MX2012010479A

MX2012010479A - Moleculas polinucleotidicas para regulacion genetica en plantas.

Info

Publication number: MX2012010479A
Application number: MX2012010479A
Authority: MX
Inventors: Hong Liu; Paul C C Feng; Sergey I Ivashuta; Robert D Sammons; Dafu Wang; Andrei Y Kouranov; Scott E Andersen
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2010-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2012-10-09
Also published as: US11812738B2; EP2545182B1; US20140057789A1; AU2011224570A1; IL221709B; ZA201206683B; WO2011112570A1; EA201792402A2; EP3231872B1; JP2018134087A; CA2790211C; HK1177230A1; US9988634B2; MY163887A; KR101982126B1; ES2641642T3; CN102822350A; JP5925701B2; CN102822350B; US20140018241A1

Abstract

La presente invención proporciona moléculas polinucleótídicas y métodos para regular genes en plantas, por ejemplo, proporcionando ARN para la regulación sistémica de genes; varios aspectos de la invención proporcionan moléculas polinucleotidicas y métodos para regular genes y transgenes endógenos en una célula vegetal y moléculas polinucleotidicas.

Description

MOLÉCULAS POLINUCLEOTÍD1CAS PARA REGULACIÓN GENÉTICA EN PLANTAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS E INCORPORACIÓN DE LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de las solicitudes de patentes provisionales de los Estados Unidos 61/31 1 ,762, presentada el 8 de marzo de 2010, 61/349,807, presentada el 28 de mayo de 2010 y 61/381 ,556, presentada el 10 de septiembre de 2010, las cuales se incorporan a modo de referencia en su totalidad a la presente. El listado de secuencias que figura en el archivo denominado "38-21_56855_D.txt", el cual tiene 133 kilobytes (medidos en el sistema operativo MS-Windows) y se creó el 7 de marzo de 2011 , se presenta con la presente y se incorpora a la misma a modo de referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN En la presente se divulgan moléculas polinucleotídicas para regular genes en plantas y métodos para preparar y utilizar dichas moléculas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ineficacia de los herbicidas para controlar las malezas resistentes es un problema especialmente cuando dichas malezas crecen en campos de cultivos resistentes a herbicidas que pueden tener una resistencia a herbicidas más baja que la maleza. Las malezas resistentes a los herbicidas se identifican por una variedad de modos de acción. La resistencia que resulta de la selección de múltiples copias de genes que producen proteínas dirigidas al herbicida en amaranto se describe en Gaines et al. (2010) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 107(3): 1029-1034. La resistencia que resulta de mutaciones en genes que producen proteínas dirigidas a herbicidas en amor de hortelano, lechuga espinaca y ryegrás se describe en Baerson et al. (2002) Plant PhysioL, 129(3):1265-1275; Preston et al. (2006) Pesticide Biochem. PhysioL, 84(3):227-235; y Wakelin et al. (2006) Weed Res. (Oxford), 46(5):432-440. El secuestro vacuolar del glifosato es un mecanismo que se observa en la hierba de caballo resistente al glifosato; ver Ge et al. (2010) Pest Management Sci., 66:576-576. La resistencia resultante de la expresión de enzimas que metabolizan herbicidas en una forma química inactiva en garranchuelos se describe en Hidayat et al. (1997) Pesticide Biochem. PhysioL, 57(2): 137-146. Reddy et al. (2008) J. Agrie. Food Chem., 56(6):2125-2130 describieron la acumulación de ácido aminometilfosfónico en especies vegetales tratadas con glifosato.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona moléculas polinucleotídicas y métodos para regular genes en plantas, por ejemplo, proporcionando ARN para la regulación sistémica de genes. Varios aspectos de la invención proporcionan moléculas polinucleotídicas y métodos para regular genes y transgenes endógenos en una célula vegetal y moléculas polinucleotídicas. Los polinucleótidos, composiciones y métodos divulgados en la presente son útiles para regular genes endógenos de una plaga o patógeno vegetal. En un aspecto de la invención, las moléculas polinucleotídicas se proporcionan en composiciones que pueden permear o ser absorbidas en el tejido vegetal vivo para iniciar el silenciamiento génico sistémico de genes o transgenes endógenos o de su ARN transcrito. En algunos aspectos de la invención, las moléculas polinucleotídicas en última instancia proporcionan a una planta o permiten la producción en células de una planta, de ARN que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en una célula vegetal con ARN transcrito a partir de un gen endógeno objetivo o transgén objetivo en la célula vegetal, produciendo así la regulación del gen objetivo, por ejemplo, el silenciamiento o supresión del gen objetivo. En otros aspectos de la invención, las moléculas polinucleotídicas divulgadas en la presente también son útiles para proporcionar en última instancia a una planta o permitir la producción en células de una planta, de ARN que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas con ARN transcrito a partir de un gen objetivo en una célula de una plaga invertebrada o de un patógeno viral de la planta, produciendo así la regulación del gen objetivo, por ejemplo, el silenciamiento o supresión del gen objetivo. En algunos aspectos, el silenciamiento o supresión del gen objetivo conduce a la sobrerregulación de otro gen que es afectado o regulado por la expresión del gen objetivo.

Se cree que las composiciones y métodos de esta invención operan a través de una o más de las diversas vías celulares naturales implicadas en la supresión génica mediada por ARN, tal como se describe generalmente en reseñas de Brodersen y Voinnet (2006), Trends Genetics, 22:268-280; Tomari y Zamore (2005) Genes & Dev., 19:517-529; Vaucheret (2006) Genes Dev., 20:759-771 ; Meins et al. (2005) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 21 :297-318; y Jones-Rhoades et al. (2006) Annu. Rev. Plant Biol., 57:19-53. La supresión mediada por ARN generalmente implica un intermediario de ARN bicatenario (ARNbc) que se forma intramolecularmente dentro de una única molécula de ARN o intermolecularmente entre dos moléculas de ARN. Este intermediario de ARNbc más largo se procesa mediante una ribonucleasa de la familia RNasa III (ribonucleasa Dicer o similar a Dicer) en uno o más ARN bícatenarios más cortos, incorporándose una cadena de estos al complejo de silenciamiento inducido por ARN ("RISC"). Por ejemplo, la vía ARNip implica la escisión de un intermediario de ARN bicatenario más largo en ARN interferentes pequeños ("ARNip"). Se cree que el tamaño de los ARNip varía de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 pares de bases, pero los tipos más comunes de ARNip en plantas incluyen los que contienen 21 pares de bases o 24 pares de bases. Ver, Hamilton et al. (2002) EMBO J., 21 :4671-4679. Tal como se usa en la presente, "oligonucleótido" significa una molécula polinucleotídica que tiene una longitud de 18-25 nucleótidos, similar al tamaño de moléculas de ARN pequeñas procesadas en mecanismos de silenciamiento génico. Varias modalidades de esta invención incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos o polinucleótidos o una mezcla de ambos.

Los aspectos de la invención incluyen composiciones y métodos para: proporcionar moléculas de ARN monocatenarias en una célula vegetal para regulación sistémica de genes; tratamiento herbicida con composiciones que incluyen tensioactivo y un agente letal vegetal que proporciona ARN monocatenario para la supresión de un gen endógeno en una célula vegetal; revestimiento tópico sobre una superficie vegetal que incluye un tensioactivo (por ejemplo, un tensioactivo de organosilicona) y una molécula de oligonucleótido o polinucleótido para supresión de un gen endógeno en una célula vegetal; composición de aplicación tópica para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta que incluye (a) un agente para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos y (b) moléculas polinucleotídicas; y tratamiento herbicida con composiciones que incluyen (a) un agente para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos y (b) moléculas polinucleotídicas. Opcionalmente estas composiciones pueden incluir un herbicida no nucleotidico.

En otros aspectos, la invención proporciona métodos para: controlar plantas espontáneas resistentes a herbicidas; investigar la genética inversa modulando un gen endógeno en una planta mediante la aplicación sobre tejido de una planta en crecimiento de una composición para proporcionar moléculas de ARN monocatenario en una célula vegetal para regulación sistémica de genes; inducir el silenciamiento sistémico de una gen objetivo que incluye aplicación tópica de polinucleótidos en una planta; inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta mediante (a) acondicionamiento de una planta para la permeación de polinucleótidos y (b) aplicación tópica de polinucleótidos en la planta; investigar la genética inversa modulando un gen endógeno en una planta mediante la aplicación tópica en una planta viva de una composición de aplicación tópica que incluye moléculas polinucleotídicas y un agente para acondicionar una planta para la permeación de dichas moléculas polinucleotídicas.

En otros aspectos, la invención proporciona una planta con ADN o ARN exógeno para suprimir un gen endógeno, donde el ADN exógeno no está integrado en un cromosoma de la planta, el ARN exógeno no se transcribe a partir de ADN integrado en un cromosoma de la planta y el gen endógeno se suprime mediante aplicación tópica de un polinucleótido en una planta. Estos y otros aspectos de la invención se describen en más detalle en las siguientes secciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 presenta la SEQ ID NO:1 , una secuencia de nucleótidos que codifica EPSPS de palmera amaranto.

La Figura 2 presenta la SEQ ID NO:3 que es una secuencia de nucleótidos de un gen Pol III sintetizado.

Las figuras 3A-3C ilustran la morbilidad de las plantas de palmera amaranto tratadas con un ARNbc. La Figura 3A muestra a las plantas 7 días después del tratamiento con glifosato. La Figura 3B muestra plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con la solución de ARNbc largo y posteriormente con tratamiento con glifosato después de 72 horas. La Figura 3C muestra plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con la solución de ARNbc corto y posteriormente con tratamiento con glifosato después de 72 horas.

La Figura 4 ilustra el blanqueado en plantas Nicotiana benthamiana tratadas con una composición de ARNbc.

La Figura 5 presenta la SEQ ID NO:2 que es una secuencia de nucleótidos de una fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana.

La Figura 6 ilustra oligonucleótidos de ADNmc antisentido marcado con Alexa Fluor 488 en 5' (SEQ ID NO: 15) permeado las hojas de palmera amaranto resistente a glifosato tal como se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 7 muestra los resultados de ARNm de EPSPS medidos en hojas de palmera amaranto resistente a glifosato tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido para EPSPS tal como se describe en el Ejemplo 9. Las barras representan experimentos repetidos para cada uno de los tratamientos No. 1 - No. 4 (indicados por los números dentro de los círculos y en referencia a la Tabla 2) y para testigos (hojas permeadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido para una proteína de semilla de cebada, SEQ ID NO:14, tratadas con y sin glifosato).

La Figura 8 muestra los resultados de la proteína EPSPS medidos en hojas de palmera amaranto resistente a glifosato tratadas tópicamente con oligonucleótidos de ADNmc antisentido para EPSPS, tal como se describe en el Ejemplo 9; los tratamientos se indican mediante los números dentro de los círculos y en referencia a la Tabla 2.

La Figura 9 muestra los resultados de la acumulación de shiquimato medida en hojas de palmera amaranto resistente a glifosato tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido para EPSPS en dos experimentos, tal como se describe en el Ejemplo 9; los tratamientos se indican mediante los números dentro de los círculos y en referencia a la Tabla 2.

La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos de una fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:2).

La Figura 11 representa esquemáticamente la ubicación de las secuencias de los oligonucleótidos y polinucleótidos sometidos a ensayo (ver Tabla 3) en relación con la secuencia de fitoeno sintasa (SEQ ID NO: 16) tal como se describe en el Ejemplo 10.

La Figura 12A ilustra el blanqueado apical de hoja en plantas Nicotiana benthamiana tratadas tópicamente con solución amortiguadora ("Testigo"), un polinucleótido de ARNbc de 200 mer con una secuencia de ARN que corresponde al segmento que consiste en los nucleótidos 914 -1 1 13 de la SEQ ID NO:2 ("200 nt dsRNA"), y una combinación de oligonucleótidos y polinucleótidos de ADN monocatenario (SEQ ID NOs:16, 17, 20, 21 , 24, 25 y 26) ("ssDNA oligos") tal como se describe en el Ejemplo 10. La Figura 12B ilustra los resultados de un análisis de transferencia northern de ARN aislado a partir de plantas Nicotiana benthamiana tratadas con solución amortiguadora (testigo), el polinucleótido de ARNbc de 200 mer y los oligonucleótidos de ADNmc. También se muestra el ARN aislado a partir de plantas que fueron estresadas manteniéndolas a 4 grados Celsius y en la oscuridad durante toda la noche antes del tratamiento con los polinucleótidos de ARNbc de 200 mer.

La Figura 13 ilustra el blanqueado apical de hojas en plantas Nicotiana benthamiana tratadas tópicamente por duplicado con varias combinaciones de polinucleótidos u oligonucleótidos (los números se refieren a los tratamiento enumerados en la Tabla 4) tal como se describe en el Ejemplo 10. Las plantas testigo (Tratamiento 13 en la Tabla 4) no se muestran.

La Figura 14 ilustra el blanqueado aplica en hojas de plantas Nicotiana benthamiana tratadas tópicamente con los polinucleótidos indicados en la Tabla 5 tal como se describe en el Ejemplo 10.

La Figura 15 ilustra el blanqueado apical de hojas observado en plantas Nicotiana benthamiana después del tratamiento tópico con el ADNmc antisentido de 21 mer de PDS (SEQ ID NO:34, "21 nt PDS antisentido") o con oligonucleótidos de 22 mer antisentido de PDS sometidos a ensayo previamente sin un promotor 17 (SEQ ID NOs:22 y 23) ("PDS antisentido"). No se observó o se observó un blanqueado apical poco visible en hojas después del tratamiento tópico solo con la solución amortiguadora o después del tratamiento tópico con ADNmc sentido de 21 mer de PDS (SEQ ID NO:36, "21 nt PDS sentido") tal como se describe en el Ejemplo 10.

La Figura 16 ¡lustra una alineación de las secuencias de ADN PDS de palmera amaranto y Nicotiana benthamiana que muestra aproximadamente 71% de identidad (1252/1762) tal como se describe en el Ejemplo 11.

La Figura 17 ilustra el blanqueado apical de hojas observado en plantas de palmera amaranto tratadas tópicamente con ARNbc PDS de Palmer de 678 pb o 198 pb pero no en plantas de palmera amaranto tratadas tópicamente con un ARNbc de gen del gusano de la raíz de maíz de 260 pares de bases, tal como se describe en el Ejemplo 1 1.

La Figura 18A ilustra el blanqueado apical en hojas, tallos y flores de plantas Nicotiana benthamiana tratadas tópicamente primero con una solución de tensioactivo y luego con un oligonucleótido PDS de ADNmc para inducir el silenciamiento sistémico de la fitoeno desaturasa, tal como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 18B ilustra el blanqueado apical en hojas, tallos y flores de plantas Nicotiana benthamiana tratadas tópicamente con un oligonucleótido PDS de ADNmc para inducir el silenciamiento sistémico de la fitoeno desaturasa, con o sin acondicionamiento con una solución de tensioactivo, tal como se describe en el Ejemplo 12.

La Figura 19 ilustra los resultados de los ensayos con diferentes líneas de palmera amaranto resistentes a glifosato (3 plantas por repetición) tratadas con las condiciones indicadas en la Tabla 6, tal como se describe en el Ejemplo 13. Las fotografías fueron sacadas a los 7 días después del tratamiento con glifosato (experimentos 1 - 6) o a los 9 días después del tratamiento con glifosato (experimentos 7 - 9).

La Figura 20 ilustra la ubicación de dos ARN pequeños identificados como abundantes en las plantas de palmera amaranto tratadas con ARNbc de EPSPS y que se muestran como nucleótidos en cursiva subrayados en las posiciones 564-588 y 743 - 767 del EPSPS de longitud completa (SEQ ID NO:40), tal como se describe en el Ejemplo 14. La secuencia de EPSPS también muestra la ubicación de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "cortas" de tamaño de oligonucleótido (testo subrayado, sin cursiva) y los tres polinucleótidos de ARN bicatenario "largos" (texto en negrita, tal como se describe en el Ejemplo 1).

La Figura 21A ilustra los resultados del tratamiento de las plantas de palmera amaranto con tensioactivo y posteriormente ARNbc en una de tres cantidades de aplicación y posteriormente con herbicida, tal como se describe en el Ejemplo 17. La Figura 21 B ilustra los resultados del ensayo 1 llevado a cabo con semillas recogidas de palmera amaranto resistente a glifosato cultivadas en el campo, tal como se describe en el Ejemplo 17; las plantas se muestran a los 8 días y 30 días después del tratamiento con herbicida.

La Figura 22 ilustra los resultados obtenidos con el tratamiento de palmera amaranto con tensioactivo de amina de sebo y sulfato de amonio o con reactivos de transfección, tal como se describe en el Ejemplo 18.

La Figura 23 ilustra los resultados de tratar plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato con ARNbc de EPSPS o híbridos de ADN/ARN de EPSPS, tal como se describe en el Ejemplo 19.

La Figura 24 ilustra los resultados de tratar plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato con ARNbc de EPSPS o polinucleótidos de ADNmc de EPSPS, tal como se describe en el Ejemplo 20. La fotografía superior se tomó a los 8 días después de la pulverización del herbicida y la gráfica inferior (barras) presenta los resultados como la puntuación de lesión por glifosato (Gl) 8 días después de la pulverización del herbicida.

La Figura 25A ilustra doce polinucleótidos de ARNbc correspondientes a segmentos de ADN de aproximadamente 250 pb, cubriendo cada uno de forma traslapada la secuencia sentido completa y parte de las regiones en 5' y en 3' sin traducir del gen EPSPS de Palmer, tal como se describe en el Ejemplo 21 ; las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "cortas" de tamaño de oligonucleótido tales como se describen en el Ejemplo 1 y la Figura 1 están ubicadas en los segmentos de traslape 2, 3, 4 y 8 respectivamente y se muestran como barras gris claro dentro de dichos segmentos. La Figura 25B y la Figura 25C ilustran los resultados del tratamiento de plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato con ARNbc diseñado a partir de estos segmentos de traslape o las cuatro moléculas de ARNbc "cortas" o solución amortiguadora.

La Figura 26 ilustra los resultados del tratamiento de plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato con glifosato y posteriormente con pulverización de Silwet L-77 al 1 % y posterior aplicación de ARNbc de EPSPS en solución amortiguadora que contenía 2% de sulfato de amonio, tal como se describe en el Ejemplo 22. Las plantas testigo sin tratamiento ("ST") se trataron solamente con pulverización de Silwet L-77 al 1 % pero no con herbicida ni ARNbc. Las plantas se fotografiaron y puntuaron a las plantas a los 16 días después del tratamiento.

La Figura 27 ilustra los resultados del tratamiento de una población de campo de palmera amaranto resistente a glifosato con gran cantidad de copias con una composición que contenía una cantidad de 20X o 100X de polinucleótidos de ARNbc de EPSPS, tensioactivo, sulfato de amonio y herbicida o con una composición que contenia tensioactivo, sulfato de amonio y herbicida, tal como se describe en el Ejemplo 23. Para cada tratamiento, se trataron dos parcelas duplicadas de 30 cm por 152 cm.

La Figura 28 representa la evolución del blanqueado y muerte de las plantas de lechuga tratadas con 1 nanomol de ADNmc por planta (de arriba hacia abajo) 37, 46 y 60 días después del tratamiento, tal como se describe en el Ejemplo 24.

La Figura 29A ilustra el silenciamiento sistémico en plantas de lechuga evidenciado por el blanqueado observado a los 4 o 12 días después del tratamiento tópico con polinucleótidos, tal como se describe en el Ejemplo 24. La Figura 29B muestra el silenciamiento sistémico evidenciado por el blanqueado observado a los 4 días después del tratamiento tópico con los cuatro ADNmc antisentido individuales ("HL287", SEQ ID NO:43; "HL288", SEQ ID NO.44; "HL289", SEQ ID NO:45; y "HL290", SEQ ID NO:46) o con una mezcla de los cuatro.

La Figura 30 ilustra el blanqueado de hojas (panel superior derecho) y flores (panel al medio derecho) de plantas de tomate tratadas con polinucleótidos de fitoeno desaturasa de tomate, tal como se describe en el Ejemplo 25. La Figura 30 también ilustra el enanismo de las plantas de tomate tratadas con polinucleótidos de PDS (panel inferior).

La Figura 31 ilustra la mejora de la actividad herbicida del glifosato en palmera amaranto con poca cantidad de copias de los polinucleótidos de EPSPS mediante polinucleótidos de TIF y que los polinucleótidos de TIF tienen actividad herbicida propia, tal como se describe en el Ejemplo 26. Los polinucleótidos de EPSPS "1 , 3, 4" se refieren a ARNbc "cortos" que tienen una cadena antisentido que es capaz de hibridar con el ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de palmera amaranto (SEQ ID NO:1 ) en las posiciones 14-38 (ARNbc- 1 corto), 345-369 (ARNbc-3 corto) y 1 105-1129 (ARNbc-4 corto), respectivamente tal como se indica mediante los nucleótidos subrayados en la Figura 1 (ver Ejemplo 1). EPSPS "5" se refiere a IDT [5] (SEQ ID NOS:91-92, tal como se describe en la Tabla 11).

La Figura 32 ilustra la mejora de la actividad herbicida del glifosato en palmera amaranto con gran cantidad de copias de los polinucleótidos de EPSPS mediante polinucleótidos de TIF y que los polinucleótidos de TIF tienen actividad herbicida propia, tal como se describe en el Ejemplo 26. Los polinucleótidos de EPSPS "1 , 3, 4" se refieren a ARNbc "cortos" que tienen una cadena antisentido que es capaz de hibridar con el ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de palmera amaranto (SEQ ID NO:1) en las posiciones 14-38 (ARNbc- 1 corto), 345-369 (ARNbc-3 corto) y 1105-1129 (ARNbc-4 corto), respectivamente tal como se indica mediante los nucleótidos subrayados en la Figura 1 (ver Ejemplo 1 ). EPSPS "5" se refiere a IDT [5] (SEQ ID NOS:91-92, tal como se describe en la Tabla 11).

La Figura 33 ilustra el efecto herbicida sobre palmera amaranto después del tratamiento con las combinaciones indicadas de herbicidas no polinucleotídicos y polinucleótidos, tal como se describe en el Ejemplo 28.

La Figura 34 ilustra una alineación del promotor del locus 1 de PDS en Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:319) y el promotor del locus 2 de PDS (SEQ ID NO:320), tal como se describe en el Ejemplo 30.

La Figura 35 ilustra esquemáticamente los promotores de locus 1 y locus 2 de PDS en Nicotiana benthamiana y las regiones a las que se dirigen las mezclas de polinucleótidos, tal como se describe en el Ejemplo 30.

Las figuras 36A-36C ilustran el efecto en la altura de la planta en plantas Nicotiana benthamiana tratadas con un polinucleótido antisentido de PDS (Figura 36A), polinucleótidos antisentido de EPSPS (Figura 36B) o polinucleótidos antisentido de RuBisCO (Figura 36C), tal como se describe en el Ejemplo 33.

La Figura 37 ilustra el efecto en plantas monocotiledóneas Zea mays (Gaspe) mediante tratamiento tópico con polinucleótidos de ARNbc ("EPSPS DNA oligo") dirigidos al gen EPSPS endógeno o con solución amortiguadora solo como testigo, tal como se describe en el Ejemplo 34.

La Figura 38 ilustra el efecto de la variación de los contraiones de glifosato en la actividad herbicida en plantas de palmera amaranto resistentes al glifosato, tal como se describe en el Ejemplo 35.

La Figura 39 ilustra el efecto de poliaminas espermina ("SPM") y espermidina ("SPMD") o sulfato de amonio ("AMS") en palmera amaranto resistente a glifosato que contiene 33, 36 o 57 copias de EPSPS, tal como se describe en el Ejemplo 35. "fb 4X WM" significa "con posterior tratamiento con glifosato (3360 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®)".

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácido nucleico en el texto de esta memoria descriptiva se proporcionan, cuando se leen de izquierda a derecha, en el sentido 5' a 3'. Las secuencias de ácido nucleico pueden proporcionarse como ADN o como ARN, según se especifique; la divulgación de una necesariamente define a la otra, tal como sabe un experto en la técnica. Cuando un término se proporciona en singular, los inventores también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de dicho término. Polinucleótidos "no transcribibles" significa que los polinucleótidos no comprenden una unidad de transcripción de polimerasa II completa. Tal como se usa en la presente, "solución" se refiere a mezclas homogéneas y mezclas no homogéneas tales como suspensiones, coloides, micelas y emulsiones.

Polinucleótidos Tal como se usa en la presente, "polinucleótido" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene múltiples nucleótidos y generalmente se refiere a "oligonucleótidos" (una molécula polinucleotídica de 18-25 nucleótidos de longitud) y polinucleótidos de 26 o más nucleótidos. Las modalidades de esta invención incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos que tienen una longitud de 18-25 nucleótidos (por ejemplo, 18 mers, 19 mers, 20 mers, 21 mers, 22 mers, 23 mers, 24 mers o 25 mers) o polinucleótidos de longitud media que tienen 26 o más nucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 260, aproximadamente 270, aproximadamente 280, aproximadamente 290 o aproximadamente 300 nucleótidos) o polinucleótidos largos que tienen una longitud mayor que aproximadamente 300 nucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de entre aproximadamente 300 a aproximadamente 400 nucleótidos, entre aproximadamente 400 a aproximadamente 500 nucleótidos, entre aproximadamente 500 a aproximadamente 600 nucleótidos, entre aproximadamente 600 a aproximadamente 700 nucleótidos, entre aproximadamente 700 a aproximadamente 800 nucleótidos, entre aproximadamente 800 a aproximadamente 900 nucleótidos, entre aproximadamente 900 a aproximadamente 1000 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 500 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 600 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 700 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 800 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 900 nucleótidos o aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, o incluso mayores que aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo hasta la longitud completa de un gen objetivo incluidas las porciones sentido o antisentido o las porciones sentidos y antisentidos del gen objetivo). Cuando un polinucleótido es bicatenario, su longitud puede describirse de forma similar en términos de pares de bases.

Las composiciones de polinucleótidos utilizadas en las diversas modalidades de esta invención incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos o polinucleótidos o una mezcla de ambos, incluidos híbridos de ARN o ADN o ARN/ADN u oligonucleótidos o polinucleótidos modificados químicamente o una mezcla de estos. En algunas modalidades, el polinucleótido puede ser una combinación de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, por ejemplo, polinucleótidos sintéticos que consisten principalmente en ribonucleótidos pero con uno o más desoxirribonucleótidos terminales o polinucleótidos sintéticos que consisten principalmente en desoxirribonucleótidos pero con uno o más didesoxirribonucleótidos terminales. En algunas modalidades, el polinucleótido incluye nucleótidos no canónicos tales como inosina, tiouridina o seudouridina. En algunas modalidades, el polinucleótido incluye nucleótidos modificados químicamente. Los ejemplos de oligonucleótidos o polinucleótidos modificados químicamente se conocen en la técnica; ver, por ejemplo, Verma y Eckstein (1998) Annu. Rev. Biochem., 67:99-134. Por ejemplo, el esqueleto de enlaces fosfodiéster de origen natural de un oligonucleótido o polinucleótido puede modificarse parcialmente o totalmente con modificaciones de ligamientos internucleótido de fosforotioato, fosforoditioato o metilfosfonato, pueden utilizarse bases de nucleósido modificadas o azúcares modificados en la síntesis de oligonucleótidos o polinucleótidos y pueden marcarse oligonucleótidos o polinucleótidos con un resto fluorescente (por ejemplo, fluoresceína o rodamina) u otro marcador (por ejemplo, biotina).

Los polinucleótidos pueden ser ARN mono o bicatenario o ADN mono o bicatenario o híbridos de ADN/ARN bicatenarios o análogos modificados de los mismos y pueden tener una longitud de oligonucleótido o ser más largos. En modalidades más específicas de la invención, los polinucleótidos que proporcionan ARN monocatenario en la células vegetal se seleccionan del grupo que consiste en (a) un molécula de ARN monocatenaria, (b) una molécula de ARN monocatenaria que se autohibrida para formar una molécula de ARN bicatenaria, (c) una molécula de ARN bicatenaria, (d) una molécula de ADN monocatenaria, (e) una molécula de ADN monocatenaria que se autohibrida para formar una molécula de ADN bicatenaria y (f) una molécula de ADN monocatenaria que incluye un gen Pol III modificado que se transcribe en una molécula de ARN, (g) una molécula de ADN bicatenaria, (h) una molécula de ADN bicatenaria que incluye un gen Pol III modificado que se transcribe en una molécula de ARN, (i) una molécula de ARN/ADN bicatenaria hibridada o combinaciones de estas. En algunas modalidades estos polinucleótidos incluyen nucleótidos modificados químicamente o nucleótidos no canónicos. En modalidades del método, los polinucleótidos incluyen ADN bicatenario formado mediante hibridación intramolecular, ADN bicatenario formado mediante hibridación intermolecular, ARN bicatenario formado mediante hibridación intramolecular o ARN bicatenario formado mediante hibridación intermolecular. En una modalidad, los polinucleótidos incluyen ADN monocatenario o ARN monocatenario que se autohibrida para formar una estructura de horquilla que tiene una estructura al menos parcialmente bicatenaria que incluye al menos un segmento que hibridará en condiciones fisiológicas en la células con ARN transcrito a partir del gen objetivo de la supresión. Sin ánimo de ceñirse a ningún mecanismo, se cree que dichos polinucleótidos son o producirán ARN monocatenario con al menos un segmento que hibridará en condiciones fisiológicas en una célula con ARN transcrito a partir del gen objetivo de la supresión. En ciertas modalidades distintas, los polinucleótidos además incluyen un promotor, generalmente un promotor funcional en una planta, por ejemplo, un promotor de pol II, un promotor de pol III, un promotor de pol IV o un promotor de pol V.

En algunas modalidades, las composiciones de polinucleótidos se formulan con contraiones u otras moléculas conocidas por asociarse con moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, iones de tetraalquil amonio, iones de trialquil amonio, iones de sulfonio, iones de litio y poliaminas tales como espermina, espermidina o putrescina. En algunas modalidades, las composiciones de polinucleótidos se formulan con un herbicida no polinucleotidico (por ejemplo, los herbicidas químicos divulgados en la presente en la sección titulada "Proteínas de tolerancia a herbicidas") o con un agente de transferencia o agente que potencia la permeabilidad (ver la sección titulada "Agentes y Tratamientos para potenciar la permeabilidad").

Los polinucleótidos se diseñan para inducir la regulación o supresión sistémica de un gen endógeno en una planta y se diseñan para tener una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia (que puede ser una secuencia sentido o una secuencia antisentido) de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de una gen endógeno de una planta. "Esencialmente idéntica" o "esencialmente complementaria" significa que los polinucleótidos (o al menos una cadena de un polinucleótido bicatenario) están diseñados para hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir la regulación o supresión del gen endógeno.

Las modalidades de polinucleótidos monocatenarios funcionales en este invención tienen una complementariedad secuencial que no es necesariamente del 100% pero es al menos suficiente para permitir la hibridación con ARN transcrito a partir del gen objetivo para formar un dúplex en condiciones fisiológicas en una células vegetal para permitir la escisión mediante un mecanismo de silenciamiento génico. Por consiguiente, en modalidades el segmento está diseñado para ser esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen objetivo o en el ARN mensajero transcrito a partir de dicho gen objetivo. "Esencialmente idéntica" significa que tiene 100% de identidad secuencial o al menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad secuencial cuando se compara con la secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen objetivo o el ARN transcrito a partir del gen objetivo; "esencialmente complementario" significa que tiene 100% de complementariedad secuencial o al menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de complementariedad secuencial cuando se compara con la secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen objetivo o el ARN transcrito a partir del gen objetivo. En algunas modalidades de esta invención, las moléculas polinucleotídicas se diseñan para tener 100% de identidad o complementariedad secuencial con una alelo de un gen objetivo dado (por ejemplo, una secuencia sentido o antisentido de un gen para una proteína de tolerancia a herbicidas, una proteína de desactivación de herbicida, un gen de respuesta a estrés o un gen esencial); en otras modalidades las de polinucleótido se diseñan para tener 100% de identidad o complementariedad secuencial con múltiples alelos de un gen objetivo dado.

En un aspecto de la invención los polinucleótidos son genes de ARN polimerasa III modificados, por ejemplo, genes que transcriben ARN de partícula de reconocimiento de señal 7SL o ARN de empalmosoma U6 (genes Pol III) o polinucleótidos que contienen una secuencia promotora de Pol III funcional. En una modalidad, los polinucleótidos son genes Pol III modificados que contienen ADN sentido y antisentido correspondiente a ARN del gen objetivo identificado para regulación reemplazando a la secuencia de ADN transcrita originalmente por el gen Pol III.

Los polinucleótidos útiles en esta invención típicamente producen la regulación o modulación (por ejemplo, supresión) de la expresión génica durante un período durante la vida de la planta tratada de al menos 1 semana o más extenso y típicamente de forma sistémica. Por ejemplo, tras días de tratar a una hoja de planta con una composición de polinucleótidos de esta invención, se pueden detectar ARNip primarios y transitivos en otras hojas laterales y por encima de la hoja tratada y en tejido apical.

Los métodos para hacer polinucleótidos se conocen en la técnica. La preparación comercial de oligonucleótidos a menudo proporciona 2 desoxírribonucleótidos en el extremo 3' de la cadena sentido. Las moléculas polinucleotídicas largas pueden sintetizarse a partir de kits disponibles en el mercado, por ejemplo, los kits de Ambion tienen ADN ligado en el extremo 5' que codifica un promotor de polimerasa T7 bacteriano que hace cadenas de ARN que pueden ensamblarse en un ARNbc. Alternativamente, se pueden producir moléculas de ADNbc a partir de casetes de expresión en células bacterianas que tienen actividad enzimática de RNasa III regulada o deficiente. Las moléculas polinucleotídicas largas también pueden ensamblarse a partir de múltiples fragmentos de ARN o ADN. En algunas modalidades, los parámetros de diseño tales como la puntuación Reynolds y las reglas TuschI se conocen en la técnica y se utilizan para seleccionar secuencias de polinucleótidos eficaces para el silenciamiento génico. En algunas modalidades, se utiliza el diseño aleatorio o la selección empírica de secuencias de polinucleótidos para seleccionar las secuencias de polinucleótidos eficaces para el silenciamiento génico. En algunas modalidades la secuencia de un polinucleótido se somete a detección contra el ADN genómico de la planta prevista para minimizar el silenciamiento no intencional de otros genes.

