[go: up one dir, main page]

HU231514B1 - Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer - Google Patents

Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer Download PDF

Info

Publication number
HU231514B1
HU231514B1 HUP1800376A HUP1800376A HU231514B1 HU 231514 B1 HU231514 B1 HU 231514B1 HU P1800376 A HUP1800376 A HU P1800376A HU P1800376 A HUP1800376 A HU P1800376A HU 231514 B1 HU231514 B1 HU 231514B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pattern
cell culture
culture medium
glycoprotein
manganese
Prior art date
Application number
HUP1800376A
Other languages
English (en)
Inventor
Balogh Tibor Dr.
Balázs Horváth
Gáspár Nagy
Párta László dr.
Putics Ákos dr.
Original Assignee
Richter Gedeon Nyrt.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richter Gedeon Nyrt. filed Critical Richter Gedeon Nyrt.
Priority to HUP1800376A priority Critical patent/HU231514B1/hu
Priority to KR1020217017260A priority patent/KR102894782B1/ko
Priority to AU2019376476A priority patent/AU2019376476B2/en
Priority to EP19801518.2A priority patent/EP3877539A1/en
Priority to MA054147A priority patent/MA54147A/fr
Priority to JP2021524198A priority patent/JP2022512928A/ja
Priority to CA3118604A priority patent/CA3118604C/en
Priority to PCT/EP2019/080342 priority patent/WO2020094694A1/en
Priority to US17/292,302 priority patent/US12168791B2/en
Priority to BR112021008458-4A priority patent/BR112021008458A2/pt
Priority to CN201980088055.3A priority patent/CN113272440B/zh
Publication of HUP1800376A2 publication Critical patent/HUP1800376A2/hu
Priority to JP2024075898A priority patent/JP2024112833A/ja
Publication of HU231514B1 publication Critical patent/HU231514B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

SEJTTENYÉSZETBEN ELŐÁLLÍTOTT REKOMBINÁNS GLIKOPROTEIN GLIKOZILÁCIÓS MINTÁZATÁNAK MEGVÁLTOZTATÁSÁRA SZOLGÁLÓ MÓDSZER
A TALÁMÁNY TÁRGYA
Jelen találmány tárgyát sejttenyészetben előállított rekombináns glikoproteinek glikozilációsmintázatának megváltoztatására szolgáló módszer képezi, ami magában foglalja rekombináns 10 glikoproteineket expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát módosítják, hogy jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához annál, mintha azt az említett kiegészítés nélkül állítanák elő.
A TALÁLMÁNY HÁTTERE
A glikoproteinek elengedhetetlenek az immunrendszer összes ágának megfelelő működéséhez, beleértve a veleszületett és az adaptív immunrendszert. A glikoproteinek például a 20 komplement-függő citotoxicitáson (CDC) és az antitest-függő sejtek által közvetített citotoxicitáson (ADCC) keresztül részt vesznek az immunológiai fenyegetések felismerésében, kötésében, jelzésében, valamint megszüntetésében (Rudd et al, Science, 291,2001,2370-2376; és Jefferis et al, Immunol Rév, 163, 1998, 59-76).
Az emlősök által expresszált antitestek nehéz láncának (HC) Asn egységén egyetlen glikán található. A glikánszerkezet jelenléte és összetétele befolyásolja az antitest receptorkötését és effektorfunkcióját (Rudd et al., Science, 291, 2001, 2370-2376; és Jefferis et al., Immunol Rév,
163, 1998, 59-76). Például, egy IgG (Fcy) Fc régiójának változatos glikánösszetétele különbözőképpen befolyásolja az Fc régió és az Fc kötő receptorok (FcR) között kialakuló kötések affinitását. Az FcyR-eknek három osztálya van, nevezetesen, FcyRI, FcyRII, és FcyRIII (Jefferis et al., Immunol Rév, 163, 1998, 59-76; Ravetch & Bolland, Annu Rev Immunol, 19,
2001, 275-290). A antitest különböző mértékű affinitása az Fcy receptorokhoz szabja meg a m r b* ©
H gazda egy adott antigénre adott immunválaszának sorsát és később felelős lehet az aktivációért,
SZTNH-100190229 a gátlásért, az antitest hatékonyságért/felezési időért, a toleranciáért és az autoimmun válaszért (Ravetch & Bolland, Annu Rev Immunol, 19, 2001, 275-290). Az antitest különböző típusú receptorokhoz való affinitása változhat az általa hordozott glikán jelenlététől és összetételétől függően, amely rávilágít az oligoszacharid/fehérje kölcsönhatások jelentőségére az antitestek 5 biológiai funkciójára nézve (Raju et al, Glycobiology, 10, 2000, 477-486; Jefferis et al, Immunol Rév, 163, 1998, 59- 76).
A fehérjék eukariótákban (pl. emlőssejtekben, gazdasejtekben) való expresszióját követően a fehérjék poszttranszlációs módosításokon mennek keresztül, amely gyakran magában foglalja 10 cukor egységek enzimatikus hozzáadását, amelyere általában glikozilációként hivatkoznak. A polipeptidek glikozilációja jellemzően N-kötésű vagy O-kötésű. A szénhidrát rész kapcsolódását az aszparagin egység oldalláncához N-kötésű glikozilációnak nevezik. Az aszparagin (Asn)-X-szerin (Ser) és az aszparagin (Asn)-X-treonin (Thr) tripeptid szekvenciák, ahol az X bármilyen aminosav (kivéve a prolint), felismerési szekvenciák a szénhidrát rész 15 aszparagin oldallánchoz való enzimatikus kapcsolódásához. A N-acetilgalaktózamin, galaktóz, fukóz, N-acetilglükozamin vagy xilóz cukrok egyikének kapcsolódását egy hidroxiaminosavhoz, leggyakrabban szerinhez vagy treoninhoz (bár 5-hidroxi-prolin és 5-hidroxilizin is részt vehet benne), O-kötésű glikozilációnak nevezik. Az emlősök által előállított fehérjék glikozilációs mintázata számos csoportra tovább osztható, beleértve komplex, magas 20 mannóztartalmú és hibrid szerkezeteket, valamint glikoziddal kapcsolt oligoszacharidokat.
(The Plasma Proteins: Structure, Function and Genetic Control, Putnam, F. W., ed., 2nd edition, Vol. 4, Academic Press, New York, 1984, különösen pp. 271- 315.)
Az elmúlt néhány évtizedben számos kutatás fókuszált a terápiás rekombináns glikoproteinek, 25 például a monoklonális antitestek termelésére. Míg az irodalomban az egyik megközelítés a szérumot vagy hidrolizátumot tartalmazó közeg alkalmazása volt, kémiailag definiált tápközegeket is kifejlesztettek, hogy elkerüljék a komplex összetevők gyártási tételeiben esetlegesen előforduló változékonyságból eredő problémákat. (Luo and Chen, Biotechnology and Bioengineering, 97(6): 1654-1659 (2007)). A sejttenyészetek jobb megértésével lehetővé 30 vált a kémiailag definiált tápközegekre történő áttérés anélkül, hogy a növekedés, az életképesség, a titer, stb. területén kompromisszumot kellett volna kötni. Optimalizált, •Λ kémiailag definiált technológiák esetén 7,5-10 g/L-es terméktiterröl is beszámoltak már a rn © Λ szakirodalomban. (Huang et al, Biotechnology Progress 26(5): 1400-1410 (2010); Ma et al, Biotechnology Progress 25(5): 1353-1363 (2009); Yu et al, Biotechnology and Bioengineering, 108(5):1078- 1088 (2011)). Általánosságban, a magas titerrel jellemezhető kémiailag definiált eljárások rátáplálásos-szakaszos eljárások, 11-18 napos tenyésztési idővel.
Számos publikációban rámutattak arra, hogy a rekombináns fehérjékhez kapcsolódó Nglikánmintázatok specifikusak az egyes emlőssejtek esetében. (James et al., Bio/Technology, 13:592-596 (1995); Lifely et al., Glycobiology, 5:813-822 (1995)). Ezek a különbségek nemcsak a terápiás glikoproteinek gyártása szempontjából fontosak az antigenicitásra kifejtett 10 direkt hatás, az in vivo kiürülési ráta és a rekombináns glikoproteinek stabilitása miatt (Jenkins et al., Nature Biotechnoi. 14:975-981 (1996)), hanem a szigorú törzskönyvezési feltételek miatt is, amelyeknek minden engedélyezett terápiás glikoproteinnek meg kell felelnie. Következésképpen, nagyon fontos, hogy ne csak a terápiás rekombináns glikoproteinekhez kötött glikánokat tudjuk karakterizálni, hogy megjósoljuk az in vivo biztonságosságra és 15 hatásosságra vonatkozó következményeket, hanem megértsük a potenciális gazdasejtben történő glikozilációs folyamatokat megalapozó sejtszintű kontrollt is. (Grabenhorst et al., Glycoconjug. J., 16:81-97 (1999); James and Baker, Encyclopedia of bioprocess technology: Fermentation, biocatalysis and bioseparation. New York: John Wiley & Sons. p. 1336-1349 (1999)).
A terápiás rekombináns glikoproteinek (pl. a monoklonális antitestek) termelésére kiválasztott eukarióta sejteken kívül a glikozilációs folyamat nagyban függ a sejttenyésztő közegtől és a gyártási folyamat egyéb paramétereitől is. (Ho et al., BioProcess International; 14(4):30-8 (2016)). Kimutatták, hogy a sejttenyésztő és a tápközeg összetétele, beleértve az ammónia, a 25 glutamin, a glükóz és fémionok koncentrációját, befolyásolni tudják az antitest glikozikációját.
(Hossler et al., Glycobiol. 19(9):936-946 (2009)). Ennek megfelelően stratégiákat dolgoztak ki a rekombináns glikoproteinek glikozilációs mintázatának és/vagy profiljának kontrollálására a sejttenyésztö közeg kiegészítése révén. Például, a WO2017079165 fúkóz forrással (pl. fukózzal) való kiegészítést mutat be olyan sejttenyészeteknél, amelyek GDP-keto-630 dezoximannóz-3,5-epimeráz, 4-reduktáz vagy GDP-D-mannóz-4,6-dehidratáz aktivitással nem rendelkeznek, hogy olyan glikoproteineket állítsanak elő, amelyek meghatározott fukozilációs m szinttel rendelkeznek. Fukóz kiegészítést alkalmaztak afukozilált cukorformák csökkentésére, mi r n © vagyis fukoziláció növelésére antitestek esetében, önmagában (WO2017120359; WO2017120347) vagy nikotinamiddal kombinációban (WO2017134667). Mangán kiegészítést alkalmaztak afükozikált cukorformák növelésére, vagyis fukoziláció csökkentésére önmagában (WO2017021871; W02015011660; WO2013114245), rézzel kombinálva 5 (WO2016089919) vagy vassal, rézzel és cinkkel kombinálva (WO2015128314). A mangánt az adalimumab terápiás monoklonális antitest galaktozilációs mintázatának kontrollálására is alkalmazták (WO2012149197).
Összegezve elmondhatjuk, hogy a szakterületen szükség van olyan módszerek kidolgozására, 10 amelyek elörejelezhetöen képesek módosítani arekombináns glikoproteinek glikozilációs mintázatát annak érdekében, hogy az jobban hasonlítson egy referencia rekombináns glikoproteinéhez, amely megfelel a biztonságossági, hatásossági és hatósági szabványoknak.
A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA
A feltalálók azt találták, hogy egy sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát módosítani lehet egy olyan módszerrel, amely rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését foglalja magában egy olyan sejttenyésztő közegben, amelyet fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítettek ki. A feltalált 20 módszerrel a glikozilációs mintázat módosítása úgy történik, hogy az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mint ha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány tárgyát a független igénypontok tárgya határozza meg. Az előnyös kiviteli alakok a függő igénypontokban láthatók.
Ennek megfelelően, az egyik kiviteli alakban a találmány megoldást biztosít sejttenyészetekben termelt rekombináns glikoproteinek glikozilációs mintázatának módosítására, ahol a 30 rekombináns glikoproteineket expresszáló eukarióta sejtek tenyésztése egy sejttenyésztő közegben történik, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki és ahol a megtermelt rekombináns glikoproteinek glikozilációs mintázatát úgy módosítják, M f** © W hogy jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mint ha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Az egyik kiviteli alakban a módosított glikozilációs mintázat magában foglal egy vagy több 5 fukozilációs mintázatot és/vagy galaktozilációs mintázatot. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával és/vagy a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %10 os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Az egyik kiviteli alakban a fukóz koncentrációját a tenyésztő közegben kiegészítés révén 0,4 1,6 mM-lal növeljük, előnyösen 0,4 - 1,2 mM-lal, előnyösebben 0,6 - 1 mM-lal és előnyösen 0,8 mM-lal.
Az egyik kiviteli alakban a mangán koncentrációját a tenyésztő közegben kiegészítés révén 15 0,02 - 0,1 μΜ-lal növeljük, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal.
Az egyik kiviteli alakban a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösen 15 mM és 35 mM közötti, előnyösebben 20 mM és 30 mM közötti és előnyösen 25 mM.
Az egyik kiviteli alakban a módszer tartalmazza továbbá a megtermelt rekombináns glikoprotein sejttenyészettől való izolálásának lépését.
Az egyik kiviteli alakban az eukarióta sejtek kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek.
Az egyik kiviteli alakban a rekombináns glikoproteint nagy mennyiségben állítják elő.
Az egyik kiviteli alakban a rekombináns glikoprotein IgG típusú immunoglobulin.
Az egyik kiviteli alakban a rekombináns glikoprotein egy monoklonális antitest, opcionálisan egy terápiás monoklonális antitest.
Az egyik kiviteli alakban a sejttenyészetet 14 napig tartják fenn.
ΜΓ ©·
Az egyik kiviteli alakban, a tenyésztő közegben minden 2. napon kerül sor kiegészítésre a tenyésztés 3. napjától kezdődően, opcionálisan a tenyésztés 13. napjáig.
Az egyik kiviteli alakban, a mangánt mangán-klorid (MnCh) formájában pótolják és a tényésztö közeg MnCh-dal való kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés 5. napjától 5 kezdődően, opcionálisan a tenyésztés 9. napjáig.
Az egyik kiviteli alakban, a tenyésztő közeg kiegészítése a sejttenyészet termelő fázisa alatt történik.
Az egyik kiviteli alakban a sejttenyészetet 37°C-on tartják.
Az egyik kiviteli alakban a sejttenyészet pH-ja: 7,05 ± 0,05.
Az egyik kiviteli alakban a sejttenyészet rátáplálásos-szakaszos tenyészet.
Az egyik kiviteli alakban a glikoprotein VEGF antagonista, előnyösen egy anti-VEGF antitest. Ebben a kiviteli alakban a módosított fukozilációs mintázat előnyösen legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-is, legelőnyösebben legalább 98 %os egyezést mutat a referencia VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest fukozilációs 15 mintázatával és/vagy a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, legalább 95 %os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest galaktozilációs mintázatával.
Az egyik kiviteli alakban a glikoprotein egy anti-CD20 antitest. Ebben a kiviteli alakban a módosított fukozilációs mintázat előnyösen legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, 20 előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia anti-CD20 antitest fukozilációs mintázatával és/vagy a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia anti-CD20 antitest galaktozilációs mintázatával.
ufi tr h* ©'
H
AZ ÁBRÁK RÖVID LEÍRÁSA
1. ábra: A guanozin, a fukóz és a mannóz hatása a jelen találmány szerinti anti-VEGF antitest összes fő afukozilált (MAF) cukorformáira. Az eredmények a tenyésztés 12. napjáról 5 származnak. Fekete oszlopok: kontroll sarzsok a tenyésztő közeg adalékolása nélkül. Szürke oszlopok: Guanozinnal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok két különböző koncentrációban (20 mM és 60 mM); Pontozott oszlopok: Fukózzal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok két különböző koncentrációban (10 mM és 20 mM); Átlósan csíkozott oszlopok: Mannózzal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok két különböző koncentrációban (20 mM és 60 mM).
2. ábra: A különböző fukóz koncentrációk hatása a jelen találmány szerint anti-VEGF antitest összes fő afukozilált (MAF) cukorformáira. Az eredmények a tenyésztés 12. napjáról származnak. Fekete oszlop: kontroll sarzsok a tápközeg fukózzal való kiegészítése nélkül; Szürke oszlop: lOmM fukózzal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Pontozott oszlop: 20 15 mM fukózzal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Átlósan csíkozott oszlop: 40 mM fukózzal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Fekete vonalak: A jelen találmány szerinti referencia anti-VEGF antitest összes fő afukozilált (MAF) cukorforma tartománya.
3. ábra: A különböző taurin koncentrációk hatása a jelen találmány szerinti anti-VEGF antitest 20 összes fő afukozilált (MAF) cukorformáira. Az eredmények a tenyésztés 14. napjáról származnak. Fekete oszlop: kontroll sarzsok a tápközeg taurinnal való kiegészítése nélkül; Szürke oszlop: 12,5 mM taurinnal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Pontozott oszlop: 25 mM taurinnal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Átlósan csíkozott oszlop: 50 mM taurinnal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Fekete vonalak: A jelen találmány szerinti 25 referencia anti-VEGF antitest összes fő afukozilált (MAF) cukorforma tartománya.
