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TWI865152B - 熱力學水解之羽毛角蛋白水解胜肽液用於提昇小麥抗乾旱逆境之用途 - Google Patents

熱力學水解之羽毛角蛋白水解胜肽液用於提昇小麥抗乾旱逆境之用途 Download PDF

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TWI865152B TW112142536A TW112142536A TWI865152B TW I865152 B TWI865152 B TW I865152B TW 112142536 A TW112142536 A TW 112142536A TW 112142536 A TW112142536 A TW 112142536A TW I865152 B TWI865152 B TW I865152B
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Abstract

本發明係關於一種利用經熱力學水解羽毛所得之水解羽毛角蛋白胜肽液用於提昇小麥抗乾旱逆境之方法，包含將羽毛角蛋白水解胜肽液施用於小麥的種苗期或苗期，降低乾旱逆境所造成的生長損害，據以促進小麥種苗及苗株於乾旱逆境下成長，進而改善小麥苗株地上部生物量。

Description

熱力學水解之羽毛角蛋白水解胜肽液用於提昇小麥抗乾旱逆境之用途
本發明係關於一種熱力學水解羽毛角蛋白產物用於提昇小麥於生長時抗逆境之用途，特別是關於一種利用熱力學水解之羽毛角蛋白水解胜肽液據以提昇小麥抵抗乾旱逆境之用途。
小麥(Triticum aestivum L.)屬於禾本科(Poaceae)，是三大穀物(玉米、稻米和小麥)之一，為廣泛種植於世界各地的植物，產量幾乎全作為食用，僅只有六分之一作為飼料使用。美國是全球小麥主要出口國之一，根據美國農業部(United States Department of Agriculture)資料顯示，小麥是美國生產前三大的農作物，然而全球氣候異常，乾旱日益嚴重造成水資源短缺，使農業生產力嚴重下降。根據美國國家乾旱監測中心的統計資料顯示，美國有超過四分之一的土地正面臨乾旱的脅迫。同時，美國農業部的世界農業產量(World Agricultural Production)通報指出，今年7至8月歐盟、加拿大和中國等小麥生產地受到偶發性乾旱和草原持續乾旱而減產，顯見全球小麥產量受到偶發性的乾旱影響已成為常態，全球乾旱平均造成21%的小麥產量損失，當全球氣溫升高1℃時，可能會導致全球小麥產 量減少4.1-6.4%，乾旱問題已經成為小麥生長發育面臨的主要非生物逆境挑戰。
植物生長過程對水分的需求最為敏感，輕微的水分脅迫就能使生長趨緩或停止，乾旱的環境足以影響小麥從種子發芽到苗期生長的各個層面，在乾旱脅迫下，不僅小麥的生長發育、光合作用、根莖葉等地上部分的生物量、根系增殖、根系的發展等均會產生變化，葉面葉綠素含量以及各類生物酶，如過氧化物酶(peroxidase)等的含量及其活性也會受到不同程度的影響，如何降低非生物逆境對小麥生長發育所帶來的影響，已成為農業各界對於小麥抗乾旱逆境研究的熱點。
