NO874673L - Genetisk manipulerte planteceller og planter som utviser resistens overfor glutaminsyntetase-inhibitorer, dna-fragmenter og rekombinanter for bruk ved fremstilling av nevnte celler og planter. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for beskyttelse av planteceller og planter mot innvirkning av glutamin-syntetase-inhibitorer.

Den angår også anvendelser av en slik fremgangsmåte, spesielt for utvikling av herbicid resistens i bestemte planter.

Videre angår oppfinnelsen ikke-biologisk transformerte planteceller og planter som viser resistens overfor glutamin-syntetase-inhibitorer samt overfor egnede DNA-fragmenter og rekombinanter inneholdende nukleotidsekvenser som koder resistens overfor glutaminsyntetase-inhibitorer.

Glutaminsyntetase (i det følgende betegnet GS) utgjør i de fleste planter et av de essensielle enzymene for utvikling av liv i planteceller. Det er kjent at GS omdanner glutamat til glutamin. GS er involvert i en effektiv bane (den eneste som idag er kjent) i de fleste planter for detoksifikering av ammoniakk frigjort ved nitratreduksjon, aminosyrenedbrytning eller fotorespirasjon. Virkningsfulle inhibitorer for GS er derfor meget toksiske overfor planteceller. En spesiell klasse av herbicider har blitt utviklet, basert på den toksiske effekten som skal inhiberere inhiberingen av GS i planter.

Disse herbicidene omfatter som aktiv bestanddel en GS-inhibitor.

Det er minst to mulige veier som kan lede til planter som er resistente overfor inhibitorene av virkningen til glutamin-syntetase; (1) ved endring av målet. Det kan forutsees at mutasjoner i GS-enzymet kan lede til insensitivitet overfor herbicidet; (2) ved inaktivering av herbicidet. Nedbrytning eller modifikasjon av herbicidet inne i planten kan lede til resistens.

Bialafos og fosfinotricin (i det følgende for enkelhets skyld betegnet PPT) er to slike inhibitorer av virkningen til GS, (ref. 16, 17) og har blitt vist å være i besittelse av utmerkede herbicide egenskaper (se mer spesielt ref. 2 som angår bialafos).

Bialafos har følgende formel (I):

PPT har følgende formel (II):

Den strukturelle forskjellen mellom PPT og bialafos ligger således i fraværet av to alaninaminosyrer i tilfellet for

PPT.

Disse to herbicidene er ikke-selektive. De inhiberer vekst av alle forskjellige arter av planter som finnes på marken, og forårsaker følgelig deres totale tilintetgjørelse.

Bialafos ble først angitt å ha antibiotiske egenskaper hvilket gjorde det mulig å benytte det som et pesticid eller fungicid. Bialafos kan fremstilles ifølge fremgangsmåten beskrevet i US patent 3.832.394. Det omfatter dyrking av Streptomyces hygroscopicus, slik som stammen som er tilgjengelig ved American Type Culture Collection med ATCC nr. 21.705, og utvinning av bialafos for dets kulturmedium. Andre stammer slik som Streptomyces viridochromogenes produserer imidlertid også denne forbindelsen (ref. 1).

Andre tripeptid-antibiotika som inneholder en PPT-del er eller kan også bli oppdaget i naturen, f.eks. fosalacin (ref. 15 ).

PPT oppnås også ved kjemisk syntese og distribueres kommersielt av firmaet Hoechst.

Det har blitt beskrevet en rekke Streptomyces-arter som produserer høyaktive antibiotika som er kjent for å sette prokaryote cellefunksjoner eller enzymer ut av virkning. Streptomyces-artene som produserer disse antibiotika ville selv bli ødelagt dersom de ikke hadde en selvforsvars-mekanisme mot disse antibiotika. Denne selvforsvarsmekanismen har blitt funnet i flere tilfeller å omfatte et enzym som er i stand til å inhibere den antibiotiske effekten, og således unngå autotoksisitet for den aktuelle Streptomyces-arten. Denne modifikasjonen reverseres generelt når molekylet eksporteres fra cellen.

Eksistensen av et gen som koder et enzym som kan modifisere antibiotikumet for derved å inhibere den antibiotiske effekten mot verten har blitt demonstrert i flere Streptomyces-produserende antibiotika, f.eks. i S. fradiae-, S. azureus-, S. vinaceus-, S. erythreus-produserende neo-mycin-, tiostrepton-, viomycin-, og MLS (Macrolide Lincos-amide Streptogramin)-antibiotika respektivt (ref. 4), (ref. 5), (ref. 6), (ref. 14 av Chater et al., 1982 beskriver standardteknikker som . kan anvendes for å bringe disse effektene opp i lyset).

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det funnet at Streptomyces hygroscopicus ATCC 21.705 også er i besittelse av et gen som koder et enzym som er ansvarlig for Inaktiveringen av de antibiotiske egenskapene til bialafos. Forsøk utført i sammenheng med foreliggende oppfinnelse har ledet til isolering av et slikt gen og dets anvendelse i en prosess for regulering av virkningen av GS-inhlbitorer, basert på PPT eller avledede produkter.

Et formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny fremgangsmåte for regulering av virkningen i planteceller og planter av GS-inhibitorer.

Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe DNA-fragmenter og DNA-rekombinanter, spesielt modifiserte vektorer inneholdende nevnte DNA-f ragmenter, hvilke DNA-fragmenter inneholder nukleotidsekvenser som, når de er inkorporert i planteceller og planter, er i stand til å beskytte dem mot virkningen av GS-inhibitorer.

Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe ikke-biologisk transformerte planteceller og planter som kan nøytralisere eller inaktivere GS-inhibitorer.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for selektiv beskyttelse av plantearter med herbicider av en GS-inhibitortype.

Mer spesielt er et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe et DNA-fragment som kan overføres til planteceller og hele planter, hvilket fragment kan beskytte dem mot de herbicide effektene til bialafos og til strukturelt analoge herbicider.

Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe planteceller som er resistente overfor produktene i klassen eksemplifisert ved bialafos, hvilke produkter har PPT-enheten i deres struktur.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for regulering av virkningen i planteceller og planter av en GS-inhibitor ved kontakt dermed, innbefatter at man forsyner nevnte planter med et heterologt DNA-fragment inkludert en fremmed nukleotidsekvens som er i stand til å bli uttrykt i form av et protein i nevnte planteceller og planter, under slike betingelser at nevnte heterologe DNA-fragment bevirkes til å bli integrert stabilt gjennom generasjoner i plantenes celler, og hvorved nevnte protein har en enzymatisk aktivitet som kan inaktivere eller nøytralisere nevnte glutamin-syntetase-inhibitor.

Et foretrukket- DNA-fragment er et som er avledet fra en antibiotikum-produserende Streptomyces-stamme (eller en sekvens omfattende en nukleotidsekvens som koder den samme aktiviteten) og som koder resistens til nevnte GS-inhibitorer. Foretrukne nukleotidsekvenser for bruk i foreliggende oppfinnelse koder et protein som har acetyl-transferase-aktivitet med hensyn til nevnte GS-inhibitorer.

Et spesielt foretrukket DNA-fragment ifølge oppfinnelsen omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har en PPT-acetyl-transferaseaktivitet.

Et spesielt DNA-fragment Ifølge oppfinnelsen for etter-følgende transformasjon av planteceller, består av en nukleotidsekvens som koder for minst en del av et polypeptid som har følgende sekvens:

hvor X representerer MET eller VAL, hvilken del av nevnte polypeptid har tilstrekkelig lengde til å gi beskyttelse mot bialafos til planteceller ved genetisk inkorporering og ekspresjon deri, dvs. som i det følgende betegnet "plantebeskyttende evne" mot bialafos.

Et foretrukket DNA-fragment består av følgende nukleotidsekvens :

eller en del derav som uttrykker et polypeptid som har plantebeskyttende evne mot bialafos.

Oppfinnelsen angår også et hvilket som helst DNA-fragment som adskiller seg fra det foretrukne som er angitt ovenfor ved erstatningen av hvilke som helst av dets nukleotider med andre, likevel uten å modifisere den genetiske informasjon til den foretrukne DNA-sekvensen som er nevnt ovenfor (normalt I betydningen av den universelle genetiske koden), og videre en hvilken som helst ekvivalent DNA-sekvens som ville kode et polypeptid som har de samme egenskapene, spesielt en bialafos-resistens-aktivitet.

Det vil forstås at fagmannen på området skulle være i stand til lett å bestemme de deler av nukleotidsekvensene som kunne fjernes fra hver side av hvilke som helst av DNA-fragmentene ifølge oppfinnelsen, f.eks. ved å fjerne terminaldeler på hver side av nevnte DNA-fragment, slik som med et ekso-nukleolytisk enzym, f.eks. Bal31, ved rekloning av det gjenværende fragment i et egnet plasmid og ved analysering av det modifiserte plasmidets evne til å transformere passende celler og til å beskytte det mot i det nedenstående beskrevne bialafos-antibiotikum eller -herbicid, hvilken enn analyse er hensiktsmessig.

Disse DNÅ-fragmentene vil i det følgende for letthets skyld bli betegnet "bialafos-resistens-DNA". På lignende måte vil det tilsvarende polypeptidet bli betegnet "bialafos-resistensenzym".

Mens det i det ovenstående har blitt lagt spesiell vekt på DNA-fragmenter som når de er innført i planteceller og planter er i stand til å gi dem beskyttelse mot bialafos eller PPT, skal det forstås at oppfinnelsen ikke på noen måte skal ansees begrenset dertil.

På samme måte vedrører oppfinnelsen DNA-fragmenter som når de er Innført i slike planteceller, også vil gi dem en beskyttelse mot andre GS-inhibitorer, f.eks. mellomprodukter som er Involvert i den naturlige biosyntesen av fosfinotricin, slik som forbindelsene betegnet ved forkortelsene MP101 (III), MP102 (IV), hvis formler er som angitt i det nedenstående:

Mer generelt har oppfinnelsen åpnet veien for fremstillingen av DNA-fragmenter som, ved riktig inkorporering i planteceller og planter, kan beskytte dem mot GS-inhibitorer når de bringes i kontakt med disse, slik det vil bli vist på detaljert måte i forbindelse med bialafos og PPT i eksempler angitt I det nedenstående.

Etter at dette har blitt fastslått, vil det forstås at et hvilket som helst fragment som koder for en enzymatisk aktivitet som vil beskytte planteceller og planter mot nevnte GS-inhibitorer ved inaktivering, bør anses som en ekvivalent til de foretrukne fragmenter som har blitt beskrevet ovenfor. Dette vil gjelde spesielt hvilke som helst DNA-fragmenter som ville resultere fra genetisk screening av de genomiske DNA'er iv stammer ,'■ spesielt.:.! .antibibtikum-produserende , stammeryt som det er sannsynlig er i besittelse av gener som, selv om de er strukturelt forskjellige, vil kode lignende aktivitet med hensyn til bialafos eller PPT, eller endog med hensyn til andre GS-inhibitorer. Dette gjelder et hvilket som helst gen i andre stammer som produserer et PPT-derivat.

Det skal derfor forstås at betegnelsen "bialafos-resistent DNA" eller "bialafos-resistent enzym" som er benyttet i det nedenstående for hensiktsmessighetens skyld, er ment å angå ikke bare de DNA'er og enzymer som spesifikt vedrører resistens til PPT eller mest direkte relaterte derivater, men mer generelt andre DNA'er og enzymer som under de samme forhold ville være i stand til å inaktivere virkningen I planter av GS-inhibitorer.

