TW202535955A - 用於ｐｔｋ７檢測之抗體及方法 - Google Patents

Abstract

本揭露提供與蛋白酪胺酸激酶7 (PTK7)特異性結合之抗體以及採用此類抗體之方法。在一些情況下，該PTK7抗體係用於可檢測來自患者之組織中存在PTK7表現細胞之免疫組織化學(IHC)檢定。

Description

用於ＰＴＫ７檢測之抗體及方法

相關申請案之交互參照本申請案主張於2023年11月27日提出申請之美國臨時申請案US63/603,097之優先權，其全文以引用方式併入本文中。序列表

本申請案包含以ASCII格式電子提交之序列表，且其全文特此以引用方式併入本文中。該ASCII副本(建立於2023年11月12日)係命名為2023-11-12-Sequence listing-20896-0005PR00.xml，且檔案大小為33,079位元組。

本揭露大致上關於PTK7之抗體及相關方法，且特別是關於檢測PTK7及PTK7陽性細胞及組織之PTK7抗體及IHC方法。

免疫組織化學(IHC)係診斷及外科病理學中廣泛使用之輔助測試方法。IHC之主要原始目的係用於細胞分類及判定來源器官。IHC之使用進一步擴展以探討在許多惡性病中之預測及預後生物標記，包括但不限於乳房、胃腸道、肝臟、肺臟、卵巢、血液淋巴、中樞神經系統等之惡性病。IHC利用抗體靶向在特定組織及細胞中之某些抗原以促進識別受關注細胞。

選擇合適目標抗原且適當建構與目標抗原結合之抗體決定IHC之特異性及敏感度。蛋白酪胺酸激酶7 (PTK7)亦稱為結腸癌激酶4 (CCK4)，被發現在許多類型之癌細胞中高度表現，且在人類的正常組織上表現有限。因此，其係用於檢測癌細胞及進一步用於癌症診斷之有吸引力的生物標記。然而，建構有效PTK7抗體之進展緩慢。對於可用於PTK7陽性細胞檢測及作為可靠IHC套組之關鍵組分的PTK7抗體有急切需求。本揭露之實施例處理此需求及相關需求。

本文提供蛋白酪胺酸激酶7 (PTK7)結合劑(例如抗體)及使用彼之方法。PTK7結合劑可包含：重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有選自如以下組成之群組所示之胺基酸序列組的胺基酸序列：分別為SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、LVS及SEQ ID NO: 7；分別為SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、QMS及SEQ ID NO: 14；及分別為SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、RVS及SEQ ID NO: 21。

在一些實施例中，VH及VL區具有選自如以下組成之群組所示之胺基酸序列對的胺基酸序列：分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2；分別為SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16。

在一些實施例中，VH及VL區具有選自如以下組成之群組所示之胺基酸序列對的胺基酸序列：分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2；分別為SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO；及分別為SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16，其中該重鏈及輕鏈框架區可選地經該框架區中之1至8個胺基酸取代、缺失或插入修飾。

在一些實施例中，結合劑之框架區係人類框架區。

在一些實施例中，結合劑之框架區係小鼠框架區。

在一些實施例中，該結合劑係抗體。在一些實施例中，結合劑係單株抗體。

在一些實施例中，結合劑進一步包含重鏈恆定區及/或輕鏈恆定區。

在一些實施例中，重鏈恆定區係IgG同型。在某些實施例中，重鏈恆定區係人類IgG1恆定區或人類IgG4恆定區。在某些實施例中，重鏈恆定區係小鼠IgG1恆定區、小鼠IgG2a恆定區、小鼠IgG2c恆定區或小鼠IgG3恆定區。在某些實施例中，重鏈恆定區具有如SEQ ID NO: 22、24或26所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，輕鏈恆定區具有如SEQ ID NO: 23、25或27所示之胺基酸序列。

在某些實施例中，結合劑係單株抗體，該單株抗體包含：具有如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列的VH區、具有如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的VL區、具有如SEQ ID NO: 22所示之胺基酸序列的重鏈恆定區及具有如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。

在某些實施例中，結合劑係單株抗體，該單株抗體包含：具有如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的VH區、具有如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的VL區、具有如SEQ ID NO: 24所示之胺基酸序列的重鏈恆定區及具有如SEQ ID NO: 25所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。

在某些實施例中，結合劑係單株抗體，該單株抗體包含：具有如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的VH區、具有如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列的VL區、具有如SEQ ID NO: 26所示之胺基酸序列的重鏈恆定區及具有如SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。

本揭露亦提供一種檢測樣本中之PTK7表現細胞之方法，其包含：使樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸，及檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物，其中檢測到結合複合物表示樣本中存在PTK7表現細胞。

在一些實施例中，檢測劑進一步包含標示結合劑之可檢測標記。在某些實施例中，可檢測標記包括生物素或酶標記。在某些實施例中，酶標記包括辣根過氧化酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)。

在一些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：添加可檢測標記之夥伴劑；及檢測可檢測標記與夥伴劑之反應作為形成結合複合物之指示。

在一些實施例中，可檢測標記包括螢光標籤。在某些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：檢測來自螢光標籤之訊號作為形成結合複合物之指示。

在一些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：使樣本與二級抗體接觸，該二級抗體係經標示及組態以結合至該結合複合物；及檢測來自二級抗體之訊號作為形成結合複合物之指示。

在一些實施例中，二級抗體係經可檢測之標記標示。在某些實施例中，可檢測標記包括生物素或酶標記。在某些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：添加可檢測標記之夥伴劑；及檢測可檢測標記與夥伴劑之反應作為形成結合複合物之指示。在某些實施例中，可檢測標記包括螢光標籤。在某些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：檢測來自螢光標籤之訊號作為形成結合複合物之指示。在某些實施例中，螢光標籤包括螢光素(FITC)、藻紅素(PE)(較佳地R-PE)或別藻藍蛋白(APC)。

在一些實施例中，樣本係來自個體之組織。在某些實施例中，組織選自由扁桃腺、闌尾、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、子宮頸、腎、胰臟、膀胱、腦、甲狀腺、耳、鼻、咽喉及食道所組成之群組。在某些實施例中，組織選自由乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、食道及膀胱所組成之群組。在某些實施例中，組織係乳房。在某些實施例中，組織係卵巢。

在一些實施例中，樣本係來自個體且存在PTK7表現細胞指示該個體罹患疾病。

在一些實施例中，樣本係來自個體且該方法進一步包含：定量該樣本中之結合PTK表現細胞以獲得定量結果，其中該定量結果超過預定閾值指示該個體罹患疾病。

在一些實施例中，疾病係癌症。

在某些實施例中，疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。在某些實施例中，疾病係乳癌。在某些實施例中，疾病係卵巢癌。在某些實施例中，疾病係肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。

在一些實施例中，本揭露提供一種測定個體是否罹患疾病之方法，包含：自個體獲得樣本；使樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸，藉由檢測及/或定量檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定個體是否罹患疾病，其中存在結合複合物或結合複合物之水準超過預定閾值指示個體罹患疾病。在一些實施例中，疾病係癌症。

在一些實施例中，本揭露提供一種治療患者的疾病之方法，該患者藉由本文所述之檢測方法測定為患有該疾病。在一個實施例中，檢測方法包含自個體獲得樣本；使樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸；藉由檢測及/或定量檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定個體是否罹患疾病，其中存在結合複合物或結合複合物之水準超過預定閾值指示個體罹患疾病。在一些實施例中，結合劑包含VH及VL區，該VH及VL區包含如以下所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2；分別為SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO:9；或分別為SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16。

在一些實施例中，疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤及肺癌所組成之群組。

在某些實施例中，治療包括向個體投予化學療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予荷爾蒙療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予放射療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予免疫療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予幹細胞療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予靶向療法。

在某些實施例中，治療包括在個體實施手術。

在某些實施例中，疾病係乳癌且治療包括腫瘤切除術或乳房切除術。

在某些實施例中，疾病係卵巢癌且治療包括子宮切除術或輸卵管卵巢切除術。

亦提供用於治療患者的癌症之方法中之抗癌劑，該方法包含：使來自患者之樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸；藉由檢測及/或定量檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定個體是否罹患疾病，其中存在結合複合物或結合複合物之水準超過預定閾值指示個體罹患疾病；及若個體經測定為超過該預定閾值，則以抗癌劑治療疾病。可能的抗癌劑包括任何本文中提及者，例如化學療法或免疫療法藥劑。

進一步提供用於製造藥物之抗癌劑，該藥物用於藉由方法來治療癌症，該方法包含：使來自患者之樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸；藉由檢測及/或定量檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定個體是否罹患疾病，其中存在結合複合物或結合複合物之水準超過預定閾值指示個體罹患疾病；及若個體經測定為超過該預定閾值，則以抗癌劑治療疾病。

在一些實施例中，本揭露提供一種監測個體的疾病之進展之方法，其包含以下步驟：自個體獲得樣本；使樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸；評估檢測劑與PTK7之間形成結合複合物以獲得第一評估結果；在後續時間點使用來自個體之樣本重複步驟(a)、(b)及(c)以獲得第二評估結果；及比較第二評估結果與第一評估結果以決定個體的疾病之進展。在某些實施例中，疾病係癌症。

在一些實施例中，本揭露提供一種用於檢測樣本中之PTK7表現細胞之套組，該套組包含檢測劑，該檢測劑包含本揭露之結合劑。在一些實施例中，套組進一步包括第二抗體，該第二抗體係經標示及組態以結合至由檢測劑及PTK7形成之結合複合物。在一些實施例中，套組進一步包含實施本發明之方法之說明。

本揭露之此等及其他態樣可藉由參照下列實施方式、特定實施例之非限制性實例及附圖來更完整理解。

下列說明的呈現使任何所屬技術領域中具有通常知識者得以製作及使用本揭露，且係在特定應用及其必要條件之範疇下提供。對揭示實施例的各種修飾將為所屬技術領域中具有通常知識者所顯而易見，且本文中定義之常規原理可在不背離本揭露之精神及範疇下施加至其他實施例及應用。因此，本揭露不限於所顯示之實施例，而是符合與申請專利範圍一致之最廣泛範疇。

本文所使用之用語僅為了說明特定範例實施例，並無意圖加以限制。如本文中所使用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」意圖包括複數形式。進一步應理解，當用於本說明書時，用語「包含(comprises/comprising)」、「包括(includes/ including)」指明所陳述之特點、整數、步驟、操作、元件及/或組分之存在，但不排除一或多個其他特點、整數、步驟、操作、元件、組分及/或其群組之存在或添加。

在參照附圖考慮下列說明後，本揭露之此等及其他特點及特徵以及操作方法及結構之相關元件的功能及部件組合及製造經濟可變得更為顯而易見，以上所有形成本說明書之一部分。然而，應明白了解，圖式僅為了例示說明之目的，並無意圖限制本揭露之範疇。應理解，圖式並非按比例描繪。

當在本文中闡述治療之方法時，亦提供用於所闡述之治療之方法中的所指稱之產物。進一步提供所指稱之產物於製造用於治療所指稱之病況的藥物之用途。亦提供醫藥組成物，其包含用於該方法之該產物。

所有在本文中提及之參考文獻全文以引用方式併入本文中。本申請案之優先權申請案全文亦以引用方式併入本文中。定義

出於方便，此處定義本說明書、實例及申請專利範圍中之某些用語。除非另外說明或在上下文中明示，下列用語及片語具有以下提供之意義。提供定義是為了協助說明具體實施例，並無意圖限制申請專利之揭露，因為本揭露之範圍僅受到申請專利範圍之限制。除非另行定義，否則本文所使用之所有技術及科學用語具有本揭露所屬技術領域中具有通常知識者所經常理解之相同意義。

如本文中所使用且除非另外指示，否則用語「一(a/an)」係指「一個(one)」、「至少一個(at least one)」或「一或多個(one or more)」。除非上下文另外要求，否則本文所使用之單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。

除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明及申請專利範圍中，用語「包含(comprise/comprising)」及類似用語應解讀為具有包容性意義而非排他性或窮舉性意義；也就是說，其意義為「包括但不限於(including, but not limited to)」。在本文中使用「包含」或類似用語闡述某事物時，亦提供「由...所組成(consisting of)」之實施例。

本文中使用之用語「降低(decreased/ decrease)」、「減少(reduce/reduced/reduction)」及「抑制(inhibit)」通常都是指相對於參照物降低統計顯著性的量。

本文中使用之用語「增加(increased/ increase)」、「增強(enhance)」或「活化(activate)」通常都是指相對於參照物增加統計顯著性的量。

如本文中所使用，用語「蛋白質(protein)」及「多肽(polypeptide)」在本文中可互換使用以表示一系列胺基酸殘基，其各自藉由相鄰殘基之α-胺基與羧基基團之間的肽鍵彼此連接。用語「蛋白質」及「多肽」亦指胺基酸之聚合物，包括經修飾之胺基酸(例如磷酸化、糖化、糖基化等)及胺基酸類似物，與其大小或功能無關。「蛋白質」及「多肽」通常用於指稱相對大型之多肽，而「肽(peptide)」通常用於指稱小型多肽，但此等用語在所屬技術領域中之使用互有重疊。當指稱經編碼之基因產物及其片段時，用語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用。因此，例示性多肽或蛋白質包括基因產物、天然存在蛋白質、同源物、異種同源物、同種同源物、片段及前述之其他等效物、變體、片段及類似物。

PTK7(蛋白酪胺酸激酶樣7)係受體蛋白酪胺酸激酶家族之成員，亦稱為結腸癌激酶4 (CCK4)。在人類中，此蛋白質係PTK7基因編碼。PTK7在許多類型的癌細胞(包括但不限於實體腫瘤)的表面上過度表現。此類實體腫瘤包括但不限於乳癌(BC)、肺癌(LC)、食道癌(EsC)、胃癌(GC)、膀胱癌(BLC)、子宮內膜癌(EC)、卵巢癌(OVC)、頭頸癌(HNC)以及血液惡性病。人類PTK7多肽包括但不限於該些具有如UniProt識別號Q13308所示之胺基酸序列者，及該些具有如Genbank諸如但不限於GenBank編號NP_002812.2、NP_690619.1、NP_690620.1、NP_690621.1、NP_001257327.1、XP_011513067.1、XP_011513068.1、XP_047275113.1、XP_054212039.1、XP_054212040.1及XP_054212041.1所示之胺基酸序列者，其係以引用方式併入本文中。雖然缺乏可偵測的催化酪胺酸激酶活性，但PTK7過度表現與Wnt傳訊有緊密關聯，且促進癌細胞的幹細胞性(stemness)、存活及腫瘤進展(參見例如Atasaven et al.,2013；Cui et al., 2021；Gärtner, 2014；Chen et al., 2014；Jiang et al., 2020；Shin et al., 2013；Liu et al., 2017；Lin et al., 2012；Özçelik et al., 2020；Xiang et al., 2022；Wang et al., 2014；Prebet et al., 2010；Jiang et al., 2012；Damelin et al., 2017)。PTK7在正常組織諸如膀胱、腎、乳腺、肺部、卵巢、子宮及樹突細胞中的表現通常為低，雖然據報告在消化道中有一些水準的蛋白質表現(Damelin et al., 2017)。因此PTK7係具有前景的新穎抗癌症療法之目標。

如本文中所使用，「表位(epitope)」係指通常由免疫球蛋白VH/VL對(諸如抗體)、其抗原結合部分及本文所述之其他結合劑結合之胺基酸。表位可在多肽上自連續胺基酸或藉由蛋白質之三級摺疊而並列之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之表位一般在暴露於變性溶劑後保留，然而藉由三級摺疊形成之表位一般在變性溶劑處理後喪失。表位一般包括呈獨特空間構形之至少3個、且更通常為至少5個、約9個、或約8至10個胺基酸。表位定義抗體、其抗原結合部分及其他結合劑之最小結合位點，且因此代表抗體、其抗原結合部分或其他基於免疫球蛋白之結合劑的特異性之目標。以單域抗體為例，表位代表由單獨的可變域結合之結構單元。除了本文中闡述之特異性結合劑(特別是抗體)，亦提供與所提供之特異性抗體的相同表位結合之結合劑(特別是抗體)。亦提供結合劑(特別是抗體)，其交叉阻斷本文中闡述之特異性結合劑(特別是抗體)。

如本文中所使用，「結合劑(binding agent)」係一般用語，該用語係指以10^-5M (10000 nM)或更小，例如10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或更小之KD與目標(諸如人類PTK7蛋白質)結合之分子。結合劑可為抗體，諸如但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFab、Fv、scFv、VH、VHH、VL、VLR及類似物、雙體抗體(diabodies)、單株抗體(mAb)、多株抗體(pAb)、mAbdAb、噬菌體展示衍生性結合物、親和抗體(affibodies)、異源共軛抗體、雙特異性抗體及工程化可變片段抗體(evibodies)。在一個實施例中，結合劑係抗體。在一個實施例中，結合劑係包含二個重鏈及二個輕鏈之抗體。在一個實施例中，結合劑係單株抗體。特異性結合可受到例如抗體、抗原結合部分或其他結合劑之親和力及親合力及目標多肽之濃度影響。所屬技術領域中具有通常知識者可使用任何合適方法，諸如在合適細胞結合檢定中滴定抗體或其他結合劑，來決定本文所述之抗體、抗原結合部分及其他結合劑選擇性地與PTK7結合之適當條件。與PTK7特異性結合之結合劑不被非類似競爭者取代。在某些實施例中，當PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑在蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中優先辨識其目標抗原PTK7時，其被稱為與PTK7特異性結合。

