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TWI847989B - 結合cd137及ox40的抗體分子 - Google Patents

結合cd137及ox40的抗體分子 Download PDF

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Abstract

本申請案係關於結合CD137及OX40二者且能夠對二者產生促效作用之抗體分子。該等抗體分子包含基於CDR之CD137結合位點，及定位於抗體分子之恆定域的OX40抗原結合位點。本發明之抗體分子例如應用於諸如癌症及感染性疾病之疾病治療。

Description

結合CD137及OX40的抗體分子
發明領域 本發明係關於結合CD137及OX40二者且能夠對二者產生促效作用(agonise)之抗體分子。該等抗體分子包含基於CDR之CD137結合位點，及定位於抗體分子之恆定域的OX40抗原結合位點。本發明之抗體分子例如應用於諸如癌症及感染性疾病之疾病治療。
發明背景 哺乳動物免疫系統係精細平衡的系統，其有時由諸如癌症之疾病擾亂。檢查點受體藉由發揮共刺激或共抑制效應，在免疫系統對疾病之反應中起到工具性作用，共刺激效應或共抑制效應之平衡決定免疫反應之結局(Pardoll, 2012)。共抑制劑抑制T細胞增殖且誘導抗發炎性細胞介素之釋放。其減弱發炎且避免來自過度免疫反應之器官/組織損傷。另一方面，共刺激劑促進T細胞無性擴增、效應子分化及存活，以便促進保護性免疫反應之產生。
一種經論證癌症免疫療法方式藉由用阻斷共抑制受體功能或誘導共刺激受體活性之抗體靶向此等檢查點受體，觸發免疫系統識別且殺死腫瘤細胞(Pardoll, 2012)。阻斷共抑制受體之活性的抗體已展示良好臨床活性，且目前批准用於癌症治療(Larkin等人, 2015)。誘導共刺激受體之活性的抗體已在臨床前模型系統中展現較大潛力(Moran等人, 2013; Schaer等人, 2014)，且數種藥劑目前處於臨床試驗中(Mayes等人, 2018; Melero等人, 2013)。此等抗體由於其旨在模擬此等共刺激受體之配位體而亦被稱為促效劑抗體。
數種T細胞共刺激受體為TNF受體超家族之成員，TNF受體超家族為在細胞表面處所表現之免疫及非免疫細胞功能二者中所涉及的一個蛋白質大家族(Bremer, 2013)。對形成於TNF家族受體與其同源配位體之間的錯合物(complex)之結構分析表明，在大部分情況下，存在三聚體對三聚體化學計量，且TNFR家族配位體典型地在細胞表面處以三聚體形式表現(Wajant, 2015)。所提出之TNFR活化模型為與三聚配位體之相互作用誘導單體受體之三聚合作用且引發信號轉導。此預先假定TNFR家族成員以單體形式表現，且只有配位體相互作用誘導受體三聚體之形成。此模型最近已受到質疑(Vanamee及Faustman, 2018)，且此等單體在不存在配位體相互作用之情況下締合成高階結構仍為爭論的問題。需要多個受體錯合物之額外聚集的預組裝受體二聚體或甚至無活性三聚體的存在，將解釋相比於可形成配位體超聚體(supercluster)且誘導TNF受體超聚體，藉此誘導較高位準受體活化之TNF配位體膜結合形式，一些可溶性、僅三聚體之TNF配位體的較低活性(Müller等人, 2008)。此理論亦與以下觀測結果一致：TNFR特異性抗體典型地不具有促效活性或具有低促效活性，且需要抗體-TNF受體錯合物之二次交聯以便誘導足夠的受體聚集及活化，藉此模擬TNF配位體超聚體(Wajant, 2015)。
抗體-TNF受體錯合物之二次交聯可藉由交聯劑，諸如蛋白A或蛋白G或靶向TNF受體特異性促效劑抗體之恆定域的二次抗體在活體外達成(Vanamee及Faustman, 2018; Wajant, 2015)。然而，在活體內，此二次交聯需要與呈現於諸如巨噬細胞、NK細胞或B細胞之免疫細胞表面上的Fcγ受體相互作用。抗體與Fcγ受體之相互作用很複雜，此係由於在人類中存在6種Fcγ受體，其具有不同表現模式及對4種人類IgG同型之親和性(Bruhns等人, 2009)。已展示Fcγ受體係活體內靶向TNF受體超家族目標之促效劑抗體的最佳抗腫瘤活性所需的(Bulliard等人, 2013; Bulliard等人, 2014)。然而，TNFR促效劑抗體對誘導受體強活化之Fcγ受體介導之交聯的依賴性可能歸因於以下數種原因而限制該等抗體之整體活體內活性：1)抗體結合細胞將需要與表現Fcγ受體之細胞以反式(trans )相互作用，且此相互作用之頻率將限制表現TNFR之細胞的活化；2)Fcγ受體對人類IgG之親和性與典型治療性抗體對其目標之親和性相比，典型地遠低(分別微莫耳範圍對奈莫耳範圍)；及3)Fcγ受體介導抗體之效應功能，諸如ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)及ADCP(抗體依賴性細胞吞噬作用)，且因此具有消除促效劑抗體意欲活化之細胞的潛在可能(Mayes等人, 2018)。
使用同源抗原中之一者交聯TNF受體促效劑之二價雙特異性抗體代表Fcγ受體介導之交聯的替代物。抗體交聯效應將由與TNF受體家族成員及另一細胞表面表現受體在相同細胞上以順式(cis )，或在另一細胞上以反式結合產生。此抗體交聯機制將隨後引起TNF受體之超聚集，其限制條件為第二目標以高位準表現，模擬TNF配位體超聚體。相對於單特異性促效劑抗體，TNFR促效劑抗體開發之雙特異性抗體方法具有數個理論優點：1)可藉由靶向第二抗原，諸如檢查點受體或腫瘤相關抗原，將TNFR促效作用導引至腫瘤微環境及周邊中之特定免疫細胞，作為雙特異性抗體之第二特異性；2)可將雙特異性抗體之交聯結合域的親和性設計成高於抗體對Fcγ受體之親和性，藉此使交聯更有效；3)可使用突變選擇性禁用抗體效應功能，藉此確保不存在意欲活化之細胞的耗乏；4)可在單一雙重促效劑分子中達成二種獨立TNF受體之促效作用，將不同免疫細胞之活化組合成對免疫反應之較強刺激；5)靶向共表現受體可以順式引起單一細胞活化，而不需要共同相互作用之二個細胞。
數種TNF受體家族成員在免疫細胞中具有重疊表現模式。具體而言，OX40、CD137、GITR及CD27在活化T細胞上表現，且OX40及CD137之共表現已以實驗方式驗證(Ma等人, 2005)。
OX40主要在活化T細胞，包括CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、第1型及第2型T輔助(Th1及Th2)細胞及調節T(Treg)細胞上表現，且亦在活化自然殺手(NK)細胞上表現。OX40與其在抗原呈現細胞(APC)上表現之配位體OX40配位體(OX40L)的相互作用增加T細胞無性擴增、分化及存活，且促進記憶T細胞產生(Croft等人, 2009)。OX40刺激可具有對T細胞之直接影響，促進其增殖及存活，或經由諸如IL2及IFNγ之發炎性細胞介素之提高產生，具有間接影響。OX40信號傳遞亦可調節Treg功能，儘管在此等細胞上OX40信號傳遞消除Treg之抑制活性(Takeda等人, 2004)。在癌症中，發現OX40在來自患有頭頸部癌、黑素瘤及結腸直腸癌之患者的腫瘤浸潤T細胞上表現，其中OX40陽性淋巴球之高位準與較好存活相關(Petty等人, 2002; Vetto等人, 1997)。在小鼠中對OX40促效劑抗體之臨床前研究已展現在數種同基因型腫瘤模型中之治療功效，但以單一療法形式靶向OX40之有效性可變化且似乎與腫瘤之免疫原性相關(Kjærgaard等人, 2000)。此與腫瘤特異性T細胞上之OX40表現將需要可能未由免疫原性不良之腫瘤提供的足夠預致敏(priming)的觀點一致。在某些同基因型模型中，已確定OX40抗體OX86之抗腫瘤活性由其以Fcγ受體依賴性方式耗乏表現高位準OX40之腫瘤內Treg的能力產生(Bulliard等人, 2014)。
OX40之促效劑抗體目前處於針對癌症之臨床試驗中，其中大部分抗體展示良好安全概況，但臨床活性有限(Curti等人, 2013)。針對此等抗體所選擇的同型不同，但數種研究性藥物為Fcγ受體致能人類IgG1抗體，其可能旨在以耗乏Treg作為作用機制。此等抗體缺少明確臨床活性，促使OX40促效劑抗體與數種其他療法之組合試驗，該等療法包括PD1/PD-L1或CTLA4抑制、抗VEGF療法及酪胺酸激酶抑制劑阿西替尼(axitinib)。
已展現此Treg耗乏作用機制在臨床前模型中極有效，且可靶向數種受體以消除Treg，該等受體諸如GITR(Bulliard等人, 2014)及CTLA4(Simpson等人, 2013)。然而，尚未展示靶向人類中之等效受體的抗體在臨床中具有相同位準之抗腫瘤功效(Glisson等人, 2016; Tran等人, 2017)。造成此之原因不明確，但相比於小鼠同基因型腫瘤模型，人類腫瘤中諸如巨噬細胞之表現Fcγ受體之細胞的較低位準(Milas等人, 1987)可部分解釋此等抗體之作用機制缺少臨床可譯性(translatability)。其他原因可為相比於小鼠Treg，人類Treg中此等標記物表現之不同位準(Aspeslagh等人, 2016)。
CD137亦在活化T細胞，包括CD4+、CD8+、Th1、Th2及Treg上表現，但其表現圖譜亦包括B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T(NKT)細胞及樹突狀細胞(DC)(Bartkowiak及Curran, 2015)。如在OX40之情況下，CD137與其配位體之相互作用觸發胞內信號傳遞路徑之活化，該活化引起T細胞存活、增殖及細胞毒性活性之誘導。在與CD4+ T細胞相比時，CD137刺激優先刺激CD8+ T細胞，且引起其增殖、存活及經由產生發炎性細胞介素而引起細胞毒性效應功能，且亦促成記憶CD8+ T細胞之分化及維持。亦已展現CD137在腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之腫瘤反應性次群上特異性表現(Weigelin等人, 2016)，其為CD137之活體內促效接合及CD137在授受性轉移之TIL選擇中之用途提供了部分理論基礎。CD137單一療法在諸如MC38、CT26及B細胞淋巴瘤之數種臨床前免疫原性腫瘤模型中有效。然而，為了甚至更有效地治療已建立之腫瘤，已展示CD137接合與其他藥劑(諸如化學療法、細胞介素及其他檢查點調節劑)之組合對腫瘤生長減少具有增強的有利效果(Bartkowiak及Curran, 2015)。在臨床前模型中用促效劑抗體靶向CD137亦與肝炎及暫時性肝功能指數上升(transaminitis)相關，其由依賴於骨髓細胞之IL27產生的CD8+ T細胞累積增加引起(Bartkowiak等人, 2018)。
CD137之促效劑抗體目前處於針對癌症之臨床試驗中，然而，臨床進展已由劑量限制性高度肝炎減緩，可能類似於在小鼠中進行之觀測(Sanchez-Paulete等人, 2016)。烏瑞魯單抗(BMS-663513)為第一種進入臨床試驗之CD137促效劑抗體，且在歸因於超過1 mg/kg之劑量下的致死性肝毒性停止試驗之前，展示臨床活性之跡象(Segal等人, 2017)。烏瑞魯單抗為能夠在不存在交聯之情況下活化CD137之人類IgG4抗體(US 8,137,667 B2)，不過如根據超聚集介導之完全受體活化之理論所預期，在交聯後活性增加。對比而言，在烏圖木單抗(PF-05082566)之情況下，在測試至多10 mg/kg時，未觀測到劑量限制性毒性(Tolcher等人, 2017)。烏圖木單抗為人類IgG2抗體，且僅能夠在交聯後活化CD137(US 8,337,850 B2)。正在進行利用二種抗體之其他臨床試驗，測試單一療法及與放射療法及化學療法，以及現有靶向療法及免疫腫瘤學療法之組合。歸因於在烏瑞魯單抗之情況下所發現之肝毒性，此抗體必須以極低位準給藥，且在此等位準下尚未觀測到臨床活性之早期跡象。
數種靶向CD137或OX40之雙特異性分子處於數家公司之早期開發中。CD137刺激之腫瘤靶向正由Macrogenics使用HER2靶向及EphA2靶向CD137促效劑DART分子測試，由Roche使用FAPalpha靶向或CD20靶向CD137配位體融合蛋白測試，且由Pieris Pharmaceuticals使用HER2靶向CD137促效劑抗運載蛋白(anticalin)分子測試。OX40及CTLA4雙重靶向正由Aligator Biosciences測試，以特異性耗乏預期表現高位準之二種目標的瘤內Treg。
已展示活體內OX40及CD137之共刺激刺激CD4+及CD8+ T細胞二者，且誘導經歷抗原及未經歷抗原之旁觀(bystander)CD4+ T細胞二者的細胞毒性功能(Qui等人, 2011)。引起關注地，雙重共刺激能夠誘導移植CD4+ T細胞減少經黑素瘤同基因型腫瘤模型(B16-F10)接種之免疫缺乏小鼠中之腫瘤生長，突顯此療法誘導CD4+ T細胞之腫瘤破壞活性的能力(Qui等人, 2011)。目前正在進行研究將OX40促效劑(PF-04518600)與CD137促效劑(烏圖木單抗(utomilumab) - PF-05082566)組合之效果的I期劑量遞增臨床試驗(NCT02315066)，以評估此組合之安全性，且目前亦在進行將相同TNFR促效劑與經艾維路單抗(avelumab)之PD-1阻斷組合之Ib/II期臨床試驗(NCT02554812)。此等研究將查看對於促效作用將需要Fcγ受體交聯之簡單單特異性促效劑抗體之組合，且可能因此低估靶向呈組合形式之此等受體的臨床活性。
最近亦已藉由將二種針對OX40及CD137之現有抗體以化學方式複合(conjugating)，使用雙特異性抗體方法在小鼠中測試OX40及CD137之雙重共刺激(Ryan等人, 2018)。被稱為奧瑟單抗(OrthomAb)之分子能夠活體外誘導CD4+及CD8+ T細胞之增殖，以及發炎性細胞介素IL-2及IFNγ之產生。在活體內，奧瑟單抗亦能夠減少黑素瘤同基因型腫瘤模型(B16-F10)之腫瘤生長。在接合至二種目標時，預計奧瑟單抗之二價雙特異性性質允許分子之高效交聯，引起OX40及CD137受體之聚集，且因此引起T細胞活化。此等結果驗證在單分子中靶向OX40及CD137之雙特異性抗體方法。奧瑟單抗分子之製程產生多個高階物種，以及需要藉由數輪尺寸排阻步驟進一步純化之所需抗體二聚體。此製程不大可能使此方法對除驗證目標之特定組合之研究工具外的任何物品可行。此外，此雙特異性抗體之結構，其中二個較大巨分子由較小化學連接子結合在一起，可能在活體內不穩定，且未展示解決此問題之藥物動力學資料。令人遺憾地，僅將奧瑟單抗之活體內抗腫瘤效果與OX40或CD137促效劑抗體之活性進行比較，且未與該等抗體之組合進行比較，使得不清楚該分子歸因於其雙特異性而具有效果，或歸因於奧瑟單抗以針對OX40及CD137之單劑促效劑抗體之組合形式起作用而具有效果。
將對TNF受體家族成員OX40及CD137之促效作用組合於單一二價、雙特異性且穩定分子中之理論基礎因此已建立，且具有執行OX40及CD137之非Fcγ受體依賴性超聚集，藉此活化CD4+及CD8+ T細胞二者以發動有效抗腫瘤免疫反應之潛力。基於在靶向OX40或CD137路徑之單株抗體之情況下所產生的臨床前組合資料，此分子亦具有作為增強標準護理癌症療法效果以提供患者益處之組合搭配物的潛力。
發明概要 諸位發明人已認識到，結合至CD137及OX40二者，且當結合至二種目標時，能夠誘導OX40及/或CD137聚集及信號傳遞的抗體分子例如在腫瘤微環境中，對活化免疫細胞高度有效。另外，諸位發明人認識到，將CD137之活化限定至CD137及OX40共表現之位置將對活化免疫細胞高度有效，而不誘發與已知抗CD137促效劑分子相關之毒性。預期此適用於例如用於治療癌症及其他疾病之免疫療法。
如以上背景章節中所描述，認為OX40配位體或CD137配位體分別與OX40或CD137之初始連接引發一連串事件，其引起受體三聚合作用，之後為受體聚集、活化及強效抗腫瘤T細胞活性之後續引發。為了使治療劑有效達成OX40或CD137之活化，因此預期數個受體單體需要以模擬由三聚配位體橋接之方式橋接在一起。
諸位發明人已分離抗體分子，其包含基於互補決定區(CDR)之CD137抗原結合位點，及定位於抗體分子之恆定域的OX40抗原結合位點。諸位發明人已展示當二種目標共表現時，此類抗體分子能夠同時結合二種目標。共表現在此意義上涵蓋CD137及OX40在相同細胞(例如免疫細胞)上表現之情境，及CD137及OX40在不同細胞(例如在腫瘤微環境中鄰近彼此而定位之二種不同免疫細胞)上表現之情境。因此，咸信本發明之抗體分子能夠以順式結合至在單一細胞上表現之二種目標，且能夠以反式結合至在不同細胞上表現之二種目標。
諸位發明人已進一步展示，包含基於CDR之CD137抗原結合位點及定位於抗體分子之恆定域之OX40抗原結合位點的抗體分子，能夠二價結合至二種目標。具體而言，諸位發明人展示，當使此類抗體分子結合至OX40及CD137，且使所得錯合物交聯且經歷質譜分析時，展示19%之錯合物包含二個OX40部分及二個CD137部分，表明抗體分子二價結合至二種目標。
此外，諸位發明人已展示，當此等抗體分子結合至二種目標時，其能夠活體外誘導OX40及CD137之聚集及信號傳遞。藉由以此方式起作用，此類抗體分子被稱為「雙重促效劑」，亦即抗體分子能夠由於藉由雙重結合至OX40及CD137二者交聯而經受體誘導信號傳遞。
如實例中所展現，OX40優先在CD4+ T細胞上表現，且CD137優先在CD8+ T細胞上表現。諸位發明人已展現抗體分子能夠誘導對CD4+ T細胞上之OX40的促效作用。在此等情況下，咸信抗體分子經其基於CDR之抗原結合域結合至CD137以交聯抗體分子，且OX40抗原結合域同時能夠結合至、聚集且活化在CD4+ T細胞上表現之OX40。類似地，諸位發明人已展現抗體分子能夠誘導對CD8+ T細胞上之CD137的促效作用。在此等情況下，咸信抗體分子經其OX40抗原結合域結合至OX40以交聯抗體分子，且OX40抗原結合域同時能夠結合至、聚集且活化在CD8+ T細胞上表現之CD137。
此外，諸位發明人已展示，當CD137及OX40共表現時，包含如上文所詳述之二個抗原結合位點，且經修飾以減少或消除與Fcγ受體結合的抗體分子能夠經受體誘導信號傳遞，展示在不需要由Fcγ受體交聯之情況下出現的促效作用。由於Fcγ受體介導之交聯並非為本發明抗體分子之活性所需的，因此預期經OX40或CD137受體之信號傳遞定位於存在二種目標之位點，諸如在腫瘤微環境中。因此，抗體分子能夠基於二種特異性目標之表現自主地驅動促效作用，且不需要額外交聯劑。
此外，由於Fcγ受體結合為ADCC所需的，因此預期與Fcγ受體結合之此減少亦將引起降低之ADCC，使得目標免疫細胞將不被本發明之抗體分子耗乏。諸位發明人認為此很重要，因為抗體分子經設計以活化表現CD137及/或OX40之免疫細胞，以便促進免疫反應。此等免疫細胞之耗乏因此為非所需的。諸位發明人展現，具有本文所定義之特性的抗體分子能夠活化免疫細胞且誘導免疫細胞之增殖，該等免疫細胞尤其為表現CD137及/或OX40之T細胞。
諸位發明人已進一步展示，包含如上文所詳述之CD137及OX40抗原結合位點的抗體分子能夠在小鼠中活體內抑制腫瘤生長。此外，相比於二種單特異性抗體分子之組合，其中抗體分子中之一者包含基於CDR之CD137抗原結合位點，且另一分子包含基於CDR之OX40抗原結合位點，在雙特異性抗體分子之情況下觀測到更有效的腫瘤生長抑制，表明OX40及CD137之同時接合及促效作用引起改良抗腫瘤功效。另外，展示抗體分子能夠在CT26小鼠腫瘤模型中誘導完全腫瘤消退，及針對用腫瘤細胞再攻擊(re-challenge)之保護性免疫記憶的建立。因此預期本發明之抗體分子將在人類患者之癌症的治療中展示功效。由於此等抗體分子已消除ADCC活性，預期其因此藉由對目標免疫細胞產生促效作用而抑制腫瘤生長，且不顯著耗乏此等有益T細胞(記憶及效應細胞)。
如在小鼠中之活體內研究中所觀測，由本文所描述之抗體分子誘導的T細胞活化及增殖為全身性的，而非腫瘤局部效果。此外，在經本發明之抗體分子投與之食蟹獼猴中之初步劑量範圍發現研究中，觀測到周邊中央記憶及效應記憶CD4+及CD8+ T細胞之增殖及活化的增加。因此，如同對腫瘤微環境中之T細胞的靶向，預期表現OX40及CD137之周邊記憶T細胞由抗體分子靶向，以驅動腫瘤反應性T細胞之擴增，其將隨後提供該等腫瘤反應性T細胞的抗腫瘤效果。
因此，除實際腫瘤自身之位點以外，受腫瘤影響之解剖位置亦可視為包括產生腫瘤特異性免疫反應之體內其他地方的位置，例如周邊淋巴結。
如上文背景章節中所解釋，CD137促效劑分子之臨床開發已至少部分歸因於治療與劑量限制性高度肝炎(烏瑞魯單抗)或低臨床功效相關(烏圖木單抗)而受到阻礙。
在不希望受理論束縛的情況下，認為肝中存在的T細胞可具有由抗CD137促效劑分子活化之潛在可能，導致肝炎。已展示CD8+ T細胞促進敗血症/病毒感染之後的肝炎及肝細胞凋亡(Wesche-Soldato等人, 2007)。已展示小鼠中之抗CD137促效劑抗體療法引起CD137依賴性T細胞浸潤進入肝臟(Dubrot J等人, 2010)。當結合在一起時，來自此等研究之結果表明具有高活性之抗CD137促效劑抗體，諸如烏瑞魯單抗，可引起活化CD8+ T細胞浸潤進入肝臟，藉此導致肝炎。烏圖木單抗之活性可能過低而使得此影響無法被觀測到。可替代地，在烏瑞魯單抗治療之情況下所觀測到之劑量限制性肝臟毒性可歸因於此抗體所結合之特定抗原決定基。
諸位發明人進行廣泛選擇程式以分離以高親和性結合二聚人類CD137，亦即預期以高親留力(avidity)結合CD137之抗體分子。鑒於所使用之選擇方案，預期抗體分子以比針對二聚CD137所觀測到之親和性低的親和性結合至單體CD137。
如本文中所提及之『親和性』可以指如藉由KD 所量測，抗體分子與其同源抗原之間結合相互作用的強度。如將對熟習此項技術者顯而易見，在抗體分子能夠與抗原形成多個結合相互作用時(例如在抗體分子能夠二價結合抗原，且任擇地，抗原為二聚時)，如藉由KD 所量測之親和性亦可受親留力影響，其中親留力係指抗體-抗原錯合物之總強度。
CD137由諸如T細胞之免疫細胞的表現在活化時上調。在不希望受理論束縛的情況下，認為歸因於CD137在活化免疫細胞上之高表現，CD137將在此類細胞表面上呈二聚體、三聚體及高階多聚體形式。對比而言，初始免疫細胞，諸如初始T細胞，在其細胞表面上表現低或可忽略位準之CD137，且存在的任何CD137因此可能呈單體形式。因此預期以高親留力結合至CD137之抗體分子相對於初始免疫細胞，將優先結合至活化免疫細胞，諸如活化T細胞。
根據上文，因此預期本發明之抗體分子在不存在經由與OX40之接合交聯的情況下，將在很大程度上無法活化CD137。此外，如上文所描述，諸位發明人開發抗體分子，其中Fcγ受體介導之交聯已經降低或消除，期望此將避免在存在很少或不存在OX40共表現之位置處的CD137活化。展示Fcγ受體結合之禁用不影響抗體分子之抗腫瘤活性。在不希望受理論束縛的情況下，咸信當向患者投與時，此類抗體分子將展示降低之毒性。認為此係因為CD137活化將在很大程度上限於OX40及CD137在足以驅動CD137之聚集及活化的位準下共表現之位置。諸位發明人已展示，在食蟹獼猴中之初步劑量範圍發現研究中，本發明之抗體分子的劑量至多30 mg/kg良好耐受。
諸位發明人已展示，本發明之抗體分子能夠甚至在不存在交聯之情況下誘導低位準之OX40聚集及活化。不同於CD137促效劑抗體，OX40促效劑抗體在臨床上未展示任何劑量限制性毒性(DLT)，且因此未預期在不存在交聯之情況下的OX40促效活性代表臨床治療之問題。相反，取決於待治療之病狀，在不存在交聯之情況下由抗體分子引起之低位準OX40促效活性可為有利的。在不希望受理論束縛的情況下，認為具有此特性之包含OX40抗原結合位點的抗體分子藉由在不存在交聯之情況下誘導腫瘤反應性T細胞之有限活化及擴增，產生隨後可由腫瘤微環境中之交聯Fcab分子進一步活化之腫瘤反應性T細胞的較大庫，可適用於癌症治療情形。
已經修飾以減少或消除與Fcγ受體結合之本發明之抗體分子的另一優點可為此等抗體分子具有抗腫瘤活性，該抗腫瘤活性不依賴於表現OX40之調節T細胞(Treg)的耗乏。Treg定位於周邊，其具有潛在保護性，且可降低可由過度刺激免疫系統所引起之自體免疫的影響(Vignali DA等人, 2008)。因此，已假定在小鼠模型中Treg耗乏可對減少腫瘤生長具有顯著效果(Bulliard等人, 2014; Simpson等人, 2013)。然而，人類腫瘤中之Treg耗乏可藉由ADCC來達成的證據有限，且若Treg耗乏確實在人類中出現，則此似乎並未引起如在小鼠模型中已觀測到之此類顯著抗腫瘤活性(Powell等人, 2007; Nizar S等人, 2009; Glisson BS等人, 2016; Tran B等人, 2017)。因此，若抗體分子未顯著耗乏Treg但仍具有抗腫瘤活性，則此可表明抗體分子具有不依賴於Fcγ受體介導之Treg耗乏的抗腫瘤活性。
已進一步展示抗體分子能夠以高親和性結合至人類及食蟹獼猴CD137及人類及食蟹獼猴OX40二者。此交叉反應性係有利的，因為其允許在臨床前開發期間在食蟹獼猴中進行抗體分子之給藥及安全性測試。
由諸位發明人鑑別之抗體分子的另一特徵為CD137之抗原結合位點及OX40之抗原結合位點均含於抗體結構自身內。特定而言，抗體分子不需要經由連接子或其他手段將其他蛋白與該抗體分子融合，以產生可二價結合至其目標二者的分子。此具有數個優點。具體而言，由諸位發明人鑑別之抗體分子可使用類似於針對標準抗體產生所採用之方法產生，因為該等抗體分子不包含任何額外融合部分。亦預期該結構引起改良之抗體穩定性，因為連接子可隨時間推移降解，產生抗體分子之異質群。僅具有一種融合蛋白之該群中之彼等抗體可能不能夠充當雙重促效劑，且由於藉由結合至OX40及CD137二者交聯而經受體進行信號傳遞。連接子之裂解或降解可在投與之前或在治療劑投與至個體之後發生(例如經由酶裂解或個體之活體內pH)，藉此導致在個體體內循環時其有效性的降低。由於由諸位發明人鑑別之抗體分子中不存在連接子，因此預期該等抗體分子在投與之前及之後均保留相同數目的結合位點。此外，自分子免疫原性之視角來看，由諸位發明人鑑別之抗體分子的結構亦為較佳的，因為融合蛋白或連接子或二者之引入可在分子向個體投與時誘導免疫原性，導致治療劑之有效性降低。
因此，本發明提供： [1]    一種抗體分子，其結合至CD137及OX40，該抗體分子包含 (a)    基於互補決定區(CDR)之CD137抗原結合位點；及 (b)    定位於該抗體分子之CH3域的OX40抗原結合位點； 其中該基於CDR之抗原結合位點包含列舉於以下中之CDR 1至CDR 6： (i)     分別為SEQ ID NO1 、 2 、 3 、 4 、 5 及6 [FS30-10-16] ； (ii)    分別為SEQ ID NO1 、 2 、 16 、 4 、 5 及6 [FS30-10-3] ； (iii)   分別為SEQ ID NO1 、 2 、 21 、 4 、 5 及6 [FS30-10-12] ； (iv)   分別為SEQ ID NO25 、 26 、 27 、 4 、 5 及28 [FS30-35-14] ；或 (v)    分別為SEQ ID NO33 、 34 、 35 、 4 、 5 及36 [FS30-5-37] ；且 其中該OX40抗原結合位點包含分別定位於該CH3域之AB、CD及EF結構環中之第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一、第二及第三序列分別具有SEQ ID NO51 、 52 及53 中所列舉之序列[FS20-22-49] 。
[2]    一種抗體分子，其結合至CD137及OX40，該抗體分子包含 (a)    基於互補決定區(CDR)之CD137抗原結合位點；及 (b)    定位於該抗體分子之CH3域的OX40抗原結合位點； 其中該基於CDR之抗原結合位點包含列舉於以下中之CDR 1至CDR 6： (i)     分別為SEQ ID NO7 、 8 、 9 、 10 、 11 及6 [FS30-10-16] ； (ii)    分別為SEQ ID NO7 、 8 、 17 、 10 、 11 及6 [FS30-10-3] ； (iii)   分別為SEQ ID NO7 、 8 、 22 、 10 、 11 及6 [FS30-10-12] ； (iv)   分別為SEQ ID NO29 、 30 、 31 、 10 、 11 及28 [FS30-35-14] ；或 (v)    分別為SEQ ID NO37 、 38 、 39 、 10 、 11 及36 [FS30-5-37] ；且 其中該OX40抗原結合位點包含分別定位於該CH3域之AB、CD及EF結構環中之第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一、第二及第三序列分別具有SEQ ID NO51 、 52 及53 中所列舉之序列[FS20-22-49] 。
[3]    如[1]或[2]之抗體分子，其中： (i)該第一序列定位於該抗體分子之該CH3域的位置14至18處； (ii)該第二序列定位於該抗體分子之該CH3域的位置45.1至77處；且/或 (iii)該第三序列定位於該抗體分子之該CH3域的位置93至101處；且 其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
[4]    如[1]至[3]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含SEQ ID NO:54 中所列舉之CH3域序列[FS20-22-49] 。
[5]    如[1]至[4]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含[1]或[2]之(i)至(iv)中之任一者中所列出之CDR 1至CDR 6。
[6]    如[1]至[5]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含[1]或[2]之(i)至(iii)中之任一者中所列出之CDR 1至CDR 6。
[7]    如[1]至[6]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含[1]或[2]之(i)中所列出之CDR 1至CDR 6。
[8]    如[1]至[7]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含重鏈可變(VH)域及/或輕鏈可變(VL)域，較佳VH域及VL域。
[9]    如[1]至[8]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含免疫球蛋白重鏈及/或免疫球蛋白輕鏈，較佳免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈。
[10]  如[8]或[9]之抗體分子，其中該抗體分子包含該VH域及/或VL域，較佳列舉於以下中之該VH域及該VL域： (i)     分別為SEQ ID NO12 及14 [FS30-10-16] ； (ii)    分別為SEQ ID NO18 及14 [FS30-10-3] ； (iii)   分別為SEQ ID NO23 及14 [FS30-10-12] ； (iv)   分別為SEQ ID NO170 及172 [FS30-35-14] ；或 (v)    分別為SEQ ID NO40 及42 [FS30-5-37] ；
[11]  如[10]之抗體分子，其中該抗體分子包含[10]之(i)至(iv)中之任一者中所列出之該VH域及VL域。
[12]  如[10]或[11]之抗體分子，其中該抗體分子包含[10]之(i)至(iii)中之任一者中所列出之該VH及VL域。
[13]  如[10]至[12]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含[10]之(i)中所列出之該VH域及VL域。
[14] 如[1]至[13]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子係人類IgG1分子。
[15]  如[1]至[14]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子包含以下抗體之重鏈及輕鏈： (i)     分別列舉於SEQ ID NO95 及97 中之FS20-22-49AA/FS30-10-16 的重鏈及輕鏈； (ii)    分別列舉於SEQ ID NO99 及97 中之FS20-22-49AA/FS30-10-3 的重鏈及輕鏈； (iii)   分別列舉於SEQ ID NO103 及97 中之FS20-22-49AA/FS30-10-12 的重鏈及輕鏈； (iv)   分別列舉於SEQ ID NO105 及107 中之FS20-22-49AA/FS30-35-14 的重鏈及輕鏈；或 (v)    分別列舉於SEQ ID NO109 及111 中之FS20-22-49AA/FS30-5-37 的重鏈及輕鏈。
[16]  如[15]之抗體分子，其中該抗體分子包含[15]之(i)至(iv)中之任一者中所列出之該輕鏈及重鏈。
[17]  如[15]之抗體分子，其中該抗體分子包含[15]之(i)至(iii)中之任一者中所列出之該輕鏈及重鏈。
[18]  如[15]之抗體分子，其中該抗體分子包含[15]之(i)中所列出之該輕鏈及重鏈。
[19]  如[1]至[18]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子結合人類CD137及人類OX40。
[20]  如[19]之抗體分子，其中該人類CD137由SEQ ID NO:127 中所列舉之序列組成或包含該序列。
[21] 如[19]或[20]之抗體分子，其中該人類OX40由SEQ ID NO:130 中所列舉之序列組成或包含該序列。
[22]  如[1]至[21]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子結合食蟹獼猴CD137及食蟹獼猴OX40。
[23]  如[22]之抗體分子，其中該食蟹獼猴CD137由SEQ ID NO:129 中所列舉之序列組成或包含該序列。
[24] 如[23]或[24]之抗體分子，其中該食蟹獼猴OX40由SEQ ID NO:131 中所列舉之序列組成或包含該序列。
[25]  如[5]至[7]、[11]至[13]及[16]至[18]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子結合人類CD137及人類OX40，且該抗體分子結合人類CD137之親和性(KD )在該抗體分子結合人類OX40之親和性(KD )的2倍以內。
[26]  如[19]至[25]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子能夠同時結合至人類CD137及人類OX40。
[27]  如[1]至[26]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子能夠在存在細胞表面表現之CD137情況下，活化免疫細胞上之OX40。
[28] 如[1]至[27]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子與免疫細胞上之OX40的結合及與CD137的結合造成該免疫細胞上OX40之聚集。
[29]  如[1]至[28]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子能夠在存在細胞表面表現之OX40之情況下，活化免疫細胞上之CD137。
[30] 如[1]至[29]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子與免疫細胞上之CD137的結合及與OX40的結合造成該免疫細胞上CD137之聚集，且其中OX40在相同免疫細胞上表現或在獨立細胞上表現。
[31]  如請求項[27]至[30]中任一項之抗體分子，其中該免疫細胞係T細胞。
[32] 如[1]至[31]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子已經修飾以減少或消除該抗體分子之CH2域與一或多種Fcγ受體的結合。
[33] 如[1]至[32]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子不結合至一或多種Fcγ受體。
[34] 如[32]或[33]之抗體分子，其中該Fcγ受體係選自由以下組成之群：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIII。
[35]  如[1]至[34]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子能夠誘導T細胞增殖。
[36]  一種複合物(conjugate)，其包含如[1]至[35]中任一項之抗體分子及生物活性分子。
[37]  一種複合物，其包含如[1]至[36]中任一項之抗體分子及可偵測標記。
[38]  一種核酸分子或多種核酸分子，其編碼如[1]至[35]中任一項之抗體分子。
[39]  一種核酸分子或多種核酸分子，其編碼如[1]至[4]、[8]至[10]、[14]至[15]及[19]至[35]中任一項之抗體分子，其中該(等)核酸分子包含以下之重鏈核酸序列及/或輕鏈核酸序列： (i)     分別列舉於SEQ ID NO96 及98 中之FS20-22-49AA/FS30-10-16 的重鏈核酸序列及/或輕鏈核酸序列； (ii)    分別列舉於SEQ ID NO100 及102 中之FS20-22-49AA/FS30-10-3 的重鏈核酸序列及/或輕鏈核酸序列； (iii)   分別列舉於SEQ ID NO104 及102 中之FS20-22-49AA/FS30-10-12 的重鏈核酸序列及/或輕鏈核酸序列； (iv)   分別列舉於SEQ ID NO106 及108 中之FS20-22-49AA/FS30-35-14 的重鏈核酸序列及/或輕鏈核酸序列；或 (v)    分別列舉於SEQ ID NO110 及112 中之FS20-22-49AA/FS30-5-37 的重鏈核酸序列及/或輕鏈核酸序列。
[40]  一種載體或多種載體，其包含如[38]至[39]中任一項之核酸分子或多種核酸分子。
[41]  一種重組宿主細胞，其包含如[38]至[39]中任一項之(多種)核酸分子，或如[40]之(多種)載體。
[42]  一種產生如[1]至[35]中任一項之抗體分子之方法，該方法包含在用於產生該抗體分子之條件下培養[41]之重組宿主細胞。
[43]  如[42]之方法，其進一步包含分離及/或純化該抗體分子。
[44]  一種醫藥組合物，其包含如[1]至[37]中任一項之抗體分子或複合物，及醫藥學上可接受之賦形劑。
[45] 如[1]至[37]中任一項之抗體分子或複合物，其用於藉由療法治療人體或動物體之方法中。
[46]  一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如[1]至[37]中任一項之抗體分子或複合物。
[47]  如[45]所使用之抗體分子或複合物，其中該抗體分子或複合物用於治療個體之癌症或感染疾病。
[48]  如[46]之方法，其中該疾病或病症係個體之癌症或感染性疾病。
[49]  一種如[1]至[37]中任一項之抗體分子或複合物之用途，其用於製備用於治療癌症或感染性疾病之藥劑。
[50]  如[47]所使用之抗體分子或複合物、如[48]之方法或如[49]之抗體分子或複合物之用途，其中該癌症係實體癌症，任擇地其中該實體癌症係選自由以下組成之群：黑素瘤、膀胱癌、腦癌、乳房癌、卵巢癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸癌、胰臟癌、腎癌及胃癌。
[51]  如[47]所使用之抗體分子或複合物、如[48]之方法或如[49]之抗體分子或複合物之用途，其中該感染性疾病係持續性病毒感染，任擇地其中該持續性病毒感染係選自由以下組成之群：人類免疫不全病毒(HIV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、水痘帶狀疱疹病毒(Varicella Zoster virus)。
[52]  如[47]所使用之抗體分子或複合物、如[48]之方法或如[49]之抗體分子或複合物之用途，其中該感染性疾病係持續性細菌感染，任擇地其中該持續性細菌感染係以下之持續性感染：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza )、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae )、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori )、梅毒螺旋體(Treponema pallidum )、糞腸球菌(Enterococcus faecalis )或肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )。
[53] 如[47]所使用之抗體分子或複合物、如[48]之方法或如[49]之抗體分子或複合物之用途，其中該感染性疾病係持續性真菌感染，任擇地其中該持續性真菌注射係以下之持續性感染：念珠菌屬(Candida )(例如白色念珠菌(Candida albicans ))、隱球菌屬(Cryptococcus )(格特隱球菌(gattii )及新型隱球菌(neoformans ))、馬爾尼菲籃狀菌(青黴菌)(Talaromyces (Penicillium) marneffe )、小芽孢菌屬(Microsporum )(例如奧杜盎小芽孢菌(Microsporum audouinii ))及匐行疹髮癬菌(Trichophyton tonsurans )。
[54]  如[47]所使用之抗體分子或複合物、如[48]之方法或如[49]之抗體分子或複合物之用途，其中該感染性疾病係持續性寄生蟲感染，任擇地其中該持續性寄生蟲注射係以下之持續性感染：瘧原蟲屬(Plasmodium )(諸如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum ))，或利什曼原蟲屬(Leishmania )(諸如黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani ))。
[55]  如[45]、[47]及[50]至[54]中任一項所使用之抗體分子或複合物，其中該治療包含向該個體投與該抗體分子或複合物與第二治療劑之組合。
[56]  如[46]、[48]及[50]至[54]之方法，其中該方法進一步包含向該個體投與治療有效量之第二治療劑。
[57]  如[47]或[50]所用於治療個體癌症之方法的抗體分子或複合物，其中該方法包含向該個體投與該抗體分子或複合物與結合PD-1或PD-L1之抗體的組合。
較佳實施例之詳細說明 現將參考隨附圖式論述本發明之態樣及實施例。對熟習此項技術者而言，其他態樣及實施例將顯而易見。本文中所提及之所有文獻均以引用之方式併入本文中。
本發明係關於結合至CD137及OX40二者之抗體分子。具體而言，本發明之抗體分子包含基於CDR之CD137抗原結合位點，及定位於抗體分子之恆定域的OX40抗原結合位點。除非本文另有規定，否則術語「CD137」及「OX40」可以指人類CD137及人類OX40、鼠類CD137及鼠類OX40及/或食蟹獼猴CD137及食蟹獼猴OX40。除非本文另有規定，否則較佳地，術語「CD137」及「OX40」係指人類CD137及人類OX40。
術語「抗體分子」描述天然或部分或完全以合成方式產生之免疫球蛋白。抗體分子可為人類或人類化，較佳人類。抗體分子較佳為單株抗體分子。抗體之實例為免疫球蛋白同型(諸如免疫球蛋白G)，及其同型亞類(諸如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)，以及其片段。抗體分子可在不含污染物意義上經分離，諸如抗體能夠結合其他多肽及/或血清組分。
如本文所用，術語「抗體分子」由此包括抗體片段，其限制條件為該片段包含基於CDR之CD137抗原結合位點，及定位於恆定域之OX40抗原結合位點。除非本文另有規定，否則如本文所用，術語「抗體分子」由此等效於「抗體分子或其片段」。
可獲得單株及其他抗體且使用重組DNA技術之技術以產生保留原始抗體之特異性的其他抗體或嵌合分子。此類技術可涉及將CDR、或可變區及/或提供OX40抗原結合位點之恆定域序列引入至不同免疫球蛋白中。將一種免疫球蛋白之CDR引入至另一免疫球蛋白中描述於例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400中。對於相關恆定域序列，可採用類似技術。可替代地，可使融合瘤或產生抗體分子之其他細胞經受遺傳突變或其他變化，遺傳突變或其他變化可或可不更改所產生之抗體的結合特異性。
由於抗體可以數種方法修飾，因此術語「抗體分子」應視為涵蓋抗體片段、抗體之衍生物、功能等效物及同系物，包括包含免疫球蛋白結合域之任何多肽，無論為天然抑或完全或部分合成的。因此包括包含與另一多肽融合之免疫球蛋白結合域或等效物之嵌合分子。嵌合抗體之選殖及表現描述於EP-A- 0120694及EP-A-0125023中。
包含CDR序列及CH3域二者之抗體片段的實例為微型抗體，其包含接合至CH3域之scFv (Hu等人, 1996)。
本發明之抗體分子結合至CD137及OX40。在此情形下結合可以指特異性結合。術語「特異性」可以指抗體分子將不展示與除其(多種)特異性結合搭配物，此處CD137及OX40外之分子之任何顯著結合的情況。術語「特異性」亦可在抗體分子對由數種抗原攜載之特定抗原決定基(諸如CD137及OX40上之抗原決定基)具有特異性時適用，在此情況下抗體分子將能夠結合至攜載抗原決定基之各種抗原。在一較佳實施例中，本發明之抗體分子不與TNFRSF1A、TNFRSF1B、GITR、NGFR、CD40及/或DR6結合，或不展示與其之任何顯著結合。
抗體及其構築及使用方法係此項技術中熟知的，且描述於例如Holliger及Hudson 2005中。可獲得單株及其他抗體且使用重組DNA技術之技術以產生保留原始抗體之特異性的其他抗體或嵌合分子。此類技術可涉及將一種抗體分子之CDR或可變區引入至不同抗體分子中(EP-A-184187、GB 2188638A及EP-A-239400)。
基於CDR之抗原結合位點為抗體可變區中之抗原結合位點。基於CDR之抗原結合位點，可由三個CDR，諸如三個輕鏈可變域(VL) CDR或三個重鏈可變域(VH) CDR形成。較佳地，基於CDR之抗原結合位點由六個CDR，三個VL CDR及三個VH CDR形成。在不同抗原結合位點中，不同CDR對抗原之結合的作用可能不同。
抗原結合位點之三個VH域CDR可定位於免疫球蛋白VH域內，且三個VL域CDR可定位於免疫球蛋白VL域內。舉例而言，基於CDR之抗原結合位點可定位於抗體可變區。
抗體分子可具有一個或較佳多於一個(例如二個)針對第一抗原之基於CDR之抗原結合位點。抗體分子由此可包含一個VH域及一個VL域，但較佳包含二個VH域及二個VL域，亦即二個VH/VL域對，如例如天然存在之IgG分子的情況。
基於CDR之抗原結合位點可包含抗體FS30-10-16 、 FS30-10-3 、 FS30-10-12 或FS30-35-14 或FS30-5-37 ，較佳抗體FS30-10-16 之三個VH CDR或三個VL CDR，較佳三個VH CDR及三個VL CDR。
此等抗體之VH及VL域序列列舉如下： (i)     SEQ ID NOFS30-10-16 之VH及VL域序列分別展示於SEQ ID NO12 及14 中； (ii)    SEQ ID NOFS30-10-3 之VH及VL域序列分別展示於SEQ ID NO18 及14 中； (iii)   SEQ ID NOFS30-10-12 之VH及VL域序列分別展示於SEQ ID NO23 及14 中； (iv)   SEQ ID NOFS30-35-14 之VH及VL域序列分別展示於SEQ ID NO170 及172 中；且 (v)         SEQ ID NOFS30-5-37 之VH及VL域序列分別展示於SEQ ID NO40 及42 中。
熟習此項技術者根據以上列舉之抗體的VH及VL域序列確定CDR之序列將沒有困難。CDR序列可例如根據Kabat (Kabat等人, 1991)或國際ImMunoGeneTics資訊系統(international ImMunoGeneTics information system；IMGT) (Lefranc等人, 2015)確定。
根據IMGT編號，抗體分子之VH域CDR1、CDR2及CDR3序列可分別為定位於抗體分子之VH域之位置27-38、56-65及105-117處的序列。
根據Kabat編號，抗體分子之VH域CDR1、CDR2及CDR3序列可分別為處於VH域之定位位置31-35、50-65及95-102處的序列。
根據IMGT編號，抗體分子之VL域CDR1、CDR2及CDR3序列可分別為定位於VL域之位置27-38、56-65及105-117處的序列。
根據Kabat編號，抗體分子之VL域CDR1、CDR2及CDR3序列可分別為處於VL域之定位位置24-34、50-56及89-97處的序列。
舉例而言，抗體分子可包含以下之VH域CDR1、CDR2及CDR3的序列： (i)     分別為SEQ ID NO1 、 2 及3 [FS30-10-16 ]； (ii)    分別為SEQ ID NO1 、 2 及16 [FS30-10-3 ]； (iii)   分別為SEQ ID NO1 、 2 及21 [FS30-10-12] ； (iv)   分別為SEQ ID NO25 、 26 及27 [FS30-35-14] ；或 (v)    分別為SEQ ID NO33 、 34 及35 [FS30-5-37] ， 其中CDR序列根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案界定。
抗體分子可包含以下之VH域CDR1、CDR2及CDR3的序列： (i)     分別為SEQ ID NO7 、 8 及9 [FS30-10-16 ]； (ii)    分別為SEQ ID NO7 、 8 及17 [FS30-10-3 ]； (iii)   分別為SEQ ID NO7 、 8 及22 [FS30-10-12] ； (iv)   分別為SEQ ID NO29 、 30 及31 [FS30-35-14] ；或 (v)    分別為SEQ ID NO37 、 38 及39 [FS30-5-37] ， 其中CDR序列根據Kabat編號方案界定。
舉例而言，抗體分子可包含以下之VL域CDR1、CDR2及CDR3的序列： (i)     分別為SEQ ID NO4 、 5 及6 [FS30-10-16 ]； (ii)    分別為SEQ ID NO4 、 5 及6 [FS30-10-3 ]； (iii)   分別為SEQ ID NO4 、 5 及6 [FS30-10-12] ； (iv)   分別為SEQ ID NO4 、 5 及28 [FS30-35-14] ；或 (v)    分別為SEQ ID NO4 、 5 及36 [FS30-5-37] ， 其中CDR序列根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案界定。
舉例而言，抗體分子可包含以下之VL域CDR1、CDR2及CDR3的序列： (i)     分別為SEQ ID NO10 、 11 及6 [FS30-10-16 ]； (ii)    分別為SEQ ID NO10 、 11 及6 [FS30-10-3 ]； (iii)   分別為SEQ ID NO10 、 11 及6 [FS30-10-12] ； (iv)   分別為SEQ ID NO10 、 11 及28 [FS30-35-14] ；或 (v)    分別為SEQ ID NO10 、 11 及36 [FS30-5-37] ， 其中CDR序列根據Kabat編號方案界定。
除根據IMGT編號方案，處於VH之位置109處的殘基(根據Kabat編號方案，VH之殘基97)之外，抗體FS30-10-16 、 FS30-10-3 及FS30-10-12 之VH及VL序列一致。因此，抗體分子可包含抗體FS30-10-16 之VH域CDR1、CDR2及CDR3序列及/或VL域CDR1、CDR2及CDR3序列、VH域序列及/或VL域序列，其中抗體分子任擇地包含根據IMGT編號方案，重鏈之位置109(根據Kabat編號方案，重鏈之殘基97)處的胺基酸取代，其中該位置處之殘基較佳選自由天冬醯胺(N)、蘇胺酸(T)及白胺酸(L)組成之群。
基於CDR之抗原結合位點可包含以下之VH或VL域，較佳VH及VL域：抗體FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14或FS30-5-37，較佳抗體FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12或FS30-35-14，更佳抗體FS30-10-16、FS30-10-3或FS30-10-12，最佳抗體FS30-10-16。
抗體FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14及FS30-5-37之VH域可分別具有SEQ ID NO 12、18、23、170及40中所列舉之序列。抗體FS30-10-16、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-35-14及FS30-5-37可分別具有SEQ ID NO 14、14、14、172及42中所列舉之序列。
本發明之抗體分子包含定位於該抗體分子之恆定域中的OX40抗原結合位點。恆定域可為CL、CH1、CH2、CH3或CH4域，較佳恆定域為CH1、CH2或CH3域，更佳CH2或CH3域，最佳CH3域。
除非另外指示，否則在本文中，恆定域之胺基酸殘基位置根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案進行編號。IMGT編號方案描述於Lefranc等人, Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)中。
OX40抗原結合位點可包含分別定位於恆定域之第一、第二及第三結構環中之第一、第二及第三序列。對抗體恆定域結構環進行工程改造以建立目標抗原之抗原結合位點係此項技術中已知的，且描述於例如Wozniak-Knopp等人, 2010，及專利公開案第WO2006/072620號及第WO2009/132876號中。較佳地，第一、第二及第三結構環分別為抗體分子之CH3域的AB、CD及EF結構環。在CH3域中，AB、CD及EF結構環分別定位於CH3域之殘基11-18、43-78及92-101處。對抗體恆定域之結構環序列以建立新抗原結合位點描述於例如WO2006/072620及WO2009/132876中。
在一較佳實施例中，抗體分子之OX40抗原結合位點包含以下之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO51 、 52 及53 中之FS20-22-49 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO51 、 59 及60 中之FS20-22-38 的第一、第二及第三序列； (iii)分別列舉於SEQ ID NO51 、 52 及60 中之FS20-22-41 的第一、第二及第三序列； (iv)分別列舉於SEQ ID NO51 、 52 及65 中之FS20-22-47 的第一、第二及第三序列；或 (v)分別列舉於SEQ ID NO51 、52 及68 中之FS20-22-85 的第一、第二及第三序列。
OX40抗原結合位點可包含FS20-22-49、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47或FS20-22-85之AB、CD及EF結構環序列，其中AB、CD及EF結構環分別為定位於CH3域之殘基11-18、43-78及92-101處的序列，且FS20-22-49、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47或FS20-22-85之CH3域分別列舉於SEQ ID NO: 54、61、63、66及69中。
在一更佳實施例中，抗體分子之OX40抗原結合位點包含分別列舉於SEQ ID NO51 、 52 及53 中之FS20-22-49 的第一、第二及第三序列。舉例而言，OX40抗原結合位點可包含分別列舉於SEQ ID NO56 、 57 及58 中之FS20-22-49 的AB、CD及EF結構環序列。
在抗體分子之OX40抗原結合位點包含FS20-22-38 、 FS20-22-41 、 FS20-22-47 、 FS20-22-49 或FS20-22-85 之第一、第二及第三序列時，第一、第二及第三序列較佳分別定位於抗體分子之CH3域的位置14至18、45.1至77及93至101處。
在OX40抗原結合位點包含FS20-22-38 、 FS20-22-41 、 FS20-22-47 、 FS20-22-49 或FS20-22-85 之AB、CD及EF結構環序列時，AB、CD及EF結構環序列較佳分別定位於抗體分子之CH3域的位置11至18、43至78及92至101處。
抗體分子可在該抗體分子之CH3域之位置91處進一步包含白胺酸(L)。特定而言，含包含FS20-22-85 之第一、第二及第三序列之OX40抗原結合位點的抗體分子可在該抗體分子之CH3域的位置91處包含白胺酸。
在一替代性實施例中，抗體分子之OX40抗原結合位點包含以下之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO71 、 72 及73 中之FS20-31-58 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO71 、 72 及76 中之FS20-31-66 的第一、第二及第三序列； (iii)分別列舉於SEQ ID NO79 、 80 及81 中之FS20-31-94 的第一、第二及第三序列； (iv)分別列舉於SEQ ID NO84 、 85 及76 中之FS20-31-102 的第一、第二及第三序列； (v)分別列舉於SEQ ID NO84 、 88 及89 中之FS20-31-108 的第一、第二及第三序列；或 (vi)分別列舉於SEQ ID NO84 、92 及89 中之FS20-31-115 的第一、第二及第三序列。
