2 多肽之 N 端丙胺酸殘基缺失，得到諸如 des-A1 C125S 或 des-A1 C125A 之突變體。替代性地或聯合地，突變型 IL-2 多肽可包括突變，由此在正常情況下出現在野生型人 IL-2 多肽之位置 104 處 (相對於 SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列編號) 的甲硫胺酸經中性胺基酸諸如丙胺酸替換 (參見美國專利號 5,206,344)。所得突變體，例如 A1 M104A IL-2、des-A1 M104A C125S IL-2、M104A IL-2、M104A C125A IL-2、des-A1 M104A C125A IL-2 或 M104A C125S IL-2 (此等及其他突變體可見於美國專利號 5,116,943 中及 Weiger 等人, Eur J Biochem180, 295-300 (1989) 中) 可與本發明之特定 IL-2 突變聯合使用。
因此，在某些態樣中，突變型 IL-2 多肽包括在對應於人 IL-2 多肽之殘基 125 (相對於 SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列編號) 的位置處的額外胺基酸突變。在一個態樣中，該額外胺基酸突變為胺基酸取代 C125A。
IL-2 突變體可另外包含在對應於人 IL-2 (SEQ ID NO:147 中所示) 之 126 的位置處的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代 Q126T。Q126T 取代降低與中等親和力 IL-2 受體 (由 IL-2 受體之 β 及 γ 次單元組成) 之結合，進一步降低 PD-1-reg-IL-2v 分子的活體內周邊活性。
在一個態樣中，突變型 IL-2 多肽包含不超過 12 個、不超過 11 個、不超過 10 個、不超過 9 個、不超過 8 個、不超過 7 個、不超過 6 個或不超過 5 個胺基酸突變，如與對應的野生型人 IL-2 多肽序列 (例如，SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列) 相比。在一特定態樣中，突變型 IL-2 多肽包含不超過 5 個胺基酸突變，如與對應的野生型人 IL-2 多肽序列 (例如，SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列) 相比。在另一特定態樣中，突變型 IL-2 多肽包含不超過 6 個胺基酸突變，如與對應的野生型人 IL-2 多肽序列 (例如，SEQ ID NO: 147 之人 IL-2 多肽序列) 相比。
在一個態樣中，突變型 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 146 之序列。在一個態樣中，突變型 IL-2 多肽由 SEQ ID NO: 146 之序列組成。在一個態樣中，突變型 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 199 之序列。在一個態樣中，突變型 IL-2 多肽由 SEQ ID NO: 199 之序列組成。 D. 連接子
包括在本文所述之免疫結合物中的連接子，例如肽連接子，可用於將本文所述之兩個多肽接合或連接在一起。在一些態樣中，本文所述之連接子用於連接 IL-2 多肽 (例如，人 IL-2 多肽，例如，突變型 IL-2 多肽；例如，突變型人 IL-2 多肽) 與本文所述之 DBA 部分。在某些態樣中，連接子用於將 IL-2 多肽連接至 DBA 部分，其中該 IL-2 多肽係以下列方向連接至 DBA 部分之 VH：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[VH]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。在某些態樣中，連接子用於將 IL-2 多肽連接至 DBA 部分，其中該 IL-2 多肽係以下列方向連接至 DBA 部分之 VL：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[VL]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。
在其他態樣中，連接子可用於連接抗 PD-1 抗體部分或 Fc 次單元與 IL-2 多肽。
在一些態樣中，連接子的長度為介於 5 至 30 個胺基酸之間，較佳地，長度為 20 個胺基酸。在一些態樣中，連接子包含胺基酸序列 (G 2SG 2) x，其中 x 為在 1 至 6 之間的整數 (SEQ ID NO: 149 至 154)。在一些態樣中，連接子包含下列中之任一者之胺基酸序列：SEQ ID NO: 149 至 154)。在較佳態樣中，連接子包含胺基酸序列 GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 150) 或 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 152)。在較佳態樣中，連接子由胺基酸序列 GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 150) 或 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 152) 組成。
在其他態樣中，連接子包含胺基酸序列 (G 4S) x，其中 x 為介於 1 與 4 之間的整數 (SEQ ID NO: 192 至 195)。在某些其他態樣中，連接子包含 SEQ ID NO: 194 之胺基酸序列。在某些其他態樣中，連接子由 SEQ ID NO: 194 之胺基酸序列組成。 E. 免疫結合物
在一些態樣中，本文所述之免疫結合物包括 (a) 第一結合域，其包括：(i) 本文所述之 IL-2 多肽；(ii) 本文所述之連接子；及 (iii) 本文所述之雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以基本上相互排斥方式結合，其中該第一結合域係經組態以使得：(i) 當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；(ii) 當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係實質上經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與 IL-2 受體結合；及 (b) 第二結合域，其包括含有 VH 及 VL 之本文所述之抗 PD-1 抗體部分。
例如，在一些態樣中，本文所述之免疫結合物包括 (a) 第一結合域，其包括：(i) 本文所述之 IL-2 多肽；(ii) 本文所述之連接子；及 (iii) 本文所述之雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中該 DBA 部分包括重鏈可變區 (VH) 及輕鏈可變區 (VL)，其中該 IL-2 多肽、該連接子及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端，並且其中第一結合域係經組態以使得：(i) 當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；(ii) 當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係實質上經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與 IL-2 受體結合；及 (b) 第二結合域，其包括含有 VH 及 VL 之本文所述之抗 PD-1 抗體部分。
在一些態樣中，免疫結合物進一步包括含有第一次單元及第二次單元的 Fc 域。在一些態樣中，DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端；且/或 (b) 抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係以下列方向連接：N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
在一些態樣中，Fc 域為 IgG Fc 域。在一些態樣中，IgG Fc 域為 IgG 1Fc 域。在一些態樣中，Fc 域為人 IgG Fc 域。在一些態樣中，Fc 域為人 IgG 1Fc 域。在一些態樣中，第一次單元包括選自第一 CH2 (CH2 1) 域及/或第一 CH3 (CH3 1) 域的一個或多個 CH 域；且第二次單元包括選自第二 CH2 (CH2 2) 域及/或第二 CH3 (CH3 2) 域的一個或多個 CH 域。在一些態樣中，該一個或多個 CH 域中之至少一者與另一 CH 域配對。在一些態樣中，該 CH3 1域及該 CH3 2域各包括隆凸或腔窩，且其中在該 CH3 1域中的該隆凸或腔窩分別可定位於在該 CH3 2域中的該腔窩或隆凸中。在一些態樣中，該 CH3 1域及該 CH3 2域在該隆凸與腔窩之間的界面處相接。在一些態樣中，該 CH2 1域及該 CH2 2域各包括隆凸或腔窩，且其中在該 CH2 1域中的該隆凸或腔窩分別可定位於在該 CH2 2域中的該腔窩或隆凸中。在一些態樣中，該 CH2 1域及該 CH2 2域在該隆凸與腔窩之間的界面處相接。在一些態樣中，(a) 第一次單元包括在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (b) 第一次單元包括在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一些態樣中，第一次單元及/或第二次單元包括在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。在一些態樣中，第一次單元及第二次單元包括在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一些態樣中，DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 的不同抗原決定基結合。在一些態樣中，DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 的相同抗原決定基結合。
在一些態樣中，DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合且/或抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。在一些態樣中，DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，或抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。在一些態樣中，(a) DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合；或 (b) DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。在一些態樣中，DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。在一些態樣中，DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。
本文所述之免疫結合物可包括本文所述之 DBA 部分、抗 PD-1 抗體部分、IL-2 多肽及連接子的不同組合。
在一些態樣中，免疫結合物可包括如本文、例如上文 A 節中所揭示之任何 DBA 部分。在一些實例中，DBA 部分包括含有如 表 1中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR (例如，包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR)。在一些情況下，DBA 部分包含含有如 表 1中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的 VH 及/或 VL。
在一些態樣中，免疫結合物可包括如本文、例如上文 B 節中所揭示之任何抗 PD-1 抗體部分。在一些實例中，抗 PD-1 抗體部分包括含有如 表 2中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR (例如，包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR)。在一些情況下，抗 PD-1 抗體部分包含含有如 表 2中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的 VH 及/或 VL。
在一些態樣中，免疫結合物可包括如本文、例如上文 C 節中所揭示之任何 IL-2 部分。
在一些態樣中，免疫結合物可包括如本文、例如上文 D 節中所揭示之任何連接子。
含有本文所述之 DBA 部分、抗 PD-1 抗體部分、IL-2 多肽及連接子的特定組合之特定免疫結合物係顯示於下 表 3(含有具有習知 Fab DBA 部分及 crossFab 抗 PD-1 抗體部分之免疫結合物)、 表 4(含有具有 crossFab DBA 部分及習知 Fab 抗 PD-1 抗體部分之免疫結合物) 及 表 5(含有習知 Fab DBA 部分及 scFv 抗 PD-1 抗體部分之免疫結合物) 中。
表 3. 具有習知 Fab DBA 部分及 CrossFab 抗 PD-1 抗體部分之免疫結合物。
構建體 ID DBA PD-1 LC DBA (SEQ ID NO) HC DBA (SEQ ID NO) HC PD-1 (SEQ ID NO) LC PD-1 (SEQ ID NO)
P1AI7473 AB002345 AB003058 D1AN8694 (94) D1AN8695 (96) D1AN8696 (100) D1AN8697 (98)
P1AI7474 AB003637 0376di D1AN8698 (102) D1AN8699 (104) D1AN8700 (106) D1AN8701 (108)
P1AI7476 AB002345 0376di D1AN8694 (94) D1AN8695 (96) D1AN8700 (106) D1AN8701 (108)
P1AJ2534 AB003637di 0376di D1AR7303 (110) D1AN8699 (104) D1AN8700 (106) D1AN8701 (108)
P1AJ2535 AB003637di2 0376di D1AR7303 (110) D1AR7306 (112) D1AN8700 (106) D1AN8701 (108)
P1AL2287 AB002345 0376di D1AN8694 (94) D1BA2202 (197) D1AN8700 (106) D1AN8701 (108)
P1AM2983 AB002345 0376di D1AN8694 (94) D1BE4057 (198) D1AN8700 (106) D1AN8701 (108)
DBA：DBA 部分；PD-1：抗 PD-1 抗體；LC：輕鏈；HC：重鏈； di：去免疫化的； di2：去免疫化的 2
表 4. 具有 CrossFab DBA 部分及習知 Fab 抗 PD-1 抗體部分之免疫結合物。
構建體 ID DBA PD-1 LC DBA (SEQ ID NO) HC DBA (SEQ ID NO) HC PD-1 (SEQ ID NO) LC PD-1 (SEQ ID NO)
P1AI7438 AB003637 0376di D1AN8717 (114) D1AN8718 (116) D1AM6910 (118) D1AM6911 (120)
P1AI7440 AB002345 0376di D1AN8719 (122) D1AN8720 (124) D1AM6910 (118) D1AM6911 (120)
P1AI7441 AB002345 1040opt D1AN8719 (122) D1AN8720 (124) D1AL8214 (126) D1AN8721 (128)
P1AI7443 AB002345 AB003058 D1AN8719 (122) D1AN8720 (124) D1AN8722 (130) D1AN8723 (132)
P1AJ1837 AB002345 0376di D1AR5691 (134) D1AN8720 (124) D1AM6910 (118) D1AM6911 (120)
P1AJ1838 AB002345 1040opt D1AR5691 (134) D1AN8720 (124) D1AL8214 (126) D1AN8721 (128)
P1AJ1839 AB003637 0376di D1AR5695 (138) D1AN8718 (116) D1AM6910 (118) D1AM6911 (120)
P1AI7455 AB002345 1040opt D1AN8668 (185) D1AN8669 (187) D1AN0599 (189) D1AN0600 (191)
DBA：DBA 部分；PD-1：抗 PD-1 抗體；LC：輕鏈；HC：重鏈； di：去免疫化的；opt：親和力成熟的
表 5. 具有習知 Fab DBA 部分及 scFv 抗 PD-1 抗體部分之免疫結合物。
構建體 ID DBA PD-1 LC DBA (SEQ ID NO) HC DBA (SEQ ID NO) HC PD-1 (SEQ ID NO)
P1AI7462 AB003637 0376di D1AN8686 (77) D1AN8687 (140) D1AN8690 (141)
P1AI7464 AB002345 0376di D1AW0211 (59) D1AN8689 (136) D1AN8690 (141)
P1AI7465 AB002345 1040opt D1AW0211 (59) D1AN8689 (136) D1AN8691 (142)
P1AI7467 AB002345 AB003058 D1AW0211 (59) D1AN8689 (136) D1AN8693 (143)
P1AK3169 AB002345 AB003058 D1AW0211 (59) D1AN8689 (136) D1AW0212 (144)
P1AK3171 AB002345 0376di D1AW0211 (59) D1AN8689 (136) D1AW0216 (145)
P1AK3173 AB003637 0376di D1AN8686 (77) D1AN8687 (140) D1AW0216 (145)
P1AK3185 AB003637di 0376di D1AW0227 (92) D1AN8687 (140) D1AW0216 (145)
DBA：DBA 部分；PD-1：抗 PD-1 抗體；LC：輕鏈；HC：重鏈； di：去免疫化的；opt：親和力成熟的
在一些態樣中，免疫結合物包含 DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分，其中：(i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分為 AB002345 且抗 PD-1 抗體部分為 0376 去免疫化的。在一些態樣中，免疫結合物的構建體 ID 為 P1AI7476、P1AI7440、P1AJ1837、P1AI7464、P1AL2287、P1AM2983 或 P1AK3171。
在一些態樣中，免疫結合物包含 DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分，其中：(i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分為 AB003637 且抗 PD-1 抗體部分為 0376 去免疫化的。在一些態樣中，免疫結合物的構建體 ID 為 P1AI7474、P1AI7438、P1AJ1839、P1AI7462 或 P1AK3173。
在一些態樣中，免疫結合物包含 DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分，其中：(i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分為 AB003637 去免疫化的，且抗 PD-1 抗體部分為 0376 去免疫化的。在一些態樣中，免疫結合物的構建體 ID 為 P1AJ2534 或 P1AK3185。
在一些態樣中，免疫結合物包含 DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分，其中：(i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分為 AB003637 去免疫化的 2，且抗 PD-1 抗體部分為 0376 去免疫化的。在一些態樣中，免疫結合物的構建體 ID 為 P1AJ2535。
在一些態樣中，免疫結合物包含 DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分，其中：(i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYWMS (SEQ ID NO: 10) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGSGGSRYYAESVKG (SEQ ID NO: 11) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 SPLQWIDV (SEQ ID NO: 12) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 1) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 EASSLQS (SEQ ID NO: 2) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQANQFPFT (SEQ ID NO: 3) 之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分為 AB002345 且抗 PD-1 抗體部分為 AB003058。在一些態樣中，免疫結合物的構建體 ID 為 P1AI7473、P1AI7443、P1AI7467 或 P1AK3169。
在一些態樣中，免疫結合物包含 DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分，其中：(i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一些態樣中，(i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分為 AB002345 且抗 PD-1 抗體部分為 1040 親和力成熟的。在一些態樣中，免疫結合物的構建體 ID 為 P1AI7441、P1AJ1838、P1AI7455 或 P1AI7465。
在一些態樣中，免疫結合物包括：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列；(ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 150 或 152 之胺基酸序列；及 (iii) DBA 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，其中 IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，且當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合；(b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元，其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，其中抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且其中：(a) DBA 部分為習知 Fab 分子；且抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換；或 (b) DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈 CL，其中 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
在一些態樣中，免疫結合物包括：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列；(ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 150 或 152 之胺基酸序列；及 (iii) 雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，其中 IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，且當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合；(b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為包含 VH 及 VL 之 scFv；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元，其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
在一些態樣中，免疫結合物包括：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列；(ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 152 之胺基酸序列；及 (iii) DBA 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，其中 IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，且當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合；(b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元，其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，其中抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且其中：(a) DBA 部分為習知 Fab 分子；且抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換；或 (b) DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈 CL，其中 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
在一些態樣中，免疫結合物包括：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列；(ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 152 之胺基酸序列；及 (iii) 雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，其中 IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，且當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合；(b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為包含 VH 及 VL 之 scFv；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元，其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 100 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 98 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 100 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 98 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 100 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 98 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7473。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7474。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7476。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AJ2534。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AJ2535。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 116 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 114 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 116 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 114 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 116 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 114 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7438。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7440。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7441。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 130 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 130 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 130 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7443。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AJ1837。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AJ1838。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 138 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 116 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 138 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 116 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 138 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 116 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AJ1839。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AL2287。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AM2983。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 187 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 185 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 189 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 191 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 187 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 185 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 189 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 191 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 187 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 185 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 189 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 191 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7455。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 141 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列；及第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 141 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列組成；及第三多肽，其由 SEQ ID NO: 141 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7462。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 141 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列；及第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 141 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列組成；及第三多肽，其由 SEQ ID NO: 141 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7464。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 142 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列；及第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 142 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列組成；及第三多肽，其由 SEQ ID NO: 142 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7465。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 143 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列；及第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 143 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列組成；及第三多肽，其由 SEQ ID NO: 143 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AI7467。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 144 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列；及第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 144 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列組成；及第三多肽，其由 SEQ ID NO: 144 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AK3169。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列；及第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列組成；及第三多肽，其由 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AK3171。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列；及第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列組成；及第三多肽，其由 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AK3173。
