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DE69612649T2 - Indolinonverbindungen zur behandlung von krankheiten - Google Patents

Indolinonverbindungen zur behandlung von krankheiten

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DE69612649T2
DE69612649T2 DE69612649T DE69612649T DE69612649T2 DE 69612649 T2 DE69612649 T2 DE 69612649T2 DE 69612649 T DE69612649 T DE 69612649T DE 69612649 T DE69612649 T DE 69612649T DE 69612649 T2 DE69612649 T2 DE 69612649T2
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DE
Germany
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indolinone
methylene
alkyl
aryl
cells
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DE69612649T
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Gerald Mcmahon
Sun
Peng Cho Tang
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Sugen LLC
Original Assignee
Sugen LLC
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Publication date
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die fähig sind, die Tyrosinkinase-Signalweiterleitung zu modulieren, regulieren und/oder zu inhibieren. Die Verbindungen der Erfindung können in Verfahren zur Regulation, Modulation oder Inhibition von Tyrosinkinasen, ungeachtet ob der Rezeptor- oder der Nicht- Rezeptorklasse angehörig, bei der Vorbeugung und/oder Behandlung von Krankheiten und Störungen, die mit unregulierter Signalweiterleitung durch Tyrosinkinasen verbunden sind, einschließlich der Zellproliferation und metabolischen Störungen, eingesetzt werden.
  • 2. Protein-Tyrosinkinasen (PTKs) umfassen eine große und diverse Klasse von Proteinen mit enzymatischer Aktivität. Die PTKs spielen eine wichtige Rolle in der Kontrolle von Zeliwachstum und Differenzierung (für einen Überblick siehe Schfessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383-391).
  • Zum Beispiel wird die Rezeptor-Tyrosinkinase vermittelte Signalweiterleitung durch extrazelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) eingeleitet, die von der Rezeptordimerisierung, der transienten Stimulation der intrinsischen Protein-Tyrosinkinaseaktivität und Phosphorylierung gefolgt wird. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle geschaffen und dies führt zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmatischen Signalmolekülen, die die geeignete zelluläre Antwort erleichtern (z. B. Zellteilung, metabolische Effekte auf die extrazelluläre Mikroumgebung). Siehe Schlessinger & Ullrich, 1992, Neurori 9: 383-391.
  • Für Rezeptor-Tyrosinkinasen ist ebenfalls gezeigt worden, dass Tyrosinphosphorylierungsstellen als Bindungsstellen mit hoher Affinität für SH2- (src Homologie) Domänen von Signalmolekülen dienen. Fantl et al.; 1992, Cell69: 413- 423; Songyang et al.; 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785); Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778; und Koch et al., 1991, Science 252: 668-678. Es sind verschiedene intrazelluläre Substratproteine identifiziert worden, die mit Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) assoziieren. Diese können in zwei prinzipielle Gruppen unterteilt werden: (1) Substrate, die eine katalytische Domäne haben, und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, aber als Adaptoren dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Die Spezifität der Interaktion zwischen Rezeptoren oder Proteinen und SH2-Domänen ihrer Substrate wird durch die Aminosäurereste bestimmt, die den phosphorylierten Tyrosinrest unmittelbar umgeben. Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2- Domänen und den den Phosphotyrosinrest umgebenden Aminosäuresequenzen in bestimmten Rezeptoren, sind konsistent mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofil. Songyang et al., 1993, Cell72: 767-778. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die Funktion einer jeden Rezeptor- Tyrosinkinase nicht nur durch ihr Expressionsmuster und die Verfügbarkeit des Liganden bestimmt wird, sondern ebenfalls durch die Anordnung von stromabwärts gelegenen Signalweiterleitungswegen, die durch einen bestimmten Rezeptors aktiviert werden. Daher stellt die Phosphorylierung einen wichtigen regulatorischen Schritt dar, der die Selektivität der Signalweiterfeitungswege, die durch spezifische Wachstumsfaktor-Rezeptoren angeschaltet werden, sowie der von Differenzierungsfaktor-Rezeptoren bestimmt.
