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BR112019016394A2 - construto de dna, pilha molecular, pilha de melhoramento, planta transgênica ou progênie da mesma, composição e método para controlar uma população de praga de inseto - Google Patents

construto de dna, pilha molecular, pilha de melhoramento, planta transgênica ou progênie da mesma, composição e método para controlar uma população de praga de inseto Download PDF

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BR112019016394A2
BR112019016394A2 BR112019016394A BR112019016394A BR112019016394A2 BR 112019016394 A2 BR112019016394 A2 BR 112019016394A2 BR 112019016394 A BR112019016394 A BR 112019016394A BR 112019016394 A BR112019016394 A BR 112019016394A BR 112019016394 A2 BR112019016394 A2 BR 112019016394A2
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BR
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seq
sequence
nucleic acid
ipd079
polypeptide
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L Lu Albert
Thomas BARRETT Chad
Wu Gusui
J Ruttman Laura
Hu Xu
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Pioneer Hi Bred Int
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Abstract

são proporcionadas composições e métodos para controlar pragas. os métodos envolvem transformar organismos com uma sequência de ácido nucleico codificando um elemento de silenciamento e uma proteína inseticida. em particular, as sequências de ácidos nucleicos são úteis para preparar plantas e microrganismos que possuem atividade inseticida. assim, são proporcionadas bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de plantas e sementes transformados. composições são ácidos nucleicos e proteínas inseticidas de espécies bacterianas. as sequências encontram uso na construção de vetores de expressão para transformação subsequente em organismos de interesse incluindo plantas, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos). as proteínas pesticidas encontram uso no controle, inibição do crescimento ou extermínio de populações de pragas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros, fungos e nematódeos e para produzir composições com atividade inseticida.

Description

CONSTRUTO DE DNA, PILHA MOLECULAR, PILHA DE MELHORAMENTO, PLANTA TRANSGÊNICA OU PROGÊNIE DA MESMA, COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA CONTROLAR UMA POPULAÇÃO DE PRAGA DE INSETO REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE [0001] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um ficheiro nomeado 7418USPSP_Sequence_Listing criado em 7 de fevereiro de 2017, e que tem um tamanho de 5196 quilobites e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e é incorporada na sua totalidade neste documento a título de referência.
CAMPO [0002] Esta divulgação se relaciona com o campo da biologia molecular. São proporcionadas certas pilhas de novos genes que codificam codificando polipeptídeos IPD079 e elementos de silenciamento. Essas proteínas pesticidas, os traços de RNAi e as sequências de ácido nucleico que codificam os mesmos são úteis no preparo de formulações pesticidas e na produção de plantas resistentes à praga transgênica.
ANTECEDENTES [0003] O controle biológico de pragas de inseto de significância agrícola com o uso de um agente microbiano, como fungos, bactérias ou outras espécies de inseto, fornece uma alternativa ecologicamente correta e comercialmente atrativa aos pesticidas guímicos sintéticos. De modo geral, o uso de biopesticidas apresenta um risco mais baixo de poluição e riscos
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2/191 ambientais, e biopesticidas fornecem especificidade para o alvo maior do que é característico de inseticidas químicos de largo espectro tradicionais. Além disso, os biopesticidas normalmente têm um menor custo de produção e melhoram, desse modo, o rendimento econômico para uma variedade ampla de culturas.
[0004] Certas espécies de microrganismos do gênero Bacillus são conhecidas por terem atividade pesticida contra uma faixa de pragas de insetos incluindo Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e outras. Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus popilliae estão entre os agentes de biocontrole mais bemsucedidos descobertos até hoje. A patogenicidade para insetos também foi atribuída a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus e B. cereus. Os inseticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos a partir de cepas de Bacillus, têm desempenhado uma função importante na agricultura como alternativas ao controle químico de pragas.
[0005] As plantas de culturas foram desenvolvidas com resistência a insetos aprimorada modificando geneticamente as plantas de cultura para produzirem proteínas pesticidas a partir de Bacillus. Por exemplo, as plantas de milho e de algodão foram geneticamente modificadas para produzir proteínas pesticidas isoladas das cepas de Bt. Essas culturas geneticamente modificadas são agora amplamente usadas na agricultura e dotaram o agricultor de uma alternativa ambientalmente amigável aos métodos tradicionais de controle de insetos. Embora tenham demonstrado ser muito bem-sucedidas comercialmente, essas plantas de cultura resistentes a insetos geneticamente modificadas fornecem resistência a apenas uma faixa estreita das pragas de insetos economicamente importantes. Em alguns casos,
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3/191 os insetos podem desenvolver resistência a compostos inseticidas diferentes, o que gera a necessidade de identificar agentes de controle biológico alternativos para controle de pragas.
[0006] Consequentemente, permanece uma necessidade de novas proteínas pesticidas com diferentes alcances de atividade inseticida contra pragas de inseto, por exemplo, proteínas inseticidas gue são ativas contra uma variedade de insetos da ordem Lepídoptera e da ordem Coleoptera, o que inclui, mas sem limitação, pragas de insetos que desenvolveram resistência a inseticidas existentes.
SUMÁRIO [0007] Em um aspecto, são fornecidas composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células, tecidos e sementes de plantas. As composições incluem pilhas de moléculas de ácidos nucleicos, incluindo moléculas de ácidos nucleicos codificando polipeptideos IPD079, vetores que compreendem essas moléculas de ácidos nucleicos e células hospedeiras que compreendem os vetores. Em algumas modalidades, pilhas de moléculas de ácidos nucleicos incluem moléculas de ácidos nucleicos codificando polipeptideos IPD079 e um ou mais elementos de silenciamento. As composições também incluem as sequências de polipeptideos pesticidas e anticorpos para esses polipeptideos. As sequências de ácidos nucleicos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As sequências de nucleotídeos ou aminoácidos podem ser sequências sintéticas que foram projetadas para expressão em um organismo que inclui, mas sem limitação, um
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4/191 microrganismo ou uma planta. As composições também compreendem bactérias, plantas, células de plantas, tecidos e sementes transformados.
[0008] Em outro aspecto, moléculas de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes são fornecidas codificando perforinas derivadas de plantas, incluindo substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos e combinações dos mesmos. Em particular, moléculas de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes são fornecidas codificando polipeptídeos IPD079 incluindo substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos e combinações dos mesmos. Adicionalmente, as sequências de aminoácidos que correspondem aos polipeptídeos IPD079 são abrangidas. São fornecidas moléculas de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes com capacidade para codificar polipeptídeos IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID
NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO:
66, SEC ) ID NO: 68, SEQ ID NO: 7 0 , SEQ ID I 40: 96, SEQ IE ) NO: 98,
SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO : 104, SEQ ID NO: 106,
SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO : 112, SEQ ID NO: 114,
SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO: 122,
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5/191
SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130,
SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138,
e SEQ ID NO: 140, assim como variantes de substituições,
variantes de deleções, variantes de inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos, e combinações dos mesmos. As sequências de ácidos nucleicos que são complementares a uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou que hibridam com uma sequência das modalidades também são abrangidas.
[0009] Em outro aspecto são fornecidos polipeptideos IPD079 isolados ou recombinantes incluindo, mas não se limitando aos polipeptideos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ
ID NO: θ, 8 ;eq ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID
NO: 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ
ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID
NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:
74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82,
SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ
ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID
NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO:
68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100,
SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108,
SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116,
SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124,
SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132,
SEQ ID NO: 134, SEQ II 3 NO: 136, SEQ ID NO : 138, e SEQ ID NO:
140, assim como variantes de substituições, variantes de deleções, variantes de inserções de aminoácidos, fragmentos dos
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6/191 mesmos, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, uma composição compreende um polipeptídeo IPD079 isolado ou recombinante revelado no presente documento e um ou mais elementos de silenciamento. Em modalidades adicionais, o elemento de silenciamento direciona uma sequência polinucleotídica apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338 ou 1341.
[0010] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para produzir os polipeptídeos e para usar esses polipeptídeos para controlar ou exterminar pragas de lepidópteros, coleópteros, nematódeos, fungos e/ou dípteros. As plantas transgênicas das modalidades expressam uma ou mais dentre as sequências pesticidas reveladas no presente documento. Em várias modalidades, a planta transgênica compreende adicionalmente um ou mais genes adicionais para resistência a inseto, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controlar pragas de coleópteros, lepidópteros, hemípteros ou nematódeos. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que a planta transgênica também pode compreender gualquer gene que confira um traço agronômico de interesse.
[0011] Composições e métodos proporcionados em certas modalidades incluem polinucleotídeos-alvo de silenciamento ou variantes e fragmentos ativos dos mesmos da Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A n° US2014/0275208 e US2015/0257389. São fornecidos elementos de silenciamento projetados em vista desses polinucleotídeos-alvo da Publicação de Pedido Internacional N° WO 2016/205445, Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A n° US2014/0275208 e US2015/0257389 que, quando ingeridos pela praga, diminuem a expressão de uma ou mais sequências-alvo e,
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7/191 assim, controlam a praga (isto é, têm atividade inseticida). Em certas modalidades, um elemento de silenciamento como revelado no presente documento direciona qualquer uma das SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338 ou 1341.
[0012] Em certas modalidades, uma pilha é proporcionada compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo IPD079 revelado no presente documento, e um polinucleotídeo codificando um elemento de silenciamento. Em uma modalidade adicional, o elemento de silenciamento compreende um RNA de fita dupla. Em algumas modalidades, o elemento de silenciamento direciona um RyanR, um Pat 3, um HP2, um RPS10, um Snf7, A VATPase, subunidade alfa de Coatâmero, subunidade gama de Coatâmero, um MAEL, um BOULE ou um gene NCLB gene, incluindo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338 ou 1341.
[0013] As composições e os métodos das modalidades são úteis para a produção de organismos com resistência ou tolerância a pragas aprimorada. Esses organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para propósitos agrícolas. As composições das modalidades também são úteis para gerar proteínas alteradas ou melhoradas que têm atividade pesticida ou para detectar a presença de polipeptideos IPD079.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0014] A FIG. 1 mostra um gráfico que representa a pontuação de lesão nodal de alimentação de verme da raiz do milho do oeste em quatro plantas T0 que expressam um construto empilhado que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD079 (SEQ ID NO: 56) e um polinucleotídeo codificando um
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8/191 elemento de silenciamento COATG (SEQ ID NO: 1322) ou uma linhagem de controle negativo, HC69.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0015] Deve ser entendido que esta divulgação não é limitada à metodologia, protocolos, linhagens celulares, gêneros e reagentes particulares descritos, visto que os mesmos podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever apenas as modalidades particulares e não é destinada a limitar o escopo da presente divulgação.
[0016] Como usadas aqui, as formas singulares um, e, e o/a incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a uma célula inclui uma pluralidade de tais células e a referência a a proteína inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta divulgação pertence, a menos que claramente indicado de outro modo.
[0017] A presente divulgação é direcionada a composições e métodos para controlar pragas. Os métodos envolvem transformar organismos com sequências de ácidos nucleicos que codificam perforinas derivadas de plantas e um ou mais elementos de silenciamento. As composições e métodos envolvem transformar organismos com sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos IPD079 e um ou mais elementos de silenciamento. Em
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9/191 particular, as sequências de ácido nucleico das modalidades são úteis para preparar plantas e micro-organismos que têm atividade pesticida. Assim, são proporcionadas bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de plantas e sementes transformados. As composições incluem sequências de ácidos nucleicos ou perforinas de espécies de plantas e um ou mais elementos de silenciamento. As sequências de ácidos nucleicos encontram uso na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos) e para a geração de perforina derivada de planta, particularmente polipeptídeos IPD079, alterados através de métodos conhecidos na técnica, como mutagênese dirigida a sítios, troca de domínios ou embaralhamento de DNA. As perforinas derivadas de plantas encontram uso no controle ou extermínio de populações de pragas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, fúngicas, hemípteros e de nematódeos e para produzir composições com atividade pesticida. As pragas de insetos de interesse incluem, mas sem limitação, espécies de Lepídoptera que incluem, mas sem limitação: Lagarta da espiga, (CEW) (Helícoverpa zea), Broca europeia do milho (ECB) (Ostrínía nubílalís) , traça das crucíferas, por exemplo, Helícoverpa zea Boddie; lagarta falsamedideira, por exemplo, Pseudoplusía íncludens Walker, e lagarta da soja, por exemplo, Antícarsía gemmatalís Hübner, e espécies de Coleoptera que incluem, mas sem limitação, Lagarta-da-raiz do milho do oeste (Díabrotíca vírgífera) - WCRW, Lagarta-da-raiz do milho do sul (Díabrotíca undecímpunctata howardi) - SCRW e Lagarta-da-raiz do milho do norte (Díabrotíca barber!) - NCRW. Os polipeptídeos IPD079 e elementos de silenciamento encontram
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10/191 uso no controle ou extermínio de populações de pragas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, fúngicas, hemípteros e de nematódeos e para produzir composições com atividade pesticida.
[0018] Toxina pesticida ou proteína pesticida é usada no presente documento para se referir a uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas sem limitação, membros das ordens Lepídoptera, Díptera, Hemíptera e Coleoptera ou do filo Nematoda ou uma proteína que tem homologia com tal proteína.
[0019] Em algumas modalidades, os polipeptideos IPD079 incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências de ácido nucleico de comprimento completo reveladas no presente documento e sequeências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de comprimento completo, devido ao uso de um local de início a jusante alternativo ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que tem atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo em que a proteína é expressa ou na praga após a ingestão da proteína. Em algumas modalidades, um elemento de silenciamento direciona um polinucleotídeo apresentado nas SEQ TD NOs: 1279, 1280, 1337, 1338 ou 1341.
[0020] Desse modo, são fornecidas no presente documento novas sequências de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes que conferem atividade pesticida. Também são fornecidas sequências de aminoácidos de polipeptideos IPD079. A proteína que resulta da tradução desses genes de polipeptídeo IPD079 permite que células controlem ou exterminem pragas que ingerem a mesma.
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Moléculas de Ácidos Nucleicos e Variantes e Fragmentos das Mesmas [0021] Em algumas modalidades, moléculas de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes que compreendem sequências de ácidos nucleicos que codificam perforinas derivadas de plantas e elementos de silenciamento ou porções biologicamente ativas das mesmas, assim como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para o uso como sondas de hibridação para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codificam proteínas com regiões de homologia de sequência. Uma modalidade se refere a moléculas de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes que compreendem sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos IPD079 ou porções biologicamente ativas das mesmas, assim como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para o uso como sondas de hibridação para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codificam proteínas com regiões de homologia de sequência. Conforme usado no presente documento, o termo molécula de ácido nucleico se refere a moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA, DNA genômico, DNA plastídico, DNA mitocondrial) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados com o uso de análogos de nucleotideos. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla.
[0022] Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) isolada é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro. Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) recombinante é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que está em uma célula hospedeira bacteriana ou de planta recombinante. Em
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12/191 algumas modalidades, um ácido nucleico isolado ou recombinante está livre de sequências (preferencialmente sequências codificadoras de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Para propósitos da divulgação, isolado ou recombinante, quando usado para se referir a moléculas de ácidos nucleicos, exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica os polipeptídeos IPD079 ou um elemento de silenciamento pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de ácidos nucleicos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado.
[0023] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma perforina derivada de planta ou polipeptídeo IPD079 ou elemento de silenciamento tem uma ou mais mudanças na sequência de ácido nucleico em comparação com a sequência de ácido nucleico nativa ou genômica. Em algumas modalidades, a mudança na sequência de ácido nucleico nativa ou genômica inclui, mas sem limitação: mudanças na sequência de ácido nucleico devido à degenerescência do código genético; mudanças na sequência de ácido nucleico devido à substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácidos em comparação com a sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais introns; deleção de uma ou mais regiões reguladoras a montante ou a jusante; e deleção da região 5' e/ou 3' não traduzida associada à sequência de ácido nucleico genômico. Em algumas modalidades,
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13/191 a molécula de ácido nucleico codificando perforinas derivadas de plantas ou polipeptídeo IPD079 da revelação é uma sequência não genômica.
[0024] Uma variedade de polinucleotídeos que codifica polipeptídeos IPD079 derivados de plantas e proteínas relacionadas é contemplada. Tais polinucleotídeos são úteis para a produção de perforinas derivadas de plantas e polipeptídeos IPD079 da revelação em células hospedeiras quando operacionalmente ligados a sequências promotoras, intensificadoras, de terminação da transcrição e/ou de poliadenilação adequadas. Tais polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam perforinas derivadas de plantas e polipeptídeos IPD079 ou proteínas relacionadas.
Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD079 [0025] Uma fonte de polinucleotídeos que codificam perforinas derivadas de plantas e polipeptídeos IPD079 ou proteína relacionada é uma samambaia ou outras espécies de plantas primitivas. Uma fonte de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD079 ou proteínas relacionadas é uma samambaia ou outras espécies de plantas primitivas que contêm um polmucleotideo IPD079 de SEQ
5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ
NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID
31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43,
ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ
ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:
35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39,
SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ
ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID
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14/191
NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID
81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93,
ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ
NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID
NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ IDNO:
85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:89,
SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55,SEQ
ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID
NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ IDNO:
99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO
107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO
115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO
123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO
131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID
NO: 139 codificando um polipeptídeo IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ
ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO : θ, SEC ID NO: 10, SEC ID NO:
12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20,
SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEC ID NO: 2 6, SEC ID NO: 28, SEC
ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 36, SEC ID
NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ 1 ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO:
46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 54,
SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEC ID NO: 7 6, SEC ID NO: 78, SEC
ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 86, SEC ID
NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEC 1 ID NO: 92, SEC ID NO: 94, SEC ID NO:
56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 64,
SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEC ID NO : 7 0, SEC ID NO: 96, SEC
ID NO: 98, SEC ID NO: 100, SEC ID NO: 102, SEC ID NO: 104, SEC
ID NO: 106, SEC ID NO: 108, SEC ID NO: 110, SEC ID NO: 112, SEC
ID NO: 114, SEC ID NO: 116, SEC ID NO: 118, SEC ID NO: 120, SEC
ID NO: 122, SEC ID NO: 124, SEC ID NO: 126, SEC ID NO: 128, SEC
ID NO: 130, SEC ID NO: 132, SEC ID NO: 134, SEC ID NO: 136, SEC
ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 140. Os polinucleotídeos de SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ
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15/191
ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 139 podem ser usados para expressar polipeptídeos IPD079 em hospedeiros bacterianos que incluem mas não se limitam a células hospedeiras bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas e Rhizobium. Os polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos IPD079 ou proteínas relacionadas. Tais sondas podem ser usadas para identificar homólogos ou polinucleotídeos substancialmente homólogos derivados da espécie Pteridophyta.
[0026] Polinucleotídeos que codificam perforinas derivadas de plantas e polipeptídeos IPD079 da revelação também podem ser sintetizados de novo a partir da sequência das perforinas derivadas de plantas ou do polipeptídeo IPD079. A sequência do
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16/191 gene de polinucleotídeo pode ser deduzida de uma sequência de polipeptídeo IPD079 através do uso do código genético. Os programas de computador, como BackTranslate (Pacote GCG™, Acclerys, Inc. San Diego, Califórnia) podem ser usados para converter uma sequência de peptídeo na sequência de nucleotideos correspondente codificadora do peptídeo. Exemplos de sequências de perforinas derivadas de plantas que podem ser usadas para obter sequências codificadoras de nucleotideos correspondentes incluem, porém, sem limitação, os polipeptídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 158-1248. Os exemplos de sequências de polipeptídeos IPD079 que podem ser usadas para obter sequências de codificação de nucleotideos correspondentes incluem, mas sem limitação, os polipeptídeos IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO:
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138, e SEQ ID NO: 140. Além disso, sequências de polinucleotídeos sintéticos codificando perforinas derivadas de plantas e polipeptídeos IPD079 da revelação podem ser planejadas de modo a serem expressas em plantas usando métodos conhecidos na técnica.
[0027] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 é um polinucleotídeo que tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID
NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID
NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID
NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID
NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID
NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou Í SEQ
ID NO: 139, e variantes , fragmentos e complemento s do mesmo .
Complemento é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que é suficientemente complementar a uma dada sequência de ácido nucleico para poder hibridar com a dada sequência de ácido nucleico para desse modo
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18/191 formar um dúplex estável. Variantes de sequência de polinucleotídeo é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que, exceto pela degenerescência do código genético, codifica o mesmo polipeptídeo.
[0028] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a perforina derivada de planta ou polipeptídeo IPD079 é uma sequência de ácido nucleico não genômico. Conforme usado no presente documento, uma sequência de ácido nucleico não genômico ou molécula de ácido nucleico não genômico ou polinucleotídeo não genômico se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem uma ou mais mudanças na sequência de ácido nucleico em comparação com uma sequência de ácido nucleico nativo ou genômico. Em algumas modalidades a mudança para uma molécula de ácido nucleico nativa ou genômica inclui mas não está limitada a: alterações na sequência de ácido nucleico devido à degenerescência do código genético; otimização de códons da sequência de ácido nucleico para a expressão em plantas; mudanças na sequência de ácido nucleico para introduzir pelo menos uma substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácidos em comparação com a sequência nativa ou genômica; a remoção de um ou mais introns associados com a sequência de ácido nucleico genômica; inserção de um ou mais introns heterólogos; deleção de uma ou mais regiões reguladoras a montante ou a jusante associadas com a sequência de ácido nucleico genômica; inserção de uma ou mais regiões reguladoras heterólogas a montante ou a jusante; deleção da região 5' e/ou 3' não traduzida associada à sequência de ácido nucleico genômica; inserção de uma região heteróloga 5' e/ou 3' não traduzida; e modificação de um sítio
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19/191 de poliadenilação. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não genômico é um cDNA. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não genômica é uma sequência de ácidos nucleicos sintética.
[0029] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo IPD079 é um polinucleotídeo não genômico tendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos
50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%,
63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,
76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91% , 92% , 93 %, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % de
identidade com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:
19, SEQ 1 ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27,
SEQ ID NO: 29, SEQ ID ] NO: 31, SEQ ID 1 40: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ
ID ] NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID
NO: 45, SEQ 1 ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:
53, SEQ 1 ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77,
SEQ ID NO: 79, SEQ ID ] NO: 81, SEQ ID 1 40: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ
ID ] NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID
NO: 57, SEQ 1 ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:
63, SEQ 1 ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95,
SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103,
SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107 , SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111,
SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115 , SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119,
SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123 , SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127,
SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 , SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135,
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SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 139, em que o polipeptídeo IPD079 tem atividade inseticida.
[0030] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo IPD079 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68,
SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ
ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ
ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ
ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ
ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ
ID NO: 134, SEQ ID NO : 136, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 140,
tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou mais substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:
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18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,
SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ
ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID
NO: 44, SEC ) ID NO: 46, SEC ) ID NO: 48, SEC ) ID NO: 50, SEC ) ID NO:
52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76,
SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ
ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID
NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 60, SEQ ID ' NO:
62, SEC ) ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID 1 MO: 68 , SEQ ) ID NO: 70,
SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102,
SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO : 108, SEQ ID NO: 110,
SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO: 118,
SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO: 126,
SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO : 132, SEQ ID NO: 134,
SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID 1 MO: 140.
[0031] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica o polipeptídeo de perforina derivada de planta de qualquer uma das SEQ ID NOs: 158-1248.
[0032] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando a perforina derivada de planta ou polipeptídeo IPD079 é derivada de uma espécie de samambaia da Divisão Pterídophyta. A filogenia de samambaias, como usado no presente documento, é baseada na classificação para samambaias existentes por A. R. Smith et al , TAXON, 55:705-731 (2006). Outras classificações filogênicas de samambaias existentes são conhecidas do perito na técnica. Informação adicional sobre a filogenia de samambaias pode ser encontrada em mobot.org/MOBOT/research/APweb/ (que pode ser acessado usando o prefixo www) e Schuettpelz E. e Pryer Κ. M., TAXON 56: 1037
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1050 (2007) com base em três genes plastidicos. Samambaias adicionais e outras espécies de plantas primitivas podem ser encontradas em homepages . caverock.net.nz/~bj/fern/list.htm (que pode ser acessado usando o prefixo http://).
[0033] Também são fornecidas moléculas de ácidos nucleicos que codificam produtos de transcrição e/ou tradução que são subsequentemente encadeados para produzir finalmente perforinas derivadas de plantas ou polipeptídeos IPD079 funcionais. O encadeamento pode ser alcançado in vitro ou in vivo, e pode envolver encadeamento cis ou trans. O substrato para o encadeamento pode consistir em polinucleotídeos (por exemplo, transcritos de RNA) ou polipeptídeos. Um exemplo de encadeamento cis de um polinucleotídeo é quando um íntron inserido em uma sequência de codificação é removido e as duas regiões de éxons de flanqueamento são encadeadas para gerar uma sequência de codificação de polipeptídeo IPD079. Um exemplo de união trans seria quando um polinucleotídeo é encriptado separando-se a sequência de codificação em dois ou mais fragmentos que podem ser separadamente transcritos e, então, submetidos à união para formar a sequência de codificação pesticida de comprimento completo. O uso de uma sequência de aprimoramento de encadeamento, a qual pode ser introduzida em um construto, pode facilitar o encadeamento em um encadeamento cis ou trans de polipeptídeos (Patentes nos U.S. 6,365,377 e 6,531,316). Desse modo, em algumas modalidades, os polinucleotídeos não codificam diretamente um polipeptídeo IPD079 de comprimento total, mas, ao invés disso, codificam um fragmento ou fragmentos de um polipeptídeo IPD079. Esses polinucleotídeos podem ser usados para expressar um polipeptídeo IPD079 funcional através de um
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23/191 mecanismo que envolve encadeamento, em que o encadeamento pode ocorrer ao nível do polinucleotídeo (por exemplo, íntron/éxon) e/ou do polipeptídeo (por exemplo, inteína/exteína). Isso pode ser útil, por exemplo, no controle de expressão da atividade pesticida, visto que um polipeptídeo pesticida funcional será apenas expresso se todos os fragmentos exigidos forem expressos em um ambiente que permite os processos de encadeamento para gerar o produto funcional. Em outro exemplo, a introdução de uma ou mais sequências de inserção em um polinucleotídeo pode facilitar a recombinação com um polinucleotídeo de homologia baixa; o uso de um intron ou inteína para a sequência de inserção facilita a remoção da sequência interveniente, restaurando, assim, a função da variante codificada.
[0034] Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos dessas sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos IPD079 também são abrangidas pelas modalidades. Fragmento, conforme usado no presente documento, se refere a uma porção da sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079. Um fragmento de uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo IPD07 9 ou o mesmo pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridação ou iniciador de PCR com o uso de métodos revelados abaixo. As moléculas de ácido nucleico são fragmentos de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 compreendem pelo menos cerca de 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390 ou 420, nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de ácido nucleico de comprimento total que codifica um polipeptídeo IPD079 revelado no presente documento, dependendo do uso
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24/191 pretendido. Nucleotídeos contíguos é usado no presente documento para se referir a resíduos de nucleotídeos que são imediatamente adjacentes uns aos outros. Os fragmentos das sequências de ácidos nucleicos das modalidades codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica do polipeptídeo IPD079 e, por isso, retêm a atividade inseticida. Reter atividade inseticida é usado no presente documento para se referir a um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida do polipeptídeo de comprimento completo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD079 tem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida do polipeptídeo IPD079Aa completo (SEQ ID NO: 2) . Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Coleópteros. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Díabrotíca. Em algumas modalidades, a atividade inseticida é contra uma ou mais pragas de insetos do complexo da lagarta da raiz do milho: lagarta da raiz do milho, Díabrotíca vírgífera; lagarta da raiz do milho setentrional, D. barberí: verme da raiz do milho do sul ou broca-de-raiz; Díabrotíca undecimpunctata howardí e o verme de raiz do milho mexicano, D. vírgífera zeae.
[0035] Em algumas modalidades, um fragmento de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína codificará, pelo menos, cerca de 15, 20, 30, 50, 75, 100, 125 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes no polipeptídeo IPD079 de comprimento total da
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25/191 revelação. Em algumas modalidades, o fragmento é um truncamento
N-terminal e/ou C-terminal de, pelo menos, cerca de 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou mais
aminoácidos do terminal N e/ou terminal C em relação a um polipeptídeo IPD079 revelado no presente documento, ou variantes do mesmo, por exemplo, por proteólise, inserção de um códon inicial, deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados com a inserção concomitante de um códon de terminação ou por inserção de um códon de terminação na sequência codificadora.
[0036] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD079 é codificado por uma sequência de ácido nucleico suficientemente homóloga à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID
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NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 139. Suficientemente homólogo é usado no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos ou ácido nucleico que tem, pelo menos, cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia de sequência em comparação com uma sequência de referência com o uso de um dos programas de alinhamento descritos no presente documento com o uso de parâmetros padrão. Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar homologia correspondente de proteínas codificadas pelas duas sequências de ácido nucleico levando-se em consideração a degeneracidade de códon, similaridade de aminoácido, posicionamento de quadro de leitura e similares. Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento total do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD079 ou contra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo IPD079.
[0037] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 é selecionado de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ
ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID
NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ 1 ID NO:
29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37,
SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID : NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ
ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID
NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ 1 ID NO:
79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID : NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ
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ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 ou SEQ ID NO: 139.
