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DE29623744U1 - Indolinonverbindungen für die Behandlung von Krankheiten - Google Patents

Indolinonverbindungen für die Behandlung von Krankheiten

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DE29623744U1
DE29623744U1 DE29623744U DE29623744U DE29623744U1 DE 29623744 U1 DE29623744 U1 DE 29623744U1 DE 29623744 U DE29623744 U DE 29623744U DE 29623744 U DE29623744 U DE 29623744U DE 29623744 U1 DE29623744 U1 DE 29623744U1
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methylene
cells
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DE29623744U
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Sugen LLC
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Publication date
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Description

Indolinonverbindungen fur die Behandlung von Krankheiten
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die fähig sind, die Tyrosinkinase-Signalweiterleitung zu modulieren, regulieren und/oder zu inhibieren. Die Verbindungen der Erfindung können in Verfahren zur Regulation, Modulation oder Inhibition von Tyrosinkinasen, ungeachtet ob der Rezeptor- oder der Nicht-Rezeptorklasse angehörig, bei der Vorbeugung und/oder Behandlung von Krankheiten und Störungen, die mit unregulierter Signalweiterleitung durch Tyrosinkinasen verbunden sind, einschließlich der Zeilproliferation und metabolischen Störungen, eingesetzt werden.
Protein-Tyrosinkinasen (PTKs) umfassen eine große und diverse Klasse von Proteinen mit enzymatischer Aktivität. Die PTKs spielen eine wichtige Rolle in der Kontrolle von Zellwachstum und Differenzierung (für einen Überblick siehe Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383-391).
Zum Beispiel wird die Rezeptor-Tyrosinkinase vermittelte Signalweiterleitung durch extrazelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) eingeleitet, die von der Rezeptordimerisierung, der transienten Stimulation der intrinsischen Protein-Tyrosinkinaseaktivität und Phosphorylierung gefolgt wird. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle geschaffen und dies führt zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmatischen Signalmolekülen, die die geeignete zelluläre Antwort erleichtern (z.B. Zellteilung, metabolische Effekte auf die extrazelluläre Mikroumgebung). Siehe Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391.
0 Für Rezeptor-Tyrosinkinasen ist ebenfalls gezeigt worden, dass Tyrosinphosphorylierungsstellen als Bindungsstellen mit hoher Affinität für SH2- (src Homologie) Domänen von Signalmolekülen dienen. Fantl et al.; .1992, Cell 69:413-423; Songyang et al.; 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785); Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778; und Koch et al., 1991, Science .252:668-678. Es sind verschiedene intrazelluläre
Substratproteine identifiziert worden, die mit Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) assoziieren. Diese können in zwei prinzipielle Gruppen unterteilt werden: (1) Substrate, die eine katalytische Domäne haben, und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, aber als Adaptoren dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778.·Die Spezifität der Interaktion zwischen Rezeptoren oder Proteinen und SH2-Domänen ihrer Substrate wird durch die Aminosäurereste bestimmt, die den phosphorylierten Tyrosinrest unmittelbar umgeben. Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domänen und den den Phosphotyrosinrest umgebenden Aminosäuresequenzen in . bestimmten Rezeptoren, sind konsistent mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofil.
Songyang et al., 1993, CeH 72:767-778. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die Funktion einer jeden Rezeptor-Tyrosinkinase nicht nur durch ihr Expressionsmuster und die Verfügbarkeit des Liganden bestimmt wird, sondern ebenfalls durch die Anordnung von stromabwärts gelegenen Signalweiterleitungswegen, die durch einen bestimmten Rezeptors aktiviert werden. Daher stellt die Phosphorylierung einen wichtigen regulatorischen Schritt dar, der die Selektivität der Signalweiterleitungswege, die durch spezifische Wachstumsfaktor-Rezeptoren angeschaltet werden, sowie der von Differenzierungsfaktor-Rezeptoren bestimmt.
Aberrierende Expression oder Mutationen in den PTKs haben gezeigt, dass dies entweder zu unkontrollierter Zellproliferation (z.B. malignes Tumorwachstum) oder zu Defekten in Schlüsselprozessen der Entwicklung führen. Daher hat die biomedizinische Gemeinde erhebliche Mittel aufgewendet, um die spezifische biologische Rolle von Mitgliedern der PTK-Familie, ihre Funktion in
Differenzierungsprozessen, ihre Beteiligung bei der Tumorentstehung und anderen Krankheiten, die biochemischen 5 Mechanismen, die ihren Signalweiterleitungswegen, die nach der Stimulation durch Liganden aktiviert werden, zugrunde liegen, sowie die Entwicklung von neuen Medikamenten ausfindig zu
machen.
Tyrosinkinasen; können dem Rezeptortyp (der extrazelluläre, Transmembran- und intrazelluläre Domänen aufweist) oder dem Nicht-Rezeptortyp (der vollständig intrazellulär vorliegt) angehören.
Rezeptor-Tyrosinkinasen. Die RTKs umfassen eine große
Anzahl von Transmembranrezeptoren mit diversen biologischen Aktivitäten. Die intrinsische Funktion von RTKs wird infolge der Ligandenbindung aktiviert, die zur Phosphorylierung des Rezeptors und zahlreichen zellulären Substraten führt und nachfolgend zu einer Vielzahl von zellulären Antworten. Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212.
Zur Zeit sind zumindest neunzehn (19) verschiedene RTK-Subfamilien identifiziert worden. Von einer RTK-Subfamilie, die als die HER-* Subf amilie bezeichnet wird, wird, angenommen, dass sie von EGFR, HER2, HER3 und HER4 umfaßt wird. Liganden der HER-Subfamilie von Rezeptoren schließen den epithelialen Wachstumsfaktor (EGF), TGF-a, Amphiregulin, HB-EGF, Betazellulin und Heregulin ein.
Eine zweite Familie von RTKs, die als die Insulin-Subfamilie bezeichnet wird, wird von INS-R, IGF-IR und dem IR-R umfaßt. Eine dritte Familie, die "PDGF"-Subfamilie schließt die PDGF &agr; und &bgr; Rezeptoren, CSFIR, c-kit und FLK-II ein. Von einer anderen Subfamilie der RTKs, die als die FLK-Familie identifiziert wurde, wird angenommen, dass sie von dem Kinaseinsertions-Domäne-Rezeptor fötale Leberkinase-1 (KDR/FLK-1), der fötalen Leberkinase 4 (FLK-4) und der fmsartigen Tyrosinkinase 1 (flt-1) umfaßt wird. Von allen diesen Rezeptoren wurde anfänglich angenommen, dass sie Rezeptoren 0 für hemapoietische Wachstumsfaktoren sind. Zwei andere Subfamilien der RTKs sind als die FGF-Rezeptorfamilie (FGFRl, FGFR2, FGFR3.und FGFR4) und die Met-Subfamilie (c-met und Ron) bezeichnet worden.
Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den PDGF- und FLK-5 Subfamilien werden die zwei Subfamilien oftmals -zusammen betrachtet. Die bekannten RTK Subfamilien sind in Plowman et al., 19 94, DN&P 7.(6) : 334-339 genannt.
Die Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen. Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen stellen eine Ansammlung von zellulären Enzymen dar, denen extrazelluläre und Transmembransequenzen fehlen. Zur Zeit sind über vierundzwanzig individuelle Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen, einschließlich elf (11) Subfamilien (Src, Frk, Btk, Csk, AbI, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack und LIMK) identifiziert worden. Zur Zeit umfaßt die Src-Subfamilie :der Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen die größte Anzahl von PTKs und schließt Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, BIk, Hck, Fgr und Yrk ein. Die Src-Subfamilie der Enzyme ist mit der Onkogenese in Verbindung gebracht worden. Eine ausführlichere Diskussion von Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen ist in Bolen, 1993, Oncogens 8:2025-2031 zu finden.
Für viele der Tyrosinkinasen, ungeachtet, ob eine RTK oder eine Nichtrezeptor-Tyrosinkinase, wurde gefunden, dass sie an zellulären Signalweiterleitungswegen beteiligt sind, die zu zellulären Signalarrays-Signalweiterleitungswegen führen, die ihrerseits zu pathogenen Zuständen, einschließlich Krebs, Schuppenflechte und Hyperimmunantwort führen.
0 Entwicklung von Verbindungen zur Modulierung'von PTKs.
Angesichts der vermuteten Bedeutung von PTKs für die Kontrolle, Regulation und Modulation der Zeilproliferation, ■ der Krankheiten und Störungen, die mit abnormer Zellprolifertation verbunden sind, sind viele Versuche unternommen worden, um "Inhibitoren" von Rezeptor- und Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen zu identifizieren, wobei eine Vielzahl von Vorgehensweisen, einschließlich der Verwendung von mutierten Liganden (US-Patentanmeldung Nr. 4,966,846), löslichen Rezeptoren und Antikörpern (Anmelde-Nr. WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natsl Acad. Sei 90:10705-09; Kim, et al·., 1993, Nature 362:841-844), RNA Liganden (Jellinek, et al., Biochemistry 33:841-844); Takano, et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4:358A; Kinsella, et al., 1992, Exp. Cell Res. 199:56-62; Wright, et al., 1992, J. Cellular Phys.
152:448-57) und Tyrosinkinase-Inhibitoren (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; U.S. Patent Nr. 5,330,992;
Mariani, et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268)
verwendet wurden. ;
Kürzlich wurden Versuche unternommen, kleine Moleküle zu identifizieren, die als Tyrosinkinase-Inhibitoren wirken. Zum Beispiel sind bismonocyclische, bicyclische oder heterocyclische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylen-Azaindolderivate (PCT WO 94/14808) und l-Cyclopropyl-4-pyridyl-chinolone (US-Patent 5,330,992) allgemein als Tyrosinkinase-Inhibitoren beschrieben worden.
Styrylverbindungen (US-Patent 5,217,999), styrylsubstituierte Pyridylverbindungen (US-Patent 5,302,606), bestimmte Chinazolinderivate (EP-Anmeldung 0 566 266 Al) , Selenoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyclische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495) sind als Verbindungen für die Verwendung als Tyrosinkinase-Inhibitoren zum Einsatz bei der Krebsbehandlung beschrieben worden.
Die Identifikation von wirksamen kleinen Verbindungen, die die Signaltransduktion spezifisch inhibieren, indem sie die Aktivität von -.-Rezeptor- und Nichtrezeptor-Tyrosipkinasen modulieren, um abnorme oder nicht hinnehmbare Zeilproliferation zu regulieren und zu modulieren, ist daher wünschenswert und die Aufgabe dieser Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher organische Moleküle, die in der Lage sind, die Signalweiterleitung durch Tyrosinkinasen zu modulieren, regulieren und/oder zu inhibieren. Solche Verbindungen sind für die Behandlung von Krankheiten geeignet, die mit unregulierter TKS-Weiterleitung verbunden sind, einschließlich zellproliferatorischer 0 Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose, Arthritis und Restenose sowie metabolische Krankheiten wie Diabetes.
In einer allgemeinen Ausführungsform haben die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Formel:
• ·
und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wobei: R1 H ist;
R2 0 oder S ist;
R3 Wasserstoff ist;
R4, R5, R6 und R7 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt werden, aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO2NRR", SO3R, SR, NO2, NRR", OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2) nC02R, und CONRR" besteht; A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Thiophen, Pyrrol, Parazol,
Imidazol, 1,2,3-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4-Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazoi und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, • . Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen,
Trihalomethyl, S(O)R, NO2NRR", SO3R, SR, NO2, NRR", OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2) nC02R und CONRR" besteht; &eegr; 0-3 ist;
R H, Alkyl oder Aryl ist und R~ H, Alkyl oder Aryl ist, mit der Maßgabe, dass die folgenden Verbindungen ausgenommen sind:
3-(Pyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon; 3-(5-Chlor-3,4-dimethylpyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon; 3-(3,5-Dimethyl-4-ethylpyrrol-2-yl)-2-indolinon; 3- (3,5-Dimethyl-4-ethoxycarbonylpyrrol-2-yl)-2-indolinon; Benzoesäure, 2-[[ [l-Ethyl-2,3-dihydro-2-oxo-3-(IH-pyrrol-2-
ylmethylen)-lH-indol-5-yl]oxy]methyl] 3-[(l-Methyl-5-nitro-imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon; 3 -(Thien-2-ylmethylen)-2-indolinon; lH-Indol-7-essigsäure, 3-[(2-butyl-lH-imidazol-4-
15 20 25 30 35
yUmethylen] -2, 3-dihydro-2-oxo- , Ethylester; und lH-Indol-7-essigsäure, 3- [ [2-butyl-l-[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]-lH-imidazol-4-yl] methylen]-2,3-dihydro-2-oxö-, Ethylester.
Weiterhin umfaßt die Erfindung eine Verbindung der Formel
und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wobei:
R1 H ist;
R2 O oder S ist;
R3 Wasserstoff ist;
R4, R5, R6 und R7 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt werden,,aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO2NRR", SO3R, SR, NO2, NRR", OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2) nCO2R, und CONRR" besteht;
A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Parazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-SuIfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-0xadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4-Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazol und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO2NRR", SO3R, SR, NO2, NRR", OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2JnCO2H und CONRR" besteht;
&eegr; 0-3 ist;
R H, Alkyl oder Aryl ist; und
R" H, Alkyl oder Aryl ist.
Bevorzugt sind dabei Verbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus 3-[(3-Methylpyrrol-2-yDmethylen]-2-indolinon; 3- [ (3 , 4-Dimethylpyrrol-2-yl) methylen]-2-indolinon; 3-[(2-Methylthien-5-yl)methylen]-2-indolinon; 3- [ (3-Methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon; 3-{[4-(2-Methoxycarbonylethyl)-3-methylpyrrol-5-yl]methylen}-2-indolinon; 3-[(4,5-Dimethyl-3-ethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon; 3-[(5-Methylimidazol-2-yl)methylen] -2-indolinon; 5-Chlor-3-[(5-methylthien-2-yDmethylen]-2-indolinon; 3-[(3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon; 3-[(3-(2-carboxyethyl)-4-methylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon; 5-Chlor-3-[(3,5-dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon; und 3-[(2,4-Dimethylpyrrol-5-yDmethylen]-2-indolinon, oder einem pharmaceutisch annehmbaren Salz davon. . .
Ganz besonders bevorzugt ist die Verbindung 3-[(2,4-Dimethylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
0 Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf pharmazeutische
. Zusammensetzungen- gerichtet, die eine pharmazeutisch wirksame Menge der oben beschriebenen Verbindungen der Formel I und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger umfaßt. Von einer solchen Zusammensetzung wird angenommen, dass sie die Signalweiterleitung durch eine Tyrosinkinase moduliert, entweder durch Inhibition der katalytischen Aktivität, Affinität gegenüber ATP oder der Fähigkeit, mit einem Substrat zu interagieren.
Insbesondere können die Verbindungen der vorliegenden 0 Erfindung zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die proliferatorische, fibrotische oder metabolische Störungen umfassen, z.B. Krebs, Fibröse, Schuppenflechte, Afteriosklerose, Arthritis und andere Störungen, die mit abnormer Vasculogenese und/oder Angiogenese verbunden sind, wie die diabetische Retinopathie.
Die in der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung verwendeten Definitionen sind wie folgt zu
verstehen.
"Pharmazeutisch annehmbares Salz" bezieht sich auf diejenigen Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen beibehalten, und die durch Reaktion mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen erhalten werden.
"Alkyl" bezieht sich auf geradkettige, verzweigte oder cyclische gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffe. Vorzugsweise hat die Alkylgruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Insbesondere ist sie eine Niederalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Typische Alkylgruppen schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Tertiärbutyl, Pentyl, Hexyl und dergleichen ein. Die Alkylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxy, Cyano, Alkoxy, =0, 0 =S, NO2, Halogen, N(CH3) 2 Amin und SH besteht.
"Alkenyl" bezieht sich auf eine geradkettige, verzweigte oder cyclische ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, die • . zumindest eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Vorzugsweise besitzt die Alkenylgruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Insbesondere ist sie eine Niederalkenylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Die Alkenylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxyl, Cyano, Alkoxy, =0,· =S, NO2, Halogen, N(CH3) 2 Amin und SH besteht.
"Alkinyl" bezieht sich auf eine geradkettige, verzweigte oder cyclische ungesättigte Kohlenwasserstoffeinheit, die zumindest eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthält. Vorzugsweise besitzt die Alkinylgruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Vorzugsweise ist sie eine Niederalkinylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen,
insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Die Alkinylgruppe kann gegebenenfalls mit; einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxyl, Cyano, Alkoxy, =0, =S, NO2, Halogen, N(CH3) 2 Amino und SH besteht.
"Alkoxy" bezieht sich auf eine "-Oalkyl"-Gruppe. . "Aryl" bezieht sich auf eine aromatische Gruppe, die. zumindest einen Ring mit einem konjugierten pi-Elektronsystem besitzt und schließt carbocyclische Aryl-, heterocyclische Aryl- und Biarylgruppen ein. Die Arylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die
aus Halogen, Trihalomethyl, Hydroxyl, SH, OH, NO2, Amin, Thioether, Cyano, Alkoxy, Alkyl und Amino besteht.
"Alkaryl" bezieht sich auf einen Alkylrest, der kovalent an eine Arylgruppe gebunden ist. Vorzugsweise ist die Alkylgruppe eine Niederalkylgruppe.
"Carbocyclisch.es Aryl" bezieht sich auf eine Arylgruppe, wobei die Ringatome Kohlenstoffe sind.
0 "Heterocyclisches Aryl" bezieht sich auf eine Arylgruppe mit 1 bis 3 Heteroatomen als Ringatome, wobei der Rest der Ringatome Kohlenstoffe sind. Heteroatome schließen Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff ein. Daher schließen heterocyclische Arylgruppen Furanyl, Thienyl, Pyrridyl, Pyrrolyl, N-Niederalkylpyrrol, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Imidazolyl und dergleichen ein.
"Amid" bezieht sich auf -C(O)-NH-R, wobei R Alkyl, Aryl, Alkylaryl oder Wasserstoff ist.
"Thioamid" bezieht sich auf -C(S)-NH-R, wobei R Alkyl, 0 Aryl, Alkylaryl oder Wasserstoff ist.
"Amin" bezieht sich auf eine -N (R".) R" Gruppe, wobei R" und R" aus der Gruppe unabhängig ausgewählt werden, die aus Alkyl, Aryl und Alkylaryl besteht.
"Thioether" bezieht sich auf -S-R, wobei R Alkyl/ Aryl oder Alkylaryl ist.
"Sulfonyl" bezieht sich auf -S(O)2-R, wobei R Aryl, C(CN)=C-Aryl, CH2CN, Alkyaryl, Sulfonamid, NH-Alkyl, NH-
Alkylaryl, oder NH-Aryl ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die fähig sind, die Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen, und insbesondere Signaltransduktion durch Rezeptor- und Nichtrezeptor-Tyrosinkinase zu regulieren und/oder zu modulieren.
Die von Rezeptor-Tyrosinkinasen vermittelte
Signaltransduktion wird durch extrazelluläre Interaktion mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert , gefolgt von Rezeptordimerisierung, transienter Stimulation der intrinsischen Protein-Tyrosinkinaseaktivität und Phosphorylierung. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle geschaffen und dies führt zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmatischen Signalmolekülen, die die geeignete zelluläre Antwort erleichtern (z.B. Zellteilung, metabolische Effekte auf die extrazelluläre Mikroumgebung). Siehe Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391.
Es wurde gezeigt, dass Tyrosin-Phosphorylierungsstellen in Wachstumsfaktor-Rezeptoren als Bindungsstellen mit hoher Affinität für SH2- (Src Homologie) Domänen von Signalmolekülen dienen. Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423; Songyang et al.,
. 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785); Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778; und Koch et al., 1991, Science 252:668-678.
Es sind verschiedene intrazelluläre Substratproteine identifiziert worden, die mit Rezeptor-Tyrosinkinasen assoziieren. Diese können in zwei allgemeine Gruppen eingeteilt werden: (1) Substrate mit einer katalytischen Domäne, und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, die 0 jedoch als Adaptoren dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-
77*8. Die Spezifität der Interaktionen zwischen Rezeptoren und SH2 Domänen ihrer Substrate wird durch die Aminosäurereste bestimmt, die den phosphorylierten Tyrosinrest unmittelbar 5 umgeben. Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domänen und den den Phosphortyrosinrest umgebenden
Aminosäuresequenzen in bestimmten Rezeptoren sind mit den beobachteten Unterschieden in ihren
Substratphosphorylierungsprofilen konsistent. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Diese Beobachtungen lassen vermuten,
dass die Funktion von jeder der Rezeptor-Tyrosinkinasen nicht nur durch ihr Expressionsmuster und die Verfügbarkeit' des Liganden bestimmt wird, sondern ebenfalls durch die Anordnung der stromabwärts gelegenen Signaltransduktionswege, die durch einen bestimmten Rezeptor aktiviert werden. Daher stellt die Phosphorylierung einen wichtigen regulatorischen Schritt dar, der die Selektivität des Signalweges, der durch spezifische Wachstumsfaktor-Rezeptoren angeschaltet wird, sowie die der Differenzierungsfaktor-Rezeptoren bestimmt.
Die Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen führt unter anderen Antworten zur Zeilproliferation, Differenzierung und Metabolismus. Eine abnorme Zeilproliferation kann zu einer großen Anzahl von Störungen und Krankheiten führen, einschließlich der Entwicklung von Neoplasmen wie Karzinomen, Sarkomen, Leukämien, Glioblastomen, Hämangiomen, 0 Schuppenflechte, Arteriosklerose, Arthritis, sowie diabetischer Retinopathie (oder anderen Störungen, die mit unkontrollierter Angiogenese und/oder Vasculogenese verbunden sind).
Diese Erfindung ist daher auf Verbindungen gerichtet, die die durch Tyrosinkinasen vermittelte Signaltransduktion regulieren, modulieren und/oder inhibieren, indem sie auf die enzymatisch^ Aktivität der RTKs und/oder Nichtrezeptortyrosinkinasen einwirken und das von solchen Proteinen weitergeleitete Signal stören, ist. Die vorliegende 0 Erfindung ist insbesondere auf Verbindungen gerichtet, die die von RTKs und/oder Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen vermittelten Signalweiterleitungswege modulieren und/oder inhibieren als ein therapeutischer Ansatz, um Leukämie und viele Arten von festen Tumoren zu heilen, einschließlich, aber nicht 5 beschränkt auf Karzinome, Sarkome, Erythroblastome, Glioblastome, Meningiome, Astrozytpme, Melanome und Myoblastome. Indikationen können Hirnkrebse, Blasenkrebse,
Gebärmutterkrebse, Magenkrebse, Pankreaskrebse, Darmkrebse, Blutkrebse, Lungenkrebse und Knochenkrebse einschließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die chemischen Formeln der erfindungsgemäßen Verbindungen, '5 auf die hier Bezug genommen wird, können das Phänomen der Tautomerisierung oder der strukturellen Isomerisierung zeigen. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Verbindungen eine eis- oder trans-Konformation in Bezug zur Doppelbindung, die den 3-Substituenten des Indolinon mit dem Indolinonring verknüpft, aufweisen, oder können ein Gemisch von eis- oder trans-Isomeren sein. Da die Formelabbildüngen in der Beschreibung nur eine mögliche Tautomer- oder Strukturisomer-Form darstellen können, sollte es selbstverständlich sein, dass die Erfindung jede tautomere oder strukturell isomere Form oder Mischungen davon umfaßt, die die Fähigkeit besitzen, die Tyrosinkinase-Signaltransduktion oder die Zeilproliferation zu regulieren, inhibieren und/oder zu modulieren und ist nicht auf eine der tautomeren oder strukturell isomeren Formen beschränkt, die in den Formeldarstellungen verwendet werden.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Verbindungen und ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen ist die Erfindung weiterhin gerichtet, soweit anwendbar, auf solvatisierte sowie unsolvatisierte Formen der Verbindungen (z.B. hydratisierte Formen), die die Fähigkeit besitzen, die Zellproliferation zu regulieren und/oder zu modulieren.
Die hier beschriebenen Verbindungen können durch jedes beliebige Verfahren hergestellt werden, von dem bekannt ist, dass es für die Herstellung von chemisch ähnlichen 0 Verbindungen verwendet werden kann. Geeignete Verfahren werden in den Beispielen veranschaulicht. Notwendige Ausgangsmaterialien können durch Standardverfahren der organischen Chemie erhalten werden.
Die Aktivität und Wirksamkeit einer individuellen Verbindung als ein Mittel, um die Rezeptor-Tyrosinkinase vermittelte Signaltransduktion zu beeinflussen,, kann unter Verwendung der verfügbaren Techniken bestimmt werden.
Vorzugsweise wird eine Verbindung einer Serie von Screening-Versuchen unterworfen, um die Fähigkeit der Verbindung, die Zeilproliferation zu modulieren, regulieren und/oder zu inhibieren, zu bestimmen. Diese Screening-Versuche umfassen in der Reihenfolge, in der sie durchgeführt werden biochemische Tests, Zellwachstumstests und in vivo-Experimente.
Die hier beschriebenen Verbindungen sind zur Behandlung von Störungen verwendbar, die mit der unregulierten Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen verbunden sind, einschließlich Störungen der Zeilproliferation, fibrotische Störungen und metabolische Störungen.
Störungen der Zellproliferationen, die mit Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt oder untersucht werden können, schließen Krebse, proliferatorische Störungen von Blutgefäßen und proliferatorische Störungen von Mesangialzellen ein.
Proliferatorische Störungen von Blutgefäßen betreffen angiogenetische und vasculogenetische Störungen, die 0 üblicherweise zur abnormen Proliferation von Blutgefäßen
führen. Die Bildung und Verbreitung von Blutgefäßen, oder die Vasculoginese bzw. Angioginese, spielt bei einer Vielzahl von ■ . physiologischen Prozessen wie der Embryonalentwicklung, der Bildung des Corpus luteum, der Wundheilung und der Organregeneration eine bedeutende Rolle. Sie spielen ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Krebsentwicklung. Andere Beispiele von proliferatorischen Störungen der Blutgefäße schließen Arthrose ein, bei der neue Kapillarblutgefäße in die Gelenke einwandern und Knorpel zerstören, und Augenkrankheiten wie die diabetische Retinopathie, bei der neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper einwandern, bluten und Blindheit verursachen. Umgekehrt sind Störungen, die mit der Schrumpfung, Kontraktion oder dem Verschließen von Blutgefäßen verbunden sind, wie die Restenose, ebenfalls daran beteiligt.
Fibrotische Störungen beziehen sich auf die abnorme Bildung von extrazellulärer Matrix. Beispiele von fibrotischen Störungen schließen hepatitische Zirrhose und
proliferatorische Störungen von Mesangialzellen ein. Die hepatitische Zirrhose ist durch die Zunahme von extrazellulären Matrixbestandteilen gekennzeichnet, was zur Bildung von hepatitischen Narben führt. Die hepatitische Zirrhose kann Krankheiten wie die Leberzirrhose verursachen. Eine Zunahme der extrazellulären Matrix, die zu hepatitischen Narben führt, kann ebenfalls durch virale Infektionen wie der Hepatitis verursacht werden. Lipocyten scheinen eine Hauptrolle bei der hepatitischen Zirrhose zu spielen. Andere fibrotische Störungen, die betroffen sind, schließen Arteriosklerose ein (siehe unten).
Proliferatorische Störungen von Mesangialzellen beziehen sich auf Störungen, die durch die abnorme Proliferation von Mesangialzellen verursacht werden. Mesangiale proliferatorische Störungen schließen zahlreiche Nierenkrankheiten.beim Menschen wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropathie, maligne Nephrosklerose, thrombotische mikroangiopathische Syndrome, Transplantatabstoßungen und Glomerulopathien ein. Der PDGF-R ist am Erhalt der mesanagialen Zellproliferation^beteiligt. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S-54S.
PTKs sind mit solchen Störungen der Zeilproliferation in Zusammenhang gebracht worden. Zum Beispiel sind einige Mitglieder der RTK Familie mit der Entwicklung von Krebs in Zusammenhang gebracht worden. Einige dieser Rezeptoren wie der EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233; Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) und der PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene 7:627-633) werden in vielen Tumoren überexprimiert 0 und/oder dauerhaft durch autokrine Loops aktiviert. In der Tat sind bei den meisten der üblichen und schweren Krebserkrankungen eine Überexpression dieser Rezeptoren (Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sei. 111:119-133; Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res.
61:249-273; Korc et al., 199.2, J. Cl in. Invest. 90:1352-1360) und autokrine Loops (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.
118:1057-1070; Korc et al., supra; Akbasak and Suner-Akbasak et al., supra) gezeigt worden. Zum Beispiel ist der EGFR
Rezeptor mit Plattenepithelkarzinomen, Astrozytomen, Glioblastomen, Kopf- und Nackenkrebs, Lungenkrebs sowie Blasenkrebs in Verbindung gebracht worden. HER2 ist mit Brust-, Gebärmutter-, Magen-, Lungen-, Speicheldrüsen- und Blasenkrebs in Verbindung gebracht worden. Der PDGF-R ist mit Glioblastomen, Lungen-, Gebärmutter-, Melanomen-, und ' Prostatakrebs in Verbindung gebracht worden. Der RTK c-met ist im allgemeinen mit der Leberkrebsentstehung und daher mit Karzinomen von Leberzellen in Verbindung gebracht worden. Weiterhin ist c-met mit maligner Tumorbildung verbunden worden. Genauer gesagt ist RTK c-met unter anderem mit Krebsen, Corektalen, Schilddrüsen-, Bauchspeicheldrüsen- und Magenkarzinomen, Leukämie und Lymphomen in Verbindung gebracht worden. Ebenfalls wurde die Überexpression des c-met-Gens in Patienten mit Hodgkins Krankheit, Burkitts Krankheit und in der Lymphomzellinie nachgewiesen.
Der IGF-IR ist zusätzlich zu seiner Beteilung bei der Nährstoffversorgung und beim Typ-II Diabetes ebenfalls mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht worden. Zum ' Beispiel ist IGF-I als ein autokriner Wachstumsstimulator für verschiedene Tumorarten, z.B. menschliche Brustkrebskarzinomzellen, (Arteaga et al., 1989, J. Clin. '
Invest. 84:1418-1423) und kleine Lungenzelltumorzellen (Macauley et al., 1990, Cancer Res. 50:2511-2517) beteiligt.
Neben seiner wesentlichen Beteiligung beim normalen Wachstum und der Differenzierung des Nervensystems scheint IGF-I ein autokriner Stimulator von humanen Gliomen zu sein. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. Die Bedeutung des IGF-IRs und seiner Liganden für die Zeilproliferation wird weiterhin auf die Tatsache gestützt, dass viele Zelltypen in Kultur (Fibroblasten, Epithelzellen, glatte Muskelzellen, T-Lymphozyten, myeloide Zellen, Chondrozyten, Osteoblasten, die Stammzellen des Knochenmarks) durch IGF-I zum Wachstum stimuliert werden. Goldring and
Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression 1:301-326. In einer Reihe von jüngeren'Publikationen schlägt Baserga sogar vor, dass IGF-IR eine zentrale Rolle beim Mechanismus der Transformation spielt, und als solcher ein bevorzugtes Ziel für therapeutische Eingriffe bei einem breiten Spektrum von humanen malignen Krankheiten sein könnte. Baserga, 1995, Cancer Res. 55:249-252; Baserga, 1994, Cell 79:927-930;
Coppola et al., 1994, Mol, Cell. Biol. 14:4588-4595.