OX40抗原結合位點可包含FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108或FS20-31-115之AB、CD及EF結構環序列，其中AB、CD及EF結構環分別為定位於CH3域之殘基11-18、43-78及92-101處的序列，且FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108或FS20-31-115之CH3域分別列舉於SEQ ID NO: 54、61、63、66及69中。
在抗體分子之OX40抗原結合位點包含FS20-31-58 、 FS20-31-66 、 FS20-31-94 、 FS20-31-102 、 FS20-31-108 或FS20-31-115 之第一、第二及第三序列時，第一、第二及第三序列較佳分別定位於抗體分子之CH3域的位置14至18、45.1至77及92至101處。
在OX40抗原結合位點包含FS20-31-58 、 FS20-31-66 、 FS20-31-94 、 FS20-31-102 、 FS20-31-108 或FS20-31-115 之AB、CD及EF結構環序列時，AB、CD及EF結構環序列較佳分別定位於抗體分子之CH3域的位置11至18、43至78及92至101處。
作為IMGT編號之替代方案，恆定域中之胺基酸殘基位置，包括如本文所描述之胺基酸序列、取代、缺失及插入的位置，可根據IMGT外顯子編號(亦被稱作連續編號)、EU編號或Kabat編號進行編號。CH3域之殘基位置之IMGT編號、IMGT外顯子編號、EU編號及Kabat編號之間的一致性展示於圖 1 中。
因此，舉例而言，在本申請案提及分別定位於抗體分子之CH3域之位置14至18、45.1至77及93至101處的第一、第二及第三序列時，其中殘基位置根據IMGT編號方案進行編號，第一、第二及第三定位於CH3域之位置18至22、46至50及74至82，其中殘基位置根據IMGT外顯子編號方案進行編號，如圖 1 中所展示。
在一個實施例中，抗體分子包含CH3域，該域包含以下、具有以下或由以下組成：FS20-22-38 、 FS20-22-41 、 FS20-22-47 、 FS20-22-49 、 FS20-22-85 、 FS20-31-58 、 FS20-31-66 、 FS20-31-94 、 FS20-31-102 、 FS20-31-108 或FS20-31-115 之CH3域序列，其中FS20-22-38 、 FS20-22-41 、 FS20-22-47 、 FS20-22-49 、 FS20-22-85 、 FS20-31-58 、 FS20-31-66 、 FS20-31-94 、 FS20-31-102 、 FS20-31-108 及FS20-31-115 之CH3域序列分別列舉於SEQ ID NO54 、 61 、 63 、 66 、 69 、 74 、 77 、 82 、 86 、 90 及93 中。
在一較佳實施例中，抗體分子包含CH3域，該域包含以下、具有以下或由以下組成：SEQ ID NO54 中所列舉之FS20-22-49 的CH3域序列。
抗體分子之CH3域可在CH3域序列之最接近的C端處任擇地包含額外離胺酸殘基(K)。
另外，本發明之抗體分子可包含免疫球蛋白G分子之CH2域，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子之CH2域。較佳地，本發明之抗體分子包含IgG1分子之CH2域。CH2域可具有SEQ ID NO:48 中所列舉之序列。
抗體分子之CH2域可包含一或多種突變，該一或多種突變減少或消除CH2域與一或多種Fcγ受體(諸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII)及/或補體之結合。諸位發明人假定減少或消除與Fcγ受體之結合將減少或消除由抗體分子介導之ADCC。類似地，預期減少或消除與補體之結合將減少或消除由抗體分子介導之CDC。減少或消除CH2域與一或多種Fcγ受體及/或補體之結合的突變係此項技術中已知的(Wang等人, 2018)。此等突變包括Bruhns等人, 2009及Hezareh等人, 2001中所描述之「LALA突變」，其涉及CH2域之IMGT位置1.3及1.2處的白胺酸殘基經丙胺酸取代(L1.3A及L1.2A)。可替代地，亦已知藉由將CH2域之IMGT位置84.4處的天冬醯胺(N)突變成丙胺酸、甘胺酸或麩醯胺酸(N84.4A、N84.4G或N84.4Q)，經由守恆N鍵聯糖基化位點之突變產生α-糖基抗體，降低IgG1效應功能(Wang等人, 2018)。作為另一替代方案，已知經由CH2域之IMGT位置114處之脯胺酸突變成丙胺酸或甘胺酸(P114A或P114G)，補體活化(C1q結合)及ADCC減少(Idusogie等人, 2000; Klein等人, 2016)。亦可將此等突變組合以便產生具有進一步減少之ADCC或CDC活性的抗體分子。
因此，抗體分子可包含CH2域，其中該CH2域包含： (i)位置1.3及1.2處之丙胺酸殘基；及/或 (ii)位置114處之丙胺酸或甘胺酸；及/或 (iii)位置84.4處之丙胺酸、麩醯胺酸或甘胺酸； 其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
在一較佳實施例中，抗體分子包含CH2域，其中該CH2域包含： (i)位置1.3處之丙胺酸殘基；及 (ii)位置1.2處之丙胺酸殘基； 其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
舉例而言，CH2域可具有SEQ ID NO:49 中所列舉之序列。
在一替代性較佳實施例中，抗體分子包含CH2域，其中該CH2域包含： (i)位置1.3處之丙胺酸殘基； (ii)位置1.2處之丙胺酸殘基；及 (iii)位置114處之丙胺酸； 其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
舉例而言，CH2域可具有SEQ ID NO:50 中所列舉之序列。
在一較佳實施例中，結合至CD137及OX40之抗體分子包含 (a)基於CDR之CD137抗原結合位點；及 (b)定位於抗體分子之CH3域的OX40抗原結合位點； 其中基於CDR之抗原結合位點包含以下之三個VH CDR及三個VL CDR (CDR 1至CDR 6)：抗體FS30-10-16 、 FS30-10-3 、 FS30-10-12 、 FS30-35-14 或FS30-5-37 ，較佳FS30-10-16 、 FS30-10-3 或FS30-10-12 ，更佳FS30-10-16 或FS30-10-3 ，最佳FS30-10-16 ；且 其中OX40抗原結合位點包含分別定位於CH3域之AB、CD及EF結構環中之第一序列、第二序列及第三序列，其中第一第二及第三序列分別具有SEQ ID NO51 、52 及53 中所列舉之FS20-22-49 的序列。
在另一較佳實施例中，結合至CD137及OX40之抗體分子包含 (a)基於CDR之CD137抗原結合位點；及 (b)CH3域，其包含以下、具有以下或由以下組成：SEQ ID NO:54 中所列舉之序列[FS20-22-49] ； 其中基於CDR之抗原結合位點包含以下之三個VH CDR及三個VL CDR (CDR 1至CDR 6)：抗體FS30-10-16 、FS30-10-3 、FS30-10-12 、FS30-35-14 或FS30-5-37 ，較佳FS30-10-16 、FS30-10-3 或FS30-10-12 ，更佳FS30-10-16 或FS30-10-3 ，最佳FS30-10-16 。
在另一較佳實施例中，結合至CD137及OX40之抗體分子包含 (a)VH域及VL域，該VH域及該VL域包含基於CDR之CD137抗原結合位點；及 (b)CH3域，其包含以下、具有以下或由以下組成：SEQ ID NO:54 中所列舉之序列[FS20-22-49] ； 其中VH及VL域包含以下、具有以下或由以下組成：抗體FS30-10-16 、FS30-10-3 、FS30-10-12 、FS30-35-14 或FS30-5-37 ，較佳FS30-10-16 、FS30-10-3 或FS30-10-12 ，更佳FS30-10-16 或FS30-10-3 ，最佳FS30-10-16 的VH及VL。
在另一較佳實施例中，結合至CD137及OX40之抗體分子包含以下抗體之重鏈及輕鏈、具有以下抗體之重鏈及輕鏈或由以下抗體之重鏈及輕鏈組成： (i)     分別列舉於SEQ ID NO95 及97 中之FS20-22-49AA/FS30-10-16 的重鏈及輕鏈； (ii)    分別列舉於SEQ ID NO99 及97 中之FS20-22-49AA/FS30-10-3 的重鏈及輕鏈； (iii)   分別列舉於SEQ ID NO103 及97 中之FS20-22-49AA/FS30-10-12 的重鏈及輕鏈； (iv)   分別列舉於SEQ ID NO105 及107 中之FS20-22-49AA/FS30-35-14 的重鏈及輕鏈；或 (v)    分別列舉於SEQ ID NO109 及111 中之FS20-22-49AA/FS30-5-37 的重鏈及輕鏈； 其中抗體分子較佳包含(i)至(iv)中所列出之輕鏈及重鏈，更佳包含(i)至(iii)中所列出之輕鏈及重鏈，最佳包含(i)中所列出之輕鏈及重鏈。
本發明之抗體分子亦可包含本文所揭示之變異體第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域、VL域、輕鏈及/或重鏈序列。適合變異體可藉助於序列改變或突變及篩選之方法獲得。在一較佳實施例中，包含一或多種變異序列之抗體分子保留親本抗體分子之功能特性中之一或多者，諸如針對CD137及OX40的結合特異性及/或結合親和性。舉例而言，與(親本)抗體分子相比，包含一或多種變異序列之抗體分子較佳以相同親和性或較高親和性結合至CD137及/或OX40。親本抗體分子為不包含已併入至變異抗體分子中之(多個)胺基酸取代、(多個)缺失及/或(多個)插入的抗體分子。
舉例而言，本發明之抗體分子可包含第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域、VL域、輕鏈及/或重鏈序列，其與本文所揭示之結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域VL域、輕鏈或重鏈序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性。
在一較佳實施例中，本發明之抗體分子包含CH3域序列，其與SEQ ID NO:54 中所列舉之CH3域序列[FS20-22-49] 具有至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性。
在另一較佳實施例中，抗體分子具有或包含CH2域序列，該序列與SEQ ID NO:48 或49 中所列舉之CH2域序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性。
序列一致性通常參考演算法GAP (Wisconsin GCG package, Accelerys Inc, San Diego USA)界定。GAP使用尼德曼及翁施演算法(Needleman and Wunsch algorithm)來比對二個完整序列，最大化匹配數目且最小化間隙數目。一般而言，使用預設參數，其中間隙創建罰分等於12且間隙擴展罰分等於4。使用GAP可為較佳的，但可使用其他演算法，例如BLAST (其使用Altschul等人, 1990之方法)、FASTA (其使用Pearson及Lipman, 1988之方法)或史密斯-沃特曼演算法(Smith-Waterman algorithm)(Smith及Waterman, 1981)，或前述Altschul等人, 1990之TBLASTN程式，一般採用預設參數。特定而言，可使用psi-Blast演算法(Altschul等人, 1997)。
本發明之抗體分子亦可包含第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域、VL域、輕鏈及/或重鏈，其與本文所揭示之第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、Fcab、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列相比，具有一或多種胺基酸序列更改(胺基酸殘基之添加、缺失、取代及/或插入)，較佳20處更改或更少、15處更改或更少、10處更改或更少、5處更改或更少、4處更改或更少、3處更改或更少、2處更改或更少、或1處更改。特定而言，可在VH及VL域序列外之抗體分子的一或多種構架區中及/或CH3域之一或多種構架區中進行更改。舉例而言，更改可處於CH3域中，在本文描述為第一、第二及第三序列，或描述為AB、CD或EF結構環序列之序列外。
在一較佳實施例中，本發明之抗體分子可包含CH3域序列，與SEQ ID NO:54 、 61 、 63 、 66 、 69 、 74 、 77 、 82 、 86 、 90 或93 中所列舉之CH3域序列相比，其具有一或多種胺基酸序列更改(胺基酸殘基之添加、缺失、取代、及/或插入)，較佳20處更改或更少、15處更改或更少、10處更改或更少、5處更改或更少、4處更改或更少、3處更改或更少、2處更改或更少、或1處更改。
在另一較佳實施例中，抗體分子包含CH2域序列，與SEQ ID NO:48 或49 中所列舉之CH2域序列相比，其具有一或多種胺基酸序列更改(胺基酸殘基之添加、缺失、取代、及/或插入)，較佳20處更改或更少、15處更改或更少、10處更改或更少、5處更改或更少、4處更改或更少、3處更改或更少、2處更改或更少、或1處更改。
在一或多個胺基酸經另一胺基酸取代之較佳實施例中，取代可為守恆取代，例如根據下表。在一些實施例中，中間欄中之相同類別中的胺基酸彼此取代，亦即例如非極性胺基酸經另一非極性胺基酸取代。在一些實施例中，最右欄中之相同行中之胺基酸彼此取代。
在一些實施例中，(多個)取代可為功能性守恆的。亦即，在一些實施例中，取代可不影響(或可不實質上影響)相比於等效未經取代抗體分子，包含取代之抗體分子的一或多種功能特性(例如結合親和性)。
抗體分子較佳結合至人類CD137及人類OX40。較佳地，抗體分子能夠同時結合至人類CD137及人類OX40，其中人類CD137及人類OX40共表現。共表現在此意義上涵蓋CD137及OX40在相同細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)上表現之情境，及CD137及OX40在不同細胞(例如在腫瘤微環境中鄰近彼此而定位之二種不同免疫細胞)上表現之情境。因此，咸信本發明之抗體分子能夠以順式結合至單一細胞上之二種目標，且能夠結合至以反式結合至不同細胞上表現之二種目標。
抗體分子較佳以8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.5 nM、0.4 nM或0.3 nM之親和性(KD )或以更高親和性結合至二聚人類CD137。較佳地，抗體分子以0.3 nM之親和性(KD )或以更高親和性結合至人類CD137。抗體分子可以比結合單體CD137之親和性高的親和性結合二聚CD137。人類CD137可例如具有SEQ ID NO:127 中所列舉之序列。
抗體分子較佳以8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.5 nM、0.4 nM或0.3 nM之親和性(KD )或以更高親和性結合至二聚人類OX40。較佳地，抗體分子以0.3 nM之親和性(KD )或以更高親和性結合至人類OX40。抗體分子可以比結合單體OX40之親和性高的親和性結合二聚OX40。人類OX40可例如具有SEQ ID NO:130 中所列舉之序列。
抗體分子較佳結合至食蟹獼猴CD137及食蟹獼猴OX40。結合至食蟹獼猴CD137及OX40以及人類CD137及OX40係有益的，因為其准許在向人類投與之前在食蟹獼猴中測試抗體分子之功效及毒性。較佳地，抗體分子能夠同時結合至食蟹獼猴CD137及食蟹獼猴OX40，其中食蟹獼猴CD137及食蟹獼猴OX40共表現。
抗體分子較佳以10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.5 nM、0.4 nM或0.3 nM之親和性(KD )或以更高親和性結合至二聚食蟹獼猴CD137。較佳地，抗體分子以0.3 nM之親和性(KD )或以更高親和性結合至二聚食蟹獼猴CD137。食蟹獼猴CD137可例如具有SEQ ID NO:129 中所列舉之序列。
抗體分子較佳以8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2.5 nM、2 nM、1.5 nM或1 nM之親和性(KD )或以更高親和性結合至二聚食蟹獼猴OX40。較佳地，抗體分子以1 nM之親和性(KD )或以更高親和性結合至食蟹獼猴OX40。食蟹獼猴OX40可例如具有SEQ ID NO:131 中所列舉之序列。
抗體分子較佳以該抗體分子結合至二聚人類OX40之親和性(KD )之10倍、9倍、8倍、7倍、6倍或5倍內的親和性(KD )結合至二聚食蟹獼猴OX40。較佳地，抗體分子以該抗體分子結合至二聚人類OX40之親和性(KD )之5倍內的親和性(KD )結合至二聚食蟹獼猴OX40。
抗體分子較佳以該抗體分子結合至二聚人類CD137之親和性(KD )之30倍、20倍、10倍、5倍、4倍、3倍或2倍內的親和性(KD )結合至二聚食蟹獼猴CD137。較佳地，抗體分子以該抗體分子結合至二聚人類CD137之親和性(KD )之2倍內的親和性(KD )結合至二聚食蟹獼猴CD137。
如本發明實例中所描述，認為與人類及食蟹獼猴抗原結合之相似性可為有利的，因為希望食蟹獼猴研究中mAb2 之特性可外推至人類。認為此有益於在食蟹獼猴中進行利用抗體分子進行之功效及毒性研究，該等研究可預測抗體分子在人類中之功效及毒性。
抗體分子較佳以該抗體分子結合至二聚人類OX40之親和性(KD )之10倍、9倍、8倍、7倍、6倍或5倍內的親和性(KD )結合至二聚人類CD137。較佳地，抗體分子以該抗體分子結合至二聚人類OX40之親和性(KD )之2倍內的親和性(KD )結合至二聚人類CD137。
抗體分子較佳以該抗體分子結合至二聚食蟹獼猴OX40之親和性(KD )之10倍、9倍、8倍、7倍、6倍或5倍內的親和性(KD )結合至二聚食蟹獼猴CD137。
如本發明實例中所描述，認為抗體分子針對與二種目標(亦即CD137及OX40)結合具有類似親和性可為有利的，因為抗體分子將更可能結合至表現二種目標之細胞。
可例如藉由表面電漿子共振(SPR)(諸如Biacore)測定抗體分子與同源抗原，諸如人類OX40、人類CD137、食蟹獼猴OX40或食蟹獼猴CD137之結合親和性。可藉由流式細胞量測術測定抗體分子與在細胞表面上表現之OX40或CD137的結合親和性。
已展示抗體分子對於配位體結合具有一系列活性。舉例而言，抗體分子可能能夠阻斷、可能不能夠阻斷或可能能夠部分阻斷CD137L與CD137之結合。
較佳地，抗體分子可能能夠阻斷、可能不能夠阻斷或可能能夠部分阻斷CD137L與CD137之結合。更佳地，抗體分子能夠部分阻斷CD137L與CD137之結合。
較佳地，當二種目標共表現時，抗體分子能夠由於藉由雙重結合至OX40及CD137二者交聯而誘導OX40及/或CD137之信號傳遞。藉由以此方式起作用，此類抗體分子被稱為「雙重促效劑」，亦即抗體分子能夠由於藉由雙重結合至OX40及CD137二者交聯而經受體誘導信號傳遞。因此，較佳地，當OX40及CD137二者共表現時，抗體分子能夠誘發雙重促效作用。如本文所描述，預期此類雙重促效劑係有利的。舉例而言，咸信此種雙重促效劑可能能夠誘發對免疫反應之較強刺激，因為其可將不同免疫細胞之活化進行組合，例如藉由以反式結合至不同細胞上之二種目標，將CD8+ T細胞及CD4+ T細胞之活性進行組合。作為另一實例，咸信此種雙重促效劑可能能夠藉由以順式結合至二種目標，引起共表現二種目標之單一細胞的活化，而不需要共同相互作用之二個細胞。
更佳地，雙重促效劑應能夠藉由與其特異性目標(OX40及CD137)同時接合自主地驅動促效作用，且不需要額外交聯，例如交聯劑或Fcγ受體。如本文所描述，預期此類自主活性係有利的，因為其將限於二種目標共表現之位置，且因此預期減少與在存在很少或不存在OX40共表現之位置處之CD137活化潛在相關的毒性。
可使用T細胞活化分析量測抗體分子活化T細胞之能力。T細胞在活化時釋放IL-2。T細胞活化分析可因此量測IL-2釋放以測定由抗體分子誘導之T細胞活化的位準。
舉例而言，藉由在T細胞活化分析中量測為達成由T細胞半最大釋放IL-2所需之抗體分子的濃度，測定抗體分子活化T細胞之能力。此在下文中被稱為EC50 。
在一較佳實施例中，抗體分子在T細胞活化分析中具有FS20-22-49AA/FS30-10-16 在相同分析中之EC50 之50倍、40倍、30倍、20倍、10倍或5倍內的EC50 ，其中FS20-22-49AA/FS30-10-16 由SEQ ID NO:95 之重鏈及SEQ ID NO:97 之輕鏈組成。
舉例而言，在交聯時，抗體分子在T細胞活化分析中可具有30 nM或更小、25 nM或更小、20 nM或更小、14 nM或更小、10 nM或更小、5 nM或更小、4 nM或更小、3 nM或更小、2 nM或更小、1.5 nM、1 nM或0.5 nM或更小，較佳1.5 nM或更小，更佳1 nM或更小的EC50 。
另外，或可替代地，可藉由在存在抗體分子之情況下，在T細胞活化分析中量測由T細胞釋放之IL-2的最大濃度，測定抗體分子活化T細胞之能力。
在一較佳實施例中，在存在抗體分子之情況下，在T細胞活化分析中由T細胞釋放之IL-2的最大濃度在相同分析中存在FS20-22-49AA/FS30-10-16 之情況下由T細胞釋放之IL-2之最大濃度的20%或10%內，其中FS20-22-49AA/FS30-10-16 由SEQ ID NO:95 之重鏈及SEQ ID NO:97 之輕鏈組成。
T細胞活化分析較佳包含共表現OX40及CD137之T細胞。在一較佳實施例中，T細胞活化分析不包含除CD137及OX40外之能夠交聯抗體分子之任何試劑。
T細胞活化分析可為如本文所描述之T細胞分析，諸如如本發明實例中所描述之泛T細胞分析、CD4+ T細胞分析或CD8+ T細胞分析。
舉例而言，T細胞活化分析可為基於自人類周邊血液單核細胞(PBMC)分離之T細胞的IL-2釋放分析。CD4+ T細胞活化分析或CD8+ T細胞活化分析可分別為基於自人類PBMC分離之CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之IL-2釋放分析。如本發明實例中所解釋，能夠在CD4+ T細胞分析及CD8+ T細胞分析二者中活化T細胞之抗體分子，能夠活化OX40及CD137二者(亦被稱作『雙重促效劑』)。舉例而言，T細胞活化分析可包含自白血球耗乏錐(cone)分離人類PBMC。用於分離PBMC之方法係此項技術中已知的，且描述於本發明實例中。T細胞接著可自PBMC分離。用於自PBMC分離T細胞(所有T細胞，CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)之方法同樣係此項技術中已知的，且描述於本發明實例中。
活化分析可涉及例如在實驗培養基(諸如T細胞培養基)中製備所需數目之T細胞。所需數目之T細胞可以1.0×106 個細胞/毫升之濃度製備。接著可使用提供T細胞活化所需之信號的適合T細胞活化試劑刺激T細胞。舉例而言，T細胞活化試劑可為包含CD3及CD28之試劑，諸如包含CD3及CD28之珠粒。經分離T細胞可用T細胞活化試劑培育隔夜以活化T細胞。在此之後，可洗滌活化T細胞以將T細胞與T細胞活化試劑分離，且以適合濃度(諸如2.0×106 個細胞/毫升)再懸浮於T細胞培養基中。活化T細胞接著可添加至經抗人類CD3抗體塗佈之培養盤中。
可製備各測試抗體分子之適合稀釋液且將稀釋液添加至孔中。T細胞接著可在37℃，5% CO2 下與測試抗體培育24小時。可收集上清液且對其進行分析，以測定上清液中IL-2之濃度。用於測定溶液中IL-2之濃度的方法係此項技術中已知的，且描述於本發明實例中。可繪製相對於抗體分子之對數濃度，人類IL-2之濃度。可使用log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。
可將抗體分子與生物活性分子或可偵測標記複合。在此情況下，抗體分子可被稱作複合物。此類複合物應用於如本文所描述之疾病治療。
舉例而言，生物活性分子可為免疫系統調節劑，諸如細胞介素，較佳人類細胞介素。舉例而言，細胞介素可為刺激T細胞活化及/或增殖之細胞介素。用於與抗體分子複合之細胞介素的實例包括IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF及IFN-γ。
可替代地，生物活性分子可為配位體捕獲劑(trap)，諸如細胞介素(例如TGF-β或IL-6)之配位體捕獲劑。
可替代地，生物活性分子可為治療性放射性同位素。
放射免疫療法用於例如癌症治療。適於放射免疫療法之治療性放射性同位素係此項技術中已知的，且包括釔-90、碘-131、鉍-213、砹-211、鎦177、錸-188、銅-67、錒-225及碘-125及鋱-161。
可與抗體分子複合之適合可偵測標記係此項技術中已知的，且包括放射性同位素，諸如碘-125、碘-131、釔-90、銦-111及鎝-99；螢光染料，諸如螢光素、若丹明(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、德州紅(Texas Red)及花青染料衍生物，例如Cy7及Alexa750；發色染料，諸如二胺基聯苯胺；膠乳珠粒；酶標記，諸如辣根過氧化酶；具有光譜分離吸收或發射特徵之磷光體或雷射染料；及可經由結合至特異性同源可偵測部分(例如經標記抗生素蛋白)而被偵測到的化學部分，諸如生物素。
抗體分子可藉助於任何適合之共價或非共價鍵(諸如二硫鍵或肽鍵)與生物活性分子或可偵測標記複合。在生物活性分子為細胞介素時，該細胞介素可藉助於肽連接子接合至抗體分子。適合肽連接子係此項技術中已知的，且長度可為5至25、5至20、5至15、10至25、10至20或10至15個胺基酸。
在一些實施例中，生物活性分子可由可裂解連接子與抗體分子複合。連接子可允許生物活性分子在療法位點處自抗體分子釋放。連接子可包括醯胺鍵(例如肽連接子)、二硫鍵或腙。肽連接子例如可由位點特異性蛋白酶裂解，二硫鍵可由胞溶質之還原性環境裂解，且腙可由酸介導之水解裂解。
本發明亦提供編碼本發明之抗體分子的一或多種經分離核酸分子。熟習此項技術者使用此項技術中熟知的方法製備此類核酸分子將沒有困難。
核酸分子或多種核酸分子可例如包含NO:55 或113 、 62 、 64 、 67 、 70 、 75 、 78 、 83 、 87 、 91 或94 中所列舉之序列，其分別編碼FS20-22-49 、 FS20-22-38 、 FS20-22-41 、 FS20-22-47 、 FS20-22-85 、 FS20-31-58 、 FS20-31-66 、 FS20-31-94 、 FS20-31-102 、 FS20-31-108 及FS20-31-115 之CH3域。舉例而言，核酸分子或多種核酸分子可包含SEQ ID NO:55 或113 中所列舉之序列，該等序列均編碼FS20-22-49 之CH3域。在一些實施例中，核酸分子或多種核酸分子包含SEQ ID NO:113 中所列舉之序列，該序列編碼FS20-22-49 之CH3域。較佳地，核酸分子或多種核酸分子包含SEQ ID NO:55 中所列舉之序列，該序列編碼FS20-22-49 之CH3域。
核酸分子或多種核酸分子可編碼VH域及/或VL域，較佳以下之VH域及VL域：抗體FS30-10-16 、 FS30-10-3 、 FS30-10-12 、 FS30-35-14 或FS30-5-37 ，較佳抗體FS30-10-16 、 FS30-10-3 、 FS30-10-12 或 FS30-35-14 ，更佳抗體FS30-10-16 、 FS30-10-3 或 FS30-10-12 ，最佳抗體FS30-10-16 。此等抗體之VH及VL域序列在本文中描述。
舉例而言，(多種)核酸分子可包含： (i)     SEQ ID NO:13 中所列舉之抗體FS30-10-16 的VH域核酸序列， 及/或SEQ ID NO:15 中所列舉之抗體FS30-10-16 的VL域核酸序列；或 (ii)    SEQ ID NO:19 中所列舉之抗體FS30-10-3 的VH域核酸序列， 及/或SEQ ID NO:20 中所列舉之抗體FS30-10-3 的VL域核酸序列； (iii)   SEQ ID NO:24 中所列舉之抗體FS30-10-12 的VH域核酸序列， 及/或SEQ ID NO:20 中所列舉之抗體FS30-10-12 的VL域核酸序列； (iv)   SEQ ID NO:171 中所列舉之抗體FS30-35-14 的VH域核酸序列， 及/或SEQ ID NO:32 中所列舉之抗體FS30-35-14 的VL域核酸序列； 或 (v)    SEQ ID NO:41 中所列舉之抗體FS30-5-37 的VH域核酸序列， 及/或SEQ ID NO:43 中所列舉之抗體FS30-5-37 的VL域核酸序列。
核酸分子或多種核酸分子可編碼重鏈及/或輕鏈，較佳以下之重鏈及輕鏈：抗體FS20-22-49AA/FS30-10-16 、 FS20-22-49AA/FS30-10-3 、 FS20-22-49AA/FS30-10-12 、 FS20-22-49AA/FS30-35-14 或FS20-22-49AA/FS30-5-37 ，較佳抗體FS20-22-49AA/FS30-10-16 、 FS20-22-49AA/FS30-10-3 、 FS20-22-49AA/FS30-10-12 或FS20-22-49AA/FS30-35-14 ，更佳抗體FS20-22-49AA/FS30-10-16 、 FS20-22-49AA/FS30-10-3 或FS20-22-49AA/FS30-10-12 ，最佳FS20-22-49AA/FS30-10-16 。此等抗體之VH及VL域序列在本文中描述。
舉例而言，(多種)核酸分子可包含： (i)     SEQ ID NO:96 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-10-16 的重鏈核酸序列，及/或SEQ ID NO:98 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-10-16 的輕鏈核酸序列；或 (ii)    SEQ ID NO:100 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-10-3 的重鏈核酸序列， 及/或SEQ ID NO:102 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-10-3 的輕鏈核酸序列； (iii)   SEQ ID NO:104 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-10-12 的重鏈核酸序列， 及/或SEQ ID NO:102 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-10-12 的輕鏈核酸序列； (iv)   SEQ ID NO:106 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-35-14 的重鏈核酸序列， 及/或SEQ ID NO:108 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-35-14 的輕鏈核酸序列；或 (v)          SEQ ID NO:110 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-5-37 的重鏈核酸序列，及/或SEQ ID NO:112 中所列舉之抗體FS20-22-49AA/FS30-5-37 的輕鏈核酸序列。
在核酸編碼本發明之抗體分子的VH及VL域，或重鏈及輕鏈時，二個域或鏈可在二個獨立核酸分子上編碼。
經分離核酸分子可用於表現本發明之抗體分子。核酸將一般以重組載體形式提供以便表現。本發明之另一態樣由此提供包含如上文所描述之核酸的載體。可選擇或構築含有適當調節序列(包括啟動子序列、終止子片段、多腺苷酸化序列、強化子序列、標記基因及視需要選用之其他序列)之適合載體。較佳地，載體含有適當調節序列以驅動核酸在宿主細胞中之表現。載體可視需要為質體、病毒(例如噬菌體)或噬菌粒。
如本文所描述之核酸分子或載體可引入至宿主細胞中。用於將核酸或載體引入至寄主細胞之技術係此項技術中公認的，且可採用任何適合之技術。適於產生重組抗體分子之一系列寄主細胞係此項技術中已知的，且包括細菌、酵母菌、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。較佳宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0或HEK細胞(例如HEK293細胞)。
本發明之另一態樣提供一種產生本發明之抗體分子的方法，該方法包含在宿主細胞中表現編碼抗體分子之核酸，及任擇地分離及/或純化由此產生之抗體分子。用於培養寄主細胞之方法係此項技術中熟知的。方法可進一步包含分離及/或純化抗體分子。用於純化重組抗體分子之技術係此項技術中熟知的，且包括例如HPLC、FPLC或親和性層析法(例如使用蛋白A或蛋白L)。在一些實施例中，可使用抗體分子上之親和標籤進行純化。方法亦可包含將抗體分子任擇地與醫藥學上可接受之賦形劑或如下文所描述之其他物質一起調配成醫藥組合物。
如上所解釋，CD137及OX40均在包括T細胞之免疫系統之細胞上表現。舉例而言，OX40在免疫系統之細胞上表現，該等細胞包括活化T細胞，尤其CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、第1型T輔助(Th1)細胞、第2型T輔助(Th2)細胞及調節T (Treg)細胞及腫瘤浸潤T細胞，以及活化自然殺手(NK)細胞。CD137在免疫系統之細胞上表現，該等細胞包括T細胞，尤其CD8+ T細胞、B細胞、NK細胞及腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。與CD8+ T細胞相比，CD4+ T細胞上CD137以較低位準表現(參見實例 14 及圖 6 )，但亦已展示CD137涉及誘導CD4+ T細胞之一些次群的增殖及活化(Wen等人, 2002)。
已展示OX40活化在增強T細胞活化、T細胞無性擴增、T細胞分化及存活及記憶T細胞之產生中起作用。已展示CD137活化在增強CD8+ T細胞之增殖、存活及細胞毒性效應功能，以及CD8+ T細胞分化及記憶CD8+ T細胞之維持中起作用。亦已展現CD137之活化增強NK細胞介導之ADCC，以及B細胞增殖、存活及細胞介素產生。
考慮到OX40及CD137之增強免疫反應的活性，已在癌症治療之情形下研究OX40及CD137促效劑分子，且亦預期該等分子應用於感染性疾病之治療中得到應用。
如本文所描述之抗體分子可由此適用於治療應用，尤其用於癌症及感染性疾病之治療。
如本文所描述之抗體分子可用於治療人體或動物體之方法。本發明之相關態樣提供； (i)用作藥劑之本文所描述之抗體分子， (ii)用於疾病或病症之治療方法的本文所描述之抗體分子， (iii)本文所描述之抗體分子在用於治療疾病或病症之藥劑之製造中的用途；及 (iv)治療個體之疾病或病症的方法，其中該方法包含向該個體投與治療有效量之如本文所描述之抗體分子。
個體可為患者，較佳人類患者。
治療可為其中達成一定所需療效之任何治療或療法，該療效例如抑制病狀或延緩病狀進展，且包括進展速率降低；進展速率停止；病狀改善；病狀之治癒或緩解(無論部分或整體)；預防、改善、延緩、緩和或遏制病狀之一或多個症狀及/或徵象；延長個體或患者之存活期，超過或在不存在治療之情況下所預期之存活期。
亦包括作為預防性措施(亦即預防)之治療。舉例而言，可如本文所描述治療易於發生或復發疾病(諸如癌症)或具有發生或復發疾病之風險的個體。此類治療可預防或延緩個體中疾病之發生或復發。
如所描述之治療方法可包含向個體投與除抗體分子以外的至少另一種治療。本文所描述之抗體分子可由此單獨或與一或多種其他治療組合投與個體。在抗體分子與另一治療組合投與個體時，額外治療可與抗體分子之投與同時、依序或分別地投與個體。在額外治療與抗體分子同時投與時，抗體分子及額外治療可以組合製劑形式投與個體。舉例而言，額外療法可為已知用於待治療之疾病的療法或治療劑。
儘管抗體分子可單獨投與，但抗體分子將通常以醫藥組合物形式投與，該醫藥組合物可包含除抗體分子以外的至少一種組分。本發明之另一態樣因此提供醫藥組合物，其包含如本文所描述之抗體分子。亦提供包含將抗體分子調配成醫藥組合物之方法。
除抗體分子以外，醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者熟知的其他材料。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係關於在合理醫學判斷之範疇內，適用於接觸個體(例如人類)之組織而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的益處/風險比相稱的化合物、物質、組合物及/或劑型。各載劑、賦形劑等必須在與調配物之其他成分相容的意義上亦為「可接受」。載劑或其他材料之確切性質將取決於投藥途徑，其可為藉由輸注、注射或任何其他適合途徑，如下文所論述。
對於非經腸，例如皮下或靜脈內投與(例如藉由注射)，包含抗體分子之醫藥組合物可呈可非經腸接受之水溶液形式，其無熱原且具有適合pH、等滲性及穩定性。具有此項技術之相關技能之彼等者能夠很好地使用例如等滲媒劑(諸如氯化鈉注射劑、林格氏注射劑(Ringer's Injection)或乳酸化林格氏注射劑)來製備適合溶液。可按需要使用之防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，諸如抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨；氯苄烷銨(benzalkonium chloride)；氯化苯索銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3'-戊醇；及間甲酚)；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉離子；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，抗體分子可以在投與之前復水之凍乾形式提供。舉例而言，在投與個體之前，凍乾抗體分子可在無菌水中復水且生理食鹽水與混合。
投與可呈「治療有效量」，此足以展示對個體之益處。所投與之實際量，及投與速率及時程將取決於所治療之疾病的性質及嚴重程度、所治療之特定個體、個體之臨床病狀、病症之病因、組合物之遞送位點、抗體分子之類型、投與方法、投與排程及醫學從業者已知的其他因素。治療開處，例如對劑量等之決定處於一般從業者及其他醫生之職責內，且可取決於症狀之嚴重程度及/或所治療之疾病的進展。抗體分子之適當劑量為此項技術中所熟知(Ledermann等人, 1991; Bagshawe等人, 1991)。可使用適於所投與抗體分子之本文所指定，或Physician's Desk Reference (2003)中之特定劑量。可藉由在動物模型中比較活體外活性及活體內活性來確定抗體分子之治療有效量或適合劑量。已知將小鼠及其他測試動物中之有效劑量外推至人類的方法。精確劑量將取決於數個因素，包括待治療之域之大小及位置，及抗體分子之確切性質。
對於全身施加，典型抗體劑量在100 µg至1 g範圍內，且對於局部施加，在1 µg至1 mg範圍內。可投與初始較高起始劑量，接著可投與一或多種較低劑量。此為用於成年個體之單次治療之劑量，其可按比例調節以用於兒童及嬰兒，且亦可針對其他抗體格式與分子量成比例地調節。
由醫師酌情處理，治療可以每天、每週二次、每週一次或每月一次間隔重複。個體之治療排程可取決於抗體組合物之藥物動力學及藥力學特性、投藥途徑及所治療之病狀的性質。
治療可為週期性的，且投與之間的時段可為約二週或更多，例如約三週或更多、約四週或更多、約一月一次或更多、約五週或更多或約六週或更多。舉例而言，治療可為每二至四週一次或每四至八週一次。適合調配物及投藥途徑描述於上文。
在一較佳實施例中，如本文所描述之抗體分子可用於治療癌症之方法中。
癌症之特徵可為惡性癌細胞之異常增殖。在提及特定類型之癌症(諸如乳房癌)時，此係指相關組織(諸如乳房組織)之惡性細胞的異常增殖。定位於乳房中但為另一組織(諸如卵巢組織)之惡性細胞異常增殖之結果的繼發癌不為如本文中所提及之乳癌，而為卵巢癌。
癌症可為原發癌或繼發癌。因此，如本文所描述之抗體分子可用於治療個體之癌症的方法中，其中癌症為原發性腫瘤及/或腫瘤轉移。
待使用如本文所描述之抗體分子治療之癌症的腫瘤可包含例如在細胞表面上表現OX40及/或CD137之TIL。在一個實施例中，可能已確定腫瘤包含表現OX40及CD137中之一者或二者的TIL。用於確定抗原在細胞表面上之表現的方法係此項技術中已知的，且包括例如流式細胞量測術。
舉例而言，待使用如本文所描述之抗體分子治療的癌症可選自由以下組成之群：白血病，諸如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)及慢性淋巴球性白血病(CLL)；淋巴瘤，諸如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤及多發性骨髓瘤；及實體癌，諸如肉瘤(例如軟組織肉瘤)、皮膚癌(例如梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma))、黑素瘤、膀胱癌(例如膀胱尿道上皮癌)、腦癌(例如多形性膠質母細胞瘤)、乳房癌、子宮/子宮內膜癌、卵巢癌(例如卵巢漿液性囊腺瘤)、前列腺癌、肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC)(諸如肺鱗狀細胞癌)，及小細胞肺癌(SCLC))、結腸直腸癌(例如結腸直腸腺癌)、子宮頸癌(例如子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌)、肝癌(例如肝細胞癌)、頭頸癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌)、食道癌(例如食道癌)、胰臟癌、腎癌(例如腎細胞癌)、腎上腺癌、胃癌(例如胃腺癌)、睪丸癌(例如睪丸生殖細胞腫瘤)、膽囊及膽道癌(例如膽管癌)、甲狀腺癌、胸腺癌、骨癌及腦癌。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之抗體分子治療之癌症為實體癌。
更佳地，待使用如本文所描述之抗體分子治療之癌症為選自由以下組成之群的實體癌：黑素瘤、膀胱癌、腦癌、乳房癌、卵巢癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸癌、胰臟癌、腎癌及胃癌。
在另一較佳實施例中，待使用如本文所描述之抗體分子治療之癌症可為對用一或多種檢查點抑制劑進行之治療起反應的癌症，檢查點抑制劑諸如結合PD-1、PD-L1或CTLA4之抗體。認為與對檢查點抑制劑療法不起反應之腫瘤相比，此類腫瘤具有較高TIL位準及/或較高腫瘤突變負荷量。此類腫瘤亦被稱作溫熱或熱腫瘤。
此類腫瘤之實例包括頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、黑素瘤、肺癌(諸如鱗狀肺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌[NSCLC]或小細胞肺癌[SCLC])、前列腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳房癌、甲狀腺癌、腎癌、結腸直腸癌(MSI或MSS；例如結腸直腸腺癌)、食道癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、胃癌、子宮內膜癌、胰臟癌、卵巢癌、肝細胞癌、間皮瘤及尿道上皮癌。在一較佳實施例中，癌症為胃癌。癌症可進一步為先前尚未經化學治療劑或放射治療劑治療的癌症，亦即待治療之個體可為尚未接受用針對所討論之癌症之化學治療劑或放射治療劑進行之治療的癌症患者。在一較佳實施例中，如本文所描述之抗體分子係用於治療個體之對一或多種免疫檢查點抑制劑起反應之癌症的方法，其中該方法包含用抗體分子與抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑的組合治療患者。
可替代地，待使用如本文所描述之抗體分子治療之癌症可為對用一或多種檢查點抑制劑進行之治療不起反應的癌症(諸如胰臟癌或前列腺癌)，檢查點抑制劑諸如結合PD-1、PD-L1或CTLA4之抗體。此類腫瘤亦被稱作冷腫瘤。
諸位發明人已展示，對用單獨的抗PD-1或抗PD-L1抗體進行之治療不起反應的腫瘤，對用抗PD-1或抗PD-L1抗體與如本文所描述之抗體分子之組合進行的治療起反應。因此，本發明之抗體分子可用於治療個體之癌症的方法中，其中癌症對用單獨的一或多種檢查點抑制劑進行之治療不起反應，或難以用其治療，且其中該方法包含向個體投與抗體分子與抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑的組合。亦設想治療個體之癌症之方法，其中癌症對用單獨的一或多種檢查點抑制劑進行之治療不起反應，或難以用其治療，且其中該方法包含向個體投與抗體分子及抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑的組合。
在不希望受理論束縛的情況下，認為用化學療法、放射療法、免疫治療劑(諸如免疫刺激劑)或抗腫瘤疫苗對用單獨的一或多種檢查點抑制劑進行之治療不起反應的癌症進行治療，將引起癌細胞死亡，其繼而將引起腫瘤中之TIL增加及免疫抑制性受體的較高表現，其繼而將使癌症對用檢查點抑制劑進行之治療起反應，亦即將冷腫瘤轉變成溫熱腫瘤。因此，本發明之抗體分子可用於治療個體之癌症的方法中，其中癌症對用單獨的一或多種檢查點抑制劑進行之治療不起反應，或難以用其治療，且其中該方法包含向個體投與抗體分子與化學治療劑、放射治療劑或免疫刺激劑，或抗癌疫苗及任擇地抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑的組合。亦設想治療個體之癌症之方法，其中癌症對用單獨的一或多種檢查點抑制劑進行之治療不起反應，或難以用其治療，且其中該方法包含向個體投與抗體分子與化學治療劑、放射治療劑或免疫刺激劑，或抗癌疫苗及任擇地抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑的組合。在一較佳實施例中，抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑為結合PD-1或PD-L1之抗體。
在癌症情形下，治療可包括抑制癌症生長，包括完全癌症緩解，及/或抑制癌轉移，以及抑制癌症復發。癌症生長一般係指指示癌症內變化成發展較完善之形式的數種指數中之任一者。因此，用於量測癌症生長之抑制的指數包括癌細胞存活率降低、腫瘤體積或形態減小(例如，如使用電腦斷層攝影(CT)、超音波掃描或其他成像方法測定)、腫瘤生長延緩、腫瘤血管破壞、延遲超敏皮膚測試之改良表現、抗癌免疫細胞或其他抗癌免疫反應之活性提高，及腫瘤特異性抗原之位準降低。活化或增強對個體之癌性腫瘤的免疫反應可改善個體抵抗癌症生長，尤其已存在於個體中之癌症之生長的能力，及/或減少個體中對癌症生長之傾向。
在癌症治療情形下，如本文所描述之抗體分子可與另一抗癌療法或治療劑組合投與個體，另一抗癌療法或治療劑諸如已展示為適用於，或潛在適用於治療所討論之癌症的抗癌療法或治療劑。舉例而言，抗體分子可與以下組合投與個體：化學治療劑、放射療法、放射核種、免疫治療劑、抗腫瘤疫苗、溶瘤病毒、過繼細胞轉移(ACT)療法(諸如過繼NK細胞療法或利用嵌合抗原受體(CAR)T細胞、自體TIL或γ/δ T細胞的療法)，或供激素療法用之藥劑。如本文所描述之抗體分子亦可與以下組合投與個體：佐劑或新輔助(neoadjuvant)(諸如新輔助激素療法)、抗血管生成劑(諸如抗VEGF或抗VEGFR2抗體)或細胞毒性劑。
在不希望受理論束縛的情況下，認為本文所描述之抗體分子可充當抗癌療法之佐劑。具體而言，認為與在單獨的化學療法或放射療法之情況下所達成之針對癌症的免疫反應相比，將抗體分子與化學療法或放射療法組合投與個體例如將觸發針對癌症的更大免疫反應。
用於與如本文所描述之抗體分子組合投與的一或多種化學治療劑可選自由以下組成之群：紫杉烷、細胞毒性抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、PARP抑制劑、B-Raf酶抑制劑、MEK抑制劑、c-MET抑制劑、VEGFR抑制劑、PDGFR抑制劑、烷基化劑、鉑類似物、核苷類似物、抗葉酸劑、沙立度胺(thalidomide)衍生物、抗腫瘤(antineoplastic)化學治療劑及其他。紫杉烷包括多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及白蛋白結合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel)；細胞毒性抗生素包括放線菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、及蒽環黴素(anthracycline)(諸如小紅莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)及伐柔比星(valrubicin))；酪胺酸激酶抑制劑包括埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、阿西替尼(axitinib)、PLX3397、伊馬替尼(imatinib)、可米替尼(cobemitinib)及曲美替尼(trametinib)；PARP抑制劑包括皮納帕尼(piraparib)；B-Raf酶抑制劑包括維羅非尼(vemurafenib)及達拉非尼(dabrafenib)；烷基化劑包括達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)及替莫唑胺(temozolomide)；鉑類似物包括卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)及奧賽力鉑(oxaliplatin)；核苷類似物包括阿紮胞苷(azacitidine)、卡培他濱(capecitabine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)及吉西他濱(gemcitabine)且；抗葉酸劑包括甲胺喋呤(methotrexate)及培美曲唑(pemetrexed)。適用於本發明之其他化學治療劑包括迪法替尼(defactinib)、恩替諾特(entinostat)、艾瑞布林(eribulin)、伊立替康(irinotecan)及長春鹼(vinblastine)。用於與如本文所描述之抗體分子組合投與之化學治療劑可為氟嘧啶。舉例而言，在待治療之癌症為HER2陰性(諸如HER2陰性胃癌)時，如本文所描述之抗體分子可與鉑、鉑類似物及氟嘧啶組合投與。在待治療之癌症為HER2陽性(諸如HER2陽性胃癌)時，如本文所描述之抗體分子可與鉑或鉑類似物、氟嘧啶及曲妥珠單抗(trastuzumab)組合投與。
用於與如本文所描述之抗體分子一起投與之較佳治療劑為小紅莓、米托蒽醌、環磷醯胺、順鉑及奧賽力鉑。
用於與如本文所描述之抗體分子組合投與之放射療法可為體外放射療法(external beam radiotherapy)或近接療法(brachytherapy)。
用於與如本文所描述之抗體分子一起投與之放射核種可選自由以下組成之群：釔-90、碘-131、鉍-213、砹-211、鎦177、錸-188、銅-67、錒-225、碘-125及鋱-161。
用於與如本文所描述之抗體分子組合投與之免疫治療劑可為治療性抗體分子、核苷酸、細胞介素或基於細胞介素之療法。舉例而言，治療性抗體分子可結合至免疫調節分子(例如抑制性檢查點分子或免疫共刺激分子)、先天免疫系統之受體或腫瘤抗原(例如細胞表面腫瘤抗原或可溶性腫瘤抗原)。治療性抗體分子可結合之免疫調節分子的實例包括CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、計劃性死亡配位體1 (PD-L1)、計劃性細胞死亡蛋白1 (PD-1)、CD47、CD73、CSF-1R、KIR、CD40、HVEM、IL-10及CSF-1。治療性抗體分子可結合之先天免疫系統之受體的實例包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9、類RIG-I受體(例如RIG-I及MDA-5)及STING。治療性抗體分子可結合之腫瘤抗原的實例包括HER2、EGFR、CD20及TGF-β。
諸位發明人已展示，與用單獨的本發明抗體分子抑或抗PD-1或抗PD-L1抗體進行之治療相比，投與本發明之抗體分子與抗PD-1或抗PD-L1抗體之組合引起小鼠腫瘤模型中增強的T細胞活化及腫瘤消退。在不希望受理論束縛的情況下，此等結果表明，投與本發明之抗體分子與能夠抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑的組合引起增強的抗腫瘤效應，以及此類組合投與可適於治療難治性或抗性腫瘤或在PD-1或PD-L1抗體單一療法後復發之腫瘤。
因此，本發明之抗體分子可用於治療個體之癌症的方法中，其中該方法包含投與抗體分子與能夠抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑的組合。亦提供能夠抑制PD1與PD-L1之間相互作用的藥劑(諸如結合PD-1或PD-L1之抗體分子)，以供用於治療個體之癌症的方法中，其中該方法包含投與能夠抑制PD-1與PD-L1之間相互作用之藥劑與本發明抗體的組合。一種治療個體之癌症之方法包含向個體投與治療有效量之本發明之抗體分子，及治療有效量之能夠抑制PD-1與PD-L1之間相互作用的藥劑。
在一較佳實施例中，能夠抑制PD-1與PD-L1相互作用之藥劑為結合PD-1或PD-L1之抗體分子。結合至PD-1之抗體係此項技術中已知的，且包括納武單抗(nivolumab)(5C4)及派姆單抗(pembrolizumab)。結合至PD-L1之已知抗體包括YW243.55.S1、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)及艾維路單抗(avelumab)。本發明之抗體分子可用於與此等已知抗PD-1或PD-L1抗體中之一者，或與另一抗PD-1或PD-L1抗體一起投與。使用日常工作方法製備結合至PD-1或PD-L1之替代抗體在熟習此項技術者能力範圍內。
用於與如本文所描述之抗體分子組合投與的核酸可為siRNA。
細胞介素或基於細胞介素之療法可選自由以下組成之群：IL-2、複合IL2之前藥、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21及第I型干擾素。
用於治療癌症之抗腫瘤疫苗既已在臨床上實施，亦已在科學文獻(諸如Rosenberg，2000)內詳細論述。此主要涉及藉由將自體或同種異體癌細胞以疫苗接種方法之形式使用，伴隨或不伴隨顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，促使免疫系統對由該等自體或同種異體癌細胞表現之各種細胞標記物起反應的策略。GM-CSF引起抗原呈現中之強烈反應，且在與該策略一起採用時尤其良好地起作用。
如本文所描述之抗體分子亦可與雷莫蘆單抗(ramucirumab)及/或太平洋紫杉醇；伊立替康及多烯紫杉醇或太平洋紫杉醇；或派姆單抗組合投與患有癌症之個體，尤其患有胃癌之個體。用如本文所描述之抗體分子與派姆單抗之組合進行的治療在MSI-H及/或dMMR胃癌之治療中較佳。
考慮到OX40及CD137之增強免疫反應的活性，預期OX40及CD137雙重促效劑分子在感染性疾病之治療中得到應用。因此，在另一較佳實施例中，如本文所描述之抗體分子可用於治療感染性疾病(諸如急性或持續性感染性疾病)之方法中。
在不希望受理論束縛的情況下，認為OX40及CD137促效劑分子可能能夠藉由誘導先天性免疫細胞(諸如嗜中性白血球及單核球)之快速浸潤及活化，增強針對由病原體所引起之急性感染性疾病的免疫反應，藉此促進對引起急性感染性疾病之病原體的清除。因此，在另一實施例中，如本文所描述之抗體分子可用於治療急性感染性疾病(諸如急性細菌疾病)之方法中。在一較佳實施例中，急性感染性疾病為由革蘭氏陽性細菌(諸如李斯特菌屬(Listeria )細菌、肺炎鏈球菌或金黃色葡萄球菌)引起之感染所導致的急性細菌疾病。
感染性疾病通常由免疫系統清除，但一些感染持續長時間段，諸如數月或數年，且未受免疫系統有效抗擊。此類感染亦被稱作持續性或慢性感染。
較佳地，如本文所描述之抗體分子用於治療持續性感染性疾病，諸如持續性病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染，較佳持續性病毒或細菌感染。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之抗體分子治療之持續性病毒感染為以下的持續性感染：人類免疫不全病毒(HIV)、埃-巴二氏病毒、巨細胞病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、水痘帶狀疱疹病毒。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之抗體分子治療之持續性細菌感染為以下的持續性感染：金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、幽門螺旋桿菌、梅毒螺旋體、糞腸球菌或肺炎鏈球菌。