[0038] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um polipeptídeo IPD079 que tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência em comparação com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID
NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID
NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID
NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID
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NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 140.
[0039] Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, um algoritmo matemático é utilizado para a comparação das sequências. O algoritmo matemático é o algoritmo de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443 a 453, usou software GAP Versão 10 para determinar a identidade ou similaridade de sequência com o uso dos seguintes parâmetros padrão: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de ácido nucleico com o uso de GAP Peso de 50 e Peso de Comprimento de 3 e a matriz de pontuação de nwsgapdna.cmpii; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos com o uso de GAP Peso de 8 e peso de comprimento de 2 e o programa de pontuação BLOSUM62. Programas equivalentes podem também ser usados. Programa equivalente é usado no presente documento para se referir a qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem correspondências de resíduos de nucleotídeos idênticas e uma identidade de sequência percentual idêntica quando em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.
[0040] As modalidades também abrangem moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de polipeptídeo IPD079. Variantes das sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo IPD079 incluem aquelas sequências que codificam os polipeptideos IPD079 revelados no presente documento, mas que diferem conservativamente devido à degenerescência do código genético, assim como aquelas que são suficientemente idênticas
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29/191 conforme discutido acima. As variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridação conforme delineado acima. Sequências de ácidos nucleicos variantes também incluem sequências de ácidos nucleicos sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, com o uso de mutagênese dirigida a sítios mas que ainda codificam os polipeptídeos IPD079 revelados conforme discutido abaixo.
[0041] A presente divulgação fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que codificam qualquer um dos polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento. Aqueles indivíduos que têm habilidade comum na técnica irão observar prontamente que, devido à degenerescência do código genético, existe uma multiplicidade de sequências de nucleotideos que codificam polipeptídeos IPD079 da presente divulgação.
[0042] O perito na técnica irá também apreciar que mudanças podem ser introduzidas por mutação das sequências de ácidos nucleicos, o que leva a mudanças na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos IPD079 codificados, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Portanto, as moléculas de ácidos nucleicos variantes podem ser criadas introduzindo uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de nucleotideos nas sequências de ácidos nucleicos correspondentes reveladas no presente documento, de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, como mutagênese dirigida a sítios e mutagênese
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30/191 mediada por PCR. Tais sequências de ácidos nucleicos variantes são também englobadas pela presente divulgação.
[0043] Alternativamente, as sequências de ácidos nucleicos variantes podem ser preparadas introduzindo mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados quanto à capacidade para conferir atividade pesticida com o propósito de identificar mutantes que retêm a atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de modo recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada com o uso de técnicas de ensaio padrão.
[0044] Os polinucleotídeos da divulgação e fragmentos dos mesmos são opcionalmente usados como substratos para uma variedade de reações de recombinação e recombinação recursiva, além de métodos de clonagem padrão, conforme estabelecido, por exemplo, em Ausubel, Berger e Sambrook, isto é, para produzir homólogos de polipeptideos pesticidas adicionais e fragmentos dos mesmos com propriedades desejadas. Uma variedade de tais reações é conhecida, incluindo aquelas desenvolvidas pelos inventores e seus colegas de trabalho. Os métodos para produzir uma variante de qualquer ácido nucleico listados no presente documento que compreendem recombinar de modo recursive tal polinucleotídeo com um segundo (ou mais) polinucleotídeo, formando, desse modo, uma biblioteca de polinucleotídeos variantes, também são modalidades da divulgação, assim como as bibliotecas produzidas, as células que compreendem as bibliotecas e qualquer polinucleotídeo recombinante produzido por tais métodos. Adicionalmente, tais métodos compreendem opcionalmente selecionar um polinucleotídeo variante de tais
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31/191 bibliotecas com base na atividade pesticida, em que tal combinação recursiva é feita in vitro ou ín vivo.
[0045] Uma variedade de protocolos geradores de diversidade, incluindo protocolos de recombinação recursiva de ácidos nucleicos, estão disponíveis e completamente descritos na técnica. Os procedimentos podem ser usados separadamente e/ou em combinação para produzir uma ou mais variantes de um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, assim como variantes de proteínas codificadas. Individual e coletivamente, esses procedimentos fornecem maneiras amplamente aplicáveis e robustas para gerar ácidos nucleicos diversificados e conjuntos de ácidos nucleicos (incluindo, por exemplo, bibliotecas de ácidos nucleicos) úteis, por exemplo, para a manipulação ou evolução rápida de ácidos nucleicos, proteínas, vias, células e/ou organismos com características novas e/ou melhoradas.
[0046] Embora distinções e classificações sejam feitas no decorrer da discussão por clareza, será notado que as técnicas normalmente não são mutuamente exclusivas. Certamente, os vários métodos podem ser usados isoladamente ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de sequências.
[0047] O resultado de qualquer um dos procedimentos de geração de diversidade descritos no presente documento pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos, os quais podem ser selecionados ou triados quanto a ácidos nucleicos com ou que conferem propriedades desejáveis ou que codificam proteínas com ou que conferem propriedades desejáveis. Após a diversificação por um ou mais dos métodos no presente documento ou disponíveis
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32/191 de outro modo para uma pessoa versada na técnica, quaisquer ácidos nucleicos que sejam produzidos podem ser selecionados quanto a uma atividade ou propriedade desejada, por exemplo, atividade pesticida ou tal atividade a um pH desejado, etc. Isso pode incluir identificar qualquer atividade que possa ser detectada, por exemplo, em um formato automatizado ou automatizável, por qualquer um dentre os ensaios da técnica, consultar, por exemplo, a discussão de triagem de atividade inseticida, infra. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou até mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, ao critério do praticante.
[0048] As descrições de uma variedade de procedimentos de geração de diversidade para gerar sequências de ácidos nucleicos modificados, por exemplo, aquelas que codificam polipeptídeos que têm atividade pesticida ou fragmentos dos mesmos, são encontradas nas publicações a seguir e nas referências citadas nas mesmas: Soong, et al. , (2000) Nat Genet 25(4) :436 a 439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4:1 a 4; Ness, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:893 a 896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793 a 797; Minshull e Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284 a 290; Christians, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:259 a 264; Crameri, et al. , (1998) Nature 391:288 a 291; Crameri, et al., (1997) Nat Biotechnol 15:436 a 438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4.504 a 4.509; Patten, et al. , (1997) Curr Opin Biotechnol 8:724 a 733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100 a 103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315 a 319; Gates, et al. , (1996) J Mol Biol 255:373 a 386; Stemmer, (1996) Sexual PCR and Assembly PCR em: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nova Iorque, pp. 447-457;
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Cramer! e Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer, et al., (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391 e Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10.747-10.751.
[0049] Métodos de mutação para gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagênese dirigida a sítios (Ling, et al. , (1997) Anal Biochem 254(2):157 a 178; Dale, et al., (1996) Methods Mol Biol 57:369 a 374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423 a 462; Botstein e Shortle, (1985) Science 229:1.193 a 1.201; Carter, (1986) Biochem J 237:1 a 7 e Kunkel, (1987) The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis em Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein e Lilley, editores, Springer Verlag, Berlim) ) ; mutagênese com o uso de modelos que contêm uracila (Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488 a 492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367 a 382 e Bass, et al., (1988) Science 242:240 a 245); mutagênese direcionada a oligonucleotideos (Zoller e Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468 a 500; Zoller e Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329 a 350 (1987); Zoller e Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6.487 a 6.500), mutagênese de DNA modificado por fosforotiato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.749 a 8.764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.765 a 8.787 (1985); Nakamaye e Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9.679 a 9.698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791 a 802 e Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803 a 814); mutagênese com o uso de DNA de dúplex incompleto (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9.441 a 9.456; Kramer e Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350 a 367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7.207 e Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6.987 a 6.999).
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34/191 [0050] Os métodos adequados adicionais incluem reparo de ponto de emparelhamento errôneo (Kramer, et al. , (1984) Cell 38:879 a 887), mutagênese com o uso de cepas hospedeiras deficientes para reparo (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4.431 a 4.443 e Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382 a 403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh e Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), seleção de restrição e purificação de restrição (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415 a 423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1.299 a 1.301; Sakamar e Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6.361 a 6.372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315 a 323 e Grundstrom, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:3.305 a 3.316), reparo de quebra em fita dupla (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7.177 a 7.181 e Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450 a 455). Os detalhes adicionais de muitos dentre os métodos acima podem ser encontrados em Methods Enzymol Volume 154, que também descreve os controles úteis para a resolução de problemas com vários métodos de mutagênese.
[0051] Detalhes adicionais em relação a vários métodos geradores de diversidade podem ser encontrados nas Patentes U.S., Pedidos e Publicações PCT e publicações EPO a seguir: Patente n° U.S. 5,723,323, Patente n° U.S. 5,763,192, Patente n° U.S. 5,814,476, Patente n° U.S. 5,817,483, Patente n° U.S.
5,824,514, Patente n° U.S. 5,976,862, Patente n° U.S. 5,605,793, Patente n° U.S. 5,811,238, Patente n° U.S. 5,830,721, Patente n° U.S. 5,834,252, Patente n° U.S. 5,837,458, documento n° WO
1995/22625, documento n° WO 1996/33207, documento n° WO
1997/20078, documento n° WO 1997/35966, documento n° WO
1999/41402, documento n° WO 1999/41383, documento n° WO
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1999/41369, documento n° WO 1999/41368, documento n° EP 752008, documento n° EP 0932670, documento n° WO 1999/23107, documento
n° WO 1999/21979, documento n° WO 1998/31837, documento n° WO
1998/27230, documento n° WO 1998/27230, documento n° WO
2000/00632, documento n° WO 2000/09679, documento n° WO
1998/42832, documento n° WO 1999/29902, documento n° WO
1998/41653, documento n° WO 1998/41622, documento n° WO
1998/42727, documento n° WO 2000/18906, documento n° WO
2000/04190, documento n° WO 2000/42561, documento n° WO
2000/42559, documento n° WO 2000/42560, documento n° WO
2001/23401 e documento i s° PCT/US01/06775.
[0052] As sequências de nucleotídeos das modalidades também
podem ser usadas para isolar sequências correspondentes de
plantas incluindo, mas não se limitando a samambaias e outras
plantas primitivas. Desta maneira, métodos tais como PCR, hibridação e semelhantes podem ser utilizados para identificar tais sequências com base na sua homologia de sequência com as sequências aqui apresentadas. Sequências que são selecionadas com base na sua identidade de sequência com as sequências inteiras aqui apresentadas ou com fragmentos das mesmas são abrangidas pelas modalidades. Tais sequências incluem sequências que são ortólogos das sequências reveladas. O termo ortólogos se refere a genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em espécies diferentes como resultado da especiação. Os genes encontrados em espécies diferentes são considerados ortólogos quando suas sequências de nucleotídeos e/ou suas sequências de proteínas codificadas compartilham identidade substancial, conforme definido em outra parte no presente
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36/191 documento. As funções de ortólogos estão muitas vezes altamente conservadas entre espécies.
[0053] Em uma abordagem de PCR, os iniciadores oligonucleotídicos podem ser projetados para o uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), mais adiante no presente documento, Sambrook. Também consultar Innis, et al. , eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, editores (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, editores (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Os métodos conhecidos de PCR incluem, mas sem limitação, métodos que usam iniciadores emparelhados, iniciadores encaixados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos para genes, iniciadores específicos para vetores, iniciadores com emparelhamento parcialmente errôneo e semelhantes.
[0054] Para identificar polipeptídeos IPD079 potenciais de samambaia, musgo ou outras coleções de plantas primitivas, os lisados de células de samambaia, musgo ou outras plantas primitivas podem ser triados com anticorpos gerados contra um polipeptídeo IPD079 e/ou polipeptídeos IPD079 com o uso de métodos de transferência Western e/ou ELISA. Esse tipo de ensaio pode ser realizado de uma maneira de produtividade alta. As amostras positivas podem ser adicionalmente analisadas por
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37/191 várias técnicas, como purificação e identificação de proteínas com base em anticorpos. Os métodos para gerar anticorpos são bem conhecidos na técnica, conforme discutido abaixo.
[0055] Alternativamente, o método de identificação de proteína com base em espectrometria de massa pode ser usado para identificar homólogos de polipeptídeos de IPD079 com o uso de protocolos nas literaturas (Scott Patterson, (1998), 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc.) . Especificamente, o método de identificação de proteína baseado em LC-MS/MS é usado para associar os dados de MS de determinado lisato celular ou amostras enriquecidas de peso molecular desejadas (retiradas de gel SDS-PAGE de faixas de peso molecular relevantes para polipeptídeos IPD079) com informações de sequência dos polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento, e seus homólogos. Qualquer correspondência em sequências de peptídeos indica o potencial para ter as proteínas homólogas nas amostras. As técnicas adicionais (purificação de proteína e biologia molecular) podem ser usadas para isolar a proteína e identificar as sequências dos homólogos.
[0056] Em métodos de hibridação, toda ou parte da sequência de ácido nucleico pesticida pode ser usada para triar cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra. As chamadas sondas de hibridação podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser etiquetadas com um grupo detectável, como 32P ou qualquer outro marcador detectável, como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um
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38/191 cofator enzimático. As sondas para hibridação podem ser produzidas por meio de etiquetagem de oligonucleotideos sintéticos com base na sequência de ácido nucleico de codificação de polipeptídeos IPD079 revelada no presente documento. Iniciadores de degeneração projetados com base em nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácido nas sequências de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos codificada podem adicionalmente ser usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos de sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 da revelação ou um fragmento ou variante do mesmo. Métodos para a preparação de sondas para hibridação são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra, incorporado no presente documento a título de referência.
[0057] Por exemplo, toda uma sequência de ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo IPD079, revelada no presente documento ou uma ou mais porções da mesma podem ser usadas como uma sonda com capacidade para hibridar especificamente com sequências de ácidos nucleicos correspondentes que codificam sequências do tipo polipeptídeo IPD079 e RNAs mensageiros. Para alcançar a hibridação específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e têm preferencialmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências pesticidas correspondentes de um organismo escolhido por PCR. Essa técnica pode ser usada para
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39/191 isolar sequências de codificação adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio de diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. Técnicas de hibridação incluem rastreamento com hibridação de bibliotecas de DNA plaqueadas (placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
[0058] A hibridação de tais sequências pode ser executada sob condições estringentes. Condições estringentes ou condições de hibridação estringentes é usado no presente documento para se referir a condições sob as quais uma sonda hibridará com a sua sequência-alvo em um grau maior de modo detectável do que com outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). Condições estringentes dependem da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Por controle da estringência das condições de hibridação e/ou de lavagem podem ser identificadas sequências-alvo que são 100% complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum emparelhamento defeituoso nas sequências de modo que sejam detectados graus mais baixos de similaridade (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos de cerca de 1.000 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente menos de 500 nucleotídeos de comprimento.
Proteínas e Variantes e Fragmentos Dos Mesmos [0059] Perforinas derivadas de plantas e polipeptídeos IPD079 também são englobados pela revelação. Perforinas derivadas de plantas, como usado no presente documento, se refere a um
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40/191 polipeptídeo isolado de uma planta ou identificado por proteômica de um genoma ou transcriptoma de planta compreendendo um domínio Pfam (PF01823) de MAC/Perforina (MACPF) ou uma variante do mesmo. Polipeptídeo IPD079 e proteína IPD079 conforme usados no presente documento se referem intercambiavelmente a um polipeptídeo de perforina derivada de planta que tem atividade inseticida incluindo, mas sem limitação, atividade inseticida contra uma ou mais pragas de inseto das ordens Lepidóptera e/ou Coleóptera, e é suficientemente homólogo à proteína da SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO: 56. Contempla-se uma variedade de polipeptideos IPD079. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD079 é derivado de uma espécie de samambaia na Divisão Pterídophyta. Fontes de perforinas derivadas de plantas e polipeptideos IPD079 ou proteínas relacionadas são de espécies de plantas selecionadas mas não limitadas a espécies Adiantum, Adonis, Aglaomorpha, Asparagus, Asplenium, Bignonia, Blechnum, Bolbitis, Campyloneurum, Celosia, Cissus, Colysis, Davallia, Didymochiaena, Doellingeria, Dryopteris, Elaphoglossum, Equisetum, Hedera, Huperzia, Lycopodium, Lygodium, Marsilea, Matteuccia, Microsorum, Nephrolepis, Onoclea, Ophioglossum, Pandorea, Pellaea, Phormium, Platycerium, Polypodium, Polystichium, Prostanthera, Psilotum, Pteris, Rumohra, Schizophragma, Selaginella, Sphaeropteris, Stenochiaena, Symphoricarpos, Thelypteris, Tupidanthus, Verbascum, Vernonia, e Waldsteinia. Fontes de perforinas derivadas de plantas e polipeptideos IPD079 ou proteínas relacionadas são samambaias e outras espécies de plantas primitivas selecionadas mas não limitadas a espécies Huperzia, Ophioglossum, Lycopodium, e
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Platycerium. Polipeptídeo IPD094 e proteína IPD094 conforme usados no presente documento se referem intercambiavelmente a um polipeptídeo de perforina derivada de planta que tem atividade inseticida incluindo, mas sem limitação, atividade inseticida contra uma ou mais pragas de inseto das ordens Lepidóptera e/ou Coleóptera, e é suficientemente homólogo à proteína da SEQ ID NO: 144.
[0060] Suficientemente homólogo é usado no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos que tem
pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%,
57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,
70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98% , 99 % ou mai s de homologi a de sequência em
comparação a uma sequência de referência com o uso de um dentre os programas de alinhamento descritos no presente documento com o uso de parâmetros padrões. O termo cerca de quando usado no presente documento em contexto com identidade de sequência em porcentagem significa +/- 0,5%. Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento completo do polipeptídeo. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar homologia correspondente de proteínas levando em consideração a similaridade de aminoácidos e semelhantes. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é calculada com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é pelo comprimento
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42/191 inteiro do polipeptídeo calculado com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão.
[0061] Conforme usados no presente documento, os termos proteína, molécula peptídica ou polipeptídeo incluem qualquer molécula que compreenda cinco ou mais aminoácidos. É bem conhecido na técnica as moléculas de proteína, peptídeo ou polipeptídeo podem ser submetidas a modificação, incluindo modificações pós-tradução como, mas sem limitação, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Desse modo, conforme usado no presente documento, os termos proteína, molécula peptídica ou polipeptídeo incluem qualquer proteína que seja modificada por qualquer processo biológico ou não biológico. Os termos aminoácido e aminoácidos se referem a todos os L-aminoácidos de ocorrência natural.
[0062] Uma proteína recombinante é usada no presente documento para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira de planta ou bacteriana recombinante. Um polipeptídeo que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteína que têm menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não pesticida (também denominada no presente documento como uma proteína contaminante).
[0063] Fragmentos ou porções biologicamente ativas incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ao polipeptídeo e que
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43/191 exibem atividade inseticida. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas em relação à atividade inseticida.
[0064] Variantes, conforme usado no presente documento, se referem a proteínas ou polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos paterna. Variantes podem estar na forma de substituições de aminoácidos; deleções, incluindo mas não se limitando a deleção de aminoácidos no terminal N e/ou terminal C; e adições, incluindo mas não se limitando a N-terminais e/ou C-terminais, em comparação com o polipeptídeo nativo.
Perforinas Derivadas de Plantas [0065] Em algumas modalidades, a perforina derivada de planta compreende um domínio Pfam (PF01823) de MAC/Perforina (MACPF). Em algumas modalidades, a perforina derivada de planta é identificada usando métodos proteômicos conhecidos do perito na técnica. Em algumas modalidades, as perforinas derivadas de plantas são identificadas por BLAST e/ou HMMSearch. Em algumas modalidades, as perforinas derivadas de plantas corresponderam ao perfil HMM de Pfam ID# IPR020864 com um valor E menor do que 0,01 e com um comprimento maior do que 250 aminoácidos. Em algumas modalidades, a perforina derivada de planta tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das SEQ ID NOs: 158-1248. Em algumas modalidades, a perforina derivada de planta compreende a sequência de aminoácidos do
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44/191 polipeptídeo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 158-1248, homólogos do mesmo ou variantes do mesmo. Em algumas modalidades, a perforina derivada de planta tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo IPD094 de SEQ ID NO: 144. Em algumas modalidades, a perforina derivada de planta é um polipeptídeo IPD094 da revelação, homólogos do mesmo ou variantes do mesmo. Em algumas modalidades, a perforina derivada de planta é um polipeptídeo IPD079 da revelação.
Filogenética, motivo da sequência e análise estrutural para famílias de proteína inseticida [0066] Um método de análise de estrutura e sequência pode ser empregue e pode ser composto por quatro componentes: construção da árvore filogenética, descoberta de motivos de sequência de proteínas, previsão da estrutura secundária e alinhamento de sequências de proteínas e estruturas secundárias. Os detalhes sobre cada componente são ilustrados abaixo.
1)Construção da árvore filogenética [0067] A análise filogenética pode ser realizada com o uso do software MEGA5. As sequências de proteína foram submetidas à análise por ClustalW versão 2 (Larkin M.A et al (2007) Bioinformatics 23(21): 2.947 a 2.948) quanto a alinhamentos de múltiplas sequências. A história evolutiva é, então, inferida pelo método de Máxima Verosimilhança com base no modelo baseado em matriz JTT. A árvore com a maior verosimilhança de log é obtida, exportada em formato Newick e, adicionalmente, processada para extrair as IDs de sequência na mesma ordem em que apareceram na árvore. Alguns ciados que representam
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45/191 subfamilias podem ser manualmente identificados para cada família de proteínas inseticidas.
2) Descoberta de motivos de sequências de proteínas [0068] As sequências de proteínas são reordenadas de acordo com a árvore filogenética construída anteriormente, e fornecidas à ferramenta de análise de MOTIVO MEME (Múltiplos EM para Elicitação de MOTIVO) (Bailey T.L., e Elkan 0., Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, páginas 28 a 36, AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, 1994.) para identificação de motivos-chave de sequências. MEME é configurado conforme segue: Número mínimo de sítios 2, Largura mínima de motivo 5 e Número máximo de motivos 30. Os motivos de sequência únicos para cada subfamília foram identificados por meio de observação visual. A distribuição de MOTIVOs ao longo de toda a família de genes pode ser visualizada na página da web HTML. Os MOTIVOs são numerados em relação à classificação do valor E para cada MOTIVO.
3) Previsão da estrutura secundária [0069] PSIPRED, método de previsão da estrutura secundária de alta classificação (Jones DT. (1999) J. Mol. Biol. 292: 195 a 202), pode ser instalado em um servidor Linux local, e usado para a previsão de estrutura secundária de proteína. A ferramenta fornece previsão de estrutura exata com o uso de duas redes neurais de alimentação direta com base no produto de PSI-BLAST. A base de dados de PSI-BLAST é criada removendo as regiões de baixa complexidade, transmembrana e de super-hélice em UnireflOO. Os resultados de PSIPRED contêm as estruturas secundárias (Alfa-hélice: H, Filamento beta: E, e Bobina: C) e
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46/191 as classificações de confiança correspondentes para cada aminoácido em uma dada sequência de proteína.
4)Alinhamento de sequências de proteínas e estruturas secundárias [0070] Um roteiro pode ser desenvolvido para gerar um alinhamento de estrutura secundária com intervalos de acordo com o alinhamento de sequência de múltiplas proteínas da etapa 1 para todas as proteínas. Todas as sequências de proteínas alinhadas e estruturas são concatenadas em um único arquivo FASTA e, então, importadas para MEGA para visualização e identificação de estruturas conservadas.
[0071] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD079 tem um peso molecular calculado entre cerca de 30 kD e cerca de 70 kD, entre cerca de 40 kD e cerca de 60 kD, entre cerca de 45 kD e cerca de 55 kD e entre cerca de 47,5 kD e cerca de 52,5 kD. Cerca de no que se refere ao peso molecular significa ± 1 kD.
[0072] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD079 tem uma propriedade física modificada. Conforme usado no presente documento, o termo propriedade física se refere a qualquer parâmetro adequado para descrever as características físicoquímicas de uma proteína. Tal como aqui utilizados, propriedade física de interesse e propriedade de interesse são utilizados indistintamente para referir propriedades físicas de proteínas que estão a ser pesquisadas e/ou modificadas. Exemplos de propriedades físicas incluem, mas não estão limitados a, carga de superfície líquida e distribuição de carga na superfície da proteína, hidrofobicidade efetiva e distribuição de resíduos hidrofóbicos na superfície da proteína, densidade de carga na
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47/191 superfície, densidade de hidrofobicidade da superfície, contagem total de grupos ionizáveis da superfície, tensão superficial, tamanho da proteína e sua distribuição em solução, temperatura de fusão, capacidade térmica e segundo coeficiente virial. Exemplos de propriedades físicas também incluem, mas não estão limitados a solubilidade, dobramento, estabilidade e digestibilidade. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD079 tem digestibilidade aumentada de fragmentos proteolíticos em um estômago de inseto. Modelos para digestão por fluidos gástricos simulados são conhecidos por um indivíduo versado na técnica (Fuchs, R.L. e J.D. Astwood. Food Technology 50: 83 a 88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14: 1.269 a 1.273, 1996; Fu TJ et al J. Agrlc Food Chem. 50: 7.154 a 7.160, 2002) .
[0073] Em algumas modalidades, as variantes incluem polipeptídeos que diferem na sequência de aminoácidos devido a mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela divulgação são biologicamente ativas, isto é, continuam a ter a atividade biológica desejada (isto é, atividade pesticida) da proteína nativa. Em alguma modalidade, a variante terá pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou mais da atividade inseticida da proteína nativa. Em algumas modalidades, as variantes podem ter atividade melhorada relativamente à proteína nativa.
[0074] Os genes bacterianos têm frequentemente múltiplos códons de início de metionina em proximidade com o início do quadro de leitura aberto. Normalmente, o início da tradução em um ou mais desses códons de início levará à geração de uma proteína funcional. Esses códons de início podem incluir códons
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ATG. Entretanto, as bactérias, como Bacillus sp., também reconhecem o códon GTG como um códon de início, e proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em ocasiões raras, a tradução em sistemas bacterianos pode se iniciar em um códon TTG, embora, nesse caso, o TTG codifique uma metionina. Adicionalmente, não é normalmente determinado a priori quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Desse modo, é entendido que o uso de um dos códons de metionina alternativos também pode levar à geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas são abrangidas na presente divulgação e podem ser usadas nos métodos da presente divulgação. Será entendido que, quando expressas em plantas, será necessário alterar o códon de início alternativo para ATG para tradução apropriada.
[0075] Uma pessoa versada na técnica entende que a sequência de codificação de polinucleotídeo pode ser modificada para adicionar um códon na penúltima posição após o códon de início de metionina para criar um sítio de enzima de restrição para propósitos de clonagem recombinante e/ou para propósitos de expressão. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD079 compreende adicionalmente um resíduo alanina na posição de resíduo imediatamente após a metionina iniciadora de tradução.
[0076] Em algumas modalidades, a metionina iniciadora de tradução do polipeptídeo IPD079 é removida por divagem após tradução. Uma pessoa versada na técnica entende que a metionina iniciadora de tradução N-terminal pode ser removida por metionina aminopeptidase em muitos sistemas de expressão celular.
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49/191 [0077] Em outra modalidade, as perforinas derivadas de plantas incluindo mas não se limitando ao polipeptídeo IPD079 podem ser expressas como uma proteína precursora com uma sequência interveniente que catalisa o encadeamento de proteínas pós-tradução de múltiplas etapas. O encadeamento de proteínas envolve a excisão de uma sequência interveniente de um polipeptídeo com a união concomitante das sequências de f lanqueamento para gerar um polipeptídeo novo (Chong, et al. , (1996) J. Biol. Chem., 271:22159 a 22168) . Essa sequência interveniente ou elemento de encadeamento de proteínas, denominada inteínas, que catalisam sua própria excisão através de três reações coordenadas nas junções de encadeamento do terminal N e do terminal C: um rearranjo de acila da cisteína ou serina do terminal N; uma reação de transesterificação entre os dois terminais para formar um intermediário de tioéster ou éster ramificado e divagem de ligação peptídica acoplada à ciclização da asparagina do terminal C de inteína para liberar a inteína (Evans, et al. , (2000) J. Biol. Chem., 275:9.091 a 9.094). A elucidação do mecanismo de encadeamento de proteínas levou a várias aplicações com base em inteína (Comb, et al., Patente n° U.S. 5, 496, 714; Comb, et al. , Patente n° U.S. 5, 834,247; Camarero e Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597-5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271-281, Chong, et al. , (1998) Nucleic Acids Res. 26:5109-5115; Chong, et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:10567-10577; Cotton, et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100-1101; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:1835918363; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:3923-3926; Evans, et al., (1998) Protein Sci. 7:2256-2264; Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275:9091-9094; Iwai e Pluckthun, (1999) FEES Lett.