4. ábra: A taurin, a fukóz és mangán hatása a jelen találmány szerinti anti-VEGF antitest összes fő afukozilált (MAF) cukorformáira. Az eredmények a tenyésztés 14. napjáról származnak. Fekete oszlop: 1,7 μΜ mangán-kloriddal kiegészített tápközeggel táplált kontroll sarzsok, 30 fukóz és taurin nélkül; Szürke oszlop: 25 mM taurinnal kiegészített tenyésztő közegben tenyészett sarzsok, amelyeket 1,7 μΜ mangán-kloriddal kiegészített tápközeggel tápláltak, de Λ fukózzal kiegészített tápközeget nem kaptak; Pontozott oszlop: 25 mM taurinnal kiegészített
IS
O
Λ
H
97435 tenyésztő közegben tenyészett sarzsok, 20 mM fokozzál és 1,7 μΜ mangán-kloriddal kiegészített tápközeggel táplálva. Fekete vonalak: A jelen találmány szerinti referencia antiVEGF antitest összes fő afokozilált (MAF) cukorforma tartománya.
5. ábra: A jelen találmány szerint előállított anti-VEGF antitest összes fő afokozilált mintázata (MAF). Az eredmények rendre a tenyésztés 7. és 13. napja, vagy a tenyésztés 7. és 14. napja közötti napi mintaelemzésből származnak. Fekete vonalak: kontroll sarzsok taurin és fokóz nélkül, de mangánnal kiegészített tápközeggel táplálva; Pontozott és szaggatott vonalak: fokozzál és mangánnal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Szaggatott vonalak: taurinnal kiegészített tenyésztő közegben, mangánnal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Pontozott vonal: taurinnal kiegészített tenyésztő közegben, mangánnal és fokozzál kiegészített tápközeggel táplált sarzsok. Szürke vonalak: A jelen találmány szerinti referencia anti-VEGF antitest összes fő afokozilált (MAF) cukorforma tartománya.
6. ábra: A jelen találmány szerint előállított anti-VEGF antitestek nem-galaktozilált cukorforma (GO) mintázata. Az eredmények rendre a tenyésztés 7. és 13. napja, vagy a tenyésztés 7. és 14. napja közötti napi mintaelemzésből származnak. Fekete vonalak: kontroll sarzsok taurin és fokoz nélkül, de mangánnal kiegészített tápközeggel táplálva; Pontozott és szaggatott vonalak: fokozzál és mangánnal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Szaggatott vonalak: taurinnal kiegészített tenyésztő közegben tenyésztett és mangánnal kiegészített tápközeggel táplált sarzsok; Pontozott vonal: taurinnal kiegészített tenyésztő közegben tenyésztett, mangánnal és fokozzál kiegészített tápközeggel táplált sarzsok. Szürke vonal: A jelen találmány szerinti referencia anti-VEGF antitest nem-galaktozilált cukorforma (GO) tartományai.
A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA
A jelen találmány, amint azt az alábbiakban szemléltetően leírjuk, megfelelően alkalmazható bármely olyan elem vagy elemek, korlátozás vagy korlátozások hiányában, melyeket itt nem kifejezetten ismertetünk.
A jelen találmányt bizonyos kiviteli alakokra vonatkozóan ismertetjük, de a találmány ezekre nem, csak az igénypontok által korlátozódik.
Ahol a “tartalmaz” kifejezést alkalmazzuk jelen leírásban és igénypontokban, az nem zár ki más elemeket. A jelen találmány szempontjából az “áll valamiből” kifejezést a “tartalmaz” kifejezés előnyös kiviteli alakjának tekintjük. Ha a következőkben egy csoportot úgy 5 definiálunk, hogy az tartalmaz legalább egy bizonyos számú kiviteli alakot, ezt úgy is kell érteni, hogy egy olyan csoportot ismertet, amely előnyösen csak ezekből a kiviteli alakokból áll.
Ahol egy határozatlan vagy határozott névelőt alkalmazunk (pl. “egy”, vagy “az”), amikor egy 10 egyes számú főnévre hivatkozunk, akkor ebbe beleértendő annak a főnévnek a többes száma is, kivéve, ha kifejezetten más nem szerepel.
A “polipeptid” vagy “protein” kifejezések, ahogyan itt használjuk, a peptidkötéseken keresztül egymáshoz kapcsolt aminosavak szekvenciális láncait jelentik. A kifejezést bármilyen 15 hosszúságú aminosav láncra alkalmazzuk, de a szakterületen jártas szakember úgy fogja értelmezni, hogy a kifejezés nem korlátozódik hosszú láncokra és minimális láncra is vonatkozhat, amely 2 aminosavból áll egy peptidkötéssel összekapcsolva. Ha egyetlen polipeptid a diszkrét funkcionális egység és ez állandó fizikai kapcsolatot kíván más polipeptidekkel, hogy létrehozzák a diszkrét funkcionális egységet, akkor a “polipeptid” és 20 “protein” kifejezéseket egymással felcserélve alkalmazhatjuk. Ha egy diszkrét funkcionális egység egynél több olyan polipeptidet tartalmaz, amely fizikai kapcsolatban van egy másikkal, akkor az itt használt “protein” kifejezés olyan többszörös polipeptidekre vonatkozik, amelyek fizikailag vannak összekapcsolva és együtt egy diszkrét egységként funkcionálnak.
A “glikoprotein” kifejezés, ahogyan itt használjuk, egy polipeptidre vagy proteinre vonatkozik, amely legalább egy szénhidrát-részhez (pl. egy poliszacharidhoz vagy oligoszacharidhoz) kapcsolódik, amely a fehérjéhez egy aminosav maradék (pl. egy szerin vagy treonin maradék (“O-kötésü”) vagy egy aszparagin maradék (“N-kötésű”)) oxigént tartalmazó vagy nitrogént tartalmazó oldalláncán keresztül kapcsolódik. A “glikoprotein”-t itt a legtágabb értelemben 30 használjuk, beletartoznak a teljes hosszúságú glikoproteinek, a genetikailag módosított glikoproteinek, a rekombináns glikoproteinek, a kiméra glikoproteinek, a humanizált tó glikoproteinek, a teljesen humanizált glikoproteinek, valamint az ilyen glikoproteinek
V l*._ βω Η fragmensei, mint a peptidek, amennyiben funkciójuk megmarad és mutatják a kívánt biológiai aktivitást. A glikoprotein “biológiai aktivitása” a glikoproteinnek azt a képességét jelenti, hogy biológiai választ vált ki, amely in vitro vagy in vivo mérhető.
A “rekombináns glikoprotein” kifejezés minden rekombináns módon előállított, expresszálódott, létrehozott vagy izolált glikoproteinre utal, mint a transzgénikus gazdasejtekből, pl. az NSO vagy a CHO sejtből, vagy a glikoprotein génekre nézve transzgénikus állatokból izolált glikoproteinek vagy gazdasejtbe transzfektált rekombináns expressziós faktorok alkalmazásával expresszált glikoproteinek, mint pl. az SP 2/0 egér 10 mielóma sejtek.
A “glikán” kifejezés poliszacharidot vagy oligoszacharidot jelent, pl. monoszacharidokból álló polimert. A glikánok lehetnek monoszacharid maradékok homo- vagy heteropolimerjei és lehetnek lineárisak vagy elágazók. A fehérjék az eukariótákban, pl. emlős gazdasejtekben való 15 expressziót követően poszttranszlációs módosításokon mennek keresztül, ami gyakran magában foglalja cukor egységek, pl. glikánok enzimatikus hozzáadását. A cukor egységek, pl. glikánok ilyen hozzáadását itt “glikozikációnak” nevezzük. Az “N-kötésü glikán” olyan glikánt jelent, amely egy aszparagin egység oldalláncához kapcsolódik. Az “O-kötésű” glikán olyan glikánt jelent, amely hidroxi-aminosavhoz, leggyakrabban szerinhez vagy treoninhez 20 kapcsolódik, de 5-hidroxi-prolin vagy 5-hidroxi-lizin is részt vehet ebben. A glikozilácóba beletartozik pl. a galaktozikáció és/vagy a fukoziláció.
Az itt releváns rekombináns glikoprotein “glikozikációs mintázata”, ahogyan itt használjuk, a glikoprotein poliszacharidjának vagy oligoszacharidjának különböző fizikai tulajdonságait 25 jelenti, mint pl. a jelenlévő különböző monoszacharidok minősége és mennyisége, az elágazás és/vagy kapcsolódás mértéke (pl. N-kötésü vagy O-kötésű). A glikoprotein “glikozilációs mintázata” utalhat a glikoprotein oligoszacharidjai és poliszacharidjai által átadott funkcionális jellemzőkre is. Például, annak a mértéke, hogy a glikoprotein mennyire képes az FcyRIIIa-hoz kötődni és antitest-függő sejtes citotoxicitást indukálni.
Az itt releváns rekombináns glikoprotein “glikozilációs mintázata” vagy “glikozilációs foka”, ahogyan itt használjuk, a jelenlévő különböző monoszacharidok mennyiségét jelenti. A W ír
Ή különbözőképpen előállított sarzsok glikozilációs mintázata eltérő lehet, pl. a bioszimiláris terápiás glikoprotein és a referenciatermékének glikoproteinjei különbözhetnek. Noha a glikozilációs mintázat bizonyos mértékű eltérése megengedhető a törzskönyvi standardokon belül anélkül, hogy a terápiás glikoprotein bioszimilárisként való engedélyezéséhez új klinikai 5 vizsgálatok lennének szükségesek, a leginkább kívánatos a glikozilációs mintázat lehető legszorosabb illesztése a referencia glikoproteinéhez, ezáltal a biztonságosság és hatásosság olyan szinten tartása, amely a lehető legközelebbi a referencia glikoproteinéhez. A rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázata magában foglalhatja pl. a rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát és/vagy galaktozilációs mintázatát.
A “fúkoziláció” kifejezés a poliszacharidokon és oligoszacharidokon, például N-glikánokon, O-glikánokon és glikolipideken lévő fükóz egységek mennyiségét és eloszlását jelenti. A “fúkozilációs mintázat” vagy “fukozilációs fok” a poliszacharidokon és oligoszacharidokon, például N-glikánokon, O-glikánokon és glikolipideken lévő fukóz egységek mennyiségét 15 jelenti. A terápiás glikoproteinek, pl. antitesek vagy Fc fúziós proteinek, nem-fukozilált vagy “afukozilált” N-glikánokkal jelentősen jobb antitest-függő sejtes citotoxicitást (ADCC) mutatnak, annak következtében, hogy FcyRIIIa kötőképesség anélkül fokozódik, hogy bármilyen kimutatható változás lenne a komplement-függő citotoxicitásban (CDC) vagy antigénkötő képességben. Bizonyos helyzetekben, pl. rák kezelésénél, nem-fükozilált vagy 20 afukozilált antitestek, vagyis alacsony “fúkozilációs mintázatú” antitestek kívánatosak, mert alacsony dózisban képesek terápiás hatékonyságot elérni, miközben nagy celluláris citotoxicitást indukálnak tumorsejtek ellen és az FcyRIIIa-val való fokozott interakció révén magas effektor fúnkciót váltanak ki a természetes ölő sejtekben (NK). Más helyzetekben, pl. gyulladásos vagy autoimmun betegségek kezelésében, a fokozott ADCC és FcyRIIIa kötés nem 25 kívánatos, következésképpen az N-glikánokon nagy fukóz szintekkel, vagyis magasabb fukozilált tartalommal rendelkező terápiás glikoproteinek előnyösebbek. Az itt releváns glikoproteinek különböző gyártott sarzsai esetében a fukozilációs mintázat eltérő lehet, pl. a bioszimiláris terápiás glikoprotein és annak referenciatermék glikoproteinje között. Míg a fúkozilációs mintázat tekintetében bizonyos fokú eltérések megengedhetők a törzskönyvi 30 standardokon belül anélkül, hogy a terápiás glikoprotein bioszimilárisként való elfogadásához új klinikai vizsgálatok lennének szükségesek, a leginkább kívánatos a fúkozilációs mintázat
ΙΛ © Λ
1307435 lehető legszorosabb illesztése a referencia glikoproteinéhez, ezáltal a biztonságosság és hatásosság olyan szinten tartása, amely a lehető legközelebbi a referencia glikoproteinéhez.
A “galaktoziláció” kifejezés a poliszacharidokon és oligoszacharidokon, például N-glikánokon, 5 O-glikánokon és glikolipideken lévő galaktóz egységek típusát és eloszlását jelenti. A “galaktozilációs mintázat” vagy “galaktozilációs fok” a poliszacharidokon és oligoszacharidokon, például N-glikánokon, O-glikánokon és glikolipideken lévő galaktóz egységek mennyiségét jelenti. A “galaktóz” monoszacharidok egy csoportját jelenti, beleértve a nyílt láncú és a gyűrűs formákat is. A galaktóz diszacharid formája a galaktóz-alfa-1,310 galaktóz (a-gal). Az itt releváns glikoproteinek különböző gyártott sarzsai esetében a galaktozilációs mintázat eltérő lehet, pl. a bioszimiláris terápiás glikoprotein és annak referenciaterméke között. Míg a galaktozilációs mintázat tekintetében bizonyos fokú eltérések megengedhetők a törzskönyvi standardokon belül anélkül, hogy a terápiás glikoprotein bioszimilárisként való elfogadásához új klinikai vizsgálatok lennének szükségesek, a leginkább 15 kívánatos a galaktozilációs mintázat lehető legszorosabb illesztése a referencia glikoproteinéhez, ezáltal a biztonságosság és hatásosság olyan szinten tartása, amely a lehető legközelebbi a referencia glikoproteinéhez.
A “glikozilációs mintázat módosítása”, “fukozilációs mintázat módosítása” és a 20 “galaktozilációs mintázat módosítása” rendre egy rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának, fukozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának változtatását jelentik, amikor ezt elsődleges tenyésztési körülmények között, például fukóz, mangán és/vagy taurin jelenlétében állítják elő, összevetve ugyanezen rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatával, fukozilációs mintázatával és galaktozilációs mintázatával, amelyet másodlagos 25 tenyésztési körülmények között, pl. fukóz, mangán és/vagy taurin nélkül állítottak elő a sejttenyésztő közegben. Az elsődleges tényésztési körülmények között elért glikozilációs mintázat, fukozilációs mintázat és/vagy galaktozilációs mintázat lehet megnövekedett vagy lecsökkent a másodlagos tenyésztési körülmények között elért mintázathoz viszonyítva. Előnyösen, az elsődleges tenyésztési körülmények között elért glikozilációs mintázat, 30 fukozilációs mintázat és/vagy galaktozilációs mintázat módosításra kerül, hogy jobban hasonlítson rendre a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, fukozilációs mintázatához és/vagy galaktozilációs mintázatához, mint a másodlagos tenyésztési körülmények között elért glikozilációs mintázat, fükozilációs mintázat és/vagy galaktozilációs mintázat. Előnyösebben, a glikozilációs mintázatot, a fiikozilációs mintázatot és/vagy a galaktozilációs mintázatot úgy módosítjuk, hogy rendre a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatával, fükozilációs mintázatával és/vagy a galaktozilációs mintázatával legalább 90 %5 os, előnyösebben legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben 98 %-os egyezést mutasson.
A “referencia glikoprotein”, “referencia VEGF antagonista”, “referencia anti-VEGF antitest” vagy “referencia anti-CD20 antitest” kifejezések, ahogyan itt használjuk, ugyanarra az itt 10 releváns glikoproteinre, antagonistára vagy antitestre vonatkoznak, amelyet a megfelelő sejttenyészetben állítottak elő, amely ahhoz szükséges, hogy a jelen találmány szerinti glikoprotein glikozilációs mintázatának, fükozilációs mintázatának és/vagy a galaktozilációs mintázatának megfeleljen vagy ahhoz jobban hasonlítson. Például, a referencia glikoproteinnek, antagonistának vagy antitestnek lehetnek olyan hasznos tulajdonságai, mint a 15 stabilitás, hatásosság, biztonságosság és/vagy egyéb tulajdonságok, amelyek a megadott glikoproteinre, antagonistára vagy antitestre nézve relevánsak. A referencia glikoprotein, antagonista vagy antitest lehet például egy glikoprotein, antagonista vagy antitest, ami egy alanyon (pl. egy humán alanyon) való terápiás alkalmazásra törzskönyvi engedélyt kapott. Ebben az esetben a glikoprotein, amelyet a glikozilációs mintázat, fükozilációs mintázat 20 és/vagy galaktozilációs mintázat módosítására szolgáló eljárás során állítottak elő, bioszimiláris lehet.
A “tenyészet”, “sejttenyészet” és “eukarióta sejttenyészet”, ahogyan itt használjuk, egy eukarióta sejtpopulációra vonatkozik, amely lehet felülethez kötött vagy szuszpendált, amelyet 25 sejttenyésztő közegben tartanak fenn vagy növesztenek olyan körülmények között, amelyek a sejtpopuláció túlélése vagy növekedése szempontjából megfelelőek. Ezek a kifejezések, ahogyan itt használjuk, vonatkozhatnak az emlőssejt populációból és sejttenyésztő közegből (amelyben a populáció szuszpendálva van) álló kombinációra. A sejttenyészetek lehetnek, pl. folyamatos tenyészetek, szakaszos tenyészetek, rátáplálásos-szakaszos tenyészetek vagy egyéb 30 típusú tenyészetek.
