MXPA02007049A - Promotores vegetales novedosos y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona composiciones y metodos para regular la expresion de secuencias heterologas de nucleotidos en un vegetal. Las composiciones son secuencias de nucleotidos novedosas para regiones de elemento promotor multimericas sinteticas y promotores vegetales que comprenden las regiones multimericas. Se proporcionan metodos para expresar una secuencia heterologa de nucleotidos en vegetal usando las secuencias promotoras descritas en la presente. Los metodos comprenden transformar una celula vegetal con una secuencia heterologa de nucleotidos enlazada operablemente a los promotores de la presente invencion y regenerar un vegetal establemente transformado a partir de la celula vegetal transformada.

Description

PROMOTORES VEGETALES NOVEDOSOS Y MÉTODOS DE USO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención s^ refiere al campo de la biología molecular vegetal, más particularmente a la regulación de expresión de genes en vegetales. La expresión de secuencias heterólogas de ADN en un huésped vegetal es dependiente de la presencia de un promotor enlazado operablemente que es funcional dentro del huésped vegetal. La selección de la secuencia promotora determinará cuando y donde dentro del organismo se expresa la secuencia heteróloga de ADN. Así, en donde se desea la expresión continua a través de la células-vegetal, se utilizan promotores constitutivos En contraste, en donde se desea la expresión del gen sin respuesta a an estímulo, los promotores mduc bles son los elementos reguladores de selección. En donde se desea la expresión en órganos particulares, se utilizan promotores específicos de tejido. Las secuencias reguladoras adicionales comencé arriba y/o corriente abajo de la secuencia promotora núcieo pueden incluirse en construcciones de expresión de vectores de transformación para efectuar diversos niveles de expresión o constitutiva o íraucible de secuencias heterclogas de nucleótidos en un vegetal t_ nssénico . Frecuentemente es deseaole tener la expresión co st tut-^a de ana secuencia ae ADN a través de las células de un organismo. Por ejemplo, ía resistencia aumentada de un vegetal a la infección por patógenos transportados por tierra y por aire pudiera lograrse por la manipulación genética del genoma del vegetal para comprender un promotor constitutivo enlazado operablemente a un gen de resistencia a patógenos heterólogo tal que las proteínas de resistencia al patógeno se expresan continuamente a través los tejidos del vegetal. Alternativamente, pudiera ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de ADN nativo dentro unos tejidos vegetales para lograr un fenotipo deseado. En este caso, tal inhibición pudiera lograrse con ia transformación del vegetal para comprender un promotor constitutivo enlazado operablemente a una secuencia de nucleótidos antisentido, tal que la expresión constitutiva de la secuencia antisentido produzca una transcripción de ARN que interfiere con la traducción de ARNm de la secuencia de ADN nativa. Así, el aislamiento y caracterización de los promotores y ios elementos promotores que pueden servir como regiones reguiadoras para la expresión de las secuencias heterólogas de nucleótidos de interés se necesitan para la manipulación genética de los vegetales. Se proporcionan las composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias heterólogas de nucleótidos en un vegetal. Las composiciones comprenden secuencias de nucleótidc novedosas oara regiones sintéticas de elementos ntsát áM JflMimt ''MfiA ijHj . 'ÍA?.??.? promotores multiméricos (las SMP?R) y promotores vegetales que comprenden las SMPER. Particularmente, se proporcionan promotores de vegetales que comprenden una o más de las SMPER que mejoran ia expresión dirigida por el promotor. Se proporcionan métodos para expresar una secuencia heteróloga de nucleótidos en un vegetal utilizando las secuencias promotoras descritas en la presente. Los métodos comprenden transformar una célula vegetal con un vector de transformación que comprende una secuencia heteróloga de nucleótidos enlazado operablemente a uno de los promotores vegetales de la presente invención y regenerando un vegetal establemente transformado a partir de la célula vegetal transformada. En esta forma, pueden controlarse los niveles de expresión en una célula vegetal, órgano vegetal, tejido vegetal o semilla del vegetal. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra las secuencias de 64 elementos promotores putativos o definidos o sitios de enlace del factor de transcripción. Les elementos promotores seleccionados para la síntesis de las SMPER se definen por un asterisco . La Figura 2 muestra ei registro bidimensional (8X8) para la reunión de sitios de enlace del factor de transcripción y/o elementos promotores Emla (SEC. DE IDENT. NC: 1), AERE1 (SEC. DE IDENT . XO . : 2), ABRE A (S?C. DE Jß?Ukit ??k--. '- '.^?i^éiii? íták kA^ia iásá IDENT. NO.: 3), casilla Prolamma P (SEC. DE IDENT . NO.: 4), casilla Z2 y Z3 (SEC. DE IDENT. NO.: 5), 35S AS-2 (SEC. DE IDENT. NO.: 6 Y 35S AS-1 (SEC. DE IDENT. NO.: 7), ele OCS (SEC. DE IDENT. NO.: 8), casilla GCC (SEC. DE IDENT. NO.: 9), GH3 DI (SEC. DE IDENT. NO.: 10), GH3 D3 (SEC. DE IDENT . NO.: 11), P3 (SEC. DE IDENT. NO.: 12), T-1 rbcS3A (SEC. DE IDENT. NO.: 13), motivo TCA (SEC. DE IDENT. NO.: 14), repetición C/DRE (SEC. DE IDENT. NO.: 15), HSE (SEC. DE IDENT . NO.: 16), ERE (SEC. DE IDENT . NO.: 17), casilla gln2 PR (SEC. DE IDENT. NO.: 18), HBP-la (SEC. DE IDENT . NO.: 19), PROMOTOR Al (SEC. DE IDENT. NO.: 20), PROMOTOR Bzl (SEC. DE IDENT . NO.: 21), promotor CHS (SEC. DE IDENT . NO.: 22), Casilla 11 (SEC. DE IDENT. NO.: 23), phyA GT-2 (SEC. DE IDENT. NO.: 24), similar a GT-2 (SEC. DE IDENT. NO.: 25), Phy PF1 (SEC. DE IDENT. NO.: 26), AT-com (SEC. D? IDENT. NO.: 27), sitio AG (SEC. DE IDENT. NO.: 28), sitio AP3 (SEC. DE IDENT . NO.: 29), motivo TGAC (SEC. DE IDENT . NO.: 30), motivo CAGT (SEC. DE IDENT . NO.: 31), Dofl/Dof2 (SEC. DE IDENT . NO.: 32), pr2 oligómero II (SEC. DE IDENT. NC . : 33), CE1 (SEC. DE IDENT NO.: 34), H- casilla 1 (SEC. DE IDENT. NO.: 35), H-casilla 2 (SEC. DE IDENT. NO.: 36), loxl (SEC. DE IDENT . NO.: 37), PR-2d (SEC. DE IDENT. NO. : 38) , ROL6 (SEC. D? IDENT . NO . : 39) , casilla SGB 2/3 'SEC. DE IDE T. NO. : ~ Z , casilla SGB 6-8 (S?C. DE IDENT. NO.: 41/, casilla MS-BS7 1-3 (SEC. DE IDENT. NO.. 42), casilla MS-3S"7 22-24 ,S?C. DE IDENT. NO. : 43) , AuxRE DR5 (SEC. DE IDENT. NO.: 44), PCNA HA (SEC. DE IDENT. NO.: 45), casilla PAL1 E (SEC. DE IDENT. NO.: 46), Myb26 (SEC. DE IDENT. NO.: 47), GARE (SEC. DE IDENT. NO.: 48), E8 (SEC. DE IDENT. NO.: 49), E1RE (SEC. DE IDENT. NO.: 50), CA (SEC. DE IDENT. NO.: 51), napA (SEC. DE IDENT. NO.: 52), HaG3-A-75 (SEC. DE IDENT. NO.: 53), HaG3-A-lll (SEC. DE IDENT. NO.: 54) , casilla Prolamin (SEC. DE IDENT. NO. : 55) , similar a TGAC (SEC. DE IDENT. NO.: 56), SP20+6 (SEC. DE IDENT . NO.: 57), MSA RTI (SEC. DE IDENT. NO.: 58), DRE rd29Al (SEC. DE IDENT. NO.: 59), DRE rd29A2 (SEC. DE IDENT. NO.: 60), CGF-1 (SEC. DE IDENT. NO.: 61), ltpl DI (SEC. DE IDENT. NO.: 62), ENBP1 (SEC. DE IDENT . NO.: 63), y MRE (SEC. DE IDENT. NO.: 64) . La Figura 3 representa elementos promotores caracterizados por tener fuerte enlace con los extractos nucleares de maíz. Estos elementos promotores están sombreados . La Figura 4 es una representación esquemática del cassette de expresión en el intron Adhl más el vector de expresión, que comprende regiones sintéticas de elementos promotores multiméricos . La designación de A (por ejemplo, A18) se refiere a los números de clones que comprenden la SMPER particular representada. Las flechas indican la orientación de cada elemento promotor. La identidad de cada elemento promotor se muestra por la clave en el fondo. LexA .?MS Af..«.. -aiti.?at. AA^tafeÉA, representa el control negativo. "+++" indica alta actividad mejoradora . La Figura 5 es una representación esquemática del cassette de expresión en el intron Adhl menos el vector de expresión, que comprende las regiones sintéticas de elementos promotores multiméricos . La designación A (por ejemplo, A42) se refiere a números de clones que comprenden la SMPER particular representada. Las flechas indican la orientación de cada elemento promotor. La identidad de cada elemento promotor se muestra por la clave en el fondo. LexA representa el control negativo. "+++"indica alta actividad mejoradora. Las Figuras 6a, 6b, 6c, y 6d representan resultados de pruebas transientes para actividad de luciferasa en extractos de plantas de semillas de maíz transformadas con las construcciones SMPER indicadas. Las Figuras 7-14 proporcionan las secuencias de nucleótidos respectivos para SMPER Al5 (SEC. DE IDENT. NO. 65), Al8 (SEC. DE IDENT . NO. 66), A23 (SEC. DE IDENT. NO. 67), A24 (SEC. DE IDENT . NO. 68), A42 (SEC. DE IDENT. NO. 69), A44 (SEC. DE IDENT. NO. 70), A48 (SEC. DE IDENT. NO. 71), y A51 (SEC. DE IDENT. NO. 72), respectivamente. Las secuencias espaciadoras se definen subrayando. Los elementos promotores individuales se designan de acuerdo con los nombres de elementos correspondientes mostrados en la Figura 1.