本文所指稱之抗體具體涵蓋保留PTK-7能力之抗體片段。因此，無論在本文何處指稱抗體，亦提供其抗原結合片段抗體片段之實例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFab、Fv、scFv、VH、VHH、VL及VLR抗體。

本文揭示變體結合劑，例如具有定義數量之序列變化的結合劑。變體抗體將仍能結合PTK7蛋白質。因此，在一個實施例中，變體抗體將仍能結合PTK7蛋白質。在一個實施例中，變體抗體在IHC中將仍給出相同或類似結果。例如，變體抗體將仍可用於實施本文所述之IHC方法中之一者。在一個實施例中，除了能結合PTK7之外，變體將保留本文中提及之至少一種其他特定功能。

如本文中所使用，「可檢測標記(a detectable marker)」係指附接至或用於標示結合劑或二級抗體且可用於產生可檢測訊號之分子，該可檢測訊號可藉由產色或螢光檢測(例如觀測)或藉由其他手段評估。此類可檢測標記可包括但不限於酶受質(例如生物素)、酶(例如辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶及β-半乳糖苷酶等)及螢光標籤(例如螢光染料，諸如但不限於螢光素(FITC)、藻紅素(PE；例如R-PE)或別藻藍蛋白(APC))。可檢測訊號可藉由可檢測標記諸如螢光蛋白質直接產生；可檢測訊號亦可為可檢測標記與其夥伴劑之間的化學反應之顯色產物。

如本文中所使用，「檢測劑(a detecting agent)」係指包括與PTK7之結合劑的分子。在某些實施例中，檢測劑係此類結合劑。在某些實施例中，檢測劑進一步包括附接至(例如共價結合至)結合劑之一或多個助劑部份(例如可檢測標記)。

如本文中所使用，「夥伴劑(a partner agent)」係指可結合至可檢測標記之分子，其中夥伴劑與可檢測標記反應以產生可檢測訊號。夥伴劑之實例包括但不限於抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、酶受質包括但不限於3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)、3,3’-二胺基聯苯胺(DAB)、2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)、鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)、高香草酸、AmplexRed、胺基乙基咔唑 (AEC)、硝基藍四唑鎓氯化物(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)及5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-哌喃半乳糖苷(BCIG或X-Gal)。

本文所述之結合劑及抗體在IHC中特別有用。但它們可用於任何類型之抗體檢定或其他目的。在一個實施例中，本發明之結合劑可用於流式細胞術。在另一實施例中，本發明之結合劑可用於ELISA。抗體及結合劑

本文提供與人類PTK7特異性結合之PTK7結合抗體(亦稱為PTK7抗體)及其抗原結合部分及其他結合劑。在一些實施例中，PTK7抗體、抗原結合部分及/或其他結合劑與個體的PTK7+細胞特異性結合且可用於識別/檢測/定量此類PTK7+細胞。在一些實施例中，PTK7抗體、抗原結合部分及/或其他結合劑與個體的PTK7+癌細胞特異性結合且可用於識別/檢測/定量此類PTK+癌細胞。在一些實施例中，PTK7抗體、抗原結合部分及/或其他結合劑特異性結合至與個體的疾病或病況(諸如癌症或自體免疫疾病)相關之PTK7+細胞。在一些實施例中，PTK7抗體、抗原結合部分及/或其他結合劑可用於識別/檢測/診斷個體(諸如人類或動物)的此類疾病或病況。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有選自以下之胺基酸序列對所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有選自以下之胺基酸序列對所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，其中重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有選自以下之胺基酸序列對所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，其中重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。片語「其中重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾」係指該VH及VL CDR不具有胺基酸取代、缺失或插入。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區，其與如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15所示之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%類似性。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含輕鏈可變(VL)區，其與如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:16所示之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%類似性。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有與選自以下之胺基酸序列對具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%類似性之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16。類似性水準來自於以下所示之VH及VL序列的胺基酸取代、缺失或插入：分別為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16。變體抗體將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，其中重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。變體抗體或其抗原結合部分將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區序列，其係如SEQ ID NO:1所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含輕鏈可變(VL)區，其係如SEQ ID NO:2所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%之胺基酸序列。變體抗體或其抗原結合部分將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，其中重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。變體抗體或其抗原結合部分將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區序列，其係如SEQ ID NO:8所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含輕鏈可變(VL)區，其係如SEQ ID NO:9所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%之胺基酸序列。變體抗體或其抗原結合部分將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，其中重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。變體抗體或其抗原結合部分將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區序列，其係如SEQ ID NO:15所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含輕鏈可變(VL)區，其係如SEQ ID NO:16所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16所示之序列的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%之胺基酸序列。變體抗體或其抗原結合部分將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有選自以下之胺基酸序列對所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16；其中結合劑與人類PTK7特異性結合。在一些實施例中，本揭露之結合劑比起抗體考非妥珠單抗以較高或類似結合親和力(較低Kd)與人類PTK7特異性結合。在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有選自以下之胺基酸序列對所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，且其中重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有選自以下之胺基酸序列對所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；及分別為SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，且其中重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。如本文所述，結合劑包括PTK7抗體或其抗原結合部分，且可選地可包括共價附接至PTK7抗體或其抗原結合部分之其他肽或多肽。在任何此等實施例中，結合劑與人類PTK7特異性結合。

在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列；其中結合劑與人類PTK7特異性結合。在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。

在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列；其中結合劑與人類PTK7特異性結合。在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。變體抗體或其抗原結合部分將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列；其中結合劑與人類PTK7特異性結合。在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，本文提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。變體抗體或其抗原結合部分將仍能結合PTK7。

在一些實施例中，提供一種抗體或抗原結合部分，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有選自以下之胺基酸序列組所示之胺基酸序列：(i)分別為SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、LVS及SEQ ID NO: 7；(ii)分別為SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、QMS及SEQ ID NO: 14；及(iii)分別為SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、RVS及SEQ ID NO: 21。在某些實施例中，本文所示之CDR序列係根據IMGT獨特編號方案。Lefranc, M. P.The Immunologist, 7, 132-136 (1999)。在一些實施例中，各VH及VL區包含人源化框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含人類框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含小鼠框架區。

在一些實施例中，提供一種抗體或抗原結合部分，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有分別如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、LVS及SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所示之CDR序列係根據IMGT獨特編號方案。Lefranc, M. P.The Immunologist, 7, 132-136 (1999)。在一些實施例中，各VH及VL區包含人源化框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含人類框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含小鼠框架區。

在一些實施例中，提供一種抗體或抗原結合部分，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有分別如SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、QMS及SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所示之CDR序列係根據IMGT獨特編號方案。Lefranc, M. P.The Immunologist, 7, 132-136 (1999)。在一些實施例中，各VH及VL區包含人源化框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含人類框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含小鼠框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含小鼠框架區。

在一些實施例中，提供一種抗體或抗原結合部分，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有分別如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、RVS及SEQ ID NO: 21所示之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所示之CDR序列係根據IMGT獨特編號方案。Lefranc, M. P.The Immunologist, 7, 132-136 (1999)。在一些實施例中，各VH及VL區包含人源化框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含人類框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含小鼠框架區。

在一些實施例中，提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有分別如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、LVS及SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所示之CDR序列係根據IMGT獨特編號方案。Lefranc, M. P.The Immunologist, 7, 132-136 (1999)。在一些實施例中，各VH及VL區包含人源化框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含人類框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含小鼠框架區。

在一些實施例中，提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有分別如SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、QMS及SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所示之CDR序列係根據IMGT獨特編號方案。Lefranc, M. P.The Immunologist, 7, 132-136 (1999)。在一些實施例中，各VH及VL區包含人源化框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含人類框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含小鼠框架區。

在一些實施例中，提供一種結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有分別如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、RVS及SEQ ID NO: 21所示之胺基酸序列。在某些實施例中，本文所示之CDR序列係根據IMGT獨特編號方案。Lefranc, M. P.The Immunologist, 7, 132-136 (1999)。在一些實施例中，各VH及VL區包含人源化框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含人類框架區。在一些實施例中，各VH及VL區包含小鼠框架區。

在一些實施例中，本文所述之分子、組成物及方法關於藉由PTK7抗體、其抗原結合部分及/或其他結合劑或其共軛物在活體外或活體內識別/檢測/定量個體的PTK7+細胞(例如識別/檢測/定量癌症或腫瘤中的PTK7+細胞或與自體免疫疾病或病症相關之PTK7+細胞)。在一些實施例中，本文所述之組成物及方法關於藉由投予PTK7抗體、其抗原結合部分、其他結合劑或其共軛物來治療個體的PTK7+癌症。因此，本發明亦提供包含本文中闡述之結合劑及醫藥上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組成物。

如本文中所使用，用語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，即含有與抗原(例如人類PTK7)特異性結合之抗原結合部位之分子。該用語大致上係指包含二個免疫球蛋白重鏈可變區及二個免疫球蛋白輕鏈可變區之抗體，包括全長抗體(具有重鏈及輕鏈恆定區)。

各重鏈係由可變區(縮寫為VH)及恆定區構成。重鏈恆定區可包括三個結構域CH1、CH2及CH3及可選地第四結構域CH4。各輕鏈係由可變區(縮寫為VL)及恆定區構成。輕鏈恆定區係CL結構域。VH及VL區可進一步分成超變異區(稱為互補決定區(CDR))及穿插其中的保守區(稱為框架區(FR))。各VH及VL區因此係由自N端至C端以下列順序配置之三個CDR及四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。此結構係所屬技術領域中具有通常知識者所廣為周知。

如本文中所使用，PTK7抗體之「抗原結合部分」係指如本文所述之PTK7抗體之部分，該部分具有PTK7抗體之VH及VL序列或PTK7抗體之CDR且與PTK7特異性結合。抗原結合部分之實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、二硫化物連接之Fv、單域抗體(亦稱為VHH、VNAR、sdAb或奈米抗體)或雙體抗體(參見例如Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)及Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)，其係以引用方式併入本文中)。如本文中所使用，在各PTK7抗體的情況下，用語Fab、F(ab’)2及Fv係指下列：(i) Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1結構域構成之單價片段；(ii) F(ab’)2片段，即包含二個Fab片段之雙價片段，該二個片段經由雙硫鍵在鉸鏈區互相連接；及(iii) 由VL及VH結構域構成之Fv片段。雖然Fv片段之二個結構域(即VL及VH)係由分開的編碼區編碼，可使用合成的連接子例如聚-G4S胺基酸序列(如SEQ ID NO: 58所揭示之「(G4S)n」，其中n =1至5)將它們進一步互相連接，使得有可能將它們製備成單一蛋白質鏈，其中VL及VH區組合以形成單價分子(被稱為單鏈Fv或scFv)。抗體之用語「抗原結合部分」亦意圖包括此類單鏈抗體。其他形式之單鏈抗體諸如「雙體抗體」同樣包括在本文中。雙體抗體係雙價、雙特異性抗體，其中VH及VL結構域表現在單一多肽鏈上，但使用過短連接子連接VH及VL結構域，使得二個結構域無法在相同鏈上組合，藉此迫使VH及VL結構域與不同鏈之互補結構域(分別為VL及VH)配對，以形成二個抗原結合部位(參見例如Holliger, R, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448；Poljak, R. J, et al. (1994) Structure 2:1121-1123)。

單域抗體係由單一單體可變抗體結構域所組成之抗體部分。單域抗體可衍生自來自駱駝之抗體重鏈的可變域(例如奈米抗體或VHH部分)。此外，用語單域抗體包括自主人類重鏈可變域(aVH)或衍生自鯊魚之VNAR部分(參見例如Hasler et al., Mol. Immunol. 75:28-37, 2016)。

用於產生單域抗體(例如DAB或VHH)之技術係所屬技術領域中已知，例如在Cossins et al. (2006, Prot Express Purif 51:253-259)及Li et al. (Immunol. Lett. 188:89-95, 2017)中所揭示。單域抗體可藉由標準免疫技術獲自例如駱駝、羊駝或駱馬。(參見例如Muyldermans et al., TIBS 26:230-235, 2001；Yau et al., J Immunol Methods 281:161-75, 2003；及Maass et al., J Immunol Methods 324:13-25, 2007。)VHH可具有強效抗原結合能力，且可與習知VH-VL對無法接近之新穎表位交互作用(參見例如Muyldermans et al., 2001)。羊駝血清IgG含有約50%僅駱駝重鏈IgG抗體(HCAb)(參見例如Maass et al., 2007)。羊駝可經抗原免疫且可單離結合至且中和目標抗原之VHH(參見例如Maass et al., 2007)。擴增羊駝VHH編碼序列之PCR引子已經識別且可用於建構羊駝VHH噬菌體展示庫，該展示庫可用於藉由所屬技術領域中廣為周知的標準生物淘選技術進行抗體片段單離(參見例如Maass et al., 2007)。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分係雙特異性或多特異性結合劑之一部分。雙特異性及多特異性抗體包括下列：scFv1-ScFv2、ScFv12-Fc-scFv22、IgG-scFv、DVD-Ig、三功能性單抗/四源雜交瘤(triomab/quadroma)、二合一IgG、scFv2-Fc、TandAb及scFv-HSA-scFv。在一些實施例中，IgG-scFv係IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、svFc-(L)IgG、2scFV-IgG或IgG-2scFv。參見例如Brinkmann and Kontermann, MAbs 9(2):182-212 (2017)；Wang et al., Antibodies, 2019, 8, 43；Dong et al., 2011, MAbs 3:273-88；Natsume et al., J. Biochem. 140(3):359-368, 2006；Cheal et al., Mol. Cancer Ther. 13(7):1803-1812, 2014；及Bates and Power, Antibodies, 2019, 8, 28。因此，本發明進一步提供包含如本文中闡述之至少一對VH及VL區之雙特異性抗體。本發明亦提供雙特異性抗體，其包含至少一個抗原結合部位，該抗原結合部位包含如本文中闡述之一組六個CDR，意即包含如本文中闡述之一組HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。VH 及 VL 區之修飾

關於VH及VL胺基酸序列，所屬技術領域中具有通常知識者將理解，對編碼VH或VL之核酸的個別取代、缺失或添加(插入)或多肽中改變經編碼序列中之單一胺基酸或小百分比胺基酸之胺基酸係「經保守修飾之變體」，其中改變導致胺基酸經化學類似胺基酸取代(保守性胺基酸取代)且經改變之多肽保留與PTK7特異性結合的能力。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分之經保守修飾之變體可具有框架區(即除CDR以外)之改變，例如PTK7抗體之經保守修飾之變體具有VH及VL CDR之胺基酸序列(如以下胺基酸序列組所示：(i)分別為SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、LVS 及SEQ ID NO: 7；(ii)分別為SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、QMS及SEQ ID NO: 14；及(iii)分別為SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、RVS及SEQ ID NO: 21)且在框架區(FR)中具有至少一個保守性胺基酸取代。在一些實施例中，相較於未經修飾之VH及VL區之胺基酸序列，VH及VL胺基酸序列在FR中總共具有不超過8或6或4或2或1個保守性胺基酸取代。在一些實施例中，相較於未經修飾之VH及VL區之胺基酸序列，VH及VL胺基酸序列在FR中具有8至1、6至1、4至1、或2至1個保守性胺基酸取代。在任何此等實施例之進一步態樣中，PTK7抗體、其抗原結合部分或其他結合劑之經保守修飾之變體展現與PTK7之特異性結合。變體抗體或其抗原結合部分將保留結合PTK7之能力。

以保守性胺基酸取代而言，給定胺基酸可經具有類似物理化學特徵之殘基置換，例如以一個脂族殘基取代另一個(諸如Ile、Val、Leu或Ala互相取代)或以一個極性殘基取代另一個(諸如Lys與Arg；Glu與Asp；或Gln與Asn之間的取代)。其他此類保守性胺基酸取代，例如具有類似疏水性特徵之整個區域的取代係廣為周知。包含保守性胺基酸取代之多肽可在本文所述之任一檢定中測試，以確認保留天然或參考多肽即對PTK7之所欲活性，例如抗原結合活性及特異性。

在一些實施例中，本文提供一種PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，本文提供一種PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。變體抗體或其抗原結合部分將保留結合PTK7之能力。

在一些實施例中，本文提供一種PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，本文提供一種PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。變體抗體或其抗原結合部分將保留結合PTK7之能力。