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459:166-172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1-13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040-16044; Otomo, et al., (1999) J. Biolmol. NMR 14:105-114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643; Severinov e Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16205-16209; Shingledecker, et al., (1998) Gene 207:187-195; Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926; Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27:110-120; Wood, et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:889-892; Wu, et al., (1998a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:922 6-9231; Wu, et al., (1998b) Biochim Biophys Acta 1387:422-432; Xu, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 12 0:5591-5592) . Quanto à aplicação de inteinas em transgenes de planta, consultar Yang, et al., (Transgene Res
15:583 a 593 (2006 ) ) e Evans, et al. , (Annu. Rev. Plant Biol.
56:375 a 392 (2005) ) .
[0078] Em outra modalidade, a perforina derivada de planta,
incluindo mas não se limitando ao polipeptídeo IPD079, pode ser
codificada por dois genes separados em que a inteína da proteína precursora é proveniente dos dois genes, denominada inteína de separação, e as duas porções do precursor são unidas por uma formação de ligação de peptídeo. Essa formação de ligação peptídica é alcançada por encadeamento trans mediado por inteína. Com esse propósito, um primeiro e um segundo cassetes de expressão que compreendem os dois genes separados codificam adicionalmente as inteinas com capacidade para mediar o encadeamento trans de proteínas. Por encadeamento trans, as proteínas e os polipeptídeos codificados pelo primeiro e segundo
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51/191 fragmentos podem ser ligados por formação de ligação peptídica. As inteínas de encadeamento trans podem ser selecionadas a partir dos genomas de nucléolo e de organela de organismos diferentes, incluindo eucariotas, arqueobactérias e eubactérias. As inteínas que podem ser usadas são listadas em neb.com/neb/inteins.html, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www. A sequência de nucleotídeos que codifica uma inteína pode ser dividida em uma parte 5' e uma parte 3' que codificam a parte 5' e a parte 3' da inteína, respectivamente. As porções de sequência não necessárias para o encadeamento de inteína (por exemplo, domínio de endonuclease de endereçamento) podem ser deletadas. A sequência de codificação de inteína é dividida de modo que as partes 5' e 3' tenham capacidade para encadeamento trans. Para selecionar um sítio de divisão adequado da sequência de codificação de inteína, as considerações publicadas por Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918 a 926 podem ser seguidas. Na construção do primeiro e do segundo cassetes de expressão, a sequência de codificação de inteína 5' é ligada à extremidade 3' do primeiro fragmento que codifica a parte de terminal N do polipeptídeo IPD079 e a sequência de codificação de inteína 3' é ligada à extremidade 5' do segundo fragmento que codifica a parte de terminal C do polipeptídeo IPD079.
[0079] Em geral, os parceiros de encadeamento trans podem ser projetados com o uso de qualquer inteína dividida, incluindo qualquer inteína artificialmente dividida ou de ocorrência natural. Diversas inteínas divididas de ocorrência natural são conhecidas, por exemplo: a inteína dividida do gene DnaE de Synechocystis sp. PCC6803 (consultar Wu, et al. , (1998) Proc
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Natl Acad Scl USA. 95(16) :9226 a 9231 e Evans, et al., (2000) J Biol Chem. 275(13) :9091 a 9094) e do gene DnaE de Nostoc punctiforme (consultar Iwai, et al., (2006) FEBS Lett.
580(7):1853 a 1858). As inteínas não divididas foram artificialmente divididas no laboratório para criar inteínas divididas novas, por exemplo: a inteína Ssp DnaB artificialmente dividida (consultar, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta.
1387:422-32) e inteína See VMA dividida (consultar, Brenzel, et al. , (2006) Biochemistry. 45(6) :1.571 a 8) e uma mini-inteína fúngica dividida artificialmente (consultar, Elleuche, et al. , (2007) Biochem Biophys Res Commun. 355(3):830 a 4). Também há bancos de dados de inteína disponíveis que catalogam inteínas conhecidas (consultar, por exemplo, o banco de dados online disponível em:
bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/Inteinstable.htm 1, o qual pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www).
[0080] As inteínas não divididas de ocorrência natural podem ter atividade de endonuclease ou outras atividades enzimáticas que podem ser tipicamente removidas durante a projeção de uma inteína artificialmente dividida. Tais mini-inteínas ou inteínas divididas minimizadas são bem conhecidas na técnica e têm tipicamente menos de 200 resíduos de aminoácidos de comprimento (consultar, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422 a 432) . As inteínas divididas adequadas podem ter outros elementos de polipeptídeo que habilitam purificação adicionados à sua estrutura, visto que tais elementos não inibem a união da inteína dividida ou são adicionados de maneira que permita que os mesmos sejam removidos antes da união. O encadeamento de proteínas foi
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53/191 relatado com o uso de proteínas que compreendem domínios semelhantes a inteínas bacterianas (BIL) (consultar Amitai, et al. , (2003) Mol Microbiol. 47:61 a 73) e domínios de autoprocessamento de hedgehog (Hog) (o posterior é combinado com inteínas quando em referência à superfamília Hog/inteína ou família HINT (consultar Dassa, et al. , (2004) J Biol Chem. 279:32001 a 32007) e domínios como esses também podem ser usados para preparar inteínas artificialmente divididas. Em particular, os membros de não encadeamento de tais famílias podem ser modificados por metodologias de biologia molecular para introduzir ou restaurar a atividade de encadeamento em tais espécies relacionadas. Os estudos recentes demonstram gue a união pode ser observada quando é permitido que um componente de inteína dividida terminal N reaja com um componente de inteína dividida terminal C não encontrado na natureza para ser seu parceiro; por exemplo, a união foi observada com a utilização de parceiros que têm de 30 a 50% de homologia com o parceiro de união natural (consultar, Dassa, et al., (2007) Biochemistry. 46(1):322 a 330). Outras tais misturas de parceiros de inteína dividida divergentes demonstraram ser não reativas entre si (consultar, Brenzel, et al. , (2006) Biochemistry. 45(6) :1571 a 1578) . Entretanto, está dentro da habilidade de uma pessoa versada na técnica relevante determinar a possibilidade de um par particular de polipeptideos se poder associar um ao outro para fornecer uma inteína funcional com o uso de métodos de rotina e sem o exercício da técnica inventiva.
[0081] Em outra modalidade, as perforinas derivadas de plantas, incluindo mas não se limitando a um polipeptídeo IPD079, são uma variante permutada circular. Em certas modalidades, o
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54/191 polipeptídeo IPD079 é uma variante permutada circular de um polipeptídeo IPD079 revelado no presente documento.
[0082] 0 desenvolvimento de métodos de DNA recombinante tornou possível estudar os efeitos de transposição de sequências no enovelamento, estrutura e função de proteínas. A abordagem usada na criação de sequências novas lembra aquela de pares de ocorrência natural de proteínas que são relacionados por reorganização linear de suas sequências de aminoácidos (Cunningham, et al. , (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3218-3222; Teather e Erfle, (1990) J. Bacteriol. 172:38373841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13-19; Yamiuchi e Minamikawa, (1991) FEES Lett. 260:127-130; MacGregor, et al., (1996) FEES Lett. 378:263-266). A primeira aplicação in vitro deste tipo de rearranjo para proteínas foi descrita por Goldenberg e Creighton (J. Mol. Biol. 165:407 a 413, 1983) . Na criação de uma variante permutada circular, um terminal N novo é selecionado em um sítio interno (interrupção) da sequência original, a sequência nova que tem a mesma ordem de aminoácidos que a original da interrupção até alcançar um aminoácido que está em ou próximo do terminal C original. Nesse ponto, a sequência nova é unida, diretamente ou através de uma porção adicional de sequência (ligante), a um aminoácido que está em ou próximo do terminal N original e a sequência nova continua com a mesma sequência que a original até alcançar um ponto em que está em ou próximo do aminoácido que era terminal N ao sítio de interrupção da sequência original, em que esse resíduo forma o terminal C novo da cadeia. O comprimento da sequência de aminoácidos do ligante pode ser selecionado empiricamente ou com orientação de informações estruturais ou usando uma combinação
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55/191 das duas abordagens. Quando nenhuma informação estrutural está disponível, uma pequena série de ligantes pode ser preparada para teste com o uso de um projeto cujo comprimento é variado a o
fim de abranger uma faixa de 0 a 50 A e cuja sequência é escolhida a fim de ser consistente com a exposição da superfície (hidrofilicidade, Hopp e Woods, (1983) Mol. Immunol. 20:483 a 489; Kyte e Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157:105 a 132; área superficial exposta a solvente, Lee e Richards, (1971) J. Mol. Biol. 55:379 a 400) e a capacidade para adotar a conformação necessária sem desarranjar a configuração do polipeptídeo pesticida (conformacionalmente flexível; Karplus e Schulz, (1985) Naturwissenschaften 72:212 a 213). Considerando uma média o de tradução de 2,0 a 3,8 A por resíduo, isso significa que o comprimento a testar será entre 0 e 30 resíduos, sendo que 0 a 15 resíduos é a faixa preferencial. Exemplificativo de tal série empírica será construir ligantes com o uso de uma sequência de cassete, como Gly-Gly-Gly-Ser repetida n vezes, em que n é 1, 2, 3 ou 4. Aqueles versados na técnica reconhecerão que há muitas tais sequências que variam em comprimento ou composição que podem servir como ligantes com a consideração primária de não serem excessivamente longas nem curtas (cf., Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437 a 462); se forem demasiado longas, os efeitos de entropia provavelmente desestabilizarão o enovelamento tridimensional e também tornarão o enovelamento cineticamente impraticável, e se forem demasiado curtas, as mesmas provavelmente desestabilizarão a molécula devido à deformação torcional ou estérica. Aqueles versados na análise de informações estruturais de proteína reconhecerão que o uso da distância entre as extremidades de cadeia, definida como a
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56/191 distância entre carbonos c-alfa, pode ser usado para definir o comprimento da sequência a ser usada ou pelo menos para limitar o número de possibilidades que devem ser testadas em uma seleção empírica de ligantes. Os mesmos também reconhecerão que é algumas vezes o caso em que as posições das extremidades da cadeia polipeptídica são mal definidas em modelos estruturais derivados de difração de raio X ou dados de espectroscopia por ressonância magnética nuclear e que, quando verdadeira, essa situação precisará ser, portanto, levada em consideração a fim de estimar apropriadamente o comprimento do ligante exigido. A partir desses resíduos cujas posições são bem definidas, são selecionados dois resíduos que estão próximos em sequência às extremidades de cadeia, e a distância entre seus carbonos c-alfa é usada para calcular um comprimento aproximado para um ligante entre os mesmos. Com o uso do comprimento calculado como um guia, ligantes com uma faixa de número de resíduos (calculada com o o
uso de 2 a 3,8 A por resíduo) são então selecionados. Esses ligantes podem ser compostos pela sequência original, encurtada ou alongada conforme necessário, e quando alongada, os resíduos adicionais podem ser escolhidos para serem flexíveis e hidrofílicos conforme descrito acima; ou opcionalmente a sequência original pode ser substituída com o uso de uma série de ligantes, em que um exemplo é a abordagem de cassete Gly-GlyGly-Ser mencionada acima; ou, opcionalmente, uma combinação da sequência original e da sequência nova que tem o comprimento total apropriado pode ser usada. As sequências de polipeptídeos pesticidas com capacidade para enovelamento em estados biologicamente ativos podem ser preparadas por seleção apropriada das posições de começo (terminal amino) e fim
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57/191 (terminal carboxila) de dentro da cadeia de polipeptídeo original com o uso da sequência ligante, conforme descrito acima. Os terminais amino e carboxila são selecionados de dentro de um estiramento comum de sequência, chamado de região de interrupção, com o uso das diretrizes descritas abaixo. Uma sequência de aminoácidos inovadora é gerada desse modo selecionando terminais amino e carboxila dentre a mesma região de interrupção. Em muitos casos, a seleção dos terminais novos será realizada de modo que a posição original do terminal carboxila preceda imediatamente aquela do terminal amino. Entretanto, as pessoas versadas na técnica reconhecerão que as seleções de terminais em qualquer local na região podem funcionar e que as mesmas levarão de modo eficaz a deleções ou adições às porções amino ou carboxila da sequência nova. É um princípio central da biologia molecular que a sequência de aminoácidos primária de uma proteína referida o enovelamento para a estrutura tridimensional necessária para a expressão de sua função biológica. Os métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica para obter e interpretar informações estruturais tridimensionais com o uso de difração de raios X de Cristais de proteína únicos ou espectroscopia por ressonância magnética nuclear de soluções de proteína. Os exemplos de informações estruturais gue são relevantes para a identificação de regiões de interrupção incluem a localização e o tipo de estrutura secundária de proteína (hélices alfa e 3-10, folhas beta paralelas e antiparalelas, inversões e voltas de cadeia e alças; Kabsch e Sander, (1983) Biopolymers 22:2.577 a 2.637; o grau de exposição a solvente de resíduos de aminoácidos, a extensão e ο tipo de interações de resíduos entre si (Chothia, (1984) Ann.
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Rev. Biochem. 53:537 a 572) e a distribuição estática e dinâmica de conformações ao longo da cadeia polipeptidica (Alber e Mathews, (1987) Methods Enzymol. 154:511 a 533) . Em alguns casos, as informações adicionais sobre a exposição de solvente de resíduos são conhecidas; um exemplo é um sítio de ligação póstradução de carboidrato que está necessariamente na superfície da proteína. Quando as informações estruturais experimentais não estão disponíveis ou não são praticáveis para obter, os métodos também estão disponíveis para analisar a sequência de aminoácidos primária a fim de fazer previsões de estrutura terciária e secundária de proteína, acessibilidade de solvente e a ocorrência de voltas e laços. Os métodos bioquímicos também são algumas vezes aplicáveis para determinar empiricamente a exposição de superfície quando métodos estruturais diretos não são praticáveis; por exemplo, com o uso da identificação de sítios de cisão de cadeia que segue a proteólise limitada a fim de inferir exposição de superfície (Gentile e Salvatore, (1993) Eur. J. Bíochem. 218:603 a 621) . Portanto, com o uso das informações estruturais experimentalmente derivadas ou métodos preditivos (por exemplo, Srinivisan e Rose, (1995) Proteins: Struct., Funct. & Genetics 22:81 a 99), a sequência de aminoácidos parentais é inspecionada para classificar regiões de acordo com a possibilidade de serem ou não integrais à manutenção de estrutura secundária e terciária. A ocorrência de sequências dentro de regiões que são conhecidas por estarem envolvidas na estrutura secundária periódica (hélices alfa e 3-10, folhas beta paralelas e antiparalelas) são regiões que devem ser evitadas. De modo similar, as regiões de sequência de aminoácidos que se observa ou prevê terem um grau baixo de exposição a solvente são
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59/191 mais propensas a fazerem parte do chamado núcleo hidrofóbico da proteína e também devem ser evitadas para seleção de terminais amino e carboxila. Em contraste, aquelas regiões que se conhece ou prevê estarem em voltas ou alças de superfície, e especialmente aquelas regiões que são conhecidas por não serem exigidas para a atividade biológica, são os sítios preferidos para localização dos extremos da cadeia polipeptídica. Os estiramentos contínuos de sequência de aminoácidos que são preferidos com base nos critérios acima são chamados de região de interrupção. Os polinucleotídeos que codificam polipeptideos IPD079 permutados circulares com novos terminal N/terminal C que contêm uma região de ligante que separa o terminal C e terminal N originais podem ser produzidos essencialmente seguindo o método descrito em Mullins, et al. , (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5.529 a 5.533. As múltiplas etapas de amplificações por reação em cadeia de polimerase (POR) são usadas para rearranjar a sequência de DNA codificadora da sequência de aminoácidos primária da proteína. Os polinucleotídeos que codificam polipeptideos IPD079 permutados circulares com novos terminal N/terminal C que contêm uma região ligante que separa o terminal C e terminal N originais podem ser produzidos com base no método de duplicação em tandem descrito em Horlick, et al., (1992) Protein Eng. 5:427 a 431. A amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) dos genes de terminal N/terminal C novos é realizada com o uso de DNA modelo duplicado em tandem.
[0083] Em outra modalidade são proporcionadas proteínas de fusão compreendendo perforinas derivadas de plantas, incluindo mas não se limitando aos polipeptideos IPD079 da revelação. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão compreendem um
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polipeptídeo IPD079 incluindo mas não se limitando aos
polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento, e
fragmentos ativos dos mesmos.
[0084] Os métodos para projeto e construção de proteínas de
fusão (e polinucleotídeos codificadores das mesmas) são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os polinucleotídeos que codificam perforinas derivadas de plantas ou um polipeptídeo IPD079 podem ser fundidos a sequências sinal que irão direcionar a localização da proteína para compartimentos específicos de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou direcionar a secreção do polipeptídeo IPD079 das modalidades a partir de uma célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, em E. colí, pode-se desejar direcionar a expressão da proteína para o espaço periplasmático. Os exemplos de sequências de sinal ou proteínas (ou fragmentos das mesmas) às quais o polipeptídeo IPD079 pode ser fundido a fim de direcionar a expressão do polipeptídeo para o espaço periplásmico das bactérias incluem, mas sem limitação, a sequência de sinal pelB, a sequência de sinal de proteína de ligação de maltose (MBP), MBP, a sequência de sinal ompA, a sequência de sinal da subunidade B de enterotoxina termolábil de E. coll periplásmica e a sequência de sinal de fosfatase alcalina. Diversos vetores estão comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que direcionarão a localização de uma proteína, como a série de vetores pMAL (particularmente a série pMAL-p) disponível a partir do New England Biolabs. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo IPD079 pode ser fundido à sequência de sinal de pectato liase de pelB para aumentar a eficiência da expressão e purificação de tais polipeptídeos em bactérias Gram-negativas (consultar, documentos
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61/191 de Patente ns US 5, 576, 195 e 5, 846, 818) . Fusões de polipeptideo/peptideo de transição de plastideo de planta são bem conhecidas na técnica (consultar, o documento de Patente na US 7.193.133) . Os peptídeos de trânsito de apoplasto, como o sinal de secreção de alfa-amilase de arroz ou cevada também são bem conhecidos na técnica. 0 peptídeo de trânsito de plastídeo é geralmente fundido de modo N-terminal ao polipeptídeo a ser direcionado (por exemplo, o parceiro de fusão). Em uma modalidade, a proteína de fusão consiste essencialmente no peptídeo de trânsito de plastídeo e no polipeptídeo IPD079 a ser direcionado. Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende o peptídeo de trânsito de plastídeo e o polipeptídeo a ser direcionado. Em tais modalidades, o peptídeo de trânsito de plastídeo está preferencialmente no terminal N da proteína de fusão. No entanto, resíduos de aminoácidos adicionais podem ser N-terminais ao peptídeo de trânsito de plastídeo, desde que a proteína de fusão seja pelo menos parcialmente direcionada para um plastídeo. Em uma modalidade específica, o peptídeo de trânsito de plastídeo está na metade N-terminal, terço Nterminal ou quarto N-terminal da proteína de fusão. A maior parte ou a totalidade do peptídeo de trânsito de plastídeo é geralmente clivada da proteína de fusão por inserção no plastídeo. A posição de divagem pode variar ligeiramente entre espécies de plantas, em diferentes estágios de desenvolvimento de plantas, como resultado de condições intercelulares específicas ou da combinação particular de peptídeo de trânsito/parceiro de fusão usada. Em uma modalidade, a divagem do peptídeo de trânsito de plastídeo é homogênea, de modo que o sítio de divagem é idêntico em uma população de proteínas de fusão. Em outra modalidade, o
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62/191 peptídeo de trânsito de plastídeo não é homogêneo, de modo que o sítio de divagem varia por 1-10 aminoácidos em uma população de proteínas de fusão. O peptídeo de trânsito de plastídeo pode ser fundido de modo recombinante a uma segunda proteína em uma de diversas maneiras. Por exemplo, um sítio de reconhecimento de endonucleases de restrição pode ser introduzido na sequência de nucleotídeos do peptídeo de trânsito em uma posição correspondente à sua extremidade C-terminal e o mesmo sítio ou um sítio compatível pode ser manipulado na sequência de nucleotídeos da proteína a ser direcionada em sua extremidade Nterminal. Deve ter-se cuidado na projeção desses sítios para garantir que as sequências de codificação do peptídeo de trânsito e da segunda proteína sejam mantidas no quadro para permitir a síntese da proteína de fusão desejada. Em alguns casos, pode ser preferencial remover o códon de metionina iniciador da segunda proteína quanto o sítio de restrição novo é introduzido. A introdução de sítios de reconhecimento de endonucleases de restrição em ambas as moléculas paternas e sua união subsequente através de técnicas de DNA recombinante podem resultar na adição de um ou mais aminoácidos extra entre o peptídeo de trânsito e a segunda proteína. Isso geralmente não afeta a atividade de direcionamento desde que o sítio de divagem de peptídeo de trânsito permaneça acessível e a função da segunda proteína não seja alterada pela adição desses aminoácidos extra em seu terminal N. Alternativamente, a pessoa versada na técnica pode criar um sítio de divagem preciso entre o peptídeo de trânsito e a segunda proteína (com ou sem sua metionina iniciadora) com o uso de síntese de genes (Stemmer, et al., (1995) Gene 164:49 a 53) ou métodos similares. Além disso, a fusão do peptídeo de
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63/191 trânsito pode incluir intencionalmente aminoácidos a jusante do sítio de divagem. Os aminoácidos no terminal N da proteína madura podem afetar a capacidade do peptídeo de trânsito para direcionar proteínas para plastídeos e/ou a eficácia da divagem após a importação de proteínas. Isso pode ser dependente da proteína a ser direcionada. Ver, por exemplo, Cornai, et al. , (1988) J. Blol. Chem. 263(29):15104-9.
[0085] Em algumas modalidades, proteínas de fusão são fornecidas as quais compreendem uma perforina derivada de planta, incluindo mas não se limitando a um polipeptídeo IPD079, e um polipeptídeo inseticida unido por um ligante de aminoácido. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão são fornecidas representadas por uma formula selecionada a partir do grupo que consiste em:
R1-L-R2, R2-L- R1, R1- R2 ou R2- R1 em que R1 é uma perforina derivada de planta ou um polipeptídeo IPD079, R2 é uma proteína de interesse. O polipeptídeo R1 é fundido, diretamente ou através de um segmento ligante (L) , ao polipeptídeo R2. O termo diretamente define fusões nas quais os polipeptídeos são unidos sem um peptídeo ligante. Desse modo, L representa uma ligação química ou segmento polipeptídico ao qual tanto R1 quanto R2 são fundidos em quadro, muito comumente L é um peptídeo linear ao qual R1 e R2 são ligados por ligações amida que ligam o terminal carbóxi de R1 ao terminal amino de L e o terminal carbóxi de L ao terminal amino de R2. Por fundido em quadro se pretende significar que não há terminação ou interrupção da tradução entre os quadros de leitura de R1 e R2. O grupo ligante (L) é geralmente um
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64/191 polipeptídeo com entre 1 e 500 aminoácidos de comprimento. Os ligantes que unem as duas moléculas são preferencialmente projetados para (1) permitir que as duas moléculas se enovelem e atuem independentemente entre si, (2) não ter uma propensão para desenvolver uma estrutura secundária ordenada, o que podería interferir nos domínios funcionais das duas proteínas, (3) ter característica hidrofóbica ou carregada mínima, que podería interagir com os domínios funcionais das proteínas e (4) fornecer separação estérica de R1 e R2, de modo que R1 e R2 possam interagir simultaneamente com seus receptores correspondentes em uma célula única. Tipicamente, os aminoácidos de superfície em regiões de proteína flexíveis incluem Gly, Asn e Ser. Será esperado que virtualmente qualquer permutação de sequências de aminoácidos que contêm Gly, Asn e Ser satisfaça os critérios acima para uma sequência ligante. Outros aminoácidos neutros, como Thr e Ala, também podem ser usados na sequência ligante. Aminoácidos adicionais também podem ser incluídos nos ligantes devido à adição de sítios de restrição únicos na sequência ligante para facilitar a construção das fusões.
[0086] Em algumas modalidades, os ligantes compreendem sequências selecionadas a partir do grupo de fórmulas: (GlysSerJn, (Gly4Ser)n, (GlysSer)n, (GlynSer)n ou (AlaGlySer)n em que n é um número inteiro. Um exemplo de um ligante altamente flexível é a região espaçadora rica em (GlySer) presente na proteína pill dos bacteriófagos filamentosos, por exemplo, bacteriófagos M13 ou fd (Schaller, et al. , 1975) . Essa região fornece uma região espaçadora flexível longa entre dois domínios da proteína de superfície pill. Também são incluídos os ligantes nos quais uma sequência de reconhecimento de endopeptidase é
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65/191 incluída. Tal sítio de divagem pode ser valioso para separar os componentes individuais da fusão para determinar se são apropriadamente enovelados e ativos in vitro. Exemplos de várias endopeptidases incluem, mas sem limitação, Plasmina, Enterocinase, Calicreína, Urocinase, Ativador do plasminogênio em tecidos, clostripaína, Quimosina, Colagenase, Protease de Veneno de Víbora de Russell, Enzima de divagem pós-prolina, protease V8, Trombina e fator Xa. Em algumas modalidades, o ligante compreende os aminoácidos EEKKN (SEQ ID NO: 157) do veículo de expressão de múltiplos genes (MGEV), que é clivado por proteases vacudares, conforme revelado na Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2007/0277263. Em outras modalidades, os segmentos de ligante peptídico da região de articulação de imunoglobulinas de cadeia pesada IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE fornecem uma relação angular entre os polipeptídeos ligados. São especialmente úteis aquelas regiões de articulação em que as cisteínas são substituídas por serinas. Ligantes da presente divulgação incluem sequências derivadas da região de articulação de IgG gama 2b murina na qual as cisteínas foram mudadas para serinas. As proteínas de fusão não são limitadas pela forma, tamanho ou número de sequências ligantes empregues e a única exigência do ligante é que funcionalmente não interfira de modo adverso no enovelamento e função das moléculas individuais da fusão.
[0087] Em outra modalidade polipeptídeos de IPD079 quiméricos são fornecidos os quais são criados através da união de duas ou mais porções de genes de IPD079 que originalmente codificaram proteínas de IPD079 separadas para criar um gene quimérico. A tradução do gene quimérico resulta em um único polipeptídeo
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IPD079 quimérico com regiões, motivos ou domínios derivados de cada um dos polipeptídeos originais. Em determinadas modalidades, a proteína quimérica compreende porções, motivos ou domínios de polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento em qualquer combinação.
[0088] É reconhecido que as sequências de DNA podem ser alteradas por vários métodos, e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA codificadoras de proteínas com sequências de aminoácidos diferentes das codificadas pela proteína pesticida do tipo selvagem (ou nativo). Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD079 pode ser alterado de várias maneiras, incluindo substituições de aminoácidos, deleções,
truncamentos e inserções de um ou mais aminoácidos, incluindo
até 2, 3, 4, 5, 6, 7, θ, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 , 45, 50,
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125,
130, 135, 140 , 145 ou mais substituições, deleções e/ou inserções
de aminoácidos ou combinações dos mesmos em comparação com qualquer um dos polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento.
[0089] Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo IPD079 podem ser preparadas por meio de mutações no DNA. Isso também pode ser alcançado por uma dentre diversas formas de mutagênese e/ou em evolução direcionada. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes terão a atividade pesticida desejada. No entanto, compreende-se que a habilidade de um polipeptídeo IPD079 para conferir atividade pesticida pode ser
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67/191 aprimorada pelo uso de tais técnicas nas composições desta revelação.
[0090] Por exemplo, as substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais. Um resíduo de aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado da sequência de tipo selvagem de um polipeptídeo IPD079 sem alterar a atividade biológica. Uma substituição de aminoácidos conservativa é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem: aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina); cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico); resíduos negativamente carregados polares e suas amidas (por exemplo, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina; cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína); resíduos alifáticos pequenos, não polares ou levemente polares (por exemplo, Alanina, serina, treonina, prolina, glicina); cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); resíduos não polares alifáticos grandes (por exemplo, metionina, leucina, isoleucina, valina, cisteína); cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina); cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina); cadeias laterais aromáticas grandes (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano).
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68/191 [0091] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não serão feitas para resíduos de aminoácidos conservados ou para resíduos de aminoácidos que residem em um motivo conservado, em que tais resíduos são essenciais para atividade da proteína. Os exemplos de resíduos que estão conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas com as sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Os exemplos de resíduos que estão conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservativas e ainda retêm a atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas com as sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento das proteínas homólogas). Entretanto, a pessoa versada na técnica entenderá que as variantes funcionais podem ter alterações conservadas ou não conservadas muito pequenas nos resíduos conservados. As diretrizes a respeito de substituições de aminoácido apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
[0092] Na realização de tais mudanças, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice
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69/191 hidropático de aminoácidos ao conferir a função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1):105 a 132). É aceite que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que define, por sua vez, a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e semelhantes.
[0093] É conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm índice ou escore hidropático similar e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína equivalente funcionalmente biológica. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, ibid) . Esses são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) e arginina (-4,5). Na realização de tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de +2 é preferida, aquelas das quais estão dentro de +1 são particularmente preferidas, e aquelas dentro de +0,5 são ainda mais particularmente preferidas.
[0094] Compreende-se também que na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita efetivamente com base na hidrofilicidade. A Patente U.S. Número 4,554,101 declara que
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70/191 a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme governada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com uma propriedade biológica da proteína.