在治療由革蘭氏陽性細菌引起之感染的情形下，已將CD137促效作用描述為有益的。因此，在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之抗體分子治療之持續性細菌感染為由革蘭氏陽性細菌引起之持續性感染。在一更佳實施例中，持續性細菌感染為由選自由以下組成之群的革蘭氏陽性細菌引起之持續性感染：金黃色葡萄球菌、麻風分枝桿菌、糞腸球菌及肺炎鏈球菌。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之抗體分子治療之持續性真菌感染為以下的持續性感染：念珠菌屬(例如白色念珠菌)、隱球菌屬(格特隱球菌及新型隱球菌)、馬爾尼菲籃狀菌(青黴菌)、小芽孢菌屬(例如奧杜盎小芽孢菌)及匐行疹發癬菌。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之抗體分子治療之持續性寄生蟲感染為以下的持續性感染：瘧原蟲屬(諸如惡性瘧原蟲)，或利什曼原蟲屬(諸如黑熱病利什曼原蟲)。
在治療持續性感染性疾病之情形下，抗體分子可與已展示為適用於，或預期適用於治療所討論之病原體的第二療法或治療劑組合投與個體。舉例而言，抗體分子可與免疫治療劑組合投與個體。用於與如本文所描述之抗體分子組合投與的免疫治療劑可為治療性抗體分子。舉例而言，治療性抗體分子可結合至先天免疫系統之受體。治療性抗體分子可結合之先天免疫系統之受體的實例包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9、類RIG-I受體(例如RIG-I及MDA-5)及STING。
在抗體分子用於預防感染性疾病時，抗體分子可與針對所討論之病原體的疫苗組合投與。在不希望受理論束縛的情況下，認為本文所描述之抗體分子可充當疫苗接種中之佐劑。具體而言，認為向個體投與抗體分子與疫苗之組合，與在單獨的疫苗情況下所達成之針對病原體的免疫反應相比，將觸發針對病原體的更大免疫反應。
在治療持續性感染性疾病之情形下，治療可包括消除感染、減少個體之病原負荷及預防感染復發。舉例而言，治療可包含預防、改善、延緩、緩和或遏制持續性感染之一或多個症狀及/或徵象。可替代地，治療可包括預防感染性疾病。
以特定形式表述，或就用於執行所揭示功能之手段，或用於獲得所揭示結果之方法或製程而言表述的前述說明書、或下文申請專利範圍或附圖中所揭示之特徵，視需要可分別地，或以此類特徵之任何組合形式，用於實現呈多樣形式之本發明。
雖然已結合以上所描述之例示性實施例來描述本發明，但在給出本發明時許多等效修改及變化對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。因此，上文闡述之本發明之例示性實施例被認為係例示性而非限制性的。可在不偏離本發明之精神及範疇的情況下對所描述實施例作出各種改變。
為避免任何疑問，本發明提供之任何理論解釋係出於增進讀者理解之目的而提供的。諸位發明人不希望受此等理論解釋中之任一者束縛。
本文所用之任何章節標題僅出於組織目的且不應理解為限制所述主題。
在本說明書通篇，包括所附申請專利範圍，除非本文另有規定，否則詞語「包含(comprise)」及「包括(include)」，及諸如「包含(comprises/comprising)」及「包括(including)」之變化形式應理解為暗示包括所述整體或步驟或整體或步驟組，但不排除任何其他整體或步驟或整體或步驟組。
應注意，除非上下文明確另外指定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。範圍可在本文中表示為「約」一個特定值及/或至「約」另一特定值。當表述此類範圍時，另一個實施例包括自一個特定值及/或至另一特定值。類似地，當值藉由使用先行詞「約」表示為近似值時，應理解特定值形成另一實施例。與數值有關之術語「約」為任擇的，且意謂例如+/- 10%。實例
諸位發明人旨在產生能夠在不存在人工交聯劑或Fcγ受體介導之交聯之情況下對OX40及CD137二者產生促效作用，且能夠產生針對諸如癌症之疾病之增強免疫反應的mAb2 。在此情形下，mAb2 為抗體分子，其包含結合基於CDR之CD137抗原結合位點，及定位於該抗體分子之CH3域中的OX40抗原結合位點。
為達成此目的，諸位發明人首先使用選擇及親和性成熟方法以鑑別能夠分別在人類及小鼠中結合OX40且誘導T細胞活化之Fcab(參見實例 2 及實例 3 )。諸位發明人隨後將來自此等Fcab之OX40抗原結合位點引入至mAb2 格式中，且展示數種此等抗人類OX40「假擬」mAb2 能夠在交聯時以高親和性結合人類及食蟹獼猴OX40，且活化T細胞(參見實例 4 )。在此等mAb2 中，純系FS20-22-49展示在交聯後之最高促效活性增加，且在存在交聯之情況下亦具有針對其促效活性之最低EC50 ，且因此將該純系進一步作為用於開發本發明mAb2 的OX40抗原結合位點。
為了開發結合CD137，且能夠對其產生促效作用之基於CDR之抗原結合位點，諸位發明人使用選擇方法以鑑別可結合人類CD137且僅在交聯時能夠活化T細胞之單株抗體(mAb)(參見實例 5 )。隨後將來自此等鑑別出之mAb的CDR選殖至包含FS20-22-49 OX40抗原結合位點之mAb2 中。此等mAb2 之CDR經序列最佳化以便產生以下mAb2 ：FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-35-14及FS20-22-49AA/FS30-5-37 (參見實例 6 )。在T細胞活化分析中，展現所有此等mAb2 對人類CD137具有高位準特異性，且能夠在交聯時活化CD137 (參見實例 7 )。mAb2 中無一者展示在不存在交聯之情況下活化CD137的顯著能力。
已確認所選mAb2 中之FS20-22-49AA OX40抗原結合位點能夠在交聯時結合且活化OX40，且分別地，基於FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-10-16、FS30-35-14及FS30-5-37 CD137 CDR之抗原結合位點能夠在交聯時結合且活化CD137，諸位發明人試圖展現含有此等抗原結合域之mAb2 能夠活化OX40及CD137二者(亦被稱作『雙重促效作用』)。此類雙重促效劑將能夠i)結合至OX40以交聯mAb2 及結合至、聚集且活化CD137 (對其產生促銷作用)，及ii)結合至CD137以交聯mAb2 及結合至、聚集且活化OX40 (對其產生促銷作用)。重要的是，雙重促效劑應能夠基於特異性目標(OX40及CD137)之表現自主地驅動促效作用，且不需要額外交聯劑。
諸位發明人展現，所測試之mAb2 分子能夠結合人類CD137、人類OX40、食蟹獼猴CD137及食蟹獼猴OX40 (參見實例 8 )，且所測試之mAb2 分子能夠同時結合至人類CD137及人類OX40 (參見實例 9 )。諸位發明人展示，mAb2 之CH2域中的『LALA』突變減弱其與Fcγ受體之結合，且在ADCC生物分析中，mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-10-16無法誘導ADCC活化(參見實例 10 )。
諸位發明人亦展示，所測試之OX40/CD137 mAb2 分子結合至細胞表現之人類及食蟹獼猴OX40及CD137，其中未觀測到非特異性結合(參見實例 11 )。
諸位發明人隨後展現，在使用葡萄球菌腸毒素A (SEA)之T細胞活化分析中，含有此LALA突變之所測試之mAb2 分子能夠在不存在人工交聯劑之情況下誘導T細胞活化(參見實例 12 )。諸位發明人亦展現，在泛T細胞活化分析中，所測試之mAb2 分子可在不存在人工交聯劑之情況下誘導T細胞活化，且此活性依賴於同時接合OX40及CD137二者的mAb2 (參見實例 13 及實例 16 )。諸位發明人另外證實，FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 能夠在不存在交聯之情況下分別活化CD4+及CD8+ T細胞中之此等受體(參見實例 14 )。
由於抗人類OX40/CD137 mAb2 不結合至小鼠蛋白，因此為了測試OX40/CD137 mAb2 違禁T細胞介導之抗腫瘤反應的潛力，製得靶向小鼠OX40及小鼠CD137，具有及不具有LALA突變之平行mAb2 (分別標記為FS20m-232-91AA/Lob12.3及FS20m-232-91/Lob12.3)。諸位發明人展示，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 可在不存在額外交聯劑之情況下誘導T細胞活化，且此活性依賴於同時接合OX40及CD137二者之mAb2 (參見實例 15 及實例 16 )。
諸位發明人展現，在CT26同基因型腫瘤模型中，FS20m-232-91AA/Lob12.3及FS20m-232-91/Lob12.3 mAb2 具有活體內抗腫瘤功效(參見實例 17 )。諸位發明人另外展現，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 對循環T細胞具有影響，提高活化及增殖T細胞之頻率(參見實例 18 及實例 19 )。諸位發明人展現，在B16-F10同基因型腫瘤模型中，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 具有活體內抗腫瘤功效(參見實例 20 )。
諸位發明人進行對mAb2 之分析表徵及初步穩定性評定(參見實例 21 )。所測試之所有五種mAb2 展示有利分析表徵及有利穩定性。
諸位發明人已展現，在使用SEA之T細胞活化分析中，FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 與抗PD-L1或抗PD-1抗體之組合可活體外引起T細胞之最大活性的增加，超過在單獨的OX40/CD137 mAb2 之情況下所發現的活性。諸位發明人已進一步展示，在CT26小鼠腫瘤模型中，與用任一單劑進行之處理相比，用FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 與抗PD-1抗體之組合進行的活體內處理能夠引起抗腫瘤活性之增加，以提供存活益處，且增強對增殖T細胞及NK細胞之藥力學調節(參見實例 22 )。
諸位發明人已展現，在CT26同基因型腫瘤模型中，直至某一劑量位準，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 具有活體內劑量依賴性抗腫瘤活性，且此活性在較高劑量位準下得到維持。諸位發明人亦已展示，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 可在「完全反應者」小鼠中誘導保護性免疫記憶之建立，且保護免受用CT26細胞再接種之影響(參見實例 23 )。諸位發明人已展現，處於不同劑量位準下之FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 對循環T細胞具有影響，顯著提高增殖(Ki67+) CD4+及CD8+ T細胞之頻率(參見實例 24 )。諸位發明人已進一步展示，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 能夠提高活化(CD69+)及增殖(Ki67+) CD8 T細胞之頻率，且CD4T細胞耗乏對由FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 介導之此周邊藥力學反應具有不利影響(參見實例 25 )。諸位發明人已展示，與等效人類分析相比，在初代食蟹獼猴PBMC分析中，FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 具有類似功能活性，mAb2 在食蟹獼猴中在至多30 mg/kg之劑量下具有良好耐受性，且其能夠在食蟹獼猴中誘導中央記憶及效應記憶CD4+及CD8+ T細胞及NK細胞之增殖及活化的藥物相關增加(參見實例 26 )。
諸位發明人亦已展示，當在BALB/c小鼠中研究時，與誘導升高且持續肝臟T細胞浸潤、增殖及活化之非交聯依賴性CD137促效劑相比，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 誘導肝中T細胞浸潤及增殖之位準的中度且暫時增加(參見實例 27 )。最後，在CT26同基因型小鼠腫瘤模型中，諸位發明人已展示，在經FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 或包含與非交聯依賴性抗CD137 Fab純系配對之相同OX40 Fcab的OX40/CD137 mAb2 任一者處理的小鼠之間，不存在腫瘤生長或存活的差異，儘管相比於FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 之交聯依賴性抗CD137 Lob12.3純系，非交聯依賴性Fab純系具有誘導提高之T細胞位準及增殖的能力(參見實例 28 )。
此等實驗更詳細地描述於以下實例中。 實例1-抗原選擇及表徵
用於鑑別能夠結合OX40及CD137二者且對二者產生促效作用之mAb2 的選擇及篩選方法需要使用多種OX40及CD137抗原。下文更詳細地描述此等抗原之產生。 1.1         OX40抗原
用於選擇對人類及小鼠OX40具有特異性之Fcab及用於測試所選Fcab與食蟹獼猴OX40之交叉反應性的OX40抗原自產(in-house)製備，或獲自如下文所描述之商業來源。 1.1.1       重組可溶性人類、食蟹獼猴及小鼠OX40抗原之製備
為製備重組可溶性二聚OX40抗原，將OX40之胞外域融合至小鼠Fc，其改良抗原之溶解度及穩定性。具體而言，使用EcoRI-HF及BglII限制酶，將相關OX40 (人類、食蟹獼猴或小鼠)之胞外域選殖至pFUSE-mIgG2aFc2載體(Invivogen目錄號pfuse-mg2afc2)中，以產生在C端具有小鼠IgG2a Fc域之抗原。隨後藉由在HEK293-6E細胞(National Research Council of Canada)中短暫表現，產生重組OX40抗原，且使用mAb Select SuRe蛋白A管柱(GE Healthcare，11003494)純化抗原，接著進行尺寸排阻層析法(SEC)以確保所得抗原為單一物種且不含聚集體。
為製備生物素標記形式的重組OX40抗原，使用EZ-Link™ Sulfo-NHS-SS-Biotin套組(Thermo Fisher Scientific，目錄號21331)遵循製造商之方案用生物素標記抗原。經生物素標記之OX40抗原用於下文所描述之選擇實驗，而非用於結合親和性量測。根據製造商說明書，使用PD-10去鹽管柱(GE Healthcare，17-0851-01)，接著用Amicon 30k自旋管柱Millipore，UFC903024)，以二個步驟進行經生物素標記之OX40抗原的純化。重組抗原之生理特性藉由SE-HPLC分析表徵，以確保不存在聚集體，且藉由PAGE表徵，以驗證分子之尺寸。藉由PAGE進行之尺寸測定表明，可溶性抗原為二聚的，因為其估計分子量為單體之預測分子量的雙倍。亦藉由凝膠位移分析對重組抗原進行分析，該分析展示生物素標記程度超過90%。使用ELISA及表面電漿子共振(SPR)以證實經生物素標記之重組人類(hOX40-mFc)、小鼠(mOX40-mFc)及食蟹獼猴(cOX40-mFc) OX40抗原可由OX40特異性抗體(針對人類及食蟹獼猴OX40之抗體11D4 [歐洲專利第2242771號]；針對食蟹獼猴OX40之多株綿羊抗人類OX40抗體[R&D Systems目錄號AF3388]；針對人類OX40之抗體ACT35 [Biolegend目錄號35002]及針對小鼠OX40之抗體OX86 [Biolegend目錄號119408])結合。此等抗原列於以下表 2 中。 1.1.2       表現人類、食蟹獼猴及小鼠OX40之細胞株的製備
使用SpeI-HF及NotI-HF限制酶，將人類、食蟹獼猴及小鼠OX40 (對於序列，參見表 1 )選殖至載體pLVX-EF1a-IRES-puro (Clontech，目錄號631253)中。將載體隨後與Lenti-X HTX包裝混合物(Clontech目錄號631249)一起轉型至Lenti-X 293T細胞株(Clontech，目錄號632180)中，以產生慢病毒。慢病毒隨後用於轉導DO11.10細胞(National Jewish Health)。藉由用5 μg/ml嘌呤黴素(Life Technologies目錄號A11113803)培育細胞持續大約2週，接著藉由連續稀釋進行細胞株選殖，選擇過度表現OX40之細胞。藉由流式細胞量測術，使用螢光標記OX40特異性抗體(OX86；ACT35；及多株綿羊抗人類OX40，如實例 1.1.1 及表 2 中所描述)測試OX40由細胞株之表現。選擇表現人類(DO11.10-hOX40)、小鼠(DO11.10-mOX40)或食蟹獼猴(DO11.10-cOX40) OX40之細胞株，其中在流式細胞量測術分析中，所有細胞展示比未經轉導之細胞高至少10倍的螢光值。此等細胞株列於以下表 2 中。表 1 ：OX40序列 1.1.3       市售OX40抗原
測試數種市售OX40抗原。
重組加His標籤之人類OX40胞外域獲自SinoBiologicals (目錄號10481-H08H-50)。然而，對此抗原之SE-HPLC分析展示，少於50%之抗原呈單體、非聚集形式。此抗原因此未用於後續分析中。
重組人類OX40/人類Fc (hOX40-hFc)及在C端包含人類IgG1 Fc域之重組小鼠OX40/人類Fc (mOX40-hFc)，獲自R&D Systems (hOX40-hFc：目錄號3388-OX-050；mOX40-hFc：目錄號1256-OX-050)且自行用生物素標記。此等可溶性抗原之生理特性藉由SE-HPLC分析表徵，以確保不存在聚集體，且藉由PAGE表徵，以驗證分子之尺寸。藉由PAGE進行之尺寸測定表明，可溶性抗原為二聚的，因為其估計分子量為針對單體抗原所預期之分子量的二倍。亦藉由凝膠位移分析對可溶性抗原進行分析，該分析展示生物素標記程度超過90%。使用ELISA及SPR以證實經生物素標記之重組人類(hOX40-hFc)及小鼠(mOX40-hFc) OX40抗原可由OX40特異性抗體(如實例 1.1.1 及以下表 2 中所描述之11D4；ACT35；及OX86結合。表 2 ：OX40抗原 1.2         CD137抗原
用於選擇對人類CD137具有特異性之mAb，且用於測試所選Fcab與食蟹獼猴OX40之交叉反應性的CD137抗原自產(in-house)製備，或獲自如下文所描述之商業來源。 1.2.1       重組可溶性人類及食蟹獼猴CD137抗原之製備
由於數種市售重組抗原例如歸因於在測試時存在不可接受位準的聚集體，而被認為不適用，因此自製以下重組二聚及單體抗原(表 3 )，以用於抗CD137 mAb之選擇、篩選及進一步表徵。表 3 ： 重組人類及食蟹獼猴CD137抗原
藉由使用EcoRI-HF及BamHI-HF限制酶，將編碼人類CD137之胞外域的DNA與Avi序列及六個C端組胺酸殘基一起選殖至經修飾pFUSE載體(Invivogen目錄號pfuse-mg2afc2)中，產生單體抗原。將載體轉染至HEK293-6E細胞中，且所表現之CD137使用HisTrap™ excel鎳管柱(GE Healthcare，17-3712-06)及尺寸排阻層析法(SEC)純化，以確保抗原為單一物種且不含聚集體。
為產生二聚抗原，將與mIgG2a Fc域連同Avi序列融合之編碼人類或食蟹獼猴(食蟹猴) CD137之胞外域的DNA構築體選殖至經修飾pFUSE載體中，且轉染至HEK293-6E細胞中。使用MabSelect SuRe™蛋白A管柱(GE Healthcare，11003494)及尺寸排阻層析法(SEC)純化重組CD137，以確保抗原為單一物種且不含聚集體。
使用BirA生物素-生物素蛋白連接酶反應套組(Avidity LLC，BirA500)製備二聚及單體CD137抗原之生物素標記形式，以產生經單一生物素分子標記之單體CD137抗原，及經二種生物素分子標記之二聚CD137抗原，對二種單體中之每一者用一種生物素分子。具體而言，將3 mg CD137抗原與7.8 μl BirA酶混合物混合成1:50之酶與受質莫耳比。隨後根據製造商建議，添加添加劑(142 μl Biomix A、142 μl Biomix B、142 μl生物素)，且將反應混合物在室溫下培育二小時。為維持經生物素標記之抗原的完整性，使用Amicon 30 μm過濾器將反應混合物立即緩衝交換至DPBS。
藉由SEC進一步純化CD137抗原，以確保移除BirA酶，且產生不具有高分子量聚集體之最終高品質單分散蛋白製劑。具體而言，將來自相同生產批次之抗原混合在一起，且藉由尺寸排阻高效液相層析法(SE-HPLC)、聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及伴隨多角度光散射之尺寸排阻層析法(SEC-MALS)針對穩定性及純度進行分析。藉由抗生蛋白鏈菌素位移SDS-PAGE凝膠證實蛋白質之完全生物素標記。藉由表面電漿子共振(SPR)，證實重組人類CD137抗原活體外結合抗人類CD137陽性對照抗體20H4.9 (美國專利第7288638號)，且藉由流式細胞量測術證實該等抗原結合至表現人類CD137配位體之DO11.10細胞。藉由流式細胞量測術，證實重組食蟹猴CD137抗原結合至表現食蟹猴CD137配位體之DO11.10細胞。為確保選擇方案中所使用之CD137抗原儘可能高的純度，進行抗原之充分蛋白表徵，以確保存在的蛋白聚集體之百分比不超過2%。 1.2.2       表現人類、食蟹獼猴及小鼠CD137之細胞株的製備
產生表現全長人類或食蟹猴CD137，分別命名為『DO11.10-hCD137』及『DO11.10-cCD137』(參見表 4 )之DO11.10細胞(National Jewish Health)，以便在選擇及所選擇抗CD137 mAb之進一步表徵期間呈現呈最天然確認之抗原。
亦產生表現全長小鼠CD137，命名為『DO11.10-mCD137』之DO11.10細胞，以便測定抗小鼠OX40/CD137 mAb2 結合表現小鼠CD137之細胞的結合(參見實例 11.2 )。
使用Lenti-X HTX Packaging System (Clontech，631249)，使用慢病毒轉導以產生過度表現人類、食蟹猴或小鼠CD137受體之DO11.10細胞。將含有編碼人類CD137 (SEQ ID NO: 126)、食蟹猴CD137 (SEQ ID NO:128)或小鼠CD137 (SEQ ID NO: 164)之cDNA的Lenti-X表現載體(pLVX) (Clontech，631253)與Lenti-X HTX Packaging Mix共轉染至Lenti-X 293T細胞株(Clontech，632180)中，以產生病毒。將DO11.10細胞株隨後用此等慢病毒載體轉導。
使用流式細胞量測術，藉由抗CD137陽性對照抗體(分別20H4.9、MOR7480.1 (專利公開案第US 2012/0237498 A1號)及Lob12.3 (南安普敦大學(University of Southampton)))與細胞之結合，證實此等細胞上人類、食蟹猴或小鼠CD137之表現。表 4 ：細胞表面表現之人類及食蟹獼猴CD137抗原 實例2-抗人類OX40 Fcab之選擇及表徵 2.1         抗人類OX40 Fcab之初始選擇
為了自初始噬菌體庫選擇對人類OX40具有特異性之Fcab，將重組生物素標記可溶性二聚人類OX40 (hOX40-mFc；參見表 2 )及細胞表現之人類OX40 (DO11.10-hOX40)二者用作抗原。在一些選擇方案中，除重組生物素標記可溶性二聚人類OX40外，使用表現人類OX40之細胞，以確保所選Fcab能夠結合至細胞表面上呈天然構形之OX40。
構築呈現CH3域(IMGT編號1.4-130))之六個初始噬菌體庫，其在CH3域中包含部分隨機AB環(根據IMGT編號方案，殘基14至18)及EF環(根據IMGT編號方案，殘基92至101)。六個庫中之一者另外包含在CH3域之EF環中位置101處具有二個或四個胺基酸(由二個或四個NNK密碼子編碼)插入(根據IMGT編號方案，插入殘基編號為101.1至101.4)的純系。
所有六個庫經歷使用重組生物素標記可溶性二聚人類OX40 (hOX40-mFc；參見表 2 )之三輪選擇。所有六個庫亦經歷在第一輪選擇中使用hOX40-mFc，接著使用細胞表現之人類OX40 (在另外二個選擇輪中，DO11.10-hOX40；參見表 2 )的另一選擇操作。
將在第三輪選擇之後自六個庫中鑑別的2133個純系藉由ELISA針對與人類OX40之結合進行篩選。此產生所鑑別之32個獨特陽性結合子，其經次選殖且以可溶性Fcab (由截短鉸鏈[SEQ ID NO: 101]、CH2及CH3域組成)形式在HEK Expi293細胞中表現(使用ExpiFectamine 293轉染套組[Life Technologies，A14524]將選殖至pTT5載體[National Research Council of Canada]中之Fcab轉染至Expi293F細胞[Life technologies，A14527]中)。
針對32個獨特Fcab結合細胞表現之人類OX40 (DO11.10-hOX40)之能力對該等Fcab進行測試。所篩選之32個Fcab中之15個展示與DO11.10-hOX40之細胞結合，且此等相互作用之EC50 範圍為0.1至62 nM。展示與DO11.10-hOX40之結合的15個Fcab使用測試NF-κB信號傳遞路徑之活化的自產人類NF-κB報導體分析進行測試。在人類NF-κB報導體分析中，15個Fcab中之六個在與抗人類Fc抗體交聯時展示活性增加，表明此等Fcab將能夠活化OX40信號傳遞。命名為FS20-22及FS20-31之Fcab在此分析中展示高位準活性，且在Fcab與抗人類CH2 mAb (純系MK1A6 (Jefferis等人, 1985及Jefferis等人, 1992)，自製)交聯時，該等Fcab之活性增加。選擇此等Fcab用於親和性成熟。 2.2         抗人類OX40 Fcab之親和性成熟
藉由使用來自ELLA Biotech之隨機化引子，使用不包括半胱胺酸之胺基酸的等莫耳分佈，使CH3域之AB環中之五個殘基(殘基14至18)或CD環中之五個殘基(殘基45.1至77)隨機化，或藉由使EF環之部分隨機化(CH3域之殘基92至94及97至101(所有殘基編號根據IMGT編號方案)，創建用於FS20-22及FS20-31之親和性成熟庫。
針對與人類OX40之結合，藉由ELISA篩選來自親和性成熟之輸出的1410個Fcab，且如上文實例 2.1 中所描述，將204個獨特陽性結合子鑑別、次選殖且以可溶性Fcab形式在HEK Expi293細胞中表現。
在不存在及存在抗CH2交聯之情況下，使用抗人類CH2 mAb純系MK1A6 (參見實例 2.1 )用Biacore 3000 (GE Healthcare)來量測在結合至hOX40-mFc時可溶性Fcabs的解離速率。針對與細胞表現之人類OX40的結合及針對自產人類T細胞活化分析中之活性，進一步篩選相比於相關親本Fcab，具有改良解離速率之Fcab。所有Fcab結合細胞表現之人類OX40。選擇在人類T細胞活化分析展示高位準活性的來自FS20-22譜系之10個Fcab及來自FS20-31譜系之18個Fcab，以用於如下文所描述之環改組(shuffling)。
對於FS20-22譜系，藉由將三個CD環、六個EF環及親本AB環或親和性成熟AB環改組，產生二個環改組庫。對於FS20-31譜系，產生含有四個AB環、七個CD環及七個EF環之一個環改組庫。
如上文實例 2.1 中所描述，將改組序列以可溶性Fcab形式在HEK Expi293細胞中表現，且針對與經生物素標記之hOX40-mFc抗原的結合，在Octet QKe System (Pall FortéBio)上使用Dip and ReadTM 抗生蛋白鏈菌素生物感測器(Pall FortéBio，18-5050)進行篩選。對在結合至hOX40-mFc時相比於親本Fcab具有改良解離速率之Fcab進行定序，得到來自FS20-22譜系之35個獨特Fcab及來自FS20-31譜系之62個獨特Fcab。針對與hOX40-mFc抗原之結合，在存在及不存在CH2交聯之情況下，使用抗人類CH2 mAb純系MK1A6用Biacore 3000儀器(GE Healthcare)對所鑑別之獨特Fcab進行測試。
對於FS20-22譜系，選擇18個Fcab用於以假擬(4420 LALA) mAb2 格式表現，及基於以下的進一步表徵：當結合至hOX40-mFc時在CH2交聯之情況下的最慢解離速率，當結合至hOX40-mFc時非交聯及CH2交聯解離速率之間的解離速率最大差值及與如上hOX40-mFc之結合強度。對於FS20-31譜系，選擇在CH2交聯之情況下在結合至hOX40-mFc時具有最慢解離速率的九個Fcab，及在無CH2交聯之情況下在結合至hOX40-mFc時具有最慢解離速率的九個Fcab，以用於以假擬(4420 LALA) mAb2 格式表現及進一步表徵。由於數個Fcab為此等九Fcab組二者所共有，因此自FS20-31譜系選擇在不存在CH2交聯之情況下在結合至hOX40-mFc時展示緩慢解離速率之額外Fcab，以使用於以假擬mAb2 格式表現及進一步表徵之來自此譜系之Fcab的總數目達18。使用來自T細胞活化分析之資料，鑑別出來自FS20-22譜系之另外六個Fcab及來自FS20-31譜系之八個Fcab，該等Fcab在此分析中展示高活性，且因此將其亦以假擬(4420 LALA) mAb2 格式表現且進一步表徵(參見實例 4 )。 實例3-抗小鼠OX40 Fcab之選擇及表徵 3.1.        抗小鼠OX40 Fcab之初始選擇
對於選擇，使用呈現人類IgG1之CH1至CH3域的初始酵母菌庫，該等域含有CH3域之AB環(根據IMGT編號方案，殘基11-18)及EF環(根據IMGT編號方案，殘基92-101)中之隨機化，且包括AB環之殘基16與17 (根據IMGT編號方案)之間的五殘基隨機插入。將酵母菌與融合至人類IgGFc域之經生物素標記之重組鼠類OX40 (mOX40-hFc；表 2 )一起培育，且使用抗生蛋白鏈菌素塗佈之珠粒藉由MACS分選。隨後在存在五倍莫耳過量hFc之情況下，使用降低濃度之經生物素標記mOX40-hFc進行三輪FACS選擇。將細胞用抗生蛋白鏈菌素-別藻藍蛋白(allophycocyanin；APC) (BD Bioscience，349024)或抗生物素-APC (Miltenyi Biotec，130-090-856)染色，且使用FACSAria (BD Bioscience)細胞分選儀進行分選。針對抗原結合，篩選來自富集群之182個個別Fcab，且如先前在實例 2.1 中所描述，將二個獨特陽性結合子次選殖且以可溶性Fcab形式表現。針對與mOX40-hFc之結合，藉由ELISA表徵Fcab，且在自產小鼠NF-κB報導體分析中針對活性表徵Fcab。僅一個Fcab，FS20m-232，在NF-κB報導體分析中具有活性且展示與表現小鼠OX40之細胞的結合，因此選擇此Fcab用於親和性成熟。 3.2         mOX40 Fcab之親和性成熟
藉由使用來自ELLA Biotech之隨機化引子，使用不包括半胱胺酸之胺基酸的等莫耳分佈，使FS20m-232 Fcab之AB環中之七個殘基(根據IMGT編號方案，殘基15 - 16.5) (庫1)、CD環中之六個殘基(根據IMGT編號方案，殘基45.1-78) (庫2)，或EF環中之五個殘基(根據IMGT編號方案，殘基92-94及97-98) (庫3)隨機化，構築三個噬菌體呈現親和性成熟庫。
使用在經抗生蛋白鏈菌素塗佈(ThermoFisher Scientific，11205D)及經中性抗生物素蛋白塗佈(ThermoFisher Scientific，14203及A2666)戴諾珠粒(Dynabead)上交替捕獲之重組生物素標記mOX40-mFc，對親和性成熟庫進行三輪選擇。使用自50 nM (第1輪)至10 nM (第2輪)，至1 nM (第3輪)之降低抗原濃度以鑑別高親和性結合子。針對與mOX40-mFc之結合，藉由噬菌體ELISA篩選來自第三輪選擇的1655個個別噬菌體，且如實例 2.1 中所描述，將98個獨特陽性結合子鑑別、次選殖且以可溶性Fcab形式在HEK Expi293細胞中表現。針對細胞結合及小鼠NF-κB報導體分析中之活性，進一步篩選Fcab。選擇活性最強的Fcab用於環改組。
產生環改組庫，該庫含有27個CD環(自親和性成熟鑑別之所有26個獨特序列及WT序列)，其經37個EF環(在噬菌體ELISA中具有與小鼠OX40之最佳結合的彼等序列及WT序列)改組，其中所有改組純系含有FS20m-232 Fcab之AB環。如上文所描述，將750個改組序列以可溶性Fcab (含有截短鉸鏈)形式在HEK Expi293細胞中表現。針對改良解離速率，藉由在Octet QKe System (Pall FortéBio)上使用Dip and ReadTM 抗生蛋白鏈菌素生物感測器(Pall FortéBio，18-5050)，量測Fcab與經生物素標記之mOX40-mFc (表 2 )之結合，篩選含有Fcab之HEK上清液。如上文所描述，將11個獨特AB環隨機化Fcab及60個獨特EF環隨機化Fcab次選殖且以可溶性Fcab形式在HEK Expi293細胞中表現。將此等Fcab與具有最慢解離速率之43個改組Fcab一起針對細胞結合及小鼠T細胞活化分析中之活性進一步篩選。在由抗人類CH2 mAb純系MK1A6交聯時，FS20m-232-91 Fcab在結合至經生物素標記之mOX40-mFc時具有最慢解離速率，且在小鼠T細胞活化分析中具有最高活性，且因此選為小鼠(替代)Fcab以用於後續實驗。 實例4-呈mAb2 格式之抗OX40 Fcab的構築、表現及表徵 4.1         假擬mAb2 之構築及表現
製備包含上述經鑑別之抗人類OX40及抗小鼠OX40 Fcab的「假擬」mAb2 ，以便允許對呈mAb2 格式之此等Fcab進行表徵。此等假擬mAb2 由抗OX40 Fcab及人類IgG1主鏈中之抗FITC抗體4420 (Bedzyk等人, 1989及Bedzyk等人, 1990)的可變區(詳見SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116)，或人類IgG1主鏈中之抗雞蛋白溶菌酶(HEL)抗體D1.3 (Braden等人, 1996)的可變區(詳見SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 118)，藉由在人類IgG1之未經修飾CH3域之序列中存在的XhoI及BamHI位點內，將抗FITC及抗HEL抗體之CH3域用抗OX40 Fcab之CH3域置換來製備。假擬mAb2 分別包含抗FITC mAb 4420之輕鏈(SEQ ID NO: 116)或抗HEL mAb D1.3之輕鏈(SEQ ID NO: 118)，且亦含有重鏈之CH2域中的LALA突變，以減少Fc-γ受體相互作用及潛在的Fc-γ受體誘導之交聯。此等實例中所提及之假擬mAb2 及mAb2 中LALA突變的存在由其純系名稱之Fcab部分末尾處的後綴『AA』表示。
假擬mAb2 藉由在HEK293-6E細胞中短暫表現產生，且使用mAb Select SuRe蛋白A管柱純化。 4.2         呈假擬mAb2 格式之抗人類OX40 Fcab對細胞表現之人類及食蟹獼猴OX40的結合親和性
使用流式細胞量測術來量測假擬呈(4420 LALA) mAb2 格式之抗人類OX40 Fcab對與細胞表現之人類或食蟹獼猴OX40 (表現人類OX40 [DO11.10-hOX40]或食蟹獼猴OX40[DO11.10-cOX40]之DO11.10細胞；參見表 2 )結合的親和性。亦藉由流式細胞量測術，由測試與不表現OX40之HEK細胞的結合評定非特異性結合。
將假擬(4420 LALA) mAb2 及對照mAb稀釋液(2×最終濃度)在1×DPBS (Gibco，14190-094)中一式三份地製備。將DO11.10-hOX40或DO11.10-cOX40或HEK細胞懸浮液在PBS+2% BSA (Sigma，A7906)中製備，且以4×106 個細胞/毫升，以50微升/孔接種於V型底96孔培養盤(Costar，3897)中。將50 µl假擬(4420 LALA) mAb2 或對照mAb (抗人類OX40 mAb，11D4)稀釋液添加至含有細胞之孔中(最終體積100 µl)，且在4℃下培育1小時。洗滌培養盤，且隨後添加100微升/孔1:1000稀釋於PBS+2% BSA中之二次抗體(抗人類Fc-488抗體，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)，且在4℃下在暗處培育30分鐘。洗滌培養盤，且再懸浮於100 µl含1 μg/ml DAPI (Biotium，目錄號40043)之PBS中。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)讀取培養盤。排除死細胞，且量測通道中之螢光(488nm/530/30)。使用GraphPad Prism軟體中之log(促效劑)對反應擬合資料。
Fcab (均以假擬[4420 LALA] mAb2 格式測試)及陽性對照人類IgG1主鏈中之抗人類OX40 mAb，11D4，及在重鏈之CH2域中含有LALA突變之mAb (G1AA/11D4；SEQ ID NO 173及175)，以一系列親和性結合至人類OX40。將來自FS20-22譜系之五個純系及來自FS20-31譜系之六個純系針對其結合細胞表現之人類及食蟹獼猴OX40的能力進行測試；此等純系之結合親和性列於表 5 中。表 5 ： 呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗OX40 Fcab對細胞表現之人類或食蟹獼猴OX40的結合親和性 4.3         由呈假擬mAb2 格式之抗OX40 Fcab引起的OX40活體外活化
活化T細胞在其細胞表面上表現OX40。三聚OX40配位體與OX40之結合引起受體之三聚合作用。由於OX40配位體在抗原呈現細胞之細胞表面上以團簇形式表現，因此OX40配位體與OX40與之間的相互作用引起OX40聚集，已知該聚集為OX40信號傳遞及進一步T細胞活化所必需的。對OX40產生促效作用之抗體必須模擬OX40配位體之此聚集活性。在單特異性抗OX40抗體情況下，Fcγ受體結合至抗體之Fc域，且與其交聯，引起OX40聚集。
針對在存在之交聯劑情況下交聯Fcab後，活化T細胞上表現之OX40的能力，在T細胞活化分析中測試上文所描述之呈含LALA突變假擬(4420) mAb2 格式之抗人類OX40及抗小鼠OX40 Fcab。用於測試呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗人類OX40 Fcab的人類T細胞活化分析涉及自人類周邊血液單核細胞(PBMC)分離T細胞，且針對T細胞活化標記物IL-2之釋放進行測試。分析以與稍後描述於實例 13 中之類似方式進行，且涉及抗人類CH2 mAb純系MK1A6或FITC-葡聚糖(Sigma)之使用，以便分別交聯陽性對照抗體(11D4)或呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之Fcab。
在由Fab目標(FITC-葡聚糖)交聯時，呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗人類OX40 Fcab在T細胞活化分析中展示一系列活性。所有Fcab能夠在存在抗CD3抗體之情況下共刺激T細胞，且誘導人類IL2之產生。來自FS20-22及FS20-31譜系之Fcab在存在及不存在交聯之情況下均展示活性。具體而言，來自此等譜系之Fcab在不存在交聯劑之情況下具有活性，該活性在交聯後顯著提高。由於此等Fcab對食蟹獼猴OX40具有高交叉反應性(與結合人類OX40相當)，因此將可能在此物種中進行毒理學研究。在FS20-22譜系中之純系中，純系FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49及FS20-22-85在交聯時對其促效活性具有最低EC50 值，且因此為來自此譜系之較佳純系。此等中，純系FS20-22-49展示在交聯後促效活性的最高提高，且在存在交聯之情況下對其促效活性亦具有最低EC50 ，且因此為較佳純系。
如上文所描述，諸位發明人旨在產生能夠在不存在額外交聯劑之情況下對OX40及CD137二者產生促效作用的mAb2 。以上實驗展現FS20-22-49 Fcab能夠在存在額外交聯劑之情況下活化OX40。為了產生不需要額外交聯劑之雙重促效劑，諸位發明人選擇出於在最終靶向OX40及CD137之mAb2 分子中使用來之此等抗體之CDR的目的，產生抗CD137抗體。 實例5-抗人類CD137抗體之選擇及表徵
使用呈現人類生殖系之Fab域，在CDR1、CDR2及CDR3中具有隨機化的合成初始噬菌粒庫(MSM Technologies)，以便用實例 1.2 中所描述之重組及細胞表面表現之CD137抗原進行抗人類CD137 mAb的初始選擇。
使用抗生蛋白鏈菌素戴諾珠粒(Thermo Fisher Scientific，11205D)及與戴諾珠粒偶合之中性抗生物素蛋白結合蛋白(Thermo Fisher Scientific，31000)，在三輪中選擇Fab庫，以分離結合至經生物素標記之人類CD137-mFc-Avi或人類CD137-Avi-His的噬菌體。為確保Fab結合至細胞表面表現之CD137，使來自使用重組CD137抗原之選擇之第一輪輸出亦經歷使用DO11.10-hCD137細胞的另外二輪選擇，及利用DO11.10-cCD137細胞之第四輪選擇。
針對與人類及食蟹猴CD137-mFc-Avi之結合，藉由噬菌體ELISA篩選來自第3輪及第4輪輸出的約2200個純系。包括經生物素標記之mFc作為陰性對照。將陽性純系(CD137結合信號比對mFc之結合信號高至少4倍的純系)之可變區進行定序，其得到36個獨特VH/VL序列組合之鑑別。所鑑別之序列源自使用重組CD137抗原及細胞表面表現之CD137抗原二者，伴隨使用二種選擇策略分離之數種純系。基於噬菌體ELISA，36個純系中之22個具有食蟹獼猴(食蟹猴)交叉反應性，但由於噬菌體ELISA之靈敏度可能尚未足以偵測弱食蟹猴交叉反應性結合子，因此將所有36個純系進一步重新格式化成IgG1分子。對於各純系，將VH及VL域個別地選殖至分別含有CH1、CH2 (在CH2域中具有LALA突變，及CH3域，或CL域的pTT5表現載體(National Research Council of Canada)中。具有突變(AA)之所得pTT5-FS30 VH及pTT5-FS30 VL載體短暫共轉染至HEK293-6E中。二十八個純系以可溶性IgG1分子形式表現。此等藉由mAb Select SuRe 蛋白A管柱純化且經歷進一步測試。
使用人類及食蟹猴CD137-mFc-Avi，在ELISA中分析抗CD137 mAb之結合。在所測試之28個純系中，10個展示與人類CD137-mFc-Avi之劑量依賴性結合，且不與人類OX40-mFc-Avi或抗生蛋白鏈菌素結合。在此組內，四個純系，FS30-5、FS30-10、FS30-15及FS30-16對食蟹猴CD137-mFc-Avi具有交叉反應性。歸因於所獲得之食蟹猴交叉反應性純系的數目低，如上文所描述篩選且表現額外純系。此引起一種額外食蟹猴交叉反應性結合子FS30-35的分離。
針對與表現人類或食蟹獼猴CD137之細胞(DO11.10-hCD137或DO11.10-cCD137)的結合，使用流式細胞量測術測試抗人類CD137 mAb FS30-5、FS30-10、FS30-15及FS30-16。亦藉由測試與不具有CD137表現之DO11.10細胞及HEK293細胞的結合，評定非特異性結合。將結合親和性與二種陽性對照mAb，MOR7480.1 (美國專利第2012/0237498號)及20H4.9 (美國專利第7288638號)之結合親和性相比，該等mAb之可變域經選殖且以在CH2域中包含LALA突變之人類IgG1格式(G1AA格式)表現。
發現FS30-5、FS30-10、FS30-15及FS30-16純系以在0.15至0.57 nM範圍內之EC50 值結合至細胞表面表現之人類及食蟹猴CD137受體，與陽性對照mAb相當。未觀測到與親本DO11.10或HEK293細胞之結合，展示結合之特異性。在此等細胞中，未觀測到20H4.9陽性對照抗CD137抗體與食蟹猴CD137之結合。公開資料(美國專利第7288638號)展示呈IgG1格式之20H4.9確實結合至PMA (佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(Phorbol Myristate Acetate))誘導之食蟹猴PMBC上的食蟹猴CD137。在諸位發明人手中，呈G1AA格式之20H4.9結合至重組食蟹猴CD137，但親和性比對人類CD137之親和性低得多(資料未展示)，其可解釋缺少觀測到的該抗體與DO11.10-cCD137細胞之結合。
為了測定FS30 mAb之生理特徵，使該等mAb經歷尺寸排阻層析法(SEC)且分析單體部分之百分比。所測試的所有四種FS30 mAb展示單峰輪廓，且為>97%單體。此單體蛋白之高位準使得可進行功能活性測試。
隨後在初代T細胞活化分析中分析抗CD137 mAb之功能活性。在活體內，抗CD137 mAb藉由募集Fcγ受體，藉此引起mAb及CD137受體聚集而誘導促效作用。為模擬mAb聚集表面CD137受體分子之最大能力，在分析之前使用抗人類CH2抗體(純系MK1A6，自製)交聯FS30 mAb。將T細胞活化與非交聯mAb進行比較。包括在具有LALA突變之人類IgG1主鏈中的抗雞蛋白溶菌酶(HEL)抗體D1.3 (G1AA/HelD1.3)作為陰性對照。
在交聯時，FS30-5、FS30-10、FS30-15及FS30-16 mAb在T細胞活化分析中展示強效活性，其中EC50 值小於10 nM，且IL-2之最大位準(Emax )類似於陽性對照抗CD137 mAb (抗CD137 MOR7480.1 mAb，5637 hIL-2 pg/ml；及抗CD137 20H4.9 mAb，10232 hIL-2 pg/ml)。FS30-6 mAb之Emax (1512 hIL-2 pg/ml)顯著低於陽性對照及其他FS30 mAb，表明T細胞活化之較低整體位準。不同於在不存在交聯之情況下展示活性(3174 pg/ml之hIL-2產生)的陽性對照抗CD137 20H4.9 mAb，FS30 mAb未展示活性(在未交聯時，如由所量測之IL-2的背景反應位準指示)。 實例6-靶向人類OX40及人類CD137之mAb2 的構築及表現
製備包含與抗人類CD137 Fab配對之抗人類OX40 Fcab的mAb2 。選擇靶向人類OX40之Fcab FS20-22-49，以用於與靶向CD137之Fab配對，因為FS20-22-49在T細胞分析中具有較高活性(參見實例 4.3 )。 6.1         呈mAb2 格式之mAb的表現及表徵
製備mAb2 分子，其由IgG1分子組成，IgG1分子包含FS30-5、FS30-10、FS30-15、FS30-16或FS30-35純系之CDR，且包括CH2域中之LALA突變，及CH3域中之FS20-22-49人類OX40受體結合位點。藉由將抗人類OX40 mAb2 FS20-22-49AA/HelD1.3之VH域用FS30純系之對應VH域置換，且將所產生之VH與FS30 mAb之對應輕鏈共轉染，產生此等mAb2 分子。所得mAb2 分子中保留IgG1分子之CH2域中的LALA突變。此等mAb2 分子命名為FS20-22-49AA/FS30-5、FS20-22-49AA/FS30-10、FS20-22-49AA/FS30-15、FS20-22-49AA/FS30-16及FS20-22-49AA/FS30-35。mAb2 藉由在HEK293-6E細胞中短暫表現而產生，且使用mAb Select SuRe 蛋白A管柱純化。
CD137屬於細胞介素受體之腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF) (Moran等人, 2013)。為分析五種mAb2 分子之抗CD137 Fab結合位點的特異性，使用SPR測試mAb2 與人類CD137及五種緊密相關人類TNFRSF成員(TNFRSF1A、TNFRSF1B、GITR、NGFR及CD40)的結合。目標為藉由展示mAb2 在1 µM濃度下不與緊密相關抗原結合，但展示在1 nM濃度下與CD137受體之結合，展現1000倍特異性。
FS20-22-49AA/FS30-5、FS20-22-49AA/FS30-10、FS20-22-49AA/FS30-16及FS20-22-49AA/FS30-35 mAb2 展示高位準特異性(接近1000倍)，而FS20-22-49AA/FS30-15 mAb2 展示與所測試之所有五種緊密相關TNFRSF成員的非特異性結合。由此純系展現之非特異性結合比在相同濃度下與CD137受體之結合低平均約5至10倍，且推斷該非特異性結合由mAb2 分子之Fab結合位點導致，因為在針對與CD137緊密相關之相同五種TNFRSF成員的結合進行測試時，FS30-15 mAb展示相同結合概況。基於此資料，自進一步選擇操作中省略FS30-15純系。 6.2         抗CD137 mAb之序列最佳化
儘管FS30-5、FS30-10、FS30-16及FS30-35抗CD137 mAb展示對CD137之高親和性及特異性，及T細胞活化分析中之活性，但其在CDR環內含有一或多個潛在轉譯後修飾(PTM)位點。決定進一步改造此等純系，嘗試鑑別可在此等位點處經取代同時保留或改良結合及活性的胺基酸殘基。所鑑別之潛在PTM位點包括VH CDR3中之甲硫胺酸殘基(FS30-5中之Kabat位置M100D及M100H、FS30-10中之M97，FS30-16中之M100A及FS30-35中之M100F)、VH CDR2中之潛在天冬胺酸異構化基元(FS30-16中之Kabat位置D54G55)及VL CDR3中之潛在去醯胺位點(FS30-16中之Kabat位置Q90G91)。
使用作為模板之五種FS20-22-49AA/FS30 mAb2 純系，及在編碼甲硫胺酸、天冬胺酸或甘胺酸殘基之位點處含有簡併密碼子NNK以允許所有可能胺基酸取代的引子，進行定點突變誘發。不包括半胱胺酸殘基及能夠產生新穎潛在PTM基元之胺基酸。表現純系且針對與DO11.10-hCD137細胞之結合篩選。選擇與親本mAb2純系相比，在10 nM下具有類似(二倍內)或改良結合之純系，以用於以30至50 ml規模表現，在蛋白A管柱上純化且使用DO11.10-hCD137細胞及作為交聯劑之抗人類CH2抗體MK1A6，在T細胞活化分析中篩選。
將DO11.10-hCD137細胞在PBS中洗滌一次，且以1.0×106 個細胞/毫升之濃度再懸浮於DO11.10細胞培養基(RPMI培養基(Life Technologies)，含有10% FBS (Life Technologies)及5 µg/ml嘌呤黴素(Life Technologies，A11113803))中。藉由在37℃，5% CO2 下與稀釋於PBS中之0.1 µg/ml抗小鼠CD3抗體一起培育2小時，且隨後用PBS洗滌二次，將96孔平底培養盤用抗小鼠CD3抗體(Thermo Fisher Scientific，純系17A2)塗佈。將DO11.10-hCD137細胞以1×105 個細胞/孔添加至培養盤中。在DPBS (Gibco)中製備各測試抗體之2 µM稀釋液，且在DO11.10細胞培養基中進一步1:10稀釋(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液。將MK1A6交聯劑以與待交聯之測試抗體樣品1:1之莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備各抗體或抗體/交聯劑混合物之連續稀釋夜。將100 µl稀釋抗體或抗體/交聯劑混合物添加至培養盤上之DO11.10-hCD137細胞中。在37℃，5% CO2 下培育細胞72小時。收集上清液且遵循製造商說明書，用小鼠IL-2 ELISA套組(eBioscience或R&D Systems)分析。使用盤讀取器用Gen5軟體，BioTek在450 nm下讀取培養盤。自450 nm之吸光值減去630 nm之吸光值(校正)。細胞介素濃度計算之標準曲線基於四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。相對於抗體之對數濃度，繪製小鼠IL-2 (mIL-2)之濃度，且使用GraphPad Prism中之log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。
對於純系中之每一者，針對重鏈CDR3中之甲硫胺酸殘基的取代，鑑別保留或改良與細胞表面CD137之結合的有限數目個胺基酸。FS20-22-49AA/FS30-16 mAb2 純系含有三個潛在PTM位點，且其中每一者之突變引起結合親和性的較小降低。當將此等組合於一個分子中時，降低之結合係加成的(資料未展示)，且因此未進一步追求此純系。發現與相關親本純系相比，很少突變改良與CD137之結合及功能活性。發現均來源於FS20-22-49AA/FS30-10 mAb2 純系之三種突變mAb2純系具有改良之結合親和性及功能活性。此等mAb2 含有針對親本FS20-22-49AA/FS30-10 mAb2 中位置97處之甲硫胺酸殘基取代的天冬醯胺酸、蘇胺酸或白胺酸殘基，且分別命名為FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16。儘管與親本純系相比，來源於FS20-22-49AA/FS30-35親本mAb2 純系之突變純系的EC50 值未展示功能活性之改良，但一種命名為FS20-22-49AA/FS30-35-14，含有針對親本純系中位置100F處之甲硫胺酸殘基取代的丙胺酸殘基的突變純系，確實展示改良結合。在FS20-22-49AA/FS30-5親本mAb2 純系情況下，位置100D處之甲硫胺酸殘基及位置100H處之甲硫胺酸殘基二者在相同分子中分別改變為異白胺酸殘基及白胺酸殘基，產生命名為FS20-22-49AA/FS30-5-37之突變mAb2 純系。選擇FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-35-14及FS20-22-49AA/FS30-5-37用於進一步表徵。 6.3         人類CD137配位體阻斷分析
CD137-CD137L相互作用對於CD137受體之活化係必需的。促效性抗CD137抗體可藉由模擬配位體相互作用，驅動CD137活化，藉此潛在阻斷配位體結合，或驅動受體之聚集及活化而不干擾配位體結合。在抗體潛在模擬CD137L時，其可阻斷受體與配位體之相互作用。此項技術中已知MOR7480.1阻斷配位體/受體相互作用(US 2012/0237498)，而先前已報導20H4.9抗體不阻斷CD137與其配位體之間的相互作用(美國專利第7288638號)。
針對阻斷CD137-CD137L相互作用之能力，使用基於ELISA之方法測試抗人類CD137 mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及FS20-22-49AA/FS30-35-14。呈IgG1格式之抗OX40 mAb 11D4 (歐洲專利第2242771號) (G1/11D4；SEQ ID NO 174及175)用作同型/陰性對照；包含抗OX40 Fcab純系FS20-22-49AA及抗FITC抗體4420之Fab區的mAb2 FS20-22-49AA/4420用作OX40結合之陰性對照mAb2 ；且抗CD137 mAb G1/MOR7480.1 (SEQ ID NO 119及120)及G1/20H4.9 (SEQ ID NO 121及122)作為CD137結合及配位體阻斷活性之陽性對照。
具體而言，重組人類CD137-mFc-Avi抗原於PBS中以1 µg/ml之濃度在Maxisorp 96孔培養盤上在4℃下塗佈隔夜。第二天，將培養盤用PBST (PBS + 0.05% Tween20™)洗滌，且在室溫下在攪拌下用PBS + 1% BSA (Sigma，A3059-500G)阻斷1小時。在阻斷後，將培養盤再用PBST洗滌。在PBS + 1% BSA中製備各測試抗體之100 nM稀釋液，且將稀釋液添加至經CD137塗佈之培養盤中，且在室溫下在攪拌下培育1小時。在此培育之後，將培養盤用PBST洗滌，且隨後在室溫下在攪拌下與於PBS中之20 ng/ml CD137L-His (R&D Systems，2295-4L-025/CF)一起培育1小時。隨後將培養盤用PBST洗滌，且隨後在室溫下在攪拌下與1/1000稀釋於PBS中的抗his二次抗體(R&D Systems，MAB050H)一起培育1小時。隨後將培養盤用PBST洗滌，且與TMB偵測試劑(Thermo Fisher Scientific，002023)一起培育，直至陽性對照孔變成藍色，且隨後添加2N H2 SO4 停止反應。使用盤讀取器用Gen5軟體，BioTek在450 nm下讀取培養盤。自450 nm之吸光值減去630 nm之吸光值(校正)。相對於抗體之對數濃度繪製減除吸光值，且使用GraphPad Prism中之log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。藉由將G1/11D4及G1/MOR7480.1對照mAb分別設定為0及100%阻斷值，對值進行標準化。使用GraphPad Prism，用單因子變異數分析檢定及霍姆-西達多重比較檢定(Holm-Sidak's multiple comparisons test)分析資料。
針對所測試之五種抗人類CD137 mAb2 純系，觀測到一系列阻斷活性。FS20-22-49AA/FS30-5-37展示與陽性對照抗體相似的對受體-配位體相互作用之完全抑制。含有FS30-10譜系之抗CD137 mAb之Fab區的所有mAb2 純系(亦即，FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16)將CD137與CD137L之間的相互作用抑制49%至54%，且因此視為部分阻斷劑。藉由僅部分阻斷CD137與CD137L之間的相互作用，有可能此等mAb可能不會完全抑制CD137L與其受體之天然相互作用，使得一些CD137信號傳遞仍可經由此機制產生，即使此等抗體中之一者經結合。與陰性對照FS20-22-49AA/4420 mAb2 分子相似，FS20-22-49AA/FS30-35-14純系不具有顯著抑制受體-配位體相互作用之能力，且因此視為非阻斷劑。