1997435
A “közegek”, “közeg”, “sejttenyésztő közeg”, “tenyésztő közeg”, “szövettenyésztő közeg” kifejezések, ahogyan itt használjuk, olyan tápanyagokat tartalmazó oldatokra vonatkoznak, amelyek a tenyésztett eukarióta sejtek növekedését segítik. Általában ezek az oldatok biztosítják az esszenciális és nem-esszenciális aminosavakat, vitaminokat, energiaforrásokat, 5 lipideket és nyomelemeket, amelyek a sejt számára a minimális növekedéshez és/vagy túléléshez szükségesek. Az oldat tartalmazhat olyan komponenseket is, amelyek fokozzák a növekedést vagy a minimális szint feletti túlélést, beleértve a hormonokat és a növekedési faktorokat. Az oldat pH-ját és sókoncentrációját úgy állítják be, hogy az a sejtek túlélése és szaporodása szempontjából optimális legyen. A közeg lehet “denifmált tápközeg” vagy 10 “kémiailag definiált tápközeg” is, egy szérummentes közeg, amely nem tartalmaz fehérjéket, hidrolizátumokat vagy ismeretlen összetételű komponenseket. A definiált tápközeg állati eredetű összetevőktől mentes és minden komponensnek ismert kémiai szerkezete van. A definiált tápközeg tartalmazhat rekombináns glikoproteineket vagy proteineket, például, de nem kizárólag, hormonokat, citokineket, interleukinokat és más jelátviteli molekulákat.
A sejttenyésztő közeg általánosságban “szérummentes”, ha a közeg alapjában véve mentes bármilyen emlős forrásból származó szérumtól (pl. alapjában véve magzati szarvasmarha szérumtól (FBS)), vagy annak frakcióitól. Az “alapjában véve mentes” alatt azt értjük, hogy a sejttenyésztő közeg 0-5% közötti szérumot, előnyösen 0-1% közötti szérumot és legelőnyösebben 0-0,1% közötti szérumot tartalmaz. Előnyösen, szérummentes definiált tápközeg alkalmazható, ahol a közeg egyes komponenseiés azok koncentrációja ismert (vagyis egy definiálásán komponens, mint az eukarióta sejtek extraktuma, sincs jelen a tenyésztő közegben).
A jelen találmány szerinti sejttenyészet bármilyen olyan közegben fenntartható, amely alkalmas az adott sejt tenyésztésére. Egyes kiviteli alakokban a közeg tartalmaz pl. szervetlen sókat, szénhidrátokat (pl. cukrokat, mint glukóz, galaktóz, maltóz vagy fruktóz), aminosavakat, vitaminokat (pl. B-vitaminok (pl. B12), A-vitamin, E-vitamin, riboflavin, tiamin és biotin), zsírsavakat és lipideket (pl. koleszterin és szteroidok), proteineket és peptideket (pl. albumin, 30 transzferrin, fibronektin és fetuin), szérumokat (pl. albumin, növekedési faktorokat és növekedésgátlókat (mint magzati szarvasmarha szérum, újszülött borjúszérum és lószérum) tartalmazó összetételek), nyomelemeket (pl. cink, réz, szelén és trikarbonsav intermedierek), W V r* © w H hidrolizátumokat (növényi és állati fonásból származó hidrolizált fehérjék) és ezek kombinációit. A kereskedelmi forgalomban kapható közegek, mint a 5x töménységű DMEM/F12 (Invitrogen), CD OptiCHO feed (Invitrogen), CD EfficientFeed (Invitrogen), Cell Boost (HyClone), BalanCD CHO Feed (Irvine Scientific), BD Recharge (Becton Dickinson), 5 Cellvento Feed (EMD Millipore), Ex-cell CHOZN Feed (Sigma-Aldrich), CHO Feed
Bioreactor Supplement (Sigma-Aldrich), SheffCHO (Kerry), Zap-CHO (Invitria), ActiCHO (PAA/GE Healthcare), Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) és a Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) példák olyan sejttenyésztő közegekre, amelyek megfelelőek a jelen találmány szerinti módszerhez.
Továbbá, minden közeg, amelyet a következőkben leírnak, alkalmas lehet tenyésztő közegnek:
Ham és Wallace,(1979) Meth. Enz., 58:44; Bames és Sato,(1980) Anal. Biochem., 102:255;
U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 5,122,469 vagy 4,560,655; International
Publication Nos. WO 90/03430; és WO 87/00195. Ezen közegek bármelyike kiegészíthető szükség esetén hormonokkal és/vagy más növekedési faktorokkal (úgy, mint inzulin, 15 transzferrin vagy epidermális növekedési faktor), sókkal (úgy, mint nátrium-klorid, kalcium, magnézium és foszfát), pufferekkel (úgy, mint HEPES), nukleozidokkal (úgy, mint adenozin és timidin), antibiotikumokkal (úgy, mint gentamicin), nyomelemekkel (definíció szerint szervetlen vegyületek, amelyek végső koncentrációja a mikromoláris tartományba esik), lipidekkel (úgy, mint a linolsav és más zsírsavak) és ezek megfelelő hordozóival és glukózzal vagy egy ekvivalens energiaforrással. Egyes kiviteli alakokban a tenyésztő közeg egy szérummentes közeg, egy fehérjementes közeg vagy egy kémiailag definiált tápközeg. Bármely más szükséges kiegészítés is alkalmazható a megfelelő koncentrációban, amely a szakterületen jártas szakember számára ismert.
Az “alaptápoldat-készítmény”, az “alaptápoldat” vagy “alaptápoldatok”, ahogyan itt alkalmazzuk, bármely olyan sejtek tenyésztésére alkalmas sejttenyésztő közegre utalnak, amelyet nem módosítottak sem kiegészítés, sem bizonyos komponens vagy bizonyos komponensek szelektív eltávolítása révén.
A “rátápláló oldat” vagy “rátápláló oldatok” vagy „rátáplálás”, ahogyan itt alkalmazzuk, bármely olyan sejttenyésztő közegre utal, amelyet a sejttenyésztés megkezdése után adagolunk. ΙΛ Ez gyakran jóval töményebb, mint amit egy sejttenyésztő közegben a sejttenyésztés kezdetén
W b* e>
H alkalmazunk és arra szolgál, hogy újra ellássa a sejttenyészetet a felhasznált tápanyagokkal vagy biztosítsa a kiegészítéseket vagy adalékanyagokat a sejttenyészet számára.
A “kiegészítés”, “kiegészítő” vagy “kiegészített” kifejezések adalékanyag vagy kiegészítő 5 komponens hozzáadását jelentik a sejttenyésztő közeghez, pl. egy alaptápoldathoz vagy egy tápközeghez. Ahogyan itt alkalmazzuk az “adalékanyag” és “kiegészítő” kifejezések utalnak minden olyan kiegészítésre, amelyet egy alaptápoldaton vagy egy tápközegen hajtunk végre, hogy az ebben a leírásban megjelölt célokat elérjük. Egy adalékanyag vagy kiegészítő tartalmazhat egy összetevőt, pl. taurint, mangánt vagy fúkózt, vagy tartalmazhat több 10 összetevőt, pl. fúkózt és taurint, fukózt és mangánt, taurint és mangánt, vagy fukózt, mangánt és taurint. Az “adalékanyag” és “kiegészítő” fogalmak minden hozzáadott összetevőre vonatkoznak, akkor is, ha ezeket nem ugyanabban az időben kell adagolni és nem ugyanolyan módon kell adagolni. Például, egy adalékanyag vagy kiegészítő egy vagy több össztevője adagolható egy adagban, vagy kettő vagy több adagban egy törzsoldatból, míg ugyanezen 15 adalékanyag vagy kiegészítő más össztevői adagolhatok a tápközeg részeként. A kiegészítő(k) adagolása történhet folyamatosan vagy félig folyamatosan. Továbbá, egy adalékanyag vagy kiegészítő egy vagy több komponense jelen lehet az alaptápoldatban a sejttenyésztés kezdetétől. A kiegészítés ennek következtében történhet a tenyésztés kezdetén, és/vagy a tenyésztés megkezdését követően, pl. a növekedési és/vagy a termelési fázis során.
A “növelés” vagy “növelt” kifejezések, ahogyan itt alkalmazzuk, azt jelentik, hogy az adalékanyag vagy a kiegészítő az említett kiegészítővel történő kiegészítés előtti koncentrációját megnövelték kiegészítés révén a kiegészítő vagy az adalékanyag egy kiegészítést követő magasabb koncentrációjára. Ez azt jelenti, hogy a kiegészített sejttenyésztő 25 közeg kiegészítő vagy adalékanyag koncentrációja egy meghatátozott mennyiséggel magasabb összehasonlítva a kiegészítővel vagy adalékanyaggal való kiegészítés előttivel.
A sejttenyészet “növekedési fázisa” kifejezés a sejtek exponenciális növekedésének időszakát (log fázis) jelentik, amelyben a sejtek általában gyorsan osztódnak. A sejttenyészet sejtjeinek 30 növekedési ciklusa egy konkrét sejtre nézve már viszonylag kisszámú kísérlet elvégzésével meghatározható. A növekedési fázis során a sejteket sejttenyésztö közegben tenyésztik, amely tartalmazza a szükséges adalékanyagokat, általában 25-40°C-on, előnyösen 37°C-on, e> cn
1907435 szabályozott környezetben, úgy, hogy meghatározott sejtek, pl. egy sejtvonal sejtjeinek optimális növekedését elérjük. A sejteket az exponenciális növekedési szakaszban tartjuk egy körülbelül 1 és 5 nap közötti időtartamon át, pl. 2 és 4 nap között, pl. 4 napig. Például, a növekedési fázis hossza az az időtartam, amely alatt az egyes sejtek egy életképes 5 sejtkoncentrációra szaporodnak fel a maximális életképes sejtkoncentráció 20 % - 80 %-os tartományán belül, ha a tenyészetet a találmány szerinti/fentebb vázolt növekedési feltételek mellett tartották fenn.
A sejttenyészet “termelési fázisa” vagy “fehérje termelési fázisa” azt az időtartamot jelenti, 10 amikor a sejtnövekedés elérte a stacionárius fázist. A termelési fázis során a logaritmikus sejtnövekedés befejeződött és a fehéijetermelés az elsődleges tevékenység a sejttenyészetben. Ezalatt az időtartam alatt a közeget általában kiegészítik, hogy segítsék az állandó fehérjetermelést és elérjék a kívánt glikoprotein terméket. A termelési fázis jellemzően a tenyésztés 5. napján kezdődik és a tenyésztés végéig tart, előnyösen a tenyésztés 14. napjáig. 15
A “sejt életképessége” kifejezés, ahogyan itt alkalmazzuk, a sejttenyésztben lévő sejtek azon képességét jelenti, hogy túléljék a tenyésztési körülményeket vagy kísérleti változások adott sorozatát. A kifejezés, ahogyan itt alkalmazzuk, a tenyészetben adott időpontban életben lévő sejtek mennyiségénekaz összes (élő és élettelen) sejtszámhoz viszonyított arányát is jelenti. A 20 “sejtkoncentráció” vagy “életképes sejtkoncentráció”, ahogyan itt alkalmazzuk, a közeg egy adott térfogatában jelenlévő élő sejtek számára utalnak.
A “szakaszos tenyészet” kifejezés, ahogyan itt alkalmazzuk, egy olyan sejttenyésztési módszert jelent, amelyben minden összetevő, beleértve a közeget, valamint a sejteket magukat is, amelyet 25 végül is alkalmazni fognak a sejtek tenyésztésében, már a tenyésztési folyamat elején rendelkezésre állnak. A szakaszos tenyészetet jellemzően egy ponton leállítják és/vagy a közeg összetevőit összegyűjtik és opcionálisan tisztítják.
A “rátáplálásos-szakaszos tenyészet” kifejezés, ahogyan itt alkalmazzuk, egy olyan 30 sejttenyésztési módot jelöl, amelyben a tenyészethez valamikor a tenyésztési folyamat megkezdése után további komponenseket adunk. A rátáplálásos-szakaszos tenyészet elindítható pl. egy alaptápoldat alkalmazásával. A tápközeg, amelynek segítségével további komponenseket juttatunk a tenyészethez a tenyésztési folyamat megkezdése után a “rátápláló oldat” vagy “tápoldat”. A “rátáplálásos-szakaszos tenyészetet” jellemzően leállítják egy ponton és/vagy a közeg összetevőit összegyűjtik és opcionálisan tisztítják.
A “folyamatos tenyészet” vagy “perfúziós tenyészet”, ahogyan itt alkalmazzuk, egy olyan sejttenyésztési módot jelöl, amelyben a további komponenseket folyamatosan vagy félig folyamatosan adjuk a tenyészethez a tenyésztési folyamat megkezdése után. A hozzáadott komponensek jellemzően tápelem kiegészítőket tartalmaznak a sejtek számára, amelyek a tenyésztési folyamat során kimerülnek. A sejtek és/vagy komponensek egy részét jellemzően 10 összegyűjtik folyamatos vagy félig folyamatos módon és opcionálisan tisztítják.
A sejttenyészetés jellemzően bioreaktorokban történik. A “bioreaktor” kifejezés, ahogyan itt alkalmazzuk, bármilyen olyan laboratóriumi edényt jelöl, amelyet emlős sejttenyészet növesztésére használnak. A tenyészet méretétől függően, a bioreaktor bármilyen méretű lehet, 15 feltéve, hogy alkalmas emlőssejtek tenyésztésére. A bioreaktorok jellemzően legalább 500 milliliteresek és lehetnek 1, 10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000, 2500, 3000, 5000, 8000, 10000, 120000, 15000, 20000 literesek vagy nagyobbak, vagy bármilyen köztes térfogatúak. Például, egy bioreaktor lehet 10-5000 literes, 10-10000 literes, 10-15000 literes, 10-20000 literes, 505000 literes, 50-10000 literes, 50-15000 literes, 50-20000 literes, 1000-5000 literes vagy 100020 3000 literes. A bioreaktor lehet kevert tartályú bioreaktor vagy rázólombik. A bioreaktor belső körülményei, beleértve pl. a pH-t és a hőmérsékletet, jellemzően szigorúan szabályozottak a tenyésztési időszak alatt. A bioreaktor bármilyen anyagból állhat, ami alkalmas emlőssejttenyészetek közegben való tárolására a jelen találmány szerinti tenyésztési feltételek mellett, beleértve az üveget, a műanyagot és a fémet. A “termelő bioreaktor”, ahogyan itt alkalmazzuk, 25 azt a végső bioreaktort jelenti, amelyet a találmány szerinti glikoprotein vagy protein előállítására alkalmazunk.
A “nagyléptékű sejttenyészet” vagy “nagyléptékű termelés”, ahogyan itt alkalmazzuk, olyan termelő bioreaktorokban lévő sejttenyészetekre vonatkozik, amelyek jellemzően legalább 500 30 vagy 1000 literesek, előnyösen legalább 5000 vagy 8000 literesek és leginkább előnyösen 10000 vagy 20000 literesek.
ΙΛ f** ro
Az “antitest” vagy immunoglobulin” kifejezést itt egymással felcserélhetően és a legszélesebb értelemben alkalmazzuk, beleértve a teljes hosszúságú antitesteket, a genetikailag módosított antitesteket, a rekombináns antitesteket, a többértékű antitesteket, a monoklonális antitesteket, a poliklonális antitesteket, a bispecifíkus antitesteket, a multispecifikus antitesteket, a kiméra 5 antitesteket, a humanizált antitesteket, a teljesen humán antitesteket, valamint ezen antitestek fragmenseit feltéve, hogy biológiailag funkcionálisak és a kívánt biológiai aktivitást mutatják. Egy antitest “biológiai aktivitása” az antitest azon képességére utal, hogy antitesthez kötődik és biológiai választ vált ki, amely in vitro vagy in vivo mérhető.
A természetben előforduló antitestek változatos szerkezetű molekulák. Például, a natív IgG antitestek mintegy 150000 Dalton-os heterotetramer glikoproteinek, melyek két azonos könnyű láncból és két azonos nehéz láncból állnak, amelyeket diszulfid hidak kötnek össze. Az N-töl a C-terminálisig, minden nehéz láncnak van egy variábilis doménje (Vh), amit variábilis nehéz doménnek vagy nehéz lánc variábilis doménnek is neveznek, ezt követi három vagy négy konstans dómén (ChI, Ch2, Ch3 és opcionálisan Ch4). Hasonlóan, az N-től a C-terminálisig, minden könnyű láncnak van egy variábilis doménje (Vl), amit variábilis könnyű doménnek vagy könnyű lánc variábilis doménnek is neveznek, ezt követi egy konstans könnyű lánc (Cl) dómén. Az antitest könnyű láncát két típusra oszthatjuk, melyeket a konstans dómén aminosav szekvenciája alapján kappa (K)-nak vagy lambda (k)-nak nevezünk.
A “teljes hosszúságú antitest” magában foglalja a könnyű (Vl) és nehéz lánc (Vh) antigénkötő variábilis régióját, a könnyű lánc konstans régióját (Cl) és a nehéz lánc ChI, Ch2 és Ch3 konstans doménjeit.
Az “antitest fragmens” vagy “antigén-kötő fragmens” kifejezéseket itt a legszélesebb értelemben alkalmazzuk és beleértjük a teljes hosszúságú antitest egy részét, előnyösen annak antigénkötö vagy variábilis régióját. Az antitest fragmens megőrzi a szülő immunoglobulin eredeti specifitását. Az antitest fragmensek közé tartoznak például a Fab, Fab', F(ab')2 és Fv fragmensek, diatestek, lineáris antitestek, egyláncú antitest molekulák és antitest fragmensekböl képzett multispecifikus antitestek. Előnyösen, az antitest fragmens egy Fab fragmens.