Las composiciones de polinucleótidos de esta invención son útiles en composiciones, tales como soluciones de moléculas polinucleotídicas, a concentraciones bajas, solas o en combinación con otros componentes (por ejemplo, tensioactivos, sales y herbicidas no polinucleotídicos) en la misma solución o en soluciones aplicadas por separado. Aunque no existe un límite superior en las concentraciones y dosificaciones de moléculas polinucleotídicas que pueden ser útiles en los métodos de esta invención, en general se buscará la eficacia de las concentraciones y dosificaciones eficaces más bajas. Las concentraciones pueden ajustarse teniendo en cuenta el volumen de pulverización aplicado sobre las hojas de las plantas. En una modalidad, un tratamiento útil para plantas herbáceas que utilizan moléculas de oligonucleótidos de 25 mer es aproximadamente 1 nanomol de moléculas de oligonucleótido por planta, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 a 1 nanomol por planta. Otras modalidades para plantas herbáceas incluyen rangos útiles de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 100 nanomoles o aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 nanomoles o aproximadamente 1 nanomol a aproximadamente 10 nanomoles de polinucleótidos por planta. Las plantas, árboles o viñas muy grandes pueden requerir, en consecuencia, cantidades mayores de polinucleótidos. Cuando se utilizan moléculas de ARNbc largas que pueden procesarse en múltiples oligonucleótidos, se pueden usar concentraciones más bajas. En los ejemplos más adelante para ilustrar modalidades de la invención, el factor 1X cuando se aplica a moléculas de oligonucleótido se usa arbitrariamente para denotar un tratamiento de 0,8 nanomoles de molécula polinucleotídica por planta; 10X, 8 nanomoles de molécula polinucleotídica por planta; y 100X, 80 nanomoles de molécula de polinucleótido por planta. Por ejemplo, en el ejemplo 23, las plantas se trataron con una solución acuosa que comprende un tratamiento de 100X de ARNbc de EPSPS (264 microgramos u 80 nanomoles) por planta.

Moléculas de ARN monocatenarias Esta invención proporciona moléculas polinucleotídicas para proporcionar ARN monocatenario para regulación sistémica de genes en una célula vegetal. Más específicamente, la invención también proporciona composiciones y métodos para inducir la regulación sistémica (por ejemplo, supresión o silenciamiento sistémico) de un gen objetivo en una planta mediante aplicación tópica en la planta de una molécula polinucleotídica con un segmento en una secuencia de nucleótidos esencialmente idéntica o esencialmente complementaria con una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen objetivo o el ARN transcrito a partir del gen objetivo, por el cual la composición permea al interior de la planta e induce la regulación sistémica del gen objetivo mediante la acción del ARN monocatenario que híbrida con el ARN transcrito, por ejemplo, ARN mensajero. La molécula polinucleotídica puede ser una o más moléculas polinucleotidicas con uno solo de dicho segmento, múltiples de dicho segmento, múltiples de dichos segmentos diferentes o combinaciones de estos.

Agentes de transferencia, agentes y tratamiento para potenciar la permeabilidad Las composiciones y métodos de esta invención pueden comprender agentes de transferencia o agentes y tratamiento para potenciar la permeabilidad para acondicionar la superficie del tejido vegetal, por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores o frutas, para la permeación medíante las moléculas polinucleotidicas en las células vegetales. La transferencia de polinucleótidos en células vegetales puede facilitarse medíante la aplicación previa o simultánea de un agente de transferencia de polinucleótido en el tejido vegetal. En algunas modalidades el agente de transferencia se aplica posteriormente a la aplicación de la composición de polinucleótido. El agente de transferencia de polinucleótido posibilita una vía para los polinucleótidos a través de las barreras de cera de la cutícula, estomas y/o membrana celular o barreras membranosas y hacia dentro de las células vegetales. Los agentes adecuados para facilitar la transferencia de la composición a una célula vegetal incluyen agentes que aumentan la permeabilidad del exterior de la planta o que aumentan la permeabilidad de las células vegetales para oligonucleótidos o polinucleótidos. Dichos agentes para facilitar la transferencia de la composición a una célula vegetal incluyen un agente químico o un agente físico o combinaciones de estos. Los agentes químicos para acondicionamiento incluyen (a) tensioactivos, (b) un disolvente orgánico o una solución acuosa o mezclas acuosas de disolventes orgánicos, (c) agentes de oxidación, (e) ácidos, (f) bases, (g) aceites, (h) enzimas o combinaciones de estos. Las modalidades del método opcionalmente pueden incluir una etapa de incubación, una etapa de neutralización (por ejemplo, para neutralizar un ácido, base o agente de oxidación o para desactivar una enzima), una etapa de enjuague o combinaciones de estas. Las modalidades de agentes o tratamientos para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos incluyen emulsiones, emulsiones inversas, liposomas y otras composiciones similares a micelas. Las modalidades de agentes o tratamientos para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos incluyen contraiones u otras moléculas que se conocen por asociarse con moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, iones de amonio inorgánico, iones de alquil amonio, iones de litio, poliaminas tales como espermina, espermidina o putrescina y otros cationes. Los disolventes orgánicos útiles para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos incluyen DMSO, DMF, piridina, N-pirrolidina, hexametilfosforamida, acetonitrilo, dioxano, polipropilenglicol, otros disolventes miscibles con agua o que disolverán fosfonucleótidos en sistemas no acuosos (tales como se utilizan en reacciones sintéticas). Se pueden utilizar aceites de origen natural o sintéticos con o sin tensioactivos o emulsionantes, por ejemplo, aceites de fuentes vegetales, se pueden utilizar aceites de cultivos (tales como los enumerados en el 9o Compendio de Adyuvantes de Herbicidas, disponibles públicamente en línea en www.herbicide.adjuvants.com), por ejemplo, aceites parafínicos, ésteres de ácido graso de polioles o aceites con moléculas de cadena corta modificados con amidas o poliaminas tales como polietilenimina o /V-pirrolidina.

Dichos agentes para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos se aplican a la planta mediante cualquier método conveniente, por ejemplo, pulverización o revestimiento con un polvo, emulsión, suspensión o solución; de forma similar, las moléculas polinucleotídicas se aplican a la planta mediante cualquier método conveniente, por ejemplo, pulverización o frotamiento de una solución, emulsión o suspensión.

Los ejemplos de tensioactivos útiles incluyen sales de sodio y litio de ácidos grasos (tales como cebo o aminas de cebo o fosfolípidos) y tensioactivos de organosilicona. Otros tensioactivos útiles incluyen tensioactivos de organosilicona incluidos tensioactivos de organosilicona no iónicos, por ejemplo, tensioactivos de etoxilato de trisiloxano o un copolímero de poliester y silicona tal como un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible en el mercado como el tensioactivo Silwet® L-77 que tiene el número CAS 27306-78-1 y el número EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, actualmente comercializado por Momentive Performance Materials, Albany, Nueva York). Cuando se usa el tensioactivo Silwet L-77 como tratamiento de prepulverización de las hojas de plantas u otras superficies, las concentraciones en el rango de aproximadamente 0,015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (%p) (por ejemplo, aproximadamente 0,01 , 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1 , 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 ,0, 1 ,1 , 1 ,2, 1 ,3, 1 ,4, 1 ,5, 1 ,6, 1 ,7, 1 ,8, 1 ,9, 2,0, 2,1 , 2,2, 2,3, 2,5%p) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie vegetal para la transferencia de moléculas polinucleotídicas en células vegetales a partir de una aplicación tópica en la superficie.

Los agentes físicos útiles pueden incluir (a) abrasivos tales como carburo de silicio, corindón, arena, calcita, piedra pómez, granate y similares, (b) nanopartículas tales como nanotubos de carbono o (c) una fuerza física. Los nanotubos de carbono se divulgan en Kam et al. (2004) J. Am. Chem. Soc, 126 (22):6850-6851 , Liu et al. (2009) Nano Lett, 9(3): 1007-1010 y Khodakovskaya ef al. (2009) ACS Nano, 3(10):3221-3227. Los agentes de fuerza física pueden incluir, calentamiento, enfriamiento, la aplicación de presión positiva o tratamiento con ultrasonidos. Las modalidades del método opcionalmente pueden incluir una etapa de incubación, una etapa de neutralización (por ejemplo, para neutralizar un ácido, base o agente de oxidación o para desactivar una enzima), una etapa de enjuague o combinaciones de las mimas. Los métodos de la invención pueden incluir además la aplicación de otros agentes que tendrán un efecto potenciado debido al silenciamiento de ciertos genes. Por ejemplo, cuando se diseña una polinucleótido para regular genes que proporcionan resistencia herbicida, la aplicación posterior del herbicida puede tener un efecto drástico en la eficacia del herbicida.

Los agentes para el acondicionamiento en laboratorio de una planta para permeación de polinucleótidos incluyen, por ejemplo, aplicación de un agente químico, tratamiento enzimático, calentamiento o enfriamiento, tratamiento con presión negativa o positiva o tratamiento con ultrasonidos. Los agentes para acondicionar plantas en un campo incluyen agentes químicos tales como tensioactivos y sales.

Genes objetivo y genes esenciales Las composiciones y métodos de la invención son útiles para modular la expresión de un gen objetivo endógeno o transgénico en una célula vegetal. En varias modalidades, un gen objetivo incluye una secuencia sentido (sentido de proteína o traducible), una secuencia antisentido (no traducible) o una secuencia sentido y una antisentido. Las composiciones de la invención pueden incluir polinucleótidos y oligonucleótidos diseñados para dirigirse a múltiples genes o múltiples segmentos de uno o más genes. El gen objetivo puede incluir múltiples segmentos consecutivos de un gen objetivo, múltiples segmentos no consecutivos de un gen objetivo, múltiples alelos de un gen objetivo o múltiples genes objetivo de una o más especies. Los ejemplos de genes objetivo incluyen genes y transgenes vegetales endógenos expresados en células vegetales. Otros ejemplos de genes objetivo incluyen genes endógenos de patógenos virales vegetales o genes endógenos de plagas vegetales invertebradas.

Los genes objetivo pueden incluir genes que codifican proteínas de tolerancia a herbicidas, secuencias antisentidos que incluyen ARN reguladores y genes esenciales, que son genes necesarios para sustentar la vida celular o para permitir la reproducción de un organismo. Las modalidades de genes esenciales incluyen genes que participan en la replicación del ADN o ARN, transcripción génica, regulación génica mediada por ARN, síntesis proteica, producción de energía y división celular. Un ejemplo de un compendio de genes esenciales se describe en Zhang et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32:D271-D272 y está disponible en tubic.tju. edu.cn/deg/; versión DEG 5.4 enumera 777 genes esenciales para Arabidopsis thaliana. Los ejemplos de genes esenciales incluyen el factor de iniciación de traducción (TIF) y la ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO). Los genes objetivo pueden incluir genes que codifican factores de transcripción y genes que codifican enzimas implicadas en la biosintesis o catabolismo de moléculas en plantas tales como, a modo no taxativo, aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, azúcares y otros carbohidratos, polímeros biológicos y metabolitos secundarios incluidos alcaloides, terpenoides, poliquétidos, péptidos no ribosómicos y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto.

Composiciones y Métodos Las moléculas de ARN monocatenarias de esta invención pueden proporcionarse directamente a la célula vegetal como ARN o pueden proporcionarse indirectamente, por ejemplo, cuando una molécula polinucleotidica en la composición de tratamiento provoca en células de una planta la producción del ARN monocatenario que es capaz de hibridar con el transcrito del gen objetivo. En muchas modalidades, las composiciones de moléculas polinucleotídicas además incluyen uno o más agentes potenciadores de la permeabilidad para facilitar la transferencia de las moléculas polinucleotídicas a una célula vegetal, tales como agentes para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos. En aspectos de la invención, los métodos incluyen una o más aplicaciones de la composición de polinucleótido y una o más aplicaciones de un agente potenciador de la permeabilidad para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos. Cuando el agente de acondicionamiento para la permeación es un tensioactivo de organosilicona, las modalidades de las moléculas polinucleotídicas son oligonucleótidos de ARN bicatenario, oligonucleótidos de ARN monocatenario, polinucleótidos de ARN bicatenarios, polinucleótidos de ARN monocatenario, oligonucleótidos de ADN bicatenario, oligonucleótidos de ADN monocatenario, polinucleótidos de ADN bicatenarios, polinucleótidos de ADN monocatenario, oligonucleótidos o polinucleótidos de ADN o ARN químicamente modificados o mezclas de estos.

Un aspecto de la invención proporciona un método para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta que incluye (a) acondicionamiento de una planta para la permeación de polinucleótidos y (b) aplicación tópica de moléculas polinucleotidicas a la planta, donde las moléculas polinucleotidicas incluyen al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos clonados o de otra forma identificados a partir del gen objetivo en orientación sentido o antisentido, por el cual las moléculas polinucleotidicas permean al interior de la planta e inducen el silenciamiento sistémico del gen objetivo. El acondicionamiento y la aplicación de polinucleótidos pueden llevarse a cabo por separado o en una sola etapa. Cuando el acondicionamiento y la aplicación de polinucleótidos se llevan a cabo en etapas separadas, el acondicionamiento puede preceder o puede ser posterior a la aplicación de polinucleótidos en minutos, horas o días. En algunas modalidades, se pueden llevar a cabo más de una etapa de acondicionamiento o más de una etapa de aplicación de molécula polinucleotídica en la misma planta. En modalidades del método, el segmento puede clonarse o identificarse a partir de partes (a) sentidos (es decir, sentidos de proteínas), (b) antisentidos o (c) sentidos y antisentidos del gen objetivo. Las partes antisentidos incluyen ADN (o el ARN codificado por el ADN) que codifica secuencias reguladoras de ARN (por ejemplo, promotores, intrones, regiones no traducidas en 5' o 3' y microARN, ARNip frans-activos, ARNip antisentidos naturales y otros ARN pequeños con función reguladora) o que codifica ARN que tienen función estructural o enzimática (por ejemplo, ribozimas, ARN ribosómicos, ARN-t, aptámeros y riboswitches).

En varias modalidades del método para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta, el gen objetivo es (a) un gen endógeno de la planta, (b) un gen endógeno de un patógeno viral de la planta, (c) un gen endógeno de una plaga invertebrada de la planta, (d) un gen endógeno de un simbionte de una plaga invertebrada de la planta o (e) un gen sintético insertado en una planta transgénica. En modalidades donde el gen objetivo es endógeno de una planta, el gen objetivo (a) es un gen endógeno de la planta que es esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta, (b) codifica una proteína que proporciona resistencia a herbicidas a la planta o (c) se transcribe a una molécula reguladora de ARN. En modalidades del método para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta, el acondicionamiento incluye la aplicación de un agente químico, abrasión, lesionado, tratamiento enzimático, calentamiento o enfriamiento, tratamiento con presión positiva o negativa, tratamiento con ultrasonidos o combinaciones de estos. En algunas modalidades, el acondicionamiento incluye la aplicación de un tensioactivo, tales como tensioactivos de organosilicona, por ejemplo, un copolímero de poliester y silicona tal como un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible en el mercado como el tensioactivo Silwet® L-77). En modalidades del método, el acondicionamiento incluye la aplicación de (a) un tensioactivo, (b) un disolvente orgánico o una solución acuosa o mezcla acuosa de un disolvente orgánico, (c) un polipropilenglicol o una solución acuosa o una mezcla acuosa de polipropilenglicol, (d) nanopartículas, (e) un agente de oxidación, (f) un ácido o una base o (g) un aceite o de una combinación de estos. Las modalidades del método opcionalmente pueden incluir una etapa de incubación, una etapa de neutralización (por ejemplo, para neutralizar un ácido, base o agente de oxidación o para desactivar una enzima), una etapa de enjuague o combinaciones de las mismas.

La invención proporciona composiciones tópicas para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta que incluyen (a) un agente para el acondicionamiento de una planta para la permeación de polinucleótidos y (b) moléculas polinucleotídicas con al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos esencialmente idénticos o complementario a la secuencia de nucleótidos del gen objetivo en sentido antisentido o sentido. Dichas composiciones pueden utilizarse para los diversos métodos divulgados en la presente, incluidos métodos para investigar la genética inversa modulando un gen endógeno en una planta y como composiciones herbicidas para los métodos divulgados de control de malezas y control de plantas espontáneas. Otro aspecto de la invención proporciona una planta que incluye ADN o ARN exógeno para suprimir un gen endógeno, donde el ADN exógeno no está integrado en un cromosoma de la planta y el ARN exógeno no se transcribe a partir de ADN integrado en un cromosoma de la planta y en donde el gen endógeno se suprime mediante aplicación tópica de un polinucleótido en la planta. Alternativamente, el ADN o ARN exógeno puede diseñarse para suprimir un gen vegetal endógeno que participan en la respuesta a una plaga o patógeno para proporcionar control de plagas o enfermedades vegetales. Dicha planta puede cultivarse a partir de una semilla o producirse mediante un proceso de corte, clonación o uso de injertos (es decir, una planta no cultivada a partir de una semilla). Dicha planta es una planta de cultivo en hileras, una fruta, una verdura, un árbol o una planta ornamental. Por ejemplo, en modalidades de las invenciones divulgadas en la presente, la planta es una planta de cultivo en hileras (por ejemplo, maíz, soja, algodón, colza, remolacha azucarera, alfalfa, caña de azúcar, arroz y trigo) o es una verdura (por ejemplo, tomate, pimiento dulce, pimiento picante, melón, sandia, pepino, berenjena, coliflor, brócoli, lechuga, espinaca, cebolla, guisantes, zanahorias, maíz dulce, col de China, puerro, hinojo, calabaza, calabacín o calabaza de San Juan, rábano, coles de Bruselas, tomatillo, porotos, porotos secos u okra) o es una planta culinaria (por ejemplo, albahaca, perejil, café o té) o es una fruta (por ejemplo, manzana, pera, cereza, durazno, ciruela, albaricoque, banana, plátano, uva de mesa, uva de vino, cítricos, aguacate, mango o baya) o es un árbol cultivado para uso comercial u ornamental (por ejemplo, un árbol frutal o un nogal o es una planta ornamental (por ejemplo, una planta floral ornamental o arbusto o hierba de césped). Las modalidades de una planta producida mediante un proceso de corte, clonación o uso de injertos (es decir, una planta no cultivada a partir de una semilla) incluye árboles frutales y plantas incluidos cítricos, manzanas, aguacates, tomates, berenjenas, pepino, melones, sandías y uvas, así como también varias plantas ornamentales.

Métodos para investigar la genética inversa En otro aspecto, la invención proporciona un método para investigar la genética inversa regulando o modulando un gen objetivo endógeno en una planta; dicho método incluye aplicar en un tejido de una planta en crecimiento una composición para proporcionar (directamente o indirectamente) ARN monocatenario de esta invención para regulación sistémica de genes en una célula vegetal. En modalidades de dicho método, el ARN mensajero que codifica una proteína o gen de ARN regulador es objetivo de un polinucleótido de la invención, produciendo la modulación del gen durante un período de al menos 1 semana durante la vida de la planta, por ejemplo, para identificar rasgos que pueden impartirse mediante aplicación tópica de polinucleótidos. El método además puede incluir etapas adicionales, por ejemplo, exponer a la planta a un conjunto de compuestos para identificar interacciones con herbicidas o exponer a la planta a estrés abiótico (por ejemplo, estrés por déficit hídrico, estrés por déficit de nutrientes, estrés por calor, estrés por frío, estrés por salinidad) o a tratamientos bióticos (por ejemplo, desafío con una plaga de insectos o nematodos o con una patógeno viral, fúngico o bacteriano o exposición a un compuesto químico o tratamiento biológico) para identificar respuestas de la planta al estrés o tratamiento. En otro aspecto de la invención, se someten a detección bibliotecas de plantas con una variedad de genes silenciados transitoriamente para contrastar con bibliotecas de compuestos (por ejemplo, herbicidas, fitohormonas, estimuladores de defensa endógenos o exógenos tales como ácido salicílico o harpinas, deficiencias de moléculas que proporciona un nutriente vegetal tal como nitrógeno, fósforos, potasio, azufre, calcio, magnesio, hierro y zinc) para identificar interacciones con dichos compuestos. Los ejemplos de plantas útiles para dichas detecciones incluyen Amaranthus palmeri y Nicotiana benthamiana.

Métodos para silenciamiento transqénico En otro aspecto adicional de la invención, este método puede utilizarse para silenciar un transgén que se expresa en una planta, proporcionando así un control negativo que es una medición independiente de acontecimientos de una contribución del transgén al rendimiento o efecto de la planta en un rasgo. Impartir un efecto de control negativo puede requerir múltiples tratamientos sucesivos con las moléculas polinucleotídicas de esta invención durante el ciclo de vida de una planta.

Aplicaciones especificas En un aspecto relacionado, las composiciones y métodos de la invención también son útiles para silenciar transitoriamente uno o más genes en una célula vegetal o planta entera en crecimiento para producir un fenotipo deseado en respuesta a condiciones de cultivo, estrés ambiental o abiótico o biótico o carga en la demanda de mercado durante la estación de crecimiento o en el ambiente poscosecha. Por ejemplo, las composiciones y métodos de la invención son útiles para suprimir transitoriamente un gen biosintético o catabólico para producir una planta o producto vegetal con un fenotipo deseado, tal como una composición nutricional deseada de un producto vegetal de cultivo, por ejemplo, suprimir un gen FAD2 para producir un perfil de ácido graso deseado en soja o colza u otra semilla de aceite o suprimir genes biosintéticos de lignina tales como COMT y CCOMT para proporcionar plantas forrajeras más fáciles de digerir. De forma similar, las composiciones y métodos de la invención son útiles para suprimir transitoriamente una molécula reguladora de ARN tal como un microARN (miARN) o un señuelo de miARN endógeno tal como un miARN endógeno, un precursor de miARN o un señuelo de miARN tal como se divulga en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 2009/0070898 que se incorpora a la presente a modo de referencia. Las modalidades de la invención son útiles para suprimir un gen vegetal endógeno que participa en la respuesta a una plaga o patógeno, proporcionando así control de plagas o enfermedades vegetales. Los polinucleótidos, composiciones y métodos de administración divulgados en la presente son útiles además para suprimir un gen objetivo endógeno de una plaga invertebrada de una planta, por ejemplo, plagas de lepidópteros o coleópteros que pueden ingerir ARN de la planta, proporcionando así control de plagas vegetales o enfermedades inducidas por plagas, por ejemplo, mediante el uso de un pulverizador tópico para cultivos, verduras o árboles frutales con moléculas de ADN o ARN dirigidas a un gen esencial invertebrado o un gen de un simbionte de la plaga invertebrada. Los polinucleótidos, composiciones y métodos de administración divulgados en la presente además son útiles para proporcionar control de un patógeno viral, por ejemplo, mediante el uso de un pulverizador antiviral tópico para cultivos, verduras o árboles frutales con moléculas de ADN o ARN dirigidas a un gen viral.

Composiciones herbicidas y métodos Un aspecto de la invención proporciona una composición herbicida liquida que comprende moléculas polinucleotídicas como agente letal para plantas que proporciona al menos una especie de ARN monocatenario que puede hibridar en condiciones fisiológicas en una célula vegetal con ARN transcrito a partir de un gen(es) endógeno(s) en la célula vegetal. En algunas modalidades, el gen objetivo codifica una proteína que proporciona tolerancia a un herbicida o codifica un gen esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta. La composición herbicida líquida puede incluir adicionalmente agentes potenciadores de la permeabilidad, herbicidas no nucleotídicos o combinaciones de los mismos y pueden utilizarse en un tratamiento multietapa con el herbicida no nucleotídico y/o los agentes potenciadores de permeabilidad aplicados por separado. Una modalidad de la composición herbicida líquida es un líquido que incluye un tensioactivo de organosilicona como agente potenciador de la permeabilidad y oligonucleótidos o polinucleótidos como agente letal para plantas que proporcionan a las células de la planta ARN monocatenario capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en las células vegetales con ARN transcrito a partir de un gen objetivo en la célula vegetal para producir el silenciamiento del gen objetivo. En una modalidad, una composición herbicida líquida eficaz contra plantas resistentes a glifosato incluye un tensioactivo de organosilicona tal como el tensioactivo Silwet® L-77 y moléculas polinucleotídicas para proporcionar ARN monocatenario capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en las células vegetales con ARN transcrito a partir de un gen EPSPS endógeno o transgénico que codifica una proteína EPSPS que proporciona tolerancia al glifosato. Cuando la molécula polinucleotídica se diseña para hibridar en condiciones fisiológicas en una célula vegetal con ARNm que codifica una proteína o no proteína endógena que codifica ARN que es esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta y para producir el silenciamiento génico y la reducción de la proteina esencial, la molécula polinucleotídica funciona como un agente letal para plantas, es decir, un herbicida nucleotídico. Estas composiciones herbicidas que incluyen moléculas polinucleotídicas pueden adaptarse para revestimiento tópico sobre las hojas de una planta en crecimiento o para aplicación sobre semillas o tallos cortados, por ejemplo, de plantas cultivadas hidropónicamente o en macetas.

Un aspecto de la invención proporciona una composición adaptada para revestimiento tópico sobre las hojas u otras superficies de una planta viva que incluye un agente potenciador de permeabilidad, por ejemplo, un tensioactivo tal como un tensioactivo de organosilicona y oligonucleótidos o polinucleótidos que proporcionan (directamente o indirectamente) ARN monocatenario que puede hibridar en condiciones fisiológicas en una célula vegetal con ARN transcrito a partir de un gen vegetal endógeno en una célula. En una modalidad, el gen vegetal endógeno es un gen vegetal endógeno que codifica una proteína que proporciona tolerancia a herbicidas para herbicidas tales como glifosato, dícamba o sulfonilurea. Más adelante, en la sección "Proteínas de tolerancia a herbicidas", se divulgan ejemplos de dichas proteínas que proporcionan tolerancia a herbicidas.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para controlar plantas espontáneas resistentes a herbicidas que crecen en un campo de cultivos resistentes a herbicidas, que incluye aplicar sobre las hojas u otra superficie de las plantas espontáneas una composición que proporciona o posibilita la producción en células de las plantas espontáneas de una molécula de ARN monocatenario es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de las plantas espontáneas con ARN transcrito a partir de un gen endógeno en las células, en donde el gen endógeno (i) es un gen esencial para mantener el crecimiento o vida de la planta espontánea, (ii) codifica una proteína que proporciona resistencia a herbicidas a la planta espontánea o (iii) se transcribe en un agente regulador de ARN (por ejemplo, promotores, también precursores de miARN, miARN, ARNip fra/is-activos y otros ARN antisentidos que tienen una función reguladora tales como aptámeros y riboswitches). La composición que proporciona o posibilita la producción en células de plantas espontáneas de una molécula de ARN monocatenaria es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de las plantas espontáneas con ARN transcrito a partir de un gen endógeno en las células incluye al menos una molécula polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en (a) una molécula de ARN monocatenaria, (b) una molécula de ARN monocatenaria que se autohibrida para formar una molécula de ARN bicatenaria, (c) una molécula de ARN bicatenaria, (d) una molécula de ADN monocatenaria, (e) una molécula de ADN monocatenaria que se autohibrida para formar una molécula de ADN bicatenaria y (f) una molécula de ADN monocatenaria que incluye un gen Pol III modificado que se transcribe en una molécula de ARN, (g) una molécula de ADN bicatenaria, (h) una molécula de ADN bicatenaria que incluye un gen Pol III modificado que se transcribe en una molécula de ARN, e (i) una molécula de ARN/ADN bicatenaria hibridada. En modalidades para silenciamiento o supresión de un gen endógeno de una planta espontánea que codifica una proteína que proporciona resistencia a herbicidas a la planta espontánea, el método puede incluir aplica sobre la planta espontánea una cantidad del herbicida para el que la proteína le proporciona resistencia. Las composiciones y métodos de la invención son útiles para controlar malezas tolerantes a herbicidas (resistentes) o plantas transgénicas espontáneas tolerantes a herbicidas (resistentes) que pueden crecer en campos de cultivo, por ejemplo, un campo de cultivos resistentes a herbicidas tales como maíz, soja, algodón, colza, remolacha azucarera, alfalfa, caña de azúcar, arroz, trigo, así como también cultivos de frutas y verduras. En algunas de dichas modalidades, la maleza o planta espontánea es amaranto (por ejemplo, palmera amaranto) y otras especies de amaranto, cola de yegua (hierba de caballo), amaranto tuberculoso, ambrosía gigante, ambrosía común, sorgo, amor de hortelano, ryegrás, garranchuelos, lechuga espinaca, yute de china, alfalfa, maíz, soja, colza, algodón, remolacha azucarera, caña de azúcar, arroz o trigo. En algunas modalidades el gen endógeno codifica una proteína que proporciona tolerancia a herbicidas; en la presente se divulgan ejemplos de dichas proteínas en la sección "Proteínas de tolerancia a herbicidas". En otras de dichas modalidades el ARN monocatenario suprime selectivamente un gen en una especie vegetal específica pero no en otras, para permitir el control selectivo de dicha especie vegetal. En otra de dichas modalidades una molécula de ADN monocatenario no selectiva suprime un gen común en múltiples especies vegetales, permitiendo un control más amplio dentro de un grupo o taxón de plantas. En modalidades más específicas, el método además incluye aplicar sobre la maleza o planta espontánea una cantidad de herbicida no nucleotídico (por ejemplo, glifosato, dicamba, glufosinato o sulfonilurea) para el que la proteina a la que se dirige la molécula de ARN proporciona resistencia, permitiendo modos de acción dobles a través de la reducción de la producción de la proteína objetivo mediante la acción de la molécula de ARN y la inhibición de la función de la proteína que se produce por acción del herbicida no nucleotídico; el herbicida puede aplicarse en una etapa aparte (más temprano o más tarde) o junto con la composición nucleotídica. La aplicación de una composición polinucleotidica concomitantemente con o seguida de la aplicación de un herbicida no nucleotídico convencional en algunos casos proporciona control de malezas o plantas espontáneas con efecto sinergístico (es decir, donde el efecto combinado es mayor que la suma de los efectos de los tratamientos administrados por separado).

Proteínas de tolerancia a herbicidasLas plantas naturales (no transgénicas) y transgénicas que exhiben tolerancia a herbicidas (resistencia) a menudo tienen un gen que codifica una proteína que es responsable por la tolerancia a herbicidas, por ejemplo, un transgén que proporciona la tolerancia, un gen endógeno mutado que proporciona la tolerancia o múltiples copias de un gen endógeno al cual se dirige normalmente un herbicida. Una estrategia de control de dichas plantas es aplicar un agente que suprime o al menos reduce la expresión del gen que codifica la proteína que imparte la tolerancia a herbicidas. Los ejemplos de proteínas que proporcionan tolerancia a un herbicida incluyen, por ejemplo, una 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una glifosato oxidorreductasa (GOX), una glifosato decarboxilasa, una glifosato-W-acetil transferasa (GAT), una dicamba monooxigenasa, una fosfinotricina acetiltransferasa, una ácido 2,2-dicloropropionico dehalogenasa, una ácido acetohidroxi sintasa, una acetolactato sintasa, una haloarilnitrilasa, una acetil-coenzima A carboxilasa, una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa, una protoporfirina IX oxigenasa, una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa, una celulosa sintasa, una befa-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa.

Los ejemplos de ácidos nucleicos que codifican proteínas que confieren tolerancia a herbicidas incluyen 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasas (EPSPS; ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Números 5,627,061 , 5,633,435 RE39247, 6,040,497 y 5,094,945 y las Publicaciones de Solicitudes Internacionales PCT WO04074443 y WO04009761 ), glifosato oxidorreductasa (GOX; Patente de los Estados Unidos Número 5.463.175), glifosato decarboxilasa (Publicación de Solicitud Internacional PCT WO05003362, Patente de los Estados Unidos Número 7.405.347 y publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 2004/0177399), glifosato-N-acetil transferasa (GAT; Patente de los Estados Unidos Número 7,714, 188) que confieren tolerancia al glifosato; dicamba monooxigenasa que confieren resistencia a herbicidas similares a auxina tales como dicamba (Patente de los Estados Unidos Número 7,105,724); fosfinotricina acetiltransferasa (pat o bar) que confiere tolerancia a la fosfinotricina o al glufosinato (Patente de los Estados Unidos Número 5,646,024); ácido 2,2- dicloropropionico dehalogenasa que confiere tolerancia al ácido 2,2-dicloropropionico (Dalapon) (Publicación de Solicitud Internacional PCT WO9927116); ácido acetohidroxi sintasa o acetolactato sintasa que confieren tolerancia a inhibidores de acetolactato sintasa tales como sulfonilurea, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidiloxibenzoatos y ftalida (Patente de los Estados Unidos Número 6,225,105); haloarilnitrilasa (Bxn) para conferir tolerancia a bromoxinilo (Patente de los Estados Unidos Número 4,810,648); acetil-coenzima A carboxilasa modificada para conferir tolerancia a ciciohexanodiona (setoxidim) y ariloxifenoxipropionato (haloxifop) (Patente de los Estados Unidos Número 6,414,222); dihidropteroato sintasa (sul I) para conferir tolerancia a herbicidas de sulfonamida (Patente de los Estados Unidos Número 5,719,046); polipéptido fotosistema II de 32 kDa (psbA) para conferir tolerancia a herbicidas de triazina (Hirscberg et al., 1983, Science, 222:1346-1349); antranilato sintasa para conferir tolerancia a 5-metiltriptófano (Patente de los Estados Unidos Número 4,581 ,847); ácido dihidrodipicolínico sintasa (dap A) para conferir tolerancia a aminoetil cisteina (Publicación de Solicitud Internacional PCT W08911789); fitoeno desaturasa (crtl) para conferir tolerancia a herbicidas de piridazinona tales como norflurazón (Patente de Japón JP06343473); hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, una ácido 4-hidroxifenilacét¡co oxidasa y una ácido 4-hidroxifenilacético 1-hidrolasa (Patente de los Estados Unidos 7,304,209) para conferir tolerancia a herbicidas de ciclopropilisoxazol tales como isoxaflutol (Patente de los Estados Unidos Número 6,268,549); protoporfirinógeno oxidasa I modificada (protox) para conferir tolerancia a inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa (Patente de los Estados Unidos Número 5939602); ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1 ) para conferir tolerancia a un herbicida que contiene un resto de ariloxialcanoato (WO05107437); una serina hidroximetiltransferasa (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 2008/0155716), una glutamina sintasa tolerante a glufosinato (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 2009/0018016). Ejemplos de dichos herbicidas incluyen fenoxi auxinas (tales como 2,4- D y diclorprop), piridiloxi auxinas (tales como fluroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP) inhibidores de acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (tales como haloxifop, quizalofop y diclofop) e inhibidores de 5- fenoxiacetato protoporfirinógeno oxidasa IX sustituida (tales como piraflufen y flumiclorac). Las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos que codifican proteínas de tolerancia a herbicidas y las secuencias de las proteínas de tolerancia a herbicidas, tales como se divulgan en las patentes y publicaciones de solicitudes de patentes de los Estados Unidos mencionadas en este párrafo se incorporan a la presente a modo de referencia.

