CN110603266A

CN110603266A - 用于治疗癌症的ii型抗cd20抗体和抗cd20/cd3双特异性抗体

Info

Publication number: CN110603266A
Application number: CN201880030116.6A
Authority: CN
Inventors: M·巴卡克; S·科洛姆贝蒂; C·克雷恩; J·萨姆; P·乌玛纳
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-06-02
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2019-12-20
Also published as: CA3059010A1; TW201902512A; MX2019014274A; EP3630829A1; US20200172627A1; WO2018220099A1; KR20200014304A; JP2020521791A; BR112019022558A2; JP2023175681A; AU2018276419A1

Abstract

本发明涉及治疗疾病的方法和用于降低与T细胞活化性治疗剂的施用有关的细胞因子释放的方法。本发明特别涉及供用于治疗个体的癌症或延迟其进展的方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体与抗CD20/抗CD3双特异性抗体组合使用。

Description

用于治疗癌症的II型抗CD20抗体和抗CD20/CD3双特异性抗体

发明领域

本发明涉及治疗疾病,特别是B细胞增殖性病症的方法和用于降低响应T细胞活化性治疗剂的施用而发生的副作用的方法。本发明进一步涉及治疗疾病的组合治疗方法和供此类方法中使用的抗体。

发明背景

B细胞增殖性病症描述一组异类的恶性,包括白血病和淋巴瘤二者。淋巴瘤自淋巴细胞发生且包括两大类别:霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在美国,B细胞起源的淋巴瘤构成所有非霍奇金淋巴瘤病例的大约80-85％,而且基于起源B细胞中的基因型和表型表达样式,B细胞子集内有可观的异质性。例如,B细胞淋巴瘤子集包括缓慢生长的无痛且不能治愈的疾病,诸如滤泡性淋巴瘤(FL)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL),以及更具攻击性的亚型,套细胞淋巴瘤(MCL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

尽管多种用于治疗B细胞增殖性病症的药剂可得,然而当前需要开发安全且有效的疗法在患者中延长消退和改善治愈率。

当前正在调查的一种策略是针对恶性B细胞的T细胞的啮合。为了有效啮合针对恶性B细胞的T细胞,最近开发了两种办法。这两种办法是:1)施用离体改造成识别肿瘤细胞的T细胞(也称作嵌合抗原受体修饰的T细胞疗法[CAR-T细胞])(Maude et al.,N Engl J Med(2014)371,1507-1517)；和2)施用活化内源T细胞的药剂,诸如双特异性抗体(Oak andBartlett,Expert Opin Investig Drugs(2015)24,715-724)。

Maude等人的研究中报告了第一种办法的一个例子,其中用经CD19定向嵌合抗原受体慢病毒载体转导的自体T细胞(CTL019 CAR-T细胞)治疗30名成人和儿童患者。结果是持续的消退,其基于67％的6个月无事件存活率和78％的总体存活率。然而,所有患者具有细胞因子释放综合征(CRS)(与肿瘤负荷相关),27％的患者具有重度CRS。还注意到高频率的原因未知的中枢神经系统毒性。

与之对比,涉及活化内源T细胞来识别肿瘤靶的第二种办法规避了这种可扩缩性(scalability)障碍,而且还能提供竞争性功效,安全性数据和潜在的长期应答持续时间。在不同CD20⁺血液学恶性中,这种办法的最好的例子是博纳吐单抗(Blinatumomab),一种CD19 CD3靶向性T细胞双特异性分子(Bargou et al.,Science(2008)321,974-977),它最近批准用于具有最低限度残余疾病阳性急性淋巴细胞性白血病(ALL)的患者。由两个单链Fv片段构成(所谓的格式)的这种化合物引导溶胞性T细胞裂解CD19⁺细胞。博纳吐单抗的主要约束是它的半衰期短(大约2小时),这使得在4-8周里经由泵连续输注成为必要。无论如何,它在具有复发性/顽固性非霍奇金淋巴瘤(r/r NHL)和ALL二者的患者中具有有力的功效,需要递升的剂量给药(SUD)来减轻重度细胞因子释放综合征和CNS毒性(Nagorsen and Baeuerle,Exp Cell Res(2011)317,1255-1260)。

CD20 CD3靶向性T细胞双特异性分子CD20XCD3 bsAB是下一代B细胞靶向性抗体的另一个例子。CD20XCD3 bsAB是靶向B细胞上表达的CD20和T细胞上存在的CD3ε链(CD3e)的T细胞双特异性(TCB)抗体。

CD20XCD3 bsAB的作用机制包含同时结合CD20⁺B细胞和CD3⁺T细胞,引起T细胞活化和T细胞介导的B细胞杀伤。在CD20⁺B细胞存在下,无论正在循环或驻留组织,药理学活性剂量会触发T细胞活化和相关的细胞因子释放。CD20XCD3 bsAB已经在非临床模型中显示出胜过竞争性T细胞啮合剂的增强的效力,而且具有基于IgG的格式而具有胜过博纳吐单抗大大改善的半衰期。

细胞因子释放是T细胞活化的结果。在由TeGenero进行的一项1期研究(Suntharalingam et al.,N Engl J Med(2006)355,1018-1028)中,所有6名健康志愿者均在输注不当剂量的T细胞刺激性超激动性抗CD28单克隆抗体后迅速经历接近致死的重度细胞因子释放综合征(CRS)。更近地,在上文提到的Maude等人的CD19靶向性嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗具有复发性ALL的患者的研究中,所有30名患者均具有细胞因子释放,在27％的患者中归类为重度。CRS是CAR-T细胞疗法的常见但重度并发症(综述见Xu andTang,Cancer Letters(2014)343,172-178)。

对CD19-CD3 T细胞双特异性药剂博纳吐单抗也频繁观察到重度CRS和CNS毒性(Klinger et al.,Blood(2012)119(26),6226-6233)。在所有临床试验中接受博纳吐单抗的患者中,在大约50％的患者中发生神经学毒性,而且观察到的毒性的类型在包装插页中有完善定义。

CNS毒性是否或如何与较早的细胞因子释放或T细胞活化相关的了解不多。与博纳吐单抗类似,用CD19靶向性CAR-T细胞治疗的具有r/r ALL的患者中43％(13/30)报告了CNSAE(范围为谵妄至全球脑病)(Maude et al.,N Engl J Med(2014)371,1507-1517；Ghorashian et al.,Br J Haematol(2015)169,463-478)。神经学毒性作用典型地在CRS的症状达到峰值并开始消退后发生；然而,没有发现直接,明确的与重度CRS的关联。作者提出神经毒性的机制可能牵涉直接CAR-T细胞介导的毒性或它可能是细胞因子介导的。与之对比,重度CRS和神经毒性(例如脑病)之间的关联已经在CD19靶向性CAR-T细胞疗法的另一项研究中提示(Davila et al.,Sci Transl Med(2014)6,224ra25)且推测是由于一般性T细胞活化,较之直接CAR-T诱导的损伤而言。

与将CD3⁺细胞连接至组织局限性(即非循环)靶细胞的其它T细胞双特异性抗体相比,细胞因子释放和/或CNS相关毒性在将CD3⁺细胞连接至B细胞的T细胞双特异性抗体中特别突出。

如此,需要降低或阻止这些有希望的药剂的此类副作用的方法,这些药剂具有显著促进具有B细胞增殖性病症，诸如NHL和CLL的患者的治疗的潜力。

发明概述

本发明基于令人惊讶的发现,即通过用II型抗CD20抗体,诸如奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab)预处理受试者能显著降低与T细胞活化性治疗剂,诸如CD20XCD3 bsAB对所述受试者的施用相关的细胞因子释放。

奥滨尤妥珠单抗是一种以高亲和力结合CD20抗原的人源化糖工程化II型抗CD20单抗,诱导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),低补体依赖性细胞毒性(CDC)活性,和高直接细胞死亡诱导。

不希望受理论束缚,预处理(Gpt)的使用应当有助于迅速消减外周血和二级淋巴样器官二者中的B细胞,使得来自T细胞活化性治疗剂所致强系统性T细胞活化的高度有关不良事件(AE)(例如CRS)的风险降低,同时支持自剂量给药开始起高得足以介导肿瘤细胞消除的暴露水平的T细胞活化性治疗剂。至今,已经在正在进行的奥滨尤妥珠单抗临床试验中在数以百计的患者中评估和管理奥滨尤妥珠单抗的安全性概况(包括细胞因子释放)。最后,在支持T细胞活化性治疗剂,诸如CD20XCD3 bsAB的安全性概况以外,Gpt应当还有助于阻止针对这些独特分子的抗药物抗体(ADA)形成。

对于患者,Gpt应当转化为更好的药物暴露及增强的安全性概况。

Gpt应当与同T细胞双特异性药剂一起使用的其它方法,诸如逐步放大剂量给药(SUD)相比在达成上述目标方面更加有效。一旦决定,没有自逐步放大剂量给药起的时间延迟,单剂奥滨尤妥珠单抗应当容许复发性/顽固性患者接受完整治疗性剂量的T细胞活化性治疗剂,诸如CD20XCD3 bsAB。例如,最近报告了在一项正在进行的2期试验中具有r/rDLBCL的患者的博纳吐单抗剂量给药方案并入一种双重逐步放大办法(即9→28→112μg/m²/天),如此,需要14天来达到112μg/m²/天的最大剂量(Viardot el at.,Hematol Oncol(2015)33,242(Abstract 285))。

如实施例中显示的,在奥滨尤妥珠单抗预处理后,CD20XCD3 bsAB对食蟹猴的施用直至比没有Gpt的情况下耐受的水平要高十倍的水平得到耐受。

在Gpt后观察到有效的外周血B细胞消减和抗肿瘤活性连同强烈降低的外周血中与第一次CD20XCD3 bsAB注射相关的细胞因子释放。

因而,在第一个方面,本发明提供一种用于在受试者中降低与T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放的方法,其包含在施用该治疗剂之前将II型抗CD20抗体施用于该受试者。在一个实施方案中,该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂的施用之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

在又一个方面,本发明提供一种在受试者中治疗疾病的方法,该方法包含治疗方案，该治疗方案包含:

(i)对该受试者施用II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

其中该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂的施用之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

在一个实施方案中,与相应的不施用该II型抗CD20抗体的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该治疗剂的施用相关的细胞因子释放。

在又一个方面,本发明提供供用于在受试者中降低与T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放的方法中使用的II型抗CD20抗体,该方法包含在施用该治疗剂之前将该II型抗CD20抗体施用于该受试者。

在一个实施方案中,该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂的施用之间的时间段足以响应该抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

在又一个方面,本发明提供供在受试者中治疗疾病的方法中使用的II型抗CD20抗体,该方法包含治疗方案，该治疗方案包含:

(i)对该受试者施用该II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

在又一个方面,本发明提供II型抗CD20抗体在制造用于在受试者中降低与T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放的药物中的用途,其中该药物要用于包含下述的治疗方案:

(i)对该受试者施用该II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

在一个实施方案中,与相应的不施用该II型抗CD20抗体的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放。

在仍有又一个方面,本发明提供一种用于在受试者中降低与T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放的试剂盒,其包含包装，该包装包含II型抗CD20抗体组合物和关于在包含下述的治疗方案中使用该II型抗CD20抗体组合物的说明书:

(i)对该受试者施用该II型抗CD20抗体组合物,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

其中该II型抗CD20抗体组合物的施用和该治疗剂的施用之间的时间段足以响应该抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

在一个实施方案中,与相应的不施用该II型抗CD20抗体组合物的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放。在一个实施方案中,该试剂盒进一步包含治疗剂组合物。

在又一个方面,本发明提供供在受试者中治疗疾病的方法中使用的T细胞活化性治疗剂,该方法包含治疗方案，该治疗方案包含:

(i)对该受试者施用II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用该T细胞活化性治疗剂,

在仍有又一个方面,本发明提供T细胞活化性治疗剂在制造用于在受试者中治疗疾病的药物中的用途,其中该治疗包含治疗方案，该治疗方案包含:

(i)对该受试者施用II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用该T细胞活化性治疗剂,

在又一个方面,本发明提供一种用于在受试者中治疗疾病的试剂盒,其包含包装，该包装包含T细胞活化性治疗剂组合物和关于在包含下述的治疗方案中使用该治疗剂组合物的说明书:

(i)对该受试者施用II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用该T细胞活化性治疗剂组合物,

其中该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂组合物的施用之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

在一个实施方案中,与相应的不施用该II型抗CD20抗体组合物的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放。在一个实施方案中,该试剂盒进一步包含II型抗CD20抗体组合物。

本发明的方法,用途,II型抗CD20抗体,治疗剂和试剂盒可以单一或组合并入本文中下文描述的任何特征。

在一个实施方案中,该II型抗CD20抗体包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

在一个更加具体的实施方案中,该II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

在一个实施方案中,该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG₁抗体。

在一个实施方案中,该II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。在一个实施方案中,该II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

在一个特定的实施方案中,该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

在一个实施方案中,该T细胞活化性治疗剂包含抗体,特别是多特异性(例如双特异性)抗体。

在一个实施方案中,该抗体特异性结合活化性T细胞抗原。

在一个实施方案中,该抗体特异性结合选自CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127的组的抗原。

在一个实施方案中,该抗体特异性结合CD3,特别是CD3ε。

在一个实施方案中,该抗体包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含SEQID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQ ID NO:17的LCDR3。

在一个实施方案中,该抗体包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

在一个实施方案中,该抗体特异性结合B细胞抗原,特别是恶性B细胞抗原。

在一个实施方案中,该抗体特异性结合选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,特别是CD20或CD19。

在一个实施方案中,该抗体特异性结合CD20。

在一个实施方案中,该抗体包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含SEQID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

在一个实施方案中,该抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

在一个实施方案中,该抗体是多特异性抗体,特别是双特异性抗体。

在一个实施方案中,该多特异性抗体特异性结合(i)活化性T细胞抗原和(ii)B细胞抗原。

在一个实施方案中,该多特异性抗体特异性结合(i)CD3和(ii)选自CD20和CD19的抗原。

在一个实施方案中,该多特异性抗体特异性结合CD3和CD20。

在一个实施方案中,该治疗剂包含双特异性抗体,该双特异性抗体包含

(i)特异性结合CD3的抗原结合模块,其包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQID NO:17的LCDR3；和

(ii)特异性结合CD20的抗原结合模块,其包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ IDNO:9的LCDR3。

在一个特定的实施方案中,该治疗剂包含CD20XCD3 bsAB。

在一个实施方案中,该治疗剂包含嵌合抗原受体(CAR)或表达CAR的T细胞,特别是特异性结合B细胞抗原的CAR,更加特别是特异性结合选自CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5的组的抗原的CAR。

在一个实施方案中,该疾病是B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症。

在一个实施方案中,该疾病选自由非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM),和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组。

在又一个方面,本发明提供供用于治疗个体的癌症或延迟其进展的方法中使用的II型抗CD20抗体。该II型抗CD20抗体与抗CD20/抗CD3双特异性抗体组合使用。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体可以在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体可以在两种或更多种不同组合物中施用。该两种或更多种不同组合物可以在不同时间点施用。

该II型抗CD20抗体可以包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3。该II型抗CD20抗体可以进一步包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

该II型抗CD20抗体可以包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

该II型抗CD20抗体可以是IgG抗体,特别是IgG1抗体。该抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖可以是非岩藻糖基化的。

特别是,该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

该II型抗CD20抗体可以与该抗CD20/抗CD3双特异性抗体并行施用,在该抗CD20/抗CD3双特异性抗体之前施用,或在该抗CD20/抗CD3双特异性抗体之后施用。

而且,可以施用抗PD-L1抗体,优选阿特珠单抗(Atezolizumab)。

该抗PD-L1抗体可以与该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体至少之一分开或组合施用。这里,“与……至少之一组合”意味着该抗PD-L1抗体与该抗CD20/抗CD3双特异性抗体一起或与该II型抗CD20抗体一起或与二者一起施用。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CD20的第二抗原结合域。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以包含第一抗原结合域和第二抗原结合域,该第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3),该第二抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和轻链可变区(VLCD20)。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:97的CDR-H1序列,SEQ IDNO:98的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:99的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD3)包含SEQ IDNO:100的CDR-L1序列,SEQ ID NO:101的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:102的CDR-L3序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD3)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQID NO:5的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:6的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ IDNO:7的CDR-L1序列,SEQ ID NO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以包含结合CD20的第三抗原结合域。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQ ID NO:5的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:6的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:7的CDR-L1序列,SEQ ID NO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域可以是交叉Fab分子,其中Fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的,且该第二和如果存在的情况中的第三抗原结合域可以是常规Fab分子。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以包含IgG1 Fc域。该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的IgG1 Fc域可以包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的IgG1 Fc域可以包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以包含第三抗原结合域,其中(i)该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端,该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,且该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。或者,(ii)该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端,该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,且该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。

该II型抗CD20抗体和该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的组合可以以约一周至三周的间隔施用。

而且,可以在该组合治疗前实施用II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗的预治疗。该预治疗和该组合治疗之间的时间段可以是足以响应该II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗减少该个体中的B细胞。该预治疗中使用的II型抗CD20抗体可以具有一项或多项如上文和下文描述的II型抗CD20抗体的特征。

本发明的又一个方面涉及一种用于治疗个体中的增殖性疾病,特别是癌症或延迟其进展的方法。该方法包含施用II型抗CD20抗体和抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该II型抗CD20抗体和该抗CD20/抗CD3双特异性抗体在单一组合物中或在两种或更多种组合物中施用。

本发明的又一个方面涉及一种药学组合物,其包含供组合治疗中使用的II型抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂,和包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的第二药物,和任选地包含抗PD-L1抗体和任选的药学可接受载剂的第三药物,供疾病,特别是癌症的组合治疗中使用。该药学组合物的各要件可以在该组合治疗中顺序或同时使用。

本发明的又一个方面涉及一种试剂盒,其包含包含II型抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂的第一药物,和包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的第二药物,供疾病,特别是癌症的组合治疗中使用。任选地,该试剂盒包含包含抗PD-L1抗体和任选的药学可接受载剂的第三药物,供上述疾病,特别是癌症的组合治疗中使用。该试剂盒的各要件可以在该组合治疗中顺序或同时使用。

该试剂盒可以还包含该第一药物和该第二药物和任选地该第三药物用于治疗个体中的癌症或延迟其进展的使用说明书。说明书可以是包装插页。

本发明的又一个方面涉及II型抗CD20抗体和抗CD20/抗CD3双特异性抗体的组合在制造用于治疗性应用,优选用于治疗个体中的增殖性疾病,特别是癌症或延迟其进展的药物中的用途。

本发明的又一个方面涉及II型抗CD20抗体在制造用于治疗个体中的癌症或延迟其进展的药物中的用途,其中该药物包含该II型抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。

本发明的又一个方面涉及抗CD20/抗CD3双特异性抗体在制造用于治疗个体中的癌症或延迟其进展的药物中的用途,其中该药物包含该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。

本发明的又一个方面涉及供用于治疗个体的癌症或延迟其进展的方法中使用的II型抗CD20抗体的制造,其中该II型抗CD20抗体与抗CD20/抗CD3双特异性抗体组合使用。

本发明的又一个方面涉及供用于治疗个体的癌症或延迟其进展的方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体的制造,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体与II型抗CD20抗体组合使用。

本发明的又一个方面涉及一种用于治疗个体中的癌症或延迟其进展的方法,其包含对该个体施用II型抗CD20抗体和施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体。施用该II型抗CD20抗体和该抗CD20/抗CD30双特异性抗体,使得二者的组合代表有效量。相反,该II型抗CD20抗体自身未以有效量施用且该抗CD20/抗CD30双特异性抗体自身未以有效量施用。然而,二者的组合导致有效量。

另外,可以对该个体施用抗PD-L1抗体。包括该PD-L1抗体的组合代表有效量。

本发明的又一个方面涉及供用于治疗个体的癌症或延迟其进展的方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体。该抗CD20/抗CD3双特异性抗体与II型抗CD20抗体组合使用。

特别是,该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

而且,可以施用抗PD-L1抗体,优选阿特珠单抗。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体可以包含第一抗原结合域和第二抗原结合域，该第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3)，该第二抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和轻链可变区(VLCD20)。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQ ID NO:5的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:6的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:7的CDR-L1序列,SEQ ID NO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

而且,在该组合治疗前实施用II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗的预治疗。该预治疗和该组合治疗之间的时间段可以是足以响应该II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗减少该个体中的B细胞。该预治疗中使用的II型抗CD20抗体可以具有一项或多项如上文和下文描述的II型抗CD20抗体的特征。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体可以在两种或更多种不同组合物中施用,其中该两种或更多种不同组合物在不同时间点施用。

该II型抗CD20抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

该II型抗CD20抗体可以是IgG抗体,特别是IgG1抗体,且其中该II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。该II型抗CD20抗体可以是奥滨尤妥珠单抗。

而且,可以施用抗PD-L1抗体,优选阿特珠单抗。

该抗PD-L1抗体可以与该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体至少之一分开或组合施用。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQID NO:5的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:6的CDR-H3序列,该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ IDNO:7的CDR-L1序列,SEQ ID NO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20),该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域可以包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQID NO:5的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:6的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ IDNO:7的CDR-L1序列,SEQ ID NO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第三抗原结合域。(i)该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域可以在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端,该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域可以在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,且该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域可以在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。或者,(ii)该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域可以在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端,该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域可以在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,且该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域可以在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。

该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体的组合可以以约一周至三周的间隔施用。

可以在该组合治疗前实施用II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗的预治疗。该预治疗和该组合治疗之间的时间段可以是足以响应该II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗减少该个体中的B细胞。该预治疗中使用的II型抗CD20抗体可以具有一项或多项如上文和下文描述的II型抗CD20抗体的特征。

本发明的又一个方面涉及一种药学组合物,其包含供组合治疗中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂,和包含II型抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂的第二药物,和任选地包含抗PD-L1抗体和任选的药学可接受载剂的第三药物,供疾病,特别是癌症的组合治疗中使用。该药学组合物的各要件可以在该组合治疗中顺序或同时使用。

本发明的又一个方面涉及本文中描述的发明。

附图简述

图1。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(TCB)的例示性构造。(A,D)“1+1CrossMab”分子的图示。(B,E)具有备选次序的Crossfab和Fab构件的(“倒转的”)“2+1 IgGCrossfab”分子的图示。(C,F)“2+1 IgG Crossfab”分子的图示。(G,K)具有备选次序的Crossfab和Fab构件的(“倒转的”)“1+1 IgG Crossfab”分子的图示。(H,L)“1+1 IgGCrossfab”分子的图示。(I,M)具有两个CrossFab的“2+1 IgG Crossfab”分子的图示。(J,N)具有两个CrossFab和备选次序的Crossfab和Fab构件的(“倒转的”)“2+1 IgG Crossfab”分子的图示。(O,S)“Fab-Crossfab”分子的图示。(P,T)“Crossfab-Fab”分子的图示。(Q,U)“(Fab)₂-Crossfab”分子的图示。(R,V)“Crossfab-(Fab)₂”分子的图示。(W,Y)“Fab-(Crossfab)₂”分子的图示。(X,Z)“(Crossfab)₂-Fab”分子的图示。黑色点:任选的Fc域中促进异二聚化的修饰。++,--:CH1和CL域中任选引入的相反电荷的氨基酸。Crossfab分子描绘为包含VH和VL区的交换,但是在CH1和CL域中没有引入电荷修饰的实施方案中,或者可以包含CH1和CL域的交换。

图2。不同处理组中外周血中的B细胞和T细胞计数。第一次和第二次CD20XCD3bsAB施用后24小时和72小时,媒介和CD20XCD3 bsAB处理的完全人源化的NOG小鼠的外周血中CD19⁺B细胞(A)和CD3⁺T细胞(B)的流式细胞术分析。黑色箭指CD20XCD3 bsAB施用的日子。

图3。不同处理组间外周血中释放的细胞因子。第一次和第二次施用CD20XCD3bsAB后24小时和72小时,媒介和经过处理的小鼠的血液中细胞因子的多路分析。柱状图的条代表5只动物的均值,误差条指标准偏差。显示了IFNγ,TNFα和IL-6的代表性图。比较在有和无奥滨尤妥珠单抗预处理的情况下第一次注射CD20XCD3 bsAB的细胞因子释放(通过连线标示要比较的条)。