Üli mi v
ín ©I
1997435
A “monoklonális antitest” egy antitest, ami specifikus egy antigén egyetlen epitópjára nézve, vagyis egyetlen antigén determinánsra irányul. A szakterületen jártas szakember számára a monoklonális antitestek előállítására szolgáló módszerek ismeretesek.
A “rekombináns antitest” kifejezés minden rekombináns módon előállított, expresszált, létrehozott vagy izolált antitestre vonatkozik, mint a transzgénikus gazdasejtekből, pl. az NSO vagy a CHO sejtből vagy az immunoglobulin génekre nézve transzgénikus állatokból izolált antitestek vagy gazdasejtbe transzfektált rekombináns expressziós faktorok alkalmazásával expresszált antitestek, mint pl. az SP 2/0 egér mielóma sejtek.
A találmány szerinti antitest vagy immunoglobulin előnyösen IgG molekula, mint például egy IgGl, IgG2, IgG3 vagy IgG4 molekula. Előnyösebben, az immunoglobulin IgGl. Előnyösebben az immunoglobulin egy IgGl, ahol legalább az Fc rész humán.
A “kiméra antitest”, pl. egy egér-humán kiméra antitest egy antitest, ahol az Fc rész humán és a variábilis régió egérből származik.
A találmány egyik kiviteli alakjában a kiméra antitest rituximab vagy infliximab.
A rituximab egy kiméra anti-CD20 antitest, amelyet részletesen leírnak, például a WO 94/11026-ben.
Az infliximab egy kiméra anti-TNFa antitest, amelyet részletesen leírnak, például a WO 92/16553-ban.
A “humanizált antitest” egy humán antitest, ahol az antigénkötő rész (komplementaritást meghatározó régió (CDR)) nem-humán fajtól, például egértől származik és ennek a szülő immunoglobulinhoz képest eltérő specificitása van. A CDR fehérjeszekvenciák az emberben természetesen termelődő antitest variánsokhoz való hasonlóság növelése érdekében 30 módosíthatók.
A találmány egyik kiviteli alakjában a humán antitest trastuzumab vagy bevacizumab.
A trastuzumab egy humanizált anti-HER2 antitest, amelyet részletesen leírnak, például a WO 92/22653-ben.
A bevacizumab egy humanizált anti-VEGF antitest, amelyet részletesen leírnak, például a WO 98/45331-ben.
A “teljesen humán antitest” egy antitest, amelynek minden része humán eredetű.
A találmány egyik kiviteli alakjában, a humán antitest adalimumab vagy denosumab.
Az adalimumab egy humán anti-TNFa antitest, amelyet részletesen leírnak, például a WO 97/29131-ben.
A denosumab egy humán anti-RANKL antitest, amelyet részletesen leírnak, például a WO 03/002713-ben.
Egy előnyős kiviteli alakban az antitest rituximab vagy bevacuzumab.
A “terápiás antitest” kifejezés olyan antitestet jelent, amelyet egy betegség kezelésére alkalmaznak. A terápiás antitestnek többféle hatásmechanizmusa lehet. A terápiás antitest köthet egy antigénnel társított targethez és semlegesítheti annak normális funkcióját. Például, egy monoklonális antitest, amely blokkolja egy rákos sejt túléléséhez szükséges fehérjék aktivitását, a sejtek halálát okozza. Egy másik terápiás monoklonális antitest köthet egy antigénnel társított targethez és aktiválhatja annak normális funkcióját. Például, egy monoklonális antitest kötődhet egy sejt fehérjéjéhez és kiválthat apoptózis jelet. A monoklonális antitestek egy másik csoportja csak beteg szöveteken expresszálódott target antigénekhez kötődhet; a hatékony ágens (úgy, mint kemoterápiás vagy radioaktív ágens) konjugációja a monoklonális antitesttel létrehozhat egy olyan ágenst, amely a hatékony ágens beteg szövethez való specifikus eljuttatására szolgál, csökkentve ezzel az egészéges szövetet érintő ártalmakat. A terápiás antitest “biológiailag funkcionális fragmense” hordoz legalább un m
v r**
Λ egy, ha nem néhány vagy az összes biológiai funkciót, ami egy ép antitestnek tulajdonítható, amely funkció magában foglalja legalább a target antigénhez való specifikus kötődést.
Az “ozmolalitás” kifejezés egy vizes oldatban lévő oldott részecskék ozmotikus nyomásának 5 mértéke. Az oldott részecskék magukban foglalják az ionokat és a nem-ionizált molekulákat egyaránt. Az ozmolalitást az 1 kg vízben feloldott ozmotikusán aktív részecskék (vagyis ozmolok) koncentrációjaként fejezik ki (1 mOsm/kg H2O 37° C-on ekvivalens 2,5 kPa ozmotikus nyomással (19 mm Hg)). A tenyészet ozmolalitása a tenyésztési periódus során és/vagy további oldott anyagok (pl. kiegészítésként történő) hozzáadásakor növekszik, hacsak 10 nem szabályozzák és/vagy stabilizálják. Következésképpen, minél hosszabb a sejttenyésztési periódus, annál nagyobb az ozmolalitás.
Az “ozmolaritás” az 1 liter oldatban lévő oldott részecskék számát jelenti. Következésképpen, az oldott anyagok, mint a kiegészítők (pl. fukóz, mangán és/vagy taurin) hozzáadása a tenyésztő 15 közeghez növelni fogja az ozmolaritást. Jellemzően az adott sejttenyészetnek van egy optimális ozmolaritási tartománya a sejttenyésztö közegre nézve és az ozmolalitást eszerint stabilan ezen az optimális ozmolalitási tartományon belül kell tartani. Amikor itt alkalmazzuk, az mOsm rövidítés milliozmol/kg H2O-t jelent.
A “titer” kifejezés”, ahogyan itt alkalmazzuk, a sejttenyészetben termelt, rekombinánsan expresszált glikoprotein és a közegtérfogat egy meghatározott mennyiségének hányadosát jelenti. A titert jellemzően milligram glikoprotein per milliliter közeg egységben vagy gram glikoprotein per liter közeg egységben fejezzük ki.
Az “izolálás”, “izolál”, “izolált”, “tisztít”, “tisztítás” vagy “tisztított” kifejezés, ahogyan itt alkalmazzuk, egyes sejteknek vagy az összes sejtnek, sejttörmeléknek, sejttenyésztő közegnek, sejttenyésztő közeg komponenseineknek és más, a sejttenyészetet alkotó anyagoknak, amelyekben rekombináns glikoproteint termeltek a rekombináns glikoproteinből, eltávolítását vagy elválasztását jelentik. Általánosságban, jellemzően kívánatos a sejttenyészetben termelt 30 glikoproteinek izolálása. A glikoproteint a sejtek pl. szekretálhatják a közegbe és így a sejteket és más szilárd anyagokat eltávolíthatjuk, pl. centrifugálással vagy szűréssel, az izolációs m folyamat első lépéseként. Vagy pedig, az expresszált glikoprotein a sejttenyészet sejtjeinek m nr b. ©' felületére kötődik. Ebben a kiviteli alakban a közeget eltávolítjuk és a glikoproteint expresszáló sejteket feltárjuk a tisztítási folyamat első lépéseként. Az emlőssejtek feltárását a szakterületen jártas szakember számos jól ismert eszközzel meg tudja valósítani, beleértve az üveggyöngyökkel való fizikai szétzúzást és magas pH körülményeknek való kitevést. A 5 glikoprotein izolálható és/vagy tisztítható standard módszerekkel, beleértve pl. a kromatográfiát (pl. ioncsere, affinitás, méretkizárásos és hidroxiapatit kromatográfia), gélszürést, centrifugálást, differenciális oldhatóságot, etanol precipitációt vagy bármely egyéb fehérjék tisztítására elérhető technikát (lásd, pl., Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S. J. és Hames, B. D. (eds.), Protein
Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; és Deutscher, Μ. P., Simon, M.
I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997). Immunoaffinitás kromatográfia esetén a glikoprotein izolálható affinitás oszlopon, amely az adott fehérjére specifikus antitesteket tartalmaz az álló fázisra rögzítve. Vagy pedig affinitás jelölések, pl. influenza köpenyfehérje szekvencia, polihisztidin vagy glutation-S-transzferáz kapcsolhatók a glikoproteinhez standard rekombináns módszerekkel, hogy a megfelelő affinitás oszlopon való elválasztás révén egyszerű tisztítást biztosítanak. A proteáz inhibitorok, mint a fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF), a leupeptin, a pepsztatin vagy az aprotinin bármely vagy az összes fázisban hozzáadhatok, hogy csökkentsék vagy megszüntessék a glikoprotein bomlását az izolációs és/vagy tisztítási folyamat során. A proteáz inhibitorok különösen akkor kívánatosak, amikor a sejteket fel kell tárni az expresszált glikoprotein izolálása és tisztítása érdekében. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a pontos izolálási és/vagy tisztítási technika attól függően változik, hogy mik az izolálandó/tisztítandó glikoprotein jellemzői, mik azon sejtek jellemzői, amelyek a glikorproteint expresszálták és függ azon közeg összetételétől, 25 amelyekben a sejteket növesztették.
Ha kívánatos a glikozilációs mintázat szabályozása, pl. a sejttenyészetben termelt rekombináns glikoproteinek afukozilált cukorformái mennyiségének csökkentése érdekében, pl. a glikoprotein ADCC-jének csökkentése és/vagy a referencia glikoproteinhez hasonló 30 fukozilációs mintázatú glikoprotein termelése érdekében, fukózzal kiegészíthető a sejttenyészet (Id. 2. példa). Azonban a fukóz hozzáadása a termelt glikoprotein galatozilációjának Λ csökkenéséhez is vezethet, ami nem kívánatos glikozilációs és/vagy galaktozilációs mintázatot b* G> £βι eredményezhet, mert ez nem hasonló a referencia glikoprotein glikozilációs és/vagy galaktozilációs mintázatához és/vagy nem kívánatos az előállított glikoprotein biológiai aktivitása, biztonságossága és hatásossága tekintetében sem. (Id. még: Raju és Jordan. MAbs. May 1; 4(3): 385-391 (2012)).
A galatoziláció csökkenése ellen mangánnal is kiegészíthetjük a sejttenyészetet. A mangánnal történő kiegészítés úgy változtatja meg az előállított glikoprotein galaktozilációs mintázatát, hogy a csak fukózzal végzett kiegészítéssel tapasztalható csökkenés nem következik be, vagyis a galaktozilációs mintázat hasonlít/j óbban hasonlít a referencia glikoproteinéhez. Azonban ez 10 a módosítás a tenyészet ozmolalitásának növekedéséhez/további növekedéséhez is vezet. A sejtek fenntartása során az ozmolalitás folyamatosan növekszik és aránylag magas értéket ér el, mivel a megtermelt glikoprotein mennyiségének maximlizálása érdekében a sejttenyésztés időtartama viszonylag hosszú, pl. 11-18 napos időtartam, pl. 13-15 napos időtartam, pl. 14 napos időtartam. Azonban a magas ozmolalitás, mely a kiegészítések hatására tovább 15 emelkedik, növeli az afukozilált cukorformák képződését, vagyis a glikoprotein fúkozilációs mintázatának csökkenéséhez vezet (Id. 3. példa). Ez természetesen pontosan az ellentéte annak a hatásnak, amit a fukózzal történő kezdeti kiegészítéssel elérhetünk és ellentetés a szakterületen tett korábbi megfigyelésekkel, ahol a magasabb ozmolalitás, függetlenül az ezért felelős oldott anyagtól, az afukozilált cukorformák csökkenéséhez, vagyis a fukozilált 20 cukorformák növekedéséhez vezetett (Konno et al., Cytotechnology 64(3):249-65 (2012)).
A sejttenyészet fukózzal és mangánnal történő kiegészítését követően megfigyelt nem kívánatos afukozilált cukorforma növekedés ellen megkíséreltük az ozmoprotektáns taurinnal való további kiegészítést (Id. 4. példa). Meglepő módon azt találtuk, hogy a taurin nemcsak a 25 sejttenyészet ozmolalitásának stabilizálására szolgálhat, de az afukozilált cukorformák képződésének további csökkentésére is, vagyis a megtermelt glikoprotein fükoziláltságának növelésére is (Id. 5. példa). Ily módon, egy sejttenyésztő közeg fukózzal, mangánnal és taurinnal való kiegészítése megváltoztathatja a sejttenyészetben előállított glikoprotein glikozilációs mintázatát, beleértve a fúkozilációs mintázatot és/vagy galaktozilációs mintázatot 30 úgy, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoproteinéhez annál, mintha kiegészítés nélkül állították volna elő. A taurin alkalmazásának, ellentétben a szakterületen szokásosan használt ozmoprotektánsokkal, mint a bétáin, további előnye a termék titer növelése (W02017024062).
Következésképpen, a jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának (beleértve egy vagy több fukozilációs mintázatot és/vagy galaktozilációs mintázatot) módosítására, ami magában 5 foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, és ahol a sejttenyésztő közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki és ahol a glikozilációs mintázatot (beleértve az előállított rekombináns glikoprotein egy vagy több fokozilációs mintázatát és/vagy galaktozilációs mintázatát) úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein egy vagy több fokozilációs mintázatához és/vagy 10 galaktozilációs mintázatához annál, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, és ahol a sejttenyésztő közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki, és ahol az előállított 15 rekombináns glikoprotein fokozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoproteinéhez annál, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fokozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fokozilációs mintázatával. Előnyösen, a módosított fokozilációs mintázat legalább 20 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, és ahol a sejttenyésztő közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki, és ahol 25 az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoproteinéhez annál, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben MM
q. előállított rekombináns glikoprotein fokozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának r* o
módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, és ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki, és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fükozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoproteinéhez annál, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fükozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fükozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Egy kiviteli alakban a tenyésztő közeg fükóz koncentrációját 0,4 -1,6 mM-lal növelik, például 0,4, 0,44, 0,48, 0,52, 0,56, 0,6, 0,64, 0,68, 0,72, 0,76, 0,8, 0,84, 0,88, 0,92, 0,96, 1, 1,04, 1,08, 1,12, 1,16, 1,2, 1,24, 1,28, 1,32, 1,36, 1,4, 1,44, 1,48, 1,52, 1,56 vagy 1,6 mM-lal, kiegészítés révén. Egy előnyös kiviteli alakban, a tenyésztő közeg fükóz koncentrációját 0,4 - 1,2 mM-mal növelik, például 0,4, 0,44, 0,48, 0,52, 0,56, 0,6, 0,64, 0,68, 0,72, 0,76, 0,8, 0,84, 0,88, 0,92, 0,96,1,1,04,1,08,1,12,1,16 vagy 1,2 mM-lal, kiegészítés révén. Egy előnyös kiviteli alakban, a tenyésztő közeg fükóz koncentrációját 0,6 -1 mM-mal növelik, például 0,6, 0,64, 0,68, 0,72, 0,76, 0,8, 0,84, 0,88, 0,92, 0,96 vagy 1 mM-lal, kiegészítés révén. A legelőnyösebb kiviteli alakban a tenyésztő közeg fükóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, kiegészítés révén.
Előnyösen, a fükózzal való kiegészítést, ahogyan fentebb leírtuk, egy rátápláló oldattal való kiegészítéssel éljük el, ahol a rátápláló oldat fükóz koncentrációja 10 mM és 40 mM közötti, például 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26, 27, 28, 29, 30,31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 vagy 40 mM. Egy előnyös kiviteli alakban a tápközeg fükóz koncentrációja 10 mM és 30 mM közötti, például 10, 11, 12,13, 14,15,16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25,26,27, 28,29 vagy 30 mM. Egy előnyös kiviteli alakban a rátápláló oldat fükóz koncentrációja 15 mM és 25 mM közötti, például 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 vagy 25 mM. A legelőnyösebb kiviteli alakban a rátápláló oldat fukóz koncentrációja 20 mM.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő ft
19Θ7435 közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal növelik, előnyösen 0,4 - 1,2 mM-lal, még előnyösebben 0,6 - 1 mM-lal, legelőnyösebben 0,8 mM-lal, és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna 5 elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a 10 sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal növelik, előnyösen 0,4 - 1,2 mM-lal, még előnyösebben 0,6 - 1 mM-lal, legelőnyösebben 0,8 mM-lal, és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna 15 elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
A jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított 20 rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 -1,6 mM-lal növelik, előnyösen 0,4 -1,2 mMlal, még előnyösebben 0,6 - 1 mM-lal, legelőnyösebben 0,8 mM-lal, és ahol az előállított 25 rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs 30 mintázatával.
A jelen találmány még egy másik, előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztö közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fukózzal, mangánnal és taurirmal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal növelik, előnyösen 0,4 - 1,2 mM-lal, még előnyösebben 0,6 - 1 mM-lal, legelőnyösebben 0,8 5 mM-lal, és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fúkozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %10 os egyezést mutat a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Egy kiviteli alakban a tenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, még előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik.
