MX2007013978A

MX2007013978A - Anticuerpos monoclonales humanos a muerte programada 1 (pd-1) y metodos para tratamiento de cancer utilizando anticuerpos anti-pd-1 solos o en combinacion con otros inmunoterapeuticos.

Info

Publication number: MX2007013978A
Application number: MX2007013978A
Authority: MX
Inventors: Josephine M Cardarelli; Mohan Srinivasan; Alan J Korman; Changyu Wang; Mark J Selby; Bing Chen
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-02
Publication date: 2008-02-22
Also published as: BE2015C074I2; CN101213297A; CN105315373A; NO20200470A1; SI2161336T1; TW200716743A; ES2427646T3; KR20130114226A; FR15C0087I2; PL2161336T5; EP1896582A4; WO2006121168A1; NO2018008I1; RU2732924C2; NO344818B1; US20170088615A1; JP2009155338A; DK2161336T3; US20090217401A1; ES2720160T3

Abstract

La presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos que se enlazan especificamente a PD-1 con alta afinidad. Tambien se proporcionan moleculas con acido nucleico que codifican los anticuerpos de la invencion, vectores de expresion, celulas huesped y metodos para expresar los anticuerpos de la invencion. Tambien se proporcionan inmunoconjugados, moleculas bisespecificas y composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos de la invencion. La invencion tambien proporciona metodos para detectar PD-1, tambien como metodos para tratamientos de varias enfermedades en las que se incluyen cancer y enfermedades infecciosas, se utilizan anticuerpos anti-PD-1. La presente invencion proporciona ademas metodos para usar una inmunoterapia de combinacion, tal como anti-CLTA-4 para tratar enfermedades hiperproliferativas, tales como cancer. Metodos para alterar eventos adversos relacionados con el tratamiento con tales anticuerpos individualmente.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS A MUERTE PROGRAMADA 1 (PD-1) Y MÉTODOS PARA TRATAMIENTO DE CÁNCER UTILIZANDO ANTICUERPOS ANTI-PD-1 SOLOS O EN COMBINACIÓN CON OTROS INMUNOTERAPÉUTICOS Campo de la Invención La presente invención es concerniente en general con inmunoterapia en el tratamiento de enfermedad humana y reducción de eventos adversos relacionados con la misma. Más específicamente, la presente invención es concerniente con el uso de anticuerpos anti-PD-1 y el uso de inmunoterapia de combinación en las que se incluyen la combinación de anticuerpos anti-CTLA-4 y anticuerpos anti-PD-1, para tratar el cáncer y/o disminuir la incidencia o magnitud de eventos adversos relacionados con el tratamiento con tales anticuerpos individualmente.

Antecedentes de la Invención La proteina de Muerte Programada 1 (PD-1) es un miembrq inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTL A-4, ICOS y BTLA. PD-1 es expresada sobre células B activadas, células T y células mieloide (Ágata y colaboradores , supra ; Okazaki y colaboradores, (2002) Curr. Opin . fmmunol . 4: 391779-82; Bennett y colaboradores, (2003) J Immunol 170 : 711-8 ) . Los miembros iniciales de la familia, CD28 e ICOS, fueron cubiertos por efectos funcionales de aumentar la proliferación de célula T enseguida de la adición de anticuerpos monoclonales (Hutloff y colaboradores, (1999) Na ture 397:263-266; Hansen y colaboradores, (1980) Immunogenics 1_0: 247-260) . PD-1 fue descubierta por medio de la selección en cuanto a expresión diferencial en células apotóticas (Ishida y colaboradores, (1992) EMBO J 11 : 3881 - 95 ) . Los otros miembros de la familia, CTLA-4 y BTLA fueron descubiertos por medio de selección en cuanto a expresión diferencial en linfocitos T citotóxicos y células TH1, respectivamente. Todos CD28, ICOS y CTLA-4 tienen un residuo de cisteína sin aparear que permite la homodimerización . En contraste, se sugiere que PD-1 existe monómero, que carece de residuo de cisteina sin aparear característico en los otros miembros de la familia de CD28. El gen PD-1 es una proteina de transmembrana tipo I de 55 kDa que es parte de la superfamilia del gen Ig (Ágata y colaboradores, (1996) Immunol 8 : 165-12 ) . PD-1 contiene una porción inhibidora de tirosina de inmunorreceptor próximo (ITIM) y una porción de conmutación a base de tirosina distal de membrana (ITSM) (Thomas, MX . (1995) J Exp Med 181: 1953-6; Vivier, E y Daeron, M (1997) Immunol Today 18 : 286-91) . Aunque es estructuralmente similar a CTLA-4, PD-1 carece de la porción de MYPPPY que es crítica para el enlace de B7-1 y B7-2. Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2, que han mostrado regular descendentemente la activación de la célula T después del enlace a PD-1 (Freeman y colaboradores, (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman y colaboradores, (2001) Na t Immunol 2:261-8; Cárter y colaboradores, (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Tanto PD-L1 y PD-L2 son homólogos de B7 que se enlazan a PD-1, pero no se enlazan a otros miembros de la familia de CD28. Un ligando para PD-1, PD-L1 es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong y colaboradores , (2002) Na t . Med 8 : 181- 9 ) . La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución en los linfocitos que infiltran el tumor, una disminución en la proliferación moderada por el receptor de célula T y evasión inmune por las células cancerosas (Dong y colaboradores, (2003) J. Mol . Med. 8JL: 281-7; Blank y colaboradores, (2005) Cáncer Immunol . Immuno ther . 5_4: 307-314; Konishi y colaboradores, (2004) Clin . Cáncer Res . 10:5094-100). La supresión inmune puede ser inhibida al inhibir la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 con PD-L2 es bloqueada también (Iwai y colaboradores , (2002) Proc . Na t ' l . Acad . Sci EUA 99: 12293-7; Brown y colaboradores, (2003) J. Immunol . 170 : 1257-66) . PD-1 es un miembro inhibidor de la familia de CD28 expresado sobre células B activadas, células T y células de mieloide (Ágata y colaboradores , supra ; Okazaki y colaboradores, (2002) Curr Opin Immunol 1_4: 391779-82; Bennett y colaboradores, (2003) J Immunol 711-8). Los animales deficientes de PD-1 desarrollan varios fenotipos autoinmunes, en los que se incluyen cardiomiopatía autoinmune y síndrome semejante a lupus con artritis y nefritis (Nishimura y colaboradores, (1999) Immuni ty 1_1: 141-51; Nishimura y colaboradores, (2001) Science 291 : 319-22 ) . Adicionalmente, se ha encontrado que PD-1 juega un papel en la encefalomielitis autoinmune, lupus eritematoso sistémicos, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , diabetes tipo I y artritis reumatoide (Salama y colaboradores, (2003) J Exp Med 198 :71-78 : Prokunina y Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 1J3:R143; Nielsen y colaboradores, (2004) Lupus 11:510). En una linea de tumo de célula B murina, se ha mostrado que el ITSM de PD-1 es esencial para bloquear el flujo de Ca2+-moderado por CBR y la fosforilación de tirosina de moléculas efectores corriente abajo (Okazaki y colaboradores, (2001) PNAS 9^:13866-71) . Así, se desean agentes que reconozcan PD-1 y métodos de uso de tales agentes.

Breve Descripción de la Invención i La presente invención proporciona anticuerpos monocl'onales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se enlazan a PD-1 y que exhiben numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen, por ejemplo, alta afinidad de enlace a PD-1 humano, pero carecen de reactividad cruzada sustancial ya sea con CD28, CTLA-4 o ICOS humanos. Todavía además, se han mostrado que los anticuerpos de la invención modulan respuestas inmunes. Así, otro aspecto de la invención es concerniente con métodos para modular respuestas inmunes utilizando anticuerpos anti-PD-1. En particular, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de células de tumor in vi vo utilizando anticuerpos anti-PD-1. En un aspecto, la invención es concerniente con un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo exhibe por lo menos una de las siguientes propiedades: (a) se enlaza a PD-I humano con una KD de 1 x 10"7 M o menor; (b) no se enlaza sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS humanos; (c) incrementa la proliferación de célula T en un análisis de Reacción de Linfocito Mezclado (MLR) ; (d) incrementa la producción de interferon-gamma en un análisis de MLR; , (e) incrementa la secreción de IL-2 en un análisis de MLR; (f) se enlaza a PD-1 humano y PD-1 de chango cinomólogo; (g) inhibe el enlace de PD-L1 y/o PD-L2 a PD-1; (h) estimula respuestas de memoria específicas de antigeno; (i) estimula las respuestas de anticuerpo; (j) inhibe el crecimiento de célula de tumor in vivo . Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano, aunque en modalidades alternativas, el anticuerpo puede, por ejemplo, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado. En modalidades más preferidas, el anticuerpo se enlaza a PD-I humano con una KD de 5 x 10~8 M o menor, se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 x 10"8 M o menor, se enlaza a PD-1 humano con una KD de 5 x 10"9 M o menor, o se enlaza a PD-1 humano con una KD de entre 1 x 10~8 M y 1 x 10"10 M. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo compite de manera cruzada por el enlace a PD-1 con un anticuerpo de referencia que comprende: (a) una región variable de cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; y (b) una región variable de cadena ligera humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14.

En varias modalidades, el anticuerpo de referencia comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y : (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En otra aspecto, la invención es concerniente con un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antigeno del mismo, gue comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un VH 3-33 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1. La invención proporciona además un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo/ gue comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivada de un gen VH 4-39 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1. La invención proporciona además un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antigeno del mismo, gue comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen V? L6 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1. La invención proporciona además un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno de mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen V? L15 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1. En una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antigeno del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada de un gen VH 3-33 humano; y (b) una región variable de cadena ligera de un gen V? L6 humano; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada de un gen VH 4-3'9 humano; y (b) una región variable de cadena ligera de un gen V? L15 humano; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de antigeno del mismo, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, en donde: (a) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena pesada gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32. 33, 34 y 35, y modificaciones conservadoras de las mismas ; (b) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena ligera gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56, y modificaciones conservadoras de las mismas; y (c) el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1 humano. Preferiblemente, la secuencia de CDR2 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28 y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia de CDR2 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49 y modificaciones conservadoras de las mismas. Preferiblemente, la secuencia de CDRl de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21 y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia de CDRl de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42 y modificaciones conservadoras de las mismas. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde : (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 ; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consisite de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14; (c) el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 x 10~7 M o menor; y (d) el anticuerpo no se enlaza sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS humanos. En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente por lo menos una de las siguientes propiedades : (a) el anticuerpo incrementa la proliferación de célula T en un análisis de MLR; (b) el anticuerpo incrementa la producción de interferón-gamma en un análisis de MLR; o (c) el anticuerpo incrementa la secreción de IL-2 en un análisis de MLR. Además o alternativamente, el anticuerpo puede comprender uno o más de los otros elementos enlistados anteriormente . En modalidades preferidas, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1. Una combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 15; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 22; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 29; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 36; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 43; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera gue comprende SEQ ID NO: 50. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 16; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 37; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 51. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 24; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 31; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 38; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 45; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 52. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 18; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 25; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 32; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 39; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 46; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 53. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 26; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 33; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 40; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 47; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 54. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 20; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 27; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 41; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 48; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera gue comprende SEQ ID NO: 55. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 21; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 28; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera gue comprende SEQ ID NO: 42; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 49; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 56. Otros anticuerpos preferidos de la invención o porciones de enlace de antígeno de los mismos, comprenden: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-I . Una combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. - Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Los anticuerpos de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de plena longitud, por ejemplo de un isotipo IgGl o IgG4. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab o Fab' 2, o anticuerpos de una sola cadena. La invención también proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención o porción de enlace de antígeno del mismo, enlazado a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radiactivo. La invención también proporciona una molécula bisespecífica que comprende un anticuerpo, o porción de enlace de antigeno del mismo de la invención, enlazado a una segunda porción funcional que tiene una diferente especificidad de enlace que el anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo. También se proporcionan composiciones gue comprenden un anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo, o inmunoconjugado o molécula biespecífica de la invención, y un portador aceptable farmacéuticamente. Moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones de enlace de antígeno de los mismos, de la invención también son abarcadas por la invención, también como vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos y células huésped que comprenden tales vectores de expresión. Además, la invención proporcionan un ratón transgénico que comprende transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humano, en donde el ratón expresa un anticuerpo de la invención, también como los hibridomas preparados de tal ratón, en donde el hibridoma produce el anticuerpo de la invención. En todavia otro aspecto, la invención proporciona un método para modular una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo de la invención, de tal manera que se modula la respuesta inmune en el sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención mejora, estimula o incrementa la respuesta inmune en el sujeto. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de células de tumor en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo PD-1, o porción de enlace de antígeno del mismo. Los anticuerpos de la invención son preparados para uso en el método aunque otros anticuerpos anti-PD-1 pueden ser usados en lugar de esto (o en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 de la invención) . Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 quimérico, humanizado o plenamente humano puede ser usado en el método para el inhibir crecimiento del tumor. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-PD-1, o porción de enlace de antígeno del mismo. Los anticuerpos de la invención son preferidos para uso en el método aunque otros anticuerpos anti-PD-1 pueden ser usados en lugar de esto (o en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 de la invención). Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo anti-PD-1 quimérico, humanizado o plenamente humano en el método de tratamiento de una enfermedad infecciosa. Todavia además, la invención proporciona un método para mejorar una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, que comprende administrar al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) un anticuerpo anti-PD-1, o porción de enlace de antígeno del mismo, de tal manera que se mejora una respuesta inmune al antígeho en el sujeto. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno de tumor, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los anticuerpos de la invención son preferidos para uso en el método aunque otros anticuerpos anti-PD-1 pueden ser usados en su lugar (o en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 de la invención) . Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo anti-PD-1 quimérico, humanizado o plenamente humano en el método para mejorar una respuesta inmune a un antigeno en un sujeto. La invención también proporciona métodos para fabricar anticuerpos anti-PD-1 "segunda generación" basado en las secuencias de los anticuerpos anti-PD-1 provistos en la presente. Por ejemplo, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-PD-1 gue comprende: (a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDRl que es seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21, y/o una secuencia de CDR2 que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; y/o una secuencia de CDR3 que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35; o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDRl que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42, y/o una secuencia de CDR2 que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49, y/o una secuencia de CDR3 que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56; (b) alterar por lo menos un residuo de aminoácido dentro de por lo menos una secuencia de anticuerpo de región variable, la secuencia es seleccionada de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera, para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo anterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. Otros elementos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos gue en otro orden sean interpretados como limitantes. El contenido de todas las referencias, entradas de GenBank, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas en toda esta solicitud son incorporadas expresamente en la presente por referencia.

Breve Descripción de las Figuras La Figura ÍA muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 57) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 17D8. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 22) y CDR3 (SEQ ID NO: 29) son delineadas y se indican las derivaciones de linea de germinación V, D y J. La Figura IB muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 64) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 17D8. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 36), CDR2 (SEQ ID NO: 43) y CDR3 (SEQ ID NO: 50) son delineadas y se indican las derivaciones de línea de germinación V y J. La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 58) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2D3. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 23) y CDR3 (SEQ ID NO: 30) son delineadas y se indican las derivaciones de línea de germinación V y J. La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 65) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2D3. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 44) y CDR3 (SEQ ID NO: 51) son delineadas y se indican las derivaciones de linea de germinación V y J. La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 59) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4H1. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO:' 24) y CDR3 (SEQ ID NO: 31) son delineadas y se indican las derivaciones de linea de germinación V y J. La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 66) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4H1. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 38), CDR2 (SEQ ID NO: 45) y CDR3 (SEQ ID NO: 52) son delineadas y se indican las derivaciones de línea de germinación V y J.

La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 60) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5C4. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 18), CDR2 (SEQ ID NO: 25) y CDR3 (SEQ ID NO: 32) son delineadas y se indican las derivaciones de línea de germinación V y J. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 67) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5C4. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 39), CDR2 (SEQ ID NO: 46) y CDR3 (SEQ ID NO: 53) son delineadas y se indican las derivaciones de linea de germinación V y J. La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 61) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4A11. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 19), CDR2 (SEQ ID NO: 26) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) son delineadas y se indican las d rivaciones de línea de germinación V y J. La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 68) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humanó 4A11. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 40), CDR2 (SEQ ID NO: 47) y CDR3 (SEQ ID NO: 54) son delineadas y se indican las derivaciones de linea de germinación V y J. La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 62) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 7D3. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 27) y CDR3 (SEQ ID NO: 34) son delineadas y se indican las derivaciones de línea de germinación V y J. La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 69) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 7D3. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 41), CDR2 (SEQ ID NO: 48) y CDR3 (SEQ ID NO: 55) son delineadas y se indican las derivaciones de línea de germinación V y J. La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 63) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5F . Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 28) y CDR3 (SEQ ID NO: 35) son delineadas y se indican las derivaciones de línea de germinación V y J. La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 70) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5F4. Las regiones de CDRl (SEQ ID NO: 42), CDR2 (SEQ ID NO: 49) y CDR3 (SEQ ID NO: 56) son delineadas y se indican las derivaciones de línea de germinación V y J. La Figura 8 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 7D3 con la secuencia de aminoácidos de línea de germinación humana VH 3-33 (SEQ ID NO: 71) . La Figura 9 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 17D8, 2D3 y 7D3 con la secuencia de aminoácidos de (SEQ ID NO: 73) de la linea de germinación humana Vk L6. La Figura 10 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 4H1 y 5C4 con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 73) de la línea de germinación humana V^ L6. La Figura 11 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 4A11 y 5F4 con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 72) de la línea de germinación humana VH 4-39. La Figura 12 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 4A11 y 5F4 con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 74) de la línea de germinación humana V L15. Las Figuras 13A-13B muestran los resultados de experimentos de citometria de flujo que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos 5C4 y 4H1, dirigidos contra PD-1 Humano, se enlaza a la superficie celular de células de CHO transfectadas con PD-1 humano de plena longitud. La Figura 13A muestra la gráfica de citometria de flujo para 5C . La Figura 13B muestra la gráfica de citometria de flujo para 4H1. La línea delgada representa el enlace a células de CHO y la línea sólida representa el enlace a células CHO hPD-1. La Figura 14 muestra una gráfica que demuestra que los anticuerpos monoclonales humanos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 4A11, dirigidos contra PD-1 humano, se enlazan específicamente a PD-1, y no a otros miembros de la familia de CD28. Las Figuras 15A-15C muestran los resultados de experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos 4H1 y 5C4, dirigidos contra PD-1 humano, se enlazan a PD-1 sobre la superficie celular. La Figura 15A muestra el enlace a células T humanas activadas. La Figura 15B muestra el enlace a células T de chango cinomolgous . La Figura 15C muestra el enlace a células transfectadas CHO que expresan PD-1. Las Figuras 16A-16C muestran los resultados de experimentos que demuestran que anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humano promueven la proliferación de célula T, secreción de IFN-gamma y secreción de IL-2 en un análisis de reacción de linfocito mezclado. La Figura 16A es una gráfica de barra que muestra la proliferación de célula T dependiente de concentración; la Figura 16B es una gráfica de barras que muestra la secreción de IFN-gamma dependiente de la concentración; la Figura 16C es una gráfica de barras que muestra la secreción de IL-2 dependiente de la concentración. Las Figuras 17A-17B muestran los resultados de experimentos de citometna de flujo que demuestran que anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humano bloquean el enlace de PD-Ll y PD-L2 a células transfectadas con CHO que expresan PD-1. La Figura 17A es una gráfica que muestra la inhibición de enlace de PD-Ll; la Figura 17B es una gráfica que muestra la inhibición del enlace de PD-L2. La Figura 18 muestra los resultados de experimentos de citometría de flujo gue demuestran que anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humano no promueven la apoptosis de célula T. La Figura 19 muestra los resultados de experimentos que demuestran que los HuMabs ant?-PD-1 tienen un efecto dependiente de la concentración sobre la secreción de IFN-gamma por PBMCs de donadores CMV-positivos cuando los PBMCs fueron estimulados con un lisado CMV y ant?-PD-1. La Figura 20 muestra los resultados de experimentos de crecimiento de tumor en un sistema de modelo de ratón que demuestra que el tratamiento m vivo de tumores de ratón con anticuerpos ant?-PD-1 inhibe el crecimiento de tumores. Las Figuras 21A a 21D muestran el volumen del tumor con respecto al tiempo en ratones individuales que fueron implantados con células de tumor de colon MC38 (PD-Ll") y el mismo dia tratados con una de las siguientes terapias: (A) IgG de ratón (control), (B) anticuerpo anti-CTLA-4, (C) anticuerpo anti-PD-1 y (D) anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1. Los ratones recibieron tratamientos de anticuerpo subsecuentes en los dias 3, 6 y 10 como describe en el Ejemplo 13 y el volumen del tumor fue monitoreado en 60 días . La Figura 22 muestra el volumen de tumor promedio de los ratones mostrados en la Figura 21. La Figura 23 muestra el volumen de tumor mediano de los ratones mostrados en la Figura 21. Las Figuras 24A a 24D muestran el volumen de tumor con respecto al tiempo en ratones individuales que fueron implantados con células de tumor de colon MC38 (PD-Ll") y una semana más tarde tratados con una de las siguientes terapias: (A) IgG de ratón (control), (B) anticuerpo anti-CTLA-4, (C) anticuerpo anti-PD-1 y (D) anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1. El volumen de tumor en el primer día de tratamiento fue de aproximadamente 315 mm3. Los ratones recibieron tratamientos de anticuerpo subsecuentes en los días 3,, 6 y 10 como se describe en el Ejemplo 14. La Figura 25 muestra el volumen de tumor medio de los ratones mostrados en la Figura 24. La Figura 26 muestra el volumen de tumor mediano de los ratones mostrados en la Figura 24. La Figura 27 muestra el volumen de tumor promedio con respecto al tiempo en ratones individuales gue fueron implantados con las células de tumor de colon MC38 (PD-Ll") (dia -7) y luego tratados el los días 0, 3, 6 y 10 pos-implante (como se describe en el Ejemplo 15) con una de las siguientes terapias: (A) IgG de ratón como un control (20 mg/kg, X20) (B) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) y IgG de ratón (10 mg/kg) (P10X?o), (C) anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg) y IgG de ratón (10 mg/kg) (C?0X?o) . (D) anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg cada uno) (C10P10) , (E) anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD- 1 (3 mg/kg cada uno) (C3P3) y (F) anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 (1 mg/kg cada uno) (O?P?) . Dos grupos de ratones fueron tratados con cada anticuerpo secuencialmente como sigue: (G) anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg, día 0), anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg, día 3), anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg, día 6) y anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg, día 10) (C10C10P10P10) ; y (H) anticuerpo anti-PD- 1 (10 mg/kg, día 0), anticuerpo anti-PD- 1 (10 mg/kg, día 3), anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg, día 6) y anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg, dia 10) (10 mg/kg, día 10) (P10P?oC10C?0) - La Figura 28 muestra el volumen de tumor promedio de los' ratones mostrados en la Figura 27. La Figura 29 muestra el volumen de tumor mediano de los ratones mostrados en la Figura 27. Las Figuras 30A a 30F muestran el volumen del tumor con respecto al tiempo en ratones individuales gue fueron implantados con células de fibrosarcoma SA1/N (PD-Ll") y un día más tarde tratados con una de las siguientes terapias: (A) PBS (control de vehículo), (B) IgG de ratón (control anticuerpo, 10 mg/kg), (C) anticuerpo ant?-PD-1 (10 mg/kg), (D) anticuerpo ant?-CTLA-4 (10 mg/kg), (E) anticuerpo anti-CTLA-4 (0.2 mg/kg) y (F) anticuerpo ant?-PD-1 (10 mg/kg) y anticuerpo ant?-CTLA-4 (0.2 mg/kg) . Los ratones recibieron tratamientos de anticuerpos subsecuentes el los días 4, 7 y 11 como se describe en el Ejemplo 16 y el volumen de tumor fue mónitoreado durante 41 días. La Figura 31 muestra el volumen de tumor medio de los ratones mostrados en la Figura 29. La Figura 32 muestra el volumen de tumor mediano de los ratones mostrados en la Figura 29. Las Figuras 33A a 33J muestran el volumen de tumor con respecto al tiempo en ratones individuales gue fueron implantados con células de fibrosarcoma de SA1/N (PD-Ll") y luego tratados en los días 7, 10, 13 y 17 pos-implante (como se describe en el Ejemplo 17) con una de las siguientes terapias: (A) PBS (control de vehículo), (B) IgG de ratón (control de anticuerpo, 10 mg/kg) , (C) anticuerpo ant?-CTLA-4 (0.25 mg/kg), (D) anticuerpo ant?-CTLA-4 (0.5 mg/kg), (E) anticuerpo ant?-CTLA-4 (5 mg/kg), (F) anticuerpo ant?-PD-1 (3 mg/kg), (G) anticuerpo ant?-PD-1 (10 mg/kg), (H) anticuerpo ant?-PD-1 (10 mg/kg) y anticuerpo ant?-CTLA-4 (0.25 mg/kg), (I) anticuerpo ant?-PD-1 (10 mg/kg) y anticuerpo ant?-CTLA-4 (0.5 mg/kg) y (F) anticuerpo ant?-PD-1 (3 mg/kg) y anticuerpo ant?-CTLA-4 (0.5 mg/kg) . El volumen de tumor en el primer día de tratamiento fue de aproximadamente 110 mm3. La Figura 34 muestra el volumen de tumor medio de los ratones mostrados en la Figura 33. La Figura 35 muestra el volumen de tumor mediano de los ratones mostrados en la Figura 33. Las Figuras 36A y 36B muestran el volumen de tumor con respecto al tiempo en ratones individuales que fueron implantados con células de fibrosarcoma SA1/N (PD-Ll") y luego tratados el los días 10, 13, 16 y 19 pos-implante (como se describe en el Ejemplo 17) con una de las siguientes terapias: (A) IgG de ratón (control de anticuerpo, 10 mg/kg) o (B) anticuerpo ant?-PD-1 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-CTLA-4 (1 mg/kg) . El volumen del tumor en el primer día del tratamiento fue de aproximadamente 250 mm3. La Figura 37 muestra el volumen de tumor medio de los ratones mostrados en la Figura 36. La Figura 38 muestra el volumen de tumor mediano de los ratones mostrados en la Figura 36. La Figura 39 muestra la inhibición de tumor porcentual media y mediana calculada a partir de los volúmenes de tumor mostrados en las Figuras 33 y 36.

Las Figuras 40A a 40D muestran el volumen de tumor en ratones BALB/c que fueron implantados subcutáneamente con células adenocarcinoma renal RENCA (PD-L1+) (Murphy y Hrushesky (1973) J. Na t ' l . Cáncer Res . 50:1013-1025) (dia -12) y luego tratados intraperitonealmente el los dias 0, 3, 6 y 9 pos-implante con una de las siguientes terapias: (A) IgG de ratón (control de anticuerpo, 20 mg/kg) , (B) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg), (C) anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg), y (D) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) en combinación con el anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg) . El volumen del tumor en el primer día del tratamiento fue de aproximadamente 115 mm3. La Figura 41 muestra que el enlace de la proteina de fusión de PD-L2-Fc de ratón a PD-1 de ratón (mPD-1) es bloqueado por el anticuerpo 4H2 anti-mPD-1 de manera dependiente de la dosis. El enlace es detectado al medir la fluorescencia de IgG de burro-anti-ratón FITC marcado mediante ELISA. Mientras mayor es la MFI (intensidad de fluor scencia) mayor es el enlace. La Figura 42 muestra curvas de enlaces de anticuerpos anti-mPD-1 a proteína de fusión del mPD-l-Fc inmovilizada mediante ELISA. La Figura 43 muestra la curva de enlace del anticuerpo de rata anti-mPD-1 4H2.B3 a células de CHO que expresan mPD-1. El enlace fue detectado con IgG de burro-anti-rata, FITC conjugado y medido mediante FACS (MFI) .

La Figura 44 muestra la curva de enlace de la proteína de fusión de mPD-Ll-hFc a células de CHO que expresan mPD-1- en presencia de concentraciones incrementadas de anticuerpo 4H2.B3 anti-mPD-1. El enlace fue detectado con IgG de cabra-anti-humano, FITC conjugado y medido mediante FACS (MFI) . La Figura 45 muestra curvas de enlace del anticuerpo 4H2.B3 de rata anti-mPD-1 a células de CHO que expresan mPD-1- en comparación con anticuerpo 4H2 de anti-mPD-1 de rata:ratón quimérico. La Figura 46 muestra las curvas de enlace de la proteina de fusión de mPD-Ll-hFc a células de CHO que expresan mPD-1- en presencia de concentraciones incrementadas ya sea de anticuerpo 4H2.B3 de anti-mPD-1 de rata o anticuerpo 4H2 anti-mPD-1 de rata: ratón quimérico. La Figura 47 muestra el volumen de tumor medio de ratones libres de tumor previamente tratados con anticuerpo anti-E-O-1 y re-tratados con células de fibrosarcoma de SAl/N (PD-LF) . También se muestra el volumen de tumor medio de ratones naturales (de control, no tratado ni desafiados previamente) con células de fibrosarcoma de SAl/N. La Figura 48 muestra el volumen del tumor con el paso del tiempo en ratones individuales, que sobrevivieron libres de tumor enseguida del implante de células de tumor de colon MC38 (PD-Ll") y tratamiento con anticuerpo anti-PDl o una combinación de anticuerpo anti-PDl con anticuerpo anti-CTLA-4), re-tratados con lOx más células de tumor de colon MC38 que el tratamiento inicial. También se muestra el volumen de tumor medio de ratones naturales (de control, no previamente desafiados o tratados) implantados con células de tumor de colon MC38. La Figura 49 muestra el volumen de tumor medio de los ratones mostrados en la Figura 48. La Figura 50 muestra el volumen de tumor medio con respecto al tiempo en ratones individuales que fueron implantados con células de tumor de colon CT26. Las Figuras 51AB muestran los resultados de experimentos que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humano promueven la proliferación de célula T y secreción de IFN-gamma en cultivos que contienen células reguladoras T. La Figura 50A es un gráfica de barras gue muestra la proliferación de célula T dependiente de la consideración utilizando HuMAb 5C4; La Figura 50B es un gráfica de barras que muestra la secreción de IFN-gamma dependiente de la concentración utilizando HuMAb 5C4. Las Figuras 52A-B muestran los resultados de experimentos que demuestran que anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humano promueven la proliferación de célula T y secreción de IFN-gamma en cultivos que contienen células T activadas. La Figura 51A es una gráfica de barras que muestra la proliferación de la célula T dependiente de la concentración utilizando HuMAb 5C4; la Figura 51B cs una gráfica de barras que muestra la secreción de IFN-gamma dependiente de la concentración utilizando HuMAb 5C . La Figura 53 muestra los resultados de un análisis de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) gue demuestra que los anticuerpos anti-PD-1 monoclonales humanos exterminan células T activadas de manera dependiente de la concentración de ADCC en relación con la región Fc del anticuerpo anti-PD-1. La Figura 54 muestra los resultados de un análisis de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) que demuestran que los anticuerpos anti-PD-1 monoclonales humanos no exterminan células T activadas humanas de manera dependiente de la concentración de CDC.