Die Verbindung zwischen Anomalien von RTKs und Krankheiten ist jedoch nicht auf Krebs beschränkt. Zum Beispiel sind RTKs mit metabolischen Krankheiten wie Schuppenflechte, Diabetes mellitus, Wundheilung, Entzündung und neurodegenerativen Krankheiten verbunden worden. Zum Beispiel ist der EGF-R bei Hornhaut- und dermaler Wundheilung angezeigt. Defekte des Insulin-R und des IGF-IR sind bei Typ-II Diabetes mellitus angezeigt. Eine vollständigere Korrelation zwischen speziellen RTKs und ihren therapeutischen Indikationen ist in Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339 dargestellt.
Jedoch sind nicht nur Tyrosinkinasen des Rezeptortyps, sondern auch viele zelluläre Tyrosinkinasen (CTK)
einschließlich src, abl, fps, yes, fyn, lyn, Ick, blk, hck, ■ fgr, yrk (Übersicht in Bolen et al., 1992, FASEB J. 6:3403-3409) an proliferatorischen und metabolischen Signalweiterleitungswegen beteiligt und daher in Indikationen der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel wurde mutiertes src (v-src) als ein Oncoprotein (pp60v"src) in Hühnern identifiziert. Zudem überträgt sein zelluläres Homolog, das Protooncogen pp6 0c"arc oncogene Signale von vielen Rezeptoren. Die Überexpression von EGF-R oder HER2/neu in Tumoren führt 0 zum Beispiel zur konstitutiven Aktivierung von pp60°"src, was charakteristisch für maligne Zellen ist, jedoch in normalen Ze*llen nicht vorkommt. Auf der anderen Seite zeigen Mäuse, die für die Expression von c-src defizient sind, einen osteopetrotischen Phänotyp, was auf eine Schlüsselrolle von csrc bei der Osteoklastenfunktion und eine mögliche Beteiligung an damit verbundenen Krankheiten hinweist. Zap 70 ist auf ähnliche Weise in der T-Zell-Signalweiterleitung verwickelt.
Des weiteren ist die Identifizierung von CTK-modulierenden Verbindungen, um die auf RTK gerichteten Blockierungsmittel zu unterstützen oder in Synergie zu treten, ein Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Schließlich sind sowohl RTKs als auch Kinasen des Nichtrezeptortyps mit Hyperimmunstörungen verbunden worden.
Die hier beschriebenen Verbindungen können einem menschlichen Patienten für sich oder in pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht werden, wo sie mit geeigneten Trägerstoffen oder Arzneimittelträgern vermischt werden.
Techniken für Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, aktuelle Ausgabe entnommen werden.
Geeignete Verabreichungswege könne beispielsweise orale, rektale, transmucosale oder intestinale Verabreichung beinhalten; parentale Darreichung einschließlich intramuskulärer, subkutaner und intramedullarer Injektionen, sowie . intratekale, direkte intraventrikulare, intravenöse, 0 intraperitonale, intranasale oder intraokulare Injektionen.
Alternativ können anstelle der systemischen Weise die Verbindungen auf lokalen Weise verabreicht werden, zum Beispiel durch Injektion der Verbindung direkt in einen festen Tumor, häufig in einer Depotformulierung oder einer Formulierung mit Langzeit-Freisetzung.
Weiterhin ist es möglich, dass Wirkstoffe in einem gerichteten System zur Wirkstoffverabreichung, z.B. in einem Liposom, das mit einem tumorspezifischen Antikörper beschichtet ist, zu verabreichen. Die Liposomen werden so auf 0 den Tumor gelenkt und selektiv von diesen aufgenommen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden, z.B. mittels konventionellen Misch-, Auflöse-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Verkapselungs-, Einschluß oder Lyophilisierungsverfahren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung in
Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können daher auf konventionelle^ Art formuliert werden unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch annehmbarer Trägerstoffe, die Arzneimittelträger und Hilfsstoffe umfassen, die die Verarbeitung des Wirkstoffs in Präparationen, die pharmazeutisch verwendet werden, können, erleichtern. Die geeignete Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab.
Für Injektionen kann das Mittel der vorliegenden Erfindung in wäßrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie Hanks's Lösung, Ringer's Lösung oder physiologischen Salinpuffern, formuliert werden. Für die transmucosale Verabreichung werden Penetriermittel, die für die zu überwindende Schranke geeignet sind, in den Formulierungen verwendet. Solche Penetriermittel sind allgemein im Stand der Technik bekannt.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen auf einfache Weise formuliert werden, indem die Wirkstoffe mit pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen, die im Stand der 0 Technik wohlbekannt sind, kombiniert werden. Solche
Trägerstoffe ermöglichen es, die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, ' ■ Sirups, Pasten, Suspensionen und dergleichen für die orale Einnahme durch den zu behandelnden Patienten zu formulieren. Pharmazeutische Präparationen für die orale Verwendung können, erhalten werden, indem die Wirkstoffe mit festen Trägerstoffe vereinigt werden, gegebenenfalls Vermählen der sich ergebenden Mischung, und Verarbeiten der Mischung zu Granulaten, nachdem geeignete Hilfsstoffe hinzugegeben wurden, wenn gewünscht, um 0 Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Arzneimittelträger sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Manitol oder Sorbitol; Cellulosepräparationen wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragant 5 Gummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Wenn gewünscht, können sich zersetzende Stoffe wie
quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Algeninsäure oder ein Salz davon wie Natriumalginat hinzugegeben werden.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen versehen. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen zur Identifikation hinzugegeben werden, oder um verschiedene Kombinationen der Wirkstoffsdosis zu kennzeichnen.
Pharmazeutische Präparationen, die oral verwendet werden können, schließen aus Gelatine hergestellte push-fit Kapseln sowie weiche, verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glycerin oder Sorbitol, ein. Die push-fit Kapseln können die Wirkstoffe in Beimischung von Füllstoffen wie Laktose, Bindemitteln wie Stärke und/oder Schmiermitteln wie Talk oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls 0 Stabilisatoren enthalten. In Weichkapseln können', die
Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen gelöst oder ■ . ■' suspendiert sein. Zusätzlich können Stabilisatoren hinzugegeben werden. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in Dosierungsbereichen liegen, die für eine solche Verabreichung geeignet ist.
Zur buccale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen, die in üblicher Weise formuliert sind, aufweisen.
0 Zur Verabreichung durch Inhalation werden die erfindungsgemäßen Verbindungen geeigneterweise in der Form einer Aerosolspraydarreichung aus unter Druck gesetzten Verpackungen oder einer Nebelkammer dargeboten unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.B. Dichlordifluormethan, Dichlorfluormethan, Diclortetrafluorethan, Kohlendioxid oder eines anderen geeigneten Gases. Im Falle eines unter Druck gesetzten
Aerosols kann die Dosierungseinheit bestimmt werden, indem ein Ventil zur Darreichung einer festgelegten Menge bereitgestellt wird. Kapseln und Kassetten z.B. aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insuflator können so formuliert werden, dass sie eine Pulvermischung aus der Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage wie Lactose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung mittels Injektion, z.B. mittels Bolusinjektion oder kontinuierlicher Infusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in einer Einzel-Dosierungsform, z.B. in Ampullen oder in Multidosierungs-Behältnissen mit einem zugesetzten Konservierungsmittel dargereicht werden. Die Zusammensetzungen können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägerstoffen annehmen und können Formulierungsstoffe wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wäßrige Lösungen der Wirkstoffe in wasserlöslicher Form ein. Zusätzlich können Suspensionen der Wirkstoffe als geeignete ölhaltige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder .Trägerstoffe schließen Fettöle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen ein. Wäßrige Injektionssuspensionen können Verbindungen wie Natriumcarboxylmethylcellulose, Sorbitol oder Dextran enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen. Gegebenenfalls kann die Suspension ebenfalls geeignete Stabilisatoren oder Stoffe, die die Löslichkeit der 0 Verbindungen erhöhen, enthalten, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zii ermöglichen.
Alternativ dazu kann der Wirkstoff in Pulverform zur Bi"ldung mit einer geeigneten Bindemittellösung, z.B. sterilem pyrogenfreien Wasser, vor der Verwendung vorliegen.
5 Die Verbindungen können ebenfalls in rektalen Zusammensetzungen wie Zäpfchen oder Bleibeklistier formuliert sein, die z.B. konventionelle Zäpfchengrundlagen wie
Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Zusätzlich zu den eben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen ebenfalls als eine Depotpräparation formuliert werden. Solche lang wirkenden Formulierungen können durch Implantation verabreicht werden (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion. Daher können zum Beispiel die Verbindungen mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien formuliert werden (zum Beispiel als eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwerlösliche Derivate, zum Beispiel als ein schwerlösliches Salz.
Ein pharmazeutischer Träger für die hydrophoben
Verbindungen der Erfindung ist ein Co-Lösungsmittelsystem, das Benzylalkohol, ein unpolares grenzflächenaktives Mittel, ein wassermischbares organisches Polymer sowie eine wäßrige.Phase umfaßt. Das Co-Lösungsmittelsystem kann das VPD-Co-Lösungsmittelsystem sein. VPD ist eine Lösung von 3% w/v Benzylalkohol, 8% w/v des unpolaren grenzflächenaktiven Mittels Polysorbat 80 und 65% w/v Polyethylenglycol 300, 0 dessen Volumen in absolutem Ethanol aufgefüllt wj.rd. Das VPD Co-Lösungsmittelsystem (VPD:D5w) besteht aus VPD, das 1:1 mit einer 5% Dextrose in Wasserlösung verdünnt wird. Dieses Co-Lösungsmittelsystem löst hydrophobe Verbindungen gut auf und bewirkt selbst nur eine niedrige Toxizität nach systemischer Verabreichung. Natürlich können die Anteile eines Co-Lösungsmittelsystems erheblich variiert werden, ohne seine Löslichkeitseigenschaften und Toxizitätseigenschaften zu vernichten. Weiterhin kann die Art der Co-Lösungsmittelkomponenten variiert werden: Beispielsweise 0 können andere unpolare oberflächenaktive Mittel mit niedriger Toxizität anstelle von Polysorbat 80 verwendet werden; die Fraktionsgröße des Polyethylenglycols kann variiert werden; aridere biologisch kompatible Polymere können Polyethylenglycol ersetzen, z.B. Polyvinylpyrrolidon; und andere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
Alternativ dazu kann jedes andere Darreichungssystem für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden.
Liposomen und Emulsionen sind wohlbekannte Beispiele von Bindemitteln zur Darreichung oder Träger für hydrophobe Wirkstoffe. Es können bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid verwendet werden, obgleich üblicherweise auf Kosten einer größeren Toxizität. Zusätzlich können die Verbindungen unter Verwendung eines Systems zur Langzeit-Freisetzung wie semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die das therapeutische Mittel enthalten, dargeboten werden. Es sind zahlreiche Materialien zur Langzeit-Freisetzung entwickelt worden und dem Fachmann wohlbekannt. Kapseln für die Langzeit-Freisetzung können, abhängig von ihrer chemischen Zusammensetzung, die Verbindungen über einige Wochen bis zu 100 Tagen freisetzen. In Abhängigkeit von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Mittels können zusätzliche Strategien für die Proteinstabilisierung angewandt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenfalls geeignete feste oder Gelphasenträger oder Arzneimittelträger umfassen. Beispiele solcher Trägerstoffe oder Arzneimittelträger schließen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, zahlreiche Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglycole ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Viele der PTK modulierenden Verbindungen der Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch annehmbaren Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren einschließlich Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure etc. gebildet werden, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
0 Salze neigen dazu, in wäßrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln leichter löslich zu sein als die entsprechenden freien Basenformen.
". Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden-Erfindung schließen Zusammensetzungen ein," in denen die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge vorhanden sind, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Genauer gesagt bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge der Verbindung,
die wirksam ist, um Symptome von Krankheiten zu verhindern, zu lindern oder zu verbessern oder um die Überlebensdauer der zu behandelnden Person zu verlängern. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge ist dem Fachmann geläufig, insbesondere im Licht der ausführlichen hier bereitgestellten Offenbarung.
Für jede eingesetzte Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosierung zu Beginn anhand von Zellkulturtests abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Dosierung in Tiermodellen formuliert werden, um einen Kreislauf-Konzentrationsbereich zu erreichen, der den IC50-Wert einschließt, wie er in Zellkulturen bestimmt wird (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibition der PTK-Aktivität erzielt). Solche Informationen können verwendet werden, um die bei Menschen anwendbare Dosierung genauer zu bestimmen.
Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der hier beschriebenen Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z.B. zur Bestimmung des LD50 (die letale Dosis für 50% der Population) und den ED50 (die therapeutisch wirksame Dosis für 50% der Population). Das Dosierungsverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index und es kann als das Verhältnis zwischen LD50 und ED50 ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes zeigen, werden bevorzugt. Die Daten, die aus diesen Zellkulturtests oder Tierstudien erhalten worden sind, können verwendet werden, um einen Dosierungsbereich für die Anwendung beim Menschen zu formulieren. Die Dosierung solcher 0 Verbindungen liegt vorzugsweise im Bereich der Kreislaufkonzentrationen,, die den ED50 mit keiner oder geringer Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Be'reiches in Abhängigkeit von der verwendeten Dosierungsform und der Art der verwendeten Verabreichung variieren. Die genaue Formulierung, Verabreichungsform und Dosierung kann von • dem jeweiligen Arzt in Anbetracht der Lage des Patienten ausgewählt werden. Siehe z.B'. Fingl. et al., 1975, in "The
Pharmacological Basis of Therapeutics", Kap. 1, S. 1).
Die Dosierungsmenge und Intervalle können individuell angepaßt werden, um Plasmagehalte der aktiven Verbindung zu erzielen, die ausreichend sind, um die kinasemodulierenden Wirkungen oder die minimale effektive Konzentration (MEC) aufrecht zu halten. Die MEC variiert für jede Verbindung, kann jedoch anhand der in vitro Daten abgeschätzt werden; z.B. die notwendige Konzentration, um 50 bis 90% Inhibition der Kinase unter Verwendung der hier beschriebenen Tests zu erreichen.
Dosierungen, die notwendig sind, um die MEC zu erreichen, hängen von den individuellen Eigenschaften und der Verabreichungsform ab. Es können jedoch HPLC-Untersuchungen oder biologische Tests zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen verwendet werden.
Dosierungsintervalle können ebenfalls unter Verwendung des· MEC Wertes bestimmt werden. Verbindungen sollten unter Verwendung einer Therapie verabreicht werden, die die Plasmaspiegel oberhalb der MEC für 10-90% der Zeit erhält, vorzugsweise zwischen 30-90% und am bevorzugtesten zwischen 50-90%.
In Fällen lokaler Verabreichung oder der selektiven Aufnahme muß die effektive lokale Konzentration des Wirkstoffs nicht mit der Plasmakonzentration in Verbindung stehen. Die Menge der verabreichten Zusammensetzung ist selbstverständlich von der zu behandelnden Person, vom Gewicht der Person, der Schwere der Erkrankung, der Art der Verabreichung und der Beurteilung des verschreibenden Arztes abhängig.
Die Zusammensetzungen können, wenn gewünscht, in einer 0 Packung oder Vorratsbehälter dargeboten werden, die eine oder mehrere Einzel-Dosierungsformen, die den Wirkstoff enthalten, enthalten kann. Die Verpackung kann, wie eine Durchdrückpackung, z.B. Metall oder Plastikfolie umfassen. Der Packung oder dem Vorratsbehälter können Verabreichungshinweise beigefügt sein. Es können ebenfalls Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung umfassen, die in einem kompatiblen pharmazeutischen' Träger formuliert ist,
hergestellt werden, in einen geeigneten Behälter überführt und zur Behandlung eines angezeigten Zustands etikettiert werden. Geeignete, auf dem Etikett angegebene Zustände können die Behandlung eines Tumors, die Inhibition der Angioginese, Behandlung von Fibröse, Diabetes und dergleichen einschließen.
Synthese der Verbindung
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Techniken synthetisiert werden. Die folgenden stellen bevorzugte Verfahren zur Synthese der Verbindung der beanspruchten Erfindung dar.
1.1. Allgemeine Synthese von 3-substituierten 2-Indolinonanaloga
Die folgenden allgemeinen Methoden wurden zur Synthese von 3-substituierte 2-Indolinonverbindungen der Erfindung verwendet.
1.1.1. Verfahren A
Eine Reaktionsmischung des geeigneten Oxindol (2-Indolinon) (1 Äquiv.), der geeignete Aldehyd (1,2 Äquiv.) und.Piperidin (0,1 Äquiv.) in Ethanol (1-2 ml/l mmol Oxindol) wurden bei
900C für 3-5 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um ■ ■ die Zielverbindung zu ergeben.
1.1.2. Verfahren B
Herstellung der geeigneten Aldehyde über Vilsmeier Reaktion. Zu einer Lösung von N,N-Dimethylformamid (1,2 Äquiv.) in 1,2-Dichlorethan (2,0 ml/1,0 mmol Ausgangsmaterial) wurde Phosphoroxychlorid (1,2 Äquiv.) tropfenweise.bei 00C hinzugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die 0 Reaktionsmischung wurde für weitere 3 0 min. gerührt. Das geeignete Ausgangsmaterial (1,0 Äquiv.) wurde zu der obigen Lösung portionsweise hinzugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei 50-70°c für 5 h - 2 Tage gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in eiskalte IN Natriumhydroxidlösung 5 (pH = 9 nach dem Mischen) gegossen und die sich ergebende Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht
wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung bis zu einem pH = 7 gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule chromatographiert, mit einem Lösungsmittelgemisch aus Ethylacetan und Hexan eluiert, um die Titelverbindung, zu ergeben.
Synthese von 3-substituierten 2-Indolinon-Analoqa Eine Reaktionsmischung des geeigneten Oxindols (2-Indolinon) (1 Äquiv.), des geeigneten Aldehyds (1,2 Äquiv.) und Piperidin (0,1 Äquiv.) in Ethanol (1-2 ml/l mraol Oxindol) wurde bei 9O0C für 3-5 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um die. Zielverbindung zu ergeben.. 1.8. Synthese von 3-&Ggr;(4-Methylthien-2-yl)methyleni-2-indolinon.
Ein Reaktionsgemisch von 133,0 mg Oxindol, 151,2 mg des 4-methylthiopheh-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 3 ml Ethanol wurden bei 900C für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen 0 wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 147,3 mg (61%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
1.9. Synthese von 3 - &Ggr;(3-Methylpyrrol-2-yl)methylenl-2-indolinon.
Ein Reaktionsgemisch von 133,0 mg Oxindol, 130,9 mg des 3-Methylpyrrol-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 900C für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 15 0,9 mg (67%) der im Titel genannten 0 Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
1.10. Synthese von 3-[3,4-Dimethylpyrrol-2-yl)methyleni-2-indolinon
*. 3- [ (3 , 4-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen] -2-indolinon wurde synthetisiert wie in J.Heterocyclic Chem. 13:1145-1147 (1976) beschrieben.
Ethyl-4-Methylpyrrol-3-Carboxylat. Eine Lösung von 11,86 g (0,1 mol) Ethylcrotonat und 19,50 g (0,1 mol) p-
Toluolsulfonylmethylisocyanid in 500 ml 2:1 Ether/Dimethylsulfoxid wurde bei Raumtemperatur tropfenweise zu einer Suspension von 6,8 g Natriumhydrid (60% Mineralöldispersion, 0,17 mol) in Ether gegeben. Nach der Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung für 30 min gerührt und mit 400 ml Wasser verdünnt. Die wäßrige Schicht wurde mit 3x100 ml Ether extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden durch eine Säule mit Aluminiumoxid laufengelassen, und mit Dichlormethan eluiert. Das organische Lösungsmittel wurde verdampft und der sich ergebende Rückstand wurde durch Stehenlassen verfestigt. Der Feststoff wurde mit Hexan gewaschen und bei 400C im Vakuumofen über Nacht getrocknet, um 12,3 8 g (80%) der Titelverbindung zu ergeben. Herstellung von 3,4-Dimethylpyrrol. Zu einer Lösung von g (80 mmol) Natriumdihydrobis(2-methoxyethoxyaluminat) wurden bei Raumtemperatur tropfenweise 5 g einer Lösung (34 mmol Ethyl-4-methylpyrrol-3-carboxylat in 50 ml Benzol unter Stickstoffatmosphäre hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 18 h gerührt. Wasser (100 ml) wurde zu der 0 Reaktionsmischung hinzugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Kochsalzlösung gewaschen und.rn.it wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde destilliert, was 1,2·g (44%) der Titelverbindung ergab.
Herstellung von 3,4-Dimethylpyrrol-2-carboxaldehyd. Zu einer Lösung von 0,92 ml (12 mmol) &Ngr;,&Ngr;-Dimethylformamid in ml 1,2-Dichlorethan wurde bei 00C tropfenweise 1,0 ml (12 mmol) Phosphoroxychlorid gegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung wurde für weitere 30 min gerührt. Es wurden 3,4-Dimethylpyrrol (960,0 mg, 10 mmol) zu der obigen Lösung portionsweise hinzugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei 500C für 5 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in ei'skalte IN Natriumhydroxidlösung gegossen (pH = 9 nach dem Mischen) und die sich ergebende Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde mit
Kochsalzlösung bis zu pH = 7 gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückst and-.wurde auf einer Silicagelsäule chromatographiert, mit einem ""' Lösungsmittelgemisch aus Ethylacetat und Hexan eluiert, um 610 ml (50%) der Titelverbindung zu ergeben.
3- [ (3 ,4-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen] -2-indolinon.. Ein Reaktionsgemisch aus 67,0 mg (0,5 mmol) Oxindol, 73,0 mg (0,6 mmol) des 3,4-Dimethylpyrrol-2-carboxaldehyds und 2 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 900C für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 78,7 mg (27%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben."
1.11 Synthese von 3 - &Ggr;(2,4-Dimethyl-3-Ethoxycarbonylpyrrol-5-yl)methyleni-2-indolinon
Eine Reaktionsmischung aus 134,0 mg Oxindol, 234,3 mg des 4-Ethoxycarbonyl-3,5-dimethylpyrrol-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 3 ml Ethanol wurden bei 900C für 3 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 244,6 mg (79%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben·.
1.12 Synthese von 3-&Ggr;(2,4-Dimethylpvrrol-5-yl)methylenl-2-■ . indolinon
Eine Reaktionsmischung aus 134,0 mg Oxindol, 147,8 mg des 3,5-Dimethylpyrrol-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 900C für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit- kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 136,7 mg (57% der Titelverbindung als gelben Feststoff zu'ergeben.
0 1.13 Synthese von 3-&Ggr;(2-Methylmercaptothien-5-yl)methylenl-2-indolinon
Eine Reaktionsmischung aus 134,0 mg Oxindol, 18 9,9 mg des 5-Methylmercaptothiophen-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol'wurden bei 900C für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 246,6 mg (900C) der Titelverbindung als orangefarbenen Feststoff zu.ergeben.
1.14. Synthese von 3-[(2-Methylthien-5-yl)methylenl-2-indolinon ;
Ein Reaktionsgemisch, aus 134,0 mg Oxindol, 151,42 mg des 5-Methylthiophen-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 9O0C für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 237,8 mg (99%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
1.15 Synthese von 3-&Ggr;(3-Methylthien-2-vl)methylenl-2-indolinon
Eine Reaktionsmischung aus 134,0 mg Oxindol, 151,4 mg des 3-Methylthiophen-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 900C für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 157,8 mg (65%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
1.20. Synthese von 3 - &Ggr;(Furan-2-yl)methylenl-2-indolinon
3-[(Furan-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.38. Synthese von 3-&Ggr;(Thien-2-vl)methylenl-2-indolinon 3-[(Thien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.40. Synthese von 3 - &Ggr;2-&Ggr;3,5-Di-(trifluormethyl)-phenyl!furan-5-&ngr;&Pgr; methylen-2-indolinon 3 -[2-[3,5-Di-(trifluormethyl)phenyl]furan-5-yl]methylen-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.42. Synthese von 3 - &Ggr; (3 -(2-Carboxyethvl)-4-methylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon
3-[(3-(2-Carboxyethyl)-4-methylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.43. Synthese von 3 -f(3,4-Dibrom-5-methylpyrrol-2-yl)methylenl-2-indolinon
\ 3-[(3,4-Dibrom-5-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren B hergestellt.
5 1.44. Synthese von 3- &Ggr; (3,4-Dimethyl-2-formylpyrrol-5-yl)methylen)-2-indolinon
3-[(3,4-Dimethyl-2-formylpyrrol-5-yl)methylen)-2-indolinon
wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.45 Synthese von 3-{&Ggr;4-(2-MethoxYcarbonylethyl)-3-methylpyrrol-5-ylimethylen)-2-indolinon 3-{[4-(2-Methoxycarbonylethyl)-S-methylpyrrol-S-yl] methylen}-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.46. Synthese von 3-i2-Iodfuran-5-yl)methyleni-2-indolinon 3-[2-Iodfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß
Verfahren A hergestellt.
1.47. Synthese von 3 - &Ggr; (3 -Ethoxycarbonvl-2 -met.hvlfuran-5-yl)methyleni-2-indolinon
3-[(3-Ethoxycarbonyl-2-methylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.48. Synthese von 3-&Ggr;(3-Bromthien-2-vl)methvlenl-2-indolinon 3-[(3-Bromthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.49. Synthese von 3-&Ggr;(2-Chlorthien-5-yl)methylen)-2-indolinon 3-[(2-Chlorthien-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt. :,
1.5 0 Synthese von 3-&Ggr;(2.3-Dimethylfuran-5-yl)methyleni-2-. indolinon
3-[(2,3-Dimethylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.51. Synthese von 3-F(5-Nitrothien-2-yl)methyleni-2-indolinon 3-[(5-Nitrothien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.52. Synthese von 3 - &Ggr;(2-Carboxvthien-5-yl)methvlenl-2-indolinon
3-[(2-Carboxythien-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
*. ' 1.53. Synthese von 3-&Ggr;(2-Bromthien-2-vl)methylenl-2-
indolinon 3-[(2-Bromothien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.54. Synthese von 3- &Ggr;(4-Bromthien-2-vl)methylenl-2 -
*V'e:
indolinon
3-[(4-Bromthien-2-yl)methylen] -2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.55. Synthese von 3 - &Ggr;(2-Sulfonylfuran-5-yl)methyleni-2-indolinon Natriumsalz
3-[(2-Sulfonylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon Natriumsalz wurde gemäß Verfahren A hergestellt
1.56. Synthese von 3-&Ggr;(Furan-2-yl)methyleni-2-indolinon
3 - C(Furan-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.57. Synthese von 3-&Ggr;(2-Methylfuran-5-yl)methyleni-2-indolinon
3-[(Furan-2-yl)methylen]-2-indolinon.wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.58. Synthese von 3- &Ggr; (2-Ethylfuran-5-yl)methylen!-2-indolinon
3-[(2-Ethylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.59. Synthese von 3-&Ggr;(2-Nitrofuran-5-yl)methyleni -2-
0 indolinon
3 -t(2-Nitrofuran-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.60. Synthese von 3 - &Ggr;(5-Bromfuran-2-yl)methylenl-2- indolinon
3-[(5-Bromfuran-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.61. Synthese von 3-&Ggr;(2-Ethylthien-5-yl)methylenl-2-indolinon
3-[(2-Ethylthien-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.62. Synthese von 3-&Ggr;(4,5-Dimethvl-3-ethvlpyrrol-2-yl)methylenl-2-indolinon
". 3 - [ (4 , 5-Dimethyl-p3-ethylpyrrol-2-yl) methylen] -2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
5 1.63. Synthese von 3-&Ggr;(5-Ethoxycarbonyl-4- ethoxycarbonvlethyl-3-ethoxycarbonylmethylpyrrol- 2 -vDmethvleni -2-indolinon
3-[(S-Ethoxycarbonyl^-ethoxycarbonylethyl-S-ethoxycarbonylmethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.64. Synthese von 3 - &Ggr; (S-Carboxy-S-ethyl^-methylpyrrol^- yl)methyleni-2-indolinon
3- [ (S-Carboxy^-ethyl-'l-methylpyrrol^-yl) methylen] -2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.65. Synthese von 3-F (3,5-Diiod-4-methylpyrrol-2-yPmethylenl -2-indolinon 3-[(3,5-Diiod-4-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.66. Synthese von 3 - &Ggr;(5-Chlor-3-methoxycarbonyl-4-methoxycarbonylmethvlpyrrol-2-yl)methylen] -2-indolinon
3-[(S-Chlor-S-methoxycarbonyl^-methoxycarbonylmethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.67. Synthese von 3 - &Ggr; (3 -Acetyl-5-ethoxycarbonyl-4 -methylpyrrol)-2-yl)methylen]-2-indolinon 3-[(3-Acetyl-5-ethoxycarbonyl-4-methylpyrrol)-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A; hergestellt.
1.68. Synthese von 3-{(1-(3,5-Dichlorphenvl)pyrrol-2-yl]methylen}-2-indolinon
3 -{ (1-(3,5-Dichlorphenyl)pyrrol-2-yl]methylen}-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.69. Synthese von 3-Fl-(4-Chlorphenyl)pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
3-[1-(4-Chlorphenyl)pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.70. Synthese von 3-&Ggr;(4-Ethoxycarbonyl-3-methyl)pvrrol-2-0 yl)methylen]-2-indolinon
3-[(4-Ethoxycarbonyl-3-methyl)pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
'. 1.71. Synthese von 3 -f(l-Methylpyrrol-2-yl)methylen] -2-indolinon
5 3-[(1-Methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.72. Synthese von 3-F (S'-Kthoxycarbonvl-S-
34
ethoxycarbonylethvl-4 -ethoxvlcarbonylmethylpyrrol-2 -yl)methyleni-2-indolinon
3-[(S-Ethoxycarbonyl-S-ethoxycarbonylethyl^- ethoxylcarbonylmethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.74. Synthese von 3-&Ggr;(5-Methvlimidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon
3-[(5-Methylimidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.75. Synthese von 3-&Ggr;(5-Methylthiazol-2-yl)methylenl-2-indolinon
3-[(5-Methylthiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.76. Synthese von 3-&Ggr;(3-Methylpyrazol-5-yl)methylenl-2-■ indolinon
3-[(3-Methylpyrazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.77. Synthese von 3-f(Imidazol-4-yl)methylenl-2-indolinon 3-[(Imidazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.78. Synthese von 3-&Ggr;(4-Chlorpyrazol-3-vl)methyien]-2-indolinon
3-[(4-Chlorpyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.79. Synthese von 3-&Ggr;(4-Brom-l-(4-chlorbenyl)pyrazol-5-yl)methylen]-2-indolinon
3-[(4-Brom-l-(4-chlorbenzyl)pyrazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.80. Synthese von 3-&Ggr;(4-Chlor-l-methylpyrazol-3-yl)methylenl-2-indolinon
3-[(4-Chlor-l-methylpyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
". 1.81. Synthese von 3-&Ggr; (4"-Ethyl-3 . 5-Dimethylpyrrol-2-yl)methylenl-2-indolinon 3-[(4-Ethyl-3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren B hergestellt.
1.82. Synthese von 3 - &Ggr; (5-Ethvlpyrrol-2-vl)methyleni -2 -
indolinon
3-[(5-Ethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren B hergestellt.
1.83. Synthese von 3 -&Ggr;3,5-Dimethyl-4-(propen-2-yl)pvrrol-2-yPmethyleni -2-indolinon
3-[3,5-Dimethyl-4-(propen-2-yl)pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren B hergestellt
1.86. Synthese von 5-Chlor-3-f(pyrrol-2-yl)methyleni-2-indolinon
5-Chlor-3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.87. Synthese von 5-Chlor-3-&Ggr;(3-methvlpyrrol-2-yPmethyleni -2-indolinon 5-Chlor-3-[(3-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.89. Synthese von 5-Chlor-3-f(3.5-dimethylpvrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
5-Chlor-3-[(3,5-dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
0 1.90. Synthese von 3-f(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon ist von Maybridge Chemical Co. Ltd. erhältlich.