图4。CD20XCD3 bsAB,奥滨尤妥珠单抗,和Gpt+CD20XCD3 bsAB的抗肿瘤活性。在完全人源化的NOG小鼠中作为单一疗法的CD20XCD3 bsAB和奥滨尤妥珠单抗或Gpt+CD20XCD3bsAB的抗肿瘤活性。黑色箭指疗法开始。(8<n<10)。肿瘤模型:WSU-DLCL2。

图5。CD20XCD3 bsAB和Gpt+CD20XCD3 bsAB处理的剂量给药后食蟹猴的外周血中释放的细胞因子。

图6。(A-F)携带攻击性淋巴瘤模型(WSU-DLCL2肿瘤)的人造血干细胞人源化小鼠(HSC-NSG小鼠)中抗CD20/CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗或阿特珠单抗任一的组合处理的抗肿瘤活性的分析。(A)媒介的功效,(B)抗CD20-抗CD3 T细胞双特异性抗体的处理的功效,(C)奥滨尤妥珠单抗的处理的功效,(D)抗CD20/CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗的组合处理的功效,(E)抗CD20/CD3双特异性抗体与阿特珠单抗的组合处理的功效,(F)抗PD-L1抗体的处理的功效。

图7。(A-B)携带攻击性淋巴瘤模型(OCI-Ly18肿瘤)的人造血干细胞人源化小鼠(HSC-NSG小鼠)中抗CD20/CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗的组合处理中的抗肿瘤活性的分析。(A)媒介,抗CD20/CD3双特异性抗体,奥滨尤妥珠单抗和抗CD20/CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗的组合的功效。(B)抗CD20/CD3双特异性抗体,奥滨尤妥珠单抗和抗CD20/CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗的组合的个别小鼠的功效。

发明详述

定义

除非下文另外定义,如本领域中通常使用的那样在本文中使用术语。

CD20(也称作B淋巴细胞抗原CD20,B淋巴细胞表面抗原B1,Leu-16,Bp35,BM5,和LF5；人蛋白质在UniProt数据库条目P11836中表征)是一种在前B和成熟B淋巴细胞上表达的具有大约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白(Valentine,M.A.et al.,J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287；Tedder,T.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212；Stamenkovic,I.et al.,J.Exp.Med.167(1988)1975-1980；Einfeld,D.A.et al.,EMBO J.7(1988)711-717；Tedder,T.F.et al.,J.Immunol.142(1989)2560-2568)。相应的人基因是跨膜4域,亚家族A,成员1,也称作MS4A1。此基因编码跨膜4A基因家族的一个成员。此初生蛋白质家族的成员特征在于共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界且在造血细胞和非淋巴样组织中展示独特的表达样式。此基因编码在B细胞发育和分化成浆细胞中发挥作用的B淋巴细胞表面分子。在一簇家族成员中,此家族成员定位于11q12。此基因的可变剪接产生编码同一蛋白质的两种转录物变体。

如本文中使用的,术语“CD20”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD20,除非另外指明。该术语涵盖“全长”,未加工的CD20以及源自细胞中加工的任何形式的CD20。该术语还涵盖CD20的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,CD20是人CD20。一种例示性人CD20的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1。

术语“抗CD20抗体”和“结合CD20的抗体”指能够以足够亲和力结合CD20,使得该抗体作为诊断剂和/或治疗剂在靶向CD20中是有用的抗体。在一个实施方案中,抗CD20抗体对无关非CD20蛋白的结合程度小于该抗体对CD20的结合的约10％,如通过例如放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中,结合CD20的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^-8M或更低,例如10^-8M至10^-13M,例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_d)。在某些实施方案中,抗CD20抗体结合在来自不同物种的CD20间保守的CD20表位。

“II型抗CD20抗体”意味着具有Cragg et al.,Blood 103(2004)2738-2743；Cragget al.,Blood 101(2003)1045-1052；Klein et al.,mAbs 5(2013)22-33中描述的和下文表1中汇总的II型抗CD20抗体的结合特性和生物学活性的抗CD20抗体。

表1:I型和II型抗CD20抗体的特性

I型抗CD20抗体	II型抗CD20抗体
		结合I类CD20表位	结合II类CD20表位
将CD20定位于脂筏	不将CD20定位于脂筏
		高CDC*	低CDC*
ADCC活性*	ADCC活性*
		完全结合B细胞的能力	大约一半结合B细胞的能力
弱同型聚集	同型聚集
		低细胞死亡诱导	强细胞死亡诱导

*若为IgG₁同种型的话

II型抗CD20抗体的例子包括例如奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(GA101),托西莫单抗(tositumumab)(B1),人源化的B-Ly1抗体IgG1(一种嵌合人源化IgG1抗体,如公开于WO 2005/044859),11B8 IgG1(如公开于WO2004/035607)和AT80 IgG1。

I型抗CD20抗体的例子包括例如利妥昔单抗(rituximab),奥法木单抗(ofatumumab),维妥珠单抗(veltuzumab),ocaratuzumab,奥瑞珠单抗(ocrelizumab),PRO131921,ublituximab,HI47 IgG3(ECACC,杂交瘤),2C6IgG1(如公开于WO 2005/103081),2F2 IgG1(如公开于WO 2004/035607和WO 2005/103081)和2H7 IgG1(如公开于WO2004/056312)。

术语“人源化B-Ly1抗体”指如WO 2005/044859和WO 2007/031875中公开的人源化B-Ly1抗体,其通过用来自IgG1的人恒定域嵌合化和接着的人源化自鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1(鼠重链可变区(VH):SEQ ID NO:2；鼠轻链可变区(VL):SEQ ID NO:3(参见Poppema,S.and Visser,L.,Biotest Bulletin3(1987)131-139)获得(参见WO 2005/044859和WO2007/031875)。这些“人源化B-Ly1抗体”在WO 2005/044859和WO 2007/031875中详细公开。

如本文中使用的,术语“释放细胞因子”,“细胞因子的释放”或“细胞因子释放”与“细胞因子风暴”或“细胞因子释放综合征”(缩写为“CRS”)同义,而且指施用治疗剂期间或之后不久(例如1天内)受试者的血液中细胞因子,特别是肿瘤坏死因子阿尔法(TNF-α),干扰素伽马(IFN-γ),白介素-6(IL-6),白介素-10(IL-10),白介素-2(IL-2)和/或白介素-8(IL-8)的水平升高,导致不良症状。细胞因子释放是一类输注相关反应(IRR),它们是针对治疗剂的常见不良药物反应且适时地涉及治疗剂的施用。IRR典型地在施用治疗剂期间或之后不久发生,即典型地在输注后24小时内,主要在第一次输注时。在一些情况中,例如在施用CAR-T细胞之后,CRS还能只在稍后发生,例如施用后数天在CAR-T细胞扩充后。发生率和严重性典型地随后续输注而降低。症状的范围可以是有症状的不适至致命事件,而且可以包括发热,寒战,头晕,高血压,低血压,呼吸困难,坐立不安,出汗,面红,皮疹,心动过速,呼吸急促,头痛,肿瘤疼痛,恶心,呕吐和/或器官衰竭。

如本文中使用的,术语“氨基酸突变”意味着涵盖氨基酸替代,删除,插入，和修饰。可以进行替代,删除,插入，和修饰的任何组合来实现最终构建物,只要最终构建物拥有期望的特征,例如降低的对Fc受体的结合。氨基酸序列删除和插入包括氨基和/或羧基端氨基酸删除和插入。特定的氨基酸突变是氨基酸替代。出于改变例如Fc区的结合特征的目的,特别优选非保守性氨基酸替代,即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然发生氨基酸或由20种标准氨基酸的天然发生氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸,3-甲基组氨酸,鸟氨酸,高丝氨酸,5-羟基赖氨酸)替换。可以使用本领域公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变,PCR,基因合成等等。涵盖的是，通过除了遗传工程以外的方法，诸如化学修饰来改变氨基酸的侧链基团的方法也可能是有用的。本文中可以使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如,从Fc区的第329位处的脯氨酸到甘氨酸的替代可指示为329G,G329,G₃₂₉,P329G，或Pro329Gly。

“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点和它的结合配偶(例如配体)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如受体和配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对它的配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)来代表,它是解离与结合速率常数(分别为k_off和k_on)的比率。如此,相等的亲和力可能包含不同的速率常数,只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的完善确立的方法来测量。一种用于测量亲和力的具体方法是表面等离振子共振(SPR)。

“降低”(及其语法变化,诸如“减少”，“缩小”或“减轻”),例如B细胞的数目或细胞因子释放降低,指相应数量的降低，如通过本领域已知的适宜方法测量的。为了清楚起见,该术语还包括降低至零(或低于分析方法的检测限),即完全消除或清除。相反,“升高”指相应数量的升高。

如本文中使用的,术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施方案中,抗原结合模块能够将它附着的实体(例如细胞因子或第二抗原结合模块)引导至靶位点，例如携带该抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。抗原结合模块包括抗体和其片段,如本文中进一步定义的。优选的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中,抗原结合模块可包括抗体恒定区,如本文中进一步定义的和本领域已知的。有用的重链恒定区包括五种同种型任一:α,δ,ε,γ,或μ。有用的轻链恒定区包括两种同种型任一:κ和λ。

“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的,而且能与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合模块结合特定抗原决定簇的能力可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术,例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中,抗原结合模块对无关蛋白的结合的程度小于该抗原结合模块对抗原的结合的约10％,如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中,结合抗原的抗原结合模块或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^-8M或更少,例如10^-8M至10^-13M,例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。

“降低的结合”,例如降低的对Fc受体的结合,指相应相互作用的亲和力降低,如例如通过SPR测量的。为了清楚起见,该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限),即完全消除相互作用。相反,“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。

如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以它的最广义指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白和其衍生物,例如片段。

如本文中使用的,术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上与抗原结合模块结合,形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象性构造)。有用的抗原决定簇可见于例如肿瘤细胞的表面上,受到病毒感染的细胞的表面上,其它患病细胞的表面上,游离在血清中，和/或细胞外基质(ECM)中。除非另外指示,本文中称作抗原的蛋白质(例如CD3)可以是来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式的蛋白质。在一个特定的实施方案中,抗原是人蛋白质。在对本文中的特定蛋白质进行提述的情况下,该术语涵盖“全长”,未加工的蛋白质以及源自细胞中加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。作为抗原有用的一种例示性人蛋白质是CD3,特别是CD3的ε亚基(对于人序列,参见UniProt no.P07766(版本130),NCBI RefSeq no.NP_000724.1,SEQ ID NO:105；或对于食蟹猴[Macacafascicularis]序列,参见UniProt no.Q95LI5(版本49),NCBI GenBank no.BAB71849.1,SEQ ID NO:106)。在某些实施方案中,本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合在来自不同物种的CD3或靶细胞抗原间保守的CD3或靶细胞表位。

如本文中使用的,术语“多肽”指由通过酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何链,而且不指特定长度的产物。如此,肽,二肽,三肽,寡肽,“蛋白质”,“氨基酸链”，或任何其它用于指两个或更多个氨基酸的链的术语包括在“多肽”的定义内,而且术语“多肽”可以代替这些术语中任一个或与其可互换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物,包括但不限于糖基化,乙酰化,磷酸化,酰胺化,通过已知的保护性/封闭性基团衍生化,蛋白水解切割,或通过非天然发生氨基酸的修饰。多肽可以自天然生物学来源衍生或通过重组技术生成,但是不必自指定核酸序列翻译。它可以以任何方式生成,包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以是约3或更多,5或更多,10或更多,20或更多,25或更多,50或更多,75或更多,100或更多,200或更多,500或更多,1,000或更多,或2,000或更多个氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构,尽管它们不必具有此类结构。具有限定的三维结构的多肽称作折叠的,而不拥有限定的三维结构但能采取多种不同构象的多肽称作未折叠的。

“分离的”多肽或其变体或衍生物意图是不处于它的天然环境中的多肽。不要求特定水平的纯化。例如,分离的多肽可以是自它的天然或自然环境取出的。出于本发明的目的,在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质认为是分离的,就像已经通过任何合适技术分出,分级,或部分或实质性纯化的天然或重组多肽。

就参照多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后,且不将任何保守替代认为是序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创作,而且源代码已经与用户文档一起提交至美国版权局,Washington D.C.,20559,它在那里在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可以从Genentech公司,South San Francisco,California公开获得,或可以从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编成供在UNIX操作系统上使用,包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不改变。在为氨基酸序列比较采用ALIGN-2的情况中,给定氨基酸序列A对，与，或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其或者可以表述为给定氨基酸序列A具有或包含对，与，或针对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性)如下计算:

100乘分数X/Y

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目,而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下,A对B的％氨基酸序列同一性会不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。

术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。

“抗体片段”指除了完整抗体以外的分子,其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)₂,双抗体,线性抗体,单链抗体分子(例如scFv),和自抗体片段形成的多特异性抗体。如本文中使用的,术语“抗体片段”还涵盖单域抗体。

术语“免疫球蛋白分子”指具有天然发生抗体的结构的蛋白质。例如,IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由形成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自N端至C端,每条重链具有可变区(VH,也称作可变重域或重链可变域),接着是三个恒定域(CH1,CH2和CH3,也称作重链恒定区)。类似地,自N端至C端,每条轻链具有可变区(VL,也称作可变轻域或轻链可变域),接着是恒定轻(CL)域(也称作轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以指派至五种类之一，称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG)，或μ(IgM),其中一些可以进一步分成亚类,例如γ₁(IgG₁),γ₂(IgG₂),γ₃(IgG₃),γ₄(IgG₄),α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。基于它的恒定域的氨基酸序列,免疫球蛋白的轻链可以指派至两种型之一，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白本质上由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。

术语“抗原结合域”指抗体中包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的部分。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6^th ed.,W.H.Freemanand Co.,page 91(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。

“人抗体”是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,典型地两个实质性整个可变域,其中所有或实质性所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些,而且所有或实质性所有FR对应于人抗体的那些。任选地,人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。

如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每一个区域。一般地,抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。本文中的例示性HVR包括:

(a)高变环,其存在于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)CDR,其存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；

(c)抗原接触,其存在于氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2),和93-101(H3)(MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和

(d)(a),(b),和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3),和94-102(H3)。

除非另外指明,HVR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等,见上文编号。

“框架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成:FR1,FR2,FR3和FR4。因而,HVR和FR序列一般在VH(或VL)中以下述顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

抗体的“类”指它的重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG，和IgM,而且这些中的数种可以进一步分成亚类(同种型),例如IgG₁,IgG₂,IgG₃,IgG₄,IgA₁，和IgA₂。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ，和μ。

术语“Fc域”或“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,由宿主细胞生成的抗体可能经历翻译后切割,自重链的C端切除一个或多个,特别是一个或两个氨基酸。因此,通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体(在本文中也称作“切割变体重链”)。在重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,编号方式依照Kabat EU索引)的情况下可能就是这种情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447),或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或不存在。除非本文中另外说明,Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统,也称作EU索引,如描述于Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)。如本文中使用的,Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两条多肽之一,即构成免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如,IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。

“促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰”是降低或阻止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基翻译后修饰。如本文中使用的,特别是,促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一和第二亚基)中每一个进行的分开的修饰,其中该修饰彼此互补,从而促进两个Fc域亚基的联合。例如,促进联合的修饰可以改变两个Fc域亚基之一或二者的结构或电荷,从而分别使得它们的联合在立体上或在静电上是有利的。如此,(异)二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生,其在与每个亚基融合的别的成分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中,促进联合的修饰包含Fc域中的氨基酸突变,具体是氨基酸替代。在一个特定的实施方案中,促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基中每一个中的分开的氨基酸突变,具体是氨基酸替代。

“活化性Fc受体”是一种在抗体的Fc区啮合后引发刺激携带受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32)，和FcαRI(CD89)。

术语“效应器功能”在提及抗体使用时指那些可归于抗体的Fc区的生物学活性，它们随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调，和B细胞活化。

如本文中使用的,术语“效应细胞”指如下的一群淋巴细胞,它们在它们的表面上展示效应器模块受体(例如细胞因子受体)和/或Fc受体,它们经由所述受体结合效应器模块(例如细胞因子)和/或抗体的Fc区并有助于对靶细胞(例如肿瘤细胞)的破坏。例如,效应细胞可介导细胞毒性或吞噬效应。效应细胞包括但不限于效应T细胞，诸如CD8⁺细胞毒性T细胞,CD4⁺辅助T细胞,γδT细胞,NK细胞,淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。

如本文中使用的,术语“工程化/改造”认为包括对肽主链的任何操作或对天然发生或重组多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列,糖基化样式，或各个氨基酸的侧链基团的修饰,以及这些办法的组合。“工程化”,特别是具有前缀“糖”时,以及术语“糖基化工程”包括细胞的糖基化机制的代谢工程,包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。而且,糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中,糖基化工程是糖基转移酶活性的改变。在一个特定的实施方案中,工程化导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。糖基化工程可用于获得“具有升高的GnTIII活性的宿主细胞”(例如经过操作而表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽的宿主细胞),“具有升高的ManII活性的宿主细胞”(例如经过操作而表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽的宿主细胞)，或“具有降低的α(1,6)岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞”(例如经过操作而表达降低水平的α(1,6)岩藻糖基转移酶的宿主细胞)。

术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可交换使用且指已经引入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化子”和“经转化的细胞”,其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代，不考虑传代数。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同,但是可以含有突变。本文中包括具有与原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可用于生成供本发明使用的蛋白质的任何类型的细胞系统。在一个实施方案中,将宿主细胞工程化为容许生成具有经修饰寡糖的抗体。在某些实施方案中,操作宿主细胞以表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些实施方案中,进一步操作宿主细胞以表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养细胞，诸如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞，和植物细胞，仅举几例,还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。

如本文中使用的,术语“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基以β-1,4连接添加至N连接的寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽。这包括展现与β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(依照国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB)也称作β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶(EC 2.4.1.144))的活性相似但不必相同的酶活性的融合多肽,如在一种特定生物学测定法中测量的，有或无剂量依赖性。在确实存在剂量依赖性的情况中,它不需要与GnTIII的相同,而是与GnTIII相比与给定活性的剂量依赖性实质性相似(即,相对于GnTIII,候选多肽会展现更大的活性或小不多于约25倍,优选小不多于约10倍的活性,最优选小不多于约3倍的活性)。在某些实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII的催化域和异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。特别地,高尔基定位域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位域,最特别地是甘露糖苷酶II的定位域。或者,高尔基定位域选自由甘露糖苷酶I的定位域,GnTII的定位域，和α1,6核心岩藻糖基转移酶的定位域组成的组。用于生成此类融合多肽和使用它们来生成具有升高的效应器功能的抗体的方法公开于WO2004/065540,美国临时专利申请No.60/495,142和美国专利申请公开文本No.2004/0241817,通过援引将其完整内容明确收入本文。

如本文中使用的,术语“高尔基定位域”指高尔基驻留多肽中负责将多肽锚定至高尔基复合体内的位置的氨基酸序列。一般地,定位域包含酶的氨基端“尾部”。

如本文中使用的,术语“具有ManII活性的多肽”指能够催化N连接的寡糖的分支GlcNAcMan₅GlcNAc₂甘露糖中间体中的末端1,3-和1,6-连接的α-D-甘露糖残基的水解的多肽。这包括展现与高尔基α-甘露糖苷酶II(依照国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB)也称作甘露糖基寡糖1,3-1,6-α-甘露糖苷酶II(EC 3.2.1.114))的活性相似但不必相同的酶活性的多肽。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致由免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其片段一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的,术语“升高/降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制,以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体,在给定时间中裂解的靶细胞的数目的增加/减少,和/或通过ADCC机制,实现给定时间中给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中的抗体浓度的降低/升高。ADCC的升高/降低是相对于使用相同标准生产,纯化,配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的),由相同类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC而言的。例如,由通过本文中描述的方法工程化改造为具有改变的糖基化样式(例如表达糖基转移酶,GnTIII，或其它糖基转移酶)的宿主细胞生成的抗体介导的ADCC的升高是相对于由相同类型的未工程化改造的宿主细胞生成的相同抗体介导的ADCC而言的。

“具有升高/降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体”意味着一种具有升高/降低的ADCC的抗体,如通过本领域普通技术人员已知的任何合适方法测定的。一种公认的体外ADCC测定法如下:

1)该测定法使用已知表达受到抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；

2)该测定法使用自随机选择的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞；

3)该测定法依照下述方案实施:

i)使用标准密度离心规程分离PBMC,并以5x 10⁶个细胞/ml在RPMI细胞培养基中悬浮；

ii)通过标准组织培养方法培养靶细胞,自存活率高于90％的指数生长期收获,在RPMI细胞培养基中清洗,用100微居里⁵¹Cr标记,用细胞培养基清洗两次,并以10⁵个细胞/ml的密度在细胞培养基中重悬浮；

iii)将100微升上述最终靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每个孔；

iv)在细胞培养基中将抗体自4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml并将50微升所得抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞,以一式三份测试覆盖上述整个浓度范围的多种抗体浓度；

v)对于最大释放(MR)对照,在含有经标记的靶细胞的板中另外3个孔接受50微升非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的2％(v/v)水溶液,代替抗体溶液(上述第iv点)；

vi)对于自发性释放(SR)对照,在含有经标记的靶细胞的板中另外3个孔接受50微升RPMI细胞培养基,代替抗体溶液(上述第iv点)；

vii)然后将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟并于4℃温育1小时；

viii)将50微升PBMC悬浮液(上述第i点)添加至每个孔以产生25:1的效应:靶细胞比并将板在温箱中在5％CO₂气氛下于37℃放置4小时；

ix)自每个孔收获无细胞上清液并使用伽马计数器量化实验释放的放射性(ER)；

x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100为每一种抗体浓度计算特异性裂解的百分比,其中ER是为该抗体浓度量化的平均放射性(见上述第ix点),MR是为MR对照(见上述第v点)量化的平均放射性(见上述第ix点),而SR是为SR对照(见上述第vi点)量化的平均放射性(见上述第ix点)；

4)“升高/降低的ADCC”定义为在上文测试的抗体浓度范围内观察到的特异性裂解的最大百分比的增加/减少,和/或实现上文测试的抗体浓度范围内观察到的特异性裂解的最大百分比的一半需要的抗体浓度的降低/升高。ADCC的升高/降低是相对于用上述测定法测量的,使用本领域技术人员已知的相同标准生产,纯化,配制和贮存方法,由相同类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC而言的。

如本文中使用的,术语“单克隆抗体”指自一群实质性同质的抗体获得的抗体,即构成群体的抗体个体是相同的和/或结合相同表位,除了例如含有天然发生突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此,修饰语“单克隆”指示抗体自一群实质性同质的抗体获得的特征,而且不应解读为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体,包括但不限于杂交瘤方法,重组DNA方法,噬菌体展示方法,和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。

如本文中使用的,就抗原结合模块等而言的术语“第一”,“第二”,“第三”等在有多于一个每种类型的模块时用于方便区分。除非明确如此陈述,这些术语的使用并不意图赋予特定次序或取向。

术语“多特异性”和“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同抗原决定簇。典型地,双特异性抗原结合分子包含两种抗原结合位点,其每种是对不同抗原决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇,特别是在两种不同细胞上表达的两种抗原决定簇。

如本文中使用的,术语“价”表示抗原结合分子中规定数目的抗原结合位点的存在。为此,术语“对抗原的单价结合”表示抗原结合分子中一个(且不多于一个)对抗原特异性的抗原结合位点的存在。

“抗原结合位点”指抗原结合分子中提供与抗原相互作用的位点,即一个或多个氨基酸残基。例如,抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子典型地具有两个抗原结合位点,Fab分子典型地具有单个抗原结合位点。

如本文中使用的,“T细胞活化性治疗剂”指能够在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂,特别是设计用于在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂。T细胞活化性治疗剂的例子包括特异性结合活化性T细胞抗原(诸如CD3)和靶细胞抗原(诸如CD20或CD19)的双特异性抗体。别的例子包括包含T细胞活化域和特异性结合靶细胞抗原(诸如CD20或CD19)的抗原结合模块的嵌合抗原受体(CAR)。