Descripción Detallada de la Invención En un aspecto, la presente invención es concerniente con anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se enlazan específicamente a PD-1. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención exhiben una o más propiedades funcionales deseables, tales como alta afinidad de enlace a PD-1, .carecen de reactividad cruzada a otros miembros de la familia de CD28, la habilidad para estimular la proliferación de célula T, secreción de IFN-? o IL-2 en reacciones de linfocito mezclada, la habilidad para inhibir el enlace de uno o más ligandos de PD-1 {por ej emplo, PD-Ll y/o PD-L2), la habilidad de reaccionar de manera cruzada con PD-1 de chango cynomolgus, la habilidad para estimular las respuestas de memoria especificas de antígeno, la habilidad para estimular respuestas de anticuerpo y/o la habilidad para inhibir el crecimiento de células de tumor in vivo . Adicional o alternativamente, los anticuerpos de la invención son derivados de secuencias de líneas de de germinación de cadena pesada y ligera y/o comprenden elementos estructurales particulares tales como regiones de CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. En otro aspecto, la invención es concerniente con el uso combinado de anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a PD-1 y anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a CTLA-4. La invención proporciona, por ejemplo, anticuerpos aislados, métodos de fabricación de tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas bisespecíficas gue comprenden tales anticuerpos y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, inmunconjugados o moléculas bisespecíficas de la invención. En otro aspecto, la invención es concerniente con métodos para inhibir el crecimiento de células de tumor en un sujeto utilizando anticuerpos ant?-PD-1. Como se demuestra en la presente, los anticuerpos ant?-PD-1 son capaces de inhibir el crecimiento de célula de tumor m vivo . La invención también es concerniente con los métodos de uso de los anticuerpos para modificar una respuesta inmune, también como para tratar enfermedades tales como cáncer o enfermedad infecciosa, o para estimular una respuesta autoinmune protectora o para estimular respuestas inmunes especificas de antígeno (por ejemplo, mediante coadministración de ant?-PD-1 con un antígeno de interés) . Con el fin de que la presente invención pueda ser más fácilmente entendida, se definen primero ciertos términos. Definiciones adicionales son resumidas en toda la descripción detallada. Los términos "Muerte Programada 1" , "Muerte de Célula Programada 1" , "Proteína PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" y "hPD-F" son usados intercambiablemente, e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de PD-1 humano y análogos que tienen por lo menos un epítope común con PD-1. La secuencia de PD-1 completa se puede encontrar bajo el No. de Acceso de GenBank U64863. Los términos "ant?geno-4 asociado a lmfocito T citotóxico", "CTLA-4", "CTLA4", "antígeno de CTLA-4" y "CD152" ( véase, por ej emplo, Murata, Am . J. Pa thol . (1999) 155 : 453-460) son usados intercambiablemente, e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de CTLA-4 y análogos que tienen por lo menos un epítope común con CTLA-4 { véase , por ej emplo, Balzano (1992) Int. J. Cáncer Suppl . 2:28-32). La secuencia de ácido nucleico de CTLA-4 completa se puede encontrar bajo el No. de Acceso de GenBank L15006. El término "respuesta inmune" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células gue presentna antígeno, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (en lo gue se incluyen anticuerpos, citocinas y complemento) que dan como resultado daño selectivo a, destrucción de, o eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas, o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. Una "ruta de transducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señal que juegan un papel en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. Como se usa en la presente, la frase "receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de tal señal a través de la membrana del plasma de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor PD-1.

El término "anticuerpo" tal como se hace referencia en la presente incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de enlace de antigeno (esto es, "porción de enlace de antígeno") o cadenas individuales del mismo. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces de disulfuro, o una porción de enlace de antigeno del mismo. Cada cadena pesada consiste de una región variable de cadena pesada (abreviada como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consiste de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas como regiones que determinan la complementariedad (CDR) ,' intercaladas que son más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuesta del término amino al término carboxi en el siguiente orden: FRl, CDRl, FR2 , CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden moderaí el enlace de la inmunoglobulina a tejidos o factores huésped, en los que se incluyen varias células del sistema inmune (por ej empl o, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo gue retienen la habilidad para enlazarse específicamente a un antígeno (por ej emplo, PD-1) . Se ha demostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo puede ser efectuada por fragmentos de un anticuerpo de plena longitud. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados en el término "porción de enlace de antigeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente gue consiste de los dominios VL, VH, C y CH?; (ü) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de engozne; (iii) un fragmento de Fd que consiste de los dominios de VH y CH?; (iv) un fragmento de Fv que consiste de los dominios de VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward y colaboradores , (1989) Na ture 341 : 544-546) , que consiste de un dominio de VH; y (vi) una región gue determina la complementariedad aislada (CDR) .: Además, aungue los dos dominios del fragmento de Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permita que sean aplicados como una sola cadena de proteina en la cual las regiones de VL y VH se apareen para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv); Bird y colaboradores, (1988) Science 242:423-426; y Huston y colaboradores, (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 85:5879-5883. Tales anticuerpos de una sola cadena también se proponen en estar abarcados en el término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo so obtenidos utilizando técnicas convencionales conocidas para aquellos con habilidad en el arte, y los fragmentos son seleccionados en cuanto a utilidad de la misma manera como lo son los anticuerpos intactos . Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente, se propone para referirse a un anticuerpo gue está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades de antígeno (por ej emplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a PD-1 está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlazan específicamente a antígenos diferentes a PD-1). Un anticuerpo aisladio que se enlaza específicamente a PD-1 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de PD-1 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o compuestos guímicos.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una sola especificidad y afinidad de enlace por un epítope particular. El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, se propone incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales la regiones de estructura y regiones de CDR son derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea de germinación humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también es derivada de las secuencias d la inmunoglobulina de linea de germinación humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por la secuencia de inmunoglobulina de línea de germinación humana (por ejemplo, mutaciones introducidas al azar o mutagénesis específica del sitio in vi tro o mediante mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no pretende incluir anticuerpos en los cuales secuencias de CDR derivadas de la línea de germinación de otra especie mamífera, tal como ratón, se han injertado sobre secuencias de estructura humanas. El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlace que tienen regiones variables en las cuales tanto las regiones de estructura como de CDR son derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea de germinación humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma gue comprende un transgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada. El término "anticuerpo humano recombinante", como usa en la presente, incluye todo los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosomal para genes de inmunoglobulina humanos o un hibridoma preparado a partir de los mismos (descrito posteriormente en la presente), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humano de combinación recombinante y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquiera otros medios que involucran empalme de secuencias de gen de inmunoglobulina humanas a otras secuencias de DNA. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las cuales las regiones de estructura de CDR son derivadas de la secuencia de inmunoglobulina de linea de germinación humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagenesis m vi tro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig humanas, mutagenesis somática m vivo) y asi las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombmantes son secuencias que, en tanto que son derivadas de y son concernientes con secuencias VH y VL de linea de germinación humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio de linea de germinación de anticuerpo humano in vivo . Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ej emplo, IgM o IgGl) gue es codificada por los genes de región constante de cadena pesada . Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo especifico por un antigeno" son usados intercambiablemente en la presente con el termino "un anticuerpo que se enlaza específicamente a un antigeno". El termino "derivados de anticuerpo humanos" se refieren a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ej emplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo . El termino "anticuerpo humanizado" se propone referirse a anticuerpos en los cuales secuencias de CDR derivadas de la linea de generación de otra especie de mamífero tal como un ratón, se han injertado sobre secuencias de estructura humanas. Modificaciones de región de estructura adicionales se pueden realizar en las secuencias de estruttura humanas. El término "anticuerpo quimérico" se propone para referirse a anticuerpos en los cuales la secuencia de región variable son derivadas de una especie y las secuencias de región constante son derivadas de otra especie, tal como un anticuerpo en el cual las secuencias de región variable son derivadas de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante son derivadas de un anticuerpo humano. Como se usa en la presente, un anticuerpo que "se enlaza específicamente a PDl humano" se propone referirse a un anticuerpo que se enlaza a PD-1 humano con una KD 1 X 10-7 M o menor, más preferiblemente 5 X 10"8 M o menor, más preferiblemente 1 X 10"8 M o menor, más preferiblemente 5 X 10"9 M o menor. El término "Kasoc", como se usa en la presente, se propone referirse a una velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular, mientras gue el término "Kd?s" o "Kd" como se usa en la presente, se propone referirse a la velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. El término "KD". como se usa en la presente, se propone referirse a la constante de disociación, que es obtenida de la proporción de K a Ka (esto es, Kd/Ka) y es expresada como concentración molar (M) . Los valores de KD para anticuerpos pueden ser determinados utilizando métodos bien establecidos en el arte. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es al utilizar resonancia de plasmón superficial, preferiblemente utilizando un sistema de biosensor tal como un sistema BIACORE (R) . ' Como se usa en la presente, el término "alta afinidad" por un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10"8 M o menor, más preferiblemente 10"9 M o menor y aun más preferiblemente 10"10 M o menor por un antígeno objetivo. Sin embargo, el enlace de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, el enlace de "alta afinidad" por un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10"7 M o menor, más preferiblemente 10"8 M o menor, aun más preferiblemente 10"9 M o menor . El término "tratamiento" o "terapia" se refiere a la administración de un agente activo con el propósito de curar, cicatrizar, aliviar, poner en relieve, alterar, remediar, aminorar, mejorar o afectar una condición (por ejemplo, una enfermedad) , los síntomas de la condición o impedir o retardar el inicio de los síntomas, complicaciones, indicaciones bioquímicas de una enfermedad u otra detención o inhibir el desarrollo adicional de la enfermedad, condición o alteración de manera estadísticamente significativa. Un "evento adverso" (AE) como se usa en la presente es cualquier signo desfavorable y en general no propuesto, aun indeseable (en los que se incluyen un hallazgo de laboratorio anormal), síntoma o enfermedad asociado con el uso de un tratamiento médico. Por ejemplo, un evento adverso puede estar asociado con la activación del sistema inmune o expansión de las células del sistema inmune (por ejemplo, células T) en respuesta a un tratamiento. Un tratamiento médico puede tener uno o mas AE asociados y cada AE puede tener el mismo o diferente nivel de severidad. La referencia a métodos capaces de "alterar eventos adversos" significa un régimen de tratamiento que disminuye la incidencia y/o severidad de uno o más AE asociados con el uso de un diferente régimen de tratamiento. Como se usa en la presente, "enfermedad hiperproliferativa" se refiere a condiciones en donde el crecimiento de la célula es incrementado con respecto a niveles normales. Por ejemplo, enfermedades o alteraciones hiperproliferativas incluyen enfermedades malignas (por ejemplo, cáncer esofagal, cáncer de colon, cáncer biliar) y enfermedades no malignas (por ejemplo, arteroesclerosis, hiperplasia benigna, hipertrofia prostática benigna).

Como se usa en la presente, "dosis subterapéutica" significa una dosis de un compuesto terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo) que es más baja que la dosis usual o típica del compuesto terapéutico cuando es administrada sola para el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer). Por ejemplo, una dosis subterapéutica de anticuerpo de CTLA-4 es una sola dosis del anticuerpo a menos de aproximadamente 3 mg/Kg, esto es, la dosis conocida de anticuerpo ant?-CTLA- . Se comprenderá que el uso de la alternativa (por ejemplo "o") significa ya sea uno u otro, ambos o cualguier combinación de los mismos de las alternativas. Como se usa en la presente, los artículos indefinidos "uno" o "una" se debe entender que se refieren a "uno o mas" del componente citado o enumerado. Como se usa en la presente, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular tal como se determina por aquel de habilidad ordinaria en el arte, que dependerá en parte de cómo el valor es medido o determinado, esto es las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que consiste esencialmente de" pueden significar dentro de uno o mas de una división estándar según la práctica en el arte. Alternativamente, "aproximadamente" o "que consiste esencialmente de" puede significar un intervalo de hasta 20%. Además, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces de un valor. Cuando se proporcionan valores particulares en la solicitud y reivindicaciones, a no ser que se afirme de otra manera, se debe suponer que el significado de "aproximadamente" o "que consiste esencialmente de" está dentro de un intervalo de error aceptable para aquel valor particular. Como se describe en la presente, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de proporción o intervalo de entero se comprenderá que incluye el valor de cualquier entero dentro del intervalo citado y cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tales como un décimo y centesimo de un entero) a no ser que se indique de otra manera. Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Excepto cuando se indique, los términos "paciente" o "sujeto" son usados intercambiablemente. Varios aspectos de la invención son descritos en detalle adicional en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos Anti-PD-1 Los anticuerpos de la invención están caracterizados por elementos o propiedades funcionales particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se enlazan específicamente a PD-1 (por ejemplo, se enlazan a PD-1 humano y pueden reaccionar de manera cruzada con PD-1 de otra especie, tales como mono cinomolgus) . Preferiblemente, un anticuerpo de la invención se enlaza a PD-1 con alta afinidad, por ejemplo con una KD de 1 X 10"7 M o menor. Los anticuerpos anti-PD-1 de la invención exhiben preferiblemente una o más de las siguientes caracteristicas: (a) se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 X 10"7 M o menor; (b) no se enlaza sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS humano; (c) incrementa la proliferación de células T en un análisis de reacción de linfocito mezclada (MLR) ; (d) incrementa la producción de interferon-gamma en un análisis de MLR; (e) incrementa la secreción de IL-2 en un análisis de MLR; (f) se enlaza a PD-1 humano y PD-1 de mono cinomolgus; (g) inhibe el enlace de PD-Ll y/o PD-L2 a PD-1; (h) estimula las respuestas de memoria especificas de antigeno; (i) estimula las respuestas de anticuerpo; (j) inhibe el crecimiento de células de tumor m vivo . Preferiblemente, el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 5 X 10"8 M o menor, se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 X 10"8 M o menor, se enlaza a PD-1 humano con una KD de 5 X 10"9 molar o menor o se enlaza a PD-1 humano con una KD de entre 1 X 10"8 molar y 1 X 10"x0 molar o menor . Un anticuerpo de la invención puede exhibir cualquier combinación de los elementos enlistados anteriormente, tales como dos, tres, cuatro, cinco o más de los elementos enlistados anteriores. Análisis estándar para evaluar la habilidad de enlace de los anticuerpos hacia PD-1 son conocidos en el arte, en los que se incluyen por ejemplo, ELISA, Western blot y RÍA. La cinética de enlace (por ejemplo, afinidad de enlace) de los anticuerpos también puede ser determinada mediante análisis estándar conocidos en el arte, tales como mediante análisis de Biacore. Análisis apropiados para evaluar cualquiera de las características descritas anteriormente son descritos en detalle en los ejemplos.

Anticuerpos monoclonales 17D8, 2D3 , 4H1 , 5C4 , 4A11, 7D3 y 5F4 Los anticuerpos preferidos de la invención son los anticuerpos monoclonales humanos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 aislados y caracterizados estructuralmente como se describe en los ejemplos 1 y 2. Las secuencias de aminoácidos VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 respectivamente. Las secuencias de aminoácidos VL de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, respectivamente. Dado que cada uno de estos anticuerpos se pueden enlazar a PD-1, las secuencias de VH y V pueden ser "mezcladas y hacerse coincidir" para crear otras moléculas de enlace anti-PD-1 de la invención. El enlace de PD-1 de tales anticuerpos "mezclados y que se hacen coincidir" puede ser probado utilizando los análisis de enlace descritos anteriormente y en los ejemplos (por ejemplo, ELISA) . Preferiblemente, cuando cadenas de VH y VL son mezcladas y se hacen coincidir, una secuencia de VH de un apareamiento de VH /VL particular es reemplazada con una secuencia de VH estructuralmente similar. Asimismo, preferiblemente, una secuencia de VL de un apareamiento de VH /VL particular es reemplazada con una secuencia de VL estructuralmente similar.

Así, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo gue comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1, preferiblemente PD-1 humano. Combinaciones de cadena pesada y cadena ligera preferida incluyen: (a) una región variable de cadena pesada gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; o (a) una región variable de cadena pesada gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden las CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las CDRl de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDRl de Vk de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de Vk de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de Vk de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56, respectivamente. Las regiones de CDR son delineadas utilizando el sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) . Dado que cada uno de estos anticuerpos se pueden enlazar a PD-1 y que se proporciona especificidad de enlace de antigeno principalmente por las regiones de CDRl, CDR2 Y CDR3, las secuencias de CDRl, CDR2 Y CDR3 de VH y las secuencias de CDRl, CDR2 Y CDR3 de Vk pueden ser "mezcladas y hacerse coincidir" (esto es, las CDR de diferentes anticuerpos pueden ser mezcladas y hacerse coincidir, aunque cada anticuerpo debe contener una CDRl, CDR2 y CDR3 de VH y una CÜR1, CDR2 y CDR3 de Vk) para crear otras moléculas de enlace de anti-PD-1 de la invención. El enlace de PD-1 de tales anticuerpos "mezclados y que se hacen coincidir" puede ser probado utilizando los análisis de enlace descritos anteriormente y en los ejemplos (por ejemplo, ELISA, análisis de Biacore) . Preferiblemente, cuando secuencias de CDR de VH son mezcladas y se hacen coincidir, la secuencia de CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VH particular es reemplazada con una(s) secuencia (s) de CDR estructuralmente similar (es) . Asimismo, cuando secuencias de CDR de Vk son mezcladas y se hacen coincidir, la secuencia de CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vk particular es reemplazada preferiblemente con una(s) secuencia (s) de CDR estructuralmente similar. Será fácilmente evidente para el técnico con habilidad ordinaria en el arte que nuevas secuencias de VH y VL pueden ser creadas al sustituir una o más secuencias de región de CDR de VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR descritas en la ' presente para los anticuerpos monoclonales 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4. Asi, en otro aspecto, la invención proporciona un antic erpo monoclonal aislado o porción de enlace de antígeno del mismo gue comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo' que consiste de SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1, preferiblemente PD-1 humano.

En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 15; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 22; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 29; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 36; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera gue comprende SEQ ID NO: 43; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 50. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 16; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 37; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 51. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 24; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 31; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 38; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera gue comprende SEQ ID NO: 45; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera gue comprende SEQ ID NO: 52. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 18; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 25; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 32; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera gue comprende SEQ ID NO: 39; ' (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que clomprende SEQ ID NO: 46; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 53. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 26; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 33; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 40; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 47; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera gue comprende SEQ ID NO: 54.

Anticuerpos que tienen secuencias de lineas de germinación particulares En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de linea de germinación particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de línea de germinación particular. Por ejemplo, en una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivada de un gen VH 3-33 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1, preferiblemente PD-1 humano. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivada de un gen VH 4-39 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1, .preferiblemente PD-1 humano. En todavia otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el produqto de o derivada de un gen VkL6 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1, preferiblemente PD-1 humano. En todavia otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivada de un gen VkLl5 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1, preferiblemente PD-1 humano. En todavia otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-33 o 4-39 humano (que codifica la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 70 o 73, respectivamente) ; (b) comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen VkL6 o L15 humano (que codifica la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 72 o 74, respectivamente); y (c) se enlaza específicamente a PD-1. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y Vk de VH 3-33 y VkL6 respectivamente, son 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 Y 7D3. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y Vk de VH 4-39 y VkL15 respectivamente, son 4A11 y 5F4. Como se usa en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo son obtenidas de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de linea de germinación humana. Tales sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico que porta genes de mmunoglobulina humanos con el antígeno de interés o seleccionar una biblioteca de gen de ínmunoglobulma humana desplegada sobre fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana puede ser identificada como tal al comparar la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal humana y seleccionar la secuencia de inmunoglobulma de linea germinal humana que es más cercana en secuencia (esto es, por ciento de identidad de secuencia mayor) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de mmunoglobulma de línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácido en comparación con las secuencias de linea i germinal debido por ejemplo a mutaciones somáticas que ocurren de manera natural o introducción no intencional de mutación dirigida en sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado comúnmente es por lo menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de mmunoglobulma de línea germinal humana y contiene residuos de aminoácido que identifican el anticuerpo humano por ser humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de linea germinal de otra especie (por ejemplo, secuencias de linea germinal murinas). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser por lo menos 95% o aun por lo menos 96%, 97% 98% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos codificado por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Comúnmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de línea germinal humana particular exhibirá no más de 10 diferencias de aminoácido de la secuencias de aminoácidos codificada por el gene de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede exhibir no más de 5 o aún no más de 4, 3, 2 o una diferencia de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de linea de germinación .

Anticuerpos Homólogos ' En todavia otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homologas con las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos ant?-PD-1 de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada y una región vapabe de cadena ligera, en donde: (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14; y el anticuerpo exhibe una o más de las siguí entes propiedades: (c) el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 X 10-7 M o menor; (d) el anticuerpo no se enlaza sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS; (e) el anticuerpo incrementa la proliferación de células T en un análisis de MLR; (f) el anticuerpo incrementa la producción de interferon-gamma en un análisis de MLR; (g) el anticuerpo incrementa la secreción de 11-2 en un análisis de MLR; (h) el anticuerpo se enlaza PD-1 humano y PD-1 de mono cinomolgus; (i) el anticuerpo inhibe el enlace de PD-Ll y/o PD- L2 a PD-1; • (j) el anticuerpo estimula, respuestas de memoria I específicas de antigeno; ) (k) el anticuerpo estimula las respuestas de anticuerpo; (1) el anticuerpo inhibe el crecimiento de célula de tumor in vivo . En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologas a las secuencias resumidas anteriormente. Un anticuerpo que tiene regiones de VH y VL que tienen alta homología (esto es 80% o mayor) a las regiones de VH y VL de las secuencias resumidas anteriormente, pueden ser obtenidas mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio ' o mutagénesis moderada por PCR) de moléculas de ácido nucleico gue codifican SEQ ID NOs: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 y 70, seguida por pruebas del anticuerpo codificado alterado en cuanto a función retenida (esto es, las funciones resumidas en (c) a (1) anteriores utilizando los análisis funcionales descritos en la presente. Como se usa en la presente, el porciento de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porciento de identidad entre las dos secuencias. El porciento de identidad entre las dos secuencias es función del numero de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (esto es, por ciento de homología = número de posiciones identicas/total numero de posiciones X 100), tomando en cuenta el numero de espacios y la longitud de cada espacio, que necesitan ser introducidas para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de por ciento de identidad entre dos secuencias se puede efectuar utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes posteriormente en la presente . El porciento de identidad entre dos secuencias de aminoácido puede ser determinado utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ( Comput . Appl . Biosci . , 4:11-17 (1988)) que ha sido incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4. Además, el porciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch ( J. Mol . Biol . 48:444-453 (1970)) gue se ha incorporado al programa GAP en el paquete de elementos de programación GCG (disponible en www, gcg . com) , utilizando ya sea una matriz de Blossum 62 o una matriz de PAM250 y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Adicional o alternativamente, la secuencias de proteína de la presente invención pueden ser usadas adicionalmente como una "secuencia de interrogación" para llevar a cabo una búsqueda contra bases de datos públicas, por ejemplo para identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden ser efectuadas utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al . (1990) J. Mol . Bíol 215: 403-10. Las búsquedas de proteína BLAST pueden ser efectuadas con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas con las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineaciones con espacios por propósitos de comparación, se pueden utilizar BLAST con espacios como se describe en Altschul et al . , (1997) Nucleic Acids Res . 25 ( 17 ): 3389-3402.

Cuando se utiliza BLAST y programas de BLAST con espacios, los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo XBLAST y NBLAST) pueden ser usados. (Véase 222.ncbi.nlm.nih.gov) .

Anticuerpos con modificaciones conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3, en donde una o más de ésta secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos específica en base a los anticuerpos descritos en la presente (por ejemplo, 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 ó 5F4), o modificaciones conservadoras de las mismas y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-PD-1 de la invención. Así, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antígeno del mismo gue comprende una región variable de cadena pesada gue comprende secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3, en donde: (a) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35, y modificaciones conservadoras de las mismas; (b) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 4, 55 y 56, y modificaciones conservadoras de las mismas; y el anticuerpo exhibe una o más de las siguientes propiedades : (c) el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 X 10- molar o menor; (d) el anticuerpo no se enlaza sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS; (e) el anticuerpo incrementa la proliferación de células T en un análisis de MLR; (f) el anticuerpo incrementa la producción de interferon-gamma en un análisis de MLR; (g) el anticuerpo incrementa la secreción de 11-2 en un análisis de MLR; (h) el anticuerpo se enlaza PD-1 humano y PD-1 de mono cinomolgus; (i) el anticuerpo inhibe el enlace de PD-Ll y/o PD-L2 a PD-1; (j) el anticuerpo estimula respuestas de memoria especificas de antígeno; (k) el anticuerpo estimula respuestas de anticuerpo; (1) el anticuerpo inhibe el crecimiento de célula de tumor in vivo . En una modalidad preferida, la secuencia de CDR2 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28 y modificaciones conservadoras de las mismas y la secuencia de CDR2 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47 48 y 49, y modificaciones conservadoras de las mismas. En otra modalidad preferida, la secuencia de CDRl de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21, y modificaciones conservadoras de las mismas y la secuencia de CDRl de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42 y modificaciones conservadoras de las mismas. Como se usa en la presente, el término "modificaciones de secuencias conservadoras" se propone referirse a modificaciones de aminoácido que no afectan o alteran significativamente las características de enlace del anticuerpo gue contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y cancelaciones de aminoácidos. Las modificaciones pueden ser introducidas a un anticuerpo de la invención mediante técnicas estándar conocidas en el arte; tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis moderada por PCR. Las sustituciones de aminoácido conservadora son unas en las cuales el residuo de aminoácido es remplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tyrosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Asi, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones de CDR de un anticuerpo de la invención pueden ser reemplazados con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede ser probado en cuanto a función retenida (esto es, las funciones resumidas en (c) a (1) anteriores utilizando los análisis funcionales descritos en la presente.

Anticuerpos que se enlazan al mismo epitopo como los anticuerpos anti-PD-1 de la invención. En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos gue se enlazan al mismo epítopo de PD-1 humano como cualquiera de los anticuerpos monoclonales de PD-1 de la invención (esto es, anticuerpos que tienen la habilidad para competir de manera cruzada por el enlace a PD-1 con cualquiera de los anticuerpos monclonales de la invención) . En modalidades preferidas, el anticuerpo de referencia para estudios de composición cruzada pueden ser el anticuerpo monoclonal 17D8 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en SEQ ID NOs: 1 y 8, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 2D3 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en SEQ ID NOs: 2 y 9, respectivamente), o el anticuerpo monocional 4H1 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en SEQ ID NOs: 3 y 10, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 5C4 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en SEQ ID NOs: 4 y 11, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 4A11 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en SEQ ID NOs: 5 y 12, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 7D3 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en SEQ ID NOs: 6 y 13, respectivamente), o el anticuerpo monocíonal 5F4 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en SEQ ID NOs: 7 y 14, respectivamente). Tales anticuerpos de competición cruzada pueden ser identificados en base a su habilidad para convertir de manera cruzada con 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4 en análisis de enlace de PD-1 estándares. Por ejemplo, análisis de Biacore, análisis de Elisa o citometria de flujo pueden ser usados para demostrar la competencia cruzada con los anticuerpos de la presente invención. La habilidad de un anticuerpo de prueba para inhibir el enlace de por ejemplo, 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4 a PD-1 humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4 en cuanto al enlace a PD-1 humano y así se enlaza al mismo epítopo sobre PD-1 humano como 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4. En una modalidad preferida, el anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo sobre PD-1 humano como 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos pueden ser preparados aislados como se describe en los ejemplos.

Anticuerpos Diseñados y Modificados Un anticuerpo de la invención puede además ser preparado utilizando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de VH y/o VL reveladas en la presente como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, tal anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede ser diseñado al modificar uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (esto es, VH y/o VL) , por ejemplo dentro de una o más regiones de CDR y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado al modificar residuos dentro de la(s) región (es) constante (s ) , por ejemplo para alterar la(s) función (es) efectora (s) del anticuerpo. Un tipo del diseño de región variable puede ser efectuado es injertación de CDR. Los anticuerpos interactúan con antigenos objetivo pero dominantemente por medio de residuos de aminoácidos que están ubicados en las seis regiones que determinan la complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácido dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables por la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antigeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos que se presentan de manera estable en la naturaleza específicos al construir vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo que se presenta de manera estable en la naturaleza injertado sobre secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo Riechmann, L. et al . (1998) Na ture 332:323-327; Jones, P. et al . (1986) Na ture 321:522-525; Queen, C. et al . (1989) Proc . Na ti . Acad. See . U. S . A . 86:10029-10033; Patente Estadounidense No. 5,225,539 a Winter y Patente Estadounidense Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 a Queen et a l . ) Así, otra modalidad de la invención es concerniente con un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21, SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28, y SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42, SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49, y SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56, respectivamente. Así, tales anticuerpos contienen las secuencias de CDR VH y/o VL de los anticuerpos monoclonales 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4 y todavía pueden contener secuencias de estructura diferentes de estos anticuerpos. Tales secuencias de estructura pueden ser obtenidas de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de gen de anticuerpo de linea germinal. Por ejemplo, secuencias de ADN de linea de germinación de genes de región variable de cadena pesada y ligera humanos se pueden encontrar en la base de datos de secuencia de línea de germinación humana "Vbase" (disponible en internet en www.mrc-cpe . cam. ac . uk/vbase) también como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlilnson, I.M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveáis about Fifty Groups of VH Segments with Différente Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227: 776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveáis a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol . 24:827-836; el contenido de cada uno de los cuales es incorporado expresamente por referencia. Como otro ejemplo, las secuencias de ADN de linea de germinación para genes de región variable de cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos GenBank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de línea de germinación de cadena pesada encontrados en el ratón HCo7 HuMAb están disponibles en los números de acceso de GenBank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, T_024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT_024637). Como otro ejemplo, las siguientes secuencias de línea de germinación de cadena pesada encontradas en el ratón HCo7 HuMAb están disponibles en los números de acceso de GenBank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 5-51 (NG_0010109 y NT_024637 ) 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (AJ556644) y 3-23 (AJ406678 ) . Secuencias de estructuras preferidas para uso en los anticuerpos de la invención son aquéllas que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura usadas por anticuerpos seleccionados de la invención, por ejemplo, similares a las secuencias de estructura de VH 3-33 (SEQ ID NO: 71) y/o secuencias de estructuras VH 4-39 (SEQ ID NO: 73) y/o las secuencias de estructura VHL6 (SEQ ID NO:72) y/o las secuencias de estructura VkL15 (SEQ ID NO:74) utilizados por anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3 de VH y las secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3 de Vk pueden ser injertadas sobre regiones de estructura que tienen la secuencia idéntica como aquélla encontrada en el gen de ínmunoglobulma de línea de germinación del cual la secuencia de estructura se deriva o la secuencia de CDR pueden ser injertadas sobre regiones de estructura gue contienen una o mas mutaciones en comparación con las secuencias de linea de germinación. Por ejemplo, se ha encontrado gue en ciertas instancias es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o mejorar la habilidad de enlace de antígeno del anticuerpo (véase, por ejemplo Patentes Estadounidenses Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 expedida a Queen et al ) . Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de aminoácido dentro de las regiones de CDRl, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o Vk para mejorar mediante esto una o más propiedades de enlace (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de ínteres. Se puede efectuar mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis moderada por PCR para introducir la(s) mutación (es) y el efecto sobre el enlace de anticuerpo u otra propiedad funcional de interés, puede ser evaluada en análisis ín vi tro o in vivo como se describe en la presente y proporcionados en los ejemplos. Se introducen modificaciones preferiblemente conservadoras (como se discute anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o cancelaciones de aminoácido, pero son preferiblemente sustituciones. Además, comúnmente no más de 1, 2, 3, 4 o 5 residuos dentro de una región de CDR son alterados . Así, en otra modalidad la invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-PD-1 aislados o porciones de enlace de antígeno de los mismos, gue comprenden una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región de CDRl de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, cancelaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21; (b) una región de CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 24, 25, 26, 27 y 28 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, cancelaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 22, 24, 25, 26, 27 y 28; (c) una región de CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, cancelaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35; (d) una región de CDRl de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42; o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, cancelaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42; (e) una región de CDR2 de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, cancelaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49; y (f) una región de CDR3 de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, cancelaciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56.