總體而言，基於ELISA之此分析的結果展示，所測試之抗CD137 mAb的組展示一系列配位體阻斷能力，包括完全、部分及無阻斷活性。純系FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及FS20-22-49AA/FS30-35-14各自展示不同於陽性對照抗CD137 mAb之阻斷活性的阻斷活性。由於鑑別出一系列配位體阻斷活性，因此對抗體中之每一者的功能活性進行測試。
針對阻斷CD137-CD137L相互作用之能力，使用基於細胞之方法進一步測試純系FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16。觀測到一系列阻斷活性，其中FS20-22-49AA/FS30-5-37展示與此分析中所使用之陽性對照抗體(G1/MOR7480.1)相似的對受體-配位體相互作用之完全抑制。含有FS30-10譜系之抗CD137 mAb之Fab區的所有三種mAb2 純系(亦即，FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16)將CD137與CD137L之間的相互作用抑制46%至76%，且因此視為部分阻斷劑。此分析之結果因此類似於基於ELISA之阻斷分析的結果，且展示所測試之抗CD137 mAb的組展現完全至部分阻斷活性的一系列配位體阻斷能力。純系FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16各自展示不同於陽性對照抗體之阻斷活性的阻斷活性。 實例7-mAb及mAb2 純系在人類CD137T細胞活化分析中之結合特異性及功能活性 7.1         mAb2 純系之結合特異性
CD137及OX40屬於細胞介素受體之腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF) (Moran等人, 2013)。為分析五種mAb2 分子之抗CD137 Fab以及OX40 Fcab結合位點的特異性，使用表面電漿子共振(SPR)測試FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/FS30-35-14及FS20-22-49AA/FS30-5-37 mAb2 與人類CD137、人類OX40及六種緊密相關人類TNFRSF成員的結合。目標為藉由展示mAb2 在1 µM濃度下不與緊密相關抗原結合，但展示在1 nM濃度下與CD137及OX40受體之結合，展現1000倍特異性。抗CD137 mAb MOR7480.1及抗OX40 mAb 11D4用作陽性對照。
簡言之，將CM5晶片上之流槽用以下固定：大約1000 RU人類CD137-mFc-Avi (表 3 )、OX40-mFc (表 2 )、重組人類TNFRSF1A-Fc、重組人類TNFRSF1B-Fc、重組人類GITR-Fc、重組人類NGFR-Fc、重組人類CD40-Fc或重組人類DR6-Fc。留下流槽1用於空白固定。將五種mAb2 在1×HBS-EP緩衝液(GE Healthcare，產品碼BR100188)中稀釋至1 µM及1 nM，使其在晶片上流動3分鐘且隨後使其解離4分鐘。10 mM pH 1.5之甘胺酸的30秒注入用於更新。以50至100 nM注入陽性對照mAb以展現各抗原之塗佈。在締合期結束時測定結合位準且對其進行比較。
所有所選mAb2 展示對人類CD137及OX40受體之高位準特異性，分別與MOR7480.1及11D4陽性對照類似或更高。 7.2         CD137促效劑抗體在人類CD137T細胞活化分析中之功能活性
為理解不同抗CD137促效劑抗體之活性，使用用DO11.10-hCD137細胞進行之T細胞活化分析。測試抗CD137促效劑抗體G1AA/MOR7480.1 (SEQ ID NO: 125及120)、G1AA/20H4.9 (SEQ ID NO: 165及122)及G1AA/FS30-10-16 (SEQ ID NO: 154及97)，以及作為同型陰性對照的呈IgG1格式之抗FITC抗體4420 (G1/4420；SEQ ID NO: 115及116)。在存在及不存在交聯抗人類CH2抗體MK1A6 (參見實例 2.1 )之情況下測試抗體分子。小鼠IL-2產生用作T細胞活化之量度。
將DO11.10-hCD137細胞在PBS中洗滌一次，且以1.0×106 個細胞/毫升之濃度再懸浮於DO11.10細胞培養基(RPMI培養基(Life Technologies)，含有10% FBS (Life Technologies)及5 µg/ml嘌呤黴素(Life Technologies，A11113803))中。藉由在37℃，5% CO2 下與稀釋於PBS中之0.1 µg/ml抗小鼠CD3抗體一起培育2小時，且隨後用PBS洗滌二次，將96孔平底培養盤用抗小鼠CD3抗體(Thermo Fisher Scientific，純系17A2)塗佈。將DO11.10-hCD137細胞以1×105 個細胞/孔添加至培養盤中。在DPBS (Gibco)中製備各測試抗體之2 µM稀釋液，且在DO11.10細胞培養基中進一步1:10稀釋(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液。在需要時，將MK1A6交聯劑以與測試抗體1:1之莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備抗體或抗體/交聯抗體混合物之連續稀釋夜。將100 µl稀釋抗體或抗體/交聯抗體混合物添加至培養盤上之DO11.10-hCD137細胞中。在37℃，5% CO2 下培育細胞72小時。收集上清液且遵循製造商說明書，用小鼠IL-2 ELISA套組(eBioscience或R&D Systems)分析。使用盤讀取器用Gen5軟體，BioTek在450 nm下讀取培養盤。自450 nm之吸光值減去630 nm之吸光值(校正)。細胞介素濃度計算之標準曲線基於四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。相對於抗體之對數濃度，繪製小鼠IL-2 (mIL-2)之濃度，且使用GraphPad Prism中之log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。
分析結果展示於圖 2C 及圖 2D 中。抗CD137抗體對交聯抗體對其之活性的要求不同，其中所有三種抗CD137抗體在存在交聯抗體之情況下展示IL-2產生的濃度依賴性增加，但僅G1AA/20H4.9抗體在不存在交聯抗體之情況下展示活性。因此，G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16需要添加交聯抗體，亦即其活性為『交聯依賴性的』，而G1AA/20H4.9在存在及不存在交聯抗體之情況下展示活性中，亦即其活性為『非交聯依賴性的』。 7.3         mAb2 純系在人類CD137T細胞活化分析中之功能活性
使用DO11.10-hCD137細胞，在T細胞活化分析中測試所選FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 之功能活性。呈IgG1格式之抗FITC抗體4420 (G1/4420；SEQ ID NO 115及116)用作同型陰性對照；抗OX40 mAb G1/11D4 (SEQ ID NO 174及175)及mAb2 純系FS20-22-49AA/4420 (SEQ ID NO 123及116)用作陰性對照；且呈IgG1格式(G1/MOR7480.1；SEQ ID NO 119及120)及IgG2格式(G2/MOR7480.1；SEQ ID NO 124及120)二者之抗CD137抗體MOR7480.1，IgG2格式為抗體已在臨床試驗中測試之格式(Gopal等人, 2017; Tolcher等人, 2017)，用作陽性對照。mAb及mAb2 經抗人類CH2抗體MK1A6 (參見實例 2.1 )交聯，且在一個實驗中研究非交聯mAb及mAb2 分子之活性。小鼠IL-2產生用作T細胞活化之量度。如實例 7.2 中所描述進行實驗。
在交聯時，所有五種所選mAb2 純系在T細胞活化分析中展示強效活性，其中平均EC50 值小於15 nM，且平均Emax 值在約16000-20000 pg/ml IL-2範圍內(表 6 及圖 2A )。在不存在交聯之情況下未觀測到所測試mAb2 純系之活性(圖 2B )。觀測到MOR7480.1陽性對照抗體僅在交聯時具有活性(對於G1/MOR7480.1，EC50 為3.3 nM且Emax 為12575 pg/ml，且對於G2/MOR7480.1，EC50 為2.4 nM且Emax 為8547 pg/ml)。缺少交聯抗OX40 mAb (G1/11D4)之活性與針對含非交聯抗OX40 Fcab之mAb2 分子觀測到之低背景信號的組合展示此分析之結果僅讀出CD137活性，最可能歸因於由DO11.10細胞產生之高位準之CD137受體表現及不可偵測位準之OX40受體表現(資料未展示)。 表6：mAb2在人類CD137 T細胞活化分析中之活性 N/A：由於低信號不允許有意義的EC50 /Emax測定而不適用 NM：未量測
因此，包含抗人類CD137單株抗體FS30-5-37、FS30-10-3、FS30-10-12、FS30-10-16及FS30-35-14之CDR的mAb2 由於能夠在交聯時在DO11.10-hCD137 T細胞活化分析中活化CD137而展示強效活性。在不存在交聯之情況下未觀測到顯著活性。此等mAb2 含有來自抗人類OX40 Fcab FS20-22-49之CH3域，該Fcab亦在交聯時在T細胞分析中展示高活性(參見實例 4.3 )。在LALA突變之情況下製備的mAb2 命名為FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16。
選擇此等mAb2 用於進一步分析，以確定其是否能夠充當可基於特異性目標之表現自主地對OX40及CD137二者產生促效作用，且不需要額外交聯劑的雙重促效劑。 實例8-mAb2 對人類及食蟹獼猴OX40及CD137之結合親和性
對於CD137親和性測定，使用人類抗體捕獲套組(GE Healthcare)，根據製造商之條件，用抗人類Fc塗佈Biacore CM5晶片(GE Healthcare)，至大約4000 RU之表面密度。捕獲測試抗體之樣品(mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16、抗CD137陽性對照G1/MOR7480.1及抗hOX40陰性對照G1/11D4)，至大約80 RU。將人類或食蟹獼猴CD137 (hCD137-mFc-Avi或cCD137-mFc-Avi)以在200 nM下起始之三倍稀釋系列之一系列濃度下，以70微升/分鐘之流動速率流動。締合時間為2分鐘且解離時間為8分鐘。操作緩衝液為HBS-EP (GE Healthcare BR100188)。藉由以30 微升/分鐘之流動速率注入3M氯化鎂持續30秒，更新流槽。
對於OX40親和性測定，使用人類Fab捕獲套組(GE Healthcare 28958325)，根據製造商之條件，用抗人類Fab塗佈Biacore CM5晶片，至大約8000 RU之表面密度。捕獲測試抗體之樣品(FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 、G1/MOR7480.1 (陰性對照)及G1/11D4 (陽性對照))，至大約80 RU，且隨後將人類或食蟹獼猴OX40抗原(hOX40-mFc或cOX40-mFc)以在200 nM下起始之三倍稀釋系列之一系列濃度下，以70微升/分鐘之流動速率流動。締合時間為2分鐘且解離時間為8分鐘。操作緩衝液為HBS-EP。藉由以30 微升/分鐘之流動速率注入在pH 2.1下之甘胺酸-HCl持續30秒，更新流槽。
藉由對照有意留空(無抗體結合)之流槽雙重參考，分析資料。用1:1朗繆爾模型(Langmuir model)擬合結合動力學，以產生結合締合(ka )及解離(kd )速率。對於各樣品，平衡結合常數(KD )藉由將解離速率除以締合速率來計算。用BiaEvaluation軟體版本3.2進行資料分析。結果展示於表 7 中。表 7 ：如藉由SPR所測定之mAb2 對人類及食蟹獼猴CD137及OX40的結合親和性 NB-未偵測到結合。NM-未量測。
對OX40/CD137 mAb2 之結合親和性展示此等分子以高親和性結合至二種受體。此等分子對人類OX40之親和性類似，其為預期的，因為此等分子均共有OX40 Fcab。對食蟹獼猴OX40之親和性在人類OX40之5倍以內。對人類CD137之親和性在4至0.2 nM範圍內，且對食蟹獼猴CD137之交叉反應性亦可變，因為各分子中之抗CD137 Fab不同。FS20-22-49AA/FS30-10-16具有對人類CD137之較高親和性，以及對食蟹獼猴CD137之類似親和性。與人類及食蟹猴抗原之結合的相似性可為有利的，因為將希望mAb2 在食蟹獼猴研究中之特性可外推至人類。
此外，FS20-22-49AA/FS30-10-16對人類OX40及人類CD137具有類似親和性，因此預期在此等共表現時，mAb2 應同樣良好地結合至二種目標。
預期同時結合至OX40及CD137且驅動二種目標之聚集及活化的mAb2 充當雙重促效劑。已知OX40及CD137二者存在於T細胞上(Ma等人, 2005)。在不希望受理論束縛的情況下，認為對與二種目標之結合具有類似親和性的mAb2 作為雙重促效劑可為有利的，因為mAb2 將更可能結合至表現二種目標之細胞。以比另一目標顯著更高之親和性優先結合一種目標的mAb2 可能不能夠充當雙重促效劑，因為其可優先結合至不表現二種目標之細胞。 實例9-mAb2 與OX40及CD137之同時結合 9.1         mAb2 與人類OX40及人類CD137之同時結合
藉由SPR在Biacore 3000上測試OX40/CD137 mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3及FS20-22-49AA/FS30-10-16同時結合至OX40及CD137之能力。G1/MOR7480.1用作對照。根據製造商說明書，將經生物素標記之人類CD137 (hCD137-mFc-Avi-Bio)在HBS-EP緩衝液中稀釋至100 nM，且固定於抗生蛋白鏈菌素(SA)晶片(GE Healthcare BR100032)上，至大約1000 RU之表面密度，且在不存在出於背景減除而固定之任何蛋白的情況下將流槽活化及去活化。將在HBS-EP緩衝液中稀釋至100 nM之抗體與100 nM人類OX40 (hOX40-mFc)或HBS-EP緩衝液以30微升/分鐘之流動速率共注入。對於各結合步驟，隨後解離3分鐘。在每一循環後，用15 µl甘胺酸2.5 (GE Healthcare)注射液以30微升/分鐘之流動速率更新感測器晶片。所測試之所有mAb2 能夠同時結合至OX40及CD137。對照mAb G1/MOR7480.1僅結合至CD137。 9.2         靶向鼠類受體之mAb2 與鼠類OX40及鼠類CD137之同時結合
製備包含抗小鼠OX40 Fcab以及抗小鼠CD137 Fab之mAb2 ，以便測試其同時結合至鼠類OX40及鼠類CD137之能力。選擇靶向小鼠OX40之Fcab FS20m-232-91，因為其在T細胞分析中具有較高活性，且選擇呈人類IgG1同型格式之抗小鼠CD137抗體Lob12.3 (Taraban等人, 2002)的Fab (G1/Lob12.3；南安普敦大學)，用於與FS20m-232-91 Fcab配對，因為該Fab展示與表現小鼠CD137之細胞的良好結合，且在文獻中廣泛用作具有活體外及活體內活性的促效性CD137抗體。含有FS20m-232-91 CH3域及抗小鼠CD137抗體Lob12.3之Fab及LALA突變的mAb2 命名為『FS20m-232-91AA/Lob12.3』，而含有FS20m-232-91 CH3域及抗小鼠CD137抗體Lob12.3之Fab，不具有LALA突變的mAb2 命名為『FS20m-232-91/Lob12.3』。
藉由SPR在BIAcore 3000儀器(GE Healthcare)上測試FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 同時結合至其二種目標之能力。G1/Lob12.3用作陽性對照。根據製造商說明書，將重組小鼠CD137 (mCD137-hFc；R&D Systems，目錄號937-4B-050)在pH 5.0之乙酸鈉(GE Healthcare)中稀釋至200 nM，且在Biacore CM5晶片上固定，至大約1000 RU之表面密度，且在不存在出於背景減除而固定之任何蛋白的情況下將流槽活化及去活化。將在HBS-EP緩衝液中稀釋至100 nM之mAb2 及陽性對照與100 nM人類OX40 (mOX40-mFc)或HBS-EP緩衝液以30微升/分鐘之流動速率共注入。對於各結合步驟，隨後解離3分鐘。在每一循環後，以20微升/分鐘之流動速率用在pH 1.7下甘胺酸-HCl水溶液之30秒注射更新感測器晶片。mAb2 能夠同時結合至OX40及CD137。G1/Lob12.3僅結合至CD137。 實例10-mAb2 與Fcγ受體之結合
自文獻已知，靶向TNFR家族成員之促效性抗體需要經Fcγ受體交聯，以驅動目標之聚集及活化以獲得活體內活性(Wajant, 2015)。然而，此對於意欲為雙重促效劑之抗體可能不為期望的。因此決定藉由插入LALA突變，降低mAb2 結合至Fcγ受體之能力。
人類IgG1同型抗體能夠結合至Fcγ受體。在該等抗體結合至Fcγ受體時，此會引起其誘導表現目標之細胞的效應功能，諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，導致細胞溶解。由於OX40/CD137 mAb2 之所需機制為活化表現OX40及CD137之細胞而不將其殺死，因此降低由mAb2 誘導之ADCC為期望的。
此外，由於OX40/CD137 mAb2 意欲以雙重促效劑形式起作用，因此其所需作用機制為藉由在OX40及CD137二者在相同細胞上共表現或在不同細胞上表現時，與二者雙重結合交聯，因此經受體傳遞信號，且因此經Fcγ受體交聯之能力不為功能之必要條件。
此外，眾所周知靶向CD137之抗體已在臨床上展示肝臟毒性(Segal等人, 2017)，且儘管毒性機制未知，有可能其依賴於抗CD137抗體之FcγR介導之交聯，及肝中或周邊表現CD137之細胞的活化。阻止經由FcγR介導之交聯的CD137促效作用可降低本發明之OX40/CD137 mAb2 的任何毒性風險，因為此等分子將僅經由雙重結合至OX40及CD137交聯。
藉由SPR之結合用於證實mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16中LALA突變之存在已降低對Fcγ受體之結合親和性，該等受體具體而言為hFcγR1 (R&D Systems，目錄號1257-FC-050/CF)、hFcγR2a (R&D Systems，目錄號1330-CD-050/CF)、hFcγR2b (R&D Systems，目錄號1460-CD-050/CF)及hFcγR3a (R&D Systems，目錄號4325-FC-050/CF)。均呈hIgG1同型格式之抗hOX40 mAb G1AA/11D4及G1/11D4 (分別具有及不具有LALA突變)及抗CD137 mAb G1AA/20H4.9及G1/20H4.9 (分別具有及不具有LALA突變)，及呈hIgG4同型格式之抗hCD137 mAb G4/20H4.9用作對照抗體。
在Biacore 3000儀器(GE Healthcare)上測試結合。將人類OX40 (BPS Bioscience目錄號71310)及人類CD137 (自產)經生物素標記his標籤抗原以2 µM濃度塗佈至SA晶片(GE Healthcare目錄號BR100398)上。將人類OX40及人類CD137塗佈於獨立流槽上，而另一流槽留空用於背景減除。更新條件確定為在20微升/分鐘流動速率下之12 µl 10 mM pH 2.0下之甘胺酸-HCl水溶液。將抗體(參見表 8 )及人類FcγR (參見表 8 )在HBS-P (0.01 M HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，0.005% v/v界面活性劑P20，GE Healthcare，BR-1003-68)中稀釋至100 nM (抗體)或500 nM (人類FcγR)，且以20微升/分鐘之流動速率共注入，且隨後解離5分鐘。
用BiaEvaluation軟體版本3.2 RC1，藉由對照空白流槽參考及比對抗體締合後之曲線，進行資料分析。藉由自抗體締合期結束時之絕對反應減去Fcγ締合期結束時之絕對反應，產生締合期結束時之結合反應之值，以將結合至OX40及CD137受體之抗體的影響標準化。
量測FcγRI解離期結束時之結合反應之值，以展現在不存在對與此FcγR之結合之完全消除的情況下，LALA突變對提高FcγRI結合之解離速率的影響。此等藉由自FcγR解離期結束時之絕對反應減去Fcγ締合期結束時之絕對反應而產生。抗CD137抗體之值獲自經CD137-his抗原塗佈之流槽，抗OX40抗體之值獲自經OX40-his抗原塗佈之流槽，且OX40/CD137 mAb2 之值獲自經OX40-his抗原塗佈之流槽及經CD137-his抗原塗佈之流槽二者。結果展示於表 8 中。表 8 ： 藉由SPR量測之抗體對人類Fcγ受體的結合反應
如所預期，mAb2 及呈IgG1及IgG4格式二者之不具有LALA突變之對照抗體均結合至Fcγ受體中之每一者。與呈IgG1格式、不具有LALA突變之對照抗體及呈IgG4格式之對照抗體相比，含有LALA突變之mAb2 及呈IgG1格式之對照抗體展示與所測試之Fcγ受體中之每一者(除FcγRI以外)，在締合期結束時顯著降低之結合(締合速率)。相比於不含LALA之IgG1抗體，高親和性Fcγ受體FcγRI與hIgG1含LALA抗體之締合速率結合僅略降低，使得其未藉由引入突變而顯著改變。然而，對於含有LALA突變之抗體，FcγRI之解離速率比不具有LALA之抗體快，如藉由FcγRI解離期結束時之結合反應的較大降低所展示(與對於不含LALA之抗體的小於60 RU相比，對於含LALA抗體中之每一者超過200 RU)。
總體而言，當與野生型人類IgG1相比時，含有LALA突變之OX40/CD137 mAb2 以與其他含LALA hIgG1抗體類似的方式，且處於比IgG4對照抗體低之位準，降低與Fcγ受體之結合。由於Fcγ受體結合為ADCC活性所需的，預期由LALA突變所引起之與Fcγ受體結合之此降低將亦引起降低之ADCC，使得目標細胞將不藉由mAb2 結合而耗乏。認為此很重要，此係由於OX40/CD137 mAb2 為促效性抗體，且因此目標細胞之耗乏係不期望的，因為此等細胞為mAb2 旨在刺激的細胞。
FcγRIIIa在諸如自然殺手(NK)細胞之免疫效應細胞上表現，且已展示為對介導ADCC重要(Chan等人, 2015)。為確定如由SPR資料證實之FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 與FcγRIIIa的降低結合是否轉換成ADCC路徑之低或可忽略的活化，使用表現FcγRIIIa之經工程改造的Jurkat細胞作為效應細胞，及過度表現人類OX40或人類CD137之Raji細胞作為目標細胞，進行ADCC生物分析。相比於針對分析中所使用之陰性及陽性對照抗體所觀測到之反應，未觀測到mAb2 在表現OX40或表現CD137之Raji細胞中誘導ADCC活化。
眾所周知其他促效性抗體依賴於抗體之Fcγ受體交聯以建立高階結構(Stewart等人, 2014; Wajant, 2015)，引起細胞表面上受體之聚集及活化來施加其促效活性。由於Fcγ受體介導之交聯並非為本發明之mAb2 所需的，因此對細胞之促效作用將定位於存在二種目標的位點。由於OX40/CD137 mAb2 中之LALA突變引起與Fcγ受體之結合降低，因此預期經由單獨的CD137結合之Fcγ受體交聯驅動活化係不可能的。因此，mAb2 不大可能在不存在OX40表現之情況下活化表現CD137之細胞。由於在人類中存在與靶向CD137相關之已知肝臟毒性風險(例如，如用烏瑞魯單抗(BMS-663513)進行之治療中所見(Segal等人, 2017)，因此希望含有LALA突變之mAb2 之Fcγ受體誘導交聯的或然性降低將減少在用mAb2 進行治療後出現此類肝臟毒性的幾率，因為CD137將僅在亦表現OX40之位置活化。CD137誘導之肝臟毒性的當前理論指出，表現CD137之骨髓細胞為造成見於經CD137促效劑處理之小鼠中之肝炎的細胞類型(Bartkowiak等人, 2018)。
已知巨噬細胞表現可潛在地介導靶向CD137之抗體交聯的FcγRI，然而，已知此等細胞不表現OX40。因此，含有LALA突變之本發明之mAb2 理論上應無法活化表現CD137但不亦表現OX40之肝臟巨噬細胞。當與對於活性需要Fcγ受體交聯之CD137促效劑或對於活性不需要交聯之CD137促效劑相比時，認為此降低本發明之OX40/CD137 mAb2 的肝臟毒性風險。在OX40情況下，儘管已在不存在交聯之情況下觀測到Fcab之一些殘餘活性，該活性會引起在不存在CD137結合之情況下OX40的一些活化，但由於在利用OX40促效劑之臨床研究中迄今尚未報導劑量限制性毒性，此未被視為風險。 實例11-mAb2 與表現OX40或CD137之細胞的結合 11.1.       mAb2 與表現人類或食蟹獼猴OX40或CD137之細胞的結合
使用流式細胞量測術，測定mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12及FS20-22-49AA/FS30-10-16對細胞表現之人類或食蟹獼猴OX40及CD137的結合親和性。在1×DPBS (Gibco，14190-094)中製備此等mAb2 抗體及對照抗體G1/4420 (FITC)、G1/11D4 (OX40)、G1/MOR7480.1 (CD137)及FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 ) (均呈IgG1同型格式)的稀釋液(2×最終濃度)。在PBS+2% BSA (Sigma，A7906)中製備DO11.10-hOX40、DO11.10-cOX40、DO11.10-hCD137、DO11.10-cCD137或HEK細胞懸浮液，且將細胞懸浮液在4×106 個細胞/微升下以50微升/孔接種於V型底96孔培養盤(Costar，3897)中。將50 µl抗體稀釋液添加至含有細胞之孔中(最終體積100 µl)且在4℃下培育1小時。洗滌培養盤，且隨後添加100微升/孔1:1000稀釋於PBS+2% BSA中之二次抗體(抗人類Fc-488抗體，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)，且在4℃下在暗處培育30分鐘。洗滌培養盤，且再懸浮於含有1 μg/ml之DAPI (Biotium，目錄號40043)之100 µl PBS中。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)分析培養盤，且使用FlowJo分析資料。藉由死細胞在UV (405nm/450/50)通道上之較高螢光鑑別死細胞，且將其自分析排除。FITC通道(488nm/530/30)中之幾何平均螢光強度(GMFI)用作抗體結合之量度。在GraphPad Prism軟體中使用log (促效劑)對反應(三參數)擬合GMFI資料，以產生EC50 值。
表 9 ： 如藉由流式細胞量測術所測定之抗OX40/CD137 mAb2 對表現人類或食蟹獼猴OX40或CD137之DO11.10細胞的結合親和性。 NB：未觀測到結合。
結果證實所測試之OX40/CD137 mAb2 結合至DO11.10細胞上表現之人類及食蟹獼猴OX40及CD137。mAb2 及陽性對照(人類IgG1主鏈中之抗人類OX40 mAb G1/11D4；及人類IgG1主鏈中之抗人類CD137 mAb G1/MOR7480.1)以一系列親和性結合至人類及食蟹獼猴OX40及CD137二者(參見表 9 )。未觀測到與HEK細胞株之表面上表現之其他蛋白的交叉反應性，因為對於所測試之抗體中之任一者，無法偵測到與此細胞株之結合。因此，OX40/CD137 mAb2 特異性結合至人類OX40及人類CD137，未觀測到非特異性結合。 11.2        FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 及其組成部分與表現人類或食蟹獼猴OX40或CD137之細胞的結合
為比較mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16及其組成部分，亦即OX40 Fcab (呈OX40/FITC假擬mAb2 格式；FS20-22-49AA/4420)及CD137 Fab (呈IgG1格式；FS30-010-016)對細胞表現之人類或食蟹獼猴OX40及CD137的親和性，使用如實例 11.1 中所描述之相同方法。然而，在此實驗中，使用未經轉導之DO11.10細胞而非使用HEK細胞分析非特異性結合。G1/4420抗FITC抗體用作對照。將實驗重複三次以提高所計算之EC50 的可靠度。所測試之分子的平均EC50 值展示於表 10 中。
表 10 ： 如藉由流式細胞量測術所測定之抗OX40/CD137 mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16及其組成部分對表現人類或食蟹獼猴OX40或CD137之DO11.10細胞的結合親和性。 Avg：平均值；SD：標準差；NB：未觀測到結合。
結果證實，OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)以次奈莫耳親和性結合至DO11.10細胞上表現之人類及食蟹獼猴OX40及CD137，mAb2 之OX40 Fcab組分以與OX40/CD137 mAb2 相當的親和性結合至人類及食蟹獼猴OX40，且mAb2 之CD137 Fab組分以與OX40/CD137 mAb2 相當的親和性結合至人類及食蟹獼猴CD137。針對OX40/CD137 mAb2 、其組成部分中之任一者或同型對照抗體(G1/4420)，未觀測到與未經轉導之DO11.10細胞的未非特異性結合。結果表明，FS20-22-49AA/FS30-10-16 OX40/CD137 mAb2 及FS20-22-49AA OX40 Fcab對細胞表現之食蟹獼猴OX40的親和性比先前觀測到的更大(如由較低EC50 所示) (實例 11.1 及表 9 )，且類似於藉由SPR測定之親和性結果(實例 8 及表 7 )。由於表 10 中詳述之平均EC50 值為三次非依賴性實驗之結果，因此此等為所測試之分子對DO11.10細胞上表現之人類及食蟹獼猴OX40及CD137之親和性的較好表示。 11.3        mAb2 與表現小鼠OX40或CD137之細胞的結合
使用流式細胞量測術測定FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 對細胞表現之小鼠OX40及CD137的結合親和性。在1×DPBS (Gibco，14190-094)中製備FS20m-232-91AA/Lob12.3及對照抗體G1/4420 (FITC)、G1/Lob12.3 (CD137)、G1/OX86 (OX40)及FS20m-232-91AA/HEL D1.3 (OX40/HEL假擬mAb2 )的稀釋液(2×最終濃度)。在PBS+2% BSA (Sigma，A7906)中製備DO11.10-mOX40、DO11.10-mCD137或HEK細胞懸浮液，且將細胞懸浮液在4×106 個細胞/微升下以50微升/孔接種於V型底96孔培養盤(Costar，3897)中。將50 µl抗體稀釋液添加至含有細胞之孔中(最終體積100 µl)且在4℃下培育1小時。洗滌培養盤，且隨後添加100微升/孔1:1000稀釋於PBS+2% BSA之二次抗體(抗人類Fc-488抗體，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)，且在4℃下在暗處培育30分鐘。洗滌培養盤，且再懸浮於含有1 μg/ml之DAPI (Biotium，目錄號40043)之100 µl PBS中。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)分析培養盤，且使用FlowJo分析資料。藉由死細胞在UV (405nm/450/50)通道上之較高螢光鑑別死細胞，且將其自分析排除。FITC通道(488nm/530/30)中之幾何平均螢光強度(GMFI)用作抗體結合之量度。在GraphPad Prism軟體中使用log (促效劑)對反應(三參數)擬合GMFI資料，以產生EC50 值。結果展示於表 11 中。
表11 ： 如藉由流式細胞量測術所測定之抗小鼠OX40/CD137 mAb2 對表現小鼠OX40或CD137之DO11.10細胞的結合親和性。 NB：未觀測到結合。
結果證實FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 結合至DO11.10細胞上表現之小鼠OX40及CD137。mAb2 及陽性對照(人類IgG1主鏈中之抗小鼠OX40 mAb OX86；及人類IgG1主鏈中之CD137 mAb Lob12.3)以一系列親和性結合至小鼠OX40及/或CD137 (參見表 11 )。未觀測到與HEK細胞株之表面上表現之其他蛋白的交叉反應性，因為對於所測試之抗體中之任一者，無法偵測到與此細胞株之結合。
因此，抗小鼠OX40/CD137 mAb2 特異性結合至小鼠OX40及小鼠CD137，未觀測到非特異性結合。 實例12-葡萄球菌腸毒素A (SEA)分析中靶向共表現受體之OX40/CD137 mAb2 的活性
腫瘤浸潤淋巴球上之OX40表現可能伴有CD137之表現，因為此等二種分子通常在活化T細胞上共表現(Ma等人, 2005)。由靶向此等二種共表現受體之mAb2 對OX40及CD137產生促效作用可誘導增殖及由預活化T細胞產生發炎性細胞介素。
為變為完全活化，T細胞需要二個信號，具有抗原特異性且經與在抗原呈現細胞(APC)膜上呈現肽抗原之MHC (主要組織相容複合體)相互作用之T細胞受體提供的第一信號，及藉由APC之膜上表現之協同刺激分子與T細胞之間相互作用提供的第二抗原非特異性信號，協同刺激信號。
為測試OX40/CD137 mAb2 之活性，建立使用葡萄球菌腸毒素A (SEA)超級抗原作為第一信號的T細胞活化分析。SEA交聯APC表面上之第II類MHC分子及T細胞之TCR，藉此提供T細胞活化之第一信號。對於其完全活化，T細胞必須亦藉由視需要交聯之對照分子或mAb2 接收第二協同刺激信號。此分析利用自血液分離之PBMC進行，且與利用分離T細胞進行之分析相比，應更緊密地表示預期活體內發生之情況。
使用SEA刺激分析以確定在存在或不存在人工交聯劑之情況下，不同OX40及CD137促效劑抗體及OX40/CD137 mAb2 抗體之活性，以比較不同OX40/CD137 mAb2 純系，及在10個PBMC供體之組中確定OX40/CD137 mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-10-16的代表性EC50 值。 12.1        OX40及CD137促效劑抗體對SEA刺激之PBMC的活性
為確定SEA分析對不同OX40及CD137促效劑抗體之靈敏度，針對表 12 中所列之mAb2 抗體(FS22-20-49AA/FS30-10-16)及對照抗體的活性，在分析中測試該等抗體。G1/4420 (抗FITC)、G1AA/MOR7480.1 (抗CD137)、G1AA/FS30-10-16 (抗CD137)、G1AA/20H4.9 (抗CD137)、G1AA/11D4 (抗OX40)及FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 )用作對照。IL-2產生用作T細胞活化之量度。表 12 ：所測試之抗體及mAb2 的細節
將周邊血液單核細胞(PBMC)自血小板捐獻副產物白血球耗乏錐(NHS Blood and Transplant服務)分離。簡言之，將白血球錐內含物用PBS沖洗且上覆於聚蔗糖梯度(GE Lifesciences目錄號17144002)上。藉由對未穿過聚蔗糖梯度之細胞進行離心及回收，分離PBMC。進一步用PBS洗滌PBMC，且根據製造商說明書，經由添加10 ml紅細胞溶解緩衝液(eBioscience)溶解剩餘的紅細胞。對PBMC進行計數，且在T細胞培養基(含10% FBS (Life Technologies)、1×青黴素鏈黴素(Life Technologies)、丙酮酸鈉(Gibco)、10 mM Hepes (Gibco)、2 mM L-麩醯胺酸(Gibco)及50 µM 2-巰基乙醇(Gibco)之RPMI培養基(Life Technologies))中再懸浮至2.0×106 個細胞/毫升。隨後將SEA (Sigma目錄號S9399)以200 ng/ml添加至PBMC中，且將細胞以2×105 個細胞/孔(100微升/孔)添加至培養盤中。
在DPBS (Gibco)中製備各測試抗體(詳見表 12 )之2 µM稀釋液，且將稀釋液在T細胞培養基中進一步1:10稀釋(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液。在需要時，將人工交聯劑(抗人類CH2抗體(純系MK1A6，自製)或FITC-葡聚糖(Sigma) (參見表 12 )以與測試抗體1:1莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備測試抗體之連續稀釋液，且將100 µl稀釋抗體混合物添加至培養盤上之活化T細胞中。
在37℃，在5% CO2 下培育細胞120小時。收集上清液，且使用人類IL-2 ELISA套組(eBioscience或R&D Systems)遵循製造商說明書量測IL-2釋放。使用盤讀取器用Gen5軟體，BioTek在450 nm下讀取培養盤。自450 nm之吸光值減去630 nm之吸光值(校正)。細胞介素濃度計算之標準曲線基於四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。相對於測試抗體之對數濃度，繪製人類IL-2 (hIL-2)之濃度，且使用GraphPad Prism中之log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。表 13 展示存在或不存在用人工交聯劑進行之交聯的情況下，SEA分析中觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 3A 展示SEA分析中由單一濃度(3.7 nM)下之測試抗體誘導的IL-2釋放位準。對此分析選擇此等抗體誘導最高位準之IL-2產生的濃度。藉由雙因子變異數分析及杜凱氏多重比較檢定進行統計分析。誤差杠上方之星號表示與同型對照(G1/4420)處理樣品相比之顯著差異(* p>0.032，** p>0.0021，*** p>0.0002，**** p>0.0001)。圖 3B 展示在SEA分析中，在存在或不存在人工交聯劑之情況下，由OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)誘導之IL-2釋放的曲線。表 13 ： 用OX40及CD137促效劑抗體及mAb2 進行的SEA分析 NAD=未偵測到活性。
結果展示，僅OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)能夠在不存在人工交聯劑之情況下提高IL-2位準，且就EC50 或最大反應而言，添加人工交聯劑並不提高OX40/CD137 mAb2 之活性。僅在存在人工交聯劑之情況下觀測到靶向OX40之抗體G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420及抗CD137抗體G1AA/20H4.9之活性，且相比於同型對照，甚至在存在人工交聯劑之情況下，針對抗CD137抗體G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16未偵測到統計顯著活性。抗OX40抗體G1AA/11D4與抗CD137抗體G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16相比，誘導較高IL-2位準，及與抗CD137抗體G1AA/20H4.9相當的IL-2位準，不過觀測到G1AA/11D4抗體與G1AA/20H4.9抗體相比，具有如由其明顯較低之EC50 指示的更大效力。此等結果表明，此SEA分析對OX40促效作用比對CD137促效作用更敏感。此可能與OX40在CD4+ T細胞上優先表現且CD137在CD8+ T細胞上優先表現相關(Croft, 2014且內部資料展示於圖 6 中)，且因為人類PBMC中典型地存在比CD8+ T細胞多的CD4+ T細胞。 12.2 不同OX40/CD137 mAb2 純系對SEA刺激之PBMC的活性
在SEA分析中，針對五種不同OX40/CD137 mAb2 純系之活性，對其進行測試。分析中所使用之mAb2 及對照抗體的細節提供於表 14 中。G1/4420 (抗FITC)、G1/11D4 (抗OX40)、G2/MOR7480.1 (抗CD137)、G1/11D4外加G2/MOR7480.1之組合，及FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 )用作對照。如實例 12.1 中所描述進行分析。表 14 ： 所測試之抗體及mAb2 的細節
表 15 展示用人工交聯劑進行之交聯的情況下，SEA分析中觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 3C 及圖 3D 展示SEA分析之IL-2釋放的曲線。表 15 ： 用靶向OX40及CD137之mAb2 進行的SEA分析 NAD=未偵測到活性
圖 3C 及圖 3D 及表 15 展示，如所預期，在非交聯或交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下，或在非交聯抗OX40抗體(單獨或與G2/MOR7480.1組合之G1/11D4)之情況下，未觀測到IL-2產生。當OX40藉由抗OX40陽性對照抗體結合而活化時，由T細胞產生IL-2，但僅在存在人工交聯劑時發生(對於單獨的G1/11D4，EC50 為0.13 nM，且當與G2/MOR7480.1組合時，EC50 為0.11 nM)。在此分析中，呈假擬mAb2 格式(4420 LALA) FS20-22-49AA/4420之靶向OX40的Fcab在不存在交聯之情況下展示一些促效活性(EC50 為8.53 nM)，但在藉由Fab臂結合至FITC-葡聚糖而交聯時，具有如藉由EC50 之降低(0.31 nM)及如藉由IL-2產生增加所示之所產生IL-2之最大量(最大反應)的增加所表明之提高的活性。
在單獨的經交聯之靶向CD137之抗體G2/MOR7480.1之情況下未觀測到活性，且靶向OX40之抗體G1/11D4與靶向CD137之抗體G2/MOR7480.1之組合在交聯時的活性類似於單獨的經交聯之靶向OX40之抗體G1/11D4的活性。
在此SEA T細胞活化分析中，無論是否存在人工交聯劑，五種OX40/CD137 mAb2 純系之活性(參見表 15 )相當。OX40/CD137 mAb2 在存在人工交聯劑之情況下之活性亦與交聯FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 相當。此SEA分析之此等結果展示，OX40/CD137 mAb2 能夠由於藉由mAb2 之抗CD137 Fab臂接合提供的交聯，在不需要人工交聯劑之情況下經OX40傳遞信號。
儘管在此分析中針對經交聯之靶向CD137之抗體G2/MOR7480.1未偵測到活性，但預期CD137在T細胞上以一位準表現以允許發生mAb2 之交聯。假設此表現已處於一位準，在該位準下，五種mAb2 純系中之每一者在結合至CD137時亦可結合至OX40，且將其活化驅動至比由非交聯FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 誘導之低位準活性高得多的程度。
在不存在人工交聯劑之OX40/CD137 mAb2 之情況下觀測到的T細胞活化亦表明，此等分子將能夠在表現OX40及CD137二者之位置活體內活化T細胞。 12.3        OX40/CD137 mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-10-16對來自10個PBMC供體之SEA刺激之PBMC的活性
在利用來自10個不同供體之PBMC的SEA分析中，測試OX40/CD137 mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-10-16，以確定其活性之準確EC20 、EC30 及EC50 值。如實例 12.1 中所描述在不存在人工交聯劑之情況下進行分析。對各供體由原始資料計算平均值加或減標準差(SD)。為計算EC50 值，將原始資料擬合至邏輯函數(4參數：頂(Top)、底(Bottom)、希爾斜率(Hill slope)及EC50 )： y軸展示作為log10 (c)之函數的所量測反應(IL-2位準)，其中c表示測試品之濃度。
來自擬合之各參數估計值具有標準誤差，其指示估計值之精確度。由於對於給定實驗之不同供體及/或技術重複將產生不同參數估計值及不同位準之精確度(取決於例如在各情況下之資料品質)，因此將來自各供體及/或技術重複之參數包括於加權平均值內。在參數常態性之假設下，權重被定義為參數之標準誤差之平方的倒數。
另外，藉由將資料擬合至類似方程計算log10 (EC20 )及log10 (EC30 )值： 使用GraphPad Prism進行所有邏輯擬合，且使用Microsoft Excel進行加權平均。以下給出用於加權平均值及加權平均值之標準誤差的等式： 其中已將加權標準差估計為：
在SEA分析中針對OX40/CD137 mAb2 觀測到之IL-2釋放的EC20 、EC30 及EC50 值展示於表 16 中。表 16 ： SEA分析中OX40/CD137 mAb2 之EC20 、EC30 及EC50 值
此等結果展示OX40/CD137 mAb2 與來自不同供體之PBMC具有相當的活性。 實例13-人類OX40/CD137 mAb2 在泛T細胞活化分析中之活性
實例 12 中所描述之SEA T細胞活化分析使用PBMC及超級抗原SEA刺激T細胞。為評定OX40及CD137促效劑對經分離T細胞之影響，建立T細胞活化分析。在此分析中，分離T細胞且使用固定於塑膠表面之抗CD3抗體刺激T細胞。固定抗CD3抗體能夠聚集T細胞之TCR，提供T細胞活化所需的第一信號，且測試分子提供第二信號。
使用T細胞刺激分析以確定不同OX40及CD137促效劑抗體及OX40/CD137 mAb2 抗體在存在或不存在交聯劑之情況下的活性，以比較不同OX40/CD137 mAb2 純系，及在九個PBMC供體之組中確定OX40/CD137 mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-10-16的代表性EC50 值。 13.1        OX40及CD137促效劑抗體在泛T細胞活化分析中之活性
為確定T細胞活化分析對不同OX40及CD137促效劑抗體的靈敏度，針對列於表 17 中之mAb2 抗體(FS20-22-49AA/FS30-10-16)及對照抗體之活性，在分析中測試該等抗體。G1/4420 (抗FITC)、G1AA/MOR7480.1 (抗CD137)、G1AA/FS30-10-16 (抗CD137)、G1AA/20H4.9 (抗CD137)、G1AA/11D4 (抗OX40)及FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 )用作對照。IL-2產生用作T細胞活化之量度。表 17 ： 所測試之抗體及mAb2 的細節
如實例 12.1 中所描述分離人類PBMC。隨後使用泛T細胞分離套組II (Miltenyi Biotec Ltd)，根據製造商說明書，自PBMC分離T細胞。
藉由渦流再懸浮人類T活化子CD3/CD28戴諾珠粒(Life technologies11452D)。用T細胞培養基(含10% FBS (Life Technologies)、1×青黴素鏈黴素(Life Technologies)、丙酮酸鈉(Gibco)、10 mM Hepes (Gibco)、2 mM L-麩醯胺酸(Gibco)及50 µM 2-巰基乙醇(Gibco)之RPMI培養基(Life Technologies))將珠粒洗滌二次。
在T-25燒瓶(Sigma)中以2:1細胞比珠粒比率用經洗滌人類T活化子CD3/CD28戴諾珠粒刺激T細胞培養基中濃度為1.0×106 個細胞/毫升所需數目之T細胞，且將T細胞在37℃，5% CO2 下培育隔夜以活化T細胞。將活化T細胞自戴諾珠粒洗滌且以2.0×106 個細胞/毫升之濃度再懸浮於T細胞培養基中。經由與稀釋於PBS中之2.5 µg/ml抗人類CD3抗體(R&D Systems純系UHCT1)在37℃，5% CO2 下一起培育2小時，且隨後用PBS洗滌二次，將96孔平底培養盤用抗人類CD3抗體塗佈。將活化T細胞以2×105 個細胞/孔添加至培養盤中。
如上文實例 12.1 中所描述，製備各測試抗體(詳見表 17 )之2 µM稀釋液，且在需要時將稀釋液與交聯劑(抗人類CH2抗體(純系MK1A6，自製)或FITC-葡聚糖(Sigma) (參見表 17 ))以1:1莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備測試抗體之連續稀釋液，且將100 µl稀釋抗體混合物添加至培養盤上之活化T細胞中。
在37℃，5% CO2 下培育T細胞72小時。隨後如實例 12.1 中所描述，收集上清液，量測IL-2釋放且製備資料。表 18 展示在存在或不存在用交聯劑進行之交聯的情況下，T細胞活化分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 4A 展示在T細胞活化分析中，由單一濃度(3.7 nM)下之測試抗體誘導的IL-2釋放位準。對此分析選擇此等抗體誘導最高位準之IL-2產生的濃度。藉由雙因子變異數分析及杜凱氏多重比較檢定進行統計分析。誤差杠上方之星號表示與同型對照(G1/4420)處理樣品相比之顯著差異(* p>0.032，** p>0.0021，*** p>0.0002，**** p>0.0001)。圖 4B 展示在T細胞活化分析中，在存在或不存在交聯劑之情況下，由OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)誘導之IL-2釋放的曲線。表 18 ： 用OX40及CD137促效劑抗體及mAb2 進行的T細胞活化分析 NAD-未偵測到活性。
結果展示，僅OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)能夠在不存在人工交聯劑之情況下提高IL-2位準，且就EC50 或最大反應而言，添加人工交聯劑並不提高OX40/CD137 mAb2 之活性。僅在存在人工交聯劑之情況下觀測到靶向OX40之抗體G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420及抗CD137抗體G1AA/20H4.9之活性，且甚至在存在人工交聯劑之情況下，針對抗CD137抗體G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16未偵測到活性。與所有三種CD137促效劑抗體相比，OX40促效劑抗體FS20-22-49AA/4420誘導較高IL-2位準。抗OX40抗體G1AA/11D4與抗CD137抗體G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16相比，誘導較高IL-2位準，及與抗CD137抗體G1AA/20H4.9相當的IL-2位準，不過觀測到G1AA/11D4抗體與G1AA/20H4.9抗體相比，具有如由其較低之EC50 指示的更大效力。此等結果表明，此T細胞活化分析對OX40促效作用比對CD137促效作用更敏感。如實例 12.1 中所推測，此可能與OX40在CD4+ T細胞上優先表現且CD137在CD8+ T細胞上優先表現相關(Croft, 2014且內部資料展示於圖 6 中)，且因為人類PBMC中典型地存在比CD8+ T細胞多的CD4+ T細胞。 13.2        泛T細胞活化分析中對OX40及CD137促效劑抗體之活性的多細胞介素分析
為更好地理解OX40及CD137刺激對T細胞活化分析之影響，分析多種細胞介素的位準。使用列於表 19 中之抗體及mAb2 抗體(FS20-22-49AA/FS30-10-16)及對照抗體。對照抗體G1/4420 (抗FITC)、G1AA/FS30-10-16 (抗CD137)及FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 )在存在人工交聯劑之情況下測試，且OX40/CD137 mAb2 在不存在人工交聯劑之情況下測試。所有抗體以單一濃度(10 nM)使用。如實例 13.1 中 所描述進行分析。表 19 ： 所測試之抗體及mAb2 的細節
隨後使用促發炎V-plex套組(MSD，K15049D-1)，根據製造商說明書，測定培育後所收集之上清液中細胞介素IL-2、IL-6、IL12p70、IL-13、TNFα、IFNγ及IL-10的位準。結果展示，OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)及經交聯之靶向OX40之抗體(FS20-22-49AA/4420)增加由T細胞產生之IL-2、IL-6、IL-12p70、IL-13及TNFα細胞介素釋放，且減少由T細胞產生之IL-10釋放。針對抗CD137抗體(G1AA/FS30-10-16)，未偵測到活性。 13.3        不同OX40/CD137 mAb2 純系在泛T細胞活化分析中之活性
此分析中所測試之分子及其各別交聯劑(適用時)的細節提供於以下表 20 中。G1/4420 (抗FITC)、G1/11D4 (抗OX40)、G2/MOR7480.1 (抗CD137)、G1/11D4外加G2/MOR7480.1之組合，及FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 )用作對照。在不存在人工交聯劑之情況下測試所有分子。在存在人工交聯劑之情況下，另外測試單劑對照G1/4420、G1/11D4、G2/MOR7480.1及FS20-22-49AA/4420。如實例 13.1 中所描述進行分析。表 20 ：所測試之抗體及mAb2 的細節
表 21 展示在不存在交聯之情況下，針對T細胞活化分析中所測試之所有分子觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。表 22 展示針對另外在存在交聯劑之情況下測試之單劑對照G1/4420、G1/11D4、G2/MOR7480.1及FS20-22-49AA/4420觀測到的IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 4C 及圖 4D 展示T細胞活化分析之IL-2釋放曲線。表 21 ： 在不存在交聯劑之情況下用靶向共表現受體之mAb2 進行的T細胞活化分析 NAD=未偵測到活性 ND=未測定表 22 ： 在存在交聯劑之情況下的單劑對照 NAD=未偵測到活性 ND=未測定
表 21 及圖 4C 展示，非交聯OX40/CD137 mAb2 具有活性(EC50 值在0.2019至1.201 nM範圍內)，且因此能夠結合至二種目標，引起目標中之一者或二者的聚集以誘導T細胞活化。如所預期，在非交聯或交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下，或在非交聯抗OX40抗體(單獨或與G2/MOR7480.1組合的G1/11D4)之情況下，未觀測到IL-2產生。當OX40受體由在存在交聯劑之情況下的抗OX40陽性對照抗體靶向時，由T細胞產生IL-2 (對於單獨的G1/11D4，EC50 為0.05 nM，且在與G2/MOR7480.1組合時，EC50 為0.02 nM)。
如SEA分析中所見，呈假擬mAb2 格式(4420 LALA) FS20-22-49AA/4420之靶向OX40之Fcab在不存在交聯之情況下展示一些促效活性(EC50 為5.02 nM，且最大反應為1508 pg/ml hIL-2)，且此活性在假擬mAb2 藉由其Fab臂結合至FITC-葡聚糖而交聯時進一步增強。
在單獨的非交聯抗CD137抗體G2/MOR7480.1之情況下，未觀測到活性，但在交聯時，其能夠誘導T細胞活化，表明不同於SEA T細胞活化分析(實例 12 )，此分析能夠量測由此抗CD137純系引起之CD137信號傳遞以上文所證實之OX40信號傳遞。與實例 13.1 中呈IgG1格式之相同抗CD137純系(G1AA/MOR7480.1) (針對該純系在不存在或存在人工交聯劑之情況下未偵測到活性)相比，針對此交聯抗體觀測到之活性的差異可由以下解釋：T細胞供體變化性，其中一些供體可能比其他供體對CD137刺激反應較好。
在實例 7.1 所描述之使用DO11.10-hCD137細胞之人類CD137T細胞活化分析中，測試OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及FS20-22-49AA/FS30-35-14)及G2/MOR7480.1對照有效力地誘導IL-2產生。因此假設OX40/CD137 mAb2 之抗CD137 Fab臂亦能夠對T細胞表現之CD137產生促效作用，以在本實例之初代T細胞活化分析中產生可偵測IL-2信號。 13.4        OX40/CD137 mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-10-16在利用來自九個PBMC供體之T細胞的泛T細胞活化分析中之活性
在利用來自九個不同供體之PBMC之T細胞活化分析中測試OX40/CD137 mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-10-16，以確定其活性之準確EC20 、EC30 及EC50 值。如實例 13.1 中所描述，在不存在人工交聯劑之情況下進行分析。
