MX2008002615A

MX2008002615A - Metodos y composiciones para la expresion de un polinucleotido de interes.

Info

Publication number: MX2008002615A
Application number: MX2008002615A
Authority: MX
Inventors: Billy Fred Mccutchen; Albert L Lu; Christine B Hazel; Donglong Liu; Wayne J Mehre; Paul D Olson; James F H Wong
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2005-08-24
Filing date: 2006-08-22
Publication date: 2008-03-14
Also published as: US7803992B2; US20130288898A1; AR055128A1; ECSP088304A; EP1931791B1; EP1931791A2; AU2006283504B2; EA201000757A1; JP2009505654A; US7973218B2; US20080234130A1; UY29761A1; BRPI0615088A2; KR20080052606A; AU2006283504A1; WO2007024866A2; CA2625371C; US20070061917A1; MX2008002616A; WO2007024782A3

Abstract

Se proporcionan metodos y composiciones para expresar un polinucleotido de interes. Las composiciones comprenden un dominio aumentador expuesto en la SEQ ID NO: 1, 10, 15 o 16 y variantes activas y fragmentos de la misma. Ademas se proporcionan construcciones de DNA que comprenden por lo menos una secuencia aumentadora transcripcional que comprende la secuencia de nucleotidos expuesta en la SEQ ID NO:1, 10, 15 o 16 o una variante activa o fragmento de la misma, operablemente enlazado a un promotor heterologo. Tales regiones moduladoras de transcripcion quimericas pueden ser operablemente enlazadas a cualquier polinucleotido de interes. Ademas se proporcionan celulas, plantas, partes de plantas, y plasma germinal que comprende la construccion de DNA. Tambien se proporcionan metodos para utilizar la region reguladora transcripcional quimerica. En modalidades especificas, se proporcionan metodos para expresar un polinucleotido de interes, que incluye por ejemplo, secuencias que confieren tolerancia a herbicidas, y metodos para seleccionar una celula que tiene la construccion de DNA.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA EXPRESIÓN DE UN POLI?UCLEÓTIDO DE INTERÉS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al campo de genética y biología molecular. Más particularmente, las composiciones y métodos se dirigen a la expresión de polinucleótidos de interés. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La expresión de secuencias de DNA heterólogas en un hospedero de planta es dependiente de la presencia de un promotor operablemente enlazado que es funcional dentro del hospedero de planta. La elección de la secuencia de promotor determinará cuándo y dónde dentro del organismo la secuencia de DNA heteróloga es expresada. Donde la expresión en tejidos u órganos específicos es deseada, se pueden utilizar promotores preferidos de tejido. En donde la expresión de gen en respuesta a un estimulo es deseada, promotores inducibles son el elemento regulador de elección. En contraste, donde se desea la expresión continua por todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Las secuencias reguladoras adicionales corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia de promotor de núcleo pueden ser incluidas en las construcciones de expresión de vectores de transformación para dar origen a niveles variables de expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica . Frecuentemente es deseable expresar una secuencia de DNA en tejidos u órganos particulares de una planta. Por ejemplo, la resistencia incrementada de una planta a la infección por patógenos de tierra o portados por el aire podria ser realizada mediante la manipulación genética del genoma de la planta para comprender un promotor preferido de tejido operablemente enlazado a un gen de resistencia a patógenos heterólogo tal que las proteinas de resistencia a patógenos son producidas en el tejido de planta deseado. Alternativamente, podría ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de DNA nativa dentro de tejidos de una planta para lograr un fenotipo deseado. En este caso, tal inhibición podría ser realizada con la transformación de la planta para comprender un promotor preferido de tejido operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos antisentido, tal que la expresión de la secuencia antisentido produce un transcrito de RNA que interfiere con la traducción del mRNA de la secuencia DNA nativa. Así, el aislamiento y caracterización de secuencias reguladoras que pueden ser posicionadas corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia de promotor de núcleo y permitir niveles variables de expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica son necesarios para la manipulación genética de las plantas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Se proporcionan métodos y composiciones para expresar un polinucleótido de interés. Las composiciones comprenden un dominio aumentador o mejorador expuesto en la SEQ ID N0:1, 10, 15, 16, 17 o 18 y variantes activas y fragmentos de las mismas. Además se proporcionan construcciones de DNA que comprenden por lo menos una secuencia aumentadora transcripcional que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:l, 10, 15, 16, 17, o 18 o una variante activa o fragmento de la misma, operablemente enlazada a un promotor heterólogo. Tales regiones reguladoras de transcripción quimérica pueden ser operablemente enlazadas por cualquier polinucleótido de interés. Además se proporcionan células, plantas, partes de plantas y plasma germinal que comprenden la construcción de DNA. ' También se proporcionan métodos para utilizar la región reguladora transcripcional quimérica. En modalidades específicas, se proporcionan métodos para expresar un polinucleótido de interés, incluyendo por ejemplo, secuencias que confieren tolerancia a herbicidas y métodos para seleccionar una célula que tiene la construcción de DNA. BREVE DESCRIPCIÓN DEL (LOS) DIBUJO (S) La Figura 1 proporciona ejemplos de construcciones que contienen elementos aumentadores 35S.

La Figura 2 proporciona un diagrama esquemático que demuestra el efecto de los aumentadores 35S sobre la eficiencia TX. La Figura 3 proporciona un diagrama esquemático que demuestra el efecto de los aumentadores 35S sobre la eficiencia TO. La Figura 4 proporciona un diagrama esquemático que demuestra el efecto de los aumentadores 35S sobre el número de copias de evento. La Figura 5 proporciona un diagrama esquemático que demuestra el efecto de los aumentadores 35S sobre la expresión. La Figura 6 proporciona un ensayo de evaluación de gen insecticida. La Figura 7 proporciona un diagrama esquemático que muestra el desarrollo de un esquema de selección GAT. La Figura 8 demuestra que GAT puede ser utilizado como un marcador seleccionable. La Figura 9 proporciona un diagrama esquemático que demuestra las eficiencias de transformación GAT. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ahora será descrita más completamente después en la presente con referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales algunas, pero no todas las modalidades de la invención son mostradas. En realidad, estas invenciones pueden ser incorporadas en muchas formas diferentes y no deben ser consideradas como limitadas para las modalidades expuestas en la presente; más bien, estas modalidades se proporcionan de modo que esta descripción cumplirá con los requerimientos legales aplicables. Números similares se refieren a elementos similares por toda la descripción . Muchas modificaciones y otras modalidades de la invención expuestas en la presente vendrán a la mente para un experto en la técnica a la cual estas invenciones pertenecen que tienen beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Por lo tanto, se va a entender que las invenciones no van a ser limitadas a las modalidades específicas divulgadas y modificaciones y otras modalidades se proponen para ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque términos específicos emplean la presente, ellos utilizan el sentido genérico descriptivo solamente y no para propósitos de limitación. I. Polinucleótidos Las composiciones de la invención comprenden un dominio aumentador de una región de control de transcripción y variantes y fragmentos de ese dominio aumentador. Cuando el dominio aumentador es operablemente enlazado a un promotor, una región de regulación transcripcional funcional se forma que puede dirigir la expresión de un polinucleótido de interés operablemente enlazado. En particular, la presente invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden el dominio aumentador expuesto en la SEQ ID N0:1, 10, 15, 16, 17 o 18; variantes activas y fragmentos de las mismas; y, polinucleótidos que consiste de la secuencia de SEQ ID NO:l, 10, 15, 16, 17 o 18. En todavía modalidades adicionales, el dominio aumentador empleado no comprende la región del promotor 35S de arriba de la posición-90 a aproximadamente -46. La región -90 a -46 del promotor se expone en la SEQ ID NO: 5. El término "promotor" se propone para dar a entender una región reguladora de DNA que comprende una región de iniciación transcripcional, que en algunas modalidades, comprende una caja TATA capaz de dirigir RNA polimerasa II para iniciar la síntesis de RNA en el sitio de iniciación de transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. El promotor puede además ser operablemente enlazado a elementos reguladores adicionales que influencian la transcripción, incluyendo, pero no limitado a, intrones, regiones no traducidas 5' , y elementos aumentadores. Como se utiliza en la presente, una "secuencia aumentadora", "dominio aumentador", "elemento aumentador", o "aumentador", cuando se enlazan operablemente a un promotor apropiado, modulará el nivel de transcripción de un polinucleótido de interés operablemente enlazado. En modalidades específicas, el aumentador de la invención puede alterar los patrones de expresión de promotores normales. Por ejemplo, un promotor preferido/específico de tejido, cuando se enlaza operablemente a un aumentador de la invención, demostrará la expresión ectópica que no son normalmente observados con el promotor solo. Por ejemplo, el promotor oleosina es un promotor preferido de semilla pero muestra expresión de hoja en la presencia del aumentador de la invención o variante o fragmento activo del mismo. En otro ejemplo, el promotor Zrp2, que es un promotor preferido de hoja, llega a ser constitutivo cuando se enlaza operablemente a la secuencia aumentadora de la invención o una variante o fragmento biológicamente activo de la misma, y el promotor RM2, un promotor de raíz, cuando se enlaza operablemente al aumentador de la invención o variante o fragmento biológicamente activo del mismo mostrará la expresión en la hoja. Así, las composiciones de la presente invención además comprenden un polinucleótido que comprende una región de control transcripcional quimérica que comprende el promotor operablemente enlazado a por lo menos uno, dos, tres, cuatro o más copias del dominio aumentador o una variante activa o fragmento del dominio. Tales composiciones permite la expresión de un polinucleótido de interés operablemente enlazado.

La invención abarca composiciones de polinucleótido o proteína aisladas o sustancialmente purificada. Un polinucleótido "aislado" o "purificado", o porción biológicamente activo del mismo, está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido como se encuentra en su ambiente en que ocurre naturalmente. Así, un polinucleótido aislado purificado es sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. Óptimamente, un polinucleótido "aislado" está libre de secuencias (óptimamente secuencias de codificación de proteínas) que naturalmente flanquean el polinucleótido (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' en el polinucleótido) en el DNA genómico del organismo del cual se deriva el polinucleótido. Por ejemplo, en varias modalidades, el polinucleótido aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de secuencia de nucleótido que naturalmente flanquea el polinucleótido en el DNA genómico de la célula de la cual se deriva el polinucleótido. Un polinucleótido que está sustancialmente libre de material celular y de preparaciones que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, o 1% (en peso seco) de proteína o polinucleótidos contaminantes.

Cuando el polinucleótido de la invención o porción biológicamente activa del mismo se produce recombinantemente, el medio de cultivo óptimamente representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, o 1% (en peso seco) de precursores químicos. Los fragmentos y variantes de la secuencia aumentadora divulgada también están abarcados por la presente invención. En particular, los fragmentos y variantes del dominio aumentador de la SEQ ID NO:l, 10, 15, 16, 17 o 18 son proporcionados. Como se utiliza en la presente, el término "fragmento" significa una porción del polinucleótido. Los fragmentos de un dominio aumentador pueden retener la actividad biológica de modular (incrementar o disminuir) el nivel de transcripción cuando se enlazan operablemente a un promotor apropiado. Alternativamente, los fragmentos de un polinucleótido que es útil como sonda de hibridación no pueden necesariamente retener la actividad biológica. Los fragmentos de un polinucleótido para el dominio aumentador puede variar de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 150 nucleótidos, aproximadamente 200 nucleótidos, aproximadamente 250 . nucleótídos, aproximadamente 300 nucleótidos, aproximadamente 350 nucleótidos, aproximadamente 400 nucleótidos, aproximadamente 450 nucleótidos, aproximadamente 500 nucleótidos, y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa de la invención para el dominio aumentador de la invención. En otras modalidades, un fragmento del dominio aumentador comprende una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, 100 a aproximadamente 150, 150 a aproximadamente 200, 200 a aproximadamente 250, aproximadamente 250 a aproximadamente 300, aproximadamente 300 a aproximadamente 350, aproximadamente 350 a aproximadamente 400, aproximadamente 400 a aproximadamente 450, aproximadamente 450 a aproximadamente 500, aproximadamente 500 a aproximadamente 535 nucleótidos. En modalidades específicas, las variantes activas y fragmentos del aumentador comprenden regiones conservadas. Tales regiones incluyen una o más de las secuencias subrayadas expuestas enseguida. cccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctctta cgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacag tr.tpagaagaccaaagggcaattgagácttttcaacaaaggptaatatccggaaacctcctcggattccattecccagctatc tgtcactttattgtgaagataetggaaaaggaaggtggctcctacaaateccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttga flgatgpctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaacc acgtcttcaaagcaagtggattgatgtgat (SEQ ID NO: 1).