A fent leírt mangánnal való kiegészítést előnyösen egy rátápláló közeggel történő kiegészítése révén valósítják meg, ahol a tápközeg mangán koncentrációja 0,5 - 2,5 μΜ közötti, előnyösen 20 1,0 - 2,0 μΜ közötti, előnyösebben 1,5 - 2,0 μΜ közötti és legelőnyösebben 1,7 μΜ ± 0,2 μΜ.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurirmal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő 25 közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lai, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lai, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lai és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lai növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Mii v
in ©
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik, előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜlal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a
Η referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sej «enyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyészto közeg fukóz koncentrációját 0,8 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sej «enyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a ui β rs sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyészto közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját
0,02 - 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg fukóz koncentrációját 0,8 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lai, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lai, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜlai és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lai növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a ui
Μ referenda glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
ts ©
Η
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fokoz koncentrációját 0,8 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜlal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fokozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztö közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fokóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal, a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fokozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fokozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fokozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fokozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fokozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek in tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fúkóz koncentrációját 0,8 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,02 - 0,1 μΜ-lal, előnyösen 0,04 - 0,08 μΜ-lal, előnyösebben 0,06 - 0,08 μΜ-lal és legelőnyösebben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %- os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Egy kiviteli alakban a tenyésztő közeg taurin koncentrációja kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, például 12,5,15,17,5,20,22,5,25,27,5, 30,32,5,35,37,5,40,42,5 vagy 50 mM. Egy előnyös kiviteli alakban a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 15 és 35 mM közötti, például 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5 vagy 35 mM. Egy előnyös kiviteli alakban a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 20 és 30 mM közötti, például 20, 22,5, 25, 27,5 vagy 30 mM. A leginkább előnyös kiviteli alakban a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 25 mM.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol a rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns
Ml 30 glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a taurin végső r* koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol a rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatához, mintha az 5 említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított 10 rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább 15 előnyösen 25 mM és ahol a rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein 20 galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egyik másik előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fukózzal, mangánnal és 25 taurinnal egészítik ki úgy, hogy a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol a rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az 30 említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os,
1307435 legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 0,6 mM-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztö közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 0,6 mM-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést 5 mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő 10 közeg fükóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül 15 állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilácós mintázatának módosítására, ami magában foglalja a 20 rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztö közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 0,6 mM-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább 25 előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilácós mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilácós mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilácós mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein 30 galaktozilácós mintázatával.
1397435
1907435
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fiikózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy 5 a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett 10 kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben 15 előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának és galaktozilácós mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fükózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 0,6 mM-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 20 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát és galaktozilácós mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához és galaktozilácós mintázatához , mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat 25 legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy további előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának és galaktozilácós mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fúkóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatát és galaktozilácós mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatához és galaktozilácós mintázatához , mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fúkozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-s, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM
ΙΛ közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az h» előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns 5 glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM 10 közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %15 os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő 20 közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés 25 nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %os egyezést egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a 30 rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik, előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fokozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜlal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fokozilációs
ΙΛ mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik, előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik, a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal, a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ-lai növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és
Üli mi v is ©
mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein
H glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg fukóz koncentrációját 0,8 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,06 0,08 μΜ-lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fükóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fükóz koncentrációját 0,8 mM-lal, a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést u·» v ft ®·
Η követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 es 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein glikozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fúkóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ-lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fúkóz koncentrációját 20 mM-lal növelik, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ-lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal növelik, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lai növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egyik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lai növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fukozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fukozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fúkózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fúkóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal növelik, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ -lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM
Ull m tr fw közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fokóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ -lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fokóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal növelik, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat f** legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány egy másik kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fukóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik, előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg fukóz koncentrációját 0,4 - 1,6 mM-lal növelik, a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ-lai növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fúkozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatával és a
I»
H
1% módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik, előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztö közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fukózzal, mangánnal és taurirmal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg fúkóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,06 - 0,08 μΜ-lai növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fúkozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik, előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztö közegben, ahol a sejttenyésztö közeget fukózzal, mangánnal és taurirmal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztő közeg fúkóz koncentrációját 0,4 - 1,4 mM-lal növelik, a sejttenyésztő közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lai növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, legmkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fúkozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fúkozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett
H kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fükozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fükozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Jelen találmány még egy másik, előnyös kiviteli alakja módszert biztosít sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fükozilációs mintázatának és galaktozilációs mintázatának módosítására, ami magában foglalja a rekombináns glikoproteint expresszáló eukarióta sejtek tenyésztését egy sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fukózzal, mangánnal és taurinnal egészítik ki úgy, hogy a sejttenyésztö közeg fukóz koncentrációját 0,8 mM-lal növelik, a sejttenyésztö közeg mangán koncentrációját 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lai növelik és a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben kiegészítést követően 12,5 és 50 mM közötti, előnyösebben 15 és 35 mM közötti, még előnyösebben 20 és 30 mM közötti, leginkább előnyösen 25 mM és ahol az előállított rekombináns glikoprotein fükozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát úgy módosítják, hogy az jobban hasonlítson a referencia glikoprotein fükozilációs mintázatához és galaktozilációs mintázatához, mintha az említett kiegészítés nélkül állították volna elő. Előnyösen, a módosított fükozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fükozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
Egy kiviteli alakban, az előző kiviteli alakok bármelyike szerinti módszer magában foglalja továbbá az előállított rekombináns glikoprotein sejttenyészettöl való izolálásának lépését. Egy speciális kiviteli alakban az izolációs lépés magában foglalja a fehérje A tisztítást.
Bármely eukarióta sejt vagy sejttípus, amely alkalmas a sejttenyésztésre és képes rekombináns glikoprotein expresszálására, használható jelen találmánnyal és különösen a találmány bármelyik előzőleg említett kiviteli alakjával megegyezően. Például, növényi sejtek, élesztösejtek, állati sejtek, rovarsejtek, madársejtek vagy emlőssejtek használhatók jelen találmánnyal megegyezően. A jelen találmánnyal megegyezően alkalmazható emlős sejtek is © ©
H példáiba beleértendő a BALB/c egér mielóma sejtvonal (NSO/l, ECACC No: 85110503); a humán retinoblasztok (PER.C6 (CruCell, Leiden, The Netherlands)); az SV40-nel transzformált majomvese CV1 sejtvonal (COS-7, ATCC CRL 1651); a humán embrionális vese sejtvonal (293 vagy szuszpenziós tenyészetben való növekedésére szubklónozott 293 sejtek, 5 Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); az embrionális hörcsög vese sejtek (BHK, ATCC
CCL 10); a kínai hörcsög petefészek sejtek ± DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), pl., kínai hörcsög petefészek M-sejtvonal (CHO-M); az egér Sertoli-sejtek (TM4, Mather, Bioi. Repród., 23:243-251 (1980)); majomvese sejtek (CV1 ATCC CCL 70); az afrikai zöld majom vese sejtek (VERO-76, ATCC CRL-1 587); a humán 10 méhnyakrák sejtek (HeLa, ATCC CCL 2); a kutya vese sejtek (MDCK, ATCC CCL 34); a
Buffalo patkány máj sejtek (BRL 3 A, ATCC CRL 1442); a humán tüdő sejtek (W138, ATCC CCL 75); a humán máj sejtek (Hep G2, HB 8065); az egér emlő tumor (MMT 060562, ATCC CCL5 1); a TRI sejtek (Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); a MRC 5 sejtek és az FS4 sejtek.
A jelen találmány céljaira megfelelő eukarióta sejtek szelektálhatok vagy módosíthatók úgy, hogy nagy mennyiségben termeljenek glikoproteint. A sejteket gyakran genetikailag módosítják úgy, hogy nagy mennyiségben termeljenek glikoproteint, például a kívánt rekombnáns glikoproteint kódoló gén bejuttatásával és/vagy olyan kontroll tényezők 20 bevezetésével, amelyek a kívánt glikoproteint kódoló gén expresszióját szabályozzák (legyen az endogén vagy bejuttatott).
Az eukarióta sejtek szelektálhatok vagy módosíthatók, úgy (is), hogy szérummentes közegben való tenyésztésre alkalmasak legyenek.
Egy kiviteli alakban az eukarióta sejtek olyan vektort tartalmaznak, amely a később glikozilált fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmazza.
Egy másik kiviteli alakban legalább egy glikoproteint expresszáló, kereskedelmi forgalomban kapható vagy nem kapható hibridóma sejtek használhatók jelen találmánnyal megegyezően. Egy előnyös kiviteli alakban az eukarióta sejtek kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek. Egy 30 előnyös kiviteli alakban a CHO sejtek tartalmaznak egy vektort, amely a később glikozilált fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmazza. Például, CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-DUKX
IS ©'
H (ATCC CRL-9096), Led ATCC CRL-1735, CHO-DG44 (ThermoFisher), CHO-M (Selexis), CHO-S (ThermoFisher) vagy CHO Pro-5 (ATCC CRL-1781) megfelelőek.
Egy különösen előnyös kiviteli alakban az eukarióta sejtek a Selexis SURE CHO-M sejtvonal (CHO-M) sejtjei. Egy előnyös kiviteli alakban a CHO-M sejtek tartalmaznak egy vektort, 5 amely a később glikozilált fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmazza.
Egy kiviteli alakban a rekombináns glikoproteint, amelynek glikozilációs mintázatát módosították az előző kiviteli alakok bármelyike szerinti módszerrel, nagy léptékben termelik, ami legalább 500 vagy 1000 literes tenyésztési térfogatot jelent, előnyösen legalább 5000 vagy 10 8000 litert és leginkább előnyösen 10000 vagy 20000 litert.
Egy kiviteli alakban a rekombináns glikoproteint, amelynek glikozilációs mintázatát módosították az előző kiviteli alakok bármelyike szerinti módszerrel, kis léptékben vagy laboratóriumi léptékben termelik, ami 1, 5, 10 vagy 100 literes tenyésztési térfogatot jelent.
Egy kiviteli alakban a rekombináns glikoprotein, amelynek glikozilációs mintázatát módosították az előző kiviteli alakok bármelyike szerinti módszerrel, egy IgG típusú immunoglobulin. Egy előnyös kiviteli alakban a rekombináns glikoprotein egy antitest. Egy előnyösebb kiviteli alakban a rekombináns glikoprotein egy monoklonális antitest. A leginkább előnyös kiviteli alakban a rekombináns glikoprotein egy terápiás monoklonális antitest.
A bármely előző kiviteli alak szerinti módszerben szereplő sejttenyészet, amelyben a rekombináns glikoproteint termelik, fenntartható 1-18 napig, pl. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 vagy 18 napig. Az egyik kiviteli alakban, a sejttenyészetet 4-18 napig tartják fenn, pl. 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 vagy 18 napig. Egy előnyös kiviteli alakban a sejttenyészetet 8-16 napig tartják fenn, pl. 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15 vagy 16 napig.
Egy előnyösebb kiviteli alakban a sejttenyészetet 10-14 napig tartják fenn, pl. 10, 11, 12, 13 vagy 14 napig. A legelőnyösebb kiviteli alakban bármely előző kiviteli alak szerinti módszerben szereplő sejttenyészetet 14 napig tartják fenn.
A bármely előző kiviteli alak szerinti módszerben lévő kiegészítés történhet a tenyésztés elejétől a tenyésztés végéig folyamatosan vagy szakaszosan. Például, az adalékanyagok vagy Mii fpj 30 kiegészítők egy vagy több komponense adagolható egy adagban vagy kettő vagy több adagban e in
Λ rt egy törzsoldatból, míg ugyanazon adalékanyag vagy kiegészítő más összetevői hozzáadhatok a tápközeg részeként. Továbbá, egy adalékanyag vagy kiegészítő egy vagy több komponense jelen lehet az alaptápoldatban a sejttenyésztés kezdetétől. A kiegészítés ennek megfelelően történhet a tenyésztés elején és/vagy tenyésztés megkezdését követően, pl. a mövekedési fázis 5 alatt és/vagy a termelési fázis alatt.
Egyik kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése történhet a tenyésztés elején. Egy előnyös kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése taurinnal történik a tenyésztés elejétől. Egy előnyösebb kiviteli alakban, a sejtenyésztö közeg kiegészítése taurinnal történik a tenyésztés elejétől úgy, hogy a kiegészítést követően a sejttenyésztő közegben a végső 10 koncentráció 12,5-50 mM közötti. A leginkább előnyös kiviteli alakban a sejtenyésztő közeg kiegészítése taurinnal történik a tenyésztés elejétől úgy, hogy a kiegészítést követően a sejttenyésztő közegben a végső koncentráció 25 mM.
Egyik kiviteli alakban, a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól kezdve, előnyösen a tápközeg részeként. Egy előnyös kiviteli 15 alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól kezdve, fukózzal. Egy előnyösebb kiviteli alakban a sejjtenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól kezdve, fukózzal, úgy, hogy a fukóz koncentrációját a tenyésztő közegben 0,4-1,6 mM-lal növelik. Egy még előnyösebb kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a 20 tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól kezdve, fukózzal, úgy, hogy a fukóz koncentrációját a tenyésztő közegben 0,8 mM-lal növelik.
Egy előnyös kiviteli alakban, a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól kezdve a tenyésztés 13. napjáig, előnyösen a tápközeg részeként. Egy előnyösebb kiviteli alakban, a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon 25 történik a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól kezdve a tenyésztés 13. napjáig, fukózzal.
Egy előnyösebb kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól kezdve a tenyésztés 13. napjáig, fukózzal, úgy, hogy a fukóz koncentrációját a tenyésztő közegben 0,4-1,6 mM-lal növelik. Egy még előnyösebb kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés 30 kezdetétől számított 3. naptól kezdve a tenyésztés 13. napjáig, fúkózzal, úgy, hogy a fukóz koncentrációját a tenyésztő közegben 0,8 mM-lal növelik.
Egyik kiviteli alakban, a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól kezdve a tenyésztés 9. napjáig, előnyösen a tápközeg részeként. Egy előnyös kiviteli alakban, a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól kezdve, mangánnal. Egy előnyösebb kiviteli alakban 5 a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól kezdve, mangánnal, úgy, hogy a mangán koncentrációját a tenyésztő közegben 0,040,08 μΜ-lal növelik. Egy előnyösebb kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól kezdve mangánnal, úgy, hogy a mangán koncentrációját a tenyésztő közegben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ -lal növelik.
Egy előnyös kiviteli alakban, a sejttenyésztő közeg mangánnal való kiegészítése a korábbi mangánnal való kiegészítésre vonatkozó kiviteli alakok bármelyikében mangán-klorid (MnCh) formájában történik. Egy előnyös kiviteli alakban a mangánnal való kiegészítés mangán-klorid formájában történik, minden 2. napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól kezdve, opcionálisan a tenyésztés 9. napjáig, előnyösen a tápközeg részeként. Egy előnyösebb kiviteli 15 alakban, a sejttenyésztö közeg kiegészítése minden 2. napon történik a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól kezdve, mangánnal. Egy előnyösebb kiviteli alakban a mangánnal való kiegészítés mangán-klorid formájában történik, minden 2. napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól kezdve, opcionálisan a tenyésztés 9. napjáig, úgy, hogy a mangán koncentrációját a tenyésztő közegben 0,04-0,08 μΜ-lal növelik. Egy még előnyösebb kiviteli 20 alakban a mangánnal való kiegészítés mangán-klorid formájában történik, minden 2. napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól kezdve, opcionálisan a tenyésztés 9. napjáig, úgy, hogy a mangán koncentrációját a tenyésztő közegben 0,068 μΜ ± 0,01 μΜ-lal növelik.
Egy kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése bármelyik korábbi kiviteli alak szerinti módon történik, taurinnal a tenyésztés kezdetétől, fúkózzal minden második napon a tenyésztés 25 kezdetétől számított 3. naptól és mangánnal, opcionálisan mangán-kloridként, minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól. Egy előnyös kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése taurinnal a tenyésztés kezdetétől, fúkózzal minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól a tenyésztés 13. napjáig, és mangánnal, opcionálisan mangán-kloridként, minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól a 30 tenyésztés 9. napjáig, előnyösen rendre a tápközeg részeként. Egy másik előnyös kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése taurinnal a tenyésztés kezdetétől történik úgy, hogy rW a sejttenyésztő közeg koncentrációja a kiegészítést követően 12,5 - 50 mM közötti, fukózzal minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól úgy, hogy a fukóz koncentrációját a sejttenyésztő közegben 0,4-1,6 mM-lal növelik és mangánnal, opcionálisan mangán-kloridként, minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól úgy, 5 hogy a mangán koncentrációját a sejttenyésztő közegben 0,04 - 0,08 μΜ-lai növelik. Egy előnyösebb kiviteli alakban a sejttenyészto közeg kiegészítése taurinnal a tenyésztés kezdetétől történik úgy, hogy a sejttenyésztő közeg koncentrációja a kiegészítést követően 12,5 - 50 mM közötti, fukózzal minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól a tenyésztés 13. napjáig, úgy, hogy a fukóz koncentrációját a sejttenyészto közegben 0,4 - 1,6 mM-lal 10 növelik és mangánnal, opcionálisan mangán-kloridként, minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól a tenyésztés 9. napjáig úgy, hogy a mangán koncentrációját a sejttenyészto közegben 0,04 - 0,08 μΜ-lai növelik. Egy másik előnyös kiviteli alakban, a tenyésztő közeg kiegészítése taurinnal történik tenyésztés elejétől úgy, hogy a kiegészítést követően a sejttenyésztő közegben a végső koncentráció 25 mM, fukózzal minden második 15 napon a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól úgy, hogy a fukóz koncentrációját a sejttenyésztő közegben 0,8 mM-lal növelik es mangánnal, opcionálisan mangán-kloridként, minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól úgy, hogy a mangán koncentrációját a sejttenyészto közegben 0.068 μΜ ± 0.01 μΜ -lal növelik. A legelőnyösebb kiviteli alakban a tenyésztő közeg kiegészítése taurinnal történik tenyésztés elejétől úgy, hogy 20 a kiegészítést követően a sejttenyésztő közegben a végső koncentráció 25 mM, fukózzal minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól a tenyésztés 13. napjáig, úgy, hogy a fukóz koncentrációját a sejttenyésztő közegben 0,8 mM-lal növelik és mangánnal, opcionálisan mangán-kloridként, minden második napon a tenyésztés kezdetétől számított 5. naptól a tenyésztés 9. napjáig, úgy, hogy a mangán koncentrációját a sejttenyésztő közegben 25 0.068 μΜ ± 0.01 μΜ -lal növelik.