在一些實施例中，本文提供一種PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個保守性胺基酸取代修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。在一些實施例中，本文提供一種PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑，其包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH及VL區具有分別如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16所示之胺基酸序列；其中重鏈及輕鏈可變框架區可選地經框架區中之1至8、1至6、1至4或1至2個胺基酸取代、缺失或插入修飾，且其中該重鏈或輕鏈可變區之CDR未經修飾。變體抗體或其抗原結合部分將保留結合PTK7之能力。

在任何此等實施例中，PTK7結合抗體或其抗原結合部分或其他結合劑之功能活性包括與PTK7特異性結合。額外功能活性包括識別/檢測/定量PTK7+細胞(例如癌細胞或自體免疫細胞)。在劑量依賴性確實存在之情況下，其不需要與參考抗體或其抗原結合部分完全相同，而是需要在給定活性的劑量依賴性方面類似於或優於如本文所述之參考抗體或其抗原結合部分(即候選多肽相對於參考抗體將展現較大活性)。因此，在一個實施例中，變體結合劑及特別是抗體或其抗原結合片段可保留本文中提及之特定功能。

以保守性取代而言，胺基酸可根據其側鏈之性質的類似性(A. L. Lehninger, Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))分組：(1)非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M)；(2)不帶電極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q)；(3)酸性：Asp (D)、Glu (E)；及(4)鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His (H)。

替代地，以保守性取代而言，天然存在殘基可基於常見側鏈性質分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守性取代將涉及一個此等類別與另一類別之成員的交換。

特定保守性取代包括例如Ala至Gly或至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或至His；Asp至Glu；Cys至Ser；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Ala或至Pro；His至Asn或至Gln；Ile至Leu或至Val；Leu至Ile或至Val；Lys至Arg、至Gln或至Glu；Met至Leu、至Tyr或至Ile；Phe至Met、至Leu或至Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp；及/或Phe至Val、至Ile或至Leu。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分之經保守修飾之變體較佳地與參考VH或VL序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高一致性，其中VH及VL CDR未經修飾。參考序列與經修飾之序列之間的同源性程度(一致性百分比)可藉由例如使用網路上為達此目的所通常採用之免費可得之電腦程式(例如使用預設設定的BLASTp或BLASTn)比較二個序列來測定。

在一些實施例中，相較於未經修飾之VH及VL區之胺基酸序列，VH及VL胺基酸序列在框架區中總共具有不超過8或6或4或2或1個保守性胺基酸取代。在一些實施例中，相較於未經修飾之VH及VL區之胺基酸序列，VH及VL胺基酸序列在框架區中總共具有8至1、或6至1、或4至1、或2至1個保守性胺基酸取代。在一些實施例中，相較於未經修飾之VH及VL區之胺基酸序列，VH及VL胺基酸序列在框架區中總共具有不超過8或6或4或2或1個胺基酸取代、缺失或插入。在一些實施例中，相較於未經修飾之VH及VL區之胺基酸序列，VH及VL胺基酸序列在框架區中具有8至1、6至1、4至1、或2至1個保守性胺基酸取代。在一些實施例中，相較於未經修飾之VH及VL區之胺基酸序列，VH及VL胺基酸序列總共具有不超過8或6或4或2或1個胺基酸取代、缺失或插入。

在一些實施例中，結合劑(特別是抗體或其抗原結合片段)在所闡述之CDR序列中可具有少量胺基酸取代、缺失或插入，前提是保留結合PTK7之能力。在一個實施例中，亦提供如本文中闡述之結合劑，其在本文中所闡述之結合劑的特定CDR中具有總共不超過六個胺基酸序列變化。在一個實施例中，總共不超過四個胺基酸序列變化。在一個實施例中，總共不超過二個胺基酸序列變化。在一個實施例中，不超過單一個胺基酸序列變化。在任何此類實施例中，胺基酸序列變化可為保守性。

天然(或參考)胺基酸序列之修飾可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之多種技術之任一者完成。突變可藉由例如合成含有所欲突變序列之寡核苷酸，與能夠和天然序列之片段接合之限制位點側接來導入特定基因座。在接合之後，所得之重新建構序列編碼具有所欲胺基酸插入、取代或缺失之變體。替代地，可採用寡核苷酸引導定點突變形成程序，以提供具有根據所欲取代、缺失或插入改變之特定密碼子的經改變核苷酸序列。用於進行此類改變之技術已經非常完備且包括例如該些揭示於Walder et al. (Gene 42:133, 1986)；Bauer et al. (Gene 37:73, 1985)；Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；及美國專利第4,518,584號及第4,737,462號，彼等全文以引用方式併入本文中。恆定區

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑具有全人類恆定區。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑具有人源化恆定區。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑具有非人類恆定區。在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑具有小鼠恆定區。免疫球蛋白恆定區係指重鏈或輕鏈恆定區。人類重鏈及輕鏈恆定區胺基酸序列係所屬技術領域中已知。恆定區可為任何合適類型，其可選自免疫球蛋白類型IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。數種免疫球蛋白類型可進一步分成同型，例如IgGl、IgG2(例如IgG2a、IgG2b、IgG2c)、IgG3、IgG4或IgAl及IgA2。對應不同類型之免疫球蛋白的重鏈恆定區(Fc)可分別為α、δ、ε、γ及μ。輕鏈可為κ及λ中之一者。

在一些實施例中，恆定區可具有IgG1同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG2同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG1同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG2a同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG1同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG2b同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG1同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG2c同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG3同型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG4同型。在一些實施例中，Fc域可具有包含來自二或更多個同型之恆定區的雜交同型。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區可為IgG1或IgG4恆定區。

在一些實施例中，PTK7抗體重鏈具有恆定區，該恆定區具有如SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 26所示之胺基酸序列。在一些實施例中，PTK7抗體輕鏈具有恆定區，該恆定區具有如SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，PTK7抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈具有恆定區，該恆定區具有如SEQ ID NO. 22所示之胺基酸序列，該輕鏈具有恆定區，該恆定區具有如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，PTK7抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈具有恆定區，該恆定區具有如SEQ ID NO. 24所示之胺基酸序列，該輕鏈具有恆定區，該恆定區具有如SEQ ID NO: 25所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，PTK7抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈具有恆定區，該恆定區具有如SEQ ID NO. 26所示之胺基酸序列，該輕鏈具有恆定區，該恆定區具有如SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，PTK7抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈具有如SEQ ID NO. 28所示之胺基酸序列，該輕鏈具有如SEQ ID NO: 29所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，PTK7抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈具有如SEQ ID NO. 30所示之胺基酸序列，該輕鏈具有如SEQ ID NO: 31所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，PTK7抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈具有如SEQ ID NO. 32所示之胺基酸序列，該輕鏈具有如SEQ ID NO: 33所示之胺基酸序列。

此外，PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑可為藉由抗體或抗原結合部分與一或多種其他蛋白質或肽之共價或非共價締合所形成之較大結合劑之一部分。與此類結合劑相關的是例如使用鏈黴抗生物素蛋白核心區以製備四聚體scFv分子(Kipriyanov, S. M., et al. (1995), Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C端多組胺酸肽，例如六組胺酸標籤(如SEQ ID NO: 59所揭示之「六組胺酸標籤」)以產生雙價及生物素化scFv分子(Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:10471058)。

在一些實施例中，當結合劑係雙特異性抗體時，重鏈之恆定區可具有「突點對應孔洞(knobs-into-holes)」修飾以促進異二聚體形成及因此雙特異性抗體產生。Fc 域修飾以改變效應功能

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑之Fc區或Fc域實質上不具有與選自FcyRI (CD64)、FcyRIIA (CD32a)、FcyRIIB (CD32b)、FcyRIIIA (CD16a)及FcyRIIIB (CD16b)之至少一種Fc受體之結合。在一些實施例中，Fc區或域實質上不展現與選自FcyRI (CD64)、FcyRIIA (CD32a)、FcyRIIB (CD32b)、FcyRIIIA (CD16a)及FcyRIIIB (CD16b)之任何Fc受體之結合。如本文中所使用，「實質上不結合」係指與選定Fcγ受體之微弱至無結合。在一些實施例中，「實質上不結合」係指與Fcγ受體之結合親和力減少(即Kd增加)至少1000倍。在一些實施例中，Fc域或區係Fc空。如本文中所使用，「Fc空(Fc null)」係指對任何Fcγ受體展現微弱至無結合之Fc區或Fc域。在一些實施例中，Fc空域或區展現對Fcγ受體之結合親和力減少(即Kd增加)至少1000倍。

在一些實施例中，Fc域具有減少或實質上無效應功能活性。如本文中所使用，「效應功能活性」係指抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞性吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，Fc域相較於野生型Fc域展現減少ADCC、ADCP或CDC活性。在一些實施例中，Fc域相較於野生型Fc域展現ADCC、ADCP及CDC之減少。在一些實施例中，Fc域展現實質上無效應功能(即刺激或致效ADCC、ADCP或CDC之能力)。如本文中所使用，「實質上無效應功能」係指相較於野生型或參考Fc域，效應功能活性減少至少1000倍。

在一些實施例中，Fc域具有減少或無ADCC活性。如本文中所使用，減少或無ADCC活性係指Fc域之ADCC活性降低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍或至少500倍。

在一些實施例中，Fc域具有減少或無CDC活性。如本文中所使用，減少或無CDC活性係指Fc域之CDC活性降低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍或至少500倍。

可進行活體外及/或活體內細胞毒性檢定以確認減少/除盡ADCC及/或CDC活性。例如，可進行Fc受體(FcR)結合檢定以確保抗體缺乏Fcγ受體結合(因此可能缺乏ADCC活性)。介導ADCC之主要細胞NK細胞僅表現FcγRIII，然而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現係摘列於Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)第464頁表3。評估受關注分子之ADCC活性的活體外檢定非限制性實例係描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))。替代地，可採用非放射性檢定方法(參見例如用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性檢定(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.；及CytoTox 96TM非放射性細胞毒性檢定(Promega, Madison, Wis.)。用於此類檢定之有用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或額外地，受關注分子之ADCC活性可在活體內評估，例如在動物模型中，諸如揭示於Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中者。

亦可進行C1q結合檢定以確認抗體或Fc域或區無法結合C1q且因此缺乏CDC活性或具有減少的CDC活性。參見例如在WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可實施CDC檢定(參見例如Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。

在一些實施例中，Fc域具有減少或無ADCP活性。如本文中所使用，減少或無ADCP活性係指Fc域之ADCP活性降低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍或至少500倍。

亦可進行ADCP結合檢定以確認抗體或Fc域或區缺乏ADCP活性或具有減少的ADCP活性。參見例如US20190079077及US20190048078及其中揭示之參考文獻。

具有減少效應功能活性之PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑包括該些具有一或多個Fc區殘基諸如例如根據Kabat之EU編號238、265、269、270、297、327及329之取代者(參見例如美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在根據Kabat之EU編號之胺基酸位置265、269、270、297及327之二或更多者具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代成丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(參見美國專利第7,332,581號)。與FcR結合減少的某些抗體變體亦為已知。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。)  可製備含有此類胺基酸修飾之與FcR結合減少之PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑。

在一些實施例中，PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑包含具有減少FcγR結合之一或多個胺基酸取代之Fc域或區，例如在Fc區之位置234及235的取代(殘基之EU編號)。在一些實施例中，取代係根據Kabat之EU編號之L234A及L235A (LALA)。在一些實施例中，根據Kabat之EU編號，Fc域在衍生自人類IgG1 Fc區之Fc區中包含D265A及/或P329G。在一些實施例中，根據Kabat之EU編號，取代係在衍生自人類IgG1 Fc區之Fc區中之L234A、L235A及P329G (LALA-PG)。(參見例如WO 2012/130831。)在一些實施例中，根據Kabat之EU編號，取代係在衍生自人類IgG1 Fc區之Fc區中之L234A、L235A及D265A (LALA-DA)。

在一些實施例中，進行Fc區之改變導致改變(即減少)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如描述於美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。製造抗體、抗原結合部分及其他結合劑之方法

在各種實施例中，PTK7抗體、其抗原結合部分及其他結合劑可在人類、鼠或其他動物衍生性細胞系中產生。重組DNA表現可用於產生PTK7抗體、其抗原結合部分及其他結合劑。此允許在選定宿主物種中產生PTK7抗體以及一系列PTK7抗原結合部分及其他結合劑(包括融合蛋白)。在細菌、酵母菌、基因轉殖動物及雞蛋中產生PTK7抗體、其抗原結合部分及其他結合劑亦為基於細胞之產生系統之替代。基因轉殖動物之主要優點在於來自可再生來源之潛在高產率。

在一些實施例中，具有如SEQ ID NO:1、8或15所示之胺基酸序列之PTK7 VH多肽係由核酸編碼。在一些實施例中，具有如SEQ ID NO: 2、9或16所示之胺基酸序列之PTK7 VL多肽係由核酸編碼。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO: 1、8或15所示之胺基酸序列之PTK7 VH多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO: 2、9或16所示之胺基酸序列之PTK7 VL多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列之PTK7 VH多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:8所示之胺基酸序列之PTK7 VH多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:15所示之胺基酸序列之PTK7 VH多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列之PTK7 VH多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列之PTK7 VH多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:16所示之胺基酸序列之PTK7 VH多肽。

在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:1及2所示之胺基酸序列之VH及VL多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:8及9所示之胺基酸序列之VH及VL多肽。在一些實施例中，核酸編碼具有如SEQ ID NO:15及16所示之胺基酸序列之VH及VL多肽。

如本文中所使用，用語「核酸」或「核酸序列」或「多核苷酸序列」或「核苷酸」係指併入核糖核酸、去氧核糖核酸或其類似物之單元的聚合分子。核酸可為單股或雙股。單股核酸可為變性雙股DNA之一股核酸。在一些實施例中，核酸可為cDNA，例如缺乏內含子之核酸。在一個實施例中，提供編碼抗體之輕鏈及重鏈的單一核酸。在一進一步實施例中，所提供之一對核酸中之一者編碼抗體之輕鏈及另一者編碼重鏈。

編碼PTK7抗體、其抗原結合部分以及其他結合劑之胺基酸序列的核酸分子可藉由所屬技術領域中已知之多種方法製備。此等方法包括但不限於製備編碼PTK7抗體、抗原結合部分或其他結合劑之合成核苷酸序列。此外，寡核苷酸介導(或定點)突變形成、PCR介導之突變形成及卡匣突變形成可用於製備編碼PTK7抗體或抗原結合部分以及其他結合劑之核苷酸序列。編碼如本文所述之至少PTK7抗體、其抗原結合部分、結合劑或其多肽之核酸序列可根據習知技術與載體DNA重組，諸如例如用於接合之鈍端或交錯末端、限制酶消化以提供適當末端、視情況填補黏性末端、鹼性磷酸酶處理以避免非所欲聯結及用適當接合酶或所屬技術領域中已知之其他技術接合。此類操作之技術係揭示於例如Maniatis et al., Molecular Cloning, Lab. Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989)及Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), 1987-1993，且可用於建構編碼PTK7抗體或其抗原結合部分或其VH或VL多肽或其他結合劑之核酸序列及載體。

若核酸分子(諸如DNA)含有包含轉錄及轉譯調節資訊之核苷酸序列，且此類序列與編碼多肽之核苷酸序列「可操作地連接」，則其被稱為「能夠表現」多肽。可操作地連接係其中調節DNA序列及尋求表現之DNA序列(例如PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑)以允許可回收量的多肽或抗原結合部分之基因表現之方式連接的連接。基因表現所需之調節區域的精確性質可隨有機體變化，如類似技術領域中所廣為周知。參見例如Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987-1993。

因此，如本文所述之PTK7抗體或其抗原結合部分之表現可在原核或真核細胞中發生。合適宿主包括細菌或真核宿主，包括活體內或原位之酵母菌、昆蟲、真菌、鳥及哺乳動物細胞，或哺乳動物、昆蟲、鳥或酵母菌來源之宿主細胞。哺乳動物細胞或組織可為人類、靈長動物、倉鼠、兔、囓齒動物、牛、豬、綿羊、馬、山羊、犬或貓來源，但可使用任何其他哺乳動物細胞。另外，藉由使用例如酵母菌泛素水解酶系統，可完成泛素-跨膜多肽融合蛋白之活體內合成。如此產生之融合蛋白可在活體內處理或在活體外純化及處理，允許合成具有指明胺基端序列之如本文所述之PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑。此外，可能避免與直接酵母菌(或細菌)表現中保留起始密碼子衍生性甲硫胺酸殘基相關之問題。(參見例如Sabin et al., 7 Bio/Technol. 705 (1989)；Miller et al., 7 Bio/Technol. 698 (1989)。)可利用併入來自當酵母菌在富含葡萄糖之培養基中生長時編碼大量產生之醣解酶的活性表現基因之啟動子及終止元件之一系列酵母菌基因表現系統中之任一者，以獲得重組PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑。已知醣解基因亦可提供非常有效的轉錄控制訊號。例如，可利用磷酸甘油酯激酶基因之啟動子及終止子訊號。

在昆蟲中產生PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑可藉由例如用桿狀病毒感染昆蟲宿主來達成，該桿狀病毒藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之方法工程改造以表現多肽。參見Ausubel et al., 1987-1993。