Los anticuerpos diseñados de la invención incluyen aquéllos en los cuales se han realizado modificaciones a residuos de estructura dentro de VH y/o V? por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo. Comúnmente, tales modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un procedimiento es "retromutar" uno o más residuos de estructura a la secuencia de línea de germinación correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo gue ha sufrido mutación somática puede contener residuos de estructura que difieren de la secuencia de línea germinal de la cual el anticuerpo es derivado. Tales residuos pueden ser identificados al comparar las secuencias de estructura de anticuerpo con las secuencias de línea germinal de las cuales el anticuerpo es derivado. Por ejemplo, la tabla 1 a continuación muestra un número de cambios de aminoácido en las regiones de estructura de los anticuerpos anti-PD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 que difieren de la secuencia de linea germinal original de cadena pesada. Para devolver uno o más de los residuos de aminoácido en las secuencias de restricción de estructura a su configuración de linea germinal, las mutaciones somáticas pueden ser "retromutadas" a la secuencia de linea germinal, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis moderada por PCR. Cambios de aminoácidos pueden ocurrir en las regiones de estructura de los anticuerpos anti-PD-1 que difieren de la secuencia de línea germinal original de cadena ligera. Por ejemplo, para 17D8, el residuo de aminoácido No. 47 (dentro de FR2) de V? se encuentra una isoleucina, mientras que este residuo en la secuencia de línea germinal L6 de V? correspondiente es una leucina. Para devolver la secuencia de región de estructura a su configuración de linea germinal, las mutaciones somáticas pueden ser "retromutadas" a la secuencia de línea germinal, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis moderada por PCR (por ejemplo residuo No. 47 (residuo No. 13 de FR2 ) de la V? de 17D8 puede ser "retromutado" de isoleucina a leucina) . Como otro ejemplo, para 4A11, residuo de aminoácido No. 20 (dentro de FRl) de V? se encuentra una serina, mientras que este residuo en la secuencia de linea germinal L15 de V? correspondiente se encuentra una trionina. Para devolver las secuencias de región de estructura a su configuración de línea germinal, por ejemplo el residuo No. 20 de V? de 4A11 puede ser "retromutado" de serina a trioni'na. Se pretende gue tales anticuerpos "retromutados" también estén abarcados por la invención. La alineación de las regiones VH para 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 7D3, contra la secuencia VH 3-33 de linea germinal original es mostrada en la figura 8. La alineación de regiones VH para 4A11 y 5F4, contra la secuencia VH 4-39 de línea germinal original es mostrada en la figura 11. Tabla I. Modificaciones a anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 de la configuración de línea germinal de cadena pesada Otro tipo de modificación de estructura involucra mutación de uno o más residuos dentro de la región de estructura o aún dentro de una o más regiones de CDR para remover epítopos de célula T para reducir mediante esto la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este procedimiento es también denominado como "desinmunización" y es descrito en detalle adicional en la Publicación de Patente Estadounidense 20030153043 por Carr et aJ. En modificaciones adicionales o alternativas efectuadas dentro de las regiones de estructura o regiones de CDR, los anticuerpos de la invención pueden ser diseñados para incluir modificaciones dentro de la región de Fc, comúnmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media en el suero, fijación de complemento, enlace de receptor de Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antigeno. Además, un anticuerpo de la invención puede ser modificado guímicamente (por ejemplo, una o más porciones químicas pueden ser anexadas al anticuerpo) o ser modificado para alterar su glicosilación otra vez para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades es descrita en detalle adicional posteriormente en la presente. La numeración de residuos en la región Fc es aquélla del Índice EU de Kabat. En una modalidad, la región de engozne de CH1 es modificada de tal manera que el número de residuos de cisteína en la región de engozne es alterada, por ejemplo incrementado o disminuido. Este procedimiento es descrito adicionalmente en la Patente Estadounidense No. 5,677,425 por Bodmer et aJ. El número de residuos de cisteina en la región de engozne de CH1 es alterado por ejemplo, para facilitar el ensamble de las cadenas ligeras y pesadas o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. En otra modalidad, la región de engozne de una Fc es mutada para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácidos son introducidas a la región de interfase de dominio de CH2-CH3 del fragmento de engozne de Fc, de tal manera que el anticuerpo tiene enlace de proteína A de Estafilocoxilo (SpA) deteriorada, en relación con el enlace de SpA de dominio de engozne de Fc natural. Este procedimiento es descrito en detalle adicional en la Patente Estadounidense No. 6,165,745 expedida a Ward et al . En otra modalidad, el anticuerpo es modificado para incrementar su vida media biológica. Varios procedimientos son posibles. Por ejemplo, una o más de las siguientes mutaciones pueden ser introducidas: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente Estadounidense No. 6,277,375 expedida a Ward. Alternativamente, para incrementar la vida media biológica, el anticuerpo puede ser alterado dentro de la región de CHl o Cl para contener un epítopo de enlace de receptor de salvamento tomado de dos bucles de un dominio de CH2 de una región de Fc de una IgG, como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,869,046 y 6,121,022 expedidas a Presta et al .

En todavia otras modalidades, la región de Fc es alterada al reemplazar por lo menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar la(s) función (s) efectora (s) del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada por un ligando efector pero retiene la habilidad de enlace de antígeno del anticuerpo original. El ligando efector al cual la afinidad es alterada puede ser por ejemplo un receptor de Fc o el componente Cl de complemento. Este procedimiento es descrito en detalle adicional en la Patentes Estadounidenses Nos. 5,624,821 y 5,648,260 ambas expedidas a Winter et al . En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 329, 331 y 322 pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tiene enlace de Clq alterada y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) reducida o abolida. Este procedimiento es descrito en detalle adicional en la Patente Estadounidense No. 6,194,551 expedida a Idusogie et al . En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones de aminoácidos 231 y 239 son alterados para alterar mediante esto la habilidad del anticuerpo para fijar complemento. Este procedimiento es descrito adicionalmente en la publicación de PCT WO 94/29351 de Bodmer et a l . En todavía otro ejemplo, la región Fc es modificada para incrementar la habilidad del anticuerpo para moderar la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy al modificar uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258,. 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este procedimiento es descrito adicionalmente en la publicación de PCT WO 00/42072 por Presta. Además, los sitios de enlace sobre IgGl humano para FcyRl, FcyRII, FcyRIII y FcRn han sido mapeados y se han descrito variantes con enlace mejorado (véase Shields, R. L. et a l . (2001) J. Bi ol . Chem . 276:6591-604) . Se demostró gue mutaciones específicas en posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran el enlace a FcyRIII. Adicionalmente, los siguientes mutantes de combinación se mostró que mejoran el enlace de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A. En todavía otra modalidad, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglicosilado (esto es, el anticuerpo carece de glicosilación) . La glicosilación puede ser alterada por ejemplo para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden efectuar por ejemplo al alterar uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, uno o más sustituciones de aminoácidos se pueden efectuar que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de estructura de región variable para eliminar mediante esto la glicosilación en aguel sitio. Tal aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo por antígeno. Tal procedimiento es descrito en detalle adicional en las Patente Estadounidenses Nos. 5,714,350 y 6,350,861 expedidas a Co et al . Adicional o alternativamente, se puede elaborar un anticuerpo gue tiene un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuo de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras de GlcNac de bisección incrementadas. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilación alterados incrementan la habilidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos pueden ser efectuadas por ejemplo al expresar el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. Células con maquinaria de glicosilacion alterada han sido descritas en el arte y pueden ser usadas como células huésped en las cuales expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir mediante esto un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, las lineas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa FUT8 (alfa ( 1, 6) fucosiltransferasa) , de tal manera que anticuerpos expresados en lineas celulares de Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las lineas celulares de Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8_/" fueron creadas mediante la disrupción apuntada del gen FUT8 en células CHO/DG44 utilizando dos vectores de reemplazo (véase, Publicación de Patente Estadounidense No. 20040110704 por Yamane et al . y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87 : 614-22) . Como otro ejemplo, EP 1,176,195 de Hanay et al . describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente roto gue codifica una fucosiltransferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en tal linea celular exhiben hipofucosilacion al reducir o eliminar la enzima alfa 1,6 enlace relacionada. Hanai et al también describe líneas celulares que tienen baja actividad enzimática por agregar fucosa a la N-acetilglucosamma gue se enlaza a la región Fc del anticuerpo o no tiene la actividad de enzima, por ejemplo la línea de célula de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662) . La publicación de PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea de célula CHO variante, células Lecl3, con habilidad reducida para anexar fucosa a carbohidratos Asn (297)-enlazados que también dan como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en aquélla célula huésped (véase también Shields, R. L. et al . (2002) J. Biol . Chem . 277:26733-26740). La publicación de PCT WO 99/54342 de Umana et al . describe lineas celulares diseñadas para expresar glicosiltransferasas gue modifican glicoproteína (por ejemplo beta ( 1, 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) de tal manera que los anticuerpos expresados en las lineas celulares diseñadas exhiben estructuras de GicNac de bisección incrementada que dan como resultado actividad de ADCC incrementada de los anticuerpos (véase también Umana et al . (1999) Wat. Biotech . 17:176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden ser escindidos utilizando un enzima de fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa remueve residuos de fucosilo de anticuerpos (Tarentino, A. L. et al . (1975) Biochem . 14:5516-23) . Otra modificación de los anticuerpos en la presente que es contemplada por la invención es PEG-ilación. Un anticuerpo puede ser PEG-ilado, por ejemplo para incrementar la vida media biológica (por ejemplo, en el suero) del anticuerpo. Para PEG-ilar un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento del mismo, se hace reaccionar comúnmente con polietilenglicol (PEG), de tal manera que un éster reactivo o derivado de aldehido de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG son anexados al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la PEG-ilación se lleva a cabo vía una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polimero soluble en agua reactivo análogo) . Como se usa en la presente, el término "polietilenglicol" se propone abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivar otras proteínas, tales como mono (Cl-ClO) acoxi- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida . En ciertas modalidades, el anticuerpo a ser PEG-ilado es un anticuerpo aglicosilado . Métodos para PEG-ilar proteínas son conocidos en el arte y pueden ser aplicados a los anticuerpos de la invención. Véase por ejemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al . y EP 0 401 384 por Ishikawa et al .

Métodos para diseñar anticuerpos Como se discute anteriormente, los anticuerpos anti-PD-1 que tienen secuencias de VH y V? regulados en la presente pueden ser usados para crear nuevos anticuerpos anti-PD-1 al modificar las secuencias de VH y/o V? o la(s) región(es) constante(s) anexadas a las mismas. Así, en otro aspecto de la invención, los elementos estructurales de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención, por ejemplo 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4, son usados para crear anticuerpos ant?-PD-1 relacionados estructuralmente que retienen por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tales como enlace a PD-1 humano. Por ejemplo, una o mas regiones de CDR de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4 o mutaciones de los mismos, pueden ser combinadas recomb antemente con regiones de estructura conocidad y/u otras CDR para crear anticuerpos ant?-PD-1 adicionales diseñados recombmantemente de la invención, como se discute anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la sección previa. El material de partida para el método de diseño es una o mas de las secuencias de VH y/o V? provistas en la presente o una o mas regiones de CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar realmente (esto es, expresar como protema) un anticuerpo gue tiene una o mas de las secuencias de VH y/o V? proporcionadas en la presente o una o mas regiones de CDR de las mismas. Mas bien, la información contenida en la(s) secuencia (s) es usada como material de partida para crear una(s) secuencia (s) de "segunda generación" derivada de la(s) secuencia (s) original y luego la(s) secuencia (s) de "segunda generación" es preparada y expresada como protema. Asi, en otra modalidad, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo ant?-PD-1 gue comprende: (a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDRl seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26 y 27 y 28, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDRl seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56; (b) alterar por lo menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada y (c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como proteina. Se pueden usar técnicas de biología molecular estándar para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada . Preferiblemente, el anticuerpo codificado por la(s) secuencia (s) de anticuerpo alterada (s) es uno que retiene una, alguna o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente, tales propiedades funcionales incluyen, pero no están limitadas a: (a) el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 X 10"7 M o menor; (b) el anticuerpo no se enlaza sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS humano; (c) el anticuerpo incrementa la proliferación de célula T en un análisis de MLR. (d) el anticuerpo incrementa la producción de interferón-gama en un análisis de MLR; (e) el anticuerpo incrementa la secreción de 11-2 en un análisis de MRL; (f) el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano y PD-1 de mono cinomolgus; (g) el anticuerpo inhibe el enlace de PD-Ll y/o PD-L2 a PD-1; (h) el anticuerpo estimula respuestas de memoria especificas de antigeno; (i) el anticuerpo estimula respuestas de anticuerpo; (j) el anticuerpo inhibe el crecimiento de células de tumor in vivo . Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden ser determinadas utilizando análisis estándar disponibles en el arte y/o descritos en la presente, tales como aquéllos resumidos en los ejemplos (por ejemplo, citometria de flujo, análisis de enlace) . ' En ciertas modalidades de los métodos de diseño de anticuerpos de la invención, se pueden introducir mutaciones aleatoria o selectivamente a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación de anticuerpo anti-PD-1 y los anticuerpos anti-PD-1 modificados resultantes pueden ser seleccionados en cuanto a actividad de enlace y/u otras propiedades funcionales como se describe en la presente. Métodos mutacionales han sido descritos en el arte. Por ejemplo, la publicación de PCT WO 02/092780 de Short describe métodos para crear y seleccionar mutaciones de anticuerpo utilizando mutagénesis de saturación, ensamble de ligación sintética o una combinación de los mismos. Alternativamente, la publicación de PCT WO 03/074679 por Lazar et al , describe métodos para usar métodos de selección computacionales para optimizar las propiedades fisicoquímicas de anticuerpos.

Moléculas de Acido Nucleico que Codifican Anticuerpos de la Invención Otro aspecto de la invención es concerniente con moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico esta "aislado" o "vuelto sustancialmente puro" cuando está purificado de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteinas, mediante técnicas estándar, en las que se incluyen tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis de gel de azarosa y otras bien conocidas en el arte. Véase, F Ausubel, et al . , ed . (1987) Current Protocols ín Molecular Biology Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un ácido nucleico de la invención puede ser por ejemplo ADN o ARN y puede o no puede contener secuencias intrónicas. En una modalidad preferida, el acido nucleico es una molécula de cADN. Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser obtenidos utilizando técnicas de biología molecular estándar. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que portan genes de inmunoglobulina humanos como se describe adicionalmente más tarde en la presente), cADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo elaborado por el hibpdoma pueden ser obtenidos mediante técnicas de amplificación de PCR o clonación de cADN estándar. Para anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de gen de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando técnicas de despliegue de fago) , el ácido nucleico que codifica al anticuerpo puede ser recuperado de la biblioteca. Las moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención son aquéllas que codifican las secuencias de VH y VL de los anticuerpos monoclonales 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4. Secuencias de ADN que codifican las secuencias de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs. 57, 58, 59, 60, 61, 62 y 63, respectivamente. Secuencias de ADN que codifican las secuencias de VL de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 son mostradas en SEQ ID NOs. 64, 65, 66, 67, 68, 69 y 70, respectivamente. Una vez que los fragmentos de ADN que codifican los segmentos de VH y VL son obtenidos, estos fragmentos de ADN pueden ser manipulados adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinantes estándar, por ejemplo, para convertir los genes de región variable a genes de cadena de anticuerpo de plena longitud, a genes de fragmento de Fab o a un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH es enlazado operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "enlazado operativamente" como se usa en este contexto, se propone para dar a entender que los dos fragmentos de ADN están unidos de tal manera que la secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en cuadro . El ADN aislado que codifica la región VH puede ser convertido a un gen de cadena pesada de plena longitud al enlazar operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3) . Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana son conocidos en el arte (véase por ejemplo, Rabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y fragmentos de AND gue abarcan estas regiones pueden ser obenidos mediante amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD pero más preferiblemente es una región constante de IgGl o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento de Fab el ADN que codifica VH puede ser enlazado operativamente a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante de CH1 de cadena pesada. El ADN aislado que codifica la región de VL puede ser convertido a un gen de cadena ligera de plena longitud (también como un gen de cadena ligera de Fab) al enlazar operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humana son conocidos en el arte, (véase por ejemplo, Rabat, E. A., et al . (1991) Seguences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden ser obtenidos de amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero es más preferiblemente una región constante kappa. Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL son enlazados operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal manera que las secuencias de VH y VL pueden ser expresadas como una proteína de una sola cadena contigua, con las regiones de VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase por ejemplo, Bird et al . (1988) Science 242 : 423-426; Huston et al . (1988) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 8j>: 5879-5883; McCafferty et al . , (1990) Na ture 348_ :552-544).

Producción de Anticuerpos Monoclonales de la Invención Los anticuerpos monoclonales (mAbs) de la presente invención pueden ser producidos mediante una variedad de técnicas, en las que se incluyen metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridización de célula somática estándar de Kohier and Milstein (1975) Na ture 256:495. Aunque los procedimientos de hibridización de células somáticas son preferidos, en principio, otras técnicas para producir anticuerpo monoclonal pueden ser usadas, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema de animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en el arte. Socios de fusión (por ejemplo, células de mieloma murinas) y procedimientos de fusión son también conocidos. Los anticuerpos guiméricos o humanizados de la presente invención pueden ser preparados en base a la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describe anteriormente. ADN gue codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede ser obtenido del hibridoma murino de interés y diseñado para contener secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana) utilizando técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas pueden ser enlazadas a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en el arte (véase, por ejemplo Patente Estadounidense No.4, 816, 567 expedida a Cabilly et al . ) . Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones de CDR murinas pueden ser insertadas a una estructura humana utilizando métodos conocidos en el arte (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 5,225,539 expedida a Winter y Patente Estadounidense Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 expedidas a Queen et al . ) . En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PD-1 pueden ser generados utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmune humano en lugar de un sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones a los que se hacen referencia como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente y son denominados colectivamente en la presente como "ratones Ig humanos" . Los ratones HuMAb® (Medarex, Inc.) contienen minisitios de gen de inmunoglobulina humanos que codifican las Secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada sin arreglar (µ y ?) y k y capas ligeras, junto con mutaciones apuntadas que desactivan los sitios de cadena µ y k endógenos (véase, por ejemplo Lonberg, et al . (1994) Nature 3_68 ( 6474 ): 856-859) . Asi, los ratones exhiben expresión reducida de IgM de ratón o k y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos sufren conmutación de clase y mutación somática para generar IgGk monoclonal humano de alta afinidad (Lonberg. N. et al . (1994), supra ; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimen tal Pharmacology 113 : 49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern Rev. Immunol . 13 : 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann . N. Y. Acad. Sci . 764 : 536-546) . La preparación y uso de ratones HuMab y las modificaciones genómicas portadas por tales ratones, es descrita adicionalmente en Taylor, L. et al . (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al . (1993) Interna tional Immunology 5:647-656; Tuaillon et al . (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 90:3720-3724; Choi et al . (1993) Na ture Genetics : 117-123 ; Chen J. et al . (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al . (1994) J. Immunol . 152:2912-2920 ; Taylor, L. et al . (1994) International Immunology 6:579-591 ; y Fishwild, D. et al . (1996) Na ture Biotechnology L4: 845-851, el contenido de todas las cuales son incorporados específicamente en la presente por referencia en su totalidad. Véanse además Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,806 ; 5,569,825 ; 5,625,126 ; 5,633,425 ; 5,789,650 ; 5,877,397 ; 5,661,016 ; 5,814,318 ; 5,874,299 ; y 5,770,429 ; expedidas a Lonberg y Kay ; Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,807 expedida a Surani et al . ; Publicaciones de PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas a Lonberg y Kay; y Publicación de PCT No. WO 01/14424 de Korman et al . En otra modalidad, los anticuerpos humanos de la invención pueden ser creados utilizando un ratón que porta secuencias se inmunoglobulina humana o transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgen de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humano. Tales ratones, a los gue se hace referencia en la presente como "ratones KM™" son descritos en detalle en la Publicación WO 02/43478 expedida a Ishida et al . Todavía además, sistemas de animal transgénico alternativos gue expresan genes de inmunoglobulina humanos están disponibles en el arte y pueden ser usados para crear anticuerpos anti-PD-1 de la invención. Por ejemplo, un sistema transgénico alternativo al gue se hace referencia como Xenomouse (Abgenix, Inc.) puede ser usado; tales ratones son descritos por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos.5, 939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 expedidas a Kucherlapati et al . Además, sistemas de animal transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humanos están disponibles en el arte y pueden ser usados para crear anticuerpos anti-PD-1 de la invención. Por ejemplo, ratones que portan un transcromosoma de cadena pesada humano y un transcromosoma de cadena ligera humano, denominados como "ratones TC" pueden ser usados; tales ratones son descritos en To izuka et al . (2000) Proc . Na ti . Acad. Scí . USA 97:722-727. Además, vacas que portan transcromosomas de cadena pesada y ligera humana han sido descritos en el arte (Kuroiwa et al . (2002) Na ture Biotechnology 20:889-894) y pueden ser usados para crear anticuerpos anti-PD-1 de la invención. Anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden también ser preparados utilizando métodos de despliegue de fago para seleccionar bibliotecas de genes de inmuno'globulina humanos. Tales métodos de despliegue de fago para aislar anticuerpos humanos están establecidos en el arte. Véase por ejemplo: Patentes Estadounidenses Nos. 5,223,409; 5,403,484 y 5,571,698 expedidas a Ladner et al ; Patentes Estadounidenses Nos. 5,427,908 y 5,580,717 expedidas a Dower et al . ; Patentes Estadounidenses Nos. 5,969,108 y 6,172,197 expedidas a McCafferty et al . y Patentes Estadounidenses Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 expedidas a Griffiths et al . Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden también ser preparados utilizando ratones SCID a los cuales células inmunes humanas han sido reconstituidas, de tal manera que se pueden generar una respu sta de anticuerpo humana después de la inmunización. Tales ratones son descritos por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,476,996 y 5, 698,767 expedidas a Wilson et al .

Inmunización de ratones Ig Humanos Cuando se usan ratones Ig humanos para crear anticuerpos humanos de la invención, tales ratones pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de antígeno de PD-1 y/o PD-1 recombinante o una proteína de fusión de PD-1, como se describe por Lonberg, N. et al . (1994) Na ture 3_68 ( 6474 ): 856-859; Fishwild, D. et al . (1996) Na ture Biotechnology 1J : 845-851; y Publicación PCT WO 98/24884 Y WO 01/14424. Preferiblemente, los ratones serán de 6-16 semanas de edad después de la primera infusión. Por ejemplo, una preparación purificada o recombinante (5-50 µg) de antígeno PD-1 puede ser usada para inmunizar los ratones Ig humanos intraperitonealmente. Procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales plenamente humanos a PD-1 son descritos en el ejemplo 1 a continuación. La experiencia acumulativa con varios antigenos ha demostrado gue los ratones transgénicos responden cuando son inmunizados inicialmente intraperitonealmente (IP) con antigeno en adyuvante de Freund completo, seguido por inmunizaciones IP una semana sí y una semana no (hasta un total de seis) con antígeno en adyuvante de Freund incompleto. Sin embargo, también se encuentra que adyuvantes diferentes a Freund son efectivos. Además, se encuentra que células enteras en ausencia de adyuvantes son altamente inmunogénicas. La respuesta inmune puede ser monitoreada en el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma siendo obtenidas mediante sangrías retroorbitales . El plasma puede ser seleccionado mediante ELISA (como se describe posteriormente en la presente) y ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti-PD-1 pueden ser usados para fusiones. Los ratones pueden ser reforzados intravenosamente con antígeno tres días antes del sacrificio y remoción del vaso. Se espera que 2-3 fusiones para cada inmunización puede necesitar ser efectuadas. Entre 6 y 24 ratones son inmunizados comúnmente, por cada antígeno. Usualmente se usan tanto cepas HCo7 como HCol2. Además, tanto el transgen HCo7 como HCol2 puede ser cruzado conjuntamente a un solo ratón gue tiene dos transgenes de cadena pesada humanos diferentes (HCo7/HCol2 ) . Alternativa o adicionalmente, la cepa de KM mouse™ puede ser usada como se describe en el ejemplo 1.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención, esplenocitos y/o células de nodo linfático de ratones inmunizados pueden ser aislados y fusionados a una línea de célula inmortalizada apropiada, tal como una línea de célula de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden ser seleccionados en cuanto a la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones de una sola célula de linfocitos esplendióos de ratones inmunizados pueden ser fusionados a un sexto del número de células de mieloma de ratón que no segregan P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50%. Alternativamente, las suspensiones de una sola célula de linfocitos esplendióos de ratones inmunizados pueden ser fusionadas utilizando un método de electrofusión a base de campo eléctrico, utilizando un electroporador de fusión celular de cámara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc. Glen Burnie, MD) . Las células son depositadas a aproximadamente 2 X 105 en una placa de microtítulo de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene suero de clon fetal al 20%, 18% de medio acondicionado "653", 5% de origen (IGEN), L-glutamina 4 mM, pirovato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicma y IX HAT (Sigma; el HAT es agregado 24 horas después de la fusión) . Después de aproximadamente 2 semanas, las células pueden ser cultivadas en un medio en el cual el HAT es reemplazado con HT . Luego las cavidades individuales pueden ser seleccionadas mediante ELISA en cuanto a anticuerpos IgM y IgG monoclonales humanos. Una vez gue ocurre el crecimiento de hibndoma extenso, el medio puede ser observado usualmente después de 10-14 días.

Los hibridomas que segregan anticuerpos pueden re-depositados, seleccionados otra vez y si todavía son positivos en cuanto a IgG humano, los anticuerpos monoclonales pueden ser subclonados por lo menos dos veces mediante dilución limitante. Luego los subclones estables pueden ser cultivados in vi tro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización. Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, hibridomas seleccionados pueden ser cultivados en matraces de spinner de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Los superna t ;¡r.tes pueden ser filtrados y concentrados antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N. J J . El IgG diluido puede ser verificado mediante electroforesis de gel y cromatografía líquida de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución reguladora del pH puede ser intercambiada a PBS y la concentración puede ser determinada mediante OD2ao utilizando un coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden ser proporcionados en alícuotas y almacenados a -80 °C .

Generación de Transfectomas que producen Anticuerpos Monoclonales de la Invención Los anticuerpos de la invención pueden ser producidos en un transfectoma de célula huésped utilizando, por ejemplo una combinación de técnicas de ADN recomb mantés y métodos de transfeccion genética como es bien conocido en el arte (Morpson, S. (1985) Science 229: 1202) . Por ejemplo, para expresar los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de los mismos, ADN gue codifican cadenas ligeras y pesadas parciales o de plena longitud pueden ser obtenidos mediante técnicas de biología molecular estándar (por ejemplo, amplificación de PCR o clonación de cADN utilizando un hibndoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN pueden ser insertados a vectores de expresión, de tal manera que los genes son enlazados operativamente a secuencias de control de transcripción y traducción. En este contexto, el término "enlazado operativamente" significa que un gen de anticuerpo está ligado a un vector, de tal manera que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven para su función planeada de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y secuencias de control de expresión son escogidas para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden ser insertados a un vector separado o más comunmente, ambos genes son insertados al mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo son insertados al vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios sobre el fragmento de gen de anticuerpo y vector o ligación de extremo embotado si no están presentes sitios ode restricción) . Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente pueden ser usadas para crear genes de anticuerpo de plena longitud de cualquier isotipo de anticuerpo al insertarlos a vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado, de tal manera gue el segmento de VH es enlazado operativamente al (los) segmento (s) de CH dentro del vector y el segmento de V? es enlazado operativamente al segmento de CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal gue facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo puede ser clonado al vector de tal manera que el péptido de señal es enlazado en cuadro al término amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de munoglobulina o un péptido de señal heterólogo (esto es, un péptido de señal de una proteína sin inmunoglobulina) . Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" se propone incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras son descritas por ejemplo en Goeddel (Gene Expresión Technology. Methods in Enzymology 185, Academia Press, San Diego, CA (1990)). Se apreciará por aquéllos experimentados en el arte que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Secuencias reguladoras preferidas para la expresión de célula huésped mamífera incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteina en células mamiferas, tales como promotores y/o mejoradores derivados de citomegalovirus (CMV),> Virus 40 Simio (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío mayor de adenovirus (AdMLP) y polioma. Alternativamente, se pueden usar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o promotor de beta-globina . Todavía además, elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa que contiene secuencias del promotor prematuro SV40 y la repetición terminal larga de virus de leucemia de célula T humano tipo 1 (Takebe, Y. et a l . (1988) Mol . Cel l . Biol . 8:466-472). Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped a las cuales el vector ha sido introducido (véase, por ejemplo Patentes Estadounidenses Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017 todas expedidas a Axel et a l . ) . Por ejemplo, comúnmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexate, sobre una célula huésped a la cual el vector ha sido introducido. Genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofoliato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexate) y el gen neo (para selección de G418) . Para expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el (los) vector (es) de expresión gue codifica (n) las cadenas pesadas y ligeras es transfectado a una célula huésped mediante técnicas estándar. Se pretende que las varias formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas usadas comúnmente para introducción de ADN exógeno a una célula huésped procarióntica o eucarióntica, por ejemplo electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrana y los semejantes. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención ya sea en células huésped procariónticas o eucariónticas, la expresión de anticuerpos en células eucariónticas y más preferiblemente células huésped mamíferas, es el más preferido debido a que tales células eucariónticas y en particular células mamíferas son más probables que las células procariónticas para ensamblar y secretar un anticuerpo plegado apropiadamente e inmunológicamente activo. La expresión procarióntica de genes de anticuerpo se ha reportado que no es efectiva para producción de alto rendimiento de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13) . Células huésped mamíferas preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen ovario de hámster chino (células CHO) (en las que se incluyen células CHO dhfr como se describe en Urlaub y Chasin, (1980) Proc . , Na ti . Acad. Sci . > USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. 'Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol . Biol . 159: 601-621) , células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión genética GS revelado en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Cuando vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos son introducidos a células huésped mamíferas, los anticuerpos son producidos al cultivar las células huésped por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o más preferiblemente, secreción del anticuerpo al medio de cultivo al cual las células huésped son cultivadas. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína estándar.

