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TWI820044B - 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體 - Google Patents

抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體 Download PDF

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TWI820044B
TWI820044B TW107134301A TW107134301A TWI820044B TW I820044 B TWI820044 B TW I820044B TW 107134301 A TW107134301 A TW 107134301A TW 107134301 A TW107134301 A TW 107134301A TW I820044 B TWI820044 B TW I820044B
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太田悠介
土居史尚
目黒正規
早川市郎
蘆田真二
益田剛
中田隆
岩本充広
原田直弥
寺內智子
岡嶌大祐
中村健介
內田宏昭
濱田洋文
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日商第一三共股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種新穎之抗體-吡咯并二氮呯衍生物及使用其之新穎之抗體-吡咯并二氮呯衍生物複合體、以及新穎之CLDN6及/或CLDN9抗體。

Description

抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體
本發明係關於一種使能夠以腫瘤細胞為標的之抗體與吡咯并苯二氮呯衍生物經由連結基結構部分結合而成之作為抗腫瘤藥有用之抗體-藥物複合體。
抗體-藥物複合體(Antibody-Drug Conjugate，ADC)係使可結合於在癌細胞表面表現之抗原、且藉由該結合使抗原於細胞中內化之抗體與具有細胞殺傷活性之藥物結合而成者。ADC由於可將藥物有效率地傳遞至癌細胞，故而可期待使藥物聚集於癌細胞內而殺死癌細胞。
作為ADC，例如使抗CD30單株抗體與單甲基奧瑞他汀E結合而成之Adcetris(商標)(brentuximab vedotin)作為霍奇金淋巴瘤與未分化大細胞淋巴瘤之治療藥而受到認可。又，使抗HER2單株抗體與美坦辛(emtansine)結合而成之Kadcyla(商標)(曲妥珠單抗-美坦辛(Trastuzumab emtansine))係用於HER2陽性之進展、複發乳癌之治療。
作為可用作與ADC結合之藥物者之一，可列舉吡咯并苯二氮呯(PBD)。PBD藉由與DNA小槽之PuGPu序列等結合而顯示細胞毒性。作為天然來源之PBD的安麯黴素(anthramycin)於1965年首次被發現，自此以後發現各種天然來源、或其相關物之PBD(非專利文獻1~4)。
PBD之通常之結構式係以下式[化1]
Figure 107134301-A0305-02-0003-1
表示。已知PBD於A、C環部，取代基之數量、種類、部位分別不同，又，B、C環部之不飽和度分別不同。
已知PBD藉由設為二聚物結構，細胞毒性飛躍性地提高(非專利文獻5、6)，亦報告有各種將二聚物PBD進行ADC化而成者(專利文獻1~13)。然而，於C2位具有螺環之PBD或其ADC體尚屬未知。
人CLDN6(緊密連接蛋白(Claudin)-6，以下記作hCLDN6)係緊密連接蛋白(Claudin，CLDN)家族蛋白質之一種，為包含220個胺基酸殘基之四次跨膜型之膜蛋白質。先前揭示hCLDN6於一部分癌中過度表現，為富於吸引力之癌治療標的(非專利文獻7~9)。又，關於CLDN家族蛋白質，亦報告有藉由內噬作用而納入至細胞內且代謝回轉時間較短之家族蛋白質(非專利文獻10)，因此認為適於抗體藥物複合體(ADC)之標的。
根據此種顯示與癌之相關性之資訊，迄今發現特異性地識別hCLDN6之單株抗體(專利文獻14、15)，且報告有使CLDN6特異性之單株抗體與微管蛋白聚合抑制藥之單甲基奧瑞他汀E(MMAE)或類美登素(maytansinoid)(DM1)結合而成之ADC(非專利文獻11)。
另一方面，認為識別複數之CLDN家族之抗體有可擴大治療之適應範圍之可能性，而亦揭示出使識別CLDN6與CLDN9之抗體(專利文獻16)與具有強力之殺細胞效果之吡咯并苯二氮呯(PBD)結合而成之ADC(專利文獻17)。
然而，該等之活性之強度尚不充分，存在以hCLDN6為治療標的之未被滿足之醫療需求。
先前技術文獻
專利文獻
專利文獻1：國際公開第2013/173496號
專利文獻2：國際公開第2014/130879號
專利文獻3：國際公開第2017/004330號
專利文獻4：國際公開第2017/004025號
專利文獻5：國際公開第2017/020972號
專利文獻6：國際公開第2016/036804號
專利文獻7：國際公開第2015/095124號
專利文獻8：國際公開第2015/052322號
專利文獻9：國際公開第2015/052534號
專利文獻10：國際公開第2016/115191號
專利文獻11：國際公開第2015/052321號
專利文獻12：國際公開第2015/031693號
專利文獻13：國際公開第2011/130613號
專利文獻14：國際公開第2009/087978號
專利文獻15：國際公開第2011/057788號
專利文獻16：國際公開第2015/069794號
專利文獻17：國際公開第2017/096163號
非專利文獻
非專利文獻1：Julia Mantaj, et al., Angewandte Chemie International Edition 2016, 55, 2-29
非專利文獻2：Dyeison Antonow. et al., Chemical Reviews 2010, 111, 2815-2864
非專利文獻3：In Antibiotics III. Springer Verlag, New York, pp.3-11
非專利文獻4：Accounts of Chemical Research 1986, 19, 230
非專利文獻5：Journal of the American Chemical Society 1992, 114, 4939
非專利文獻6：Journal of Organic Chemistry 1996, 61, 8141
非專利文獻7：BMC Cancer, 2006, 6, 186.
非專利文獻8：Histopatholody, 2012, 61, 1043-1056.
非專利文獻9：Int J Cancer, 2014, 135, 2206-2214.
非專利文獻10：J Membrane Biol, 2004, 199, 29-38.
非專利文獻11：14th Annu Meet Cancer Immunother(CIMT)(May 10-12, Mainz) 2016, Abst 185
本發明提供一種新穎之抗體-吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物複合體及新穎之吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物。
本發明提供一種新穎之抗CLDN6抗體。
又，本發明提供一種具有抗腫瘤活性之上述抗體-PBD衍生物複合體、含有PBD衍生物或抗CLDN6抗體之醫藥組合物。
進而，本發明提供一種使用上述抗體-PBD衍生物複合體、PBD衍生物或抗CLDN6抗體之癌之治療方法。
本發明者等人進行銳意研究，結果發現，新穎之抗體-吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物複合體具有較強之抗腫瘤活性，從而完成本發明。
即，本案發明係關於以下。
[1]一種抗體-藥物複合體，其係以下式表示，
Figure 107134301-A0305-02-0006-2
(式中，m1表示1至10之整數，較佳表示2至8之整數，Ab表示抗體或該抗體之功能性片段，該抗體之糖鏈可被重建，L表示將Ab與D連結之連結基，Ab可自其胺基酸殘基直接與L鍵結，或者亦可自Ab之糖鏈或經重建之糖鏈與L鍵結，D表示下式所表示之藥物，
Figure 107134301-A0305-02-0006-3
式中，星號表示與L鍵結，n1表示2至8之整數，A表示可經1~4個鹵素原子取代之螺鍵結之3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環，R1及R2各自獨立地表示C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、氫原子、羥基、硫醇基、C1~C6烷硫基、鹵素原子或-NR'R"， 此處，R'及R"各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，R3、R4及R5選自下述(i)~(iii)，(i)R3及R4一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R5表示可具有選自群1之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者可具有選自群2之1個或複數個取代基之C1~C6烷基；(ii)R3表示氫原子，R4及R5與R4及R5所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環或者CH2=；(iii)R3、R4及R5與R3所鍵結之碳原子以及R4及R5所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群3之1個或複數個取代基之苯環或6員之雜環；R6及R7均表示氫原子，或者R6及R7成為一體，表示亞胺鍵(C=N)，R8為羥基或C1~C3烷氧基，X及Y各自獨立為氧原子、氮原子或硫原子，群1表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷氧基；b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-NR'R"、-C(=NR')-NR"R'''及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C6烷基；c)鹵素原子；d)C3~C5環烷氧基；e)C1~C6烷硫基；f)-NR'R"；g)-C(=NR')-NR"R'''；h)-NHC(=NR')-NR"R'''；i)-NHCOR'；或 j)羥基，此處，R'及R"如上文所定義，R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，群2表示鹵素原子、羥基、或C1~C6烷氧基，以及群3表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷基或C1~C6烷氧基)。
[2]如[1]所記載之抗體-藥物複合體，其中A表示可經1~2個鹵素原子取代之螺鍵結之3~5員之飽和烴環，R1及R2各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R3及R4一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R5表示可具有選自群4之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者可具有選自群5之1個或複數個取代基之C1~C3烷基，X及Y為氧原子，群4表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷氧基；b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR"、-C(=NR')-NR"R'''、及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C3烷基；c)C3~C5環烷氧基；d)-C(=NR')-NR"R'''；e)-NHC(=NR')-NR"R'''；或f)羥基，此處，R'、R"、及R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C3烷基，以及群5表示鹵素原子、羥基、或C1~C3烷氧基。
[3]如[1]所記載之抗體-藥物複合體，其中A表示可經1~2個鹵素原子 取代之螺鍵結之3~5員之飽和烴環，R1及R2各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R3表示氫原子，R4及R5與R4及R5所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或=CH2，及X及Y為氧原子。
[4]如[1]所記載之抗體-藥物複合體，其中A表示可經1~2個鹵素原子取代之螺鍵結之3~5員之飽和烴環，R1及R2各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R3、R4及R5與R3所鍵結之碳原子以及R4及R5所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群6之1個或複數個取代基之苯環，X及Y為氧原子，及群6表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷基或C1~C3烷氧基。
[5]如[1]或[2]所記載之抗體-藥物複合體，其中D係由以下之2式之任一者表示，
Figure 107134301-A0305-02-0009-5
式中，星號表示與L鍵結。
[6]如[1]或[3]所記載之抗體-藥物複合體，其中D係由以下之2式之任一者表示，[化5]
Figure 107134301-A0305-02-0010-7
式中，星號表示與L鍵結。
[7]如[1]至[6]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中L係以-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*表示，式中，星號表示與D鍵結，B表示苯基或雜芳基，Lp表示包含可在標的細胞中切斷之胺基酸序列之連結基，La表示選自以下之群之任一者：-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-、及-(CH2)n4-O-C(=O)-，n2表示1~3之整數，n3表示1~5之整數，n4表示0~2之整數，Lb表示將La與Ab之糖鏈或經重建之糖鏈鍵結之間隔基。
[8]如[7]所記載之抗體-藥物複合體，其中B為選自1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基、2,5-噻吩基之任一者。
[9]如[8]所記載之抗體-藥物複合體，其中B為1,4-苯基。
[10]如[7]至[9]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中Lp係包含2至7個胺基酸之胺基酸殘基。
[11]如[7]至[10]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中Lp為包含選自甘胺酸、纈胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、異白胺酸、脯胺酸、瓜胺酸、白胺酸、絲胺酸、離胺酸及天冬胺酸之胺基酸的胺基酸殘基。
[12]如[7]至[11]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中Lp選自以下之群：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、及-GGPL-。
[13]如[7]至[12]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中La選自以下之群：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及-OC(=O)-。
[14]如[7]至[13]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中Lb係以下式表示，
Figure 107134301-A0305-02-0011-8
Figure 107134301-A0305-02-0011-9
 或者[化8]
Figure 107134301-A0305-02-0012-10
於上述所示之Lb之結構式中，星號表示與La鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重建之糖鏈鍵結。
[15]如[7]至[14]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中L係以-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*表示，式中，B為1,4-苯基，Lp表示選自以下之群之任一者：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及-GGPL-，La表示選自以下之群之任一者：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及-OC(=O)-，以及Lb係以下式表示，
Figure 107134301-A0305-02-0012-11
Figure 107134301-A0305-02-0013-12
 或者
Figure 107134301-A0305-02-0013-13
此處，於上述所示之Lb之結構式中，星號表示與La鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重建之糖鏈鍵結。
[16]如[7]至[15]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中L選自以下之群：-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2- OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，Z1表示以下之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0014-14
Z2表示以下之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0014-15
Z3表示以下之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0014-16
此處，於Z1、Z2及Z3之結構式中，星號表示與La鍵結，波形線表示 與Ab之糖鏈或經重建之糖鏈鍵結，及B表示1,4-苯基。
[17]如[16]所記載之抗體-藥物複合體，其中L選自以下之群：-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，B為1,4-苯基，Z1表示以下之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0015-17
此處，於Z1之結構式中，星號表示與鄰接於Z1之C(=O)鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重建之糖鏈鍵結。
[18]如[1]至[6]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中L係以-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*表示，式中，星號表示與D鍵結，B表示1,4-苯基， Lp表示-GGVA-、或-VA，La表示-(CH2)n9-C(=O)-、或-(CH2CH2)n10-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n11-CH2CH2-C(=O)-，n9表示2~7之整數，n10表示1~3之整數，n11表示6~10之整數，Lb為-(丁二醯亞胺-3-基-N)-(-(Succinimid-3-yl-N)-)。
[19]如[18]所記載之抗體-藥物複合體，其中L表示選自以下之群之任一者：-(丁二醯亞胺-3-基-N)-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-(丁二醯亞胺-3-基-N)-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-(丁二醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，B為1,4-苯基。
[20]如[1]至[19]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中抗體為IgG。
[21]如[20]所記載之抗體-藥物複合體，其中抗體為IgG1、IgG2或IgG4。
[22]如[1]至[21]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其特徵在於：抗體與腫瘤細胞結合，納入至腫瘤細胞內而內化。
[23]如[22]所記載之抗體-藥物複合體，其特徵在於：抗體進而具有抗腫瘤效果。
[24]如[1]至[17]、[20]至[23]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中抗體係自與抗體之Asn297鍵結之糖鏈(N297糖鏈)與L鍵結。
[25]如[24]所記載之抗體-藥物複合體，其中N297糖鏈為經重建之糖鏈。
[26]如[24]或[25]所記載之抗體-藥物複合體，其中N297糖鏈為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或該等之混合物、或者N297-(Fuc)SG：
Figure 107134301-A0305-02-0017-18
式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L鍵結，及n5表示2~10之整數；
Figure 107134301-A0305-02-0017-19
式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-6鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L鍵結，及 n5表示2~10之整數；以及
Figure 107134301-A0305-02-0018-20
式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L鍵結，及n5表示2~10之整數。
[27]如[26]所記載之抗體-藥物複合體，其中n5為2~5之整數。
[28]如[24]至[27]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其係以下式表示，
Figure 107134301-A0305-02-0018-21
(式中，m2表示1或2，L係將Ab之N297糖鏈與D連結之連結基，且係選自以下之群之任一連結基：-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、 -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，B為1,4-苯基，Z1表示以下之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0019-22
此處，於上述所示之Z1之結構式中，星號表示與鄰接於Z1之C(=O)鍵結，波形線表示與Ab之N297糖鏈鍵結，Ab表示IgG抗體或該抗體之功能性片段，Ab之N297糖鏈表示具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或該等之混合物、或者N297-(Fuc)SG之任一者，
Figure 107134301-A0305-02-0019-23
Figure 107134301-A0305-02-0019-24
Figure 107134301-A0305-02-0020-25
上述式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，N297糖鏈中之L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-*，此處，n5表示2~5之整數，左端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側或/及1-6鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L中之Z1之三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結，D為選自以下之群之任一者，
Figure 107134301-A0305-02-0020-27
此處，式中，星號表示與L鍵結)。
[29]一種抗體-藥物複合體，其選自以下之群：[化25]
Figure 107134301-A0305-02-0021-28
Figure 107134301-A0305-02-0021-29
[化27]
Figure 107134301-A0305-02-0022-346
 或
Figure 107134301-A0305-02-0022-31
於上述所示之各結構式中，m2表示為1或2，Ab表示IgG抗體或其功能性片段，Ab之N297糖鏈表示具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或該等之混合物、或者N297-(Fuc)SG之任一者，
Figure 107134301-A0305-02-0023-32
Figure 107134301-A0305-02-0023-33
Figure 107134301-A0305-02-0023-34
式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，N297糖鏈中之L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，此處，左端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側或/及1-6鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與各結構式中之三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結。
[30]一種抗體或該抗體之功能性片段，其與CLDN6及/或CLDN9結合。
[31]如[30]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其中CLDN6為包含序列編號1所記載之胺基酸序列之分子，CLDN9為包含序列編號3所記載之胺基酸序列之分子。
[32]如[30]或[31]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其係包含含有以下之(a)或(b)所記載之CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈、以及含有CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈而成： (a)包含序列編號9所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號10所記載之胺基酸序列之CDRH2及包含序列編號11所記載之胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列編號5所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號6所記載之胺基酸序列之CDRL2及包含序列編號7所記載之胺基酸序列或該胺基酸序列中1或2個胺基酸經置換而成之胺基酸序列之CDRL3；(b)包含序列編號15所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號16所記載之胺基酸序列之CDRH2及包含序列編號17所記載之胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列編號12所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號13所記載之胺基酸序列之CDRL2及包含序列編號14所記載之胺基酸序列之CDRL3。
[33]如[32]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其係包含含有以下之(a)或(b)所記載之CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈、以及含有CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈而成：(a)包含序列編號9所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號10所記載之胺基酸序列之CDRH2及包含序列編號11所記載之胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列編號5所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號6所記載之胺基酸序列之CDRL2及包含序列編號7所記載之胺基酸序列或序列編號8所記載之胺基酸序列之CDRL3；(b)包含序列編號15所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號16所記載之胺基酸序列之CDRH2及包含序列編號17所記載之胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列編號12所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號13所記載之胺基酸序列之CDRL2及包含序列編號14所記載之胺基酸序列之CDRL3。
[34]如[30]至[33]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其包含以下之(a)或(b)所記載之重鏈可變區及輕鏈可變區：(a)包含序列編號21所記載之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號19所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含序列編號25所記載之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列編號23所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區。
[35]如[30]至[34]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其包含含有選自由以下之(a)~(e)所組成之群中之胺基酸序列之重鏈可變區、及含有選自由(f)~(k)所組成之群中之胺基酸序列之輕鏈可變區：(a)序列編號54所記載之胺基酸序列；(b)序列編號58所記載之胺基酸序列；(c)序列編號62所記載之胺基酸序列；(d)相對於(a)~(c)之序列中各CDR序列以外之架構區之序列具有至少95%以上之同源性之胺基酸序列；(e)(a)~(c)之序列中之各CDR序列以外之架構區之序列中1個或數個胺基酸經缺失、置換或附加而成之胺基酸序列；(f)序列編號38所記載之胺基酸序列；(g)序列編號42所記載之胺基酸序列；(h)序列編號46所記載之胺基酸序列；(i)序列編號50所記載之胺基酸序列；(j)相對於(f)~(i)之序列中各CDR序列以外之架構區之序列具有至少95%以上之同源性之胺基酸序列；及(k)(f)~(i)之序列中之各CDR序列以外之架構區之序列中1個或數個 胺基酸經缺失、置換或附加而成之胺基酸序列。
[36]如[35]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其包含選自由以下之(a)~(e)所組成之群中之重鏈可變區及輕鏈可變區：(a)包含序列編號54所記載之胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列編號38所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含序列編號58所記載之胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列編號42所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)包含序列編號54所記載之胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區；(d)包含序列編號58所記載之胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列編號50所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區；以及(e)包含序列編號62所記載之胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區。
[37]如[30]至[36]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其中抗體為嵌合抗體。
[38]如[30]至[36]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其中抗體為人類化抗體。
[39]如[30]至[38]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其中抗體包含人IgG1、人IgG2或人IgG4之重鏈恆定區。
[40]如[38]或[39]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其包含選自由以下之(a)~(e)所組成之群中之重鏈及輕鏈：(a)包含序列編號52之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號36之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈 (H1L1)；(b)包含序列編號56之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號40之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈(H2L2)；(c)包含序列編號52之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號44之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈(H1L3)；(d)包含序列編號56之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號48之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈(H2L4)；以及(e)包含序列編號60之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號44之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈(H3L3)。
[41]如[30]或[31]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其結合於如[32]至[36]及[40]中任一項所記載之抗體所識別之抗原上之部位上。
[42]如[30]或[31]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其與如[32]至[36]及[40]中任一項所記載之抗體競爭對CLDN6及/或CLDN9之結合。
[43]一種多核苷酸，其編碼如[30]至[42]中任一項所記載之抗體。
[44]如[43]所記載之多核苷酸，其包含選自由以下之(a)~(j)所組成之群中之多核苷酸：(a)編碼包含序列編號54所記載之胺基酸序列之重鏈可變區之多核苷酸、及編碼包含序列編號38所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區之多核苷酸； (b)編碼包含序列編號58所記載之胺基酸序列之重鏈可變區之多核苷酸、及編碼包含序列編號42所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區之多核苷酸；(c)編碼包含序列編號54所記載之胺基酸序列之重鏈可變區之多核苷酸、及編碼包含序列編號46所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區之多核苷酸；(d)編碼包含序列編號58所記載之胺基酸序列之重鏈可變區之多核苷酸、及編碼包含序列編號50所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區之多核苷酸；(e)編碼包含序列編號62所記載之胺基酸序列之重鏈可變區之多核苷酸、及編碼包含序列編號46所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區之多核苷酸；(f)編碼包含序列編號52之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈之多核苷酸、及編碼包含序列編號36之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈之多核苷酸；(g)編碼包含序列編號56之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈之多核苷酸、及編碼包含序列編號40之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈之多核苷酸；(h)編碼包含序列編號52之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈之多核苷酸、及編碼包含序列編號44之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈之多核苷酸；(i)編碼包含序列編號56之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈之多核苷酸、及編碼包含序列編號48之胺基酸編號21~234所記載之 胺基酸序列之輕鏈之多核苷酸；以及(j)編碼包含序列編號60之胺基酸編號20~471所記載之胺基酸序列之重鏈之多核苷酸、及編碼包含序列編號44之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈之多核苷酸。
[45]一種表現載體，其含有如[43]或[44]中任一項所記載之多核苷酸。
[46]一種宿主細胞，其藉由如[45]所記載之表現載體而經轉形。
[47]如[46]所記載之宿主細胞，其中宿主細胞為真核細胞。
[48]如[47]所記載之宿主細胞，其中宿主細胞為動物細胞。
[49]一種如[30]至[42]所記載之抗體或該抗體之功能性片段之製造方法，其特徵在於包括：培養如[46]至[48]中任一項所記載之宿主細胞之步驟；及自該步驟中所獲得之培養物中採集目標抗體之步驟。
[50]一種抗體或該抗體之功能性片段，其特徵在於：其係藉由如[49]所記載之製造方法所獲得。
[51]如[30]至[42]及[50]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其包含選自由N-結合型糖鏈附加、O-結合型糖鏈附加、N末之加工、C末之加工、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化、N末之甲硫胺酸殘基之附加、脯胺酸殘基之醯胺化、及重鏈之羧基末端中之1個或2個胺基酸殘基之缺失所組成之群中之1種或2種以上之修飾。
[52]如[51]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其中於重鏈之羧基末端缺失1個或數個胺基酸殘基。
[53]如[52]所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其中2條重鏈之雙方於羧基末端缺失1個胺基酸殘基。
[54]如[50]至[53]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段，其中重鏈之羧基末端之脯胺酸殘基進而經醯胺化。
[55]一種糖鏈重建抗體之製造方法，其包括以下之步驟：i)培養如[46]至[48]中任一項所記載之宿主細胞，自所獲得之培養物中採集目標抗體之步驟；ii)藉由水解酶對步驟i)中所獲得之抗體進行處理，而製造(Fucα1,6)GlcNAc-抗體之步驟；及iii)-1於糖基轉移酶存在下使(Fucα1,6)GlcNAc-抗體與糖鏈供體分子進行反應之步驟，該糖鏈供體分子係對MSG(9)或SG(10)之唾液酸之2位之羧酸之羰基導入具有疊氮基之PEG連結基，將還原末端進行
Figure 107134301-A0305-02-0030-354
唑啉化所獲得，或者iii)-2於糖基轉移酶存在下使(Fucα1,6)GlcNAc-抗體與糖鏈供體分子進行反應之步驟，該糖鏈供體分子係對α-胺基可經保護之(MSG-)Asn或(SG-)Asn之唾液酸之2位之羧酸之羰基及上述Asn之羧酸之羰基導入具有疊氮基之PEG連結基，使水解酶發揮作用後，將還原末端進行
Figure 107134301-A0305-02-0030-355
唑啉化所獲得。
[56]如[55]所記載之製造方法，其進而包括藉由利用羥磷灰石管柱對步驟ii)之反應液進行純化而對(Fucα1,6)GlcNAc-抗體進行純化之步驟。
[57]一種如[1]至[29]中任一項所記載之抗體-藥物複合體之製造方法，其包括以下之步驟：i)藉由如[55]或[56]所記載之方法製造糖鏈重建抗體之步驟；及ii)使具有DBCO之藥物連結基(製造中間物)與步驟i)中所製作之糖鏈重建抗體之糖鏈中之疊氮基進行反應之步驟。
[58]一種糖鏈重建抗體，其特徵在於：其係藉由如[55]或[56]所記載之製造方法所獲得。
[59]一種抗體-藥物複合體，其特徵在於：其係藉由如[57]所記載之製造方法所獲得。
[60]一種抗體-藥物複合體，其選自以下之群：
Figure 107134301-A0305-02-0031-36
[化33]
Figure 107134301-A0305-02-0032-37
Figure 107134301-A0305-02-0032-38
 或者[化35]
Figure 107134301-A0305-02-0033-39
於上述所示之各結構式中，m2表示為1或2，Ab表示為如[30]至[42]、[50]至[54]及[58]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段或抗HER2抗體，Ab之N297糖鏈表示具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或該等之混合物、或者N297-(Fuc)SG之任一者，
Figure 107134301-A0305-02-0033-40
Figure 107134301-A0305-02-0033-41
[化38]
Figure 107134301-A0305-02-0034-42
式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，此處，左端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側或/及1-6鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與各結構式中之三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結。
[61]如[1]至[29]、[59]~[60]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之平均藥物結合數為1~3或3~5。
[62]一種化合物、其鹽、或該等之水合物，該化合物係以下式表示，
Figure 107134301-A0305-02-0034-44
(式中，l表示2至8之整數，E表示可經1~4個鹵素原子取代之螺鍵結之3~5員之飽和烴環、或3~5員之飽和雜環，R9及R10各自獨立地表示C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、氫原子、羥基、硫醇基、C1~C6烷硫基、鹵素原子或-NR'R"，此處，R'及R"各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，R11、R12及R13係選自下述(i)~(iii)，(i)R11及R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R13表示可具有選自群7之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者 可具有選自群8之1個或複數個取代基之C1~C6烷基；(ii)R11表示氫原子，R12及R13一起形成3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環或CH2=；或者(iii)R11及R12一起形成可具有選自群9之1個或複數個取代基之苯環或6員之雜環，R13表示單鍵，R14及R15均表示氫原子，或者R14及R15成為一體，表示亞胺鍵(C=N)，R16及R17表示下述(a)或(b)，(a)R16及R17一起形成亞胺鍵(N=C)；(b)R16為J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*，式中，星號表示與鄰接於R16之氮原子鍵結，B'表示苯基或雜芳基，Lp'表示包含可在標的細胞中切斷之胺基酸序列之連結基，La'表示選自以下之群之任一者：-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-、-(CH2)n8-O-C(=O)-、-(CH2)n12-C(=O)-、及-(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-， 此處，式中，n6表示1~3之整數，n7表示1~5之整數，n8表示0~2之整數，n12表示2~7之整數，n13表示1~3之整數，n14表示6~10之整數，J表示以下所示之任一者，
Figure 107134301-A0305-02-0036-45
此處，於上述所示之J之結構式中，星號表示與La'鍵結，R17表示羥基或C1~C3烷氧基，V及W各自獨立為氧原子、氮原子、或硫原子，群7表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷氧基；b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-NR'R"、-C(=NR')-NR"R'''及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C6烷基；c)鹵素原子；d)C3~C5環烷氧基；e)C1~C6烷硫基；f)-NR'R"；g)-C(=NR')-NR"R'''；h)-NHC(=NR')-NR"R'''；i)-NHCOR'；或j)羥基，此處，R'及R"如上文所定義，R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基， 群8表示鹵素原子、羥基、或C1~C6烷氧基，及群9表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷基或C1~C6烷氧基)。
[63]如[62]所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中E表示可經1~2個鹵素原子取代之螺鍵結之3~5員之飽和烴環，R9及R10各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R11及R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R13表示可具有選自群10之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者可具有選自群11之1個或複數個取代基之C1~C3烷基，V及W為氧原子，群10表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷氧基；b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR"、-C(=NR')-NR"R'''、及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C3烷基；c)C3~C5環烷氧基；d)-C(=NR')-NR"R'''；e)-NHC(=NR')-NR"R'''；或f)羥基，此處，R'、R"、及R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C3烷基，以及群11表示鹵素原子、羥基、或C1~C3烷氧基。
[64]如[62]所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中E表示可經1~2個鹵素原子取代之螺鍵結之3~5員之飽和烴環，R9及R10各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R11表示氫原子， R12及R13與R12及R13所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或CH2=，及V及W為氧原子。
[65]如[62]所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中E表示可經1~2個鹵素原子取代之螺鍵結之3~5員之飽和烴環，R9及R10各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R11、R12及R13與R11所鍵結之碳原子以及R12及R13所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群12之1個或複數個取代基之苯環，V及W為氧原子，及群12表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷基或C1~C3烷氧基。
[66]如[62]至[65]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中B'為選自1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基、2,5-噻吩基之任一者。
[67]如[66]所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中B'為1,4-苯基。
[68]如[62]至[67]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中Lp'為選自以下之群之胺基酸殘基：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)P-I-、及-GGPL-。
[69]如[62]至[68]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中La'選自以下之群：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、 -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-、-(CH2)5-C(=O)-、及-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-。
[70]如[62]至[69]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中R16係以J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*表示，式中，B'為1,4-苯基，Lp'表示選自以下之群之任一者，-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及-GGPL-，La'表示選自以下之群之任一者，-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-、-(CH2)5-C(=O)-、及-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-，以及J表示以下所示之任一者，
Figure 107134301-A0305-02-0039-47
此處，於J之結構式中，星號表示與La'鍵結。
[71]如[62]至[70]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中R16選自以下之群：J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、及J4-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'- CH2-OC(=O)-，此處，J1、J2、J3及J4表示以下之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0041-49
此處，於J1、J2、J3及J4之結構式中，星號表示與鄰接之基鍵結，及B'為1,4-苯基。
[72]如[62]至[71]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中R16選自以下之群：J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、及J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-，此處，B'為1,4-苯基，J1、J4表示以下之結構式：[化43]
Figure 107134301-A0305-02-0042-50
此處，於J1及J4之結構式中，星號表示與鄰接之基鍵結。
[73]一種化合物、其鹽、或該等之水合物，該化合物係下式所表示之任一者：
Figure 107134301-A0305-02-0042-51
[74]一種化合物、其鹽、或該等之水合物，該化合物係下式所表示之任一者：
Figure 107134301-A0305-02-0042-52
[75]如[1]至[29]及[59]至[61]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中D係以下式表示：
Figure 107134301-A0305-02-0043-53
[76]如[62]至[72]及[74]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中該化合物係以下式表示：
Figure 107134301-A0305-02-0043-54
[77]如[1]至[29]及[59]至[61]中任一項所記載之抗體-藥物複合體，其中D係以下式表示：
Figure 107134301-A0305-02-0043-55
[78]如[62]至[72]及[74]中任一項所記載之一化合物、其鹽、或該等之水合物，其中該化合物係以下式表示：
Figure 107134301-A0305-02-0043-56
[79]一種醫藥組合物，其特徵在於含有選自如[1]至[29]、[59]至[61]、[75]及[77]中任一項所記載之抗體-藥物複合體、其鹽、或該等之水 合物、如[30]至[42]、[50]至[54]及[58]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段、及如[62]至[74]、[76]及[78]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物中之任一者。
[80]如[79]所記載之醫藥組合物，其特徵在於：其為抗腫瘤藥。
[81]如[80]所記載之醫藥組合物，其特徵在於：腫瘤係CLDN6及/或CLDN9表現之腫瘤。
[82]如[80]或[81]所記載之醫藥組合物，其特徵在於：腫瘤為卵巢癌(表層上皮性腫瘤、間質性腫瘤、胚細胞腫瘤)、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌)、胃癌、子宮體癌、睾丸癌(精原細胞瘤、非精原細胞瘤)、子宮頸癌、胎盤絨毛膜癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、腦腫瘤、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌或食道癌。
[83]一種腫瘤之治療方法，其特徵在於：對個體投予選自如[1]至[29]、[59]至[61]、[75]及[77]中任一項所記載之抗體-藥物複合體、其鹽、或該等之水合物、如[30]至[42]、[50]至[54]及[58]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段、及如[62]至[74]、[76]及[78]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物中之任一者。
[84]如[83]所記載之腫瘤之治療方法，其特徵在於：腫瘤係CLDN6及/或CLDN9表現之腫瘤。
[85]如[83]或[84]所記載之治療方法，其特徵在於：腫瘤為卵巢癌(表層上皮性腫瘤、間質性腫瘤、胚細胞腫瘤)、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌)、胃癌、子宮體癌、睾丸癌(精原細胞瘤、非精原細胞瘤)、子宮頸癌、胎盤絨毛膜癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經 膠質母細胞瘤、腦腫瘤、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌或食道癌。
[86]一種腫瘤之治療方法，其特徵在於：對個體同時、分開或連續投予含有選自如[1]至[29]、[59]至[61]、[75]及[77]中任一項所記載之抗體-藥物複合體、其鹽、或該等之水合物、如[30]至[42]、[50]至[54]及[58]中任一項所記載之抗體或該抗體之功能性片段、及如[62]至[74]、[76]及[78]中任一項所記載之化合物、其鹽、或該等之水合物中之至少一者之醫藥組合物、及至少一種抗腫瘤藥。
[87]一種化合物，其表現出具有與Table1或Table2所記載者實質上類似之峰值位置之質子NMR。
本發明所提供之新穎之抗體-吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物複合體具有優異之抗腫瘤活性與安全性，因此作為抗腫瘤劑有用。又，本發明之PBD衍生物具有抗腫瘤活性，作為該複合體之藥物有用。進而，本發明之抗體識別腫瘤細胞或與腫瘤細胞結合，因此作為該複合體之抗體有用。
圖1係模式性地表示本發明之藥物-複合體((I)之分子)者。(a)表示藥物D，(b)表示連結基L，(c)表示N3-L(PEG)-，(d)表示N297糖鏈(此處，白色橢圓為NeuAc(Sia)，白色六邊形為Man，塗滿之六邊形為GlcNAc，白色菱形為Gal，白色倒三角形為Fuc)。(b)與(c)中(c)之疊氮基(黑色淚滴型)與(b)之間隔基(白色半圓)中之炔烴結構進行反應，形成三唑環而鍵結。Y 字型表示抗體Ab。又，於本模式圖中，為方便起見將N297糖鏈表示為N297-(Fuc)MSG，示出各N297糖鏈僅於一支鏈具有鍵結有具有疊氮基之PEG連結基(N3-L(PEG)-)之唾液酸而於另一支鏈之非還原末端不具有唾液酸之態樣，但亦可藉由採用N297-(Fuc)SG而為於兩支鏈之非還原末端具有鍵結有具有疊氮基之PEG連結基之唾液酸的態樣。只要未特別說明，則此種表示方法適用於本說明書整篇。
圖2係表示作為本發明之藥物-複合體之製造中間物的(Fucα1,6)GlcNAc-抗體(圖2之A之(II)之分子)、及MSG型糖鏈重建抗體(圖2之B之(III)之分子)之結構之模式圖。於兩圖中，Y字型與圖1同樣地表示抗體Ab。於圖2之A中，(e)表示僅由在Fuc之1位與6位進行α糖苷鍵結之GlcNAc構成之N297糖鏈。於圖2之B中，(d)表示與圖1相同之N297糖鏈，(f)為具有疊氮基之PEG連結基部分之結構，表示供於在末端與連結基L鍵結之疊氮基。具有疊氮基之PEG連結基之鍵結方式與圖1之說明相同。
圖3係由動物細胞中產生之抗體製造MSG型糖鏈重建抗體之步驟之模式圖。圖中之分子(II)、(III)與圖2同樣，分別表示(Fucα1,6)GlcNAc-抗體及MSG型糖鏈重建抗體。(IV)之分子為動物細胞中產生之抗體，為N297糖鏈不均勻之分子之混合物。圖3A表示藉由利用EndoS之類之水解酶對(IV)之不均勻之N297糖鏈進行處理而製作均勻之(Fucα1,6)GlcNAc-抗體(II)之步驟。圖3B表示對於抗體(II)之N297糖鏈之GlcNAc使用EndoS D233Q/Q303L變異體之類之糖基轉移酶，使MSG型糖鏈供體分子之糖鏈進行糖鏈轉移，藉此製作(III)之MSG型糖鏈重建抗體的步驟。此處所使用之MSG型糖鏈供體分子係MSG之非還原末端之唾液酸經具有疊氮基之 PEG連結基修飾者，於製作之MSG型N297糖鏈重建抗體中，亦如圖2B中所說明，非還原末端之唾液酸受到同樣之修飾。於圖3B中，為方便起見，作為供體分子示出MSG，但藉由以SG(10)作為糖鏈供體，關於(III)之重建抗體，合成於N297糖鏈之兩個非還原末端鍵結有具有疊氮基之連結基分子之糖鏈重建抗體。
圖4表示抗HER2抗體-藥物複合體ADC26、ADC19、ADC54對經皮下移植之作為人胃癌株之NCI-N87細胞之效果。
圖5表示抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、曲妥珠單抗、抗LPS抗體-藥物複合體ADC53對經皮下移植之作為人胃癌株之NCI-N87細胞之效果。
圖6表示抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、抗LPS抗體-藥物複合體ADC53或曲妥珠單抗-Tesirine(參考例1)對經皮下移植之作為人乳癌株之KPL-4細胞之效果。
圖7表示抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、或曲妥珠單抗-Tesirine(參考例1)對經皮下移植之作為人乳癌株之JIMT-1細胞之效果。
圖8表示抗CLDN6抗體-藥物複合體ADC40、或抗CLDN6抗體(H1L1)-Tesirine(參考例1)對經皮下移植之作為人卵巢癌株之OV-90細胞之效果。
圖9表示抗CLDN6抗體-藥物複合體ADC40、或抗CLDN6抗體(H1L1)-Tesirine(參考例1)對經皮下移植之作為人卵巢癌株之NIH：OVCAR-3細胞之效果。
圖10表示抗體-藥物複合體抗TROP2抗體-藥物複合體ADC50、或抗LPS抗體-藥物複合體ADC53對經皮下移植之作為人頭頸部癌細胞株之 FaDu細胞之效果。
圖11表示人CLDN6之全長胺基酸序列(序列編號1)及全長cDNA之鹼基序列(序列編號2)。
圖12表示人CLDN9之全長胺基酸序列(序列編號3)及全長cDNA之鹼基序列(序列編號4)。
圖13表示B1抗體輕鏈之CDRL1~3之胺基酸序列(序列編號5~7)。
圖14表示人類化B1抗體輕鏈L4之CDRL3之胺基酸序列(序列編號8)。
圖15表示B1抗體重鏈之CDRH1~3之胺基酸序列(序列編號9~11)。
圖16表示C7抗體輕鏈之CDRL1~3之胺基酸序列(序列編號12~14)。
圖17表示C7抗體重鏈之CDRH1~3之胺基酸序列(序列編號15~17)。
圖18表示編碼B1抗體輕鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列(序列編號18)及B1抗體輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列編號19)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖19表示編碼B1抗體重鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列(序列編號20)及B1抗體重鏈之可變區之胺基酸序列(序列編號21)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖20表示編碼C7抗體輕鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列(序列編號22)及C7抗體輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列編號23)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖21表示編碼C7抗體重鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列(序列編號 24)及C7抗體重鏈之可變區之胺基酸序列(序列編號25)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖22表示chB1輕鏈之胺基酸序列(序列編號28)及含有編碼chB1輕鏈之胺基酸序列之DNA序列的DNA片段(序列編號29)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖23表示chB1輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列編號30)及編碼chB1輕鏈可變區之核苷酸序列(序列編號31)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖24表示chB1重鏈之胺基酸序列(序列編號32)及編碼chB1重鏈之核苷酸序列(序列編號33)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖25表示chB1重鏈之可變區之胺基酸序列(序列編號34)及編碼chB1重鏈之可變區之核苷酸序列(序列編號35)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖26表示人類化抗體輕鏈hL1之胺基酸序列(序列編號36)及編碼人類化抗體輕鏈hL1之核苷酸序列(序列編號37)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖27表示人類化抗體輕鏈hL1之可變區之胺基酸序列(序列編號38)及編碼人類化抗體輕鏈hL1之可變區之核苷酸序列(序列編號39)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖28表示人類化抗體輕鏈hL2之胺基酸序列(序列編號40)及編碼人類化抗體輕鏈hL2之核苷酸序列(序列編號41)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖29表示人類化抗體輕鏈hL2之可變區之胺基酸序列(序列編號42)及 編碼人類化抗體輕鏈hL2之可變區之核苷酸序列(序列編號43)。
圖30表示人類化抗體輕鏈hL3之胺基酸序列(序列編號44)及編碼人類化抗體輕鏈hL3之核苷酸序列(序列編號45)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖31表示人類化抗體輕鏈hL3之可變區之胺基酸序列(序列編號46)及編碼人類化抗體輕鏈hL3之可變區之核苷酸序列(序列編號47)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖32表示人類化抗體輕鏈hL4之胺基酸序列(序列編號48)及編碼人類化抗體輕鏈hL4之核苷酸序列(序列編號49)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖33表示人類化抗體輕鏈hL4之可變區之胺基酸序列(序列編號50)及編碼人類化抗體輕鏈hL4之可變區之核苷酸序列(序列編號51)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖34表示人類化抗體重鏈hH1之胺基酸序列(序列編號52)及編碼人類化抗體重鏈hH1之核苷酸序列(序列編號53)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖35表示人類化抗體重鏈hH1之可變區之胺基酸序列(序列編號54)及編碼人類化抗體重鏈hH1之可變區之核苷酸序列(序列編號55)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖36表示人類化抗體重鏈hH2之胺基酸序列(序列編號56)及編碼人類化抗體重鏈hH2之核苷酸序列(序列編號57)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖37表示人類化抗體重鏈hH2之可變區之胺基酸序列(序列編號58)及 編碼人類化抗體重鏈hH2之可變區之核苷酸序列(序列編號59)。
圖38表示人類化抗體重鏈hH3之胺基酸序列(序列編號60)及編碼人類化抗體重鏈hH3之核苷酸序列(序列編號61)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖39表示人類化抗體重鏈hH3之可變區之胺基酸序列(序列編號62)及編碼人類化抗體重鏈hH3之可變區之核苷酸序列(序列編號63)。胺基酸序列中之下劃線表示CDR序列。
圖40表示B1抗體及C7抗體之利用流式細胞儀獲得之對人CLDN6及家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9之結合能力。
圖41表示B1抗體及C7抗體之利用Mab-ZAP獲得之抗體內化活性能。
圖42表示人類化抗CLDN6抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3之利用流式細胞儀獲得之對CLDN6及家族分子之結合能力。
圖43表示曲妥珠單抗輕鏈之胺基酸序列(序列編號64)及重鏈之胺基酸序列(序列編號65)。
圖44表示曲妥珠單抗變異體之輕鏈之胺基酸序列(序列編號73)及重鏈之胺基酸序列(序列編號75)。
圖45係表示作為人類嵌合化抗CLDN6抗體chB1之重鏈之chB1＿H、作為人類化抗體重鏈之hH1、hH2及hH3之胺基酸序列之比較的圖。「‧」表示與chB1＿H相同之胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基之位置表示經置換之胺基酸殘基。
圖46係表示作為人類嵌合化抗CLDN6抗體chB1之輕鏈之chB1＿L、作為人類化抗體輕鏈之hL1、hL2、hL3及hL4之胺基酸序列之比較的圖。 「‧」表示與chB1＿L相同之胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基之位置表示 經置換之胺基酸殘基。
圖47表示抗HER2抗體-藥物複合體ADC49及ADC55對經皮下移植之作為人乳癌株之KPL-4細胞之效果。
圖48表示抗HER2抗體-藥物複合體ADC55對經皮下移植之作為人乳癌株之JIMT-1細胞之效果。
圖49表示抗HER2抗體-藥物複合體ADC49及ADC55、抗LPS抗體-藥物複合體ADC53對經皮下移植之作為人胰腺癌株之CFPAC-1細胞之效果。
本發明之抗體-藥物複合體係使可識別或結合腫瘤細胞之抗體經由連結基結構部分與抗腫瘤性化合物結合而成之抗腫瘤性藥物。
於本發明中，作為「鹵素原子」，可列舉：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。
於本發明中，所謂「C1~C6烷基」意指碳數1~6之直鏈、支鏈之烷基。作為「C1~C6烷基」，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、正己基等。
於本發明中，所謂「C1~C6烷氧基」意指碳數1~6之具有直鏈、支鏈烷基之烷氧基。作為「C1~C6烷氧基」，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、正戊氧基、正己氧基等。
於本發明中，所謂「C1~C6烷硫基」意指碳數1~6之具有直鏈、支鏈烷基之烷硫基。作為「C1~C6烷硫基」，例如可列舉：甲硫 基、乙硫基、正丙硫基、異丙硫基、正丁硫基、異丁硫基、第二丁硫基、第三丁硫基、正戊硫基、正己硫基等。
於本發明中，所謂「3~5員之飽和烴環」意指碳數3~5之飽和環狀烴基。作為「3~5員之飽和烴環」，例如可列舉：環丙基、環丁基、環戊基。
於本發明中，所謂「C3~C5環烷氧基」意指碳數3~5之具有飽和環狀烴基之環烷氧基。作為「C3~C5環烷氧基」，例如可列舉：環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基。
於本發明中，所謂「3~5員之飽和雜環」，可列舉：1,3-環氧丙烷、氮雜環丁烷、環硫丙烷、四氫呋喃、吡咯啶等。
於本發明中，所謂「芳基」，可列舉：苯基、苄基、茚基、萘基、茀基、蒽基、菲基等。
於本發明中，所謂「雜芳基」，可列舉：噻吩基、吡咯基、吡唑基、三唑基、
Figure 107134301-A0305-02-0053-356
唑基、
Figure 107134301-A0305-02-0053-357
二唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、嗒
Figure 107134301-A0305-02-0053-358
基、吡
Figure 107134301-A0305-02-0053-359
基、喹啉基、喹
Figure 107134301-A0305-02-0053-360
啉基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并呋喃基等。
於本發明中，所謂「6員之雜環」，可列舉：吡啶環、嘧啶環、嗒
Figure 107134301-A0305-02-0053-361
環等。
於本發明中，所謂「螺鍵結之」，如實施例所例示，意指A及A所鍵結之吡咯啶環或者E及E所鍵結之吡咯啶環形成螺環。
[抗體-藥物複合體]
本發明之抗體-藥物複合體係以下式表示。
[化50]
Figure 107134301-A0305-02-0054-348
m1表示抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之藥物結合數，Ab表示抗體或該抗體之功能性片段，L表示將Ab與D連結之連結基，D表示藥物。
<藥物>
對與本發明之抗體-藥物複合體結合之藥物D進行說明。本發明之藥物D較佳為抗腫瘤性化合物。本抗腫瘤性化合物中連結基之一部分或全部於腫瘤細胞內被切斷，抗腫瘤性化合物部分游離而表現出抗腫瘤效果。若連結基於與藥物之結合部分被切斷，則抗腫瘤性化合物以本來之結構游離，而發揮出其本來之抗腫瘤效果。
本發明之抗體-藥物複合體中之抗腫瘤性化合物係通式(V)
Figure 107134301-A0305-02-0054-350
所表示之吡咯并苯二氮呯衍生物(PBD衍生物)。以下進行說明。
星號表示與連結基L鍵結。
n1表示2至8之整數，較佳為2至6之整數，更佳為3至5之整數。
上述n1為2至8之整數、較佳為2至6之整數、更佳為3至5之整數所表示之烷基鏈可含有雙鍵。
A表示螺鍵結之3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環，較佳為3~5員之飽和烴環(環丙烷、環丁烷、環戊烷)，更佳為環丙烷、環丁烷，最佳為環丙烷。
上述螺鍵結之3~5員之飽和烴環可經1~4個鹵素原子取代，較佳可經1或2個氟原子取代(例如，2,2-二氟環丙烷等)。
R1、R2各自獨立地表示C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、氫原子、羥基、硫醇基、C1~C6烷硫基、鹵素原子或-NR'R"，較佳為C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、羥基，更佳為C1~C3烷氧基，最佳為甲氧基。
R3、R4及R5表示下述(i)~(iii)。
(i)於R3及R4如以下所示般，一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵之情形時，
Figure 107134301-A0305-02-0055-351
R5表示可具有選自群1之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、可具有選自群2之1個或複數個取代基之C1~C6烷基，較佳為上述可具有選自群1之1個或複數個取代基之芳基。
R5之「可具有選自群1之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基」之「芳基」較佳為苯基、萘基，更佳為苯基。
R5之「可具有選自群1之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基」之「雜芳基」較佳為噻吩基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、喹
Figure 107134301-A0305-02-0055-362
啉基、苯并噻吩基，更佳為2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基，進而較佳為3-吡啶基、3-噻吩基。
作為上述R5之芳基或雜芳基之取代基，可列舉以下a)~j)。
a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷氧基； b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-NR'R"、-C(=NR')-NR"R'''及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C6烷基；c)鹵素原子；d)C3~C5環烷氧基；e)C1~C6烷硫基；f)-NR'R"；g)-C(=NR')-NR"R'''；h)-NHC(=NR')-NR"R'''；i)-NHCOR'；j)羥基，此處，b)、f)~i)中之R'、R"、及R'''各自獨立地表示氫原子、C1~C6烷基，較佳為各自獨立為氫原子或C1~C3烷基。
a)~j)較佳為以下。
a)為可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷氧基，更佳為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、三氟甲氧基，進而較佳為甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基，最佳為甲氧基。
b)為可經1~3個鹵素原子、羥基、-OCOR'、-C(=NR')-NR"R'''、-NHC(=NR')-NR"R'''取代之C1~C3烷基，R'、R"、及R'''各自獨立為氫原子或C1~C3烷基，更佳為可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-C(=NR')-NR"R'''、-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C3烷基，R'、R"、及R'''各自獨立為氫原子、甲基，進而較佳為甲基、乙基、正丙基、異丙基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、羥甲基、-CH2OCOMe、-CH2-NHC(=NH)-NH2、-CH2-NHC(=NMe)-NH2。
c)為鹵素原子，較佳為氟原子、氯原子。
d)為C3~C5環烷氧基，更佳為環丙氧基。
e)為C1~C3烷硫基，更佳為甲硫基、乙硫基。
f)為-NR'R"，R'及R"各自獨立為氫原子或C1~C3烷基，更佳為-NH2、-NHMe、-NMe2、-NHEt、-NEt2。
g)為-C(=NR')-NR"R'''，R'、R"、及R'''各自獨立為氫原子或C1~C3烷基，更佳為-C(=NH)-NH2、-C(=NMe)-NH2。
h)為-NHC(=NR')-NR"R'''，R'、R"及R'''各自獨立為氫原子或C1~C3烷基，更佳為-NHC(=NH)-NH2、-NHC(=NMe)-NH2。
i)為-NHCOR'，R'為氫原子或C1~C3烷基，更佳為-NHCOMe、-NHCOEt，j)為羥基。
R5之芳基(較佳為苯基)或雜芳基(較佳為吡啶基)之取代基之位置可為任意，於取代基為複數個之情形時，該等可相同亦可不同。
R5為芳基之情形時之取代基較佳為a)、b)、d)、g)、h)、j)，更佳為a)、b)、d)、j)。
於R5為苯基之情形時，取代基之位置可為任意，取代基可存在複數個，較佳為取代基之位置為3位或/及4位，且取代基為1個或2個，更佳為4位，且取代基為1個。
於R5為萘基之情形時，取代基之位置可為任意，取代基可存在複數個，較佳為取代基之位置為6位，且取代基為1個。
於R5為苯基之情形時，更佳為苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基苯基、4-(正丙氧基)-苯基、4-(異丙氧基)-苯基、4-環 丙氧基-苯基、4-三氟甲基苯基、4-羥基甲基-苯基、4-乙醯氧基甲基-苯基、4-甲脒基(carbamimido)醯胺甲基-苯基，進而較佳為苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-環丙氧基-苯基、4-羥基甲基-苯基、4-乙醯氧基甲基-苯基、4-甲脒基醯胺甲基-苯基、4-三氟甲基苯基。
於R5為萘基之情形時，更佳為萘基、6-甲氧基-2-萘基。
最佳為4-甲氧基苯基。
R5為雜芳基之情形時之取代基較佳為a)、b)、d)、g)、h)、j)，更佳為a)、b)。
於R5為雜芳基之情形時，取代基之位置可為任意，於3-吡啶基之情形時，較佳為6位或/及5位，於2-吡啶基之情形時，較佳為5位或/及4位、或者5位或/及6位，於4-吡啶基之情形時，較佳為2位或/及6位。
R5為雜芳基之情形時之取代基可存在複數個，較佳為1個或2個，較佳為1個。
於R5為吡啶基之情形時，較佳為6-甲氧基-3-吡啶基、6-甲基-3-吡啶基。
於R5為3-噻吩基或6-喹
Figure 107134301-A0305-02-0058-363
啉基之情形時，較佳為未經取代。
R5之「可具有選自群2之1個或複數個取代基之C1~C6烷基」之「C1~C6烷基」較佳為C1~C3烷基，更佳為甲基、乙基。
R5之「可具有選自群2之1個或複數個取代基之C1~C6烷基」之取代基為鹵素原子、羥基、C1~C6烷氧基(較佳為C1~C3烷氧基)，較佳為羥基、甲氧基、乙氧基，更佳為羥基。
(ii)於R3表示氫原子之情形時，R4及R5如以下所示般，與R4及R5所鍵結之碳原子一起形成3~5員之 飽和烴環或3~5員之飽和雜環，或者形成CH2=。
Figure 107134301-A0305-02-0059-57
 或
Figure 107134301-A0305-02-0059-58
上述3~5員之飽和烴環可經1~4個鹵素原子取代，較佳可經1或2個氟原子取代。
R4及R5較佳為一起形成3~5員之飽和烴環或CH2=，更佳為形成環丙烷、環丁烷或CH2=(環外亞甲基)，進而較佳為環丙烷。
於R4及R5一起形成3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環之情形時，較佳為與A相同之3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環。更佳為A為3~5員之飽和烴環，且R4及R5一起形成3~5員之飽和烴環，進而較佳為A為環丙烷環，且R4及R5一起形成環丙烷環。
(iii)R3、R4及R5與R3所鍵結之碳原子以及R4及R5所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群3之1個或複數個取代基之苯環或6員之雜環。
下式表示R3及R4一起形成可具有1個或複數個取代基之苯環之情形。
[化55]
Figure 107134301-A0305-02-0060-59
上述苯環或雜環之取代基之位置可為任意，於取代基為複數個之情形時，該等可相同亦可不同。
苯環或雜環之取代基為鹵素原子、可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷基或C1~C6烷氧基，較佳為鹵素原子、可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷基或C1~C3烷氧基，更佳為鹵素原子、甲基、甲氧基。
「可具有1個或複數個取代基之苯環或6員之雜環」較佳為未經取代之苯環。
R3、R4及R5最佳為上述(i)。
R6、R7均表示氫原子，或者R6及R7一起表示亞胺鍵(C=N)。
R8為羥基或C1~C3烷氧基，較佳為羥基、甲氧基，更佳為羥基。R8可為亞硫酸氫鹽加成物(OSO3M(M為金屬陽離子))。
R8由於鍵結於不對稱碳原子上，故而具有下述部分結構(Va)或(Vb)所表示之立體組態。波形線表示與通式(V)中之Y鍵結，星號表示與L鍵結。
Figure 107134301-A0305-02-0060-60
X、Y各自獨立為氧原子、氮原子、硫原子，較佳為氧原 子。
本發明之藥物D較佳為選自下群中之一種化合物。
Figure 107134301-A0305-02-0061-62
Figure 107134301-A0305-02-0061-63
Figure 107134301-A0305-02-0061-64
<連結基結構>
對本發明之抗體-藥物複合體中使抗腫瘤性藥物結合於抗體之連結基結構進行說明。
該連結基L係以下式表示：-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*。
星號表示與藥物D之N10'位之氮原子鍵結，Lb表示使Ab之糖鏈或經 重建之糖鏈與La鍵結之間隔基、或者使抗體Ab之胺基酸殘基(例如，半胱胺酸、離胺酸等)之側鏈與La鍵結之間隔基。