Aspectos de esta invención proporcionan polinucleótidos y métodos que proporcionan directamente o indirectamente a una célula vegetal, A N que hibridan con ARN que codifica dichas proteínas de tolerancia a herbicidas a un nivel que es letal para las plantas o al menos a una nivel para reducir la tolerancia al herbicida. Debido a la degeneración secuencial del ADN que codifica proteínas de tolerancia a herbicidas es posible diseñar un polinucleótido para uso en esta invención que es específicamente eficaz en una planta específica. Debido a la conservación de dominios de ADN entre múltiples plantas es posible diseñar un polinucleótido para uso en esta invención que es eficaz en una variedad de plantas.

En una modalidad el polinucleótido se mezcla con el herbicida correspondiente para potenciar la actividad del herbicida proporcionan una actividad herbicida mejorada. En una modalidad el polinucleótido se utiliza separado del herbicida pero en combinación con una aplicación del herbicida como un pre o postratamiento. En modalidades, el tensioactivo de organosilicona se combina de forma ventajosa con el herbicida y el polinucleótido o se combina con uno o el otro cuando las composiciones se aplican de forma secuencial. Las plantas en un invernadero pueden tratarse utilizando un pulverizador agrícola o un pulverizador de laboratorio con una boquilla de pulverización 1 1001XR para administrar la solución de muestra a una tasa determinada (por ejemplo, 140 L/ha) a 0,25 Pa de presión. En el campo, la solución de tratamiento puede aplicarse con un pulverizador de mochila presurizado con C02 calibrado para administrar la tasa apropiada de la composición con una boquilla de pulverización de chorro plano 1015 con un ensamblaje de boquilla simple adaptado (para minimizar el desperdicio) a una presión de pulverización de 0,25 MPa; el pulverizador de boquilla simple proporciona una pulverización eficaz de 60 cm por encima de la copa de 7.62 a 30 cm de altura de las plantas en crecimiento.

La descripción precedente y los ejemplos presentados en esta divulgación describen el objeto de esta invención, que incluye, a modo no taxativo, aspectos y modalidades descritas en estas oraciones enumeradas con números romanos: (I) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo. (II) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo en células vegetales distintas a las revestidas tópicamente. (III) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo sistémicamente en al menos un órgano vegetal. (IV) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotídica induce la supresión del gen endógeno objetivo. (V) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotídica produce un fenotipo deseado en la planta u órgano vegetal en crecimiento. (VI) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotídica suprime la expresión de una enzima, una proteína estructural o una proteína reguladora vegetal en las plantas u órganos vegetales en crecimiento. (VII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotidica es un agente letal para plantas. (VIII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotidica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el gen endógeno objetivo codifica una proteína que interactúa con un herbicida. (IX) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotidica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el gen endógeno objetivo se selecciona del grupo que consiste en 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante al glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco liasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa. (X) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el gen endógeno objetivo codifica una proteína esencial para mantener el crecimiento de las plantas en crecimiento. (XI) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el gen endógeno objetivo se selecciona del grupo que consiste en RuBisCO, Factor de iniciación de traducción y fitoeno desaturasa. (XII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el gen endógeno objetivo codifica una proteína que proporciona tolerancia a un herbicida. (XIII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el gen endógeno objetivo codifica una enzima acetolactato sintasa muíante que confiere resistencia a los herbicidas de sulfonilurea y imidazolinona o una ACCasa mutante que confiere resistencia a herbicidas de ariloxifenoxi propionato. (XIV) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotidica incluye además un segundo polinucleótido, teniendo el segundo polinucleótido una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de un segundo gen endógeno objetivo o ARN mensajero transcrito a partir del segundo gen endógeno objetivo. (XV) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotidica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotidica incluye además un segundo polinucleótido, teniendo el segundo polinucleótido una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de un segundo gen endógeno objetivo o ARN mensajero transcrito a partir del segundo gen endógeno objetivo, en donde el al menos un polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen EPSPS endógeno en las plantas u órganos vegetales en crecimiento y el segundo polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos del gen de Factor de iniciación de traducción endógeno en las plantas u órganos vegetales en crecimiento. (XVI) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el gen endógeno objetivo es una secuencia antisentido, una secuencia sentido o una combinación de la secuencia antisentido y la secuencia sentido. (XVII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotidica se aplica sobre un órgano de las plantas en crecimiento. (XVIII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotidica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotidica se aplica sobre un hoja, tallo, semilla, fruta o flor de las plantas en crecimiento. (XIX) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotidica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotídica incluye además un segundo polinucleótido, teniendo el segundo polinucleótido una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de un segmento diferente del gen endógeno objetivo o ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo diferente del al menos un polinucleótido. (XX) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde las plantas en crecimiento están en un campo abierto o en un invernadero. (XXI) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde los polinucleótidos no están integrados en el cromosoma de las plantas en crecimiento. (XXII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal. (XXIII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y una sal. (XXIV) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal. (XXV) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal, en donde el copolímero de poliester y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter. (XXVI) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal, en donde la sal es una sal orgánica o una inorgánica . (XXVII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo, una sal de amonio orgánica y una sal de amonio inorgánica.

(XXVIII) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y sulfato de amonio. (XXIX) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal y además incluye un humectante o un agente quelante. (XXX) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde la composición polinucleotídica se aplica sobre las plantas u órganos vegetales en crecimiento mediante un aparato de pulverización. (XXXI) Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotídica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen endógeno objetivo o el ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de las plantas en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión del gen endógeno objetivo, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en ADNmc, ADNbc, ARNmc, ARNbc y híbridos de ARN/ADN. (XXXII) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento. (XXXIII) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotidica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que ¡nteractúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el gen endógeno expresa una proteína que es un gen objetivo de herbicida o un gen de desactivación de herbicida. (XXXIV) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotidica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaría a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el gen endógeno expresa una proteína que es un gen objetivo de herbicida o un gen de desactivación de herbicida seleccionado del grupo que consiste en 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), un ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenase (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante a glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco liasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa. (XXXV) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteina que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde la composición polinucleotídica y el herbicida se aplican por separado o en la misma solución. (XXXVI) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en ADNmc, ADNbc, ARNmc, ARNbc y híbridos de ARN/ADN. (XXXVII) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotidica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde la composición polinucleotidica incluye además un segundo polinucleótido, teniendo el segundo polinucleótido una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de un segmento diferente del gen endógeno objetivo o ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo diferente del al menos un polinucleótido. (XXXVIII) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotidica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde la composición polinucleotídíca incluye además una pluralidad de polinucleótidos, teniendo la pluralidad de polinucleótidos cada uno una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de un segmento diferente del gen endógeno objetivo o ARN mensajero transcrito a partir del gen endógeno objetivo diferente del al menos un polinucleótido. (XXXIX) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídíca que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal. (XL) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y una sal. (XLI) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal. (XLII) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando asi la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal, en donde el copolímero de poliester y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter. (XLIII) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotidica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal, en donde la sal es una sal orgánica o una inorgánica. (XLIV) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotidica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo, una sal de amonio orgánica y una sal de amonio inorgánica. (XLV) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y sulfato de amonio. (XLVI) Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que incluye (a) revestir tópicamente la superficie de una planta en crecimiento una composición polinucleotídica que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de una esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de la planta, en donde el gen endógeno expresa una proteina que interactúa con un herbicida y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que los polinucleótidos permeen el interior de las plantas en crecimiento y (b) aplicar el herbicida a las plantas en crecimiento; con lo cual el al menos un polinucleótido permea el interior de las plantas en crecimiento e induce la supresión del gen endógeno, potenciando así la actividad del herbicida en las plantas en crecimiento, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal, en donde el agente de transferencia incluye además un humectante o un agente quelante. (XLVII) En una composición herbicida líquida adaptada para revestimiento tópico sobre la superficie exterior de plantas en crecimiento que incluye tensioactivo y al menos un agente letal para plantas, la mejora en donde el agente letal para plantas incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen vegetal o la secuencia del ARN transcrito del gen vegetal, produciendo los polinucleótidos la producción sistémica de ARN pequeños que hibridan con una sonda para el gen vegetal. (XLVIII) En una composición herbicida líquida que incluye un herbicida no polinucleotídico, la mejora en donde la composición incluye además polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a una secuencia de una planta vegetal o a una secuencia del ARN transcrito del gen vegetal. (XLIX) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta. (L) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal. (Ll) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el siienciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y una sal inorgánica. (Ll I) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el siienciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal inorgánica. (LUI) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal inorgánica, en donde el copolímero de poliester y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible como el tensioactivo Silwet® L-77). (LIV) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, que incluye además una molécula herbicida no polinucleotidica. (LV) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el gen vegetal codifica una proteína que proporciona tolerancia a herbicidas y es una 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante al glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco Nasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa. (LVI) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta. (LVII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal. (LVIII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y una sal inorgánica. (LIX) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un copolímero de poliester y silicona y una sal inorgánica. (LX) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal inorgánica, en donde el copolímero de poliester y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible como el tensioactivo Silwet® L-77). (LXI) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, que incluye además una molécula herbicida no polinucleotídica. (LXII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el gen vegetal codifica una proteína que proporciona tolerancia a herbicidas y es una 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante al glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco liasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa. (LXIII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibrídar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el sílenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta. (LXIV) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el sílenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal. (LXV) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y una sal inorgánica. (LXVI) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliester y silicona y una sal inorgánica. (LXVII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribióle que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal inorgánica, en donde el copolímero de poliester y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible como el tensioactivo Silwet® L-77). (LXVIII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, que incluye además una molécula herbicida no polinucleotídica. (LXIX) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el gen vegetal codifica una proteína que proporciona tolerancia a herbicidas y es una 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante al glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco Nasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa. (LXX) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribióle que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta. (LXXI) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal. (LXXII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y una sal inorgánica. (LXXIII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliester y silicona y una sal inorgánica. (LXXIV) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal inorgánica, en donde el copolímero de poliester y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible como el tensioactivo Silwet® L-77). (LXXV) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, que incluye además una molécula herbicida no polinucleotídica. (LXXVI) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos del ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el gen vegetal codifica una proteína que proporciona tolerancia a herbicidas y es una 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante al glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco Nasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa. (LXXVII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta. (LXXVIII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal. (LXXIX) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y una sal inorgánica. (LXXX) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliester y silicona y una sal inorgánica. (LXXXI) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo de organosilicona y copolímero de poliéter y silicona y una sal inorgánica, en donde el copolímero de poliester y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible como el tensioactivo Silwet® L-77). (LXXXII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN desde la superficie de la planta hacía las células de la planta, que incluye además una molécula herbicida no polinucleotídica. (LXXXIII) Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN desde la superficie de la planta hacia las células de la planta, en donde el gen vegetal codifica una proteína que proporciona tolerancia a herbicidas y es una 5-enolpiruvilshiquímato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfírina IX oxigenasa (PPO), una hídroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-amínobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante al glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco liasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa. (LXXXIV) Un método para controlar selectivamente plantas espontáneas resistentes a herbicidas objetivo en un campo de cultivos resistentes a herbicidas que incluye aplicar sobre las hojas de las plantas espontáneas una composición que incluye oligómeros polinucleotídicos que proporciona a células de las plantas espontáneas ARN monocatenario sistémico que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de las plantas espontáneas con ARN mensajero que se transcribe a partir de una gen endógeno que (i) es un gen esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta espontánea, (¡i) codifica una proteina que proporciona resistencia herbicida la planta espontánea o (iii) se transcribe en un agente regulador de ARN. (LXXXV) Un método para controlar selectivamente plantas espontáneas resistentes a herbicidas objetivo en un campo de cultivos resistentes a herbicidas que incluye aplicar sobre las hojas de las plantas espontáneas una composición que incluye oligómeros polinucleotídicos que proporciona a células de las plantas espontáneas ARN monocatenario sistémico que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de las plantas espontáneas con ARN mensajero que se transcribe a partir de una gen endógeno que (i) es un gen esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta espontánea, (ii) codifica una proteína que proporciona resistencia herbicida la planta espontánea o (iii) se transcribe en un agente regulador de ARN, en donde la composición incluye un tensioactivo y oligómeros seleccionados del grupo que consiste en ARN monocatenario, ARN bicatenario, ADN monocatenario, ADN bicatenario y ARN/ADN hibridados bicatenarios, en donde los oligómeros tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria al ARN mensajero del gen endógeno; y en donde el gen endógeno es un gen natural o un transgén recombinante. (LXXXVI) Un método para controlar selectivamente plantas espontáneas resistentes a herbicidas objetivo en un campo de cultivos resistentes a herbicidas que incluye aplicar sobre las hojas de las plantas espontáneas una composición que incluye oligómeros polinucleotídicos que proporciona a células de las plantas espontáneas ARN monocatenario sistémico que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de las plantas espontáneas con ARN mensajero que se transcribe a partir de una gen endógeno que (i) es un gen esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta espontánea, (ii) codifica una proteína que proporciona resistencia herbicida la planta espontánea o (iii) se transcribe en un agente regulador de ARN, en donde la planta espontánea es amaranto, yute de china, amaranto tuberculoso, lechuga espinaca, diente de león, alfalfa, maíz, soja, colza, algodón, remolacha azucarera, caña de azúcar, trigo, arroz o una verdura. (LXXXVII) Un método para controlar selectivamente plantas espontáneas resistentes a herbicidas objetivo en un campo de cultivos resistentes a herbicidas que incluye aplicar sobre las hojas de las plantas espontáneas una composición que incluye oligómeros polinucleotídicos que proporciona a células de las plantas espontáneas ARN monocatenario sistémico que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de las plantas espontáneas con ARN mensajero que se transcribe a partir de una gen endógeno que (i) es un gen esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta espontánea, (ii) codifica una proteína que proporciona resistencia herbicida la planta espontánea o (iii) se transcribe en un agente regulador de ARN, en donde los cultivos son maíz, soja, algodón, colza, remolacha azucarera, alfalfa, caña de azúcar, arroz, trigo o cultivos de frutas o verduras. (LXXXVIII) Un método para controlar selectivamente plantas espontáneas resistentes a herbicidas objetivo en un campo de cultivos resistentes a herbicidas que incluye aplicar sobre las hojas de las plantas espontáneas una composición que incluye oligómeros polinucleotídicos que proporciona a células de las plantas espontáneas ARN monocatenario sistémico que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de las plantas espontáneas con ARN mensajero que se transcribe a partir de una gen endógeno que (i) es un gen esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta espontánea, (ii) codifica una proteína que proporciona resistencia herbicida la planta espontánea o (iii) se transcribe en un agente regulador de ARN, en donde el gen endógeno codifica una proteína que proporciona resistencia a herbicidas a la planta espontánea y la proteína es una 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante a glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco liasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina o una serina hidroximetiltransferasa. (LXXXIX) Un método para controlar selectivamente plantas espontáneas resistentes a herbicidas objetivo en un campo de cultivos resistentes a herbicidas que incluye aplicar sobre las hojas de las plantas espontáneas una composición que incluye oligómeros polinucleotídicos que proporciona a células de las plantas espontáneas ARN monocatenario sistémico que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de las plantas espontáneas con ARN mensajero que se transcribe a partir de una gen endógeno que (i) es un gen esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta espontánea, (ii) codifica una proteína que proporciona resistencia herbicida la planta espontánea o (iii) se transcribe en un agente regulador de ARN, en donde el gen endógeno codifica una proteína que proporciona resistencia a herbicidas a la planta espontánea y la proteína es una 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una glutamina sintasa tolerante a glufosinato, una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco liasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteina D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina o una serina hidroximetiltransferasa, que incluye además aplicar sobre la planta espontánea una cantidad del herbicida para el que la proteína proporciona resistencia. (XC) Un método para investigar la genética inversa modulando un gen objetivo endógeno en una planta, incluyendo el método aplicar sobre tejido de una planta en crecimiento: (1) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (2) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (3) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (4) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (5) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta. (XCI) Un método para investigar la genética inversa modulando un gen objetivo endógeno en una planta, incluyendo el método aplicar sobre tejido de una planta en crecimiento: (1) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (2) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (3) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (4) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (5) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno, en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; en donde la composición produce la modulación del gen objetivo durante un período de al menos 1 semana durante la vida de la planta. (XCII) Un método para investigar la genética inversa modulando un gen objetivo endógeno en una planta, incluyendo el método aplicar sobre tejido de una planta en crecimiento: (1) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bícatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (2) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (3) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribióle que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (4) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (5) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; en donde el ARN transcrito en las células es ARN mensajero que codifica una proteína o ARN regulador. (XCIII) Un método para investigar la genética inversa modulando un gen objetivo endógeno en una planta, incluyendo el método aplicar sobre tejido de una planta en crecimiento: (1 ) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (2) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (3) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (4) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (5) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; incluyendo además exponer la planta a un conjunto de compuestos para identificar interacciones con herbicidas. (XCIV) Un método para investigar la genética inversa modulando un gen endógeno en una planta, incluyendo el método aplicar tópicamente sobre tejido de una planta viva: (1) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (2) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ADN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (3) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (4) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de ARN monocatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta; o (5) una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir del gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de la plante con el gen endógeno o con el ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir el silenciamiento del gen endógeno; y (b) un agente de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario desde la superficie de la planta hacia las células de la planta. (XCV) Una composición herbicida que incluye una solución acuosa de (a) un agente para acondicionar una planta para la permeacion de oligómeros polinucleotídicos y (b) oligómeros polinucleotídicos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen endógeno de la planta en sentido antisentido o sentido, en donde el gen endógeno codifica una proteína que proporciona a la planta resistencia a un herbicida químico o es un gen esencial. (XCVI) Una composición herbicida que incluye una solución acuosa de (a) un agente para acondicionar una planta para la permeacion de oligómeros polinucleotídicos y (b) oligómeros polinucleotídicos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen endógeno de la planta en sentido antisentido o sentido, en donde el gen endógeno codifica una proteína que proporciona a la planta resistencia a un herbicida químico o es un gen esencial, incluyendo además un herbicida químico. (XCVII) Una composición herbicida que incluye una solución acuosa de (a) un agente para acondicionar una planta para la permeacion de oligómeros polinucleotídicos y (b) oligómeros polinucleotídicos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen endógeno de la planta en sentido antisentido o sentido, en donde el gen endógeno codifica una proteína que proporciona a la planta resistencia a un herbicida químico o es un gen esencial, incluyendo además un herbicida químico, que incluye compuestos herbicidas de glifosato, dicamba, fosfinotricina, bromoxinilo, ioxinilo o clorsulfurón. (XCVIII) Una composición herbicida que incluye una solución acuosa de (a) un agente para acondicionar una planta para la permeación de oligómeros polinucleotídicos y (b) oligómeros polinucleotídicos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen endógeno de la planta en sentido antisentido o sentido, en donde el gen endógeno codifica una proteína que proporciona a la planta resistencia a un herbicida químico o es un gen esencial, incluyendo además un herbicida químico, que incluye un compuesto de glifosato, un tensioactivo de copolímero de poliester y silicona y oligómeros polinucleotídicos. (XCIX) Una planta que incluye ADN o ARN exógeno para suprimir un gen endógeno, donde el ADN exógeno no está integrado en un cromosoma de la planta y el ARN exógeno no se transcribe a partir de ADN integrado en un cromosoma de la planta y en donde el gen endógeno se suprime mediante aplicación tópica de un polinucleótido en la planta después que la planta ha emergido de una semilla. (C) Un método para administrar un polinucleótido en el interior de una célula vegetal mediante aplicación tópica del polinucleótido al exterior de la célula vegetal, incluyendo el método combinar el polinucleótido con un tensioactivo de organosilicona. (Cl) Un método para administrar un polinucleótido en el interior de una célula vegetal mediante aplicación tópica del polinucleótido al exterior de la célula vegetal, incluyendo el método combinar el polinucleótido con un tensioactivo de organosilicona, en donde el tensioactivo de organosilicona es un copolímero de poliester y silicona. (C II) Un método para administrar un polinucleótido en el interior de una célula vegetal mediante aplicación tópica del polinucleótido al exterior de la célula vegetal, incluyendo el método combinar el polinucleótido con un tensioactivo de organosilicona, en donde el tensioactivo de organosilicona es un copolímero de poliester y silicona, en donde el copolímero de poliester y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter. (Clll) Un método para administrar un polinucleótido en el interior de una célula vegetal mediante aplicación tópica del polinucleótido en el exterior de la célula vegetal, incluyendo el método combinar el polinucleótido con un tensioactivo de organosilicona y una sal orgánica o una inorgánica. (CIV) Un método para administrar un polinucleótido en el interior de una célula vegetal mediante aplicación tópica del polinucleótido en el exterior de la célula vegetal, incluyendo el método combinar el polinucleótido con un tensioactivo de organosilicona y una sal orgánica o una inorgánica, en donde la sal es una sal de amonio. (CV) Un método para administrar un polinucleótido en el interior de una célula vegetal mediante aplicación tópica del polinucleótido en el exterior de la célula vegetal, incluyendo el método combinar el polinucleótido con un tensioactivo de organosilicona y una sal orgánica o una inorgánica, en donde la sal es una sal de amonio, en donde la sal de amonio es sulfato de amonio. (CVI) Un método para administrar un polinucleótido en el interior de una célula vegetal mediante aplicación tópica del polinucleótido al exterior de la célula vegetal, incluyendo el método combinar el polinucleótido con un tensioactivo de organosilicona, en donde la composición polinucleotidica se aplica sobe las plantas u órganos vegetales en crecimiento mediante un aparato pulverizador.

EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención en el control de malezas resistentes a herbicidas. Se identificó que los genotipos de palmera amaranto resistente a glifosato tienen múltiples copias, por ejemplo, de 4 a más de 100 copias del gen que codifica la 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) a la cual se dirigen los compuestos de glifosato en los tratamientos con herbicidas.

En referencia a la SEQ ID NO:1 tal como se muestra en la Figura 1 , se diseñaron cuatro moléculas de ARNbc "cortas" de tamaño de oligonucleótido con una cadena antisentido que es capaz de hibridar con ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de la palmera amaranto en las posiciones 14-38 (ARNbc-1 corto), en las posiciones 153-177 (ARNbc-2 corto), 345-369 (ARNbc-3 corto) y 1105-1129 (ARNbc-4 corto), tal como se indica mediante los nucleótidos subrayados en la Figura 1. Los cuatro ARNbc cortos diseñados se adquirieron de Integrated DNA Technologies (IDT); los ARNbc tenían un excedente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la cadena antisentido y tenían dos desoxinucleótidos como los nucleótidos terminales en el extremo 3' de la cadena sentido.

En referencia a la SEQ ID NO:1 y la Figura 1 , se diseñaron tres polinucleótidos de ARN bicatenario "largo" con una cadena que es capaz de hibridar con el ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de la palmera amaranto en las posiciones 16-170 (ARNbc-1 largo), 451-722 (ARNbc-2 largo) y 1 109-1328 (ARNbc-3 largo) tal como se indica mediante los nucleótidos en negrita en la Figura 1. Los ARNbc largos diseñados se hicieron utilizando el Ambion MEGAscript® RNAi Kit, Cat. No. 1626.

Se cultivaron clones vegetativos de palmera amaranto resistente e glifosato con 16 copias del gen endógeno que codifica EPSPS (Gaines, et al. (2010) Proceedings of the National Academy of Sciences 107(3): 1029-1034) en pocilios cuadrados de 8,89 pulgadas con mezcla para plántulas SunGro® Redi-earth que contenía 3,5 kg/metro cúbico de fertilizante Osmocote® 14-14-14 en un invernadero con un fotoperíodo de 14 horas y una temperatura diurna de 30 grados centígrados y una temperatura nocturna de 20 grados centígrados; las plantas se regaron con agua desionizada según fuera necesario.

Se preparó una solución de pretratamiento de tensioactivo para bañar las hojas, diluyendo el tensioactivo de organosilicona de marca Silwet L-77 con agua destilada hasta 0,1% (v/v). Se preparó una solución de pretratamiento de carburo de silicio al 5% (p/v) mezclando 2 g de carburo de silicio (arena 400) en 40 mi de agua destilada. Se preparó una solución amortiguadora de tratamiento con 10 mM de fosfato de sodio y tensioactivo de organosilicona Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) en agua DEPC (Omega Bio-Tek) y se ajustó hasta pH 6,8. Se preparó una solución de ARNbc corto con cantidades equimolares de cada uno de los cuatro ARNbc cortos (identificados anteriormente) en la solución amortiguadora de tratamiento a una concentración de 0,005 nanomoles de cada ARNbc corto por microlitro. Se preparó una solución de ARNbc largo con cantidades equimolares de cada uno de los tres ARNbc largos en la solución amortiguadora de tratamiento a una concentración de 0,0006 nanomoles de cada ARNbc largo por microlitro. Se preparó una solución mixta de ARNbc (corto/largo) con 0,005 nanomoles de cada uno de los cuatro ARNbc cortos y 0,0006 nanomoles de cada uno de los tres ARNbc largos por microlitro.

Los clones vegetativos de palmera amaranto resistente a glifosato con 16 copias del gen endógeno que codifica EPSPS se pretrataron con la solución de carburo de silicio o la solución de tensioactivo para acondicionar las hojas para transferir o permear los ARNbc. Para el pretratamiento con solución de carburo de silicio se llevó a cabo la abrasión de la hoja frotando suavemente 0,5 mi de la solución de carburo de silicio sobre la superficie superior de una hoja, se enjuagó con agua y se secó con papel secante. Para el pretratamiento con la solución de tensioactivo se sumergieron cuatro hojas fuente maduras, completamente expandidas en la solución de tensioactivo y se dejaron secar. Después del pretratamiento de la hoja con la solución de carburo de silicio o la solución de tensioactivo, las hojas acondiciones se trataron con la solución amortiguadora (como testigo) o con 40 microlitros de una solución de ARNbc (aplicando 10 microlitros de solución de ARNbc en cada una de 4 hojas por planta). En el tratamiento con la solución de ARNbc corto se aplicaron aproximadamente 0,8 nanomoles de moléculas de ARNbc corto (0,2 nanomoles de cada ARNbc corto) a cada planta tratada. En el tratamiento con la solución de ARNbc largo se aplicaron aproximadamente 0,072 nanomoles de moléculas de ARNbc largo (0,024 nanomoles de cada ARNbc largo) a cada planta tratada. En el tratamiento con la solución mixta de ARNbc (corto/largo) se aplicaron aproximadamente 0,8 nanomoles de las moléculas de ARNbc corto y aproximadamente 0,072 nanomoles de las moléculas de ARNbc largo a cada planta tratada. Excepto los testigos, todas las plantas se pulverizaron con una solución de herbicida glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®) inmediatamente, 48 o 72 horas después del tratamiento con ARNbc y se evaluaron al menos después de 7 días postratamiento con glifosato.

Resultados: Seis plantas testigo tratadas con tensioactivo (sin tratamiento con molécula de ARNbc) sobrevivieron al tratamiento con glifosato. Ver la Figura 3A que muestra una fotografía de las plantas 7 días después del tratamiento con glifosato.

Dos de cuatro plantas testigo tratadas con abrasión con carburo de silicio (sin tratamiento con molécula de ARNbc) murieron a causa del tratamiento con glifosato.

Seis plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con glifosato inmediatamente después de la aplicación de la solución mixta de ARNbc (corto/largo) sobrevivieron pero presentaban enanismo.

Seis plantas tratadas con tensioactivo que se trataron solo con la solución mixta de ARNbc (corto/largo) y sin glifosato, sobrevivieron. Cinco de seis plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con las soluciones mixtas de ARNbc (corto/largo) y posteriormente con tratamiento con glifosato, murieron.

Cinco de seis plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con glifosato 48 horas después de la aplicación de la solución mixta de ARNbc (corto/largo) murieron.

Tres de cuatro plantas tratadas con carburo de silicio que se trataron con glifosato 48 horas después de la aplicación de la solución mixta de ARNbc (corto/largo) murieron.

Cinco de seis plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con la solución de ARNbc largo y posteriormente con tratamiento con glifosato después de 72 horas, murieron; ver Figura 3B. Seis de seis plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con la solución de ARNbc corto y posteriormente con tratamiento con glifosato después de 72 horas, murieron; ver Figura 3C.

EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención en la mejor del control de malezas sensibles al herbicida glifosato. Las soluciones mixtas de ARNbc (corto/largo) preparadas en el Ejemplo 1 se aplicaron a plantas de yute de china sensibles al glifosato (un total de 40 microlitros aplicados a dos hojas) que se pretrataron con la solución de tensioactivo utilizada en el Ejemplo 1. Las plantas testigo se trataron solo con solución amortiguadora luego del pretratamiento con la solución de tensioactivo. 48 horas después del tratamiento con ARNbc las plantas se trataron con una solución del herbicida glifosato (53 g de equivalente ácido por hectárea del herbicida glifosato de marca Roundup® WeatherMAX®). Se observó un aumento por duplicado de la actividad del glifosato según se estimó por la observación del crecimiento de la planta (medido como la altura de planta) en las plantas tratadas con la composición polinucleotídica y el herbicida en comparación con las plantas testigo tratadas con solución amortiguadora y herbicida. Las plantas tratadas con la composición polinucleotídica y el herbicida sobrevivieron con un enanismo grave; las plantas testigos tratadas con solución amortiguadora y herbicida sobrevivieron y se recuperaron completamente. Se obtuvieron resultados similares con otros malezas sensibles al herbicida glifosato, es decir, amaranto tuberculoso, bledo, ambrosía gigante, lechuga espinaca, tabaco y diente de león.

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención en el control de malezas en cultivos transgénicos resistentes a glifosato. Se trataron plantas transgénicas de alfalfa, colza, maíz, algodón, arroz, soja, caña de azúcar y trigo que tienen ADN recombinante para expresar una EPSPS bacteriana (ver Patente de los Estados Unidos RE39.247 para ver la descripción de los genes de EPSPS "tipo II" resistentes a glifosato) con (a) la solución de tensioactivo utilizada en el Ejemplo 1 , (b) la solución mixta de ARNbc (corto/largo) preparada en el Ejemplo 1 y (c) una solución de herbicida glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de Roundup® WeatherMAX®) 48 horas después del tratamiento con ARNbc. Después de 30 días todas las plantas de cultivos transgénicos resistentes a glifosato sobrevivieron y no presentaron enanismo.

EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención como agentes herbicidas. Se diseñaron dos moléculas polinucleotídicas de ARNbc para dirigirse a segmentos superpuestos de ARNm que codifican fitoeno desaturasa en tabaco (Nicotiana benthamiana). En referencia a la SEQ ID NO:2 y la Figura 5, un ARNbc dirigido a 192 nt de longitud (se muestra en negrita en la Figura 5) y a 685 nt de longitud (se muestra subrayado en la Figura 5) del ARNm se hizo utilizando un kit Ambion® MEGAscript®. Se prepararon solución de ARNbc separadas. Las hojas de planta de tabaco se pretrataron con la solución de tensioactivo preparada tal como en el Ejemplo 1 y luego se trataron con uno de las soluciones de ARNbc aplicando aproximadamente 0,6 micromoles de ARNbc por planta. El día 9 después del tratamiento con ARNbc, el silenciamiento de la fitoeno desaturasa se evidenció a partir del blanqueado de hojas en hojas apicales; ver Figura 4. A los 15 días después del tratamiento con ARNbc una mitad de las plantas tratadas parecía estar muerta y la otra mitad de las plantas tenía blanqueada la mayor parte de los tejidos por encima del suelo. El análisis de transferencia northern indica la presencia de los ARNip correspondientes a los ARNbc utilizados en el tratamiento.

EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra adicionalmente la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención como agentes herbicidas. Se diseñaron moléculas oligonucleotídicas de ARNbc para dirigirse a ARN que codifica EPSPS para cada una de las siguientes plantas: ambrosía común (Ambrosia artemisiifolia), ambrosía gigante (Ambrosia trífida), sorgo de Alepo (Sorghum halepense), rama negra (Conzya bonariensis), cola de zorro (Digitaria insularis), urochloa (Urochloa panicoides), Poinsettia salvaje (Euphorbia heterophylla), arocillo (Echinochloa colona), quínoa blanca (Chenopodium álbum), almorejo (Setaria viridis), moha (Setaria italic), amor de hortelano (Echinochloa crus-galli), digitaria (Digitaria sanguinalis), cadillo (Xanthium strumarium), alopecuro de campo (Alopecurus myosuroides), avena salvaje (Avena fatua), palo zorrillo (Senna obtusifolia), bejucos {Ipomoea sp.), correhuela (Convolvulus arvensis), sorgo (Sorghum bicolor), hierba del pollo (Commelina ), amor de hombre (Tradescantia sp.), ryegrás (Lolium sp.), pata de ganso (Eleusine indica), cola de caballo (Conzya canadensis), llantén (Plantago lanceolata), palmera amaranto (Amaranthus palmeri), amaranto tuberculoso (Amaranthus tuberculatus), amaranto blanco (Amaranthus albus), quintonil (Amaranthus hybridus), abrebujo (Amaranthus retroflexus), cánamo común (Amaranthus rudis/tuberculatus), amaranto sudamericano (Amaranthus viridis), amaranto de Thunberg (Amaranthus thumbergii), amaranto espinoso (Amaranthus spinosis), (Amaranthus rubra), (Amaranthus lividus), bledo (Amaranthus graecizans), alegría (Amaranthus chlorostachys), amaranto de Powell (Amaranthus powellii), cenizo (Amaranthus blitoides), rodadora (Kochia scoparia), abrepuño (Centaurea solstitialis) y abutilón (Abutilón theophrasti). Las hojas de la planta se pretrataron con la solución de tensioactivo preparada tal como en el Ejemplo 1 y se trataron con las soluciones de ARNbc a una tratamiento de aproximadamente 1 nanomol por planta. Después de 15 días las plantas tratadas murieron, están muriendo o presentan enanismo.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra adicionalmente la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención como agentes herbicidas. Se diseñaron moléculas oligonucleotídicas de ARNbc para dirigirse a ARN que codifica acetolactato sintasa y fitoeno desaturasa para cada una de las plantas indicadas en el Ejemplo 5. Las hojas de la planta se pretrataron con la solución de tensioactivo preparada tal como en el Ejemplo 1 y se trataron con las soluciones de ARNbc a una tratamiento de aproximadamente 1 nanomol por planta. Después de 15 días las plantas tratadas murieron, están muriendo o presentan enanismo.