1.92. Synthese von 5-Chlor-3-&Ggr;(thien-2-yl)methylen]-2-indolinon
5-Chlor-3-[(thien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.93. Synthese von 5-Chlor-3-&Ggr;(3-methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon 5-Chlor-3-[(3-methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde 0 gemäß Verfahren A hergestellt.
1.94. Synthese von 5-Chlor-3-f(5-methylthien-2-yPmethyleni -2-indolinon
5-Chlor-3-[(5-methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
5 1.95. Synthese von 5-Chlor-3- &Ggr;(5-ethylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon
5-Chlor-3-[(5-ethylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde
gemäß Verfahren A hergestellt.
1.96. Synthese:von 5-Chlor-3-&Ggr;(5-methylmercaptothien-2-yl)methylenl-2-indolinon
5-Chlor-3-[(5-methylmercaptothien-2-yl)methylen]-2-indolirion wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.97. Synthese von 5-Ghlor-3-&Ggr;(imidazol-2-yl)methylenl-2-indolinon
5-Chlor-3-[(imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.99. Synthese von 5-Nitro-3-&Ggr;(pyrrol-2-vl)methylenl-2-indolinon
5-Nitro-3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.100. Synthese von 3-&Ggr;(3-Methylpvrrol-2-vl)methylenl-5-nitro-2-indolinon
3- [ (3-Methylpyrrol-2-yl.) methylen] -5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.101. Synthese von 3-&Ggr;(3,5-Dimethylpyrrol-2-vl)methylenl-5-nitro-2-indolinon
3-[(3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-5-nitrö-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.103. Synthese von 5-Nitro-3-&Ggr;(thien-2-yl)methylenl-2-. ■' indolinon
5-Nitro-3-[(thien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.104. Synthese von 3 - &Ggr;(3-Methvlthien-2-vl)methylenl-5-nitro-2-indolinon
3- [ (3-Methylthien-2-yl) methylen] -5-nitro-2-indolirion wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
0 1.105. Synthese von 3-&Ggr;(5-Methylthien-2-yl)methylenl-5-nitro-2-indolinon
3-[(5-Methylthien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde ge'mäß Verfahren A hergestellt.
1.106. Synthese von 3- &Ggr;(5-Ethylthien-2-yl)methylenl -5-ni tro-2 -indolinon
3-[(5-Ethylthien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
37
1.107. Synthese von 3-&Ggr;(5-Methylmercaaptothien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon
3-[(5-Methylmercaaptothien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.108. Synthese von 3-&Ggr;(Imidazol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon
3-[(Imidazol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.109. Synthese von 3 - &Ggr;(Oxazol-2-yl)methylenl -2-indolinon 3-[(Oxazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.110. Synthese von 3-&Ggr;(Oxazol-4-yl)methylenl-2-indolinon 3-[(Oxazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren
A hergestellt.
1.111. Synthese von 3-&Ggr;(Oxazol-5-yl)methylen]-2-indolinon
3-[(Oxazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.112. Synthese von 3-&Ggr;(Thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon 3-[(Thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.113. Synthese von 3-&Ggr;(Thiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon 3-[(Thiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß
Verfahren A hergestellt.
1.114. Synthese von 3-&Ggr;(Thiazol-5-yl)methylenl-2-indolinon 3-[(Thiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.115. Synthese von 3-&Ggr;(Imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon 3-[(Imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß
Verfahren A hergestellt. 0 1.116. Synthese von 3-&Ggr;(Pyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon
3-[(Pyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.117. Synthese von 3-&Ggr;(Pyrazol-4-yl)methylenl-2-indolinon 3-[(Pyrazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.118. Synthese von 3 - &Ggr;(Isoxazol-3-yl)methylenl -2-indolinon 3-[(Isoxazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß
Verfahren A hergestellt.
1.119. Synthese von 3-&Ggr;(Isoxazol-4-yl)methyleni-2-indolinon 3-[(Isoxazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß
Verfahren A hergestellt.
1.120. Synthese von 3-&Ggr;(Isoxazol-5-yl)methylenl-2-indolinon 3-[(Isoxazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß
Verfahren A hergestellt.
1.121. Synthese von 3 - &Ggr;(Isothiazol-3-vl)methvlenl-2-indolinon
3-[(Isothiazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.122. Synthese von 3-&Ggr;(Isothiazol-4-yl)methvlenl-2-indolinon
3-[{Isothiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.123. Synthese von 3-&Ggr;(Isothiazol-5-yl)methvlenl-2-indolinon
3-[(Isothiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.124. Synthese von 3-&Ggr;(1,2,3-Triazol-4-yl)methylenl-2-indolinon
3-[ (1, 2, 3-Triazol-4-yl.) methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.125. Synthese von 3-&Ggr; (1.3,4-Thiadiazol-2-yl)methylenl -2-indolinon
3-[(1,3,4-Thiadiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.126. Synthese von 3 - &Ggr;(5-Phenyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)methylen]-2-indolinon 3 -[(5-Phenyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.127. Synthese von 3 - &Ggr;(3-Phenyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl') methylenl -2-indolinon 3-[(3-Phenyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
1.128. Synthese von 3 - &Ggr;(3 -Phenyl-1,2,5-oxadiazol-4-vDmethvlenl -2-indolinon
3-[(3-Phenyl-l,2,5-oxadiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
In vitro RTK Assays
Die folgenden in vitro Tests können verwendet werden, um den Level der Aktivität und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehrere der RTKs zu bestimmen. Ähnliche Tests können daran für jede andere Tyrosinkinase unter Verwendung der im Stand der Technik wohlbekannten Techniken entwickelt werden. 2.1. Enzymimmunoassay (ELISA)
Enzymimmunoassays (Enzyme linked immunosorbent assays/ELISA) können verwendet werden, um das Vorhandensein von Tyrosinkinase-Aktivität zu detektieren und zu messen. Der ELISA kann nach bekannten Protokollen, die z.B. in Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", In: Manual of Clinical Immunology, 2. Aufl., Herausgeber Rose und Friedman,
S. 359-371 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C. beschrieben sind, durchgeführt werden.
Das offenbarte Protokoll kann zur Bestimmung'der Aktivität für eine spezielle RTK angepaßt werden. Zum Beispiel sind die bevorzugten Protokolle zum Durchführen der ELISA-Experimente ' . für spezielle RTKs unten angegeben. Das Anpassen dieser
Protokolle zur Bestimmung einer Aktivität einer Verbindung bei anderen Mitgliedern der RTK-Familie sowie den Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen ist dem Fachmann geläufig. 2.1.1. FLK-I ELISA
Es wurde ein ELISA-Versuch durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-I Rezeptors und genauer die Inhibition 0 oder Aktivierung der Protein-Tyrosinkinaseaktivität des FLK-I Rezeptors zu messen. Im speziellen wurde der folgende Test durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-I Rezeptors in FLK-1/NIH3T3 Zellen zu messen.
Materialien und Methoden.
Materialien. Es wurden die folgenden Reagenzien und Gegenstände verwendet:
a. Corning 95-Loch ELISA Platten (Corning Katalognr. 25805-
96) ;
b. Cappel Ziege Anti-Kaninchen IgG (Katalognr. 55641);
c. PBS (Gibco Katalognr. 450-1300EB);
d. TBSW Buffer (50 mM Tris (pH 7.2), 150 mM NaCl und 0,1% Tween-2 0);
e. Ethanolamin-Stammlösung (10% Ethanolamin (pH 7.,O), bei 40C gelagert);
f. HNTG Puffer (2OmM HEPES Puffer (pH 7,5), 15OmM NaCl, 0,2% Triton X-100 und 10% Glycerin);
g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) als lOOX Stammlösung);
h. Natriumorthovanadat (0,5 M als eine 100 X Stammlösung); i. Natriumpyrophosphat (0,2M als eine lOOX Stammlösung); j. NUNC 96 well V Boden Polypropylen-Platten (Applied Scientific Katalognr. AS-72092);
k. NIH3T3 C7#3 Zellen (FLK-I exprimierende Zellen);
1. DMEM mit IX Hochglucose L-Glutamin (Katalognr. 11965-050) ;
m. FBS, Gibco (Katalognr. 16000-028); n. L-Glutamin, Gibco (Katalognr. 25030-016);
o. VEGF, PeproTech, Inc. (Katalognr. 100-20) ; (als 1 &mgr;&pgr;&igr;/&idiagr;&Ogr;&Ogr; &mgr;.1 Stammlösung in Milli-Q dH2O gelagert und bei -200C aufbewahrt);
■ . p. affinitätsgereinigtes anti-FLK-1-Antiserum, Enzymlabor, Sugen, Inc.;
q. monoklonaler Antikörper UB4 0, spezifisch für Phosphotyrosin, Enzymlabor, Sugen Inc. (siehe Fendly, et al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558):
r. Ziege Anti-Maus IgG-POD mit EIA-Reinheit (Bio Rad Katalognr. 172-1011);
s. 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)- Lösung (100 mM Zitronensäure (wasserfrei), 250 mM Na2HPO4 (pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma Katalognr. A-1888)) , die Lösung sollte bis zur Verwendung im dunkeln bei 40C gelagert werden;
t. H2O2 (30% Lösung) (Fisher Katalognr. H325),
u. ABTS/H2O2 (15 ml ABTS-Lösung, 2 &mgr;&idiagr; H2O2) , 5 Minuten vor der Verwendung hergestellt und bei Raumtemperatur
stehengelassen;
&ngr;. 0,2 M HCl Stammlösung in H2O;
w. Dimethylsulfoxid (100%) (Sigma Katalognr. D-8418); und y. Trypsin-EDTA (Gibco BRL Katalognr. 25200-049).
Protokoll: Das folgende Protokoll wurde zur Durchführung des Versuchs verwendet:
1. Man beschichte Corning 96-Loch ELISA Platten mit 1,0 /xg pro Vertiefung Cappel Anti-Kaninchen IgG Antikörper in 0,1 M Na2CO3 pH 9,6. Man bringe das Endvolumen auf 15 0 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung. Man beschichte die Platten bei 4°C über Nacht. Die Platten können bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden, wenn sie bei 40C gelagert werden.
2. Man kultiviere Zellen bei 37°C, 5% CO2 im Nährmedium (DMEM, Supplementiert mit 2,0 mM L-Glutamin, 10% FBS) in geeigneten Kulturschalen bis zur Konfluenz.
3. Man ernte die Zellen durch Trypsinverdau und säe 25.000 Zellen/Vertiefung in 200 &mgr;&idiagr; Nährmedium in Corning 25850 Polystyrol 96-Lochzellplatten mit rundem Boden aus.
4. Man kultiviere die Zellen mindestens für einen Tag bei 37°C, 5% CO2.
5. Man wasche die Zellen mit D-PBS IX.
6. Man füge 200 /xl/Vertiefung Hungermedium (DMEM, 2,0 mM 1-Glutamin, 0,1% FBS) hinzu. Man inkubiere über Nacht bei 37°C, 5% CO2.
7. Man verdünne die Verbindungen/Extrakte 1:20 in 96-Loch Platten aus Polypropylen unter Verwendung von Hüngermedien. Man verdünne Dimethylsulfoxid 1:20 zur Verwendung in Kontrollvertiefungen.
8. Man entferne das Hungermedium aus den 96 Loch-
Zellkulturplatten und gebe 162 &mgr;&idiagr; frisches Hungermedium zu jeder Vertiefung dazu.
9. Man füge 18 &mgr;&idiagr; einer 1:20 verdünnter Ve'rbindungs/Extraktverdünnung (aus Schritt 7) zu jeder Vertiefung sowie der 1:20 Dimethylsulfoxidverdünnung der Kontrollplatten (+/- VEGF), für eine Endverdünnung von 1:200 nach der Zellstimulation. Die Dimethylsulfoxidendkonzentration ist 0,5%. Man inkubiere die Platte bei 37°C, 5% CO2 für zwei
Stunden.
10. Man entferne nicht gebundenen Antikörper von den ELISA Platten durch Umdrehen der Platten.zur Entfernung von Flüssigkeit. Man wasche dreimal mit TBSM + 0,5% Ethanolamin, pH 7,0. Man klopft die Platten auf einem Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit und Tropfen zu entfernen.
11. Man blockt die Platten mit TBSM + 0,5% Ethanolamin, pH 7,0, 150 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung. Man inkubiere die Platte für 3 0 Minuten unter Schütteln auf einem Mikrotiter-Plattenschüttler.
12. Man wasche die Platten dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
13. Man füge 0,5 &mgr;g/Vertiefung polyklonales
affinitätsgereinigtes Anti-FLU-1 Kaninchenantiserum hinzu. Man bringe das Endvolumen auf 150 &mgr;&Igr;/Vertiefung mit TBSW + 0,5% Ethanolamin pH 7,0.
14. Man gebe 180 &mgr;&idiagr; Hungermedium zu den Zellen hinzu und stimuliert die Zellen mit 20 &mgr;&Igr;/Vertiefung 10,0 mM Natriumorthovanadat und 500 ng/ml VEGF (was eine Endkonzentration von 1,0 mM Natriumorthovanadat und 50 ng/ml VEGF pro Vertiefung ergibt) für 8 Minuten bei 37?C, 5% CO2.
Vertiefungen der Negativkontrollen erhalten nur das
Hungermedium.
■ ■ 15. Nach 8 Minuten sollten die Medien von den Zellen entfernt werden und einmal mit 200 &mgr;&Igr;/Vertiefung PBS gewaschen werden.
16. Man lysiere die Zellen in 150 &mgr;&Igr;/Vertiefung HNTG unter
Schütteln bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Die HNTG Formulierung schließt Natriumorthovanadat, Natriumpyrophosphat und EDTA ein.
17. Man wasche die ELISA Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
18. Man überführe die Zellysate aus der Zellplatte zu einer EL'ISä Platte und inkubiert unter Schütteln für 2 Stunden. Um das Zellysat zu überführen, pipettiert man unter Abkratzen der 5 Vertiefungen auf und ab.
19. Man wasche dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
20. Man inkubiere eine ELISA Platte mit 0,02 &mgr;g/Vertiefung
• ·
UB40 in TBSW + 0,5% Ethanolamin. Man bringe das Endvolumen auf 150 &mgr;&Igr;/Vertiefung.; Man inkubiere unter Schütteln für 30 Minuten.
21. Man wasche die Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
22. Man inkubiere die ELISA Platte mit 1:10.000 verdünntem Ziege Anti-Maus IgG konjugierter Meerrettichperoxidase mit EIA-Reinheit in TBSW + 0,5% Ethanolamin, pH 7,0. Man bringe das Endvolumen auf 150 &mgr;&Igr;/Vertiefung. Man inkubiere für 3 0 Minuten unter Schütteln.
23. Man wasche die Platte wie in Schritt 10 beschrieben.
24. Man gebe 100 &mgr;&idiagr; ABTS/H2O2 Lösung zu der Vertiefung. Man inkubiere für 10 Minuten unter Schütteln.
25. Man füge 100 &mgr;&idiagr; 0,2 M HCl für eine HCl-Endkonzentration von 0,1 M hinzu, um die Farbentwicklungsreaktion abzustoppen.
Man schüttle für 1 Minute bei Raumtemperatur. Man entferne Blasen mit einem schwachen Luftstrom und mißt die ELISA Platte mit einem ELISA Platten-Leser bei 410 nm.
2.1.2. HER-2 ELISA
0 Assay 1: EGF Rezeptor-HER2 chimärer Rezeptor;Assay in ganzen Zellen. Die HER2 Kinaseaktivität in ganzen EGFR-NIH3T3 Zellen wurde wie unten beschrieben gemessen:
Materialien und Reagenzien. Zur Durchführung des Versuchs wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet. a. EGF: Konzentrationen der Stammlösungen = 16,5 ILM; EGF 2 01, TOYOBO, Co., Ltd. Japan.
b. 05-101 (UBI) (ein monoklonaler Antikörper, der eine extrazelluläre Domäne des EGFR erkennt).
c. Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Anti-Ptyr) (polyklonal) (siehe Fendly et al., supra).
d. Nachweis-Antikörper: Ziege Anti-Kaninchen IgG Meerrettichperoxidase-Konjugat, TAGO, Inc., Burlingame, CA.
". e. TBST Puffer:
Tris-HCl, pH 7,2 50 mM
NaCl 150 mM
Triton X-100 ' 0, 1
f. HNTG 5X Stammlösung:
44 0, 1 M • · ·
• · ··
•
•
0, 75 M
HEPES 50%
NaCl ; 1,0%
Glycerin
Triton X-IOO
g. ABTS-Stammlösung:
Zitronensäure 100 mM
Na2HPO4 2 50 mM
HCl, cone. 0,5 pM
ABTS* 0,5 mg/ml
* (2, 2 ' -Azinobis (3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) ) .. Man bewahre die Lösung vor dem Gebrauch bei 40C im Dunkeln auf.
h. Stammlösung von:
EDTA 100 mM pH 7,0
Na3VO4 0 , 5 M
Na4(P2O7) 0,2 M
Vorgehensweise. Es wurde das folgende Protokoll verwendet:
A. Vorbeschichtete ELISA Platten
1. Man. beschichte ELISA Platten (Corning, 96-Loch, Kat. #25805-96) mit 05-101 Antikörper mit 0,5 g pro Vertiefung in PBS, Endvolumen/Vertiefung 100 &mgr;&idiagr; und bewahre sie über Nacht bei 40C auf. Beschichtete Platten sind für bis zu 10 Tage verwendbar, wenn sie bei 4°c aufbewahrt werden. ■ . ■■' 2. Am Tag der Verwendung entferne man den Beschxchtungspuffer und ersetze ihn mit 100 &mgr;&idiagr; Blockierungspuffer (5% Carnation Instant fettfreie Trockenmilch in PBS). Man inkubiere die Platte, schüttle bei Raumtemperatur (ungefähr 230C bis 25°C) für 30 Minuten. Unmittelbar vor der Verwendung entferne man den Blockierungspuffer und wäscht die Platte viermal mit TBST Puffer.
B. Aussäen der Zellen
1. Eine NIH3T3 Zellinie, die einen chimären Rezeptor üb'erexprimiert, der die EGFR extrazelluläre Domäne und die extrazelluläre HER2 Kinasedomäne enthält, kanu für diesen 5 Assay verwendet werden.
2. Man wählt Schalen mit 80 bis 90% Konfluenz für dieses Experiment aus. Man unterwerfe die Zellen einer
Trypsinbehandlung und beende die Reaktion durch Zugabe von 10% fötalem bovinen Serum. Man suspendiere die Zellen in DMEM Medium (10% CS DMEM Medium), und zentrifugiere einmal bei 1500 rpm bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
3. Man resuspendiere die Zellen im Aussaatmedium (DMEM, 0,5% bovines Serum) und zählt die Zellen unter Verwendung von Trypanblau. Eine Überlebensrate von ungefähr 90% ist akzeptabel. Man säe die Zellen in DMEM Medium (0,5% bovines Serum) in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung, 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung, in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte aus. Man inkubiere die ausgesäten Zellen in 5% CO2 bei 37°C für ungefähr 40 Stunden.
C. Vorgehensweise beim Test
Man überprüfe die ausgesäten Zellen auf Kontamination unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Man verdünne die Stammlösung des Wirkstoffs (10 mg/ml in DMSO) 1:10 in DMEM Medium, überführe 5 &mgr;&idiagr; in eine TBST Vertiefung für eine Endverdünnung des Wirkstoffs von 1:200 und einer Endkonzentration von DMSO von 1%. Kontrollvertiefungen erhalten nur DMSO. Man inkubiere in 5% CO2 bei 37/C für 2 Stunden.
2. Man präpariert den EGF Ligand: Man verdünne EGF-
■ ' Stammlösung in DMEM, sodaß nach Transfer von 10 &mgr;&idiagr; verdünntem EGF (1:12 Verdünnung) eine Endkonzentration von 100 nM erhalten wird.
3. Man präpariert frisches HNTG*, das für 100 &mgr;&idiagr;/Vertiefung ausreicht, und stellt es auf Eis.
HNTG (10 ml):
HNTG Stammlösung 2,0 ml
milli-Q H2O 7,3 ml
EDTA, 10 0 mM', pH 7, 0 0, 5 ml
Na3VO4, 0,5 M 0,1 ml
". Na4(P2O7) , 0,2 M 0, 1 ml
4. Nach 120 Minuten Inkubation mit dem Wirkstoff gebe man präparierten SGF Liganden zu den Zellen, 10 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung, bis zu einer Endkonzentration von 100 nM. Kontrollvertiefungen erhalten nur DMEM. Man inkubiere, schüttle bei Raumtemperatur
46 . '
für 5 Minuten.
5. Man entferne den Wirkstoff, IGF sowie das DMEM. Man wasche die Zellen zweimal mit PBS. Man überführt HNTG* zu den Zellen, 100 &mgr;&idiagr;/Vertiefung. Man stelle für 5 Minuten auf Eis.
In der Zwischenzeit entferne man den Blockierungspuffer von der anderen ELISA Platte und wasche mit TBST wie oben, beschrieben.
6. Mit einer Pipettenspitze, die fest an einer Mikropipette angebracht ist, kratze man die Zellen von den Platten ab und homogenisiere das Zellmaterial durch wiederholtes Aufsaugen und Verteilen des HNTG* Lysepuffer. Man überführe das Lysat in eine beschichtete, blockierte und gewaschene ELISA Platte. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
7. Man entferne das Lysat und wasche viermal mit TBST. Man überführe frisch verdünnten Anti-Ptyr-Antikörper mit 100 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung in die ELISA Platte. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 3 0 Minuten in der Gegenwart des Anti-Ptyr Antiserums (1:3000 Verdünnung in TBST).
8. Man entferne den Anti-Ptyr-Antikörper und wasche viermal 0 mit TBST. Man überführe den frisch verdünnten TAGO Antikaninchen mit 100 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung IgG Antikörper in die ELISA Platte. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten (Anti-Kaninchen IgG Antikörper:1:3000 Verdünnung in TBST).
9. Man entferne den TAGO Nachweis-Antikörper und wasche viermal mit TBST. Man überführe frisch angesetzte ABTS/H2O2 Lösung zu der ELISA Platte, 100 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. (ABTS/H2O2 Lösung: 1,0 &mgr;&idiagr; 30% H2O2 in 10 ml ABTS Stammlösung).
10. Man beende die Reaktion durch Zugabe von 50 &mgr;&idiagr; 5&Ngr; H2SO4 (optional) und bestimmt die O.D. bei 410 nm.
11. Das maximale Phosphotyrosinsignal wird durch Subtraktion der Werte der Negativkontrollen von den Positivkontrollen bestimmt. Anschließend wird nach Subtraktion der Negativkontrollen die prozentuale Inhibition des Phosphotyrosingehalts für Vertiefungen, die Extrakt enthalten, berechnet.
Assay 2: HER-2-BT 474 ELISA. Ein zweiter Test kann durchgeführt werden., um die HER2 Aktivität von ganzen Zellen zu messen. Ein solcher Test kann wie folgt durchgeführt werden:
Materialien und Reagenzien. Es wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet:
a. BT-474 (ATCC HBT20), eine humane Brusttumorzellinie, die hohe Level von HER2 Kinase exprimiert.
b. Nährmedien, die RPMI + 10% FBS + GMS-G (Gibco
Supplement) + Glutamin umfassen, zur Verwendung bei der Kultivierung von BT-4 74 in einem Inkubator mit 5% CO2 bei 37°C.
c .-.Ein monoklonaler Anti-HER2 Antikörper. . d. D-PBS:
KH2HPO4 0,20 g/l 10 (GIBCO, 30-4190AJ) K2HPO4 2,16 g/l KCl 0,20 g/l NaCl 8,00 g/l (pH 7,2)
e. Blockierungspuffer: TBST plus 5% Milch (Carnation Instant fettfreie Trockenmilch). f. TBST Puffer:
Tris-HCl 50 mM
NaCl 150 mM (pH 7,2, HCl 10 N)
Triton X-IOO 0,1%,
wobei die Stammlösung von TES (10X) hergestellt wird, und Triton X-100 während des Verdünnens zu dem Puffer hinzugegeben wird.
g. HNTG Puffer (5X): HEPES 0,1 M
NaCl 750 mM (pH 7,2 (HCl, 1 N)
Glycerin 50% Triton X-100 1,0%
Die Stammlösung (5X) wird hergestellt und bei 4°C aufbewahrt. ' h. EDTA-HCl: 0,5 M pH 7,0 (10 N HCl) als 500X Stammlösung.
i. Na3VO4: 0,5 M als lOOX Stammlö&ung wird bei -800C als Aliquots aufbewahrt.
j. Na4(P2O7) : 0,2 M als 10OX Stammlösung.
k. Polyklonales Anti-Phosphotyrosin Antiserum.
1. Ziege Anti-Kaninchen IgG, Meerrettich Peroxidase (POD) Konjugat (NachweisrAntikörper), Tago (Katnr. 4520; Charge Nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.
m. ABTS Lösung:
Zitronensäure 100 mM
Na2HPO4 250 mM (pH 4,0, IN HCl) . .
ABTS 0,5 mg/ml,
wobei ABTS 2,2'-Azinobis(3-Ethylbenzthiazolinsulfonsäure) ist. Für diesen Test sollte die ABTS-Lösung im dunkeln bei 40C aufbewahrt werden. Die Lösung sollte verworfen werden, wenn sie sich grün färbt.
n. Wasserstoffperoxid: 30%ige Lösung, wird im dunkeln und bei 40C aufbewahrt.
Vorgehensweise: Alle der folgenden Schritte werden, solange nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur und aseptisch durchgeführt. Das gesamte Waschen der ELISA Platten wird durchgeführt, indem dreimal mit destilliertem Wasser und einmal mit TBST abgespült wird.
A. Aussäen der Zellen
1. Man kultiviere BT474 Zellen in Gewebekulturschalen
(Corning 25020-100) bis zu 80-90% Konfluenz und sammele sie unter Verwendung von Trypsin-EDTA (0,25%, GIBCO). • . 2. Man resuspendiere die Zellen in frischem Medium und transferiere sie mit ungefähr 25.000-50.000 Zellen/Vertiefung (100 &mgr;&Igr;/Vertiefung) in eine 96-Loch-Gewebekulturschale (Corning, 25806-96). Man inkubiere die Zellen in 5% CO2 bei 370C über Nacht.
B. Beschichten und Blockieren der ELISA Platten
1. Man beschichte die ELISA Platte (Corning, 25805-96) mit 0 Anti-HER2 Antikörper mit 0,5 &mgr;g/Vertiefung in 150 &mgr;&idiagr; PBS über Nacht bei 40C und verschließt sie mit Parafilm. Die mit Antikörper beschichteten Platten können bis zu zwei Wochen ve'rwendet werden, wenn sie bei 40C gelagert werden.
2. Am Tag der Verwendung entferne man den Beschichtungspuffer, ersetzt ihn mit 200 &mgr;&idiagr; Blockierungspuffer, schüttle die Platte und entferne anschließend den Blockierungspuffer und wasche die Platte
• ·
unmittelbar vor der Zugabe von Lysat. C. Vorgehensweise beim Test
1. Die Wirkstoffe werden in TBST bei serumfreien Bedingungen aufgenommen. Bevor die Wirkstoffe hinzugegeben werden, wird das alte Medium mit serumfreiem RPMI (90 &mgr;&Igr;/Vertiefung) ersetzt.
2. Man verdünne die Stammlösung des Wirkstoffs (in 100% DMSO) 1:10 mit RPMI und transferiere 10 &mgr;&Igr;/Vertiefung dieser Lösung zu den Zellen, um eine Endkonzentration des Wirkstoffs in DMSO von 1% zu erhalten. Man inkubiere die Zellen in 5% CO2 bei 37°C.
3. Man setze frischen Zellysepuffer an (HNTG*) 5xHNTG 2 ml
EDTA 0,2 ml
Na3NO4 0, 1 ml
Na4P2O7 0,1 ml
H2O 7,3 ml
4. Nach Vorinkubation des Wirkstoffs für 2 Stunden entferne man die gesamte Lösung aus der Platte, transferiere HNTG* (10 &mgr;&idiagr;/Vertiefung) zu den Zellen und schüttle für 1Oj Minuten.
5. Man verwende eine 12-Kanal Pipette, um die Zellen von der Platte abzukratzen und homogenisiert das Lysat durch wiederholtes Aufsaugen und Verteilen. Man überführe das gesamte Lysat in eine ELISA Platte und schüttle für eine Stunde.
6. Man entferne das Lysat, wasche die Platte, gebe AntipTyr, (1:3.000 in TBST) 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung hinzu, und schüttle für 3 0 Minuten.
7. Man entferne den Anti-pTyr, wasche die Platte, gebe Ziege Anti-Kaninchen konjugiertem Antikörper (1:5.000 mit TBST), 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung hinzu, und schüttelt für 30 Minuten.
8. Man entferne den Anti-Kaninchen IgG Antikörper, wasche di'e Platte und gebe 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung frisches ABTS/H2O2 (1,2 &mgr;&idiagr; H2O2 auf 10 ml ABTS) zu der Platte' hinzu, um die.
Farbentwicklung zu starten, was üblicherweise 20 Minuten benötigt.
9. Man mißt die OD 410 nM, Dynatec MR5000.
2.1.3. PDGF-R ELISA
Alle Zellkulturmedien, Glutamin und fötales bovines Serum wurden, solange nicht anderweitig angegeben, von Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) bezogen. Alle Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre aus 90-95% Luft und 5-10% CO2 bei 37°C kultiviert. Alle Zellinien wurden üblicherweise zweimal pro Woche subkultiviert und waren Mycoplasmen-negativ, wie durch die Mycotect Methode (Gibco) bestimmt.
Für ELISA Tests wurden Zellen (U1242, von Joseph Schlessinger, NYU erhalten) zu 80 bis 90% Konfluenz im Nährmedium kultiviert (MEM mit 10% FBS, NEAA, 1 mM NaPyr und 1 mM Gin) und in 96-Loch Gewebekulturschalen in 0,5% Serum mit 25.000 bis 30.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach Inkubation über Nacht in 0,5% Serum enthaltendem Medium wurden die Zellen in serumfreies Medium ausgetauscht und mit der Testverbindung für 2 Stunden in einem 5% CO2, 370C Inkubator behandelt. Die Zellen wurden anschließend mit Ligandem für 5-10 Minuten stimuliert, was von Lyse mit HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10% Glycerin, 5 mM EDTA, 5 mM Na3VO4, 0,2% Triton X-0 10 0 und 2 mM NaPyr) gefolgt wurde. Die Zellysate;(0,5 mg/Vertiefung in PBS) wurden in ELISA Platten, die zuvor mit einem rezeptorspezifischen Antikörper beschichtet worden waren und die mit 5% Milch in TBST geblockt worden waren (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl und 0,1% Triton X-100), für 30 Minuten bei Raumtemperatur überführt. Die Lysate wurden unter Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden viermal mit TBST gewaschen und anschließend mit polyklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Überschüssiger Anti-Phosphotyrosin-Antikörper wurde entfernt, indem die Platte viermal mit TBST abgespült wurde. Ziege Anti-Kaninchen IgG Antikörper wurde zu der ELISA Platte für 3 0 Minuten bei Raumtemperatur hinzugegeben, und nachfolgend wurde viermal mit TBST abgespült. Es wurde ABTS (100 mM Zitronensäure, 250 mM Na2HPO4 und 0,5 mg/mL 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) plus H2O2 (1,2 ml 30% H2O2 auf 10 ml ABTS) zu den ELISA Platten hinzugegeben, um die Farbentwicklung zu starten.