Caracterización de Enlace de Anticuerpo a Antígeno Los anticuerpos de la invención pueden ser probados en cuanto a enlace a PD-1 por ejemplo mediante ELISA estándar. Brevemente, placas de microtítulo son recubiertas con PD-1 purificado a 0.25 µg/ml en PBS y luego bloqueados con albúmina de suero bovino al 5% en PBS. Se agregan diluciones de anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma de ratones PD-1 inmunizado) a cada cavidad, e incubados durante 1-2 horas a 37°C. Las placas son lavadas con PBS/Tween y luego incubadas con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpos humanos, reactivo policlonal IgG-específico de cabra-antihumano) conjugado a fosfatasa alcalina por una hora a 37 °C . Después del lavado, las placas son reveladas con sustrato de pNPP (1 mg/ml) y analizadas a OD de 405-650. Preferiblemente, los ratones gue desarrollan los títulos mas altos serán usados para las fusiones. Un análisis de ELISA como se describe anteriormente puede también ser usado para seleccionar hibridomas que muestran reactividad positiva con inmunógeno de PD-1. Los hibridomas que se enlazan con alta avidez a PD-1 son subclonados y caracterizados adicionalmente . Un clon de cada hibndoma, que retiene la reactividad de las células originales (mediante ELISA) puede ser escogido para elaborar un banco de 5-10 frascos de células almacenados a -140 °C y para purificación de anticuerpo. Para purificar anticuerpos ant?-PD-1, hibridomas seleccionados pueden ser cultivados en matraces de spinner de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenatantes pueden ser filtrados y concentrados antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N J . ) . El IgG eluido puede ser verificado mediante electroforesis de gel y cromatografía líguida de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución reguladora del pH puede ser intercambiada a PBS y la concentración puede ser determinada mediante OD2so utilizando un coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden ser proporcionados en alícuotas y almacenados a -80 °C . Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 seleccionados se enlazan a epítopos únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado utilizando reactivos disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL) . Estudios de competencia utilizando anticuerpos monoclonales sin marcar y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden ser efectuados utilizando placas de ELISA recubiertas con PD-1 como se describe anteriormente. El enlace de mAb biotinilado puede ser detectado con una sonda de fosfatasa alcalina esteptavidina . Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden efectuar ELISAS de isotipo utilizando reactivos específicos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, cavidades de placas de microtítulo pueden ser recubiertas con 1 µg/ml de inmunoglobulina anti-humana durante toda la noche a 4 °C . Después del bloqueo con BSA al 1%, las placas se hacen reaccionar con 1 µg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificado, a temperatura ambiente por una a dos horas. Luego las cavidades se pueden hacer reaccionar ya sea con IgGl humano o sondas fosfatasa alcalina-conjugadas IgM específicas humanas. Las placas son desarrolladas y analizadas como se describe anteriormente. IgG humano anti-PD-1 pueden ser probados adicionalmente en cuanto a reactividad con antígeno de PD-1 mediante Western blotting. Brevemente, PD-1 puede ser preparado y sometido a electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados son transferidos a membranas de nitrocelulosa, bloqueados con suero de becerro fetal al 10% y probados con los anticuerpos monoclonales a ser probados. El enlace de IgG humano puede ser detectado utilizando fosfatasa alcalina de IgG anti-humano y desarrollado con tabletas de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Me).

Inmunoconjugados En otro aspecto, la presente invención comprende un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo, conjugado a una porción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados son denominados en la presente como " inmurioconj ugados'J Los inmunoconjugados gue incluyen una o más citotoxinas son denominados como "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualguier agente gue es perjudicial para las células (por ejemplo, extermina) . Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorúbicina, daunorubicina, dihidroxi antrasin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexate, 6-mercaptopupna, 6-t?oguan?na, citarabma, 5-fluorouracil decarbacma) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa clorambucilo, melfalana, carmustma (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfana, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiam a platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclina (por ejemplo, daunorubicma (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actmomicina ) , bleomicina, mitramicina y antramicma (AMC)) y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que pueden ser conjugadas a un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicma, calichamicina, maitansmas y auristatmas y derivados de los mismos. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de calichamicina está disponible comerdialmente (Mylotarg™, Wyeth-Ayerst) . Las citotoxinas pueden ser conjugadas a anticuerpos de la invención utilizando tecnología de enlazador disponible en el arte. Ejemplos de tipos de enlazador que han sido usados para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no están limitados a hidrazona, tioéter, esteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptido. Un enlazador puede ser escogido que es, por ejemplo suceptible a escisión mediante bajo pH dentro del compartimiento lisosomal o susceptible a escisión mediante proteasas tales como proteasas expresadas preferencialmente en tejido de tumor tales como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D) . Para discusión adicional de tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, véase también Saito, G. et al . (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al . (2003) Cáncer Immunol . Immunother . 5_2: 328-337; Payne, G (2003) Cáncer Cel l 3:207-212; Alien, T.M. (2002) Na t . Rev. Cáncer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr . Opin . Inves tig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C. J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264. Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser conjugados a un isótopo reactivo para generar radiofarmacéuticos citotóxicos, también denominados como radioinmunoconjugados . Ejemplos de isótopos radioactivos que pueden ser conjugados a anticuerpo para uso diagnóstico o terapéuticamente incluyen, pero no están limitados a yodo131, indio111, itrio90 y lutesio177. Métodos para preparar radioinmunoconjugados están establecidos en el arte. Ejemplos de radioinmunoconjugados están disponibles comercialmente, en los que se incluyen Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) y métodos similares pueden ser usados para preparar radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos conjugados de la invención pueden ser usados para modificar una respuesta biológica dada y la porción de fármaco no se interpretará como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteinas pueden incluir, por ejemplo una toxina enzimáticamente activa o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoina de seudomonas o toxinade difteria; una proteína tal como factor de necrosis de tumor o interferon-gamma o modificadores de respuesta biológica tales como por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonia de macrófago de granulocito ("GM-CSF"), factor estimulador de colonia de granulocito ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento . Técnicas para conjugar tal porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas, véase por ejemplo Arnon et al . , "Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al . (eds.), pp . 243-56 (Alan R. Liss. Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed . ) , Robinson et al . (eds.), pp 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et aJ. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al . (eds.), pp 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al . , "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol Rev., 62:119-58 (1982).

Moléculas Bisespecificas En otro aspecto, la invención comprende moléculas bisespecíficas gue comprenden un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo de la invención. Un anticuerpo de la invención o porciones de enlace de antígeno del mismo, pueden ser derivadas o enlazadas a otra molécula funcional, por ejemplo otro péptido o proteina (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando por un receptor) para generar una molécula bisespecífica que se enlaza a por lo menos dos sitios de enlace diferentes o moléculas objetivo. El anticuerpo de la invención puede en efecto ser derivado o enlazado a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecificas que se enlazan a más de dos sitios de enlace diferentes y/o moléculas objetivo; tales moléculas multiespecíficas también se propone estar abarcadas por el término "molécula bisespecífica" como se usa en la presente. Para crear una molécula bisespecifica de la invención, un anticuerpo de la invención puede ser enlazado funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más de otras moléculas de enlace, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de enlace, de tal manera gue se tiene como resultado una molécula bisespecífica . Así, la presente invención incluye moléculas bisespecífica que comprenden por lo menos una primera especificidad de enlace por PD-1 y una segunda especificidad de enlace por un segundo epitopo objetivo. En una modalidad particular de la invención, el segundo epitopo objetivo es un receptor Fc, por ejemplo Fc?RI humano (CD64) o un receptor Fca humano (CD89) . Por consiguiente, la invención incluye moléculas bisespecíficas capaces de enlace tanto a Fc?RI o Fca que expresan células efectoras (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN)) y a células objetivo gue expresan PD-1. Estas moléculas bisespecíficas apuntan células que expresan PD-1 a células efectoras y disparan actividades de célula efectoras moderadas por el receptor Fc, tales como fagocitosis de células gue expresan PD-1, citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) , liberación de citosina o generación de anión de superóxido. En una modalidad de la invención, en la cual la molécula bisespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir adicionalmente una tercera especificidad de enlace, además de una especificidad de enlace anti-Fc y una especificidad de enlace anti-PD-1. En una modalidad, la tercera especificidad de enlace es una porción de factor de anti-mejora (EF) por ejemplo, una molécula que se enlaza a una proteína de superficie involucrada en actividad citotóxica e incrementa mediante esto la respuesta inmune contra la célula objetivo. La "porción de factor de anti-mejora" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se enlaza a una molécula dada, por ejemplo un antígeno o un receptor y mediante esto da como resultado una mejora del efecto de los determinantes de enlace por el receptor de Fc o antigeno de célula objetivo. La "porción de factor anti-mejora" se puede enlazar a un receptor de Fc o un antígeno de célula objetivo. Alternativamente, la porción de factor de anti-mejora se puede enlazar a una entidad que es diferente de la entidad a la cual las primeras y segundas especificidades de enlace se enlazan. Por ejemplo, la porción de factor de anti-mejora se puede enlazar a una célula T citotóxica (por ejemplo, via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que da como resultado una respuesta inmune incrementada contra la célula objetivo). En una modalidad, las moléculas bisespecíficas de la invención comprenden como especificidad de enlace por lo menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo, en los que se incluyen, por ejemplo un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o Fv de una sola cadena. El anticuerpo puede también ser un dimero de cadena ligera o cadena pesada o cualquier fragmento mínimo del mismo, tal como un Fv o un constructo de una sola cadena como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,946,778 expedida a Ladner et al . , el contenido de la cual es incorporado expresamente por referencia. En una modalidad, la especificidad de enlace por un receptor Fcy es proporcionada por un anticuerpo monoclonal, el enlace del cual no es blogueado por G de inmunoglobulina humana (IgG) . Como se usa en la presente, el término "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los 8 genes de cadena gamma localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de 12 isoformas de tal membrana o isoformas de receptor soluble gue son agrupados en tres clases de receptor de Fcy: Fc?RI(CD64), Fc?RII(CD32) y Fc?RIII (CD16) . En una modalidad preferida, el receptor de Fcy es un Fc?RI de alta afinidad humano. El Fc?RI humano es una molécula de 72 KDa que muestra alta afinidad por IgG monomérico (108-109M"1) . La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti- Fcy preferidos son descritos por Fanger et al. en la Publicación de PCT WO 88/00052 y en la Patente Estadounidense No. 4,954,617, las enseñanzas de las cuales son incorporadas plenamente por referencia en la presente. Estos anticuerpos se enlazan a un epítopo de Fc?RI, FcyRII o Fc?RIII en un sitio gue es distinto del sitio de enlace de Fo? del receptor y asi su enlace no es bloqueado sustañcialmente por niveles fisiológicos de IgG. Anticuerpos anti- FcyRI específicos útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma gue produce mAb 32 está disponible de la American Type Culture Collection, ATCC Accession No. HB9469. En otras modalidades, el anticuerpo receptor anti- Fcy es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22) . La producción y caracterización del anticuerpo H22 es descrita en Graziano, R.F. et al . (1995) J. Immunol 155 ( 10 ): 4996-5002 y Publicación PCT WÓ 94/10332. La linea de célula que produce anticuerpo H22 fue depositada en la American Type Culture Collection bajo la designación HA022CL1 y tiene el número de acceso CRL 11177. En todavia otras modalidades preferidas, la especificidad de enlace por un receptor Fc es provista por un anticuerpo que se enlaza a un receptor de IgA humano, por ejemplo un receptor Fc alfa ( FcaRI (CD89) ) , el enlace del cual es preferiblemente no bloqueado por inmunoglobulina A humana (IgA) . El término "receptor de IgA" se propone incluir el producto genético de un gen alfa (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas de transmembrana empalmadas alternativamente de 55 a 110 KDa. FcaRI (CD89) es expresado constitutivamente sobre monocitos/macrófagos, granulocitos eosinofílicos y neutrofilicos, pero no sobre poblaciones de células no efectoras. FcaRI tiene afinidad media (= 5 x 107 M"1) tanto por IgAl como IgA2, que es incrementado después de la exposición a citosinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H.C. et al . (1996) Cri tical Review in Immunology 16:423-440). Cuatro anticuerpos monoclonales FcaRI-especificos, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se enlazan a FcaRI fuera del dominio de enlace de ligando IgA han sido descritos (Monteiro, R.C. et al . (1992) J. Immunol . 148: 1764) . FcaRI y FcaRI son receptores de disparo preferidos para uso en las moléculas bisespecificas de la invención debido a que son (1) expresados principalmente sobre células efectoras inmune, por ejemplo, monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas; (2) expresados a altos niveles (por ejemplo, 5,000-100,000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); (4) moderan la presentación de antígeno mejorada de antígenos, en los que se incluyen anti-antígenos, apuntados a ellos. En tanto que los anticuerpos monoclonales humanos son preferidos, otros anticuerpos que pueden ser usados en las moléculas bisespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados. Las moléculas bisespecíficas de la presente invención pueden ser preparadas al conjugar las especificidades de enlace constituyentes, por ejemplo, las especificidades de enlace anti-FcR y anti-PD-1, utilizando métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de la molécula bisespecifica puede ser generada separadamente y luego conjugadas entre sí. Cuando las especificidades de enlace son proteínas o péptidos, se pueden usar una variedad de agentes de acoplamiento o agentes de articulación para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de articulación incluyen proteína A, carbodimida, N-suxinidimil-s-acetil-tioacetato (SATA), 5, 5' -ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o fenilendimalimida (oPDM) , N-suxinidimil-3- ( 2-piridiltio) propionato (SPDP), y 4-(N-malemidometil) ciclohexan-1-carboxilato de sulfosuxinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo Karpovsky et al . (1984) J.

Exp . Med. 160:1686; Liu, MA et al . (1985) Proc . Na ti . Acad.

Sci . USA 8_2:8648). Otros métodos incluyen aquéllos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al . (1985) Science 229:81-83), y Glennie et al . (1987) J. Immunol . 139 : 2367-2375) . Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) . Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos, pueden ser conjugados vía enlace de sulfidrilo de las regiones de engozne de término C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de engozne es modificada para contener un número impar de residuos de sulfidrilo, preferiblemente 1, antes de la conjugación . Alternativamente, ambas especificidades de enlace pueden ser codificadas en el mismo vector y expresadas y ensambladas en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil en donde la molécula bisespecífica es una proteína de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula bisespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena gue comprende un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de enlace o una molécula bisespecífica de una sola cadena gue comprende dos d terminantes de enlace. Las moléculas bisespecíficas pueden comprender por lo menos dos moléculas de una sola cadena. Métodos para preparar moléculas bisespecíficas son descritos por ejemplo en la Patente Estadounidense Número 5,260,203; Patente Estadounidense Número 5,455,030; Patente Estadounidense Número 4,881,175; Patente Estadounidense Número 5,132,405; Patente Estadounidense Número 5,091,513 Patente Estadounidense Número 5,476,786; Patente Estadounidense Número 5,013,653; Patente Estadounidense Número 5,258,498; Patente Estadounidense Número 5,482,858. El enlace de las moléculas bisespecificas a sus objetivos específicos puede ser confirmado por ejemplo mediante análisis inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) , radioinmunoanálisis (RÍA) , análisis de FACS, bioanálisis (por ejemplo, inhibición de crecimiento) o análisis de Western Blot. Cada uno de estos análisis detecta en general la presencia de complejos de proteina-anticuerpo de interés particular al emplear un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico por el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo pueden ser detectados utilizando por ejemplo un anticuerpo enzima-enlazado o fragmento de anticuerpo que reconoce y se enlaza específicamente a los complejos de anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden ser detectados utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoanálisis o pruebas inmunológicas. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado radioactivamente y usado en un radioinmunoanálisis (RÍA) ' (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioímmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, que es incorporado a la presente por referencia) . El isótopo radioactivo puede ser detectado mediante medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o mediante autoradiografía.

Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales o porción (es) de enlace de antígeno del mismo de la presente invención formulada junto con un portador aceptable farmacéuticamente. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos o inmunoconjugados o moléculas bisespecificas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o bisespecíficos) que se enlazan a epítopos diferentes sobre el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden ser administradas en terapia de combinación, esto es, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluuir un anticuerpo anti-PD-1 de la presente invención combinado con por lo menos otro agente anti-inflamatorio o inmunosupresor. Ejemplos de agentes terapéuticos que pueden ser usados en terapia de combinación son descritos en mayor detalle posteriormente en la sección de usos de los anticuerpos de la invención. Como se usa en la presente, "portador aceptable farmadéuticamente" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y retardadores de absorción y los semejantes gue son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es apropiado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión) . Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, esto es, anticuerpo, inmunoconjugado o molécula bisespecifica, puede ser cubierto en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto . Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales aceptables farmacéuticamente. Una "sal aceptable farmacéuticamente" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico indeseable (véase, por ejemplo Berge, S.M., et al . (1977) J. Pharm . Sci . 66 : 1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquéllas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, brómico, yodrídico, fosforoso y los semejantes, también como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono- y di-carboxilicos, ácidos alcanoicos fenilsustituidos, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos, alifáticos y aromáticos y los semejantes. Las sales de adición de base incluyen aquéllas derivadas de metales alcalino térreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y los semejantes, también como de aminas orgánicas no tóxicas tales como N, N' -dibenziletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y los semejantes. Una composición farmacéutica de la invención puede también incluir un antioxidante aceptable farmacéuticamente. Ejemplos de antioxidantes aceptables farmacéuticamente incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y los semejantes; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxiamisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y los semejantes y (3) agentes quelantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamin tetracético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y los semejantes.

Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos apropiados que pueden ser usados en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles, (tales como glicerol, propilenglicol, poliet elglicol y los semejantes) y mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables tales como oliato de etilo. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecit a, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de surfactantes. Estas composiciones pueden también contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede ser asegurada tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, paraben, clorobutanol, fenol, ácido ascorbico y los semejantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y los semejantes en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser efectuada mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los portadores aceptables farmacéuticamente incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de tales medios y agentes por sustancias farmacéuticamente activas es conocido en el arte. Excepto en cuanto a cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. Compuestos activos complementarios pueden también ser incorporados a las composiciones. Las composiciones terapéuticas comúnmente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada apropiada a alta concentración del fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión gue contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilenglicol líguido y los semejantes) y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser efectuada al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monosterato y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por microfiltración de esterilización. En general, las dispersiones son preparadas al incorporar el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquéllos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacio y congelación-secado (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualguier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril de la misma. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinado con un material portador para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del sujeto que es tratado y el modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con un material portador para producir un sola forma de dosificación será en general aquélla cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, de un ciento por ciento, esta cantidad fluctuará de alrededor de 0.01% a aproximadamente 99% de ingrediente activo, preferiblemente de alrededor de 0.1% a alrededor de 70%, más preferiblemente de alrededor de 1% a alrededor de 30% de ingrediente activo en combinación con un portador aceptable farmacéuticamente. Los regímenes de dosificación son ajustados para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un solo bolo puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas con el paso del tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria por facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Forma unitaria de dosificación como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico regueride La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención son determinadas por y \ directamente dependientes de (a) las caracteristicas únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser obtenido y (b) las limitaciones inherentes en el arte de composición tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Para administración del anticuerpo, la dosificación fluctúa de alrededor de 0.0001 a 100 mg/Kg, y mas usualmente 0.01 a 5 mg/Kg del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0.3 mg/Kg de peso corporal, 1 mg/Kg de peso corporal, 3 mg/Kg de peso corporal, 5 mg/Kg de peso corporal o 10 mg/Kg de peso corporal o en el intervalo de 1-10 mg/Kg. Un régimen de tratamiento ejemplar abarca la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada tres meses o una vez cada 3 a 6 meses. Los regimenes de dosificación preferidos para un anticuerpo ant?-PD-1 de la invención incluyen 1 mg/Kg de peso corporal o 3 mg/Kg de peso corporal via administración intravenosa, el anticuerpo es dado utilizando uno de los siguientes programas de dosificación: (i) cada 4 semanas para seis dosificaciones, luego cada 3 meses; (n) cada 3 meses; (m) 3 mg/Kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/Kg de peso corporal cada tres meses. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de enlace son administrados simultáneamente, en cuyo caso, la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo es administrado usualmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada 3 meses o anualmente. Los intervalos pueden también ser irregulares, tal como se indica al medir los niveles en la sangre de anticuerpo al antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación es ajustada para obtener una concetración de anticuerpo en el plasma de 1-1000 µg/ml y en algunos métodos alrededor de 25-300 µg/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede ser administrado como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia variarán dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguidos por anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, una dosificación relativamente baja es administrada a intervalos relativamente infrecuentes en un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento por el' resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos es algunas veces requerida hasta que el avance de la enfermedad es reducido o terminado y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de esto, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden hacer variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para obtener la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular sin ser tóxico al paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos en los que se incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención usadas o el éster, sal o amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que es usado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que es tratado y factores semejantes bien conocidos en las artes medicas. Una "dosificación terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención da como resultado preferiblemente una disminución en la severidad de síntomas de enfermedad, un incremento en frecuencia y duración de periodos libres de síntomas de enfermedad o una prevención del deterioro o lisabilidad debido a la aflicción de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una "dosificación terapéuticamente efectiva" inhibe preferiblemente el crecimiento de células o crecimiento de tumor por al menos alrededor de 20%, más preferiblemente por al menos alrededor de 40%, aún más preferiblemente por al menos alrededor de 60% y todavia más preferiblemente por lo menos alrededor de 80% en relación con los sujetos sin tratar. La habilidad de un compuesto para inhibir el crecimiento de tumor puede ser evaluada en un sistema de modelo de animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede ser evaluada al examinar la habilidad del compuesto para Inhibir, tal inhibición in vi tro mediante análisis conocidos para el técnico experimentado en el arte. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o de otra manera mejorar los síntomas en un sujeto. Aquel de habilidad ordinaria en el arte seria apto de determinar tales cantidades en base a factores tales como la talla del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto y la composición o ruta de administración particular seleccionada. En otro aspecto, la presente revelación proporciona un equipo farmacéutico de partes que comprenden un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-CTLA-4, como se describe en la presente. El equipo puede también comprender instrucciones para uso en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (tal como cáncer como se describe en la presente) . En otra modalidad, los anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 pueden ser co-empacados en forma de dosificación unitaria. En ciertas modalidades, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de enlace (por ejemplo, anti-PD-1 y anti-CTLA-4) son administrados simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo puede ser administrado como una sola dosis o más comúnmente puede ser administrado en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo semanalmente, mensualmente, cada 3 meses o anualmente. Los intervalos pueden también ser irregulares como se indica al medir los niveles en la sangre de anticuerpo al antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación es ajustada para obtener una concentración de anticuerpo en el plasma de alrededor de 1-1000 µg/ml y en algunos métodos alrededor de 25-300 µg/ml.

Una composición de la presente invención puede ser administrada vía una o más rutas de administración utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en el arte. Como se apreciará por el técnico experimentado, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Rutas de administración preferidas para anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras rutas de administración parenteral, por ejemplo mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se usa en la presente significa modos de administración diferentes a la administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e inyección intraeisternal e infusión. Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede ser administrado vía una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópicamente . Los compuestos activos pueden ser preparados con portadores gue protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, en los que se incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etileno, acetato de vinilo, polianidres, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son en general conocidos para aquéllos experimentados en el arte. Véase, por ejemplo Sus tained and Controlled Reléase Drug Deli very System , J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, 1978. Las composiciones terapéuticas pueden ser administradas con dispositivos médicos conocidos en el arte. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede ser administrada con dispositivo de inyección hipodérmico, sin agujas, tales como los dispositivos revelados en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,:824 o 4,596,556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: Patente Estadounidense No. 4,487,603, que revela una bomba de microinfusión implantable para surtir medicación a una velocidad controlada; Patente Estadounidense No. 4,486,194, que revela un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente Estadounidense No. 4,447,233, que revela una bomba de infusión de medicación para administrar medicación a una velocidad de infusión precisa; Patente Estadounidense No. 4,447,224, que revela un aparato de infusión implantable de flujo variable para administración de fármaco continua. Patente Estadounidense No. 4,439,196, que revela un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de multicámaras y Patente Estadounidense No. 4,475,196, que revela un sistema de administración de fármaco osmótico. Estas pantentes son incorporadas en la presente por referencia. Muchos de otros de tales implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos para aquéllos experimentados en el arte. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden ser formulados para asegurar la distribución ín vivo apropiada. Por ejemplo, la barrera de sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), pueden ser formulados, por ejemplo en liposomas. Para métodos de manufactura de liposomas, véase, por ejemplo Patentes Estadounidenses Nos. 4,522,811; 5,374,548 y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones que son transportadas selectivamente a células u órganos específicos, mejoran así la administración de fármaco apuntada (véase por ejemplo V.V.Ranade (1989) J. Cl in . Pharmacol . 29;: 685).

Porciones de apuntamiento ejemplares incluyen foliato o biotma (véase, por ejemplo Patente Estadounidense ,416,016 expedida a Low et al.); manósidos (Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038) ; anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 35 :140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agentes Chemother. 39 :180) ; receptor de proteina A surfactante (Briscoe et al. (1995) Am. J.

Physiol. 1233:134) ; pl20 (Schreier et aJ . (1944) J. Biol.

Chem. 269 :9090) ; véase también K. Ke anen ; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346 :123 ; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods A.213.

Usos y Métodos de la Invención Los anticuerpos, composiciones de anticuerpo y métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades í-n vitro e m vivo en las que se involucran, por ejemplo, detección de PD-1 o mejora de respuesta inmune mediante el bloqueo de PD-1. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanos. Por ejemplo, estas moléculas pueden ser administradas a células en cultivo, ín vitro o ex vivo o a sujetos humanos, por ejemplo, m vivo, para mejorar la inmunidad en una variedad de situaciones. Asi, en un aspecto, la invención proporciona un método para modificar una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de la invención, de tal manera que se modifica la respuesta inmune en el sujeto. Preferiblemente, la respuesta es mejorada, estimulada o regulada ascendentemente. Como se usa en la presente, el término "sujeto" se propone incluir animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles, aunque los mamíferos son preferidos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos en necesidad de mejora de una respuesta inmune. Los métodos son particularmente apropiados para el tratamiento de pacientes humanos que tienen una alteración que puede ser tratada al aumentar la respuesta inmune moderada por célula T. En una modalidad particular, los métodos son particularmente apropiados para el tratamiento de células de cáncer in vivo . Para obtener la mejora de inmunidad específica de antígeno, los anticuerpos anti-PD-1 pueden ser administrados junto con un antígeno de interés. Cuando los anticuerpos a PD-1 son administrados junto con otro agentes, los dos pueden ser administrados ya sea en uno u otro orden o simultáneamente. La invención proporciona además métodos para detectar la presencia de antígeno de PD-1 humano en una muestra o medir la cantidad de antígeno de PD-1 humano, que comprende poner en contacto la muestra y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza específicamente a PD-1 humano, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y PD-1 humano. Luego la formación de un complejo es detectada, en donde una diferencia de formación de complejo entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicadora de la presencia de antigeno de PD-1 humano en la muestra . Dado el enlace específico de los anticuerpos de la invención por PD-1, en comparación con CD28, ICOS y CTLA-4, los anticuerpos de la invención pueden ser usados para detectar específicamente la expresión de PD-1 sobre la superficie de células y además, puede ser usado para purificar PD-1 via purificación de inmunoafinidad.

