BRPI0613111A2

BRPI0613111A2 - proteìnas bacterianas com atividade pesticida

Info

Publication number: BRPI0613111A2
Application number: BRPI0613111-5A
Authority: BR
Inventors: Mario Soberon-Chavez; Alejandra Bravo-De-La-Parra
Original assignee: Univ Mexico Nacional Autonoma
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2010-12-21
Also published as: EP1904521A2; CA2625061A1; US8822157B2; CN101300268A; US20140304855A1; WO2007007147A2; EP1904521B1; US20120255065A1; US8173871B2; ES2435079T3; US20090144854A1; WO2007007147A3

Abstract

PROTEìNAS BACTERIANAS COM ATIVIDADE PESTICIDA. A presente invenção refere-se a proteínas pesticidas, particularmente inseticidas, que se parecem com proteínas da camada S, assim como variantes ou mutantes das mesmas e DNAs que codificam as mesmas. Também são fornecidos processos e dispositivos para a utilização do dito DNA ou da proteína para o controle de pragas, particularmente pragas de insetos em vegetais. E enfatizado que este resumo é fornecido para estar de acordo com as regras que requerem um resumo que irão permitir que um pesquisador ou um outro leitor rapidamente se informe sobre a matéria em questão da descrição técnica. Ele é submetido com o entendimento de que ele não será usado para interpretar ou limitar o âmbito ou o significado das reivindicações.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS BACTERIANAS COM ATIVIDADE PESTICIDA".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se ao campo de controle de pragas,particularmente de controle de insetos. São fornecidas seqüências de DNArecombinantes que codificam proteínas pesticidas denominadas proteínasISLP e fragmentos tóxicos ou variações dos mesmos, que são úteis paraproteger organismos de danos causados por pragas, tal como a proteção deplantas de danos causados por insetos. São ainda fornecidas plantas quecompreendem uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteínaISLP da invenção, assim como métodos e meios para a utilização destasseqüências de ácidos nucléicos para a redução de danos causados por pra-gas, tais como os danos cauxados por insetos, às plantas.

Antecedentes

O uso de biopesticidas bacterianos tal como Bacillus thuríngien-sis (Bt) é uma alternativa viável para o controle de insetos na agricultura eoutras áreas (isto é, vetores de doenças) que intensificará a produção deplantas de cultivo de uma maneira economicamente sustentável e não hostilao ambiente. As proteínas Cry de Bt são altamente específicas, inofensivaspara seres humanos, vertebrados e plantas e são completamente biodegra-dáveis de forma que nenhum produto tóxico residual se acumula no ambien-te (Schnepf e outros, 1998). Até hoje, mais de 200 seqüências de genes cryforam determinadas e classificadas em 44 famílias e subclasses diferentes(Crickmore e outros, 1998, 2005). Adicionalmente, Bt produz um número decompostos extracelulares que poderiam contribuir para a virulência comofosfolipases, proteases, quitinases e outras toxinas tal como a β-exotoxinaou as proteínas VIP (Schnepf e outros, 1998).

Apesar da pesquisa extensiva ao longo das últimas décadas,apenas algumas toxinas inseticidas bacterianas são utilizadas em uma am-pia escala contra as pragas de insetos que mais danificam em aplicações decontrole de pragas, tais como as que utilizam Bt-plantas.

A camada S é uma estrutura ordenada de arranjo paracristalinoproteináceo, que cobre a superfície de muitas archaeas e eubactérias (Beve-ridge e outros, 1997; Sara e Sleytr, 2000) e pode constituir até 15% da prote-ína celular total. A função das proteínas da camada S não foi acuradamentedefinida, mas foi proposto que estas proteínas estão envolvidas na integri-dade celular e na manutenção do formato. Ainda, foi levantada a hipótese deque podem estar envolvidas na troca macromolecular com o ambiente umavez que constituem o componente de envelope celular mais externo (Beve-ridge e outros, 1997). Em algumas bactérias patogênicas gram-negativas,foram implicadas na virulência e na resistência à morte mediada pelo com-plemento (Sara e SLeytr, 2000; Pei e Blaser, 1990). Em B.cereus, a camadaS foi descrita como promovendo interações com leucócitos humanos e como hospedeiro, contribuindo com a patogenicidade (Kotiranta e outros, 1998).Em B. anthracis foi proposto que a camada Sea cápsula poderiam cooperarna interação com o hospedeiro (Mignot e outros, 2002).

Em B. anthracis foram descritas duas proteínas de Camada Sdiferentes (SAP e EA1) (Mignot e outros, 2002). A presença destas proteínasnão é necessária para o encapsulamento normal dos bacilos (Mesnage eoutros, 1998). Estas proteínas aparecem seqüencialmente de uma maneiradependente da fase de crescimento, com a síntese de SAP anterior a deEA1 (Mignot e outros, 2002). Em B. thuringiensis subs. galleria foi descritauma proteína de camada S, SIpA1 que é similar à SAP de B. anthracis. Aproteína CTC de camada S foi descrita em B. thuringiensis subsp. finitimus(número de acesso do GenBank AAR23791), esta proteína é similar à EA1de B. anthracis (Sun e outros, 20Ó1). A CTC possui um tamanho molecularde 100 kDa e forma corpos paraesporais durante a fase de esporulação docrescimento.

Xu e outros (2004) descrevem a presença de uma proteína de120 kDa em uma análise de SDS-PAGE de uma mistura de cristal/esporo deuma cepa de Bacillus thuringiensis esporulante. Foi observado que o sobre-nadante desta mistura de cristal/esporo, obtido após a dissolução, a centri-fugação e a diálise, prolonga a sobrevivência de camundongos injetadoscom uma amostra de sangue infecciosa de Plasmodium berghei. A seqüên-cia N-terminal (15 aminoácidos) da proteína de 120 kDa exibia 100% de ho-mologia com aquela da proteína da camada S de Bacillus thuringiensissubsp. galleria (relatado em Mesnage e outros, 1998). A seqüência de nu-cleotídeos do gene que codifica esta proteína não é fornecida, mas é ditoque codifica 821 resíduos de aminoácidos com um peso molecular deduzidode 87,5 kDa. Nenhuma proteína isolada ou purificada, nem um hospedeirorecombinante que produz esta proteína, foi testado aqui em relação a suaeficiência contra infecção de Plasmodium. Ainda, a cepa da qual tal misturade cristal/esporo foi isolada não foi depositada ou descrita especificamenteneste artigo.

Sumário da Invenção

São fornecidas nesta invenção proteínas ISLP pesticidas isola-das caracterizadas por:

a) serem especificamente pesticidas a algumas pragas e não aoutras, e

b) possuírem pelo menos 50% de identidade de seqüência comuma proteína de camada S bacteriana, assim como tais proteínas que pos-suem pelo menos 50% de identidade de seqüência com a proteína da SEQID NO: 2 ou um fragmento tóxico da mesma e que possui um peso molecularde aproximadamente 50 até aproximadamente 120 kDa.

São também fornecidas aqui as proteínas ISLP pesticidas quesão caracterizadas por:

a) serem especificamente inseticidas a alguns insetos e não aoutros,

b) possuírem pelo menos 70% de identidade de seqüência comuma proteína de camada S bacteriana,

c) um peso molecular de aproximadamente 50 até aproximada-mente 120 kDa, assim como tais proteínas que possuem pelo menos 75%de identidade de seqüência com a proteína da SEQ ID NO: 2 ou um frag-mento tóxico da mesma e que possuem um peso molecular de aproximada-mente 50 até aproximadamente 120 kDa.

É ainda fornecida de acordo com esta invenção uma proteínapesticida ISLP como definido anteriormente, que compreende a seqüênciade aminoácidos da SEQ ID NO: 2 partindo de uma posição de aminoácidoentre a posição de aminoácido 1 e a posição de aminoácido 31 até a posiçãode aminoácido 863 ou que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID NO: 2 partindo de uma posição de aminoácido entre a posição deaminoácido 1 e a posição de aminoácido 531 até a posição de aminoácido863, tal como uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID NO: 2.

São ainda incluídas aqui seqüências de DNA isoladas que codi-ficam qualquer uma das proteínas ISLP anteriores e genes quiméricos quecompreendem: a) uma seqüência codificadora que compreende tal DNA e b)um promotor que permite a expressão em células vegetais. Em uma modali-dade, tal gene quimérico compreende uma seqüência codificadora que éuma seqüência de DNA sintética que foi otimizada para a expressão em umaplanta hospedeira, particularmente, milho, algodão, soja, arroz, colza comsemente oleosa, couve-flor e repolho. São ainda fornecidos aqui vetores detransformação de plantas que compreendem tais genes quiméricos anterio-res.

Em uma outra modalidade desta invenção, é fornecida umaplanta, uma semente ou uma célula vegetal transgênica que compreendequalquer um dos genes quiméricos anteriores, particularmente uma planta,uma semente ou uma célula de milho, algodão, soja, arroz, colza com se-mente oleosa, couve-flor e repolho.

É também fornecido aqui um método de proteção das plantascontra danos causados por pragas de plantas, tais como pragas de insetos,que se alimento de espécies vegetais às quais as ditas plantas pertencem,que compreende a etapa de expressão de qualquer um dos genes quiméri-cos anteriores nas células das ditas plantas; assim como um método de pro-teção de plantas contra danos causados por pragas de insetos, tais comopragas de insetos, que se alimentam das espécies vegetais às quais as ditasplantas pertencem, que compreende a etapa de transformação de uma célu-la vegetal com qualquer um dos genes quiméricos anteriores, regenerando adita célula em uma planta e obtendo-se uma progênie e material de propa-gação da dita planta, tal como sementes, que compreendem qualquer umdos tais genes quiméricos.

É ainda fornecido nesta invenção um método para matar pragas,que compreende o contato das ditas pragas com qualquer uma das proteí-nas ISLP anteriores, particularmente quando tal praga for uma praga de in-seto; assim como um método para proteger um campo de plantas de pragastais como insetos, que compreende: a aplicação de qualquer uma das prote-ínas ISLP anteriores a um campo de plantas, na forma de uma composiçãopesticida que compreende tal proteína ou na forma de um organismo recom-binante que expressa a dita proteína, particularmente em que o dito orga-nismo é uma planta transgênica que expressa tal proteína.

É ainda fornecido aqui o uso de qualquer DNA que codificaqualquer uma das proteínas ISLP anteriores ou um fragmento tóxico dasmesmas ou qualquer um dos genes quiméricos anteriores ou qualquer umadas proteínas ISLP anteriores, para controlar ou matar as pragas, tais comopragas de insetos.

Descrição Detalhada das Modalidades da Invenção

A presente invenção fornece métodos e meios para a reduçãode danos às plantas causados por pragas, particularmente pragas de inse-tos, tais como pragas de insetos lepidópteros ou coleópteros. A presenteinvenção fornece novas seqüências de ácidos nucléicos e proteínas que sãodistintas das seqüências de ácidos nucléicos e das proteínas descritas ante-riormente. Estes ácidos nucléicos e proteínas podem ser utilizados para ocontrole de pragas tais como pragas de insetos, por exemplo, através daintegração e da expressão de pelo menos uma destas novas seqüências denucleotídeos em plantas ou células vegetais ou através do tratamento exter-no de plantas ou partes de plantas com composições que compreendem astoxinas codificadas por estas moléculas de ácidos nucléicos.

A presente invenção fornece novas toxinas pesticidas derivadasde cepas bacterianas e o uso das mesmas para controlar pragas, tais comoinsetos.De acordo com esta invenção, uma "seqüência de ácidos nucléi-cos" se refere a uma molécula de DNA ou de RNA, na forma de filamentosimples ou duplo, que codifica qualquer uma das proteínas ISLP desta in-venção. O termo "seqüência de ácido nucléico isolada", como utilizado aqui,não está limitado a uma seqüência de ácidos nucléicos em isolamento, mastambém abrange uma seqüência de ácidos nucléicos que não está mais noambiente natural de onde foi isolada. Assim, um "ácido nucléico (seqüência)de ISLP isolado" ou uma "proteína (seqüência) de ISLP isolada", de acordocom esta invenção, inclui o ácido nucléico ou a proteína (seqüência) em umoutro hospedeiro bacteriano, comparado com o organismo bacteriano origi-nal ou em um genoma nuclear vegetal.

De acordo com a presente invenção, o termo "proteína" ou "poli-peptídeo" é utilizado de forma intercambiável para se referir a uma moléculaque consiste em uma cadeia de aminoácidos, sem referência a qualquermodo de ação específico, tamanho, estrutura tridimensional ou origem. As-sim, um fragmento ou uma parte de uma proteína ISLP da invenção é tam-bém referida aqui como uma "proteína". A expressão "proteína isolada", co-mo utilizado aqui, não está limitada a uma proteína em isolamento, mas a-brange ainda uma proteína que não está mais em seu ambiente natural. Oambiente natural da proteína se refere ao ambiente em que a proteína pode-ria ser encontrada na natureza, isto é, na cepa da qual a seqüência de nu-cleotídeos foi originalmente isolada. Por exemplo, uma proteína isolada podeestar presente in vitro ou em um outro hospedeiro bacteriano ou em umacélula vegetal ou pode ser secretada de um outro hospedeiro bacteriano oude uma célula vegetal.

De acordo com esta invenção, as seqüências de ácidos nucléi-cos, incluindo as seqüências de DNA, que codificam novas proteínas ISLPforam isoladas e caracterizadas e novas formas são feitas artificialmenteatravés da síntese de DNA. Um gene ISLP específico descrito aqui foi de-nominado de islpl e sua proteína ISLP1 codificada.

De acordo com esta invenção, uma "ISLP" ou uma "proteína IS-LP" é uma proteína pesticida, particularmente inseticida, de aproximadamen-te 40 até aproximadamente 250 kDa, particularmente de aproximadamente50 até aproximadamente 120 kDa ou entre aproximadamente 60 até aproxi-madamente 100 kDa, especialmente uma proteína de aproximadamente 80ou aproximadamente 100 kDa, isolada ou derivada de bactérias, preferenci-almente bacilos, com pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%,pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85 ou 90%, de identidadede seqüência ou de similaridade de seqüência a uma proteína de camada Sconhecida, por exemplo, a proteína CTC2 de B. thuringiensis CTC (númerode acesso do GenBank AAR23791) e quaisquer fragmentos tóxicos (comodefinido aqui) ou variações dos mesmos tais como pré-proteínas, formasmaduras ou fusões com peptídeos sinais, a proteínas marcadoras selecio-náveis ou a outras proteínas pesticidas ou inseticidas. As variações de prote-ínas ISLP, como utilizado aqui, incluem proteínas pesticidas, preferencial-mente inseticidas, imunologicamente relacionadas com uma proteína ISLP,de forma que são reconhecidas por anticorpos que reconhecem as ISLPs.As ISLPs desta invenção se originam preferencialmente de ou são encontra-das dentro (ou sobre) bactérias da classe dos bacilos dentro da divisão Fir-micutes. Em uma outra modalidade desta invenção, as ISLPs desta inven-ção se originam de ou são encontradas dentro (ou sobre) bactérias da Or-dem Bacillales. Ainda em uma outra modalidade desta invenção, as ISLPsdesta invenção se originam de ou são encontradas dentro (ou sobre) bacté-rias da família Bacillaceae. Em uma modalidade adicional desta invenção, asISLPs se originam de ou são encontradas dentro (ou sobre) bactérias dogrupo Bacillus cereus ou dentro (ou sobre) bactérias do gênero Brevibacillusou Bacillus, preferencialmente Bacillus cereus, B. sphaericus, B. anthracis,B. Iicheniformis e B. thuringiensis. Uma proteína ISLP de acordo com estainvenção pode ser produzida na fase vegetativa e/ou na de esporulação dociclo de vida bacteriano e na natureza é tipicamente uma proteína secretada.De acordo com esta invenção, a toxicidade de uma proteína ISLP é prefe-rencialmente específica, de forma que a ISLP é tóxica apenas para algumaspragas, preferencialmente insetos e organismos e deixam os organismosque não são alvos, tais como mamíferos, inafetados. Em uma modalidadedesta invenção, a proteína ISLP não é tóxica aos mamíferos ou é facilmentedegradada nos sistemas digestivos de mamíferos.

Uma "proteína ISLP madura" como utilizado aqui, se refere auma proteína ISLP desta invenção que não possui seu peptídeo sinal bacte-riano. Uma proteína ISLP1 como utilizado aqui, pode ser uma proteína notamanho completo ou pode ser uma forma truncada contanto que a atividadepesticida, por exemplo, inseticida ou de controle de pragas, por exemplo, decontrole de insetos, seja mantida ou possa ser uma combinação de váriasproteínas ou domínios de proteína em uma proteína híbrida ou de fusão.

Em uma modalidade desta invenção, uma proteína ISLP é umaproteína pesticida, particularmente uma proteína inseticida, especificamentetóxica a algumas pragas, preferencialmente insetos, que é capaz de formarestruturas cristalinas tais como arranjos cristalinos ou camadas S sobre aparte externa de uma célula bacteriana na natureza. Em uma modalidade dainvenção, tais ISLPs podem ser freqüentemente isoladas ou co-purificadasem um procedimento para isolamento bacteriano, por exemplo, Bacillus thu-ringiensis (Bt), preparações de cristal/esporo, embora não tenham identidadede seqüência significativa, preferencialmente menor que 40%, menor que30% ou menor que 20% de identidade de seqüência, a toxinas pesticidas ouinseticidas bacterianas conhecidas tais como as proteínas Cry1 VIP ou Cytde Bacillus thuringiensis (ver Crickmore e outros, 1998 e 2005) ou a outrasproteínas pesticidas ou inseticidas conhecidas, tal como Bt. Estas ISLPs sãoencontradas na parte externa da parede celular bacteriana na natureza epodem ser liberadas no ambiente das bactérias ou esporos na esporulação.