Die Absorption bei 410 nm wurde mit einer Referenzwellenlänge von 63 0 nm für 15 bis 3 0 Minuten nach der ABTS Zugabe aufgezeichnet.
2.1.4. IGF-I ELISA
Das folgende Protokoll kann zur Messung der Phosphotyrosinlevel auf dem IGF-I Rezeptor verwendet werden, was die IGF-I Rezeptortyrosin-Kinaseaktivität anzeigt.
Materialien und Reagenzien. Es wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet:
a. Die Zellinie, die in diesem Test verwendet wurde, ist 3T3/IGF-1R, eine Zellinie, die den IGF-I Rezeptor überexprimiert.
b. NIH3T3/IGF-1R werden in einem Inkubator mit 5% CO2 bei 370C kultiviert. Das Nährmedium ist DMEM + 10% FBS ■ (hitzeinaktiviert) + 2mM L-Glutamin.
c. Es wird der 17-69 genannte Anti-IGF-IR Antikörper verwendet. Die Antikörper wurden vom Enzymlabor von Sugen, Inc. gereinigt.
d. D-PBS:
KH2PO4 0,20 g/l
K2HPO4 2,16 g/l
KCl 0,2 0 g/l
NaCl 8,0 0 g/l (pH 7,2)
e. Blockierungspuffer: TBST plus 5% Milch (Carnation Instant fettfreie Trockenmilch)
f. TBST Puffer:
Tris-HCl 50 mM
NaCl 15OmM (pH 7,2/HCl 10N)
Triton X-100 0,1%
Die Stammlösung des TBS (10X) wird hergestellt und Triton X-wird während des Verdünnens zu dem Puffer hinzugeben.
g. HNTG Puffer:
" HEPES 2 0 mM
NaCl 150 mM (pH 7,2/HCl IN)
Glycerin 10%
Triton X-100 0,2%
Die Stammlösung (5X) wird hergestellt und bei 4°C aufbewahrt.
h. EDTA/HCl: 0,5 M pH 7,0 (NaOH) als 10OX Stammlösung.
i. Na3VO4: 0,5 M als 10OX Stammlösung und Aliquots werden bei -8O0C aufbewahrt,
j. Na4P2O7: 0,2 M als lOOX Stammlösung.
k. Insulinartiger Wachstumsfaktor 1 von Promega (Kat.# G5111) .
1. Polyklonales Anti-Phosphotyrosin Antiserum: Kaninchenserum, vom Enzymlabor, Sugen Ine hergestellt.
m. Ziege Anti-Kaninchen IgG, POD Konjugat (Nachweis-Antikörper), Tago (Kat.-Nr. 4520, Charge Nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.
n. ABTS (2,2'-Azinobis(3-Ethylbenzthiazoninsulfonsäure))-Lösung:
Zitronensäure 100 mM
Na2HPO4 ■ 250 mM (pH 4,0/1 N HCl)
ABTS 0,5 mg/ml
ABTS Lösung sollte im Dunkeln und 40C aufbewahrt werden. Die Lösung sollte verworfen werden, wenn sie sich grün verfärbt.
0. Wasserstoffperoxid: 30%ige Lösung, wird im Dunkeln und 0 bei 40C aufbewahrt.
Vorgehensweise: Alle der folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, solange es nicht besonders angegeben ist. Das gesamte Waschen der ELISA Platten wurde, durchgeführt, indem die Platten dreimal mit Leitungswasser abgespült wurden, gefolgt von einmaligem Abspülen mit TBST. Die Platte wurde mit Papierhandtüchern trockengeklopft.
A. Aussäen der Zellen:
1. Die Zellen, die in Gewebekulturschalen (Corning 25020-100) bis zu 80 bis 90% Konfluenz kultiviert wurden, werden mit Trypsin-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, GIBCO) geerntet.
2. Man resuspendiere die Zellen in frischem DMEM + 10% FBS + 2mM L-Glutamin und überführt diese mit 20.000 Ze'llen/Vertiefung (100 &mgr;&Igr;/Vertiefung) in eine 96-Loch Gewebekulturplatte (Corning, 25805-96). Man inkubiere für 1 Tag, ersetze anschließend das Medium durch serumfreies Medium (90/ &mgr;&idiagr;) und inkubiere bei 5% CO2 und 370C über Nacht.
B. Beschichten und Blockieren der ELISA Platten:
• C
1. Man beschichte die ELISA Platte (Coming 25805-96) mit Anti-IGF-1R Antikörper mit 0,5 &mgr;&Igr;/Vertiefung in 100 &mgr;&idiagr; PBS für zumindest 2 Stunden.
2. Man entferne die Beschichtungslösung, und ersetze sie
mit 10 0 &mgr;.1 Blockierungspuffer und schüttle für 3 0 Minuten. Man entferne den Blockierungspuffer und wasche die Platte unmittelbar vor der Zugabe des Lysates. C. Vorgehensweise beim Test:
1. Die Wirkstoffe werden unter serumfreien Bedingungen getestet.
2. Man verdünne die Stammlösung der Wirkstoffe (in 100% DMSO) 1:10 mit DMEM in 96-Loch-Polypropylenplatten und überführt 10 &mgr;&idiagr;/Vertiefung dieser Lösung zu den Zellen, um eine Endverdünnung der Wirkstoffe von 1:100 und eine End-DMSO-Konzentration von 1,0% zu erreichen. Man inkubiere die Zellen in 5% CO2 bei 37°C für 2 Stunden.
3. Man setze frischen Zellysepuffer an (HNTG*) HNTG 2 ml
EDTA 0,1 ml
Na3NO4 0,1 ml ,
Na4(P2O7) 0,1 ml
H2O 7 , 3 ml
■ . ■ 4. Nach der Inkubation mit dem Wirkstoff für 2 Stunden transferiere man 10 &mgr;&Igr;/Vertiefung des 20OnM IGF-I Liganden in PBS zu den Zellen (Endkonzentration = 20 nM) und inkubiere in 5% CO2 bei 37°C für 10 Minuten.
5. Man entferne das Medium und gebe 100 &mgr;&idiagr;/Vertiefung HNTG* hinzu und schüttle für 10 Minuten. Man betrachte die Zellen unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob sie ausreichend lysiert sind.
6. Man verwende eine 12-Kanal Pipette, um die Zellen von der Platte abzukratzen und homogenisiere das Lysat durch wiederholtes Ansaugen und Verteilen. Man überführe das gesamte Lysat in eine mit Antikörper beschichtete ELISA Platte und schüttle für 1 Stunde.
7. Man entferne das Lysat, wasche die Platte, transferiere Anti-pTyr (1:3.000 in TBST) 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung und schüttle für
· * fr
3 0 Minuten.
8. Man entferne den Anti-pTyr, wasche die Platte, transferiere Tago (1.3.000 in TBST) 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung und schüttle für 3 0 Minuten.
9. Man entferne den Nachweis-Antikörper, wasche die Platte und transferiere frisches ABTS/H2O2 (1,2 &mgr;&idiagr; H2O2 auf 10 ml ABTS), 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung zu der Platte, um die Farbentwicklung zu starten.
10. Man mißt die OD in einem Dynatec MR5000, der mit Ingres verbunden ist.
2.1.5. EGF Rezeptor ELISA
Die EGF Rezeptorkinaseaktivität (EGFR-NIH3T3 Assay) in ganzen Zellen wurde, wie unten beschrieben, gemessen.
Materialien und Reagenzien. Es wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet.
a. EGF Ligand: Stammlösung = 16,5 &mgr;&Mgr;; EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japan.
b. 05-101 (UBI) (ein monoklonaler Antikörper, der eine extrazelluläre Domäne des EGFR erkennt).
c. Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Anti-Ptyr) (polyklonal).
d. Nachweis-Antikörper: Ziege Anti-Kaninchen IgG Meerrettichperoxidase-Konjugat, TAGO, Inc., Burlingame, CA.
e. TBST Puffer:
Tris-HCl, pH 7 50 mM
NaCl 150 mM
Triton X-100 0,1
f. HNTG 5X Stammlösung:
HEPES 0, 1 M
NaCl 0,75 M
Glycerin 50
Triton X-100 1, 0%
g. ABTS Stammlösung:
Zitronensäure 100 mM
Na2HPO4 250 mM
HCl, cone. 4, 0 pH
ABTS* 0,5 mg/ml
Man bewahre die Lösung bis zur Verwendung im Dunkeln bei 40C
auf.
h. Stammreagenzien von:
EDTA 100 mM pH 7,0
Na3VO4 0 , 5 M
Na4(P2O7) 0,2 M
Vorgehensweise. Es wurden die folgenden Protokolle verwendet: A. Vorbeschichten der ELISA Platten
1. Man beschichte ELISA Platten (Corning, 96-Loch, Kat. Nr. 25805-96) mit Antikörper 05-101 mit 0,5 ^g/Vertiefung in PBS, 150 &mgr;&idiagr; Endvolumen/Vertiefung und bewahre sie über Nacht bei 40C auf. Beschichtete Platten sind bis zu 10 Tagen verwendbar, wenn bei 40C gelagert.
2. Am Tag der Verwendung entfernt man den Beschichtungspuffer und ersetzt ihn mit Blockierungspuffer (5% Carnation Instant fettfreie Trockenmilch in PBS). Man inkubiere die Platte, schüttelt bei Raumtemperatur (ungefähr 230C bis 250C) für 3 0 Minuten. Unmittelbar vor der Verwendung entfernt man den Blockierungspuffer und wäscht die Platte viermal mit TBST Puffer.
B. Aussäen der Zellen ;
1. Die NIH 3T3/C7 Zellinie (Honegger, et al., Cell 51:199-
209, 1987) kann für diesen Test verwendet werden. ' ·" 2. Man wähle Schalen mit 80-90% Konfluenz für das Experiment aus. Die Zellen werden einer Trypsinbehandlung unterworfen und die Reaktion wird durch Zugabe von 10% CS DMEM Medium beendet. Man suspendiere die Zellen in DMEM Medium (10% CS DMEM Medium) und zentrifugiere einmal bei 10 0 0 rpm und einmal bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
3. Man resuspendiere die Zellen im Aussaatmedium (DMEM,
0 0,5% bovines Serum) und zähle die Zellen unter Verwendung von Trypanblau. Eine Lebensrate von ungefähr 9 0% ist akzeptabel. Man säe die Zellen in DMEM Medium (0,5% bovines Serum in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung, 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung, in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte aus. Man inkubiere die ausgesäten Zellen mit 5% CO2 bei 37°C für ungefähr 40 Stunden. C. Vorgehensweise beim Test
1. Man überprüfe die ausgewählen Zellen auf Kontamination
unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Man verdünne die Stammlösung des Wirkstoffs (10 mg/ml in DMSO) 1:10 in DMEM Medium, überführt anschließend 5 &mgr;&idiagr; in eine Testvertiefung für eine Endverdünnurig des Wirkstoffs von 1:200 und einer Endkonzentration von DMSO von 1%. Vertiefungen von Kontrollen erhalten nur DMSO. Man inkubiere in 5% CO2 bei 37°C für eine Stunde.
2. Man präpariere den EGF Liganden: Man verdünne die EGF Stammlösung in DMEM, sodaß nach Transfer von 10 &mgr;&idiagr; verdünnten EGF (1:12 Verdünnung) eine Endkonzentration von 25 nM erhalten wird.
3. Man setze frischen 10 ml HNTG* an, der für 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung ausreicht, wobei der HNTG* umfaßt: HNTG Stammlösung (2,0 ml) , milli-Q H2O (7,3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na3VO4, 0,5M (0,1ml) und Na4 (P2O7) , 0,2 M (0,1ml).
4. Man stelle dies auf Eis.
5. Nach 2 Stunden Inkubation mit dem Wirkstoff gebe man präparierten EGF Liganden zu den Zellen, 10 &mgr;&Igr;/Vertiefung, um eine Endkonzentration von 25 nM zu erreichen.
0 Kontrollvertiefungen erhalten nur DMEM. Man inkubiere unter Schütteln für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Man entferne den Wirkstoff, den EGF und das DMEM. Man wasche die Zellen zweimal mit PBS. Man überführe HNTG* zu den Zellen, 100 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung. Man stelle für 5 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit entferne man den Blockierungspuffer von der anderen ELISA Platte und wasche mit TBST wie oben beschrieben.
7. Mit einer Pipettenspitze, die auf einer Mikropipettenvorrichtung fest angebracht ist, kratze man die Zellen aus den Platten und homogenisiere das Zellmaterial durch wiederholtes Aufziehen und Verteilen des HNTG* Lysepuffers. Man überführe das Lysat in eine beschichtete, blockierte und gewaschene ELISA Platte. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
8. Man entferne das Lysat und wasche viermal mit TBST. Man transferiere frisch verdünnten Anti-Ptyr-Antikörper in die ELISA Platte mit 100 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung. Man inkubiere unter
Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten in der Gegenwart des Anti-Ptyr Antiserums (1:3.000 Verdünnung in TBST).
9. Man entferne den Anti-Ptyr-Antikörper und wasche viermal mti TBST. Man überführe den frisch verdünnten TAGO 30 Anti-Kaninchen IgG Antikörper in die ELISA Platte in 100 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten (Anti-Kaninchen IgG Antikörper: 1:3.000 Verdünnung in TBST).
10. Man entferne den Nachweis-Antikörper und wasche viermal mit TBST. Man überführe frisch hergestellte ABTS/H2O2 Lösung in die ELISA Platte, 10 0 &mgr;&Igr;/Vertiefung. Man inkubiere bei Raumtemperatur für 20 Minuten. ABTS/H2O2 Lösung: 1,2 &mgr;&idiagr; 30% H2O2 auf 10 ml ABTS Stammlösung.
11. Man beendet die Reaktion durch Zugabe von 50 &mgr;&idiagr; 5&Ngr; H2SO4 (optional) und bestimmt die O.D. bei 410 nm.
12. Das maximale Phosphotyrosinsignal wird durch Subtraktion des Wertes der Negativkontrollen von den Positivkontrollen bestimmt. Anschließend wird nach Subtraktion der Negativkontrollen die prozentuale Inhibition des Phosphotyrosingehalts für Vertiefungen, die Extrakt enthalten, berechnet,.
2.1.6. Zellulärer-Insulinrezeptor ELISA
Das folgende Protokoll wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Insulinrezeptor-Tyrosinkinaseaktivität besitzen.
Materialien und Reagenzien. Es wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet, um Phosphotyrosinlevel des Insulinrezeptors zu messen (was die Insulinrezeptor-Tyrosinkinaseaktivität anzeigt):
0 1. Die bevorzugte Zellinie war eine NIH3T3 Zellinie (ATCC Nr. 1658), die den Insulinrezeptor überexprimiert (H25 Zellen);
*. 2. H25 Zellen werden in einem Inkubator mit 5% CO2 bei 37°C kultiviert. Das Nährmedium ist DMEM + 10% FBS (hitzeinaktiviert) + 2 mM Glutamin;
3. Für das Beschichten der ELISA Platte wird.der monoklonale BBE genannte Antikörper verwendet. Dieser
58
Antikörper wurde vom Enzymlabor von Sugen Inc. gereinigt;
4. D-PBS, umfassend:
KH2PO4 0,20 g/l (GIBCO, 310-4190AJ)
K2HPO4 : 2,16 g/l
KCl 0,20 g/l
NaCl 8,00 g/l (pH 7,2) ;
5. Blockierungspuffer: TBST + 5% Milch (Carnation Instant fettfreie Trockenmilch);
6. TBST-Puffer umfassend: Tris-HCl 5OmM
NaCl 15OmM pH 7,2 (HCl, 1 N)
Triton X-100 0,1%
Man beachte: Die Stammlösung des TBS (10X) wird hergestellt und Triton X-10 0 wird zu dem Puffer während des Verdünnens hinzugegeben;
7. HNTG Puffer, umfassend: HEPES 2OmM
NaCl 15OmM pH 7,2 (HCl, 1 N)
Glycerin 10%
Triton X-100 0,2% Man beachte: Die Stammlösung (5X) wird hergestellt und bei 4°C aufbewahrt;
8. EDTA/HCI: 0,5 M pH 7,0 (NaOH) als 100fach Stammlösung;
9. Na3VO4: 0,5 M als lOOX Stammlösung und Aliquots wurden bei -8O0C aufbewahrt;
10. Na4P2O7: 0,2 M als lOOX Stammlösung;
11. Insulin von GIBCO BRL (Kat.-Nr. 18125039);
12. Polyklonales Anti-Phosphotyrosin Antiserum: Kaninchenserum, hergestellt vom Enzymlabor, Sugen Inc.;
13. Nachweis-Antikörper, vorzugsweise Ziege Anti-Kaninchen IgG, POD Konjugat, Tago (Kat.-Nr. 4520: Charge Nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA;
14. ABTS Lösung, umfassend: Zitronensäure 100 mM
Na2HPO4 250 mM pH 4,0 (1 N HCl)
ABTS 0,5 mg/ml
wobei ABTS 2,2'-Azinobis(3Lethylbenzthiazolinsulfönsäure) ist
und im Dunkeln bei 40C gelagert wird und verworfen wird, wenn es sich grün verfärbt;
15. Wasserstoffperoxid: eine 3 0%ige Lösung wird im Dunkeln und bei 40C aufbewahrt.
Protokoll. Alle der folgenden Schritt werden bei Raumtemperatur durchgeführt, solange es nicht besonders anders angegeben ist. Das gesamte Waschen der ELISA Platte wurde' durchgeführt, indem die Platte dreimal mit Leitungswasser abgespült wurde, gefolgt von einmaligem Abspülen mit TBST. Alle Platten wurden mit Papiertüchern vor der Verwendung trockengeklopft.
A. Aussäen der Zellen:
1. Die Zellen wurden in Gewebekulturschalen (10 cm, Corning 25020-100) bis zu einer Konfluenz von 80 bis 90% kultiviert und mit Trypsin-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, GIBCO) geerntet;
2. Man resuspendiere die Zellen in frischem DMEM + 10% FBS + 2mM L-Glutamin und überführe diese mit 20.000 Zellen/Vertiefung (100 &mgr;&Igr;/Vertiefung) in eine 96-Loch Gewebekulturplatte (Corning, 25806-96). Die Zellen werden anschließend für 1 Tag inkubiert. Nach einer solchen Inkubation ersetzt 0,01% Serummedium (90 &mgr;&idiagr;) das alte Medium und die Zellen werden in 5% CO2 und 37°C über Nacht inkubiert.
B. Beschichten und Blockieren der ELISA Platte
1. Man beschichte die ELISA Platte (Corning 25805-96) mit Anti-IR Antikörper mit 0,5 /zg/Vertiefung in 100 &mgr;&idiagr; PBS für zumindest 2 Stunden.
2. Man entferne die Beschichtungslösung und ersetze sie mit 10 0 &mgr;&idiagr; Blockierungspuffer und schüttle für 3 0 Minuten. Man entferne den Blockierungspuffer und wasche die Platte 0 unmittelbar vor der Zugabe von Lysat.
C. Vorgehenweise beim Test
1. Die Wirkstoffe werden unter serumfreien Bedingungen ge"testet.
2. Man verdünne die Stammlösung des Arzneimittels (in 100% DMSO) 1:10 mit DMEM in einer 96-Loch Polypropylenplatte und transferiere 10 &mgr;&Igr;/Vertiefung dieser Lösung zu den Zellen, um eine Endverdünnung des Wirkstoffs von 1:100 und eine
Endkonzentration von 1,0% zu erhalten. Man inkubiere die Zellen in 5% CO2 bei 37°C für 2 Stunden.
3. Man setze frischen Zellysepuffer (HNTG*) an
HNTG (5X) 2 ml
EDTA 0,1 ml
Na3VO4 0 ,1 ml
Na4P2O7 0,1 ml
H2O 7,3 ml
HNTG* 10 ml
4. Nach Inkubation mit dem Wirkstoff für 2 Stunden transferiere man 10 &mgr;&Igr;/Vertiefung von 1 &mgr;&Mgr; Insulin in PBS zu den Zellen (Endkonzentration = 100 nM) und inkubiere unter 5% CO2 bei 37°C für 10 Minuten.
5. Man entferne das Medium und gebe 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung HNTG* hinzu und schüttle für 10 Minuten. Man beobachte die Zellen unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob sie ausreichend lysiert sind.
6. Unter Verwendung einer 12-Kanal-Pipette kratze man die Zellen aus der Platte und homogenisiere das Lysat durch wiederholtes Aufziehen und Verteilen. Man transferiere das gesamte Lysat in eine mit Antikörper beschichtete ELISA Platte und schüttle für eine Stunde.
■ 7. Man entferne das Lysat, wasche die Platte, transferiert Anti-pTyr (1:3000 in TBST), 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung und schüttelt für 3 0 Minuten.
8. Man entferne den Anti-pTyr, wasche die Platte, transferiere TAGO (1:3000 in TBST), 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung und schüttelt für 30 Minuten.
9. Man entferne den Nachweis-Antikörper, wasche die Platte 0 und transferiere frisches ABTS/H2O2 (1,2 &mgr;&idiagr; H2O2 auf 10 ml ABTS) 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung zu den Platten, um die Farbentwicklung zu starten.
10. Man mißt die OD in'einem Dynatec MR5000, der mit einem Ingres verbunden ist. Alle nachfolgenden Schritte sollten die 5 Ingres-Anweisungen befolgen.
2.1.7. Experimentelle Ergebnisse der ELISA Assays Die experimentellen Ergebnisse für zahlreiche
• ·
61
erfindungsgemäße Verbindungen unter Verwendung der oben beschriebenen Protokolle sind in Tabelle 1 dargestellt:
Tabelle &igr;
Ergebnisse der ELISA Assays
Verbindung
(Beispiel)		 PDCFR
IC50 (&mgr;&KHgr;.) 		PXK-I
IC50 (&mgr;&Mgr;) 		7.9 28.8 41 I 4 17 &igr; 0.24 j EGFR
ICSO (&mgr;&Mgr;)		 E2R2
Kicase
ICSO (&mgr;&Mgr;)		 I • 35.7 22.5 IGc-IR
ICSO (&mgr;&EEgr;)
27 19.4 ■ 0.8 • 9 8 I 9.6 10.8 I 23.8 I
4313 14.5 13.8 33.1 2.2 42 4.7 0.17 I 11 16.9 8.0
13 12 0.39 8.5 43 14.8 53.7 i.i I
16 87.4 . 4.2 22.6 9 6.4 &ngr;* · \* / I 39.4
17 I 11.8 44 2.9 o.ii I
20 11.2 10 0.4 15.4 . I 90.2
21 20.9 45 I 1.8 2.3 I 51.S
22 2.1 11 4.6 I
24 * 21.6 12 I 2.4 I
26 4.1 43. I Sl.4 !
28 5.8 j 1.6 13 I 4-5 I
29 50 I S.&dgr; I 39.3
32 14 I 73 .4 I
4 53 ! 41.2 I
33 15 I
34 5 5 I
5 57 I
35 = 3 &iacgr;
37
33
39
70. &dgr;
Verbindung
(Beispiel)		 PDGrH.
IC50'(&mgr;&KHgr;) 		6 I 63.5 78 I FLX-I
IC5O (&mgr;&KHgr;) 		ECrR
ICSO (^.'H)		 . &Egr;&Xgr;&Rgr;.2
Ki. aase
ICSO (&mgr;&KHgr;) 		IGF-IR
IC50 (&mgr;,&EEgr;)
59 61 81 22.8
62 7 4.5 92.6
64 3.4 44 39.6
70 So 0.14
71 55.9 36.2
73 0.18
74 14". 2 20.3
76 1.6
77 2.7
•8.7
l.S
7.4
0.1S
■ 5.3 30.4
2.2. Zellwachstumstests
Die folgenden Tests wurden durchgeführt, um die Wirkung der beanspruchten Verbindungen auf das Zellwachstum als Folge der Interaktion der Verbindungen mit einer oder mehrerer RTKs zu messen. Soweit nicht anders angegeben, können die folgenden Tests generell angewendet werden, um die Aktivität einer Verbindung gegen eine bestimmte RTK zu messen. Zu dem Maß, in • dem ein Assay, wie unten geschildert, sich auf eine spezifische RTK bezieht, wäre der Fachmann in der Lage, das offenbarte Protokoll für die Verwendung zur Messung der Aktivität einer zweiten RTK anzupassen. 2.2.1. Weichagar-Test
Der Weichagar-Test kann verwendet werden, um die Wirkung 0 von Substanzen auf das Zellwachstum zu messen. Solange nicht anders angegeben, werden die Weichagar-Tests wie folgt durchgeführt:
Materialien und Reagenzien. Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:
a. Ein Wasserbad, das auf 390C eingestellt war und ein anderes Wasserbad auf 370C.
b. 2X Testmedium, umfaßt·von 2X- Dulbecco's 5Modified
Eaglets Medium (DMEM) (Gibco Cat. # CA400-4AN03), das wie folgt supplementiert ist:
• 20% fötales bovines Serum (FBS), 2 mM Natriumpyruvat, 4 mM Glutaminamin; und
· 20 mM HEPES, nicht-essentielle Aminosäuren (1:50 aus lOOX Stammlösung).
c. IX Assay Medium, hergestellt aus IX DMEM supplementiert mit 10% FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, nicht essentiellen Aminosäuren (1:100 aus lOOX Stammlösung). d. 1,6% SeaPlaque Agarose in Autoklaven-Flaschen.
e. Sterile 35 mm Corning Platten (FMC Bioproducts Kat. #50102).
f. Sterile 5 ml Glaspipetten (einzeln verpackt).
g. Sterile 15 ml und 50 ml konische Zentrifugenröhrchen. h. Pipetten und sterile Spitzen.
i. Sterile Mikrozentrifugenröhrchen. j. Zellen in T75 Kolben: SKOV-3 (ATCC HTB77).
Vorgehensweise. Die folgende Vorgehensweise wurde verwendet, um den Weichagar-Test durchzuführen: Verfahren zur Herstellung der Grundschicht ;
1. Man habe alle Medien in einem 37°C Wasserbad aufgewärmt.
2. Um ein IX Testmedium + 0,8% Agar herzustellen: man mache eine 1:2 (Volumen:Volumen) Verdünnung von geschmolzenem Agar (auf 39°C abgekühlt) mit 2X Testmedium.
3. Man halte alle Medien mit Agar in dem 39°C Wasserbad warm, solange sie sieht verwendet werden.
4. Man verteilt 1 ml des IX Testmediums + 0.8% Agar in Schalen und schwenkt die Platte behutsam, um eine gleichmäßige Grundschicht auszubilden. Blasen sollten vermieden werden. 5. Man kühlt die Grundschicht zum Verfestigen ab (für ungefähr 20 Minuten). Die Grundschichten können über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt werden.
*. B. Vorgehensweise zum Sammeln der Zellen
1. Man nehme einen Kolben pro Zellinie aus dem Inkubator; 5 sauge das Medium ab, wasche einmal mit PBS und saugt ab, gebe 3 ml Trypsinlösung hinzu.
2. Nachdem alle Zellen von dem Kolben abgelöst sind, gebe
man 3 ml IX Testmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu inhibieren. Man pipettiert die Zellen auf und ab und überführt anschließend die Suspension in ein 15 ml Röhrchen.
3. Man bestimmt die Konzentration der Zellen unter
Verwendung eines Coulter Zählers und die Lebensfähigkeit durch Trypanblau Ausschluß.
4. Man nehme das geeignete Volumen, das nötig ist, um 3300 lebende Zellen pro Platte auszusäen und verdünne es auf 1,5 ml mit IX Testmedium.
C. Vorgehensweise zur Herstellung der oberen 0,4%
Aqaroseschicht:
1. Man füge die Verbindungen in TBST im Zweifachen der
gewünschten Test-Endkonzentration hinzu; + 1,5 ml Zellsuspension in IX Testmedium 10% FBS; + 1,5 ml IX Testmedium +0.8% Agarose: Gesamt = 3,0 ml IX Testmedium 10% FBS + 0,4% Agarose mit 3300 lebenden Zellen/ml, mit und ohne Verbindungen in TBST.
* (Hergestellt durch 1:2 Verdünnung von 2X Medium mit 1,6%
Agar 3 0 für die obige Vorgehensweise für die Grundschicht.) 2. Man platiere 1 ml der Testmischung auf dej: 1 ml Grundschicht aus. Die Duplikate werden aus 3 ml Volumen
ausplatiert.
■ .-'■ 3. Man inkubiere die Schalen für 2-3 Wochen in einem 100% befeuchteten, 10% CO2 Inkubator.
4. Kolonien, die 60 Mikrons und größer sind, werden als positiv bewertet.
2.2.2. Sulforhodamin B (SRB) Wachstumstests Die SRB-Tests können verwendet werden, um die Wirkungen der
Substanzen auf das Zellwachstum zu messen. Die Tests werden 0 wie folgt durchgeführt:
Test 1: 3T3/E/H+TGF-a(T) Zellwachstums SRB-Test Materialien·.
Sterile 96-Loch Platten mit flachem Boden Sterile 96-Loch Platten mit rundem Boden Sterile 25 ml oder 100 ml Reservoir
Pipetten, MuItikanal-Pipettierhilfe
Sterile Pipettenspitzen
Sterile 15 ml und 50 ml Röhrchen
Reagenzien: &iacgr;
0,4% SRB in 1% Essigsäure
10 mM Tris-Base
10% TCA
1% Essigsäure
Steriles DMSO (Sigma)
Verbindung in DMSO (100 mM oder geringere Stammlösung) 25% Trypsin-EDTA in Zell-Dissoziationslösung (Sigma) Zellinie und Nährmedium:
3T3/E/H+TGF-a(T) (NIH 3T3 Zellen des Klons 7, die EGF-R/HER2-Chimäre und TGF-a exprimieren, von Tumoren abstammende autokrine Loopzellen)
2% Kälberserum/DMEM + 2 mM Glutamin Protokoll:
Tag 0: Auspiatieren der Zellen: .
Dieser Teil des Testes wird in einer Bank mit laminaren Fluß durchgeführt.
1. Man behandle Zellen mit Trypsin wie üblich. Man
überführe 100 &mgr;&idiagr; der Zellsuspension in 10 ml Isoton. Man zähle die Zellen mit dem Coulter Zähler.
2. Man verdünne die Zellen in Nährmedium auf 60.000 Zellen/ml. Man überführe 100 &mgr;&idiagr; der Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch Platte mit flachem Boden, um 6.000 Zellen/Vertiefung zu erhalten.
3. Man verwende die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und Vierfach-Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung, einen Satz von 4 Vertiefungen für Mediumkontrollen und 4 Vertiefungen für die DMSO Kontrolle.
4. Man schüttle die Platten sanft, um eine gleichförmige Anheftung der Zellen zu ermöglichen.
5. Man inkubiere die Platten bei 37°C in einem 10% CO2 Inkubator.
Tag 1: Zugabe der Verbindung:
Dieser Teil des Versuchs wird in einer Arbeitsbank mit laminarem Fluß durchgeführt.
1. In einer 96-"Loch Platte mit rundem Boden gebe man 125 &mgr;&idiagr;
• ·
Nährmedium in die Spalten 3 bis 11. Diese Platte wird zur Titration der Verbindungen verwendet, jeweils 4 Reihen pro Verbindung.