如本文中使用的,“活化性T细胞抗原”指由T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞表达的抗原决定簇,其能够在与抗原结合分子相互作用时诱导或增强T细胞活化。具体地,抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联诱导T细胞活化。一种例示性活化性T细胞抗原是CD3。在一个特定的实施方案中,活化性T细胞抗原是CD3,特别是CD3的ε亚基(对于人序列，参见UniProt no.P07766(版本130),NCBIRefSeq no.NP_000724.1,SEQ ID NO:105；或对于食蟹猴[Macaca fascicularis]序列，UniProt no.Q95LI5(版本49),NCBI GenBank no.BAB71849.1,SEQ ID NO:106)。

如本文中使用的,“T细胞活化”指T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答,其选自:增殖,分化,细胞因子分泌,细胞毒性效应分子释放,细胞毒性活性，和活化标志物的表达。在本发明中使用的T细胞活化性治疗剂能够诱导T细胞活化。合适的测量T细胞活化的测定法是本领域已知的和本文中描述的。

如本文中使用的,“靶细胞抗原”指在靶细胞的表面上呈现的抗原决定簇,例如肿瘤中的细胞，诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞。在一个特定的实施方案中,靶细胞抗原是CD20,特别是人CD20(参见UniProt no.P11836)。

如本文中使用的,“B细胞抗原”指在B淋巴细胞,特别是恶性B淋巴细胞的表面上呈现的抗原决定簇(在该情况中,该抗原也称作“恶性B细胞抗原”)。

如本文中使用的,“T细胞抗原”指在T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上呈现的抗原决定簇。

“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链的VH和CH1域(“Fab重链”)和轻链的VL和CL域(“Fab轻链”)组成的蛋白质。

“嵌合抗原受体”或“CAR”意味着经遗传工程改造的受体蛋白,其包含抗原结合模块,例如靶向性抗体的单链可变片段(scFv),跨膜域,胞内T细胞活化性信号域(例如T细胞受体的CD3泽塔链)和任选地一个或多个胞内共刺激域(例如CD28,CD27,CD137(4-1BB),Ox40的)。CAR介导抗原识别,T细胞活化,和—在第二代CAR的情况中—提升T细胞功能性和持久性的共刺激。综述参见例如Jackson et al.,Nat Rev Clin Oncol(2016)13,370-383。

“B细胞增殖性病症”意味着如下疾病,其中患者中B细胞的数目与健康受试者中B细胞的数目相比增多,特别是其中B细胞数目的增多是疾病的起因或标志。“CD20阳性B细胞增殖性病症”是如下B细胞增殖性病症,其中B细胞,特别是恶性B细胞(在正常B细胞以外)表达CD20。

例示性B细胞增殖性病症包括非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),以及一些类型的多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)。

“融合”意味着各成分(例如Fab分子和Fc域亚基)或是直接或是经由一种或多种肽接头通过肽键连接。

药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理学变化必需的量。

药剂，例如药物组合物的“治疗有效量”指以必要的剂量和时间段有效实现期望的治疗或预防结果的量。例如，治疗有效量的药剂消除,降低,延迟,最小化或预防疾病的不良作用。

“治疗剂”意味着施用于受试者,试图改变所治疗的受试者中疾病的天然过程,而且可以为了预防或在临床病理学过程期间实施的活性组分,例如药学组合物的。“免疫治疗剂”指施用于受试者,试图恢复或增强受试者的免疫应答(例如对肿瘤的)的治疗剂。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬，和马),灵长动物(例如人和非人灵长动物，诸如猴),家兔，和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地,个体或受试者是人。

术语“药学组合物”指如下制备物，其处于使得允许其中含有的活性组分的生物学活性有效的形式,而且不含对会接受组合物施用的受试者有不可接受的毒性的另外的成分。

“药学可接受载剂”指药学组合物中除了活性组分以外的对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂，或防腐剂。

如本文中使用的,“治疗/处理”(及其语法变化)指试图改变所治疗的个体中疾病的自然过程,而且可以为了预防或在临床病理学过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,降低疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,本发明的方法用于延迟疾病的发生或减缓病症的进展。

术语“包装插页”或“使用说明书”用于指治疗性产品的商业包装中通常包括的说明书,其含有关于关注使用此类治疗性产品的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。

本文中记载的术语“组合治疗”涵盖组合施用(其中在相同或分开的配制剂中包括两种或更多种治疗剂)和分开施用(在该情况中,如本文中报告的抗体的施用可在一种或多种另外的治疗剂,优选抗体的施用之前,同时,和/或之后发生)。

“CD3”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人),非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD3,除非另外指明。该术语涵盖“全长”,未加工的CD3以及源自细胞中加工的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,CD3是人CD3,特别是人CD3的厄普西隆亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(版本144),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1。还见SEQ ID NO:91。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列显示于NCBI GenBank no.BAB71849.1。还见SEQ ID NO:92。

“CD19”指B淋巴细胞抗原CD19,也称作B淋巴细胞表面抗原B4或T细胞表面抗原Leu-12且包括来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD19,除非另外指明。该术语涵盖“全长”,未加工的CD19以及源自细胞中加工的任何形式的CD19。该术语还涵盖CD19的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,CD19是人CD19。一种例示性人CD19的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P15391(版本174),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_001770.5,和SEQ ID NO:93。

“交换”Fab分子(也称作交叉Fab,“Crossfab”)意味着如下Fab分子，其中Fab重和轻链的可变域或恒定域是交换(即彼此替换)的,即交换Fab分子包含由轻链可变域VL和重链恒定域1CH1构成的肽链(VL-CH1,N至C端方向)和由重链可变域VH和轻链恒定域CL构成的肽链(VH-CL,N至C端方向)。为了清楚起见,在其中Fab轻链和Fab重链的可变域交换的交换Fab分子中,包含重链恒定域1CH1的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。相反,在其中Fab轻链和Fab重链的恒定域交换的交换Fab分子中,包含重链可变域VH的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。

与之形成对比,“常规”Fab分子意味着处于它的天然格式的Fab分子,即包含由重链可变和恒定域构成的重链(VH-CH1,N至C端方向)和由轻链可变和恒定域构成的轻链(VL-CL,N至C端方向)。

术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建物,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA,或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(PNA)中找到的)。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段,例如DNA或RNA片段。

“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自它的天然环境移出的核酸分子,DNA或RNA。例如,出于本发明的目的,载体中含有的编码多肽的重组多核苷酸认为是分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或在溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是多核苷酸分子存在于染色体外或与它的天然染色体位置不同的染色体位置。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。

具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了多核苷酸序列可包括多至参照核苷酸序列的每100个核苷酸五处点突变之外,多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中多至5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者多至参照序列中总核苷酸的5％的数目的核苷酸可插入参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以参照序列内的一个或多个连续组散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如ALIGN-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。

术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。

术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入接受其导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体在靶细胞内部,由细胞转录和/或翻译机制生成由基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含如下表达盒，其包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。

II型抗CD20抗体

CD20分子(也称作人B淋巴细胞局限的分化抗原或Bp35)是一种已经广泛描述的在恶性和非恶性前B和成熟B淋巴细胞的表面上表达的疏水性跨膜蛋白(Valentine,M.A.etal.,J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287；Einfeld,D.A.et al.,EMBO J.7(1988)711-717；Tedder,T.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212；Stamenkovic,I.et al.,J.Exp.Med.167(1988)1975-1980；和Tedder,T.F.et al.,J.Immunol.142(1989)2560-2568)。

CD20由超过90％的B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)高度表达(Anderson,K.C.etal.,Blood 63(1984)1424-1433)但在造血干细胞,原B细胞,正常浆细胞,或其它正常组织上没有找到(Tedder,T.F.et al.,J,Immunol.135(1985)973-979)。

存在两种不同类型的抗CD20抗体,在它们的CD20结合模式和生物学活性中显著不同(Cragg,M.S.et al.,Blood 103(2004)2738-2743；和Cragg,M.S.et al.,Blood 101(2003)1045-1052)。I型抗CD20抗体主要利用补体来杀死靶细胞,而II型抗体主要经由直接诱导细胞死亡来运转。

I型和II型抗CD20抗体和它们的特征在例如Klein et al.,mAbs 5(2013)22-33中综述。II型抗CD20抗体并不将CD20定位于脂筏,显示低CDC活性,只显示与I型抗CD20抗体相比约一半的对B细胞的结合能力,且诱导同型聚集和直接细胞死亡。与之形成对比,I型抗体将CD20定位于脂筏,显示高CDC活性,完全的对B细胞的结合能力,和仅仅较弱的对同型聚集和直接细胞死亡的诱导。

奥滨尤妥珠单抗和托西莫单抗(CAS编号192391-48)是II型抗CD20抗体的例子,而rituximab,ofatumumab,veltuzumab,ocaratuzumab,ocrelizumab,PRO131921和ublituximab是I型抗CD20抗体的例子。

依照本发明,抗CD20抗体是II型抗CD20抗体。在依照本发明的一个实施方案中,II型抗CD20抗体能够降低受试者中的B细胞的数目。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG1抗体。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体是全长抗体。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体包含Fc区,特别是IgG Fc区,更加特别是IgG1 Fc区。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体。特别地,II型抗CD20抗体是人源化IgG类II型抗CD20抗体,具有鼠B-Ly1抗体的结合特异性(Poppema and Visser,Biotest Bulletin 3,131-139(1987)；SEQ ID NO:2和3)。

在一个实施方案中,II型抗CD20抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ IDNO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。特别地,所述II型抗CD20抗体的重链可变区框架区(FR)FR1,FR2,和FR3是由VH1_10人种系序列编码的人FR序列,所述II型抗CD20抗体的重链可变区FR4是由JH4人种系序列编码的人FR序列,所述II型抗CD20抗体的轻链可变区FR FR1,FR2,和FR3是由VK_2_40人种系序列编码的人FR序列,且所述II型抗CD20抗体的轻链可变区FR4是由JK4人种系序列编码的人FR序列。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQID NO:11的轻链可变区序列。

在一个特定的实施方案中,II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗(推荐的INN,WHO药物信息,Vol.26,No.4,2012,p.453)。如本文中使用的,奥滨尤妥珠单抗与GA101同义。商品名称是或这替换所有先前的版本(例如Vol.25,No.1,2011,p.75-76),而且以前称作afutuzumab(推荐的INN,WHO药物信息,Vol.23,No.2,2009,p.176；Vol.22,No.2,2008,p.124)。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体是托西莫单抗。

在本发明中有用的II型抗CD20抗体可以改造成具有与相应的非改造抗体相比升高的效应器功能。在一个实施方案中,改造成具有升高的效应器功能的抗体具有与相应的非改造抗体相比升高至少2倍,至少10倍或甚至至少100倍的效应器功能。升高的效应器功能可以包括但不限于下述中一项或多项:升高的Fc受体结合,升高的C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),升高的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP),升高的细胞因子分泌,升高的抗原呈递细胞的免疫复合物介导的抗原摄取,升高的对NK细胞的结合,升高的对巨噬细胞的结合,升高的对单核细胞的结合,升高的对多形核细胞的结合,升高的直接的诱导凋亡的信号传导,升高的靶物结合的抗体的交联,升高的树突细胞成熟,或升高的T细胞引发。

在一个实施方案中,升高的效应器功能是选自升高的Fc受体结合,升高的CDC,升高的ADCC,升高的ADCP,和升高的细胞因子分泌的组的一项或多项。在一个实施方案中,升高的效应器功能是升高的对活化性Fc受体的结合。在一个此类实施方案中,对活化性Fc受体的结合亲和力与相应的非改造抗体的结合亲和力相比升高至少2倍,特别是至少10倍。在一个具体的实施方案中,活化性Fc受体选自FcγRIIIa,FcγRI,和FcγRIIa的组。在一个实施方案中,活化性Fc受体是FcγRIIIa,特别是人FcγRIIIa。在另一个实施方案中,升高的效应器功能是升高的ADCC。在一个此类实施方案中,ADCC与由相应的非改造抗体介导的ADCC相比升高至少10倍,特别是至少100倍。在还有另一个实施方案中,升高的效应器功能是升高的对活化性Fc受体的结合和升高的ADCC。

升高的效应器功能可以通过本领域已知的方法来测量。本文中描述了一种合适的用于测量ADCC的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子描述于美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)；Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；和Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者,可以采用非放射活性测定法方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射活性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.,Mountain View,CA)；和CytoTox 非放射活性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如公开于Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)。对Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过使用标准仪器，诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)来容易地测定,而Fc受体可以诸如通过重组表达来获得。依照一个特定的实施方案,对活化性Fc受体的结合亲和力于25℃使用T100机器(GEHealthcare)通过表面等离振子共振测量。或者,抗体对Fc受体的结合亲和力可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系来评估,诸如表达FcγIIIa受体的NK细胞。也可以进行C1q结合测定法以确定抗体是否能够结合C1q且因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化,可以实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood101,1045-1052(2003)；和Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。

升高的效应器功能可以源自例如Fc区的糖工程化或在抗体的Fc区中引入氨基酸突变。在一个实施方案中,通过在Fc区中引入一处或多处氨基酸突变来改造抗CD20抗体。在一个具体的实施方案中,氨基酸突变是氨基酸替代。在一个甚至更加具体的实施方案中,氨基酸替代在Fc区的位置298,333,和/或334处(EU残基编号方式)。别的合适的氨基酸突变描述于例如Shields et al.,J Biol Chem 9(2),6591-6604(2001)；美国专利No.6,737,056；WO2004/063351和WO 2004/099249。突变型Fc区可以使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成,等等。正确的核苷酸变化可以例如通过测序来验证。

在另一个实施方案中,通过修饰Fc区中的糖基化来改造II型抗CD20抗体。在一个具体的实施方案中,II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。抗体的Fc区中比例升高的非岩藻糖基化的寡糖导致抗体具有升高的效应器功能,特别是升高的ADCC。

在一个更加具体的实施方案中,II型抗CD20抗体的Fc区中至少约20％,约25％,约30％,约35％,约40％,约45％,约50％,约55％,约60％,约65％,约70％,约75％,约80％,约85％,约90％,约95％,或约100％,优选至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的Fc区中介于约40％和约80％之间的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的Fc区中介于约40％和约60％之间的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合或复合类型的。

在另一个具体的实施方案中,II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的两分的寡糖。在一个更加具体的实施方案中,II型抗CD20抗体的Fc区中至少约10％,约15％,约20％,约25％,约30％,约35％,约40％,约45％,约50％,约55％,约60％,约65％,约70％,约75％,约80％,约85％,约90％,约95％,或约100％,优选至少约40％的N连接的寡糖是两分的。在一个实施方案中,抗CD20抗体的Fc区中介于约40％和约80％之间的N连接的寡糖是两分的。在一个实施方案中,抗CD20抗体的Fc区中介于约40％和约60％之间的N连接的寡糖是两分的。两分的寡糖可以是杂合或复合类型的。

在还有另一个具体的实施方案中,II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的两分的,非岩藻糖基化的寡糖。在一个更加具体的实施方案中,II型抗CD20抗体的Fc区中至少约10％,约15％,约20％,约25％,约30％,约35％,约40％,约45％,约50％,约55％,约60％,约65％,约70％,约75％,约80％,约85％,约90％,约95％,或约100％,优选至少约15％,更加优选至少约25％的N连接的寡糖是两分的,非岩藻糖基化的。两分的,非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合或复合类型的。

抗体Fc区中的寡糖结构可以通过本领域公知的方法,例如通过Umana et al.,NatBiotechnol 17,176-180(1999)或Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)中描述的MALDI TOF质谱术来分析。非岩藻糖基化的寡糖的百分比是相对于附着于Asn297(例如复合的,杂合的和高甘露糖的结构)且通过MALDI TOF MS在经N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有寡糖而言,缺乏岩藻糖残基的寡糖的量。Asn297指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的EU编号方式)处的天冬酰胺残基；然而,由于抗体中的微小序列变异,Asn297也可以位于位置297上游或下游约±3个氨基酸,即介于位置294和300之间。类似地测定两分的,或两分的非岩藻糖基化的寡糖的百分比。

在一个实施方案中,通过在具有改变的一种或多种糖基转移酶活性的宿主细胞中生成抗体,II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比经修饰的糖基化。糖基转移酶包括β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII),β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT),β(1,2)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶I(GnTI),β(1,2)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶II(GnTII)和α(1,6)-岩藻糖基转移酶。在一个具体的实施方案中,通过在具有升高的β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的宿主细胞中生成抗体,II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。在一个甚至更加具体的实施方案中,宿主细胞另外具有升高的α-甘露糖苷酶II(ManII)活性。可用于工程化改造对本发明有用的抗体的糖工程方法学极为详细地描述于Umana et al.,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342(美国专利No.6,602,684；EP 1071700)；WO2004/065540(美国专利申请公开文本No.2004/0241817；EP1587921)；和WO03/011878(美国专利申请公开文本No.2003/0175884),通过援引将其每一篇的整个内容完整收入本文。使用这种方法学糖工程化改造的抗体在本文中称作GlycoMab。

一般地,可以使用任何类型的培养细胞系,包括本文中讨论的细胞系来生成具有改变的糖基化样式的抗TNC A2抗体。特定的细胞系包括CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,和其它哺乳动物细胞。在某些实施方案中,宿主细胞操作成表达水平升高的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些实施方案中,宿主细胞进一步操作成表达水平升高的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。在一个具体的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII的催化域和异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。特别地,所述高尔基定位域是甘露糖苷酶II的高尔基定位域。用于生成此类融合多肽和使用它们来生成具有升高的效应器功能的抗体的方法公开于Ferraraet al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)和WO 2004/065540,通过援引将其整个内容明确收入本文。

含有对本发明有用的抗体的编码序列和/或具有糖基转移酶活性的多肽的编码序列,且表达生物学活性基因产物的宿主细胞可以例如通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交；“标志物”基因功能的存在或缺失；评估转录的水平(如通过宿主细胞中相应mRNA转录物的表达来测量)；或检测基因产物(如通过免疫测定法或通过它的生物学活性测量的)-本领域公知的方法来鉴定。GnTIII或ManII活性可以例如通过采用分别结合GnTIII或ManII的生物合成产物的凝集素来检测。此类凝集素的一个例子是优先结合含有两分的GlcNAc的寡糖的E₄-PHA凝集素。具有GnTIII或ManII活性的多肽的生物合成产物(即特定的寡糖结构)也可以通过自由表达所述多肽的细胞生成的糖蛋白释放的寡糖的质谱术分析来检测。或者,可以使用测量由用具有GnTIII或ManII活性的多肽工程化改造的细胞生成的抗体介导的升高的效应器功能,例如升高的Fc受体结合的功能测定法。

在另一个实施方案中,通过在具有降低的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中生成抗体,II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。具有降低的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞可以是其中α(1,6)-岩藻糖基转移酶基因遭到破坏或以其它方式灭活(例如敲除)的细胞(参见Yamane-Ohnuki etal.,Biotech Bioeng 87,614(2004)；Kanda et al.,Biotechnol Bioeng,94(4),680-688(2006)；和Niwa et al.,J Immunol Methods 306,151-160(2006))。

能够生成去岩藻糖基化的抗体的细胞系的其它例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.,Arch Biochem Biophys 249,533-545(1986)；美国专利申请No.US 2003/0157108；和WO 2004/056312,尤其是实施例11)。或者,依照EP 1 176195A1,WO 03/084570,WO 03/085119和美国专利申请公开文本No.2003/0115614,2004/093621,2004/110282,2004/110704,2004/132140,美国专利No.6,946,292(Kyowa)中公开的技术,例如通过降低或消除用于抗体生成的宿主细胞中GDP-岩藻糖转运蛋白的活性,在本发明中有用的抗体可以糖工程化改造成具有Fc区中减少的岩藻糖残基。

在本发明中有用的糖工程化改造的抗体也可以在生成经修饰的糖蛋白的表达系统中生成,诸如WO 03/056914(GlycoFi,Inc.)或WO 2004/057002和WO 2004/024927(Greenovation)中教导的那些。

T细胞活化性治疗剂

本发明连同各种治疗剂,特别是在受试者中活化T细胞(即有能力在受试者中诱导T细胞活化)的治疗剂是有用的。此类治疗剂包括例如针对T细胞抗原(特别是活化性T细胞抗原)的抗体,或用嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)修饰的T细胞。本发明连同B细胞靶向性T细胞活化性治疗剂特别有用。

在一个实施方案中,当以不施用II型抗CD20抗体的治疗方案施用于受试者时,该治疗剂在该受试者中诱导细胞因子释放。

在一个实施方案中,该治疗剂是生物学药剂。在一个实施方案中,该治疗剂包含多肽,特别是重组多肽。在一个实施方案中,该治疗剂包含在该受试者中并不天然发生的多肽。在一个实施方案中,该治疗剂要系统施用。在一个实施方案中,该治疗剂要通过输注,特别是静脉内输注来施用。

在一个实施方案中,该治疗剂包含抗原结合多肽。在一个实施方案中,该治疗剂包含选自抗体,抗体片段,抗原受体或其抗原结合片段,和受体配体或其受体结合片段的组的多肽。在一个实施方案中,该治疗剂包含抗体。在一个实施方案中,该抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中,该抗体是多克隆抗体。在一个实施方案中,该抗体是人抗体。在一个实施方案中,该抗体是人源化抗体。在一个实施方案中,该抗体是嵌合抗体。在一个实施方案中,该抗体是全长抗体。在一个实施方案中,该抗体是IgG类抗体,特别是IgG1亚类抗体。在一个实施方案中,该抗体是重组抗体。

在某些实施方案中,该治疗剂包含抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)₂,Fv,和scFv片段,和下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述,参见Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论,参见美国专利No.5,869,046。在一个实施方案中,该抗体片段是Fab片段或scFv片段。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。

单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。

可以通过多种技术来生成抗体片段,包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生成,如本文中描述的。

在某些实施方案中,该治疗剂包含嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利No.4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一个例子中,嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠,大鼠,仓鼠,家兔,或非人灵长动物,诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中,嵌合抗体是“类转换的”抗体,其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中,该治疗剂包含人源化抗体。典型地,将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性,同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地,人源化抗体包含一个或多个可变域,其中HVR,例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生,而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地,人源化抗体还会包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中,将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如自其衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代,例如用于恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体和生成它们的方法综述于例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008),而且进一步描述于例如Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321，和7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“重修表面”)；Dall’Acqua et al.,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)和Klimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“导向选择”办法)。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于:使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见例如Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和自筛选FR文库衍生的框架区(参见例如Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

在某些实施方案中,该治疗剂包含人抗体。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体。一般地,人抗体描述于van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通过对如下转基因动物施用免疫原来制备人抗体,该转基因动物已经修饰成响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物典型地含有所有或部分人免疫球蛋白基因座,其替换内源免疫球蛋白基因座,或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体。在此类转基因小鼠中,一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584,其描述XENOMOUSE^TM技术；美国专利No.5,770,429,其描述技术；美国专利No.7,041,870,其描述K-M技术；和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900,其描述技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有描述(参见例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也描述于Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。另外的方法包括例如美国专利No.7,189,826(描述自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。

也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后,可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了用于自抗体文库选择人抗体的技术。

可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离该治疗剂中包含的抗体。例如,用于生成噬菌体展示文库和对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom et al.,in Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)且进一步描述于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks andBradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中,通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆VH和VL基因的全集并在噬菌体文库中随机重组,然后可以对其筛选抗原结合性噬菌体,如描述于Winter etal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)。噬菌体典型地作为单链Fv(scFv)片段或Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体,不需要构建杂交瘤。或者,可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况下提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源,如描述于Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)。最后,也可以通过自干细胞克隆未重排V基因区段,并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库,如描述于Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如:美国专利No.5,750,373,和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936,和2009/0002360。

自人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中认为是人抗体或人抗体片段。

在某些实施方案中,该治疗剂包含多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中,结合特异性针对不同抗原。在某些实施方案中,结合特异性针对相同抗原上的不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达抗原的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983),WO 93/08829,和Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991)),和“节-入-穴”工程(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980,和Brennan et al.,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体(参见例如Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991))来生成多特异性抗体。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体,包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。