Las composiciones de ia presente invención se dirigen a secuencias de nucleótidos novedosas para regiones sintéticas de elementes promotores multiméricos (las SMPER) y promotores vegetales que comprenden las SMPER. Particularmente, se proporcionan promotores vegetales que comprenden al menos una SMPER que mejora la transcripción dirigida por el promotor. Las SMPER comprenden disposiciones novedosas de elementes promotores individuales. Véase, por ejemplo, la Figura 1. En particular, se proporcionan las combinaciones específicas que comprenden los elementos promotores PCNA HA, GT-2, ABRE 1, AS-1 y DRE 1. Las regiones de elementos promotores multiméricos de la invención, y los promotores vegetales de la invención que comprenden las regiones de elementos promotores multiméricos, son sintéticas. Por "sintética" se quiere decir que las secuencias de nucleótidos de las regiones de elementos promotores multiméricos de la invención, o aquellas de los promotores vegetales de la invención que comprenden las regiones de eletrentos promotores multiméricos, no se encuentran en la naturaleza. Por "región sintética de elemento promotor multimérico" o "SMPER" se quiere decir un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleóti?os que comprende más de un elemento promotor, en donde la disposición de la combinación multimérica de los eie~entos promotores no se encuentra en la íA..8t£¡*j,é~ ¡&?»it~z?Z^&t*M.. , , , ^-füflfl fl, i±M ?t??filmÁif ?irltfllÍ ftfl*M*-^'«--'-^MBiS í daÍ? naturaleza. Esto es, la invención reconoce que los elementos promotores pueden proporcionarse por cualquier secuencia o disposición para proporcionar una =MPER. Tal SMPER se prueba después por su efecto en la transcripción. Se reconoce que los elementos pueden presentarse en cualquier orden. En algunos casos, los elementos pueden duplicarse, es decir, más de una copia de un elemento individual puede estar presente en la SMPER. Usando los métodos descritos en la presente, pueden probarse combinaciones de elementos promotores por su efecto en la transcripción. En esta forma, cualquier combinación se abarca por la invención. Las SMPER preferidas de la invención comprenden elementos promotores que incluyen pero no se limitan a PCNA HA, GT-2, ABRE 1, AS-1 y DRE1. Las SMPER de la invención pueden usarse con cualquier promotor, nativo o sintético. Más particularmente, las SMPER pueden usarse con cualquier promotor vegetal, nativo o sintético. Por "promotor vegetal" se quiere decir un promotor capaz de impulsar ía expresión en una célula vegetal . En referencia a un promotor, por "nativo" se quiere decir un promotor capaz de impulsar la expresión en una célula particular, en donde ía secuencia de nucleótidcs del promotor se encuentra en esa célula en la naturaleza. Esto es, la secuencia del nucleótiac de un promotor nativo puede aislarse a partir de la célula, o la correspondiente fuente de células, sin la introducción dei promotor a la célula, la fuente de células, o un ancestro de los mismos. Por "fuente de células" se quiere decir un organismo o tejido del cual se derivan las células. En referencia a un promotor, por "sintético" se quiere decir un promotor capaz de impulsar la expresión en una célula particular, en donde ía secuencia de nucleótido del promotor no se encuentra en la naturaleza. Esto es, la secuencia de nucleótido de un promotor sintético no puede aislarse a partir de la célula, o la fuente de célula correspondiente, sin haber introducido el promotor a la célula, la fuente de célula, o un ancestro de los mismos. Así, la combinación de los promotores y las SMPER es sintética. Estas combinaciones no se encuentran en la naturaleza y no pueden aislarse de un vegetal nativo, célula vegetal, o tejido vegetal. Los elementos promotores individuales PCNA HA, GT- 2, ABRE1, AS-1 y DRE1 se describen en la Figura 1. Los métodos para sintetizar y aislar los promotores vegetales de la invención se proporciona en los Ejemplos descritos posteriormente . Las secuencias de nucleótidos de las SMPER de la presente invención que comprenden combinaciones específicas de ios elementos promotores PCNA HA, GT-2, ABRE1, AS-1 y DRE1 se indican en las Figuras 7-ii (SEC. DE IDENT. NOS: 65-72) . La invención abarca lae composiciones de ácidos nucleicos aisladas o sustancial ente purificadas. Una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada", o porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Como se utiliza en la presente, el término "vegetal" incluye la referencia a vegetales completos y su progenie; células vegetales; partes y órganos vegetales, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, flores, granos, maíz, mazorcas, espigas, hojas, cascaras, pedúnculo, tallos, raíces, puntas de raíz, anteras, seda y similares. La célula vegetal, como se utiliza en la presente, incluye adicionalmente , sin limitación, células obtenidas a partir de o encontradas en: semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas , tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, y microsporos . También puede entenderse que las células vegetales incluyen células modificadas, tales como protopiastos , obtenidos a partir de los tejidos anteriores. La clase de —egetales que puede asarse en los métodos de la K?lllJ^M?A-^±^^.**^»» Jdki. invención es generalmente tan amplia como la clase de vegetales superiores tratables a técnicas de transformación, que incluyen vegetales monocotiledóneos y dicotiledóneos. Un vegetal particularmente preferido es Zea maye . Por "promotor" o "región de iniciación de transcripción" se quiere decir una región reguladora de ADN que comprende normalmente una casilla TATA capaz de dirigir el ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de iniciación de transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Un promotor puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento generalmente indicadas corriente arriba o 5 ' a la casilla de TATA, y refiriéndose como elementos promotores que influencian las secuencias de las regiones promotoras descritas en la presente. Los elementos promotores ubicados corriente arriba o 5' a la casilla TATA también se refieren, a elementos promotores corriente arriba. En modalidades particulares de la invención, las SMPER de la invención se colocan corriente arriba o 5' a la casilla TATA. Sin embargo, la invención también abarca configuraciones de promotores vegetales en las cuales las SMPER se colocan corriente abajo o 3 ' hacia la casilla TATA. Los elementos promotores de la invención pueden actuar como mejoradores o supresores de expresión. Los mejoradores son secuencias de nucleótidos que . «..^.. ki?wg actúan para mejorar o aumentar la expresión dirigida por una región promotora. Un mejorador puede identificarse comparando el nivel de expresión dirigido por un promotor de muestra que comprende ía secuencia del mejorador a ser probada colocado en cualquier posición corriente arriba o corriente abajo del promotor, con relación a un promotor de control que no comprende la secuencia en cuestión. Los elementos mejoradores individuales conocidos para los vegetales incluyen, por ejemplo, la región mejoradora SV40, el elemento mejorador 35 S, y similares. Las SMPER de la invención mejoran la expresión de las secuencias de codificación enlazadas operablemente a los promotores vegetales que comprenden las SMPER. En consecuencia, las SMPER de la invención pueden actuar como mejoradores. Li et al. (1999), Nature Biotechnology: 17: 241-245, describe ensambles aleatorios de elementos promotores de músculo para lograr actividad promotora mejorada en músculo. Por "supresores" se quiere decir secuencias de nucleótidos que median la supresión o disminución en la expresión dirigida hacia una región promotora. Esto es, los supresores son los sitios de ADN a través de los cuales las proteínas represoras de transcripción ejercen sus efectos. Los supresores pueden mediar ía supresión de expresión empalmando los sitios de inicio de transcripción o los sitios activadores ?e transcripción, o puede mediar la supresión a ¿jjtÜAtjj .AjKiLfc* «— jj-*"«?.NlWfc? i íl i" partir de ubicaciones distintas con respecto a estos sitios. Las SMPER de la invención pueden actuar como supresores. Las SMPER pueden enlazarse operablemente a cualquier promotor de interés. Aunque no sea una limitación, 5 puede ser preferible usar promotores de núcleo. Por "promotor de núcleo" se quiere decir un promotor sin elementos promotores reguladores, tales como mejoradores, supresores, y similares. Los promotores de interés incluyen pero no se limitan a promotores constitutivos, débiles, inducíbles por 10 patógeno, inducibles por herida, regulados por químico, y promotores específicos de tejido, que incluyen, pero no se limitan a promotores específicos de hoja, específicos de raíz, y específicos de semilla. Tales promotores constitutivos incluyen, por 15 ejemplo, el promotor de núcleo del Rsyn7 (Patente Norteamericana 6,072,050); el promotor de núcleo CaMV 35S (Odell et al . (1985) Na ture 313 : 810-812 ) ; actina de arroz (McElroy et al . (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen eü al . (1989) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y 20 Christensen et al . (1992) Plant Mol . Biol . 18 : 675-689) ; pEMU (Last et al . (1991) Theor. Appl . Genet . 81:581-588); MAS (Velten et al . (1984) EMBO J. 3 -. 2123 -2130 ) ; promotor ALS (Patente Norteamericana 5,659,026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, Patentes 25 Norteamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144, 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; y 5,608,142. Véase también la solicitud copendiente intitulada "Constitutive Maize Promoters", Solicitud Norteamericana No. de Serie 09/257,584, presentada el 25 de febrero de 1999, incorporada en la presente para referencia. Tales promotores inducibles por patógenos, incluyen pero no se limitan a aquellos de proteínas relacionadas a patogenosis (proteínas de PR) , las cuales se inducen después de la infección en un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 , 3-glucanasa, citinasa, etc. Véase, por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 83:245-254; Uknes ec al. (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Véase también, la solicitud copendiente intitulada "Inducible Maize Promoters", Solicitud Norteamericana No. de Serie 09/257,583, presentada el 25 de febrero de 1999, incorpora en la presente para referencia. Son de interés los promotores que se expresan localmente o cerca del sitio de infección de patógenos. Véase por ejemplo, Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interacticns 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:73-98; y Yang (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:14972-1-977. Véase también, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966 ; Zhang et al. (1994^ Proc. Nati. Acad. Sci. USA .í A ..k.m. ??fmí.» 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3: 191-201; Siebertz et ai. (1989) Plañe Cell 2:961-968; Patente Norteamericana No. 5,750,386 (inducible por nemátodo) ; y las referencias citadas en el misma. De interés particular es el promotor inducible para el gen PRms de maíz, cuya expresión se induce por el patógeno Fusarium moniliforme (véase, por ejemplo, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 42:189-200) . Tales promotores inducibles por herida incluyen pero no se limitan al gen inhibidor de proteinasa de papa (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28 :425-449 ; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl y wun2 , Patente Norteamericana No. 5,428,148; winl y in2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215 -.200-208) ; sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225.1570-1573) ; WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:13-16) ; gen MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6 (2) : 141-150 ) ; y similares, incorporadas en la presente para referencia. Tales promotores inducibles por químicos se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 de maíz, el cual se activa por aseguradores del herbicida benzensulfonamida, el promotor GST de maíz, que se activa por compuestos electrofíiicos hidrofóbicos que se usan como herbicidas pre-emergentes , y el promotor PR-la del i^^ i? 11M iltiihlimllíÉÍliÉl?ik.M i ^... ^ :,A ....~ ..?j*aJmj^ik?am-jjaa&íktfck,..A?AA?^?.a^?¿l".i?a*tjj*i-..~- - .*. ..-.«^--^-^^->^^-™--^*..<:í..,t m?í¡tj¡S£?^¡b 1 ? tadaco, que se activa por ei ácido salicílico. Otros promotores regulados por químico de interés incluyen los promotores que responden a los esteroides (véase, por ejemplo, el promotor mducible por glucocorticoide en Schena et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y McNellis et al. (1998) Plañe J. 14 (2 ) : 247-257) y los promotores inducibles por tetraciclina y represibles por tetraciclina (véase, por ejemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genev. 227 : 229-237 , y Patentes Norteamericanas Nos. 5,814,618 y 5,789,156), incorporadas en la presente para referencia . Tales promotores preferidos de tejido, incluyen pero no se limitan a Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2)255-265 ; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7) -.192-803 ; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3) -.331-343 ; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2) .-157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3) : 1331-1341; Van Camp et ai. (1996) Plant Physiol. 112 (2) : 525-535 ; Canevascmi et al. (1996) Plant Physiol. 222 (2) -.513-524 ,- Yamamoto et al. ,1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) -.113-118; Lam (1994) Resuits Probl. Cell Differ. 20:181- 196; Orozco ec al. (1993) Plan Mol Biol. 23 (6 ) -.1129-1138 ; Matsuoka et al. (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90 (20) : 9586- 9590; y Guevara García et al. 1993) Plant J. 4 (3) : 495-505. Tales promotores pueden modificarse, si es necesario, por expresión débil. Los promotores específicos de hoja se conocen en la técnica, véase por ejemplo. Yamamoto eü al . (1997) Plant J. 12 (2) . - 255-265 ; Kwon et al . (1994) Plant Physiol . 105:357-67 ; Yamamoto et al . (1994) Plant Cell Physiol . 35 (5) .-773-778 ; Gotor et al . (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al . (1993) Plant Mol . Biol . 23 (6) .-1129-1138 ; y Matsuoka et al . (1993) Proc. Na ti . Acad . Sci . USA 90 (20) : 9586-9590. Los promotores específicos de raíz se conocen y pueden seleccionarse a partir de los muchos disponibles en la literatura o aislarse de nuevo a partir de diversas especies compatibles. Véase, Por ejemplo, Hire et al . (1992) Plant Mol . Biol . 20 (2) : 207-218 (gen glutamina sintetasa específico de raíz de soya) ; Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) . - 1051-1061 (elemento control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de frijol Francés); Sanger et al . (1990) Plant Mol . Biol . 24(3):433-443 (el promotor específico de raíz del gen mannopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) ; y Miao et al . (1991) Plant Cell 3 (1 ) : 11-22 (clon de AD?c de longitud completa que codifica glutamina sintetasa citosólica (GS) que se expresa en las raíces y módulos de raíz de soya) .

Véase también, Bogusz et al . (1990) Plant Cell 2 ( 7 ) : 633-641 , en donde se describen dos promotores específicos de raíz aislados a partir de los genes de hemoglobina a partir de la no leguminosa que fijan nitrógeno Paraspoma andersonii y la no leguminosa que no fija nitrógeno relacionada Trema tomentosa . Los promotores de estos genes se enlazaron al gen reportero de ß-glucuronidasa y se introdujeron dentro de la no leguminosa Nicotiana tabacum y la leguminosa Lotus cornicula tus , y en ambos casos se conservó la actividad promotora específica de raíz. Leach y Aoyagi (1991) describe su análisis de los promotores de los genes que inducen raíz rolC y rolD altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (véase Plan t Science (Limerick) 19 (1) : 69-76) . Concluyeron que el mejorador y los determinantes de ADN preferidos de tejido están disociados en esos promotores. Teeri et al . (1989) usaron fusión de genes para lacZ para mostrar que el gen ADN- T de Agrobacterium que codifica octopina sintasa es especialmente activa en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2 ' es específico de raíz en el vegetal intacto y se estimula por herida en tejido de hoja, una combinación especialmente deseable de características para uso con un gen insecticida o larvicida (véase EMBO J. 8 (2) :343-350) . El gen TRl ' , fusionado a nptll (neomicin fosfotransferasa II) mostró características similares. Los promotores preferidos de raíz adicionales incluyen el promotor del gen VÍENOD-GRP3 (Kuster et al . (1995) Plant Mol . Biol . 29 (4 ) : 759-772) ; y promotor rolB (Capana et al . (1994) Plant Mol . Biol . 25 (4 ) : 681-691) . Véase también Patentes Norteamericanas Nos. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; y 5, 023, 179. Los promotores "preferidos de semilla" incluyen los promotores "específicos de semilla" (aquellos promotores activos durante el desarrollo de semilla tales como los promotores de las proteínas de almacenamiento de semilla) así como promotores de "semilla que germina" (aquellos promotores activos durante la germinación de semilla) . Véase Thompson et al . (1989) BíoEssays 10 : 108 , incorporado en la presente para referencia. Tales promotores preferidos de semilla incluyen, pero no se limitan a, Ciml (mensaje inducido por citocinina); cZ19Bl (zeina de 19 kDa de maíz) ; milps (mio-inositol-1- fosfato sintasa) ; y celA (celulosa sintasa) (véase la solicitud copendiente intitulada "Seed-Preferred Promoters", Solicitud Norteamericana No. de Serie 09/377,648, presentada el 19 de agosto de 1999, incorporada en la presente para referencia. La gama-zeina es un promotor específico de endosperma preferido. Glob 1 es un promotor específico de embrión preferido. Para dicotiledóneos, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no se limitan a, ß- faseolina de frijol, napina, ß-conglicinina, lectina de soya, cruciferina, y similares. Para monocotiledóneos , los promotores específicos de semilla incluyen, pero no se limitan a, zema de 15 kDa de maíz, zeina de 22 kDa, zeina de 27 kDa, zema-g, ceroso, encogido 1, encogido 2, globulina 1, etc.