Ver, también, Fang y colaboradores, (1989) The Plant Cell 1:141-150, incorporada en la presente por referencia. Una porción biológicamente activa del dominio aumentador se puede preparar al aislar una porción del dominio aumentador de la invención y al estimar la actividad de regulación transcripcional del fragmento. Los métodos para detectar regulación transcripcional incluye, por ejemplo, analizar el nivel de polinucleótido operablemente enlazado de interés o al analizar la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia operablemente enlazada de interés. Tales ensayos pueden medir directamente el nivel de polinucleótido o polipéptido o pueden la actividad de un fenotipo esperado cuando se altera la expresión de una secuencia. Tale ensayos son conocidos en la técnica. Como se utiliza en la presente, el término "variantes" significa secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, las variantes en las que ocurre naturalmente se pueden identificar con el uso de técnicas de biología moleculares bien conocidas, tales como, por ejemplo, con una reacción en cadena de polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como se resumen en la presente. Para los polinucleótidos, una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos a uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se utiliza en la presente, un polinucleótido "nativo" comprende secuencia de nucleótido que ocurre naturalmente. Para polinucleótidos, las variantes que ocurren naturalmente pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como se resumen enseguida. Los polinucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas, tales como aquellas generadas, por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida al sitio. Generalmente, las variantes de los polinucleótidos particulares de la invención tendrán por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a aquellos polinucleótidos particulares como es determinado por los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Una variantes biológicamente activa de los polinucleótidos de la invención puede diferir de aquella secuencia por tan pocos como 1-15 residuos de ácido nucleico, tan pocos como 1-10, tal como 6-10, tan pocos como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o aun 1 residuo de ácido nucleico. Así, los genes y polinucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias que ocurren naturalmente así como formas mutantes. Tales variantes continuarán presentando la actividad reguladora de transcripción deseada. Las supresiones, inserciones y sustituciones de las secuencias abarcadas en la presente no se esperan que produzcan cambios radicales en las características de la secuencia. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción por adelantado al hacerlo de esta manera, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante los ensayos de clasificación de rutina. Esto es, la actividad puede ser evaluado utilizando ensayos divulgados en otra parte en la presente. Los polinucleótidos variantes también abarcan secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como la tergiversación de DNA. Con tal procedimiento, una o más secuencias de dominio aumentador diferentes para el promotor pueden ser manipulados para crear un nuevo dominio aumentador. De esta manera, librerías de polinucleótidos recombinantes se generan de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprende regiones de secuencia que tiene identidad de secuencia secuencial que pueden ser homólogamente recombinados in vi tro o in vivo . Las estrategias para tal tergiversación de DNA son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Na ture 370:389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Na ture Biotech . 75:436-438; Moore y colaboradores, (1997) J Mol . Biol . 272:336-347; Zhang y colaboradores, (1997) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Na ture 397:288-291; y patentes norteamericanas Nos. 5,605,793 y 5,837,458. Los polinucleótidos de la invención se pueden utilizar para aislar secuencias correspondientes de estos organismos, particularmente otras plantas, más particularmente otras monocotiledóneas. De esta manera, los métodos tales como PCR, hibridación y los similares se pueden utilizar para identificar tales secuencias basado en su homología de secuencia a las secuencias expuestas en la presente. Las secuencias aisladas basada en su identidad de secuencia del dominio aumentador completo expuesto en la presente o fragmentos o variantes de los mismos están abarcados por la presente invención. En un procedimiento de PCR, los cebadores de oligonucleótido pueden ser diseñados para el uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de DNA correspondientes del DNA genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación de PCR son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainvie , New York) , después en la presente Sambrook. Ver también Innis y colaboradores, eds. (1990) PCR Protocols : A Guide a Methods y Applica tions (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Stra tegies (Academic Press, New York) ; y Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no están limitados a, métodos utilizando cebadores emparejados, cebadores empalmados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desigualados y los similares. En las técnicas de hibridación, todo o parte de un polinucleótido conocido se utiliza como una sonda que selectivamente hibrida a otra secuencia de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmento de DNA genómico clonado del organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser marcados con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas de hibridación se pueden hacer al marcar oligonucleótidos sintéticos basados en el dominio aumentador de la invención. Los métodos para la preparación de sondas de hibridación para la construcción de librerías genómicas son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook. Por ejemplo, la secuencia del dominio aumentador completa divulgada en la presente, una o más porciones de la misma, se puede utilizar como una sonda capaz de hibridar específicamente las secuencias aumentadores correspondientes. Para lograr la hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de dominio del dolor que son por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos en longitud o por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar secuencias aumentadoras 35S correspondiente del organismo seleccionado mediante PCR. Esta técnica se puede utilizar para aislar secuencias de codificación adicionales a partir de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determina presencia de secuencias de codificación en un organismo. La técnica de hibridación incluye la clasificación de hibridación de librerías de DNA colocadas en placas (ya sea placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989) Cloning: A Laboratory Manual (2° ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York.) La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. Los términos "condiciones severas" y "condiciones de hibridación severas" se proponen para dar a entender condiciones bajo las cuales una sonda hibridará secuencia objetivo a un grado detectablemente más grande que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el antecedente) . Las condiciones severas son dependientes de las secuencias y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda puede ser identificada (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad pueden ser ajustadas para permitir algo de desigualación de secuencia de modo que menores grados de similitud son detectados (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda es menor que aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud o menor que 500 nucleótidos en longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ion Na, de manera típica aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (u otras sales) pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden lograr son adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderadas ejemplares incluyen la hibridación en 40 a 45% de formamida, NaCl 1.0 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC at 55 a 60°C. Las condiciones de esta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado final en 0. IX SSC a 60 a 65°C durante una duración de por lo menos 30 minutos. La duración de la hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, de manera usual aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración de tiempo de lavado será de por lo menos una duración de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio . La especificidad es típicamente la función de los lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, Tm (punto de fusión térmica) puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal . Biochem . 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el DNA, % de form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de base. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica definida y pH) en la cual 50% de la secuencia objetivo complementaria hibrida a una sonda perfectamente desigualada. La, Tm se reduce por aproximadamente 1°C para cada 1% de desigualación; así, Tm, hibridación y/o condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar a la secuencia de identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con >90% de identidad son buscadas, la Tm puede ser disminuida 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que la Tm para la secuencia específica y su complemento en una intensidad iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 1, 2, 3, o 4°C menor que la Tm; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado de 6, 7, 8, 9, o 10°C menor que la Tm; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado en 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menor que la Tm. Utilizando la ecuación, las construcciones de hibridación de lavado y la Tm deseada, aquellos de habilidad ordinaria entenderán que las variaciones en la severidad de variaciones y/o las soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de desigualación da por resultado una Tm de menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) , se prefiere que al aumentar la concentración en SSC de modo que se puede utilizar a una temperatura más alta. Una guía extensiva a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Labora tory Techniques in Biochemistry y Molecular Biology — Hybridiza tion wi th Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); y Ausubel y colaboradores, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York) . Ver también Sambrook. Así, las secuencias aisladas que tienen actividad del promotor preferido de embrión y que hibridan bajo condiciones severas a las secuencias de dominio aumentador divulgados en la presente, o a fragmentos de las mismas, están abarcadas por la presente invención. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que la Tm para la secuencia específica en una intensidad iónica y pH definido. Sin embargo, las condiciones severas abarcan temperaturas en el intervalo de aproximadamente 1°C a aproximadamente 20 °C menor que la Tra, dependiendo del grado deseado de severidad como se califica de otra manera en la presente. Los siguientes términos se utilizan para describir la relación de la secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia" y (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto en la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de cDNA de longitud completa o secuencia de gen, o el cDNA completo o secuencia de gen. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de un polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de los dos polinucleótidos. Generalmente, la ventaja de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser 30, 40, 50, 100 o más larga. Aquellos de habilidad en la técnica evitarán que para evitar una alta similitud a una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótido una sanción de espacio es típicamente introducida y sustraída del número de igualaciones. Métodos de alineación de secuencia para comparación son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación del por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos secuencias se puede realizar utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; .el algoritmo de alineación local de Smith y colaboradores, (1981) Adv. Appl . Ma th . 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda para alineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc . Nati . Acad. Sci 85:2444-2448; el algoritmo de Ka lin y Altschul (1990) Proc . Na ti . Acad. Sci USA 872264, modificado como Karlin y Altschul (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci USA 90:5873-5877. Las implementaciones en computadora de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de GCG de Wisconsin, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA) . Las alineaciones utilizadas en estos programas se pueden realizar utilizando parámetros de error. El programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins y colaboradores, (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores, (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Res . 16:10881-90; Huang y colaboradores, (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson y colaboradores, (1994) Meth . Mol . Biol . 24:307-331. El programa ALIGN está basado en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra . Una tabla de residuos ponderado PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12, y una sanción de espacio de 4 se puede utilizar con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y colaboradores, (1990) J. Mol . Biol . 215:403 están basados en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra . La búsqueda de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar por el programa BLASTX, registro = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, Gapped BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar como es descrito en Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul y colaboradores, (1997) supra . Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, los parámetros de error de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótido, BLASTX para proteínas) se puede utilizar. Ver www. ncbi . nlm. nih. gov. La alineación también se puede realizar manualmente por inspección. A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente se refiere al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando GAP Peso de 50 y Peso de Longitud de 3, y la matriz de registro nwsgapdna. cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando GAP Peso de 8 y Peso de Longitud de 2 , y la matriz de registro BLOSUM62; o cualquier programa equivalente del mismo. Por "programa equivalente" se propone cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuo de nucleótidos o aminoácidos idénticos y un por ciento de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443-453, para incorporar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y maximiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de espacio y crear la alineación con el número más grande de bases igualadas y menores espacios. Esto permite la provisión de una sanción de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de igualaciones para cada espacio que se inserta. Si una sanción de extensión de espacio mayor que cero es elegida, GAP debe además, hacer el aprovechamiento para cada espacio insertado de la longitud de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de espacios y extensión de espacio en Versión 10 del Paquete de Programa Genetics GCG Wisconsin para las secuencias de proteína son 8 y 2 respectivamente. Para secuencias de nucleótido la sanción de creación de espacio de error 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es 3. La sanción de creación de espacio la extensión de espacio puede expresar un número entero seleccionado del número de números enteros que consiste de 0 a 200. Así, por ejemplo, la sanción de creación de espacio y extensión de espacio pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más grande. GAP representa un número de la familia de mejores alineaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP exhibe cuatro cifras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida del número de bases en el segmento más corto. Por Ciento de Identidad es el por ciento de símbolos que realmente se igualan. El Por Ciento de Similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de la matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, en el umbral de similitud. La matriz de registro utilizada en la Versión 10 del Paquete de Sorftware de Genética GCG Wisconsin es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci USA 89:10915). (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido hacen referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difiere construcciones de aminoácido conservativas, donde los residuos de aminoácido son sustituidos por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambiar las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservativas se dice que tiene "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. Típicamente esto involucra registrar una sustitución conservativa como una desigualación parcial antes que una desigualación completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, donde un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y un registro no conservativo se le da un registro de cero, una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales el residuo de aminoácido o base de ácido nucleico ocurre en ambas de las secuencias para producir el número de posiciones igualadas al dividir el número de posiciones igualadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. II. Construcciones de DNA El uso del término "polinucleótido" no se propone la limitar la presente invención a polinucleótidos que comprenden DNA. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica reconocerán que los polinucleótidos, pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y deoxiribonucleótidos . Tales deoxiribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen moléculas que ocurren naturalmente y análogos sintéticos. Los polinucleótidos de la invención también abarcan todas las formas de secuencias, incluyendo, pero no limitado a, formas de una sola hebra, formas de doble hebra, horquillas, estructuras de tallo y vuelta, y los similares . El polinucleótido divulgado en la presente invención, así como variantes y fragmentos del mismo, son útiles en la manipulación genética de cualquier planta. El dominio del dolor del fragmento activo o variante del mismo son útiles en este aspecto cuando se enlazan operablemente a un promotor heterólogo. Las regiones de control reguladora transcripcional son referidas en la presente como regiones de control reguladoras transcripcionales "quimérica". Las regiones de control transcripcionales quiméricas pueden ser operablemente enlazadas a un polinucleótido cuya expresión va a ser controlada para lograr la respuesta fenotípica deseada. De esta manera, el polinucleótido para el dominio aumentador o la región de control reguladora transcripcional quimérica de la emulsión se puede proporcionar el case de expresión junto con un polinucleótido de interés para la expresión en el en el organismo de interés. La región reguladora transcripcional quimérica puede comprender múltiples copias del dominio aumentador o variantes activas y fragmentos de las mismas. En modalidades específicas, la región de control reguladora transcripcional quimérica comprende por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más copias del dominio aumentador. En modalidades adicionales, el dominio aumentador empleado no comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5. La distancia entre el promotor y el dominio aumentador puede variar, mientras que la región reguladora transcripcional quimérica continua en la región de la transcripción del polinucleótido operablemente enlazado de interés en la manera deseada. Por ejemplo, un dominio aumentador puede ser posicionado por lo menos aproximadamente 10000 a aproximadamente 15000, aproximadamente 10000 a aproximadamente a 9000, aproximadamente 9000 a aproximadamente 8000, aproximadamente 8000 a aproximadamente 7000, aproximadamente 7000 a aproximadamente 6000, aproximadamente 6000 a aproximadamente 5000, aproximadamente 5000 a aproximadamente 4000, aproximadamente 4000 a aproximadamente 3000, aproximadamente 3000 a aproximadamente 2000, aproximadamente 2000 a aproximadamente 1000, aproximadamente 1000 a aproximadamente 500, aproximadamente 500 a aproximadamente 250, aproximadamente 250 a inmediatamente adyacente al promotor. Además se reconoce que una o más copias del aumentador puede ser colocada corriente arriba (5') del promotor o alternativamente, una o más copias del aumentador pueden ser localizadas 3' al promotor. En modalidades específicas, cuando se localiza 3' del promotor, el aumentador está corriente debajo de la región terminadora. En todavía modalidades adicionales, uno o más de los aumentadores pueden ser arreglados ya sea en la orientación 5' o 3' (como se muestra en la SEQ ID NO:l) o en la región 3' a 5' . Si se emplean múltiples aumentadores, los aumentadores pueden ser posicionados en la construcción con respecto al promotor tal que el efecto deseado sobre la expresión es logrado. Por ejemplo, los aumentadores pueden estar inmediatamente adyacentes entre si o por lo menos entre 1 a 100, 100 a 300, 300 a 500, 500 a 1000 nucleótidos aparte. Tales construcciones se pueden proporcionar en casetes de expresión para la expresión en el organismo de interés. El cásete puede incluir secuencias reguladoras 3' y secuencias reguladoras 5' operablemente enlazado a un polinucleótido de interés. "Operablemente enlazado" se propone para dar a entender un enlace funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un enlace operable de un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Un enlace operable entre un aumentador y una región de iniciación transcripción es un enlace que permite la región de control transcripcional transcribir un polinucleótido operablemente enlazado de interés. Los elementos operablemente enlazados pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se utiliza para referirse a la unión de dos regiones de codificación de proteína, por operablemente enlazado se propone que las regiones de codificación están en la misma estructura de lectura. El cásete adicionalmente puede contener por lo menos un gen adicional a ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, el (los) gen (es) adicional (es) se puede proporcionar sobre múltiples casetes de expresión. Tal cásete de expresión de proporciona con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para la inserción del polinucleótido de interés que está bajo la regulación transcripcional de la región reguladora. El cásete de expresión puede adicionalmente contener genes marcadores seleccionables . El cásete de expresión puede incluir, en la dirección 5' -3' de transcripción, una región reguladora transcripcional quimérica que comprende el dominio aumentador o una variante activa o fragmento del mismo, un promotor, o variante activo o fragmento del mismo, una región de iniciación traduccional, un polinucleótido de interés, una región de terminación traduccional y, opcionalmente, una región de terminación transcripcional funcional en el organismo hospedero. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, dominios aumentadores, y regiones de terminación traduccionales, etc.) y/o el polinucleótido de interés puede ser nativo/análogo a la célula hospedera o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de interés puede ser heterólogo a la célula hospedera o entre sí. Como se utiliza en la presente, "heterólogos" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina de una especie foránea, o, si es de la misma especie, es sustancialmente modificada de su forma nativa en una composición y/o sitio genómico por la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la cual se derivó el polinucleótido, o, si es de la misma/especie análoga, uno o ambos son sustancialmente modificados de su forma original y/o sitio genómico, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido operativamente enlazado. Un "polinucleótido heterólogo" como se relaciona aun dominio aumentador, se propone para dar a entender una secuencia que no está ocurriendo naturalmente con la secuencia de dominio aumentador de la invención. Mientras que este promotor es heterólogo a la secuencia de dominio aumentador, esto puede ser homólogo, o nativo, o heterólogo, o foráneo al hospedero de planta. La región de terminación puede ser nativa con el dominio aumentador o la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con el polinucleótido de interés operablemente enlazado, puede ser nativo con el hospedero de planta o puede ser derivado de otra fuente (es decir, foráneo o heterólogo) al dominio aumentador, la región de iniciación transcripcional, el polinucleótido de interés, el hospedero de planta, o cualquier combinación de los mismos. Las regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A . tumefa ciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau y colaboradores, (1991) Mol . Gen . Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91:151-158; Bailas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res . 17:7891-7903; y Joshi y colaboradores, (1987) Nuclei c Acids Res . 15:9627-9639. El cásete de expresión que comprende las secuencias de la presente invención también puede contener por lo menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen a ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, la(s) secuencia (s) adicional se puede proporcionar sobre otro cásete de expresión. Las modificaciones de secuencia adicionales se conoce que aumenta la expresión de gen en un hospedero celular. Estos incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales del sitio de empalme de exón-intrón, repeticiones similares de transposón y otras de tales secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales a la expresión de gen. El contenido de G-C de la secuencia se puede ajustar a niveles promedio para un hospedero celular dado, como es calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedera. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras de mRNA secundarias de horquilla predichas. Los casetes de expresión pueden adicionalmente contener secuencias guía 5' . Tales secuencias guía pueden actuar para aumentar la traducción. Las guías de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: guías de picornavírus, por ejemplo, guía EMCV (región de no codificación de Encefalomiocarditis 5' ) (Elroy-Stein y colaboradores, (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86:6126-6130) ; guías de potivirus, por ejemplo, guía TEV (Virus de Grabado de Tabaco) (Gallie y colaboradores (1995) Gene 165(2) : 233-238) , guía MDMV (Virus de Mosaico Enano de Maíz) ( Virology 154:9-20), y protein de enlace de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y colaboradores (1991) Na ture 353:90-94); guía no traducida de mRNA de proteína de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores (1987) Na ture 325:622-625); guía de virus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores, (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); y virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel y colaboradores (1991) Virology 81:382-385). Ver también, Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiol . 84:965-968. En la preparación del cásete de expresión, los diversos fragmentos de DNA pueden ser manipulados, para proporcionar las secuencias de DNA en la orientación apropiada y, como sea apropiado, la estructura de lectura apropiada. Hacia este fin, adaptadores y enlazadores pueden ser empleados para unir los fragmentos de DNA u otras manipulaciones pueden ser involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes, remoción del DNA superfluo, remoción de sitios de restricción o los similares. Para este propósito, la mutagénesis in vi tro, reparación de cebador, restricción, recocido, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones, pueden ser involucradas. El cásete de expresión también puede comprender un gen marcador seleccionable para la selección de células transformados. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibiótico, tales como aquellos que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT) , así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tal como flufosinato amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2, -diclofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores seleccionables adicionales incluyen marcadores fenotípicos tales como las proteínas de ß-galactosidasa y fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su y colaboradores, (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 y Fetter y colaboradores, (2004) Plan t Cell 16:215-28), proteína fluorescente de ciano (CYP) (Bolte y colaboradores, (2004) J. Cell Science 117:943-54 y Kato y colaboradores, (2002) Plan t Physiol 129:913-42), y proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, Ver, Bolte y colaboradores, (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores seleccionables adicionales, ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson y colaboradores, (1992) Proc. Nati. Acad. Set USA 89:6314-6318; Yao y colaboradores, (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley y colaboradores, (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu y colaboradores, (1987) Cell 48:555-566; Brown y colaboradores, (1987) Cell 49:603-612; Figge y colaboradores, (1988) Cell 52:713-722; Deuschle y colaboradores, (1989) Proc. Nati Acad.