本文中的抗体或片段还包括包含结合两种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。

本文中还包括“Crossmab”抗体(参见例如WO 2009080251,WO2009080252,WO2009080253,WO 2009080254)。

用于生成双特异性抗体片段的另一种技术是“双特异性T细胞啮合剂”或办法(参见例如WO 2004/106381,WO 2005/061547,WO 2007/042261,和WO 2008/119567)。这种办法利用在单一多肽上排列的两种抗体可变域。例如,单一多肽链包括两个单链Fv(scFv)片段,每个具有由多肽接头分开的可变重链(VH)域和可变轻链(VL)域,多肽接头的长度足以容许两个域之间的分子内联合。此单一多肽进一步包括两个scFv片段之间的多肽间隔物序列。每个scFv识别不同表位,而且这些表位可以是对于不同细胞类型特异性的,使得当每种scFv与它的关联表位啮合时两种不同细胞类型的细胞变成紧密接近或系留。这种办法的一个特定实施方案包括识别由免疫细胞表达的细胞表面抗原(例如T细胞上的CD3多肽)的scFv连接识别由靶细胞(诸如恶性或肿瘤细胞)表达的细胞表面抗原的另一个scFv。

因为它是单一多肽,所以双特异性T细胞啮合剂可以使用本领域已知的任何原核或真核细胞表达系统(例如CHO细胞系)来表达。然而,特定纯化技术(参见例如EP1691833)对于分开单体双特异性T细胞啮合剂与其它多聚体种类(其可能具有与单体的预定活性不同的生物学活性)可能是必需的。在一种例示性纯化方案中,首先将含有分泌多肽的溶液提交金属亲和层析,并用咪唑浓度的梯度洗脱多肽。使用阴离子交换层析进一步纯化此洗出液,并使用氯化钠浓度的梯度洗脱多肽。最后,将此洗出液提交大小排阻层析以分开单体与多聚体种类。

涵盖具有多于两个效价的抗体。例如,可制备三特异性抗体(Tuft et al.,J.Immunol.,147:60(1991))。

在某些实施方案中,可以进一步修饰该治疗剂中包含的抗体以含有本领域知道的且易于获得的另外的非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧杂环戊烷,聚-1,3,6-三氧杂环己烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(均聚物或随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,和其混合物。由于它在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量的,而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物的数目可以变化,而且如果附着了多于一个聚合物的话,它们可以是相同或不同分子。一般而言,可基于下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的特定特性或功能,抗体衍生物是否会用于限定条件下的疗法，等。

该治疗剂还可包含与一种或多种细胞毒剂,诸如化疗剂或药物,生长抑制剂,毒素(例如蛋白质毒素,细菌,真菌,植物，或动物起源的酶活性毒素,或其片段),或放射性同位素缀合的抗体。

在一个实施方案中,该治疗剂包含抗体-药物缀合物(ADC),其中抗体与一种或多种药物缀合,包括但不限于美登木生物碱(参见美国专利No.5,208,020,5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235B1)；奥瑞司他汀(auristatin)，诸如单甲基奥瑞司他汀药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利No.5,635,483和5,780,588，和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001,和5,877,296；Hinmanet al.,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode et al.,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素,诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz et al.,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey et al.,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov et al.,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik et al.,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King et al.,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，诸如多西他赛(docetaxel),帕利他赛(paclitaxel),拉洛他赛(larotaxel),特西他赛(tesetaxel),和欧塔他赛(ortataxel)；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。

在另一个实施方案中,该治疗剂包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中描述的抗体,包括但不限于白喉A链,白喉毒素的非结合活性片段,外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)),蓖麻毒蛋白(ricin)A链,相思豆毒蛋白(abrin)A链,蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链,α-帚曲霉素(sarcin),油桐(Aleurites fordii)毒蛋白,香石竹(dianthin)毒蛋白,美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI,PAPII,和PAP-S),苦瓜(Momordica charantia)抑制物,麻疯树毒蛋白(curcin),巴豆毒蛋白(crotin),肥皂草(saponaria officinalis)抑制物,白树毒蛋白(gelonin),丝林霉素(mitogellin),局限曲菌素(restrictocin),酚霉素(phenomycin),依诺霉素(enomycin)，和单端孢菌素(tricothecene)。

在另一个实施方案中,该治疗剂包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At²¹¹,I¹³¹,I¹²⁵,Y⁹⁰,Re¹⁸⁶,Re¹⁸⁸,Sm¹⁵³,Bi²¹²,P³²,Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时,它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子,例如Tc^99m或I¹²³,或供核磁共振(NMR)成像(也称作磁共振成像,mri)用的自旋标记物,诸如再一次的碘-123,碘-131,铟-111,氟-19,碳-13,氮-15,氧-17,钆,锰或铁。

可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物,诸如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC),亚氨基硫烷(IT),亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯),活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯),醛类(诸如戊二醛),双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺),双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺),二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯),和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如,可以如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是推动在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可使用酸不稳定接头,肽酶敏感性接头,光不稳定接头,二甲基接头或含二硫化物接头(Chari et al.,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

在一个实施方案中,该治疗剂包含指明用于治疗癌症的抗体。在一个实施方案中,该治疗剂指明用于治疗癌症。在一个实施方案中,该癌症是B细胞增殖性病症。在一个实施方案中,该癌症是CD20阳性B细胞增殖性病症。在一个实施方案中,该癌症选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM),和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组。在一个实施方案中,该治疗剂是免疫治疗剂。

在一些实施方案中,该治疗剂包含特异性结合活化性T细胞抗原的抗体。在一个实施方案中,该治疗性抗体可包含特异性结合选自CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127的组的抗原的抗体。

在一个实施方案中,该治疗剂包含特异性结合CD3,特别是CD3ε的抗体。

在一个实施方案中,该治疗剂包含是下述或与下述竞争结合的抗体:抗体H2C(PCT公开文本No.WO 2008/119567),抗体V9(Rodrigues et al.,Int J Cancer Suppl 7,45-50(1992)和美国专利No.6,054,297),抗体FN18(Nooij et al.,Eur J Immunol 19,981-984(1986)),抗体SP34(Pessano et al.,EMBO J 4,337-340(1985)),抗体OKT3(Kung et al.,Science 206,347-349(1979)),抗体WT31(Spits et al.,J Immunol 135,1922(1985)),抗体UCHT1(Burns et al.,J Immunol 129,1451-1457(1982)),抗体7D6(Coulie et al.,EurJ Immunol 21,1703-1709(1991))或抗体Leu-4。在一些实施方案中,该治疗剂还可包含特异性结合CD3的抗体，如描述于WO 2005/040220,WO 2005/118635,WO2007/042261,WO2008/119567,WO 2008/119565,WO 2012/162067,WO2013/158856,WO 2013/188693,WO2013/186613,WO 2014/110601,WO2014/145806,WO 2014/191113,WO 2014/047231,WO2015/095392,WO2015/181098,WO 2015/001085,WO 2015/104346,WO 2015/172800,WO2016/020444,或WO 2016/014974。

在一个实施方案中,该治疗剂可包含特异性结合B细胞抗原,特别是恶性B细胞抗原的抗体。在一个实施方案中,该治疗剂可包含特异性结合选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,特别是CD20或CD19的抗体。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含选自rituximab,ocrelizumab,ofatumumab,ocaratuzumab,veltuzumab,和ublituximab的抗体。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含多特异性抗体,特别是双特异性抗体。在一些实施方案中,该治疗剂可包含能够结合T细胞和靶细胞,例如肿瘤细胞的双特异性抗体。在一些实施方案中,该靶细胞是B细胞,特别是恶性B细胞。在一些实施方案中,该治疗剂可包含特异性结合(i)活化性T细胞抗原和(ii)B细胞抗原的双特异性抗体。在一些实施方案中,该治疗剂可包含特异性结合T细胞上的CD3和靶细胞抗原的双特异性抗体。在一些实施方案中,该靶细胞抗原是B细胞抗原,特别是恶性B细胞抗原。在一些实施方案中,该治疗剂可包含双特异性T细胞啮合剂

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD3和CD20的双特异性抗体。在一个实施方案中,该双特异性抗体是13676。在一个实施方案中,该双特异性抗体是REGN1979。在一个实施方案中,该双特异性抗体是FBTA05(Lymphomun)。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD3和CD19的双特异性抗体。在一个实施方案中,该双特异性抗体是blinatumomab在一个实施方案中,该双特异性抗体是AFM11。在一个实施方案中,该双特异性抗体是MGD011(JNJ-64052781)。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD3和CD38的双特异性抗体。在一个实施方案中,该双特异性抗体是13551,15426,或14702。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD3和BCMA的双特异性抗体。在一个实施方案中,该双特异性抗体是BI836909。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD3和CD33的双特异性抗体。在一个实施方案中,该双特异性抗体是AMG330。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD3和CD123的双特异性抗体。在一个实施方案中,该双特异性抗体是MGD006。在一个实施方案中,该双特异性抗体是14045。在一个实施方案中,该双特异性抗体是JNJ-63709178。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含重组受体或其片段。在一些实施方案中,该受体是T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中,该治疗剂可包含嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL)。在一些实施方案中,该治疗剂可包含表达重组T细胞受体(TCR)的T细胞。

在一个实施方案中,该治疗剂可包含特异性结合B细胞抗原,特别是恶性B细胞抗原的CAR。在一个实施方案中,该治疗剂可包含特异性结合选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,特别是CD20或CD19的CAR。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD19的CAR,或表达针对CD19的CAR的T细胞。在一些实施方案中,该治疗剂可包含KTE-C19,CTL019,JCAR-014,JCAR-015,JCAR-017,BPX-401,UCART19,

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD22的CAR,或表达针对CD22的CAR的T细胞。在一些实施方案中,该治疗剂可包含JCAR-018或UCART22。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对T细胞活化性共刺激分子的激动剂。在一些实施方案中,T细胞活化性共刺激分子可包括CD40,CD226,CD28,OX40,GITR,CD137,CD27,HVEM,或CD127。在一些实施方案中,该针对T细胞活化性共刺激分子的激动剂是结合CD40,CD226,CD28,OX40,GITR,CD137,CD27,HVEM,或CD127的激动性抗体。在一些实施方案中,该治疗剂可包含靶向GITR的抗体。在一些实施方案中,该靶向GITR的抗体是TRX518。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD137(也称作TNFRSF9,4-1BB,或ILA)的激动剂,例如活化性抗体。在一些实施方案中,该治疗剂可包含urelumab(也称作BMS-663513)。在一些实施方案中,该治疗剂可包含CD137(也称作TNFRSF9,4-1BB,或ILA)的配体,诸如4-1BBL。在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD40的激动剂,例如活化性抗体。在一些实施方案中,该治疗剂可包含CP-870893。在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对OX40(也称作CD134)的激动剂,例如活化性抗体。在一些实施方案中,该治疗剂可包含抗OX40抗体(例如AgonOX)。在一些实施方案中,该治疗剂可包含OX40的配体,诸如OX40L。在一些实施方案中,该治疗剂可包含针对CD27的激动剂,例如活化性抗体。在一些实施方案中,该治疗剂可包含CDX-1127。

在一些实施方案中,该治疗剂可包含本文中提到的药剂,例如抗体的仿制(generic),生物类似(biosimilar)或不可比生物(comparable biologic)型式。

在一个实施方案中,该治疗剂不包含奥滨尤妥珠单抗。

在一些实施方案中,该治疗剂包含特异性结合CD3,特别是CD3ε的抗体。在一个实施方案中,该特异性结合CD3的抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQ ID NO:17的LCDR3。在又一个实施方案中,该特异性结合CD3的抗体包含与SEQ ID NO:18的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:19的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区序列。在又一个实施方案中,该特异性结合CD3的抗体包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ IDNO:19的轻链可变区序列。

在一个实施方案中,该特异性结合CD3的抗体是全长抗体。在一个实施方案中,该特异性结合CD3的抗体是人IgG类的抗体,特别是人IgG₁类的抗体。在一个实施方案中,该特异性结合CD3的抗体是抗体片段,特别是Fab分子或scFv分子,更加特别是Fab分子。在一个特定的实施方案中,该特异性结合CD3的抗体是交换Fab分子,其中Fab重和轻链的可变域或恒定域交换(即彼此替换)。在一个实施方案中,该特异性结合CD3的抗体是人源化抗体。

在一个实施方案中,该治疗剂包含多特异性抗体,特别是双特异性抗体。在一个实施方案中,该多特异性抗体特异性结合(i)活化性T细胞抗原和(ii)B细胞抗原。特定的双特异性抗体描述于PCT公开文本No.WO2016/020309和欧洲专利申请No.EP15188093和EP16169160(通过援引将每一篇完整收入本文)。

在一个实施方案中,该双特异性抗体特异性结合CD3和CD20。在一个实施方案中,该双特异性抗体包含特异性结合CD20的抗原结合模块和特异性结合CD3的抗原结合模块。在一个实施方案中,该双特异性抗体包含特异性结合CD3的第一抗原结合模块和特异性结合CD20的第二和第三抗原结合模块。在一个实施方案中,该第一抗原结合模块是交换Fab分子,且该第二和该第三抗原结合模块每一个是常规Fab分子。在一个实施方案中,该双特异性抗体进一步包含Fc域。该双特异性抗体可包含如本文中描述的抗原结合模块和/或Fc区中的修饰。

在一个实施方案中,该治疗剂包含双特异性抗体,其包含

(i)特异性结合CD3的抗原结合模块,其包含重链可变区,该重链可变区包含SEQID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQ IDNO:17的LCDR3；和

(ii)特异性结合CD20的抗原结合模块,其包含重链可变区,该重链可变区包含SEQID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

在一个实施方案中,该治疗剂包含双特异性抗体,其包含

(i)特异性结合CD3的抗原结合模块,其包含SEQ ID NO:18的重链可变区和SEQ IDNO:19的轻链可变区；和

(ii)特异性结合CD20的抗原结合模块,其包含SEQ ID NO:10的重链可变区和SEQID NO:11的轻链可变区。

在一个特定的实施方案中,该治疗剂包含双特异性抗体,其包含

a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；

b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子,且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH彼此替换；

c)特异性结合该第一抗原的第三Fab分子；和

d)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域；

其中

(i)该第一抗原是CD20且该第二抗原是CD3,特别是CD3ε；

(ii)a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子每一个包含SEQ ID NO:4的重链互补决定区(CDR)1,SEQ ID NO:5的重链CDR 2,SEQ ID NO:6的重链CDR 3,SEQ ID NO:7的轻链CDR 1,SEQ ID NO:8的轻链CDR 2和SEQ ID NO:9的轻链CDR 3,且b)下的第二Fab分子包含SEQ ID NO:12的重链CDR 1,SEQ ID NO:13的重链CDR 2,SEQ ID NO:14的重链CDR 3,SEQID NO:15的轻链CDR 1,SEQ ID NO:16的轻链CDR 2和SEQ ID NO:17的轻链CDR 3；

(iii)在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CL中,位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R),特别是精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat),且其中在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CH1中,位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且(iv)a)下的第一Fab分子在Fab重链的C端融合至b)下的第二Fab分子的Fab重链的N端,且b)下的第二Fab分子和c)下的第三Fab分子每一个在Fab重链的C端融合至d)下的Fc域的亚基之一的N端。

在一个实施方案中,a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子每一个包含与SEQID NO:10的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:11的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区。

在一个实施方案中,a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子每一个包含SEQ IDNO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

在一个实施方案中,b)下的第二Fab分子包含与SEQ ID NO:18的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:19的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区。

在仍有又一个实施方案中,b)下的第二Fab分子包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

在一个特定的实施方案中,该双特异性抗体包含与SEQ ID NO:20的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,与SEQ ID NO:21的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,与SEQ ID NO:22的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,和与SEQ ID NO:23的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽。在又一个特定的实施方案中,该双特异性抗体包含SEQ ID NO:20的多肽序列,SEQ ID NO:21的多肽序列,SEQ ID NO:22的多肽序列和SEQ ID NO:23的多肽序列(CD20XCD3 bsAB)。

在一个实施方案中,该双特异性抗体包含特异性结合CD19的抗原结合模块和特异性结合CD3的抗原结合模块。在一个实施方案中,该双特异性抗体包含特异性结合CD3的第一抗原结合模块和特异性结合CD19的第二和第三抗原结合模块。在一个实施方案中,该第一抗原结合模块是交换Fab分子,且该第二和该第一抗原结合模块每一个是常规Fab分子。在一个实施方案中,该双特异性抗体进一步包含Fc域。该双特异性抗体可包含本文中描述的抗原结合模块和/或Fc区中的修饰。

在一个实施方案中,该治疗剂包含双特异性抗体,其包含(i)特异性结合CD3的抗原结合模块,其包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQ ID NO:17的LCDR3；和(ii)特异性结合CD19的抗原结合模块,其包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:24的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:25的HCDR2,和SEQ ID NO:26的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:28的LCDR2，和SEQ ID NO:29的LCDR3。

在一个实施方案中,该治疗剂包含双特异性抗体,其包含

(ii)特异性结合CD19的抗原结合模块,其包含SEQ ID NO:30的重链可变区和SEQID NO:31的轻链可变区。

a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；

c)特异性结合该第一抗原的第三Fab分子；和

d)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域；

其中

(i)该第一抗原是CD19且该第二抗原是CD3,特别是CD3ε；

(ii)a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子每一个包含SEQ ID NO:24的重链互补决定区(CDR)1,SEQ ID NO:25的重链CDR 2,SEQ ID NO:26的重链CDR 3,SEQ ID NO:27的轻链CDR 1,SEQ ID NO:28的轻链CDR 2和SEQ ID NO:29的轻链CDR 3,且b)下的第二Fab分子包含SEQ ID NO:12的重链CDR 1,SEQ ID NO:13的重链CDR 2,SEQ ID NO:14的重链CDR3,SEQ ID NO:15的轻链CDR 1,SEQ ID NO:16的轻链CDR 2和SEQ ID NO:17的轻链CDR 3；

(iii)在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CL中,位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R),特别是精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat),且其中在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CH1中,位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且

(iv)a)下的第一Fab分子在Fab重链的C端融合至b)下的第二Fab分子的Fab重链的N端,且b)下的第二Fab分子和c)下的第三Fab分子每一个在Fab重链的C端融合至d)下的Fc域的亚基之一的N端。

在一个实施方案中,a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子每一个包含与SEQID NO:30的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:31的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区。

在一个实施方案中,a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子每一个包含SEQ IDNO:30的重链可变区序列和SEQ ID NO:31的轻链可变区序列。

在一个特定的实施方案中,该双特异性抗体包含与SEQ ID NO:23的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,与SEQ ID NO:32的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,与SEQ ID NO:33的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽,和与SEQ ID NO:34的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的多肽。在又一个特定的实施方案中,该双特异性抗体包含SEQ ID NO:23的多肽序列,SEQ ID NO:32的多肽序列,SEQ ID NO:33的多肽序列和SEQ ID NO:34的多肽序列。

抗体格式

治疗剂中包含的抗体,特别是多特异性抗体的各成分可以以多种构造彼此融合。例示性构造描绘于图1。

在特定的实施方案中,抗体中包含的抗原结合模块是Fab分子。在此类实施方案中,第一,第二,第三等抗原结合模块在本文中可分别称作第一,第二,第三等Fab分子。而且,在特定的实施方案中,抗体包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。

在一些实施方案中,第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。

在一个此类实施方案中,第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中,抗体本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。此类构造示意性描绘于图1G和1K。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。

在另一个此类实施方案中,第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个具体的此类实施方案中,抗体本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域，和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一和第二Fab分子各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端。此类构造示意性描绘于图1A和1D。第一和第二Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定的实施方案中,第一和第二Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG₁铰链区,特别是在Fc域是IgG₁ Fc域的情况中。

在其它实施方案中,第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。

在一个此类实施方案中,第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中,抗体本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域，和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。此类构造示意性描绘于图1H和1L。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。

Fab分子可以直接或经由包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽接头融合至Fc域或彼此融合。肽接头是本领域已知的和本文中描述的。合适的,非免疫原性的肽接头包括例如(G₄S)_n,(SG₄)_n,(G₄S)_n或G₄(SG₄)_n肽接头。“n”一般是1至10,典型地2至4的整数。在一个实施方案中,所述肽接头具有至少5个氨基酸的长度,在一个实施方案中5至100个氨基酸的长度,在又一个实施方案中10至50个氨基酸的长度。在一个实施方案中,所述肽接头是(GxS)_n或(GxS)_nG_m,其中G＝甘氨酸,S＝丝氨酸,且(x＝3,n＝3,4,5或6,且m＝0,1,2或3)或(x＝4,n＝2,3,4或5且m＝0,1,2或3),在一个实施方案中x＝4且n＝2或3,在又一个实施方案中x＝4且n＝2。在一个实施方案中,所述肽接头是(G₄S)₂。一种特别适合于将第一和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的肽接头是(G₄S)₂。一种适合于连接第一和第二Fab片段的Fab重链的例示性肽接头包含序列(D)-(G₄S)₂(SEQ ID NO:95和96)。另一种合适的此类接头包含序列(G₄S)₄。另外,接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地,在Fab分子融合至Fc域亚基的N端的情况中,它可以在有或无另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。

具有单个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块(诸如Fab分子)的抗体(例如如图1A,D,G,H,K,L中显示的)是有用的,特别是在高亲和力抗原结合模块结合后预期靶细胞抗原内在化的情况中。在此类情况中,多于一个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块的存在可增强靶细胞抗原的内在化,由此降低它的利用度。

然而,在许多其它情况中,会有利的是具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块(诸如Fab分子)的抗体(见图1B,1C,1E,1F,1I,1J,1M或1N中显示的例子),从而例如优化对靶部位的靶向或容许靶细胞抗原的交联。

因而,在特定的实施方案中,抗体进一步包含特异性结合第一抗原的第三Fab分子。第一抗原优选是靶细胞抗原。在一个实施方案中,第三Fab分子是常规Fab分子。在一个实施方案中,第三Fab分子与第一Fab分子相同(即第一和第三Fab分子包含相同的重和轻链氨基酸序列且具有相同的域排列(即常规或交换))。在一个特定的实施方案中,第二Fab分子特异性结合活化性T细胞抗原,特别是CD3,且第一和第三Fab分子特异性结合靶细胞抗原。

在备选实施方案中,抗体进一步包含特异性结合第二抗原的第三Fab分子。在这些实施方案中,第二抗原优选是靶细胞抗原。在一个此类实施方案中,第三Fab分子是交换Fab分子(其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1彼此替换/交换的Fab分子)。在一个此类实施方案中,第三Fab分子与第二Fab分子相同(即第二和第三Fab分子包含相同的重和轻链氨基酸序列且具有相同的域排列(即常规或交换))。在一个此类实施方案中,第一Fab分子特异性结合活化性T细胞抗原,特别是CD3,且第二和第三Fab分子特异性结合靶细胞抗原。

在一个实施方案中,第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。

在一个特定的实施方案中,第二和第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端,且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中,抗体本质上由第一,第二和第三Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一亚基的N端,且其中第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第二亚基的N端。此类构造示意性描绘于图1B和1E(特定的实施方案,其中第三Fab分子是常规Fab分子且优选与第一Fab分子相同),和图1I和1M(备选的实施方案,其中第三Fab分子是交换Fab分子且优选与第二Fab分子相同)。第二和第三Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定的实施方案中,第二和第三Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG₁铰链区,特别是在Fc域是IgG₁ Fc域的情况中。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。

在另一个实施方案中,第一和第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端,且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中,抗体本质上由第一,第二和第三Fab分子,由第一亚基和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一亚基的N端,且其中第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第二亚基的N端。此类构造示意性描绘于图1C和1F(特定的实施方案,其中第三Fab分子是常规Fab分子且优选与第一Fab分子相同)和图1J和1N(备选的实施方案,其中第三Fab分子是交换Fab分子且优选与第二Fab分子相同)。第一和第三Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定的实施方案中,第一和第三Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG₁铰链区,特别是在Fc域是IgG₁ Fc域的情况中。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。

在其中Fab分子经由免疫球蛋白铰链区在Fab重链的C端融合至Fc域的每个亚基的N端的抗体的构造中,两个Fab分子,铰链区和Fc域本质上形成免疫球蛋白分子。在一个特定的实施方案中,免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中,免疫球蛋白是IgG₁亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中,免疫球蛋白是IgG₄亚类免疫球蛋白。在又一个特定的实施方案中,免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其它实施方案中,免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。