Generalmente, las secuencias promotoras vegetales de la presente invención, cuando se enlazan operablemente a una secuencia heteróloga de nucleótidos de interés y se inserta dentro de un vector de transformación, controlan la expresión constitutiva de la secuencia heteróloga de nucleótidos en las células de un vegetal transformado establemente con este vector. Por "constitutivo" se quiere decir la expresión en las células a través de un vegetal en la mayoría de las veces y en la mayoría de los tejidos. Se reconoce que dependiendo del vegetal o tejido huésped particular, la SMPER particular o promotor que comprende las SMPER, y las variantes y fragmentos de las mismas, podría usarse para controlar la expresión preferida de tejido o específica de tejido. Por "secuencia heteróloga de nucleótidos" se quiere decir una secuencia que no ocurre naturalmente con la secuencia promotora. Las SMPER y los promotores vegetales de la invención que comprenden las SMPER no se encuentran en la naturaleza. Por lo tanto, cualquier secuencia de interés enlazado operablemente a un promotor que comprende las SMPER de ía invención es una secuencia heteróloga de nucleótidos. Mientras que esta secuencia de nucleótidos enlazada es heteróloga con respecto a la secuencia promotora, puede ser homologa (nativa) o heteróloga (extraña) respecto al huésped vece t al .

Las secuencias de SMPER aisladas de la presente invención, y las secuencias promotoras vegetales que comprenden las SMPER, puede modificarse para proporcionar un rango de expresión de niveles de la secuencia heteróloga de nucleótidos. Así, puede utilizarse menos de las regiones promotoras completas y retenerse la capacidad para impulsar la expresión de la secuencia de codificación. Sin embargo, se reconoce que los niveles de expresión de ARNm pueden disminuirse con las sustracciones de las porciones de las secuencias promotoras. Igualmente, puede cambiarse la naturaleza general de la expresión. Las modificaciones de las secuencias de SMPER de la presente invención y de las secuencias promotoras vegetales que comprenden las SMPER puede proporcionar un rango de expresión. Así, pueden modificarse para ser promotores débiles o promotores fuertes. Generalmente, por "promotor débil" se quiere decir un promotor que impulsa la expresión de una secuencia de codificación a un bajo nivel. Por "bajo nivel" se quiere decir niveles de aproximadamente 1/10,000 copias hasta aproximadamente 1/100,000 copias hasta aproximadamente 1/500,000 copias. Inversamente, un promotor fuerte impulsa la expresión de una secuencia de codificación a un alto nivel, o a aproximadamente 1/10 copias hasta aproximadamente 1/100 copias hasta aproximadamente 1/1,000 copias .

Las secuencias de nucleótidos para los promotores vegetales de la presente invención pueden comprender las secuencias indicadas en las Figuras 7-14 (SEC. DE IDENT. NO.: 65-72) o cualquier secuencia que tenga identidad sustancial con las secuencias. Por "identidad sustancial" se quiere decir una secuencia que presenta equivalencia funcional y estructural sustancial con la secuencia indicada. Cualquier diferencia funcional o estructural entre las secuencias sustancialmente idénticas no afecta la capacidad de la secuencia para funcionar como un promotor como se describe en la presente invención. Así, ei promotor vegetal de la presente invención dirigirá la expresión mejorada de una secuencia de nucleótidos heteróloga enlazada operablemente. Se consideran dos secuencias de nucleótidos SMPER sustancialmente idénticas cuando tienen al menos aproximadamente 80%, de preferencia al menos aproximadamente 85%, de mayor preferencia al menos aproximadamente 90%, aún de mayor preferencia al menos aproximadamente 95%, y de mayor preferencia al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia. Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos S.MPER indicadas en la presente están también abarcadas por la presente invención. Por el "fragmento" se quiere decir una porción de la secuencia del nucleótidos que es más larga que el elemento promotor individual más corto . ?i ti?ttkaeti ts?etul contenido en la porción particular. Los fragmentos de una secuencia del nucleótidos pueden retener la actividad biológica y en consecuencia mejorar la expresión de una secuencia de nucleótidos enlazado operablemente a un promotor sintético que comprende la SMPER. (Véase Lam et al . (1989) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 86 : 1890 ; Véase también Oliphant et al (1989) Mol . Cell Biol . 5:2944-2949; Niu y Guiltinan (1994) Nucleic Acid Res . 22 : 4969-497 ; Oeda, et al. EMBO J. 10:1793; y Catron et al . (1993) Mol . Cell Biol . 23:2354-2365). Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótídos que son útiles como sondas de hibridización o cebadores PCR generalmente no retienen la actividad biológica. Así, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de al menos 7 a 10, o aproximadamente 21, 25, 28, ó 29 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la longitud completa de una secuencia de nucleótidos de la invención. Una porción biológicamente activa de un promotor que comprende las SMPER de la invención puede prepararse sintetizando una porción de una de las secuencias de nucleótidos promotoras y valorar la actividad del fragmento. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora comprende al menos 21, 50, 75, 100, 150, o 200 nucleótidos, o hasta el número de . -. ...?A.At^^*jtefl...i^,^ nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos promotora de longitud completa descrita en la presente (por ejemplo, 413, 392, 314, 278, 348, 198, 302, o 157 nucleótidos para las Figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 (SEC. DE 5 IDENT. NOS: 65-72), respectivamente). Las variantes de éstos fragmentos promotores, tales como aquellos que resultan de la mutagénesis dirigida al sitio, están abarcadas por las composiciones de la presente invención. 10 La invención abarca las variantes de las SMPER y de las secuencias promotoras vegetales que comprenden las SMPER. Por "variantes" se quiere decir secuencias sustancialmente idénticas. Las variantes que ocurren naturalmente de las secuencias de elementos promotores individuales pueden 15 identificarse y/o aislarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con las técnicas de PCR e hibridización como se delinea posteriormente. La invención abarca las variantes de las SMPER y las secuencias promotoras vegetales descritas en la presente en las cuales 20 uno o más de los elementos promotores individuales se sustituyen por una variante natural de ese elemento. Por ejemplo, y sin limitación, el elemento ABRE 1 podría sustituirse por el ABRE A; y/o DRE1 podría sustituirse por DRE2. 25 La invención abarca variantes de las SMPER y las secuencias promotoras vegetales descritas en la presente en las cuales uno o más de ios elementos promotores individuales está en la orientación alternativa. Por "orientación" se quiere decir la configuración 5' a 31 (sentido) o la 3 ' a 5' 5 (antisentido) de una secuencia de elemento promotor contenida en una hebra contigua con relación a la configuración de otros elementos promotores y/o la casilla TATA contenida en esa hebra. La invención abarca secuencias SMPER y promotoras 10 de vegetal en las cuales los elementos promotores individuales se separan y/o flanquean por secuencias espaciadoras. Por "secuencia espadadora" se quiere decir la secuencia de nucleótidos contenida en una SMPER que no es un elemento promotor. La invención también abarca variantes de 15 las SMPER y las secuencias promotoras vegetales que comprenden multímeros contiguos de elementos promotores individuales que no contienen por ello secuencias espaciadoras; variantes en las cuales uno o más elementos individuales se separan o flanquean por secuencias 20 espaciadoras, y variantes que comprenden secuencias espaciadoras que son diferentes a las secuencias espaciadoras descritas en la presente. Las SMPER variantes y las secuencias de nucleótidos prcmotoras incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente 25 derivados, tales como aquéllos generados, por ejemplo, al usar mutagénesis dirigida al sitio, pero las cuales aún presentan actividad promotora. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Kunkel (1985) Proc . Na ti . Acad . Scí . USA 82:488-492; Kunkel et al . (1987) Methods in Enzymol . 154 : 367-382; Patente Norteamericana No. 4,873,192; Waiker and Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en el mismo. Generalmente, una secuencia del nucleótido de la invención tendrá al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95%, hasta 98% o más identidad de secuencias con sus secuencias de nucleótidos promotora de referencia respectiva, y mejora o promueve la expresión de las secuencias de codificación heterólogas en vegetales o células vegetales. Las secuencias de nucleótidos promotoras variantes también abarcan las secuencias derivadas a partir de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como redistribución de ADN. Con tai procedimiento, pueden manipularse una o más secuencias promotoras diferentes para crear un nuevo promotor que posee las propiedades deseadas . En esta forma, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprende regiones de secuencia que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden ser •t *"jA' '-•*-*- '-JbUkiiita¿t?.-?i?aíut??¿'- homólogamente recombinados in vi tro o in vivo . Las estrategias para tal redistribución en ADN son conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati . Acad . Sci . USA 31:10747-10751; Stemmer (1994) Na ture 370:389- 391; Crameri et al . (1997) Na ture Biotech . 15:436-438 ; Moore et al . (1997) J. Mol . Biol . 272:336-347; Zhang et al . (1997) Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 34:4504-4509; Crameri et al . (1998) Na ture 331:288-291; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,605,793 y 5,837,458. Las variantes biológicamente activas de las secuencias promotoras deben retener la actividad promotora y mejorar así la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga operablemente enlazada. La actividad promotora puede medirse por análisis de Northern blot . Véase por ejemplo, Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), incorporada en la presente para referencia. La expresión de proteínas indicativa de la actividad promotora puede medirse determinando la actividad de una proteína codificada por la secuencia de codificación enlazada operablemente al promotor particular, que incluye pero no se limita a tales ejemplos como GUS (b-glucoronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol . Biol . Rep . 5:387), GFP (proteína de fluorescencia verde); Chalfie et al . (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al . (1987) Nucleic Acids Res . 25 U3J : 8115 y Luehrsen et al . (1992) Methods Enszymol . 216 : 397-414) , y los genes de maíz que codifican la producción de antocianina (Ludwig et al . (1990) Science 247:449) Se reconoce que las SMPER no se encuentran en la naturaleza. Esto es, la combinación de los elementos promotores individuales es novedosa. Sin embargo, también se reconoce que las secuencias de nucleótidos de la invención pueden utilizarse para aislar fragmentos de secuencia sustancialmente idénticos a partir de fuentes naturales, particularmente vegetales. En esta forma, métodos tales como PCR, hibridización, y similares pueden usarse para identificar tales secuencias con base en su homología de secuencia con las secuencias indicadas en la presente . Tales métodos se conocen generalmente en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . Véase también Innis et al . , eds. (1990) PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Stra tegies (Academic Press, New York); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) . Las secuencias aisladas con base en su identidad de secuencia a un fragmento de las secuencias indicadas en la presente están abarcadas por la presente invención. Tales elementos individuales pueden usarse en una SMPER. >-. 1 ., .» ?*JLJ ?A? fcjtonn» I,^, . ..-.^¡¿¿¿^ ¿¿^fa La hibridización de tales secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones severas. Por "condiciones severas" o "condiciones de hibridización severa" se quiere decir condiciones bajo las cuales una sonda se hibridizará con su secuencia objetivo a un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre la base) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar la severidad de la hibridización y/o condiciones de lavado, pueden identificarse las secuencias objetivo que son 100% complementarias con la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad pueden ajustarse para permitir algún desajuste en las secuencias de manera que se detectan grados menores de identidad (sondeo heterólogo) . Generalmente, una sonda es menor de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menor de 500 nucleótidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor de aproximadamente 1.5 M de ion Na, en forma típica de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (u otras sales) a pH 7.0 hasta 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucieótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen hibridización con una solución reguiadora de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato sódico) a 37°C, y un lavado en IX a 2X de SSC (20X SSC = 3.0 M de NaCl/0.3 M de citrato trisódico) de 50 a 55°C. Ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen la hibridización en 40 a 45% de formamida, 1.0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX de SSC de 55 a 60°C. Ejemplos de condiciones de alta severidad incluyen la hibridización en 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 0. IX de SSC de 60 a 65°C. La especificidad es típicamente la función de los lavados pos-hibridización, siendo los factores críticos la concentración iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos ADN-ADN, la Tm puede aproximarse de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal . Biochem . 138:267-284: la Tp = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) 0.61 (% de form)-500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el por ciento de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form es el por ciento de formamida en la solución de hibridización, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tr es la temperatura (bajo concentración iónica definida y pH) a la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se hibpdiza a una sonda perfectamente ajustada. La T? se reduce en aproximadamente 1°C durante cada 1% de desajuste; así, las condiciones de Tm, hibpdización, y/o lavado pueden ajustarse para hibridizar a las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm puede disminuirse 10°C. Generalmente, se seleccionan las condiciones de severidad para estar aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento en una concentración iónica definida y pH . Sin embargo, las condiciones rigurosamente severas pueden utilizar una hibridización y/o lavado a l, 2, 3, o 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridización y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridización y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menos que el punto de fusión térmico (T . Usando la ecuación, las composiciones de hibridización y lavado, y T„, deseada, aquellos con experiencia común entenderán que se describen inherentemente las variaciones en la severidad de la hibridización y/o soluciones del lavado. Si el grado deseado de desajuste resulta en una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefire aumentar la concentración de SSC de manera que pueda usarse una temperatura superior. Una guía extensa a la 37 hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques ín Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York) ; y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . En general, las secuencias que tienen actividad promotora o mejoradora e hibpdizan a las secuencias descritas en la presente tendrán al menos 80%, 85%, 90%, 95% hasta 98% o más idénticas con las secuencias descritas. Los métodos de alineación para determinar el grado de identidad de dos secuencias son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias cualquiera puede lograrse usando un algoritmo matemático. Ejemplos preferidos, no limitantes de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-11,- el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch (1970) J". Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de similaridad de Pearson and Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Nati. li i" il I I iij|||l. I ni t.tk. Á-?já&ik.JikÍ lk kíí Acad . Sci . USA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Na ti . Acad . Sci . USA 90 : 5873-5877. Pueden utilizarse implementos de computadora de estos algoritmos matemáticos para la comparación de las secuencias para determinar la identidad de secuencias. Tales implementos incluyen, pero no se limita a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible a partir de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIG? (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Versión 8 (disponible a partir de Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA) ,- y Sequencher (GeneCodes, Ann Arbor, MI) . Las alineaciones que usan estos programas pueden realizarse usando los parámetros de omisión. El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins et al . (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al . (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al . (1988) Nuclei c Acids Res . 