Ad. USA 86:5400-5404; Fuerst y colaboradores, (1989) Proc.

Nati. Acad. Set USA 86:2549-2553; Deuschle y colaboradores, (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines y colaboradores, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci USA 90:1917-1921; Labow y colaboradores, (1990) Mol. Cell Biol 10:3343-3356; Zambretti y colaboradores, (1992) Proc. Nati Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Bairn y colaboradores, (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski y colaboradores, (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb y colaboradores (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt y colaboradores, (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen y colaboradores, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547- 5551; Oliva y colaboradores, (1992) An timi crob . Agen ts Chemother. 36:913-919; Hlavka y colaboradores, (1985) Handbook of Experimental Pharma cology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí y colaboradores (1988) Na ture 334:721-724. Tales descripciones se incorporan en la presente por referencia. La lista anterior de genes marcadores seleccionables no se propone para ser limitativa. Cualquier gen marcador seleccionable puede ser utilizado en la presente invención . Como se discutió en lo anterior, una región reguladora transcripcional quimérica que comprende por lo menos una copia del dominio aumentador o variante activo o fragmento del mismo operablemente enlazado a un promotor heterólogo son proporcionados . Cualquier promotor de interés puede ser operablemente enlazado al dominio aumentador de la invención. Tales promotores puede ser seleccionado basado en el efecto deseado y puede comprender promotores constitutivos, inducibles, preferidos de tejido, u otros promotores para la expresión de una célula hospedera de interés (es decir, una planta) . Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor de núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en WO 99/43838 y la patente norteamericana No, 6,072,050; el promotor 35S de CaMV de núcleo (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:163-171); ubicuitin (Christensen y colaboradores, (1989) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen y colaboradores, (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-689); pEMU (Last y colaboradores, (1991) Theor. Appl . Genet . 81 :581-588); MAS (Velten y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente norteamericana No. 5,659,026) y los similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611. En una modalidad, el promotor comprende un promotor inducible, particularmente de un promotor inducible por patógeno. Tales promotores incluyen aquellos de proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR) , que son inducidas después de la infección por patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1, 3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi y colaboradores, (1983) Neth J. Plant Pa thol . 89:245-254; Uknes y colaboradores, (1992) Plan t Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plan t Mol . Virol . 4:111-116. Ver también WO 99/43819, incorporado en la presente por referencia. Los promotores que son expresados localmente o cerca del sitio de la infección de patógeno pueden ser utilizados. Ver, por ejemplo, Marineau y colaboradores, (1987) Plan t Mol . Biol . 9:335-342; Matton y colaboradores, (1989) Molecular Plan t-Microbe In teractions 2:325-331; Somsisch y colaboradores, (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 83:2427-2430; Somsisch y colaboradores, (1988) Mol . Gen . Genet . 2:93-98; y Yang (1996) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 93:14972-14977. Ver también, Chen y colaboradores, (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang y colaboradores, (1994) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 91:2507-2511; Warner y colaboradores, (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz y colaboradores, (1989) Plant Cell 1:961-968; patente norteamericana No. 5,750,386 (inducidos por nematodos y las referencias citadas en las mismas. De particular interés es el promotor inducible para el gen PRms de maíz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium monili forme (Ver, por ejemplo, Cordero y colaboradores, (1992) Physiol . Mol . Plant Pa th . 41:189-200). Adicionalmente, como los patógenos se encuentran a la entrada en plantas a través de lesiones o el daño por insectos, un promotor inducible por lesión puede ser utilizado en las construcciones de la invención. Tales promotores inducibles por lesión incluyen el inhibidor de proteinasa de papa (pin II) gen (Ryan (1990) Ann . Rev. Phytopa th . 28:425-449; Duan y colaboradores, (1996) Na ture Biotechnology 14:494-498); wunl y wun2, patente norteamericana No. 5,428,148; winl y win2 (Stanford y colaboradores, (1989) Mol . Gen . Genet . 215:200-208); sistemina (McGurl y colaboradores, (1992) Science 225:1570- 1573); WIP1 (Rohmeier y colaboradores, (1993) Plan t Mol . Biol . 22:783-792; Eckelkamp y colaboradores, (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok y colaboradores, (1994) Plant J. 6 (2) : 141-150) y los similares, incorporado en la presente por referencia. Los promotores regulados químicamente, pueden ser utilizados para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible químicamente, donde la aplicación de la sustancia química induce la expresión de gen, o un promotor reprimible químicamente, donde la aplicación de la sustancia química suprime la expresión de gen. Los promotores inducibles químicamente son conocidos en la técnica e incluye, pero no están limitados al promotor In2-2 de maíz, que es activado por los moderadores herbicidas bencensulfonamida, el promotor GST de maíz, que es activado por los compuestos electrofílicos hidrofóbicos que se usan como herbicidas pre-emergentes, y el promotor PT-la de tabaco, que es activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados químicamente de interés incluyen promotores responsivos a esteroides (ver, por ejemplo, el promotor inducible glucocorticoide en Schena y colaboradores, (1991) Proc. Na ti . Acad. Sci USA 88:10421-10425 y McNellis y colaboradores, (1998) Plant J. 14(2):247-257) y los promotores inducibles por tetraciclina es reprimible con tetraciclina (Ver, por ejemplo, Gatz y colaboradores, (1991) Mol . Gen . Genet . 227 :229-237 , y las patentes norteamericanas Nos. ' 5,814,618 y 5,789,156), incorporadas en la presente por referencia. Los promotores preferidos de tejido se pueden utilizar para dirigir la expresión aumentada de un polinucleótido de interés dentro de un tejido de planta particular. Los promotores preferidos de tejido incluyen Yamamoto y colaboradores, (1997) Plant J. 12 (2 ): 255-265; Kawamata y colaboradores, (1997) Plan t Cell Physiol . 38 (7) : 792-803; Hansen y colaboradores, (1997) Mol . Gen Genet . 254 (3) : 337-343; Russell y colaboradores, (1997) Transgenic Res . 6 (2) : 157-168; Rinehart y colaboradores, (1996) Plant Physiol . 112 (3) : 1331-1341; Van Camp y colaboradores, (1996) Plan t Physiol . 112 (2 ): 525-535; Canevascini y colaboradores, (1996) Plant Physiol . 112 (2) : 513-524; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plan t Cell Physiol . 35 (5) : 773-778 ; Lam (1994) Resul ts Probl . Cell Differ. 20:181- 196; Orozco y colaboradores, (1993) Plan t Mol . Biol . 23 (6) : 1129-1138; Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc Na ti . Acad. Sci USA 90 (20) : 9586-9590; y Guevara-Garcia y colaboradores, (1993) Plant J. 4 (3) : 495-505. Tales promotores pueden ser modificados, si es necesario, para la expresión débil. Los promotores preferidos de hoja son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Yamamoto y colaboradores, (1997) Plant J. 12 (2) : 255-265; Kwon y colaboradores (1994) Plan t Physiol . 105:357-67; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol . 35 (5) : 773-778 ; Gotor y colaboradores, (1993)* Plan t J. 3:509-18; Orozco y colaboradores, (1993) Plan t Mol . Biol . 23 ( 6) : 1129-1138 ; y Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci USA 90 (20) : 9586-9590. Los promotores preferidos de raíz son conocidos y se pueden seleccionar de los muchos disponibles de literatura o aislados de novo de varias especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hire y colaboradores, (1992) Plan t Mol . Biol . 20 (2 ): 207-218 (gen glucamina sintetasa específico de raíz de soya de raíz); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) : 1051-1061 (elemento de control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de haba); Sanger y colaboradores, (1990) Plant Mol . Biol . 14 (3) : 433-443 (promotor específico de raíz del gen manopina sintasa (MAS) de Agrobacteri um tumefaciens) ; y Miao y colaboradores, (1991) Plan t Cell 3(1): 11-22 (clon de cDNA de longitud completa que codifica glutamina sintetasa (GS) , citosólica, que es expresada en raíces y nudo de raíz de soya). Ver también Bogusz y colaboradores, (1990) Plan t Cell 2 (7 ): 633-641, donde dos promotores específicos de raíz aislados de genes de hemoglobina de la no legumbre fijadora de ni trógeno Parasponia andersonii y la no legumbre no fijadora de nitrógeno relacionada Trema tomen tosa son descritos. Los promotores de estos genes se enlazaron a un gen reportador de ß-glucuronidas y se produjeron en tanto la no legumbre Ni cotiana tabacum como la legumbre Lotus cornicula tus, y en ambos casos se preservó la actividad de promotor específico de raíz. Leach y Aoyagi (1991) describe su análisis de los promotores de los genes de inducción de raíz rolC y rolD altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79 (1) : 69-76) . Ellos concluyeron que los determinantes de DNA preferidos de tejido aumentadores son disociados en esos promotores. Teeri y colaboradores, (1989) utilizaron la fusión de gen lacZ para mostrar que el gen T-DNA de Agrobacterium que codifica octopina sintasa es especialmente activo en la epidermis de la punta de raíz y que el gen TR2' es específico de raíz en la planta intacta y estimulado mediante la lesión en el tejido de hoja, en la combinación especialmente deseable de características para el uso con un gen insecticida o larvicida (ver EMBOJ. 8 (2) : 343-350) . The TR1' gene, fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa II) mostró características similares. Los promotores preferidos de raíz adicionales incluyen el promotor de gen VÍENOD-GRP3 (Kuster y colaboradores, (1995) Plan t Mol . Biol . 29 (4) -. 159-112 ) ; y el promotor rolB (Capana y colaboradores, (1994) Plan t Mol . Biol . 25 (4) : 681-691. Ver también las patentes norteamericanas Nos. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 y 5,023,179.

Los promotores preferidos de semilla incluyen tanto promotores específicos de semilla (aquellos promotores activos durante el desarrollo de semilla tales como promotores de proteína de almacenamiento de semillas) así como promotores de germinación de semillas (aquellos promotores activos durante la germinación de semillas). Ver Thompson y colaboradores, (1989) BioEssays 10:108, incorporado en la presente por referencia. Tales promotores preferidos de semilla incluyen, pero no están limitados a Ciml dmensaje inducido por citoquinina); CZ19B1 (zeína 19 kDa de maíz) ; milpas (mio-inositol-1-fosfato sintasa) (ver WO 00/11177 y la patente norteamericana No. 6,225,529; incorporadas en la presente por referencia). Gamma-zeína es un promotor específico de endosperma. La Globulina 1 (GIb-I) es un promotor específico de embrión representativo. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a, ß-faseolina de frijol, napina, ß-conglicinina, lectina de soya, cruciferina y los similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a, zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gamma-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, Globulina 1, etc. Ver también WO 00/12733, donde los promotores preferidos de semilla de los genes endl y end2 genes son divulgados; incorporados en la presente por referencia.