[0095] Conforme detalhado na Patente U.S. Número 4,554,101, os valores de hidrofilicidade a seguir foram atribuídos a resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina ( + 3,0); aspartato ( + 3,0,+0,1) ; glutamato ( + 3,0,+0,1) ; serina ( + 0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5,+0,1) ; alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).
[0096] Alternativamente, alterações podem ser feitas à sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, como PCR, incluindo amplificações de PCR que alteram ou estendem a sequência de codificação de proteína em virtude da inclusão de sequências codificadoras de aminoácido nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação de PCR. Alternativamente, as sequências de proteínas adicionadas podem incluir sequências de codificação de proteína inteiras, como aquelas usadas comumente na técnica para gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação da proteína, a detecção da proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína para uma
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71/191 organela subcelular, como o espaço periplasmático de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias ou cloroplastos de plantas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, sendo gue o último resulta frequentemente em glicosilação da proteína.
[0097] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos variantes da divulgação também abrangem as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, por exemplo, uma ou mais regiões de codificação de polipeptídeo IPD079 diferentes da revelação podem ser usadas para criar um novo polipeptídeo IPD079 que possui as propriedades desejadas. Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de modo homólogo in vitro ou in vivo. Por exemplo, com o uso dessa abordagem, os motivos de sequência codificadores de um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene pesticida e outros genes pesticidas conhecidos para obter um gene novo que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, como uma atividade inseticida aumentada. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10.747 a 10.751; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391; Crameri, et ai., (1997) Nature Biotech. 15:436 a 438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4.504 a 4.509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288 a 291; e as Patentes nos U.S. 5,605,793 e 5,837,458.
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72/191 [0098] A permuta ou o embaralhamento de domínios é um outro mecanismo para gerar polipeptídeos IPD079 alterados. Os domínios podem ser trocados entre polipeptídeos IPD079 da revelação, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade inseticida ou espectro visado melhorados. Os métodos para gerar proteínas recombinantes e testar as mesmas quanto à atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5.328-5.330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1.5371.543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17.954-17.958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20.923-20.930; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2.918 a 2.925).
[0099] O alinhamento de homólogos de IPD079 (Figuras 1 & 2) permite a identificação de resíduos que estão altamente conservados entre os homólogos nesta família.
Elementos de Silenciamento [0100] São fornecidos elementos de silenciamento que, quando
ingeridos pela praga, diminuem a expressão de uma ou mais
sequências-alvo e, assim, controlam a praga (isto é, têm atividade inseticida).
[0101] Por elemento de silenciamento é concebido um
polinucleotídeo que, quando colocado em contato com ou ingerido por um inseto-praga de planta, tem capacidade para reduzir ou eliminar o nível ou a expressão de um polinucleotídeo-alvo ou o polipeptídeo codificado pelo mesmo. De modo correspondente, deve ser entendido que elemento de silenciamento, conforme usado no
presente documento, compreende polinucleotídeos, tais como
construtos de RNA, RNA de fita dupla (dsRNA) , RNA em forma de
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73/191 grampo e RNA senso e/ou antissenso. Em uma modalidade, o elemento de silenciamento empregado pode reduzir ou eliminar o nível de expressão da sequência-alvo influenciando o nível do transcrito de RNA alvo ou, alternativamente, influenciando a tradução e, assim, afetando o nível do polipeptídeo codificado. Os métodos para avaliar elementos de silenciamento funcionais que têm capacidade para reduzir ou eliminar o nível de uma sequência de interesse são revelados em outra parte no presente documento. Um único polinucleotídeo empregado nos métodos revelados pode compreender um ou mais elementos de silenciamento a polinucleotídeos-alvo iguais ou diferentes. 0 elemento de silenciamento pode ser produzido ín vivo (isto é, em uma célula hospedeira, tal como uma planta ou micro-organismo) ou in vitro.
[0102] Conforme usado no presente documento, uma sequênciaalvo ou polinucleotídeo-alvo compreende qualquer sequência na praga que se deseja para reduzir o nível de expressão da mesma. Em certas modalidades, diminuir o nível de expressão da sequência-alvo na praga controla a praga. Por exemplo, a sequência-alvo pode ser essencial para crescimento e desenvolvimento. Os exemplos não limitantes de sequências-alvo incluem um polinucleotídeo apresentado nas SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338, ou 1341, ou variantes e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Fragmentos-alvo incluem, mas não se limitam a, SEQ ID NOs: 1281-1336, 1339-1340, e 1343-1376. Conforme exemplificado em outra parte no presente documento, diminuir o nível de expressão de uma ou mais dessas sequênciasalvo em uma praga de plantas Coleoptera ou uma praga de plantas Diabrotica controla a praga. Uma sequência-alvo, ou fragmento de sequência-alvo, pode ser usada como modelo para produzir um
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74/191 elemento de silenciamento, incluindo mas não se limitando a, um RNA de fita dupla.
[0103] Em determinadas modalidades, um elemento de silenciamento pode compreender uma molécula de construção quimérica que compreende duas ou mais sequências reveladas ou porções das mesmas. Por exemplo, a construção quimérica pode ser uma forma de grampo ou dsRNA conforme revelado no presente documento. Uma quimera pode compreender duas ou mais sequências reveladas ou porções das mesmas. Em uma modalidade, uma quimera contempla duas sequências complementares apresentadas no presente documento, ou porções das mesmas, que têm algum grau de correspondência errônea entre as sequências complementares de modo que as duas sequências não sejam complementos perfeitos uma da outra. Fornecer pelo menos duas sequências diferentes em um único elemento de silenciamento pode permitir direcionar múltiplos genes com o uso de um elemento de silenciamento e/ou, por exemplo, um cassete de expressão. Direcionar múltiplos genes pode permitir retardar ou reduzir a possibilidade de resistência pela praga. Adicionalmente, fornecer capacidade de direcionamento múltiplo em uma molécula expressa pode reduzir a carga de expressão da planta transformada ou produto de planta ou fornecer tratamentos tópicos que têm capacidade para direcionar múltiplos hospedeiros com uma aplicação.
[0104] Em certas modalidades, embora o elemento de silenciamento controle pragas, de preferência, o elemento de silenciamento não tem efeito sobre a planta normal ou parte de planta.
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75/191 [0105] Conforme discutido em mais detalhes abaixo, os elementos de silenciamento podem incluir, porém, sem limitação, um elemento de supressão senso, um elemento de supressão antissenso, um RNA de fita dupla, um siRNA, um amiRNA, um miRNA ou um elemento de supressão em forma de grampo. Em uma modalidade, os elementos de silenciamento podem compreender uma quimera em que duas ou mais sequências reveladas ou fragmentos ativos ou variantes ou complementos das mesmas são encontrados na mesma molécula de RNA. Em várias modalidades, uma sequência revelada ou fragmento ativo ou variante, ou complemento das mesmas, pode estar presente como mais de uma cópia em um construto de DNA, elemento de silenciamento, molécula de DNA ou molécula de RNA. Em uma molécula em forma de grampo ou de dsRNA, a localização de uma sequência senso ou antissenso na molécula, por exemplo, em que a sequência é transcrita primeiramente ou está localizada em uma terminação particular da molécula de RNA, não está limitada às sequências reveladas, e o dsRNA não está limitado pelas revelações no presente documento de uma localização particular para tal sequência. Os exemplos não limitantes de elementos de silenciamento que podem ser empregados para diminuir a expressão dessas sequências-alvo compreendem fragmentos ou variantes da sequência senso ou antissenso ou, alternativamente, consiste na sequência senso ou antissenso, de uma sequência apresentada nas SEQ ID NOS: 1279, 1280, 1337, 1338, ou 1341, ou variantes e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. O elemento de silenciamento pode compreender, ainda, sequências adicionais que efetuam vantajosamente a transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Por exemplo, os elementos de
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76/191 silenciamento podem compreender pelo menos um resíduo de timina na extremidade 3'. Isso pode auxiliar na estabilização. Assim, os elementos de silenciamento podem ter pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de timina na extremidade 3'. Conforme discutido em mais detalhes abaixo, elementos supressores intensificadores podem ser também empregados em conjunto com os elementos de silenciamento revelados no presente documento.
[0106] Por reduz ou que reduz o nível de expressão de um polinucleotídeo ou um polipeptídeo assim codificado destina-se a significar o nível de polinucleotídeo ou polipeptídeo da sequência-alvo ser estatisticamente menor que o nível de polinucleotídeo ou o nível de polipeptídeo da mesma sequênciaalvo em uma praga de controle adequada que não é exposta ao (isto é, não ingeriu ou entrou em contato com o) elemento de silenciamento. Em modalidades particulares, os métodos e/ou composições revelados no presente documento reduzem o nível de polinucleotídeo e/ou o nível de polipeptídeo da sequência-alvo em um inseto-praga de planta é menos que 95%, menos que 90%, menos que 80%, menos que 70%, menos que 60%, menos que 50%, menos que 40%, menos que 30%, menos que 20%, menos que 10% ou menos que 5% do nível de polinucleotídeo ou o nível do polipeptídeo assim codificado da mesma sequência-alvo em uma praga de controle adequada. Em algumas modalidades, um elemento de silenciamento tem identidade de sequência substancial com o polinucleotídeoalvo, tipicamente maior que cerca de 65% de identidade de sequência, maior que cerca de 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Além disso, um elemento de
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77/191 silenciamento pode ser complementar a uma porção do polinucleotídeo-alvo. De modo geral, podem ser usadas sequências de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 450 nucleotídeos contínuos ou mais da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338, ou 1341, ou variantes e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Os métodos para avaliar o nível do transcrito de RNA, o nível do polipeptídeo codificado ou a atividade do polinucleotídeo ou polipeptídeo são discutidos em outra parte no presente documento.
i. Elementos de Supressão Senso [0107] Conforme usado no presente documento, um elemento de supressão senso compreende um polinucleotídeo projetado para expressar uma molécula de RNA que corresponde a pelo menos uma parte de um RNA mensageiro alvo na orientação senso. A expressão da molécula de RNA que compreende o elemento de supressão senso reduz ou elimina o nível do polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo assim codificado. O polinucleotídeo que compreende o elemento de supressão senso pode corresponder a toda ou parte da sequência do polinucleotídeo-alvo, toda ou parte da região não traduzida 5' e/ou 3' do polinucleotídeo-alvo, toda ou parte da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo ou toda ou parte tanto da sequência de codificação como das regiões não traduzidas do polinucleotídeo-alvo.
[0108] Tipicamente, um elemento de supressão senso tem identidade de sequência substancial com o polinucleotídeo-alvo, tipicamente maior que cerca de 65% de identidade de sequência, maior que cerca de 85% de identidade de sequência, cerca de 90%,
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91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Consulte as Patentes ns U.S. 5.283.184 e 5.034.323; aqui incorporadas a título de referência. O elemento de supressão senso pode ter qualquer comprimento contanto que permite a supressão da sequência direcionada. O elemento de supressão senso pode ter, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 900, 1000, 1100, 1200, 1300 nucleotídeos ou mais dos polinucleotídeos-alvo apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS.: 1 a 53 ou 107 a 254, ou variantes e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Em outras modalidades, o elemento de supressão senso pode ter, por exemplo, cerca de 15-25, 19-35, 19-50, 25-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350400, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 16001700, 1700-1800 nucleotídeos ou mais dos polinucleotídeos-alvo apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338, ou 1341, ou variantes e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas.
ii. Elementos de Supressão Antissenso [0109] Conforme usado no presente documento, um elemento de supressão antissenso compreende um polinucleotídeo que é projetado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte de um RNA mensageiro alvo. A expressão do elemento de supressão de RNA reduz ou elimina o nível do polinucleotídeoalvo. O polinucleotídeo para uso em supressão antissenso pode corresponder a todo ou parte do complemento da sequência que codifica o polinucleotídeo-alvo, todo ou parte do complemento da
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79/191 região não traduzida 5' e/ou 3' do polinucleotídeo-alvo, todo ou parte do complemento da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo ou todo ou parte do complemento tanto da sequência de codificação como das regiões não traduzidas do polinucleotídeo-alvo. Adicionalmente, o elemento de supressão antissenso pode ser completamente complementar (isto é, 100% idêntico ao complemento da sequência-alvo) ou parcialmente complementar (isto é, menor que 100% idêntico ao complemento da sequência-alvo) ao polinucleotídeo-alvo. Em certas modalidades, o elemento de supressão antissenso compreende pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de complementaridade de sequência ao polinucleotídeo-alvo. A supressão antissenso pode ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta. Consultar, por exemplo, a Patente na U.S. 5.942.657. Além disso, o elemento de supressão antissenso pode ser complementar a uma porção do polinucleotídeo-alvo. De modo geral, podem ser usadas sequências de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 450 nucleotídeos ou mais da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS.: 1 a 53 ou 107 a 254; ou variantes e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Os métodos para usar a supressão de antissenso para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos, por exemplo, em Liu et al (2002) Plant Physiol. 129:1.732 a 1.743 e na Patente n£ U.S. 5.942.657, que está incorporado ao presente documento a título de referência.
iii. Elemento de Supressão de RNA de Fita Dupla [0110] Um elemento de silenciamento de RNA de fita dupla ou dsRNA compreende pelo menos um transcrito que tem capacidade
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80/191 para formar um dsRNA antes ou após a ingestão por um insetopraga de planta. Assim, um elemento de silenciamento de dsRNA inclui um dsRNA, um transcrito ou polirribonucleotideo com capacidade de formar um dsRNA ou mais de um transcrito ou polirribonucleotideo com capacidade de formar um dsRNA. RNA de fita dupla ou dsRNA refere-se a uma estrutura de polirribonucleotideo formada por uma única molécula de RNA autocomplementar ou uma estrutura de polirribonucleotideo formada pela expressão de pelo menos duas fitas de RNA distintas. A molécula (ou moléculas) de dsRNA empregada nos métodos e composições revelados medeiam a redução de expressão de uma sequência-alvo, por exemplo, mediando a interferência de RNA RNAi ou silenciamento de gene de uma maneira especifica para sequência. Em várias modalidades, o dsRNA tem capacidade para reduzir ou eliminar o nivel ou expressão de um polinucleotídeoalvo ou o polipeptídeo assim codificado em um inseto-praga de planta.
[0111] O dsRNA pode reduzir ou eliminar o nível de expressão da sequência-alvo influenciando o nível do transcrito de RNA, influenciando a tradução e, assim, afetando o nível do polipeptídeo codificado ou influenciando a expressão no nível pré-transcricional (isto é, por meio da modulação de estrutura de cromatina, padrão de metilação, etc., para alterar a expressão de gene) . Por exemplo, consultar Verdel et al. (2004) Science 303:672 a 676; Pal-Bhadra et al. (2004) Science 303:669 a 672; Allshire (2002) Science 297:1.818 a 1.819; Volpe et al. (2002) Science 297:1.833 a 1.837; Jenuwein (2002) Science 297:2.215 a 2.218; e Hall et al. (2002) Science 297:2.232 a 2.237. Os métodos para avaliar dsRNA funcional que têm capacidade para reduzir ou
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81/191 eliminar o nível de uma sequência de interesse são revelados em outra parte no presente documento. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo dsRNA destina-se a abranger outros termos usados para descrever moléculas de ácido nucleico que têm capacidade para mediar a interferência de RNA ou silenciamento de gene, incluindo, por exemplo, RNA interferente curto (siRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), microRNA (miRNA) , RNA em forma de grampo, RNA em forma de grampo curto (shRNA), RNA de silenciamento de gene pós-transcricional (ptgsRNA) e outros.
[0112] Em certas modalidades, pelo menos uma fita do duplex ou região de fita dupla do dsRNA compartilha identidade de sequência ou complementaridade de sequência suficiente ao polinucleotídeo-alvo para permitir que o dsRNA reduza o nível de expressão da sequência-alvo. Tipicamente, um dsRNA tem identidade de sequência substancial com o polinucleotídeo-alvo, tipicamente maior que cerca de 65% de identidade de sequência, maior que cerca de 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Além disso, um elemento de dsRNA pode ser complementar a uma porção do polinucleotídeo-alvo. De modo geral, podem ser usadas sequências de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 450 nucleotídeos ou mais da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338, ou 1341, ou variantes e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Conforme usado no presente documento, a fita que é complementar ao polinucleotídeo-alvo é a fita antissenso e a fita homóloga ao polinucleotídeo-alvo é a fita senso.
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82/191 [0113] Em outra modalidade, o dsRNA compreende um RNA em forma de grampo. Um RNA em forma de grampo compreende uma molécula de RNA que tem capacidade para enovelamento de volta sobre si mesma para formar uma estrutura de fita dupla. Múltiplas estruturas podem ser empregadas como elementos em forma de grampo. Em certas modalidades, o elemento de supressão de dsRNA compreende um elemento em forma de grampo que compreende, na ordem a seguir, um primeiro segmento, um segundo segmento e um terceiro segmento, em que o primeiro e o terceiro segmentos compartilham complementaridade suficiente para permitir que o RNA transcrito forme uma estrutura de haste e laço de fita dupla.
[0114] O segundo segmento da forma de grampo compreende um laço ou uma região de laço. Esses termos são usados como sinônimos no presente documento e devem ser interpretados amplamente para compreender qualquer sequência de nucleotídeos que confira flexibilidade suficiente para permitir que autopareamento ocorra entre as regiões complementares de um polinucleotídeo (isto é, segmentos 1 e 3 que formam a haste da forma de grampo). Por exemplo, em algumas modalidades, a região de laço pode ser substancialmente de fita simples e atuar como um espaçador entre as regiões autocomplementares da haste e laço da forma de grampo. Em algumas modalidades, a região de laço pode compreender uma sequência de nucleotídeos aleatória ou não senso e, assim, não compartilhar identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo. Em outras modalidades, a região de laço compreende uma sequência de RNA senso ou antissenso ou fragmento da mesma que compartilha identidade com um polinucleotídeo-alvo. Consultar, por exemplo, a Publicação de Patente Internacional n° WO 02/00904. Em certas modalidades, a sequência de laço pode
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83/191 incluir uma sequência de introns, uma sequência derivada de uma sequência de introns, uma sequência homóloga a uma sequência de introns ou uma sequência de introns modificada. A sequência de introns pode ser aquela encontrada em espécies iguais ou diferentes das quais os segmentos 1 e 3 são derivados. Em certas modalidades, a região de laço pode ser otimizada para ser tão curta quanto possível enquanto ainda fornece flexibilidade intramolecular suficiente para permitir a formação da região de haste com bases pareadas. Consequentemente, a sequência de laço, de modo geral, tem 1.000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 10 nucleotídeos ou menos .
[0115] O primeiro e o terceiro segmentos da molécula de RNA em forma de grampo compreendem a haste com bases pareadas da estrutura em forma de grampo. O primeiro e o terceiro segmentos são repetições invertidas um do outro e compartilham complementaridade suficiente para permitir a formação da região de haste com bases pareadas. Em certas modalidades, o primeiro e o terceiro segmentos são completamente complementares um ao outro. Alternativamente, o primeiro e o terceiro segmentos podem ser parcialmente complementares um ao outro contando que tenham capacidade de se hibridizar um ao outro para formar uma região de haste com bases pareadas. A quantidade de complementaridade entre o primeiro e o terceiro segmentos pode ser calculada como uma porcentagem do segmento inteiro. Assim, o primeiro e o terceiro segmentos do RNA em forma de grampo compartilham geralmente pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, até e incluindo 100% de complementaridade.
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84/191 [0116] O primeiro e o terceiro segmentos têm pelo menos cerca de 1.000, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 25, 22, 20, 19, 18, 17, 16, 15 ou 10 nucleotideos de comprimento. Em certas modalidades, o comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmento é cerca de 10 a 100 nucleotideos, cerca de 10 a cerca de 75 nucleotideos, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotideos, cerca de 10 a cerca de 40 nucleotideos, cerca de 10 a cerca de 35 nucleotideos, cerca de 10 a cerca de 30 nucleotideos, cerca de 10 a cerca de 25 nucleotideos, cerca de 10 a cerca de 19 nucleotideos, cerca de 10 a cerca de 20 nucleotideos, cerca de 19 a cerca de 50 nucleotideos, cerca de 50 nucleotideos a cerca
de 100 nucleotideos, cerca de 100 nucleotideos a cerca de 150
nucleotideos, cerca de 100 nucleotideos a cerca de 300
nucleotideos, cerca de 150 nucleotideos a cerca de 200
nucleotideos, cerca de 200 nucleotideos a cerca de 250
nucleotideos, cerca de 250 nucleotideos a cerca de 300
nucleotideos, cerca de 300 nucleotideos a cerca de 350
nucleotideos, cerca de 350 nucleotideos a cerca de 400
nucleotideos, cerca de 400 nucleotideo a cerca de 500
nucleotideos, cerca de 600 nt, cerca de 700 nt, cerca de 800 nt,
cerca de 900 nt , cerca de 1.000 nt, cerca de 1. 100 nt, cerca de
1.200 nt, 1.300 nt, 1. 400 nt, 1. 500 nt, 1.600 nt, 1.700 nt, 1 .800
nt, 1.900 nt, 2.000 nt ou maior. Em outras modalidades , O
comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmento compreende
pelo menos 10 a 19 nucleotideos, 10 a 20 nucleotideos; 19 a 35
nucleotideos, 20 a 35 nucleotideos; 30 a 45 nucleotideos; 40 a
50 nucleotideos; 50 a 100 nucleotideos; 100 a 300 nucleotideos;
cerca de 500 a 700 nucleotideos; cerca de 700 a 900 nucleotideos;
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85/191 cerca de 900 a 1.100 nucleotídeos; cerca de 1.300 a 1.500 nucleotídeos; cerca de 1.500 a 1.700 nucleotídeos; cerca de 1.700 a 1.900 nucleotídeos; cerca de 1.900 a 2.100 nucleotídeos; cerca de 2.100 a 2.300 nucleotídeos; ou cerca de 2.300 a 2.500 nucleotídeos. Consultar, por exemplo, a Publicação Internacional n£ WO 02/00904.
[0117] As moléculas em forma de grampo reveladas ou moléculas de RNA de fita dupla podem ter mais de uma sequência revelada ou fragmentos ativos ou variantes, ou complementos da mesma, encontrada na mesma porção da molécula de RNA. Por exemplo, em uma estrutura em forma de grampo quimérica, o primeiro segmento de uma molécula em forma de grampo compreende duas seções de polinucleotídeo, cada uma com uma sequência revelada diferente. Por exemplo, lendo-se uma terminação da forma de grampo, o primeiro segmento é composto por sequências de dois genes separados (A seguido por B) . Esse primeiro segmento é seguido pelo segundo segmento, a porção de laço da forma de grampo. O segmento de laço é seguido pelo terceiro segmento, em que as fitas complementares das sequências no primeiro segmento são encontradas (B* seguido por A*) na formação da estrutura em forma de grampo de haste e laço, a haste contém SeqA-A* na extremidade distai da haste e SeqB-B* proximal à região de laço.
[0118] Em certas modalidades, o primeiro e o terceiro segmentos compreendem pelo menos 20 nucleotídeos que têm pelo menos 85% de complementariedade com o primeiro segmento. Em ainda outras modalidades, o primeiro e o terceiro segmentos que formam a estrutura de haste e laço da forma de grampo compreendem regiões de projeção 3' ou 5' que têm resíduos de nucleotídeo não pareados.
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86/191 [0119] Em certas modalidades, as sequências usadas no primeiro, no segundo e/ou no terceiro segmentos compreendem domínios que são projetados para ter identidade de sequência suficiente a um polinucleotídeo-alvo de interesse e, assim, têm a capacidade de diminuir o nível de expressão do polinucleotídeoalvo. A especificidade dos transcritos de RNA inibidores é, portanto, conferida de modo geral por esses domínios do elemento de silenciamento. Assim, em algumas modalidades, o primeiro, o segundo e/ou o terceiro segmentos do elemento de silenciamento compreendem um domínio que tem pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1.000 ou mais de 1.000 nucleotídeos que compartilham identidade de sequência suficiente com o polinucleotídeo-alvo para permitir uma diminuição em níveis de expressão do polinucleotídeo-alvo quando expressos em uma célula adequada. Em outras modalidades, o domínio está entre cerca de 15 a 50 nucleotídeos, cerca de 19 a 35 nucleotídeos, cerca de 20-35 nucleotídeos, cerca de 25 a 50 nucleotídeos, cerca de 19 a 75 nucleotídeos, cerca de 20 a 75 nucleotídeos, cerca de 40 a 90 nucleotídeos cerca de 15 a 100 nucleotídeos, 10 a 100 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 35 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 150
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nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos a cerca de 200
nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 250
nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos a cerca de 300
nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos a cerca de 350
nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos a cerca de 400
nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeo a cerca de 500
nucleotídeos ou maior . Em outras modalidades , o comprimento do
primeiro e/ou do terceiro segmento compreende pelo menos 10 a 20 nucleotídeos, pelo menos 10 a 19 nucleotídeos, 20 a 35 nucleotídeos, 30 a 45 nucleotídeos, 40 a 50 nucleotídeos, 50 a 100 nucleotídeos ou cerca de 100 a 300 nucleotídeos.
[0120] Em certas modalidades, um domínio do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos tem 100% de identidade de sequência com o polinucleotídeo-alvo. Em outras modalidades, o domínio do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos que têm homologia ao polinucleotídeo-alvo tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com uma região do polinucleotídeo-alvo. A identidade de sequência dos domínios do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos complementares a um polinucleotídeo-alvo precisa ser apenas suficiente para diminuir a expressão do polinucleotídeo-alvo de interesse. Consultar, por exemplo, Chuang e Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4.985 a 4.990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1.723 a 1.731; Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29 a 38; Pandolfini et al. BMC Biotechnology 3:7 e Publicação de Patente ns U.S. 20030175965; cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência. Um ensaio temporário para a eficácia dos construtos de hpRNA
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88/191 para silenciar a expressão gênica in vivo foi descrito por
Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135 a 140.
[0121] A guantidade de complementaridade compartilhada entre o primeiro, o segundo e/ou o terceiro segmentos e o polinucleotideo-alvo ou a quantidade de complementaridade compartilhada entre o primeiro segmento e o terceiro segmento (isto é, a haste da estrutura em forma de grampo) pode variar dependendo do organismo em que a expressão gênica deve ser controlada. Alguns organismos ou tipos de célula podem exigir pareamento exato ou 100% de identidade, enquanto outros organismos ou tipos de célula podem tolerar alguma correspondência errônea. Em algumas células, por exemplo, uma única correspondência errônea na sequência de direcionamento anula a capacidade de suprimir a expressão gênica. Nessas células, os cassetes de supressão revelados podem ser usados para direcionar a supressão de genes mutantes, por exemplo, oncogenes cujos transcritos compreendem mutações pontuais e, portanto, podem ser especificamente direcionados com o uso dos métodos e composições revelados no presente documento sem alterar a expressão do alelo do tipo selvagem remanescente. Em outros organismos, a variabilidade de sequência holística pode ser tolerada contanto que alguma região de 22 nt da sequência seja representada em 100% de homologia entre o polinucleotideoalvo e o cassete de supressão.
[0122] Qualquer região do polinucleotideo-alvo pode ser usada para projetar um domínio do elemento de silenciamento que compartilha identidade de sequência suficiente para permitir que a expressão do transcrito em forma de grampo diminua o nível do polinucleotideo-alvo. Por exemplo, um domínio pode ser projetado
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89/191 para compartilhar identidade de sequência com a região não traduzida 5' do polinucleotídeo-alvo (ou polinucleotídeos-alvo), a região não traduzida 3' do polinucleotídeo-alvo (ou polinucleotídeos-alvo), regiões exônicas do polinucleotídeoalvo (ou polinucleotídeos-alvo) , regiões intrônicas do polinucleotídeo-alvo (ou polinucleotídeos-alvo) e qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, um domínio do elemento de silenciamento compartilha identidade, homologia suficientes, ou é complementar a pelo menos cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25 ou 30 nucleotídeos consecutivos de cerca de
nucleotídeos 1-50, 25-7 5, 75-125, 50-100, , 125-175, 175-225, 100-
150, 150-200, 200-250, 225-275, 275-325, 250-300, 325-375, 375-
425, 300-350, 350-400, 425-475, 400-450, 475-525, 450-500, 525-
575, 575-625, 550-600, 625-675, 675-725, 600-650, 625-675, 675-
725, 650-700, 725-825, 825-875, 750-800, 875-925, 925-975, 850-
900, 925-975, 975-1025 , 950-1000, 1000- -1050, 1025-1075, 1075-
1125, 1050-1100, 1125- -1175, 1100-1200, 1175-122 5, 1225-1275,
1200- 1300, 1325-1375, 1375-1425, 1300- 1400, 142 5-1475, 1475-
1525, 1400-1500, 1525-1575, 1575-1625, 1625-1675, 1675-1725, 1725-1775, 1775-1825, 1825-1875, 1875-1925, 1925-1975, 19752025, 2025-2075, 2075-2125, 2125-2175, 2175-2225, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, 1900-2000 da sequência-alvo. Em alguns casos para otimizar as sequências de siRNA empregadas na forma de grampo, o método de oligodesoxirribonucleotídeo/RNAse
H sintético pode ser usado para determinar os sítios no mRNA
alvo que estão em uma conformação que é suscetível a
silenciamento de RNA. Consultar, por exemplo, Vickers et al.