依此，專利公開號：CN113951262A，提出一種提高小麥抗逆潛力和災後恢復力的製劑及應用，所提提高小麥抗逆潛力和災後恢復力的製劑由以下幾種製劑依比例組合而成，包含：植物營養劑(複合氨基酸和鈣鹽)、植物生理活性物質(5-氨基乙醯丙酸或5-氨基乙醯丙酸鹽酸鹽)、植物生長調節劑(芸苔素內脂)、乙醇輔助劑加水等組成；據以提供小麥快速生長，有效增加葉綠素含量，促進光合作用，提高和激發植物對於抗低溫、抗乾旱、抗乾熱風等抗逆性抗逆能力。又，專利公開號：CN108849984A，提出一種小麥耐旱抗逆複合調節劑及其應用，其組成包括用於小麥種子處理的浸種誘導劑以及用於小麥葉面噴施的耐旱抗逆調節劑。其中，所述浸種誘導劑A包括甜菜鹼、果聚多糖、殼聚糖、油菜素內酯等組分；所述用於葉面噴施的耐旱抗逆調節劑B包含稀釋的上述誘導劑A溶液、葉面營養組分(磷酸鈣，磷酸二氫鉀，硝酸銨中的至少兩種)、輔助抗逆組分C(包括腐殖酸， 甘氨酸螯合物)、葉面噴施輔助組分(糖脂類生物表面活性劑，以及磺酸鈉作為木質素)；此前案技術提出複合型製劑，據以增強小麥抵禦乾旱以及其他脅迫例如低溫、弱光的能力，減緩逆境對小麥品質和產量的損失。再者，專利公開號第CN116121293A，提出一種以NRT2.1基因在提高作物抗乾旱和/或抗高溫性能中的應用，此前案提供了一種可調控作物對氮利用的基因NRT2.1，通過轉基因技術獲得NRT2.1基因表達植株，對該基因功能進行驗證，NRT2.1基因確實能顯著提高植株在乾旱或高溫脅迫條件下的生物量、產量和氮利用效率。
然，上述前案技術，無論以基因轉殖方式或以複方組成製劑，均有其複方製劑製程的複雜度與基因轉殖株無法適用於不同小麥品種、以及不同生長環境調適的困難等，均有其缺失。若能以最佳快速施作、最符合經濟成本與最環保的方式提昇小麥對乾旱逆境的抗性，提高小麥在乾旱逆境後的恢復能力，如此既能降低乾旱逆境所造成的生長損害，讓未來產量不受乾旱影響，讓農民獲得更高收益，乃為上選策略。
又，禽類羽毛中含有85-91%的角蛋白、13-15%有機氮、1.6-2%有機硫，高於任何其他生物材料，其中富含三種含硫胺基酸：胱胺酸、半胱胺酸和甲硫胺酸。由含硫胺基酸所組成的胜肽可啟動與作物之生理、發育、防禦以及風味物質累積相關的關鍵元素。目前，已有技術利用微生物發酵、酵素、化學或高溫高壓水解等方式，將羽毛分解為角蛋白、胜肽、胺基酸或其他水解產物，應用於飼料、肥料及培養基(葉瑞涵等人，畜產研究54(4)：259-272,2021)。
Nurdiawati等人曾於2019年發表，將羽毛與水混合後(混合比例1：3)，進行高溫高壓水解(反應條件：160℃、6.1kg/cm2或180℃、9.2kg/cm2，30min)，並將所成之羽毛水解液(含有氮與胺基酸)和家禽墊料水解液混合製成一種液態肥料，結果發現該液態肥料可促進廣藿香(Pogostemon cablin)及綠豆(Vigna radiata)的生長(Nurdiawati et al.,International Journal of Recycling of Organic Waste in Agriculture 8：221-232,2019)。又，刁春武等人於2016年發表關於以酸解羽毛粉作為外源添加蛋白，加入生物有機堆肥中，據以增殖固體發酵過程中的功能菌數量的增生，達到促進生物有機肥的使用(刁春武等人，酸解羽毛粉研製生物有機肥及其促生效果研究，土壤，48(4),661-667，2016)。然酸解羽毛製程以強鹼處理羽毛後再經酸鹼中和，雖然酸鹼處理法的流程較為簡便，但以此方法產製的羽毛粉，有腐蝕性酸鹼液操作危險、廢液必須處理、成品無法應用於有機農業及缺乏額外促進作物生長的物質等缺點。再者，目前已知另有利用微生物作為降解羽毛成羽毛粉之技術，其必須根據羽毛物種的不同，搭配適合的微生物種，且須進一步透過培養策略上的設計及優化，才能達到較佳的生產效率。目前所見，鮮少有將羽毛水解胜肽應用在作物栽培上，尤其是作為輔助植物對抗生長逆境的成功前例。