在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列；及第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列組成；及第三多肽，其由 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，免疫結合物為 P1AK3185。
在一些態樣中，免疫結合物為參考免疫結合物。在一些態樣中，參考免疫結合物包括：(a) 第一抗 PD-1 抗體部分及第二抗 PD-1 抗體部分，其中第一及第二抗 PD-1 抗體部分各為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (b) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元 其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中第一抗 PD-1 抗體部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[可以抗 PD-1 抗體部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，其中第二抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係根據 N-[第二抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中：(a) 第一及第二抗 PD-1 抗體部分各為習知 Fab 分子，並且其中包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列的突變型 IL-2 多肽、包含 SEQ ID NO: 194 之胺基酸序列的連接子、及第一次單元係根據 N-[第一次單元]-[連接子]-[突變型 IL-2 多肽]-C 連接。
在一些態樣中，參考免疫結合物的每個抗 PD-1 抗體部分包括：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 166) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 TISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 167) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 168) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 157) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RSSTLES (SEQ ID NO: 158) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 159) 之胺基酸序列。在一些態樣中，參考免疫結合物的每個抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 169 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 160 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一些態樣中，參考免疫結合物的每個抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含SEQ ID NO: 169 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 160 之胺基酸序列。在一些態樣中，參考免疫結合物的每個抗 PD-1 抗體部分為 0376。
在一個態樣中，參考免疫結合物包括：第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 170 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 179 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 161 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，參考免疫結合物包括：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 170 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 179 之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含 SEQ ID NO: 161 之胺基酸序列。在一個態樣中，參考免疫結合物包括：第一多肽，其由 SEQ ID NO: 170 之胺基酸序列組成；第二多肽，其由 SEQ ID NO: 179 之胺基酸序列組成；以及第三多肽及第四多肽，其各由 SEQ ID NO: 161 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，參考免疫結合物為 P1AE4422-14542 (亦即，常開或常開 P1AE4422-14542 對照)。
在一些態樣中，參考免疫結合物為常開免疫結合物。在一些態樣中，參考免疫結合物不包括 DBA 部分。
在一些態樣中，參考免疫結合物包含兩個 DBA 部分。在一些態樣中，參考免疫結合物包括：(a) 第一結合域，其包含：(i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 147 之胺基酸序列；(ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 152 之胺基酸序列；及 (iii) 第一 DBA 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中第一 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，其中 IL-2 多肽、連接子及第一 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[第一 DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中當第一 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，並且當第一 DBA 部分係與 PD-1 結合時，第一 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且 IL-2 多肽能夠與其受體結合；(b) 第二結合域，其包含第二 DBA 部分，其中第二 DBA 部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈，並且其中當第二 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合，並且當第二 DBA 部分係與 PD-1 結合時，第二 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且 IL-2 多肽能夠與其受體結合；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元，其中：(i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，其中第一 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[第一 DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，其中第二 DBA 部分及第二次單元係根據 N-[第二 DBA 部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且其中第一 DBA 部分及第二 DBA 部分各為習知 Fab 分子。
在一個態樣中，參考免疫結合物包含構建體 ID P1AM2158，包含兩個具有序列 AB002345 的 DBA 部分，包含兩個包含 D1AW0211 (SEQ ID NO: 59) 的 DBA LC、DBA-IL-2 HC D1AN8689 (SEQ ID NO: 136) 及 DBA HC C2184344765 (SEQ ID NO: 196)。
在一些態樣中，參考免疫結合物包括兩個 DBA 部分，其中：該等 DBA 部分中之每一者包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列。在一些態樣中，該等 DBA 部分中之每一者包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一些態樣中 DBA 部分中之每一者包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分中之每一者為 AB002345。在一些態樣中，參考免疫結合物的構建體 ID 為 P1AM2158 (亦即，化合物 C)。
在一個態樣中，參考免疫結合物包括：第一多肽及第二多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 196 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽及一多肽，其各包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 196 之胺基酸序列。在一個態樣中，免疫結合物包括：第一多肽及第二多肽，其各由 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列組成；第三多肽，其由 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列組成；及第四多肽，其由 SEQ ID NO: 196 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，參考免疫結合物為 P1AM2158 (化合物 C)。
在一些態樣中，本發明提供本文所提供之免疫結合物的鼠類似物形式。製備鼠類似物之方法為本領域中所知。本文所揭示之免疫結合物的鼠類似物的構建體 ID 係顯示於下 表 6中。
表 6. 人免疫結合物構建體的鼠類似物。
DBA 僅 PD-1 人構建體 ID 鼠構建體 ID
AB003637 0376di P1AI7438/P1AJ1839 P1AI8561
AB002345 0376di P1AI7440/P1AJ1837 P1AI8564
AB002345 1040opt P1AI7441/P1AJ1838 P1AI8565
AB002345 AB003058 P1AI7467 P1AI8589
AB003637 0376di P1AI7474 P1AI8600
AB002345 0376di P1AI7476 P1AI8597
AB003637di 0376di P1AJ2534 P1AJ4846
AB003637di2 0376di P1AJ2535 -
DBA：DBA 部分；PD-1：抗 PD-1 抗體；LC：輕鏈；HC：重鏈； di：去免疫化的；opt：親和力成熟的 F. 額外抗體
在一些態樣中，本節中所述之額外抗體中之任一者可在本文所述之免疫結合物的背景下使用 (例如，在經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物中)。在一些態樣中，本文所述之免疫結合物 (例如，在經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物中) 可包含本節中所述之額外抗體中之任一者，例如，包含本節中所述之額外抗體中指任一者中之一者或多者、本文所述之連接子中之任一者或多者 (例如，如 D 節中所述) 及/或本文所述之 IL-2 多肽中之任一者或多者 (例如，如 C 節中所述)。在一些態樣中，IL-2 多肽可例如經由連接子連接至額外抗體之重鏈及/或輕鏈中之任一者之 N 端或 C 端，以產生免疫結合物。在一較佳態樣中，IL-2 多肽可例如經由連接子連接至額外抗體之重鏈及/或輕鏈中之任一者之 N 端，以產生本文所述之免疫結合物。
在一些態樣中，抗體包括兩個 DBA 部分，其各包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分為 AB002345。
在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分為 AB002345。
在一些態樣中，抗體包括兩個 DBA 部分，其各包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分為 AB003637 或 AB003637 去免疫化的。
在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分為 AB003637。
在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 155 之胺基酸序列。在一些態樣中，DBA 部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各 DBA 部分為 AB003637 去免疫化的。
在一些態樣中，抗體包括兩個抗 PD-1抗體部分，其各包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 SYWMS (SEQ ID NO: 10) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGSGGSRYYAESVKG (SEQ ID NO: 11) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 SPLQWIDV (SEQ ID NO: 12) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 1) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 EASSLQS (SEQ ID NO: 2) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQANQFPFT (SEQ ID NO: 3) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分為 AB003058。
在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分為 AB003058。
在一些態樣中，抗體包括兩個抗 PD-1抗體部分，其各包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分為 0376 去免疫化的。
在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分為 0376 去免疫化的。
在一些態樣中，抗體包括兩個抗 PD-1抗體部分，其各包含下列六個 CDR：CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分為 1040 親和力成熟的。
在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含下列八個框架區 (FR) 中之一者或多者：(i) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列；(ii) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列；(iii) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；(iv) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；(v) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；(vi) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列；(vii) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及/或 (viii) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分包含：(a) VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；(b) VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些態樣中，抗體的各抗 PD-1 抗體部分為 1040 親和力成熟的。
在一些態樣中，抗體進一步包括含有第一次單元及第二次單元的 Fc 域。在一些態樣中，第一抗 PD-1 抗體部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[第一抗 PD-1 抗體部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端；且/或 (b) 第二抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係以下列方向連接：N-[第二抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
在一些態樣中，Fc 域為 IgG Fc 域。在一些態樣中，IgG Fc 域為 IgG 1Fc 域。
在一些態樣中，第一次單元及/或第二次單元包括在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一些態樣中，抗體可包括如本文、例如上文 A 節中所揭示之任何 DBA 部分。在一些實例中，DBA 部分包括含有如 表 1中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR (例如，包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR)。在一些情況下，DBA 部分包含含有如 表 1中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的 VH 及/或 VL。
在一些態樣中，抗體可包括如本文、例如上文 B 節中所揭示之任何抗 PD-1 抗體部分。在一些實例中，抗 PD-1 抗體部分包括含有如 表 2中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR (例如，包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個 CDR)。在一些情況下，抗 PD-1 抗體部分包含含有如 表 2中所示之 SEQ ID NO 之胺基酸序列的 VH 及/或 VL。
本文所述之抗體可包括不同的 DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分。含有本文所述之 DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分的特定組合之特定抗體係顯示於 下表 7中。
表 7. 抗體 ( 含有兩個部分， HC 及 LC 各一 )
構建體 ID 結合物 LC (SEQ ID NO) HC (SEQ ID NO)
P1AI7512 AB003058 (7G12) C2184287900 (14) D1AN8723 (132)
P1AH4157 0376-去免疫化的 D1AN8736 (32) D1AM6911 (120)
P1AG3741 1040 親和力成熟的 D1AK1422 (50) D1AN8721 (128)
P1AI3784 AB002345 C2184287921 (68) D1AW0211 (59)
P1AI7516 AB003637 C2184287898 (86) D1AN8686 (77)
P1AI7514 AB003637 去免疫化的 C2184287898 (86) D1AW0227 (92)
DBA：DBA 部分；PD-1：抗 PD-1 抗體；LC：輕鏈；HC：重鏈； di：去免疫化的； di2：去免疫化的 2
在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含 SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各由 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列組成；以及第三多肽及第四多肽，其各由 SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，抗體為 P1AI7512。
在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各由 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列組成；以及第三多肽及第四多肽，其各由 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，抗體為 P1AH4157。
在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各由 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列組成；以及第三多肽及第四多肽，其各由 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，抗體為 P1AG3741。
在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各由 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列組成；以及第三多肽及第四多肽，其各由 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，抗體為 P1AI3784。
在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 86 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含 SEQ ID NO: 86 之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各由 SEQ ID NO: 86 之胺基酸序列組成；以及第三多肽及第四多肽，其各由 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，抗體為 P1AI7516。
在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 86 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含與 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各包含 SEQ ID NO: 86 之胺基酸序列；以及第三多肽及第四多肽，其各包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包括：第一多肽及第二多肽，其各由 SEQ ID NO: 86 之胺基酸序列組成；以及第三多肽及第四多肽，其各由 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列組成。在一些態樣中，抗體為 P1AI7514。 G. 免疫結合物及 / 或抗體的特性
在一些實例中，本文所揭示之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物) 及/或抗體 (例如，DBA 及/或抗 PD-1 抗體) 可包括下文 1 至 6 節所規定之特性中之任一者或該等特性之任何組合。 1.  抗體片段
在某些態樣中，本文所述之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 包括一個或多個抗體片段。在某些態樣中，本文所提供之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物) 或抗體包括抗體片段。
可以使用任何適當的抗體片段。在一個態樣中，抗體片段 (例如，DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分) 為 Fab、Fab'、Fab'-SH 或 F(ab') 2片段。在特定實例中，抗體片段 (例如，DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分) 為 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化生產兩個相同的抗原結合片段，稱為 Fab 片段，其各包含重鏈及輕鏈可變域 (分別為 VH 及 VL) 以及輕鏈之恆定域 (CL) 及重鏈之第一恆定域 (CH1)。Fab'-SH 是 Fab' 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合抗原決定位殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab') 2片段的論述，參見美國專利號 5,869,046。
在另一態樣中，抗體片段為雙抗體、三抗體或四抗體。
在又一態樣中，抗體片段為單鏈 Fab 片段。
在另一態樣中，抗體片段 (例如，抗 PD-1 抗體部分) 為單鏈可變片段 (scFv)。
在另一態樣中，抗體片段為單域抗體。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 ( 例如大腸桿菌) 之重組產生。 2.  嵌合及人源化免疫結合物及/或抗體
在某些態樣中，本文所提供之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 為嵌合免疫結合物或抗體。在某些態樣中，本文所提供之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 包括嵌合免疫結合物或抗體。
某些嵌合抗體描述於 例如，美國專利號 4,816,567；及 Morrison 等人, Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 81:6851-6855 (1984))。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區 ( 例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物 (諸如猴) 之可變區) 及人類恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些態樣中，嵌合免疫結合物或抗體為人源化免疫結合物或抗體。通常，非人免疫結合物或抗體係經人源化以降低對人之免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。通常，人源化免疫結合物或抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR (或其部分) 來源於非人免疫結合物或抗體，並且 FR (或其部分) 來源於人抗體序列。人源化免疫結合物或抗體視情況將亦包含人恆定區之至少一部分。在一些態樣中，人源化免疫結合物或抗體中的一些 FR 殘基係經來自非人免疫結合物或抗體 (例如，CDR 殘基所源自之抗體或抗體片段) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法係綜述於例如 Almagro 及 Fransson， Front.Biosci.13:1619-1633 (2008)，並且在例如 Riechmann 等人 , Nature332:323-329 (1988)；Queen 等人, Proc.Nat'l Acad.Sci.USA86:10029-10033 (1989)；美國專利號 5, 821,337、7,527,791、6,982,321 及 7,087,409；Kashmiri 等人, Methods36:25-34 (2005) (描述特異性決定區 (SDR) 移植)；Padlan, Mol.Immunol.28:489-498 (1991) (描述「表面重塑 (resurfacing)」)；Dall'Acqua 等人, Methods36:43-60 (2005) (描述「FR 改組 (shuffling)」)；及 Osbourn 等人, Methods36:61-68 (2005) 及 Klimka 等人, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (描述 FR 改組的「引導選擇」方法)。
可以用於人源化的人骨架區包括但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇的骨架區 (參見 例如，Sims 等人 J. Immunol.151:2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區之特定亞群的人抗體的共同序列的骨架區 (參見 例如，Carter 等人 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:4285 (1992)；及 Presta 等人 J. Immunol., 151:2623 (1993))；人類成熟 (體細胞突變) 骨架區或人類生殖系列骨架區 (參見 例如，Almagro 及 Fransson, Front.Biosci.13:1619-1633 (2008))；及來源於篩選 FR 文庫的骨架區 (參見 例如, Baca 等人, J. Biol.Chem.272:10678-10684 (1997) 及 Rosok 等人, J. Biol.Chem.271:22611-22618 (1996))。 3.  人免疫結合物及抗體
在某些態樣中，本文所提供之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 為或包括人免疫結合物或抗體。可使用此領域中所知的各種技術生產人免疫結合物或抗體。人抗體一般描述於 van Dijk 及 van de Winkel, Curr.Opin.Pharmacol.5: 368-74 (2001) 及 Lonberg, Curr.Opin.Immunol.20:450-459 (2008)。
可透過對轉基因動物投予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以回應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。有關從轉基因動物中獲得人抗體的方法的綜述，參見 Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005)。亦參見例如描述 XENOMOUSE TM技術之美國專利號 6,075,181 及 6,150,584；描述 HuMab® 技術之美國專利號 5,770,429；描述 K-M Mouse® 技術之美國專利號 7,041,870 及描述 VelociMouse® 技術之美國專利申請公開案號 US 2007/0061900。由此類動物產生之完整抗體的人類可變區可進一步加以修飾， 例如藉由與不同人類恆定區組合。
人抗體也可透過基於融合瘤的方法進行製備。用於生產人單株抗體之人骨髓瘤及小鼠-人异源骨髓瘤細胞株已有描述。(參見 例如，Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur 等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及 Boerner 等人, J. Immunol., 147: 86 (1991).)經由人 B 細胞融合瘤技術產生之人抗體亦描述於 Li 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 103:3557-3562 (2006) 中。其他方法包括描述於例如以下文獻中的那些：美國專利號 7,189,826 (描述了由融合瘤細胞株生產單株人 IgM 抗體)，及 Ni， Xiandai Mianyixue，26(4):265-268 (2006) (描述了人-人融合瘤)。人融合瘤技術 (Trioma 技術) 也描述於以下文獻中：Vollmers 及 Brandlein， Histology and Histopathology，20(3):927-937 (2005)；及 Vollmers 和 Brandlein， Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3):185-91 (2005)。
人抗體也可以藉由分離選自人源性噬菌體展示文庫的可變域序列來產生。然後可以將此等可變域序列與所需的人恆定域結合。 4.  多特異性免疫結合物及多特異性抗體
在某些態樣中，本文揭示一種多特異性免疫結合物或多特異性抗體。「多特異性免疫結合物」為對至少兩個不同位點 (亦即不同抗原上的不同抗原決定基或同一抗原上的不同抗原決定基) 具有結合特異性之單株免疫結合物。在某些態樣中，多特異性免疫結合物或多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些態樣中，結合特異性中之一者為以相互排斥方式對 IL-2 多肽或 PD-1 之結合特異性，且其他特異性為僅針對 PD-1。多特異性 (例如，雙特異性) 免疫結合物或抗體亦可用於將細胞毒性劑 (例如，IL-2 多肽) 或細胞定位於表現 PD-1 之細胞。多特異性免疫結合物或抗體可製備成全長免疫結合物或抗體或抗體片段。
製備多特異性免疫結合物或抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現 (參見 Milstein 及 Cuello, Nature305: 537 (1983)) 及「杵及臼 (Knob-in-hole)」工程化 (參見 例如，美國專利號 5,731,168 及 Atwell 等人, J. Mol.Biol.270:26 (1997))。多特異性免疫結合物或抗體亦可藉由以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc 異型二聚體分子的工程化靜電轉向效應 (參見例如，WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如，美國專利號 4,676,980；及 Brennan 等人, Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參見 例如，Kostelny 等人 J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 及 WO 2011/034605)；使用常見輕鏈技術來規避輕鏈錯配問題 (參見 例如，WO 98/50431)；使用「雙抗體」技術來製備雙特異性抗體片段 (參見 例如，Hollinger 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參見 例如，Gruber 等人 , J. Immunol., 152:5368 (1994))；以及如 例如以下所述製備三特異性抗體：Tutt 等人 J. Immunol.147: 60 (1991)。 5.  免疫結合物及抗體變異體
在某些態樣中，考慮到本文所提供之免疫結合物、抗體或 IL-2 多肽之胺基酸序列變異體。例如，可能期望改變免疫結合物或抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適合的修飾引入編碼免疫結合物或抗體的核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括，例如，免疫結合物、抗體或 IL-2 多肽之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵， 例如抗原結合特徵。 a) 取代、插入及刪除變異體
在某些態樣中，提供具有一個或多個胺基酸取代的免疫結合物、抗體或 IL-2 多肽。取代誘變的目標位點包括 CDR 和 FR。
保守取代在 表 8中的「保守取代」標題下顯示。 表 8中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入所關注抗體中，並篩選具有所需活性之產物，例如，保留/改善的抗原結合、降低的免疫原性或改善的 ADCC 或 CDC。
表 8. 所考慮之胺基酸取代
原始 殘基 例示性 取代 保守 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型的取代變異體涉及取代親代抗體之一個或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親代抗體將在某些生物特性方面具有修飾 ( 例如改良) ( 例如親和力提高、免疫原性減少)，及/或將實質上保留親代抗體之某些生物特性。一種示例性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可 例如使用基於噬菌體顯示之親和力成熟技術 (諸如本文所述之技術) 便利地生成。簡言之，將一個或多個 CDR 殘基突變，並且將變異體抗體顯示在噬菌體上並篩選特定的生物學活性 ( 例如結合親和力)。