2. In einem sterilen 15 ml Röhrchen setze man eine 2X
Lösung der höchsten Konzentration der Verbindung an, indem man 8 &mgr;&idiagr; der Verbindung zu einem Gesamtvolumen von 2 ml Nährmedium für eine Verdünnung von 1:250 hinzugibt. Bei dieser Verdünnung ist die Konzentration des DMSO 0,4% für eine 2X Lösung oder 0,2% für eine IX Lösung auf den Zellen. Die Ausgangskonzentration der Verbindung beträgt üblicherweise 100 &mgr;&tgr;&eegr;, jedoch kann diese Konzentration in Abhängigkeit von der Löslichkeit der Verbindung variieren,
3. Man überführe die 2X Ausgangslösung der Verbindung in Vierfach-Vertiefungen in Spalte 12 der 96-Lochplatte mit rundem Boden. Man mache serielle 1:2 Verdünnungen in der Platte von rechts nach links, indem 125 &mgr;&idiagr; von Spalte 12 nach Spalte 11, Spalte 11 zu 10 usw. überführt werden. Man transferiert 100 &mgr;&idiagr; der Verdünnungen der Verbindung in 10 0 /xl Medium auf Zellen in entsprechenden Vertiefungen der 96-Loch 0 Platte mit flachem Boden. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte 200 &mgr;&idiagr; betragen.
4. Für eine Lösungsmittelkontrolle stelle man eine 2X Lösung DMSO mit 0,4% DMSO im Nährmedium her. Man überführe 100 /xl der DMSO Lösung in die vorgesehenen Vertiefungen der Zellen. Die Endkonzentration von DMSO beträgt 0,2%.
5. Für die Vertiefungen der Mediumkontrolle füge man 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung des Nährmediums zu den vorgesehenen Vertiefungen der Zellen.
6. Man stellt die Platte in den Inkubator zurück und
0 inkubiert für 4 Tage.
Tag 5: Entwicklung des Tests
Dieser Teil des Testes wird auf der Laborbank durchgeführt.
1. Man sauge oder gieße das Medium ab. Man gebe 200 &mgr;&idiagr; kalte 10% TCA in jede Vertiefung, um die Zellen zu fixieren.
5 Man inkubiere die Platte für zumindest 6 0 Minuten bei 40C.
2. Man verwerfe die TCA und spüle die Vertiefungen fünfmal mit Wasser. Man trockne die Platten auf dem Kopf liegend auf
Papiertüchern.
3. Man färbe die Zellen mit 100 &mgr;&idiagr;/Vertiefung 0,4% SRB für 10 Minuten an.
4. Man gieße das SRB ab und spüle die Zellen fünfmal mit 1% Essigsäure. Man trockne die Platten auf dem Kopf liegend auf Papiertüchern vollständig.
5. Man löse den Farbstoff mit 100 &mgr;&idiagr;/Vertiefung 10 mM Tris-Base für 5-10 Minuten auf dem Schüttler auf.
6. Man liest die Platten auf einem Dynatech ELISA Plattenleser bei 570 nM mit Referenz zu 630 mM.
Test 2: 3T3/EGF-R+TGF-a(T) Zellwachstum SRB-Test
Materialien und Reagenzien sind dieselben wie in Test 1.
Zellinie und Nährmedium:
3T3/EGF-R+TGF-a(T) (NIH 3T3 Zellen des Klons I1 die den EGF-R und TGF-a exprimieren, von Tumoren abstammende autokrine Loopzellen)
2% Kälberserum/DMEM + 2 mM Glutamin
Protokoll:
Tag 0: Auspiatieren der Zellen:
Dieser Teil des Testes wird in einer Arbeitsbankj mit laminarem Fluß durchgeführt.
1. Man behandle die Zellen mit Trypsin wie üblich. Man
überführe 100 &mgr;&idiagr; der Zellsuspension zu 10 ml Isoton. Man zähle die Zellen mit dem Coulter Zähler.
2. Man verdünne Zellen in Nährmedium auf 60.000 Zellen/ml.
Man überführe 10 0 &mgr;&idiagr; Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch Platte mit flachem Boden, um 6.000 Zellen/Vertiefung zu erhalten.
3. Man verwende die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede 0 Verbindung und Vierfach-Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung, ein Satz von 4 Vertiefungen für die Mediumkontrolle und 4 Vertiefungen für die DMSO Kontrolle. -
4. Man schüttle die Platten sanft, um eine gleichmäßige Anheftung der Zellen zu ermöglichen.
5. Man inkubiere die Platten bei 37°C in einem 10% CO2 Inkubator.
Tag 1: Zugabe der Verbindung: wie in Test 1.
Tag 5: Entwicklung des Testes: wie in Test 1.
Test 3: 3T3/PD0F~ßR/PDGF-BB(T) Zellwachstum SRB-Test . ZeIlinie und Nährmedium:
3T3/PDGF-ßR/PDGF-BB(T) (NIH 3T3 Zellen des Klons 7, die den PDGF ß-Rezeptor und PDGF-BB exprimieren, aus Tumoren, die von athymischen Mäusen resektiert werden) 2% Kälberserum/DMEM + 2 mM Glutamin
Protokoll:
Tag 0: Auspiatieren der Zellen:
Dieser Teil des Tests wird in einer Arbeitsbank mit laminarem Fluß durchgeführt.
1. Man behandle die Zellen mit Trypsin wie üblich. Man überführe 200 &mgr;&idiagr; der Zellsuspension in 10 ml Isoton. Man zähle die Zellen in dem Coulter Zähler.
2. Man verdünne die Zellen in Nährmedium auf 60.000 Zellen/ml. Man überführe 100 &mgr;&idiagr; der Zellen in jede Vertiefung einer 96-Lochplatte mit flachem Boden, um 6.000 Zellen/Vertiefung zu erhalten.
3. Man läßt die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und Vierfach-Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung, einen Satz von 4 Vertiefungen für die Mediumkontrolle und 4 Vertiefungen für die DMSO Kontrolle.
4. Man schüttle die Platte sanft, um ein gleichförmiges Anheften der Zellen auf der Platte zu ermöglichen.
5. Man inkubiere die Platten bei 370C in einem 10% CO2 Inkubator.
Tag 1: Zugabe der Verbindung: wie in Test 1. Tag 5: Entwicklung des Testes: wie in Test 1.
Test 4: SRB Wachstums-Test mit menschlichen glatten Muskelzellen (SMC)
Materialien und Reagenzien wie in Test 1:
Ze'llinie und Nährmedium:
Humane aortische glatte Wachstumszellen (Clonetics) Clonetic Bullet Kit: Glattmuskel-Basalmedium (SmBM), das modifiziertes MCDB 131 ist, das fötales bovines Serum (5%), hFGF (2ng/ml), hEGF (0,1 ng/ml), Insulin (5,0 ug/ml),
Gentamicin (50 ug/ml) und Amphotericin B (50 ng/ml) enthält. Protokoll: ;
Tag 0: Auspiatieren der Zellen:
Dieser Teil des Testes wird in einer Arbeitsbank mit laminarem Fluß durchgeführt.
1. Man behandele die Zellen mit Trypsin wie üblich. Man überführe 200 &mgr;&idiagr; der Zellsuspension in 10 ml Isoton. Man zähle die Zellen in dem Coulter Zähler.
2. Man verdünne die Zellen in Nährmedium auf 20.00
Zellen/ml. Ma überführt 100 &mgr;&idiagr; der Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch Platte mit flachem Boden, um 2.000 Zellen/Vertiefung zu erhalten.
3. Man läßt die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und Vierfach-Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung, einen Satz von 4 Vertiefungen für die Mediumkontrolle und 4 Vertiefungen für die DMSO Kontrolle.
4. Man schüttle die Platten sanft, um ein gleichförmiges Anheften der Zellen auf der Platte zu ermöglichen.
5. Man inkubiere die Platten bei 37°C in einem 10% CO2 Inkubator. ;
Tag 1: Zugabe der Verbindung: wie in Test 1. . Tag 5: Entwicklung des Tests: wie in Test 1.
2.2.3. 3T3 Zellwachstumstest
Test 1: Test für den PDGF-induzierten Einbau von BrdU Materialien und Reagenzien:
(1) PDGF: humaner PDGF B/B; 1276-956, Boehringer Mannheim, Deutschland
(2) BrdU Markxerungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. 0 Nr. 1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig), Kat. Nr. . .1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4)' Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 64 7 22 9, Boehringer Mannheim, 5 Deutschland.
(5) TMB Substratlösung:
Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 647
• ·
229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung: IX PBS, pH 7,4, selbst angesetzt.
(7) Albumin, Bovin (BSA) : Fraktion V Pulver,· A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Protokoll:
(1) Engineerte 3T3 Zellinie: 3T3/EGFRC7.
(2) Die Zellen werden in 8.000 Zellen/Vertiefung in DMEM , 10% CS, 2 mM GIn in einer 96-Lochplatte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 370C in 5% CO2 inkubiert.
(3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden anschließend bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
(4) Am Tag 3 werden Ligand (PDGF =3,8 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA. Die Zellen der Positivkontrolle erhalten den Ligand (PDGF), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Ligand in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(5) Nach 2 0 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration - 10 &mgr;&Mgr;) für 1,5 Stunden inkubiert.
(6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf liegenden Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 4 5 Minuten auf einem 0 Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf liegenden Platte auf einem Pa'piertuch entfernt. Es wird Milch (5%ige entwässerte Milch in PBS, 200 &mgr;&idiagr;/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt
und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1:10 0 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(10) Es wird TMB-Substratlösung hinzugegeben (100 &mgr;,&Igr;/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
(11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
Test 2: Test des EGF-Induzierten BrdU-Einbaus Materialien und Reagenzien
(1) EGF: Maus EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd. Japan
(2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland • . ' (3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(5) TMB Substrat-Lösung:
Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung: IX PBS, pH 7,4, selbst angesetzt
(7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Puder; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Protokoll
(1) Engineerte 3T3 Zellinie: 3T3/EGFRc7
(2) Die Zellen werden mit 8.000 Zellen/Vertiefung in 10% CS, 2mM GIn in DMEM in einer 96-Loch Platte ausgesät. Die
Zellen werden über Nacht bei 370C in 5% CO2 inkubiert.
(3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
(4) Am Tag 3 werden Ligand (EGF = 2 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrollen erhalten den Liganden (EGF), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Liganden in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(5) Nach 20 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 &mgr;&Mgr;) für 1,5 Stunden inkubiert.
(6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch hinzugegeben (5% entwässerte Milch in PBS, 200 &mgr;&Igr;/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 3 0 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler 5 inkubiert.
(9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS
entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(10) Es wird TMB-Substratlösung hinzugegeben (100 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
(11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
Test 3: EGF-induzierter, Her2-gesteuerter Einbau von BrdU Materialien und Reagenzien:
(1) EGF: Maus EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd. Japan
(2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Ka t. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland
(3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) Kat. Nr. 64 7 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, 0 Deutschland.
(5) TMB Substrat-Lösung:
Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 • . ' 22 9, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung: IX PBS, pH 7,4, selbst angesetzt
. (7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Puder; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Protokoll:
(1) Engineerte 3T3 Zellinie: 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFR mit
einer Her2-Kinase Domäne)
(2) Die Zellen werden mit 8.000 Zellen/Vertiefung in 10% CS, 2mM Gin in DMEM in einer 96-Loch Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5% CO2 inkubiert.
(3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann bezüglich des Serums in serumfreietii Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
(4) Am Tag 3 werden Ligand (EGF = 2 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den
Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrollen erhalten den Liganden (EGF), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Liganden in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(5) Nach 2 0 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 &mgr;&Mgr;) für 1,5 Stunden inkubiert.
(6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 &mgr;, 1/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch hinzugegeben (5% entwässerte Milch in PBS, 200 &mgr;&Igr;/Vertiefung) als; Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 3 0 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
0 (9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(10) Es wird TMB Substratlösung hinzugegeben (10 0 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
(11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
5
Test 4: Test des IGFl-induzierten Einbaus von BrdU: Materialien und Reagenzien:
(1) IGFl Ligand: human, rekombinant; G511, Promega Corp., USA.
(2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. Nr. 1 647 22 9, Boehringer Mannheim, Deutschland
(3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) Kat. Nr. 1 S4 7 22 9, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(5) TMB Substrat-Lösung:
Tetramethylbenzidxn (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung: IX PBS, pH 7,4, selbst angesetzt
(7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Puder; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
- . Protokoll:
(1) Engineerte 3T3 Zellinie: 3T3/IGFlr.
(2) Die Zellen werden mit 8.000 Zellen/Vertiefung in 10% CS, 2mM GIn in DMEM in einer 96-Loch Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 370C in 5% CO2 inkubiert.
(3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
(4) Am Tag 3 werden Ligand (IGF =3.3 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Ze'llen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrollen erhalten den Liganden (IGF), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Liganden in einer 96-Loch Platte angesetzt und
seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(5) Nach 16 Stünden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 &mgr;&Mgr;) für 1,5 Stunden inkubiert.
(6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 ^l/Vertiefung) iind die Platten werden bei Raumtemperatur für 4 5 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch hinzugegeben (5% entwässerte Milch in PBS, 200 &mgr;&Igr;/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 3 0 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt 0 und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewasghen. Es wird
Anti-BrdU-POD Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 /zl/Vertiefung) und die Platte wird für 90 ■ . Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspulen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(10) Es wird TMB-Substratlösung hinzugegeben (100
&mgr;&Igr;/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
(11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
Test 5: Test zum Insulin induzierten Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:
(1) Insulin: kristallin, bovin, Zink; 13007, Gibco BRL, USA
(2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland
(3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) Kat. Nr. 647 22 9, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(5) TMB Substrat-Lösung:
Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung.· IX PBS, pH 7,4, selbst angesetzt
(7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Puder; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
Protokoll:
(1) Engineerte 3T3 Zellinie: H25
(2) Die Zellen werden mit 8.000 Zellen/Vertiefung in 10% CS, 2mM Gin in DMEM in einer 96-Loch Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5% CO2 inkubiert.
(3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
(4) Am Tag 3 werden Ligand (Insulin = 10 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrollen erhalten den Liganden (Insulin), aber keine 0 Testverbindung. Die Testverbindungen sind in serumfreiem DMEM mit Liganden in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(5) Nach 16 Stunden Ligaradenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 &mgr;&Mgr;) für 1,5 Stunden inkubiert.
(6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das
Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch hinzugegeben (5% entwässerte Milch in PBS, 200 &mgr;&Igr;/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 3 0 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 &mgr;.1/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch
Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(10) TMB Substratlösung wird hinzugegeben (10 0 &mgr;&Igr;/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
(11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
2.2.4. HUV-EC-C-Test
Das folgende Protokoll kann ebenfalls zur Messung der Aktivität einer Verbindung verwendet werden: Tag 0
1. Man wäscht und behandelt HUV-EC-C Zellen (humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen, (American Type Culture Collection; Katalog Nr. 1730' CRL)) mit Trypsin. Man wasche mit
Dulbecco's phosphatgepufferten Salin (D-PBS, erhalten von Gibco BRL, Katalog· Nr. 14190-029) zweimal mit ungefähr 1 ml/10 cm2 des Gewebekulturkolbens. Man behandle mit Trypsin mittels 0,05% Trypsin-EDTA in nicht-enzymatischer Zelldissoziations-Lösung (Sigma Chemical Company; Katalog Nr. C-1544). Das 0,05% Trypsin wurde durch Verdünnen von 0,25% Trypsin/1 mM EDTA (Gibco; Katalognr. 25200-049) in der Zelldissoziations-Lösung hergestellt. Man behandle mit Trypsin mit ungefähr 1 ml/25-30 cm2 Gewebekulturkolben für ungefähr 5 Minuten bei 37°C. Nachdem die Zellen sich von dem Kolben losgelöst haben, gebe man ein gleiches Volumen Testmedium hinzu und überführt.in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen (Fisher Scientific; Katalognr. 05-539-6).
2. Man wasche die Zellen mit ungefähr 35 ml Testmedium in dem 50 ml sterilen Zentrifugenröhrchen durch Zugabe des Testmediums, zentrifugiert für 10 Minuten bei ungefähr 200 &khgr; g, saugt den Überstand ab und resuspendiert mit 35 ml D-PBS. Man wiederhole das Waschen weitere zweimal mit D-PBS, resuspendiert die Zellen in ungefähr 1 ml Testmedium/ 15 cm2 0 Gewebekulturkolben. Das Testmedium besteht aus FJ.2K Medium (Gibco BRL; Katalog Nr. 21127-014) + 0,5% hitzeinaktiviertem fötalem bovinen Serum. Man zählt die Zellen mit einem Coulter Counter® &ngr; (Coulter Electronics, Inc.) und gibt Testmedium zu den Zellen, um eine Konzentration von 0,8-1,0 &khgr; &Igr;&Ogr;5 Zellen/ml zu erhalten.
3. Man gibt Zellen zu den 96-Loch Platten mit flachem Boden mit 100 &mgr;&Igr;/Vertiefung oder 0,8-1,0 &khgr; 104 Zellen/Vertiefung,-inkubiert für ungefähr 24 Stunden bei 37°C, 5% CO2.
Tag 1
1. Man mache zweifache Titrationen des Wirkstoffs in separaten 96-Loch Platten, üblicherweise 50 &mgr;&Mgr; bis hinunter zu 0 &mgr;&Mgr;. Man verwendet dasselbe Testmedium wie oben für Tag 0, Schritt 2 erwähnt. Die Titrationen werden durch Zugabe von 90 &mgr;&Igr;/Vertiefung des Wirkstoffs bei 200 &mgr;&Mgr; (4 &khgr; die 5 Endkonzentration der Vertiefung) zu der obersten Vertiefung einer ausgewählten Spalte der Platte gemacht. Da die Konzentration des Wirkstoffs in der Stammlösung üblicherweise
20 &pgr;&igr;&Mgr; in DMSO beträgt, enthält die 200 &mgr;&Mgr; Konzentration des Wirkstoffs 2% DMSO;.
Daher wird eine Verdünnung bis auf 2% DMSO im Testmedium (F12K + 0,5% fötales bovines Serum) als Verdünnung für die Wirkstofftitrationen verwendet, um den Wirkstoff zu verdünnen, die DMSO Konzentration jedoch konstant zu halten. Dieses Verdünnungsmittel gebe man zu den verbleibenden Vertiefungen in der Spalte mit 60 &mgr;&Igr;/Vertiefung. Man nehme 60 &mgr;&idiagr; aus den 12 0 &mgr;&idiagr; der 200 &mgr;&Mgr; WirkstoffVerdünnung in der obersten Vertiefung der Spalte und mischt mit den 60 &mgr;&idiagr; in der zweiten Vertiefung der Spalte. Man nehme 60 &mgr;&idiagr; dieser Vertiefung und mischt mit den 60 &mgr;&idiagr; in der dritten Vertiefung der Spalte u.s.w. bis Zweifachtitrationen vollständig sind. Wenn die vorletzte Vertiefung gemischt wird, nimmt man 60 &mgr;&idiagr; der 120 &mgr;&idiagr; in dieser Vertiefung und verwirft sie. Die letzte Vertiefung mit 6 0 &mgr;&idiagr; der DMSO/Mediumverdünnung beläßt man als Kontrolle, die keinen Wirkstoff enthält. Man macht 9 Spalten des titrierten Wirkstoffs, ausreichend für Dreifach-Vertiefungen jeweils von 1) VEGF (erhalten von Pepro Tech Inc., Katalog-Nr.
100-200,- 2) endothelialen Zeilwachstumsfaktor (EpGF)
(ebenfalls bekannt als saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor . oder aFGF) (erhalten von Boehringer Mannheim Biochemica, Katalognr. 143 9 600) und eine Testmediumkontrolle. ECGF wird als eine Präparation mit Natriumheparin geliefert.
2. Man überführt 50 &mgr;&Igr;/Vertiefung der WirkstoffVerdünnungen zu den 96-Loch Testplatten, die 0,8-1,0 &khgr; 104 Zellen/100 &mgr;&Igr;/Vertiefung der HUV-EC-C Zellen aus Tag 0 enthalten, und inkubiert ungefähr 2 Stunden bei 37°C, 5% CO2.
3. Man fügt dreifach 50 &mgr;&Igr;/Vertiefung von 80 &mgr;g/ml VEGF, 0 ng/ml ECGF, oder Mediumkontrolle zu jeder Wirkstoffbedingung. Wie für die Wirkstoffe betragen die
Wachstumsfaktorkonzentrationen 4X die gewünschte Endkonzentration. Man verwendet die Testmedien von Tag 0, Schritt 2, um die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren· 5 herzustellen. Man inkubiert ungefähr für 24 Stunden bei 37°C, 5% CO2. Jede Vertiefung weist 50 &mgr;&idiagr; WirkstoffVerdünnung, 50 &mgr;&idiagr; Wachstumsfaktor oder Medium und 10 0 &mgr;&idiagr; Zellen auf = 200
&mgr;&Igr;/Vertiefung insgesamt. Daher werden aus den 4X Konzentrationen der Wirkstoffe und Wachstumsfaktoren IX, sobald alles in die Vertiefungen hinzugegeben wurde. Tag 2
1. Man gebe hinzu 3H-Thymidin (Amersham; Katalognr. TRK-686) mit 1 &mgr;&thgr;&khgr;/ Vertiefung (10 &mgr;&Igr;/Vertiefung einer 100 &mgr;&Ogr; Lösung, hergestellt in RPMI Medium + 10% hitzeinaktiviertem fötalen bovinen Serum) und inkubiert ungefähr 24 Stunden bei 3 70C, 5% CO2. Man beachte: 3H-Thymidin wird in RPMI Medium angesetzt, da alle anderen Anwendungen für die wir das 3H-Thymidin verwenden, Experimente einschließen, die in RPMI durchgeführt werden. Der Unterschied im Medium bei diesem Schritt ist vermutlich nicht signifikant. RPMI wurde von Gibco BRL erhalten, Katalognr. 11875-051.
Tag 3
1. Man friert die Platten über Nacht bei -200C ein. Tag 4
1. Man taut die Platten auf und erntet mit einem 96-Loch Plattenernter (Tomtec Harvester 96{R)) auf Filtermatten (Wallac; Katalog Nr. 1205-401) ; liest die Counts mit eineji Wallac Betaplate (TM> Flüssigkeits-Szintillationszähler.
2.2.5. zellulärer PDGF-R Test
Der zelluläre PDGF Kinasetest wurde wie folgt durchgeführt.
Die Zellen wurden in 0,2 M Hepes, 0,15 M NaCl7 10% V/V Glycerin, 0,04% Triton X-100, 5 mM EDTA, 5 mM Natriumvanadat und 2 mM Na-pyrophosphat lysiert; Die Zellysate wurden anschließend in eine ELISA Platte gegeben, die mit einem Anti-PDGF-Rezeptorantikörper (Genzyme) beschichtet war; ELISA Platten wurden mit 0,5 ^m Antikörper/Vertiefung in 150 &mgr;&idiagr; PBS für 18 Stunden bei 40C vor der Zugabe des Lysates beschichtet; das Lysat wird in den beschichteten Platten für eine Stune irikubiert und anschließend viermal in TBST (35 mM Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton XlOO); ein Anti-pliosphotyrosin-5 Antikörper (100 &mgr;&idiagr; in PBS) wird hinzugegeben und die Mischung wird für 3 0 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; die Vertiefungen werden anschließend viermal in TBST gewaschen,
ein Zweitantikörper, konjugiert mit POD (TAGO) wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben, und die behandelten Vertiefungen
werden für 3 0 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Vertiefungen werden anschließend viermal in TBST gewaschen; ABTS/H2O2 Lösung wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Vertiefungen werden für 2 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Absorption bei 410 mM gemessen.
2.2.6. Experimentelle Ergebnisse der Zellwachstumstests Ergebnisse, die für zahlreiche Verbindungen in den oben beschriebenen Tests erhalten wurden, sind in den folgenden
Tabellen dargestellt:
Tabelle 2
Mitogenese in Endothelzellen
Einbau von £3H] Thymidin
Verbindung"
(Beispiel)		 KUV-EC Test
VEGr (&mgr;«) a-FGF (pK)		 2.5 153.8
27 1.1 5217 I S.£ 6.0
IB 0.2 3.4
16 €.6 35.7
17 4.8 35.8
4796 30.7
20 43.2
21 19.9 45.2
22 2.5 4.6
23 1.6
24 14.8 3.7
2S 3.4 19.3
25 25.6 13.0
23 S.O 16.3
29 34.3 1.4
30 1.0 4.9
32 4.4
£ 0.6 27.3
33 -46.1 25.S
5 0.8 2.3
5201 2.5 0.7
3ä 2.3 11.S
37 i 5.1 i30 ■ j
33 10 . 5
Verbindung
(Beispiel)		 HUV-EC Test
VEGF (&mgr;&Mgr;) a-FGF (&mgr;&Kgr;)		 2.7
41 2.4
S 2.2 • 2.0
42 <o.s 31.1
9 <0.8 0.6
44 0.9
10 <0.8 35.5
45 39.8 22.7
11 <O. 8
5409 26.0
12 <0.8 40
48 &bull; -13.6
13 0.7
50 11.4
14 2.5
15 5.7
5429 " 27.6 0.14
59 0.16 · 33.0
60 39.8 30.0
61 1.2 3.4
63 3.8 20
64 20 <0.07·
68 <0.07 0.8
69 0.5 7.9
70 0.14 12.9.
71 3.8 3.2
73 1.3 S.7
74 0.54 5.0-
76 2.0 14.1
77 1.2 37.S
SI 0 .05
84
Verbindung
(Beispiel)		 7 HUV-EC Test
VEGF (&mgr;&Mgr;) a-FGF (&mgr;&Kgr;)
1.2 3.8
Tabelle 3
Mitogenese in 3T3/EGFR Zellen BrdU-Einbau
COMPOUIfD
(Example) 		PDGFR
PDGF Iiigand
IC50 (JiM) 		FGFR
FGF Ligand
IC50 (jiM) 		EGFR
EGF Ligand
IC50 (JiM) 		■
27 75
4313 6 5.5 5.5
IB 2.5 100
29 9 4.9 60
4 3 10. 20
5402 50 ■ 40 23
36 3 25 95
10 S.2 50
45 7.5 70 17
12 2.8 ' 70
61 30 16 28
5463 54
71 70 60 43
5465 40 25
73 18 15
74 8
5469 4 15
77 4 50
ai 6.5 9
Tabelle 4
Zeilwachstumstest für verschiedene Zellinien
SRB-Auswertung
Verbindung
(Beispiel)		 3T3/E/E+
TGF-a(T)
ICSO (&mgr;&Kgr;) 		3T3/EGFR+
IGT-Z. (T)
IC5 0 (JiK)		 3T3/PDGPK+
PDGF(T)
1C5 0 (&mgr;&Kgr;) 		SHC
IC5 0 (&mgr;&Kgr;)
27 36
4313 32 10.7 * s.&egr;
IB 78 10
5 22.2
3T3/E/H+TGF-a(T): NIH 3T3 Zellen, die EGFR/HER2-Chimäre und TGF-a exprimieren, von Tumoren abstammend
3T3/EGFR+TGF-a(T): NIH 3T3 Zellen, die EGFR und TGF-a exprimieren, von Tumoren abstammend
3T3/PDGFR+PDgF(T): NIH 3T3 Zellen, die PDGF-ßR und PDGF-ßß exprimieren, von Tumoren abstammend
SMC: humane glatte Muskelzellen von Clonetics 2.3. Messung der Zelltoxizität
■■■. Therapeutische Verbindungen sollten hinsichtlich der
" Inhibition der Rezeptor-Tyrosinkinaseaktivität wirksamer sein als bei der Ausübung eines cytotoxischen Effekts. Eine Messung der Wirksamkeit und Zelltoxizität einer Verbindung kann durch die Bestimmung des therapeutische Index: IC50/LD50 erhalten werden. IC50, die Dosis, die erforderlich ist, um 50% Inhibition zu erreichen, kann unter Verwendung von 0 Standardtechniken wie den hier beschriebenen, gemessen werden. LD50, die Dosis, die zu 50% Toxizität führt, kann ebenfalls durch Standardtechniken (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods,
6&Xgr;?: 55-63) , durch Messung der Menge des freigesetzten LDH (Korzeniewski und Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods
6j4:313; Decker und Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods 115:61), oder durch Messung der letalen Dosis in Tiermodellen gemessen werden. Verbindungen mit einem großen therapeutischen
5·|
Index sind bevorzugt. Der therapeutische Index sollte größer als 2, vorzugsweise zumindest 10, am bevorzugtesten zumindest 50 betragen.
2.3. In Vivo Tiermodelle
2.3.1. Heterotransplantat-Tiermodelle
Die Fähigkeit menschlicher Tumore als Heterotransplantat in athymischen Mäusen (z.B. Balb/c, nu/nu) zu wachsen, bietet ein nützliches in vivo Modell zum Studium der biologischen Antwort auf Therapien für menschliche Tumore. Seit der ersten erfolgreichen Heterotransplantation von menschlichen Tumoren in athymische Mäuse (Rygaard und Povlsen, 1969, Acta Pathol.
Microbial. Scand. 22:758-760} sind viele verschiedene
menschliche Tumorzellinien (z.B. Brust-, Lungen-, Urogenital-, Gastrointestinal-, Kopf- und Nacken-, Glioblastome-, Knochen- und maligne Melanome) transplantiert und erfolgreich in Nacktmäusen kultiviert worden. Menschliche Brust-Tumorzellinien, einschließlich MCF-7, ZR-75-1 und MDA-MB-231 sind als subkutane Heterotransplantate in Nacktmäusen etabliert worden (Warri et al., 1991, Int. J. Cancer 49:616-
623; Ozello and Sordat 1980, Eur. J. Cancer 16:553-559;
Osborne et al., 1985, Cancer Res. A5_: 584-590; Seibert et al., 1983, Cancer Res. 43.: 2223-2239) .
Test l: HER2/Heterotransplantat-Tiermodell Um die Wirkung von Kandidaten von Antitumormitteln auf HER2 exprimierende Tumore zu studieren, sollten die Tumorzellen in der Lage sein, in Abwesenheit von supplementiertem Östrogen zu wachsen. Viele Brustzellinien sind von Östrogen für das in vivo Wachstum in Nacktmäusen abhängig (Osborne et al., supra), exogenes Östrogen unterdrückt jedoch die HER2 Expression in Nacktmäusen (Warri et al., supra, Dati et al., 1990, Oncogene 5.rlOOl-1006) . Zum Beispiel wachsen MCF-7, ZR-75-1 und T47D Zellen in der Gegenwart von Östrogen gut in vivo, exprimieren jedoch sehr niedrige Level von HER2 (Warri et al., supra, Dati et al., supra).
Es kann die folgende Art Heterotransplantat-Protokoll
* ··· it
verwendet werden:
1) Man implantiere Tumorzellen (subkutan) in die Hinterflanke von 5 bis 6 Wochen alten weiblichen Balb/c, nu/nu athymischen Mäusen;
2) verabreicht die Antitumorverbindung;
3) mißt den Tumorwachstum durch Messung des Tumorvolumens. Die Tumore können ebenfalls auf die Anwesenheit eines Rezeptors wie HER2, EGF oder PDGF durch Western und immunhistochemische Analysen untersucht werden. Unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken kann der Fachmann die obigen Prozeduren abändern, z.B. durch den Einsatz eines anderen Behandlungsplanes. Test 2: FLK-l/Heterotransplantatmodell
Es wurde die Fähigkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung untersucht, Ovar-, Melanom-, Prostata-·, Lungen- und Brusttumorzellinien, die als SC Heterotransplantate etabliert sind, zu inhibieren. Diese Studien wurden unter Verwendung von Dosen im Bereich von 1 bis 75 mg/kg/Tag durchgeführt.