正瀚生技股份公司利用熱力學水解技術，在高壓下，利用溫度不超過200℃(即臨界溫度以下)的液態水作為水解溶劑，將羽毛(主要含角蛋白)進行不同參數組合的水解反應，每個組合都會產生大小不同的胜肽，再從中篩選出適用於作物、發揮不同健康作用的功能胜肽並研析具有系統 性調節作物健康功能的胜肽，開發出一種經熱力學水解之羽毛角蛋白水解胜肽液(Keratin Hydrolysate Peptides，以下簡稱為KHP)。
本發明透過實驗驗證，首先發現應用正瀚生技公司之熱力學水解的羽毛角蛋白水解胜肽液，可有效提高小麥種子萌芽出苗後，苗株遭受乾旱逆境後的恢復能力，改善受乾旱逆境影響之小麥的生長，並減輕乾旱所造成的苗株地上部生長損失，促進受乾旱逆境影響的小麥地上部和地下部生物量成長，更可強化其光合作用能力，降低乾旱逆境所造成的生長損害，達到提升小麥未來的結果與充實之功效。
依此，本發明一方面係關於一種利用經熱力學水解羽毛所得之羽毛角蛋白水解胜肽液用於提昇小麥抗乾旱逆境之方法，包含將一水解羽毛角蛋白胜肽液以預定倍數稀釋後，於小麥的播種期、苗期擇一施作於小麥。
於本發明之一些具體實施例，所述之羽毛角蛋白水解胜肽液係以50-1000之稀釋倍數澆灌施用於小麥，較佳實施例為50-500之稀釋倍數於小麥播種期、苗期擇一以澆灌方式或葉面噴施方式施用。
於本發明之一些具體實施例，所述該羽毛角蛋白水解胜肽液係利用熱力學水解技術，將羽毛在10-16kg/cm2之高壓下，以溫度不超過200℃的液態水作為水解溶劑，進行水解反應20-80分鐘所得的胜肽水溶液，其中所含之胜肽濃度係介於200,000~450,000ppm。
於本發明之一些具體實施例，所述該羽毛角蛋白水解胜肽液所含 之胜肽具有分子量500~4,000Da，包含5~30個胺基酸。
於本發明之一些具體實施例，所述之該羽毛角蛋白水解胜肽液係用於小麥在乾旱逆境下增加苗株葉綠素含量(SPAD)，提升小麥進行光合作用之能力，藉以促進生長。
於本發明之一些具體實施例，所述之該羽毛角蛋白水解胜肽液係用於小麥在乾旱逆境下促進提升小麥苗株之莖寬、葉長與分蘗數量。
圖1顯示於小麥苗期以羽毛角蛋白水解胜肽液噴施於小麥葉面，於乾旱逆境下，小麥地上部生長表現；圖1A為小麥苗株地上部乾重表現，圖1B為小麥苗株葉面葉綠素SPAD值。其中KHP-500X為羽毛角蛋白水解胜肽液以稀釋倍數500施作，對照組為以等量體積清水施作；每測試樣品處理重複數(n=15)，實驗組與對照組，進行t檢定(Student's t-test)分析：*p<0.05,***p<0.001。
圖2為乾旱逆境下以不同稀釋倍數的羽毛角蛋白水解胜肽液澆灌於小麥種苗，小麥地上部各項生長表現；圖2A為小麥苗株地上部莖寬，圖2B為小麥苗株地上部葉長，圖2C為小麥苗株地上部分蘗數值，圖2D為小麥地上部葉片生物量表現；正常組代表正常澆水，無乾旱環境下正常生長之小麥，KHP-100X為乾旱環境下以羽毛角蛋白水解胜肽液稀釋倍數100施作，KHP-100X為乾旱環境下以羽毛角蛋白水解胜肽液稀釋倍數50施作，對照組為乾旱環境下，與實驗組施作等量體積清水；每測試樣品處理重複 數(n=15)，實驗組與對照組，進行t檢定(Student's t-test)分析：*p<0.05,***p<0.001。
實施例1. 羽毛角蛋白水解胜肽液之製備及特性分析