Oppfinnelsen angår også DNA-rekombinanter inneholdende de ovenfor definerte bialafos-resistens-DNA-fragmentene rekombinert med heterolog DNA, idet nevnte heterologe DNA som inneholder reguleringselementer og nevnte bialafos-resistens-DNA er under kontroll av nevnte reguleringselementer på en slik måte at den kan uttrykkes i et fremmed cellemiljø som er forenelig med nevnte reguleringselementer. Spesielt er ovennevnte bialafos-resistens-DNA-fragmenter som inneholdes i nevnte DNA-rekombinanter frie for ethvert DNA-område som er involvert i biosyntesen av bialafos, når nevnte bialafos- resistens-DNA-fragment selv har sin opprinnelse I bialafos-produserende stammer.

Med "heterolog DNA" menes en DNA av en annen opprinnelse enn den fra hvilken nevnte bialafos-resistens-DNA skriver seg, f.eks. er forskjellig fra den i en Streptomyces hygroscopicus eller Streptomyces viridochromogenes eller enda mer foretrukket en DNA som er fremmed for Streptomyces-DNA. Spesielt er nevnte reguleringselementer de som er i stand til å regulere transkripsjonen og translasjonen av DNA-sekvenser som normalt er forbundet med dem i nevnte fremmede miljø. "Cellulær eller celle-" refererer både til mikroorganismer og til cellestrukturer.

Denne heterologe DNA kan være en bakteriell DNA, spesielt når det er ønsket å produsere en stor mengde av den rekombinante DNA, slik som for ampiifikasjonsformål. I dette henseende består en foretrukken heterolog DNA av DNA av E. coli eller av DNA som er forenelig med E. coli. Det kan være DNA av samme opprinnelse som den i de aktuelle cellene eller annen DNA, f.eks. viral eller plasmidisk DNA kjent for å kunne replikeres i de aktuelle cellene.

Foretrukken rekombinant DNA inneholder heterolog DNA som er forenelig med planteceller, spesielt Ti-plasmid-DNA.

Spesielt foretrukne rekombinanter er de som inneholder GS-inhibitor-inaktiverende DNA under kontroll av en promotor som gjenkjennes av planteceller, spesielt de planteceller til hvilke inaktivering av GS-inhibitorer skal gis.

Foretrukne rekombinanter ifølge oppfinnelsen angår ytterligere modifiserte vektorer, spesielt plasmider, inneholdende nevnte GS-Inhibitor-inaktiverende DNA plassert på en slik måte i forhold til reguleringselementene, inkludert spesielt promotorelementer, at de gjør nevnte GS-inhibitor-Inaktiverende DNA I stand til å bli transkribert og translatert i cellemiljøet som er forenelig med nevnte heterologe DNA. Fordelaktige vektorer er de som er manipulert på en slik måte at de bevirker stabil inkorporering av nevnte GS-inhibitor-Inaktiverende DNA i fremmede celler, spesielt i deres genomiske DNA. Foretrukne modifiserte vektorer er de som muliggjør stabil transformasjon av planteceller og som gir de tilsvarende cellene evnen til å inaktivere GS-inhibitorer.

Som beskrevet senere synes det som inaktiveringskodonet i bialafos-resistens-genet i Streptomyces hygroscopicus-stammen som heri er benyttet, er et GTG-kodon. I foretrukne rekombinante DNA'er eller vektorer er imidlertid bialafos-resistensgenet modifisert ved anvendelse av et ATG-initieringskodon istedenfor initieringskodonet GTG, hvilket ATG muliggjør translasjonsinitiering i planteceller.

I eksemplet som følger besto plantepromotorsekvensen som har blitt benyttet av en promotor i 35 S blomkål-mosaikkvirus. Det skulle være unødvendig å si at fagmannen på området vil kunne velges andre plantepromotorer når det er mer hensiktsmessig i forhold til de aktuelle planteartene.

Ifølge en annen foretrukken utførelse av oppfinnelsen, spesielt når det er ønsket å oppnå transport av enzymet som er kodet av bialafos-resistens-DNA'en inn i kloroplastene, blir det heterologe DNA-fragmentet sammensmeltet med et gen eller DNA-fragment som koder et transittpeptid, idet sistnevnte fragment deretter innføyes mellom det GS-inhibitor-aktiverende genet og den valgte plantepromotor.

Når det gjelder metoder som kan tilveiebringe slike konstruksjoner, skal det vises til GB patentsøknader 84.32757, inngitt 28. desember 1984 og 85.00336 inngitt 7. januar 1985 og de beslektede søknader inngitt I USA (nr. 755.173, inngitt 15. juli 1985) i EPO (nr. 85.402596.2, inngitt 20. desember 1985), I Japan (nr. 299.730, inngitt 27. desember 1985), i Israel (nr. 77.466, inngitt 27. desember 1985) og i Australia (nr. 5.165.485, inngitt 24. desember 1985).

Det skal også vises til vitenskaplig litteratur spesielt til følgende artikler: - Van Den Broeck et al., 1985, Nature, 313, 358-363;

- Schreier et al., Embo. J., vol. 4, nr. 1, 25-32.

For ordens skyld skal det her minnes om at med uttrykket "transittpeptid" menes et polypeptidfragment som normalt er forbundet med et kloroplastprotein eller en kloroplastprotein-underenhet i et forløperprotein kodet av nukleær plantecelle-DNA. Transittpeptidet separeres deretter fra kloroplastproteinet eller fjernes proteolytisk under trans-lokasjonsprosessen av sistnevnte protein inn i kloroplastene. Eksempler på egnede transittpeptider er de som er forbundet med den lille underenheten i riboluse-1,5-bifosfat (RuBP)-karboksylase eller den som er forbundet med klorofyll a/b-bindingsproteinene.

Det er således tilveiebragt DNA-fragmenter og DNA-rekombinanter som er egnet for bruk i den i det følgende definerte f remgangsmåte.

Mer spesielt angår oppfinnelsen også en fremgangsmåte som generelt kan defineres som en fremgangsmåte for fremstilling av planter og reproduksjonsmateriale I nevnte planter inkludert et heterologt genetisk materiale som er stabilt integrert deri og som kan uttrykkes i nevnte planter eller reproduksjonsmaterialer i form av et protein som kan inaktivere eller nøytralisere aktiviteten til en glutaminsyntetase-inhibitor, omfattende de ikke-biologiske trinn med fremstilling av planteceller eller plantevev innbefattende nevnte heterologe genetiske materiale fra utgangsplanteceller eller

-plantevev som ikke kan uttrykke nevnte inhiberende eller nøytraliserende aktivitet, regenerering av planter eller reproduksjonsmateriale i nevnte planter eller begge deler fra

nevnte planteceller eller plantevev Innbefattende nevnte genetiske materiale og, eventuelt, biologisk replikering av sistnevnte planter eller reproduksjonsmateriale eller begge deler, hvor nevnte ikke-biologiske trinn med fremstilling av nevnte planteceller eller plantevev Innbefattende det heterologe genetiske materialet, omfatter transformasjon av nevnte utgangsplanteceller eller -plantevev med en DNA-rekombinant som inneholder en nukleotidsekvens som koder nevnte protein, samt de regulatoriske elementene valgt blant de som kan muliggjøre ekspresjon av nevnte nukleotidsekvens i nevnte planteceller eller plantevev, og å bevirke stabil integrering av nevnte nukleotidsekvens i nevnte planteceller og -vev, samt i planten og reproduksjonsmateriale oppnådd derfra gjennom generasjoner.

Oppfinnelsen vedrører også cellekulturene inneholdende bialafos-resistens-DNA, eller mer generelt nevnte GS-inhibitor-inaktiverende DNA, hvilke cellekulturer har den egenskap at de er resistente overfor et preparat som inneholder en GS-inhibitor, ved dyrking i et medium inneholdende et slikt preparat ved doseringer som ville være ødeleggende for ikke-transformerte celler.

Oppfinnelsen angår mer spesielt de planteceller eller cellekulturer hvori bialafos-resistens-DNA'en er stabilt integrert og som forblir nærværende over suksessive generasjoner i nevnte planteceller. Resistensen overfor en GS-inhibitor, mer spesielt bialafos eller PPT, kan således ansees som en måte å karakterisere plantecellene i foreliggende oppfinnelse på.

Man kan eventuelt også ty til hybridiseringsforsøk mellom den genomiske DNA oppnådd fra nevnte planteceller med en probe inneholdende en GS-inhibitor-inaktiverende DNA-sekvens.

Mer spesielt angår oppfinnelsen planteceller, reproduksjonsmateriale, spesielt frø, samt planter inneholdende et fremmed eller heterologt DNA-fragment som er stabilt Integrert 1 deres respektive genomiske DNA'er, idet nevnte fragmenter overføres gjennom generasjoner av slike planteceller, reproduksjonsmateriale, frø og planter, hvor nevnte DNA-fragment koder et protein som induserer en ikke-varietet-spesifikk enzymatisk aktivtet som kan inaktivere eller nøytralisere GS-inhibitorer, spesielt bialafos og PPT, mer spesielt å gi nevnte planteceller, reproduksjonsmateriale, frø og planter en tilsvarende ikke-varietet-spesifikk resistens fenotype overfor GS-inhibitorer.

"Ikke-varietet-spesifikk" enzymatisk aktivitet eller fenotype tar sikte på å vise til det faktum at de ikke er karakteri-stiske for spesifikke plantegener eller -arter slik dette vil bli illustrert på en ikke-begrensende måte i nedenstående eksempler. De induseres i nevnte plantematerialer ved hjelp av vesentlig ikke-biologiske prosesser som kan anvendes på planter som tilhører arter som normalt er ubeslektet med hverandre og omfatter inkorporering i nevnte plantemateriale av heterolog DNA, f.eks. bakteriell DNA eller kjemisk syntetisert DNA, som normalt ikke forekommer i nevnte plantemateriale eller som normalt ikke kan inkorporeres deri ved hjelp av naturlige formeringsprosesser og som likevel gir dem en felles fenotype (f.eks. herbicidresistens).

Oppfinnelsen har spesielt fordelaktig anvendelse i prosesser for beskyttelse av feltdyrkede plantearter mot ugress, hvilke prosesser omfatter behandling av feltet med et herbicid, f.eks. bialafos eller PPT i en dose som er effektiv med hensyn til å utrydde nevnte ugress, hvor den dyrkede plantearten derved i dets genom inneholder et DNA-fragment som koder et protein som har en enzymatisk aktivitet som kan nøytralisere eller inaktivere nevnte GS-inhibitor.

For illustrasjonsformål varierer effektive doser for bruk i ovennevnte prosess fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/hektar av bialafos eller PPT.

I det følgende angis hvordan det ovenfor beskrevne foretrukne DNA-fragmentet ble Isolert med utgangspunkt i den Streptomyces hygroscopicus-stammen som er tilgjengelig i American Type Culture Collection under deponeringsnummeret ATCC 21.705; kun som eksemplifisering.

Det nedenstående representerer også den teknikk som kan benyttes på andre stammer som produserer forbindelser med en PPT-del.

Nevnte angivelse vil deretter fullføres med beskrivelse av innsetningen av et foretrukket DNA-fragment som gir de transformerte cellene evne til å inaktivere bialafos og PPT. Det bialafos-inaktiverende DNA-fragmentet deretter angitt som bialafos-resistensgenet eller "sfr"-genet, isoleres således ved hjelp av den ovenfor beskrevne teknikk i plasmider som kan benyttes for å transformere planteceller og gi dem en resistens mot bialafos.