Las secuencias de palinucleótido expresadas por la región de control reguladora transcripcional quimérica de la invención se puede utilizar para variar el fenotipo de una planta. Varios cambios en el fenotipo de interés incluyendo la expresión de modificación de un gen en un embrión de planta, la alteración de un patógeno de planta o mecanismo de defensa de insecto, incremento a la tolerancia de plantas a herbicidas en una planta, alteración del desarrollo de embrión a responder al estrés ambiental y los similares. Estos resultados se pueden lograr mediante la expresión de una secuencia de nucleótidos heterólogos de interés que comprende un producto de gen apropiado. En modalidades específicas, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés es una secuencia de planta endógena cuyo nivel de expresión es incrementado en la planta o parte de planta. Alternativamente, los resultados se pueden lograr al proporcionar una reducción de expresión de uno o más polinucleótidos de interés. La región de control reguladora transcripcional quimérica de la invención puede además comprender porciones adicionales de otras regiones reguladoras transcripcionales. Así, el elemento de control regulador transcripcional divulgado en la presente, que comprende el dominio aumentador y un promotor heterólogo pueden comprender elementos reguladores corriente arriba, tales como, aquellos responsables para el tejido y la expresión temporal de la secuencia de codificación. En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" también se refiere a una secuencia de DNA, usualmente, pero no siempre, corriente arriba (5' ) a la secuencia de codificación de un gen estructural, que incluye secuencias que modulan la expresión de la región de codificación. Se va a entender que la secuencia de nucleótidos, localizada dentro de los intrones, o 3' de la secuencia de región de codificación también puede contribuir a la regulación de expresión de una región de codificación de interés. Ejemplos de intrones adecuados incluyen, pero no están limitados a, el intrón IVS6 de maíz, o el intrón de actina de maíz. Un elemento regulador también puede incluir aquellos elementos localizados corriente abajo (3') al sitio de iniciación de transcripción, o dentro de regiones transcritas o ambos. En el contexto de la presente invención un elemento regulador transcripcional puede incluir elementos que son activos después de la iniciación de transcripción, por ejemplo aumentadores de traducción y de transcripción, represores de traducción y transcripción y determinante de estabilidad de mRNA. Además se reconoce que el aumentador de la invención puede ser posicionada en la construcción de DNA entre y operablemente enlazado a un primero y un segundo promotor. En tales modalidades, el aumentador permite una modulación en expresión de tanto el primero y el segundo promotor a partir de una dirección divergente. Ejemplos ejemplares, pero no limitativos de tales construcciones de DNA comprende en la orientación 5' a 3' o 3' a 5' : un primer polinucleótido de interés operablemente enlazado a un primer promotor, operablemente enlazado a por lo menos una copia de un aumentador de la invención, operablemente enlazado a un segundo promotor, operablemente enlazado a un segundo polinucleótido de interés. En modalidades específicas, la secuencia aumentadora es heteróloga a la primera y la segunda secuencia aumentadora. III. Plantas y Partes de las mismas Como se utiliza en la presente, el término planta, incluye células de planta, protoplastos de planta, cultivo de tejidos de célula de planta a partir de las cuales las plantas pueden ser regeneradas, tallos de plantas, agrupaciones de plantas y células_ de plantas que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, pone, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, semillas, mazorcas, espigas, vainas, tallos, raíces, productos de raíz, anteras y los similares. El grano se propone para dar a entender la semilla madura producida por los cultivadores comerciales para propósitos diferentes al crecimiento o reproducción de las especies. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas también son incluidos dentro del alcance de la invención, con la condiciones de que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. La presente invención se puede utilizar para transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitado a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de especies de planta de interés incluyen, pero no están limitados a maíz {Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semilla, alfalfa {Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum) , mijo proso (Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorra (Setaria itálica) , mijo de extensión (Eleusine coracana) , girasol (Helianthus annuus) , cártamo (Carthamus tinctorius) , trigo (Triticum aestivum) , soyan (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (Solanum tuberosum) , cacahuates (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote (Ipomoea batatus) , cassava (Manihot esculenta) , café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera) , piña (Ananas comosus) , árboles cítricos (Citrus spp.), cocoa (Theobroma cacao), te (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana) , "higo (Ficus casica) , guayaba (Psidíum guajava) , mango (Mangífera indica), olivo (Olea europaea) , papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale) , macadamia (Macadamia integrifolia) , almendra (Prunus amygdalus) , betabeles (Beta vulgaris) , caña de azúcar (Saccharum spp.), avenas, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), chícharos (Phaseolus vulgaris) , haba (Phaseolus limensis) , guisantes (Lathyrus spp.), y los miembros del género Cucumis tal como pepino (C sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) , y melón chino (C. meló) . Ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrangea (Macrophylla hydrangea) , hibisco (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hyb r ida) , clavel (Dianthus caryophyllus) , poinsettia (Euphorbia pulcherrima) , y crisantemo. Las coniferas que se pueden emplear en la práctica de la presente invención incluye, por ejemplo, pinos tal como el pino de incienso (Pinus taeda), pino cenizo (Pinus elliotii) , pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino lodgepole (Pinus contorta) , y pino Monterey (Pinus radiata) ; abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii) ; abeto del Occidente (Tsuga canadensis) ; abeto Sitka (Picea glauca); madera roja (Sequoia sempervirens) ; abetos grandes tal como el abeto plateado (Abies amabilis) y el abeto de bálsamo (Abies balsamea) ; y cedro tal como el cedro rojo de Occidente ( Thuja plica ta ) y el cedro amarillo de Alaska ( Chamaecyparis nootka tensis) . En modalidades específicas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassi ca , soya, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras modalidades, las plantas de maíz y de soya son óptimas, y todavía otras modalidades las plantas de maíz son óptimas. Otras plantas de interés incluyen plantas de granos que proporcionan semillas de interés, plantas de semilla de aceite y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de granos, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Plantas de semilla de aceite incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen grisantes y frijoles. Los guisantes incluyen guar, guisante de locust, fenogreco, soya, guisantes de jardín, caupí, mungbean, haba, fava vean, lentejas, garbanzo, etc. Una "planta sujeto o célula de planta" es una en la cual la alteración genética, tal como la transformación, se ha efectuado en cuanto a un gen de interés, o es una planta o una célula de planta que es descendiente de una planta o célula así alterada y que comprende la alteración. Un "control" o "planta de control" o "célula de planta de control" proporciona un punto de referencia para medir cambios en el fenotipo de la planta o célula de planta sujeto. Una planta de control o célula de planta puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula de tipo silvestre, es decir, del mismo genotipo como el material de partida para la alteración genética que dio por resultado la planta o célula sujeto; (b) una planta o célula de planta del mismo genotipo como el material de partida pero que se ha transformado con una construcción nula (es decir, una construcción que no tiene efectos sobre el atributo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador) ; (c) una planta o célula de planta que es un segregante no transformado entre la progenie de una planta o célula de planta sujeto, (d) una planta o célula de planta genéticamente idéntica a la planta o célula de planta sujeto pero que no se ha expuesto a las condiciones o estímulos que no inducirían la expresión del gen de interés; o (e) la planta sujeto o célula de planta misma, bajo condiciones en las cuales el gen de interés no es expresado. Cualquier organismo que tiene una región de control transcripcional quimérico que comprende un dominio aumentador de la invención o un variante activo o fragmento del mismo se han proporcionado. En modalidades específicas, las plantas, partes de plantas, células y plasma germinal que tiene una región e control transcripcional quimérico que comprende un dominio aumentador de la invención o una variante activa o fragmento de la misma son proporcionados. En modalidades específicas, la región de control transcripcional quimérico es operablemente enlazada a un polinucleótido de interés. Tales polinucleótidos incluyen, por ejemplo, cualquier polinucleótido que confiere transferencia a un herbicida. Las células de planta, partes de plantas y plasma germinal comprende tales secuencias que además son proporcionadas. IV. Polinucleótidos de Interés La región de control reguladora transcripcional quimérica que tiene un dominio aumentador o un variante activo o fragmento del mismo pueden ser utilizado para expresar cualquier polinucleótido de interés. Las categorías generales de polinucleótidos de interés para la presente invención incluyen, por ejemplo, aquellos genes involucrados en la información, tales como las extensiones de zinc, aquellos involucrados en la comunicación, tales como quinasas, y aquellos involucrados en conservadores, tales como proteínas de choque de calor, categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican atributos importantes para la agronomía, resistencia a insectos, resistencia a la enfermedad, resistencia a herbicida y resistencia de estrés ambiental (tolerancia alterada al frío, sal, sequía, etc.) . Los genes de resistencia de insectos pueden codificar la resistencia a pestes que tienen gran arrastre de rendimiento tal como gusanos de raíz, gusano trepador, barrenador de maíz Europeo y los similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, los genes de proteína Ba cillus thuringiensis (patentes norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881 y Geiser y colaboradores, (1986) Gene 48:109); y los similares. Los genes que codifican atributos de resistencia a la enfermedad incluyen genes de detoxificación, tales como _ aquellos que detoxifican fumonisina (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a avirulencia (avr) y genes de resistencia a enfermedad (R) (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; y Mindrinos y colaboradores, (1994) Cell 7S:1089); y los similares. Los productos exógenos incluyen enzimas de plantas y productos así como aquellos que otras fuentes que incluyen procariotas y otras eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y los similares. Ejemplos de otros genes aplicables y su fenotipo asociado incluyen el gen que codifica la proteína de recubrimiento viral y/o RNA, u otros genes virales o de plantas que confieren resistencia viral; genes que confieren resistencia fungal; genes que promueven la mejora de rendimiento y genes que proporcionan resistencia al estrés, tal como frío, deshidratación que resulta de la sequía, calor y salinidad, elementos metálicos o elementos menores tóxicos, o los similares. Como se observó, el polinucleótido operablemente enlazado a la región de control de transcripción que comprende el dominio aumentador en la presente puede ser una secuencia antisentido para un gen dirigido. Así, las secuencias promotoras divulgadas en la presente pueden ser operablemente enlazadas a las secuencias de DNA antisentido para reducir el nivel de expresión de una proteína nativa en el embrión de planta. "RNAi" se refiere a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de genes (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,506,559). Las técnicas más viejas referidas por otros nombres ahora se cree que dependen del mismo mecanismo, pero se le dan diferentes nombres en la literatura. Estos incluyen "inhibición antisentido", la producción de transcriptos de RNA antisentido capaz de suprimir la expresión de la proteína objetivo, y "co-supresión" o "supresión de sentido", que se refieren a la producción de transcripto de RNA de sentido capaz de suprimir la expresión de genes foráneos o endógenos idénticos o sustancialmente similares (patente norteamericana No. 5,231,020, incorporada en la presente por referencia. Tales técnicas dependen del uso de construcciones que dan por resultado la acumulación de RNA de doble hebra con una hebra complementaria del gen objetivo que es silenciado. El aumentador 35S en el contexto de la región de control de transcripción de las modalidades se puede utilizar para inducir la expresión de construcciones que darán por resultado la interferencia de RNA que incluye microRNAs y siRNAs. Donde es apropiado, los polinucleótidos pueden ser optimizados para la expresión incrementada en la planta transformada. Esto es, los polinucleótidos pueden ser sintetizados utilizando codones preferidos de planta para la expresión mejorada. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plan t Physiol . 92:1-11 para una discusión de la utilización de codón preferida por el hospedero. Los métodos están disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de planta. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,380,831, y 5,436,391, y Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res . 17:477-498, incorporadas en la presente por referencia. En una modalidad, el polinucleótido de interés codifica un polinucleótido que confiere tolerancia a un herbicida de interés. En una modalidad, el polinucleótido que confiere tolerancia al herbicida de interés comprende un polipéptido toleran al inhibidor de ALS que confiere resistencia a una dosis de sulfonilurea, imidazolinona, triazolopirimidinas, pirimidinioxi (tio) benzoatos, y/o hercibida sulfonilamino-carbonil-triazolina . Los herbicidas sulfonilurea e imidazolinona inhiben el crecimiento de plantas superiores al bloquear la acetolactato sintasa (ALS) , también conocida como, acetohidroxi ácido sintasa (AHAS) . Por ejemplo, las plantas que contienen mutaciones particulares en ALS (por ejemplo, las mutaciones S4 y/o HRA) son tolerantes a los herbicidas de sulfonilurea. La producción de plantas tolerantes de sulfonilurea y plantas tolerantes e imidazolinona es descrito más completamente en las patentes norteamericanas Nos. 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937; y 5,378,824; y la publicación internacional WO 96/33270, que son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos. En modalidades específicas, el polipéptido tolerante inhibidor de ALS comprende un acetolactato sintasa tolerante a sulfonamida, un acetohidroxi ácido sintasa tolerante a sulfonamida, un acetolactato sintasa tolerante a imidazolinona, o un acetohidroxi ácido sintasa tolerante a imidazolinona. Los polinucleótidos que codifican para resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), glifosato (por ejemplo, el gen EPSPS y el gen GAT; ver, por ejemplo, la publicación norteamericana No. 20040082770 y WO 03/092360) u otros de tales genes conocidos en la técnica también pueden ser utilizados. El gen bar que codifica resistencia a herbicida basta, el gen nptll codifica resistencia a los antibióticos de canamicina y geneticina, y los mutantes de gen ALS codifican resistencia al herbicida clorsulfurón. La resistencia a glifosato es impartida por el mutante 5-enolpiruvl-3-fosfiquimato sintasa (EPSP) y los genes aroA. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 4,940,835 en Shah y colaboradores, que divulgan la secuencia de nucleótido de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia a glifosato. Patente norteamericana No. 5,627,061 a Barry y colaboradores, también describe genes que codifican enzimas EPSPS. Ver también las patentes norteamericanas Nos. 6,248,876 Bl; 6,040,497; 5,804,425; 5,633,435; 5,145,783 4,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 4,940,835; 5,866,775 6,225,114 Bl; 6,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061 5,633,448; 5,510,471; Re. 36,449; RE 37,287 E; y 5,491,288; y las publicaciones internacionales WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 y WO 00/66748, que son incorporadas en la presente por referencia para ese propósito. La resistencia a glifosato también se impartirá a plantas que expresan un gen que codifica la enzima óxido-reductasa a glifosato como es descrito más completamente en las patentes norteamericanas Nos. 5,776,760 y 5,463,175, que son incorporadas en la presente por referencia para este propósito. Además, la resistencia a glifosato puede ser impartida a plantas mediante la sobreexpresión de genes que codifican glifosato en un N-acetiltransferasa . Ver, por ejemplo, la solicitud de patente norteamericana Nos. de serie 10/004,357 y 10/427,692, cada una de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los polipéptidos que confieren tolerancia a herbicidas que inhiben la enzima glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o glufosinato (por ejemplo, el gen jbar) también pueden ser utilizados. La glutamina sintetasa (GS) aparece para ser una enzima esencial necesaria para el desarrollo y la mayoría de células de planta, e inhibidores de GS son tóxicos a células de plantas. Los herbicidas de glufosinato se han desarrollado basado en el efecto tóxico debido a la inhibición de GS en plantas. Estos herbicidas no son selectivos, esto es, ellos inhiben el crecimiento de todas las diferentes especies de plantas presentes. El desarrollo de plantas que contienen una fosfinotricina acetiltransferasa exógena se describe en las patentes norteamericanas Nos. 5,969,213; 5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616; y 5,879,903, que son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos. La fosfinotricina acetiltransferasa mutada que tiene esta actividad también son divulgadas. En todavía otras modalidades, los polipéptidos que confieren resistencia a herbicidas que inhiben protox (protoporfirinogen oxidasa) pueden ser utilizados. El protox es necesario para la producción de clorofila, que es necesario para toda la supervivencia de la planta. La enzima protox sirve como el objetivo para una variedad de compuestos herbicidas. Estos herbicidas también inhiben el crecimiento de todas las diferentes especies de plantas presentes. El desarrollo de plantas que contienen la actividad protox alterada que son resistentes a estos herbicidas se describen en las patentes norteamericanas Nos. 6,288,306; 6,282,837; y 5,767,373; y la publicación internacional WO 01/12825, que son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos. En todavía otras modalidades, se emplean polipéptidos que involucran otros modos de resistencia a herbicida. Por ejemplo, las hidroxifenilpiruvatodioxigenasas son enzimas que catalizan la reacción en la cual para-hidroxifenilpiruvato (HPP) se transforma en homogentizado. Las moléculas que inhiben esta enzima y que enlazan a la enzima con el fin de inhibir la transformación del HPP en el homogenizado son útiles como herbicidas. Las plantas más resistentes a ciertos herbicidas se describen en las patentes norteamericanas Nos. 6,245,968; 6,268,549 y 6,069,115 y la publicación internacional WO 99/23886, que son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades para todos los propósitos. También se divulgan hidroxifenilpiruvatodioxigenasa mutada que tiene esta actividad. Los herbicidas adicionales, incluyen pero no están limitados a, un inhibidor de acetil Co-A carboxilasa tal como quizalofop-P-etilo, una auxina sintética tal como quinclorac, un herbicida inhibidor de protoporfirinogen oxidasa (PPO) (tal como sulfentrazona) , un herbicida inhibidor de síntesis de pigmento tal como el inhibidor de hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (por ejemplo, mesotriona o sulcotriona) , una fosfinotricin acetiltransferasa o un inhibidor de fitoeno desaturasa similar a diflufenican o inhibidor de síntesis de pigmento. V. Métodos de Introducción La construcción de DNA que comprende el dominio aumentador de la presente invención operablemente enlazado a un promotor heterólogo se puede utilizar para transformar cualquier organismo de interés. En modalidades específicas, el organismo comprende una planta o parte de la misma. De esta manera, se pueden obtener plantas genéticamente modificadas, células de plantas, tejido de planta, semilla, embriones, y los similares. Los métodos de la invención involucran la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducción" se propone para dar a entender la presentación en la planta del polinucleótido de tal manera que la secuencia dan acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no dependen sobre un método particular para introducir una secuencia en una planta, solamente que el polinucleótido o polipéptido gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para la introducción del polinucleótido o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, métodos de transformación estables, métodos de transformación transientes y métodos mediados por virus. "Transformación estable" se propone para dar a entender que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma. "Transformación transiente" se propone para dar a entender que un polinucleótido se introduce en la planta y no se integra en el genoma de la planta o un polipéptido se introduce en una planta . Los protocolos de transformación así como protocolos para introducir polipéptidos o secuencias de polinucleótido en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados de introducción de polipéptidos y polinucleótidos en células de plantas incluyen microinyección (Crossway y colaboradores, (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y colaboradores, (1986) Proc. Na ti .

Acad. Sci . USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacteri um (patente norteamericana No. 5,563,055 y patente norteamericana No. 5,981,840), transferencia de gen directa (Paszkowski y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2717-2722) , aceleración de partícula balística (Ver, por ejemplo, la patente norteamericana Nos. 4,945,050; patente norteamericana No. 5,879,918; patentes norteamericanas Nos. 5,886,244 y 5,932,782; Tomes y colaboradores, (1995) in Plant Cell , Tíssue, y Organ Cul ture : Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín) ; McCabe y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:923-926); y transformación de Lecl (WO 00/28058) . También ver Weissinger y colaboradores, (1988) Ann . Rev. Genet . 22:421-477; Sanford y colaboradores, (1987) Particula te Science y Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores, (1988) Plan t Physiol . 87:671-674 (soya); McCabe y colaboradores, (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soya); Finer y McMullen (1991) In Vi tro Cell Dev. Biol . 27P:175-182 (soya); Singh y colaboradores, (1998) Theor .