Em uma modalidade, uma ISLP é uma proteína pesticida, parti-cularmente inseticida, que compreende três regiões de homologia na cama-da S (SLH), cada uma de tais regiões possuindo pelo menos 50% ou pelomenos 60% ou pelo menos 70%, particularmente pelo menos 85 ou 90%, deidentidade ou similaridade de seqüência com as regiões de homologia dacamada S na SEQ ID NO: 2. As "regiões de homologia com a camada S" daproteína ISLP da SEQ ID NO: 2, como utilizado aqui, são a região partindoda posição de aminoácido 34 até 76, a região partindo da posição de amino-ácido 95 até 136 e a região partindo da posição de aminoácido 162 até aposição de aminoácido 198 na SEQ ID NO: 2.

Esta invenção fornece ainda o uso de proteínas ISLP, como de-finido aqui, para o controle ou para matar pragas, tais como insetos, tal comoatravés da plantação de sementes ou do plantio de plantas que expressamuma proteína ISLP em um campo ou através da aplicação das proteínas IS-LP sobre plantas ou animais para protegê-los de pragas, tais como insetos.São também fornecidos processos para o aumento do rendimento ou paramelhorar a produtividade das plantas de cultivo, que compreendem a etapade cultivo de uma planta de cultivo que compreende um DNA que codificauma proteína ISLP da invenção.

De acordo com esta invenção, é fornecido um processo para oisolamento de proteínas ISLP de bacilos. Em uma modalidade, os bacilossão crescidos sem ou sem muitas etapas de subcultivo antes do isolamentodas proteínas ISLP, uma vez que um subcultivo prolongado pode diminuir aprodução de proteínas ISLP. Alternativamente, os bacilos partindo dos quaisas ISLPs serão isoladas, podem ser cultivados em uma praga susceptível,preferencialmente uma praga de inseto, por exemplo, através da aplicaçãodos mesmos em seu sistema digestivo ou hemolinfa. As proteínas ISLP pro-duzidas pelos bacilos podem ser então isoladas da praga, tal como um inse-to, por exemplo, de seu intestino ou hemolinfa, preferencialmente das pragasou insetos que morreram ou exibiram inibição de crescimento grave após aaplicação de bactérias produtoras de ISLP. Em tal processo, as bactériasque produzem ISLPs altamente tóxicas para uma certa praga-alvo, tal comouma praga de inseto, serão facilmente identificadas através de seus efeitosóbvios sobre tal praga-alvo. Ainda, uma praga-alvo preferida e um ambientede praga-alvo in vivo podem induzir níveis mais altos de proteínas ISLP.Freqüentemente as proteínas ISLP podem ser isoladas das bactérias, talcomo do sobrenadante de cultura, particularmente em culturas em esporula-ção e após a centrifugação ou similar as proteínas Cry de Bacillus thuringi-ensis são tipicamente enriquecidas e isoladas. Como utilizado aqui, o termo"bacilos" se refere a bactérias com formato de bastão. Estes incluem bacté-rias de Bacilli, Bacillales ou Bacillaceae, tais como bactérias do grupo deBacillus cereus ou bactérias do gênero Bacillus, por exemplo, Bacillus thu-ringiensis.

Em uma modalidade desta invenção, é fornecido um processopara o isolamento de novas proteínas ISLP pesticidas, preferencialmenteinseticidas, particularmente proteínas ISLP tóxicas a insetos Lepidópteros ouColeópteros. Tal processo compreende a etapa de seleção de bacilos pesti-cidas, preferencialmente inseticidas, preferencialmente Bt, culturas para ge-nes com alta similaridade de seqüência com as ISLPs, particularmente emcepas de bacilos pesticidas, por exemplo, inseticidas, preferencialmente ce-pas de Bt, negativas em relação aos genes Cry ou VIP na análise de PCR,particularmente em cepas que exibem toxicidade específica a algumas pra-gas, preferencialmente insetos, mas não a outras. Tais genes com alta simi-laridade de seqüência serão reconhecidos utilizando a tecnologia da PCR einiciadores específicos para ISLPs, tais como iniciadores direcionados paraas regiões de homologia da camada S de proteínas ISLP, por exemplo, asregiões de homologia da camada S de ISLP1. O gene correspondente podeentão ser isolado e a nova proteína ISLP produzida através da tecnologia deexpressão recombinante.

"kDa", como utilizado aqui, se refere ao tamanho em kiloDáltondo peso molecular de uma proteína. "kDa", como utilizado aqui com o termoaproximadamente ou se referindo a um número aproximado ("aproximada-mente 80 kDa"), se refere ao peso molecular observado no SDS-PAGE/Westem blotting padronizado de uma proteína quando comparadocom os padrões de peso molecular. O SDS-PAGE/Western blotting é reali-zado utilizando tecnologia padronizada. Preferencialmente, a proteína ou ofragmento de proteína é confirmado como uma proteína ISLP através de re-ação cruzada imunológica (por exemplo, Western blotting) ou através de su-as características (por exemplo, características de proteínas típicas das pro-teínas de camada S ou fragmentos das mesmas).

"Proteína de camada S" ou "proteína de camada de superfície",como utilizado aqui, se refere a uma proteína secretada da célula que a pro-duz e capaz de formar um arranjo ou entrelaçado cristalino sobre a superfí-cie de procariotos, particularmente bactérias. Tal entrelaçado é principalmen-te formado pela automontagem de subunidades de proteínas sobre a super-fície do procarioto de forma que são formadas camadas cristalinas planares.

Os exemplos são as proteínas de camada S descritas por Luckevich e Beve-ridge (1989), Sleytr e Beveridge (1999) e Mesnage e outros (2001), particu-larmente a proteína de camada S da cepa de Bt CTC, número de acesso doGenBank AAR23791.

Um exemplo de uma proteína ISLP é a proteína ISLP1 da inven-ção. De acordo com esta invenção, uma "proteína ISLP1" se refere a qual-quer proteína que compreende o menor fragmento tóxico da seqüência deaminoácidos da SEQ ID NO: 2 que mantém a atividade inseticida (posteri-ormente referida aqui como o "menor fragmento tóxico de ISLP1"), particu-larmente qualquer proteína inseticida que compreende a seqüência de ami-noácidos da SEQ ID NO: 2 partindo de um aminoácido entre a posição deaminoácido 1 e a posição de aminoácido 31 até a posição de aminoácido863 ou qualquer proteína inseticida que compreenda a seqüência de amino-ácidos da SEQ ID NO: 2 partindo de um aminoácido entre a posição de ami-noácido 1 e a posição de aminoácido 531 até a posição de aminoácido 863ou qualquer proteína inseticida que compreenda a seqüência de aminoáci-dos da digestão da protease do inseticida, particularmente da digestão datripsina, fragmento da proteína da SEQ ID NO: 2, particularmente uma prote-ína de aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50 ouaproximadamente 60 obtida através da digestão com tripsina partindo daproteína madura da SEQ ID NO: 2. Está incluída aqui uma fusão da proteínaISLP1 com um peptídeo sinal vegetal, tal como um peptídeo de trânsito decloroplasto, para produzir uma proteína de fusão. Isto inclui proteínas híbri-das ou quiméricas que compreende o menor fragmento tóxico da seqüênciade aminoácidos da SEQ ID NO: 2. É incluída na proteína ISLP1, como Litili-zado aqui, um fragmento proteolítico inseticida, preferencialmente um frag-mento de digestão da tripsina, da proteína da SEQ ID NO. 2 ou qualquerfragmento eficaz como inseticida da proteína da SEQ ID NO. 2, assim comovariações ou equivalentes do mesmo que possuem alguns aminoácidos de-letados, adicionados ou substituídos enquanto ainda mantêm toda ou a mai-or parte da atividade inseticida da proteína ISLP1. É ainda incluída uma pro-teína ISLP madura, que não possui seu peptídeo sinal ou que possui o pep-tídeo sinal substituído por uma Metionina ou por um dipeptídeo de Met-Alaou Met-Asp.

Estão ainda incluídas nesta definição variações da seqüência deaminoácidos na SEQ ID NO: 2, tais como seqüências de aminoácidos es-sencialmente similares à SEQ ID NO: 2, possuindo uma identidade de se-qüência de pelo menos 70% ou pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,97%, 98% ou 99% no nível de seqüência de aminoácidos. No contexto dapresente invenção, "identidade de seqüência" pode ser determinada utilizan-do alinhamentos em pares utilizando o programa GAP do pacote Wisconsindo GCG (Madison, Wisconsin, EUA, versão 10.2). O programa GAP é utili-zado com os parâmetros a seguir para as comparações das seqüências deaminoácidos: a matriz de classificação 'blosum62', uma 'penalidade de cria-ção de espaço1 (ou 'peso do espaço') de 8 e uma 'penalidade de extensãode espaço1 (ou 'peso do comprimento1) de 2. As proteínas inseticidas de a-cordo com a presente invenção possuem alguns aminoácidos adicionados,substituídos ou deletados sem alterar significativamente ou sem diminuir, aatividade inseticida da proteína.

Como utilizado aqui, o termo "compreendendo" deve ser inter-pretado como especificando a presença das características, dos númerosinteiros, das etapas ou dos componentes citados como referido, mas nãoimpede a presença ou a adição de uma ou mais características, númerosinteiros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Assim, a referênciacontida aqui ao DNA ou à proteína "que compreende a seqüência ou a regi-ão X" se refere a um DNA ou a uma proteína que inclui ou contém pelo me-nos a seqüência ou a região X, de forma que outras seqüências de nucleotí-deos ou de aminoácidos possam ser incluídas na extremidade a 5' (ou N-terminal) e/ou a 3' (ou C-terminal). Por exemplo, uma seqüência de nucleotí-deos pode compreender a seqüência de nucleotídeos que codifica um peptí-deo de trânsito e/ou uma seqüência líder a 5' ou a 3'.

Um "fragmento tóxico" de uma proteína ISLP1 como utilizadoaqui, é um fragmento ou uma parte de uma proteína ISLP que mantém parteou toda, preferencialmente a maior parte, da toxicidade da proteína ISLPmadura pesticida, preferencialmente inseticida. Tipicamente, tal fragmentotóxico é obtido através da clivagem do peptídeo sinal ou através da digestãoenzimática da proteína de comprimento completo ou madura, por exemplo,através da digestão com as enzimas intestinais da praga, preferencialmenteinseto, tal como a tripsina, a quimiotripsinâ ou outras proteases ativas nosistema digestivo de uma praga-alvo, tais como as enzimas digestivas dointestino médio do inseto-alvo. Tipicamente tal fragmento tóxico possui umpeso molecular de aproximadamente 40 até aproximadamente 80 kDa, pre-ferencialmente de aproximadamente 50 ou de aproximadamente 60 kDa. Umfragmento tóxico da proteína ISLP1 desta invenção é um fragmento de di-gestão pela tripsina de aproximadamente 50 kDa. O "menor fragmento tóxi-co" de uma proteína ISLP é o menor fragmento tóxico da proteína ISLP. Talmenor fragmento tóxico pode ser obtido através da clivagem enzimática ouatravés da expressão do DNA de islp com deleções de nucleotídeos. O DNAque codifica os fragmentos tóxicos de ISLP também pode ser sintetizadoquimicamente; assim, os fragmentos tóxicos que podem ser obtidos partindoda transcrição e da tradução do DNA sintético são incluídos na definição defragmento tóxico. Qualquer proteína que compreende o menor fragmentotóxico de ISLP é útil nesta invenção e não apenas a proteína ISLP originalou madura, uma vez que as seqüências de aminoácidos não necessáriaspara a toxicidade podem ser deletadas ou podem ser substituídas por outrasseqüências enquanto mantém as características da proteína ISLP.

Os fragmentos tóxicos das proteínas ISLP também podem serobtidos através da quebra e da solubilização das proteínas ISLP no momen-to da autólise das bactérias, por exemplo, no sistema digestivo de uma pra-ga, tal como o intestino médio de um inseto ou após a esporulação em cultu-ras in vitro. Fragmentos mais solúveis menores que ainda são imunologica-mente detectados com anticorpos anti-ISLP aparecem e podem ser identifi-cados ou isolados após a autólise utilizando tecnologias de rotina tal como apurificação mediada por anticorpos.

Uma "praga-alvo", como utilizado aqui, é uma praga, preferenci-almente um inseto, que pode ser morto ou negativamente afetado (por e-xemplo, seu crescimento é inibido) por uma ISLP. Esta praga ou inseto exibetoxicidade acima dos níveis de controle, quando infectado ou alimentadocom bactérias que produzem esta proteína ISLP ou quando alimentado comuma dieta que contém a proteína ISLP isolada.

Os insetos-alvo Lepidópteros possíveis para as proteínas ISLPda invenção incluem, mas não estão limitados a lagarta da espiga de milho(Helicoverpa zea), lagarta da cápsula de algodão (Helicoverpa armigera),lagarta de botões de algodão nativa (Helicoverpa punctigera), lagarta do bro-to de tabaco (Heliothis virescens), broca européia do milho (Ostrinia nubila-lis), lagarta do cartucho (Spodoptera frugiperdá), lagarta-rosca (Agrotis ipsi-lor7), lagarta rosada (Pectinophora gossypiella), broca amarela-do-colmo(Seirphophaga ineertulas), enrolador de folhas (Cnaphalocrocis medinalis),broca rosada (Sesamia inferens), broca-pontuda-do-colmo de milho (Chilopartellus), lagarta da soja (Antiearsia gemmatalis), lagarta mede palmos dasoja (Pseudoplusia ineludens), broca das axilas (Epinotia aporema) e Rachi-plusia nu.

Outros insetos-alvo possíveis para as proteínas ISLP da inven-ção são selecionados da lista que consiste em: Plathypena seabra, Spodop-tera exígua, Spodoptera ornithogalli, Chilo suppressalis, Hereitogramma Iica-risalis, Naranga aeneseens, Myealesis gotama, Marasmia patnalis, Marasmiaexigua, Marasmia ruralis, Nymphula depunetalis, Seirpophaga innotata, Spo-doptera litura, Chilo poliehrysus, Rupela albinella, Diatraea saecharalis, Spo-doptera frugiperdá, Mythimna unipuneta, Chilo zaeeonius e Parnara guttata,Agelastiea alni, Hypera postiça, Hypera brunneipennis, Haltiea tombaeina,Anthonomus grandis, Tenebrio molitor, Triboleum eastaneum, Dieladispaarmigera, Triehispa seriea, Oulema oryzae, Colaspis brunnea, Lissorhorptrusoryzophilus, Phyllotreta crueiferae, Phyllotreta striolata, Psylliodes punctula-ta, Entomoscelis americana, Meligethes aeneus, Ceutorynchus sp., Psyllio-des chrysocephala, Phyllotreta undulata, Leptinotarsa decemlineata, Diabro-tica undecimpunctata undecimpunctata, Diabrotica undecimpunctata howar-di, Diabrotica barberi e Diabrotica virgifera.

Como utilizado aqui, o termo "DNA de islp" ou "DNA de ISLP" serefere a qualquer DNA que codifica uma proteína ISLP, tal como um DNAque codifica a "proteína ISLP1" como definido anteriormente, por exemplo, oDNA de islpl mostrado na SEQ ID NO: 1, particularmente partindo da posi-ção de nucleotídeo 325 até a posição de nucleotídeo 2913, preferencialmen-te partindo da posição de nucleotídeo 412 até a posição de nucleotídeo2913. Este inclui seqüências de DNA que ocorrem naturalmente, artificiaisou sintéticas que codificam a proteína da SEQ ID NO: 2 ou seus fragmentostóxicos ou variações como definido anteriormente. São também incluídasaqui as seqüências de DNA que codificam proteínas inseticidas, que sãosimilares o suficiente a um DNA que codifica uma proteína ISLP da invençãoque podem (isto é, têm a capacidade de) se hibridizar a estas seqüências deDNA sob condições de hibridização estringentes.

São também incluídos na invenção quaisquer promotores degenes islp isolados de acordo com esta invenção e seu uso, por exemplo, aregião promotora do DNA de islpl da SEQ ID NO: 1, que pode fornecerpromotores poderosos para expressão bacteriana. O promotor do DNA islplcomo utilizado aqui compreende a seqüência da SEQ ID NO: 1 partindo daposição de nucleotídeo 1 até a posição de nucleotídeo 324.

"Condições de hibridização estringentes", como utilizado aqui, serefere particularmente às condições a seguir: imobilização do DNA relevanteem um filtro e pré-hibridização dos filtros durante 1 até 2 horas em 50% deformamida, 5% de SSPE, 2x reagente de Denhardt e 0,1% de SDS a 42°Cou 1 até 2 horas em 6x SSC, 2x reagente de Denhardt e 0,1% de SDS a68°C. A sonda marcada (com Digoxigenina ou radioativamente) desnaturadaé então adicionada diretamente no fluido de pré-hibridização e a incubação érealizada durante 16 até 24 horas à temperatura apropriada mencionadaanteriormente. Após a incubação, os filtros são então lavados durante 30minutos à temperatura ambiente em 2x SSC, 0,1% de SDS, seguidos por 2lavagens de 30 minutos cada a 68°C em 0,5 χ SSC e 0,1% de SDS. Umaauto-radiografia é estabelecida através da exposição dos filtros durante 24até 48 ao filtro de raio X (Kodak XAR-2 ou equivalente) a -70°C com umatela intensificadora (20x SSC = 3 M de NaCI e 0,3 M de citrato de sódio;100x reagente de Denhardt= 2% (p/v) de albumina de soro bovino, 2% (p/v)de Ficoll® e 2% (p/v) de polivinilpirrolidona; SDS = dodecil sulfato de sódio;20x SSPE= 3,6 M de NaCI, 02 M de fosfato de sódio e 0,02 M de EDTA pH7,7). Um perito versado na técncia será facilmente capaz de modificar ascondições e os parâmetros particulares especificados anteriormente enquan-to manterá as condições de hibridização estringentes desejadas.