EJEMPLO 7 Este ejemplo ilustra adicionalmente la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención como agentes herbicidas. El método del Ejemplo 4 se repite para proporcionar oligonucleótidos de ARNbc corto diseñados para dirigirse a ARN que codifica cada una de las siguiente proteínas en la palmera amaranto: una 5-enolpiruvilshiquímato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una acetil-coenzima A carboxilasa, una dihidropteroato sintasa, una protoporfirina IX oxigenasa, una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, una glutamina sintasa, proteína D1 , un factor de iniciación de traducción (TIF), una ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO) y una ATPasa dependiente de ADN (ddATPasa). Las hojas de plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato separadas se trataron con la solución de tensioactivo preparada tal como en el Ejemplo 1 y por separado cada una con las moléculas oligonucleotídicas de ARNbc en la forma del Ejemplo 1 a una tratamiento de 1 nanomol de ARNbc por planta. Después de 30 días las plantas tratadas murieron, están muriendo o presentan enanismo.

EJEMPLO 8 Este ejemplo ilustra la utilidad de emplear un gen Pol III sintético en composiciones y métodos de esta invención. En referencia a la SEQ ID NO:3 y la Figura 2, se creó un gen Pol III sintético utilizando elementos de un gen de ARNmc de U6 de Arabidopsis thaliana para proporcionar una molécula de ADNbc con dos copias de elementos RGCCCR (en negrita y subrayado), un elemento de secuencia hacia 5 (USE) que tiene la secuencia "TCCCACATCG" (SEQ ID NO:4, en negrita y subrayada), una secuencia TATA (en negrita y subrayada), un nucleótido "G" (en negrita y subrayado), ADN antisentido (en cursiva) correspondiente a una ADN bacteriano que codifica una proteína EPSPS (ver Patente de los Estados Unidos RE39.247) que imparte resistencia al herbicida glifosato cuando se expresa en plantas de maíz transgénicas, un elemento "AAGATTAGCACGG" (SEQ ID NO:5, en negrita y subrayado) incluido en el ADN antisentido, un elemento "ACGCATAAAAT" (SEQ ID NO:6, en negrita y subrayado) seguido por el ADN sentido (en minúsculas) y un elemento de terminación "TTTTTT" (SEQ ID NO:7, en negrita y subrayado). Se pulverizaron una solución de tensioactivo de organosilicona de marca Silwet L-77 al 0,1 %p y una solución de múltiples copias de la molécula de ADNbc sobre las hojas de plantas espontáneas de maíz resistentes al glifosato que crecieron en un campo de plantas de soja resistentes al glifosato y posteriormente, 7 días después, se aplicó el tratamiento con el herbicida glifosato de marca Roundup Weather AX®. 15 días después las plantas de maíz murieron y las plantas de soja siguieron creciendo; las plantas de maíz resistentes a glifosato testigo tratadas solo con tensioactivo y herbicida glifosato siguieron creciendo.

EJEMPLO 9 Este ejemplo ilustra un aspecto de la invención. En este ejemplo, las moléculas polinucleotídicas se aplicaron y permearon en tejido vegetal induciendo así la regulación sistémica, es decir, el silenciamiento de un gen objetivo (una EPSPS endógena). Más específicamente, una composición que incluye oligonucleótidos de ADN monocatenario (ADNmc) suprimió la expresión de una EPSPS endógena en palmera amaranto tolerante a glifosato (Amaranthus palmen).

Los oligonucleótidos de ADNmc antisentido se diseñaron utilizando el programa informático IDT SciTools (disponible en idtdna.com/Scitools/Applications/Anti-sense/Anti-sense.aspx). Los oligonucleótidos incluían cuatro oligonucleótidos de ADNmc antisentidos para EPSPS de Amaranthus palmen (SEQ ID NOs:8, 9, 10 y 1 1 ), dos oligonucleótidos de ADNmc antisentido químicamente modificados (modificado con fosgorotioato) para EPSPS de Amaranthus palmen (SEQ ID NOs: 12 y 13) y un oligonucleótido de ADNmc antisentido testigo para un gen testigo, proteína de semilla de cebada (Hordeum vulgare), identificación de GenBank X97636 (SEQ ID NO: 14) y un oligonucleótido de ADNmc antisentido químicamente modificado (marcado en 5'con Alexa Fluor 488 de Invitrogen) para EPSPS de Amaranthus palmeri (SEQ ID NO: 15), tal como se indica en la Tabla ! TABLA 1 Oligonucleótidos de ADNmc antisentido La absorción de los oligonucleótidos se demostró con los oligonucleótidos de ADNmc marcados fluorescentemente (SEQ ID NO: 15) que confirmaron que los oligonucleótidos de ADNmc permearon el tejido de la hoja. Se colocaron peciolos de hojas arrancadas de palmera amaranto resistente a glifosato en 200 mM de solución de sacarosa con oligonucleótidos de ADNmc marcados fluorescentemente (SEQ ID NO:15). Las imágenes de la hoja se obtuvieron con un generador de imágenes Bio-Rad PharosFX equipado con un láser de 488 nm de 4 h hasta 48 h después de la absorción a través del peciolo. Las hojas se incubaron con 200 mM de sacarosa solo y sirvieron como testigo. Se observó una absorción vacuolar ligeramente dependiente del tiempo de los oligonucleótidos de ADNmc marcados fluorescentemente (ver Figura 6). Los oligonucleótidos de ADNmc marcados fluorescentemente se liberaron del tejido vacuolar hacia las células tan temprano como 8 h después del tratamiento y se observó que se acumularon en el borde de la hoja a las 24 h y 48 h, lo que sugiere un efecto de la transpiración.

La supresión de EPSPS se demostró con hojas arrancadas de palmera amaranto resistente a glifosato utilizando la técnica de absorción del peciolo. Se colocaron peciolos de hojas arrancadas de palmera amaranto resistente a glifosato en 200 mM de solución de sacarosa con oligonucleótidos de acuerdo con los tratamientos indicados en la Tabla 2. Las hojas testigo se permearon con el testigo antisentido (SEQ ID NO:14) y adicionalmente se trataron con o sin 50 microgramos/mL de glifosato. Se midieron los niveles de ARNm de EPSPS, proteína EPSPS y shiquimato después de 48 h de incubación. Para evaluar los efectos de los oligonucleótidos de ADNmc antisentidos sobre el ARNm de EPSPS, se aisló el ARN total de la hoja y se llevó a cabo una RT-PCR en tiempo real cuantitativa para comparar los niveles de ARNm de EPSPS. Para evaluar los efectos de los oligonucleótidos de ADNmc antisentidos sobre la proteína EPSPS, se aisló la proteína soluble total de la hoja, se separó mediante SDS-PAGE y se midieron los niveles de proteína EPSPS mediante transferencia Western utilizando anticuerpos contra EPSPS_TIPA de maíz. Los efectos de los oligonucleótidos de ADNmc antisentidos sobre la acumulación de shiquimato como un indicador de la supresión de la EPSPS se evaluaron en dos experimentos: en el experimento 1 , las hojas tratadas con oligonucleótidos se incubaron con 50 microgramos/mL de glifosato durante 48 h adicionales mediante absorción de peciolo (las hojas testigo se permearon con el testigo antisentido (SEQ ID NO: 14) y se trataron adicionalmente con o sin 50 microgramos/mL de glifosato); en el experimento 2, se llevaron a cabo experimentos con discos de hoja en las hojas tratadas con oligonucleótidos y se midieron los niveles de shiquimato mediante HPLC (los testigos en este caso fueron hojas que no habían sido tratadas con oligonucleótidos pero se incubaron con 50 microgramos/mL de glifosato).

TABLA 2 Lista de tratamientos que utilizan oligonucleótidos de ADNmc antisentido Los resultados para expresión de ARNm de EPSPS, niveles de proteína EPSPS y niveles de shiquimato se muestran en las Figuras 7, 8 y 9, respectivamente. Estos resultados demuestran que el tratamiento con los oligonucleótidos de ADNmc antisentidos regularon o suprimieron sistémicamente el gen objetivo disminuyendo los niveles del transcrito del gen objetivo (ARNm de EPSPS) de la proteína (EPSPS) codificada por el gen objetivo en el tejido vegetal. En este experimento específico, los tratamientos No. 1 y No. 6 parecieron ser más eficaces en la supresión de los niveles de ARNm de EPSPS y proteína y en el aumento de la eficacia del glifosato, tal como se evidencia por la acumulación aumentada de shiquimato. Estos resultados también indican que la eficacia del glifosato mejora suprimiendo el ARNm de EPSPS y la proteína en la palmera amaranto resistente al glifosato.

EJEMPLO 10 Este ejemplo ilustra un aspecto de la invención. En este ejemplo, se trataron plantas en crecimiento con una composición aplicada tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta que incluye (a) un agente para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen objetivo en dirección antisentido o sentido. Más específicamente, se trataron plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) con (a) una solución de tensioactivo aplicada tópicamente para acondicionar la planta para la permeación de polinucleótidos y (b) una composición que incluye oligonucleótidos o polinucleótidos de ADN aplicados tópicamente que tiene al menos una cadena que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen objetivo en dirección antisentido o sentido, con la cual se logró la regulación o supresión sistémica del gen objetivo (una fitoeno desaturasa, "PDS").

El gen objetivo utilizado fue de una fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:2), que se muestra en la Figura 10; el segmento que consistía en los nucleótidos 421 - 1120 de la SEQ ID NO:2 (testo subrayado en la Figura 10) se utilizó para diseñar un polinucleótido de ARNbc de 700-mer ("700-mer de PDS") y el segmento que consistía en los nucleótidos 914 - 1 113 de la SEQ ID NO:2 (testo en negrita subrayado en la Figura 10) se utilizó para diseñar un polinucleótido de ARNbc de 200-mer ("200-mer de PDS"). Las secuencias de otros polinucleótidos u oligonucleótidos utilizados en los tratamientos se indican en la Tabla 3. La Figura 11 representa esquemáticamente la ubicación de las secuencias de estos oligonucleótidos y polinucleótidos en relación con la secuencia de fitoeno sintasa (SEQ ID NO:2). Se utilizaron secuencias no vegetales obtenidas del gusano de la raíz del maíz ("CRW"), SEQ ID NOs:27, 28, 29 y 30 como testigos no homólogos. Algunos de los polinucleótidos incluían una secuencia promotora de T7 (indicada por el texto en minúsculas en la Tabla 3) que es un promotor reconocido por una polimerasa de ARN del bacteriófago T7.

TABLA 3 El siguiente procedimiento se utilizó para todos los ensayos descritos en este ejemplo. Se utilizaron plantas de Nicotiana benthamiana con cuatro semanas en todos los ensayos. Las plantas se trataron con solución de Silwet L-77 al 0,1 % hecho recientemente con H20 bidestilada. Se sumergieron dos hojas completamente expandidas por planta (un cotiledón, una hoja verdadera) en la solución de Silwet L-77 durante poco segundos y se dejaron secar durante 15-30 minutos antes de la aplicación de la composición polinucleotidica. La concentración final para cada oligonucleótido o polinucleótido fue 25 microM (en Silwet L-77 al 0,01 % , 5 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8) a menos que se indique lo contrario. Se aplicaron 20 microlitros de la solución a la superficie superior de cada una de las dos hojas pretratadas para proporcionar un total de 40 microlitros (1 nmol de oligonucleótido o polinucleótido) para cada planta. El blanqueado de la hoja se observó 3 días postratamiento.

La Figura 12A ilustra los resultados de un ensayo donde se aplicaron por separado un polinucleótido de ARNbc de 200-mer con una secuencia de ARN correspondiente al segmento "PDS 200-mer" (nucleótidos 914 - 1 1 13 de la SEQ ID NO:2) y una combinación de oligonucleótidos y polinucleótidos de ADN monocatenario (SEQ ID NOs:16, 17, 20, 21 , 24, 25 y 26) a plantas de tabaco. El polinucleótido de ARNbc de 200-mer se aplicó a una concentración de 0,6 microM. El blanqueado de las hojas aplicables se observó después del tratamiento tópico con los polinucleótidos y oligonucleótidos, indicando la regulación o supresión sistémica del gen de fitoeno desaturasa objetivo.

La Figura 12B ilustra los resultados del análisis de transferencia northern de ARN aislado a partir de plantas Nicotiana benthamiana tratadas con solución amortiguadora (testigo), el polinucleótido de ARNbc de 200-mer y los oligonucleótidos de ADNmc. También se muestra el ARN aislado a partir de plantas que se habían estresado manteniéndolas a 4 grados Celsius y en la oscuridad durante toda la noche antes del tratamiento con los polinucleótidos de ARNbc de 200-mer.

La Figura 13 ilustra los fenotipos observados el día 12 después del tratamiento en otro ensayo del efecto de doce combinaciones de polinucleótidos u oligonucleótidos (ver Tabla 4). La Tabla 4 también indica observaciones de blanqueado visible de las plantas el día 5 después del tratamiento y los resultados de las mediciones de clorofila llevadas a cabo los días 7 y 12 después del tratamiento. Las mediciones de clorofila son un indicador de la supresión de la fitoeno desaturasa del gen objetivo y las mediciones que se llevaron a cabo en 6 lugares del área apical, enfocándose en hojas visiblemente blanqueadas o (en plantas sin blanqueado visible) en hojas en ubicaciones equivalentes en las plantas; los valores de medición de clorofila más bajos indicaron supresión de la fitoeno desaturasa. Estos resultados muestran que las combinaciones de oligonucleótidos y polinucleótidos en los tratamientos 2, 3, 4, 8 y 1 1 fueron eficaces para regular (suprimir) sistemáticamente el gen objetivo en las plantas tratadas; el tratamiento 1 también produjo la regulación (supresión) sistemática del gen objetivo en menor medida. El polinucleótido de ARNbc de 200-mer también fue eficaz para regular (suprimir) sistemáticamente el gen objetivo en las plantas tratadas. Los oligonucleótidos de un gen no homólogo (gusano de la raíz de maíz) (tratamientos 5 y 6) no suprimieron el gen de la fitoeno desaturasa objetivo. Estos resultados demuestran que los oligonucleótidos y polinucleótidos de ADN monocatenario sentidos y antisentido fueron eficaces para regular (suprimir) sistemáticamente el gen objetivo en las plantas tratadas. En este ejemplo específicos, los oligonucleótidos sentidos con el promotor de T7 (tratamiento 1) produjeron una supresión sistemática débil del gen de la fitoeno desaturasa, mientras que los oligonucleótidos sentidos sin el promotor de T7 (tratamiento 7) no suprimió el gen de la fitoeno desaturasa. In este ejemplo específico, los oligonucleótidos antisentido con el promotor de T7 (tratamiento 2) así como los oligonucleótidos antisentido sin el promotor de T7 (tratamiento 8) proporcionaron un blanqueado intenso, indicando una regulación sistémica fuerte del gen de la fitoeno desaturasa objetivo.

TABLA 4 La Tabla 5 muestra seis polinucleótidos: un segmento de 40-mer ("ADNmc antisentido de 40-mer de PDS", SEQ ID NO:31 ) que consiste en los 40 nucleótidos más hacia 5' de la "PDS 700-mer" (nucleótidos 1081 - 1 120 de la SEQ ID NO:2) y cuatro polinucleótidos de ADN monocatenario antisentido y un polinucleótido de ADN monocatenario sentido sintetizado en base a la secuencia "ADNmc antisentido de 40-mer de PDS" (SEQ ID NO:31). La Figura 14 ilustra los resultados del tratamiento tópico de plantas de tabaco con los polinucleótidos y oligonucleótidos. Se observó un blanqueado intenso de las hojas apicales que indica la regulación o supresión sistémica del gen objetivo de la fitoeno desaturasa después del tratamiento tópico con el ADNmc antisentido de 21 mer de PDS y el ADNmc antisentido de 33 mer de PDS, así como también después del tratamiento tópico con el polinucleótido de ARNbc de 700 mer amplificado por PCR y purificado en columna ("ARNbc de 700 mer amplificado por PCR"), oligonucleótidos de 22 mer antisentido de PDS sometidos a ensayo previamente con un promotor de T7 (SEQ ID NOs:20 y 21) ("T7 antisentido de PDS") o oligonucleótidos de 22 mer antisentido de PDS sometidos a ensayo previamente sin un promotor de T7 (SEQ ID NOs:22 y 23) ("antisentido de PDS"). No se observó o se observó poco blanqueado de las hojas aplicables después del tratamiento tópico solo con la solución amortiguadora ("Buffer") o después del tratamiento tópico con polinucleótido de ARNbc de 700 mer desnaturalizados por calor (5 minutos a 95 grados Celsius, a continuación almacenados sobre hielo) ("ARNbc de 700-mer calentado de PDS"), el ADNmc antisentido de 15 mer de PDS o el ADNmc antisentido de 18 mer de PDS .

TABLA 5 Los resultados de otro ensayo se muestran en la Figura 15, se observó un blanqueado de las hojas apicales indicando una regulación o supresión sistémica del gen objetivo de la fitoeno desaturasa después del tratamiento tópico con el ADNmc antisentido de 21 mer de PDS (SEQ ID NO:34, "ADNmc antisentido de 21 mer de PDS") o con oligonucleótidos de 22 mer antisentido de PDS sometidos a ensayo previamente sin un promotor de T7 (SEQ ID NOs:22 y 23) ("antisentido de PDS"). No se observó o se observó un blanqueado de hojas apicales poco visible después del tratamiento tópico solo con la solución amortiguadora ("control: buffer") o después del tratamiento tópico con ADNmc sentido de 21 mer de PDS (SEQ ID NO:36, "sentido de 21mer de PDS").

EJEMPLO 11 Este ejemplo ilustra el tratamiento de plantas en crecimiento con una composición aplicada tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta que incluye (a) un agente para acondicionar una planta a la permeación de polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen objetivo en dirección antisentido o sentido. Más específicamente, este ejemplo demuestra la especificidad objetivo (especificidad secuencial) de los polinucleótidos.

La fitoeno desaturasa de palmera amaranto (PDS) tiene la secuencia TCAATTTCATCTATTGGAAGTGATTTTTTGGGTCATTCTGTGA GAAATTTCAGTGTTAGTAAAGTTTATGGAGCAAAGCAAAGAAATGGGCAC TGCCCTTTAAAGGTTGTTTGTATAGATTATCCTAGGCCAGAGCTTGAAAGT ACATCCAATTTCTTGGAAGCCGCCTACTTATCTTCTACTTTTCGGAATTCG CCTCGTCCTCAGAAGCCATTAGAAGTTGTAATTGCTGGAGCAGGTTTGGC TGGTCTATCCACGGCAAAGTATTTAGCTGATGCAGGTCACAAACCCATAT TGTTGGAAGCACGAGATGTTTTAGGAGGAAAGGTTGCAGCGTGGAAGGA TGAGGATGGTGACTGGTATGAGACTGGGCTACATATATTCTTTGGGGCAT ATCCAAATGTCCAAAATCTATTTGGAGAACTTGGTATAAATGACCGACTGC AATGGAAGGAGCACTCTATGATTTTTGCAATGCCCAGCAAGCCCGGTGAA TTCAGTCGCTTTGATTTTCCCGAAATCCTGCCTGCACCATTAAATGGCATA TGGGCAATCCTAAGAAATAATGAAATGCTAACCTGGCCAGAAAAAATCAA GTTTGCCATTGGCTTGTTGCCTGCTATGGCAGGCGGACAGTCATATGTTG AAGCACAAGATGGTTTGAGTGTCCAAGAGTGGATGAGAAAACAAGGAGTA CCCGATCGTGTAACTGATGATGTGTTTATTGCCATGTCAAAGGCACTGAA CTTCATAAATCCCGATGAACTTTCAATGCAGTGCATCTTGATTGCTCTGAyA CCGA TTCCTG CAGGA GAAA CA TG G TTC TAA GATGGCC TTCC TA GA CGGAA ACCCTCCAGAGAGGCTGTGCATGCCTA TTG TTAAA CA CA TCGA G TCA C TA GGTGGTGAAG TTAAA C TTAA CTCTCG TA TACAAAAGA TTCAGTTGGACCA GAGTGGAAGCGTGAAGAGTTTTTTGCTAAATAACGGGAGGGAAATACGA GGAGATGCCTATGTTTTTGCCACCCCAGTTGACATCTTGAAGCTGTTACTA CCTGATACTTGGAAGGAAATCTCATACTTCAAAAAACTTGAGAAATTAGTG GGCGTTCCTGTGATTAATGTTCACATATGGTTTGACAGAAAATTAAAGAAT ACATATGACCATCTACTCTTCAGCAGGAGTCCTCTTTTGAGTGTCTATGCT GATATGTCGGAGACATGCAAGGAATATAAGGATCCAAATAGATCCATGCT GGAATTGGTTTTTGCACCCGCGGAGGAATGGATTTCACGAAGCGACACT GATATTATAGAGGCAACAATGAAAGAGCTTGCCAAGCTTTTCCCGGATGA AATCGCTGCCGATGGAAGCAAGGCCAAGATCCTCAAATATCATGTCGTCA AAACTCCAAGGTCGGTTTATAAGACTGTACCGGATTGTGAACCTTGTCGG CCGCTGCAAAGATCACCAATAGAGGGTTTCTATTTAGCTGGTGATTACAC AAAACAAAAATATTTGGCTTCTATGGAAGGTGCTGTCTTATCTGGGAAGCT TTGTGCACAGGCTATCGTACAGGATTATGATCTGCTGAGTTCTCGAGCAC AAAGAGAATTGGCG (SEQ ID NO:37).

Se sintetizaron un polinucleótido de ARNbc de 678 pares de bases con una cadena antisentido capaz de hibridar con el ARN codificado por los nucleótidos en las posiciones 317 - 994 (se muestran como texto subrayado) en la SEQ ID NO:37 y un polinucleótido de ARNbc de 198 pares de bases con una cadena antisentido capaz de hibridar con el ARN codificado por los nucleótidos en las posiciones 797 - 994 (se muestran como texto en cursiva y subrayado) en la SEQ ID NO:37.

La fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana tiene la secuencia ATGCCCCAAATCGGACTTGTATCTGCTGTTAATTTGAGAGTC CAAGGTAATTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCTTCGTTGGGAACTGA AAGTC GATGTTTGCTTGCAMGGAATTTGTTATGTTTTGGTAGTAGCGA CTCCATGGGGCATAAGTTAAGGATTCGTACTCCAAGTGCCACGACCCGAA GATTGACAAAGGACTTTAATCCTTTAAAGGTAGTCTGCATTGATTATCCAA GACCAGAGCTAGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCGGCGTTATTATCA TCATCGTTTCGTACTTCCTCACGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTATT GCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATCTGGCAGATGC TGGTCACAAACCGATATTGCTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGGTGGGAAG GTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGGTTGC ACATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATGCAGAACCTGTTTGGAGAACTAG GGATTGATGATCGGTTGCAGTGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCGATG CCTAACAAGCCAGGGGAGTTCAGCCGCTTTGATTTTCCTGAAGCTCTTCC TGCGCCATTAAATGGAATTTTGGCCATACTAAAGAACAACGAAATGCTTAC GTGGCCCGAGAAAGTCAAATTTGCTATTGGACTCTTGCCAGCAATGCTTG GAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGACGGTTTAAGTGTTAAGGACTGG ATGAGAAAGCAAGGTGTGCCTGATAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATTG CCATGTCAAAGGCACTTAACTTCATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAG TGCATTTTGATTGCTTTGAA CAGA TTTC TTCA G GA GAAA CA TGGTTCAAAA ATGGCC TTTTTA GA TG G TAACCC TCC TGA GA GA C TTTGCA TGCCGA TTG T GGAA CA TA TTGA G TCAAAA GGTGGCCAAG TCA GA C TAAA C TCA CGAA TA A AAAAGA TCGAGCTGAA TGAGGA TGGAAGTGTCAAA TGTTTTA TACTGAATA A TGGCAG r^CAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGAT ATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAA AAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTT TGACAGAAAACTGAAGAACACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGCC CGTTGCTCAGTGTGTACGCTGACATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTACA ACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACCCGCAGAAGAGTGG ATAAATCGTAGTGACTCAGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCG AAGCTTTTCCCTGATGAAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTG AAGTATCATGTTGTCAAAACCCCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGT TGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCCCTATAGAGGGTTTTTATTTA GCTGGTGACTACACGAAACAGAAGTACTTGGCTTCAATGGAAGGTGCTGT CTTATCAGGAAAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGGATTACGAGTTACT TCTTGGCCGGAGCCAGAAGATGTTGGCAGAAGCAAGCGTAGTTAGCATA GTGAACTAA (SEQ ID NO:38).

Se sintetizaron un polinucleótido de ARNbc de 685 pares de bases con una cadena antisentido capaz de hibridar con el ARN codificado por los nucleótidos en las posiciones 421 - 1 105 (se muestran como texto subrayado) en la SEQ ID NO:38 y un polinucleótido de ARNbc de 192 pares de bases con una cadena antisentido capaz de hibridar con el ARN codificado por los nucleótidos en las posiciones 914 - 1105 (se muestran como texto en cursiva y subrayado) en la SEQ ID NO:38.

Se llevó a cabo una alineación de las secuencias de ADN de PDS de palmera amaranto y Nicotiana benthamiana utilizando una alineación en pares global (extensor) y se ¡lustra en la Figura 16; con este método las dos secuencias exhibieron aproximadamente 71 % de identidad (1252/1762).

Las plantas de palmera amaranto que tenían 16 copias de EPSPS y 12 - 20 cm de altura se trataron con una solución de Silwet L-77 al 0, 1 % preparada recientemente con H20 bidestilada. Se sumergieron cuatro hojas completamente expandidas por planta en la solución de Silwet L-77 durante pocos segundos y se dejaron secar durante 30 minutos hasta 1 hora antes de la aplicación de la composición polinucleotídica. Se hicieron soluciones individuales de polinucleótidos para cada uno de ARNbc de PDS de palmera de 678 pb, ARNbc de PDS de palmera de 198 pb, el ARNbc de PDS de Nicotiana benthamiana de 685 pb y el ARNbc de PDS de Nicotiana benthamiana de 192 pb (0,6 micromolares de polinucleótido en Silwet L-77 al 0,01 %, 5 m de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8). Se aplicaron 10 microlitros de solución de polinucleótido (o solución amortiguadora como testigo) sobre la superficie superior de de cada una de las cuatro hojas pretratadas por planta para proporcionar un total de 40 microlitros para cada planta. Las plantas se mantuvieron en una cámara de crecimiento y el blanqueado de hojas se observó 3 días postratamiento. Las plantas tratadas tópicamente con ARNbc de PDS de palmera de 678 pb o ARNbc de PDS de palmera de 198 pb, exhibieron blanqueado de hojas (que indica silenciamiento de la fitoeno desaturasa endógena) pero las plantas de palmera amaranto tratadas tópicamente con ARNbc de PDS de Nicotiana benthamiana de 685 pb o ARNbc de PDS de Nicotiana benthamiana de 192 pb no exhibieron blanqueado de hojas. Esta especificidad secuencial demuestra que las composiciones polinucleotídicas y métodos de la invención son útiles para el control selectivo de una especie o taxón dado que tiene una secuencia de gen objetivo específica, por ejemplo, para el control de plantas espontáneas resistentes a herbicidas que crecen en una campo de plantas de cultivo resistentes al mismo herbicida.

En un ensayo aparte, las plantas de palmera amaranto tratadas tópicamente con ARNbc de PDS de palmera 678 pb (marcados como "700 nt dsRNA PDS") o ARNbc de PDS de palmera de 198 pb (marcados como "200 nt dsRNA PDS") exhibieron blanqueado de hojas (que indica el silenciamiento de la fitoeno desaturasa endógena) pero las plantas de palmera amaranto tratadas tópicamente con un ARNbc de 260 pares de bases de un gen invertebrado (marcado como "260 nt dsRNA DV49", del gusano de la raíz de maíz Diabrotica virgifera) no resultaron en un fenotipo blanqueado, indicando que no hubo silenciamiento de la fitoeno desaturasa endógena (Figura 17). Esta especificidad secuencial demuestra que las composiciones polinucleotídicas y los métodos de la invención son útiles para el control selectivo de una especie o taxón dado.

EJEMPL0 12 Este ejemplo describe el uso de una composición aplicada tópicamente que incluye al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen objetivo en dirección antisentido o sentido para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta. Más específicamente, este ejemplo demuestra el uso de un único tratamiento con un oligonucleótido de fitoeno desaturasa (PDS) para inducir el silenciamiento sistémico en diferentes órganos vegetales incluidos hojas, tallos y flores.

Se utilizaron plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) con cuatro semanas en todos los tratamientos. Se acondicionaron dos hojas completamente expandidas (un cotiledón, una hoja verdadera) sumergiéndolas en solución de tensioactivo preparada recientemente (Silwet L-77 al 0,1 % en agua bidestilada) durante pocos segundos y se dejaron secar durante 15 - 30 minutos. Se aplicaron veinte microlitros de un oligonucleótido de 22 mer de ADN monocatenario (ADNmc) con la secuencia GGCAGTACAATTAAAGGAGATG (SEQ ID NO:39), correspondiente a los nucleótidos en las posiciones 1099 - 1 120 de la fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:2) como 25 micromolares de solución de 0,01% de Silwet L-77 en 5 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8 sobre la superficie superior de cada hoja acondicionada para un total de 40 microlitros (1 nanomol de oligonucleótido) por planta. Las plantas testigo se trataron con la solución de Silwet sin el oligonucleótido de ADN . Las plantas se observaron para determinar el blanqueado 3 días postratamiento. Las hojas apicales, tallos y flores de plantas tratadas con el oligonucleótido de ADN exhibieron todos blanqueado indicando el silenciamiento sistémico de PDS (Figura 18A).

Se dejó que las flores de las plantas tratadas con ADNmc y testigo produjeran semillas. Se recogieron semillas de frutas maduras, se pesaron y se dejaron germinar. Los pesos de las semillas eran idénticos (aproximadamente 11 mg por 100 semillas) y la morfología de la semilla parecía similar entre las plantas tratadas con ADNmc y las testigo. Se observó una cantidad reducida de semillas producidas por fruta y una reducción en la tasa de germinación (4 de 100 semillas germinaron) en semillas de las plantas tratadas con ADNmc, en comparación con la cantidad de semillas por fruta y tasa de germinación (95 de 100 semillas germinadas) de semillas de plantas testigo.

En un ensayo aparte utilizando un procedimiento similar, se acondicionaron plantas de tabaco sumergiéndolas en Silwet L-77 al 0,1 % en agua bidestilada, se dejaron secar durante 15 - 30 minutos y se trataron con ADNmc de 22 mer de PDS (SEQ ID NO:39) aplicado como 25 micromolares de solución de 0,01 % de Silwet L-77 en 5 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8 sobre la superficie superior de cada hoja acondicionada para un total de 40 microlitros (1 nanomol de oligonucleótido) por planta. Otras plantas no se acondicionaron con tratamiento de tensioactivo pero se trataron solo con 1 nanomol del ADNmc de 22 mer de PDS (SEQ ID NO:39) aplicado mediante infiltración con una jeringa sin aguja (se muestra en la Figura 18B) o mediante aplicación manual de gotas sobre la superficie de la hoja (no se muestra en la Figura 18B) y como 25 micromolares de solución de 0,01 % de Silwet L-77 en 5 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8 o como 25 micromolares de solución en 5 milimolares de una solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8 (sin tensioactivo). Las plantas control negativo se trataron con la solución amortiguadora de Silwet sin el oligonucleótido de ADN. Los resultados se muestran en la Figura 18B. Todas las plantas tratadas solo con aplicación directa del ADNmc de PDS (sin acondicionamiento mediante tratamiento con tensioactivo Silwet L-77), ya sea aplicado por infiltración o por aplicación manual de gotas, exhibieron blanqueado de hojas apicales, tallos y flores, indicando el silenciamiento sistémico de PDS.

EJEMPLO 13 Este ejemplo ilustra métodos y composiciones aplicadas tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico que incluye el uso de agentes para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos. Más específicamente, este ejemplo describe el uso de polinucleótidos de la invención para controlar la palmera amaranto resistente a herbicida.

Las plantas de palmera amaranto que tienen una cantidad menor (menos de 30) de copias de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) son susceptibles al tratamiento con ARNbc diseñado para silenciar la EPSPS con posterior tratamiento con glifosato (ver detalles en el Ejemplo 1). Sin embargo, las plantas de palmera amaranto que tienen grandes cantidades de copias de EPSPS (es decir, 30 o más copias de EPSPS) son resistentes al tratamiento con glifosato y son un desafio la gestión de la resistencia a malezas. Por ejemplo, en un ensayo (no se muestran los resultados) en palmera amaranto resistente a glifosato con gran cantidad de copias utilizando tratamientos similares a los descritos en el Ejemplo 1 pero donde se aumentó la dosis de ARNbc hasta diez veces (es decir, 8 nanomoles de ARNbc corto descrito en el Ejemplo 1 por planta) o donde se utilizó una formulación de glifosato patentada ("herbicida marca Roundup® WeatherMAX®") combinada con un tensioactivo de amina de cebo, la actividad del glifosato mejoró (estimada mediante la observación del crecimiento de la planta medido por la altura de la planta) pero las plantas resistentes no murieron.

Se trataron tres líneas diferentes de palmera amaranto resistente a glifosato con gran cantidad de copias (3 plantas por repetición) con ARNbc utilizando las condiciones de tratamiento indicadas en la Tabla 6, donde el vehículo de administración de ARNbc, el agente de permeabilización o acondicionamiento y otras etapas se variaron. Los resultados se muestran en la Figura 19. El tratamiento con glifosato "4X" (es decir, tratamiento con 3360 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® que es cuatro veces mayor a la tasa estándar de aplicación de 840 g equivalente ácido por hectárea) solo no mató la palmera amaranto con 35 copias (experimento 3) ni con 57 copias (experimento 6).