B表示苯基或雜芳基，較佳為1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基、2,5-噻吩基，更佳為1,4-苯基。
Lp表示包含可在活體內或標的細胞中切斷之胺基酸序列之連結基。Lp例如可藉由酯酶或肽酶等酶之作用而被切斷。
Lp係包含2至7個(較佳為2至4個)胺基酸之肽殘基。即包含2至7個胺基酸進行肽結合而成之寡肽之殘基。
Lp於N末端鍵結於Lb-La-之La之羰基上，於C末端與連結基之-NH-B-CH2-O(C=O)-部分之胺基(-NH-)形成醯胺鍵。藉由上述酯酶等酶將Lp之C末端與-NH-間之鍵切斷。
構成Lp之胺基酸並無特別限定，例如為L-或D-胺基酸，較佳為L-胺基酸。又，除了α-胺基酸以外，亦可為β-丙胺酸、ε-胺基己酸、γ-胺基丁酸等之結構之胺基酸，進而亦可為例如經N-甲基化之胺基酸等非天然型之胺基酸。
Lp之胺基酸序列並無特別限定，作為構成之胺基酸，可列舉：甘胺酸(Gly，G)、纈胺酸(Val，V)、丙胺酸(Ala，A)、苯丙胺酸(Phe，F)、麩胺酸(Glu，E)、異白胺酸(Ile，I)、脯胺酸(Pro，P)、瓜胺酸(Cit)、白胺酸(Leu，L)、絲胺酸(Ser，S)、離胺酸(Lys，K)及天冬胺酸(Asp，D)等。該等中，較佳為甘胺酸(Gly，G)、纈胺酸(Val，V)、丙胺酸(Ala，A)、瓜胺酸(Cit)。
該等胺基酸可重複，具有含有任意選擇之胺基酸之胺基酸序列。又，可根據胺基酸之種類而對藥物游離之模式進行控制。
作為連結基Lp之具體例，可列舉：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-、-EGGVA、-PI-、-GGF-、DGGF-、(D-)D-GGF-、-EGGF-、-SGGF-、-KGGF-、-DGGFG-、-GGFGG-、-DDGGFG-、-KDGGFG-、-GGFGGGF-。
此處，上述『(D-)V』意指D-纈胺酸，『(D-)P』意指D-脯胺酸，『(D-)D』意指D-天冬胺酸。
連結基Lp較佳為以下。
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-
連結基Lp更佳為以下。
-GGVA-、-GGVCit-、-VA-
Lb表示：i)使抗體Ab之糖鏈或經重建之糖鏈與La鍵結之間隔基；或ii)使抗體Ab之胺基酸殘基(例如，半胱胺酸、離胺酸等)之側鏈與La鍵結之間隔基。
於Lb為i)之情形時，La表示選自以下之群之任一者。
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-、-(CH2)n4-O-C(=O)-
此處，式中，n2表示1~3之整數(較佳為1或2)，n3表示1~5之整數(較佳為2~4之整數，更佳為2或4)，n4表示0~2之整數(較佳為0或1)。
於Lb為i)之情形時，La較佳為表示選自以下之群之任一者，-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及-OC(=O)-，La更佳為-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、或-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-。
Lb之間隔基並無特別限定，例如可列舉下式所表示之間隔基。
Figure 107134301-A0305-02-0064-65
Figure 107134301-A0305-02-0064-66
Figure 107134301-A0305-02-0064-67
於上述所示之Lb之各結構式中，星號表示與La之左端之-(C=O)、或- (CH2)n4鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重建之糖鏈鍵結。
於上述所示之Lb(Lb-1、Lb-2或Lb-3)之各結構式中，藉由疊氮基與DBCO之點擊反應(click reaction)所形成之三唑環部位具有幾何異構結構，於1個Lb中存在該等2種結構之任一種，或該等2種結構以該等之混合物之形式存在於1個Lb中。於本發明之抗體-藥物複合體1分子中存在m1個『-L-D』，m1個『-L-D』各自之L中之各Lb(Lb-1、Lb-2或Lb-3)中存在該等2種結構之任一種，或混合存在該2種結構。
於Lb為i)之情形時，L較佳為以-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*表示，B為1,4-苯基，Lp表示選自以下之群之任一者，-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-，La表示選自以下之群之任一者，-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-，Lb表示上述所示之Lb之任一結構式。
於Lb為i)之情形時，L更佳為選自以下之群之任一者。
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、 -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
此處，Z1表示上述Lb之以下所示之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0066-68
Z2表示上述Lb之以下所示之結構式：[化64]
Figure 107134301-A0305-02-0067-69
Z3表示上述Lb之以下所示之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0067-70
B為1,4-苯基。
L最佳為以下之任一者。
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
此處，B為1,4-苯基，Z1為上述Lb之以下所示之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0067-71
於Lb為ii)之情形時，於該胺基酸殘基為半胱胺酸殘基之情形時，Lb之間隔基並無特別限定，例如可列舉-(丁二醯亞胺-3-基-N)-。
『-(丁二醯亞胺-3-基-N)-』具有下式所表示之結構，
Figure 107134301-A0305-02-0068-72
於上述所示之結構式中，星號表示與La鍵結。波形線表示經由硫醇鍵而鍵結於抗體之半胱胺酸殘基之硫醇基上，亦可為部位特異性(Site specific)之半胱胺酸複合(RSC Adv.,2017,7,24828-24832 etc)。
於Lb為ii)之情形時，L係以-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*表示，B為1,4-苯基，Lp表示-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、或-GGFG-之任一者，La表示-(CH2)n9-C(=O)-、或-(CH2CH2)n10-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n11-CH2CH2-C(=O)-，n9表示2~7之整數(較佳為2~5之整數，更佳為2或5)，n10表示1~3之整數(較佳為1)，n11表示6~10之整數(較佳為8)，Lb表示-(丁二醯亞胺-3-基-N)-。
於Lb為ii)之情形時，L較佳為以下之任一者。
-(丁二醯亞胺-3-基-N)-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-(丁二醯亞胺-3-基-N)-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、或-(丁二醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2- C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
此處，B為1,4-苯基。
認為若本發明之抗體-藥物複合體於其大部分轉移至腫瘤細胞內後連結基部分(例如，Lp)被酶等切斷而被活性化，則藥物D部分游離(以下稱為游離藥物(下文說明))，發揮出抗腫瘤活性。
因此，本發明之抗體-藥物複合體較佳為於腫瘤細胞外穩定。
<游離藥物及製造中間物>
本發明之抗體-藥物複合體之中間物及游離藥物係以下式表示，
Figure 107134301-A0305-02-0069-73
以下進行說明。
本發明之游離藥物係於轉移至腫瘤細胞內後，抗體-藥物複合體中之連結基L部分被切斷而生成。例如，可列舉實施例45~54、150~152之藥物1~16。
本發明之抗體-藥物複合體係使用本製造中間物所製作。
本發明之抗體-藥物複合體中之游離藥物係如下情形：(a)關於R16、R17，R16及R17一起形成亞胺鍵(N=C)。
本發明之抗體-藥物複合體中之製造中間物係(b)R16以J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*
表示之情形。
因此，式中，l與上述n1、E與上述A、R9與上述R1、R10與上述R2、 R11與上述R3、R12與上述R4、R13與上述R5、R14與上述R6、R15與上述R7、V與上述X、W與上述Y、群7與上述群1、群8與上述群2、群9與上述群3、群10與上述群4、群11與上述群5、群12與上述群6之含義相同。
l表示2至8之整數，較佳為2至6之整數，更佳為3至5之整數。
上述l為2至8之整數、較佳為2至6之整數、更佳為3至5之整數所表示之烷基鏈可含有雙鍵。
E表示螺鍵結之3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環，較佳為3~5員之飽和烴環(環丙烷、環丁烷、環戊烷)，更佳為環丙烷、環丁烷，最佳為環丙烷。
上述螺鍵結之3~5員之飽和烴環可經1~4個鹵素原子取代，較佳可經1或2個氟原子取代(例如，2,2-二氟環丙烷等)。
R9、R10各自獨立地表示C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、氫原子、羥基、硫醇基、C1~C6烷硫基、鹵素原子或-NR'R"，較佳為C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、羥基，更佳為C1~C3烷氧基，最佳為甲氧基。
R11、R12及R13表示下述(i)~(iii)。
(i)於R11及R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵之情形時，R13表示可具有選自群7之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、可具有選自群8之1個或複數個取代基之C1~C6烷基，較佳為上述可具有選自群7之1個或複數個取代基之芳基。
R13之「可具有選自群7之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基」之「芳基」較佳為苯基、萘基，更佳為苯基。
R13之「可具有選自群7之1個或複數個取代基之芳基或雜 芳基」之「雜芳基」較佳為噻吩基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、喹
Figure 107134301-A0305-02-0071-364
啉基、苯并噻吩基，更佳為2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基，進而較佳為3-吡啶基、3-噻吩基。
作為上述R13之芳基或雜芳基之取代基，可列舉以下a)~j)。
a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷氧基；b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-NR'R"、-C(=NR')-NR"R'''及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C6烷基；c)鹵素原子；d)C3~C5環烷氧基；e)C1~C6烷硫基；f)-NR'R"；g)-C(=NR')-NR"R'''；h)-NHC(=NR')-NR"R'''；i)-NHCOR'；j)羥基。
此處，b)、f)~i)中之R'、R"、及R'''各自獨立地表示氫原子、C1~C6烷基，較佳為各自獨立為氫原子或C1~C3烷基。
a)~j)較佳為以下。
a)為可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷氧基，更佳為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、三氟甲氧基，進而較佳為甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基，最佳為甲氧基。
b)為可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-C(=NR')- NR"R'''、-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C3烷基，R'、R"、及R'''各自獨立為氫原子或C1~C3烷基，更佳為可經1~3個鹵素原子、羥基、-OCOR'、-C(=NR')-NR"R'''、-NHC(=NR')-NR"R'''取代之C1~C3烷基，R'、R"、及R'''各自獨立為氫原子、甲基，進而較佳為甲基、乙基、正丙基、異丙基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、羥甲基、-CH2OCOMe、-CH2-NHC(=NH)-NH2、-CH2-NHC(=NMe)-NH2。
c)為鹵素原子，較佳為氟原子、氯原子。
d)為C3~C5環烷氧基，更佳為環丙氧基。
e)為C1~C3烷硫基，更佳為甲硫基、乙硫基。
f)為-NR'R"，R'及R"各自獨立為氫原子或C1~C3烷基，更佳為-NH2、-NHMe、-NMe2、-NHEt、-NEt2。
g)為-C(=NR')-NR"R'''，R'、R"、及R'''各自獨立為氫原子或C1~C3烷基，更佳為-C(=NH)-NH2、-C(=NMe)-NH2。
h)為-NHC(=NR')-NR"R'''，R'、R"、及R'''各自獨立為氫原子或C1~C3烷基，更佳為-NHC(=NH)-NH2、-NHC(=NMe)-NH2。
i)為-NHCOR'，R'為氫原子或C1~C3烷基，更佳為-NHCOMe、-NHCOEt，
j)為羥基。
R13之芳基(較佳為苯基)或雜芳基(較佳為吡啶基)之取代基之位置可為任意，於取代基為複數個之情形時，該等可相同亦可不同。
R13為芳基之情形時之取代基較佳為a)、b)、d)、g)、h)、j)，更佳為a)、b)、d)、j)。
於R13為苯基之情形時，取代基之位置可為任意，取代基可存在複數個，較佳為取代基之位置為3位或/及4位，且取代基為1個或2個，更佳為4位，且取代基為1個。
於R5為萘基之情形時，取代基之位置可為任意，取代基可存在複數個，較佳為取代基之位置為6位，且取代基為1個。
於R13為苯基之情形時，更佳為苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基苯基、4-(正丙氧基)-苯基、4-(異丙氧基)-苯基、4-環丙氧基-苯基、4-三氟甲基苯基、4-羥基甲基-苯基、4-乙醯氧基甲基-苯基、4-甲脒基醯胺甲基-苯基，進而較佳為苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-環丙氧基-苯基、4-羥基甲基-苯基、4-乙醯氧基甲基-苯基、4-甲脒基醯胺甲基-苯基、4-三氟甲基苯基。
於R13為萘基之情形時，更佳為萘基、6-甲氧基-2-萘基。
最佳為4-甲氧基苯基。
R13為雜芳基之情形時之取代基較佳為a)、b)、d)、g)、h)、j)，更佳為a)、b)。
於R13為雜芳基之情形時，取代基之位置可為任意，於3-吡啶基之情形時，較佳為6位或/及5位，於2-吡啶基之情形時，較佳為5位或/及4位、或者5位或/及6位，於4-吡啶基之情形時，較佳為2位或/及6位。
R13為雜芳基之情形時之取代基可存在複數個，較佳為1個或2個，較佳為1個。
於R13為吡啶基之情形時，較佳為6-甲氧基-3-吡啶基、6-甲基-3-吡啶基。
於R13為3-噻吩基或6-喹
Figure 107134301-A0305-02-0074-365
啉基之情形時，較佳為未經取代。
R13之「可具有選自群8之1個或複數個取代基之C1~C6烷基」之「C1~C6烷基」較佳為C1~C3烷基，更佳為甲基、乙基。
R13之「可具有選自群8之1個或複數個取代基之C1~C6烷基」之取代基為鹵素原子、羥基、C1~C6烷氧基(較佳為C1~C3烷氧基)，較佳為羥基、甲氧基、乙氧基，更佳為羥基。
(ii)於R11表示氫原子之情形時，R12及R13與R12及R13所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環，或者形成CH2=。
上述3~5員之飽和烴環可經1~4個鹵素原子取代，較佳可經1或2個氟原子取代。
R12及R13較佳為一起形成3~5員之飽和烴環或CH2=，更佳為形成環丙烷、環丁烷或CH2=(環外亞甲基)，進而較佳為環丙烷。
於R12及R13一起形成3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環之情形時，較佳為與E相同之3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環。更佳為E為3~5員之飽和烴環，且R12及R13一起形成3~5員之飽和烴環，進而較佳為E為環丙烷環，且R12及R13一起形成環丙烷環。
(iii)R11、R12及R13與R11所鍵結之碳原子以及R12及R13所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群9之1個或複數個取代基之苯環或6員之 雜環。
上述苯環或雜環之取代基之位置可為任意，於取代基為複數個之情形時，該等可相同亦可不同。
苯環或雜環之取代基為鹵素原子、可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷基或C1~C6烷氧基，較佳為鹵素原子、可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷基或C1~C3烷氧基，更佳為鹵素原子、甲基、甲氧基。
「可具有1個或複數個取代基之苯環或6員之雜環」較佳為未經取代之苯環。
R11、R12及R13最佳為上述(i)。
R14、R15均表示氫原子，或者R14及R15一起表示亞胺鍵(C=N)。
V、W各自獨立為氧原子、氮原子、硫原子，較佳為氧原子。
關於R16、R17，(a)R16及R17一起形成亞胺鍵(N=C)；或(b)R16表示J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*，R17係以羥基或C1~C3烷氧基表示。
於上述(b)R16為J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*之情形時，式中，星號表示鍵結於上述式所表示之吡咯并苯二氮呯環之N10'位上。
B'表示苯基或雜芳基，較佳為1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基、2,5-噻吩基，更佳為1,4-苯基。
Lp'表示包含可在活體內或標的細胞中切斷之胺基酸序列之 連結基。Lp例如可藉由酯酶或肽酶等酶之作用而被切斷。
作為連結基Lp'之具體例，可列舉：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-、-EGGVA、-PI-、-GGF-、DGGF-、(D-)D-GGF-、-EGGF-、-SGGF-、-KGGF-、-DGGFG-、-GGFGG-、-DDGGFG-、-KDGGFG-、-GGFGGGF-。
此處，上述『(D-)V』意指D-纈胺酸，『(D-)P』意指D-脯胺酸，『(D-)D』意指D-天冬胺酸。
連結基Lp'較佳為以下。
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-
更佳可列舉-GGVA-、-GGVCit-、-VA-。
La'表示選自以下之群之任一者。
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-、-(CH2)n8-O-C(=O)-、-(CH2)n12-C(=O)-、及-(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-
此處，式中，n6表示1~3之整數(較佳為1或2)，n7表示1~5之整數(較佳為2~4之整數，更佳為2或4)，n8表示0~2之整數(較佳為0或1)，n12表示2~7之整數(較佳為2~5之整數，更佳為2或5)，n13表示1~3之整數 (較佳為1)，n14表示6~10之整數(較佳為8)。
La'較佳為表示選自以下之群之任一者，-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-、-(CH2)2-C(=O)-、-(CH2)5-C(=O)-、及-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-。
La'更佳為-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、或-(CH2)5-C(=O)-。
J只要為包含與疊氮基進行反應而形成1,2,3-三唑環之炔烴結構之環狀結構，則無特別限定，例如可列舉下式所表示之化合物。
Figure 107134301-A0305-02-0077-74
於上述所示之J之各結構式中，星號表示與La'之左端之-(C=O)或-(CH2)n8鍵結。
或者J可為與抗體Ab之胺基酸殘基(例如，半胱胺酸、離胺酸等)之側鏈鍵結之化合物或鹵素原子，例如可列舉下式所表示之順丁烯二醯亞胺基。
[化70]
Figure 107134301-A0305-02-0078-75
於上述所示之順丁烯二醯亞胺基中，星號表示與La'之左端之-(CH2)n12、或-(CH2CH2)n13鍵結。
R16較佳為以J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*表示，B'為1,4-苯基，Lp'表示選自以下之群之任一者：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-，La'表示選自以下之群之任一者：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-OC(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-(CH2)5-C(=O)-、及-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-，J表示以下所示之任一結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0078-76
此處，於J之結構式中，星號表示與La'鍵結。
R16更佳為選自以下之群之任一者。
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、及J4-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-
此處，J1、J2、J3、J4表示以下所示之結構式：[化72]
Figure 107134301-A0305-02-0080-77
此處，於J1、J2、J3及J4之結構式中，星號表示與鄰接於J1、J2、J3或J4之基鍵結，B'為1,4-苯基。
R16最佳為以下之任一者。
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-
此處，B'為1,4-苯基，J1、J4為上述J之以下所示之結構式：
Figure 107134301-A0305-02-0080-78
此處，於J1及J4之結構式中，星號表示與鄰接於J1或J4之基鍵結。
R17為羥基或C1~C3烷氧基，較佳為羥基、甲氧基。
R17可為亞硫酸氫鹽加成物(OSO3M(M為金屬陽離子))。
R17由於鍵結於不對稱碳原子上，故而具有下述部分結構(VIa)或(VIb)所表示之立體組態。波形線表示與通式(VI)所表示之中間物及游離藥物中之W鍵結。
Figure 107134301-A0305-02-0081-80
游離藥物較佳為選自下群之一種化合物。
Figure 107134301-A0305-02-0081-81
本游離藥物亦存在於鍵結有連結基L之一部分之狀態下於腫瘤細胞內游離之情形，但為即便於該狀態下亦發揮出優異之抗腫瘤效果之優異之藥物。本游離藥物亦存在於轉移至腫瘤細胞內後進一步被氧化而R16、R17脫氫之情況，但即便於該狀態下亦發揮出優異之抗腫瘤效果。
製造中間物較佳為選自下群之一種化合物。
[化76]
Figure 107134301-A0305-02-0082-352
Figure 107134301-A0305-02-0082-353
製造中間物較佳為選自下群之一種化合物。
Figure 107134301-A0305-02-0082-83
Figure 107134301-A0305-02-0082-84
Figure 107134301-A0305-02-0083-85
Figure 107134301-A0305-02-0083-90
<抗體>
於本發明中，「癌」與「腫瘤」係以相同之含義使用。
於本發明中，所謂「基因」意指含有編碼蛋白質之胺基酸之核苷酸序列的核苷酸或核苷酸序列、或者其互補鏈，例如作為含有編碼蛋白質之胺基酸之核苷酸序列之核苷酸序列或其互補鏈的多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、RNA等包含於「基因」之含義中。作為本發明之「CLDN6基因」，例如可列舉含有編碼CLDN6蛋白質之胺基酸序列之核苷酸序列的DNA、mRNA、cDNA、cRNA等。
於本發明中，「核苷酸」、「多核苷酸」或「核苷酸序列」與「核酸」含義相同，例如DNA、RNA、探針、寡核苷酸、多核苷酸、引子等亦包含於「核苷酸」或「核苷酸序列」之含義中。
於本發明中，「多肽」、「肽」、「蛋白質」係無區別地使用。
於本發明中，「CLDN6」以與CLDN6蛋白質相同之含義使用。
於本發明中，「細胞」亦包括動物個體內之細胞、培養細胞。
於本發明中，所謂「細胞殺傷活性」係指以任何形式使細胞發生病理性之變化，不僅限於引起直接之外傷，而係指引起DNA之切斷或鹼基之二聚物之形成、染色體之切斷、細胞分裂裝置之損傷、各種酶活性之降低等所有細胞之結構或功能上之損傷。
於本發明中，所謂「抗體之功能性片段」亦稱為「抗體之抗原結合片段」，意指具有與抗原之結合活性之抗體之部分片段，包括由Fab、F(ab')2、Fv、scFv、雙功能抗體(diabody)、線性抗體及抗體片段所形成之多特異性抗體等。又，於還原條件下對F(ab')2進行處理所獲得之抗體之可變區之一價片段即Fab'亦包含於抗體之抗原結合片段。但只要具有與抗原之結合能力，則該等分子並無限定。又，該等抗原結合片段不僅包含藉由適當之酶對抗體蛋白質之全長分子進行處理而成者，而且亦包含使用以基因工程方式經修飾之抗體基因於適當之宿主細胞中產生之蛋白質。
本發明之功能性片段包含保持受到利用IgG重鏈之Fc區中良好保存之N結合型糖鏈之修飾之天冬醯胺(Asn297)及其周邊之胺基酸，且具有與抗原之結合能力的功能性片段。
於本發明中，所謂「表位」意指特定之抗體(例如，抗CLDN6抗體)所結合之抗原之部分肽或部分立體結構(例如，CLDN6之部分肽或部分立體結構)。作為上述部分肽(例如，CLDN6之部分肽)之表位可藉由免疫分析法等業者熟知之方法決定。
本發明中之所謂「CDR」意指互補性決定區(CDR， Complementarity determining region)。已知抗體分子之重鏈及輕鏈分別有3處CDR。CDR亦稱為高變區(hypervariable region)，係處於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內且一級結構之變異性尤其高之部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈之一級結構中分離於3處。於本說明書中，關於抗體之CDR，將重鏈之CDR自重鏈胺基酸序列之胺基末端側起表述為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之CDR自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側起表述為CDRL1、CDRL2、CDRL3。該等部位於立體結構上互相接近，決定對所結合之抗原之特異性。
於本發明中，所謂「於嚴格之條件下進行雜交」係指於市售之雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司)中在68℃下進行雜交，或者於如下條件或與其同等之條件下進行雜交：使用固定有DNA之過濾器，於0.7~1.0M之NaCl存在下在68℃下進行雜交後，使用0.1~2倍濃度之SSC(Saline Sodium Citrate，鹽水檸檬酸鈉)溶液(所謂1倍濃度SSC包含150mM之NaCl、15mM之檸檬酸鈉)於68℃下洗淨，藉此可鑑定。
於本發明中，所謂「1~數個」意指1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個或1~2個。
於本發明中，有時將識別或結合CLDN6或CLDN6及CLDN9之抗體分別標記為「抗CLDN6抗體」、「抗CLDN6/CLDN9抗體」。該抗體包括嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體等。有時將識別或結合CLDN6及CLDN9之抗體標記為「抗CLDN6抗體」。
本發明之抗體-藥物複合體所使用之抗體意指免疫球蛋白，為含有與抗原免疫特異性地結合之抗原結合部位之分子。作為本發明之抗 體，可為IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY之任意類型，較佳為IgG。又，作為亞型，可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2之任意者，較佳為IgG1、IgG2、IgG4。於使用IgG1或IgG4之情形時，可藉由將恆定區之胺基酸殘基之一部分置換而調整效應功能(參照WO88/07089、WO94/28027、WO94/29351)。
抗體可源自任意物種，較佳可例示人類、大鼠、小鼠及兔。於源自人類以外之物種之情形時，較佳為使用周知之技術進行嵌合化或人類化。本發明之抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體，較佳為單株抗體。單株抗體包括大鼠抗體、小鼠抗體、兔抗體等源自非人類動物之單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、該等之功能性片段、或該等之修飾體。
本發明之抗體較佳為可以腫瘤細胞為標的之抗體。即，由於經由連結基使其結合具有抗腫瘤活性之藥物，故而作為抗體，較佳為具備可識別腫瘤細胞之特性、可結合於腫瘤細胞之特性、納入至腫瘤細胞內進行內化之特性、進而傷害腫瘤細胞之特性之一種或一種以上之特性。
抗體對腫瘤細胞之結合性可使用流式細胞儀加以確認。抗體於腫瘤細胞內之納入可使用如下分析進行確認：(1)使用與治療抗體結合之二次抗體(螢光標記)並利用螢光顯微鏡將納入至細胞內之抗體可視化之分析(Cell Death and Differentiation(2008)15,751-761)；(2)使用與治療抗體結合之二次抗體(螢光標記)測定納入至細胞內之螢光量之分析(Molecular Biology of the Cell Vol.15,5268-5282,December 2004)；或者(3)Mab-ZAP分析，即使用與治療抗體結合之抗毒素，若納入至細胞內，則釋放出毒素而抑制細胞增殖(Bio Techniques 28：162-165,January 2000)。作為抗毒素，亦可使用白喉毒素之觸媒區與蛋白質G之重組複合 蛋白質。
於本發明中，所謂「較高之內化能」意指添加有該抗體與皂草素標記抗小鼠或大鼠IgG抗體之標的抗原表現細胞(例如，CLDN6表現細胞)之生存率(以將未添加抗體時之細胞生存率設為100%之相對率表示者)較佳為70%以下，更佳為60%以下。
本發明之抗體-藥物複合體由於結合有發揮抗腫瘤效果之化合物，故而抗體本身具有抗腫瘤效果較佳，但並非必需。就使抗腫瘤性化合物之細胞傷害性於腫瘤細胞中特異性地、選擇性地發揮之目的而言，抗體具有內化並轉移至腫瘤細胞內之性質較為重要而較佳。就發揮抗腫瘤效果之方面而言，抗體具有內化並轉移至腫瘤細胞內之性質於利用藥物對腫瘤細胞特異性地、選擇性地造成傷害之方面而言較為重要而較佳。抗體之抗腫瘤活性係指對腫瘤細胞之細胞殺傷活性、抗細胞效果。可使用公知之體外(in vitro)或體內(In vivo)之評價系統確認抗腫瘤活性。
作為此種抗體，可列舉針對腫瘤相關抗原之抗體，可例示：抗CLDN6抗體、抗CLDN6/CLDN9抗體、抗HER2抗體、抗DLL3(Delta like protein3，δ樣蛋白3)抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗FGFR2抗體(WO201315206等)、抗G250抗體、抗MUC1抗體(WO2011012309等)、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素(Mesothelin)抗體、抗EGFR(Epidermal growth factor receptor，表皮細胞生長因子接受器)抗體、抗DR5抗體，但並不限於此。
作為本發明之抗體，較佳為抗CLDN6抗體、抗CLDN6/CLDN9抗體、抗HER2抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體，進而較佳為抗CLDN6抗體、抗HER2抗體(例如，曲妥珠單抗、曲妥珠單抗變異體)。
本發明之抗體可藉由使用該領域通常實施之方法，使動物免疫成為抗原之多肽，採集活體內產生之抗體並進行純化而獲得。抗原之來源並不限定於人類，亦可使動物免疫源自小鼠、大鼠等人類以外之動物之抗原。於該情形時，藉由試驗與所獲得之異種抗原結合之抗體與人類抗原之交叉性，可篩選出適用於人類之疾病之抗體。
又，依照公知之方法(例如，Nature(1975)256,p.495-497、Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，使產生針對抗原之抗體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，藉此建立融合瘤，亦可獲得單株抗體(下文說明)。
再者，抗原可藉由利用基因操作使宿主細胞產生編碼抗原蛋白質之基因而獲得。
本發明之嵌合抗體、人類化抗體可依照公知之方法(例如，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984)、Nature(1986)321,p.522-525、WO90/07861)而獲得。
抗HER2抗體(美國專利第5,821,337號等)、抗TROP2抗體(WO2003/074566等)、抗CD98抗體(WO2015/146132等)可藉由公知之方法獲得。
以下，對本發明所使用之抗CLDN6抗體進行說明。再者，以下所說明之實施形態係表示本發明之代表性之實施形態之一例，並非藉此狹隘地解釋本發明之範圍。
1.CLDN6及CLDN9
CLDN6係屬於Claudin家族之包含220個胺基酸之四次跨膜型之蛋白質，於細胞內具有N末端及C末端。
人CLDN6之胺基酸序列及DNA序列係公開於公共資料庫上，例如可根據NP＿067018(序列編號1(圖11))、NM＿021195(序列編號2(圖11))(均為NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國生物技術資訊中心))等登錄號進行參照。
關於人CLDN6蛋白質之胺基酸序列(以下為「CLDN6胺基酸序列」)，細胞外區包括包含序列表之序列編號1之胺基酸編號29~81的細胞外區域(EC1)、及包含胺基酸編號138~160之細胞外區域(EC2)。
CLDN9係屬於Claudin家族之包含217個胺基酸之四次跨膜型之蛋白質，於細胞內具有N末端及C末端。CLDN9與CLDN6具有較高之同源性。
人CLDN9之胺基酸序列及DNA序列係公開於公共資料庫上，例如可根據NP＿066192(序列編號3(圖12))、NM＿020982(序列編號4(圖12))(均為NCBI)等登錄號進行參照。
2.抗CLDN6抗體
作為本發明之抗CLDN6抗體之一例，可列舉一種抗CLDN6抗體，其識別包含自序列表之序列編號1所示之CLDN6之N末端起第29至81號胺基酸序列、及第138至160號胺基酸序列之2個細胞外區的高次結構，且具有內化活性。
本發明之抗CLDN6抗體係可以腫瘤細胞為標的之抗體，即具備可識別腫瘤細胞之特性、可結合於腫瘤細胞之特性、及納入至腫瘤細胞內進行內化之特性等。因此，可經由連結基使本發明之抗CLDN6抗體與具有抗 腫瘤活性之化合物結合而製成抗體-藥物複合體。
本發明之抗CLDN6抗體亦可具有抗腫瘤活性。
抗CLDN6抗體可藉由使用該領域通常實施之方法，使動物免疫成為抗原之多肽，採集活體內產生之抗體並進行純化而獲得。由於CLDN6為四次跨膜型之蛋白質，故而可使用保持立體結構之蛋白質作為抗原，作為此種方法，可列舉細胞免疫法。
又，依照上述公知之方法，使產生針對抗原之抗體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，藉此建立融合瘤，亦可獲得單株抗體。
以下，對針對CLDN6之抗體之獲得方法進行具體說明。
1)抗原之製備
CLDN6可由人類之腫瘤組織或腫瘤細胞直接純化而使用，或者製備該細胞之細胞膜組分而使用。又，可藉由在in vitro(例如Roche Diagnostics公司製造之快速轉譯系統(RTS))合成CLDN6，或者藉由利用基因操作使宿主細胞產生而獲得。
於基因操作中，具體而言，將CLDN6之cDNA組入可表現之載體中後，於含有轉錄與轉譯所必需之酶、受質及能量物質之溶液中進行合成，或者將其他原核生物或真核生物之宿主細胞轉形，使CLDN6表現，藉此可獲得抗原。又，亦可將利用上述基因操作之CLDN6表現細胞、或表現CLDN6之細胞株用作CLDN6蛋白質。
藉由使將作為膜蛋白質之CLDN6之細胞外區與抗體之恆定區連結之融合蛋白質於適當之宿主-載體系統中表現，亦可以分泌蛋白質之形式獲得抗原。
亦可將上述所說明之轉形體本身用作抗原。
進而，亦可將表現CLDN6之細胞株用作抗原。作為此種細胞株，可列舉：人類胰臟癌細胞株NOR-P1細胞、人卵巢癌株NIH：OVCAR-3、OV-90、或OAW28、人類卵巢畸胎瘤細胞株PA-1、人類肝臟癌株HuH-7、人類妊娠性絨毛膜癌株JEG-3、及人類多能性胚胎癌株NTERA-2 clone D1，但只要表現CLDN6，則並不限定於該等細胞株。
本發明所使用之CLDN9蛋白質亦可同樣地製備而使用。
2)抗CLDN6單株抗體之製造
本發明所使用之抗CLDN6抗體並無特別限制，例如可適宜地使用由本案之序列表所示之胺基酸序列所特定之抗體。作為本發明中所使用之抗CLDN6抗體，較理想為具有以下之特性者。
(1)一種抗體，其特徵在於具有以下(a)及(b)之特性；(a)識別或結合CLDN家族。
本發明之抗體識別CLDN家族。換言之，本發明之抗體與CLDN家族結合。本發明之抗體較佳為與CLDN6結合，更佳為與CLDN6特異性地結合。進而，本發明之抗體亦可識別CLDN9或與CLDN9結合。
本發明中所謂「特異性之識別」、即「特異性之結合」意指不為非特異性之吸附之結合。作為結合是否為特異性之判定基準，例如可列舉解離常數(Dissociation Constant，以下稱為「KD」)。本發明之適宜之抗體針對CLDN6及/或CLDN9之KD值為1×10-5M以下、5×10-6M以下、2×10-6M以下或1×10-6M以下，更適宜為5×10-7M以下、2×10-7M以下或1×10-7M以下。
本發明中之抗原與抗體之結合可藉由ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析)法、RIA(radio immuno assay，放射免疫分析)法、Surface Plasmon Resonance(表面電漿子共振)(以下稱為「SPR」)解析法等進行測定或判定。於細胞表面上表現之抗原與抗體之結合可藉由流式細胞測量法等進行測定。
(b)具有藉由與CLDN6及/或CLDN9結合而於CLDN6及/或CLDN9表現細胞中內化之活性。
(2)如上述(1)所記載之抗體，其中CLDN6及/或CLDN9為人CLDN6及/或人CLDN9。
本發明之針對CLDN6之抗體之獲得方法通常經過如下所述之步驟，但不限定於此。
(使用融合瘤之方法)
(a)用作抗原之活體高分子之純化、或抗原表現細胞之製備、及該活體高分子或抗原表現細胞向動物之投予；(b)自誘發免疫反應之上述動物採集含有抗體產生細胞之組織(例如淋巴結)；(c)骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)(例如小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞)之製備；(d)抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合；(e)產生目標抗體之融合瘤群之篩選；(f)分離為單一細胞純系(選殖)；(g)視情形培養用於大量製造單株抗體之融合瘤、或飼養移植有融合瘤之動物；(h)以上述方式製造之單株抗體之生理活性(內化活性)、及其結合特異性之研究、或作為標記試劑之特性之檢驗。
作為此處所使用之抗體效價之測定法，例如可列舉流式細胞測量法或Cell-ELISA法，但不受該等方法限制。
作為以上述方式獲得之單株抗CLDN6抗體之例，可列舉小鼠抗CLDN6抗體B1及C7。再者，於本發明中，有時亦將該「B1」表述為「B1抗體」，將該「C7」表述為「C7抗體」。
B1抗體之重鏈可變區之鹼基序列係記載於序列表之序列編號20(圖19)，胺基酸序列係記載於序列編號21(圖19)。又，B1抗體之輕鏈可變區之鹼基序列係記載於序列表之序列編號18(圖18)，胺基酸序列係記載於序列編號19(圖18)。
B1抗體之CDRH1之胺基酸序列係記載於序列編號9(圖15)，CDRH2之胺基酸序列係記載於序列編號10(圖15)，CDRH3之胺基酸序列係記載於序列編號11(圖15)，CDRL1之胺基酸序列係記載於序列編號5(圖13)，CDRL2之胺基酸序列係記載於序列編號6(圖13)，CDRL3之胺基酸序列係記載於序列編號7(圖13)。
C7抗體之重鏈可變區之鹼基序列係記載於序列表之序列編號24(圖21)，胺基酸序列係記載於序列編號25(圖21)。又，C7抗體之輕鏈可變區之鹼基序列係記載於序列表之序列編號22(圖20)，胺基酸序列係記載於序列編號23(圖20)。
C7抗體之CDRH1之胺基酸序列係記載於序列編號15(圖17)，CDRH2之胺基酸序列係記載於序列編號16(圖17)，CDRH3之胺基酸序列係記載於序列編號17(圖17)，CDRL1之胺基酸序列係記載於序列編號12(圖16)，CDRL2之胺基酸序列係記載於序列編號13(圖16)，CDRL3之胺基酸序列係記載於序列編號14(圖16)。
進而，於再次實施「抗CLDN6抗體之製造」(a)~(h)之步驟而另行獨立地獲得單株抗體之情形或藉由其他方法另行獲得單株抗體之情形時，亦可獲得具有與B1抗體或C7抗體同等之內化活性之抗體。作為此種抗體之一例，可列舉與和B1抗體或C7抗體相同之表位結合之抗體。若新製作之單株抗體與B1抗體或C7抗體所結合之部分肽或部分立體結構結合，則可判定該單株抗體與和B1抗體或C7抗體相同之表位結合。又，藉由確認該單株抗體與B1抗體或C7抗體對CLDN6之結合發生競爭(即該單株抗體妨礙B1抗體或C7抗體與CLDN6之結合)，而可判定即便不決定具體之表位之序列或結構，該單株抗體亦與和抗CLDN6抗體相同之表位結合。於確認表位相同之情形時，強烈期待該單株抗體具有與B1抗體或C7抗體同等之抗原結合能力、生物活性及/或內化活性。
本發明之抗體除了上述針對CLDN6之單株抗體以外，亦包括以降低針對人類之異種抗原性等為目的而人為改型之基因重組型抗體，例如嵌合(Chimeric)抗體、人類化(Humanized)抗體、人類抗體等。該等抗體可使用已知之方法製造。
(1)嵌合抗體
作為嵌合抗體，可列舉抗體之可變區與恆定區互為異種之抗體、例如將源自小鼠或大鼠之抗體之可變區接合於源自人類之恆定區而成之嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。
作為本發明之嵌合抗體所例示之源自小鼠抗人CLDN6抗體B1抗體之嵌合抗體係包含重鏈及輕鏈之抗體，可具有任意源自人類之恆定區，該重鏈含有包含序列編號21(圖19)所示之胺基酸序列之重鏈可變區，該輕鏈含有序列編號19(圖18)所示之輕鏈可變區。
作為源自小鼠抗人CLDN6抗體B1抗體之嵌合抗體之具體例，可列舉源自小鼠抗人CLDN6抗體B1抗體之嵌合抗體chB1抗體(以下亦記載為「chB1」)。chB1抗體之胺基酸序列可列舉包含重鏈及輕鏈之抗體，該重鏈具有包含序列表之序列編號32(圖24)之第20~471號胺基酸殘基之胺基酸序列，該輕鏈具有包含序列表之序列編號28(圖22)之21~234之胺基酸序列。
再者，於序列表之序列編號32(圖24)所示之重鏈序列中，包含第1~19號胺基酸殘基之胺基酸序列為訊息序列，包含第20~141號胺基酸殘基之胺基酸序列為重鏈可變區，包含第142~471號胺基酸殘基之胺基酸序列為重鏈恆定區。又，於序列表之序列編號28(圖22)所示之輕鏈序列中，包含第1~20號胺基酸殘基之胺基酸序列為訊息序列，包含第21~127號胺基酸殘基之胺基酸序列為輕鏈可變區，包含第128~234號胺基酸殘基之胺基酸序列為輕鏈恆定區。
chB1抗體之重鏈及輕鏈之可變區之胺基酸序列係記載於序列表之序列編號34(圖25)、序列編號30(圖23)。
chB1抗體之重鏈胺基酸序列係由序列表之序列編號33(圖24)所示之核苷酸序列編碼。包含序列表之序列編號33所示之核苷酸序列之第1~57號核苷酸的核苷酸序列編碼chB1抗體重鏈之訊息序列，包含序列表之序列編號33所示之核苷酸序列之第58~423號核苷酸的核苷酸序列編碼chB1抗體之重鏈可變區，包含序列表之序列編號33所示之核苷酸序列之第424~1413號核苷酸的核苷酸序列編碼chB1抗體之重鏈恆定區。
chB1抗體之重鏈可變區之鹼基序列係記載於序列表之序列編號35(圖25)。
chB1抗體之輕鏈胺基酸序列係由序列表之序列編號29(圖22)所示之核苷酸序列編碼。包含序列表之序列編號29所示之核苷酸序列之第26~85號核苷酸的核苷酸序列編碼chB1抗體輕鏈之訊息序列，包含序列表之序列編號29所示之核苷酸序列之第86~406號核苷酸的核苷酸序列編碼chB1抗體之輕鏈可變區，包含序列表之序列編號29所示之核苷酸序列之第407~727號核苷酸的核苷酸序列編碼chB1抗體之輕鏈恆定區。
chB1抗體之輕鏈可變區之鹼基序列係記載於序列表之序列編號31(圖23)。
(2)人類化抗體
作為人類化抗體，可列舉：僅將互補性決定區(CDR，complementarity determining region)組入源自人類之抗體中而成之抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)；藉由CDR移植法，除了CDR之序列以外亦對人類抗體移植一部分架構之胺基酸殘基而成之抗體(WO90/07861號)；進而，維持對抗原之結合能力並且一部分CDR之胺基酸序列經修飾之抗體。
其中，作為源自B1抗體或C1抗體之人類化抗體，只要保持B1抗體或C1抗體之全部6種CDR序列且具有CLDN6結合活性，則不限定於特定之人類化抗體，進而，1~數個(較佳為1~2個、更佳為1個)CDR之胺基酸序列經修飾之人類化抗體變異體只要識別CLDN6蛋白質或具有該抗體之CLDN6蛋白質結合活性，則亦不限定於特定之人類化抗體。
作為本發明之抗CLDN6人類化抗體或其功能性片段，例如可列舉含有具有可變區之重鏈及具有可變區之輕鏈、且識別本發明之CLDN6蛋白質或保持該抗體之CLDN6蛋白質結合活性之抗體或該抗體之功能性片段 等，該重鏈所具有之可變區含有：包含序列表之序列編號9(圖15)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列之1~數個(較佳為1~2個)胺基酸經置換之胺基酸序列的CDRH1、包含序列表之序列編號10(圖15)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列之1~數個(較佳為1~2個)胺基酸經置換之胺基酸序列的CDRH2、及包含序列表之序列編號11(圖15)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列之1~數個(較佳為1~2個)胺基酸經置換之胺基酸序列的CDRH3，該輕鏈所具有之可變區含有：包含序列表之序列編號5(圖13)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列之1~數個(較佳為1~2個)胺基酸經置換之胺基酸序列的CDRL1、包含序列表之序列編號6(圖13)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列之1~數個(較佳為1~2個)胺基酸經置換之胺基酸序列的CDRL2、及包含序列表之序列編號7(圖13)所示之胺基酸序列或該胺基酸序列之1~數個(較佳為1~2個)胺基酸經置換之胺基酸序列的CDRL3。
作為上述抗CLDN6人類化抗體或其功能性片段中之CDR之胺基酸置換之例，較佳可列舉上述CDRL3之1~數個(較佳為1~2個)胺基酸置換，可例示序列表之序列編號7之胺基酸編號4號與5號胺基酸經置換的序列表之序列編號8(圖14)所示之CDRL3。
作為上述具有CDRH之人類化抗體之重鏈可變區，可例示序列表之序列編號54(圖35)所示之胺基酸序列、序列表之序列編號58(圖37)所示之胺基酸序列、及序列表之序列編號62(圖39)所示之胺基酸序列，作為上述具有CDRL之人類化抗體之輕鏈可變區，可例示序列表之序 列編號38(圖27)所示之胺基酸序列、序列表之序列編號42(圖29)所示之胺基酸序列、序列表之序列編號46(圖31)所示之胺基酸序列、及序列表之序列編號50(圖33)所示之胺基酸序列。
作為包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之組合之人類化抗體，可適宜地例示：含有包含序列表之序列編號54(圖35)所示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列表之序列編號38(圖27)所示之胺基酸序列之輕鏈可變區的人類化抗體、含有包含序列表之序列編號58(圖37)所示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列表之序列編號42(圖29)所示之胺基酸序列之輕鏈可變區的人類化抗體、含有包含序列表之序列編號54(圖35)所示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列表之序列編號46(圖31)所示之胺基酸序列之輕鏈可變區的人類化抗體、含有包含序列表之序列編號58(圖37)所示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列表之序列編號50(圖33)所示之胺基酸序列之輕鏈可變區的人類化抗體、含有包含序列表之序列編號62(圖39)所示之胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列表之序列編號46(圖31)所示之胺基酸序列之輕鏈可變區的人類化抗體。
作為包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之組合之人類化抗體之全長序列，可例示：含有包含序列表之序列編號52(圖34)之胺基酸編號20~471所示的胺 基酸序列之重鏈、及包含序列表之序列編號36(圖26)之胺基酸編號21~234所示的胺基酸序列之輕鏈之人類化抗體(H1L1)、含有包含序列表之序列編號56(圖36)之胺基酸編號20~471所示的胺基酸序列之重鏈、及包含序列表之序列編號40(圖28)之胺基酸編號21~234所示的胺基酸序列之輕鏈之人類化抗體(H2L2)、含有包含序列表之序列編號52(圖34)之胺基酸編號20~471所示的胺基酸序列之重鏈、及包含序列表之序列編號44(圖30)之胺基酸編號21~234所示的胺基酸序列之輕鏈之人類化抗體(H1L3)、含有包含序列表之序列編號56(圖36)之胺基酸編號20~471所示的胺基酸序列之重鏈、及包含序列表之序列編號48(圖32)之胺基酸編號21~234所示的胺基酸序列之輕鏈之人類化抗體(H2L4)、或含有包含序列表之序列編號60(圖38)之胺基酸編號20~471所示的胺基酸序列之重鏈、及包含序列表之序列編號44(圖30)之胺基酸編號21~234所示的胺基酸序列之輕鏈之人類化抗體(H3L3)。
再者，於序列表之序列編號52(圖34)、56(圖36)、或60(圖38)所示之重鏈胺基酸序列中，包含第1~19號胺基酸殘基之胺基酸序列為訊息序列，包含第20~141號胺基酸殘基之胺基酸序列為重鏈可變區，包含第142~471號胺基酸殘基之胺基酸序列為重鏈恆定區。
又，於序列表之序列編號36(圖26)、40(圖28)、44(圖30)或48(圖32)所示之輕鏈胺基酸序列中，包含第1~20號胺基酸殘基之胺基酸序列為訊息序列，包含第21~127號胺基酸殘基之胺基酸序列為輕鏈可變區，包含第128~234號胺基酸殘基之胺基酸序列為輕鏈恆定區。
編碼上述人類化抗體H1L1之重鏈胺基酸序列之鹼基序列 係序列編號53(圖34)所示之多核苷酸，編碼輕鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號37(圖26)所示之多核苷酸，編碼人類化抗體H2L2之重鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號57(圖36)所示之多核苷酸，編碼輕鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號41(圖28)所示之多核苷酸，編碼人類化抗體H1L3之重鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號53(圖34)所示之多核苷酸，編碼輕鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號45(圖30)所示之多核苷酸，編碼人類化抗體H2L4之重鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號57(圖36)所示之多核苷酸，編碼輕鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號49(圖32)所示之多核苷酸，編碼人類化抗體H3L3之重鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號61(圖38)所示之多核苷酸，編碼輕鏈胺基酸序列之鹼基序列係序列編號45(圖30)所示之多核苷酸。
編碼上述人類化抗體H1L1之重鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號55(圖35)所示之多核苷酸，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號39(圖27)所示之多核苷酸，編碼人類化抗體H2L2之重鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號59(圖37)所示之多核苷酸，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號43(圖29)所示之多核苷酸，編碼人類化抗體H1L3之重鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號55(圖35)所示之多核苷酸，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號47(圖31)所示之多核苷酸， 編碼人類化抗體H2L4之重鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號59(圖37)所示之多核苷酸，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號51(圖33)所示之多核苷酸，編碼人類化抗體H3L3之重鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號63(圖39)所示之多核苷酸，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列之鹼基序列係序列編號47(圖31)所示之多核苷酸。
再者，包含序列表之序列編號53(圖34)、57(圖36)、61(圖38)所示之各核苷酸序列之第1~57號核苷酸的核苷酸序列編碼該人類化抗體重鏈之訊息序列，包含第58~423號核苷酸之核苷酸序列編碼該人類化抗體重鏈可變區之胺基酸序列，包含第424~1413號鹼基序列之核苷酸之核苷酸序列編碼該抗體重鏈恆定區。
又，包含序列表之序列編號37(圖26)、41(圖28)、45(圖30)、49(圖32)所示之各核苷酸序列之第1~60號核苷酸的核苷酸序列編碼該人類化抗體輕鏈之訊息序列，包含第61~381號核苷酸之核苷酸序列編碼該人類化抗體輕鏈可變區之胺基酸序列，包含第382~702號核苷酸之核苷酸序列編碼該抗體輕鏈恆定區。
包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之組合之抗體、或與包含上述重鏈及輕鏈之組合之抗體之胺基酸序列的同一性或同源性為80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為97%以上、最佳為99%以上之抗體只要具有對CLDN6之結合活性，則亦包含於本發明之抗體中。
又，包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之組合之抗體、或具有包含與包含上述重鏈及輕鏈之組合之抗體之CDR相同的胺基酸序列之CDR且 該抗體之除了CDR之胺基酸序列以外的胺基酸序列之同一性或同源性為80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為97%以上、最佳為99%以上之抗體只要具有對CLDN6之結合活性，則亦包含於本發明之抗體中。
進而，藉由組合對重鏈或輕鏈之胺基酸序列進行1~數個胺基酸殘基經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列，亦可選擇具有與上述各抗體同等之生物活性之抗體。又，作為本說明書中之胺基酸之置換，較佳為保存性胺基酸置換(WO2013154206)。
所謂保存性胺基酸置換係於與胺基酸側鏈相關之胺基酸群內發生之置換。該胺基酸置換較佳為於不降低具有原來之胺基酸序列之物質之特性的範圍內進行。
兩種胺基酸序列間之同源性可藉由使用Blast algorithm version 2.2.2(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402)之內定參數而確定。Blast algorithm亦可藉由在網際網路訪問www.ncbi.nlm.nih.gov/blast使用。
(3)人類抗體
作為本發明之抗體，進而可列舉與CLDN6及/或CLDN9結合之人類抗體。所謂抗CLDN6及/或CLDN9人類抗體意指僅具有源自人類染色體之抗體之基因序列之人類抗體。抗CLDN6人類抗體可藉由使用具有含有人類抗體之重鏈與輕鏈之基因的人類染色體片段之人類抗體產生小鼠之方法 (參照Nature Genetics(1997)16,p.133-143,；Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73,Kluwer AcademicPublishers,1999.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等)而獲得。
具體而言，此種人類抗體產生小鼠可作為基因重組動物，藉由基因剔除動物及基因轉殖動物之製作及使該等動物彼此交配而製作，該基因重組動物係破壞內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座，取而代之經由酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)載體等導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座而成。
又，藉由基因重組技術，利用編碼此種人類抗體之重鏈及輕鏈之各鏈之cDNA、較佳為含有該cDNA之載體使真核細胞轉形，培養產生基因重組人類單株抗體之轉形細胞，藉此亦可自培養上清液中獲得該抗體。
此處，作為宿主，例如可使用真核細胞，較佳可使用CHO(Chinese Hamster Ovary，中國倉鼠卵巢)細胞、淋巴細胞或骨髓瘤等哺乳動物細胞。
又，亦已知一種獲得自人類抗體庫篩選之利用噬菌體展示技術之人類抗體之方法(參照Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。
例如，可使用如下噬菌體展示法，其使人類抗體之可變區以單鏈抗體(scFv)之形式於噬菌體表面表現，選擇與抗原結合之噬菌體(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
藉由對利用與抗原結合所選擇之噬菌體之基因進行解析，可確定編碼與抗原結合之人類抗體之可變區之DNA序列。
若與抗原結合之scFv之DNA序列變得明確，則藉由製作具有該序列之表現載體，並導入至適當之宿主中使其表現，可獲得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
藉由以上之方法獲得之嵌合抗體、人類化抗體、或人類抗體等可藉由公知之方法等評價對抗原之結合性，而選出適宜之抗體。
作為比較抗體之性質時之其他指標之一例，可列舉抗體之穩定性。示差掃描熱量計(DSC)係可迅速且準確地測定成為蛋白之相對結構穩定性良好之指標之熱變性中點(Tm)的裝置。藉由使用DSC測定Tm值，並將該值加以比較，可比較熱穩定性之差異。已知抗體之保存穩定性與抗體之熱穩定性表現出某種程度之相關(Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，可以熱穩定性為指標而選出適宜之抗體。作為用以選出抗體之其他指標，可列舉於適當之宿主細胞中之產量較高、及於水溶液中之凝聚性較低。例如產量最高之抗體未必表現出最高之熱穩定性，因此必須基於以上所述之指標進行綜合判斷，選出最適於對人類投予之抗體。
本發明之抗體亦包括與和本發明所提供之抗CLDN6抗體「相同之部位結合之抗體」。即，與本發明之B1或C7所識別之CLDN6蛋白質上之部位結合之抗體亦包括於本發明中。
本發明之抗體亦包括抗體之修飾體。所謂該修飾體意指對本發明之抗體實施化學或生物學修飾而成者。化學性之修飾體包括化學部分與胺基酸骨架之結合、N-鍵結或O-鍵結碳水化合物鏈之化學修飾體等。生物學性之修飾體包括轉譯後修飾(例如，N-結合或O-結合型糖鏈附加、N末或C末之加工、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化)而成者、藉由使用原核生物宿主細胞使其表現而於N末附加有甲硫胺酸殘基而成者等。又，為了實現本發明之抗體或抗原之檢測或單離所標記者、例如酶標記體、螢光標記體、親和性標記體亦包含於該修飾體之含義中。此種本發明之抗體之修飾體對抗體之穩定性及血中滯留性之改善、抗原性之降低、抗體或抗原之檢測或單離等有用。
又，藉由調節與本發明之抗體鍵結之糖鏈修飾(糖基化、去岩藻糖化等)，可增強抗體依存性細胞殺傷活性。作為抗體之糖鏈修飾之調節技術，已知有WO1999/54342、WO2000/61739、WO2002/31140等，但不限定於該等。本發明之抗體亦包括該糖鏈修飾經調節之抗體。
該修飾可對抗體或其功能性片段中之任意位置實施，或亦可對所需之位置實施，亦可對1個或2個以上之位置實施相同或2種以上之不同之修飾。
於本發明中，「抗體片段之修飾體」係其含義亦包括「抗體之修飾體之片段」者。
於將抗體基因暫時單離後導入至適當之宿主中製作抗體之情形時，可使用適當之宿主與表現載體之組合。作為抗體基因之具體例，可列舉將本說明書所記載之編碼抗體之重鏈序列等之基因、及編碼抗體之輕鏈序列等之基因組合而成者。於轉形宿主細胞時，可將重鏈序列基因等 與輕鏈序列基因等插入至同一表現載體中，或亦可插入至不同之表現載體中。
於使用真核細胞作為宿主之情形時，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。尤其是作為動物細胞，可列舉哺乳類細胞，例如可列舉作為猴之細胞之COS細胞(Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC N0.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酶缺損株(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)、FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)。
於使用原核細胞之情形時，例如可列舉大腸桿菌、枯草桿菌。
藉由轉形將目標抗體基因導入至該等細胞中，於in vitro培養經轉形之細胞，藉此可獲得抗體。於該培養中存在根據抗體之序列而產量不同之情形，可以產量為指標自具有同等之結合活性之抗體中篩選出作為醫藥之生產容易者。因此，本發明之抗體亦包括藉由該抗體之製造方法獲得之抗體，該抗體之製造方法之特徵在於包括：培養上述經轉形之宿主細胞之步驟；及自該步驟中獲得之培養物中採集目標抗體或該抗體之功能性片段之步驟。
上述抗體基因較佳為包含以下之(a)~(e)之任一者所記載之多核苷酸之多核苷酸。
(a)編碼B1或C7抗體、chB1抗體、及人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3之任一抗體之重鏈胺基酸序列的多核苷酸與編碼該抗體之輕鏈胺基酸序列之多核苷酸的組合；(b)編碼包含B1或C7抗體、chB1抗體、及人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3之任一抗體之CDRH1~CDRH3的重鏈胺基酸序列之 多核苷酸與編碼包含該抗體之CDRL1~CDRL3之輕鏈胺基酸序列之多核苷酸的組合；(c)編碼包含B1或C7抗體、chB1抗體、及人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3之任一抗體之重鏈可變區的胺基酸序列之重鏈胺基酸序列之多核苷酸與編碼包含該抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列的輕鏈胺基酸序列之多核苷酸的組合；(d)於嚴格之條件下與包含與(a)~(c)之任一項所記載之多核苷酸互補之多核苷酸的核苷酸雜交且編碼與CDLN6結合之抗體之胺基酸序列的多核苷酸；及(e)編碼(a)~(c)之任一項所記載之多核苷酸中1~50個、1~45個、1~40個、1~35個、1~30個、1~25個、1~20個、1~15個、1~10個、1~8個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1或2個、或1個胺基酸置換、缺失、附加或插入而成之多肽之胺基酸序列且編碼與CLDN6結合之抗體之胺基酸序列的多核苷酸。
本發明包括編碼本發明之抗體或其功能性片段或其修飾體之核苷酸、插入有該基因之重組載體、導入有該基因或該載體之細胞。
又，本發明亦包括抗體或其功能性片段或其修飾體之製造方法，該製造方法包括：培養上述細胞之步驟；及自該培養物回收抗體或其功能性片段或其修飾體之步驟。
再者，已知哺乳類培養細胞中產生之抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，同樣已知重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2種胺基酸殘基缺失，新位於羧基末端之脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。然而，該等重鏈序列之缺失及修飾不會對抗體之抗原結合能力及效應功能(補體之活性化或抗體依存性細胞傷害作用等)造成影響。因此，本發明之抗體亦包含受到該修飾之抗體及該抗體之功能性片段，亦包含重鏈羧基末端中1或2個胺基酸缺失之缺失體、及經醯胺化之該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化之重鏈)等。其中，只要可保持抗原結合能力及效應功能，則本發明之抗體之重鏈的羧基末端之缺失體不限定於上述種類。構成本發明之抗體之2條重鏈可為選自由全長及上述缺失體構成之群中之重鏈之任一種，亦可為組合任意兩種而成者。各缺失體之量比存在受產生本發明之抗體之哺乳類培養細胞之種類及培養條件所影響之可能性，作為本發明之抗體之主成分，可列舉2條重鏈兩者中羧基末端之1個胺基酸殘基缺失之情形。
作為本發明之抗CLDN6抗體之同型，例如可列舉IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)等，較佳可列舉IgG1、IgG2或IgG4。
於使用IgG1作為本發明之抗體之同型之情形時，藉由置換恆定區之胺基酸殘基之一部分，可調整效應功能。作為降低或減弱效應功能之IgG1之變異體，可列舉IgG1 LALA(IgG1-L234A、L235A)、IgG1 LAGA(IgG1-L235A、G237A)等，較佳為IgG1 LALA。再者，上述L234A、L235A表示由EU index(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.63,N0.1(May 15,1969),pp.78-85)特定出之234位、235位之白胺酸向丙胺酸之置換，G237A表示由EU index特定出之237位之甘胺酸向丙胺酸之置換。
作為抗體之生物活性，通常可列舉抗原結合活性、藉由與抗原結合而於表現該抗原之細胞中內化之活性、將抗原之活性中和之活 性、增強抗原活性之活性、抗體依存性細胞傷害(ADCC)活性、補體依存性細胞傷害(CDC)活性及抗體依存性細胞介導吞噬作用(ADCP)，本發明之抗體所具有之功能係對CLDN6之結合活性，較佳為藉由與CLDN6結合而於CLDN6表現細胞中內化之活性。進而，本發明之抗體除了細胞內化活性以外，亦可兼具ADCC活性、CDC活性及/或ADCP活性。
所獲得之抗體可進行純化直至變得均勻。抗體之分離、純化使用通常之蛋白質所使用之分離、純化方法即可。例如若適當選擇管柱層析法、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、製備用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等並加以組合，則可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限定於該等。
作為層析法，可列舉親和層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、凝膠過濾層析法、逆相層析法、吸附層析法等。
該等層析法可使用HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)或FPLC(fast protein liquid chromatography，快速蛋白液相層析法)等液相層析法進行。
作為親和層析法所使用之管柱，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。
又，亦可使用將抗原固定化之載體，利用對抗原之結合性純化抗體。
本發明之抗HER2抗體並無特別限制，例如較理想為具有 以下之特性者。
(1)一種抗HER2抗體，其特徵在於具有以下之特性，(a)與HER2特異性地結合；(b)藉由與HER2結合而於HER2表現細胞中內化之活性。
(2)如上述(1)所記載之抗體，其與HER2之細胞外區域結合。
(3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中上述抗體為單株抗體。
(4)如上述(1)至(3)之任一項所記載之抗體，其具有抗體依存性細胞傷害(ADCC)活性及/或補體依存性細胞傷害(CDC)活性。
(5)如上述(1)至(4)之任一項所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體或人類化單株抗體。
(6)如上述(1)至(3)之任一項所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人IgG1之重鏈恆定區，包含降低ADCC及/或CDC活性之變異。
(7)如上述(6)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人IgG1之重鏈恆定區，由EU Index所示之234位及235位之白胺酸被置換為丙胺酸。
(8)如上述(1)至(4)之任一項所記載之抗體，其係含有包含序列編號65所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號64所記載之胺基酸序列之輕鏈而成之人類化單株抗體。
(9)如上述(1)至(3)、(6)或(7)之任一項所記載之抗體，其係含有包含序列編號75之胺基酸編號20~469所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號73之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈而成的人類化單株抗體。
(10)如上述(1)至(9)之任一項所記載之抗體，其中於重鏈羧基末端1或2個胺基酸缺失。
(11)如上述(1)至(3)、(8)或(10)之任一項所記載之抗體，其係含有包含序列編號65之胺基酸編號1~449所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號64之胺基酸編號1~214所記載之胺基酸序列之輕鏈而成。
(12)如上述(1)至(3)、(6)、(7)、(9)或(10)之任一項所記載之抗體，其係含有包含序列編號75之胺基酸編號20~468所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號73之胺基酸編號21~234所記載之胺基酸序列之輕鏈而成。
(13)一種抗體，其係藉由包括如下步驟之該抗體之製造方法獲得：培養藉由含有編碼如上述(1)至(12)之任一項所記載之抗體的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞的步驟；及自該步驟中所獲得之培養物中採集目標抗體之步驟。
<糖鏈重建>
近年，報告有藉由酶反應等將不均勻之抗體之糖蛋白質重建而將具有官能基之糖鏈均勻地導入之方法(ACS Chemical Biology 2012,7,110、ACS Medicinal Chemistry Letters 2016,7,1005)。業界亦嘗試使用該糖鏈重建技術將藥物部位特異性地導入，而合成均勻之ADC(Bioconjugate Chemistry 2015,26,2233、Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,2361-2367、US2016361436)。
本發明之糖鏈之重建係首先利用水解酶，僅保留末端之GlcNAc而將附加於蛋白質(抗體等)之不均勻之糖鏈切除，從而製備附加有GlcNAc之均勻之蛋白質部分(以下稱為「受體」)。繼而，準備另行製備之任意之糖鏈(以下稱為「供體」)，使用糖基轉移酶將該受體與供體連結。藉此，可合成具有任意糖鏈結構之均勻之糖蛋白質。
於本發明中，所謂「糖鏈」意指藉由糖苷鍵將2個以上之單糖鍵結而成之結構單元。存在將具體之單糖或糖鏈以例如「GlcNAc-」、「MSG-」般之簡稱之形式標記之情況。於結構式中以該等簡稱記載之情形時，還原末端歸屬於與其他結構單元之糖苷鍵之氧原子或氮原子除了有特別之定義之情形以外，以不包含於表示該糖鏈之簡稱中者之形式表示。
於本發明中，關於成為糖鏈之基本單元之單糖之記載，除了另行規定之情形以外，為方便起見，將其環結構中與構成環之氧原子鍵結、且與羥基(或歸屬於糖苷鍵之氧原子)直接鍵結之碳原子表述為1位(僅唾液酸中為2位)。實施例化合物之名稱係作為化學結構整體而起，未必適用該規則。
於本發明中，於以符號(例如，GLY、SG、MSG、GlcNAc等)記載糖鏈之情形時，除了另行定義之情形以外，將至還原末端之碳為止包含於該符號內，歸屬於N-或O-糖苷鍵之N或O不包含於該符號內。
於本發明中，只要無特別記載，則胺基酸之側鏈中與糖鏈連結之情形時之部分結構以括號表示側鏈部分，例如以如「(SG-)Asn」之方式表述。
本發明之抗體-藥物複合體係以下式
Figure 107134301-A0305-02-0112-92
表示，抗體Ab或其功能性片段可自其胺基酸殘基(例如，半胱胺酸、離胺酸等)之側鏈起直接與L鍵結，或者亦可自Ab之糖鏈或經重建之糖鏈 與L鍵結，較佳為自Ab之糖鏈或經重建之糖鏈與L鍵結，更佳為自Ab之經重建之糖鏈與L鍵結。
本發明中之Ab之糖鏈為N結合型糖鏈或O結合型糖鏈，較佳為N結合型糖鏈。
N結合型糖鏈係藉由N糖苷鍵與抗體之胺基酸側鏈鍵結，O結合型糖鏈係藉由O糖苷鍵與抗體之胺基酸側鏈鍵結。
本發明之Ab為IgG，較佳為IgG1、IgG2或IgG4。
已知IgG具有良好保存於其重鏈之Fc區中之第297號天冬醯胺殘基(以下稱為「Asn297或N297」)之N結合型糖鏈，有助於抗體分子之活性或動態等(Biotechnol.Prog.,2012,28,608-622、Sanglier-Cianferani,S.,Anal.Chem.,2013,85,715-736)。
IgG之恆定區中之胺基酸序列被良好保存，於Edelman et al.,(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.63,N0.1(May 15,1969),pp.78-85)中，各胺基酸由Eu編號(Eu INDEX)特定。例如，Fc區中N結合型糖鏈附加之Asn297於Eu編號中相當於297位，即便於分子之片段化或區域缺損導致實際之胺基酸位置發生變動之情形時，亦可藉由以Eu編號表示而將胺基酸單一化地特定出。
於本發明之抗體-藥物複合體中，更佳為抗體或其功能性片段自與其Asn297之側鏈鍵結之糖鏈(以下稱為「N297糖鏈」)與L鍵結，進而較佳為抗體或其功能性片段自上述N297糖鏈與L鍵結，該N297糖鏈為經重建之糖鏈。
下式表示本發明之抗體-藥物複合體中抗體或其功能性片段自上述N297糖鏈與L鍵結之情形。
Figure 107134301-A0305-02-0114-93
再者，將具有該經重建之糖鏈之抗體稱為糖鏈重建抗體。
SGP係Sialyl GlycoPeptide(唾液酸糖肽)之縮寫，為N結合型複合糖鏈之代表性者。SGP可依照例如WO2011/0278681所記載之方法從雞蛋之蛋黃中單離、純化。又，SGP之純化品有市售(東京化成股份有限公司、伏見製藥所股份有限公司)，可購買。市售有僅由SG之糖鏈部分中還原末端之GlcNAc缺損一個而成之糖鏈(以下稱為「SG(10)」)構成之二唾液酸八糖(Disialo Octasaccharide)(東京化成股份有限公司)等。
於本發明中，將僅於SG(10)之β-Man之任一支鏈缺失非還原末端之唾液酸之糖鏈結構稱為MSG(9)，將僅於支鏈之1-3糖鏈具有唾液酸者表述為MSG1，將僅於支鏈之1-6糖鏈具有唾液酸者表述為MSG2。
本發明之經重建之糖鏈為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)MSG1與N297-(Fuc)MSG2之混合物、或N297-(Fuc)SG，較佳為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG，更佳為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2。
N297-(Fuc)MSG1係以如下之結構式或序列式表示。
[化84]
Figure 107134301-A0305-02-0115-94
Figure 107134301-A0305-02-0115-95
上述式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L、尤其是連結基L中之Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結，此處，n5為2~10之整數，較佳為2~5之整數。
N297-(Fuc)MSG2係以如下之結構式或序列式表示。
[化86]
Figure 107134301-A0305-02-0116-96
Figure 107134301-A0305-02-0116-97
上述式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-6鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L、尤其是連結基L中之Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結，此處，n5為2~10之整數，較佳為2~5之整數。
N297-(Fuc)SG係以如下之結構式或序列式表示。
[化88]
Figure 107134301-A0305-02-0117-98
Figure 107134301-A0305-02-0117-100
上述式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L、尤其是連結基L中之Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結，此處，n5為2~10之整數，較佳為2~5之整數。
於本發明之抗體-藥物複合體中之抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2或者該等之混合物之情形時，由於抗體為二聚物，故而抗體-藥物複合體成為結合有2個連結基L及2個藥物D之分子(上述m2=1)(參照圖1)。
例如，實施例74：ADC8係N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1之情形，實施例67：ADC1係N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1及N297-(Fuc)MSG2之混合物之情形。
於本發明之抗體-藥物複合體中之抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)SG之情形時，由於抗體為二聚物，故而抗體-藥物複合體成為結合有4個連結基L及4個藥物D之分子(上述m2=2)。例如，實施例72：ADC6係N297糖鏈為N297-(Fuc)SG之情形。
N297糖鏈較佳為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG，更佳為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2。
於本發明之抗體-藥物複合體中之抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG之情形時，可獲得均勻之ADC。
本發明提供包括以下i)~iii)之步驟之重建抗體或該抗體之功能性片段之製造方法。
i)培養如上述[46]至[48]中任一項所記載之宿主細胞(例如，動物細胞(CHO細胞等))，自所獲得之培養物中採集目標抗體之步驟；ii)藉由水解酶對步驟i)中所獲得之抗體進行處理，而製造N297糖鏈為(Fucα1,6)GlcNAc之抗體((Fucα1,6)GlcNAc-抗體)之步驟(圖3A)；較佳為進而包括藉由包含利用羥磷灰石管柱對該反應液進行純化之步驟而純化(Fucα1,6)GlcNAc-抗體之步驟；及iii)-1或iii)-2之任一步驟(圖3B)。
iii)-1於糖基轉移酶存在下使(Fucα1,6)GlcNAc-抗體與糖鏈供體分子進行反應，而合成對唾液酸導入疊氮基而成之糖鏈重建抗體之步驟，該糖鏈供體分子係對MSG(9)或SG(10)之唾液酸之2位之羧酸之羰基導入具有疊氮基之PEG連結基(N3-L(PEG))，將還原末端進行
Figure 107134301-A0305-02-0118-366
唑啉化所獲得；iii)-2於糖基轉移酶存在下使(Fucα1,6)GlcNAc-抗體與糖鏈供體分子 進行反應，而合成對唾液酸導入疊氮基而成之糖鏈重建抗體之步驟，該糖鏈供體分子係對α-胺基可經保護或修飾之(MSG-)Asn或(SG-)Asn之唾液酸之2位之羧酸之羰基及上述Asn之羧酸之羰基導入具有疊氮基之PEG連結基(N3-L(PEG))，使水解酶發揮作用後，將還原末端進行
Figure 107134301-A0305-02-0119-367
唑啉化所獲得。
又，藉由該製造方法獲得之糖鏈重建抗體或其功能性片段、或該等之修飾體亦包含於本發明中。
上述本抗體-藥物複合體之製造中間物具有DBCO(Dibenzocyclooctyne，二苯并環辛炔)等與疊氮基進行反應之炔烴結構。因此，藉由使該製造中間物與上述i)~iii)之步驟中所獲得之對糖鏈之唾液酸導入具有疊氮基之PEG連結基而成之MSG1型、MSG2型或SG型糖鏈重建抗體或該抗體之功能性片段進行反應，而可製造本發明之抗體-藥物複合體。
於本發明之N297糖鏈中，還原末端之附加有岩藻糖之GlcNAc(Fucα1,6)GlcNAc)係來自由動物細胞產生之抗體，與此相對，非還原末端側之糖鏈較佳為重建成與上述MSG(MSG1、MSG2)或SG同樣之糖鏈結構者。該等均利用與該非還原末端之唾液酸2位鍵結之羧酸而與L(PEG)鍵結。
此種具有MSG(MSG1、MSG2)或SG型N297糖鏈之糖鏈重建抗體可依照例如WO2013/120066等所記載之方法，藉由如圖3所示之方法而製造。於依照公知之方法，使用動物細胞作為宿主而以基因重組蛋白質之形式產生抗體之情形時(上述步驟i)，係以雖然N297糖鏈具有附加有岩藻糖之N結合型糖鏈結構作為基本結構，但具有由對非還原末端之結構或構成 糖進行了多種修飾之各種結構構成之糖鏈(圖3A之IV)的抗體或其片段之混合物獲得。由此，動物細胞中產生之抗體藉由利用EndoS等水解酶進行處理，還原末端之幾丁二糖結構之GlcNAcβ1-4GlcNAc之間的糖苷鍵被水解，而獲得具有僅含有(Fucα1,6)GlcNAc作為N297糖鏈之單一糖鏈結構之抗體分子(稱為「(Fucα1,6)GlcNAc-抗體」，參照圖2之A)(圖3A)(上述步驟ii))。
作為N297糖鏈之水解反應所使用之酶，可使用EndoS或保持其水解活性之變異酶等。