Há muitas abordagens conhecidas na técncia para o isolamentode variações das seqüências de DNA da invenção. Por exemplo, as varia-ções podem ser detectadas e isoladas de cepas bacterianas, por exemplo,bacilos, particularmente Bacillus spp., através da hibridização que é descritasupra e/ou através da tecnologia da PCR, que é conhecida na técncia. Inici-adores específicos ou degenerados podem ser produzidos para regiões dasseqüências de DNA de islp e utilizados para amplificar variações de cepasbacterianas conhecidas ou novas.

As variações do DNA de islp da invenção incluem seqüências deDNA que codificam as variações da proteína ISLP descritas anteriormenteou uma seqüência de DNA, que codifica uma proteína inseticida, com pelomenos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, 80% ou 90% de identidadede seqüência com um DNA de islp da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1,preferencialmente partindo da posição de nucleotídeo 412 até a posição denucleotídeo 2913. As identidades de seqüência referidas são calculadas uti-lizando o programa GAP do pacote Wisconsin do GCG (Madison, Wisconsin,EUA) Versão 10,2. O programa GAP é utilizado com os parâmetros a seguirpara ácidos nucléicos: a matriz de classificação "nwsgapdna", uma "penali-dade de criação de espaço" (ou "peso do espaço") de 50 e uma "penalidadede extensão de espaço" (ou "peso do comprimento") de 3. As condições dehibridização estringentes são como definido anteriormente.

"Atividade inseticida" de uma proteína ISLP, como utilizadoaqui, significa a capacidade de tal proteína de matar insetos quando tal pro-teína é fornecida como alimento aos insetos, preferencialmente através daexpressão em um hospedeiro tal como uma planta. É entendido que umaproteína possui atividade inseticida se esta tiver a capacidade de matar oinseto durante pelo menos um de seus estágios do desenvolvimento, prefe-rencialmente o estágio larvar.

"Quantidades que controlam insetos" de uma proteína, comoutilizado aqui, se refere a uma quantidade de proteína que é suficiente paralimitar os danos em uma planta, causados por insetos em qualquer estágiodo desenvolvimento (por exemplo, larvas de insetos) que se alimentam detal planta, em níveis comercialmente aceitáveis. A limitação dos danos cau-sados por insetos a uma planta pode ser o resultado, por exemplo, da mortedos insetos ou da inibição do desenvolvimento, da fertilidade ou do cresci-mento dos insetos de tal maneira que o inseto causa menos danos a umaplanta e o rendimento da planta não é significativamente afetado de formaadversa. Como utilizado aqui, "controlar" insetos significa a obtenção de pelomenos uma inibição de crescimento, um retardo no desenvolvimento ou umainibição da fertilidade significativa (acima dos valores de controle) de taisinsetos quando tratados com a proteína ISLP da invenção.

De acordo com esta invenção, os insetos susceptíveis às novasproteínas ISLP da invenção são colocados em contato com esta proteína emquantidades que controlam os insetos, preferencialmente quantidades inseti-cidas. Os insetos-alvo preferidos para as proteínas desta invenção são pra-gas de insetos que causam danos econômicos do milho, do algodão, do ar-roz, da soja, de plantas vegetais, de plantas de espécies de Brassica, deBrassica napus, de couve-flor, de cenoura, de ervilha, de trigo, de cevada,de centeio, de tomate, de batata, de beterraba de açúcar, flores de corte, derosas, de plantas de frutos (maçã, pêra, pêssego, morango etc.), de árvores(tais como choupo e salgueiro) e de alface, particularmente na Europa, nospaíses da América do Norte e do Sul, Ásia e Austrália. O termo "planta", co-mo utilizado aqui, abrange plantas inteiras assim como partes de plantas,tais como folhas, caules, sementes, flores ou raízes."Atividade pesticida" de uma proteína ISLP, como utilizado aqui,se refere à atividade de uma proteína de matar, causar doença, inibir o cres-cimento ou afetar negativamente de outra maneira todo ou parte de orga-nismo de praga de plantas ou de animais, tal como certos artrópodes, áca-ros, afídeos, moscas, bactérias, vírus, fungos etc. Um organismo de pragade plantas ou de animais, como utilizado aqui, é qualquer organismo vivoque causa danos a uma planta ou a um animal, incluindo seres humanos,causando infecções, doenças ou morte em partes ou toda a planta ou o ani-mal ou inibindo de outra maneira o crescimento, mutilando ou afetando deforma negativa tal planta ou animal, preferencialmente estes são organismosmenores tais como invertebrados. Um organismo vetor capaz de passar umorganismo de praga para uma planta ou um animal, é também consideradoum organismo de praga como utilizado aqui, por exemplo, pragas tais comomosquitos e baratas.

A seqüência de ácidos nucléicos, particularmente a seqüênciade DNA, que codificam uma proteína ISLP desta invenção pode ser produzi-da sinteticamente e pode ser inserida em vetores de expressão para produ-zir altas quantidades de proteínas ISLP. As proteínas ISLP podem ser utili-zadas para preparar anticorpos monoclonais ou policlonais específicos deuma maneira convencional (Hõfte e outros, 1988; Harlow e Lane, 1988).

Em uma modalidade da invenção, são fornecidos anticorpos quese ligam especificamente à proteína ISLP. Em particular, são fornecidos an-ticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam a uma proteína ISLP ou afragmentos ou variações da mesma. Estão também incluídos fragmentos deanticorpos monoclonais ou policlonais, que mantêm a capacidade de se liga-rem à proteína ISLP ou a um fragmento contra o qual foram produzidos (porexemplo, anticorpos de cadeia isolada). Um anticorpo para uma proteínaISLP pode ser preparado através da utilização da proteína ISLP na forma deum antígeno em um animal (tal como coelho ou camundongo), utilizandométodos conhecidos na técncia. Os métodos adequados para a preparaçãode anticorpos incluem os descritos em Harlow e Lane "Using Antibodies: ALaboratory Manual" (Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998); e em Liddell e Cryer "A Practical Guide to Monoclonal Antibodies"(Wiley e Sons, 1991). Os anticorpos podem ser utilizados para isolar, identi-ficar, caracterizar ou purificar a proteína ISLP a qual se ligam. Por exemplo,o anticorpo pode ser utilizado para detectar a proteína ISLP em uma amos-tra, permitindo que o anticorpo e a proteína formem um complexo imunológi-co e detectando a presença do complexo imunológico, por exemplo, atravésde ELISA ou immunoblots.

Em uma modalidade adicional da invenção são fornecidos inici-adores e/ou sondas para PCR e kits para a detecção das seqüências deDNA de ISLP. Os pares de iniciadores da PCR (em que cada iniciador tempelo menos 15 até 25, preferencialmente pelo menos 18 ou 20 nucleotídeosde comprimento) para a amplificação do DNA de ISLP otimizado de plantadesta invenção de amostras podem ser sintetizados com base na seqüênciada ISLP, por exemplo, na seqüência de ISLP1, através de métodos conheci-dos na técncia (ver, por exemplo, Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Pri-mer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; e McPher-son e outros (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primeira Edi-ção, Springer Verlag, Alemanha). Similarmente, os fragmentos de DNA daseqüência da SEQ ID NO: 1, particularmente partes de regiões com alta ho-mologia em várias proteínas de camada S bacterianas, preferencialmente debacilos, tal como a região SLH (Mesnage e outros, 2001, Microbiology 147,1343-1351) tal como a região SLH de ISLP1 descrita anteriormente, podemser utilizadas como sondas de hibridização. Um kit de detecção de ISLP po-de compreender iniciadores específicos para ISLP ou sondas específicaspara ISLP e um protocolo associado para uso dos iniciadores ou da sondapara detectar o DNA de ISLP em uma amostra. Por exemplo, tal kit de de-tecção pode ser utilizado para determinar se uma planta foi transformadacom um gene que codifica uma proteína ISLP (ou parte da mesma) da in-venção.

Devido à degeneração do código genético, alguns códons deaminoácidos podem ser substituídos por outros sem alterar a seqüência deaminoácidos da proteína. Além disso, alguns aminoácidos podem ser substi-tuídos por outros aminoácidos equivalentes sem alterar ou sem alterar signi-ficativamente a atividade pesticida, preferencialmente inseticida, da proteínaou pelo menos sem diminuir a atividade pesticida, preferencialmente inseti-cida, da proteína. Por exemplo, as substituições de aminoácidos incluem atroca de aminoácidos dentro das categorias: básicos (por exemplo, Arg, His,Lys), ácidos (por exemplo, Asp, Glu), não polares (por exemplo, Ala, Vai,Trp, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp, Gly) e polares (por exemplo, Ser, Thr, Tyr,Cys, Asn, Gln). Tais substituições dentro das categorias se encaixam dentrodo âmbito da invenção contanto que a atividade pesticida da proteína ISLPseja substancialmente a mesma ou não seja diminuída além do nível neces-sário para a obtenção do controle da praga, tal como o controle de insetos.

Em adição, substituições de aminoácidos não conservativas se encaixamdentro do âmbito da invenção contanto que a atividade pesticida da proteínaISLP seja substancialmente a mesma ou não seja diminuída. As variaçõesou os equivalentes das seqüências de DNA da invenção incluem as seqüên-cias de DNA que codificam uma ISLP como definido aqui, que se hibridizamcom a seqüência de DNA de ISLP da SEQ ID NO: 1 sob condições de hibri-dização estringentes. Tais variações ou equivalentes devem codificar umaproteína com as mesmas ou substancialmente as mesmas característicaspesticidas que a proteína desta invenção, enquanto outras características talcomo a estabilidade térmica ou a susceptibilidade à clivagem por proteasepodem ser alteradas. Em alguns casos pode ser preferido ter disponível umaISLP tóxica com a mesma ou uma toxicidade aproximadamente similar, mascom uma estabilidade térmica menor ou com maior sensibilidade à pepsina etais variações podem ser produzidas através de processos conhecidos paramutagênese aleatória e seleção ou através de mutagênese direcionada aosítio de uma proteína ISLP desta invenção, por exemplo, através da introdu-ção de sítios de clivagem pela pepsina em uma proteína ISLP (ver, WO02074799). As variações ou os equivalentes, como utilizado aqui, incluemainda seqüências de DNA que possuem um uso diferente de códons compa-rado com o de genes ISLP nativos desta invenção, mas que codificam umaproteína com a mesma atividade pesticida e com a mesma ou substancial-mente a mesma seqüência de aminoácidos. As seqüências de DNA de ISLPpodem ter os códons otimizados através da adaptação do uso de códons aaqueles mais preferidos nos genes vegetais, particularmente nos genes nati-vos ao gênero ou à espécie vegetal de interesse, isto é, nos quais a expres-são da proteína ISLP é desejada utilizando tabelas de uso de códons dispo-níveis (por exemplo, mais adaptados para a expressão no algodão, na soja,no milho ou no arroz).

Para a expressão em plantas ou outros eucariotos, filamentoslongos de nucleotídeos AT ou GC (por exemplo, filamentos de 6 ou maisnucleotídeos A ou T ou filamentos de 6 ou mais nucleotídeos G ou C) sãoevitados, removidos ou reduzidos nos genes ISLP da invenção e sítios derestrição adequados podem ser introduzidos.

Em adição, o terminal N de uma proteína ISLP pode ser modifi-cado para ter um contexto de início da tradução ótimo, adicionando ou dele-tando assim um ou mais aminoácidos no N-terminal da proteína. Na maiorparte dos casos, é preferido que as proteínas da invenção sejam expressasem células vegetais começando com um dipeptídeo Met-Asp ou Met-Ala pa-ra o início ótimo da tradução, requerendo algumas vezes assim a inserçãono DNA de ISLP de um códon que codifica um aminoácido Asp ou Ala a ju-sante do códon de início como um novo segundo códon (se tal segundo có-don já não for Ala ou Asp).

As seqüências de DNA também podem ser modificadas pararemover sítios de processamento ou sinais de término da transcrição ilegíti-mos. Uma vez que os genes bacterianos podem conter motivos que são re-conhecidos em outros hospedeiros, especialmente no hospedeiro eucarióticotal como plantas, como os sinais de processamento a 5' ou a 3' ou sinais detérmino da transcrição, a transcrição em tais outros hospedeiros pode serineficaz ou pode ser terminada prematuramente. Os sítios de processamentoou os sinais de término da transcrição ilegítimos podem ser identificados a-través de uma análise baseada em computador das seqüências de DNAe/ou através da análise de PCR que são conhecidas na técncia.

Qualquer seqüência de DNA que difere em seu uso de códons,mas que codifica a mesma proteína ou uma proteína similar com substanci-almente a mesma atividade pesticida pode ser construída, dependendo dafinalidade particular. Foi descrito em sistemas de expressão em procariotose em eucariotos que a alteração do uso de códons para aquele da célulahospedeira possui benefícios para a expressão gênica em hospedeiros es-tranhos (Bennetzen & Halll 1982; Itakura e outros, 1977). As tabelas de usode códons estão disponíveis na literatura (Wada e outros, 1990; Murray eoutros, 1989) e nos bancos de dados principais de seqüências de DNA (porexemplo, EMBL em Heidelberg, Alemanha) e como descrito por Nakamura eoutros (2000). Conseqüentemente, um versado na técncia pode facilmenteconstruir seqüências de DNA sintéticas de forma que as mesmas ou subs-tancialmente as mesmas proteínas sejam produzidas. É evidente que se-qüências de DNA alternativas podem ser produzidas uma vez que a seqüên-cia de aminoácidos das proteínas ISLP desta invenção é mostrada. Tais se-qüências de DNA alternativas incluem seqüências de DNA sintéticas ou se-mi-sintéticas que foram alteradas para inativar certos sítios no gene. Estainativação pode ser realizada, por exemplo, através da adaptação do uso decódons geral aquele de um organismo hospedeiro mais relacionado, tal co-mo aquele do organismo hospedeiro em que a expressão é desejada. Váriastécnicas para a modificação do uso de códons para o preferido pelas célulashospedeiras podem ser encontradas na literatura de patentes e científica. Ométodo extado de modificação do uso de códons não é crítico para esta in-venção contanto que a maior parte ou todas as seqüências reguladoras críp-ticas ou elementos de processamento (tais como sinais de poliadenilação esítios de processamento da planta) tenham sido substituídos por outras se-qüências e preferencialmente o conteúdo de AT da região codificadora seaproxime aquele do organismo hospedeiro.

Pequenas modificações em uma seqüência de DNA tais comoas descritas anteriormente podem ser feitas rotineiramente, por exemplo,através da mutagênese mediada pela PCR (Ho e outros, 1989, White e ou-tros, 1989). Modificações mais substanciais em uma seqüência de DNA po-dem ser feitas rotineiramente através da síntese de DNA de novo de umaregião codificadora desejada utilizando técnicas disponíveis.

A expressão "substancialmente a mesma", quando utilizada a-qui, em referência à seqüência de aminoácidos de uma proteína ISLP, serefere a uma seqüência de aminoácidos que difere em não mais que 5% ounão mais que 2%, da seqüência de aminoácidos da proteína com a qual écomparada (em relação à região do mesmo comprimento, se uma proteínafor menor). Quando se faz referência à toxicidade de uma proteína ISLP, aexpressão "substancialmente a mesma" se refere a uma proteína cujo valormédio de LC5O difere em não mais que um fator de 2 até 5, preferencialmen-te 2, do valor médio de LC5O obtido para a proteína com a qual é comparada.Neste contexto, 11LC50 média" é a concentração de proteína que causa 50%de mortalidade da população de teste, calculada partindo de três ensaiosbiológicos independentes realizados utilizando as mesmas condições de en-saios biológicos. Os valores de LC50 são calculados com a análise Probit,utilizando o programa POLO PC (da LeOra Software, 1987, Berkely, Califór-nia). É entendido que limites de confiança de 95% (ou 90%) (um parâmetroassociado calculado com a análise Probit) são calculados para os valores deLC50 de cada uma das duas proteínas que serão comparadas com a finali-dade de determinar se existe uma diferença estatisticamente significativanos valores de LC50. Em uma modalidade desta invenção, a toxicidade dasduas proteínas é observada como sendo substancialmente a mesma, se -no mesmo ajuste experimental ou em um comparável utilizando controlesapropriados - os limites de confiança se sobrepõem e substancialmente dife-rente se os limites de confiança não se sobrepuserem.

As seqüências de DNA de ISLP da invenção, preparadas partin-do do DNA total, podem ser ligadas em vetores de expressão adequados etransformadas em uma cepa bacteriana, tal como E. coli ou uma outra cepabacteriana, preferencialmente em outro bacilo tal como em Bacillus thuringi-ensis. Em uma modalidade da invenção, para a expressão em bactérias, umDNA que codifica o peptídeo sinal bacteriano da proteína ISLP ou um outropeptídeo sinal bacteriano adequado (por exemplo, um que se origina de umaproteína secretada produzida pela célula hospedeira) é incluído no construtode DNA. Os clones podem então ser selecionados através de métodos deutilização de sonda imunológica em colônias convencionais (French e ou-tros, 1986) para a expressão da toxina com anticorpos monoclonais ou poli-clonais produzidos contra as proteínas ISLP.