En un conjunto de experimentos (1 - 3, Tabla 6), que incluyen sulfato de amonio al 2% en un vehículo de administración de ARNbc acuoso que comprende tensioactivo de amina de cebo al 0,1 % y glicerol al 10% (experimento 2) se mejoró la eficacia de una dosis 10 veces mayor de ARNbc con posterior aplicación de un glifosato 4X. También se observó una eficacia mejorada de una dosis 10 veces mayor de ARNbc con posterior aplicación de glifosato cuando se incluyó sulfato de amonio en un vehículo de administración ARNbc sin un tensioactivo de amina de cebo (experimento 8).

En otro conjunto de experimentos (4 - 6, Tabla 6), la aplicación del tensioactivo Silwet L-77 antes de la aplicación del ARNbc en un vehículo de administración que contiene sulfato de amonio fue eficaz, mientras que la combinación del tensioactivo Silwet L-77 con el ARNbc en el vehículo de administración de ARNbc que contenía sulfato de amonio no fue eficaz. La aplicación de glifosato ("herbicida marca WeatherMAX®") a las 72 horas (experimento 7) fue menos eficaz que la aplicación de glifosato a las 48 horas (experimento 2) después del tratamiento con ARNbc.

TABLA 6 *el glifosato (como la formulación comercial "herbicida marca Roundup® WeatherMAX®" que contiene 660 g/L de glifosato K+ sal en un portador que incluye la mezcla de tensioactivo de amina de cebo MON56151 de amina de cebo (16-18C) y cocoamina (12-14C) en la relación 55:45) se indica en la cantidad utilizada (donde 1X = 840 g equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®, 4X = 3360 g equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®) y las horas después de la aplicación del ARNbc.

EJEMPLO 14 Este ejemplo ilustra métodos y composiciones aplicadas tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos.

Se descubrió que dos ARN pequeños identificados a través de secuenciación de ARN pequeños eran abundantes y exclusivos de plantas de palmera amaranto que habían sido tratadas con cuatro moléculas de ARNbc "corto" de EPSPS de tamaño de oligonucleótidos tal como se describió en el Ejemplo 1. Estos dos ARN pequeños se mapearon respectivamente en las posiciones de nucleótidos 743 - 764 y 566 - 585 de la EPSPS de longitud completa que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 20 (SEQ ID NO:40). Se diseñaron dos moléculas de ARNbc "corto" de tamaño de oligonucleótido de 25 nucleótidos de longitud con una cadena antisentido que es capaz de hibridar con el ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de palmera amaranto en las posiciones nucleotídicas 743 - 767 ("ARCbc corto- 5") y 564 - 588 ("ARCbc corto-6"), tal como se indica mediante los nucleótidos en cursiva subrayados en la SEQ ID NO:40 que se muestra en la Figura 20, que también muestra las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido (testo subrayado sin cursiva) y los tres polinucleótidos de ARN bicatenario "largos" (texto en negrita), tal como se describió en Ejemplo 1.

La aplicación de una mezcla de cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido (descritos en el Ejemplo 1) con posterior aplicación de glifosato repitiendo el procedimiento de tratamiento descrito en el Ejemplo 1 resultó en 4 de 4 plantas de palmera amaranto con 16 copias de EPSPS muertas. El uso del mismo procedimiento de tratamiento pero aplicando ARNbc de 5 corto y ARNbc de 6 corto juntos resultó en 0 de 4 plantas de palmera amaranto muertas. La adición de cualquiera o ambos ARNbc de 5 corto y ARNbc de 6 corto a la mezcla de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido (descritas en el Ejemplo 1 ) resultó en 4 de 4 plantas de palmera amaranto muertas, es decir, no se observó un efecto antagonístico del ARNbc de 5 corto y el ARNbc de 6 corto.

EJEMPL0 15 Este ejemplo ilustra métodos y composiciones aplicadas tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos. Más específicamente, este ejemplo describe el uso de ácido salicílico y polinucleótidos.

El ácido salicílico (SA) induce la resistencia a virus en el tabaco; ver, por ejemplo, Chivasa et al. (1997) Plant Cell, 19:547 - 557. Las plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que tienen 49 o 63 copias de EPSPS se pretrataron con 5 milimolares de SA. Se aplicó una solución de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido (descritas en el Ejemplo 1 ) manualmente a 1 , 5 o 24 horas después del tratamiento con SA, con posterior con pulverización con glifosato 72 horas después (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de marca Roundup® WeatherMAX®). No se observó mejora de los efectos de los ARNbc y la actividad de glifosato (estimada mediante la observación del crecimiento de la planta medido por la altura de la planta) para cualquiera de los tratamientos con SA a los 7 días después del tratamiento con glifosato.

EJEMPLO 16 Este ejemplo ilustra métodos y composiciones aplicadas tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos. Más específicamente, este ejemplo describe variaciones en el orden y tiempo de aplicación de polinucleótidos y solución de tensioactivo.

Estos ensayos se llevaron a cabo en plantas de palmera amaranto con grandes cantidades de copias (56, 63 o 100 copias) de EPSPS, utilizando un protocolo que incluye las siguientes etapas: (1 ) aplicación de ARNbc (una solución de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido descritas en el Ejemplo 1) en una solución que contenía tensioactivo de amina de cebo y glicerol; (2) aplicación de 1 % de tensioactivo de silicona Silwet L-77; y (3) aplicación de glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de marca Roundup® WeatherMAX®). Se evaluó la separación del tiempo de aplicación de los polinucleótidos y la aplicación de Silwet, aplicándose el Silwet por pulverización a los 30 minutos, 1 hora o 2 horas después de la aplicación de la solución de ARNbc. En este conjunto de ensayos, los tres tiempo diferentes de aplicación de la solución de Silwet produjeron resultados similares, es decir, enanismo de crecimiento en la mayoría de las plantas con gran cantidad de copias que se trataron con la solución de ARNbc, tal como se comparó con las plantas de gran cantidad de copias testigo que se trataron con una solución testigo que contenía solo tensioactivo de amina de cebo y glicerol.

EJEMPLO 17 Este ejemplo ilustra métodos y composiciones aplicadas tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos.

Más específicamente, este ejemplo describe la aplicación de polinucleótidos de la invención mediante pulverización de bajo volumen y el uso de un tensioactivo de silicona y sulfato de amonio.

Se aplicó una solución de ARNbc (una solución de los cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido descritas en el Ejemplo 1 ) en una solución que contenía 2% de sulfato de amonio mediante pulverización de bajo volumen a palmera amaranto que tenía 16 copias de EPSPS, con posterior pulverización con glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®), que resultó en la muerte de las plantas de palmera amaranto.

Se trataron seis plantas de palmera amaranto por tratamiento con un procedimiento de tres etapas utilizando pulverización de bajo volumen: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; (2) pulverización de 2 mililitros de una solución de ARNbc que contenía cantidades iguales de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido descritas en el Ejemplo 1 a una de 3 dosis (1X o 0,8 nanomoles por planta, 2X o 1 ,6 nanomoles por planta o 4X o 3,2 nanomoles por planta); y (3) pulverización de glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®) a una tasa de 159 litros/ 0.40 ha. Nueve días después de la pulverización con glifosato, todas las seis plantas que se pulverizaron con 4X (3,2 nanomoles por planta) de ARNbc murieron y las plantas pulverizadas con 2X (1 ,6 nanomoles por planta) de ARNbc o 1X (0,8 nanomoles por planta) de ARNbc presentaban enanismo (Figura 21A).

Se llevaron a cabo varios ensayos en palmera amaranto resistente a glifosato cultivada a partir de semillas recogidas en el campo. Las plantas se trataron con varios protocolos descritos a continuación, tratándose tópicamente algunas plantas con una solución de ARNbc y tratándose las plantas testigo con la solución amortiguadora (vehículo de ARNbc); la aplicación se hizo mediante pulverización de bajo volumen. A menos que se indique lo contrario, la solución de ARNbc contenía cantidades iguales de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido descritas en el Ejemplo 1 en solución amortiguadora a una dosis "4X" (3,2 nanomoles por planta); la solución amortiguadora consistía en 10 milimolares de fosfato de sodio y 0,01 % (v/v) de tensioactivo de organosilicona Silwet L-77 en agua con dietilpirocarbonato (DEPC) (Omega Bio-Tek) y se ajustó hasta pH 6,8; y el herbicida era un herbicida de glifosato aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/ 0.40 ha. Los resultados se proporcionan en la Tabla 7.

Ensayos 1 y 2: Estos ensayos se llevaron a cabo en palmera amaranto resistente a glifosato cultivada a partir de semillas obtenidas de una muestra de suelo de una granja con plantaciones de palmera amaranto resistente a glifosato conocidas. Para el ensayo 1 , se trataron diez plantas por tratamiento de la siguiente forma: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1%; (2) pulverización de 2 mililitros de la solución de ARNbc; y (3) pulverización de glifosato. Para el ensayo 2, se trataron dieciocho plantas por tratamiento utilizando el mismo procedimiento que en el ensayo 1.

Ensayo 3: Este ensayo comparó tratamientos aplicados a diferentes etapas de desarrollo y utilizó plántulas cultivadas a partir de semillas de palmera amaranto de un sitio del Condado de Macón, GA y seleccionados por su resistencia al glifosato. La solución amortiguadora incluía 2% de sulfato de amonio. Se trataron doce plántulas pequeñas (etapa de hoja 3) o doce plántulas grandes (etapa de hoja 5) por tratamiento de la siguiente forma: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; (2) pulverización de 2 mililitros de la solución de ARNbc; y (3) pulverización de glifosato. Este tratamiento proporcionó mejor control (murieron más plantas) en plántulas pequeñas en comparación con plántulas más grandes. El tratamiento con ARNbc mató o provocó enanismo en más plantas resistentes al glifosato que el tratamiento con solución amortiguadora y herbicida, aunque a los 16 días después del tratamiento no todas las plantas tratadas con ARNbc habían muerto.

Ensayos 4 y 5: Estos ensayos utilizaron plantas de palmera amaranto cultivadas a partir de semillas en suelo de una granja de Pemiscot, MO. La solución amortiguadora incluía 2% de sulfato de amonio. Se trataron once plántulas pequeñas (etapa de hoja 3) de la siguiente forma: (1 ) pulverización de Silwet L-77 al 1%; (2) pulverización de 2 mililitros de la solución de ARNbc; y (3) pulverización de glifosato. Para el ensayo 5, Se trataron doce plantas por tratamiento utilizando el mismo procedimiento que en el ensayo 4.

Ensayo 6: Este ensayo utilizó plantas de palmera amaranto cultivadas a partir de semillas en suelo de la granja "Ivy2". La solución amortiguadora incluía 2% de sulfato de amonio. Se trataron dieciocho plántulas pequeñas (etapa de hoja 3) por tratamiento de la siguiente forma: (1 ) pulverización de Silwet L-77 al 1%; (2) aplicación de 2 mililitros de la solución de ARNbc, manualmente o mediante pulverización; y (3) pulverización de glifosato. En este ensayo el método de aplicación (manualmente o pulverización) proporcionó resultados similares.

Ensayo 7: Este ensayo utilizó plántulas de palmera amaranto en la etapa de hoja 3 a 4 cultivadas a partir de semillas F3 seleccionadas por su resistencia al glifosato y por ser más resistentes al glifosato que las plantas en los ensayos 1 - 6. La solución amortiguadora incluía 2% de sulfato de amonio. Se trataron dieciocho plantas por tratamiento de la siguiente forma: (1 ) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; (2) pulverización de 2 mililitros de la solución de ARNbc; y (3) pulverización de glifosato.

TABLA 7 EJEMPLO 18 Este ejemplo ilustra métodos y composiciones aplicadas tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos.

En este ensayos, la solución de ARNbc contenía cantidades iguales de de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido descritas en el Ejemplo 1 a una dosis "10X" (8 nanomoles por planta) en una solución que contenía 0,2% de tensioactivo de amina de cebo y 2% de sulfato de amonio (identificada en la Figura 22 como "amina de cebo/AMS") o uno de los siguiente reactivos de transfección: (a) a poliamina (JetPRIME™, Polyplus-transfection SA, lllkirch, Francia), (b) una nanopartícula magnética (SilenceMag, OZ Biosciences, Marsella, Francia), (c) un péptido ÍNTER™ Nanoparticle, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), (d) un lípido (siPORT™ NeoFX™, Ambion, Foster City, CA) o (e) un lipido/polímero catiónico (TransIT®, Mirus Bio, Madison, Wl). Las plantas se trataron de la siguiente forma: (1 ) aplicación manual de la solución de ARNbc; (2) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; y (3) pulverización con glifosato aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha. Este protocolo cuando se utiliza con ARNbc en la solución de tensioactivo de amina de cebo/sulfato de amonio mata a la palmera amaranto resistente a glifosato que tiene 35 copias de EPSPS. Los resultados se muestran en la Figura 22. Se observó enanismo o muerte de las plantas para plantas tratadas con ARNbc en soluciones que contienen poliamina (JetPRIME™), péptido (N-TER™ Nanoparticle), lipido/polímero catiónico (TransIT®) o tensioactivo de amina de cebo/sulfato de amonio.

EJEMPLO 19 Este ejemplo ilustra métodos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe el uso de diferentes tipos de polinucleótidos para inducir el silenciamiento sistémico.

Se adquirieron ADN monocatenarios sentidos (ADNmc) y ARN monocatenarios antisentido (ARNmc) correspondientes al gen de EPSPS de la palmera amaranto en las posiciones 14-38, posiciones 153-177, 345-369 y 1 105-1 129 (indicadas por los nucleótidos subrayados en la Figura 1 ) de Integrated ADN Technologies. Los ADNmc sentidos y ARNmc antisentido se aparearon calentando moles iguales de ADNmc y ARNmc mezclados a 95 grados Celsius durante 5 minutos y se enfriaron lentamente durante 1 ,5 - 2 horas hasta alcanzar temperatura ambiente para proporcionar los híbridos de ADN/ARN. Se utilizaron plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato de 16 copias en los ensayos que utilizaron este procedimiento: (1 ) pulverización de Silwet L-77 al 1 % ; (2) aplicación manual sobre cuatro hojas maduras de cada planta para un total de 0,8 nanomoles de los ARNbc de EPSPS de palmera (tal como se describió en Ejemplo 1) o de los híbridos de ADN/ARN de EPSPS de palmera; y (3) pulverización con glifosato aplicada a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha.

Los resultados se representan en la Figura 23. Siete días después de la pulverización del herbicida, 4 de 6 plantas tratadas con ARNbc estaban muertas y las 2 restantes estaban muriendo, mientras que las plantas pulverizadas con el híbrido de ADN/ARN presentaban enanismo en el crecimiento (lesión por glifosato) en comparación con el testigo.

EJEMPLO 20 Este ejemplo ¡lustra métodos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe el uso de tipos diferentes de polinucleótidos para inducir el silenciamiento sistémico.

Se utilizaron seis plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que tenían 16 copias de EPSPS por tratamiento en este ensayo. Se aplicaron un tratamiento de 0,8 nanomoles de ARNbc ("1X") por planta, un tratamiento con una cantidad diez veces mayor (tratamiento de 8 nanomoles por planta, "10X") de polinucleótidos de ADNmc (descritos en el Ejemplo 19) y solución amortiguadora sola como testigo a plantas separadas manualmente en solución amortiguadora que contenía 2% de sulfato de amonio, con posterior pulverización con glifosato a las 48 horas aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha. La Figura 24 muestra los resultados. Ambos tratamientos polinucleotídicos proporcionaron un control mejor de palmera amaranto en comparación con plantas tratadas solo tratadas con solución amortiguadora y herbicida. De las plantas tratadas con el tratamiento con ADNmc 10X, dos de seis murieron y las cuatro restantes presentaron enanismo en el crecimiento en el 30%. De las plantas tratadas con el tratamiento con ARNbc 1X, las seis plantas murieron a los 8 días después de la pulverización con WM o 10 días después del tratamiento con ARNbc.

EJEMPLO 21 Este ejemplo ilustra métodos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe la selección de una secuencia poiinudeotidica para inducir el silenciamiento sistémico en una planta.

Se diseñaron doce ARNbc de aproximadamente 250 pb cada uno y con una cadena del ARNbc correspondiente a las secuencias de ADN traslapadas de EPSPS de las SEQ ID NOS:41-52 (Tabla 8) para cubrir de forma traslapada la secuencia sentido completa y parte de las regiones sin traducir en 5' y 3' del gen de EPSPS de palmera amaranto, tal como se muestra en la Figura 25A.

TABLA 8 Las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido tales como se describieron en el Ejemplo 1 y la Figura 1 están ubicadas en los segmentos de traslape 2, 3, 4 y 8 respectivamente y se muestran como barras gris claro dentro de dichos segmentos. Los polinucleótidos se sintetizaron mediante transcripción in vitro utilizando un vector pBR322 con los polinucleótidos de EPSPS insertados en los sitios de clonación EcoRI y BamHI; el ADN de plásmido se aisló con kits Qiagen Maxi prep y se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. La solución de ADN digerido se utilizó en el tratamiento de las plantas sin purificación adicional.

Las plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que tenían 16 copias de EPSPS se trataron de la siguiente forma: pulverización con Silwet L-77 al 1 %; (2) aplicación manual de una solución de ARNbc (que contenía polinucleótidos seleccionados de los doce segmentos de traslape de las cuatro moléculas de ARNbc "corto" descritas en el Ejemplo 1 a la tasa de 0,01 nanomol ADN/planta) o de solución amortiguadora como testigo; y (3) pulverización con glifosato 48 horas después aplicada a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha. Se observó la altura por encima del suelo de las plantas tratadas 1 1 días después del tratamiento con herbicida; a las plantas que estaban muertas o muriendo se les asignó una altura de cero. Los resultados se muestran en las Figuras 25B y 25C. Las combinaciones de polinucleótidos de ARNbc que mostraron la mayor eficacia en este ensayo incluyeron las cuatro moléculas de ARNbc "corto" descritas en el Ejemplo 1 , la combinación de los segmentos de traslape 2, 5, 8 y 1 1 y la combinación de los segmentos de traslape 7, 8 y 9.

EJEMPLO 22 Este ejemplo ilustra métodos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe la aplicación tópica de polinucleótidos con posterior aplicación de herbicida a una planta.

En un ensayo, las plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que tenían 16 copias de EPSPS se pulverizaron con glifosato aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha. Dos o 24 horas después de la aplicación de herbicida, las plantas se trataron con pulverización con Silwet L-77 al 1 %. Quince a 20 minutos después del tratamiento con Silwet, las plantas se trataron mediante aplicación manual con 0,8 nanomoles ("1X") por planta de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido tal como se describieron en Ejemplo 1 en solución amortiguadora que contenía 2% de sulfato de amonio o en solución amortiguadora que contenía 2% de sulfato de amonio. En este ensayo, las plantas testigo no tratadas ("UT") se trataron solo con pulverización de Silwet L-77 al 1 % pero no con herbicida o ARNbc. Los resultados se muestran en la Figura 26. En este ensayo, la aplicación de Silwet al 1 % resultó en una actividad de glifosato mejorada en 60% cuando se aplicó 2 horas después de la pulverización del herbicida y en 20% cuando se aplicó 24 horas después de la pulverización del herbicida. En este ensayo, la aplicación de Silwet al 1 % con posterior aplicación de ARNbc de EPSPS resultó en actividad de glifosato mejorada en al menos 80% cuando se aplicó 2 horas después de la pulverización del herbicida y en 20% cuando se aplicó 24 horas después de la pulverización del herbicida.

En otro ensayo, las plantas de palmera amaranto cultivadas a partir de semillas en suelo de una granja en Macón, GA se pulverizaron con glifosato aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha. Tres días después del tratamiento con herbicida, 9 de 40 plantas murieron y 3 presentaban enanismo grave. Las plantas supervivientes se pulverizaron con Silwet L-77 al 1 % , con posterior aplicación tópica manual de 8 nanomoles ("10X") por planta de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido tales como se describieron en Ejemplo 1 o de solución amortiguadora como testigo. Tres días después, 3 plantas más en el grupo de las tratadas con ARNbc murieron y 2 plantas más en el grupo de las tratadas con solución amortiguadora murieron. En este punto (6 días después del tratamiento original con herbicida y 3 días después del tratamiento con Silwet/ARNbc o solución amortiguadora), la mitad de las plantas supervivientes en cada grupo se pulverizó con una segunda aplicación de glifosato (aplicado a las misma dosis que la primera aplicación). Dos semanas después de este segundo tratamiento con herbicida, las plantas tratadas con ARNbc restantes exhibieron 80% de lesión y las plantas tratadas con solución amortiguadora restantes exhibieron 40% de lesión.

EJEMPLO 23 Este ejemplo ilustra métodos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe una aplicación tópica de una sola etapa de una sola composición que incluye polinucleótidos, tensioactivo y herbicida para controlar malezas resistentes a herbicidas.

Este ensayo se llevó a cabo en una población de campo de plantas de palmera amaranto resistentes al glifosato conocidos por tener cantidades muy grandes de copias de EPSPS (Gaines et al. (2010) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 107:1029-1034 informó que las plantas de este sitio de estudio tienen de 5 a más de 160 copias de EPSPS). Los polinucleótidos utilizados en este ensayo eran una mezcla equimolar de las cuatro moléculas de ARNbc de EPSPS "corto" de tamaño de oligonucleótido tal como se describieron en el ejemplo 1.

Se pulverizaron plantas de diez a quince centímetros de altura en un área de tratamiento de 30 cm por 152 cm es un único tratamiento con 264 microgramos ("100X") o 52,8 microgramos ("20X") de los ARNbc de EPSPS en una solución que también contenía 1 % de tensioactivo Silwet L-77, 2% de sulfato de amonio y glifosato (aplicado a 1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha.). Para la comparación, se pulverizaron otras plantas en áreas de tratamiento de 30 cm por 152 cm con glifosato (en una solución que también contenía 1 % de tensioactivo Silwet L-77 y 2% de sulfato de amonio) aplicado a la misma tasa.

Los resultados se muestran en la Figura 27. El tratamiento de las plantas solo con glifosato (aplicado a 1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha.) en una solución que también contenía Silwet L-77 y sulfato de amonio resultó en un control de aproximadamente 70% (muerte de las plantas). El tratamiento de una etapa utilizando una composición que contenía 20X de los polinucleótidos de ARNbc de EPSPS, tensioactivo, sulfato de amonio y herbicida resultó en un control de aproximadamente 80 - 85% de la palmera amaranto resistente a glifosato, que es la tasa de control aproximada obtenida mediante pulverización con glifosato aplicado a 6720 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha. (es decir, 8 veces la tasa de aplicación estándar de aproximadamente 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha.). El tratamiento de una etapa utilizando una composición que contenía 100X de los polinucleótidos de ARNbc de EPSPS, tensioactivo, sulfato de amonio y herbicida resultó en un control de aproximadamente 90 - 95% de la palmera amaranto resistente a glifosato, que es la tasa de control aproximada obtenida mediante pulverización con glifosato aplicado a 13440 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 59 litros/0.40 ha. (es decir, 16 veces la tasa de aplicación estándar de aproximadamente 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/0.40 ha.).

EJEMPLO 24 Este ejemplo ilustra un método para inducir la regulación sistémica de un gen objetivo en una hortaliza mediante aplicación tópica a la hortaliza de una molécula polinucleotídica que incluye un segmento con una secuencia nucleotídica esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen objetivo o el ARN transcrito a partir de gen objetivo, por el cual la molécula permea el interior de la hortaliza e induce la regulación sistémica del gen objetivo. En este ejemplo, se trataron hortalizas en crecimiento con una composición aplicada tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una hortaliza o planta de cultivo frutal que incluye (a) un agente para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen objetivo en dirección antisentido o sentido. Más específicamente, este ejemplo demuestra el uso de polinucleótidos aplicados tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico de un gen de fitoeno desaturasa (PDS) en una hortaliza, es decir, lechuga (Lactuca sativa).

La PDS de lechuga tiene la secuencia ATGTCTCTGTTTGGAAATGTTTCTGCCATTAACTCAAGTGGA AAGTGTATAGTAATGAATCTTTCAAGCACACAAATCACTTCAAGAGATTGT TTCAAGATTACCTCAGGGCAAAAAGATGTTTTGTCATTTGGATGCTGTGAT GCTATGGGTAACAGATTGCAATTCCCAAGTGCTCGTTCTTTTACACCAAGA TCAAAG AAG AATGTCTCC C CTCTAAAGGTAGTTTGTGTTGATTATC C AAG A CCAGATCTTGATAACACATCTAATTTCTTGGAAGCTGCTCACTTGTCTTCA ACCTTCAGAACTTCCCCACGCCCATCTAAGCCATTGAAGATTGTAATTGCT GGTGCAGGTTTAGCTGGTTTATCAACTGCTAAGTATTTAGCTGATGCAGG TCACAAGCCAATTTTACTAGAAGCAAGAGATGTTCTTGGTGGAAAGGTGG CAGCTTGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTATGAGACAGGTTTACACATA TTCTTTGGAGCTTACCCAAATGTACAAAATTTATTTGGAGAGCTAGGAATT AATGATAGATTACAGTGGAAGGAGCATTCTATGATATTTGCAATGCCAAAT AAGCCTGGAGAATTTAGTAGGTTTGACTTCCCAGATGTTTTACCTGCACCA TTGAATGGAATTTTTGCTATATTGAGGAACAATGAAATGCTGACGTGGCCT GAGAAAGTGAAGTTTGCAATTGGGCTGTTGCCTGCAATGTTAGGTGGACA GGCTTATGTTGAGGCCCAAGATGGGCTTAGTGTTCAGGACTGGATGAGA AAGCAAGGTATACCTGATCGAGTTACTACTGAAGTGTTTATTGCAATGTCA AAAGCATTAAACTTTATAAATCCAGATGAACTTTCAATGCAATGTATTCTCA TTGCTCTAAAC C GTTTTCTTC AGGAAAAGC ATG GTTC C AAG ATG GC ATTTT TAGATGGGAGCCCACCAGAAAGACTTTGCAAGCCAATTGTTGACCACATC GAGTCACTCGGTGGCCAAGTCAGAGTCAACTCACGAATACAAAAAATTGA GTTAAACAAAGACGGAACTGTCCGGAACTTTCTATTGAGTGATGGGAATG TTCTAGAAGCTGATGCTTATGTTTTCGCTACCCCTGTTGACATTCTCAAGC TTCTTTTACCCGAAGAATGGAAACCAATTCCATATTTCAAAAAATTAGAGA AGTTAGTCGGTGTTCCTGTTATAAACGTTCATATATGGTTTGACAGAAAGC TGAAAAACACATATGATCACTTACTTTTCAGTAGGTCACCTCTGCTGAGTG TGTATGCTGACATGTCAGTGACATGTAAGGAATATTATGATCCGAATAAGT CAATGTTGGAGTTGGTTCTTGCTCCAGCTGAGGAATGGATTTCAAGAAGT GACACTGATATTATTGATGCAACAATGAGTGAACTTTCAAGGCTTTTTCCT GATGAAATTGCAGCTGATCAAAGTAAAGCAAAAATCTTGAAATATAAAGTT GTTAAAACACCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTTCCAGATTGTGAACCATGT CGACCCCTACAAAGATCTCCAATTCAAGGATTTTATTTATCTGGTGATTAT ACTAAACAAAAGTATTTGGCTTCAATGGGGGGTGCTGTTTTATCTGGAAAA ATTTGTGCACAAGCTATTTTACAAGATTATGAGATGCTTGCTACA (SEQ ID NO:53).

Se sintetizaron ADN monocatenarios polinucleotídicos de 21 -45 nucleótidos de longitud con las siguientes secuencias: taatacgactcactatagggtttggagcttacccaaATGtac ("HL286", dirección sentido, SEQ ID NO:54), taatacgactcactatagggaggccacgtcagcatttcattgttc ("HL287", dirección antisentido, SEQ ID NO:55), ccattcaATGgtgcaggtaaaac ( "HL288", dirección antisentido, SEQ ID NO:56), catagaATGctccttccactg ("HL289", dirección antisentido, SEQ ID NO:57) y caaataaattttgtacatttgggtaagctccaa ( "HL290", dirección antisentido, SEQ ID NO:58). Se preparó una solución de ADNmc con una mezcla igual de los cinco polinucleótidos en 0,01 % de Silwet L-77 en 5 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8.

Se utilizó la variedad de lechuga LS49 "Green Tower" en los ensayos. Se sumergieron dos hojas completamente expandidas en una solución preparada recientemente de 0,1 % de Silwet L-77 en agua bidestilada durante pocos segundos. Las hojas se dejaron secar durante 15-30 minutos. A continuación cada planta se trató mediante aplicación de 20 microlitros de solución de ADNmc sobre la superficie superior de dos hojas tratadas con Silwet (total 40 microlitros por planta). La Tabla 9 indica las condiciones del ensayo utilizadas y el blanqueado observado en las plantas tratadas tópicamente con polinucleótidos de ADNmc. La Figura 28 representa la evolución del blanqueado y la muerte de las plantas de lechuga tratadas con 1 nanomol de ADNmc por planta a los (de arriba hacia abajo) 37, 46 y 60 días después del tratamiento.

TABLA 9 Los ensayos se repitieron con 2 o 4 nanomoles de ADNmc aplicados por planta. La Figura 29A muestra el silenciamiento sistémico evidenciado por el blanqueado observados a los 4 u 12 días después del tratamiento tópico con los polinucleótidos.

Los ensayos se repitieron utilizando cada ADNmc individual antisentido ("HL287", SEQ ID NO:55; "HL288", SEQ ID NO:56; "HL289", SEQ ID NO:57; y "HL290", SEQ ID NO:58) aplicándose 8 nanomoles de polinucleótido por planta; las plantas testigo positivo se trataron con una mezcla de los cuatro ADNmc individuales antisentido a 2 nanomoles de cada uno (para un total de 8 nanomoles de polinucleótido aplicados por planta) y las plantas testigo negativo se trataron solo con solución amortiguadora. La Figura 29B muestra el silenciamiento sistémico evidenciado por el blanqueado observado a 4 después del tratamiento tópico con los ADNmc antisentido.

EJEMPLO 25 Este ejemplo ¡lustra un aspecto de la invención. En este ejemplo, se trataron plantas en crecimiento con una composición aplicada tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico de un gen objetivo en una planta que incluye (a) un agente para acondicionar una planta para la permeación de polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena polinucleotidica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen objetivo en dirección antisentido o sentido. Más específicamente, este ejemplo demuestra el uso de polinucleótidos aplicados tópicamente para inducir el silenciamiento sistémico de un gen de fitoeno desaturasa (PDS) en una hortaliza, es decir, tomate {Solanum lycopersicum).

El PDS del tomate tiene la secuencia GGGTTTATCTCGCAAGTGTGGCTATGGTGGGACGTGTCAAA TTTTGGATTGTAGCCAAACATGAGATTTGATTTAAAGGGAATTGGCCAAAT CACCGAAAGCAGGCATCTTCATCATAAATTAGTTTGTTTATTTATACAGAA TTATACGCTTTTACTAGTTATAGCATTCGGTATCTTTTTCTGGGTAACTGC CAAACCACCACAAATTTCAAGTTTCCATTTAACTCTTCAACTTCAACCCAA CCAAATTTATTTGCTTAATTGTGCAGAACCACTCCCTATATCTTCTAGGTG CTTTCATTCGTTCCGAGTAAAATGCCTCAAATTGGACTTGTTTCTGCTGTT AACTTGAGAGTCCAAGGTAGTTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCGTC TTCTTTGGGAACTGAAAGTCGAGATGGTTGCTTGCAAAGGAATTCGTTAT GTTTTGCTGGTAGCGAATCAATGGGTCATAAGTTAAAGATTCGTACTCCC CATGCCACGACCAGAAGATTGGTTAAGGACTTGGGGCCTTTAAAGGTCGT ATGCATTGATTATCCAAGACCAGAGCTGGACAATACAGTTAACTATTTGGA GGCTGCATTTTTATCATCAACGTTCCGTGCTTCTCCGCGCCCAACTAAAC CATTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCA AAATATTTGGCAGATGCTGGTCACAAACCGATACTGCTGGAGGCAAGGG ATGTTCTAGGTGGAAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGG TACGAGACTGGTTTGCATATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATTCAGAAC CTGTTTGGAGAATTAGGGATTAACGATCGATTGCAATGGAAGGAACATTC AATGATATTTGCAATGCCAAGCAAGCCAGGAGAATTCAGCCGCTTTGATT TCTCCGAAGCTTTACCCGCTCCTTTAAATGGAATTTTAGCCATCTTAAAGA ATAACGAAATGCTTACATGGCCAGAGAAAGTCAAATTTGCAATTGGACTCT TGCCAGCAATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGATGGGATA AGTGTTAAGGACTGGATGAGAAAGCAAGGTGTGCCGGACAGGGTGACAG ATGAGGTGTTCATTGCTATGTCAAAGGCACTCAACTTTATAAACCCTGACG AACTTTCAATGCAGTGCATTTTGATCGCATTGAACAGGTTTCTTCAGGAGA AACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAATCCTCCTGAGAGACTTT GCATGCCGATTGTTGAACACATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTG AACTCACGAATAAAAAAGATTGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAGAG TTTTATACTGAGTGACGGTAGTGCAATCGAGGGAGATGCTTTTGTGTTTG CCGCTCCAGTGGATATTTTCAAGCTTCTATTGCCTGAAGACTGGAAAGAG ATTCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGTTAGTCGGAGTACCTGTGATAAAT GTACATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATATGATCATTTGCTC TTCAGCAGAAGCTCACTGCTCAGTGTGTATGCTGACATGTCTGTTACATG TAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGG I I I I I GCACC TGCAGAAGAGTGGATATCTCGCAGCGACTCAGAAATTATTGATGCAACGA TGAAGGMCTAGCAACGCTTTTTCCTGATGAAATTTCAGCAGATCAAAGC AAAGCAAAAATATTGAAGTACCATGTTGTCAAAACTCCGAGGTCTGTTTAT AAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCTTTACAAAGATCCCCAAT AGAGGGGTTTTATTTAGCCGGTGACTACACGAAACAGAAATACTTGGCTT CAATGGAAGGCGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCTCAAGCTATTGTA CAGGATTATGAGTTACTTGTTGGACGTAGCCAAAAGAAGTTGTCGGAAGC GCGTAGTTTAGCTTTGTGGTTATTATTTAGCTTCTGTACACTAAATTTAT GATGCAAGAAGCGTTGTACACAACATATAGAAGAAGAGTGCGAGGTGAA GCAAGTAGGAGAAATGTTAGGAAAGCTCCTATACAAAAGGATGGCATGTT GAAGATTAGCATC I I I I I AATCCCAAGTTTAAATATAAAGCATATTTTATGT ACCACTTTCTTTATCTGGGGTTTGTAATCCCTTTATATCTTTATGCAATCTT TACGTTAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGA (SEQ ID NO:59).