(2003) J. Biol. Chem 278:7.108 a 7.118 e Yang et al. (2002) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 99:9.442 a 9.447, incorporados ao presente
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90/191 documento a título de referência. Esses estudos indicam que há uma correlação significativa entre os sítios sensíveis a RNaseH e os sítios que promovem degradação de mRNA direcionada a siRNA eficaz.
[0123] O elemento de silenciamento em forma de grampo pode ser também projetado de modo que a sequência senso ou a sequência antissenso não correspondam a um polinucleotídeo-alvo. Nessa modalidade, as sequências senso e antissenso flanqueiam uma sequência de laço que compreende uma sequência de nucleotídeos que corresponde e todo ou parte do polinucleotídeo-alvo. Assim, é a região de laço que determina a especificidade da interferência de RNA. Consultar, por exemplo, o documento WO 02/00904 .
[0124] Adicionalmente, o silenciamento de gene transcricional (TGS) pode ser realizado através do uso de um elemento de supressão em forma de grampo em que a repetição invertida da forma de grampo compartilha identidade de sequência com a região promotora de um polinucleotídeo-alvo a ser silenciado. Consultar, por exemplo, Aufsatz et al. (2002) PNAS 99 (Suppl. 4):16.499 a 16.506 e Mette et al. (2000) EMBO J 19(19):5.194 a 5.201.
[0125] Em outras modalidades, o elemento de silenciamento pode compreender um RNA pequeno (sRNA). Os sRNAs podem compreende tanto micro RNA (miRNA) como RNA interferente curto (siRNA) (Meister e Tuschl (2004) Nature 431:343 a 349 e Bonetta et al.
(2004) Nature Methods 1:79 a 86). Os miRNAs são agentes reguladores que compreendem cerca de 19 a cerca de 24 ribonucleotídeos de comprimento que são altamente eficazes na
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91/191 inibição da expressão de polinucleotídeos-alvo. Ver, por exemplo Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263. Para interferência de miRNA, o elemento de silenciamento pode ser projetado para expressar uma molécula de dsRNA que forma uma estrutura em forma de grampo ou uma estrutura com base parcialmente pareada contendo uma sequência de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos que é complementar ao polinucleotídeo-alvo de interesse. O miRNA pode ser produzido sinteticamente ou transcrito como um RNA mais longo que é subsequentemente clivado para produzir o miRNA ativo. Especificamente, o miRNA pode compreender 19 nucleotídeos da sequência que tem homologia a uma polinucleotídeo-alvo em orientação senso e 19 nucleotídeos de uma sequência antissenso correspondente que é complementar à sequência senso. O miRNA pode ser um miRNA artificial ou amiRNA que compreende uma sequência de miRNA que é sinteticamente projetado para silenciar uma sequência-alvo.
[0126] Ao expressar um miRNA, o miRNA final (maduro) está presente em um duplex em uma estrutura de cadeia principal precursora, em que as duas bandas são denominadas como o miRNA (a fita que será eventualmente pareada em base com o alvo) e miRNA*(sequência em estrela). Foi demonstrado que miRNAs podem ser expressos transgenicamente e os genes-alvo de interesse para silenciamento eficaz (Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D. Plant Cell. Maio de 2006; 18(5):1.121 a 1.133. Epub 10 de março de 2006; e Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Niu QW, Lin SS, Reyes JL, Chen KC, Wu HW, Yeh SD, Chua NH. Nat Biotechnol. Novembro de 2006; 24(11):1.420 a
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1.428. Epub 22 de outubro de 2006. Erratum in: Nat Biotechnol. Fevereiro de 2007; 25(2):254).
[0127] O elemento de silenciamento para interferência de miRNA compreende uma sequência primária de miRNA. A sequência primária de miRNA compreende uma sequência de DNA que tem o miRNA e as sequências em estrela separadas por um laço assim como sequências adicionais que falqueiam essa região que são importantes para processamento. Quando expressa como um RNA, a estrutura do miRNA primário é tal de modo a permitir a formação de uma estrutura de RNA em forma de grampo que pode ser processada em um miRNA maduro. Em algumas modalidades, a cadeia principal de miRNA compreende uma sequência precursora de miRNA de cDNA ou genômico, em que a dita sequência compreende um primário nativo em que um miRNA maduro heterólogo (artificial) e a sequência em estrela estão inseridos.
[0128] Conforme usado no presente documento, uma sequência em estrela é a sequência dentro de uma cadeia principal precursora de miRNA que é complementar ao miRNA e forma um duplex com o miRNA para formar a estrutura de haste de um RNA em forma de grampo. Em algumas modalidades, a sequência em estrela pode compreender menos de 100% de complementaridade com a sequência de miRNA. Alternativamente, a sequência em estrela pode compreender pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% ou menos complementaridade de sequência com a sequência de miRNA contanto que a sequência em estrela tenha complementariedade suficiente com a sequência de miRNA para formar uma estrutura de fita dupla. Em ainda outras modalidades, a sequência em estrela compreende uma sequência que tem 1, 2, 3, 4, 5 ou mais correspondências errôneas com a sequência de miRNA e ainda tem
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93/191 complementaridade suficiente para formar uma estrutura de fita dupla com a sequência de miRNA, resultando na produção de miRNA e supressão da sequência-alvo.
[0129] As cadeias principais precursoras de miRNA podem ser de qualquer planta. Em algumas modalidades, a cadeia principal precursora de miRNA é de uma monocotiledônea. Em outras modalidades, a cadeia principal precursora de miRNA é de uma dicotiledônea. Em modalidades adicionais, a cadeia principal é de milho ou soja. As cadeias principais precursoras de MicroRNA foram descritas anteriormente. Por exemplo, o documento US20090155910A1 (WO 2009/079532) revela as seguintes cadeias principais precursoras de miRNA de soja: 156c, 159, 166b, 168c, 396b e 398b, e o documento US20090155909A1 (WO 2009/079548) revela as seguintes cadeias principais precursoras de miRNA de milho: 159c, 164h, 168a, 169r e 396h.
[0130] Assim, o miRNA primário pode ser alterado para permitir a inserção eficaz de miRNA heterólogo e sequências em estrela dentro da cadeia principal precursora de miRNA. Em tais casos, o segmento de miRNA e o segmento em estrela da cadeia principal precursora de miRNA são substituídos pelo miRNA heterólogo e as sequências em estrela heterólogas, projetados para direcionar qualquer sequência de interesse, com o uso de uma técnica de PCR, e clonados em um construto de expressão. Reconhece-se que podería haver alterações na posição em que o miRNA artificial e as sequências em estrela são inseridos na cadeia principal. Métodos detalhados para inserir o miRNA e a sequência em estrela na cadeia principal precursora de miRNA são descritos, por exemplo, nos Pedidos de Patente n° US 20090155909A1 e US20090155910A1 .
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94/191 [0131] Ao projetar uma sequência de miRNA e sequência em estrela, várias escolhas de projeto podem ser realizadas. Consultar, por exemplo, Schwab R, et al. (2005) Dev Cell 8: 51727. Em modalidades não limitantes, as sequências de miRNA reveladas no presente documento podem ter um U na extremidade 5', um C ou G na 19a posição de nucleotídeo e um A ou U na 10a posição de nucleotídeo. Em outras modalidades, o projeto de miRNA é tal que o miRNA tenha um alto teor de delta-G livre conforme calculado com o uso do algoritmo ZipFold (Markham, N. R. e Zuker, M. (2005) Nucleic Acids Res. 33: W577-W581.) Opcionalmente, uma alteração de par de bases pode ser adicionada dentro da porção 5' do miRNA de modo que a sequência difira da sequência-alvo por um nucleotídeo.
[0132] Os métodos e composições revelados no presente documento empregam construtos de DNA que, quando transcritos, formam um elemento de silenciamento, tal como uma molécula de dsRNA. Os métodos e composições também podem compreender uma célula hospedeira que compreende o construto de DNA que codifica um elemento de silenciamento. Em outra modalidade, os métodos e composições também podem compreender uma planta transgênica que compreende o construto de DNA que codifica um elemento de silenciamento. Consequentemente, o polinucleotídeo heterólogo que é expresso não precisa formar o dsRNA sozinho, mas pode interagir com outras sequências na célula vegetal ou no intestino da praga após a ingestão para permitir a formação do dsRNA. Por exemplo, um polinucleotídeo quimérico que pode silenciar seletivamente o polinucleotídeo-alvo pode ser gerado expressando-se um construto quimérico que compreende a sequência-alvo para um miRNA ou siRNA a uma sequência
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95/191 correspondente a todo ou parte do gene ou genes a serem silenciados. Nessa modalidade, o dsRNA é formado quando o alvo para o miRNA ou siRNA interage com o miRNA presente na célula. 0 dsRNA resultante pode, então, reduzir o nível de expressão do gene ou genes a serem silenciados. Consultar, por exemplo, a Publicação de Pedido n° US 2007-0130653, intitulado Methods and Compositions for Gene Silencing. O construto pode ser projetado para ter um alvo para um miRNA endógeno ou, alternativamente, um alvo para um miRNA heterólogo e/ou sintético pode ser empregado no construto. Se um miRNA heterólogo e/ou sintético for empregado, o mesmo pode ser introduzido na célula no mesmo construto de nucleotídeo que o polinucleotídeo quimérico ou em um construto separado. Conforme discutido em outra parte no presente documento, qualquer método pode ser usado para introduzir o construto que compreende o miRNA heterólogo.
[0133] Conforme usado no presente documento, controlar uma pragas ou controla uma praga é concebido como qualquer efeito em uma praga que resulta na limitação do dano que a praga causa. Controlar uma praga inclui, mas sem limitação, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou crescimento da praga de tal maneira que a praga forneça menos dano à planta, diminuir o número de descendentes produzido, produzir pragas menos adaptadas, produzir pragas mais suscetíveis a ataque de predadores ou impedir as pragas de se alimentarem com a planta.
[0134] Reduzir o nível de expressão do polinucleotideo-alvo ou o polipeptídeo codificado assim na praga resulta na supressão, controle e/ou extermínio do organismo patogênico invasor. Reduzir o nível de expressão da sequência-alvo da praga reduzirá
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96/191 os sintomas da doença resultantes de estimulo de patógeno em pelo menos cerca de 2% a pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 5% a cerca de 50%, pelo menos cerca de 10% a cerca de 60%, pelo menos cerca de 30% a cerca de 70%, pelo menos cerca de 40% a cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 50% a cerca de 90% ou mais. Portanto, os métodos da invenção podem ser utilizados para controlar pragas, particularmente, praga de planta de Coleópteros ou uma praga de planta de Díabrotíca.
[0135] Ensaios que medem o controle de uma praga são comumente conhecidos na técnica, assim como os métodos para quantificar a resistência à doença em plantas após a infecção com patógeno. Consultar, por exemplo, a Patente n° U.S. 5.614.395, incorporada ao presente documento a titulo de referência. Tais técnicas incluem medir ao longo do tempo o diâmetro médio da lesão, a biomassa do patógeno e a porcentagem geral de tecidos vegetais apodrecidos. Consultar, por exemplo, Thomma et al. (1998) Plant Biology 95:15.107 a 15.111, incorporado ao presente documento a titulo de referência. Consultar também Baum et al. (2007) Nature Biotech 11:1.322 a 1.326 e o documento WO 2007/035650 que demonstraram tanto ensaios de alimentação de planta inteira como ensaios de alimentação de raiz de milho. Ambas as referências estão incorporadas ao presente documento a titulo de referência em sua totalidade.
Composições [0136] Composições compreendendo um elemento de silenciamento e uma perforina derivada de planta da revelação incluindo, mas limitado a um polipeptídeo IPD079 da revelação, também estão abrangidas. Em algumas modalidades, a composição compreende um
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97/191 polipeptídeo IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6,
SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID I 40: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ
ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID
NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ 1 ID NO:
32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ 1 ID NO: 40,
SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 4 6, SEQ ID NO: 48, SEQ
ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID
NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ 1 ID NO:
82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ 1 ID NO: 90,
SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ
ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID
NO: 68, Í 3EQ ID NO: 70, SEQ ID NO 1: 9 6, SEQ ID NO: : 98, SEQ ID NO:
100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO:
108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO:
116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO:
124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO:
132, SEQ ID NO : 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, OU SEQ ) ID
NO: 140. Em algumas modalidades, a composição compreende uma proteína de fusão IPD079. Em algumas composições, a composição compreende um elemento de silenciamento direcionando as SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338 ou 1341.
[0137] Em certas modalidades, a composição compreende uma perforina de planta ou um polipeptídeo IPD079 revelado no presente documento e um polinucleotídeo codificando um ou mais elementos de silenciamento. Em algumas modalidades, o(s) elemento(s) de silenciamento direciona(m) um RyanR, um Pat 3, um HP2, um RPS10, um Snf7, uma V-ATPase, uma subunidade alfa de Coatâmero, uma subunidade beta de Coatâmero, um MAEL, um BOULE,
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98/191 ou um gene NCLB, incluindo qualquer um dos polinucleotideos apresentados nas SEQ ID NOs: 1279-1376.
[0138] Um ou mais dos polinucleotideos que compreendem o elemento de silenciamento podem ser fornecidos como uma composição externa, tal como uma aspersão ou pó, à planta, parte da planta, semente, um inseto-praga de planta ou uma área de cultivo. Reconhece-se que a composição pode compreender uma célula (tal como célula vegetal ou uma célula bacteriana), em que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD079 e um elemento de silenciamento é estavelmente incorporado no genoma e ligado de modo operativo a promotores ativos na célula. Em outras modalidades, as composições que compreendem o polipeptídeo IPD079 e um elemento de silenciamento não estão contidas em uma célula. Em tais modalidades, a composição pode ser aplicada a uma área habitada por um inseto-praga de planta. Em uma modalidade, a composição é aplicada externamente a uma planta (isto é, aspergindo-se um campo ou uma área de cultivo) para proteger a planta da praga. Os métodos para aplicar nucleotídeos de tal maneira são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0139] A composição da invenção pode ser, ainda, formulada como isca. Nessa modalidade, as composições compreendem uma substância de alimento ou um atrativo que aumenta a atratividade da composição para a praga.
[0140] A composição que compreende um polipeptídeo IPD079 e um elemento de silenciamento pode ser formulada em um carreador agricolamente adequado e/ou ambientalmente aceitável. Tais carreadores podem ser qualquer material que o animal, planta ou
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99/191 ambiente a ser tratado possa tolerar. Além disso, o carreador precisa ser tal que a composição permaneça eficaz no controle de um inseto-praga de planta. Os exemplos de tais carreadores incluem água, solução salina, solução de Ringer, dextrose ou outras soluções de açúcar, solução de Hank e outras soluções salinas fisiologicamente equilibradas, tampão fosfato, tampão bicarbonate e tampão Tris. Adicionalmente, a composição pode incluir compostos que aumentam a meia-vida de uma composição. Várias formulações inseticidas também podem ser encontradas, por exemplo, nas Publicações dos Pedidos de Patentes US Números 2008/0275115, 2008/0242174, 2008/0027143, 2005/0042245 e 2004/0127520.
Construtos de Nucleotídeos, Cassetes de Expressão e Vetores [0141] O uso do termo construtos de nucleotídeos no presente documento não é destinado a limitar as modalidades aos construtos de nucleotídeos que compreendem DNA. Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que os construtos de nucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos por ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, também podem ser empregues nos métodos revelados no presente documento. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem adicionalmente todas as formas complementares de tais construtos, moléculas e sequências. Além disso, os construtos de nucleotídeos, moléculas de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem todos os construtos, moléculas e sequências de nucleotídeos que podem ser empregues nos métodos das modalidades para transformação de plantas, incluindo, mas não se limitando
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100/191 àqueles compreendidos por desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e suas combinações. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas que ocorrem naturalmente como análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das modalidades também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeos incluindo, mas sem limitação, formas de fita única, formas de fita dupla, grampos, estruturas de haste e alça e semelhantes.
[0142] Uma modalidade adicional se refere a um organismo transformado, como um organismo selecionado de células de planta e inseto, bactérias, levedura, baculovírus, protozoários, nematódeos e algas. O organismo transformado compreende uma molécula de DNA das modalidades, um cassete de expressão que compreende a molécula de DNA ou um vetor que compreende o cassete de expressão, o qual pode ser incorporado de modo estável no genoma do organismo transformado.
[0143] As sequências das modalidades são fornecidas em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto incluirá sequências reguladoras 5' e 3' ligadas de modo operacional a uma sequência das modalidades. O termo ligado de modo operacional, conforme usado no presente documento, se refere a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. O construto pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser proporcionado(s) em múltiplos construtos de DNA.
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101/191 [0144] O construto de DNA incluirá geralmente, na direção de 5' para 3' de transcrição: uma região de iniciação de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA das modalidades, e uma região de terminação de transcrição e de tradução (isto é, região de terminação) funcional no organismo que serve como um hospedeiro. A região de iniciação de transcrição (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à sequência das modalidades. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. O termo estranho, tal como aqui utilizado, indica que o promotor não se encontra no organismo nativo no qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é estranho ou heterólogo à sequência das modalidades, se pretende que o promotor não seja o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência operacionalmente ligada das modalidades. Tal como aqui utilizado, um gene quimérico compreende uma sequência codificante operacionalmente ligada a uma região de iniciação da transcrição gue é heteróloga à sequência codificante. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência ligada operacionalmente é alterada da expressão de tipo selvagem, o que resulta em uma alteração do fenótipo.
[0145] O polinucleotídeo que codifica o elemento de silenciamento ou em modalidades específicas empregadas nos métodos e composições revelados pode ser fornecido em cassetes de expressão para expressão em uma planta ou organismo de interesse. Reconhece-se que múltiplos elementos de silenciamento, incluindo múltiplos elementos de silenciamento idênticos, múltiplos elementos de silenciamento que direcionam
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102/191 regiões diferentes da sequência-alvo ou múltiplos elementos de silenciamento de diferentes sequências-alvo podem ser usados. Nessa modalidade, reconhece-se que cada combinação de elemento de silenciamento e polipeptídeo IPD079 pode estar contida em um cassete, construto de DNA ou vetor único ou separado. Conforme discutido, qualquer meio para fornecer o elemento de silenciamento é contemplado.
[0146] Em outra modalidade, um elemento de silenciamento revelado no presente documento é expresso a partir de um cassete de supressão. Tal cassete pode compreender dois promotores convergentes que acionam a transcrição de um elemento de silenciamento ligado operativamente. Promotores convergentes referem-se a promotores que são orientados em qualquer terminação do elemento de silenciamento ligado operativamente de modo que cada promotor acione a transcrição do elemento de silenciamento em direções opostas, rendendo dois transcritos. Em tais modalidades, os promotores convergentes permitem a transcrição da fita senso e antissenso e, assim, permitem a formação de um dsRNA. Tal cassete pode também compreender dois promotores divergentes que acionam a transcrição de um ou mais elementos de silenciamento ligados operativamente. Promotores divergentes referem-se a promotores que são orientados em direções opostas um em relação ao outro, acionando a transcrição do um ou mais elementos de silenciamento em direções opostas. Em tais modalidades, os promotores divergentes permitem a transcrição das fitas senso e antissenso e permitem a formação de um dsRNA. Em tais modalidades, os promotores divergentes também permitem a transcrição de pelo menos dois RNAs em forma de grampo separados. Em outra modalidade, um cassete que
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103/191 compreende dois ou mais elementos de silenciamento sob o controle de dois promotores separados na mesma orientação está presente em um construto. Em outra modalidade, dois ou mais cassetes individuais, em que cada um compreende pelo menos um elemento de silenciamento sob o controle de um promotor, estão presentes em um construto na mesma orientação.
[0147] Em algumas modalidades, o construto de DNA também pode incluir uma sequência de aprimoramento de transcrição. Conforme usado no presente documento, o termo um aprimorador se refere a uma sequência de DNA que pode estimular a atividade promotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ou a especificidade para tecidos de um promotor. Vários intensificadores são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, introns com propriedades de intensificação da expressão de genes em plantas (Publicação de Pedido de Patente Número US 2009/0144863, o intron de ubiquitina (isto é, o intron de ubiquitina de milho 1 (consulte, por exemplo, sequência de NCBI S94464)), o intensificador de ômega ou o intensificador de iniciador de ômega (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA editor Cech (Liss, Nova Iorque) 237 a 256 e Gallie, et al. , (1987) Gene 60:217 a 225), o intensificador de CaMV 35S (consulte, por exemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1.685 a 1.696) e os intensificadores da Patente número US 7,803,992 também podem ser usados, cada um dos quais é incorporado a título de referência. A lista acima de aprimoradores de transcrição não é destinada a ser limitante. Qualquer aprimorador de transcrição apropriado pode ser usado nas modalidades.
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104/191 [0148] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, à sequência de interesse, ao hospedeiro de planta ou qualquer combinação dos mesmos).
[0149] Regiões de terminação convenientes são disponibilizadas pelo plasmídeo de Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Ver também, Guerineau, et al. , (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al. , (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen, et al. , (1990) Plant Cell 2:1.261 a 1.272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 a 7.903 e Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9.627 a 9.639.
[0150] Quando apropriado, um ácido nucleico pode ser otimizado para a expressão aumentada no organismo hospedeiro. Assim, quando o organismo hospedeiro é uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados utilizando códons preferenciais para plantas para uma expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11 quanto a uma discussão de uso de códons preferenciais para hospedeiros. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas.
[0151] Uma tabela de uso de códons de Glycine max pode ser encontrada em kazusa. or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=3847&aa=l&style=N, que pode ser acessado com o uso do prefixo www.
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105/191 [0152] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo IPD079 tem códons otimizados de milho.
[0153] Modificações de sequências adicionais são conhecidas por intensificarem a expressão genética em um hospedeiro celular. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítio de encadeamento éxon-íntron, repetições semelhantes a transposons e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de genes. O teor de GC da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado em referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. O termo célula hospedeira, conforme usado aqui, se refere a uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão pretendida. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como E. coli, ou células eucarióticas, como células de levedura, inseto, anfíbio ou mamífero ou células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula hospedeira monocotiledônea é uma célula hospedeira de milho. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas.
[0154] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências líder 5'. Tais sequências líder podem atuar para aumentar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região de não codificação 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al. , (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6.126 a 6.130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus
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Etch do Tabaco) (Gallie, et al. , (1995) Gene 165(2) :233 a 238), líder de MDMV (Virus do Mosaico do Nanismo de Milho), proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90 a 94); líder não traduzido do mRNA da proteína de revestimento do virus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622 a 625); líder do virus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) em Molecular Biology of RNA, editor Cech (Liss, Nova Iorque), páginas 237 a 256) e líder do vírus de mancha clorótica do milho (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382 a 385) . Também consultar Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965 a 968. Tais construtos também podem conter uma sequência de sinal ou sequência líder para facilitar o transporte cotradução ou pós-tradução do peptídeo para determinadas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.
[0155] Sequência de sinal, conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência que é conhecida ou que há suspeitas de resultar em transporte de peptídeo cotradução ou pós-tradução através da membrana da célula. Em eucariotas, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi com alguma glicosilação resultante. Toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como pró-toxinas que são proteoliticamente ativadas no estômago da praga-alvo (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência das modalidades. Sequência líder, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma
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107/191 sequência de aminoácidos suficiente para acionar o transporte cotradução da cadeia peptídica para uma organela subcelular. Desse modo, isso inclui sequências líder que direcionam o transporte e/ou glicosilação pela passagem para o retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes. Proteínas codificadas de modo nuclear direcionadas ao compartimento do lúmen de tilacoide de cloroplasto têm um peptídeo de trânsito bipartido característico, composto por um peptídeo sinal de direcionamento estromal e um peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen. As informações de direcionamento estromal estão na porção próxima do terminal amino do peptídeo de trânsito. O peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen está na porção próxima do terminal carboxila do peptídeo de trânsito e contém todas as informações para direcionamento para o lúmen. Pesquisa recente em proteômica do cloroplasto de plantas superiores alcançou a identificação de numerosas proteínas do lúmen codificadas de modo nuclear (Kieselbach et al. FEES LETT 480:271 a 276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319 a 341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350 a 356, 2001), cujo peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen pode ser potencialmente usado de acordo com a presente divulgação. Cerca de 80 proteínas de Arabidopsis, assim como proteínas homólogas de espinafre e ervilha, são relatadas por Kieselbach et al. , Photosynthesis Research, 78:249 a 264, 2003. Em particular, a Tabela 2 dessa publicação, a qual está incorporada à descrição do presente documento a título de referência, revela 85 proteínas do lúmen do cloroplasto, identificadas por seu número de acesso (também consultar a Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2 009/090442 98) .
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Além disso, a versão de rascunho recentemente publicada do genoma de arroz (Goff et al, Science 296:92 a 100, 2002) é uma fonte adequada para peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen, a qual pode ser usada de acordo com a presente divulgação.
[0156] Peptídeos de transição de cloroplasto (CTP) adequados são bastante conhecidos para um indivíduo versado na técnica também incluem CTPs quiméricos que compreendem, mas sem limitação, um domínio de terminal N, um domínio central ou um domínio de terminal C de um CTP a partir de Oryza sativa 1deóxi-D xiulose-5-Fosfato Sintase, Superóxido de Oryza sativa dismutase, amido solúvel em Oryza sativa sintase, Enzima de ácido málico dependente de NADP-Oryza sativa, Oryza sativa-Fosfo-2dehidro-3-deoxiheptonato Aldolase 2, Oryza sativa-L-Ascorbato peroxidase 5, Oryza sativa-Fosfoglucan água diquinase, Zea Mays ssRUBISCO, Zea Mays-beta-glucosidase, Zea Mays-Malate dehidrogenase, Zea Mays Tioredoxina tipo M Documento de Patente n£ US 2012/0304336.
[0157] O gene de polipeptídeo IPD079 a ser direcionado ao cloroplasto pode ser otimizado para a expressão no cloroplasto para contabilizar as diferenças em uso de códon entre o núcleo de planta e essa organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados com o uso dos códons preferidos de cloroplasto.
[0158] Na preparação da cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Para este fim podem ser utilizados adaptadores ou ligantes para juntar os fragmentos
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109/191 de DNA, ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar locais de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou semelhantes. Para este propósito, podem estar envolvidos mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, emparelhamento, novas substituições, por exemplo, transições e transversões.
[0159] Alguns promotores podem ser usados na prática das modalidades. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais para tecidos, induzíveis ou outros promotores para expressão no organismo hospedeiro. Promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor de Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no documento n° WO 1999/43838 e na Patente n° U.S. 6,072,050; o promotor nuclear de CaMV 35S (Odell, et al. , (1985) Nature 313:810 a 812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163 a 171); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619 a 632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675 a 689); pEMU (Last, et al. , (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581 a 588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2.723 a 2.730); promotor de ALS (Patente n° U.S. 5,659,026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes nos U.S. 5,608,149; 5, 608, 144; 5, 604,121; 5, 569, 597; 5, 466, 785; 5, 399, 680; 5,268,463; 5,608,142 e 6,177,611.
[0160] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico expressar o gene a partir de um promotor induzível. Os promotores induzíveis por ferimento são de interesse particular para
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110/191 regular a expressão das sequências de nucleotídeos das modalidades em plantas. Tais promotores induzíveis por ferimento podem responder ao dano causado por alimentação de insetos e incluem o gene de inibidor de proteinase de batata (pin II) (Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl e wun2, Patente US Número 5, 428,148; winl e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp, et al., (1993) FEES Letters 323:73-76) ; gene MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141150) e similares, aqui incorporados a título de referência.
[0161] Adicionalmente, os promotores induzíveis por patógenos podem ser empregues nos métodos e construtos de nucleotídeos das modalidades. Tais promotores induzíveis por patógenos incluem aqueles de proteínas relacionadas com a patogênese (proteínas PR) , que são induzidas após infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exemplo, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245 a 254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645 a 656 e Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111 a 116. Ver também, WO 1999/43819, aqui incorporado a título de referência .
[0162] De interesse são os promotores que são expressos localmente no sítio da infecção patogênica ou perto deste. Consultar, por exemplo, Marineau, et al. , (1987) Plant Mol. Biol. 9:335 a 342; Matton, et al. , (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325 a 331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2.427 a 2.430; Somsisch, et al., (1988) Mol.
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Gen. Genet. 2:93 a 98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93 : 14.972 a 14.977. Também consultar Chen, et al., ( 1996) Plant
J. 10:955 a 966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91:2.507 a 2. 511; Warne r, et al. , i (1993) Plant J. 3:191 a
201 ; Siebertz, et al., (1989 ) Plant Cell 1: 961 a 968; Patente n°
U.S . 5,750,386 ( induzível por nematódeos) e as referências
citadas nos mesmos. É de interesse particular o promotor induzivel para o gene PRms de milho, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consultar, por exemplo, Cordero, et al. , (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189 a 200) .