Appl . Genet . 96:319-324 (soya); Datta y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores, (1988) Proc . Na ti Acad. Sci . USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz) ; patentes norteamericanas Nos. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein y colaboradores, (1988) Plan t Physiol . 91:440-444 (maíz); Fromm y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores, (1984) Na ture (London) 311:763-764; patente norteamericana No. 5,736,369 (cereales); Bytebier y colaboradores, (1987) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 84:5345-5349 (Liliáceas); De Wet y colaboradores, (1985) in The Experimental Manipula tion of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores, (Longman, New York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler y colaboradores, (1990) Plan t Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler y colaboradores, (1992) Theor. Appl . Genet . 84:560-566 (transformación mediada por whisker); D'Halluin y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li y colaboradores, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por la vía de Agrobacterium tumefaciens) ; todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. En modalidades específicas, la construcción de DNA de la invención se puede proporcionar a la planta utilizando una variedad de métodos de transformación transiente. Tales métodos de transformación transiente incluyen, la construcción de DNA que comprende el dominio aumentador puede ser transientemente transformado a la planta utilizando técnicas conocidas en el arte. Tales técnicas incluyen sistema de vector viral y la precipitación del polinucleótido de una manera que evita la liberación subsecuente del DNA. Así, la transcripción del DNA enlazado a partícula puede ocurrir, pero la frecuencia en la cual se libera llega ser integrada en el genoma es grandemente reducida. Tales métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilenimina (PEÍ; Sigma #P3143) . En otras modalidades, el polinucleótido de la invención se puede introducir en plantas al poner en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos involucran la incorporación de una construcción de nucleótidos de la invención dentro de un DNA viral o moléculas de RNA. Además, se reconoce que los promotores de la invención también comprenden promotores utilizados para la transcripción por RNA polimerasas virales. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una secuencia operablemente enlazada, que involucra moléculas de DNA o RNA virales, son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367, 5,316,931, y Porta y colaboradores, (1996) Molecular Biotechnology 5:209- 221; incorporados en la presente por referencia. Los métodos son conocidos en la técnica para la inserción dirigida de un polinucleótido en una localización específica en el genoma de la planta. En una modalidad, la inserción del polinucleótido a una localización genómica deseada se logra utilizando sistemas de recombinación específico del sitio. Ver, por ejemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855, y W099/25853, todos los cuales son incorporados por referencia. Brevemente, el polinucleótido de la invención puede ser contenido en el cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos. El cásete de transferencia se introduce en una planta que tiene establemente incorporado en su genoma un sitio objetivo que es flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Una recombinasa apropiada se proporciona y el cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. El polinucleótido de interés de esta manera integrado en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta. Las células que se han transformado pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas luego pueden ser cultivadas, ya sea polinizadas con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y la progenie resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada, identificada. Dos o más generaciones pueden ser cultivadas para asegurar la expresión de la característica fenotípica deseada que sea establemente mantenida y heredada y luego las semillas cosechadas para asegurar la expresión de la característica fenotípica deseada que se ha logrado. De esta manera, la presente invención proporciona semilla transformada (también referida como "semilla transgénica") que tiene un polinucleótido de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, establemente incorporado en su genoma. En ciertas modalidades los polinucleótidos de la presente invención pueden ser apilados con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés con el fin de crear plantas con un atributo deseado. Un atributo, como se utiliza en la presente se refiere al fenotipo derivado de una secuencia particular o grupos de secuencias. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser apilados con cualquier otro de los polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad pesticida y/o insecticida y/o actividad herbicida, tales como otras proteínas tóxicas de Bacill us thuringiensis descrito en las patentes norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881 y Geiser y colaboradores, (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme y colaboradores, (1994) Plant Mol . Biol . 24:825, pentina (descrita en la patente norteamericana No. 5,981,722), y los similares. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar en cualquier otro gen o combinaciones de genes para producir plantas de una variedad de combinaciones de atributos deseados incluyendo, pero no limitados a, atributos deseables para la alimentación para animales tales como genes de alto contenido de aceites (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (patentes norteamericanas Nos. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802 y 5,703,409); cebada de alto contenido de lisina (Williamson y colaboradores, (1987) Eur. J. Biochem . 165:99-106; y WO 98/20122) y proteínas de alto contenido de metionina (Pedersen y colaboradores, (1986) J. Biol . Chem . 261:6279; Kirihara y colaboradores, (1988) Gene 71:359; y Musumura y colaboradores, (1989) Plan t Mol . Biol . 12:123)); digestibilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud norteamericana No. de serie 10/053,410, presentada el 7 de Noviembre del 2001); y tioredoxinas (solicitud norteamericana No. de serie 10/005,429, presentada el 3 de Diciembre del 2001); las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia.

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser apilados con atributos deseables para resistencia a enfermedad o herbicida (por ejemplo, genes de detoxificación de fumonisina (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a avirulencia y enfermedad (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; Mindrinos y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); mutante de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicida tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar) ; y resistencia a glifosato (gen EPSPS) ; y atributos deseables para procesamiento o proceso de productos tal como alto contenido de aceite (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasa (patente norteamericana No. 5,952,544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa) , almidón sintasa (SS) , enzimas de ramificación de almidón (SBE) , y enzimas de desramificación de almidón (SDBE) ; y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, la patente norteamericana No. 5.602,321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa, y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert y colaboradores, (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs) ) ; las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. También se podrían combinar el polinucleótido de la presente invención con polinucleótidos que proporcionan atributos agronómicos tal como esterilidad masculina (por ejemplo, ver la patente norteamericana No. 5.583,210), resistencia del tallo, tiempo de florecimiento o atributos de tecnología de transformación tal como la regulación del sitio celular o dirección al gen (por ejemplo, WO 99/61619, WO 00/17364 y WO 99/25821); las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Estas combinaciones apiladas se pueden crear mediante cualquier método que incluye, pero no limitado a, a la reproducción cruzada de plantas mediante cualquier metodología convencional o TopCross o transformación genética. Si las secuencias son apiladas o transformadas genéticamente a las plantas, las secuencias de polinucleótido de interés se pueden combinar en cualquier tiempo y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más atributos deseados se puede utilizar en el futuro para introducir atributos adicionales mediante la transformación subsecuente. Los atributos pueden ser introducidos simultáneamente en el protocolo de cotransformación de los polinucleótidos de interés proporcionados por cualquier combinación de cásete de transformación. Por ejemplo, las dos secuencias serán introducidas, las dos secuencias pueden ser contenidas en cásete de transformación separado (trans) o contenidos en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de las secuencias se puede inducir por el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Este se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de atributos en planta. Además se reconoce que la secuencia de polinucleótidos pueden ser apiladas en una localización genómica deseada utilizando un sistema de recombinación específico en el sitio. Ver, por ejemplo, W099/25821,' W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. VI . Métodos de Uso Se proporciona un método para modular la concentración y/o actividad de cualquier polinucleótido o polipéptido codificado de esta manera. En general, la concentración y/o actividad se incrementa o se disminuye por al menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con relación a una planta de control nativa, parte de planta, o célula que no tuvo la secuencia de la invención introducida. La modulación en la presente invención puede ocurrir durante y/o subsecuente al crecimiento de la planta a la etapa deseada de desarrollo. El nivel de expresión del polinucleótido o polipéptido de interés puede ser medido directamente, por ejemplo, al analizar el nivel del polipéptido o polinucleótido en el organismo, o indirectamente, por ejemplo, al medir la actividad del polipéptido o polipéptido en el organismo. En modalidades específicas, la construcción de DNA que comprende el dominio aumentador se introduce en la célula de planta. Subsecuentemente, una célula de planta que tiene la secuencia introducida de la invención se selecciona utilizando métodos conocidos para aquellos de habilidad en la técnica tal como, pero no limitado a, análisis de manchado de Southern, secuenciación de DNA, análisis de PCR, o análisis fenotípico. En un método, se proporciona una población de células y una construcción de DNA que comprende una región reguladora transcripcional quimérica de la invención operablemente enlazada al polínucleótido que comprende un marcador seleccionable se introduce por lo menos una célula de la población. La población de células luego se pone en contacto con una concentración efectiva de un agente de selección apropiado; y, la célula de planta que expresa el polinucleótido es seleccionada. Las células de planta que tienen las construcciones de DNA de esta manera son identificados. Una planta o parte de planta alterada o modificada por las modalidades anteriores se cultiva bajo condiciones de formación de planta durante un tiempo suficiente para modular la concentración y/o actividad del polinucleótido operablemente enlazado a la región de control transcripcional que comprende el dominio aumentador. Las condiciones de formación de * planta son bien conocidas en la técnica y se discuten brevemente en otra parte en la presente . En una modalidad, el aumentador de la invención se emplea para modular la expresión de dos polinucleótidos de interés. En tales métodos, una construcción de DNA que tiene el aumentador de la invención posicionado entre y operablemente enlazado a un primero y un segundo promotor se introduce en una planta. En tales métodos, el aumentador permite una modulación o expresión de tanto el primero y el segundo promotor a partir de una dirección divergente. Ejemplos ejemplares, pero no limitativos, de tales construcciones de DNA comprenden en la orientación 5 ' a 3 ' o 3' a 5': un primer polinucleótido de interés operablemente enlazado a un primer promotor, operablemente enlazado a por lo menos una copia de un aumentador de la invención, operablemente enlazado a un segundo promotor, operablemente enlazado a un segundo polinucleótido de interés. En modalidades específicas, la secuencia aumentadora es heteróloga a la primera y la segunda secuencia aumentadora.

En algunas modalidades, la región reguladora transcripcional quimérica que comprende el dominio aumentador se puede utilizar en construcciones de DNA que son operablemente enlazados a un marcador seleccionable, tal como un polinucleótido que puede conferir tolerancia a un herbicida. Por ejemplo, una construcción de DNA que comprende la región reguladora transcripciónal quimérica que comprende un dominio aumentador de la invención es operablemente enlazado a un polinucleótido que puede conferir tolerancia a un herbicida que puede funcionar como un marcador seleccionable, por ejemplo, en una planta, bacteria, actinomicete, levadura, alga u otros hongos. Por ejemplo, un organismo que se ha transformado con tal construcción de DNA puede ser seleccionado basando su habilidad para crecer en la presencia de un herbicida que no permitirá que crezca un organismo de control. Como se utiliza en la presente "una concentración efectiva" de un agente selectivo es una concentración de un agente que permite que las células que expresan el nucleótido de interés sobreviva, pero las células que no expresan la secuencia de polinucleótido de interés no sobrevivirán en la presencia del agente en esa concentración. Como se demostró en el Ejemplo 4 y la Figura 6, tales métodos de selección permitirán evaluar la expresión de un polinucleótido de interés. Por ejemplo, en modalidades específicas tales métodos permiten a los problemas potenciales con la expresión de un polinucleótido de interés en etapas tempranas en el proceso de transformación. En tales modalidades, la construcción que comprende la región reguladora transcripcional quimérica es operablemente enlazada a un polinucleótido que codifica un marcador seleccionable. La misma construcción además comprende un polinucleótido de interés que también es operablemente enlazado a la región reguladora transcripcional quimérica o a un promotor separado de interés. Mientras que cualquier polinucleótido de interés puede sr empleado, en ejemplos específicos, se emplean polinucleótidos insecticidas . En otras modalidades, una construcción que comprende una región reguladora transcripcional quimérica que comprende un dominio aumentador es operablemente enlazado a un polinucleótido de interés que pude exhibir una eficiencia de transformación muy alta tal como una eficiencia de por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, o 60% o más alta. En modalidades específicas, el polinucleótido de interés confiere tolerancia a un marcador seleccionable, y en una modalidad más específica, la secuencia confiere tolerancia a un herbicida de interés) . De esta manera, se proporcionan métodos mejorados de transformación. Por otra parte, cuando una construcción que comprende un dominio aumentador de la invención es operablemente enlazada a un polinucleótido que puede conferir tolerancia a un marcador seleccionable (tal como una secuencia que confiere tolerancia a herbicidas), los transformantes que se obtienen pueden exhibir una muy alta frecuencia de tolerancia al marcador, de modo que, por ejemplo, por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de los transformantes son tolerantes al marcador. Como se utiliza en la presente "Eficacia de transformación" se define como el porcentaje de eventos T0 que exhiben el fenotipo deseado del polinucleótido de interés (es decir, exhiben tolerancia a un herbicida) . Además, cuando una construcción que comprende un dominio regulador transcripcional quimérico que comprende por lo menos una copia del dominio aumentador es operablemente enlazado a un polinucleótido de interés, la frecuencia de eventos de transformación en la cual solamente una sola copia de la construcción es insertada en el genoma puede ser tan alto como por lo menos 35%, 40%, 50%, '60%, 70%, 80%, 90%, o más alto. De esta manera la invención también proporciona métodos mejorados de transformación. Se reconoce que múltiples copias del dominio aumentador pueden ser utilizadas, incluyendo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más. En tales métodos, los transformantes se pueden seleccionar utilizando el método apropiado basado en el polinucleótido introducido en el organismo.