以上述藉由水解反應獲得之(Fucα1,6)GlcNAc-抗體作為糖鏈受體分子，使用如EndoS D233Q或EndoS D233Q/Q303L變異體之糖基轉移酶(WO2017010559等)，使其與MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈供體分子進行反應，可獲得具有包含上述結構之MSG(MSG1、MSG2)或SG型N297糖鏈之抗體(參照圖2之B)(圖3B)(上述步驟iii)-1、iii)-2)。
於抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之藥物結合數m2為1之情形時，採用具有MSG、MSG1或MSG2作為糖鏈之糖鏈供體分子。此種糖鏈可以市售之monosialo-Asn free(1S2G/1G2S-10NC-Asn，糖鏈工學研究所股份有限公司，以下稱為「(MSG-)Asn」)為原料，依照實施例56所記載之方法將(MSG-)Asn1或(MSG2-)Asn分離而採用，亦可不分離而以混合物之形式採用。
於抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之藥物結合數m2為2之情形時，該糖基轉移反應使用具有SG(10)作為糖鏈之糖鏈供體分子。此種SG(10)糖鏈可使用藉由水解等由例如SGP獲得者，亦可使用如市售之二唾液酸八糖(東京化成工業股份有限公司)之SG(10)糖鏈。
供體分子所含之MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈於其唾液酸之2位具有含有疊氮基之PEG連結基(N3-L(PEG))。含有疊氮基之PEG連結基(N3-L(PEG))向唾液酸之2位之導入可利用有機合成科學領域所公知之反應(縮合反應等)使MSG(MSG(9))、MSG1或MSG2或二唾液酸八糖(SG(10))與作為含有疊氮基之PEG連結基(N3-L(PEG))之N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2(n5為2~10之整數，較佳表示2~5之整數)進行反應。即，導向唾液酸2位之羧酸與N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2之右末端之胺基藉由縮合反應形成醯胺鍵。
又，MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈例如亦可利用縮合反應對α-胺基可經保護或修飾之(MSG1-)Asn、(MSG2-)Asn或(SG-)Asn(糖鏈工學研究所)等原料之唾液酸之2位之羧酸及上述Asn之羧酸導入具有疊氮基之PEG連結基(N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2)，使如EndoM或EndoRp之水解酶發揮作用而獲得(上述iii)-2)。作為α-胺基之保護基，可列舉乙醯基(Ac)、第三丁氧基羰基(t-Butoxycarbonyl)(Boc)基、苯甲醯基(Bz)、苄基(Bzl)、苄氧羰基(Carbobenzoxy)(Cbz)、9-茀基甲氧基羰基(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)(Fmoc)等，但不限於此。α-胺基之保護基較佳為Fmoc基。
作為α-胺基之修飾基，可列舉羥基乙醯基、或具有PEG結構等之提高水溶性之修飾基。
(MSG1-)Asn、(MSG-2)Asn或(SG-)Asn較佳為α-胺基經上述保護基保護。於α-胺基經保護基(例如，Fmoc基)保護之情形時，可視需要於導入具有疊氮基之PEG連結基後、使水解酶發揮作用前將保護基去除。
分子所含之MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈之還原末端 之GlcNAc較佳為使用例如以如利用2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓鹽酸鹽處理之
Figure 107134301-A0305-02-0122-368
唑啉化之形式活性化而成者。
作為糖基轉移反應所使用之酶(糖基轉移酶)，只要為具有使複合型糖鏈轉移為N297糖鏈之活性者，則可採用各種者，較佳者為藉由將EndoS之第233號之Asp置換為Gln而抑制水解反應之改型體即EndoS D233Q。關於使用EndoS D233Q之糖基轉移反應，於WO2013/120066等中有所記載。又，亦可利用對EndoS D233Q進一步施加變異而成之如EndoS D233Q/Q303L之改型體酶(WO2017010559)。
抗體之糖鏈重建(糖水解、及糖鏈轉移反應)後之抗體之純化操作係以與反應所使用之低分子化合物及酶分離為目的，此種純化通常使用凝膠過濾層析法、離子交換層析法、親和層析法等，亦可進一步進行利用羥磷灰石管柱之追加純化。即，本發明提供自抗體之糖水解後之反應液純化中間物之步驟中進一步包括利用羥磷灰石管柱之純化步驟之藥物-複合體之製造方法。若依照糖鏈重建報告例(J.Am.Chem.Soc.2012,134,12308-12318.、Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,2361-2367)，則僅為利用蛋白質A管柱(親和層析法管柱)純化藉由水解酶處理抗體所獲得之反應液，判明於該純化方法中，無法將水解酶(EndoS等)完全去除，殘留酶產生影響，會對其後之糖基轉移反應造成影響。此處，對純化法進行研究，結果藉由利用蛋白質A管柱、羥磷灰石管柱(CHT(Ceramic Hydroxyapatite Type，陶瓷羥磷灰石)管柱，Bio-Rad Laboratories,Inc.)依序對利用水解酶處理抗體所獲得之反應液進行純化，殘留酶之影響消失，其後之糖鏈轉移反應之反應效率提高。
本發明之抗體-藥物複合體最佳為選自下群中之一種抗體- 藥物複合體。
Figure 107134301-A0305-02-0123-101
Figure 107134301-A0305-02-0123-102
[化92]
Figure 107134301-A0305-02-0124-103
Figure 107134301-A0305-02-0124-104
[化94]
Figure 107134301-A0305-02-0125-105
Figure 107134301-A0305-02-0125-106
[化96]
Figure 107134301-A0305-02-0126-107
Figure 107134301-A0305-02-0126-109
[化98]
Figure 107134301-A0305-02-0127-110
Figure 107134301-A0305-02-0127-111
[化100]
Figure 107134301-A0305-02-0128-112
 或者
Figure 107134301-A0305-02-0128-113
於上述所示之各結構式中，m2表示1或2(較佳為m2為1)，抗體Ab為IgG抗體(較佳為IgG1、IgG2、IgG4，更佳為IgG1)或其功能性片段，N297糖鏈表示為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或該等之混 合物或N297-(Fuc)SG(較佳為N297-(Fuc)MSG1)之任一者，L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，左端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側或/及1-6鏈側(較佳為1-3鏈側)之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L中之Lb之三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結。
為方便起見，作為上述最佳之抗體-藥物複合體，記載有複合體1分子中具有2或4個(m2=1或2)「N297糖鏈與L中之Lb之三唑環上之1位之氮原子鍵結之『-(N297糖鏈)-L-D』(『(N297糖鏈)-(N1Lb)L-D』)」、或具有2或4個(m2=1或2)「與3位之氮原子鍵結之『-(N297糖鏈)-L-D』(『(N297糖鏈)-(N3Lb)L-D』)」之結構，但亦包括複合體1分子中具有『(N297糖鏈)-(N1Lb)L-D』(於m2=1之情形時為1個，於m2=2之情形時為1、2、3個)及『(N297糖鏈)-(N3Lb)L-D』(於m2=1之情形時為1個，於m2=2之情形時為3、2、1個)之兩者之抗體-藥物複合體。即，於複合體1分子中存在『(N297糖鏈)-(N1Lb)L-D』或『(N297糖鏈)-(N3Lb)L-D』之任一者，或混合存在該兩者。
進而，Ab較佳為抗CLDN6抗體、抗CLDN6/CLDN9抗體、抗HER2抗體、抗DLL3抗體、抗FAP抗體、抗CDH11抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗FGFR2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體、抗Mesothelin抗體、抗EGFR抗體、抗DR5抗體，更佳為抗CLDN6抗體、抗CLDN6/CLDN9抗 體、抗HER2抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體，進而較佳為上述抗CLDN6抗體(例如，實施例106、107、108、109)、抗HER2抗體(例如，曲妥珠單抗、曲妥珠單抗變異體)。
本發明之抗體-藥物複合體及本發明之抗CLDN6抗體或抗HER2抗體-藥物複合體表現出較強之腫瘤活性(in vivo抗腫瘤活性、in vitro抗細胞活性)、良好之體內動態及物性，且安全性較高，因此作為醫藥品有用。
本發明之抗體-藥物複合體、其游離藥物或其製造中間物有時亦存在立體異構物或源自不對稱碳原子之光學異構物、幾何異構體、互變異構物或d體、1體、旋轉對映異構物等光學異構物，該等異構物、光學異構物及該等之混合物均包含於本發明中。本發明之PBD衍生物(V)或(VI)於11'位存在不對稱碳，因此存在光學異構物。於本說明書中，該等異構物、及該等異構物之混合物全部以單一之式、即通式(V)或(VI)表示。因此，(V)或(VI)亦包含全部光學異構物及光學異構物之任意比率之混合物。(V)或(VI)之11'位之絕對組態可藉由結晶性之產物或中間物或者該等之衍生物之X射線結晶結構解析或Mosher法等之NMR而確定。此時，亦可使用經具有立體組態已知之不對稱中心之試劑誘導化的結晶性之產物或中間物確定絕對組態。立體異構物可藉由根據所需使用通常之光學拆分法或分離法將合成之本發明之化合物單離而獲得。
於本發明之抗體-藥物複合體中，與抗體1分子結合之藥物之結合數係影響其有效性、安全性之重要因子。抗體-藥物複合體之製造係以藥物之結合數成為一定數量之方式規定所反應之原料、試劑之使用量等反應條件而實施，但與低分子化合物之化學反應不同，通常作為結合有 不同數量之藥物之混合物而獲得。與抗體1分子結合之藥物之結合數可以平均值、即平均藥物結合數(藥物與抗體比率(DAR，Drug to Antibody Ratio))之形式特定出。與抗體分子結合之吡咯并苯二氮呯衍生物之結合數可控制，作為每個抗體之藥物平均結合數(DAR)，可結合1至10之範圍之吡咯并苯二氮呯衍生物，較佳為1至8個，更佳為1至5個。
於本發明之抗體-藥物複合體中，於抗體自抗體之經重建之糖鏈與L鍵結之情形時，抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之藥物結合數m2為1或2之整數。該糖鏈為N297糖鏈，於糖鏈為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)MSG1與N297-(Fuc)MSG2之混合物之情形時，m2為1，DAR為1~3之範圍(較佳為1.0~2.5之範圍，更佳為1.2~2.2之範圍)。於N297糖鏈為N297-(Fuc)SG之情形時，m2為2，DAR為3~5之範圍(較佳為3.2~4.8之範圍，更佳為3.5~4.2之範圍)。
再者，只要為業者，則可根據本案之實施例之記載設計出使抗體與所需數量之藥物結合之反應，可獲得吡咯并苯二氮呯衍生物之結合數經控制之抗體。
再者，本發明之抗體-藥物複合體、游離藥物或製造中間物因放置於大氣中或進行再結晶而吸收水分，存在附著有吸附水、或成為水合物之情形，此種含水之化合物及鹽亦包含於本發明中。
於本發明之抗體-藥物複合體、游離藥物或製造中間物具有胺基等鹼性基之情形時，可根據所需製成醫藥學上容許之鹽。作為此種鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、氫碘酸鹽等氫鹵酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽等低級烷磺酸鹽；苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等芳基磺酸鹽；甲酸、乙酸、蘋果酸、 反丁烯二酸鹽、丁二酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等有機酸鹽；及鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等胺基酸鹽。
於本發明之抗體-藥物複合體、游離藥物或製造中間物具有羧基等酸性基之情形時，通常可形成鹼加成鹽。作為醫藥學上容許之鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；銨鹽等無機鹽；二苄胺鹽、
Figure 107134301-A0305-02-0132-369
啉鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、環己基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N'-二苄基乙二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌
Figure 107134301-A0305-02-0132-370
鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽等有機胺鹽等。
本發明之抗體-藥物複合體、游離藥物或製造中間物亦存在因吸收空氣中之水分等而以水合物之形式存在之情況。作為本發明之溶劑合物，只要為醫藥學上可容許者，則無特別限定，具體而言，較佳為水合物、乙醇合物、2-丙醇合物等。又，於本發明之抗體-藥物複合體、游離藥物或製造中間物中存在氮原子之情形時，亦可成為N-氧化物體，該等溶劑合物及N-氧化物體亦包含於本發明之範圍中。
又，本發明亦包含經各種放射性或非放射性同位素標記之化合物。構成本發明之抗體-藥物複合體、游離藥物或製造中間物之原子之1個以上中亦可含有原子同位素之非天然比率。作為原子同位素，例如可列舉氘(2H)、氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)等。又，本發明化合物例如可經如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)之放射性同位素進行放射性標記。經放射性標記之化合物作為治療或予防劑、研究試劑、例如分析試劑、及診斷劑、例如體內圖像診斷劑而有用。本發明之抗體-藥物複合體之全部同位素變異種不論是否為放射性，均包含於本發明之範圍中。
[製造方法]
繼而，對本發明之抗體-藥物複合體及游離藥物或該等之製造中間物之代表性之製造方法進行說明。再者，以下為了表示化合物而使用各反應式中所示之化合物之編號。即，稱為『式(1)之化合物』、『化合物(1)』等。又，除此以外之編號之化合物亦以同樣之方式記載。
1.製造方法1
本發明之化合物(1)可依照以下所記載之A法至Q法製造。
Figure 107134301-A0305-02-0133-114
A法至M法係本發明之抗體-藥物複合體中之製造中間物之製造法。
N法至Q法係本發明之游離藥物之製造法。
下述A法至Q法之各步驟可使用公知之有機化學方法進行所需之反應。
下述A法至Q法之各步驟之反應中所使用之溶劑只要不阻礙反應、不對反應造成不良影響、某種程度地溶解起始原料，則無特別限定。
於下述A法至Q法之各步驟之反應中，反應溫度根據溶劑、起始原料、試劑等而有所不同，反應時間根據溶劑、起始原料、試劑、反應溫度等而有所不同。
於下述A法至Q法之各步驟之反應中，反應結束後，各目標化合物可依照常規方法自反應混合物中採集。例如，將反應混合物適當中和，又，於存在不溶物之情形時藉由過濾將其去除後，添加如乙酸乙酯般不與水混 合之有機溶劑，將含有目標化合物之有機層分離，藉由水等洗淨後，利用無水硫酸鎂、無水硫酸鈉等加以乾燥、過濾後，將溶劑蒸餾去除，藉此可獲得目標化合物。所獲得之目標化合物可視需要將常規方法、例如再結晶、再沈澱、層析法(例如，使用如矽膠、氧化鋁、鎂-矽膠系之矽酸鎂、SO3H-二氧化矽(Fuji Silysia製造)之載體之吸附管柱層析法；使用如Sephadex LH-20(Pharmacia公司製造)、Amberlite XAD-11(Rohm & Haas公司製造)、Diaion HP-20(三菱化學公司製造)之載體之分配柱層析法等使用合成吸附劑之方法；使用離子交換層析之方法；將利用矽膠或烷基化矽膠之正相-逆相管柱層析法(適宜為高效液相層析法)適當組合並利用適當之溶離劑溶出)等通常有機化合物之分離純化所慣用之方法適當組合進行分離、純化。若為不溶於溶劑之目標化合物，則可利用溶劑將所獲得之固體之粗產物洗淨並加以純化。又，各步驟之目標化合物亦可不純化而直接用於其後之反應。
於下述A法至Q法之各步驟之反應中，J、La'、Lp'、B'、E、V、W、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、l、n7、n6、m1表示與上文所述者相同之含義。(Lp')'表示-VA-、-FG-、-PI-、-VCit-、-VK-、-(D-)PI-、-PL-、-(D-)VA-、-GF-所表示之任一二肽殘基。(R13)'於在R13之取代基上存在羥基、胺基之情形時亦可使用保護基，於無保護基之情形時表示R13。(R17)'表示利用第三丁基二甲基矽烷氧基等保護基保護羥基之狀態或R17之任一者。
PRO1、PRO4、PRO6、PRO8、PRO9表示胺基之保護基。PRO1、PRO4、PRO8、PRO9適宜為烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、三甲基矽烷基乙氧基甲氧基、苄氧基羰基或9-茀基甲氧基羰基等。 又，PRO6適宜為2-(三甲基矽烷基)乙氧基甲基、甲氧基甲基等。
又，PRO2、PRO3、PRO5、PRO7、PRO10、PRO11、PRO12表示有機合成化學之領域所使用之羥基、酚基或羧基之保護基。適宜為乙醯基、苄基、第三丁基二甲基矽烷基(TBDMS)或三異丙基矽烷基或第三丁基。
X2表示有機合成化學之領域所使用之脫離基。適宜為氯原子、溴原子、碘原子、甲磺醯基、對甲苯磺醯基。
Ra、Rc表示鍵結於羧基之取代基，適宜為甲基、乙基、苄基、第三丁基等。
Rb表示形成烯醇磺酸酯之脫離基，適宜為三氟甲磺醯基等。
又，A法至Q法中關於保護而未明示之胺基、羥基亦可視需要使用保護基加以保護。又，亦可視需要進行去保護，亦可於保護後進行去保護並替換為其他保護基。
A法
本製造法係製造化合物(1)所必需之合成中間物、化合物(12a)之製造方法。
[化103]
Figure 107134301-A0305-02-0136-115
A-1步驟(1a)→(2a)：還原反應
於溶劑(二乙醚、四氫呋喃(THF)、二氯甲烷、乙醇等或該等之混合溶劑)中，於自-78℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自-78℃至50℃下，利用還原劑(氫化鋰鋁、二硼烷、硼氫化鋰、硼氫化鈉、硼烷-四氫呋喃錯合物或氫化雙(2-甲氧基乙氧基)鋁鈉等)處理化合物(1a)，藉此進行該步驟。還原劑相對於化合物(1a)而使用1莫耳至過量、較佳為1至5莫耳。視需要添加路易斯酸(氯化鋰、氯化鈣、氯化錫、三氟化硼醚錯合物 等)進行。反應時間為1分鐘至60小時，較佳為5分鐘至24小時。
A-2步驟(2a)→(3a)：保護基導入(第三丁基二甲基矽烷基等)
於PRO2為TBDMS基之情形時，於溶劑(二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)等或該等之混合溶劑)中，於自-20℃至120℃下，較佳為於自0℃至100℃下，使化合物(2a)與矽烷化試劑(氯化第三丁基二甲基矽烷、三氟甲磺酸第三丁基二甲基矽烷酯等)進行反應而實施。視需要添加鹼(咪唑、吡啶、2,6-二甲基吡啶、4-二甲胺基吡啶、氫化鈉等)而進行。相對於化合物(2a)之1莫耳，矽烷化劑係使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳，鹼使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳。反應時間為1分鐘至72小時，較佳為5分鐘至24小時。
A-3步驟(3a)→(4a)：去保護基化反應
於PRO1為苄氧基羰基之情形時，於溶劑(乙醇、丙醇、甲醇、乙酸乙酯、THF、1,4-二
Figure 107134301-A0305-02-0137-371
烷等或該等之混合溶劑)中，於過渡金屬觸媒(鈀碳等)存在下，於自0℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(3a)進行催化氫化，藉此實施該步驟。通常於氫氣環境下進行，亦可視需要使用環己烯、1,4-環己二烯等作為氫供與體。反應時間為10分鐘至100小時，較佳為30分鐘至72小時。
A-4步驟(4a)→(5a)：縮合反應
於溶劑(苯、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、THF、DMF、水等或該等之混合溶劑)中，於自-30℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，於N,N-二環己基碳二醯亞胺、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟硼酸鹽、N- 乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 107134301-A0305-02-0138-372
-2-基)-4-甲基
Figure 107134301-A0305-02-0138-373
啉鎓鹽酸鹽等縮合劑之存在下，使化合物(4a)與羧酸(化合物(A))進行反應而實施。關於縮合劑，相對於化合物(4a)之1莫耳，羧酸(化合物(A))係使用0.3至5莫耳，較佳為使用0.4至2莫耳，縮合劑係使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳。又，視需要添加鹼(三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基
Figure 107134301-A0305-02-0138-374
啉、4-二甲胺基吡啶等)及添加劑(1-羥基苯并三唑、1-羥基-7-氮雜苯并三唑等)進行。鹼相對於化合物(4a)之1莫耳，使用觸媒量至過量，較佳為使用0.2至3莫耳。添加劑相對於化合物(4a)之1莫耳，使用觸媒量至過量，較佳為使用0.01至3莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
又，於將羧酸(化合物(A))變更為醯鹵化物進行縮合反應之情形時，於溶劑(苯、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、四氫呋喃、二氯甲烷等或該等之混合溶劑)中，於自-78℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自-50℃至100℃下，於鹼(三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基
Figure 107134301-A0305-02-0138-375
啉、4-二甲胺基吡啶等)之存在下，使化合物(4a)與羧酸(化合物(A))之醯鹵化物進行反應而實施。相對於化合物(4a)之1莫耳，醯鹵化物使用0.3莫耳至5莫耳，較佳為使用0.4莫耳至2莫耳，鹼使用觸媒量至過量，較佳為使用0.2至5莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
為了製備羧酸(化合物(A))之醯鹵化物，藉由在溶劑(苯、甲苯、二氯甲烷、二氯乙烷等、或該等之混合溶劑)中，於自0℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自0℃至100℃下，利用乙二醯氯、亞硫醯氯等處理羧酸(化合物(A))而實施。視需要添加觸媒量之N,N-二甲基甲醯胺等進行。相對於羧酸(化合物(A))，乙二醯氯或亞硫醯氯使用1莫耳至過量，較 佳為使用1至10莫耳。反應時間於10分鐘至72小時、較佳為30分鐘至24小時下進行。
A-5步驟(5a)→(6a)：還原反應
於溶劑(乙醇、丙醇、甲醇、乙酸乙酯、THF、1,4-二
Figure 107134301-A0305-02-0139-376
烷、DMF等或該等之混合溶劑)中，於過渡金屬觸媒(鈀碳、鎳等)存在下，於自0℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(5a)進行催化氫化，藉此實施該步驟。通常於氫氣環境下進行，視需要亦可使用環己烯、1,4-環己二烯、肼等作為氫供與體。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
又，硝基之還原亦可於以下之條件下進行。
於溶劑(乙醇、甲醇、二乙醚、乙酸乙酯、水或該等之混合溶劑)中，於自0℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至90℃下，使化合物(5a)與還原劑(鐵、鋅、氯化錫等)進行反應而實施。視需要添加酸(乙酸、甲酸、氯化銨等)進行。相對於化合物(5a)之1莫耳，還原劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至100莫耳，酸添加1莫耳至過量而進行。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
A-6步驟(6a)→(7a)：胺基甲酸酯化反應
於溶劑(THF、二氯甲烷、DMF等或該等之混合溶劑)中，於自-30℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(6a)與三光氣(異氰酸酯化劑)進行反應，於系內產生異氰酸酯中間物後，利用通式(B)所表示之醇進行處理，藉此實施該步驟。視需要添加鹼(三乙胺、二異丙基乙基胺、碳酸鈉、氫氧化鈉等)進行。相對於化合物(6a)之1莫耳，三光氣(異氰酸酯化劑)使用0.3莫耳至過量，較佳為使用0.35至3莫耳，鹼 係添加0.5至5莫耳而進行。至形成異氰酸酯中間物為止之反應時間為10分鐘至24小時，較佳為30分鐘至1小時。又，異氰酸酯中間物與醇(B)之反應時間為10分鐘至72小時，較佳為1小時至24小時。
本步驟所使用之醇(B)可依照下文所述之L法製造。
A-7步驟(7a)→(8a)：去保護基化反應
於PRO2為TBDMS基之情形時，於溶劑(二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、乙醇、THF、水等或該等之混合溶劑)中，於自-20℃至100℃下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(7a)與酸(乙酸等)或脫矽烷化試劑(氫氟酸-吡啶、氫氟酸-三乙胺、氫氟酸鹽、氫氟酸、氟化四正丁基銨等)、及該等之混合物之任一者進行反應而實施。相對於化合物(7a)之1莫耳，酸使用1莫耳至過量，酸及脫矽烷化試劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至10莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
A-8步驟(8a)→(9a)：氧化反應
於溶劑(丙酮、二氯甲烷、吡啶等或該等之混合溶劑)中，於自-78℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自-78℃至30℃下，使化合物(8a)與氧化劑(氯化鋶鹽、戴斯-馬丁(Dess-Martin)試劑、釕酸四丁基銨、吡啶鎓氯鉻酸鹽、氮氧自由基氧化觸媒等)進行反應而實施。視需要添加鹼(三乙胺、二異丙基乙基胺、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉等)及再氧化劑(N-甲基
Figure 107134301-A0305-02-0140-377
啉N-氧化物、二乙酸碘苯、次氯酸鈉等)或添加劑(溴化四丁基銨、溴化鉀等)進行。相對於化合物(8a)之1莫耳，氧化劑使用0.005莫耳至過量，較佳為使用0.005至10莫耳。又，相對於化合物(8a)之1莫耳，鹼或再氧化劑添加1至10莫耳，添加劑添加0.02至1莫耳而進行。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
A-9步驟(9a)→(10a)：保護基導入
於(R17)'為第三丁基二甲基矽烷氧基之情形時，依照A-2步驟而製造。
A-10步驟(10a)→(11a)：去保護基化反應
於PRO3為三異丙基矽烷基之情形時，於溶劑(DMF、水等或該等之混合物)中，於自0℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，利用乙酸鋰處理化合物(10a)，藉此製造。相對於化合物(10a)之1莫耳，乙酸鋰使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
A-11步驟(11a)→(12a)：烷基化反應
於溶劑(THF、DMF、N,N-二甲基乙醯胺或該等之混合溶劑)中，於自-20℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自0℃至沸點下，使化合物(11a)與烷基化劑(C)(1,5-二溴戊烷、1,3-二溴丙烷等)進行反應，藉此製造。視需要添加鹼(碳酸鉀、碳酸銫等)進行。相對於化合物(11a)之1莫耳，烷基化劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至10莫耳，鹼使用0.4莫耳至過量，較佳為使用0.5至5莫耳。反應時間為1分鐘至60小時，較佳為5分鐘至24小時。
B法
本製造法係製造化合物(1)中R11與R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵且R14、R15為氫之化合物所必需之中間物、化合物(10b)之製造方法。
[化104]
Figure 107134301-A0305-02-0142-116
B-1步驟(1b)→(2b)：去保護基化反應
於PRO7為三異丙基矽烷基之情形時，依照A法A-10步驟製造。
於PRO7為苄基之情形時，依照A法A-3步驟製造。
B-2步驟(2b)→(3b)：烷基化反應
依照A法A-11步驟製造。
B-3步驟(3b)→(4b)：去保護基化反應
於PRO5為TBDMS基之情形時，依照A法A-7步驟製造。
於PRO5為乙醯基之情形時，於溶劑(甲醇、乙醇、THF或水等或該等之混合溶劑)中，於自-20℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(3b)與適當之鹼(碳酸鉀、甲醇鈉或氫氧化鈉等)進行 反應而實施。作為鹼之量，使用觸媒量至過量，較佳為使用0.1至10莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
B-4步驟(4b)→(5b)：氧化反應
依照A法A-8步驟製造。
B-5步驟(5b)→(6b)：烯醇磺醯基化反應
於Rb為三氟甲磺醯基之情形時，於溶劑(二氯甲烷等)中，於自-78℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於-78℃至30℃下，使化合物(5b)與三氟甲磺酸酐等進行反應而實施。視需要添加鹼(2,6-二甲基吡啶等)進行。相對於化合物(5b)之1莫耳，三氟甲磺酸酐使用1莫耳至過量，較佳為使用1莫耳至5莫耳。鹼使用1莫耳至10莫耳。反應時間為10分鐘至24小時，較佳為30分鐘至6小時。
B-6步驟(6b)→(7b)：過渡金屬觸媒交叉偶合反應(例如，鈴木-宮浦反應等)
於溶劑(乙醇、甲苯、1,4-二
Figure 107134301-A0305-02-0143-378
烷、DMF、四氫呋喃、水等或該等之混合溶劑)中，於自0℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至120℃下，於過渡金屬觸媒(四(三苯基膦)鈀、二氯雙(苯甲腈)鈀(II)等)之存在下，使用有機硼化合物(4-甲氧基苯基硼酸等)與化合物(6b)反應而實施。視需要添加鹼(碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、碳酸氫鈉、氫氧化鈉等)、添加劑(氧化銀、三苯基胂等)進行。相對於化合物(6b)之1莫耳，鈀觸媒使用0.01莫耳至1莫耳，較佳為使用0.01莫耳至0.5莫耳。又，相對於化合物(6b)之1莫耳，有機硼化合物使用1莫耳至過量，較佳為使用1莫耳至10莫耳，鹼使用1莫耳至5莫耳，添加劑使用0.1莫耳至5莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
B-7步驟(7b)→(8b)：還原反應
例如於PRO6為2-(三甲基矽烷基)乙氧基甲基之情形時，於溶劑(二乙醚、THF、二氯甲烷、乙醇等或該等之混合溶劑)中，於自-78℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自-78℃至50℃下，利用還原劑(硼氫化鋰、硼氫化鈉等)處理化合物(7b)，藉此進行該步驟。相對於化合物(7b)之1莫耳，還原劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至30莫耳。反應時間為1分鐘至24小時，較佳為5分鐘至6小時。可於藉由還原反應獲得之粗產物之溶液(二氯甲烷、乙醇、水或該等之混合溶劑)中添加矽膠，並進行攪拌處理，藉此製造化合物(8b)。矽膠相對於化合物(7b)而過量使用。處理時間為12小時至150小時，較佳為12小時至100小時。
B-8步驟(8b)→(9b)：亞胺基之還原
於溶劑(THF、二氯甲烷、N,N-二甲基甲醯胺等或該等之混合溶劑)中，於自-78℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自-78℃至50℃下，利用還原劑(硼氫化鈉、氰基氫化硼、三乙醯氧基硼氫化鈉、2-甲基吡啶硼烷、吡啶硼烷等)處理化合物(8b)，藉此進行該步驟。相對於化合物(8b)之1莫耳，還原劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳。反應時間為1分鐘至60小時，較佳為5分鐘至24小時。
B-9步驟(9b)→(10b)：保護基之導入
於PRO8為烯丙氧基羰基之情形時，於溶劑(苯、甲苯、吡啶、二乙醚、二氯甲烷、THF、1,4-二
Figure 107134301-A0305-02-0144-379
烷、水等或該等之混合溶劑)中，於自-30℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(9b)與氯甲酸烯丙酯、二碳酸二烯丙酯等進行反應而實施。視需要添加鹼(三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶、碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉等)進行。相 對於化合物(9b)之1莫耳，氯甲酸烯丙酯使用1莫耳至過量，較佳為使用1莫耳至10莫耳，鹼使用1莫耳至過量，較佳為使用1至10莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為10分鐘至48小時。
於PRO8為2,2,2-三氯乙氧基羰基之情形時，於溶劑(苯、甲苯、吡啶、二乙醚、二氯甲烷、THF、1,4-二
Figure 107134301-A0305-02-0145-380
烷、水等或該等之混合溶劑)中，於自-30℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(9b)與氯甲酸2,2,2-三氯乙酯等進行反應而實施。視需要添加鹼(三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶、碳酸鈉、氫氧化鈉等)進行。相對於化合物(9b)之1莫耳，氯甲酸2,2,2-三氯乙酯使用1莫耳至過量，較佳為使用1莫耳至10莫耳，鹼使用1莫耳至過量，較佳為使用1至10莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至48小時。
C法
本製造法係製造化合物(1)中R11與R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵且R14、R15為氫之化合物所必需之中間物、化合物(14c)之製造方法。又，化合物(10b)亦可藉由本製造法製造。
[化105]
Figure 107134301-A0305-02-0146-117
C-1步驟(1c)→(2c)：保護基之導入
於PRO5為乙醯基之情形時，於溶劑(二氯甲烷、DMF、吡啶、THF、1,4-二
Figure 107134301-A0305-02-0146-381
烷等或該等之混合溶劑)中，於自-20℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自0℃至100℃下，使化合物(1c)與乙醯化試劑(乙酸酐、乙醯氯等)進行反應而實施。視需要添加鹼(三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶、4-二甲胺基吡啶等)進行。相對於化合物(1c)之1莫耳，乙醯化劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1莫耳至20莫耳，鹼使用觸媒量至過量，較佳為使用0.1至20莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分 鐘至24小時。
於PRO5為TBDMS基之情形時，依照A法A-2步驟製造。
C-2步驟~C-5步驟及C-7步驟~C-14步驟
C-2步驟依照A法之A-5步驟，C-3步驟依照B法之B-9步驟，C-4步驟依照A法A-7步驟，C-5步驟依照A法A-8步驟，C-7步驟依照B法B-8步驟，C-8步驟依照B法之B-9步驟，C-9步驟依照B法B-3步驟，C-10步驟依照A法之A-8步驟，C-11步驟依照B法之B-5步驟，C-12步驟依照B法之B-6步驟，C-13步驟依照A法之A-10步驟，C-14步驟依照A法A-11步驟而製造。
C-6步驟(6c)→(7c)：去保護基化反應
於PRO9為2,2,2-三氯乙氧基羰基之情形時，於溶劑(THF、乙酸、乙酸銨水溶液、水等或該等之混合溶劑)中，於-20℃至溶劑之沸點下，較佳為於0℃至40℃下，使化合物(6c)與金屬試劑(鋅、鋅-鉛合金、鎘、鎘鉛等)進行反應而實施。相對於化合物(6c)之1莫耳，金屬試劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至10莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
於PRO9為烯丙氧基羰基之情形時，於溶劑(二氯甲烷、DMF、THF等或該等之混合物)中，於自0℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至30℃下，使用鈀觸媒(四(三苯基膦)鈀等)與烯丙基之捕捉劑(吡咯啶、
Figure 107134301-A0305-02-0147-382
啉、巴比妥酸等)與化合物(6c)進行反應而實施。相對於化合物(6c)之1莫耳，鈀觸媒使用0.005莫耳至1莫耳，較佳為使用0.005莫耳至0.5莫耳。烯丙基之捕捉劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1莫耳至10莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
D法
化合物(13c)亦可藉由本法製造。
Figure 107134301-A0305-02-0148-118
D-1步驟~D-6步驟、D-9步驟、D-10步驟
D-1步驟依照B法之B-6步驟，D-2步驟依照A法之A-5步驟，D-3步驟依照B法之B-9步驟，D-4步驟依照A法A-7步驟，D-5步驟依照A法A-8步驟，D-6步驟依照C法C-6步驟，D-9步驟依照B法B-8步驟，D-10步驟依照B法之B-9步驟而製造。
D-7步驟及D-8步驟
化合物(7d)亦可依照與B法B-6步驟相同之D-7步驟、與B法B-7步驟相同之D-8步驟製造。
E法
E法係使藉由A法製造之化合物(11a)及(12a)與藉由B法或C法製造之 化合物(10b)及(14c)結合而製造化合物(4e)之方法。
Figure 107134301-A0305-02-0149-120
E-1步驟
本步驟係藉由利用A法製造之化合物(11a)與利用B法製造之化合物(10b)之偶合反應製造化合物(1e)之步驟。
於溶劑(THF、DMF、N,N-二甲基乙醯胺或該等之混合溶劑)中，於自-20℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於自0℃至50℃下，於鹼(碳酸鉀、碳酸銫等)存在下，使化合物(11a)與化合物(10b)進行偶合反應，藉此製造。相對於化合物(11a)之0.5莫耳，化合物(10b)使用1莫耳至過量，較佳為使用0.7至1.5莫耳。鹼使用1至5莫耳。反應時間為1分鐘至60小時，較佳為5分鐘至24小時。
E-2步驟
化合物(1e)亦可藉由使利用A法製造之化合物(12a)與利用C法製造之 化合物(14c)以與E-1步驟同樣之方式進行偶合反應而製造。
E-3步驟
E-3步驟依照A法A-7步驟而製造。
E-4步驟
本步驟係於化合物(2e)中PRO4與PRO8為相同之保護基之情形時，藉由與C法C-6步驟同樣地進行去保護基化反應而製造化合物(4e)之步驟。
於化合物(2e)之PRO4與PRO8為不同之保護基之情形時，化合物(4e)亦可藉由經由E-5步驟及E-6步驟階段性地進行去保護化反應而製造。
E-5步驟及E-6步驟依照C法C-6步驟而製造。
F法
化合物(4e)亦可由本合成法之中間物化合物(10f)製造。本製造法表示製造化合物(10f)及化合物(4e)之方法。
[化108]
Figure 107134301-A0305-02-0151-121
F-1步驟~F-10步驟、F-15步驟
F-1步驟依照A法A-2步驟，F-2步驟依照B法B-3步驟，F-3步驟依照A法之A-8步驟，F-4步驟依照B法之B-5步驟，F-5步驟依照B法之B-6步驟，F-6步驟依照A法A-2步驟，F-7步驟依照A法之A-10步驟，F-8步驟依照A法A-11步驟，F-9步驟依照E法E-1步驟，F-10步驟依照E法E-1步驟，F-15步驟依照B法B-8步驟而製造。
F-11步驟
於PRO10與(R17)'中之羥基之保護基均為TBDMS基之情形時，依照A 法A-7步驟製造。
F-12步驟
本步驟係於化合物(9f)中保護基PRO4與PRO9相同之情形時，藉由與C法C-6步驟同樣地進行去保護基化反應而製造化合物(10f)之步驟。
F-13步驟及F-14步驟
於化合物(9f)之PRO4與PRO9為不同之保護基之情形時，化合物(10f)亦可藉由經由F-13步驟及F-14步驟階段性地進行去保護基化反應而製造。F-13步驟及F-14步驟依照C法C-6步驟而製造。
G法
本製造法係用以製造化合物(1)中R11表示氫原子、R12及R13一起形成螺環且R14、R15表示氫原子之化合物之中間物、化合物(11g)之製造方法。
[化109]
Figure 107134301-A0305-02-0153-122
G-1~G-2步驟、G-5~G-11步驟
G-1步驟依照A法之A-4步驟，G-2步驟依照A法之A-5步驟，G-5步驟依照A法A-11步驟，G-6步驟依照B法B-7步驟，G-7步驟依照B法B-8步驟，G-8步驟依照B法B-9步驟，G-9步驟依照E法E-1步驟，G-10步驟依照A法A-7步驟，G-11步驟依照C法C-6步驟而製造。
G-3步驟：保護基之導入
於溶劑(THF、DMF、二
Figure 107134301-A0305-02-0153-383
烷等或該等之混合溶劑)中，於自-78℃至溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(2g)與氯甲氧基醚系試劑(2-(氯甲氧基)乙基三甲基矽烷、氯甲基甲基醚、苄基氯甲基醚等)進行反應而實施。視需要添加鹼(氫化鈉、正丁基鋰、六甲基二矽氮烷鋰)進行。相對於化合物(2g)之1莫耳，試劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5 莫耳。相對於化合物(2g)之1莫耳，鹼使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
G-4步驟
於PRO7為苄基之情形時，依照A法A-3步驟製造。
於PRO7為三異丙基矽烷基之情形時，依照A法A-10步驟製造。
H法
本製造法係用以製造化合物(1)中R11表示氫原子、R12及R13一起形成螺環且R14、R15一起為亞胺鍵(C=N)之化合物之中間物、化合物(9h)之製造方法。於本製造法中，由R12及R13形成之螺環與E含義相同，因此表述亦以E表示。
Figure 107134301-A0305-02-0154-123
H-1步驟~H-10步驟
H-1步驟依照A法之A-4步驟，H-2步驟依照A法之A-1步驟，H-3步驟依照C法C-1步驟，H-4步驟依照A法之A-4步驟，H-5步驟依照A法之A-5步驟，H-6步驟依照B法B-9步驟，H-7步驟依照A法A-6步驟，H-8步驟依照B法B-3步驟，H-9步驟依照A法A-8步驟，H-10步驟依照C法C-6步驟而製造。
I法
本製造法係用以製造化合物(1)中R11與R12一起形成苯環、R13為單鍵且R14、R15一起形成亞胺之化合物之中間物、化合物(11i)之製造方法。
Figure 107134301-A0305-02-0155-124
I-1步驟~I-11步驟
I-1步驟依照A法之A-4步驟，I-2步驟依照A法之A-5步驟，I-3步驟依照B法B-9步驟，I-4步驟依照A法A-7步驟，I-5步驟依照A法A-8步驟，I-6步驟依照A法A-2步驟，I-7步驟依照A法之A-10步驟，I-8步驟依照A法之A-11步驟，I-9步驟依照E法E-1步驟，I-10步驟依照A法A-7步驟，I-11步驟依照C法C-6步驟而製造。
J法
本製造法係化合物(1)中R12與R13一起形成CH2=、R11為氫且R14、R15一起形成亞胺之化合物之中間物、化合物(12j)之製造方法。
[化112]
Figure 107134301-A0305-02-0157-125
J-1步驟
本步驟係藉由使化合物(1j)進行Wittig反應而製造化合物(2j)之步驟。
J-2步驟：保護基導入
於PRO7為三異丙基矽烷基之情形時，於溶劑(二氯甲烷、乙腈、THF、DMF等或該等之混合溶劑)中，於自-20℃至120℃下，較佳為於自0℃至100℃下，使化合物(2j)與矽烷化試劑(三異丙基氯矽烷、三氟甲磺酸 三異丙基矽烷酯等)進行反應而實施。視需要添加鹼(咪唑、吡啶、2,6-二甲基吡啶、4-二甲胺基吡啶、氫化鈉等)而進行。相對於化合物(2a)之1莫耳，矽烷化劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至3莫耳，鹼使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
J-3步驟~J-11步驟
J-3步驟依照A法之A-5步驟，J-4步驟依照B法之B-9步驟，J-5步驟依照A法A-7步驟，J-6步驟依照A法A-8步驟，J-7步驟依照A法A-2步驟，J-8步驟依照A法之A-10步驟，J-9步驟依照E法之E-1步驟，J-10步驟依照A法A-7步驟，J-11步驟依照C法C-6步驟而製造。
K法
K法係用以製造化合物(1)中、R11與R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵、R13為羥甲基且R14、R15一起形成亞胺之化合物所必需之中間物、化合物(7k)之製造方法。
[化113]
Figure 107134301-A0305-02-0159-126
K-1步驟
本步驟係對化合物(6b)進行羰基化反應而製造化合物(1k)之步驟。
K-2步驟
本步驟係藉由對化合物(1k)進行醛選擇性之還原反應而製造化合物(2k)之步驟。
K-3步驟~K-7步驟
K-3步驟依照A法A-2步驟，K-4步驟依照B法B-7步驟，K-5步驟依照E法E-1步驟，K-6步驟依照A法A-7步驟，K-7步驟依照C法C-6步驟而製造。
L法
L法係化合物(B)之代表性之製造方法。
Figure 107134301-A0305-02-0160-127
通式(Lp')'所表示之肽殘基可藉由胺基酸之縮合反應而製造。
PRO4保護肽殘基(Lp')'中之N末端，PRO12保護C末端。
L-1步驟
L-1步驟依照B法B-9步驟而製造。
L-2步驟：去保護基化反應
於PRO12為第三丁基之情形時，於溶劑(二氯甲烷等)中，於自0℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至40℃下，使化合物(2l)與酸(三氟乙酸、對甲苯磺酸、鹽酸、乙酸等)進行反應而實施。相對於化合物(2l)之1莫耳，酸使用觸媒量至過量。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
L-3步驟~L-4步驟
L-3步驟依照B法B-9步驟，L-4步驟依照A法之A-4步驟而製造。
L-5步驟
化合物(B)亦可依照B法B-9步驟，藉由L-5步驟而製造。
M法
M法係化合物(2)之製造方法。
本製造方法所示之化合物(2)與化合物(1)中本發明之製造中間物中之R16為J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*含義相同。
Figure 107134301-A0305-02-0161-128
上述製造方法所示之化合物(1m)表示藉由E至K法製造之化合物(4e)、(4f)、(11g)、(9h)、(11i)、(12j)、(7k)、(8k)。
上述製造方法所示之(PBD)'表示
Figure 107134301-A0305-02-0161-130
 PBD表示[化117]
Figure 107134301-A0305-02-0162-131
(PBD)'中PBD中之R13上之取代基(羥基等)可經保護基保護，於無保護基之情形時，與PBD含義相同(R13=(R13)')。
上述製造方法中以(Lp')"t-(Lp')'表示之肽殘基中Lp'所表示之胺基酸殘基之側鏈上官能基(胺基等)可經保護基保護，於保護基未經取代之情形時，與Lp'含義相同。
此處，(Lp')'表示如以下所示之2個胺基酸序列，於側鏈具有官能基(胺基、羥基)之情形時亦可經保護。
-VA-、(D-)VA-、-FG-、-PI-、-VCit-、-VK-、-PL-、-(D-)P-I-、或-GF-
(Lp')"表示如以下所示之2~4個胺基酸序列，於側鏈存在官能基(胺基、羥基)之情形時亦可經保護。
-GG-、-EGG-、-DG-、-(D-)DG-、-EG-、-GGF-、-SG-、-KG-、-DGG-、-GGF-、-DDGG-、-KDGG-、或-GGFG-
(La')'表示選自以下之群之任一者。
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)、-C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-、-(CH2)n8-O-C(=O)-、-(CH2)n12-C(=O)-、及-(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-
(La')"表示選自以下之群之任一者。
-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-、或-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-、 s或t各自獨立地表示0或1。
例如，下述M-1步驟係s及t為0之情形，M-3步驟係s為1且t為0之情形，M-5步驟係s為0且t為1之情形。
(La')'-(La')"s與La'含義相同。
(Lp')"t-(Lp')'於具有保護基之情形時，藉由進行去保護而成為Lp'，於無保護基之情形時，與Lp'含義相同。
上述製造方法中所示之Lx表示氫原子或脫離基(羥基丁二醯亞胺等)。
上述製造方法中所示之1m、9m、10m、11m、化合物(2)中之PBD或(PBD)'表示藉由星號(N10'位)與-O-C(=O)-之右端之C(=O)-鍵結。
M-1步驟
本步驟係進行藉由E至K法製造之化合物(1m)與化合物(2m)之縮合反應而製造化合物(11m)之方法。
於Lx=H而化合物(2m)為羧酸之情形時，可依照A法A-4步驟製造化合物(2m)。
於Lx為脫離基(羥基丁二醯亞胺或對硝基苯氧基等)之情形時，於溶劑(苯、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、THF、DMF、甲醇、水等或該等之混合溶劑)中，於自-30℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，使化合物(1m)與化合物(2m)進行反應而實施。相對於化合物(1m)之1莫耳，化合物(2m)使用0.9莫耳至過量，較佳為使用0.9至2莫耳。又，視需要添加鹼(三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、N-甲基
Figure 107134301-A0305-02-0163-384
啉、4-二甲胺基吡啶、二氮雜雙環十一烯等)進行。相對於化合物(1m)之1莫耳，鹼使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳 為30分鐘至36小時。
M-2步驟~M-5步驟及M-8步驟
M-2步驟依照M-1步驟，M-3步驟依照A法A-4步驟，M-4步驟依照M-1步驟，M-5步驟依照A法A-4步驟，M-8步驟依照A法A-4步驟而製造。
M-6步驟
本步驟係對化合物(6m)進行縮合反應而製造活性酯中間物(7m)之步驟。
於溶劑(苯、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、THF、DMF等或該等之混合溶劑)中，於自-30℃至反應所使用之溶劑之沸點下，較佳為於0℃至50℃下，於N,N-二環己基碳二醯亞胺、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺等縮合劑之存在下，使化合物(6m)與羥基丁二醯亞胺等進行反應而實施。相對於化合物(6m)之1莫耳，縮合劑使用1莫耳至過量，較佳為使用1至5莫耳。相對於化合物(6m)之1莫耳，羥基丁二醯亞胺使用1莫耳至過量，較佳為使用1莫耳至5莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為30分鐘至24小時。
M-7步驟
本步驟係使化合物(1m)與化合物(7m)以與M-1步驟同樣之方式進行縮合反應而製造化合物(11m)之步驟。
M-9步驟
本步驟係對化合物(9m)進行去保護化反應而製造化合物(10m)之步驟。於PRO4為9-茀基甲氧基羰基之情形時，於溶劑(THF、二氯甲烷、DMF等或該等之混合溶劑)中，於-20℃至溶劑之沸點下，較佳為於0℃至 40℃下，使化合物(9m)與鹼(1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯、哌啶等)進行反應而實施。相對於化合物(9m)之1莫耳，鹼使用1莫耳至過量，較佳為使用1至10莫耳。反應時間為1分鐘至72小時，較佳為5分鐘至24小時。
M-10步驟
本步驟係使化合物(10m)與化合物(2m)或(4m)進行與A法A-4步驟相同之縮合反應而製造化合物(11m)之步驟。
M-11步驟
本步驟於化合物(11m)中(Lp')"t-(Lp')'或PBD'具有保護基之情形時，藉由進行去保護化而製造化合物(2)之步驟。依照B法B-3步驟及C法C-6步驟而製造。
又，於(Lp')'或PBD'無保護基之情形時，將M-11步驟省略，於該情形時，化合物(11m)與(2)含義相同。
N法
N法表示(1)所示之游離藥物中R11與R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵、R14、R15為氫且R16與R17一起形成亞胺鍵之化合物之合成法。
[化118]
Figure 107134301-A0305-02-0166-132
N-1步驟~N-8步驟
N-1步驟依照B法之B-9步驟，N-2步驟依照A法A-7步驟，N-3步驟依照A法A-8步驟，N-4步驟依照A法A-2步驟，N-5步驟依照A法A-10步驟，N-6步驟依照A法A-11步驟，N-7步驟依照E法E-1步驟，N-8步驟依照E法E-1步驟而製造。
於(R13)'=R13之情形時，依照以下之N-9步驟及N-10步驟 而製造。
N-9步驟
N-9步驟依照A法A-7步驟而製造。
N-10步驟
於PRO4與PRO8為相同之保護基之情形時，依照E法E-4步驟而製造。於PRO4與PRO8為不同之保護基之情形時，依照E法E-5及6步驟而製造。
於(R13)'具有保護基之情形時，依照以下之N-11步驟及N-12步驟而製造。
N-11步驟
依照B法B-3步驟而製造。
N-12步驟
於PRO4與PRO8為相同之保護基之情形時，依照E法E-3及4步驟而製造。於PRO4與PRO8為不同之保護基之情形時，依照E法E-3、5及6步驟而製造。
O法
O法係製造(1)所示之游離藥物中R11與R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵且R14與R15及R16與R17一起為亞胺鍵(C=N)之化合物(6o)之方法。
[化119]
Figure 107134301-A0305-02-0168-133
O-1步驟~O-6步驟
O-1步驟依照E法E-1步驟，O-2步驟依照B法B-3步驟，O-3步驟依照A法之A-8步驟，O-4步驟依照B法之B-5步驟，O-5步驟依照B法之B-6步驟，O-6步驟依照B法B-7步驟而製造。
P法
本製造法係製造(1)所表示之游離藥劑中R11表示氫原子、R12及R13一起形成螺環且R14與R15及R16與R17一起為亞胺鍵(C=N)之化合物之方法。於本製造法中，作為起始原料之化合物(4h)所表示之R12及R13所形成之螺環與E含義相同，因此表述亦以E表示。
[化120]
Figure 107134301-A0305-02-0169-134
P-1步驟~P-4步驟
P-1步驟依照B法之B-9步驟，P-2步驟依照B法B-3步驟，P-3步驟依照A法A-8步驟，P-4步驟依照C法C-6步驟而製造。
Q法
本製造法係製造(1)所表示之游離藥劑中R11、R14與R15表示氫原子、R12及R13一起形成螺環且及R16與R17一起為亞胺鍵(C=N)之化合物之方法。
[化121]
Figure 107134301-A0305-02-0170-136
Q-1步驟~Q-6步驟
Q-1步驟依照A法之A-1步驟，Q-2步驟依照A法A-8步驟，Q-3步驟依照A法A-5步驟，Q-4步驟依照E法E-1步驟，Q-5步驟依照A法A-7步驟，Q-6步驟依照C法C-6步驟而製造。
上述中所謂可經保護之胺基、羥基保護基係指可藉由如氫解、水解、電解、光解之化學方法斷鍵之保護基，表示有機合成化學中通常使用之保護基(例如，參照Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Edition,John Wiley & Sons,Inc.(1999年))。
上述中可經保護之羥基之「保護基」(例如，烷基羰基、矽烷基或芳烷基)、可經保護之羧基之「保護基」(例如，C1-C6烷基或芳烷基)、可經保護之胺基之「保護基」(例如，烷氧基羰基)只要為有機合成化學之領域所使用之羥基、羧基、胺基之保護基，則無特別限定。
必需保護、去保護之步驟可依照已知之方法(例如，「Protective Groups in Organic Synthesis」(Theodora W.Greene、Peter G.M.Wuts 著、1999年、Wiley-Interscience Publication發行)等所記載之方法)進行。
R法：抗體之製備
糖鏈重建抗體可依照例如WO2013/120066等所記載之方法，藉由如圖3所示之方法而製造。
Figure 107134301-A0305-02-0171-137
R-1步驟還原末端之幾丁二糖結構之GlcNAcβ1-4GlcNAc之間的糖苷鍵之水解
本步驟係對於目標抗體，利用公知之酶反應將與抗體之胺基酸序列第297號之天冬醯胺結合之N結合型糖鏈(N297結合糖鏈)切斷而製備糖鏈切斷抗體之步驟。
對於目標抗體(20mg/ml)，於緩衝溶液(50mM磷酸緩衝溶液等)中，於0℃至40℃下，使用EndoS酶等水解酶，實施還原末端之幾丁二糖結構之GlcNAcβ1與4GlcNAc之間之糖苷鍵之水解反應。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為1小時至6小時。相對於抗體100mg，野生型EndoS酶使用0.1至10mg，較佳為使用0.1至3mg。反應結束後，實施下文所述之親和層析法純化及/或羥磷灰石管柱純化，藉此可製造GlcNAcβ1與4GlcNAc之間之糖鏈經水解之(Fucα1,6)GlcNAc抗體。
R-2步驟糖鏈轉移反應
本步驟係利用酶反應使上述(Fucα1,6)GlcNAc抗體與具有含有疊氮基之PEG連結基之MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈
Figure 107134301-A0305-02-0172-385
唑啉體(以下為「疊氮基糖鏈
Figure 107134301-A0305-02-0172-386
唑啉體」)結合而製造糖鏈重建抗體之步驟。
於緩衝溶液(磷酸緩衝溶液等)中，於0℃至40℃下，於觸媒量之EndoS(D233Q/Q303L)等糖基轉移酶存在下，使上述糖鏈切斷抗體與疊氮基糖鏈
Figure 107134301-A0305-02-0172-387
唑啉體進行反應，藉此實施糖鏈轉移反應。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為1小時至6小時。相對於抗體100mg，EndoS酶(D233Q/Q303L)使用1至10mg，較佳為使用1至3mg，疊氮基糖鏈
Figure 107134301-A0305-02-0172-388
唑啉體使用2至過量當量，較佳為使用2至20當量。
反應結束後，實施親和層析法純化與羥磷灰石管柱純化，藉此可獲得經純化之糖鏈重建抗體。
疊氮基糖鏈
Figure 107134301-A0305-02-0172-389
唑啉體可依照實施例55~57所記載之方法製備。可利用有機合成科學領域所公知之反應(縮合反應等)，對MSG(MSG1、MSG2)或二唾液酸八糖(東京化成工業股份有限公司)導入作為含有疊氮基之PEG連結基(N3-L(PEG))之N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2。即，導向唾液酸2位之羧酸與N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2之右末端之胺基藉由縮合反應而形成醯胺鍵。
於使用縮合反應之情形時，作為縮合劑，可列舉：N,N'-二環己基碳二醯亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺(EDCI)、羰基二咪唑(CDI)、2-(2H-苯并三唑-2-基)-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚(BOP)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)等，但無特別限定，作為反應所使用之溶劑，可列舉：二氯甲烷、DMF、THF、乙酸乙 酯等或該等之混合溶劑，但無特別限定。
反應溫度通常為-20℃至100℃或溶劑之沸點為止之範圍，較佳為-5℃至50℃為止之範圍。又，可視需要添加三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基
Figure 107134301-A0305-02-0173-390
啉或4-二甲胺基吡啶等有機鹼或碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉等無機鹼。進而，亦可添加1-羥基苯并三唑、N-羥基丁二醯亞胺等作為反應促進劑。
再者，MSG、MSG1或MSG2可藉由利用EndoM等水解酶將上述(MSG-)Asn或者經分離純化之(MSG1-)Asn或(MSG2-)Asn(實施例56)水解而獲得。
Figure 107134301-A0305-02-0173-391
唑啉化可依照公知之論文(J.Org Chem.,2009,74(5),2210-2212.Helv.Chim.Acta,2012,95,1928-1936.)，由MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈之還原末端之GlcNAc製備。
於上述糖鏈重建抗體之製備中，抗體水溶液之濃縮、濃度測定、緩衝液交換可依照以下之共通操作A至C進行。
共通操作A：抗體水溶液之濃縮
於Amicon Ultra(30,000至50,000MWCO，Millipore Co.)之容器內加入抗體或抗體-藥物複合體溶液，藉由使用離心機(Allegra X-15R，Beckman Coulter,Inc.)之離心操作(以2000G至4000G離心5至20分鐘)將抗體及下文所述之抗體-藥物複合體溶液濃縮。
共通操作B：抗體之濃度測定
使用UV(ultraviolet，紫外線)測定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Inc.)，依照製造商規定之方法，進行抗體濃度之測定。此時，各抗體使用不同之280nm吸光係數(1.3mLmg-1cm-1至1.8mL mg-1cm-1)。
共通操作C：抗體之緩衝液交換
對於抗體水溶液，添加緩衝溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)、磷酸緩衝液(pH值6.0)等)，利用共通操作A進行濃縮。將該操作進行數次後，利用共通操作B進行抗體濃度之測定，使用緩衝溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)、磷酸緩衝液(pH值6.0)等)將抗體濃度調整為10mg/mL。
S法：複合
本製造法係藉由SPAAC(strain-promoted alkyne azide cycloaddition(應變促進之炔基-疊氮環加成)：J.AM.CHEM.SOC.2004,126,15046-15047)反應使上述糖鏈重建抗體與製造中間物(2)結合而製造抗體-藥物複合體之方法。式中Ab表示糖鏈重建抗體。
Figure 107134301-A0305-02-0174-138
將抗體Ab之緩衝溶液(乙酸鈉溶液、磷酸鈉、硼酸鈉溶液等或該等之混合物)與使化合物(2)溶解於適當之溶劑(二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、丙二醇(PG)等或該等之混合物)中而成之溶液加以混合，藉此進行SPAAC反應。
相對於抗體1莫耳，化合物(2)為2莫耳至過量，較佳為1莫耳至30莫耳，有機溶劑之比率相對於抗體之緩衝液較佳為1至200%v/v。反應溫度為0℃至37℃，較佳為10℃至25℃，反應時間為1至150小時，較佳為6小時至100小時。反應時之pH值較佳為5至9。
對於抗體-藥物複合體，可藉由上文所述之共通操作A至C及下文所述之共通操作D至F進行緩衝液交換、純化、抗體濃度、及抗體 每1分子之藥物平均結合數之測定，而進行抗體-藥物複合體化合物(ADC)之鑑定。
共通操作D：抗體-藥物複合體之純化
藉由市售之含有山梨糖醇(Sorbitol)(5%)之乙酸緩衝液(10mM，pH值5.5，本說明書中稱為ABS)之任一緩衝液使NAP-25管柱平衡化。將抗體-藥物複合體反應水溶液(約1.5~2.5mL)上樣至該NAP-25管柱，利用製造商規定之量之緩衝液使其溶出，藉此分取抗體組分。將該分取組分再次上樣至NAP-25管柱，利用緩衝液使其溶出，將該凝膠過濾純化操作重複進行共計2至3次，藉此獲得未結合之藥物連結基或二甲基亞碸、丙二醇經去除之抗體-藥物複合體。視需要藉由共通操作A及C製備抗體-藥物複合體溶液之濃度。
共通操作E：抗體-藥物複合體中之抗體濃度之測定
抗體-藥物複合體中之結合藥物濃度可利用下述所示之朗泊-比爾定律(Lambert-Beer law)算出。
以下表示使用朗泊-比爾定律之式(I)。
Figure 107134301-A0305-02-0175-139
此處，A280表示抗體-藥物複合體水溶液於280nm下之吸光度，ε280表示抗體-藥物複合體於280nm下之莫耳吸光係數，C(mol‧L-1)表示抗體-藥物複合體之莫耳濃度。
根據上述式(I)，抗體-藥物複合體之莫耳濃度C(mol‧L-1)可藉由以下之式(II)求出。
[數2]
Figure 107134301-A0305-02-0176-141
進而，藉由使兩邊乘以抗體-藥物複合體之莫耳質量MW(g‧mol-1)，可求出抗體-藥物複合體之重量濃度C'(mg‧mL-1)(式(III))。
Figure 107134301-A0305-02-0176-142
以下，記載上述式所使用且適用於本實施例之各值。
吸光度A280使用抗體-藥物複合體水溶液於280nm下之UV吸光度之實測值。莫耳質量MW(g‧mol-1)使用由抗體之胺基酸序列求出之抗體分子量之計算推定值作為抗體-藥物複合體之莫耳質量之近似值。光程長度l(cm)以1cm進行測定。
抗體藥物複合體之莫耳吸光係數ε280可藉由以下之式(IV)求出。
[數4]ε 280=抗體莫耳吸光係數ε Ab.280+藥物莫耳吸光係數ε DL.280×藥物結合數 式(IV)
此處，εAb，280表示於280nm下之抗體之莫耳吸光係數，εDL，280表示於280nm下之藥物之莫耳吸光係數。
εAb，280可藉由已知之計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)，由抗體之胺基酸序列推定。於實施例中，曲妥珠單抗之莫耳吸光係數使用εAb，280=215400(計算推定值)。CLDN6抗體之莫耳吸光係數使用εAb，280=221340(計算推定值)，TROP2抗體之莫耳吸光係數使用εAb，280=226400(計算推定值)，CD98抗體之莫耳吸光係數使用εAb，280=240400(計算推定值)，LPS抗體之莫耳吸光係數使用εAb，280=230300(計算推定值)，曲妥珠單抗變異體之莫耳吸光係數使用εAb，280=215057(計算推定值)。
εDL，280使用由每次利用UV測定獲得之實測值所算出者。即，使用藉由對以某種莫耳濃度將複合體前驅物(藥物)溶解而成之溶液之吸光度進行測定，並應用朗泊-比爾定律、式(I)所獲得之值。
共通操作F：抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之藥物平均結合數之測定
抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之藥物平均結合數可藉由使用以下之方法之高效液相層析(HPLC)分析求出。
[F-1.HPLC分析用樣品之製備(抗體-藥物複合體之還原)]
將抗體-藥物複合體溶液(約1mg/mL、60μL)與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100mM、15μL)加以混合。於37℃下將混合物保溫30分鐘，藉此將抗體-藥物複合體之L鏈及H鏈間之二硫鍵切斷，將獲得之樣品用於HPLC分析。
[F-2.HPLC分析]
於下述之測定條件下進行HPLC分析。
HPLC系統：Agilent 1290 HPLC系統(Agilent Technologies)
檢測器：紫外吸光度計(測定波長：280nm、329nm)
管柱：BEH Phenyl(2.1×50mm、1.7μm、Waters Acquity)
管柱溫度：75℃
流動相A：0.1%三氟乙酸(TFA)，15%異丙醇水溶液
流動相B：0.075%TFA，15%異丙醇乙腈溶液
梯度程式：14%-36%(0分鐘~15分鐘)、36%-80%(15~17分鐘)、80%-14%(17分鐘~17.1分鐘)、14%-14%(17.1分鐘~23分鐘)
樣品注入量：5μL
[F-3.資料解析]
[F-3-1]相對於未結合藥物之抗體之L鏈(L0)及H鏈(H0)，結合有藥物之L鏈(結合有一個藥物之L鏈：L1)及H鏈(結合有一個藥物之H鏈：H1、結合有兩個藥物之H鏈：H2、結合有三個藥物之H鏈：H3)之疏水性與所結合之藥物數量成比例地增大，保持時間成比例地變大，因此依序溶出L0、L1、H0、H1、H2、H3。L1、H0之順序存在互為前後之情況，但未結合藥物之H0不具有藥物所特徵性之329nm之波長吸收。因此，藉由確認329nm之波長吸收，可判別L1、H0。藉由與L0及H0之保持時間比較，可將檢測波峰分配至L0、L1、H0、H1、H2、H3之任一者。
[F-3-2]由於藥物連結基有UV吸收，故而根據藥物連結基之結合數，使用L鏈、H鏈及藥物連結基之莫耳吸光係數，依照下式而進行波峰面積值之修正。
Figure 107134301-A0305-02-0178-143
此處，各抗體中之L鏈及H鏈之莫耳吸光係數(280nm)可使用藉由已知之計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)，由各抗體之L鏈及H鏈之胺基酸序列推定出之值。於曲妥珠單抗之情形時，依照其胺基酸序列，作為L鏈之莫耳吸光係數，使用26150作為推定值，作為H鏈之莫耳吸光係數，使用81290作為推定值。同樣地，於CLDN6抗體之情形時，作為L鏈之莫耳吸光係數，使用33140，作為H鏈之莫耳吸光係數，使用77280，於TROP2抗體之情形時，作為L鏈之莫耳吸光係數，使用26210，作為H鏈之莫耳吸光係數，使用68990，於CD98抗體之情形時， 作為L鏈之莫耳吸光係數，使用41680，作為H鏈之莫耳吸光係數，使用78500，於LPS抗體之情形時，作為L鏈之莫耳吸光係數，使用31710，作為H鏈之莫耳吸光係數，使用77470，又，於曲妥珠單抗變異體之情形時，作為L鏈之莫耳吸光係數，使用26251，作為H鏈之莫耳吸光係數，使用81488，藥物連結基之莫耳吸光係數(280nm)使用作為複合體前驅物之化合物(1)之實測之莫耳吸光係數(280nm)。
[F-3-3]依照下式計算相對於波峰面積修正值合計之各鏈波峰面積比(%)。
Figure 107134301-A0305-02-0179-144
[F-3-4]依照下式計算抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之藥物平均結合數。
藥物平均結合數=(L0波峰面積比×0+L0波峰面積比×1+H0波峰面積比×0+H1波峰面積比×1+H2波峰面積比×2+H3波峰面積比×3)/100×2
<醫藥>
本發明之抗體-藥物複合體由於對癌細胞表現出細胞殺傷活性，故而可用作醫藥，尤其可用作針對癌之治療劑及/或預防劑。
作為本發明之抗體-藥物複合體所適用之癌之種類，可列舉：肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌等)、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌(表層上皮性腫瘤、間質性腫瘤、胚細胞腫瘤等)、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃 癌、食道癌等、子宮體癌、睾丸癌(精原細胞瘤、非精原細胞瘤)、子宮頸癌、胎盤絨毛膜癌、腦腫瘤、頭頸部癌及該等之轉移性形態等，成為治療對象之癌細胞只要為表現抗體-藥物複合體中之抗體可識別之蛋白質之癌細胞，則不限定於該等。
本發明之抗體-藥物複合體可適宜地對哺乳動物投予，更佳為人類。
作為含有本發明之抗體-藥物複合體之醫藥組合物中所使用之物質，可根據投予量或投予濃度，自該領域中通常使用之製劑添加物等中適當選擇應用。
本發明之抗體-藥物複合體可以含有1種以上之藥學相容性之成分之藥學組合物的形式投予。例如，代表性而言，上述藥學組合物包含1種以上之藥學載體(例如，經滅菌之液體(例如，水及油(包括石油、動物、植物、或合成起源之油(例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等))))。於將上述藥學組合物進行靜脈內投予之情形時，水為更具代表性之載體。又，食鹽水溶液、以及葡萄糖水溶液及甘油水溶液亦可用作液體載體，尤其可用於注射用溶液。適當之藥學賦形劑為該領域所公知。又，根據所需，上述組合物可含有微量之濕潤劑或乳化劑、或pH值緩衝劑。適當之藥學載體之例記載於E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。其配方對應於投予之態樣。
各種傳遞系統為公知，可用於投予本發明之抗體-藥物複合體。作為導入方法，可列舉皮內、肌內、腹腔內、靜脈內、及皮下之路徑，但不限定於該等。投予例如可利用注入或快速注射。於特定之較佳之實施形態中，上述配體藥物結合體之投予係利用注入。非經口投予為較佳 之投予路徑。
於代表性實施形態中，上述藥學組合物係作為適於對人類靜脈內投予之藥學組合物而依照常規程序進行配方。代表性而言，用於靜脈內投予之組合物係滅菌之等張性之水性緩衝液中之溶液。又，於必要之情形時，上述醫藥可含有助溶劑及用以緩和注射部位之疼痛之局部麻醉劑(例如，里格卡因(Lignocaine))。通常上述成分例如以顯示活性劑之量之安瓿或藥囊等經密封而封口之容器中之冷凍乾燥粉末或無水之濃縮物之形式分開供給，或於單位劑形中一起混合供給。於預定藉由注入投予上述醫藥之情形時，其可藉由例如含有滅菌之製藥級之水或食鹽水之注入瓶進行投藥。於藉由注射投予上述醫藥之情形時，注射用滅菌水或食鹽水之安瓿可以例如可於投予前混合上述成分之方式提供。
本發明之醫藥組合物可為僅含有本案之抗體-藥物複合體之醫藥組合物，亦可為含有抗體-藥物複合體及至少一種其以外之癌治療劑之醫藥組合物。本發明之抗體-藥物複合體亦可與其他癌治療劑共同投予，藉此可增強抗癌效果。以此種目的使用之其他抗癌劑可與抗體-藥物複合體同時分開投予或連續以個體投予，亦可改變各自之投予間隔而投予。作為此種癌治療劑，可列舉：凱素(abraxane)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、索拉菲尼(sorafenib)、長春鹼(vinblastin)或WO2003/038043號說明書所記載之藥劑，進而可列舉LH-RH類似物(亮丙瑞林(Leuprorelin)、戈舍瑞林(Goserelin)等)、雌莫司汀-磷酸鹽、雌激素拮抗藥(他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)等)、芳香酶抑制劑(阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦 (exemestane)等)等，只要為具有抗腫瘤活性之藥劑，則無限定。
此種醫藥組合物作為具有所選擇之組成與必要之純度之製劑，以冷凍乾燥製劑或液狀製劑之形式進行製劑化即可。於以冷凍乾燥製劑之形式進行製劑化時，可為含有該領域所使用之適當之製劑添加物之製劑。又，液劑方面亦同樣，可以含有該領域所使用之各種製劑添加物之液狀製劑之形式進行製劑化。
醫藥組合物之組成及濃度根據投予方法亦有變化，但本發明之醫藥組合物所含之抗體-藥物複合體就抗體-藥物複合體對抗原之親和性、即相對於抗原之解離常數(Kd值)之方面而言，親和性越高(Kd值越低)，越可以即便少量之投予量發揮出藥效。因此，於決定抗體-藥物複合體之投予量時，亦可基於抗體-藥物複合體與抗原之親和性之狀況設定投予量。於對人類投予本發明之抗體-藥物複合體時，例如將約0.001~100mg/kg以1次投予或以每1~180天1次之間隔複數次投予即可。
又，本發明之抗體或該抗體之功能性片段亦可用作醫藥。於該情形時，可將上述關於與<醫藥>相關之「抗體-藥物複合體」之記載適當換稱為與「抗體或該抗體之功能性片段」相關之記載。
進而，本發明之游離藥物(新穎PBD衍生物化合物)、其鹽、或該等之水合物亦可用作醫藥。於該情形時，可將上述關於與<醫藥>相關之「抗體-藥物複合體」之記載適當換稱為與「游離藥物(新穎PBD衍生物化合物)、其鹽、或該等之水合物」相關之記載。
實施例
藉由以下所示之實施例對本發明進行具體說明，但本發明並不限定於該等。又，該等中任何含義均非限定性解釋。又，於本說明書 中，無特別記載之試劑、溶劑及起始材料可自市售之供給源容易地獲得。
參考例1：曲妥珠單抗-Tesirine
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於20℃下向曲妥珠單抗(參考例3)之5mM四乙酸乙二胺-磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.5)溶液(9.91mg/mL，0.70mL)中添加磷酸二鉀水溶液(1.0M，0.0112mL)、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽水溶液(10mM，0.0086mL)，於20℃下反應60分鐘，於室溫下反應30分鐘。於反應溶液中添加以文獻(Med.Chem.Lett.2016,7,983-987)為參考所合成之Tesirine(0.36mg)之二甲基乙醯胺溶液(0.0415mL)，於室溫下反應1小時。於反應溶液中添加N-乙醯基半胱胺酸水溶液(100mM、0.0024mL)，反應30分鐘使反應停止。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液3.5mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.40mg/mL，抗體產量：4.90mg(71%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：2.0
參考例2：抗CLDN6(H1L1)-Tesirine
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於20℃下向抗CLDN6(H1L1)抗體之5mM四乙酸乙二胺-磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.5)溶液(9.87mg/mL，0.45mL)中添加磷酸二鉀水溶液(1.0M，0.0072mL)、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽水溶液(10mM，0.0041mL)，於20℃下反應90分鐘。於反應溶液中添加以文獻(Med.Chem.Lett.2016,7,983-987)為參考所合成之Tesirine(0.15mg)之N,N-二甲基乙醯胺 溶液(0.0277mL)，於20度下反應1小時。於反應溶液中添加N-乙醯基半胱胺酸水溶液(100mM，0.001mL)，反應30分鐘使反應停止。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液3.5mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.56mg/mL，抗體產量：3.90mg(88%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：2.1
參考例3：抗HER2抗體曲妥珠單抗
抗HER2抗體係參照US5821337而製作。將曲妥珠單抗之輕鏈及重鏈之胺基酸序列示於序列編號64及序列編號65。
參考例4：抗LPS抗體h#1G5-H1L1
抗LPS抗體係參照WO2015/046505而製作。將h#1G5-H1L1之輕鏈及重鏈之胺基酸序列示於序列編號66及序列編號67。
參考例5：抗TROP2抗體hRS7
抗TROP2抗體係參照WO2003/074566、WO2015/098099(參考例1)而製作。將hRS7之輕鏈及重鏈之胺基酸序列示於序列編號68及序列編號69。
參考例6：抗CD98抗體hM23-H1L1
抗CD98抗體係參照WO2015/146132而製作。將hM23-H1L1之輕鏈及重鏈之胺基酸序列示於序列編號70及序列編號71。
[製造中間物之合成]
實施例1：中間物1
[化124]
Figure 107134301-A0305-02-0185-145
步驟1：(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚烷-5-羧酸苄酯
於0℃下向(6S)-5-氮螺[2.4]庚烷-5,6-二羧酸5-苄酯6-甲酯(104mmol，WO2012087596)之THF(500mL)溶液中逐量添加硼氫化鋰(4.30g，178mmol)。於0℃下攪拌30分鐘後，於室溫下攪拌2小時。於0℃下添加水(180mL)、2當量濃度鹽酸(186mL)，於減壓下蒸餾去除。利用乙酸乙酯將所獲得之殘渣萃取4次，利用飽和鹽水洗淨有機層後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除，將所獲得之殘渣(27.9g，90%)直接用於下一反應。
步驟2：(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚烷-5-羧酸苄酯
於室溫下向上述步驟1中獲得之化合物(27.9g，107mmol)與咪唑(14.5g，214mmol)之二氯甲烷(300mL)溶液中添加第三丁基二甲基氯矽烷(24.2g，160mmol)，於室溫下攪拌18小時。利用飽和檸檬酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和鹽水洗淨反應溶液，利用無水硫酸鈉加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~50：50(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(32.5g，81%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.39-7.34(5H,m),5.23-5.11(2H,m),4.10- 3.48(4H,m),3.16-3.14(1H,m),2.15-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m),0.91-0.88(9H,m),0.65-0.55(4H,m),0.08-0.01(6H,m).