Cáncer El bloqueo de PD-1 por anticuerpos puede mejorar la respuesta inmune a células cancerosas en el paciente. El ligando para PD-1, PD-Ll, no es expresado en células humanas normales, pero es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong et a l . (2002) Nat Med 8:787-9) . La interacción entre PD-1 y PD-Ll da como resultado una dimensión que infiltra linfocitos, una disminución en proliferación moderada por receptor de célula T y evasión inmune por las células cancerosas (Dong et al . (2003) J Mol Med 8J1: 281-7; Blank et al . (2005) Cáncer Immunol . Immunother. 5_4: 307-314 ; Konishi et al . (2004) Clin . Cáncer Res . 10:5094-100). La supresión inmune puede ser invertida al inhibir la interacción local de PD-1 a PD-Ll y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 a PD-L2 es bloqueada también (Iwai et al . (2002) PNAS 99:12293-7 ; Brown et al . (2003) J. Immunol . 170 : 1257-66) . En tanto que estudios previos han demostrado que la proliferación de célula T puede ser restaurada al inhibir la interacción de PD-1 a PD-Ll, no ha habido reportes de un efecto directo sobre el crecimiento de tumor de cáncer in vivo mediante el bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1. En un aspecto, la presente invención es concerniente con el tratamiento de un sujeto in vivo utilizando un anticuerpo anti-PD-1 de tal manera que el crecimiento de tumores cancerosos es inhibido. Un anticuerpo anti-PD-1 puede ser usado solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Alternativamente, un anticuerpo anti-PD-1 puede ser usado en conjunción con otros agentes inmunogénicos, tratamientos de cáncer estándar u otros anticuerpos, como se describe posteriormente en la presente. Asi, en una modalidad, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de células de tumor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-PD-1 o porción de enlace de antígeno del mismo. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-PD-1 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos PD-1 anti-humanos humanos descritos en la presente) . Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-PD-1 quimérico o humanizado . Los cánceres preferidos cuyo crecimiento puede ser inhibido utilizando los anticuerpos de la invención incluyen cánceres comúnmente sensibles a inmunoterapia. Ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastático), cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de célula clara), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata refractario de hormona), cáncer de pecho, cáncer de colon y cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de célula no pequeña) . Adicianal ente, la invención incluye malignidades refractarias o recurrentes cuyo crecimiento puede ser inhibido utilizando los anticuerpos de la invención. Ejemplos de otros cánceres que pueden ser tratados utilizando los métodos de la invención incluyen cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de la cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas en las que se incluyen leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfositica crónica, tumores sólidos de la niñez, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uretra, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS), linfoma de CNS primario, angiogénesis de tumor, tumor de eje espinal, glioma de tallo cerebral, adenoma pituitaria, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de célula escamosa, linfoma de célula T, cánceres inducidos ambientalmente en los que se incluyen aquéllos inducidos por asbestos y combinaciones de los cánceres. La presente invención es también útil para el tratamiento de cánceres metastáticos, especialmente cánceres metastáticos que expresan PD-Ll (Iwai et a l . (2005) In t . Immunol . 11_ :133-144). Opcionalmente, anticuerpos a PD-1 pueden ser combinados con un agente inmunogénico, tales como células cancerosas, antigenos de tumor purificados (en los que se incluyen proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citosinas estimulantes inmunes (He et al (2004) J. Immunol . 173 : 4919-28 ) . Ejemplos no limitantes de vacunas de tumor que pueden ser usadas incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como peptidos de gplOO, antígenos de MAGE, y/o tirosinasa o células de tumor transfectadas para expresar el Trp-2 de citosina (discutido además posteriormente en la presente) . En humanos, se ha mostrado que algunos tumores son inmunogenicos tales como melanomas. Se anticipa que la elevación del umbral de la activación de célula T mediante el bloqueo de PD-1, se puede esperar que active respuestas de tumor en el huésped. Es probable que el bloqueo de PD-1 sea mas efectivo cuando es combinado con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para vacunación contra tumores (véase Rosenbert, S., 2000, Development of Cáncer Vaccines, ASCO Educational Book Spring : 60-62 ; Logothet?s,C. , 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO, Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. and Sznol, M., Cáncer Vaccines, Ch . 61, pp. 3023-3043 ín DeVita, V. et al . (eds.), 1997, Cáncer: Principies and Practiceof Oncology. Fifth Edition). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna utilizando células de tumor autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más efectivas cuando las células de tumor son transducidas para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un activador potente de presentación de antígeno para vacunación de tumor (Dranoff et aJ. (1993) Proc. Na ti . Acad . Sci U. S . A . 90: 3539-43) . El estudio de expresión genética y patrones de expresión genética a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los llamados antígenos específicos de tumor (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10:281-7). En muchos casos, estos antigenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la cual el tumor surgió, por ejemplo antígenos de melanosito gplOO, antígenos de MAGE y Trp-2. Más importantemente, se puede demostrar gue muchos de estos antígenos :., .-. -?^ ' .-<-, '.<? \ <- ' , de células T específicas de tumor encontrados en el huésped. El bloqueo de PD-1 puede ser usado en conjunción con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor con el fin de generar una respuesta inmune a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmune como autoantígenos y son por consiguiente tolerantes a ellas. El antigeno de tumor puede también incluir la proteina de telomerasa que es requerida para la síntesis de telómeros de cromosomas y que es expresado en más del 85% de cánceres humanos y en solamente un número limitados de tejidos somáticos (Kim, N. et al . (1994) Science 266:2011-2013) . (Estos tejidos somáticos pueden ser protegidos de ataque inmune mediante varios medios) . El antigeno de tumor puede también ser "neo-antigenos") expreados en células de cáncer debido a mutaciones somáticas que alteran las secuencias de proteina o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (esto es bcr-abl en el cromosoma de Filadelfia) o idiotipo de tumores de célula B. Otras vacunas de tumor pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como Virus de Papiloma Humano (HPV) , Virus de Hepatitis (HBV y HCV) y virus de Sarcoma de Herpes de Kaposi (KHSV) . Otra forma de antígeno específico de tumor que puede ser usado en conjunción con el bloqueo de PD-1 son proteínas de choque térmico purificadas (HSP) aisladas del tejido de tumor mismo. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células de tumor y estos (HSP) son altamente eficientes en la entrega a células que presentan antígeno para producir inmunidad de tumor (Suot, R & Srivastava, P (1995) Science 2Xó9_ : 1585-1588 ; Tamura, Y. et al. (1997) Science 278:117-120) . , Las células dendríticas (DC) son células que presentan antigeno potentes que pueden ser usadas para cebar respuestas antigeno-especificas . Las DC pueden ser producidas ex vivo y cargadas con varios antigenos de proteina y péptido también como extractos de célula de tumor (Nestle, F. et al . (1998) Na ture Medicine 4:328-332). Las DC pueden también ser transducidas por medios genéticos para expresar estos antígénos de tumor también. Las DC también han sido fusionadas directamente a células de tumor por propósitos de inmunización (Kugler, A. et al . (2000) Na ture Medicine JJ 332-336) . Como método de vacunación, la inmunización de DC puede ser combinada efectivamente con el blogueo de PD-1 para activar respuestas antitumor más potentes. El blogueo de PD-1 puede también ser combinado con tratamientos de cáncer estándar. El bloqueo de PD-1 puede ser combinado efectivamente con regímenes guimioterapéuticos . En esas instancias, puede ser posible reducir la dosis de reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr, M. et al . (1998) Cáncer Research 58:5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es un anticuerpo ant?-PD-1 en combinación con decarbaz a para el tratamiento de melanoma. Otro ejemplo de tal combinación es un anticuerpo ant?-PD-1 en combinación con ?nterleucma-2 (IL-2) para el tratamiento de melanoma. El razonamiento científico detrás del uso combinado de bloqueo de PD-1 y quimioterapia es que la muerte celular, que es consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debe dar como resultado niveles incrementados de antígeno de tumor en la ruta de presentación de antigeno. Otras terapias de combinación que pueden dar como resultado sinergia con el bloqueo de PD-1 por medio de muerte celular son radiación, cirugía y privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antigeno de tumor en el huésped. Inhibidores de angiogénesis pueden también ser combinados con el bloqueo de PD-1. La inhibición de angiogénesis conduce a muerte de célula de tumor que puede alimentar el antígeno de tumor a las rutas de presentación de antígeno del huésped. Los anticuerpos de bloqueo de PD-1 pueden también ser usados en combinación con anticuerpos bisespecíficos que apuntan a células efectoras que expresan receptor Fc alfa o Fc gamma a células de tumor (véanse, por ejempolo Patentes Estadounidenses Nos. 5,922,845 y 5,837,243). Anticuerpos bisespecíficos pueden ser usados para apuntar dos antígenos separados. Por ejemplo, anticuerpos bisespecíficos de receptor anti-Fc/antígeno antitumor (por ejemplo Her-2/neu) han sido usados para apuntar macrófagos a sitios de tumor. Este apuntamiento puede activar más efectivamente respuestas específicas de tumor. El brazo de célula T de estas respuestas sería aumentado mediante el uso de bloqueo de PD-1. Alternativamente, el antígeno puede ser administrado directamente las DC mediante el uso de anticuerpos bisespecificos que se enlazan a antigeno de tumor y un marcador de superficie celular especifico de célula dendrítica . Los tumores evaden la vigilancia inmune huésped mediante una gran variedad de mecanismos. Muchos de éstos mecanismos pueden ser superados mediante la desactivación de proteínas gue son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estas incluyen entre otras ligando TGF-beta (Kehrl, J. et al . (1986) J. Exp . Med. 163: 1037-1050) , IL-10 (Howard, M. & O' Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200), y Fas (Hahne, M. et al (1996) Science 214 : 1363-1365) . Los anticuerpos a cada una de estas entidades pueden ser usados en combinación con anti-PD-1 para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer respuestas inmunes de tumor por el huésped. Otros anticuerpos que pueden ser usados para activar la sensibilidad inmune del huésped pueden ser usados en combinación con anti-PD-1. Estas incluyen moléculas sobre las superficie de células dendríticas que activan la función de DC y presentación de antígeno. Los anticuerpos anti-CD40 son aptos de sustituir efectivamente la actividad auxiliar de célula T (Ridge, J. et al . (1998) Nature 393 :474-478) y pueden ser usados en conjunción con anticuerpos PD-1 (Ito, N. et aJ. (2000) Immunobiology 201(5)527-40). La activación de anticuerpos a moléculas co-estimuladoras de célula T tales como CTLA-4 (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,811,097), OX-40 (We berg, A. et al . (2000) Immunol 164:2160-2169), 4-IBB (Melero, I.et al (1997) Na ture Medicine 3:682-685 (1997) e ICOS (Hutloff, A. et al . (1999) Na ture 397 : 262-266) pueden también proporcionar niveles incrementados de activación de célula T. El transplante de medula osea es usado actualmente para tratar una variedad de tumores de origen hematopoyético. En tanto que la enfermedad de injerto contra huésped es una consecuencia de este tratamiento, se puede obtener beneficio terapéutico de respuestas de injerto contra tumor. El bloqueo de PD-1 puede ser usado para incrementar la efectividad de células T especificas de tumor injertadas al donador. También hay varios protocolos de tratamientos experimentales que involucran la activación ex vivo y expansión de células T específicas de antígeno y transferencia adoptiva de estas células a receptores con el fin de células T específicas de antigeno contra tumor (Greenberg, R & Riddell, S (1999) Science 285:546-51). Estos métodos pueden también ser usados para activar respuestas de célula T a agentes infecciosos tales como CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de anticuerpos ant?-PD-1 incremente la frecuencia de actividad de las células T transferidas adoptivamente.

Enfermedades Infecciosas Otros métodos de la invención son usados para tratar pacientes que han sido expuestos a toxinas o patógenos particulares. Así, otro aspecto de la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-PD-1 o porción de enlace de antígeno del mismo, de tal manera que el sujeto es tratado por la enfermedad infecciosa. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo PD-1 anti-humanó humano (tales como cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 humanos descritos en la presente). Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. Similar a su aplicación a tumores como se discute anteriormente, el bloqueo de PD-1 moderado por anticuerpo puede ser usado solo como adyuvante en combinación con vacunas para estimular la respuesta inmune a patógenos, toxinas y autoantigenos . Ejemplos de patógenos para los cuales este procedimiento terapéutico puede ser particularmente útil incluyen patógenos para los cuales no hay ninguna vacuna actualmente efectiva o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos de completamente efectivas. Estas incluyen pero no están limitadas a HIV, Hepatitis (A, B & C), Influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Estafilococo aureus, Seudomonas Aeruginosa. El bloqueo de PD-1 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como HIV que presentan antigenos alterados en el curso de las infecciones. Estos nuevos epitopos son reconocidos como extraños al tiempo de Ja administración de PD-1 anti-humano, provocando así una respuesta de célula T fuerte que no es amortiguada por las señales negativas por medio de PD-1. Algunos ejemplos de virus patógenos que provocan infecciones tratables mediante los métodos de la invención incluyen HIV, hepatitis (A, B o C) , virus de herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de influenza, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus de coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de paperas, rotavirus, virus de sarampión o cistisercosis, virus de rubéola, parvovirus, virus de vacuna, virus de HTLV, virus de dengue, papilomavirus, virus de molusco, poliovirus, virus de rabia, virus de JC y virus de endefalitis arboviral. Algunos ejemplos de bacterias patógenas gue provocan infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen clamidia, bacteria rickettsia, microbacterias, estafilococos, estreptococos, neumococos, meningococos y conococos, klebsiela, protus, serratia, seudomonas, legionela, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántras, plaga, leptospirosis y bacteria de enfermedad de Lymes. Algunos ejemplos de hongos patógenos que provocan infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen Cándida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococus neoformans, Aspergilus (fumigatus, niger, etc). Genus Mucomoralse (mucor, absidia, rizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidiodes brasiliensis, Coccidioides immitis y Histoplasma capsulatum. Algunos ejemplos de parásitos patógenos que provocan infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen Enta oeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri , Acanthamoeba sp . , Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi y Nippostrongylus brasiliensis . En todos los métodos anteriores, el bloqueo de PD-1 puede ' ser combinado con otras formas de inmunoterapia tal como tratamiento de citocina (por ejemplo, interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpo bisespecífica , que proporciona la presentación mejorada de antígeno de tumor (véase, por ejemplo Holliger (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).

Reacciones autoinmunes Los anticuerpos anti-PD-1 pueden provocar y amplificar respuestas autoinmunes. Por supuesto, la inducción de respuestas antitumor utilizando células de tumor y vacunas de péptido revela que muchas respuestas antitumor involucran anti-autoreactividades (despigmentación observada en melanoma de B16 anti-CTLA-4+GM-CSF-modificado en van Elsas et al . supra; despigmentación en ratones vacunados con Trp-2 (Overwijk, W. et a l . (1999) Proc . Na ti . Acad. Sci . U. S . A . 9_6: 2982-2987 ) ; prostatitis autoinmune evocada por vacunas de célula de tumor TRAMP (Hurwitz, A. (2000) supra ) , vacunación de antígeno de péptido de melanoma y vitilago observado en pruebas clínicas humanas (Rosenberg, SA and White, DE (1996) J. Immuno ther Empha sis Tumor Immunol JJ) ( 1 ) :81-4) . Por consiguiente, es posible considerar usar blogueo anti-PD-1 en conjunción con varias autoproteínas con el fin de idear protocolos de vacunación para generar eficientemente respuestas inmunes contra estas autoproteínas para tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimers involucra acumulación inapropiada de péptido Aß en depósitos amiloides en el cerebro; respuestas de anticuerpo contra amiloide son aptas de despejar estos depósitos amiloides (Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177) . Otras autoproteínas pueden también ser usadas como objetivos tales como IgE para el tratamiento de alergia y asma y TNFa para artritis reumatoide. Finalmente, respuestas de anticuerpo a varias hormonas pueden ser inducidas mediante el uso de anticuerpo anti-PD-1. Respuestas de anticuerpo neutralizantes a hormonas reproductoras pueden ser usadas para la anticoncepción. La respuesta de anticuerpo neutralizante a hormonas y otros factores solubles que son requeridos para el crecimiento de tumores particulares pueden también ser considerados como objetivos de vacunación posibles. Se pueden usar métodos análogos como se describe anteriormente para el uso de anticuerpo anti-PD-1 para inducción de respuestas autoinmunes terapéuticas para tratar pacientes que tienen acumulación inapropiada de otros autoantígenos, tales como depósitos de amiloide, en los que se incluyen Aß en enfermedad de Alzheimer, citosinas tales como TNFa, e IgE.

Vacunas Los anticuerpos anti-PD-1 pueden ser usados para estimular respuestas inmune especificas de antígeno mediante coadmínistración de un anticuerpo anti-PD-1 con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna) . Asi, en otro aspecto, la invención proporciona un método para mejorar una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, que comprende administrar al sujeto: (i) el antígeno y(ii) un anticuerpo anti-PD-1 o porción de enlace de antígeno del mismo, de tal manera que se mejora una respuesta inmune al antigeno en el sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo PD-1 anti-humano humano (tales como cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 humanos descritos en la presente). Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno de tumor, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Ejemplos no limitantes de tales antígenos incluyen aquéllos discutidos en las secciones anteriores, tales como los antígenos de tumor (o vacunas de tumor) discutidos anteriormente o antígenos de los virus, bacterias y otros patógenos descritos anteriormente. Rutas de administración apropiadas de las composiciones de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y bisespecíficas e inmunoconjugados) de la invención in vivo e in vi tro son bien conocidas en el arte y pueden ser seleccionadas por aquéllos de habilidad ordinaria. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpo pueden ser administradas mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosificaciones apropiadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpo . Como se describe previamente, los anticuerpos anti-PD-1 humanos de la invención pueden ser co-administrados con uno u otros más agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede ser enlazado al agente (como un inmunocomplejo) o puede ser administrado separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo puede ser administrado antes, después o concurrentemente con el agente o puede ser co-administrado con otras terapias conocidas, por ejemplo una terapia anticáncer, por ejemplo radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes anti-neoplásicos, tales como doxorubicina, (adriamicina), bleomicin sulfato de cisplatina, carmustina, clorambucilo, decarbacina y ciclofosomida hidroxiurea que, por sí mismos, son solamente efectivos a niveles que son tóxicos o subtóxicos a un paciente. Cisplatina es administrada intravenosamente como una dosis de 100 mg/dosis cada 4 semanas y adriamicina es administrada intravenosamente como Una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 dias. La coadministración de los anticuerpos anti-PD-1 humanos o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, de la presente invención, con agentes guimioterapéuticos proporciona dos agentes anticáncer que operan via mecanismos diferentes gue producen un efecto citotóxico a las células de tumor humanas. Tal co-administración puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células de tumor que las volvería no reactivas con el anticuerpo. También dentro del alcance de la presente invención se encuentran equipos que comprenden las composiciones de anticuerpos de la invención (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas bisespecíficas o multiespecíficas o inmunoconjugados) e instrucciones para uso. El eguipo puede contener además por lo menos un reactivo adicional o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene actividad complementaria que se enlaza a un epítopo en el antígeno de PD-1 distinto del primer anticuerpo humano) . Los equipos incluyen comúnmente una etiqueta que indica el uso propuesto del contenido del equipo. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado suministrado sobre o con el equipo o que de otra manera acompaña el equipo.

Terapia de combinación La presente invención está basada, en parte, en los siguientes datos experimentales. Modelos de tumor de ratón (cáncex de colon MC38 y fibrosarcoma SAl/N) fueron usados para examinar el efecto in vivo del tratamiento de un tumor al combinar anticuerpos terapéuticos inmunoestimulatorios-anti-CTLA-4 y anti-PD-1. La combinación inmunoterapéutica fue proporcionada ya sea simultáneamente con el implante de células de tumor (ejemplos 14 y 17) o después que las células de tumor fueron implantadas por un tiempo suficiente para convertirse en un tumor establecido (ejemplos 15, 16 y 18). Sin consideración de la temporización del tratamiento de anticuerpo, se encontró que el tratamiento de anticuerpo anti-CTLA-4 solo y anticuerpo anti-PD-1 (anticuerpo quimérico en el cual un PD-1 anti-ratón de rata fue modificado con una región Fc de inmunoglobulina de ratón, véase ejemplo 1) tratamiento solo tuvo un efecto moderado sobre la reducción del crecimiento de tumor en el modelo de tumor de MC38 (véanse, por ejemplo figuras 21, 24 y 27). El anticuerpo anti-CTLA-4 solo fue bastante efectivo en el modelo de tumor de SAl/N (véase figura 30D) , que requirió una dosis de anticuerpo anti-CTLA-4 más baja para los estudios de combinación en este modelo. No obstante, el tratamiento de combinación del anticuerpo anti-CTLA-4 y el anticuerpo anti-PD-1 mostró un efecto inesperado significativamente mayor en la reducción del crecimiento de tumor en comparación con el tratamiento ya sea con uno u otro anticuerpo solo (véanse, por ejemplo figuras 21D, 24D, 30F y 33H-J) . Además, los resultados de los ejemplos 14, 16 y 18 muestran que el tratamiento de combinación del anticuerpo anti-CTLA-4 y el anticuerpo anti-PD-1 tuvo un efecto significativo (sinergístico) sobre el crecimiento del tumor aún a dosis terapéuticas subóptimas en comparación con el tratamiento ya sea con uno u otro anticuerpo solo (esto es, la terapia de combinación fue sorprendentemente más efectiva a dosis subterapéuticas que ya sea una u otra monoterapia). Sin desear estar limitados por la teoría, es posible que al elevar el umbral de activación de célula T mediante el bloqueo de PD-1 y CTLA-4, las respuestas antitumor puedan ser activadas en un huésped. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa , que comprende administrar un anticuerpo PD-1 y un anticuerpo CTLA-4 a un sujeto. En modalidades adicionales, el anticuerpo anti-PD-1 es administrado a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado a una dosis subterapéutica o ambos son administrados a una dosis subterapéutica. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para alterar un evento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar un anticuerpo anti-PD-1 y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4 a un sujeto. En cierta's modalidades, el sujeto es humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CTLA-4 es el anticuerpo monoclonal de secuencia humana 10D1 y el anticuerpo anti-PD-1 es el anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 4A11. Anticuerpos monoclonales de secuencia humana 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 4A11 han sido aislados y caracterizados estructuralmente, como se describe en la Patente Estadounidense provisional No. 60/679,466. El anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpos monoclonales anti-PD-1 (mAbs) y los anticuerpos de secuencia humana de la invención pueden ser producidos mediante una variedad de técnicas, en las que se incluyen metodologías de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridización de célula somática estándar de Kohier y Milstein (1975) Na ture 256 : 495. Cualquier técnica para producir anticuerpo monoclonal puede ser usada, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema de animal para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Protocolos y técnicas de inmunización para aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en el arte. Los socios de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión son también conocidos (véase, por ejemplo Harlow and Lañe (1988) An tibodies , A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York) . Los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención se pueden enlazar a un epitopo sobre CTLA-4 humano para inhibir que CTLA-4 interactúe con un contrareceptor de B7 humano. Debido a que la interacción del CTLA-4 humano con B7 humano transduce una señal que conduce a la desactivación de células T que llevan el receptor CTLA-4 humano, el antagonismo de la interacción induce, aumenta o prolonga efectivamente la activación de células T que llevan el receptor CTLA-4 humano, prolongando mediante esto o aumentando una respuesta inmune. Anticuerpos anti-CTLA-4 son descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,811,097; 5,855,887; 6,051,227; en la Publicación de solicitud de PCT Nos. WO 01/14424 y WO 00/37504; y en la Publicación de Patente Estadounidense No. 2002/0039581. Cada una de estas referencias es incorporada específicamente por referencia en la presente por propósitos de descripción de anticuerpos anti-CTLA-4. Un anticuerpo anti-CTLA-4 clínico ejemplar es el anticuerpo monclonal humano 10D1 tal como es revelado en WO 01/14424 y en la solicitud de Patente Estadounidense No. 09/644,668. El anticuerpo 10D1 ha sido administrado en una sola dosis y múltiples dosis, sólo o en combinación con una vacuna, quimioterapia o interleucina-2 a más de 500 pacientes diagnosticados con melanoma metastático, cáncer de próstata, linfoma, cáncer de célula renal, cáncer de pecho, cáncer de ovarios y HIV. Otros anticuerpos anti-CTLA-4 abarcados por los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, aquéllos revelados en WO 98/42752; WO 00/37504; Patente Estadounidense No. 6,207,156; Hurwitz et al . (1998) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 95 ( 17 ): 10067-10071 ; Camacho et al . (2004) J. Clin . Oncology 22(145) : Abstract No. 2505 (anticuerpo CP-675206); y Mokyr et al . (1998) Cáncer Res . 5_8: 5301-5304. En ciertas modalidades, los métodos de la presente invención comprenden el uso de un anticuerpo anti-CTLA-4 que es un anticuerpo de secuencia humana, preferiblemente un anticuerpo monoclonal y en otra modalidad, es el anticuerpo monoclonal 10D1. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CTLA-4 se enlaza a CTLA-4 humano con una KD de 5 x 10"8 M o menor, se enlaza a CTLA-4 humano con una KD de 1 x 10~8 M o menor, se enlaza a CTLA-4 humano con una KD de 5 x 10"9 M o menor o se enlaza a CTLA-4 humano con una KD de entre 1 x 10"8 M y 1 x 10"10 M o menor. La combinación de anticuerpos es útil para la mejora de una respuesta inmune contra una enfermedad hiperproliferativa mediante el bloqueo de PD-1 y CTLA-4. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanos. Por ejemplo, estas moléculas pueden ser administradas a células en cultivo, in vi tro o ex vivo o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar la inmunidad en una variedad de situaciones. Así, én un aspecto, la invención proporciona un método para modificar una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una combinación de anticuerpos o una combinación de porciones de enlace de antígeno del mismo de la invención, de tal manera que se modifica la respuesta inmune en el sujeto. Preferiblemente, la respuesta es mejorada, estimulada o regulada ascendentemente. En otra modalidad, la presente revelación proporciona un método para alterar eventos adversos asociados con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente terapéutico inmunoestimulatorio, que comprende administrar un anticuerpo anti-PD-1 y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4 a un sujeto. El bloqueo de anticuerpos PD-1 y CTLA-4 puede mejorar la respuesta inmune a células cancerosas en el paciente. Cánceres cuyo crecimiento puede ser inhibido utilizando los anticuerpos de la presente revelación incluyen cánceres comúnmente sensibles a inmunoterapia. Ejemplos representativos de cánceres para tratamiento con la terapia de combinación de la presente revelación incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastático), cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de pecho, cáncer de colon y cáncer de pulmón. Ejemplos de otros cánceres que pueden ser tratados utilizando los métodos de la presente revelación incluyen cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o infraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de la cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas en las que se incluyen leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de niñez, linfoma linfocitico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uretra, carcinoma del pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS), linfoma de CNS primario, angiogénesis de tumor, tumor de eje espinal, glioma de tallo cerebral, adenoma pituitaria, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de célula escamosa, linfoma de célula T, cánceres inducidos ambientalmente en los que se incluyen aquéllos inducidos por asbestos y combinaciones de los cánceres. La presente invención es también útil para el tratamiento de cánceres metastáticos. En ciertas modalidades, la combinación de anticuerpos terapéuticos discutidos en la presente puede ser administrada concurrentemente como una sola composición en un portador aceptable farmacéuticamente o concurrentemente como composiciones separadas con cada anticuerpo en un portador aceptable farmacéuticamente. En otra modalidad, la combinación de anticuerpos terapéuticos puede ser administrada secuencialmente . Por ejemplo, un anticuerpo ant?-CTLA-4 y un anticuerpo ant?-PD-1 pueden ser administrados secuencialmente, tal como ant?-CTLA-4 siendo administrado primero y ant?-PD-1 en segundo lugar o ant?-PD-1 siendo administrado primero y ant?-CTLA-4 en segundo lugar. Ademas, si se administra mas de una dosis de la terapia de combinación secuencialmente, el orden de la administración secuencial puede ser invertido o mantenido en el mismo orden en cada punto en el tiempo de administración, administraciones secuenciales pueden ser combinadas con administraciones concurrentes o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la primera administración de un anticuerpo ant?-CTLA-4 y anticuerpo ant?-PD-1 combinado puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con ant?-CTLA-4 primero y ant?-PD-1 en segundo lugar y la tercera administración puede ser secuencial con ant?-PD-1 primero y ant?-CTLA-4 en segundo lugar, etc. Otro esquema de dosificación representativo puede involucrar una primera administración que es secuencial con el ant?-PD-1 primero y ant?-CTLA-4 en segundo lugar y las administraciones subsecuentes pueden ser concurrentes. Opcionalmente, la combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 puede ser combinada adicionalmente con un agente inmunógeno, tales como células cancerosas, antigenos de tumor purificados (en los que se incluyen proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas estimulantes inmunes (He et al . (2004) J. Immunol . 173 : 4919-28) . Ejemplos no limitantes de vacunas de tumor que pueden ser usadas incluyen péptidos de antigenos de melanoma, tales como péptidos de gplOO, antigenos de MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa o células de tumor transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (discutida adicionalmente posteriormente en la presente) . Un bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado puede ser combinado adicionalmente con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S. (2000) Development of Cáncer Vaccines, ASCO Educational Book Spring; 60-62 Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302 Khayat, D. (2000) ASCO Educational Book Spring: 414-428 Foon, K. (2000) ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo and Sznol, Cáncer Vaccines, Ch . 61, pp . 3023-3043 en DeVita et ai. (eds.), 1997, Cáncer: Principies and Practice of Oncology. Fifth Edition) . En una de estas estrategias, se prepara una vacuna utilizando células de tumor autólogas o alogénicas. Se ha mostrado que estas vacunas celulares son mas efectivas cuando las células de tumor son transducidas para expresar GM-CSF. GM-CSF ha mostrado ser un activador potente de presentación de antígeno para vacunación de tumor (Dranoff et al . (1993) Proc . Na ti . Acad . Sci U. S . A . SMD : 3539-43 ) . El estudio de expresión genética y patrones de expresión genética a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los llamados antígenos específicos de tumor (Rosenbert (1999) Immunity 10:281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la cual el tumor surgió, por ejemplo antígenos de melanosito gplOO, antígenos MAGE y Trp-2. Más importantemente, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son los objetivos de células T específicas de tumor encontradas en el huésped. En ciertas modalidades, un bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado utilizando las composiciones de anticuerpo descritas en la presente puede ser usado en conjunción con una colección de proteínas recombmantes y/o péptidos expresados en un tumor con el fin de generar una respuesta inmune a estas proteínas. Estas proteínas son vistas normalmente por el sistema inmune como autoantígenos y son por consiguiente tolerantes a ellos. El antígeno de tumor puede también incluir la proteína telomerasa, que es requerida para la sintesis de telómeros de cromosomas y que es expresada en más del 85% de cánceres humanos y en solamente un número limitado de tejidos somáticos (Kim et ai. (1994) Science 266:2011-2013). (Estos tejidos somáticos pueden ser protegidos de ataque inmune mediante varios medios) . El antigeno de tumor puede también ser "neo-antígenos" expresados en células de cáncer debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteína o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (esto es, bcr-abl en el cromosoma de Filadelfia) o idiotipo de tumores de célula B. Otras vacunas de tumor pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus de papiloma humano (HPV) , Virus de Hepatitis (HBV y HCV) y Virus de Sarcoma de Kaposi (KHSV) . Otra forma de antígeno específico de tumor que puede ser usado en conjunción con el bloqueo de PD-1 son proteínas de choque térmico purificadas (HSP) aisladas del tejido de tumor mismo. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células de tumor y estas HSP son altamente eficientes en la entrega a células que presentan antigeno para producir inmunidad al tumor (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al . (1997) Science 278:117-120) . Las células dendríticas (DC) son células gue presentan antígeno potentes que pueden ser usadas para cebar respuestas específicas de antígeno. Las DC pueden ser producidas ex vivo y cargadas con varios antígenos de proteína y péptido también como extractos de célula de tumor (Nestle et al . (1998) Na ture Medicine 4:328-332). Las DC pueden también ser transducidas por medios genéticos para expresar estos antígenos de tumor también. Las DC también han sido fusionadas directamente a células de tumor por propósitos de inmunización (Kugler et ai. (2000) Na ture Medicine 6 : 332-336). Como método de vacunación, la inmunización de DC puede ser combinada adicional efectivamente con un blogueo de PD-1 y CTLA-4 combinado para activar respuestas antitumor más potentes. Un bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado puede también ser combinado adicionalmente con tratamientos de cáncer estándar. Por ejemplo, un bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado puede ser combinado efectivamente con regímenes quimioterapéuticos. En estas instancias, como se observa con la combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4, puede ser posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente revelación (Mokyr et al . (1998) Cáncer Research 5_8: 5301-530 ) . Un ejemplo de tal combinación es una combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 además en combinación con decarbazina para el tratamiento de melanoma.

Otro ejemplo es una combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 además en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento de melanoma. El razonamiento científico detrás del uso combinado de bloqueo de PD-1 y CTLA-4 con quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, daría como resultado niveles incrementados de antígeno de tumor en la ruta de presentación de antígeno. Otras terapias de combinación que pueden dar como resultado sinergia con un bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado por medio de la muerte celular incluyen radiación, cirugía o privación de hormona. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno de tumor en el huésped. Los inhibidores de angiogénesis pueden también ser combinados con un bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado. La inhibición de angiogénesis conduce a muerte de célula de tumor, que puede también ser una fuente de antígeno de tumor para ser alimentado a rutas de presentación de antígeno huésped. Una combinación de anticuerpos de blogueo de PD-1 y CTLA-4 puede también ser usada en combinación con anticuerpos bisespecíficos gue apuntan a células efectoras gue expresan receptor Fca o FCY a células de tumor (véanse, por ejemplo Patentes Estadounidenses Nos. 5,922,845 y 5,837,243). Anticuerpos bisespecificos pueden ser usados para apuntar dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado anticuerpos bisespecíficos de receptor anti-Fc/antígeno antitumor (por ejemplo Her-2/neu) para apuntar macrófagos a sitios de tumor. Este apuntamiento puede activar más efectivamente respuestas específicas de tumor. El brazo de célula T de estas respuestas sería aumentado mediante el uso de un bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado. Alternativamente, el antígeno puede ser alimentado directamente a las DC mediante el uso de anticuerpos bisespecíficos gue se enlazan al antígeno de tumor y un marcador de superficie celular especifico de célula dendritica. En otro ejemplo, se puede usar una combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 en conjunción con anticuerpos antineoplásicos, tales como Rituxan© (rituximab), Herceptin© (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab), Zevalin® ( ibritumomab) , Campath® (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab) , Avastin® (bevacizumab) , y Tarceva® (erlotinib) y los semejantes. A manera de ejemplo y no deseando estar limitados por la teoria, el tratamiento con un anticuerpo anticáncer o un anticuerpo anticáncer conjugado a una toxina puede conducir a muerte de célula de cáncer (por ejemplo, células de tumor) que potenciarla una respuesta inmune moderada por CTLA-4 o PD-1. En una modalidad ejemplar, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor de cáncer) puede incluir un anticuerpo anticáncer en combinación con anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 concurrente o secuencialmente o cualquier combinación de los mismos, que puede potenciar respuestas inmune antitumor por el huésped. Los tumores evaden la vigilancia inmune huésped mediante una gran variedad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la desactivación de proteínas, que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estas incluyen, entre otras, ligando TGF-ß (Kehrl, J. et al . (1986) J. Exp . Med. 163:1037-1050), IL-10 (Howard, M. & O' Garra, A. (1992) Immunology Today 13:198- 200), y Fas (Hahne, M. et al . (1996) Science 274: 1363-1365) .