對於各供體，如實例 12.3 中所描述由原始資料計算平均值加或減標準差(SD)。亦如實例 12.3 中所描述，計算T細胞分析中針對OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)觀測到之IL-2釋放的EC20 、EC30 及EC50 值，且展示於表 23 中。表 23 ： T細胞活化分析中OX40/CD137 mAb2 之EC20 、EC30 及EC50 值
此等結果展示OX40/CD137 mAb2 對來自不同供體之T細胞具有相當的活性。 實例14-人類OX40/CD137 mAb2 在CD4+及CD8+ T細胞活化分析中之活性
T細胞可根據其在免疫系統中之功能細分成CD4+及CD8+ T細胞。CD4+ T細胞被稱為T輔助細胞，且產生調節免疫反應之細胞介素，而CD8+ T細胞被稱為T殺手細胞，且直接消除目標細胞。已觀測到CD4+ T細胞上OX40之表現高於CD137表現，且反之亦然，已發現CD8+ T細胞上CD137之表現高於OX40表現(Croft, 2014且參見圖 6 )。儘管具有此表現位準差異，但CD4+及CD8+ T細胞均共表現二種受體(Ma等人, 2005)。
為進一步探究OX40/CD137 mAb2 在T細胞之此等二種群體中的活性，分離CD4+及CD8+ T細胞，以便在獨立CD4+及CD8+ T細胞活化分析中測試以下表 24 中所列之分子活化各T細胞群體的能力。在此分析中，利用OX40及CD137之共表現，以測定OX40/CD137 mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16之交聯。G1/4420 (抗FITC)、G1AA/11D4 (抗OX40)、G1AA/MOR7480.1 (抗CD137) G1AA/FS30-10-16 (抗CD137)、FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 )及FS20-22-49AA/4420外加G1AA/FS30-10-16之組合用作對照。IL-2產生用作T細胞活化之量度。表 24 ：所測試之抗體及mAb2 的細節
為分離人類CD4+及CD8+ T細胞，首先如實例 13.1 中所描述分離PBMC。隨後分別使用CD4+ T細胞分離套組(人類) (Miltenyi Biotec，130-096-533)及CD8+ T細胞分離套組(人類) (Miltenyi Biotec，130-096-495)，根據製造商說明書，分別地自PBMC分離CD4+及CD8+ T細胞。
如實例 13.1 中所描述，使用人類T活化子CD3/CD28戴諾珠粒，將T細胞培養基中1.0×106 個細胞/毫升濃度下呈所需量之CD4+或CD8+ T細胞活化隔夜。
將活化CD4+或CD8+ T細胞自戴諾珠粒洗滌，且以2.0×106 個細胞/毫升之濃度再懸浮於T細胞培養基中。經由與稀釋於PBS中之2.5 µg/ml (用於CD4+ T細胞活化分析)或10 µg/ml (用於CD8+ T細胞活化分析)抗人類CD3抗體(R&D Systems，純系UHCT1)在37℃，5% CO2 下一起培育2小時，且隨後用PBS洗滌二次，將96孔平底培養盤用抗人類CD3抗體塗佈。隨後將活化CD4+或CD8+ T細胞以2×105 個細胞/孔添加至各別培養盤中。
如實例 6 中所描述，製備各測試抗體(詳見表 24 )之2 µM稀釋液，且在需要時將稀釋液與交聯劑(抗人類CH2抗體或FITC-葡聚糖(Sigma) (參見表 24 ))以1:1莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備測試抗體之連續稀釋液，且將100 µl稀釋抗體混合物添加至各別培養盤上之活化CD4+或CD8+ T細胞中。
在37℃，5% CO2 下培育T細胞72小時。如實例12.1中所描述，收集上清液，量測IL-2釋放且製備資料。表 25 展示在存在或不存在用交聯劑進行之交聯的情況下，獨立T細胞活化分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 5A 至圖 5C 分別展示CD4+或CD8+ T細胞活化分析之IL-2釋放的曲線。
在收集上清液之後，將T細胞在PBS中洗滌，且在4℃下用1/1000稀釋於PBS中的Alexa Fluor 488標記之抗人類Fc二次抗體(Jackson Immunoresearch，目錄號109-546-098)染色1小時。隨後將細胞用PBS洗滌一次且再懸浮於含1 μg/ml之DAPI (Biotium，目錄號89139-054)的100微升/孔PBS中。隨後在FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)上分析細胞。圖 6 展示經G1AA/MOR7480.1或G1AA/11D4處理之CD4+或CD8+ T細胞之488通道中的幾何平均螢光強度。表 25 ： 用靶向共表現受體之mAb2 進行的CD4+及CD8+ T細胞活化分析 NAD=未偵測到活性 ND=未測定
表 25 及圖 5B 展示，CD4+ T細胞可由交聯抗OX40對照G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420 (單獨及與G1AA/FS30-10-16組合二者)活化，而非由單劑抗CD137對照G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16活化。圖 5C 展示另一方面，CD8+ T細胞由交聯時之抗CD137對照G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16二者活化，以及由交聯抗OX40對照G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420活化，不過對單劑抗CD137對照G1AA/FS30-10-16之反應位準大於對單劑抗OX40對照二者。如在SEA分析(實例 12.2 )及人類泛T細胞活化分析(實例 13.3 )中觀測到，呈假擬mAb2 格式(FS20-22-49AA/4420)之OX40 Fcab在存在CD4+ T細胞，不存在交聯之情況下展示一些活性，且此活性在該抗體交聯時提高。如由先前結果(參見實例 12 及實例 13 )預期，OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)在不存在交聯，存在CD4+及CD8+ T細胞二者之情況下展示活性。
圖 6 展示與CD8+ T細胞相比，CD4+ T細胞表現較低位準之CD137及較高位準之OX40。G1AA/MOR7480.1與CD137之結合為CD137表現之量度，且G1AA/11D4與OX40之結合為OX40表現之量度。
遵循如上文所描述之相同方案，但在自不同PBMC供體分離之T細胞以及添加抗CD137抗體G1AA/20H4.9 (參見表 24 )之情況下重複用分離CD4+及CD8+ T細胞進行之此T細胞分析。與在圖 5 A至圖 5D 中所展示之結果一致，圖 5E 及圖 5F 展示CD8+ T細胞對CD137促效作用反應較多，且CD4+ T細胞對OX40促效作用反應較多。抗OX40抗體(G1AA/11D4及呈假擬mAb2 格式FS20-22-49AA/4420之抗OX40 Fcab)在交聯時活化CD4+ T細胞而非CD8+ T細胞，且CD137抗體(G1AA/20H4.9及G1AA/FS30-10-16)在交聯時活化CD8+ T細胞而非CD4+ T細胞。G1AA/20H4.9抗體在不存在交聯抗體之情況下亦活化CD8+ T細胞，類似於在實例 7.1 中所描述之DO11.10-hCD137細胞分析中所獲得的結果。在此重複實驗中，G1AA/MOR7480.1抗體在交聯時不活化CD8+ T細胞。一些PBMC供體可比其他供體對CD137共刺激更敏感，且此實驗中所獲得之不同結果可為此天然變化之結果。
此等資料表明，與CD8+ T細胞相比，CD4+ T細胞對經由OX40促效作用之活化更敏感，且相反地，與CD4+ T細胞相比，CD8+ T細胞對經由CD137促效作用之活化更敏感。此與CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上OX40及CD137受體之表現位準的報導差異相關，前者表現高於CD137受體位準之OX40位準，且後者表現高於OX40受體位準之CD137位準。交聯抗CD137對照抗體G1AA/FS30-10-16 (其Fab臂存在於OX40/CD137 mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16中)在存在CD8+ T細胞之情況下的活性，展現mAb2 在藉由其Fcab與OX40結合而交聯時具有活化CD137受體的能力。此外，呈假擬mAb2 格式(FS20-22-49AA/4420)之交聯抗OX40 Fcab (其亦存在於OX40/CD137 mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16中)在存在CD4+ T細胞之情況下的活性，展示mAb2 在藉由其Fab臂與CD137結合而交聯時具有活化OX40受體的能力。可由此推斷FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 具有藉由經由對OX40之促效作用活化CD4+ T細胞，且藉由經由對CD137及較低程度OX40之促效作用活化CD8+ T細胞，以雙重促效劑形式起作用的潛力。OX40由mAb2 引起之活化經其Fcab產生，且在經其Fab臂結合至CD137時mAb2 之交聯而提高，而CD137之活化經由其Fab臂與CD137之結合，及在經其Fcab結合至OX40時mAb2 之交聯產生。 實例15-小鼠OX40/CD137 mAb2 及抗小鼠CD137抗體在T細胞活化分析中之活性
由於抗人類OX40/CD137 mAb2 不結合至小鼠蛋白，因此為了測試OX40/CD137 mAb2 違禁T細胞介導之抗腫瘤反應的潛力，製得靶向小鼠OX40及小鼠CD137之平行試劑(參見實例 8.2 )。 15.1        小鼠OX40/CD137 mAb2 在泛T細胞活化分析中之活性
為了測試靶向此等二種共表現受體之小鼠OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)是否可誘導由預活化T細胞產生發炎性細胞介素，建立小鼠T細胞活化分析。抗體G1/4420 (抗FITC)、G1AA/OX86 (抗mOX40)、G1AA/Lob12.30 (抗mCD137)、G1AA/OX86與G1AA/Lob12.3之組合及FS20m-232-91AA/4420 (mOX40/FITC假擬mAb2 )用作對照(詳見表 26 )，且IL-2產生用作T細胞刺激之量度。表 26 ：所測試之抗體及mAb2 的細節
為分離T細胞，自4至8週齡雌性Balb/C小鼠(Charles River)收集脾臟。將小鼠人道地安樂死且藉由剝離分離脾臟。藉由使用5 ml塑膠注射器之內部將脾臟推動通過70 µm細胞過濾器(Corning)分離脾細胞。將細胞過濾器用1 ml杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's phosphate-buffered saline；DPBS) (Gibco)洗滌10次，且在50 ml管中收集溶析液。經由添加10 ml紅細胞溶解緩衝液(eBioscience)，根據製造商說明書，溶解溶析液中存在的紅細胞。使用泛T細胞分離套組II (小鼠) (Miltenyi Biotec Ltd)，根據製造商說明書，自存在於溶析液中之脾細胞分離T細胞，且隨後活化T細胞且用於與實例 13.1 中所描述之人類T細胞活化分析基本相同的方案中，但替代地，對於T細胞活化使用小鼠T活化子CD3/CD28戴諾珠粒(Life Technologies)，對於培養盤塗佈使用抗小鼠CD3抗體(Biolegend純系145-2C11)，且對於IL-2釋放之量測使用小鼠IL-2 ELISA套組(eBioscience或R&D systems)。
表 27 展示在存在所測試之mAb2 及mAb之情況下，在T細胞活化分析中觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 7A 及圖 7B 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。表 27 ： 用靶向共表現受體之mAb2 進行的T細胞活化分析 NAD=未偵測到活性
表 27 及圖 7B 展示，在OX40受體經靶向且抗OX40抗體經交聯時，存在T細胞活化的增加。如所預期，在交聯或非交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下，或在非交聯抗OX40抗體(單獨或與G1AA/Lob12.3組合之G1AA/OX86)之情況下，未觀測到T細胞活化。在OX40受體由抗OX40抗體G1AA/OX86在存在交聯劑之情況下靶向時，由T細胞產生IL-2 (對於單獨的G1AA/OX86，EC50 為2.41 nM；且在與G1AA/Lob12.3組合時，EC50 為1.72 nM)。
呈假擬mAb2 格式(FS20m-232-91AA/4420)之靶向OX40之Fcab在不存在交聯的情況下不具有促效活性，但在藉由Fab臂與FITC-葡聚糖結合而交聯時，展示強效T細胞活化。在靶向OX40之Fcab與抗CD137 Fab (Lob12.3)配對時，mAb2 展示在不存在任何額外交聯劑之情況下的T細胞活性。此表明mAb2 藉由結合至相同細胞表面上之共表現受體而交聯。
在單獨的經交聯之靶向CD137之抗體G1AA/Lob12.3的情況下，觀測到邊際活性，且在交聯時，靶向OX40之抗體G1AA/OX86與靶向CD137之抗體G1AA/Lob12.3之組合的活性與單獨的經交聯之靶向OX40之抗體G1AA/OX86相當，表明分析對由Lob12.3引起之CD137促效作用的偵測具有低靈敏度。此與實例13.3中所描述之人類T細胞分析形成對比，在人類T細胞分析中，針對交聯抗CD137對照G2/MOR7480.1觀測到較強CD137特異性信號(IL-2釋放之最大反應)。針對抗小鼠CD137及抗人類CD137對照抗體發現之功能活性的此差異可能與該等抗體對其各別CD137目標具有不同親和性相關。此亦可反映細胞來源(人類PBMC對小鼠脾細胞)或小鼠與人類系統中目標生物學之間的細微差異。
此資料展示，FS20m-232-91AA/Lob12.3 OX40/CD137 mAb2 可在不存在任何額外交聯劑之情況下，藉由同時接合二種受體誘導T細胞活化。
由於抗人類OX40/CD137 mAb2 分子不具有小鼠交叉反應性，且在平行活體外實驗系統中抗小鼠OX40/CD137 mAb2 在功能上與人類前導相當，因此將抗小鼠分子視為推斷OX40/CD137 mAb2 活體內誘導抗腫瘤免疫之潛力的適合代替物。 15.2        抗小鼠CD137抗體在CD137 T細胞活化分析中之活性
由於在實例 15.1 之泛T細胞分析中偵測到小鼠OX40/CD137 mAb2 之抗CD137 Fab純系(Lob12.3)的活性很低或無活性，因此為理解不同抗CD137促效劑抗體之活性，使用DO11.10-mCD137細胞進行T細胞活化分析。測試抗CD137促效劑抗體G1AA/Lob12.3 (參見表 26 )及G1AA/3H3 (SEQ ID NO: 166及167)，以及作為同型陰性對照之呈IgG1格式的抗FITC抗體4420 (G1/4420；SEQ ID NO 115及116)。在存在及不存在交聯抗人類CH2抗體MK1A6 (參見實例 2.1 )之情況下，測試mAb分子。小鼠IL-2產生用作T細胞活化之量度。
如實例 6.2 中所描述，但使用DO11.10-mCD137細胞替代DO11.10-hCD137細胞進行分析。使用盤讀取器用Gen5軟體(BioTek)在450 nm下讀取培養盤。自450 nm之吸光值減去630 nm之吸光值(校正)。細胞介素濃度計算之標準曲線基於四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。相對於抗體之對數濃度，繪製小鼠IL-2 (mIL-2)之濃度，且使用GraphPad Prism中之log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。
結果展示於圖 7C 及圖 7D 中。抗CD137抗體對交聯抗體誘導活性之要求不同。觀測到G1AA/Lob12.3需要添加交聯抗體以獲得活性，亦即對其活性具有交聯依賴性，而G1AA/3H3在存在及不存在交聯抗體之情況下展示活性，且因此具有非交聯依賴性活性。 實例16-OX40/CD137 mAb2 之活性所需的OX40及CD137雙重接合 16.1        人類OX40/CD137 mAb2
靶向OX40/CD137之mAb2 在不存在額外交聯劑之情況下，在SEA (實例 12 )、人類泛T細胞(實例 13 )及人類CD4+及CD8+ T細胞(實例 14 )分析中展示活性，在該等分析中T細胞共表現OX40及CD137。為了測試此活性是否需要OX40/CD137 mAb2 同時結合至二種受體，進行T細胞競爭分析，以評定mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16在存在100倍過量之靶向OX40之FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 、抗CD137 mAb G1AA/FS30-10-16、FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 外加G1AA/FS30-10-16 mAb之組合，或同型對照mAb G1/4420之情況下，活化經分離T細胞之能力。IL-2產生用作T細胞活化之量度。
如實例 13 中所描述分離T細胞。如實例 13 中所描述，隨後活化經分離T細胞且用抗CD3抗體塗佈培養盤。將活化T細胞以2 nM OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)補充且在100 µl中以2×105 個細胞/孔添加至培養盤中。OX40/CD137 mAb2 之最終濃度因此為1 nM。
在DPBS (Gibco)中製備各測試抗體之2 µM稀釋液，且將稀釋液進一步1:10稀釋於T細胞培養基中(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液，且將100 µl各稀釋抗體添加至培養盤上之活化T細胞中。
如實例 13 中所描述，培育T細胞，收集上清液且量測IL-2釋放。細胞介素濃度計算之標準曲線基於四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。使用GraphPad Prism套裝軟體，使用單因子變異數分析檢定及鄧尼特多重比較檢定進行統計分析。
圖 8 展示競爭分析之IL-2釋放。相比於在mAb2 能夠在不存在抗OX40及抗CD137抗體之情況下結合至二種受體時，mAb2 之活性在對於與OX40結合被FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 競爭超過，且在對於與CD137結合被G1AA/FS30-10-16 mAb競爭超過時極大地降低。靶向OX40之假擬mAb2 FS20-22-49AA/4420與抗CD137 mAb G1AA/FS30-10-16之組合進一步降低OX40/CD137 mAb2 之活性。此等結果表明，為了使mAb2 經由OX40及CD137之聚集及促效作用誘導T細胞活化，mAb2 與二種受體之雙重結合係必需的。 16.2        小鼠OX40/CD137 mAb2
靶向小鼠OX40/CD137之mAb2 在不存在額外交聯劑之情況下在T細胞分析中展示活性，在該分析中T細胞共表現二種受體。為了測試此活性是否需要OX40/CD137 mAb2 同時結合至二種受體，進行競爭分析，以評定FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 在存在100倍過量之靶向OX40之假擬mAb2 FS20m-232-91AA/4420、抗CD137 mAb G1/Lob12.3或陰性對照mAb G1AA/4420 (FITC)之情況下，活化經分離T細胞之能力。如實例 15.1 中所描述分離T細胞。如實例 13.1 (人類泛T細胞活化分析)中所描述，隨後活化經分離T細胞且用抗CD3抗體塗佈培養盤，但替代地，對於T細胞活化使用小鼠T活化子CD3/CD28戴諾珠粒(Life Technologies)，且對於培養盤塗佈使用抗小鼠CD3抗體(Biolegend純系145-2C11)。將活化T細胞以2 nM OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)補充且以2×105 個細胞/孔添加至培養盤中。
在DPBS (Gibco)中製備各測試抗體之2 µM稀釋液，且將稀釋液進一步1:10稀釋於T細胞培養基中(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液，且將100 µl各稀釋抗體添加至培養盤上之活化T細胞中。
如實例 12.1 中所描述，培育T細胞，收集上清液且量測IL-2釋放，但替代地，對於IL-2釋放之量測使用小鼠IL-2 ELISA套組(eBioscience或R&D systems)。細胞介素濃度計算之標準曲線基於四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。使用GraphPad Prism套裝軟體，使用單因子變異數分析檢定及鄧尼特多重比較檢定進行統計分析。圖 9 展示競爭分析之IL-2釋放的代表性曲線。
圖 9 展示，在過量引入競爭OX40或CD137結合之抗體時，由OX40/CD137 mAb2 誘導之IL-2產生的量存在減少。所使用之競爭抗體為mAb2 組成部分(呈假擬(4420) mAb2 格式之Fcab，及不具有Fcab之Fab)，以便確保靶向相同抗原決定基。添加此等競爭抗體降低由OX40/CD137 mAb2 誘導之IL-2釋放的量，表明此分子對其活性需要雙重結合。此展示OX40/CD137 mAb2 活性依賴於同時接合OX40及CD137二者，藉此聚集二種受體且對其產生促效作用。 實例17-OX40/CD137 mAb2 在CT26同基因型腫瘤模型中之活性 17.1        具有或不具有LALA突變之OX40/CD137 mAb2 之抗腫瘤活性的比較
使用CT26 Balb/c同基因型小鼠結腸直腸腫瘤模型，以活體內測試抗小鼠OX40/CD137 mAb2 之抗腫瘤活性。先前已展示CT26腫瘤模型對OX40促效劑抗體及CD137促效劑抗體二者敏感(Sadun等人, 2008)，且預期自CT26腫瘤分離之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)表現OX40及CD137二者。所測試之抗體詳述於表 28 中。表 28 ：所測試之抗體及mAb2 的細節
將具有或不具有LALA突變之mAb2 (分別FS20m-232-91AA/Lob12.3及FS20m-232-91/Lob12.3)抑制腫瘤生長之能力與同型對照mAb G1/4420 (抗FITC)、單劑mAb G1/OX86 (不具有LALA突變之抗OX40對照)或G1/Lob12.3 (不具有LALA突變之抗CD137對照)、G1/OX86外加G1/Lob12.3之組合，或G1AA/OX86 (具有LALA突變之抗OX40 mAb)外加G1AA/Lob12.3 (具有LALA突變之抗CD137 mAb)之組合進行比較。
在研究起始之前，使各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)適應一週。將所有動物植入微晶片(micro-chipped)且給定唯一識別符。各群組具有12隻小鼠。CT26結腸癌細胞株(ATCC，CRL-2638)經擴增、儲備，且隨後針對病原體由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I方案預篩選且展示為不含病原體。將CT26細胞(大約3-5×106 )自-150℃解凍，且添加至T175組織培養燒瓶中含10% FCS (Gibco，10270-106)之20 ml DMEM (Gibco，61965-026)中。使用異氟醚(Abbott Laboratories)麻醉小鼠，且各動物在左側腹接受1×106 個細胞皮下注射以產生腫瘤。在腫瘤細胞接種之後第10天，量測腫瘤且基於腫瘤體積將小鼠隨機分入研究群組。將此時不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除。
在注射之前24小時內，將抗體藉由SEC-HPLC譜分析且檢查雜質。將抗體在PBS中稀釋至0.1 mg/ml之最終濃度，且每小鼠腹膜內(IP)注射200 μl，對20 g小鼠給予1 mg/kg之最終劑量。在腫瘤接種之後第13、15及17天進行注射(三次劑量，每二天)。動物一週三次在麻醉下進行健康篩選，在該時間中，取得腫瘤之準確量測值。用卡尺取得腫瘤體積量測值，以確定腫瘤之最長軸及最短軸。使用下式計算腫瘤體積： L × (S2 ) / 2 (其中L=最長軸；S=最短軸) 根據United Kingdom Animal (Scientific Procedures) Act及EU Directive EU86/609，當腫瘤體積到達人道終點時，在第27天停止試驗。
對於統計檢定，使用混合模型以對數標度分析腫瘤體積。將獨立模型擬合至感興趣的各處理對。模型為：
A與B分別為截距及斜率；其對各小鼠不同，且包括組之固定效應及動物之隨機效應：
T為虛擬變數，其在一組中以值0表示處理組且在另一組中以值1表示處理組。隨機效應以常態分佈分佈：, 其中σA 及σB 分別為截距及斜率之動物間變化的標準差。動物間變化亦通常以標準差σ分佈：
對各處理對，將以上模型擬合至資料。對於A 1及B 1，計算與零之差值的(雙側) p值；0.05以下之p值為處理組之間的差異的統計顯著證據。
結果展示於圖 10A 中。繪製平均CT26腫瘤體積加或減標準誤差均值。結果展示，與用抗OX40對照(G1/OX86)、抗CD137對照(G1/Lob12.3)、此等二種抗體之組合(G1/OX86 + G1/Lob12.3)，或含LALA抗OX40與抗CD137抗體之組合(G1AA/OX86+ G1AA/Lob12.3)進行之處理相比，用在存在及不存在LALA突變下之OX40/CD137 mAb2 二者(分別FS20m-232-91AA/Lob12.3及FS20m-232-91/Lob12.3)進行之處理引起腫瘤生長的減少。
結果展示，相比於對照抗體(G1/4420)，存在OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3及FS20-232-91/Lob12.3)之統計顯著抗腫瘤效果。靶向OX40之抗體與靶向CD137之抗體之組合(G1/OX86外加G1/Lob12.3，或G1AA/OX86外加G1AA/Lob12.3)的活性不顯著抑制腫瘤生長，且單劑對照(G1/OX86或G1/Lob12.3)亦不顯著抑制腫瘤生長。
在結合至表現此等受體之細胞上的OX40或CD137時，預期OX40/CD137 mAb2 之人類IgG1主鏈的Fc區中LALA突變之引入阻止表現OX40或表現CD137之細胞的ADCC及ADCP，以及Fcγ受體介導之mAb2 的交聯。因此，咸信FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 之活性經由共接合OX40及CD137，引起經任一種或二種受體之信號傳遞驅動，而非經由Fc介導之效應功能或Fcγ受體介導之交聯驅動。隨後，預期此引起表現OX40及CD137之T細胞活化，最終產生T細胞介導之抗腫瘤活性。
此等結果展現，OX40/CD137 mAb2 抗體具有針對預期包含表現OX40及CD137之TIL之腫瘤的活體內抗腫瘤功效，表明由OX40/CD137 mAb2 雙特異性接合OX40及CD137介導之OX40及CD137的活體內活化有效控制腫瘤生長。
如上文背景章節中所描述，在CD137促效劑抗體之情況下，在臨床中已觀測到肝臟毒性(Segal等人, 2017)。尚未完全確定此毒性作用之機制，但臨床前模型中之研究已強調回應於CD137促效劑抗體，產生IL-27之表現CD137之骨髓細胞的作用(Bartkowiak等人, 2018)。尚未研究此肝臟毒性機制中Fcγ受體之作用，但對所觀測到之毒性的可能解釋為骨髓細胞中CD137及Fcγ受體之共表現可引起CD137促效劑抗體在此等細胞上之交聯，觸發發炎性細胞介素之產生。因此認為在本發明之OX40/CD137雙重促效劑抗體分子中包括LALA突變係期望的，以防在遠離腫瘤微環境或周邊之位置，在不存在OX40之情況下分子之Fcγ受體交聯會引起表現CD137之細胞的任何活化。因此，藉由對雙重促效劑抗體分子進行工程改造，該抗體分子藉由同時接合二種目標刺激表現OX40及CD137二者之T細胞，但歸因於分子中LALA突變之存在，在不存在OX40之情況下不經由Fcγ受體介導之交聯活化表現CD137之細胞，認為本發明之抗體分子有可能在臨床上具有降低之毒性潛力。
在本發明之抗體分子中包括LALA突變另一原因為其用以避免Fcγ受體介導之對表現OX40及CD137之細胞的殺滅，該分子意欲活化該等細胞以抑制腫瘤生長。已將OX40促效劑抗體在某些臨床前腫瘤模型中之作用機制描述為經由Fcγ受體介導之對腫瘤微環境中Treg之耗乏，且在此等分子中引入Fcγ受體功能失能突變已減弱其抗腫瘤活性(Bulliard等人, 2014)。儘管LALA突變之影響可為保藏意欲由本發明之抗體分子活化的有益免疫細胞，伴有缺少對Treg細胞之耗乏，但應注意，設計成誘發如臨床前腫瘤模型中所見之腫瘤Treg耗乏之相同機制的靶向OX40之人類IgG1抗體未展示控制腫瘤生長之相同能力(Glisson等人, 2016)。設計成耗乏Treg之其他分子亦未展示高位準臨床活性(Powell等人, 2007; Tran等人, 2017)。此種見於同基因型小鼠腫瘤模型中之Treg耗乏之影響缺少臨床可譯性可歸因於腫瘤微環境中表現Fcγ受體之細胞的較低位準(Milas等人, 1987)、人類與小鼠之間Treg生物學的差異(Liu等人, 2016)，或其他未知因素(Stewart等人, 2014)。
出人意料地，在FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 中包括LALA突變不減弱其在CT26模型中之抗腫瘤活性，表明其具有非Fcγ受體依賴性作用機制，該作用機制不依賴於與表現Fcγ受體之細胞的相互作用。在實例 19 中所描述之「作用機制」研究中，缺少腫瘤Treg之可觀測耗乏及由此含LALA突變之mAb2 在血液中誘導之強烈T細胞增殖提供對如本文所描述之OX40/CD137雙重促效劑mAb2 之非Fcγ受體依賴性作用機制的進一步支持。考慮到在對於活性依賴於Fcγ受體相互作用之抗體之情況下發現的不良臨床活性，預期本發明之抗體分子之非Fcγ受體依賴性作用機制在臨床上產生更大功效。 17.2        OX40/CD137 mAb2 與其組分Fcab及Fab部分之抗腫瘤活性的比較
在小鼠泛T細胞活化分析(實例 15 )中，小鼠OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)藉由同時接合CD137及OX40受體二者，在不存在額外交聯劑之情況下展示活體外活性，與單特異性對照抗體G1AA/Lob12.3 (抗mCD137 mAb)及FS20m-232-91AA/4420 (mOX40/FITC假擬mAb2 )形成對比(實例 16.2 )。自泛T細胞活化分析繼續，在CT26腫瘤模型中，將FS20m-232-91AA/Lob12.3之抗腫瘤活性與其組成部分，亦即呈單劑或組合形式之呈假擬(抗FITC) mAb2 格式(FS20m-232-91AA/4420)之FS20m-232-91AA Fcab及不具有Fcab之單特異性抗小鼠CD137 mAb (G1AA/Lob12.3)的抗腫瘤活性，或同型對照(G1AA/4420)的抗腫瘤活性進行比較。
按照如實例 17.1 中所描述之相同方法，在BALB/c雌性小鼠中皮下建立CT26腫瘤。在CT26細胞接種之後第10天，將帶有腫瘤之小鼠隨機分入每組25隻小鼠之研究群組，且接受抗體處理。
將抗體在PBS中稀釋至0.3 mg/mL之最終濃度，且將200 μL體積腹膜內注射至各小鼠，對20 g小鼠給予3 mg/kg之最終劑量(60 μg各抗體之固定劑量)。每二天進行一次(Q2D)注射，持續總共三次劑量，在腫瘤接種之後第10天起始。如先前所描述藉由卡尺量測測定腫瘤體積。在細胞接種之後64天終止研究，在基於腫瘤體積及病狀，到達人道終點時，將動物自研究移出。
個別動物隨時間推移之腫瘤體積資料展示於圖 10B 中，且展示於圖 10C 中之平均結果表明，與同型對照抗體(G1AA/4420)相比，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 抑制早期CT26腫瘤生長速率(在第10天與第22天之間)。在經抗小鼠CD137 mAb、小鼠OX40/FITC假擬mAb2 或其組合處理之群組中，未觀測到明顯腫瘤生長抑制。
按照先前所描述之相同混合模型方法，對直至第22天之腫瘤體積資料之分析(細胞接種後，表 29 )展示，與同型對照相比，FS20m-232-91AA/Lob12.3引起平均腫瘤生長速率之統計顯著(p = 0.003)降低。相比而言，與同型對照相比，用抗小鼠CD137 mAb、小鼠OX40/FITC假擬mAb2 或其組合進行之處理不引起顯著不同腫瘤生長速率。使用混合模型方法，對整個研究持續時間(64天)內之腫瘤生長速率進行比較，展示與同型對照相比，所有處理組中腫瘤生長速率的統計顯著降低(分析未展示)。表 29 ：使用混合效應模型分析進行之平均CT26腫瘤生長速率的成對比較 ns=非統計顯著；TGR=腫瘤生長速率；CI=信賴區間 注意：為比較早期腫瘤生長速率，在混合效應模型中使用接種後前22天之腫瘤體積資料。對於各成對比較，涉及計算p值之組中之至少一者含有超過50%顯著非對數常態分佈腫瘤生長速率。
使用對數秩(曼特爾-考克斯)檢定，存活分析展示，與同型對照相比，FS20m-232-91AA/Lob12.3引起存活之統計顯著改善(p ≤ 0.0001) (圖 10D )。與同型對照相比，接受抗小鼠CD137 mAb、小鼠OX40/FITC假擬mAb2 或其組合之帶有腫瘤之小鼠未展示存活的統計顯著差異。
總之，結果展現，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 與其組分Fcab及Fab部分之組合，或單獨的組成部分相比，具有更大且非等效抗腫瘤活性。 實例18-OX40/CD137 mAb2 在CT26同基因型腫瘤模型中之藥力學反應 18.1        OX40/CD137 mAb2 及抗OX40及抗CD137對照mAb之藥力學反應的比較
在帶有CT26同基因型腫瘤之小鼠中評定OX40/CD137替代mAb2 之藥力學反應。為此目的，歷經一段時間過程，自經FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 、同型對照(G1/4420)、單劑抗小鼠OX40對照(G1/OX86)、單劑抗小鼠CD137對照(G1/Lob12.3)或此等抗OX40與抗CD137對照之組合(G1/OX86外加G1/Lob12.3)接種之帶有CT26之小鼠獲得血液樣品，且將血液樣品藉由流式細胞量測術針對T細胞活化及增殖標記物進行分析。
按照如實例 17 中所描述之相同方案，使各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)對研究起始進行準備，且用CT26結腸癌細胞株(ATCC，CRL-2638)接種。在腫瘤細胞接種之後第10天，量測腫瘤且基於腫瘤體積將小鼠隨機分入每組10隻小鼠的研究群組。將此時不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除。
如先前所描述分析抗體，且檢查抗體之雜質，在PBS中稀釋至0.1 mg/ml之最終濃度，且每小鼠注射200 μl，對20 g小鼠給予1 mg/kg之最終劑量。藉由在腫瘤接種之後第10、12及14天腹膜內(IP)注射，向小鼠投與抗體。
在第10天給藥之前1小時、在第11天(第一劑量後24小時)、在第15天(第三劑量後24小時)自尾部靜脈，且在第17天及第24天藉由心臟穿刺將血液收集至含EDTA之管中。根據製造商說明書，將未凝固血液之紅細胞在紅細胞溶解緩衝液(eBioscience目錄號00-4300-54)中溶解二次。對於流式細胞量測術，在存在Fc阻斷劑(eBioscience目錄號14-0161-86，在1:100下)之情況下，使用染色劑1 (CD4-E450 (純系GK1.5)、Ki67-FITC (純系SolA15)、Foxp3-PE (純系FJK-16s)、CD69-PECy5 (純系H1.2F3)、CD3-PECy7 (純系145-2C11)、CD8-APC (純系53-6.7)、可固定生存力染料780，均由eBioscience供應；及CD45-V500 (純系30-F11)，由BD Bioscience供應)或染色劑2 (CD49b-E450 (純系DX5)、F4/80-PE (純系6F12)、CD69-PECy5 (純系H1.2F3)、CD19-PECy7 (純系1D3)、CD3-APC (純系145-2C11)及可固定生存力染料780，均由eBioscience供應；CD45-V500 (純系30-F11)，由BD Bioscience供應；及抗-hFc-488 (多株)，由Jackson ImmunoResearch供應)對細胞進行染色。隨後將細胞用PBS洗滌一次，且將經染色劑2染色之樣品再懸浮於200 µl PBS中且在FACS Canto II上運作。對於經染色劑1染色之樣品，將細胞最初用100 µl抗體混合物1 (除Ki67及FoxP3抗體之外之全部)在4℃下染色30分鐘。隨後將細胞用eBioscience Foxp3染色套組(eBioscience目錄號00-5523-00)根據製造商說明書固定且滲透。簡言之，將200 µl固定溶液添加至各孔，且在4℃下在暗處靜置隔夜。隨後在200 µl滲透緩衝液中洗滌細胞。隨後將細胞再自旋，且在存在Fc阻斷劑之情況下再懸浮於含Ki67及Foxp3抗體(均以1:100稀釋)之100 µl滲透緩衝液中，且在4℃下在暗處培育30分鐘。隨後將細胞用滲透緩衝液洗滌一次且再懸浮於200 µl PBS中。隨後在BD FACS CantoII細胞計數器中分析細胞。用FlowJoX、Excell及GraphPad Prism分析資料。測定針對總T細胞，以及CD4+及CD8+亞群隨時間推移觀測到之T細胞活化及增殖。
此實驗展示，OX40/CD137 mAb2 對循環T細胞具有影響，與所有經對照處理之組相比，提高活化T細胞(CD45+ CD3+ CD69+)及CD4+ T細胞(CD45+ CD3+ CD4+ CD69+)及增殖T細胞(CD45+ CD3+ Ki67+)、CD4+ T細胞(CD45+ CD3+ CD4+ Ki67+)及CD8+ T細胞(CD45+ CD3+ CD8+ Ki67+)之頻率，且與用單獨的抗OX40對照或抗CD137對照，或同型對照進行之處理相比，亦提供活化CD8+ T細胞(CD45+ CD3+ CD8+ CD69+)之頻率。針對經抗OX40與抗CD137對照mAb之組合處理的對照組，觀測到活化CD8+ T細胞(CD45+ CD3+ CD8+ CD69+)之頻率的類似提高。此等結果與所觀測到之活體外結果一致，在活體外結果中，OX40/CD137 mAb2 亦展示如藉由IL-2產生所量測之T細胞活化的增加，亦已知IL-2為T細胞增殖中所涉及之細胞介素。 18.2        OX40/CD137 mAb2 與其組分Fcab及Fab部分之藥力學反應的比較
在CT26腫瘤模型中，將小鼠OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)之周邊藥力學反應與其組成部分，具體而言呈單劑或組合形式之呈假擬(4420) mAb2 格式(FS20m-232-91AA/4420)之FS20m-232-91AA Fcab及不具有Fcab之單特異性抗小鼠CD137 mAb (G1AA/Lob12.3)的周邊藥力學反應，或同型對照(G1AA/4420)的周邊藥力學反應進行比較。
在實例 17.2 中所描述之相同研究中，在CT26細胞接種之後第16天，自每組10隻小鼠之尾部靜脈獲得血液樣品且將血液樣品收集於含EDTA之管中。按照實例 18.1 中所描述之相同方法，溶解紅細胞，且隨後在存在Fc阻斷劑之情況下，用生存力染料對剩餘細胞進行染色，接著用除抗Ki67及抗Foxp3抗體以外，實例 22.2.2 中所列之反應劑(例外之處為對於此研究，使用抗小鼠CD4純系GK1.5 (BD Bioscience，目錄號563790)替代抗CD4純系RM4-5)進行表面染色。隨後將細胞用eBioscience Foxp3染色套組(eBioscience)根據製造商說明書固定且滲透隔夜。隨後將細胞用抗Ki67及抗Foxp3抗體胞內染色。在洗滌之後，隨後使用BD Fortessa流式細胞儀分析細胞。使用FlowJo、Excel及GraphPad Prism 7軟體進行資料分析。
與同型對照處理相比，觀測到FS20m-232-91AA/Lob12.3顯著提高血液中Ki67+ CD4+ 效應子之比例(按總CD4+ Foxp3- 細胞之%計)，及Ki67+ CD8+ 周邊T細胞之比例(按總CD8+ 細胞之%計)。呈單劑或組合形式之抗小鼠CD137 mAb及FS20m-232-91AA/4420假擬mAb2 ，亦能夠誘導增殖Ki67+ CD4+ 效應子及Ki67+ CD8+ T細胞之位準相對於經同型對照處理之小鼠的顯著提高。然而，在用FS20m-232-91AA/Lob12.3給藥之後，Ki67+ CD8+ 增殖T細胞之位準提高顯著大於針對單獨的抗小鼠CD137 mAb、單獨的FS20m-232-91AA/4420假擬mAb2 或其組合所觀測到的彼等提高。
總之，此等研究結果證明，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 與其組分Fcab及Fab部分之組合，或單獨的組成部分相比，能夠就Ki67+ CD8+ 增殖T細胞之頻率提高而言，誘導增強之周邊藥力學反應。 實例19-OX40/CD137 mAb2 在CT26同基因型腫瘤模型中之作用機制
使用CT26同基因型腫瘤模型以活體內確定抗小鼠OX40/CD137 mAb2 之抗腫瘤活性的作用機制(MOA)。先前已展示CT26同基因型腫瘤模型對OX40促效劑抗體及CD137促效劑抗體二者敏感(Sadun等人, 2008)，且預期自CT26腫瘤分離之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)表現OX40及CD137二者。所測試之抗體詳述於表 30 中。表 30 .所測試之抗體及mAb2 的細節
將具有或不具有LALA突變之mAb2 (分別FS20m-232-91AA/Lob12.3及FS20m-232-91/Lob12.3)活化血液及腫瘤中之T細胞且誘導該等T細胞增殖的能力與同型對照mAb G1/4420 (抗FITC)、單劑mAb G1/OX86 (不具有LALA突變之抗OX40對照)或G1/Lob12.3 (不具有LALA突變之抗CD137對照)、G1/OX86外加G1/Lob12.3之組合，或G1AA/OX86 (具有LALA突變之抗OX40 mAb)外加G1AA/Lob12.3 (具有LALA突變之抗CD137 mAb)之組合進行比較。
在研究起始之前，使各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)休息一週。將所有動物植入微晶片且給定唯一識別符。各群組具有5隻小鼠。CT26結腸癌細胞株(ATCC，CRL-2638)經初始擴增、儲存，且隨後針對病原體由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I方案預篩選且展示為不含病原體。將CT26細胞(大約3-5×106 )自-150℃解凍，且添加至T175組織培養燒瓶中含10% FCS (Gibco，10270-106)之20 ml DMEM (Gibco，61965-026)中。使用異氟醚(Abbott Laboratories)麻醉小鼠，且各動物在左側腹接受1×106 個細胞皮下注射。在腫瘤細胞接種之後第10天，監測小鼠之健康，使用卡尺來量測腫瘤且基於腫瘤體積將小鼠隨機分入研究群組。將此時不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除。
在注射之24小時內，將注射抗體藉由SEC-HPLC譜分析且檢查雜質。將抗體在PBS中稀釋至0.1 mg/ml之最終濃度，且每小鼠注射200 μl，對20 g小鼠給予1 mg/kg之最終劑量。藉由在腫瘤接種之後第10、12及14天腹膜內(IP)注射，向小鼠投與抗體。每週三次用卡尺取得腫瘤體積量測值，以確定腫瘤之最長軸及最短軸。在第三劑量之後七天(腫瘤接種後第21天)將小鼠安樂死，藉由剝離分離腫瘤且藉由心臟穿刺收集血液。
使用腫瘤解離套組，小鼠(Miltenyi 130-096-730)，根據製造商說明書，解離腫瘤。簡言之，藉由每腫瘤添加2.35 ml RPMI 1640、100 µl酶D、50 µl酶R及12.5 µl酶A來製備酶混合物，且將各腫瘤置於輕緩MACS C管中，且將管置放於Gentle MACS解離器上且在m_TDK_1程式上運作，且隨後在37℃下伴隨振搖(200 rpm)培育1小時。將所得細胞懸浮液使用70 µM細胞過濾器(Corning目錄號352350)瀝濾，離心(在1500 rpm下10分鐘)，在PBS中洗滌一次且再懸浮於5 ml PBS中。
藉由心臟穿刺將血液收集至含EDTA之管中。根據製造商說明書，將未凝固血液之紅細胞在紅細胞溶解緩衝液(eBioscience目錄號00-4300-54)中溶解二次。
將自腫瘤及血液分離之細胞針對流式細胞量測術使用以下抗體組及試劑(染色劑1)染色：CD4-E450 (純系GK1.1)、Ki67-FITC (純系SolA15)、Foxp3-PE (FJK-16s)、CD69-PECy5 (純系H1.2F3)、CD3-PECy7 (純系145-2C11)、CD8-APC (純系53-6.7)、可固定生存力染料780及Fc阻斷劑(純系93)，均由eBioscience供應；及CD45-V500 (純系30-F11)，由BD Bioscience供應。將細胞在PBS中洗滌，且隨後在4℃下與100 µl抗體混合物1 (除Ki67及FoxP3抗體之外之全部)一起培育30分鐘。隨後將細胞用PBS洗滌，且隨後用eBioscience Foxp3染色套組(eBioscience目錄號00-5523-00)根據製造商說明書固定且滲透。簡言之，將200 µl固定溶液添加至各孔，且在4℃下在暗處靜置隔夜。隨後在200 µl滲透緩衝液中洗滌細胞。隨後將細胞再自旋，且在存在Fc阻斷劑之情況下再懸浮於含Ki67及Foxp3抗體(均以1:100稀釋)之100 µl滲透緩衝液中，且在4℃下在暗處培育30分鐘。隨後將細胞用滲透緩衝液洗滌一次且再懸浮於200 µl PBS中。隨後在BD FACS CantoII細胞計數器中分析細胞。
用FlowJoX、Excell及GraphPad Prism分析資料。使用GraphPad Prism套裝軟體，對每一對使用單因子變異數分析，接著使用杜凱氏多重比較檢定，進行比較各組的統計分析。
在經OX40/CD137 mAb2 或對照處理後，測定經CT26細胞接種之小鼠血液或腫瘤中T細胞(CD45+CD3+)、增殖T細胞(CD45+ CD3+ Ki67+)及T調節細胞(CD45+ CD3+ CD4+ FoxP3+)的頻率。相比於同型對照(G1/4420)，FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 展示血液中增殖T細胞之統計顯著增加，以及Treg的增加。在腫瘤中，存在FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 提高T細胞頻率之趨勢。
相比於用同型對照進行之處理，在經抗CD137抗體G1/Lob12.3及此抗CD137抗體與抗OX40抗體G1/OX86之組合處理的小鼠中，存在腫瘤中Treg之位準的統計顯著降低。然而，當將LALA突變引入至抗OX40及抗CD137抗體中時，用此等抗體之組合(G1AA/OX86外加G1AA/Lob12.3)進行之處理不再降低腫瘤中Treg的位準。含有LALA突變之OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)不降低Treg之位準，但不具有LALA突變之OX40/CD137 mAb2 的野生型人類IgG1形式(FS20m-232-91/Lob12.3)確實展示腫瘤中Treg之位準的統計顯著降低。
此等資料展現，將LALA突變引入至人類IgG1消除OX40/CD137 mAb2 耗乏Treg之能力，且因此，在OX40/CD137 mAb2 之人類IgG1 LALA變異體(FS20m-232-91AA/Lob12.3)之情況下所觀測到的抗腫瘤活性不依賴於Treg耗乏。此外，觀測到FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 在評定時間點誘導周邊T細胞增殖，預期該T細胞增殖擴增T細胞庫，誘發抗腫瘤免疫反應。此等資料表明，人類IgG1含LALA OX40/CD137 mAb2 在不存在該mAb2 與Fcγ受體接合之情況下，在癌症具有抗腫瘤活性之潛力，Fcγ受體可或可不在腫瘤中普遍。 實例20-抗小鼠OX40/CD137 mAb2 在B16-F10同基因型腫瘤模型中之活性
使用B16-F10同基因型腫瘤模型，以活體內測試抗小鼠OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)之抗腫瘤活性。抗體G1/4420在研究中用作對照。此前尚未展示B16-F10同基因型腫瘤模型對OX40或CD137促效劑抗體敏感(Hirschhorn-Cymerman等人, 2009; Wilcox等人, 2002)。然而，預期自B16-F10腫瘤分離之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)表現OX40及CD137二者。
在研究起始之前，使各8至10週齡且重量大約20 g之C57BL/6雌性小鼠(Charles River)適應一週。將所有動物植入微晶片且給定唯一識別符。各群組具有10隻小鼠。B16-F10結腸癌細胞株(ATCC目錄號CRL-6475)經初始擴增、儲存，且隨後針對病原體由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I方案預篩選且展示為不含病原體。
將B16-F10細胞自-150℃儲存解凍，且添加至T175組織培養燒瓶中含10% FCS (Gibco，10270-106)之20 ml DMEM (Gibco，61965-026)中。各動物在左側腹接受1×106 個細胞皮下注射。在腫瘤細胞接種之後7至8天，將此時不具有腫瘤之小鼠自研究移除。如先前所描述分析抗體，且檢查抗體之雜質，隨後以於PBS中0.1 mg/ml之最終濃度，以每小鼠200 μl之體積注射，以對20 g小鼠給予1 mg/kg之最終劑量。在腫瘤接種之後第8、10及12天，各小鼠藉由腹膜內(IP)注射接受抗體。藉由使用卡尺量測測定腫瘤體積(如實例 17 中所描述)，且進行所討論之當天應有的任何藥物給與。
基於腫瘤體積及病狀，在到達人道終點時處死小鼠。使用實例 17 中所描述之混合模型統計分析，對腫瘤生長進行統計分析。研究之結果展示於圖 11 中。
相比於經對照抗體(G1/4420)注射之對照動物，OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)展示顯著抗腫瘤活性。此係出人意料的，因為先前已展示此模型對OX40或CD137刺激不敏感(Hirschhorn-Cymerman等人, 2009; Wilcox等人, 2002)。重要的是，針對OX40/CD137 mAb2 所觀測到之活性係在存在LALA突變之情況下，且因此不依賴於腫瘤Treg耗乏。此表明OX40/CD137 mAb2 之MOA在多種同基因型腫瘤模型，甚至具有較低位準免疫浸潤之模型(諸如B16-F10)中引起抗腫瘤活性。 實例21-OX40/CD137 mAb2 之分析表徵及初步穩定性評定 21.1        mAb2 之表現、純化及分析表徵
以實驗室規模產生mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及FS20-22-49AA/FS30-35-14，且藉由標準分析方法使用SE-HPLC及SDS-PAGE表徵。
在HEK293-6E (National Research Council Canada)中短暫表現編碼mAb2 之DNA序列。在5天之後，收集細胞培養液，且在MabSelect蛋白A預裝填管柱上使用AKTAxpress儀器(均GE Healthcare)純化。在50 mM Tris-HCl、250 mM NaCl pH 7.0中進行管柱之平衡，接著用所收集之細胞培養液負載。樹脂隨後經歷使用pH 7.0下50 mM Tris-HCl，250 mM NaCl洗滌，且此之後為使用3.5之pH下的緩衝液溶析mAb2 。將mAb2 使用PD-10去鹽管柱(GE Healthcare，產品號17085101)緩衝交換至預調配緩衝液中。
在裝備有TSK-GEL SUPERSW3000 4.6 mm ID×30.0 cm管柱(Tosoh Bioscience)之Agilent 1100系列HPLC系統(Agilent)上，使用20 mM磷酸鈉、200 mM氯化鈉pH 6.8作為移動相進行SE-HPLC。使用Chemstation軟體(Agilent)進行單體百分比之定量。SE-HPLC分析之結果概述於表 31 中。表 31 .藉由SE-HPLC進行之分析表徵
使用NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris蛋白凝膠及1×MOPS分離緩衝液(Thermo Fisher Scientific)，基本上遵循製造商說明書進行SDS-PAGE分析。對於非還原SDS-PAGE，在變性步驟之前將樣品暴露於烷基化試劑N-乙基順丁烯二醯亞胺(Sigma-Aldrich)，且自變性混合物省略2-巰基乙醇。由Coomassie InstantBlue (Expedeon)使蛋白條帶可視化。
所有五種mAb2 在蛋白A純化之後展示有利分析表徵參數，其中在藉由SE-HPLC測定時單體純度高於95%。SDS-PAGE分析展現重組IgG1典型之蛋白條帶圖案。因此，在非還原條件下，單一條帶遷移至對應於預期分子量之區，且在還原條件下，二個條帶遷移接近分別對應於重鏈及輕鏈之51 kDa及28 kDa分子量標記物。未觀測到片段產生(資料未展示)。 21.2        OX40/CD137 mAb2 之初步穩定性評定
進行mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及FS20-22-49AA/FS30-35-14之穩定性的初步評定。在進入初步穩定性評定之前，藉由尺寸排阻層析法(SEC)，使用經預調配緩衝液平衡之HiLoad 26/600 200 pg管柱(GE Healthcare)進一步純化mAb2 。將穩定性樣品儲存在5℃下，且在2週及4週之後藉由標準分析方法使用SE-HPLC及毛細管電泳十二基硫酸鈉(CE-SDS)分析。
在裝備有TSK-GEL SUPERSW3000 4.6 mm ID×30.0 cm管柱(Tosoh Bioscience)之Agilent 1100系列HPLC系統(Agilent)上，使用20 mM磷酸鈉、200 mM氯化鈉pH 6.8作為移動相進行SE-HPLC。使用Chemstation軟體(Agilent)進行資料採集及單體含量之定量。結果概述於表 32 中。
在5℃下儲存4週之後，對於所測試之所有mAb2 ，如藉由SE-HPLC所測定單體含量保持與起始物質(T=0)相當(± 0.9%內)。因此，所測試之所有mAb2 顯示有利穩定性概況。表 32 ：藉由SE-HPLC進行之穩定性分析
在2100生物分析儀毛細管電泳系統(Agilent)上遵循製造商建議進行CE-SDS分析。對於還原CE-SDS，添加DTT且將樣品在70℃下變性5分鐘。使用2100 Expert軟體(Agilent)，進行資料採集及重鏈及輕鏈物質之百分比定量。按重鏈物質之百分比及輕鏈物質之百分比的總和計算百分比純度。分析結果概述於表 33 中。
如藉由CE-SDS在還原條件下按重鏈物質及輕鏈物質之百分比總和測定，所有所測試之mAb2 的純度亦保持與起始物質相當(± 1.0%內)。因此，所測試之所有mAb2 再次展示有利穩定性。表 33 .藉由CE-SDS進行之穩定性分析 實例22-OX40/CD137 mAb2 與抗PD-1或抗PD-L1抗體之組合的活性
已知抗原呈現細胞(例如樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞)、腫瘤細胞及腫瘤微環境中之細胞上的PD-L1表現經由PD-1相互作用抑制T細胞之活化、增殖及效應及細胞毒性功能。已展示使用針對PD-1或PD-L1之單株抗體阻斷此相互作用引起患有數種癌症類型之患者的存活率提高。
然而，在一些腫瘤中，抗PD-L1及抗PD-1抗體具有很小效果或沒有效果。諸位發明人已在活體外及活體內研究中測試OX40/CD137 mAb2 與抗PD-L1或抗PD-1抗體之組合，以理解與使用單獨的OX40/CD137 mAb2 、抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體相比，使用該組合是否可引起改良效果。 22.1        OX40/CD137 mAb2 與PD-1或PD-L1阻斷之組合在葡萄球菌腸毒素A (SEA)分析中之活性