I det nedenstående vises det til de medfølgende tegninger hvor: Fig. 1 er et restriksjonskart av et plasmid inneholdende et Streptomyces hygroscopicus DNA-fragment som koder bialafos-resistens, hvilket plasmid, som i det følgende er betegnet pBGl har blitt konstruert som angitt i det nedenstående; Fig..2 viser nukleotidsekvensen I et mindre fragment oppnådd fra pBGl, subklonet inn i et annet plasmid (pBG39) og inneholdende resistensgenet; Fig. 3 viser konstruksjonen av en serie eksempelvise plasmider, hvilke plasmider tar sikte på å tilveiebringe egnede tillempningsmetoder for innføring deri av blalafos-resistensgenet eller "sfr"-genet; Fig. 4A og 4B viser konstruksjonen av en serie eksempelvise plasmider, hvilke plasmider inneholder egende plantecelle-promotorsekvenser som kan initiere transkripsjon og ekspresjon av det fremmede genet som er innført under deres kontroll i nevnte plasmider; Fig. 5A viser et bestemt fragment av nukleotidsekvensen i plasmidet oppnådd i fig. 3; Fig. 5B viser rekonstruksjonen av de første kodonene i et bialafos-resistensgen, fra et Fokl/Bglll-fragment oppnådd fra pBG39 og anvendelsen av et ATG-initieringskodon istedenfor GTG-initieringskodonet i det naturlige "sfr"-genet; Fig. 5C viser rekonstruksjonen av hele "sfr"-genet, nemlig de siste kodonene deri, og dets innføring i et plasmid oppnådd i fig. 4A og 4B; Fig. 6A viser en ekspresjonsvektor inneholdende "sfr"-genet satt under kontroll av en plantecellepromotor; Fig. 6B viser en annen ekspresjonsvektor som er avledet fra den som er vist på fig. 6A, ved erstatning av noen nukleotider; Fig. 7 viser konstruksjonen av en serie eksempelvise plasmider for til slutt å fremstille plasmider inneholdende promotorregionen og transitt-peptid-sekvensen i et bestemt plantecellegen, for innføring av "sfr"-genet under kontroll av nevnte promotor-region og nedstrøms for nevnte transitt-peptid-sekvens;

Fig. 8-11 vil bli omtalt i det nedenstående.

Følgende forsøk ble benyttet for å isolere et bialafos-resistensgen fra S. hygroscopicus, ifølge standardteknikker for kloning i Streptomyces.

2,5 pg av S. hygroscopicus genomisk DNA og 0,5 pg av Streptomyces vektor pIJ61 ble spaltet med Pstl ifølge metoden beskrevet i ref. 6. Vektorfragmentene og genomiske fragmenter ble blandet og ligert (4 timer ved 10°C fulgt av 72 timer ved 4°C i ligeringssalter som inneholder 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol og 0,1 mM ATP) ved en total DNA-konsentrasjon på 40 jjg ml-<1>med T4 DNA-ligase. Ligeringsprodukter ble innført i 3 x 10^ S. lividans stamme 66 protoplaster ved en transformasjonsmetode formidlet ved hjelp av polyetylen-glykol (PEG) som beskrevet i det følgende. Disse protoplaster ga opphav til 5 x 10^ kolonier og 4 x IO<4>arr etter regenerering på 20 plater med R2-agar inneholdende 0,5$ Difco-gjærekstrakt (R2 YE). Preparering og sammensetning av de forskjellige mediene og bufrene benyttet I de beskrevne forsøk er angitt i det nedenstående. Når disse "plener" ble replika-utplatet på minimalmediumplater inneholdende 50 jjg ml~<l>bialafos, oppsto legemiddelresistente kolonier ved en frekvens på 1 pr. IO<4>transformanter. Etter rensing av de legemiddelresistente koloniene, ble deres plasmid-DNA isolert og benyttet for å retransformere S. 1 ividans-protoplaster. Ikke-selektiv regenerering fulgt av replikasjon til Bialafos-holdig medium viste en 100$ korrela-sjon mellom arr og bialafos-resistent vekst. De rekombinante plasmidene i flere resistente kolonier inneholdt alle et 1,7 kB Pstl-innskudd (se fig. 1).

Subklonlng av herblcld- reslstensgenet

1,7 Kb Pstl-innskuddet ble deretter subklonet inn i høykopi-antall-streptomycetevektoren pIJ385 for å utvikle plasmid pBG20. S. 1ividans-stammer som inneholdt pBG20 var mer enn 500 ganger mer resistente til bialafos. S. lividans-vekst inhiberes normalt i minimalmedium inneholdende 1 pg/ml bialafos; vekst av transformanter inneholdende pBG20 ble ikke

merkbart inhibert i et medium inneholdende 500 pg/ml bialafos. Pstl-fragmentet ble også subklonet i hver orientering inn i Pstl-setet i plasmid pBR322 for dannelse av plasmider pBGl og pBG2, I overensstemmelse med deres orientering. En test på minimalt M9-medium demonstrerte at E. coli E8767 inneholdende pBGl eller pBG2 var resistent til bialafos.

Et ± 1,65 Kb Pstl - BamHI-fragment ble subklonet fra pBGl inn i plasmid pUC19 for dannelse av plasmid pBG39, og ga bialafos-resistens til E. coli, W3110, C600 og JM83.

Ved anvendelse av et in vitro-koblet transkripsjon-transla-sjonssystem (ref. 5) fra S. lividans-ekstrakter, ble det vist at 1,65 Kb Pstl - BamHI-fragmentet i pBG39 dirigerte syntesen av et 22 Kd-protein. I det følgende Innbefatter dette 1,65 Kb-lnnskuddet et fragment som koder for et 22 Kd-protein og vil bli betegnet "sfr"-gen.

Fin- kartlegging og sekvensering av genet

Et 625 bp Sau3A-fragment ble subklonet fra pBG39 inn i pUC19 og ga fremdeles bialafos-resistens til en E. coli W3110-vert. De resulterende klonene var pBG93 og pBG94, i overensstemmelse med orienteringen.

Orienteringen til genet i Sau3A-fragmentet ble indikert gjennom forsøk som hadde vist at bialafos-resistens kunne induseres med IPTG fra pUC19-lac-promotoren i pBG93. I nærvær av IPTG (0,5 mM) øket resistensen til pBG93/W3110 fra 5-50 pg/ml på et M9-medium inneholdende bialafos. W3110-verten som manglet pBG93 vokste ikke på M9-medium inneholdende 5 jjg/ml bialafos. Disse forsøk demonstrerte at Sau3A-fragmentet kunne subklones uten tap av aktivitet. De tilveiebragte også riktig orientering som vist på fig. 2. Proteinet som var kodet for av disse klonene ble detektert ved bruk av koblede transkripsjon-translasjonssytemer avledet fra ekstrakter av S. lividans (ref. 7). Avhengig av orienteringen av Sau3A- fragmentet ble translasjonsprodukter av forskjellige størrel-ser observert; 22 Kd for pBG94 og ± 28 Kd for pBG93. Dette Indikerte at Sau3A-fragmentet ikke inneholdt hele resistens-genet og at et fusjonsprotein ble dannet som innbefattet en polypeptidsekvens resulterende fra translasjonen av en pUC19-sekvens.

For å oppnå store mengder av proteinet, ble et 1,7 Kb Pstl-fragment fra pBGl klonet inn i Streptomycete-høykopitall-replikonet pIJ385. Det oppnådde plasmid, pBG20, ble benyttet for å transformere S. hygroscopicus. Transformanter som inneholdt dette plasmidet hadde mer enn fem ganger så mye PPT-acylerlngsaktivitet og hadde også forøkede mengder av et 22 kd-protein på natriumdodecylsulfatgeler (SDS-geler). Videre, både acetyl-transferasen og 22 kd-proteinet viste seg når produksjonen av bialafos begynte. Korrelasjonen av in vitro-data, syntesekinetikk, og amplifisert ekspresjon forbundet med pBG20-transformanter ga en sterk antydning om at dette 22 Kd-båndet var genproduket.

Den fullstendige nukleotidsekvensen til 625 bp Sau3A-fragmentet ble bestemt samt for flankerende sekvenser. Datamaskinanalyse viste tilstedeværelsen av en åpen leseramme over hele lengden til Sau3A-fragmentet.

Karakterisering av sfr- genproduktet

En rekke forsøk ble foretatt for å bestemme at den åpne leserammen til "sfr"-genet virkelig kodet bialafos-resistens-enzymet. For å bestemme 5'-enden til resistensgenet ble Nltø-terminalsekvensen til enzymet bestemt. Hva mer spesielt angår den benyttede teknikk for å bestemme nevnte sekvens, vises det til teknikken utviklet av J. Vandekerckhove, Eur. J. Bloc. 152, s. 9-19, 1985, og franske patentsøknader 85.14579 inngitt 1. oktober 1985 og 85.13046 inngitt 2. september 1985.

Denne teknikk gir anledning for immobilisering på glassfiber-ark belagt med det polykvaternære aminet som er kommersielt tilgjengelig under varebetegnelsen POLYBRENE, av proteiner og nukleinsyrer som på forhånd er separert på en natriumdodecyl-sulfatholdig polyakrylamidgel. Overføringen utføres vesentlig som for protein-blotting på nitrocellulosemembraner (ref. 8). Dette tillater bestemmelse av aminosyresammensetning og delvis sekvens for de immobiliserte proteinene. Delen av arket som bærer det immobiliserte 22 kd proteinet produsert av S. hygroscopicus pBG20 ble utskåret og skiven ble montert i reaksjonskammeret i en gassfase-sekvensator for å under-kaste det glassfiber-bundede 22 Kd-protein for Edman-ned-brytningsmetoden. Følgende aminosyresekvens ble oppnådd:

Pro-Glu-Arg-Arg-Pro-Ala-Asp-Ile-Arg-Arg

Sekvensen passet en aminosyresekvens som ble avledet fra den åpne leserammen i 625 bp Sau3A-fragmentet. Den tilsvarte strekningen av kodon 3 til kodon 12.

Således var NHg-terminusen i 22 Kd-proteinet oppstrøm i denne sekvensen. Det ble bestemt at translasjon av det aktuelle proteinet sannsynligvis ble initiert to aminosyrer tidligere enn et GTG-initieringskodon. GTG anvendes ofte som initiator-kodon i Streptomyces og translatert som methionin. Proteinet translatert fra GTG-initieringskodonet ville være 183 aminosyrer langt og ville ha en molekylvekt på 20.550. Dette var I god overensstemmelse med den observerte omtrentlige molekylvekten på 22.000.

Videre ble termineringskodonet, TGA, lokalisert like ned-strøms for Sau3A-setet. Kloning av 625 bp Sau3A-fragmentet i et BamHI-sete-nedbrutt pUC19 resulterte ikke i rekonstruksjon av termineringskodonet. Dette forklarte fusjonsproteinene som ble observert i in vitro-transkripsjon-translasjonsanalysen.