En otro ejemplo, los anticuerpos a cada una de estas entidades pueden ser combinados adicionalmente con una combinación de anti-PD-1 y anti-CTLA-4 para contrarrestar los efectos de agentes inmunosupresores y favorecer respuestas inmune antitumor por el huésped. Otros anticuerpos que pueden ser usados para activar sensibilidad inmune del huésped pueden ser usados adicionalmente en combinación con una combinación de anti-PD-1 y anti-CTLA- . Estos incluyen moléculas sobre la superficie de células dendriticas que activan la función de DC y presentación de antígeno. Los anticuerpos anti-CD40 son aptos de sustituir efectivamente por actividad auxiliar de célula T (Ridge, J. et al . (1998) Nature 393:474-478) y pueden ser usados' en conjunción con una combinación de anti-PD-1 y anti-CTLA-4 (Ito, N. et al . (2000) Immunobiology 201 ( 5) 527-40) . La activación de anticuerpos a moléculas co-estimuladoras de células T, tales como OX-40 (Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164:2160-2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3:682-685(1997), e ICOS (Hutloff, A. et al. (1999) Nature 397:262-266) puede también proporcionar niveles incrementados de activación de célula T. El transplante de médula ósea es usado actualmente para tratar una variedad de tumores de origen hematopoyético. En tanto la enfermedad de injerto contra huésped es una consecuencia de este tratamiento, se puede obtener beneficio terapéutico de respuestas de injerto contra tumor. Un bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado puede ser usado para incrementar la efectividad de células T específicas de tumor injertadas a donador. También hay varios protocolos de tratamiento experimentales que involucran la activación ex vivo y expansión de células T específicas de antígeno y transferencia adoptable de estas células a receptores con el fin de células T específicas de antígeno contra tumor (Greenberg, R & Riddell, S. (1999) Science 285:546-51) . Estos métodos pueden también ser usados para activar respuestas de célula T a agentes infecciosos tales como CMV. La activación ex vivo en presencia de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 se puede esperar que incremente la frecuencia y actividad de las células T transferidas adoptablemente. Como se resume en la presente, los órganos pueden exhibir eventos adversos mmune-relacionados enseguida de la terapia de anticuerpo terapéutica mmunoestimuladora, tal como el sistema Gl (diarrea y colitis) y la piel (erupción y pruritis) después del tratamiento con anticuerpo ant?-CTLA-4. Por ejemplo, también se han observado eventos adversos inmune relacionados gastrointestinales no colónicos en el esófago (esofaguitis ) , duodeno (duodenitis) e 1I10 (íleitis) después del tratamiento de anticuerpo ant?-CTLA-4. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para alterar un evento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, gue comprende administrar un anticuerpo ant?-PD-1 y una dosis subterapéutica de anticuerpo ant?-CTLA-4 a un sujeto. Por ejemplo, los métodos de la presente invención proporcionan un método para producir la incidencia de colitis o diarrea inducidas por anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Debido a gue cualquier paciente que reciba un anticuerpo terapéutico munoestimulador está en riesgo de desarrollar colitis o diarrea inducidos por tal anticuerpo, toda esta población de pacientes es apropiada para terapia de acuerdo con los métodos de la presente invención. Aunque se han administrado esferoides para tratar enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) e impedir exacerbaciones de IBD, no se han usado para impedir (disminuir la incidencia de) IBD en pacientes que no han sido diagnosticados con IBD. Los efectos secundarios significativos asociados con esteroides, aun esteroides no absorbibles, han desalentado el uso profiláctico. En modalidades adicionales, una combinación de bloqueo de PD-1 y CTLA-4 (esto es, anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores anti-PD-1 y anti-CTLA-4) puede ser combinada adicionalmente con el uso de cualquier esteroide no absorbible. Como se usa en la presente, un "esteroide no absorbible" es un glucocorticoide que exhibe metabolismo de primer paso extenso, de tal manera que, enseguida del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, esto es, menos de alrededor del 20%. En una modalidad de la invención, el esteroide no absorbible es budenoside. El budenoside es un glucocorticosteroide de acción local, que es metabolizado extensamente principalmente por el hígado, enseguida de la administración oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) es una formulación oral dependiente del pH y el tiempo de budenoside desarrollado para optimizar la administración de fármaco al ilio y en todo el colon. ENTOCORT EC® está aprobado en los Estados Unidos de América para el tratamiento de enfermedad de Crohn suave a moderada gue involucra el ilio y/o colon ascendente. La dosificación oral usual de ENTOCORT EC® para el tratamiento de enfermedad de Crohn es 6 a 9 mg/día. ENTOCORT EC® es liberado en los intestinos, antes de ser absorbido y retenido en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido objetivo de mucosa intestinal, ENTOCORT EC® es metabolizado extensamente por el sistema de citocromo P450 en el hígado a metabolitos con actividad de glucocorticoide despreciable. Por consiguiente, la biodisponibilidad es baja (aproximadamente 10%) . La baja biodisponibilidad de budenoside da como resultado una proporción terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides con metabolismo de primer paso menos extenso. El budenoside da como resultado menos efectos adversos en los que se incluyen menos supresión hipotalámica-pituitaria que los corticosteroides de acción sistémica. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT EC® puede dar como resultado efectos de glucocorticoides sistémicos tales como hipercorticismo y supresión adrenal. Véase PDR 58th ed. 2004; 608-610. En todavía modalidades adicionales, una combinación de bloqueo de PD-1 y CTLA-4 (esto es, anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores anti-PD-1 y anti-CTLA-4) en conjunción con un esteroide no absorbible puede ser combinado adiciónalmente con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA tales como, por ejemplo: sufasalacina (AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); olsalacina (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn) ; balsalacida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.) y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA© , Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay). De acuerdo con los métodos de la presente invención, un salicilato administrado en combinación con anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 y un esteroide no absorbible pueden incluir cualquier superposición o administración secuencial del salicilato y el esteroide no absorbible por el propósito de disminuir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores. Así, por ejemplo, los métodos para reducir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores de acuerdo con la presente invención abarca administrar un salicilato y un no absorbible concurrente o secuencialmente (por ejemplo, un salicilato es administrado 6 horas después de un esteroide no absorbible) o cualquier combinación de los mismos. Además, de acuerdo con la presente invención, un salicilato y un esteroide no absorbible pueden ser administrados por la misma ruta (por ejemplo, ambos son administrados oralmente) o por diferentes rutas (por ejemplo, un salicilato es administrado oralmente y un esteroide no absorbible es administrado rectalmente) , que puede diferir de la(s) ruta(s) usada (s) para administrar los anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4. La presente invención es ilustrada adicionalmente por los siguientes ejemplos que no deben ser interpretados como limitantes. El contenido de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas en toda esta solicitud son incorporados expresamente en la presente por referencia.

Ejemplos E emplo 1 : Generación de Anticuerpos Monoclonales Humanos contra PD-1 Antígeno Los protocolos de inmunización utilizados como antígeno tanto (i) una proteína de fusión recombinante gue comprende la posición extracelular de PD-1 y (ii) PD-1 de plena longitud enlazado a membrana. Ambos antigenos fueron generados mediante métodos de transfección recombinantes a una línea de célula CHO.

Ratones transgénicos HuMab y KM™ Anticuerpos monoclonales plenamente humanos a PD-1 fueron preparados utilizando la cepa Hco7 de ratones transgénicos HuMab y la cepa KM de ratones transcromosómicos transgénicos, cada uno de los cuales expresa genes de anticuerpo humanos. En cada una de estas cepas de ratón, el gen de cadena ligera kappa de ratón endógeno ha sido sometido a disrupcíón homócigamente como se describe en Chen et al . (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen de cadena pesada de ratón endógeno ha sido sometido a disrupción homócigamente como se describe en el ejemplo 1 de la publicación de PCT WO 01/09187. Cada una de estas cepas de ratón porta un transgen de cadena ligera kappa humano, KCo5, como se describe en Fishwild et al . (1996) Na ture Biotechnology 14:845-851. La cepa Hco7 porta el transgen de cadena pesada humano HCo7 como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,806; 5,625,825 y 5,545,807. La cepa KM contiene el transcromosoma SC20 como se describe en la publicación PCT WO 02/43478.

Inmunizaciones de HuMab y KM Para generar anticuerpos monoclonales plenamente humanos a PD-1, ratones HuMab y ratones KM fueron inmunizados con proteína de fusión de PD-1 recombinante purificada y células de CHO PD-1-transfectadas como antigeno. Esquemas de inmunización generales para ratones HuMab son descritos en Lonberg, N. et al (1994) Na ture 368 ( 6474 ): 856-859; Fishwild, D. et al . (1996) Na ture Biotechnology 14:845-851 y publicación PCT WO 98/24884. Los ratones eran de 6-16 semanas de edad después de la primera infusión de antígeno. Una preparación recombinante purificada (5-50 µg) de antígeno de proteína de fusión PD-1 y 5-10 X 106 fueron usadas para inmunizar los ratones HuMab y ratones KM intraperitoneal, subcutáneamente (Se) o vía inyección del cuarto trasero. Los ratones transgénicos fueron inmunizados dos veces con antígeno en adyuvante de Freund completo o IP adyuvante de Ribi, seguido por 3-21 días IP (hasta un total de 11 inmunizaciones) donde el antigeno en adyuvante de Freund incompleto o adyuvante de Ribi. La respuesta inmune fue monitoreada mediante sangrados retraorbitales . El plasma fue seleccionado mediante ELISA (como se describe anteriormente en la presente) y ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti-PD-1 fueron usados para fusiones. Los ratones fueron reforzados intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y remoción del vaso. Comúnmente, se efectuaron 10-35 fusiones para cada antígeno. Varias docenas de ratones fueron inmunizados por cada antígeno .

Selección de ratones HuMab o KM que producen anticuerpos anti-P'D-1 Para seleccionar ratones HuMab o KM que producen anticuerpos que se enlazan a PD-1, los sueros de ratones inmunizados fueron probados mediante ELISA como se describe por Fishwild, D. et al . (1996) . Brevemente, placas de microtitulo fueron recubiertas con proteína de fusión de PD-1 recombinante purificada de células CHO transfectadas a 1-2 µg/ml en PBS, 100 µg/cavidades incubadas a 4°C durante toda la noche y luego bloqueados con 200 ml/cavidad de suero bovino fetal al 5% en PBS/Tween (0.05%) . Se agregaron diluciones de suero de ratones PD-1-inmunizados a cada cavidad e incubadas durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas con PBS/Tween y luego incubadas con un anticuerpo policlonal de IgG de cabra-antihumano conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas fueron reveladas con sustrato de ABTS (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml) y analizados mediante espectrofotómetro a OD 415-495. Los ratones que desarrollaron los títulos más altos de anticuerpos anti-PD-1 fueron usados para fusiones. Las fusiones fueron efectuadas como se describe posteriormente en la presente y los sobrenatantes de hibridoma fueron probados en cuanto a actividad anti-PD-1 mediante ELISA.

Generación de Hibridomas que producen Anticuerpos Monoclonales Humanos a PD-1 Los esplenocitos de ratón, aislados de ratones HuMab o KM fueron fusionados a una línea celular de mieloma de ratón ya sea utilizando PEG a base de protocolos estándar o electrofusión a base de campo eléctrico utilizando un electroporador de fusión celular de cámara grande de Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD) . Luego los hibridomas resultantes fueron seleccionados para la producción de anticuerpos antigeno-específicos. Suspensiones unicelulares de esplenocitos de ratones inmunizados fueron fusionadas a un cuarto del número de células de mieloma de ratón gue no segregan SP2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50% (Sigma) . Las células fueron depositadas a aproximadamente 1 x 105/cavidad en la placa de microtítulo de fondo plano, seguida por aproximadamente 2 semanas de incubación en medio selectivo que contiene suero bovino fetal al 10%, medio acondicionado con P388D1 al 10% (ATCC, CRL TIB-63) 3-5% de Origen (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con alto contenido de glucosa, L-glutamina y pirovato de sodio) más HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 mg/ml de gentamicina y lxHAT (Sigma, CRL P-7185) . Después de 1-2 semanas, las células fueron cultivadas en un medio en el cual el HAT fue reemplazado con HT . Luego las cavidades individuales fueron seleccionadas mediante ELISA (descrita anteriormente) en cuanto a anticuerpos IgG monoclonales anti-PD-1 humanos. Una vez que ocurrió el crecimiento de hibridoma extenso, el medio fue monitoreado usualmente después de 10-14 días. Los hibridomas que segregan anticuerpos fueron re-depositados, seleccionados otra vez y si todavía son positivos para IgG humano, los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 fueron subclonados por lo menos dos veces mediante dilución limitante. Luego los subclones estables fueron cultivados in vi tro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización adicional . Los clones de hibridoma 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 fueron seleccionados para análisis adicional.

Ejemplo 2: Caracterización estructural de anticuerpos monoclonales humanos 17D8, 2D3, 4H1 , 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 Las secuencias de cADN que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 fueron obtenidas de los hibridomas 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 respectivamente, utilizando técnicas de PCR estándar y fueron secuenciadas utilizando técnicas de secuenciación de ADN estándar. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 17D8 son mostradas en la figura: ÍA y en SEQ ID NO: 57 y 1, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 17D8 son mostradas en la figura IB y en SEQ ID NO: 64 y 8, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 17D8 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea de germinación humanas conocidas -demuestran que la cadena pesada de 17D8 utiliza un segmento de VH de la linea de germinación humana VH 3-33, un segmento D indeterminado y un segmento de JH de la linea de germinación humana JH4b. La alineación de la secuencia de VH de 17D8 con la secuencia de VH 3-33 de línea de germinación es mostrada en la figura 8. El análisis adicional de la secuencia de VH de 17D8 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las figuras ÍA Y 8 en SEQ ID NOs: 15, 22 y 29, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 17D8 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de linea de germinación humanas conocidas demuestra gue la cadena ligera de 17D8 utiliza un segmento de VL de la línea de germinación humana VK L6 y un fragmento JK de la línea de germinación humana JK4. La alineación de la secuencia de VL de 17D8 con la secuencia de VK L6 de línea de germinación es mostrada en la figura 9. El análisis adicional de la secuencia de VL de 17D8 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en IB y 9 y en SEQ ID NOs: 36, 43 y 50, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 2D3 son mostradas en la figura 2A y en SEQ ID NO: 58 y 2, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 2D3 son mostradas en la figura 2B y en SEQ ID NO: 65 y 9, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 2D3 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de linea de germinación humanas conocidas demuestra que la cadena pesada de 2D3 utiliza un segmento de VH de la linea de germinación humana VH 3-33 y un segmento D de la linea de germinación humana 7-27 y un segmento JH de la linea de germinación humana JH4b. La alineación de la secuencia de VH de 2D3 con la secuencia de VH 3-33 de línea de germinación es mostrada en la figura 8. El análisis adicional de la secuencia de VH de 2D3 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 2A y 8 y en SEQ ID NOs: 16, 23 y 30, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 2D3 con las secuencias de cadena ligera de mmunoglobulma de linea de germinación humanas conocidas demuestra gue la cadena ligera de 2D3 utiliza un segmento de VL de la línea de germinación humana VK L6 y un segmento de JK de la línea de germinación humana JK4. La alineación de la secuencia de VL 2D3 con la secuencia de VK de L6 de línea de germinación es mostrada en la figura 9. El análisis adicional de la secuencia de VL de 2D3 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 2B y 9 y en SEQ ID NOs: 37, 44 y 51, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 4H1 son mostradas en la figura 3A y en SEQ ID NO: 59 y 3, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 4H1 son mostradas en la figura 3B y en SEQ ID NO: 66 y 10, respectivamente. La comparación de la secuencia de mmunoglobulina de cadena pesada 4H1 con las secuencias de cadena pesada de mmunoglobulina de línea de germinación humanas conocidas demuestra que la cadena pesada de 4H1 utiliza un segmento de VH de la linea de germinación humana VH 3-33 y un segmento D sin determinar y un segmento JH de la línea de germinación humana JH4b. La alineación de la secuencia de VH de 4H1 con la secuencia de VH 3-33 de línea de germinación es mostrada en la figura 8. El análisis adicional de la secuencia de VH 4H1 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la del eación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 3A y 8 y en SEQ ID NOs: 17, 24 y 31, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 4H1 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea de germinación humanas conocidas demuestra que la cadena ligera de 4H1 utiliza un segmento de VL de la linea de germinación humana VK L6 y un segmento JK de la linea de germinación humana JK 1. La alineación de la secuencia de VL 4H1 con la secuencia de VK L6 de linea de germinación es mostrada en la figura 10. El análisis adicional de la secuencia de VL de 4H1 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 3B y 10 y en SEQ ID NOs: 38, 45 y 52, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 5C4 son mostradas en la figura 4A y en SEQ ID NO: 60 y 4, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 5C4 son mostradas en la figura 4B y en SEQ ID NO: 67 y 11, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 5C4 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de linea de germinación humanas conocidas demuestra que la cadena pesada de 5C4 utiliza un segmento de VH de la linea de germinación humana VH 3-33, un segmento D sin determinar y un segmento JH de la línea de germinación humana JH4b. La alineación de la secuencia de VH 5C4 con la secuencia de VH 3-33 de linea de germinación es mostrada en la figura 8. El análisis adicional de la secuencia de VH de 5C4 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 4A y 8 y en SEQ ID NOs: 18, 25 y 32, respectivamente. La comparación de la secuencia de mmunoglobulina de cadena ligera de 5C4 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea de germinación humanas conocidas demuestra que la cadena ligera de 5C4 utiliza un segmento de VL de la linea de germinación humana VK L6 y un segmento de JK de la linea de germinación humana JK 1. La alineación de la secuencia de VL de 5C4 con la secuencia VK L6 de línea de germinación es mostrada en la figura 10. El análisis adicional de la secuencia de VL de 5C4 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delmeación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 4B y 10 y en SEQ ID NOs: 39, 46 y 53, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 4A11 son mostradas en la figura 5A y en SEQ ID NO: 61 y 5, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 4A11 son mostradas en la figura 5B y en SEQ ID NO: 68 y 12, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 4A11 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea de germinación humanas conocidas demostró que la cadena pesada de 4A11 utiliza un segmento de VH de la línea de germinación humana VH 4-39, un segmento D de la línea de germinación humana 3-9 y un segmento JH de la línea de germinación humana JH 4b. La alineación de la secuencia de VH 4A11 con la secuencia de VH 4-39 de línea de germinación es mostrada en la figura 11. El análisis adicional de la secuencia de VH de 4A11 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 5A y 11 y en SEQ ID NOs: 19, 26 y 33, respectivamente. La comparación de secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 4A11 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de linea de germinación humanas conocidas demostró gue la cadena ligera de 4A11 utiliza un segmento de VL de la línea de germinación humana VK L15 y un segmento de JK de la línea de germinación humana JK 1. La alineación de la secuencia de VL de 4A11 con la secuencia VK L6 de linea de germinación es mostrada en la figura 12. El análisis adicional de la secuencia de VL de 4A11 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 5B y 12 y en SEQ ID NOs: 40, 47 y 54, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 7D3 son mostradas en la figura 7A y en SEQ ID NO: 62 y 6, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 7D3 son mostradas en la figura 7B y en SEQ ID NO: 69 y 13, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 7D3 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de linea de germinación humanas conocidas demostró que la cadena pesada de 7D3 utiliza un segmento de VH de la linea de germinación humana VH 3-33, un segmento D 7-27 de la línea de germinación humana y un segmento JH de la línea de germinación humana JH 4b. La alineación de la secuencia de VH de 7D3 con la secuencia de VH 3-33 de línea de germinación es mostrada en la figura 8. El análisis adicional de la secuencia de VH de 7D3 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 6A y 8 y en SEQ ID NOs: 20, 27 y 34, respectivamente. La comparación de secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 7D3 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea de germinación humanas conocidas demostró que la cadena ligera de 7D3 utiliza un segmento de VL de la línea de germinación humana VK L6 y un segmento de JK de la línea de germinación humana JK 4. La alineación de la secuencia de VL de 7D3 con la secuencia VK L6 de línea de germinación es mostrada en la figura 9. El análisis adicional de la secuencia de VL de 7D3 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delmeación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 6B y 9 y en SEQ ID NOs: 41, 48 y 55, respectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 5F4 son mostradas en la figura 7A y en SEQ ID NO: 63 y 7, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 5F4 son mostradas en la figura 7B y en SEQ ID NO: 70 y 14, respectivamente. La comparación de la secuencia de ínmunoglobulma de cadena pesada de 5F4 con las secuencias de cadena pesada de mmunoglobulma de linea de germinación humanas conocidas demostró que la cadena pesada de 5F4 utiliza un segmento de VH de la línea de germinación humana VH 4-39, un segmento D de la linea de germinación humana 3-9 y un segmento JH de la línea de germinación humana JH 4b. La alineación de la secuencia de VH de 5F4 con la secuencia de VH 4-39 de línea de germinación es mostrada en la figura 11. El análisis adicional de la secuencia de VH de 5F4 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 7A y 11 y en SEQ ID NOs: 21, 28 y 35, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 5F4 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea de germinación humanas conocidas demostró que la cadena ligera de 5F4 utiliza un segmento de VL de la línea de germinación humana VK L 15 y un segmento JK de la- linea de germinación humana JK 1. La alineación de la secuencia de VL de 5F4 con la secuencia VK L6 de linea de germinación es mostrada en la figura 12. El análisis adicional de la secuencia de VL de 5F4 utilizando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 7B y 12 y en SEQ ID NOs: 42, 49 y 56, respectivamente.

Ejemplo 3 : Caracterización de Especificidad de Enlace y Cinética de Enlace de Anticuerpos Monoclonales Humanos Anti-PD-1 En este ejemplo, se examinaron la afinidad de enlace y cinética de enlace de anticuerpos anti-PD-1 mediante análisis de Biacore. La especificidad de enlace y competición cruzada fueron examinadas mediante citometría de flujo.

Afinidad y cinética de enlace Los anticuerpos anti-PD-1 fueron caracterizados en cuanto a afinidades y cinética de enlace mediante análisis de Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suecia) . Proteina de fusión de PD-1 humana recombinante purificada fue enlazada covalentemente a un chip de CM5 (chip recubierto con carboximetil dextrana) vía aminas primarias, utilizando una química de cubrimiento de amina estándar y equipo proporcionado por Biacore. El enlace fue medido al hacer fluir los anticuerpos en solución reguladora de pH de HBS EP (proporcionado por Biacore AB) a una concentración de 267 nM a una velocidad de flujo de 50 µl/min. La cinética de asociación de antígeno-anticuerpo fue seguida por 3 minutos y la cinética de disociación fue seguida por 7 minutos. Las curvas de asociación y disociación fueron ajustadas a un modelo de enlace de Langmuir de 1:1 utilizando elementos de programación de evaluación de Bia (Biacore AB) . Para minimizar los efectos de avidez en la estimación de constantes de enlace, solamente el segmento inicial de datos correspondientes a las fases de asociación y disociación fueron usadas para el ajuste. Los valores de KD, Kon y Koff que fueron determinados son mostrados en la Tabla 2.

Tabla 2. Datos de enlace de Biacore para anticuerpos monoclonales humanos PD-1 Especificidad de enlace mediante citometría de flujo Lineas de célula de ovario de hámster chino (CHO) que expresan PD-1 humano recombinante en la superficie celular fueron desarrolladas y usadas para determinar la especificidad de anticuerpos monoclonales humanos PD-1 mediante citometría de flujo. Células CHO fueron transfectadas con plásmidos de expresión que contienen formas de transmembrana que codifica cADN de plena longitud de PD-1. El enlace de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 5C4 y 4H1 fue determinado al incubar las células transfectadas con los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 a una concentración de 20 µg/ml. Las células fueron lavadas y el enlace fue detectado con un Ab de IgG antihumano FITC-marcado . Los análisis citométricos de flujo fueron efectuados utilizando una citometría de flujo de barrido de FACS (Becton Dickinson, San José, CA) . Los resultados son ilustrados en las figuras 13A (5C4) Y 13B (4H1). Los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 enlazados a las células CHO transfectadas con PD-1 pero no a células CHO que no fueron transfectadas con PD-1 humano. Estos datos demuestran la especificidad de anticuerpos monoclonales humanos anti-PD- 1 por PD-1.

Especificidad de enlace mediante ELISA contra otros miembros de la familia CD28 Se llevó a cabo una comparación del enlace de anticuerpos anti-PD-1 a miembros de la familia de CD28 mediante ELISA estándar utilizando 4 miembros de familia CD28 diferentes para examinar la especificidad de enlace por PD-1. Proteinas de fusión de miembros de familia de CD28, ICOS, CTLA-4 y CD28 (R & D Biosystems) fueron probadas en cuanto a enlace contra los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 4A11. Se efectuaron procedimientos de ELISA estándar. Los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 fueron agregados a una concentración de 20 µg/ml. Anticuerpo policlonal IgG (específico de cadena Kappa) de cabra-antihumano conjuado con peroxídasa de rábano (HRP) fue usado como anticuerpo secundario. Los resultados son mostrados en la figura 14. Cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se enlazaron con alta especificidad a PD-1 pero no a los otros miembros de familia de CD28 E emplo 4 : Caracterización de enlace de anticuerpo anti-PD-1 a PD-1 expresado sobre la superficie de células humanas y de mono Anticuerpos anti-PD-1 fueron probados en cuanto a enlace a células que expresan PD-1 sobre su superficie celular mediante citometría de flujo.

Células T humanas activadas, células mononucleares de sangre periférica de mono (PBMC) y células CHO transfectadas con PD-1 fueron cada una probadas en cuanto a enlace de anticuerpo. Las células T humanas y PBMC de cynomolgus fueron activadas mediante anticuerpo anti-CD3 para inducir la expresión de PD-1 sobre células T antes del enlace con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 humano. El enlace de los anticuerpos monoclonales humanos anti-DP-1 5C4 y 4H1 fue determinado al incubar las células transfectadas ya sea con las formas IgGl o IgG4 de los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 humanos a diferentes concentraciones. Las células fueron lavadas y el enlace fue detectado con un Ab IgG anti-humano FITC-marcado . Los análisis citométricos de flujo fueron efectuados utilizando una citometría de flujo de barrido de FACS (Becton Dickinson, San José, CA) . Los resultados son mostrados en las Figuras 15 A (células T humanas activadas), 15B (PBMC de mono cynomolgous) y 15C (células CHO PD-1-transfectadas). Los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 5C4 y 4H1 se enlazaron a células T humanas activadas, PBMCs de mono activadas y células de CHO transfectadas con PD-1 humano, tal como se mide por la intensidad fluorescente promedio (MFI) del teñido. Estos datos demuestra que los HuMAbs anti-PD-1 se enlazan tanto a PD-1 de superficie celular de humano y de mono cynomolgous.

Ejemplo 5: Efecto de anticuerpos anti-PD-1 humanos sobre la proliferación celular y producción de citocina en una Reacción de Linfocito Mezclada Una reacción de linfocito mezclada fue usada para demostrar el efecto del bloqueo de la ruta de PD-1 a células efectoras de linfocito. Las células T en el análisis fueron probadas en cuanto a proliferación, secreción de IFN-gamma y secreción IL-2 en presencia o ausencia de un anticuerpo HuMAb anti-PD-1. Las células T humanas fueron purificadas de PBMC utilizando una columna de enriquecimiento de célula T CD4+ humano (R&D systems). Cada cultivo contenia 105 células T purificadas y 104 células dendríticas alogeneicas en un volumen total de 200 µl . El anticuerpo monoclonal anti-PD-15C4, 4H1, 17D8, 2D3 o una porción de fragmento de Fab de 5C4 fue agregado a cada cultivo a diferentes concentraciones de anticuerpo. No se utilizó ni anticuerpo ni anticuerpo de control de isotipo como control negativo. Las células fueron cultivadas durante 5 días a 37°C. Después de día 5, se tomaron 100 µl del medio de cada cultivo para medición de citocina. Los niveles de IFN-gamma y otras citocinas fueron medidos utilizando equipos de ELISA ELISA OptEIA (BD Biosciences). Las células fueron marcadas con 3H-timidina, cultivadas por otras 18 horas, y analizadas en cuanto a proliferación celular. Los resultados son mostrados en las Figuras 16A (proliferación de célula T) , 16B (secreción de IFN-?) y 16C (secreción de IL-2). Los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 promovieron la proliferación de célula T, secreción de IFN-gamma y secreción IL-2 de manera dependiente de la concentración. El fragmento 5C4-Fab también promovió la proliferación de célula T, secreción de IFN-gamma y secreción IL-2 de manera dependiente de la concentración. En contraste, las cultivos que contienen el anticuerpo de control de isotipo no mostraron incremento en proliferación de célula T, secreción de IFN-gamma o secreción IL-2.

Ejemplo 6: Bloqueo de enlace de Ligando a PD-1 mediante anticuerpos anti-PD-1 humanos Los HuMAbs Anti-PD-1 fueron probados en cuanto a la habilidad para bloquear el enlace de los ligandos PD-Ll y PD-L2 a PD-1 expresado sobre células CHO transfectadas al utilizar un análisis citometría de flujo. Células CHO que expresan PD-1 fueron suspendidas en solución reguladora del pH de FACS (PBS con suero de becerro fetal al 4%). Se agregaron varias concentraciones de HuMAbs anti-PD-1 5C4 y 4H1 a la suspensión celular e incubadas a 4°C durante 30 minutos. El anticuerpo sin enlazar fue lavado y se agregó ya sea proteina de fusión PD-Ll FITC-marcada o proteína de fusión PD-L2 FITC-marcada a los tubos e incubada a 4°C durante 30 minutos. Se efectuaron análisis citométricos de flujo utilizando un citometro de flujo de barrido de FACS (Becton Dickinson, San José, CA) . Los resultados son ilustrados en las Figuras 17A (bloqueo de PD-Ll) y 17B (bloqueo de PD-L2). Los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 5C4 y 4H1 bloquearon el enlace de PD-Ll y PD-L2 a células de CHO transfectadas con PD-1 humano, tal como se mide por la intensidad fluorescente media (MFI) del teñido. Estos datos demuestran que los HuMAbs anti-PD-1 bloquean el enlace del ligando (tanto PD-Ll como PD-L2) a PD-1 de superficie celular .