16": 10881-90 ; Huang et al . (1992) CABIOS 8 : 155-65 ; y Pearson et al . (1994) Meth. Mol . Biol . 24:307-331. El programa ALIG? se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra . Puede usarse una tabla de residuo de peso PAM120, una sanción de longitud de intervalo de 12, y una sanción de intervalo de 4 pueden usarse con el programa ALIG? cuando se comparan las secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol . Biol . 215:403 se basan en los algoritmos de Karlm y tMt k&s kA?ám&? Altschul (1990) supra . La búsqueda de nucleótidos BLAST puede realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabras = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. La búsqueda de proteínas BLAST puede lograrse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabras = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones en intervalos para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al . (1997) Acids Res . 25:3389. Alternativamente, puede usarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecta las relaciones distantes entre las moléculas. Véase Altschul et al . (1997) supra . Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, los parámetros de omisión de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) pueden usarse. Véase http : //www. ncbi . nlm. nih. gov. La alineación también puede realizarse manualmente por inspección. Para propósitos de la presente invención, la comparación de la secuencia de nucleótidos o proteínas para la determinación del por ciento de identidad de secuencia con las secuencias descritas en la presente se hace preferiblemente usando GAP (GCG Versión 10) con sus parámetros de omisión, o cualquier programa de ni f i f ái^^ »i«afe* AAH . comparación de secuencias equivalentes. Por "programa equivalente" se quiere decir cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera una alineación que tiene ajustes de residuos de nucleótidos o aminoácidos sustancialmente idénticos y un por ciento de identidad de secuencia sustancialmente idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por el programa preferido. Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima durante una ventana de comparación especificada. El término "identidad sustancial" de las secuencias de polinucleótidos quiere decir que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 85%, de mayor preferencia al menos 90%, aún de mayor preferencia al menos 95%, y de mayor preferencia al menos 98%, en comparación a una secuencia de la invención usando uno de los programas de alineación descritos anteriormente usando parámetros estándar o de omisión. Otro indicio de que las secuencias de nucleótidos son sustanciaimente idénticas es si dos moléculas se hibridizan una con otra bajo condiciones severas. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menos que ei punto de fusión térmico (Tra) para la secuencia específica a una concentración iónica definida y pH . Sin embargo, las condiciones severas abarcan temperaturas en el rango de aproximadamente 1°C hasta aproximadamente 20 °C, dependiendo del grado deseado de severidad como se califica de otra forma en la presente. Las secuencias de nucleótidos para las SMPER y los promotores de la presente invención, así como las variantes y fragmentos de las mismas, son útiles en la manipulación genética de cualquier vegetal cuando se enlaza operablemente con una secuencia heteróloga de nucleótidos cuya expresión debe controlarse para lograr una respuesta fenotípica deseada. Por "enlazada operablemente" se quiere decir que la transcripción o traducción de la secuencia heteróloga de nucleótidos está bajo la influencia de la secuencia promotora. En esta forma, las secuencias de nucleótidos para los promotores de la invención se proporcionan en cassettes de expresión junto con secuencias de nucleótidos de interés para la expresión en el vegetal de interés. Tales construcciones de ADN o cassettes de expresión comprenderán una región de iniciación de transcripción que comprende una de las secuencias promotoras de nucleótídos de ia presente invención, o variantes o fragmentos de las mismas, enlazadas operablemente a la secuencia heteróloga de nucleótidos cuya expresión debe controlarse por los promotores descritos en la presente. Tal cassette de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia del nucleótido esté bajo la regulación de transcripción de las regiones reguladoras. El cassette de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables. El cassette de transcripción incluirá en la dirección de transcripción 5' a 3', una región de iniciación de transcripción y de traducción, una secuencia heteróloga de nucleótidos de interés, y una región de terminación de transcripción y traducción funcionales en células vegetales. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de transcripción que comprende una de las secuencias de nucleótidos promotoras de la presente invención, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés, o puede derivarse de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A . tumefaciens , tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también, Guerineau et al . (1991) Mol . Gen . Gene t . 262 : 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64 : 611- 614 ,- Sanfacon et al . (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al . (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al . (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al . ?foHJTiAflitl j¿j..sSi?ßu?t ?É íiki 1989) Nucl ei c Acids Res . 11 -. 1891 - 1903 ; Joshi et al . (1987) Nucl ei c Acid Res . 15:9627-9639. El cassette de expresión que comprende la secuencia promotora de la presente invención enlazada operablemente a una secuencia heteróloga de nucleótidos también puede contener al menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen a ser cotransformado dentro del organismo. Alternativamente, la o las secuencias adicionales pueden proporcionarse en otro cassette de expresión. Donde sea apropiado, la secuencia heteróloga de nucleótidos cuya expresión debe estar bajo el control de la secuencia promotora de la presente invención y cualquiera de la o las secuencias de nucleótidos adicionales puede optimizarse para la expresión aumentada en el vegetal transformado. Esto es, estas secuencias de nucleótidos pueden sintetizarse usando codones preferidos de vegetal para la expresión mejorada. Están disponibles métodos en la técnica para sintetizar secuencias de nucleótidos preferidas de vegetal. Véase por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,380,831 y 5,436,391, y Murray et al . (1989) Nucl ei c Acids Res . 17 : 477-498 , incorporadas en la presente para referencia. Se sabe que las modificaciones de secuencia adicionales mejoran la expresión del gen en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadeniiación espurias, señales de IJAJÍ ?kK^ut?i?átoj ?Jtll?kt?f. sitio de empalme exon-intron, repeticiones similares a transposon, y otras de tales secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales a la expresión del gen. El contenido de G-C de la secuencia heteróloga de nucleótidos puede ajustarse a niveles promedio para un huésped celular dado, como se calcula con referencia a los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias de horquilla predichas. Los cassettes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias guía 5 ' en la construcción del cassette de expresión. Tales secuencias guía pueden actuar para mejorar la traducción. Se conocen en la técnica guías de traducción e incluyen: guías picornavirus, por ejemplo, guía EMCV (región 5' que no codifica encefalomiocarditis) (Elroy - Stein et al . (1989) Proc . Na t . Acad . Sci . USA 86:6126-6130); guías potivirus, por ejemplo, guía TEV (Virus del Grabado del Tabaco) (Allison et al . (1986)),- guía MDMV (Virus Mosaico del Maíz Enano) ( Virology 154:9-20); proteína de enlace a la immunoglobulina de cadena pesada humana (BiP) (Macejak y Sarnow (1991) Na ture 353:90-94); guía no traducido del ARNm de proteína de recubrimiento del virus mosaico de la alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling y Gehrke (1987) Na ture 325:622-625); guía del virus mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al . (1989) Mol ecular Biology of RNA, páginas 237-256) ; y guía del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al . (1991) Virology 81:382-385). Véase también Della-Cioppa et al . (1987) Plant Physiology 84:965-968. También pueden utilizarse otros métodos conocidos para mejorar la traducción y/o estabilidad de .ARNm, por ejemplo, intrones, y similares. En aquellos casos en donde es deseable tener el producto expresado de la secuencia heteróloga de nucleótidos dirigida a un organelo particular, tal como el cloroplasto o mitocondrion, o secretado en la superficie de la célula o extracelularmente, el cassette de expresión puede comprender adicionalmente una secuencia de codificación para un péptido de tránsito. Tales péptidos de tránsito son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el péptido del tránsito para la proteína portadora de acilo, la subunidad pequeña de RUBISCO, EPSP sintasa vegetal, y similares. Para preparar el cassette de expresión, pueden manipularse en los diversos fragmentos de ADN, para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, cuando sea apropiado en la estructura de lectura apropiada. Hacia este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazantes para unir los fragmentos de ADN, o pueden involucrarse otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, pueden involucrarse mutagénesis in vi tro, reparación de cebador, restricción, templando, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones . Los promotores pueden usarse para impulsar genes reporteros o genes marcadores seleccionables . Ejemplos de genes reporteros adecuados conocidos en la técnica pueden encontrarse en, por ejemplo, Jefferson et al. (1991) in Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp . 1-33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; y Kain et al. (1995) BioTechniques 19:650-655; y Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325-330. Los genes marcadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican la resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne- Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 1 -.111-116) , - sufonamida (Guerineau et al . (1990) Plan t Mol . Biol . 15:127-136); bromoxinil (Stalker et al . (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al . (1986) Science 233:478-481); fosfinotricma (DeBlock et al . (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Otros genes que podrían servir de utilidad en la recuperación de eventos transgénicos pero que no pueden requerirse en el producto final incluyen, pero no se limitan a, ejemplos tales como GUS (b-glucoronidasa,- Jefferson (1987) Plant Mol . Biol . Rep . 5:387), GFP (proteína de florescencia verde); Chalfie et al . (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al . (1987) Nucl ei c Acids Res . 15 (19) -. 8115 y Luehrsen et al . (1992) Methods Enszymol . 216. - 391-414 ) , y los genes de maíz que codifican la producción de antocianina (Ludwig et al . (1990) Science 247:449). El cassette de expresión que comprende la secuencia promotora particular de la presente invención enlazado operablemente a una secuencia heteróloga de nucleótidos de interés puede usarse para transformar cualquier vegetal . En esta forma, pueden obtenerse, vegetales, células vegetales. tejido vegetal, semillas y similares genéticamente modificados. Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos dentro de los vegetales pueden variar dependiendo del tipo de vegetal o célula vegetal, es decir, monocotiledóneo o dicotiledóneo, seleccionado para transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos dentro de las células vegetales y la inserción subsecuente dentro del genoma vegetal incluyen la microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, Agrobacterium-transformación mediada (Townsend et al., Patente Norteamericana No. 5,563,055), transferencia de gen directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3 -.2111-2122) , y aceleración de partículas balísticas (véase, por ejemplo, Sanford et al., Patente Norteamericana No. 4,945,050; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); y MeCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926) . Véase también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-411 ; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:21-31 (cebolla) ; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87 -.611-614 (soya) ; MeCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soya); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soya); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soya); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, Patente Norteamericana No. 5,240,855; Buising ec al., Patentes Norteamericanas Nos. 5,322,783 y 5,324,646; Tomes et al . (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell , Tissue, and Organ Cul ture : Fundamental Methods , ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (maíz); Klein et al . (1988) Plant Physiol . 92:440-444 (maíz); Fromm et al . (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al . (1984) Na ture London) 322:763-764; Bytebier et al . (1987) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al . (1985) en The Experimental Manipula tion of Ovule Tissues, ed. Chapman et al . (Longman, New York), pp . 197-209 (polen); Kaeppler et al . (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al . (1992) Theor . Appl . Genet . 84:560-566 (transformación mediada por bigotes) D'Halluin et al . (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al . (1993) Plant Cell Reports 22:250-255 y Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al . (1996) Na ture Biotechnology 24:745-750 (maíz via Agrobacterium tumefaciens) ; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia. Las células que se han transformado pueden cultivarse en vegetales de acuerdo con medios convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al . (1986) Plan t Cell Reports 5:81-84. Estos vegetales pueden cultivarse después, y polinizarse con la misma cepa transformada o cepas diferentes, e identificarse el híbrido resultante que tiene j¿jva¿ü j.«., la expresión de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga establemente y se herede y después de cosechen las semillas, para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie vegetal, que incluye, pero no se limita a, maíz Zea mays), Brassica sp . (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea) , particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeno (Sécale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum) , mijo proso (Panicum miliaceum) , mijo carricera (Setaria itálica) , mijo dedo (Eleusine coracana) ) , girasol (Helianthus annuus) , cártamo (Carthamus tinctorius) , trigo (Triticum aestivum) , soya (Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (Solanum tuberosum) , cacahuate (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote (Ipoinoea batatus) , yuca (Manihot esculenta) , café (Cofea spp.), coco {Cocos nucífera) , pina (Ananas comosus) , árboles de cítrico (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao) , té (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana) , higo (Ficus cas ica) , guayaba (Psidium gua java) , mango (Mangifera indica) , oliva (Olea europaea) , papaya {Carica papaya) , marañón (Anacardium occidentale) , macadamia (Macadamia mtegri folia) , almendra (Prunus amygdalus) , remolacha (Seta vulgaris) , caña de azúcar (Saccharum spp.), avenas (Avena sativa) , cebada (Hordeum vulgare) , vegetales, plantas ornamentales, y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa) , habas verdes (Phaseolus vulgaris) , habas (Phaseolus limensis) , chícharos (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantaloupe (C. cantalupensis) , y melón (C. meló) . Las plantas ornamentales incluyen azalias {Rhododendron spp.), hidrangeas {Macrophylla hydrangea) , hibisco (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida) , clavel (Díanthus caryophyllus) , nochebuena (Euphorbia pulcherrima) , y crisantemo. Las coniferas que pueden emplearse para practicar la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino del incienso (Pinus taeda) , pino de tala (Pinus elliotii) , pino ponderosa (Pinus ponderosa) , pino contorta (Pinus contorta) , y pino Monterey (Pmus radiata) ; abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii) ,- Sucota del Oeste (Tsuga canadensis) ; abeto Sitka {Picea glauca) ; secoya (Sequoia sempervirens) ; abetos verdaderos tales como abeto de plata {Abies amabilis) y abeto de balsamina {Abies balsamea) ; y cedros tales como cedro rojo del Oeste ( Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska { Chamaecypaps nootka tensis) . Preferiblemente, los vegetales de la presente invención son vegetales de cultivo (por ejemplo, máiz, alfalfa, girasol, Brassica, soya, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), de mayor preferencia vegetales de maíz y soya, aún de mayor preferencia vegetales de maíz. Los vegetales de interés particular incluyen vegetales de grano que proporcionan semillas de interés, vegetales de semilla oleaginosa, y vegetales de leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Los vegetales de semilla oleaginosa incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Los vegetales de leguminosas incluyen frijoles y chícharos. Los frijoles incluyen guar, haba, fenogreco, soya, habas de jardín, capuil, garbanzo mungo, haba, haba fava, lentejas, chícharo pollo, etc. Las secuencias promotoras y los métodos descritos en la presente son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia heteróloga de nucleótidos en un vegetal huésped. Así, la secuencia heteróloga de nucleótidos enlazado operablemente a los promotores descritos en la presente pueden ser un gen estructural que codifica una proteína de interés. Ejemplos de tales genes heterólogos incluyen, pero no se limita a, genes que codifican proteínas que confieren resistencia a la tensión abiótica, tales como sequía, temperatura, salinidad, y toxinas tales como pesticidas y herbicidas, o a tensión biótica, tales como ataques por hongos, virus, bacterias, insectos, y nemátodos, y el desarrollo de enfermedades asociadas con estos organismos. Los genes de interés son reflejo de los mercados comerciales e intereses de aquéllos involucrados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian, y conforme las naciones en desarrollo abren mercados mundiales, surgirán también nuevos cultivos y tecnologías. Además, conforme aumenta nuestro entendimiento de los rasgos agronómicos y las características tales como rendimiento y heterosis, la selección de los genes para transformación cambiará en consecuencia. Las categorías generales de los genes de interés incluyen, por ejemplo, aquellos genes involucrados en la información, tales como dedos de zinc, aquellos involucrados en la comunicación, tales como cinasas, y aquellos involucrados en el cuidado del hogar, tales como proteínas de choque por calor. Categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes para la agronomía, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicidas, esterilidad, características del grano, y productos ¿U£¿ÑM^ÍM¡Í _!