可以在 CDR 中進行修改 (例如，取代)，以改善抗體親和力。此種改變可以在 CDR「熱點」， 即由在體細胞成熟過程中經歷高頻突變的密碼子編碼之殘基，中進行 (參見 例如，Chowdhury, Methods Mol.Biol.207:179-196 (2008))，及/或接觸抗原之殘基，測試所產生之變異體 VH 或 VL 的結合親和力。藉由構建和從二級文庫中重選以實現親和力成熟，例如在 Hoogenboom 等人, Methods in Molecular Biology178:1-37 (O'Brien 等人編輯，Human Press, Totowa, NJ, (2001)) 中已有描述。在親和力成熟之一些態樣中，經由多種方法 ( 例如，易錯 PCR、鏈改組 (chain shuffling) 或寡核苷酸定向誘變) 將多樣性引入選擇用於成熟的變異基因中。然後創建第二文庫。然後篩選該文庫，以識別具有所需之親和性的任何抗體變異體。引入多樣性的另一種方法涉及 CDR 定向方法，其中若干 CDR 殘基 (例如，一次 4-6 個殘基) 是隨機的。可特異性地鑑定抗原結合所涉及之 CDR 殘基， 例如，使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來鑑定。特別地，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為靶點。
在某些態樣中，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中實施基本上不降低結合親和力的保守修改 (例如，本文所提供之保守取代)。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之某些 VH 和 VL 序列變異體中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham 和 Wells (1989) ( Science，244:1081-1085) 所述，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在此方法中，殘基或標靶殘基組 ( 例如，帶電殘基，諸如 Arg、Asp、His、Lys 及 Glu) 經鑑定且經中性或帶負電胺基酸 ( 例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 置換以確定抗體與抗原之交互作用是否受影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以判定它們是否含有所需之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 ( 例如，對於 ADEPT (針對抗體之酶前驅藥療法)) 或提高抗體血清半衰期之多肽。 b) 醣基化變異體
在某些態樣中，本文所提供之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 係經改變以增加或減少免疫結合物或抗體經醣基化之程度。PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體中添加或缺失醣基化位點可藉由改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當免疫結合物或抗體包含 Fc 區域時，可改變接附至其的寡醣。由哺乳動物細胞生產的天然免疫結合物或抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵結接附至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。參見 例如，Wright 等人 TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物， 例如，甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺 (GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，及接附至雙觸寡醣結構之「莖」中之 GlcNAc 的岩藻醣。在一些態樣中，可對如本文所述之抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個態樣中，提供具有非岩藻醣基化寡醣之抗體變異體，即缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區之岩藻醣的寡醣結構。此類非岩藻醣基化寡醣 (也稱為「去岩藻醣基化」寡醣) 特定而言在雙天線型寡醣結構之莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻醣殘基的 N-連接寡醣，且此類抗體在本文中進一步稱為「去岩藻醣基化抗體」。在一個態樣中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區域中具有增加比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡醣之比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻醣基化寡醣)。在某些實施例中，去岩藻醣基化之比例係在約 65% 至約 100% 之間、約 80% 至約 100% 之間或約 80% 至約 95% 之間。非岩藻醣基化寡糖之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡糖相對於連接至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡糖的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域中約位置 297 (Fc 區域殘基之 EU 編號) 處之天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體之輕微序列變化，Asn297 亦可位於位置 297 上游或下游約 ± 3 個胺基酸處，亦即，位置 294 與 300 之間，例如 Asn 299。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡糖的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應功能，特定而言改善的 ADCC 功能。參見 例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。
在一個態樣中，本揭露提供了具有增強的 FcγRIIIa 受體結合的去岩藻醣基化抗體變異體。在一個態樣中，本揭露提供了具有增強的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 的去岩藻醣基化抗體變異體。在一個態樣中，本揭露提供了具有抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 活性的去岩藻醣基化抗體變異體。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人 Arch.Biochem.Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；及敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻醣基轉移酶基因 FUT8的 CHO 細胞 (參見 例如，Yamane-Ohnuki 等人 Biotech.Bioeng.87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人 , Biotechnol.Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻醣合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (參見 例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。另參見 Pereira 等人 , MABS(2018) 693-711。
在再一態樣中，抗體變異體被提供有二等分之寡醣， 例如，其中連接至抗體之 Fc 區的雙天線型寡醣被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
亦提供了在寡醣上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於 例如WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。 c)  Fc 區域變異體
在某些態樣中，可將一個或多個胺基酸修飾引入本文所提供之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 的 Fc 區中，從而產生 Fc 區變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG 1、IgG 2、IgG 3或 IgG 4Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮一种具有一些但非全部效應功能的經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體變異體，使其成為以下應用中所需之候選者：其中抗體活體內半衰期很重要，但某些效應功能 (諸如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 及抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)) 是不必要或有害的。可實施 活體外及/或 活體內細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。舉例而言，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。介導 ADCC 的主要細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核細胞表現 FcγRI、FcγRII 及 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現概述於以下文獻第 464 頁之表 3 中：Ravetch 及 Kinet. Annu.Rev. Immunol.9:457-492 (1991)。評定所關注分子之 ADCC 活性的 活體外測定之非限制性實例描述於：美國專利號 5,500,362 (參見 例如，Hellstrom, I. 等人 Proc.Nat'l Acad.Sci.USA83:7059-7063 (1986)) 及 Hellstrom, I 等人, Proc.Nat'l Acad.Sci.USA82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人, J. Exp.Med.166:1351-1361 (1987))。替代性地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞分析技術之 Acti™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及 CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI)。用於此等測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。替代性地或另外地，可在活體內評定所關注分子的 ADCC 活性，例如在動物模型中，諸如揭露於 Clynes 等人 Proc.Nat'l Acad.Sci.USA95:652-656 (1998) 中所揭露。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見 例如WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中之 C1q 及 C3c 結合 ELISA。為評定補體活化，可進行 CDC 測定 (參見例如，Gazzano-Santoro 等人, J. Immunol.Methods202:163 (1996); Cragg, M.S. 等人, Blood101:1045-1052 (2003)；以及 Cragg, M.S. 及 M.J.Glennie, Blood103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合及 活體內清除率/半衰期測定也可使用本領域中已知的方法進行 (參見 例如, Petkova, S.B. 等人, Int'l.Immunol.18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929 Al)。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的免疫結合物或抗體變異體。(參見 例如，美國專利號 6,737,056；WO 2004/056312；及 Shields 等人 , J. Biol.Chem.9(2): 6591-6604 (2001).)
在某些態樣中，免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 或抗體變異體包含具有改善 ADCC 的一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，例如，在 Fc 區之位置 298、333 及/或 334 處的取代 (殘基的 EU 編號)。
在某些態樣中，免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分，以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 或抗體變異體包含具有減弱 FcγR 結合的一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，例如，在 Fc 區之位置 234 及 235 處的取代 (殘基的 EU 編號)。在一個態樣中，取代為 L234A 及 L235A (LALA)。在某些態樣中，免疫結合物或抗體變異體進一步包含 Fc 區中之 D265A 及/或 P329G (殘基的 EU 編號)，其來源於人 IgG 1Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 及 P329G (LALA-PG)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。(參見 例如WO 2012/130831)。在另一態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 及 D265A (LALA-DA)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。
在某些態樣中，Fc 區包含經組態用於促進第一 Fc 次單元與第二 Fc 次單元之締合的修飾。免疫結合物或抗體的「杵入臼」工程可用於產生含有杵的第一臂以及含有第一臂的杵可結合於其中的臼的第二臂。在一個實施例中，本發明之多特異性抗體的杵可包括 DBA 部分。替代性地，本發明之免疫結合物或抗體的杵可包括抗 PD-1 抗體部分。本發明之免疫結合物或抗體的臼可包括 DBA 部分。替代性地，本發明之免疫結合物或抗體的臼可包括抗 PD-1 抗體部分。免疫結合物及抗體亦可使用免疫球蛋白交叉 (immunoglobulin crossover) (亦稱為 Fab 域交換或 CrossMab 型式) 技術進行工程化 (參見例如，WO 2009/080253；Schaefer 等人 , Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 108:11187-11192 (2011))。免疫結合物或抗體亦可藉由以下製備：工程化靜電操縱效應來製備抗體 Fc 異二聚體分子 (WO 2009/089004A1)；交聯兩個或更多抗體或片段 (參見，例如，美國專利號 4,676,980 及 Brennan 等人 , Science, 229: 81 (1985))；或藉由使用白胺酸拉鏈來生產雙特異性抗體 (參見例如，Kostelny 等人, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))。
第二 Fc 次單元的 CH3 域中之胺基酸殘基可由具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替換，從而在該第二 Fc 次單元的 CH3 域內產生隆凸 (例如，杵)，該隆凸可定位於第一 Fc 次單元的 CH3 域內的腔窩 (例如，臼) 中，並且第一 Fc 次單元的 CH3 域中之胺基酸殘基可以被具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替換，從而在該第一 Fc 次單元的 CH3 域內產生腔窩 (例如，臼)，該腔窩可定位於第二 Fc 次單元的 CH3 域內的隆凸 (例如，杵) 內。在一些實施例中，第二 Fc 次單元的 CH3 域包含 T366 之胺基酸取代，並且第一 Fc 次單元的 CH3 域包含 T366、L368 及/或 Y407 中之一個、兩個或全部三個處之胺基酸取代。在一些實施例中，第二 Fc 次單元的 CH3 域包含 T366W 之胺基酸取代，並且第一 Fc 次單元的 CH3 域包含 T366S、L368A 及/或 Y407V 中之一個、兩個或全部三個處之胺基酸取代。
在某些態樣中，免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 包含具有改善 FcγR 結合 (並從而改善效應功能) 的一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，例如，在多個位置處的取代。在某些態樣中，抗體變異體包含具有 G236A、I332E、S298A、E333A、K334A、S239D、A330L、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、L235V、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E (殘基的 EU 編號) 之至少一個胺基酸取代之 Fc 區域 (參見例如，Liu 等人, Antibodies (Basel)(2020);9(4):64)。
在一些態樣中，改變在 Fc 區中進行，得到改變的 ( 即改善或減少的) C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)， 例如，如美國專利號 6,194,551、WO 99/51642 及 Idusogie 等人 J. Immunol.164: 4178-4184 (2000)。
具有增加之半衰期及改善之與新生兒 Fc 受體 (FcRn) 的結合的抗體，新生兒 Fc 受體負責將母體 IgG 轉移給胎兒 (Guyer 等人, J. Immunol.117:587 (1976) 及 Kim 等人, J. Immunol.24:249 (1994))，描述於 US2005/0014934 (Hinton 等人)。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434 (殘基的 EU 編號)，例如，Fc 區殘基 434 之取代 (參見例如，美國專利號 7,371,826；Dall'Acqua, W.F., 等人 J. Biol.Chem.281 (2006) 23514-23524)。
藉由定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 交互作用至關重要之 Fc 區殘基 (參見 例如，Dall’Acqua, W.F., 等人 J. Immunol169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 及 H435 (殘基的 EU 編號) 參與交互作用 (Medesan, C., 等人, Eur.J. Immunol.26 (1996) 2533；Firan, M., 等人, Int. Immunol.13 (2001) 993；Kim, J.K., 等人, Eur.J. Immunol.24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 及 H435 對於人類 Fc 與鼠 FcRn 之交互作用至關重要 (Kim, J.K., 等人, Eur.J. Immunol.29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究已表明，殘基 I253、S254、H435 及 Y436 對於交互作用至關重要 (Firan, M., 等人, Int. Immunol.13 (2001) 993; Shields, R.L., 等人, J. Biol.Chem.276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A., 等人( J. Immunol.182 (2009) 7667-7671) 中，已報告並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 (殘基的 EU 編號) 的各種突變型。
在某些態樣中，免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 包含具有降低 FcRn 結合的一個或多個胺基酸取代之 Fc 區，例如，在 Fc 區之位置 253 及/或 310 及/或 435 (殘基的 EU 編號) 處的取代。在某些態樣中，免疫結合物或抗體包含具有在位置 253、310 及 435 處的胺基酸取代的 Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 I253A、H310A 及 H435A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。參見 例如，Grevys, A., 等人, J. Immunol.194 (2015) 5497-5508。
在某些態樣中，免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 包含具有降低 FcRn 結合的一個或多個胺基酸取代之 Fc 區，例如，在 Fc 區的位置 310 及/或 433 及/或 436 (殘基的 EU 編號) 處的取代。在某些態樣中，免疫結合物或抗體包含具有在位置 310、433 及 436 處的胺基酸取代的 Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 H310A、H433A 及 Y436A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。(參見 例如WO 2014/177460 Al)。
在某些態樣中，免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 包含具有增加 FcRn 結合的一個或多個胺基酸取代之 Fc 區，例如，在 Fc 區之位置 252 及/或 254 及/或 256 (殘基的 EU 編號) 處的取代。在某些態樣中，免疫結合物或抗體包含具有在位置 252、254 及 256 處的胺基酸取代的 Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 M252Y、S254T 及 T256E，其來源於人 IgG 1Fc 區域。另參見 Duncan & Winter, Nature322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
如本文所報導之免疫結合物或抗體的重鏈的 C 端可為以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個態樣中，重鏈之 C 端為縮短的 C 端結尾 PG。在本文所報告的所有態樣中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 指數編號)。在本文所報導之全部態樣中之一個態樣中，如本文所指定，包含包括 C 端 CH3 域之重鏈之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置的 EU 索引編號)。在本文所報導的所有態樣中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端脯胺酸殘基 (P445，胺基酸位置的 EU 索引編號)。 d) 半胱胺酸工程化之免疫結合物及抗體變異體
在某些態樣中，可能期望創建半胱胺酸工程化免疫結合物或抗體，例如 THIOMAB TM抗體，其中免疫結合物或抗體之一個或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，經取代之殘基出現在免疫結合物或抗體的可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體的可及位點處，並可用於使抗體結合至其他部分 (諸如藥物部分或連接子-藥物部分)，以形成經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化之免疫結合物或抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所述之方法產生。 e) 免疫結合物及抗體衍生物
在某些態樣中，本文所提供之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 可經進一步修飾以含有本領域中已知且輕易可獲得之額外非蛋白性部分。適用於免疫結合物或抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或無規共聚物) 以及右旋糖酐或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可聚支鏈或無支鏈。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來判定，此等考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。 6.  促進異源性二聚化的 Fc 域修飾
本發明之免疫結合物及抗體可包含與 Fc 域的兩個次單元中之一者或另一者融合的一個或多個 DBA 部分及/或一個或多個抗 PD-1 抗體部分。因此，Fc 域的兩個次單元通常包含在兩條不相同的多肽鏈中。此等多肽的重組共表現及隨後的二聚化可導致該兩種多肽之若干可能的組合。為改善重組生產中免疫結合物及抗體之產率及純度，在一些實例中，向免疫結合物或抗體之 Fc 域中引入促進所期望之多肽締合之修飾為有利的。
據此，在特定實施例中，根據本發明之免疫結合物或抗體的 Fc 域可包含促進 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾。人 IgG Fc 域之兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用位點在 Fc 域之 CH3 域中。因此，在一個實施例中，該修飾係在 Fc 域的 CH3 域中。
存在若干對 Fc 域的 CH3 域進行修飾以便增強異源性二聚化之方法，該等方法描述於例如 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291 中。通常，在此類方法中，Fc 域之第一次單元的 CH3 域及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域皆以互補的方式進行工程化，以使每個 CH3 域 (或包含其之重鏈) 不再能夠與自身發生同源二聚化，而是被迫與經互補工程化之其他 CH3 域進行異源二聚化 (使得第一及第二 CH3 域異源二聚化，並且在兩個第一或兩個第二 CH3 域之間不形成同源二聚體)。此等用於改善重鏈異源二聚化之不同方法被視為與根據本發明之免疫結合物或抗體中重鏈-輕鏈修飾 (一個結合臂中之 VH 與 VL 交換/替換，以及在 CH1/CL 界面中引入帶有相反電荷的帶電胺基酸之取代) 組合的不同選擇，其降低輕鏈錯配及 Bence Jones 型副產物。
在一具體實施例中，促進 Fc 域的第一次單元與第二次單元之締合之修飾為所謂「杵入臼」修飾，其包含在 Fc 域的兩個次單元中之一者中的「杵」修飾及在 Fc 域的兩個次單元中之另一者中的「臼」修飾。
「杵入臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等, Prot Eng9, 617-621 (1996)；及 Carter, J Immunol Meth248, 7-15 (2001) 中。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可安置在空腔內，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。藉由用較大側鏈 (例如，酪胺酸或色胺酸) 替換來自第一多肽的界面上之較小胺基酸側鏈來構建隆凸。藉由將較大胺基酸側鏈替換為較小胺基酸側鏈 (例如，丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽的界面中形成與隆凸具有相同或相近大小的互補腔窩。
因此，在一特定實施例中，在免疫結合物或抗體之 Fc 域的第一次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基由具有較大側鏈體積的胺基酸殘基替換，從而在第一次單元的 CH3 域內產生隆凸，該隆凸可定位在第二次單元的 CH3 域內的腔窩中，並且在 Fc 域的第二次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基由具有較小側鏈體積的胺基酸殘基替換，從而在第二次單元的 CH3 域內產生腔窩，第一次單元之 CH3 域內的隆凸可定位在該腔窩內。
較佳地，具有較大側鏈體積的胺基酸殘基係選自由以下所組成之群組：精胺酸 (R)、苯丙胺酸 (F)、酪胺酸 (Y) 及色胺酸 (W)。
較佳地，具有較小側鏈體積的胺基酸殘基係選自由以下所組成之群組：丙胺酸 (A)、絲胺酸 (S)、蘇胺酸 (T) 及纈胺酸 (V)。
可藉由改變編碼多肽的核酸 (例如藉由針對特定位點之突變或藉由肽合成) 來製備隆凸及腔窩。
在一個具體實施例中，該 Fc 結構域之第一次單元的 CH3 結構域 (「杵」次單元) 中，在位置 366 位的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基 (T366W) 替換，並且在該 Fc 結構域之第二次單元的 CH3 結構域中 (「臼」次單元) 的在位置 407 位酪胺酸殘基被纈胺酸殘基 (Y407V) 取代。在一個實施例中，在 Fc 域之第二次單元中，位置 366 的穌胺酸殘基又被絲胺酸殘基取代 (T366S)，並且位置 368 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L368A) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一實施例中，在該 Fc 域之第一次單元中，另外地位置 354 處的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換 (S354C) 或位置 356 處的麩胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換 (E356C)，並且在該 Fc 域之第二次單元中，另外地位置 349 處的酪胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換 (Y349C) (根據 Kabat EU 索引編號)。引入此等兩個半胱胺酸殘基導致在 Fc 域的兩個次單元之間形成二硫鍵，從而進一步穩定二聚體 (Carter, J Immunol Methods248, 7-15 (2001))。
在一特定實施例中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W，並且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S、L368A 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
考慮將用於實施異源二聚化的 CH3 修飾之其他技術作為本發明之替代方案，並且該等技術闡述於例如 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291 中。
在一個實施例中，替代性地使用 EP 1870459 A1 中所述之異源二聚化方法。該方法基於在 Fc 域之兩個次單元之間的 CH3/CH3 域界面的特定胺基酸位置引入帶有相反電荷的胺基酸。本發明之免疫結合物或抗體的一個較佳實施例為 (Fc 域的) 兩個 CH3 域中之一者中的胺基酸突變 R409D 及 K370E；及 Fc 域的 CH3 域中之另一者中的胺基酸突變 D399K 及 E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一實施例中，本發明之免疫結合物或抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 T366W 及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 T366S、L368A、Y407V，以及 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 R409D、K370E 及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 D399K、E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一實施例中，本發明之免疫結合物或抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 S354C、T366W 及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者免疫結合物或抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 Y349C、T366W 及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 S354C、T366S、L368A、Y407V，以及 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 R409D、K370E 及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 D399K、E357K (全部根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個實施例中，替代性地使用 WO 2013/157953 中所揭示之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366K，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 L351D（根據 Kabat EU 索引編號）。在進一步之實施例中，第一 CH3 域進一步包含胺基酸突變 L351K。在進一步之實施例中，第二 CH3 域進一步包含選自 Y349E、Y349D 和 L368E（較佳係 L368E）（根據 Kabat EU 索引編號）的胺基酸突變。
在一個實施例中，替代性地使用 WO 2012/058768 中所揭示之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 L351Y、Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366A、K409F。在又一實施例中，第二 CH3 域進一步包含在位置 T411、D399、S400、F405、N390 或 K392 處的胺基酸突變，該等胺基酸突變例如選自：a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E 或 T411W；b) D399R、D399W、D399Y 或 D399K；c) S400E、S400D、S400R 或 S400K；d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V 或 F405W；e) N390R、N390K 或 N390D；f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F 或 K392E (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 L351Y、Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366V、K409F。在另一個實施例中，第一 CH3 結構域包含胺基酸突變 Y407A，並且第二 CH3 結構域包含胺基酸突變 T366A、K409F。在又一實施例中，第二 CH3 域進一步包含胺基酸突變 K392E、T411E、D399R 及 S400R (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個實施例中，替代性地使用 WO 2011/143545 中所述之異源二聚化方法，例如，在選自 368 及 409 (根據 Kabat EU 指數編號) 的位置處進行胺基酸修飾。
在一個實施例中，替代性地使用 WO 2011/090762 中所揭示之異源二聚化方法，該方法同樣使用上揭「杵臼」技術。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366W，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 Y407A。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366Y，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 Y407T (根據 Kabat EU 指數編號)。