Mekanisme for PPT- reslstens

Etter å ha definert en første fenotype og noen av de fysi-kalske egenskapene til resistensgenet og dets genprodukt, ble en serie forsøk deretter utført for å forstå mekanismen ved hjelp av hvilken det gir resistens. Som beskrevet ovenfor er PPT den del av bialafos som inhiberer glutamin-syntetase (GS) og at N-acetyl-PPT ikke er en inhibitor. Ved bruk av en standardanalyse (ref. 9), ble S. hygroscopicus ATCC 21705-derivater vist å inneholde en PPT-acetyl-transferase som ikke ble funnet i S. lividans. Aktiviteten acetylerer ikke bialafos-tripeptidet. S. lividans som bærer resistensgenet klonet i pBG20 eller pBG16 (et plasmid inneholdende 625 bp Sau3A-fragmentet klonet inn i en annen streptomycete-vektor, pIJ680) inneholdt også aktiviteten som kunne acetylere PPT, men ikke bialafos. Det PPT-avledede reaksjonsproduktet produsert av ekstrakter av pBG20/S. lividans ble isolert for å bekrefte at det virkelig var acetyl-PPT. Analyse ved massespektroskopi viste at molekylvekten hadde øket i forhold til PPT med ekvivalenten til en acetylgruppe. Det ble således konkludert at 625 bp Sau3A-fragmentet inneholdt sekvenser som koder for PPT-acetyl-transferase.

Forsøksbetingelsene og reagensene benyttet i de ovenfor beskrevne teknikker var som følger: Fremstilling av og sammensetning for de ovenfor benyttede medier og buffere

1° P- mediuro: 10,3 g sukrose, 0,025 g K2S04, 0,203 g MgClg^HgO og 0,2 ml av en sporelementoppløsning, oppløses i 80 ml destillert vann og autoklaveres. Deretter tilsettes i rekkefølge 1 ml KH2P04(0,5$), 10 ml CaCl2*2H20 (3,68$) og 10 ml TES-buffer (0,25 M), pH 7,2. Sporelementoppløsning (pr. liter): ZnCl2, 40 mg; FeCl3'6H20, 200 mg; CuCl2'2H20, 10 mg; MnCl2-4H20, 10 mg; Na2B407•10H20, 10 mg; (NH4)6Mo7<0>24•4H20, 10 mg.

2° R2YE: 10,3 g sukrose, 0,025 g K2S04 , 1,012 g MgCl2-6H20, 1 g glukose, 0,01 g Difco-kasaminosyrer og 2,2 g Dlfco-agar oppløses i 80 ml destillert vann og autoklaveres. 0,2 ml sporelementoppløsning, 1 ml KH2P04(0,5$), 8,02 ml CaCl2'2H20 (3,68$), 1,5 ml L-prolin (20$), 10 ml TES-buffer (0,25 M)

(pH: 7,2), 0,5 ml av (1 M) NaOH, 5 ml gjærekstrakt (10$), tilsettes i rekkefølge.

3° TE: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.

4° YEME: Difco-gjærekstrakt (0,3$), Dicfo-pepton (0,5$), oksoidmaltekstrakt (0,3$), glukose (1$).

Transformasjon av S. 1ividans- protoplaster

1. En kultur bestående 25 ml YEME, 34$ sukrose, 0,005 M MgCl2, 0,5$ glycin, i en 250 ml ledeplate-f or synt kolbe sentrifugeres i 30-36 timer. 2. Pelletene suspenderes i 10,3$ sukrose og sentrifugeres.

Denne vasking gjentas en gang.

3. Myceliet suspenderes i 4 ml lysozymoppløsning (1 mg/ml i P-medium med CaCl2- og MgCl2-konsentrasjoner reduset til 0,0025 M) og inkuberes ved 30°C i 15-60 minutter. 4. Oppløsningen blandes ved pipettering tre ganger i en 5 ml pipette og inkuberes i ytterligere 15 minutter. 5. P-medium (5 ml) tilsettes og blandes ved pipettering som i trinn 4. 6. Oppløsningen filtreres gjennom bomull og protoplaster sedimenteres forsiktig i benksentrifuge ved 800 x g i løpet av 7 minutter. 7. Protoplaster suspenderes i 4 ml P-medium og sentrifugeres på nytt. 8. Trinn 7 gjentas og protoplaster suspenderes i dråpen av P-medium som er tilbake etter avhelling av supernatanten (for transformasjon).

9. DNA tilsettes i mindre enn 20 pl TE.

10. 0,5 ml PEG 1000-oppløsning (2,5 g PEG oppløst i 7,5 ml 2,5$ sukrose, 0,0014 K2S04, 0,1 M CaCl2, 0,05 M Tris-maleinsyre, pH 8,0, pluss sporelementer) tilsettes umiddelbart og pipetteres en gang for å blande kompo-nentene. 11. Etter 60 sekunder tilsettes 5 ml P-medium og proto-plastene sedimenteres ved forsiktig sentrifugering.

12. Pelleten suspenderes i P-medium (1 ml).

13. 0,1 ml utstrykes på R2YE-plater (for transformasjon av tørre plater til 85$ av deres friske vekt f.eks. i et avlukke med laminær strøm).

14. Inkubasjon ved 30°C.

A - Konstruksjon av en " sfr"- genkassett

En "sfr"-genkassett ble konstruert for å tillate etter-følgende kloning i plante-ekspresjonsvektorer.

Isolering av et Foki-BglII-fragment fra plasmidet pBG39 inneholdende et "sfr"-genfragment ledet til tap av de første kodonene, inkludert inltieringskodonet og de siste kodonene, inkludert stoppkodonet.

Dette fragmentet "sfr"-genet kunne rekonstrues in vitro med syntetiske oligonukleotider som koder hensiktsmessige aminosyrer.

De komplementære syntetiske oligonukleotidene var

5'-CATGAGCCCAGAAC og 3'-TCGGGTCTTGCTGC.

Ved bruk av slike syntetiske oligonukleotider kunne 5'-enden i "sfr"-genet gjendannes og TGT-initieringskodonet erstattes med et kodon som translateres godt av planteceller, spesielt et ATG-kodon.

DNA-fragmentet inneholdende oligonukleotidene bundet til "sfr"-genet ble deretter innført i et passende plasmid, som inneholdt en bestemt nukleotidsekvens deretter og betegnet et "adapter"-fragment.

Dette adapter-fragmentet omfattet:

- et TGA-termineringskodon som gjorde det mulig at de siste kodonene i "sfr"-genet kunne gjendannes; - passende restriksjonsseter som muliggjorde innsetning av fragmentet i nukleotidsekvensen omfattende "sfr"-genet delvis gjendannet med de syntetiske oligonukleotidene; denne innsetning resulterte i rekonstruksjon av et intakt "sfr"-gen; - passende restriksjonsseter for isoleringen av hele "sfr"-genet.

"sfr"-genet ble deretter innsatt i et annet plasmid som inneholdt en passende plante-promotorsekvens. Plantepromotorsekvensen besto av blomkålmosaikkvirus-promotorsekvensen (p35S). Foreliggende oppfinnelse er naturligvis Ikke begrenset til anvendelse av denne spesielle promotoren. Andre sekvenser kunne velges som promotorer egnet i planter, f.eks. TR 1'-2'-promotorområdet og promotorfragmentet i et lite Rubisco-underenhetgen fra Aarabidopsis thaliana som er beskrevet i det nedenstående.

1<*>Konstruksjon av plasmidet PLK56. 2 ( fig. 3)

Konstruksjonen av plasmid pLK56.2 tok sikte på å oppnå en egnet adaptor innbefattende følgende sekvens av restriksjons seter: Smal, BamHI, Ncol, Kpnl, Bgll, Mlul, BamHI, HindiII og Xbal.

Startplasmidene benyttet for denne konstruksjon pLK56, pJB64 og pLK33 var de som er beskrevet av Botterman (ref. 11).

De i det følgende beskrevne DNA-fragmenter ble Isolert og separert fra lavtsmeltende agarose (LGA).

Plasmidet pLK56 ble spaltet med enzymene BamHI og Ndel. Et NcoI-Ndel-fragment (angitt på tegningene med buen "a" i stiplet linje) oppnådd fra plasmid pJB64 ble innsatt i pLK56 istedenfor BamHI-Ndel-fragmentet vist ved "b". Ligering var mulig etter ifylling av de BamHI-NcoI-fremstikkende ender med DNA-polymerase I i E. coli (Klenows fragment).

Spesielt fant resirkularisering sted ved hjelp av en T4 DNA-ligase. Et nytt plasmid pLK56.3 ble oppnådd.

Dette plasmidet ble spaltet med enzymene Xbal og Pstl.

BamHI-Pstl-fragmentet i pLK33 (c) (på fig. 3) ble benyttet Istedenfor Xbal-Pstl-fragmentet (d) i pLK56.3, etter repara-sjon av deres respektive ender ved hjelp av Klenows fragment.

Etter resirkularisering ved hjelp av T4 DNA-ligase Inneholdt det oppnådde plasmidet pLK56.2 en nukleotidsekvens som omfattet de nødvendige restriksjonssetene for etterfølgende innsetning av "sfr"-genet.

2° Konstruksjon av plasmidet pGSH150 ( flg. 4A)

Parallelt med den ovenfor omtalte konstruksjon, ble det fremstilt et plasmid inneholdende en promotorsekvens som gjenkjennes av polymerasene i planteceller og innbefattende egnede restriksjonsseter, nedstrøms for promotorsekvensen i transkripsjonsretningen, hvilke restriksjonsseter deretter skal gi plass for "sfr"-genet som deretter kan oppnås fra pLK56.2, under kontroll av nevnte plantepromotor.

Plasmid pGV825 er beskrevet i Deblaere et al. (ref. 10). Plasmid pJB63 er fra Botterman (ref. 11).

pGV825 ble linearisert med PvuII og resirkularisert med T4 DNA-ligasen, resulterende i fjerning av et indre PvuII-fragment vist ved (e), (plasmid pGV956).

pGV956 ble deretter spaltet med BamHI og Bglll.

BamHI-BglII-fragmentet (f) oppnådd fra pJB63 ble defosfory-lert med kalvetarmfosfatase (CIP) og benyttet istedenfor BamHI-BglII-fragmentet i pGV956.

Plasmid pGV1500 ble oppnådd etter resirkularisering ved T4 DNA-ligase.

Et EcoRI-Hindlll-fragment oppnådd fra plasmid pGSH50 ble renset. Sistnevnte plasmid inneholdt det dobbelte Tr l'-2'-promotorfragmentet beskrevet i Velten et al., (ref. 13). Dette fragmentet ble innsatt i pGV1500, nedbrutt med Hpal og Hindlll og ga pGSH150.

Dette plasmidet inneholder promotorfragmentet i fronten av 3'-enden av T-DNA-transkript 7 og BamHI- og Clal-seter for kloning.

3° Konstruksjon av plasmidet pGSJ260 ( fig. 4B)

CP3 er et plasmid avledet fra pBR322 og som inneholder 35S-promotorområdet i blomkålmosaikkvlrus i et BamHI-fragment.

pGSH150 ble uttatt ved hjelp av BamHI og Bglll.

BamHI-Bgl11-fragmentet (h) 1 CP3, som inneholdt nukleotidsekvensen til p35S-promotor, ble Innsatt istedenfor BamHI-

BglII-fragmentet (1) i pGSH150 for dannelse av plasmid pGSJ250. pGSJ250 ble deretter åpnet ved dets Bglll-restrik-sjonssete.

Et BamHI-fragment oppnådd fra mGV2 (ref. 12) ble innført i pGSJ250 ved Bglll-setet til dannelse av plasmid pGSJ260.