在一些實施例中，將經導入之核酸序列(編碼PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑或其多肽)併入能夠在接受者宿主細胞中自主複製之質體或病毒載體中。可出於此目的採用任何各式各樣的載體且係所屬技術領域中具有通常知識者已知且可得。參見例如Ausubel et al., 1987-1993。選擇特定質體或病毒載體之重要因子包括：易於辨識及選擇含有載體之接受者細胞與不含有載體之接受者細胞；在特定宿主中所欲之載體的拷貝數；及是否希望能夠在不同物種的宿主細胞之間「穿梭」載體。

所屬技術領域中已知之例示性原核載體包括質體，諸如該些能夠在大腸桿菌中複製者。可用於表現編碼PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑之DNA的其他基因表現元件包括但不限於：(a)病毒轉錄啟動子及其增強子元件，諸如SV40早期啟動子(Okayama et al., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983))、勞斯肉瘤病毒LTR (Gorman et al., 79 PNAS 6777 (1982))及Moloney鼠白血病病毒LTR (Grosschedl et al., 41 Cell 885 (1985))；(b)剪接區及多腺苷酸化位點，諸如該些衍生自SV40晚期區域者(Okayarea et al., 1983)；及(c)多腺苷酸化位點，諸如SV40 (Okayama et al., 1983)。編碼免疫球蛋白之DNA基因可如Liu et al., infra及Weidle et al., 51 Gene 21 (1987)所述，使用以下作為表現元件表現：SV40早期啟動子及其增強子、小鼠免疫球蛋白H鏈啟動子增強子、SV40晚期區域mRNA剪接、兔S-球蛋白介入序列、免疫球蛋白及兔S-球蛋白多腺苷酸化位點及SV40多腺苷酸化元件。

以編碼免疫球蛋白之核苷酸序列而言，轉錄啟動子可為例如人類巨細胞病毒，啟動子增強子可為巨細胞病毒及小鼠/人類免疫球蛋白。

在一些實施例中，以囓齒動物細胞中之DNA編碼區的表現而言，轉錄啟動子可為病毒LTR序列，轉錄啟動子增強子可為小鼠免疫球蛋白重鏈增強子及病毒LTR增強子中任一或兩者及多腺苷酸化及轉錄終止區域。在其他實施例中，編碼其他蛋白質之DNA序列係與以上記述之表現元件組合以達成在哺乳動物細胞中表現蛋白質。

將各編碼區或基因融合組裝於或插入至表現載體中。接著將能夠表現PTK7可變區或其抗原結合部分或其他結合劑之接受者細胞單獨轉染編碼PTK7抗體或抗體多肽或其抗原結合部分或其他結合劑之核苷酸，或用編碼VH及VL鏈編碼區或其他結合劑之多核苷酸共轉染。將經轉染之接受者細胞在允許經併入之編碼區表現之條件下培養，並將所表現之抗體鏈或完整抗體或抗原結合部分或其他結合劑自培養回收。

在一些實施例中，將含有編碼PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑之編碼區的核酸組裝於分開的表現載體中，該等表現載體接著用於共轉染接受者宿主細胞。各載體可含有一或多個可選擇基因。例如，在一些實施例中，使用二個可選擇基因，第一可選擇基因設計用於在細菌系統中選擇及第二可選擇基因設計用於在真核系統中選擇，其中各載體具有一組編碼區。此策略導致首先引導核苷酸序列在細菌系統中產生及允許擴增之載體。如此在細菌宿主中產生及擴增之DNA載體後續用於共轉染真核細胞，且允許選擇攜帶所欲轉染核酸(例如含有PTK7抗體重鏈及輕鏈)之共轉染細胞。用於細菌系統中之可選擇基因的非限制性實例係授予對安比西林之抗性的基因及授予對氯黴素之抗性的基因。用於真核轉染細胞之可選擇基因包括黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(命名為gpt)及來自Tn5之磷酸轉移酶基因(命名為neo)。替代地，可將編碼VH及VL鏈之融合核苷酸序列組裝在相同表現載體上。

為了轉染表現載體及產生PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑，接受者細胞系可為中國倉鼠卵巢細胞系(例如DG44)或骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞可合成、組裝及分泌由經轉染之免疫球蛋白基因所編碼之免疫球蛋白且具有糖基化免疫球蛋白之機制。例如，在一些實施例中，接受者細胞係產生重組Ig之骨髓瘤細胞SP2/0。SP2/0細胞僅產生由經轉染之基因所編碼之免疫球蛋白。骨髓瘤細胞可在培養或在小鼠的腹膜腔中生長，其中經分泌之免疫球蛋白可獲自腹水。

編碼PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑之表現載體可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之多種合適手段之任一者導入適當宿主細胞中，包括生化手段諸如轉形、轉染、原生質體融合、磷酸鈣沉澱及施加諸如二甲基胺乙基(DEAE)右旋糖苷之多價陽離子，及機械手段諸如電穿孔、直接顯微注射及微彈撞擊(Johnston et al., 240 Science 1538 (1988))。

酵母菌在產生免疫球蛋白重鏈及輕鏈方面提供某些優於細菌之優點。可例行地評估酵母菌基因表現系統產生、分泌抗體及經組裝之PTK7抗體及其抗原結合部分及其他結合劑的水準及穩定性的水準。

亦可利用細菌菌株(例如大腸桿菌K12菌株)作為用於產生如本文所述之抗體分子或其抗原結合部分或其他結合劑之宿主。

宿主哺乳動物細胞可在活體外或活體內生長。哺乳動物細胞提供免疫球蛋白分子的轉譯後修飾，包括移除前導肽、VH及VL鏈的摺疊及組裝、抗體分子之糖基化及功能性抗體及/或其抗原結合部分或其他結合劑之分泌。

除了上述淋巴來源之細胞外，可用來作為產生抗體蛋白質之宿主的哺乳動物細胞包括纖維母細胞來源之細胞，諸如Vero或CHO-K1細胞。可用於表現免疫球蛋白多肽之例示性真核細胞包括但不限於COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO--S細胞及DG44細胞；PERC6TM細胞(Crucell)；及NSO細胞。在一些實施例中，基於對重鏈及/或輕鏈進行所欲轉譯後修飾的能力選擇特定真核宿主細胞。舉例來說，在一些實施例中，CHO細胞產生之多肽相較於在293細胞產生之相同多肽具有較高水準之唾液酸化。

在一些實施例中，一或多種PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑可根據任何合適方法，在經一或多種編碼多肽之核酸分子工程改造或轉染之動物的活體內產生。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分係在無細胞系統中產生。非限制性例示性無細胞系統係描述於例如Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009)；Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004)；及Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)。

許多載體系統可用於在哺乳動物細胞中表現VH及VL鏈(參見Glover, 1985)。可遵照各種方法以獲得完整抗體。此外，植物已經成為基於大規模培養微生物或動物細胞之重組抗體生產的方便、安全且經濟的替代表現系統。

以完整抗體而言，PTK7抗體之可變區(VH及VL區)一般與至少一部分的免疫球蛋白恆定區(Fc)或結構域(一般為人類免疫球蛋白之結構域)連接。人類恆定區DNA序列可根據廣為周知之程序自多種人類細胞諸如永生化B細胞(WO 87/02671)單離。PTK7結合抗體可含有輕鏈及重鏈恆定區兩者。重鏈恆定區可包括CH1、鉸鏈、CH2、CH3及可選地CH4區域。在一些實施例中，可刪除或省略CH2結構域。

可調適所述之用於產生單鏈抗體之技術(參見例如美國專利第4,946,778號；Bird, Science 242:423-42 (1988)；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；及Ward et al., Nature 334:544-54 (1989))以產生與PTK7特異性結合之單鏈抗體。單鏈抗體係經由胺基酸橋連接Fv區之重鏈及輕鏈可變區形成，導致單鏈多肽。亦可使用在大腸桿菌中組裝功能性Fv部分之技術(參見例如Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)；其全文以引用方式併入本文中)。

在一些實施例中，抗原結合部分或其他結合劑包含一或多個scFv。在一些實施例中，抗原結合部分或其他結合劑係單域抗體，其係由單一單體可變抗體結構域所組成之抗體部分。用於產生單域抗體(DAB或VHH)之技術係所屬技術領域中已知，例如在Cossins et al. (2006, Prot Express Purif 51:253-259)及Li et al. (Immunol. Lett. 188:89-95, 2017)中所揭示。

用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現具有不同特異性之二個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見例如Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO 93/08829及Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991))及「突點對應孔洞」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號；Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。

具有三或更多個功能性抗原結合部位之經工程改造之抗體包括「章魚抗體」亦可為結合劑(參見例如US 2006/0025576A1)。

本文中之結合劑(例如抗體或抗原結合部分)亦包括「雙重作用FAb」或「DAF」，其包含與二種不同抗原結合之抗原結合部位(參見例如US 2008/0069820及Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-14)。本文亦包括「互換單抗(crossmab)」抗體(參見例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254及WO2013/026833)。

在一些實施例中，結合劑包含融合至Fc域之二個次單元中之一者或另一者之不同抗原結合部位；因此，Fc域之二個次單元可包含二個非完全相同之多肽鏈。重組共表現此等多肽及後續二聚化導致二個多肽之數種可能的組合。為了改善重組產生之雙特異性分子的產率及純度，因此將促進所欲多肽之締合的修飾導入結合劑之Fc域中係有利的。

大致上，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換二個Fc域之界面處的一或多個胺基酸殘基，使得同二聚體形成變成在靜電上不利，但異二聚化在靜電上則有利。

在一些實施例中，結合劑係「雙特異性T細胞接合子」或BiTE(參見例如WO2004/106381、WO2005/ 061547、WO2007/042261及WO2008/119567)。此方法利用配置在單一多肽上之二個抗體可變域。例如，單一多肽鏈可包括二個單鏈Fv (scFv)部分，各具有藉由長度足以允許二個結構域之間的分子內締合之多肽連接子分離的可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)結構域。此單一多肽進一步包括介於二個scFv之間的多肽間隔序列。各scFv辨識不同表位，且此等表位可為不同蛋白質的特異性，以使兩種蛋白質皆與BiTE結合。

在一些實施例中，結合劑係多特異性，諸如IgG-scFV。IgG-scFv格式包括IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、svFc-(L)IgG、2scFV-IgG及IgG-2scFv。此等及其他雙特異性抗體格式及製備彼等之方法描述於例如Brinkmann and Kontermann, MAbs 9(2):182-212 (2017)；Wang et al., Antibodies, 2019, 8, 43；Dong et al., 2011, MAbs 3:273-88；Natsume et al., J. Biochem. 140(3):359-368, 2006；Cheal et al., Mol. Cancer Ther. 13(7):1803-1812, 2014；及Bates and Power, Antibodies, 2019, 8, 28。

IgG樣雙重可變域抗體(DVD-Ig)已由Wu et al., 2007, Nat Biotechnol 25:1290-97；Hasler et al., Mol. Immunol. 75:28-37, 2016及WO 08/024188及WO 07/024715描述。三功能性單抗已由Chelius et al., MAbs 2(3):309-319, 2010描述。2合1-IgG已由Kontermann et al., Drug Discovery Today 20(7):838-847, 2015描述。Tanden抗體或TandAb已由Kontermann et al., id.描述。ScFv-HSA-scFv抗體亦已由Kontermann et al. (id.)描述。

完整(例如整個)抗體、其二聚體、個別輕鏈及重鏈或其抗原結合部分及其他結合劑可藉由已知技術回收及純化，例如免疫吸附或免疫親和層析法、層析方法諸如HPLC(高效液相層析法)、硫酸銨沉澱、凝膠電泳或此等之任何組合。大致上參見Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)。具有至少約90%至95%均質狀態之實質上純的PTK7結合抗體或其抗原結合部分或其他結合劑係有利的，如同該些具有98%至99%或更高均質狀態者，特別是用於醫藥用途。一旦視需要部分純化或純化至均質狀態後，完整PTK7抗體或其抗原結合部分或其他結合劑接著可用於治療或用於發展及實施檢定程序、免疫螢光染色等。大致上參見Vols. I & II Immunol. Meth. (Lefkovits & Pernis, eds., Acad. Press, NY, 1979 and 1981)。共軛物

本發明之結合劑(特別是抗體)可提供為共軛物之形式。在一個實施例中，本發明之結合劑(特別是抗體)可提供為與標籤共軛之結合劑(特別是抗體)之形式。標籤可為例如該些本文中提及之任一者。在一個實施例中，本發明之結合劑(特別是抗體)可提供為與藥物共軛之結合劑(特別是抗體)之形式。藥物可為例如化學治療劑。在一個實施例中，本發明之結合劑(特別是抗體)可提供為與部份共軛之結合劑(特別是抗體)之形式，該部份允許更容易純化該共軛物。部份可為例如生物素。IHC方法

本發明提供使用本發明之結合劑檢測及/或定量PTK7蛋白質。在一具體實施例中，本發明提供使用本發明之結合劑進行免疫組織化學(IHC)。

本揭露亦提供採用本發明之結合劑檢測樣本中之PTK7表現細胞之免疫組織化學(IHC)方法。在一些實施例中，方法包含：使樣本與包含本揭露之抗體、其抗原結合部分及其他結合劑中任一者之檢測劑接觸，及檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物。在某些實施例中，檢測到結合複合物表示樣本中存在PTK7表現細胞。

根據本揭露，用語來自個體之「樣本(sample)」可為該個體之組織或任何體液之樣本，其可包含PTK7。例示性體液包括例如血液、唾液、鼻黏液或淋巴液。在某些實施例中，樣本係血液樣本，諸如選自包含全血、血清、血漿、微血管血液、動脈血液、靜脈血液或其任何混合物之群組。例示性組織樣本包括但不限於扁桃腺、闌尾、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、子宮頸、腎、胰臟、膀胱、腦、甲狀腺、耳、鼻、咽喉、食道及肝臟之組織。在一個實施例中，組織係卵巢組織。在另一實施例中，組織係乳癌組織。在一個實施例中，組織係來自乳癌活體組織切片之組織。技藝人士了解可施用以自個體獲得適用於本文揭示之方法、產物及用途之目的及所需數量之樣本的各種手段及方法。在某些實施例中，可由醫師自個體獲得樣本，然而在其他情況下，可由個體自己獲得樣本。在某些實施例中，樣本可源自單一個體，即單一對象。在某些實施例中，樣本可包含來自超過一個個體之組織或體液。在一些實施例中，樣本可為組織切片。在利用組織樣本之實施例中，方法因此係活體外方法。但本發明之結合劑亦可用於活體內成像。

根據本揭露，「個體(subject)」或在本文中可互換地稱為「患者(patient)」係指哺乳動物，較佳地人類，但可替代地亦指不同哺乳動物，諸如非人類靈長動物或其他哺乳動物或甚至非哺乳動物，其任一者產生PTK7表現細胞。在某些實施例中，個體係人類患者。在某些實施例中，個體係人類癌症患者。

在一些實施例中，檢測劑進一步包含標示結合劑之可檢測標記。可檢測標記及檢測劑之定義及實例可見於本揭露他處。

如本文中所使用，關於結合劑之用語「標示(label/labeled)」意欲包括其中結合係藉由偶合標示之此類實施例，諸如藉由物理偶合或共價結合可檢測物質，諸如放射活性劑或提供可檢測訊號之另一分子，諸如但不限於螢光標籤(即螢光團，諸如小型有機化學螢光團或螢光蛋白質)、結合分子(例如生物素，其可以高親和力與抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白結合)或酶活性標籤(「酶標記(enzyme marker)」)，即酶，諸如辣根過氧化酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)，其存在可經評估且可選地基於其與受質物質之反應及/或受質物質之轉換來定量。各種合適可檢測標記係所屬技術領域中已知且其中一些亦於本文中描述。

在一些實施例中，可檢測標記包括生物素，其可以高親和力與抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白結合。此類雙分子(生物素-抗生物素蛋白、生物素-鏈黴抗生物素蛋白)已相當廣泛用於標示及目標分子(例如抗原)檢測。

在一些實施例中，可檢測標記包括酶標記。在某些實施例中，酶標記包括辣根過氧化酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)。此類標記催化可產生可檢測訊號之某些反應，該訊號可指示結合劑與PTK7之間形成複合物的存在。HRP之常見受質包括但不限於3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)、3,3’-二胺基聯苯胺(DAB)、2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)、鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)、高香草酸、AmplexRed及流明諾。

在一些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：添加可檢測標記之夥伴劑；及檢測可檢測標記與夥伴劑之反應作為形成結合複合物之指示。

夥伴劑之定義及實例可見於本揭露他處。基本上，可檢測標記與夥伴劑反應以產生可檢測到(例如藉由顯微鏡檢及成像技術)之訊號(例如組織染色)。在某些實施例中，夥伴劑係生物素之結合伴(例如抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白)。在某些實施例中，夥伴劑係酶標記之受質(例如HRP之受質或AP之受質)。