Os clones bacterianos podem ser selecionados em relação àprodução de proteínas ISLP (o Iisado de células ou o sobrenadante podemser corridos em géis de SDS-PAGE utilizando métodos padronizados e pro-cedimentos de western-blotting padronizados podem ser realizados) ou asbactérias ou a proteína ISLP purificada ou semipurificada pode ser testadaem relação a sua atividade pesticida comparada com bactérias de controleutilizando métodos conhecidos na técncia ou descritos aqui abaixo. Os clo-nes também podem ser analisados em relação à presença de mRNA quecodifica a proteína ISLP utilizando procedimentos padronizados de PCR, talcomo RT-PCR.

Os genes que codificam as proteínas ISLP desta invenção po-dem ser seqüenciados de uma maneira convencional (Maxam e Gilbert,1980; Sanger1 1977) para a obtenção da seqüência de DNA. As com-parações de seqüências indicam que os genes islp são diferentes dos genesdescritos anteriormente que codificam toxinas bacterianas pesticidas, parti-cularmente inseticidas e pertencem a uma nova classe de genes que codifi-cam proteínas pesticidas ou inseticidas com identidade de seqüência signifi-cativa com as proteínas de camada S bacterianas, preferencialmente de ba-cilos.

Uma parte eficaz como pesticida das seqüências de DNA, quecodifica uma parte eficaz como pesticida das proteínas ISLP recém-identificadas, pode ser produzida de uma maneira convencional após a aná-lise da seqüência do gene. A seqüência de aminoácidos das proteínas ISLPpode ser determinada partindo da seqüência do DNA isolado. A expressão"uma parte (ou porção ou fragmento) eficaz como pesticida" de uma se-qüência de DNA que codifica a proteína ISLP, também referida aqui comoum "gene truncado" ou um "DNA truncado", como utilizado aqui se refere auma seqüência de DNA que codifica um fragmento tóxico de uma proteínaISLP como definido aqui.

Para expressar toda ou uma parte eficaz como pesticida da se-qüência de DNA que codifica uma proteína ISLP desta invenção em E. coli,em outras cepas bacterianas ou em plantas, sítios de restrição adequadospodem ser introduzidos, flanqueando a seqüência de DNA. Isto pode serfeito através da mutagênese direcionada ao sítio, utilizando procedimentosbem-conhecidos (ver, por exemplo, Stanssens e outros, 1989; White e ou-tros, 1989). Para a obtenção de uma maior expressão em plantas, o uso decódons do gene ISLP ou de parte do gene ISLP eficaz como pesticida destainvenção pode ser modificado para formar um gene equivalente, modificadoou artificial ou parte do gene de acordo com as publicações PCT WO91/16432 e WO 93/09218 e as publicações EP O 385 962, EP O 359 472 eUS 5.689.052. Os genes ISLP ou partes do gene também podem ser inseri-das no genoma de plastídeo (por exemplo, cloroplasto) ou mitocondrial deuma planta e expressas ali utilizando um promotor adequado (ver, por e-xemplo, McBride e outros, 1995; US 5.693.507).

Para a obtenção da expressão aumentada em plantas monocoti-ledôneas tal como milho ou arroz, um íntron (por exemplo, um íntron de mo-nocotiledônea) pode ser também adicionado ao gene quimérico. Por exem-pio, foi mostrado que a inserção do íntron do gene Adhl do milho na regiãoreguladora a 5' aumenta a expressão no milho (Callis e outros, 1987). Simi-larmente, o íntron HSP70, como descrito na US 5.859.347, pode ser utilizadopara aumentar a expressão. A seqüência de DNA do gene ISLP ou de seufragmento tóxico pode ser adicionalmente alterada de uma maneira neutraem relação à tradução. Tais alterações podem modificar possivelmente se-qüências de DNA inibidoras presentes na parte do gene através da inserçãode íntrons direcionada ao sítio e/ou através da introdução de alterações nouso de códons. As alterações no uso de códons podem ser, por exemplo,para adaptar o uso de códons ao mais preferido pelas plantas, particular-mente para a planta hospedeira, sem alterar ou sem alterar significativamen-te a seqüência de aminoácidos codificada.

De acordo com uma modalidade desta invenção, as proteínaspodem ser direcionadas para organelas intracelulares em células vegetais,tais como plastídeos (por exemplo, cloroplastos), mitocôndrias ou podem sersecretadas da célula. Para esta finalidade, em uma modalidade desta inven-ção, os genes quiméricos da invenção compreendem uma região codificado-ra que codifica um peptídeo sinal ou de direcionamento, preferencialmenteum peptídeo sinal ou de direcionamento vegetal, ligado à região codificadorada proteína ISLP da invenção. Os peptídeos que podem ser incluídos nasproteínas desta invenção são os peptídeos de trânsito para cloroplasto ououtros com direcionamento para plastídeos, tais como regiões de peptídeosde trânsito duplicadas de genes de plantas cujo produto gênico é direciona-do para os plastídeos, o peptídeo de trânsito otimizado de Capellades e ou-tros (US 5.635.618), o peptídeo de trânsito de ferredoxina-NADP+oxidorredutase do espinafre (Oelmuller e outros, 1993), o peptídeo detrânsito descrito em Wong e outros (1992) e os peptídeos de direcionamentono pedido de patente PCT publicado WO 00/26371. Os peptídeos alternati-vos incluem aqueles que sinalizam a secreção de uma proteína ligada a talpeptídeo, tal como o sinal de secreção do inibidor de proteinase Il da batata(Keil e outros, 1986), o sinal de secreção do gene da alfa-amilase 3 do arroz(Sutliff e outros, 1991) e o sinal de secreção da proteína PR1 do tabaco(Cornelissen e outros, 1986).

Os peptídeos sinais úteis de acordo com a invenção o peptídeode trânsito de cloroplasto (por exemplo, Van Den Broeck e outros, 1985) opeptídeo de trânsito de cloroplasto otimizado da US 5.510.471 e da US5.635.618 causando o transporte da proteína para os cloroplastos, um peptí-deo sinal secretor ou um peptídeo que direciona a proteína para outros plas-tídeos, para mitocôndrias, para o RE ou uma outra organela. As seqüênciassinais para o direcionamento para organelas intracelulares ou para a secre-ção fora da célula vegetal ou na parede celular foram descobertas em prote-ínas naturalmente direcionadas ou secretadas, tais como as descritas porKlõsgen e outros (1989), Klósgen e Weil (1991), Neuhaus & Rogers (1998),Bih e outros (1999), Morris e outros (1999), Hesse e outros (1989), Tavlado-raki e outros (1998), Terashima e outros (1999), Park e outros (1997), Sh-cherban e outros (1995), dos quais todos são incorporados aqui como refe-rência. As seqüências sinais alternativas incluem as seqüências de peptí-deos sinais de proteínas direcionadas ou secretadas do milho, do algodão,da soja ou do arroz.

Para permitir a secreção das proteínas ISLP para o exterior dacélula hospedeira transformada, um peptídeo sinal de secreção apropriadopode ser fundido à extremidade amino terminal (extremidade N-terminal) daproteína ISLP. Ainda, qualquer peptídeo sinal de secreção bacteriano nativopode ser deletado e substituído pelo dipeptídeo Met-Ala ou Met-Asp ou porum outro peptídeo sinal, tal como um peptídeo sinal de secreção de plantacomo descrito anteriormente. Particularmente, os aminoácidos 1 até 29 dasproteínas ISLP da invenção, por exemplo, a proteína ISLP1 mostrados naSEQ ID NO: 2, compreendem um peptídeo sinal bacteriano. Os aminoácidos1 até 29 podem ser removidos ou podem ser substituídos por um aminoáci-do Metionina ou por um dipeptídeo Met-Ala ou Met-Asp ou pode ser substitu-ído por um peptídeo sinal apropriado, tal como um peptídeo sinal vegetalcomo descrito anteriormente. Os peptídeos sinais podem ser detectados uti-lizando análises com base em computador, utilizando programas tal como oprograma Signal Peptide search (SignalP V1.1 ou 2.0), utilizando uma matrizapropriada (por exemplo, para bactérias gram-positivas procarióticas) e umescore de limiar menor que 0,5, um escore de limiar de 0,25 ou menos (ver,por exemplo, Von Heijne, Gunnar, 1986 e Bendtsen e outros, 2004) ou atra-vés do alinhamento com proteínas similares com peptídeos sinais conheci-dos.

Além disso, as propriedades de ligação das proteínas ISLP dainvenção podem ser avaliadas, utilizando métodos conhecidos na técncia(ver, por exemplo, Van Rie e outros, 1990), para determinar se as proteínasISLP da invenção se ligam aos sítios na praga, tal como o intestino do inse-to, que não são reconhecidas (ou competem) por outras proteínas bacteria-nas. Uma nova classe de proteínas inseticidas que se ligam a sítios de liga-ção diferentes em insetos susceptíveis relevantes comparada com proteínasinseticidas conhecidas tais como as toxinas de Bt das famílias de toxinasCry, Cyt ou VIP é muito valiosa. Tais proteínas podem ser utilizadas parasubstituir proteínas bacterianas conhecidas as quais os insetos podem terdesenvolvido resistência ou para a utilização em combinação com proteínasbacterianas inseticidas que possuem um modo de ação diferente para pre-venir ou retardar o desenvolvimento de resistência do inseto contra proteínasbacterianas, particularmente quando expressas (preferencial e simultanea-mente) em uma planta. Devido às características das toxinas ISLP da pre-sente invenção, estas são extremamente útil para a transformação de plan-tas, por exemplo, monocotiledôneas tais como milho e arroz e dicotiledôneastais como algodão, plantas de cultivo vegetais, feijões e soja, para a prote-ção destas plantas dos danos causados por insetos. O modo de ação dasproteínas ISLP da presente invenção é diferente comparado com o das toxi-nas de Bt conhecidas que são atualmente utilizadas nos produtos de plantastransgênicas, tais como as proteínas Cry ou VIP de bacilos. Tais proprieda-des de ligação podem ser medidas através de ensaios de ligação de rotinacomo descrito anteriormente ou na Patente U.S. N2 6.291.156 e na PatenteU.S. Nq 6.137.033.

Especialmente com a finalidade de controle da resistência deinsetos em relação a uma praga de inseto específica, é preferido combinaruma proteína ISLP desta invenção com uma outra proteína de controle deinsetos, particularmente uma proteína Cry bacteriana, tal como uma proteínaCrylF, Cry2A ou CryIAc ou uma proteína VIP ou similar à VIP, tal comoVIP3A, preferencialmente uma proteína que não reconhece pelo menos umsítio de ligação reconhecido por tal proteína ISLP. As proteínas de controlede insetos adequadas para combinação com as proteínas ISLP desta inven-ção, particularmente para a expressão simultânea em plantas (tal como mi-lho, algodão, espécies de Brassica (tal como couve-flor ou repolho), arroz ouplantas de soja), incluem, mas não estão limitadas às proteínas Cry, tal co-mo uma proteína CrylB, CrylC, CryID ou CryIE ou fragmentos tóxicos dasmesmas, uma proteína que compreende o fragmento tóxico de CryIF ouhíbridos derivados de uma proteína CryIF (por exemplo, as proteínas híbri-das Cryl A-Cryl F descritas na US 6.326.169; na US 6.281.016; na US6.218.188 ou fragmentos tóxicos das mesmas), uma proteína que compre-ende as proteínas do tipo CryIA ou fragmentos tóxicos das mesmas, prefe-rencialmente a proteína CryIAc ou híbridos derivados da proteína CryIAc(por exemplo, a proteína híbrida Cryl Ab-Cryl Ac descrita na US 5.880.275)ou uma proteína que compreende a proteína CryIAb ou fragmentos insetici-das da mesma como descrito na EP451878, uma proteína que compreendeo fragmento tóxico da proteína Cry2Ab, tal como a proteína de fusão proteí-na Cry2Ab-peptídeo de trânsito descrita na Patente U.S. N- 6.489.542; umaproteína que compreende os fragmentos tóxicos de Cry2Ae, Cry2Af ouCry2Ag como descrito na W002/057664, uma proteína que compreende osfragmentos tóxicos da proteína Cry como descrito na W001/47952, uma pro-teína que compreende a proteína VIP3Aa ou um fragmento tóxico da mesmacomo descrito em Estruch e outros (1996) e na US 6.291.156, proteínas in-seticidas de Xenorhabdus spp. como descrito na W098/50427, proteínasinseticidas de Serratia (particularmente de S. entomophila) ou de cepas deespécies de Photorhabdus, tais como as proteínas Tc de Photorhabdus co-mo descrito na W098/08932 (por exemplo, Waterfield e outros, 2001; Ffren-ch-Constant e Bowen, 2000). Em uma modalidade, tal co-expressão é facil-mente obtida através da transformação de uma planta que já expressa umaproteína de controle de insetos com um DNA que codifica uma proteína ISLPdesta invenção ou através do cruzamento de plantas transformadas comuma proteína de controle de insetos conhecida com plantas transformadascom uma ou mais proteínas ISLP desta invenção. Para o milho, o arroz, oalgodão ou as plantas de soja, a proteína ISLP pode ser utilizada como umaprimeira proteína de controle de insetos e como a segunda proteína de con-trole de insetos as proteínas CryIAb, CryIAc, Cry2Ae ou VIP3Aa ou proteí-nas que compreendem seus fragmentos tóxicos, híbridos ou variações dosmesmos podem ser utilizados. Os métodos para a obtenção da expressãode proteínas inseticidas diferentes na mesma planta em um esforço paraminimizar ou prevenir o desenvolvimento de resistência às plantas transgê-nicas resistentes a insetos são descritos na EP 0 408 403. As proteínas dife-rentes podem ser expressas na mesma planta ou cada uma pode ser ex-pressa em uma única planta e então combinadas na mesma planta atravésdo cruzamento de plantas isoladas com uma outra. Por exemplo, na produ-ção de sementes híbridas, cada planta parental pode expressar uma únicaproteína. Após o cruzamento das plantas parentais para a produção de hí-bridos, ambas as proteínas são combinadas na planta híbrida. Em algumascircunstâncias, pode ser preferível ter os genes de toxinas diferentes inseri-dos no mesmo local ou lócus gênico de uma planta, de forma que os genesnão se segreguem na progênie de tal planta.

É bem-sabido que as proteínas Cry de Bt são expressas na for-ma de pró-toxinas, que são convertidas no cerne tóxico através de proteóliseno intestino do inseto. Quando as proteínas ISLP da invenção são combina-das com as proteínas Crv de Bt. é entendido que podem ser utilizados osgenes cry que codificam a pró-toxina inteira ou o cerne tóxico ou qualquerforma intermediária.

Para as finalidades de seleção e/ou para aumentar as opções decontrole de ervas-daninhas, as plantas transgênicas da invenção tambémpodem ser transformadas com um DNA que codifica uma proteína que con-fere resistência a um herbicida de amplo espectro, por exemplo, herbicidasbaseados em glufosinato ou glifosato.

A parte do gene ISLP eficaz como pesticida ou seu equivalente,preferencialmente o gene quimérico de ISLP, que codifica uma parte eficazcomo pesticida da proteína ISLP, pode ser inserido de forma estável de umamaneira convencional no genoma nuclear de uma única célula vegetal e acélula vegetal transformada dessa maneira pode ser utilizada de uma manei-ra convencional para produzir uma planta transformada que controla pragas,tais como pragas de insetos. Sob este aspecto, um vetor de T-DNA, conten-do um DNA que codifica uma proteína ISLP, em Agrobacterium tumefacienspode ser utilizado para transformar a célula vegetal. Depois disso, uma plan-ta transformada pode ser regenerada partindo da célula vegetal transforma-da utilizando os procedimentos descritos, por exemplo, na EP 0 116 718, naEP 0 270 822, na publicação PCT WO 84/02913 e no pedido de Patente Eu-ropéia publicado EPO 242 246 e em Gould e outros (1991). A construção deum vetor de T-DNA para a transformação de plantas mediada por Agrobac-terium é bem-conhecida na técncia. O vetor de T-DNA pode ser um vetorbinário como descrito na EP 0 120 561 e na EP 0 120 515 ou um vetor deco-integração que pode se integrar no plasmídeo Ti de Agrobacterium porrecombinação homóloga, como descrito na EP 0 116 718. Os vetores de T-DNA preferidos contêm cada um promotor ligado de forma operacional coma parte do gene ISLP eficaz como pesticida entre as seqüências de borda doT-DNA ou pelo menos localizado à esquerda da seqüência da borda direita.As seqüências das bordas são descritas em Gielen e outros (1984). Outrostipos de vetores podem ser utilizados para transformar a célula vegetal, utili-zando procedimentos tais como a transferência gênica direta (como descrito,por exemplo, na EP 0 223 247), a transformação mediada por pólen (comodescrito, por exemplo, na EP 0 270 356 e na WO 85/01856), a transforma-ção de protoplastos, por exemplo, como descrito na US 4.684.611, a trans-formação mediada por vírus de RNA vegetal (como descrito, por exemplo,na EP 0 067 553 e na US 4.407.956), a transformação mediada por Iiposso-mos (como descrito, por exemplo, na US 4.536.475) e outros métodos, taiscomo os métodos recentemente descritos para a transformação de certaslinhagens de milho (por exemplo, US 6.140.553; Fromm e outros, 1990;Gordon-Kamm e outros, 1990) e de arroz (Shimamoto e outros, 1989; Dattae outros 1990) e o método para a transformação de monocotiledôneas deforma geral (publicação PCT WO 92/09696). Um método adequado para atransformação de algodão é descrito na publicação de patente PCT WO00/71733. Para a transformação de arroz, é feita referência aos métodosdescritos na W092/09696, na W094/00977 e na W095/06722.