Materialien und Methoden. Die Tumorzellen wurden subkutan in die angegebenen Mausstämme implantiert. Die Behandlung
wurde am Tag 1 nach der Implantation begonnen, soweit nicht anders angegeben (z.B. Behandlung der SCID Maus, die die A375 &bull; . Melanomzellinie betrifft, begann an Tag 9). Acht (8) bis sechzehn (16) Mäuse umfaßte jede Testgruppe. Spezifisch:
Tiere: Weibliche athymische Mäuse (BALB/c, nu/nu), BALB/c Mäuse, Wistar Ratten und Fisher 344 Ratten wurden von Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) erhalten. Weibliche A/I Mäuse wurden von Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. DA Ratten 0 wurden von B&K Universal, Inc. (Fremont, CA) erhalten.
Athymische R/Nu Ratten, DBA/2N Mäuse und BALB/c Mäuse wurden von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) erhalten. We'ibliche C57BL/6 Mäuse wurden von Taconic (Germantown, NY) erhalten. Alle Tiere wurden unter Reinraumbedingungen in Mikro-Isolatorkäfigen mit alpha-Trockenstreu gehalten. Sie erhielten steriles Nagetierfutter und Wasser ad libitum.
Alle Prozeduren wurde gemäß den NIH-Richtlinien zur Pflege
und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
Subkutane Heterotransplantatmodelle. Zellinien wurden in geeigneten Medium, wie beschrieben, kultiviert (siehe Abschnitt 6). Die Zellen wurden bei oder nahe bei Konfluenz mit 0,05% Trypsin-EDTA geerntet und bei 450 &khgr; g für 10 Minuten pelletiert. Die Pellets wurden in sterilem PBS oder Medium (ohne FBS) zu einer geeigneten Konzentration, wie in den Legenden der Figuren angegeben, resuspendiert und die Zellen wurden in die Hinterflanke von Mäusen implantiert. Das Tumorwachstum wurde für 3 bis 6 Wochen unter Verwendung von Vinier Schieblehren gemessen und die Tumorvolumina wurden, solange nicht anders angegeben, als Produkt von Länge &khgr; Breite &khgr; Höhe berechnet. P-Werte wurden unter Verwendung des Students-T-Tests berechnet. Die Verbindung in 50-100 &mgr;&idiagr; Träger (Dimethylsulfoxid, PBTE, PBTE6C.-D5W oder PBTE:D5W) wurde durch IP-Injektion in den Konzentrationen, die den Legenden der Figuren angegeben sind, verabreicht.
Intracerebrale Heterotransplantatmodelle. Für das Maus IC Modell wurden Ratten C6 Glioma Zellen geerntet und in sterilem PBS in einer Konzentration von 2,5 &khgr; 107 Zellen/njl suspendiert und auf Eis gestellt. Die Zellen wurden auf die folgende Artin BALB/c, nu/nu Mäuse implantiert: Die frontoparietale &bull; - Kopfhaut der Mäuse wurde mit Tierschermaschinen rasiert, wenn notwendig; vor dem Abtupfen mit 70%igem Ethanol. Die Tiere wurden mit Isofluoran betäubt und die Nadel wurde durch den Schädel in die linke Hemisphäre des Gehirns eingeführt. Die Zellen wurden mit gasdichten Hamilton Spritzen unter Verwendung von 30 ga 1/2 Inch Nadeln, die mit Muffen versehen waren, die nur eine 3 mm Penetration zuließen, verteilt. Ein 0 Mehrmalsverteiler wurde für die genaue Verabreichung von 4 &mgr;&idiagr; Zellsuspension verwendet. Die Tiere wurden täglich auf ihr Wohlbefinden überwacht und wurden geopfert, wenn sie einen Gewichtsverlust von ungefähr 4 0% aufwiesen und/oder neurologische Sympthome zeigten..
5 Für das Ratten IC Modell wurden Ratten (Wistar, Sprague Dawley, Fisher 344, oder athymische R/Nu; ungefähr 200-400 g (einige 3-400 g) durch eine IP Injektion von 100 mg/kg Ketaset
(Ketaminhydrochlorid; Aveco, Fort Dodge, Iowa) und 5 mg/kg Rompun (Xylazin, 2% Lösung; Bayer, Deutschland) betäubt. Nach dem Einsetzen der Betäubung wurde die Kopfhaut rasiert und das Tier wurde in einer stereotaxischen Apparatur (Stoelting, Wood Dale, IL) orientiert. Die Haut an der Einschnittstelle wurde dreimal durch abwechselndes Betupfen mit 70% Ethanol und 10% Povidon-Iod gereinigt. Ein medianer 1,0-1,5 cm Schnitt wurde in der Kopfhaut unter Verwendung einer sterilen Operationsklinge gemacht. Die Haut wurde leicht abgelöst und auf die Seiten geschoben, um die Suturen auf der Schädeloberfläche freizusetzen. Ein Zahnbohrer (Stoelting, Wood Dale, IL) wurde verwendet, um ein kleines (1-2 mm Durchmesser) Bohrloch im Schädel ungefähr 1 mm vor und 2 mm lateral zum Bregma zu machen. Die Zellsuspension wurde in eine 50 &mgr;&idiagr; Hamiltonspritze aufgezogen, die mit einer 23 oder 25 ga abgeschrägten Standardnadel versehen, war. Die Spritze wurde in dem Bohrloch auf der Höhe der Arachnoidea orientiert und abgesenkt, bis sich die Spitze der.Nadel 3 mm tief in der Gehirnstruktur befand, wo die Zellsuspension langsam injiziert wurde. Nachdem die Zellen injiziert waren, wurde;die Nadel für 1-2 Minuten in dem Bohrloch belassen, um eine vollständige Verabreichung der Zellen zu ermöglichen. Der Schädel wurde gereinigt und die Haut wurde mit 2 bis 3 Nähten geschlossen. Die Tiere wurden auf die Erholung von dem Eingriff und der Betäubung beobachtet. Während des Experiments wurden die Tiere zumindest zweimal am Tag bezüglich Entwicklung von Symthomen, die mit dem Fortschreiten von intracerebralen Tumoren verbunden sind, beobachtet. Tiere, die fortgeschrittene Symptome zeigten (Neigung, Verlust des Gleichgewichtes, 0 Entwässerung, Verlust des Appetits, Koordinationsverlust, Beendigung von Körperpflegeaktivitäten, und/oder signifikanten Gewichtsverlust) wurden human geopfert und die interessierenden Organe und Gewebe wurden entnommen.
Intraperitonales Modell. Die Zellinien wurden in den geeigneten Medien kultiviert. Die Zellen wurden geerntet und in sterilem PBS oder Medium ohne FBS gewaschen, zu einer geeigneten Konzentration resuspendiert und in die IP-Kavität
von Mäusen des geeigneten Stammes injiziert. Die Mäuse wurden täglich auf das Auftreten von Ascitesbildung beobachtet. Einzelne Tiere wurden geopfert, wenn sie einen Gewichtszuwachs von 4 0% zeigten oder wenn die Belastung des IP Tumors begann, dem Tier übermäßige Belastung oder Schmerzen zu bereiten. 2.3.2. VEGF Küaelchen In Vivo Modell In dem folgenden Beispiel wurde das Kügelchen-Modell verwendet, um die Aktivität einer Verbindung gegen den FLK-I Rezeptor und gegen Störungen, die mit der Bildung von Blutgefäßen assoziiert sind, zu überprüfen. In diesem Modell wird VEGF in ein Kügelchen mit zeitverzögerter Abgabe eingebettet und subkutan in den Abdomen von nackten Mäusen implantiert, um eine "Rötungs"- Antwort und nachfolgendes Anschwellen um das Kügelchen herum zu induzieren. Potentielle FLK-I Inhibitoren können anschließend in Methylcellulose nahe dem VEGF Kügelchen implantiert werden, um zu bestimmen, ob ein solcher Inhibitor verwendet werden kann, um die "Rötungs"-Antwort und das nachfolgende Anschwellen zu inhibieren. Materialien und Methoden. Es wurden die folgenden
0 Materialien verwendet: ;
1) VEGF- humanes rekombinantes lyophilisiertes Produkt ist kommerziell erhältlich und kann von Peprotech, Inc., Princeton . Business Park, G2; P.O. Box 275, Rocky Hill, NJ 08553 bezogen werden.
2) VEGF, das in Kügelchen mit 21-tägiger Abgabe eingebettet ist, wurde erhalten von Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3 3 61 Executive Parkway, P.O. Box 2746, Toledo, Ohio 43606) unter Verwendung eines patentierten matrixgesteuerten Freisetzungssystem. Die 0 Kügelchen wurden mit 0,20, 0,21 oder 2,2 /zg VEGF/Kügelchen
verpackt. Diese Dosierungen nähern eine Freisetzung von VEGF von 10 und 100 ng/Tag an.
*. 3) Methylcellulose
4) Wasser (steril)
5) Methanol
6) geeignete Wirkstoffe/Inhibitoren
7) 10 cm Kulturplatten
8) Parafilm
Das folgende Protokoll wurde anschließend befolgt, um das VEGF Kugelchenmodell auszuführen:
1) VEGF, bezogen von Peprotech, wurde zu Innovative Research für- die Maßanfertigung der Kügelchen geschickt;
2) Methylcellulose wurde mit 1,5% (w/v) in sterilem Wasser angesetzt;
3) Wirkstoffe wurden in Methanol gelöst (üblicher Konzentrationsbereich = 10 bis 2 0 mg/ml);
4) Sterilen Parafilm legt man in sterile 10 cm Platten;
5) 150 &mgr;&idiagr; des Wirkstoffs in Methanol werden zu 1,35 ml 1,5% Mehylcellulose hinzugegeben und sorgfältig gemischt/gevortext;
6) 25 &mgr;&idiagr; Proben des Homogenats werden auf Parafilm gesetzt und zu Scheiben getrocknet;
7) Mäuse (6-10 Wochen Balb/C athymische nu/nu, weiblich) wurden durch Isofluran-Inhalation betäubt;
8) VEGF Kügelchen und Methylcellulosescheiben wurden subkutan in den Abdomen implantiert und 9). Mäuse wurden nach 24 Stunden und 48 Stunden auf Rötung und Schwellungsantwort beurteilt. j
Der spezielle experimentelle Aufbau, der in diesem Beispiel verwendet wurde war;
N = 4 Tiere/Gruppe
Kontrollen: VEGF Kügelchen + Wirkstoffplacebo VEGF Placebo + Wirkstoffkügelchen
Experimentelle Ergebnisse. Es wird angenommen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Aktivität gemäß diesem Assay zeigen.
2.3.3. Das Brustfettkissenmodell
0 Aufgrund der anerkannten Rolle, die viele der RTKs, z.B. dem HER2 Rezeptor bei Brustkrebs spielt, ist das Brustfettkissenmodell besonders geeignet, um die Wirksamkeit von Verbindungen, die solche RTKs inhibieren, zu messen. Indem Tumorzellen direkt in die interessierende Stelle implantiert werden, spiegeln in situ Modelle die Biologie der Tumorentwicklung genauer wieder als dies subkutane Modelle tun. Humane Brust-Zellinien, einschließlich MCF-7, sind in den
Fettkissen veh Brust at&Igr;&igr;&ggr;&igr;&tgr;&rgr;;scher Mäusen kultJTilTr-te worden.-Shafie und Grantham, 1981, Na ti. Cancer Ins tit. .67.: 51-5 6;
Gottardis et al.,. 1988, «J. Steroid Biochem. 3 0: 3.1.1-314.
Insbesondere kann die folgende Vorgehensweise verwendet werden, um den inhibitorischen Effekt einer Verbindung gegenüber dem HER2 Rezeptor zu messen:
1) Man implantiere bei verschiedenen Konzentrationen MDA-MB-231 und MCF-7 Zellen, die mit HER-2 transfektiert worden sind, in die Zusatzfettkissen der Brustdrüse von weiblichen athymischen Mäusen;
2) verabreiche die Verbindung; und
3) mißt den Tumorwachstum zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Tumo'fe können ebenfäTl-s&mdash;auf die Anwesenheit eines
Rezeptors wie HER-2 durch Western und immunohistochemische Analysen untersucht werden. Unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken kann der Fachmann die obigen Verfahrensweisen abändern, zum Beispiel durch die Verwendung von unterschiedlichen Behandlungsplänen. 2.3.4. Tumorinvasionsmodell
0 Das folgende Tumorinvasionsmodell ist entwickelt worden und
kann für die Auswertung des therapeutischen Werts und die .. Wirksamkeit der Verbindungen, für die gefunden wurde, dass sie - den KDR/FLK-1 Rezeptor selektiv inhibieren, verwendet werden.
2.3.4.1. Vorgehensweise
8 Wochen alte Nacktmäuse (weiblich) (Simonson Inc.) wurden als Versuchstiere verwendet. Die Implantation von Tumorzellen wurde in einer Arbeitsbank unter laminarem Fluss durchgeführt. Für die Betäubung wird ein Xylazin/Ketamincocktail (100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg) intraperitonal verabreicht. Es wird ein 0 Mittellinienschnitt gesetzt, um den Bauchraum (ungefähr auf einer Länge von 1,5 cm) freizusetzen, um 107 Tumorzellen in e^nem Volumen von 100 &mgr;&idiagr; Medium zu injizieren. Die Zellen .weirden entweder in den Duodenal lappen des Pankreas oder unter die Serosa des Darms injiziert. Die Bauchhöhle und die Muskeln 5 werden mit einer- 6-0 durchgehenden Seidennaht verschlossen und die Haut wurde unter Verwendung von Wundklammern geschlossen. Die Tiere wurde täglich beobachtet.
&bull; *
I » · 111 ·
93
2.3.4.2. Analyse
Nach 2-6 Wochen, in Abhängigkeit von den groben Beobachtungen der Tiere wurden die Mäuse geopfert und es werden die lokalen Tumormetastasen in verschiedenen Organen (Lunge, Leber, Gehirn, Magen, Milz, Herz, Muskel) ausgeschnitten und analysiert (Messung von Tumorgröße, Grad der Invasion, Immunchemie und in situ Hybridisierung).
2.3.5. Ergebnisse
Die Ergebnisse für zahlreiche Verbindungen, die in den oben beschriebenen in vivo Versuchen erhalten wurden, sind in Tabelle 5 unten dargestellt:
Tabelle 5 In vivo Daten
"Verbindung
(Beispiel) > 		&bull; 22 EpH4-VEGF
% Inhibition bei mg/kg
27 4942 56% g 75
12 50% § 75
63% g 50
42% &euro; 75
14 42% e 50/50
<6k % 50
47% 8 25
15 50% # 25
57% &bgr; 37.5/37.5
45% §'50 ·
65% £ 50
47% @ 50
&bull;65% g 50

Claims (6)

1. Eine Verbindung der Formel:


und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wobei:
R1 H ist;
R2 O oder S ist;
R3 Wasserstoff ist;
R4, R5, R6 und R7 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt werden, aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO2NRR', SO3R, SR, NO2, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2)nCO2R, und CONRR' besteht;
A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Thiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3- Oxadiazol, 1,2,4-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4- Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazol und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO2NRR' SO3R, SR, NO2, NRR' OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2)nCO2R und CONRR' besteht;
n 0-3 ist;
R H, Alkyl oder Aryl ist und R' H, Alkyl oder Aryl ist, mit der Maßgabe, dass die folgenden Verbindungen ausgenommen sind:
3-(Pyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon;
3-(5-Chlor-3,4-dimethylpyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon;
3-(3,5-Dimethyl-4-ethylpyrrol-2-yl)-2-indolinon;
3-(3,5-Dimethyl-4-ethoxycarbonylpyrrol-2-yl)-2-indolinon;
Benzoesäure, 2-[[[1-Ethyl-2,3-dihydro-2-oxo-3-(1H-pyrrol-2- ylmethylen)-1H-indol-5-yl]oxy]methyl]-;
3-[(1-Methyl-5-nitro-imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
3-(Thien-2-ylmethylen)-2-indolinon;
1H-Indol-7-essigsäure, 3-[(2-butyl-1H-imidazol-4- yl)methylen]-2,3-dihydro-2-oxo-, Ethylester; und
1H-Indol-7-essigsäure, 3-[[2-butyl-1-[(1,1- dimethylethoxy)carbonyl]-1H-imidazol-4-yl]methylen]-2,3- dihydro-2-oxo-, Ethylester.
2. Eine Verbindung der Formel:


und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wobei:
R1 H ist;
R2 O oder S ist;
R3 Wasserstoff ist;
R4, R5, R6 und R7 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt werden, aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO2NRR', SO3R, SR, NO2, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2)nCO2R, und CONRR' besteht;
A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Pyrazol, Zmidazol, 1,2,3-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2- Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5- Oxatriazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5- Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4-Thiatriazol, 1,2,3,5- Thiatriazol und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO2NRR', SO3R, SR, NO2, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2)nCO2R und CONRR' besteht;
n 0-3 ist;
R H, Alkyl oder Aryl ist und R H, Alkyl oder Aryl ist.
3. Eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus 3-[(3-Methylpyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon; 3-[(3,4-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon; 3-[(2-Methylthien-5-yl)methylen]-2-indolinon; 3-[(3- Methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon; 3-{[4-(2- methoxycarbonylethyl)-3-methylpyrrol-5-yl]methylen}-2- indolinon; 3-[(4,5-Dimethyl-3-ethylpyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon; 3-[(5-Methylimidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon; 5- Chlor-3-[(5-methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon; 3-[(3,5- Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon; 3-[(3-(2- Carboxyethyl)-4-methylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon; 5- Chlor-3-[(3,5-dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon; und 3-[(2; 4-Dimethylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon, oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon.
4. 3-[(2,4-Dimethylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, oder eine pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbares Trägermaterial umfaßt.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, zur parenteralen oder subkutanen Anwendung oder in Form einer Depotformulierung.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6525072B1 (en) 1998-08-31 2003-02-25 Sugen, Inc. Geometrically restricted 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity

Families Citing this family (488)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US6872699B2 (en) * 1992-11-13 2005-03-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften, E.V. Truncated Flk-1 receptor protein, methods of use and a recombinant vector containing a nucleotide encoding the truncated Flk-1 protein
US5837815A (en) * 1994-12-15 1998-11-17 Sugen, Inc. PYK2 related polypeptide products
US6906093B2 (en) 1995-06-07 2005-06-14 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
US6147106A (en) * 1997-08-20 2000-11-14 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
US6846839B1 (en) * 1995-06-07 2005-01-25 Sugen, Inc. Methods for treating diseases and disorders related to unregulated angiogenesis and/or vasculogenesis
US6316635B1 (en) * 1995-06-07 2001-11-13 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
US5880141A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
ATE253908T1 (de) * 1995-08-16 2003-11-15 Huntington Medical Res Inst Rhodamin 123 zusammensetzungen für behandlung von prostatakrebs
ES2201266T3 (es) * 1996-01-17 2004-03-16 Taiho Pharmaceutical Company Limited Inhibidores del espesamiento de la capa intima.
CA2249603A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 Pfizer Inc. Benzyl(idene)-lactam derivatives, their preparation and their use as selective (ant)agonists of 5-ht1a- and/or 5-ht1d receptors
US6696448B2 (en) 1996-06-05 2004-02-24 Sugen, Inc. 3-(piperazinylbenzylidenyl)-2-indolinone compounds and derivatives as protein tyrosine kinase inhibitors
US6682921B1 (en) 1996-08-21 2004-01-27 New York University Crystals of the tyrosine kinase domain of non-insulin receptor tyrosine kinases
ATE308520T1 (de) * 1996-08-23 2005-11-15 Sugen Inc Kombinatorische bibliotheken von indolinone und verwandte produkte und verfahren zur behandlung von krankheiten
WO1998024432A2 (en) * 1996-12-05 1998-06-11 Sugen, Inc. Use of indolinone compounds as modulators of protein kinases
JP2001505779A (ja) * 1996-12-11 2001-05-08 スージェン・インコーポレーテッド Ｐｙｋ２関連産物および方法
WO1998038984A2 (en) 1997-03-05 1998-09-11 Sugen, Inc. Formulations for hydrophobic pharmaceutical agents
AR012634A1 (es) 1997-05-02 2000-11-08 Sugen Inc Compuesto basado en quinazolina, composicion famaceutica que lo comprende, metodo para sintetizarlo, su uso, metodos de modulacion de la funcion deserina/treonina proteinaquinasa con dicho compuesto y metodo in vitro para identificar compuestos que modulan dicha funcion
WO1998050356A1 (en) * 1997-05-07 1998-11-12 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
US6486185B1 (en) 1997-05-07 2002-11-26 Sugen, Inc. 3-heteroarylidene-2-indolinone protein kinase inhibitors
US6316429B1 (en) * 1997-05-07 2001-11-13 Sugen, Inc. Bicyclic protein kinase inhibitors
US6987113B2 (en) 1997-06-11 2006-01-17 Sugen, Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6114371A (en) * 1997-06-20 2000-09-05 Sugen, Inc. 3-(cyclohexanoheteroarylidenyl)-2-indolinone protein tyrosine kinase inhibitors
US6313158B1 (en) 1997-06-20 2001-11-06 Sugen, Inc. Bioavailability of 3-heteroarylidenyl-2-indolinones active as protein tyrosine kinase inhibitors
TW527355B (en) 1997-07-02 2003-04-11 Bristol Myers Squibb Co Inhibitors of farnesyl protein transferase
US6235769B1 (en) * 1997-07-03 2001-05-22 Sugen, Inc. Methods of preventing and treating neurological disorders with compounds that modulate the function of the C-RET receptor protein tyrosine kinase
GB9716557D0 (en) * 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
US20040067531A1 (en) * 1997-08-20 2004-04-08 Sugen, Inc. Methods of modulating protein tyrosine kinase function with substituted indolinone compounds
ES2289791T3 (es) 1997-08-22 2008-02-01 Astrazeneca Ab Derivados de oxindolilquinazolina como inhibidores de la angiogenesis.
GB9718913D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Glaxo Group Ltd Substituted oxindole derivatives
PL191618B1 (pl) 1997-09-26 2006-06-30 Zentaris Gmbh Związki azabenzimidazolowe, środki farmaceutyczne zawierające te związki, sposób wytwarzania i zastosowania tych związków
US6133305A (en) 1997-09-26 2000-10-17 Sugen, Inc. 3-(substituted)-2-indolinones compounds and use thereof as inhibitors of protein kinase activity
UA71555C2 (en) 1997-10-06 2004-12-15 Zentaris Gmbh Methods for modulating function of serine/threonine protein kinases by 5-azaquinoline derivatives
US20030219380A1 (en) * 1997-11-07 2003-11-27 Annie Fong Method of determining an efficacious dose of a drug
US8071384B2 (en) * 1997-12-22 2011-12-06 Roche Diagnostics Operations, Inc. Control and calibration solutions and methods for their use
US7494816B2 (en) 1997-12-22 2009-02-24 Roche Diagnostic Operations, Inc. System and method for determining a temperature during analyte measurement
US6531502B1 (en) 1998-01-21 2003-03-11 Sugen, Inc. 3-Methylidenyl-2-indolinone modulators of protein kinase
AU3363599A (en) * 1998-03-26 1999-10-18 Max-Planck Institut Fur Biochemie Heterocyclic families of compounds for the modulation of tyrosine protein kinase
US6514981B1 (en) 1998-04-02 2003-02-04 Sugen, Inc. Methods of modulating tyrosine protein kinase function with indolinone compounds
US6428172B1 (en) 1999-11-24 2002-08-06 Donnelly Corporation Rearview mirror assembly with utility functions
DE19816624A1 (de) * 1998-04-15 1999-10-21 Boehringer Ingelheim Pharma Neue substituierte Indolinone, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
US6569868B2 (en) 1998-04-16 2003-05-27 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
EP1082305A4 (de) 1998-05-29 2001-09-26 Sugen Inc Pyrrol substituierte 2-indolinone wirksam als proteinkinase-hemmer
DE19824922A1 (de) * 1998-06-04 1999-12-09 Boehringer Ingelheim Pharma Neue substituierte Indolinone, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
US6319918B1 (en) 1998-06-04 2001-11-20 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Substituted indolinones with kinase inhibitory activity
US6553123B1 (en) 1998-08-12 2003-04-22 Prince Corporation Conversation mirror/intercom
PT1115704E (pt) * 1998-09-25 2003-11-28 Boehringer Ingelheim Pharma Novas indolinonas substituidas com accao inibidora sobre varias quinases e complexos ciclina/cdk
AU770375B2 (en) * 1998-12-17 2004-02-19 F. Hoffmann-La Roche Ag 4-alkenyl (and alkynyl) oxindoles as inhibitors of cyclin-dependent kinases, in particular CDK2
US6153634A (en) * 1998-12-17 2000-11-28 Hoffmann-La Roche Inc. 4,5-azolo-oxindoles
CA2354510A1 (en) * 1998-12-17 2000-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag 4- and 5-alkynyloxindoles and 4- and 5-alkenyloxindoles
CA2354591A1 (en) 1998-12-17 2000-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag 4-aryloxindoles as inhibitors of jnk protein kinases
AU767138B2 (en) 1998-12-17 2003-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag 4,5-pyrazinoxindoles as protein kinase inhibitors
US20030119895A1 (en) * 1998-12-23 2003-06-26 Pharmacia Corporation Methods using a combination of a 3-heteroaryl-2-indolinone and a cyclooxygenase-2 inhibitor for the treatment of neoplasia
US6861442B1 (en) * 1998-12-30 2005-03-01 Sugen, Inc. PYK2 and inflammation
EP1630559A3 (de) * 1998-12-30 2006-06-07 Sugen, Inc. PYK2 (RAFTK) und Entzündung
AU760964B2 (en) * 1998-12-31 2003-05-22 Sugen, Inc. 3-heteroarylidenyl-2-indolinone compounds for modulating protein kinase activityand for use in cancer chemotherapy
US6828106B2 (en) * 1999-02-26 2004-12-07 Cyclacel Limited Methods and compositions using coiled binding partners
US6972182B1 (en) * 1999-02-26 2005-12-06 Cyclacel, Ltd. Methods and compositions using coiled binding partners
US6670144B1 (en) * 1999-02-26 2003-12-30 Cyclacel, Ltd. Compositions and methods for monitoring the phosphorylation of natural binding partners
US6656696B2 (en) * 1999-02-26 2003-12-02 Cyclacel Compositions and methods for monitoring the phosphorylation of natural binding partners
GB9904933D0 (en) 1999-03-04 1999-04-28 Glaxo Group Ltd Compounds
US6492398B1 (en) 1999-03-04 2002-12-10 Smithkline Beechman Corporation Thiazoloindolinone compounds
US6624171B1 (en) 1999-03-04 2003-09-23 Smithkline Beecham Corporation Substituted aza-oxindole derivatives
US7064114B2 (en) 1999-03-19 2006-06-20 Parker Hughes Institute Gel-microemulsion formulations
CA2855415A1 (en) * 1999-03-23 2000-09-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Phenylalanine derivatives
US7226991B1 (en) * 1999-03-23 2007-06-05 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Phenylalanine derivatives
US6689806B1 (en) 1999-03-24 2004-02-10 Sugen, Inc. Indolinone compounds as kinase inhibitors
CA2368041A1 (en) * 1999-03-24 2000-09-28 Sugen, Inc. Indolinone compounds as kinase inhibitors
US7049410B2 (en) * 1999-05-14 2006-05-23 Majumdar Adhip P N Antibodies to a novel EGF-receptor related protein (ERRP)
WO2000069909A1 (en) 1999-05-14 2000-11-23 The United States Of America Through The Department Of Veterans Affairs Isolation and characterization of epidermal growth factor related protein
US6762180B1 (en) 1999-10-13 2004-07-13 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Substituted indolines which inhibit receptor tyrosine kinases
DE19949209A1 (de) * 1999-10-13 2001-04-19 Boehringer Ingelheim Pharma In 5-Stellung substituierte Indolinone, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
UA75054C2 (uk) * 1999-10-13 2006-03-15 Бьорінгер Інгельхайм Фарма Гмбх & Ко. Кг Заміщені в положенні 6 індолінони, їх одержання та їх застосування як лікарського засобу
US7871981B2 (en) * 1999-10-22 2011-01-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibition of cell motility, angiogenesis, and metastasis
US7364866B2 (en) * 1999-10-22 2008-04-29 Pharmacia & Upjohn Company Drosophila G protein coupled receptors, nucleic acids, and methods related to the same
US6835546B1 (en) 1999-10-22 2004-12-28 Pharmacia & Upjohn Company Drosophila G protein coupled receptors, nucleic acids, and methods related to the same
US20030162223A1 (en) * 1999-10-22 2003-08-28 Lowery David E. Drosophila G protein coupled receptors, nucleic acids, and methods related to the same
JP2003512334A (ja) 1999-10-22 2003-04-02 アメリカ合衆国 Ｇｒｂ−２ｓｈ−２ドメインの阻害剤による細胞運動性及び脈管形成の阻害
UA74803C2 (uk) 1999-11-11 2006-02-15 Осі Фармасьютікалз, Інк. Стійкий поліморф гідрохлориду n-(3-етинілфеніл)-6,7-біс(2-метоксіетокси)-4-хіназолінаміну, спосіб його одержання (варіанти) та фармацевтичне застосування
US20030082534A1 (en) * 1999-11-16 2003-05-01 Peter Lind Novel G protein-coupled receptors
WO2001036473A2 (en) * 1999-11-16 2001-05-25 Pharmacia & Upjohn Company Human g protein-coupled receptors
JP2003515281A (ja) 1999-11-19 2003-04-22 ジェンテクス・コーポレーション 乗物用付属機器
US8682005B2 (en) 1999-11-19 2014-03-25 Gentex Corporation Vehicle accessory microphone
EP1103420B1 (de) 1999-11-24 2006-06-21 Donnelly Corporation Rückblickspiegel mit Nutzfunktion
JP5336686B2 (ja) * 1999-11-24 2013-11-06 スージェン， インク． 遊離酸または遊離塩基としてイオン化可能な医薬品のための処方
US6878733B1 (en) 1999-11-24 2005-04-12 Sugen, Inc. Formulations for pharmaceutical agents ionizable as free acids or free bases
US6313310B1 (en) 1999-12-15 2001-11-06 Hoffmann-La Roche Inc. 4-and 5-alkynyloxindoles and 4-and 5-alkenyloxindoles
EP1255536B1 (de) * 1999-12-22 2006-06-28 Sugen, Inc. Indolinonderivate zur abänderung der c-kit tyrosinproteinkinase
US6339100B1 (en) 1999-12-29 2002-01-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inhibiting mastocytosis
ES2269156T3 (es) * 1999-12-30 2007-04-01 Sugen, Inc. Compuestos de heteroarilidenil-3-indolinona para modular la actividad de proteina-quinasas y para el uso en quimioterapia del cancer.
MY130363A (en) * 2000-02-15 2007-06-29 Sugen Inc "pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors"
US6620818B1 (en) 2000-03-01 2003-09-16 Smithkline Beecham Corporation Method for reducing the severity of side effects of chemotherapy and/or radiation therapy
MY128450A (en) * 2000-05-24 2007-02-28 Upjohn Co 1-(pyrrolidin-1-ylmethyl)-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
US6706709B2 (en) 2000-06-02 2004-03-16 Sugen, Inc. Indolinone derivatives as protein kinase/phosphatase inhibitors
GB0016454D0 (en) 2000-07-04 2000-08-23 Hoffmann La Roche Thienopyrrolidinones
US6977241B2 (en) * 2000-08-22 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services SH2 domain binding inhibitors
US7425537B2 (en) * 2000-08-22 2008-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services SH2 domain binding inhibitors
US20030129223A1 (en) * 2000-10-11 2003-07-10 Targesome, Inc. Targeted multivalent macromolecules
US20030133972A1 (en) * 2000-10-11 2003-07-17 Targesome, Inc. Targeted multivalent macromolecules
ATE419239T1 (de) * 2000-10-20 2009-01-15 Eisai R&D Man Co Ltd Verfahren zur herstellung von 4-phenoxy chinolin derivaten
PE20020572A1 (es) 2000-12-06 2002-07-31 Centro Inmunologia Molecular Preparaciones para potenciar la inmunogenicidad de antigenos poco inmunogenicos
CA2432114A1 (en) * 2000-12-20 2002-07-18 Sugen, Inc. 4-(hetero)aryl substituted indolinones
WO2002060426A2 (en) * 2001-01-03 2002-08-08 President And Fellows Of Harvard College Compounds regulating cell proliferation and differentiation
MX349009B (es) * 2001-01-05 2017-07-06 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina.