Se sintetizó un polinucleótido de ARNbc de 201 nucleótidos con una cadena antisentido capaz de hibridar con el ARN codificado por la secuencia tcgcagcgactcagaaattattgATGcaacgATGaaggaactagcaacgctttttcc tgATGaaatttcagcagatcaaagcaaagcaaaaatattgaagtaccATGttgtcaaaactccgaggt ctgtttataaaactgtgccaggttgtgaaccctgtcggcctttacaaagatccccaatagaggggttttatttag (SEQ ID NO:60) que corresponde a los nucleótidos en las posiciones 1724 -1923 del ARNm transcrito a partir de la secuencia del gen de PDS del tomate (SEQ ID NO:59) mediante RT PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos con las secuencias taatacgactcactatagggtcgcagcgactcagaaattattg (SEQ ID NO:61 , cebador sentido) y taatacgactcactataggggtaaaggccgacagggttcacaacc (SEQ ID NO:62, cebador antisentido). Se preparó una solución de ARNbc de 2,5 micromolares con el polinucleótido de ARNbc de 201 nucleótidos (SEQ ID NO:60) en 0,01 % de Silwet L-77 en 5 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8.

Se trataron plántulas de tomate de tres semanas de la siguiente forma. Se sumergieron dos hojas completamente expandidas en una solución preparada recientemente de 0,1% de Silwet L-77 en agua bidestilada durante pocos segundos. Las hojas se dejaron secar durante 30 minutos a 1 hora. A continuación cada planta se trató mediante aplicación de 20 microlitros de solución de ARNbc sobre la superficie superior de dos hojas tratadas con Silwet (total 40 microlitros por planta). Las plantas testigo se trataron con solución amortiguadora. Las plantas se mantuvieron en una cámara de crecimiento para la observación. La Figura 30 muestra el silenciamiento sistémico del gen objetivo de PDS, tal como se evidencia por el blanqueado de las plantas tratadas con ARNbc 30 días después del tratamiento tópico. Las plantas tratadas con ARNbc presentaban enanismo grave en comparación con las plantas testigo.

EJEMPLO 26 Este ejemplo ¡lustra una mejora en composiciones herbicidas adaptadas para revestimiento tópico sobre la superficie exterior de una planta en crecimiento donde el agente letal para plantas incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a secuencias de uno o más genes vegetales o a la secuencia del ADN transcrito a partir de los genes vegetales. Los polinucleótidos producen la supresión sistémica del gen vegetal en órganos o tejidos vegetales distintos a los que recibieron la aplicación tópica del polinucleótido. Más específicamente, este ejemplo ilustra una composición herbicida adaptada para revestimiento tópico sobre la superficie exterior de una planta en crecimiento que comprende tensioactivo y al menos un agente letal para plantas que incluye combinaciones de polinucleótidos que tienen una secuencia dirigida al gen de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una factor de iniciación de la transcripción (TIF) y ATPasa dependiente de ADN (ddATPasa) en palmera amaranto.

La composición herbicida incluye al menos uno de los siguientes polinucleótidos de ARN bicatenario de 21 pares de bases: (1) nDsARNI : cadena sentido CUACCAUCAACAAUGGUGUCC (SEQ ID NO: 63) y cadena antisentido GGACACCAUUGUUGAUGGUAG (SEQ ID NO: 64) (2) nDsARN3: cadena sentido GUCGACAACUUGCUGUAUAGU (SEQ ID NO: 65) y cadena antisentido ACUAUACAGCAAGUUGUCGAC (SEQ ID NO: 66) (3) nDsARN4: cadena sentido GGUCACCUGGACAGAGAAUAG (SEQ ID NO: 67) y cadena antisentido CUAUUCUCUGUCCAGGUGACC (SEQ ID NO: 68) (4) nDsNA5: cadena sentido AAUGCCAGAUGUUGCUAUGAC (SEQ ID NO. 69) y cadena antisentido GUCAUAGCAACAUCUGGCAUU (SEQ ID NO: 70) Una mezcla de múltiples polinucleótidos es ventajosa para prevenir la selección de resistencia en las plantas tratadas. En una modalidad, la composición herbicida incluye una mezcla de los cuatro polinucleótidos de ARNbc mencionados anteriormente que tienen las SEQ ID NOS: 63-70. En otra modalidad, la composición herbicida incluye polinucleótidos de ADN monocatenario con secuencias desoxirribonucleotídicas que corresponden a una o más de las secuencias de ARNbc SEQ ID NOS: 63-70. En otra modalidad, la composición herbicida incluye híbridos de ARN/ADN con secuencias nucleotídicas que corresponden a una o más de las secuencias de ARNbc SEQ ID NOS: 63-70. En otra modalidad, la composición herbicida incluye polinucleótidos de ARNbc donde los 2' hidroxilos se metilan para proporcionar estabilidad.

La composición herbicida incluye un tensioactivo tal como Silwet L-77 (u otros tensioactivos eficaces tales como los proporcionados en el Ejemplo 36). Opcionalmente, la composición herbicida puede incluir uno o más aditivos tales como una sal, agente quelante o un humectante (tales como los proporcionados en el Ejemplo 35) para mejorar el rendimiento herbicida, por ejemplo, potenciando la transferencia de polinucleótidos hacia el interior de la planta, potenciando la eficacia de los polinucleótidos o potenciando la actividad herbicida del herbicida no polinucleotídico.

Opcionalmente, la composición herbicida incluye polinucleótidos diseñados para regular múltiples genes en la planta. En una modalidad, la composición herbicida incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un segundo gen o a la secuencia del ARN transcrito a partir del segundo gen, en donde la regulación del segundo gen proporciona una mejora sinergística de la actividad herbicida de la composición.

En una modalidad, la composición herbicida incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia del gen endógeno de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de palmera amaranto o a la secuencia del ARN transcrito a partir del gen endógeno de EPSPS así como también polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia del gen endógeno del factor de iniciación de traducción (TIF) de la palmera o a la secuencia del ARN transcrito a partir del gen endógeno de TIF. El factor de iniciación de traducción (TIF) es una proteina cloroplástica codificada en el núcleo que es esencial para la iniciar la síntesis proteica y se expresa en toda la planta. La Arabidopsis thaliana tiene un ortólogo denominado AT1 G17220,1 (descrito en la base de datos disponible públicamente The Arabidopsis Information Resource que se encuentra en línea en www.arabidopsis.org/servlets TairObject?type=locus&name=AT1 G17220) y con el número de acceso a GenBank Gl: 186478573, que se ha identificado como una proteína localizada en el cloroplasto con similitud al factor de iniciación de traducción bacteriano 2; ver además Miura et al. (2007) Plant Cell, 19:1313-1328 para ver la descripción de este gen. Las secuencias de TIF se identificaron a partir de la palmera amaranto (Amaranthus palmeri); se identificó que un gen de TIF tiene la secuencia de SEQ ID NO:71. Los ejemplos de polinucleótidos para la supresión de este gen de TIF en Amaranthus palmen se muestran en la Tabla 10.

TABLA 10 AAAAAGTAGTGCAAGAATCTCCGAAGATTGAAAAG GTTGAGAGAGTGGAAGCTCGAACGACCAGCCAAT CGTCTGAAACGATAAGACCCCCAGTGCCACTACAG AGGCCTGAGATTAAGTTGCAGGCAAAGCCTTCTAC TGCTCCTCCACCCATGCCTAAGAAGCCGGTTTTGA AGGATGTGGGGATGTCCTCCAGAGCTGATGGGAA GGACCAGTCTGTGAAATCTAAAGAGAGGAAGCCTA TTCTAGTGGACAAATTTGCCACCAAGAAGGCATCA GTTGATCCGTCGATTGCTCAAGCAGTAATTGCCCC ACCAAAACCTGCTAAATTTCCTTCTGGAAAGTTTAA AGATGATTATCGGAAGAAGGGTCTTGCAGCTGGTG GGCCGAAGAGGCGTATGGTCAATGATGATGATATT GAAATGCATGAAGACACTTCAGAGCTCGGTCTTTC TATTCCTGGTGCTGCTACGGCTCGGAAAGGCAGG AAATGGAGTAAGGCAAGTCGCAAGGCTGCCAGAC GCCAAGCAGCTAGAGATGCCGCTCCTGTTAAAGT GGAAATCTTAGAGGTTGAAGAAAAGGGCATGTCGA CCGAAGAATTAGCATACAACTTGGCTATTAGCGAA GGTGAAATTCTTGGGTACCTGTATTCTAAGGGGAT AAAACCAGATGGTGTGCAAACTCTTGACAAGGCAA TGGTAAAGATGATATGTGAAAGATATGACGTGGAG GTTTTGGACGCACTTTCTGAACAAATGGAAGAAAT GGCTCGAAAGAAGGAAATTTTCGACGAAGATGACC TTGACAAGCTTGAAGATAGGCCTCCTGTGCTTACT ATAATGGGTCATGTAGATCATGGCAAGACGACCCT TCTGGATTATATACGGAAGAGCAAGGTTGCTGCTT CTGAAGCTGGTGGGATTACACAAGGTATTGGTGCT TATAAAGTGGAAGTACCGGTTGATGGCAAGTTGCT GCCTTGTGTCTTTCTTGACACTCCCGGACACGAGG CGTTCGGGGCAATGAGGGCTCGTGGAGCAAGAGT GACAGATATTGCTATTATAGTTGTAGCTGCTGACG ATGGGATCCGTCCTCAAACAAATGAAGCCATAGCA CATGCAAAAGCAGCTGGTGTACCTATTGTGGTTGC AATTAATAAGATTGACAAGGATGGGGCTAATCCGG ACCGTGTGATGCAAGAGCTTTCATCAATTGGTCTA ATGCCAGAGGATTGGGGTGGTGATACCCCAATGG TCAAGATAAGTGCTCTAAAAGGTGAAAATGTGGAC GAGTTACTCGAGACAGCCATGCTTGTCGCCGAGTT GCAAGAGTTAAAGGCTAATCCTCAGAGGAACGCTA AGGGCACTGTAATTGAGGCTGGTCTTCATAAATCA AAAGGACCCATTGCCACTTTTATTGTGCAGAATGG TACCCTCAAACAAGGGGATACTGTAGTTTGTGGGG AAGCATTTGGGAAGGTTCGTGCCCTATTTGATCAC GGAGGGAATCGCGTTGATGAAGCTGGTCCATCTAT TCCCGTGCAGGTTATTGGATTGAATAATGTTCCTTT TGCCGGTGATGAGTTCGAGGTAGTGAGTTCCCTTG ATATAGCTCGTGAAAAGGCAGAGGTCCGTGCAGA GTCTTTACGAAATGAGCGTATAGCTGCTAAGGCCG GAGACGGAAAGGTTACGCTGTCATCCTTGGCATC GGCTGTTTCTTCAGGGAAGATGGCTGGTTTGGATT TGCACCAGTTAAATATCATTTTGAAGGTTGATGTTC AGGGATCAATCGAGGCATTGAGGCAAGCTCTAGA AGTTCTTCCTCAAGATAACGTCACTTTGAAGTTTCT CTTACAAGCGACCGGAGATGTTACTACAAGTGATG TTGATCTTGCAGTTGCTAGTAAAGCTATTATCTTGG GGTTCAATGTGAAGGCACCAGGTTCTGTCGAAAAA TTAGCAGATAACAAAGGTGTTGAAATTCGGCTTTAT AAAGTCATTTATGATCTAATTGACGACATGCGGAG TGCAATGGAAGGAATGCTAGATCCCGTTGAGGAAC En una modalidad, la composición herbicida incluye una mezcla de al menos dos de los polinucleótidos de ARNbc de EPSPS mencionados anteriormente que tienen la SEQ ID NOS: 63-70 y también al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia del gen endógeno del factor de iniciación de traducción (TIF) de palmera o a la secuencia del ARN transcrito a partir del gen endógeno de TIF, tales como los proporcionados en la Tabla 10. En una modalidad específica, la composición herbicida incluye una mezcla de los cuatro polinucleótidos de ARNbc de EPSPS que tienen las SEQ ID NOS: 63-70 y un polinucleótido de ARN bicatenario de TIF de 160 pares de bases que tiene la secuencia sentido de UUCGAGUAAUGGGAAAUUGGAUAAUGUAGAGGAGAGGAAGAAGGUUAU UGAUUCAUUGGAUGAGGUAUUAGAAAAGGCCGAGAGAUUAGAAACGGC GAACUUACAAGCAGAUAAUAGAAAGGAUAGCACAAAUGUAAAUAAACCG UCUCCGAGUGUAAGU (SEQ ID NO. 73) y la secuencia antisentido de ACUUACACUCGGAGACGGUUUAUUUACAUUUGUGCUAUCCUUUCUAUU AUCUGCUUGUAAGUUCGCCGUUUCUAAUCUCUCGGCCUUUUCUAAUAC CUCAUCCAAUGAAUCAAUAACCUUCUUCCUCUCCUCUACAUUAUCCAAU UUCCCAUUACUCGAA (SEQ ID NO. 74).

En algunas modalidades, los polinucleótidos se diseñan para regular múltiples genes objetivo, que resultan en un efecto sinergístico sobre la actividad herbicida. Por ejemplo, se obtuvo un efecto sinergístico sobre la actividad herbicida mediante el tratamiento de una planta con polinucleótidos diseñados para suprimir un factor de iniciación de traducción (TIF) y la 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) con posterior tratamiento con el herbicida glifosato no polinucleotídico.

Los polinucleótidos indicados en la Tabla 1 1 se produjeron mediante síntesis o mediante transcripción in vitro.

TABLA 11 Las soluciones de los polinucleótidos se prepararon y aplicaron a las hojas de palmera amaranto utilizando los protocolos descritos en la Tabla 12.

TABLA 12 Las combinaciones de polinucleótidos se evaluaron tal como se indica en la Tabla 13.

TABLA 13 'cuando se Indica más de una cantidad de copias, las plantas tratadas eran una mezcla de cantidades de copias "DDT = días después del tratamiento; "0% testigo" significa que no se observaron diferencias entre las plantas tratadas y las testigo; el % de enanismo se calcula como [100 - (promedio de altura de las plantas de prueba/promedio de altura de las plantas testigo)"! 00] Se diseñaron secuencias polinucleotídicas de ARN bicatenario de 25 mer para la supresión del gen TIF en Amaranthus palmen tal como se indica en la Tabla 14.

TABLA 14 Los polinucleótidos de ARNbc de TIF de 25 mer se evaluaron en palmera amaranto resistente a glifosato con alta cantidad de copias (1 12) y baja cantidad de copias (16) de EPSPS.

Las plantas con alta cantidad de copias se trataron con una mezcla de 4 ARNbc cortos de EPSPS (ARNbc 1 corto, ARNbc 3 corto, ARNbc 4 corto, tales como se describieron en el Ejemplo 1 y IDT [5] (SEQ ID NOS:91-92 tales como se describieron en la Tabla 11) a 11 ,5 gramos/O. 40 ha. y un ARNbc de TIF individual a 5,8 gramos/0.40 ha. o con cada ARNbc de TIF individual de 25 mer a 5,8 gramos/0.40 ha.; las soluciones de polinucleótidos se formularon en 10 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio (pH 6,8) que contenía 2% de sulfato de amonio y 1 % de Silwet L-77. Treinta minutos después del tratamiento con polinucleótidos, las plantas se pulverizaron con glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® Weather AX®) o no.

Las plantas con baja cantidad de copias se trataron con una mezcla de 4 ARNbc cortos de EPSPS (ARNbc 1 corto, ARNbc 3 corto, ARNbc 4 corto, tales como se describieron en el Ejemplo 1 y IDT [5] (SEQ ID NOS.91-92 tales como se describieron en la Tabla 11)) a 0,23 gramos/0.40 ha. un ARNbc de TIF individual a 5,8 gramos/0.40 ha. o con cada ARNbc de TIF individual de 25 mer a 5,8 gramos/0.40 ha.; las soluciones de polinucleótidos se formularon en 10 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio (pH 6,8) que contenía 2% de sulfato de amonio y 1 % de Silwet L-77. Treinta minutos después del tratamiento con polinucleótidos, las plantas se pulverizaron con glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®) o no.

Los resultados se muestran en las Figuras 31 y 32 y muestran que los polinucleótidos de TIF potencian la actividad de los polinucleótidos de EPSPS y que los polinucleótidos de TIF tienen actividad herbicida propia.

EJEMPLO 27 Los aspectos de la invención incluyen composiciones polinucleotídicas y métodos de uso para potenciar la actividad de un herbicida no polinucleotídico en una planta. Por ejemplo, una composición polinucleotidica diseñada para regular un gen dirigido a un herbicida o un gen de desactivación de un herbicida o un gen de respuesta a estrés o una combinación de dichos genes objetivo, se aplica a una maleza o a una planta espontánea, simultáneamente o posteriormente o antes de la aplicación de un herbicida no polinucleotídico (típicamente un herbicida químico convencional), resultando en la mejora de la actividad del herbicida no polinucleotídico. La combinación de una composición polinucleotidica con un herbicida no polinucleotídico (por ejemplo, un herbicida químico convencional) proporciona un efecto sinergístico, es decir, el efecto herbicida de la combinación es mayor que la suma del efecto herbicida de la composición polinucleotidica y el efecto herbicida del herbicida no polinucleotídico.

Se proporcionan ejemplos de herbicidas químicos convencionales y sus genes dirigidos al herbicida correspondientes en la Tabla 15.

TABLA 15 Se proporcionan ejemplos de herbicidas químicos convencionales y sus genes de desactivación del herbicida correspondientes en la Tabla 16.

TABLA 16 EJEMPLO 28 Este ejemplo ¡lustra un método para inducir la regulación sistémica de un gen objetivo endógeno en una planta en crecimiento que incluye revestir tópicamente hojas de la planta en crecimiento con polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen objetivo endógeno o en el ARN mensajero transcrito a partir de gen objetivo endógeno, por los cual los polinucleótidos permean el interior de la planta en crecimiento e inducen la regulación sistémica del gen objetivo endógeno.

Se diseñaron polinucleótidos de ARN bicatenario o ADNmc antisentido para los genes dirigidos al herbicida 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), fitoeno desaturasa (PDS), protoporfirina IX oxigenasa (PPO), fenilalanina amoníaco Nasa (PAL), hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), acetolactato sintasa (ALS) y glutamina sintasa (GS). Para cada gen dirigido a herbicida, se aplicó una solución que contenía una mezcla de 8 polinucleótidos de ADNmc antisentido en 2% de sulfato de amonio en 10 milímolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8, a una tasa de 2,32 g/0.40 ha. con posterior aplicación de 0,5% de Silwet L-77 por pulverización (37 litros /0.40 ha.). Los polinucleótidos evaluados y las observaciones del fenotipo resultante se indican en la Tabla 17.

TABLA 17 Se investigaron la actividad herbicida de los polinucleótidos de ADNmc que se dirigen a las enzimas 4-hidroxifenilpiruvato (HPPD) y protoporfirinógeno oxidasa (PPO) y un factor de iniciación de transcripción (TIF) y su efecto sobre la actividad herbicida cuando se usan en combinación con los herbicidas mesotriona, fomesafen y atrazina en palmera amaranto. Los polinucleótidos utilizados en este experimento eran 8 oligonucleótidos de ADNmc antisentido de HPPD (SEQ ID NOS:141-148), 8 oligonucleótidos antisentido de PPO (SEQ ID NOS: 25-132) y 8 oligonucleótidos de ADNmc antisentido de TIF (SEQ ID NOS:75-82, ver Ejemplo 26).

Se cultivaron plantas de palmera amaranto (Amaranthus palmeri) sensibles al glifosato en macetas cuadradas de 10 cm con mezcla para plántulas Sun Gro® Redi-Earth que contenía 3,5 kg/metro cúbico de fertilizante Osmocote® 14-14-14 en un invernadero con un fotoperíodo de 14 h p y una temperatura diurna de 30 grados Celsius y una temperatura nocturna de 20 grados Celsius. Se subregaron las plantas según fue necesario.

Las plantas de 10 a 15 cm de altura se pretrataron manualmente con 40 microlitros (se trataron 4 hojas maduras completamente expandidas con 10 microlitros de solución por hoja en cada planta) de una solución de solución amortiguadora-tensioactivo (como testigo; 0,5% de Silwet L-77 y 2% de sulfato de amonio) o una mezcla de solución amortiguadora-tensioactivo-polinucleótido de ADNmc de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a HPPD, PPO o TIF. Algunas plantas se dejaron sin tratamiento y se usaron como testigos. Veinticuatro horas después, las plantas sin tratamiento, las plantas tratadas con solución amortiguadora-tensioactivo y las plantas tratadas con solución amortiguadora-tensioactivo-ADNmc se trataron utilizando un pulverizador agrícola equipado con una boquilla 9501 E y calibrado para administrar 93 litros de solución por hectárea con un inhibidor de HPPD, mesotriona (1.81 kg de ingrediente activo por 3.7 litros;) o con un inhibidor de PPO, fomesafen (907 gramos de ingrediente activo por 3.7 litros) o con un inhibidor de Fotosistema II, atrazina (90% de ingrediente activo) tal como se indica en la Tabla 18. Se agregó concentrado de aceite de cultivo (CAC) a 1 % a todos los tratamientos con herbicida. Se usó una tasa baja de cada herbicida (mesotriona: 13 g por 0.40 ha., equivalente a 1/8X de la tasa de campo recomendada; fomesafen: 16 g por 0.40 ha., equivalente a1/22X de la tasa de campo recomendada; y atrazina: 170 g por 0.40 ha., equivalente a1/8X de la tasa de campo recomendada), para poder detectar cualquier mejora en la actividad herbicida mediante la mezcla oligonucleotídica.

TABLA 18 La altura de las plantas se determinó cuatro días después del tratamiento con herbicida. Se recogieron los datos de un experimento con cuatro repeticiones por tratamiento. Los resultados (expresados como altura de las plantas de palmera amaranto según fue afectada por la solución de solución amortiguadora-tensioactivo, ADNmc y combinaciones de tratamientos con herbicida) se muestran en la Tabla 19 y la Figura 33. Las plantas tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de HPPD, oligonucleótidos de ADNmc antisentido de PPO y oligonucleótidos de ADNmc antisentido de TIF exhibieron enanismo en el crecimiento, midiendo 125, 153 y 115 mm, respectivamente, mientras que las plantas tratadas con solución amortiguadora-tensioactivo (testigo) midieron 185 mm (Figura 33). El tratamiento con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de HPPD, oligonucleótidos de ADNmc antisentido de PPO y oligonucleótidos de ADNmc antisentido de TIF respectivamente provocó una reducción del crecimiento de 32%, 18% y 38% con respecto al testigo con solución amortiguadora-tensioactivo.

No se observaron diferencias importantes en la altura de las plantas entre plantas tratadas con solución amortiguadora-tensioactivo y posteriormente con herbicida y plantas tratadas solo con herbicida. Las plantas tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de HPPD y posteriormente con mesotriona exhibieron la mayor reducción en el crecimiento de la planta, midiendo 100 mm, una reducción del 46% en comparación con las plantas tratadas con solución amortiguadora-tensioactivo. Las plantas tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de PPO y posteriormente con fomesafen midieron 126 mm, un reducción del 32% en comparación con las plantas tratadas con solución amortiguadora-tensioactivo. Las plantas tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de TIF y posteriormente con atrazina midieron 121 mm, un reducción del 34% en comparación con las plantas tratadas con solución amortiguadora-tensioactivo.

TABLA 19 EJEMPLO 29 Este ejemplo ¡lustra las secuencias evaluadas de polinucleótidos ARN bicatenario diseñadas para diferentes genes esenciales para determinar el efecto de la secuencia evaluada en el fenotipo observable. Para cada gen esencial, se aplicó una solución que contenía el polinucleótido de ARNbc en 2% de sulfato de amonio en 10 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6.8, a palmera amaranto a una tasa de 240 picomoles por planta con posterior aplicación de 0,5% de Silwet L-77 por pulverización (37 litros/0.40 ha.). Los polinucleótidos evaluados y las observaciones del fenotipo resultante se indican en la Tabla 20.

TABLA 20 EJEMPLO 30 Este ejemplo ilustra polinucleótidos diseñados para dirigirse a una región de homología secuencial baja específica y son útiles, por ejemplo, para seleccionar un alelo específico de un gen objetivo o un gen de una especie específica. Los polinucleótidos diseñados para dirigirse a secuencias antisentidos son útiles para regular ARN antisentidos que participan en la regulación génica, por ejemplo, regular ARN antisentidos que se procesan en ARNip en una vía regulada por ¡ARN. La Figura 34 muestra una alineación del promotor de locus 1 de PDS de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:319) y del promotor de locus 3 de PDS (SEQ ID NO:320)¡ en el caso del locus 1 que contiene múltiples sitios de inicio de transcripción, la secuencia promotora usada en esta alineación es la que tiene más sitios de inicio de transcripción en 5'. Se descubrió que los genes PDS1 y PDS2 de Nicotiana benthamiana tienen baja homología secuencial en la región promotora pero alta homología secuencial en la región sentido.

Los polinucleótidos diseñados para dirigirse a partes diferentes de los promotores de PDS1 y PDS2 se muestran en la Tabla 21.

TABLA 21 Se evaluaron seis combinaciones diferentes de polinucleótidos (1 nanomol/planta de cada polinucleótido aplicado) tal como se indica en la Tabla 21 y se ilustra en la Figura 35 en plantas de Nicotiana benthamiana de 4 semanas usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 12. Las soluciones polinucleotídicas se prepararon en 0,01 % (v/v) de Silwet L-77 y 2% (p/v) de sulfato de amonio en 5 milimolares de fosfato de sodio, pH 6,8. Se sumergieron dos hojas completamente expandidas por planta en solución de 0,1 % de Silwet L-77 preparada recientemente con H2O bidestilada durante pocos segundos y se dejaron secar. Aproximadamente 30 minutos después, se aplicaron 20 microlitros de solución polinucleotídica a cada una de las dos hojas pretratadas. Las plantas testigo positivo se trataron de forma similar con un oligonucleótido de ADN dirigido a un segmento conservado de la región sentido de PDS1 y PDS2; las plantas testigo negativo se trataron de forma similar con un oligonucleótido de ADN diseñado para silenciar la proteína verde fluorescente (GFP). Las seis combinaciones de polinucleótidos diseñados para dirigirse a las regiones promotoras de PDS1 o PDS2 indujeron el silenciamiento sistémico en las plantas tratadas tal como se evidenció por el blanqueado. El tratamiento con polinucleótidos de ARNbc o ADNbc de aproximadamente 200 pb y dirigidos a las regiones promotoras de PDS1 o PDS2 también indujo el silenciamiento sistémico en las plantas tratadas tal como se evidenció por el blanqueado.

Las siguientes secuencias genómicas adicionales (incluidos el promotor y la secuencia del intrón y exón transcrita) indicadas en la Tabla 22 se identificaron para los genes de Amaranthus palmen para uso en el diseño de polinucleótidos para aplicación tópica: TABLA 22 CCTAAGGGCCAGACTGTTGGATCCTTTAGGAAAGGGCTCATTATGTTACCT ACCGCCATTGCTGCTAGGTATCTTTTGACTCTCAAATCTTAAATATTTCTCAT CTTCTCCTTCTGCTAATACTAGTATGTTTACCATCTTTTTATTTTTTTAGGCTT GGCAGTAAAGTCAAACTATCGTGGACACTTTCTAATATTGATAAGTCGCTCA ATGGTGAATACAATCTCACTTATCAAACACCCGATGGACCGGTTTCTGTTAG GACCAAAGCGGTTGTCATGACTGTCCCTTCATACATTGCAAGTAGCCTGCTT CGTCCGCTCTCAGTGAGTATCATTCTTTCCTTCATTTCTTTTCGTTTATTGTT GTCCAATGTCTTGTTAAACACCAGTTTGGCCTTGTGCTCGTGAATTATGGCT ACAATGTTAACTGATTCAGGCACTGTGGGAGATGCCTAAGTTTCTAAAACCT CTGCGCATAATGTTTGTTTGGATGTTAGGAATTGCATTGAAAAATTGCTTTTG TGATGTTGATGTTAATACCAATTACAAGTGTGTTCTTCAACTTCTGCAATACC TTGTTCGAGTGAGCTTGAGGGGGTTTAGATTAGTGTCCAATGTGAAACTAG CAAATGAACTCCAAGCGCTGGGATAGGTCCTTGGGATGGAGCCCCTGATAC CCAAGACAGTATTCAAACCCTCTAAGTAGAGTGAGAGATCAAGGAAAGAAA CTGGGTGGTTCCTCAAATCGTAAAAAATGAATACAGTGTCATGATTGCTAAT CTTATCACAAATCGTAAAAAATGAATTATGGTCGATTTTGGACTATTTTTGGG TCATTTTGAGTGAATCTCGAACTTAAAAAGCGAGTCTTCTAGCAGTTCTTGTT ACAGCGGGGCATACATAGGTAGGAATTTGGTTTTTTACTATTTGAGCCTTTT GACTGTTGTGGCCGGTAATATGGAATAGTCTAGCACTTCTGCGTGTGTACA ACTAGTATTTATTGTAATTATGTGATCGCACTTAACTCTCAGATAAAACCTTA AGCACTAACATTTTGTTTTGGTTGAAGGAATCAGGAGGAAAGAAAATTGAGG GATTTGTTGGTATATAGATTCCTTTGTTTGGATAACAAAATTGGAGTGGAGA GATTTGGAAGGAAGAATTTTATAGGGATTAGTTCCCATTACACTTATGTTGAT TACAAAATTTCTCCAAAAGTGGAAAGATTTTGAGTGAAAATGTTTTTTATTTC TCTTCCTCTCCCTTTCTTTCCCTCTTAAACAAACAAGGAAAGTTAATCTTATC ATTCCGTACCTTCCCCTTCTGTTCTT I I I I I TCTCTCCAAAATTCTTATCCTAA CGTAGTGTTATTGTCACTGTCTTATGAACGAGAATTCTTTTCTTCCTAATACT GCTTGTGTTGCACAGTCAATGATTTAGCTAGATCATCTTTGGTTAGCTACTC AAAATATTTACATAAAATACTTGTAGAAATAAATACCAATAGGTCTTGTCAAG AAGTAGTTTCAATGCTATAAGTTTTAACCAATCCTCAAAATTTACACCATGGA GATATCTGCGGATAAGAACTAGTAACTGTAGCAGCTGTAACTGTTGCAATCA GTTTTATGGTTTGCCTTGCAAATCAAACTTTGGATGTTGTTTGCCTTACAATT TGTTACTATTACGTGAAGTTTAGTGTTCGCCCTTCACATTGTACTTTGGTTTT TGTTTTCCTTGCAATTTGCTCTTTGAAGTATAAAGTGCTGAGTGCTGAGTGC TGAGTGCTGACCTTTCCTGCTCAGGATGTTGCTGCAGATTCTCTTTCTCAAT TTTACTATCCACCAGTCGCAGCAGTGTCCCTTTCTTATCCCAAAGAAGCAAT TAGACCAGAATGCTTGATCGATGGAGAACTAAAAGGATTCGGGCAATTGCA TCCTCGCAGCCAGGGTGTGGAAACCTTGGGTATATGCTCCCATTCAACTAT ATCTCAA I I I I I ATGAGTATTTTTCTTTCTCTGAATTATTCAATTTGGTGACGT TAAATTTTGATTGTACTCGACAGGAACAATTTATAGTTCATCTCTTTTCCCTG GTCGAGCACCACCTGGTAGGACCTTGATCTTGAGCTACATTGGAGGTGCTA CAAATGTTGGCATATTACAAAAGGCAAGTCATTTATACAATTATATCTGTTGT ATCCTCAAATAAGTGGGTATCAATCCTGACGACATGCTTGCTTGTATCGATG CAGAGTGAAGATGA EJEMPLO 31 Este ejemplo ilustra una secuencia polinucleotídica que regula la expresión génica en más de una especie vegetal. Se identificaron dos regiones altamente conservadas en secuencias de EPSPS de diferentes especies de malezas y se muestran como las secuencias "Región 1" y "Región 2" en la Tabla 23.

TABLA 23 La Tabla 24 muestra secuencias de polinucleótidos de ARNbc de 21 , 22, 24, 35, 45 y 55 mer diseñadas en base a la secuencia consenso de EPSPS para la región 2, TNGANGTcAAcATGAAcAAaATGCCaGATGTNGCNATGACNcTtGCNGTNGT TGC (SEQ ID N0.263).

TABLA 24 Los polinucleótidos de ARNbc de consenso de EPSPS se sintetizaron mediante transcripción in vitro y se aplicaron tópicamente como preparaciones de ARN en bruto. Las malezas resistentes de glifosato (palmera amaranto de 16 copias e hierba de caballo) se trataron con los seis ARNbc consenso individuales (21 , 22, 24, 35, 45, 55 mer); las malezas no resistentes a glifosato (hierba de caballo, palo zorrillo, digitaria, bejuco, quínoa blanca, poinsettia salvaje) se trataron con los tres ARNbc consenso individuales más cortos (21 , 22, 24 mer). Luego del tratamiento con polinucleótidos las plantas resistentes a glifosato se trataron con glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®) y las plantas no reisstentes a glifosato se trataron con glifosato (105 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®). A los 7 días después del tratamiento se descubrió que los seis polinucleótidos de ARNbc consenso de región 2 de EPSPS proporcionan 100% de control (plantas muertas) de palmera amaranto resistente a glifosato; plantas de palmera amaranto testigo tratadas solo con glifosato no murieron. A los 7 días después del tratamiento, se descubrió que los tres polinucleótidos de ARNbc consenso de región 2 de EPSPS más cortos (21 , 22, 24 mer) evaluados individualmente proporcionan 95%, 80% y 65% de control (combinación de plantas muertas y lesionadas), respectivamente, de amaranto tuberculoso; las plantas de amaranto tuberculoso tratadas solo con glifosato proporcionaron aproximadamente 40% de control (combinación de plantas muertas y lesionadas); y una mezcla de los tres polinucleótidos de ARNbc consenso de región 2 de EPSPS más cortos (21 , 22, 24 mer) proporcionó aproximadamente el mismo control que el glifosato solo. Los polinucleótidos de ARNbc consenso de región 2 de EPSPS no provocaron un efecto observable sobre las otras especies de malezas (hierba de caballo, palo zorrillo, digitaria, bejuco, quínoa blanca, poinsettia salvaje) evaluadas.