Os termos "milho (maize)" e "milho (corn)" são utilizados aquicomo sinônimos, se referindo a Zea mays. O algodão como utilizado aqui serefere a Gossypium spp., particularmente G. hirsutum e G. barbadense. Otermo "arroz" se refere a Oryza spp., particularmente O. sativa. "Soja" serefere a Giycine spp, particularmente G. max. As plantas vegetais ou vege-tais, como utilizado aqui, se referem a pepino, tomate, alface, couve de Bru-xelas, vegetais Brassica tal como couve-flor ou repolhos, alho-porro, alface,cebola, melancia, alcachofra, cenoura ou pimentas.

Além da transformação do genoma nuclear, é também incluídana invenção a transformação do genoma de plastídeos (por exemplo, o ge-noma de cloroplastos). Kota e outros (1999) descreveram um método para asuperexpressão de uma proteína Cry2Aa em cloroplastos do tabaco.

A planta transformada resultante pode ser utilizada em um es-quema de cruzamento de plantas convencional para produzir mais plantastransformadas com as mesmas características ou para introduzir a parte dogene ISLP eficaz como pesticida em outras variedades da mesma ou de es-pécies de plantas relacionadas. As sementes, que são obtidas partindo dasplantas transformadas, contêm o gene que codifica a proteína ISLP na formade um inserto genômico estável. As células da planta transformada podemser cultivadas de uma maneira convencional para produzir a parte eficazcomo pesticida da toxina ou da proteína ISLP1 que pode ser recuperada parauso em composições inseticidas convencionais, particularmente composi-ções inseticidas contra Lepidoptera.

A parte do gene ISLP eficaz como pesticida é inserida no geno-ma de uma célula vegetal de forma que o gene inserido fique a jusante (istoé, a 3') e sob o controle de um promotor que pode direcionar a expressão daparte do gene na célula vegetal. Isto pode ser realizado através da inserçãodo gene quimérico ISLP no genoma da célula vegetal, por exemplo, no ge-noma nuclear ou de plastídeo (por exemplo, cloroplasto).

Os promotores adequados incluem, mas não estão limitados:aos promotores 35S constitutivos fortes (os "promotores 35S") do vírus mo·saico da couve-flor (CaMV) de isolados CM 1841 (Gardner e outros, 1981),CabbB-S (Franck e outros, 1980) e CabbB-JI (Hull e Howell, 1987); ao pro-motor 35S descrito por Odell e outros (1985), aos promotores da família daubiquitina (por exemplo, o promotor da ubiquitina do milho de Christensen eoutros, 1992, EP O 342 926, ver também Cornejo e outros, 1993), ao promo-tor gos2 (de Pater e outros, 1992), ao promotor emu (Last e outros, 1990),aos promotores da actina de Arabidopsis tal como o promotor descrito porAn e outros (1996), aos promotores da actina do arroz tal como o promotordescrito por Zhang e outros (1991) e ao promotor descrito na US 5.641.876;aos promotores do vírus mosaico do veio da Mandioca (WO 97/48819, Ver-daguer e outros (1998)), à série pPLEX de promotores do Vírus de Retardodo Trevo Subterrâneo (WO 96/06932, particularmente o promotor S7), a umpromotor da álcool desidrogenase, por exemplo, pAdhIS (números de aces-sos do GenBank X04049, X00581) e ao promotor TR1' e ao promotor TR21(o "promotor TR1'" e o "promotor TR2'", respectivamente) que controlam aexpressão dos genes 11 e 2', respectivamente, do T-DNA (Velten e outros,1984). Alternativamente, pode ser utilizado um promotor que não é constitu-tivo, mas ao invés disso é específico para um ou mais tecidos ou órgãos daplanta (por exemplo, folhas e/ou raízes) em que a parte do gene ISLP inseri-do e expressa apenas em celulas do(s) tecido(s) ou orgao(s) especifico(s).Por exemplo, uma parte do gene ISLP eficaz como inseticida poderia serseletivamente expressa nas folhas de uma planta (por exemplo, milho, algo-dão, arroz, soja) através da substituição da parte do gene eficaz como inse-ticida sob o controle de um promotor que pode ser induzido pela luz tal comoo promotor do gene da subunidade pequena da ribulose-1,5-bisfosfato car-boxilase da própria planta ou de uma outra planta, tal como ervilha, comodivulgado na US 5.254.799. O promotor pode, por exemplo, ser escolhido deforma que o gene ISLP da invenção seja apenas expresso em tais tecidosou células em que a praga-alvo, tal como uma praga de inseto, se alimentade forma que a alimentação pela praga-alvo susceptível resultará em danosreduzidos para a planta hospedeira, comparada com as plantas que não ex-pressam o gene ISLP. Uma praga que danifica principalmente as raízes po-de assim ser eficazmente controlada através da expressão de um gene ISLPsob um promotor específico à raiz. Um promotor preferencialmente ativo nasraízes é descrito no WOOO/29566. Um promotor adequado para a expressãopreferecial nas raízes é o promotor ZRP (e modificações do mesmo) comodescrito na US 5.633.363. Uma outra alternativa é utilizar um promotor cujaexpressão pode ser induzida, por exemplo, um promotor que pode ser indu-zido por ferimentos tal como, por exemplo, o promotor MPI descrito por Cor-dera e outros (1994), que é induzido por ferimentos (tais como os causadospela alimentação dos insetos) ou um promotor que pode ser induzido por umreagente químico, tal como dexametasona como descrito por Aoyama eChua (1997) ou um promotor que pode ser induzido por temperatura, tal co-mo o promotor de choque térmico descrito na US 5.447.858 ou um promotorque pode ser induzido por outros estímulos externos. Nas plantas monocoti-ledôneas, tais como milho e arroz, o promotor TR21 de Agrobacterium ouvariações do mesmo, são um promotor induzido por ferimentos preferidopara controlar a transcrição de um gene ISLP quimérico da invenção, ver aWO 03/093483.

A parte do gene ISLP eficaz como pesticida pode ser inseridadentro do genoma da planta de forma que a parte do gene inserida fique amontante (isto é, a 5') dos sinais de regulação da transcrição na extremidadea 3' adequados (isto é, sinais de formação de produtos da transcrição e depoliadenilação). Isto é preferencialmente realizado através da inserção dogene quimérico ISLP no genoma da célula vegetal. Os sinais de poliadenila-ção e de formação de produtos da transcrição adequados incluem aquelesdo gene 35S do CaMV1 do gene da nopalina sintase (Depicker e outros,1982), do gene da octopina sintase (Gielen e outros, 1984) e do gene 7 doT-DNA (Velten e Schell, 1985), que atuam como as seqüências de DNA nãotraduzidas a 3' nas células vegetais transformadas.

A introdução do vetor de T-DNA em Agrobacterium pode ser rea-lizada utilizando métodos conhecidos, tal como a eletroporação ou o cruza-mento triparental.

A parte do gene ISLPeficaz como pesticida pode ser opcional-mente inserida no genoma da planta na forma de um gene híbrido (US5.254.799; Vaeck e outros, 1987) sob o controle do mesmo promotor que umgene marcador que pode ser selecionado ou classificado, tal como o geneneo (EP 0 242 236) que codifica resistência à canamicina, de forma que aplanta expressa uma proteína de fusão que pode ser facilmente detectada.

A transformação de células vegetais também pode ser utilizadapara produzir as proteínas da invenção em grandes quantidades em culturasde células vegetais, por exemplo, para produzir uma proteína ISLP que podeentão ser aplicada em plantas de cultivo após a formulação apropriada.Quando é feita aqui referência a uma célula vegetal transgênica, esta se re-fere a uma célula vegetal (ou também a um protoplasto vegetal) como tal noisolamento ou na cultura de tecidos ou a uma célula vegetal (ou protoplasto)contida em uma planta ou em um órgão ou tecido diferenciado e ambas aspossibilidades são especificamente incluídas aqui. Assim, entende-se queuma referência a uma célula vegetal na descrição ou nas reivindicações serefira não apenas a células isoladas em cultura, mas também a qualquercélula vegetal, seja onde esta puder estar localizada ou em qualquer tipo detecido ou órgão vegetal esta puder estar presente.

Todo ou parte de um gene ISLP, que codifica uma proteína inse-ticida, particularmente antilepidóptera. também pode ser utilizada para trans-formar outros microorganismos, incluindo bactérias, tal como um B. thuringi-ensis, que já pode ter atividade inseticida contra Lepidoptera ou Coleoptera.Assim, pode ser produzida uma cepa de Bt transformada que é útil para ocombate de um espectro amplo de pragas de insetos lepidópteros e/ou cole-ópteros ou para o combate adicional de pragas de insetos lepidópteros. Atransformação de bactérias, tais como as bactérias do gênero Pseudomo-nas, Agrobacterium, Bacillus ou Escherichia, com todo ou parte do gene IS-LP desta invenção, incorporada em um veículo de clonagem adequado, po-de ser realizada de uma maneira convencional, utilizando, por exemplo, téc-nicas de eletroporação convencionais como descrito em Mahillon e outros(1989) e na publicação de Patente PCT WO 90/06999.

As cepas de espécies de Bacillus transformadas contendo o ge-ne ISLP desta invenção podem ser fermentadas através de métodos con-vencionais (Dulmage, 1981; Bernhard e Utz, 1993) para fornecer rendimen-tos maiores de células. Sob condições de crescimento apropriadas, estascepas podem produzir a proteína ISLP em rendimentos-altos.

Os microorganismos hospedeiros adequados alternativos emque os genes ISLP podem ser expressos são fungos, algas ou vírus, particu-larmente espécies que são espécies ou agentes patogênicos de pragas, taiscomo pragas de insetos (por exemplo, espécies (endo)simbiônticas).Uma composição inseticida, particularmente antilepidóptera,desta invenção pode ser formulada de uma maneira convencional utilizandoos microorganismos transformados com o gene ISLP ou uma proteína ISLPou uma parte de ISLP eficaz como inseticida como um ingrediente ativo, jun-to com carreadores, diluentes, emulsificantes e/ou agentes de dispersão a-dequados (por exemplo, como descrito por Bernhard e Utz, 1993). Estacomposição inseticida pode ser formulada na forma de um pó que pode serumedecido, péletes, grânulos ou pó ou na forma de uma formulação líquidacom solventes aquosos ou não aquosos como uma espuma, um gel, umasuspensão, um concentrado etc.. Os exemplos de composições que com-preendem esporos bacterianos inseticidas são descritos na W096/10083.

Um método para o controle de insetos, particularmente Lepidop-tera ou Coleoptera, de acordo com esta invenção pode compreender a apli-cação (por exemplo, aspersão), em um lócus (área) que será protegido, umaquantidade inseticida das proteínas ISLP ou composições que compreen-dem as proteínas ISLP ou que compreendem células hospedeiras transfor-madas com o gene ISLP desta invenção. O lócus que será protegido podeincluir, por exemplo, o habitat das pragas de insetos ou a vegetação emcrescimento (por exemplo, aplicação na folhagem) ou uma área em que avegetação será crescida (por exemplo, aplicação no solo ou na água). Emuma modalidade, uma composição de acordo com a presente invençãocompreende uma quantidade inseticida de pelo menos uma das proteínasISLP da invenção, que podem ser produzidas por um hospedeiro bacteriano.Tal composição pode ser aplicada nas folhas, no solo ou como revestimentode sementes.

O termo "colocar em contato" é utilizado aqui para significar, "co-locar em contato físico com". O contato de uma planta com uma proteínainseticida significa que a proteína inseticida é colocada em contato com célu-las da planta, internamente (por exemplo, através da expressão na planta)ou externamente (por exemplo, através da aplicação de composições quecompreendem a proteína inseticida externamente à planta). É entendido queo termo não indica o período de tempo de contato, mas compreende qual-quer período de contato. Quando é feita referência a um método de proteçãode uma planta contra danos causados por insetos que compreende o conta-to da dita planta (ou células ou tecidos da mesma) com uma proteína inseti-cida da invenção, o contato pode ser longo o suficiente e extensivo o sufici-ente (com uma quantidade alta o suficiente de proteína que entra em contatocom um número grande o suficiente de células) para prevenir ou reduzir osdanos causados por insetos.

Esta invenção se refere ainda a um método para o controle depragas de algodão ou pragas de insetos sugadoras de algodão lepidópterasou coleópteras, tais como broca da cápsula, lagartas da cápsula, lagartas dobroto ou lagartas de espiga, Aphis gossypii, Myzus persieae, besouros Ly-gus, mosca-branca, perceveios, tripse ou Creontiadès dilutus. As pragas dealgodão lepidópteras específicas que podem ser controladas através dosmétodos da presente invenção incluem, mas não estão limitadas às selecio-nadas do grupo de Helicoverpa zea (lagarta da espiga de milho), Helicover-pa armigera (lagarta da cápsula de algodão), Helicoverpa punetigera (lagartade botões de algodão nativa), Heliothis virescens (lagarta do broto de taba-co), Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho) e Pectinophora gossypiella(lagarta rosada). O método de controle de pragas de insetos de algodãocompreende a aplicação em uma área ou uma planta que será protegida, deuma proteína ISLP como definido aqui. Isto pode ser realizado através docontato de uma planta de algodão com uma proteína ISLP desta invenção,por exemplo, através do plantio de uma planta, tal como uma planta de algo-dão, transformada com um gene ISLP desta invenção ou da aspersão deuma composição que contém uma proteína ISLP desta invenção. A invençãose refere ainda ao uso das proteínas ISLP desta invenção, contra pragas deinsetos de algodão lepidópteros, afídios ou coleópteras para minimizar osdanos causados às plantas de algodão.

Uma praga de inseto-alvo para as proteínas ISLP desta inven-ção, tal como a proteína ISLP1, pode ser também Epilachna varivestis, obesouro do feijão mexicano. Esta é uma praga grave em várias plantas decultivo Ieguminosas na América do Norte, mas é também um problema graveem outras plantas de cultivo na Ásia e na África tais como cucurbitáceas,solanáceas, feijões, milho, sorgo, arroz, trigo, algodão, gergelim, alface, sojae feijão-de-corda.

Esta invenção se refere ainda a um método para o controle depragas de lepidóptera ou de coleóptera ou afídios de milho, tais como afídiosda folha do milho (Rhopalosiphum maidis), pulgão verde (Schizaphis grami-num) ou pulgão verde do pessegueiro (Myzus persicae)·, lagartas da espiga,lagarta dos cereais, lagarta dos agrotídeos que destroem plantas novas,brocas de pedúnculos, larvas de elaterídeos, brocas do milho ou lagartas daraiz do milho. As pragas de milho específicas que podem ser controladasatravés dos métodos da presente invenção podem ser selecionadas do gru-po de Helicoverpa zea (lagarta da espiga de milho), Agrotis ipsilon (lagarta-rosca), Ostrinia nubilalis (broca européia do milho), lagartas da raiz de milhode Diabrotica spp. e Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho). O métodocompreende a aplicação em uma área ou uma planta que será protegida, deuma proteína ISLP que é definida, como definido aqui. Isto pode ser realiza-do através do contato de uma planta de milho com uma proteína ISLP destainvenção, por exemplo, através do plantio de uma planta de milho transfor-mada com um gene ISLP desta invenção ou da aspersão de uma composi-ção que contém uma proteína ISLP desta invenção. A invenção se refereainda ao uso das proteínas ISLP desta invenção, contra pragas de insetosde milho lepidópteras para minimizar os danos causados nas plantas de mi-lho.

Esta invenção se refere ainda a um método para o controle depragas de arroz lepidópteras ou coleópteras ou insetos sugadores no arroz,tais como cigarras cicadúlidas ou gafanhotos, besouros do arroz (negros),brocas do caule do arroz, larvas do arroz, lagartas do arroz, lagartas milita-res do arroz, larvas de inseto encasulado do arroz e Desmia maculalis doarroz ou gusanos brancos. As pragas de insetos de arroz lepidópteras espe-cíficas que podem ser controladas pelos métodos da presente invenção po-dem ser selecionadas do grupo de broca amarela-do-colmo (Scirphophagaineertulas), enrolador de folhas (Cnaphalocrocis medinalis), broca rosada docaule (Sesamia inferens) e broca-pontuda-do-colmo de milho (Chilo partel-lus). O método compreende a aplicação em uma área ou uma planta queserá protegida, de uma proteína ISLP como definido aqui. Isto pode ser rea-lizado através do contato de uma planta de arroz com uma proteína ISLPdesta invenção, por exemplo, através do plantio de uma planta de arroztransformada com um gene ISLP desta invenção ou da aspersão de umacomposição que contém uma proteína ISLP desta invenção. A invenção serefere ainda ao uso das proteínas ISLP desta invenção, contra pragas deinsetos de arroz lepidópteras, afídios ou coleópteras para minimizar os da-nos causados às plantas de arroz.