MS(APCI)m/z：376(M+H)+
步驟3：(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚烷
於室溫下向上述步驟2中獲得之化合物(32.5g，86.5mmol)之乙醇(400mL)溶液中添加7.5%鈀碳觸媒(54%水分，5.00g)，於室溫、氫氣環境下攪拌6小時。將反應溶液進行矽藻土過濾，於減壓下對濾液進行蒸餾去除，而獲得目標物(21.3g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：3.79-3.77(1H,m),3.71-3.69(1H,m),3.65-3.60(1H,m),3.01-2.98(2H,m),1.81-1.71(2H,m),0.90(9H,s),0.65-0.57(4H,m),0.08(3H,s),0.07(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：242(M+H)+
步驟4：[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基](5-甲氧基-2-硝基-4-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)甲酮
於冰浴冷卻下向5-甲氧基-2-硝基-4-{三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯甲酸(52.2g，141mmol，US20150283262)與1-羥基苯并三唑一水合物(23.8g，155mmol)之二氯甲烷(500mL)溶液中添加N,N'-二環己基碳二醯亞胺(35.0g，170mmol)。於室溫下攪拌反應混合物。羧酸消失後，於-60℃下緩慢滴加上述步驟3中獲得之化合物(34.1g，141mmol)與三乙胺(29.4mL，212mmol)之二氯甲烷(100mL)溶液。於室溫下將反應溶液攪拌一晚後，於反應混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用氯仿萃取反應 混合物。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除，於所獲得之殘渣中添加乙酸乙酯與二乙醚，藉由過濾去除固體成分，於減壓下對濾液進行蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~25：75(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(55.0g，66%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.72-7.66(1H,m),6.80-6.73(1H,m),4.53-4.49(1H,m),4.04-3.95(1H,m),3.91-3.88(3H,m),3.59-3.54(1H,m),3.36-3.25(0.5H,m),3.01-2.96(1.5H,m),2.24-2.20(0.3H,m),2.09-2.05(0.7H,m),2.00-1.97(0.7H,m),1.69-1.67(0.3H,m),1.32-1.24(3H,m),1.12-1.05(18H,m),0.93-0.91(6H,m),0.79-0.77(3H,m),0.71-0.62(2H,m),0.57-0.40(2H,m),0.12-0.10(4H,m),0.11-0.15(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：593(M+H)+
步驟5：(2-胺基-5-甲氧基-4-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]甲酮
於氮氣環境下向上述步驟4中獲得之化合物(55.0g，92.8mmol)之乙醇(300mL)溶液中添加7.5%鈀碳(10.0g)。立即將氮氣球更換為氫氣球，於氫氣環境、室溫下遽烈攪拌反應混合物。原料消失後，過濾反應混合物，於減壓下對濾液進行蒸餾去除，將所獲得之目標物(52.2g，100%)直接用於下一反應。
1H-NMR(CDCl3)δ：6.71(1H,s),6.25(1H,s),4.55-4.28(2H,m),3.97(1H,m),3.75-3.62(3H,m),3.70(3H,s),3.09-3.07(1H,m),2.24- 2.19(1H,m),1.81-1.68(1H,m),1.27-1.22(3H,m),1.09-1.05(18H,m),0.90(9H,s),0.65-0.46(4H,m),0.07-0.03(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：563(M+H)+
步驟6：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
於乙醇-冰浴上向上述步驟5中獲得之化合物(18.6g，33.0mmol)及三乙胺(6.26mL，45.2mmol)之THF(300mL)溶液中緩慢添加三光氣(4.22g，14.2mmol)。添加後，於經冰浴冷卻之反應混合物中緩慢滴加N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(11.4g，30.2mmol，WO2011130598)與三乙胺(6.26mL，45.2mmol)之THF(100mL)、N,N-二甲基甲醯胺(30mL)混合溶液。滴加後，取下冰浴，於氮氣環境、40℃下攪拌反應混合物。原料消失後，於反應混合物中添加水，利用乙酸乙酯萃取反應混合物。利用飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~40：60(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(23.5g，74%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.99(1H,m),8.58(1H,s),7.80(1H,s),7.55-7.53(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.77-6.75(2H,m),5.94-5.87(1H,m),5.40-5.38(1H,m),5.33-5.29(1H,m),5.23-5.21(1H,m),5.13(1H,m),5.10(2H,m),4.69-4.64(1H,m),4.62-4.52(2H,m),4.06-4.03(1H,m),3.98(1H,m),3.76-3.65(6H,m),3.04(1H,m),2.28-2.26(1H,m),2.18- 2.13(1H,m),1.46(3H,m),1.32-1.25(3H,m),1.11-1.09(18H,m),0.99-0.84(15H,m),0.65-0.40(4H,m),0.08-0.00(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：966(M+H)+
步驟7：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
於室溫下向上述步驟6中獲得之化合物(23.5g，24.3mmol)之THF(50mL)、甲醇(50mL)、水(44mL)溶液中添加乙酸(200mL)。於室溫下攪拌反應混合物。原料消失後，利用乙酸乙酯萃取反應混合物。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(18.0g，87%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.64-8.62(1H,m),8.50(1H,m),7.69(1H,m),7.55-7.53(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.79-6.75(3H,m),5.91-5.89(1H,m),5.39(1H,m),5.32-5.29(1H,m),5.23-5.21(1H,m),4.68-4.54(4H,m),4.31(1H,m),4.06-4.04(1H,m),3.81-3.79(3H,m),3.76(3H,s),3.63-3.61(1H,m),3.13-3.11(1H,m),2.16-2.13(1H,m),1.87-1.81(2H,m),1.46-1.43(3H,m),1.30-1.24(3H,m),1.12-1.08(18H,m),0.98-0.91(6H,m),0.63-0.45(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：852(M+H)+
步驟8：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]- 10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於氮氣環境、-78℃下向二甲基亞碸(3.75mL，52.8mmol)之二氯甲烷(300mL)溶液中緩慢滴加乙二醯氯(2.17mL，25.3mmol)。滴加後，於-78℃下攪拌反應混合物。於反應混合物中緩慢滴加上述步驟7中獲得之化合物(18.0g，21.1mmol)之二氯甲烷(50.0mL)溶液。於-78℃下向反應溶液中添加三乙胺(14.6mL，105mmol)。添加後，取下冷媒浴，緩慢升溫至室溫。原料消失後，於反應混合物中添加水，利用氯仿(200mL)萃取反應混合物。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鎂加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~0：60(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(16.5g，92%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.51-8.36(1H,m),7.54-7.38(2H,m),7.22-7.07(3H,m),6.73-6.64(1H,m),5.94-5.87(2H,m),5.33-5.22(3H,m),5.09(1H,m),4.97(1H,m),4.64-4.58(4H,m),4.02-4.00(1H,m),3.86-3.83(3H,m),3.75-3.70(1H,m),3.61-3.54(2H,m),3.38-3.29(1H,m),2.40(1H,m),2.16-2.14(1H,m),1.74-1.71(1H,m),1.44(3H,m),1.18-1.16(3H,m),1.05-1.00(18H,m),0.97-0.92(6H,m),0.72-0.60(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：850(M+H)+
步驟9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於氮氣環境、0℃下向上述步驟8中獲得之化合物(12.0g，14.1mmol)及2,6-二甲基吡啶(6.58mL，56.5mmol)之二氯甲烷(200mL)溶液 中緩慢滴加三氟甲基磺酸第三丁基二甲基矽烷酯(9.73mL，42.3mmol)。於冰浴冷卻下攪拌10分鐘後，取下冰浴，於室溫下加以攪拌。原料消失後，於反應混合物中添加水，利用氯仿萃取反應混合物。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~25：75(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(8.12g，60%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.67-8.45(1H,m),7.50-7.44(2H,m),7.19(1H,s),7.13(2H,m),6.95(2H,m),6.62-6.57(2H,m),6.01(1H,m),5.95-5.86(1H,m),5.33-5.13(3H,m),4.82(1H,m),4.65-4.54(3H,m),4.03-4.01(1H,m),3.84-3.82(3H,m),3.73-3.66(1H,m),3.50-3.48(1H,m),3.27(1H,m),2.37-2.33(1H,m),2.19-2.13(1H,m),1.54-1.43(3H,m),1.22-1.13(3H,m),1.10-1.00(18H,m),0.97-0.91(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.59(4H,m),0.19-0.09(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：964(M+H)+
步驟10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於上述步驟9中獲得之化合物(8.12g，8.42mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(90mL)與水(2mL)溶液中添加乙酸鋰(0.611g，9.26mmol)，於室溫下加以攪拌。原料消失後，於反應混合物中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v) ~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(5.48g，81%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.76-8.60(1H,m),8.02-7.56(1H,m),7.45-7.44(2H,m),7.21(1H,s),7.10-7.09(2H,m),6.81-6.74(1H,m),6.65(1H,s),6.23(1H,s),6.01-5.99(1H,m),5.95-5.84(1H,m),5.41-5.20(2H,m),5.16(1H,m),4.84(1H,m),4.67-4.54(4H,m),4.05-4.03(1H,m),3.87(3H,s),3.71(1H,m),3.55-3.51(1H,m),3.26(1H,m),2.35(1H,m),2.18-2.12(1H,m),1.55-1.42(3H,m),0.97-0.92(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.61(4H,m),0.20-0.06(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：808(M+H)+
步驟11：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-8'-(3-溴丙氧基)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟10中獲得之化合物(2.40g，2.97mmol)以與實施例4步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.73g，99%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.01-9.86(1H,m),8.24-8.04(2H,m),7.64-7.54(2H,m),7.32-7.14(4H,m),6.59-6.48(1H,m),5.94-5.88(2H,m),5.32-4.76(5H,m),4.44-4.38(3H,m),3.87-3.81(5H,m),3.64-3.55(2H,m),3.41(1H,m),3.14(1H,m),2.45-2.09(4H,m),1.97-1.94(1H,m),1.44-1.30(4H,m),0.89-0.53(9H,m),0.79(9H,s),0.13-0.06(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：930[81Br,(M+H)+],928[79Br,(M+H)+].
實施例2：中間物2
Figure 107134301-A0305-02-0193-146
步驟1：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0193-355
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯甘胺酸
於室溫下向甘胺醯甘胺酸(0.328g，2.49mmol)、N,N-二異丙基乙基胺(0.433mL，2.49mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(20mL)之混合物中添加1-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0193-356
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(1.00g，2.49mmol，Click Chemistry Tools)、水(10mL)，於室溫下攪拌一晚。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：CMW=100：0(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.930g，89%)。
所謂CMW係氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分佈有機層。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：12.58(1H,s),8.14-8.12(1H,m),8.08-8.07(1H,m),7.69-7.68(1H,m),7.62-7.61(1H,m),7.53-7.45(3H,m),7.40-7.29(3H,m),5.05-5.01(1H,m),3.73-3.72(2H,m),3.66-3.60(3H,m),2.66-2.60(1H,m),2.33-2.24(1H,m),2.08-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：420[(M+H)+].
步驟2：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0193-357
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯甘胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯
於上述步驟1中獲得之化合物(0.612g，1.46mmol))、N-羥基丁二醯亞胺(0.168g，1.459mmol)之二氯甲烷(6mL)溶液中添加1-乙基-3-(3-二 甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(0.420g，2.19mmol)，於室溫下攪拌21小時。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：CMW=100：0(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.375g，50%)。
所謂CMW係氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分佈有機層。
實施例3：藥物連結基1
Figure 107134301-A0305-02-0194-147
步驟1：(2R,11aS)-2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8-羥基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
於氮氣環境下向(2R,11aS)-8-(苄氧基)-2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(25.5g，41.6mmol， WO2016149546)之THF(150mL)、乙醇(150mL)溶液中添加5%鈀碳(54%水分，10.0g)後，於氫氣環境、室溫下將反應溶液攪拌三天。於反應溶液中添加氯仿，進行矽藻土過濾後，於減壓下對濾液進行蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~50：50(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(19.4g，89%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.36(1H,s),7.25(1H,s),6.01(1H,s),5.45-5.43(1H,m),4.69-4.67(1H,m),4.60-4.55(1H,m),4.23-4.21(1H,m),3.96(3H,s),3.76-3.68(2H,m),3.63-3.61(1H,m),3.56-3.53(1H,m),2.88-2.83(1H,m),2.03-2.00(1H,m),1.00-0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.02(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：523(M+H)+
步驟2：(2R,11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
於室溫下向上述步驟1中獲得之化合物(10.8g，20.7mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(30mL)溶液中添加1,5-二溴戊烷(23.8g，103mmol)、碳酸鉀(3.43g，24.8mmol)。於室溫下攪拌3小時後，於反應溶液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水洗淨所獲得之有機層，利用硫酸鈉加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)~50：50(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(14.5g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.52-5.49(1H,m),4.63-4.62(1H,m),4.58-4.55(1H,m),4.24-4.22(1H,m),4.07-4.04(2H, m),3.92(3H,s),3.82-3.64(3H,m),3.56-3.53(1H,m),3.45-3.43(2H,m),2.86-2.84(1H,m),2.04-2.00(1H,m),1.97-1.87(4H,m),1.66-1.62(2H,m),1.01-0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：673[81Br,(M+H)+],671[79Br,(M+H)+].
步驟3：(2R,11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-羥基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
於0℃下向上述步驟2中獲得之化合物(21.5mmol)之THF(40mL)溶液中添加1mol/L之氟化四丁基銨之THF溶液(28.0mL，28.0mmol)。於室溫下攪拌30分鐘後，於反應溶液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取，利用飽和鹽水洗淨所獲得之有機層。利用硫酸鈉加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=97.5：2.5(v/v)~92.5：7.5(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(11.3g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.53-5.50(1H,m),4.69-4.64(2H,m),4.32-4.30(1H,m),4.10-4.00(2H,m),3.91(3H,s),3.88-3.75(2H,m),3.73-3.64(2H,m),3.45-3.44(2H,m),2.99-2.96(1H,m),2.15-2.09(1H,m),1.99-1.85(5H,m),1.68-1.62(2H,m),1.01-0.95(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
步驟4：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2,5,11(3H,10H,11aH)-三酮
將上述步驟3中獲得之化合物(11.3g，20.2mmol)、溴化四丁基銨 (0.325g，1.01mmol)、溴化鉀(0.240g，2.02mmol)溶解於飽和碳酸氫鈉水溶液(60mL)、二氯甲烷(60mL)中，於0℃下添加nor-AZADO(0.0279g，0.202mmol)、次氯酸鈉五水合物(2.03g，27.2mmol)，於0℃下攪拌30分鐘。由於有原料殘存，故而於0℃下添加次氯酸鈉五水合物(1.00g，13.4mmol)，於0℃下攪拌15分鐘。進而，於0℃下添加次氯酸鈉五水合物(0.300g，4.03mmol)，於0℃下攪拌15分鐘，藉由TLC(thin layer chromatography，薄層層析法)確認原料之消失。於反應溶液中添加硫代硫酸鈉水溶液，利用氯仿進行萃取，利用硫酸鈉乾燥所獲得之有機層。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=75：25(v/v)~40：60(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(9.74g，87%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.33(1H,s),7.24(1H,s),5.56-5.53(1H,m),4.71-4.69(1H,m),4.66-4.63(1H,m),4.27-4.22(1H,m),4.12-4.02(2H,m),3.93-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.69-3.67(1H,m),3.61-3.56(1H,m),3.46-3.44(2H,m),2.82-2.77(1H,m),1.97-1.89(4H,m),1.68-1.64(2H,m),1.05-0.93(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：557[81Br,(M+H)+],555[79Br,(M+H)+].
步驟5：(11aS)-三氟甲磺酸8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2-基酯
於-40℃下向上述步驟4中獲得之化合物(9.74g，17.5mmol)之二氯甲烷(160mL)溶液中添加2,6-二甲基吡啶(8.17mL，70.1mmol)，於-40℃下攪拌10分鐘。於-40℃下向反應溶液中添加三氟甲磺酸酐(8.85mL， 52.6mmol)，於-40℃下攪拌30分鐘。於反應溶液中添加10%檸檬酸水溶液，利用氯仿進行萃取，利用硫酸鈉乾燥所獲得之有機層。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=95：5(v/v)~70：35(v/v)]純化所獲得之殘渣後，藉由NH2矽膠層析法[己烷：乙酸乙酯=95：5(v/v)~65：35(v/v)]進行純化，而獲得目標物(7.10g，59%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.32(1H,s),7.24(1H,s),7.15-7.14(1H,m),5.56-5.53(1H,m),4.70-4.68(1H,m),4.66-4.63(1H,m),4.11-4.01(2H,m),3.94-3.90(4H,m),3.84-3.75(1H,m),3.73-3.68(1H,m),3.46-3.44(2H,m),3.18-3.14(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.69-1.61(2H,m),1.02-0.92(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：689[81Br,(M+H)+],687[79Br,(M+H)+].
步驟6：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
於室溫下向上述步驟5中獲得之化合物(2.00g，2.91mmol)、4-甲氧基苯基硼酸(0.884g，5.82mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(0.336g，0.291mmol)、碳酸鈉(1.23g，11.6mmol)之混合物中添加甲苯(20mL)、乙醇(10mL)、水(10mL)。於室溫下將反應溶液攪拌30分鐘後，利用乙酸乙酯萃取反應溶液，利用水、飽和鹽水將其洗淨。利用硫酸鈉將有機層乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)~50：50(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(1.71g，91%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.38-7.37(3H,m),7.33(1H,s),7.25(1H,s), 6.89-6.88(2H,m),5.56-5.54(1H,m),4.71-4.68(1H,m),4.65-4.62(1H,m),4.09-4.04(2H,m),3.96-3.91(4H,m),3.85-3.66(5H,m),3.46-3.45(2H,m),3.16-3.12(1H,m),1.99-1.94(4H,m),1.69-1.64(2H,m),1.00-0.98(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：647[81Br,(M+H)+],645[79Br,(M+H)+].
步驟7：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,11a-二氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮
將上述步驟6中獲得之化合物(0.789g，1.22mmol)溶解於乙醇(10mL)、THF(10mL)中，於0℃下添加2.0M之硼氫化鋰四氫呋喃溶液(6.11mL，12.2mmol)，於0℃下攪拌3小時。於反應溶液中添加水，利用氯仿進行萃取，利用硫酸鈉乾燥所獲得之有機層。於減壓下蒸餾去除，將所獲得之殘渣溶解於二氯甲烷(10mL)、乙醇(20mL)、水(10mL)中，於室溫下添加矽膠(4g)，並於室溫下攪拌4天。藉由過濾去除矽膠，添加水，利用氯仿進行萃取，利用硫酸鈉乾燥所獲得之有機層。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=60：40(v/v)~25：75(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.496g，81%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.90-7.89(1H,m),7.53(1H,s),7.40-7.40(1H,m),7.35-7.34(2H,m),6.92-6.90(2H,m),6.83-6.81(1H,m),4.43-4.40(1H,m),4.13-4.06(2H,m),3.96(3H,s),3.84(3H,s),3.61-3.57(1H,m),3.47-3.36(3H,m),2.00-1.92(4H,m),1.67-1.63(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：501[81Br,(M+H)+],499[79Br,(M+H)+].
步驟8：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,10,11,11a-四氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮
於0℃下向上述步驟7中獲得之化合物(0.496g，0.992mmol)之二氯甲烷(20mL)溶液中添加三乙醯氧基硼氫化鈉(0.421g，1.99mmol)。於室溫下攪拌2小時後，添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用氯仿進行萃取。利用硫酸鈉乾燥有機層，於減壓下蒸餾去除後，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=60：40(v/v)~25：75(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.426g，86%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.53-7.53(2H,m),7.32-7.30(2H,m),6.89-6.87(2H,m),6.05(1H,s),4.33-4.27(2H,m),4.00-3.98(2H,m),3.86(3H,s),3.82(3H,s),3.57-3.55(2H,m),3.42-3.38(3H,m),2.76-2.72(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.65-1.62(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：503[81Br,(M+H)+],501[79Br,(M+H)+].
步驟9：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
於0℃下向上述步驟8中獲得之化合物(0.426g，0.849mmol)之二氯甲烷(30mL)溶液中添加吡啶(0.102mL，1.27mmol)、氯甲酸烯丙酯(0.374mL，3.54mmol)，於0℃下攪拌15分鐘。於反應溶液中添加10%檸檬酸水溶液，利用氯仿進行萃取，利用飽和碳酸氫鈉水溶液洗淨所獲得之有機層後，利用硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)~50：50(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.465g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.38(1H,s),7.31-7.29(2H,m),7.26-7.25(1H,m),6.89-6.87(2H,m),6.71(1H,s),5.80-5.78(1H,m),5.14-5.11 (2H,m),4.65-4.62(1H,m),4.39-4.26(3H,m),4.03-4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.82(3H,s),3.66-3.64(1H,m),3.46-3.44(2H,m),3.30-3.27(1H,m),2.72-2.68(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.68-1.60(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：587[81Br,(M+H)+],585[79Br,(M+H)+].
步驟10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於室溫下向實施例1步驟10中獲得之化合物(0.130g，0.161mmol)與上述步驟9中獲得之化合物(0.104g，0.177mmol，)之N,N-二甲基甲醯胺(3mL)溶液中添加碳酸鉀(0.0266g，0.193mmol)，於室溫下攪拌一晚。利用乙酸乙酯稀釋反應溶液，利用水、飽和鹽水將其洗淨後，利用硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除後，藉由NH2-矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=70：30(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.184g，87%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.76(1H,s),7.58-7.56(2H,m),7.39(1H,s),7.32-7.30(2H,m),7.26-7.24(2H,m),7.19-7.17(3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68-6.66(1H,m),6.37(1H,s),5.99-5.93(3H,m),5.34-5.20(6H,m),4.66-4.01(11H,m),3.90(3H,s),3.89(3H,s),3.78-3.54(9H,m),3.31-3.28(2H,m),2.73-2.69(1H,m),2.38-2.35(1H,m),2.19-2.13(1H,m),1.82-1.80(2H,m),1.46-1.29(6H,m),0.98-0.90(6H, m),0.83(9H,s),0.69-0.63(4H,m),0.19-0.16(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1312(M+H)+
步驟11：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於室溫下向上述步驟10中獲得之化合物(0.1837g，0.140mmol)與乙酸(0.048mL，0.840mmol)之THF(5.00mL)溶液中添加1mol/L之氟化四丁基銨四氫呋喃溶液(0.700mL，0.700mmol)，於室溫下攪拌3小時。利用乙酸乙酯稀釋反應溶液，利用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和鹽水洗淨有機層後，利用硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除後，藉由矽膠層析法[氯仿：甲醇=99.5：0.5(v/v)~95：5(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.178g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.86(1H,s),7.60-7.59(2H,m),7.39(1H,s),7.32-7.20(7H,m),6.90-6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68(1H,s),6.38(1H,s),5.90-5.87(3H,m),5.39-5.22(6H,m),4.72-4.02(11H,m),3.90(3H,s),3.88(3H,s),3.83(3H,s),3.70-3.63(6H,m),3.32-3.29(3H,m),2.73-2.69(1H,m),2.43-2.40(1H,m),2.12-2.06(1H,m),1.77-1.74(2H,m),1.39-1.25(6H,m),0.96-0.89(6H,m),0.73-0.66(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1198(M+H)+
步驟12：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基 -8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於室溫下向上述步驟11中獲得之化合物(0.140mmol)之二氯甲烷(2mL)溶液中添加吡咯啶(0.0579mL，0.700mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(0.0162g，0.0140mmol)，於室溫下攪拌15分鐘。於減壓下蒸餾去除後，藉由矽膠層析法[氯仿：甲醇=99.5：0.5(v/v)~92.5：7.5(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.143g，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.12(1H,s),7.94-7.92(1H,m),7.57-7.53(4H,m),7.33-7.31(2H,m),7.20-7.18(3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.36(1H,s),6.07(1H,s),5.91-5.88(1H,m),5.47-5.44(1H,m),5.21-5.13(1H,m),4.66-4.58(3H,m),4.32(1H,s),4.03-3.49(17H,m),3.38-3.29(4H,m),3.15-3.14(1H,m),2.77-2.73(1H,m),2.57(2H,s),2.43-2.40(1H,m),2.32-2.27(1H,m),1.81-1.39(8H,m),0.98-0.96(3H,m),0.85-0.83(3H,m),0.75-0.62(4H,m).
1H-NMR(CD3OD,50℃)δ：7.84(1H,s),7.56-7.48(2H,m),7.44-7.32(4H,m),7.26-7.13(3H,m),6.89(2H,d,J=8.5Hz),6.78-6.66(1H,m),6.26(1H,s),5.96(1H,d,J=9.7Hz,H11'),5.27(1H,d,J=12.1Hz),4.96-4.78(1H,m),4.63-4.58(2H,m),4.49(1H,q,J=6.9Hz),4.28-4.19(1H,m),4.07-3.89(4H,m),3.85(3H,s),3.79(3H,s),3.76(3H,s),3.67(1H,d,J=11.5Hz),3.61(1H,d,J=13.3Hz),3.54(1H,dd,J=9.7,8.2Hz,H11'a),3.43-3.31(2H,m),3.21(1H,d,J=11.5Hz), 3.14(1H,d,J=4.8Hz),2.78(1H,dd,J=16.6,4.5Hz),2.43(1H,dd,J=13.0,8.2Hz,H1'b),2.05-1.93(1H,m),1.91-1.75(4H,m),1.73-1.55(2H,m),1.69(1H,d,J=13.3Hz,H1'a),1.40(3H,d,J=7.3Hz),0.96(3H,d,J=6.7Hz),0.89(3H,d,J=7.3Hz),0.76-0.58(4H,m).
Figure 107134301-A0305-02-0204-148
MS(APCI,ESI)m/z：1030(M+H)+
步驟13：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0204-358
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於室溫下向實施例2步驟1中獲得之化合物(0.0640g，0.153mmol)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(0.0446g，0.180mmol)之混合物中添加二氯甲烷(2mL)，於室溫下攪拌15分鐘。於反應溶液中添加上述步驟13中獲得之化合物(0.143g，0.139mmol)之二氯甲烷(2mL)溶液，於室溫下攪拌五小時後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=99.5：0.5(v/v)~92.5：7.5(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標 物(0.103g，52%)。
Table 1：關於藥物連結基1之質子NMR峰值位置及MS
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.93(1H,s),8.21-8.16(2H,m),8.07-8.04(1H,m),7.83-7.64(2H,m),7.60-7.55(3H,m),7.51-7.28(10H,m),7.19-7.16(2H,m),7.10-7.04(1H,m),6.92-6.90(2H,m),6.76-6.70(1H,m),6.39(1H,s),5.77-5.75(1H,m),5.21-5.18(1H,m),5.03-4.99(1H,m),4.82-4.79(1H,m),4.37-4.35(1H,m),4.21-4.20(2H,m),4.02-3.24(26H,m),3.16-3.13(1H,m),2.79-2.59(2H,m),2.39-2.28(2H,m),2.05-1.97(2H,m),1.91-1.77(4H,m),1.57-1.54(3H,m),1.28-1.23(3H,m), 0.85-0.80(6H,m),0.67-0.61(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1431(M+H)+
實施例4：藥物連結基2
[化128]
Figure 107134301-A0305-02-0206-149
步驟1：(2R,11aS)-8-(3-溴丙氧基)-2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
使實施例3步驟1中獲得之化合物(5.06g，9.67mmol)與1,3-二溴丙烷(4.93mL，48.4mmol)以與實施例3步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(4.85g，78%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(1H,s),7.26(1H,s),5.52-5.50(1H,m),4.65-4.63(1H,m),4.61-4.55(1H,m),4.25-4.14(3H,m),3.92(3H,s),3.82-3.62(5H,m),3.57-3.54(1H,m),2.86-2.84(1H,m),2.41-2.39(2H,m),2.06-1.99(1H,m),1.03-0.97(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：645[81Br,(M+H)+],643[79Br,(M+H)+].
步驟2：(2R,11aS)-8-(3-溴丙氧基)-2-羥基-7-甲氧基-10- {[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
使上述步驟1中獲得之化合物(4.85g，7.54mmol)以與實施例3步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(4.05g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(1H,s),7.26(1H,s),5.53-5.51(1H,m),4.66-4.61(2H,m),4.32-4.30(1H,m),4.21-4.16(2H,m),3.91-3.85(4H,m),3.82-3.74(1H,m),3.71-3.59(4H,m),2.99-2.96(1H,m),2.43-2.37(2H,m),2.15-2.09(2H,m),1.04-0.96(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：531[81Br,(M+H)+],529[79Br,(M+H)+].
步驟3：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2,5,11(3H,10H,11aH)-三酮
使上述步驟2中獲得之化合物(7.54mmol)以與實施例3步驟4同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.73g，93%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.34(1H,s),7.29(1H,s),5.56-5.53(1H,m),4.72-4.69(1H,m),4.67-4.61(1H,m),4.23-4.17(3H,m),3.97-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.74-3.56(4H,m),2.82-2.77(1H,m),2.43-2.38(2H,m),1.06-0.94(2H,m),0.08-0.00(9H,m).
步驟4：(11aS)-三氟甲磺酸8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-5,10,11,11α-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2-基酯
使上述步驟3中獲得之化合物(3.73g，7.08mmol)以與實施例3步驟5同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.27g，70%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.33(1H,s),7.29(1H,s),7.15-7.15(1H,m),5.56-5.54(1H,m),4.70-4.65(2H,m),4.21-4.18(2H,m),3.94-3.91(4H,m),3.81-3.79(1H,m),3.70-3.64(3H,m),3.19-3.15(1H,m),2.47-2.38(2H,m),1.02-1.00(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：661[81Br,(M+H)+],659[79Br,(M+H)+].
步驟5：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
使上述步驟4中獲得之化合物(3.27g，4.96mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.49g，81%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.49-7.47(2H,m),7.40(1H,s),7.31-7.24(2H,m),6.93-6.88(2H,m),5.33-5.31(1H,m),5.25-5.18(1H,m),4.81-4.80(1H,m),4.23-4.10(2H,m),3.85(3H,s),3.77(3H,s),3.70-3.59(3H,m),3.52-3.40(2H,m),3.15-3.08(1H,m),2.33-2.27(2H,m),0.86-0.74(2H,m),-0.07(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：619[81Br,(M+H)+],617[79Br,(M+H)+].
步驟6：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,11a-二氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮
使上述步驟5中獲得之化合物(2.49g，4.04mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.59g，84%)。
MS(APCI,ESI)m/z：473[81Br,(M+H)+],471[79Br,(M+H)+].
步驟7：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,10,11,11a-四氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮
使上述步驟6中獲得之化合物(1.59g，3.38mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.39g，87%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.54(1H,s),7.54-7.51(1H,m),7.32-7.29(2H,m),6.89-6.87(2H,m),6.10(1H,s),4.32-4.28(2H,m),4.14-4.13(2H,m),3.85(3H,s),3.82(3H,s),3.63-3.62(2H,m),3.57-3.55(2H,m),3.40-3.36(1H,m),2.76-2.72(1H,m),2.40-2.37(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：475[81Br,(M+H)+],473[79Br,(M+H)+].
步驟8：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟7中獲得之化合物(1.40g，2.95mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.885g，54%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.34(1H,s),7.27-7.25(2H,m),7.22(1H,s),6.86-6.84(2H,m),6.73(1H,s),5.76-5.74(1H,m),5.11-5.09(2H,m),4.62-4.59(2H,m),4.33-4.31(1H,m),4.16-4.13(3H,m),3.88(3H,s),3.79(3H,s),3.60-3.59(3H,m),3.27-3.23(1H,m),2.69-2.65(1H,m),2.37-2.34(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
步驟9：N-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11'aS)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11'a-二氫-1'H,3'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯 二氮呯]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.0381g，0.0683mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0712g，81%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1284(M+H)+.
步驟10：N-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11'aS)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11'a-二氫-1'H,3'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟9中獲得之化合物(0.0712g，0.0554mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0671g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：1170(M+H)+.
步驟11：L-纈胺醯基-N-[4-({[(11'aS)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11'a-二氫-1'H,3'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟10中獲得之化合物(0.0571mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0574g，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.16(1H,s),7.93-7.91(1H,m),7.55-7.52(1H,m),7.50-7.47(3H,m),7.35-7.32(2H,m),7.21(1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.40(1H,s),6.08(1H,s),5.90-5.87(1H, m),5.37-5.34(1H,m),4.73-4.53(3H,m),4.23-4.08(5H,m),3.89(3H,s),3.82(3H,s),3.78-3.72(5H,m),3.57-3.51(3H,m),3.38-3.30(3H,m),2.76-2.71(1H,m),2.36-2.24(4H,m),1.78-1.42(6H,m),1.00-0.98(3H,m),0.87-0.84(3H,m),0.74-0.62(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1002(M+H)+.
步驟12：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0211-359
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11'aS)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11α-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11'α-二氫-1'H,3'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟11中獲得之化合物(0.189g，0.189mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.169g，64%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1402(M+H)+.
實施例5：藥物連結基3
[化129]
Figure 107134301-A0305-02-0212-151
步驟1：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-L-異白胺酸
於0℃下向L-脯胺醯基-L-異白胺酸(1.00g，4.40mmol)之1mol/l氫氧化鈉水溶液(8.80mL，8.80mmol)、1,4-二
Figure 107134301-A0305-02-0212-360
烷(30mL)溶液中緩慢滴加氯甲酸烯丙酯(0.690mL，6.53mmol)。於室溫下將反應混合物攪拌5小時後，於反應混合物中添加硫酸氫鉀水溶液，將pH值調整為4左右，利用氯仿進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下進行濃縮，於殘渣中添加己烷。濾取所產生之固體並加以乾燥，藉此獲得目標物(1.20g，88%)。
MS(APCI,ESI)m/z：311(M-H)-
步驟2：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-L-異白胺醯胺
於室溫下向上述步驟1中獲得之化合物(13.7g，43.4mmol)與4-胺基苄醇(6.00g，48.7mmol)之THF溶液(100mL)中添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(12.0g，48.7mmol)。於室溫下將反應溶液攪拌23小 時，添加二乙醚(200mL)後，濾取所產生之固體，將所獲得之化合物(13.2g，65%)直接用於下一反應。
步驟3：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-異白胺醯胺
使上述步驟2中獲得之化合物(6.87g，16.5mmol)以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(7.46g，56%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.99-8.97(1H,m),8.45-8.42(1H,m),7.81-7.49(3H,m),7.36-7.33(2H,m),6.81-6.77(2H,m),5.96-5.91(1H,m),5.32-5.23(2H,m),5.13-5.10(2H,m),4.73-4.30(6H,m),4.00-3.98(1H,m),3.78-3.52(7H,m),3.06-3.02(1H,m),2.37-2.12(5H,m),2.06-1.92(1H,m),1.77-1.48(2H,m),1.32-1.27(3H,m),1.11-1.09(18H,m),1.03-0.91(15H,m),0.66-0.44(4H,m),0.09-0.04(6H,m).
步驟4：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-異白胺醯胺
使上述步驟3中獲得之化合物(7.46g，7.41mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(6.07g，92%)。
MS(APCI,ESI)m/z：892(M+H)+
步驟5：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]- 10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-異白胺醯胺
使上述步驟4中獲得之化合物(6.07g，6.80mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(4.18g，69%)。
MS(APCI,ESI)m/z：890(M+H)+
步驟6：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-異白胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(4.18g，4.70mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(4.26g，90%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1004(M+H)+
步驟7：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-異白胺醯胺
使上述步驟6中獲得之化合物(4.26g，4.70mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.48g，69%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.44-8.41(1H,m),7.53-7.37(1H,m),7.24-7.23(1H,m),7.14-7.11(2H,m),6.82(1H,s),6.67-6.65(1H,m),6.11-6.07(1H,m),5.99-5.95(2H,m),5.33-5.02(4H,m),4.84-4.41(5H,m),3.94(3H,s),3.73-3.70(1H,m),3.59-3.52(4H,m),3.29-3.26(1H,m),2.39-2.24(5H,m),1.99-1.97(2H,m),1.56-1.53(1H,m),1.10-0.64(19H,m),0.20-0.16(3H,m),0.09-0.07(3H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：848(M+H)+
步驟8：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11'-[(三甲基矽烷基)氧基]-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-異白胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.200g，0.236mmol)以與實施例4步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.308g，99%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1324(M+H)+
步驟9：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-異白胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.308g，0.233mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.261g，93%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1210(M+H)+
步驟10：L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧 基)甲基]苯基}-L-異白胺醯胺
使上述步驟9中獲得之化合物(0.261g，0.216mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.183g，81%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.06(1H,s),8.33-8.31(1H,m),7.53-7.47(4H,m),7.33-7.31(2H,m),7.21(1H,s),7.11-7.09(2H,m),6.89-6.87(2H,m),6.40(1H,s),6.08(1H,s),5.91-5.88(1H,m),5.35-5.32(1H,m),4.69-4.66(2H,m),4.45-4.28(3H,m),4.15-4.05(3H,m),3.87(3H,s),3.82(3H,s),3.78(3H,s),3.74-3.72(3H,m),3.64-3.47(3H,m),3.37-3.30(2H,m),3.04-3.00(1H,m),2.94-2.88(1H,m),2.75-2.72(1H,m),2.42-2.39(1H,m),2.13-2.05(4H,m),1.92-1.55(6H,m),1.20-1.14(1H,m),0.98-0.96(3H,m),0.91-0.89(3H,m),0.70-0.66(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1042(M+H)+
步驟11：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0216-361
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-異白胺醯胺
使上述步驟10中獲得之化合物(0.0474g，0.455mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0495g，75%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1443(M+H)+
實施例6：藥物連結基4
[化130]
Figure 107134301-A0305-02-0217-152
步驟1：於室溫下向實施例4步驟11中獲得之化合物(0.0564g，0.0563mmol)、三乙胺(0.00936mL，0.0675mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(5mL)溶液中添加1-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0217-362
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(0.0249g，0.0619mmol)。於室溫下攪拌2小時後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=99.5：0.5(v/v)~90：10(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.0490g，68%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1289(M+H)+
實施例7：藥物連結基5
Figure 107134301-A0305-02-0217-153
步驟1：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-苯基丙胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]甘胺醯胺
於0℃下向起始物質7-1(1.24g，3.80mmol，Bioorganic & Medicinal Chemistry 2015,3,3237-3247)、碳酸鉀(0.945g，6.84mmol)之THF(18mL)、水(12mL)溶液中添加氯甲酸烯丙酯(0.482mL，4.560mmol)，於室溫下添加1小時。利用乙酸乙酯進行萃取後，利用水、飽和鹽水將其洗淨，利用硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除後，將所獲得之殘渣溶解於少量之乙酸乙酯中，並添加二乙醚。濾取所產生之固體(1.30g，83%)，直接用於下一反應。
步驟2：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-苯基丙胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]甘胺醯胺
使上述步驟1中獲得之化合物(1.30g，3.16mmol)以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.32g，54%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.01(1H,s),8.38(1H,s),7.80(1H,s),7.60-7.58(2H,m),7.32-7.29(5H,m),7.19-7.18(2H,m),6.76(1H,s),6.55(1H,s),5.89-5.83(1H,m),5.24-5.13(5H,m),4.56-4.55(3H,m),4.34-4.33(1H,m),4.10-4.06(1H,m),3.98-3.94(2H,m),3.75-3.72(5H,m),3.16-3.08(3H,m),2.28-2.25(1H,m),1.70-1.68(1H,m),1.30-1.27(3H,m),1.11-1.09(18H,m),0.90(9H,s),0.65-0.48(4H,m),0.05-0.02(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1000(M+H)+
步驟3：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-苯基丙胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]甘胺醯胺
使上述步驟2中獲得之化合物(1.32g，1.32mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.23g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.48-8.38(2H,m),7.71(1H,s),7.61-7.59(2H,m),7.36-7.27(5H,m),7.20-7.18(2H,m),6.76(1H,s),6.55-6.52(1H,m),5.89-5.83(1H,m),5.28-5.13(5H,m),4.56-4.55(3H,m),4.34-4.33(1H,m),4.22-4.20(1H,m),4.10-4.06(1H,m),3.98-3.94(1H,m),3.78-3.75(5H,m),3.64-3.62(1H,m),3.17-3.07(3H,m),1.84-1.83(2H,m),1.30-1.26(3H,m),1.11-1.09(18H,m),0.61-0.49(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：886(M+H)+
步驟4：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-苯基丙胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}甘胺醯胺
使上述步驟3中獲得之化合物(1.32mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.660g，57%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.34(1H,s),7.53-7.51(2H,m),7.26-7.18(8H,m),6.66-6.57(2H,m),5.88-5.80(2H,m),5.27-5.21(3H,m),5.11-5.07(1H,m),4.99-4.96(1H,m),4.55-4.54(2H,m),4.36-4.34(1H,m),4.13-3.92(2H,m),3.83(3H,s),3.73-3.70(1H,m),3.57-3.55(1H,m),3.46-3.44(1H,m),3.32-3.29(1H,m),3.18-3.15(1H,m),3.09-3.05(1H,m),2.42-2.38(1H,m),1.75-1.72(1H,m),1.25-1.02(21H,m),0.73-0.60(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：884(M+H)+
步驟5：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-苯基丙胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}甘胺醯胺
使上述步驟4中獲得之化合物(0.834g，0.943mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.555g，59%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.26-8.23(1H,m),7.51-7.50(2H,m),7.29-7.28(3H,m),7.18-7.13(5H,m),6.64-6.62(1H,m),6.52-6.49(1H,m),6.02-6.00(1H,m),5.88-5.83(1H,m),5.25-5.17(4H,m),4.84-4.81(1H,m),4.55-4.55(2H,m),4.34-4.33(1H,m),4.06-3.97(2H,m),3.84(3H,s),3.71-3.68(1H,m),3.50-3.48(1H,m),3.28-3.05(3H,m),2.36-2.33(1H,m),1.56-1.53(1H,m),1.28-1.01(21H,m),0.81-0.61(13H,m),0.19(3H,s),0.09(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：998(M+H)+
步驟6：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-苯基丙胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}甘胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(0.555g，0.556mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.451g，96%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.42-8.40(1H,m),7.50-7.46(2H,m),7.28-7.26(3H,m),7.20-7.18(3H,m),7.10-7.08(2H,m),6.67-6.65(2H,m),6.16-6.13(1H,m),6.02-5.99(1H,m),5.88-5.82(1H,m),5.28-5.18(4H, m),4.87-4.84(1H,m),4.54-4.53(2H,m),4.38-4.36(1H,m),4.10-4.07(1H,m),3.93-3.90(4H,m),3.72-3.69(1H,m),3.54-3.52(1H,m),3.25-3.17(2H,m),3.08-3.04(1H,m),2.36-2.33(1H,m),1.57-1.54(1H,m),0.81-0.61(13H,m),0.19(3H,s),0.10(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：842(M+H)+
步驟7：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-苯基丙胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}甘胺醯胺
使上述步驟6中獲得之化合物(0.115g，0.137mmol)以與實施例4步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.160g，89%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1318(M+H)+
步驟8：N-[(丙-2-烯-1-基)羰基]-L-苯基丙胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}甘胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.160g，0.121mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.136g，93%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1204(M+H)+
步驟9：L-苯基丙胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}甘胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.136g，0.113mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0372g，32%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.84-8.81(1H,m),8.07-8.05(1H,m),7.53-7.39(4H,m),7.34-7.19(8H,m),7.12-7.10(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.44-6.42(1H,m),6.10-6.08(1H,m),5.90-5.88(1H,m),5.38-5.35(1H,m),4.76-4.72(1H,m),4.57-4.44(1H,m),4.32-4.29(1H,m),4.17-4.01(5H,m),3.89-3.52(17H,m),3.41-3.25(3H,m),2.72-2.69(2H,m),2.43-2.40(1H,m),2.19-2.16(2H,m),1.78-1.74(1H,m),1.59-1.56(1H,m),0.72-0.66(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1036(M+H)+
步驟10：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0222-363
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}甘胺醯胺
使上述步驟9中獲得之化合物(0.0372g，0.0359mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0170g，33%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1437(M+H)+
實施例8：藥物連結基6
Figure 107134301-A0305-02-0223-154
步驟1：N-[(11,12-二去氫-5,6-二氫二苯并[a,e][8]輪烯-5-基氧基)羰基]甘胺醯甘胺酸
於室溫下向4-硝基苯基胺基甲酸11,12-二去氫-5,6-二氫二苯并[a,e][8]輪烯-5-基酯(0.437g，1.14mmol)、N,N-二異丙基乙基胺(0.198mL，1.14mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(6mL)溶液中添加甘胺醯甘胺酸(0.150g，1.14mmol)、水(3mL)，於室溫下攪拌一晚。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：CMW=100：0(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.324g，75%)。
MS(APCI,ESI)m/z：378(M+H)+
步驟2：N-[(11,12-二去氫-5,6-二氫二苯并[a,e][8]輪烯-5-基氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟1中獲得之化合物(0.0306g，0.0305mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0361g，87%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1362(M+H)+
實施例9：藥物連結基7
Figure 107134301-A0305-02-0224-155
步驟1：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
使起始物質9-1以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.37g，45%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.06(1H,s),9.16(1H,s),8.10-8.06(1H,m),7.62-7.60(2H,m),7.33-7.31(2H,m),7.27-7.24(2H,m),6.84-6.81(1H,m),5.94-5.89(2H,m),5.41(2H,s),5.32-5.28(1H,m),5.18-5.16(1H,m),5.03(2H,s),4.48-4.42(3H,m),4.30(1H,s),3.93-3.73(6H,m),3.47-3.14(3H,m),3.00-2.95(2H,m),2.00-1.89(2H,m),1.65-1.60(2H,m),1.42-1.39(2H,m),1.26-1.19(3H,m),1.04-1.01(18H,m),0.88-0.75(15H,m),0.51-0.49(4H,m),0.05-0.17(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1052(M+H)+
步驟2：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-鳥胺醯胺
使上述步驟1中獲得之化合物(1.37g，1.31mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.00g，82%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.07(1H,s),9.13(1H,s),8.11-8.09(1H,m),7.62-7.60(2H,m),7.34-7.31(2H,m),7.26-7.23(2H,m),6.92-6.90(1H,m),5.97-5.86(2H,m),5.41(2H,s),5.32-5.28(1H,m),5.19-5.16(1H,m),5.04(2H,s),4.80(1H,s),4.48-4.41(3H,m),4.27(1H,s),3.93-3.87(1H,m),3.74(3H,s),3.61-3.58(2H,m),3.39-3.30(2H,m),3.03-2.97(3H,m),2.00-1.84(2H,m),1.65-1.60(2H,m),1.44-1.37(2H,m),1.26-1.19(3H,m),1.05-1.04(18H,m),0.87-0.83(6H,m),0.53-0.42(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：938(M+H)+
步驟3：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-鳥胺醯胺
於0℃下向上述步驟2中獲得之化合物(1.00g，1.07mmol)、二氯甲烷(80mL)、二甲基甲醯胺(10mL)之混合物中添加戴斯-馬丁過碘烷(0.455g，1.07mmol)。於0℃下攪拌一小時後，再一次添加戴斯-馬丁過 碘烷(0.455g，1.07mmol)，於0℃下攪拌一小時。於反應溶液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用氯仿萃取後，利用飽和鹽水將其洗淨。於減壓下蒸餾去除後，添加乙酸乙酯，並濾取固體。於減壓下對濾液進行蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=50：50~己烷：乙酸乙酯=0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，與固體合併而獲得目標物(0.671g，67%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.05(1H,s),8.11-8.09(1H,m),7.56-7.54(2H,m),7.25-7.23(1H,m),7.13-7.09(3H,m),6.62(1H,s),6.53(1H,s),5.94-5.88(2H,m),5.78-5.76(1H,m),5.40(2H,s),5.32-5.28(1H,m),5.17-5.14(2H,m),4.81-4.78(1H,m),4.48-4.41(3H,m),3.92-3.90(1H,m),3.79(3H,s),3.54-3.51(1H,m),3.16-3.14(1H,m),3.02-2.89(2H,m),2.37-2.34(2H,m),1.97-1.92(1H,m),1.63-1.57(3H,m),1.43-1.37(2H,m),1.08-1.01(21H,m),0.87-0.83(6H,m),0.67-0.61(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：938(M+H)+
步驟4：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
使用二氯甲烷(80mL)、二甲基甲醯胺(5mL)之混合溶劑，使上述步驟3中獲得之化合物(0.671g，0.712mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.335g，44%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.04(1H,s),8.12-8.10(1H,m),7.56-7.54 (2H,m),7.26-7.24(1H,m),7.14-7.11(3H,m),6.51(1H,s),5.94-5.91(3H,m),5.40-5.16(5H,m),4.79-4.76(1H,m),4.47-4.44(3H,m),3.92-3.90(1H,m),3.80(3H,s),3.55-3.52(1H,m),3.17-3.14(1H,m),3.00-2.96(3H,m),2.56-2.30(1H,m),2.06-1.17(6H,m),1.10-0.99(21H,m),0.78-0.61(19H,m),0.17(3H,s),0.07(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：1050(M+H)+
步驟5：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
使上述步驟4中獲得之化合物(0.355g，0.712mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.264g，93%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.07-10.03(1H,m),9.89-9.86(1H,m),8.12-8.10(1H,m),7.63-7.54(2H,m),7.35-7.26(1H,m),7.14-7.12(2H,m),7.06(1H,s),6.62-6.59(1H,m),5.97-5.87(3H,m),5.43-5.40(2H,m),5.32-5.28(1H,m),5.17-5.14(2H,m),4.86-4.82(1H,m),4.46-4.42(3H,m),3.91-3.89(1H,m),3.81(3H,s),3.54-3.51(1H,m),3.42-3.40(1H,m),3.09-2.96(3H,m),2.40-2.34(1H,m),1.98-1.97(1H,m),1.68-1.59(2H,m),1.42-1.38(3H,m),0.77-0.64(19H,m),0.16(3H,s),0.08(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：894(M+H)+
步驟6：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-[3- ({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(0.113g，0.126mmol)以與實施例4步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.149g，86%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1370(M+H)+
步驟7：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-鳥胺醯胺
使上述步驟6中獲得之化合物(0.149g，0.109mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.119g，87%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1256(M+H)+
步驟8：L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-鳥胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.050g，0.0398mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0347g，80%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.43(1H,s),7.96-7.94(1H,m),7.51-7.46(4H,m),7.33-7.31(2H,m),7.22(1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.46(1H,s),6.11(1H,s),5.92-5.89(1H,m),5.42-5.39(2H,m),4.78-4.67(4H,m),4.31-4.29(1H,m),4.11-4.04(3H,m),3.92-3.70(13H,m),3.60-3.23(8H,m),3.07-3.05(1H,m),2.75-2.70(1H,m),2.43-2.39(1H,m),2.19-2.16(3H,m),1.73-1.48(6H,m),0.98-0.96(3H,m),0.83-0.81(3H,m),0.71-0.65(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1088(M+H)+
步驟9：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0229-364
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-鳥胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.0347g，0.0319mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.00650g，14%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1489(M+H)+
實施例10：藥物連結基8
[化134]
Figure 107134301-A0305-02-0230-157
步驟1：N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺酸
於室溫下向起始物質10-1(2.78g，7.75mmol，Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry 2012,76,205)之1,2-二甲氧基乙烷(30 mL)、水(30mL)、THF(15mL)溶液中添加碳酸氫鈉(1.30g，15.5mmol)、N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(3.39g，7.76mmol)。於室溫下將反應溶液攪拌五天後，利用氯仿與甲醇混合液(10：1，v/v)進行萃取。利用水、飽和鹽水洗淨有機層後，於減壓下蒸餾去除。利用二乙醚洗淨所獲得之殘渣，將固體過濾去除。於減壓下對濾液進行蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=30：70(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(2.13g，43%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.78-7.76(2H,m),7.60-7.58(2H,m),7.41-7.39(2H,m),7.32-7.30(2H,m),6.85-6.83(1H,m),5.58-5.56(1H,m),5.32-5.30(1H,m),4.72-4.57(3H,m),4.46-4.34(2H,m),4.23-4.21(1H,m),4.05-4.03(1H,m),3.22-3.15(2H,m),2.06-1.88(3H,m),1.52-1.51(2H,m),1.40-1.38(2H,m),0.97-0.96(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：642(M+H)+
步驟2：N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟1中獲得之化合物(2.11g，3.29mmol)以與實施例5步驟2同樣之方式進行反應，將所獲得之化合物(2.24g，91%)直接用於下一反應。
步驟3：L-纈胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
於室溫下向上述步驟2中獲得之化合物(2.24g，3.00mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(20mL)溶液中添加哌啶(0.5934mL，5.994mmol)，於室溫 下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除，將所獲得之殘渣(1.576g，定量)直接用於下一反應。
步驟4：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟3中獲得之化合物(1.58g，3.00mmol)以與實施例7步驟1同樣之方式進行反應，將所獲得之化合物(1.50g，82%)直接用於下一反應。
步驟5：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟4中獲得之化合物(1.57g，2.57mmol)以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.691g，71%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.04-9.02(1H,m),8.48-8.45(1H,m),7.81(1H,s),7.55-7.53(2H,m),7.35-7.33(2H,m),6.76(1H,s),6.68-6.66(1H,m),5.94-5.86(1H,m),5.32-5.23(4H,m),5.14-5.10(2H,m),4.79-4.76(1H,m),4.69-4.67(1H,m),4.57-4.54(4H,m),4.03-4.02(2H,m),3.75-3.72(5H,m),3.29-3.22(2H,m),3.04-3.02(1H,m),2.27-2.01(4H,m),1.83-1.58(3H,m),1.46-1.44(2H,m),1.31-1.27(3H,m),1.11-1.09(18H,m),1.00-0.90(15H,m),0.65-0.48(4H,m),0.06-0.03(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1219(M+Na)+
步驟6：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙 烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(1.69g，1.41mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.43g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.57-8.52(2H,m),7.70(1H,s),7.56-7.54(2H,m),7.35-7.33(2H,m),6.76-6.75(2H,m),5.91-5.90(1H,m),5.40-5.26(4H,m),5.12(2H,s),4.78-4.75(1H,m),4.69-4.66(1H,m),4.58-4.55(4H,m),4.37-4.34(1H,m),4.04-4.02(1H,m),3.80-3.77(5H,m),3.65-3.62(1H,m),3.28-3.11(3H,m),2.13-2.04(2H,m),1.81-1.78(3H,m),1.60-1.58(2H,m),1.45-1.43(2H,m),1.33-1.25(3H,m),1.11-1.09(18H,m),0.98-0.94(6H,m),0.58-0.51(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1083(M+H)+
步驟7：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟6中獲得之化合物(1.43g，1.32mmol)以與實施例9步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.714g，50%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.49-8.46(1H,m),7.52-7.45(2H,m),7.19-7.18(3H,m),6.72-6.68(2H,m),5.90-5.87(2H,m),5.33-5.23(4H,m),5.10-5.07(1H,m),4.98-4.95(1H,m),4.78-4.76(1H,m),4.69-4.66(1H,m),4.58-4.53(3H,m),4.01(1H,s),3.83-3.81(4H,m),3.73-3.70(1H, m),3.57-3.55(2H,m),3.29-3.25(3H,m),2.42-2.39(1H,m),2.15-2.13(1H,m),2.03-2.01(2H,m),1.74-1.71(2H,m),1.44-1.42(2H,m),1.23-1.17(3H,m),1.03-0.93(24H,m),0.67-0.64(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1081(M+H)+
步驟8：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.714g，0.660mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.476g，60%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.63-8.51(1H,m),7.49-7.48(2H,m),7.18-7.14(3H,m),6.61-6.53(2H,m),5.99-5.94(2H,m),5.33-5.17(4H,m),4.81-4.78(3H,m),4.59-4.57(3H,m),4.03-4.01(1H,m),3.88-3.85(4H,m),3.70-3.67(2H,m),3.50-3.47(1H,m),3.24-3.17(3H,m),2.37-2.34(1H,m),2.13-2.07(2H,m),1.59-1.54(3H,m),1.38(2H,s),1.16-0.92(35H,m),0.81-0.76(9H,m),0.67-0.64(4H,m),0.34-0.31(6H,m),0.19(3H,s),0.09(3H,s).
步驟9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-N-{4-[({[(11'S，11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.476g，0.398mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.283g，68%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.48(1H,s),7.51-7.47(2H,m),7.25-7.24(2H,m),7.12-7.10(2H,m),6.70-6.67(2H,m),6.09-6.07(1H,m),5.98-5.92(2H,m),5.33-5.20(5H,m),4.82-4.71(3H,m),4.59-4.56(3H,m),4.03-4.00(1H,m),3.91(3H,s),3.72-3.69(1H,m),3.54-3.52(1H,m),3.28-3.25(3H,m),2.37-2.34(1H,m),2.18-2.16(1H,m),2.05-1.99(1H,m),1.78-1.75(1H,m),1.56-1.53(2H,m),1.43-1.41(2H,m),0.98-0.94(6H,m),0.82-0.75(9H,m),0.67-0.64(4H,m),0.19(3H,s),0.10(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：1039(M+H)+
步驟10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟9中獲得之化合物(0.119g，0.114mmol)以與實施例4步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.134g，77%)。
步驟11：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并 [2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟10中獲得之化合物(0.134g，0.0881mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.120g，97%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1423(M+Na)+
步驟12：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟11中獲得之化合物(0.120g，0.0855mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0813g，77%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.10(1H,s),7.94-7.92(1H,m),7.58(1H,s),7.47-7.45(3H,m),7.35-7.33(2H,m),7.21(2H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.88(2H,m),6.43(1H,s),6.11(1H,s),5.90-5.88(1H,m),5.51(1H,s),5.39-5.36(1H,m),4.73-4.70(3H,m),4.52-4.51(2H,m),4.32(1H,s),4.13-4.08(3H,m),3.89(3H,s),3.80-3.76(9H,m),3.60-3.50(4H,m),3.34-3.24(5H,m),2.76-2.72(1H,m),2.44-2.12(4H,m),1.94-1.27(7H,m),1.00-0.98(3H,m),0.84-0.82(3H,m),0.70-0.66(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1233(M+H)+
步驟13：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0236-365
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥 基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺醯胺
使上述步驟12中獲得之化合物(0.0813g，0.0659mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0721g，67%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1656(M+Na)+
步驟14：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0237-367
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-離胺醯胺
使由上述步驟13獲得之化合物(0.0721g，0.0441mmol)以與實施例21步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0348g，54%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1460(M+H)+
實施例11：藥物連結基9
[化135]
Figure 107134301-A0305-02-0238-158
步驟1：N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-D-纈胺醯基-L-丙胺酸
使用N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-D-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(0.528g，5.92mmol)代替N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯，使L-丙胺酸(0.0721g，0.0441mmol)以與實施例10步驟1同樣之方式進行反應。所獲得之化合物(0.0348g，54%)直接用於下一反應。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.55(1H,s),8.23-8.21(1H,m),7.91-7.89(2H,m),7.76-7.75(2H,m),7.42-7.40(3H,m),7.33-7.31(2H,m),4.31-4.20(4H,m),3.93-3.91(1H,m),1.97-1.93(1H,m),1.27-1.25(3H,m),0.86-0.84(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：411(M+H)+
步驟2：N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-[4- (羥基甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟1中獲得之化合物(2.05g，4.99mmol)以與實施例5步驟2同樣之方式進行反應，將所獲得之化合物(2.19g，85%)直接用於下一反應。
步驟3：D-纈胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟2中獲得之化合物(2.19g，4.25mmol)以與實施例10步驟3同樣之方式進行反應，將所獲得之化合物(0.966g，76%)直接用於下一反應。
步驟4：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟3中獲得之化合物(0.966g，3.29mmol)以與實施例7步驟1同樣之方式進行反應，將所獲得之化合物(1.11g，89%)直接用於下一反應。
步驟5：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟4中獲得之化合物(1.11g，2.93mmol)以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.75g，80%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.02(1H,s),8.55(1H,s),7.81(1H,s),7.57-7.54(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.76(1H,s),6.52-6.50(1H,m),5.91-5.86(1H,m),5.30-5.22(3H,m),5.13-5.10(2H,m),4.65-4.59(4H,m),3.99-3.97(1H,m),3.87-3.85(1H,m),3.75-3.72(5H,m),3.04-3.02(1H, m),2.28-2.13(2H,m),1.70-1.68(1H,m),1.49-1.47(3H,m),1.31-1.27(3H,m),1.11-1.09(18H,m),1.00-0.90(15H,m),0.65-0.48(4H,m),0.06-0.03(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：966(M+H)+
步驟6：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(1.75g，1.81mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.53g，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.66(1H,s),8.50(1H,s),7.69(1H,s),7.57-7.54(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.75-6.71(2H,m),5.90-5.85(1H,m),5.40-5.38(1H,m),5.29-5.21(2H,m),5.12(2H,s),4.71-4.50(4H,m),4.34-4.31(1H,m),3.89-3.77(6H,m),3.64-3.61(1H,m),3.13-3.10(1H,m),2.17-2.09(1H,m),1.87-1.84(2H,m),1.48-1.46(3H,m),1.32-1.28(3H,m),1.11-1.09(18H,m),0.97-0.94(6H,m),0.63-0.49(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：852(M+H)+
步驟7：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-{4-[({[(11'S，11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟6中獲得之化合物(1.53g，1.79mmol)以與實施例9步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.24g，81%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.51(1H,s),7.51-7.49(2H,m),7.18-7.15 (3H,m),6.65(1H,s),6.56-6.54(1H,m),5.90-5.85(2H,m),5.31-5.19(3H,m),5.10-5.07(1H,m),4.97-4.94(1H,m),4.67-4.50(3H,m),3.90-3.88(1H,m),3.84(3H,s),3.73-3.70(1H,m),3.58-3.56(2H,m),3.31-3.28(1H,m),2.42-2.39(1H,m),2.18-2.15(1H,m),1.74-1.71(1H,m),1.48-1.46(3H,m),1.19-0.88(27H,m),0.69-0.65(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：850(M+H)+
步驟8：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(1.24g，1.45mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.979g，70%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.48(1H,s),7.51-7.49(2H,m),7.19(1H,s),7.14-7.12(2H,m),6.62(1H,s),6.53-6.51(1H,m),6.01-5.99(1H,m),5.91-5.85(1H,m),5.30-5.28(2H,m),5.21-5.15(2H,m),4.82-4.79(1H,m),4.68-4.51(3H,m),3.88-3.84(4H,m),3.71-3.69(1H,m),3.50-3.47(1H,m),3.28-3.25(1H,m),2.37-2.34(1H,m),2.20-2.13(1H,m),1.52-1.47(4H,m),1.21-0.94(27H,m),0.80-0.77(9H,m),0.67-0.64(4H,m),0.19(3H,s),0.08(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：964(M+H)+
步驟9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]- 10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.979g，1.02mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.769g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.71(1H,s),7.37-7.35(2H,m),7.23(1H,s),7.04-7.02(2H,m),6.86-6.84(1H,m),6.74-6.72(1H,m),6.65(1H,s),6.05-5.85(2H,m),5.64-5.62(1H,m),5.32-5.20(3H,m),4.82-4.78(1H,m),4.70-4.52(3H,m),4.00-3.98(1H,m),3.93-3.90(3H,m),3.73-3.70(1H,m)3.55-3.53(1H,m),3.27-3.23(1H,m),2.38-2.18(2H,m),1.60-1.46(4H,m),1.00-0.92(6H,m),0.80(9H,s),0.68-0.63(4H,m),0.20(3H,s),0.10(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：808(M+H)+
步驟10：N-[(丙-2-烯)-1-基氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使用上述步驟9中獲得之化合物(0.100g，0.124mmol)，以與實施例4步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.148g，94%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1284(M+H)+
步驟11：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-D-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并 [2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使用上述步驟10中獲得之化合物(0.148g，0.124mmol)，以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.132g，98%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1170(M+H)+
步驟12：D-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使用上述步驟11中獲得之化合物(0.132g，0.113mmol)，以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0963g，85%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.12(1H,s),7.85-7.84(1H,m),7.54-7.52(1H,m),7.49(1H,s),7.44-7.42(2H,m),7.34-7.32(2H,m),7.21(1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.88(2H,m),6.41(1H,s),6.10(1H,s),5.90-5.87(1H,m),5.35-5.32(1H,m),4.74-4.71(1H,m),4.60-4.56(2H,m),4.30(1H,s),4.13-4.10(4H,m),3.89(3H,s),3.83(3H,s),3.80(3H,s),3.74-3.71(1H,m),3.60-3.49(4H,m),3.39-3.35(1H,m),3.31-3.27(2H,m),2.75-2.72(1H,m),2.44-2.18(4H,m),1.78-1.44(6H,m),0.98-0.97(3H,m),0.74-0.68(7H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1002(M+H)+
步驟13：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0243-368
-5(6H)-基)- 4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-D-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使用上述步驟12中獲得之化合物(0.0455g，0.0454mmol)，以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0416g，65%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1403(M+H)+
實施例12：藥物連結基10
Figure 107134301-A0305-02-0244-159
步驟1：化合物12-2
於室溫下向起始物質12-1(2.01g，5.94mmol)之二氯甲烷(50mL)中添加1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(1.37g，7.13mmol)，於室溫下攪拌10分鐘後，於0℃下添加N-羥基丁二醯亞胺(0.821g，7.13mmol)。於室溫下將反應溶液攪拌一晚後，於減壓下將溶劑蒸餾去除。於所獲得之殘渣中添加乙酸乙酯、水，利用水、10%檸檬酸水溶液、飽和碳 酸氫鈉水溶液、飽和鹽水洗淨有機層，利用硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除後，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)~50：50(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(2.11g，82%)。
MS(APCI,ESI)m/z：435(M+H)+
步驟2：化合物12-3
使用L-異白胺酸代替N6-[(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]-L-離胺酸鹽酸鹽，使上述步驟1中獲得之化合物(2.11g，4.85mmol)以與實施例10步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.16g，99%)。
MS(APCI,ESI)m/z：451(M+H)+
步驟3：化合物12-4
使上述步驟2中獲得之化合物(2.16g，4.85mmol)以與實施例5步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.48g，56%)。
步驟4：化合物12-5
使上述步驟3中獲得之化合物(1.48g，2.67mmol)以與實施例10步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.794g，89%)。
步驟5：化合物12-6
使上述步驟3中獲得之化合物(0.794g，2.38mmol)以與實施例7步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.886g，89%)。
步驟6：化合物12-7
使上述步驟5中獲得之化合物(0.794g，2.12mmol)以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.19g，72%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1006(M+H)+
步驟7：化合物12-8
使上述步驟6中獲得之化合物(1.19g，1.18mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.07g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：892(M+H)+
步驟8：化合物12-9
使上述步驟7中獲得之化合物(1.18mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.800g，76%)。
MS(APCI,ESI)m/z：890(M+H)+
步驟9：化合物12-10
使上述步驟8中獲得之化合物(0.800g，0.899mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.567g，90%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1004(M+H)+
步驟10：化合物12-11
使上述步驟9中獲得之化合物(0.567g，0.564mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.454g，94%)。
MS(APCI,ESI)m/z：848(M+H)+
步驟11：化合物12-12
使上述步驟10中獲得之化合物(0.100g，0.118mmol)以與實施例4步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.159g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：1324(M+H)+
步驟12：化合物12-13
使上述步驟11中獲得之化合物(0.118mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.139g，97%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1210(M+H)+
步驟13：化合物12-14
使上述步驟12中獲得之化合物(0.139g，0.114mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0667g，56%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.81(1H,s),8.21-8.19(1H,m),7.55-7.44(4H,m),7.33-7.31(2H,m),7.22(1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.39(1H,s),6.11(1H,s),5.89-5.87(1H,m),5.35-5.32(1H,m),4.80-4.58(2H,m),4.30(1H,s),4.22-4.07(5H,m),3.89(3H,s),3.81-3.72(9H,m),3.58-3.53(3H,m),3.38-3.31(2H,m),2.98-2.93(2H,m),2.76-2.72(1H,m),2.42-2.39(1H,m),2.18-2.12(3H,m),1.94-1.51(7H,m),1.31-1.13(1H,m),0.97-0.90(6H,m),0.71-0.66(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1042(M+H)+
步驟14：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0247-369
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-D-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-異白胺醯胺
使上述步驟13中獲得之化合物(0.0314g，0.0301mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0300g，69%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1443(M+H)+
實施例13：藥物連結基11
[化137]
Figure 107134301-A0305-02-0248-160
步驟1：[2-(2-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0248-370
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙酸
於室溫下向起始物質13-1(3.00g，7.78mmol，東京化成工業股份有限公司)之N,N-二甲基甲醯胺(10mL)溶液中添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(1.16mL，7.78mL)，於室溫下攪拌2小時後，於室溫下添加1-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0248-371
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(1.10g，2.72mmol)、三乙胺(1.94mL，14.0mmol)。於減壓下對反應溶液進行蒸餾去除後，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~氯仿：甲醇=90：10(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.410g，12%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.68-7.66(1H,m),7.55-7.53(1H,m),7.44-7.24(6H,m),6.58-6.56(1H,m),5.16-5.12(1H,m),4.16-4.11(2H,m),3.80-3.57(5H,m),3.48-3.44(2H,m),3.30-3.18(2H,m),2.90-2.86(1H,m),2.52-2.45(1H,m),2.26-2.22(1H,m),2.02-1.98(1H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：451(M+H)+
步驟2：N-{[2-(2-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0248-372
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙醯基}-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1- c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟1中獲得之化合物(0.050g，0.0499mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0590g，82%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1434(M+H)+
實施例14：藥物連結基12
Figure 107134301-A0305-02-0249-161
步驟1：N-[20-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0249-373
-5(6H)-基)-16,20-二側氧基-4,7,10,13-四氧雜-17-氮雜二十烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
將實施例4步驟11中獲得之化合物(0.0500g，0.0499mmol)、起始物質14-1(0.050g，0.0499mmol，Alfa Aesar處有售)、三乙胺(0.00830mL，0.0599mmol)之二氯甲烷(3mL)溶液於室溫下攪拌一晚。於減壓下蒸餾去除後，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~氯仿：甲醇=90：10(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.0490g，64%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1536(M+H)+
實施例15：藥物連結基13
[化139]
Figure 107134301-A0305-02-0250-162
步驟1：(6S,6'S)-5,5'-{1,5-戊二基雙[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)羰基]}雙(5-氮螺[2.4]庚烷-6-羧酸二甲酯)
於0℃下向起始物質15-1(5.41g，10.9mmol，Journal of Medicinal Chemistry 2004,47,1161)之二氯甲烷(50mL)溶液中添加乙二醯氯(5.63mL，65.7mmol)，並滴加N,N-二甲基甲醯胺(0.0844mL，1.09mmol)。將反應溶液升溫至室溫，並攪拌2小時。於減壓下蒸餾去除，將所獲得之殘渣溶解於二氯甲烷(100mL)中，於氮氣環境、-40℃下滴加至(6S)-5-氮螺[2.4]庚烷-6-羧酸甲酯鹽酸鹽(4.28g，24.1mmol，Tetrahedron Letters 2012.53.3847)與三乙胺(6.07mL，43.8mmol)之二氯甲烷溶液(100mL)中。將反應溶液升溫至0℃並攪拌2小時。於反應混合物中添加1當量濃度鹽酸(100mL)，利用水、飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除，而獲得目標物(8.40g，定量)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.71(2H,s),6.88(2H,s),4.63(2H,m),4.15-4.12(4H,m),3.94(6H,s),3.71(6H,s),3.25(2H,m),3.10(2H,m),2.31-2.28(2H,m),1.90-1.83(6H,m),1.60-1.58(2H,m),0.71-0.49 (8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：769(M+H)+.