Før innføring av "sfr"-genet som kan oppnås fra pLK56.2 i plasmidet pGSJ260, var det imidlertid fremdeles ønskelig ytterligere å modifisere det første for å tillate innsetning på en mer praktisk måte. Således ble pLK56.2 ytterligere modifisert som omtalt nedenfor til dannelse av pGSRl.

Med utgangspunkt i plasmid pGSJ260, ble to plasmidkonstruk-sjoner for etterfølgende transformasjoner av planteceller fremstilt: - et første plasmid som tillater ekspresjon av "sfr"-genet i cytoplasmaet i planteceller, og - et annet plasmid som er modifisert slik at det oppnås transport av bialafos-resistensenzymene til kloroplastene i planteceller.

Første tilfelle: Plasmid som muliggjør ekspresjonen av " sfr"- genet i cytoplasmaet i planteceller

Kloning av sfr- genkassetten 1 en planteekspresjonsvektor ( pGSR2) ( fig. 5)

På fig. 5A er nukleotidsekvensen til adaptoren i pLK56.2 vist. Spesielt er plasseringene til BamHI-, Ncol-, Bglll-restriksjonsseter vist.

Dette adaptorfragmentet ble spaltet med enzymene Ncol og Bglll.

Fig. ;5B viser et Fokl-BglII-fragmentet (j ) oppnådd fra pBG39. Plasseringene til disse to restriksjonssetene er vist på fig. 2.

Ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider ble de første kodonene i "sfr"-genet gjendannet, spesielt 5'-enden i genet hvori et ATG-initieringskodon var innført istedenfor det opprinnelige GTG-kodonet.

FokI-BglII-fragmentet komplettert med de syntetiske oligonukleotidene ble deretter innsatt i pLK56.2 istedenfor Ncol-BglII-fragmentet i adaptoren. 3'-enden til genet ble således også gjendannet, etter resirkularisering med T4 DNA-ligase. Det oppnådde plasmid, pGSRl, inneholdt således hele "sfr"-genet innført i sin adaptor.

Plasmidet pGSJ260 ble deretter åpnet med BamHI (fig. 5C) og BamHI-fragmentet oppnådd fra pGSRl, som inneholdt hele "sfr"-genet, ble Innført i pGSJ260.

Det oppnådde plasmid, pGSR2 (se fig. 6A) inneholdt et pBR322-replikon, et bakterielt streptomycin-resistensgen (SDM-SP-AD-transferase) og en konstruert T-DNA bestående av: kantfragmentene til T-DNA'en;

et chimerisk kanamycingen som tilveiebragte en dominerende

selekterbar markør i planteceller; og

et chimerisk "sfr"-gen.

Det chimeriske "sfr"-genet besto av:

promotorområdet i blomkålmosaikkvirusen (p35S); "sfr"-genkassetten som beskrevet i fig. 5;

det 3'-utranslaterte området, inkludert polyadenylerings-signalet i T-DNA transkript 7.

pGSR2 ble innført i Agrobacterium tumefaciens resipient C58ClRif<R>(pGV2260) ifølge metoden beskrevet av Deblaere et al. (ref. 10).

Denne stammen ble benyttet for å introdusere det chimeriske "sfr"-genet i N. tabacum SR^-planter.

To variantplasmider fra pGSR2, nemlig pGSFR280 og pGSFR281, har blitt konstruert. De adskiller seg fra hverandre med hensyn til den utranslaterte sekvensen etter transkripsjon-initieringssetet. I pGSR2 består dette fragmentet av følgende sekvens:

mens det bstår av: I pGSR280 og av

i pGSFR281, idet et ATG-kodon er initierIngskodonet i "sfr"-genet. #sfr"-genet er også sammensmeltet med TRI'-2'-promotoren i plasmid pGSH150 (fig. 4A), hvilket gir pGSFR160 og pGSFR161 (fig. 6B). Disse plasmidene inneholder små for-skjeller i pTR2 "sfr"-genkonfigurasjonen: "sfr"-genet er korrekt sammensmeltet med det endogene gen 2' ATG i pGSFR161 (for sekvenser se ref. 13), mens fire ekstra basepar (ATCC) er tilstede like foran ATG-kodonet i pGSFR160. Ellers er plasmider p65FR161 og p65FR160 helt identiske.

Alle plasmider innføres i Agrobacterium ved kointegrasjon i akseptorplasmidene pGV2260, hvilket gir de respektive plasmider pGSFR1280, pGSFR1281, pGSFR1160 og pGSFR1161.

Annet tilfelle: Konstruksjon av et plasmid inneholdende " sfr"- genet nedstrøms for en DNA- sekvens som koder et transittpeptid og er egnet for oppnåelse av etterfølgende translokasjon av " sfr"- genekspresjonsproduktet i plantecelle-kloroplaster.

I et annet sett av forsøk ble nukleotidsekvensen som inneholdt "sfr"-genet sammensmeltet med en DNA-sekvens som koder et transittpeptid for derved å muliggjøre dets transport inn i kloroplaster.

Et fragment av "sfr"-genet ble isolert fra det ovenfor beskrevne adaptorfragmentet og sammensmeltet med et transittpeptid. Med syntetiske oligonukleotider ble hele "sfr"-genet rekonstruert og sammensmeltet med et transittpeptid.

Plasmidet (plasmid pATS3 nevnt nedenfor) som inneholdt nukleotidsekvensen som koder transittpeptidet omfattet også promotorsekvensen derav.

Konstruksjon av plasmidet pGSR4 som inneholder " sfr"- genet sammensmeltet med en DNA- sekvens som koder transittpeptid

( fig- 7)

Plasmid pLK57 er fra Botterman, (ref. 11). Plasmid pATS3 er en pUC19-klon som inneholder et 2 Kb EcoRI genomisk DNA-fragment fra arabidopsis thaliana omfattende promotorområdet og transittpeptidnukleotidsekvensen i genet; ekspresjonen derav er den lille underenheten i ribulosebifosfatkarboksy-lase (ssu). Den lille A. thaliana-underenheten ble isolert som et 1500 bp EcoRI-SphI-fragment. Sphl-spaltningssetet foreligger ved det setet hvor kodingsområdet i det modne ssu-proteinet starter.

Plasmider pLK57 og pATS3 ble åpnet med EcoRI og SphI. Etter resirkularisering ved hjelp av T4 DNA-llgase, ble et rekombinant plasmid pLKABl inneholdende den sekvensen som koder transittpeptidet (Tp) og dens promotorområde (Pssu) oppnådd.

For på korrekt måte å sammensmelte "sfr"-genet ved spaltningssetet i signalpeptidet, ble N-terminalgensekvensen først modifisert. Siden ble det observert at N-terminalgenfusjoner med "sfr"-genet bibeholder deres enzymatiske aktivitet, ble det andre kodonet (AGC) modifisert til et GAC, hvilket gir et Ncol-sete som overlapper med ATG-initiatorsetet. Et nytt plasmid, pGSSFR2, ble oppnådd. Det adskiller seg bare fra pGSRl (fig. 5B) ved nevnte mutasjon. NcoI-BamHI-fragmentet oppnådd fra pGSSFR2 ble sammensmeltet ved Sphl-enden av transittpeptidsekvensen. På parallell måte ble "sfr"-gen-fragmentet sammensmeltet korrekt med ATG-initiatoren i ssu-genet (ikke vist på figurene).

Innføring av " sfr"- genet i en forskjellig planteart

Bialafos-resistensen indusert i planter ved ekspresjon av chimeriske gener, når de sistnevnte har blitt transformert med passende vektorer Inneholdende nevnte chimeriske gener, har blitt demonstrert som følger. De rekombinante plasmidene inneholdende "sfr"-genet ble innført separat ved mobilisering i Agrobacterium-stamme C58C-L Rif<R>(pGV2260 ) ifølge metoden beskrevet av Deblaere et al., Nucl. Acld. Res., 13, s. 1477, 1985. Rekombinante stammer inneholdende hybridet Ti-plasmider ble dannet. Disse stammene ble benyttet for å infisere og transformere bladskiver av forskjellige plantearter, ifølge en metode vesentlig som beskrevet av Horsch et al., 1985, Science, vol 227. Transformasjonsmetoden for disse forskjellige planteartene gitt som eksempel, er beskrevet i det følgende.

1. Bladskive-transformasjon av Nicotiana tabacum

Benyttede media er som følger:

Plantemateriale:

Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI

Planter anvendes 6-8 uker etter subkultur på medium A^

Infeksjon:

- Midtribber og kanter fjernes fra blader.

- Gjenværende deler oppskjæres i segmenter på ca. 0,25 cm<2>og anbringes 1 Inf eks j onsmediet A-^g (ca. 12 segmenter i en 9 cm Petri-skål Inneholdende 10 ml A^g). - Segmenter infiseres deretter med 25 pl pr. Petri-skål av en sen log-kultur av Agrobacterium-stammen dyrket i min A-medium. - Petri-skål inkuberes i 2-3 dager ved lav lysintensitet. - Etter 2-3 dager fjernes medium og erstattes med 20 ml medium A^g Inneholdende 500 mg/l klarofan.

Seleksjon og skuddinduksjon:

- Bladsklvene anbringes på medium A-q inneholdende et selektivt middel:

100 mg/l kanamycin og

10-100 mg/l fosfinotrlcin.

- Bladskiver overføres ukentlig til friskt medium.

- Etter 3-4 uker oppstår regenererende kalli. De separeres og anbringes på medium A^2mec* den samme konsentrasjon av selektivt middel som benyttet for seleksjonen.

Rotdannelse

- Etter 2-3 uker dekkes nevnte kalli med skudd som kan isoleres og overføres til rotdannelsesmedium A^3(uten seleksjon).

- Rotdannelse tar 1-2 uker.

- Etter noen ytterligere uker blir disse plantene formert på medium A^. 2. Rotknollskive-infeksjon av Solanum tuberosum (potet) Benyttede media er som følger:

- „ Plantemateriale

Rotknoller av Solanum tuberosom cv. Berolina cv. Désirée

Inf eks. 1 on

- Poteter skrelles og vaskes med vann.

- Deretter vaskes de med konsentrert kommersielt bleke-middel 1 20 minutter, og

- skylles 3-5 ganger med sterilt vann.

- Det ytre laget fjernes (1-1,5 cm).

- Den midtre delen oppskjæres i skiver på ca. 1 cm<2>og med en tykkelse på 2-3 mm. - Skiver anbringes på medium C^(4 stykker i en 9 cm Petri-skål). - 10 pl av en sen log-kultur av en Agrobacterium-stamme dyrket i min A-medium anbringes i hver skål. - Skiver inkuberes i 2 dager ved lav lysintensitet.

Seleksjon og skuddinduks. ion

- Skiver tørkes på et filterpapir og overføres til medium 0, 2 me& 1°° rog/l kanamycin. - Etter en måned fjernes små kalli fra skivene og over-føres til medium C7inneholdende 50 mg/l kanamycin. - Etter noen ytterligere uker overføres nevnte kalli til medium C3inneholdende 50 mg/l kanamycin. - Dersom små skudd begynner å utvikle seg, overføres nevnte kalli til forlengelsesmedium Cg inneholdende 50 mg/l kanamycin.

Rotdannelse

- Avlange skudd separeres og overføres til rotdannelsesmedium C-j^.

- Rotdannede skudd formeres på medium C5.

3. Bladskiveinfeksjon av Lycopersicum esculentum (tomat) Benyttede media er som følger:

Åi MS-salt/2 + 1$ sukrose

0,8$ agar

pH 5,7

Plantemateriale

Lycoperisicum esculentum cv. Lucullus.