  • Aberrierende Expression oder Mutationen in den PTKs haben gezeigt, dass dies entweder zu unkontrollierter Zellproliferation (z. B. malignes Tumorwachstum) oder zu Defekten in Schlüsselprozessen der Entwicklung führen. Daher hat die biomedizinische Gemeinde erhebliche Mittel aufgewendet, um die spezifische biologische Rolle von Mitgliedern der PTK-Familie, ihre Funktion in Differenzierungsprozessen, ihre Beteiligung bei der Tumorentstehung und anderen Krankheiten, die biochemischen Mechanismen, die ihren Signalweiterleitungswegen, die nach der Stimulation durch Liganden aktiviert werden, zugrunde liegen, sowie die Entwicklung von neuen Medikamenten ausfindig zu machen.
  • Tyrosinkinasen können dem Rezeptortyp (der extrazelluläre, Transmembran- und intrazelluiäre Domänen aufweist) oder dem Nicht-Rezeptortyp (der vollständig ntrazellulär vorliegt) angehören.
  • Rezeptor-Tyrosinkinasen. Die RTKs umfassen eine große Anzahl von Fransmembranrezeptoren mit diversen biologischen Aktivitäten. Die intrinsische Funktion von RTKs wird infolge der Ligandenbindung aktiviert, die zur Phosphorylierung des Rezeptors und zahlreichen zellulären Substraten führt und nachfolgend zu einer Vielzahl von zellulären Antworten. Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212.
  • Zur Zeit sind zumindest neunzehn (19) verschiedene RTK-Subfamilien identifiziert worden. Von einer RTK-Subfamilie, die als die HER-Subfamilie bezeichnet wird, wird angenommen, dass sie von EGFR, HER2, HER3 und HER4 umfaßt wird. Liganden der HER-Subfamilie von Rezeptoren schließen den epithelialen Wachstumsfaktor (EGF), TGF-α, Amphiregulin, HB-EGF, Betazellulin und Heregulin ein.
  • Eine zweite Familie von RTKs, die als die Insulin-Subfamilie bezeichnet wird, wird von INS-R, IGF-1R und dem IR-R umfaßt. Eine dritte Familie, die "PDGF"- Subfamilie schließt die PDGF α und β Rezeptoren, CSFIR, c-kit und FLK-11 ein. Von einer anderen Subfamilie der RTKs, die als die FLK-Familie identifiziert wurde, wird angenommen, dass sie von dem Kinaseinsertions-Domäne-Rezeptor fötale Leberkinase-1 (KDR/FLK-1), der fötalen Leberkinase 4 (FLK-4) und der fms-artigen Tyrosinkinase 1 (flt-1) umfaßt wird. Von allen diesen Rezeptoren wurde anfänglich angenommen, dass sie Rezeptoren für hemapoietische Wachstumsfaktoren sind. Zwei andere Subfamilien der RTKs sind als die FGF-Rezeptorfamilie (FGFR1, FGFR2, FGFR3 und FGFR4) und die Met-Subfamilie (c-met und Ron) bezeichnet worden.
  • Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den PDGF- und FLK- Subfamilien werden die zwei Subfamilien oftmals zusammen betrachtet. Die bekannten RTK Subfamilien sind in Plowman et al., 1994, DN&P 7(6): 334-339 genannt.
  • Die Nichtrezeptor-Tyroslnklnasen. Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen stellen eine Ansammlung von zellulären Enzymen dar, denen extrazelluläre und Transmembransequenzen fehlen. Zur Zeit sind über vierundzwanzig individuelle Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen, einschließlich elf (11) Subfamilien (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack und LIMK) identifiziert worden. Zur Zeit umfaßt die Src-Subfamilie der Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen die größte Anzahl von PTKs und schließt Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk ein. Die Src-Subfamilie der Enzyme ist mit der Onkogenese in Verbindung gebracht worden. Eine ausführlichere Diskussion von Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen ist in Bolen, 1993, Oncogene 8: 2025- 2031 zu finden.
  • Für viele der Tyrosinkinasen, ungeachtet, ob eine RTK oder eine Nichtrezeptor- Tyrosinkinase, wurde gefunden, dass sie an zellulären Signalweiterleitungswegen beteiligt sind, die zu zellulären Signaltests, Signalweiterleitungswegen führen, die ihrerseits zu pathogenen Zuständen, einschließlich Krebs, Schuppenflechte und Hyperimmunantwort führen.