步驟2：{1,5-戊二基雙[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)]}雙{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]甲酮}
於上述步驟1中獲得之化合物(8.40g，10.9mmol)之THF(100mL)溶液中添加硼氫化鋰(714mg，32.8mmol)，於0℃下攪拌30分鐘，升溫至室溫並攪拌1小時。於0℃下添加1當量濃度鹽酸後，利用乙酸乙酯進行萃取，利用飽和鹽水將其洗淨後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，而獲得目標物(7.70g，99%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.67(2H,s),7.05(2H,s),4.86-4.74(2H,m),4.22-4.12(6H,m),3.92(6H,s),3.83-3.73(2H,m),3.62-3.51(2H,m),3.29(1H,m),3.11(2H,m),2.96(1H,m),2.12-2.03(2H,m),1.82-1.77(6H,m),1.59-1.56(2H,m),0.67-0.41(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：713(M+H)+.
步驟3：二乙酸戊烷-1,5-二基雙[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)羰基(6S)-5-氮螺[2.4]庚烷-5,6-二基甲二基]酯
將上述步驟2中獲得之化合物(7.70g，10.8mmol)溶解於吡啶(20mL)及乙酸酐(10mL，105.9mmol)中，於室溫下加以攪拌。於減壓下蒸餾去除，而獲得目標物(8.38g，97%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.68(2H,s),7.03(2H,s),4.47-4.46(2H,m),4.36-4.27(4H,m),4.13-4.11(6H,m),3.92(6H,s),3.16(2H,m),2.98(2H,m),2.17(1H,m),2.06(6H,s),1.84(4H,m),1.68(1H,m),1.58(2H,m),0.64-0.45(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：797(M+H)+.
步驟4：二乙酸1,5-戊二基雙[氧基(2-胺基-5-甲氧基苯-4,1-二基)羰基(6S)-5-氮螺[2.4]庚烷-5,6-二基甲二基]酯
於上述步驟3中獲得之化合物(8.28g，10.4mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(100mL)溶液中添加5%鈀碳(54%水分，1.00g)後，於氫氣環境、室溫下將反應溶液遽烈攪拌6小時。進行矽藻土過濾後，於減壓下對濾液進行蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~90：10(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(5.05g，66%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：6.66(2H,s),6.36(2H,s),5.11(4H,s),4.49(2H,s),4.19(4H,m),3.90(4H,m),3.62(6H,s),3.48-3.46(2H,m),3.33(2H,s),3.23-3.20(2H,m),2.01(6H,s),1.78-1.74(6H,m),1.55(2H,m),0.61-0.58(4H,m),0.49-0.48(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：737(M+H)+.
步驟5：{(6S)-5-[4-({5-[4-({(6S)-6-[(乙醯氧基)甲基]-5-氮螺[2.4]庚-5-基}羰基)-5-胺基-2-甲氧基苯氧基]戊基}氧基)-5-甲氧基-2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯甲醯基]-5-氮螺[2.4]庚-6-基}乙酸甲酯(單烯丙氧基羰基體)
於上述步驟4中獲得之化合物(5.05g，6.85mmol)之二氯甲烷(100mL)溶液中添加吡啶(1.10mL，13.7mmol)，於氮氣環境、-78℃下添加氯甲酸烯丙酯(0.725mL，6.85mmol)並攪拌2小時。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=70：30(v/v)~100：0(v/v)、氯仿：甲醇=100：0(v/v)~90：10(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得作為目標物之雙烯丙氧基羰基體(1.36g，22%)與單烯丙氧基羰基體(2.63g， 47%)。
二乙酸戊烷-1,5-二基雙[氧基(5-甲氧基-2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯-4,1-二基)羰基(6S)-5-氮螺[2.4]庚烷-5,6-二基甲二基]酯(雙烯丙氧基羰基體)：1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.14(2H,s),7.14(2H,s),6.85(2H,s),5.94(2H,m),5.33(2H,m),5.21(2H,m),4.55(4H,m),4.47(1H,s),4.23(3H,s),3.96(4H,m),3.74(6H,s),3.34(6H,s),3.31(2H,m),3.21(2H,m),2.04(6H,s),1.79(4H,m),1.67(2H,m),1.56(2H,m),0.56-0.48(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：905(M+H)+.
單烯丙氧基羰基體：1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.14(1H,s),7.14(1H,s),6.85(1H,s),6.65(1H,s),6.35(1H,s),5.95(1H,m),5.33(1H,m),5.22(1H,m),5.11(2H,s),4.55(2H,m),4.48(2H,s),4.23-4.14(4H,m),3.96(2H,m),3.90(2H,m),3.74(3H,s),3.63(3H,s),3.49(1H,m),3.38-3.30(4H,m),3.21(1H,m),2.04(3H,s),2.01(3H,s),1.77(5H,m),1.68(1H,m),1.56(2H,m),0.63-0.48(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：821(M+H)+.
步驟6：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[2-({(6S)-6-[(乙醯氧基)甲基]-5-氮螺[2.4]庚-5-基}羰基)-5-({5-[4-({(6S)-6-[(乙醯氧基)甲基]-5-氮螺[2.4]庚-5-基}羰基)-2-甲氧基-5-{[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯氧基]戊基}氧基)-4-甲氧基苯基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟5中獲得之單烯丙氧基羰基體(2.00g，2.44mmol)以與實 施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.64g，89%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.02(1H,s),9.14(2H,s),8.18(1H,m),7.59(2H,m),7.33(2H,m),7.27(1H,m),7.14(2H,s),6.85(2H,s),5.99-5.86(2H,m),5.31(2H,n),5.19(2H,m),5.03(2H,s),4.55(2H,m),4.48(2H,n),4.41(2H,m),4.23-4.21(3H,m),3.94-3.91(4H,m),3.88-3.86(2H,m),3.74(3H,s),3.74(3H,s),3.34(4H,s),3.32-3.30(2H,m),3.20-3.18(2H,m),2.03(6H,s),1.96(1H,m),1.79(4H,s),1.66(1H,m),1.55(2H,s),1.30(3H,m),0.88(3H,m),0.83(3H,m),0.54-0.49(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1224(M+H)+.
步驟7：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-5-{[5-(4-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-2-甲氧基-5-{[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯氧基)戊基]氧基}-4-甲氧基苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
於上述步驟6中獲得之化合物(2.64g，2.16mmol)之甲醇(10mL)溶液中添加碳酸鉀(1.49g，10.8mmol)，於室溫下攪拌3小時。於反應混合物中添加飽和氯化銨水溶液(100mL)，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鈉乾燥有機層。於減壓下蒸餾去除，而獲得目標物(2.21g，90%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.04(1H,s),9.18(1H,s),8.18(1H,m),7.59(2H,m),7.33(2H,m),7.26(1H,m),7.22(1H,s),7.14(2H,s),6.89(2H,s),5.98-5.86(2H,m),5.31(2H,m),5.19(2H,m),5.04(2H,s),4.80(2H,m),4.55(2H,m),4.48(2H,m),4.41(1H,m),4.26(2H,s), 3.96-3.94(4H,m),3.90-3.85(1H,m),3.74(6H,s),3.59(2H,m),3.33(6H,s),3.09(1H,m),1.93-1.83(8H,m),1.57-1.54(2H,m),1.30(3H,m),0.88(3H,m),0.83(3H,m),0.52-0.43(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1140(M+H)+.
步驟8：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-8'-{[5-({(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-10'-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基}氧基)戊基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於上述步驟7中獲得之化合物(2.03g，1.78mmol)之二氯甲烷(50mL)溶液中添加戴斯-馬丁過碘烷(1.59g，3.74mmol)，於室溫下攪拌一晚。於反應混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)，利用氯仿進行萃取。利用無水硫酸鈉乾燥有機層。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~90：10(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(2.05g，定量)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.99(1H,s),8.16(1H,m),7.54(2H,m),7.32-7.22(3H,m),7.08-7.04(2H,m),6.80-6.72(2H,m),6.55(2H,s),5.94-5.86(2H,m),5.75(2H,m),5.31-5.04(2H,m),4.81(1H,m),4.62(1H,m),4.48-4.38(4H,m),4.00-3.87(4H,m),3.79-3.76(7H,m),3.54(2H,m),3.42-3.40(2H,m),3.33(4H,s),3.14(2H,m),2.35(2H,m),1.80-1.78(4H,m),1.59-1.56(4H,m),1.29(3H,m),0.87(3H,m),0.83(3H,m),0.70-0.59(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1136(M+H)+.
步驟9：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(2.05g，1.80mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.02g，60%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.08(1H,s),7.57(2H,m),7.32-7.20(3H,m),7.05(2H,s),6.68-6.60(3H,m),5.74(1H,m),4.99-4.58(4H,m),3.99-3.94(4H,m),3.78-3.73(6H,m),3.66-3.38(4H,m),3.15-3.01(3H,m),2.40-2.34(3H,m),1.89-1.81(6H,m),1.57-1.53(4H,m),1.28(3H,m),0.88(3H,m),0.78(3H,m),0.64-0.55(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：950(M+H)+.
步驟10：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0256-374
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
將上述步驟9中獲得之化合物(0.710g，0.747mmol)與實施例2步驟1中獲得之化合物(0.313g，0.747mmol)溶解於二氯甲烷(1.5mL)與甲醇(0.1mL)之混合溶劑中。添加4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 107134301-A0305-02-0256-375
-2-基)-4-甲基
Figure 107134301-A0305-02-0256-376
啉鎓鹽酸鹽(0.264g，0.897mmol)，於室溫下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~80：20(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.671g，66%)。
Table 2：藥物連結基13之質子NMR之峰值位置及MS
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.91(1H,s),8.32(1H,s),8.23-7.91(3H,m),7.81-7.19(14H,m),7.04(1H,m),6.80-6.62(3H,m),5.77-5.75(1H,m),5.20(1H,m),5.01(1H,m),4.79(1H,m),4.46-4.35(1H,m),4.04(4H,m),3.86-3.38(18H,m),3.22-3.15(2H,m),2.67-2.63(1H,m),2.46-2.23(3H,m),2.09-1.91(2H,m),1.80-1.78(5H,m),1.57(3H,m),1.27(3H,s),1.11-1.04(1H,m),0.87-0.79(6H,m),0.63-0.55(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1351(M+H)+.
實施例16：藥物連結基14
Figure 107134301-A0305-02-0257-163
步驟1：N-[6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0257-378
-5(6H)-基)-6-側氧基己醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使實施例15步驟9中獲得之化合物(0.100g，0.105mmol)與氮雜二苯 并環辛炔酸(0.0351g，0.105mmol)以與實施例15步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0702g，53%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.92(1H,s),8.14(1H,m),7.92-7.19(16H,m),7.04(1H,m),6.86-6.72(1H,m),6.60-6.58(1H,m),5.76(1H,m),5.20(1H,m),5.03(1H,m),4.81-4.78(1H,m),4.43-4.37(2H,m),4.11-3.41(14H,m),3.21-3.15(3H,m),2.43-2.37(2H,m),2.19-2.15(1H,m),2.03-1.92(3H,m),1.77-1.75(5H,m),1.55(4H,s),1.26-1.18(6H,m),1.09-1.04(1H,m),0.87-0.77(6H,m),0.69-0.50(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1265(M+H)+.
實施例17：藥物連結基15
Figure 107134301-A0305-02-0258-166
步驟1：化合物17-2
使起始原料17-1(2.00g，2.81mmol，WO2013053872)與2-甲氧基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)吡啶(2.00g，8.51mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.89g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：672(M+H)+.
步驟2：化合物17-3
將上述步驟1中獲得之化合物(1.89g，2.81mmol)溶解於乙醇(30mL)與甲酸(1.5mL)之混合溶劑中。添加鋅粉末(3.68g)，於室溫下攪拌1小時。進行矽藻土過濾，於濾液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鈉乾燥有機層。於減壓下蒸餾去除，而獲得目標物(1.81g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：642(M+H)+.
步驟3：化合物17-4
使上述步驟2中獲得之化合物(1.81g，2.82mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.76g，86%)。
MS(APCI,ESI)m/z：726(M+H)+.
步驟4：化合物17-5
使上述步驟3中獲得之化合物(1.76g，2.42mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.05g，71%)。
MS(APCI,ESI)m/z：612(M+H)+.
步驟5：化合物17-6
使上述步驟4中獲得之化合物(1.05g，1.71mmol)以與實施例9步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.686g，66%)。
MS(APCI,ESI)m/z：610(M+H)+.
步驟6：化合物17-7
使上述步驟5中獲得之化合物(0.481g，0.789mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.288g，72%)。
MS(APCI,ESI)m/z：508(M+H)+.
步驟7：化合物17-8
使上述步驟6中獲得之化合物(0.288g，0.567mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.268g，93%)。
MS(APCI,ESI)m/z：510(M+H)+.
步驟8：化合物17-9
使上述步驟7中獲得之化合物(0.267g，0.525mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.278g，89%)。
MS(APCI,ESI)m/z：594(M+H)+.
步驟9：化合物17-10
使上述步驟8中獲得之化合物(0.278g，0.468mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.207g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：438(M+H)+.
步驟10：化合物17-11
使用實施例1步驟11中獲得之化合物(0.307g，0.331mmol)，使上述步驟9中獲得之化合物(0.0964g，0.220mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.224g，79%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1285(M+H)+.
步驟11：化合物17-12
使上述步驟10中獲得之化合物(0.294g，0.228mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.284g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：1171(M+H)+.
步驟12：化合物17-13
使上述步驟11中獲得之化合物(0.284g，0.242mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.114g，47%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1003(M+H)+.
步驟13：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0261-379
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[7-甲氧基-2-(6-甲氧基-3-吡啶基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟12中獲得之化合物(0.114g，0.113mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0121g，8%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.75(1H,s),8.24-8.09(2H,m),7.85-6.98(13H,m),6.75-6.73(2H,m),6.57-6.47(1H,m),6.18(1H,s),5.89(1H,s),5.37-4.96(3H,m),4.67-4.60(3H,m),4.41-4.06(6H,m),3.92(3H,s),3.86-3.82(3H,m),3.74-3.70(3H,m),3.59-3.45(3H,m),3.32-3.23(2H,m),2.81-2.64(3H,m),2.28-2.04(4H,m),1.49-1.38(4H,m),1.23-1.22(2H,m),1.09-1.01(3H,m),0.96-0.90(5H,m),0.69-0.64(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1404(M+H)+.
實施例18：藥物連結基16
[化142]
Figure 107134301-A0305-02-0262-167
步驟1：化合物18-1
使用起始原料17-1(2.00g，2.81mmol)與2-甲基-5-吡啶基硼酸(1.00g，7.30mmol)，以與實施例3步驟6同樣之方式進行鈴木宮浦偶合反應，而獲得目標物(0.901g，49%)。
MS(APCI,ESI)m/z：656(M+H)+.
步驟2：化合物18-2
使上述步驟1中獲得之化合物(1.98g，3.02mmol)以與實施例17步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.86g，98%)。
MS(APCI,ESI)m/z：626(M+H)+.
步驟3：化合物18-3
使上述步驟2中獲得之化合物(1.86g，2.97mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.36g，65%)。
MS(APCI,ESI)m/z：710(M+H)+.
步驟4：化合物18-4
使上述步驟3中獲得之化合物(1.36g，2.42mmol)以與實施例1步驟7 同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.991g，87%)。
MS(APCI,ESI)m/z：596(M+H)+.
步驟5：化合物18-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.991g，1.66mmol)以與實施例9步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.608g，62%)。
MS(APCI,ESI)m/z：594(M+H)+.
步驟6：化合物18-6
使上述步驟5中獲得之化合物(0.405g，0.682mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.239g，71%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：8.60(1H,s),8.02(1H,m),7.87(1H,m),7.67(1H,s),7.62(1H,m),7.57-7.54(1H,m),7.40(1H,s),7.25(1H,m),6.74(1H,s),4.53-4.49(1H,m),3.85(3H,s),3.52(2H,m),2.46(3H,s),1.30-1.24(3H,m),1.07-1.06(18H,m)以目標物之水加成體之形式觀測到。
MS(APCI,ESI)m/z：492(M+H)+.
步驟7：化合物18-7
使上述步驟6中獲得之化合物(0.239g，0.485mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.180g，75%)。
MS(APCI,ESI)m/z：494(M+H)+.
步驟8：化合物18-8
使上述步驟7中獲得之化合物(0.180g，0.364mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.179g，85%)。
MS(APCI,ESI)m/z：578(M+H)+.
步驟9：化合物18-9
使上述步驟8中獲得之化合物(0.179g，0.309mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.137g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：422(M+H)+.
步驟10：化合物18-10
使用實施例1步驟11中獲得之化合物(0.258g，0.278mmol)代替實施例1步驟10中獲得之化合物，使上述步驟9中獲得之化合物(0.0780g，0.185mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.213g，91%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1269(M+H)+.
步驟11：化合物18-11
使上述步驟10中獲得之化合物(0.213g，0.168mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.182g，94%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.00-9.85(1H,m),8.54(1H,s),8.32(1H,m),8.16(1H,s),7.82(1H,m),7.65-7.56(3H,m),7.35-7.06(6H,m),6.79(1H,m),6.57(1H,s),5.87-5.80(3H,m),5.26-5.09(5H,m),4.85-4.83(1H,m),4.56-4.40(5H,m),4.13(5H,m),3.92-3.87(2H,m),3.80(5H,s),3.58-3.54(1H,m),3.21-3.09(3H,m),2.81(1H,m),2.45(3H,s),2.36-2.34(1H,m),2.16-2.10(2H,m),1.98-1.92(1H,m),1.57(2H,m),1.30-1.28(4H,m),0.92-0.84(7H,m),0.67-0.62(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1155(M+H)+.
步驟12：化合物18-12
使上述步驟11中獲得之化合物(0.182g，0.157mmol)以與實施例3步 驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0751g，48%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.15(1H,s),8.54(1H,m),8.50(1H,s),7.78(1H,m),7.67(1H,s),7.57(2H,m),7.30(1H,s),7.21-7.19(3H,m),7.05(1H,s),6.77(1H,s),6.60-6.56(2H,m),6.35(1H,s),5.91-5.83(2H,m),5.76(1H,m),5.29-5.13(4H,m),4.84(1H,m),4.54-4.49(1H,m),4.19-4.03(4H,m),3.79(3H,s),3.65(3H,s),3.57-3.53(2H,m),3.42-3.40(1H,m),3.28-3.26(1H,m),3.14(1H,m),2.81(1H,m),2.44(3H,s),2.37-2.33(1H,m),2.21-2.01(3H,m),1.57(1H,m),1.30-1.26(3H,m),0.93-0.83(6H,m),0.67-0.61(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：987(M+H)+.
步驟13：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0265-380
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[7-甲氧基-2-(6-甲基-3-吡啶基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟12中獲得之化合物(0.0751g，0.0761mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0117g，11%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.75(1H,s),8.48-8.46(1H,m),7.69-7.56(4H,m),7.47-6.89(14H,m),6.45(1H,m),6.24-6.19(1H,m),5.91(1H,m),5.37(1H,m),5.01(1H,m),4.67-4.59(3H,m),4.30-3.19(22H,m),2.88-2.63(3H,m),2.55(3H,s),2.42-2.34(2H,m),2.27-2.04(4H,m),1.51-1.34(4H,m),1.12-1.06(3H,m),0.99-0.84(3H,m),0.71-0.66(4H, m).
MS(APCI,ESI)m/z：1388(M+H)+.
實施例19：藥物連結基17
Figure 107134301-A0305-02-0266-168
步驟1：[(2S)-2-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-4-(4-甲氧基苯基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基](5-甲氧基-2-硝基-4-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)甲酮
使起始物質17-1(2.00g，2.81mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.31g，93%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.75-7.73(1H,m),7.12(2H,m),6.82-6.76(4H,m),6.13-6.11(1H,m),4.80-4.70(1H,m),3.93-3.91(3H,m),3.79-3.75(4H,m),3.21-3.15(1H,m),3.01-2.93(1H,m),1.34-1.25(3H,m),1.12(18H,m),0.89(9H,s),0.13-0.18(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：671(M+H)+
步驟2：(2-胺基-5-甲氧基-4-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基} 苯基)[(2S)-2-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-4-(4-甲氧基苯基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基]甲酮
使上述步驟1中獲得之化合物(1.31g，1.95mmol)以與實施例17步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.12g，90%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.21-7.18(2H,m),6.85-6.81(2H,m),6.79-6.76(2H,m),6.28(1H,s),4.42(2H,m),3.98-3.93(1H,m),3.90-3.86(1H,m),3.80(3H,s),3.71(3H,s),3.11(1H,m),2.98(1H,m),1.32-1.23(4H,m),1.12-1.10(18H,m),0.85(9H,s),0.08-0.02(6H,m).
步驟3：(2-{[(2S)-2-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-4-(4-甲氧基苯基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺基甲酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟2中獲得之化合物(1.12g，1.59mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.890g，77%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.57(1H,m),7.77(1H,m),7.18(2H,m),6.86-6.78(4H,m),5.95-5.90(1H,m),5.32(1H,m),5.20(1H,m),4.79-4.77(1H,m),4.64-4.57(2H,m),4.00-3.98(1H,m),3.93-3.91(1H,m),3.80(3H,s),3.76(3H,s),3.14-3.09(1H,m),3.00(1H,m),1.36-1.25(3H,m),1.14-1.11(18H,m),0.85(9H,s),0.11-0.03(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：725(M+H)+
步驟4：(2-{[(2S)-2-(羥基甲基)-4-(4-甲氧基苯基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺基甲酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟3中獲得之化合物(0.890g，1.23mmol)以與實施例1步驟 7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.696g，93%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.54-8.36(1H,m),7.71(1H,m),7.18-7.17(2H,m),6.86-6.84(3H,m),6.77(1H,m),5.94-5.90(1H,m),5.32(1H,m),5.21(1H,m),4.87-4.85(1H,m),4.61(2H,m),4.50(1H,m),3.96-3.84(2H,m),3.80(3H,s),3.76(3H,s),3.28(1H,m),2.64(1H,m),1.36-1.25(3H,m),1.13(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：611(M+H)+
步驟5：(11aS)-11-羥基-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-8-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟4中獲得之化合物(0.696g，1.14mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.532g，77%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.36(1H,s),7.31-7.29(2H,m),7.22(1H,s),6.90-6.87(2H,m),6.72(1H,m),5.82-5.76(2H,m),5.19-5.14(2H,m),4.60(1H,m),4.49-4.46(1H,m),3.98-3.96(1H,m),3.86(3H,s),3.82(3H,s),3.44(1H,m),3.36(1H,m),3.05(1H,m),1.28-1.21(3H,m),1.10-1.07(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：609(M+H)+
步驟6：(11aS)-11-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-8-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟5中獲得之化合物(0.532g，0.874mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.532g，95%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(1H,s),7.29(2H,m),7.23(1H,s),6.89(2H,m),6.70(1H,s),5.90(1H,m),5.76(1H,m),5.14-5.10(2H,m),4.60(1H,m),4.38(1H,m),3.93-3.85(1H,m),3.87(3H,s),3.82(3H,s),3.32(1H,m),2.82-2.78(1H,m),1.29-1.22(3H,m),1.12-1.07(18H,m),0.89(9H,s),0.27(3H,s),0.20(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：723(M+H)+
步驟7：(11aS)-11-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8-羥基-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟6中獲得之化合物(0.532g，0.756mmol)以如實施例1步驟10之方式般進行反應，而獲得目標物(0.359g，86%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.34(1H,s),7.30-7.27(3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.76(1H,s),5.93-5.90(2H,m),5.81-5.73(1H,m),5.12-5.08(2H,m),4.61(1H,m),4.42(1H,m),3.97(3H,s),3.93-3.88(1H,m),3.83(3H,s),3.31(1H,m),2.83-2.79(1H,m),0.91(9H,s),0.27(3H,s),0.22(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：567(M+H)+
步驟8：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-11-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟7中獲得之化合物(0.405g，0.715mmol)以與實施例4步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.490g，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(1H,s),7.29(2H,m),6.89(2H,m),6.69 (1H,s),5.94(1H,m),5.82-5.75(1H,m),5.13-5.08(1H,m),5.13-5.08(2H,m),4.65(1H,m),4.41(1H,m),4.20-4.13(2H,m),3.94-3.88(1H,m),3.92(3H,s),3.83(3H,s),3.62(2H,m),3.32(1H,m),2.83-2.80(1H,m),2.41-2.36(2H,m),0.91(9H,s),0.27(3H,s),0.24(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：687(M+H)+
步驟9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-8'-[3-({(11aS)-11-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.490g，0.713mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.600g，60%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1414(M+H)+
步驟10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-8'-[3-({(11aS)-11-羥基-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟9中獲得之化合物(0.600g，0.424mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.500g，99%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1184(M-H)+
步驟11：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟9中獲得之化合物(0.500g，0.421mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.113g，27%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.94(1H,s),7.70(1H,s),7.56-7.53(2H,m),7.46-7.44(2H,m),7.36(1H,s),7.31(2H,m),7.23(1H,s),7.03(2H,m),6.90-6.88(2H,m),6.68(1H,m),6.57(1H,s),6.40(1H,s),5.92(1H,m),5.43(1H,m),4.67(1H,m),4.55-4.53(1H,m),4.46(1H,m),4.35-4.33(1H,m),4.28-4.24(1H,m),4.15-4.13(1H,m),3.88(3H,s),3.87(3H,s),3.83(3H,s),3.77-3.72(1H,m),3.62-3.60(1H,m),3.52-3.47(2H,m),3.34(1H,m),3.30-3.28(1H,m),3.00-2.91(2H,m),2.50-2.41(2H,m),2.24-2.22(1H,m),2.10-2.08(1H,m),1.77-1.75(1H,m),1.40-1.37(1H,m),1.16(3H,m),0.82(3H,m),0.76-0.62(4H,m),0.69(3H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1000(M+H)+
步驟12：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0271-381
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)- 基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟11中獲得之化合物(0.157g，0.157mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.120g，49%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1401(M+H)+
實施例20：藥物連結基18
Figure 107134301-A0305-02-0272-169
步驟1：{丙烷-1,3-二基雙[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)]}雙{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]甲酮}
使起始原料20-1(3.00g，6.43mmol，Journal of the American Chemical Society 1992,13,4939)與實施例1步驟3中獲得之化合物(3.42g，14.2mmol)以與實施例15步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.74g，64%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.79-7.70(2H,m),6.83-6.75(2H,m),4.52- 4.50(1.5H,m),4.35-4.29(4.5H,m),4.03(0.5H,m),3.97-3.92(6H,m),3.88(0.5H,m),3.60-3.52(1H,m),3.38-3.33(0.5H,m),3.26-3.24(0.5H,m),3.04-2.93(3H,m),2.45-2.39(2H,m),2.25-2.21(1H,m),2.09-1.98(1H,m),1.68(1H,m),1.56(1H,m),0.93-0.90(14H,m),0.77-0.74(4H,m),0.71-0.62(4H,m),0.57-0.49(4H,m),0.44-0.40(2H,m),0.11(9H,m),-0.14(3H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：912(M+H)+
步驟2：{丙烷-1,3-二基雙[氧基(2-胺基-5-甲氧基苯-4,1-二基)]}雙{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]甲酮}}
使上述步驟1中獲得之化合物(3.74g，4.10mmol)以與實施例15步驟4同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.97g，85%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.79-7.69(2H,m),6.82-6.75(2H,m),4.54-4.47(1.5H,m),4.36-4.26(4.5H,m),4.03(0.5H,m),3.98-3.92(6H,m),3.88(0.5H,m),3.61-3.51(1H,m),3.39-3.32(0.5H,m),3.28-3.21(0.5H,m),3.05-2.93(3H,m),2.45-2.39(2H,m),2.24-2.21(1H,m),2.08-2.06(1H,m),2.00-1.99(1H,m),1.69-1.66(1H,m),1.57-1.54(5H,m),0.94-0.88(14H,m),0.78-0.74(4H,m),0.71-0.62(4H,m),0.57-0.49(4H,m),0.44-0.40(2H,m),0.13-0.10(9H,m),-0.11-0.17(3H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：853(M+H)+
步驟3：(5-[3-(5-胺基-4-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-2-甲氧基苯基)丙氧基]-2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰 基}-4-甲氧基苯基)胺基甲酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟2中獲得之化合物(2.97g，3.48mmol)以與實施例15步驟5同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.549g，17%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.18(1H,m),7.88(1H,m),6.80(1H,m),6.73(1H,s),6.31(1H,s),5.96(1H,m),5.36(1H,m),5.24(1H,m),4.68-4.59(4H,m),4.59-4.43(2H,m),4.27-4.25(2H,m),4.20-4.18(2H,m),4.00(2H,m),3.79-3.72(9H,m),3.05(1H,m),2.35(2H,m),2.32-2.19(2H,m),1.78-1.50(4H,m),0.99-0.89(20H,m),0.67-0.54(4H,m),0.50-0.48(2H,m),0.05(12H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1021(M+H)+
步驟4：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-5-[3-(4-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-2-甲氧基-5-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯氧基)丙氧基]-4-甲氧基苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟3中獲得之化合物(0.549g，0.586mmol)以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.402g，51%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1341(M+H)+
步驟5：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-5-[3-(4-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-2-甲氧基-5-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯氧基)丙氧基]-4-甲氧基苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺
使上述步驟4中獲得之化合物(0.402g，0.300mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.282g，85%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1120(M+H)+
步驟6：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-8'-[3-({(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-10'-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基}氧基)丙氧基]-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(0.282g，0.253mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0600g，21%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1106(M-H)+
步驟7：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟6中獲得之化合物(0.0600g，0.0541mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0347g，70%)。
MS(APCI,ESI)m/z：922(M+H)+
步驟8：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0275-383
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',11a'-二氫-1'H-螺[環丙 烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.0347g，0.0376mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.00770g，16%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1323(M+H)+
實施例21：藥物連結基19
Figure 107134301-A0305-02-0276-170
步驟1：化合物21-2
於冰浴冷卻下向起始原料21-1(11.8g，20.2mmol，WO 2013053872)及吡啶(1.79mL，22.2mmol)之THF(50mL)溶液中緩慢添加乙酸酐(2.10mL，22.3mmol)。繼而，添加4-二甲胺基吡啶(0.459g，3.76mmol)，於室溫下加以攪拌。原料消失後，於反應混合物中添加水，利用乙酸乙酯萃取反應混合物。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)~60：40(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(12.3g，97%)。
MS(APCI,ESI)m/z：625(M+H)+
步驟2：化合物21-3
使上述步驟1中獲得之化合物(12.3g，19.7mmol)以與實施例15步驟4同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(11.3g，97%)。
MS(APCI,ESI)m/z：595(M+H)+
步驟3：化合物21-4
使用氯甲酸2,2,2-三氯乙酯(2.93mL，21.9mmol)代替氯甲酸烯丙酯，使上述步驟2中獲得之化合物(11.3g，19.0mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(12.4g，85%)。
MS(APCI,ESI)m/z：769(M+H)+
步驟4：化合物21-5
使上述步驟3中獲得之化合物(12.4g，16.1mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(9.90g，94%)。
MS(APCI,ESI)m/z：655(M+H)+
步驟5：化合物21-6
使上述步驟4中獲得之化合物(9.90g，15.1mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(8.19g，83%)。
MS(APCI,ESI)m/z：653(M+H)+
步驟6：化合物21-7
於上述步驟5中獲得之化合物(3.00g，4.59mmol)之四氫呋喃(10mL)、10%乙酸銨水溶液(10mL)中添加10%Cd/Pb(3.00g，24.0mmol，90質量%)，於氮氣環境下遽烈攪拌。原料消失後，過濾反應混合物。利用二氯甲烷萃取濾液。利用飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，將所獲得之化合物(2.10g，99%)直接用於下一反應。
MS(APCI,ESI)m/z：461(M+H)+
步驟7：化合物21-8
使上述步驟6中獲得之化合物(2.10g，4.56mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.09g，99%)。
MS(APCI,ESI)m/z：463(M+H)+
步驟8：化合物21-9
使步驟7中獲得之化合物(2.09g，4.52mmol)以與實施例21步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.88g，100%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.23(1H,s),6.81(1H,s),5.40-5.37(1H,m),4.95(1H,m),4.41(1H,m),4.21(1H,m),4.05(1H,m),3.96-3.92(1H,m),3.86(3H,s),3.79-3.75(1H,m),3.64(1H,m),2.34-2.28(1H,m),2.18-2.13(1H,m),2.05(3H,s),1.30-1.19(3H,m),1.11-1.04(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：637(M+H)+
步驟9：化合物21-10
於步驟8中獲得之化合物(2.28g，4.51mmol)之甲醇(15mL)、四氫呋喃(5mL)混合溶液中緩慢滴加碳酸鉀(0.624g，4.52mmol)之水(15mL)溶液，於室溫下加以攪拌。原料消失後，於反應混合物中添加水，利用乙酸乙酯萃取反應混合物。利用飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(2.08g，77%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.18(1H,s),6.80(1H,s),4.96(1H,m),4.64-4.59(1H,m),4.40(1H,m),4.18(1H,m),4.00-3.92(2H,m),3.82(3H,s),3.65(2H,m),2.28-2.20(2H,m),2.04-1.97(1H,m),1.27-1.20(3H,m),1.09-1.05(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：595(M+H)+
步驟10：化合物21-11
於冰浴冷卻下向步驟9中獲得之化合物(2.08g，3.49mmol)及2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧自由基(0.109g，0.698mmol)之二氯甲烷(50mL)溶液中緩慢添加二乙酸碘苯(2.00g，6.21mmol)。於室溫下將反應混合物攪拌2小時。原料消失後，於反應混合物中添加水，利用二氯甲烷萃取反應混合物。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鎂加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)~60：40(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(1.94g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.21(1H,s),6.84(1H,s),4.96(1H,m),4.44 (1H,m),4.34-4.23(3H,m),3.99-3.92(1H,m),3.86(3H,s),3.68-3.62(1H,m),2.94(1H,m),2.50-2.46(1H,m),1.29-1.21(3H,m),1.21-1.21(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：593(M+H)+
步驟11：化合物21-12
使上述步驟10中獲得之化合物(1.94g，3.27mmol)以與實施例3步驟5同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.17g，92%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.22-7.18(2H,m),6.84(1H,s),4.95(1H,m),4.45-4.39(2H,m),4.23-4.15(1H,m),3.85(3H,s),3.64(1H,m),3.36-3.30(1H,m),2.74-2.68(1H,m),1.29-1.19(3H,m),1.11-1.04(18H,m).
步驟12：化合物21-13
使上述步驟11中獲得之化合物(0.837g，1.15mmol)與喹
Figure 107134301-A0305-02-0280-384
啉-6-硼酸頻那醇酯(1.18g，4.61mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.713g，88%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.82-8.77(2H,m),8.05(1H,m),7.95(1H,m),7.79-7.75(2H,m),7.25(1H,s),6.88(1H,s),4.96(1H,m),4.49-4.40(2H,m),4.37-4.28(1H,m),3.88(3H,s),3.75(1H,m),3.48(1H,m),2.90(1H,m),1.30-1.22(3H,m),1.13-1.06(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：705(M+H)+
步驟13：化合物21-14
使上述步驟12中獲得之化合物(0.713g，1.01mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.400g，72%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.81-8.80(2H,m),8.05(1H,m),7.95(1H,m), 7.80-7.75(2H,m),7.29(1H,s),6.96(1H,s),6.10(1H,m),5.07(1H,m),4.45-4.32(3H,m),3.98(3H,s),3.80-3.73(1H,m),3.51-3.46(1H,m),2.91(1H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：549(M+H)+
步驟14：化合物21-15
使用實施例1步驟11中獲得之化合物(0.321g，0.346mmol)，使上述步驟13中獲得之化合物(0.200g，0.364mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行偶合反應，而獲得目標物(0.475g，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.83-8.79(2H,m),8.65-8.55(1H,m),8.09-7.98(2H,m),7.92-7.82(2H,m),7.47-7.31(2H,m),7.24-7.19(1H,m),7.14-7.02(2H,m),6.97-6.88(1H,m),6.80-6.66(1H,m),6.55-6.47(1H,m),6.06-6.00(1H,m),5.97-5.85(1H,m),5.51-5.09(3H,m),4.82-4.71(2H,m),4.63-4.52(2H,m),4.48-4.30(2H,m),4.26-4.17(2H,m),4.16-4.09(1H,m),4.08-3.98(3H,m),3.9-3.73(6H,m),3.53-3.44(2H,m),3.28-3.26(1H,m),2.94-2.91(1H,m),2.40-2.33(2H,m),2.21-2.13(1H,m),2.07-2.03(4H,m),1.67-1.50(2H,m),1.46-1.39(2H,m),1.29-1.24(2H,m),1.00-0.60(18H,m),0.22-0.06(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1395(M+H)+
步驟15：化合物21-16
使上述步驟14中獲得之化合物(0.475g，0.340mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.310g，71%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.83-8.79(2H,m),8.72(1H,m),8.07-8.01(2H,m),7.88(2H,m),7.41-7.39(2H,m),7.23(1H,m),7.13(2H,m), 6.84(1H,m),6.56(1H,s),5.95-5.88(2H,m),5.48-5.47(1H,m),5.32-5.10(3H,m),4.87-4.72(2H,m),4.61-4.55(2H,m),4.47-4.20(3H,m),4.07-4.03(2H,m),3.90(3H,s),3.83(3H,s),3.80-3.72(3H,m),3.58(1H,m),3.49(1H,m),3.31(1H,m),2.92(1H,m),2.41(1H,m),2.36-2.29(1H,m),2.19-2.11(1H,m),1.77-1.72(1H,m),1.68-1.66(3H,m),1.65-1.63(1H,m),1.42-1.41(3H,m),0.97(3H,m),0.93(3H,m),0.76-0.61(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1282(M+H)+
步驟16：化合物21-17
使上述步驟15中獲得之化合物(0.310g，0.242mmol)以與實施例21步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.168g，63%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.85-8.76(3H,m),8.04-7.99(3H,m),7.86(1H,s),7.49-7.41(3H,m),7.25-7.06(3H,m),6.96-6.83(1H,m),6.49(1H,m),6.13(1H,s),5.51-5.45(2H,m),5.34-5.28(2H,m),5.21(1H,m),4.80-4.37(4H,m),4.17-4.02(6H,m),3.88(3H,s),3.84-3.70(6H,m),3.68-3.50(5H,m),3.31(1H,m),2.93-2.90(1H,m),2.42(1H,m),2.29-2.12(3H,m),1.78-1.75(1H,m),1.44(3H,m),0.97(3H,m),0.94(3H,m),0.79-0.60(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1108(M+H)+
步驟17：化合物21-18
使上述步驟16中獲得之化合物(0.168g，0.152mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.112g，72%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.18(1H,m),8.78(2H,m),8.04-8.02(2H,m), 7.95-7.93(2H,m),7.77(1H,s),7.50-7.44(3H,m),7.23-7.21(1H,m),7.11(2H,m),6.44(1H,m),6.11(1H,m),5.90(1H,m),5.34(1H,m),4.74-4.63(3H,m),4.42(1H,m),4.16-4.03(3H,m),3.89(3H,s),3.80(3H,s),3.74-3.72(1H,m),3.65-3.51(4H,m),3.32-3.28(3H,m),2.92(1H,m),2.41(1H,m),2.34-2.28(1H,m),2.20-2.18(2H,m),1.76(4H,m),1.43(3H,m),1.00(3H,m),0.84(3H,m),0.75-0.62(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1024(M+H)+
步驟18：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0283-385
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-5-側氧基-2-(喹
Figure 107134301-A0305-02-0283-386
啉-6-基)-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟18中獲得之化合物(0.112g，0.109mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.110g，71%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1425(M+H)+
實施例22：藥物連結基20
[化146]
Figure 107134301-A0305-02-0284-171
步驟1：化合物22-1
使實施例21步驟5中獲得之化合物(5.11g，7.81mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(5.70g，95.0%)。
MS(APCI,ESI)m/z：767(M+H)+
步驟2：化合物22-2
使上述步驟1中獲得之化合物(5.70g，7.42mmol)以與實施例21步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(5.07g，94%)。
MS(APCI,ESI)m/z：725(M+H)+
步驟3：化合物22-3
使上述步驟2中獲得之化合物(5.07g，6.98mmol)以與實施例21步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(4.44g，88%)。
MS(APCI,ESI)m/z：723(M+H)+
步驟4：化合物22-4
使上述步驟3中獲得之化合物(4.44g，6.13mmol)以與實施例3步驟5同樣之方式進行反應，而獲得目標物(4.85g，92%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.24-7.16(1H,m),6.78(1H,s),5.92(1H,m),5.05(1H,m),4.34(1H,m),3.91-3.87(2H,m),3.86(3H,s),3.35-3.29(1H,m),2.80(1H,m),1.28-1.22(3H,m),1.10-1.05(18H,m),0.86(9H,s),0.28(3H,s),0.21(3H,s).
步驟5：化合物22-5
使用上述步驟4中獲得之化合物(1.20g，1.40mmol)與6-甲氧基-2-萘基硼酸(0.850g，4.21mmol)，以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.06g，88%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.72-7.69(2H,m),7.59-7.51(3H,m),7.30(1H,s),7.16-7.07(2H,m),6.82(1H,s),5.94(1H,m),5.06(1H,m),4.34(1H,m),3.99-3.95(1H,m),3.93(3H,s),3.88(3H,s),3.46(1H,m),2.94(1H,m),1.30-1.23(3H,m),1.12-1.07(18H,m),0.93(9H,s),0.31(3H,s),0.23(3H,s).
步驟6：化合物22-6
使上述步驟5中獲得之化合物(1.06g，1.23mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.6126g，71%)。
MS(APCI,ESI)m/z：707(M+H)+
步驟7：化合物22-7
使上述步驟6中獲得之化合物(0.205g，0.290mmol)與實施例1步驟11中獲得之化合物(0.255g，0.274mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式 進行偶合反應，而獲得目標物(0.375g，83%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.68(1H,s),7.72(2H,m),7.67-7.55(3H,m),7.36-7.21(4H,m),7.16-7.06(4H,m),6.82-6.79(2H,m),6.53(1H,s),6.03-6.02(1H,m),5.97-5.89(2H,m),5.36-5.30(2H,m),5.23-5.16(3H,m),4.83-4.80(1H,m),4.75-4.72(1H,m),4.61-4.55(3H,m),4.33-4.29(1H,m),4.17-4.11(2H,m),4.06-4.01(2H,m),3.94(3H,s),3.92-3.90(2H,m),3.81(3H,s),3.72-3.70(1H,m),3.51-3.47(2H,m),3.26(1H,m),2.99-2.95(1H,m),2.42-2.32(2H,m),2.20-2.13(1H,m),1.55-1.40(4H,m),0.97-0.92(18H,m),0.84-0.81(9H,m),0.69-0.63(4H,m),0.30-0.05(12H,m).
步驟8：化合物22-8
使上述步驟7中獲得之化合物(0.375g，0.241mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.236g，74%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.70(1H,s),7.72-7.68(3H,m),7.63-7.58(2H,m),7.43-7.41(2H,m),7.27-7.22(2H,m),7.16-7.12(2H,m),6.91-6.86(2H,m),6.56(1H,s),5.95-5.84(2H,m),5.49(1H,m),5.34-5.14(4H,m),4.78(1H,m),4.64-4.53(4H,m),4.27-4.24(2H,m),4.17-4.02(3H,m),3.97-3.88(2H,m),3.93(3H,s),3.89(3H,s),3.88(3H,s),3.75-3.72(2H,m),3.61-3.48(3H,m),3.33-3.30(2H,m),3.23-3.19(1H,m),2.44-2.39(2H,m),2.29-2.27(2H,m),2.17-2.11(1H,m),1.76-1.72(1H,m),1.43(3H,m),0.95(3H,m),0.92(3H,m),0.77-0.61(4H,m).
步驟9：化合物22-9
使上述步驟8中獲得之化合物(0.236g，0.178mmol)以與實施例21步 驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.201g，99%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1134(M+H)+
步驟10：化合物22-10
使上述步驟9中獲得之化合物(0.201g，0.177mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.180g，97%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.17(1H,s),7.90(1H,s),7.72-7.68(2H,m),7.63-7.53(4H,m),7.44-7.42(2H,m),7.25-7.22(1H,m),7.16-7.12(3H,m),7.02-6.99(2H,m),6.76-6.74(1H,m),6.59(1H,s),6.41(1H,s),5.94-5.87(2H,m),5.42(1H,m),4.66(1H,m),4.56-4.49(2H,m),4.40-4.38(1H,m),4.29-4.24(1H,m),4.17-4.11(1H,m),3.93(3H,s),3.89(3H,s),3.87(3H,s),3.85-3.70(2H,m),3.65-3.59(2H,m),3.37-3.31(2H,m),3.06(1H,m),2.46-2.41(2H,m),2.20(1H,m),2.10-2.06(1H,m),1.76-1.74(2H,m),1.17(3H,m),0.88-0.63(4H,m),0.78(3H,m),0.67(3H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1050(M+H)+
步驟11：化合物22-11
使上述步驟10中獲得之化合物(0.0870g，0.0828mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0650g，75%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.19(1H,s),7.92(1H,m),7.73-7.64(4H,m),7.55-7.44(4H,m),7.22(1H,s),7.15-7.09(4H,m),6.43(1H,s),6.09(1H,s),5.90(2H,m),5.34(1H,m),4.72(1H,m),4.65-4.63(1H,m),4.36-4.34(1H,m),4.17-4.02(4H,m),3.92(3H,s),3.89(3H,s),3.80(3H,s),3.78-3.72(3H,m),3.60-3.46(5H,m),3.31-3.27(2H,m),2.89- 2.85(1H,m),2.41(1H,m),2.33-2.26(1H,m),2.21-2.15(2H,m),1.77-1.75(1H,m),1.43(3H,m),0.98(3H,m),0.83(3H,m),0.76-0.61(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1051(M+H)+
步驟12：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0288-387
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(6-甲氧基萘-2-基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟11中獲得之化合物(0.065g，0.062mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.048g，54%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1453(M+H)+
實施例23：藥物連結基21
Figure 107134301-A0305-02-0288-172
步驟1：化合物23-2
使起始原料23-1(14.8g，54.4mmol，WO2011130613)以與實施例5步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(12.2g，63%)。
MS(APCI,ESI)m/z：379(M+H)+
步驟2：化合物23-3
使上述步驟1中獲得之化合物(3.78g，10.0mmol)以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.86g，40%)。
MS(APCI,ESI)m/z：967(M+H)+
步驟3：化合物23-4
使上述步驟2中獲得之化合物(3.860g，3.99mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.11g，92%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.03(1H,m),8.70-8.63(2H,m),8.17-8.13(1H,m),7.68(1H,s),7.35(1H,m),6.82-6.76(2H,m),5.93-5.83(1H,m),5.49-5.42(1H,m),5.32-5.17(4H,m),4.73-4.52(5H,m),4.03(1H,m),3.86(1H,s),3.80-3.75(2H,m),3.77(3H,s),3.65-3.63(1H,m),3.12-3.10(1H,m),2.20-2.14(1H,m),1.93-1.88(1H,m),1.45(3H,m),1.31-1.23(3H,m),1.10-1.08(18H,m),0.98(3H,m),0.94(3H,m),0.64-0.47(4H,m).
步驟4：化合物23-5
使上述步驟3中獲得之化合物(3.11g，3.65mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.58g，84%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.02-8.88(1H,m),8.69-8.59(1H,m),8.17-8.02(1H,m),7.22-7.17(1H,m),7.02(1H,m),6.79-6.78(2H,m),6.63 (1H,m),5.95-5.87(2H,m),5.33-5.11(4H,m),4.65-4.53(3H,m),4.01(1H,m),3.83(3H,s),3.73(1H,m),3.59(1H,m),3.32(1H,m),2.43-2.39(1H,m),2.18-2.16(1H,m),1.75-1.67(2H,m),1.48-1.43(3H,m),1.20-1.14(3H,m),1.10-0.94(24H,m),0.73-0.60(4H,m).
步驟5：化合物23-6
使上述步驟4中獲得之化合物(2.58g，3.03mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.75g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.78(1H,m),8.58(1H,m),8.03(1H,m),7.21(1H,s),6.97(1H,m),6.73(1H,s),6.59-6.55(1H,m),6.02(1H,m),5.93-5.85(1H,m),5.32-5.04(4H,m),4.72-4.55(3H,m),3.99(1H,m),3.84(3H,s),3.73-3.70(1H,m),3.53(1H,m),3.28(1H,m),2.36(1H,m),2.21-2.14(1H,m),1.55-1.53(1H,m),1.47-1.44(4H,m),1.23-1.16(3H,m),1.10-1.00(18H,m),0.98(3H,m),0.94(3H,m),0.83(9H,s),0.81-0.60(4H,m),0.21-0.19(3H,m),0.18-0.16(3H,m).
步驟6：化合物23-7
使上述步驟5中獲得之化合物(2.75g，2.85mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.28g，99%)。
MS(APCI,ESI)m/z：809(M+H)+
步驟7：化合物23-8
使上述步驟6中獲得之化合物(0.340g，0.420mmol)以與實施例4步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.530g，98%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1285(M+H)+
步驟8：化合物23-9
使上述步驟7中獲得之化合物(0.530g，0.412mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.362g，75%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1171(M+H)+
步驟9：化合物23-10
使上述步驟8中獲得之化合物(0.444g，0.379mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.347g，91%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1103(M+H)+
步驟10：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0291-388
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{6-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]吡啶-3-基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟9中獲得之化合物(0.100g，0.0997mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.067g，48%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1404(M+H)+
實施例24：藥物連結基22
[化148]
Figure 107134301-A0305-02-0292-173
步驟1：化合物24-2
於氮氣環境、0℃下向甲基三苯基溴化鏻(7.28g，20.4mmol)之四氫呋喃(30mL)懸浮溶液中逐量添加第三丁醇鉀(2.06g，18.3mmol)後，攪拌2小時。歷經2分鐘滴加化合物24-1(1.18g，2.04mmol，WO2013053872)之THF(10mL)溶液，於0℃下攪拌28小時。於反應液中添加水、及檸檬酸水溶液後(pH值=4.0)，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層，利用硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.450g，52%)。
MS(APCI,ESI)m/z：423(M+H)+.
步驟2：化合物24-3
於氮氣環境下向上述步驟1中獲得之化合物(0.668g，1.58mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(10mL)溶液中添加咪唑(0.211g，3.16mmol)。其後，滴加三異丙基氯矽烷(0.502mL，2.37mmol)，於室溫下攪拌6小時。於反應液中添加10%檸檬酸水溶液，利用乙酸乙酯萃取2次。利用飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~50：50(v/v)]對所獲得之殘渣進行純化，而獲得目標物(0.520g，57%)。
MS(APCI,ESI)m/z：579(M+H)+.
步驟3：化合物24-4
使上述步驟2中獲得之化合物(0.520g，0.898mmol)以與實施例17步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.478g，97%)。
MS(APCI,ESI)m/z：547(M-H)+.
步驟4：化合物24-5
於氮氣環境下使上述步驟3中獲得之化合物(0.478g，0.871mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應。於減壓下蒸餾去除後，將所獲得之殘渣(0.570g)直接用於下一反應。
步驟5：化合物24-6
使上述步驟4中獲得之化合物(0.570g)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.446g，95%)。
MS(APCI,ESI)m/z：519(M+H)+.
步驟6：化合物24-7
使上述步驟5中獲得之化合物(0.446g，0.859mmol)以與實施例1步 驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.196g，44%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.19(1H,s),6.68(1H,s),5.78-5.76(1H,m),5.55(1H,m),5.19-5.13(4H,m),4.61-4.58(1H,m),4.49-4.46(1H,m),4.29(1H,m),4.15(1H,m),3.85(3H,s),3.61(1H,m),3.38(1H,s),2.93-2.90(1H,m),2.71(1H,m),1.30-1.18(3H,m),1.12-1.06(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：517(M+H)+.
步驟7：化合物24-8
使上述步驟6中獲得之化合物(0.195g，0.377mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.230g，97%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.19(1H,s),6.66(1H,s),5.75-5.65(1H,m),5.66(1H,m),5.12-5.10(4H,m),4.59(1H,m),4.35(1H,m),4.28(1H,m),4.11(1H,m),3.86(3H,s),3.53(1H,m),2.90-2.84(1H,m),2.48(1H,m),1.26-1.19(3H,m),1.09-1.06(18H,m),0.86(9H,s),0.23(3H,s),0.17(3H,s).
步驟8：化合物24-9
使上述步驟7中獲得之化合物(0.230g，0.365mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應。於本步驟中，反應結束後，進行分液操作，於減壓下將有機溶劑蒸餾去除，將所獲得之粗產物(0.238g，定量)用於下一反應。
步驟9：化合物24-10
使上述步驟中獲得之化合物與實施例1步驟10中獲得之化合物(0.251g，0.311mmol)以與實施例3步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.185g，62%)。
MS(APCI,ESI)m/z：958[81Br,(M+H)+],956[79Br,(M+H)+].
步驟10：化合物24-11
使上述步驟8中獲得之化合物(0.0660g，0.139mmol)與上述步驟9中獲得之化合物(0.133g，0.139mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.123g，66%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1350(M+H)+.
步驟11：化合物24-12
使上述步驟10中獲得之化合物(0.123g，0.0910mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0950g，92%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.65(1H,s),7.59(2H,m),7.31-7.29(2H,m),7.23-7.21(3H,m),6.89-6.86(1H,m),6.78(1H,s),6.38(1H,s),5.92-5.88(2H,m),5.81-5.79(1H,m),5.61-5.52(2H,m),5.31(2H,m),5.23(1H,n),5.13-5.10(4H,m),5.05-5.02(1H,m),4.69-4.67(2H,m),4.58-4.55(2H,m),4.49-4.46(1H,m),4.30(2H,m),4.16(1H,m),3.98-3.96(3H,m),3.93(3H,s),3.89(3H,s),3.81-3.78(2H,m),3.74(1H,m),3.69-3.66(1H,m),3.61(1H,m),3.43-3.41(1H,m),3.32(1H,m),2.89-2.87(1H,m),2.73(1H,m),2.42(1H,m),2.10-2.08(1H,m),1.80-1.73(4H,m),1.53-1.50(2H,m),1.25-1.24(3H,m),0.93-0.89(6H,m),0.75-0.63(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1122(M+H)+.
步驟12：化合物24-13
使上述步驟11中獲得之化合物(0.0950g，0.0847mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0610g，76%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.12-8.96(1H,m),7.82-7.60(4H,m),7.22-7.19(3H,m),6.94-6.66(1H,m),6.40-6.34(2H,m),5.89-5.86(1H,m),5.55(1H,m),5.40-5.07(3H,m),4.60-4.42(4H,m),4.23-4.09(5H,m),3.91-3.88(8H,m),3.81-3.75(8H,m),3.60(1H,m),3.32-3.30(2H,m),3.24-3.22(1H,m),3.12-3.09(1H,m),2.65-2.61(1H,m),2.41(1H,m),2.12-2.11(1H,m),1.89-1.84(9H,m),1.75(3H,m),1.40-1.38(2H,m),1.25-1.21(3H,m),0.99(3H,m),0.84(3H,m),0.74-0.66(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：936(M+H)+.
步驟13：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0296-389
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟12中獲得之化合物(0.0600g，0.0629mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.075g，89%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.91(1H,s),8.21-8.16(2H,m),8.07-8.03(1H,m),7.74-7.65(3H,m),7.60-7.44(6H,m),7.39-7.29(5H,m),7.21-7.19(2H,m),7.03(1H,s),6.85(1H,s),6.72(1H,s),6.58-6.56(1H,m),5.77-5.74(1H,m),5.19-5.16(3H,m),5.03-5.00(1H,m),4.82-4.79(1H,m),4.36-4.33(1H,m),4.21-4.19(1H,m),4.14-4.11(2H,m),4.00-3.95(3H,m),3.80-3.73(10H,m),3.65-3.52(4H,m),3.41-3.38(2H,m),3.15-3.30(1H,m),3.14(1H,m),3.04-3.01(1H,m),2.68-2.66(1H,m), 2.32-2.28(2H,m),2.05-1.98(2H,m),1.78-1.77(5H,m),1.57-1.54(3H,m),1.28-1.25(3H,m),0.86-0.81(6H,m),0.67-0.62(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1337(M+H)+.
實施例25：藥物連結基23
Figure 107134301-A0305-02-0297-174
步驟1：化合物25-1
使起始物質17-1(3.81g，5.34mmol)與4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基碳酸第三丁酯(5.13g，16.0mmol)以與實施例3步驟6同 樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.05g，75%)。
MS(APCI,ESI)m/z：757(M+H)+.
步驟2：化合物25-2
使上述步驟1中獲得之化合物(3.05g，4.09mmol)以與實施例17步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.67g，91%)。
MS(APCI,ESI)m/z：727(M+H)+.
步驟3：化合物25-3
使上述步驟2中獲得之化合物(2.67g，3.67mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應。於本步驟中，反應結束後，進行分液操作，於減壓下將有機溶劑進行濃縮，將所獲得之粗產物(3.00g，定量)直接用於下一反應。
步驟4：化合物25-4
使上述步驟3中獲得之化合物(3.05g)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.67g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.34(1H,m),7.70(1H,m),7.24(2H,m),7.12(2H,m),6.86(1H,s),6.84(1H,s),5.95-5.89(1H,m),5.31(1H,m),5.21(1H,m),4.87-4.86(1H,m),4.61-4.61(2H,m),4.41(1H,m),3.93-3.90(2H,m),3.76(3H,s),3.29(1H,m),2.68-2.66(1H,m),1.55(9H,s),1.33-1.26(3H,m),1.13-1.11(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：697(M+H)+.
步驟5：化合物25-5
使上述步驟4中獲得之化合物(1.22g，1.75mmol)以與實施例9步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.838g，69%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.45(1H,s),7.37(2H,m),7.22(1H,s),7.15(2H,m),7.11-7.09(1H,m),6.72(1H,s),5.82-5.79(1H,m),5.19-5.16(2H,m),4.61-4.59(2H,m),4.50-4.47(1H,m),4.00(1H,m),3.86(3H,s),3.41-3.28(1H,m),3.09-3.05(1H,m),1.57(9H,s),1.29-1.25(3H,m),1.14-1.07(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：695(M+H)+.
步驟6：化合物25-6
使上述步驟5中獲得之化合物(0.838g，1.21mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.745g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.88(1H,m),7.50(1H,s),7.48-7.48(1H,m),7.40(2H,m),7.18(2H,m),6.86(1H,s),4.45-4.43(1H,m),3.90(3H,s),3.60-3.56(1H,m),3.38(1H,m),1.57(9H,s),1.31-1.26(3H,m),1.11-1.10(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：593(M+H)+.
步驟7~9：化合物25-9
使上述步驟6中獲得之化合物(0.745g，1.26mmol)以與實施例3步驟8、步驟9及實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.516g，3步驟產率78%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.46(1H,s),7.35(2H,m),7.27-7.25(2H,m),7.15(2H,m),6.82(1H,s),5.93(1H,s),5.84-5.81(1H,m),5.12(1H,m),4.61(1H,m),4.49-4.46(1H,m),4.35-4.32(1H,m),4.23-4.21(1H,m),3.96(3H,s),3.65-3.62(1H,m),3.29(1H,m),2.71(1H,m),1.57(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：523(M+H)+.
步驟10：化合物25-10
使上述步驟9中獲得之化合物(0.105g，0.200mmol)與實施例1步驟11中獲得之化合物(0.186g，0.200mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行偶合反應，而獲得目標物(0.248g，90%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.72-8.50(1H,m),7.52(1H,s),7.40-7.38(4H,m),7.23-7.21(2H,m),7.16(2H,m),7.09(1H,m),6.84-6.82(2H,m),6.51-6.49(1H,m),6.02(1H,m),5.92-5.90(1H,m),5.30-5.21(5H,m),4.71-4.61(6H,m),4.36-4.24(5H,m),4.02-4.00(3H,m),3.93-3.88(1H,m),3.87(3H,s),3.81(3H,s),3.71(2H,m),3.51-3.49(1H,m),3.32-3.28(2H,m),2.72(1H,m),2.37-2.34(3H,m),2.16-2.13(1H,m),1.66(9H,s),1.50-1.46(4H,m),0.97-0.93(7H,m),0.82(9H,s),0.68-0.65(4H,m),0.20(3H,s),0.14(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：1370(M+H)+.
步驟11：化合物25-11
於上述步驟11中獲得之化合物(0.248g，0.181mmol)之二氯甲烷(3mL)溶液中添加哌啶(3mL)，於室溫下攪拌2小時。利用檸檬酸水溶液將反應液稀釋，利用乙酸乙酯萃取2次。利用飽和鹽水洗淨有機層，利用硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下將有機溶劑蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~90：10(v/v)]對所獲得之殘渣進行純化，而獲得目標物(0.153g，93%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.77-8.69(1H,m),7.40-7.36(3H,m),7.23-7.21(4H,m),7.07(2H,m),6.88-6.86(1H,m),6.82(2H,m),6.51(1H, s),6.03(1H,m),5.92-5.90(1H,m),5.30-5.21(4H,m),4.75-4.72(2H,m),4.58-4.55(3H,m),4.37-4.35(1H,m),4.23-4.21(3H,m),4.01-3.99(2H,m),3.86(3H,s),3.79(3H,s),3.72(2H,m),3.66-3.64(1H,m),3.51-3.48(1H,m),3.28(2H,m),2.67(1H,m),2.37-2.12(4H,m),1.55-1.52(2H,m),1.45-1.42(4H,m),0.95-0.91(6H,m),0.81(9H,s),0.81-0.78(2H,m),0.68-0.65(3H,m),0.20-0.15(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1270(M+H)+.
步驟12：化合物25-12
使上述步驟11中獲得之化合物(0.175g，0.138mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.162g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：1156(M+H)+.