一對可檢測標記與夥伴劑之一個實例係生物素與DAB。藉由用生物素標示結合劑、使樣本與生物素化結合劑(即檢測劑)接觸及添加DAB，PTK7陽性之細胞將被染色且可根據預定規程觀測、成像及(若有需要)定量。

在一些實施例中，可檢測標記包括螢光標籤，其提供無須添加夥伴劑即產生可檢測訊號之手段。在某些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：檢測來自螢光標籤之訊號作為形成結合複合物之指示。在某些實施例中，螢光標籤包括螢光素(FITC)、藻紅素(PE)(較佳地R-PE)或別藻藍蛋白(APC)。

在一些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：使樣本與二級抗體接觸，該二級抗體係經標示及組態以結合至該結合複合物；及檢測來自二級抗體之訊號作為形成結合複合物之指示。

根據本揭露，「二級抗體(secondary antibody)」係指能夠與IgA、IgG及/或IgM類型抗體或其片段特異性結合之任何種類的「結合部份(binding moiety)」，例如結合蛋白質。結合部份之非限制性實例包括抗體，例如免疫性或遺傳性衍生自任何物種例如人類、雞、駱駝、駱馬、八目鰻、鯊魚、山羊、囓齒動物、牛、犬、兔等之抗體、其抗體片段、結構域或部分，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFab、Fv、scFv、VH、VHH、VL、VLR及類似物、雙體抗體、單株抗體(mAb)及多株抗體(pAb)。

在一些實施例中，二級抗體係在非人類物種中產生之免疫球蛋白(Ig)，例如IgG，其中二級抗體特異性結合另一選定物種，例如小鼠或人類之一或多種特定Ig類型的免疫球蛋白或其片段(例如特定Ig類型之恆定域)。

在一些實施例中，二級抗體係經可檢測標記標示，以使得可檢測訊號可由二級抗體直接產生或在經標示之二級抗體與另一分子反應之後產生。用於發展、篩選及識別針對所欲目標結構(諸如IgA及/或IgG類型抗體)之各種支架的合適結合分子(包括但不限於該些在本文中以上描述者)之手段及方法係所屬技術領域中已知且採用。例示性現今例行實施方法包括但不限於基於高通量(HT)組合庫展示及選擇方法，諸如噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示及細胞表面展示(例如酵母菌展示)。

在某些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：添加可檢測標記之夥伴劑；及檢測可檢測標記與夥伴劑之反應作為形成結合複合物之指示。

在某些實施例中，可檢測標記包括生物素或酶標記。針對二級抗體之可檢測標記、生物素、酶標記及夥伴劑的說明基本上與他處針對結合劑之此類分子或其部分所提供者相同。

在某些實施例中，可檢測標記包括螢光標籤。在某些實施例中，檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物包含：檢測來自螢光標籤之訊號作為形成結合複合物之指示。在某些實施例中，螢光標籤包括螢光素(FITC)、藻紅素(PE)(較佳地R-PE)或別藻藍蛋白(APC)。

在一些實施例中，樣本係來自個體之組織。在某些實施例中，組織選自由扁桃腺、闌尾、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、子宮頸、腎、胰臟、膀胱、腦、甲狀腺、耳、鼻、咽喉及食道所組成之群組。在某些實施例中，組織選自由乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、食道及膀胱所組成之群組。在某些實施例中，組織係乳房。在某些實施例中，組織係卵巢。在某些實施例中，組織係前列腺。除了本文中闡述之方法，本發明亦提供使用本發明之結合劑染色之組織樣本。

在一些實施例中，樣本係來自個體且存在PTK7表現細胞指示該個體罹患疾病。

在一些實施例中，樣本係來自個體且該方法進一步包含：定量該樣本中之結合PTK表現細胞以獲得定量結果，其中該定量結果超過預定閾值指示該個體罹患疾病。

在某些實施例中，疾病的發生與存在PTK7表現相關。在某些實施例中，疾病的發生與存在PTK7表現細胞相關。在某些實施例中，疾病的發生與組織切片中PTK7表現細胞的數量超過預定數量閾值相關。在某些實施例中，疾病的發生與組織切片中PTK7表現細胞佔總細胞的比率超過預定比率閾值相關。

在一些實施例中，疾病係癌症。在某些實施例中，疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。

在某些實施例中，疾病係乳癌。在某些實施例中，疾病係卵巢癌。在某些實施例中，疾病係肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。

在一些實施例中，疾病係結腸癌。在一些實施例中，疾病係前列腺癌。在某些實施例中，疾病係黑色素瘤。在一些實施例中，疾病係肺癌。在一些實施例中，疾病係食道癌。在一些實施例中，疾病係胃癌。在一些實施例中，疾病係子宮內膜癌。在某些實施例中，疾病係頭頸癌。在一些實施例中，疾病係膀胱癌。疾病檢測及治療

在一些實施例中，本揭露提供一種測定個體是否罹患疾病之方法，包含：自個體獲得樣本；使樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸，藉由檢測及/或定量檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定個體是否罹患疾病，其中存在結合複合物或結合複合物之水準超過預定閾值指示個體罹患疾病。在一些實施例中，方法係在已自個體獲得之樣本上實施，且因此方法不包含樣本收集之步驟。

在某些實施例中，疾病的發生與存在PTK7表現相關。在某些實施例中，疾病的發生與存在PTK7表現細胞相關。在某些實施例中，疾病的發生與組織切片中PTK7表現細胞的數量超過預定數量閾值相關。在某些實施例中，疾病的發生與組織切片中PTK7表現細胞佔總細胞的比率超過預定比率閾值相關。

在一些實施例中，疾病係癌症。在某些實施例中，疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。

在某些實施例中，疾病係乳癌。在某些實施例中，疾病係卵巢癌。在某些實施例中，疾病係肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。

在一些實施例中，疾病係結腸癌。在一些實施例中，疾病係前列腺癌。在某些實施例中，疾病係黑色素瘤。在一些實施例中，疾病係肺癌。在一些實施例中，疾病係食道癌。在一些實施例中，疾病係胃癌。在一些實施例中，疾病係子宮內膜癌。在某些實施例中，疾病係頭頸癌。在一些實施例中，疾病係膀胱癌。

在一些實施例中，本揭露提供一種治療患者的疾病之方法，該患者藉由本文所述之檢測方法測定為患有該疾病。在一個實施例中，檢測方法包含自個體獲得樣本；使樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸；藉由檢測及/或定量檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定個體是否罹患疾病，其中存在結合複合物或結合複合物之水準超過預定閾值指示個體罹患疾病；及治療疾病。在一些實施例中，結合劑包含VH及VL區，該VH及VL區包含如以下所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2；分別為SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO:9；或分別為SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16。亦提供用於此類方法中之抗癌劑。

在某些實施例中，疾病的發生與存在PTK7表現相關。在某些實施例中，疾病的發生與存在PTK7表現細胞相關。在某些實施例中，疾病的發生與組織切片中PTK7表現細胞的數量超過預定數量閾值相關。在某些實施例中，疾病的發生與組織切片中PTK7表現細胞佔總細胞的比率超過預定比率閾值相關。

在一些實施例中，疾病係癌症。在某些實施例中，疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。

在某些實施例中，疾病係乳癌。在某些實施例中，疾病係卵巢癌。在某些實施例中，疾病係肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。

在一些實施例中，疾病係結腸癌。在一些實施例中，疾病係前列腺癌。在某些實施例中，疾病係黑色素瘤。在一些實施例中，疾病係肺癌。在一些實施例中，疾病係食道癌。在一些實施例中，疾病係胃癌。在一些實施例中，疾病係子宮內膜癌。在某些實施例中，疾病係頭頸癌。在一些實施例中，疾病係膀胱癌。

在某些實施例中，治療包括向個體投予化學療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予荷爾蒙療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予放射療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予免疫療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予幹細胞療法。

在某些實施例中，治療包括向個體投予靶向療法。

在某些實施例中，治療包括在個體實施手術。

在某些實施例中，疾病係乳癌且治療包括腫瘤切除術或乳房切除術。

在某些實施例中，疾病係卵巢癌且治療包括子宮切除術或輸卵管卵巢切除術。

在一些實施例中，本揭露提供一種監測個體的疾病之進展之方法，其包含以下步驟：自個體獲得樣本；使樣本與包含本揭露之結合劑之檢測劑接觸；評估檢測劑與PTK7之間形成結合複合物以獲得第一評估結果；在後續時間點使用來自個體之樣本重複步驟(a)、(b)及(c)以獲得第二評估結果；及比較第二評估結果與第一評估結果以決定個體的疾病之進展。

在某些實施例中，疾病的發生與存在PTK7表現相關。在某些實施例中，疾病的發生與存在PTK7表現細胞相關。在某些實施例中，疾病的發生與組織切片中PTK7表現細胞的數量超過預定數量閾值相關。在某些實施例中，疾病的發生與組織切片中PTK7表現細胞佔總細胞的比率超過預定比率閾值相關。

在一些實施例中，疾病係癌症。在某些實施例中，疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。

在某些實施例中，疾病係乳癌。在某些實施例中，疾病係卵巢癌。在某些實施例中，疾病係肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。

在一些實施例中，疾病係結腸癌。在一些實施例中，疾病係前列腺癌。在某些實施例中，疾病係黑色素瘤。在一些實施例中，疾病係肺癌。在一些實施例中，疾病係食道癌。在一些實施例中，疾病係胃癌。在一些實施例中，疾病係子宮內膜癌。在某些實施例中，疾病係頭頸癌。在一些實施例中，疾病係膀胱癌。套組

本揭露亦提供一種用於檢測樣本中之PTK7表現細胞之套組。在一些實施例中，此類套組一般包含實施本文所述之IHC方法(即檢定)所必需之一或多種組分。組分可為化合物、試劑、容器及/或設備。

在一些實施例中，套組包含檢測劑，其包括本揭露之抗體、抗體片段及其他檢測劑中之任一者(整體稱為「結合劑」)。

在一些實施例中，套組之結合劑係經可檢測之標記標示。

在一些實施例中，套組進一步包括第二抗體，該第二抗體係經標示及組態以結合至可由檢測劑及PTK7形成之結合複合物。在某些實施例中，二級抗體係經可檢測之標記標示。

在一些實施例中，套組進一步包括夥伴劑。針對可檢測標記及夥伴劑的說明提供於本揭露他處。

在一些實施例中，套組進一步包括檢定中使用之緩衝劑。

在一些實施例中，套組進一步包含實施本發明之方法之說明。

在一些實施例中，套組包含本文中關於本發明之方法所提及之所有試劑。在一些實施例中，套組進一步包含實施方法之說明。用途

本揭露亦提供結合劑於檢測樣本中之PTK7表現細胞之用途、結合劑於製造用於檢測樣本中之PTK7表現細胞的套組之用途及/或測定個體是否罹患疾病之用途。

在一些實施例中，疾病係癌症。在某些實施例中，疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。

在某些實施例中，疾病係乳癌。在某些實施例中，疾病係卵巢癌。在某些實施例中，疾病係肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。

在一些實施例中，疾病係結腸癌。在一些實施例中，疾病係前列腺癌。在某些實施例中，疾病係黑色素瘤。在一些實施例中，疾病係肺癌。在一些實施例中，疾病係食道癌。在一些實施例中，疾病係胃癌。在一些實施例中，疾病係子宮內膜癌。在某些實施例中，疾病係頭頸癌。在一些實施例中，疾病係膀胱癌。

亦提供本發明之結合劑於檢測及/或定量PTK7之用途。

亦提供本發明之結合劑於染色組織樣本之用途。進一步提供本發明之結合劑於流式細胞術之用途。進一步實施例

本文闡述之任何結合劑(特別是抗體)可用於檢測表現PTK7之癌症。在一個實施例中，本發明之結合劑(且特別是抗體)可基於其展示之染色模式(例如本申請案之表格中所闡述者)選用於如本文闡述之方法或用途中。在一個實施例中，其可因為例如比起本文闡述之其他抗體顯示與目標癌症組織更強之結合而選擇。其可例如因為染色膜PTK7而選擇。其可例如因為染色胞內PTK7而選擇。

在一個實施例中，包含M10-5F7抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測卵巢癌(SEQ ID NO: 17之HCDR1、SEQ ID NO: 18之HCDR2、SEQ ID NO: 19之HCDR3、SEQ ID NO: 20之LCDR1、RVS之LCDR2及SEQ ID NO: 21之LCDR3)。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M10-5F7抗體之VH及VL序列(分別為SEQ ID NO: 15及16)。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M10-5F7抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測扁桃腺癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M10-5F7抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M10-5F7抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測腎癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M10-5F7抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M10-5F7抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測子宮癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M10-5F7抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-8G5抗體之六個CDR(SEQ ID NO: 10之HCDR1、SEQ ID NO: 11之HCDR2、SEQ ID NO: 12之HCDR3、SEQ ID NO: 13之LCDR1、QMS之LCDR2及SEQ ID NO: 14之LCDR3)的抗體或其抗原結合片段可用於檢測卵巢癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-8G5抗體之VH及VL序列(分別為SEQ ID NO: 8及9)。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-8G5抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測乳癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-8G5抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-8G5抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測胰臟癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-8G5抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-8G5抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測肺癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-8G5抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-8G5抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測子宮癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-8G5抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-8G5抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測腎癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-8G5抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-8G5抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測胰臟癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-8G5抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-8G5抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測前列腺癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-8G5抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-11E2抗體之六個CDR(SEQ ID NO: 3之HCDR1、SEQ ID NO: 4之HCDR2、SEQ ID NO: 5之HCDR3、SEQ ID NO: 6之LCDR1、LVS之LCDR2及SEQ ID NO: 7之LCDR3)的抗體或其抗原結合片段可用於檢測乳癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-11E2抗體之VH及VL序列(分別為SEQ ID NO: 1及2)。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-11E2抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測卵巢癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-11E2抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-11E2抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測胰臟癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-11E2抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。

在一個實施例中，包含M6-11E2抗體之六個CDR的抗體或其抗原結合片段可用於檢測胃癌。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含M6-11E2抗體之VH及VL序列。亦可使用變體抗體。其他

本揭露之IHC方法及檢定應被理解為涵蓋不僅本文所述之特定步驟及試劑。本文至少提供：PTK7或複合物之檢測/定量及/或PTK7表現細胞/組織之檢測/定量。此類方法可用於疾病(例如癌症)之預後及診斷，且套組可用於根據本揭露之相同目的。可採用本揭露之結合劑的方法/檢測可包括：免疫擴散技術、免疫電泳技術、光散射免疫檢定、凝集技術、經標示之免疫檢定諸如該些來自包含以下之群組者：經放射標示之免疫檢定、酶免疫檢定諸如比色檢定、化學發光免疫檢定及免疫螢光技術。所屬技術領域中具有通常知識者熟悉此等方法，其亦描述於目前最佳技術例如Zane, H. D. (2001): Immunology-Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company(特別是第14章)中。較佳地，測試格式係ELISA，且使用包含孔之微量滴定盤作為診斷有用載體。序列表

下表提供本發明之抗體殖株的CDR序列、VL序列、VH序列、恆定區序列、完整重鏈序列及完整輕鏈序列之概要。本發明提供包含所闡述之六個CDR組以及變體版本之抗體。亦提供包含來自該些殖株之VL及VH序列對中之一者以及該些序列之變體序列的抗體。亦提供具有該些抗體以及其變體中之一者的完整重鏈及輕鏈序列對的抗體。

序列	SEQ ID NO.
11E2 VH	1
11E2 VL	2
11E2 HCDR1	3
11E2 HCDR2	4
11E2 HCDR3	5
11E2 LCDR1	6
11E2 LCDR2	LVS
11E2 LCDR3	7
8G5 VH	8
8G5 VL	9
8G5 HCDR1	10
8G5 HCDR2	11
8G5 HCDR3	12
8G5 LCDR1	13
8G5 LCDR2	QMS
8G5 LCDR3	14
5F7 VH	15
5F7 VL	16
5F7 HCDR1	17
5F7 HCDR2	18
5F7 HCDR3	19
5F7 LCDR1	20
5F7 LCDR2	RVS
5F7 LCDR3	21
11E2 CH	22
11E2 CL	23
8G5 CH	24
8G5 CL	25
5F7 CH	26
5F7 CL	27
11E2 重鏈	28
11E2 輕鏈	29
8G5 重鏈	30
8G5 輕鏈	31
5F7 重鏈	32
5F7 輕鏈	33

實例材料及方法1.IHC 方法

樣本製備：在60℃下乾燥烘箱中烘烤FFPE玻片1小時以改善樣本黏著至玻片。

脫蠟及復水：將FFPE組織浸入新鮮二甲苯中二次各10 min以脫蠟；分別用一系列梯度EtOH洗液(100%、95%、85%、75%)復水5 min。

將切片在dH₂O中洗滌3 min，且在PBS中洗滌二次各3 min。

表位修復：將玻片在壓力鍋中之pH9.0 EDTA抗原修復溶液(1X)中加熱直到開始沸騰，隨後在高溫及高壓下進行表位修復3 min。冷卻至室溫。將切片用PBS洗滌二次達3 min。