在一個實施例中，免疫結合物或抗體或其 Fc 域屬於 IgG2 亞類，並且替代性地使用 WO 2010/129304 中所述之異源二聚化方法。
在一替代性實施例中，促進 Fc 域的第一次單元與第二次單元的締合之修飾包含媒介靜電轉向作用的修飾，例如 PCT 公開 WO 2009/089004 中所述。通常，此方法涉及用帶電荷的胺基酸殘基取代兩個 Fc 域次單元界面上的一個或多個胺基酸殘基，從而使同源二聚體形成在靜電上不利，但異源二聚化在靜電上有利。在一個此類實施例中，第一 CH3 域包含帶負電荷的胺基酸對 K392 及 N392 之胺基酸取代 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)，較佳係 K392D 或 N392D)，並且第二 CH3 域包含帶正電荷的胺基酸對 D399、E356、D356 或 E357 之胺基酸取代 (例如離胺酸 (K) 或精胺酸 (R)，較佳係 D399K、E356K、D356K 或 E357K 且更佳係 D399K 及 E356K)。在又一實施例中，第一 CH3 域進一步包含帶負電荷的胺基酸對 K409 或 R409 之胺基酸取代 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)，較佳係 K409D 或 R409D)。在又一實施例中，第一 CH3 域進一步或替代性地包含帶負電荷的胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)) 對 K439 及/或 K370 之胺基酸取代 (全部根據 Kabat EU 索引編號)。
在又一個實施例中，可替代地使用 WO 2007/147901 中所述之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 K253E、D282K 和 K322D，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 D239K、E240K 和 K292D（根據 Kabat EU 索引編號）。
在另一個實施例中，可替代地使用 WO 2007/110205 中所述之異源二聚化方法。
在一實施例中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 K392D 及 K409D，並且Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 D356K 及 D399K (根據 Kabat EU 索引編號)。 H. 重組方法及組成物
免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 可使用重組方法及組成物生產，例如，如 US 4,816,567 中及美國公開號 2013/0078249 中所述，其各以引用方式整體併入本文中。在一個實施例中，提供編碼本文所述之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體的經分離之核酸 (例如，多核苷酸) 或一組經分離之核酸。在一個實施例中，提供編碼本文所述之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體或其片段的經分離之核酸 (例如，多核苷酸) 或一組經分離之核酸。此核酸或此組核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含免疫結合物或抗體的 VH 之胺基酸序列 (例如，免疫結合物或抗體之任一臂的輕鏈及/或重鏈)。在又一實施例中，提供包含此核酸或此組核酸之一種或多種載體 (例如，表現載體)。
編碼本發明之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 的多核苷酸可作為單一多核苷酸分子或作為經共表現之多種 (例如，兩種或更多種) 多核苷酸來表現。經共表現之由多核苷酸編碼的多肽可透過例如二硫鍵或其他方式締合以形成功能性免疫結合物或抗體。例如，抗原結合部分的輕鏈部分 (例如，DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分) 可由與免疫結合物或抗體的包含該抗原結合部分的重鏈部分之部分、Fc 域次單元分離的多核苷酸進行編碼。當共同表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成抗原結合部分。在另一實例中，免疫結合物或抗體的包含兩個 Fc 域次單元中之一者之部分可由與免疫結合物或抗體的包含兩個 Fc 域次單元中之另一者之部分分離的多核苷酸進行編碼。當共表現時，Fc 域次單元將締合以形成 Fc 域。
在某些實施例中，本發明之經分離之多核苷酸編碼包含第一及第二抗原結合域以及由兩個次單元組成的 Fc 域之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體的片段。在一個實施例中，本發明之經分離之多核苷酸編碼第一抗原結合部分 (例如，DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分) 的重鏈及 Fc 域的次單元。在另一實施例中，本發明之經分離之多核苷酸編碼第二抗原結合部分的重鏈及 Fc 域的次單元。在一更具體實施例中，經分離之多核苷酸編碼多肽，其中 Fab 重鏈 (或 scFv) 與 Fc 域次單元共享 C 端肽鍵。在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分的輕鏈係經共表現並與重鏈區締合以形成 Fab 域。
在又一實施例中，提供包含此核酸或此組核酸之宿主細胞。在此等實施例中，宿主細胞包含 (例如，已轉化)：(1) 載體，該載體包含核酸，該核酸編碼包含免疫結合物或抗體的至少一個 VL 之胺基酸序列及包含免疫結合物或抗體的至少一個 VH 之胺基酸序列，或 (2) 第一載體，該第一載體包含編碼包含免疫結合物或抗體的 VL 之胺基酸序列的核酸，以及第二載體，該第二載體包含編碼包含免疫結合物或抗體的 VH 之胺基酸序列的核酸。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞。在一個實施例中，提供一種製備經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體之方法，其中該方法包含在適合於該免疫結合物或抗體表現的條件下培養包含如上所述之編碼免疫該結合物或抗體的核酸之宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收該免疫結合物或抗體。
對於經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或抗體之重組生產，將例如上所述之編碼免疫結合物或抗體的核酸分離並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可使用習知方法 (例如，藉由使用能夠與編碼免疫結合物或抗體的重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並定序，或藉由重組方法生產或藉由化學合成獲得。
適用於載體 (例如，表現載體) 之選殖或表現的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效應功能的情況下。有關抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另請參見 Charlton, K.A.，在： Methods in Molecular Biology, 第 248 卷, Lo, B.K.C.(編), Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第 245-254 頁，其描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，免疫結合物或抗體可自可溶性部分中的細菌細胞糊分離，並可經進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物 (諸如絲狀真菌或酵母菌) 亦為載體 (例如，表現載體) 之合適的選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑業經「人源化」的真菌及酵母菌株，從而導致具有部分或完全人醣基化模式之抗體之生產。參見 Gerngross, T.U., Nat. Biotech.22 (2004) 1409-1414；及 Li, H. 等人, Nat. Biotech.24 (2006) 210-215。
用於表現 (醣基化) 抗體的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多桿狀病毒毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾 ( Spodoptera frugiperda) 細胞。
植物細胞培養物亦可以用作宿主。參見例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978 及 US 6,417,429 (描述在基因轉殖植物中生產抗體的 Plantibodies™ 技術)。
脊椎動物細胞也可用為宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。有用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例係由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 株；人胚胎腎株 (如以下文獻中所述之 293 或 293T 細胞： 例如，Graham, F.L. 等人, J. Gen Virol.36 (1977) 59-74)；小倉鼠腎細胞 (BHK)；小鼠支持細胞 (如以下文獻中所述之 TM4 細胞： 例如，Mather, J.P., Biol.Reprod.23 (1980) 243-252)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人類子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK；水牛鼠肝細胞 (BRL 3A)；人類肺細胞 (W138)；人類肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如以下文獻中所述： 例如，Mather, J.P. 等人, Annals N.Y.Acad.Sci.383 (1982) 44-68)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR -CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，諸如 Y0、NS0 及 Sp2/0。關於某些適合於抗體生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見 例如，Yazaki, P. 及 Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 第 248 卷, Lo, B.K.C.(編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 第 255-268 頁。
在一個態樣中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。 I. 測定
在一些態樣中，本文所提供之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 可經針對其物理/化學特性及/或生物活性藉由本領域中已知或本文所揭示之各種測定進行鑑定、篩選或表徵。 1.  PD-L1/PD-1 阻斷報告基因測定
在一個態樣中，提供測定以判定免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 阻斷 PD-1 與其配體 PD-L1 之交互作用的能力。
在一些態樣中，針對阻斷 PD-1 與其配體 PD-L1 之交互作用，對用於產生本文所述之若干經 PD-1 調節之 IL-2v 免疫結合物之 PD-1 結合物 7G12 (亦即，AB003058) 進行評定，並在效力方面將其與 Roche 抗 PD-1 結合物進行比較。
使用來自 Promega (目錄號J1250、J1255) 之 PD-1/PD-L1 阻斷生物測定，該測定由基於細胞之生物發光測定組成，其可用於以及時的方式測量經設計為阻斷 PD-1/PD-L1 交互作用之抗體的效力。
該測定由兩種基因工程化細胞株組成： PD-1 效應細胞：表現人 PD-1 及由 NFAT 反應元件驅動之螢光素酶報告基因 (NFAT-RE) 的 Jurkat T 細胞；及 PD-L1 抗原呈現細胞 (APC)/CHO-K1 細胞：表現人 PD-L1 及經工程化之細胞表面蛋白的 CHO-K1 細胞，該經工程化之細胞表面蛋白經設計以不依賴抗原之方式活化同源 T 細胞受體 (TCR)。
當兩種細胞類型係經共培養時，PD-1/PD-L1 交互作用抑制 TCR 傳訊及經活化之 T 細胞核因子 (NFAT) 報告基因媒介的發光。添加阻斷 PD-1/PD-L1 交互作用的抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體釋放抑制訊號，並導致 TCR 活化及 NFAT 報告基因媒介的發光。
將 5 x 10 3個表現 PD-L1 的 CHO-K1 細胞接種在 96 孔板中越夜，同時將 5 x 10 4個表現 PD-1 的 Jurkat 細胞在實驗當天鋪板。在共培養兩種細胞株之前 30 分鐘，將親代抗 PD-1 阻斷抗體 (二價羅氏抗 PD-1 (0376))、同型對照或基於 7G12 之經 PD-1 調節之 IL-2v 構建體的八個 10 倍稀釋物 (100 µg/ml 至 10 pg/ ml) 添加至含有 Jurkat 報告細胞株之板中，以阻斷 PD-1/PD-L1 路徑。在 37℃ 孵育 6 小時後，添加受質 (Bio-Glo Reagent)，然後在光度計 (TECAN Infinite M1000 Pro) 上測量樣品。PD-1 傳訊之阻斷係藉由添加 Bio-Glo™ 螢光素酶檢測受質後的發光訊號來測量。 2.  結合分析
在一個態樣中，如本文所述之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 係例如藉由已知方法諸如 ELISA、西方墨點等針對其抗原結合活性進行測試。
在一些態樣中，用 25 µl 具有野生型 Fc 之抗 PGLALA huIgG1 (VH 及 VL 為鼠的，來自融合瘤，Roche 內部) 以 1 µg/ml 在包覆緩衝液中包覆透明 384 孔板 (Corning # 3700)，並在 4℃ 孵育越夜。在 EL406 Biotek® 洗滌機上用 90 µl/孔緩衝液將板洗滌 3 次後，將 90 µl 阻斷緩衝液添加至板中並在室溫孵育 1 小時。如上所述洗滌板後，將 25 µl 在 ELISA 稀釋液中之濃度為 6 nM 的樣品 (例如，含有免疫結合物) 添加至板中，然後在室溫再孵育 1 小時。在另一洗滌步驟後，將 25 µl 生物素化人 IL-2R β γ 異源二聚體、Fc、Avitag (Acro # ILG-H82F3) 連續稀釋物添加至該板中，該連續稀釋物從最高濃度 100 nM 開始、在 ELISA 稀釋液中按 1:3 連續稀釋 12 個點。在室溫孵育 1 小時後，在 EL406 Biotek® 洗滌機上用 90 µl/孔洗滌緩衝液洗滌3 次，並將 25 µl 在 ELISA 稀釋劑中經 1:5000 稀釋之鏈黴親和素-辣根過氧化物酶 (POD) (Roche # 11089153001) 添加至板的全部孔中，然後在室溫再孵育 1 小時，並如上所述進行另一洗滌步驟。添加 25 µl 1-Step Ultra TMB 受質溶液 (Thermo Fisher # 34029)，然後在室溫孵育 5 分鐘，並使用 Tecan Safire 2 多模式讀取器在 370/492 nm 處測量光密度 (OD)。
DPBS pH 7.4 (PAN BIOTECH # P04-36500) 係用為包覆緩衝液。Superblock pH 7,4 (Thermo Fisher # 37515) 係用為阻斷緩衝液。含有 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 及 0.05% Tween® 20 之 1x PBS pH 7.4 (Roche # 11666789001) 係用為 ELISA 的稀釋劑。含有 0.05% Tween® 20 之 1x PBS pH 7.4 (Roche #11666789001) 係用為洗滌緩衝液。 3.  IL-2R 訊號傳導測定
在一個態樣中，提供測定以判定免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 的效力及順式/反式傳訊。
為此目的，用 CD4 珠 (130-045-101，Miltenyi) 從健康供體 PBMC 中分選 CD4 T 細胞，並在存在 1 μg/ml 板結合的抗 CD3 的情況下活化 3 天 (越夜預包覆，殖株 OKT3，#317315，BioLegend) 及 1 μg/ml 可溶性抗 CD28 (殖株 CD28.2，#302923，BioLegend) 抗體誘導 PD-1 表現。三天後，收集細胞並洗滌幾次以去除內源性細胞激素，一半的細胞用細胞微量紫 (CTV) 標記 (5 µM、在室溫 (RT) 5 分鐘；C34557，Thermo Scientific)，且另一半未標記。
然後，將未經標記之細胞與飽和濃度的競爭性抗 PD-1 抗體 (內部分子，10 µg / ml) 在 RT 孵育 30 分鐘，然後進行若干洗滌步驟以去除過量的未結合之抗 PD-1 抗體。隨後，將經 PD-1 預阻斷之細胞 (25 μl，6x10 6個細胞/ml) 與 PD-1 +經 CTV 標記之細胞 (25 μl，6x10 6個細胞/ml) 在 V-型底板中 1:1 共培養，然後在 37℃ 用濃度遞增的處理免疫結合物 (50 µl，1:10 稀釋步驟) 處理 60 分鐘。為了保持磷酸化狀態，在與各種構建體培養 60 分鐘後，立即添加等量的 Phosphoflow Fix Buffer I (100 µl，557870，BD Bioscience)，以允許經 PD-1 調節之 IL-2v 在與 PD-1 結合後解折疊。然後將細胞在 37℃ 培養 30 分鐘，然後用 Phosphoflow PermBuffer III (558050，BD Bioscience) 在 -80℃ 滲透過夜。第二天，透過使用抗 STAT-5P 抗體 (47/Stat5(pY694) 殖株，562076，BD Bioscience) 在 4℃ 將磷酸化的 STAT-5 染色 30 分鐘。
細胞係在螢光活化細胞分選 (FACS) BD-Symphony A5 (BD Bioscience) 儀器上獲取。STAT-5P 的頻率係使用 FlowJo™ (V10) 判定，並使用 GraphPad Prism 繪製。
PD-1 +T 細胞上的劑量反應曲線提供有關评估分子透過 IL-2R 進行訊號傳導的效價資訊。此外，用競爭性抗 PD-1 抗體預處理 (以防止 PD-1 媒介的遞送) 之 T 細胞的劑量反應曲線顯示分子在獨立於 PD-1 表現來提供 IL-2R 傳訊中的效力，以及在經 PD-1 調節之 IL-2v 的情況下的雙重結合抗體 (DBA) 的洩漏程度。 4.  抑制測定
在一個樣態中，提供一種測定來評定免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物) 是否可逆轉調節性 T 細胞 (T reg) 對習知 T 細胞 (T conv) 效應功能之抑制。在某些情況下，T conv及 T reg被分離並標記。
在某些樣態中，用兩步法調節性 T 細胞分離試劑盒 (Miltenyi，＃130-094-775) 分離 CD4 +CD25 +CD127 dimT reg。同時，透過收集 CD25 陽性選擇的陰性部分 (Miltenyi，＃130-092-983)，接著進行 CD4 +富集 (Miltenyi，＃130-045-101)，分離出 CD4 +CD25 -T conv。T conv以羧基螢光素琥珀醯亞胺酯 (CFSE；eBioscience, #65-0850-84) 標記，且 T reg以細胞微量紫 (CTV，ThermoFisher Scientific，C34557) 標記，以追蹤兩個群體之增殖。隨後，將 T conv及 T reg一起培養 5 天，在有或沒有治療的情況下，在非親屬供體的 CD4 -CD25 -PBMC 的存在下，以提供同種異體刺激。
在某些樣態中，在第 5 天，在 FACS 染色前 5 小時投予蛋白質轉運抑制劑 (GolgiPlug™ #555029，BD Bioscience；及 GolgiStop™ #554724，BD Bioscience) 來增強高基氏體中細胞激素的積累。在存在及缺乏 T reg的情況下，測量增生的 T conv分泌粒酶 B (GrzB) 的能力。使用以下公式計算 T reg抑制： 其中 % 細胞激素 ( Tconv+Treg± 免疫結合物) 係在存在 T reg± 處理免疫結合物的情況下由 T conv分泌的細胞激素的含量，% 細胞激素 (Tconv)係在缺乏 T reg的情況下由 T conv分泌的細胞激素的含量。使用單向 ANOVA 計算 P (*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001)。 5.  對於經活化之 T 細胞的結合競爭測定
在一個態樣中，本發明提供一種測定來評定免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物) 的阻斷及非阻斷 DBA 是否與阻斷及非阻斷抗 PD-1 靶向臂競爭，結合競爭係針對表現 PD-1 的 (PD-1 +) 經活化之 CD4 T 細胞。
為此目的，用 CD4 珠 (130-045-101，Miltenyi) 從健康供體 PBMC 中分選 CD4 T 細胞，並在存在 1 μg/ml 板結合的抗 CD3 的情況下活化 3 天 (越夜預包覆，殖株 OKT3，#317315，BioLegend) 及 1 μg/ml 可溶性抗 CD28 (殖株 CD28.2，#302923，BioLegend) 抗體誘導 PD-1 表現。三天後，收穫並洗滌細胞，然後將其在 4℃ 曝露於遞增濃度的處理抗體 (50 µl，1:10 稀釋步驟) 中達 30 分鐘。在兩個洗滌步驟後，經處理之細胞係在固定前用飽和濃度的直接以 Alexa Fluor®-647 及活/死可固定活力染料 eFluor 780 標記之阻斷及非阻斷雙重抗體 (亦即，DBA 部分) 在 4℃ 再染色 30 分鐘。然後在 FACS BD-Symphony A5 (BD Bioscience) 儀器上獲取細胞，使用 FlowJo (V10) 進行 FACS 分析，且資料係使用 GraphPad Prism 繪製。 6.  競爭性結合測定
在一個態樣中，本發明提供一種測定來評定 DBA 部分及/或抗 PD-1 抗體部分是否在 PD-1 表面上具有不同抗原決定基或它們是否競爭相同或重疊結合抗原決定基。
表面電漿子共振 (SPR) 實驗係在 Biacore® T200 上在 25℃ 進行，使用 PBS-P+ 作為運行及樣品稀釋緩衝液 (0.2 M 磷酸鹽緩衝液，含有 27 mM KCl、1.37 M NaCl 及 0.5% 界面活性劑 P20 (Tween® 20)，Cytiva, Freiburg, Germany)。
本實驗中使用預先包覆有 ssDNA 寡核苷酸序列之 CAP 晶片 (提供於生物素 CAPture 套組，S 系列，Cytiva，28920234 中)，根據製造商的說明進行標準化及流體動力學處理。
最初，將含有固定有鏈黴親和素之互補寡核苷酸序列之生物素 CAPture 試劑送到溢出池 1 及 2。互補 ssDNA-SA 與 CAP 晶片上預固定的 ssDNA 寡核苷酸之雜交係以 2 µL/min 之流速進行 300 秒。然後將經生物素化之的人 PD-1 (內部 ID P1AF8774) 以 25 nM 的濃度以 10 µL/min 之流速注入 60 秒。
為了測量與 PD-1 的競爭性結合，首先將 PD-1 結合分子 (例如，含有 DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分) 以 10 µg/mL 之濃度以 10 µL/min 至流速注入 180 秒。其次，在第一次注入後，立即將 10 mg/ml 的不同 PD-1 結合分子 (例如，含有 DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分) 以 10 µL/min 之流速注入到兩個流動池上達 180 秒。解離時間設定為 120 秒，然後為 60 秒的穩定時間段。
第二注入階段期間的訊號增加指示與第二 PD-1 結合分子相比，結合在 PD-1 上之第一 PD-1 結合分子的抗原決定基區不同，因為該構建體不阻斷第二種經注入之 PD-1 結合分子與 PD-1 的結合抗原決定基。沒有額外結合訊號，指示第二 PD-1 結合分子對 PD-1 之阻斷，因為抗原決定基區由第一 PD-1 結合分子結合。阻斷指示兩個 PD-1 結合分子與同一抗原決定基競爭性地結合。
然後，在每個分析週期後，使用提供於生物素 CAPture 套組中之三份再生儲備液 1 (8 M 鹽酸胍) 及 1 份再生儲備液 2 (1 M NaOH) 之混合物，從表面去除生物素 CAPture 試劑以及經結合之分析物。在 90 秒的穩定時間段後，以 5 µL/min 之流速注入再生溶液混合物達 120 秒。 7.  競爭性結合測定
在一個態樣中，本發明提供一種測定來檢測經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物中的 IL-2 部分所觸發之 IL-2 傳訊。
材料
細胞殖株：使用來自 InvivoGen 之 HEK-Blue IL-2 報告細胞株在內部產生表現 PD-1 的細胞殖株。產生了三種表現高 (殖株 42)、中 (殖株 26) 及低 (殖株 4) PD-1 量的殖株。測定介質及試劑：DMEM 4.5 g/L、10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、胰蛋白酶 (Pan Biotech P10-023100)、QUANTI-Blue™ 溶液 (InvivoGen Cat#rep-qbs2)。
步驟準則
當測試 HEK-Blue IL-2 WT 報告細胞 (不表現 PD-1) 時，在細胞培養基中稀釋分子以達到 20 nM 之最大測定濃度，且在測試 HEK-Blue IL-2 報告 PD-1 殖株時達到 2 nM 之最大測定濃度。製備 8 個 1:8 稀釋度的連續稀釋液，並將 25 µl/孔移液至 384 孔平底透明板中。然後，將四種細胞株 (HEK-Blue IL-2 WT、HEK-Blue IL-2 PD-1 殖株 42、26 及 4) 在 37℃ 經胰蛋白酶消化 3 分鐘，並以4x10 5個細胞/mL 的濃度重懸於測定培養基中。接下來，將 25 µl/孔的細胞懸浮液添加至先前製備之含有分子之板中，達到 1x10 4個細胞/孔的細胞密度。將板置於培養箱中達 24 小時。QUANTI-Blue™ 試劑係遵循製造商的說明進行製備。簡而言之，將 QUANTI-Blue™ 試劑在室溫解凍，在 37℃ 水浴中孵育 2 分鐘以溶解可能的晶體，並重懸於 98 mL 無菌水加 1mL QUANTI-Blue™ 緩衝液中。經稀釋之 QUANTI-Blue™ 溶液立即使用或儲存於 -20℃。將 45 µl/孔的 QUANTI-Blue™ 溶液移液至 384 白色透明平底板中。將含有細胞處理物之板從培養箱中取出並在室溫放置 10 分鐘。然後，小心地獲取 5 µl 細胞上清液，並使用 Viaflow Assist Plus (Integra) 移液至含有 QUANTI-Blue™ 試劑之板上。將板在軌道搖床 (在 RT，300 rpm) 中孵育 20 至 30 分鐘，並使用以下設定在吸光度讀取器 (Tecan) 上測量吸光度：讀數類型：終點，波長：620 nm。 8.  比色測定
HEK-Blue™ IL-2 報告細胞係經專門設計以藉由用人 CD25 (IL-2Rα)、CD122 (IL-2Rβ) 及 CD132 (IL-2Rγ) 基因連同人 JAK3 及 STAT5 基因對 HEK293 細胞進行穩定轉染來活化 JAK-STAT 路徑以獲得完全活躍的 IL-2 傳訊路徑，從而檢測人 IL-2/IL-15。此外，亦將 STAT5 誘導型經分泌之胚胎鹼性磷酸酶 (SEAP) 報告基因引入報告細胞中。在 IL-2 刺激後，HEK-Blue™ IL-2 細胞觸發 JAK/STAT5 活化及隨後的 SEAP 之分泌，然後可以使用 QUANTI-Blue™ 溶液輕易地對其進行監測。
依照製造商的說明來培養及製備細胞，並在 37℃ 曝露於劑量增加濃度的 IL-2 免疫結合物中達 24 小時。然後收穫經培養之細胞的上清液，並將其與 QUANTI-Blue 溶液一起置於平底板中達 6 小時，然後使用分光光度計在 620-655 nm 處測量 SEAP 含量。
描繪分光光度計所測量之吸光度之劑量反應曲線指示，由於每個單一細胞之 IL‑2v 與高密度 IL-2R 的高親合力結合，在不存在 PD-1 表現的情況下之免疫結合物的活性。 J. 用於診斷和檢測之方法及組成物
在某些態樣中，本文所提供之抗 PD-1 抗體可用於檢測生物樣品中 PD-1 的存在。如本文所用的術語「檢測」，涵蓋定量或定性檢測。在某些態樣中，生物樣品包含細胞或組織，諸如腫瘤。
在一個態樣中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的抗 PD-1 抗體。在又一態樣中，提供了一種檢測生物樣品中是否存在 PD-1 的方法。在某些態樣中，該方法包含在允許抗 PD-1 抗體與 PD-1 結合的條件下使生物樣品與如本文所述之抗 PD-1 抗體接觸，並檢測抗 PD-1 抗體與 PD-1 之間是否形成複合物。此等方法可為 活體外或 活體內方法。
在某些態樣中，提供一種經標記之抗 PD-1 抗體。標記包括但不限於直接偵測的標記或部分 (諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接偵測 (例如，透過酶促反應或分子相互作用) 的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素 32、P 14C、 125I、 3H 及 131I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利號 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基，諸如此類。 K. 醫藥組成物
在又一態樣中，提供醫藥組成物，其包含本文所提供之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分)，例如，該等組成物使用於以下治療方法中。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 及醫藥上可接受之鹽。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之免疫結合物或抗體中之任一者及至少一種額外治療劑，例如，如下所述。
如本文所述之抗體或經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的醫藥組成物 (調配物) 可藉由將該免疫結合物或抗體與熟習此項技術者已知的醫藥上可接受之載劑或賦形劑組合來製備。參見例如， Remington's Pharmaceutical Sciences第 16 版，Osol, A. 編輯(1980), Shire S., Monoclonal Antibodies: Meeting the Challenges in Manufacturing, Formulation, Delivery and Stability of Final Drug Product, 第 1 版，Woodhead Publishing (2015), §4 及 Falconer R.J., Biotechnology Advances (2019), 37, 107412。如本文所述之抗體或經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的例示性醫藥組成物係凍乾的、水性的、冷凍的等。
醫藥上可接受之載劑在採用的劑量及濃度下通常對接受者無毒，其包括但不限於：緩衝劑，諸如組胺酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑 (諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苄烷銨；氯化苯索寧；苯酚、丁醇或苄醇；對羥苯甲酸烷基酯，如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (諸如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬複合物 ( 例如， 鋅蛋白複合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇 (PEG)。
本文所述之醫藥組成物還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。例如，可能希望進一步提供可用於治療相同疾病之另外的治療劑。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
用於 活體內投予之醫藥組成物通常為無菌的。無菌性可易於 例如藉由無菌濾膜過濾來實現。 L. 治療方法及投予途徑
在一些態樣中，本文所提供之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供一種經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分)，其用為藥物。在又一態樣中，提供一種免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分)，其使用於治療癌症。在某些態樣中，提供一種免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分)，其使用於治療方法中。在某些態樣中，本揭露提供一種經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分)，其使用於治療有需要的個體 (例如，人個體) 之方法中，該方法包含向該個體投予有效量之免疫結合物或抗體。
在又一態樣中，本揭露提供一種經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 在製造或製備藥物中之用途。在一個態樣中，該藥物用於治療癌症。在再一態樣中，該藥物用於治療癌症之方法中，該方法包含向有此需要之個體 (例如，人類個體) 投予有效量之藥物。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外的治療劑 (例如，如下文所述) 投予該個體。
在再一態樣中，本揭露提供一種用於治療癌症的方法。在一個態樣中，該方法包含向有需要之個體 (例如，人個體) 投予有效量之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分)，以便治療癌症。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外的治療劑 (如下文所述) 投予該個體。
例示性癌症包括但不限於癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更特定實例包括但不限於膀胱癌 (例如，尿路上皮癌 (UC)，包括轉移性 UC (mUC)；肌肉層浸潤性膀胱癌 (MIBC) 及非肌肉層浸潤性膀胱癌 (NMIBC))；腎臟或腎癌 (例如，腎細胞癌 (RCC))；肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌；泌尿道癌症；乳癌 (例如，HER2+ 乳癌及的三陰性乳癌 (TNBC)，其等呈雌激素受體 (ER-)、黃體素受體 (PR-) 及 HER2 (HER2-) 陰性)；前列腺癌，諸如去勢抵抗性前列腺癌 (CRPC)；腹膜癌；肝細胞癌；胃癌或胃部癌，包括胃腸道癌及胃腸道間質癌；胰臟癌 (例如，胰臟導管腺癌 (PDAC))；膠質母細胞瘤；子宮頸癌；卵巢癌；肝臟癌 (例如，肝細胞癌 (HCC))；肝癌；結腸癌；直腸癌；結腸直腸癌；子宮內膜癌或子宮癌；唾液腺癌；前列腺癌；外陰癌；甲狀腺癌；肝癌；肛門癌；陰莖癌；黑色素瘤，包括表淺擴散性黑色素瘤、雀斑樣惡性黑色素瘤、肢端雀斑樣黑色素瘤及結節性黑色素瘤；多發性骨髓瘤及 B 細胞淋巴瘤 (包括低惡性度/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)；小淋巴球性 (SL) NHL；中惡性度/濾泡性 NHL；中惡心度瀰漫性 NHL；高惡性度免疫母細胞性 NHL；高惡性度淋巴球性 NHL；高惡性度小非裂解細胞 NHL；巨大腫塊 NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS 相關淋巴瘤；及華氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴球性白血病 (CLL)；急性淋巴性白血病 (ALL)；急性骨髓性白血病 (AML)；毛細胞白血病；慢性骨髓性白血病 (CML)；移植後淋巴增生性失調 (PTLD)；及骨髓增生異常症候群 (MDS)，以及與斑狀細胞瘤、水腫 (諸如與腦腫瘤相關聯)、Meigs 氏症候群、腦癌、頭頸癌及相關轉移相關聯之異常血管增生。
在某些態樣中，癌症為膀胱癌、血癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌及皮膚癌。
在某些態樣中，癌症為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸癌、肝癌、肺癌或皮膚癌。