如上文實例 12 中所描述，在T細胞活化分析中使用葡萄球菌腸毒素A (SEA)超級抗原作為第一信號測試OX40/CD137 mAb2 之活性。為測試OX40/CD137 mAb2 與阻斷PD-1與PD-L1之間相互作用之組合對T細胞刺激活性的影響，在SEA分析中將PD-1或PD-L1阻斷抗體與OX40/CD137 mAb2 組合。
SEA分析中所使用之抗體及mAb2 列於以下表 34 中。測試G1/4420 (anti-FITC)與FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 之組合、單獨或與FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 組合之G1AA/S1 (抗PD-L1)、G1AA/5C4 (抗PD-1)。介白素-2 (IL-2)產生用作T細胞活化之量度。表 34 ：所測試之抗體及mAb2 的細節
5C4及YW243.55.S1 (S1)抗體之可變域序列亦分別揭示於US 8,008,449 B2及US 2013/0045202 A1中。
基本上如上文實例 12.1 中所描述，分離PBMC且進行SEA分析。在分析中，使用G1/4420作為同型對照且不使用交聯劑。
將OX40/CD137 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16)與抗PD-L1 (G1AA/S1)或抗PD-1抗體(G1AA/5C4)之組合的活性與FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 外加同型對照(G1/4420)之活性，或單獨的PD-L1抗體(G1AA/S1)，或PD-1抗體(G1AA/5C4)，或同型對照(G1/4420)之活性進行比較。在SEA分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應展示於表 35 中。圖 12A 及圖 12B 展示SEA分析之IL-2釋放的曲線。表 35 ： 用靶向OX40及CD137之mAb2 與阻斷PD-1與PD-L1之間相互作用之抗體之組合進行的SEA分析 NAD=未偵測到活性
如所預期，在同型對照(G1/4420)之情況下未觀測到活性。同樣地，在此分析中，單獨阻斷PD-1與PD-L1之間相互作用不具有活性。然而，將刺激OX40及CD137受體(藉由OX40/CD137 mAb2 進行)與阻斷PD-1與之間PD-L1相互作用(藉由抗PD-L1或抗PD-1抗體進行)組合引起如藉由最大IL-2產生所量測之T細胞之最大活性的提高，超過在單獨的OX40/CD137 mAb2 之情況下所發現的提高。在OX40/CD137 mAb2 與抗PD-L1或抗PD-1抗體組合時所發現之T細胞之最大活性的提高類似。 22.2        在CT26小鼠腫瘤模型中投與抗小鼠OX40/CD137 mAb2 及PD-1拮抗劑之抗腫瘤活性及藥力學反應
使用CT26小鼠腫瘤模型，以確定FS20m-232-91AA/Lob12.3與PD-1拮抗劑抗體(純系RMP1-14小鼠IgG1)之組合與任一單劑相比的抗腫瘤活性及藥力學反應。 22.2.1     抗腫瘤活性之評估
按照如實例17中所描述之相同方案，將各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)準備用於研究起始，且經CT26結腸癌細胞株接種。在腫瘤細胞接種之後10天，量測腫瘤，將不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除，且將其餘小鼠隨機分入4個處理組(表 36 )，每組15隻動物。將動物用PBS中之以下腹膜內注射：(1) 1 mg/kg G1AA/4420與10 mg/kg mIgG1/4420同型(Absolute Antibodies，純系4420，目錄號Ab00102-1.1)對照抗體之組合，(2) 10 mg/kg 抗小鼠PD-1抗體(Absolute Antibodies，純系RMP1-14小鼠IgG1，目錄號Ab00813-1.1)，(3) 1 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 ，或(4) 10 mg/kg抗小鼠PD-1抗體及1 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 。動物每2天接受一次G1AA/4420或FS20m-232-91AA/Lob12.3腹膜內(IP)注射，持續總共3次劑量，在腫瘤接種之後第10天起始。mIgG1/4420或抗小鼠PD-1抗體每4天IP給藥一次，持續總共4次劑量，在腫瘤接種之後第10天起始。藉由卡尺量測測定腫瘤體積(如實例 17 中所描述)。在腫瘤細胞接種之後60天終止研究，在基於腫瘤體積及病狀，到達人道終點時，將動物自研究移出。處理組、所測試之分子、劑量及給藥時程概括於表 36 中。表 36. 處理組及所測試之分子的概述
如圖 13A 至圖 13D 中所展示，在研究終止時，抗PD-1拮抗劑抗體與1 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3之組合引起具有完全腫瘤消退反應(被定義為腫瘤體積≤ 62.5 mm3 )之動物的最高比例，15分之7 (47%)( 圖 13D) 。在研究結束時，同型對照抗體( 圖 13A) 、單劑抗PD-1抗體( 圖 13B) 及1 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3( 圖 13C) 分別展示0%、0%及7%腫瘤消退。
存活分析展示，與同型對照抗體相比，FS20m-232-91AA/Lob12.3與抗PD-1抗體之組合引起統計顯著存活益處(對數秩(曼特爾考克斯)檢定，p > 0.0001) (圖 13E )。未觀測到與同型對照抗體相比，任一單劑處理之間的顯著存活差異。此等結果展現，在此模型中，與單劑相比，用拮抗劑進行之PD-1/PD-L1抑制性路徑之阻斷及用抗OX40/CD137 mAb2 引起之OX40及CD137雙重促效作用能夠提高抗腫瘤活性且提供存活益處。 22.2.2     周邊藥力學反應之評估
在實例 22.2.1 中所描述之研究中，亦檢查抗PD-1拮抗劑調節對FS20m-232-91AA/Lob12.3之藥力學反應的能力，且將其與單劑處理進行比較。在給藥起始之後6天(在腫瘤細胞接種之後16天)，自處理組1、2、3及5中6隻隨機選擇之帶有CT26腫瘤之小鼠的尾部靜脈收集血液至含EDTA之管中(表 36 )。根據製造商說明書，將未凝固血液之紅細胞在紅細胞溶解緩衝液(Miltenyi Biotech，#130-094-183)中溶解二次。對於流式細胞量測分析，在存在Fc阻斷劑(eBioscience，目錄號14-0161-86，在1:50下)之情況下，將細胞在4℃下用以下染色30分鐘：CD4-BUV395 (純系RM4-5)、CD8-BUV737 (純系53-6.7)、CD44-BV510 (純系IM7)及CD3e-BV786 (純系145-2C11)均由BD Bioscience供應；CD69-FITC (純系H1.2F3)、NKp46-PE (純系29A1.4)、PD-1-APC (純系J43)、CD45-Alexa700 (純系30-F11)及可固定生存力染料780，均由eBioscience供應；及CD62L-BV421 (純系MEL-14)，由Biolegend供應。隨後將細胞用eBioscience Foxp3染色套組(eBioscience目錄號00-5523-00)根據製造商說明書固定且滲透隔夜。將細胞再懸浮於含Ki67及Foxp3抗體(Ki67-PE-Cy7 (純系SolA15)及Foxp3-PerCP-Cy5.5 (純系FJK-16s)，均由eBioscience供應)之100 μL滲透緩衝液中，且在室溫下在暗處培育30分鐘。隨後將細胞用滲透緩衝液洗滌二次且再懸浮於PBS + 0.5% BSA中。隨後在BD Fortessa流式細胞儀中分析細胞。在FlowJo、Excel及GraphPad Prism 7軟體中進行資料分析。
如上文所描述，藉由流式細胞量測術分析測定增殖Ki67+ CD4+ T細胞(在總CD45+ CD3+ CD4+中)、Ki67+ CD8+ T細胞(在總CD45+ CD3+ CD8+中)及Ki67+ NKp46+ NK細胞(在總CD45+ CD3- NKp46+中)之頻率。與同型對照相比，FS20m-232-91AA/Lob12.3誘導增殖Ki67+ CD4+及Ki67+ CD8+ T細胞之統計顯著增加，證實先前結果(實例 18 )，及增殖Ki67+NK細胞的統計顯著增加(成對比較曼-惠特尼(Mann-Whitney)非參數檢定；對所有三種免疫細胞群體p ≤ 0.005)。與同型對照相比，單劑抗PD-1拮抗劑抗體對三種免疫細胞群體不具有值得注意的影響。與單劑或同型對照相比，1 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3與抗PD-1抗體之組合引起增殖Ki67+ CD4+ T細胞、Ki67+ CD8+ T細胞及Ki67+ NKp46+ NK細胞的統計顯著較高位準(對於所有統計顯著比較，p ≤ 0.005，除與單獨的FS20m-232-91AA/Lob12.3相比，組合對增殖Ki67+ CD4+ T細胞之位準的影響以外，對於其p ≤ 0.05)。
如上文所描述，亦藉由流式細胞量測術分析測定單劑抗PD-1抗體mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3，及抗PD-1抗體與FS20m-232-91AA/Lob12.3之組合對周邊血液表現PD-1之T細胞(CD4+及CD8+ T細胞)的影響。與同型對照相比，單劑抗PD-1抗體及FS20m-232-91AA/Lob12.3提高表現PD-1之CD4+及CD8+ T細胞之比例，與單獨的抗PD-1相比，在FS20m-232-91AA/Lob12.3處理之後，PD-1+細胞之中值頻率較高。與同型對照相比，單獨的FS20m-232-91AA/Lob12.3提高PD-1+ NK細胞之頻率。與單劑或同型對照相比，組合引起表現PD-1之CD4+及CD8+ T細胞(而非NK細胞)之統計顯著較高位準(成對比較曼-惠特尼非參數檢定；對於所有統計顯著比較，p ≤ 0.005，除與單獨的FS20m-232-91AA/Lob12.3相比，組合對表現PD-1之CD4+ T細胞細胞之頻率的影響以外，對於其p ≤ 0.05)。
與來自抗腫瘤活性之評估的研究結果一致，同時發生的用拮抗劑進行之PD-1/PD-L1抑制性路徑之阻斷及用抗OX40/CD137 mAb2 引起之OX40及CD137雙重促效作用引起對增殖T細胞及NK細胞之增強的藥力學調節，其支持利用組合方式驅動抗腫瘤免疫。
總之，阻斷PD-1/PD-L1軸同時亦對OX40及CD137產生促效作用，引起與單獨阻斷PD-1/PD-L1相比之提高的效果。特定而言，抗PD-1或抗PD-L1抗體與抗OX40/CD137 mAb2 之組合在使用中引起與單獨的抗體中之一者的反應相比改良的效果。在實例 22.1 中所描述之SEA分析中，與EC50 為0.1474 nM之抗OX40/CD137 mAb2 相比，所測試之抗PD-1或PD-L1抗體均不具有任何活性。然而，在抗OX40/CD137 mAb2 與抗PD-1或抗PD-L1抗體組合測試時，EC50 值分別為0.2373 nM及0.5961 nM。此外，由任一組合產生之IL-2的最大反應大於單獨的抗OX40/CD137 mAb2 之雙倍。此活體外資料展現，在抗PD-L1或抗PD-1抗體之情況下未觀測到活性之系統中，將此等抗體中之任一者與抗OX40/CD137 mAb2 組合引起活性之顯著改良。
此活體外活性由如實例 22.2 中所描述，單獨或與抗PD-1抗體組合之抗小鼠OX40/CD137 mAb2 在CT26腫瘤模型中之活體內測試進一步支持。來自此研究之結果展示，在研究結束時，與單獨的OX40/CD137 mAb2 或抗PD-1抗體(其中沒有動物不具有腫瘤)相比，來自經抗PD-1抗體與OX40/CD137 mAb2 之組合處理之組的較大數目動物不具有腫瘤。此外，亦觀測到統計顯著存活益處(圖 13E )，且與單獨的mAb2 或抗PD-1抗體相比，藉由用組合進行之處理增強增殖T細胞及NK細胞之藥力學調節。
由於在針對抗PD-1或抗PD-L1抗體之活體外或活體內研究中未觀測到活性，但在任一者與OX40/CD137 mAb2 一起給藥時觀測到顯著改良，因此此可表明，OX40/CD137 mAb2 與此類抗體之組合將引起增強的抗腫瘤功效，以及此類組合可適於治療不具反應性之腫瘤，例如難治性或抗性腫瘤或在抗PD-1或抗PD-L1抗體單一療法之後已復發的腫瘤。 實例23-抗小鼠OX40/CD137 mAb2 在CT26同基因型腫瘤模型中之劑量依賴性抗腫瘤活性及針對用CT26腫瘤細胞再攻擊之保護性免疫記憶的建立
為在CT26同基因型小鼠結腸直腸腫瘤模型中評估OX40/CD137替代mAb2 之劑量與抗腫瘤活性之間的關係，評定0.1至10 mg/kg之五種不同劑量位準。
按照如實例 17 中所描述之相同方案，各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)經CT26結腸癌細胞皮下注射至各動物之左側腹中。在腫瘤細胞接種之後10天，量測腫瘤，且將不具有已建立之腫瘤的動物自研究移除。將其餘小鼠隨機分入六個處理組，每組25隻動物。
在注射之前，將同型對照抗體(G1AA/4420)及OX40/CD137替代mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)過濾且稀釋於PBS中。各動物腹膜內投與每次投與200 μl體積之稀釋抗體，對20 g小鼠給予每次投與10 mg/kg G1AA/4420或0.1、0.3、1、3或10 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3之最終劑量。每二天進行一次(Q2D)注射，持續總共三次劑量，在腫瘤接種之後第10天起始。如實例 17 中所描述，藉由卡尺量測測定腫瘤體積。在腫瘤細胞接種之後67天終止研究，在基於腫瘤體積及病狀，到達人道終點時，將動物自研究移出。
經不同劑量位準下之G1AA/4420或FS20m-232-91AA/Lob12.3處理之個別動物隨時間推移的腫瘤體積展示於圖 14A 中。0.3、1、3或10 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3之劑量位準分別在每組動物之4% (1/25)、4% (1/25)、8% (2/25)及4% (1/25)中引起完全腫瘤消退(被定義為在第60天≤ 62.5 mm3 )。同型對照及0.1 mg/kg替代mAb2 組中之動物中無一者經歷完全腫瘤消退。
如實例 17 中所描述，使用混合模型統計分析對經FS20m-232-91AA/Lob12.3處理之組及經G1AA/4420處理之組之間平均腫瘤生長速率進行成對比較，且在與同型對照相比時，遍及所測試之所有劑量位準(0.1、0.3、1、3及10 mg/kg)觀測到統計顯著差異(p > 0.01) (表 37 )。在以0.1至3 mg/kg給藥時，FS20m-232-91AA/Lob12.3以劑量依賴型方式降低平均腫瘤生長速率(TGR) (平均Log (TGR)分別為0.255529至0.156767)。3 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3之平均TGR不與1 mg/kg劑量位準之平均TGR具有統計差異(p = 0.18)。然而，與3 mg/kg劑量組相比，將劑量位準提高至10 mg/kg引起較快TGR (p > 0.001)。表 37 ：使用混合模型統計分析進行之平均CT26腫瘤生長速率的成對比較 縮寫：ns=非統計顯著；TGR=腫瘤生長速率 注意：對於各成對比較，涉及計算p值之組中之至少一者含有超過50%顯著非對數常態分佈腫瘤生長速率
存活分析展示，使用對數秩(曼特爾-考克斯)檢定，與同型對照相比，所測試之所有劑量位準下之FS20m-232-91AA/Lob12.3引起統計顯著存活益處(圖 14B )。1 mg/kg與3 mg/kg組之比較未展示存活的統計學差異。
總之，在圖 14A 及圖 14B 及表 37 中所展示之腫瘤體積及存活資料支持實例 17 之研究結果，亦即OX40/CD137替代mAb2 可在CT26小鼠腫瘤模型中活體內誘發抗腫瘤活性。此外，所觀測到之抗腫瘤活性自0.1 mg/kg至1 mg/kg以劑量依賴性方式提高，且在所測試之較高劑量位準(3 mg/kg及10 mg/kg)下得到維持。
為測試OX40/CD137替代mAb2 是否可誘導針對CT26腫瘤細胞之保護性免疫記憶，將來自上文所描述之本發明實例之劑量範圍研究的已經歷完全腫瘤消退的動物(完全反應者)，在第一細胞接種之後第84天用1×105 個CT26細胞再次皮下接種。亦將未經處理不帶腫瘤之BALB/c小鼠用CT26細胞接種作為對照組。如上文所描述監測腫瘤體積。在第一細胞接種之後第137天終止研究，在基於腫瘤體積及病狀，到達人道終點時，將動物自研究移出。在研究結束時，對照組中0% (0/4)之小鼠存活，而對比而言，100% (4/4)之完全反應者動物存活。此等結果展示，在一小組小鼠中，OX40/CD137替代mAb2 可誘導完全腫瘤消退，且建立針對用CT26細胞再挑戰之保護性免疫記憶。 實例24-抗小鼠OX40/CD137 mAb2 在CT26小鼠腫瘤模型中之劑量依賴性藥力學反應
使用CT26同基因型小鼠結腸直腸腫瘤模型，評估OX40/CD137替代mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)之劑量位準、給藥頻率及周邊藥力學反應之間的關係。比較單次腹膜內(i.p.)注射1、3、10或30 mg/kg之不同劑量位準下的FS20m-232-91AA/Lob12.3，或三次i.p.注射每2天給予一次(Q2D)之1 mg/kg下之FS20m-232-91AA/Lob12.3。如實例 18 中所描述，藉由對血液中免疫細胞次群之流式細胞量測術分析評定FS20m-232-91AA/Lob12.3之藥力學反應，具體而言替代mAb2 對循環T細胞之影響。
按照如實例 17 中所描述之相同方案，各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)經CT26結腸癌細胞皮下注射至各動物之左側腹中。在腫瘤細胞接種之後10天，量測腫瘤，且將不具有已建立之腫瘤的動物自研究移除。將其餘小鼠隨機分入六個處理組，每組六隻動物。
在注射之前，將同型對照抗體(G1AA/4420)及FS20m-232-91AA/Lob12.3過濾且稀釋於PBS中。各動物腹膜內投與每次投與200 μl體積之稀釋抗體，對20 g小鼠給予每次投與30 mg/kg G1AA/4420或1、3、10或30 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3之最終劑量。動物接受單次i.p.注射G1AA/4420(在30 mg/kg下)或FS20m-232-91AA/Lob12.3 (在1、3、10或30 mg/kg下)，或每二天給予一次(Q2D)，在腫瘤接種之後第10天起始之總共3次劑量的FS20m-232-91AA/Lob12.3 (每劑在1 mg/kg下)。如實例 17 中所描述，藉由卡尺量測測定腫瘤體積。將動物在給藥起始之後六天(細胞接種後16天)移出研究。
藉由心臟穿刺將血液收集至含EDTA之管中。根據製造商說明書，將未凝固血液之紅細胞在紅細胞溶解緩衝液(Miltenyi Biotech，#130-094-183)中溶解二次。對於流式細胞量測分析，在存在Fc阻斷劑(eBioscience，目錄號14-0161-86)之情況下，將細胞用以下試劑染色：CD4-BUV395 (純系RM4-5)、CD8-BUV737 (純系53-6.7)、CD44-BV510 (純系IM7)及CD3e-BV786 (純系145-2C11)，均由BD Bioscience供應)；CD69-FITC (純系H1.2F3)、NKp46-PE (純系29A1.4)、CD45-Alexa700及可固定生存力染料780，均由eBioscience供應；及CD62L-BV421 (生存力MEL-14)，由Biolegend供應。隨後將細胞用eBioscience Foxp3染色套組(eBioscience，目錄號00-5523-00)根據製造商說明書固定且滲透隔夜。將細胞再懸浮於含抗Gzmb、抗Ki67及抗Foxp3抗體(Gzmb-AF647 (純系GB11)，由Biolegend供應，及Ki67-PE-Cy7 (純系SolA15)及Foxp3-PerCP-Cy5.5 (純系FJK-16s)，均由eBioscience供應)之100 μl滲透緩衝液中，且在室溫下在暗處培育30分鐘。隨後將細胞用滲透緩衝液洗滌二次且再懸浮於PBS外加0.5% BSA中。隨後在BD Fortessa流式細胞儀中分析細胞。使用FlowJo、Excel及GraphPad Prism 7軟體進行資料分析。
在投與第一劑量後六天，藉由流式細胞量測分析測定周邊血液中Ki67+ CD8+ (在總CD8+中)及Ki67+ CD4+ (在總CD4+中)增殖T細胞的頻率。與同型對照相比，在FS20m-232-91AA/Lob12.3之1及10 mg/kg單次劑量下觀測到Ki67+ CD4+增殖T細胞之頻率的統計顯著增加。與同型對照相比，在FS20m-232-91AA/Lob12.3之1、3及10 mg/kg單次劑量下觀測到Ki67+ CD8+增殖T細胞之頻率的統計顯著增加。
Ki67+ CD8+增殖T細胞在1 mg/kg單次劑量位準下傾向於最高，而Ki67+ CD4+增殖T細胞在1及10 mg/kg劑量位準下傾向於最高。相對於同型對照，將劑量位準提高至30 mg/kg不引起對Ki67+ CD8+及Ki67+ CD4+ T細胞之顯著影響。值得注意的，在該等劑量位準中之任一者下，未觀測到明顯臨床觀測結果或重量減輕。
多次給藥組(在1 mg/kg Q2D三次劑量下之FS20m-232-91AA/Lob12.3)與1 mg/kg單次劑量組之比較未展示Ki67+ CD8+及Ki67+ CD4+ T細胞位準的統計顯著性(不成對曼-惠特尼檢定，分別p = 0.4848及p = 0.0931)。此資料表明，至少在此研究中所評估之六天時段內，多次給藥不提供對周邊Ki67+藥力學調節之額外影響。
與實例 18 之結果一致，此實驗展示，OX40/CD137替代mAb2 對循環T細胞具有影響，在1 mg/kg至10 mg/kg之劑量位準下顯著提高增殖(Ki67+) CD8+ T細胞的頻率，且在1 mg/kg及10 mg/kg之劑量位準下顯著提高增殖(Ki67+) CD4+ T細胞的頻率。 實例25-CD4 T細胞耗乏對抗小鼠OX40/CD137 mAb2 在CT26小鼠腫瘤模型中之藥力學反應的影響
先前已展示與任一單獨的藥劑相比，靶向CD137及靶向OX40之共刺激抗體之組合在小鼠中投與葡萄球菌腸毒素A之後，協同增強特異性CD8+ T細胞無性擴增(Lee等人, 2004)。在機理上，Lee等人展現CD4 T細胞起到驅動增強之特異性CD8+ T細胞反應之作用。使用CT26小鼠腫瘤模型及小鼠CD4 T細胞耗乏性抗體，以測試宿主CD4 T細胞是否為回應於用OX40/CD137替代mAb2 進行之處理，周邊CD8+ T細胞之活化及增殖所需，或促進該活化及增殖。
按照如實例 17 中所描述之相同方案，8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)經CT26結腸癌細胞皮下注射至各動物之左側腹中。在第七天將動物隨機分入處理組，每時間點每組五隻動物。
如先前所描述分析抗體，且檢查抗體之雜質。將同型對照抗體(G1/4420)及OX40/CD137替代mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)在PBS中稀釋至0.1 mg/ml之最終濃度。將抗小鼠CD4抗體(GK1.5；BioXCell，目錄號BE0003-1)在PBS中稀釋至1 mg/ml之最終濃度。各動物接受每次投與200 μl體積之稀釋抗體，對20 g小鼠給予1 mg/kg (G1/4420或FS20m-232-91AA/Lob12.3)或10 mg/kg (GK1.5)之最終劑量。G1/4420及FS20m-232-91AA/Lob12.3藉由在細胞接種之後第10、12及14天腹膜內(i.p.)注射投與動物。GK1.5之I.p.注射在第8、9、11、13及15天給予。
將動物在細胞接種之後第16天移出研究，且收集組織用於流式細胞量測分析。藉由心臟穿刺將血液收集至含EDTA之管中。按照如實例 19 中所描述之相同方案，根據製造商說明書，將未凝固血液之紅細胞在紅細胞溶解緩衝液(Miltenyi Biotech，#130-094-183)中溶解二次，且使用腫瘤解離套組，小鼠(Miltenyi 130-096-730)及gentleMACS解離器(Miltenyi Biotech)，根據製造商說明書解離腫瘤。將所得細胞懸浮液使用70 µM細胞過濾器(Corning，目錄號352350)瀝濾，在PBS中洗滌再懸浮於PBS中。藉由將脾臟推動通過70 µm細胞過濾器(Corning)製備來自脾臟之細胞懸浮液，藉由在紅細胞溶解緩衝液(Milteny Biotech)中培育溶解紅細胞，洗滌剩餘脾細胞且將其再懸浮於PBS中。
在存在Fc阻斷劑(eBioscience，目錄號14-0161-86)之情況下，將細胞首先用以下試劑染色：CD4-E450 (純系GK1.5)、CD69-PE-Cy5 (純系H1.2F3)、CD3-PE-Cy7 (純系145-2C11)、CD8-APC (純系53-6.7)及可固定生存力染料780，均由eBioscience供應；及CD45-V500 (純系30-F11)，由BD Bioscience供應。隨後將細胞用eBioscience Foxp3染色套組(eBioscience，目錄號00-5523-00)根據製造商說明書固定且滲透。將細胞在存在Fc阻斷劑之情況下再懸浮於含抗Ki67及抗Foxp3抗體(Ki67-FITC (純系SolA15)及Foxp3-PE (純系FJK-16s)，均由eBioscience供應) (均1:100)之100 μl滲透緩衝液中，且在4℃下在暗處培育30分鐘。隨後將細胞用滲透緩衝液洗滌一次且再懸浮於200 ul PBS中。在BD FACSCanto II細胞計數器上分析細胞。使用FlowJo、Excel及GraphPad Prism軟體進行資料分析。使用GraphPad Prism軟體內之雙尾曼-惠特尼檢定進行處理組之間的成對比較。
與經同型對照處理之動物相比，用單獨的FS20m-232-91AA/Lob12.3進行之處理誘導血液及脾臟中活化CD69+及增殖Ki67+ CD8+ T細胞之比例的統計顯著提高，及腫瘤中增殖Ki67+ CD8+ T細胞之比例的統計顯著提高。
與同型對照相比，將FS20m-232-91AA/Lob12.3與CD4+ T細胞耗乏性抗體GK1.5組合亦引起血液中增殖Ki67+ CD8+ T細胞的統計顯著增加，但此增加顯著低於在經FS20m-232-91AA/Lob12.3單劑處理之動物中所觀測到的增加。與用FS20m-232-91AA/Lob12.3外加CD4+ T細胞耗乏性抗體GK1.5進行之處理相比，在經單獨的FS20m-232-91AA/Lob12.3處理後，未觀測到脾臟及腫瘤組織中增殖CD8+ T細胞之位準的統計顯著差異。
血液中CD69+ CD8+ T細胞之FS20m-232-91AA/Lob12.3誘導之增加受GK1.5抗體抑制，因為在同型對照組與FS20m-232-91AA/Lob12.3外加CD4耗乏組之間未觀測到統計顯著差異(中值分別為總CD8 T細胞之1.6%及2.33%)。FS20m-232-91AA/Lob12.3單劑組與FS20m-232-91AA/Lob12.3外加CD4耗乏組之比較展示，活化CD8+ T細胞之頻率在脾臟中顯著降低(在不存在及存在耗乏之情況下分別29.3%對6.45%中值頻率)，且在腫瘤中顯著降低(在不存在及存在耗乏之情況下分別86.4%對66.5%中值頻率)。
與如實例 18 中所描述之先前研究結果一致，OX40/CD137替代mAb2 提高活化(CD69+)及增殖(Ki67+) CD8 T細胞之頻率，且本研究之結果展示，CD4+ T細胞耗乏對此OX40/CD137 mAb2 介導之周邊藥力學反應具有不利影響。此外，資料表明CD4+及CD8+ T細胞活體內介導抗OX40/CD137 mAb2 活性之潛在相互作用，及CD4+ T細胞可為與抗OX40/CD137 mAb2 活體內最佳共刺激CD8+ T細胞免疫所需的。 實例26-OX40/CD137 mAb2 在基於食蟹獼猴細胞之分析中的功能活性及食蟹獼猴中對OX40/CD137 mAb2 之藥力學反應及耐受性 26.1        OX40/CD137 mAb2 在基於食蟹獼猴細胞之分析中的功能活性
進行類似於實例 13 中所描述之初代T細胞分析，但使用PBMC替代經分離活化T細胞之初代PBMC分析，以確定抗人類FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 對內源性表現之人類及食蟹獼猴受體的相對效力。簡言之，分離食蟹獼猴或人類PBMC，且在存在提高濃度之FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 或同型對照之情況下用塗佈抗CD3抗體刺激三天(食蟹獼猴)或四天(人類)，其中IL-2釋放充當T細胞活化之量度。
觀測到mAb2 對食蟹獼猴PBMC之功能活性(平均EC50 = 0.28 ± 0.15 nM)類似於在等效人類分析中所觀測到的活性(平均EC50 = 0.26 ± 0.1 nM；IL-2)。因此將食蟹獼猴視為mAb2 之毒性研究的藥理相關物種。 26.2        食蟹獼猴中對OX40/CD137 mAb2 之耐受性及藥力學反應
在食蟹獼猴中進行初步劑量範圍發現研究，以評估抗人類OX40/CD137 mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16之耐受性，且評定回應於FS20-22-49AA/FS30-10-16，主要白血球群體之比例的潛在藥力學變化，以及特異性T細胞次亞之增殖及活化的誘導。
簡言之，將FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 以單次劑量形式或重複劑量投與形式經由靜脈內輸注投與食蟹獼猴。評定標準毒理學參數，諸如體重、食物消耗、臨床觀測結果、血液學及血液化學，以便評估研究持續時間內之耐受性。
如藉由臨床化學及組織病理學結果所測定，FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 至多30 mg/kg每週給藥一次耐受良好。
與在CT26同基因型小鼠腫瘤模型中評定抗小鼠OX40/CD137 mAb2 對循環T細胞之影響之研究(實例 18 )的結果一致，觀測到中央記憶及效應記憶體CD4+及CD8+ T細胞，以及NK細胞中細胞增殖及活化之藥物相關增加，該增加藉由Ki67之提高表現及在一定程度上CD69之提高表現量測。
綜合而言，此等結果強有力地表明，抗人類FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 在食蟹獼猴中具有強效活體內藥理學活性且至多30 mg/kg耐受良好。此外，此研究中產生之藥力學資料符合實例 18 中所描述之小鼠藥力學研究中針對OX40/CD137替代mAb2 觀測到之資料，且提供結合OX40及CD137之mAb2 (諸如FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 )在人類癌症患者中之預期抗腫瘤功效及耐受性的另外證據。 實例27-OX40/CD137 mAb2 在BALB/c小鼠中之肝臟藥理學
已展示CD137促效劑抗體在小鼠臨床前模型中誘導增加的肝臟T細胞浸潤，且一種CD137促效劑抗體在超過1 mg/kg之劑量下在臨床上誘導肝臟毒性(Dubrot等人, 2010; Segal等人, 2017)。因此研究抗小鼠OX40/CD137 mAb2 在BALB/c小鼠中之影響，以確定相比於CD137促效劑抗體，是否存在增加的肝臟T細胞浸潤。將血液及脾組織用作對照，且研究T細胞位準以及T細胞增殖及活化。所測試之抗體的細節列於表 38 中。表 38 ：所測試之抗體及mAb2 的細節
將mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)增加、活化血液、脾臟及肝臟中之T細胞且誘導該等T細胞增殖的能力與單劑mAb (G1/OX86、G1/Lob12.3、G1/3H3及G1/4420)及組合(G1/OX86及G1/Lob12.3)對照進行比較。在研究起始之前，使各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)休息一週。將所有動物植入微晶片且給定唯一識別符。各群組具有6隻小鼠。
在注射之前24小時內，將抗體藉由SEC-HPLC譜分析且檢查雜質。將抗體在PBS中稀釋至1 mg/ml之最終濃度，且每小鼠腹膜內(IP)注射200 μl，對20 g小鼠給予10 mg/kg之最終劑量。在研究之第0、2及4天進行注射(每二天一次劑量)。在第三劑量之後七天及十四天，將每組3隻小鼠安樂死，藉由剝離分離脾臟及肝臟，且藉由心臟穿刺收集血液。
肝臟及脾臟使用Miltenyi解離套組(肝臟- Miltenyi，130-105-807；脾臟- Miltenyi，130-095-926)根據製造商說明書進行解離。將所得細胞懸浮液使用70 µM細胞過濾器(Corning，目錄號352350)瀝濾，離心(在1500 rpm下10分鐘)，在PBS中洗滌一次且再懸浮於5 ml PBS中。
藉由心臟穿刺將血液收集至含EDTA之管中。根據製造商說明書，將未凝固血液之紅細胞在紅細胞溶解緩衝液(eBioscience，目錄號00-4300-54)中溶解二次。
將細胞自腫瘤及血液分離，且針對流式細胞量測術使用實例 19 中詳述之抗體組及試劑(染色劑1)染色。將細胞在PBS中洗滌，且隨後在4℃下與100 µl抗體混合物1 (除Ki67及FoxP3抗體之外之全部)一起培育30分鐘。隨後將細胞用PBS洗滌，且隨後用eBioscience Foxp3染色套組(eBioscience，目錄號00-5523-00)根據製造商說明書固定且滲透。簡言之，將200 µl固定溶液添加至各孔，且在4℃下在暗處靜置隔夜。隨後在200 µl滲透緩衝液中洗滌細胞。隨後將細胞再自旋，且在存在Fc阻斷劑之情況下再懸浮於含Ki67及Foxp3抗體(均以1:100稀釋)之100 µl滲透緩衝液中，且在4℃下在暗處培育30分鐘。隨後將細胞用滲透緩衝液洗滌一次且再懸浮於200 µl PBS中。隨後在BD FACSCanto II流式細胞儀中分析細胞。
用FlowJoX、Excel及GraphPad Prism軟體分析資料。使用GraphPad Prism套裝軟體，對每一對使用單因子變異數分析，接著使用杜凱氏多重比較檢定，進行比較各組的統計分析。資料以親本群體之百分比的形式表現。
結果展示，在7天及14天二者時，非交聯依賴性CD137促效劑抗體(G1/3H3)誘導肝臟、脾臟及血液中提高的T細胞位準，且相比於同型對照抗體(G1/4420)，彼等T細胞展示提高的增殖及活化位準。交聯依賴性CD137促效劑抗體(G1/Lob12.3)不展示肝臟、脾臟或血液中T細胞位準、增殖或活化的顯著提高。在研究之第7天時，OX40促效劑抗體(G1/OX86)不誘導組織中之任一者中提高的T細胞位準，但展示肝臟、脾臟及血液中提高的T細胞增殖位準，截至第14天該位準返回至同型對照位準。OX40與交聯依賴性CD137促效劑抗體之組合(G1/OX86及G1/Lob12.3)展示在第7天肝臟T細胞浸潤位準提高，在第7天肝臟中及在第7天及第14天脾臟(不顯著)及血液中增加的T細胞增殖，及在第14天肝臟及血液中及在第7天及第14天脾臟中增加的T細胞活化。OX40/CD137 mAb2 展示在第7天肝臟T細胞浸潤位準(不顯著)及血液T細胞位準之提高，截至第14天該等位準返回至同型對照位準，及在第7天肝臟(不顯著)、脾臟及血液中增加的T細胞增殖，截至第14天該增加的T細胞增殖亦返回至同型對照位準。此等結果表明，僅非交聯依賴性CD137促效劑(G1/3H3)誘導肝臟以及脾臟及血液中升高且持續T細胞浸潤、增殖及活化，且表明與非交聯依賴性CD137促效劑抗體相比，本發明之靶向OX40/CD137的抗體分子可具有較低肝毒性風險。此等結果提高以下可能性：由純系3H3誘導之非交聯依賴性CD137促效作用與此研究中針對此非交聯依賴性純系觀測到之增加的肝臟T細胞發炎之間存在關聯。 實例28-CT26同基因型腫瘤模型中含有不同抗CD137 Fab純系之OX40/CD137 mAb2 的比較
在實例 27 中，觀測到非交聯依賴性CD137促效劑抗體(G1/3H3)誘導BALB/c小鼠中升高且持續T細胞浸潤、增殖及活化位準。為測試此增加的活性在OX40/CD137 mAb2 情形下是否具有有益抗腫瘤活性，使用CT26同基因型腫瘤模型以活體內比較二種不同抗小鼠OX40/CD137 mAb2 之活性，在一種mAb2 中CD137促效劑為交聯依賴性純系Lob1.23且在另一種mAb2 中CD137促效劑為非交聯依賴性純系3H3。先前已展示CT26同基因型腫瘤模型對OX40促效劑抗體及CD137促效劑抗體二者敏感，且自CT26腫瘤分離之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)表現OX40及CD137二者。 28.1        含有不同抗CD137 Fab純系之OX40/CD137 mAb2 抗體在CT26同基因型腫瘤模型中之抗腫瘤活性
在CT26同基因型小鼠腫瘤模型中活體內測定二種不同OX40/CD137 mAb2 FS20m-232-91AA/3H3 (SEQ ID NO: 169及167)及FS20m-232-91AA/Lob12.3 (參見表 38 )之抗腫瘤活性，且將該活性與同型對照抗體(G1/4420；參見表 38 )之活性進行比較。另外，分析由二種OX40/CD137 mAb2 在血液中誘導之T細胞增殖及活化的位準，且將該等位準與由同型對照抗體誘導之位準進行比較。在研究起始之前，使各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)休息一週。將所有動物植入微晶片且給定唯一識別符。各群組具有10隻小鼠。CT26結腸癌細胞株(ATCC，CRL-2638)經初始擴增、儲存，且隨後針對病原體由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I方案預篩選且展示為不含病原體。將CT26細胞(大約3-5×106 )自150℃解凍，且添加至T175組織培養燒瓶中含10% FCS (Gibco，10270-106)之20 ml DMEM (Gibco，61965-026)中。使用異氟醚(Abbott Laboratories)麻醉小鼠，且各動物在左側腹接受1×106 個細胞皮下注射。在腫瘤細胞接種之後第10天，監測小鼠之健康及腫瘤生長，將小鼠分選且隨機分入研究群組。將此時不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除。
在注射之前24小時內，將抗體藉由SEC-HPLC譜分析且檢查雜質。將抗體在PBS中稀釋至0.1 mg/ml之最終濃度，且每小鼠腹膜內(IP)注射200 μl，對20 g小鼠給予1 mg/kg之最終劑量。在腫瘤接種之後第10、12及14天進行注射(每二天一次劑量)。動物在麻醉下一週三次以不知情方式進行健康篩選，在該時間中，取得腫瘤之準確量測值。藉由卡尺量測測定腫瘤體積(如實例 17 中所描述)。在腫瘤細胞接種之後35天終止研究，在基於腫瘤體積及病狀，到達人道終點時，將動物自研究移出。處理組、所測試之分子、劑量及給藥時程概括於表 39 中。使用GraphPad Prism軟體，藉由雙因子變異數分析及杜凱氏多重比較檢定統計檢定第21天時之腫瘤體積。使用GraphPad Prism軟體，藉由對數秩檢定(曼特爾-考克斯)進行存活之統計檢定。表 39 ： 所測試之處理組及分子的概述
如圖 15A 及圖 15B 中所展示，相比於用同型對照抗體進行之處理，用二種OX40/CD137 mAb2 抗體中之任一者進行之處理延緩腫瘤生長且提高存活率。在分別經FS20m-232-91AA/3H3 mAb2 及FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 處理之小鼠之間未觀測到腫瘤生長或存活率的差異。此資料表明，儘管如實例27中所描述，針對非交聯依賴性CD137促效劑(G1/3H3)觀測到增加的T細胞活化及增殖，但相比於其中抗CD137 Fab純系為交聯依賴性純系Lob12.3之OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)，其中抗CD137 Fab純系為非交聯依賴性純系3H3之OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/3H3)的抗腫瘤活性未提高。 28.2        含有不同抗CD137 Fab純系之OX40/CD137 mAb2 在CT26同基因型腫瘤模型中之周邊藥力學反應的評估
在上文實例 28.1 中所描述之研究的延伸中，在投與第三劑量五天之後(亦即腫瘤接種後第19天)，自五隻小鼠之尾部靜脈收集血液至含EDTA之管中。根據製造商說明書，將未凝固血液之紅細胞在紅細胞溶解緩衝液(eBioscience，目錄號00-4300-54)中溶解二次。
將細胞自血液分離，且針對流式細胞量測術使用實例 19 中詳述之抗體組及試劑(染色劑1)染色。將細胞在PBS中洗滌，且隨後在4℃下與100 µl抗體混合物1 (除Ki67及FoxP3抗體之外之全部)一起培育30分鐘。隨後將細胞用PBS洗滌，且隨後用Foxp3染色套組(eBioscience，目錄號00-5523-00)根據製造商說明書固定且滲透。簡言之，將200 µl固定溶液添加至各孔，且在4℃下在暗處靜置隔夜。隨後在200 µl滲透緩衝液中洗滌細胞。隨後將細胞再自旋，且在存在Fc阻斷劑之情況下再懸浮於含Ki67及Foxp3抗體(均以1:100稀釋)之100 µl滲透緩衝液中，且在4℃下在暗處培育30分鐘。隨後將細胞用滲透緩衝液洗滌一次且再懸浮於200 µl PBS中。隨後在BD FACSCanto II流式細胞儀中分析細胞。
用FlowJoX、Excel及GraphPad Prism軟體分析資料。使用GraphPad Prism套裝軟體，對每一對使用單因子變異數分析，接著使用杜凱氏多重比較檢定，進行比較各組的統計分析。
相比於同型對照抗體(G1/4420)及FS20m-232-91AA/Lob12.3二者，FS20m-232-91AA/3H3誘導血液T細胞位準之統計顯著提高。由FS20m-232-91AA/3H3誘導此等提高的T細胞位準伴有與針對G1/4420同型對照及FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 觀測到之此等細胞類型之相對百分比相比，CD4+ T細胞之相對百分比的統計顯著降低，及CD8+ T細胞之相對百分比的統計顯著提高。二種OX40/CD137 mAb2 抗體亦誘導CD4+及CD8+ T細胞之增殖，但由FS20m-232-91AA/3H3誘導之位準顯著高於由FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 誘導之位準。相比於同型對照，FS20m-232-91AA/3H3 mAb2 誘導提高的活化CD4+ T細胞之位準。相比於經同型對照處理之群組，經FS20m-232-91AA/Lob12.3或FS20m-232-91AA/3H3處理之小鼠中活化T細胞及活化CD8+ T細胞的位準變化適中且非統計顯著，經FS20m-232-91AA/Lob12.3處理之小鼠中活化CD4+ T細胞的位準變化亦如此。此等結果表明，在OX40/CD137 mAb2 情形下之非交聯依賴性CD137促效劑純系3H3具有活性，且相比於在OX40/CD137 mAb2 情形下之交聯依賴性CD137促效劑純系Lob12.3，能夠誘導提高的T細胞位準及增殖，且因此與如在實例 27 中所描述之BALB/c小鼠研究中所觀測到的由呈單株抗體(mAb)形式之純系3H3誘導之提高的T細胞位準及增殖一致。
此等結果與抗腫瘤活性資料一起表明，在OX40/CD137 mAb2 情形下，不存在就由非交聯依賴性CD137促效劑誘導之提高的T細胞位準及增殖之抗腫瘤反應而言的額外益處。此等結果與其中針對由純系3H3誘導之非交聯依賴性CD137促效作用觀測到增加的肝臟T細胞發炎之實例 27 的結果一起，表明使用CD137促效作用依賴於與OX40結合之OX40/CD137 mAb2 ，可提供刺激免疫系統對抗癌症之安全且有效的方式。序列表 FS30-10-16 mAb之CDR胺基酸序列(IMGT) VH CDR1 - GFTFSSYD (SEQ ID NO: 1) VH CDR2 - IDPTGSKT (SEQ ID NO: 2) VH CDR3 - ARDLLVYGFDY (SEQ ID NO: 3) VL CDR1 - QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) VL CDR2 - GAS (SEQ ID NO: 5) VL CDR3 - QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6) FS30-10-16 mAb之CDR胺基酸序列(Kabat) VH CDR1 - SYDMS (SEQ ID NO: 7) VH CDR2 - DIDPTGSKTDYADSVKG (SEQ ID NO: 8) VH CDR3 - DLLVYGFDY (SEQ ID NO: 9) VL CDR1 - RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) VL CDR2 - GASSRAT (SEQ ID NO: 11) VL CDR3 - QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6) FS30-10-16 mAb之重鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 12) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-10-16 mAb之重鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 13) FS30-10-16 mAb之輕鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 14) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-10-16 mAb之輕鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 15) FS30-10-3 mAb之CDR胺基酸序列(IMGT) VH CDR1 - GFTFSSYD (SEQ ID NO: 1) VH CDR2 - IDPTGSKT (SEQ ID NO: 2) VH CDR3 - ARDLNVYGFDY (SEQ ID NO: 16) VL CDR1 - QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) VL CDR2 - GAS (SEQ ID NO: 5) VL CDR3 - QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6) FS30-10-3 mAb之CDR胺基酸序列(Kabat) VH CDR1 - SYDMS (SEQ ID NO: 7) VH CDR2 - DIDPTGSKTDYADSVKG (SEQ ID NO: 8) VH CDR3 - DLNVYGFDY (SEQ ID NO: 17) VL CDR1 - RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) VL CDR2 - GASSRAT (SEQ ID NO: 11) VL CDR3 - QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6) FS30-10-3 mAb之重鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 18) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-10-3 mAb之重鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 19) FS30-10-3 mAb之輕鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 14) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-10-3 mAb之輕鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 20) FS30-10-12 mAb之CDR胺基酸序列(IMGT) VH CDR1 - GFTFSSYD (SEQ ID NO: 1) VH CDR2 - IDPTGSKT (SEQ ID NO: 2) VH CDR3 - ARDLTVYGFDY (SEQ ID NO: 21) VL CDR1 - QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) VL CDR2 - GAS (SEQ ID NO: 5) VL CDR3 - QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6) FS30-10-12 mAb之CDR胺基酸序列(Kabat) VH CDR1 - SYDMS (SEQ ID NO: 7) VH CDR2 - DIDPTGSKTDYADSVKG (SEQ ID NO: 8) VH CDR3 - DLTVYGFDY (SEQ ID NO: 22) VL CDR1 - RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) VL CDR2 - GASSRAT (SEQ ID NO: 11) VL CDR3 - QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6) FS30-10-12 mAb之重鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 23) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-10-12 mAb之重鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 24) FS30-10-12 mAb之輕鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 14) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-10-12 mAb之輕鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 20) FS30-35-14 mAb之CDR胺基酸序列(IMGT) VH CDR1 - GFTFSAYN (SEQ ID NO: 25) VH CDR2 - ISPYGGAT (SEQ ID NO: 26) VH CDR3 - ARNLYELSAYSYGADY (SEQ ID NO: 27) VL CDR1 - QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) VL CDR2 - GAS (SEQ ID NO: 5) VL CDR3 - QQYYYSSPIT (SEQ ID NO: 28) FS30-35-14 mAb之CDR胺基酸序列(Kabat) VH CDR1 - AYNIH (SEQ ID NO: 29) VH CDR2 - DISPYGGATNYADSVKG (SEQ ID NO: 30) VH CDR3 - NLYELSAYSYGADY (SEQ ID NO: 31) VL CDR1 - RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) VL CDR2 - GASSRAT (SEQ ID NO: 11) VL CDR3 - QQYYYSSPIT (SEQ ID NO: 28) FS30-35-14 mAb之重鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 170) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-35-14 mAb之重鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 171) FS30-35-14 mAb之輕鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 172) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-35-14 mAb之輕鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 32) FS30-5-37 mAb之CDR胺基酸序列(IMGT) VH CDR1 - GFTFSSYA (SEQ ID NO: 33) VH CDR2 - ISGSGGST (SEQ ID NO: 34) VH CDR3 - ARSYDKYWGSSIYSGLDY (SEQ ID NO: 35) VL CDR1 - QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) VL CDR2 - GAS (SEQ ID NO: 5) VL CDR3 - QQYYSYYPVT (SEQ ID NO: 36) FS30-5-37 mAb之CDR胺基酸序列(Kabat) VH CDR1 - SYAMS (SEQ ID NO: 37) VH CDR2 - AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 38) VH CDR3 - SYDKYWGSSIYSGLDY (SEQ ID NO: 39) VL CDR1 - RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) VL CDR2 - GASSRAT (SEQ ID NO: 11) VL CDR3 - QQYYSYYPVT (SEQ ID NO: 36) FS30-5-37 mAb之重鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 40) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-5-37 mAb之重鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 41) FS30-5-37 mAb之輕鏈可變域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 42) CDR IMGT編號(加粗斜體)，CDR Kabat編號(加底線斜體) FS30-5-37 mAb之輕鏈可變域的核酸序列(SEQ ID NO: 43) WT CH3域結構環之胺基酸序列 WT AB環 - RDELTKNQ (SEQ ID NO: 44) WT CD環 - SNGQPENNY (SEQ ID NO: 45) WT EF環 - DKSRWQQGNV (SEQ ID NO: 46) WT CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 47) AB、CD及EF環加底線 CH2域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 48) 具有LALA突變之CH2域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 49) LALA突變加底線 具有LALA突變及P114A突變之CH2域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 50) LALA突變加底線；P114A突變加粗且加底線 Fcab FS20-22-49 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-49第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 51) FS20-22-49第二序列 - DEQFA (SEQ ID NO: 52) FS20-22-49第三序列 - QYRWNPADY (SEQ ID NO: 53) Fcab FS20-22-49 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 54) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-22-49 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 55) Fcab FS20-22-49 CH3域AB、CD及EF環序列之胺基酸序列 FS20-22-49 AB環 - RDEYWDQE (SEQ ID NO: 56) FS20-22-49 CD環 - SNGDEQFAY (SEQ ID NO: 57) FS20-22-49 EF環 - DQYRWNPADY (SEQ ID NO: 58) Fcab FS20-22-38 