在一些抗体中,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合,任选地经由肽接头。取决于第一和第二Fab分子的构造,第一Fab分子的Fab轻链可在它的C端融合至第二Fab分子的Fab轻链的N端,或者第二Fab分子的Fab轻链可在它的C端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N端。第一和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步降低不匹配的Fab重和轻链的错配,而且还减少表达一些抗体需要的质粒数。

在某些实施方案中,抗体包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换),第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎-CH2-CH3(-CH4)),和其中第一Fab分子的Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在某些实施方案中,多肽共价连接,例如通过二硫键。

在某些实施方案中,抗体包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎-CH2-CH3(-CH4)),和其中第一Fab分子的Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在某些实施方案中,多肽共价连接,例如通过二硫键。

在一些实施方案中,抗体包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换),第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键,第一Fab分子的Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4))。在其它实施方案中,抗体包含其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换),第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎-CH2-CH3(-CH4))。

在这些中的一些实施方案中,抗体进一步包含第二Fab分子的交换Fab轻链多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH₍₂₎-CL₍₂₎),和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在这些中的其它实施方案中,在适宜时,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎-VL₍₁₎-CL₍₁₎),或其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎)。

依照这些实施方案的抗体可以进一步包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4)),或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₃₎-CH1₍₃₎-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₃₎-CL₍₃₎)。在某些实施方案中,多肽共价连接,例如通过二硫键。

在一些实施方案中,抗体包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键,第一Fab分子的Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4))。在其它实施方案中,抗体包含其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎-CH2-CH3(-CH4))。

在这些中的一些实施方案中,抗体进一步包含第二Fab分子的交换Fab轻链多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL₍₂₎-CH1₍₂₎),和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在这些中的其它实施方案中,在适宜时,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VL₍₁₎-CL₍₁₎),或其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎)。

在一些实施方案中,第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在某些此类实施方案中,抗体不包含Fc域。在某些实施方案中,抗体本质上由第一和第二Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性描绘于图1O和1S。

在其它实施方案中,第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在某些此类实施方案中,抗体不包含Fc域。在某些实施方案中,抗体本质上由第一和第二Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性描绘于图1P和1T。

在一些实施方案中,第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且抗体进一步包含第三Fab分子,其中所述第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在特定的此类实施方案中,所述第三Fab分子是常规Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第三Fab分子是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1彼此替换/交换的Fab分子。在某些此类实施方案中,抗体本质上由第一,第二和第三Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性描绘于图1Q和1U(特定的实施方案,其中第三Fab分子是常规Fab分子且优选与第一Fab分子相同)。

在一些实施方案中,第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且抗体进一步包含第三Fab分子,其中所述第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第二Fab分子的Fab重链的C端。在特定的此类实施方案中,所述第三Fab分子是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL彼此替换/交换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第三Fab分子是常规Fab分子。在某些此类实施方案中,抗体本质上由第一,第二和第三Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第二Fab分子的Fab重链的C端。此类构造示意性描绘于图1W和1Y(特定的实施方案,其中第三Fab分子是交换Fab分子且优选与第二Fab分子相同)。

在一些实施方案中,第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且抗体进一步包含第三Fab分子,其中所述第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第一Fab分子的Fab重链的C端。在特定的此类实施方案中,所述第三Fab分子是常规Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第三Fab分子是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL彼此替换/交换的Fab分子。在某些此类实施方案中,抗体本质上由第一,第二和第三Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第一Fab分子的Fab重链的C端。此类构造示意性描绘于图1R和1V(特定的实施方案,其中第三Fab分子是常规Fab分子且优选与第一Fab分子相同)。

在一些实施方案中,第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且抗体进一步包含第三Fab分子,其中所述第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在特定的此类实施方案中,所述第三Fab分子是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL彼此替换/交换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第三Fab分子是常规Fab分子。在某些此类实施方案中,抗体本质上由第一,第二和第三Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性描绘于图1X和1Z(特定的实施方案,其中第三Fab分子是交换Fab分子且优选与第一Fab分子相同)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换)的多肽(VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换),第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键,第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换)的多肽(VH₍₃₎-CH1₍₃₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₃₎-CL₍₃₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键,第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换)的多肽(VH₍₃₎-CH1₍₃₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₃₎-CL₍₃₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换),第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键,第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₃₎-CH1₍₃₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₃₎-CL₍₃₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键,第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₃₎-CH1₍₃₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₃₎-CL₍₃₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换),第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第三Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键,第三Fab分子的Fab轻链可变区继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换)的多肽(VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VL₍₃₎-CH1₍₃₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₃₎-CL₍₃₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第三Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键,第三Fab分子的Fab重链可变区继而与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换)的多肽(VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₃₎-CL₍₃₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₃₎-CH1₍₃₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换),第三Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链可变区用轻链可变区替换),第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₃₎-CH1₍₃₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₂₎-CL₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₃₎-CL₍₃₎)。

在某些实施方案中,抗体包含其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),第三Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键,第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链,其中重链恒定区用轻链恒定区替换),第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VH₍₃₎-CL₍₃₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₂₎-CH1₍₂₎)和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL₍₁₎-CL₍₁₎)。在一些实施方案中,抗体进一步包含其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL₍₃₎-CH1₍₃₎)。

依照任何上述实施方案,抗体的各成分(例如Fab分子,Fc域)可直接或经由本文中描述的或本领域已知的各种接头(特别是包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽接头)融合。合适的,非免疫原性的肽接头包括例如(G₄S)_n,(SG₄)_n,(G₄S)_n或G₄(SG₄)_n肽接头,其中n一般是1至10,典型地2至4的整数。

Fc域

治疗剂中包含的抗体,例如双特异性抗体可包含Fc域,其由一对包含抗体分子的重链域的多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体,其每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。

在一个实施方案中,Fc域是IgG Fc域。在一个特定的实施方案中,Fc域是IgG₁ Fc域。在另一个实施方案中,Fc域是IgG₄ Fc域。在一个更加具体的实施方案中,Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代S228P的IgG₄ Fc域。此氨基酸替代降低IgG₄抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch et al.,Drug Metabolism andDisposition 38,84-91(2010))。在又一个特定的实施方案中,Fc域是人的。人IgG₁ Fc区的一种例示性序列在SEQ ID NO:94中给出。

(i)促进异二聚化的Fc域修饰

治疗剂中包含的抗体,特别是双特异性抗体可包含融合至Fc域的两个亚基之一或另一的不同成分(例如抗原结合域),如此Fc域的两个亚基典型地包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中此类抗体的产量和纯度,如此在抗体的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。

因而,在特定的实施方案中,Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此,在一个实施方案中,所述修饰在Fc域的CH3域中。

存在数种办法来修饰Fc域的CH3域以加强异二聚化,它们详细描述于例如WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO2007/147901,WO 2009/089004,WO2010/129304,WO 2011/90754,WO2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954,WO2013/096291。典型地,在所有此类办法中,Fc域的第一亚基的CH3域和Fc域的第二亚基的CH3域二者以互补方式进行工程化改造，使得每个CH3域(或包含它的重链)不再能与它自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的另一CH3域异二聚化(使得第一和第二CH3域异二聚化且两个第一CH3域或两个第二CH3域之间不形成同二聚体)。涵盖这些用于改善重链异二聚化的不同办法作为不同办法,与减少轻链错配和Bence Jones型副产物的重-轻链修饰(例如Fab臂中的可变或恒定区交换/替换或在CH1/CL界面中引入具有相反电荷的带电荷氨基酸的替代)组合。

在一个具体的实施方案中,所述促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,包含Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。

节-入-穴技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,ProtEng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得隆起可放置在空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔,其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。

因而,在一个特定的实施方案中,在Fc域的第一亚基的CH3域中,一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成隆起,其可放置在第二亚基的CH3域内的空腔中,而且在Fc域的第二亚基的CH3域中,一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,其内可放置第一亚基的CH3域内的隆起。

优选地,所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组由精氨酸(R),苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),和色氨酸(W)组成的组。

优选地,所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T),和缬氨酸(V)组成的组。

可以通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变，或通过肽合成来生成隆起和空腔。

在一个具体的实施方案中,在Fc域的第一亚基的CH3域(“节”亚基)中,第366位处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),而在Fc域的第二亚基的CH3域(“穴”亚基)中,第407位处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中,在Fc域的第二亚基中,另外,第366位处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引)。

在还有又一个实施方案中,在Fc域的第一亚基中,另外,第354位处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或第356位处的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C),而在Fc域的第二亚基中,另外,第349位处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥,进一步稳定二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。

在一个特定的实施方案中,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W,且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S,L368A和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个特定的实施方案中,本文中描述的CD3抗原结合模块融合至Fc域的第一亚基(包含“节”修饰)。不希望受理论束缚,CD3抗原结合模块与Fc域的含节亚基的融合会(进一步)使包含两个CD3抗原结合模块的双特异性抗体的生成最小化(两条含节多肽的空间碰撞)。

涵盖加强异二聚化的CH3修饰的其它技术作为依照本发明的备选,它们描述于例如WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO2007/147901,WO 2009/089004,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954,WO 2013/096291。

在一个实施方案中,备选地，使用EP 1870459A1中描述的异二聚化办法。这种办法基于在Fc域的两个亚基之间的CH3/CH3域界面中的特定氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷氨基酸。一个优选的实施方案是(Fc域的)两个CH3域之一中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的CH3域之另一中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照Kabat EU索引)。

在另一个实施方案中,抗体包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变T366S,L368A,Y407V,和另外地Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照Kabat EU索引)。

在另一个实施方案中,抗体包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C,T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C,T366S,L368A,Y407V,或抗体包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C,T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C,T366S,L368A,Y407V和另外地Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(所有编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个实施方案中,备选地使用WO 2013/157953中描述的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366K且第二CH3域包含氨基酸突变L351D(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步包含氨基酸突变L351K。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含选自Y349E,Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个实施方案中,备选地使用WO 2012/058768中描述的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变L351Y,Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A,K409F。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含位置T411,D399,S400,F405,N390,或K392处的氨基酸突变,例如选自a)T411N,T411R,T411Q,T411K,T411D,T411E或T411W,b)D399R,D399W,D399Y或D399K,c)S400E,S400D,S400R,或S400K,d)F405I,F405M,F405T,F405S,F405V或F405W,e)N390R,N390K或N390D,f)K392V,K392M,K392R,K392L,K392F或K392E(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变L351Y,Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366V,K409F。在又一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A,K409F。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含氨基酸突变K392E,T411E,D399R和S400R(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个实施方案中,备选地使用WO 2011/143545中描述的异二聚化办法,例如选自由368和409组成的组的位置处的氨基酸修饰(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个实施方案中,备选地使用WO 2011/090762中描述的异二聚化办法,它也使用上文描述的节-入-穴技术。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366W且第二CH3域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366Y且第二CH3域包含氨基酸突变Y407T(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个实施方案中,抗体或它的Fc域是IgG₂亚类的且备选地使用WO2010/129304中描述的异二聚化办法。

在一个备选的实施方案中,促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰,例如如描述于PCT公开文本No.WO2009/089004。一般地,此方法牵涉将在两个Fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基用带电荷的氨基酸残基替换,从而同二聚体形成变成在静电上不利的但异二聚化变成在静电上有利的。在一个此类实施方案中,第一CH3域包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K392或N392的氨基酸替代(优选K392D或N392D)且第二CH3域包含带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R))对D399,E356,D356,或E357的氨基酸替代(优选D399K,E356K,D356K,或E357K,更加优选D399K和E356K)。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K409或R409的氨基酸替代,优选K409D或R409D。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步或择一地包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸替代(所有编号方式依照Kabat EU索引)。

在还有又一个实施方案中,备选地使用WO 2007/147901中描述的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变K253E,D282K,和K322D且第二CH3域包含氨基酸突变D239K,E240K,和K292D(编号方式依照Kabat EU索引)。

在仍有另一个实施方案中,可以备选地使用WO 2007/110205中描述的异二聚化办法。

在一个实施方案中,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代K392D和K409D,且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代D356K和D399K(编号方式依照Kabat EU索引)。

(ii)降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰

Fc域赋予抗体,诸如双特异性抗体以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而,同时它可能导致不想要的抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外,Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放,其与抗体可具有的其它免疫刺激特性和抗体的长半衰期组合,在系统性施用后引起细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。

因而,在特定的实施方案中,治疗剂中包含的抗体,特别是双特异性抗体的Fc域展现与天然IgG₁ Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中,Fc域(或包含所述Fc域的分子,例如抗体)展现与天然IgG₁ Fc域(或相应的包含天然IgG₁ Fc域的分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力,和/或与天然IgG₁ Fc域(或相应的包含天然IgG₁ Fc域的分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中,Fc域(或包含所述Fc域的分子,例如抗体)并不实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个特定的实施方案中,Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中,Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中,Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的实施方案中,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更加具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中,效应器功能是选自CDC,ADCC,ADCP,和细胞因子分泌的组的一项或多项。在一个特定的实施方案中,效应器功能是ADCC。在一个实施方案中,Fc域展现与天然IgG₁ Fc域相比实质性相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的分子,例如抗体)展现大于约70％,特别是大于约80％,更加特别是大于约90％的天然IgG₁ Fc域(或相应的包含天然IgG₁ Fc域的分子)对FcRn的结合亲和力时,实现实质性相似的对FcRn的结合。

在某些实施方案中,Fc域工程化改造成具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在特定的实施方案中,Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。典型地,Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中,氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中,氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍,至少5倍,或至少10倍。在有多于一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中,这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍,至少20倍,或甚至至少50倍。在一个实施方案中,包含工程化Fc域的分子,例如抗体展现与相应的包含非工程化Fc域的分子相比少于20％,特别是少于10％,更加特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个特定的实施方案中,Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中,Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中,Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的实施方案中,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更加特别是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最特别是人FcγRIIIa。优选地,对这些受体中每一种的结合是降低的。在一些实施方案中,对补体成分的结合亲和力,具体是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中,对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的分子,例如抗体)展现大于约70％的非工程化形式的Fc域(或相应的包含所述非工程化形式的Fc域的分子)对FcRn的结合亲和力时,实现实质性相似的对FcRn的结合,即保留Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的分子(例如抗体)可展现大于约80％和甚至大于约90％的此类亲和力。在某些实施方案中,Fc域工程化改造成具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下述一项或多项:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的靶物结合的抗体的交联,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。在一个实施方案中,降低的效应器功能是选自降低的CDC,降低的ADCC,降低的ADCP,和降低的细胞因子分泌的组的一项或多项。在一个特定的实施方案中,降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中,降低的ADCC是小于20％的由非工程化Fc域(或相应的包含非工程化Fc域的分子)诱导的ADCC。

在一个实施方案中,降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中,Fc域包含在选自E233,L234,L235,N297,P331和P329(编号方式依照Kabat EU索引)的组的位置处的氨基酸替代。在一个更加具体的实施方案中,Fc域包含在选自L234,L235和P329(编号方式依照Kabat EU索引)的组的位置处的氨基酸替代。在一些实施方案中,Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个此类实施方案中,Fc域是IgG₁ Fc域,特别是人IgG₁ Fc域。在一个实施方案中,Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加具体的实施方案中,氨基酸替代是P329A或P329G,特别是P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个实施方案中,Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和在选自E233,L234,L235,N297和P331(编号方式依照Kabat EU索引)的位置处的又一处氨基酸替代。在一个更加具体的实施方案中,又一处氨基酸替代是E233P,L234A,L235A,L235E,N297A,N297D或P331S。在特定的实施方案中,Fc域包含在位置P329,L234和L235处的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。在更加特定的实施方案中,Fc域包含氨基酸突变L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”)。在一个此类实施方案中,Fc域是IgG₁ Fc域,特别是人IgG₁Fc域。氨基酸替代组合“P329G LALA”几乎完全消除人IgG₁ Fc域的Fcγ受体(以及补体)结合,如描述于PCT公开文本no.WO 2012/130831,通过援引完整收入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。

IgG₄抗体展现与IgG₁抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此,在一些实施方案中,Fc域是IgG₄ Fc域,特别是人IgG₄ Fc域。在一个实施方案中,IgG₄ Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代S228P(编号方式依照KabatEU索引)。为了进一步降低它对Fc受体的结合亲和力和/或它的效应器功能,在一个实施方案中,IgG₄ Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代L235E(编号方式依照Kabat EU索引)。在另一个实施方案中,IgG₄ Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个特定的实施方案中,IgG₄ Fc域包含在位置S228,L235和P329处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代S228P,L235E和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。此类IgG₄ Fc域突变体和它们的Fcγ受体结合特性描述于PCT公开文本no.WO 2012/130831,通过援引完整收入本文。

在一个特定的实施方案中,展现与天然IgG₁ Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A,L235A和任选地P329G的人IgG₁ Fc域,或包含氨基酸替代S228P,L235E和任选地P329G的人IgG₄ Fc域(编号方式依照Kabat EU索引)。

在某些实施方案中,已经消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中,Fc域包含位置N297处的氨基酸突变,特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)或甘氨酸(N297G)替换天冬酰胺的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在上文和PCT公开文本no.WO 2012/130831中描述的Fc域以外,具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238,265,269,270,297,327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)(编号方式依照Kabat EU索引)。此类Fc突变体包括具有氨基酸位置265,269,270,297和327中两个或更多个处的替代的Fc突变体,包括所谓的“DANA”Fc突变体,其具有丙氨酸对残基265和297的替代(美国专利No.7,332,581)。

可以使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成，等等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。

可以容易地测定对Fc受体的结合,例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR),而且Fc受体诸如可以通过重组表达来获得。或者,可使用已知表达特定Fc受体的细胞系,诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估Fc域或包含Fc域的分子对Fc受体的结合亲和力。

可通过本领域已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的分子(例如抗体)的效应器功能。本文中描述了一种适合于测量ADCC的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子描述于美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.,Proc Natl Acad SciUSA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者,可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.,Mountain View,CA)；和CytoTox 非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的。

在一些实施方案中,Fc域对补体成分(具体是C1q)的结合是降低的。因而,在其中Fc域工程化成具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可进行C1q结合测定法来确定Fc域或包含Fc域的分子(例如抗体)是否能够结合C1q并因而具有CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化,可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J ImmunolMethods202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg andGlennie,Blood 103,2738-2743(2004))。

抗原结合模块

治疗剂中包含的抗体可以是双特异性的,即它包含能够特异性结合两种不同抗原决定簇的至少两种抗原结合模块。依照特定的实施方案,抗原结合模块是Fab分子(即由各自包含可变和恒定域的重和轻链构成的抗原结合域)。在一个实施方案中,所述Fab分子是人的。在另一个实施方案中,所述Fab分子是人源化的。在还有另一个实施方案中,所述Fab分子包含人重和轻链恒定域。

在一些实施方案中,抗原结合模块至少之一是交换Fab分子。此类修饰减少来自不同Fab分子的重和轻链的错误配对,由此改进重组生产中抗体的产量和纯度。在对于抗体有用的一种特定的交换Fab分子中,Fab轻链和Fab重链的可变域(分别是VL和VH)是交换的。然而,甚至在有这种域交换的情况下,由于错误配对的重和轻链之间所谓的Bence Jones型相互作用,抗体的制备物可包含某些副产物(参见Schaefer et al.,PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步减少来自不同Fab分子的重和轻链的错误配对和如此提高想要的抗体的纯度和产量,可以在特异性结合靶细胞抗原的Fab分子或特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子任一的CH1和CL域中的特定氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷氨基酸。在抗体中包含的常规Fab分子(诸如例如图1A-C,G-J中显示的)或在抗体中包含的VH/VL交换Fab分子(诸如例如图1D-F,K-N中显示的)任一中(但并不在二者中)进行电荷修饰。在特定的实施方案中,在抗体中包含的常规Fab分子(它在特定的实施方案中特异性结合靶细胞抗原)中进行电荷修饰。

在依照本发明的一个特定的实施方案中,抗体能够同时结合靶细胞抗原(特别是肿瘤细胞抗原)和活化性T细胞抗原(特别是CD3)。在一个实施方案中,抗体能够通过同时结合靶细胞抗原和活化性T细胞抗原来交联T细胞和靶细胞。在一个甚至更加特定的实施方案中,此类同时结合导致靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在一个实施方案中,此类同时结合导致T细胞的活化。在其它实施方案中,此类同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答,选自下组:增殖,分化,细胞因子分泌,细胞毒性效应分子释放,细胞毒性活性,和活化标志物的表达。在一个实施方案中,在没有同时结合靶细胞抗原的情况下抗体对活化性T细胞抗原,特别是CD3的结合不导致T细胞活化。

在一个实施方案中,抗体能够将T细胞的细胞毒性活性重定向于靶细胞。在一个特定的实施方案中,所述重定向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。

特别地,依照本发明的任何实施方案的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中,T细胞是CD4⁺或CD8⁺T细胞,特别是CD8⁺T细胞。

(i)活化性T细胞抗原结合模块

在一些实施方案中,治疗剂中包含的抗体,特别是双特异性抗体包含至少一个特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块,特别是Fab分子(在本文中也称作“活化性T细胞抗原结合模块,或活化性T细胞抗原结合Fab分子”)。在一个特定的实施方案中,抗体包含不多于一个能够特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块。在一个实施方案中,抗体提供对活化性T细胞抗原的单价结合。

在特定的实施方案中,特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL彼此替换/交换的Fab分子。在此类实施方案中,特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块优选是常规Fab分子。在抗体中包含多于一个特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块,特别是Fab分子的实施方案中,特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块优选是交换Fab分子且特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。

在备选实施方案中,特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。在此类实施方案中,特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL彼此替换/交换的Fab分子。

在一个实施方案中,活化性T细胞抗原选自由CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127组成的组。

在一个特定的实施方案中,活化性T细胞抗原是CD3,特别是人CD3(SEQ ID NO:91)或食蟹猴CD3(SEQ ID NO:92),最特别是人CD3。在一个特定的实施方案中,活化性T细胞抗原结合模块对于人和食蟹猴CD3是交叉反应性的(即特异性结合)。在一些实施方案中,活化性T细胞抗原是CD3的ε亚基(CD3ε)。

在一些实施方案中,活化性T细胞抗原结合模块特异性结合CD3,特别是CD3ε,且包含至少一种选自由SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一种选自由SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17组成的组的轻链CDR。

在一个实施方案中,CD3结合抗原结合模块,特别是Fab分子包含包含SEQ ID NO:12的重链CDR1,SEQ ID NO:13的重链CDR2,和SEQ ID NO:14的重链CDR3的重链可变区,和包含SEQ ID NO:15的轻链CDR1,SEQ ID NO:16的轻链CDR2,和SEQ ID NO:17的轻链CDR3的轻链可变区。

在一个实施方案中,CD3结合抗原结合模块,特别是Fab分子包含与SEQ ID NO:18至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:19至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的轻链可变区序列。

在一个实施方案中,CD3结合抗原结合模块,特别是Fab分子包含包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个实施方案中,CD3结合抗原结合模块,特别是Fab分子包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

(ii)靶细胞抗原结合模块

在一些实施方案中,治疗剂中包含的抗体,特别是双特异性抗体包含至少一个特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块,特别是Fab分子。在某些实施方案中,抗体包含两个特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块,特别是Fab分子。在一个特定的此类实施方案中,这些抗原结合模块中的每一个特异性结合相同抗原决定簇。在一个甚至更加特定的实施方案中,这些抗原结合模块都是同一的,即它们包含相同的氨基酸序列,包括相同的如本文中描述的CH1和CL域中的氨基酸替代(如果有的话)。在一个实施方案中,抗体包含特异性结合靶细胞抗原的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中,抗体包含不多于两个特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块,特别是Fab分子。

在特定的实施方案中,特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。在此类实施方案中,特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL彼此替换/交换的Fab分子。

在备选实施方案中,特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL彼此替换/交换的Fab分子。在此类实施方案中,特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。

靶细胞抗原结合模块能够将抗体引导至靶部位,例如表达靶细胞抗原的特定类型的肿瘤细胞。

在一个实施方案中,靶细胞抗原是B细胞抗原,特别是恶性B细胞抗原。在一个实施方案中,靶细胞抗原是细胞表面抗原。在一个实施方案中,靶细胞抗原选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组。