[0163] Promotores regulados quimicamente podem ser utilizados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzível, em que a aplicação da substância química induz a expressão genética, ou um promotor quimicamente repressível, em que a aplicação da substância química reprime a expressão genética. Promotores induzíveis quimicamente são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados ao promotor de In2-2 de milho, que é ativado por meio de agentes fitoprotetores de herbicidas benzenossulfonamida, o promotor de GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são utilizados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor de PRla do tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores de interesse regulados quimicamente incluem promotores responsivos a esteróides (consultar, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 e McNeills et al.
(1998) Plant J. 14(2) :247-257) e promotores induzíveis por
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112/191 tetraciclina e repressiveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e Patentes U.S. Nos. 5,814,618 e 5,789,156), incorporados aqui a título de referência .
[0164] Os promotores preferenciais de tecido podem ser utilizados para direcionar a expressão de polipeptídeo IPD079 intensificada em um tecido de planta específico. Os promotores preferidos para tecidos incluem aqueles discutidos em Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2)255 a 265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792 a 803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337 a 343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2) :157 a 168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1.331 a 1.341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525 a 535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513 a 524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138,Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):95869590 e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3) :495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.
[0165] Promotores preferenciais para folhas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265,- Kwon, et al. , (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, et al. , (1994) Plant Cell Physiol. 35(5) :773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 e Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.
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113/191 [0166] Promotores preferenciais para raizes ou específicos para raízes são conhecidos e podem ser selecionados dos muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo de várias espécies compatíveis. Consultar, por exemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207 a 218 (gene de glutamina sintetase específico para raiz de soja); Keller e Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051 a 1061 (elemento de controle específico para raiz no gene GRP 1.8 de Vagem); Sanger, et al. , (1990) Plant Mol. Biol. 14(3) :433 a 443 (promotor específico para raiz do gene de manopina sintase (MAS) de Agrobacteríum tumefacíens) e Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11 a 22 (clone de cDNA de comprimento completo codificador de glutamina sintetase (GS) citosólica, a qual é expressa em raízes e nódulos de raiz de soja). Também consultar Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7) :633 a 641, em que dois promotores específicos para raiz isolados de genes de hemoglobina da não leguminosa de fixação de nitrogênio Parasponía andersoníí e da não leguminosa não de fixação de nitrogênio Trema tomentosa são descritos. Os promotores desses genes foram ligados a um gene-repórter de βglucuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nícotíana tabacum quanto na leguminosa Lotus cornículatus, e em ambos casos a atividade promotora específica de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raízes rolC e rolD altamente expressos de Agrobacteríum rhízogenes (consultar, Plant Science (Limerick) 79(1) :69 a 76) . Os mesmos concluíram que o intensificador e determinantes de DNA preferenciais para tecidos estão dissociados nesses promotores. Teeri, et al., (1989) usaram fusão genética a lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de
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Agrobacteríum codificador de octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz e que o gene de TR2' é específico para raiz na planta intata e estimulado por ferimento no tecido foliar, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida (consultar, EMBO J. 8(2):343 a 350). O gene TR1' fundido a nptll (neomicina fosfotransferase II) apresentou características semelhantes. Os promotores preferidos para raiz adicionais incluem o promotor do gene VÍENOD-GRP3 (Kuster, et al. , (1995) Plant Mol. Biol. 29(4) :759 a 772) e o promotor de rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681 a 691. Também consultar as Patentes nos U.S. 5, 837,876; 5, 750,386; 5, 633,363; 5, 459, 252; 5,401,836; 5,110,732 e 5,023,179. As sequências regulatórias preferenciais para raiz de Arabidopsis thaliana são reveladas no documento ns US20130117883 .
[0167] Promotores preferenciais para sementes incluem tanto promotores específicos para sementes (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento de sementes tais como promotores de proteínas de armazenamento de sementes) assim como promotores de germinação de sementes (aqueles promotores ativos durante a germinação de sementes). Consultar Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108, incorporado no presente documento a título de referência. Tais promotores preferidos para sementes incluem, mas sem limitação, Ciml (mensagem induzida por citoquinina); cZ19Bl (zeína de 19 kDa de milho), e milps (mioinositol-l-fosfato sintase) (consultar a Patente n° U.S. 6.225.529 incorporada no presente documento a título de referência). Gama-zeína e Glb-1 são promotores específicos para endosperma. Para dicotiledôneas, promotores específicos de
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115/191 semente incluem, mas sem limitação, inibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku e Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1.079 a 1.093), β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, promotores específicos para sementes incluem, mas sem limitação, zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gzeina, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Consultar também, documento na WO 2000/12733, em que promotores preferenciais para sementes de genes endl e end2 são revelados; no presente documento incorporados a título de referência. Em dicotiledôneas, os promotores específicos para sementes incluem, mas sem limitação, promotor de revestimento de sementes de Arabidopsis, pBAN; e os promotores de sementes iniciais de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (Patentes nos U.S. 7,294,760 e 7,847,153). Um promotor que tem expressão preferida em um tecido particular é expresso nesse tecido em um grau maior do que em pelo menos um outro tecido de planta. Alguns promotores preferenciais para tecidos mostram expressão quase exclusivamente no tecido particular.
[0168] Quando expressão de nível baixo for desejada, os promotores fracos serão usados. Geralmente, o termo promotor fraco tal como aqui utilizado se refere a um promotor que dirige a expressão baixo de uma sequência codificante em um nível baixo. Por expressão de nível baixo, níveis entre cerca de 1/1.000 transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos a cerca de 1/500.000 transcritos são pretendidos. Alternativamente, é reconhecido que o termo promotores fracos também abrange os promotores que acionam a expressão apenas em algumas células e não em outras para gerar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor
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116/191 aciona a expressão em níveis inaceitavelmente altos, porções da sequência promotora podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão.
[0169] Tais promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor de Rsyn7 (documento n° WO 1999/43838 e Patente n° U.S. 6,072,050), o promotor nuclear do CaMV 35S e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes dos E.U.A. n.os 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611.
[0170] A lista acima de promotores não é destinada a ser limitante. Qualquer promotor apropriado pode ser usado nas modalidades.
[0171] Geralmente, o cassete de expressão compreenderá um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem os genes que codificam a resistência a antibióticos, como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase IT (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência aos compostos herbicidas, como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Os exemplos adicionais de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas sem limitação, genes codificando resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella, et al. , (1983) Nature 303:209 a 213 e Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807
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117/191 a 820); estreptomicma (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet.
210:86 a 91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996)
Transgenic Res. 5:131 a 137); bleomicina (Hille, et al., (1990)
Plant Mol. Biol. 7:171 a 176); (1990) Plant Mol. Biol. 15:127 al., (1988) Science 242:419 a (1986) Science 233:478 a 4
U.S.10/004,357 e 10/427,692); :
sulfonamida (Guenneau, et al., a 136); bromoxinil (Stalker, et 423); glifosato (Shaw, et al., il e Pedidos de Patente n° osfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2.513 a 2.518) . Consultar, de modo geral, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506 a 511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6.314 a 6.318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63 a 72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2419 a 2422; Barkley, et al., (1980) em
The Operon, páginas 177 a 220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555 a 566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603 a 612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713 a 722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5.400 a 5.404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549 a 2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480 a 483; Gossen, (1993) Tese de Doutoramento, Universidade de Heidelberga; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917 a 1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3.343 a 3.356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3.952 a 3.956; Balm, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5.072 a 5.076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4.647 a 4.653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143 a 162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1.591 a 1.595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1.094 a 1.104; Bonin, (1993) Tese de
Doutoramento, Universidade de Heidelberga; Gossen, et al.,
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118/191 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5.547 a 5.551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913 a 919; Hlavka, et al., (1985) Handbook de Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim) e Gill, et al., (1988) Nature 334:721 a 724.
[0172] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é destinada a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado nas modalidades.
Transformação de Plantas [0173] Os métodos das modalidades envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. Introduzir significa, conforme usado no presente documento, apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das modalidades não dependem de um método particular para introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeos ganhem acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir polinucleotídeo ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.
[0174] Transformação estável significa, conforme usado no presente documento, que o construto de nucleotídeos introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e tem capacidade para ser herdado pela descendência da mesma. Transformação transiente significa, conforme usado no presente documento, que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no
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119/191 genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta. Planta se refere, conforme usado no presente documento, a plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e descendência dos mesmos. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura em suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen).
[0175] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, visada para transformação. Métodos adequados para introduzir sequências de nucleotídeos em células de plantas e inserção subsequente no genoma de plantas incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs, et al. , (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602 5606), transformação mediada por Agrobacterium (Patentes nos U.S. 5, 563, 055 e 5, 981,840), transferência de genes direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717 a 2722) e aceleração balística de partículas (consultar, por exemplo, Patentes nos U.S. 4,945,050; 5,879,918;
5, 886, 244 e 5, 932,782; Tomes, et al. , (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editores Gamborg e Phillips, (Springer-Verlag, Berlim) e McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923 a 926) e transformação Led (documento n° WO 00/28058). Para transformação de batata, consultar Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829 a 838 e Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71 a 78. Procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger, et
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120/191 al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4.305 a 4.309 (milho); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (milho); Patentes dos E.U.A. n.os 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (milho); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; Patente dos E.U.A. n.° 5.736.369 (cereais); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, Nova Iorque), páginas 197 a 209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (milho por meio de Agrobacterium tumefaciens) .
[0176] Em modalidades específicas, as sequências das modalidades podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação transiente. Tais métodos de transformação transiente incluem, mas sem limitação, a
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121/191 introdução do polipeptídeo IPD079 ou variantes e fragmentos do mesmo diretamente na planta ou a introdução do transcrito do polipeptídeo IPD079 na planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Consultar, por exemplo, Crossway, et al. , (1986) Mol Gen. Genet. 202:179 a 185; Nomura, et al., (1986) Plant Sei. 44:53 a 58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91:2176 a 2180 e Hush, et al. , (1994) The Journal of Cell Science 107:775 a 784, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Alternativamente, o polinucleotídeo IPD079 pode ser transformado transientemente na planta com o uso das técnicas conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de um modo que impede a subsequente liberação do DNA. Assim, pode ocorrer a transcrição a partir do DNA ligado a partículas, mas a frequência com que é liberado para se integrar no genoma é grandemente reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143).
[0177] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em uma localização genômica desejada é conseguida utilizando um sistema de recombinação específico para sítios. Consultar, por exemplo, os documentos n° WO 1999/25821, n° WO 1999/25854, n° WO 1999/25840, n° WO 1999/25855 e n° WO 1999/25853, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Brevemente, o polinucleotídeo das modalidades pode ser contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos. O
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122/191 cassete de transferência é introduzido em uma planta que incorporou de modo estável em seu genoma um sítio-alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado no sítio-alvo. 0 polinucleotídeo de interesse é deste modo integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.
[0178] Os vetores de transformação de planta podem ser compreendidos por um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar os vetores de transformação de planta que são compreendidos por mais de um segmento de DNA contíguo. Esses vetores são frequentemente chamados na técnica de vetores binários. Vetores binários, assim como vetores com plasmídeos auxiliadores, são muito frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacteríum, em que o tamanho e complexidade dos segmentos de DNA necessários para alcançar transformação eficiente são bem grandes, e é vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmídico que contém as sequências de atuação cis exigidas para a transferência de T-DNA (como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é modificado para ter capacidade para expressão em uma célula de planta e um gene de interesse (um gene modificado para ter capacidade para expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes nesse vetor plasmídico as sequências exigidas para replicação bacteriana. As sequências de atuação cis são dispostas de maneira
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123/191 a permitir a transferência eficaz para células de plantas e expressão nas mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida são localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor plasmídico contém os fatores de atuação trans que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacteríum para células de plantas. Esse plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de plantas por Agrobacteríum, e transferência de DNA por divagem em sequências de borda e transferência de DNA mediada por Vir, conforme é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446 a 451) . Diversos tipos de cepas de Agrobacteríum (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para transformação de plantas. O segundo vetor plasmídico não é necessário para transformar as plantas por outros métodos, como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.
[0179] Em geral, os métodos de transformação de plantas envolvem transferir DNA heterólogo para células de plantas-alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo não diferenciado, protoplastos, etc.), seguido da aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células de plantas transformadas a partir de um grupo de massa de células não transformadas. Após a integração de DNA estranho heterólogo em células de plantas, é aplicado um nível de limiar máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas para separar e proliferar as células transformadas de modo putativo que sobrevivem a esse tratamento de seleção
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124/191 transferindo as mesmas de modo regular para um meio fresco. Pela passagem contínua e o desafio com seleção apropriada, são identificadas e proliferadas as células que são transformadas com o vetor plasmídeo. Os métodos moleculares e bioquímicos podem, então, ser usados para confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.
[0180] Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após colocação em meio de regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são, então, transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar o broto ou plântula enraizado. A plântula transgênica cresce, então, para uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei, et al. , (1994) The Plant Journal 6:271 a 282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750). Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219 a 239 e Bommineni e Jauhar, (1997) Maydica 42:107 a 120. Visto que o material transformado contém muitas células, tanto células transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer parte de calo ou tecido ou grupo de células-alvo em questão. A capacidade de matar células não transformadas e permitir que células transformadas proliferem resulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a capacidade para remover células não transformadas é uma
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125/191 limitação à recuperação rápida de células de plantas transformadas e geração bem-sucedida de plantas transgênicas.
[0181] As células que foram transformadas podem se desenvolver em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick, et al. , (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas e ser polinizadas com a mesma cepa transformada ou com cepas diferentes, e o híbrido resultante que tem expressão constitutiva ou induzível da característica fenotípica desejada pode ser identificado. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada é mantida de modo estável e herdada e, então, as sementes são recolhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada.
[0182] As sequências de nucleotídeos das modalidades podem ser fornecidas à planta colocando a planta em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar o construto de nucleotídeos de interesse dentro de uma molécula de RNA ou DNA viral. Se reconhece que as proteínas recombinantes das modalidades podem ser inicialmente sintetizadas como parte de uma poliproteína viral, que posteriormente pode ser processada por meio de proteólise ín vivo ou in vitro para produzir o polipeptídeo IPD079 desejado. Se reconhece também que tal poliproteína viral, que compreende pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de um IPD079 das modalidades, pode ter a atividade pesticida desejada. Tais poliproteínas virais e as sequências de nucleotídeos que codificam as mesmas são englobadas pelas modalidades. Os métodos para dotar plantas de construtos de nucleotídeos e produzir as
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126/191 proteínas codificadas nas plantas, que envolvem moléculas de RNA ou DNA viral, são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Patentes nos U.S. 5, 889, 191; 5, 889, 190; 5, 866, 785; 5, 589, 367 e 5,316,931; incorporadas no presente documento a título de referência.
[0183] Os métodos para transformação de cloroplastos são
conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Svab , et al., ( 1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga, ( 1993)
Proc. Natl. Acad. Sci . USA 90:913-917; Svab e Maliga, ( 1993)
EMBO J. 12:601-606. O método se baseia na entrega com canhão de partículas de DNA que contém um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o genoma plastídico através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação de plastídeos pode ser realizada pela transativação de um transgene originado por plastídeo silencioso por expressão preferida para tecidos de uma RNA polimerase codificada de modo nuclear e direcionada para plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride, et al. , (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301 a 7305.
[0184] As modalidades se referem adicionalmente a material de propagação de plantas de uma planta transformada das modalidades o que inclui, mas sem limitação, sementes, tubérculos, cormos, bulbos, folhas e cortes de raízes e brotos.
[0185] As modalidades podem ser usadas para transformação de quaisquer espécies de planta, incluindo, mas sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de
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127/191 semente, alfafa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeio (Secale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , milhete (por exemplo, milhete-pérola (Pennisetum glaucum), milho miúdo (Panicum miliaceum), milho painço (Setaria italica), capim-pé-de-galinha-gigante (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nícotíana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentals), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, legumes, plantas ornamentais e coníferas.
[0186] Legumes incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa) , feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) e melão (C. melo) . Plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hidrângea (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), craveiro (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e
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128/191 crisântemo. Coníferas que podem ser empregues na prática das modalidades incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pínus taeda) , pinheiro-americano (Pínus elliotii), pinheiro ponderosa (Pínus ponderosa), pinheiro de Lodgepole (Pínus contorta) e pinheiro de Monterey (Pínus radiata); pinheiro do Oregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canadensis) ; abeto Sitka (Picea glauca); sequoia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis) . As plantas das modalidades incluem plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milhete, tabaco, etc.), como plantas de milho e soja.
[0187] Gramados incluem, mas sem limitação: poa-anual (Poa annua); azevém anual (Lolium multiflorum); poa canadiana (Poa compressa); festuca-encarnada (Festuca rubra); Agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); grama de trigo do deserto (crested wheatgrass) (Agropyron desertorum); capim-mombaça (Agropyron cristatum); festuca rígida (Festuca longifolia) ; erva-de-febra (Poa pratensis) ; panasco (Dactylis glomerata); azevém perene (Lolium perenne); festuca-encarnada (Festuca rubra); germínia rubra (Agrostis alba); poa-comum (Poa trivialis) ; festuca ovina (Festuca ovina); bromo (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); rabo-de-gato (Phleum pratense); Agrostis-de-cão (velvet bentgrass) (Agrostis canina); weeping alkaligrass (Puccinellia distans); erva-trigo ocidental (Agropyron smithii); grama Bermuda (Cynodon spp. ) ; grama Santo Agostinho (Stenotaphrum secundatum) ; Grama
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Zoysia (Zoysia spp.); grama-Bahia (Paspalum notation) ; grama tapete (Axonopus affinis); grama centipede (Eremochloa ophiuroides); grama Kikuio (Pennisetum clandesinum); capimarame-da-praia (Paspalum vaginaturn) ; grama azul (Bouteloua gracilis) ; grama americana (Buchloe dactyloids); sideoats gramma (Bouteloua curtipendula) .
[0188] As plantas de interesse incluem plantas de grãos que fornecem sementes de interesse, plantas de sementes oleaginosas e leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grão, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, milheto, etc. Plantas com sementes oleaginosas incluem algodão, soja, açafrão-bastardo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, linho, rícino, azeitona, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, feijão de alfarroba, feno-grego, soja, feijão de jardim, caupi, feijão mungo, feijãode-lima, feijão-fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.
[0189] Após a introdução de DNA estranho heterólogo em células de plantas, a transformação ou integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados ao gene integrado.
[0190] A análise de PCR é um método rápido para triar células, tecido ou brotos transformados quanto à presença de gene incorporado no estágio inicial antes da transplantação para o solo (Sambrook e Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). É executada PCR com o uso de iniciadores de
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130/191 oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor de Agrobacteríum, etc.
[0191] A transformação de planta pode ser confirmada por análise de transferência Southern de DNA genômico (Sambrook e Russell, (2001) supra) . Em geral, DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. A membrana ou coloração é então sondada com, por exemplo, fragmento de DNA-alvo radioetiquetado com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma de planta, de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, (2001) s upra) .
[0192] Na análise de transferência Northern, RNA é isolado de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose e formaldeído e transferido para um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrão que são usados de modo rotineiro na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra) . A expressão de RNA codificado pelo gene pesticida é, então, testada hibridando o filtro com uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra) .
[0193] Transferência Western, ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser realizados nas plantas transgênicas para confirmar a presença de proteína codificada pelo gene pesticida por meio de procedimentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) com o uso de anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes no polipeptídeo IPD079.
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Empilhamento de traços de IPD079 e elementos de silenciamento em planta transgênica [0194] As plantas transgênicas podem compreender uma pilha de um ou mais polinucleotídeos inseticidas codificando polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento com um ou mais polinucleotídeos de elementos de silenciamento adicionais que resultam na produção ou supressão de múltiplas sequências de polipeptídeos. As plantas transgênicas que compreendem empilhamentos de sequências de polinucleotídeos podem ser obtidas por qualquer um ou ambos os métodos de reprodução tradicionais ou através de métodos de manipulação genética. Estes métodos incluem, mas sem limitação, cultivar linhas individuais, sendo que cada uma compreende um polinucleotídeo de interesse, transformar uma planta transgênica que compreende um gene revelado no presente documento com um gene subsequente e cotransformar genes em uma célula de planta única. Conforme usado no presente documento, o termo empilhado inclui ter os múltiplos traços presentes na mesma planta (isto é, ambos os traços são incorporados no genoma nuclear, um traço é incorporado no genoma nuclear e um traço é incorporado no genoma de um plastídeo ou ambos os traços são incorporados no genoma de um plastídeo). Em um exemplo não limitante, traços empilhados compreendem um empilhamento molecular em que as sequências são fisicamente adjacentes entre si. Um traço, conforme usado no presente documento, se refere ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. A cotransformação de genes pode ser executada com o uso de vetores de transformação únicos que compreendem múltiplos genes ou genes portados separadamente em múltiplos vetores. Se as sequências forem
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132/191 empilhadas transformando geneticamente as plantas, as sequências de polinucleotídeos de interesse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências forem introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser acionada pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que irá suprimir a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de sobre-expressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É adicionalmente reconhecido que as sequências de polinucleotídeos podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada com o uso de um sistema de recombinação específica para sítios. Consultar, por exemplo, os documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853.
[0195] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam um ou mais dos polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento, sozinhos ou empilhados com um ou mais traços de resistência a inseto adicionais podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicida, resistência fúngica, resistência a vírus, tolerância à tensão, resistência a doenças, esterilidade do macho, força da haste e semelhantes) ou traços de saída (por
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133/191 exemplo, rendimento aumentado, amidos modificados, perfil de óleo aprimorado, aminoácidos equilibrados, lisina ou metionina alta, digestibilidade aumentada, qualidade de fibra aprimorada, resistência à seca e semelhantes). Portanto, as modalidades de polinucleotídeo podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de cultura aprimorada com a capacidade de controlar de modo flexível e rentável quaisquer pragas agronômicas.
[0196] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam uma ou mais das perforinas de plantas ou polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento são empilhados com um ou mais polinucleotídeos que codificam as proteínas pesticidas ou elementos de silenciamento revelados no presente documento. Em certas modalidades, polinucleotídeos das modalidades codificando uma ou mais das perforinas de plantas ou polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento são empilhados com um ou mais polinucleotídeos codificando um elemento de silenciamento apresentado nas SEQ ID NOs: 1279-1376.
[0197] Em algumas modalidades, o traço empilhado pode estar na forma de silenciamento de um ou mais polinucleotídeos de interesse resultando na supressão de um ou mais polipeptídeos de praga direcionada. Em algumas modalidades, o silenciamento é alcançado através do uso de um construto de DNA de supressão.
[0198] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento são empilhados com um ou mais polinucleotídeos que codificam elementos de silenciamento que direcionam Coatômero, subunidade alfa (SEQ ID NO: 1279), Coatômero, subunidade gama
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134/191 (SEQ ID NO: 1280), MAEL (SEQ ID NO: 1337), NCLB (SEQ ID NO: 1338), ou BOULE (SEQ ID NO: 1341). Em uma modalidade, os polinucleotideos que codificam os polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento são empilhados com polinucleotideos que codificam um elemento de silenciamento revelado nas Publicações de Pedidos de Patentes Internacionais Números. WO 2016/205445, WO2016138106, WO 2016/060911, WO 2016/060912, WO 2016/060913, e WO 2016/060914, ou Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. No. US US2014/0275208 ou US2015/0257389. Em uma modalidade, os polinucleotideos que codificam um ou mais dos polipeptídeos IPD079 revelados no presente documento são empilhados com polinucleotideos codificando um ou mais elementos de silenciamento direcionados para qualquer uma ou mais das sequências-alvo de SEQ ID NOs: 1279-1376.
[0199] Em algumas modalidades, os polinucleotideos codificadores dos polipeptídeos IPD079 e polinucleotideos que codificam elementos de silenciamento revelados no presente documento devem ser empilhados com um ou mais traços de resistência a inseto adicionais, podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicidas, resistência fúngica, resistência a vírus, tolerância ao estresse, resistência a doenças, esterilidade masculina, força de talo e semelhantes) ou traços de saída (por exemplo, rendimento aumentado, amidos modificados, perfil de óleo melhorado, aminoácidos equilibrados, lisina ou metionina alta, digestibilidade aumentada, qualidade de fibra melhorada, resistência à seca e semelhantes). Portanto, as modalidades de polinucleotídeo podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de cultura aprimorada com a
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135/191 capacidade de controlar de modo flexível e rentável quaisquer pragas agronômicas.
[0200] Algumas modalidades se referem à regulação descendente de expressão de genes de direcionamento em espécies de praga de inseto por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) interferentes.
[0201] Algumas modalidades se referem à regulação descendente de expressão de genes de direcionamento em espécies de praga de inseto por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) interferentes. As Publicações PCT WO 2007/074405; WO 2005/110068, e WO 2009/091864 descrevem composições para inibir o besouro da batata do Colorado, lagarta-da-raiz do milho do oeste, e espécies Lygus.
[0202] Moléculas de ácido nucleico, incluindo elementos de silenciamento para direcionar a subunidade de ATPase H vacuolar, úteis para controlar uma população e infestação de praga de coleópteros conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2012/0198586. A Publicação PCT WO 2012/055982 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita dupla) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica: uma proteína ribossômica de inseto, como a proteína ribossômica L19, a proteína ribossômica L40 ou a proteína ribossômica S27A; uma subunidade de proteassomo de inseto, como a proteína Rpn6, a Pros 25, a proteína Rpn2, a proteína de subunidade beta 1 de proteassomo ou a proteína Pros beta 2; um β-coatômero de inseto da vesícula COPI, o γ-coatômero da vesícula COPI, a proteína β'-coatômero ou o ζ-coatômero da vesícula COPI; uma proteína Tetraspanina 2 A de inseto que é uma proteína de domínio transmembrana putativo; uma proteína de inseto que
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136/191 pertence à família de actina, como Actina 5C; uma proteína ubiquitina-5E de inseto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador de GTPase envolvido em transporte de proteína intracelular; uma proteína plissada de inseto que é uma miosina não convencional que está envolvida em atividade motora; uma proteína torcicolo de inseto que está envolvida na regulação de encadeamento de mRNA alternativo nuclear; uma proteína de subunidade G de H+-ATPase vacuolar de inseto e uma Tbp-1 de inseto, como uma proteína de ligação a Tat. A Publicação PCT WO 2007/035650 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita dupla) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica Snf7. A Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2011/0054007 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeos que visam RPS10. A Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2014/0275208 e US2015/0257389 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeo que direcionam RyanR, HP2 e PAT3. A Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2011/0054007 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeo que direciona RPS10. As publicações PCT número WO 2016/138106, WO 2016/060911, WO 2016/060912, WO 2016/060913 e WO 2016/060914 descrevem elementos de silenciamento de polinucleotídeo que direcionam moléculas de ácido nucleico de subunidade de coatômero COPI que conferem resistência às pragas Coleóptera e Hemíptera. As Publicações de Pedido de Patente dos E.U.A. n° US 20120297501, e n.° 2012/0322660 descrevem os ácidos ribonucleicos interferentes (RNA ou RNA de fita dupla) que funcionam mediante captação por uma espécie de praga de inseto para regular de modo descendente a expressão de um gene de direcionamento na dita praga de inseto, em que o RNA compreende
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137/191 pelo menos um elemento de silenciamento, em que o elemento de silenciamento é uma região de RNA de fita dupla que compreende fitas complementares aneladas, em que uma fita compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de direcionamento de nucleotídeo dentro do gene de direcionamento. A Publicação de Pedido de Patente n° dos E.U.A. 2012/0164205 descreve alvos potenciais para ácidos ribonucleicos de fita dupla interferentes para inibir pragas invertebradas incluindo: uma Sequência Homóloga de Chd3, uma Sequência Homóloga de Beta-Tubulina, uma Sequência Homóloga de V-ATPase de 40 kDa, uma Sequência Homóloga de EFla, uma Sequência Homóloga de p28 de Subunidade de Proteassomo 26S, uma Sequência Homóloga de Epóxido Hidrolase de Hormônio Juvenil, uma Sequência Homóloga de Proteína de Canal de Cloreto Dependente de Inchaço, uma Sequência Homóloga de Proteína Glicose-6-Fosfato 1-Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Proteína Act42A, uma Sequência Homóloga de Fator de Ribosilação de ADP 1, uma Sequência Homóloga de Proteína de Fator de Transcrição IIB, Sequências Homólogas de Quitinase, uma Sequência Homóloga de Enzima de Conjugação de Ubiquitina, uma Sequência Homóloga de Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Ubiquitina B, um Homólogo de Esterase de Hormônio Juvenil e uma Sequência Homóloga de Alfa Tubulina.
[0203] Em algumas modalidades, as composições e métodos se referem ao empilhamento de um ou mais polipeptídeos pesticidas. Peptídeos pesticidas podem incluir, mas não se limitam a, genes codificando uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado naquela. Ver, por exemplo, Geiser, et al. , (1986) Gene 48:109, que revelam a
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138/191 clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de deltaendotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes de delta-endotoxinas podem ser comprados à American Type Culture Collection (Rockville, Md.), por exemplo, com Números de Acesso ATCC® 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitantes de transgenes de Bacillus thuringiensis que são modificados genericamente são dados nas seguintes patentes e pedidos de
patente : Patentes nos U.S. 5, 188,960; 5, 689, 052; 5,880,275;
5,986,177; 6,023,013, 6, 060,594, 6,063,597, 6,077,824,
6,620,988, 6,642,030, 6, 713,259, 6, 893, 826, 7,105,332;
7,179,965, 7,208,474; 7, 227,056, 7,288,643, 7,323, 556,
7,329, 736, 7,449,552, 7, 468,278, 7,510,878, 7,521,235,
7,544,862, 7,605,304, 7, 696,412, 7,629,504, 7,705, 216,
7,772,465, 7,790, 846, 7 , 858, 849 e documento n° WO 1991/14778;
documento n° WO 1999/3124 8; documento n° WO 2001/12731;
documento n° WO 1999/24581 e documento n° WO 1997/40162.