阻斷：將洗滌緩衝液移除，使用PAP筆在組織周圍畫出疏水性圓圈。將切片用過氧化酶阻斷試劑在室溫下阻斷15 min。將切片用PBS洗滌二次各3 min。

一級抗體培育：根據特定產品說明書進行抗體稀釋。將洗滌緩衝液移除，且用經稀釋於建議抗體稀釋劑中之100至400μL一級抗體覆蓋切片。在37℃下增濕室中培育1小時。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。

二級抗體培育：將洗滌緩衝液移除，且用1至3滴經HRP共軛之山羊抗兔及小鼠試劑覆蓋切片。在37℃下增濕室中培育30 min。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。

DAB染色：藉由徹底混合每1mL DAB受質緩衝劑1滴濃縮DAB溶液來製備含DAB之受質工作溶液。將洗滌緩衝液移除，且在室溫下將組織切片覆蓋於1X DAB工作溶液中達3 min。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。

對比染色：將切片完全浸沒在蘇木精中且培育1 min。將玻片浸入藍色溶液中。將玻片在自來水中潤洗3 min。

脫水及透明化：分別用一系列梯度EtOH洗液(70%、85%、95%、100%)脫水3 min。浸入新鮮二甲苯中二次各10 min。

封片：將切片用封片劑封片。2. 在細胞系上製備 FFPE 嵌塊

在對數生長期期間分別收集細胞，並使用Count-star計數細胞數量。

在4℃下以1000 rpm離心24小時後，收集約5×10⁶個細胞(1x10⁷)。

將上清液丟棄，接著添加30 mL 10% NBF至含有細胞團塊之50mL試管中。

藉由將試管反轉數次來製備細胞懸浮液。接著將試管水平放置在工作台上，且將細胞固定在10%NBF中達30 min。

將樣本在4℃下以1000 rpm離心5 min，將所有固定液小心丟棄而不擾動試管底部之細胞團塊，並將樣本放置在50℃培育箱中預熱。

將HistoGel在沸騰水浴中加熱3至10分鐘，並將液體HitoGel放置在50℃培育箱中。

添加一或二滴HistoGel在細胞沉積物上，渦旋數秒以徹底混合。接著將混合物放置在冰上5至10分鐘以固化凝膠。

將細胞凝膠放置在長孔包埋盒中。在250 mL燒杯中，將細胞凝膠用流動水緩慢潤洗1h，接著依序添加50%、75%、85%、95%乙醇至細胞嵌塊，使細胞凝膠浸泡在各乙醇溶液中達1h。最後，使細胞凝膠浸泡在100%乙醇中二次，每次1h。

將細胞嵌塊自100%乙醇移出，並將其浸泡在二甲苯中二次，每次1h。

將細胞嵌塊浸泡在液體石蠟中二次，每次1h，但可置放隔夜。

根據標準包埋程序製備FFPE嵌塊。在石蠟包埋站上將組織包埋在石蠟中。實例 1 - 最佳選殖株的融合瘤製作

PTK7 ECD蛋白質係在實驗室內部製備且用來作為抗原。抗PTK7之單株抗體係藉由依序用含有佐劑之PTK7-his抗原蛋白質免疫動物來發展，且實驗動物係Balb/c小鼠。

動物用每動物100 μg之抗原進行第一次免疫接種，後續使用每動物50 μg之抗原進行第二次及第三次免疫接種，及25 μg進行加強免疫。實驗中使用之免疫佐劑係Freund氏佐劑(完全及不完全)。所有動物係藉由腹膜內注射免疫。選擇具有良好免疫力價及血清免疫組織化學(IHC)陽性之小鼠進行加強免疫。在加強免疫後，將小鼠犧牲且浸泡在75 %醇中。將脾臟分割出來，用研磨棒研磨，並通過細胞過濾器過濾以製備單細胞懸浮液。將脾臟細胞懸浮液以1,500 rpm離心5 min，並將上清液丟棄。在室溫下添加5 mL紅血球溶解物以溶解紅血球5 min，並添加PBS以達到20 mL。在以1,500 rpm離心5 min後，將上清液丟棄。再懸浮後計數存活細胞。收集在培養瓶中之Sp2/0細胞，且在以1,500 rpm離心5 min後，將上清液丟棄。再懸浮後計數存活細胞。將脾臟細胞與Sp2/0細胞以4:1之比率混合，並以1,500 rpm進行離心5 min，將上清液丟棄。將細胞再懸浮於20 mL電穿孔緩衝劑中。在以1,500 rpm離心7 min後，將上清液丟棄，並將步驟重複一次。將細胞用適量電穿孔緩衝劑再懸浮以確保細胞濃度為約2x10⁷個細胞/mL。將細胞懸浮液添加至9 mL電穿孔槽以進行融合。在融合後，將細胞懸浮液轉移至含有20% FBS之20 mL RPMI 1640完全培養基中，接著留置在室溫下20 min。將融合細胞用含有1xHAT、1xBIOMYC3及20% FBS之RPMI 1640培養基再懸浮。將細胞懸浮液以100 μL/孔添加至數個96孔細胞培養盤以確保每孔的細胞體積係約5x10⁴個細胞/孔，且將盤放置在37°C細胞培育箱中。在7天後，將額外100 μL之含有20 % FBS、1xHAT及1xBIOMYC-3之RPMI 1640完全培養基添加至各孔。在融合10天後，收集來自融合瘤親代選殖株之細胞培養上清液，且藉由ELISA及IHC方法與人類PTK7-his蛋白質之結合來用於篩選。後續選擇ELSIA及IHC兩者皆陽性之選殖株用於進一步驗證。實例 2-IHC 方法 - 小鼠血清驗證

將卵巢癌之FFPE(福馬林固定石蠟包埋)切片在60℃下乾燥烘箱中烘烤1小時，接著在新鮮二甲苯中脫蠟10min且透過梯度濃度乙醇(100%、95%、85%、75%)至蒸餾水復水，將切片用PBS洗滌二次各3 min。藉由將切片在壓力鍋中之pH 9.0 EDTA抗原修復溶液(1X)中加熱直到開始沸騰來實施表位修復。將切片冷卻至室溫。將切片用蒸餾水洗滌二次達3 min。藉由在室溫下於過氧化酶阻斷試劑中培育切片15 min來阻斷內源性過氧化酶活性，接著用PBS洗滌二次各3 min。分別使用稀釋1:500、1:2000之抗PTK7之一級抗體(小鼠血清)實施PTK7之免疫檢測。將切片用100至400 μL之一級抗體稀釋液覆蓋且在37℃下培育1小時。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。接著將切片與經HRP共軛之山羊抗兔及小鼠試劑在37℃下培育30 min且在室溫下使用含DAB之受質工作溶液作為色原體觀測3 min，導致棕色染色。將切片用PBS洗滌二次各3 min。最後，將切片對比染色(用蘇木精且培育1 min，在自來水中潤洗3 min)，脫水(分別透過梯度濃度乙醇(70%、85%、95%、100%)達3 min)且在封片劑中封片。實例 3-IHC 方法 - 融合瘤篩選 ( 手動 )

將福馬林固定、石蠟包埋腫瘤組織切片在60℃下乾燥烘箱中烘烤1小時，接著在新鮮二甲苯中脫蠟10min且透過梯度濃度乙醇(100%、95%、85%、75%)至蒸餾水復水，將切片用PBS洗滌二次達3 min。藉由將切片在壓力鍋中之pH9.0 EDTA抗原修復溶液(1X)中加熱直到開始沸騰來實施表位修復。將切片冷卻至室溫。將切片用蒸餾水洗滌二次達3 min。藉由在室溫下於過氧化酶阻斷試劑中培育切片15 min來阻斷內源性過氧化酶活性。接著將切片用PBS洗滌二次各3 min。使用抗PTK7之一級抗體(融合瘤上清液)實施PTK7之免疫檢測，並將切片用100至400 μL一級抗體稀釋液覆蓋，且在37℃下培育1小時。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。接著將切片與經HRP共軛之山羊抗兔及小鼠試劑在37℃下培育30 min且在室溫下使用含DAB之受質工作溶液作為色原體觀測3 min，導致棕色染色。將切片用PBS洗滌二次各3 min。最後，將切片對比染色(用蘇木精且培育1 min，在自來水中潤洗3 min)，脫水(分別透過梯度濃度乙醇(70%、85%、95%、100%)達3 min)且在封片劑中封片。結果顯示於圖1A至圖1D。實例 4-IHC 方法 - 次選殖株篩選 ( 手動 )

將福馬林固定、石蠟包埋腫瘤組織切片在60℃下乾燥烘箱中烘烤1小時，接著在新鮮二甲苯中脫蠟10min且透過梯度濃度乙醇(100%、95%、85%、75%)至蒸餾水復水。將切片用PBS洗滌二次達3 min。藉由將切片在壓力鍋中之pH9.0 EDTA抗原修復溶液(1X)中加熱直到開始沸騰來實施表位修復。將切片冷卻至室溫。將切片用蒸餾水洗滌二次達3 min。藉由在室溫下於過氧化酶阻斷試劑中培育切片15 min來阻斷內源性過氧化酶活性，接著將切片用PBS洗滌二次各3 min。使用抗PTK7之一級抗體(融合瘤上清液)實施PTK7之免疫檢測，並將切片用100至400 μL一級抗體稀釋液覆蓋，且在37℃下培育1小時。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。接著將切片與經HRP共軛之山羊抗兔及小鼠試劑在37℃下培育30 min且在室溫下使用含DAB之受質工作溶液作為色原體觀測3 min，導致棕色染色。將切片用PBS洗滌二次各3 min。最後，將切片對比染色(用蘇木精且培育1 min，在自來水中潤洗3 min)，脫水(分別透過梯度濃度乙醇(70%、85%、95%、100%)達3 min)且在封片劑中封片。表1顯示在卵巢癌及乳癌中最佳8個次選殖株(畫底線)之IHC篩選結果。表 1 ：在卵巢癌及乳癌中最佳 8 個次選殖株 IHC 篩選結果

樣本編號	選殖株編號	卵巢癌	乳癌
26	M1-13A8	細胞質陽性及核膜陽性	細胞質陽性及核膜陽性
28	M1-15B5	膜2+，基質2+	膜2+，基質2+
204	M6-9E10	基質陽性	膜2+，基質2+
206	M6-9H5	膜1+，基質1+	膜1+，基質1+
222	M6-2C6	膜3+，基質3+	膜3+，基質3+
226	M6-13A4	陰性	陰性
235	M6-14H10	膜3+，基質3+ 免疫細胞強陽性染色	膜3+，基質3+ 免疫細胞強陽性染色
246	M6-15H4	泛染色	泛染色
270	M6-18H11	細胞質陽性	細胞質陽性
312	M10-5F7	膜3+，基質陰性	陰性
58	M1-11E5	細胞質陽性及核膜陽性	細胞質陽性及膜陽性
134	M6-17F7	膜3+，基質陽性	膜陽性
148	M6-20A4	陰性	陰性
156	M10-1A6	陰性	陰性
236	M6-8G5	膜3+，基質3+	膜3+，基質3+
254	M6-11B1	陰性	陰性
259	M6-11E2	膜3+，基質3+	膜3+，基質3+

基於良好及不同的染色結果選擇206-M6-9H5 (M10091-01)(參見圖2A至圖2B)、222-M6-2C6 (M10091-04)(參見圖3A至圖3B)、235-M6-14H10 (M10091-05)(參見圖4A至圖4B)、312-M10-5F7 (M10091-08)(參見圖5A至圖5B)、58-M1-11E5 (M10091-06)(參見圖6A至圖6B)、134-M6-17F7 (M10091-03)(參見圖7A至圖7B)、236-M6-8G5 (M10091-07)(參見圖8A至圖8B)、259-M6-11E2 (M10091-02)(參見圖9A至圖9B)。

最佳3個次選殖株IHC結果：表2顯示用於IHC測試之最佳3個次選殖株的建議濃度；表3顯示用於最佳3個次選殖株之滴定檢定的腫瘤切片之ID及組織來源；表4顯示用於最佳3個次選殖株之組織微陣列(TMA)的組織類型。

11E2：卵巢癌細胞膜陽性，乳癌細胞膜陽性，腫瘤基質陽性。(參見圖10)

8G5：卵巢癌細胞膜陽性，乳癌細胞膜陽性，腫瘤基質陽性。(參見圖11)

5F7：卵巢癌細胞膜係陽性，乳癌腫瘤細胞係陰性，且腫瘤基質係陽性。(參見圖12)

CST：卵巢癌細胞膜係陽性，乳癌細胞膜係陽性，且腫瘤基質係陽性。(參見圖13) 表 4 ：組織類型

扁桃腺	結腸	闌尾	脾臟	胰臟	肝臟
胃	肺臟	腎臟	心肌	腦	子宮
乳房	結直腸癌	甲狀腺	前列腺癌	乳癌	卵巢癌
鱗狀細胞肺癌	肺腺癌	肝細胞癌	腎癌	胃癌	惡性黑色素瘤

實例 5-IHC 方法 - 用於 TMA 之最佳殖株最佳化 ( 手動 )

將福馬林固定、石蠟包埋腫瘤組織切片在60℃下乾燥烘箱中烘烤1小時，接著在新鮮二甲苯中脫蠟10min且透過梯度濃度乙醇(100%、95%、85%、75%)至蒸餾水復水。將切片用PBS洗滌二次達3 min。藉由將切片在壓力鍋中之pH9.0 EDTA抗原修復溶液(1X)中加熱直到開始沸騰來實施表位修復。將切片冷卻至室溫，接著用蒸餾水洗滌二次達3 min。藉由在室溫下於過氧化酶阻斷試劑中培育切片15 min來阻斷內源性過氧化酶活性，將切片用PBS洗滌二次各3 min。使用建議濃度(分別為1、2、4、8 μg/mL)之抗PTK7之一級抗體實施PTK7之免疫檢測，並將切片用100至400 μL一級抗體稀釋液覆蓋且在37℃下培育1小時。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。接著將切片與經HRP共軛之山羊抗兔及小鼠試劑在37℃下培育30 min且在室溫下使用含DAB之受質工作溶液作為色原體觀測3 min，導致棕色染色。將切片用PBS洗滌二次各3 min。最後，將切片對比染色(用蘇木精且培育1 min，在自來水中潤洗3 min)，脫水(分別透過梯度濃度乙醇(70%、85%、95%、100%)達3 min)且在封片劑中封片。

次選殖株11E2結果顯示於圖14A至圖14D。次選殖株8G5結果顯示於圖15A至圖15D。次選殖株5F7結果顯示於圖16A至圖16D。實例 6-IHC 方法 -TMA

將來自腫瘤石蠟嵌段之一毫米核心用於產生TMA。在染色之前，將微陣列在60℃下乾燥烘箱中烘烤1小時，將此等切片在新鮮二甲苯中脫蠟10min且透過梯度濃度乙醇(100%、95%、85%、75%)至蒸餾水復水，接著用PBS洗滌二次達3 min。藉由將切片在壓力鍋中之pH9.0 EDTA抗原修復溶液(1X)中加熱直到開始沸騰來實施表位修復。將切片冷卻至室溫，接著用蒸餾水洗滌二次達3 min。藉由在室溫下於過氧化酶阻斷試劑中培育切片15 min來阻斷內源性過氧化酶活性，接著將切片用PBS洗滌二次各3 min。使用建議濃度(分別為1、2、2 μg/mL)之抗PTK7之一級抗體實施PTK7之免疫檢測，並將切片用100至400 μL之一級抗體稀釋液覆蓋且在37℃下培育1小時。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。接著將切片與經HRP共軛之山羊抗兔及小鼠試劑在37℃下培育30 min且在室溫下使用含DAB之受質工作溶液作為色原體觀測3 min，導致棕色染色。將切片用PBS洗滌二次各3 min。最後，將切片對比染色(用蘇木精且培育1 min，在自來水中潤洗3 min)，脫水(分別透過梯度濃度乙醇(70%、85%、95%、100%)達3 min)且在封片劑中封片。表5顯示TMA-Leica。表6顯示TMA-手動。表 5 ： TMA- 藉由 Leica 自動染色機之 IHC