在一个实施方案中,靶细胞抗原是CD20,特别是人CD20。

在一个实施方案中,特异性结合CD20的抗原结合模块,特别是Fab分子包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链互补决定区(CDR)1,SEQ ID NO:5的重链CDR2,和SEQ ID NO:6的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR1,SEQ ID NO:8的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:9的轻链CDR 3。在又一个实施方案中,特异性结合CD20的抗原结合模块,特别是Fab分子包含与SEQ ID NO:10的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:11的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区。在仍有又一个实施方案中,特异性结合CD20的抗原结合模块,特别是Fab分子包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

在一个实施方案中,靶细胞抗原是CD19,特别是人CD19。

在一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:24的重链互补决定区(CDR)1,SEQ ID NO:25的重链CDR2,和SEQ ID NO:26的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的轻链CDR 1,SEQ ID NO:28的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:29的轻链CDR 3。在又一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含与SEQ ID NO:30的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:31的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区。在仍有又一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含SEQ ID NO:30的重链可变区序列和SEQ ID NO:31的轻链可变区序列。

在另一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:35的重链互补决定区(CDR)1,SEQ ID NO:36的重链CDR 2,和SEQ ID NO:37的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:38的轻链CDR 1,SEQ ID NO:39的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:40的轻链CDR 3。在又一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含与SEQ ID NO:41的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:42的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区。在仍有又一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含SEQ ID NO:41的重链可变区序列和SEQ ID NO:42的轻链可变区序列。

在另一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含

(i)重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:43的重链互补决定区(CDR)1,SEQID NO:44的重链CDR 2,和SEQ ID NO:45的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:46的轻链CDR 1,SEQ ID NO:47的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:48的轻链CDR 3；

(ii)重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:51的重链互补决定区(CDR)1,SEQID NO:52的重链CDR 2,和SEQ ID NO:53的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:54的轻链CDR 1,SEQ ID NO:55的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:56的轻链CDR 3；

(iii)重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:59的重链互补决定区(CDR)1,SEQ ID NO:60的重链CDR 2,和SEQ ID NO:61的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:62的轻链CDR 1,SEQ ID NO:63的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:64的轻链CDR 3；

(iv)重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:67的重链互补决定区(CDR)1,SEQID NO:68的重链CDR 2,和SEQ ID NO:69的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:70的轻链CDR 1,SEQ ID NO:71的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:72的轻链CDR 3；

(v)重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:75的重链互补决定区(CDR)1,SEQID NO:76的重链CDR 2,和SEQ ID NO:77的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:78的轻链CDR 1,SEQ ID NO:79的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:80的轻链CDR 3；或

(vi)重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(CDR)1,SEQID NO:84的重链CDR 2,和SEQ ID NO:85的重链CDR 3,和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:86的轻链CDR 1,SEQ ID NO:87的轻链CDR 2，和SEQ ID NO:88的轻链CDR 3。

在又一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含

(i)与SEQ ID NO:49的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:50的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区；

(ii)与SEQ ID NO:57的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:58的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区；

(iii)与SEQ ID NO:65的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:66的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区；

(iv)与SEQ ID NO:73的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:74的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区；

(v)与SEQ ID NO:81的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:82的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区；或

(vi)与SEQ ID NO:89的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区和与SEQ ID NO:90的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区。

在仍有又一个实施方案中,特异性结合CD19的抗原结合模块,特别是Fab分子包含

(i)SEQ ID NO:49的重链可变区序列和SEQ ID NO:50的轻链可变区序列；

(ii)SEQ ID NO:57的重链可变区序列和SEQ ID NO:58的轻链可变区序列；

(iii)SEQ ID NO:65的重链可变区序列和SEQ ID NO:66的轻链可变区序列；

(iv)SEQ ID NO:73的重链可变区序列和SEQ ID NO:74的轻链可变区序列；

(v)SEQ ID NO:81的重链可变区序列和SEQ ID NO:82的轻链可变区序列；或

(vi)SEQ ID NO:89的重链可变区序列和SEQ ID NO:90的轻链可变区序列。

电荷修饰

治疗剂中包含的抗体,特别是多特异性抗体可以在其中包含的Fab分子中包含特别有效地减少轻链与非匹配重链的错误配对(Bence-Jones型副产物)的氨基酸替代,在它们的一个(或多个,在分子包含多于两个抗原结合Fab分子的情况中)结合臂中具有VH/VL交换的基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的生产中可发生所述错误配对(还参见PCT公开文本no.WO 2015/150447,特别是其中的实施例,通过援引完整收入本文)。

因而,在特定的实施方案中,治疗剂中包含的抗体包含

(a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子,

(b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的,

其中第一抗原是活化性T细胞抗原且第二抗原是靶细胞抗原,或第一抗原是靶细胞抗原且第二抗原是活化性T细胞抗原；且

其中

i)在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat),且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用带负电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)；或

ii)在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat),且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用带负电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

抗体并不同时包含i)和ii)下提到的修饰。第二Fab分子的恒定域CL和CH1并不彼此替换(即保持不交换)。

在抗体的一个实施方案中,在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中,用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个实施方案中,在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个特定的实施方案中,在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中,用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中,用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个更加特定的实施方案中,在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat),且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在一个甚至更加特定的实施方案中,在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat),且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在特定的实施方案中,a)下的第一Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。

或者,依照上述实施方案的氨基酸替代可以在b)下的第二Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行,代替在a)下的第一Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行。在特定的此类实施方案中,b)下的第二Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。

抗体可以进一步包含特异性结合第一抗原的第三Fab分子。在特定的实施方案中,所述第三Fab分子与a)下的第一Fab分子相同。在这些实施方案中,依照上述实施方案的氨基酸替代会在第一Fab分子和第三Fab分子中每一个的恒定域CL和恒定域CH1中进行。或者,依照上述实施方案的氨基酸替代可以在b)下的第二Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行,但是不在第一Fab分子和第三Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行。

在特定的实施方案中,抗体进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。

治疗方案

依照本发明,II型抗CD20抗体和治疗剂可以以各种方式施用(例如就施用路径,剂量和/或时机而言),只要II型抗CD20抗体在治疗剂之前施用且到施用治疗剂的时候II型抗CD20抗体的施用在所治疗的受试者中有效诱导B细胞数目减少。

不希望受理论束缚,在施用治疗剂之前受试者中的B细胞数目减少会降低或阻止与治疗剂的施用相关的细胞因子释放，而且会如此降低或阻止受试者中与治疗剂的施用相关的不良事件(诸如IRR)。

在一个实施方案中,与相应的不施用II型抗CD20抗体的治疗方案相比,治疗方案有效降低受试者中与治疗剂的施用相关的细胞因子释放。在一个实施方案中,与相应的不施用II型抗CD20抗体的治疗方案相比,细胞因子释放降低至少2倍,至少3倍,至少4倍,至少5倍,至少10倍,至少20倍,至少50倍,或至少100倍。在一个实施方案中,细胞因子释放本质上受到阻止。在一个实施方案中,细胞因子释放的降低或阻止在施用治疗剂后1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23或24小时。在一个实施方案中,细胞因子释放的降低或阻止在施用治疗剂后头24小时内。

在一个实施方案中,施用治疗剂后受试者中的细胞因子浓度(如例如在取自受试者的血液样品中测量的)没有超出施用治疗剂前受试者中的细胞因子浓度。在一个实施方案中,施用治疗剂后受试者中的细胞因子浓度超出施用治疗剂前受试者中的细胞因子浓度没有多于1.1倍,多于1.2倍,多于1.5倍,多于2倍,多于3倍,多于4倍,多于5倍,多于10倍,多于20倍,多于50倍或多于100倍。在一个实施方案中,与施用治疗剂前受试者中的细胞因子浓度相比,施用治疗剂后受试者中的细胞因子浓度升高少于1.1倍,少于1.2倍,少于1.5倍,少于2倍,少于3倍,少于4倍,少于5倍,少于10倍,少于20倍,少于50倍或少于100倍。在一个实施方案中,施用治疗剂后受试者中的细胞因子浓度是施用治疗剂后1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23或24小时时的细胞因子浓度。在一个实施方案中,施用治疗剂后受试者中的细胞因子浓度是施用治疗剂后头24小时内的细胞因子浓度。

在一个实施方案中,施用治疗剂后,特别是施用治疗剂后1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23或24小时,本质上检测不到受试者中细胞因子浓度的升高。

细胞因子可以通过本领域已知方法来检测,诸如例如ELISA,FACS或测定法。

细胞因子可以例如在取自受试者的血液样品中检测。在一个实施方案中,细胞因子浓度是受试者的血液。

在一些实施方案中,细胞因子是选自由肿瘤坏死因子阿尔法(TNF-α),干扰素伽马(IFN-γ),白介素-6(IL-6),白介素-10(IL-10),白介素-2(IL-2)和白介素-8(IL-8)组成的组,特别是由TNF-α,IFN-γ和IL-6组成的组的一种或多种细胞因子。在一些实施方案中,细胞因子是TNF-α。在一些实施方案中,细胞因子是IFN-γ。在一些实施方案中,细胞因子是IL-6。在一些实施方案中,细胞因子是IL-10。在一些实施方案中,细胞因子是IL-2。在一些实施方案中,细胞因子是IL-8。

在一些实施方案中,与相应的不施用II型抗CD20抗体的治疗方案相比,治疗方案提高治疗剂的安全性。在一些实施方案中,与相应的不施用II型抗CD20抗体的治疗方案相比,治疗方案降低受试者中的不良事件。在一些实施方案中,与相应的不施用II型抗CD20抗体的治疗方案相比,治疗方案提供治疗剂的功效。在一些实施方案中,与相应的不施用II型抗CD20抗体的治疗方案相比,治疗方案延长治疗剂的血清半衰期。在一些实施方案中,与相应的不施用II型抗CD20抗体的治疗方案相比,治疗方案降低治疗剂的毒性。

依照本发明,II型抗CD20抗体的施用和治疗剂的施用之间的时间段足以响应II型抗CD20抗体的施用而降低受试者中的B细胞的数目。

在一个实施方案中,时间段是3天至21天,5天至20天,7天至21天,7天至14天,5天至15天,7天至15天,8天至15天,10天至20天,10天至15天,11天至14天,或12天至13天。在一个实施方案中,时间段是7天至14天。在一个实施方案中,时间段是5天至10天。在一个特定的实施方案中,时间段是7天。

在一个实施方案中,时间段是约3天,约4天,约5天,约6天,约7天,约8天,约9天,约10天,约11天,约12天,约13天,约14天,约15天,约16天,约17天,约18天,约19天,约20天,约21天,约22天,约23天,约24天,约25天,约26天,约27天,约28天,约29天,或约30天。

在一个实施方案中,时间段是至少3天,至少4天,至少5天,至少6天,至少7天,至少8天,至少9天,至少10天,至少11天,至少12天,至少13天,至少14天,或至少15天。在一个特定的实施方案中,时间段是至少5天。在又一个特定的实施方案中,时间段是至少7天。

在一个实施方案中,时间段介于II型抗CD20抗体的最后一次施用和治疗剂的(第一次,如果数次的话)施用之间。在一个实施方案中,在时间段期间不进行治疗剂的施用。

在一个特定的实施方案中,B细胞数目减少在受试者的血液中。在一个实施方案中,B细胞是外周血B细胞。在一个实施方案中,B细胞是恶性和正常B细胞。在一个实施方案中,B细胞是恶性B细胞。

在一些实施方案中,B细胞减少在受试者的组织中。在一个实施方案中,组织是肿瘤。在一个实施方案中,组织是淋巴结。在一个实施方案中,组织是脾。在一个实施方案中,组织是脾的边缘区。在一个实施方案中,B细胞是淋巴结B细胞。在一个实施方案中,B细胞是脾B细胞。在一个实施方案中,B细胞是脾边缘区B细胞。在一个实施方案中,B细胞是CD20阳性B细胞,即在它们的表面上表达CD20的B细胞。

在一个实施方案中,B细胞数目减少是减少至少约10％,至少约15％,至少约20％,至少约25％,至少约30％,至少约35％,至少约40％,至少约45％,至少约50％,至少约55％,至少约60％,至少约65％,至少约70％,至少约75％,至少约80％,至少约85％,至少约90％,或至少约95％。在一个实施方案中,B细胞数目减少是B细胞完全消除。在一个特定的实施方案中,B细胞数目减少是受试者的(外周)血液中的B细胞数目减少至少90％,特别是至少95％。在一个实施方案中,B细胞数目减少是与在将II型抗CD20抗体(第一次,如果数次的话)施用于受试者之前受试者中的B细胞数目相比减少。

受试者中的B细胞数目可以通过本领域知道的适合于量化患者血液或组织中的B细胞的任何方法来测定,诸如流式细胞术,免疫组织化学或免疫荧光方法,使用针对B细胞标志物诸如CD20,CD19,和/或PAX5的抗体。

B细胞数目也可以间接测定,通过量化患者血液或组织中B细胞标志物的蛋白质或mRNA水平。本领域知道的适合于测定特定蛋白质水平的方法包括免疫测定方法,诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA),或Western印迹,用于测定mRNA水平的方法包括例如定量RT-PCR或微阵列技术。

所有上述方法和技术是本领域公知的且可以自标准教科书推导,诸如Lottspeich,Bioanalytik,Spektrum Akademisher Verlag,1998或Sambrook andRussell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,U.S.A.,2001。

在某些实施方案中,B细胞数目减少是通过量化受试者的血液中(例如取自受试者的血液样品中)的B细胞测定的。在一个此类实施方案中,B细胞是通过流式细胞术分析量化的。流式细胞术方法(FACS)是本领域公知的,用于量化血液或组织样品中的细胞。特别是,它们容许测定血液或组织样品(例如血液样品,或(部分)组织活检)中限定总数的细胞中表达特定抗原(例如CD20和/或CD19)的细胞的数目。在一个实施方案中,B细胞是使用抗CD19抗体和/或抗CD20抗体通过流式细胞术分析量化的。

在其它实施方案中,B细胞数目减少是通过量化所述个体的组织,例如肿瘤中(例如取自受试者的组织活检中)的B细胞测定的。在一个此类实施方案中,B细胞是通过免疫组织化学或免疫荧光分析量化的。在一个实施方案中,B细胞是使用抗CD19抗体,抗CD20抗体和/或抗PAX5抗体通过免疫组织化学分析量化的。

本发明的方法可应用于多种疾病的治疗,取决于所使用的治疗剂。然而,该方法在治疗B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症中特别有用,其中(CD20阳性)B细胞大量(即与健康受试者相比,罹患病症的受试者中存在数目增多的B细胞)存在。如此,在一个实施方案中,疾病是B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症。

在一个实施方案中,疾病选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM)或霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组。在一个实施方案中,疾病选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL)和边缘区淋巴瘤(MZL)组成的组。

在一个特定的实施方案中,疾病是NHL,特别是复发性/顽固性(r/r)NHL。在一个实施方案中,疾病是DLBCL。在一个实施方案中,疾病是FL。在一个实施方案中,疾病是MCL。在一个实施方案中,疾病是MZL。

技术人员容易认识到在许多情况中治疗剂可能不提供治愈但可能只提供部分益处。在一些实施方案中,具有一些益处的生理变化也认为是治疗上有益的。如此,在一些实施方案中,提供生理变化的治疗剂的量认为是“有效量”或“治疗有效量”。

需要治疗的受试者,患者,或个体典型地是哺乳动物,更加具体地是人。

在某些实施方案中,受试者是人。在一个实施方案中,受试者罹患B细胞增殖性病症,特别是非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM)或霍奇金淋巴瘤(HL)。

在一个实施方案中,受试者罹患复发性/顽固性(r/r)NHL。

II型抗CD20抗体的施用

依照本发明,选择II型抗CD20抗体的施用和治疗剂的施用之间的时间段和II型抗CD20抗体的剂量,诸如有效降低施用治疗剂前受试者中的B细胞的数目的。

可以通过任何合适手段来施用II型抗CD20抗体，包括胃肠外,肺内,和鼻内,和若期望用于局部治疗的话,损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以是通过任何合适路径，例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射。本文中涵盖各种剂量给药日程表,包括但不限于单次施用或在多个时间点上的多次施用,推注施用,和脉冲输注。在一个实施方案中,胃肠外,特别是静脉内,例如通过静脉内输注来施用II型抗CD20抗体。

II型抗CD20抗体会以与优秀医学实践一致的方式配制,定剂量，和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂投递部位,施用方法,施用日程表，和医学从业人员知道的其它因素。

在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的施用是单次施用。在另一个实施方案中,II型抗CD20抗体的施用是两次或更多次分开施用。在一个实施方案中,两次或更多次分开施用是在连续两天或更多天上。在一个实施方案中,在施用治疗剂之前或之后没有对受试者进行别的II型抗CD20抗体的施用。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的施用是单次施用,或连续两天上的两次施用,且没有进行别的II型抗CD20抗体的施用。在一个实施方案中,时间段是II型抗CD20抗体的最后一次施用和治疗剂的(第一次,如果数次的话)施用之间的。

在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的施用是有效减少受试者中的B细胞的II型抗CD20抗体的剂量。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的剂量在II型抗CD20抗体的施用和治疗剂的施用之间的时间段内有效减少受试者中的B细胞的数目。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的施用和治疗剂的施用之间的时间段和所施用的II型抗CD20抗体的剂量足以响应II型抗CD20抗体的施用而减少受试者中的B细胞的数目。

在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的施用是约2g II型抗CD20抗体的剂量。约2gII型抗CD20抗体的剂量可以作为约2g的单次施用,或作为数次施用,例如每次约1g的两次施用或例如100mg,900mg和1000mg的三次施用施用于受试者。在一个实施方案中,对受试者进行约2g II型抗CD20抗体的一次施用。在另一个实施方案中,在连续两天上对受试者进行每次约1g II型抗CD20抗体的两次施用。在仍有另一个实施方案中,在连续三天上对受试者进行(i)约100mg II型抗CD20抗体,(ii)约900mg II型抗CD20抗体,和(iii)约1000mg II型抗CD20抗体的三次施用((i)至(iii))。在一个实施方案中,在施用治疗剂前10天至15天的连续两天上对受试者进行约1g II型抗CD20抗体的两次施用。在一个实施方案中,在施用治疗剂前10天至15天对受试者进行约2g II型抗CD20抗体的一次施用。在一个实施方案中,没有对受试者进行别的II型抗CD20抗体的施用。在一个实施方案中,在II型抗CD20抗体的施用之前(至少在同一治疗过程内)没有对受试者进行治疗剂的施用。

在一个实施方案中,II型抗CD20抗体的施用是约1000mg II型抗CD20抗体的剂量。约1000mg II型抗CD20抗体的剂量可以作为约1000mg的单次施用,或数次施用,例如每次约500mg的两次施用施用于受试者。在一个特定的实施方案中,对受试者进行约1000mg II型抗CD20抗体的一次施用。在另一个实施方案中,在连续两天上对受试者进行每次约500mgII型抗CD20抗体的两次施用。在一个实施方案中,在施用治疗剂前7天对受试者进行约1000mg II型抗CD20抗体的一次施用。在一个实施方案中,没有对受试者进行别的II型抗CD20抗体的施用。在一个实施方案中,在II型抗CD20抗体的施用之前(至少在同一治疗过程内)没有对受试者进行治疗剂的施用。

在一个实施方案中,治疗方案进一步包含在施用II型抗CD20抗体之前施用预药疗。在一个实施方案中,预药疗包含皮质类固醇(诸如例如泼尼松龙,地塞米松,或甲泼尼龙),扑热息痛/醋氨酚,和/或抗组胺药(诸如例如苯海拉明)。在一个实施方案中,在施用II型抗CD20抗体之前至少60分钟施用预药疗。

在一个实施方案中,治疗方案不包含在施用治疗剂之前施用除了II型抗CD20抗体(和任选地上文描述的预药疗)以外的免疫阻抑剂。在一个实施方案中,治疗方案不包含在施用治疗剂之前施用选自甲氨蝶呤,硫唑嘌呤,6-巯基嘌呤,来氟米特,环孢霉素,他克莫司/FK506,霉酚酸吗乙酯和霉酚酸钠的组的药剂。在一个实施方案中,治疗方案不包含在施用治疗剂之前施用除了II型抗CD20抗体以外的别的抗体。

治疗剂的施用

可以通过任何合适手段来施用治疗剂，包括胃肠外,肺内,和鼻内,和若期望用于局部治疗的话,损伤内施用。然而,本发明的方法在涉及通过胃肠外,特别是静脉内输注施用的治疗剂时特别有用。胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以通过任何合适路径，例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射。本文中涵盖各种剂量给药日程表,包括但不限于单次施用或在多个时间点上的多次施用,推注施用,和脉冲输注。在一个实施方案中,胃肠外,特别是静脉内施用治疗剂。在一个特定的实施方案中,通过静脉内输注来施用治疗剂。

治疗剂会以与优秀的医学实践一致的方式配制,定剂量，和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂投递部位,施用方法,施用日程表，和医学从业人员知道的其它因素。治疗剂无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的治疗剂的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。这些一般以与本文所述相同的剂量和施用途径使用,或以约1-99％的本文中描述的剂量使用,或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。

对于预防或治疗疾病,治疗剂(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型,治疗剂的类型,疾病的严重性和过程,施用治疗剂是出于预防还是治疗目的,先前的疗法,患者的临床史和对治疗剂的响应,和主治医师的斟酌。合适地，治疗剂在一次或一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的治疗剂可以是施用于受试者的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开的施用,或者是通过连续输注。取决于上文提到的因素,一种典型的日剂量可以范围是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间上的重复施用,取决于状况,治疗一般会持续直至疾病症状发生期望的阻抑。治疗剂的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此,可以将一剂或多剂约0.5mg/kg,2.0mg/kg,4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)施用于受试者。此类剂量可间歇施用,例如每周,每两周,或每三周(例如使得受试者接受约2至约20剂,或例如约6剂治疗剂)。可以施用较高的初始加载剂,继以较低的一或多剂,或者较低的初始剂,继以较高的一或多剂。一种例示性剂量给药方案包含施用约10mg的初始剂量,继以约20mg治疗剂的每两周剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。此疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。

在一个实施方案中,治疗剂的施用是单次施用。在某些实施方案中,治疗剂的施用是两次或更多次施用。在一个此类实施方案中,每周,每两周,或每三周,特别是每两周施用治疗剂。在一个实施方案中,以治疗有效量施用治疗剂。在一个实施方案中,以约50μg/kg,约100μg/kg,约200μg/kg,约300μg/kg,约400μg/kg,约500μg/kg,约600μg/kg,约700μg/kg,约800μg/kg,约900μg/kg或约1000μg/kg的剂量施用治疗剂。在一个实施方案中,以比相应的不施用II型抗CD20抗体的治疗方案中治疗剂的剂量要高的剂量施用治疗剂。在一个实施方案中,治疗剂的施用包含治疗剂的第一剂量的初始施用,和治疗剂的第二剂量的一次或多次后续施用,其中第二剂量比第一剂量要高。在一个实施方案中,治疗剂的施用包含治疗剂的第一剂量的初始施用,和治疗剂的第二剂量的一次或多次后续施用,其中第一剂量并不比第二剂量要低。

在一个实施方案中,依照本发明的治疗方案中治疗剂的施用是该治疗剂第一次施用于受试者(至少在同一治疗过程内)。在一个实施方案中,在施用II型抗CD20抗体之前没有对受试者进行治疗剂的施用。

在本发明中,治疗剂可以在疗法中单独或与其它药剂组合使用。例如,治疗剂可以与至少一种另外的治疗剂共施用。在某些实施方案中,另外的治疗剂是免疫治疗剂。

上文记载的此类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一配制剂或分开的配制剂中包括两种或更多种治疗剂)和分开施用(在该情况中,治疗剂的施用可以在一种或多种另外的治疗剂的施用之前,同时,和/或之后发生)。在一个实施方案中,治疗剂的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约一个月内,或在约1,2或3周内,或在约1,2,3,4,5,或6天内发生。