在某些態樣中，癌症為實性瘤癌症。
在某些態樣中，癌症為 PD-1 陽性癌症。
在又一態樣中，本揭露提供一種醫藥組成物，其包含本文所述之免疫結合物或抗體之任一者，例如，該醫藥組成物使用於上述治療方法中之任一者中。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之免疫結合物或抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之免疫結合物或抗體中之任一者及至少一種額外治療劑，例如，如下所述。
在一些態樣中，如本文所述之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 可經單獨投予或用於組合療法中，例如，有用於治療癌症。例如，組合療法包括投予如本文所述之免疫結合物或抗體並投予至少一種額外治療劑 (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種額外治療劑)。
至少一種另外的治療劑涵蓋可以被投予用於治療的任何藥劑。在某些態樣中，另外的治療劑為另外的抗癌劑。例示性抗癌劑包括但不限於微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡誘導劑、抗血管生成劑、免疫調節劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑或細胞生長抑制劑、細胞凋亡誘導劑、增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑、細胞激素、抗癌疫苗或溶瘤病毒、類鐸受體 (TLR) 劑、雙特異性抗體、細胞療法及免疫細胞接合物。在某些態樣中，額外治療劑為免疫調節抗癌劑， 例如查核點抑制劑 (CPI)，諸如抗 CTLA4 抗體 ( 例如伊匹木單抗)、PD-L1 結合拮抗劑或 PD-1 結合拮抗劑。
如本文所述之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA)部分及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) (及任何額外治療劑) 可藉由任何適當的方式投予，包括經腸胃外、經靜脈內、經皮內、經動脈內、經腹膜內、經病灶內、經顱內、經關節內、經前列腺內、經脾內、經腎內、經胸膜內、經氣管內、經鼻內、經玻璃體內、經陰道內、經直腸內、經腫瘤內、經肌肉內、經腹膜內、經皮下、經結膜下、經膀胱內、經黏膜、經心包膜內、經臍內、經眼內、經口服、經外用、經局部、藉由吸入 (例如氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續輸注、直接定位灌注濯洗標靶細胞、經由導管、經由灌洗、在乳霜中、在脂質組成物 (例如脂質體) 中、或藉由其他方法或前述方法的任意組合，如具有本領域一般知識者已知者 (參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第 18 版Mack Printing Company, 1990，該文獻以引用方式併入本文中。該投予可為全身性或局部性。可透過任何適當途徑給藥， 例如，透過注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫投予還是長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予及脈衝輸注。
在一些態樣中，如本文所述之免疫結合物 (例如，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分)) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 可以與良好醫療實踐一致之方式調配、給藥及投予。在此情況下，考慮的因素包括待治療的具體疾病、待治療的個體物種、個體的臨床狀態、疾病的原因、遞送藥劑的部位、投予方法、投予時程及醫療從業者已知的其他因素。該免疫結合物或該抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於治療所討論的病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑的有效量取決於醫藥組成物中存在之免疫結合物或抗體的量、疾病或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些藥物通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量及藉由任意途徑使用。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。
在一些實例中，經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分) 可一次性或歷經一系列治療而合適地向個體投予。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。然而，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術及測定很容易監測此治療的進展。 M. 製成品
在另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。製成品可包括本文所揭示之經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物 (例如，包括至少一個與結合至 IL-2 多肽之 PD-1 結合的結合域；例如，包括與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合的雙重結合抗體 (DBA) 部分、以及與 PD-1 結合的抗 PD-1 抗體部分) 及/或抗體 (例如，包括兩個 DBA 部分或包括兩個抗 PD-1 抗體部分)。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。適當的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。容器可由各種材料諸如玻璃或塑料形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防及/或診斷症狀的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為如本文所揭示之免疫結合物或抗體。標籤或包裝說明書指示該組成物用於治療所選擇的疾病。此外，該製品可包含：(a) 其中含有組成物之第一容器，其中該組成物包含如本文所揭示之抗體；及 (b) 其中含有組成物之第二容器，其中該組成物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。如本文所述之此態樣中的製品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。 實例
以下為本發明之方法及組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。 實例 1. 經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物之產生 1.1. 免疫結合物的表現質體之構建
對於如本文所報告之免疫結合物之表現，使用包含下列功能元件之轉錄單元： •    來自包括內含子 A 的人類巨細胞病毒 (P-CMV) 的直接早期增強子和啟動子， •    人重鏈免疫球蛋白 5'-非轉譯區 (5'UTR)， •    鼠免疫球蛋白重鏈訊號序列， •    編碼相應的融合多肽的核酸，及 •    牛生長激素多腺苷酸化序列 (BGH pA)。
除了包括所期望的基因之表現單元/匣之外，基礎/標準哺乳動物表現質體亦含有： •    來自載體 pUC18 之複製起點，其允許該質體於大腸桿菌中複製，和 •    β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予安比西林 (ampicillin) 抗性。 1.2. 免疫結合物之表現
使用 ExpiFectamine™ 293 轉染套組 (ExpiFectamine™ 293 試劑，ExpiFectamine™ 293 轉染增強劑 1 及 2) 在經懸浮適應之 Expi293 (Expi293F™ 細胞；Thermofisher Scientific) 中進行免疫結合物之瞬時表現。
在 125 ml 震盪瓶中解凍後，細胞藉由稀釋繼代至少四次 (體積 30 ml) (在 37℃、7% CO 2、85% 濕度、135 rpm 下孵育/搖動)。在 250 ml 體積中將細胞擴增至 3x10 5個細胞/ml。三天後，將細胞分樣並以 1.5x10 6至 7x10 5個細胞/ml 的密度重新接種在 1 升震盪瓶中的 250 毫升體積中。在 24 小時後以大約 1.4 至 3.0x10 6個細胞/ml 的細胞密度進行轉染。
在轉染前，以預熱 (水浴；37℃) Opti-MEM (Gibco) 將 250 µg 質體-DNA 稀釋至 12.5 ml 的最終體積。將溶液輕輕混合並在室溫孵育最多 5 分鐘。對於用 ExpiFectamine™ 轉染，將 675 µl 的 ExpiFectamine™ 293 試劑添加至 12.5 ml OptiMEM 溶液中，並在單獨的試管中孵育 5 分鐘。接下來，將兩個溶液合併，輕輕混合，並在室溫孵育 15 至 20 分鐘，並將完整的混合物添加至裝有 250 ml Expi293 細胞培養物的 1 L 搖瓶中。
在 37℃、7% CO 2、85% 濕度、135 rpm 下搖晃燒瓶 6 至 7 天來進行孵育。
藉由透過矽藻土 Sartoclear Dynamics Lab Filter Aid 10g (產品編號 SDLKG-10.0-----2 (Sartorius Stedim Biotech)) 過濾來收穫上清液，隨後透過 0.22 µm 瓶頂過濾器過濾並儲存在冰箱中 (-20℃)。 1.3. 免疫結合物之純化
藉由兩個層析步驟過濾並純化含有免疫結合物之培養物上清液。使用以 PBS (1 mM KH 2PO 4、10 mM Na 2HPO 4、137 mM NaCl、2.7 mM KCl)，pH 7.4 平衡的 HiTrap® MabSelect™ SuRe™ 親和抗體管柱 (GE Healthcare)，藉由親和層析來捕獲免疫結合物。藉由以平衡緩衝液洗滌去除未結合之蛋白質，並以 100 mM 乙酸鹽緩衝液 (pH 2.8) 回收免疫結合物，並在洗脫後立即以 1 M Tris 鹼 (pH 9.0) 中和至 pH 6.0。隨後，在 Superdex 200™ 管柱 (GE Healthcare) 上的粒經篩析層析係用為精製步驟。在 20 mM 組胺酸緩衝液、0.14 M NaCl、pH 6.0 中進行粒徑篩析層析。最後，含有免疫結合物之溶液以配備 Biomax-SK 膜 (Millipore，Billerica，MA) 的 Ultrafree-CL 離心過濾裝置濃縮，並儲存在 -80℃。 1.4. 免疫結合物之質譜分析
PNGase F 係獲自 Roche Diagnostics GmbH (14.3 U/µl；在磷酸鈉、EDTA 及甘油中之溶液)。
用 PNGase F 進行酶促去醣基化
將 100 µg 免疫結合物用 100 mM 磷酸鈉緩衝液 (pH 7.1) 稀釋至 0.5 mg/ml 的終濃度，並用 1 µl PNGase F 在 37℃ 去醣基化 16 小時。
ESI-QTOF 質譜分析
然後藉由 LC-MS 分析經消化之樣品。液相層析係在 Waters Acquity 超高效液相層析 (UPLC) (Waters) 上用逆相 C18 管柱 (Agilent PLRP-S 管柱，2.1 x 150 mm，8 µm，1000Å (Agilent，目錄編號：PL1912-3802)) 進行。水性流動相 (流動相 A) 含有在 HPLC 級水中之 0.1% (v/v) 甲酸 (FA)。有機流動相 (流動相 B) 含有在乙腈中之 0.1% FA。本實驗中所使用之梯度係繪製於下 表 9中：
表 9. 用於純化免疫結合物之 HPLC 程式。
步驟 (n) 時間 (min) % A1 (FA/ 水 ) % B1 (FA/ 乙腈 )
1 0 90 10
2 1 75 25
3 16 55 45
4 17 5 95
5 19 5 95
6 19.5 90 10
7 21 90 10
進一步的層析設定： 流速：0.6 mL/min 管柱箱溫度：75℃ 注入體積： 8 µl
UPLC 係與電噴霧電離四極桿飛行時間 (ESI-QTOF) 質譜 (MS) 儀器 (maXis II UHR-QTOF MS 系統 (Bruker Daltonik)) 耦合。用碘化鈉進行校準。對於經消化之免疫結合物，資料獲取係在 800 至 4000 m/z (isCID：85 eV) 進行。評估原始質譜圖並將其轉化為個別的相對莫耳質量。為了使結果可視化，使用專有軟體來產生解卷積質譜圖。結果係顯示於下 表 10中。
表 10. 經瞬時表現之免疫結合物的純化產量。
結合物 / 格式 批次 % 單體 ( 分析物 SEC) 最終產量 (mg/L)
P1AI7473 AB002345/AB003058crossed -004 95.8 47.8
P1AI7474 AB003637/0376dicrossed -009 98 54.7
P1AI7476 AB002345/0367dicrossed -003 97.4 66
P1AJ2535 AB003637di2/0376dicrossed -004 99 40.8
P1AI7438 AB003637crossed/0376di -003 98.4 132
P1AI7440 AB002345crossed/0367di -004 99.3 61.9
P1AI7441 AB002345crossed/1040opt -003 89.2 32.9
P1AI7443 AB002345crossed/AB003058 -005 99.3 37.2
P1AJ1837 AB002345crossed/0367di -005 98 44.4
P1AJ1838 AB002345crossed/1040opt -047 93 43.9
P1AI7462 BO-AB003637/0376di -005 76.3 45.2
P1AI7464 BO-AB002345/0367di -004 85.6 25.1
P1AI7465 BO-AB002345/1040opt -003 95.5 115.4
P1AI7467 BO-AB002345/AB003058 -004 95.8 62.4
opt：親和力成熟的；di：去免疫化的；crossed：交叉修飾；dicrossed = 去免疫化的及交叉修飾；BO：開瓶器
與 P1AI7440 相比，P1AJ1837 在 DBA 輕鏈的 C 端處具有 Asp，這對結合特性沒有影響。因此，此等分子在活性方面可以被認為是等效的。這同樣適用於 P1AJ1838 及 P1AI7441。 實例 2.7G12 抗 PD-1 抗體 ( 亦即 AB003058) 在 PD-1 Jurkat 報告基因測定中阻斷 PD-1-PD-L1 路徑，且其效力比二價抗 PD-1 阻斷抗體 ( 亦即 0376) 低 10 倍
針對阻斷 PD-1 與其配體 PD-L1 之交互作用，對用於產生本文所述之若干經 PD-1 調節之 IL-2v 免疫結合物之 PD-1 結合物 7G12 (亦即，AB003058) 進行評定，並在效力方面將其與 Roche 抗 PD-1 結合物進行比較。
使用來自 Promega (目錄號J1250、J1255) 之 PD-1/PD-L1 阻斷生物測定，該測定由基於細胞之生物發光測定組成，其可用於以及時的方式測量經設計為阻斷 PD-1/PD-L1 交互作用之抗體的效力。
該測定由兩種基因工程化細胞株組成： PD-1 效應細胞：表現人 PD-1 及由 NFAT 反應元件驅動之螢光素酶報告基因 (NFAT-RE) 的 Jurkat T 細胞；及 PD-L1 抗原呈現細胞 (APC)/CHO-K1 細胞：表現人 PD-L1 及經工程化之細胞表面蛋白的 CHO-K1 細胞，該經工程化之細胞表面蛋白經設計以不依賴抗原之方式活化同源 T 細胞受體 (TCR)。
當兩種細胞類型係經共培養時，PD-1/PD-L1 交互作用抑制 TCR 傳訊及經活化之 T 細胞核因子 (NFAT) 報告基因媒介的發光。添加阻斷 PD-1/PD-L1 交互作用的抗 PD-1 抗體或抗 PD-L1 抗體釋放抑制訊號，並導致 TCR 活化及 NFAT 報告基因媒介的發光。
將 5 x 10 3個表現 PD-L1 的 CHO-K1 細胞接種在 96 孔板中越夜，同時將 5 x 10 4個表現 PD-1 的 Jurkat 細胞在實驗當天鋪板。在共培養兩種細胞株之前 30 分鐘，將親代抗 PD-1 阻斷抗體 (二價羅氏抗 PD-1 (0376))、同型對照或基於 7G12 之經 PD-1 調節之 IL-2v 構建體的八個 10 倍稀釋物 (100 µg/ml 至 10 pg/ ml) 添加至含有 Jurkat 報告細胞株之板中，以阻斷 PD-1/PD-L1 路徑。在 37℃ 孵育 6 小時後，添加受質 (Bio-Glo Reagent)，然後在光度計 (TECAN Infinite M1000 Pro) 上測量樣品。PD-1 傳訊之阻斷係藉由添加 Bio-Glo™ 螢光素酶檢測受質後的發光訊號來測量。
全部基於 7G12 之構建體在 PD-1/PD-L1 阻斷生物測定中皆顯示活性，指示 7G12 阻斷 PD-1 與 PD-L1 之交互作用，導致相對發光單位的劑量反應增加。此外，7G12 顯示具有比 Roche 抗 PD-1 高 10 倍的 EC50，指示低 10 倍的效力 ( 圖 1及 表 11)。如所預期，同型對照並未引發對報告細胞株的發光的任何影響。
表 11.PD-1/PD-L1 阻斷的 EC50 。
EC50 (µg/ml) 常開 7G12 構建體 A 7G12 構建體 B Roche 抗 PD-1 (0376)
EC50 (µg/ml) 0.03 0.03 0.03 0.003
實例 3. 用增加劑量的經 PD-1 調節之 IL-2v AF5842 處理後，在經活化之 PD-1 + 及 PD-1 -CD4 T 細胞上的 IL-2R 傳訊 (STAT5-P)
藉由用增加濃度的免疫結合物處理經活化之表現 PD-1 的 (PD-1 +) 及 PD-1 陰性 (PD-1 -) (經抗 PD-1 預處理之) CD4 T 細胞，經 PD-1 調節之 IL-2v (經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物) 的效力及順式/反式傳訊係作為 IL-2R 傳訊進行測量。目的為判定經 PD-1 調節之 IL-2v 對 T 細胞 PD-1 表現的依賴性，以便遞送 IL-2R 傳訊。
為此，用 CD4 珠 (130-045-101，Miltenyi) 從健康供體 PBMC 中分選 CD4 T 細胞，並在存在 1 μg/ml 板結合的抗 CD3 的情況下活化 3 天 (越夜預包覆，殖株 OKT3, #317315，BioLegend) 及 1 μg/ml 可溶性抗 CD28 (殖株 CD28.2，#302923，BioLegend) 抗體誘導 PD-1 表現。三天後，收集細胞並洗滌幾次以去除內源性細胞激素，一半的細胞用細胞微量紫 (CTV) 標記 (5 µM、在室溫 (RT) 5 分鐘；C34557、Thermo Scientific)，及另一半未標記。
然後，將未標記的細胞與飽和濃度的競爭性抗 PD-1 抗體 (內部分子，10 µg / ml) 在室溫下培養 30 分鐘，然後進行幾個洗滌步驟以去除過量的未結合抗 PD-1 抗體。隨後，將經 PD-1 預阻斷之未經標記之細胞 (25 μl，6*10 6個細胞/ml) 與 PD-1 +經 CTV 標記之細胞 (25 μl，6x10 6個細胞/ml) 在 V-型底板中 1:1 共培養，然後在 37℃ 用濃度遞增的處理免疫結合物 (50 µl，1:10 稀釋步驟) 處理 60 分鐘。為了保持磷酸化狀態，在與各種構建體培養 60 分鐘後，立即添加等量的 Phosphoflow Fix Buffer I (100 µl，557870，BD Bioscience)，以允許經 PD-1 調節之 IL-2v 在與 PD-1 結合後解折疊。然後將細胞在 37℃ 培養 30 分鐘以固定，然後用 Phosphoflow PermBuffer III (558050，BD Bioscience) 在 -80℃ 滲透過夜。第二天，透過使用抗 STAT-5P 抗體(47/Stat5(pY694) 殖株, 562076, BD Bioscience) 在 4℃ 下將磷酸化的 STAT-5 染色 30 分鐘。
細胞係在流式細胞儀 (FACS) BD-Symphony A5 (BD Bioscience) 儀器上獲取。STAT-5P 的頻率用 FlowJo (V10) 判定，並由 GraphPad Prism 繪製。
PD-1 +T 細胞上的劑量反應曲線提供有關所評定之分子透過 IL-2R 進行傳訊的效力之資訊。此外，用競爭性抗 PD-1 抗體預處理 (以防止 PD-1 媒介的遞送) 之 T 細胞的劑量反應曲線顯示分子在獨立於 PD-1 表現來提供 IL-2R 傳訊中的效力，以及在經 PD-1 調節之 IL-2v 的情況下的雙重結合抗體 (DBA) 的洩漏程度。在該特定測定中，AF5842 被證明其效力比 PD-1-IL-2v (常開，例如，常開 P1AE4422-14542；參見 PCT 公開號 WO 2018/184964，其以引用形式整體併入本文) 低 8 倍，然而，其對 PD-1 +的活性比對 PD-1 -T 細胞的活性高出大約 100 倍，與 PD-1-IL-2v 的 80 倍相對比 ( 圖 2及 表 12)。如所預期，FAP-IL-2v (參見 PCT 公開號 WO 2012/146628，其以引用方式整體併入本文) 的效力比 PD-1-IL-2v 低 50 倍，缺乏順式活性，並且因此，無論其 PD-1 表現如何，對 T 細胞皆具有相同活性。
表 12. 用增加劑量之免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。
PD-1-IL-2v FAP-IL-2v AF5842
順式活性 (倍) 80 1.4 103
與 PD-1-IL-2v 相比效力降低 1 50 8
實例 4. 用增加劑量的各種經 PD-1 調節之 IL-2v ( 含有一個或兩個具有 DBA 之 IL-2v 、具有或不具有一個或多個抗 PD-1 靶向臂 ) 處理後，經活化之 PD-1 + 及 PD-1 -CD4 T 細胞上的 IL-2R 傳訊 (STAT5-P)
藉由用增加濃度的免疫結合物處理經活化之 PD-1 +及 PD-1 -(經抗 PD-1 預處理之) CD4 T 細胞，若干經 PD-1 調節之 IL-2v 的效力及順式/反式傳訊係作為 IL-2R 傳訊進行測量。目的為判定經 PD-1 調節之 IL-2v 對 T 細胞 PD-1 表現的依賴性，以便遞送 IL-2R 傳訊。CD4 T 係如實例 3 中針對 圖 2中所述進行處理，並在 37℃ 用增加濃度的免疫結合物處理 12 或 60 分鐘。
PD-1 +T 細胞上的劑量反應曲線提供有關所評定之分子透過 IL-2R 進行傳訊的效力之資訊。此外，用競爭性抗 PD-1 抗體預處理 (以防止 PD-1 媒介的遞送) 之 T 細胞的劑量反應曲線顯示分子在獨立於 PD-1 表現來提供 IL-2R 傳訊中的效力，以及在經 PD-1 調節之 IL-2v 的情況下的 DBA 的洩漏程度。在此特定測定中表明，在孵育 60 分鐘後，AF5842 的效力比 PD-1-IL-2v 低 22 倍，然而，其對 PD-1 +的活性比對 PD-1 -T 細胞的活性高超過 200 倍。在 60 分鐘後，經 PD-1 調節之 IL-2v 分子的效力與 PD-1-IL-2v 相比降低超過 300 倍，且具有降低的順式活性 (作為 EC50 倍數增加：EC50 PD-1 經阻斷/ EC50 PD-1 +)，當與 AF5842 及 PD-1-IL-2v 相比時 ( 圖 3A及 圖 3B及 表 13)。
FAP-IL-2v 的效力比 PD-1-IL-2v 低大約 80 倍，且缺乏順式活性，因此無論 PD-1 表現如何，它對 T 細胞的活性皆相同。
作為額外對照，亦包括曝露於增量劑量的 PD-1-IL-2v 中達 12 分鐘的 PD-1 +和 PD-1 -中 STAT-5P +T 細胞的頻率。在孵育 60 分鐘後，PD-1-IL-2v 的效力增加大約 10 倍，導致 PD-1 +T 細胞上的順式活性比孵育 12 分鐘後高出超過兩倍。
表 13. 用不同免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。
EC50 (PD-1 +) EC50(PD-1 bl.) 順式活性 (倍) 相對於 PD-1-IL-2v 的效力降低 (倍)
PD-1-IL-2v 5 593 115 1
FAP-IL-2v 422 425 1 84
AF5842 112 25263 227 22.4
P1AI3551 1586 60574 38 317
P1AI3563 492 38993 79 98.4
P1A3554 1616 64303 40 323
P1AI3550 13725 289722 21 2745
P1AI3558 4380 181786 42 876
PD-1-IL-2v_12min 56 2821 50 11
實例 5. 用增加劑量的各種經 PD-1 調節之 IL-2v ( 含有一個具有阻斷或非阻斷 DBA 及一個或多個具有阻斷或非阻斷活性之抗 PD-1 靶向臂之 IL-2v) 處理後，經活化之 PD-1+ 及 PD-1- CD4 T 細胞上的 IL-2R 傳訊 (STAT5-P)
藉由將經活化之 PD-1 +及 PD-1 -(經抗 PD-1 預處理之) CD4 T 細胞曝露於增加濃度的免疫結合物中，各種經 PD-1 調節之 IL-2v 的效力及順式/反式傳訊係作為在該等細胞中引發 IL-2R 傳訊的能力進行測量。目的為判定經 PD-1 調節之 IL-2v 相對於 T 細胞上之 PD-1 表現的條件活性及選擇活性，以便以順式遞送 IL-2R 傳訊。為此目的，如實例 3 中所述來處理 CD4 T 細胞，並在 37℃ 用增加濃度的處理免疫結合物來處理 12 或 60 分鐘。
PD-1 +T 細胞上的劑量反應曲線提供有關所評定之分子透過 IL-2R 進行傳訊的效力之資訊。此外，用競爭性抗 PD-1 抗體預處理 (以防止 PD-1 對接) 之 T 細胞的劑量反應曲線顯示分子在獨立於 PD-1 表現來提供 IL-2R 傳訊中的效力，以及在經 PD-1 調節之 IL-2v 的情況下的 DBA 的洩漏程度。在該特定測定中，在 60 分鐘後，經 PD-1 調節之 IL-2v 分子的效力與 PD-1-IL-2v 相比具有介於 5 倍與 100 倍之間的降低，且顯示它們中的一些具有改善的順式活性 (作為 EC50 倍數增加：EC50 PD-1 經阻斷/ EC50 PD-1 +或作為 AUC 變化)，當與 AF5842 及 PD-1-IL-2v 相比時 ( 圖 4A及 圖 4B及 表 14，以及 圖 5A及 圖 5B及 表 15)。
表 14. 用不同免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。
EC50 (PD-1 +) EC50 (PD-1 bl.) 順式活性 [EC50(PD-1 bl.) /EC50(PD-1 +)] 與 PD-1-IL-2v 相比效力降低 AUC (PD-1 +) AUC (PD-1 bl.) AUC 變化
PD-1-IL-2v 8.981 459.5 51.2 1 290.4 153.5 136.9
FAP-IL-2v 347.1 367.7 1.1 39 174.2 169.4 4.8
AF5842 228 30198 132.4 25 141.8 23.72 118.1
P1AI3563 936.2 92640 99.0 104 121.3 27.79 93.5
P1AI7438 47.77 19004 397.8 5.3 224 66.01 158.0
P1AI7465 313.8 24112 76.8 35 146 28.79 117.2
P1AI7476 50.28 17772 353.5 5.6 125.7 8.979 116.7
PD-1-IL-2v (12 分鐘) 45.39 1453 32.0 5 262.2 131 131.2
bl.：經阻斷
表 15. 用不同免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。
EC50 EC50 (PD-1 bl.) 順式活性 [EC50 (PD-1 bl.) / EC50 (PD-1 +)] 與 PD-1-IL-2v 相比效力降低 面積 面積 (PD-1 bl.) AUC 變化
PD-1-IL-2v 4.0 389.3 97.9 1 147.2 77.8 69.4
FAP-IL-2v 581.2 647.8 1.1 145 73.7 72.5 1.2
AF5842 78.8 350.4 4.4 19 66.7 19.9 46.8
P1AI7440 20.3 31002.0 1526.4 5 71.4 19.5 51.9
P1AI7441 222.7 435.4 2.0 55.7 58.8 18.9 39.9
P1AI7443 105.1 4768.0 45.4 26.25 52.4 11.4 41
P1AI7455 326.7 209.9 0.6 81.7 39.2 7.9 31.3
P1AI7462 44.6 13028.0 292.3 11.5 81.1 22.9 58.2
P1AI7464 27.3 469.6 17.2 6.8 67.1 12.8 54.3
P1AI7467 87.9 1228.0 14.0 22 56.1 14.9 41.2
P1AI7473 70.6 4113.0 58.2 17.65 50.3 12.8 37.5
bl.：經阻斷
在孵育 60 分鐘後，AF5842 的效力比 PD-1-IL-2v 低大約 20 倍；然而，其對 PD-1 +的活性比對 PD-1 -T 細胞的活性高超過 100 倍。FAP-IL-2v 的效力比 PD-1-IL-2v 低，缺乏順式活性，因此無論 PD-1 表現如何，它對 T 細胞的活性皆相同。
作為額外對照，亦包括曝露於增量劑量的 PD-1-IL-2v 中達 12 分鐘的 PD-1 +和 PD-1 -中 STAT-5P +T 細胞的頻率。在孵育 60 分鐘後，PD-1-IL-2v 的效力增加大約 5 倍，導致 PD-1 +T 細胞上的順式活性比孵育 12 分鐘後高出大約 2 倍 ( 圖 4)。 實例 6. 用增加劑量的各種經 PD-1 調節之 IL-2v ( 含有一個具有阻斷或非阻斷 DBA 及一個具有阻斷或非阻斷活性之抗 PD-1 靶向臂之 IL-2v) 處理後，經活化之 PD-1 + 及 PD-1 -CD4 T 細胞上的 IL-2R 傳訊 (STAT5-P)
藉由將經活化之 PD-1 +及 PD-1 -(經抗 PD-1 預處理之) CD4 T 細胞曝露於增加濃度的免疫結合物中，各種經 PD-1 調節之 IL-2v 的效力及順式/反式傳訊係作為在該等細胞中引發 IL-2R 傳訊的能力進行測量。目的為判定經 PD-1 調節之 IL-2v 相對於 T 細胞上之 PD-1 表現的條件活性及選擇活性，以便遞送順式 IL-2R 傳訊。如實例 3 中所述來處理 CD4 T 細胞，並在 37℃ 用增加濃度的處理免疫結合物來處理 12 或 60 分鐘。
PD-1 +T 細胞上的劑量反應曲線提供有關所評定之分子透過 IL-2R 進行傳訊的效力之資訊。此外，用競爭性抗 PD-1 抗體預處理 (以防止 PD-1 對接) 之 T 細胞的劑量反應曲線顯示分子在獨立於 PD-1 表現來提供 IL-2R 傳訊中的效力，以及在經 PD-1 調節之 IL-2v 的情況下的 DBA 的洩漏程度。在該特定測定中，在 60 分鐘後，經 PD-1 調節之 IL-2v 分子的效力與 PD-1-IL-2v 相比具有介於 6 倍與 600 倍之間的降低，且顯示它們中的一些具有改善的順式活性 (作為 EC50 倍數增加：EC50 PD-1 經阻斷/ EC50 PD-1+ 或作為 AUC 變化)，當與 AF5842 及 PD-1-IL-2v 相比時 ( 圖 6及 表 16)。
在孵育 60 分鐘後，AF5842 的效力比 PD-1-IL-2v 低大約 100 倍，然而，其對 PD-1 +的活性比對 PD-1 -T 細胞的活性高超過 400 倍。如所預期，FAP-IL-2v 的效力比 PD-1-IL-2v 低，缺乏順式活性，因此無論 PD-1 表現如何，它對 T 細胞的活性皆相同。
作為額外對照，亦包括曝露於增量劑量的 PD-1-IL-2v 中達 12 分鐘的 PD-1 +和 PD-1 -中 STAT-5P +T 細胞的頻率。在孵育 60 分鐘後，PD-1-IL-2v 的效力增加大約 10 倍，導致 PD-1+ T 細胞上的順式活性比孵育 12 分鐘後高出大約兩倍 ( 圖 6及 表 16)。
表 16. 用不同免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。
EC50 (PD-1 +) EC50 (PD-1 bl.) 順式活性 效力降低，相對於 PD-1-IL-2v 面積 (PD-1 +) 面積 (PD-1 bl.) AUC 變化
PD-1-IL-2v 3.386 820.3 242.3 1 244.1 125.5 118.6
FAP-IL-2v 891.6 965.7 1.1 263 102.9 117.9 -15.0
AF5842 148.7 62991 423.6 44 117.8 10.39 107.4
P1AI7467 58.16 108939 1873.1 17 142.6 19.42 123.2
P1AI7438 30.17 34093 1130.0 9 196.4 50.65 145.8
P1AI7440 39.7 103150 2598.2 12 140.7 22.58 118.1
P1AI7441 648 140011 216.1 191 94.58 14.42 80.2
P1AI7476 9.785 222926 22782.4 3 138.1 8.568 129.5
P1AI7455 927.3 182191071 196474.8 274 78.42 5.952 72.5
PD-1-IL-2v_12min 33.11 3393 102.5 10 187.9 87.19 100.7
bl.：經阻斷 實例 7. 各種經 PD-1 調節之 IL-2v (PD-1-reg-IL-2v) 對細胞毒性效應功能及同種異體特異性 PD-1 +CD4 T 細胞增殖的功能活性
為評定 PD-1-reg-IL-2v 對 T 細胞效應功能的功能活性並將其與 PD-1-IL-2v、FAP-IL-2v 及 AF5842 進行比較，將 CD4 T 細胞與 B 細胞淋巴母細胞樣腫瘤細胞株 (ARH77) 共培養 5 天，以產生同種異體反應性 T 細胞。ARH77 表現中等量的 PD-L1 及高量的 MHCII，並誘導同種異體 CD4 T 細胞表面的 PD-1 表現 ( 圖 7A)。因此，該測定允許對 PD-1 阻斷及 PD-1 媒介的經調節之 IL-2v 的遞送進行功能評定。
如上所述進行 CD4 分離和 CTV 標記。經分選之 CD4 +T 細胞與經輻照之 ARH-77 (人 B 淋巴母細胞株) 以 5:1 的 E:T 比率 (100,000 個 T 細胞：20,000 ARH-77) 在存在或不存在增加劑量的基於 PD-1 或基於 FAP 之 IL-2 構建體的情況下進行共培養。將細胞在 96 圓底板中在 37℃、5% CO 2下共培養 5 天。5 天後，在 FACS 染色前 5 小時投予蛋白質轉運抑制劑 (GolgiPlug™、555029，BD Bioscience；及 GolgiStop™、554724，BD Bioscience) 來增強高基氏體中細胞因子的積累。首先對細胞進行 CD4 染色以及為了活/死。於固定/通透化越夜 (554714，BD Bioscience) 後，將該細胞內的顆粒酶 B (GrzB) 染色。該等細胞係在 FACS BD-Symphony A5 (BD Bioscience) 儀器處獲取，並用 FlowJo® 及 GraphPad Prism® 進行分析。藉由對存活及增殖的 CD4 +T 細胞 (CTV low) 進行門控，將顆粒酶 B 分泌的頻率及平均螢光強度在該等條件之間進行比較。
劑量反應曲線指示 PD-1-reg-IL-2v 具有功能活性，並且在引發細胞毒性 T 細胞效應功能方面具有類似效力。它們在不同程度上表現出比 PD-1-IL-2v 低的 T 細胞效應功能活性，以及比 FAP-IL-2v 高的活性 ( 圖 7及表 17)。
表 17. 不同免疫結合物的細胞毒性 T 細胞效應功能，如藉由來自 CD4 T 細胞的顆粒酶 B 分泌所判定。
分子 效力 (EC50 pM) 與 PD-1-IL-2v 相比效力降低
PD-1 IL-2v 6 1
FAP IL-2v 3275 545
AF5842 1607 267
P1AI7467 610 101
P1AI7438 578 96.3
P1AI7440 151 25.2
P1AI7441 4643 773
P1AI7476 197 32.8
P1AI7455 2023 337
實例 8. 在 PD-1-reg-IL-2v 處理後，從 T reg 抑制中救援 T conv 效應功能
為了評定 PD-1-reg-IL-2v 構建體是否可逆轉習知 T 細胞 (T conv) 效應功能的調節性 T 細胞 (T reg) 抑制，建立了抑制性功能測定。為此目的，T conv及 T reg係經分離及標記。簡而言之，用兩步法調節性 T 細胞分離套組 (Miltenyi，＃130-094-775) 分離 CD4 +CD25 +CD127 dimT reg。同時，透過收集 CD25 陽性選擇的陰性部分 (Miltenyi，＃130-092-983)，接著進行 CD4 +富集 (Miltenyi，＃130-045-101)，分離出 CD4 +CD25 -T conv。T conv係用 CFSE (eBioscience，#65-0850-84) 標記且 T reg係用 CTV (ThermoFisher Scientific，C34557) 標記，以追蹤兩個群體的增殖。
隨後，將 T conv及 T reg一起培養 5 天，在有或沒有治療的情況下，在非親屬供體的 CD4 -CD25 -PBMC 的存在下，以提供同種異體刺激。