Planter benyttes 6 uker etter subkultur på medium Al.

Inf eks. 1 on

- Midtribbe fjernes fra bladene.

- Blader oppskjæres i segmenter på ca. 0,25-1 cm<2>(kantene på bladene beskadiges ikke slik at bare maksimum tre sider av bladstykkene blir beskadiget). - Segmenter anbringes i infeksjonsmedium B^(oppned), ca.

10 segmenter i en 9 cm Petri-skål.

- Segmenter infiseres deretter med 20 pl pr. Petri-skål av en sen log-kultur av Agrobacterium-stammen dyrket i min A-medium. - Petri-skåler inkuberes i 2 dager ved lav lysintensitet. - Medium fjernes etter 2 dager og erstattes med 20 ml medium B^inneholdende 500 mg/l klarofan.

Seleksjon og skuddlnduksjon

- Bladskivene anbringes på medium B2+ 50 eller 100 mg/l kanamycin. - Hver 5. dag senkes mediets osmotiske trykk ved å nedsette mannitolkonsentrasjonen, overføringer foretas fortløpende i medium B3, B4, B5og B^. - Etter en måned separeres kalli med delingsvev fra bladskivene og anbringes på medium B7med 50 eller 100 mg/l kanamycin. - Når først små skudd har blitt dannet, overføres kalli til f orlengelsesmedium Bg med 50 eller 100 mg/l kanamycin.

Rotdannelse

- Avlange skudd separeres og overføres til medium Bg for rotdannelse.

- Planter formeres på medium A^.

Drivhusforsøk for herbicidreslstens

Materiale og metode

I dette forsøk anvendes to herbicider omfattende fosfinotricin som aktiv bestanddel.

Disse forbindelsene er de som er kommersielt tilgjengelige under de registrerte varebetegnelse BASTA<R>og MEIJI

HERBIACE<R>.

Disse produktene fortynnes til 2$ med ledningsvann. Dusjing utføres på et kvadratmeterareal fra fire hjørner. Tempera-turen i drivhuset er ca. 22° C for tobakk og tomat, og over 10-15°C for potet.

Resultater

Tobakk-dusjtest

a) Nicotiana tabacum cv. Petit Haana SRl-planter transformert med chimeriske "sfr"-gener som finnes i pGSFR1161

eller pGSFR1281, samt utransformerte kontrollplanter (med høyde på 10-50 cm) behandles med 20 1 BASTA<R>/ha. SRl-kontrollplanter dør etter 6 dager, mens transformerte planter er fullstendig resistente overfor 20 1 BASTA<R>/ha og fortsetter å vokse på en måte som ikke kan skjelnes fra ubehandlede planter. Ingen synlig skade kan påvises, behandlingen gjentas også hver to uker. Behandlingen har ingen virkning på etterfølgende blomsterdannelse. Den anbefalte dose av BASTA<R->herblcid i landbruk er 2,5-7,5 l/ha.

b) Et lignende forsøk foretas ved bruk av 8 l/ha MEIJIEERBIACE<R>. De transformerte plantene (samme som

ovenfor) er fullstendig resistente og fortsetter å vokse på en slik måte som ikke kan skjelnes fra ubehandlede planter. Ingen synlig skade kan påvises.

Potet-dusjtest

Utransformerte og transformerte potetplanter (Solanum tuberosum cv. Berolina) (20 cm høye) med chimerisk "sfr"-gen som er tilstede i pGSFR1161 eller pGSFR1281, behandles med 20 g BASTA<R>/ha. Kontrollplanter dør etter 6 dager, mens de transformerte plantene ikke viser noen synlig skade. De vokser på en slik måte at de ikke kan skjelnes fra ubehandlede planter.

Tomat-dusjtest

Utransformerte og transformerte tomatplanter (lycopersium esculentum cv. luculus) (25 cm høye) med det chimeriske "sfr"-genet som er tilstede i pGSFR1161 og pGSFR1281, behandles med 10 1 BASTA<R>/ha. Kontrollplanter dør etter 6 dager, mens transformerte planter er fullstendig resistente. De viser ingen synlig skade og vokser på en slik måte at de ikke kan skjeldes fra ubehandlede planter.

Vekstkontroll av fytopatogene fungi med transformerte

planter.

I et annet forsøkssett blir potetplanter som uttrykker chimeriske "sfr"-gener, som er tilstede i pGSFR1161 eller pGSFR1281, dyrket i et drivhusrom ved 20°C under høy fuktighet. Planter inokuleres ved dusjing av 1 ml av en suspensjon av 10^ Phytophtora infestans-sporer pr. ml. Planter vokser i vekstkammere (20°C, 95$ fuktighet, 4000 lux) inntil sopp-sykdomssymptomer er synlige (1 uke). Et sett av plantene blir ved det øyeblikket dusjet med bialafos ved en dose på 8 l/ha. To uker senere er ubehandlede planter fullstendig oppspist av soppen. Veksten av soppen stoppes på de bialafos-behandlede plantene og ingen ytterligere sykdomssymptomer utvikles. Plantene beskyttes på effektiv måte av den fungicide virkningen til bialafos.

Transmisjon av PPT-resistensen gjennom frø.

Transformerte tobakksplanter som uttrykker det chimeriske "sfr"-genet som er tilstede i pGSFR1161 og pGSFR1281 bringes til blomstring i drivhuset. De viser en normal fertilitet.

Ca. 500 Fl-frø av hver plante såes i jorden; Fl betegner frø av første generasjon, dvs. direkte utgått fra de opprinnelig transformerte plantene. Når frøplanter er 2-3 cm høye, sprøytes de med 8 1 BASTA<R>/ha. 7 dager senere kan friske og skadede planter skjelnes 1 et forhold på ca. 3:1. Dette viser at PPT-resistens arves som en dominerende markør kodet av en enkelt lokus. 10 resistente Fl-frøplanter dyrkes til modenhet og frø innhøstes. F2-frøplanter dyrkes som beskrevet ovenfor og testes med henblikk på PPT-resistens ved sprøyting av BASTA<R>ved en dose på 8 l/ha. oen av Fl-plantene produserer F2-frøplanter som alle er PPT-resistente hvilket viser at disse plantene er homozygotiske for resistensgenet. Oppfinnelsen angår også planteceller og planter som er ikke-vesentlig-biologisk-transformerte med et GS-inhibitor-inaktiverende gen ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukken utførelse av oppfinnelsen blir planteceller og planter ikke-biologisk-transformert med "sfr"-genet som beskrevet I det ovenstående.

Slike planteceller og planter har, på stabil måte integrert i deres genom, en ikke-varietet-spesifikk egenskap som gjør dem i stand til å produsere påviselige mengder av fosfinotricin-acetyl-transferase.

Denne egenskap gir de transformerte plantecellene og plantene en ikke-varietet-spesifikk enzymatisk aktivitet som er i stand til å inaktivere eller nøytralisere GS-inhibitorer slik som bialafos og PPT.

Følgelig gjøres planteceller og planter som er transformert Ifølge oppfinnelsen resistente mot de herbicide effektene til bialafos og beslektede forbindelser.

Siden bialafos først ble beskrevet som et fungicid, kan transformerte planter også beskyttes mot soppsykdommer ved sprøyting med forbindelsen flere ganger.

I en foretrukken utførelse blir bialafos eller beslektede forbindelser behandlet flere ganger, spesielt ved tidsintervaller på ca. 20-100 dager.

Oppfinnelsen angår også en ny fremgangsmåte for selektiv beskyttelse av en planteart mot soppsykdommer og selektiv ødeleggelse av ugress i et felt, omfattende behandling av et felt med et herbicid, hvor plantearten i sitt genom Inneholder et DNA-fragment som koder et protein som har en enzymatisk aktivitet som er i stand til å nøytralisere eller inaktivere GS-inhibitorer, og hvor det benyttede herbicid som aktiv bestanddel omfatter en GS-inhibitor.

Det skulle være klart at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan benyttes med den samme effektivitet, enten kun for å ødelegge ugress i et felt, dersom planter ikke er infisert med sopp, eller til bare å stoppe utviklingen av sopp, dersom denne viser seg etter ødeleggelse av ugress.

I en foretrukket utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen transformeres plantearter med et DNA-fragment omfattende "sfr"-genet som beskrevet ovenfor, og det benyttede herbicid er PPT eller en beslektet forbindelse.

Følgelig blir en oppløsning av PPT eller beslektet forbindelse påført over feltet, f.eks. ved sprøyting, flere ganger etter emergens av plantearten som skal dyrkes, inntil tidlig-og sent-spirende ugress er ødelagt.

Det skulle være klart at før emergens av plantearten som skal dyrkes, kan feltet behandles med et herbicidpreparat for å ødelegge ugress.

På samme måte kan felter behandles også før plantearten som skal dyrkes blir utsådd.

Før emergens av den ønskede plantearten kan felter behandles med et hvilket som helst tilgjengelig herbicid, inkludert herbicider av bialafos-typen.

Etter emergens av den ønskede plantearten påføres bialafos eller beslektet forbindelse flere ganger.

I en foretrukken utførelse påføres herbicidet ved tidsintervaller fra ca. 20 til 100 dager.

Siden planter som skal dyrkes er transformert på en slik måte at de tåler de herbicide effektene til herbicidene av bialafos-typen, kan felter behandles selv etter emergens av de dyrkede plantene.

Dette er spesielt nyttig for fullstendig å ødelegge tidlig-og sent-spirende ugress, uten noen effekt på de plantene som skal produseres.

Bialafos eller beslektet forbindelse blir fortrinnsvis påført ved en dose som varierer fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/ha, og fortynnet i en væskeformig bærer ved en konsentrasjon slik at dens påføring på feltet muliggjøres i en mengde varierende fra ca. 2 til ca. 8 l/ha.

Følgende eksempler illustrerer utførelser av foreliggende fremgangsmåte med forskjellige plantearter.

Sukkerroer

Den nord-europeiske sukkerroen plantes fra 15. mars opptil 15. april, avhengig av værforholdene og mer nøyaktig av nedbør og gjennomsnittstemperatur. Ugressproblemene er mer eller mindre de samme i hvert land og kan forårsake vanske-ligheter inntil avlingen lukker sitt bladverk omkring midten av juli.

Ugressproblemer kan oppdeles 1 tre situasjoner:

- tidlig spiring av gressaktig ugress,

- tidlig spring av bredbladet ugress,

- sen spring av bredbladet ugress.

Hittil har pre-emergens-herbicider blitt benyttet på vel-lykket måte. Slike forbindelser er f.eks. de som er kommersielt tilgjengelige under de registrerte varebetegnelser PYRAMIN<R>, GULTIX<R>og VENZAR<R>. Disse produkters følsomhet overfor tørre værforhold samt mangelen på restaktivitet for bekjempelse av sentspirende ugress, har imidlertid ledet gårdbrukeren til bruk av post-emergens-produkter i tillegg til pre-emergens-produktene.

Nedenstående tabell I angir de aktive bestanddelene som inneholdes i de herbicide preparatene angitt i følgende eksempler.

Ifølge oppfinnelsen består post-emergens-herbicider av bialafos eller beslektede forbindelse, som gir et godt nivå av vekstbekjempelse av ettårige gresstyper (Bromus, Avena spp. , Alopecurus, POA) og bredbladede typer (Galium, Polygonum, Senecio, Solanum, Mercurialis ). Post-emergens-herbicider kan påføres ved forskjellige tidspunkter i veksten av sukkerroe; ved et frøbladnivå, to-bladnivå eller et fire-bladnivå.