E emplo 7 : Efecto de anticuerpos anti-PD-1 humanos sobre la liberación de citocinas en sangre humana Los HuMAbs anti-PD-1 fueron mezclados con sangre entera< humana fresca con el fin de determinar si los HuMAbs anti-P'D-1 solos estimulaban la liberación de ciertas citocinas a partir de células de sangre humana. 500 µl de sangre entera humana recién heparinizada, fue agregado a cada cavidad. Se agrega ya sea 10 µg o 100 µg de HuMAb anti-PD-1 (4H1 o 5C4, el último ya sea como isotipo IgGl o IgG4) a cada cavidad. Algunas cavidades fueron incubadas con anticuerpo anti-CD3 como control positivo, o un anticuerpo IgGl humano o anticuerpo IgG4 humano como controles negativos de isotipo correspondiente. Las células fueron incubadas a 37°C ya sea por 6 o 24 horas. Las células fueron centrifugadas y el plasma fue recolectado para medición de las citocinas IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 y IL-12 utilizando un análisis de arreglo de lecho citométrico de citocina (BD Biosciences) . La concentración de cada citocina (pg/ml) es mostrada en las Tablas 3a, con una incubación de 6 horas, y 3b, con una incubación de 24 hora, a continuación. Los resultados muestran que el tratamiento con los anticuerpos anti-PD-1 humanos 5C4 y 4H1 solos no estimularon células de sangre humana para liberar cualquiera de las citocinas IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 y IL-12.

Tabla 3a . Producción de citocina enseguida de incubación de 6 horas Tabla 3b Producción de citocina enseguida de incubación de 24 horas Ejemplo 8 : Efecto de anticuerpos anti-PD-1 sobre la apoptosis de células T El efecto de anticuerpos anti-DP-1 sobre la inducción de apoptosis de célula T fue medido utilizando una prueba de teñido de anexina V.

Células T fueron cultivadas en una reacción de linfocito mezclado, como se describe anteriormente en el Ejemplo 5. El anticuerpo anti-PD-1 5C4 fue agregado al tubo a una concentración de 25 µg/ml. Se uso un anticuerpo no específico como control. Se agregaron anexina V y yoduro de propidio de acuerdo con protocolos estándar (BD Biosciences). La mezcla fue incubada durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente y luego analizada utilizando un citometro de flujo de barrido FACS (Becton Dickinson, San José, CA) . Los resultados son mostrados en la Figura 18. El anticuerpo anti-PD-1 el 5C4 no tuvo un efecto sobre la apoptosis de célula T.

Ejemplo 9: Efecto de anticuerpos anti-PD-1 sobre la secreción de citocina mediante células PBMC viral-estimuladas de un donador positivo de virus En este ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donador positivo en cuanto a CMV fueron aisladas y expuestas a un lisado de CMV en presencia o ausencia de anticuerpos anti-PD-1 para examinar los efectos de los anticuerpos sobre la secreción de citocina estimulada por antígeno. 2xl05 PMBCs humanas de un donador positivo CMV fueron cultivadas en un volumen total de 200 µl y agregadas en cada cavidad junto con un lisado de células infectadas por CMV. El HuMAb anti-PD-1 5C4 fue agregado a cada cavidad en varias concentraciones por 4 días. Después del día 4, se tomaron 100 µl de medio de cada cultivo para medición de citocina. El nivel de IFN-gamma fue medido utilizando un equipo de ELISA OptEIA (BD Biosciences). Las células fueron marcadas con 3H-timidina, cultivadas otras 18 horas y analizadas en cuanto a proliferación celular. La proliferación celular fue analizada utilizando el reactivo Cell Titer-Glo (Promega). Los resultados son mostrados en la Figura 19. El HuMab anti-PD-1 5C4 incrementó la secreción IFN gamma de manera dependiente de la concentración. Estos resultados muestran que los HuMAbs anti-PD-1 pueden estimular la liberación de IFN-gamma en una respuesta de célula T de memoria de células PBMC previamente estimuladas contra un antígeno.

Ejemplo 10: Efecto de anticuerpo anti-PD-1 sobre respuesta de anticuerpo secundaria al antígeno Ratones fueron inmunizados y re-desafiados con un antígeno TI (DNP-Ficoll) y también tratados con un anticuerpo anti-ratón-PD-1 de rata, o un anticuerpo de control para examinar el efecto del anticuerpo anti-PD-1 sobre títulos de anticuerpo . Ratones C57BL6 hembra fueron divididos en dos grupos, con 6 ratones/grupo. Un grupo fue tratado con IgG de rata de control y el otro control con un anticuerpo PD-1 anti-ratón de rata. Los ratones fueron inmunizados con 5 µg de DNP-Ficoll (un antígeno de TI) y 500 µl CFA mediante i.p. en el dia 0. Ya sea el anticuerpo de IgG de rata de control o el anticuerpo de rata-mPD-1 (200 µg/ratón) fueron administrados mediante i.p. en los dias -1, 0 y 2. Cuatro semanas más tarde, los ratones fueron re-desafiados con 5 µg de DNP-Ficoll en 500 µl de IFA mediante i.p. en el dia 0. El anticuerpo de anti-mPD-1 de rata o el anticuerpo de control (200 µg/ratón) fue administrado mediante i.p. en los días 0 y 1. Los títulos de anticuerpo fueron medidos mediante análisis de ELISA estándar en el dia 7 enseguida del refuerzo. Los resultados son mostrados en la Tabla 4 a continuación. En los ratones tratados con el anticuerpo anti-mPD-1, ambos isotipos IgM y IgG3 mostraron el mayor incremento en titulo enseguida del desafío con el antígeno TI, en comparación con ratones tratados con un anticuerpo de control. Estos resultados demuestran que el tratamiento anti-PD-1 puede incrementar los títulos de anticuerpo en respuesta al antígeno TI.

* Los resultados mostrados son la concentración promedio de isotipo de anticuerpo (µg/ml) Ejemplo 11 : Tratamiento de modelo de tumor in vivo utilizando anticuerpos anti-PD-1 Ratones implantados con un tumor canceroso fueron tratados in vivo con anticuerpos anti-PD-1 para examinar el efecto in vivo de los anticuerpos sobre el crecimiento del tumor. Como control positivo, se uso un anticuerpo anti-CTLA-4, puesto que se ha demostrado que tales anticuerpos inhiben el crecimiento de tumor in vivo . En este experimento, el anticuerpo anti-PD-1 utilizado fue un anticuerpo anti-ratón-PD-1 de rata quimérico generado utilizando técnicas de laboratorio bien conocidas. Para generar el anticuerpo PD-1 anti-ratón de rata, las ratas fueron inmunizadas con el células de ratón transfectadas para expresar una proteína de fusión de PD-1 de ratón recombinante (R&D 'Systems Catálogo No. 1021-PD) y los anticuerpos monoclonales fueron seleccionados en cuanto al enlace a antígeno de PD-1 de ratón mediante análisis de ELISA. Las regiones V de anticuerpo de anti-PD-1 de rata fueron luego enlazadas recombinantemente a una región constante de IgGl murina utilizando técnicas de biología molecular estándar y reseleccionadas en cuanto a enlace a PD-1 de ratón mediante ELISA y FACS. El anticuerpo de anti-ratón-PD-1 de rata quimético usado en la presente es referido como 4H2. Para los estudios de tumor, ratones AJ hembra de entre 6-8 semanas de edad (Harían Laboratories) fueron aleatorizados por peso en 6 grupos. Los ratones fueron implantados subcutáneamente en el flanco derecho con 2 x 10d células de SAl/N fibrosarcoma disueltos en 200 µl de medio DMEM en el día 0. Los ratones fueron tratados con vehículo de PBS, o anticuerpos a 10 mg/kg. Los animales fueron dosificados mediante inyección intraperitoneal con aproximadamente 200 µl de PBS que contiene anticuerpo o vehiculo el los días 1, 4, 8 y 11. Cada grupo contenía 10 animales y los grupos consistían de: (i) un grupo de vehículo, (ii) IgG de ratón de control, (iii) IgG de hámster de control, (iv) anticuerpo CTLA-4 anti-ratón de hámster y (v) anticuerpo anti-PD-1 guimérico 4H2. Los ratones fueron monitoreados dos veces a la semana en cuanto a crecimiento de tumor por aproximadamente 6 semanas. Utilizando un calibrador electrónico, los tumores fueron medidos tri-dimensional ente (altura x ancho X longitud) y el volumen del tumor fue calculado. Los ratones fueron sometidos a eutanasia cuando los tumores llegaron al punto final del tumor (1500 mm3) o mostraron una pérdida de peso mayor del 15%. Los resultados son mostrados en la Figura 20. El anticuerpo anti-PD-1 prolongó el tiempo medio para llegar al volumen de punto final del tumor (1500 mm3) de -25 dias en los grupos de control a ~40 días. Así, el tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1 tiene un efecto inhibidor in vivo directo sobre el crecimiento del tumor.

Ejemplo 12 : Generación de Anticuerpo anti-PD-1 Quimérico (Rata-Ratón) 4H2 Anticuerpos PD-1 de ratón contra anticuerpo monoclonal de rata (anti-mPD-1 da rata) fueron generados a partir de ratas inmunizadas con proteína de fusión mPD-1-hFc utilizando métodos de producción de hibridoma estándar (véase Kohier y Milstein (1975) Na ture 256:495; y Harlow y Lañe (1988) An tibodi es , A Labora tory Manua l , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Nueva York) . Ocho hibridomas fueron subclonados, y los anticuerpos fueron aislados y seleccionados en cuanto a su habilidad para bloquear el enlace de PD-L2 de ratón (mPD-L2) a mPD-1. Varios anticuerpos anti-mPD-1 actos de bloquear de enlace de mPD-L2 a mPD-1 fueron identificados ( véase, por ejemplo, actividad de 4H2, Figura 41) y la afinidad de enlace de varios de estos anticuerpos a la proteína de fusión mPD-l-Fc fue determinada mediante ELISA (Figura 42).

El anticuerpo 4H2.B3 fue caracterizado adicionalmente, que es denominado intercambiablemente en la presente como "4H2". Células de CHO que expresan PD-1 de ratón fueron construidas e incubadas con anticuerpo anti-mPD-1 4H2 a una concentración que fluctúa de 200 µg/ml a 0.012 µg/ml para determinar la afinidad de enlace de 4H2 a PD-1. El enlace del anticuerpo ant?-mPD-1 a células de CHO que expresa PD-1 fue detectado mediante incubación de IgG de burro-anti-rata, FITC conjugado y medido mediante FACS. El anticuerpo ant?-mPD-1 tuvo una EC50 (concentración efectiva al 50%) de alrededor de 0.38 µg (Figura 43) y un KD de 4.7 x 10~9 M. Para examinar la inhibición del enlace de PD-Ll a PD-1, el mismo análisis fue efectuado excepto que las células también incubadas con 0.16 µg de proteína de fusión mPD-Ll-hFc, luego en enlace de PD-Ll a células de CHO que expresan PD-1 fue detectado mediante incubación con IgG de cabra-anti-humano ( Fc específico), FITC conjugado y medición de señal de enlace mediante FACS (MFI, intensidad de fluorescencia media) . El anticuerpo ant?-mPD-1 tuvo una EC50 de alrededor de 0.72 µg (Figura 44) . Para uso en los modelos de tumor de ratón, el ant?-mPD-1 de rata 4H2 necesitó ser modificado de tal manera que el sistema inmune de ratón no neutralizarla el anticuerpo inmunoterapéutico ( es to es, de tal manera que el anticuerpo tendría mejores farmacocineticas) y evitar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) al reducir las interacciones del receptor Fc ( es to es , de tal manera que el bloqueo mediante anti-PD-1 pudiera ser evaluado sin ser comprometido por los efectos de ADCC) . El anticuerpo anti-mPD-1 de rata original, 4H2, fue determinado que era un isotipo de IgG2a de rata. De aguí, la porción de Fc del anticuerpo 4H2 fue reemplazada con una porción de Fc de un isotipo de IgGl de ratón. Utilizando el análisis descrito anteriormente, se encontró que la afinidad de enlace del 4H2 quimérico de ratón-rata a mPD-1 era comparable al anticuerpo 4H2.B3 anti-mPD-1 de rata (Figura 45) . Similarmente, la inhibición del enlace de PD-Ll a PD-1 fue comparable para ambos anticuerpos (Figura 46) . Así, el anticuerpo anti-mPD-1 4H2 quimérico de rata-ratón fue usado para examinar la eficacia terapéutica de anti-PD-1 en combinación con anti-CTLA-4.

Ejemplo 13: Eficacia in vivo de Terapia de Combinación (Anticuerpos anti-CTLA-4 ^ anti-PD-1) sobre el Establecimiento y Crecimiento de Tumor Células de cáncer colorrectal MC38 (PD-Ll") (disponible de Dr . N. Restifo, National Cáncer Institute, Bethesda, MD; o Jeffrey Schlom, National Institutes of Health, Bethesda, MD) fueron implantadas en ratones C57BL/6 (2 x 106 células/ratón) . En el dia 0 ( es to es , el dia en que las células MC38 fueron implantadas en los ratones), cada uno de cuatro grupos de 10 ratones fue inyectado intraperitonealmente (IP) con uno de los siguientes: (1) IgG de ratón (control), (2) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (CTLA-4 anti-ratón de ratón, obtenido de J. Allison, J. Allison, Memorial Sloan-Kettering Cáncer Center, Nueva York, NY) (3) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (anticuerpo guimérico en el cual un PD-1 anti-ratón de rata fue modificado con una región Fc de ratón, como se describe en el Ejemplo 6), o (4) anticuerpo anti-CTLA-4 9D9 y anticuerpo anti-PD-1 4H2. Luego se administraron inyecciones de anticuerpo en los días 3, 6 y 10. Los tratamientos con un solo anticuerpo fueron dosificados a 10 mg/kg, y la combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 fue dosificada a 5 mg/kg de cada anticuerpo ( esto es, 10 mg/kg de anticuerpo total). Utilizando un calibrador electrónico, los tumores fueron medidos tri-dimensionalmente (altura x ancho x longitud) y el volumen del tumor fue calculado. Los ratones fueron sometidos a eutanasia cuando los tumores llegaron a un punto final de tumor designado. Los resultados son mostrados en la Tabla 5 y la Figura 21.

Tabla 5. Porcentaje de Ratones Libres de Tumor Enseguida del Tratamiento con Anti-PD-1 y/o Anti-CTLA-4 Ocho ratones en Grupo de IgG llegaron al final del tumor por alrededor del día 30 y dos ratones (86066 y 87260) en Grupo IgG tuvieron tumores ulcerados (Figura 21 A) . En Grupo de anticuerpo CTLA-4 solo, siete ratones llegaron al punto final del tumor por alrededor del 60, un ratón tuvo un tumor ulcerado (84952), un ratón tuvo un tumor con un volumen de menos de 1500 mrrJ (85246) y un ratón estaba libre de tumor (86057) (Figura 21B) . En Grupo de anticuerpo anti-PD-1 solo, seis ratones llegaron al punto final del tumor por alrededor del día 60, un ratón tuvo un tumor ulcerado (86055) y tres ratones estuvieron libres de tumor (84955, 85239 y 86750) (Figura 21C) . En Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1, cuatro ratones llegaron al punto final del tumor por alrededor del dia 40, y seis ratones estuvieron libres de tumor (84596, 85240, 86056, 86071, 86082 y 86761) (Figura 21D) . La Figura 22 muestra que el volumen de tumor medio medido en el día 21 fue de alrededor de 2955 mm3 en Grupo de control de IgG; aproximadamente 655 mm3 para Grupo de anticuerpo CTLA-4 solo, alrededor de 510 mm3 para Grupo de anticuerpo de PD-1 solo y alrededor de 280 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1. La Figura 23 muestra que el volumen de tumor medio medido en el día 21 fue de alrededor de 2715 mm3 para Grupo IgG; aproximadamente 625 mm3 para Grupo de anticuerpo CTLA-4 solo; alrededor de 525 mm3 para Grupo de anticuerpo de PD-1 solo; y alrededor de 10 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo CTLA-4 y anticuerpo PD-1 (y hasta 0 mm3 por el día 32). Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con anticuerpo CTLA-4 solo y tratamiento con anticuerpo PD-1 solo tiene un efecto moderado sobre el crecimiento de tumor, y que el tratamiento de combinación de anticuerpo CTLA-4 y anticuerpo PD-1 tiene un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento del tumor. Es interesante notar que el tratamiento de combinación con anticuerpo CTLA-4 y anticuerpo PD-1 tuvo un efecto más signi fJcativo sobre el crecimiento de tumor a una dosis de 5 mg/kg ,de cada anticuerpo en comparación con efecto ya sea de un anticuerpo solo cuando cada uno es administrado a una dosis más alta de 10 mg/kg.

Ejemplo 14: Eficacia in vivo de la Terapia de la Combinación (Anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre el Crecimiento de Tumor Establecido Células de cáncer colorrectal MC38 (PD-Ll") fueron implantadas en ratones C57BL/6 (2 x 106 células/ratón) por un tiempo suficiente (alrededor de 6 a 7 días) para permitir la formación de tumores. En el dia 6 pos-implante (dia -1), se tomaron mediciones de tumor y los ratones fueron aleatorizados en base al volumen de tumor medio (alrededor de 250 mm3) en 11 grupos para terapia de anticuerpo subsecuente. En el día 0 (esto es, una semana después de gue las células MC38 fueron implantadas), los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con (1) IgG de ratón (control), (2) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9, (3) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 o (4) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 y anticuerpo monoclonal de anticuerpo anti-PD-1 4H2, a una concentración de 10 mg/kg por ratón. Inyecciones de anticuerpo fueron también administradas el los días 3, 6 y 10. Las composiciones de anticuerpo monoclonal usadas tuvieron bajos niveles de endotoxina y no se agregan significativamente. Utilizando un calibrador electrónico, los tumores fueron medidos tri-dimensionalmente (altura x ancho x longitud) y el volumen del tumor fue calculado. Se tomaron mediciones de tumor en el día 0 (tumores al comienzo del tratamiento tuvieron un volumen de alrededor de 125 mm3) y en los días 3, 6, 10, 13, 17 y 20 pos-inyección de anticuerpo. Los ratones fueron sometidos a eutanasia cuando los tumores llegaron a un punto final de tumor designado (un volumen de tumor particular tal como 1500 mm3 y/o cuando los ratones mostraron una pérdida de peso mayor de alrededor de 15%) . Todos los once ratones en Grupo IgG llegaron al punto final del tumor por aproximadamente el día 17 (Figura 24A) . En Grupo de anticuerpo anti-CTLA-4 solo, siete de once ratones llegaron al punto final del tumor por alrededor del día 12 (Figura 24B) . En Grupo de anticuerpo anti-PD-1 solo, cuatro ratones llegaron al punto final del tumor por alrededor del día 13 y dos ratones estuvieron libres de tumor (Figura 24C) . En Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1, un ratón llegó al punto final del tumor por alrededor del día 17, un ratón llegó al punto final del tumor por alrededor del dia 45 y nueve ratones estuvieron libres de tumor en el día 45 (Figura 24D) . La Figura 25 muestra que el volumen de tumor medio medido en el 10 fue de alrededor de 1485 mm3 para Grupo de control de IgG; alrededor de 1010 mm3 para Grupo de anticuerpo CTLA-4 solo; alrededor de 695 mm3 para Grupo de anticuerpo de PD-1 solo; y alrededor de 80 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1. La Figura 26 muestra que el volumen de tumor medio medido en el dia 10 fue de alrededor de 1365 mm3 para Grupo IgG; alrededor de 1060 mm3 para Grupo de anticuerpo anti-CTL A-4; alrededor de 480 mm3 para Grupo de anticuerpo anti-PD-1 solo; y alrededor de 15 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 (que fue de esta 0 mm3 por el dia 17) . Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con la combinación de anticuerpo CTLA-4 y anticuerpo PD-1 tuvo un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento de tumor que ya sea el anticuerpo solo, aun cuando un tumor ya está bien establecido.

Ejemplo 15 : Titulación de la Dosis de Terapia de Combinación (Anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre el Crecimiento de Tumor Establecido Células de cáncer colorrectal MC38 (PD-Ll") fueron implantadas en ratones C57BL/6 (2 x 106 células/ratón) por un tiempo suficiente (alrededor de 6 a 7 días) para permitir la formación de tumores como se describe en el Ejemplo 3. Grupos de 10 ratones fueron inyectados intraperitonealmente en los días 0, 3, 6 y 10 como sigue: Grupo (A) IgG de ratón (control, 20 mg/kg), Grupo (B) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg) y IgG de ratón (10 mg/kg), Grupo (C) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (10 mg/kg) y IgG de ratón (10 mg/kg), Grupo (D) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (10 mg/kg) y anticuerpo monoclonal de anticuerpo anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg), Grupo (E) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (3 mg/kg) y anticuerpo monoclonal de anticuerpo antJ-PD- 1 4H2 (3 mg/kg) o Grupo (F) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (1 mg/kg) y anticuerpo monoclonal de anticuerpo anti-PD-1 4H2 (1 mg/kg). Utilizando un calibrador electrónico, los tumor s fueron medidos tri-dimensionalmente (altura x ancho x longitud) y el volumen del tumor fue calculado. Mediciones de tumor fueron tomadas al comienzo del tratamiento ( esto es, en el día 0 los tumores tenían un volumen promedio de aproximadamente 90 mm3) y en los dias 3, 6, 10, 13, 17 y 20 pos-tratamiento de anticuerpo. Los ratones fueron sometidos a eutanasia cuando los tumores llegaron a un punto final de tumor designado (un volumen de tumor particular tal como 1500 mm3 y/o cuando los ratones mostrados una pérdida de peso mayor de aproximadamente 15%) . La Figura 27A muestra que todos los 10 ratones de control habían alcanzado un punto final del tumor. La Figura 27B muestra que Grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 (Grupo B) tuvo 6 ratones gue llegaron al punto final del tumor y 4 ratones con tumores que tienen un volumen de aproximadamente 750 mm3 o menos. La Figura 27C muestra que Grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo C) tuvo 3 ratones que llegaron al punto final del tumor y 7 ratones con tumores que tienen un volumen de aproximadamente 1000 mm3 o menor. La Figura 27D muestra que Grupo tratado con una combinación de 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 10 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo D) tuvo 2 ratones con tumores que tienen un volumen de aproximadamente 1000 mm3 o menor y 8 ratones que estuvieron libres de tumor. La Figura 27E muestra que Grupo tratado con una combinación de 3 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 3 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo E) tuvo un ratón que había llegado al punto final del tumor, 7 ratones con tumores que tienen un volumen de aproximadamente 500 mm3 o menor y 2 ratones que estuvieron libres de tumor. La Figura 27F muestra que Grupo tratado con una combinación de 1 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 1 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo F) tuvo 4 ratones que habían alcanzado el punto final del tumor, 5 ratones con tumores que tienen un volumen de aproximadamente 1100 mm3 o menor, y un ratón que estuvo libre de tumor. Las Figuras 27G y 27H muestran los volúmenes de tumor en ratones tratados secuencialmente con anticuerpo anti-PD-1 primero y anticuerpo anti-CTLA-4 en segundo lugar, y viceversa. Los ratones de la Figura 27G recibieron primero 10 mg/kg de anti-CTLA-4 en cada uno de los días 0 y 3, y luego recibieron 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 en cada uno de loS días 6 y 10. Los ratones de la Figura 27H recibieron primero 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 en cada uno de los días 0 y 3, y luego recibieron 10 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 en cada uno de los días 6 y 10. Para Grupo G en el día 27, 8 ratones llegaron al punto final del tumor, un ratón tuvo un tumor muy pequeño (que después de un retardo significativo, eventualmente disminuyó) y un ratón estuvo libre de tumor. Para Grupo H en el día 27, 8 ratones llegaron al punto final del tumor y 2 estuvieron libres de tumor. La Figura 28 muestra que el volumen de tumor medio medido en el día 10 fue de aproximadamente 1250 mm3 para Grupo de control de IgG; aproximadamente 470 rnm3 para el anticuerpo PD-1 con el control de IgG; aproximadamente 290 mm3 para el anticuerpo CTLA-4 con el control de IgG (medido en el día 6); aproximadamente 40 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg); aproximadamente 165 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 (3 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (3 mg/kg); y aproximadamente 400 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 (1 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (1 mg/kg) . La Figura 29 muestra gue el volumen de tumor , medio medido en el dia 13 fue de aproximadamente 1680 mm3 para Grupo de control de IgG; aproximadamente 400 mm3 para el anticuerpo PD-1 con el control de IgG; aproximadamente 660 mm3 para el anticuerpo CTLA-4 con el control de IgG; 0 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg); aproximadamente 90 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 (3 mg/kg)' y anticuerpo anti-PD-1 (3 mg/kg); y aproximadamente 650 mm3 para Grupo de combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 (1 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (1 mg/kg). Para el tratamiento de combinación del anticuerpo anti-PD-1 con el anticuerpo anti-CTLA-4, el número de ratones por grupo que estuvieron libres de tumor en el día 27 del estudio fue 8/10 (10 mg/kg), 2/10 (3 mg/kg) y 1/10 (1 mg/kg) (datos no mostrados ) . Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con la combinación de anticuerpo CTLA-4 y anticuerpo PD-1 funciona de manera dependiente de la dosis y tiene un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento de tumor gue ambos anticuerpos solos, aun a una dosis más baja y aun cuando un tumor ya está bien establecido. Además, los anticuerpos pueden ser administrados secuencialmente (anticuerpo anti-CTLA-4 primero y anticuerpo anti-PD-1 en segundo lugar, o viceversa) y la combinación es todavia superior a las monoterapias de anticuerpo.

Ejemplo 16: Eficacia in vivo de Terapia de Combinación (Anticuerpos anti-CTLA-4 ^ anti-PD-1) sobre el Establecimiento y Crecimiento de Fibrosarcoma Células de Fibrosarcoma SAl/N (PD-Ll") (Leach y colaboradores, (1996) Science 271:1734-1736) fueron implantadas subcutáneamente en ratones A/J (2 x 106 célulás/ratón) en el día 0. En los días 1, 4, 7 y 11 pos-implante, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente como sigue: Grupo (A) PBS solo (al que se hace referencia como el "vehículo"); Grupo (B) IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón), Grupo (C) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón), Grupo (D) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (10 mg/kg o 0.2 mg/kg por ratón) y Grupo (E) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón) en combinación con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0.2 mg/kg por ratón) . El estudio duró 41 dias y se tomaron mediciones de tumor en varios días en todo el curso del estudio (véase Figura 29) . El volumen del tumor fue calculado al medir tumores en tres dimensiones (altura x ancho x longitud) utilizando un calibrador electrónico. Los ratones fueron sometidos a eutanasia cuando los tumores llegaron a un volumen de punto final de tumor designado de 1500 mm3 y/o un tumor ulcerado. Las Figuras 30A y 30B muestran gue 19 de los 20 ratones de control (9/10 en grupo A y 10/10 en grupo B) ya sea habían alcanzado un punto final del tumor o habían desarrollado tumores ulcerados. La Figura 30C muestra que Grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 (Grupo C) tenía 6 ratones gue habían llegado al punto final del tumor (2 con un volumen mayor de 1500 mm3 y 4 con un tumor ulcerado) y 4 ratones que estaban libre de tumor. La Figura 30D muestra que Grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo D) tenía 5 ratones que llegaron a un punto final del tumor (2 con un volumen mayor de 1500 mm3 y 3 con un tumor ulcerado) , un ratón con un tumor pequeño (volumen de aproximadamente 70 mm3) y 4 ratones que estuvieron libres de tumor. La Figura 30E muestra que Grupo tratado con 0.2 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo E) tuvo 10 ratones que llegaron a un punto final del tumor (6 con un volumen mayor de 1500 mm3 y 4 con un tumor ulcerado) . La figura 30F muestra que Grupo tratado con una combinación de 10 dmg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 0.2 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo F) tuvo 2 ratones que llegaron a un punto final del tumor (uno con un volumen mayor de 1500 mm3 y uno con un tumor ulcerado) y 8 ratones que estuvieron libres del tumor. Las Figuras 31 y 32 muestran el volumen de tumor medio y mediano, respectivamente, gue se desarrolló en los ratones tratados y sin tratar en el curso de este estudio. L inhibición de crecimiento del tumor en ratones tratados con estos' anticuerpos, en comparación con los ratones tratados con el IgG de ratón de anticuerpo de control, se resume en la Tabla 6.

Tabla 6. Inhibición de Crecimiento de Tumor y Ratones Libres de Tumor Enseguida del Tratamiento con Anti-PD-1 y/o Anti-CTLA-4 * TGI = inhibición de crecimiento de tumor; la mediana podria ser calculada solamente cuando menos del 50% de los ratones llegaron al punto final del tumor. t Los grupos son como se define en la Figura 30. A = vehículo (PBS); B = IgG de ratón; C = anti-PD-1, 10 mg/kg; D = anti-CTLA-4, 10 mg/kg; E = anti-CTLA-4, 0.2 mg/kg; y F = anti-PD- 1, 10 mg/kg con anti-CTLA-4, 0.2 mg/kg. Estos datos indican además gue la terapia de combinación que comprende anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 es sustancialmente más efectiva que el tratamiento ya sea con uno u otro anticuerpo solo. Por supuesto, la combinación es todavía más efectiva que los tratamientos de anticuerpo individual aun cuando la terapia de combinación contiene una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4. Estos datos también indican que sorprendentemente, la presencia o ausencia de PD-Ll sobre el tumor pueden no tener ningún efecto sobre la eficacia del tratamiento con esta combinación de anticuerpos, aunque la presencia de PD-Ll puede influenciar el efecto de las monoterapias de anticuerpo en que la expresión de PD-Ll sobre el tumor puede también conducir a inhibición de respuestas células T anti-tumor {véase Figura 40) .