Leica
組織	M10091-02 (11E2)	M10091-07 (8G5)	M10091-08 (5F7)	CST PTK7/CCK4 (D2Z1N)兔mAb
扁桃腺	整體微弱鱗狀上皮具有細胞膜定位染色及基底細胞層染色	鱗狀上皮具有細胞膜定位染色及基底細胞層染色	中度至強烈細胞質染色	基底細胞層染色
結腸	腺體細胞膜、 基質染色	腺體細胞膜、 基質染色	基質染色	腺體細胞膜、 基質染色
闌尾	腺體細胞膜、 基質染色	腺體細胞膜、 基質染色	腺體細胞膜、基質染色，血管內皮染色	腺體細胞膜、 基質染色
脾臟	無染色	有限的細胞染色
胰臟	無染色	胰臟細胞強烈 染色	胰臟細胞微弱染色及血管內皮染色	胰臟細胞強烈染色及非特異性染色
肝臟	無染色	肝細胞之顆粒細胞質染色
胃	胃小窩底部的腺體上之擴散細胞質染色
肺臟	無染色	少量的肺泡細胞細胞質染色	無染色	少量的肺泡細胞細胞質染色
腎臟	遠端小管及近端小管微弱染色	遠端小管強烈染色及近端小管微弱染色	遠端小管強烈染色及近端小管微弱染色	遠端小管強烈染色及近端小管微弱染色
心肌	無染色	背景染色
腦	非常有限的細胞染色	有限的細胞染色	有限的細胞染色	有限的細胞染色
子宮	腺體染色	腺體染色	無染色	腺體染色
乳腺	失敗
甲狀腺	輕微非特異性染色
結腸癌	腫瘤基質染色	腫瘤基質染色	腫瘤細胞及基質染色	強烈染色
前列腺癌	細胞膜微弱染色	細胞膜強烈染色	細胞膜微弱染色	細胞質染色
乳癌	細胞膜微弱染色	細胞膜強烈染色	細胞質染色	細胞膜及細胞質染色
卵巢癌	陽性染色	陽性染色	陽性染色，無基質染色	陽性染色
肺鱗狀細胞癌	失敗
肺腺癌	基質染色	基質染色	肺腺癌細胞及基質染色	肺腺癌細胞及基質染色
肝癌	無染色	顆粒細胞質染色
胃癌	僅一些非典型細胞染色在組織中
惡性黑色素瘤	腫瘤細胞膜染色	腫瘤細胞核染色

表 6 ： TMA- 藉由手動 染色之 IHC

手動
組織	M10091-02 (11E2)	M10091-07 (8G5)	M10091-08 (5F7)	CST PTK7/CCK4 (D2Z1N)兔mAb
扁桃腺	整體微弱鱗狀上皮具有細胞膜定位染色及基底細胞層染色	鱗狀上皮具有細胞膜定位染色及基底細胞層染色	中度至強烈細胞質染色	基底細胞層染色
結腸	腺體細胞膜、 基質染色	腺體細胞膜、 基質染色	基質染色	腺體細胞膜、 基質染色
闌尾	腺體細胞膜、 基質染色	腺體細胞膜、 基質染色	基質染色， 血管內皮染色	腺體細胞膜、 基質染色
脾臟	無染色	有限的細胞染色
胰臟	胰臟細胞強烈染色	胰臟細胞強烈染色	胰臟細胞微弱染色及血管內皮染色	胰臟細胞強烈染色及非特異性染色
肝臟	無染色	肝細胞之顆粒細胞質染色
胃	胃小窩底部的腺體上之擴散細胞質染色	無染色	胃小窩底部的腺體上之擴散細胞質染色
肺臟	少量的肺泡細胞細胞質染色	少量的肺泡細胞細胞質染色	無染色	少量的肺泡細胞細胞質染色
腎臟	細胞質染色，遠端小管強烈染色，近端小管微弱染色	細胞質染色，遠端小管強烈染色，近端小管微弱染色	細胞質染色	細胞質染色，遠端小管強烈染色，近端小管微弱染色
心肌	無染色	背景染色
腦	非常有限的細胞染色	有限的細胞染色	有限的細胞染色	有限的細胞染色
子宮	腺體染色	腺體染色	無染色	腺體染色
乳腺	乳腺管染色
甲狀腺	輕微非特異性染色
結腸癌	腫瘤基質染色	腫瘤基質染色	腫瘤細胞染色	強烈染色
前列腺癌	前列腺癌細胞及管微弱至中度膜染色
乳癌	細胞膜染色	細胞膜染色	無染色	細胞膜染色
卵巢癌	陽性染色	陽性染色	陽性染色，無基質染色	陽性染色
肺鱗狀細胞癌	鱗狀腫瘤細胞中度染色	鱗狀腫瘤細胞強烈染色	鱗狀腫瘤細胞中度染色	鱗狀腫瘤細胞強烈染色
肺腺癌	腺癌細胞無染色，基質染色	腺癌細胞無染色，基質染色	腺癌細胞及基質兩者染色	腺癌細胞及基質兩者染色
肝癌	無染色	顆粒細胞質染色
胃癌	僅一些非典型細胞染色在組織中
惡性黑色素瘤	腫瘤細胞膜染色	腫瘤細胞膜染色	腫瘤細胞無染色，血管內皮 染色	腫瘤細胞核染色

次選殖株11E2 TMA結果顯示於圖17A至圖17B。次選殖株8G5 TMA結果顯示於圖18A至圖18B。次選殖株5F7 TMA結果顯示於圖19A至圖19B。實例 7-IHC 方法 - 腫瘤細胞嵌塊 ( 手動 )

將福馬林固定、石蠟包埋腫瘤細胞切片在60℃下乾燥烘箱中烘烤1小時，接著在新鮮二甲苯中脫蠟10min且透過梯度濃度乙醇(100%、95%、85%、75%)至蒸餾水復水。將切片用PBS洗滌二次達3 min。藉由將切片在壓力鍋中之pH9.0 EDTA抗原修復溶液(1X)中加熱直到開始沸騰來實施表位修復。將切片冷卻至室溫。將切片用蒸餾水洗滌二次達3 min。藉由在室溫下於過氧化酶阻斷試劑中培育切片15 min來阻斷內源性過氧化酶活性，接著將切片用PBS洗滌二次各3 min。使用建議濃度(分別為1、2、2 μg/mL)之抗PTK7之一級抗體實施PTK7之免疫檢測，並將切片用100至400 μL一級抗體稀釋液覆蓋，在37℃下培育1小時。將切片在PBS中洗滌二次各3 min。接著將切片與經HRP共軛之山羊抗兔及小鼠試劑在37℃下培育30 min且在室溫下使用含DAB之受質工作溶液作為色原體觀測3 min，導致棕色染色。將切片用PBS洗滌二次各3 min。最後，將切片對比染色(用蘇木精且培育1 min，在自來水中潤洗3 min)，脫水(分別透過梯度濃度乙醇(70%、85%、95%、100%)達3 min)且在封片劑中封片。

最佳3個細胞系IHC。

PTK7抗原表現水準：PA-1＞MDA-MB-453＞ MCF-7。Raji係陰性對照。次選殖株11E2結果顯示於圖20。次選殖株8G5結果顯示於圖21。次選殖株5F7結果顯示於圖22。PA-1係原本單離自卵巢癌患者之癌細胞系。MDA-MB-453係原本來自轉移性乳癌患者之癌細胞系。MCF-7係原本單離自乳腺癌患者之癌細胞系。

已經如此描述基本概念，所屬技術領域中具有通常知識者在閱讀此詳細揭露後相當明顯的是，前述詳細揭露之意圖在於僅以例示方式呈現而非限制性。雖然本文中並未明白陳述，但各種改變、改善及修飾皆可發生且為所屬技術領域中具有通常知識者所意圖。此等改變、改善及修飾意圖由本揭露提出且在本揭露之例示性實施例的精神及範疇內。

此外，某些用語用於描述本揭露之實施例。例如，用語「一個實施例」、「一實施例」及「一些實施例」表示關於該實施例所述之特定特點、結構或特徵係包括在本揭露之至少一個實施例中。因此，所強調且應理解的是，在本說明書之各個部分二或更多次提及「一實施例」或「一個實施例」或「替代實施例」時不必然均參照相同實施例。此外，特定特點、結構或特徵可在本揭露之一或多個實施例中合適地組合。

另外，所屬技術領域中具有通常知識者將理解的是，本揭露之態樣可在本文中以若干可專利的類型或範疇中任一者說明及描述，該可專利的類型或範疇包括任何新穎且有用的過程、機器、製造或物質組成或其任何新穎且有用的改善。

此外，所記述之處理元件或序列之順序，或數字、字母或其他標識之使用因此並無意圖限制所主張權利的過程及方法之任何順序，除非在申請專利範圍中可能指明者。雖然以上揭露透過各種實例討論多種目前認為有用的本揭露之實施例，但應理解此類細節僅出於該目的，且隨附的申請專利範圍並不限於該揭示實施例，但相反地意圖涵蓋在該揭示實施例之精神及範疇內的修飾及等效配置。

類似地，應理解在本揭露之實施例的前述說明中，有時將各種特點集中在單一實施例、圖式或其說明中，以簡化本揭露從而協助理解各種實施例之一或多者。然而，此揭露方法不應被解讀為反映所主張權利之標的需要比起各請求項中明白記述者更多特點之意圖。而是，所主張權利之標的少於單一前述揭示實施例之所有特點。進一步實施例 - 結合劑1.   一種蛋白酪胺酸激酶7 (PTK7)之結合劑，其包含：重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，該VH及VL CDR具有選自如以下組成之群組所示之胺基酸序列組的胺基酸序列：a.   分別為SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、LVS及SEQ ID NO: 7；b.   分別為SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、QMS及SEQ ID NO: 14；及c.   分別為SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、RVS及SEQ ID NO: 21。2.   如1之結合劑，其中該VH及VL區具有選自如以下組成之群組所示之胺基酸序列對的胺基酸序列：a.   分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2；b.   分別為SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO:9；及c.    分別為SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16。3.   如1之結合劑，其中該VH及VL區具有選自如以下組成之群組所示之胺基酸序列對的胺基酸序列：a.   分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2；b.   分別為SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 9；及c.    分別為SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16，其中該重鏈及輕鏈框架區可選地經該框架區中之1至8個胺基酸取代、缺失或插入修飾。4.   如1至3中任一者之結合劑，其中該框架區係人類框架區。5.   如1至3中任一者之結合劑，其中該框架區係小鼠框架區。6.   如1至5中任一者之結合劑，其中該結合劑係抗體。7.   如1至6中任一者之結合劑，其中1至6中任一者，其中該結合劑進一步包含重鏈恆定區。8.   如1至6中任一者之結合劑，其中該結合劑係單株抗體。9.   如8之結合劑，其中該重鏈恆定區係IgG同型。10.  如8之結合劑，其中該重鏈恆定區係人類IgG1恆定區或人類IgG4恆定區。11.  如8之結合劑，其中該重鏈恆定區係小鼠IgG1恆定區、小鼠IgG2a恆定區、小鼠IgG2c恆定區或小鼠IgG3恆定區。12.  如8之結合劑，其中該重鏈恆定區具有如SEQ ID NO: 22、24或26所示之胺基酸序列。13.  如1至11中任一者之結合劑，其中該結合劑進一步包含輕鏈恆定區。14.  如13之結合劑，其中該輕鏈恆定區具有如SEQ ID NO: 23、25或27所示之胺基酸序列。15.  如1之結合劑，其中該結合劑係單株抗體，該單株抗體包含：具有如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列的VH區、具有如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的VL區、具有如SEQ ID NO: 22所示之胺基酸序列的重鏈恆定區及具有如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。16.  如1之結合劑，其中該結合劑係單株抗體，該單株抗體包含：具有如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的VH區、具有如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的VL區、具有如SEQ ID NO: 24所示之胺基酸序列的重鏈恆定區及具有如SEQ ID NO: 25所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。17.  如1之結合劑，其中該結合劑係單株抗體，該單株抗體包含：具有如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的VH區、具有如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列的VL區、具有如SEQ ID NO: 26所示之胺基酸序列的重鏈恆定區及具有如SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。進一步實施例 -IHC 方法：A1.一種檢測樣本中之PTK7表現細胞之方法，其包含：使該樣本與包含如進一步編號實施例1至17中任一者之結合劑之檢測劑接觸，及檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物，其中檢測到該結合複合物表示該樣本中存在PTK7表現細胞。A2.如A1之方法，其中該檢測劑進一步包含標示該結合劑之可檢測標記。A2.1.如A2之方法，其中該可檢測標記包括生物素或酶標記。A2.2.如A2.1之方法，其中該酶標記包括辣根過氧化酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)。A2.3.如A2至A2.2中任一者之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：添加該可檢測標記之夥伴劑；及檢測該可檢測標記與該夥伴劑之反應作為形成該結合複合物之指示。A2.4.如A2之方法，其中該可檢測標記包括螢光標籤。A2.5.如A2.4之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：檢測來自該螢光標籤之訊號作為形成該結合複合物之指示。A3.如A1之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：使該樣本與二級抗體接觸，該二級抗體係經標示及組態以結合至該結合複合物；及檢測來自該二級抗體之訊號作為形成該結合複合物之指示。A3.1.如A3之方法，其中該二級抗體係經可檢測之標記標示。A3.2.如A3.1之方法，其中該可檢測標記包括生物素或酶標記。A3.3.如A3.1至A3.2中任一者之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：添加該可檢測標記之夥伴劑；及檢測該可檢測標記與該夥伴劑之反應作為形成該結合複合物之指示。A3.4.如A3.1之方法，其中該可檢測標記包括螢光標籤。A3.5.如A3.4之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：檢測來自該螢光標籤之訊號作為形成該結合複合物之指示。A3.6.如A3.4之方法，其中該螢光標籤包括螢光素(FITC)、藻紅素(PE)(較佳地R-PE)或別藻藍蛋白(APC)。A4.如A1之方法，其中該樣本係來自個體之組織。A4.1.如A4之方法，其中該組織選自由扁桃腺、闌尾、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、子宮頸、腎、胰臟、膀胱、腦、甲狀腺、耳、鼻、咽喉及食道所組成之群組。A4.2.如A4至A4.1中任一者之方法，其中該組織選自由乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、食道及膀胱所組成之群組。A4.3.如A4至A4.2中任一者之方法，其中該組織係乳房。A4.4.如A4至A4.2中任一者之方法，其中該組織係卵巢。A5.如A1之方法，其中該樣本係來自個體且存在PTK7表現細胞指示該個體罹患疾病。A5.1.如A5.1之方法，其中該樣本係來自個體且該方法進一步包含：定量該樣本中之結合PTK表現細胞以獲得定量結果，其中該定量結果超過預定閾值指示該個體罹患疾病。A5.2.如A5或A5.1之方法，其中該疾病係癌症。A5.3.如A5或A5.1之方法，其中該疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。A5.4.如A5或A5.1之方法，其中該疾病係乳癌。A5.5.如A5或A5.1之方法，其中該疾病係卵巢癌。A5.6.如A5或A5.1之方法，其中該疾病係肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。進一步實施例 - 疾病診斷、治療及監測B1.一種測定個體是否罹患疾病之方法，其包含：自該個體獲得樣本；使該樣本與包含如進一步編號實施例1至17中任一者之結合劑之檢測劑接觸，及藉由檢測及/或定量該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定該個體是否罹患該疾病，其中存在該結合複合物或該結合複合物之水準超過預定閾值指示該個體罹患該疾病。B1.1.如B1之方法，其中該疾病係癌症。B2.一種治療疾病之方法，其包含：自個體獲得樣本；使該樣本與包含如1至17中任一者之結合劑之檢測劑接觸；藉由檢測及/或定量該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定該個體是否罹患該疾病，其中存在該結合複合物或該結合複合物之水準超過預定閾值指示該個體罹患該疾病；及治療該疾病。B2.1.如B2之方法，其中該疾病係癌症。B2.2.如B2.1之方法，其中該疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。B2.3.如B2至B2.2中任一者之方法，其中該治療包括向該個體投予化學療法。B2.4.如B2至B2.2中任一者之方法，其中該治療包括向該個體投予荷爾蒙療法。B2.5.如B2至B2.2中任一者之方法，其中該治療包括向該個體投予放射療法。B2.6.如cB2至B2.2中任一者之方法，其中該治療包括向該個體投予免疫療法。B2.7.如B2至B2.2中任一者之方法，其中該治療包括向該個體投予幹細胞療法。B2.8.如B2至B2.2中任一者之方法，其中該治療包括向該個體投予靶向療法。B2.9.如B2至B2.2中任一者之方法，其中該治療包括在該個體實施手術。B2.10.如B2至B2.2中任一項之方法，其中該疾病係乳癌且該治療包括腫瘤切除術或乳房切除術。B2.11.如B2至B2.2中任一項之方法，其中該疾病係卵巢癌且該治療包括子宮切除術或輸卵管卵巢切除術。B3.一種監測個體的疾病之進展之方法，其包含以下步驟：(a)   自該個體獲得樣本；(b)   使該樣本與包含如進一步編號實施例1至17中任一者之結合劑之檢測劑接觸；(c)   評估該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物以獲得第一評估結果；(d)   在後續時間點使用來自該個體之樣本重複步驟(a)、(b)及(c)以獲得第二評估結果；及(e)   比較該第二評估結果與該第一評估結果以決定該個體的該疾病之進展。B3.1.如B3之方法，其中該疾病係癌症。進一步實施例 - 套組C1.一種用於檢測樣本中之PTK7表現細胞之套組，該套組包含檢測劑，該檢測劑包含如進一步編號實施例1至17中任一者之結合劑。C2.如C1之套組，其進一步包含第二抗體，該第二抗體係經標示及組態以結合至由該檢測劑及PTK7形成之結合複合物。序列表