_. comerciales. Los genes de interés incluyen, generalmente, aquellos involucrados en el metabolismo de aceite, almidón, carbohidrato, o nutrientes así como aquellos que afectan el tamaño del grano de maíz, carga de sacarosa y similares. Los rasgos agronómicamente importantes tales como contenido de aceite, almidón y proteína pueden alterarse genéticamente además de usar los métodos de cría tradicionales. La calidad del grano se refleja en rasgos tales come ios niveles y tipos de aceites, saturados y no saturados, calidad y cantidad de los aminoácidos esenciales, y niveles de celulosa. Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oleico, aceites saturados y no saturados, aumentar los niveles de lisina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales, y también la modificación del almidón. Las modificaciones de la proteína ordotionina se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,990,389, 5,885,801, y 5,885,802, incorporadas en la presente para referencia. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de soya descrita en la Patente Norteamericana No. 5,850,016, y el inhibidor del quimiotripsina de cebada, descrito er. Williamson et al . (1987) Eur. J. Biochem 165:99 106, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. ? _eden hacerse derivados de las secuencias de codificación por mutagénesis dirigida al sitio para aumentar el nivel de los aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido alto en lisina de cebada (BHL) se deriva del inhibidor de quimiotripsina de cebada, Solicitud Norteamericana No. de Serie 08/740,682, presentada el 1 de noviembre de 1996, y la Publicación PCT No. WO98/20133, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en metionina tales como, a partir de semilla de girasol (Lilley et al . (1989) Proceedings of the World Congress on Vege table Protein Utiliza tion in Human Foods and Animal Feedstuffs , ed. Applewhi te (American Oil Chemists Society, Champaing, Illinois), pp . 497-502; incorporada en la presente para referencia); maíz (Pedersen et al . (1986) J". Biol . Chem. 261:6279; el Kirihara et al . (1988) Gene 72:359; los cuales se incorporan en la presente para referencia) ; y arroz (Musumura et al . (1989) Plant Mol . Biol . 12 : 123 , incorporado en la presente para referencia) . Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Fluory 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento de semilla, y factores de transcripción. Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que tiene gran obstrucción a la cosecha, como el gusano de la raíz, oruga, Oradador del *-'-- — * -~ *- - ^g? ^^j *^-ijMáküitt Maíz Europeo y similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, genes de proteína tóxica de Bacillus thuringiensis (Patentes Norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; y Geiser et al . (1986) Gene 48 : 109 ) ; lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol . Biol . 24 : 825 ) ; y similares . Los genes que codifican rasgos de resistencia a enfermedad incluyen genes de destoxificación, tales como en contra de fumonosina (Patente Norteamericana No. 5,792,931); genes de avirulencias (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones et al . (1994) Science 266 : 189 ; Martin et al . (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al . (1994) Cell 78:1089); y similares . Los rasgos de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción acetolactato sintasa (ALS) , en particular los hebicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican la resistencia herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutaminas sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, bar), u otros genes conocidos, en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica la resistencia a los antibióticos canamicina y geneticina, y las mutantes del gen ALS codifican la resistencia al herbicida clorsulfuron . También pueden codificarse genes de esterilidad en un cassette de expresión y proporcionan una alternativa al desespigado físico. Ejemplos de genes usados en tales formas, incluyen genes preferidos de tejido macho y genes con fenotipos de esterilidad de macho tales como QM, descritos en la Patente Norteamericana No. 5,583,210. Otros genes incluyen cinasa y aquellos que codifican compuestos tóxicos al desarrollo gametofítico macho o hembra. También pueden codificarse rasgos comerciales sobre un gen o genes que pudieran aumentar, por ejemplo, el almidón para producción de etanol, o proporcionar la expresión de proteínas. Otro importante uso comercial de los vegetales transformados es la producción de polímeros y bioplásticos, tal como se describe en la Norteamericana No. 5,602,321. Los genes tales como ß-Ketotiolasa, PHBasa (polihidroxibutirato sintasa), y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert et al . (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilita la expresión de polihiroxialcanoatos (los PHA) . Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales así como aquellos de otras fuentes que incluyen procariotas y otros eucariotas . Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas, y similares. Puede aumentarse el nivel de proteínas, particularmente las proteínas modificadas que tienen distribución de aminoácidos mejorada para mejorar el valor nutriente del vegetal. Esto se logra por la expresión de las proteínas que tienen contenido de aminoácidos mejorado. Alternativamente, la secuencia heteróloga de nucleótidos enlazado operablemente a uno de los promotores descritos en la presente puede ser una secuencia antisentido para un gen seleccionado. Así, pueden construirse secuencias que son complementarias a, y se hibridizaran con, el ARN mensajero (ARNm) del gen seleccionado. Pueden hacerse modificaciones de las secuencias antisentido, siempre y cuando las secuencias se hibridizen e interfieran con la expresión de ARNm correspondiente. En esta forma, pueden usarse las construcciones antisentido que tienen 70%, preferiblemente 80%, de mayor preferencia 85% de similitud de secuencia con las secuencias de antisentido correspondientes. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para desorganizar la expresión del gen objetivo. Generalmente, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, o más. Cuando se suministran dentro de una célula vegetal, la expresión de la secuencia de ADN antisentido previene la expresión normal de la secuencia de nucleótidos de ADN para el gen seleccionado. En esta forma, se inhibe la producción de la proteína nativa codificada por el gen seleccionado para lograr una respuesta fenotípica deseada. Así el promotor se ^^laS&á m &k^BßtB i í • z1 enlaza a las secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en el vegetal. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

EXPERIMENTAL EJEMPLO 1: Recolección e Identificación de Elementos Promotores Se recolectaron secuencias de 64 elementos 10 promotores definidos o putativos o sitios de enlace del factor de transcripción, cada elemento de 20-40 pares de bases (pb de largo) . Las secuencias se muestran en la Figura 1 en la dirección 5' a 3' (sentido). Se sintetizaron oligonucleótidos 15 (oligos) que corresponden a las hebras superiores (sentido) y las hebras inferiores (antisentido) de estas secuencias de elementos promotores por el sintetizador de ADN automatizadas. Para la síntesis de ADN, se agregó la secuencia espaciadora TAGC a todos los oligonucleótidos de 20 hebra superior y GCTA a todos los oligonucleótidos de hebra inferior para facilitar la subsecuente manipulación de ADN. Los 64 pares de oligonucleótidos de sentido y antisentido sintetizados correspondientes se templaron en reacciones individuales (88°C durante 2 minutos (min.), 65°C 25 durante 15 min., 37°C durante 15 mm., 25°C durante 5 min.) . posteriormente, los oligonucleótidos se dispusieron y registraron en un formato de 8x8 en una placa de microtítulo. Estos oligonucleótidos se reunieron usando una estrategia de reunión de 2 dimensiones (8 reuniones horizontales y 8 verticales) . Cada reunión contiene 8 pares de oligonucleótidos, como se indica en la Figura 2. Las 16 reuniones de oligonucleótidos se marcaron con la enzima de Klenow en la presencia de P-32 dCTP en reacciones separadas (200 ng de ADN en cada reacción de 200 µtl) . El ADN marcado se purificó por una columna del giro (columna de giro Bio-Gel P- 6, Biorad) . Estas sondas de ADN se usaron en reacciones de enlace de ADN con extractos nucleares de maíz . Los extractos nucleares se prepararon usando un protocolo modificado de Green et al . (1988) "In vitro DNA Footprinting, " en Plant Molecular Biology Manual , ed. Gelvin, Schilperoort , y Verma (Kluwer Academic Publishers, Dordrecht) B22: 1-22. Las semillas se germinaron en la obscuridad a 24 °C. Se recolectaron las raíces de plantas de semilla de 4 días y se agregó volumen de 4X del Regulador Homogeneizante (25 mM de Hepes/KOH pH 7.6 , 10 mM de MgC12, 0.3M de sacarosa, 0.5% de Tritón X-100, 5 mM de ß-mercaptoetanol, 1 mM de PMSF) . Los tejidos se disectaron en piezas pequeñas usando un mezclador Waring comercial a baja velocidad durante 10 segundos y se molió hasta una pasta con mortero y manilla. Los tejidos homogeneizados se filtraron a través de dos capas de miracloth (CalBiochem) y una capa de 70 µm de malla de nylon. Los extractos se centrifugaron en un rotor Sorval GSA, 4500 rpm, 15 minutos. Los granulos de los núcleos se resuspendieron después suavemente con una brocna de pintura en Regulador Homogeneizante y se centrifugó como anteriormente. Este paso se repitió una vez. Después de la última centrifugación, los núcleos se resuspendieron en Regulador de Lysis Nuclear (15 mm de Hepes/KOH pH 7.6, 110 mM de KCl, 5 mM de MgC12, 1 mM de DTT, 1 mm de PMSF, 5µg/ml de leupeptina, 2µg/ml de aprotinina, lµg/ml de pepstatina A) . Se agregó NaCl en una forma por goteo hasta una concentración final de 0.5 M. Las proteínas nucleares se extrajeron a partir de los núcleos por incubación de la mezcla de NaCl sobre hielo durante 40 minutos con agitación suave. El extracto se centrifugó en un rotor Sorval SS34, 16K rpm, durante 30 minutos. Los sobrenadantes se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Para continuar la preparación del extracto nuclear, se descongelaron extractos nucleares congelados sobre hielo y se agregó sulfato de amonio lentamente a los extractos nucleares hasta una concentración final de 0.35 mg/ml agitando a la vez. Las proteínas nucleares precipitadas se centrifugaron en un rotor Sorval SS34 a 16k rpm durante 30 min. Los granulos se resuspendieron en un Regulador de Extracto Nuclear (25 mM de Hepes/KOH pH 7.6, 40 mM de KCl, 0.1 mM de EDTA, 10% glicerol, 5 mM de ß-mercaptoetanol) con 1 M de PMSF, 5µg/ml de antipaina, 5µg/ml de leupeptina y 5µg/ml de aprotinina y se dializó durante 6 horas en contra de NEB con 0.1 mM de PMSF. Se tomaron alícuotas de los extractos nucleares dializados y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Pruebas de Cambio de Gel Para las reacciones de enlace de ADN, se incubaron alícuotas de aproximadamente 1-2 µg de los extractos nucleares con las sondas de ADN marcado (10 ng) en la presencia de 1 µg poli (dl-dC) . Las reacciones de enlace se incubaron sobre hielo durante 5-20 minutos y se corrieron en gel al 04% de poliacrilamida-0.5 x TBE a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada una de las 16 filas del gel correspondió a una reunión de oligonucleótidos como se indica en la Figura 2. El gel se secó después y se expuso a películas Kodak. Los resultados de cambio de gel indicaron que algunas oligosondas se enlazaron muy fuertemente por factores en los extractos nucleares de maíz, como se evidenció por su movilidad reducida en el gel. La referencia cruzada a estas actividades de enlace fuerte a partir del registro de reunión de dos dimensiones 8x8 (Figura 2) indicó que éstas fuertes actividades de enlace fueron contribuidas por los elementos promotores PCNA HA, GT-2, ABRE1, As-1, y DRE1, como indica en la Figura 3. sa » EJEMPLO 2: Multimerización de Elementos Promotores Debido a que los elementos promotores PCNA HA, GT-2, ABRE1, As-1, y DRE1 se enlazaron fuertemente por factores en los extractos nucleares de maíz, la conclusión que los factores de transcripción que interactúan con los elementos se expresan abundantemente en el maíz. En consecuencia, se seleccionaron los cinco elementos promotores para combinarse sintéticamente dentro de promotores sintéticos altamente activos . Para sintetizar los múltimeros de elementos promotores, los oligonucleótidos descritos anteriormente (hebras superior e inferior que tienen secuencias espaciadas) para los cinco elementos promotores se fosforilaron por T4 ADN cinasa (1 µg ADN en 10 µl de reacción) . Después estos cinco pares de oligonucleótidos se templaron en reacciones separadas como se describió anteriormente. Se combinaron cinco pares de oligonucleótidos y se ligaron aleatoriamente dentro de secuencias de multímero de elementos promotores en una reacción. El tamaño promedio de los productos ligados fue ~200 pbs. El ADN de la reacción de ligaduras se purificó en gel para eliminar pequeños fragmentos de ADN ("100 pbs y abajo) y moléculas no ligadas. Los extremos de los fragmentos de ADN purificado fue reparado por la enzima de Klenow y se clonaron dentro de vectores de expresión. EJEMPLO 3 : Pruebas de Clonación y Transcientes de los Elementos Promotores Sintéticos. Para clonar los promotores sintéticos dentro de vectores de expresión, se dirigió plásmido, Pl más intron Adhl (LexA: : AdhI-89-minimal : :Adh intron :: LUC :: Pinll ) y plásmido P2 menos-intron Adhl (LexA: :AdhI-89-minimal :: LUC :: Pinll) con enzimas de restricción para eliminar las secuencias del elemento promotor LexA. Los sitios desdoblados se llenaron con enzimas de Klenow, y los vectores de estructura principal resultante se purificaron en gel. Los promotores sintéticos se ligaron dentro de estos vectores de expresión de estructura principal en reacciones separadas. Se secuenciaron aproximadamente 20 clones positivos para cada construcción. Cada secuencia ligada se comparó con las secuencias de elementos promotores originales usando ya sea software Sequencher (GeneCodes, Ann, Arbor, MI) o GAP (Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA) . Con base en la información de secuencia, se seleccionaron siete construcciones derivadas de plásmidos más intron Adhl (Figura 4) y diez construcciones derivadas de plásmidos menos-intron Adhl para análisis de expresión transiente (Figura 5) . Se bombardearon plantas de semillas de maíz de tres días de edad con 3 µg de los plásmidos experimentales que comprenden SMPER ::AdhI-89-min?mal :: Adh intron :: LUC :: Pinll o aquellos que comprenden SMPER: : dhI-89-minimal :: LUC :: Pinll .