La invención además proporciona un equipo que comprende por lo menos una construcción de ácido nucleico que comprende una región reguladora transcripcional quimérica que comprende por lo menos una copia del domino aumentador de la invención o una variante activa o fragmento del mismo. En algunos aspectos, una construcción de la invención comprenderá una secuencia de T-DNA. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. EXPERIMENTAL Ejemplo 1. Métodos de Transformación que emplean una secuencia GAT de Maíz I . Preparación de la Placa Maestra de Agrobacteri um 1. Obtener la cepa de Agrobacterium tumefaciens diseñada con componentes GAT (SEQ ID NO: 7 o 8) y almacenar en el congelador a -80°C como un extracto de glicerol al 50%. La región de control transcripcional utilizada fue el 3X35 S ENH (-) operablemente enlazado al promotor de intrón 1 ZmUbi PRO-5UTR-ZmUbi (SEQ ID NO: 9). Esta región de control transcripcional (SEQ ID NO: 9) se expone enseguida denotando la ubicación de las diversas regiones de la región reguladora: a) el aumentador 35S (3X) en la dirección inversa tiene un solo subrayado; b) el promotor UBI tiene doble subrayado y c) el intrón UBI está en cursivas. tatr.ttpacaataaa^^^ tgccctttggtcttc-tpapactgtatcffigpt tttftpp^t^^aagc tgtcgtgctccaccatgttgacgaagatfflcttc ttg ^ttgagtcgta^apactctgtatgaactf cgccagtcfflacggcgagttctgttaggtcctctaW r.catggacggt3tcgataagctagcttgatatcacatcaatccacftpr.fflgaapacptgpttggaacgtcttctttttccacg atgctcctc tgggtPgpggtccatctttpppaccactgtcggcagaggcatcttcaacgatggcctttcctttatcgcaatg atggcatttgtaggagccaccttcctttt(xactatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtt tccggatattaccctttgttgaaaagtctcaattgccctttggtcttctgagactgtatctttgatatttttggagtagacaagcgtg tcgtgctccaccatgttgacgaagatt tcttcttgtcattgagtcgtaagagactctgtatgaactgttcgccagtctttacggc gagttctgttaggtcctctatttgaatctttgactccatgatcgaattatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaac gtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttcaacgatggccttt cctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttccttttccactatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatgga atccgaggaggtttccggatattacccttt i^gaaaagtctcaattgccctttggtcttctgagactgtatctttgatatttttgga gtagacaagcgtgtcgtgctccaccatgttgacgaagattttcttcttgtcattgagtcgtaagagactctgtatgaactgttcg ccagtctttacggcgagttctgttaggtcctctatttgaatctttgactccatgggaattcctgcagcccagcttgcatgcctgca gjgcagcgt:gacccggtcgtpcccctctctagagataatgagcatt tcacacttgffigaagtgcagffiatctatcffiatacatatattl^ atcagtgtfflagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaa^ggacaattgagtattttgacaacaggactctacagt tttatcttmagtgtgcatgtgttctcctttffl ttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttatta ^ ggtaagggttaatggtttttatagacteattttffla tacatctatttte tttagtttttttatttaataat*tta ¡atataaaatagaataaaataaaetgactaaaaattaaacaaatacccffla ^actaaggaaacattfflctt tttcgagtegataatgccagcctg^aaacgcc i:pgacgagtQtaacggacaccaac^ cgaaccagcagcgtcgc tcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctcj^acccctctc aga g^ccg£í^accgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgl&agccggsacge caggcggcctcctcctcctctcacggcaccggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcc cgccgtaataaatagacaccocct?cacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatc tcccccaaatccacccgtcggcacctccgc tcaaggtacgccgctcgtcctcccccccccccctctctaccttctctagat cggcgttccggtccatggttagggcccggtagttcíacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgct gctagcgttcgtacacggatgcg cctgtacgtcagac cgttctgattgcíaacttgccagtgtttctctttggggaatcct gggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttfígtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttccttt atttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcg gtcgttctagatcggagtag attctgtttcaa ctacctggtggatttattaattttggatctgtatgtglgtgccatacatatt c t gttacgaattgaagatgatgg tggaaatatcg tctaggataggtatacatgttgatgcgggítttactgatgcat atacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaat actgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcalacatcttcatagttacgaglttaagatgga tggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatat catgatggcatatgcagcatctatt catatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgtttlataattatíttgatcttg tatacttggatgatgg c t tgc gcagcta tgtgg t tttagccctgccttc tacgct fítatttgcttggíactgmcttttgtcgatgctcac cctgttgtttggtgttacttctgca (SEQ ID NO:9) . Preparar la placa maestra de un extracto de glicerol al poner en raya las bacterias para producir colonias individuales en el medio #800 e incubar las bacterias a 28°C en la oscuridad durante 3-4 días. . Preparar una placa de trabajo al poner en rayas 1 colonia de la placa maestra a través del medio #810. Incubar las bacterias a 28°C en la oscuridad durante 1-2 días. II. Prepara ción de bacteria para la infección del embrión 1. Preparar el cultivo líquido del Agrobacteri um 1 día antes del aislamiento del embrión. Disponer un matraz con 30 mis del medio 557A, 30 µl de acetosiringona al 2% y 30 µl de espectinomicina al 5%. 2. Inocular con 1 abertura de Agrobacteri um del medio 810 y colocar en el agitador (200 rpm) en un cuarto oscuro a 28°C durante la noche. n la mañana de la infección, tomar muestras del cultivo líquido de Agrobacteri um y hacer una dilución de H con 557A. Utilizar el cultivo liquido diluido para formar la lectura de OD utilizando luz visible a 550 nm. acer diluciones al cultivo de Agrobacteri um como sea apropiado de acuerdo con la lectura de OD para mantener la lectura de OD entre 0.2-0.8 durante el aislamiento del embrión. uando se prepara el Agrobacteri um para infección, repetir la lectura de OD de cultivo líquido. Utilizando la lectura de OD calcular el número de mis requerido para obtener 5 E10 cfu/ml (cfu=unidad de formación de colonia) al utilizar la fórmula EXPONENTE (1.755 * (InOD) + 21.77) como es derivado de una curva estándar. Pipetear la cantidad calculada de cultivo líquido de Agrobacteri um en el cultivo de 14 ml y centrifugar a 4500 rpm en 4—20°C durante diez minutos. Remover el sobrenadante y resuspender Agrobacterium en cantidad apropiada de solución de acetosiringona de 100 uM en 56 IQ. Aislamiento del Embrión Inmaduro Recolectar mazorcas GS3 en 9-11 días después de la polinización con un embrión de 1-2 mm en longitud. sterilizar la mazorca en 50% de blanqueador y 1 gota de Tween durante 20-30 minutos. Enjuagar 3-5 veces en agua estéril . islar el embrión de los granos y colocar el microtubo que contiene 2 mis de 561Q. Infección por Agrobacterium de Embriones emover 56IQ con la pipeta de microtubo con embriones aislados y fusionar 1 ml de suspensión de Agrobacterium de OD descrito en lo anterior. ezclar al girar el vórtice durante aproximadamente 30 segundos. Permitir 5 minutos durante la infección a temperature ambiente . o-cul tivación espués de la remoción del medio liquido, transferir los embriones y orientar los embriones con el eje embriónico hacia abajo sobre la superficie del medio de co-cultivo de 562P. olocar los embriones en el incubador a 20 °C durante 3 días. Transferir a 28°C durante 3 días adicionales. Selección de eventos de callos puta tivos transgénicos . espués del co-cultivo, transferir los embriones en medio de selección 5631 que contiene glifosato 1 mM. Cultivar los embriones a 28°C en la oscuridad. Cada 14-21 días transferir los embriones al medio 5631 fresco. El proceso de selección puede durar aproximadamente 2 meses hasta que se puedan identificar eventos de callo putativo en crecimiento activamente. Mantener los eventos de callo putativo en el medio 5631 y el callo de muestra para PCR. VII . Regeneración de plantas TO 1. Transferir los eventos de callo al medio 2871 que contiene glifosato 0.1 mM hasta que maduran los embriones somáticos. Cultivar los callos a 28°C en la oscuridad. 2. Transferir los embriones maduros al medio de germinación de embrión 2731 que contiene glifosato 0.1 mM en las placas. Cultivar las placas a 28°C en la luz. 3. Cuando emergen retoños y raíces, transferir plantas individuales a 2731 que contienen glifosato a 0.1 mM en tubos. Cultivar los tubos a 28 °C en la luz. 4. Las plantitas con retoños y raíces establecidas serán transferidos al invernadero para el crecimiento adicional en la producción de semilla TI. Ejemplo 2. Efecto del aumentador 35S sobre la Eficiencia y Eficacia de Transformación de GAT y ALS en el Maiz. Ma teriales y Métodos Cuatro construcciones aumentadoras 35S (PHP20118, PHP20120, PHP20122, PHP20124) y una construcción no de 35S (PHP 19288) se utilizaron para producir eventos para evaluar el efecto del aumentador 35S sobre la eficiencia y eficacia de transformación de GAT (SEQ ID NO:7) (Fig. 1). Las diferencias tanto en las cuatro construcciones aumentadoras 35S sobre los números de copia del aumentador 35S y la orientación del aumentador 35S en las construcciones. Un resumen de cada construcción aumentadora 35S se proporciona enseguida. PHP20118 comprende 35S ENH(+):ZmUBI PR0-5UTR-UBI INTR0N1 (+ denota dirección delantera del aumentador 35S) . Esta región de control transcripcional (SEQ ID NO: 11) está enseguida denotando la ubicación de las diversas regiones de la región regulatoria: a) el aumentador 35S en la dirección delantera tiene un solo subrayado; b) el promotor UBI tiene un doble subrayado y c) el intrón UBI está en cursivas. cccatgqagtcaaaga tcaaatagagqacctaacaqaactcgccgtaaaqactciqcaaacagttcatacaqaqtctcttacqa ctcaatqacaaqaaqaaaatcttcqtcaacat qtqqaqcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaaqatacagtctcaq aaqaccaaaqqqcaattqaqacttttcaacaaaqqqtaatatccggaaacctcctcqqattccattgcccagctatctqtcactttat tqtqaagataqtqqaaaaqqaaqqtqqctcctacaaatgccatcattqcgataaaggaaaqqccatcqttqaaqatqcctctqcc qacaqtqgtcccaaaqatqqacccccacccacqa qaqcatcqtqgaaaaagaaqacqttccaaccacqtcttcaaaqcaaq tggattgatgtgatatcaaqcttatcqataccqtcqacctcqaq gggqqcccaqcttqcatgcptqcaatqcaqcqtqacx-icqqtc qtq^cctctctaqaqataatqagcaftqcatqtctaaqttataaaaaatiaccacat ctatctttatacatatatttaaactttactctacqaataatataatctataqtactacaataatatcaqtattt aqagaatcatataaatqa acaattaqacatqqtctaaaqqacaattaaqtatWaacaacaqqactctacaatttta^tcttWagtqtq ^tqtqttctccttt tt ttac aaataaGttcacctatataatacttcatccaMattaqta8tc**cafflaqgqffl^ ctattttattctatmaacctctaaattaaaaaaac^aaaa ctat ttaglliatlaítlaataamaqata gt actaaaaattaaacaaataccctttaaaaaattaaaaaaac aaqqaaacatttttcttq ttcqaqtaqataatqccaqcctatt aaacqccqtcqacqaatctaacqqacaccaaccaqcqaaccaacaqcqtcqcqtcqqqccaaqcqaascaqacqqcacq gcatctctqtcqctqcctctqqacccctctcqaqaq tccqctccaccqttqqacttactccqctqtcqqcatccaqaaattqcqtqqc ggaqgggeag3gqtqaqccqqcacqqcaqqcqqcctcctcctcctctcacqqcaccqqcaqctacqqqqqattcct tcr.papp qctcct r.qctttcccttcctcqcccqccqtaataaataqacaccccctccacaccctctt ccccaacctcqtgttqttcqqaqpf|r.af. acacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaagg'facgfccgcfcgrfccfccccccccccccfcícf accttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgt gctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctggga tggctctagccgttccgcagac ggatcgatttcatgattttMgtttcgttgcatagggtttggM gtgcacngtt/^tcgggtcatcmcatgcm gtcüggltgtgßtgatgtggtotggügggcggtcgttctaga ^gagtagaatt ctgttt(^aacta8tggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaa atatcgatctaggataggtatacatgttgatg^ggtmactgatgcatatacagagatgctt ^tcgcttggttgtgatgatgtggtgt ggttgggcggtcgttcattcgttctßgatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtc atacatcttcatagttacgagtttaagßtggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatac atgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgat atacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccticatacgctatttatttgctíggtactgtttcMgtcgat gctcaccctgtígt ggtgttacttctgca (SEQ ID NO: 11) PHP20122 comprende 3X35S ENH (+):ZmUBI PRO-5UTR-UBI INTRONl (+ denota la dirección delantera del aumentador 35S) . Esta región de control transcripcional (SEQ ID NO: 12) está enseguida denotando la ubicación de las diversas regiones de la región regulatoria: a) el aumentador 35S en la dirección delantera tiene un solo subrayado; b) el promotor UBI tiene un doble subrayado, y c) el intrón UBI está en cursivas. cccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctctta cgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacag tctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatc tgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttga agatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaacc acgtcttcaaagcaagtggattgatgtgataattcgatcatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgt aaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacga cacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatat ccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaa tgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaaeatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccac gaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatcaagcttatcgatacc gccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctctta cgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacag tctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatc tgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcpttga agatgcctctgccgacagtgptcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaacc acgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatgtctgcagtgcagcgtgacccggtcgtpcccctctctapagataatgngrag g¿atgtcta gttataaaaaattaccacatatt^^ toctc acgaataatataatctataptactacaataatat agt:p^tttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaa gacaattgagtatfflgacaacaggactctacagtmatcttt tagtgtgcatgtg^ctcctttttt atataatocttcatccai-ffiattagtacatccat^ ctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctatttta ttttffiattta^^ saaaaaattaaacaaatacccfflaagaaattaaaaaaactaaggaaacattfflcttgtttcgagtagataa.tgccagcctgtta, aacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagc tcgcgtcgggccaagpgaagcagacpgca cggcatctctgtcgctgcctct:ggacccctctcgagagttccgctccaccgttggactt ctccgct tcggcatccagaaa1; tgcgtggcg agcggcagacgtgagggggcacggcaggcggcctcptcctcctctcacggcaccpgcag?tacgggg gattqctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacc tcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtscgcc ctcgtcctcccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttc atgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgt cgtcagacacgttct gattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgatttt ttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgctttt ttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttc aactacctggtggattí attaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaogatgatggatggaaatatcgatctaggat aggtatac tgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgg gcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtaíttattaaítttggaactgíatgtgtgt gtcatacatcttcatagttacgagttíaagatggatggaaatatcgatctaggataggí tacatgttgatgtgggtttíact g tgcatatac tg tggcatatgcagcatct ttcatatgctctaaccttgagtacctatctattataalaaacaagtatgt tttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagct tatgtggatttttttagccctgccttcatacgct atttatttgcttggtactgtttctmgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgca (SEQ ID NO: 12) PHP20120 comprende 35S ENH (-):ZmUBI PRO-5UTR-UBI INTR0N1 (- denota la dirección trasera del aumentador 35S) .

Esta región de control transcripcional (SEQ ID NO: 13) está enseguida denotando la ubicación de las diversas regiones de la región regulatoria: a) el aumentador 35S en la dirección trasera tiene un solo subrayado; b) el promotor UBI tiene un doble subrayado , y c ) el intrón UBI está en curs ivas . atcacatcaatccacttgctttgaagacp ggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatotttgg gaccactgtcggcagaggcatcttcaacgatggcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttccttttccan. tatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttccggatattaccctttgttgaaaagtotcaat tgccctttggtcttctgagactgtatctttgatatttttggagtagacaagcgtgtcgtgctccaccatgttgacgaagattttcttc ttgtcattgagtcgtaagagactctgtatgaactgttcgccagtctttacggcgagttctgttaggtcctctatttgaatctttgact ccatgggaattcctgcagcccagcttgcatgcctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagca, ttgcatgtctaagttataaaaaatta8acatat1*tt^ títactctacgaataatataatctata tac^caataatatcagtgttttagagaatcatataaa^aaca ttagacatggtcta, aaggftcaattpagtamgacaacagpactctacagttt^^ ctatataatacttcatccattttattagtacatccafflaggg^ ttctatfflagcctctaaattaagaaaactaaaactctatttto^ actaaaaattaaacaaatacccmaagaaattaaaaaaactaaggaaacattfflcttgmcgag agataatgccagcctgtt aaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaacoagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggc acggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaa attgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcaccggcagctacggg ggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaac ctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaagg/ocgcc gctcgtcctcccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgtt catgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcg cctgtacgtcagacacgtt ctgaltgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcg tttcatgat tttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaat tatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgct tttttttgtctíggttgtg tg tgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaact cctggtgga tttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattc t gttacgaattgaagatgatggatggaaat tcgatctagg taggtatac tgttgatgcgggttttactgatgc tatacagagatgcttíttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggtt gggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgt gtgtcatacatcttcatagtt cgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttg tgtgggtttta . ctgatgcat tacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtat gttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggc tatgcagcagctat tgtggatttttttagccctgccttcatacg ctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgca (SEQ ID NO: 13) PHP20124 comprende 3X35S ENH(-): ZmUBI PRO-5UTR-UBI INTRON1 (- denota dirección trasera del aumentador 35S) . Esta región de control transcripcional (SEQ ID NO: 14) está enseguida denotando la localización de las diversas regiones de la región reguladora: a) el aumentador 35S en la dirección trasera tiene un solo subrayado; b) el promotor UBI tiene un doble subrayado, y c) el intrón UBI está en cursivas. atcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttt.ccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgg gacc^ctgtcggcagaggcatcttcaacgatggcctttccti atcgcaatgatggcatttg?aggagccaccttccttttccac tatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttccggatattaccctttgttgaaaagtctcaat tgccct tggtcttctgagactgtatctttgatatttttggagtaga ttgtcattgagtcgteagagactctgtatgaactgttcgccagtctttacggcgag tctgttaggtcctctatttgaatctttgact ccatggacggtatcgataagctagcttgatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacg atgctcctcgtgggteggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttcaacgatggcctttcctttatcgcaatg atggcatttgtaggagccaccttccttttccactatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtt tccggatattaccctttgttgaaaagtctcaattgccc ggtcttctgagactgtatcfflgatattt tggagtagacaagcgtg tcgtgctccaccatgttgacgaagattttcttcttgtcattgagtcgtaagagactctgtatgaactgttcgccagtctttacggc gagttctgttaggtcctctatttgaatctttgactccatgatcgaattatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaac gtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttcaacgatggccttt cctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttccttttccactatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatgga atccgaggaggtttccggatattaccctttgttgaaaagtctcaattgccctt ggtcttctgagactgtatctttgatatttttgga gtagacaagcgtgtcgtgctccaccatgttgacg agattttcttcttgtcattgagtcgtaagagactctgtatgaactgttcg ccagtctttacggcgagttctgttaggtcctctatttgaatctttgactccatgggaattcctgcagcccagcttgcatgcctgca gtgcagcgtgacccggtcgi;gcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttt*tttg tcacacttgfflgaagtgcagtttatctatclttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactaca^aat. atcagtgt agagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagt; tttatctttttagtgtgcatgtgttctccttt tttgcaaatagcttcacctate^ ggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagta^ tttagttttffla-tttaataafflagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaa aactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccag cgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatCtctgtcgctgcctctggacccctctcgaga ßttccgctccaccgttggacttgctccgctp^cggcatccagaaattgcgíggcggagcggcagapgtgagccggcacgg caggcggcctcctcctcctctcacggcaccggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcjgcc cgCCgtaataaatagacaccccctccacaccctc ttccccaacctcptgttgttcppapr.?pacapar.af:ar.aar. agfltp. tcccccaaatccaoccgtcggcacctccgcttcaag^t cgccgctcg cc/cccccccccccctcrcí ccrtctc/ gat cggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgtt gatccgtgct gctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcct gggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgatt tttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttccttt amcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcmcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcg gtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattacatttggatctgtatgtgtgtgccatac tatt catagttacgaattgaagatgatgg tggaaatatcgatct ggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcat atacagagatgctttttgttcgcttggttgtg tgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctag tcggagtagaat actgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatgga tggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactg tgcatatacatgatggcatatgcagcatctatt catatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttata ttattttgatcttgatatacttggatgatgg catatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctattt tttgcttggt ctgtttcttttgtcgatgctcac cctgttgtttggtgttacttctgca (SEQ ID NO: 14) Los experimentos de transformación se condujeron lado por lado utilizando los miembros embriones de las mismas mazorcas. Los embriones inmaduros de la línea GS3 se removieron asépticamente de cada mazorca y se dividieron en cinco porciones. Cada porción de los embriones luego se infectó con la cepa LBA4404 de A . tumefaciens que contiene casetes de expresión de cada una de las cinco construcciones, respectivamente. Después de 6 días de co-cultivo, los embriones se transfirieron al medio de selección fresco que contiene glifosato. Las células transformadas que* sobrevivieron a la selección de glifosato, proliferaron y produjeron callos embriogénicos somáticos. Después de aproximadamente dos meses de subcultivo, los callos luego se manipularon para regenerar plantas transgénicas completas con presencia de glifosato y se transfirieron al invernadero. Las plantas TO luego se sometieron a rocío de glifosato en 6X (156 oz/ac) Roundup Ready UltraMaxTM en la etapa V3 o V4 en el invernadero. Las plantas positivas se muestrearon para el PCR cuantitativo para el número de copias y manchado de Western para la expresión. Las plantas TO luego se cruzaron con líneas endogámicas para obtener semillas para evaluación adicional . Resul tados La eficiencia de transformación se midió como el porcentaje de los embriones infectados que produjeron callos resistentes después de la selección. Las eficiencias de transformación promedio para PHP19288, PHP20118, PHP20120, PHP20122, y PHP20124 fueron 58%, 63%, 59%, 57% y 51%, respectivamente. Los datos indicaron que todas las construcciones tuvieron muy altas y similares eficiencias de transformación, aunque PHP20118 mostró un ligero incremento (Fig 2) . La eficacia de la planta TO se definió como el porcentaje de los eventos TO que fueron completamente resistentes a rocío de glifosato 6x. La eficacia de la construcción no de 35S (PHP19288) fue 48.1%. En contraste, las eficacias de las construcciones aumentadoras de 35S (PHP20118, PHP20120, PHP20122, y PHP20124) fueron 96.6%, 93.5%, 89.1% y 91.1%, respectivamente (Fig. 3). Los datos mostrados mostraron que todas las construcciones aumentadoras 35S significativamente incrementaron la eficacia de la planta contra glifosato. Otra mejora significante de la utilización del aumentador 35S que estuvo en el patrón de integración del transgen. El porcentaje de los eventos probados que fueron una sola copia para la construcción aumentadora no de 35S fue de solo 38%, pero para las cuatro construcciones aumentadoras 35S (PHP20118, PHP20120, PHP20122 y PHP20124) eventos de copia individual representaron 65%, 63%, 71% y 88% de los eventos, respectivamente (Fig. 4).