[0204] Genes que codificam proteínas pesticidas podem também ser empilhados, o que inclui, mas sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp., tais como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de cepas de Pseudomonas protegens CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368 a 2386: n° de Acesso GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12.343 a 12.349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45 a 50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159 a 168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxicology Journal 3:101 a 118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir.
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Micro. 67:2062-2069), Patente US Número 6,048,838, e Patente US Número 6,379,946; um polipeptídeo PIP-1 de US Número de Série 13792861; um polipeptídeo AfIP-lA e/ou AfIP-lB de US Número de Série 13/800233; um polipeptídeo PHI-4 de US Número de Série 13/839702; um polipeptídeo PIP-47 de PCT Número de Série PCT/US14/51063; um polipeptídeo PIP-72 de PCT Número de Série PCT/US14/55128; um polipeptídeo PtIP-50 e um polipeptídeo PtlP65 de Número de Publicação PCT WO2015/120270; um polipeptídeo PtIP-83 de Número de Publicação PCT WO2015/120276; um polipeptídeo PtIP-96 de PCT Número de Série PCT/US15/55502; e δ-
endotoxinas incluindo, mas não se limitando às classes Cryl,
Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryl1,
Cryl2, Cryl3, Cryl4, Cryl5, Cryl6, Cryl7, Cryl8, Cryl9, Cry2 0,
Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29,
Cry 30 , Cry31 , Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38,
Cry39, Cry4 0, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47,
Cry49, Cry 51 e Cry55 de genes de δ-endotoxina e os genes Cytl e Cyt2 citollticos de B. thuringiensis. Membros destas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, mas não se limitam a CrylAal (Acesso # AAA22353); CrylAa2 (Acesso # Acesso
# AAA22552); CrylAa3 (Acesso # BAA00257) ; CrylAa4 (Acesso #
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BAD35157); Cry41Abl (Acesso # BAD35163) ; Cry41Bal
HM461871); Cry41Ba2 (Acesso # ZP_04099652) ; Cry42Aal
BAD35166) ; Cry43Aal (Acesso # BAD15301); Cry43Aa2
BAD95474); Cry43Bal (Acesso # BAD15303); Cry43Cal
KC156676); Cry43Cbl (Acesso # KC156695); Cry43Ccl
KG156696); tipo Cry43 (Acesso # BAD15305) ; Cry44Aa
BAD08532); Cry45Aa (Acesso # BAD22577); Cry4 6Aa
BAC79010) ; Cry4 6Aa2 (Acesso # BAG68 90 6) ; Cry4 6Ab
BAD35170); Cry47Aa (Acesso # AAY24695) ; Cry4 8Aa
CAJ18351) ; Cry4 8Aa2 (Acesso # CAJ 8 654 5) ; Cry4 8Aa3
CAJ8 654 6) ; Cry4 8Ab (Acesso # CAJ8 654 8) ; Cry4 8Ab2
CAJ8 654 9) ; Cry4 9Aa (Acesso # CAH56541); Cry4 9Aa2
(Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso # (Acesso #
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CAJ86541) ; Cry4 9Aa3 (Acesso # CAJ86543); Cry4 9Aa4 (Acesso #
CAJ86544) ; Cry4 9Abl (Acesso # CAJ86542); Cry50Aal (Acesso #
BAE86999) ; Cry50Bal (Acesso # GU446675); Cry50Ba2 (Acesso #
GU 4 4 6 67 6) ; Cry51Aal (Acesso # ABI14444); Cry51Aa2 (Acesso #
GU570697); Cry52Aal (Acesso # EF613489); Cry52Bal (Acesso #
FJ361760); Cry53Aal (Acesso # EF633476); Cry53Abl (Acesso #
FJ361759); Cry54Aal (Acesso # ACA52194); Cry54Aa2 (Acesso #
GQ140349); Cry54Bal (Acesso # GU446677); Cry55Aal (Acesso #
ABW88932); Cry54Abl (Acesso # JQ916908); Cry55Aa2 (Acesso #
AAE33526) ; Cry56Aal (Acesso # ACU57499); Cry56Aa2 (Acesso #
GQ483512); Cry56Aa3 (Acesso # JX025567); Cry57Aal (Acesso #
ANC87261); Cry58Aal (Acesso # ANC87260); Cry59Bal (Acesso #
JN790647); Cry59Aal (Acesso # ACR43758); Cry60Aal (Acesso #
ACU24782); Cry60Aa2 (Acesso # EAO57254); Cry60Aa3 (Acesso #
EEM99278); Cry60Bal (Acesso # GU810818); Cry60Ba2 (Acesso #
EAO572 53) ; Cry60Ba3 (Acesso # EEM99279); Cry61Aal (Acesso #
HM035087); Cry61Aa2 (Acesso # HM132125); Cry61Aa3 (Acesso #
EEM19308); Cry62Aal (Acesso # HM054509); Cry63Aal (Acesso #
BAI44028) ; Cry64Aal (Acesso # BAJ05397); Cry65Aal (Acesso #
HM461868); Cry65Aa2 (Acesso # ZP_04123838); Cry66Aal (Acesso #
HM485581); Cry66Aa2 (Acesso # ZP_04099945); Cry67Aal (Acesso #
HM485582); Cry67Aa2 (Acesso # ZP_04148882); Cry68Aal (Acesso #
HQ113114); Cry69Aal (Acesso # HQ401006); Cry69Aa2 (Acesso #
JQ821388); Cry69Abl (Acesso # JN209957); Cry7 OAal (Acesso #
JN646781); Cry7 OBal (Acesso # AD051070); Cry7 OBbl (Acesso #
EEL67276); JX025569). Cry7lAal (Acesso # JX025568); Cry72Aal (Acesso #
[0205] Exemplos de δ-endotoxinas também incluem, porém, sem
limitação, proteínas CrylA das Patentes US Números 5 ,880,275 e
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7,858,849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção N-terminal de variantes de α-hélice 1 e/ou a-hélice 2 de proteínas Cry, tais como CrylA) das Patentes US Números 8,304,604 e 8,304,605, CrylB do Pedido de Patente US número de série 10/525,318; CrylC da Patente US número 6,033,874; CrylF das Patentes US números 5,188,960, 6,218,188; quimeras CrylA/F das Patentes US números 7,070,982; 6,962,705 e 6,713,063; uma proteína Cry2, tal como a proteína Cry2Ab da Patente US número 7,064,249; uma proteína Cry3A, incluindo, porém, sem limitação, uma proteína inseticida híbrida modificada (eHIP) criada por fusão de combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. número 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das Patentes US números 7,329,736, 7,449,552, 7,803,943, 7,476,781, 7,105,332, 7,378,499 e 7,462,760; uma proteína Cry9 tal como os membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F; uma proteína Cryl5 de Naimov, et al. , (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7.145 a 7.151; uma Cry22, uma proteína Cry34Abl das Patentes números US 6,127,180, 6,624,145 e 6,340,593; uma proteína CryET33 e CryET34 das Patentes números US 6,248,535, 6,326,351, 6,399,330, 6,949,626, 7,385,107 e 7,504,229; um homólogo CryET33 e CryET34 da Publicação de Patente número US 2006/0191034, 2012/0278954 e Publicação PCT número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Abl das Patentes números US 6,083,499, 6,548,291 e 6,340,593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 do documento US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 do documento PCT US 2006/033867; TIC3131, TTG
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3400 e TIC3407 da Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A. Número 2015/0047076; AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Patente número US 8,236,757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 do documento US7,923,602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 do documento WO 2006/083891; AXMI-010 do documento WO 2005/038032; AXMI-003 do documento WO 2005/021585; AXMI-008 do documento US 2004/0250311; AXMI-006 do documento US 2004/0216186; AXMI-007 do documento US 2004/0210965; AXMI-009 do documento US 2004/0210964; AXMI-014 do documento US 2004/0197917; AXMI-004 do documento US 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 do documento WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-008 Orf2 , AXMI-009, AXMI014 e AXMI-004 de WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente número US 8,084,416; AXMI-205 do documento US20110023184; AXMI-011, AXMI012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 e AXMI-064 do documento US 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas do documento US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z do documento WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 do documento WO11/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 e AXMI-184 da Patente número US 8,334,431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, e AXMI-045 do documento US 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 do documento US20090144852;
AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142
AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153
AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165
AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172
AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179
AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188
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AXMI189 da Patente US número 8,318,900 ; AXMI079, AXMI080,
AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098,
AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107,
AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116,
AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123,
AXMI124, AXMI1257, AXMI1268 , AXMI127 , AXMI129, AXMI164, AXMI151,
AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138 , AXMI137 do documento US
2010/0005543; e proteinas Cry, tais como CrylA e Cry3A, que têm sítios proteolíticos modificados da Patente número US 8,319,019, e uma proteína de toxina CrylAc, Cry2Aa e CrylCa de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 da Publicação de Pedido de Patente US número 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica (consultar Crickmore, et al., Bacillus thuringiensis toxin nomenclature (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www). A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por um versado na técnica (para revisão, consultar van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1 a 16). O uso de proteinas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um versado na técnica e as plantas transgênicas Cry incluindo, mas sem limitação, CrylAc, CrylAc+Cry2Al, CrylAl, CrylA.105, CrylF, CrylFa2, CrylF+CrylAc, Cry2Al, Cry3A, mCry3A, Cry3Bbl, Cry34Abl, Cry35Abl, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-T 1 receberam aprovação regulamentadora (consultar, Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283 a 300 e o banco de dados de culturas CERA (2010) GM Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em ceragmc.org/index.php?action=gm_crop_database que pode ser acessado
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155/191 pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um versado na técnica pode ser também expressa em plantas, tal como Vip3Ab e CrylFa (US2012/0317682), CrylBE e CrylF (US2012/0311746), CrylCA e CrylAB (US2012/0311745), CrylF e CryCa (US2012/0317681), CrylDA e CrylBE (US2012/0331590), CrylDA e CrylFa (US2012/0331589), CrylAB e CrylBE (US2012/0324606), e CrylFa e Cry2Aa, Cryll ou CrylE (US2012/0324605) ); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab e Cry3Aa (US20130167268); Cry3A e CrylAb ou Vip3Aa (US20130116170); e CrylF, Cry34Abl, e Cry35Abl (PCT/US2010/060818). As proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas incluindo lipídio acil hidrolases da Patente Número U.S. 7.491.869, e colesterol oxidases, tais como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1.406 a 1.413). Proteínas pesticidas também incluem toxinas de VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das Patentes U.S. Números 5,877,012, 6,107,279, 6,137,033, 7,244,820, 7,615,686 e 8,237,020 e semelhantes. Outras proteínas VIP são bem conhecidas para um indivíduo versado na técnica (consultar lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www). Proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC), obteníveis de organismos tais como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar as Patentes números US 7,491, 698 e 8, 084,418) . Algumas proteínas TC têm atividade inseticida autônoma e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC autônoma (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode
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156/191 ser melhorada por um ou mais potenciadores de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A (Proteína A) são toxinas autônomas. As proteínas de Classe B (Proteína B) e as proteínas de Classe C (Proteína C) aumentam a toxicidade das proteínas de Classe A. Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptAl e XptA2. Os exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptBlXb e XptCIWi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptClXb e XptBIWi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente U.S. ns 8,334,366).
Uso em Controle Pesticida [0206] Os métodos gerais para empregar cepas que compreendem uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou uma variante da mesma em controle pesticida ou na manipulação de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, a Patente n° U.S. 5.039.523 e o documento n° EP 0480762A2.
[0207] Os hospedeiros de microrganismos que são conhecidos por ocuparem a fitosfera (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplana) de uma ou mais culturas de interesse podem ser selecionados. Esses micro-organismos são selecionados de modo a terem capacidade de competir de modo bem-sucedido no ambiente particular com os micro-organismos do tipo selvagem, fornecer manutenção estável e expressão do gene que expressa o
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157/191 polipeptídeo IPD079 e, desejavelmente, fornecer proteção aprimorada do pesticida contra degradação ambiental e inativação.
[0208] Alternativamente, os polipeptídeos de IPD079 são produzidos introduzindo-se um gene heterólogo em um hospedeiro celular. A expressão do gene heterólogo resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Estas células são então tratadas em condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada no ambiente da(s) praga(s)-alvo. O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses polipeptídeos IPD079 naturalmente encapsulados podem então ser formulados de acordo com técnicas convencionais para a aplicação no ambiente hospedando uma praga-alvo, por exemplo, solo, água e folhagem de plantas. Consultar, por exemplo, o documento n° EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo.
Composições Pesticidas [0209] Em algumas modalidades, a perforina derivada de planta pode ser aplicada na forma de composições e pode ser aplicada na área de cultura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de ervas daninhas, Crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabões pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de transportadores de liberação no tempo ou biodegradáveis que permitem a dosagem de longa duração de uma área-alvo após uma aplicação única da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbiocidas, amebicidas, pesticidas,
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158/191 fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de diversas dentre essas preparações, se desejado, junto com transportadores adicionais aceitáveis de modo agrícola, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação empregues de modo costumeiro na técnica da formulação. Os transportadores e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias empregues de modo comum na tecnologia da formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, ligantes ou fertilizantes. De modo similar, as formulações podem ser preparadas em iscas comestíveis ou fabricadas em armadilhas para praga para permitir alimentação ou ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.
[0210] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição agroquímica que contém um elemento de silenciamento pelo menos uma das perforinas derivadas de planta da revelação incluindo mas não se limitando ao polipeptídeo IPD079 produzido pelas estirpes bacterianas incluem aplicação em folha, revestimento de semente e aplicação em solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.
[0211] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, pulverização, emulsão, coloide, solução ou semelhantes, e pode ser preparada por meios convencionais, tais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo. Em todas as tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo
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159/191 pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso. Cerca de no que se refere a % em peso significa ± 0,5%.
[0212] As pragas de Lepidópteros, Diptera, Heteroptera, nemátodos, Hemiptera ou Coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em números em uma dada área pelos métodos da divulgação ou podem ser aplicados de modo profilático em uma área ambiental para impedir a infestação por uma praga suscetível. Preferencialmente, a praga ingere ou faz contato com uma quantidade eficaz como pesticida do polipeptídeo. Quantidade eficaz para pesticida, conforme usado no presente documento, se refere a uma quantidade do pesticida que é capaz de exterminar pelo menos uma praga ou reduzir de modo notável o crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal de praga. Essa quantidade irá variar dependendo de fatores tais como, por exemplo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, a localização, a planta, cultura ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação da composição polipeptídica eficaz como pesticida. As formulações também podem variar em relação a condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou severidade de infestação da praga.
[0213] As composições pesticidas descritas podem ser produzidas formulando a célula bacteriana, suspensão de Cristal e/ou esporo ou componente de proteína isolada com o transportador agriculturalmente aceitável desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em meios apropriados, como liofilizada, secada a frio, dessecada ou em um carreador, meio
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160/191 ou diluente aquoso adequado, como salino ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como um pó molhável ou em combinação com qualquer outro material transportador adequado para aplicação agrícola. Os transportadores agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo transportador aceitável de modo agrícola abrange todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, aprimoradores de pegajosidade, aglutinantes, etc. que são usados de modo comum na tecnologia da formulação de pesticidas; esses são bem conhecidos por aqueles versados na técnica da formulação de pesticidas. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, por mistura de modo homogêneo, mescla e/ou trituração da composição pesticida com adjuvantes adequados com o uso de técnicas de formulação convencionais. As formulações e métodos de aplicação adequados são descritos na Patente n° U.S. 6,468,523, incorporada no presente documento a título de referência. As sementes ou plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. As composições químicas exemplificativas incluem: Herbicidas de Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halossulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halossulfuron, Indaziflam; Inseticidas de Frutas/Vegetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaril, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation,
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Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambdacialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, FluaCripirim,
Tolfenpirad, Clotianidina, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Espinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Espinoteram, Triflumuron, Espirotetramate, Imidacloprida, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam,
Espinotoram, Tiodicarb, Flonicamida, Metiocarb, Emamectinabenzoato, Indoxacarb, Fostiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifeno, Fenbutatina-dxido, Hexitiazox, Metomil, 4—[ [ (6 — Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)ona; Fungicidas de Frutas/Vegetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato metilico, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Cresoxim metilico, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobina, Fenexamida, Fumarato de oxpoconazol,
ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina,
Piraclostrobina , Ciflufenamida, Boscalida; Herbicidas de
Cereais: Isoproturon, Bromoxinil, loxinil, Fenóxidos,
Clorossulfuron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop,
Florasulam, Fluoroxipir, Metsulfuron, Triassulfuron,
Flucarbazona, lodossulfuron , Propoxicarbazona, Picolinafeno,
Mesossulfuron, Beflubutami da, Pinoxadeno, Amidossulfuron,
Tifensulfuron Metila, Tribenuron, Flupirsulfuron,
Sulfossulfuron, Pirassulfotol, Piroxsulam, Flufenacet,
Tralcoxidim, Pi roxassulfona; Fungicidas de Cereais: Carbendazim,
Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil,
Fenpropimorf, Epoxiconazol, Cresoxim metilico , Quinoxifeno,
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Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Inseticidas____de____Cereais : Dimetoato, Lambda-cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Clorpirifos, Metamidofos, Oxidemeton metilico, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas de Milho: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetoclor, Dicamba, Clopiralida, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-
)Metolaclor, Mesotriona, Nicossulfuron, Primissulfuron,
Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona,
Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet,
Piroxassulfona ; Inseticidas de Milho: Carbofurano, Clorpirifos,
Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda -Cialotrina,
Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina, Tebupirimifos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarb, Espirodiclofeno, Espirotetramate; Fungicidas de Milho: Fenitropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazossulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazossulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofano, Flufenacet, Fentrazamida, Halossulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxissulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimissulfano; Inseticidas de Arroz:
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Diazinon, Fenitrotiona, Fenobucarb, Monocrotofos, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprida, Isoprocarb, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprida, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[ [ ( 6-Cloropiridin-3il)metil] (2,2-difluoretil) amino]furan-2(5H)-ona, Carbofurano, Benfuracarb; Fungicidas de Arroz: Tiofanato metilico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifopbutila, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac sódico, Trifloxissulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazuron; Inseticidas de Algodão: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofos, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de Emamectina, Imidacloprida, Indoxacarb, Lambda-Cialotrina, Espinosad, Tiodicarb, Gama-Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, BetaCiflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, gama Cialotrina, 4-[ [ (6-Cloropiridin-3il)metil] (2,2-difluoretil) amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamida, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endossulfano; Fungicidas de Algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas de Soja:
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Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron Etilico,
Cloransulam Metilico, Fenoxaprop, Fomesafeno, Fluazifop,
Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor,
Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas de Soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarb, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprol, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan2(5H)-ona, Espirotetramat, Espinodiclofeno, Triflumuron, Flonicamida, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas de Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas de Beterraba sacarina: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralida, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflussulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Inseticidas de Beterraba sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Deltametrina, βCiflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[ [ ( 6-Cloropiridin-3il)metil] (2,2-difluoretil) amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de Canola: Clopiralida, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato,
Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de Canola: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas de Canola: Organofosfatos de carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina,
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Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprida, Dinetofurano, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tauFluvaleriato, Etiprol, Espinosad, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[ [ (6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.
[0214] Em algumas modalidades, o herbicida é Atrazina, Bromacil, Diuron, Clorsulfuron, Metsulfuron, Tifensulfuron Metil, Tribenuron, Acetoclor, Dicamba, Isoxaflutole, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Piritiobaque-sódico, Flumioxazin, Clorimuron-Etil, Metribuzin, Quizalofop, S-metolaclor, Hexazinona ou combinações dao mesmos.
[0215] Em algumas modalidades, o inseticida é Esfenvalerato, Clorantraniliprol, Metomil, Indoxacarbe, Oxamil ou combinações dos mesmos.
Atividade pesticida e inseticida [0216] Praga inclui, mas sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes. Pragas de insetos incluem insetos selecionados dentre as ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Lsoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera e Coleoptera.
[0217] Aqueles versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos das modalidades exibem atividade contra pragas de insetos, que podem incluir pragas agronômicas, florestais, de estufas, viveiros, plantas ornamentais, alimentos e fibras, de
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166/191 saúde pública e animal, de estrutura doméstica e comercial, domésticas e de produtos armazenados de importância econômica.
[0218] Larvas da ordem Lepidoptera incluem, mas sem limitação, lagartas-militares, larvas cortadoras, lagartas falsa-medideiras e lagartas da maçã-do-algodoeiro na família Noctuidae Spodoptera frugíperda JE Smith (lagarta-militar do outono); S. exígua Hübner (lagarta-militar da beterraba); S. lítura Fabricius (lagarta cortadora do tabaco, lagarta-rosca de tabaco); Mamestra configurata Walker (lagarta-militar bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ípsílon Hufnagel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. subterrânea Fabricius (lagarta-rosca granulada); Alabama argíllacea Hübner (curuquerê-do-algodoeiro) ; Tríchoplusía ní Hübner (falsa-medideira da couve); Pseudoplusía íncludens Walker (falsa-medideira da soja); Antícarsía gemmatalís Hübner (lagarta-da-soja); Hypena scabra Fabricius (verme-de-trevo verde); Helíothís virescens Fabricius (lagarta da maçã); Pseudaletía unipuncta Haworth (lagarta-militar); Athetís míndara Barnes e Mcdunnough (lagarta-rosca de pele áspera); Euxoa messoria Harris (lagarta-rosca de lado escuro); Earias insulana Boisduval (lagarta capulho espinhosa); E. víttella Fabricius (lagarta capulho pontilhada); Helícoverpa armígera Hübner (lagarta capulho americana); H. zea Boddie (lagarta de espiga de milho ou lagarta de capulho de algodão); Melanchra pícta Harris (lagartas zebra); Egíra (Xylomyges) curíalís Grote (lagarta-rosca de citros); brocas, traça-dasparedes, larva das teias, lagartas cone e descarnadores da família Pyralídae Ostrínía nubílalís Hübner (broca de milho europeia); Amyeloís transítella Walker (lagarta de laranja
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167/191 naval); Anagasta kuehniella Zeller (Traça do trigo mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça-do-cacau); Chilo suppressalis Walker (broca de caule de arroz); C. partellus, (broca de sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (traça de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta de teia de raiz de milho); C. teterrellus Zincken (lagarta tecedeira de teia de gramineas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (traça tortricidea de arroz); Desmia funeralis Hübner (dobrador de folha de uva);
Diaphania hyalinata Linnaeus (lagarta de melão); D. nitidalis Stoll (lagarta de picles); Diatraea grandiosella Dyar (broca de milho do sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca de cana-deaçúcar) ; Eoreuma loftini Dyar (broca de arroz mexicano); Ephestia elutella Hübner (traça do tabaco (cacau); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (lagarta de teia de céspede); Homoeosoma electellum Hulst (traça de girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca-do-colo) ; Achroia grisella Fabricius (traça da cera); Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta de teia de beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (mariposa de teia da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca de feijão); Plodia interpunctella Hübner (Mariposa de refeição Indiana); Scirpophaga incertulas Walker (broca do tronco amarelo); Udea rubigalis Guenée (traça do aipo); e lagartas enroladeiras, lagartas de broto, lagartas de semente e lagartas de fruta na familia Tortricidae Aderis gloverana Walsingham (lagarta de broto de cabeça preta do oeste); A. variana Fernaid (lagarta de broto de cabeça preta do leste); Archips argyrospila Walker (lagarta enroladeira de árvore frutífera); A. rosana Linnaeus (lagarta enroladeira europeia); e outras espécies Archips,
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Adoxophyes orana Fischer von Rõsslerstamm (traça tortricidea dos frutos de verão) ; Cochylis hospes Walsingham (mariposa bandeada de girassol); Cydia latiferreana Walsingham (traça da avelaneira); C. pomonella Linnaeus (bichado das 5 pomoideas); Platynota flavedana Clemens (lagarta enroladeira de folha variegada); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira de folha de omnivoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (Eudémis); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (traça vermelha dos 10 gomos); Endopiza viteana Clemens (mariposa de bagas de uva); Eupoecilia ambiguella Hübner (cochilis); Bonagota salubricola Meyrick (lagarta enroladeira da maçã); Grapholita molesta Busck (traça oriental do pessegueiro); Suleima helianthana Riley (mariposa de broto de girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.
[0219] Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidoptera incluem, mas sem limitação, Alsophila pometaría Harris (locustas); Anarsia líneatella Zeller (broca do pêssego); Anisota senatoría J.E. Smith (lagarta de carvalho de listras laranjas); Antheraea pernyí Guérin-Méneville (Traça de Tussah de Carvalho Chinesa); Bombyx morí Linnaeus (Mariposa-de-seda); Bucculatrix thurberíella Busck (Lagarta mineradora das folhas); Colias eurytheme Boisduval (lagarta de alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta de nogueira); Dendrolimus síbírícus Tschetwerikov (Mariposa-de-seda siberiana), Ennomos subsígnaría Hübner (lagarta de olmo); Erannis tílíaría Harris (mede-palmo de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (mariposa de cauda marrom); Harrísína americana Guérin-Méneville (esqueletizador de folha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de faixa); Hyphantria cunea Drury (larva de teias de
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169/191 outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiúro de tomate); Lambdina fisceiiaria fisceiiaria Hulst (lagarta-enroladora de cicuta do leste); L. fisceiiaria lugubrosa Hulst (lagartaenroladora de cicuta do oeste); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa de cetim); Lymantria díspar Linnaeus (mariposacigana); Manduca quinquemacuiata Haworth (mariposa falcão de 5 manchas, mandarová de tomate) ; M. sexta Haworth (mandarová de tomate, mandarová de tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (traça de inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta de gangrena de primavera); Papilio cresphontes Cramer (calda engolidora gigante, cachorro laranja); Phryganidia californica Packard (lagarta de carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (minerador de folha de citros); Phyiionorycter biancardeiia Fabricius (minerador de folha manchado); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta grande branca); P. rapae Linnaeus (borboleta pequena branca); P. napi Linnaeus (borboleta branca com verde raiado); Platyptilia carduidactyla Riley (mariposa plumosa de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (mariposa de costas de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta coroaulho rosa); Pontia protodice Boisduval e Leconte (lagarta de repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta enroladora de omnivoros); Schizura concinna J.E. Smith (lagarta arqueada vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (mariposa Angoumois dos cereais); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (mariposa processionária do pinheiro); Tineola bisseliiella Hummel (traça doméstica de riscas); Tuta absoluta Meyrick (lagarta mineira do tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (mariposa arminho); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. e Orgyia spp.
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170/191 [0220] São de interesse as larvas e os adultos da ordem Coleoptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchídae e Curculionidae (incluindo, mas sem limitação: Anthonomus grandis Boheman (bicudo-do-algodeiro); Lissorhoptrus oryzophílus Kuschel (gorgulho da água do arroz); Sítophílus granaríus Linnaeus (gorgulho do celeiro); S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha de trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule de girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente de girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de girassol); Sphenophorus maidis Chittenden (gorgulho do milho); besouros-pulga, besouros do pepino, vermes da raiz, besouros da folha, besouros da batata e lagartas mineiras da família Chrysomelidae (incluindo, mas sem limitação: Leptinotarsa decemlineata Say (besouro do Colorado da batata); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (verme de raiz do milho ocidental); D. barber! Smith e Lawrence (verme de raiz do milho do norte); D. undecímpunctata howardí Barber (verme de raiz do milho do sul); Chaetocnema pulícaría Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta cruel ferae Goeze (besouro-pulga das crucíferas); Phyllotreta stríolata (besouro-pulga listrado); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis da uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro da folha de cereal); Zygogramma exclamatíonís Fabricius (besouro do girassol); besouros da família Coccinellidae (incluindo, mas sem limitação: Epilachna varívestís Mulsant (besouro do feijão mexicano)); escaravelhos e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, porém, sem limitação: Popíllía japoníca Newman (besouro japonês); Cyclocephala borealis Arrow (escaravelho mascarado do norte,
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171/191 escaravelho branco); C. immaculata Olivier (escaravelho mascarado do sul, escaravelho branco); Rhízotrogus majalís Razoumowsky (escaravelho europeu); Phyllophaga críníta Burmeister (escaravelho branco); Lígyrus gíbbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; larvas-arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp. ; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros da casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.