Esta invenção se refere ainda a um método para o controle depragas da soja lepidópteras, afídios ou coleópteras. As pragas de soja espe-cíficas que podem ser controladas pelos métodos da presente invenção po-dem ser selecionadas do grupo de lagarta da soja (Anticarsia gemmataiis),lagarta mede palmos da soja (Pseudoplusia includens), lagarta da beterraba(Spodoptera exigua), lagarta de listras amarelas (Spodoptera ornithogalli),lagarta da espiga de milho (Helicoverpa zea), broca das axilas (Epinotia apo-rema) e Rachiplusia nu. Este método compreende a aplicação em uma áreaou uma planta que será protegida, de uma proteína ISLP como definido aqui.Isto pode ser realizado através do contato de uma planta de soja com umaproteína ISLP, por exemplo, uma proteína ISLP1, desta invenção, por exem-plo, através do plantio de uma planta de soja transformada com um geneISLP desta invenção ou da aspersão de uma composição que contém umaproteína ISLP desta invenção. A invenção se refere ainda ao uso das proteí-nas ISLP desta invenção, contra pragas de insetos da soja lepidópteros paraminimizar os danos causados às plantas de soja.

Para a obtenção de uma toxina ou uma proteína ISLP, as célulasdos hospedeiros recombinantes que expressam a proteína ISLP podem sercultivadas de uma maneira convencional em um meio de cultura adequado.A proteína ISLP produzida pode ser separada e purificada das células Usa-das ou quando secretada, do meio de cultivo. Se as proteínas não foremsecretadas, as células podem ser Iisadas utilizando meios convencionais talcomo a degradação por enzimas, por ultra-som ou através da utilização dedetergentes ou similares. A proteína ISLP pode então ser separada e purifi-cada através de técnicas padronizadas tal como cromatografia, extração,eletroforese ou similar.

O termo "gene" como utilizado aqui significa qualquer fragmentode DNA ou de RNA que compreende uma região (a "região transcrita") quepode ser transcrita em uma molécula de RNA (por exemplo, um mRNA) emuma célula, ligado de forma operacional a regiões reguladoras adequadas,por exemplo, um promotor que pode ser expresso em planta. Um gene podeassim compreender vários fragmentos ligados de forma operacional tais co-mo um promotor, uma seqüência líder a 5', uma região codificadora e umaregião não traduzida a 3', que compreende um sítio de poliadenilação. Umgene endógeno a um organismo particular (tal como uma espécie vegetal ouuma cepa bacteriana) é um gene, que é naturalmente encontrado em tal or-ganismo na natureza. Um "gene quimérico", quando se refere a um DNA deISLP desta invenção, se refere a uma seqüência de DNA de ISLP que pos-sui seqüências reguladoras a 5' e/ou a 3' diferentes das seqüências regula-doras a 5' e/ou a 3' bacterianas que ocorrem naturalmente, que controlam aexpressão do gene ISLP em sua célula hospedeira nativa.

O termo "expressão de um gene" quando se refere aos genesISLP da invenção, se refere ao processo em que uma região codificadora deDNA que está ligada de forma operacional a regiões reguladoras apropria-das, tal como a um promotor, é transcrita e traduzida em uma proteína.

Para a finalidade desta invenção a "identidade de seqüência" deduas seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos relacionadas, expressana forma de uma porcentagem, se refere ao número de posições nas duasseqüências alinhadas de forma ótima que possui resíduos idênticos (x100)dividido pelo número de posições comparadas. Um espaço, isto é, uma po-sição em um alinhamento em que um resíduo está presente em uma se-qüência, mas não na outra é considerado como uma posição com resíduosnão idênticos (para seqüências de comprimento diferente o tamanho é igua-lado ao da seqüência mais curta, por exemplo, no caso do alinhamento deum fragmento de uma ISLP e uma proteína de camada S de comprimentocompleto, a comparação é em relação à parte correspondente do mesmotamanho na proteína de camada S). Para calcular a identidade de seqüênciaentre duas seqüências para a finalidade desta invenção, o programa GAP,que utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) e que é fornecidopelo Wisconsin Package, Versão 10.2, Genetics Computer Group (GCG),575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711, EUA, pode ser utilizado. Osparâmetros de GAP utilizados são uma penalidade de criação de espaço =50 (nucleotídeos)/8 (aminoácidos), uma penalidade de extensão de espaço=3 (nucleotídeos)/2 (aminoácidos) e uma matriz de classificação "nwsgapd-na" (nucleotídeos) ou "blosum62" (aminoácidos). GAP utiliza o algoritmo dealinhamento global de Needleman e Wunsch para alinhar duas seqüênciasao longo de todo o seu comprimento, maximizando o número de combina-ções e minimizando o número de espaços. Os parâmetros padrões são umapenalidade de criação de espaço = 50 (nucleotídeos)/8 (proteínas) e umapenalidade de extensão de espaço = 3 (nucleotídeos)/2 (proteínas). Para osnucleotídeos, a matriz de classificação padrão utilizada é "nwsgapdna" epara as proteínas a matriz de classificação padrão é "blosum62" (Henikoff &Henikoff, 1992). Similarmente, a porcentagem de similaridade de seqüênciapode ser obtida em tais alinhamentos utilizando um software padronizado,que indica não somente a porcentagem de resíduos idênticos, mas indicatambém os resíduos que diferem, mas que têm natureza similar (tais comodiferenças em aminoácidos conservativos, como definido aqui, para alinha-mentos de proteínas). Os exemplos de algoritmos que são adequados paraa determinação da porcentagem de identidade de seqüência e de similarida-de de seqüência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritosem Altschul e outros (1977) e Altschul e outros (1990).

Estas e/ou outras modalidades desta invenção são refletidas nasreivindicações, que fazem parte da descrição da invenção.

Os Exemplos a seguir ilustram a invenção e não são fornecidospara limitar a invenção ou a busca por proteção. A listagem de seqüênciasreferida nos Exemplos, nas Reivindicações e na Descrição é como a seguir:SEQ ID NO: 1: DNA que codifica a seqüência e a seqüência de aminoácidosdo gene islp 1

SEQ ID NO: 2: seqüência de aminoácidos da proteína ISLP1SEQ ID NO: 3: iniciador da PCR ISLPIXderSEQ ID NO: 4: iniciador da PCR ISLP1 XrevSEQ ID NO: 5: iniciador da PCR BSLX-1SEQ ID NO: 6: iniciador da PCR BSLX-4SEQ ID NO: 7: iniciador da PCR BSLX-3SEQ ID NO: 8: iniciador da PCR BSLX-2SEQ ID NO: 9: iniciador da PCR BSLN-5SEQ ID NO: 10: iniciador da PCR BSLN-6SEQ ID NO: 11: iniciador da PCR BSLP-8SEQ ID NO: 12: iniciador da PCR BSLP-7SEQ ID NO: 13: iniciador da PCR EAGB-4SEQ ID NO: 14: seqüência de aminoácidos do terminal N da proteína ISLP1madura isolada

SEQ ID NO: 15: seqüência de aminoácidos do terminal N do fragmento tríp-tico de aproximadamente 50 kDa da proteína ISLP1

A não ser que seja citado de outra maneira nos Exemplos, todasas técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolospadronizados como descrito em Sambrook e Russell (2001) Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, NY, nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocolsin Molecular Biology, Current Protocols, EUA e nos Volumes I e Il de Brown(1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (ReinoUnido). Os materiais e métodos padronizados para o trabalho molecular emplantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D.Croy, publicado juntamente pela BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Uni-do) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Os materiais e métodospadronizados para as reações em cadeia da polimerase podem ser encon-trados em Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR prímer: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press e em McPherson e outros (2000) PCR- Basics: From Background to Bench, Primeira Edição, Springer Verlag1 Ale-manha.

Deve ser entendido que o que foi descrito anteriormente é me-ramente uma descrição detalhada de modalidades particulares desta inven-ção e que várias alterações nas modalidades descritos podem ser feitas deacordo com a descrição contida aqui sem sair do espírito ou do âmbito dainvenção. Não significa que a descrição anterior, portanto, seja Iimitante doâmbito da invenção. Ao invés disso, o âmbito da invenção deve ser determi-nado apenas pelas reivindicações em anexo e seus equivalentes.

EXEMPLOS

Materiais e métodos.

Cepas Bacterianas

As cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) foram isoladas de amos-tras de insetos mortos (Epilachna varivestis) através do método de seleçãocom acetato (Travers e outros, 1987). Os corpos de E. varivestis foram lava-dos duas vezes com hipoclorito de sódio a 1% e com água esterilizada antesda homogeneização e do isolamento da cepa de Bt.Ensaios Biológicos

Os ensaios biológicos contra E. varivestis foram realizados comsuspensões de esporos/cristais utilizando a técnica de imersão foliar. As fo-lhas das plantas de Phaseolus vulgaris foram imersas em uma diluição detoxina e foi permitido que secassem. Concentrações diferentes da proteínaforam testadas com cinco larvas do primeiro instar por folha tratada. Foramfeitas quatro repetições por concentração. A mortalidade e os danos foliaresforam determinados após 6 dias. Os ensaios biológicos contra as larvas doprimeiro instar de Manduca sexta ou de Spodoptera frugiperda foram feitosem uma dieta artificial como descrito anteriormente (Bravo e outros, 1998).Os ensaios biológicos contra as larvas do mosquito Aedes aegypti foramfeitos em 100 mL de H2O como descrito por Ibarra e outros (2003).

Purificação da Inclusão de Cristais Presente na cepa ISLP1

A cepa ISLP1 foi cultivada em placas de Petri contendo meio deesporulação em caldo de nutrientes sólido (Lereclus e outros, 1995). A mis-tura de esporos/cristais foi coletada em 5 mL de água esterilizada. Centrifu-gada 10 min a 10.000 rpm, o sobrenadante foi recuperado e o pélete con-tendo apenas esporos foi descartado. Esta etapa foi repetida 5 vezes paraeliminar todos os esporos da suspensão. Finalmente, as inclusões de cristaisforam recuperadas por centrifugação durante 30 min a 19.000 rpm. As prote-ínas em cristal foram solubilizadas em 50 mM de Na2CO3, pH 10,5 0,2% debeta-mercaptoetanol e purificadas por cromatografia por troca aniônica emuma coluna de Q-sepharose FPLC Pharmacia (Hill, 1983).

Seqüência N-Terminal

O seqüenciamento N-terminal da proteína produzida pela cepaISLP1 foi realizado na Harvard Microchemistry Facility of Harvard University(Cambridge, Massachusetts) após SDS-PAGE a 7% e a transferência paramembranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore Co., Bedford, MA) emuma câmara de transferência semi-seca como indicado pelo fabricante. Aseqüência N-terminal também foi feita partindo de um fragmento de tripsinada proteína em cristal de ISLP1 que foi purificada por cromatografia por ex-clusão de tamanho por HPLC (Güereca e Bravo, 1999).

Imunização de Coelhos

Um coelho branco New Zealand foi imunizado com a proteínaISLP1 através de injeções subcutâneas. 1 mg da proteína ISLP1 em PBS foiemulsificado com o adjuvante completo de Freund e injetado em cinco locaisno dorso do coelho. O coelho recebeu reforço três vezes com 1 mg da prote-ína ISLP1, misturado com o adjuvante incompleto, em intervalos de 15 dias.Uma amostra do sangue foi isolada 40 dias após a imunização primária.

Determinação da Seqüência de DNA do Gene ISLP1

Com base na seqüência N-terminal da proteína ISLP1, dois ini-ciadores da PCR, ISLPIXder (ACGCTCTAGATAGCAGGTAAATCATTCC-CAGACG, SEQ ID NO. 3) e ISLPIXrev (ACGCTCTAGATCGCCG-TATTGGTCAGTTGTTAC, SEQ ID NO.4), foram planejados para a amplifi-cação de um produto da PCR de 1536 pb. As reações da PCR foram reali-zadas através de técnicas padronizadas (Sambrook e outros, 1989) com PfuDNA polimerase (Stratagene La Jolla, CA) por causa de sua alta fidelidade.O DNA total foi extraído da cepa ISLP1 (Msadek e outros, 1990) e utilizadocomo molde em todas as reações da PCR. O produto da PCR foi utilizadopara a análise de Blast e foram obtidas duas seqüências relacionadas degenes de camada S (número de acesso u38842 e x99724). O alinhamentodestas seqüências demonstrou que compartilhavam extremidades a 5' e a 3'similares. Quatro iniciadores da PCR foram planejados partindo das extremi-dades terminais a 5' e a 3' destes genes de camada S e partindo da seqüên-cia interna do fragmento amplificado de ISLP1. Os iniciadores BSLX-1(GCTCTAGATGAGAGTGCTTTATAGGAAAAT, SEQ ID NO: 5) e BSLX-4(GCTCTAGATCTTCAGCCGGAGCGTATGTACC, SEQ ID NO: 6) amplificamum fragmento da extremidade a 5' de 553 pb e os iniciadores BSLX-3(GCTCTAGATACTGCTGAGGCTGCTGGTGAGG. SEQ ID NO; 7) e BSLX-2(GCTCTAGATCCTCGACCTGCTTCACTATCA, SEQ ID NO: 8) amplificamum fragmento a 3' de 1372 pb. Cada fragmento da PCR foi digerido comXba 1 (New England BioLabs, Beverly, MA) e clonado no pBluescript SK (S-tratagene, La Jolla, CA) previamente digerido com Xba1. Os produtos daligação foram purificados através da extração com fenol/clorofórmio, precipi-tados com etanol e eletroporados em células eletrocompetentes de Escheri-chia coli TG1 (Lereclus e outros, 1989). As colônias transformantes foramcultivadas em placas de LB ágar, suplementado com ampicilina (100 pg/mL),as colônias foram misturadas com glicerol (20%) e armazenadas a -70°C.Estes plasmídeos chamados de ISLP1-SL1, ISLP1-SL2 e ISLP1-SL3 e seusinsertos de DNA foram seqüenciados utilizando unidades de seqüenciamen-to de DNA automáticas.

Clonagem e Expressão da Proteína ISLP1 em B. thuringiensis

O gene /'s/p1 completo foi reconstituído através da clonagem detrês fragmentos da PCR no plasmídeo pHT315 (Lereclus e outros, 1989). Oprimeiro produto da PCR contendo a região promotora foi obtido com os ini-ciadores BSLX-1 e BSLN-5 (TCTTTGCCATGGTATAAATTTCCTCCTTC,SEQ ID NO: 9). O iniciador BSLX-1 possui 10 pb extras na extremidade a 5'contendo um sítio de restrição de Xbal e o iniciador BSLN-5 possui um sítiode restrição de Ncol interno. O segundo fragmento da PCR foi obtido com oiniciador BSLN-6 (TTATACCATGGCAAAGACTAACTCTTAC, SEQ ID NO:10) que contém um sítio de restrição de Ncol interno e o iniciador BSLP-8(AAAACTGCAGAAGTACCGTCAGCACTTGCTTC, SEQ ID NO: 11) que in-clui o sítio de restrição de Pstl único do gene islp 1. Finalmente, o terceirofragmento da PCR foi amplificado com o iniciador BSLP-7 (AACGCTG-CAGTTGTAACACTTGGTGGTAAAG, SEQ ID NO: 12) que também inclui osítio de restrição de Pstl único e o iniciador EAGB-4 (CGGGATCCTCCTC-GACCTGCGTCACTATCA, SEQ ID NO: 13) que é similar ao BSLX-2, maspossui 8 pb extras contendo um sítio de restrição de BamHI na extremidadea 5'. Cada produto da PCR foi purificado e digerido com as enzimas de res-trição correspondentes e subclonado separadamente no pBluescript KS. Osfragmentos de DNA contidos nestes plasmídeos foram purificados, ligados einseridos no plasmídeo pHT315 previamente digerido com Xbale BamHI. Oproduto da reação de ligação foi transformado diretamente na cepa de Bacil-lus thuringiensis 407 acristolífera (Lereclus e outros, 1989) que foi gentilmen-te fornecida pelo Dr. Didier Lereclus (Pasteur Institute, França) e foi cultivadaa 30°C em LB suplementado com 7,5 Mg/mL de eritromicina. O plasmídeoresultante foi chamado de pHT-ISLP1. A cepa de Bt contendo pHT-ISLP1 foicultivada em placas de Petri contendo meio HCT sólido suplementado comeritromicina. A mistura de esporos/cristais foi coletada em 2 mL de água es-terilizada e utilizada em experimentos de Western blot. A detecção foi feitacom o anticorpo policlonal anti-SL-ISLP1 (1/10.000; 1 h) e visualizada comum anticorpo anticoelho de cabra acoplado à peroxidase de rábano-silvestre(HR) (Sigma, St. Louis, MO) (1/7.500; 1 h), seguido pelo substrato quimiolu-minescente SuperSignaI (Pierce, Rockford, II) como descrito pelo fabricante.

Extração Química de Proteína de Camada S.

A cepa ISLP1, a cepa Bt contendo pHT-ISLP1 e a cepa 407 deBt acristolífera foram cultivadas em meio de caldo BHI (Difco) até uma D.O.de 0,9 em 600 nm para a obtenção de células exclusivamente vegetativas.As células foram peletizadas por centrifugação (10 min a 10.000 rpm). Ospéletes foram lavados e ressuspensos em 1/50 do volume inicial de 1, 1,5 ou2 M de cloridrato de guanidínio (pH 2,5), como descrito por Luckevich e Be-veridge (1989) para extrair especificamente as proteínas ancoradas na su-perfície celular. As amostras foram centrifugadas 10 min a 10.000 rpm, ospéletes contendo as células bacterianas e os sobrenadantes contendo asproteínas extraídas foram então precipitados através da adição de ácido tri-cloroacético (TCA) até uma concentração final de 10% (20 min a -20°C),centrifugados 10 min a 10.000 rpm, lavados duas vezes com água e sus-pensos em 0,03 N de NaOH. Um volume equivalente do tampão 2X de car-regamento de amostra de Laemmli foi adicionado. As amostras foram fervi-das durante 5 min e carregadas em dois géis de SDS-PAGE a 10%. Um gelfoi corado com azul brilhante de Coomassie e o gel duplicado foi eletrotrans-ferido para membranas Immobilon de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (A-mersham Biosciences) para a detecção por Western Blot utilizando o anti-corpo policlonal anti-SL-ISLP1 como descrito anteriormente.