本發明之羽毛角蛋白水解胜肽液(KHP)係得自正瀚生技公司(台灣)，其製造方法主要包括：利用熱力學水解技術，將羽毛(有或無加水，羽毛與水之比例為1：0~1：1.5)，於10-16kg/cm2之高壓下，利用不超過200℃(即熱力學溫度，較佳為150-200℃)的液態水作為水解溶劑，進行熱力學水解20-80分鐘，而產出不同胺基酸序列及長度的胜肽群。經過精選得到253種、具有分子量500-4,000Da的功能性胜肽，組成羽毛角蛋白水解胜肽液，該水解胜肽液其所含胜肽濃度係介於200,000~450,000ppm，表一所示為水解羽毛製程之實施參數例，本案發明乃以其中之一組水解參數所得之羽毛角蛋白水解胜肽液作為本案實施例(KHP)。
Figure 112142536-A0101-12-0007-1
實施例2. 羽毛角蛋白水解胜肽液促進小麥於苗期抗乾旱逆境
試驗作物與栽種條件：
取泥炭土和珍珠石混合之介質(福壽牌固根土)填充至黑色3.5吋長深軟盆，夯實並鋪平。選取小麥台中選2號(Triticum aestivum L.em Thell)籽粒外觀健康無受損之種子，播種於土表2公分深之介質中，各實驗盆播種3粒。酌量以清水潤濕土表，置於人工氣候室培養，生長溫度為25℃，日照16小時，夜晚8小時，光照度約35000 lux。
小麥苗期葉片噴施後乾旱逆境試驗：
試驗組施用以表一所示本案實施例羽毛角蛋白水解胜肽液KHP經水稀釋500倍(KHP-500X)，對照組僅以清水，於小麥苗株生長至第一分蘗階段(播種後15日)時，噴施於各組小麥苗株葉片，每盆施用量2ml。靜置待葉片吸收後，置於人工氣候室進行乾旱逆境試驗。各實驗組先停止供水8日，小麥植株呈現輕微萎凋狀態，再恢復供水3日。
恢復3日供水後，觀察並紀錄小麥性狀表現。選取完全展開之成熟葉片，以葉綠素測定儀(2900PDL,Spectrum Technologies)測量葉綠素SPAD(Soil-Plant Analysis Development)讀值，並收穫地上部進行分析，放置於大型熱風循環烘箱烘乾後以數位天平(AP224X,SHIMADAZU)秤取生物量，每個處理重複數(n=15)，進行Student's t-test分析。
圖1所見為小麥苗期受乾旱逆境下，以羽毛角蛋白水解胜肽液噴施小麥苗株葉面，地上部生物量生長表現，圖1A顯示，小麥苗株於乾旱逆境下地上部乾重相較對照組重，有顯著優異的表現(*p<0.05)；圖1B所見 小麥苗株在乾旱逆境的環境下，噴施羽毛角蛋白水解胜肽液，小麥苗株葉面所測得葉綠素SPAD值遠高於對照組(***p<0.001)，顯見小麥於苗期生長階段經葉片噴施羽毛胜肽羽毛角蛋白水解胜肽液，其苗株地上部生物量皆具有顯著的差異表現，能促進小麥苗株於乾旱逆境中生長發育，使小麥苗在經歷乾旱逆境後快速恢復生長，並緩解乾旱所帶來的傷害。
實施例3. 羽毛角蛋白水解胜肽液促進小麥於播種期抗乾旱逆境
試驗作物與栽種條件：
取泥炭土和珍珠石混合之介質(福壽牌固根土)填充至黑色3.5吋長深軟盆，夯實並鋪平。選取小麥台中選2號(Triticum aestivum L.em Thell)籽粒外觀健康無受損之種子，播種於土表2公分深之介質中，各實驗盆播種1粒。
小麥播種期乾旱逆境試驗
試驗組以表一之本案實施例羽毛角蛋白水解胜肽液KHP經水稀釋100倍為KHP-100X、稀釋50倍為KHP-50X施用；對照組與正常組僅施用以清水；各組於小麥播種育苗初期以澆灌方式施用，各盆施用量100ml後置於人工氣候室培養，生長溫度為25℃，日照16小時，夜晚8小時，光照度約35000 lux。試驗組與對照組進行斷水乾旱逆境處理15日後，恢復供水3日；正常組則正常澆水，無斷水乾旱逆境處裡。