[0221] Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, incluindo lagartas mineiras Agromyza parvicornis Loew (lagarta mineira da folha do milho); moscas (incluindo, mas sem limitação: Contarínía sorghícola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol)); moscas dos frutos (Tephrítídae), Oscinella frit Linnaeus (moscas dos frutos); vermes (incluindo, mas sem limitação: Delia platura Meigen (verme da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outras Delia spp., Meromyza americana Fitch (verme do caule do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas menores domésticas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas da face, moscas de corno, moscas de sopro, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas de moscas, moscas dos cavalos Tabanus spp.; moscas-varejeiras Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; besouros do gado Hypoderma spp.; moscas dos veados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outras Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium
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172/191 spp.; Simulium spp.; moscas mordedoras, moscas da areia, esciarideos e outras Nematocera.
[0222] Incluídos como insetos de interesse estão adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homoptera, tais como, mas sem limitação, adelgídeos da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da Cicadellidae, cigarrinhas de plantas das famílias Cixiidae , Flatidae, Fulgoroídear Issidae e Delphacidae, cigarrinhas de árvore da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas-brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, filoxera da família Phylloxera dae, cochonilhas-farinhentas da família Pseudococcidae, escalas das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae , Eríococcídae Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejo-de-renda da família Tíngídae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos-de-cincha, Blissus spp.; e outros percevejos de semente da família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae, percevejos de polpa da família Coreidae e percevejos vermelhos e percevejos manchados de algodão da família Pyrrhocoridae.
[0223] Os membros agronomicamente importantes da ordem Homoptera incluem adicionalmente, mas sem limitação: Acyrthisiphon písum Harris (afídeo de ervilha); Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão-frade); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão preto); A. gossypíí Glover (afídeo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz de milho) ; A. pomi De Geer (afídeo da maçã); A. spiraecola Patch (afídeo de Spiraea); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de Dedalis); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afídeo do morango); Diuraphis noxia
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Kurdjumov/Mordvilko (afideo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afideo cinzento da macieira); Eriosoma lanigerum Hausmann (afideo lanigero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afideo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afideo farinhento da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afideo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afideo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afideo da batata); Myzus persicae Sulzer (afideo do pessegueiro, afideo verde do pessegueiro) ; Nasonovia ribisnigri Mosley (afideo da alface); Pemphigus spp. (afideos da raiz e afideos de galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afideo da folha do milho); R. padi Linnaeus (afideo-da-cerejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão dos cereais); Sipha flava Forbes (afideo amarelo da cana-de-açúcar); Sitobion avenae Fabricius (afideo inglês dos grãos); Therioaphis maculata Buckton (afideo manchado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afideo preto dos citrinos) e T. citricida Kirkaldy (afideo marrom dos citrinos); Adelges spp. (adelgideos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de nogueira-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata doce); B. argent!folii Bellows & Perring (mosca-branca da folha de prata); Dialeurodes citri Ashmead (mosca-branca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asa listrada) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha menor marrom); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N. nigropictus Stãl (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stãl (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead
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174/191 (cigarrinha do milho); Sogatella furci fera Horvath (cigarrinha de costas brancas); Sogatodes orizicola Muir (delfacideo do arroz); Typhiocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da macieira); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchase Maskell (pulgão branco); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (pulgão de São José); Pianococcus citri Risso (cochonilha dos citrinos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha); Cacopsylla pyricola Foerster (psilideo da pera); Trioza diospyri Ashmead (psilideo do caqui).
[0224] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Hemiptera incluem, mas sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (escaravelho da abóbora); Blissus leucopterus leucopterus Say (escaravelho das gramineas); Corythuca gossypii Fabricius (escaravelho da renda de algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (escaravelho do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schãffer (percevejo manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo manchado); Graptostethus spp. (complexo de escaravelhos de semente); Leptoglossus corculus Say (escaravelho de semente de pinheiro de pé em folha); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (escaravelho manchado da planta); L. Hesperus Knight (escaravelho ocidental manchado da planta); L. pratensis Linnaeus (escaravelho comum de prado); L. rugulipennis Poppius (escaravelho europeu manchado da planta); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsideo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus
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Dallas (escaravelho grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).
[0225] Adicionalmente, modalidades podem ser eficazes contra Hemiptera como Calocoris norvegicus Gmelin (escaravelho do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugícollís Fallen (capsideo da maçã); Cyrtopeltís modestus Distant (escaravelho do tomate); Cyrtopeltís notatus Distant (mosca); Spanagonícus albofascíatus Reuter (pulga de marca branca); Diaphnocoris chloríonís Say (escaravelho de espinheiro-daVirgínia); Labopidicola allii Knight (escaravelho da planta de cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (escaravelho rápido da planta); Poecilocapsus lineatus Fabricius (escaravelho da planta de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (escaravelho falso das gramineas); Nysius raphanus Howard (escaravelho falso das gramineas); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.
[0226] Também estão incluídos adultos e larvas da ordem Acari (ácaros), como Aceria tosichella Keifer (ácaro do enrolamento do trigo); Petrobia latens Müller (ácaro marrom do trigo); ácarosaranha e ácaros vermelhos da família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro-aranha de duas manchas); (T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro-aranha do morango); ácaros planos da família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano dos citrinos); ácaros da ferrugem e do broto da família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e
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176/191 ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, os ácaros de poeira da família Epidermoptidae, ácaros do folículo da família Demodicidae, ácaros dos grãos da família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularís Say (carrapato de veado); I. holocyclus Neumann (carrapato da paralisia australiana); Dermacentor variabilis Say (carrapato do cão americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato lone star) e ácaros de sarna e coceira das famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptídae.
[0227] As pragas de insetos da ordem Thysanura são de interesse, como Lepisma saccharins Linnaeus (peixinho-de-prata);
Thermobia domestica Packard (inseto de fogo).
[0228] Pragas de artrópodes adicionais abrangidas incluem: aranhas da ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha reclusa marrom) e a Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra) e centopeias da ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica).
[0229] Pragas de insetos de interesse incluem a superfamília de percevejos e outros insetos relacionados incluindo, mas não se limitando a espécies pertencentes à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus , Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, e Bagrada hilaris /Pulgão Bagrada)), à família Plataspidae (Megacopta cribraria - Plataspídeo do feijão) e à família Cydnidae (Scaptocoris castanea - Percevejo das raízes) e espécies lepidópteras incluindo mas não se limitando a: traça-das-crucíferas, por exemplo, Helicoverpa zea
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Boddie; lagarta falsa medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja, por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner.
[0230] Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480 a 2485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199 a 206; Marrone, et al. , (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e Patente n° U.S. 5,743,477, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência na sua totalidade. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Consultar, por exemplo Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293. Tais ensaios podem incluir colocar plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a capacidade da planta para sobreviver e/ou causar o extermínio das pragas.
[0231] Nematódeos incluem nematódeos parasitários tais como nematódeos das galhas radiculares, formadores de cistos, e formadores de lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos formadores de cistos, incluindo, mas não se limitando a, Heterodera glycines (nematódeo formador de cistos da soja); Heterodera schachtii (nematódeo formador de cistos da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo formador de cistos de cereais); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeos formadores de cistos da batata). Os nematódeos formadores de lesões incluem Pratylenchus spp.
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Tratamento de Sementes [0232] Para proteger e aprimorar as tecnologias de produção de rendimento e traço, as opções de tratamento de semente podem fornecer flexibilidade de plano de cultura adicional e controle rentável contra insetos, ervas daninhas e doenças. Material de semente pode ser tratado, tipicamente tratado na superfície, com uma composição que compreende combinações de herbicidas químicos ou biológicos, fitoprotetores herbicidas, inseticidas, fungicidas, inibidores e aprimoradores de germinação, nutrientes, reguladores e ativadores de crescimento de planta, bactericidas, nematocidas, avicidas e/ou moluscicidas. Estes compostos são tipicamente formulados juntos com transportadores, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação adicionais empregues de modo costumeiro na técnica da formulação. Os revestimentos podem ser aplicados impregnando o material de propagação com uma formulação líquida ou por revestimento com uma formulação úmida ou seca combinada. Os exemplos dos vários tipos de compostos que podem ser usados como tratamentos de semente são fornecidos em The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., publicado por British Crop Production Council, que é incorporado no presente documento a título de referência.
[0233] Alguns tratamentos de semente que podem ser usados em semente de cultivo incluem, mas sem limitação, um ou mais dentre ácido abscísico, acibenzolar-S-metila, avermectina, amitrol, azaconazol, Azospirillum, azadiractina, azoxistrobina, Bacillus spp. (o que inclui uma ou mais espécies de cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis e/ou thuringiensis) , Bradyrhizobium spp. (o que inclui um ou mais de betae,
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179/191 canariense, eikanii, iriomotense, japonicum, iiaonigense, pachyrhizi e/ou yuanmingense) , captana, carboxina, quitosana, clotianidina, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazol, fipronil, fludioxonil, fluoxastrobina, fluquinconazol, flurazol, fluxofenim, proteina harpina, imazalil, imidacloprida, ipconazol, isoflavonoides, lipo-quito-oligossacarideo, mancozeb, manganês, maneb, mefenoxam, metalaxil, metconazol, miclobutanil, PCNB, penflufeno, Peniciiiium, pentiopirad, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rinaxipir, S-metolaclor, saponina, sedaxano, TCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tiocarb, tiram, tolclofos-metila, triadimenol, Trichoderma, trifloxistrobina, triticonazol e/ou zinco. Revestimento de semente PCNB se refere ao Número de Registro EPA 00293500419, que contém quintozeno e terrazol. TCMTB se refere a 2-(tiocianometiltio)benzotiazol.
[0234] As variedades de semente e sementes com traços transgênicos específicos podem ser testadas para determinar quais opções de tratamento de semente e taxas de aplicação podem complementar tais variedades e traços transgênicos a fim de aprimorar o rendimento. Por exemplo, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório, mas com suscetibilidade à ferrugem do milho pode beneficiar do uso de um tratamento de sementes que forneça proteção contra a ferrugem do milho, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório mas suscetibilidade a nematódeos formadores de cistos pode beneficiar do uso de um tratamento de sementes que forneça proteção contra nematódeos formadores de cistos, e assim por diante. De modo semelhante, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a insetos pode beneficiar do segundo modo de ação
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180/191 conferido pelo tratamento de sementes, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a um herbicida pode beneficiar de um tratamento de sementes com um fitoprotetor que aprimora a resistência de plantas àquele herbicida, etc. Adicionalmente, o estabelecimento de raízes satisfatórias e a emergência inicial resultantes do uso apropriado de um tratamento de sementes podem resultar em um uso de nitrogênio mais eficiente, uma capacidade melhor para resistir à seca e um aumento geral do potencial de rendimento de uma variedade ou variedades que contêm um certo traço quando combinadas com um tratamento de sementes.
Métodos para exterminar uma praga de insetos e controlar uma população de insetos [0235] Em algumas modalidades, são proporcionados métodos para exterminar uma praga de insetos, compreendendo contato da praga de insetos com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um elemento de silenciamento e pelo menos uma perforina recombinante derivada de planta incluindo mas não se limitando a um polipeptídeo IPD079 e um elemento de silenciamento revelado no presente documento. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para exterminar uma praga de insetos, compreendendo colocar a praga de insetos em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de uma proteína pesticida recombinante de
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, . SEQ ID NO : θ, SEQ ID
NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:
18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID : NO: 24, SEQ ID NO: 26,
SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ
ID : NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID
NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO : 4 8, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:
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52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76,
SEQ ID : NO: 78, SEQ ID ] NO: 80, SEQ ID ] NO: 82, SEQ ID ] NO: 84, SEQ
ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID
NO: 94, SEC ) ID NO: 56, SEQ ) ID NO: 58, SEQ ) ID NO: 60, SEQ ) ID NO:
62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70,
SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102,
SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO : 108, SEQ ID NO: 110,
SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO: 118,
SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO: 126,
SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO : 132, SEQ ID NO: 134,
SEQ ID NO: 136, SEQ II 3 NO : 138 >, ou SEQ : ID NO: 140 ou uma sua
variante e um elemento de silenciamento revelado no presente documento.
[0236] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de praga de inseto que compreendem colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um ou mais polipeptídeos IPD079 recombinantes e um ou mais polinucleotídeos que codificam um elemento (ou elementos) de silenciamento. Conforme usado no presente documento, controlar uma população de pragas ou controla uma praga se refere a qualquer efeito em uma praga que resulta na limitação do dano que a praga causa. Controlar uma praga inclui, mas sem limitação, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou crescimento da praga de tal maneira que a praga faça menos danos à planta, diminuir o número de descendentes produzidos, produzir pragas menos adaptadas, produzir pragas mais suscetíveis a ataque de predadores ou impedir as pragas de se alimentarem da planta.
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182/191 [0237] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de inseto resistentes a uma proteína pesticida que compreendem colocar a população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um ou mais polipeptídeos IPD079 recombinantes e um ou mais elementos de silenciamento revelados no presente documento.
[0238] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para proteger uma planta de uma praga de inseto que compreendem expressar na planta ou célula da mesma um polinucleotídeo recombinante que codifica um ou mais polipeptídeo(s) IPD079 e um ou mais elemento(s) de silenciamento revelados no presente documento.
Estratégias de Gerenciamento de Resistência a Insetos (IRM) [0239] A expressão de δ-endotoxinas de B. thuríngíensís em plantas de milho transgênicas demonstrou ser um meio eficaz para controlar pragas de insetos importantes para a agricultura (Perlak, et al., 1990; 1993). No entanto, os insetos evoluíram, de modo que se tornaram resistentes a δ-endotoxinas de B. thuringiensis expressas em plantas transgênicas. Tal resistência, se disseminada, limitará claramente o valor comercial de germoplasma que contém genes codificadores de tais δ-endotoxinas de B. thuringiensis.
[0240] Uma maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas é fornecer refúgios (uma seção de culturas/milho não inseticidas) não transgênicos (isto é, proteínas não inseticidas) para uso com culturas transgênicas que produzem uma proteína inseticida única
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183/191 ativa contra pragas-alvo. A United States Environmental Protection Agency (epa. gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2 00 6.htm, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) publica as exigências para o uso com culturas transgênicas que produzem uma única proteína Bt ativa contra pragas-alvo. Além disso, a National Corn Growers Association, em seu sítio da web: (ncga. com/inseto-resistência-management-fact-sheet-bt-corn, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) também fornece orientação similar em relação a exigências de refúgio. Devido a perdas para insetos dentro da área de refúgio, os refúgios maiores podem reduzir o rendimento geral.
[0241] Outra maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas consiste em ter um depósito de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pragas de insetos e que manifestam seus efeitos através de modos de ação diferentes.
[0242] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de inseto, em que cada inseticida é expresso em níveis eficazes, será outra maneira para alcançar o controle do desenvolvimento de resistência. Isso tem base no princípio de que a evolução de resistência contra dois modos separados de ação é muito mais improvável do que contra apenas um. Roush, por exemplo, destaca estratégias com duas toxinas, também chamadas de formação de pirâmide ou empilhamento para o gerenciamento de culturas transgênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B.
(1998) 353:1777 a 1786). 0 empilhamento ou formação de pirâmide
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184/191 de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pragasalvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir uso de um refúgio menor. A US Environmental Protection Agency exige significativamente menos refúgio estruturado (geralmente 5%) de milho não Bt a ser plantado em relação aos produtos de traço único (geralmente 20%). Há várias maneiras para fornecer os efeitos de IRM de um refúgio, incluindo vários padrões de plantio geométricos nos campos e misturas de sementes em bolsas, conforme discutido adicionalmente por Roush.
[0243] Em algumas modalidades, um elemento de silenciamento revelado no presente documento e uma perforina derivada de planta da revelação incluindo, mas não se limitando a um polipeptídeo IPD079, são úteis como uma estratégia de gerenciamento de resistência a inseto em conjunto ou em combinação (isto é, em pirâmide) com outras proteínas pesticidas incluem, mas sem limitação, toxinas Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp., e semelhantes.
[0244] São fornecidos os métodos para controlar infestação (ou infestações) de insetos Lepídoptera e/ou Coleoptera em uma planta transgênica que promovem gerenciamento de resistência a insetos, que compreendem expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas diferentes que têm modos diferentes de ação.
[0245] Em algumas modalidades, nos métodos de controle de infestação de inseto Lepídoptera e/ou Coleoptera em uma planta transgênica e promoção de gerenciamento de resistência a insetos, a pelo menos um dentre as proteínas inseticidas compreende um elemento de silenciamento e um polipeptídeo de
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IPD079 inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera.
[0246] Em algumas modalidades, os métodos para controlar a infestação de insetos Lepidóptera e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e promover o gerenciamento de resistência a insetos compreendem expressão na planta transgênica de pelo menos uma das proteínas inseticidas compreende um polipeptídeo IPD079 de
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, , SEQ ID NO : θ, SEQ ID
NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:
18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,
SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID I JO: 32, SEQ ID : NO: 34, SEQ
ID : NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID
NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:
52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76,
SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID I JO: 82, SEQ ID : NO: 84, SEQ
ID : NO: 86, SEQ ID NO : 8 8, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID
NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO:
62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70,
SEQ ID NO: 96, SEC ) ID NO: : 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ; [D NO: 1 02,
SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO:110,
SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO:118,
SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO:126,
SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO:134,
SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, ou SEQ ID NO: 140 ou variantes do mesmo, inseticidas para insetos na ordem Lepidóptera e/ou
Coleóptera.
[0247]
Também são fornecidos os métodos para reduzir a probabilidade de emergência de resistência a inseto Lepidóptero e/ou Coleóptero para plantas transgênicas que expressam nas
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186/191 plantas as proteínas inseticidas para controlar as espécies de inseto que compreendem a expressão de um polipeptídeo IPD079 e um ou mais elementos de silenciamento inseticidas para as espécies de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida para as espécies de inseto que têm modos diferentes de ação.
[0248] Também são fornecidos meios para o gerenciamento de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros eficaz de plantas transgênicas compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros, mas cada uma exibe um modo diferente de efetuar sua atividade de extermínio, em gue as duas ou mais proteínas inseticidas compreendem um polipeptídeo IPD079 revelado no presente documento e uma proteína Cry.
[0249] Em algumas modalidades, uma pilha de um ou mais polipeptideos IPD079 revelados no presente documento e um ou mais elementos de silenciamento revelados no presente documento aumenta a durabilidade da eficácia inseticida em uma planta de qualquer perforina de planta, qualquer polipeptídeo IPD079, ou o polipeptídeo IPD079 revelado no presente documento em comparação com uma planta sem o elemento de silenciamento revelado no presente documento.
[0250] A descrição de várias modalidades ilustradas da revelação não pretende ser exaustiva ou limitar o escopo à forma precisa revelada. Embora modalidades específicas e exemplos sejam descritos no presente documento com propósitos de ilustração, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da divulgação, como aqueles indivíduos versados
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187/191 na técnica relevante reconhecerão. Os ensinamentos fornecidos no presente documento podem ser aplicados a outros propósitos, diferentes dos exemplos descritos acima. Numerosas modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações anexas.
[0251] Essas e outras mudanças podem ser feitas à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados como limitantes do escopo às modalidades específicas reveladas no relatório descritivo e nas reivindicações.
[0252] Toda a divulgação de cada documento citado (o que inclui patentes, pedidos de patente, artigos de periódico, resumos, manuais, livros ou outras revelações) em Antecedentes, Descrição Detalhada e Exemplos é incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade.
[0253] Esforços foram feitos para garantir precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser permitidos. A não ser que indicado de outro modo, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio; a temperatura está em graus centígrados; e a pressão é igual ou próxima da atmosférica.
EXPERIMENTOS
Exemplo 1 - Atividade inseticida de plantas transgênicas que expressam IPD079 e elemento de silenciamento de COATG de dsRNA [0254] Os ensaios de vermes da raiz foram realizados infestando-se plantas que foram recentemente transplantadas de planos em recipientes com um volume de aproximadamente 3 litros.
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Dois dias após o transplante, as plantas foram infestadas com 200 ovos de verme da raiz do milho do oeste suspensos em água. Os ovos foram cronometrados para que a eclosão pudesse ocorrer dentro de alguns dias de infestação. As plantas foram mantidas com práticas de estufa padrão de rega e aplicações de fertilizante. 19 dias após, as plantas foram removidas dos recipientes, e o solo lavado das raízes para expor os danos por alimentação. As classificações foram realizadas com o uso da Escala de Lesão de Nódulo desenvolvida por Nowatzki et al (2005) J. of Economic Entomology, 98, 1 a 8. A Pontuação de Lesão Nodal é baseada no número de nódulos de raiz de dano com 0 indicando nenhum dano e 3 indicando que 3 nódulos de raízes são alimentados a um comprimento menor que 2 centímetros. Os construtos empilhados mostram dano por alimentação significativamente reduzido em comparação com os controles negativos (Figura 1).
Exemplo 2 - Expressão de elemento de silenciamento de COATG de dsRNA em IPD079 e elemento de silenciamento de COATG de dsRNA Empilhado em Milho Transgênico [0255] O ensaio de RNA QuantiGene® Plex 2.0 (Affymetrix®) foi usado para detectar um dsRNA direcionando um fragmento de coatômero de Diabrotica virgifera virgifera, subunidade gama (COATG; SEQ ID NO: 1322) de transcrito em plantas transgênicas. RNA de fita dupla direcionando COATG foi preparado por transcrição In vitro. O dsRNA purificado foi quantificado por OD260 e usado como padrão para detecção quantitativa. Raízes transgênicas (cerca de 45 mg) foram coletadas de cada planta T0 individual e processadas para detecção QuantiGene® de acordo com o Manual do Usuário QuantiGene® 2.0. Os dados de expressão de RNA foram calculados como picograma por mg de raiz fresca (ou
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189/191 pg/mg). Os construtos empilhados mostraram expressão significativa de dsRNA que direciona COATG, sem nenhuma detecção em um controle negativo.
Exemplo 3 - Expressão de polipeptídeo IPD079 em IPD079 e elemento de silenciamento de COATG de dsRNA Empilhado em Milho Transgênico [0256] A concentração da expressão absoluta da proteína IPD079 (SEQ ID NO: 56) foi determinada com o uso de LC-MS/MS (cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem) de acordo com J Agríc Food Chem. 27 de abril de 2011; 59(8) :3.551 a 3.558) . Após serem liofilizados e triturados, 10 mg de amostras de folha foram extraídos com 600 μΐ de tampão PBST (solução salina tamponada com fosfato e 0,05% de Tween 20). Aproximadamente, 500 mg de amostras de raiz congeladas frescas foram extraídos com 1.000 μΐ de tampão PBST. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado e as proteínas extraídas totais (TEPs) foram medidas com um ensaio de Bradford. As amostras foram normalizadas por TEP. Um total de 50 μΐ do extrato normalizado foi adicionado a 100 μΐ de tampão de digestão ABCT (100 mM de bicarbonate de amônio e 0,05% de Tween 20). Uma curva padrão foi preparada adicionando-se quantidades diferentes da proteína recombinante padrão em alíquotas de 50 μΐ de extrato de amostra negativa. Uma quantidade adequada do tampão de digestão ABCT foi adicionada a cada ponto da curva padrão para manter os volumes totais consistentes entre as amostras e padrões. As amostras e padrões foram reduzidos com 6 μΐ de ditiotreitol a 0,25 M a 50 °C por 30 min e, então, alquilados com 6 μΐ de iodoacetamida a 0,3 M à temperatura ambiente no escuro por 30 min. Um pg de tripsina (10 μΐ) foi adicionado a cada amostra, e a digestão foi
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190/191 deixada prosseguir a 37 °C de um dia para o outro (~18 horas) antes de 10 μΐ de ácido fórmico a 10% (v/v) terem sido adicionados. A proteína IPD079 foi quantificada monitorando-se seu peptídeo tríptico de assinatura QETWDR com transição de MRM (monitoramento de múltiplas reações) de 417.7/577.3, com o uso de UPLC (cromatografia líquida de ultra desempenho) Waters acoplada com AB SCIEX Q-TRAP 5500. A temperatura do autoamostrador foi mantida a 8 °C durante a análise. Volumes de 10 μΐ foram injetados em uma coluna BEH 50 x 2,1 mm 1,7μ C18 (Waters) mantidos a 60 °C. As fases móveis consistiram em 0,1% de ácido fórmico (MPA) e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (MPB), e LC foi realizada a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min com gradiente linear de 2 a 10% de MPB em 1,5 min. As concentrações de proteína nas amostras desconhecidas foram calculadas por interpelação na curva padrão com o uso do software Analyst versão 1.6.2 (AB Sciex). Os construtos empilhados mostraram expressão significativa de IPD079, sem nenhuma detecção em um controle negativo.
Exemplo 4 - Transformação Estável de Milho Mediada por
Agrobacterium [0257] Para transformação de milho mediada por Agrobacteríum de IPD079 e elemento de silenciamento de COATG de dsRNA empilhado em milho transgênico, o método de Zhao foi empregue (Patente US Número 5,981,840 e Publicação de Patente Internacional Número WO 1998/32326, cujos conteúdos são incorporados ao presente documento a título de referência). Em resumo, embriões imaturos foram isolados de milho e os embriões colocados em contato com uma Suspensão de Agrobacteríum, em que as bactérias tiveram capacidade de transferir um polinucleotídeo que codifica um
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191/191 polipeptídeo IPD079 e um polinucleotídeo que codifica um elemento de silenciamento que direciona COATG a pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nessa etapa os embriões imaturos foram imersos em uma suspensão de Agrobacteríum para a iniciação de inoculação. Os embriões foram cocultivados por um tempo com o Agrobacteríum (etapa 2: a etapa de cocultivar). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para a eliminação de Agrobacteríum e para uma fase de repouso para as células infectadas. Em seguida, embriões inoculados foram cultivados em meio que contém um agente seletivo e o cultivo de calo transformado é recuperado (etapa 4: etapa de selecionar). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo de células transformadas. 0 calo foi então regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regenerar), e os calos cultivados em meio seletivo foram cultivados em meio sólido para regenerar as plantas.
[0258] As plantas de milho transgênicas positivas para expressão das proteínas inseticidas são testadas pela atividade pesticida com o uso de bioensaios padrão conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, bioensaios de remoção de raiz e bioensaios de planta total. Consultar, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n° U.S. 2003/0120054 e a Publicação Internacional n° WO 2003/018810.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Construto de DNA caracterizado por compreender 1) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 com atividade inseticida e ii) um elemento de silenciamento que direciona um polinucleotídeo tendo 95% de identidade com qualquer um apresentado nas SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338 ou 1341 tendo atividade inseticida.
  2. 2. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo IPD079 e o elemento de silenciamento estarem ligados de modo operacional a um elemento regulatório heterólogo.
  3. 3. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o elemento de silenciamento ser um elemento de supressão senso, um elemento de supressão antissenso, um RNA de fita dupla, um siRNA, um amiRNA, um miRNA ou um elemento de supressão em forma de grampo.
  4. 4. Pilha molecular caracterizada por compreender i) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 com atividade inseticida e ii) um elemento de silenciamento que direciona um polinucleotídeo tendo 95% de identidade com qualquer uma das sequências de polinucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338 ou 1341 tendo atividade inseticida.
  5. 5. Pilha molecular, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo IPD079 e o elemento de silenciamento estarem
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    2/3 ligados de modo operacional a um elemento regulatório heterólogo.
  6. 6. Pilha molecular, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada por o elemento de silenciamento ser um elemento de supressão senso, um elemento de supressão antissenso, um RNA de fita dupla, um siRNA, um amiRNA, um miRNA ou um elemento de supressão em forma de grampo.
  7. 7. Pilha de melhoramento caracterizada por compreender i) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 com atividade inseticida e ii) um elemento de silenciamento que direciona um polinucleotídeo tendo 95% de identidade com qualquer um apresentado nas SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338 ou 1341 tendo atividade inseticida.
  8. 8. Pilha de melhoramento, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo IPD079 e o elemento de silenciamento estarem, cada um, ligados de modo operacional a um elemento regulatório heterólogo.
  9. 9. Pilha de melhoramento, de acordo com a reivindicação 7 ou
    8, caracterizada por o elemento de silenciamento ser um elemento de supressão senso, um elemento de supressão antissenso, um RNA de fita dupla, um siRNA, um amiRNA, um miRNA ou um elemento de supressão em forma de grampo.
  10. 10. Planta transgênica ou progênie da mesma caracterizada por compreender o construto de DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3.
    Petição 870190076275, de 07/08/2019, pág. 234/241
    3/3
  11. 11. Planta transgênica ou progênie da mesma caracterizada por compreender a pilha molecular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 ou 6.
  12. 12. Planta transgênica ou progênie da mesma caracterizada por compreender a pilha de melhoramento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 8 ou 9.
  13. 13. Composição caracterizada por compreender i) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD079 com atividade inseticida e ii) um elemento de silenciamento que direcionando um polinucleotídeo tendo 95% de identidade com qualquer um apresentado nas SEQ ID NOs: 1279, 1280, 1337, 1338, ou 1341 tendo atividade inseticida.
  14. 14. Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por o elemento de silenciamento ser um elemento de supressão senso, um elemento de supressão antissenso, um RNA de fita dupla, um siRNA, um amiRNA, um miRNA ou um elemento de supressão em forma de grampo.
  15. 15. Método para controlar uma população de praga de inseto caracterizado por compreender colocar a população de praga de inseto em contato com a planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11 ou 12.
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