在第 5 天，在 FACS 染色並在 FACS BD-Symphony A5 (BD Bioscience) 儀器上獲取前 5 小時投予蛋白質轉運抑制劑 (GolgiPlug™、#555029，BD Bioscience；及 GolgiStop™、#554724，BD Bioscience) 來增強高基氏體中細胞因子的積累。使用 FlowJo (V10) 分析資料並使用 GraphPad Prism 繪製資料。在存在及不存在 T reg的情況下測量經增殖之 T conv分泌顆粒酶 B 的能力 (GrzB； 圖 8A及 圖 8B)。用下列公式計算該 T reg抑制： 其中 % 細胞激素 ( Tconv+Treg± 免疫結合物) 係在存在 T reg± 處理免疫結合物的情況下由 T conv分泌的細胞激素的含量，% 細胞激素 (Tconv)係在缺乏 T reg的情況下由 T conv分泌的細胞激素的含量。
在未處理之樣品中，T conv所分泌的超過 95% 的顆粒酶 B 由 T reg抑制。用未靶向之 IL-2v (FAP-IL-2v) 進行處理不能從 T reg抑制中顯著地救援顆粒酶 B 的 T conv分泌。相比之下，用 PD-1-IL-2v (由於其克服 T reg抑制的能力而用為陽性對照) 進行處理使得 T reg抑制顯著降低至 48%，而 AF5842 分子具有到 71% 的溫和降低 ( 圖 8B)。
黨與未處理組相比時，PD-1-reg-IL-2v 的一部分顯示出顯著克服 T reg抑制 ( 圖 8A及 圖 8B及 表 18)。
表 18.T reg 對 T conv 顆粒酶 B 分泌的抑制百分比。
T reg對 T conv顆粒酶 B 分泌的抑制百分比
未處理 (UT) 95.84718071
PD-1-IL-2v 48.57139465
FAP-IL-2v 85.709394
REF P1AI7467 49.88084771
P1AI7440 57.22955198
P1AI7441 71.31207835
P1AI7476 59.82616595
AF5842 71.03656351
P1AI7455 76.61656521
實例 9. 在用增加劑量的各種經 PD-1 調節之 IL-2v 構建體 ( 在 DBA 輕鏈的 C 端處含有一種額外胺基酸 ) 處理後，經活化之 PD-1 + 及 PD-1 -CD8 T 細胞上的 IL-2R 傳訊 (STAT5-P)
測量在 DBA 輕鏈的 C 端處引入一個額外胺基酸之各種經 PD-1 調節之 IL-2v 構建體的效力及順式/反式傳訊，並針對在經活化之 PD-1 +及 PD-1 -(經抗 PD-1 預處理之) CD8 T 細胞中引發 IL-2R 傳訊的能力與母體分子進行比較。目的為判定在 DBA 輕鏈序列的 C 端處添加胺基酸是否可能影響經 PD-1 調節之 IL-2v 構建體相對於 T 細胞上的 PD-1 表現的條件活性及選擇性活性，以便以順式遞送 IL-2R 傳訊。
為此目的，用 CD8 珠 (130-045-201，Miltenyi) 從健康供體 PBMC 中分選 CD8 T 細胞，並如上文實例 3 中針對 CD4 針對 圖 2中所述進行處理，並在 37℃ 用增加濃度的處理抗體處理 12 或 60 分鐘。
在給特定測定中，在 C 端處含有額外胺基酸之經 PD-1 調節之 IL-2v 分子被證明具有與母體分子相當或略有改善的效力及順式活性 ( 圖 9A 至圖 9C及 表 19)。
表 19. 用不同免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。
EC50 PD-1 + EC50 PD-1 bl 順式效應 對 PD-1 + 的效力降低，相對於 PD-1-IL-2v
PD-1-IL-2v 30.02 684.5 22.8 1
FAP-IL-2v 1598 1452 0.9 53.3
AF5842 212.1 30231 142.5 7
P1AI7467 102 24499 240.2 3.4
P1AI7476 33.09 23264 703.1 1.1
P1AI7476 32.38 22826 704.9 1.1
P1AI7440 63.03 21805 345.9 2.1
P1AJ1837 47.07 25824 548.6 1.8
P1AI7441 1515 33734 22.3 50.5
P1AJ1838 1159 35074 30.3 38.7
P1AI7474 65.98 14848 225.0 2.2
P1AJ2535 66.48 2799 42.1 2.2
bl = 阻斷
與 P1AI7440 相比，P1AJ1837 在 DBA 輕鏈的 C 端處具有 Asp，這對結合特性沒有影響。因此，此等分子在活性方面可以被認為是等效的。這同樣適用於 P1AJ1838 及 P1AI7441。 實例 10.PD-1-reg-IL-2v 構建體對 PD-1 +T 細胞優於 NK 細胞的條件活性，以評定雙重阻斷抗體的滲漏性
為了評定 PD-1-reg-IL-2v 構建體是否對 PD-1 +T 細胞具有條件活性且對 PD-1 -細胞 (如 NK 細胞) 無活性，對以 1:5 比率與新鮮經分離之 PBMC 共培養的經活化之 T 細胞進行劑量反應競爭測定。
為此目的，用 CD4 珠 (130-045-101，Miltenyi) 以及用 CD8 珠 (130-045-201，Miltenyi) 從健康供體 PBMC 中分選 CD4 及 CD8 T 細胞，並在存在 1 μg/ml 板結合的抗 CD3 的情況下活化 3 天 (過夜預包覆，殖株 OKT3，#317315，BioLegend) 和 1 μg/ml 可溶性抗 CD28 (殖株 CD28.2，#302923，BioLegend) 抗體誘導 PD-1 表現。三天後，收穫細胞並洗滌若干次以去除內源性細胞激素，並用 CTV 標記 (5 µM、在室溫 5 分鐘；C34557，Thermo Scientific) 標記該等細胞。
在進行標記的同一天，用 CD16 加 CD56 對 10 6個新鮮經分離之 PBMC 進行染色，且在若干洗滌步驟後，在存在增加濃度的治療抗體 (50 µl，1:10 稀釋步驟) 的情況下在 37℃ 與 2 x 10 5個經標記之經活化之 CD4 及 CD8 T 細胞共培養 60 分鐘。然後將細胞與等量的 Phosphoflow® Fix Buffer I (100 µl，557870，BD Bioscience) 一起在 37℃ 再孵育 30 分鐘以保持磷酸化狀態，然後用表面譜系標記物染色，然後在 -80℃ 用Phosphoflow® PermBuffer III (558050，BD Bioscience) 透化越夜。第二天，藉由使用抗 STAT-5P 抗體 (47/Stat5(pY694) 殖株，562076，BD Bioscience) 在 4℃ 將經磷酸化之 STAT-5 染色 30 分鐘。
細胞係在 FACS BD-Symphony A5 (BD Bioscience) 儀器上獲取。STAT-5P 的頻率用 FlowJo (V10) 判定，並由 GraphPad Prism 繪製。
PD-1-IL-2v 在表現 PD-1 的 CD4 ( 圖 10A) 及 CD8 T 細胞 ( 圖 10B) 上引發 IL-2R 傳訊的效力比在新鮮 NK 細胞上 ( 圖 10C) 上高出大約 10 倍。然而，參考分子 AF5842 儘管對 PD-1 +CD4 及 CD8 T 細胞的效力比 PD-1-IL-2v 低 10 至 15 倍，但對 NK 細胞幾乎無活性 ( 圖 10A 至圖 10D)。
結果係總結於於下 表 20中。
表 20. 免疫結合物對經活化之 CD4/CD8 細胞及 NK 細胞的條件活性。
EC50 PD-1-IL-2v AF5842 P1AI7476 P1AJ1837 P1AI7474 P1AJ2535
經活化之 CD4 50.49 598.7 96.75 123.3 118.9 97.43
經活化之 CD8 61.61 976.7 110.1 200.3 185.5 139.7
NK 細胞 635.6 約 1635023 約 13226024 約 19961459 約 41766615 3671
值得注意的是，在透過 PD-1 +T 細胞上的 IL-2R 進行傳訊中，三種 PD-1-reg-IL-2v 構建體顯示具有僅比 PD-1-IL-2v 降低大約 2 至3 倍的效力。然而，此等分子對 NK 細胞無活性，類似於參考分子 AF5842 ( 圖 10A 至圖 10C)。只有 P1AJ2535 構建體 (在 VH 及 VL 中包含 2 個突變，而不是在 VL 中包含一個突變) 表現出對 NK 細胞的活性，指示在去免疫化期間的胺基酸取代後非阻斷 DBA 之洩漏。 實例 11. 阻斷及非阻斷雙重結合抗體與阻斷及非阻斷抗 PD-1 靶向抗體的結合競爭
為了評定 PD-1-reg-IL-2v 構建體的阻斷及非阻斷 DBA 是否與阻斷及非阻斷抗 PD-1 靶向臂競爭，對表現 PD-1 (PD-1 +) 的經活化之 CD4 T 細胞進行結合競爭。
為此目的，用 CD4 珠 (130-045-101，Miltenyi) 從健康供體 PBMC 中分選 CD4 T 細胞，並在存在 1 μg/ml 板結合的抗 CD3 的情況下活化 3 天 (越夜預包覆，殖株 OKT3，#317315，BioLegend) 及 1 μg/ml 可溶性抗 CD28 (殖株 CD28.2，#302923，BioLegend) 抗體誘導 PD-1 表現。三天後，收穫並洗滌細胞，然後將其在 4℃ 曝露於遞增濃度的處理抗體 (50 µl，1:10 稀釋步驟) 中達 30 分鐘。在兩個洗滌步驟後，經處理之細胞係在固定前用飽和濃度的直接以 Alexa Fluor®-647 及活/死可固定活力染料 eFluor 780 標記之阻斷及非阻斷雙重抗體 在 4℃ 再染色 30 分鐘。然後在 FACS BD-Symphony A5 (BD Bioscience) 儀器上獲取細胞，使用 FlowJo (V10) 進行 FACS 分析，且資料係使用 GraphPad Prism 繪製。
阻斷 DBA AB002345 與阻斷抗 PD-1 抗體殖株 0376 (其佔據 PD-1 受體的 80%) 在 PD-1 +經活化之 CD4 T 細胞上競爭結合，而阻斷 DBA AB002345 既不與非阻斷 DBA AB003637 競爭也不與非阻斷抗 PD-1 抗體殖株 1040 競爭。作為陽性對照，使用相同的阻斷 DBA AB002345 來防止經直接標記之阻斷 DBA AB002345 的結合，從而達成與殖株 0376 相似的佔據 ( 圖 11A)。
相反，非阻斷性 DBA AB003637 與非阻斷抗 PD-1 抗體殖株 1040、與阻斷 DBA AB002345 且與非阻斷 DBA AB003637 在 PD-1 +經活化之 CD4 T 細胞上競爭結合，但它不與阻斷抗 PD-1 抗體殖株 0376 競爭 ( 圖 11B)。 實例 12.PD-1/IL-2v 免疫結合物的配體抑制 / 競爭性測定
配體抑制測定
配體抑制測定的目的為判定抗體 (DBA 及抗 PD-1) 與 PD-1 之結合是否抑制 PD-L1 與 PD-1 之間的結合。
SPR 實驗係在 Biacore® T200 上在 25℃ 進行，使用 PBS-P+ 作為運行及樣品稀釋緩衝液 (0.2 M 磷酸鹽緩衝液，含有 27 mM KCl、1.37 M NaCl 及 0.5% 界面活性劑 P20 (Tween® 20)，Cytiva, Freiburg, Germany)。
本實驗中使用預先包覆有 ssDNA 寡核苷酸 (oligo) 序列之 CAP 晶片 (提供於生物素 CAPture 套組，S 系列，Cytiva，28920234 中)，根據製造商的說明進行標準化及流體動力學處理。
最初，將含有固定有鏈黴親和素之互補寡核苷酸序列之生物素 CAPture 試劑送到溢出池 1 及 2。互補 ssDNA-SA 與 CAP 晶片上預固定的 ssDNA 寡核苷酸之雜交係以 2 µL/min 之流速進行 360 秒。然後將經生物素化之的人 PD-1 (內部 ID P1AF8774) 以 100 nM 的濃度以 5 µL/min 之流速注入 180 秒。
為了測量配體抑制作用，首先以 5 µL/min 的流速、10 µg/mL 的濃度注入 PD-1 分子達 300 秒。其次，在第一次注入後，立即將與 10 mg/ml 的相同 PD-1 結合分子混合的恆定量之 PD-L1 (內部 ID P1AD8568，1000nM) 以 5 µL /min 的流速注入在兩個流動池上達 150 秒。解離時間不是必需的。
在第二注入期期間觀察到 P1AG3741 及 P1AI7514 的訊號增加，這指示此等結合物的 PD-1 上的抗原決定基區不幹擾 PD-L1 與 PD-1 之間的交互作用。針對 P1AI3784 及 P1AH4157 沒有觀察到額外結合訊號，這指示 PD-L1 與 PD-1 的結合被阻斷。
然後，在每個分析週期後，使用提供於生物素 CAPture 套組中之三份再生儲備液 1 (8 M 鹽酸胍) 及 1 份再生儲備液 2 (1 M NaOH) 之混合物，從表面去除生物素 CAPture 試劑以及經結合之分析物。在 90 秒的穩定時間段後，以 5 µL/min 的流速注入再生溶液混合物達 120 秒。各種免疫結合物的配體抑制能力的總結係於下文顯示於 表 21中。
表 21. 對免疫結合物配體之抑制測定的總結。
抗體 對 PD-1/PD-L1 交互作用的影響
P1AI3784 阻斷
P1AH4157 阻斷
P1AG3741 無阻斷
P1AI7514 無阻斷
競爭性結合測定
競爭性結合實驗的目的為判定結合物在 PD-1 表面上是否具有不同的抗原決定基，或它們是否競爭相同或重疊的結合抗原決定基。
表面電漿子共振 (SPR) 實驗係在 Biacore® T200 上在 25℃ 進行，使用 PBS-P+ 作為運行及樣品稀釋緩衝液 (0.2 M 磷酸鹽緩衝液，含有 27 mM KCl、1.37 M NaCl 及 0.5% 界面活性劑 P20 (Tween® 20)，Cytiva, Freiburg, Germany)。
本實驗中使用預先包覆有 ssDNA 寡核苷酸序列之 CAP 晶片 (提供於生物素 CAPture 套組，S 系列，Cytiva，28920234 中)，根據製造商的說明進行標準化及流體動力學處理。
最初，將含有固定有鏈黴親和素之互補寡核苷酸序列之生物素 CAPture 試劑送到溢出池 1 及 2。互補 ssDNA-SA 與 CAP 晶片上預固定的 ssDNA 寡核苷酸之雜交係以 2 µL/min 之流速進行 300 秒。然後將經生物素化之的人 PD-1 (內部 ID P1AF8774) 以 25 nM 的濃度以 10 µL/min 之流速注入 60 秒。
為了測量與 PD-1 的競爭性結合，首先將 PD-1 結合分子 (例如，DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分) 以 10 µg/mL 之濃度以 10 µL/min 至流速注入 180 秒。其次，在第一次注入後，立即將 10 mg/ml 的不同 PD-1 結合分子 (例如，DBA 部分或抗 PD-1 抗體部分) 以 10 µL/min 之流速注入到兩個流動池上達 180 秒。解離時間設定為 120 秒，然後為 60 秒的穩定時間段。
第二注入階段期間的訊號增加指示與第二 PD-1 結合分子相比，結合在 PD-1 上之第一 PD-1 結合分子的抗原決定基區不同，因為該構建體不阻斷第二種經注入之 PD-1 結合分子與 PD-1 的結合抗原決定基。沒有額外結合訊號，指示第二 PD-1 結合分子對 PD-1 之阻斷，因為抗原決定基區由第一 PD-1 結合分子結合。阻斷指示兩種 PD-1 結合分子與同一抗原決定基競爭性地結合。
然後，在每個分析週期後，使用提供於生物素 CAPture 套組中之三份再生儲備液 1 (8 M 鹽酸胍) 及 1 份再生儲備液 2 (1 M NaOH) 之混合物，從表面去除生物素 CAPture 試劑以及經結合之分析物。在 90 秒的穩定時間段後，以 5 µL/min 之流速注入再生溶液混合物達 120 秒。競爭性測定之結果係顯示於下 表 22中。
表 22. 對免疫結合物之競爭性結合測定的總結。
P1AH4157 P1AI3784 P1AG3741 P1AI7514
P1AH4157 + – –
P1AI3784 + – –
P1AG3741 – – +
P1AI7514 – – +
+ 觀察到競爭；– 沒有觀察到競爭 實例 13. 基於酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 之 PD-1-reg-IL-2v: IL-2Rβγ 結合測定
本實例中所述之調節 ELISA 評定了經 PD-1 調節之 IL-2 構建體依賴於 PD-1 濃度的切換行為。
緩衝液：
DPBS pH 7.4 (PAN BIOTECH # P04-36500) 係用為包覆緩衝液。Superblock pH 7,4 (Thermo Fisher # 37515) 係用為阻斷緩衝液。含有 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 及 0.05% Tween® 20 之 1x PBS pH 7.4 (Roche # 11666789001) 係用為 ELISA 的稀釋劑。含有 0.05% Tween® 20 之 1x PBS pH 7.4 (Roche #11666789001) 係用為洗滌緩衝液。
方法：
用 25 µl 具有野生型 Fc 之抗 PGLALA huIgG1 (VH 及 VL 為鼠的，來自融合瘤，Roche 內部) 以 1 µg/ml 在包覆緩衝液中包覆透明 384 孔板 (Corning # 3700)，並在 4℃ 孵育越夜。在 EL406 Biotek® 洗滌機上用 90 µl/孔緩衝液將板洗滌 3 次後，將 90 µl 阻斷緩衝液添加至板中並在室溫孵育 1 小時。如上所述洗滌板後，將 25 µl 在 ELISA 稀釋液中之濃度為 6 nM 的樣品添加至板中，然後在室溫再孵育 1 小時。在另一洗滌步驟後，將 25 µl 生物素化人 IL-2R β γ 異源二聚體、Fc、Avitag (Acro # ILG-H82F3) 連續稀釋物添加至該板中，該連續稀釋物從最高濃度 100 nM 開始、在 ELISA 稀釋液中按 1:3 連續稀釋 12 個點。在室溫孵育 1 小時後，在 EL406 Biotek® 洗滌機上用 90 µl/孔洗滌緩衝液洗滌3 次，並將 25 µl 在 ELISA 稀釋劑中經 1:5000 稀釋之鏈黴親和素-辣根過氧化物酶 (POD) (Roche # 11089153001) 添加至板的全部孔中，然後在室溫再孵育 1 小時，並如上所述進行另一洗滌步驟。添加 25 µl 1-Step Ultra TMB 受質溶液 (Thermo Fisher # 34029)，然後在室溫孵育 5 分鐘，並使用 Tecan Safire 2 多模式讀取器在 370/492 nm 處測量光密度 (OD)。
各種免疫結合物的 ELISA 測定結果係顯示於 圖 12A及 圖 12B中。「常閉」對照分子內不具有任何 IL-2 模組，因此不結合 IL-2R。「常開」對照為 PD-1 結合物與 IL-2v 的融合物，且因此顯示出不依賴於 PD-1 的 IL-2R 結合。經 PD-1 調節之 IL-2 構建體展現出與 IL-2R 的 PD-1 依賴性結合。 實例 14.HEK-Blue IL-2 報告基因測定
HEK-Blue IL-2 報告細胞株係經過工程化以檢測 IL-2 傳訊，在該測定中，IL-2 傳訊係由經 PD-1 調節之 IL-2 構建體中的 IL-2 部分觸發。HEK-Blue IL-2 報告細胞用於產生表現不同量之 PD-1 的 3 種細胞株。在該測定中使用此等 3 種細胞株加 WT 細胞株來檢測經 PD-1 調節之 IL-2 構建體依賴於 PD-1 表現量的在關閉狀態與開啟狀態之間的差異。
材料
細胞殖株：使用來自 InvivoGen 之 HEK-Blue IL-2 報告細胞株在內部產生表現 PD-1 的細胞殖株。產生了 3 種表現高 (殖株 42)、中 (殖株 26) 及低 (殖株 4) PD-1 量的殖株。測定介質及試劑：DMEM 4.5 g/L、10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、胰蛋白酶 (Pan Biotech P10-023100)、QUANTI-Blue™ 溶液 (InvivoGen Cat#rep-qbs2)。
步驟準則
當測試 HEK-Blue IL-2 WT 報告細胞 (不表現 PD-1) 時，在細胞培養基中稀釋分子以達到 20 nM 之最大測定濃度，且在測試 HEK-Blue IL-2 報告 PD-1 殖株時達到 2 nM 之最大測定濃度。製備 8 個 1:8 稀釋度的連續稀釋液，並將 25 µl/孔移液至 384 孔平底透明板中。然後，將四種細胞株 (HEK-Blue IL-2 WT、HEK-Blue IL-2 PD-1 殖株 42、26 及 4) 在 37℃ 經胰蛋白酶消化 3 分鐘，並以4x10 5個細胞/mL 的濃度重懸於測定培養基中。接下來，將 25 µl/孔的細胞懸浮液添加至先前製備之含有分子之板中，達到 1x10 4個細胞/孔的細胞密度。將板置於培養箱中達 24 小時。QUANTI-Blue™ 試劑係遵循製造商的說明進行製備。簡而言之，將 QUANTI-Blue™ 試劑在室溫解凍，在 37℃ 水浴中孵育 2 分鐘以溶解可能的晶體，並重懸於 98 mL 無菌水加 1mL QUANTI-Blue™ 緩衝液中。經稀釋之 QUANTI-Blue™ 溶液立即使用或儲存於 -20℃。將 45 µl/孔的 QUANTI-Blue™ 溶液移液至 384 白色透明平底板中。將含有細胞處理物之板從培養箱中取出並在室溫放置 10 分鐘。然後，小心地獲取 5 µl 細胞上清液，並使用 Viaflow Assist Plus (Integra) 移液至含有 QUANTI-Blue™ 試劑之板上。將板在軌道搖床 (在 RT，300 rpm) 中孵育 20 至 30 分鐘，並使用以下設定在吸光度讀取器 (Tecan) 上測量吸光度：讀數類型：終點，波長：620 nm。
結果顯示於 圖 13A至 圖 13M中。「常開」對照 ( 圖 13A) 為 IL-2 與 PD-1 結合物的常規融合物，沒有任何切換功能，因此其 IL-2 活性不依賴於 PD-1。即使在 WT 細胞中，常開對照也顯示高 IL-2 傳訊活化，並且由於 PD-1 結合使該分子滯留在細胞表面上，因此表現 PD-1 的細胞中的傳訊增加。全部開關分子在 WT 細胞上皆顯示低活性，因為在不存在 PD-1 的情況下，DBA 藉由屏蔽 IL-2 融合來關閉該等分子。在表現 PD-1 的細胞的情況下，經 PD-1 調節之 IL-2 分子與 PD-1 的結合導致 IL-2 融合物之曝露，該融合物然後變得自由，以在報告細胞中觸發 IL-2 傳訊。經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物在殖株中顯示比在 WT 細胞株中更強的 IL-2 活性。該差異在常開對照中小得多，其中在殖株中活性之增加僅由於分子滯留率較高，而非由於開關機制。經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的 IL-2 活化依賴於 PD-1 含量這一事實在 P1AI7455 及 P1AI7441 的情況下得到很好的反映，這顯示 IL-2 活化與 PD-1 含量之間存在相關性，高 PD-1 表現細胞對此等經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的反應最靈敏。 實例 15.PD-1-reg-IL-2v 作為單一藥劑在小鼠腫瘤細胞株之同基因模型中的活體內功效。
PD-1-reg-IL-2v 免疫結合物雙特異性抗體係作為單一藥劑在同基因模型中測試其抗腫瘤功效。
Panc02-Fluc 胰臟皮下同基因模型
鼠體代物 PD-1-reg-IL-2v 免疫結合物係在經皮下注射至黑色 6-huPD tg 小鼠的小鼠胰臟 Panc02-Fluc 細胞株中進行測試。
Panc02-Fluc 細胞株係藉由鈣轉染及亞選殖技術在內部生產。在含有 10% 肽牛血清 (FCS) (Sigma)、500 µg/ml 潮黴素及 1% 的 Glutamax® 之 RPMI 培養基中培養 Panc02-Fluc。將細胞置於水飽和氣氛及 5% CO 2中於 37℃ 進行培養。將通道 15 用於移植。細胞存活率為 96.4%。使用 1 ml 結核菌素注射器 (BD Biosciences) 將每隻動物 2x10 5個細胞在 100 µl RPMI 細胞培養基 (Gibco) 中皮下注射入小鼠腹側面。
實驗開始時為 8 至 10 週的雌性黑色 6-huPD-1 tg 小鼠 (Charles Rivers, Lyon, France) 根據規定的指南 (GV-Solas; Felasa; TierschG)，維持在無病原體條件下，每天 12 小時光照/ 12 小時黑暗。實驗研究方案已經由地方政府審查及批准 (P 184/2020)。收到動物後，將動物飼養一周以適應新環境並進行觀察。定期進行持續的健康狀況監測。
在研究第 0 天，將 2x10 5的 Panc02-Fluc 細胞皮下注射給小鼠，並且隨機稱重。腫瘤細胞注射後十三天 (腫瘤體積 ＞ 120 mm 3)，對不同組的小鼠進行如下處理 (見 表 23)： 1- mu1+1DBAnon-cross_AB002345_FV020519_IL-2v_4G2SG2 (P1AI8597)，i.v.，每週兩次，持續一周 2.- mu1+1DBAnon-cross_AB003637_FV020519_IL-2v_4G2SG2 (P1AI8600)，i.v.，每週兩次，持續一周 3- mu1+1DBAcrossCH1Ck_AB002345_FV014541_IL-2v_4G2SG2 (P1AI8565)，i.v.，每週兩次，持續一周 4- mu1+1DBAcrossCH1Ck_AB002345_FV020519_IL-2v_4G2SG2 (P1AI8564)，i.v.，每週兩次，持續一周 5- mu1+1scFv_AB002345_AB003058_IL-2v_4G2SG2_4G2SG2 (P1AI8589)，i.v.，每週兩次，持續一周 6- huPD-1-muIgG1-DAPD-DD/KK 與 muIL-2v (muPD-IL-2v) (P1AE2791)，i.v.，每週兩次，持續一周 7- 帕博利珠單抗，i.v.，每週兩次，持續一周 8- 組胺酸緩衝液，i.v.
表 23. 第 1 至 7 組的處理條件。
化合物 供應商/ 批次 ID 劑量 / 小鼠
mu1+1DBA 非交叉_AB002345_FV020519_IL-2v_4G2SG2 Roche，P1AI8597-001 200 μg
mu1+1DBA 非交叉_AB003637_FV020519_IL-2v_4G 2SG 2 Roche，P1AI8600-001 200 μg
mu1+1DBA 交叉 CH1Ck_AB002345_FV014541_IL-2v_4G 2SG 2 Roche，P1AI8565-001 200 μg
mu1+1DBA 交叉 CH1Ck_AB002345_FV020519_IL-2v_4G 2SG 2 Roche，P1AI8564-001 200 μg
mu1+1scFv_AB002345_AB003058_IL-2v_4G 2SG 2_4G 2SG 2 Roche，P1AI8589-001 200 μg
huPD-1-muIgG1-DAPD-DD/KK mit muIL-2v Roche，P1AE2791-003 10 μg
帕博利珠單抗 Keytruda®，MSD 200 μg
全部經靜脈內注射 (i.v.) 之小鼠皆接受 200 µl 的適當溶液 (例如，含有適當劑量之免疫結合物/抗體)。媒劑組 (亦即第 8 組) 的小鼠係經注射 200 µl 組胺酸緩衝液，且治療組係經注射 10 mg/kg 之 PD-1-reg-IL-2v 構建體或 muPD-1-IL-2v 0.5 mg/ kg 或帕博利柱單抗 10 mg/kg ( 表 23)。為獲得每 200 µl 適量之免疫結合物，將儲備溶液用組胺酸緩衝液稀釋。腫瘤生長之後進行卡尺測量，並將資料轉移到 Graph Pad 進行可視化及統計分析。腫瘤生長資料係顯示於 圖 14中。
最後一次投予後 3 天，處死每組 (4 隻小鼠/組) 的前哨小鼠並評估肺重量，如 圖 15中。對於該測量，切除肺部並將其放置在天平上並測量重量，並且使用 Graph Pad Prism 記錄以在組之間進行比較。
另外，藉由流式細胞術對每一組 (4 隻小鼠/組) 的腫瘤及血液進行免疫藥效學 (Immuno-PD) 分析，如 圖 16A及 圖 16B中所示，該等腫瘤及血液係在最後一次療法投予後 3 天從相同的哨兵小鼠收穫。將腫瘤切成小塊並用膠原酶 D 及 DNAse I 在 37℃ 消化 30 分鐘，以便獲得單一細胞懸浮液。腫瘤單一細胞懸浮液及血液用經直接標記之抗體 (CD45-APC-Cy7、TCRb-BUV737、CD8-BV510、CD4-BUV395，R&D, Switzerland) 染色。使用 BD Fortessa 流式細胞術採集樣本。在使用 FlowJo 10.1 版進行分析後，使用 Graph Pad Prism 將結果可視化。
如 圖 14中所示，與媒劑及帕博利珠單抗組相比，PD-1-reg-IL-2v 構建體在腫瘤生長抑制方面媒介了優異的功效。其亦表明，對於大多數 PD-1-reg-IL-2v 構建體，除 P1AI8600 外，抗腫瘤功效類似於 muPD-1-IL-2v 分子。
如 圖 15中所示，在最後一次療法治療後 3 天，經 muPD-1-IL-2v 治療之小鼠的肺重量顯著增加。然而，除 P1AI8565 構建體外，經 PD-1-reg-IL-2v 治療之小鼠的肺重量與經媒劑及帕博利珠單抗治療之小鼠相當，指示 PD-1-reg-IL-2v 缺乏外周活性。
如 圖 16A及 圖 16B中所示，muPD-1-IL-2v 及 PD-1-reg-IL-2v 影響對腫瘤中 CD8 陽性 (CD8 +) T 細胞擴增的治療 ( 圖 16A)及血液 ( 圖 16B)。與媒劑組及帕博利珠單抗組相比，PD-1-reg-IL-2v 構建體及 muPD-1-IL-2v 皆增加了腫瘤中 CD8 +T 細胞的數目 ( 圖 16A)。然而，在血液中，僅 muPD-1-IL-2v 顯示 CD8 T 細胞之顯著增加 ( 圖 16B)，指示 PD-1-reg-IL-2v 分子缺乏外周活性或具有最小限度的外周活性，但 P1AI8565 構建體除外，其亦顯示血液 CD8 +T 細胞的較小增加。 實例 16. 用增加劑量的各種經 PD-1 調節之 IL-2v ( 含有一個具有阻斷或非阻斷 DBA 及一個具有阻斷或非阻斷活性之抗 PD-1 靶向臂之 IL-2v) 處理後，經活化之 PD-1 + 及 PD-1 -CD4 T 細胞上的 IL-2R 傳訊 (STAT5-P)
藉由將經活化之 PD-1 +及 PD-1 -(經抗 PD-1 預處理之) CD4 T 細胞曝露於增加濃度的免疫結合物中，各種經 PD-1 調節之 IL-2v 的效力及順式/反式傳訊係作為在該等細胞中引發 IL-2R 傳訊的能力進行測量。目的為判定經 PD-1 調節之 IL-2v 相對於 T 細胞上之 PD-1 表現的條件活性及選擇活性，以便遞送順式 IL-2R 傳訊。如實例 3 中所述來處理 CD4 T 細胞，並在 37℃ 用增加濃度的處理免疫結合物來處理 60 分鐘。
針對 PD-1 +T 細胞之劑量反應曲線提供有關所評定之分子透過 PD-1 +T 細胞上之 IL-2R 進行傳訊的效力之資訊。此外，用競爭性抗 PD-1 抗體預處理 (以防止 PD-1 對接) 之 T 細胞的劑量反應曲線顯示分子在獨立於 PD-1 表現來提供 IL-2R 傳訊中的效力，以及在經 PD-1 調節之 IL-2v 的情況下的 DBA 的洩漏程度。在 PD-1 -T 細胞與 PD-1 +T 細胞上的 EC50 之間的比率或在 PD-1 +與 PD-1 -T 細胞之間的 AUC 變化代表所測試之分子的順式活性窗口，且因此代表與 PD-1 結合並透過同一細胞上的 IL-2R 發出訊號的能力。在該特定測定中，在孵育 60 分鐘後，經 PD-1 調節之 IL-2v 顯示對 PD-1 -T 細胞具有當與 PD-IL-2v 相比時降低 32 倍的效力，且具有當與 PD-1-IL-2v 相比時改善的順式活性 (作為 EC50 倍數增加：EC50 PD-1 經阻斷/EC50 PD-1 +或 AUC 變化) ( 圖 17A及 表 24)。
如所預期，FAP-IL-2v 的效力比 PD-1-IL-2v 低，缺乏順式活性，因此無論 PD-1 表現如何，它對 T 細胞的活性皆相同 ( 圖 17A及 表 24)。
將具有一個 DBA 及一個僅 PD-1 結合物的 PD-1-reg-IL-2v 之 1+1 形式 (其中 IL-2v 係經接附至 DBA) 與具有兩個 DBA 的化合物 C 之不對稱形式 (其中 IL-2v 係經接附至一個 DBA) (WO 2021/231773 的實例 18 及圖 20 中的 2B07 IL-2 mut) 進行比較。在孵育 60 分鐘後，化合物 C 的效力比 PD-1-IL-2v 低大約 10 倍，然而，其對 PD-1 +的活性比對 PD-1 -T 細胞的活性高超過 200 倍。然而，儘管 PD-1-reg-IL-2v 僅展現出比 PD-1-IL-2v 小量倍的對 PD-1 +T 細胞之效力，與 PD-1 -T 細胞相比，PD-1-reg-IL-2v 顯示高出 1100 倍之對 PD-1 +的活性並因此具有分別比化合物 C 及 PD-1-IL-2v 高出 5 倍及 15 倍之順式活性窗 ( 圖 17A及 表 24)。此等結果說明，與具有兩種 DBA 之不對稱形式 (例如，其中一個 DBA 與 IL-2 多肽結合而一個 DBA 並未結合) 相比，具有一個 DBA 及一個僅 PD-1 結合物 (例如，抗 PD-1 抗體部分) 之 PD-1-reg-IL-2v 的 1+1 形式在增加對 PD-1 +細胞的順式活性及總體效力中具有優越性。這種更好的順式窗增加該分子的治療指數。與 1+1 格式相比，具有兩個 DBA 之不對稱格式展現出對 PD-1 陽性 T 細胞之降低的順式窗及整體較低效力 (作為較高的 EC50 值)。這可部分地藉由選擇具有更高親和力的 PD-1 靶向結合物 (例如，抗 PD-1 抗體部分) 來解釋。此外，全身性游離 IL-2 可藉由結合靶向臂中的 DBA 來干擾靶向臂中 DBA 的 PD-1 結合，從而在不對稱形式的活性之降低中發揮作用。
表 24. 用不同免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。
EC50 PD-1 + EC50 PD-1 - CIS (EC50 Bl/EC50 PD-1 +) 對 PD-1 +T 細胞的效力降低，相對於 PD-1-IL-2v AUC PD-1 + AUC Bl. PD-1 AUC 變化
PD-1-IL-2V、P1AE4422-23200 7.128 491.7 69 1.00 389 213.2 175.8
FAP-IL-2V、P1AA5355-004 397.6 449.4 1.1 55.78 222.3 218.3 4
PD-1-reg-IL-2V，P1AI7476-28583 14.6 16137 1105.3 2.05 308 83.52 224.48
化合物 C，P1AM2158-001 71.26 16974 238.2 10.00 246.4 50.29 196.11
重要的是，當將 PD-1-reg-IL-2v 與 PD-1-reg-IL-2vQ126T 進行比較時，後者在 IL-2v 中含有額外突變以進一步減少對 IL-2Rb 之結合親和力並因此增加 IL-2v 對 PD-1 表現的條件活性，觀察到 PD-1-reg-IL-2vQ126T 與 PD-1-reg-IL-2v 具有相等的對 PD-1 +T 細胞的效力。然而，PD-1-reg-IL-2vQ126T 沒有顯示對 PD-1 -T 細胞的任何活性，指示 IL-2v 中的額外突變 (例如 Q126T) 與 DBA 之掩蔽耦合能夠完全阻止與 IL-2R 之滲漏結合性及 IL-2R 傳訊，例如在不存在 PD-1 表現的情況下。( 圖 17B及 表 25)。
表 25. 用不同免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。
EC50 PD-1 + EC50 PD-1 - CIS (EC50 Bl./EC50 PD-1 +) 對 PD-1 +T 細胞的效力降低，相對於 PD-1-IL-2v AUC PD‑1 + AUC Bl.PD-1 AUC 變化
PD-1-reg-IL-2V，P1AI7476-28583 14.6 16137 1105.3 2.05 308 83.52 224.48
PD-1-reg-IL-2v Q126T， P1AL2287-016 7.293 不適用 不適用 1.02 262.1 48.59 213.51
bl.：經阻斷 實例 17.PD-1-reg-IL-2v 構建體對 PD-1 +T 細胞優於 NK 細胞的條件活性，以評定雙重阻斷抗體的滲漏性
為了評定 PD-1-reg-IL-2v 構建體是否對 PD-1 +T 細胞具有條件活性且對 PD-1 -細胞 (如 NK 細胞，然而該等細胞所表現的 IL-2Rb 比 T 細胞高 10 倍) 無活性，對以 1:5 比率與新鮮經分離之 PBMC 共培養的經活化之 T 細胞進行劑量反應競爭測定。如實例 10 中所述來處理 CD4 T 細胞、CD8 T 細胞及 NK 細胞，並在 37℃ 用增加濃度的處理免疫結合物來處理 60 分鐘。
PD-1-IL-2v 在表現 PD-1 的 CD4 ( 圖 18A) 及 CD8 T 細胞 ( 圖 18B) 上引發 IL-2R 傳訊的效力比在新鮮 NK 細胞上 ( 圖 18C) 高出超過 100 倍。PD-1-reg-IL-2v 及 PD-1-reg-IL-2vQ126T 對 PD-1 +CD8 及 CD4 T 細胞的活性僅比 PD-1-IL-2v 降低 2 至 8 倍。然而，PD-1-reg-IL-2v 對 NK 細胞具有一定程度的活性，指示 DBA 的洩漏，儘管與 PD-1-IL-2v 及 FAP-IL-2v 相比，這種洩漏大大減少。重要的是，PD-1-reg-IL-2vQ126T 對 NK 細胞完全無活性，支持免疫結合物的選擇性條件活性，例如，IL-2v 的活性由 PD-1 表現嚴格地調節 ( 圖 18A 至圖 18C ）。
結果係總結於於下 表 26中。
表 26. 免疫結合物對經活化之 CD4/CD8 細胞及 NK 細胞的條件活性。 資料顯示為 EC50 。
PD-1-IL-2v FAP-IL-2v PD-1-reg-IL-2v PD-1-reg-IL-2vQ126T
經活化之 CD4 0.9759 758.9 7.302 7.795
經活化之 CD8 2.445 400.1 9.967 5.942
NK 細胞 458.5 229.4 N.D. N.D.