制品

在本发明的另一个方面,,提供含有对于治疗,预防和/或诊断病症,或如本文中描述的降低细胞因子释放有用的材料的制品,例如试剂盒。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋，等。容器可以自各种材料，诸如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物,其自身或与其它组合物组合有效治疗,预防和/或诊断状况,或容纳有效降低细胞因子释放的组合物,而且可以具有无菌存取口(例如,容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文中描述的II型抗CD20抗体或治疗剂。标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的状况和/或降低细胞因子释放。此外,制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器,其中该组合物包含如本文中描述的II型抗CD20抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器,其中该组合物包含如本文中描述的治疗剂。本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包含包装插页,指示组合物可用于治疗特定的状况和/或降低细胞因子释放。或者/另外,制品可以进一步包含第二(或第三)容器,包含药学可接受缓冲剂,诸如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针,和注射器。

术语“PD-L1结合拮抗剂”指如下分子,其降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1,B7-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1对它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂包括降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1,B7-1)相互作用的信号转导的抗PD-L1抗体,其抗原结合片段,免疫粘附素,融合蛋白,寡肽和其它分子。在一个实施方案中,PD-L1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L1介导信号传导),从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中,抗体是人源化抗体,嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中,抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,抗原结合片段选自由Fab,Fab’,F(ab’)2,和Fv组成的组。在一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文中描述的YW243.55.S70。在另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文中描述的MDX-1105。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文中描述的MPDL3280A(阿特珠单抗(atezolizumab))。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文中描述的MDX-1105。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文中描述的YW243.55.S70。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文中描述的MEDI4736(度伐单抗(durvalumab))。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文中描述的MSB0010718C(阿维单抗(avelumab))。

在一些实施方案中,PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对它的配体结合配偶的结合。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L1的结合。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L2的结合。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L1和PD-L2二者的结合。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂选自由MDX 1106(纳武单抗(nivolumab)),MK-3475(派姆单抗(pembrolizumab)),CT-011(匹迪单抗(pidilizumab)),MEDI-0680(AMP-514),PDR001,REGN2810,和BGB-108组成的组。

在一些实施方案中,PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1的结合。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对B7-1的结合。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1和B7-1二者的结合。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂选自由MPDL3280A(阿特珠单抗(atezolizumab)),YW243.55.S70,MDX-1105,MEDI4736(度伐单抗(durvalumab)),和MSB0010718C(阿维单抗(avelumab))组成的组。在特定的实施方案中,抗PD-L1抗体是MPDL3280A(阿特珠单抗)。在一些实施方案中,以约800mg至约1500mg每三周(例如约1000mg至约1300mg每三周,例如约1100mg至约1200mg每三周)的剂量施用MPDL3280A。在一些实施方案中,以约1200mg每三周的剂量施用MPDL3280A。在一些实施方案中,抗PD-L1抗体包含重链和/或轻链,重链包含SEQ ID NO:107的HVR-H1序列,SEQ IDNO:108的HVR-H2序列,和SEQ ID NO:109的HVR-H3序列,轻链包含SEQ ID NO:110的HVR-L1序列,SEQ ID NO:111的HVR-L2序列,和SEQ ID NO:112的HVR-L3序列。在一些实施方案中,抗PD-L1抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,重链可变区包含SEQ ID NO:113或114的氨基酸序列,轻链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区,重链可变区包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列,轻链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中,抗PD-L1抗体包含WO 2010/077634和美国专利No.8,217,149(其通过援引收入本文)中描述的抗体YW243.55.S70的三种重链HVR序列和/或抗体YW243.55.S70的三种轻链HVR序列。在一些实施方案中,抗PD-L1抗体包含抗体YW243.55.S70的重链可变区序列和/或抗体YW243.55.S70的轻链可变区序列。

在一些实施方案中,PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方案中,PD-L2结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中,PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。

在一些实施方案中,PD-1轴结合拮抗剂是抗体(例如抗PD-1抗体,抗PD-L1抗体,或抗PD-L2抗体)且包含无糖基化位点突变。在一些实施方案中,无糖基化位点突变是替代突变。在一些实施方案中,替代突变在氨基酸残基N297,L234,L235,和/或D265(EU编号方式)处。在一些实施方案中,替代突变选自由N297G,N297A,L234A,L235A,和D265A组成的组。在一些实施方案中,替代突变是D265A突变和N297G突变。在一些实施方案中,无糖基化位点突变降低抗体的效应器功能。在一些实施方案中,PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体,抗PD-L1抗体,或抗PD-L2抗体)是具有依照EU编号方式的第297位处的Asn至Ala替代的人IgG₁。

术语“PD-L2结合拮抗剂”指如下分子,其降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中,PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2对一种或多种它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2对PD-1的结合。在一些实施方案中,PD-L2拮抗剂包括降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导的抗PD-L2抗体,其抗原结合片段,免疫粘附素,融合蛋白,寡肽和其它分子。在一个实施方案中,PD-L2结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L2介导信号传导),从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中,PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。

本发明的别的方面

在本发明的又一个实施方案中,组合治疗包括抗CD20抗体的至少第一施用和抗CD20/抗CD3双特异性抗体的至少第二施用,其中该至少第一施用和该至少第二施用之间的时间段不足以响应该II型抗CD20抗体的施用而降低个体中的B细胞的数目。

在又一个实施方案中,组合治疗可包含施用免疫粘附素,优选包含融合至恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素,更优选抗PD-L1抗体。在一个实施方案中,抗PD-L1抗体选自由YW243.55.S70,MPDL3280A,MDX-1105,和MEDI4736组成的组。抗体YW243.55.S70是WO 2010/077634中描述的一种抗PD-L1抗体。MDX-1105,也称作BMS-936559,是WO 2007/005874中描述的一种抗PD-L1抗体。MEDI4736是WO 2011/066389和US 2013/034559中描述的一种抗PD-L1单克隆抗体。在一个实施方案中,抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。

实施方案

下面列出了本发明的一些实施方案。

1.一种在受试者中治疗疾病的方法,该方法包含治疗方案，该治疗方案包含:

(i)对该受试者施用II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

其中该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂的施用之间的时间段足以响应该抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

2.实施方案1的方法,其中与相应的不施用该II型抗CD20抗体的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该治疗剂的施用相关的细胞因子释放。

3.一种用于在受试者中降低与治疗剂的施用相关的细胞因子释放的方法,该方法包含在施用该治疗剂之前将II型抗CD20抗体施用于该受试者。

4.实施方案3的方法,其中该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂的施用之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

5.前述实施方案任一项的方法,其中该II型抗CD20抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

6.前述实施方案任一项的方法,其中该II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

7.前述实施方案任一项的方法,其中该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG₁抗体。

8.前述实施方案任一项的方法,其中该II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。

9.前述实施方案任一项的方法,其中该II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

10.前述实施方案任一项的方法,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

11.前述实施方案任一项的方法,其中该治疗剂包含抗体,特别是多特异性抗体。

12.实施方案11的方法,其中该抗体特异性结合活化性T细胞抗原,特别是选自由CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127组成的组的抗原,更加特别是CD3,最特别是CD3ε。

13.实施方案11或12的方法,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQ IDNO:17的LCDR3。

14.实施方案11至13任一项的方法,其中该抗体包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

15.实施方案11至14任一项的方法,其中该抗体特异性结合B细胞抗原,特别是选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,更加特别是CD20或CD19,最特别是CD20。

16.实施方案15的方法,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ IDNO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

17.实施方案15或16的方法,其中该抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

18.前述实施方案任一项的方法,其中该抗体是双特异性抗体,该双特异性抗体包含(i)如实施方案12至14任一项中定义的抗体和(ii)如实施方案15至17任一项中定义的抗体。

19.前述实施方案任一项的方法,其中该治疗剂包含CD20XCD3 bsAB。

20.实施方案1至10任一项的方法,其中该治疗剂包含表达嵌合抗原受体(CAR),特别是特异性结合B细胞抗原的CAR,更加特别是特异性结合选自CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5的组的抗原的CAR的T细胞。

21.前述实施方案任一项的方法,其中该疾病是B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症,和/或是选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组的疾病。

22.供在受试者中治疗疾病的方法中使用的II型抗CD20抗体,该方法包含包括下述的治疗方案:

(i)对该受试者施用该II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

23.实施方案22的II型抗CD20抗体,其中与相应的不施用该II型抗CD20抗体的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该治疗剂的施用相关的细胞因子释放。

24.供用于在受试者中降低与治疗剂的施用相关的细胞因子释放的方法中使用的II型抗CD20抗体,该方法包含在施用该治疗剂之前将该II型抗CD20抗体施用于该受试者。

25.实施方案24的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂的施用之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

26.实施方案22至25任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

27.实施方案22至26任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体包含SEQID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

28.实施方案22至27任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG₁抗体。

29.实施方案22至28任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。

30.实施方案22至29任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

31.实施方案22至30任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

32.实施方案22至31任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂包含抗体,特别是多特异性抗体。

33.实施方案32的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体特异性结合活化性T细胞抗原,特别是选自由CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127组成的组的抗原,更加特别是CD3,最特别是CD3ε。

34.实施方案32或33的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQID NO:14的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQID NO:16的LCDR2，和SEQ ID NO:17的LCDR3。

35.实施方案32至34任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

36.实施方案32至35任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体特异性结合B细胞抗原,特别是选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,更加特别是CD20或CD19,最特别是CD20。

37.实施方案36的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

38.实施方案36或37的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体包含SEQ IDNO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

39.实施方案22至38任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体是双特异性抗体,该双特异性抗体包含(i)如实施方案33至35任一项中定义的抗体和(ii)如实施方案36至38任一项中定义的抗体。

40.实施方案22至39任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂包含CD20XCD3bsAB。

41.实施方案22至31任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂包含表达嵌合抗原受体(CAR),特别是特异性结合B细胞抗原的CAR,更加特别是特异性结合选自CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5的组的抗原的CAR的T细胞。

42.实施方案22至41任一项的II型抗CD20抗体,其中该疾病是B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症,和/或是选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组的疾病。

43.II型抗CD20抗体在制造用于在受试者中降低与T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放的药物中的用途,其中该药物要用于包含下述的治疗方案:

(i)对该受试者施用该II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

44.T细胞活化性治疗剂在制造用于在受试者中治疗疾病的药物中的用途,其中该治疗包含治疗方案，该治疗方案包含:

(i)对该受试者施用II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用该T细胞活化性治疗剂,

45.实施方案43或44的用途,其中与相应的不施用该II型抗CD20抗体的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该治疗剂的施用相关的细胞因子释放。

46.实施方案43至45任一项的用途,其中该II型抗CD20抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

47.实施方案43至46任一项的用途,其中该II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

48.实施方案43至47任一项的用途,其中该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG₁抗体。

49.实施方案43至48任一项的用途,其中该II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。

50.实施方案43至49任一项的用途,其中该II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

51.实施方案43至50任一项的用途,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

52.实施方案43至51任一项的用途,其中该治疗剂包含抗体,特别是多特异性抗体。

53.实施方案51的用途,其中该抗体特异性结合活化性T细胞抗原,特别是选自由CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127组成的组的抗原,更加特别是CD3,最特别是CD3ε。

54.实施方案52或53的用途,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQ IDNO:17的LCDR3。

55.实施方案52至54任一项的用途,其中该抗体包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

56.实施方案52至55任一项的用途,其中该抗体特异性结合B细胞抗原,特别是选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,更加特别是CD20或CD19,最特别是CD20。

57.实施方案56的用途,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ IDNO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

58.实施方案56或57的用途,其中该抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

59.实施方案43至58任一项的用途,其中该抗体是双特异性抗体,该双特异性抗体包含(i)如实施方案53至55任一项中定义的抗体和(ii)如实施方案56至58任一项定义的抗体。

60.实施方案43至59任一项的用途,其中该治疗剂包含CD20XCD3 bsAB。

61.实施方案43至51任一项的用途,其中该治疗剂包含表达嵌合抗原受体(CAR),特别是特异性结合B细胞抗原的CAR,更加特别是特异性结合选自CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5的组的抗原的CAR的T细胞。

62.实施方案43至61任一项的用途,其中该疾病是B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症,和/或是选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组的疾病。

63.一种用于在受试者中降低与T细胞活化性治疗剂的施用相关的细胞因子释放的试剂盒,其包含包装,该包装包含II型抗CD20抗体组合物和关于在包含下述的治疗方案中使用该II型抗CD20抗体组合物的说明书:

(i)对该受试者施用该II型抗CD20抗体组合物,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

64.实施方案63的试剂盒,其进一步包含T细胞活化性治疗剂组合物。

65.一种用于在受试者中治疗疾病的试剂盒,其包含包装,该包装包含T细胞活化性治疗剂组合物和关于在包含下述的治疗方案中使用该治疗剂组合物的说明书:

(iii)对该受试者施用II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(iv)对该受试者施用该T细胞活化性治疗剂组合物,

其中该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂组合物的施用之间的时间段足以响应该抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

66.实施方案65的试剂盒,其进一步包含II型抗CD20抗体组合物。

67.实施方案63至66任一项的试剂盒,其中与相应的不施用该II型抗CD20抗体组合物的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该治疗剂的施用相关的细胞因子释放。

68.实施方案63至67任一项的试剂盒,其中该II型抗CD20抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

69.实施方案63至68任一项的试剂盒,其中该II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

70.实施方案63至69任一项的试剂盒,其中该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG₁抗体。

71.实施方案63至70任一项的试剂盒,其中该II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。

72.实施方案63至71任一项的试剂盒,其中该II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

73.实施方案63至72任一项的试剂盒,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

74.实施方案63至73任一项的试剂盒,其中该治疗剂包含抗体,特别是多特异性抗体。

75.实施方案74的试剂盒,其中该抗体特异性结合活化性T细胞抗原,特别是选自由CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127组成的组的抗原,更加特别是CD3,最特别是CD3ε。

76.实施方案74或75的试剂盒,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQID NO:17的LCDR3。

77.实施方案74至76任一项的试剂盒,其中该抗体包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

78.实施方案74至77任一项的试剂盒,其中该抗体特异性结合B细胞抗原,特别是选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,更加特别是CD20或CD19,最特别是CD20。

79.实施方案78的试剂盒,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ IDNO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

80.实施方案78或79的试剂盒,其中该抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

81.实施方案78至80任一项的试剂盒,其中该抗体是双特异性抗体,该双特异性抗体包含(i)如实施方案75至77任一项中定义的抗体和(ii)如实施方案78至80任一项中定义的抗体。

82.实施方案63至81任一项的试剂盒,其中该治疗剂包含CD20XCD3 bsAB。

83.实施方案63至73任一项的试剂盒,其中该治疗剂包含表达嵌合抗原受体(CAR),特别是特异性结合B细胞抗原的CAR,更加特别是特异性结合选自CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5的组的抗原的CAR的T细胞。

84.实施方案63至83任一项的试剂盒,其中该疾病是B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症,和/或是选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组的疾病。

85.供在受试者中治疗疾病的方法中使用的T细胞活化性治疗剂,该方法包含治疗方案，该治疗方案包含:

(i)对该受试者施用II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用该T细胞活化性治疗剂,

86.实施方案85的T细胞活化性治疗剂,其中与相应的不施用该II型抗CD20抗体的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该治疗剂的施用相关的细胞因子释放。

87.实施方案85或86的T细胞活化性治疗剂,其中该II型抗CD20抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ IDNO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ IDNO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

88.实施方案85至87任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。89.实施方案85至88任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG₁抗体。

90.实施方案85至89任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该II型抗CD20抗体改造成具有Fc区中与未改造抗体相比比例升高的非岩藻糖基化的寡糖。

91.实施方案85至90任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

92.实施方案85至91任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

93.实施方案85至92任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该治疗剂包含抗体,特别是多特异性抗体。

94.实施方案93的T细胞活化性治疗剂,其中该抗体特异性结合活化性T细胞抗原,特别是选自由CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127组成的组的抗原,更加特别是CD3,最特别是CD3ε。

95.实施方案93或94的T细胞活化性治疗剂,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:16的LCDR2，和SEQ ID NO:17的LCDR3。

96.实施方案93至95任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该抗体包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

97.实施方案93至96任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该抗体特异性结合B细胞抗原,特别是选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,更加特别是CD20或CD19,最特别是CD20。

98.实施方案97的T细胞活化性治疗剂,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

99.实施方案97或98的T细胞活化性治疗剂,其中该抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

100.实施方案85至99任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体包含(i)如实施方案94至96任一项中定义的抗体和(ii)如实施方案97至99任一项中定义的抗体。

101.实施方案85至100任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该治疗剂包含CD20XCD3bsAB。

102.实施方案85至92任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该治疗剂包含表达嵌合抗原受体(CAR),特别是特异性结合B细胞抗原的CAR,更加特别是特异性结合选自CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5的组的抗原的CAR的T细胞。

103.实施方案85至102任一项的T细胞活化性治疗剂,其中该疾病是B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症,和/或是选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组的疾病。

下面给出了本发明的又一些方面。

I.供治疗受试者中的疾病的方法中使用的II型抗CD20抗体,该方法包含治疗方案，该治疗方案包含:

(i)对该受试者施用该II型抗CD20抗体,

并且序贯地在一段时间后

(ii)对该受试者施用T细胞活化性治疗剂,

II.方面I的II型抗CD20抗体,其中与相应的不施用该II型抗CD20抗体的治疗方案相比该治疗方案有效降低该受试者中与该治疗剂的施用有关的细胞因子释放。

III.供用于降低受试者中与T细胞活化性治疗剂的施用有关的细胞因子释放的方法中使用的II型抗CD20抗体,该方法包含在施用该治疗剂之前将该II型抗CD20抗体施用于该受试者。

IV.方面III的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体的施用和该治疗剂的施用之间的时间段足以响应该抗CD20抗体的施用而降低该受试者中的B细胞的数目。

V.方面I至IV任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体包含重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

VI.方面I至V任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

VII.方面I至VI任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG1抗体,且其中该II型抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

VIII.方面I至VII任一项的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

IX.方面I至XIII任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂包含抗体,特别是多特异性抗体。

X.方面IX的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体特异性结合活化性T细胞抗原,特别是选自由CD3,CD28,CD137(也称作4-1BB),CD40,CD226,OX40,GITR,CD27,HVEM,和CD127组成的组的抗原,更加特别是CD3,最特别是CD3ε。

XI.方面IX或X的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:12的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:13的HCDR2,和SEQ ID NO:14的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:15的轻链CDR(LCDR)1,SEQ IDNO:16的LCDR2，和SEQ ID NO:17的LCDR3。

XII.方面IX至XI任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体包含SEQID NO:18的重链可变区序列和SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。

XIII.方面IX至XII任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体特异性结合B细胞抗原,特别是选自由CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5组成的组的抗原,更加特别是CD20或CD19,最特别是CD20。

XIV.方面XIII的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

XV.方面XIII或IV的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体包含SEQ IDNO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

XVI.方面I至XV任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂中包含的抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体包含(i)如方面X至XII任一项中定义的抗体和(ii)如方面XIII至XV任一项中定义的抗体。

XVII.方面I至VIII任一项的II型抗CD20抗体,其中该治疗剂包含表达嵌合抗原受体(CAR),特别是特异性结合B细胞抗原的CAR,更加特别是特异性结合选自CD20,CD19,CD22,ROR-1,CD37和CD5的组的抗原的CAR的T细胞。

XVIII.方面I至XVII任一项的II型抗CD20抗体,其中该疾病是B细胞增殖性病症,特别是CD20阳性B细胞病症,和/或是选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL),急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),滤泡性淋巴瘤(FL),套细胞淋巴瘤(MCL),边缘区淋巴瘤(MZL),多发性骨髓瘤(MM)和霍奇金淋巴瘤(HL)组成的组的疾病。

实施例

下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践各种其它实施方案。

实施例1

完全人源化的小鼠中由CD20XCD3 bsAB±奥滨尤妥珠单抗预处理(Gpt)介导的抗肿瘤活性和细胞因子释放的评估

我们调查Gpt是否能在完全人源化的NOG小鼠中阻止与CD20XCD3bsAB的第一施用相关的细胞因子释放。

所有处理选项(奥滨尤妥珠单抗,CD20XCD3 bsAB和Gpt+CD20XCD3bsAB)均引起早在第一次疗法施用后24小时检测到的有效的外周血B细胞消减(图1A)。T细胞计数揭示CD20XCD3 bsAB的第一施用后而非奥滨尤妥珠单抗或Gpt+CD20XCD3 bsAB后24小时外周血中的瞬时减少(图1B)。因此,在CD20XCD3 bsAB之前施用时,奥滨尤妥珠单抗的单次施用消除外周血中由CD20XCD3 bsAB介导的T细胞减少。

不同实验组中的经处理小鼠的血液中释放的细胞因子的分析揭示CD20XCD3 bsAB处理诱导血液中数种细胞因子的瞬时升高,第一施用后24小时达到峰并到72小时回到基线水平附近(图2)。MIP-1b,IL-5,IL-10,MCP-1显示与IFNγ,TNFα和IL-6相似的趋势(未显示)。Gpt强烈降低外周血中与第一CD20XCD3 bsAB注射相关的细胞因子释放(表2)。

表2:CD20XCD3 bsAB和Gpt+CD20XCD3 bsAB处理后完全人源化的NOG小鼠的外周血中释放的细胞因子

注释:数据以算术均值(SD)展示。两种处理中均为N＝5。

CD20XCD3 bsAB的抗肿瘤活性不受奥滨尤妥珠单抗预处理影响(图3)。作为单一疗法,奥滨尤妥珠单抗处理显示强烈的抗肿瘤活性,尽管在这种肿瘤和小鼠模型中动力学与CD20XCD3 bsAB相比要慢。

因此,数据指示Gpt降低与第一CD20XCD3 bsAB注射相关的细胞因子释放,然而,尽管靶向肿瘤细胞上的相同抗原,CD20XCD3 bsAB的抗肿瘤活性不受Gpt影响。

实施例2

食蟹猴中的奥滨尤妥珠单抗预处理研究

实施了雄性食蟹猴中的一项机制研究(非GLP)来调查奥滨尤妥珠单抗预处理对0.1,0.3和1mg/kg剂量的CD20XCD3 bsAB的影响(表3)。在这项研究中,6只未实验雄性食蟹猴/组(第1组4只)接受一剂IV对照项1(第1和2组)或奥滨尤妥珠单抗(50mg/kg,第3,4,5组),4天后继以对照项2(第1组),0.1mg/kg CD20XCD3 bsAB(第2组,第3组),0.3mg/kgCD20XCD3 bsAB(第4组)或1mg/kg CD20XCD3 bsAB(第5组)处理。认为奥滨尤妥珠单抗和CD20XCD3bsAB剂量给药之间的4天足以容许奥滨尤妥珠单抗消减外周血,淋巴结和脾中的B细胞。在第12天,对2只来自第1组的动物和4只来自第2至5组的动物尸检(终末尸检)。为8周恢复时段保留2只来自每一个组的动物。

表3:研究设计:食蟹猴中的奥滨尤妥珠单抗预处理

注释:对照项1＝奥滨尤妥珠单抗的对照；对照项2＝CD20XCD3 bsAB的对照。

^a主要组动物,终末尸检第12天。

^b恢复动物,尸检第8周。

下述初步数据自这项当前正在进行的研究可得:

·在奥滨尤妥珠单抗预处理(50mg/kg,Gpt)后,IV施用CD20XCD3 bsAB直至最高测试剂量1mg/kg得到耐受。在所有剂量的CD20XCD3 bsAB,对单独的CD20XCD3 bsAB观察到的临床体征(呕吐,驼背体态和活动减退)通过Gpt显著减轻。

·单独的CD20XCD3 bsAB施用导致B淋巴细胞减少和T淋巴细胞(CD4+和CD8+)子集和NK细胞的活化和扩充。而且,在施用CD20XCD3 bsAB之前施用奥滨尤妥珠单抗导致B淋巴细胞消减,以及随后T淋巴细胞活化削弱,表现为CD20XCD3 bsAB施用后淋巴细胞和单核细胞群体的瞬时减少降低,以及T细胞活化标志物上调和扩充降低,是相对于单独用CD20XCD3bsAB处理的动物存在的变化而言的。

·0.1mg/kg CD20XCD3 bsAB处理后4小时的IFNγ,IL-8,TNFα,IL-2和IL-6的释放在Gpt组中显著降低。类似地,在Gpt组中在更高剂量的CD20XCD3 bsAB注意到低水平的细胞因子释放。