Egy kiviteli alakban a sejttenyésztő közeg kiegészítése a sejttenyészet termelő fázisában történik.
Egy kiviteli alakban, a bármelyik korábbi kiviteli alak szerinti módszerben lévő sejttenyészetet 35 - 40 °C között tartják, pl. 35, 36, 37, 38, 39 vagy 40 °C-on vagy bármely köztes 30 hőmérsékleten. Egy előnyös kiviteli alakban, a sejttenyészetet 36 - 38 °C között tartják, pl. 36, tíli m r K © vagy 38 °C vagy bármely köztes hőmérsékleten. A legelőnyösebb kiviteli alakban, a sejttenyészetet 37 °C-on tartják.
Egy kiviteli alakban, a bármelyik korábbi kiviteli alak szerinti módszerben lévő sejttenyészet pH-ja 6-9 közötti, pl. pH= 6, 7, 8 vagy 9. Egy előnyös kiviteli alakban, a sejttenyészet pH-ja 5 7,05 ± 0,05.
Egy különösen előnyös kiviteli alakban, a bármelyik korábbi kiviteli alak szerinti sejttenyészet egy rátáplálásos-folyamatos tenyészet.
Egy kiviteli alakban, a bármelyik korábbi kiviteli alak szerinti módszerben lévő glikoprotein egy VEGF antagonists előnyösen egy anti-VEGF antitest (Id. 1-5. példák). Egy előnyös kiviteli 10 alakban a VEGF antagonists előnyösen az anti-VEGF antitest fokozilációs mintázatát módosítják. Egy előnyösebb kivititeli alakban, a módosított fokozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest fokozilációs mintázatával. Egy másik előnyös kivititeli alakban, a VEGF antagonista, 15 előnyösen az anti-VEGF antitest galaktozilációs mintázatát módosítják. Egy előnyösebb kivititeli alakban a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest galaktozilációs mintázatával. Még egy másik előnyös kiviteli alakban a VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest 20 fokozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát módosítják. Egy előnyösebb kivititeli alakban a módosított fokozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest fokozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 25 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest galaktozilációs mintázatával.
Egy kiviteli alakban, a bármelyik korábbi kiviteli alak szerinti módszerben lévő glikoprotein egy anti-CD20 antitest (Id. 6. példa). Egy előnyös kiviteli alakban az anti-CD20 antitest fokozilációs mintázatát módosítják. Egy előnyösebb kivititeli alakban, a módosított m 30 fokozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább V N ©' Λ' H ui r
υΐ %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia anti-CD20 antitest fukozilációs mintázatával. Egy másik előnyös kivititeli alakban az anti-CD20 antitest galaktozilációs mintázatát módosítják. Egy előnyösebb kivititeli alakban a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 5 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia anti-CD20 antitest galaktozilációs mintázatával. Még egy másik előnyös kiviteli alakban az anti-CD20 antitest fukozilációs mintázatát és galaktozilációs mintázatát módosítják. Egy előnyösebb kivititeli alakban a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat referencia 10 anti-CD20 antitest fukozilációs mintázatával és a módosított galaktozilációs mintázat legalább %-os, előnyösen legalább 95%-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia anti-CD20 antitest galaktozilációs mintázatával.
Bár a találmányt részletesen szemléltettük és leírtuk a rajzokkal és az előbbi leírással, ezeket az 15 illusztrációkat és a leírást szemléltetőnek vagy irányadónak és nem korlátozónak kell tekinteni.
A találmány nem korlátozódik a feltárt kiviteli alakokra. A szakterületen jártas szakember az igényelt találmány gyakorlati megvalósítása során a feltárt kiviteli alakok más változatait képes megérteni és megvalósítani a rajzok, feltárás és a függő igénypontok tanulmányozásával.
A részletes leírás sokkal inkább irányadó jellegű és nem célja az alkalmazások és felhasználás korlátozása. A következő példák tovább szemléltetik a jelen találmányt anélkül, hogy a találmány oltalmi körét korlátoznák. A szakterületen jártas szakember különböző változtatásokat és módosításokat tehet a találmány leírása alapján és ezek a változtatások és módosítások szintén beleértendők a jelen találmányba.
1.907 43 5
PÉLDÁK
1. A fukóz források hatása a fukozilációs mintázatra
Ahhoz, hogy egy anti-VEGF antitest fukozilációs mintázatát úgy tudjuk változtatni, hogy jobban hasonlítson (ebben az esetben nagyobb legyen) a humán terápiás alkalmazás céljára törzskönyvet szerzett referencia anti-VEGF antitest fukozilációs mintázatához, mintha az antiVEGF antitestet a tenyésztőközeg kiegészítése nélkül állítottuk volna elő. Rátáplálásosszakaszos tenyésztési kísérletek sorozatát végeztük el, hogy a tenyésztő közeg és a különböző 10 koncentrációjú guanozinnal, fukózzal és mannózzal kiegészített rátápláló oldat hatásait teszteljük. A mannóz és a guanozin kritikus szerepet játszik a de novo fukozilációs útvonalban, a mannóz a folyamat szubsztrátjaként, a guanozin pedig a guanozin-trifoszfát összetevőjeként szolgál, amely az enzimatikus folyamatban a szubsztrát aktiválásához szükséges, ahol a fukóz szubsztrátként szolgál a fukoziláció mellékútvonala számára. (Gramer et al. Biotechnoi Bioeng 15 108:1591-1602 (2011)).
Sejttenyészet
Sejtek
Az elterjedten használt CHO KI sejtekből származó kínai hörcsög petefészek M-sejtvonalat 20 (CHO-M) a Selexistől szereztük be (Selexis SA, Svájc). A CHO-M sejteket adaptáltuk a szérummentes, kémiailag definiált G11.2 alaptápközegben (Irvine Scientific, Egyesült Államok) való növekedésre. A CHO-M sejtvonalat, annak érdekében, hogy az anti-VEGF antitestet expresszálni tudja, transzfektálás révén genetikailag módosítottuk az anti-VEGF antitestet kódoló rekombináns DNS-sel.
A kísérleteket laboratóriumi léptékben AMBR kisméretű reaktorokban, továbbá 1-10 L-es munkatérfogatú asztali bioreaktorokban (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Németország) vagy 100 L-es bioreaktorban végeztük. A példákban alkalmazott termelési lépték és a maximális tenyésztési térfogat 5000 L volt.
A sejtek tenyésztése
A CHO-M sejteket 12 napig, aerob körülmények között tenyésztettük (az oldott oxigén (DO) szintjét 40%-ra állítottuk be és levegő-tiszta oxigén gázkeverékkel szabályoztuk). A pCO2 szintet, szükség esetén a levegőztetés szabályozásával, 60 mmHg alatt tartottuk. A sejteket 37°C-on tenyésztettük. A pH-t, a teljes tenyésztési időszak alatt 7,05 ± 0,05 értéken tartottuk 12,3% (m/m)-os H3PO4 oldattal vagy NaHCCh bázis 0,5M-os oldatával. A glükóz limitáció elkerülése érdekében a glükóz szintjét a célzott 10-30 mM közötti tartományban tartottuk, szükség esetén a tenyészethez 35% (m/m)-os glükózoldatot adtunk. Habzás esetén habzásgátlót alkalmaztunk. A releváns metabolitokat naponta mértük.
Rátáplálásos-szakaszos tenyészet
A rátáplálásos-szakaszos tenyészeteket úgy állítottuk elő, hogy a sejteket kezdetben egy szérummentes, kémiailag definiált alaptápoldatban, Gll.2-ben (Irvine Scientific, Egyesült Államok) növesztettük 12 napig. A tenyésztés 3. napjától (az inokulálást követően) számított minden második napon koncentrált rátápláló oldatokat (Rátápláló oldat A és Rátápláló oldat B) adagoltunk a tenyésztő közeghez.
A példákban alkalmazott tápoldatok és a hozzáadott adalékanyagok szállítóit és katalógusszámait az alábbiakban foglaljuk össze.
G11.2 alaptápoldat
HyClone™ Cell Boost 7a Rátápláló oldat A
HyClone™ Cell Boost 7b Rátápláló oldat B
NaHCO3 oldat
L-glutamin (Gin; L-Gln)
B12 vitamin
NaOH oldat
Réz(II)-szulfát pentahidrát (CuSO4*5H2O)
Irvine Scientific, Cat No.: (egyedi rendelésre)
GE Healthcare, Cat No.: SH31026
GE Healthcare, Cat No.: SH31027
Sigma-Aldrich, Cat No.: S8761
Sigma-Aldrich, Cat No.: G5792
Sigma-Aldrich, Cat. No.: V6629
Sigma-Aldrich, Cat. No.: S72068
Sigma-Aldrich, Cat. No.: C8027
Az alaptápoldat és a rátápláló oldatok részletes összetétele az 1. táblázatban található.
tn h,
G>
1. táblázat: Az alaptápoldat, valamint a Rátápláló oldat A és Rátápláló oldat B összetevői (3.,5.,7.,9., 11., 13. nap*).
Alaptápoldat összetevői Koncentráció
G11.2 alaptápoldat por 19,98 [g/L]
NaHCO3 2,2 [g/L]
L-glutamin 1,17 [g/L]
B12 vitamin 7,8 [mg/L]
tisztított víz -
Rátápláló oldat A (3., 5., 7., 9., 11., 13. nap*) Koncentráció
Cell Boost 7a 181,04 [g/L]
5 M NaOH 18,6 [mL/L]
CuSO4*5H2O 0,5 [mg/L]
tisztított víz -
Rátápláló oldat B (3., 5., 7., 9., 11., 13. nap*) Koncentráció
Cell Boost 7 b 96,4 [g/L]
5 M NaOH 160,5 [mL/L]
tisztított víz
*14 napos tenyésztés esetén, Id. 4. példa
A tenyésztés 3., 5., 7., 9. és 11. napján a sejttenyészethez a teljes tenyésztési térfogat 4%-ának megfelelő Rátápláló oldat A-t és a teljes tenyésztési térfogat 0,4%-ának megfelelő Rátápláló oldat B-t adagoltunk, ahol a Rátápláló oldat A-t továbbá guanozinnal (Sigma-Aldrich, Cat. No.: G6264), fukózzal (L-(-)-Fucose; Sigma-Aldrich, Cat. No.: F2252) vagy manózzal (D-(+)Mannose; Sigma-Aldrich, Cat. No.: M6020) egészítettük ki, mindhárom komponens esetében két különböző koncentrációt teszteltünk (guanozin 20 vagy 60 mM, fukóz 10 vagy 20 mM, mannóz 20 vagy 60 mM).
Tisztítás
Fehérje A kromatográfía
A termelt fehérjét protein A kromatográfiás módszer segítségével választjuk el a fermentlétől. Ez kivételes szelektivitást biztosít a Fc-hordozó molekuláknak, azáltal, hogy a szennyezők több, mint 99,5%-át eltávolítja egyetlen lépésben.
Analitika u«i 20 Életképes sejtkoncentráció és életképesség
Az életképes sejtkoncentrációt és az életképességet egy tripánkék festési módszeren alapuló ©
H
Countess™ automata sejtszámlálóval (Invitrogen Carlsbad, CA, 2008) határoztuk meg.
Glükóz
A glukóz koncentrációját Cedex Bio HT analizátorral mértük (Roche, Mannheim, 5 Németország).
pCO2
Az oldott szén-dioxid tartalmat (pCO2) ABL80 vérgáz analizátorral határoztuk meg (Radiometer, Bronshoj, Dánia).
pH mérés
Az in situ pH-mérö újrakalibrálására szolgáló „at-line” pH mérést S47 SevenMulti pH mérővel végeztük (Mettler Toledo, Zürich, Svájc).
Ozmolalitás
Az ozmolalitást Advanced Model 2020 típusú, egyszene több minta mérésére alkalmas ozmométerrel határoztuk meg (Advanced Instruments, Norwood, MA).
Titer
A termék mAb koncentrációjának meghatározása HPLC folyadékkromatográfiás módszerrel történt protein A oszlopon.
Glikozilációs mintázat
A jelen találmány szerinti antitestek N-glikán mintázatát a következőképpen határoztuk meg: 25 A megfelelő antitest minták denaturálását és deglikolizációját oszlopon történőPNGáz F emésztéssel (3 óráig, 37°C-on ) végeztünk, az N-glikánokat fluoreszcens jelölő reagenssel (2AB) jelöltük. A festék feleslegét tisztító töltetek (HILIC módszer alkalmazásával választottuk el a megjelölt N-glikánoktól. A megjelölt, tisztított N-glikánokat ezt követően amid állófázison, hidrofil kölcsönhatáson alapuló folyadékkromatográfiával (HILIC-UHPLC) választottuk el és 30 a megjelölt glikánok relatív mennyiségét fluoreszcens detektálással határoztuk meg. Az antitesteken (200 mg, 350 ml) puffercserét hajtottunk végre jellegzetesen Nanosep® centrifugális berendezés (Pali, USA) segítségével, ammónium-formiát pufferre (10 mM, pH=8,6). A N-glikozid-kötésű oligoszacharidokat inkubálás révén szabadítottuk fel (48 ml minta 2 ml PNGáz F-fel (500,000 U/ml, New England Biolabs), 45°C-on, 1 órán át). A felszabadított glikánokat 2-AB-vel megjelöltük 65°C-on, 2 órán át (Glyko® Signal 2-AB Labeling Kit, ProZyme). A fölös 2-AB-t HyperSep-96 Diói töltetek (Thermo) alkalmazásával, vákuummal távolítottuk el. A megjelölt glikánokat 96%-os acetonitrillel mostuk, eluáltuk a töltetekről és HILIC-UHPLC-vel, Waters BEH glikán szeparációs technológiára alkalmas oszloppal (2,1 x 150 mm, 1,7 mm) analizáltuk Dionex RSLC Ultimate 3000RS vagy Waters ACQUITY UPLC® rendszeren. 45 perces acetonitril gradienst alkalmaztuk és a fluorszcens jeleket 420 nm-en detektáltuk (gerjesztés 330 nm-en). A csúcsokat Chromeleon® szoftverrel, automatikusan integráltuk előre meghatározott paraméterek szerint és kiszámítottuk a relatív glikán összetételt. A HILIC és a HILIC-UHPLC részletesebb leírása megtalálható: Reusch et al.,mAbs, 7(1), 2015,167-179.
A felszabadított glikánok mennyiségét a megfelelő csúcsok terület% értékei segítségével számítottuk ki. A jelen találmány szerinti antitestek négy fő glikánját (G0F, GIF, Gl’F, G2F) a megfelelő referencia antitestekkel összevetve értékeltük. Az elfogadási kritériumok az alábbiak voltak: G0F: > 73,4 terület0/», GIF: 4-12,9 terület0/», G1 ’F: 2,3-5,6 terület0/», G2F: 0,51,7 terület%, összes fő afukozilált cukorforma (MAF): 1,9-3,7 terület0/». Az anti-CD20 antitest elfogadási kritériumai a következők voltak: G0F: 40-56 terület0/»; GIF: 28-38 terület %; Gl'F: 9-13 terület % és G2F: 5-12 terület %.
Eredmények
A különböző adalékanyagoknak az anti-VEGF antitest összes fő afukozilált cukorformáira gyakorolt hatását (12 napos tenyésztés esetén)az 1. ábra mutatja.
A szakaszos-rátáplálásos kísérletek azt mutatták, hogy a fukózzal kiegészített Rátápláló oldat A eredményezte az anti-VEGF antitest összes fő afukozilált cukorformáinak (MAF) legjelentősebb mértékű csökkenését a fükóz két vizsgált alternatívájával (gunaozin és mannóz) összevetve. A Rátápláló oldat A guanozinnal történő kiegészítése (60 mM-os legmagasabb vizsgált koncentrációban) bizonyult a második leghatékonyabb adalékanyagnak az összes MAF cukorforma csökkentés tekintetében. Ez ellentétben áll a fúkózzal kiegészített rátápláló oldattal
U1 rt ft folytatott kísérlet eredményeivel, ahol az összes MAF cukorformák legjelentősebb csökkenését
H
1907435 az alacsonyabb, 10 mM-os fukóz koncentrációnál tapasztaltuk. Ugyanez igaz volt a mannóz esetében is, ahol az alacsonyabb, 20 mM-os koncentráció hatékonyabb volt az összes fő afukozilált forma csökkentésében, mint a 60 mM mannózzal kiegészített rátápláló oldat. Következésképpen, a fukózt válaasztottuk ki a további kísérletek céljára.