Nedenstående tabell II representerer mulige systemer for feltbehandling.

I de angitt eksempler er det benyttede post-emergens-herbicidet av klassen bialafos BASTA<R>, i kombinasjon med forskjellige pre-emergens herbicider. Konsentrasjoner er angitt i l/ha eller kg/ha.

Poteter

Poteter dyrkes i Europa på ca. 8*10^ Ha. Hovedproduktene som benyttes for ugressbekjempelse er Linuron/monolinuron eller den forbindelse som er kommersielt tilgjengelig under betegnelsen METRABUZIN.

Disse produktene virker godt mot de fleste ugressarter.

Ugress slik som Galium og Solanum samtt sentspirende Cheno-podium og Polygonum lar seg imidlertid ikke alltid bekjempes på effektiv måte, mens bekjempelse av de ettårige ugress-typene også noen ganger er feilslått.

Sentspirende bredbladede ugresstyper kan også her bare bekjempes ved hjelp av post-emergens-anvendelser av herbicider slik som BASTA<R>.

Tabell III i det nedenstående representerer noen eksempler på feltbehandling når det gjelder poteter.

organisms" (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) i GOtting-en, Tyskland). De fikk deponer ingsnr. DSM 3606 og DSM 3607, respektivt.

Ytterligere utførelse av oppfinnelsen er beskrevet i det følgende under henvisning til tegningene, hvor: Fig. 8 viser restriksjonskartet for et plasmid pJSl inneholdende et annet bialafos-resistensgen; Fig. 9 viser nukleotidsekvensen til "sfrsv"-genet inneholdende resistensgenet; Fig. 10 viser aminosyrehomologien til "sfrsv"-genet og "sfr"-genet, Fig. 11 viser konstruksjonen av et plasmid, gitt som eksempel, hvilket inneholder "sfrsv"-genet og er egnet for transformasjon av planteceller.

Et annet bialafos-resistensgen har blitt isolert fra en annen bialafos-produserende stamme, dvs. Streptomyces viridochromogenes. Dette andre resistensgenet er i det følgende betegnet "sf rsv"-genet.

Dette andre foretrukne DNA-fragmentet ifølge oppfinnelsen, for etterfølgende transformasjon av planteceller, består av en nukleotidsekvens som koder for i det minste en del av et polypeptid som har følgende sekvens:

hvilken del av nevnte polypeptid har tilstrekkelig lengde til å gi beskyttelse mot bialafos-"plantebeskyttendeevne", til planteceller ved genetisk inkorporering og ekspresjon deri. Det vil i det følgende også bli vist til den "plante-beskyttendeevnen" mot bialafos til ovennevnte nukleotidsekvens .

Betydningen av angivelsen av aminosyrer ved hjelp av en enkelt bokstav er som følger:

Dette andre foretrukne DNA-fragmentet består av følgende nukleotidsekvens:

eller en del derav som uttrykker et polypeptid som har plantebeskyttende evne mot bialafos.

I det følgende angis forsøk utført for isolering av "sfrsv"-resistensgenet, konstruksjonen av ekspresjonsvektorer som inneholder resistensgenet og som tillater etterfølgende transformasjon av planteceller, for å gjøre dem resistente overfor GS-inhibitorer.

Kloning av bialafos- reslstens-" sfrsv"- genet fra Streptomyces viridochromogenes

Stammen Streptomyces viridochomogenes DSM 40736 (ref. 1) ble dyrket og totalt DNA fra denne stammen ble fremstilt ifølge standardteknikker. DNA-prøver ble nedbrutt henholdsvis med Pstl, Smal og Sau3AI i tre forskjellige reaksjoner og separert på en agarosegel, sammen med plasmid DNA fra pGSRl (fig. 5B) nedbrutt med BamHI. I en Southern-analyse ble DNA'en blottet på et nitrocellulosefliter og hybridisert med det merkede BamHI-fragmentet fra pGSRl inneholdende "sfr"-genet. I alle fire feltene i gelen, viste et restriksjons-fragment sterk homolog! med proben: et Pstl-fragment på ca. 3 kb, et Smal-fragment på ca. 1,2 kb og Sau3AI-fragment på 0,5 kb. For å klone dette genet ble Pstl-restriksjonsfragmenter direkte klonet i Escherichia coli-vektoren pUC8. 3000 kolonier oppnådd etter transformasjon ble overført til nitrocellulosefilteret og hybridisert med "sfr"-proben. Positive kandidater ble ytterligere testet for deres vekst på minimal mediumplater inneholdende 300 pg/ml PPT. En trans-formant som vokste på PPT-holdig medium ble ytterligere analysert. Plasmidkartet og relevante restriksjonsseter i dette plasmidet pJSl er representert på fig. 8. Stammen MC1061 (pJSl) ble deponert den 26. mars 1987 ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) under deponeringsnr. DSM 4023. Klon-restriksjonsfragmentet har blitt sekvensert ifølge Maxam og Gilbert-metoden og det kodende området i genet kunne identifiseres gjennom homolog!. Sekvensen til "sfrsv"-genet er representert på fig. 9 og homologien på nukleotid- og aminosyresekvensnivået med "sfr"-genet er vist på fig. 10.

Ekpresjon av " sfrsv"- genet

En "sfrsv-genkassett" ble også konstruert for å tillate etterfølgende kloning i planteekspresjonsvektorer. Et Banll-BglII-fragment inneholdende det "sfrs"-kodende området uten initieringskodonet GTG ble isolert fra pJSl. Dette fragmentet ble ligert i vektoren pLK56-2 nedbrutt med Ncol og Baglll, sammen med et syntetisk oligonukleotid 5'-CATGAGCC-3' , lik det som er beskrevet for "sfr"-genet og vist på fig. 5. Konstruksjonen av pGSRlSV er vist skjematisk på fig. 11. Siden lignende kassetter av begge gener er tilstede i henholdsvis pGSRl og pGSRlSV, kan tidligere beskrevne konstruksjoner for ekspresjonen av "sfr"-genet i planter gjentas.

Enzymatisk analyse av råekstrakter fra E. coli-stammer inneholdende plasmid pGSRlSV demonstrerte syntesen av en acetylase som kan acetylere PPT. Dette ble vist ved tynn-sjiktskromatografi av reaksjonsproduktene.

"sfrsv"-genet ble deretter innsatt i plasmidvektoren pGSJ260 (fig. 4B) under kontroll av CaMV 35s promotoren, til dannelse av et plasmid pGS2SV, lik pGSR2 (fig. 6A) med unntagelse for at "sfrsv"-genet er innsatt istedenfor "sfr"-genet.

Det er klart at herbicid-resistensgener av den ovenfor angitte type kan oppnås fra mange andre mikroorganismer som produserer PPT eller PPT-derivater. Herbicid-resistensgen kan inkorporeres i planteceller for å beskytte dem mot innvirk- ningen av slike glutaminsyntetase-inhibitorer. F.eks. oppnås et bialafos-resistensgen fra Kitasotosporia (ref. 15).

Transformerte planteceller og planter som inneholder "sfrsv"-resistensgenet kan oppnås med plasmid pGSR2SV under anvendelse av det samme Agrobacterium-formidlede-transformasjons-system som beskrevet ovenfor for transformasjonen av forskjellige plantearter med "sfr"-genet.

Planter regenereres og testes med henblikk på deres resistens med lignende dusjingstester som beskrevet ovenfor. Alle planter oppførte seg likt og viste resistens mot herbicider bestående av glutaminsyntetase-inhibitorer.

Oppfinnelsen angår også kombinasjonen av de planter som er resistente overfor en inhibitor av glutaminsyntetase som definert ovenfor, med den tilsvarende inhibitor for glutamin-syntetase for bruk ved fremstilling av kulturer av nevnte planter som er frie for ugress.

REFERANSER

1. Bayer et al., Helvetica Chemica Acta, 1972

2. Wakabayashi K. og Matsunaka S., Proe. 1982, British Crop

Protection Conference, 439-450

3. M. Mason et al., Phytochemistry, 1982, vo. 21, n° 4,

s. 855-857 4. C.J. Thompson et al., Nature, 31. juli 1980, vol. 286, n<*>5 772, s. 525-527 5. C.J. Thompson et al., Journal of Bacteriology, august 1982, s. 678-685

6. C.J. Thompson et al., Gene 20, 1982, s. 51-62

7. C.J. Thompson et al., Mol. Gen. Genet., 1984, 195,

s. 39-43 8. Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1979, 76, s. 350-4 354

9. Methods of Enzymology, V.XLIII, s. 737-755

10. Deblaere H. et al., 1985, Nucl. Acid. Res. 13, 1477

11. Botterman J., februar 1986, Ph. D. Thesis, State

University of Ghent

12. Deblaere R., februar 1986, Ph. D. Thesis, Free Univesity of Brussel, Belgia 13. Velten et al., Embo J. 1984, vol. 3, n' 12, s. 2723-2730 14. Chater et al., Gene cloning in Streptomyces. Curr. Top.

Microbiol. Immunol., 1982, 96, s. 69-75

15. Omura et al., J. of Antibiotics, vol. 37, 8, 939-940, 1984

16. Murakami et al., Mol. Gen. Genet., 205, 42-50, 1986.

17. Manderscheid og Wild, J. Plant Phys., 123. 135-142, 1986.

Claims (58)

1. Fremgangsmåte for regulering av virkningen i planteceller og planter av en glutaminsyntetase-inhibitor ved kontakt hermed,karakterisert vedat man forsynes nevnte planter med en heterolog DNA som innbefatter en fremmed nukleotidsekvens som kan uttrykkes i form av et protein i plantecellene og plantene, under slike betingelser at nevnte heterologe DNA blir integrert stabilt gjennom generasjoner i cellene i nevnte planter, og ved at nevnte protein har en enzymatisk aktivitet som kan bevirke inaktivering eller nøytralisering av glutaminsyntetase-inhibitoren.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det heterologe DNA-fragmentet omfatter en fremmed nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har en PPT-acetyltransferase-aktivitet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1-2,karakterisertved at det heterologe DNA-fragmentet tilhører genomet til en Streptomyces.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3,karakterisert vedat det heterologe DNA-fragmentet omfatter en fremmed nukleotidsekvens som koder for følgende aminosyresekvens:

hvor X representerer MET eller VAL eller en del av et polypeptid av tilstrekkelig lengde til å inneha nevnte enzymatiske aktivitet og, når nevnte DNA-fragment er uttrykt i planteceller, til å beskytte sistnevnte mot den herbicide aktiviteten til glutaminsyntetase-inhibitorer.

5 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert vedat det heterologe DNA-fragmentet omfatter følgende nukleotidsekvens:

eller en del derav, som uttrykker et polypeptid som kan inaktivere nevnte glutaminsyntetase-inhibitor.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisert vedat initieringskodonet ATG innsettes istedenfor initieringskodonet GTG i sekvensen definert i krav 5.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3,karakterisert vedat det heterologe DNA-fragmentet omfatter en fremmed nukleotidsekvens som koder for følgende aminosyresekvens:

eller en del av et polypeptid av tilstrekkelig lengde til å være i besittelse av nevnte enzymatiske aktivitet og, når nevnte DNA-fragment er uttrykt i planteceller, til å beskytte sistnevnte mot den herbicide aktiviteten til glutamin-syntetase-inhibitorer .