Resultados

Isolamento de Cepas de Bt Ativas Contra Epilachna varivestis.

Quatro cepas de Bt isoladas no México de corpos de E. varives-tis foram utilizadas em ensaios de toxicidade contra as larvas de E. varivestis(Coleoptera:Coccinellidae). Estas cepas eram muito similares uma vez quetodas das mesmas produziam um cristal similar composto de uma proteínade 100 kDa e tinham um padrão de proteínas total idêntico. As quatro cepasexibiam 100% de mortalidade para as larvas de E. varivestis quando testa-das em 100 e 1000 ng/cm2. Foi selecionada uma destas cepas, chamadaISLP1 e a inclusão de cristais foi purificada através da centrifugação suces-siva como descrito nos Materiais e Métodos, seguida pela cromatografia portroca aniônica. Os ensaios biológicos contra as larvas de E. varivestis reali-zados com a mistura de esporos/cristais desta cepa mostraram uma concen-tração letal (LC50) de 16 ng/cm2 (7-25 de limites de confiança de 95%). Coma proteína do cristal pura foi observada uma LC50 de 8,6 ng/cm2 (4-14 delimites de confiança de 95%). O cristal puro ou a mistura de esporos/cristais(até 10.000 ng/cm2) não exibiu atividade tóxica contra as larvas de primeiroinstar dos insetos lepidópteros Manduca sexta ou Spodoptera frugiperda enão foi observada toxicidade contra as larvas do A- instar do díptero Aedesaegypti.

A cepa ISLP1 foi caracterizada por reações de PCR utilizandoiniciadores gerais e específicos para os genes cryl, cry3, cry5, cry7, cry8,cry9, cryl 1, cry13, cry14 e cytIA (Bravo e outros, 1998; Ceron e outros,1994; Ceron e outros, 1995). Todas as reações de PCR eram negativas. Ogene de RNAr 16S da cepa ISLP1 foi então amplificado utilizando os inicia-dores planejados por Aguino de Muro e Priest (Aguino de Muro e Priest,1993). A análise de Blast da seqüência de DNA de 16S confirmou que a ce-pa ISLP1 pertence ao grupo de Bacillus thuringiensis.

Caracterização da Proteína ISLP1 Encontrada nas Inclusões de Cristal.

A proteína de 100 kDa produzida pela cepa ISLP1 foi purificadapor cromatografia de troca aniônica. transferida para !mmobüon Psq e a se-qüência amino-terminal da proteína foi obtida. Esta seqüência de aminoáci-dos (AGKSFPDVPAGH, SEQ ID NO: 14) corresponde aos primeiros 12 ami-noácidos após o peptídeo líder de um precursor de proteína de camada S deOIpA de B. Iicheniformis (número de acesso do GenBank U38842, númerode acesso do GenPept AAC44405) e de EA1 de B.anthracis (número de a-cesso do GenBank X99724, número de acesso do GenPept CAA68063).Uma digestão com tripsina da proteína ISLP1 pura foi realizada e um frag-mento de aproximadamente 50 kDa foi purificado por cromatografia por ex-clusão de tamanho por HPLC. Foi obtida uma seqüência interna de 18 ami-noácidos que também era encontrada nas proteínas de camada S Olpl eEA1: KLPVTFVTTDQYGDPYGAN (SEQ ID NO: 15).

Os iniciadores da PCR (ISLPIXder e ISLPIXrev) foram planeja-dos partindo das duas seqüências N-terminais obtidas desta proteína e utili-zados para a amplificação de um fragmento interno que era o DNA seqüen-ciado. A análise de Blast da seqüência resultante mostrava um alto escorecom seqüências de dois genes de camada S o/pA e eag (números de aces-so do GenBank u38842 e x99724). Utilizando esta informação e o alinha-mento da seqüência de DNA destes genes, novos iniciadores da PCR foramplanejados para a amplificação de dois outros produtos da PCR sobrepos-tos. Um inclui 500 pb a montante do códon ATG para ter o suposto promotore ο outro incluía 200 pb após o suposto códon de término. Foi obtida a se-qüência do gene islpl completo (SEQ ID NO: 1). O quadro aberto de leitura(ORF) encontrado nesta seqüência continha 2.589 nucleotídeos, era prece-dido por uma seqüência de Shine-Dalgarno. Foi observada uma estruturapalindrômica 22 nucleotídeos a jusante do códon de término. A comparaçãodo N-terminal da proteína seqüenciada e da seqüência de aminoácidos de-duzida partindo da seqüência de nucleotídeos confirmou que esta proteína étambém sintetizada na forma de um pré-polipeptídeo com um peptídeo sinalde 29 aminoácidos. O terminal N da proteína madura com a seqüência sinalremovida ocorre na posição de aminoácido 30 na SEQ ID NO: 2. Três moti-vos de homologia de camada S (SLH) estão presentes na seqüência da pro-teína, o primeiro foi observado entre a região da posição de aminoácido 34até 76, o segundo na região da posição de aminoácido 95-136 e o terceirona região da posição de aminoácido 162-198 (todas são posições de amino-ácidos na SEQ ID NO: 2).

Finalmente, o gene islpl completo foi clonado diretamente nacepa 407 de B. thuringiensis acristolífera, através da amplificação de trêsfragmentos de PCR que se sobrepõem em um sítio de restrição de Ncol e dePst1, respectivamente, como descrito nos Materiais e Métodos. Não erapossível a obtenção de transformantes de E. coli com este construto. Outrosautores descobriram que em muitos casos a clonagem do gene de camadaS em E. coli com sua região reguladora poderia levar a problemas (Mesnagee outros, 2001; Sun e outros, 2001). A cepa de Bt resultante expressava aproteína ISLP1 como jumgado pela imunodetecção da proteína utilizando umanticorpo policlonal produzido contra a proteína ISLP1 pura. Uma culturaesporulada desta cepa exibia uma mortalidade de 100% das larvas de E.varivestis quando avaliada a 100 e 1000 ng/cm2 em contraste com a cepa decontrole transformada com o vetor binário (shuttle) pHT315 que não expres-sa a proteína ISLP1 e não exibia qualquer toxicidade em relação às larvasde E. varivestis.

Expressão de ISLP1 na cepa ISLP1

Foi analisada a expressão da proteína ISLP1 durante o cresci-mento no meio de esporulação SP. Esta proteína é expressa durante a fasevegetativa e de esporulação do crescimento. Durante a fase vegetativa docrescimento a proteína estava associada com as bactérias uma vez que todaproteína detectada por Western era encontrada na pélete bacteriano após acentrifugação da cultura. Entretanto, durante a fase de esporulação a proteí-na ISLP1 também foi encontrada no sobrenadante de culturas centrifugadas.

Luckevich e Beveridge (1989) descreveram um procedimento deextração específico para a proteína de camada S de B. thuringiensis subsp.galleria. Este método foi utilizado para testar se a proteína ISLP1 possuía acapacidade de se ligar à superfície celular da cepa original e na cepa trans-formante. O tratamento de células vegetativas com 2 M de agente caotrópicoem pH baixo resultou na extração específica da proteína SL-ISLP1 comojulgado pelas análises de SDS-PAGE e de Western Blot da proteína extraí-da. A proteína SL-ISLP1 estava presente apenas na cepa ISLP1 e na cepatransformante de Bt, esta proteína estava ausente na cepa 407 acristolífera.Similarmente, como relatado por Luckevich e Beveridge (1989), a proteínaISLP1 foi extraída apenas com o tratamento de 2 M do reagente caotrópico,tratamentos com concentrações inferiores do reagente caotrópico (1 - 1,5 M)não extraíam a proteína das células bacterianas.

A detecção por Western desta proteína também foi feita em ou-tras cepas de Bt tais como Bt subs kurstaki HD1 e HD73, Bt subs israelinsisHD567, Bt subs aizawai HD137, Bt subs tolworthi HD125, Bt subs morrisonitenebrionis, mostrando que esta proteína não é produzida por estas cepas. Aanálise de PCR destas cepas, utilizando os iniciadores ISLPIXder e IS-LPIXrev, também confirmou que estas cepas de Bt não carregam a seqüên-cia codificadora de ISLP1.

A proteína ISLP1 (SEQ ID NO: 2) possui alta identidade de se-qüência com a proteína de camada S EA1 de Bacillus anthracis (92% deidentidade de seqüência em relação à proteína incluindo o peptídeo sinal) ecom a proteína CTC2 relatada em B. thuringiensis (89% de identidade deseqüência em relação à proteína incluindo o peptídeo sinal). A identidade deseqüência de aminoácidos da proteína ISLP1 em relação a outra proteínaSAP de camada S de B. anthracis é de apenas 32%.

LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

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<110> Universidad Nacional Autonoma de México, Instituto de Biotechnologia

<120> Novas proteínas bacterianas com atividade pesticida

<130> BCS 05-2014

<150> US 60/697.391

<151> 2005-07-08

<160> 15

<170> PatentIn versão 3.3<210> 1<211> 3117<212> DNA

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (325)..(2916)<400> 1

actttattca ttttatattt gagtattact gatatattaa taatacgatt aaaagactga 60attatcagaa tgtgtcgaat cttcttttga gaaagttctt gataacgaat ggttttgtat 120agtatgatga acttgtttca gaaaatggta tttaaacctt atatttacat ctaacggttt 180atatcatttt tttatgtgaa ctacttttca ttatagtatt tttgtttatg tttttattgt 240tttatggctt ttctaactag ctagttttca aatttaatat gatgtgaaac tagtagcata 300ttcctgaagg aggaaattta taaa atg gca aag act aac tct tac aaa aaa 351

Met Ala Lys Thr Asn Ser Tyr Lys Lys1 5

gta ate gca ggt aca atg aca gca gca atg gta gca ggt gtt gtt tct 399Val Ile Ala Gly Thr Met Thr Ala Ala Met Val Ala Gly Val Val Ser10 15 20 25

cca gta gca gca gca ggt aaa tcg ttc cca gac gtt cca gct ggt cat 447Pro Val Ala Ala Ala Gly Lys Ser Phe Pro Asp Val Pro Ala Gly His30 35 40

tgg gga tta gat tct ate aat tac tta gta gat aaa ggt gca ate gaa 495Trp Gly Leu Asp Ser Ile Asn Tyr Leu Val Asp Lys Gly Ala Ile Glu45 50 55

ggt aag cca gat ggt aca tac gct ccg gct gaa gaa att gat cgt gct 543Gly Lys Pro Asp Gly Thr Tyr Ala Pro Ala Glu Glu Ile Asp Arg Ala60 65 70

tct gct gcg aaa att atg gca att aca tta ggt tta aaa gtt gaa gag 591Ser Ala Ala Lys Ile Met Ala Ile Thr Leu Gly Leu Lys Val Glu Glu75 80 85

ggt gca caa cca tct ttc aaa gat gct aaa aat cat tgg gct tct aaa 63 9Gly Ala Gln Pro Ser Phe Lys Asp Ala Lys Asn His Trp Ala Ser Lys90 95 100 105

tac att gca gcg gtt gaa aaa gcg ggt gtt gtt aga ggt gat ggt aaa 687Tyr Ile Ala Ala Val Glu Lys Alá Gly Val Val Arg Gly Asp Gly Lys

110 115 120

gaa aac ttc tct cca gat aaa aag att gac cgt gct tct ttc gct tct 735Glu Asn Phe Ser Pro Asp Lys Lys Ile Asp Arg Ala Ser Phe Ala Ser125 130 135

atg ate gta ggt gct tat aac tta aaa gat aaa gtt aac ggc gag tta 783Met Ile Val Gly Ala Tyr Asn Leu Lys Asp Lys Val Asn Gly Glu Leu140 145 150

gtt aca aaa ttt gaa gat tta tta gac cat tgg ggt gaa gaa aaa gct 831Val Thr Lys Phe Glu Asp Leu Leu Asp His Trp Gly Glu Glu Lys Ala

155 160 165aac ate cta ate cat ctt gga ctt tct gaa gga aca gga gga aac aag 879Asn Ile Leu Ile His Leu Gly Leu Ser Glu Gly Thr Gly Gly Asn Lys170 175 180 185

tgg gag cca aat aaa tct gta tct cgt gca gaa gca gct aaa ttt ate 927Trp Glu Pro Asn Lys Ser Val Ser Arg Ala Glu Ala Ala Lys Phe Ile

190 195 200

gca gta gca gat aaa aaa tat ggc aaa aaa gat aat gca caa gca tat 975Ala Val Ala Asp Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Asp Asn Ala Gln Ala Tyr205 210 215gta act gat gtg aaa gtt tct gaa cca acg aaa tta aca tta act ggt 1023Val Thr Asp Val Lys Val Ser Glu220 225 230

act ggt tta gat aag ctt gct gctThr Gly Leu Asp Lys Leu Ala Ala235 240 245

aaa gct gtt gcg att gaa gca agtLys Ala Val Ala Ile Glu Ala Ser250 255 260 265

aca ctt ggt ggt aaa gtt gct ccaThr Leu Gly Gly Lys Val Ala Pro270 275 280

aaa aat caa tca ttc ata acg aaaLys Asn Gln Ser Phe Val Thr Lys285 290 295

gca gta gaa aaa ctt aca ttt gatAla Val Glu Lys Leu Thr Phe Asp

300 305 310

gct ttc aaa tta aac gat gaa aaaAla Phe Lys Leu Asn Asp Glu Lys315 320 325

aac tta gca gac cat gac gtc aaaAsn Leu Ala Asp His Asp Val Lys330 335 340 345

tca tca gca aac ate ttt gaa ggtSer Ser Ala Asn Ile Phe Glu Gly350 355 360

aaa cta gct gtt ggc att aaa ccaLys Leu Ala Val Gly Ile Lys Pro365 370 375

gtt aca aaa cgc ggt ggt tta acaVal Thr Lys Arg Gly Gly Leu Thr380 385 390

57

Pro Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly

gaa gat gta act ctt gag gga gac 1071Glu Asp Val Thr Leu Glu Gly Asp

gct gac ggt act tet gca gtt gta 1119Ala Asp Gly Thr Ser Ala Val Val

aat aaa aat ctt act gta aaa gtg 1167Asn Lys Asn Leu Thr Val Lys Val

ttt gta tac gaa gtg aaa aaa tta 1215Phe Val Tyr Glu Val Lys Lys Leu

gat gat cgt gct ggt caa gca gtt 1263Asp Asp Arg Ala Gly Gln Ala Val

ggt aac gct gat gtt gaa tac tta 1311Gly Asn Ala Asp Val Glu Tyr Leu

ttt gta gca aat aac tta gat ggt 1359Phe Val Ala Asn Asn Leu Asp Gly

gga gta gct act tet act aca ggc 1407Gly Val Ala Thr Ser Thr Thr Gly

gct gac tac aaa gta gaa gta caa 1455Ala Asp Tyr Lys Val Glu Val Gln

gtt tet aac act ggt att att aca 1503Val Ser Asn Thr Gly Ile Ile Thrgtg aaa aac ctt gat aca cca gct