EJEMPLO 32 Este ejemplo ilustra el uso de un tratamiento con polinucleótidos tópico para silenciar trasitoriamente un gen en una planta para producir un fenotipo deseado. El silenciamiento de polifenol oxidasa en tejidos vegetales inhibe el amarronamiento de los tejidos vegetales cortados o lesionados, una rasgo valorable para frutas y verduras donde la resistencia al amarronamiento es un rasgo deseable. 1 ) Se diseñaron oligonucleótidos de ADN antisentido con las secuencias que se muestran en la Tabla 25 para dirigirlos a tres genes de polifenol oxidasa (PPO1 , PP02 y PP03) de lechuga; el texto subrayado indica la secuencia T7 que se incluyó en los polinucleótidos antisentido.

TABLA 25 Se trataron plantas de lechuga de tres semanas (variedad SVR3603 L4) de la siguiente forma. Se pretrataron dos hojas fuente (hojas que son más viejas y tiene un ~60% de su tamaño en la madurez) en cada planta con 0,1 % (v/v) de Silwet-L-77 y se dejaron secar (-15 minutos). A cada hoja se aplicaron en pequeñas gotas 20 microlitros de una mezcla de los polinucleótidos antisentido de polifenol oxidasa en una solución de 0,01 % (v/v) de Silwet L-77 y 2% (p/v) de sulfato de amonio en 5 milimolares de fosfato de sodio, pH 6,8; cada planta se trató con 6,7 nanomoles de cada uno de los tres polinucleótidos HH07, HH09 y HH1 1 (para un total de 20 nanomoles por planta). Las plantas testigo se trataron con un polinucleótido HH02-05 no relacionado (antisentido para fitoeno desaturasa) o solo con solución amortiguadora (0,01 % (v/v) de Silwet L-77 y 2% (p/v) de sulfato de amonio en 5 milimolares de fosfato de sodio, pH 6,8).

Aproximadamente 3 semanas después del tratamiento con polinucleótidos tópico, las hojas de lechuga "no tratadas" (es decir, las que no fueron tratadas con los polinucleótidos tópicos) se cortaron de la cabeza de la lechuga bajo agua y se incubaron en un recipiente con 1 ,33 milimolares de jasmonato de metilo en 5% de etanol. Las hojas se inspeccionaron para determinar el amarronamiento de las nervaduras centrales y se fotografiaron cada 24 horas. Se tomaron muestras de las plantas restantes y se congelaron para análisis de ARN pequeño y ARNm.

Las plantas tratadas con los polinucleótidos antisentido de polifenol oxidasa HH07, HH09 y HH1 1 exhibieron reducción considerable en el amarronamiento en las nervaduras centrales después del tratamiento con jasmonato de metilo. Las plantas tratadas con HH02-05 (antisentido para fitoeno desaturasa) como testigo exhibieron una leve reducción en el amarronamiento de las nervaduras centrales en comparación con las tratadas con solución amortiguadora.

EJEMPLO 33 Este ejemplo ilustra una composición herbicida adaptada para revestimiento tópico sobre la superficie exterior de una planta en crecimiento que comprende tensioactivo y al menos un agente letal para plantas, la mejora en donde el agente letal para plantas incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen vegetal o a la secuencia del ARN transcrito del gen vegetal, produciendo los polinucleótidos la supresión sistémica del gen vegetal. Más específicamente, este ejemplo ilustra una composición herbicida adaptada para revestimiento tópico sobre la superficie exterior de una planta en crecimiento que comprende tensioactivo y al menos un agente letal para plantas, la mejora en donde el agente letal para plantas incluye polinucleótidos que producen la supresión de los genes endógenos de fitoeno desaturasa (PDS), 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) o ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO) de Nicotiana benthamiana. Este ejemplo también ilustra el uso de polinucleótidos aplicados tópicamente para suprimir un gen expresado altamente (ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa) en una planta.

Se diseñó un polinucleótido antisentido con la secuencia CATCTCCTTTAATTGTACTGC (SEQ ID NO:34) para el gen endógeno de fitoeno desaturasa (PDS) de Nicotiana benthamiana, que tiene los fragmentos de secuencia de ADNc ATGCCCCAAATCGGACTTGTATCTGCTGTTAATTTGAGAGTC CAAGGTAATTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCTTCGTTGGGAACTGA AAGTCAAGATGTTTGCTTGCAAAGGAATTTGTTATGTTTTGGTAGTAGCGA CTCCATGGGGCATAAGTTAAGGATTCGTACTCCAAGTGCCACGACCCGAA GATTGACAAAGGACTTTAATCCTTTAAAGGTAGTCTGCATTGATTATCCAA GACCAGAGCTAGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCGGCGTTATTATCA TCATCGTTTCGTACTTCCTCACGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTATT GCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATCTGGCAGATGC TGGTCACAAACCGATATTGCTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGGTGGGAAG GTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGGTTGC ACATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATGCAGAACCTGTTTGGAGAACTA GGGATTGATGATCGGTTGCAGTGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCGAT GCCTAACAAGCCAGGGGAGTTCAGCCGCTTTGATTTTCCTGAAGCTCTTC CTGCGCCATTAAATGGAATTTTGGCCATACTAAAGAACAACGAAATGCTTA CGTGGCCCGAGAAAGTCAAATTTGCTATTGGACTCTTGCCAGCAATGCTT GGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGACGGTTTAAGTGTTAAGGACTG GATGAGAAAGCAAGGTGTGCCTGATAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATT GCCATGTCAAAGGCACTTAACTTCATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCA GTGCATTTTGATTGCTTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAA AATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTG TGGAACATATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTAAACTCACGAATA AAAAAGATCGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAATGTTTTATACTGAAT AATGGCAGTACAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGA TATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCA AAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGT TTGACAGAAAACTGAAGAACACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGC CCGTTGCTCAGTGTGTACGCTGACATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTA CAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACCCGCAGAAGAGT GGATAAATCGTAGTGACTCAGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTA GCGAAGCTTTTCCCTGATGAAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAAT ATTGAAGTATCATGTTGTCAAAACCCCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCC AGGTTGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCCCTATAGAGGGTTTTT ATTTAGCTGGTGACTACACGAAACAGAAGTACTTGGCTTCAATGGAAGGT GCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGGATTACGA GTTACTTCTTGGCCGGAGCCAGAAGATGTTGGCAGAAGCAAGCGTAGTT AGCATAGTGAACTAA (SEQ ID NO:38).

Se diseñaron polinucleótidos antisentido con las secuencias CTGTGATCATCATATGTATCA (SEQ ID NO:279), CCTTAACTCTCCAGCTAGCAA (SEQ ID NO:280), CAGCCCGCAAATG I I I CATTC (SEQ ID NO:281), GCCGTCAATGGCCGCATTGCT (SEQ ID NO:282), TCCTTCCCTCAGAAAGGGCAG (SEQ ID NO:283) y TTGCCTCATGCTGCTAATCTG (SEQ ID NO:284) para el gen endógeno de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Nicotiana benthamiana, en base a la secuencia de ADNc de EPSPS de Nicotiana benthamiana CTTATATGTGCTTAAGCCTAACGTGCACCCGGCCCCTTAAC CCCAGCAGTTTTCAATCTACCTACCGTCTCTACCATTTTCTTCTAGTTGGT GAAAATTTCTAACTTTGAGAAAACAAGCCAAAG I I I I I GTTTCTAAGAACG CAAAATGAGTGAAATTTTTTGCAGCAATGGCACAGATTAGCAGCATGAG GCAAGGGATACAGACCCCTAATCTTAATTCCTATTTTCCTAAAACCCAAA AGGTTCCTCTTTTTTCGCATTCTATCTTCTTTGGATCAAAGAAAATAACCC AAAATTCAGCAAAATCTTTGTGGGTGTGTAAGAAAGATTCAGTTTTGAGG GTGGCAAAGTCACCTTTTAGGATTTGTGCATCAGTGGCCACTGCACAGA AGCCCAACGAGATTGTGCTGCAACCCATCAAAGATATATCAGGCACTGT TAAATTGCCTGGTTCTAAATCCCTTTCCAACCGTATTCTCCTTCTTGCTGC CCTTTCTGAGGGAAGGACTGTTGTTGACAATTTACTGAGTAGTGATGACA TTCATTACATGCTTGGTGCGTTGAAAACACTTGGACTTCATGTAGAAGAT GACAATGAAAACCAACGAGCAATTGTGGAAGGTTGTGGTGGGCAGTTTC CTGTCGGCGAGAAGTCTGAGGAAGAAATCCAACTATTCCTTGGAAATGC AGGAACAGCAATGCGGCCATTGACGGCAGCAGTTACTGTAGCTGGAGG ACATTCAAGATATGTACTTGATGGAGTTCCTAGGATGAGAGAGAGACCG AT (SEQ ID NO:285), CACTGACGTTGGATTAGAGGTAGGCTCCTTATATGTGCTTAAGCCTAAC GTGCAGCCGGCCCCCAACCCCAGCAGTTTTCAATCTACCTACCGTCTCT ACCATTTTCTTATAGTAGTTGAAAATTTCTAACTTTGAGAAAACAAGCCAA AGTTTTGTTTCTAAGAACACAAAGGGAGTGAAATTTTTTGCAGCAATGGC ACAGATTAGCAGCATGAGGCAAGGGATACAGACCCCTAATCTTAATTCC TATTTTCCTAAAACCCAAAAGGTTCCTC I I I I I I CGCATTCTATCTTCATT GGATCAAAGAAAATAACCCAAAATTCAGCAAAATCTTTGTGGGTGTGTAA GAAAGATTCAGTTTTGAGGGTGGCAAAGTCACCTTTTAGGATTTGTGCAT CAGTGGCCACTGCACAGAAGCCTAACGAGATTGTGCTGCAACCTATCAA AGATATATCAGGCACTGTTAAATTACCTGGTTCTAAATCCCTTTCCAATC GTATTCTCCTTCTTGCTGCCCTTTCTGAGGGAAGGACTGTTGTTGACAAT TTACTGAGTAGTGATGACATTCATTACATGCTTGGTGCATTGAAAACACT TGGACTTCATGTAGAAGATGACAATGAAAACCAACGAGCAATCGTAGAA GGTTGTGGTGGGCAGTTTCCTGTCGGCAAGAAGTCTGAGGAAGAAATCC AACTATTCCTTGGAAATGCAGGAACAGCAATGCGGCCATTGACGGCAGC AGTTACTGTAGCTGGTGGACATTCTAGATATGTACTTGATGGAGTTCCTA GGAT (SEQ ID NO:286) y AAATTCTTGGTTCGAGGAGGTCAGAAGTACAAGTCTCCTGGAAAAGCAT ATGTTGAAGGAGATGCCTCAAGTGCTAGCTACTTTTTGGCGGGTGCAGC TGTCACAGGTGGAACTGTCACTGTTGAAGGTTGTGGAACAAGCAGTTTA CAGGGGGATGTTAAGTTTGCTGAGGTCCTCGAAAAGATGGGGGCAGAA GTTACATGGACAGAGAACAGTGTCACGGTTAAAGGACCTCCAAGGAACT CTTCTGGAATGAAACATTTGCGGGCTGTTGACGTTAACATGAACAAAATG CCAGATGTTGCCATGACTCTTGCTGTAGTTGCACTTTTTGCTGATAGTCC TACTGCCATAAGAGATGTTGCTAGCTGGAGAGTTAAGGAAACTGAGCGG ATGATTGCCATATGCACAGAACTTAGGAAGTTGGGTGCAACAGTTGTAG AAGGGCCAGACTACTGCATAATCACTCCACCTGAAAAGTTAAAAGTAGC GGAAATTGATACATATGATGATCACAGAATGGCCATGGCTTTCTCTCTTG CGGCTTGTGCTGATGTTCCAGTCACCATTAAGGACCCCGGTTGTACTCG CAAAACCTTCCCCAACTACTTTGACGTTCTCCAGCAGTATTCCAAGCATT AAAC C ACTTTC CATTAAG AATTTTG AAAAAG AG AG ACTTTG AC AAC AATG GTGTCATACCGGAAGAGAAAAGCTTTGATCCAAGCTTTCAACTCCTTTTC ATTTGTCATGTGATGATCATTGTATTTGTTGAAGTTGAGCTGCTTTTCTTT TGTCCAGAAGACATGTATGGATACTATTACTATATAGTTAAGGTGAACTC AGCA (SEQ ID NO:287).

Se diseñaron polinucleótidos antisentido con las para el gen endógeno de ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO) de Nicotiana benthamiana , en base a los fragmentos de secuencia de ADNc 2A de cadena pequeña de RuBisCO cloroplástico de Nicotiana benthamianas I GCAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCAC CCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCACCTTTCACAGGTCTTA AGTCTGCTGCCTCATTCCCTGTTTCAAGAAAGCAAAACCTTGACATCACT TCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCA CCAATTAACATGAAGAAGTATGAGACTCTCTCATACCTTCCCGATTTGAG | CCAGGAGCAATTGCTCTCCGAAATTGAGTACCTTTTGAAGAATGGATGG GTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGAAAGGATTTGTCTACCGTGAACA CCACAAGTCACCAGGATACTATGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAG CTACCTATGTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCTGAGGTGG GAGAGGCGAAGAAGGAATACCCACAGGCCTGGGTCCGTATCATTGGAT TTGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCTCCAAGCC TGACGGCTAC (SEQ ID NO:296), ACAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCA ATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCACCTTTCACTGGTCTTAAGTCAGCT GCCTTTTTCCCTGTTTCAAGGAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGC CAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAA CAAGAAGAAGTACGAGACTCTCTCATACCTTCCTGATCTGAGCGTGGAG CAATTGCTTAGCGAAATTGAGTACCTCTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTG CTTGGAATTCGAGACTGAGCGCGGATTTGTCTACCGTGAACACCACAAG TCACCGGGATACTATGACGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCTA TGTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCCGAGGTGGAAGAGG CGAAGAAGGCATACCCACAGGCCTGGATCCGTATTATTGGATTCGACAA CGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCTACAAGCCAGAAGGC TAC (SEQ ID NO:297), CAAGCCAACATGGTTGCACCCTTCACTGGCCTCAAGTCCGCCTCCTCCT TCCCTGTTACCAGGAAACAAAACCTTGACATTACCTCCATTGCTAGCAAT GGTGGAAGAGTTCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACATGAAGA AGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTT AGTGAAGTTGAGTACCTTTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATT CGAGACTGAGCGTGGATTCGTCTACCGTGAACACCACAACTCACCAGGA TACTACGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGT GCACTGATGCCACTCAGGTGTTGGCTGAGGTCGAGGAGGCAAAGAAGG CTTACCCACAAGCCTGGGTTAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCA AGTGCAATGCATCAGTTTTATCGCCTCCAAGCCAGAAGGCTAC (SEQ ID NO:298) y GGCTCAGTTATGTCCTCAGCTGCCGCTGTTTCCACCGGCGCCAATGCTG TTCAAGCCAGCATGGTCGCACCCTTCACTGGCCTCAAGGCCGCCTCCTC CTTCCCGGTTTCCAGGAAACAAAACCTTGACATTACTTCCATTGCTAGAA ATGGTGGAAGAGTCCAATGCATGCAGGTGTGGCCGCCAATTAACAAGAA GAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCGTGGAGCAATTG CTTAGCGAAATTGAGTACCTTTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGA ATTCGAGACTGAGCATGGATTCGTCTACCGTGAACACCACCACTCACCA GGATACTACGATGGCAGATACTGGACGATGTGGAAGTTGCCCATGTTCG GGTGCACCGATGCCACTCAGGTCTTGGCTGAGGTAGAGGAGGCCAAGA AGGCTTACCCACAAGCCTGGGTCAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCG TCAAGTGCAATGCATCAGTTTCATCGCCTACAAGCCCGAAGGCTAT (SEQ ID NO:299).

Las plantas de Nicotiana benthamiana se trataron utilizando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 12. La solución polinucleotidica (o de polinucleótidos mezclados en el caso de EPSPS y RuBisCO) se preparó en 0,01% (v/v) de Silwet L-77 y 2% (p/v) de sulfato de amonio en 5 milimolares de fosfato de sodio, pH 6,8. Se sumergieron dos hojas completamente expandidas por planta en una solución de 0,1 % de Silwet L-77 preparada recientemente con H20 bidestilada durante pocos segundos y se dejaron secar. Aproximadamente 30 minutos después, se aplicaron 20 microlitros de solución polinucleotídica a cada una de las dos hojas pretratadas. Para PDS, cada una de las 5 plantas recibió 25 nanomoles del polinucleótido antisentido de PDS (SEQ ID NO:34); para EPSPS, cada una de las 5 plantas recibió 50 nanomoles de cada polinucleótido antisentido de EPSPS (SEQ ID NOS.279-284); y para RuBisCO, cada una de las 5 plantas recibió 50 nanomoles de cada polinucleótido antisentido de RuBisCO (SEQ ID NOS:288-295). Las plantas testigo apareadas se trataron con solución amortiguadora (0,01% (v/v) de Silwet L-77 y 2% (p/v) de sulfato de amonio en 5 milimolares de fosfato de sodio, pH 6,8). Los resultados se midieron como la altura de la planta a los 12 días (PDS y EPSPS) o 10 días (RuBisCO) después del tratamiento y se muestran en las Figuras 36A - 36B. Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentido de PDS exhibieron enanismo grave (Figura 36A) y blanqueado. Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentidos de EPSPS exhibieron enanismo grave (Figura 36B) y lesión severa en los tejidos del meristemo y el tallo. Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentidos de RuBisCO exhibieron enanismo grave (Figura 36C) y tejidos apicales deformes.

Se diseñó un segundo conjunto de experimentos para investigar los efectos del silenciamiento de un componente de la vía de silenciamiento de ¡ARN endógeno en una planta. Las proteínas Argonauta (AGO) son componentes del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que une pequeños ARN en el proceso de silenciamiento de ¡ARN. Se esperaría que la supresión de Argonauta redujera el efecto fenotípico observado provocado por un proceso de silenciamiento con ¡ARN. Se diseñaron polinucleótidos antisentido de AG01 con las secuencias ggaggcaaaatacgagcctca (HL510, SEQ ID NO:300), cactaatcttaataccaaact (HL51 1 , SEQ ID NO:301 ), tATGggtcattagcataggcattAT (HL512, SEQ ID NO:302), tctcaagaatatcacgctccc (HL513, SEQ ID NO:303), cccttggggacgctggcaggtcac (HL514, SEQ ID NO:304), taatacgactcactatagggggagagagctagatcttttg (HL515, SEQ ID NO:305), taatacgactcactataggcacagtatttcttcctccaacc (HL516, SEQ ID NO:306), TTGCTCATCTTAAATACATGT (HL517, SEQ ID NO:307), TCATCTTAAATACATGTTTTGTCA (HL518, SEQ ID NO:308), ttatcttcagggatacattagc (HL519, SEQ ID NO:309), aatactgcttgctcatcttaaata (HL520, SEQ ID NO:310), gacaattccaagttcagtttc (HL521 , SEQ ID NO:31 1 ), ccgttttagatcaccataaagaga (HL522, SEQ ID NO:312), ttgtctggtaatatcacaatc (HL523, SEQ ID NO:313) para el gen endógeno de Argonaute-1 (AG01 ) de Nicotiana benthamiana,en base a dos secuencias de ADNc parcial de AGO1-2 de Nicotiana benthamiana, ATGGTGAGGAAGAGGAGAACTGAGTTACCTGGTTCTGGTG AGAGCTCTGGGTCTCAAGAAACTGGCGGACAGGGTCGTGGCCAGCATC CACAGCAGCTGCACCAAGCTACCTCCCAGACTCCATATCAAACTGCAAT GACTACTCAGCCAATACCTTATGCAAGACCAACTGAAACATCCTCCGAA GCTGGTTCCTCATCTCAGCCACCTGAGCAGGCAGCTCTACAAGTGACAC AACAGTTCCAGCAACTTGCTTTGCAACAAGAAGCGGCTACAACGCAAGC AGTTCCACCTGCATCAAGCAAATTACTAAGGTTTCCCCTGCGTCCAGGG AAGGGGAGCAATGGTATGAGATGCATAGTCAAAGCCAATCACTTCTTCG CAGAGCTGCCTGACAAAGACTTGCACCAGTATGATGTCACAATTTCTCCA GAGGTGTCATCACGTGGCGTCAACCGTGCTGTCATGGCGCAACTGGTG AAGCTGTACCAAGAATCTCATCTTGGGAAGAGACTTCCAGCATATGATG GAAGGAAAAGTCTATACACTGCAGGGCCCCTTCCATTTGTTCAAAAAGA CTTCAAAATAACTCTTATTGATGATGAGGATGGGCCTGGTGGTGCTAGAA GGGAAAGGGAATTTAAAGTTGTGATCAAATTGGCTGCCCGTGCTGATCT TCATCACTTGGGAATGTTTTTAGAAGGGAAACAGGCTGATGCACCTCAA GAGGCGCTTCAAGTTCTGGATATTGTTCTGCGTGAGTTGCCAACATCTA GGTTTTGTCCTGTGGGTCGTTCTTTCTATTCCCGTGATTTAGGGCGAAAG CAACCATTGGGTGAAGGTTTAGAAAGTTGGCGTGGGTTCTATCAAAGCA TTCGCCCCACACAAATGGGCTTATCACTGAACATCGATATGTCTTCCACT GCATTCATTGAGCCACTGCCAGTCATTGATTTTGTGACACAGCTTCTGAA CCGAGATGTGCCATCTAGACCACTGTCTGATGCTGGCCGTGTAAAGATA AAAAAAGCTCTGAGAGGTGTGAAGGTGGAGGTTACTCATCGTGGAAATA TGCGGAGGAAGTACCGCATTTCGGGTTTAACATCTCAAGCAACAAGAGA GTTGACCTTCCCTGTTGATGAAAATGGTACAGTGAAATCTGTAATTGAGT ATTTTCGAGAAACATATGGGTTTGTAATTCAGCATACTCAGTGGCCTTGT CTACAAGTTGGAAATCAGCAGAGACCTAATTACTTGCCAATGGAAGTCTG CAAGATTGTGGAGGGACAAAGGTACTCAAAGCGCTTGAATGAGAGACAG ATTACTGCACTTCTGAAAGTGACCTGCCAGCGTCCCCAAGGGAGGGAG CGTGATATTCTTGAGACCGTACATCATAATGCCTATGCTAATGACCCATA TGCCAAGGAGTTTGGTATTAAGATTAGTGACAAGTTGGCACAAGTTGAG GCTCGTATTTTGCCTCCACCTCGGCTTAAATATCATGATAACGGTCGAGA AAAGGACTGCCTGCCACAAGTTGGCCAATGGAATATGATGAATAAGAAA ATGGTAAATGGAGGGACGGTGAACAATTGGATCTGCATAAACTTCTCTC GCAATGTGCAAGATAGTGTTGCTCATGGGTTTTGCTCTGAGCTTGCACA AATGTGCCAGATATCTGGCATGAATTTCAATCCAAATCCTGTTCTGCCAC CTTCGAGTGCACGCCCTGATCAGGTCGAAAGAGTATTGAAAACTCGATT TCATGATGCTATGACTAAGTTGCAGCTGCATGGGAGAGAGCTTGATTTG CTAGTTGTCATCTTGCCAGACAATAATGGATCTCTTTATGGTGATCTGAA GCGCATTTGTGAGACTGAACTAGGAGTCGTCTCACAGTGCTGTTTGACA AAACATGTATTTAAGATGAGCAAACAGTATCTAGCCAATGTAGCGCTGAA AATCAATGTGAAGGTGGGAGGGAGAAACACTGTGCTTGTTGATGCAATA TCGAGGCGAATTCCTCTTGTCAGCGACCGGCCTACCATCA I I I I I GGTG CAGATGTCACCCACCCTCACCCTGGGGAGGACTCTAGCCCATCCATTGC CGCGGTGGTTGCTTCTCAAGATTGGCCTGAGATTACAAAGTATGCTGGT CTAGTTTCTGCTCAAGCCCATAGGCAAGAGCTTATTCAGGATCTGTACAC GACTAGGCAAGATCCTGTTAAGGGGACAGTTGCTGGTGGAATGATTAAG GACTTACTTATATCCTTCCGAAGAGCTACTGGACAAAAGCCCCAGAGAAT AATTTTCTATAGGGATGGTGTTAGTGAAGGACAATTTTATCAAGTGCTTC TGTTCGAACTTGATGCGATCCGCAAAGCATGTGCGTCTTTGGAGCCAAA TTATCAGCCCCCAGTCACATTTGTTGTGGTTCAGAAACGACATCACACAA GGCTTTTTGCCAATAACCACCGTGACAGAAATGCAGTTGACAGGAGCGG GAAC ATTATACCTGGTACTGTTGTAG ATTC AAAGATATG C C ACC C GAC AG AGTTTGATTTCTATCTTTGTAGCCATGCCGGCATACAGGGTACGAGCCG TCCAGCTCACTACCATGTTCTATGGGACGAGAACAAATTCACAGCCGAT GCGCTGCAGTCTTTGACCAACAACCTCTGCTATACATATGCAAGGTGCA CGCGTTCCGTCTCCATCGTTCCCCCTGCATATTATGCACATTTGGCAGCT TTCCGTGCTCGATTTTATATGGAGCCGGAGACATCTGACGGTGGTTCAG TAACAAGTGGGGCTGCTGGTGGCAGAGGGGGTGGTGCAGGAGCTGCT GGAAGGAACACCCGAGCCCCAAGTGCTGGTGCTGCTGTTAGACCTCTT CCTGCGCTCAAGGATAATGTGAAGAGGGTTATGTTCTACTGC (SEQ ID NO:314) y CACCTATCACTCTCTTTCTCTCTCTACAAACATATCGTGCCGTTTCTCTCT CGGCCTCTCTTCGTGTTTTAGGGCACCGTGGTGGTTGGTATCCAGGCG GCGGTTTTGAGTTATTACCATGGTGCGGAAGAAGAGGACTGATGTTCCT GGTGGTGCTGAGAGTTTTGAGTCCCATGAAACTGGAGGGGCACGAGGT GGTGCCCAACGCCCATCACAGCAGCAGCAACATCAGCATCAGCAAGGC GGAGGAAGAGGCTGGGCACCTCAGCATGGAGGACATGGTGGCCGTGG TGGTGGGGGAGCTCCACGTGGTGGAATGGCCCCTCAACAATCCTATGG TGGACCTCCTGAATACTACCAACAGGGCAGGGGAACTCAACAGTATCAA CGAGGTGGAGGACAACCCCAGCGCCGTGGTGGCATGGGGGGCCGTGG GGCACGGCCACCAGTACCCGAGCTGCACCAAGCAACCCAGACTCCACA TCAGCCTGTACCATATGGAAGACCATCAGAAACATACTCAGAGGCTGGT TCCTCGTCTCAGCCACCTGAACCAACGACACAGCAAGTGACTCAGCAAT TCCAGCAACTTGTTGTGCAGCCAGAAGCAGCTGCAACCCAAGCAATACA ACCAGCATCGAGCAAGTCGATGAGGTTTCCACTCCGGCCAGGAAAGGG TAGTACTGGTATTAGATGCATAGTTAAGGCCAATCACTTCTTTGCCGAGT TACCTGACAAAGATCTGCACCAGTATGATGTTTCAATTACTCCTGAGGTC GCCTCTCGGGGTGTCAACCGGGCCGTCATGGAGCAGCTGGTGAAGCTT TATAGAGAATCCCATCTTGGGAAGAGGCTTCCAGCCTATGACGGAAGAA AAAGTCTATACACAGCAGGGCCCCTCCCTTTTGTTCAAAAGGATTTTAAA ATCACTCTAATTGATGATGATGATGGACCTGGTGGTGCTAGGAGGGAAA GAGAGTTTAAAGTTGTGATCAAGCTGGCGGCTCGTGCTGATCTTCATCA CTTGGGGATGTTCTTACAAGGGAGACAGGCTGATGCACCGCAAGAAGC ACTTCAGGTGCTGGATATTGTGCTACGTGAGTTGCCAACATCTAGGTATT GTCCTGTGGGCCGCTCTTTCTATTCCCCTCATTTAGGACGAAGACAACC ACTGGGTGAAGGTTTAGAGAGCTGGCGTGGCTTCTATCAAAGTATTCGT CCTACACAGATGGGATTATCCCTGAATATTGATATGTCTTCCACGGCTTT CATTGAGCCACTGCCGATTATTGACTTCGTGAGCCAGCTTCTGAATCGG GATATCTCTTCTAGACCACTGTCTGATGCTGACCGCGTTAAGATAAAGAA GGCACTGAGAGGTGTAAAGGTGGGGGTCACTCATCGTGGAAATATGCG GAGGAAGTATCGCATTTCTGGCTTGACGTCTCAAGCAACAAGAGAGTTG ACTTTTCCTGTCGATGAAAGGGGTACGATGAAAGCTGTTGTGGAATATTT TCGGGAAACCTATGGTTTTGTCATTCGGCATACCCAGTGGCCTTGTCTTC AAGTTGGAAATACGCAGAGGCCAAATTACTTGCCAATGGAAGTATGTAA GATTGTAGAGGGACAGAGATACTCAAAGCGCTTGAATGAGAGGCAGATA ACAGCACTTCTAAAAGTGACCTGCCAACGTCCTCAAGAGAGAGAACGTG ATATTCTTC AG ACTGTTC ATCAC AATG CTTATGCTGATGACC C ATATG C G AAGGAGTTTGGTATTAAGATCAGTGAGGAGCTTGCTCAAGTTGAGGCTC GCGTTTTGCCTGCACCTTGGCTTAAATACCATGATACAGGTCGAGAGAA AGACTGTCTGCCACAAGTGGGCCAGTGGAATATGATGAATAAGAAAATG GTTAATGGAGGAACAGTGAACAACTGGATCTGTGTAAACTTTTCTCGCAA TGTGCAAGACACAGTTGCACGTGGATTTTGTTCCGAGCTTGCACAAATG TGCATGATATCCGGAATGAACTTCAATCCCAATCCTGTTCTACCACCAGT GAGTGCTCGCCCTGATCAAGTTGAGAGAGTCTTGAAAACTCGATTTCAC GATGCTATGACAAAGTTGCAGCCAAATGGGAGAGAGCTAGATCTTTTGA TTGTGATATTACCAGACAATAACGGCTCTCTTTATGGTGATCTAAAACGG ATTTGTGAAACTGAACTTGGAATTGTCTCACAATGCTGCTTGACAAAACA TGTATTTAAGATGAGCAAGCAGTATTTAGCTAATGTATCCCTGAAGATAA ATGTGAAGGTTGGAGGAAGAAATACTGTGCTGGTTGATGCGCTCTCTAG ACGAATTCCCCTTGTCAGCGACCGCCCAACTATCATTTTTGGTGCAGAT GTCACCCATCCCCACCCTGGGGAGGATTCTAGCCCGTCAATTGCTGCG GTGGTTGCTTCTCAAGATTGGCCTGAAATTACAAAGTATGCTGGTTTGGT TTCTGCTCAAGCGCATAGGCAAGAGCTTATACAAGATCTGTACAAGACTT GGCAAGATCCAGTTAGAGGACCTGTGACTGGTGGCATGATAAAGGAATT ACTTATTTCCTTCCGTCGAGCAACTGGACAGAAGCCGCAGAGAATTATAT TCTACAGAGATGGTGTTAGTGAAGGACAATTTTACCAAGTTCTTCTTTTT GAACTTGATGCAATCCGCAAGGCATGTGCATCTTTAGAACCCAACTATCA GCCCCCGGTTACGTTTGTTGTGGTCCAGAAACGGCATCATACTAGGTTG TTTGCCAATAACCACCACGACAGAAATGCAGTTGATCGGAGTGGGAACA TTTTGCCTGGTACCGTTGTAGATTCAAAGATATGCCACCCTACTGAATTT GATTTCTATCTCTGTAGCCATGCCGGCATACAGGGTACTAGCCGCCCAG CTCATTATCATGTTCTGTGGGATGAGAACAATTTTACTGCTGACGCCCTG CAGTCTTTGACTAACAATCTTTGCTATACATATGCTAGGTGTACTCGTTCT GTCTCCATTGTTCCACCAGCATATTATGCACATTTGGCAGCTTTCCGTGC TCGGTTTTACATGGAGCCAGAGACATCTGATAATGGATCAGTCACAAGC GCAGCTGCTTCAAACAGAGGAGGTTTAGGAGCTATGGGAAGGAGCACG CGAGCACCAGGTGCTGGTGCTGCTGTAAGGCCCCTTCCTGCTCTCAAG GAGAATGTTAAGAGGGTTATGTTTTATTGT (SEQ ID NO:315).

Las plantas de Nicotiana benthamiana se trataron utilizando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 12. La solución polinucleotidica (o de polinucleótidos mezclados en el caso de AG01) se preparó en 0,01 % (v/v) de Silwet L-77 y 2% (p/v) de sulfato de amonio en 5 milimolares de fosfato de sodio, pH 6,8. Se sumergieron dos hojas completamente expandidas por planta en una solución de 0,1% de Silwet L-77 preparada recientemente con H20 bidestilada durante pocos segundos y se dejaron secar. Aproximadamente 30 minutos después, se aplicaron 20 microlitros de solución polinucleotidica a cada una de las dos hojas pretratadas. Para PDS, cada una de las 5 plantas recibió 25 nanomoles del polinucleótido antisentido de PDS (SEQ ID NO:34); para AGO1 , cada una de las 5 plantas recibió 50 nanomoles de cada uno de los 14 polinucleótidos antisentido de AG01 (SEQ ID NOS:300-313); para los tratamientos combinados con PDS y AGO, cada una de las 5 plantas recibió 25 nanomoles del polinucleótido antisentido de PDS (SEQ ID NO:34) y nanomoles de cada uno de los 14 polinucleótidos antisentido de AG01 (SEQ ID NOS:300-313) aplicados en hojas separadas.