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-38第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 51) FS20-22-38第二序列 - AEKYQ (SEQ ID NO: 59) FS20-22-38第三序列 - QYRWNPGDY (SEQ ID NO: 60) Fcab FS20-22-38 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 61) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-22-38 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 62) Fcab FS20-22-41 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-41第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 51) FS20-22-41第二序列 - DEQFA (SEQ ID NO: 52) FS20-22-41第三序列 - QYRWNPGDY (SEQ ID NO: 60) Fcab FS20-22-41 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 63) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-22-41 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 64) Fcab FS20-22-47 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-47第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 51) FS20-22-47第二序列 - DEQFA (SEQ ID NO: 52) FS20-22-47第三序列 - QYRWSPGDY (SEQ ID NO: 65) Fcab FS20-22-47 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 66) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-22-47 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 67) Fcab FS20-22-85 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-85第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 51) FS20-22-85第二序列 - DEQFA (SEQ ID NO: 52) FS20-22-85第三序列 - QYRWNPFDD (SEQ ID NO: 68) Fcab FS20-22-85 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 69) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-22-85 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 70) Fcab FS20-31-58 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-58第一序列 - YYSGE (SEQ ID NO: 71) FS20-31-58第二序列 - QPEND (SEQ ID NO: 72) FS20-31-58第三序列 - PYWRWGSPRT (SEQ ID NO: 73) Fcab FS20-31-58 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 74) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-31-58 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 75) Fcab FS20-31-66 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-66第一序列 - YYSGE (SEQ ID NO: 71) FS20-31-66第二序列 - QPEND (SEQ ID NO: 72) FS20-31-66第三序列 - PYWRWGVPRT (SEQ ID NO: 76) Fcab FS20-31-66 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 77) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-31-66 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 78) Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-94第一序列 - WEHGE (SEQ ID NO: 79) FS20-31-94第二序列 - IREHD (SEQ ID NO: 80) FS20-31-94第三序列 - PYWRWGGPGT (SEQ ID NO: 81) Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 82) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 83) Fcab FS20-31-102 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-102第一序列 - WASGE (SEQ ID NO: 84) FS20-31-102第二序列 - QPEVD (SEQ ID NO: 85) FS20-31-102第三序列 - PYWRWGVPRT (SEQ ID NO: 76) Fcab FS20-31-102 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 86) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-31-102 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 87) Fcab FS20-31-108 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-108第一序列 - WASGE (SEQ ID NO: 84) FS20-31-108第二序列 - EKEID (SEQ ID NO: 88) FS20-31-108第三序列 - PYWRWGAKRT (SEQ ID NO: 89) Fcab FS20-31-108 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 90) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-31-108 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 91) Fcab FS20-31-115 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-115第一序列 - WASGE (SEQ ID NO: 84) FS20-31-115第二序列 - EQEFD (SEQ ID NO: 92) FS20-31-115第三序列 - PYWRWGAKRT (SEQ ID NO: 89) Fcab FS20-31-115 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 93) 第一、第二及第三序列加底線 Fcab FS20-31-115 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 94) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-16之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 95) 可變域(斜體)，LALA突變(加底線粗體) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-16之重鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 96) FS30-10-16之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 97) 可變域(斜體) FS30-10-16之輕鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 98) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-3之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 99) 可變域(斜體)，LALA突變(加底線粗體) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-3之重鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 100) FS30-10-3之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 97) 可變域(斜體) FS30-10-3之輕鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 102) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-12之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 103) 可變域(斜體)，LALA突變(加底線粗體) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-12之重鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 104) FS30-10-12之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 97) 可變域(斜體) FS30-10-12之輕鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 102) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-35-14之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 105) 可變域(斜體)，LALA突變(加底線粗體) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-35-14之重鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 106) FS30-35-14之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 107) 可變域(斜體) FS30-35-14之輕鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 108) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-5-37之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 109) 可變域(斜體)，LALA突變(加底線粗體) 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-5-37之重鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 110) FS30-5-37之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 111) 可變域(斜體) FS30-5-37之輕鏈的核酸序列(SEQ ID NO: 112) Fcab FS20-22-49 CH3域之替代核酸序列(SEQ ID NO: 113) 包含LALA突變之抗FITC mAb G1AA/4420之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 114)
CDR之位置加底線。LALA突變之位置加粗。 不具有LALA突變之抗FITC mAb G1/4420之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 115)
CDR之位置加底線。 4420 mAb之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 116) VL域(斜體) 具有LALA突變之G1AA/HelD1.3抗體之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 117) HelD1.3 mAb之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 118) VL域(斜體) G1/MOR7480.1之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 119) VH域(斜體) G1/MOR7480.1、G1AA/MOR7480.1及G2/MOR7480.1 mAb之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 120) VL域(斜體) G1/20H4.9之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 121) VH域(斜體) G1/20H4.9及G1AA/20H4.9 mAb之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 122) VL域(斜體) FS20-22-49AA/4420之重鏈(具有LALA突變)的胺基酸序列(SEQ ID NO: 123) VH域(斜體)；LALA突變(加粗且加底線) G2/MOR7480.1之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 124) VH域(斜體) G1AA/MOR7480.1之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 125) VH域(斜體) LALA(加粗且加底線) 人類CD137之胺基酸序列(SEQ ID NO: 126) 胞外域(斜體)；跨膜域及胞內域(粗體) 人類CD137胞外域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 127) 食蟹獼猴CD137之胺基酸序列(SEQ ID NO: 128) 胞外域(斜體)；跨膜域及胞內域(粗體) 食蟹獼猴CD137胞外域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 129) 人類OX40胞外域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 130) 食蟹獼猴OX40胞外域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 131) DO11.10-hOX40及人類OX40受體之胺基酸序列(SEQ ID NO: 132) DO11.10-mOX40及小鼠OX40受體之胺基酸序列(SEQ ID NO: 133) DO11.10-cOX40及食蟹獼猴OX40受體之胺基酸序列(SEQ ID NO: 134) 人類OX40-mFc之胺基酸序列(SEQ ID NO: 135) IL-2前導序列(加底線)，OX40胞外域(斜體)，小鼠IgG2a Fc域(粗體) 小鼠OX40-mFc之胺基酸序列(SEQ ID NO: 136) IL-2前導序列(加底線)，OX40胞外域(斜體)，小鼠IgG2a Fc域(粗體) 食蟹猴OX40-mFc之胺基酸序列(SEQ ID NO: 137) IL-2前導序列(加底線)，OX40胞外域(斜體)，小鼠IgG2a Fc域(粗體) 在CD137-mFc-Avi重組抗原之情況下使用之人類CD137序列的胺基酸序列(SEQ ID NO: 138) 在CD137-mFc-Avi及CD137-Avi-His重組抗原之情況下使用之食蟹獼猴CD137序列的胺基酸序列(SEQ ID NO: 139) 在CD137-mFc-Avi重組抗原之情況下使用之小鼠CD137序列的胺基酸序列(SEQ ID NO: 140) 在CD137-mFc-Avi重組抗原之情況下使用之mFc-Avi的胺基酸序列(SEQ ID NO: 141) 小鼠Fc域(斜體) Avi標籤(粗體) 截短Fcab鉸鏈區之胺基酸序列(SEQ ID NO: 101) Fcab FS20-22-49 CH3域之替代核酸序列(SEQ ID NO: 143) FS20-22-49/FS30-5-37重鏈AA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 144) FS20-22-49/FS30-5-37重鏈DNA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 145) FS20-22-49/FS30-10-3重鏈AA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 146) FS20-22-49/FS30-10-3重鏈DNA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 147) FS20-22-49/FS30-10-12重鏈AA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 148) FS20-22-49/FS30-10-12重鏈DNA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 149) FS20-22-49/FS30-10-16重鏈AA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 150) FS20-22-49/FS30-10-16重鏈DNA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 151) FS20-22-49/FS30-35-14重鏈AA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 152) FS20-22-49/FS30-35-14重鏈DNA (不具有LALA) (SEQ ID NO: 153) G1AA/FS30-10-16 mAb之重鏈(具有LALA)的胺基酸序列(SEQ ID NO: 154) G1AA/FS30-10-16 mAb之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 97) G1AA/OX86 mAb之重鏈(具有LALA)的胺基酸序列(SEQ ID NO: 155) G1/OX86及G1AA/OX86 mAb之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 156) FS20m-232-91AA/4420之重鏈(具有LALA)的胺基酸序列(SEQ ID NO: 157) FS20m-232-91AA/4420之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 116) 人類CD137-Avi-His之胺基酸序列(SEQ ID NO: 158) 胞外域CD137 (粗體)；Avi標籤(斜體)；His標籤(加底線) G1/OX86 mAb之重鏈(不具有LALA)的胺基酸序列(SEQ ID NO: 159) 抗PD-1 mAb G1AA/5C4之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 160) 可變域(粗體) 抗PD-1 mAb G1AA/5C4之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 161) 可變域(粗體) 抗PD-L1 mAb G1AA/S1之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 162) 可變域(粗體) 抗PD-L1 mAb G1AA/S1之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 163) 可變域(粗體) 小鼠CD137之胺基酸序列(SEQ ID NO: 164) 胞外域(斜體)；跨膜域及胞內域(粗體) G1AA/20H4.9 mAb之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 165) VH域(斜體) G1AA/3H3 mAb之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 166) VH域(斜體) G1AA/3H3及G1/3H3 mAb及FS20m-232-91AA/3H3 mAb2 之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 167) VL域(斜體) G1/3H3 mAb之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 168) VH域(斜體) 重鏈FS20m-232-91AA/3H3 (具有LALA)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 169) VH域(斜體) 抗OX40 mAb G1AA/11D4之重鏈的胺基酸序列 (SEQ ID NO: 173) VH域(斜體) 抗OX40 mAb G1/11D4之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 174) VH域(斜體) 抗OX40 mAb G1AA/11D4及G1/11D4之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 175) VL域(斜體) 參考文獻
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圖1 展示Fcab FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49、FS20-22-85、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108及FS20-31-115以及野生型(WT) Fcab之CH3域之序列的比對。指示AB、CD及EF結構環之位置，以及與WT序列相比，Fcab之CH3域中所存在之任何胺基酸取代、缺失(由波浪符「~」表示)或插入。展示根據IMGT、IMGT外顯子(連續編號)、EU及Kabat編號系統之殘基編號。
圖2 展示在存在及不存在交聯之情況下，人類CD137T細胞活化分析中CD137 mAb及OX40/CD137 mAb2 之活性。圖 2A 及圖 2B 展示在存在增加濃度之抗CD137mAb，且在存在(圖 2A )或不存在(圖 2B )交聯抗體之情況下的IL2釋放。在存在及不存在交聯抗體之情況下，G1AA/20H4.9展示活性，而僅在存在交聯抗體之情況下觀測到G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16抗體之活性。圖 2C 及圖2D 展示在存在(圖2C )或不存在(圖2D )交聯劑之情況下，在存在增加濃度之包含抗人類OX40 Fcab，呈mAb2 格式之抗CD137 FS30 mAb (FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及FS20-22-49AA/FS30-35-14)之情況下的IL-2釋放。包括如下對照：抗CD137抗體G2/MOR7480.1 (陽性對照)；抗OX40 mAb G1/11D4及mAb2 FS20-22-49AA/4420 (陰性對照)；抗FITC mAb G1/4420 (同型陰性對照)。圖2C 展示存在DO11.10-hCD137細胞之活化的濃度依賴性增加，如在存在交聯陽性對照mAb (G2/MOR7480.1)及抗CD137 FS30 mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及FS20-22-49AA/FS30-35-14)之情況下，而非在存在陰性對照mAb及mAb2 (G1/4420、FS20-22-49AA/4420及G1/11D4)之情況下小鼠IL-2釋放的增加所證明。圖2D展示在不存在交聯之情況下，陽性對照G2/MOR7480.1，mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37、FS20-22-49AA/FS30-10-3、FS20-22-49AA/FS30-10-12、FS20-22-49AA/FS30-10-16及FS20-22-49AA/FS30-35-14，及陰性對照G1/4420、FS20-22-49AA/4420及G1/11D4未展示T細胞活化或展示弱T細胞活化，如所量測之IL-2的低基礎位準所證明。
圖3 展示在葡萄球菌腸毒素A (SEA)分析中，CD137 mAb、OX40 Fcab及OX40/CD137 mAb2 之活性。在存在指定mAb/mAb2 ，且存在及不存在交聯劑(對於抗FITC mAb及OX40/FITC假擬mAb2 對照，FITC-葡聚糖，且對於所測試之所有其他分子，抗人類CH2抗體)之情況下，量測IL-2釋放。圖 3A 展示在存在濃度為3.7 nM之mAb G1/4420 (抗FITC；同型對照)、G1AA/MOR7480.1 (抗CD137)、G1AA/FS30-10-16 (抗CD137)、G1AA/20H4.9 (抗CD137)、G1AA/11D4 (抗OX40)、FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 )及FS20-22-49AA/4420外加G1AA/FS30-10-16之組合，以及mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16之情況下的IL-2釋放。結果展示，與同型對照相比，僅OX40/CD137 mAb2 在不存在人工交聯劑之情況下增加T細胞活化，而與同型對照相比，靶向OX40之抗體G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420及抗CD137抗體G1AA/20H4.9僅在存在人工交聯劑之情況下，展示增加的T細胞活化，且抗CD137抗體G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16甚至在存在人工交聯劑之情況下，未展示統計顯著活性。圖 3B 展示在存在增加濃度之OX40/CD137 mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16，存在及不存在人工交聯劑(抗人類CH2抗體)之情況下的IL-2釋放。結果展示，在不存在抗人類CH2抗體之情況下，由OX40/CD137 mAb2 誘導之T細胞活化與在存在此人工交聯劑之情況下所測試之T細胞活化相當。圖 3C 及圖 3D 展示在存在增加濃度之mAb及mAb2 ，存在(圖 3D )及不存在(圖 3C )人工交聯劑(對於抗FITC mAb及OX40/FITC假擬mAb2 對照，FITC-葡聚糖，且對於所測試之所有其他分子，抗人類CH2抗體)情況下的IL-2釋放。對照如下：G1/4420 (抗FITC)、G1/11D4 (抗OX40)、G2/MOR7480.1 (抗CD137)、G1/11D4外加G2/MOR7480.1之組合，及FS20-22-49AA/4420 (OX40/FITC假擬mAb2 )。結果展示，當OX40由單獨及在與抗CD137 mAb G2/MOR7480.1組合給藥時之對照G1/11D4，及在交聯時之FS20-22-49A/4420結合時，存在T細胞活化之濃度依賴性增加。OX40/CD137 mAb2 在存在及不存在人工交聯劑之情況下具有相當活性，且活性類似於交聯OX40 Fcab (FS20-22-49AA/4420交聯(Xlink))之活性。僅抗CD137對照抗體(G2/MOR7480.1)在存在及不存在交聯之情況下發現極小活性。
圖4 展示在人類泛T細胞活化分析中，CD137 mAb、OX40 Fcab及OX40/CD137 mAb2 之活性。在存在指定mAb/mAb2 ，且存在及不存在交聯劑(對於抗FITC mAb及OX40/FITC假擬mAb2 對照，FITC-葡聚糖，且對於所測試之所有其他分子，抗人類CH2抗體)之情況下，量測IL-2釋放。圖4A展示在存在濃度為3.7 nM之mAb及mAb2 之情況下的IL-2釋放。結果展示，僅OX40/CD137 mAb2 在不存在人工交聯劑之情況下增加T細胞活化。靶向OX40之抗體G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420，及抗CD137抗體G1AA/20H4.9僅在存在交聯劑之情況下展示增加的T細胞活化。對於抗CD137抗體G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16，甚至在存在人工交聯劑之情況下未偵測到活性，證實如圖3A中所報導之SEA分析結果。圖 4B 展示在存在及不存在人工交聯劑(抗人類CH2抗體)之情況下，由增加濃度之OX40/CD137 mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16誘導的IL-2釋放。OX40/CD137 mAb2 在存在及不存在人工交聯劑之情況下具有相當活性。圖 4C 展示在存在增加濃度之OX40/CD137 mAb2 及對照，不存在人工交聯劑之情況下的IL-2釋放，而圖 4D 展示在存在增加濃度之單劑對照G1/4420、G1/11D4、G2/MOR7480.1及FS20-22-49AA/4420，存在人工交聯劑(視需要FITC-葡聚糖或抗人類CH2抗體)之情況下的IL-2釋放。結果展示，在不存在人工交聯劑之情況下，OX40/CD137 mAb2 具有次奈莫耳(sub-nanomolar)或單數位(single-digit)奈莫耳活性。如所預期，無論交聯劑是否存在，G1/4420對照不具有活性。在不存在交聯劑之情況下，對照G1/11D4、FS20-22-49AA/4420、G2/MOR7480.1及G1/11D4與G2/MOR7480.1之組合具有很少活性或不具有活性。當由抗人類CH2抗體或FITC-葡聚糖交聯時，單劑抗OX40及抗CD137對照展現T細胞活化之濃度依賴性增加，由此表明分析能夠偵測經T細胞上之OX40或CD137受體的信號傳遞。
圖5 展示CD4+及CD8+ T細胞活化分析中之人類OX40/CD137 mAb2 的活性。圖 5A 及圖 5B 展示在存在增加濃度之mAb及mAb2 的情況下，CD4+ T細胞活化分析中之IL-2釋放，如所指示。在存在(圖 5B )或不存在(圖 5A )人工交聯劑(對於抗FITC mAb及OX40/FITC假擬mAb2 對照，FITC-葡聚糖，且對於所測試之所有其他分子，抗人類CH2抗體)之情況下，測試mAb及mAb2 。結果展示，OX40/CD137 mAb2 能夠在不存在人工交聯劑之情況下活化CD4+ T細胞。CD4+ T細胞由交聯抗OX40對照G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420 (單獨及與G1AA/FS30-10-16組合)活化，而非由單劑抗CD137對照G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16活化。當未交聯時，抗OX40對照FS20-22-49AA/4420亦展示在存在CD4+ T細胞之情況下的低位準活性，該活性在該抗體交聯後極大地增加。因此展示由FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 及FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 二者共有之抗OX40 Fcab能夠在抗體藉由人工交聯劑或Fab結合至CD137交聯時，經由對OX40之促效作用活化CD4+ T細胞。圖 5C 及圖 5D 展示在存在增加濃度之mAb及mAb2 的情況下，CD8+ T細胞活化分析中之IL-2釋放，如所指示。在存在(圖 5D )或不存在(圖 5C )人工交聯劑(參見圖5A及圖5B之圖例以獲得詳述)之情況下，測試mAb及mAb2 。結果展示，OX40/CD137 mAb2 能夠在不存在人工交聯劑之情況下活化CD8+ T細胞。針對抗CD137對照G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16 (單獨及與S20-22-49AA/4420組合)二者，觀測到CD8+ T細胞活化，以及在存在人工交聯劑之情況下，由抗OX40對照FS20-22-49AA/4420，及在較低程度上，G1AA/11D4引起之活化。因此展示為G1AA/FS30-10-16對照mAb及FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 二者所共有之抗CD137 Fab臂能夠在抗體藉由人工交聯劑或Fcab結合至OX40交聯時，對在CD8+ T細胞上表現之CD137起促效作用，而由FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 及FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 二者共有之抗OX40 Fcab能夠在抗體藉由人工交聯劑或Fab結合至CD137聯時，經由對OX40之促效作用活化CD8+ T細胞。圖 5E 及圖 5F 展示在存在濃度為3.7 nM之mAb/mAb2 ，且存在或不存在人工交聯劑(參見圖5A及圖5B之圖例以獲得詳述)之情況下，分別CD4+及CD8+ T細胞活化分析中的IL-2釋放。圖 5E 展示OX40/CD137 mAb2 能夠在不存在人工交聯劑之情況下活化CD4+ T細胞。CD4+ T細胞由交聯抗OX40對照G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420活化，而非由單劑抗CD137對照G1AA/MOR7480.1及G1AA/FS30-10-16活化。在未交聯時，抗OX40對照FS20-22-49AA/4420亦展示低位準活性，該活性在該抗體交聯後極大地增加。因此展示由FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 及FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 二者共有之抗OX40 Fcab能夠在抗體藉由人工交聯劑或Fab結合至CD137交聯時，經由對OX40之促效作用活化CD4+ T細胞。圖 5F 展示OX40/CD137 mAb2 能夠在不存在人工交聯劑之情況下活化CD8+ T細胞。針對抗CD137對照G1AA/20H4.9及G1AA/FS30-10-16 (單獨及與FS20-22-49AA/4420組合)，觀測到CD8+ T細胞活化，而針對抗CD137對照G1AA/MOR7480.1或針對交聯抗OX40對照G1AA/11D4及FS20-22-49AA/4420，未觀測到活化。在不存在人工交聯劑之情況下，針對抗CD137對照G1AA/20H4.9亦觀測到CD8+ T細胞活化。因此展示為G1AA/FS30-10-16對照mAb及FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 二者所共有之抗CD137 Fab臂能夠在抗體藉由人工交聯劑或Fcab結合至OX40交聯時，對在CD8+ T細胞上表現之CD137起促效作用。
圖6 展示與CD8+ T細胞相比，CD4+ T細胞表現較低位準之CD137及較高位準之OX40。圖解展示經G1AA/MOR7480.1或G1AA/11D4處理之CD4+或CD8+ T細胞的幾何平均螢光強度(GMFI)。G1AA/MOR7480.1與CD137之結合為CD137表現之量度，且G1AA/11D4與OX40之結合為OX40表現之量度。
圖7 展示T細胞活化分析中抗小鼠CD137 mAb及mAb2 之活性。
圖7A 及圖 7B 展示在存在增加濃度之結合小鼠OX40及小鼠CD137受體的mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3)，不存在(圖7A )及存在(圖7B )人工交聯劑(視需要，抗人類CH2抗體或FITC-葡聚糖)之情況下的IL-2釋放。對照為抗體G1/4420 (抗FITC)、G1AA/OX86 (抗mOX40)、G1AA/Lob12.3 (抗mCD137)、G1AA/OX86外加G1AA/Lob12.3之組合，及FS20m-232-91AA/4420 (mOX40/FITC假擬mAb2 )。結果展示，在不存在交聯劑之情況下，對照G1AA/OX86、FS20m-232-91AA/4420、G1AA/Lob12.3及G1AA/OX86與G1AA/Lob12.3之組合不具有活性。當由抗人類CH2抗體或FITC-葡聚糖交聯時，G1AA/OX86、FS20m-232-91AA/4420及G1AA/OX86外加G1AA/Lob12.3對照展現T細胞活化之濃度依賴性增加。在交聯時，針對G1AA/Lob12.3對照觀測到活性之邊際增加。無論是否存在人工交聯劑，OX40/CD137 mAb2 展示良好活性。圖 7C 及圖 7D 展示在CD3刺激DO11.10-mCD137細胞中，不同抗小鼠CD137抗體(G1AA/Lob12.3及G1AA/3H3)在不存在(圖7C )或存在(圖7D )交聯抗體(純系MK1A6)之情況下的活性。在存在及不存在交聯抗體之情況下觀測到G1AA/3H3之活性，而僅在存在交聯抗體之情況下觀測到G1AA/Lob12.3抗體之活性。因此，G1AA/3H3抗體被稱為『非交聯依賴性的』且G1AA/Lob12.3抗體被稱為『交聯依賴性的』。
圖8 展示在存在100倍過量之靶向人類OX40的假擬mAb2 (FS20-22-49AA/4420)、抗人類CD137抗體(G1AA/FS30-10-16)或其組合之情況下，測試人類OX40/CD137 mAb2 純系FS20-22-49AA/FS30-10-16之活性的競爭分析。來自重複實驗之資料以平均值加或減標準差(SD)之形式展示。藉由單因子變異數分析(one-way ANOVA)及鄧尼特氏多重比較檢定(Dunnett’s multiple comparisons test)進行統計檢定。誤差杠上方之星號表示與同型對照(G1/4420)處理樣品相比之顯著差異(*** p>0.0002)。結果展示，相比於OX40/CD137 mAb2 能夠在不存在抗OX40及抗CD137抗體之情況下結合至二種受體時，在對於與OX40結合被FS20-22-49AA/4420假擬mAb2 競爭超過，對於與CD137結合被G1AA/FS30-10-16 mAb競爭超過時，OX40/CD137 mAb2 之活性極大地降低。靶向OX40之假擬mAb2 FS20-22-49AA/4420與抗CD137 mAb G1AA/FS30-10-16之組合進一步降低OX40/CD137 mAb2 之活性。此等結果表明，為了使OX40/CD137 mAb2 經由OX40及CD137之聚集及促效作用誘導T細胞活化，mAb2 與二種受體之雙重結合係必需的。
圖9 展示在存在100倍過量之靶向OX40之假擬mAb2 FS20m-232-91AA/4420、抗CD137 mAb G1/Lob12.3或陰性對照mAb G1AA/4420 (抗FITC)之情況下，測試小鼠OX40/CD137 mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3之活性的競爭分析。結果展示，相比於mAb2 能夠在不存在抗OX40及抗CD137抗體之情況下結合至二種受體時，mAb2 之活性在對於與CD137結合被G1/Lob12.3 mAb競爭超過時極大地降低，且在對於與OX40結合被FS20m-232-91AA/4420假擬mAb2 競爭超過時亦降低至低位準。如所預期，在存在過量之陰性對照mAb之情況下時，針對mAb2 觀測到與在不存在此陰性對照mAb及抗OX40及抗CD137抗體之情況下時類似位準的活性。此等結果表明，為了使mAb2 經由OX40及CD137之聚集及促效作用誘導T細胞活化，mAb2 與二種受體之雙重結合係必需的。
圖10 展示CT26同基因型腫瘤模型中抗小鼠OX40/CD137 mAb2 之抗腫瘤活性。在圖 10A 中，展示經以下物質處理之Balb/c小鼠之平均CT26腫瘤體積(加或減平均值之標準誤差)：G1/OX86 (不具有LALA突變之抗OX40陽性對照)、G1/Lob12.3 (不具有LALA突變之抗CD137陽性對照)、G1/4420 (IgG對照)、G1/OX86與G1/Lob12.3之組合、抗OX40 mAb G1AA/OX86與抗CD137 mAb G1AA/Lob12.3之組合(二者均具有LALA突變)、FS20m-232-91/Lob12.3 (不具有LALA突變之OX40/CD137 mAb2 )及FS20m-232-91AA/Lob12.3 (具有LALA突變之OX40/CD137 mAb2 )。結果展示，與用抗OX40抗體G1/OX86、抗CD137抗體G1/Lob12.3、此等二種抗體之組合(G1/OX86外加G1/Lob12.3)及含LALA抗OX40及抗CD137抗體之組合(G1AA/OX86外加G1AA/Lob12.3)進行之處理相比，用具有或不具有LALA突變之OX40/CD137 mAb2 (分別FS20m-232-91AA/Lob12.3及FS20m-232-91/Lob12.3)進行之處理引起腫瘤生長之減少。圖 10B 展示經由腹膜內注射3 mg/kg以下物質處理之個別帶有CT26腫瘤之小鼠的腫瘤體積(隨時間推移)：同型對照(純系G1AA/4420)、mOX40/FITC假擬mAb2 (純系FS20m-232-91AA/4420)、抗mCD137 mAb (純系G1AA/Lob12.3)、mOX40/FITC假擬mAb2 與抗mCD137 mAb之組合，或mOX40/CD137 mAb2 (純系FS20m-232-91AA/Lob12.3)。水平虛線指示0 mm3 在y軸上所處的位置。定性地，mOX40/CD137 mAb2 及mOX40/FITC假擬mAb2 與抗mCD137 mAb之組合在一小組動物中抑制CT26腫瘤生長。圖 10C 展示在圖10B中個別地表示之帶有CT26腫瘤之小鼠的平均腫瘤體積(加或減平均值之標準誤差)。與同型對照組相比，經mOX40/CD137 mAb2 處理之組具有延緩的早期腫瘤生長期(第10天至第22天)。呈單劑或組合形式之抗mCD137 mAb及mOX40/FITC假擬mAb2 對早期腫瘤生長速率沒有影響。圖 10D 展示圖10B及圖10C中所表示之相同的帶有CT26腫瘤之小鼠的卡本-麥爾(Kaplan-Meier)存活曲線。存活分析展示，用mOX40/CD137 mAb2 進行之處理，而非用呈單劑或組合形式之抗mCD137 mAb及mOX40/FITC假擬mAb2 進行之處理，引起與同型對照相比，存活之統計顯著增加。(使用對數秩(曼特爾-考克斯(Mantel-Cox))檢定進行成對比較；**** p ≤ 0.0001，ns =非統計顯著。)
圖11 展示B16-F10同基因型腫瘤模型中抗小鼠OX40/CD137 mAb2 之抗腫瘤活性。小鼠經FS20m-232-91AA/Lob12.3 (OX40/CD137 mAb2 )或G1/4420 (IgG對照)處理。繪製平均腫瘤體積加或減標準誤差均值。結果展示，與經G1/4420對照抗體處理之小鼠相比，OX40/CD137 mAb2 能夠在B16-F10同基因型模型中顯著減少腫瘤生長。
圖12 展示SEA分析中OX40/CD137 mAb2 與抗PD-1或抗PD-L1抗體之組合的活性。所測試之mAb2 為FS20-22-49AA/FS30-10-16。對照為G1/4420 (抗FITC)、G1AA/S1 (抗PD-L1；圖12A )、G1AA/5C4 (抗PD-1；圖12B )，該等對照在存在或不存在FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 之情況下測試。結果展示當FS20-22-49AA/FS30-10-16存在時T細胞活化之濃度依賴性增加，且相比於經單獨的mAb2 處理之T細胞，將G1AA/S1或G1AA/5C4添加至FS20-22-49AA/FS30-10-16 mAb2 增加IL-2釋放(最大反應)。當T細胞經單獨的對照抗體處理時，未發現活性。使用雙因子變異數分析及杜凱氏多重比較檢定(Tukey's multiple comparison test)進行G1/4420外加FS20-22-49AA/FS30-10-16及G1AA/S1外加FS20-22-49AA/FS30-10-16 (圖12A )，或G1/4420外加FS20-22-49AA/FS30-10-16及G1AA/5C4外加FS20-22-49AA/FS30-10-16 (圖12B )之組之間的統計檢定，其中星號指示p值(* p > 0.032，** p > 0.0021，*** p > 0.0002，**** p > 0.0001)。
圖 13 展示單獨及以組合形式測試之CT26小鼠腫瘤模型中抗小鼠OX40/CD137 mAb2 及PD-1拮抗劑之抗腫瘤活性。展示經以下物質處理之帶有CT26腫瘤之小鼠中的腫瘤體積：(圖13A )同型對照抗體之組合(G1AA/4420及mIgG1/4420)、(圖13B )抗小鼠PD-1抗體、(圖13C )抗小鼠OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 )或(圖13D )抗小鼠PD-1抗體與抗小鼠OX40/CD137 mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 mAb2 之組合。展示各處理組在細胞接種之後60天研究終止時具有消退腫瘤(被定義為小於或等於62.5 mm3 之腫瘤體積)之小鼠的比例。結果展示抗PD-1拮抗劑抗體與FS20m-232-91AA/Lob12.3之組合引起具有完全腫瘤消退反應之動物的最高比例，15分之7 (47%)(圖13D )。在研究結束時，經受用抗PD-1抗體(圖 13B )或FS20m-232-91AA/Lob12.3 (圖 13C )進行之單劑處理的小鼠分別展示0%及7%腫瘤消退。圖 13E 展示如針對圖 13A 至 圖13D 描述所處理之帶有CT26腫瘤之小鼠的卡本-麥爾存活曲線。存活分析展示FS20m-232-91AA/Lob12.3與抗PD-1抗體之組合，引起與同型對照抗體相比之統計顯著存活益處(對數秩(曼特爾考克斯)檢定，p > 0.0001)。與同型對照抗體相比，針對單劑治療未觀測到顯著存活差異。
圖14 展示CT26同基因型腫瘤模型中抗小鼠OX40/CD137 mAb2 之劑量依賴性抗腫瘤活性。圖 14A 展示經由用10 mg/kg同型對照抗體(G1AA/4420)，或0.1、0.3、1、3或10 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3腹膜內(i.p.)注射處理之帶有CT26腫瘤之小鼠的腫瘤體積。展示各處理組在細胞接種之後67天研究終止時具有消退腫瘤(被定義為小於或等於62.5 mm3 之腫瘤體積)之小鼠的比例(參見各圖之右上方)。結果展示，在研究結束時，0.3、1、3或10 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3分別引起4% (1/25)、4% (1/25)、8% (2/25)及4% (1/25)之動物中的腫瘤消退。同型對照及0.1 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3組中之動物中無一者展示腫瘤消退。圖 14B 展示如針對圖14A描述所處理之帶有CT26腫瘤之小鼠的卡本-麥爾存活曲線。存活分析展示，與同型對照相比，處於所測試之所有劑量位準下的FS20m-232-91AA/Lob12.3引起統計顯著存活益處。1 mg/kg與3 mg/kg組，及3 mg/kg與10 mg/kg組之比較未展示存活的統計學差異。除非指定，否則使用對數秩(曼特爾-考克斯)檢定進行各組與10 mg/kg同型對照之間的成對比較；* p ≤ 0.05，*** p ≤ 0.0005，**** p ≤ 0.0001，ns =非統計顯著。
圖15 展示CT26同基因型腫瘤模型中含有不同抗CD137 Fab純系之OX40/CD137 mAb2 抗體之抗腫瘤功效的比較。圖 15A 展示經以下物質處理之BALB/c小鼠中的平均CT26腫瘤體積：G1/4420 (IgG對照)、FS20m-232-91AA/Lob12.3 (OX40/CD137 mAb2 伴隨交聯依賴性CD137促效劑純系Lob12.3)及FS20m-232-91AA/3H3 (OX40/CD137 mAb2 伴隨非交聯依賴性CD137促效劑純系3H3)。展示平均腫瘤體積加或減平均值之標準誤差。結果展示，與用同型對照抗體(G1/4420)進行之處理相比，用OX40/CD137 mAb2 抗體(FS20m-232-91AA/Lob12.3或FS20m-232-91AA/3H3)中之任一者進行之處理引起腫瘤生長之減少，且在經FS20m-232-91AA/Lob12.3或FS20m-232-91AA/3H3處理之小鼠中未觀測到減少位準的差異。圖 15B 展示如針對圖15A描述所處理之帶有CT26腫瘤之小鼠的卡本-麥爾存活曲線。存活分析展示，與用同型對照抗體進行之處理相比，用OX40/CD137 mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3或FS20m-232-91AA/3H3)中之任一者進行之處理引起統計顯著存活益處(對數秩(曼特爾考克斯)檢定；p > 0.05)，但在經OX40/CD137 mAb2 中之任一者處理之小鼠之間未觀測到差異。
<110> 英商F-星治療有限公司(F-STAR THERAPEUTICS LIMITED)
<120> 結合CD137及OX40的抗體分子
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<160> 175
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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Figure 108124753-A0305-02-0299-1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 2
Figure 108124753-A0305-02-0299-2
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16 mAb(IMGT)VH CDR3
<400> 3
Figure 108124753-A0305-02-0300-3
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16 mAb(IMGT)VL CDR1
<400> 4
Figure 108124753-A0305-02-0300-4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16 mAb(IMGT)VL CDR2
<400> 5
Figure 108124753-A0305-02-0300-5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16 mAb(IMGT)VL CDR3
<400> 6
Figure 108124753-A0305-02-0301-6
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 7
Figure 108124753-A0305-02-0301-7
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> FS30-10-16 mAb(Kabat)VH CDR2
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Figure 108124753-A0305-02-0301-8
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108124753-A0305-02-0301-9
Figure 108124753-A0305-02-0302-10
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 108124753-A0305-02-0302-11
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 108124753-A0305-02-0302-12
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 12
Figure 108124753-A0305-02-0302-13
Figure 108124753-A0305-02-0303-14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16 mAb之重鏈可變域
<400> 13
Figure 108124753-A0305-02-0303-15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16 mAb之輕鏈可變域
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16 mAb之輕鏈可變域
<400> 15
Figure 108124753-A0305-02-0304-17
Figure 108124753-A0305-02-0305-18
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 108124753-A0305-02-0305-19
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-3 mAb(Kabat)VH CDR3
<400> 17
Figure 108124753-A0305-02-0305-20
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> FS30-10-3 mAb之重鏈可變域
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Figure 108124753-A0305-02-0305-21
Figure 108124753-A0305-02-0306-22
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Figure 108124753-A0305-02-0306-23
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<211> 324
<212> DNA
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<220>
<223> FS30-10-3 mAb之輕鏈可變域
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Figure 108124753-A0305-02-0307-24
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-12 mAb(IMGT)VH CDR3
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Figure 108124753-A0305-02-0307-25
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-12 mAb(Kabat)VH CDR3
<400> 22
Figure 108124753-A0305-02-0307-26
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-12 mAb之重鏈可變域
<400> 23
Figure 108124753-A0305-02-0308-27
<210> 24
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-12 mAb之重鏈可變域