Val Lys Asn Leu Asp Thr Pro Ala

395 400 405

gca tta gat gct gat aat gat ggt

Ala Leu Asp Ala Asp Asn Asp Gly

410 415 420 425

tct ggt aaa gac ttt gct tta aat

Ser Gly Lys Asp Phe Ala Leu Asn

430 435 440

aaa gca tct ctt aat aaa tta gtt

Lys Ala Ser Leu Asn Lys Leu Val

445 450 455

gta gtt gat cca gga tca att age

Val Val Asp Pro Gly Ser Ile Ser

460 465 470

att tct gta gta aat aac tac att

Ile Ser Val Val Asn Asn Tyr Ile

475 480 485

aca ctt act att aaa gta ggt gac

Thr Leu Thr Ile Lys Val Gly Asp

490 495 500 505

gta acg act gat tct cgt aaa tta

Val Thr Thr Asp Ser Arg Lys Leu

510 515 520

aaa tta caa gtt gtt caa aat aaa

Lys Leu Gln Val Val Gln Asn Lys

525 530 535

act gac caa tat ggc gat cca ttt

Thr Asp Gln Tyr Gly Asp Pro Phe

540 545 550

gaa gtt ctt ccg aaa act ggt gta

Glu Val Leu Pro Lys Thr Gly Val

58

tct gca ate aaa aat gct gta ttt 1551Ser Ala Ile Lys Asn Ala Val Phe

gtt gta aac tac ggt age aaa ctt 1599Val Val Asn Tyr Gly Ser Lys Leu

age caa aac tta gtt gtt ggt gaa 1647Ser Gln Asn Leu Val Val Gly Glu

gct aca att gct gga gaa gat aaa 1695Ala Thr Ile Ala Gly Glu Asp Lys

att aag tct tca aac cac ggt att 1743Ile Lys Ser Ser Asn His Gly Ile

act gct gag gct gct ggt gag gca 1791Thr Ala Glu Ala Ala Gly Glu Ala

gca acg aaa gat gtt aaa ttt aaa 1839Ala Thr Lys Asp Val Lys Phe Lys

gca tca gta aaa gct aac cca gat 1887Ala Ser Val Lys Ala Asn Pro Asp

aaa tta cct gtt aca ttc gta aca 1935Lys Leu Pro Val Thr Phe Val Thr

ggt gct aac cca gat gca att aaa 1983Gly Ala Asn Pro Asp Ala Ile Lys

gtt gca gaa ggt gga tta gat gta 2031Val Ala Glu Gly Gly Leu Asp Val555 560 565

gta acg act gac tct ggt tca attVal Thr Thr Asp Ser Gly Ser Ile570 575 580 585

ggt aac gaa gta ggc gaa ggt acaGly Asn Glu Val Gly Glu Gly Thr

590 595 600

gct act tta ggc tca tta tat gtgAla Thr Leu Gly Ser Leu Tyr Val605 610 615

ttt aaa aac ttt gaa ctt gta tctPhe Lys Asn Phe Glu Leu Val Ser

620 625 630

cct gat aca aaa ctt gac ctt aatPro Asp Thr Lys Leu Asp Leu Asn635 640 645

tta tct aag tac act tca gat cgcLeu Ser Lys Tyr Thr Ser Asp Arg650 655 660 665

gaa ggt tat gca gtt gag tct aaaGlu Gly Tyr Ala Val Glu Ser Lys

670 675 680

att gtfc gga aat aaa gtt gtt gttIle Val Gly Asn Lys Val Val Val685 690 695

gat ate cac tta acg aaa aat ggtAsp Ile His Leu Thr Lys Asn Gly

700 705 710

gaa ate gtc caa gag aca att gctGlu Ile Val Gln Glu Thr Ile Ala715 720 725

gtt caa aca gaa aac ttc gtt gag

59

ggt acg aaa aca ctt gat gtt aca 2079Gly Thr Lys Thr Leu Asp Val Thr

gtt cac ttc caa aac ggt aac ggt 2127Val His Phe Gln Asn Gly Asn Gly

aat gta aca gaa gga aac gtg gca 2175Asn Val Thr Glu Gly Asn Val Ala

aaa gta ggt caa tac ggt gca tca 2223Lys Val Gly Gln Tvr Glv Ala Ser

gtt tct gac aca gtt gca tat caa 2271Val Ser Asp Thr Val Ala Tyr Gln

gta tac tct gat cct gaa aac tta 2319Val Tyr Ser Asp Pro Glu Asn Leu

aac gaa aaa gta gct aca gct aaa 2367Asn Glu Lys Val Ala Thr Ala Lys

aca ggt aaa gct cca ggt aaa gtt 2415Thr Gly Lys Ala Pro Gly Lys Val

gca act gct ggt aaa gca act ate 2463Ala Thr Ala Gly Lys Ala Thr Ile

att aaa tct gta aac ttc aaa cca 2511Ile Lys Ser Val Asn Phe Lys Piro

aag aaa ate aac ate ggt act gtg 2559Val Gln Thr Glu Asn Phe Val Glu Lys Lys Ile Asn Ile Gly Thr Val730 735 740 745

tta gag ctt gag aag agt aac ctt gat gat ate gta aaa ggt att aac 2607Leu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Leu Asp Asp Ile Val Lys Gly Ile Asn

750 755 760

tta acg aaa gat aca caa cat aaa gta, cgt gtt gta aaa tet ggt gac 2655Leu Thr Lys Asp Thr Gln His Lys Val Arg Val Val Lys Ser Gly Asp

765 770 775

gag caa ggt aaa ctt tac tta gat aga aac ggc gat gct gta ttt aac 2703Glu Gln Gly Lys Leu Tyr Leu Asp Arg Asn Gly Asp Ala Val Phe Asn

780 785 790

gct ggc gat gta ac.c ctt ggt tat gta aca gta LcL υαα aca. agt gat 2751Ala Gly Asp Val Asn Leu Gly Tyr Val Thr Val Ser Gln Thr Ser Asp

795 800 805

tet gea ctt cca aac ttc aag gea gac ctt tac gat act tta act act 2799Ser Ala Leu Pro Asn Phe Lys Ala Asp Leu Tyr Asp Thr Leu Thr Thr810 815 820 825

aag tac act gac aaa ggt aca tta gta ttc aaa gta tta ggt gag aaa 2847Lys Tyr Thr Asp Lys Gly Thr Leu Val Phe Lys Val Leu Gly Glu Lys

830 835 840

gat gtt cta aca age gaa att ggt tca caa gct gta cac gtg aac gtt 2895Asp Val Leu Thr Ser Glu Ile Gly Ser Gln Ala Val His Val Asn Val

845 850 855

ctt aac aac cca aat cta taa gtcgattata gataaagtga aaaatcagtg 2946Leu Asn Asn Pro Asn Leu860

gggatgaatt cccactgatt tttttgctgt caatagcgaa aagaagcctc ttgtgaaaaa 3006tacaagaggc tcctttctat ttcttaaact taaacatatc cccactcaaa ttcgaatcac 3066tatacacgaa caataccatg ttaatgttgt tgtctttcat gtattgatat a 3117<210> 2<211> 863<212> PRT<213> Bacillus thuringiensis<400> 2

Met Ala Lys Thr Asn Ser Tyr Lys Lys Val Ile Ala Gly Thr Met Thr1 5 10 15

Ala Ala Met Val Ala Gly Val Val Ser Pro Val Ala Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Ser Phe Pro Asp Val Pro Ala Gly His Trp Gly Leu Asp Ser Ile Asn

35 40 45

Tyr Leu Val Asp Lys Gly Ala Ile Glu Gly Lys Pro Asp Gly Thr Tyr

50 55 60

Ala Pro Ala Glu Glu Ile Asp Arg Ala Ser Ala Ala Lys Ile Met Ala65 70 75 80

Ile Thr Leu Gly Leu Lys Val Glu Glu Gly Ala Gln Pro Ser Phe Lys

85 90 95

Asp Ala Lys Asn His Trp Ala Ser Lys Tyr Ile Ala Ala Val Glu Lys

100 105 110

Ala Gly Val Val Arg Gly Asp Gly Lys Glu Asn Phe Ser Pro Asp Lys

115 120 125

Lys Ile Asp Arg Ala Ser Phe Ala Ser Met Ile Val Gly Ala Tyr Asn

130 135 140

Leu Lys Asp Lys Val Asn Gly Glu Leu Val Thr Lys Phe Glu Asp Leu145 150 155 160

Leu Asp His Trp Gly Glu Glu Lys Ala Asn Ile Leu Ile His Leu Gly

165 170 175

Leu Ser Glu Gly Thr Gly Gly Asn Lys Trp Glu Pro Asn Lys Ser Val

180 185 190

Ser Arg Ala Glu Ala Ala Lys Phe Ile Ala Val Ala Asp Lys Lys Tyr

195 200 205Gly Lys Lys Asp Asn Ala Gln Ala Tyr Val Thr Asp Val Lys Val Ser

210 215 220

Glu Pro Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Thr Gly Leu Asp Lys Leu Ala225 230 235 240Ala Glu Asp Val Thr Leu Glu Gly245 250 255

Ser Ala Asp Gly Thr Ser Ala Val

260 265 270Pro Asn Lys Asn Leu Thr Val Lys

275 280 285

Lys Phe Val Tyr Glu Val Lys Lys

290 295 300

Asp Asp Asp Arg Ala Gly Gln Ala305 310 315 320

Lys Gly Asn Ala Asp Val Glu Tyr

325 330 335

Lys Phe Val Ala Asn Asn Leu Asp

340 345 350

Gly Gly Val Ala Thr Ser Thr Thr

355 360 365

Pro Ala Asp Tyr Lys Val Glu Val

370 375 380

Thr Val Ser Asn Thr Gly Ile Ile385 390 395 400

Ala Ser Ala Ile Lys Asn Ala Val

405 410 415

Gly Val Val Asn Tyr Gly Ser Lys

420 425 430

Asn Ser Gln Asn Leu Val Val Gly

435 440 445

Val Ala Thr Ile Ala Gly Glu Asp

450 455 460

Ser Ile Lys Ser Ser Asn His Gly465 470 475 480

Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Glu485 490 495

62

Asp Lys Ala Val Ala Ile Glu Ala

Val Thr Leu Gly Gly Lys Val Ala

Val Lys Asn Gln Ser Phe Val Thr

Leu Ala Val Glu Lys Leu Thr Phe

Val Ala Phe Lys Leu Asn Asp Glu

Leu Asn Leu Ala Asp His Asp Val

Gly Ser Ser Ala Asn Ile Phe Glu

Gly Lys Leu Ala Val Gly Ile Lys

Gln Val Thr Lys Arg Gly Gly Leu

Thr Val Lys Asn Leu Asp Thr Pro

Phe Ala Leu Asp Ala Asp Asn Asp

Leu Ser Gly Lys Asp Phe Ala Leu

Glu Lys Ala Ser Leu Asn Lys Leu

Lys Val Val Asp Pro Gly Ser Ile

Ile Ile Ser Val Val Asn Asn Tyr

Ala Thr Leu Thr Ile Lys Val GlyAsp Ala Thr Lys Asp Val Lys Phe

500 505 510

Leu Ala Ser Val Lys Ala Asn Pro

515 520 525

Lys Lys Leu Pro Val Thr Phe Val

530 535 540

Phe Gly Ala Asn Pro Asp Ala Ile545 550 555 560

Val Val Ala Glu Gly Gly Leu Asp

565 570 575

Ile Gly Thr Lys Thr Leu Asp Val

580 585 590

Thr Val His Phe Gln Asn Gly Asn

595 600 605

Val Asn Val Thr Glu Gly Asn Val

610 615 620

Ser Lys Val Gly Gln Tyr Gly Ala625 630 635 640

Asn Val Ser Asp Thr Val Ala Tyr

645 650 655

Arg Val Tyr Ser Asp Pro Glu Asn

660 665 670

Lys Asn Glu Lys Val Ala Thr Ala

675 680 685

Val Thr Gly Lys Ala Pro Gly Lys

690 695 700

Gly Ala Thr Ala Gly Lys Ala Thr705 710 715 720Ala Ile Lys Ser Val Asn Phe Lys

725 730 735Glu Lys Lys Ile Asn Ile Gly Thr740 745 750

63

Lys Val Thr Thr Asp Ser Arg Lys

Asp Lys Leu Gln Val Val Gln Asn

Thr Thr Asp Gln Tyr Gly Asp Pro

Lys Glu Val Leu Pro Lys Thr Gly

Val Val Thr Thr Asp Ser Gly Ser

Thr Gly Asn Glu Val Gly Glu Gly

Gly Ala Thr Leu Gly Ser Leu Tyr

Ala Phe Lys Asn Phe Glu Leu Val

Ser Pro Asp Thr Lys Leu Asp Leu

Gln Leu Ser Lys Tyr Thr Ser Asp

Leu Glu Gly Tyr Ala Val Glu Ser

Lys Ile Val Gly Asn Lys Val Val

Val Asp Ile His Leu Thr Lys Asn

Ile Glu Ile Val Gln Glu Thr Ile

Pro Val Gln Thr Glu Asn Phe Val

Val Leu Glu Leu Glu Lys Ser AsnLeu Asp Asp Ile Val Lys Gly Ile Asn Leu Thr Lys Asp Thr Gln His

755 760 765

Lys Val Arg Val Val Lys Ser Gly Asp Glu Gln Gly Lys Leu Tyr Leu

770 775 780

Asp Arg Asn Gly Asp Ala Val Phe Asn Ala Gly Asp Val Asn Leu Gly785 790 795 800

Tyr Val Thr Val Ser Gln Thr Ser Asp Ser Ala Leu Pro Asn Phe Lys

805 810 815

Ala Asp Leu Tyr Asp Thr Leu Thr Thr Lys Tyr Thr Asp Lys Gly Thr

820 825 830

Leu Val Phe Lys Val Leu Gly Glu Lys Asp Val Leu Thr Ser Glu Ile

835 840 845

Gly Ser Gln Ala Val His Val Asn Val Leu Asn Asn Pro Asn Leu

850 855 860

<210> 3<211> 34<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 3

acgctctaga tagcaggtaa atcattccca gacg 34

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 4

acgctctaga tcgccgtatt ggtcagttgt tac 33

<210> 5<211> 30<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 5

gctctagatg agagtgcttt ataggaaaat<210> 6<211> 31<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 6

gctctagatc ttcagccgga gcgtatgtac c

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 7

gctctagata ctgctgaggc tgctggtgagg

<210> 8<211> 30<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 8

gctctagatc ctcgacctgc ttcactatca<210> 9<211> 29<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 9

tctttgccat ggtataaatt tcctccttc<210> 10<211> 28<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 10

ttataccatg gcaaagacta actcttac<210> 11<211> 32<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 11

aaaactgcag aagtaccgtc agcacttgct tc

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 12

aaegetgcag ttgtaaeaet tggtggtaaag<210> 13<211> 30<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador da PCR<400> 13

cgggatcctc ctcgacctgc gtcactatca

<210> 14<211> 12<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis<400> 14

Ala Gly Lys Ser Phe Pro Asp Val

1 5 10

<210> 15

<211> 19

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis<400> 15

Lys Leu Pro Val Thr Phe Val Thr15 10 15

Gly Ala Asn

30

Pro Ala Gly His

Thr Asp Gln Tyr Gly Asp Pro Tyr

Claims

1. Proteína pesticida isolada caracterizada pelo fato de que:a) é especificamente pesticida para algumas pragas e não paraoutras eb) tem pelo menos 50% de identidade de seqüência com umaproteína bacteriana da camada S.

2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, que é caracterizadapelo fato de que:a) é especificamente inseticida para alguns insetos e não paraoutros,b) tem pelo menos 70% de identidade de seqüência com umaproteína bacteriana da camada S.c) um peso molecular de desde aproximadamente 50 até apro-ximadamente 120 kDa.

3. Proteína de acordo com a reivindicação 1, que tem pelo me-nos 50% de identidade de seqüência com a proteína da ID SEQ NO: 2 oucom um fragmento tóxico da mesma e que tem um peso molecular de desdeaproximadamente 50 até aproximadamente 120 kDa.

4. Proteína de acordo com a reivindicação 2, que tem pelo me-nos 50% de identidade de seqüência com a proteína da ID SEQ NO: 2 oucom um fragmento tóxico da mesma e que tem um peso molecular de desdeaproximadamente 50 até aproximadamente 120 kDa.

5. Proteína de acordo com a reivindicação 4, que compreende aseqüência de aminoácido da ID SEQ NO: 2 de uma posição de aminoácidoentre a posição de aminoácido 1 e a posição de aminoácido 31 até a posiçãode aminoácido 863.

6. Proteína de acordo com a reivindicação 4, que compreende aseqüência de aminoácido da ID SEQ NO: 2 de uma posição de aminoácidoentre a posição de aminoácido 1 e a posição de aminoácido 531 até a posi-çao de aminoácido 863.

7. Proteína de acordo com a reivindicação 4, que compreende aseqüência de aminoácido da ID SEQ NO: 2.

8. DNA isolado que codifica a proteína como definido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Gene quimérico que compreende:a) uma seqüência de codificação que compreende o DNA comodefinido na reivindicação 8, eb) um promotor que permite a expressão em células vegetais.

10. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 9, em que adita seqüência de codificação é uma seqüência de DNA sintético que foi oti-mizada para expressão em um vegetal hospedeiro.

11. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 10, em que odito vegetal hospedeiro é selecionado do grupo que consiste em: milho, al-godão, soja, arroz, colza de semente oleaginosa, couve-flor e repolho.

12. Vetor de transformação de vegetal que compreende o genequimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11.

13. Vegetal, semente ou célula transgênicos que compreende ogene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11.

14. Vegetal, semente ou célula transgênicos da reivindicação 13,em que o dito vegetal é selecionado do grupo de: milho, algodão, soja, arroz,colza de semente oleosa, couve-flor e repolho.

15. Processo de proteção de vegetais contra danos causadospor pragas de vegetais, tais como pragas de insetos, alimentação às espé-cies de vegetal às quais pertencem os ditos vegetais, que compreende aetapa de expressão do gene quimérico como definido em qualquer uma dasreivindicações 9 a 11 nas células dos ditos vegetais.

16. Processo de proteção de um vegetal contra danos causadospor pragas de vegetais, tais como pragas de insetos, alimentação às espé-cies de vegetal às quais pertencem os ditos vegetais, que compreende aetapa de transformar uma célula vegetal com o gene quimérico como defini-do em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, regenerando a dita célula emum vegetal e obtendo progênie e material de propagação do dito vegetal,tais como sementes, que compreende o dito gene quimérico.

17. Processo de eliminação de pragas, que compreende o con-tato das ditas pragas com a proteína como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 7.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que a ditapraga é uma praga de insetos.

19. Uso do DNA de acordo com a reivindicação 8, para controlarou eliminar pragas tais como pragas de insetos.

20. Uso do gene quimérico como definido em qualquer uma dasreivindicações 9 a 11, para controlar ou eliminar pragas tais como pragas deinsetos.

21. Uso da proteína como definido em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 7, para controlar ou eliminar pragas tais como pragas de inse-tos.

22. Processo para proteger um campo de vegetais contra pragastais como insetos, que compreende: a aplicação da proteína como definidaem qualquer uma das reivindicações 1 a 7 a um campo de vegetais, seja naforma de uma composição pesticida que compreende a proteína como defi-nida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou na forma de um orga-nismo recombinante que expressa a dita proteína.

23. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que o ditoorganismo recombinante é um vegetal transgênico que expressa a proteínacomo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.