Ejemplo 17 : Eficacia In Vivo y Titulación de Dosis de Terapia de Combinación (Anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre el Crecimiento de Fibrosarcoma PD-Ll Células de fibrosarcoma SAl/N (PD-Ll") fueron implantadas subcutáneamente en ratones A/J (2 x 106 células/ratón) en el día 0 por un tiempo suficiente (aproximadamente de 7 días) para permitir el establecimiento de un tumor. El los días 7, 10, 13 y 16 pos-implante, diez grupos de 8 ratones que tienen un volumen de tumor promedio de 110 mm3 fueron inyectados intraperitonealmente como sigue: Grupo' (A) PBS solo (al que se hace referencia como el "vehículo"); Grupo (B) IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón); Grupo (C) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0.25 mg/kg); Grupo (D) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0.5 mg/kg'por ratón); Grupo (E) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (5 mg/kg); Grupo (F) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (3 mg/kg por ratón); Grupo (G) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón); Grupo (H) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón) en combinación con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0.25 mg/kg por ratón); Grupo (I) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón) en combinación con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0.5 mg/kg por ratón); y Grupo (J) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (3 mg/kg por ratón) en combinación con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0.5 mg/kg por ratón). El los dias 10, 13, 16 y 19 pos-implante, dos grupos de 6 ratones que tienen un volumen de tumor promedio de 255 mm3 fueron inyectados intraperitonealmente inyectado como sigue: (K) IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón); y Grupo (L) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón) en combinación con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (1 mg/kg por ratón) . El estudio duró 51 días y se tomaron mediciones de tumor en varios días en todo el curso del estudio (véanse Figuras 33-38) . El volumen del tumor fue calculado al medir tumores en tres dimensiones (anchura x ancho x longitud) utilizando un calibrador electrónico. Los ratones fueron sometidos a eutanasia cuando los tumores llegaron a un volumen de punto final de tumor designado de 1500 mm3 y/o un tumor ulcerado. La Figura 33 muestra la respuesta al tratamiento de anticuerpo inmunoestimulador en ratones con tumores que tienen un volumen inicial de aproximadamente 110 mm3 ( es to es, al tiempo del primer tratamiento de anticuerpo. Laos Figuras 33A y 33B muestran que todos los 16 ratones de control (Grupos A y B) llegaron a un punto final del tumor (15 con un volumen de tumor mayor de 1500 mm3 y 1 con un tumor ulcerado) . Las Figuras 33C-33E muestran que los ratones que llevan tumor responden al tratamiento con anticuerpo anti-CTLA-4 de manera dependiente de la dosis (por ej emplo, el Grupo C que recibe 0.25 mg/kg tuvo 7/8 ratones que llegaron al punto final del tumor y un ratón con un volumen de tumor menor de 200 mm3, mientras que el Grupo E que recibe 5 mg/kg tuvo 6/8 ratones gue llegan al punto final del tumor y dos ratones que estuvieron libres de tumor) . Las Figuras 33F y 33G muestran que los ratones respondieron aproximadamente igual sin consideración de la dosis de anticuerpo anti-PD-1 (el Grupo F recibió 3 mg/kg y el Grupo G recibió 10 mg/kg) . En contraste, los ratones que reciben un tratamiento de combinación de 10 o 3 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 0.25 o 0.5 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupos H, I y J) mostraron una reducción significativa en crecimiento de tumor. Por ejemplo, la Figura 33J muestra que el Grupo tratado con una combinación de 3 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 0.5 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo J) tuvo 2 ratones que tuvieron tumores ulcerados, 2 ratones con un volumen de tumor menor de 500 mm3, y 4 ratones que estuvieron libres de tumor. El efecto sinergistico inesperado de un anticuerpo anti-PD-1 combinado con un anticuerpo anti-CTLA-4, junto con la efectividad sorprendente de niveles subterapéuticos de anticuerpo ant?-CTLA-4 en la combinación, son mostrados en las Figuras 34 (volumen de tumor medio) y 35 (volumen de tumor mediano) . La Figura 36 muestra la respuesta al tratamiento de anticuerpo inmunoestimulador en ratones con tumores más grandes, aquellos que tienen un volumen inicial de aproximadamente 250 mm3 ( esto es, al tiempo del primer tratamiento de anticuerpo) . La Figura 36A muestra que todos los 6 ratones de control (Grupo K) llegaron a un punto final del tumor (4 con un volumen de tumor mayor de 1500 mm3 y 2 con un tumor ulcerado) . La Figura 36B muestra que el Grupo tratado con una combinación de 10 dmg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 1 mg/kg de anticuerpo ant?-CTLA-4 (Grupo L) tuvo un ratón con un tumor ulcerado, 4 ratones con un volumen de tumor mayor de 1500 mm3 y un ratón gue estaba libre de tumor. Los volúmenes de tumores medios y medianos son mostrados en las Figuras 37 y 38. La inhibición de crecimiento de tumor en ratones tratados con estos anticuerpos, en comparación con ratones tratados con el IgG de ratón de anticuerpo de control, es resumida en la Tabla 7 y Figura 39.

Tabla 7. Inhibición de Crecimiento de Tumor Enseguida del Tratamiento con anti-PD-1 y/o anti-CTLA-4 * TGI = Inhibición de crecimiento de tumor; la mediana podría solamente ser calculada cuando menos de 50% de los ratones llegan al punto final del tumor. t los grupos son como se define en las Figuras 33 y 36. Para el tumor inicial más pequeño: A = vehiculo (PBS); B = IgG de ratón, 10 mg/kg; C = anti-CTLA-4, 0.25 mg/kg; D = anti-CTLA- 4, 0.5 mg/kg; E = anti-CTLA-4, 5 mg/kg; F = anti-PD-1, 3 mg/kg'; G = anti-PD-1, 10 mg/kg; H = anti-PD-1, 10 mg/kg con anti-CTLA-4, 0.25 mg/kg; I = anti-PD-1, 10 mg/kg con anti- CTLA-4, 0.5 mg/kg; y J = anti-PD-1, 3 mg/kg con anti-CTLA-4, 0.5 rftg/kg. Para el tumor inicial más grande: K = IgG de ratón!, 10 mg/kg; y L = anti-PD-1, 10 mg/kg con anti-CTLA-4, 0.25 mg/kg. ' Conjuntamente, estos datos indican gue la terapia de combinación que comprende anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 es sustancialmente más efectiva que el tratamiento que ya sea con uno u otro anticuerpo solo. Además, sorprendentemente, la dosis de cada anticuerpo puede ser reducida sin afectar la eficacia sinergística de esta combinación de anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores. La terapia de combinación todavía parece ser efectiva aun cuando la masa de tumor está más madura ( esto es, más grande) .

Ejemplo 18 : Inmunidad a Tumor en Ratones Enseguida del Tratamiento de Anticuerpo anti-PD-1 y Re-Desafío con Células de Fibrosarcoma PD-Ll" Los ratones que sobrevivieron libres de tumor de un desafío con células de tumor y tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 ( es to es, tratamiento similar a los estudios de eficacia descritos en los Ejemplos 5 y 6) fueron re-desafiados con células de tumor para investigar la inmunidad a la formación de tumor después de tal tratamiento. Brevemente, en el desafío inicial, células de fibrosarcoma SAl/N (PD-LF) fueron implantadas subcutáneamente en A/J (1 x 106 células/ratón) en el día 0. El los días 1, 4, 7, 10, 14, 17 y 20 pos-implante, los grupos de ratones fueron inyectados intraperitonealmente ya sea con IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón) o con una de varias dosis de anticuerpo monoclonal ant?-PD-1 4H2 (30, 10, 3, 1 y 0.3 mg/kg por ratón) . La formación y volumen de tumor fue monitoreado con un calibrador electrónico de precisión dos veces a la semana hasta que el estudio estaba consumado. Un grupo de 8 ratones estuvieron libres de tumor después del tratamiento de anticuerpo anti-PDl (4 que fueron tratados con 30 mg/kg, 2 con 3 mg/kg, uno con 1 mg/kg y uno con 0.3 mg/kg) . Los ocho ratones A/J libres de tumor tratados fueron re-desaflados al implantar subcutáneamente 1 x 106 células de fibrosarcoma de SAl/N/ratón. Como control o referencia, nueve ratones naturales fueron implantados subcutáneamente con 1 x 106 células de fibrosarcoma SAl/N/ratón. La formación y volumen de tumor fue monitoreada con un calibrador electrónico de precisión dos veces a la semana hasta el día 62 pos-implante. Todos los nueve ratones naturales (de control) llegaron al punto final del tumor al dia 22 pos-implante de las células de fíbrosarcoma . En contraste, los ocho ratones libres de tumor re-desafíados con células de fibrosarcoma no desarrollaron tumores hasta 62 días pos-implante. La Figura 47 muestra el volumen de tumor medio de los ratones naturales y los ratones re-desaflados . Estos resultados demuestran que el tratamiento con un anticuerpo inmunoestimulador, tal como ant?-PD-1, proporciona al sujeto tratado con inmunidad a la formación de tumor adicional, aun en presencia de células capaces de formar un tumor .

Ejemplo 19: Inmunidad al Tumor en Ratones Enseguida de la Terapia con un solo Anticuerpo (anti-PD-1) o Terapia de Anticuerpo de Combinación (anti-CTLA-4 y anti-PD-1 Re-Desafiado con Células de Cáncer Colorrectal PD-Ll" Los ratones que sobrevivieron libres de tumor de un desafío con células de tumor y tratamiento ya sea con anticuerpo anti-PD-1 solo o anticuerpo anti-PD-1 combinado con anticuerpo anti-CTLA-4 (esto es, tratamiento similar a los estudios de eficacia descritos en los Ejemplos 2-4) fueron luego re-desafiados con células de tumor para investigar la inmunidad a la formación de tumor después de tales tratamientos. Brevemente, en el desafío inicial, células de cáncer colorrectal MC38 (PD-Ll") fueron implantadas en ratones C57BL/6 (2 x 106 células/ratón) en el día 0. En los días 0, 3, 6 y 10 por-implante, los grupos de ratones fueron inyectados intraperitonealmente con uno de los siguientes tratamientos: (1) IgG de ratón, (control) 10 mg/kl por ratón), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2, o (3) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 en combinación con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9. El crecimiento de tumor fue monitoreado con un calibrador electrónico de precisión como se describe en el Ejemplo 15. Un grupo de 11 ratones estuvieron libres de tumor después del tratamiento de anticuerpo anti-PDl (2 en total) o el tratamiento de combinación de anticuerpo ant?-PD-l/ant?-CTLA-4 (9 en total). Los 11 ratones C57BL/6 libres de tumor tratados fueron re-desafíados mediante implante de 2 x 107 células de cáncer correctal MC38/raton ( es to es , una dosis de células 10 x mayor que el desafío inicial) . Como control o referencia, siete ratones naturales fueron implantados, con 2 x 107 células de cáncer correctal MC38/ratón. La formación y volumen de tumor fueron monitoreados con un calibrador electrónico de precisión por la duración del experimento de re-desafío (por lo menos 20 días). La Figura 48 muestra que todos los siete ratones naturales (control) desarrollaron un tumor y llegaron al punto final del tumor por el dia 18 pos-implante de las células de cáncer colorrectal. En contraste, todos los 11 ratones libres de tumor re-desaflados con células de cáncer colorrectal no desarrollaron tumores hasta 18 días pos-implante. La Figura 49 muestra el volumen de tumor medio para los ratones naturales y re-desaflados . Estos datos indican que, similar a la monoterapia de anticuerpo, la terapia de anticuerpo de combinación resultante en el bloqueo de PD-1 y CTL A-4 produce una inmunidad persistente a la recaída de tumor.

Ejemplo 20: Eficacia In Vivo de Terapia de Combinación (Anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre Crecimiento dde Tumor Establecido Células de cáncer colorrectal CT26 fueron implantadas en ratones BALB/C (2 x 106 células/ratón) por un tiempo suficiente (aproximadamente 10 dias) para permitir la formación de tumores. En el día 10 pos-implante, se tomaron mediciones de tumor y los ratones fueron aleatorizados en base al volumen de tumor medio (aproximadamente 250 mm3) en 5 grupos para terapia de anticuerpo subsecuente. En el dia 0 ( esto es, 10 días después que las células CT26 fueron implantadas), los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con (1) IgG de ratón (control), (2) el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9, (3) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2, o (4) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 y anticuerpo monoclonal de anticuerpo anti-PD-1 4H2, a una concentración de 10 mg/kg por ratón. También se administraron inyecciones de anticuerpo en los días 3, 6 y 10. Las composiciones de anticuerpo monoclonales usadas tenían bajos niveles de endotoxina y no se agregaron significativamente. Utilizando un calibrador electrónico, los tumores fueron medidos tri-dimensionalmente (altura x ancho x longitud) y el volumen del tumor fue calculado. Se tomaron mediciones de tumor en el dia 0 (tumores al comienzo del tratamiento tuvieron un de aproximadamente 125 mm3) y en los dias dias 3, 6, 10, 13, 17 y 20 pos-inyección de anticuerpo. Los ratones fueron sometidos a eutanasia cuando los tumores llegaron a un punto final de tumor designado (un volumen de tumor particular tal como 1500 mm3 y/o cuando los ratones mostrados más de aproximadamente 15% de pérdida de peso) . Los resultados son mostrados en la Figura 50. Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con la combinación de anticuerpo CTLA-4 y anticuerpo PD-1 tuvo un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento de tumor ya sea de uno u otro anticuerpo solo, aun cuando un tumor ya está bien establecido.

Ejemplo 21: Efecto de Anticuerpo anti-PD-1 humano sobre la función de células reguladoras T Las células reguladoras T son linfocitos que suprimen la respuesta inmune. En este ejemplo, células reguladoras T fueron probadas en cuanto a su función inhibidora sobre la proliferación y secreción de IFN-gamma de células T CD4+CD25- en presencia o ausencia de un anticuerpo monoclonal humano anti-PD-1. Células reguladoras T fueron purificadas de PBMC utilizando un equipo de aislamiento de célula T reguladora CD4+CD25+ (Miltenyi Biotec) . Células reguladoras T fueron agregadas en una reacción de linfocito mezclada (véase anteriormente) gue contiene células T CD4+CD25- purificadas y células dendríticas alogénicas en una proporción de 2:1 de células reguladoras CD4+CD25- a T. El anticuerpo monoclonal anti-PD-1 5C4 fue agregado a una concentración de 10 µg/ml. Ni un' anticuerpo o ni un anticuerpo de control de isotipo fue usado como control negativo. Los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados en el dia 5 pero la medición de citocina utilizando un sistema de detección de citocina Beadlyte (Upstate) . Las células fueron marcadas 3H-timidina, cultivadas por otras 18 horas, y analizadas en cuanto a proliferación celular. Los resultados fueron mostrados en las Figuras 51A (proliferación de célula T) y 51B (secreción de IFN-gamma) . La adición de anticuerpo monoclonal humano anti-PD-1 5C4 liberó parcialmente la inhibición impuesta por células Treg sobre la proliferación y secreción de IFN-gamma de células T CD4+CD25-, indicando gue los anticuerpos anti-PD-1 tienen un efecto sobre las células reguladoras T.

Ejemplo 22 : Efecto de anticuerpo anti-PD-1 humano sobre activación de célula T En este ejemplo, se examinó el bloqueo de la ruta de PD-1 mediante el anticuerpo anti-PD-1 5C4 sobre la activación de célula T. Células CD4+ T humanas purificadas (equipo de purificación de célula T CD de Dynal) fueron activadas con un 1 µg/ml de anticuerpo anti-CD3 soluble (BD) en presencia de monocitos autólogos o células dendriticas derivadas de monolito (DCs) . Los monocitos fueron purificado utilizando el equipo de purificación de monolito Miltenyi CD14, y se generaron DCs in vi tro después del cultivo de monocitos con GM-CSF y IL-4 (PeproTech) por 7 días. Después de tres días de activación en presencia o ausencia de anticuerpo anti-PD-1 titulado o mAb de control de isotipo irrelevante, los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados para análisis de ELISA de secreción de IFN-gamma en tanto que se agrega timidina tritiada durante las 18 horas finales del análisis con el fin de medir la proliferación de célula T. Los resultados mostrados en las Figuras 52A y 52B demuestran que el bloqueo de PD-1 mediante el anticuerpo anti-PD-1 dio como resultado proliferación de célula T mejorada y secreción de IFN-gamma mejorada. El efecto sinergístico por el anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CTLA-4 sobre la activación de célula T (específicamente en la secreción de IFN-?) en presencia de monolitos también fue observado.

Ejemplo 23: Determinación de actividad ADCC del anticuerpo anti-PD-1 ; En este ejemplo, se efectuó un análisis de citot?xicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) para evaluar si el anticuerpo anti-PD-1 podría inducir ADCC a células objetivo. Dos versiones de 5C4, una eon una región Fc de IgGl humana (5C4-IgGl) y la otra con una región Fc de IgG4 humana (5C4-IgG4) fueron probadas en el análisis se usó el equipo de citotoxicidad celular Delfia de Perkin Elmer para el análisis. Brevemente, células T CD4 humanas purificadas (equipo de purificación de células T CD4 Dynal) fueron activadas mediante anticuerpo anti-CD3 enlazado a placa (BD) para inducir la expresión de PD-1. Luego las células T CD4 activadas objetivo fueron marcadas con reactivo BATDA. Las células T CD4 marcadas fueron agregadas a una placa de 96 cavidades con fondo en forma de V, seguidas por la adición de PBMC humano (un efector a la proporción celular (E/T) objetivo de 50:1) y el anticuerpo diseñado. Después de incubación por 1 hora a 37°C, la placa fue centrifugada. El sobrenadante fue transferido a una placa de 96 cavidades de fondo plano y la placa fue leída usando un lector de placa RubyStar. Los resultados mostraron que 5C4-IgG4 no moderó la ADCC sobre células T CD4 activadas, en tanto que 5C4-IgGl moderó ADCC sobre las células T CD4 activadas (figura 53), indicando gue la actividad de ADCC está relacionada con su región Fc del anticuerpo anti-PD-1.

Ejemplo 24: Determinación de citotoxicidad dependiente de complemento de anticuerpo anti-PD-1 En este ejemplo, se examinó la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo anti-PD-1. Dos versiones de 5C4, una con región Fc de IgGl humana (5C4-IgGl) y la otra con región Fc de IgG4 humana (5C4-IgG4), fueron probadas en el análisis. Brevemente, células T CD4 humanas purificadas (equipo de purificación de células T CD4 Dynal) fueron activadas mediante anticuerpo anti-CD3 enlazado a placa (BD) para inducir la expresión de PD-1. Diluciones seriales del anticuerpo anti-PD-1 (5C4) y anticuerpos de control de 50 µg/ml a 640 pg/ml fueron probadas en cuanto a CDC en presencia de complemento humano (Quidel-A113) . Se usó azul de Alamar (Biosource Internacional) para medir la citotoxicidad. La placa fue leída sobre un lector de placa fluorescente (EX530 EM590). Los conteos de célula viables son proporcionales a las unidades de fluorescencia. Los resultados mostraron que ni 5C4-IgGl o 5C4-IgG4 moderaban la CDC sobre células T CD4 activadas, en tanto que el anticuerpo de control positivo (anticuerpo anti-HLA-ABC) si (figura 54).

Ejemplo 25: Determinación de expresión de PD-1 sobre células T humanas En este ejemplo, PBMC humanas de diferentes donadores fueron examinados en cuanto a expresión de PD-1 en varios subconjuntos de células mediante FACS. Anticuerpo anti-PD-1 biotinilado, que ha mostrado una sensibilidad mucho más alta que el anticuerpo anti-PD-1 disponible comercialmente sobre la detección de moléculas de PD-1 sobre la superficie celular fue usado en el análisis. El anticuerpo enlazado fue detectado usando una estreptavidina PE- conjugada. Se efectuaron análisis citométricos de flujo usando una citometría de flujo FACSscan (Becton Dickinson) y elementos de programación de Flo jo (Tree Star) . La expresión de PD-1 fue detectada sobre algunas células T humanas periféricas, pero no sobre células B o monolitos. El examen adicional de subconjuntos de célula T indica que PD-1 es expresado en células T de memoria CD4 y CD8 y efectoras, pero ausente en células T CD4 o CD8 naturales. La presente invención no estará limitada en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. Por -supuesto, varias modificaciones de la invención, además de aquellas descritas en la presente, se harán evidentes para aquellos experimentados en el arte a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente la invención estará limitada solamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas junto con el pleno alcance de equivalentes a las cuales las reivindicaciones tienen derecho .

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace antígeno del mismo, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a PD-1 y en donde el anticuerpo exhibe por lo menos una de las siguientes propiedades: (a) se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 x 10"7M o menor; (b) no se enlaza sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS humano; (c) incrementa la proliferación de células T en un análisis de reacción del linfocito mezclada (MLR) ; (d) incrementa la producción de interferon-gamma en un análisis de MLR o (e) incrementa la secreción de interleucina-2 (IL-2) en un análisis de MLR.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue es un anticuerpo de plena longitud de un isótipo de IgGI o IgG4.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de una sola cadena.
4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue se enlaza a PD-1 humano con una KD de 5 X 10"8 M o menor.
5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 X 10"8 M o menor.
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 5 X 10"9 M o menor.
7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 X 10"8 M y 1 X 10"10 M.
8. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace del antígeno del mismo, caracterizado porque el anticuerpo compite de manera cruzada por el enlace a PD-1 con un anticuerpo de referencia que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo gue consiste de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 y (b) una región variable de cadena pesada o una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14.
9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
13. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porgue la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
16. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-33 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
17. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada gue es el producto de o derivado de un gen VH 4-39 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
18. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo, caracterizado porgue comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen VK L6 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
19. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlacé de antigeno del mismo, caracterizado porgue comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen Vk L15 humano, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
20. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada de un gen VH 3-33 humano; (b) una región variable de cadena ligera de un gen humano VK L16 humano; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
21. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada de un gen VH 4-39 y (b)una región variable de cadena ligera de un gen humano; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
22. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3, en donde: (a) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35 y modificaciones conservadoras de las mismas; (b) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 50, 51, 52, 53, 54, 55, y 56 y modificaciones conservadoras de las mismas y (c) el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la secuencia de CDR2 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nos: 22, 23, 24, 25, 26, 27y 28 y modificaciones conservadoras de las mismas y la secuencia de CDR2 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de 43, 44, 45, 46, 47, 48, y 49 y modificaciones conservadoras de las mismas.
24. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de CDRl de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo gue comprende de secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nos: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21 y modificaciones conservadoras de las mismas y la secuencia variable de CDRl de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de 36, 37, 38, 39, 40 y 41 y modificaciones conservadoras de las mismas .
25. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde: (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14; (c) el anticuerpo se enlaza a PD-1 humano con una KD de 1 x 10"7 M o menor y (d) el anticuerpo no se enlaza sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS humano.
26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo comprende además por lo menos una de las siguientes propiedades : (a) el anticuerpo incrementa la proliferación de células T en un análisis de la acción del linfocito mezclada (MLR) ; (b) el anticuerpo incrementa la producción de interferon-gamma en un análisis de MLR o (c) el anticuerpo incrementa la secreción de interleucina-2 (IL-2) en un análisis de MLR.
27. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de enlace de antigeno del mismo, caracterizado porque comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49; (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 54 y 56; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende: (a) una CDR-1 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 15; (b) una CDR-2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 22; (c) una CDR-3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 29; (d) una CDR-1 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 36; (e) una CDR-2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 43; y (f) una CDR-3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 50.
29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende: (a) una CDR-1 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 16; (b) una CDR-2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 23; (c) una CDR-3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 30; (d) una CDR-1 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 37; (e) una CDR-2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR-3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 51.
30. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende: (a) una CDR-1 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 17; (b) una CDR-2 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 24; (c) una CDR-3 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 31; (d) una CDR-1 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 38; (e) una CDR-2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 45; y (f) una CDR-3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 52.
31. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende: (a) una CDR-1 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 18; (b) una CDR-2 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 25; (c) una CDR-3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 32; (d) una CDR-1 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 39; (e) una CDR-2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 46; y (f) una CDR-3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 53.
32. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende: (a) una CDR-1 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 19; (b) una CDR-2 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 26; (c) una CDR-3 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 33; (d) una CDR-1 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 40; (e) una CDR-2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 47; y (f) una CDR-3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 54.
33. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende: (a) una CDR-1 de región variable de cadena pesada gue comprende SEQ ID NO: 20; (b) una CDR-2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 27; (c) una CDR-3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 34; (d) una CDR-1 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 41; (e) una CDR-2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 48; y (f) una CDR-3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 55.
34. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende: (a) una CDR-1 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 21; (b) una CDR-2 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 28; (c) una CDR-3 de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35; (d) una CDR-1 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 42; (e) una CDR-2 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 49; y (f) una CDR-3 de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 56.
35. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 (b) una región variable de cadena ligera gue comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a PD-1.
36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;
37. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9;
38. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada que compr nde la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;
39. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11;
40. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;
41. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada gue comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
42. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;
43. Una composición caracterizada por que comprende el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo, de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1-36 y un portador aceptable farmacéuticamente.
44. Un inmunoconjugado, caracterizado porgue comprende el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo, de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1-36, enlazado a un agente terapéutico.
45. Una composición caracterizada por que comprende el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 44 y un portador aceptable farmacéuticamente.
46. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porgue el agente terapéutico es una citotoxina.
47. Una composición caracterizada porque comprende el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 46 y un portador aceptable farmacéuticamente.
48. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el agente terapéutico es un isótopo radioactivo.
49. Una composición caracterizada por que comprende el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 48 y un portador aceptable farmacéuticamente.
50. Una molécula bisespecifica caracterizada porque comprende el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1-36, enlazada a una segunda porción funcional que tiene una especificidad de enlace diferente que el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo.
51. Una composición caracterizada por que comprende la molécula bisespecifica de conformidad con la reivindicación 50 y un portador aceptable farmacéuticamente.
52. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque codifica el anticuerpo o porción de enlace de antigeno del mismo de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1-36.
53. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 52.
54. Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 53.
55. Un ratón transgénico caracterizado porque comprende transgenes de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobina humana, en donde el ratón expresa el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36.
56. Un hibridoma preparado a partir del ratón de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el hibridoma produce el anticuerpo.
57. Un método para modular una respuesta inmune en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto el anticuerpo o porción de enlace antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, de tal manera que se modula la respuesta inmune en el sujeto.
58. Un método para inhibir el crecimiento de células de tumor en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-PD-1 o porción de enlace de antígeno del mismo.
59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico .
60. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
61. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo plenamente humano.
62. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque las células de tumor son de un cáncer seleccionado del grupo que consiste de melanoma, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de pecho, cáncer de colon y cáncer de pulmón.
63. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque las células de tumor son de un cáncer seleccionado de la lista que consiste de cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estomago, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas en las que se incluyen leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblastica aguda, leucemia linfoblastica crónica, tumores sólidos de niñez, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uretra, carcinoma de pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS) , linfoma de CNS primario, angiogenesis de tumor, tumor de eje espinal, glioma de tallo cerebral, adenoma pituitario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de célula escamosa, linfoma de célula T, cánceres inducidos ambientalmente en los que se incluyen aquellos inducidos por asbestos y combinaciones de los cánceres .
64. Un método para inhibir el crecimiento de células de tumor en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto el anticuerpo o porción de enlace de antigeno del mismo de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1-36 en una cantidad efectiva para inhibir el crecimiento de las células de tumor.
65. Un método para tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto, caracterizado porgue comprende administrar al sujeto el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, de tal manera que el sujeto es tratado por la enfermedad infecciosa.
66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la enfermedad infecciosa seleccionada de la lista que consiste de: HIV, influenza, herpes, Giardia, malaria, Leishmania, la infección patogénica del virus de hepatitis (A, B y C) , virus de herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, CMV y virus de Epstein Barr),. adenovirus, virus de influenza, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus de coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de paperas, rotavirus, virus de sarampión o cisticercosis , virus de rubéola, parvovirus, virus de vacuna, virus de HTLV, virus de dengue, papilomavirus, virus de molusco, poliovirus, virus de rabia, virus de JC y virus de encefalitis arboviral, infección patógena por las bacterias clamidia, bacterias riquetsias, micobactepas, estafilococos, estreptococos, pneumococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, plaga, leptospirosis y bacterias de enfermedad de Lymes, infección patógena por el hongo Candida (albicans, kruseí, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkn, Blastomyces dermatitidis, Parococcidioides brasiliensis, Coccidioides ímmitis e Histoplasma capsulatum e infección patógena por los parasitis Entamoeba histolítica, Balantidio coli, Naegleriafowlep, Acanthamoeba sp., Giardia lambía, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinn, Plasmodium vivax, Babesia microtí, Tppanosoma brucei, Tripanosoma cruzi, Leishmania donovam, Toxoplasma gondi y Nippostrongylus brasiliensis .
67. Un método para mejorar una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto: (i) el antigeno y (n) el anticuerpo o porción de enlace de antigeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, de tal manera que se mejora la respuesta inmune al antígeno en el sujeto.
68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el antígeno es un antígeno de tumor, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno .
69. Un método para el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa, el método esta caracterizado porque comprende: (a) administrar un anticuerpo anti-PD-1 a un sujeto y (b) administrar un anticuerpo anti-CTLA-4 al sujeto .
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 es administrado a una dosis subterapéutica.
71. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado a una dosis subterapéutica.
72. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo anti-CTLA-4 son cada uno administrados a una dosis subterapéutica .
73. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 y al anticuerpo anti-CTLA-4 son administrados secuencialmente.
74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 es administrado antes del anticuerpo anti-CTLA-4
75. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado antes que el anticuerpo anti-PD-1.
76. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo anti-CTLA-4 son administrados concurrentemente.
77. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 y al anticuerpo anti-CTLA-4 son mezclados como una sola composición y administrados concurrentemente.
78. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque comprende administrar aun sujeto (a) una composición que comprende el anticuerpo anti-PD-1 y un portador aceptable farmacéuticamente y (b) una composición que comprende el anticuerpo anti-CTLA-4 y un portador aceptable farmacéuticamente.
79. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69 a 78, caracterizado porque la enfermedad hiperproliferativa es cáncer.
80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque caracterizado porque el cáncer es cáncer de colon.
81. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 79, caracterizado porque el sujeto es un humano.
82. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 79, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo de secuencia humana.
83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el anticuerpo de secuencia humana de anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal.
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal de secuencia humana de anti-PD-1 es 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 o 5F4.
85. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 79, caracterizado porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo de secuencia humana.
86. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el anticuerpo de secuencia humana de anti-CTLA-4 es un anticuerpo monoclonal.
87. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal de secuencia humana de anti-CTLA-4 es 10D1 (MDX-010) .
88. Un método para alterar un evento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, el método esta caracterizado porque comprende: (a) administrar un anticuerpo anti-PD-1 a un sujeto y (b) administrar una dosis subterapeutica de al anticuerpo anti-CTLA-4 al sujeto.
89. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 es administrado en una dosis subterapeutica.
90. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 y al anticuerpo anti-CTLA-4 son administrados secuencialmente.
91. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 es administrado antes del anticuerpo anti-CTLA-4.
92. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado antes del anticuerpo anti-PD-1.
93. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 y al anticuerpo anti-CTLA-4 son administrados concurrentemente.
94. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el anticuerpo anti-PD-1 y al anticuerpo anti-CTLA-4 son mezclados como una sola composición y administrados concurrentemente.
95. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque comprende administrar a un su jeto (a) una composición que comprende el anticuerpo ant?-PD-1 y un portador aceptable farmacéuticamente y (B) una composición que comprende el anticuerpo ant?-CTLA-4 y un portador aceptable farmacéuticamente.
96. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 95, caracterizado porque la enfermedad hiperproliferativa es cáncer.
97. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque el cáncer es cáncer de colon.
98. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 95, caracterizado porque el sujeto es un humano.
99. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 95, caracterizado porque el anticuerpo ant?-PD-1 es un anticuerpo de secuencia humana.
100. El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque el anticuerpo de secuencia humana ant?-PD-1 es un anticuerpo monoclonal.
101. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal de secuencia humana ant?-PD-1 es 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 O 5F4.
102. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 95, caracterizado porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo de secuencia humana.
103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el anticuerpo de secuencia humana anti-CTLA-4 es un anticuerpo monoclonal.
104. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal de secuencia humana anti-CTLA-4 es 10D1 (MDX-010) .
105. Un método para la preparación de un anticuerpo anti-PD-1, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDRl que es seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID Nos: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21, una secuencia de CDR2 que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs:22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28 y una secuencia de CDR3 que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 3, 34 y 35 o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDRl que es seleccionada del grupo gue consiste de SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42, una secuencia de CDR2 que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49 y una secuencia de CDR3 que es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56; (b) alterar por lo menos un residuo de aminoácido dentro de por lo menos una secuencia de anticuerpo de región variable; la secuencia es seleccionada de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y la secuencia de región variable de cadena ligera para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada y (e) expresar la secuencia de anticuerpo variable como una proteina.