US6504034B2 (en) 2001-01-23 2003-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Naphthostyrils
US20050069976A1 (en) * 2001-02-14 2005-03-31 Peter Lind Protein-coupled receptor
AU2002250080A1 (en) 2001-02-14 2002-08-28 Gentex Corporation Vehicle accessory microphone
AR042586A1 (es) 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
LT2269604T (lt) 2001-02-19 2016-11-10 Novartis Ag Inkstų solidinių navikų gydymas rapamicino dariniu
FR2821358B1 (fr) * 2001-02-27 2006-04-07 Aventis Pharma Sa Oxindoles inhibiteurs de cdk-1 et leur application en therapeutique
US7186745B2 (en) * 2001-03-06 2007-03-06 Astrazeneca Ab Indolone derivatives having vascular damaging activity
FR2822155B1 (fr) * 2001-03-13 2003-12-12 Aventis Pharma Sa Composes derives des oxindoles et leur application therapeutique en cancerologie
SE0101230L (sv) * 2001-04-06 2002-10-07 Innoventus Project Ab Ny användning av en tyrosinkinasinhibitor
US6797725B2 (en) * 2001-04-09 2004-09-28 Sugen, Inc. Prodrugs of a 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
MXPA03010401A (es) 2001-05-16 2004-03-09 Novartis Ag Combinacion que comprende n-[5-[4- (4-metil- piperazino-metil) -benzoilamido] -2-metilfenil] -4-(3-piridil)-2 -pirimidin-amina, y un agente quimioterapeutico.
AU2002303892A1 (en) 2001-05-30 2002-12-09 Jingrong Cui 5-aralkylsulfonyl-3- (pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
WO2003000194A2 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Pfizer Inc. Thienopyridine and thienopyrimidine anticancer agents
EP1401412A2 (de) * 2001-06-29 2004-03-31 AB Science Verwendung von potenten, selektiven und nontoxischen c-kithemmer zur behandlung von tumorangiogenese
DK1401415T3 (da) * 2001-06-29 2006-10-16 Ab Science Anvendelse af N-phenyl-2-pyrimidinamin-derivater til behandling af inflammatoriske sygdomme
WO2003002109A2 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for treating autoimmune diseases
ATE376182T1 (de) * 2001-06-29 2007-11-15 Ab Science C-kit inhibitoren
DK1401416T5 (da) * 2001-06-29 2007-03-19 Ab Science Anvendelse af C-kit-inhibitorer til behandling af inflammatorisk tarmsygdom
JP2004537536A (ja) 2001-06-29 2004-12-16 アブ サイエンス アレルギー疾患を治療するためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用方法
DE10134196B4 (de) * 2001-07-13 2005-08-18 Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh Technik Und Umwelt Pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung der unkontrollierten Vermehrung und/oder Induzierung der Apoptose von Zellen
TWI315982B (en) 2001-07-19 2009-10-21 Novartis Ag Combinations comprising epothilones and pharmaceutical uses thereof
CA2455050C (en) * 2001-08-15 2007-02-20 Pharmacia & Upjohn Company Crystals including a malic acid salt of n-[2-(diethylamino) ethyl]-5-[(5-fluoro-2-oxo-3h-indole-3-ylidene) methyl]-2, 4-dimethyl-1h-pyrrole-3-carboxamide, processes for its preparation and compositions thereof
AR038957A1 (es) * 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer
DE60227701D1 (de) * 2001-09-20 2008-08-28 Ab Science Die verwendung von c-kithemmern zur förderung des haarwuchses
CA2461183A1 (en) * 2001-09-20 2003-05-15 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for whitening human skin and treating melanocyte dysfunction associated diseases
EP1427379B1 (de) * 2001-09-20 2008-08-13 AB Science Die verwendung von potenten, selektiven und nontoxischen c-kithemmern zur behandlung von interstitieller blasenentzündung
JP2005508336A (ja) * 2001-09-27 2005-03-31 アラーガン、インコーポレイテッド キナーゼ阻害物質としての３−（アリールアミノ）メチレン−１，３−ジヒドロ−２ｈ−インドール−２−オン類
US6559173B1 (en) 2001-09-27 2003-05-06 Allergan, Inc. 3-(heteroarylamino)methylene-1,3-dihydro-2H-indol-2-ones as kinase inhibitors
MXPA04003385A (es) 2001-10-10 2005-04-11 Sugen Inc Derivados de 3-?4-substituido con heterociclilo)-pirrol-2-ilmetilidene?-2-indolinona como inhibidores de cinasa.
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
JP2005514368A (ja) * 2001-11-21 2005-05-19 スージェン・インコーポレーテッド インドリノン誘導体を含む医薬製剤
US6797825B2 (en) 2001-12-13 2004-09-28 Abbott Laboratories Protein kinase inhibitors
US20030187026A1 (en) 2001-12-13 2003-10-02 Qun Li Kinase inhibitors
PE20030701A1 (es) 2001-12-20 2003-08-21 Schering Corp Compuestos para el tratamiento de trastornos inflamatorios
RU2316554C2 (ru) 2001-12-27 2008-02-10 Тереванс, Инк. Производные индолина, используемые как ингибиторы протеинкиназы
ES2262996T3 (es) * 2002-01-07 2006-12-01 Eisai Co., Ltd. Deazapurinas y sus usos.
EP1478380B1 (de) * 2002-02-27 2006-08-02 AB Science Verwendung von tyrosine-kinase inhibitoren zur behandlung von cns krankheiten
WO2003074529A2 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Pfizer Inc. iNDOLYL-UREA DERIVATIVES OF THIENOPYRIDINES USEFUL AS ANTI-ANGIOGENIC AGENTS
GB0206215D0 (en) 2002-03-15 2002-05-01 Novartis Ag Organic compounds
MXPA04009434A (es) * 2002-04-03 2005-01-25 Allergan Inc (3z)-3- (3 -hidroisobenzofuran- 1-iliden) -1, 3-dihidro- 2h-indol -2-onas como inhibidores de cinasa.
US6541504B1 (en) * 2002-04-03 2003-04-01 Allergan Sales, Llc (3Z)-3-(2,3-dihydro-1H-inden-1-ylidene)-1,3-dihydro-2H-indol-2-ones as kinase inhibitors
MXPA04011384A (es) 2002-05-16 2005-02-14 Novartis Ag Uso de agentes de union del receptor edg en cancer.
UA77303C2 (en) * 2002-06-14 2006-11-15 Pfizer Derivatives of thienopyridines substituted by benzocondensed heteroarylamide useful as therapeutic agents, pharmaceutical compositions and methods for their use
AU2003262544A1 (en) * 2002-08-01 2004-02-23 Pharmacia Italia S.P.A. Isotopically labelled indolinone derivatives and process for their preparation
WO2004014903A1 (en) 2002-08-02 2004-02-19 Ab Science 2-(3-aminoaryl)amino-4-aryl-thiazoles and their use as c-kit inhibitors
US8450302B2 (en) * 2002-08-02 2013-05-28 Ab Science 2-(3-aminoaryl) amino-4-aryl-thiazoles and their use as c-kit inhibitors
US20050032871A1 (en) * 2002-09-03 2005-02-10 Sugen, Inc. Sulfonylated pyrrole-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
EP1581309A4 (de) * 2002-11-15 2009-07-29 Exelixis Inc Kinase-modulatoren
WO2004048525A2 (en) * 2002-11-21 2004-06-10 Genentech, Inc. Therapy of non-malignant diseases or disorders with anti-erbb2 antibodies
US6699863B1 (en) 2002-11-27 2004-03-02 Allergan, Inc. Kinase inhibitors for the treatment of disease
US6747025B1 (en) 2002-11-27 2004-06-08 Allergan, Inc. Kinase inhibitors for the treatment of disease
US20040186160A1 (en) * 2002-12-13 2004-09-23 Sugen, Inc. Hexahydro-cyclohepta-pyrrole oxindole as potent kinase inhibitors
RS20050430A (sr) * 2002-12-19 2007-08-03 Pfizer Inc., Jedinjenja 2-(1h-indazol-6-ilamino)- benzamida kao inhibitori protein kinaza, korisni u tretmanu oftalmoloških bolesti
US20040138104A1 (en) * 2003-01-14 2004-07-15 The Government Of The United States Of America Represented By The Secretary, Peptides
ITRM20030074A1 (it) * 2003-02-21 2004-08-22 Pharmacia Italia Spa Formulazioni semisolide a rilascio immediato intese
US7230098B2 (en) 2003-02-26 2007-06-12 Sugen, Inc. Aminoheteroaryl compounds as protein kinase inhibitors
US7157577B2 (en) * 2003-03-07 2007-01-02 Sugen Inc. 5-sulfonamido-substituted indolinone compounds as protein kinase inhibitors
US20040266843A1 (en) * 2003-03-07 2004-12-30 Sugen, Inc. Sulfonamide substituted indolinones as inhibitors of DNA dependent protein kinase (DNA-PK)
EP1604665B1 (de) * 2003-03-10 2011-05-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. C-kit kinase-hemmer
KR20050119671A (ko) * 2003-04-03 2005-12-21 화이자 인코포레이티드 Ａｇ013736을 포함하는 제형
CL2004001120A1 (es) 2003-05-19 2005-04-15 Irm Llc Compuestos derivados de amina sustituidas con heterociclos, inmunosupresores; composicion farmaceutica; y uso para tratar enfermedades mediadas por interacciones de linfocito, tales como enfermedades autoinmunes, inflamatorias, infecciosas, cancer.
MY150088A (en) 2003-05-19 2013-11-29 Irm Llc Immunosuppressant compounds and compositions
AR042955A1 (es) 2003-07-18 2005-07-13 Amgen Inc Agentes de union especifica al factor de crecimiento de hepatocitos
DE10334582A1 (de) * 2003-07-28 2005-02-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Maleinsäureanhydrid
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
JP2007501229A (ja) * 2003-08-06 2007-01-25 スゲン，インコーポレイティド 強力なプロテインキナーゼ阻害剤としての幾何学的に束縛された３−シクロペンチリデン−１，３−ジヒドロインドール−２−オン類
US20070032521A1 (en) * 2003-08-15 2007-02-08 Ab Science Use of c-kit inhibitors for treating type II diabetes
JP2007504122A (ja) * 2003-08-29 2007-03-01 ファイザー・インク 新規抗血管形成剤として有用なチエノピリジン−フェニルアセトアミドおよびその誘導体
CA2536788A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Pfizer Inc. Naphthalene carboxamides and their derivatives useful as new anti-angiogenic agents
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
US20050119163A1 (en) * 2003-09-18 2005-06-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, SH2 domain binding inhibitors
US7718676B2 (en) 2003-10-23 2010-05-18 Ab Science 2-aminoaryloxazole compounds as tyrosine kinase inhibitors
BRPI0415773A (pt) * 2003-10-24 2006-12-26 Schering Ag derivados de indolinona e sua aplicação no tratamento de estados de doença tais como cáncer
CN101337930B (zh) * 2003-11-11 2010-09-08 卫材R&D管理有限公司 脲衍生物的制备方法
DK1689721T3 (da) * 2003-11-26 2010-09-20 Pfizer Prod Inc Aminopyrazolderivater som GSK-3-ihibitorer
WO2005058309A1 (en) * 2003-12-16 2005-06-30 Leo Pharma A/S Novel therapeutic use of indolinone derivatives
GEP20084572B (en) * 2003-12-23 2008-12-25 Pfizer Novel quinoline derivatives
WO2005073366A1 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Lifecord Inc. Method for isolating and culturing multipotent progenitor/stem cells from umbilical cord blood and method for inducing differentiation thereof
JP2007523188A (ja) * 2004-02-23 2007-08-16 スゲン，インコーポレイティド Ｃ−ｍｅｔ阻害薬及びｍ−ｔｏｒ阻害薬を使用する異常な細胞増殖の治療法
DE102004012070A1 (de) * 2004-03-12 2005-09-29 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue cycloalkyl-haltige 5-Acylindolinone, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
EP1740184A1 (de) * 2004-03-30 2007-01-10 Pfizer Products Incorporated Kombinationen von signalübertragungshemmern
US7915443B2 (en) 2006-11-16 2011-03-29 Allergan, Inc. Sulfoximines as kinase inhibitors
US8455656B2 (en) 2004-04-30 2013-06-04 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
US7771742B2 (en) * 2004-04-30 2010-08-10 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants containing tyrosine kinase inhibitors and related methods
WO2005107708A1 (en) 2004-04-30 2005-11-17 Allergan, Inc. Biodegradable intravitreal tyrosine kinase inhibitors implants
JP2008504292A (ja) 2004-06-24 2008-02-14 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 免疫増強用の化合物
GB0512324D0 (en) 2005-06-16 2005-07-27 Novartis Ag Organic compounds
CN101014365B (zh) * 2004-07-16 2011-04-13 辉瑞产品公司 使用抗-igf-1r抗体联合治疗非血液的恶性肿瘤
CA2578066C (en) * 2004-08-26 2011-10-11 Pfizer Inc. Enantiomerically pure aminoheteroaryl compounds as protein kinase inhibitors
ATE492544T1 (de) * 2004-08-26 2011-01-15 Pfizer Pyrazol-substituierte aminoheteroarylverbindungen als proteinkinasehemmer
EP1786777A1 (de) * 2004-08-26 2007-05-23 Pfizer, Inc. Aminoheteroarylverbindungen als proteintyrosinkinaseinhibitoren
US8772269B2 (en) * 2004-09-13 2014-07-08 Eisai R&D Management Co., Ltd. Use of sulfonamide-including compounds in combination with angiogenesis inhibitors
WO2006030947A1 (ja) 2004-09-13 2006-03-23 Eisai R & D Management Co., Ltd. スルホンアミド含有化合物の血管新生阻害物質との併用
EP1797881B1 (de) * 2004-09-17 2009-04-15 Eisai R&D Management Co., Ltd. Medizinische zusammensetzung mit verbesserter stabilität und reduzierten gelierungseigenschaften
GB0423043D0 (en) * 2004-10-16 2004-11-17 Astrazeneca Ab Compounds
US20060107555A1 (en) * 2004-11-09 2006-05-25 Curtis Marc D Universal snow plow adapter
CA2589501A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Boehringer Ingelheim International Gmbh Indolinones and their use as antiproliferative agents
PE20060777A1 (es) * 2004-12-24 2006-10-06 Boehringer Ingelheim Int Derivados de indolinona para el tratamiento o la prevencion de enfermedades fibroticas
SG176463A1 (en) 2005-02-22 2011-12-29 Univ Michigan Small molecule inhibitors of mdm2 and uses thereof
WO2006105488A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
EP2361624A1 (de) * 2005-04-04 2011-08-31 AB Science Oxazolderivate und Ihre Anwendung als Tyrosinkinase Inhibitoren
KR100990027B1 (ko) 2005-04-26 2010-10-26 화이자 인코포레이티드 Ｐ-카드헤린 항체
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
US7749530B2 (en) 2005-07-13 2010-07-06 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
US7439371B2 (en) * 2005-07-13 2008-10-21 Allergan, Inc. Indol kinase inhibitors
US7309787B2 (en) * 2005-07-13 2007-12-18 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
AU2006268265A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
WO2007015569A1 (ja) * 2005-08-01 2007-02-08 Eisai R & D Management Co., Ltd. 血管新生阻害物質の効果を予測する方法
US9006240B2 (en) 2005-08-02 2015-04-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for assay on the effect of vascularization inhibitor
AU2006285673B2 (en) * 2005-09-01 2010-12-02 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for preparation of pharmaceutical composition having improved disintegratability
DOP2006000195A (es) 2005-09-07 2017-08-15 Amgen Fremont Inc Anticuerpos monoclonales humanos para la quinasa-1 tipo receptor de activina
ATE533057T1 (de) 2005-09-20 2011-11-15 Osi Pharm Inc Biologische marker als prädiktoren der antikrebsreaktion auf insulinähnlichen wachstumsfaktor-1-rezeptor-kinaseinhibitoren
JP2009510073A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト カルボキシアミン化合物およびその使用方法
KR101353763B1 (ko) 2005-11-07 2014-01-21 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 혈관 신생 저해 물질과 ｃ―ｋｉｔ 키나아제 저해 물질의병용
US9006224B2 (en) 2005-11-21 2015-04-14 Novartis Ag Neuroendocrine tumor treatment
WO2007061127A1 (ja) * 2005-11-22 2007-05-31 Eisai R & D Management Co., Ltd. 多発性骨髄腫に対する抗腫瘍剤
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
US8367664B2 (en) 2006-01-24 2013-02-05 Allergan, Inc. Substituted 3-(5-membered unsaturated heterocyclyl-1, 3-dihydro-indol-2-one's and derivatives thereof as kinase inhibitors
PE20070978A1 (es) * 2006-02-14 2007-11-15 Novartis Ag COMPUESTOS HETEROCICLICOS COMO INHIBIDORES DE FOSFATIDILINOSITOL 3-QUINASAS (PI3Ks)
MX2008011220A (es) 2006-03-07 2008-09-11 Array Biopharma Inc Compuestos de pirazol heterobiciclicos y metodos de uso.
US7977351B2 (en) 2006-03-22 2011-07-12 Allergan, Inc. Heteroaryl dihydroindolones as kinase inhibitors
RU2447891C2 (ru) 2006-04-05 2012-04-20 Новартис Аг Комбинации терапевтических средств, предназначенные для лечения рака
AR060358A1 (es) * 2006-04-06 2008-06-11 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolinas para la inhibicion de pdk 1
KR20080110912A (ko) 2006-04-19 2008-12-19 노파르티스 아게 인다졸 화합물 및 ｃｄｃ７의 억제 방법
BRPI0711358A2 (pt) 2006-05-09 2011-09-27 Pfizer Prod Inc derivados do ácido cicloalquilamino e suas composições farmacêuticas
EP2026800A1 (de) 2006-05-09 2009-02-25 Novartis AG Kombination aus einem eisenchelatbildner und einem anti-neoplastischen mittel und ihre verwendung
CA2652442C (en) * 2006-05-18 2014-12-09 Eisai R & D Management Co., Ltd. Antitumor agent for thyroid cancer
WO2007146824A2 (en) * 2006-06-08 2007-12-21 Array Biopharma Inc. Quinoline compounds and methods of use
GB0612721D0 (en) 2006-06-27 2006-08-09 Novartis Ag Organic compounds
JPWO2008001956A1 (ja) * 2006-06-29 2009-12-03 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 肝線維症治療剤
PE20121506A1 (es) 2006-07-14 2012-11-26 Amgen Inc Compuestos triazolopiridinas como inhibidores de c-met
US8217177B2 (en) 2006-07-14 2012-07-10 Amgen Inc. Fused heterocyclic derivatives and methods of use
US8246966B2 (en) * 2006-08-07 2012-08-21 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Trypanosome microsome system and uses thereof
US8034957B2 (en) 2006-08-11 2011-10-11 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
CN101511793B (zh) * 2006-08-28 2011-08-03 卫材R&D管理有限公司 针对未分化型胃癌的抗肿瘤剂
JP2010504933A (ja) 2006-09-29 2010-02-18 ノバルティス アーゲー Ｐｉ３ｋ脂質キナーゼ阻害剤としてのピラゾロピリミジン
EP2077838B1 (de) * 2006-10-25 2013-04-03 The Rockefeller University Verfahren zur behandlung von amyloid-beta verwandten erkrankungen und zusammensetzungen dafür
US8143410B2 (en) 2006-11-16 2012-03-27 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
US8558002B2 (en) 2006-11-16 2013-10-15 Allergan, Inc. Sulfoximines as kinase inhibitors
US8338433B2 (en) 2006-11-22 2012-12-25 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Tyrosine kinase inhibitors as anti-kinetoplastid agents
WO2008066498A1 (en) * 2006-12-01 2008-06-05 Agency For Science, Technology And Research Cancer-related protein kinases
US8962655B2 (en) * 2007-01-29 2015-02-24 Eisai R&D Management Co., Ltd. Composition for treatment of undifferentiated gastric cancer
US9187485B2 (en) * 2007-02-02 2015-11-17 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for the treatment of cancer and related hyperproliferative disorders
EP2120900A2 (de) 2007-02-15 2009-11-25 Novartis AG Kombinationen von lb589 mit anderen therapeutischen wirkstoffen zur krebsbehandlung
MX2009008531A (es) 2007-02-16 2009-08-26 Amgen Inc Cetonas de heterociclilo que contienen nitrogeno y su uso como inhibidores de c-met.
CA2683804A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Receptor tyrosine kinase profiling
AU2008239594B2 (en) 2007-04-13 2013-10-24 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics
US7825143B2 (en) 2007-07-10 2010-11-02 Montana State University - Billings Method for controlling the yeast-to-filamentous growth transition in fungi
EP2592093A1 (de) 2007-08-21 2013-05-15 Amgen, Inc An menschliches C-FMS bindende antigenbindende Proteine
EP2218712B1 (de) 2007-11-09 2015-07-01 Eisai R&D Management Co., Ltd. Kombination einer antiangiogenen substanz und eines platinkomplexes mit antitumorwirkung
BRPI0820722A2 (pt) 2007-12-20 2015-06-16 Novartis Ag Derivados de tiazol usados como inibidores de pi 3 cinases
CN101970426A (zh) 2007-12-21 2011-02-09 大学健康网络 吲唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基取代的二氢吲哚酮衍生物作为癌症治疗中有用的激酶抑制剂
US20110104166A1 (en) * 2008-01-18 2011-05-05 Stankovic Konstantina M Methods and Compositions for Treating Polyps
MX2010008187A (es) * 2008-01-29 2010-08-10 Eisai R&D Man Co Ltd Uso combinado de inhibidor de angiogenesis y taxano.
US8232402B2 (en) 2008-03-12 2012-07-31 Link Medicine Corporation Quinolinone farnesyl transferase inhibitors for the treatment of synucleinopathies and other indications
PT2260020E (pt) 2008-03-26 2014-10-28 Novartis Ag Inibidores das desacetilases b baseados no hidroxamato
CA2758016A1 (en) * 2008-06-05 2009-12-10 Novotyr Therapeutics Ltd. Novel modulators of protein kinase signaling
EP2307421A4 (de) * 2008-06-30 2011-07-13 Cylene Pharmaceuticals Inc Oxindolverbindungen
US20100029491A1 (en) * 2008-07-11 2010-02-04 Maike Schmidt Methods and compositions for diagnostic use for tumor treatment
US20100029675A1 (en) * 2008-07-25 2010-02-04 Hwang Soo-In Pyrimidine-2, 4-diamine JAK2 Kinase inhibiting anti-inflammation use
US8993615B2 (en) * 2008-08-08 2015-03-31 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treatment of neurodegenerative disease
CA2734172A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Genentech, Inc. Diagnostics and treatments for vegf-independent tumors
EP2350001A4 (de) * 2008-10-14 2011-11-16 Univ Singapore Neue benzylidene-indolinonen und ihre medische und diagnostische verwendung
EP2334701A4 (de) 2008-10-16 2014-01-08 Univ Pittsburgh Vollständig menschliche antikörper gegen mit melanomen von hohem molekulargewicht assoziierte antigene und verwendungen davon
ES2704986T3 (es) 2008-10-16 2019-03-21 Celator Pharmaceuticals Inc Combinaciones de una camptotecina liposomal soluble en agua con cetuximab o bevacizumab
US8343996B2 (en) 2008-11-13 2013-01-01 Astrazeneca Ab Azaquinolinone derivatives and uses thereof
US20100222371A1 (en) * 2008-11-20 2010-09-02 Children's Medical Center Corporation Prevention of surgical adhesions
AU2009335887A1 (en) 2008-12-18 2011-06-30 Novartis Ag New salts
CA2747437C (en) 2008-12-18 2018-08-21 Novartis Ag Hemifumarate salt of 1-[4-[1-(4-cyclohexyl-3-trifluoromethyl-benzyloxyimino)-ethyl]-2-ethyl-benzyl]-a zetidine-3-carboxylic acid
CA2746764A1 (en) 2008-12-18 2010-06-24 Novartis Ag New polymorphic form of 1- (4- { l- [ (e) -4-cyclohexyl--3-trifluoromethyl-benzyloxyimino] -ethyl) -2-ethyl-benzy l) -azetidine-3-carboxylic
WO2010088335A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Novartis Ag Substituted benzimidazoles for the treatment of astrocytomas
CA2748943A1 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Supergen, Inc. Pyrrolopyrimidinyl axl kinase inhibitors
US20120189641A1 (en) 2009-02-25 2012-07-26 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
WO2010099137A2 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. In situ methods for monitoring the emt status of tumor cells in vivo
US8642834B2 (en) 2009-02-27 2014-02-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
WO2010099138A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
TW201035088A (en) 2009-02-27 2010-10-01 Supergen Inc Cyclopentathiophene/cyclohexathiophene DNA methyltransferase inhibitors
EP2401613A2 (de) 2009-02-27 2012-01-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Verfahren zur identifizierung von mesenchymähnlichen tumorzellen oder deren bildung hemmenden stoffen
JP5629752B2 (ja) 2009-04-06 2014-11-26 ユニバーシティ・ヘルス・ネットワークＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ キナーゼインヒビターおよびこれを用いた癌の治療方法
CA2761243A1 (en) 2009-05-12 2010-11-18 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-tumor agent containing tegafur-gimeracil-oteracil potassium combination drug and oxaliplatin
NZ596488A (en) 2009-06-26 2012-11-30 Novartis Ag 1, 3-disubstituted imidazolidin-2-one derivatives as inhibitors of cyp 17
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
AU2010273585B2 (en) 2009-07-13 2015-04-23 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
US20120128670A1 (en) 2009-07-31 2012-05-24 OSI Pharmaceuticals, LLC mTOR INHIBITOR AND ANGIOGENESIS INHIBITOR COMBINATION THERAPY
US8389526B2 (en) 2009-08-07 2013-03-05 Novartis Ag 3-heteroarylmethyl-imidazo[1,2-b]pyridazin-6-yl derivatives
KR20120089643A (ko) 2009-08-12 2012-08-13 노파르티스 아게 헤테로시클릭 히드라존 화합물, 및 암 및 염증을 치료하기 위한 그의 용도
PE20170003A1 (es) 2009-08-17 2017-03-15 Intellikine Llc Compuestos heterociclicos y usos de los mismos
CA2771403C (en) 2009-08-19 2015-02-24 Eisai R&D Management Co. Ltd. Quinoline derivative-containing pharmaceutical composition
IN2012DN01453A (de) 2009-08-20 2015-06-05 Novartis Ag
KR20120050492A (ko) 2009-08-26 2012-05-18 노파르티스 아게 테트라-치환된 헤테로아릴 화합물 및 ｍｄｍ2 및/또는 ｍｄｍ4 조절제로서의 그의 용도
WO2011027249A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Pfizer Inc. Benzimidazole derivatives
US9340555B2 (en) 2009-09-03 2016-05-17 Allergan, Inc. Compounds as tyrosine kinase modulators
BR112012004843A2 (pt) * 2009-09-03 2019-09-24 Allergan Inc compostos como moduladores de tirosina cinase
BR112012005400A2 (pt) 2009-09-10 2016-04-05 Irm Llc derivados do tipo éter de heteroarilas bicíclicas
KR20120105423A (ko) 2009-09-11 2012-09-25 제넨테크, 인크. 항암제에 반응할 증가된 가능성을 갖는 환자를 확인하는 방법
MX2012002909A (es) 2009-09-17 2012-04-19 Hoffmann La Roche Metodos y composiciones para su uso en diagnostico de pacientes con cancer.
JP5466767B2 (ja) 2009-11-04 2014-04-09 ノバルティス アーゲー Ｍｅｋ阻害剤として有用なヘテロ環式スルホンアミド誘導体
EP2504339A1 (de) 2009-11-25 2012-10-03 Novartis AG Benzolkondensierte 6-gliedrige sauerstoffhaltige heterocyclische derivate bicyclischer heteroaryle
PE20121384A1 (es) 2009-12-08 2012-10-13 Novartis Ag Derivados de sulfonamida heterociclicos
WO2011073521A1 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Petri Salven Methods for enriching adult-derived endothelial progenitor cells and uses thereof
US8440693B2 (en) 2009-12-22 2013-05-14 Novartis Ag Substituted isoquinolinones and quinazolinones
CU24130B1 (es) 2009-12-22 2015-09-29 Novartis Ag Isoquinolinonas y quinazolinonas sustituidas
KR20120127495A (ko) 2010-02-12 2012-11-21 화이자 인코포레이티드 8-플루오로-2-｛4-［(메틸아미노)메틸］페닐｝-1,3,4,5-테트라하이드로-6ｈ-아제피노［5,4,3-ｃｄ］인돌-6-온의 염 및 다형체
JP2013527748A (ja) 2010-03-03 2013-07-04 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー インスリン様増殖因子１受容体キナーゼ阻害剤に対する抗癌反応の予測に役立つ生物学的マーカー
EP2542893A2 (de) 2010-03-03 2013-01-09 OSI Pharmaceuticals, LLC Biologische marker als prädiktoren der antikrebsreaktion auf insulinähnlichen wachstumsfaktor-1-rezeptor-kinaseinhibitoren
KR101782668B1 (ko) 2010-04-06 2017-09-27 유니버시티 헬스 네트워크 인산화 효소 억제제와 이를 이용한 종양을 치료하는 방법.
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
CA2802857C (en) 2010-06-16 2018-09-11 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antibodies to endoplasmin and their use
US20130085161A1 (en) 2010-06-17 2013-04-04 Novartis Ag Piperidinyl substituted 1,3-dihydro-benzoimidazol-2-ylideneamine derivatives
CN102947274A (zh) 2010-06-17 2013-02-27 诺瓦提斯公司 联苯基取代的1,3-二氢-苯并咪唑-2-亚基胺衍生物
BR112012032462A2 (pt) 2010-06-25 2016-11-08 Eisai R&D Man Co Ltd agente antitumoral empregando compostos que, em combinação, têm efeito inibidor de quinase.