Un subconjunto de eventos de todas las cinco construcciones se muestrearon en el análisis de Western para observar cualquiera de las diferencias comparativas en la expresión GAT entre los eventos no de 35S y 35S. Este análisis mostró que los eventos de la construcción aumentadora no de 35S tuvo niveles muy bajos de la expresión de GAT en la mayoría de los eventos de las construcciones aumentadoras de 35S mostraron niveles muy altos de la expresión GAT (Fig. 5) . Ejemplo 3. Utilización del Aumentador 35S GAT en el Desarrollo de un Sistema de Evaluación de Gen/Construcción basado en Callo Novedoso Materiales y Métodos Este ensayo está siendo desarrollado para mejorar la evaluación de expresión de un gen insecticida en una etapa muy temprana en el proceso de transformación con el fin de identificar problemas potenciales con la expresión. La base de este ensayo es el uso del glifosato del gen transferasa (GAT) (SEQ ID NO: 8) como un marcador seleccionable. Tanto el GÁT como el gen de prueba insecticida será inducido por un promotor constitutivo fuerte y enlazado en la misma construcción. El promotor empleado comprendió el ZmUBI PRO-5UTR-UBI INTRON1 con el aumentador 3X35S como es descrito en lo anterior en el Ejemplo 1. Como un resultado se espera que la selección o altos niveles de glifosato identificará altos expresores de gen de prueba insecticida. El tejido de callo a partir de estos expresores altos putativos luego será utilizado en el ensayo de insecto para determinar si el producto de gen es funcional. Esas construcciones que muestran eficacia se pueden adelantar en la transformación. Si la construcción no muestra eficacia entonces siguen los análisis bioquímicos y moleculares que pueden ser conducidos para identificar el problema y el gen será rediseñado y reprobado en el sistema (Fig. 6). Resul tados Los datos preliminares han mostrado que la actividad de un gen de control de insecto eficaz se puede detectar en la etapa de callo. La correlación entre la actividad de callo y la eficacia de planta está actualmente siendo evaluado. Ejemplo 4. GAT como un Marcador Seleccionable Ma teriales y Métodos La transformación mediada por Agrobacterium se utilizó para introducir el cásete de expresión GAT (SEQ ID NO: 8) en el genoma de maíz. El cásete de expresión GAT comprende el promotor que comprende ZmUBI PRO-5UTR-UBI INTRONl con el aumentador 3X35S (como es descrito en lo anterior en el Ejemplo 1) operablemente enlazado al gen gat, y el terminador pinll. La cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens, se desarmó patogénicamente al remover su T-DNA nativo. En cambio, el sitio de T-DNA sobre el plásmido Ti contuvo el cásete de expresión GAT. Embriones inmaduros de maíz se removieron asépticamente de la cariopsis en desarrollo y se trataron con la cepa LBA4404 de A . tumefaciens que contiene los casetes de expresión GAT. Después de un período de co-cultivo de embrión de Agrobacterium sobre el medio de cultivo sólido sin la presencia de glifosato, los embriones se transfirieron al medio de selección fresco que contuvo antibióticos y glifosato. Los antibióticos exterminan cualquier Agrobacteri um restante. El medio de selección es estimuladora a la embriogénesis somática de maíz y selectiva para aquellas células que contienen un gen ga t integrado. Por lo tanto, el callo que sobrevive al glifosato para proliferar y producir tejido embriogénico es presumiblemente transformado genéticamente. Las muestras de callo se tomaron para el análisis molecular para verificar la presencia del transgen mediante PCR. El tejido embriónico luego se manipula para regenerar plantas transgénicas en la presencia de un glifosato que luego se transfieren al invernadero. Las plantas TO se rocían con un glifosato de diferentes concentraciones. Las plantas positivas se muestrean para el análisis molecular para el número de copias de transgen y se cruzan con líneas endogámicas para obtener semillas de las plantas inicialmente transformadas.

Una curva de exterminación de glifosato se estableció al probar la respuesta de embriones no transformados sobre el medio con diferentes niveles de glifosato. Los embriones GS3 se aislaron de una mazorca inmadura y se colocaron sobre el medio que contiene glifosato en 0.0, 0.5, 1.0, y 2.0 mM. Después de aproximadamente 40 días de cultivo, la respuesta a los embriones se observaron y se registraron. De manera similar, los embriones GS3 infectados por la construcción GAT se colocaron sobre el medio que contiene glifosato en 0.0, 0.5, 1.0, y 2.0 mM. Después de aproximadamente 40 días de cultivo, la respuesta de los embriones infectados se observaron y se registraron (Fig. 7) . Un experimento de lado por lado se condujo para comparar la eficiencia de transformación de GAT, bar y mopat. Los embriones inmaduros de la línea GS3 se removieron asépticamente de cada mazorca y se dividieron en tres porciones. Cada porción de los embriones o se infectó con la cepa LBA4404 de A . tumefaciens que contiene los casetes de expresión GAT, bar, o mopat respectivamente. Después del cocultivo, los embriones infectados con la construcción GAT se seleccionaron en el medio de glifosato de rutina y los embriones infectados con las construcciones bar o mopat se seleccionaron en el medio de glufosinato de rutina. Los subcultivos se hicieron cada 2 semanas. En aproximadamente 50 días de selección las respuestas de los embriones se observaron y se registraron. Resultados A partir del experimento de la curva de exterminación de glifosato, todos los embriones en el medio con glifosato 0.0 mM iniciaron con callo sano, mientras que aproximadamente la mitad de los embriones en el medio con glifosato 0.5 mM mostraron iniciación de callo. Hubo poco crecimiento de callo con embriones en el medio que contiene 1.0 y 2.0 mm de glifosato. Esto indicó que 0.5 mm no es bastante para inhibir todo el crecimiento de los embriones, pero 1 mm o 2 mm es bastante fuerte para exterminar los embriones no transformados. En el experimento del embrión infectado, más callo se cultivo en el medio con 0.0 y 0.5 de glifosato, pero algunos embriones indicaron callo resistente en el medio de 1.0 mM o 2.0 mM de glifosato. El análisis de Western o PCR ha conformado que estos callos resistentes fueron transformados. Actualmente, GAT se ha desempeñado consistentemente como un marcador seleccionado efectivo con eficiencia de transformación excelente en ambos genotipos GS3 e introEF09B (Fig. 9 y Tabla 1) . Tabla 1 Eficiencia de transformación de GAT en introEF09B genotipo Construcción Marcador # embriones # eventos a txn % basado seleccionable infectados GH en # eventos a GH EFWWBTX GATHRA GAT 1332 354 27% EFWWCTX GATHRA GAT 136 47 35% EFWWETX GATHRA GAT 1109 158 14% EFWWZTX GATHRA GAT 1790 502 28% 4367 1061 24% En el experimento de lado por lado para comparar GAT, br y mopat, GAT tuvo la mejor eficiencia de transformación en aproximadamente 64%, bar en 34%, y mopat en 30%. Los callos con selección GAT se observa que crecen más rápido que aquellos seleccionados con glufosinato (Fig. 9). Ejemplo 5: Transformación y Regeneración de Plantas Transgénicas Embriones de maíz inmaduros de plantas donadoras de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene una región reguladora transcripcional quimérica que comprende dominio aumentador de la SEQ ID NO:l operablemente enlazado a ZmUBI PRO-5UTR-ZmUBI INTRON1 (SEQ ID NO: 6) . La región reguladora transcripcional quimérica es operablemente enlazada a un polinucleótido de interés y el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben y colaboradores, (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialafos. Alternativamente, el gen marcador seleccionable se proporciona sobre un plásmido separado. La transformación se realiza como sigue. Las recetas de los medios se muestran enseguida.

Preparación del Tejido Objetivo Las mazorcas se despinochan y se esterilizan en la superficie en blanqueador Clorox al 30% más Micro detergente al 0.5% durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirpan y se colocan con el eje del embrión de lado hacia abajo (lado de escutelo hacia arriba) , 25 embriones por placa, sobre el medio 560Y durante 4 horas y luego se alinean dentro de la zona objetivo 2.5 cm en la preparación para el bombardeo. Un vector de plásmido que comprende la construcción descrita en lo anterior se hace. Este DNA de plásmido más el DNA de callo que contiene un marcador seleccionable de PAT se precipita sobre 1.1 µm (diámetro promedio) de pelotillas de tugsteno utilizando un procedimiento de precipitación de CaCl2 como sigue: 100 µl de partículas de tugsteno preparadas en agua; 10 µl (1 µg) de DNA en solución reguladora Tris EDTA (1 µg de DNA total); 100 µl de CaCl2 de 2.5 M y 10 µl de espermidina 0.1 M. Cada reactivo se adiciona secuencialmente a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras que se mantiene sobre el aparato formador de vórtice de multitubo. La mezcla final se sónica brevemente y se deja incubar bajo formación de vórtice constante durante 10 minutos. Después del período • e precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, el líquido se remueve, se lava con 500 ml de etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos. Nuevamente el líquido se remueve y 105 µl de etanol al 100% se adiciona a la pelotilla de partícula de tungsteno final. Para el bombardeo con pistola de partículas, las partículas de tugsteno/DNA se sonican brevemente y 10 µl se manchan sobre el centro de cada macroportador y se dejan secar durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Las placas se muestra se bombardean en el nivel #4 en una pistola de partículas. Todas las muestras reciben un solo dispararon en 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/DNA preparada. Después del bombardeo, los embriones se conservan en el medio 560Y durante 2 días, luego se transfieren al medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialafos y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callo resistentes a la selección se transfieren al medio 288J para iniciar la regeneración de plantas. Después de la maduración del embrión somático (2-4 semanas) , los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio para germinación y se transfieren al cuarto de cultivo alumbrado. Aproximadamente 7-10 días después, las plantitas en desarrollo se transfiere al medio libre de hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plantitas son bien establecidas. Las plantas luego se transfieren a insertos en cajones planos (equivalente a maceta de 2.5") que contiene tierra de maceta y se cultivan durante una semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente se cultivan 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfieren a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y se cultivan a la madurez. Las plantas se monitorean y se registran para el fenotipo deseado basado en el polinucleótido dé interés. El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 ml/l de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l de HCl de tiamina, 120.0 g/1 de sacarosa, 1.0 mg/l de 2,4-D y 2.88 g/1 de L-prolina (llevado a volumen con H20 D-I llevado al ajuste a pH 5.8 con KOH); 2.0 g/1 de Gelrite (adicionado después de llevar el volumen con H20 D-I) y 8.5. mg/l de nitrato de plata (adicionado después de la esterilización del medio y enfriamiento a temperatura ambiente) . El medio de selección (560R) comprende 4.0 g/1 de sales básales de N6 (SIGMA C-1416), 1.0 ml/l de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l de tiamina HCl, 30.0 g/1 de sacarosa y 2.0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3.0 g/1 de Gelrite (adicionado después de llevar a volumen con H20 D-I); y 0.85 mg/l de nitrato de plata y 3.0 mg/l de bialafos (ambos adicionados después de la esterilización del medio y el enfriamiento a temperatura ambiente) .