( Véase Tomes, D. et al . , IN: Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Eds. O.L. Gamborg and G.C. Phillips, Chapter 8, pgs. 197-213 (1995), para descripción general del proceso de bombardeo) . Después de 20 horas de incubación en la obscuridad, se prepararon extractos de proteína cruda a partir de raíces y brotes. Se usaron extractos de tejido de 20 µl para pruebas de actividad de luciferasa. Para medición de la actividad promotora, se usó actividad de luciferasa directamente para cada construcción (Figura 6) . Los controles negativos (plásmidos Pl y P2 ) y sus derivados sin las secuencias LexA mostraron muy baja actividad. Las pruebas transientes indicaron que los promotores sintéticos que comprenden algunas SMPER pueden promover la expresión del gen en maíz. Por lo tanto, solamente combinaciones únicas de elementos promotores generan promotores funcionales. Algunos promotores sintéticos que comprenden los SMPER particulares (A15, A18, A23, A24, A42, A44, A48, y A51 (Figura 6; secuencias en las Figuras 7-14 (SEC. DE IDENT. NO.: 65-72)) presentaron expresión de gen mejorado. EJEMPLO 4: Transformación y Regeneración de Maíz Transgénico: Biolisticas : Los polinucleótidos de la invención contenidos dentro de un vector se transforman en callo de maíz embriogénico por bombardeo de partículas, generalmente como se describe por Tomes, D. et al., IN: Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Eds. O.L. Gamborg and G.C. Phillips, Capítulo 8, pgs. 197-213 (1995) y como se delinea en forma breve posteriormente. Los vegetales de maíz transgénico se producen por bombardeo de embriones inmaduros embriogénicamente responsivos con partículas de tungsteno asociadas con plásmidos de ADN. Los plásmidos comprenden un gen marcador seleccionable y un gen estructural de interés . Preparación de Partículas: Se agregan quince mg de partículas de tungsteno (General Electric) , 0.5 a 1.8 µ, de preferencia 1 a 1.8 µ, y de mayor preferencia 1 µ, a 2 ml de ácido nítrico concentrado. Esta suspensión se sometió a sonicación a 0°C durante 20 minutos (Branson Sonifier Model 450, 40% de salida, ciclo de trabajo constante) . Las partículas de tungsteno se granulan por centrifugación a 10000 rpm (Biofuge) durante un minuto, y se elimina el sobrenadante. Dos mililitros de agua destilada estéril se agregan al granulo, y se usa sonicación breve para resuspender las partículas. La suspensión se granula, se agrega un mililitro de etanol absoluto al granulo, y se usa sonicación breve para resuspender las partículas. El lavado, granulado y resuspendido de las partículas se realiza dos veces con agua destilada estéril, y finalmente las partículas se resuspenden en dos mililitros de agua destilada estéril. Las partículas ..... ,J.,j>,„t^j^»i?a Mfc^.j» i^>ffi^e^.Aii?a§ se subdividen en alícuotas de 250-ml y se almacenan congeladas . Preparación de la Asociación de Partícula-ADN Plásmido: La existencia de partículas de tungsteno se somete a sonicación brevemente en un sonicador de baño de agua (Branson Sonifier Model 450, 20% de salida, ciclo de trabajo constante) y se transfieren 50 ml a un tubo del microcentrífuga. Todos los vectores fueron cis: que es el marcador seleccionable y el gen de interés estaban en el mismo plásmido. Estos vectores se transformaron después sencillamente o en combinación. Se agregó ADN plásmido a las partículas para una cantidad de ADN final de 0.1 a 10 µig en 10 µL de volumen total, y se sometió a sonicación brevemente. De preferencia, se usa 10 µg (1 µg/µL en un regulador de TE) de ADN total para mezclar el ADN y las partículas para el bombardeo. Se agregan cincuenta microlitros (50 µL) de CaCl-, de 2.5 M acuoso estéril y la mezcla se somete a sonicación brevemente y se agita con remolinos. Se agregan veinte microlitros (20 µL) de espermidina 0.1 M acuoso estéril y la mezcla se somete a sonicación brevemente y se agita con remolino. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos con sonicación breve intermitente. La suspensión de partículas se centrifuga, y los sobrenadantes se eliminan. Se agregan doscientos cincuenta microlitros (250 µL) de etanol absoluto al granulo, seguido por sonicación breve. La suspensión se granula, el sobrenadante se eliman, y se agregan 60 ml de etanol absoluto. La suspensión se somete a sonicación brevemente antes de cargar la aglomeración de partículas-ADN sobre macroportadores . Preparación de Tejido: Embriones inmaduros de maíz de la variedad Tipo Alto II son el objetivo para la transformación mediada con bombardeo de partículas. Este genotipo es el F, de dos líneas genéticas de raza pura, los parientes A y B, derivados de la cruza de dos congénitod de maíz conocidos, A188 y B73. Se seleccionan ambos parientes por alta competencia de embriogénesis somática, de acuerdo a Armstrong et al . , Maize Genetics Coop. News 65:92 (1991) . Las mazorcas de los vegetales F,_ son uniformes o pertenecientes, los embriones se disecan asépticamente a partir de caryopses cuando el esculeto se vuelve primero opaco. Esta etapa ocurre aproximadamente 9-13 días después de la polinación, y en forma más general de aproximadamente 10 días después de la polinación, dependiendo de las condiciones del cultivo. Los embriones son de aproximadamente 0.75 a 1.5 milímitros de largo. Las mazorcas se esterilizan de la superficie con 20-50% de Clorox durante 30 minutos, seguido por tres lavados con agua destilada estéril. Los embriones inmaduros se cultivan con el escutelio orientado hacia arriba, en un medio de inducción embriogénico comprendido de sales básales N6 , vitaminas de Eriksson, 0.5 mg/l de clorhidrato de tiamina HCl, 30 gm/1 de sacarosa, 2.88 gm/1 L-prolma, 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 2 gm/1 de Gelrite, y 8.5 mg/l de AgNO, . Chu et al . , Sci. Sin. 18:659 (1975); Eriksson, Physiol. Plant 18:976 (1965) . El medio se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos y se dispensa en placas de Petri de 10 X 25 mm. El AgN03 se filtra - se esteriliza y se agrega al medio después de esterilizarse en autoclave. Los tejidos se cultivan en completa obscuridad a 28°C. Después de aproximadamente 3 a 7 días, de manera más normal aproximadamente 4 días, el escutelio de los embriones se hincha hasta aproximadamente el doble de su tamaño original y las protuberancias en la superficie coleorhizal del escutelio indica la incepción del tejido embriogénico. Hasta 100% de los embriones muestran esta respuesta, pero más comúnmente, la frecuencia de respuesta embriogénica es aproximadamente 80%. Cuando se observa la respuesta embriogénica, los embriones se transfieren a un medio comprendido de medio de inducción modificado para contener 120 gm/1 de sacarosa. Los embriones se orientan con el polo coleorhizal, el tejido embriogénícamente responsivo, hacia arriba del medio de cultivo. Se ubican diez embriones por caja de Petri en el .... A..A. _ i IÍIÜÉÉMÍBÉI. ? fM¿j„ ,. .. - ijjÉmMtéiii?i 'i i ^fff""»-^ «*• A * - centro de una caja de Petri en un área de aproximadamente 2 cm de diámetro. Los embriones se mantienen en este medio durante 3-16 horas, de preferencia 4 horas, en oscuridad completa a 28°C justo antes del bombardeo con partículas asociadas con los ADN plásmidos que contienen el gen marcador seleccionable y el gen o genes estructurales de interés. Para efectuar el bombardeo de partículas de los embriones, los aglomerados de partículas-ADN se aceleran usando un dispositivo de aceleración de partículas DuPont PDS-1000. La aglomeración de partículas-ADN se somete a sonicación brevemente y se depositaron 10 ml sobre macro portadores y el etanol se dejó evaporar. El macroportador se acelera sobre una malla para detener de acero inoxidable por la ruptura de un diafragma polimérico (disco de ruptura) . La ruptura se efectúa por helio presurizado. La velocidad de la aceleración de partícula-ADN se determina con base en la presión de rompimiento del disco de rupturas . Se usan presiones del disco de ruptura de 200 a 1800 psi, prefiriéndose 650 a 1100 psi, y siendo más altamente preferido aproximadamente 900 psi. Se usan discos múltiples para efectuar un rango de presiones de ruptura. La repisa que contiene la placa con los embriones se coloca 5.1 cm por abajo del fondo de la plataforma macroportadora (repisa #3) . Para efectuar el bombardeo de partículas de los embriones inmaduros cultivados, se instala 00 en el dispositivo un disco de ruptura y un macro portador con aglomerados secos de partículas-ADN. La presión de He suministrada al dispositivo se ajusta a 200 psi por arriba de la presión de rompimiento del disco de ruptura. Una caja de Petri con los embriones objetive se colocan dentro de la cámara de vacío y se ubican en la ruta proyectada de las partículas aceleradas. Se crea un vacío en la cámara, de preferencia aproximadamente 28 en Hg . Después de la operación del dispositivo, se libera el vacío y se remueve la caja de Petri. Los embriones bombardeados permanecen sobre medios osmóticamente ajustados durante el bombardeo, y 1 a 4 días subsecuentemente. Los embriones se transfieren a un medio de selección comprendido de sales básales N6 , vitaminas de Eriksson, 0.5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 30 gm/1 de sacarosa, 1 mg/l de ácido 2 , 4-diclorofenoxíacético, 2 gm/1 de Gelrite, 0.85 mg/l de AgN03 y 3 mg/l de bialaphos (Herbiace, Meiji) . Se agrega Bialaphos esterilizado por filtro. Los embriones se subcultivan en un medio de selección reciente a intervalos de 10 a 14 días. Después de aproximadamente 7 semanas, el tejido embriogénico, putativamente transformado para el gen marcador seleccionable y un gen o genes estructurales de interés, prolifera de aproximadamente 7% de los embriones bombardeados. El tejido transgénico putativo se rescata, y eí tejido derivado de embriones individuales se ^H ^ '—*- '^tul *- •-^ •*• ? ? * •*—*i"** considera que es un evento y se propaga independientemente en un medio de selección. Dos ciclos de propagación clonal se logran por selección visual para los fragmentos contiguos más pequeños del tejido embriogénico organizado. Se procesa una muestra de tejido de cada evento para recuperar ADN. El ADN se restringe con una endonucleasa de restricción y se sondea con las secuencias cebadoras diseñadas para amplificar las secuencias de ADN que empalman al menos una porción de la región sintética de elemento promotor multimérico. El tejido embriogénico con secuencia amplificable se adelanta a la regeneración vegetal . Para la regeneración de vegetales transgénicos, el tejido embriogénico se subcultiva en un medio que comprende sales y vitaminas MS (Murashige & Skoog, Physiol . Plant 15: 473 (1962)), 100 mg/l mio-inositol, 60 gm/1 de sacarosa, 3 gm/1 de Gelrite, 0.5 mg/l de zeatina, 1 mg/l de ácido indol-3-acético, 26.4 ng/1 de ácido cis-trans-abscisico, y 3 mg/l en bialaphos en 100 X 25 mm en cajas de Petp, y se incuba en la oscuridad a 28°C hasta que puede verse el desarrollo de embriones somáticos maduros bien formados. Esto requiere aproximadamente 14 días. Los embriones somáticos bien formados son opacos y de color crema, y están comprendidos de un escutelio y coleoptilo identificables. Los embriones se subcultivan individualmente en un medio de germinación que comprende sales y vitaminas de MS , 100 mg/l de io-inositol , 40 gm/1 de sacarosa y 1.5 gm/1 de Gelrite en cajas de Petri de 100 X 25 mm y se incuba bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de obscuridad y 40 meinsteinsrrf seg"1 de tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, los embriones somáticos han germinado y han producido un brote y raíz bien definidos. Los vegetales individuales se subcultivan en medio de germinación en tubos de vidrio de 125 X 25 mm para permitir el desarrollo adicional del vegetal. Los vegetales se mantienen bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de obscuridad y 40 meinsteinsrrf2seg-1 de tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, los vegetales están bien establecidos y se transplantan en suelo de horticultura, se endurecen y se ponen en macetas en una mezcla de suelo de invernadero comercial y se cultivan hasta madurez sexual en un invernadero. Se usa una línea congénita de élite como un macho para polinizar los vegetales transgénicos regenerados. Transformación mediada por Agrobacterium: Como una alternativa preferida al bombardeo de partículas, los vegetales se transforman usando la transformación mediada por Agrobacterium. Para construir vectores transgénicos para esta transformación, los promotores sintéticos contenidos en los vectores de prueba transiente (Ejemplo 3) se transfirieron a vectores transgénicos por digestión de restricción apropiada y ga ligadura. Los fragmentos promotores aislados a partir de derivados del vector Pl transiente más-intron Adhl y de derivados del vector P2 transiente menos-intron Adhl se ligaron dentro de la estructura principal del vector P3 transgénico (GUS :: Pinll/2XCaMV35S :: O ':: Adhl intron :: BAR :: Pinll) corriente arriba de la secuencia reportero GUS. La estructura principal del vector P3 se preparó por digestión del vector P3 para eliminar el promotor de ubiquitina (UBI), 5'UTR, y UBI intron. Estos vectores transgénicos intermedios resultantes se introdujeron dentro de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por apareamientos triparentales para generar vectores "super binarios". Se usa Agrobaterium tumefaciens LBA4404 que alberga el vector super binario para transformar el maíz. Para la transformación mediada por Agrobacterium se emplea el método de Zhao (publicación de patente PCT W098/32326, los contenidos de la cual se incorporan en la presente para referencia) . Brevemente, se aislan embriones inmaduros a partir de maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium (paso 1: el paso de infección) . En este paso, los embriones inmaduros se sumergen de preferencia en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones se cocultivan durante un tiempo con el Agrobacterium (paso 2 : el paso de cocultivación) . De preferencia los embriones inmaduros se cultivan en un medie sólido después del paso de infección. Después de este periodo de cocultivación se contempla un paso de "descansar" opcional. En este paso de descansar, ios embriones se incuban en la presencia de al menos un antibiótico que se conoce que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes vegetales (paso 3 : paso de descansar) . De preferencia los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de descansar de las células infectadas. Después, los embriones inoculados se cultivan en un medio que contiene a un agente selectivo y se recupera el callo transformado cultivado (paso 4 : el paso de selección) . De preferencia, los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con un agente selectivo que resulta en el cultivo selectivo de las células transformadas. El callo se regenera después en vegetales (paso 5 : el paso de regeneración) y de preferencia los callos cultivados en un medio selectivo se cultivan en un medio sólido para regenerar los vegetales. Se observan los vegetales regenerados y se cuenta la actividad del gen de interés. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionada en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica al cual pertenece esta invención. Todas las pulolicaciones y solicitudes de patente -*• '" —-**M»M««**»"-• -** **»•" - ^ .—.¿fanf se incorporan en la presente para referencia en el mismo arado como si cada publicación o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada para referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será obvio que pueden practicarse algunos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas .

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LISTA DE SECUENCIA <110> Pioneer Hi-Bred International, Ine <120> PROMOTORES VEGETALES NOVEDOSOS Y MÉTODOS DE USO <130> 1165-PCT <150> US 60/177,437 <151> 2000-01-21 <160> 72 <170> FastSEQ for Windows Versión 3 0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Tpticu aestivura <400> 1 tgccggacac gtggcgcga 19 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Zea maye <400> 2 ttegagaaga acegagaegt ggcgggc 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Zea raays <400> 3 gcgctcgcgc cacgtgggca tgccgcc 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA 213> Zea mays <400> 4 ggttgtcaca tgtgtaaagg tgaag 25 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Zea mays <400=> 5 gatcatgeat gtcattccac gtagataa 28 <210> 6 <211> 20 212> DNA <213> Cauliflower raoeaic virus VA - <400> 6 gtggattgat gtgatatctc 20 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Cauliflower mosaic virus <400> 7 tccactgacg taagggatga cgcacaat 28 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Agrobacterium <400> 8 tgacgtaagc gcttacgtca 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 9 gactaatggc ggctcttatc tcac 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Glycine max <400> 10 gccctcgtgt ctcctcaata agcta 25 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Glycine max <400> 11 gcaatccttt gtctcaataa gttccac 27 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Glycine max <400> 12 aagggagaca acttgtctcc ca 22 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Pisum sativum <400> 13 atcttgtgtg gttaatatgg ctgc 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Arabidopsis thajßitapa <400> 14 cttcatcttc ttcctccacc aaacg 25 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 15 atttcatggc cgacctgctt ttt 23 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Glycine max <400> 16 agaagcttcc agaagcttct agaag 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA < 13> Zea mays <400> 17 atgcacgaat tgaccattcc 20 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Petroselinum crispum <400> 18 cataagagcc gccactaaaa taagaccg 28 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 19 ggccacgtca ccaatccgcg 20 <210> 20 <:211> 30 <212> DNA <213> Zea mays <400> 20 cgggtcagtg tacctaccaa ccttaaacac 30 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Zea mays <400> 21 cgtctaactg cgactggcag gtgcgcac 28 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Petroselinum crispum <400> 22 atccggtggc cgtccctcca acctaacct 29 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Rice tungro bacilliform virus <400> 23 ccagtgtgcc cctgg 15 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 24 taggttaatt attggcggta atta 24 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 aaacggtaaa aaagcggtag attacc 26 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Avena sativa <400> 26 gaaatagcaa atgttaaaaa ta 22 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Glycine max <400> 27 aaaaataata ttaatattat attgaaa 27 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 28 ataagcttta ccattaatgg taaagcttgg 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA jj^^^kj. <213> Arabidopsis thaliana <400> 29 caatactttc catttttagt aactaagctt 30 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 30 ggtatcgttg accgagttga ct 22 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Petunia hybrida <400> 31 ttgacagtgt cacttgacag tgtcac 26 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Zea mays <400> 32 gatcaaaaaa gtgagatc 18 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Petroselinum crispum <400> 33 attcaatagt gtgctaattg tttaagagtt g 31 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 34 tgccattgcc accggccccc ca 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Glycine max <400> 35 agcagacatg gtaggcagtg ca 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Phaseolus vulgarie <400> 36 tcacctaccc tacttcctat cc 22 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 37 aatcgtcatg aatgaagtca tgtgacggct 30 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 38 aggggcagct tcgacctcct tctcc 25 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eynthetic <400> 39 tcagaacacg caagttgcca gctcacccaa c 31 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Zea mays «:400> 40 agatatgcat gatctttaac 20 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Zea maye <400> 41 tgcggtttct tttggcacaa atggcatga 29 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Zea mays <400> 42 aaatctacct ccaaccaacc cagctttgta 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Zea mays <400> 43 atcacaccaa cttatcacct agaaaagcga 30 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Glycine max <400> 44 ccttttgtct cccttttgtc te 22 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 45 cgaggtgggc ccgtaggtgg gcccgtat 28 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Petroselinum crispum <400> 46 taccttttta cccttcatgt cate 24 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213-» Pisum sativum <400> 47 gtcgacaaaa gttaggttag caggc 25 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 48 ggccgataac aaactccggc c 21 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 49 ttttattccc aacaatagaa agtcttg 27 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 50 gatttggtca gaaagtcagt cc 22 <210> 51 <211> 31 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 51 gtagtgccac caaacacaac ataccaaatt a 31 <210> 52 <211> 21 - f-*» *f - *HM--4?J??»mr * •*'!T*fffc*B^*J*>tfr^t^*•-**- "^ ' <212> DNA <213> Brassica napus <400> 52 gatcccacat acacatacac g 21 <210> S3 <211> 27 <212> DNA <213> Helianthus annuus <400> 53 cagctccaaa tggtgatctt ctcctgg 27 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Helianthus annuus <400> 54 tatacagatg tagcatgtct 20 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Zea mays <400> 55 ttgacgtgta aagtaaattt acaac 25 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Pisum sativum <400> 56 gacacgtaga atgagtcatc ac 22 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Zea mays <400> 57 gtccctctcc cgtcccagag aaaccc 26 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 58 tgtcccccaa cggtcttatt 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Arabidopeis thaliana <400> 59 atatcatacc gacatcagtt 20 A— ^^i-L texj <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 60 atatactacc gacatgagtt 20 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 61 gataaagatt acttcagata taacaaacgt t 31 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 62 ttcccctagc tagatacttc att 23 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Pisum sativum <400> 63 cgattattga gatatataat aaattag 27 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 64 cgaaaacata cgcgcgaaat t 21 <210> 65 <211> 413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 65 taggttaatt tattgggcgg taattatagc ttcgagaaga accgagacgt ggcgggctag 60 cttcgagaag aaccgagacg tggcgggcta gctaggttaa ttattggcgg gtaattatag 120 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatt agctaggtta attattggcg ataattatag 180 ctaggttaat tattggcggt aattatagca tatcataccg acatcagttt agctaggtta 240 attattggcg gtaattatag catatcatac cgacatcagt ttagcatatc ataccgacat 300 cagtttagct ccactgacgt aagggatgac gcacaattag catatcatac cgacatcagt 360 ttagcatatc ataccgacat cagtttagct tcgagaagaa ccgagacgtg gcg 413 <210> 66 <211> 392 <212> DNA <213> Artificial Sequence 10 H¿ * <220> «:223> synthetic <:400: > 66 gctaaactga tgtcggtatg atatgctagc ccgccacgtc tcggttcttc tcgaagctaa 60 actgatgtcg gtatgatatg ctaattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg agctagcccg 120 ccacgtctcg gttcttctcg aagctaaact gatgtcggta tgatatgcta taattaccgc 180 caataattaa cctagctaat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagcta aactgatgtc 240 ggtagatatg ctaatacggg cccacctacg ggcccacctc ggctaatacg ggcccaccta 300 cgggcccacc tcggctaaac tgatgtcggt atgatatgct aattgtgcgt catcccttac 360 gtcagtggag ctaaactgat gtcggtatga ta 392 <210> 67 <211> 314 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 67 tagcatatca taccgacatc agtttagcat atcataccga catcagttta gctccactga 60 cgtaagggat gacgcacaat tagccgaggt gggcccgtag gtgggcccgt attagcttcg 120 agaagaaccg agacgtggcg ggctagccga ggtgggcccg taggtgggcc cgtattagct 180 tcgagaagaa ctgagacgtg gcgggctagc atatcatacc gacatcagtt tagctaggtt 240 aattattggc ggtaattata gctaggttaa ttattggcgg taattatagc ttcgagaaga 300 accgaggacg tggc 314 <210> 68 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 68 tagcttcgag aagacgtggc gggccgccac gtctcggttc ttctcgaagc tataattacc 60 gccaataatt aacctagcta taattaccgc caataattaa cctagctata attaccgcca 120 ataattaacc tagctaaact gatgtcggta tgatatgcta aactgatgtc ggtatgatat 180 gctaaactga tgtcggtatg atatgctaaa ctgatgtcgg tatgatatgc tagcccgcca 240 cgtctcggtt cttctcgaag ctaatacggg cccaccta 278 <210> 69 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eynthetic <400> 69 cgaggtgggc ccgtaggtgg gcccgtatta gctccactga cgtaagggat gacgcacaat 60 tagctaggtt aattattggc ggtaattata gctccactga cgtaagggat gacgcacaat 120 tagcatatca taccgacatc agtttagctc cactgacgta agggatgacg cacaattagc 180 tccactgacg taagggatga cgcacaatta gccgaggtgg gcccgtaggt gggcccgtat 240 tccactgacg taagggatga cgcacaatta gccgaggtgg gcccgaggtg ggcccgtatt 300 agcatatcat accgacatca gtttagcttc gagaagaacc gagtcgag 348 <210> 70 <211> 198 <212> DNA ^f f^f**4--*^ --^"..-fft 'f 11 <213> Artificial Seguence <220> <223> synthetic <400> 70 taaactgatg tcggtatgat aatgccaacc cggcaacgtc ccggttcttc tcgaagctat 60 aattaccgcc aataattaac ctagctaaac tgatgtcggt atgatatgct aattgtgcgt 120 catcccttac gtcagtggag ctaattgtgc gtcatccctt acgtcagtegg agctccactg 180 aacgtaaggg atgacgtc 198 <210> 71 <211> 302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 71 ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagta attaccgcca ataattaacc tagctaaact 60 gatgtcggta tgatatgcta aactgatgtc ggtatgatat gctagcccgc cacgtctcgg 120 ttcttctcga agctaatacg ggcccaccta cgggcccacc tcggctaaac tgatgtcggt 180 atgatatgct aatacgggcc cacctacggg cccacctcgg ctagcccgcc acgtctcggt 240 tcttctcgaa gctaaactga tgtcggtatg atatgctaaa ctgatgtcgg tatgatatgc 300 ta 302 <210> 72 <211> 157 <212> DNA <213> Artificial Seguence <220> <223> synthetic <400> 72 gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagcttc gagaagaacc gagacgtggc gggctagcta 60 ggttaattat tggcggtaat tatagctcca ctgacgtaag agcttcgaga agaaccgaga 120 cgtggcgggc tagcatatca taccgacatc agtttag 157