2. A fukóz koncentrációtól függő hatása a fukozilációs mintázatra
A fukóz anti-VEGF antitest fukozilációs mintázatra gyakorolt hatásának további vizsgálata érdekében rátáplásos-szakaszos kísérletek sorozatát végeztük, hogy a rátápláló oldat különböző 10 koncentrációjú fukózzal való kiegészítésének hatásait vizsgáljuk.
Hacsak másképp nem tüntetjük fel, akkor a sejttenyésztést, az izolálást és az analitikai vizsgálatokat ugyanúgy végeztük, ahogyan a fenti példában.
A rátáplálásos-szakaszos tenyészeteket 12 napig tartottuk fenn. A tenyésztés 3.,5.,7.,9. és 11. napján a sejttenyészethez a teljes tenyésztési térfogat 4%-ának megfelelő Rátápláló oldat A-t és a teljes tenyésztési térfogat 0,4%-ának megfelelő Rátápláló oldat B-t adagoltunk, ahol a Rátápláló oldat A-t továbbá fukózzal (L-(-)-Fucose; Sigma-Aldrich, Cat. No.: F2252) egészítettük ki 10 mM, 20 mM vagy 40 mM koncentrációban.
Eredmények
A megfelelő koncentrációjú fukózt tartalmazó rátápláló oldat hozzáadását követően az antiVEGF antitest összes fő afukozilált formájának koncentrációtól függő csökkenését, a 2. ábra mutatja.
Az általunk elöállíotott anti-VEGF antitest az összes fő afukozilált forma (MAF) tekintetében (fukozilációs mintázata is) közelebb került a fent említett referencia anti-VEGF antitest cukormintázatához. A rátáplálásos-szakaszos tenyésztéses kísérletek azt mutatták, hogy a kontroll kísérlethez képest (ahol a tenyésztőközegből hiányzik a fukóz), az anti-VEGF antitest 30 a tenyésztés 12. napján mért összes fő afukozilált formája csökkent a fukóz hozzáadására minden vizsgált koncentrációban, amely a referencia anti-VEGF antitest összes MAF mennyiségéhez való jobb hasonlósághoz vezetett. Az összes MAF-nak ez a csökkenése
1397435 koncentrációfüggö volt, vagyis a legjelentősebb csökkenést a 40 mM koncentrációjú fúkóz hozzáadása esetén értük el. A sejttenyészet ozmolalitásának jelentős emelkedése és a velejáró nem kívánt mellékhatások elkerülése érdekében a további kísérleteknél a rátápláló oldat 20 mM fokozzál való kiegészítését preferáltuk. Bár a 20 mM fokozzál való kiegészítés az anti-VEGF 5 antitest olyan fokozilációs mintázatát eredményezte, amely a referencia anti-VEGF antitest fokozilációs mintázatához jobban hasonlított, az anti-VEGF antitest galaktozilációs foka a referencia anti-VEGF antitestéhez képest az elfogadható alatt maradt.
3. A mangán koncentrációtól függő hatása a glikozilációs mintázatra
Annak érdekében, hogy az általunk előállított anti-VEGF antitest galaktozilációs mintázata jobban hasonlítson a referencia anti-VEGF antitest galaktozilációs mintázatára, rátáplásosszakaszos tenyésztési kísérletek sorozatát végeztük. A kísérletekben a rátápláló oldatot különböző időpontokban és koncentrációban mangánnal egészítettük ki, mely mangán 15 egyébként a béta-1,4-galaktoziltranszferáz kofaktoraként funkcionált.
Hacsak másképp nem tüntetjük fel, akkor a sejttenyésztést, az izolálást és az analitikai vizsgálatokat ugyanúgy végeztük, ahogyan az 1. példában.
A rátáplálásos-szakaszos tenyészeteket 11 napig tartottuk fenn. A mangánt mangán(II)-klorid tetrahidrát (MnC12*4H2O; Sigma-Aldrich, Cat. No.: M5005) formájában adtuk a Rátápláló oldat A-hoz a tenyésztés 3.,5.,7. és 9. napján; 5., 7. és 9. napján; 7. és 9. napján vagy 9. napján a 2. táblázatban jelzett koncentrációkban.
Eredmények
A mangánnal való kiegészítéssel végzett kísérletekből szármázó glikozilációs mintázat eredményeit a 2. táblázat mutatja be. A mangán hozzáadásának galaktozilációra gyakorolt legkedvezőbb hatásai a tenyésztés 5. és 9. napján figyelhetők meg, abban az időszakban, amikor a sejtek a legnagyobb specifikus produktivitással jellemezhetők. Következésképpen, a 30 Rátápláló oldat A-t a későbbi rátáplálásos-szakaszos kísérletekben 1,7 μΜ mangán-kloriddal egésztítettük ki a tenyésztés 5.,7. és 9. napján. Bár azt anti-VEGF antitest galaktozilációs mintázata mangán kiegészítéssel is javítható lett volna, az is látható, hogy a mangán hozzáadása az afukozilált cukorformák szintjének (pl. GO nő a mangán hatására, GOF csökken a mangán hatására) jelentős növelkedését is okozta. Éppen ezért szükségessé vált további adalékanyagok alkalmazása annak érdekében, hogy az általunk előállított anti-VEGF antitest fukolizációs mintázata nagyobb egyezést mutasson a referencia anti-VEGF antitest fúkozilációs mintázatával.
2. táblázat: A különböző MnChMFEO kiegészítési stratégiák hatása az anti-VEGF antitest glikozilációs mintázatára. A feltüntetett koncentráció értékek a Rátápláló oldat A MnChMFhO tartalmára vonatkoznak.
Mn2+ tápkiegészítés [nap] Mn2+ [μΜ/táp] GO [%] GOF [%] GIF [%] Gl’F [%] G2F |%] ZAF _[%]_
3-5-7-9 0 3,32 79,84 4,47 2,41 0,37 3,85
3-5-7-9 0,625 4,53 78,15 6,28 3,12 0,59 5,19
3-5-7-9 1,25 4,79 73,57 9,70 4,31 1,16 5,69
3-5-7-9 2,5 4,72 69,05 12,64 5,27 1,89 5,91
5-7-9 0 3,56 79,98 4,78 2,52 0,40 4,12
5-7-9 0,83 4,61 77,19 7,17 3,42 0,69 5,34
5-7-9 1,67 4,78 74,37 9,16 4,12 1,02 5,66
5-7-9 3,3 4,82 71,61 10,99 4,73 1,49 5,82
7-9 0 3,50 79,75 4,82 2,54 0,40 4,10
7-9 1,25 4,29 79,50 5,75 2,93 0,47 4,94
7-9 2,5 4,42 77,18 7,65 3,60 0,73 5,20
7-9 5 4,61 74,79 9,01 4,04 1,07 5,51
9 0 3,36 79,30 4,86 2,53 0,39 3,95
9 2,5 4,10 80,27 5,02 2,64 0,42 4,70
9 5 4,29 79,94 5,51 2,81 0,47 4,92
9 10 4,62 79,24 5,41 2,74 0,55 5,27
Referencia* min. max. 1,6 2,9 73,4 4,0 12,9 2,3 5,6 0,5 1,7 1,9 3,7
*9 kereskedelmi forgalomban kapható anti-VEGF antitest sarzs glikozilációs mintázatának átlagából és szórásából számítva.
4. A taurin kiegészítés hatása a fúkozilációs mintázatra
Annak érdekében, hogy ellensúlyozzuk a tenyésztési idő későbbi kísérletekben tervezett, 14 5 napra történő meghosszabbításából következő nem kívánt ozmolalitás növekedését és a fukoziláció további visszaszorulását, rátáplálásos-szakaszos kísérletek sorozatát hajtottuk végre, ahol a sejttenyésztő közeget ozmoprotektánssal egészítettük ki. Lehetséges ozmoprotektánsként a taurint választottuk, mert a szakterületen ismert volt, hogy a taurinnal való kiegészítés növelheti a sejttenyészetben előállított glikoproteinek titerét is.
Hacsak másképp nem tüntetjük fel, akkor a sejttenyésztést, az izolálást és az analitikai vizsgálatokat ugyanúgy végeztük, ahogyan az 1. példában.
A rátáplálásos-szakaszos tenyészeteket 14 napig tartottuk fenn. Az alaptápoldatot a tenyésztés 15 kezdetén (0 nappal az inokulálást követően) 12,5 mM, 25 mM vagy 50 mM koncentrációjú taurinnal (Sigma-Aldrich, Cat. No.: T4571) egészítettük ki. . Továbbá a Rátápláló oldat A-t a tenyésztés 5.,7. és 9. napján, 1,7 μΜ koncentrációban mangánnal egészítettük ki mangán(II)klorid tetrahidrát formájában (MnChMHiO; Sigma-Aldrich, Cat. No.: M5005)..
Eredmények
A taurinnal kiegészített alaptápoldatnak az anti VEGF antitest összes fő afukozilált formájára gyakorolt koncentrációtól függő hatását a 3. ábra mutatja.
Meglepő módon, az alaptápoldat taurinnal való kiegészítését követően az összes fő afukozilált 25 cukorforma csökkenését észleltük a koncnetráció függvényében. Azoknál a rátáplálásosszakaszos tenyésztési kísérleteknél, ahol az alaptápoldatba taurin komponenst is adagoltunk, az anti-VEGF antitest összes fő afukozilált formáinak (MAF) mennyisége a tenyésztés 14 napját követően minden esetben csökkent, összehasonlítva a taurint nem tartalmazó tenyésztési kísérletekkel, ahol hasonló jelenséget nem tapasztaltunk. A magas koncentrációjú taurinnal 30 történő kiegészítés (50mM) mutatott olyan fúkozilációs mintázatot, amely a legközelebb állt a referencia anti-VEGF antitest fúkozilációs mintázatának megfelelő tartományához. A fenti uii eredmények ellenére a további kísérletekben az alaptápoldatot mindössze 25 mM taurinnal
N
W egészítjük ki annak érdekében, hogy elkerüljük a sejttenyészet ozmolalitásának további növekedését és megőrizzük a taurin ozmoprotektáns hatását.
5. A fukóz, a mangán és a taurin kiegészítés hatása a glikozilációs mintázatra
Ezt követően, az alaptápoldatba adagolt taurinnak, valamint a rátápláló oldatba adagolt fukóz és mangán adalékanyagoknak az anti VEGF-antitest glikozilációs mintázatára gyakorolt együttes hatását vizsgáltuk.
Hacsak másképp nem tüntetjük fel, akkor a sejttenyésztést, az izolálást és az analitikai vizsgálatokat ugyanúgy végeztük, ahogyan az 1. példában.
Sejttenyészet
Sejtek
Az elterjedten használt CHO KI sejtektől származó kínai hörcsög petesejt M-sejtvonalat a Selexistöl szereztük be (Selexis SA, Svájc). A CHO-M sejteket adaptáltuk a szérummentes, kémiailag definiált G11.2 alaptápoldatban (Irvine Scientific US) való növekedésre. A CHO-M sejtvonalat, annak érdekében, hogy az anti-VEGF antitestet expresszálni tudja, transzfektálás révén genetikailag módosítottuk az anti-VEGF antitestet kódoló rekombináns DNS-sel.
Rátáplálásos-szakaszos tenyészet
A rátáplálásos-szakaszos tenyészetet 14 napig tartottuk fenn úgy, hogy egy szérummentes, kémiailag definiált, a tenyésztés kezdetén (0 nappal az inokulálást követően) 25 mM taurinnal (Sigma-Aldrich, Cat. No.: T4571) kiegészített alaptápközegben, Gll.2-ben (Irvine Scientific, 25 Egyesült Államok) növesztettük a sejteket.
A tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól (az inokulálást követően) minden második napon, a sejttenyészethez külön-külön a teljes tenyésztési térfogat 4%-ának megfelelő, 20 mM fúkózzal kiegészített Rátápláló oldat A-t és a teljes tenyésztési térfogat 0,4%-ának megfelelő Tápoldat 30 B-t adtunk hozzá adagonként. A Rátápláló oldat A-t továbbá mangán (II) klorid tetrahidrát formájában (MnC12*4H2O; Sigma-Aldrich, Cat. No.: M5005) mangánnal egészítettük ki a m tenyésztés 5., 7. és 9. napján (az inokulálást követően), 1,7 μΜ koncentrációban.
rt
IN e·
H
Az 5. példában alkalmazott tápoldatok és a hozzáadott kiegészítések szállítóit és katalógusszámait az alábbiakban foglaljuk össze.
G11.2 alaptápoldat
HyClone™ Cell Boost 7a Rátápláló oldat A
HyClone™ Cell Boost 7b Rátápláló oldat B NaHCO3 oldat
L-glutamin (Gin; L-Gln)
B12 vitamin
NaOH oldat
Réz(II)-szulfát pentahidrát
Taurin
L-fukóz
Mangán(II)-klorid tetrahidrát (MnC12*4H2O)
Irvine Scientific, Cat No.: (egyedi rendelésre)
GE Healthcare, Cat No.: SH31026
GE Healthcare, Cat No.: SH31027
Sigma-Aldrich, Cat No.: S8761
Sigma-Aldrich, Cat No.: G5792
Sigma-Aldrich, Cat. No.: V6629
Sigma-Aldrich, Cat. No.: S72068
Sigma-Aldrich, Cat. No.: C8027 (CUSO4*5H2O)
Sigma-Aldrich, Cat. No.: T4571
Sigma-Aldrich, Cat. No.: F2252
Sigma-Aldrich, Cat. No.: M5005
Az 5. példában használt alaptápoldat részletes összetétele és az alkalmazott tápoldatok a 3. táblázatban találhatók.
ΜΊ m tr is θ·
H
3. táblázat: Az alaptápoldat, a Rátápláló oldat A (3., 11. és 13. nap), a Rátápláló oldat A (5., 7. és 9. nap) és Rátápláló oldat B (3.,5., 7., 9., 11. és 13. nap) összetevői
Alaptápoldat összetevői Koncentráció
G11.2 alaptápoldat por 19,98 [g/L]
NaHCO3 2,2 [g/L]
L-glutamin 1,17 [g/L]
B12 vitamin 7,8 [mg/L]
taurin 3,14 [g/L]
tisztított víz -
Rátápláló oldat A (3., 11., 13. nap) Koncentráció
Cell Boost 7a 181,04 [g/L]
5M NaOH 18,6 [mL/L]
L-fukóz 3,28 [g/L]
CuSO4*5H2O 0,5 [mg/L]
tisztított víz -
Rátápláló oldat A (5., 7., 9. nap) Koncentráció
Cell Boost 7a 181,04 [g/L]
5M NaOH 18,6 [mL/L]
L-fukóz 3,28 [g/L]
CuSO4*5H2O 0,5 [mg/L]
MnCl2*4H2O 333 [pg/L]
tisztított víz -
Rátápláló oldat B (3., 5., 7., 9., 11., 13. nap) Koncentráció
Cell Boost 7b 94,6 [g/L]
5M NaOH 160,5 [mL/L]
tisztított víz -
Eredmények
A taurin, a fukóz és a mangán az anti VEGF-antitest összes fő afukozilált formára gyakorolt hatását a 4. ábra mutatja.
A rátáplálásos-szakaszos kísérletek, összevetve a taurin és fukóz nélküli alaptápoldattal, azt mutatták, hogy az anti-VEGF antitest összes fő afukozilált formáinak (MAF) mennyisége 14 nappal a tenyésztés kezdete után csökkenthető 25 mM taurin alaptápoldatba történő adagolásával. Ugyanakkor, az anti-VEGF antitest összes MAF mennyisége tovább csökkenthető, ha a taurint tartalmazó sejttenyészethez 20 mM fukózt adunk. A taurin és a fukóz u11 15 adalékanyagok sejttenyészethez való hozzáadásának szinergikus hatása olyan fukozilációs
W r fN
H mintázatot eredményez, amely jól illeszkedik a referencia anti-VEGF antitest fükozilációs mintázatának megfelelő tartományába.
Az 5. ábra a fermentléből származó minták napi elemzése szerinti fükozilációs mintázatot 5 szemlélteti a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól (az inokulálást követően).
A vizsgálat azt mutatja, hogy a 20 mM-os fukózzal történő kiegészítés az 1,7 μΜ-os mangánnal való tápkiegészítéssel kombinálva és a sejttenyészet 25 mM-os taurinnal történő kiegészítése az 1,7 μΜ-os mangánnal való tápkiegészítéssel kombinálva csökkenteni tudja az összes fő 10 afukozilált cukorformát (MAF) önmagában (pontozott és szaggatott vonalak, valamint szaggatott vonalak az 5. ábrán). A legalacsonyabb MAF mintázatot azonban akkor figyeltük meg, amikor mindhárom komponenst egyszerre alkalmaztuk kiegészítésként (pontozott vonal az 5. ábrán). Ez a MAF mintázat jóval az összes MAF mintázat tartományán belül volt, azaz a referencia anti-VEGF antitest fükozilációs mintázatához képest legalább 90 %-os, előnyösen 15 legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutatott.
Hasonlóan, a megfelelő minták napi elemzése szerinti nem-galaktozilált cukorformák (GO) mintázatát a 6. ábra szemlélteti.