步驟13：化合物25-13
使上述步驟12中獲得之化合物(0.116g，0.100mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0410g，41%)。
MS(APCI,ESI)m/z：988(M+H)+.
步驟14：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0301-390
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-8'-(3-{[(11aS)-2-(4-羥基苯基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
將上述步驟13中獲得之化合物(0.00500g，0.00506mmol)、實施例2步驟2中獲得之化合物(0.0100g，0.0202mmol)溶解於二氯甲烷(0.3 mL)與甲醇(0.3mL)中，添加N,N-二異丙基乙基胺(3.5μL，0.0202mmol)，於室溫下攪拌1小時。於減壓下對反應液進行蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：CMW=100：0(v/v)~0：100(v/v)]對所獲得之殘渣進行純化，而獲得目標物(0.00350g，50%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1389(M+H)+.
實施例26：藥物連結基24
Figure 107134301-A0305-02-0302-175
步驟1：化合物26-1
使起始物質17-1(3.93g，5.51mmol)與4-(羥基甲基)苯基硼酸以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.09g，84%)。
MS(APCI,ESI)m/z：671(M+H)+.
步驟2：化合物26-2
將上述步驟1中獲得之化合物(3.09g，4.61mmol)之二氯甲烷(100mL)溶液進行冰浴冷卻，添加三乙胺(1.60mL，11.5mmol)後，滴加乙醯氯(0.491mL，6.91mmol)，於室溫下攪拌2小時。利用檸檬酸水溶液將反應液稀釋，利用氯仿萃取3次。利用飽和碳酸鈉水溶液、飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥後，於減壓下將溶劑蒸餾去除，將所獲得之化合物(3.75g，定量)直接用於下一反應。
步驟3：化合物26-3
使上述步驟2中獲得之化合物(3.28g，4.60mmol)以與實施例17步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.09g，67%)。
MS(APCI,ESI)m/z：682(M+H)+.
步驟4：化合物26-4
使上述步驟3中獲得之化合物(1.01g，1.48mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應。於減壓下蒸餾去除後，將所獲得之化合物(1.19g，定量)直接用於下一反應。
步驟5：化合物26-5
使上述步驟4中獲得之化合物(1.19g，1.55mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.885g，87%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.34(1H,m),7.71(1H,s),7.31(2H,m),7.24(2H,m),6.91(1H,s),6.84(1H,s),5.97-5.88(1H,m),5.35-5.29(1H,m),5.22-5.20(1H,m),5.07(2H,s),4.88-4.87(1H,m),4.62-4.61(3H,m),4.33-4.31(1H,m),3.94-3.91(2H,m),3.76(3H,s),3.33-3.29(1H,m),2.68(1H,m),1.33-1.29(4H,m),1.15-1.12(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：653(M+H)+.
步驟6~7：化合物26-7
使上述步驟5中獲得之化合物(0.885g，1.36mmol)與實施例9步驟3及實施例3步驟12同樣，而獲得目標物(0.515g，85%)。
MS(APCI,ESI)m/z：549(M+H)+.
步驟8-10：化合物26-10
使上述步驟7中獲得之化合物(0.515g，0.983mmol)以與實施例3步驟8、步驟9及實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.448g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.51(1H,s),7.37-7.30(4H,m),7.26-7.25(1H,m),6.82(1H,s),5.94(1H,s),5.86-5.79(1H,m),5.15-5.13(1H,m),5.09(3H,s),4.61(1H,m),4.48-4.46(1H,m),4.35-4.32(1H,m),4.25-4.23(1H,m),3.96(3H,s),3.64(1H,d,m),3.33-3.29(1H,m),2.73(1H,m),2.11(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：479(M+H)+.
步驟11：化合物26-11
使上述步驟10中獲得之化合物(0.0690g，0.144mmol)與實施例1步驟11中獲得之化合物(0.134g，0.144mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.118g，62%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1325(M+H)+.
步驟12~13：化合物26-13
使上述步驟11中獲得之化合物(0.134g，0.101mmol)以與實施例3步驟11及實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0950g，兩 步驟產率90%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.14(1H,s),7.91(1H,m),7.69(1H,s),7.47(4H,m),7.40-7.38(2H,m),7.34-7.32(2H,m),7.21(1H,s),7.18(2H,m),7.13(2H,m),6.40(1H,s),6.08(1H,s),5.88(1H,m),5.36(1H,m),5.09(2H,s),4.72(1H,m),4.62-4.59(2H,m),4.35-4.32(1H,m),4.12-4.07(4H,m),3.89(3H,s),3.80(3H,s),3.74-3.71(2H,m),3.58-3.53(3H,m),3.41-3.38(1H,m),3.31-3.29(2H,m),2.78-2.74(1H,m),2.41(1H,m),2.31-2.31(1H,m),2.18-2.15(1H,m),2.11(3H,s),1.76(1H,m),1.44-1.42(3H,m),0.99(3H,m),0.83(3H,m),0.71-0.66(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1044(M+H)+.
步驟14：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0305-391
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-8'-(3-{[(11aS)-2-{4-[(乙醯氧基)甲基]苯基}-7-甲氧基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟13中獲得之化合物(0.0700g，0.0670mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0520g，54%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1445(M+H)+.
實施例27：藥物連結基25
[化151]
Figure 107134301-A0305-02-0306-176
步驟1：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0306-392
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-8'-[3-({(11aS)-2-[4-(羥基甲基)苯基]-7-甲氧基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
於實施例26步驟14中獲得之化合物(0.0230g，0.0159mmol)之甲醇(2mL)溶液中添加1當量濃度之氫氧化鈉溶液(0.0175mL，0.0175mmol)，並於室溫下攪拌1小時。進一步添加1當量濃度之氫氧化鈉溶液(0.0175mL，0.0175mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。於反應液中添加1當量濃度之鹽酸水溶液(0.0350mL)、及水，利用氯仿萃取3次。利用硫酸鈉乾燥有機層，於減壓下蒸餾去除後，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：CMW=100：0(v/v)~0：100(v/v)]對所獲得之殘渣進行純化，而獲得目標物(0.0190g，85%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1403(M+H)+.
實施例28：藥物連結基26
[化152]
Figure 107134301-A0305-02-0307-177
步驟1：化合物28-1
使實施例4步驟4中獲得之化合物(1.12g，1.70mmol)與4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)三氟甲基苯(0.924g，3.40mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.918g，83%)。
MS(APCI,ESI)m/z：657[81Br,(M+H)+],655[79Br,(M+H)+].
步驟2：化合物28-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.918g，1.40mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.425g，60%)。
MS(APCI,ESI)m/z：511[81Br,(M+H)+],509[79Br,(M+H)+].
步驟3：化合物28-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.425g，0.834mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應。進行分液操作後，於減壓下蒸餾去除，將所獲得之化合物(0.410g)直接用於下一反應。
步驟4：化合物28-4
使上述步驟2中獲得之化合物(0.425g，0.834mmol)以與實施例3步驟8及實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.420g，85%)。
MS(APCI,ESI)m/z：597[81Br,(M+H)+],595[79Br,(M+H)+].
步驟5：化合物28-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.0960g，0.160mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.212g，99%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1321(M+H)+.
步驟6：化合物28-6
使上述步驟5中獲得之化合物(0.210g，0.159mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.162g，84%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1208(M+H)+.
步驟7：化合物28-7
使用上述步驟6中獲得之化合物(0.160g，0.132mmol)，以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.103g，75%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1039(M+H)+.
步驟8：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0308-393
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-5-側氧基-2-[4-(三氟甲基)苯基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使起始原料4-4與上述步驟7中獲得之化合物(0.101g，0.0971mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.107g，76%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1441(M+H)+.
實施例29：藥物連結基27
[化153]
Figure 107134301-A0305-02-0310-180
步驟1：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-L-白胺酸第三丁酯
使用三乙胺(3.41mL，24.5mmol)代替吡啶，使L-脯胺醯基-L-白胺酸第三丁酯(4.64g，16.3mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應。反應結束後，進行分液操作，於減壓下將有機溶劑蒸餾去除，將由此獲得之化合物(5.79g，96%)直接用於下一反應。
步驟2：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-L-白胺酸
於上述步驟1中獲得之化合物(5.79g，15.7mmol)之二氯甲烷(60mL)溶液中添加三氟乙酸(20mL)，於室溫下攪拌1小時。於反應液中添加甲苯，於減壓下蒸餾去除，將由此獲得之化合物(2.69g，55%)直接用於下一反應。
步驟3：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-L-白胺醯胺
於上述步驟2中獲得之化合物(6.10g，19.5mmol)之THF(100mL)溶液中添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(5.07g，20.5mmol)，於室溫下攪拌1小時。添加4-胺基苄醇(2.16g，20.5mmol)並攪拌一晚。於減壓下對反應液進行蒸餾去除，將所獲得之殘渣溶解於乙酸乙酯中。利用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和鹽水將其洗淨，利用無水硫酸鈉乾燥有機層。過濾後，於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(1.60g，20%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.62-8.33(1H,m),7.68-7.49(2H,m),7.31-7.30(2H,m),6.66-6.43(1H,m),5.97-5.70(1H,m),5.39-4.96(2H,m),4.64-4.53(5H,m),4.40-4.35(1H,m),3.57-3.50(2H,m),2.20-2.19(2H,m),1.98-1.97(3H,m),1.66-1.64(3H,m),0.97-0.94(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：418(M+H)+.
步驟4：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基} 甲基)苯基]-L-白胺醯胺
使上述步驟3中獲得之化合物(0.838g，2.01mmol)以與實施例1步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.535g，37%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.98(1H,m),8.62(1H,s),7.80(1H,s),7.65-7.50(2H,m),7.33-7.31(2H,m),6.76(1H,s),6.67-6.34(1H,m),5.95-5.92(1H,m),5.33-5.25(1H,m),5.30-5.27(1H,m),5.12(2H,s),4.66-4.63(3H,m),4.58-4.55(3H,m),4.38-4.36(1H,m),3.99-3.96(1H,m),3.73(3H,s),3.70-3.65(2H,m),3.57-3.55(2H,m),3.04-3.02(1H,m),2.21-2.20(3H,m),1.98-1.95(3H,m),1.74-1.62(3H,m),1.32-1.30(3H,m),1.11-1.09(16H,m),0.97-0.94(6H,m),0.90(9H,s),0.60-0.52(4H,m),0.05-0.04(6H,m).
步驟5~6：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
使上述步驟4中獲得之化合物(0.535g，0.531mmol)以與實施例1步驟7及實施例9步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.367g，78%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.60(1H,s),7.58-7.42(2H,m),7.19-7.16(3H,m),6.69-6.64(2H,m),5.89-5.87(2H,m),5.32-5.24(2H,m),5.10(1H,m),4.93(1H,m),4.65-4.63(1H,m),4.57-4.54(2H,m),4.37-4.34(1H,m),3.84(3H,s),3.72(1H,m),3.57-3.55(3H,m),3.40-3.38(1H,m),3.31(1H,m),2.41(1H,m),2.20-2.18(2H,m),1.98-1.95(3H,m), 1.73(1H,m),1.66-1.63(1H,m),1.16-1.10(4H,m),1.05-0.99(18H,m)0.97-0.93(6H,m),0.71-0.64(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：890(M+H)+.
步驟7：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
使用上述步驟6中獲得之化合物(0.367g，0.412mmol)，以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.181g，44%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.54(1H,s),7.52-7.45(2H,m),7.19(1H,s),7.14(2H,m),6.71-6.68(1H,m),6.61(1H,s),6.01(1H,m),5.94-5.92(1H,m),5.34-5.17(2H,m),4.77(1H,m),4.64-4.56(3H,m),4.38-4.35(1H,m),3.85(3H,s),3.72-3.69(1H,m),3.55-3.46(3H,m),3.27(1H,m),2.35(1H,m),2.21-2.18(2H,m),1.97-1.95(3H,m),1.54-1.51(2H,m),1.16-1.09(5H,m),1.02-1.01(18H,m),0.97-0.93(6H,m),0.81(9H,s),0.68-0.63(4H,m),0.19(3H,s),0.09(3H,s).
步驟8：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.181g，0.180mmol)與實施例1步驟10同樣，而獲得目標物(0.153g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.57-8.27(1H,m),7.69-7.41(2H,m),7.23 (1H,s),7.12(2H,m),6.69-6.66(1H,m),6.64(1H,s),5.99-5.92(3H,m),5.34-5.19(3H,m),4.81(1H,m),4.63-4.57(4H,m),4.38-4.36(1H,m),3.94(3H,s),3.71(1H,m),3.54-3.52(3H,m),3.27(1H,m),2.35(1H,m),2.19(2H,m),1.97-1.95(3H,m),1.55-1.52(2H,m),0.97-0.93(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.61(4H,m),0.21(3H,s),0.09(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：848(M+H)+.
步驟9：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.153g，0.180mmol)以與實施例4步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.137g，57%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.79(1H,s),7.54-7.51(1H,m),7.39-7.37(2H,m),7.30-7.29(2H,m),7.23-7.21(3H,m),7.13-7.11(2H,m),6.88(2H,m),6.82-6.80(1H,m),6.50-6.48(1H,m),6.03-6.01(1H,m),5.92-5.89(1H,m),5.75-5.72(1H,m),5.28-5.26(3H,m),5.06-5.03(2H,m),4.74-4.71(1H,m),4.62-4.60(4H,m),4.36-4.34(2H,m),4.22-4.19(3H,m),4.01-3.99(1H,m),3.88(3H,s),3.84-3.81(6H,m),3.71(2H,m),3.53-3.50(4H,m),3.28-3.25(2H,m),2.72-2.68(1H,m),2.37-2.34(4H,m),2.19-2.16(3H,m),1.97-1.94(2H,m),1.49-1.43(2H,m),0.95-0.92(7H,m),0.81(9H,s),0.68-0.65(4H,m),0.19(3H,s),0.13(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：1324(M+H)+.
步驟10：1-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
使上述步驟9中獲得之化合物(0.136g，0.103mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.116g，93%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.83(1H,s),7.57-7.52(1H,m),7.39-7.37(2H,m),7.30-7.29(2H,m),7.24-7.20(5H,m),6.88(2H,m),6.81(1H,s),6.54-6.51(1H,m),5.90-5.88(2H,m),5.76-5.74(1H,m),5.55-5.53(1H,m),5.33-5.05(3H,m),4.79-4.76(1H,m),4.63-4.60(4H,m),4.35-4.33(2H,m),4.22-4.19(3H,m),4.04-4.03(1H,m),3.88(3H,s),3.85-3.83(6H,m),3.72(2H,m),3.62-3.56(4H,m),3.32-3.29(2H,m),2.70(1H,m),2.45-2.38(2H,m),2.30-2.27(2H,m),2.20-2.10(3H,m),1.94-1.89(4H,m),1.75-1.71(2H,m),0.95(7H,m),0.72-0.66(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1210(M+H)+.
步驟11：L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
使上述步驟10中獲得之化合物(0.116g，0.0958mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0530g，53%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.15(1H,s),8.11(1H,m),7.50-7.45(4H,m),7.32-7.31(2H,m),7.21(1H,s),7.13(2H,m),6.89(2H,m),6.37(1H,s),6.08(1H,s),5.88(1H,m),5.38(1H,m),4.69(1H,m),4.63-4.60(1H,m),4.53-4.51(1H,m),4.31-4.28(1H,m),4.13-4.08(3H,m),3.89(3H,s),3.83(3H,s),3.81(3H,s),3.75-3.70(4H,m),3.57-3.55(3H,m),3.37-3.33(2H,m),3.01-2.99(1H,m),2.90-2.86(1H,m),2.76-2.73(1H,m),2.41(1H,m),2.17-2.15(3H,m),1.90-1.87(1H,m),1.74(4H,m),1.25(2H,m),0.97-0.91(7H,m),0.67(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1042(M+H)+.
步驟12：N-[(9H-茀-9-基氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
於上述步驟11中獲得之化合物(0.0410g，0.0393mmol)與N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯甘胺酸(0.0410g，0.0393mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1mL)溶液中添加1-羥基苯并三唑一水合物(0.000602g，0.00393mmol)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(0.00905g，0.0472mmol)，於室溫下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法(氯仿：甲醇=100：0~90：10)對所獲得之殘渣進行純化，而獲得 目標物(0.0520g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.57(1H,s),7.77-7.75(3H,m),7.63-7.61(2H,m),7.51-7.48(2H,m),7.40-7.38(3H,m),7.31-7.29(4H,m),7.21-7.11(5H,m),6.88(2H,m),6.47(1H,s),6.08(1H,s),5.93(1H,m),5.21-5.19(1H,m),5.13(1H,m),4.78(1H,m),4.66-4.59(1H,m),4.53-4.51(1H,m),4.42-4.39(1H,m),4.33-4.31(1H,m),4.19-4.11(6H,m),4.10-3.86(4H,m),3.82(3H,s),3.76(3H,s),3.73-3.71(3H,m),3.56-3.51(7H,m),3.32-3.29(2H,m),2.73-2.69(1H,m),2.40(1H,m),2.29-2.27(3H,m),2.06-2.04(4H,m),1.73-1.70(2H,m),1.25(2H,m),0.96-0.93(6H,m),0.66(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1378(M+H)+.
步驟13：甘胺醯基甘胺醯基-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
於上述步驟12中獲得之化合物(0.0520g，0.0377mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(2mL)溶液中添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(67μL，0.0453mmol)，於室溫下攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：CMW=100：0(v/v)~0：100(v/v)]對所獲得之殘渣進行純化，而獲得目標物(0.0420g，92%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.64(1H,s),7.74(1H,m),7.66-7.64(1H,m),7.50(1H,s),7.45(1H,s),7.33-7.30(3H,m),7.24-7.21(2H,m),7.18- 7.16(3H,m),6.89(2H,m),6.51(1H,s),6.15(1H,s),5.89(1H,m),5.27(1H,m),4.82-4.78(1H,m),4.74(1H,m),4.56-4.54(1H,m),4.49-4.47(1H,m),4.23-4.20(3H,m),4.13-4.10(3H,m),3.96-3.92(1H,m),3.90(3H,s),3.83(3H,s),3.76(3H,s),3.72(2H,m),3.62-3.56(5H,m),3.40-3.36(1H,m),3.31(1H,m),3.04(1H,m),2.90-2.86(1H,m),2.75-2.71(1H,m),2.42-2.39(1H,m),2.36(2H,s),2.29-2.27(3H,m),2.07-2.05(3H,m),1.97-1.95(1H,m),1.75-1.72(2H,m),0.94(6H,m),0.69(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1156(M+H)+.
步驟14：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0318-394
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-脯胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-白胺醯胺
於上述步驟13中獲得之化合物(0.0400g，0.0346mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1mL)溶液中添加1-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0318-395
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(0.0140g，0.0346mmol，Click Chemistry Tools)與二異丙胺(0.0240mL，0.138mmol)，於室溫下攪拌18小時。於減壓下對反應液進行蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~90：10(v/v)]對所獲得之殘渣進行純化，而獲得目標物(0.0230g，46%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1443(M+H)+.
實施例30：藥物連結基28
Figure 107134301-A0305-02-0319-181
步驟1：N-{[(1R,8S)-雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基}甘胺醯甘胺酸
於起始物質30-1(0.215g，0.682mmol，Chemistry-A European Journal 2016，22,639)之N,N-二甲基甲醯胺(4mL)溶液中添加N,N-二異丙基乙基胺(0.119mL，0.682mmol)、甘胺醯基-甘胺酸(0.0900g，0.682mmol)、及水(2mL)，於室溫下攪拌一晚。於減壓下對反應液進行蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：CMW=100：0(v/v)~0：100(v/v)]對所獲得之殘渣進行純化，而獲得目標物(0.205g，98%)。
MS(APCI,ESI)m/z：309(M+H)+.
步驟2：N-{[(1R,8S)-雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基}甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟1中獲得之化合物(0.0180g，0.0587mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0420g，60%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.93(1H,s),8.25(1H,m),8.05(1H,s), 7.85(1H,m),7.60-7.54(2H,m),7.45(1H,s),7.39-7.37(3H,m),7.29(1H,s),7.20(1H,m),7.04(1H,s),6.91(2H,m),6.72(1H,s),6.56-6.53(2H,m),6.31(1H,s),5.76-5.74(1H,m),5.19(1H,m),4.80(1H,m),4.38-4.36(1H,m),4.23-4.21(2H,m),4.04(2H,m),3.95-3.92(3H,m),3.78-3.76(9H,m),3.66(3H,s),3.60(2H,m),3.55-3.52(2H,m),3.45-3.38(2H,m),3.26-3.23(1H,m),3.14(1H,m),2.77-2.74(1H,m),2.35-2.33(1H,m),2.20-2.11(6H,m),1.99-1.96(1H,m),1.81-1.78(4H,m),1.56-1.54(5H,m),1.29-1.26(4H,m),0.87-0.82(9H,m),0.67-0.62(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1320(M+H)+.
實施例31：藥物連結基29
Figure 107134301-A0305-02-0320-182
步驟1：化合物31-1
使實施例4步驟4中獲得之化合物(1.00g，1.52mmol)與4-甲基苯基 硼酸(0.309g，2.27mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.653g，72%)。
步驟2：化合物31-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.653g，1.09mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.377g，76%)。
MS(APCI,ESI)m/z：457[81Br,(M+H)+],455[79Br,(M+H)+].
步驟3：化合物31-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.377g，0.828mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.311g，82%)。
MS(APCI,ESI)m/z：459[81Br,(M+H)+],457[79Br,(M+H)+].
步驟4：化合物31-4
使上述步驟3中獲得之化合物(0.311g，0.68mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.320g，87%)。
MS(APCI,ESI)m/z：543[81Br,(M+H)+],541[79Br,(M+H)+].
步驟5：化合物31-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.0737g，0.136mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.145g，92%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1272(M+H)+.
步驟6：化合物31-6
使上述步驟5中獲得之化合物(0.145g，0.114mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.122g，93%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1158(M+H)+.
步驟7：化合物31-7
使上述步驟6中獲得之化合物(0.122g，0.114mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0598g，53%)。
MS(APCI,ESI)m/z：990(M+H)+.
步驟8：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0322-396
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.0300g，0.0304mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0184g，44%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1391(M+H)+.
實施例32：藥物連結基30
Figure 107134301-A0305-02-0322-183
步驟1：化合物32-1
使實施例4步驟4中獲得之化合物(1.00g，1.52mmol)與4-氟苯基硼酸(0.318g，2.27mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.623g，68%)。
步驟2：化合物32-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.623g，1.03mmol)以與實施例3步驟 7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.244g，52%)。
MS(APCI,ESI)m/z：461[81Br,(M+H)+],459[79Br,(M+H)+].
步驟3：化合物32-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.244g，0.531mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.144g，59%)。
MS(APCI,ESI)m/z：463[81Br,(M+H)+],461[79Br,(M+H)+].
步驟4：化合物32-4
使上述步驟3中獲得之化合物(0.144g，0.312mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.139g，82%)。
MS(APCI,ESI)m/z：547[81Br,(M+H)+],545[79Br,(M+H)+].
步驟5：化合物32-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.0742g，0.136mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.138g，88%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1284(M+H)+.
步驟6：化合物32-6
使上述步驟5中獲得之化合物(0.138g，0.108mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.109g，87%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1170(M+H)+.
步驟7：化合物32-7
使上述步驟6中獲得之化合物(0.109g，0.101mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0613g，61%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1002(M+H)+.
步驟8：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0324-397
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-8'-(3-{[(11aS)-2-(4-氟苯基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.0300g，0.0333mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0191g，45%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1402(M+H)+.
實施例33：藥物連結基31
[化157]
Figure 107134301-A0305-02-0325-184
步驟1：化合物33-1
使用實施例4步驟4中獲得之化合物(1.00g，1.52mmol)與噻吩-3-硼酸(0.582g，4.55mmol)，以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.611g，68%)。
步驟2：化合物33-2
使用上述步驟1中獲得之化合物(0.611g，1.03mmol)，以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.397g，86%)。
MS(APCI,ESI)m/z：449[81Br,(M+H)+],447[79Br,(M+H)+].
步驟3：化合物33-3
使用上述步驟2中獲得之化合物(0.397g，0.887mmol)，以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.341g，86%)。
MS(APCI,ESI)m/z：451[81Br,(M+H)+],449[79Br,(M+H)+].
步驟4：化合物33-4
使用上述步驟3中獲得之化合物(0.341g，0.759mmol)，以與實施例 3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.368g，91%)。
MS(APCI,ESI)m/z：535[81Br,(M+H)+],533[79Br,(M+H)+].
步驟5：化合物33-5
使用上述步驟4中獲得之化合物(0.0726g，0.136mmol)，以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.125g，80%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1260(M+H)+.
步驟6：化合物33-6
使用上述步驟5中獲得之化合物(0.125g，0.0992mmol)，以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.109g，96%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1146(M+H)+.
步驟7：化合物33-7
使用上述步驟6中獲得之化合物(0.109g，0.0951mmol)，以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0723g，78%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.13-9.04(1H,m),7.89-7.87(1H,m),7.47-7.42(4H,m),7.27-7.23(3H,m),7.18(1H,s),7.12-7.08(2H,m),6.97-6.96(1H,m),6.42-6.37(1H,m),6.08-6.04(1H,m),5.86-5.84(1H,m),5.34-5.31(1H,m),4.65-4.58(3H,m),4.23-3.95(5H,m),3.85(3H,s),3.75-3.69(6H,m),3.57-3.47(3H,m),3.34-3.29(3H,m),2.72-2.68(1H,m),2.38-2.29(2H,m),2.15-2.14(2H,m),1.72-1.69(1H,m),1.40-1.38(3H,m),0.96-0.95(3H,m),0.80-0.61(7H,m).
步驟8：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0326-398
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-5-側氧基-2-(噻吩-3-基)-5,10,11,11a- 四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使用上述步驟7中獲得之化合物(0.0300g，0.0307mmol)，以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0101g，24%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1379(M+H)+.
實施例34：藥物連結基32
Figure 107134301-A0305-02-0327-185
步驟1：化合物34-2
於0℃下向起始物質34-1(4.00g，10.8mmol，US20150283262)之二氯甲烷(100mL)溶液中添加N,N-二甲基甲醯胺(0.2mL)、乙二醯氯(2.75g，21.7mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。於減壓下將溶劑蒸餾去除後，於減壓下乾燥殘渣，並溶於二氯甲烷(60mL)中。於0℃下添加(2S)-2-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-2,3-二氫-1H-吲哚(4.28g，16.2 mmol，Journal of the American Chemical Society 2006,128,14264)、三乙胺(1.64g，16.2mmol)，於室溫下攪拌15分鐘。於反應溶液中添加水，利用二氯甲烷進行萃取。利用飽和鹽水洗淨所獲得之有機層，利用硫酸鎂加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~80：20(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(6.10g，92%)。
MS(APCI,ESI)m/z：615(M+H)+
步驟2：化合物34-3
於氮氣環境下向上述步驟1中獲得之化合物(6.10g，9.90mmol)之乙醇(100mL)溶液中添加5%鈀碳(54%水分，1.00g)後，於氫氣環境、室溫下將反應溶液攪拌4小時。將反應溶液進行矽藻土過濾後，於減壓下對濾液進行蒸餾去除，而獲得目標物(5.80g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：585(M+H)+
步驟3：化合物34-4
使上述步驟2中獲得之化合物(2.90g，5.00mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.20g，96%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.26(1H,s),7.78(1H,s),7.18-7.17(1H,m),6.94-6.83(3H,m),5.94-5.90(1H,m),5.35-5.19(2H,m),4.74(1H,m),4.65-4.60(2H,m),3.76-3.61(6H,m),3.31-3.27(1H,m),3.10(1H,m),1.35-1.17(3H,m),1.10(18H,m),0.79-0.70(9H,m),-0.03(3H,s),-0.08(3H,s).
步驟4：化合物34-5
使上述步驟3中獲得之化合物(3.20g，4.80mmol)以與實施例1步驟7 同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.32g，87%)。
MS(APCI,ESI)m/z：555(M+H)+
步驟5：化合物34-6
使上述步驟4中獲得之化合物(2.32g，4.18mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.68g，73%)。
MS(APCI,ESI)m/z：553(M+H)+
步驟6：化合物34-7
使上述步驟5中獲得之化合物(1.68g，3.04mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.32g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.16(1H,m),7.28-7.20(3H,m),7.09-7.07(1H,m),6.70(1H,s),5.80-5.76(2H,m),5.14-5.12(2H,m),4.60(1H,m),4.37(1H,m),4.01-3.99(1H,m),3.87(3H,s),3.45-3.41(1H,m),2.99-2.95(1H,m),1.28-1.23(3H,m),1.10-1.07(18H,m),0.92(9H,s),0.26(3H,s),0.19(3H,s).
步驟7：化合物34-8
使上述步驟6中獲得之化合物(2.32g，3.48mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.42g，80%)。
MS(APCI,ESI)m/z：511(M+H)+
步驟8：化合物34-9
使上述步驟7中獲得之化合物(0.720g，1.41mmol)以與實施例4步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.580g，65%)。
MS(APCI,ESI)m/z：633[81Br,(M+H)+],631[79Br,(M+H)+].
步驟9：化合物34-10
使上述步驟8中獲得之化合物(0.235g，0.371mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.347g，83%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1359(M+H)+
步驟10：化合物34-11
使上述步驟9中獲得之化合物(0.347g，0.255mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得矽烷基去保護體(0.265g，92%)。使矽烷基去保護體(0.265g，0.234mmol)以與實施例1步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.086g，39%)。
MS(APCI,ESI)m/z：944(M+H)+
步驟11：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0330-399
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(5aS)-10-甲氧基-12-側氧基-5a,12-二氫-5H-吲哚并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-9-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟10中獲得之化合物(0.0860g，0.0911mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0800g，65%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1345(M+H)+
實施例35：藥物連結基33
[化159]
Figure 107134301-A0305-02-0331-187
步驟1：化合物35-1
使實施例34步驟7中獲得之化合物(0.700g，1.37mmol)以與實施例3步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.790g，87%)。
MS(APCI,ESI)m/z：661[81Br,(M+H)+],659[79Br,(M+H)+].
步驟2：化合物35-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.245g，0.371mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.368g，86%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1387(M+H)+
步驟3：化合物35-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.368g，0.265mmol)以與實施例3步驟11、12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.180g，81%)。
MS(APCI,ESI)m/z：972(M+H)+
步驟4：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0331-400
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(5aS)-10-甲氧基-12-側氧基-5a,12-二氫-5H-吲哚并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-9-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟3中獲得之化合物(0.0700g，0.0720mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0440g，44%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1373(M+H)+
實施例36：藥物連結基34
Figure 107134301-A0305-02-0332-188
步驟1：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2-甲醛
將實施例3步驟5中獲得之化合物(3.54g，5.15mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(52mL)中，添加N-甲醯基糖精(5.44g，25.7mmol)、乙酸鈀(0.0578g，0.257mmol)、1,4-雙(二苯基膦)丁烷(0.154g，0.360mmol)、碳酸鈉(2.73g，25.7mmol)、三乙基矽烷(1.20g，10.3mmol)，於室溫下攪拌19小時。於反應溶液中添加水，利用乙酸乙酯萃取反應溶液，利用水、飽和鹽水將其洗淨。利用硫酸鎂乾燥有機層後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~40：60(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.760g，26%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：9.74(1H,s),7.79(1H,s),7.32(1H,s),7.24 (1H,s),5.54(1H,m),4.76-4.69(2H,m),4.07-4.05(2H,m),3.93(3H,s),3.83-3.65(3H,m),3.45(2H,m),3.02-2.98(1H,m),1.95-1.91(4H,m),1.69-1.58(2H,m),1.02-0.92(2H,m),0.06-0.03(9H,m).
步驟2：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-(羥基甲基)-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
將上述步驟1中獲得之化合物(0.760g，1.34mmol)溶解於二氯甲烷(14mL)中，於-78℃下添加硼氫化鈉(0.101g，2.68mmol)後，升溫至室溫。於反應溶液中添加1當量濃度鹽酸，利用水、飽和鹽水洗淨有機層。利用硫酸鎂乾燥有機層後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.432g，57%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(1H,s),7.23(1H,s),6.93(1H,s),5.53(1H,m),4.67(1H,m),4.57-4.54(1H,m),4.32-4.31(2H,m),4.10-4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.83-3.57(3H,m),3.45(2H,m),2.90-2.88(1H,m),1.99-1.88(4H,m),1.69-1.61(2H,m),1.00-0.98(2H,m),0.03(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：571[81Br,(M+H)+],569[79Br,(M+H)+].
步驟3：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
將上述步驟2中獲得之化合物(0.432g，0.758mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(8mL)中，於室溫下添加咪唑(0.0775g，1.14mmol)、第三 丁基二甲基氯矽烷(0.137g，0.910mmol)，並於室溫下攪拌10分鐘。於反應溶液中添加水，利用乙酸乙酯萃取反應溶液。利用水、飽和鹽水洗淨有機層，利用硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除後，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~30：70(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.485g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(1H,s),7.22(1H,s),6.87(1H,m),5.53(1H,m),4.68(1H,m),4.54-4.52(1H,m),4.33-4.28(2H,m),4.11-4.00(2H,m),3.92(3H,s),3.80-3.78(1H,m),3.69-3.66(1H,m),3.52-3.50(1H,m),3.45(2H,m),2.86-2.82(1H,m),1.99-1.87(4H,m),1.68-1.60(2H,m),1.00-0.98(2H,m),0.91(9H,s),0.09(6H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：685[81Br,(M+H)+],683[79Br,(M+H)+].
步驟4：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-7-甲氧基-1,11a-二氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮
使上述步驟3中獲得之化合物(0.103g，0.151mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0590g，73%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.83(1H,m),7.51(1H,s),6.92(1H,m),6.79(1H,s),4.32-4.30(3H,m),4.12-4.04(2H,m),3.93(3H,s),3.86-3.84(1H,m),3.46-3.39(2H,m),3.26-3.23(1H,m),3.07-3.03(1H,m),1.97-1.85(4H,m),1.68-1.63(2H,m),0.92(9H,s),0.09(6H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：539[81Br,(M+H)+],537[79Br,(M+H)+].
步驟5：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-[(5-{[(11aS)-2-({[第 三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟4中獲得之化合物(0.251g，0.467mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.300g，51%)。
步驟6：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-8'-[(5-{[(11aS)-2-(羥基甲基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(0.300g，0.237mmol)以與實施例33步驟11、12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0540g，53%)。
MS(APCI,ESI)m/z：952(M+H)+
步驟7：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0335-401
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-8'-[(5-{[(11aS)-2-(羥基甲基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟6中獲得之化合物(0.0500mg，0.0525mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0340mg，48%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1351(M-H)-
實施例37：藥物連結基35
Figure 107134301-A0305-02-0336-354
步驟1：(6S)-5-[4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲醯基]-5-氮螺[2.4]庚烷-6-羧酸甲酯
於冰浴冷卻下歷經5分鐘向4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(6.07g，20.0mmol，Tetrahedron 1995,51,5617)、N,N-二甲基甲醯胺(1.08mL，13.9mmol)之二氯甲烷(100mL)溶液中滴加乙二醯氯(3.43mL，40.0mmol)。於室溫下將反應溶液攪拌5小時後，於減壓下蒸餾去除，將所獲得之殘渣溶解於二氯甲烷(20mL)中，於減壓下蒸餾去除。將該操作重複3次後，使殘渣懸浮於二氯甲烷(5mL)中，於其中添加過量之二乙醚與己烷並過濾，於減壓下加以乾燥，藉此獲得粗醯氯。將所獲得之醯氯溶解於二氯甲烷中，冷卻至-40℃(乾冰-乙腈浴)，緩緩添加(6S)-5-氮螺[2.4]庚烷-6-羧酸甲酯鹽酸鹽(4.22g，22.0mmol，Tetrahedron Letters 2012.53.3847)、三乙胺(3.36mL，24.2mmol)。歷經一晚將反應混合物升溫至室溫。於反應混合物中添加1當量濃度鹽酸，利用二氯甲烷萃取反應混合物。利用水，飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0~50：50]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(6.55g，80%)。
MS(APCI,ESI)m/z：441(M+H)+
步驟2：(11a'S)-8'-(苄氧基)-7'-甲氧基-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5',11'(10'H,11a'H)-二酮
於氮氣環境下向上述步驟1中獲得之化合物(6.55g，16.0mmol)之乙醇(150mL)、THF(150mL)溶液中添加雷氏鎳(7.00g)。於反應混合物中添加肼一水合物(7mL)，緩緩升溫至50℃。於50℃下攪拌2小時後添加雷氏鎳(3.00g)、肼一水合物(3mL)並攪拌1小時。於反應混合物中添加THF(100mL)並進行矽藻土過濾。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~25：75(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(4.42g，73%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.82(1H,s),7.48(1H,s),7.42-7.35(4H,m),7.32-7.31(1H,m),6.44(1H,s),5.16(2H,s),4.16-4.10(1H,m),3.93(3H,s),3.78-3.76(1H,m),3.39-3.37(1H,m),2.45-2.43(1H,m),2.24-2.21(1H,m),0.83-0.61(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：379(M+H)+
步驟3：(11a'S)-8'-(苄氧基)-7'-甲氧基-10'-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]- 5',11'(10'H,11a'H)-二酮
於-40℃下向上述步驟2中獲得之化合物(10.0g，26.4mmol)之THF(150mL)溶液中緩慢滴加2.6mol/L之正丁基鋰正己烷溶液(12.0mL，31.8mmol)。於-40℃下將反應溶液攪拌15分鐘後，緩慢滴加2-(氯甲氧基)乙基三甲基矽烷(5.57mL，31.7mmol)。於室溫下將反應溶液攪拌3小時後，添加水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~30：70(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(11.8g，88%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.45-7.44(2H,m),7.37-7.32(4H,m),7.28(1H,s),5.48-5.46(1H,m),5.21(2H,s),4.50-4.48(1H,m),4.22-4.20(1H,m),3.95(3H,s),3.73-3.70(2H,m),3.62-3.60(1H,m),3.41-3.38(1H,m),2.45-2.43(1H,m),2.23-2.20(1H,m),0.98-0.96(2H,m),0.83-0.68(4H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：509(M+H)+
步驟4：(11a'S)-8'-羥基-7'-甲氧基-10'-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5',11'(10'H,11a'H)-二酮
於氮氣環境下向上述步驟3中獲得之化合物(18.7g，36.8mmol)之THF(50mL)、乙醇(100mL)溶液中添加5%之鈀碳觸媒(5.00g)。立即將氮氣球更換為氫氣球，於氫氣環境下將反應混合物攪拌6小時。於反應混合物中添加氯仿進行稀釋，進行矽藻土過濾後，於減壓下對濾液進行蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~25： 75(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(15.1g，98%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.38(1H,s),7.28(1H,s),6.01(1H,s),5.49-5.47(1H,m),4.70-4.68(1H,m),4.24-4.22(1H,m),3.96(3H,s),3.76-3.71(2H,m),3.66-3.64(1H,m),3.42-3.39(1H,m),2.47-2.45(1H,m),2.23-2.21(1H,m),1.01-0.99(2H,m),0.89-0.63(4H,m),0.03(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：419(M+H)+
步驟5：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-7'-甲氧基-10'-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5',11'(10'H,11a'H)-二酮
使上述步驟4中獲得之化合物(2.77g，6.62mmol)以與實施例3步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.31g，88%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.36(1H,s),7.25(1H,s),5.55(1H,m),4.65(1H,m),4.24-4.23(1H,m),4.11-4.03(2H,m),3.93(3H,s),3.85-3.78(1H,m),3.72-3.69(2H,m),3.46-3.39(3H,m),2.47-2.44(1H,m),2.25-2.22(1H,m),1.95-1.91(4H,m),1.67-1.59(1H,m),1.03-0.95(2H,m),0.90-0.85(1H,m),0.70-0.66(4H,m),0.05(9H,s).
步驟6：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-7'-甲氧基-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟5中獲得之化合物(3.31g，5.83mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.11g，45%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.81(1H,m),7.53(1H,s),6.82(1H,s),4.13-4.06(2H,m),3.97(3H,s),3.88-3.83(1H,m),3.69(1H,m),3.52-3.39(3H,m),2.55-2.52(1H,m),2.06-1.89(5H,m),1.67-1.63(2H,m),0.76- 0.72(4H,m).
步驟7：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-7'-甲氧基-1',10',11',11a'-四氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟6中獲得之化合物(2.56g，6.08mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.15g，45%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.60(1H,s),6.07(1H,s),4.11-4.04(1H,m),3.99(2H,m),3.87-3.84(1H,m),3.85(3H,s),3.73(1H,m),3.58-3.53(2H,m),3.47-3.42(3H,m),2.03-1.78(6H,m),1.65-1.63(2H,m),0.77-0.56(4H,m).
步驟8：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟7中獲得之化合物(1.15g，2.72mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.14g，82%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.23(1H,s),6.69(1H,s),5.79(1H,s),5.13-5.10(2H,m),4.68-4.66(1H,m),4.48-4.45(2H,m),4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.76(1H,m),3.54-3.37(3H,m),2.39(1H,m),1.95-1.90(4H,m),1.68-1.61(3H,m),1.44(1H,m),0.75-0.66(4H,m).
步驟9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-10'-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'- 基}氧基)戊基]氧基}-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟8中獲得之化合物(0.374g，0.737mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.589g，65%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1234(M+H)+
步驟10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-10'-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基}氧基)戊基]氧基}-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(0.589g，0.477mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.382g，71%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.90(1H,s),7.55(2H,m),7.25-7.21(2H,m),6.74(2H,m),6.38(1H,s),5.90-5.87(5H,m),5.33-5.09(8H,m),4.66-4.60(8H,m),3.98-3.91(10H,m),3.77-3.30(12H,m),2.42-2.36(2H,m),1.77-1.39(6H,m),0.91-0.70(14H,m).
步驟11：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟10中獲得之化合物(0.382g，0.341mmol)以與實施例3步 驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.200g，62%)。
MS(APCI,ESI)m/z：952(M+H)+
步驟12：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0342-403
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟11中獲得之化合物(0.0560g，0.0588mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0500g，63%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1354(M+H)+
實施例38：藥物連結基36
Figure 107134301-A0305-02-0342-189
步驟1：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0342-404
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使實施例37步驟11中獲得之化合物(0.0410g，0.0430mmol)以與實施例6步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0210g，39%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1240(M+H)+
實施例39：藥物連結基37
Figure 107134301-A0305-02-0343-190
步驟1：化合物39-1
使用實施例4步驟4中獲得之化合物(1.00g，1.52mmol)與苯基硼酸(0.370g，3.03mmol)，以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.726g，81%)。
MS(APCI,ESI)m/z：589[81Br,(M+H)+],587[79Br,(M+H)+].
步驟2：化合物39-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.726g，1.24mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.344g，63%)。
MS(APCI,ESI)m/z：443[81Br,(M+H)+],441[79Br,(M+H)+].
步驟3：化合物39-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.344g，0.779mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.248g，72%)。
MS(APCI,ESI)m/z：445[81Br,(M+H)+],443[79Br,(M+H)+].
步驟4：化合物39-4
使上述步驟3中獲得之化合物(0.248g，0.559mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.267g，90%)。
MS(APCI,ESI)m/z：529[81Br,(M+H)+],527[79Br,(M+H)+].
步驟5：化合物39-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.100g，0.190mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.201g，85%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1255(M+H)+.
步驟6：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0344-405
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基1-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-5-側氧基-2-苯基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}側氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(0.201g，0.160mmol)以與實施例3步驟11、12、13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.080g，36%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1372(M+H)+.
實施例40：藥物連結基38
[化164]
Figure 107134301-A0305-02-0345-191
步驟1：化合物40-1
使實施例4步驟4中獲得之化合物(1.48g，2.24mmol)與4-(二甲胺基)苯基硼酸(0.741g，4.49mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.520g，37%)。
MS(APCI,ESI)m/z：632[81Br,(M+H)+],630[79Br,(M+H)+].
步驟2：化合物40-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.520g，0.825mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.167g，42%)。
步驟3：化合物40-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.167g，0.345mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0650g，39%)。
MS(APCI,ESI)m/z：488[81Br,(M+H)+],486[79Br,(M+H)+].
步驟4：化合物40-4
使上述步驟3中獲得之化合物(0.0650g，0.134mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0690g，90%)。
MS(APCI,ESI)m/z：572[81Br,(M+H)+],570[79Br,(M+H)+].
步驟5：化合物40-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.0690g，0.121mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0660g，42%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1297(M+H)+.
步驟6：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0346-406
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-8'-[3-({(11aS)-2-[4-(二甲胺基)苯基]-7-甲氧基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟5中獲得之化合物(0.0660g，0.0509mmol)以與實施例3步驟11、12、13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0350g，49%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1417(M+H)+.
實施例41：藥物連結基39
Figure 107134301-A0305-02-0346-192
步驟1：5-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0346-407
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}戊酸-N,N-二甲基甲醯胺加成物
將5-胺基戊酸(0.436g，3.72mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10mL)中，於室溫下添加1-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0346-408
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(1.36g，3.38mmol)、三乙胺(0.937mL，6.76mmol)，於室溫下攪拌1.5小時。於反應溶液中添加1當量濃度鹽酸，利用氯仿進行萃取，利用水、飽和鹽水洗淨所獲得之有機層後，利 用硫酸鎂加以乾燥。於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿~氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分佈有機層]純化所獲得之殘渣，而以固體之形式獲得目標物(0.730g，45%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.06(1H,s),7.71(1H,m),7.54-7.52(1H,m),7.46-7.32(6H,m),6.04(1H,m),5.18(1H,m),3.72(1H,m),3.17-3.10(2H,m),3.00(3H,s),2.92(3H,s),2.84-2.80(1H,m),2.45-2.34(3H,m),2.28-2.24(1H,m),2.03-1.99(1H,m),1.66-1.58(2H,m),1.47-1.40(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：405(M+H)+
步驟2：N-(5-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0347-409
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}戊醯基)-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟1中獲得之化合物(0.0176g，0.0368mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.00880g，18%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1339(M+H)+
實施例42：藥物連結基40
[化166]
Figure 107134301-A0305-02-0348-193
步驟1：化合物42-1
使實施例3步驟1中獲得之化合物(5.00g，9.66mmol)以與實施例3步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.95g，100%)。
MS(APCI,ESI)m/z：409(M+H)+
步驟2：化合物42-2
使上述步驟1中獲得之化合物(3.95g，9.67mmol)以與實施例24步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(4.78g，87%)。
MS(APCI,ESI)m/z：565(M+H)+
步驟3：化合物42-3
使上述步驟2中獲得之化合物(4.78g，8.43mmol)以與實施例3步驟4同樣之方式進行反應，而獲得目標物(2.36g，50%)。
MS(APCI,ESI)m/z：563(M+H)+
步驟4：化合物42-4
使上述步驟3中獲得之化合物(1.53g，2.72mmol)以與實施例3步驟5同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(1.27g，69%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.31(2H,s),7.15(1H,m),5.52(1H,m),4.65(1H,m),4.57(1H,m),3.95-3.89(1H,m),3.87(3H,s),3.75-3.58(2H,m),3.18-3.14(1H,m),1.33-1.25(3H,m),1.10(18H,m),1.00-0.96(2H,m),0.03(9H,s).
步驟5：化合物42-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.255g，0.367mmol)與4-(胺基甲基)苯基硼酸(0.344g，1.84mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.148g，62%)。
MS(APCI,ESI)m/z：652(M+H)+
步驟6：化合物42-6
於室溫下向上述步驟5中獲得之化合物(0.142g，0.218mmol)與[(Z)-(甲基硫基)亞甲基]雙胺基甲酸二丙-2-烯-1-基酯(0.079g，0.079mmol，WO9920628)之二甲基甲醯胺(2.2mL)之溶液中添加三乙胺(0.090mL，0.653mmol)與氯化汞(II)(0.083g，0.305mmol)。於室溫下將反應溶液攪拌30分鐘後，於反應溶液中添加乙酸乙酯並進行稀釋，藉由過濾去 除汞鹽。利用0.1當量濃度之磷酸緩衝液與飽和鹽水洗淨所獲得之有機層。利用硫酸鈉乾燥有機層後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~60：40(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.157g，83%)。
MS(APCI,ESI)m/z：863(M+H)+
步驟7：化合物42-7
於室溫下向上述步驟6中獲得之化合物(0.153g，0.177mmol)之THF(1.8mL)溶液中添加1mol/L之氟化四丁基銨四氫呋喃溶液(0.266mL，0.266mmol)。於室溫下攪拌50分鐘後，於反應溶液中添加0.1當量濃度磷酸緩衝液(pH值7.0)，利用乙酸乙酯進行萃取，利用0.1當量濃度磷酸緩衝液(pH值7.0)洗淨所獲得之有機層。利用硫酸鈉加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.115g，92%)。
MS(APCI,ESI)m/z：706(M+H)+
步驟8：化合物42-8
於室溫下向上述步驟7中獲得之化合物(0.115g，0.163mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1.0mL)溶液中添加1,5-二溴戊烷(0.088mL，0.652mmol)、碳酸銫(0.032g，0.098mmol)。於室溫下攪拌2小時後，於反應溶液中添加0.1當量濃度磷酸緩衝液(pH值7.0)，利用乙酸乙酯進行萃取。利用0.1當量濃度磷酸緩衝液(pH值7.0)與飽和鹽水洗淨所獲得之有機層，利用硫酸鈉加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~50：50(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.111g，80%)。
MS(APCI,ESI)m/z：856[81Br,(M+H)+],854[79Br,(M+H)+]
步驟9：化合物42-9
使上述步驟8中獲得之化合物(0.105g，0.123mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.036g，41%)。
MS(APCI,ESI)m/z：772[81Br,(M+H)+],770[79Br,(M+H)+]
步驟10：化合物42-10
使上述步驟9中獲得之化合物(0.163g，0.169mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.132g，88%)。
MS(APCI,ESI)m/z：880(M+H)+
步驟11：化合物42-11
於室溫下向上述步驟10中獲得之化合物(0.13g，0.147mmol)、5-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]胺基}戊酸(0.0386g，0.192mmol)及1-羥基苯并三唑一水合物(0.038g，0.251mmol)之二氯甲烷(3mL)溶液中添加三乙胺(0.035mL，0.251mmol)與1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(0.048g，0.251mmol)，於室溫下攪拌1小時。於反應溶液中添加0.1當量濃度磷酸緩衝液(pH值7.0)，利用乙酸乙酯進行萃取。利用0.1當量濃度磷酸緩衝液(pH值7.0)洗淨所獲得之有機層，於減壓下將乙酸乙酯蒸餾去除。進行甲苯共沸，藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~50：50(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.150g，95%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1063(M+H)+
步驟12：化合物42-12
於室溫下向上述步驟11中獲得之化合物(0.150g，0.141mmol)之 N,N-二甲基甲醯胺(3.5mL)溶液中添加乙酸鋰水溶液(1.52M，0.088mL)。於室溫下攪拌1.5小時後，於反應溶液中添加水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用水洗淨有機層後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~95：5(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.135g，96%)。
MS(APCI,ESI)m/z：907(M+H)+
步驟13：化合物42-13
於室溫下向上述步驟12中獲得之化合物(0.048g，0.053mmol)與上述步驟9中獲得之化合物(0.034g，0.048mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)溶液中添加碳酸銫(0.011g，0.034mmol)。於室溫下攪拌1.5小時後，於45℃下攪拌5小時。於反應溶液中添加0.1當量濃度磷酸緩衝液(pH值7.0)，利用乙酸乙酯進行萃取。利用0.1當量濃度磷酸緩衝液(pH值7.0)洗淨所獲得之有機層，利用硫酸鈉加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~97：3(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.038g，52%)。
MS(APCI，ESI)m/z：1534(M+H)+
步驟14：化合物42-14
使上述步驟13中獲得之化合物(0.038g，0.247mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應。將反應溶液進行分液後，於減壓下將有機溶劑蒸餾去除，於下一反應中直接使用所獲得之化合物。
MS(APCI,ESI)m/z：1420(M+H)+
步驟15：化合物42-15
於室溫下向上述步驟14中獲得之化合物(0.034g，0.140mmol)之二 甲基甲醯胺(2mL)溶液中添加吡咯啶(0.048mL，0.574mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(0.0054g，0.0046mmol)，於室溫下攪拌50分鐘。於減壓下將有機溶劑蒸餾去除後，將所獲得之殘渣溶解於二甲基亞碸中，藉由逆相管柱層析法(管柱：DevelosilCombi-RP-5(Nomurachemical)，20mm×100mm.：0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液=79.2：20.8至51.4：48.6，流速：25mL/min，溫度：25℃)進行純化，而獲得目標化合物(0.020g，72%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1168(M+H)+
步驟16：化合物42-16
於上述步驟15中獲得之化合物(0.002g，0.0017mmol)之二甲基甲醯胺(0.5mL)溶液中添加三乙胺(0.007mL，0.051mmol)與市售之1-{[4-(11,12-二去氫苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0353-410
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]側氧基吡咯啶-2,5-二酮(0.083g，0.0205mmol)，於室溫下攪拌10小時。於減壓下將有機溶劑蒸餾去除，將所獲得之殘渣溶解於二甲基亞碸中，藉由逆相管柱層析法(管柱：DevelosilCombi-RP-5(Nomurachemical)，20mm×100mm.：0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液=62.5：37.5至34.7：65.3，流速：25mL/min，溫度：25℃)、及矽膠管柱層析法[氯仿~氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分佈有機層]進行純化，而獲得目標物(0.033g，14%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1455(M+H)+
實施例43：藥物連結基41
[化167]
Figure 107134301-A0305-02-0354-194
步驟1：化合物43-1
使實施例4步驟4中獲得之化合物(0.72g，1.09mmol)與3-甲氧基苯基硼酸(0.332g，2.18mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.526g，78%)。
MS(APCI,ESI)m/z：619[81Br,(M+H)+],617[79Br,(M+H)+]
步驟2：化合物43-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.526g，0.851mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.195g，49%)。
MS(APCI,ESI)m/z：473[81Br,(M+H)+],471[79Br,(M+H)+]
步驟3：化合物43-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.195g，0.414mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.195g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：475[81Br,(M+H)+],473[79Br,(M+H)+]
步驟4：化合物43-4
使上述步驟3中獲得之化合物(0.413mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.106g，46%)。
MS(APCI,ESI)m/z：559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+]
步驟5：化合物43-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.069g，0.124mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.128g，80%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1284(M+H)+
步驟6：化合物43-6
使上述步驟5中獲得之化合物(0.128g，0.099mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.105g，90%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1170(M+H)+
步驟7：化合物43-7
使上述步驟6中獲得之化合物(0.105g，0.089mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.072g，80%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1002(M+H)+
步驟8：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0355-411
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.072g，0.072mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.053g，52%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1403(M+H)+
實施例44：藥物連結基42
Figure 107134301-A0305-02-0356-195
步驟1：化合物44-1
使實施例4步驟4中獲得之化合物(0.68g，1.03mmol)與3,4-二甲氧基苯基硼酸(0.375g，2.06mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.506g，75%)。
MS(APCI,ESI)m/z：649[81Br,(M+H)+],647[79Br,(M+H)+]
步驟2：化合物44-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.506g，0.781mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.199g，50%)。
MS(APCI,ESI)m/z：503[81Br,(M+H)+],501[79Br,(M+H)+]
步驟3：化合物44-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.169g，0.337mmol)以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.231g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：505[81Br,(M+H)+],503[79Br,(M+H)+]
步驟4：化合物44-4
使上述步驟3中獲得之化合物(0.337mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.170g，86%)。
MS(APCI,ESI)m/z：589[81Br,(M+H)+],587[79Br,(M+H)+]
步驟5：化合物44-5
使上述步驟4中獲得之化合物(0.076g，0.136mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.116g，71%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1314(M+H)+
步驟6：化合物44-6
使上述步驟5中獲得之化合物(0.116g，0.088mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.108g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：1200(M+H)+
步驟7：化合物44-7
使上述步驟6中獲得之化合物(0.090mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.066g，71%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1032(M+H)+
步驟8：N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]氮
Figure 107134301-A0305-02-0357-412
-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11a'S)-8'-(3-{[(11aS)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側 氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺
使上述步驟7中獲得之化合物(0.066g，0.064mmol)以與實施例3步驟13同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.053g，58%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1434(M+H)+
[藥物D之合成]
實施例45：藥物1
Figure 107134301-A0305-02-0358-196
步驟1：(2-{[(6S)-6-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺基甲酸丙-2-烯-1-基酯
使實施例1步驟5中獲得之化合物(4.59g，8.15mmol)以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(4.86g，92%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.97(1H,s),7.77(1H,s),6.77(1H,s),5.97-5.94(1H,m),5.39-5.21(2H,m),4.67-4.59(3H,m),4.00-3.98(1H,m),3.74-3.66(5H,m),3.05-3.03(1H,m),2.30-2.28(1H,m),1.72-1.70(1H,m),1.30-1.27(3H,m),1.11-1.05(18H,m),0.99-0.91(9H,m),0.61-0.53(4H,m),0.10-0.06(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：647(M+H)+
步驟2：(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}苯基)胺基甲酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟1中獲得之化合物(4.86g，7.51mmol)以與實施例1步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.42g，86%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.52(1H,s),7.71(1H,s),6.77(1H,s),6.00-5.94(1H,m),5.35-5.27(2H,m),4.65-4.64(3H,m),4.33-4.31(1H,m),3.82-3.77(5H,m),3.68-3.66(1H,m),3.15-3.13(1H,m),1.89-1.86(2H,m),1.30-1.26(3H,m),1.14-1.10(18H,m),0.66-0.51(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：533(M+H)+
步驟3：(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟2中獲得之化合物(6.68g，12.5mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(6.44g，97%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.20(1H,s),6.69(1H,s),5.89-5.78(2H,m),5.18-5.15(2H,m),4.62-4.60(1H,m),4.49-4.47(1H,m),3.85(3H,s),3.74-3.71(1H,m),3.59-3.57(1H,m),3.33-3.30(2H,m),2.43-2.40(1H,m),1.76-1.73(1H,m),1.28-1.20(3H,m),1.09-1.07(18H,m),0.74-0.65(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：531(M+H)+
步驟4：(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'- 甲氧基-5'-側氧基-8'-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟3中獲得之化合物(3.24g，6.10mmol)以與實施例1步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.86g，98%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.20(1H,s),6.67(1H,s),6.01-5.98(1H,m),5.79-5.73(1H,m),5.14-5.10(2H,m),4.64-4.61(1H,m),4.37-4.34(1H,m),3.86(3H,s),3.72-3.69(1H,m),3.52-3.50(1H,m),3.29-3.26(1H,m),2.38-2.34(1H,m),1.55-1.51(1H,m),1.28-1.24(3H,m),1.15-1.07(18H,m),0.81-0.66(13H,m),0.21(3H,s),0.18(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：645(M+H)+
步驟5：(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-8'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟4中獲得之化合物(4.49g，6.96mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.24g，95%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.25(1H,s),6.73(1H,s),6.02-6.00(1H,m),5.91(1H,s),5.77-5.75(1H,m),5.11-5.09(2H,m),4.64-4.62(1H,m),4.41-4.40(1H,m),3.95(3H,s),3.72-3.70(1H,m),3.54-3.53(1H,m),3.29-3.26(1H,m),2.36-2.34(1H,m),1.56-1.54(1H,m),0.79-0.67(13H,m),0.21(3H,s),0.20(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：489(M+H)+
步驟6：(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2- 烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟5中獲得之化合物(0.080g，0.164mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.160g，98%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.44-7.42(3H,m),7.12-7.10(2H,m),7.05-7.03(1H,m),6.92-6.90(2H,m),6.61-6.59(1H,m),5.87-5.81(3H,m),5.10-5.07(4H,m),4.66-4.55(3H,m),4.43-4.39(2H,m),4.21-3.94(5H,m),3.83(3H,s),3.81(3H,s),3.76(3H,s),3.65-3.62(1H,m),3.56-3.54(1H,m),3.42-3.39(1H,m),3.22-3.14(2H,m),2.77-2.73(1H,m),2.42-2.33(1H,m),1.81-1.79(4H,m),1.55-1.44(3H,m),0.82(9H,s),0.72-0.53(4H,m),0.19(3H,s),0.17(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：993(M+H)+
步驟7：(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟6中獲得之化合物(160mg，0.161mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(141mg，定量)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.44-7.42(3H,m),7.08-7.06(3H,m),6.92-6.90(2H,m),6.82-6.79(1H,m),6.56-6.54(1H,m),5.77-5.74(3H,m),5.09(4H,s),4.58-4.55(3H,m),4.43-4.41(2H,m),4.16-4.01(5H, m),3.81-3.81(6H,m),3.76(3H,s),3.64(1H,s),3.56-3.53(1H,m),3.42-3.38(1H,m),3.25-3.13(2H,m),2.74-2.70(1H,m),2.37-2.34(1H,m),1.82-1.79(4H,m),1.59-1.56(3H,m),0.66-0.62(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：879(M+H)+
步驟8：(11a'S)-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟7中獲得之化合物(141mg，0.161mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(109.8mg，99%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.92-7.91(1H,m),7.45(1H,s),7.39-7.37(2H,m),7.33(1H,s),7.29(1H,s),6.92-6.89(2H,m),6.85(1H,s),6.56-6.54(1H,m),6.31(1H,s),4.19-4.12(2H,m),4.05-3.99(1H,m),3.95-3.93(2H,m),3.82-3.79(4H,m),3.76(3H,s),3.66(3H,s),3.52-3.46(3H,m),3.30-3.21(2H,m),2.78-2.74(1H,m),2.45-2.42(1H,m),2.06-2.05(1H,m),1.89-1.82(4H,m),1.60-1.58(2H,m),0.80-0.63(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：693(M+H)+
實施例46：藥物2
Figure 107134301-A0305-02-0362-197
步驟1：化合物46-1
使用實施例26步驟10中獲得之化合物(0.246g，0.514mmol)，以與實施例4步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.122g，40%)。
MS(APCI,ESI)m/z：601[81Br,(M+H)+],599[79Br,(M+H)+].
步驟2：化合物46-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.122g，0.204mmol)以與實施例45步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.176g，86%)。
步驟3：化合物46-3
使上述步驟2中獲得之化合物(0.0870g，0.0864mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0660g，86%)。
MS(APCI,ESI)m/z：892(M+H)+
步驟4：乙酸4-[(11aS)-7-甲氧基-8-(3-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',11a'二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}丙氧基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2-基]苄基酯
使上述步驟3中獲得之化合物(0.0660g，0.0793mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0444g，85%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.80-7.79(1H,m),7.66-7.65(1H,m),7.52-7.50(2H,m),7.39-7.33(5H,m),6.86-6.85(1H,m),6.14-6.13(1H,m),5.09(2H,s),4.32-4.23(6H,m),3.95-3.95(3H,m),3.85-3.82(4H,m),3.71-3.68(2H,m),3.55-3.49(3H,m),3.42-3.33(1H,m),2.79-2.72(1H,m),2.54-2.50(1H,m),2.40-2.36(2H,m),2.02-1.98(1H,m),1.26-1.24(1H,m),0.76-0.72(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：706(M+H)+
實施例47：藥物3
Figure 107134301-A0305-02-0364-198
步驟1：[4-(苄基)-5-甲氧基-2-硝基苯基][(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]甲酮
於0℃下向實施例37步驟1中獲得之化合物(6.49g，14.7mmol)之四氫呋喃(147mL)溶液中添加硼氫化鋰(0.642g，29.5mmol)，於室溫下攪拌2小時。於反應溶液中添加1當量濃度鹽酸，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水洗淨所獲得之有機層，利用硫酸鎂加以乾燥後，於減壓下蒸餾去除。所獲得之殘渣(6.94g，定量)不進行純化而於下一步驟中使用。
MS(APCI,ESI)m/z：413(M+H)+
步驟2：(6S)-5-[4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲醯基]-5-氮螺[2.4]庚烷-6-甲醛
使上述步驟1中獲得之化合物(4.50g，11.0mmol)以與實施例1步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(1.94g，43%)。
MS(APCI,ESI)m/z：411(M+H)+
步驟3：(11a'S)-8'-羥基-7'-甲氧基-1',10',11',11a'-四氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
於氮氣環境下向上述步驟2中獲得之化合物(1.94g，4.73mmol)之四氫呋喃(25mL)、乙酸乙酯(25mL)、甲醇(25mL)之混合溶液中添加5%鈀碳(54%水分，1.0g)後，於氫氣環境、室溫下將反應溶液攪拌22小時。將反應溶液進行矽藻土過濾後，於減壓下對濾液進行蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法[己烷：乙酸乙酯=80：20(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(1.20g，93%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.55(1H,s),6.16(1H,s),5.86(1H,s),4.08-4.02(2H,m),3.86(3H,s),3.72-3.69(1H,m),3.57-3.37(3H,m),2.04-2.01(1H,m),1.78-1.75(1H,m),0.79-0.53(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：275(M+H)+
步驟4：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使實施例45步驟3中獲得之化合物(0.300g，0.614mmol)以與實施例3步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.388g，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.24(1H,s),6.60(1H,s),6.02-5.98(1H,m),5.80-5.75(1H,m),5.11-5.06(2H,m),4.68-4.64(1H,m),4.40-4.38(1H,m),4.02-3.98(2H,m),3.92(3H,s),3.72-3.69(1H,m),3.54-3.52(1H,m),3.46-3.41(2H,m),3.29-3.26(1H,m),2.38-2.34(1H,m),1.94-1.87(4H,m),1.65-1.62(2H,m),1.55-1.55(1H,m),0.86(9H,s),0.75-0.67(4H,m),0.24-0.22(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：639[81Br,(M+H)+],637[79Br,(M+H)+].
步驟5：(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'- 甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟4中獲得之化合物(0.203g，0.318mmol)與上述步驟3中獲得之化合物(0.131g，0.478mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0880g，33%)。
MS(APCI,ESI)m/z：831(M+H)+
步驟6：(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',10',11',11a'-四氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟5中獲得之化合物(0.0880g，0.106mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0500g，66%)。
MS(APCI,ESI)m/z：717(M+H)+
步驟7：(11a'S)-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-側氧基-5',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-1',10',11',11a'-四氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟6中獲得之化合物(0.0500g，0.0698mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0330g，77%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.80(1H,m),7.58(1H,s),7.52(1H,s),6.81(1H,s),6.05(1H,s),4.17-3.97(5H,m),3.94(3H,s),3.87(1H,m),3.84 (3H,s),3.72-3.68(3H,m),3.51-3.45(5H,m),2.54-2.51(1H,m),2.03-1.90(6H,m),1.75-1.68(2H,m),0.66(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：615(M+H)+
實施例48：藥物4
Figure 107134301-A0305-02-0367-199
步驟1：化合物48-1
使實施例39步驟4中獲得之化合物(0.165g，0.313mmol)以與實施例45步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.270g，92%)。
MS(APCI,ESI)m/z：935(M+H)+.
步驟2：化合物48-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.270g，0.289mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.208g，88%)。
MS(APCI,ESI)m/z：821(M+H)+.
步驟3：(11a'S)-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-5-側氧基-2-苯基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟2中獲得之化合物(0.208g，0.253mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.130g，80%)。
MS(APCI,ESI)m/z：635(M+H)+.
實施例49：藥物5
Figure 107134301-A0305-02-0368-200
步驟1：化合物49-1
使用化合物4-1(8.52g，13.2mmol)與實施例37步驟4中獲得之化合物37-5(6.09g，14.5mmol)，以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標物(10.7g，83%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.36(1H,s),7.34(1H,s),7.26(1H,s),7.23(1H,s),5.53-5.46(2H,m),4.72-4.69(2H,m),4.59-4.55(1H,m),4.28-4.20(6H,m),3.90-3.89(6H,m),3.80-3.63(6H,m),3.57-3.54(1H,m),3.42-3.39(1H,m),2.87-2.82(1H,m),2.47-2.40(3H,m),2.24-2.20(1H,m),2.04-1.99(1H,m),0.99-0.95(4H,m),0.87(9H,s),0.70-0.63(4H,m),0.09(6H,s),0.02-0.00(18H,m).