  • Entwicklung von Verbindungen zur Modulierung von PTKs. Angesichts der vermuteten Bedeutung von PTKs für die Kontrolle, Regulation und Modulation der Zellproliferation, der Krankheiten und Störungen, die mit abnormer Zellprolifertation verbunden sind, sind viele Versuche unternommen worden, um "Inhibitoren" von Rezeptor- und Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen zu identifizieren, wobei eine Vielzahl von Vorgehensweisen, einschließlich der Verwendung von mutierten Liganden (US- Patentanmeldung Nr. 4,966,846), löslichen Rezeptoren und Antikörpern (Anmelde- Nr. WO 94/10202; Kendaü & Thomas, 1994, Proc. Nat'l Acad. Sci 90: 10705-09; Kim, et al., 1993, Nature 362 : 841-844), RNA Liganden (Jellinek, et al., Biochemistry 33: 841-844); Takano, et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella, et al., 1992, Exp. Cell Res. 199: 56-62; Wright, et al., 1992, J. Cellular Phys. 152: 448-57) und Tyrosinkinase-Inhibitoren (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; U. S. Patent Nr. 5,330,992; Mariani, et at., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35: 2268) verwendet wurden.
  • Kürzlich wurden Versuche unternommen, kleine Moleküle zu identifizieren, die als Tyrosinkinase-Inhibitoren wirken. Zum Beispiel sind bismonocyclische, bicyclische oder heterocyclische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylen-Azaindolderivate (PCT WO 94/14808) und 1-Cyciopropyl-4-pyridyl-chinolone (US- Patent 5,330,992) allgemein als Tyrosinkinase-Inhibitoren beschrieben worden. Styrylverbindungen (US-Patent 5,217,999), styrylsubstituierte Pyridylverbindungen (JS-Patent 5,302,606), bestimmte Chinazolinderivate (EP-Anmeldung 0 566 266 A1), Selenoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyclische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91 /15495) sind als Verbindungen für die Verwendung als Tyrosinkinase-Inhibitoren zum Einsatz bei der Krebsbehandlung beschrieben worden.
  • Die Identifikation von wirksamen kleinen Verbindungen, die die Signaltransduktion spezifisch inhibieren, indem sie die Aktivität von Rezeptor- und Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen modulieren, um abnorme oder nicht hinnehmbare Zellproliferation zu regulieren und zu modulieren, ist daher wünschenswert und die Aufgabe dieser Erfindung.
  • 3. Die vorliegende Erfindung betrifft daher organische Moleküle, die in der Lage sind, die Signalweiterleitung durch Tyrosinkinasen zu modulieren, regulieren und/oder zu inhibieren. Solche Verbindungen sind für die Behandlung von Krankheiten geeignet, die mit unregulierter TKS-Weiterleitung verbunden sind, einschließlich zellproliferatorischer Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose, Arthritis und Restenose sowie metabolische Krankheiten wie Diabetes.