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisertved at det heterologe DNA-fragmentet omfatter følgende nukleotidsekvens:

eller en del derav som uttrykker et polypeptid som kan inaktivere nevnte glutaminsyntetase-inhibitor.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av planter og reproduksjonsmateriale av nevnte planter innbefattende et heterologt genetisk materiale som er stabilt integrert deri og kan uttrykkes i nevnte planter eller reproduksjonsmateriale i form av et protein som kan inaktivere eller nøytralisere aktiviteten til en glutaminsyntetase-inhibitor,karakterisert vedde ikke-biologiske trinn omfattende fremstilling av planteceller eller plantevev innbefattende nevnte heterologe genetiske materiale fra start-planteceller eller -plantevev som ikke er i stand til å uttrykke nevnte inhiberende eller nøytraliserende aktivitet, regenerering av planter eller reproduksjonsmateriale av nevnte planter eller begge deler fra nevnte planteceller eller plantevev som omfatter nevnte genetiske materiale og, eventuelt, biologisk replikasjon av sistnevnte planter eller reproduksjonsmateriale eller begge deler, hvorved nevnte trinn for fremstilling av nevnte planteceller eller plantevev innbefattende nevnte heterologe genetiske materiale omfatter transformasjon av nevnte start-planteceller eller plantevev med en DNA-rekombinant inneholdende en nukleotidsekvens som koder nevnte protein samt de regulatoriske elementene valgt blant de som er i stand til å muliggjøre ekspresjon av nevnte nukleotidsekvens i nevnte planteceller eller plantevev og til å bevirke stabil integrasjon av nevnte nukleotidsekvens i nevnte planteceller og -vev, både i planten og reproduksjons-materialet produsert derfra gjennom generasjoner.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisertved at startcellene transformeres med en rekombinant DNA som inneholder fragmentet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8 rekombinert med heterolog DNA, og at nevnte rekombinante DNA mangler ethvert DNA-område som er involvert i biosyntesen av bialafos, når nevnte fragment selv skriver seg fra en bialafos-produserende stamme.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisertved at den rekombinante DNA er en vektor som er egnet for transformasjon av en cellevert og, når den er Innført deri, for tilveiebringelse av nøytralisering eller inhibering av glutaminsyntetase-inhibitorer.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisertved at vektoren omfatter nevnte rekombinante DNA under kontroll av replikonelementer egnet for transformasjon av bakterier, spesielt E. coli.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisertved at vektoren omfatter nevnte rekombinante DNA-fragment under kontroll av et plante-promotorområde, hvilken vektor ytterligere omfatter reguleringselementer som tillater ekspresjon av nevnte DNA-fragmenter i planteceller, når disse senere transformeres med nevnte vektor.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 10-13,karakterisert vedat den gir resistens mot herbicide effekter av bialafos, PPT eller beslektede derivater til transformerte planteceller.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13 eller 14,karakterisert vedat vektoren omfatter en nukleotidsekvens som koder et transittpeptid innføyet mellom nevnte plante-promotorområde og nevnte rekombinante DNA-fragment.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisertved at transittpeptidet velges fra ribolose-1,5-bifosfat-karboksylase og klorofyll a/b-bindingsproteiner.

17. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 11-16,karakterisert vedat nevnte vektor er et Tl-plasmid.

18. Planteceller, ikke-biologisk transformerte,karakterisert vedat de har, stabilt integrert i deres genom, et DNA-fragment som koder et protein som har en ikke-varietet-spesif ikk enzymatisk aktivitet som kan nøytralisere eller inaktivere glutaminsyntetase-inhibitorer.

19. Planteceller ifølge krav 18,karakterisertved at de kan utvikle en plante som kan produsere frø, hvor nevnte frø har en ikke-varietet-spesifikk enzymatisk aktivitet som kan inaktivere eller nøytralisere glutamin-syntetase-inhibitorer .

20. Planteceller ifølge krav 18 eller 19,karakterisert vedat de er transformert ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 9-17.

21. Planteceller ifølge et hvilket som helst av kravene 18-20,karakterisert vedat de produserer påviselige mengder av fosfinotricin-acetyltransferase.

22. Frø, ikke-biologisk transformerte,karakterisertved at har, stabilt integrert i deres genom, et DNA-fragment som koder et protein som har en ikke-varietet- spesifikk enzymatisk aktivitet som kan inaktivere eller nøytralisere glutaminsyntetase-inhibitorer.

23. Frø ifølge krav 22,karakterisert vedat de kan spire til en plante som kan produsere frø som har en ikke-varietet-spesif ikk enzymatisk aktivitet som kan inaktivere eller nøytralisere glutaminsyntetase-inhibitorer.

24 . Frø ifølge krav 22 eller 23,karakterisertved at de er transformert ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 9-17.

25 . Planter, ikke-biologisk transformerte,karakterisert vedat de har, stabilt integrert i deres genom, et DNA-fragment som koder et protein som har en ikke-varietet-spesif ikk enzymatisk aktivitet som kan nøytralisere eller inaktivere glutaminsyntetase-inhibitorer.

26. Planter ifølge krav 25,karakterisert vedat de kan produsere frø som har en ikke-varietet-spesif ikk enzymatisk aktivitet som kan inaktivere eller nøytralisere glutaminsyntetase-inhibitorer.

27. Planter ifølge krav 25 eller 26,karakterisertved at de er transformert ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 9-17.

28. Fremgangsmåte for beskyttelse av en planteart og selektivt ødeleggende ugress i et felt,karakterisertved at man behandler et felt med et herbicid, idet plantearten i sitt genom inneholder et DNA-fragment som koder et protein som har en enzymatisk aktivitet som kan nøytrali-sere eller inaktivere glutaminsyntetase-inhibitorer, og hvor det benyttede herbicid er en glutaminsyntetase-inhibitor.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28,karakterisertved at plantearten inneholder et DNA-fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 28 eller 29,karakterisert vedat plantearten er transformert ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 9-17.

31. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 28-30,karakterisert vedat en oppløsning av en glutaminsyntetase-inhibitor påføres på feltet, etter emergens av den dyrkede plantearten, flere ganger, spesielt ved tidsintervaller fra ca. 20 til 100 dager, inntil tidlig- og sentspirende ugress er ødelagt.

32. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 28-30,karakterisert vedat glutaminsyntetase-inhibitorene omfatter bialafos, fosfinotricin og beslektede forbindelser.

33. Fremgangsmåte for selektiv beskyttelse av en planteart i et felt mot soppsykdommer,karakterisert vedat man behandler et felt med et herbicid, idet plantearten i sitt genom inneholder et DNA-fragment som koder et protein som har en enzymatisk aktivitet som kan nøytralisere eller inaktivere glutaminsyntetase-inhibitorer og idet det benyttede herbicid er en glutaminsyntetase-inhibitor.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33,karakterisertved at plantearten inneholder et DNA-fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 33 eller 34,karakterisert vedat plantearten er transformert ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 9-17.

36. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 33-35,karakterisert vedat en oppløsning en glutaminsyntetase-inhibitor påføres på feltet, etter emergens av den dyrkede plantearten, flere ganger, spesielt ved tidsintervaller fra ca. 20 til 100 dager inntil sopp er utryddet.

37. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 33-36,karakterisert vedat glutaminsyntetase-inhibitoren velges fra en gruppe omfattende bialafos, fosfinotricin og beslektede forbindelser.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 32 eller 37,karakterisert vedat bialafos, PPT eller beslektede forbindelser påføres ved en dose varierende fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/ha.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 38,karakterisertved at bialafos, PPT eller beslektet forbindelse fortynnes i en væskebærer ved en konsentrasjon for derved å muliggjøre dens påføring på feltet i en mengde varierende fra ca. 2 til ca. 8 l/ha.

40. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 38-39, karakteriser,t ved at selektivt beskyttede plantearter omfatter sukkerroe, ris, potet, tomat, mais, tobakk.

41. Vektor,karakterisert vedat den inneholder et DNA-fragment som koder et polypeptid som har en enzymatisk aktivitet som kan bevirke inaktivering av glutaminsyntetase-inhibitorer.

42. Vektor ifølge krav 41,karakterisert vedat den er egnet for transformasjon av planteceller og planter.

43. Vektor ifølge krav 41 eller 42,karakterisertved at den inneholder et DNA-fragment som tilhører genomet i en Streptomyces.

44 . Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 41-43,karakterisert vedat den inneholder DNA-fragmentet rekombinert med heterolog DNA, hvor nevnte rekombinante DNA mangler ethvert DNA-område som er involvert i biosyntesen av bialafos.

45. Vektor ifølge krav 44,karakterisert vedat den er egnet for transformasjon av en cellevert og, når den er innført deri, er egnet for ekspresjon av et polypeptid som kan inaktivere glutaminsyntetase-inhibitor.

46. Vektor ifølge krav 45,karakterisert vedat DNA-fragmentet er under kontroll av replikonelementer som er egnet for transformasjon av bakterier, spesielt E. coli.

47. Vektor ifølge krav 46,karakterisert vedat DNA-fragmentet er under kontroll av et plante-promotorområde og av regulerende elementer som tillater ekspresjon av nevnte DNA-fragmenter i planteceller, når sistnevnte senere transformeres med nevnte vektor.

48. Vektor ifølge krav 47,karakterisert vedat den gir bialafos-resistens til de transformerte plantecellene .

49. Vektor ifølge krav 48,karakterisert vedat en sekvens som koder et transittpeptid er innskudd mellom nevnte plante-promotorområde og nevnte DNA-fragment.

50. Vektor ifølge krav 49,karakterisert vedat transittpeptidet er valgt fra ribulose-1,5-bifosfat-karboksylase og klorofyll a/b-bindingsproteiner.

51. Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 45-50,karakterisert vedat vektoren er et modifisert Ti-plasmid.

52. Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 41-51,karakterisert vedat den innbefatter følgende nukleotidsekvens:

53. Vektor ifølge krav 52,karakterisert vedat initieringskodonet ATG er innsatt istedenfor initieringskodonet GTG i sekvensen definert i krav 52.

54 . Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 41-51,karakterisert vedat den Innbefattende følgende nukleotidsekvens:

55. DNA-fragment, for etterfølgende transformasjon av planteceller, hvilket fragment koder for et polypeptid som har fosfinotricin-acetyl-transferase-aktivitet,karakterisert vedat det består av en nukleotidsekvens som koder for følgende aminosyresekvens:

hvor X representerer MET eller VAL, eller en del av nevnte nukleotidsekvens av tilstrekkelig lengde til å kode for et polypeptid som fremdeles har fosfinotricin-acetyl-transferase-aktivitet.

56 . DNA-fragment ifølge krav 55,karakterisertved det innbefatter følgende nukleotidsekvens:

eller en del derav som uttrykker et polypeptid som har fosfinotrlcln-acetyl-transferase-aktivitet.

57. DNA-fragment, for etterfølgende transformasjon av planteceller, hvilket fragment koder for et polypeptid som har fosflnotrlcin-acetyl-transferase-aktlvltet,karakterisert vedat det hestår av en nukleotidsekvens som koder for følgende aminosyresekvens:

eller av en del av nevnte nukleotidsekvens av tilstrekkelig lengde til å kode for et polypeptid som fremdeles har fosfinotricin-acetyl-transferase-aktivitet.

58. DNA-fragment ifølge krav 57,karakterisertved det omfatter følgende nukleotidsekvens:

eller omfatter en del derav som uttrykker et polypeptid som har fosfinotricin-acetyl-transferase-aktivitet.