步驟2：化合物49-2
使上述步驟1中獲得之化合物(10.7g，10.9mmol)以與實施例3步驟3同樣之方式進行反應，而獲得目標物(9.45g，100%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.36-7.34(2H,m),7.26(1H,s),7.23(1H,s),5.53-5.47(2H,m),4.72-4.64(3H,m),4.30-4.20(6H,m),3.89(6H,s),3.85-3.62(7H,m),3.42-3.39(1H,m),2.99-2.93(1H,m),2.47-2.39(3H, m),2.25-2.07(3H,m),0.99-0.95(4H,m),0.89-0.86(1H,m),0.70-0.64(3H,m),0.02-0.00(18H,m).
步驟3：化合物49-3
使上述步驟2中獲得之化合物(9.45g，10.9mmol)以與實施例3步驟4同樣之方式進行反應，而獲得目標物(9.14g，97%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.37(1H,s),7.33(1H,s),7.27-7.26(2H,m),5.54-5.51(2H,m),4.77-4.70(2H,m),4.64-4.61(1H,m),4.31-4.20(6H,m),3.91(3H,s),3.90(3H,s),3.80-3.65(6H,m),3.60-3.55(1H,m),3.42-3.39(1H,m),2.83-2.75(1H,m),2.47-2.41(3H,m),2.25-2.20(1H,m),1.00-0.95(4H,m),0.92-0.85(1H,m),0.71-0.63(3H,m),0.02-0.01(18H,m).
步驟4：化合物49-4
使上述步驟3中獲得之化合物(4.27g，4.94mmol)以與實施例3步驟5同樣之方式進行反應，而獲得目標物(3.16g，64%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.37(1H,s),7.32(1H,s),7.27-7.25(2H,m),7.15-7.14(1H,m),5.53-5.50(2H,m),4.77-4.70(2H,m),4.64-4.60(1H,m),4.30-4.20(6H,m),3.90(6H,s),3.81-3.66(4H,m),3.42-3.39(1H,m),3.18-3.13(1H,m),2.47-2.41(3H,m),2.25-2.20(1H,m),0.99-0.94(4H,m),0.89-0.86(1H,m),0.69-0.64(3H,m),0.02-0.00(18H,m).
步驟5：化合物49-5
使上述步驟4中獲得之化合物(1.00g，1.00mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.900g，94%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.69-7.65(1H,m),7.57-7.53(1H,m),7.49- 7.45(1H,m),7.39-7.36(4H,m),7.33(1H,s),7.27(1H,s),6.90-6.88(2H,m),5.53-5.50(2H,m),4.77-4.71(2H,m),4.62-4.59(1H,m),4.30-4.20(5H,m),3.91(3H,s),3.91(3H,s),3.82(3H,s),3.80-3.65(4H,m),3.42-3.39(1H,m),3.16-3.10(1H,m),2.47-2.41(3H,m),2.25-2.20(1H,m),1.00-0.96(4H,m),0.89-0.85(1H,m),0.70-0.63(3H,m),0.02-0.01(18H,m).
步驟6：(11a'S)-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
於0℃下向上述步驟5中獲得之化合物(0.900g，0.942mmol)之THF(30mL)、乙醇(3mL)溶液中緩慢添加硼氫化鋰(0.456g，18.8mmol)。於室溫下將反應混合物攪拌1.5小時後，於反應混合物中添加水並遽烈攪拌。利用氯仿萃取反應混合物。於減壓下對有機層進行蒸餾去除，將所獲得之殘渣溶解於二氯甲烷(10mL)、乙醇(20mL)、水(5mL)中。於反應混合物中添加矽膠(15.0g)，於氮氣環境下攪拌3天。過濾反應混合物，利用飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下蒸餾去除，藉由矽膠管柱層析法[氯仿：甲醇=100：0(v/v)~92：8(v/v)]純化所獲得之殘渣，而獲得目標物(0.308g，49%)。
MS(APCI,ESI)m/z：663(M+H)+
實施例50：藥物6
[化174]
Figure 107134301-A0305-02-0371-201
步驟1：{1,5-戊二基雙[氧基(6-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基苯-3,1-二基)]}雙胺基甲酸二-2-丙烯-1-基酯
將實施例15步驟5中獲得之雙烯丙氧基羰基體15-6(0.460g，0.508mmol)溶解於甲醇(10mL)中後，添加碳酸鉀(351mg，2.54mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。添加飽和氯化銨水溶液50mL，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鈉乾燥有機層。於減壓下蒸餾去除，而獲得目標物(0.421g，定量)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.19(2H,s),7.22(2H,s),6.89(2H,s),5.97-5.92(2H,m),5.33(2H,m),5.22(2H,m),4.81(2H,m),4.55(4H,m),4.26(2H,s),3.96(4H,m),3.74(6H,s),3.62(2H,m),3.56(2H,s),3.37(2H,m),3.11(2H,m),1.88-1.78(8H,m),1.56-1.54(2H,m),0.54-0.43(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：821(M+H)+.
步驟2：(11a'S,11a''''S)-8',8"-[戊烷-1,5-二基雙(氧基)]雙(11'-羥基-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸)二丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟1中獲得之化合物(0.421g，0.513mmol)以與實施例15步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.326g，78%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.07(2H,s),6.80(2H,s),6.55(2H,m), 5.84-5.81(2H,m),5.75(2H,m),5.09-5.05(4H,m),4.62(2H,mz),4.40(2H,m),3.98(4H,m),3.81(6H,s),3.54(2H,m),3.43-3.37(2H,m),3.14(2H,m),2.35(2H,m),1.81-1.79(4H,m),1.59-1.56(4H,m),0.70-0.59(8H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：817(M+H)+.
步驟3：(11a'S,11a''''S)-8',8"-[1,5-戊二基雙(氧基)]雙(7'-甲氧基-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮)
使上述步驟2中獲得之化合物(0.326g，0.399mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.208g，85%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：7.91(2H,m),7.32(2H,s),6.84(2H,s),4.11(2H,m),4.06(2H,m),3.82(6H,s),3.51-3.31(6H,m),2.43(2H,m),2.05(2H,m),1.82-1.80(4H,m),1.60-1.58(2H,m),0.79-0.77(2H,m),0.68-0.64(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：613(M+H)+.
實施例51：藥物7
Figure 107134301-A0305-02-0372-202
步驟1：化合物51-1
使化合物46-2(0.0870g，0.0863mmol)以與實施例27步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0660mg，79%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.50(1H,s),7.36-7.34(4H,m),7.27-7.24(2H,m),6.80(1H,s),6.64(1H,s),6.03(1H,m),5.80-5.74(2H,m),5.10-5.06(3H,m),4.70(2H,m),4.67-4.60(2H,m),4.41-4.37(3H,m),4.23-4.20(6H,m),3.90(3H,s),3.89(3H,s),3.72(1H,m),3.65-3.62(1H,m),3.51(1H,m),3.34-3.26(2H,m),2.75-2.71(1H,m),2.39-2.35(3H,m),1.74(1H,m),1.56-1.52(1H,m),0.85(9H,s),0.80-0.62(4H,m),0.22(3H,s),0.21(3H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：965(M+H)+.
步驟2：化合物51-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.0660g，0.0683mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0590g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：851(M+H)+.
步驟3：(11a'S)-8'-[3-({(11aS)-2-[4-(羥基甲基)苯基]-7-甲氧基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-7'-甲氧基-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟2中獲得之化合物(0.0590g，0.0693mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.0290g，63%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.80-7.79(1H,m),7.64-7.64(1H,m),7.52-7.51(2H,m),7.36-7.33(4H,m),6.85(1H,m),6.14(1H,m),4.69(2H,m),4.30-4.26(6H,m),3.95-3.95(3H,m),3.86-3.84(3H,m),3.67(1H,m),3.56-3.54(2H,m),3.50-3.48(2H,m),3.39-3.30(1H,m),2.80-2.73(1H,m),2.52(1H,m),2.41-2.39(2H,m),2.00(1H,m),1.73-1.72(1H, m),0.76-0.70(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：665(M+H)+.
實施例52：藥物8
Figure 107134301-A0305-02-0374-203
步驟1：(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-10-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-8-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮
使實施例42步驟4中獲得之化合物(0.519g，0.747mmol)以與實施例3步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.511g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.41-7.31(5H,m),6.91-6.85(2H,m),5.52(1H,m),4.64(1H,m),4.57(1H,m),3.97-3.90(1H,m),3.88(3H,s),3.83(3H,s),3.75-3.56(2H,m),3.19-3.09(1H,m),1.36-1.23(3H,m),1.11(18H,m),1.02-0.97(2H,m),0.03(9H,s).
MS(APCI,ESI)m/z：653[(M+H)+]
步驟2：(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-8-{[三(丙烷- 2-基)矽烷基]氧基}-1,11a-二氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮
使上述步驟1中獲得之化合物(0.178g，0.272mmol)以與實施例3步驟7同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.094g，68%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.87(1H,m),7.51(1H,s),7.41-7.39(1H,m),7.36-7.33(2H,m),6.93-6.89(2H,m),6.86(1H,s),4.44-4.38(1H,m),3.90(3H,s),3.83(3H,s),3.61-3.53(1H,m),3.41-3.34(1H,m),1.33-1.25(3H,m),1.11-1.06(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：507(M+H)+
步驟3：(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-8-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-1,10,11,11a-四氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮
使用上述步驟2中獲得之化合物(0.063g，0.124mmol)，以與實施例3步驟8同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.046g，72%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.53-7.48(2H,m),7.33-7.29(2H,m),6.90-6.86(2H,m),6.13-6.11(1H,m),4.36-4.29(1H,m),4.11(1H,s),3.82(3H,s),3.79(3H,s),3.59-3.50(2H,m),3.40-3.31(1H,m),2.78-2.68(1H,m),1.31-1.20(3H,m),1.13-1.02(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：509(M+H)+
步驟4：丙-2-烯-1-基(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-8-{[三(丙烷-2-基)矽烷基]氧基}-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-羧酸酯
使用上述步驟3中獲得之化合物(0.046g，0.090mmol)，以與實施例3步驟9同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.03g，56%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.39-7.36(1H,m),7.31-7.28(2H,m),7.22(1H,s),6.90-6.86(3H,m),6.75-6.72(1H,m),5.82-5.69(1H,m),5.18-5.08(2H,m),4.59-4.52(1H,m),4.48-4.39(1H,m),4.39-4.29(1H,m),4.23-4.12(1H,m),3.86(3H,s),3.82(3H,s),3.64-3.58(1H,m),3.32-3.25(1H,m),2.73-2.65(1H,m),1.30-1.20(2H,m),1.12-1.06(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：593(M+H)+
步驟5：(11aS)-8-羥基-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟4中獲得之化合物(0.030g，0.050mmol)以與實施例1步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.015g，0.034mmol)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.39-7.25(4H,m),6.92-6.78(3H,m),6.03-5.92(1H,m),5.86-5.68(1H,m),5.20-5.07(2H,m),4.66-4.57(1H,m),4.52-4.40(1H,m),4.40-4.27(1H,m),4.27-4.16(1H,m),3.95(3H,s),3.82(3H,s),3.66-3.59(1H,m),3.32-3.21(1H,m),2.74-2.64(1H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：437(M+H)+
步驟6：(11a'S)-8'-(3-溴丙氧基)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使實施例45步驟5中獲得之化合物(0.131g，0.268mmol)以與實施例4步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.086g，52%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.24(1H,s),6.65(1H,s),6.02(1H,m),5.87-5.71(1H,m),5.15-5.04(2H,m),4.72-4.62(1H,m),4.44-4.32(1H,m), 4.23-4.07(3H,m),3.92(3H,s),3.77-3.47(4H,m),3.28(1H,m),2.37(3H,m),1.57-1.52(1H,m),0.86(9H,s),0.82-0.57(4H,m),0.21(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：611[81Br,(M+H)+],609[79Br,(M+H)+]
步驟7：(11a'S)-11'-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟5中獲得之化合物(0.015g，0.034mmol)與上述步驟6中獲得之化合物(0.030g，0.048mmol)以與實施例3步驟10同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.032g，96%)。
MS(APCI,ESI)m/z：965(M+H)+
步驟8：(11a'S)-11'-羥基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)丙氧基]-5'-側氧基-11',11a'-二氫-1'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10'(5'H)-羧酸丙-2-烯-1-基酯
使上述步驟7中獲得之化合物(0.031g，0.032mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.026g，95%)。
MS(APCI,ESI)m/z：851(M+H)+
步驟9：(11a'S)-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯- 8-基]氧基}丙氧基)-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟8中獲得之化合物(0.026g，0.030mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.018g，88%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.80(1H,m),7.54-7.51(3H,m),7.33-7.29(2H,m),6.91-6.85(3H,m),6.14(1H,s),4.35-4.17(6H,m),3.95(3H,s),3.85(3H,s),3.82(3H,s),3.76-3.25(5H,m),2.79-2.69(1H,m),2.52(1H,m),2.45-2.35(1H,m),2.03-1.96(1H,m),1.28-1.23(2H,m),0.78-0.69(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：665(M+H)+
實施例53：藥物9
Figure 107134301-A0305-02-0378-204
步驟1：化合物53-1
使實施例43步驟4中獲得之化合物(0.027g，0.048mmol)以與實施例45步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.037g，79%)。
MS(APCI,ESI)m/z：965(M+H)+
步驟2：化合物53-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.037g，0.038mmol)以與實施例3步 驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(35mg，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：851[(M+H)+]
步驟3：(11a'S)-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟2中獲得之化合物(0.038mmol)以與實施例45步驟6~8同樣之方式進行反應，而獲得目標物(25mg，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.81-7.78(1H,m),7.65-7.62(1H,m),7.53-7.49(2H,m),7.24(1H,m),6.96(1H,m),6.91-6.88(1H,m),6.85(1H,m),6.78(1H,m),6.14(1H,m),4.41-4.18(5H,m),3.97-3.92(3H,m),3.88-3.84(3H,m),3.83(3H,s),3.76-3.25(5H,m),2.78-2.71(1H,m),2.52(1H,m),2.45-2.35(2H,m),2.03-1.96(1H,m),1.29-1.21(2H,m),0.78-0.69(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：664(M+H)+
實施例54：藥物10
Figure 107134301-A0305-02-0379-205
步驟1：化合物54-1
使實施例44步驟4中獲得之化合物(0.027g，0.046mmol)以與實施例45步驟6同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.037g，81%)。
MS(APCI,ESI)m/z：995(M+H)+
步驟2：化合物54-2
使上述步驟1中獲得之化合物(0.037g，0.037mmol)以與實施例3步驟11同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.034g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z：881(M+H)+
步驟3：(11a'S)-8'-(3-{[(11aS)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-7'-甲氧基-1',11a'-二氫-5'H-螺[環丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5'-酮
使上述步驟2中獲得之化合物(0.037mmol)以與實施例3步驟12同樣之方式進行反應，而獲得目標物(0.027g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.81-7.78(1H,m),7.55-7.49(3H,m),6.99-6.96(1H,m),6.87-6.82(3H,m),6.14(1H,m),4.41-3.28(22H,m),2.77-2.71(1H,m),2.57-2.48(1H,m),2.45-2.34(2H,m),2.04-1.96(1H,m),1.43-1.11(2H,m),0.79-0.67(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：695(M+H)+
[糖鏈供體之合成]
實施例55：[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox
[化179]
Figure 107134301-A0305-02-0381-206
(於上述圖中，結構式右側之模式圖表示實施例58之反應式所表示之具有導入有疊氮基之連結基結構的中間物之模式圖中之對應結構)
步驟1：[N3-PEG(3)]2-SG(10)
於5ml取樣管(INA‧OPTIKA股份有限公司)中添加11-疊氮基-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(0.096mL，0.485mmol)、二唾液酸八糖(50mg，0.24mmol)之水溶液(0.5mL)並攪拌1小時後進行冷凍乾燥。於冷凍乾燥後之5ml取樣管中添加O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(92mg，0.24mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.6mL)與二異丙基乙基胺(0.042mL，0.24mmol)，並於37℃下攪拌4小時。反應結束後，將反應液轉移至預先添加有二乙醚(20ml)之離心管(50ml)中。利用小型離心機(日立工機，CF16RX)，使固形物沈澱，去除上清液。添加二乙醚(20ml)，進行傾析。繼而，添加乙腈(20mL)並進行傾析後，於減壓下加以乾燥，而獲得粗產物。將所獲得之固形物溶解於適量之0.2%三氟乙酸水溶液中，進行逆相HPLC分離純化。以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science製造)。將溶出 中經UV檢測(220nm)出之含有目標物之溶出分彙總為一體，加以冷凍乾燥而獲得目標物(42mg)。
步驟2：[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox
於5mL取樣管(INA‧OPTIKA股份有限公司製造)中添加上述步驟1中合成之化合物(40mg)、2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓鹽酸鹽(伏見製藥所製造，17.9mg，0.083mmol)之水溶液(200μl)。於冰浴冷卻後之反應液中添加磷酸三鉀(52.6mg，0.25mmol)之水溶液(200μl)，於冰浴冷卻下攪拌2小時。使用Amicon Ultra(ULTRAcel 30K，Merck Millipore製造)將所獲得之反應液進行超過濾，而將固形物去除。藉由凝膠過濾層析法純化該通過液。裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製造)，管柱使用HiPrep 26/10 Desalting(GE Healthcare製造)，流動相使用0.03%-NH3水溶液，將流速設為10mL/min，將區分容量設為10mL。將溶出中經UV檢測(220nm)出之含有目標物之溶出分彙總為一體，添加1N氫氧化鈉水溶液(33μl，0.033mmol)並進行冷凍乾燥，而獲得目標物(34mg)。
實施例56：[N3-PEG(3)]-MSG1-Ox
Figure 107134301-A0305-02-0382-207
(於上述圖中，結構式右側之模式圖表示實施例60、61、62、63、64、65、66之反應式所表示之具有導入有疊氮基之連結基結構的中間物之模式圖中之對應結構)
步驟1：(MSG1-)Asn
於以下之條件下將作為市售品之monosialo-Asn free(1S2G/1G2S-10NC-Asn，糖鏈工學研究所股份有限公司製造)(稱為「(MSG-)Asn」)(500mg)進行逆相HPLC分離純化，分離為作為第一主峰(1st main peak)溶出之(MSG1-)Asn(保持時間15~19min左右)與作為第二主峰(2nd main peak)溶出之(MSG2-)Asn(保持時間21~26min左右)。使用0.1%甲酸水溶液作為溶離液，裝置使用ELS-PDA觸發分取系統(日本分光股份有限公司製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(10μm，30Φ×250mm，GL Science公司製造)，將流速設為30mL/min。將歸屬於溶出中經UV檢測(210nm)出之最初之峰值的溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥而獲得目標物(238mg)。
步驟2：MSG1
將上述步驟1中獲得之化合物(229mg)溶解於200mM磷酸緩衝溶液(pH值6.25)(1145μL)中，添加EndoM(東京化成工業股份有限公司製造，1U/mL)水溶液(100μL)，於35℃下保溫6天。反應結束後，使用VIVASPIN 15R(Hydrosart膜，30K，6,000g)將反應液進行超過濾，將所獲得之通過液進行逆相HPLC分離純化。使用0.1%三氟乙酸水溶液作為溶離液，裝置使用ELS-PDA觸發分取系統(日本分光股份有限公司製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science公司製造)。將含有溶出中經UV檢測(210nm)出之目標物之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥，而獲得目標物 (117mg)。
步驟3：[N3-PEG(3)]-MSG1
使上述步驟2中合成之化合物(169mg)以與實施例55步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標物(94.2mg)。
步驟4[N3-PEG(3)]-MSG1-Ox
使上述步驟3中合成之化合物(100mg)以與實施例55步驟2同樣之方式進行反應，而獲得目標物(89mg)。
實施例57：[N3-PEG(3)]-MSG-Ox
Figure 107134301-A0305-02-0384-208
(於上述圖中，結構式右側之模式圖表示實施例59之反應式所表示之具有導入有疊氮基之連結基結構的中間物之模式圖中之對應結構)
步驟1：(MSG-)Asn之製備
將作為市售品之1S2G/1G2S-10NC-Asn-Fmoc(糖鏈工學研究所股份有限公司製造)(稱為「Fmoc-(MSG-)Asn」)(1000mg)溶解於乙醇/水(1/1)(10mL)中，添加1當量濃度之氫氧化鈉水溶液(1.75mL，4當量)，於室溫下攪拌3小時。反應結束後，使用Amicon Ultra(30K，Millipore公司製造)將反應液進行超過濾，去除固形物，於所獲得之通過液中添加1N鹽酸(832μl，1.9當量)。使用高速濃縮裝置V-10(Biotage公司製造)將溶劑去除。添加乙腈，使用高速濃縮裝置V-10(Biotage公司製造)去除溶劑後，進行逆相HPLC分離純化。以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science製造)。將溶出中經UV檢測(220nm)出之含有目標物之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥。若將其再次溶解於純水中，則利用pH值試紙確認為酸性，因此添加18%氨水(150μl)，利用pH值試紙確認成為鹼性，再次進行冷凍乾燥。將所獲得之目標物(840mg)直接用於下一反應。
步驟2：MSG之合成
將步驟1中獲得之化合物(840mg)溶解於200mM磷酸緩衝溶液(pH值6.25)(6000μL)中，添加EndoM(東京化成工業股份有限公司製造，1U/mL)水溶液(200μL)，於28℃下保溫26小時。由於反應未結束，故而添加EndoM(東京化成工業股份有限公司製造，1U/mL)水溶液(50μL)，於28℃下保溫2小時後，於室溫下放置直至反應結束。反應結束後，使用Amicon Ultra(30K，Millipore公司製造)將反應液進行超過濾。於所獲得之通過液中添加三氟乙酸(80μl)，進行逆相HPLC分離純化。以0.1%三氟 乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science製造)。將溶出中經UV檢測(220nm)出之含有目標物之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥。為了去除殘留三氟乙酸而再次溶解於純水中，而以無色固體之形式獲得目標化合物(618mg)。
ESI-MS：C66H110N4O49：[M+H]+理論值1743.62，實際值1743.63
步驟3：[N3-PEG(3)]-MSG之合成
使用上述步驟2中獲得之化合物(120mg)，依照與實施例55步驟1同樣之方法，而獲得目標物(88.6mg)。
ESI-MS：C73H124N8O51：[M+2H]2+理論值965.37，實際值965.37
步驟4[N3-PEG(3)]-MSG-Ox之合成
使用上述步驟4中獲得之化合物(100mg)，依照與實施例55步驟2同樣之方法，而獲得目標物(88mg)。
[糖鏈重建抗體之製備]
實施例58：糖鏈轉換1(T-SG)
Figure 107134301-A0305-02-0386-209
(上述式表示於SG型N297糖鏈之非還原末端唾液酸中導入疊氮基而 成之連結基結構。於實施例58中，於N297糖鏈中導入有疊氮基之中間物之連結基結構全部為與上述式相同之結構)
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗之製備
對於參考例3中製備之曲妥珠單抗溶液22mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH值6.0)，5%山梨糖醇溶液)(45.5mL)，利用共通操作C，分兩次進行與50mM磷酸緩衝液(pH值6.0)之緩衝液交換。於所獲得之28.1mg/mL之曲妥珠單抗溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(18mL)與28.0mg/mL之相同溶液(18mL)中分別添加2.0mg/mL野生型EndoS溶液(PBS)1.26mL、1.27mL，於37℃下保溫4小時。使用Experion電泳工作站(BIO-RAD製造)確認反應之進行情況。反應結束後，依照以下之方法，進行利用親和層析法之純化及利用羥磷灰石管柱之純化。
(1)利用親和層析法之純化
純化裝置：AKTA pure150(GE Healthcare製造)
管柱：HiTrap rProtein A FF(5mL)(GE Healthcare製造)
流速：5mL/min(充電(charge)時為1.25mL/min)
分複數次純化上述中獲得之反應液。管柱連結2根，與管柱結合時將反應液向管柱上部添加，以1.25mL/min流通結合緩衝液(20mM磷酸緩衝液(pH值6.0))2CV，進而以5mL/min流通5CV。中間洗淨時流通洗淨溶液(20mM磷酸緩衝液(pH值7.0)、0.5M氯化鈉溶液)15CV。溶出時流通溶出緩衝液(ImmunoPure IgG Eution buffer，PIERCE製造)6CV。立即利用1M三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值9.0)中和溶出液。關於溶出中經UV檢測(280nm)出之溶出分，使用微量分光光度計Xpose(Trinean製造)、及Experion電泳工作站(BIO-RAD製造)進行確認。對於含有目標物 之溶出分，利用共通操作C，進行與5mM磷酸緩衝液50mM 2-
Figure 107134301-A0305-02-0388-356
啉基乙磺酸(MES)溶液(pH值6.8)之緩衝液交換。
(2)利用羥磷灰石層析法之純化
純化裝置：AKTA avant25(GE Healthcare製造)
管柱：Bio-Scale Mini CHT Type I筒(5mL)(BIO-RAD製造)
流速：5mL/min(充電時為1.25mL/min)
連結2根管柱，分複數次純化上述(1)中獲得之溶液。將溶液向管柱之上部添加，以1.25mL/min流通A液(5mM磷酸緩衝液，50mM 2-
Figure 107134301-A0305-02-0388-357
啉基乙磺酸(MES)溶液(pH值6.8))2CV，進而以5mL/min流通3CV。其後，使用A液與B液(5mM磷酸緩衝液50mM 2-
Figure 107134301-A0305-02-0388-358
啉基乙磺酸(MES)溶液(pH值6.8)，2M氯化鈉溶液)進行溶出。溶出條件為A液：B液=100：0~0：100(15CV)。進而，流通洗淨溶液(500mM磷酸緩衝液(pH值6.5))5CV。
對於含有目標物之溶出分，利用共通操作C進行緩衝液交換，而獲得25.5mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(35mL)。
步驟2：曲妥珠單抗[SG-(N3)2]2之製備
於上述步驟1中獲得之23.9mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(3.37mL)中添加實施例55步驟2中合成之化合物(12.9mg)之50mM磷酸緩衝液(pH值6.0)溶液(0.258mL)、4.90mg/mL之EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(0.328mL)，於30℃下保溫4.5小時。將以上之操作進行2組。使用Experion電泳工作站(BIO-RAD製造)確認反應之進行情況。反應結束後，與上述步驟1同樣地進行利用親和層 析法之純化與利用羥磷灰石層析法之純化後，對於含有目標物之溶出分，利用共通操作C與磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)進行緩衝液交換，而獲得10.0mg/mL之曲妥珠單抗[SG-(N3)2]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(15.5mL)。
實施例59：糖鏈轉換2(T-MSG)
Figure 107134301-A0305-02-0389-210
(上述式表示於MSG型N297糖鏈之非還原末端唾液酸中導入疊氮基而成之連結基結構。於實施例59中，於N297糖鏈中導入有疊氮基之中間物之連結基結構全部為與上述式相同之結構)
步驟1：曲妥珠單抗[MSG-N3]2
將以下之操作進行5組。使用實施例58步驟1中獲得之化合物(20mg/mL，15.0mL)，使用實施例57步驟4中獲得之化合物(25.5mg)作為糖鏈供與體，於30℃下保溫3小時，進行與實施例59步驟2同樣之操作。合併5組而獲得14.4mg/mL曲妥珠單抗[MSG-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(93.5mL)。
實施例60：糖鏈轉換3(T-MSG1)
[化184]
Figure 107134301-A0305-02-0390-211
(上述式表示於MSG1型N297糖鏈之非還原末端唾液酸中導入疊氮基而成之連結基結構。於實施例60中，於N297糖鏈中導入有疊氮基之中間物之連結基結構全部為與上述式相同之結構。實施例61-66亦相同)
步驟1：曲妥珠單抗[MSG1-N3]2
將以下之操作進行2組。使用實施例58步驟1中獲得之化合物(25.5mL，7.8mL)，使用實施例56步驟4中獲得之化合物(25.5mg)作為糖鏈供與體，於30℃下保溫3小時，進行與實施例59步驟2相同之操作。合併2組而獲得10.6mg/mL曲妥珠單抗[MSG1-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(31mL)。
實施例61：糖鏈轉換4(CLDN6-MSG1(H1L1))
Figure 107134301-A0305-02-0390-212
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L1)
使用實施例136中製備之抗CLDN6抗體溶液ca.37.7mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH值6.0)，5%山梨糖醇溶液)(2.5mL)，進行與實施例58步驟1相同之操作，而獲得19.2mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L1)溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(4.8mL)。
步驟2：抗CLDN6抗體(H1L1)-[MSG1-N3]2
使用上述步驟1中獲得之19.2mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6(H1L1)抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(4.8mL)，進行與實施例60步驟1相同之操作，藉此獲得10.2mg/mL抗CLDN6抗體(H1L1)-[MSG1-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(7.2mL)。
實施例62：糖鏈轉換5(CLDN6-MSG1(H2L2))
Figure 107134301-A0305-02-0391-213
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H2L2)
使用實施例136中製備之抗CLDN6抗體溶液ca.20mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH值6.0)，5%山梨糖醇溶液)(6mL)，進行與實施例58步驟1相同之操作，而獲得21.84mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H2L2)溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(5.7mL)。
步驟2：抗CLDN6抗體(H2L2)-[MSG1-N3]2
使用上述步驟1中獲得之21.8mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6(H2L2)抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(5.7mL)，進行與實施例60步驟1相同之操作，藉此獲得10.2mg/mL抗CLDN6抗體(H2L2)-[MSG1-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(11.1mL)。
實施例63：糖鏈轉換6(CLDN6-MSG1(H1L3))
Figure 107134301-A0305-02-0392-214
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L3)
使用實施例136中製備之抗CLDN6抗體溶液ca.39.4mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH值6.0)，5%山梨糖醇溶液)(3mL)，進行與實施例58步驟1相同之操作，而獲得39.2mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L3)溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(4.5mL)。
步驟2：抗CLDN6抗體(H1L3)-[MSG1-N3]2
使用上述步驟1中獲得之39.2mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6(H1L3)抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(4.5mL)，進行與實施例60步驟1相同之操作，藉此獲得9.83mg/mL抗CLDN6抗體(H1L3)-[MSG1-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(7.2mL)。
實施例64：糖鏈轉換7(CD98-MSG1)
Figure 107134301-A0305-02-0393-215
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗CD98抗體
使用參考例6中製備之抗CD98抗體溶液ca.20mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH值6.0)，5%山梨糖醇溶液)(6mL)，進行與實施例58步驟1相同之操作，而獲得21.7mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗CD98抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(4.7mL)。
步驟2：抗CD98抗體-[MSG1-N3]2
使用上述步驟1中獲得之21.7mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗CD98抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(4.7mL)，進行與實施例60步驟1相同之操作，藉此獲得10.1mg/mL之抗CD98抗體-[MSG1-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(7.6mL)。
實施例65：糖鏈轉換8(TROP2-MSG1)
[化189]
Figure 107134301-A0305-02-0394-216
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗Trop2抗體
使用參考例5中製備之抗Trop2抗體溶液ca.20mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH值6.0)，5%山梨糖醇溶液)(6mL)，進行與實施例58步驟1相同之操作，而獲得21.69mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗Trop2抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(3.3mL)。
步驟2：抗Trop2抗體-[MSG1-N3]2
使用上述步驟1中獲得之21.69mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗Trop2抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(3.35mL)，進行與實施例60步驟1相同之操作，藉此獲得10.3mg/mL之抗Trop2抗體-[MSG1-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(6.4mL)。
實施例66：糖鏈轉換9(LPS-MSG1)
[化190]
Figure 107134301-A0305-02-0395-217
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗體
使用參考例4中製備之抗LPS抗體溶液ca.17mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH值6.0)，5%山梨糖醇溶液)(6.6mL)，進行與實施例58步驟1相同之操作，而獲得21.03mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(5.4mL)。
步驟2：抗LPS抗體-[MSG1-N3]2
使用上述步驟1中獲得之21.03mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(5.4mL)，進行與實施例60步驟1相同之操作，藉此獲得9.89mg/mL之抗LPS抗體-[MSG1-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(7.9mL)。
[ADC之合成]
實施例67~71、77~80、82~88、92~95、109~114、120所記載之ADC係如下述之反應式所示般，藉由將實施例59之步驟1中獲得之抗體與藥物連結基複合而合成。式中，R根據各實施例所使用之藥物連結基而有所不同。
[化191]
Figure 107134301-A0305-02-0396-218
實施例72、73、75、91所記載之ADC係如下述之反應式所示般，藉由將實施例58步驟2中獲得之抗體與藥物連結基複合而合成。式中，R根據各實施例所使用之藥物連結基而有所不同。
[化192]
Figure 107134301-A0305-02-0397-219
實施例74、81、89、90、96~105、115、118所記載之ADC係如下述之反應式所示般，藉由將實施例60步驟1中獲得之抗體與藥物連結基複合而合成。式中，R基根據各實施例所使用之藥物連結基而有所不同。
[化193]
Figure 107134301-A0305-02-0398-220
實施例67：ADC1
[化194]
Figure 107134301-A0305-02-0399-221
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例67步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例24步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液14.00mL。利用共通操作A將該溶液濃縮，而獲得含有目標化合物之溶液0.75mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：11.4mg/mL，抗體產量：8.56mg(86%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例68：ADC2
Figure 107134301-A0305-02-0400-223
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例68步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例25步驟14中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.48mg/mL，抗體產量：8.88mg(89%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例69：ADC3
Figure 107134301-A0305-02-0401-226
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例69步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例26步驟14中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化 合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.45mg/mL，抗體產量：8.67mg(89%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例70：ADC4
Figure 107134301-A0305-02-0402-227
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例70步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例27步驟1中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公 司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.30mg/mL，抗體產量：7.80mg(78%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例71：ADC5
Figure 107134301-A0305-02-0403-228
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例71步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施 例28步驟8中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.08mg/mL，抗體產量：6.48mg(65%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.6
實施例72：ADC6
Figure 107134301-A0305-02-0404-229
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例72步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例58步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.835mL)、含有實施例27步驟1中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.165mL，相對於抗體1分子為24當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液4.50mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.75mg/mL，抗體產量：7.86mg(79%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：3.8
實施例73：ADC7
Figure 107134301-A0305-02-0405-230
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例73步驟1中獲得之化 合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例58步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.835mL)、含有實施例4步驟12中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.165mL，相對於抗體1分子為24當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液4.50mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.66mg/mL，抗體產量：7.48mg(75%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：3.8
實施例74：ADC8
Figure 107134301-A0305-02-0406-231
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例74步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例29步驟14中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.36mg/mL，抗體產量：8.17mg(82%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例75：ADC9
[化202]
Figure 107134301-A0305-02-0408-232
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例75步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例58步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.835mL)、含有實施例9步驟9中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.165mL，相對於抗體1分子為24當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液8.50mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：0.86mg/mL，抗體產量：7.35mg(73%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：3.6
實施例76：ADC10
Figure 107134301-A0305-02-0409-234
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例76步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
如實施例106之反應式所示般，於室溫下向實施例61步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，0.400mL)中添加1,2-丙二醇(0.200mL)、含有實施例30步驟2中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0549mL，相對於抗體1分子為20當量)、及二甲基亞碸(0.145mL)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應72小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液2.50mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.19mg/mL，抗體產量：2.98mg(75%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例77：ADC11
Figure 107134301-A0305-02-0410-235
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例77步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(9.88mg/mL，0.500mL)中添加1,2-丙二醇(0.459mL)、含有實施例19步驟12中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0408mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，利用共通操作A將所獲得之溶液濃縮，而獲得含有目標化合物之溶液0.470mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：8.31mg/mL，抗體產量：3.90mg(79%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例78：ADC12
Figure 107134301-A0305-02-0411-238
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例78步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例20步驟8中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化後，利用共通操作A 將所獲得之溶液濃縮，而獲得含有目標化合物之溶液0.75mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：8.70mg/mL，抗體產量：6.94mg(69%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.7
實施例79：ADC13
Figure 107134301-A0305-02-0412-239
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例79步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例21步驟18中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公 司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：0.96mg/mL，抗體產量：5.77mg(58%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例80：ADC14
Figure 107134301-A0305-02-0413-240
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例80步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施 例22步驟12中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.28mg/mL，抗體產量：7.70mg(77%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例81：ADC15
Figure 107134301-A0305-02-0414-241
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例81步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例23步驟10中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.60mg/mL，抗體產量：9.60mg(96%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例82：ADC16
Figure 107134301-A0305-02-0415-242
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例82步驟1中獲得之化 合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(9.88mg/mL，0.500mL)中添加1,2-丙二醇(0.459mL)、含有實施例34步驟11中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0408mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應1天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液10.5mL。利用共通操作A將該溶液濃縮，而獲得含有目標化合物之溶液0.500mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：6.94mg/mL，抗體產量：3.47mg(70%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例83：ADC17
[化210]
Figure 107134301-A0305-02-0417-243
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例83步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(9.88mg/mL，0.500mL)中添加1,2-丙二醇(0.459mL)、含有實施例35步驟4中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0408mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應1天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，利用共通操作A將該溶液濃縮，而獲得含有目標化合物之溶液0.500mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：8.07mg/mL，抗體產量：4.03mg(82%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例84：ADC18
Figure 107134301-A0305-02-0418-244
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例86步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例36步驟7中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應1天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液14.0mL。利用共通操作A將該溶液濃縮，而獲得含有目標化合物之溶液0.700mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：12.9mg/mL，抗體產量：9.00mg(90%)，抗體每1分子 之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例85：ADC19
Figure 107134301-A0305-02-0419-245
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例85步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例37步驟12中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.33mg/mL，抗體產量：7.97mg(80%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例86：ADC20
Figure 107134301-A0305-02-0420-246
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例86步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例38步驟1中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.56mg/mL，抗體產量：9.37mg(94%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：2.0
實施例87：ADC21
Figure 107134301-A0305-02-0421-247
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例87步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例39步驟6中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公 司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.89mg/mL，抗體產量：11.4mg(定量)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例88：ADC22
Figure 107134301-A0305-02-0422-248
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例88中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施 例40步驟6中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.47mg/mL，抗體產量：8.84mg(88%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例89：ADC23
Figure 107134301-A0305-02-0423-249
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例89步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值 6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例37步驟12中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.46mg/mL，抗體產量：8.76mg(88%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例90：ADC24
Figure 107134301-A0305-02-0424-250
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例90步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例41步驟2中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.53mg/mL，抗體產量：9.17mg(92%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例91：ADC25
Figure 107134301-A0305-02-0425-251
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例91中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例58步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.835mL)、含有實施例37步驟12中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.165mL，相對於抗體1分子為24當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液10.5mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：0.73mg/mL，抗體產量：7.70mg(77%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：3.8
實施例92：ADC26
Figure 107134301-A0305-02-0426-252
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例92步驟1中獲得之化 合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(9.88mg/mL，0.500mL)中添加1,2-丙二醇(0.459mL)、含有實施例15步驟10中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0408mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應1天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。利用共通操作A將該溶液濃縮，而獲得含有目標化合物之溶液0.420mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：7.27mg/mL，抗體產量：3.54mg(72%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例93：ADC27
[化220]
Figure 107134301-A0305-02-0428-253
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例93步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(9.88mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例16步驟1中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應1天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液10.5mL。利用共通操作A將該溶液濃縮，而獲得含有目標化合物之溶液0.850mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：8.90mg/mL，抗體產量：7.56mg(77%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例94：ADC28
Figure 107134301-A0305-02-0429-254
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例94步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例17步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.24mg/mL，抗體產量：7.43mg(73%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.5
實施例95：ADC29
Figure 107134301-A0305-02-0430-255
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例95步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例18步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.29mg/mL，抗體產量：7.76mg(76%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例96：ADC30
Figure 107134301-A0305-02-0431-256
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例96步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，5.00mL)中添加1,2-丙二醇(4.59mL)、含有實施例4步驟12中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.413mL，相對於1 分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液30.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.30mg/mL，抗體產量：38.9mg(78%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例97：ADC31
Figure 107134301-A0305-02-0432-257
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例97步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值 6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例5步驟11中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.47mg/mL，抗體產量：8.82mg(88%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例98：ADC32
Figure 107134301-A0305-02-0433-260
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例98步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例6步驟1中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.35mg/mL，抗體產量：8.10mg(81%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例99：ADC33
Figure 107134301-A0305-02-0434-261
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例99步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例7步驟10中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.41mg/mL，抗體產量：8.44mg(84%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例100：ADC34
[化227]
Figure 107134301-A0305-02-0436-262
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例100步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例9步驟9中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.47mg/mL，抗體產量：8.79mg(88%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例101：ADC35
Figure 107134301-A0305-02-0437-263
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例101步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例10步驟14中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.67mg/mL，抗體產量：10.0mg(定量)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例102：ADC36
Figure 107134301-A0305-02-0438-264
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例103步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例11步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化 合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.40mg/mL，抗體產量：8.39mg(84%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例103：ADC37
Figure 107134301-A0305-02-0439-265
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例103步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例12步驟14中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公 司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.41mg/mL，抗體產量：8.49mg(85%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例104：ADC：38
Figure 107134301-A0305-02-0440-266
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例104步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例13步驟2中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於 1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.63mg/mL，抗體產量：9.80mg(98%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例105：ADC39
Figure 107134301-A0305-02-0441-267
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例105步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例14步驟1中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於 1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.72mg/mL，抗體產量：10.3mg(定量)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例106：ADC40
Figure 107134301-A0305-02-0442-268
Figure 107134301-A0305-02-0443-269
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例106步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例61步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，2.50mL)中添加1,2-丙二醇(2.29mL)、含有實施例3步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.206mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液14.5mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.54mg/mL，抗體產量：22.3mg(89%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例107：ADC41
Figure 107134301-A0305-02-0444-270
Figure 107134301-A0305-02-0445-271
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例107步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例62步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(9.96mg/mL，2.50mL)中添加1,2-丙二醇(2.29mL)、含有實施例3步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.206mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液14.5mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.52mg/mL，抗體產量：22.0mg(88%)，抗體每1分子 之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例108：ADC42
Figure 107134301-A0305-02-0446-273
Figure 107134301-A0305-02-0447-274
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例108步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例63步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(9.83mg/mL，2.50mL)中添加1,2-丙二醇(2.29mL)、含有實施例3步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.206mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液14.5mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.45mg/mL，抗體產量：21.0mg(84%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例109：ADC43
Figure 107134301-A0305-02-0448-275
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例109步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例42步驟16中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液3.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.30mg/mL，抗體產量：7.79mg(78%)，抗體每1分子 之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例110：ADC44
Figure 107134301-A0305-02-0449-276
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例110步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例43步驟8中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化 合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：0.93mg/mL，抗體產量：5.58mg(56%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例111：ADC45
Figure 107134301-A0305-02-0450-277
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例111步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例44步驟8中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於 1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.0mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：0.99mg/mL，抗體產量：5.95mg(59%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例112：ADC46
Figure 107134301-A0305-02-0451-278
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例112步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值 6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例31步驟8中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.49mg/mL，抗體產量：8.94mg(89%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例113：ADC47
Figure 107134301-A0305-02-0452-279
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例113步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例32步驟8中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.45mg/mL，抗體產量：8.73mg(87%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例114：ADC48
Figure 107134301-A0305-02-0453-280
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例114步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例33步驟8中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.45mg/mL，抗體產量：8.70mg(87%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例115：ADC49
[化242]
Figure 107134301-A0305-02-0455-281
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例115步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例3步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.41mg/mL，抗體產量：8.45mg(85%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例116：ADC50
Figure 107134301-A0305-02-0456-282
Figure 107134301-A0305-02-0457-283
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例116步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例65步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例3步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.47mg/mL，抗體產量：8.8mg(88%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例117：ADC51
Figure 107134301-A0305-02-0458-284
Figure 107134301-A0305-02-0459-285
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例117步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例64步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例3步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.36mg/mL，抗體產量：8.19mg(82%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例118：ADC52
Figure 107134301-A0305-02-0460-286
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例118步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例60步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例8步驟2中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應3天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.06mg/mL，抗體產量：6.35mg(63%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.2
實施例119：ADC53
Figure 107134301-A0305-02-0461-287
Figure 107134301-A0305-02-0462-288
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例119步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例66步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(9.89mg/mL，0.40mL)中添加1,2-丙二醇(0.367mL)、含有實施例3步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0328mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應2天。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液2.50mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.16mg/mL，抗體產量：2.89mg(72%)，抗體每1分子 之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例120：ADC54
Figure 107134301-A0305-02-0463-289
(步驟1中所形成之三唑環具有幾何異構，實施例120步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例59步驟1中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含有實施例4步驟12中獲得之化合物10mM之二甲基亞碸溶液(0.0825mL，相對於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液6mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.49mg/mL，抗體產量：8.94mg(89%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例121：抗體-藥物複合體之抗細胞效果(1)
作為HER2抗原陽性細胞之人胃癌株之NCI-N87(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC CRL-5822)係於含有10%之胎牛血清(Hyclone)之RPMI1640培養基(Thermo Fisher Scientific，以下為RPMI培養基)中培養。HER2抗原陰性細胞之MDA-MB-468(ATCC HTB-132)係於含有10%之胎牛血清(Hyclone)之Leibovitz's L-15培養基(Thermo Fisher Scientific，以下為Leibovitz's培養基)中培養。分別以成為2.5×104Cells/mL之方式利用RPMI培養基製備NCI-N87，利用Leibovitz's培養基製備MDA-MB-468細胞，以每孔80μL之方式添加至96孔細胞培養用微盤中。添加細胞後，NCI-N87於37℃、5%CO2下培養一晚，MDA-MB-468於37℃、不設定CO2濃度之情況下培養一晚。
第二天，將利用RPMI培養基或Leibovitz's培養基稀釋為100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM之抗HER2抗體-藥物複合體以每孔20μL之方式添加至微盤中。對於未添加抗體-藥物複合體之孔，以每孔20μL之方式添加RPMI培養基或Leibovitz's培養基。NCI-N87於37℃、5%CO2下培養6天，MDA-MB-468於37℃、不設定CO2濃度之情況下培養6天。培養後，將微盤自恆溫箱中取出，於室溫下靜置30分鐘。添加與培養液等量之CellTiter-Glo發光型細胞活性偵測套組(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega)，利用微盤攪拌器加以攪拌。於室溫下靜置10 分鐘後藉由讀板儀(PerkinElmer)測量發光量。
活細胞率係利用下式算出。
活細胞率(%)=a÷b×100
a：添加有試驗物質之孔之發光量之平均值
b：添加有培養基之孔之發光量之平均值
IC50值係利用下式算出。
IC50(nM)=antilog((50-d)×(LOG10(b)-LOG10(a))÷(d-c)+LOG10(b))
a：試驗物質之濃度a
b：試驗物質之濃度b
c：添加濃度a之試驗物質時之活細胞率
d：添加濃度b之試驗物質時之活細胞率
a、b係夾著活細胞率50%之2點且a>b。
針對NCI-N87細胞，抗體-藥物複合體ADC17、ADC18、ADC1、ADC54、ADC20、ADC34、ADC23、ADC24、ADC25表現出IC50<0.001(nM)之抗細胞效果。抗體-藥物複合體ADC26、ADC27、ADC16、ADC11、ADC12、ADC2、ADC3、ADC4、ADC43、ADC5、ADC21、ADC48、ADC44、ADC6、ADC7、ADC28、ADC29、ADC13、ADC14、ADC30、ADC31、ADC32、ADC33、ADC35、ADC36、ADC8、ADC9、ADC38、ADC39表現出0.001≦IC50<0.1(nM)之抗細胞效果。又，任一抗體-藥物複合體對MDA-MB-468細胞均未表現出抗細胞效果(IC50>0.1(nM))。
實施例122：抗體-藥物複合體之抗細胞效果(2)
作為HER2抗原陽性細胞之人胃癌株之NCI-N87(ATCC CRL-5822)係 於含有10%之胎牛血清(Hyclone)之RPMI1640培養基(Thermo Fisher Scientific，以下為RPMI培養基)中培養。作為HER2抗原陽性細胞之人乳癌株之JIMT-1(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ ACC 589)係於含有10%之胎牛血清(Hyclone)之Dulbecco's Modified Eagle培養基(Thermo Fisher Scientific，以下為DMEM培養基)中培養。以成為5.0×104Cells/mL之方式利用RPMI培養基製備NCI-N87，以成為1.3×104Cells/mL之方式利用DMEM培養基製備JIMT-1細胞，以每孔80μL之方式添加至96孔細胞培養用微盤中，於37℃、5%CO2下培養一晚。
第二天，將利用RPMI培養基或DMEM培養基稀釋為400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0.13nM、0.026nM、0.0051nM、0.0010nM之抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、或抗LPS抗體-藥物複合體ADC53以每孔20μL之方式添加至微盤中。對於未添加抗體-藥物複合體之孔，以每孔20μL之方式添加RPMI培養基或DMEM培養基。於37℃、5%CO2下培養6天。培養後，將微盤自恆溫箱中取出，於室溫下靜置30分鐘。添加與培養液等量之CellTiter-Glo發光型細胞活性偵測套組(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega)，利用微盤攪拌器加以攪拌。於室溫下靜置10分鐘後藉由讀板儀(PerkinElmer)測量發光量。
活細胞率係利用下式算出。
活細胞率(%)=a÷b×100
a：添加有試驗物質之孔之發光量之平均值
b：添加有培養基之孔之發光量之平均值
IC50值係利用下式算出。
IC50(nM)=antilog((50-d)×(LOG10(b)-LOG10(a))÷(d-c)+LOG10(b))
a：試驗物質之濃度a
b：試驗物質之濃度b
c：添加濃度a之試驗物質時之活細胞率
d：添加濃度b之試驗物質時之活細胞率
a、b係夾著活細胞率50%之2點且a>b。
對於NCI-N87、JIMT-1兩種細胞，抗HER2抗體-藥物複合體ADC49表現出0.001<IC50<0.1(nM)之抗細胞效果。另一方面，抗LPS抗體-藥物複合體ADC53對任一細胞均未表現出抗細胞效果(IC50>0.1(nM))。
實施例123：抗體-藥物複合體之抗細胞效果(3)
作為CLDN6抗原陽性細胞之人卵巢癌株之OV-90(ATCC CRL-11732)係於含有15%之胎牛血清(Hyclone)之培養基199(Thermo Fisher Scientific)與MCDB 105培養基(Sigma-Aldrich)之1比1混合培養基(以下為培養基)中培養。以成為1.9×104Cells/mL之方式利用培養基製備OV-90細胞，以每孔80μL之方式添加至96孔細胞培養用微盤中，於37℃、5%CO2下培養一晚。
第二天，將利用培養基稀釋為50nM、10nM、2.0nM、400pM、80pM、16pM、3.2pM、0.64pM、0.13pM之抗CLDN6抗體-藥物複合體ADC40、ADC41、ADC42以每孔20μL之方式添加至微盤中。對於未添加抗體-藥物複合體之孔，以每孔20μL之方式添加培養基。於37℃、5%CO2下培養6天。培養後，將微盤自恆溫箱中取出，於室溫下靜置30分鐘。添加與培養液等量之CellTiter-Glo發光型細胞活性偵測套組(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega)，利用微盤攪拌器加以攪 拌。於室溫下靜置10分鐘後藉由讀板儀(PerkinElmer)測量發光量。
活細胞率係利用下式算出。
活細胞率(%)=a÷b×100
a：添加有試驗物質之孔之發光量之平均值
b：添加有培養基之孔之發光量之平均值
IC50值係利用下式算出。
IC50(nM)=antilog((50-d)×(LOG10(b)-LOG10(a))÷(d-c)+LOG10(b))
a：試驗物質之濃度a
b：試驗物質之濃度b
c：添加濃度a之試驗物質時之活細胞率
d：添加濃度b之試驗物質時之活細胞率
a、b係夾著活細胞率50%之2點且a>b。
對於OV-90細胞，抗CLDN6抗體-藥物複合體ADC40、ADC41、ADC42表現出0.001<IC50<0.1(nM)之抗細胞效果。
實施例124：抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(1)
小鼠：於實驗使用前將4~5週齡之雌BALB/c裸小鼠(日本Charles River)於SPF(Specific Pathogen Free，無特定病原)條件下馴化4~7天。對小鼠餵食經滅菌之固體飼料(FR-2，Funabashi Farms Co.,Ltd)，並提供經滅菌之自來水(添加5~15ppm次氯酸鈉溶液而製備)。
測定、計算式：於全部研究中，利用電子式數位卡尺(CD-15CX，Mitutoyo Corp.)對腫瘤之長徑及短徑每週測定2~3次，計算腫瘤體積(mm3)。計算式如以下所示。
腫瘤體積(mm3)=長徑(mm)×[短徑(mm)]2×1/2
抗體-藥物複合體及抗體全部利用10mM-乙酸鹽緩衝液(Acetate Buffer)、5%山梨糖醇(Sorbitol)、pH值5.5(Nacalai Tesque股份有限公司，ABS緩衝液)進行稀釋，以10mL/kg之液量進行尾靜脈內投予。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將NCI-N87細胞(ATCC CRL-5822)懸浮於生理鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)中，將1×107cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第7天實施隨機分組。於第7天以0.3mg/kg之用量尾靜脈內投予抗HER2抗體-藥物複合體ADC26，於第7天以1mg/kg之用量尾靜脈內投予ADC19、或ADC54。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖4。抗HER2抗體-藥物複合體ADC26、ADC19、或ADC54觀察到伴隨腫瘤消退之較強之抗腫瘤效果。任一投予抗HER2抗體-藥物複合體之小鼠均減少。
於以下關於抗腫瘤試驗之評價例中，於無特別記載之情形時，藉由本評價例所使用之方法實施試驗。
實施例125：抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(2)
將NCI-N87細胞(ATCC CRL-5822)懸浮於杜氏磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline)(Sigma-Aldrich)中，將1×107cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第4天實施隨機分組。於第4天將抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、抗HER2抗體曲妥珠單抗(參考例3)、或抗LPS抗體-藥物複合體ADC53全部以0.33mg/kg之用量進行尾靜脈內投予。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖5。抗HER2抗體-藥物複合體ADC49觀察到伴隨腫瘤消 退之較強之抗腫瘤效果。另一方面，藉由抗HER2抗體曲妥珠單抗、抗LPS抗體-藥物複合體ADC53未抑制腫瘤之增殖。又，未觀察到小鼠體重因投予抗體-藥物複合體ADC49、ADC53、或抗HER2抗體而減少。
實施例126：抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(3)
將KPL-4細胞(川崎醫科大學，紅林淳一先生，British Journal of Cancer,(1999)79(5/6).707-717)懸浮於杜氏磷酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich)中，將1.5×107cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第14天實施隨機分組。於第14天以0.4mg/kg之用量尾靜脈內投予抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、抗LPS抗體-藥物複合體ADC53、或曲妥珠單抗Tesirine(參考例1)。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖6。抗HER2抗體-藥物複合體ADC49觀察到伴隨腫瘤消退之較強之抗腫瘤效果。另一方面，ADC53、曲妥珠單抗Tesirine中未觀察到腫瘤之消退。又，未觀察到小鼠體重因投予ADC49、曲妥珠單抗Tesirine而減少。