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES 1. Un promotor vegetal caracterizado porque comprende al menos una región sintética de elemento promotor multimérico que tiene una secuencia de nucleócidos seleccionada a partir del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótidos que comprende seis DRE1 (SEC. DE IDENT. NO.: 59), dos ABRE1 (SEC. DE IDENT . NO.: 2), tres As-1 (SEC. DE IDENT . NO.: 7), un GT-2 (SEC. DE IDENT. NO. : 24) , y dos PCNA HA (SEC. DE IDENT. NO. : 45) elementos promotores; b) una secuencia de nucleótidos que comprende tres DRE 1 (SEC. DE IDENT . NO.: 59), tres ABRE1 (SEC. DE IDENT. NO.: 2), uno As-1 (SEC. DE IDENT . NO.: 7), dos GT-2 (SEC. DE IDENT. NO.: 24), y dos PCNA HA (SEC. DE IDENT. NO.: 45) elementos promotores; c) una secuencia de nucleótidos que comprende cinco DRE 1 (SEC. DE IDENT . NO.: 59), tres ABRE1 (SEC. DE IDENT . NO.: 2), dos As-1 (SEC. DE IDENT . NO.: 7), y cinco GT-2 (SEC. DE IDENT. NO.: 24) elementos promotores; d) una secuencia de nucleótidos que comprende cuatro DRE 1 (SEC. DE IDENT. NO.: 59), tres ABRE1 (SEC. DE IDENT. NO.: 2), tres GT-2 (SEC. DE IDENT. NO.: 24), y un PCNA HA (SEC. DE IDENT. NO.: 45) elementos promotores; e) una secuencia de nucleótidos que comprende dos DRE 1 (SEC. DE IDENT. NO.: 59), un ABRE1 (SEC. DE IDENT . NO. : 73
2. 2), cinco As-1 (SEC. DE IDENT. NO.: 7), un GT-2 (SEC. DE IDENT\ NO. : 24) , y tres PCNA HA (SEC. DE IDENT. NO. : 45) elementos promotores; f) una secuencia de nucleótidos que comprende cinco DRE 1 (SEC. DE IDENT. NO.: 59), dos ABRE1 (SEC. DE IDENT. NO.: 2), un As-1 (SEC. DE IDENT. NO.: 7), un GT-2 (SEC. DE IDENT. NO.: 24), y dos PCNA HA (SEC. DE IDENT. NO.: 45) elementos promotores; g) una secuencia de nucleótidos que comprende un DRE 1 (SEC. DE IDENT. NO.: 59), dos ABRE1 (SEC. DE IDENT. NO.: 2), dos As-1 (SEC. DE IDENT. NO.: 7), y un GT-2 (SEC. DE IDENT. NO.: 24) elementos promotores; h) una secuencia de nucleótidos que comprende dos DRE 1, un ABRE1 (SEC. DE IDENT. NO.: 2), tres As-1 (SEC. DE IDENT. NO.: 7), y un GT-2 (SEC. DE IDENT . NO.: 24) elementos promotores; y i) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas o cualquiera de las secuencias de nucleótidos de a) , b) , c) , d) , e) , f ) , g) , y h) . 2. El promotor vegetal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos una región sintética de elemento promotor multimépco que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste de : (a) una secuencia de nucleótidos que comprende i i litÉf- • 74 elementos promotores, DREl, ABREl, DREl, As-1, ABREl, DREl, GT-2, As-1, DREl, PCNA HA, PCNA HA, DREl, As-1, y DREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 66); (b) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, DREl, DREl, As-1, PCNA HA, ABREl, PCNA HA, ABREl, DREl, GT-2, GT-2, y ABREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO. : 67) ; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, GT-2, ABREl, ABREl, GT-2, As-1, GT-2, GT-2, DREl, GT-2, DREl, DREl, As-1, DREl, DREl, y ABREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO. : 65) ; (d) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, ABREl, ABREl, GT-2, GT-2 , GT-2, DREl, DREl, DREl, DREl, ABREl, y PCNA HA secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO. : 68) ; (e) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, PCNA HA, As-1, GT-2, As-1, DREl, As-1, As-1, PCNA HA, As-1, PCNA HA, DREl, y ABREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 69); (f) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, As-1, GT-2, DREl, DREl, ABREl, PCNA HA, DREl, PCNA HA, ABREl, DREl, y DREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 71); (g) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, As-1, ABREl, GT-2, As-1, ABREl, y DREl , ¡^ ??..? .¡ 75 secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 72); , h) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, DREl, ABREl, GT-2, DREl, As-1, As-1, y As-1 secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO. : 70) ; (i) una secuencia de nucleótidos indicada en las Figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 (las SEC. DE IDENT. NOS. : 65-72) ; (j) una secuencia de nucleótidos que comprende una variante de una secuencia de nucleótidos indicada en las Figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 (las SEC. DE IDENT. NOS. : 65-72) ; y (k) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas a una secuencia de nucleótidos de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) , (h) , (i) , o (j) . 3. El gen quimérico caracterizado porque comprende el promotor de conformidad con la reivindicación 2, enlazado operablemente a una secuencia de codificación. 4. El cassette de expresión caracterizado porque comprende el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 3. 5. Un vector de transformación caracterizado porque comprende el cassette de expresión de conformidad con la reivindicación 4. 6. El vegetal establemente transformado con el vector de • transformación de conformidad con la reivindicación 7o 5. 7. Un vegetal, o sus partes, que tiene establemente incorporado dentro de su genoma una construcción de ADN caracterizado porque comprende un promotor vegetal enlazado operablemente a una secuencia de codificación, comprendiendo el promotor vegetal al menos una región sintética de elemento promotor multimérico (SMPER) que mejora la expresión de la secuencia de codificación. 8. Un vegetal, o sus partes, que tiene establemente incorporado dentro de su genoma una construcción de ADN caracterizado porque comprende un promotor vegetal enlazado operablemente a una secuencia de codificación, comprendiendo el promotor vegetal al menos una región sintética de elemento promotor multimérico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, DREl, ABREl, DREl, As-1, ABREl, DREl, GT-2, As-1, DREl, PCNA HA, PCNA HA, DREl, As-1, y DREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 66); (b) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, DREl, DREl, As-1, PCNA HA, ABREl, PCNA HA, ABREl, DREl, GT-2, GT-2 , y ABREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO. : 67) ; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, GT-2, ABREl, ABREl, GT-2, As-1, GT-2, 77 GT-2, DREl, GT-2, DREl, DREl, As-1, DREl, DREl, y ABREl secuencialmente (SEC. DE IDENT . NO . : 65) ; (d) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, ABREl, ABREl, GT-2, GT-2, GT-2, DREl, DREl, DREl, DREl, ABREl, y PCNA HA secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO. : 68) ; (e) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, PCNA HA, As-1, GT-2, As-1, DREl, As-1, As-1, PCNA HA, As-1, PCNA HA, DREl, y ABREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO. : 69) ; (f) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, As-1, GT-2, DREl, DREl, ABREl, PCNA HA, DREl, PCNA HA, ABREl, DREl, y DREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 71); (g) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, As-1, ABREl, GT-2, As-1, ABREl, y DREl secuencialmente (SEC. DE IDENT . NO . : 72) ; (h) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, DREl, ABREl, GT-2, DREl, As-1, As-1, y As-1 secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO . : 70) ; (i) una secuencia de nucleótidos indicada en las Figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ó 14 (las SEC. DE IDENT. NOS. : 65-72) ; j) una secuencia de nucleótidos que comprende una variante de una secuencia de nucleótidos indicada en las ?&já?kteJüfc^^í ^ fjt ^ 78 Figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ó 14 (las SEC. DE IDENT. NOS. : 65-72) ; y (k) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas a una secuencia de nucleótidos de (a), (b) , (c) , (d) , (e) , (f), (g) , (h) , (i), o (j). 9. El vegetal de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el vegetal es una dicotiledónea. 10. El vegetal de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el vegetal es una monocotiledónea. 11. El vegetal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la monocotiledónea es maíz. 12. Una célula vegetal que tiene establemente incorporado dentro de su genoma una construcción de ADN caracterizado porque comprende un promotor vegetal enlazado operablemente a una secuencia de codificación, comprendiendo el promotor vegetal al menos una región sintética de elemento promotor multimérico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionado a partir del grupo que consiste de : (a) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, DREl, ABREl, DREl, As-1, ABREl, DREl, GT-2, As-1, DREl, PCNA HA, PCNA HA, DREl, As-1, y DREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 66); (b) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, DREl, DREl, As-1, PCNA HA, ABREl, PCNA HA, ABREl, DREl, GT-2, GT-2, y ABREl secuencialmente (SEC. 79 DE IDENT. NO. : 67) ; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, GT-2, ABREl, ABREl, GT-2, As-1, GT-2, GT-2, DREl, GT-2, DREl, DREl, As-1, DREl, DREl, y ABREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO . : 65) ; (d) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, ABREl, ABREl, GT-2, GT-2, GT-2, DREl, DREl, DREl, DREl, ABREl, y PCNA HA secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO. : 68) ; (e) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, PCNA HA, As-1, GT-2, As-1, DREl, As-1, As-1, PCNA HA, As-1, PCNA HA, DREl, y ABREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 69); (f) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, As-1, GT-2, DREl, DREl, ABREl, PCNA HA, DREl, PCNA HA, ABREl, DREl, y DREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO.: 71); (g) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, As-1, ABREl, GT-2, As-1, ABREl, y DREl secuencialmente (SEC. DE IDENT. NO . : 72) ; (h) una secuencia de nucleótidos que comprende elementos promotores, DREl, ABREl, GT-2, DREl, As-1, As-1, y As-1 secuencialmente (SEC. DE IDENT . NO.: 70); (i) una secuencia de nucleótidos indicada en las Figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ó 14 (las SEC. DE IDENT. 80 NOS. : 65-72) ; (j) una secuencia de nucleótidos que comprende una variante de una secuencia de nucleótidos indicada en las Figuras 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 (las SEC. DE IDENT. NOS. : 65-72) ; y (k) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas a una secuencia de nucleótidos de (a), (b) , (c) , (d) , (e), (f), (g) , (h) , (i), o (j) . 13. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula vegetal es de un vegetal dicotiledóneo. 14. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula vegetal es de un vegetal monocotiledóneo . 15. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el vegetal monocotiledóneo es un vegetal de maíz. 16. El método por expresar constitutivamente una secuencia heteróloga de nucleótidos en un vegetal caracterizado porque comprende el método de: i) transformar una célula vegetal con un vector de transformación que comprende un cassette de expresión, comprendiendo el cassette de expresión un promotor vegetal enlazado operablemente a una secuencia de codificación, comprendiendo el promotor vegetal una región sintética de •* •"*- elemento promotor multimérico seleccionada a partir del grupo que consiste de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f ) , (g) , (h) , (i) , v ) , y (k) de conformidad con la reivindicación 1; y 11 ) regenerar un vegetal establemente transformado a partir de la célula transformada, teniendo el vegetal establemente incorporado dentro de su genoma el cassette de expresión . 17. Un método para seleccionar elementos promotores activos en un tejido de interés, caracterizado porque comprende a) aislar o sintetizar oligonucleótidos que representan elementos promotores conocidos o putativos o sitios de enlace del factor de transcripción; b) marcar los oligonucleótidos; c) reunir los oligonucleótidos para crear una disposición que facilite la selección; d) hibridizar los oligonucleótidos con extractos nucleares del tejido de interés; y e) seleccionar aquellos oligonucleótidos que presentan enlace preferencial a los extractos nucleares. 18. Un método para crear regiones sintéticas de elemento promotor multimérico activas en un tejido de interés, caracterizado porque comprende a) seleccionar elementos promotores conocidos o putativos o sitios de enlace del factor de transcripción que i¿¿ ti i ¡huí ti rtfftiiitrrri y- >•»*****-- 4ti t? Ld presenten enlace preferencial al extracto nuclear preparado a partir del tejido de interés; b) combinar los oligonucleótidos seleccionados en disposiciones novedosas que abarcan la variación en número de copias, orden secuencial, orientación, y regiones espadadoras; y c) probar las disposiciones novedosas por su efecto en la transcripción y seleccionar aquellas que demuestran mejora o supresión de la expresión del gen enlazado.