A kísérletek azt mutatták, hogy a 20 mM-os fükózzal való kiegészítés az 1,7 μΜ-os mangánnal való tápkiegészítéssel kombinálva és a tenyésztő közeg kiegészítése 25 mM-os taurinnal az 1,7 μΜ-os mangánnal való tápkiegészítéssel kombinálva csökkenteni tudja a nem-galaktozilált cukorformák (G0) mennyiségét önmagában (pontozott és szaggatott vonalak, valamint 25 szaggatott vonalak a 6. ábrán). Mindazonáltal, a legalacsonyabb G0 mintázatot, amely a galaktozilációs mintázat tartományán belül van, azaz legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutatott a referencia anti-VEGF antitest galaktozikációs mintázatával, csak abban az esetben figyeltük meg, amikor a tenyésztő közeget és a tápoldatot rendre a három komponenssel egyszerre 30 egészítettük ki (pontozott vonal a 6. ábrán). Mindent egybevéve, a tenyészet taurinnal, mangánnal és fükózzal végzett kombinált kiegészítése révén az anti VEGF-antitest referencia ui h, © rt
1907 435 anti VEGF-anti testhez való hasonlósága javítható a nem-galaktozilált cukorformák (GO) mintázata, azaz a galaktozilációs mintázat tekintetében.
6. A fukóz, a mangán és a taurin kiegészítés hatása a glikozilációs mintázatra
Anti CD-20 antitesttel végzett analóg rátáplálásos-szakaszos kísérletekben ugyanezt a hatást értük el a glikozilációs mintázat módosítása tekintetében a tenyésztőközeg fukózzal, a mangánnal és taurinnal való kiegészítése révén.
Hacsak másképp nem tüntetjük fel, akkor a sejttenyésztést, az izolálást és az analitikai vizsgálatokat ugyanúgy végeztük, ahogyan az 5. példában.
A rátáplálásos-szakaszos tenyészetet 12 napig tartottuk fenn úgy, hogy egy szérummentes, kémiailag definiált, a tenyésztés kezdetén (0 nappal az inokulálást követően) 25 mM taurinnal 15 (Sigma-Aldrich, Cat. No.: T4571) kiegészített alaptápközegben, G11.2-ben (Irvine Scientific, Egyesült Államok) növesztettük a sejteket.
A tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól (az inokulálást követően) minden második napon, a sejttenyészethez külön-külön a teljes tenyésztési térfogat 4%-ának megfelelő, 20 mM fukózzal 20 kiegészített Rátápláló oldat A-t és a teljes tenyésztési térfogat 0,4%-ának megfelelő Rátápláló oldat B-t adtunk adagonként. A Rátápláló oldat A-t továbbá mangán(II)-klorid tetrahidrát formájában (MnCh*4H2O; Sigma-Aldrich, Cat. No.: M5005) mangánnal egészítettük ki a tenyésztés 5., 7. és 9. napján (az inokulálást követően), 1,7 μΜ koncentrációban.
Eredmények
A 4. táblázat a különböző tápkiegészítési stratégiák anti CD-20 antitest glikozilációs mintázatára gyakorolt hatását mutatja be a fermentléből származó minták napi elemzése alapján a tenyésztés kezdetétől számított 3. naptól (az inokulálást követően).
A cukorformák meghatározásából származó eredmények mutatják, hogy ha a taurinnal kiegészített alaptápoldathoz a fukóz adalékanyagot a tenyésztés 3. vagy 4. napján adagoljuk, abban az esetben nem figyelhető meg az anti CD-20 antitest fukozilációs mintázatának és
Ül m r b © Λ H galaktozilációs mintázatának módosulása. Abban az esetben viszont, ha az alaptápoldattal kiegészített taurinhoz a fukóz és mangán adalékanyagokat csak a tenyésztés 5. napjától kezdve adagoltuk, más szóval, amikor mindhárom komponens, a fukóz, a mangán és a taurin is jelen voltak a sejttenyészetben, akkor sikerült elérnünk az anti CD-20 antitest fukozilációs 5 mintázatának és galaktozilációs mintázatának nagyobb mértékű egyezését a referencia termékkel összevetve.
4. táblázat: A fukóz, mangán és taurin adalékanyagok hatása az anti CD-20 antitest glikozilációs mintázatára
Alaptápoldat kiegészítése Rátápláló oldat A kiegészítése Hozzáadás ideje [nap] Tenyésztés ideje [nap] GOF [%] GIF [%] Gl’F [%] G2F [%]
Taurin Fukóz 3 3 63,94 24,17 8,62 3,27
3 4 63,20 24,66 8,80 3,34
Fukóz + MnCh 5, 7,9 5 57,80 27,72 9,66 4,50
5, 7,9 6 54,99 29,86 10,17 4,98
5, 7,9 7 51,71 31,74 10,66 5,89
5, 7,9 8 53,09 30,84 10,43 5,64
5, 7,9 9 53,32 30,71 10,40 5,57
5, 7,9 10 54,28 29,95 10,23 5,54
min. 40 28 9 5
Referencia* max. 56 38 13 12
*13 kereskedelmi forgalomban kapható anti-CD20 antitest sarzs glikozilációs mintázatának átlagából és szórásából számítva

Claims (14)

1. Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein fokozilációs és/vagy galaktozilációs mintázatának módosítására szolgáló eljárás, amely magában foglalja:
a rekombináns glikoproteint expresszáló kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek tenyésztését sejttenyésztő közegben, ahol a sejttenyésztő közeget fokozzál, mangánnal és taurinnal egészítjük ki, és ahol a tenyésztő közeg kiegészítése a sejttenyészet termelő fázisában történik;
ahol az előállított rekombináns glikoprotein fokozilációs és/vagy galaktozilációs mintázatát úgy módosítjuk, hogy az jobban hasonlítson egy referencia glikoprotein fokozilációs és/vagy galaktozilációs mintázatához, mintha a tenyésztés az említett kiegészítés nélkül történt volna, ahol a rekombináns glikoprotein monoklonális antitest, opcionálisan terápiás monoklonális antitest, ahol a fokoz koncentrációját a tenyésztő közegben 0,4-1,6 mM-lal, előnyösen 0,4-1,2 mM-lal, előnyösebben 0,6-1 mM-lal növeljük kiegészítés révén, és adott esetben a fokozzál való kiegészítést rátápláló közeggel való kiegészítéssel érjük el;
ahol a mangán koncentrációját a tenyésztő közegben 0,02-0,1 μΜ-lai, előnyösen 0,04-0,08 μΜ-lai, előnyösebben 0,06-0,08 μΜ-lai növeljük kiegészítés révén, és adott esetben a mangánnal való kiegészítést rátápláló közeggel való kiegészítéssel érjük el; és ahol a taurin végső koncentrációja a tenyésztő közegben a kiegészítés után 12,5 mM 50 mM, előnyösen 15 mM - 35 mM, előnyösebben 20 mM - 30 mM, és adott esetben az alap tápközeget a tenyészet elejétől kezdve kiegészítjük taurinnal; és ahol a módosított fokozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %os, előnyösebben legalább 96 %-os, előnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein fokozilációs mintázatával és/vagy a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, előnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia glikoprotein galaktozilációs mintázatával.
ih &
s IMII II···
K 2023.08.01 SZTNH-100390954
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az eljárás tartalmazza továbbá az előállított rekombináns glikoprotein sejttenyészetből történő izolálásának lépését.
3. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a rekombináns glikoproteint nagy léptékben állítjuk elő.
4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a rekombináns glikoprotein IgG típusú immunglobulin.
5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a sejttenyészetet 14 napig tartjuk fenn.
6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a tenyésztő közeg kiegészítése a tenyésztés 3. napjától kezdve minden 2. napon történik, adott esetben a tenyésztés 13. napjáig.
7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a mangán kiegészítés mangán-klorid (MnCh) formájában történik és ahol a tenyésztő közeg MnCh-dal való kiegészítése a tenyésztés 5. napjától kezdve minden 2. napon történik, adott esetben a tenyésztés 9. napjáig.
8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a sejttenyészetet 37°C-on tartjuk.
9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a sejttenyészet pH-ja: 7,05 ± 0,05.
10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a sejttenyészet rátáplálásos-szakaszos tenyészet.
11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a glikoprotein VEGF antagonista, előnyösen anti-VEGF antitest.
12. All. igénypont szerinti eljárás, ahol a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, előnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest fukozilációs mintázatával és/vagy a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, <6 i W PI
SZTNH-100408614
2024.02.12
W » ©· ίτ CM előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, előnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia VEGF antagonista, előnyösen az anti-VEGF antitest galaktozilációs mintázatával.
13. Az előző 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a glikoprotein antiCD20 antitest.
14. A 13. igénypont szerint eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított fukozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, legelőnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia anti-CD20 antitest fukozilációs mintázatával és/vagy a módosított galaktozilációs mintázat legalább 90 %-os, előnyösen legalább 95 %-os, előnyösebben legalább 96 %-os, előnyösebben legalább 98 %-os egyezést mutat a referencia anti-CD20 antitest galaktozilációs mintázatával.
HUP1800376A 2018-11-07 2018-11-07 Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer HU231514B1 (hu)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUP1800376A HU231514B1 (hu) 2018-11-07 2018-11-07 Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
JP2021524198A JP2022512928A (ja) 2018-11-07 2019-11-06 細胞培養で生産される組換え糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを変更する方法
AU2019376476A AU2019376476B2 (en) 2018-11-07 2019-11-06 Method for modifying the glycosylation profile of a recombinant glycoprotein produced in cell culture
EP19801518.2A EP3877539A1 (en) 2018-11-07 2019-11-06 Method for modifying the glycosylation profile of a recombinant glycoprotein produced in cell culture
MA054147A MA54147A (fr) 2018-11-07 2019-11-06 Procédé de modification du profil de glycosylation d'une glycoprotéine recombinante produite dans une culture cellulaire
KR1020217017260A KR102894782B1 (ko) 2018-11-07 2019-11-06 세포 배양에서 생산된 재조합 당단백질의 글리코실화 프로파일의 변형 방법
CA3118604A CA3118604C (en) 2018-11-07 2019-11-06 Method for modifying the glycosylation profile of a recombinant glycoprotein produced in cell culture
PCT/EP2019/080342 WO2020094694A1 (en) 2018-11-07 2019-11-06 Method for modifying the glycosylation profile of a recombinant glycoprotein produced in cell culture
US17/292,302 US12168791B2 (en) 2018-11-07 2019-11-06 Method for modifying the glycosylation profile of a recombinant glycoprotein produced in cell culture
BR112021008458-4A BR112021008458A2 (pt) 2018-11-07 2019-11-06 método para modificar o perfil de glicosilação de uma glicoproteína recombinante produzida em cultura celular
CN201980088055.3A CN113272440B (zh) 2018-11-07 2019-11-06 改变细胞培养物中产生的重组糖蛋白的糖基化谱的方法
JP2024075898A JP2024112833A (ja) 2018-11-07 2024-05-08 細胞培養で生産される組換え糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを変更する方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUP1800376A HU231514B1 (hu) 2018-11-07 2018-11-07 Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP1800376A2 HUP1800376A2 (hu) 2020-05-28
HU231514B1 true HU231514B1 (hu) 2024-07-28

Family

ID=89992786

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUP1800376A HU231514B1 (hu) 2018-11-07 2018-11-07 Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer

Country Status (10)

Country Link
US (1) US12168791B2 (hu)
EP (1) EP3877539A1 (hu)
JP (2) JP2022512928A (hu)
KR (1) KR102894782B1 (hu)
CN (1) CN113272440B (hu)
AU (1) AU2019376476B2 (hu)
BR (1) BR112021008458A2 (hu)
HU (1) HU231514B1 (hu)
MA (1) MA54147A (hu)
WO (1) WO2020094694A1 (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU231514B1 (hu) 2018-11-07 2024-07-28 Richter Gedeon Nyrt. Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
JP2024527450A (ja) * 2021-02-12 2024-07-25 ロンザ ベンド インコーポレイテッド 抗体産物のアフコシル化を調節するための方法
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
CN115323021B (zh) * 2022-09-23 2025-12-05 创胜生物医药(杭州)有限公司 一种调控抗体糖型的方法及其应用
IL319976A (en) * 2022-11-02 2025-05-01 Hoffmann La Roche Method for producing glycoprotein compositions
WO2025133872A1 (en) * 2023-12-19 2025-06-26 Intas Pharmaceuticals Ltd. Method for reducing oxidation levels in vedolizumab during cell culture process
WO2025133873A1 (en) * 2023-12-19 2025-06-26 Intas Pharmaceuticals Ltd. Method for improving galactosylation profile and reducing oxidized species in production of pembrolizumab
CN119060185B (zh) * 2024-11-01 2025-03-14 正大天晴药业集团股份有限公司 一种调节抗体糖基化的方法

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4560855A (en) 1982-09-08 1985-12-24 Nippon Steel Corporation Method for joining of articles by energy beam and apparatus for controlling said method
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5122489A (en) 1990-10-15 1992-06-16 Mobil Oil Corporation Non-acidic dehydrogenation catalyst of enhanced stability
DE10199067I2 (de) 1991-03-18 2006-03-16 Univ New York Fuer Menschlichen Tumornekrose-Faktor spezifische Monoklonale und Chimaere Antikoerper
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US6258562B1 (en) 1996-02-09 2001-07-10 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
NZ500078A (en) 1997-04-07 2001-10-26 Genentech Inc Humanized anti-VEGF antibodies and their use in inhibiting VEGF-induced angiogenesis in mammals
CN103232539B (zh) 2001-06-26 2015-06-03 安姆根弗里蒙特公司 抗opgl抗体
PT2495307T (pt) 2006-07-13 2018-05-10 Wyeth Llc Produção do fator ix de coagulação com padrão melhorado de glicosilação
AU2010254215A1 (en) 2009-05-26 2011-12-01 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Production of glycoproteins
US9376654B2 (en) 2011-03-03 2016-06-28 Meissner Filtration Products, Inc. Biocontainer
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
WO2013114245A1 (en) 2012-01-30 2013-08-08 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process of modulating man5 and/or afucosylation content of glycoprotein composition
KR20210037745A (ko) 2013-03-15 2021-04-06 제넨테크, 인크. 항산화제를 함유하는 세포 배양 조성물 및 폴리펩티드 생산 방법
WO2015011660A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Biocon Limited Methods for controlling fucosylation levels in proteins
MX380800B (es) * 2014-01-29 2025-03-12 Lg Chemical Ltd Método de modulación de la galactosilación de proteína recombinante mediante optimización de medio de cultivo.
PT3110961T (pt) 2014-02-27 2020-01-29 Hoffmann La Roche Modulação do crescimento celular e da glicosilação na produção de glicoproteínas recombinantes
HUE049201T2 (hu) 2014-12-01 2020-09-28 Amgen Inc Eljárás glikoprotein glikántartalmának befolyásolására
WO2016196621A1 (en) * 2015-06-01 2016-12-08 Biogen Ma Inc. Manganese supplementation for control of glycosylation in mammalian cell culture process
WO2017021871A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Dr. Reddy's Laboratories Limited A cell culture process for modulating glycans
TWI797060B (zh) * 2015-08-04 2023-04-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
HU231463B1 (hu) 2015-08-04 2024-01-28 Richter Gedeon Nyrt. Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére
MX2018004831A (es) 2015-11-02 2018-08-01 Genentech Inc Metodos para confeccionar formas fucosiladas y afucosiladas de una proteina.
MX2018008447A (es) 2016-01-06 2019-05-30 Oncobiologics Inc Modulacion de especies afucosilados en una composicion de anticuerpo monoclonal.
JP2019500878A (ja) 2016-01-06 2019-01-17 オンコバイオロジクス，インコーポレイティド モノクローナル抗体組成物中の高分子量種、酸性荷電種、及び断片の低減
WO2017134667A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Methods of generating antibodies
HU231514B1 (hu) 2018-11-07 2024-07-28 Richter Gedeon Nyrt. Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024112833A (ja) 2024-08-21
HUP1800376A2 (hu) 2020-05-28
AU2019376476B2 (en) 2024-12-05
WO2020094694A1 (en) 2020-05-14
AU2019376476A1 (en) 2021-05-27
CN113272440B (zh) 2024-12-31
MA54147A (fr) 2022-02-16
CN113272440A (zh) 2021-08-17
KR102894782B1 (ko) 2025-12-04
CA3118604A1 (en) 2020-05-14
EP3877539A1 (en) 2021-09-15
US20220098634A1 (en) 2022-03-31
JP2022512928A (ja) 2022-02-07
US12168791B2 (en) 2024-12-17
KR20210089220A (ko) 2021-07-15
BR112021008458A2 (pt) 2021-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102894782B1 (ko) 세포 배양에서 생산된 재조합 당단백질의 글리코실화 프로파일의 변형 방법
US20220372157A1 (en) Method for increasing the galactose content of recombinant proteins
WO2015026846A1 (en) Control of protein glycosylation by culture medium supplementation and cell culture process parameters
AU2021258023B2 (en) Methods for modulating protein galactosylation profiles of recombinant proteins using peracetyl galactose
JP2021506323A (ja) ポリエーテルイオノフォアを使用するタンパク質マンノシル化プロファイルの調節方法
KR20210043618A (ko) 단백질 글리코실화를 조정하기 위한 세포 배양 전략
EP4400515A2 (en) Enzyme and pathway modulation with sulfhydryl compounds and their derivatives
CN108350476A (zh) 调节重组蛋白生产状况的方法
RS66894B1 (sr) Upotreba monensina za regulaciju glikozilacije rekombinantnih proteina
CA3118604C (en) Method for modifying the glycosylation profile of a recombinant glycoprotein produced in cell culture
JP2024527450A (ja) 抗体産物のアフコシル化を調節するための方法
HK40101916A (zh) 用於调节抗体产物的无岩藻糖基化的方法
WO2016162514A1 (en) Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant proteins