El medio de regeneración de planta (288J) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117- 074), 5.0 ml/l de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g de ácido nicotínico, 0.02 g/1 de tiamina HCL, 0.10 g/1 de piridoxina HCL, y 0.40 g/1 de glicina llevado a volumen con H20 D-I purificada) (Murashige y Skoog (1962) Physiol . Plan t . 15:473), 100 mg/l de mioinositol, 0.5 mg/l de zeatina, 60 g/1 de sacarosa y 1.0 ml/l de ácido abscísico 0.1 mM (llevado a volumen con H20 D-I purificado después del ajuste a pH 5.6); 3.0 g/1 de Gelrite (adicionado después de llevar al volumen con H20 D-I) y 1.0 mg/l de ácido indolacético y 3.0 mg/l de bialafos (adicionado después de esterilizar el medio y enfriamiento a 60°C). El medio libre de hormona (272V) que comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g/1 de ácido nicotínico, 0.02 g/1 de tiamina HCL, 0.10 g/1 de piridoxina HCL, y 0.40 g/1 de glicina llevado a volumen con H20 D-I no purificada), 0.1 g/1 de mio-inositol, y 40.0 g/1 de sacarosa (llevado a volumen con H20 D-I purificado después de ajustar el pH a 5.6); y 6 g/1 bacto-agar (adicionado después de llevar a volumen con H20 D-I purificado), esterilizado y enfriado a 60°C. Ejemplo 6. Transformación dei Embrión de Soya Condiciones de Cul tivo Los cultivos de suspensión embriónicos de soya (cv. Jack) se mantienen en 35 ml de medio líquido SB 196 (ver las recetas enseguida) sobre el agitador rotatorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes blancas frías en un fotoperiodo de día/noche de 16:8 hr en intensidad de luz de 60-85 µE/m2/s. Los cultivos se subcultivan cada 7 días en dos semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de SB196 líquido fresco (el intervalo de subcultivo preferido es cada 7 días) . Los cultivos de suspensión embriónicos de soya se transforman con los plásmidos y fragmentos de DNA descritos en los siguientes ejemplos por el método de bombardeo de pistola de partículas (Klein y colaboradores, (1987) Na ture, 327:70) . Iniciación de Cul tivo de Suspensión Embriogénico de Soya Los cultivos de soya se inician dos veces cada mes con 5-7 días entre cada iniciación. Receptáculos son semillas inmaduras con plantas de soya disponibles de 45-55 días después de la plantación se recolectan, se remueven de su vaina y se colocan en una caja magenta esterilizada. Las semillas de soya se esterilizan al agitarlas durante 15 minutos en una solución de Clorox al 5% con 1 gota de jabón ivory (95 ml de agua destilada en autoclave más 5 ml de Clorox y 1 gota de jabón) . Se mezclan bien. Las semillas se enjuagan utilizando 2 botellas de 1 litro de agua destilada estéril y aquella de menos de 4 mm se colocan sobre platinas de microscopio individuales. El sistema pequeño de las semillas se cortan y las cotiledóneas se prensan fuera del recubrimiento de semilla. Los cotiledones se transfieren a placas que contienen medio SB1 (25-30 cotiledones por placa) . Las placas se envuelven con cinta de fibra y se almacenan durante 8 semanas. Después de este tiempo embriones secundarios se cortan y se colocan en el medio líquido SB196 durante 7 días. Preparación de DNA para el bombardeo Ya sea un plásmido intacto o un fragmento de plásmido de DNA que contiene los genes de interés y el gen marcador seleccionable se utiliza para el bombardeo. El DNA de plásmido para el bombardeo se preparan rutinariamente y se purifican utilizando el método descrito en el Promega™ Protocols y Applications Guide, Segunda Edición (página 106) . Los fragmentos de los plásmidos que llevan la región reguladora transcripcional quimérica que comprende el dominio aumentador de la SEQ ID NO: 1 operablemente enlazado a ZmUBI PRO-5UTR-ZmUBI INTRON1 (SEQ ID NO: 6) que es operablemente enlazado a un polinucleótido de interés se obtuvo mediante el aislamiento de gel de plásmidos digeridos dobles. En cada caso, 100 µg de DNA de plásmido se digiere en 0.5 ml de la mezcla de enzima específica que es apropiada para el plásmido de interés. Los fragmentos de DNA resultantes se separan mediante electroforesis en gel sobre agarosa GTG SeaPlaque al 1% (BioWhitaker Molecular Applications) y los fragmentos de DNA que contienen la construcción descrita arriba se cortan del gen de agarosa. El DNA se purifica de la agarosa utilizando la enzima de digestión GELasa después del protocolo del fabricante. Una alícuota de 50 µl de agua destilada estéril que contiene 3 mg de partículas de oro (3 mg de oro) se adiciona a 5 µl de una solución de DNA de 1 µg/µl (ya sea plásmido intacto o fragmento de DNA preparado como es descrito en lo anterior), 50 µl de CaC12 2.5 M y 20 µl de espermidina de 0.1 M. La mezcla se agitó 3 min sobre el nivel 3 de un agitador de vórtice y se giran durante 10 seg en una microcentrífuga de banco. Después de un lavado con 400 µl -de etanol al 100% las pelotillas se suspenden en sonicación en 40 µl de etanol al 100%. Cinco µl de suspensión de DNA se suministra a cada disco volante del disco de instrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada alícuota de 5 µl que contiene aproximadamente 0.375 mg de oro por bombardeo (es decir, por disco) . Preparación del Tejido y Bombardeo con DNA Aproximadamente 150-200 mg de cultivos de suspensión embriónicos de 7 días de edad se colocan en una caja petri de 60 x 15 mm estéril vacía con disco y la caja se cubre con una malla de plástico. El tejido de bombardea 1 o 2 disparos por placa con el ajuste de presión de ruptura de membrana en 1100 PSI y la cámara se evacúa a un vacío de 27-28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3.5 pulgadas de la criba de la criba de retención/detención. Selección de Embriones Transformados Los embriones transformados se seleccionaron ya sea utilizando higromicina (cuando el gen HPT higromicina fosfotransferasa se utilizó como el marcador seleccionable) o clorsulfurón (cuando el gen ALS acetolactato sintasa se utilizó como un marcador seleccionable. Selección de Higromi cina (HPT) Después del bombardeo, el tejido se coloca en medio de SB196 fresco y se cultiva como es descrito en lo anterior. Seis días después del bombardeo, el SB196 se intercambia con SB196 fresco que contiene un agente de selección de 30 mg/L de higromicina. El medio de selección se renueva cada semana. Cuatro a seis semanas de post selección, tejido transformado verde se puede observar creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en placas de multicavidades para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Selección de Clorsulfurón (ALS) Después del bombardeo, el tejido se divide entre 2 matraces con medio SB196 fresco y se cultiva como es descrito en lo anterior. Seis a siete días después del post bombardeo, el SB196 se intercambia con SB196 fresco que contiene agente de selección de 100 ng/ml de Clorsulfurón. El medio de selección se renueva cada semana. Cuatro a seis semanas después de la selección, tejido transformado verde se puede observar creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se renueva y se inocula en placas de multicavidades que contiene SB196 para generar cultivos de suspensión embriogénico transformados clonalmente propagados, nuevos. Regeneración de Embriones Somáticos de Soya en Plantas Con el fin de obtener plantas enteras de los cultivos de suspensión embriogénicos, el tejido debe ser regenerado. Maduración del Embrión Los embriones se cultivan durante 4-6 semanas a 26°C en SB196 bajo nudos fluorescentes blancos fríos (Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW) y Agro (Phillips F40 Agro) bulbos (40 watt) durante un fotoperiodo de 16:8 hr con intensidad de luz de 90-120 uE/m2s. Después de este tiempo, las agrupaciones de embriones se remueven a un medio de agar medio, SB 166, durante 1-2 semanas. Las agrupaciones luego se subcultivan al medio SB 103 durante 3 semanas. Durante este periodo, los embriones individuales se> pueden remover de las agrupaciones y clasificar para el fenotipo deseado basado en el polinucleótido de interés empleado. Se debe observar que cualquier fenotipo detectable, que resulta de la expresión de los genes de interés, podría ser clasificado en esta etapa. Desecación y Germinación del Embrión Embriones individuales maduros se desecan al colocarlos en una capa petri pequeña, vacía (35 x 10 mm) durante aproximadamente 4-7 días. Las placas se sellan con cinta de fibra (creando una cámara húmeda pequeña) . Los embriones desecados se plantan en el medio SB71-4 donde se dejaron germinal bajo las mismas condiciones de cultivo descritas en lo anterior. Las plantitas germinadas se removieron del medio de germinación y se enjuagaron completamente con agua y se plantaron en Redi-Earth en la charola de paquete de 24 celdas, se cubrieron con un domo de plástico claro. Después de 2 semanas el domo se remueve y las plantas se endurecieron durante una semana adicional. Si las plantitas se observan duras ellas se transplantan a la maceta de 10" de Redi-Earth con hasta 3 plantitas por maceta. Después de 10 a 16 semanas, las semillas maduras se recolectan, se desmenuzan y se analizan para las proteínas. Recetas de los Medios SB196-Medio de proliferación líquido FN Lite (por litro) -MS FeEDTA- lOOx Extracto 1 10 ml MS Sulfato - lOOx Extracto 2 10 ml Haluros de FN Lite - 100 x Extracto 3 10 ml FN Lite P,B, Mo - 100 x Extracto 4 10 ml Vitaminas B6 (1 ml/L) 1.0 ml 2,4-D (10 mg/L de concentración final) 1.0 ml KN03 2.83 gm (NH4)2 SO 4 0-463 gm Asparagina 1.0 gm Sacarosa (1%) 10 gm pH 5.8 Soluciones de Extracto de FN Lite Extracto # lOOOml 500ml 1 MS Fe EDTA Extracto 100 x EDTA Na2 * 3.724 g 1.862 g FeS04-7H20 2784 g 1.392 ^Adicionar primero, disolver en la botella oscura mientras que se agita 2 MS sulfato extracto 100 x MgS04-7H20 37.0 g 18.5 G MnS04-H20 1.69g 0.845 g ZnS04-7H20 0.86 g 0.43 g CuS04-5H20 0.0025 g 0.00125 g 3 Haluros FN Lite Extracto lOOx CaCl2-2H20 30.0 g 15.0 g Kl 0.083 g 0.0715 g CoCl2-6H20 0.0025 g * 0.00125 g 4 FN Lite P, B, Mo Extracto lOOx KH2P04 18.5 g 9.25 g H3B03 0.62 g 0.31 g Na2Mo04-2H20 0.025g 0.0125 g Medio sólido de SB1 (por litro) comprende: 1 pkg. Sales MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 extracto 1000X stock; 31.5 g de sacarosa; 2 ml de 2,4-D (20 mg/L de concentración final); pH 5.7 y 8 g de TC agar. Medio sólido SB 166 (por litro) que comprende: 1 pkg de sales MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 extracto 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de MgC12 de hexahidrato; 5 g de carbón vegetal activado; pH 5.7 y 2 g de gelrite. Medio sólido SB 103 (por litro) comprende: 1 pkg. sales MS (Gibco/BRL - Cat# 11117-066) ; 1 ml de vitaminas B5 extracto 1000 X; 60 g maltosa; 750 mg de hexahidrato MgC12; pH 5.7 y 2 g de gelrite. - Medio sólido SB 71-4 (por litro) comprende: 1 botella de sales B5 de Gamborg w/sacarosa (Gibco/BRL - Cat# 21153-036); pH 5.7 y 5 g de agar TC. 2,4-D extracto se obtiene prehecho de Phytotech cat# D 295 - concentración es 1 mg/ml. Extracto de Vitaminas B5 (por 100 ml) que se almacena en alícuotas a -20°C que comprende: 10 g de mioinositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCl y 1 g de tiamina. Si la solución no se disuelve lo bastante rápido, aplicar el nivel bajo de calor con la vía de la placa de agitación caliente. Extracto de clorsulfurón comprende 1 mg/ml en Hidróxido de Amonio 0.01 N. El artículo "un" y "uno" se utiliza en la presente para referirse a uno o más que uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para expresar un polinucleótido de interés, caracterizado porque comprende introducir en una célula por lo menos una construcción de DNA que comprende una región reguladora transcripcional quimérica que comprende por lo menos un dominio aumentador operablemente enlazado a un promotor heterólogo, la región reguladora transcripcional quimérica operablemente enlazada al polinucleótido de interés, en donde el dominio aumentador se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO:l, 17; b) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l o 17, en donde el polinucleótido tiene actividad reguladora transcripcional; y (c) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:l o 17.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio aumentador no comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la región reguladora transcripcional quimérica comprende por lo menos dos copias o or lo menos tres copias del aumentador.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque a) las copias del aumentador están inmediatamente adyacentes entre sí; o b) por lo menos uno de los aumentadores está orientado en la orientación delantera o trasera con respecto al promotor.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, o 4, caracterizado porque el polinucleótido de interés codifica un polipéptido.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, o 5, caracterizado porque el polinucleótido de interés comprende un marcador seleccionable.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el marcador seleccionable comprende un polinucleótido que confiere resistencia a un herbicida.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la célula es una célula de planta.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el método además comprende cultivar la célula en un medio que comprende una concentración efectiva del herbicida.
10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula de planta es de una dicotiledónea .
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la dicotiledónea es soya, trigo, cánola, girasol, algodón o alfalfa.
12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula de planta es de una monocotiledónea .
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.
14. Un método para seleccionar una célula que tiene un polinucleótido de interés, caracterizado porque comprende a) proporcionar una población de células; b) introducir en por lo menos una célula de la población una construcción de DNA que comprende el polínucleótido de interés y además que comprende una región reguladora transcripcional quimérica que comprende por lo menos un dominio aumentador operablemente enlazado a un primer promotor heterólogo, la región reguladora transcripcional quimérica operablemente enlazada a un marcador seleccionable, en donde el dominio aumentador se selecciona del grupo que consiste de: (i) la secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N0:1 o 17; (ii) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1 o 17, en donde el polinucleótido tiene actividad transcripcional de regulación; y (iii) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:l o 17. c) poner en contacto la población de células con una concentración efectiva de un agente de selección apropiado; y d) seleccionar la planta que expresa el marcador seleccionable y de esta manera identificar plantas que tienen el polinucleótido de interés.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el dominio aumentador no comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.
16. El método de conformidad con la reivindicación 14 o 15, caracterizado porque la región reguladora transcripcional quimérica comprende por lo menos dos copias o por lo menos tres copias del aumentador.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque a) las copias del aumentador están inmediatamente adyacentes entre sí; o b) por lo menos uno de los aumentadores está orientado en la orientación delantera o trasera con respecto al promotor.
18. El método de conformidad con la reivindicación 14, 15, 16, o 17, caracterizado porque el marcador seleccionable codifica un polipéptido que confiere tolerancia a un herbicida.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente selectivo comprende un herbicida .
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-19, caracterizado porque la célula comprende una célula de planta.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la célula de planta es de una dicotiledónea.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la dicotiledónea es soya, trigo, cánola, girasol, algodón o alfalfa.
23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la célula de planta es de una monocotiledónea .
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.
25. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la construcción de DNA comprende en la orientación 5' a 3' o 3' a 5' : el primer polinucleótido de interés operablemente enlazado a un segundo promotor heterólogo, operablemente enlazado a por lo menos uno de los dominios aumentadores, operablemente enlazado al primer promotor heterólogo, operablemente enlazado al marcador seleccionable, en donde el primer polinucleótido de interés del marcador seleccionable se expresa en direcciones divergentes .
26. Un polinucleótido, caracterizado porque comprende un elemento regulador transcripcional quimérico que comprende un promotor que induce expresión en una célula operablemente enlazada a por lo menos una copia de un dominio aumentador heterólogo donde el dominio aumentador se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO:l o 10; (b) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l o 17, mientras que el polinucleótido tiene actividad transcripcional regulatoria; y (c) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:l o 17.
27. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el dominio aumentador no comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 5.
28. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 26 o 27, caracterizado porque la región reguladora transcripcional quimérica comprende por lo menos dos copias o por lo menos tres copias del aumentador.
29. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque a) las copias del aumentador están inmediatamente adyacentes entre sí; b) por lo menos uno de los aumentadores está orientado en la orientación delantera o trasera con respecto al promotor.
30. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 26, 27, 28, o 29.
31. Una célula, caracterizada porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 26, 27, 28, 29, o 30.
32. La célula de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque la célula es una célula de planta.
33. La célula de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la célula de planta es de una dicotiledónea.
34. La célula de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la dicotiledónea es soya, trigo, cánola, girasol, algodón o alfalfa.
35. La célula de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la .célula de planta es de una monocotiledónea .
36. La célula de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.
37. Una planta, caracterizada porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 26, 27, 28 o 29.
38. La planta de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea.
39. La planta de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la dicotiledónea es soya, trigo, cánola, girasol, algodón o alfalfa.
40. La planta de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la planta es una monocotiledónea.
41. La planta de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.
42. Un método para mejorar la eficiencia de transformación, incrementando un evento de integración de una sola copia, o incrementando la eficacia de transformación de una planta, caracterizado porque comprende: a) introducir en la planta un cásete que comprende una región reguladora transcripcional quimérica que comprende por lo menos un dominio aumentador operablemente enlazado a un promotor heterólogo, la región reguladora transcripcional quimérica operablemente enlazada a un marcador seleccionable en donde el dominio aumentador se selecciona del grupo que consiste de: i) la secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 1 o 17; ii) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1 o 17, en donde el polinucleótido tiene actividad transcripcional de regulación; y iii) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID N0:1 o • 17; b) poner en contacto la planta que tiene concentración efectiva de un agente de selección apropiado, y c) seleccionar la planta que expresa el marcador seleccionable .
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el aumentador no comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.
44. El método de conformidad con la reivindicación 42 o 43, caracterizado porque la región reguladora transcripcional quimérica comprende por lo menos dos copias o por lo menos tres copias del aumentador.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque a) las copias del aumentador están inmediatamente adyacentes entre sí; b) por lo menos uno de los aumentadores están orientados en la orientación delantera o trasera con respecto al promotor.
46. El método de conformidad con la reivindicación 42, 43, 44, o 45, caracterizado porque el cásete además comprende un polinucleótido de interés.
47. El método de conformidad con la reivindicación 42, 43, 44, 45, o 46, caracterizado porque el marcador seleccionable confiere tolerancia* a un herbicida.