觀察並紀錄恢復供水後之性狀表現。選取完全展開之成熟葉片，並收穫地上部材料進行分析，放置於大型熱風循環烘乾後以數位天平 (AP224X,SHIMADAZU)秤取各生物量表現。每個處理重複數(n=15)，進行Student's t-test分析。
圖2顯示在乾旱逆境下，於小麥播種期以澆灌方式，施用不同稀釋倍數的羽毛角蛋白水解胜肽液，小麥地上部各項生長表現；圖2A為小麥苗株地上部莖寬表現，圖2B為小麥苗株地上部葉長，圖2C為小麥苗株地上部分蘗數值，圖2D為小麥地上部葉片生物量表現；由圖2A-2D所見，相較對照組，小麥播種期間澆灌不同稀釋倍數的羽毛角蛋白水解胜肽液，均能緩解乾旱逆境造成的傷害，圖2A顯示使用KHP-50X、KHP-100X於小麥莖寬表現分別增加18%與35%；小麥地上部葉長表現分別增加7%與23%(圖2B)；小麥分蘗數量上也增加2%與69%(圖2C)；地上部葉片生物量表現分別增加13%與57%(圖2D)。由實驗結果顯見偶發性乾旱和持續乾旱逆境，羽毛角蛋白水解胜肽液能使小麥種苗在經歷乾旱逆境後快速恢復生長勢，並緩解乾旱所帶來的傷害。整體生物量的表現尤以稀釋50倍的KHP-50X為最佳(***p<0.001)，此結果表示，乾旱逆境下確實會致使小麥種苗與苗株的生長狀況變差(對照組)，但施用羽毛角蛋白水解胜肽液能減輕乾旱逆境造成的地上部生物量損害，促進小麥在乾旱逆境中生長發育。
綜上所述，水解羽毛角蛋白胜肽液可以提高小麥種苗於播種期、苗期遭受乾旱逆境後的恢復能力，減少乾旱逆境對苗株地上部生長之損害，同時改善受乾旱逆境影響的苗株葉綠素SPAD值，提升光合作用能力及作物生產力，據以降低乾旱逆境造成產量的損失。

Claims (7)

  1. 一種利用經熱力學水解羽毛所得之羽毛角蛋白水解胜肽液用於提昇小麥抗乾旱逆境之方法，包含將熱力學水解所得的一羽毛角蛋白水解胜肽液以50-1000之稀釋倍數稀釋後，於小麥的播種期、苗期擇一施作於小麥；該羽毛角蛋白水解胜肽液係將羽毛在10-16kg/cm2之高壓下，以溫度為150-200℃的液態水作為水解溶劑，進行水解反應所得的胜肽水溶液。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該羽毛角蛋白水解胜肽液係以100-500之稀釋倍數以葉面噴施方式施作於小麥苗期。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該羽毛角蛋白水解胜肽液係以50-500之稀釋倍數以澆灌方式施用於小麥播種期。
  4. 如請求項1所述之方法，其中，水解反應時間為20-80分鐘，該羽毛角蛋白水解胜肽液所含之胜肽濃度係介於200,000~450,000ppm。
  5. 如請求項1或4所述之方法，其中該羽毛角蛋白水解胜肽液所含之胜肽具有分子量500~4,000Da，包含5~30個胺基酸。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該羽毛角蛋白水解胜肽液係用於小麥在乾旱逆境下增加苗株葉綠素含量(SPAD)，提升小麥進行光合作用之能力，藉以促進生長。
  7. 如請求項1所述之方法，其中該羽毛角蛋白水解胜肽液係用於小麥在乾旱逆境下促進提升小麥苗株之莖寬、葉長與分蘗數量。
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