本揭露就例示性實施例進一步描述。此等例示性實施例參照圖式詳細描述。應注意，圖式並非按比例描繪。此等實施例係非限制性例示性實施例，其中在貫穿圖式的數個視圖中類似元件符號代表類似結構，且其中：

[圖1A]係說明腫瘤組織樣本26、28、42、50、61、161、170、175藉由IHC檢定之PTK7抗體融合瘤篩選結果的圖表，其中陽性對照在圖表的左上角。

[圖1B]係說明腫瘤組織樣本204、206、218、222、226、227、231、233藉由IHC檢定之PTK7抗體融合瘤篩選結果的圖表，其中陽性對照在圖表的左上角。

[圖1C]係說明腫瘤組織樣本309、312、316、331、333、363藉由IHC檢定之PTK7抗體融合瘤篩選結果的圖表，其中陽性對照在圖表的左上角。

[圖1D]係說明腫瘤組織樣本204、206、218、222、226、227、231、233藉由IHC檢定之PTK7抗體融合瘤篩選結果的圖表，其中陽性對照在圖表的左上角及右下角。

[圖2A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-9H5(樣本26)在乳癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖2B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-9H5(樣本26)在卵巢癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖3A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-2C6(樣本222)在乳癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖3B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-2C6(樣本222)在卵巢癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖4A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-14H10 (樣本235)在乳癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖4B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-14H10 (樣本235)在卵巢癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖5A]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7 (樣本312)在乳癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖5B]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7 (樣本312)在卵巢癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖6A]係說明PTK7抗體次選殖株M1-11E5 (樣本58)在乳癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖6B]係說明PTK7抗體次選殖株M1-11E5 (樣本58)在卵巢癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖7A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-17F7 (樣本134)在乳癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖7B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-17F7 (樣本134)在卵巢癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖8A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5(樣本236)在乳癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖8B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5(樣本236)在卵巢癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖9A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2 (樣本259)在乳癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖9B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2 (樣本259)在卵巢癌中之IHC染色結果的圖表。

[圖10]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2(樣本259)在不同放大率下之IHC染色結果的圖表：卵巢癌及乳癌兩者膜陽性，腫瘤基質陽性。

[圖11]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5(樣本236)在不同放大率下之IHC染色結果的圖表：卵巢癌及乳癌兩者膜陽性，腫瘤基質陽性。

[圖12]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7(樣本312)在不同放大率下之IHC染色結果的圖表：卵巢癌膜陽性，乳癌膜陰性，腫瘤基質陽性。

[圖13]係說明細胞染色技術(CST)在不同放大率下之IHC染色結果的圖表：卵巢癌及乳癌兩者膜陽性，腫瘤基質陽性。

[圖14A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2 (樣本259)在扁桃腺中之IHC滴定結果的圖表。

[圖14B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2 (樣本259)在卵巢癌-1中之IHC滴定結果的圖表。

[圖14C]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2 (樣本259)在卵巢癌-2中之IHC滴定結果的圖表。

[圖14D]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2 (樣本259)在乳癌中之IHC滴定結果的圖表。

[圖15A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5 (樣本236)在扁桃腺中之IHC滴定結果的圖表。

[圖15B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5 (樣本236)在卵巢癌-1中之IHC滴定結果的圖表。

[圖15C]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5 (樣本236)在卵巢癌-2中之IHC滴定結果的圖表。

[圖15D]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5 (樣本236)在乳癌中之IHC滴定結果的圖表。

[圖16A]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7 (樣本312)在扁桃腺中之IHC滴定結果的圖表。

[圖16B]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7 (樣本312)在卵巢癌-1中之IHC滴定結果的圖表。

[圖16C]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7 (樣本312)在卵巢癌-2中之IHC滴定結果的圖表。

[圖16D]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7 (樣本312)在乳癌中之IHC滴定結果的圖表。

[圖17A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2 (樣本259)藉由手動染色在各種類型之正常及癌症組織中之IHC組織微陣列結果的圖表。

[圖17B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-11E2 (樣本259)藉由Leica自動染色機在各種類型之正常及癌症組織中之IHC組織微陣列結果的圖表。

[圖18A]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5 (樣本236)藉由手動染色在各種類型之正常及癌症組織中之IHC組織微陣列結果的圖表。

[圖18B]係說明PTK7抗體次選殖株M6-8G5 (樣本236)藉由Leica自動染色機在各種類型之正常及癌症組織中之IHC組織微陣列結果的圖表。

[圖19A]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7 (樣本312)藉由手動染色在各種類型之正常及癌症組織中之IHC組織微陣列結果的圖表。

[圖19B]係說明PTK7抗體次選殖株M10-5F7 (樣本312)藉由Leica自動染色機在各種類型之正常及癌症組織中之IHC組織微陣列結果的圖表。

[圖20]係藉由使用次選殖株M6-11E2(樣本259)作為一級抗體之IHC染色，說明在細胞系PA-1、MDA-MB-453、MCF-7及Raji(陰性對照)中不同的PTK7抗原表現水準的圖表。自左下圖順時針所顯示的是MCF-7、PA-1、MDA-MB-453及Raji細胞系的結果。

[圖21]係藉由使用次選殖株M6-8G5(樣本236)作為一級抗體之IHC染色，說明在細胞系PA-1、MDA-MB-453、MCF-7及Raji(陰性對照)中不同的PTK7抗原表現水準的圖表。自左下圖順時針所顯示的是MCF-7、PA-1、MDA-MB-453及Raji細胞系的結果。

[圖22]係藉由使用次選殖株M10-5F7(樣本312)作為一級抗體之IHC染色，說明在細胞系PA-1、MDA-MB-453、MCF-7及Raji(陰性對照)中不同的PTK7抗原表現水準的圖表。自左下圖順時針所顯示的是MCF-7、PA-1、MDA-MB-453及Raji細胞系的結果。

額外特點部分將在以下之說明闡示，且部分將為所屬技術領域中具有通常知識者在檢視下列及隨附圖式後所顯而易見，或可藉由實例之產生或操作學習。本揭露之特點可藉由實施或使用如以下討論之詳細實例所示之方法、工具及組合之各種態樣來實現及達到。

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Claims (68)

1. 一種蛋白酪胺酸激酶7 (PTK7)之結合劑，該結合劑包含：重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含設置在重鏈可變區框架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL區包含設置在輕鏈可變區框架區中之LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該VH及VL選自以下a.至c.所示之下列VH及VL對中之一者：a. 該VH包含：包含SEQ ID NO: 3之HCDR1、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2及包含SEQ ID NO: 5之HCDR3，且該VL包含：包含SEQ ID NO: 6之LCDR1、包含LVS之LCDR2及包含SEQ ID NO: 7之LCDR3；b.   該VH包含：包含SEQ ID NO: 10之HCDR1、包含SEQ ID NO: 11之HCDR2及包含SEQ ID NO: 12之HCDR3，且該VL包含：SEQ ID NO: 13之LCDR1、包含QMS之LCDR2及包含SEQ ID NO: 14之LCDR3；及c.   該VH包含：包含SEQ ID NO: 17之HCDR1、包含SEQ ID NO: 18之HCDR2及包含SEQ ID NO: 19之HCDR3，且該VL包含：SEQ ID NO: 20之LCDR1、包含RVS之LCDR2及包含SEQ ID NO: 21 (LCDR3)之LCDR3。
2. 如請求項1之結合劑，其中該VH及VL區選自下列VH及VL區對中之一者：a.   包含SEQ ID NO: 1之VH及包含SEQ ID NO: 2之VL；b.   包含SEQ ID NO: 8之VH及包含SEQ ID NO: 9之VL；及c.   包含SEQ ID NO: 15之VH及包含SEQ ID NO: 16之VL。
3. 如請求項1之結合劑，其中該VH及VL區具有以下所示之下列VH及VL序列對中之一者的胺基酸序列：a.   包含SEQ ID NO: 1之VH及包含SEQ ID NO: 2之VL；b.   包含SEQ ID NO: 8之VH及包含SEQ ID NO: 9之VL；及c.   包含SEQ ID NO: 15之VH及包含SEQ ID NO: 6之VL，其中該重鏈及輕鏈框架區可選地經該框架區中之1至8個胺基酸取代、缺失或插入修飾，且該抗體保留結合PTK7之能力。
4. 如請求項1至3中任一項之結合劑，其中該框架區係人類框架區。
5. 如請求項1至3中任一項之結合劑，其中該框架區係小鼠框架區。
6. 如請求項1至5中任一項之結合劑，其中該結合劑係抗體。
7. 如請求項1至6中任一項之結合劑，其中該結合劑係單株抗體。
8. 如前述請求項中任一項之結合劑，其中該結合劑包含重鏈，該重鏈包含該VH及重鏈恆定區。
9. 如請求項8之結合劑，其中該重鏈恆定區係IgG同型。
10. 如請求項8之結合劑，其中該重鏈恆定區係人類IgG1恆定區或人類IgG4恆定區。
11. 如請求項8之結合劑，其中該重鏈恆定區係小鼠IgG1恆定區、小鼠IgG2a恆定區、小鼠IgG2c恆定區或小鼠IgG3恆定區。
12. 如請求項8之結合劑，其中該重鏈恆定區具有如SEQ ID NO: 22、24或26所示之胺基酸序列。
13. 如前述請求項中任一項之結合劑，其中該結合劑包含輕鏈，該輕鏈包含該VL及輕鏈恆定區。
14. 如請求項13之結合劑，其中該輕鏈恆定區具有如SEQ ID NO: 23、25或27所示之胺基酸序列。
15. 如請求項1之結合劑，其中該結合劑係抗體，其包含：a.   重鏈，其包含具有如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列的VH區及具有如SEQ ID NO: 22所示之胺基酸序列的重鏈恆定區；及b.   輕鏈，其包含具有如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的VL區及具有如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
16. 如請求項1之結合劑，其中該結合劑係抗體，其包含：a.   重鏈，其包含具有如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列的VH區及具有如SEQ ID NO: 24所示之胺基酸序列的重鏈恆定區；及b.   輕鏈，其包含具有如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列的VL區及具有如SEQ ID NO: 25所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
17. 如請求項1之結合劑，其中該結合劑係抗體，其包含：a.   重鏈，其包含具有如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列的VH區及具有如SEQ ID NO: 26所示之胺基酸序列的重鏈恆定區；及b.   輕鏈，其包含具有如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列的VL區及具有如SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
18. 如請求項1之結合劑，其包含SEQ ID NO: 28之重鏈及SEQ ID NO: 29之輕鏈。
19. 如請求項1之結合劑，其包含SEQ ID NO: 30之重鏈及SEQ ID NO: 31之輕鏈。
20. 如請求項1之結合劑，其包含SEQ ID NO: 32之重鏈及SEQ ID NO: 33之輕鏈。
21. 一種檢測樣本中之PTK7表現細胞之方法，其包含：使該樣本與包含如請求項1至20中任一項之結合劑之檢測劑接觸，及檢測該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物，其中檢測到該結合複合物表示該樣本中存在PTK7表現細胞。
22. 如請求項21之方法，其中該檢測劑進一步包含標示該結合劑之可檢測標記。
23. 如請求項21之方法，其中該可檢測標記包括生物素或酶標記。
24. 如請求項23之方法，其中該酶標記包括辣根過氧化酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)。
25. 如請求項21至24中任一項之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：添加該可檢測標記之夥伴劑；及檢測該可檢測標記與該夥伴劑之反應作為形成該結合複合物之指示。
26. 如請求項22之方法，其中該可檢測標記包括螢光標籤。
27. 如請求項21之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：檢測來自該螢光標籤之訊號作為形成該結合複合物之指示。
28. 如請求項21之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：使該樣本與二級抗體接觸，該二級抗體係經標示及組態以結合至該結合複合物；及檢測來自該二級抗體之訊號作為形成該結合複合物之指示。
29. 如請求項28之方法，其中該二級抗體係經可檢測之標記標示。
30. 如請求項29之方法，其中該可檢測標記包括生物素或酶標記。
31. 如請求項25至30中任一項之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：添加該可檢測標記之夥伴劑；及檢測該可檢測標記與該夥伴劑之反應作為形成該結合複合物之指示。
32. 如請求項25之方法，其中該可檢測標記包括螢光標籤。
33. 如請求項32之方法，其中該檢測該檢測劑與PTK7之間形成該結合複合物包含：檢測來自該螢光標籤之訊號作為形成該結合複合物之指示。
34. 如請求項33之方法，其中該螢光標籤包括螢光素(FITC)、藻紅素(PE)(較佳地R-PE)或別藻藍蛋白(APC)。
35. 如請求項21之方法，其中該樣本係來自個體之組織。
36. 如請求項35之方法，其中該組織選自由扁桃腺、闌尾、乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、子宮頸、腎、胰臟、膀胱、腦、甲狀腺、耳、鼻、咽喉及食道所組成之群組。
37. 如請求項35至37中任一項之方法，其中該組織選自由乳房、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、肺、子宮、食道及膀胱所組成之群組。
38. 如請求項35至38中任一項之方法，其中該組織係乳房。
39. 如請求項35至37中任一項之方法，其中該組織係卵巢。
40. 如請求項21之方法，其中該樣本係來自個體且存在PTK7表現細胞指示該個體罹患疾病。
41. 如請求項37之方法，其中該樣本係來自個體且該方法進一步包含：定量該樣本中之結合PTK表現細胞以獲得定量結果，其中該定量結果超過預定閾值指示該個體罹患疾病。
42. 如請求項40或41之方法，其中該疾病係癌症。
43. 如請求項40或41之方法，其中該疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。
44. 如請求項42或43之方法，其中該疾病係乳癌。
45. 如請求項42或43之方法，其中該疾病係卵巢癌。
46. 如請求項42或43之方法，其中該疾病係肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。
47. 如請求項21至46中任一項之方法，其中該方法係免疫組織化學方法。
48. 一種如請求項1至20中任一項之結合劑於檢測PTK7蛋白質之用途。
49. 一種測定個體是否罹患疾病之方法，其包含：自該個體獲得樣本；使該樣本與包含如請求項1至20中任一項之結合劑之檢測劑接觸，及藉由檢測及/或定量該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定該個體是否罹患該疾病，其中存在該結合複合物或該結合複合物之水準超過預定閾值指示該個體罹患該疾病。
50. 如請求項49之方法，其中該疾病係癌症。
51. 一種治療個體的疾病之方法，其中該個體藉由如請求項40之方法測定為患有該疾病。
52. 如請求項51之方法，其中該結合劑包含VH及VL區，該VH及VL區包含如以下所示之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2；分別為SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO:9；或分別為SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16。
53. 一種治療疾病之方法，其包含：自個體獲得樣本；使該樣本與包含如請求項1至20中任一項之結合劑之檢測劑接觸；藉由檢測及/或定量該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物來測定該個體是否罹患該疾病，其中存在該結合複合物或該結合複合物之水準超過預定閾值指示該個體罹患該疾病；及治療該疾病。
54. 如請求項53之方法，其中該疾病係癌症。
55. 如請求項54之方法，其中該疾病選自由乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌及膀胱癌所組成之群組。
56. 如請求項53至55中任一項之方法，其中該治療包括向該個體投予化學療法。
57. 如請求項53至56中任一項之方法，其中該治療包括向該個體投予荷爾蒙療法。
58. 如請求項53至56中任一項之方法，其中該治療包括向該個體投予放射療法。
59. 如請求項53至56中任一項之方法，其中該治療包括向該個體投予免疫療法。
60. 如請求項53至56中任一項之方法，其中該治療包括向該個體投予幹細胞療法。
61. 如請求項53至56中任一項之方法，其中該治療包括向該個體投予靶向療法。
62. 如請求項53至56中任一項之方法，其中該治療包括在該個體實施手術。
63. 如請求項53至56中任一項之方法，其中該疾病係乳癌且該治療包括腫瘤切除術或乳房切除術。
64. 如請求項53至56中任一項之方法，其中該疾病係卵巢癌且該治療包括子宮切除術或輸卵管卵巢切除術。
65. 一種監測個體的疾病之進展之方法，其包含以下步驟：(a)  使來自該個體之樣本與包含如請求項1至20中任一項之結合劑之檢測劑接觸；(b)  評估該檢測劑與PTK7之間形成結合複合物以獲得第一評估結果；(c)  在後續時間點使用來自該個體之樣本重複步驟(a)、(b)及(c)以獲得第二評估結果；及(d)  比較該第二評估結果與該第一評估結果以決定該個體的該疾病之進展。
66. 如請求項65之方法，其中該疾病係癌症。
67. 一種用於檢測樣本中之PTK7表現細胞之套組，該套組包含檢測劑，該檢測劑包含如請求項1至21中任一項之結合劑。
68. 如請求項67之套組，其進一步包含第二抗體，該第二抗體係經標示及組態以結合至由該檢測劑及PTK7形成之結合複合物。