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Figure 108124753-A0305-02-0308-28
Figure 108124753-A0305-02-0309-29
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<212> PRT
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Figure 108124753-A0305-02-0309-30
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108124753-A0305-02-0309-31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb(IMGT)VH CDR3
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Figure 108124753-A0305-02-0309-32
Figure 108124753-A0305-02-0310-33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb(IMGT)VL CDR3
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Figure 108124753-A0305-02-0310-34
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb(Kabat)VH CDR1
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Figure 108124753-A0305-02-0310-35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb(Kabat)VH CDR2
<400> 30
Figure 108124753-A0305-02-0310-36
<210> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb(Kabat)VH CDR3
<400> 31
Figure 108124753-A0305-02-0311-37
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb之輕鏈可變域
<400> 32
Figure 108124753-A0305-02-0311-38
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb(IMGT)VH CDR1
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Figure 108124753-A0305-02-0311-39
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb(IMGT)VH CDR2
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Figure 108124753-A0305-02-0312-40
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
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<220>
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<400> 35
Figure 108124753-A0305-02-0312-41
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb(IMGT)VL CDR3
<400> 36
Figure 108124753-A0305-02-0312-42
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb(Kabat)VH CDR1
<400> 37
Figure 108124753-A0305-02-0313-43
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb(Kabat)VH CDR2
<400> 38
Figure 108124753-A0305-02-0313-44
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb(Kabat)VH CDR3
<400> 39
Figure 108124753-A0305-02-0313-45
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb之重鏈可變域
<400> 40
Figure 108124753-A0305-02-0314-46
<210> 41
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb之重鏈可變域
<400> 41
Figure 108124753-A0305-02-0314-48
Figure 108124753-A0305-02-0315-49
<210> 42
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb之輕鏈可變域
<400> 42
Figure 108124753-A0305-02-0315-50
<210> 43
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37 mAb之輕鏈可變域
<400> 43
Figure 108124753-A0305-02-0316-51
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT CH3域AB環
<400> 44
Figure 108124753-A0305-02-0316-52
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT CH3域CD環
<400> 45
Figure 108124753-A0305-02-0316-53
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT CH3域EF環
<400> 46
Figure 108124753-A0305-02-0317-54
<210> 47
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT CH3域
<400> 47
Figure 108124753-A0305-02-0317-55
<210> 48
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2域
<400> 48
Figure 108124753-A0305-02-0318-56
<210> 49
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之CH2域
<400> 49
Figure 108124753-A0305-02-0318-57
Figure 108124753-A0305-02-0319-58
<210> 50
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變及P114A突變之CH2域
<400> 50
Figure 108124753-A0305-02-0319-59
Figure 108124753-A0305-02-0320-60
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域結構環序列
<400> 51
Figure 108124753-A0305-02-0320-61
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域結構環序列
<400> 52
Figure 108124753-A0305-02-0320-62
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域結構環序列
<400> 53
Figure 108124753-A0305-02-0320-63
Figure 108124753-A0305-02-0321-64
<210> 54
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域
<400> 54
Figure 108124753-A0305-02-0321-65
<210> 55
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域
<400> 55
Figure 108124753-A0305-02-0322-66
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域AB環
<400> 56
Figure 108124753-A0305-02-0322-67
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域CD環
<400> 57
Figure 108124753-A0305-02-0322-68
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域EF環
<400> 58
Figure 108124753-A0305-02-0323-69
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-38 CH3域結構環序列
<400> 59
Figure 108124753-A0305-02-0323-70
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-38 CH3域結構環序列
<400> 60
Figure 108124753-A0305-02-0323-71
<210> 61
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-38 CH3域
<400> 61
Figure 108124753-A0305-02-0323-72
Figure 108124753-A0305-02-0324-74
<210> 62
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-38 CH3域
<400> 62
Figure 108124753-A0305-02-0324-75
<210> 63
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-41 CH3域
<400> 63
Figure 108124753-A0305-02-0325-76
<210> 64
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-41 CH3域
<400> 64
Figure 108124753-A0305-02-0325-77
Figure 108124753-A0305-02-0326-78
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-47 CH3域結構環序列
<400> 65
Figure 108124753-A0305-02-0326-79
<210> 66
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-47 CH3域
<400> 66
Figure 108124753-A0305-02-0326-80
Figure 108124753-A0305-02-0327-81
<210> 67
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-47 CH3域
<400> 67
Figure 108124753-A0305-02-0327-82
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-85 CH3域結構環序列
<400> 68
Figure 108124753-A0305-02-0327-83
<210> 69
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-85 CH3域
<400> 69
Figure 108124753-A0305-02-0328-84
<210> 70
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-85 CH3域
<400> 70
Figure 108124753-A0305-02-0328-339
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-58 CH3域結構環序列
<400> 71
Figure 108124753-A0305-02-0329-86
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-58 CH3域結構環序列
<400> 72
Figure 108124753-A0305-02-0329-87
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-58 CH3域結構環序列
<400> 73
Figure 108124753-A0305-02-0329-88
<210> 74
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-58 CH3域
<400> 74
Figure 108124753-A0305-02-0330-89
<210> 75
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-58 CH3域
<400> 75
Figure 108124753-A0305-02-0330-90
Figure 108124753-A0305-02-0331-91
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-66 CH3域結構環序列
<400> 76
Figure 108124753-A0305-02-0331-92
<210> 77
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-66 CH3域
<400> 77
Figure 108124753-A0305-02-0331-93
Figure 108124753-A0305-02-0332-94
<210> 78
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-66 CH3域
<400> 78
Figure 108124753-A0305-02-0332-95
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域結構環序列
<400> 79
Figure 108124753-A0305-02-0332-96
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域結構環序列
<400> 80
Figure 108124753-A0305-02-0333-97
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域結構環序列
<400> 81
Figure 108124753-A0305-02-0333-98
<210> 82
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域
<400> 82
Figure 108124753-A0305-02-0333-99
Figure 108124753-A0305-02-0334-100
<210> 83
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域
<400> 83
Figure 108124753-A0305-02-0334-101
<210> 84
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-102 CH3域結構環序列
<400> 84
Figure 108124753-A0305-02-0334-102
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-102 CH3域結構環序列
<400> 85
Figure 108124753-A0305-02-0335-103
<210> 86
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-102 CH3域
<400> 86
Figure 108124753-A0305-02-0335-104
<210> 87
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-102 CH3域
<400> 87
Figure 108124753-A0305-02-0336-105
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-108 CH3域結構環序列
<400> 88
Figure 108124753-A0305-02-0336-106
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-108 CH3域結構環序列
<400> 89
Figure 108124753-A0305-02-0336-107
<210> 90
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-108 CH3域
<400> 90
Figure 108124753-A0305-02-0337-108
<210> 91
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-108 CH3域
<400> 91
Figure 108124753-A0305-02-0337-109
Figure 108124753-A0305-02-0338-110
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-115 CH3域結構環序列
<400> 92
Figure 108124753-A0305-02-0338-111
<210> 93
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-115 CH3域
<400> 93
Figure 108124753-A0305-02-0338-112
Figure 108124753-A0305-02-0339-113
<210> 94
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-31-115 CH3域
<400> 94
Figure 108124753-A0305-02-0339-114
<210> 95
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-16的重鏈
<400> 95
Figure 108124753-A0305-02-0339-115
Figure 108124753-A0305-02-0340-116
Figure 108124753-A0305-02-0341-117
<210> 96
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-16的重鏈
<400> 96
Figure 108124753-A0305-02-0342-118
Figure 108124753-A0305-02-0343-119
<210> 97
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16之輕鏈(
<400> 97
Figure 108124753-A0305-02-0343-120
Figure 108124753-A0305-02-0344-121
<210> 98
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-16之輕鏈(
<400> 98
Figure 108124753-A0305-02-0344-122
Figure 108124753-A0305-02-0345-123
<210> 99
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-3的重鏈
<400> 99
Figure 108124753-A0305-02-0345-124
Figure 108124753-A0305-02-0346-125
Figure 108124753-A0305-02-0347-126
<210> 100
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-3的重鏈
<400> 100
Figure 108124753-A0305-02-0347-127
Figure 108124753-A0305-02-0348-128
<210> 101
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短Fcab鉸鏈區
<400> 101
Figure 108124753-A0305-02-0348-129
<210> 102
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-10-3之輕鏈
<400> 102
Figure 108124753-A0305-02-0349-130
<210> 103
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-12的重鏈
<400> 103
Figure 108124753-A0305-02-0349-131
Figure 108124753-A0305-02-0350-132
Figure 108124753-A0305-02-0351-133
<210> 104
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-10-12的重鏈
<400> 104
Figure 108124753-A0305-02-0352-134
Figure 108124753-A0305-02-0353-135
<210> 105
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-35-14的重鏈
<400> 105
Figure 108124753-A0305-02-0353-136
Figure 108124753-A0305-02-0354-137
Figure 108124753-A0305-02-0355-138
<210> 106
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-35-14的重鏈
<400> 106
Figure 108124753-A0305-02-0355-340
Figure 108124753-A0305-02-0356-140
<210> 107
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14之輕鏈
<400> 107
Figure 108124753-A0305-02-0356-141
Figure 108124753-A0305-02-0357-142
Figure 108124753-A0305-02-0358-143
<210> 108
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14之輕鏈
<400> 108
Figure 108124753-A0305-02-0358-144
<210> 109
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-5-37的重鏈
<400> 109
Figure 108124753-A0305-02-0358-145
Figure 108124753-A0305-02-0359-146
Figure 108124753-A0305-02-0360-147
Figure 108124753-A0305-02-0361-148
<210> 110
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之FS20-22-49AA/FS30-5-37的重鏈
<400> 110
Figure 108124753-A0305-02-0361-149
Figure 108124753-A0305-02-0362-150
<210> 111
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37之輕鏈
<400> 111
Figure 108124753-A0305-02-0362-151
Figure 108124753-A0305-02-0363-152
<210> 112
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-5-37之輕鏈
<400> 112
Figure 108124753-A0305-02-0363-153
Figure 108124753-A0305-02-0364-154
<210> 113
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 替代性Fcab FS20-22-49 CH3域
<400> 113
Figure 108124753-A0305-02-0364-155
<210> 114
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含LALA突變之抗FITC mAb G1AA/4420的重鏈
<400> 114
Figure 108124753-A0305-02-0364-156
Figure 108124753-A0305-02-0365-157
Figure 108124753-A0305-02-0366-158
Figure 108124753-A0305-02-0367-159
<210> 115
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不具有LALA突變之抗FITC mAb G1/4420的重鏈
<400> 115
Figure 108124753-A0305-02-0367-160
Figure 108124753-A0305-02-0368-161
Figure 108124753-A0305-02-0369-162
<210> 116
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4420 mAb之輕鏈
<400> 116
Figure 108124753-A0305-02-0369-163
Figure 108124753-A0305-02-0370-164
<210> 117
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有LALA突變之G1AA/HelD1.3抗體的重鏈
<400> 117
Figure 108124753-A0305-02-0371-165
Figure 108124753-A0305-02-0372-166
Figure 108124753-A0305-02-0373-167
<210> 118
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HelD1.3 mAb之輕鏈
<400> 118
Figure 108124753-A0305-02-0373-168
Figure 108124753-A0305-02-0374-169
<210> 119
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1/MOR7480.1之重鏈
<400> 119
Figure 108124753-A0305-02-0374-170
Figure 108124753-A0305-02-0375-171
Figure 108124753-A0305-02-0376-172
Figure 108124753-A0305-02-0377-173
<210> 120
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1/MOR7480.1、G1AA/MOR7480.1及G2/MOR7480.1 mAb之輕鏈
<400> 120
Figure 108124753-A0305-02-0377-174
Figure 108124753-A0305-02-0378-175
<210> 121
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1/20H4.9之重鏈
<400> 121
Figure 108124753-A0305-02-0378-176
Figure 108124753-A0305-02-0379-177
Figure 108124753-A0305-02-0380-178
<210> 122
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1/20H4.9及G1AA/20H4.9 mAb之輕鏈
<400> 122
Figure 108124753-A0305-02-0381-179
Figure 108124753-A0305-02-0382-180
<210> 123
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49AA/4420之重鏈(具有LALA突變)
<400> 123
Figure 108124753-A0305-02-0382-181
Figure 108124753-A0305-02-0383-182
Figure 108124753-A0305-02-0384-183
<210> 124
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G2/MOR7480.1之重鏈
<400> 124
Figure 108124753-A0305-02-0384-184
Figure 108124753-A0305-02-0385-185
Figure 108124753-A0305-02-0386-186
Figure 108124753-A0305-02-0387-187
<210> 125
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1AA/MOR7480.1之重鏈
<400> 125
Figure 108124753-A0305-02-0387-188
Figure 108124753-A0305-02-0388-189
Figure 108124753-A0305-02-0389-190
<210> 126
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人CD137
<400> 126
Figure 108124753-A0305-02-0389-191
Figure 108124753-A0305-02-0390-192
<210> 127
<211> 163
<212> PRT
<213> 智人CD137胞外域
<400> 127
Figure 108124753-A0305-02-0391-193
<210> 128
<211> 231
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴CD137
<400> 128
Figure 108124753-A0305-02-0392-194
Figure 108124753-A0305-02-0393-195
<210> 129
<211> 163
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴CD137胞外域
<400> 129
Figure 108124753-A0305-02-0393-196
Figure 108124753-A0305-02-0394-197
<210> 130
<211> 186
<212> PRT
<213> 智人OX40胞外域
<400> 130
Figure 108124753-A0305-02-0394-198
Figure 108124753-A0305-02-0395-199
<210> 131
<211> 186
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴OX40胞外域
<400> 131
Figure 108124753-A0305-02-0395-200
Figure 108124753-A0305-02-0396-201
<210> 132
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DO11.10-hOX40及人類OX40受體
<400> 132
Figure 108124753-A0305-02-0396-202
Figure 108124753-A0305-02-0397-203
Figure 108124753-A0305-02-0398-204
<210> 133
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D011.10-mOX40及小鼠OX40受體
<400> 133
Figure 108124753-A0305-02-0398-205
Figure 108124753-A0305-02-0399-206
<210> 134
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DO11.10-cOX40及食蟹獼猴OX40受體
<400> 134
Figure 108124753-A0305-02-0399-207
Figure 108124753-A0305-02-0400-208
<210> 135
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人OX40-mFc
<400> 135
Figure 108124753-A0305-02-0401-209
Figure 108124753-A0305-02-0402-210
Figure 108124753-A0305-02-0403-211
<210> 136
<211> 447
<212> PRT
<213> 鼠類OX40-mFc
<400> 136
Figure 108124753-A0305-02-0403-212
Figure 108124753-A0305-02-0404-213
Figure 108124753-A0305-02-0405-214
<210> 137
<211> 444
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴OX40-mFc
<400> 137
Figure 108124753-A0305-02-0405-215
Figure 108124753-A0305-02-0406-216
Figure 108124753-A0305-02-0407-217
Figure 108124753-A0305-02-0408-218
<210> 138
<211> 164
<212> PRT
<213> 用於在CD137-mFc-Avi重組抗原之情況下使用的智人CD137序列
<400> 138
Figure 108124753-A0305-02-0408-219
Figure 108124753-A0305-02-0409-220
<210> 139
<211> 164
<212> PRT
<213> 用於在CD137-mFc-Avi及CD137-Avi-His重組抗原之情況下使用的食蟹獼猴CD137序列
<400> 139
Figure 108124753-A0305-02-0409-221
Figure 108124753-A0305-02-0410-222
<210> 140
<211> 165
<212> PRT
<213> 用於在CD137-mFc-Avi重組抗原之情況下使用的鼠類CD137序列
<400> 140
Figure 108124753-A0305-02-0410-223
Figure 108124753-A0305-02-0411-224
<210> 141
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在CD137-mFc-Avi重組抗原之情況下使用的mFc-Avi
<400> 141
Figure 108124753-A0305-02-0411-225
Figure 108124753-A0305-02-0412-226
<210> 142
<400> 142 000
<210> 143
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fcab FS20-22-49 CH3域
<400> 143
Figure 108124753-A0305-02-0412-227
Figure 108124753-A0305-02-0413-228
<210> 144
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-5-37重鏈AA(不具有LALA)
<400> 144
Figure 108124753-A0305-02-0413-229
Figure 108124753-A0305-02-0414-230
Figure 108124753-A0305-02-0415-231
<210> 145
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-5-37重鏈AA(不具有LALA)
<400> 145
Figure 108124753-A0305-02-0415-232
Figure 108124753-A0305-02-0416-233
<210> 146
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-10-3重鏈AA(不具有LALA)
<400> 146
Figure 108124753-A0305-02-0417-234
Figure 108124753-A0305-02-0418-235
Figure 108124753-A0305-02-0419-236
<210> 147
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-10-3重鏈AA(不具有LALA)
<400> 147
Figure 108124753-A0305-02-0419-237
Figure 108124753-A0305-02-0420-238
<210> 148
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-10-12重鏈AA(不具有LALA)
<400> 148
Figure 108124753-A0305-02-0420-239
Figure 108124753-A0305-02-0421-240
Figure 108124753-A0305-02-0422-241
<210> 149
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-10-12重鏈AA(不具有LALA)
<400> 149
Figure 108124753-A0305-02-0423-242
<210> 150
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-10-16重鏈AA(不具有LALA)
<400> 150
Figure 108124753-A0305-02-0424-243
Figure 108124753-A0305-02-0425-244
Figure 108124753-A0305-02-0426-247
<210> 151
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-10-16重鏈AA(不具有LALA)
<400> 151
Figure 108124753-A0305-02-0426-246
Figure 108124753-A0305-02-0427-248
<210> 152
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-35-14重鏈AA(不具有LALA)
<400> 152
Figure 108124753-A0305-02-0427-249
Figure 108124753-A0305-02-0428-250
Figure 108124753-A0305-02-0429-251
Figure 108124753-A0305-02-0430-252
<210> 153
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20-22-49/FS30-35-14重鏈AA(不具有LALA)
<400> 153
Figure 108124753-A0305-02-0430-253
Figure 108124753-A0305-02-0431-254
<210> 154
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1AA/FS30-10-16 mAb之重鏈(具有LALA)
<400> 154
Figure 108124753-A0305-02-0431-255
Figure 108124753-A0305-02-0432-256
Figure 108124753-A0305-02-0433-257
<210> 155
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1AA/OX86 mAb之重鏈(具有LALA)
<400> 155
Figure 108124753-A0305-02-0433-258
Figure 108124753-A0305-02-0434-259
Figure 108124753-A0305-02-0435-260
Figure 108124753-A0305-02-0436-261
<210> 156
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1/OX86及G1AA/OX86 mAb之輕鏈
<400> 156
Figure 108124753-A0305-02-0436-262
Figure 108124753-A0305-02-0437-263
<210> 157
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS20m-232-91AA/4420之重鏈(具有LALA)
<400> 157
Figure 108124753-A0305-02-0437-264
Figure 108124753-A0305-02-0438-265
Figure 108124753-A0305-02-0439-266
<210> 158
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人CD137-Avi-His
<400> 158
Figure 108124753-A0305-02-0440-267
<210> 159
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1/OX86 mAb之重鏈(不具有LALA)
<400> 159
Figure 108124753-A0305-02-0441-268
Figure 108124753-A0305-02-0442-269
Figure 108124753-A0305-02-0443-270
<210> 160
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-1 mAb G1AA/5C4之重鏈
<400> 160
Figure 108124753-A0305-02-0443-271
Figure 108124753-A0305-02-0444-272
Figure 108124753-A0305-02-0445-273
<210> 161
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-1 mAb G1AA/5C4之輕鏈
<400> 161
Figure 108124753-A0305-02-0446-274
Figure 108124753-A0305-02-0447-275
<210> 162
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1 mAb G1AA/S1之重鏈
<400> 162
Figure 108124753-A0305-02-0447-276
Figure 108124753-A0305-02-0448-277
Figure 108124753-A0305-02-0449-278
<210> 163
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1 mAb G1AA/S1之輕鏈
<400> 163
Figure 108124753-A0305-02-0449-279
Figure 108124753-A0305-02-0450-280
<210> 164
<211> 233
<212> PRT
<213> 鼠類CD137
<400> 164
Figure 108124753-A0305-02-0451-281
Figure 108124753-A0305-02-0452-282
<210> 165
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1AA/20H4.9 mAb之重鏈
<400> 165
Figure 108124753-A0305-02-0452-283
Figure 108124753-A0305-02-0453-284
Figure 108124753-A0305-02-0454-285
<210> 166
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1AA/3H3 mAb之重鏈
<400> 166
Figure 108124753-A0305-02-0455-286
Figure 108124753-A0305-02-0456-287
Figure 108124753-A0305-02-0457-288
<210> 167
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> lG1AA/3H3及G1/3H3 mAb及FS20m-232-91AA/3H3 mAb2之輕鏈
<400> 167
Figure 108124753-A0305-02-0457-289
Figure 108124753-A0305-02-0458-290
<210> 168
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G1/3H3 mAb之重鏈
<400> 168
Figure 108124753-A0305-02-0458-291
Figure 108124753-A0305-02-0459-292
Figure 108124753-A0305-02-0460-293
Figure 108124753-A0305-02-0461-294
<210> 169
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈FS20m-232-91AA/3H3(具有LALA)
<400> 169
Figure 108124753-A0305-02-0461-295
Figure 108124753-A0305-02-0462-296
Figure 108124753-A0305-02-0463-297
<210> 170
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb之重鏈可變域
<400> 170
Figure 108124753-A0305-02-0463-298
Figure 108124753-A0305-02-0464-299
<210> 171
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb之重鏈可變域
<400> 171
Figure 108124753-A0305-02-0464-300
<210> 172
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb之輕鏈可變域
<400> 172
Figure 108124753-A0305-02-0465-302
<210> 173
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FS30-35-14 mAb之輕鏈可變域
<400> 173
Figure 108124753-A0305-02-0465-303
Figure 108124753-A0305-02-0466-304
<210> 174
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40 mAb G1/11D4之重鏈
<400> 174
Figure 108124753-A0305-02-0466-305
Figure 108124753-A0305-02-0467-306
Figure 108124753-A0305-02-0468-307
<210> 175
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40 mAb G1AA/11D4及G1/11D4之輕鏈
<400> 175
Figure 108124753-A0305-02-0468-308
Figure 108124753-A0305-02-0469-309
Figure 108124753-A0305-02-0470-310
(無)

Claims (24)

  1. 一種抗體分子，其結合至CD137及OX40，該抗體分子包含(a)一基於互補決定區(CDR)之CD137抗原結合位點；及(b)一OX40抗原結合位點，其定位於該抗體分子之一CH3域；其中根據ImMunoGeneTics(IMGT)編號方案界定，該基於CDR之抗原結合位點包含列舉於以下中之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3：(i)分別為SEQ ID NOs：1、2、3、4、5及6；(ii)分別為SEQ ID NOs：1、2、16、4、5及6；(iii)分別為SEQ ID NOs：1、2、21、4、5及6；(iv)分別為SEQ ID NOs：25、26、27、4、5及28；或(v)分別為SEQ ID NOs：33、34、35、4、5及36；或者其中根據Kabat編號方案界定，該基於CDR之抗原結合位點包含列舉於以下中之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3：(vi)分別為SEQ ID NOs：7、8、9、10、11及6；(vii)分別為SEQ ID NOs：7、8、17、10、11及6；(viii)分別為SEQ ID NOs：7、8、22、10、11及6；(ix)分別為SEQ ID NOs：29、30、31、10、11及28； 或(x)分別為SEQ ID NOs：37、38、39、10、11及36；且其中該OX40抗原結合位點包含分別定位於該CH3域之AB、CD及EF結構環中之一第一序列、一第二序列及一第三序列，其中該第一序列、該第二序列及該第三序列分別具有SEQ ID NOs：51、52及53中所列舉之序列。
  2. 如請求項1之抗體分子，其中：(i)該第一序列定位於該抗體分子之該CH3域的位置14至18處；(ii)該第二序列定位於該抗體分子之該CH3域的位置45.1至77處；且/或(iii)該第三序列定位於該抗體分子之該CH3域的位置93至101處；且其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
  3. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包含SEQ ID NO：54中所列舉之CH3域序列。
  4. 如請求項3之抗體分子，其中該CH3域在該CH3域序列之最接近的C端處進一步包含一額外的離胺酸殘基(K)。
  5. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包含列舉於以下中之VH域及VL域：(i)分別為SEQ ID NOs：12及14；(ii)分別為SEQ ID NOs：18及14； (iii)分別為SEQ ID NOs：23及14；(iv)分別為SEQ ID NOs：170及172；或(v)分別為SEQ ID NOs：40及42。
  6. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包含以下重鏈及輕鏈：(i)分別列舉於SEQ ID NOs：95及97中之重鏈及輕鏈；(ii)分別列舉於SEQ ID NOs：99及97中之重鏈及輕鏈；(iii)分別列舉於SEQ ID NOs：103及97中之重鏈及輕鏈；(iv)分別列舉於SEQ ID NOs：105及107中之重鏈及輕鏈；或(v)分別列舉於SEQ ID NOs：109及111中之重鏈及輕鏈。
  7. 如請求項6之抗體分子，其中在該重鏈中之CH3域在CH3域序列之最接近的C端處包含一離胺酸殘基(K)。
  8. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子包含：(i)根據IMGT編號方案界定，分別列舉於SEQ ID NOs：1、2、3、4、5及6中之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；(ii)根據Kabat編號方案界定，分別列舉於SEQ ID NOs：7、8、9、10、11及6中之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；(iii)分別列舉於SEQ ID NOs：12及14中之VH域及VL域；及/或(iv)分別列舉於SEQ ID NOs：95及97中之重鏈及輕鏈。
  9. 如請求項8之抗體分子，其中該抗體分子包含分別列舉於SEQ ID NOs：95及97中之重鏈及輕鏈。
  10. 如請求項9之抗體分子，其中在該重鏈中之CH3域在CH3域序列之最接近的C端處包含一離胺酸殘基(K)。
  11. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗體分子結合人類CD137及人類OX40。
  12. 如請求項11之抗體分子，其中該抗體分子能夠同時結合至人類CD137及人類OX40。
  13. 如請求項1或2之抗體分子，其中：(i)該抗體分子能夠在存在細胞表面表現之CD137之情況下活化一免疫細胞上的OX40，且/或該抗體分子能夠在存在細胞表面表現之OX40之情況下活化一免疫細胞上的CD137；(ii)該抗體分子與一免疫細胞上之OX40之結合及與CD137之結合引起該免疫細胞上OX40的聚集，且/或其中該抗體分子與該免疫細胞上之CD137之結合及與OX40之結合引起該免疫細胞上CD137的聚 集；及/或(iii)該抗體分子已經修飾以減少或消除該抗體分子之CH2域與一或多種Fcγ受體的結合。
  14. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至13中任一項之抗體分子。
  15. 一種核酸分子群，其等編碼如請求項1至13中任一項之抗體分子。
  16. 一種載體，其包含如請求項14之核酸分子或如請求項15之核酸分子群。
  17. 一種載體群，其等包含如請求項14之核酸分子或如請求項15之核酸分子群。
  18. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項14之核酸分子或如請求項15之核酸分子群，或者如請求項16之載體或如請求項17之載體群。
  19. 一種產生如請求項1至13中任一項之抗體分子之方法，該方法包含在用於產生該抗體分子之條件下培養如請求項18之重組宿主細胞。
  20. 如請求項19之方法，其進一步包含分離及/或純化該抗體分子。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之抗體分子，及一醫藥學上可接受之賦形劑。
  22. 一種如請求項1至13中任一項之抗體分子在製備一藥劑之用途，該藥劑用於治療一個體之癌症或一感染性疾病。
  23. 如請求項22之用途，其中該治療包含向該個體投與該抗體分子與一第二治療劑之組合。
  24. 如請求項23之用途，其中該第二治療劑係一結合PD-1或PD-L1之抗體。
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