CD20XCD3 bsAB相关组织病理学发现局限于淋巴样器官(例如,脾的淋巴滤泡中存在降低的特异性影响CD20阳性细胞的细胞性(cellularity))。CD20阳性细胞减少在8周无处理时段后几乎完全逆转。在用0.1mg/kg CD20XCD3bsAB处理的猴中和Gpt后施用0.1,0.3或1mg/kg CD20XCD3 bsAB的动物中不存在其它组织病理学变化,包括脑,脊髓和坐骨神经中。

实施例3

具有r/r NHL的患者中在有奥滨尤妥珠单抗预处理的情况下CD20XCD3 bsAB的安全性,耐受性和药动学的临床评估

实施一项I期剂量放大研究,其主要目标包括评估在具有复发性/顽固性(r/r)NHL的患者中在有奥滨尤妥珠单抗预处理的情况下CD20XCD3 bsAB的安全性,耐受性和药动学。

该研究登记具有r/r NHL的患者,他们的肿瘤预期在B细胞中表达CD20。不登记具有CLL的患者。患者预期在至少一个在先处理方案后复发或未能响应至少一个在先处理方案。

静脉内(IV)施用奥滨尤妥珠单抗和CD20XCD3 bsAB。

在施用奥滨尤妥珠单抗和CD20XCD3 bsAB之前,连同抗组胺药和乙酰氨基酚一起,施用皮质类固醇(例如100mg IV泼尼松龙或等同物)预药疗。还根据需要或要求推荐针对其它事件,诸如肿瘤裂解综合征的防范性措施。

在周期1/第1天(C1/D1)启动通过静脉内(IV)输注的作为单一药剂的CD20XCD3bsAB,这在第一剂CD20XCD3 bsAB(周期1/第1天)前7天(周期1/第-7天)的单剂奥滨尤妥珠单抗(1000mg；IV)的预处理之后。CD20XCD3bsAB的预期起始剂量是5微克(平坦剂量给药)。所有剂量给药周期长14天(Q2W)。剂量给药方案是在周期1中的第1和8天(C1/D1；C1/D8)施用CD20XCD3 bsAB,接着在所有后续周期中只在第1天(Q2W)进行剂量给药,总共12个周期(24周)的处理或直至不可接受的毒性或进展发生。

在适宜的时间点收集血液样品以测定CD20XCD3 bsAB的相关PK特性,以及血液中的一系列PD标志物,评估例如Gpt和CD20XCD3 bsAB剂量给药起始后B细胞消减的程度和动力学,T细胞表型,及评估在选定时间点施用Gpt和CD20XCD3 bsAB后的可溶性介导物释放(细胞因子和趋化因子)。

实施例4

GAZYVA预处理以避免CAR-T细胞的过继性T细胞疗法后的细胞因子释放

细胞因子释放综合征(CRS)是用CD19 CAR-T细胞以及针对CD20或CD22的CAR-T细胞处理后非常频繁的现象,能导致致死副作用。避免或降低CRS的策略聚焦于CAR-T疗法的各个方面(综述于Xu and Tang,Cancer Letters(2014)343,172-178)。

我们建议一种新颖办法来避免B细胞增殖性病症中用CAR-T细胞处理后的CRS,其通过使用奥滨尤妥珠单抗预处理来消减外周和恶性B细胞进行。

为此目的,将具有B细胞增殖性病症(例如NHL)的患者随机化入奥滨尤妥珠单抗预处理分支和没有奥滨尤妥珠单抗预处理的对照分支。奥滨尤妥珠单抗预处理分支中的患者接受1g奥滨尤妥珠单抗,在施用CD19,CD20或CD22 CAR-T细胞之前第-7天(+/-2天)施用。

对患者输注对于所使用的具体CAR-T细胞,患者和要治疗的疾病适宜的剂量的经CAR慢病毒载体转导的自体T细胞(例如0.76×10⁶至20.6×10⁶个CAR-T细胞每千克体重,如Maude et al.,N Engl J Med(2014)371,1507-1517中描述的；1.4×10⁶至1.2×10⁷个CAR-T细胞每千克体重,如Grupp et al.,New Engl J Med(2013)368,1509-1518中描述的；或0.14×10⁸至11×10⁸个CAR-T细胞,如Porter et al.,Sci Transl Med(2015)7,303ra139中描述的)。对患者监测响应,毒性效应,和循环中的CAR-T细胞的扩充和存留。

在每一次奥滨尤妥珠单抗剂量给药之前给予预药疗。在处理时段之前和期间收集血液样品用于监测B淋巴细胞计数。使用流式细胞术和CD19染色获得B细胞计数。另外,通过测量包括IL-6在内的细胞因子来筛选CRS的发生率。

实施例5

抗CD20/抗CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗或抗PD-L1抗体的组合治疗

图6显示抗CD20/抗CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗的组合治疗(图6D)和抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗PD-L1抗体的组合治疗(图6E)的功效。

抗CD20/抗CD3双特异性抗体是“2:1”T细胞双特异性人源化单克隆抗体,其经由两个抗原结合片段(Fab)域结合肿瘤细胞上的人CD20并经由单个Fab域结合T细胞上的T细胞受体(TCR)复合物的人CD3厄普西隆亚基(CD3e)。该分子基于人IgG1同种型,但是含有缺乏Fc伽马受体(FcγR)和补体(C1q)结合的Fc部分。分子量是大约194kDa。在实施例5中,抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含依照SEQ ID NO:116的重链,依照SEQ ID NO:117的重链,两份依照SEQ ID NO:118的轻链和依照SEQ ID NO:119的轻链。

抗PD-L1抗体基于WO 2010/077634中描述的YW243.55.S70 PD-L1抗体(序列在WO2010/077634的图11中显示)。这种抗体含有DAPG突变以消除FcγR相互作用。YW243.55.S70的可变区附着于具有DAPG Fc突变的鼠IgG1恒定域。实施例5中使用的抗PD-L1抗体包含依照SEQ ID NO:120的重链和依照SEQ ID NO:121的轻链。

在携带第0天皮下注射的攻击性淋巴瘤模型(WSU-DLCL2肿瘤)的人造血干细胞人源化小鼠(HSC-NSG小鼠)中分析抗CD20/抗CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗(GAZYVA；图6D)和抗PD-L1抗体(图6E)组合时的抗肿瘤活性。当肿瘤平均体积为600mm³时开始疗法,如图6A-F中通过箭指示的。在研究第15天达到肿瘤平均体积600mm³。

对于抗CD20/抗CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗的组合治疗,以亚最佳有效剂量0.15mg/kg每周一次静脉内施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体。以10mg/kg每周一次静脉内施用奥滨尤妥珠单抗(图6D)。同时注射两种配偶。

对于抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗PD-L1抗体的组合治疗,以亚最佳有效剂量0.15mg/kg每周一次静脉内施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体并以10mg/kg每周一次静脉内施用抗PD-L1抗体(图6E)。也同时注射两种配偶。

媒介组中的动物接受每周静脉内注射磷酸盐缓冲盐水(图6A)。在单一疗法组中,以10mg/kg每周一次静脉内施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体(图6B),以10mg/kg每周一次静脉内施用奥滨尤妥珠单抗(图6C),并以10mg/kg每周一次静脉内施用抗PD-L1抗体(图6F)。每个组含有10只动物。依照Dunnet氏方法对标准化曲线下面积(sAUC)的单向ANOVA,单一疗法组彼此之间没有统计学差异(表4)。

表4:单一疗法组的体内数据的统计分析

如上文所示,抗CD20/抗CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗或抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗PD-L1抗体的组合治疗显示研究过程期间肿瘤平均尺寸的显著缩小。这指示与抗CD20/抗CD3双特异性抗体,奥滨尤妥珠单抗或抗PD-L1抗体任一的单独治疗相比组合治疗缩小肿瘤平均尺寸的卓越潜力。

依照Dunnet氏方法对sAUC的单向ANOVA对上文与实施例5的组合治疗有关的体内数据进行统计分析(表5)。

表5:组合治疗的体内数据的统计分析

在所测试的条件中,与抗CD20/抗CD3双特异性抗体与抗PD-L1抗体的组合治疗相比抗CD20/抗CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗的组合治疗对缩小平均肿瘤尺寸显示更强的效果。

图7显示抗CD20/抗CD3双特异性抗体与奥滨尤妥珠单抗的组合治疗的功效(图7A和7B)。关于抗CD20/抗CD3双特异性抗体的构造,见实施例5。在携带攻击性淋巴瘤模型(OCI-Ly18肿瘤)的人造血干细胞人源化小鼠(HSC-NSG小鼠)中测试抗CD20/抗CD3双特异性抗体(这里的RO7082859)与奥滨尤妥珠单抗组合时的抗肿瘤活性。在第0天皮下注射所述组合。当肿瘤平均体积为500mm³时(在研究第14天达到)开始疗法。以0.5mg/kg的剂量一周一次静脉内施用抗CD20/抗CD3双特异性抗体。以30mg/kg每周一次静脉内施用奥滨尤妥珠单抗。在组合组中同时注射组合的两种配偶。媒介组中的动物接受每周注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)。每个组含有8只动物。图7A以均值和均值的标准误差(SEM)显示所有组的肿瘤生长动力学。图7B显示每个治疗组中的单只小鼠的肿瘤生长动力学。用单向ANOVA实施统计分析。比较各个组,其中“*”代表图7A中抗CD20/抗CD3双特异性抗体对抗CD20/抗CD3双特异性抗体和奥滨尤妥珠单抗的组合,而“**”代表奥滨尤妥珠单抗对抗CD20/抗CD3双特异性抗体和奥滨尤妥珠单抗的组合。

抗CD20/抗CD3双特异性抗体和奥滨尤妥珠单抗的可组合性以当一起施用两种抗体达数个施用周期时的强抗肿瘤功效例证。在两种不同DLBCL模型,即WSU-DLCL2和OCI-Ly18中观察到它们的组合的协同性,而且通过与相应的单一抗体相比所有动物中和两种肿瘤模型中的快速肿瘤消退证明。

***

尽管为了理解清楚的目的已经通过举例说明较为详细地描述了前述发明,但是描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过援引明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

<120> 用于治疗癌症的II型抗CD20抗体和抗CD20/CD3双特异性抗体

<130> PX

<160> 121

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 297

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg

20 25 30

Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile

195 200 205

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210 215 220

Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

225 230 235 240

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275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro

290 295

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys

1 5 10 15

Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu

20 25 30

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50 55 60

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Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

100 105 110

<210> 3

<211> 103

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 3

Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

1 5 10 15

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20 25 30

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn

35 40 45

Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr

50 55 60

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65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

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100

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20 HCDR1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 5

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Gly

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 6

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20 LCDR3

<400> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20 VH

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

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Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 LCDR1

<400> 15

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 LCDR2

<400> 16

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 LCDR3

<400> 17

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 18

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 VH

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

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<210> 19

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 VL

<400> 19

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

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65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

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<210> 20

<211> 672

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (节, P329G LALA)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

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35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

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130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu

225 230 235 240

Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly

245 250 255

Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln

260 265 270

Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys

275 280 285

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595 600 605

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

610 615 620

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

625 630 635 640

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

645 650 655

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

660 665 670

<210> 21

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20 VH-CH1(EE)-Fc (穴, P329G LALA)

<400> 21

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 22

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20 VL-CL(RK)

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

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100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

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<213> 人工序列

<220>

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145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 25

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR3

<400> 26

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR1

<400> 27

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR2

<400> 28

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR3

<400> 29

Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 30

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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<210> 31

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL

<400> 31

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 32

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH-CH1(EE)-Fc(穴, P329G LALA)

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

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165 170 175

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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

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420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro

<210> 33

<211> 674

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(节, P329G LALA)

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr

225 230 235 240

Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr

245 250 255

Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

260 265 270

Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr

275 280 285

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu

305 310 315 320

Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly

325 330 335

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

340 345 350

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

355 360 365

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

370 375 380

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

385 390 395 400

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

405 410 415

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

420 425 430

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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

565 570 575

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

580 585 590

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

595 600 605

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

610 615 620

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

625 630 635 640

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

645 650 655

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

660 665 670

Ser Pro

<210> 34

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL-CL(RK)

<400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro

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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

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Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR1

<400> 35

Asp Tyr Ile Met His

1 5

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR2

<400> 36

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 37

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR3

<400> 37

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr

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<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR1

<400> 38

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR2

<400> 39

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR3

<400> 40

Leu Gln Leu Leu Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 41

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL

<400> 42

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

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100 105 110

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR1

<400> 43

Asp Tyr Ile Met His

1 5

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR2

<400> 44

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 45

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR3

<400> 45

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 46

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR1

<400> 46

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Ser Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 47

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR2

<400> 47

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR3

<400> 48

Leu Gln Leu Ile Asp Tyr Pro Val Thr

1 5

<210> 49

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL

<400> 50

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Ser Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Ile Asp Tyr Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR1

<400> 51

Asp Tyr Ile Met His

1 5

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR2

<400> 52

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR3

<400> 53

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 54

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR1

<400> 54

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR2

<400> 55

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR3

<400> 56

Leu Gln Ala Thr His Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210> 57

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL

<400> 58

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90 95

Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR1

<400> 59

Asp Tyr Ile Thr His

1 5

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR2

<400> 60

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR3

<400> 61

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Asp Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 62

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR1

<400> 62

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR2

<400> 63

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR3

<400> 64

Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 65

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Thr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Asp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL

<220>

<221> 混杂特征

<222> (107)..(107)

<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸

<400> 66

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Xaa Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR1

<400> 67

Asp Tyr Ile Met His

1 5

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR2

<400> 68

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 69

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR3

<400> 69

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 70

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR1

<400> 70

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR2

<400> 71

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR3

<400> 72

Leu Gln Pro Gly His Tyr Pro Gly Thr

1 5

<210> 73

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 74

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL

<400> 74

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Pro

85 90 95

Gly His Tyr Pro Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 75

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR1

<400> 75

Asp Tyr Ile Met His

1 5

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR2

<400> 76

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 77

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR3

<400> 77

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 78

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR1

<400> 78

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR2

<400> 79

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR3

<400> 80

Leu Gln Leu Asp Ser Tyr Pro Asn Thr

1 5

<210> 81

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 82

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL

<400> 82

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Asp Ser Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 83

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR1

<400> 83

Asp Tyr Ile Met His

1 5

<210> 84

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR2

<400> 84

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 85

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 HCDR3

<400> 85

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 86

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR1

<400> 86

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 87

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR2

<400> 87

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 LCDR3

<400> 88

Leu Gln Leu Thr His Glu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 89

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VH

<400> 89

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 90

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 VL

<400> 90

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 91

<211> 207

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 91

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 92

<211> 198

<212> PRT

<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）

<400> 92

Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys

50 55 60

Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro

85 90 95

Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn

100 105 110

Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp

115 120 125

Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys

130 135 140

Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn

165 170 175

Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195

<210> 93

<211> 556

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 93

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val

325 330 335

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu

340 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp

370 375 380

Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu

420 425 430

Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser

465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly

485 490 495

Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln

500 505 510

Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala

515 520 525

Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp

530 535 540

Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

545 550 555

<210> 94

<211> 225

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 94

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro

225

<210> 95

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 95

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 96

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 96

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 97

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 97

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 98

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 98

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1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 99

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 99

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 100

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 100

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 101

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 101

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 102

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 102

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 103

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 103

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 104

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 104

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

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<210> 105

<211> 207

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 105

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

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Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

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Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

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180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 106

<211> 198

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 106

Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr

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Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

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Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys

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Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro

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Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn

100 105 110

Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp

115 120 125

Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys

130 135 140

Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly

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Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn

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Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 107

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1 5 10

<210> 108

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 108

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 109

Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 110

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工构建物

<400> 110

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 111

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 111

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 112

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 112

Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr

1 5

<210> 113

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 113

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

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Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 114

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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65 70 75 80

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

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<210> 115

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 115

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

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100 105

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 116

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

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Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu

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Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly

245 250 255

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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

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530 535 540

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

545 550 555 560

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565 570 575

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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

645 650 655

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

660 665 670

Gly

<210> 117

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 117

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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<210> 118

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 118

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

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Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 119

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 119

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

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85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 120

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 120

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro

210 215 220

Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Ala Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp

260 265 270

Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser

305 310 315 320

Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln

340 345 350

Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe

355 360 365

Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu

370 375 380

Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe

385 390 395 400

Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn

405 410 415

Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

420 425 430

Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 121

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建物

<400> 121

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

Claims

1.供用于治疗个体的癌症或延迟其进展的方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体与抗CD20/抗CD3双特异性抗体组合使用。

2.依照权利要求1的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。

3.依照权利要求1或2的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体在两种或更多种不同组合物中施用,其中该两种或更多种不同组合物在不同时间点施用。

4.依照权利要求1至3任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQID NO:5的HCDR2，和SEQ ID NO:6的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

5.依照权利要求1至4任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

6.依照权利要求1至5任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG1抗体,且其中该抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

7.依照权利要求1至6任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab)。

8.依照权利要求1至7任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该II型抗CD20抗体与该抗CD20/抗CD3双特异性抗体并行施用,在该抗CD20/抗CD3双特异性抗体之前施用,或在该抗CD20/抗CD3双特异性抗体之后施用。

9.依照权利要求1至8任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中还施用抗PD-L1抗体,优选阿特珠单抗(Atezolizumab)。

10.依照权利要求9的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗PD-L1抗体与该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体至少之一分开或组合施用。

11.依照前述权利要求任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CD20的第二抗原结合域。

12.依照权利要求11的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第一抗原结合域和第二抗原结合域，该第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3)，该第二抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和轻链可变区(VLCD20)。

13.权利要求11至12任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:97的CDR-H1序列,SEQ ID NO:98的CDR-H2序列，和SEQ IDNO:99的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD3)包含SEQ ID NO:100的CDR-L1序列,SEQ ID NO:101的CDR-L2序列，和SEQ ID NO:102的CDR-L3序列。

14.权利要求11至12任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD3)包含SEQ IDNO:104的氨基酸序列。

15.权利要求11至14任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQ ID NO:5的CDR-H2序列,和SEQID NO:6的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:7的CDR-L1序列,SEQ IDNO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

16.权利要求11至14任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列。

17.权利要求11至16任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含结合CD20的第三抗原结合域。

18.权利要求17的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQ ID NO:5的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:6的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:7的CDR-L1序列,SEQ ID NO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

19.权利要求17或18的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

20.权利要求11至19任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域是交叉Fab分子,其中Fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的,且该第二和如果存在的情况中的第三抗原结合域是常规Fab分子。

21.权利要求20的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含IgG1 Fc域。

22.权利要求21的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的IgG1 Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。

23.权利要求21或22的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。

24.权利要求21至23任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第三抗原结合域,

其中(i)该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端,该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,且该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端,或(ii)该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端,该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,且该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。

25.前述权利要求任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中该组合以约一周至三周的间隔施用。

26.依照权利要求1至25任一项的供方法中使用的II型抗CD20抗体,其中在该组合治疗前实施用II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗的预治疗,其中该预治疗和该组合治疗之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗减少该个体中的B细胞。

27.一种用于治疗个体中的增殖性疾病,特别是癌症或延迟其进展的方法,其包含施用II型抗CD20抗体和抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该II型抗CD20抗体和该抗CD20/抗CD3双特异性抗体在单一组合物中或在两种或更多种组合物中施用。

28.一种药学组合物,其包含供组合治疗中使用的II型抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂,和包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的第二药物,和任选地包含抗PD-L1抗体和任选的药学可接受载剂的第三药物,供疾病,特别是癌症的组合治疗中使用。

29.一种试剂盒,其包含：包含II型抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂的第一药物,和包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的第二药物,和任选地包含抗PD-L1抗体和任选的药学可接受载剂的第三药物,供疾病,特别是癌症的组合治疗中使用。

30.依照权利要求29的试剂盒,其中该试剂盒包含该第一药物和该第二药物和任选地该第三药物用于治疗个体中的癌症或延迟其进展的使用说明书。

31.II型抗CD20抗体和抗CD20/抗CD3双特异性抗体的组合在制造用于治疗性应用,优选用于治疗个体中的增殖性疾病,特别是癌症或延迟其进展的药物中的用途。

32.II型抗CD20抗体在制造用于治疗个体中的癌症或延迟其进展的药物中的用途,其中该药物包含该II型抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。

33.抗CD20/抗CD3双特异性抗体在制造用于治疗个体中的癌症或延迟其进展的药物中的用途,其中该药物包含该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。

34.一种用于治疗个体中的癌症或延迟其进展的方法,其包含将II型抗CD20抗体和抗CD20/抗CD3抗体施用于该个体。

35.依照权利要求36的方法,其中还将抗PD-L1抗体施用于该个体。

36.供用于治疗个体的癌症或延迟其进展的方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体与II型抗CD20抗体组合使用。

37.依照权利要求39的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。

38.依照权利要求39或40的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体在两种或更多种不同组合物中施用,其中该两种或更多种不同组合物在不同时间点施用。

39.依照权利要求39至41任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该II型抗CD20抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:4的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:5的HCDR2,和SEQ ID NO:6的HCDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:7的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:8的LCDR2，和SEQ ID NO:9的LCDR3。

40.依照权利要求39至42任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该II型抗CD20抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区序列和SEQ ID NO:11的轻链可变区序列。

41.依照权利要求39至42任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该II型抗CD20抗体是IgG抗体,特别是IgG1抗体,且其中该抗CD20抗体的Fc区中至少约40％的N连接的寡糖是非岩藻糖基化的。

42.依照权利要求39至44任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。

43.依照权利要求39至45任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该II型抗CD20抗体与该抗CD20/抗CD3双特异性抗体并行施用,在该抗CD20/抗CD3双特异性抗体之前施用,或在该抗CD20/抗CD3双特异性抗体之后施用。

44.依照权利要求39至46任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中还施用抗PD-L1抗体,优选阿特珠单抗。

45.依照权利要求47的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗PD-L1抗体与该抗CD20/抗CD3双特异性抗体和该II型抗CD20抗体至少之一分开或组合施用。

46.权利要求39至48任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CD20的第二抗原结合域。

47.依照权利要求49的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第一抗原结合域和第二抗原结合域，该第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3)，该第二抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和轻链可变区(VLCD20)。

48.权利要求48至50任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:97的CDR-H1序列,SEQ ID NO:98的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:99的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD3)包含SEQ ID NO:100的CDR-L1序列,SEQ ID NO:101的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:102的CDR-L3序列。

49.权利要求48至51任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD3)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。

50.权利要求48至52任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQ ID NO:5的CDR-H2序列,和SEQ ID NO:6的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:7的CDR-L1序列,SEQ ID NO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

51.权利要求48至52任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第二抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

52.权利要求48至54任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含结合CD20的第三抗原结合域。

53.权利要求55的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:4的CDR-H1序列,SEQ ID NO:5的CDR-H2序列,和SEQID NO:6的CDR-H3序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQ ID NO:7的CDR-L1序列,SEQ IDNO:8的CDR-L2序列,和SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

54.权利要求55或56的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第三抗原结合域包含重链可变区(VHCD20)和/或轻链可变区(VLCD20)，该重链可变区(VHCD20)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD20)包含SEQID NO:11的氨基酸序列。

55.权利要求48至57任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域是交叉Fab分子,其中Fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的,且该第二和如果存在的情况中的第三抗原结合域是常规Fab分子。

56.权利要求58的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含IgG1 Fc域。

57.权利要求59的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的IgG1 Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。

58.权利要求59或60的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体的IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照KabatEU索引)。

59.权利要求59至61任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该抗CD20/抗CD3双特异性抗体包含第三抗原结合域,

60.权利要求39至62的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中该组合以约一周至三周的间隔施用。

61.依照权利要求39至63任一项的供方法中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体,其中在该组合治疗前实施用II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗的预治疗,其中该预治疗和该组合治疗之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗减少该个体中的B细胞。

62.一种药学组合物,其包含供组合治疗中使用的抗CD20/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂,和包含II型抗CD20抗体和任选的药学可接受载剂的第二药物,和任选地包含抗PD-L1抗体和任选的药学可接受载剂的第三药物,供疾病,特别是癌症的组合治疗中使用。

63.说明书中描述的发明。