KR20130126576A (ko) 2010-07-19 2013-11-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법
WO2012010550A1 (en) 2010-07-19 2012-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
EP3696195B1 (de) 2010-07-23 2024-02-14 Trustees of Boston University Anti-despr-inhibitoren als therapeutika zur hemmung der pathologischen angiogenese und invasivität von tumorzellen sowie zur molekularen bildgebung und gezielten freisetzung
CN101912363A (zh) * 2010-07-29 2010-12-15 蔡海德 溶解超滤-喷雾干燥-分子分散包衣-水化制粒-冷冻干燥生产脂质体组合药物
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
WO2012027716A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Collabrx, Inc. Method to treat melanoma in braf inhibitor-resistant subjects
US8946260B2 (en) 2010-09-16 2015-02-03 Novartis Ag 17α-hydroxylase/C17,20-lyase inhibitors
WO2012042421A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Pfizer Inc. Method of treating abnormal cell growth
US9056865B2 (en) 2010-10-20 2015-06-16 Pfizer Inc. Pyridine-2-derivatives as smoothened receptor modulators
US8987257B2 (en) 2011-01-31 2015-03-24 Novartis Ag Heterocyclic derivatives
EP2673277A1 (de) 2011-02-10 2013-12-18 Novartis AG [1, 2, 4] triazolo [4, 3]pyridazinverbindungen als inhibitoren dec-met-tyrosinkinase
WO2012116040A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors in hepatocellular carcinoma
WO2012116237A2 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Intellikine, Llc Heterocyclic compounds and uses thereof
US20130338152A1 (en) 2011-03-08 2013-12-19 Irm Llc Fluorophenyl bicyclic heteroaryl compounds
WO2012129344A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Amgen Inc. Fused tricyclic dual inhibitors of cdk 4/6 and flt3
WO2012142164A1 (en) 2011-04-12 2012-10-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (igf) i and ii
MX2013009931A (es) 2011-04-18 2013-10-01 Eisai R&D Man Co Ltd Agentes terapeuticos contra tumores.
TR201905909T4 (tr) 2011-04-19 2019-05-21 Pfizer Kanser tedavisi için anti-4-1bb antikorlarının ve adcc indükleyici antikorların kombinasyonları.
JP2014519813A (ja) 2011-04-25 2014-08-21 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー 癌薬剤発見、診断、および治療におけるｅｍｔ遺伝子シグネチャーの使用
EP2702052B1 (de) 2011-04-28 2017-10-18 Novartis AG 17a-hydroxylase/c17,20-lyase hemmer
EP2714937B1 (de) 2011-06-03 2018-11-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarker zur vorhersage und beurteilung des ansprechens von schilddrüsen- und nierenkrebspatienten auf lenvatinibverbindungen
IN2014DN00123A (de) 2011-06-09 2015-05-22 Novartis Ag
WO2012175520A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 Novartis Ag Hydroxy substituted isoquinolinone derivatives
WO2012175487A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 Novartis Ag Cyclohexyl isoquinolinone compounds
PT3409278T (pt) 2011-07-21 2020-12-18 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology Inc Inibidores de proteína cinase heterocíclicos
SG187375A1 (en) 2011-08-04 2013-02-28 Univ Singapore Benzylidene-indolinone compounds and their medical uses
US9745288B2 (en) 2011-08-16 2017-08-29 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds and methods for treating cancer by inhibiting the urokinase receptor
UY34329A (es) 2011-09-15 2013-04-30 Novartis Ag Compuestos de triazolopiridina
JP5914667B2 (ja) 2011-09-22 2016-05-11 ファイザー・インク ピロロピリミジンおよびプリン誘導体
US9783613B2 (en) 2011-10-04 2017-10-10 Igem Therapeutics Limited IgE anti-HMW-MAA antibody
PT2771342T (pt) 2011-10-28 2016-08-17 Novartis Ag Derivados de purina e o seu uso no tratamento de doença
US20140286959A1 (en) 2011-11-08 2014-09-25 Pfizer Inc. Methods of Treating Inflammatory Disorders Using Anti-M-CSF Antibodies
WO2013080141A1 (en) 2011-11-29 2013-06-06 Novartis Ag Pyrazolopyrrolidine compounds
EP2794588A1 (de) 2011-12-23 2014-10-29 Novartis AG Verbindungen zur hemmung der interaktion von bcl2 mit bindungspartnern
CA2859873A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Novartis Ag Compounds for inhibiting the interaction of bcl2 with binding partners
KR20140104047A (ko) 2011-12-23 2014-08-27 노파르티스 아게 Bcl2와 결합 파트너의 상호작용을 억제하기 위한 화합물
KR20140107575A (ko) 2011-12-23 2014-09-04 노파르티스 아게 Bcl2와 결합 파트너의 상호작용을 억제하기 위한 화합물
JP2015503519A (ja) 2011-12-23 2015-02-02 ノバルティス アーゲー Ｂｃｌ２と結合相手の相互作用を阻害するための化合物
CN102491932A (zh) * 2011-12-26 2012-06-13 天津科技大学 一种3-吲哚啉酮类衍生物及其制备方法及其应用
US8815926B2 (en) 2012-01-26 2014-08-26 Novartis Ag Substituted pyrrolo[3,4-D]imidazoles for the treatment of MDM2/4 mediated diseases
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
WO2013149581A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Novartis Ag Combination products with tyrosine kinase inhibitors and their use
WO2013152252A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
EP2849756A1 (de) 2012-05-16 2015-03-25 Novartis AG Dosierungsplan für einen pi-3-kinaseinhibitor
WO2013175417A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Novartis Ag Pyrrolopyrrolidinone compounds
EP2909181B1 (de) 2012-10-16 2017-08-09 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Pkm2-modulatoren und verfahren zu deren verwendung
US9260426B2 (en) 2012-12-14 2016-02-16 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1H-pyrazolo [3, 4-b] pyridine derivatives as salt inducible kinase 2 (SIK2) inhibitors
RU2015115397A (ru) 2012-12-21 2017-01-25 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Аморфная форма производного хинолина и способ его получения
WO2014115077A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 Novartis Ag Substituted purinone compounds
WO2014115080A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 Novartis Ag Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinone compounds as inhibitors of the p53/mdm2 interaction
US10202356B2 (en) 2013-03-14 2019-02-12 Tolero Pharmaceuticals, Inc. JAK2 and ALK2 inhibitors and methods for their use
WO2014151147A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Intellikine, Llc Combination of kinase inhibitors and uses thereof
WO2014155268A2 (en) 2013-03-25 2014-10-02 Novartis Ag Fgf-r tyrosine kinase activity inhibitors - use in diseases associated with lack of or reduced snf5 activity
US9206188B2 (en) 2013-04-18 2015-12-08 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines as ITK and JAK inhibitors
CN105264380B (zh) 2013-05-14 2017-09-05 卫材R&D管理有限公司 用于预测和评价子宫内膜癌受试者对乐伐替尼化合物响应性的生物标志
WO2015008206A1 (en) 2013-07-14 2015-01-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Igf-1r signaling pathway inhibitors useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2015022663A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
US9227969B2 (en) 2013-08-14 2016-01-05 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of MEK
WO2015022664A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
KR20160058960A (ko) 2013-10-04 2016-05-25 압토스 바이오사이언시스 인코포레이티드 암을 치료하기 위한 조성물과 방법
MX357763B (es) 2013-10-18 2018-07-23 Univ Health Network Tratamiento para cancer pancreatico.
US20150141438A1 (en) * 2013-11-15 2015-05-21 Pharmacyclics, Inc. Methods for delaying or preventing the onset of type 1 diabetes
UA115388C2 (uk) 2013-11-21 2017-10-25 Пфайзер Інк. 2,6-заміщені пуринові похідні та їх застосування в лікуванні проліферативних захворювань
TW201605450A (zh) 2013-12-03 2016-02-16 諾華公司 Ｍｄｍ２抑制劑與ＢＲＡＦ抑制劑之組合及其用途
WO2015083101A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Novartis Ag Dosage regimen for an alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor
ES2728932T3 (es) 2014-01-09 2019-10-29 Intra Cellular Therapies Inc Compuestos orgánicos
KR20160137599A (ko) 2014-03-24 2016-11-30 제넨테크, 인크. C-met 길항제로의 암 치료 및 이것과 hgf 발현과의 상관관계
EP4012049A3 (de) 2014-04-04 2022-08-24 Crown Bioscience, Inc. (Taicang) Verfahren zur bestimmung der reaktion auf einen mek/erk-hemmer
WO2015155624A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Pfizer Inc. Dihydropyrrolopyrimidine derivatives
GEP20186879B (en) 2014-04-30 2018-07-10 Pfizer Cycloalkyl-linked diheterocycle derivatives
WO2016001789A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives as pi3k inhibitors for use in the treatment of cancer
EP3174869B1 (de) 2014-07-31 2020-08-19 Novartis AG Kombinationstherapie von einem met-hemmer und einem egfr-hemmer
JP6811706B2 (ja) 2014-07-31 2021-01-13 ザ ホンコン ユニヴァーシティ オブ サイエンス アンド テクノロジー Ｅｐｈａ４に対するヒトモノクローナル抗体及びそれらの使用
LT3524595T (lt) 2014-08-28 2022-09-26 Eisai R&D Management Co., Ltd. Aukšto grynumo chinolino darinys ir jo gamybos būdas
CN104326964A (zh) * 2014-09-16 2015-02-04 中国科学院海洋研究所 一类氟代2-吲哚酮衍生物及其制备和应用
CN105481751A (zh) * 2014-09-16 2016-04-13 中国科学院海洋研究所 一类2-吲哚酮衍生物及其制备和应用
JP6621477B2 (ja) 2014-12-18 2019-12-18 ファイザー・インク ピリミジンおよびトリアジン誘導体ならびにａｘｌ阻害薬としてのそれらの使用
EP3750530B1 (de) 2015-02-05 2025-12-24 TyrNovo Ltd. Kombinationen von irs/stat3-doppelmodulatoren und antikrebsmittel zur behandlung von krebs
US20180028662A1 (en) 2015-02-25 2018-02-01 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for Suppressing Bitterness of Quinoline Derivative
WO2016140717A1 (en) 2015-03-04 2016-09-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Combination of a pd-1 antagonist and a vegfr/fgfr/ret tyrosine kinase inhibitor for treating cancer
HK1251655A1 (zh) 2015-04-20 2019-02-01 Tolero Pharmaceuticals, Inc. 通过线粒体分析预测对阿伏西地的应答
MX382566B (es) 2015-05-01 2025-03-13 Univ Emory Analogos de nucleosidos para el tratamiento de la familia de virus flaviviridae y cancer
TR201911032T4 (tr) 2015-05-18 2019-08-21 Tolero Pharmaceuticals Inc Artırılmış biyoyararlanıma sahip alvocıdıb ön ilaçları.
MX373231B (es) 2015-06-16 2020-05-08 Eisai R&D Man Co Ltd Agente anticancerigeno.
WO2017009751A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives
CN108289861B (zh) 2015-08-03 2021-11-02 大日本住友制药肿瘤公司 用于治疗癌症的组合疗法
CN108135894B (zh) 2015-08-20 2021-02-19 卫材R&D管理有限公司 肿瘤治疗剂
AU2016347881A1 (en) 2015-11-02 2018-05-10 Novartis Ag Dosage regimen for a phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor
AU2016364855B2 (en) 2015-12-03 2019-08-29 Les Laboratoires Servier MAT2A inhibitors for treating MTAP null cancer
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
US10132797B2 (en) 2016-12-19 2018-11-20 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Profiling peptides and methods for sensitivity profiling
CN110366550A (zh) 2016-12-22 2019-10-22 美国安进公司 作为用于治疗肺癌、胰腺癌或结直肠癌的KRAS G12C抑制剂的苯并异噻唑、异噻唑并[3,4-b]吡啶、喹唑啉、酞嗪、吡啶并[2,3-d]哒嗪和吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物
JP6581320B2 (ja) 2017-02-08 2019-09-25 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 腫瘍治療用医薬組成物
RU2019134940A (ru) 2017-05-16 2021-06-16 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Лечение гепатоцеллюлярной карциномы
JOP20190272A1 (ar) 2017-05-22 2019-11-21 Amgen Inc مثبطات kras g12c وطرق لاستخدامها
EP3679040B1 (de) 2017-09-08 2022-08-03 Amgen Inc. Inhibitoren von kras g12c und verfahren zur verwendung davon
US11497756B2 (en) 2017-09-12 2022-11-15 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment regimen for cancers that are insensitive to BCL-2 inhibitors using the MCL-1 inhibitor alvocidib
US20200237766A1 (en) 2017-10-13 2020-07-30 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Pkm2 activators in combination with reactive oxygen species for treatment of cancer
EP3697425A1 (de) 2017-10-18 2020-08-26 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Verfahren und verbindungen zur verbesserten immunzelltherapie
EP3730483B1 (de) 2017-12-21 2023-08-30 Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences Klasse von pyrimidinderivaten als kinaseinhibitoren
MA52496A (fr) 2018-05-04 2021-03-10 Amgen Inc Inhibiteurs de kras g12c et leurs procédés d'utilisation
US11090304B2 (en) 2018-05-04 2021-08-17 Amgen Inc. KRAS G12C inhibitors and methods of using the same
WO2019217691A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
US11096939B2 (en) 2018-06-01 2021-08-24 Amgen Inc. KRAS G12C inhibitors and methods of using the same
JP7357644B2 (ja) 2018-06-11 2023-10-06 アムジエン・インコーポレーテツド がんを処置するためのｋｒａｓ ｇ１２ｃ阻害剤
EP3807276B1 (de) 2018-06-12 2025-12-10 Amgen Inc. Einen piperazinring umfassende kras g12c-inhibitoren und ihre verwendung zur krebsbehandlung
JP2021530554A (ja) 2018-07-26 2021-11-11 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド 異常なａｃｖｒ１発現を伴う疾患を処置するための方法およびそこで使用するためのａｃｖｒ１阻害剤
JP7516029B2 (ja) 2018-11-16 2024-07-16 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ阻害剤化合物の重要な中間体の改良合成法
AU2019384118B2 (en) 2018-11-19 2025-06-12 Amgen Inc. KRAS G12C inhibitors and methods of using the same
JP7377679B2 (ja) 2018-11-19 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド がん治療のためのｋｒａｓｇ１２ｃ阻害剤及び１種以上の薬学的に活性な追加の薬剤を含む併用療法
CN109912490B (zh) * 2018-11-30 2020-10-16 深圳大学 一种吲哚类化合物Plancyindole E及其制备方法
JP2022511029A (ja) 2018-12-04 2022-01-28 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド がんの処置のための薬剤としての使用のためのｃｄｋ９インヒビターおよびその多形
IL283639B2 (en) 2018-12-20 2024-06-01 Amgen Inc Kif18a inhibitors
EP3898616B1 (de) 2018-12-20 2024-10-02 Amgen Inc. Als kif18a-inhibitoren verwendbare heteroarylamide
US12459932B2 (en) 2018-12-20 2025-11-04 Amgen Inc. KIF18A inhibitors
ES2997190T3 (en) 2018-12-20 2025-02-14 Amgen Inc Heteroaryl amides useful as kif18a inhibitors
CA3127502A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Formulations comprising heterocyclic protein kinase inhibitors
AU2020232616A1 (en) 2019-03-01 2021-09-09 Revolution Medicines, Inc. Bicyclic heterocyclyl compounds and uses thereof
WO2020180768A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Revolution Medicines, Inc. Bicyclic heteroaryl compounds and uses thereof
JP2022525149A (ja) 2019-03-20 2022-05-11 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド ベネトクラクスが失敗した急性骨髄性白血病（ａｍｌ）の処置
CN113747895A (zh) 2019-03-22 2021-12-03 大日本住友制药肿瘤公司 包含pkm2调节剂的组合物和用其治疗的方法
EP3738593A1 (de) 2019-05-14 2020-11-18 Amgen, Inc Dosierung von kras-inhibitor zur behandlung von krebserkrankungen
JP7092935B2 (ja) 2019-05-21 2022-06-28 アムジエン・インコーポレーテツド 固体形態
CA3147451A1 (en) 2019-08-02 2021-02-11 Amgen Inc. Kif18a inhibitors
CA3147276A1 (en) 2019-08-02 2021-02-11 Amgen Inc. Kif18a inhibitors
CA3146693A1 (en) 2019-08-02 2021-02-11 Amgen Inc. Kif18a inhibitors
RU2734495C1 (ru) * 2019-09-13 2020-10-19 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ лечения сахарного диабета
AU2020369569A1 (en) 2019-10-24 2022-04-14 Amgen Inc. Pyridopyrimidine derivatives useful as KRAS G12C and KRAS G12D inhibitors in the treatment of cancer
CR20220240A (es) 2019-11-04 2022-08-03 Revolution Medicines Inc Inhibidores de ras
US11608346B2 (en) 2019-11-04 2023-03-21 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
CN114901662A (zh) 2019-11-08 2022-08-12 锐新医药公司 双环杂芳基化合物及其用途
BR112022009390A2 (pt) 2019-11-14 2022-08-09 Amgen Inc Síntese melhorada de composto inibidor de kras g12c
TW202132271A (zh) 2019-11-14 2021-09-01 美商安進公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ抑制劑化合物之改善的合成
WO2021097256A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Cohbar, Inc. Cxcr4 antagonist peptides
CN114980976A (zh) 2019-11-27 2022-08-30 锐新医药公司 共价ras抑制剂及其用途
WO2021142026A1 (en) 2020-01-07 2021-07-15 Revolution Medicines, Inc. Shp2 inhibitor dosing and methods of treating cancer
WO2021155006A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Les Laboratoires Servier Sas Inhibitors of cyclin-dependent kinases and uses thereof
EP4168002A1 (de) 2020-06-18 2023-04-26 Revolution Medicines, Inc. Verfahren zur verzögerung, prävention und behandlung von erworbener resistenz gegen ras-inhibitoren
US11945809B2 (en) 2020-07-19 2024-04-02 King Saud University Isatin derivatives
CA3187757A1 (en) 2020-09-03 2022-03-24 Ethan AHLER Use of sos1 inhibitors to treat malignancies with shp2 mutations
US11690915B2 (en) 2020-09-15 2023-07-04 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
US20240051956A1 (en) 2020-12-22 2024-02-15 Qilu Regor Therapeutics Inc. Sos1 inhibitors and uses thereof
CR20230558A (es) 2021-05-05 2024-01-24 Revolution Medicines Inc Inhibidores de ras para el tratamiento del cáncer
CN118561952A (zh) 2021-05-05 2024-08-30 锐新医药公司 Ras抑制剂
CN117500811A (zh) 2021-05-05 2024-02-02 锐新医药公司 共价ras抑制剂及其用途
IT202100023357A1 (it) 2021-09-09 2023-03-09 Cheirontech S R L Peptidi con attività anti-angiogenica
AR127308A1 (es) 2021-10-08 2024-01-10 Revolution Medicines Inc Inhibidores ras
KR20240115979A (ko) 2021-11-08 2024-07-26 프로젠토스 테라퓨틱스, 인크. 혈소판-유래 성장 인자 수용체(pdgfr) 알파 억제제 및 이의 용도
US20250282782A1 (en) 2021-12-17 2025-09-11 Genzyme Corporation Pyrazolopyrazine compounds as shp2 inhibitors
EP4227307A1 (de) 2022-02-11 2023-08-16 Genzyme Corporation Pyrazolopyrazinverbindungen als shp2-inhibitoren
WO2023158785A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 University Of Houston System Small molecules that treat or prevent viral infections
AU2023230882A1 (en) 2022-03-07 2024-08-22 Amgen Inc. A process for preparing 4-methyl-2-propan-2-yl-pyridine-3-carbonitrile.
CN119136806A (zh) 2022-03-08 2024-12-13 锐新医药公司 用于治疗免疫难治性肺癌的方法
EP4536364A1 (de) 2022-06-10 2025-04-16 Revolution Medicines, Inc. Makrocyclische ras-inhibitoren
EP4601644A1 (de) 2022-10-14 2025-08-20 Black Diamond Therapeutics, Inc. Verfahren zur behandlung von krebs mit isochinolin- oder 6-azachinolinderivaten
CR20250458A (es) 2023-03-30 2025-11-21 Revolution Medicines Inc Composiciones para inducir la hidrólisis de ras gtp y sus usos
WO2024211712A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Revolution Medicines, Inc. Condensed macrocyclic compounds as ras inhibitors
AU2024251341A1 (en) 2023-04-14 2025-10-16 Revolution Medicines, Inc. Crystalline forms of a ras inhibitor
AU2024265078A1 (en) 2023-05-04 2025-12-11 Revolution Medicines, Inc. Combination therapy for a ras related disease or disorder
CN116585307B (zh) * 2023-05-10 2024-08-20 重庆医科大学 5-羟基氧吲哚在制备急性呼吸窘迫综合征治疗药物中的应用
US20250049810A1 (en) 2023-08-07 2025-02-13 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras protein-related disease or disorder
US20250154171A1 (en) 2023-10-12 2025-05-15 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
WO2025137507A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Regor Pharmaceuticals, Inc. Sos1 inhibitors and uses thereof
WO2025155711A1 (en) * 2024-01-17 2025-07-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Lrrk2 inhibitors and compositions and uses thereof
WO2025240847A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
WO2025255438A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras protein-related disease or disorder
WO2025265060A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Revolution Medicines, Inc. Therapeutic compositions and methods for managing treatment-related effects
WO2026006747A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
WO2026015790A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras related disease or disorder
WO2026015796A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras related disease or disorder
WO2026015825A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Revolution Medicines, Inc. Use of ras inhibitor for treating pancreatic cancer
WO2026015801A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras related disease or disorder

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL230368A (de) * 1957-08-19
DE878539C (de) * 1939-08-17 1953-06-05 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von Methinfarbstoffen
BE553661A (de) * 1955-12-23
BE558210A (de) * 1956-06-08
FR1398224A (fr) * 1964-05-06 1965-05-07 Ici Ltd Procédé de teinture de matières textiles de polyacrylonitrile
DE2159360A1 (de) * 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159362A1 (de) * 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159361A1 (de) * 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159363A1 (de) * 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Antimikrobielle mittel
GB1384599A (en) * 1972-05-04 1975-02-19 Colgate Palmolive Co Coloured detergent compositions
US4002749A (en) 1975-08-12 1977-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Substituted indolinones
US4053613A (en) 1975-09-17 1977-10-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones
DE3310891A1 (de) * 1983-03-25 1984-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue indolinon-(2)-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
DE3426419A1 (de) * 1984-07-18 1986-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue oxindol-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4827847A (en) * 1985-05-30 1989-05-09 Her Majesty The Queen In Right Of Canada Short range tubular projectile
JPH078851B2 (ja) * 1985-07-29 1995-02-01 鐘淵化学工業株式会社 ３−フエニルチオメチルスチレン誘導体
JPS6229570A (ja) * 1985-07-29 1987-02-07 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ３，５−ジイソプロピルベンジリデン複素環式化合物
JPS6239564A (ja) * 1985-08-13 1987-02-20 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd α−ベンジリデン−γ−ブチロラクトンまたはγ−ブチロラクタム誘導体
US4966849A (en) * 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
WO1993012786A1 (en) * 1986-07-10 1993-07-08 Howard Harry R Jr Indolinone derivatives
JPS63141955A (ja) * 1986-12-03 1988-06-14 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd トリベンジルアミン誘導体
US5089516A (en) * 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
US5202341A (en) * 1987-03-11 1993-04-13 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hydroxystyrene compounds having tyrosine kinase inhibiting activity
JP2539504B2 (ja) * 1987-03-11 1996-10-02 鐘淵化学工業株式会社 ヒドロキシスチレン誘導体
US5217999A (en) * 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
US4868304A (en) * 1988-05-27 1989-09-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Synthesis of nitrogen heterocycles
GB8816944D0 (en) * 1988-07-15 1988-08-17 Sobio Lab Compounds
GB8816945D0 (en) 1988-07-15 1988-08-17 Ici Plc Polymeric foams
DK0429685T3 (da) * 1989-07-25 1997-12-15 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Oxoindolderivat
GB9004483D0 (en) * 1990-02-28 1990-04-25 Erba Carlo Spa New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation
CA2012634A1 (en) * 1990-03-20 1991-09-20 Hassan Salari Tyrphostins for treatment of allergic, inflammatory and cardiovascular diseases
EP0526488B1 (de) * 1990-04-02 1994-11-30 Pfizer Inc. Benzylphosphonsäure-tyrosinkinaseinhibitoren
US5196446A (en) 1990-04-16 1993-03-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Certain indole compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5302606A (en) * 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
WO1992007830A2 (en) * 1990-10-29 1992-05-14 Pfizer Inc. Oxindole peptide antagonists
US5480883A (en) 1991-05-10 1996-01-02 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
EP0584222B1 (de) 1991-05-10 1997-10-08 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Bis mono- und bicyclische aryl- und heteroarylderivate mit inhibierender wirkung auf die egf und/oder pdgf-rezeptor tyrosinkinase
CA2108889A1 (en) * 1991-05-29 1992-11-30 Robert Lee Dow Tricyclic polyhydroxylic tyrosine kinase inhibitors
GB9115160D0 (en) * 1991-07-12 1991-08-28 Erba Carlo Spa Methylen-oxindole derivatives and process for their preparation
US5124347A (en) * 1991-07-31 1992-06-23 Warner-Lambert Co. 3-5-ditertiarybutylphenyl-4-hydroxymethylidene derivatives of 1,3-dihydro-2H-indole-2-ones as antiinflammatory agents
JPH0558894A (ja) * 1991-08-27 1993-03-09 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 抗腫瘍剤
US5322950A (en) * 1991-12-05 1994-06-21 Warner-Lambert Company Imidazole with angiotensin II antagonist properties
EP0549348A1 (de) * 1991-12-24 1993-06-30 PHARMACIA S.p.A. Arylidene-heterocyclische Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Anwendung als Tyrisine-Kinase Inhibitoren
GB9300059D0 (en) 1992-01-20 1993-03-03 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
FR2689397A1 (fr) * 1992-04-01 1993-10-08 Adir Utilisation des dérivés de la 3-(3,5-Ditert-Butyl-4-Hydroxybenzylidenyl) Indoline-2-one pour l'obtention de médicaments.
WO1993023040A1 (en) 1992-05-20 1993-11-25 Merck & Co., Inc. 17-ethers and thioethers of 4-aza-steroids
FR2694004B1 (fr) * 1992-07-21 1994-08-26 Adir Nouvelles 3-(Hydroxybenzylidényl)-indoline-2-ones et 3-(hydroxybenzylidényl)-indoline-2-thiones, leurs procédés de préparation, et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
WO1994003427A1 (en) * 1992-08-06 1994-02-17 Warner-Lambert Company 2-thioindoles (selenoindoles) and related disulfides (selenides) which inhibit protein tyrosine kinases and which have antitumor properties
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5330992A (en) * 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
DK1975181T3 (da) * 1992-10-28 2011-06-06 Genentech Inc Anvendelse af vaskulære endothelcelle-vækstfaktor-antagonister
FR2698397B1 (fr) 1992-11-20 1995-06-09 Arte Procede d'isolation et de revetement exterieur d'une construction et nouveau type de corniere destinee a sa mise en oeuvre.
DE4239169A1 (de) * 1992-11-21 1994-05-26 Merck Patent Gmbh Cyclobutan - Benzol - Derivate
GB9226855D0 (en) * 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
JP3507124B2 (ja) * 1993-05-26 2004-03-15 塩野義製薬株式会社 ベンジリデン誘導体の製造法
EP0632102B1 (de) * 1993-06-28 1997-04-02 Bayer Ag Massefärben von Kunststoffen
GB9313638D0 (en) * 1993-07-01 1993-08-18 Erba Carlo Spa Arylidene and heteroarylidene oxindole derivatives and process for their preparation
US5502072A (en) * 1993-11-26 1996-03-26 Pfizer Inc. Substituted oxindoles
FR2713431B1 (fr) * 1993-12-01 1996-02-16 Dehaeze Jean Marie Perfectionnement à l'interface "Amplificateur de puissance-enceinte acoustique".
GB9326136D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Erba Carlo Spa Biologically active 3-substituted oxindole derivatives useful as anti-angiogenic agents
GB9412719D0 (en) * 1994-06-24 1994-08-17 Erba Carlo Spa Substituted azaindolylidene compounds and process for their preparation
GB9423997D0 (en) * 1994-11-28 1995-01-11 Erba Carlo Spa Substituted 3-arylidene-7-azaoxindole compounds and process for their preparation
GB9501567D0 (en) * 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
GB9507298D0 (en) * 1995-04-07 1995-05-31 Pharmacia Spa Substituted indolylmethylene-oxindale analogues as tyrosine kinase inhibitors
US5880141A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
ES2201266T3 (es) * 1996-01-17 2004-03-16 Taiho Pharmaceutical Company Limited Inhibidores del espesamiento de la capa intima.
EP0788890A1 (de) * 1996-02-06 1997-08-13 Agfa-Gevaert N.V. Farbstoffe und Farbstoffdonorelemente zur thermischen Farbstoffübertragungsaufzeichnung
WO1997034920A1 (en) * 1996-03-21 1997-09-25 Sugen, Inc. Assays for kdr/flk-1 receptor tyrosine kinase inhibitors
CA2249603A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 Pfizer Inc. Benzyl(idene)-lactam derivatives, their preparation and their use as selective (ant)agonists of 5-ht1a- and/or 5-ht1d receptors
JP3696330B2 (ja) * 1996-04-18 2005-09-14 大鵬薬品工業株式会社 ３−（ジアリールメチレン）オキシインドール誘導体の製造方法
EP0931152A2 (de) 1996-08-21 1999-07-28 Sugen, Inc. Kristallstrukturen einer protein-tyrosin kinase
ATE308520T1 (de) 1996-08-23 2005-11-15 Sugen Inc Kombinatorische bibliotheken von indolinone und verwandte produkte und verfahren zur behandlung von krankheiten
WO1998024432A2 (en) 1996-12-05 1998-06-11 Sugen, Inc. Use of indolinone compounds as modulators of protein kinases
WO1998038984A2 (en) 1997-03-05 1998-09-11 Sugen, Inc. Formulations for hydrophobic pharmaceutical agents
WO1998050356A1 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
AU3363599A (en) 1998-03-26 1999-10-18 Max-Planck Institut Fur Biochemie Heterocyclic families of compounds for the modulation of tyrosine protein kinase
EP1082305A4 (de) 1998-05-29 2001-09-26 Sugen Inc Pyrrol substituierte 2-indolinone wirksam als proteinkinase-hemmer

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6525072B1 (en) 1998-08-31 2003-02-25 Sugen, Inc. Geometrically restricted 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
US6642251B1 (en) 1998-08-31 2003-11-04 Sugen, Inc. Geometrically restricted 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity

Also Published As

Publication number Publication date
CA2192797C (en) 2006-05-16
GR3036315T3 (en) 2001-10-31
EP0769947B1 (de) 2001-05-02
CN1268333C (zh) 2006-08-09
EP0934931A2 (de) 1999-08-11
AU6044196A (en) 1996-12-30
HK1011933A1 (en) 1999-07-23
AU706597C (en) 2001-10-18
AR003088A1 (es) 1998-07-08
PT769947E (pt) 2001-10-31
US20030176487A1 (en) 2003-09-18
HK1001121A1 (en) 1998-05-29
AU706597B2 (en) 1999-06-17
DK0769947T3 (da) 2001-08-13
US5880141A (en) 1999-03-09
US5792783A (en) 1998-08-11
CN1155838A (zh) 1997-07-30
JP2000026412A (ja) 2000-01-25
DE69612649D1 (de) 2001-06-07
JPH10504323A (ja) 1998-04-28
HU226755B1 (en) 2009-09-28
US5883113A (en) 1999-03-16
US6225335B1 (en) 2001-05-01
NO965377L (no) 1997-02-12
NZ310109A (en) 1999-01-28
US6469032B2 (en) 2002-10-22
HUP9701694A2 (hu) 1999-06-28
MX9606401A (es) 1998-01-31
US5834504A (en) 1998-11-10
US5886020A (en) 1999-03-23
EP0769947A4 (de) 1998-09-30
JP3231044B2 (ja) 2001-11-19
US20010027207A1 (en) 2001-10-04
AR037562A2 (es) 2004-11-17
EP0934931A3 (de) 1999-10-20
CA2192797A1 (en) 1996-12-19
ATE200863T1 (de) 2001-05-15
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