實例 18 在 HEK-Blue™ IL-2 報告細胞株上用增加劑量的經 PD-1 調節之 IL-2v 處理後，受質的比色變化。
為了評定 DBA 之掩蔽在非生理條件下的滲漏性，使用 HEK-Blue™ IL‑2 報告細胞株，其表現的 IL-2R β 比經活化之 PD-1 +T 細胞多大約 30 倍。
HEK-Blue™ IL-2 報告細胞業經專門設計以藉由用人 CD25 (IL-2Rα)、CD122 (IL-2Rβ) 及 CD132 (IL-2Rγ) 基因連同人 JAK3 及 STAT5 基因對 HEK293 細胞進行穩定轉染來活化 JAK-STAT 路徑以獲得完全活躍的 IL-2 傳訊路徑，從而檢測人 IL-2/IL-15。此外，亦引入 STAT5 誘導型經分泌之胚胎鹼性磷酸酶 (SEAP) 報告基因。在 IL-2 刺激後，HEK-Blue™ IL-2 細胞觸發 JAK/STAT5 活化及隨後的 SEAP 之分泌，可使用 QUANTI-Blue™ 溶液輕易地對其進行監測。
依照製造商的說明來培養及製備細胞，並在 37℃ 曝露於劑量增加濃度的 IL-2 免疫結合物中達 24 小時。然後收穫經培養之細胞的上清液，並將其與 QUANTI-Blue™ 溶液一起置於平底板中達 6 小時，然後使用分光光度計在 620-655 nm 處測量 SEAP 含量。
描繪分光光度計所測量之吸光度之劑量反應曲線指示，由於每個單一細胞之 IL‑2v 與高密度 IL-2R 的高親合力結合，在不存在 PD-1 表現的情況下之免疫結合物的活性。因此，該測定對於檢測及增強 DBA 掩蔽的甚至微弱洩漏係有用的 ( 圖 19及 表 27)。
PD-1-IL-2v 及 FAP-IL-2v 誘導 SEAP 元件的類似劑量反應活化，隨後與 PD-1-IL-2v 相比，PD-1-reg-IL-2v 的效力降低超過 300 倍。重要的是，PD-1-reg-IL-2vQ126T 並未觸發 SEAP 元件之活化，進一步支持以下結論：DBA 掩蔽及 IL-2v 的額外突變 (亦即 Q126T) 導致僅在存在 PD-1 受體的情況下發生 IL-2v 與 IL-2R 之條件交相互作用，從而降低免疫結合物的滲漏 ( 圖 19及 表 27)。
表 27. 用不同免疫結合物處理後， HEK-Blue™ IL-2 報告細胞株的 SEAP 下游 IL-2R 傳訊活性。
EC50 AUC 效力降低，相對於 PD-1-IL-2v EC50
PD-1-IL-2v 32.26 1.572 1
FAP-IL-2v 47.69 1.413 1.478301
PD-1-reg-IL-2v 10820 0.4325 335.3999
PD-1-reg-IL-2vQ126T 2.76E-08 0.02794 8.54E-10
實例 19. 在用增加劑量的具有 10 聚體及 20 聚體連接子之經 PD-1 調節之 IL-2vQ126T 處理後，經活化之 PD-1 + 及 PD-1 -CD4 T 細胞上的 IL-2R 傳訊 (STAT5-P)
藉由將經活化之 PD-1 +及 PD-1 -(經抗 PD-1 預處理之) CD4 T 細胞曝露於增加濃度的免疫結合物中，具有不同連接子長度之經 PD-1 調節之 IL-2vQ126T 的效力及順式/反式傳訊係作為在該等細胞中引發 IL-2R 傳訊的能力進行測量。目的為判定經 PD-1 調節之 -IL-2v 相對於 T 細胞上之 PD-1 表現的條件活性及選擇活性是否受到連接子長度的影響。為此，來自健康捐贈者 PBMC 的 CD4 T 細胞係如實例 3 中所述進行處理、活化及獲取。
針對 PD-1 +T 細胞之劑量反應曲線提供有關所評定之分子透過 PD-1 +T 細胞上之 IL-2R 進行傳訊的效力之資訊。此外，用競爭性抗 PD-1 抗體預處理 (以防止 PD-1 對接) 之 T 細胞的劑量反應曲線顯示分子在獨立於 PD-1 表現來提供 IL-2R 傳訊中的效力，並且因此顯示 DBA 的洩漏程度。在 PD-1 +與 PD-1 -T 細胞之間的 AUC 變化代表所測試分子的順式活性窗口，並且因此代表與 PD-1 結合並透過同一細胞上的 IL‑2R 發出訊號的能力。
經 PD-1 調節之 IL-2vQ126T 10 聚體及 20 聚體連接子顯示對 PD-1 +T 細胞具有相當的效力，對 PD-1 -T 細胞沒有活性，並且具有改善的順式活性窗口，如在孵育 60 分鐘後的 AUC 變化 ( 圖 20及 表 28)。EC50 資料報告為 EC50 倍數增加。因此，連接子的長度不影響經 PD-1 調節之 IL-2vQ126T 對 PD-1 +T 細胞的效力，也不影響其對 PD-1 -T 細胞無活性或 PD-1 依賴性條件活性。
表 28. 用不同免疫結合物處理後的 IL-2R 傳訊活性。 EC50 對應於 EC50 。
EC50 PD-1 + EC50 PD-1 - AUC PD-1 + AUC Bl.PD-1 AUC 變化
PD-1-reg-IL-2vQ126T 20 聚體， P1AL2287-016 7.293 N.D. 262.1 65.98 213.51
PD-1-reg-IL-2vQ126T 10 聚體， P1AL2287-016 6.844 N.D. 238 39.32 198.68
Bl.：經阻斷 實施例1.一種免疫結合物，其包含： (a) 第一結合域，其包含： (i) IL-2 多肽； (ii) 連接子；及 (iii) 雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分包含重鏈可變區 (VH) 及輕鏈可變區 (VL)， 其中 IL-2 多肽、連接子及 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端，且 其中第一結合域係經組態以使得： (i) 當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且 (ii) 當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係實質上經阻斷與 IL-2 多肽結合，且 IL-2 多肽能夠與 IL-2 受體結合；以及 (b) 第二結合域，其包含含有 VH 及 VL 之抗 PD-1 抗體部分。 2.如實施例 1 之免疫結合物，其中抗 PD-1 抗體部分實質上不與 IL-2 多肽結合。 3.如實施例 1 或 2 之免疫結合物，其中 DBA 部分包含 Fab 分子。 4.如實施例 3 之免疫結合物，其中 DBA 部分包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及重鏈恆定域 1 (CH1)；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈恆定域 (CL)，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。 5.如實施例 3 之免疫結合物，其中 DBA 部分為習知 Fab 分子。 6.如實施例 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中抗 PD-1 抗體部分包含 Fab 分子。 7.如實施例 6 之免疫結合物，其中抗 PD-1 抗體部分包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。 8.如實施例 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 該 DBA 部分係習知 Fab 分子；且 (b) 抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換，或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。 9.如實施例 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 該 DBA 部分係習知 Fab 分子；且 (b) 抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換。 10.如實施例 6 之免疫結合物，其中抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。 11.如實施例 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中： (a) DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此替換或 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且 (b) 抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。 12.如實施例 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中： (a) DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈 CL，其中 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且 (b) 該抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。 13.如實施例 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中抗 PD-1 抗體部分為單鏈可變片段 (scFv)。 14.如實施例 1 至 13 中任一項之免疫結合物，其進一步包含含有第一次單元及第二次單元之 Fc 域。 15.如實施例 1 至 14 中任一項之免疫結合物，其中 (a) DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端；且/或 (b) 抗 PD-1 抗體部分及第二次單元係以下列方向連接：N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。 16.如實施例 14 或 15 之免疫結合物，其中 Fc 域為 IgG Fc 域。 17.如實施例 16 之免疫結合物，其中 IgG Fc 域為 IgG 1Fc 域。 18.如實施例 14 至 17 中任一項之免疫結合物，其中 Fc 域為人 IgG Fc 域。 19.如實施例 14 至 18 中任一項之免疫結合物，其中第一次單元包含選自第一 CH2 (CH2 1) 域及/或第一 CH3 (CH3 1) 域的一個或多個 CH 域；且第二次單元包含選自第二 CH2 (CH2 2) 域及/或第二 CH3 (CH3 2) 域的一個或多個 CH 域。 20.如實施例 19 之免疫結合物，其中該一個或多個 CH 域中之至少一者與另一 CH 域配對。 21.如實施例 20 之免疫結合物，其中 CH3 1域及 CH3 2域各包含隆凸或腔窩，且其中在 CH3 1域中的隆凸或腔窩分別可定位於在 CH3 2域中的腔窩或隆凸中。 22.如實施例 21 之免疫結合物，其中 CH3 1域及 CH3 2域在隆凸與腔窩之間的界面處相接。 23.如實施例 20 至 22 中任一項之免疫結合物，其中 CH2 1域及 CH2 2域各包含隆凸或腔窩，且其中在 CH2 1域中的隆凸或腔窩分別可定位於在 CH2 2域中的腔窩或隆凸中。 24.如實施例 23 之免疫結合物，其中 CH2 1域及 CH2 2域在隆凸與腔窩之間的界面處相接。 25.如實施例 14 至 24 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (b) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。 26.如實施例 14 至 25 中任一項之免疫結合物，其中第一次單元及/或第二次單元包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。 27.如實施例 1 至 26 中任一項之免疫結合物，其中 DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 的不同抗原決定基結合。 28.如實施例 1 至 26 中任一項之免疫結合物，其中 DBA 部分及抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 的相同抗原決定基結合。 29.如實施例 1 至 28 中任一項之免疫結合物，其中 DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合且/或抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。 30.如實施例 1 至 28 中任一項之免疫結合物，其中 DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合，或抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。 31.如實施例 1 至 27、29 及 30 中任一項之免疫結合物，其中： (a) DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合；或 (b) DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合且抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。 32.如實施例 1 至 31 中任一項之免疫結合物，其中 DBA 部分包含下列六個互補決定區 (CDR)： (a) CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；或 (b) CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列。 33.如實施例 32 之免疫結合物，其中 DBA 部分包含： (a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (b) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (d) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。 34.如實施例 33 之免疫結合物，其中 DBA 部分包含： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列； (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；或 (d) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列。 35.如實施例 1 至 34 中任一項之免疫結合物，其中抗 PD-1 抗體部分包含下列六個 CDR： (a) CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列； (b) CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列；或 (c) CDR-H1，其包含 SYWMS (SEQ ID NO: 10) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGSGGSRYYAESVKG (SEQ ID NO: 11) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 SPLQWIDV (SEQ ID NO: 12) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 1) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 EASSLQS (SEQ ID NO: 2) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQANQFPFT (SEQ ID NO: 3) 之胺基酸序列。 36.如實施例 35 之免疫結合物，其中抗 PD-1 抗體部分包含： (a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (b) VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。 37.如實施例 36 之免疫結合物，其中抗 PD-1 抗體部分包含： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列； (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。 38.如實施例 1 至 31 中任一項之免疫結合物，其中： (a) (i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列； (b) (i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列；或 (c) (i) DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列。 39.如實施例 38 之免疫結合物，其中： (a) (i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (b) (i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (c) (i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (d) (i) DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。 40.如實施例 39 之免疫結合物，其中： (a) (i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列； (b) (i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列； (c) (i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；或 (d) (i) DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列。 41.如實施例 1 至 40 中任一項之免疫結合物，其中連接子的長度為介於 5 至 30 個胺基酸之間。 42.如實施例 41 之免疫結合物，其中連接子的長度為 20 個胺基酸。 43.如實施例 1 至 41 中任一項之免疫結合物，其中連接子包含胺基酸序列 (G 2SG 2) x，其中 x 為在 1 至 6 之間的整數 (SEQ ID NO: 149 至 154)。 44.如實施例 43 之免疫結合物，其中 x 為 2 (SEQ ID NO: 150) 或 4 (SEQ ID NO: 152)。 45.如實施例 1 至 44 中任一項之免疫結合物，其中 IL-2 多肽係以下列方向連接至 DBA 部分的 VH：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[VH]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。 46.如實施例 1 至 44 中任一項之免疫結合物，其中 IL-2 多肽係以下列方向連接至 DBA 部分的 VL：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[VL]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。 47.如實施例 1 至 46 中任一項之免疫結合物，其中 IL-2 多肽為突變型人 IL-2 多肽，其包含在位置 3 處的丙胺酸殘基、在位置 42 處的丙胺酸殘基、在位置 45 處的丙胺酸殘基、在位置 72 處的甘胺酸殘基及/或在位置 125 處的丙胺酸殘基 (相對於 SEQ ID NO: 147 的人 IL-2 序列編號)。 48.如實施例 47 之免疫結合物，其中突變型人 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列。 49.如實施例 1 至 46 中任一項之免疫結合物，其中 IL-2 多肽為突變型人 IL-2 多肽，其包含在位置 3 處的丙胺酸殘基、在位置 42 處的丙胺酸殘基、在位置 45 處的丙胺酸殘基、在位置 72 處的甘胺酸殘基、在位置 125 處的丙胺酸殘基及/或在位置 126 處的蘇胺酸殘基 (相對於 SEQ ID NO: 147 的人 IL-2 序列編號)。 50.如實施例 49 之免疫結合物，其中突變型人 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列。 51.如請求項 1 至 50 中任一項之免疫結合物，其中 PD-1 為人 PD-1。 52.一種免疫結合物，其包含： (a) 第一結合域，其包含： (i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列； (ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 150 或 152 之胺基酸序列；及 (iii) DBA 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈， 其中該 IL-2 多肽、該連接子、及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且 其中當 DBA 部分係與 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且當 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與 IL-2 多肽結合，且 IL-2 多肽能夠與其受體結合； (b) (b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元， 其中： (i) 第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且 其中第一次單元及第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)， 其中 DBA 部分及第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端， 其中該抗 PD-1 抗體部分及該第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中： (a) DBA 部分為習知 Fab 分子；且抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含抗 PD-1 抗體部分之 VL 及 CL，其中 Fab 重鏈之 VH 及 Fab 輕鏈之 VL 係經彼此；或 (b) DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含 DBA 部分之 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含 DBA 部分之 VL 及輕鏈 CL，其中 Fab 重鏈之 CH1 及 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。 53.一種免疫結合物，其包含： (a) 第一結合域，其包含： (i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列； (ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 152　之胺基酸序列；及 (iii) DBA 部分，其與 PD-1 及該 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中該 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈， 其中該 IL-2 多肽、該連接子、及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中當該 DBA 部分係與該 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且當該 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與該 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合； (b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元， 其中： (i) 該第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 該第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，且 其中該第一次單元及該第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)， 其中該 DBA 部分及該第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端， 其中該抗 PD-1 抗體部分及該第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中： (a) 該 DBA 部分為習知 Fab 分子；且該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VL 及 CL，其中該 Fab 重鏈之該 VH 及該 Fab 輕鏈之該 VL 係經彼此替換；或 (b) 該 DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該 DBA 部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該 DBA 部分之該 VL 及輕鏈 CL，其中該 Fab 重鏈之該 CH1 及該 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且該抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。 54.一種免疫結合物，其包含： (a) 第一結合域，其包含： (i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列； (ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 150 或 152 之胺基酸序列；及 (iii) 雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈， 其中該 IL-2 多肽、該連接子、及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中當該 DBA 部分係與該 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且當該 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與該 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合； (b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為包含 VH 及 VL 之 scFv；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元， 其中： (i) 該第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 該第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，且 其中該第一次單元及該第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)， 其中該 DBA 部分及該第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，並且 其中該抗 PD-1 抗體部分及該第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。 55.如實施例 1 至 51 中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物包含： (a) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (b) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (c) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (d) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (e) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (f) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (g) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (h) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (i) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。 56.如實施例 55 之免疫結合物，其中該免疫結合物包含： (a) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列； (b) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列； (c) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列； (d) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列； (e) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列； (f) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列； (g) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列； (h) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列；或 (i) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。 57.一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。 58.一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。 59.一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列。 60.一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列。 61.一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。 62.一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。 63.一種經分離之多核苷酸或一組經分離之多核苷酸，其編碼如實施例 1 至 62 中任一項之免疫結合物。 64.一種載體或一組載體，其包含如實施例 63 之經分離之多核苷酸或該組經分離之多核苷酸。 65.一種宿主細胞或一組宿主細胞，其包含 (i) 如實施例 63 之經分離之多核苷酸或該組經分離之多核苷酸，或 (ii) 如實施例 64 之載體或該組載體。 66.一種生產免疫結合物之方法，其包含以下步驟：(a) 在適合於表現該免疫結合物的條件下培養如實施例 65 之宿主細胞或該組宿主細胞。 67.如實施例 66 之方法，其進一步包含回收免疫結合物。 68.如實施例 66 之方法，其中宿主細胞表現第一結合域及第二結合域。 69.如實施例 66 之方法，其中第一宿主細胞表現第一結合域，且第二宿主細胞表現第二結合域。 70.如實施例 68 或 69 之方法，其進一步包含回收第一結合域及第二結合域。 71.如實施例 70 之方法，其進一步包含使經回收之第一結合域與經回收之第二結合域接觸。 72.一種免疫結合物，其藉由如實施例 66 至 71 中任一項之方法所生產。 73.一種醫藥組成物，其包含如實施例 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物及醫藥上可接受之載劑。 74.如實施例 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如實施例 73 之醫藥組成物，其用為藥物。 75.一種如實施例 1 至 62 及 72 中任一者之免疫結合物或如實施例 73 之醫藥組成物在製造藥物中之用途。 76.一種如實施例 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如實施例 73 之醫藥組成物，其使用於治療有需要之個體的癌症。 77.一種如實施例 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如實施例 73 之醫藥組成物在製造用於治療有需要之個體的癌症的藥物中之用途。 78.一種如實施例 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如實施例 73 之醫藥組成物用於治療有需要之個體的癌症之用途。 79.一種治療個體的癌症之方法，該方法包含向該個體投予有效量之如實施例 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如實施例 73 之醫藥組成物。 80.如實施例 76 至 79 中任一項之使用之免疫結合物、使用之醫藥組成物、用途或方法，其中癌症為 PD-1 陽性癌症。 81.如實施例 76 至 79 中任一項之使用之免疫結合物、使用之醫藥組成物、用途或方法，其進一步包含向個體投予額外治療劑。 序列之列表
本文所揭露之序列提供於下 表 29中。
表 29. 本文所揭示之序列的列表。
SEQ ID NO 描述 序列
1 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 CDR-L1 RASQGISSWLA
2 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 CDR-L2 EASSLQS
3 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 CDR-L3 QQANQFPFT
4 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANQFPFTFGPGTKVDIK
5 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANQFPFT FGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
6 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 FR-L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
7 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 FR-L2 WYQQKPGKAPKLLIY
8 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 FR-L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
9 D1AN8723 LC 非交叉 ＜PD1＞ AB003058 FR-L4 FGPGTKVDIK
10 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 CDR-H1 SYWMS
11 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 CDR-H2 AISGSGGSRYYAESVKG
12 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 CDR-H3 SPLQWIDV
13 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSRYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWIDVWGQGTTVTVSS
14 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSRYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWIDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
15 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 FR-H1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
16 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 FR-H2 WVRQAPGKGLEWVS
17 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 FR-H3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS
18 C2184287900 HC ＜PD1＞ AB003058 FR-H4 WGQGTTVTVSS
19 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 CDR-L1 KASESVDTSDNSFIH
20 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 CDR-L2 RASTLES
21 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 CDR-L3 QQNYDVPWT
22 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRASTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
23 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 LC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRASTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
24 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 FR-L1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC
25 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 FR-L2 WYQQKPGQSPKLLIY
26 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 FR-L3 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
27 D1AM6911 LC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 FR-L4 FGQGTKVEIK
28 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 CDR-H1 SYTMS
29 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 CDR-H2 AISGGGRDIYYPDSVKG
30 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 CDR-H3 LTGRVYFALDS
31 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS
32 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
33 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 FR-H1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFS
34 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 FR-H2 WVRQAPGKGLEWVS
35 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 FR-H3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVL
36 D1AN8736 HC ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 FR-H4 WGQGTLVTVSS
37 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 CDR-L1 RASQSISSYLN
38 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 CDR-L2 TASSLQS
39 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 CDR-L3 QQSYSTPLT
40 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
41 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
42 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 FR-L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
43 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 FR-L2 WYQQKPGKAPKLLIY
44 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 FR-L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
45 D1AN8721 LC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 FR-L4 FGGGTKVEIK
46 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 CDR-H1 SYAMS
47 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 CDR-H2 VITGSGGSTYYADSVKG
48 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 CDR-H3 GEGYAGSSYFRASDI
49 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEGYAGSSYFRASDIWGQGTMVTVSS
50 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEGYAGSSYFRASDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
51 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 FR-H1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
52 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 FR-H2 WVRQAPGKGLEWVS
53 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 FR-H3 RFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
54 D1AK1422 HC ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 FR-H4 WGQGTMVTVSS
55 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 CDR-L1 RASQSIGRYLA
56 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 CDR-L2 SASNLET
57 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 CDR-L3 QQYNSFPVT
58 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIK
59 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
60 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 FR-L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
61 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 FR-L2 WYQQKPGKAPKLLIY
62 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 FR-L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
63 D1AW0211 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 FR-L4 FGPGTKVDIK
64 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 CDR-H1 RYYVH
65 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 CDR-H2 IINPSGGYASYAQKFQG
66 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 CDR-H3 GLFI
67 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSS
68 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 HC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
69 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 FR-H1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFT
70 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 FR-H2 WVRQAPGQGLEWMG
71 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 FR-H3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAA
72 C2184287921 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 FR-H4 WGQGTLVTVSS
73 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 CDR-L1 RASQGIRNDLG
74 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 CDR-L2 GASSLQS
75 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 CDR-L3 QESYTSSNT
76 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGQGTKLEIK
77 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
78 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 FR-L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
79 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 FR-L2 WYQQKPGKAPKLLIY
80 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 FR-L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
81 D1AN8686 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 FR-L4 FGQGTKLEIK
82 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 CDR-H1 AYYIH
83 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 CDR-H2 WIHPYSGMTNYAQKFQG
84 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 CDR-H3 GHYYGKTDY
85 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIGHYYGKTDYWGQGTLVTVSS
86 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 HC QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIGHYYGKTDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
87 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 FR-H1 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFT
88 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 FR-H2 WVRQAPGQGLEWMG
89 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 FR-H3 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAI
90 C2184287898 HC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 FR-H4 WGQGTLVTVSS
91 D1AW0227 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 去免疫化的 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGGGTKLTVL
92 D1AW0227 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 去免疫化的 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
93 D1AN8694 LC 非交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIK
94 D1AN8694 LC 非交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
95 D1AN8695 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSS
96 D1AN8695 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 HC APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
97 D1AN8697 LC 交叉 ＜PD1＞ AB003058 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSRYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWIDVWGQGTTVTVSS
98 D1AN8697 LC 交叉 ＜PD1＞ AB003058 LC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSRYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWIDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
99 D1AN8696 HC 臼 ＜PD1＞ AB003058VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANQFPFTFGPGTKVDIK
100 D1AN8696 HC 臼 ＜PD1＞ AB003058HC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANQFPFTFGPGTKVDIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
101 D1AN8698 LC 非交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGQGTKLEIK
102 D1AN8698 LC 非交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
103 D1AN8699 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIGHYYGKTDYWGQGTLVTVSS
104 D1AN8699 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 HC APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIGHYYGKTDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
105 D1AN8700 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRASTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
106 D1AN8700 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 HC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRASTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
107 D1AN8701 LC 交叉 ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS
108 D1AN8701 LC 交叉 ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 LC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
109 D1AR7303 LC 非交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 去免疫化的 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGGGTKLTVL
110 D1AR7303 LC 非交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 去免疫化的 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
111 D1AR7306 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 去免疫化的 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGHYYGKTDYWGQGTLVTVSS
112 D1AR7306 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 去免疫化的 HC APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGHYYGKTDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
113 D1AN8717 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGQGTKLEIK
114 D1AN8717 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
115 D1AN8718 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIGHYYGKTDYWGQGTLVTVSS
116 D1AN8718 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 HC APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIGHYYGKTDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
117 D1AM6910 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS
118 D1AM6910 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
119 D1AM6911 LC 非交叉 ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRASTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
120 D1AM6911 LC 非交叉 ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 LC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRASTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
121 D1AN8719 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIK
122 D1AN8719 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
123 D1AN8720 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSS
124 D1AN8720 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 HC APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
125 D1AL8214 HC 臼 ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEGYAGSSYFRASDIWGQGTMVTVSS
126 D1AL8214 HC 臼 ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEGYAGSSYFRASDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
127 D1AN8721 LC 非交叉 ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
128 D1AN8721 LC 非交叉 ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
129 D1AN8722 HC 臼 ＜PD1＞ AB003058 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSRYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWIDVWGQGTTVTVSS
130 D1AN8722 HC 臼 ＜PD1＞ AB003058 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSRYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWIDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
131 D1AN8723 LC 交叉 ＜PD1＞ AB003058 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANQFPFTFGPGTKVDIK
132 D1AN8723 LC 交叉 ＜PD1＞ AB003058 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANQFPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
133 D1AR5691 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIK
134 D1AR5691 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
135 D1AN8689 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSS
136 D1AN8689 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 HC APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
137 D1AR5695 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGQGTKLEIK
138 D1AR5695 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYTSSNTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
139 D1AN8687 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIGHYYGKTDYWGQGTLVTVSS
140 D1AN8687 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 HC APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIHPYSGMTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIGHYYGKTDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
141 D1AN8690 HC 臼 scFv-VLVH ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 HC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRASTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
142 D1AN8691 HC 臼 scFv-VLVH ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 HC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEGYAGSSYFRASDIWGQGTMVTVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
143 D1AN8693 HC 臼 scFv-VLVH ＜PD1＞ AB003058 HC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANQFPFTFGPGTKVDIKGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSRYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWIDVWGQGTTVTVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
144 D1AW0212 HC 臼 scFv-VHVL ＜PD1＞ AB003058 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSRYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWIDVWGQGTTVTVSSGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANQFPFTFGPGTKVDIKDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
145 D1AW0216 HC 臼 scFv-VHVL ＜PD1＞ 0376 去免疫化的 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRASTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
146 T3A、F42A、Y45A、L72G 及 C125A IL-2 APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
147 人 IL-2 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLE EELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR WITFCQSIISTLT
148 IL-2 (C125A) APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
149 GGSGGn 連接子 n=1 GGSGG
150 GGSGGn 連接子 n=2 GGSGGGGSGG
151 GGSGGn 連接子 n=3 GGSGGGGSGGGGSGG
152 GGSGGn 連接子 n=4 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
153 GGSGGn 連接子 n=5 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
154 GGSGGn 連接子 n=6 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
155 D1AW0227 LC ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637FR-L4 FGGGTKLTVL
156 D1AR7306 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB003637 去免疫化的 FR-H3 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
157 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 CDR-L1 KASESVDTSDNSFIH
158 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 CDR-L2 RSSTLES
159 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 CDR-L3 QQNYDVPWT
160 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
161 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 LC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
162 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 FR-L1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCK
163 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 FR-L2 WYQQKPGQSPKLLIY
164 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 FR-L3 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
165 D1AD1004 LC ＜PD1＞ 0376 FR-L4 FGQGTKVEIK
166 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 CDR-H1 SYTMS
167 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 CDR-H2 TISGGGRDIYYPDSVKG
168 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 CDR-H3 LTGRVYFALDS
169 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS
170 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSAPASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
171 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 FR-H1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFS
172 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 FR-H2 WVRQAPGKGLEWVA
173 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 FR-H3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVL
174 D1AD1003 HC 杵 ＜PD1＞ 0376 FR-H4 WGQGTLVTVSS
175 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 CDR-H1 SYTMS
176 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 CDR-H2 TISGGGRDIYYPDSVKG
177 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 CDR-H3 LTGRVYFALDS
178 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS
179 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
180 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 FR-H1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFS
181 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 FR-H2 WVRQAPGKGLEWVA
182 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 FR-H3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVL
183 D1AD1226 HC 臼 ＜PD1＞ 0376 FR-H4 WGQGTLVTVSS
184 D1AN8668 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSS
185 D1AN8668 LC 交叉 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 LC APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
186 D1AN8669 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIK
187 D1AN8669 HC 杵 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 HC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSFPVTFGPGTKVDIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
188 D1AN0599 HC 臼 ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEGYAGSSYFRASDIWGQGTMVTVSS
189 D1AN0599 HC 臼 ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEGYAGSSYFRASDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
190 D1AN0600 LC 非交叉 ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
191 D1AN0600 LC 非交叉 ＜PD1＞ 1040 親和力成熟之 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
192 GGGGSn 連接子 n=1 GGGGS
193 GGGGSn 連接子 n=2 GGGGSGGGGS
194 GGGGSn 連接子 n=3 GGGGSGGGGSGGGGS
195 GGGGSn 連接子 n=4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
196 C2184344765 HC 臼 ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFT RYYVHWVRQAPGQGLEWMG IINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAA GLFIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
197 D1BA2202 HC 杵 IL2v-Q126T - ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFATSIISTLTGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
198 D1BE4057 HC 杵 IL2v-Q126T - ＜PD1＞/＜IL2＞ AB002345 APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFATSIISTLTGGSGGGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFTRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGYASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAGLFIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
199 IL-2 (Q126T) APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFATSIISTLT
其他實施例
儘管為了清楚理解起見，藉由圖示及實例的方式對上述發明進行了詳細描述，但是此等描述及實例不應被解釋是限製本發明之範圍。本文引用的所有專利及科學文獻的揭露內容皆以引用的方式明確納入其所有內容。
圖 1顯示針對不同 PD-1 結合物的 PD-1/PD-L1 阻斷生物測定之結果。7G12 構建體包括抗 PD-1 部分 AB003058。「常開 (Always on)」構建體含有 0376 結合物。同型為陰性對照。 圖 2顯示經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物作為 IL-2R 傳訊的效力及順式/反式傳訊。PD-1-IL-2v：常開 PD-1-IL-2 構建體 (亦即，「常開 P1AE4422-14542」)；FAP-IL-2V：非標靶 IL-2 多肽；AF5842：PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物。預阻斷：用競爭性抗 PD-1 進行預阻斷。 圖 3A及 圖 3B顯示各種免疫結合物在活化 IL-2 受體 (IL-2R) 傳訊中的效力及順式/反式傳訊。 圖 3A為顯示該測定之結果的圖。 圖 3B顯示所測試之分子的結構及方向。Fc 區中之新月形/圓形顯示杵入臼修飾。實心圓顯示 IL-2 多肽。未圖案化之 VH/VL 指示 DBA 部分。圖案化之 VH/VL 指示抗 PD-1 抗體部分。bl.：阻斷。 圖 4A及 圖 4B顯示各種免疫結合物在活化 IL-2R 傳訊中的效力及順式/反式傳訊。 圖 4A為顯示該測定之結果的圖。 圖 4B顯示所測試之分子的結構及方向。Fc 區中之新月形/圓形顯示杵入臼修飾。實心圓顯示 IL-2 多肽。未圖案化之 VH/VL 指示 DBA 部分。條紋圖案化之 VH/VL 指示抗 PD-1 抗體部分。方格圖案化之 VH/VL 指示非阻斷 DBA 部分。對於代表 VH/VL 或 CH1/CL 之各對圓柱體：深色圓柱體代表 VH 或 CH1，且淺色圓柱體代表 CL 或 CH1。b 或 bl.：阻斷；nb：非阻斷。 圖 5A及 圖 5B顯示各種免疫結合物在活化 IL-2R 傳訊中的效力及順式/反式傳訊。 圖 5A為顯示該測定之結果的圖。 圖 5B顯示所測試之分子的結構及方向。Fc 區中之新月形/圓形顯示杵入臼修飾。實心圓顯示 IL-2 多肽。未圖案化之 VH/VL 指示 DBA 部分。條紋圖案化之 VH/VL 指示抗 PD-1 抗體部分。方格圖案化之 VH/VL 指示非阻斷 DBA 部分。對於代表 VH/VL 或 CH1/CL 之每對圓柱體：深色圓柱體代表 VH 或 CH1，且淺色圓柱體代表 CL 或 CH1。P1AI7462 包含抗 PD-1 抗體部分之 scFV。b 或 bl.：阻斷；nb：非阻斷。 圖 6顯示經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物在活化 IL-2R 傳訊中的效力及順式/反式傳訊。bl.：阻斷 圖 7A及 圖 7B顯示各種免疫結合物引發細胞毒性 T 細胞效應功能的能力。最小 MLR：最小混合淋巴球反應。 圖 7A說明該測定。 圖 7B顯示針對不同免疫結合物構建體的測定之結果。 圖 8A及 圖 8B顯示經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物從 T reg抑制中救援習知 T conv效應功能的能力。 圖 8A說明該測定。 圖 8B顯示救援測定之結果。每個符號代表單獨的供體，水平線表示來自 3 個獨立實驗的 N = 9 個供體之中值。使用單向 ANOVA 計算 P (*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001)。 圖 9A 至圖 9C顯示各種免疫結合物在活化 IL-2R 傳訊中的效力及順式/反式傳訊。 圖 9A說明該測定。 圖 9B顯示所測試之分子的結構及方向。Fc 區中之新月形/圓形顯示杵入臼修飾。實心圓顯示 IL-2 多肽。未圖案化之 VH/VL 指示 DBA 部分。條紋圖案化之 VH/VL 指示抗 PD-1 抗體部分。方格圖案化之 VH/VL 指示非阻斷 DBA 部分。對於代表 VH/VL 或 CH1/CL 之每對圓柱體：深色圓柱體代表 VH 或 CH1，且淺色圓柱體代表 CL 或 CH1。 圖 9C顯示測定之結果。特定而言，與 P1AI7440 相比，P1AJ1837 的差異僅在於 DBA 輕鏈之 C 端具有一額外的 Asp 殘基。這同樣適用於 P1AJ1838 (一個額外的 C 端天冬胺酸殘基) 及 P1AI7441。b：阻斷；nb：非阻斷； dei：去免疫化的。 圖 10A 至圖 10D顯示各種免疫結合物對於例如在以下細胞上之 IL-2R 傳訊的效力、順式/反式傳訊及滲漏性：經活化之 CD4 細胞 ( 圖 10A)、經活化之 CD8 細胞 ( 圖 10B) 及 NK 細胞 ( 圖 10C)。 圖 10D顯示所測試之分子的結構及方向。Fc 區中之新月形/圓形顯示杵入臼修飾。實心圓顯示 IL-2 多肽。未圖案化之 VH/VL 指示 DBA 部分。條紋圖案化之 VH/VL 指示抗 PD-1 抗體部分。方格圖案化之 VH/VL 指示非阻斷 DBA 部分。對於代表 VH/VL 或 CH1/CL 之每對圓柱體：深色圓柱體代表 VH 或 CH1，且淺色圓柱體代表 CL 或 CH1。B：阻斷；nb：非阻斷； dei：去免疫化的。 圖 11A及 圖 11B顯示結合競爭測定之結果以判定經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的阻斷 DBA 部分 ( 圖 11A) 或非阻斷 DBA 部分 ( 圖 11A) 是否與阻斷或非阻斷抗 PD-1 抗體部分臂競爭 PD-1 結合。B：阻斷；nb：非阻斷；mat：親和力成熟的。 圖 12A及 圖 12B顯示基於酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 的測定之結果，以評定經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的切換行為。 圖 12A顯示免疫結合物的 PD-1 濃度依賴性切換。 圖 12B進一步提供每種所測試之免疫結合物的 IgG 濃度依賴性陰性對照。 圖 13A 至圖 13M顯示 HEK-Blue IL-2 報告基因測定之結果，顯示 PD-1 濃度依賴性訊號及經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物濃度依賴性訊號。每張圖顯示不同免疫結合物之結果。 圖 13A ：常開 P1AE4422-14542 對照； 圖 13B ：P1AI7455； 圖 13C ：P1AI7441； 圖 13D ：P1AI7465； 圖 13E ：P1AI7476； 圖 13F ：P1AI7440； 圖 13G ：P1AI7464； 圖 13H ：P1AI7474； 圖 13I ：P1AI7438； 圖 13J ：P1AI7462； 圖 13K ：P1AI7473； 圖 13L ：P1AI7443； 圖 13M ：P1AI7467。 圖 14顯示經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物作為單一藥劑在使用小鼠胰臟 Panc02-Fluc 細胞株的同基因模型中抑制胰臟腫瘤生長的活體內功效。 圖 15顯示以媒介物、經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物或帕博利珠單抗 (pembrolizumab) 治療之小鼠的肺重量，作為治療副作用之量度。 圖 16A及 圖 16B顯示經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物對腫瘤 ( 圖 16A)及血液 ( 圖 16B) 中之 CD8 +T 細胞擴增的影響。 圖 17A及 圖 17B顯示經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物及對照在活化 IL-2R 傳訊中的效力及順式/反式傳訊。 圖 17A將具有一個 DBA 及一個僅 PD-1 結合物的 PD-1-reg-IL-2v 之 1+1 形式 (其中 IL-2v 經接附至 DBA) 與具有兩個 DBA 的化合物 C 之不對稱形式 (其中 IL-2v 接附至一個 DBA) 進行比較。 圖 17B將 PD-1-reg-IL-2v 與 PD-1-reg-IL-2vQ126T 進行比較，後者在 IL-2v 中含有額外突變以進一步減少對 IL-2Rb 之結合親和力並因此增加 IL-2v 對 PD-1 表現的條件活性。資料顯示為 4 個供體之均值 ± SEM。 圖 18A 至圖 18C顯示各種免疫結合物對於例如在以下細胞上之 IL-2R 傳訊的效力、順式/反式傳訊及滲漏性：經活化之 CD4 細胞 ( 圖 18A)、經活化之 CD8 細胞 ( 圖 18B) 及 NK 細胞 ( 圖 18C)。資料顯示 2 個供體之平均值 ± SEM。 圖 19顯示不同經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物對 JAK/STAT5 活化的 IL-2 刺激以及隨後如由 HEK-blue™ IL-2 報告細胞株所檢測之 SEAP 分泌。報告細胞株的活化係作為在 640 nm 處的吸光度變化進行檢測。 圖 20顯示在 DBA 與 IL-2 多肽之間具有 10 聚體或 20 聚體連接子的經 PD-1 調節之 IL-2 免疫結合物的效力及順式/反式傳訊。資料顯示為 4 個供體之均值 ± SEM。
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Claims (81)

  1. 一種免疫結合物，其包含： (a) 第一結合域，其包含： (i) IL-2 多肽； (ii) 連接子；及 (iii) 雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及該 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中該 DBA 部分包含重鏈可變區 (VH) 及輕鏈可變區 (VL)， 其中該 IL-2 多肽、該連接子、及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端，且 其中該第一結合域係經組態以使得： (i) 當該 DBA 部分係與該 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且 (ii) 當該 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係實質上經阻斷與該 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與 IL-2 受體結合；以及 (b) 第二結合域，其包含含有 VH 及 VL 之抗 PD-1 抗體部分。
  2. 如請求項 1 之免疫結合物，其中該抗 PD-1 抗體部分實質上不與 IL-2 多肽結合。
  3. 如請求項 1 或 2 之免疫結合物，其中該 DBA 部分包含 Fab 分子。
  4. 如請求項 3 之免疫結合物，其中該 DBA 部分包含：Fab 重鏈，其包含該 DBA 部分之該 VH 及重鏈恆定域 1 (CH1)；及 Fab 輕鏈，其包含該 DBA 部分之該 VL 及輕鏈恆定域 (CL)，其中該 Fab 重鏈之該 VH 及該 Fab 輕鏈之該 VL 係經彼此替換或該 Fab 重鏈之該 CH1 及該 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。
  5. 如請求項 3 之免疫結合物，其中該 DBA 部分為習知 Fab 分子。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中該抗 PD-1 抗體部分包含 Fab 分子。
  7. 如請求項 6 之免疫結合物，其中該抗 PD-1 抗體部分包含：Fab 重鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VL 及 CL，其中該 Fab 重鏈之該 VH 及該 Fab 輕鏈之該 VL 係經彼此替換或該 Fab 重鏈之該 CH1 及該 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。
  8. 如請求項 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 該 DBA 部分係習知 Fab 分子；且 (b) 該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VL 及 CL，其中該 Fab 重鏈之該 VH 及該 Fab 輕鏈之該 VL 係經彼此替換或該 Fab 重鏈之該 CH1 及該 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換。
  9. 如請求項 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 該 DBA 部分係習知 Fab 分子；且 (b) 該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VL 及 CL，其中該 Fab 重鏈之該 VH 及該 Fab 輕鏈之該 VL 係經彼此替換。
  10. 如請求項 6 之免疫結合物，其中該抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
  11. 如請求項 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 該 DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該 DBA 部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該 DBA 部分之該 VL 及輕鏈 CL，其中該 Fab 重鏈之該 VH 及該 Fab 輕鏈之該 VL 係經彼此替換或該 Fab 重鏈之該 CH1 及該 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且 (b) 該抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
  12. 如請求項 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 該 DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該 DBA 部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該 DBA 部分之該 VL 及輕鏈 CL，其中該 Fab 重鏈之該 CH1 及該 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且 (b) 該抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
  13. 如請求項 1 至 5 中任一項之免疫結合物，其中該抗 PD-1 抗體部分為單鏈可變片段 (scFv)。
  14. 如請求項 1 至 13 中任一項之免疫結合物，其進一步包含含有第一次單元及第二次單元的 Fc 域。
  15. 如請求項 1 至 14 中任一項之免疫結合物，其中 (a) 該 DBA 部分及該第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端；且/或 (b) 該抗 PD-1 抗體部分及該第二次單元係以下列方向連接：N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
  16. 如請求項 14 或 15 之免疫結合物，其中該 Fc 域為 IgG Fc 域。
  17. 如請求項 16 之免疫結合物，其中該 IgG Fc 域為 IgG 1Fc 域。
  18. 如請求項 14 至 17 中任一項之免疫結合物，其中該 Fc 域為人 IgG Fc 域。
  19. 如請求項 14 至 18 中任一項之免疫結合物，其中該第一次單元包含選自第一 CH2 (CH2 1) 域及/或第一 CH3 (CH3 1) 域的一個或多個 CH 域；且該第二次單元包含選自第二 CH2 (CH2 2) 域及/或第二 CH3 (CH3 2) 域的一個或多個 CH 域。
  20. 如請求項 19 之免疫結合物，其中該一個或多個 CH 域中之至少一者與另一 CH 域配對。
  21. 如請求項 20 之免疫結合物，其中該 CH3 1域及該 CH3 2域各包含隆凸或腔窩，且其中在該 CH3 1域中的該隆凸或腔窩分別可定位於在該 CH3 2域中的該腔窩或隆凸中。
  22. 如請求項 21 之免疫結合物，其中該 CH3 1域及該 CH3 2域在該隆凸與腔窩之間的界面處相接。
  23. 如請求項 20 至 22 中任一項之免疫結合物，其中該 CH2 1域及該 CH2 2域各包含隆凸或腔窩，且其中在該 CH2 1域中的該隆凸或腔窩分別可定位於在該 CH2 2域中的該腔窩或隆凸中。
  24. 如請求項 23 之免疫結合物，其中該 CH2 1域及該 CH2 2域在該隆凸與腔窩之間的界面處相接。
  25. 如請求項 14 至 24 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 該第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (b) 該第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。
  26. 如請求項 14 至 25 中任一項之免疫結合物，其中該第一次單元及/或該第二次單元包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)。
  27. 如請求項 1 至 26 中任一項之免疫結合物，其中該 DBA 部分及該抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 的不同抗原決定基結合。
  28. 如請求項 1 至 26 中任一項之免疫結合物，其中該 DBA 部分及該抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 的相同抗原決定基結合。
  29. 如請求項 1 至 28 中任一項之免疫結合物，其中該 DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合且/或該抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。
  30. 如請求項 1 至 28 中任一項之免疫結合物，其中該 DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合或該抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。
  31. 如請求項 1 至 27、29、及 30 中任一項之免疫結合物，其中： (a) 該 DBA 部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合且該抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合；或 (b) 該 DBA 部分與 PD-1 之結合不抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合且該抗 PD-1 抗體部分與 PD-1 之結合抑制 PD-1 與 PD-L1 之結合。
  32. 如請求項 1 至 31 中任一項之免疫結合物，其中該 DBA 部分包含以下六個互補決定區 (CDR)： (a) CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；或 (b) CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列。
  33. 如請求項 32 之免疫結合物，其中該 DBA 部分包含： (a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (b) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (d) VH，其包含與 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。
  34. 如請求項 33 之免疫結合物，其中該 DBA 部分包含： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列； (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；或 (d) VH，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列。
  35. 如請求項 1 至 34 中任一項之免疫結合物，其中該抗 PD-1 抗體部分包含以下六個 CDR： (a) CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列； (b) CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列；或 (c) CDR-H1，其包含 SYWMS (SEQ ID NO: 10) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGSGGSRYYAESVKG (SEQ ID NO: 11) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 SPLQWIDV (SEQ ID NO: 12) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 1) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 EASSLQS (SEQ ID NO: 2) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQANQFPFT (SEQ ID NO: 3) 之胺基酸序列。
  36. 如請求項 35 之免疫結合物，其中該抗 PD-1 抗體部分包含： (a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (b) VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。
  37. 如請求項 36 之免疫結合物，其中該抗 PD-1 抗體部分包含： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列； (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；或 (c) VH，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及/或 VL，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。
  38. 如請求項 1 至 31 中任一項之免疫結合物，其中： (a) (i) 該 DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列； (b) (i) 該 DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 AYYIH (SEQ ID NO: 82) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 WIHPYSGMTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 83) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GHYYGKTDY (SEQ ID NO: 84) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 73) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 GASSLQS (SEQ ID NO: 74) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QESYTSSNT (SEQ ID NO: 75) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYTMS (SEQ ID NO: 28) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 AISGGGRDIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 29) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 LTGRVYFALDS (SEQ ID NO: 30) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 KASESVDTSDNSFIH (SEQ ID NO: 19) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 RASTLES (SEQ ID NO: 20) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQNYDVPWT (SEQ ID NO: 21) 之胺基酸序列；或 (c) (i) 該 DBA 部分包含：CDR-H1，其包含 RYYVH (SEQ ID NO: 64) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 IINPSGGYASYAQKFQG (SEQ ID NO: 65) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GLFI (SEQ ID NO: 66) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSIGRYLA (SEQ ID NO: 55) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 SASNLET (SEQ ID NO: 56) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQYNSFPVT (SEQ ID NO: 57) 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：CDR-H1，其包含 SYAMS (SEQ ID NO: 46) 之胺基酸序列；CDR-H2，其包含 VITGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 47) 之胺基酸序列；CDR-H3，其包含 GEGYAGSSYFRASDI (SEQ ID NO: 48) 之胺基酸序列；CDR-L1，其包含 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 37) 之胺基酸序列；CDR-L2，其包含 TASSLQS (SEQ ID NO: 38) 之胺基酸序列；及 CDR-L3，其包含 QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 39) 之胺基酸序列。
  39. 如請求項 38 之免疫結合物，其中： (a) (i) 該 DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (b) (i) 該 DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (c) (i) 該 DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (d) (i) 該 DBA 部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。
  40. 如請求項 39 之免疫結合物，其中： (a) (i) 該 DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列； (b) (i) 該 DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列； (c) (i) 該 DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列；或 (d) (i) 該 DBA 部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；且 (ii) 該抗 PD-1 抗體部分包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列。
  41. 如請求項 1 至 40 中任一項之免疫結合物，其中該連接子的長度為介於 5 至 30 個胺基酸之間。
  42. 如請求項 41 之免疫結合物，其中該連接子的長度為 20 個胺基酸。
  43. 如請求項 1 至 41 中任一項之免疫結合物，其中該連接子包含胺基酸序列 (G 2SG 2) x，其中 x 為介於 1 與 6 之間之整數 (SEQ ID NO: 149 至 154)。
  44. 如請求項 43 之免疫結合物，其中 x 為 2 (SEQ ID NO: 150) 或 4 (SEQ ID NO: 152)。
  45. 如請求項 1 至 44 中任一項之免疫結合物，其中該 IL-2 多肽係以下列方向連接至該 DBA 部分之該 VH：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[VH]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。
  46. 如請求項 1 至 44 中任一項之免疫結合物，其中該 IL-2 多肽係以下列方向連接至該 DBA 部分之該 VL：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[VL]-C，其中 N- 表示多肽 N 端，且 -C 表示多肽 C 端。
  47. 如請求項 1 至 46 中任一項之免疫結合物，其中該 IL-2 多肽為突變型人 IL-2 多肽，其包含在位置 3 處的丙胺酸殘基、在位置 42 處的丙胺酸殘基、在位置 45 處的丙胺酸殘基、在位置 72 處的甘胺酸殘基、及/或在位置 125 處的丙胺酸殘基 (相對於 SEQ ID NO: 147 的人 IL-2 序列編號)。
  48. 如請求項 47 之免疫結合物，其中該突變型人 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列。
  49. 如請求項 1 至 46 中任一項之免疫結合物，其中該 IL-2 多肽為突變型人 IL-2 多肽，其包含在位置 3 處的丙胺酸殘基、在位置 42 處的丙胺酸殘基、在位置 45 處的丙胺酸殘基、在位置 72 處的甘胺酸殘基、在位置 125 處的丙胺酸殘基、及/或在位置 126 處的蘇胺酸殘基 (相對於 SEQ ID NO: 147 的人 IL-2 序列編號)。
  50. 如請求項 49 之免疫結合物，其中該突變型人 IL-2 多肽包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列。
  51. 如請求項 1 至 50 中任一項之免疫結合物，其中該 PD-1 為人 PD-1。
  52. 一種免疫結合物，其包含： (a) 第一結合域，其包含： (i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列； (ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 150 或 152 之胺基酸序列；及 (iii) DBA 部分，其與 PD-1 及該 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中該 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈， 其中該 IL-2 多肽、該連接子、及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中當該 DBA 部分係與該 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且當該 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與該 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合； (b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元， 其中： (i) 該第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 該第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，且 其中該第一次單元及該第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)， 其中該 DBA 部分及該第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端， 其中該抗 PD-1 抗體部分及該第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中： (a) 該 DBA 部分為習知 Fab 分子；且該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VL 及 CL，其中該 Fab 重鏈之該 VH 及該 Fab 輕鏈之該 VL 係經彼此替換；或 (b) 該 DBA 部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該 DBA 部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該 DBA 部分之該 VL 及輕鏈 CL，其中該 Fab 重鏈之該 CH1 及該 Fab 輕鏈之 CL 係經彼此替換；且該抗 PD-1 抗體部分為習知 Fab 分子。
  53. 一種免疫結合物，其包含： (a) 第一結合域，其包含： (i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 199 之胺基酸序列； (ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 152 之胺基酸序列；及 (iii) DBA 部分，其與 PD-1 及該 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中該 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈， 其中該 IL-2 多肽、該連接子、及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中當該 DBA 部分係與該 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且當該 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與該 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合； (b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元， 其中： (i) 該第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 該第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，且 其中該第一次單元及該第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)， 其中該 DBA 部分及該第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端， 其中該抗 PD-1 抗體部分及該第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中該 DBA 部分為習知 Fab 分子；且該抗 PD-1 抗體部分為 Fab 分子，其包含：Fab 重鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VH 及 CH1；及 Fab 輕鏈，其包含該抗 PD-1 抗體部分之該 VL 及 CL，其中該 Fab 重鏈之該 VH 及該 Fab 輕鏈之該 VL 係經彼此替換。
  54. 一種免疫結合物，其包含： (a) 第一結合域，其包含： (i) IL-2 多肽，其包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列； (ii) 連接子，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 150 或 152 之胺基酸序列；及 (iii) 雙重結合抗體 (DBA) 部分，其與 PD-1 及該 IL-2 多肽以相互排斥方式結合，其中該 DBA 部分為 Fab 分子，其包含含有 VH 之 Fab 重鏈及含有 VL 之 Fab 輕鏈， 其中該 IL-2 多肽、該連接子、及該 DBA 部分係以下列方向連接：N-[IL-2 多肽]-[連接子]-[DBA 部分]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中當該 DBA 部分係與該 IL-2 多肽結合時，該 IL-2 多肽係實質上經阻斷與其受體結合；且當該 DBA 部分係與 PD-1 結合時，該 DBA 部分係經阻斷與該 IL-2 多肽結合，且該 IL-2 多肽能夠與其受體結合； (b) 第二結合域，其包含抗 PD-1 抗體部分，其中該抗 PD-1 抗體部分為包含 VH 及 VL 之 scFv；及 (c) Fc 區，其包含第一次單元及第二次單元， 其中： (i) 該第一次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)；或 (ii) 該第一次單元包含在位置 366 處的絲胺酸殘基、在位置 368 處的丙胺酸殘基、及在位置 407 處的纈胺酸殘基；且該第二次單元包含在位置 366 處的色胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)，且 其中該第一次單元及該第二次單元中之每一者包含在位置 234 處的丙胺酸殘基、在位置 235 處的丙胺酸殘基、及在位置 329 處的甘胺酸殘基 (根據 Kabat EU 索引編號)， 其中該 DBA 部分及該第一次單元係以下列方向連接：N-[DBA 部分]-[第一次單元]-C，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端，且 其中該抗 PD-1 抗體部分及該第二次單元係根據 N-[抗 PD-1 抗體部分]-[第二次單元]-C 連接，其中 N- 表示多肽 N 端且 -C 表示多肽 C 端。
  55. 如請求項 1 至 51 中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物包含： (a) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (b) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (c) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (d) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (e) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (f) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (g) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列； (h) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；或 (i) 第一多肽，其包含與 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第二多肽，其包含與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；第三多肽，其包含與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列；及第四多肽，其包含與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列至少 95% 相同之胺基酸序列。
  56. 如請求項 55 之免疫結合物，其中該免疫結合物包含： (a) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列； (b) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列； (c) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列； (d) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列； (e) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列； (f) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列； (g) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列； (h) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列；或 (i) 第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
  57. 一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
  58. 一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
  59. 一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 126 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 之胺基酸序列。
  60. 一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 124 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 118 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 120 之胺基酸序列。
  61. 一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 197 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
  62. 一種免疫結合物，其包含：第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列；第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列；第三多肽，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列；及第四多肽，其包含 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列。
  63. 一種經分離之多核苷酸或一組經分離之多核苷酸，其編碼如請求項 1 至 62 中任一項之免疫結合物。
  64. 一種載體或一組載體，其包含如請求項 63 之經分離之多核苷酸或該組經分離之多核苷酸。
  65. 一種宿主細胞或一組宿主細胞，其包含 (i) 如請求項 63 之經分離之多核苷酸或該組經分離之多核苷酸，或 (ii) 如請求項 64 之載體或該組載體。
  66. 一種生產免疫結合物之方法，其包含以下步驟：(a) 在適合於表現該免疫結合物的條件下培養如請求項 65 之宿主細胞或該組宿主細胞。
  67. 如請求項 66 之方法，其進一步包含回收該免疫結合物。
  68. 如請求項 66 之方法，其中該宿主細胞表現該第一結合域及該第二結合域。
  69. 如請求項 66 之方法，其中第一宿主細胞表現該第一結合域，且第二宿主細胞表現該第二結合域。
  70. 如請求項 68 或 69 之方法，其進一步包含回收該第一結合域及該第二結合域。
  71. 如請求項 70 之方法，其進一步包含使經回收之第一結合域與經回收之第二結合域接觸。
  72. 一種免疫結合物，其藉由如請求項 66 至 71 中任一項之方法所生產。
  73. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物及醫藥上可接受之載劑。
  74. 如請求項 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如請求項 73 之醫藥組成物，其用為藥物。
  75. 一種如請求項 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如請求項 73 之醫藥組成物在製造藥物中之用途。
  76. 如請求項 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如請求項 73 之醫藥組成物，其使用於治療有需要之個體的癌症。
  77. 一種如請求項 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如請求項 73 之醫藥組成物在製造用於治療有需要之個體的癌症的藥物中之用途。
  78. 一種如請求項 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如請求項 73 之醫藥組成物用於治療有需要之個體的癌症之用途。
  79. 一種治療個體的癌症之方法，該方法包含向該個體投予有效量之如請求項 1 至 62 及 72 中任一項之免疫結合物或如請求項 73 之醫藥組成物。
  80. 如請求項 76 至 79 中任一項之使用之免疫結合物、使用之醫藥組成物、用途、或方法，其中該癌症為 PD-1 陽性癌症。
  81. 如請求項 76 至 79 中任一項之使用之免疫結合物、使用之醫藥組成物、用途、或方法，其進一步包含向該個體投予額外治療劑。
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