Las plantas testigo apareadas se trataron con solución amortiguadora (0,01 % (v/v) de Silwet L-77 y 2% de (p/v) de sulfato de amonio en 5 milimolares de fosfato de sodio, pH 6,8). No se observaron diferencias entre las plantas tratadas con los polinucleótidos antisentido de AG01 y las plantas tratadas solo con solución amortiguadora . Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentido de PDS exhibieron blanqueado sistémico. Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentido de PDS y los polinucleótidos antisentido de AG01 aplicados por separado no exhibieron blanqueado sistémico, indicando que la supresión de AG01 bloqueó la expansión sistémica de la señal de silenciamiento.

EJEMPLO 34 Este ejemplo ilustra un método para inducir la regulación sistémica de un gen objetivo endógeno en una planta en crecimiento que comprende revestir tópicamente sobre hojas de dicha planta en crecimiento, polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en dicho gen objetivo endógeno o en el ARN mensajero transcrito a partir de dicho gen objetivo endógeno, con lo cual dichos polinucleótidos permean el interior de dicha planta en crecimiento e inducen la regulación sistémica de dicho gen objetivo endógeno. Más específicamente, este ejemplo ilustra el uso de una composición que comprende tensioactivo y polinucleótidos para inducir al menos transitoriamente la regulación sistémica del gen endógeno de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Zea mays.

Se identificó una secuencia genómica del gen endógeno de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Zea mays como ACCTACTTCCCCCTCGCCCCTCTCATGGTCTCTCTCGCGCC CAGATCTGCTACTAGACGGCACCGCTGCAGCGCGTCGTGTCGCGGGGG TTGGTGGCAGGCAGCGAGAGCTTGCCGTTCCTCTCTCTCAGTTGTCAGG TCCTAGGCTCACCTCACCGGCTCCCAGCCCGCTTCTATTTCTTCCTCCC CGACCCCGTGCAGGTGGCAGTCCAGTCCACGCCACCAACCGCGAGGC GAACCAAACCAACCCACTCTCCCCAACCCCGCGCGCCCAGGCCGCCCG CCCTACCAACCATCGGCGTCGGCAATGGCGGCCATGGCGACCAAGGCC GCCGCGGGCACCGTGTCGCTGGACCTCGCCGCGCCGCCGGCGGCGGC AGCGGCGGCGGCGGTGCAGGCGGGTGCCGAGGAGATCGTGCTGCAGC CCATCAAGGAGATCTCCGGCACCGTCAAGCTGCCGGGGTCCAAGTCGC TTTCCAACCGGATCCTCCTGCTCGCCGCCCTGTCCGAGGTGAGCGATTT TGGTGCTTGCTGCGCTGCCCTGTCTCACTGCTACCTAAATGTTTTGCCTG TCGAATACCATGGATTCTCGGTGTAATCCATCTCACGATCAGATGCACC GCATGTCGCATGCCTAGCTCTCTCTAATTTGTCTAGTAGTTTGTATACGG ATTAATATTGATAAATCGGTACCGCAAAAGCTAGGTGTAAATAAACACTA GAAAATTGGATGTTCCCCTATCGGCCTGTACTCGGCTACTCGTTCTTGTG ATGGCATGCTGTCTCTTCTTGGTGTTTGGTGAACAACCTTATGAAATTTG GGCGCAAAGAACTCGCCCTCAAGGGTTGATCTTATGCCATCGTCATGAT AAACAGTGGAGCACGGACGATCCTTTACGTTGTTTTTAACAAACTTTGTC AGAAAACTAGCATCATTAACTTCTTAATGACGATTTCACAACAAAAAAAG GTAACCTCGCTACTAACATAACAAAATACTTGTTGCTTATTAATTATATGT TTTTTAATCTTTGATCAGGGGACAACAGTGGTTGATAACCTGTTGAACAG TGAGGATGTCCACTACATGCTCGGGGCCTTGAGGACTCTTGGTCTCTCT GTCGAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCTGTAGTTGTTGGCTGTGGT GGAAAGTTCCCAGTTGAGGATTCTAAAGAGGAAGTGCAGCTCTTCTTGG GGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTTACTGCTGC TGGTGGAAATGCAACGTATGTTTCCTCTCTTTCTCTCTACAATACTTGCT GGAGTTAGTATGAAACCCATGGGTATGTCTAGTGGCTTATGGTGTATTG G I I I I I GAACTTCAGTTACGTGCTTGATGGAGTACCAAGAATGAGGGAG AGACCCATTGGCGACTTGGTTGTCGGATTGAAGCAGCTTGGTGCAGATG TTGATTGTTTCCTTGGCACTGACTGCCCACCTGTTCGTGTCAATGGAATC GGAGGGCTACCTGGTGGCAAGGTTAGCTACTAAGGGCCACATGTTACAT TCTTCTGTAAATGGTACAACTATTGTCGAGCTTTTGCATTTGTAAGGAAA GCATTGATTGATCTGAATTTGATGCTACACCACAAAATATCCTACAAATG GTCATCCCTAACTAGCAAACAATGAAGTAATACTTGGCATGTGTTTATCA AATTAATTTCCATCTTCTGGGGCATTGCCTGTTTTCTAGTCTAATAGCATT TGTTTTTAGCATTAATTAGCTCTTACAATTGTTATGTTCTACAGGTCAAGC TGTCTGGCTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGC TCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGGAGATTGAAATCATTGATAAATTAATCT CCATTCCCTACGTCGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGT GAAAGCAGAGCATTCTGATAGCTGGGACAGATTCTACATTAAGGGAGGT CAAAAATACAAGTAAGCTCTGTAATGTATTTCACTACTTTGATGCCAATGT TTCAGTTTTCAGTTTTCCAAACAGTCGCATCAATATTTGAATAGATGCACT GTAGAAAAAAAATCATTGCAGGGAAAAACTAGTACTGAGTATTTTGACTG TAAATTATTTTACCAGTCGGAATATAGTCAGTCTATTGGAGTCAAGAGCG TGAACCGAAATAGCCAGTTAATTATCCCATTATACAGAGGACAACCATGT ATACTATTGAAACTTGGTTTATAAGAGAATCTAGGTAGCTGGACTCGTAG CTGCTTGGCATGGATACCTTCTTATCTTTAGGAAAAGACACTTGATTTTTT TTTTCTGTGGCCCTCTATGATGTGTGAACCTGCTTCTCTATTGCTTTAGAA GGATATATCTATGTCGTTATGCAACATGCTTCCCTTAGCCATTTGTACTG AAATCAGTTTCATAAGTTCGTTAGTGGTTCCCTAAACGAAACCTTGTTTTT CTTTGCAATCAACAGGTCCCCTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCT CAAGCGCAAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATTACTGGAGGGACTGT GACTGTGGAAGGTTGTGGCACCACCAGTTTGCAGGTAAAGATTTCTTGG CTGGTGCTACAATAACTGCTTTTGTC I I I I I GGTTTCAGCATTGTTCTCAG AGTCACTAAATAACATTATCATCTGCAAATGTCAAATAGACATACTTAGGT GAATTCATGTAACCGTTTCCTTACAAATTTGCTGAAACCTCAGGGTGATG TGAAGTTTGCTGAGGTACTGGAGATGATGGGAGCGAAGGTTACATGGAC CGAGACTAGCGTAACTGTTACTGGCCCACCGCGGGAGCCATTTGGGAG GAAACACCTCAAGGCGATTGATGTCAACATGAACAAGATGCCTGATGTC GCCATGACTCTTGCTGTGGTTGCCCTCTTTGCCGATGGCCCGACAGCCA TCAGAGACGGTAAAACATTCTCAGCCCTACAACCATGCCTCTTCTACATC ACTACTTGACAAGACTAAAAACTATTGGCTCGTTGGCAGTGGCTTCCTG GAGAGTAAAGGAGACCGAGAGGATGGTTGCGATCCGGACGGAGCTAAC CAAGGTAAGGCTACATACTTCACATGTCTCACGTCGTCTTTCCATAGCTC GCTGCCTCTTAGCGGCTTGCCTGCGGTCGCTCCATCCTCGGTTGCTGTC TGTGTTTTCCACAGCTGGGAGCATCTGTTGAGGAAGGGCCGGACTACTG CATCATCACGCCGCCGGAGAAGCTGAACGTGACGGCGATCGACACGTA CGACGACCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTTGCCGCCTGTGCCGA GGTCCCCGTGACCATCCGGGACCCTGGGTGCACCCGGAAGACCTTCCC CGACTACTTCGATGTGCTGAGCACTTTCGTCAAGAATTAATAAAGCGTGC GATACTACCACGCAGCTTGATTGAAGTGATAGGCTTGTGCTGAGGAAAT AC ATTTCTTTTGTTCTGTTTTTTCTCTTTC AC GG G ATTAAGTTTTGAGTCT GTAACGTTAGTTGTTTGTAGCAAGTTTCTATTTCGGATCTTAAGTTTGTGC ACTGTAAGCCAAATTTCATTTCAAGAGTGGTTCGTTGGAATAATAAGAAT AATAAATTACGTTTCAGTGGCTGTCAAGCCTGCTGCTACGTTTTAGGAGA TGGCATTAGACATTCATCATCAACAACAATAAAACCTTTTAGCCTCAAACA ATAATAGTGAAGTTATTTTTTAGTCCTAAACAAGTTGCATTAGGATATAGT TAAAACACAAAAGAAGCTAAAGTTAGGGTTTAGACATGTGGATATTGTTT TCCAT (SEQ ID NO:316), con una región en 5' sin traducir ubicada en las posiciones nucleotidicas 1 - 306 y una región en 3' sin traducir ubicada en las posiciones nucleotidicas 3490 - 3907. La secuencia de ADNc de EPSPS se identificó como ACCTACTTCCCCCTCGCCCCTCTCATGGTCTCTCTCGCGCC CAGATCTGCTACTAGACGGCACCGCTGCAGCGCGTCGTGTCGCGGGGG TTGGTGGCAGGCAGCGAGAGCTTGCCGTTCCTCTCTCTCAGTTGTCAGG TCCTAGGCTCACCTCACCGGCTCCCAGCCCGCTTCTATTTCTTCCTCCC CGACCCCGTGCAGGTGGCAGTCCAGTCCACGCCACCAACCGCGAGGC GAACCAAACCAACCCACTCTCCCCAACCCCGCGCGCCCAGGCCGCCCG CCCTACCAACCATCGGCGTCGGCAATGGCGGCCATGGCGACCAAGGCC GCCGCGGGCACCGTGTCGCTGGACCTCGCCGCGCCGCCGGCGGCGGC AGCGGCGGCGGCGGTGCAGGCGGGTGCCGAGGAGATCGTGCTGCAGC CCATCAAGGAGATCTCCGGCACCGTCAAGCTGCCGGGGTCCAAGTCGC TTTCCAACCGGATCCTCCTGCTCGCCGCCCTGTCCGAGGGGACAACAGT GGTTGATAACCTGTTGAACAGTGAGGATGTCCACTACATGCTCGGGGCC TTGAGGACTCTTGGTCTCTCTGTCGAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAG CTGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGAAAGTTCCCAGTTGAGGATTCTAAAGA GGAAGTGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTG ACAGCAGCTGTTACTGCTGCTGGTGGAAATGCAACTTACGTGCTTGATG GAGTACCAAGAATGAGGGAGAGACCCATTGGCGACTTGGTTGTCGGATT GAAGCAGCTTGGTGCAGATGTTGATTGTTTCCTTGGCACTGACTGCCCA CCTGTTCGTGTCAATGGAATCGGAGGGCTACCTGGTGGCAAGGTCAAG CTGTCTGGCTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTG CTCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGGAGATTGAAATCATTGATAAATTAATC TCCATTCCCTACGTCGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGT GAAAGCAGAGCATTCTGATAGCTGGGACAGATTCTACATTAAGGGAGGT CAAAAATACAAGTCCCCTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAG CGCAAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATTACTGGAGGGACTGTGACT GTGGAAGGTTGTGGCACCACCAGTTTGCAGGGTGATGTGAAGTTTGCTG AGGTACTGGAGATGATGGGAGCGAAGGTTACATGGACCGAGACTAGCG TAACTGTTACTGGCCCACCGCGGGAGCCATTTGGGAGGAAACACCTCAA GGCGATTGATGTCAACATGAACAAGATGCCTGATGTCGCCATGACTCTT GCTGTGGTTGCCCTCTTTGCCGATGGCCCGACAGCCATCAGAGACGTG GCTTCCTGGAGAGTAAAGGAGACCGAGAGGATGGTTGCGATCCGGACG GAGCTAACCAAGCTGGGAGCATCTGTTGAGGAAGGGCCGGACTACTGC ATCATCACGCCGCCGGAGAAGCTGAACGTGACGGCGATCGACACGTAC GACGACCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTTGCCGCCTGTGCCGAG GTCCCCGTGACCATCCGGGACCCTGGGTGCACCCGGAAGACCTTCCCC GACTACTTCGATGTGCTGAGCACTTTCGTCAAGAATTAATAAAGCGTGCG ATACTACCACGCAGCTTGATTGAAGTGATAGGCTTGTGCTGAGGAAATA CATTTCTTTTGTTCTG l i l i l í CTCTTTCACGGGATTAAGTTTTGAGTCTGT AACGTTAGTTGTTTGTAGCAAGTTTCTATTTCGGATCTTAAGTTTGTGCAC TGTAAGCCAAATTTCATTTCAAGAGTGGTTCGTTGGAATAATAAGAATAAT AAATTACGTTTCAGTGGCTGTCAAGCCTGCTGCTACGTTTTAGGAGATG GCATTAGACATTCATCATCAACAACAATAAAACCTTTTAGCCTCAAACAAT AATAGTGAAGTTATTTTTTAGTCCTAAACAAGTTGCATTAGGATATAGTTA AAACACAAAAG GCTAAAGTTAGGGTTTAGACATGTGGATATTGTTTTC CAT (SEQ ID NO.317).

Se diseñó un polinucleótido de ARN bicatenario de 240 pares de bases con una cadena correspondiente a la secuencia de ADN TACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCTCTTGG GGATGTGG AGATTGAAATC ATTGATAAATTAATCTC C ATTCC GTAC GTC G AAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAAGCAGAGCATTCT GATAGCTGGGACAGATTCTACATTAAGGGAGGTCAAAAATACAAGTCCC CTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCAAGCTATTTCTTG (SEQ ID NO:318) que corresponde a un segmento de 240 nucleótidos ubicado en las posiciones nucleotídicas 937 - 1 176 de la secuencia de ADNc de EPSPS.

Se germinaron semillas de Zea mays (Gaspe) sobre papel de germinación. Las plántulas se transfirieron a macetas de 10 cm y las plantas se cultivaron en una cámara de cultivo. Se trataron tópicamente con polinucleótidos 3 plantas de 17 días y tres plantas se usaron como testigos. Dos hojas inferiores de cada planta se marcaron y luego se pretrataron sumergiéndolas en una solución de 0,1 % de Silwet L-77. Aproximadamente 30 minutos después del pretratamiento con tensioactivo, se aplicaron 20 microlitros de solución de tratamiento sobre el lado superior de cada una de las dos hojas pretratadas. La solución de tratamiento consistía en una mezcla de 100 microlitros de 2X solución amortiguadora, 90 microlitros de agua, 10 microlitros de una solución de 4,6 microgramos/microlitro de ARNbc de EPSPS (con una cadena correspondiente a la SEQ ID NO:318); la 2X solución amortiguadora era una mezcla de 200 microlitros de 0,1% de Silwet L-77, 200 microlitros de 50 milimolares de fosfato de sodio, 146 microlitros de 34% de fosfato de amonio y 454 microlitros de agua . A los 8 días después del tratamiento, dos de las tres plantas tratadas con polinucleótidos presentaban enanismo con hojas apicales muertas o dañadas (similar al fenotipo observado en plantas de Nicotiana benthamiana tratadas de forma similar con polinucleótidos de EPSPS), mientras que las tres plantas testigo presentaban crecimiento y morofología normales (Figura 37).

EJEMPLO 35 Se investigó la eficacia de diferentes sustancias (incluidas sales, un agente quelante, un humectante y poliaminas) como agentes de transferencia de polinucleótidos o como potenciadores de agentes de transferencia de polinucleótidos conocidos. Anteriormente el sulfato de amonio había demostrado que potenciaba la permeabilidad de las plantas a polinucleótidos (ver, por ejemplo, Ejemplo 13). La Tabla 26 muestra el efecto sobre la actividad herbicida (presentada como un pocentaje del control/muerte de malezas y como la altura de la planta) del sulfato de amonio y de EDTA como aditivos para soluciones de pulverización 1 % de Silwet L-77 de polinucleótidos aplicados tópicamente (ARN) sobre plantas de palmera amaranto resistentes al glifosato. En este experimento específico, se descubrió que el ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) a 0,004% actúa de forma similar al 2% de sulfato de amonio en la solución de pulverización, mejorando la eficacia de los polinucleótidos y potenciando la actividad herbicida del glifosato.

TABLA 26 La Tabla 27 muestra el efecto sobre la actividad herbicida (presentada como un porcentaje de control/muerte de la maleza y como la altura de la planta) de varias sales incluidas sales inorgánicas (cloruro de sodio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, cloruro de amonio) y sales orgánicas (cloruro de tetrametilamonio, cloruro de tetraetilamonio, bromuro de tetrapropilamonio y bromuro de tetrabutilfosfonio) como aditivos para soluciones de 1% de Silwet L-77 para pulverización de polinucleótidos aplicados tópicamente (ARN) sobre plantas de palmera amaranto resistentes al glifosato. En este experimento específico, se descubrió que el cloruro de amonio y el bromuro de tetrabutilfosfonio actúan de forma similar al sulfato de amonio en la solución de pulverización, mejorando la eficacia de los polinucleótidos y potentiaciando la actividad herbicida del glifosato.

TABLA 27 La Tabla 28 muestra el efecto del humectante glicerina sobre la actividad herbicida (presentada como un porcentaje del control/muerte de la maleza y como la altura de la planta) de polinucleótidos aplicados tópicamente (ARN) sobre plantas de palmera amaranto resistentes al glifosato. Se descubrió que la glicerina mejora la eficacia de los polinucleótidos, potenciando la actividad herbicida del glifosato.

TABLA 28 La Figura 38 muestra el efecto de la variación de los contraiones de glifosato sobre la actividad herbicida (presentada como un porcentaje del control/muerte de la maleza y como la altura de la planta) de polinucleótidos aplicados tópicamente (ARN) sobre plantas de palmera amaranto resistentes al glifosato. Se preparó una mezcla de polinucleótidos de EPSPS (IDT [1] (SEQ ID NO:83-84), IDT [2] (SEQ ID NO:85-86), IDT [3] (SEQ ID NO:87-88) y IDT [4] (SEQ ID NO:89-90)) en 0,5% de Silwet L-77, 2% de sulfato de amonio en 10 milimolares de solución amortiguadora de fosfato de sodio, pH 6,8 con 0,2% de portador Roundup® WeatherMax® (MON56151 tensioactivo de amina de cebo mezcla de amina de cebo (16-18C) y cocoamina (12-14C) en la relación de 55:45) y 1682 g de equivalente ácido por hectárea de una de las sales de glifosato; K+ glifosato, isopropilamonio+ glifosato o monoetanolamonio+ glifosato a 215 litros/0.40 ha. mediante pulverizador Milli en 3 repetición de palmera amaranto resistente a glifosato de 10-15 pulgadas que contenían 16 copias de EPSPS. La altura de la planta se puntuó a los 21 días después del tratamiento con glifosato. Los resultados (presentados como un porcentaje del control/muerte de la maleza y como la altura de la planta) se proporcionan en la Tabla 29. Las sales de isopropilamonio y monoetanolamonio de glifosato proporcionaron mejor actividad herbicida en comparación con la sal de potasio.

TABLA 29 Se investigó el efecto de los cationes de poliamina de espermina (/V,Af-b/'s(3-aminopropíl)butano-1 ,4-d¡am¡na) y espermidina (?/-(3-aminopropil)butano-1 ,4-diamina) sobre la actividad herbicida de polinucleótidos aplicados tópicamente (ARN) sobre plantas de palmera amaranto resistentes al glifosato. Las soluciones polinucleotídicas se prepararon utilizando una mezcla de cantidades iguales de las cuatro moléculas de ARNbc "corto" de tamaño de oligonucleótido descritas en el Ejemplo 1 , que tienen una cadena antisentido diseñada para hibridar con el ARNm transcrito a partir del gen de EPSPS palmera amaranto (SEQ ID NO:1 ) en las posiciones 14-38 (ARNbc- 1 corto), posiciones 153-177 (ARNbc-2 corto), 345-369 (ARNbc-3 corto) y 1 105-1129 (ARNbc-4 corto) tal como se indica mediante los nucleótidos subrayados en la Figura 1 ; los ARNbc tenían un excedente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la cadena antisentido y tenían dos desoxinucleótidos como los nucleótidos terminales en el extremo 3' de la cadena sentido. Las soluciones de polinucleótidos de ARNbc se prepararon con 1 o 10 milimolares de espermina o espermidina o 2% de sulfato de amonio, en solución amortiguadora de 10 milimolares de fosfato de sodio (pH 6,8). Las soluciones testigo (sin polinucleótidos) se prepararon con 1 o 10 milimolares de espermina o espermidina o 2% de sulfato de amonio, en solución amortiguadora de 10 milimolares de fosfato de sodio (pH 6,8). Las plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato (33, 36 o 57 copias de EPSPS) se prepulverizaron con 1 % de Silwet L-77. Las soluciones de polinucleótido de ARNbc (1 1 ,6 gramos/0.40 ha.) o las soluciones amortiguadoras se aplicaron como gotas en cuatro hojas inferiores completamente expandidas de palmera amaranto de resistente a glifosato mediante pipeteo. Dos días después del tratamiento con polinucleótidos las plantas se pulverizaron con glifosato (3360 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®). Las plantas se fotografiaron a los 14 días después del tratamiento con glifosato; los resultados se muestran en la Figura 39. El tratamiento con ARNbc y 10 milimolares de espermina con posterior tratamiento con glifosato mató a la palmera amaranto resistente a glifosato con 33 copias de EPSPS y lesionó gravemente y produjo enanismo en la palmera amaranto resistente a glifosato con 36 copias de EPSPS. El tratamiento con 10 mM de espermidina sola produjo enanismo en la palmera amaranto resistente a glifosato con 33 copias. En este experimento específico, ni espermina ni espermidina a 1 o 10 milimolares tuvieron el mismo rendimiento que el 2% de sulfato de amonio.

EJEMPLO 36 Se evaluó la eficacia de diferentes tensioactivos como agentes de transferencia de polinucleótidos en soluciones de polinucleótidos para pulverización aplicadas a palmera amaranto resistente a glifosato. Se adquirieron tensioactivos Break-Thru de Evonik Industries; y tensioactivos Silwet de Momentive. Las soluciones para pulverización se prepararon el mismo día de la pulverización. Se agregó una mezcla de polinucleótidos de EPSPS (IDT [1] (SEQ ID NO:83-84), IDT [3] (SEQ ID NO:87-88) y IDT [4] (SEQ ID NO:89-90)) a soluciones para pulverización 15 a 50 minutos antes de la pulverización y se aplicaron 1 a 2 mililitros utilizando un pulverizador común de bajo volumen muerto ("milli") a plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato de 2.54 a 10 cm (R-22) cultivadas a partir de cortes. Se aplicaron entre 10 y 225 microgramos de polinucleótidos totales a cada planta, dependiendo del experimente; típicamente se aplicaron 23 microgramos de polinucleótidos totales por planta. Las plantas tratadas se colocaron en un invernadero con una programación fijada de temperatura de 26,7/21 ,1 grados Celsius o 29,4/21 ,1 grados Celsius durante 14/10 horas y luz complementaria. 2 a 3 días después, la plantas se pulverizaron con glifosato ("2X Wmax" o 1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®) mediante pulverizador común (37 litros/0.40 ha.) y se volvieron a colocar en el invernadero. La cantidad de control (lesión visual) con respecto a los tratamientos sin pulverización, la altura de las plantas y las fotografías de la palmera amaranto se tomaron a diferentes intervalos de tiempo de hasta 21 días después del tratamiento con glifosato. El peso fresco del material vegetal por encima del suelo se recogió en el último punto de tiempo. Se otorgó una puntuación general de lesión de la planta 0 y 3 a cada tratamiento en base al análisis combinado de Control, Altura, Peso fresco y Fenotipo vegetal visual, donde "3"es actividad herbicida intensa, "2" es actividad moderada, "1 " es actividad leve y "0" es sin actividad observada después de la corrección para cualquier lesión observada provocada por el tratamiento solo con glifosato; los resultados se muestran en la Tabla 30.

Las propiedades físicas de los diferentes tensioactivos también se investigaron y se muestra en la Tabla 30. Se prepararon setenta mililitros de solución de tensioactivo (0,5% de tensioactivo en solución acuosa que contenía 2% de sulfato de amonio, solución amortiguadora (20 milimolares de fosfato de potasio, pH 6,8), con o sin un polinucleótido de EPSPS (IDT [2] (SEQ ID NO:85-86), 0,09 miligramos/mililitro) agregados, el mismo día de la medición. La tensión superficial dinámica se midió a temperatura ambiente (22 a 23 grados Celsius) en un tensiómetro Kruss BP100 utilizando el método de presión máxima de burbuja con gráfica de tensión superficial con respecto a edad de la superficie. El instrumento se programó para detectar automáticamente la superficie e sumergir el capilar hasta una profundidad de 10 mm. Se registraron las mediciones de tensión superficial para tres edades de superficie (aproximadamente 20, 500 y 1250 ms). La tensión superficial en dinas por cm se indicó en el intervalo de 1250 ms como una aproximación de la tensión superficial estática y el cambio entre 20 y 500 ms se indicó como una estimación de la tensión superficial dinámica. Los valores de balance hidrófilo-lipófilo balance (HLP) para los tensioactivos se obtuvieron a partir de referencias de tensioactivo e información del producto.

TABLA 30

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para regular la expresión de un gen endógeno objetivo en plantas u órganos vegetales en crecimiento que incluye revestir tópicamente plantas u órganos vegetales en crecimiento con una composición polinucleotidica que comprende al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en dicho gen endógeno objetivo o en el ARN mensajero transcrito a partir de dicho gen endógeno objetivo y una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que el al menos un polinucleótido permee el interior de dichas plantas u órganos vegetales en crecimiento, con lo cual el al menos un polinucleótido regula la expresión de dicho gen endógeno objetivo.

2.- Un método para potenciar la actividad de un herbicida en plantas en crecimiento que comprende: (a) revestir tópicamente la superficie de dichas plantas en crecimiento con una composición polinucleotidica que comprende: (i) al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en un gen endógeno de dichas plantas crecientes, en donde dicho gen endógeno expresa una proteína que interactúa con un herbicida y (ii) una cantidad eficaz de un agente de transferencia para permitir que dichos polinucleótidos permeen el interior de dichas plantas en crecimiento y (b) aplicar dicho herbicida a dichas plantas en crecimiento; con lo cual dicho al menos un polinucleótido permea el interior de dichas plantas en crecimiento e induce la supresión de dicho gen endógeno, potenciando así la actividad dicho herbicida en dichas plantas en crecimiento.

3. - En una composición herbicida líquida adaptada para revestimiento tópico sobre la superficie exterior de plantas en crecimiento que comprende tensioactivo y al menos un agente letal para plantas, la mejora en donde dicho agente letal para plantas comprende polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia de un gen vegetal o a la secuencia del ARN transcrito de dicho gen vegetal, produciendo dichos polinucleótidos la producción sistémica de ARN pequeños que hibridan con una sonda para dicho gen vegetal.

4. - En una composición herbicida líquida que comprende un herbicida no polinucleotídico, la mejora en donde dicha composición comprende además polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de una planta vegetal o a una secuencia del ARN transcrito de dicho gen vegetal.

5. - Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de dicho gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de dicha planta con dicho gen endógeno o dicho ARN transcrito a partir de dicho gen endógeno para producir el silenciamiento de dicho gen endógeno; y (b) transferir un agente eficaz para facilitar la transferencia de dichos polinucleótidos de ADN bicatenario desde la superficie de dicha planta hacia las células de dicha planta.

6. - Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ADN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de dicho gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ADN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de dicha planta con dicho gen endógeno o dicho ARN transcrito a partir de dicho gen endógeno para producir el silenciamiento de dicho gen endógeno; y (b) transferir un agente eficaz para facilitar la transferencia de dichos polinucleótidos de ADN monocatenario desde la superficie de dicha planta hacia las células de dicha planta.

7. - Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de dicho gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de dicha planta con dicho gen endógeno o dicho ARN transcrito a partir de dicho gen endógeno para producir el silenciamiento de dicho gen endógeno; y (b) transferir un agente eficaz para facilitar la transferencia de dichos polinucleótidos de ARN bicatenario desde la superficie de dicha planta hacia las células de dicha planta.

8. - Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de ARN monocatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de dicho gen endógeno; en donde los polinucleótidos de ARN monocatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de dicha planta con dicho gen endógeno o dicho ARN transcrito a partir de dicho gen endógeno para producir el silenciamiento de dicho gen endógeno; y (b) transferir un agente eficaz para facilitar la transferencia de dichos polinucleótidos de ARN monocatenario desde la superficie de dicha planta hacia las células de dicha planta.

9. - Una composición que consiste esencialmente en (a) una solución de polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario no transcribible que tiene una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de dicho gen endógeno; en donde los polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de dicha planta con dicho gen endógeno o dicho ARN transcrito a partir de dicho gen endógeno para producir el silenciamiento de dicho gen endógeno; y (b) transferir un agente eficaz para facilitar la transferencia de dichos polinucleótidos de híbrido de ADN/ARN bicatenario desde la superficie de dicha planta hacia las células de dicha planta.

10. - Un método para controlar selectivamente plantas espontáneas resistentes a herbicidas objetivo en un campo de cultivos resistentes a herbicidas que comprende aplicar sobre las hojas de las plantas espontáneas una composición que comprende oligómeros polinucleotidicos que proporcionan en células de las plantas espontáneas ARN monocatenario sistémico que es capaz de hibridar en condiciones fisiológicas en células de dichas plantas espontáneas con ARN mensajero que se transcribe a partir de un gen endógeno que (i) es un gen esencial para mantener el crecimiento o la vida de la planta espontánea, (ii) codifica una proteina que proporciona resistencia a herbicidas a dicha planta espontánea o (iii) se transcribe en un agente regulador de ARN.

1 1. - Un método para investigar la genética inversa modulando un gen endógeno en una planta, comprendiendo dicho método aplicar tópicamente sobre tejido de una planta viva una composición de conformidad con la reivindicación 1.

12. - Una composición herbicida que comprende una solución acuosa de (a) un agente para acondicionar una planta para la permeación de oligómeros polinucleotidicos y (b) oligómeros polinucleotidicos que comprenden al menos una cadena polinucleotídica que comprende al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen endógeno de dicha planta en dirección antisentido o sentido, en donde el gen endógeno codifica una proteína que proporciona a dicha planta resistencia a un herbicida químico o es un gen esencial.

13. - Una planta que comprende ADN o ARN exógeno para suprimir un gen endógeno, en donde el ADN exógeno no está integrado en un cromosoma de dicha planta y dicho ARN exógeno no se transcribe a partir de ADN integrado en un cromosoma de dicha planta y en donde el gen endógeno se suprime mediante aplicación tópica de un polinucleótído en dicha planta después que la planta ha emergido de una semilla.

14. - Un método para administrar un polinucleótído en el interior de una célula vegetal mediante aplicación tópica del polinucleótído en el exterior de la célula vegetal, comprendiendo dicho método combinar dicho polinucleótído con un tensioactivo de organosilícona.

15. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 10, 11 o 14, caracterizado además porque dicha expresión de dicho gen endógeno objetivo se regula en células vegetales distintas a las revestidas tópicamente; en donde dicho gen endógeno objetivo se regula sistémicamente en al menos un órgano vegetal; en donde dicho gen endógeno objetivo codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en 5-enolp¡ruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxílasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco liasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina, una RUBISCO, un factor de iniciación de traducción, una fitoeno desaturasa y una adenosina tripolifosfatasa (ddATP) de ADN bicatenario; en donde los polinucleótidos se dirigen a diferentes segmentos de un gen endógeno o a diferentes genes endógenos; en donde la permeación de dichos polinucleótidos desde la superficie de una planta hacia las células utiliza un agente de transferencia que comprende una organosilicona; en donde la permeación de dichos polinucleótidos desde la superficie de una planta hacia las células utiliza un agente de transferencia que comprende una sal de amonio; en donde dichas plantas se cultivan en un campo abierto; en donde dichas plantas se cultivan en un invernadero; en donde dichas plantas también se pulverizan con un herbicida no polinucleotídico; o una combinación de uno o más de estos.

16.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 12, caracterizada además porque dicho agente de transferencia se selecciona del grupo que consiste en un tensioactivo y una sal; en donde dicho tensioactivo es un tensioactivo de organosilicona; en donde dicho tensioactivo de organosilicona es un copolímero de poliéster y silicona; en dicho copolímero de poliéster y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible como tensioactivo Silwet® L-77); comprendiendo además una molécula herbicida no polinucleotídica; en donde dicho gen vegetal codifica una proteina que proporciona tolerancia a herbicidas y es una 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una ácido acetohidroxi sintasa o una acetolactato sintasa (ALS), una acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa (PDS), una protoporfirina IX oxigenasa (PPO), una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa (GS), una 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DOXP) sintasa, una dihidropteroato (DHP) sintasa, una fenilalanina amoníaco liasa (PAL), una glutatión S-transferasa (GST), una proteína D1 de fotosistema II, una mono-oxigenasa, un citocromo P450, una celulosa sintasa, una beta-tubulina, una RUBISCO, un factor de iniciación de traducción, una fitoeno desaturasa y una adenosina tripolifosfatasa (ddATP) de ADN bicatenario; o una combinación de estas.