實施例127：抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(4)
將JIMT-1細胞(DSMZ ACC 589)懸浮於生理鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)中，將5×106cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第10天實施隨機分組。於第10天以0.4mg/kg之用量尾靜脈內投予抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、或曲妥珠單抗Tesirine(參考例1)。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖7。抗HER2抗體-藥物複合體ADC49觀察到伴隨腫瘤消退之較強之抗腫瘤效果。另一方面，曲妥珠單抗Tesirine中觀察到抗腫瘤效果，但未觀察到腫瘤之消退。又，未觀察到小鼠體重因投予ADC49、 曲妥珠單抗Tesirine而減少。
實施例128：抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(5)
將OV-90細胞(ATCC CRL-11732)懸浮於基質膠(CORNING)中，將2.5×106cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第15天實施隨機分組。於第15天以0.33mg/kg之用量尾靜脈內投予抗CLDN6抗體-藥物複合體ADC40、或抗CLDN6抗體(H1L1)Tesirine。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖8。抗CLDN6抗體-藥物複合體ADC40觀察到伴隨腫瘤消退之較強之抗腫瘤效果。另一方面，抗CLDN6抗體(H1L1)-Tesirine中未觀察到腫瘤之消退。又，未觀察到小鼠體重因投予ADC40、H1L1-Tesirine而減少。
實施例129：抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(6)
將NIH：OVCAR-3細胞(ATCC HTB-161)懸浮於基質膠(CORNING)中，將1×107cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第25天實施隨機分組。於第25天以0.33mg/kg之用量尾靜脈內投予抗CLDN6抗體-藥物複合體ADC40、或抗CLDN6抗體(H1L1)-Tesirine。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖9。抗CLDN6抗體-藥物複合體ADC40觀察到伴隨腫瘤消退之較強之抗腫瘤效果。另一方面，H1L1-Tesirine中觀察到抗腫瘤效果，但未觀察到腫瘤之消退。又，未觀察到小鼠體重因投予ADC40、H1L1-Tesirine而減少。
實施例130：抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(7)
將FaDu細胞(ATCC HTB-43)懸浮於生理鹽水(大塚製藥工場股份有 限公司)中，將3×106cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第10天實施隨機分組。於第10天以0.4mg/kg之用量尾靜脈內投予抗TROP2抗體-藥物複合體ADC50、或抗LPS抗體-藥物複合體ADC53。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖10。抗TROP2抗體-藥物複合體ADC50觀察到伴隨腫瘤消退之較強之抗腫瘤效果。另一方面，抗LPS抗體-藥物複合體ADC53未抑制腫瘤之增殖。又，未觀察到小鼠體重因投予ADC50、ADC53而減少。
實施例131：小鼠抗CLDN6抗體B1產生融合瘤(218B1)及小鼠抗CLDN6抗體C7產生融合瘤(218C7)
131-1.小鼠之免疫與融合瘤之獲得
1-1)小鼠免疫所使用之細胞之準備
將2×106個或5×106個NOR-P1細胞(人類胰臟癌細胞株，RIKEN RCB-2139)於RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)10%FBS(胎牛血清)(+)培養基(10ml或20ml)中培養5天後回收，利用PBS(磷酸緩衝生理鹽水)洗淨2次，並再懸浮於PBS(300μl)中。
1-2)對小鼠之免疫
對於BALB/c小鼠(12週齡)，第1~5次免疫係以約1週為間隔對腹腔內免疫NOR-P1細胞(2×106個)。自第5次免疫起約2週後對腹腔內免疫NOR-P1細胞(5×106個)。自第6次免疫起約3週後對腹腔內免疫NOR-P1細胞(2×106個)。第8~10次係以約2週為間隔對腹腔內免疫2×106個NOR-P1細胞。於第10次之約3週後(第11次)及其3天後(第12次，最終免疫)對腹腔內免疫5×106個NOR-P1細胞。最終免疫起3天後摘下脾臟細胞。
1-3)經免疫之小鼠之脾臟細胞之準備
摘下經免疫小鼠之脾臟，磨碎懸浮於RPMI1640 10%FBS(+)培養基中。使細胞懸浮液通過細胞過濾器(70μm，BD Falcon公司)後，於室溫下以1500rpm離心5分鐘，並將上清液廢棄。添加Tris-NH4Cl溶液(20mM Tris-HCl pH值7.2，77.6mM NH4Cl，20mL)，於室溫下處理5分鐘。添加PBS(20mL)，於室溫下以1500rpm離心5分鐘。將上清液廢棄後，添加RPMI1640 FBS(+)培養基(10ml)。
1-4)骨髓瘤細胞之準備
將P3U1細胞(小鼠骨髓瘤細胞株)於RPMI1640 FBS(+)培養基中培養5天後回收，將其再懸浮於RPMI1640 FBS(+)培養基(20ml)中。
1-5)細胞融合
將脾臟細胞與骨髓瘤細胞以成為5：1之方式加以混合，於室溫下以1500rpm離心5分鐘。利用RPMI1640 FBS(-)培養基(10ml)洗淨2次後進行離心分離(1500rpm、5分鐘)。將所獲得之沈澱組分之細胞組充分解散後，一面攪拌，一面歷經約1分鐘緩緩添加聚乙二醇-1500(PEG-1500；1ml)。攪拌3分30秒後，於室溫下靜置30秒。其後，歷經1分鐘於該細胞液中添加RPMI培養基10%Low IgG FBS(+)(10ml)。將該細胞懸浮液進行離心分離(1500rpm、5分鐘)，將所獲得之沈澱組分之細胞緩慢解散後，緩慢地懸浮於HAT培養基(含有10%Low IgG FBS、HAT Media Supplement、5%BriClone之RPMI1640培養基，200ml)中。以200μl/孔之方式將該懸浮液分注於96孔培養用盤中，於37℃、5% CO2之恆溫箱中培養6天。
1-6)融合瘤之篩選、探針之準備
以測定抗體之內化及抗毒素活性為目的製作作為重組複合蛋白質之DT3C。該DT3C係使白喉毒素(DT)之觸媒區與鏈球菌蛋白質G之抗體結合區以基因工程方式融合而成之蛋白質。DT3C特異性地結合於抗體之Fc部分，若納入至細胞內，則因阻礙蛋白質合成而誘發細胞死。藉由使用該系統，可同時觀察抗體之內化及利用抗毒素之殺細胞效果(Yamaguchi,M.et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications 454(2014)600-603)。
1-7)利用DT3C之融合瘤之篩選
於96孔盤中添加4μg/ml之DT3C(25μl)，進而添加步驟1-5中獲得之融合瘤之培養上清液(25μl)，於室溫下培育30分鐘。接種2×105個/ml(RPMI培養基10%Low IgG FBS(+))之NOR-P1細胞(50μl)，於37℃、CO2恆溫箱中培養3天。藉由培養後之顯微鏡觀察，將顯示出使用陰性對照抗體時之附著細胞數之約25%以下之附著細胞數的孔判定為陽性。選出之純系進行1~2次之次選殖，建立單株之融合瘤細胞株8株。
131-2：融合瘤所產生之抗體所結合之抗原之鑑定
對實施例131-1中製備之融合瘤所產生之抗體中之2個純系218B1及218C7進行抗原之鑑定。
2-1)使用經生物素標記之細胞表面蛋白質之218B1抗體及218C7抗體的免疫沈澱
去除2×106個NTERA-2細胞(人類睾丸癌細胞株，ATCC CRL-1973)之培養上清液，利用PBS洗淨2次。將EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)以0.1mg/ml之濃度懸浮於PBS中。將PBS去除後，添加生物素/PBS溶液，於振盪器上培育30分鐘後利用100 mM甘胺酸/PBS溶液(25ml)洗淨2次，其後，利用PBS(10ml)洗淨1次。將洗淨後之細胞再懸浮於200μl之溶解緩衝液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH值7.4、1%DDM、蛋白酶抑制劑、Complete EDTA free(Roche公司)1粒/50ml)中，於4℃下處理30分鐘。進行離心分離(13000rpm、20分鐘、4℃)而製備細胞溶解液。將Protein G Sepharose(Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司))之緩衝液置換為溶解緩衝液，將所獲得之Protein G Sepharose/溶解緩衝液(50%漿料，30μl)添加至細胞溶解液中，於4℃下旋轉30分鐘後，於4℃下離心1分鐘，將上清液回收。於該上清液中添加218B1抗體或218C7抗體(約3μg)，於4℃下旋轉30分鐘後添加Protein G Sepharose/溶解緩衝液(50%漿料，60μl)，於4℃下旋轉1小時。利用溶解緩衝液(1ml)將Protein G Sepharose洗淨6次後，將其再懸浮於1×SDS樣品緩衝液(BioRad公司)中。於100℃下將懸浮液處理5分鐘後，將溶液回收，製成用於SDS-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)之樣品。
2-2)SDS-PAGE及西方墨點法
對於2-1)中製備之SDS-PAGE樣品，使用SuperSep Ace 5-20%(Wako 公司)，於50mV下堆疊30分鐘後，於200mV下漂泳1小時後，於12mV下自凝膠向薄膜轉印(blotting)47分鐘。利用PBS-T(PBS(-)-0.02% Tween 20)將薄膜洗淨後，封閉(blocking)1小時。利用PBS-T將薄膜以5分鐘洗淨3次後，使其與抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶複合體(Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate)(GE Healthcare公司，利用PBS-T稀釋為2000倍使用)反應1小時。利用PBS-T將薄膜以5分鐘洗淨2次後，使用增強化學發光(enhanced chemiluminecscence，ECL)法檢測目標頻帶。於使 用218B1抗體及218C7抗體之任一情形時，不論有無添加DTT，均檢測出分子量18kDa之頻帶。
2-3)使用細胞蛋白質之218B1抗體及218C7抗體之免疫沈澱產物之質量分析
將2×107個NTERA-2細胞回收。利用PBS洗淨2次。使用細胞刮勺將細胞回收，以1500rpm離心5分鐘。將上清液去除後再懸浮於2ml之溶解緩衝液中，於4℃下處理30分鐘。進行離心分離(13000rpm、20分鐘、4℃)而製備細胞溶解液。於細胞溶解液中添加Protein G Sepharose/溶解緩衝液(50%漿料，180μl)，於4℃下旋轉30分鐘後於4℃下離心1分鐘，將上清液回收。於該上清液中添加218B1抗體(約9μg)，於4℃下旋轉30分鐘後，添加Protein G Sepharose/溶解緩衝液(50%漿料，180μl)，於4℃下旋轉1小時。利用溶解緩衝液(1ml)將Protein G Sepharose洗淨6次後再懸浮於1×SDS樣品緩衝液中。於100℃下將懸浮液處理5分鐘後，將溶液回收，製成用於SDS-PAGE之樣品。藉由與2-2)相同之方法進行SDS-PAGE，將漂泳凝膠進行CBB(Coomassie Brilliant Blue，庫馬斯亮藍)染色。自漂泳凝膠切下相當於18kDa之部分而供質量分析。質量分析之結果為判明該凝膠片含有Claudin-6。
2-4)FACS解析
根據質量分析可預測218B1抗體及218C7抗體之抗原為Claudin-6，因此進行利用cDNA之基因導入之強制表現解析。FACS解析之結果為人類Claudin-6表現CHO-K1細胞中218B1抗體及218C7抗體表現出強陽性反應，因此表明218B1抗體及218C7抗體之抗原為Claudin-6。
實施例132：自融合瘤培養上清液之抗體之純化
將實施例131中製作之小鼠抗CLDN6抗體B1產生融合瘤(218B1)及小鼠抗CLDN6抗體C7產生融合瘤(218C7)於含有10%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、Ultra-Low IgG(Thermo Fisher Scientific)之融合瘤(Hybridoma)-SFM(Thermo Fisher Scientific)中進行培養。藉由離心回收培養上清液，並利用0.45μm之過濾器(Corning公司製造)進行過濾。藉由rProtein A親和層析法(4~6℃下)1階段步驟自培養上清液中純化抗體。rProtein A親和層析法純化後之緩衝液置換步驟係於4~6℃下實施。首先將培養上清液應用於填充有經PBS平衡化之MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製造)之管柱。培養液全部進入管柱後，利用管柱容量2倍以上之PBS洗淨管柱。其次，利用2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH值4.0)進行溶出，收集含有抗體之組分。藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer透析卡)對該組分進行與PBS(-)之液置換。最後，藉由離心超濾裝置(Centrifugal UF Filter Device)VIVASPIN20(分組分子量UF10 K，Sartorius公司，4℃下)進行濃縮，將IgG濃度製備為1mg/mL以上。藉由Minisart-Plus過濾器(Sartorius公司)進行過濾，而製成純化樣品。
實施例133：小鼠抗CLDN6抗體B1及C7之in vitro評價
133-1：利用流式細胞儀之小鼠抗CLDN6抗體之結合能力評價
藉由流式細胞法評價實施例132中製作之小鼠抗CLDN6抗體之人CLDN6及家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9結合性。使用脂染胺(Lipofectamine)2000(Thermo Fisher Scientific)將自Origene公司購買之human CLDN3/pCMV6-Entry、human CLDN4/pCMV6-Entry、human CLDN6/pCMV-Entry、human CLDN9/pCMV6-Entry或pCMV6-Entry臨 時導入至293T細胞(Thermo Fisher Scientific HCL4517)中，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚後，製備細胞懸浮液。將經基因導入之293T細胞懸浮液進行離心，將上清液去除後，以最終濃度30μg/mL、10μg/mL、3.3μg/mL、1.1μg/mL添加小鼠抗CLDN6抗體(純系編號為B1、C7)、或小鼠IgG1對照抗體(R&D Systems)並使其懸浮，於4℃下靜置1小時。利用含有5%之胎牛血清(Hyclone)之杜氏磷酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich)(以下為含5%FBS之PBS)洗淨2次後，添加利用含5%FBS之PBS稀釋500倍之FLUORESCEIN-CONJUGATED GOAT IGG FRACTION TO MOUSE IGG(全分子(WHOLE MOLECULE))(MP BIOMEDICALS)並懸浮，於4℃下靜置1小時。利用含5%FBS之PBS洗淨2次後，利用流式細胞儀(FC500，Beckman Coulter)進行檢測。資料解析係利用FlowJo(TreeStar)進行。再者，各基因導入之確認係利用含0.25%Tween20之PBS對細胞進行透過處理後使用小鼠抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich)進行。將結果示於圖40。於圖40之曲線圖中，縱軸表示表現出抗體結合量之FITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸螢光素)之螢光強度，橫軸表示抗體濃度。所製作之小鼠抗CLDN6抗體以相同程度結合於人CLDN6與人CLDN9，不與人類CLDN3、人類CLDN4結合。小鼠對照IgG1與任一細胞均不結合。
133-2：抗體內化活性
小鼠抗CLDN6抗體B1及C7之內化活性係使用結合有阻礙蛋白質合成之毒素(皂草素)之抗小鼠IgG試劑Mab-ZAP(ADVANCED TARGETING SYSTEMS)進行評價。於該評價中，依賴於小鼠抗CLDN6抗體之內化活性，Mab-ZAP納入至細胞內，阻礙蛋白質合成之皂草素被釋放至細胞內，由此細胞增殖受到抑制。
將作為人CLDN6陽性細胞之人類絨毛膜癌株之JEG-3(ATCC HTB-36)、作為人CLDN6陽性細胞之人卵巢癌株之NIH：OVCAR-3(ATCC HTB-161)、或作為人CLDN6陰性細胞之人類胰腺癌株之BxPC-3(ATCC CRL-1687)以2x103cells/well接種於96孔細胞培養用微盤中，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。第二天，添加將小鼠抗CLDN6抗體、或小鼠IgG1抗體(R&D Systems)以最終濃度成為1nM之方式與Mab-ZAP(最終濃度：0.5nM)、或未結合毒素之AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch)(最終濃度：0.5nM)混合而成之混合溶液，於37℃、5% CO2之條件下培養5天。生存細胞數係藉由使用CellTiter-Glo發光型細胞活性偵測套組(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega)之ATP(adenosine triphosphate，腺苷三磷酸)活性之定量進行測定。添加抗CLDN6抗體獲得之細胞增殖抑制作用係以將未添加混合溶液之孔之值設為100%之相對生存率求出。將結果示於圖41。小鼠抗CLDN6抗體(B1、C7)對人CLDN6陽性細胞株JEG-3與NIH：OVCAR-3表現出細胞增殖抑制效果。另一方面，對人CLDN6陰性細胞株BxPC-3未表現出細胞增殖抑制效果。又，小鼠IgG1抗體對任一細胞株均未表現出細胞增殖抑制效果。根據該結果，認為所製作之抗CLDN6抗體(B1、C7)具有內化活性，適合用作抗體-藥物複合體用之抗體。
實施例134：編碼小鼠抗CLDN6抗體B1及C7之可變區之cDNA之核苷酸序列之確定
134-1：編碼B1抗體之可變區之cDNA的核苷酸序列之確定
134-1-1：B1抗體產生融合瘤之總RNA之製備
為了擴增編碼B1抗體之可變區之cDNA，使用TRIzol Reagent (Ambion公司)，由B1抗體產生融合瘤製備總RNA。
134-1-2：利用5'-RACE(rapid amplification of cDNA 5' ends，cDNA 5'末端快速擴增)PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)之編碼B1抗體之輕鏈可變區之cDNA的擴增與序列之確定
編碼輕鏈可變區之cDNA之擴增係使用實施例134-1-1中製備之約1μg之總RNA與SMARTer RACE 5'/3'套組(Clontech公司)實施。作為用以利用PCR擴增編碼B1抗體之輕鏈基因之可變區之cDNA的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix，附屬於SMARTer RACE 5'/3'套組)、及由公知之小鼠輕鏈之恆定區的序列設計之引子。
將藉由5'-RACE PCR擴增之編碼輕鏈之可變區之cDNA選殖於質體中，繼而，實施編碼輕鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列之序列分析。
將經確定之編碼B1抗體之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列編號18，將胺基酸序列示於序列編號19。
134-1-3：利用5'-RACE PCR之編碼B1抗體之重鏈可變區的cDNA之擴增與序列之確定
編碼重鏈可變區之cDNA之擴增係使用實施例134-1-1中製備之約1μg之總RNA與SMARTer RACE 5'/3'套組(Clontech公司)實施。作為用以利用PCR擴增編碼LB1抗體之重鏈基因之可變區之cDNA的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE 5'/3'套組)、及由公知之小鼠重鏈之恆定區的序列設計之引子。
將藉由5'-RACE PCR擴增之編碼重鏈之可變區之cDNA選殖於質體中，繼而，實施編碼重鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列之序列分析。
將經確定之編碼B1抗體之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於 序列編號20，將胺基酸序列示於序列編號21。
134-2：編碼C7抗體之可變區之cDNA的核苷酸序列之確定
以與實施例134-1同樣之方法實施。將經確定之編碼C7抗體之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列編號22，將胺基酸序列示於序列編號23。將編碼重鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列示於序列編號24，將胺基酸序列示於序列編號25。
實施例135：嵌合化抗CLDN6抗體chB1之製作
135-1：嵌合化抗CLDN6抗體chB1之表現載體之構建
135-1-1：嵌合化及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK之構建
使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)將利用限制酶XbaI及PmeI消化質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)所獲得之約5.4kb之片段與包含示於序列編號26之人類輕鏈訊息序列及編碼人κ鏈恆定區之DNA序列之DNA片段結合，而製作pcDNA3.3/LK。藉由自pcDNA3.3/LK去除新黴素表現單元而構建pCMA-LK。
135-1-2：嵌合化及人類化IgG1LALA型重鏈表現載體pCMA-G1LALA之構建
使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)將利用XbaI及PmeI消化pCMA-LK並去除輕鏈訊息序列及人κ鏈恆定區之DNA片段與包含序列編號27所表示之人類重鏈訊息序列及編碼人IgG1LALA恆定區之DNA序列之DNA片段結合，而構建pCMA-G1LALA。
135-1-3：嵌合化chB1重鏈表現載體之構建
合成序列編號33所示之chB1重鏈之核苷酸序列的核苷酸編號36至440所示之DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組 (Clontech公司)，於利用限制酶BlpI切斷pCMA-G1LALA之位置插入所合成之DNA片段，藉此構建chB1重鏈表現載體。將chB1重鏈之胺基酸序列示於序列編號32。
135-1-4：嵌合化chB1輕鏈表現載體之構建
合成含有序列編號29所示之編碼chB1輕鏈之DNA序列之DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，將所合成之DNA片段與利用XbaI及PmeI消化pCMA-LK而去除輕鏈訊息序列及人κ鏈恆定區之DNA片段結合，藉此構建chB1輕鏈表現載體。將chB1輕鏈之胺基酸序列示於序列編號28。
135-2：嵌合化抗CLDN6抗體chB1之生產及純化
135-2-1：嵌合化抗體chB1之生產
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係依照手冊進行繼代、培養。將對數增殖期之1.2×109個FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer燒瓶(CORNING公司)中，利用FreeStyle293表現培養基(Invitrogen公司)加以稀釋而製備為2.0×106細胞/mL。於40mL之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中添加0.24mg之重鏈表現載體、0.36mg之輕鏈表現載體及1.8mg之聚伸乙基亞胺(Polyethyleneimine)(Polyscience #24765)並平穩攪拌，進而放置5分鐘後添加至FreeStyle 293F細胞中。於37℃、8%CO2恆溫箱中以90rpm振盪培養4小時後，添加600mL之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、18mL之GlutaMAX I(GIBCO公司)、及30mL之Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司)，於37℃、8%CO2恆溫箱中以90rpm振盪培養7天，利用拋棄式膠囊過濾器(Disposable Capsule Filter)(Advantec #CCS-045-E1H)過濾所獲得 之培養上清液。將所獲得之嵌合化抗CLDN6抗體命名為「chB1」。
135-2-2：嵌合化抗體chB1之純化
利用rProtein A親和層析法之1階段步驟由實施例135-2-1中獲得之培養上清液中純化抗體。將培養上清液應用於填充有經PBS平衡化之MabSelectSuRe之管柱(GE Healthcare Bioscience公司製造)後，利用管柱容量之2倍以上之PBS洗淨管柱。繼而利用2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH值4.0)進行溶出，收集含有抗體之組分。藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer透析卡)對該組分進行與PBS(-)之緩衝液置換。利用離心超濾裝置(Centrifugal UF Filter Device)VIVASPIN20(分組分子量UF10 K，Sartorius公司)將抗體進行濃縮，將IgG濃度製備為1mg/mL以上。最後藉由Minisart-Plus過濾器(Sartorius公司)進行過濾，而製成純化樣品。
實施例136：人類化抗CLDN6抗體之製作
136-1：抗CLDN6抗體之人類化體設計
136-1-1：嵌合化抗體chB1之可變區之分子模擬
chB1之可變區之分子模擬係利用公知之方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))作為同源模擬法。以對chB1之重鏈與輕鏈之可變區具有較高之序列同一性之註冊於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))之結構(PDB ID：1XIW)作為模板，使用市售之蛋白質立體結構解析程式BioLuminate(Schrodinger公司製造)進行。
136-1-2：人類化胺基酸序列之設計
chB1係藉由CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))進行人類化。Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))中既定之人類之gamma鏈亞群1及kappa鏈亞群1之一致序列對chB1之架構區具有較高之同一性，因此分別被選作重鏈與輕鏈之受體。應轉移至受體上之供體殘基係藉由以由Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))提供之基準等為參考，對三維模型進行分析而選擇。再者，由於CDRL3富有疏水性之胺基酸，故而亦設計對CDRL3導入變異之人類化輕鏈。
136-2：chB1重鏈之人類化
將所設計之3種重鏈命名為hH1、hH2及hH3。將hH1之重鏈全長胺基酸序列記載於序列編號52(圖34)。將編碼序列編號52之胺基酸序列之核苷酸序列記載於序列編號53(圖34)。將hH2之重鏈全長胺基酸序列記載於序列編號56(圖36)。將編碼序列編號56之胺基酸序列之核苷酸序列記載於序列編號57(圖36)。將hH3之重鏈全長胺基酸序列記載於序列編號60(圖38)。將編碼序列編號60之胺基酸序列之核苷酸序列記載於序列編號61(圖38)。
將實施例135所表示之作為人類嵌合化抗CLDN6抗體chB1之重鏈之chB1_H、人類化抗體重鏈hH1、hH2、及hH3之胺基酸序列之比較示於圖45。於hH1、hH2及hH3之序列中「‧」表示與chB1_H相同之胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基之位置表示經置換之胺基酸殘基。
136-3：chB1輕鏈之人類化
將所設計之4種輕鏈命名為hL1、hL2、hL3及hL4。將hL1之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列編號36(圖26)。將編碼序列編號36之胺基酸序列之核苷酸序列記載於序列編號37(圖26)。將hL2之輕鏈全長胺基酸序列記 載於序列編號40(圖28)。將編碼序列編號40之胺基酸序列之核苷酸序列記載於序列編號41(圖28)。將hL3之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列編號44(圖30)。將編碼序列編號44之胺基酸序列之核苷酸序列記載於序列編號45(圖30)。將hL4之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列編號48(圖32)。將編碼序列編號48之胺基酸序列之核苷酸序列記載於序列編號49(圖32)。
將實施例135所表示之作為人類嵌合化抗CLDN6抗體chB1之輕鏈之chB1_L、人類化抗體輕鏈hL1、hL2、hL3及hL4之胺基酸序列之比較示於圖46。於hL1、hL2、hL3及hL4之序列中，「‧」表示與chB1_L相同之胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基之位置表示經置換之胺基酸殘基。
136-4：利用重鏈及輕鏈之組合之人類化抗體之設計
將包含hH1及hL1之抗體稱為「H1L1抗體」或「H1L1」。將包含hH2及hL2之抗體稱為「H2L2抗體」或「H2L2」。將包含hH1及hL3之抗體稱為「H1L3抗體」或「H1L3」。將包含hH2及hL4之抗體稱為「H2L4抗體」或「H2L4」。將包含hH3及hL3之抗體稱為「H3L3抗體」或「H3L3」。
136-5：人類化抗CLDN6抗體之製作
136-5-1：人類化重鏈表現載體之構建
136-5-1-1：hH1表現載體之構建
合成序列編號53所示之hH1之核苷酸序列的核苷酸編號36至440所示之DNA片段(GENEART公司)。藉由與實施例135-1-3同樣之方法構建hH1表現載體。
136-5-1-2：hH2表現載體之構建
合成序列編號57所示之hH2之核苷酸序列的核苷酸編號36至440所示 之DNA片段(GENEART公司)。藉由與實施例135-1-3同樣之方法構建hH2表現載體。
136-5-1-3：hH3表現載體之構建
合成序列編號61所示之hH2之核苷酸序列的核苷酸編號36至440所示之DNA片段(GENEART公司)。藉由與實施例135-1-3同樣之方法構建hH3表現載體。
136-5-2：人類化輕鏈表現載體之構建
136-5-2-1：hL1表現載體之構建
合成序列編號37所示之hL1之核苷酸序列的核苷酸編號37至402所示之DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，於利用限制酶BsiWI切斷pCMA-LK之位置插入所合成之DNA片段，藉此構建hL1表現載體。
136-5-2-2：hL2表現載體之構建
合成序列編號41所示之hL2之核苷酸序列的核苷酸編號37至402所示之DNA片段(GENEART公司)。藉由與實施例136-5-2-1同樣之方法構建hL2表現載體。
136-5-2-3：hL3表現載體之構建
合成序列編號45所示之hL3之核苷酸序列的核苷酸編號37至402所示之DNA片段(GENEART公司)。藉由與實施例136-5-2-1同樣之方法構建hL3表現載體。
136-5-2-4：hL4表現載體之構建
合成序列編號49所示之hL4之核苷酸序列的核苷酸編號37至402所示之DNA片段(GENEART公司)。藉由與實施例136-5-2-1同樣之方法構建 hL4表現載體。
136-5-3：人類化抗體之製備
136-5-3-1：人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3之生產
藉由與實施例135-2-1同樣之方法生產。藉由與實施例136-4所示之重鏈與輕鏈之組合相對應之重鏈表現載體與輕鏈表現載體之組合，生產H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3。
136-5-3-2：人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3之2步純化
藉由rProtein A親和層析法與陶瓷羥磷灰石之2階段步驟純化實施例136-5-3-1中獲得之培養上清液。將培養上清液應用於填充有經PBS平衡化之MabSelectSuRe之管柱(GE Healthcare Bioscience公司製造)後，利用管柱容量之2倍以上之PBS洗淨管柱。繼而，利用2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH值4.0)溶出抗體。藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer透析卡)對含有抗體之組分進行與PBS之緩衝液置換，利用5mM磷酸鈉/50mM MES/pH值7.0之緩衝液稀釋5倍後，應用於經5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH值7.0之緩衝液平衡化之陶瓷羥磷灰石管柱(日本Bio-Rad，Bio-Scale CHT Type-1羥磷灰石(Hydroxyapatite Column))。實施利用氯化鈉之線性濃度梯度溶出，收集含有抗體之組分。藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer透析卡)對該組分進行與HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇，pH值6.0)之緩衝液置換。利用離心超濾裝置(Centrifugal UF Filter Device)VIVASPIN20(分組分子量UF10 K，Sartorius公司)將抗體濃縮，將IgG濃度製備為50mg/mL。最後利用 Minisart-Plus過濾器(Sartorius公司)過濾，而製成純化樣品。
實施例137：利用流式細胞儀之人類化抗CLDN6抗體之結合能力評價
藉由流式細胞法對實施例136中製作之人類化抗CLDN6抗體之人CLDN6及家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9結合性進行評價。使用藉由與實施例133-1同樣之方法臨時經基因導入之293T細胞。對於導入有人CLDN6或人CLDN9基因之細胞，以最終濃度100nM、20nM、4nM、0.8nM添加人類化抗CLDN6抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3、或人IgG1對照抗體(CALBIOCHEM)並懸浮，於4℃下靜置30分鐘。對於導入有人類CLDN3、人類CLDN4基因、或空載體之細胞，以最終濃度100nM添加人類化抗CLDN6抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3並懸浮，於4℃下靜置30分鐘。利用含有5%之胎牛血清(Hyclone)之杜氏磷酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich)(以下為含5%FBS之PBS)洗淨後，添加利用含5%FBS之PBS稀釋150倍之FITC AffiniPureF(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)並懸浮，於4℃下靜置30分鐘。利用含5%FBS之PBS洗淨後，利用流式細胞儀(FC500，Beckman Coulter)進行檢測。資料解析係藉由FlowJo(TreeStar)進行，算出表示抗體之結合量之FITC之平均螢光強度(MFI)。將結果示於圖42。於圖42之曲線圖中，橫軸表示抗體濃度，縱軸表示MFI。所製作之人類化抗CLDN6抗體以相同程度結合於人CLDN6與人CLDN9，不與人類CLDN3、人類CLDN4結合。人類對照IgG1與任一細胞均不結合。
實施例138：曲妥珠單抗變異體之製作
138-1：曲妥珠單抗-LALA之重鏈表現載體之構建
合成序列編號74所示之曲妥珠單抗-LALA之重鏈的核苷酸序列之核苷酸編號36至434所示之DNA片段(GENEART公司)。藉由與實施例135-1-3同樣之方法構建表現載體。將曲妥珠單抗-LALA之重鏈之胺基酸序列示於序列編號75。
138-2：曲妥珠單抗-LALA之輕鏈表現載體之構建
合成序列編號72所示之曲妥珠單抗-LALA之輕鏈之核苷酸序列的核苷酸編號37至402所示之DNA片段(GENEART公司)。藉由與實施例136-5-2-1同樣之方法構建表現載體。將曲妥珠單抗-LALA之輕鏈之胺基酸序列示於序列編號73。
138-3：曲妥珠單抗變異體之生產
藉由與實施例135-2-1同樣之方法生產。
138-4：曲妥珠單抗變異體之純化
藉由與實施例135-2-2同樣之方法自實施例138-3中獲得之培養上清液中純化曲妥珠單抗-LALA。其中，進行與50mM磷酸緩衝溶液(pH值6.0)而非PBS(-)之緩衝液置換。
實施例139：糖鏈轉換(曲妥珠單抗變異體-MSG1)
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗變異體
使用實施例138中調整之曲妥珠單抗變異體溶液ca.22.3mg/ml(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(2.7ml)，進行與實施例58步驟1相同之操作，而獲得6.1mg/ml之(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗變異體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(6.1mL)。
步驟2：曲妥珠單抗變異體-[MSG1-N3]2
使用上述步驟1中獲得之6.1mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗變 異體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH值6.0))(6.1ml)，進行與實施例60步驟1相同之操作，藉此獲得10.2mg/ml曲妥珠單抗變異體-[MSG1-N3]2溶液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0))(3.7ml)。
實施例140：ADC55
Figure 107134301-A0305-02-0490-290
(步驟1中獲得之化合物如上述式所示般具有三唑環幾何異構體，實施例140步驟1中獲得之化合物係將包含上述作為R例示出之2種結構之連結基混合而保持)
步驟1：抗體與藥物連結基之複合
於室溫下向實施例139步驟2中獲得之抗體之磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(10.2mg/mL，0.40mL)中添加磷酸緩衝生理鹽水(pH值6.0)溶液(0.40mL)、1,2-丙二醇(0.767mL)、二甲基甲醯胺(0.20mL)、含有實施例3步驟13中獲得之化合物10mM之二甲基甲醯胺溶液(0.033mL，相對 於1分子抗體為12當量)，使用管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫下反應48小時。
純化操作：利用共通操作D對上述溶液進行純化，而獲得含有目標化合物之溶液7.00mL。
特性評價：利用共通操作E、F獲得下述之特性值。
抗體濃度：0.39mg/mL，抗體產量：1.38mg(35%)，抗體每1分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例141：抗HER2抗體-藥物複合體之抗細胞效果
藉由含有10%之胎牛血清(Hyclone)之RPMI1640培養基(Thermo Fisher Scientific，以下稱為RPMI培養基)以成為6.25×103Cells/mL之方式製備作為HER2抗原陽性細胞之人乳癌株的KPL-4細胞(川崎醫科大學，紅林淳一先生)，以每孔80μL之方式添加至96孔細胞培養用微盤中。添加細胞後，於37℃、5%CO2下培養一晚。
第二天，以每孔20μL之方式將經RPMI培養基稀釋為100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM、6.4pM、1.3pM、0.26pM之抗HER2抗體-藥物複合體添加至微盤中。對於未添加抗體-藥物複合體之孔，以每孔20μL之方式添加RPMI培養基。KPL-4係於37℃、5%CO2下培養6天。培養後，將微盤自恆溫箱中取出，於室溫下靜置30分鐘。添加與培養液等量之CellTiter-Glo發光型細胞活性偵測套組(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega)，利用微盤攪拌器加以攪拌。於室溫下靜置10分鐘後藉由讀板儀(PerkinElmer)測量發光量。
活細胞率係藉由與實施例123同樣之方法算出。
對於KPL-4細胞，抗HER2抗體-藥物複合體ADC49及ADC55均表現 出0.001<IC50<0.01(nM)之抗細胞效果。
實施例142：抗HER2抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(1)
使用與實施例124同樣之實驗動物及方法，測定抗HER2抗體-藥物複合體之抗腫瘤之抗腫瘤效果。
將KPL-4細胞(川崎醫科大學，紅林淳一先生)懸浮於杜氏磷酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich)中，將1.5×107cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第14天實施隨機分組。於第14天以0.33mg/kg之用量尾靜脈內投予抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、或抗HER2抗體-藥物複合體ADC55。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖47。ADC49與ADC55均於0.33mg/kg投予下表現出同等之抗腫瘤活性。又，未觀察到小鼠體重因投予ADC49、ADC55而減少。
實施例143：抗HER2抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(2)
將JIMT-1細胞(DSMZ ACC 589)懸浮於生理鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)中，將5×106cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)，於第11天實施隨機分組。於第11天以0.4mg/kg或0.2mg/kg之用量尾靜脈內投予ADC55。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖48。ADC55於以0.4mg/kg投予時觀察到伴隨腫瘤消退之較強之抗腫瘤效果。又，任一投予用量下均未觀察到小鼠體重因投予ADC55而減少。
實施例144：抗HER2抗體-藥物複合體之抗腫瘤試驗(3)
將CFPAC-1細胞(ATCC CRL-1918)懸浮於生理鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)中，將5×106cells皮下移植於雌裸小鼠之右體側部(第0天)， 於第10天實施隨機分組。於第10天以0.4mg/kg之用量尾靜脈內投予抗HER2抗體-藥物複合體ADC49、ADC55或抗LPS抗體-藥物複合體ADC53。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。
將結果示於圖49。投予ADC49與ADC55之任一者之小鼠中均觀察到伴隨腫瘤消退之較強之抗腫瘤效果。又，未觀察到小鼠體重因投予ADC49、ADC55、或ADC53而減少。
實施例145：藥物連結基43
Figure 107134301-A0305-02-0493-291
於室溫下向實施例3步驟12中獲得之化合物(0.051g，0.049mmol)與市售之順丁烯二醯亞胺己酸(0.011g，0.054mmol)之二氯甲烷(5mL)溶液中添加1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(0.010g，0.054mmol)，於室溫下攪拌2小時。利用氯仿稀釋反應溶液後，利用水洗淨有機層，利用硫酸鈉加以乾燥。將有機溶劑濃縮後，藉由矽膠層析法(氯仿：甲醇=97.5：2.5(v/v)~90：10(v/v))純化所獲得之殘渣，而獲得目標化合物(41mg，69%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.94(1H,s),8.20-8.12(1H,m),7.86-7.77(1H,m),7.65-7.52(2H,m),7.45(1H,s),7.38(2H,d,J=7.9Hz),7.30(1H,s),7.24-7.16(2H,m),7.11-7.01(1H,m),7.00(2H,s),6.91(2H,d,J=8.5Hz),6.83-6.67(1H,m),6.63-6.45(2H,m),6.31(1H,s),5.81-5.71(1H,m),5.23-5.14(1H,m),4.86-4.74(1H,m),4.43-4.32(1H,m),4.24-4.11(2H,m),4.03-3.88(3H,m),3.88-3.69(4H,m),3.76(3H,s), 3.66(3H,s),3.60-3.49(2H,m),3.47-3.08(5H,m),2.82-2.64(1H,m),2.40-2.29(1H,m),2.25-2.04(2H,m),2.04-1.89(1H,m),1.88-1.67(4H,m),1.63-1.38(7H,m),1.35-1.09(6H,m),0.90-0.76(6H,m),0.76-0.50(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1224(M+H)+
利用公知之方法(WO2014/057687)製作藥物連結基43及藥物連結基44(實施例146)之抗CLDN6抗體(實施例136(H1L1))-PBD ADC(半胱胺酸複合，m1=2)。該ADC表現出較強之抗腫瘤效果。
實施例146：藥物連結基44
Figure 107134301-A0305-02-0494-293
使實施例3步驟12中獲得之化合物(0.047g，0.046mmol)與市售之N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯甘胺酸(0.016g，0.050mmol)以與實施例145同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(30mg，50%)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.92(1H,s),8.23(1H,d,J=6.7Hz),8.12-8.02(2H,m),7.84(1H,d,J=9.1Hz),7.65-7.50(2H,m),7.45(1H,s),7.38(2H,d,J=9.1Hz),7.30(1H,s),7.26-7.16(2H,m),7.10-7.02(1H,m),7.00(2H,s),6.91(2H,d,J=9.1Hz),6.82-6.67(1H,m),6.62-6.48(2H,m),6.31(1H,s),5.80-5.72(1H,m),5.25-5.15(1H,m),4.85-4.77(1H,m),4.43-4.30(1H,m),4.25-4.14(2H,m),4.06-3.87(3H,m),3.86-3.71(6H,m),3.76(3H,s),3.71-3.62(2H,m),3.66(3H,s), 3.61-3.45(2H,m),3.45-3.08(1H,m),2.81-2.64(2H,m),2.39-2.29(1H,m),2.14-2.04(2H,m),2.05-1.90(1H,m),1.90-1.68(1H,m),1.62-1.39(7H,m),1.35-1.26(6H,m),1.26-1.13(6H,m),0.91-0.77(6H,m),0.75-0.52(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：1338(M+H)+
實施例147：藥物連結基45
Figure 107134301-A0305-02-0495-294
使實施例3步驟12中獲得之化合物(0.050g，0.049mmol)與市售之31-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-酸(0.029g，0.049mmol)以與實施例145同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(45mg，57%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1604(M+H)+
實施例148：藥物連結基46
Figure 107134301-A0305-02-0495-295
使實施例15步驟9中獲得之化合物(0.081g，0.085mmol)與市售之N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯甘胺酸(0.042g，0.13mmol)以與實施例16步驟1同樣之方式進行反應，而獲得目標化合物(0.089g，82%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1257(M+H)+
實施例149：藥物連結基47
Figure 107134301-A0305-02-0496-296
於室溫下向市售之N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯甘胺酸(0.036g，0.11mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(0.035g，0.14mmol)，於室溫下攪拌1小時。於反應溶液中添加實施例4步驟11中獲得之化合物(0.10g，0.10mmol)與甲醇(1mL)，於室溫下攪拌18小時。將反應溶液濃縮後，藉由矽膠層析法(氯仿~氯仿：甲醇=80：20(v/v))純化所獲得之殘渣，而獲得目標化合物(0.078g，60%)。
MS(APCI,ESI)m/z：1309(M+H)+
實施例150：藥物11
Figure 107134301-A0305-02-0496-297
[步驟1~4]
使實施例19步驟7中獲得之化合物以與實施例3步驟2、實施例3步驟 10、實施例3步驟11、實施例3步驟12同樣之方式進行反應，藉此獲得藥物11。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.89-7.80(1H,m),7.60-7.51(2H,m),7.43-7.40(1H,m),7.34-7.30(2H,m),6.91-6.88(2H,m),6.81(1H,d,J=3.0Hz),4.39-4.32(1H,m),4.11-4.06(4H,m),3.95(4H,d,J=3.0Hz),3.87-3.84(5H,m),3.68-3.61(2H,m),3.51-3.49(3H,m),3.44-3.34(2H,m),2.53(1H,dd,J=13.0,8.2Hz),2.01-1.96(4H,m),1.69-1.68(2H,m),1.30-1.25(1H,m),0.93-0.77(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：691(M+H)+.
實施例151：藥物12
Figure 107134301-A0305-02-0497-298
[步驟1]
將實施例47步驟3中獲得之化合物(0.77g，2.8mmol)溶解於二氯甲烷(20mL)中，於0℃下添加吡啶(0.338mL，4.20mmol)、氯甲酸烯丙酯(0.355mL，3.36mmol)，於室溫下攪拌2小時。將反應溶液濃縮後，將所獲得之殘渣溶解於甲醇(20mL)中，於室溫下添加碳酸鉀(1.93g，14.0mmol)，於該狀態下攪拌3小時。於反應溶液中添加水，於減壓下將甲醇蒸餾去除，於所獲得之殘渣中添加1當量濃度鹽酸，利用氯仿進行萃取。利用硫酸鈉乾燥有機層，過濾後，於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由矽膠管 柱層析法[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~0：100(v/v)]純化所獲得之殘渣，而以淡黃色固體之形式獲得目標化合物(0.921g，92%)。
MS(APCI,ESI)m/z：359(M+H)+.
[步驟2~4]
使上述步驟1中獲得之化合物以與實施例3步驟10~12同樣之方式進行反應，藉此獲得藥物12。
1HNMR(CDCl3)δ：7.89(1H,d,J=4.2Hz),7.59(1H,s),7.53(1H,s),7.40(1H,s),7.34(2H,d,J=8.5Hz),6.91(2H,d,J=8.5Hz),6.82(1H,s),6.05(1H,s),4.44-4.39(1H,m),4.16-4.11(2H,m),4.09-4.04(2H,m),3.99(2H,t,J=6.7Hz),3.95(3H,s),3.84(6H,s),3.72(1H,d,J=12.1Hz),3.59-3.49(3H,m),3.45-3.34(2H,m),2.00-1.92(4H,m),1.79(1H,dd,J=12.4,7.0Hz),1.70-1.64(2H,m),1.25(1H,t,J=7.0Hz),0.73-0.55(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：693(M+H)+.
實施例152：藥物13~16
[化256]
Figure 107134301-A0305-02-0499-299
[環丁基衍生物：藥物13]n=1，R=F
[步驟1]
於-78℃(乾冰-丙酮浴)下向市售之N-T-BOC-4-(3,3-二氟環丁基)-L-脯胺酸(OmegaChem公司之OC-0707)(12g，41mmol)之甲醇(200mL)溶液中緩慢滴加亞硫醯氯(10mL，138mmol)。滴加後，取下冷媒浴，將反應混合物於室溫下攪拌一晚。於減壓下將反應混合物進行濃縮，利用二乙醚洗淨殘渣，而獲得目標化合物(10g，定量(quant.))。
[步驟2]
於冰浴冷卻下向上述步驟1中獲得之化合物(10g，41.4mmol)與碳酸鈉(8.77g，82.7mmol)之1,4-二
Figure 107134301-A0305-02-0499-359
烷(200mL)、水(50mL)懸浮溶液中緩慢滴加氯甲酸苄酯(8.82mL，62.0mmol)。反應結束後，添加水，利用乙酸乙酯萃取反應混合物。利用水及飽和鹽水洗淨有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾後，於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得目標化合物。
[步驟3~15]
使上述步驟中獲得之化合物以與實施例1步驟1~5、實施例45步驟1~8同樣之方式進行反應，藉此獲得藥物13。
1HNMR(CDCl3)δ：7.72-7.71(1H,m),7.53-7.49(3H,m),7.34-7.28(2H,m),6.91-6.78(3H,m),6.06-6.03(1H,m),4.35-4.28(1H,m),4.16-4.04(2H,m),4.02-3.96(1H,m),3.94(3H,s),3.90-3.76(2H,m),3.84(2H,s),3.82(3H,s),3.59-3.31(2H,m),2.76-2.44(8H,m),1.99-1.88(4H,m),1.71-1.59(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：743(M+H)+.
[環丁基衍生物：藥物14]n=1，R=H
[步驟2~15]
使市售之4-環丁基-L-脯胺酸甲基酯鹽酸鹽(OmegaChem公司之OC-0728)以與上述步驟2、實施例1步驟1~5、實施例45步驟1~8同樣之方式進行反應，藉此獲得藥物連結基14。
1HNMR(CDCl3)δ：7.73-7.45(3H,m),7.34-7.14(2H,m),6.94-6.42(3H,m),6.05-5.99(1H,m),5.30-5.06(2H,m),4.49-4.28(2H,m),4.17-3.96(2H,m),3.95-3.79(9H,m),3.77-3.30(6H,m),2.77-2.70(1H,m),2.37-2.30(1H,m),2.19-1.85(8H,m),1.73-1.55(4H,m),1.30-1.16(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：707(M+H)+.
[環丙基衍生物：藥物15]n=0，R=F，*：(S)
使市售之N-t-BOC-4S-(2,2-二氟環丙基)-L-脯胺酸(OmegaChem公司之OC-0732)以與上述步驟1~15同樣之方式進行反應，藉此獲得藥物連結 基15。
1HNMR(CDCl3)δ：7.76-7.75(1H,m),7.54-7.47(3H,m),7.33-7.27(2H,m),6.93-6.85(2H,m),6.83-6.79(1H,m),6.08-5.96(1H,m),4.32-4.30(1H,m),4.16-3.96(3H,m),3.94(3H,s),3.84(3H,s),3.82(3H,s),3.74-3.67(3H,m),3.59-3.51(2H,m),3.39-3.34(1H,m),2.76-2.69(2H,m),2.38-2.33(1H,m),1.98-1.89(4H,m),1.69-1.54(4H,m),1.30-1.22(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：729(M+H)+.
[環丙基衍生物：藥物16]n=0，R=F，*：(R)
使市售之N-t-BOC-4R-(2,2-二氟環丙基)-L-脯胺酸(OmegaChem公司之OC-0722)以與上述步驟1~15同樣之方式進行反應，藉此獲得藥物連結基16。
1HNMR(CDCl3)δ：7.76-7.69(1H,m),7.55-7.44(3H,m),7.33-7.28(2H,m),6.94-6.80(2H,m),6.59-6.42(1H,m),6.08-5.97(1H,m),4.36-4.24(1H,m),4.20-3.95(3H,m),3.95-3.76(12H,m),3.75-3.50(2H,m),3.42-3.31(1H,m),2.79-2.52(2H,m),2.48-2.32(1H,m),2.06-1.83(4H,m),1.72-1.41(4H,m),1.28-1.15(2H,m).
MS(APCI,ESI)m/z：729(M+H)+.
實施例153：[N3-PEG(3)]2-SG(10)
步驟1：Fmoc-(SG-)Asn游離體
將Fmoc-(SG-)Asn(1S2S-11NC-Asn-Fmoc，糖鏈工學研究所製造，2g)溶解於適量之0.1%三氟乙酸水溶液中，分複數次進行逆相HPLC分離純化。以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液，裝 置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science製造)。將溶出中經UV檢測(220nm)出之含有目標物之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥。獲得無色固體(1.8g)。
步驟2：([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3之合成
Figure 107134301-A0305-02-0502-300
對步驟1中製備之Fmoc-(SG-)Asn游離體(1000mg)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(10ml)添加HATU(891mg，2.34mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(3ml)、11-疊氮基-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(東京化成工業股份有限公司，511mg，2.34mmol)與二異丙基乙基胺(816μL，4.69mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(3ml)，於37℃下攪拌3小時。進而，添加HATU(148mg，0.39mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(500μL)，於37℃下攪拌1小時。其後添加哌啶(386μL，3.91mmol)，於37℃下攪拌1小時。反應結束後，添加乙酸(469μL)。
將反應液以每支中一半之方式轉移至2支預先添加有二乙醚(100ml)之巨型錐形管(jumbo conical tube)(175ml)中。利用小型離心機(日立工機，CF16RX)使固形物沈澱，去除上清液。將膠狀之固形物轉移至離心管(50ml)中，添加二乙醚(30ml)、乙腈(10ml)並進行傾析。將該操作重複2次。以同樣方式添加適量之乙腈、或適量之二乙醚並進行傾析後，於 減壓下加以乾燥而獲得粗產物。將所獲得之固形物溶解於適量之0.2%三氟乙酸水溶液中，進行逆相HPLC分離純化。以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science製造)。將溶出中經UV檢測(220nm)出之含有目標物之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥，而以無色固體之形式獲得表述目標化合物(637mg)。
ESI-MS：C112H192N20O70：[M+3H]3+理論值980.6(ave.)，實際值980.4
步驟3：[N3-PEG(3)]2-SG(10)之合成
Figure 107134301-A0305-02-0503-301
於2ml之管中，將步驟-2中合成之([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3(78.6mg)溶解於pH值6.0之100mM磷酸緩衝液(Nacalai Tesque股份有限公司，465μL)中。添加1U/mL之EndoM(東京化成工業股份有限公司，70μL)，於28℃下振盪5小時後，於室溫下靜置4天。反應結束後，添加適量之0.2%三氟乙酸水溶液，進行逆相HPLC分離純化。以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science製 造)。將溶出中經UV檢測(220nm)出之含有目標物之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥，而以無色固體之形式獲得表述目標化合物(40mg)。
ESI-MS：C92H157N13O61：[M+2H]2+理論值1211.7(ave.)，實際值1211.5
實施例154：[N3-PEG(3)]-MSG2(9)、[N3-PEG(3)]-MSG1(9)
步驟1：(MSG1-)Asn與(MSG2-)Asn
於以下之條件下將作為市售品之monosialo-Asn free(1S2G/1G2S-10NC-Asn，糖鏈工學研究所股份有限公司製造)(稱為「(MSG-)Asn」)(500mg)進行逆相HPLC分離純化，分離為作為第一主峰(1st main peak)溶出之(MSG1-)Asn(保持時間15~19min左右)與作為第二主峰(2nd main peak)溶出之(MSG2-)Asn(保持時間21~26min左右)。使用0.1%甲酸水溶液作為溶離液，裝置使用ELS-PDA觸發分取系統(日本分光股份有限公司製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(10μm，30Φ×250mm，GL Science公司製造)，將流速設為30ml/min。將歸屬於溶出中經UV檢測(210nm)出之最初之峰值的溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥，而以無色固體之形式獲得(MSG1-)Asn(238mg)。將歸屬於經UV檢測出之第2個峰值之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥，而以無色固體之形式獲得(MSG2-)Asn(193mg)。
步驟-2：Fmoc-(MSG2-)Asn游離體
[化259]
Figure 107134301-A0305-02-0505-302
將步驟1中合成之(MSG2-)Asn(900mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺溶液(6ml)/蒸餾水(2ml)中，添加二異丙基乙基胺(0.23ml)與碳酸9-茀基甲酯N-丁二醯亞胺基酯(223mg)，於室溫下攪拌30分鐘。進而，添加二異丙基乙基胺(0.16ml)、碳酸9-茀基甲酯N-丁二醯亞胺基酯(74mg)及N,N-二甲基甲醯胺溶液(1ml)，於室溫下攪拌30分鐘。
將反應液以每支中一半之方式轉移至2支預先添加有二乙醚(80ml)/乙腈(4ml)之巨型錐形管(175ml)中。利用小型離心機(日立工機，CF16RX)，使固形物沈澱，去除上清液。將膠狀之固形物轉移至離心管(50ml)中，添加二乙醚(30ml)、乙腈(10ml)並進行傾析。將該操作重複2次。以同樣之方式添加適量之乙腈、或適量之二乙醚並進行傾析後，於減壓下加以乾燥而獲得粗產物。將所獲得之固形物溶解於適量之0.2%三氟乙酸水溶液中，進行逆相HPLC分離純化。以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science製造)。將溶出中經UV檢測(220nm)出之含有目標物之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥，而以無色固體之形式獲得表述目標化合物(830mg)。
步驟3：([N3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N3
[化260]
Figure 107134301-A0305-02-0506-303
使用步驟2中合成之Fmoc-(MSG2-)Asn(830mg)，以與實施例153之步驟2同樣之方法，以固體形式獲得表述目標物之粗產物(1.06g)。不進行進一步純化，而用於下一反應。
可以同樣之方式由Fmoc-(MSG1-)Asn合成下述([N3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N3。
Figure 107134301-A0305-02-0506-304
步驟4：[N3-PEG(3)]-MSG2(9)
Figure 107134301-A0305-02-0506-305
於2ml之收集瓶中，將步驟3中合成之([N3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N3粗產物(150mg)溶解於由200mM之KH2PO4與200mM之KH2PO4製備之pH值6.25之200mM磷酸鉀緩衝液(750μL)中。添加Endo-Rp(3μg)，於50℃下靜置16小時。反應結束後，添加5%三氟乙酸水溶液(150μL)，進行逆相HPLC分離純化。以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶離液，裝置使用ELS-PDA觸發分取系統(日本分光股份有限公司製造)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL Science製造)。將含有溶出中經UV檢測(210nm)出之目標物之溶出分彙總為一體，進行冷凍乾燥，而以無色固體之形式獲得表述目標化合物(62mg)。
ESI-MS：C73H124N8O51：[M+2H]2+理論值965.3(ave.)，實際值965.4
可以同樣之方式由([N3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N3合成下述[N3-PEG(3)]-MSG1(9)。
Figure 107134301-A0305-02-0507-306
產業上之可利用性
藉由使用本發明之抗體-藥物複合體、抗體及/或PBD衍生物等，可治療或預防各種癌。
序列表非關鍵文字
序列編號1：人CLDN6之胺基酸序列
序列編號2：編碼人CLDN6之胺基酸序列之cDNA之核苷酸序列
序列編號3：人CLDN9之胺基酸序列
序列編號4：編碼人CLDN9之胺基酸序列之cDNA之核苷酸序列
序列編號5：B1抗體輕鏈之CDRL1之胺基酸序列
序列編號6：B1抗體輕鏈之CDRL2之胺基酸序列
序列編號7：B1抗體輕鏈之CDRL3之胺基酸序列
序列編號8：人類化B1抗體輕鏈L4之CDRL3之胺基酸序列
序列編號9：B1抗體重鏈之CDRH1之胺基酸序列
序列編號10：B1抗體重鏈之CDRH2之胺基酸序列
序列編號11：B1抗體重鏈之CDRH3之胺基酸序列
序列編號12：C7抗體輕鏈之CDRL1之胺基酸序列
序列編號13：C7抗體輕鏈之CDRL2之胺基酸序列
序列編號14：C7抗體輕鏈之CDRL3之胺基酸序列
序列編號15：C7抗體重鏈之CDRH1之胺基酸序列
序列編號16：C7抗體重鏈之CDRH2之胺基酸序列
序列編號17：C7抗體重鏈之CDRH3之胺基酸序列
序列編號18：編碼B1抗體輕鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列
序列編號19：B1抗體輕鏈之可變區之胺基酸序列
序列編號20：編碼B1抗體重鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列
序列編號21：B1抗體重鏈之可變區之胺基酸序列
序列編號22：編碼C7抗體輕鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列
序列編號23：C7抗體輕鏈之可變區之胺基酸序列
序列編號24：編碼C7抗體重鏈之可變區之cDNA之核苷酸序列
序列編號25：C7抗體重鏈之可變區之胺基酸序列
序列編號26：含有人類輕鏈訊息序列及編碼人κ鏈恆定區之DNA序列之DNA片段
序列編號27：含有人類重鏈訊息序列及編碼人IgG1LALA恆定區之DNA序列之DNA片段
序列編號28：chB1輕鏈之胺基酸序列
序列編號29：含有編碼chB1輕鏈之胺基酸序列之DNA序列的DNA片段
序列編號30：chB1輕鏈之可變區之胺基酸序列
序列編號31：編碼chB1輕鏈可變區之核苷酸序列
序列編號32：chB1重鏈之胺基酸序列
序列編號33：編碼chB1重鏈之核苷酸序列
序列編號34：chB1重鏈之可變區之胺基酸序列
序列編號35：編碼chB1重鏈之可變區之核苷酸序列
序列編號36：人類化抗體輕鏈hL1之胺基酸序列
序列編號37：編碼人類化抗體輕鏈hL1之核苷酸序列
序列編號38：人類化抗體輕鏈hL1之可變區之胺基酸序列
序列編號39：編碼人類化抗體輕鏈hL1之可變區之核苷酸序列
序列編號40：人類化抗體輕鏈hL2之胺基酸序列
序列編號41：編碼人類化抗體輕鏈hL2之核苷酸序列
序列編號42：人類化抗體輕鏈hL2之可變區之胺基酸序列
序列編號43：編碼人類化抗體輕鏈hL2之可變區之核苷酸序列
序列編號44：人類化抗體輕鏈hL3之胺基酸序列
序列編號45：編碼人類化抗體輕鏈hL3之核苷酸序列
序列編號46：人類化抗體輕鏈hL3之可變區之胺基酸序列
序列編號47：編碼人類化抗體輕鏈hL3之可變區之核苷酸序列
序列編號48：人類化抗體輕鏈hL4之胺基酸序列
序列編號49：編碼人類化抗體輕鏈hL4之核苷酸序列
序列編號50：人類化抗體輕鏈hL4之可變區之胺基酸序列
序列編號51：編碼人類化抗體輕鏈hL4之可變區之核苷酸序列
序列編號52：人類化抗體重鏈hH1之胺基酸序列
序列編號53：編碼人類化抗體重鏈hH1之核苷酸序列
序列編號54：人類化抗體重鏈hH1之可變區之胺基酸序列
序列編號55：編碼人類化抗體重鏈hH1之可變區之核苷酸序列
序列編號56：人類化抗體重鏈hH2之胺基酸序列
序列編號57：編碼人類化抗體重鏈hH2之核苷酸序列
序列編號58：人類化抗體重鏈hH2之可變區之胺基酸序列
序列編號59：編碼人類化抗體重鏈hH2之可變區之核苷酸序列
序列編號60：人類化抗體重鏈hH3之胺基酸序列
序列編號61：編碼人類化抗體重鏈hH3之核苷酸序列
序列編號62：人類化抗體重鏈hH3之可變區之胺基酸序列
序列編號63：編碼人類化抗體重鏈hH3之可變區之核苷酸序列
序列編號64：曲妥珠單抗輕鏈之胺基酸序列
序列編號65：曲妥珠單抗重鏈之胺基酸序列
序列編號66：抗LPS抗體(h#1G5-H1L1)輕鏈之胺基酸序列
序列編號67：抗LPS抗體(h#1G5-H1L1)重鏈之胺基酸序列
序列編號68：抗TROP2抗體(hRS7)輕鏈之胺基酸序列
序列編號69：抗TROP2抗體(hRS7)重鏈之胺基酸序列
序列編號70：抗CD98抗體(hM23-H1L1)輕鏈之胺基酸序列
序列編號71：抗CD98抗體(hM23-H1L1)重鏈之胺基酸序列
序列編號72：編碼曲妥珠單抗變異體輕鏈之核苷酸序列
序列編號73：曲妥珠單抗變異體輕鏈之胺基酸序列
序列編號74：編碼曲妥珠單抗變異體重鏈之核苷酸序列
序列編號75：曲妥珠單抗變異體重鏈之胺基酸序列
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
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Claims (51)

  1. 一種抗體-藥物複合體，其係以下式表示，
    Figure 107134301-A0305-02-0592-307
     (式中，m1表示1至10之整數，Ab表示抗體或該抗體之抗原結合片段，該抗體之糖鏈可被重建，此處，經重建之糖鏈係指藉由酶反應等將不均勻之抗體之糖蛋白質進行重建而成之導入至抗體或該抗體之抗原結合片段的均勻之糖鏈，L表示將Ab與D連結之連結基，且係選自以下之群之任一連結基：-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、 -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，Z1表示以下之結構式：
    Figure 107134301-A0305-02-0593-308
     Z2表示以下之結構式：
    Figure 107134301-A0305-02-0593-309
     Z3表示以下之結構式：
    Figure 107134301-A0305-02-0593-310
     此處，於Z1、Z2及Z3之結構式中，星號表示與鄰接之基鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重建之糖鏈鍵結，B表示1,4-苯基，Ab係自Ab之糖鏈或經重建之糖鏈與L鍵結，D表示下式所表示之藥物，[化5]
    Figure 107134301-A0305-02-0594-311
     式中，星號表示與L鍵結，n1表示2至8之整數，A表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R1及R2各自獨立地表示C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、氫原子、羥基、硫醇基、C1~C6烷硫基、鹵素原子或-NR'R"，此處，R'及R"各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，R3、R4及R5選自下述(i)~(iii)，(i)R3及R4一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R5表示可具有選自群1之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者可具有選自群2之1個或複數個取代基之C1~C6烷基；(ii)R3表示氫原子，R4及R5與R4及R5所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環或者CH2=；(iii)R3、R4及R5與R3所鍵結之碳原子以及R4及R5所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群3之1個或複數個取代基之苯環或6員之雜環；R6及R7均表示氫原子，或者R6及R7成為一體，表示亞胺鍵(C=N)，R8為羥基或C1~C3烷氧基，X及Y各自獨立為氧原子、氮原子或硫原子，群1表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷氧基、b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-NR'R"、-C(=NR')-NR"R'''及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C6烷基、 c)鹵素原子、d)C3~C5環烷氧基、e)C1~C6烷硫基、f)-NR'R"、g)-C(=NR')-NR"R'''、h)-NHC(=NR')-NR"R'''、i)-NHCOR'、或j)羥基，此處，R'及R"如上文所定義，R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，群2表示鹵素原子、羥基、或C1~C6烷氧基，並且群3表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷基或C1~C6烷氧基)。
  2. 如請求項1之抗體-藥物複合體，其中A表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R1及R2各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R3及R4一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R5表示可具有選自群4之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者可具有選自群5之1個或複數個取代基之C1~C3烷基，X及Y為氧原子，群4表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷氧基、b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR"、-C(=NR')-NR"R'''、 及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C3烷基、c)C3~C5環烷氧基、d)-C(=NR')-NR"R'''、e)-NHC(=NR')-NR"R'''、或f)羥基，此處，R'、R"、及R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C3烷基，並且群5表示鹵素原子、羥基、或C1~C3烷氧基。
  3. 如請求項1之抗體-藥物複合體，其中A表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R1及R2各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R3表示氫原子，R4及R5與R4及R5所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或=CH2，並且X及Y為氧原子。
  4. 如請求項1之抗體-藥物複合體，其中A表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R1及R2各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R3、R4及R5與R3所鍵結之碳原子以及R4及R5所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群6之1個或複數個取代基之苯環，X及Y為氧原子，並且群6表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷基或 C1~C3烷氧基。
  5. 如請求項1或2之抗體-藥物複合體，其中D係由以下之2式之任一者表示，
    Figure 107134301-A0305-02-0597-312
     式中，星號表示與L鍵結。
  6. 如請求項1或3之抗體-藥物複合體，其中D係由以下之2式之任一者表示：
    Figure 107134301-A0305-02-0597-313
     式中，星號表示與L鍵結。
  7. 如請求項1之抗體-藥物複合體，其中L選自以下之群：-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B- CH2-OC(=O)-、及-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，B為1,4-苯基，Z1表示以下之結構式：
    Figure 107134301-A0305-02-0598-314
     此處，於Z1之結構式中，星號表示與鄰接於Z1之C(=O)鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重建之糖鏈鍵結。
  8. 一種抗體-藥物複合體，其係以下式表示，
    Figure 107134301-A0305-02-0598-315
     (式中，m1表示1至10之整數，Ab表示抗體或該抗體之抗原結合片段，L係以-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*表示，式中，星號表示與D鍵結，B表示1,4-苯基，Lp表示-GGVA-、或-VA，La表示-(CH2)n9-C(=O)-、或-(CH2CH2)n10-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n11-CH2CH2-C(=O)-，n9表示2~7之整數，n10表示1~3之整數，n11表示6~10之整數，Lb為-(丁二醯亞胺-3-基-N)-， Ab係自其胺基酸殘基直接與L鍵結，D表示下式所表示之藥物，
    Figure 107134301-A0305-02-0599-316
     式中，星號表示與L鍵結，n1表示2至8之整數，A表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R1及R2各自獨立地表示C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、氫原子、羥基、硫醇基、C1~C6烷硫基、鹵素原子或-NR'R"，此處，R'及R"各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，R3、R4及R5選自下述(i)~(iii)，(i)R3及R4一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R5表示可具有選自群1之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者可具有選自群2之1個或複數個取代基之C1~C6烷基；(ii)R3表示氫原子，R4及R5與R4及R5所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環或者CH2=；(iii)R3、R4及R5與R3所鍵結之碳原子以及R4及R5所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群3之1個或複數個取代基之苯環或6員之雜環；R6及R7均表示氫原子，或者R6及R7成為一體，表示亞胺鍵(C=N)，R8為羥基或C1~C3烷氧基，X及Y各自獨立為氧原子、氮原子或硫原子， 群1表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷氧基、b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-NR'R"、-C(=NR')-NR"R'''及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C6烷基、c)鹵素原子、d)C3~C5環烷氧基、e)C1~C6烷硫基、f)-NR'R"、g)-C(=NR')-NR"R'''、h)-NHC(=NR')-NR"R'''、i)-NHCOR'、或j)羥基，此處，R'及R"如上文所定義，R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，群2表示鹵素原子、羥基、或C1~C6烷氧基，並且群3表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷基或C1~C6烷氧基)。
  9. 如請求項8之抗體-藥物複合體，其中L表示選自以下之群之任一者：-(丁二醯亞胺-3-基-N)-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-(丁二醯亞胺-3-基-N)-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-(丁二醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-， 此處，B為1,4-苯基。
  10. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中抗體為IgG。
  11. 如請求項10之抗體-藥物複合體，其中抗體為IgG1、IgG2或IgG4。
  12. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中抗體與腫瘤細胞結合，並納入至腫瘤細胞內而內化。
  13. 如請求項12之抗體-藥物複合體，其中抗體進而具有抗腫瘤效果。
  14. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中抗體係自與抗體之Asn297鍵結之糖鏈(N297糖鏈)與L鍵結。
  15. 如請求項14之抗體-藥物複合體，其中N297糖鏈為經重建之糖鏈。
  16. 如請求項14之抗體-藥物複合體，其中N297糖鏈為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或該等之混合物、或者N297-(Fuc)SG：
    Figure 107134301-A0305-02-0601-355
     式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上， L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L鍵結，並且n5表示2~10之整數；
    Figure 107134301-A0305-02-0602-318
     式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-6鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L鍵結，並且n5表示2~10之整數；以及
    Figure 107134301-A0305-02-0602-319
     式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L鍵結，並且n5表示2~10之整數。
  17. 如請求項16之抗體-藥物複合體，其中n5為2~5之整數。
  18. 如請求項14之抗體-藥物複合體，其係以下式表示：
    Figure 107134301-A0305-02-0603-320
     (式中，m2表示1或2之整數，L係將Ab之N297糖鏈與D連結之連結基，且係選自以下之群之任一連結基：-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，B為1,4-苯基，Z1表示以下之結構式：
    Figure 107134301-A0305-02-0603-322
     此處，於上述所示之Z1之結構式中，星號表示與鄰接於Z1之C(=O)鍵結，波形線表示與Ab之N297糖鏈鍵結，Ab表示IgG抗體或該抗體之抗原結合片段，Ab之N297糖鏈表示具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或該等之混合物、或者N297-(Fuc)SG之任一者，
    Figure 107134301-A0305-02-0604-323
    Figure 107134301-A0305-02-0604-324
    Figure 107134301-A0305-02-0604-325
     上述式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，N297糖鏈中之L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-*，此處，n5表示2~5之整數，左端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側或/及1-6鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與上述連結基L中之Z1之三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結，D為選自以下之群之任一者，[化17]
    Figure 107134301-A0305-02-0605-326
     此處，式中，星號表示與L鍵結)。
  19. 一種抗體-藥物複合體，其選自以下之群：
    Figure 107134301-A0305-02-0605-327
     [化19]
    Figure 107134301-A0305-02-0606-328
    Figure 107134301-A0305-02-0606-330
     或[化21]
    Figure 107134301-A0305-02-0607-331
     於上述所示之各結構式中，m2表示1或2之整數，Ab表示IgG抗體或其抗原結合片段，Ab之N297糖鏈表示具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或該等之混合物、或者N297-(Fuc)SG之任一者，
    Figure 107134301-A0305-02-0607-332
    Figure 107134301-A0305-02-0607-333
    Figure 107134301-A0305-02-0607-334
     式中，波形線表示鍵結於抗體之Asn297上，N297糖鏈中之L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*， 此處，左端之胺基表示與N297糖鏈之β-Man之支鏈之1-3鏈側或/及1-6鏈側之非還原末端之唾液酸之2位之羧酸進行醯胺鍵結，星號表示與各結構式中之三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結。
  20. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中上述抗體為抗HER2抗體、抗DLL3(Delta like protein3，δ樣蛋白3)抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗FGFR2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素(Mesothelin)抗體、抗EGFR抗體或抗DR5抗體。
  21. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中上述抗體為單株抗體。
  22. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中上述抗體具有抗體依存性細胞傷害(ADCC)活性及/或補體依存性細胞傷害(CDC)活性。
  23. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中上述抗體包含人IgG1之重鏈恆定區，且包含降低ADCC及/或CDC活性之變異。
  24. 如請求項23之抗體-藥物複合體，其中上述抗體包含人IgG1之重鏈恆 定區，且由EU Index所示之234位及235位之白胺酸被置換為丙胺酸。
  25. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中D係以下式表示：
    Figure 107134301-A0305-02-0609-335
  26. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中D係以下式表示：
    Figure 107134301-A0305-02-0609-336
  27. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物複合體，其中抗體-藥物複合體中之抗體每1分子之平均藥物結合數為1~3或3~5。
  28. 一種化合物、其鹽、或該等之水合物，該化合物係以下式表示，
    Figure 107134301-A0305-02-0609-337
     (式中，l表示2至8之整數，E表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R9及R10各自獨立地表示C1~C6烷氧基、C1~C6烷基、氫原子、羥 基、硫醇基、C1~C6烷硫基、鹵素原子或-NR'R"，此處，R'及R"各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，R11、R12及R13選自下述(i)~(iii)，(i)R11及R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R13表示可具有選自群7之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者可具有選自群8之1個或複數個取代基之C1~C6烷基；(ii)R11表示氫原子，R12及R13與R12及R13所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或3~5員之飽和雜環或CH2=；或(iii)R11、R12及R13與R11所鍵結之碳原子以及R12及R13所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群9之1個或複數個取代基之苯環或6員之雜環，R13表示單鍵，R14及R15均表示氫原子，或者R14及R15成為一體，表示亞胺鍵(C=N)，R16及R17表示下述(a)或(b)，(a)R16及R17一起形成亞胺鍵(N=C)；(b)R16為J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*，式中，星號表示與鄰接於R16之氮原子鍵結，B'表示苯基或雜芳基，Lp'表示包含可在標的細胞中切斷之胺基酸序列之連結基，La'表示選自以下之群之任一者：-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-、 -C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-、-(CH2)n8-O-C(=O)-、-(CH2)n12-C(=O)-、及-(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-，此處，式中，n6表示1~3之整數，n7表示1~5之整數，n8表示0~2之整數，n12表示2~7之整數，n13表示1~3之整數，n14表示6~10之整數，J表示以下所示之任一者，
    Figure 107134301-A0305-02-0611-338
     此處，於上述所示之J之結構式中，星號表示與La'鍵結，R17表示羥基或C1~C3烷氧基，V及W各自獨立為氧原子、氮原子、或硫原子，群7表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷氧基、b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR'、-NR'R"、-C(=NR')-NR"R'''及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C6烷基、c)鹵素原子、d)C3~C5環烷氧基、e)C1~C6烷硫基、f)-NR'R"、g)-C(=NR')-NR"R'''、 h)-NHC(=NR')-NR"R'''、i)-NHCOR'、或j)羥基，此處，R'及R"如上文所定義，R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C6烷基，群8表示鹵素原子、羥基、或C1~C6烷氧基，並且群9表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C6烷基或C1~C6烷氧基)。
  29. 如請求項28之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中E表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R9及R10各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R11及R12一起與各基所鍵結之碳原子共同形成雙鍵，R13表示可具有選自群10之1個或複數個取代基之芳基或雜芳基、或者可具有選自群11之1個或複數個取代基之C1~C3烷基，V及W為氧原子，群10表示：a)可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷氧基、b)可經1~3個選自鹵素原子、羥基、-OCOR"、-C(=NR')-NR"R'''、及-NHC(=NR')-NR"R'''之任一者取代之C1~C3烷基、c)C3~C5環烷氧基、d)-C(=NR')-NR"R'''、e)-NHC(=NR')-NR"R'''、或f)羥基， 此處，R'、R"、及R'''各自獨立地表示氫原子或C1~C3烷基，並且群11表示鹵素原子、羥基、或C1~C3烷氧基。
  30. 如請求項28之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中E表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R9及R10各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R11表示氫原子，R12及R13與R12及R13所鍵結之碳原子一起形成3~5員之飽和烴環或CH2=，並且V及W為氧原子。
  31. 如請求項28之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中E表示可經2個氟原子取代之螺鍵結之3~4員之飽和烴環，R9及R10各自獨立地表示C1~C3烷氧基，R11、R12及R13與R11所鍵結之碳原子以及R12及R13所鍵結之碳原子一起形成可具有選自群12之1個或複數個取代基之苯環，V及W為氧原子，並且群12表示鹵素原子、或者可經1~3個鹵素原子取代之C1~C3烷基或C1~C3烷氧基。
  32. 如請求項28至31中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中B'為選自1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基、2,5-噻吩基之任一者。
  33. 如請求項32之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中B'為1,4-苯基。
  34. 如請求項28至31中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中Lp'為選自以下之群之胺基酸殘基：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)P-I-、及-GGPL-。
  35. 如請求項28至31中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中La'選自以下之群：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-、-(CH2)5-C(=O)-、及-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-。
  36. 如請求項28至31中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中R16係以J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*表示，式中，B'為1,4-苯基，Lp'表示選自以下之群之任一者：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、- GGVK-、及-GGPL-，La'表示選自以下之群之任一者：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-、-(CH2)5-C(=O)-、及-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-，並且J表示以下所示之任一者：
    Figure 107134301-A0305-02-0615-339
     此處，於J之結構式中，星號表示與La'鍵結。
  37. 如請求項28至31中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中R16選自以下之群：J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B'-CH2-OC(=O)-、 J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、及J4-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-，此處，J1、J2、J3、J4表示以下之結構式：
    Figure 107134301-A0305-02-0616-340
     此處，於J1、J2、J3及J4之結構式中，星號表示與鄰接之基鍵結，並且B'為1,4-苯基。
  38. 如請求項28至31中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中R16選自以下之群：J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-、及J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-，此處，B'為1,4-苯基，J1、J4表示以下之結構式：
    Figure 107134301-A0305-02-0617-341
     此處，於J1及J4之結構式中，星號表示與鄰接之基鍵結。
  39. 一種化合物、其鹽、或該等之水合物，該化合物係以下式表示之任一者：[化32]
    Figure 107134301-A0305-02-0618-342
  40. 一種化合物、其鹽、或該等之水合物，該化合物係以下式表示之任一者：
    Figure 107134301-A0305-02-0618-343
  41. 如請求項28至31及40中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物，其中該化合物係以下式表示：
    Figure 107134301-A0305-02-0618-344
  42. 如請求項28至31及40中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物， 其中該化合物係以下式表示：
    Figure 107134301-A0305-02-0619-345
  43. 一種化合物，其表現出具有與Table1或Table2所記載者實質上類似之峰值位置之質子NMR：Table 1：1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.93(1H,s),8.21-8.16(2H,m),8.07-8.04(1H,m),7.83-7.64(2H,m),7.60-7.55(3H,m),7.51-7.28(10H,m),7.19-7.16(2H,m),7.10-7.04(1H,m),6.92-6.90(2H,m),6.76-6.70(1H,m),6.39(1H,s),5.77-5.75(1H,m),5.21-5.18(1H,m),5.03-4.99(1H,m),4.82-4.79(1H,m),4.37-4.35(1H,m),4.21-4.20(2H,m),4.02-3.24(26H,m),3.16-3.13(1H,m),2.79-2.59(2H,m),2.39-2.28(2H,m),2.05-1.97(2H,m),1.91-1.77(4H,m),1.57-1.54(3H,m),1.28-1.23(3H,m),0.85-0.80(6H,m),0.67-0.61(4H,m)；Table 2：1H-NMR(DMSO-D6)δ：9.91(1H,s),8.32(1H,s),8.23-7.91(3H,m),7.81-7.19(14H,m),7.04(1H,m),6.80-6.62(3H,m),5.77-5.75(1H,m),5.20(1H,m),5.01(1H,m),4.79(1H,m),4.46-4.35(1H,m),4.04(4H,m),3.86-3.38(18H,m),3.22-3.15(2H,m),2.67-2.63(1H,m), 2.46-2.23(3H,m),2.09-1.91(2H,m),1.80-1.78(5H,m),1.57(3H,m),1.27(3H,s),1.11-1.04(1H,m),0.87-0.79(6H,m),0.63-0.55(6H,m)。
  44. 一種醫藥組合物，其特徵在於含有選自如請求項1至27中任一項之抗體-藥物複合體、其鹽、或該等之水合物、及如請求項28至43中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物之任一者。
  45. 如請求項44之醫藥組合物，其係抗腫瘤藥。
  46. 如請求項44或45之醫藥組合物，其中腫瘤為卵巢癌、肺癌、胃癌、子宮體癌、睾丸癌、子宮頸癌、胎盤絨毛膜癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、腦腫瘤、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌或食道癌。
  47. 如請求項46之醫藥組合物，其中卵巢癌為表層上皮性腫瘤、間質性腫瘤或胚細胞腫瘤，肺癌為非小細胞肺癌或小細胞肺癌，睾丸癌為精原細胞瘤或非精原細胞瘤。
  48. 一種選自如請求項1至27中任一項之抗體-藥物複合體、其鹽、或該等之水合物、及如請求項28至43中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物之任一者的用途，其係用以製造對個體投予之抗腫瘤用醫藥組合物者。
  49. 如請求項48之用途，其中腫瘤為卵巢癌、肺癌、胃癌、子宮體癌、睾丸癌、子宮頸癌、胎盤絨毛膜癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、腦腫瘤、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌或食道癌。
  50. 如請求項49之用途，其中卵巢癌為表層上皮性腫瘤、間質性腫瘤或胚細胞腫瘤，肺癌為非小細胞肺癌或小細胞肺癌，睾丸癌為精原細胞瘤或非精原細胞瘤。
  51. 一種選自如請求項1至27中任一項之抗體-藥物複合體、其鹽、或該等之水合物、及如請求項28至43中任一項之化合物、其鹽、或該等之水合物之至少一者的用途，其係用以製造與至少一種抗腫瘤藥同時、分開或連續對個體投予之抗腫瘤用醫藥組合物者。
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