  • In einer beispielgebenden Ausführungsform haben die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Formel:
  • und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, wobei:
  • R&sub1; H ist;
  • R&sub2; O oder S ist;
  • R&sub3; Wasserstoff ist;
  • R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R, und CONRR' besteht;
  • A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Thiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3,-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4- Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4- Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazofund Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R und CONRR' besteht;
  • n 0-3 ist;
  • R H, Alkyl oder Aryl ist und
  • R' H, Alkyl oder Aryl ist,
  • wobei in den obigen Definitionen:
  • Alkyl sich auf ein gradkettiger, verzweigter oder cyclischer saturierter aliphatischer Kohlenwasserstoff bezieht mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxy, Cyano, =O, =S, NO&sub2;, Halogen, N(CH&sub3;)&sub2;, Amino und -SH besteht;
  • Aryl sich auf aromatische Gruppe bezieht, die mindestens einen Ring hat, der ein konjugiertes pi-Elektronensystem hat, einschließlich carbocyclische Aryl-, heterocyclische Aryl- und Biaryl-Gruppen und gegebenenfalls substituiert mit einer oder mehreren Substituenten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Halogen, Trihalomethyl, Hydroxyl, SH, OH, NO&sub2;, Amin, Thioether, Cyano, Alkoxy, Alkyl, Alkyl und Amino besteht;
  • Alkaryl sich auf ein Alkyl bezieht, das an einer Arylgruppe kovalent gebunden ist; und
  • Alkoxy, Aryloxy bzw. Alkaryloxy sich auf eine -O-Alkyl-, -O-Aryl- bzw. -O- Alkaryl-Gruppe beziehen;
  • mit der Maßgabe, daß die folgenden Verbindungen ausgenommen sind:
  • 3-(pyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon;
  • 3-(5-chlor-3,4-dimethylpyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon;
  • 3-(3,5-dimethyl-4-ethylpyrrol-2-yl)-2-indolinon;
  • 3-(3,5-dimethyl-4-efihoxycarbonylpyrrol-2-yl)-2-indolinon;
  • Benzoesäure, 2-[[[1-ethyl-2,3-dihydro-2-oxo-3-(1H-pyrrol-2-ylmethylen)-1Hindol-5-yl]oxy]methyl]-;
  • 3-[(1-methyl-5-nitro-imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
  • 3-(thien-2-ylmethylen)-2-indolinon;
  • 1H-Indol-7-essigsäure, 3-[(2-butyl-1H-imidazol-4-yl)methylen]-2,3-dihydro-2- oxo-, Ethylester;
  • 1 H-Indol-7-essigsäure, 3-[[2-butyl-1-[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]-1H-imidazol- 4-yl]methylen]-2,3-dihydro-2-oxo-, Ethylester;
  • 5-benzoyl-3-[(imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
  • 6-diethylamino-3-[(isothiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
  • 5-chlor-3-[(thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon; und
  • 6-nitro-3-[(pyrro(-2-yl)methylen]-2-indolinon.
  • In einer anderen beispielgebenden Ausführungsform haben die Verbindungen der vorliegenden Erfindung folgende Formel:
  • und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, wobei:
  • R&sub1; H ist;
  • R&sub2; O oder S ist;
  • R&sub3; Wasserstoff ist;
  • R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R, und CONRR' besteht;
  • A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Pyrazol, 1,2,3,-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2- Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3,-Oxadiazol, 1,2,4,-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4,-Oxadiazol, 1,2,3,4,-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3,-Thiadiazol, 1,2,4,- Thiadiazol, 1,2,5,-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4-Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazol und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R und CONRR' besteht;
  • n 0-3 ist;
  • R H, Alkyl oder Aryl ist, und R' H, Alkyl oder Aryl ist, mit der Maßgabe, daß die Verbindungen 6-diethylamino-3-[(isothiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon und 5- chlor-3-[(thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon ausgeschlossen sind; wobei in den obigen Definitionen Alkyl, Aryl, Alkaryl, Alkoxy, Aryloxy und Alkaryloxy jene Definitionen wie oben angegeben haben.
  • Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, die eine pharmazeutisch wirksame Menge der oben beschriebenen Verbindungen der Formeln I und II einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger umfaßt. Von einer solchen Zusammensetzung wird angenommen, dass sie die Signalweiterleitung durch eine Tyrosinkinase moduliert, entweder durch Inhibition der katalytischen Aktivität, Affinität gegenüber ATP oder der Fähigkeit, mit einem Substrat zu interagieren.
  • Insbesondere können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die proliferatorische, fibrotische oder metabolische Störungen umfassen, z. B. Krebs, Fibrose, Schuppenflechte, Arteriosklerose, Arthritis und andere Störungen, die mit abnormer Vasculogenese und/oder Angiogenese verbunden sind, wie die diabetische Retinopathie.
    • 4. Detaillierte Beschreibung der Erfindung 4.1 Definitionen
  • "Pharmazeutisch annehmbares Salz" bezieht sich auf diejenigen Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen beibehalten, und die durch Reaktion mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen erhalten werden.
  • "Alkyl" bezieht sich auf geradkettige, verzweigte oder cyclische gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffe. Vorzugsweise hat die Alkylgruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Insbesondere ist sie eine Niederalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Typische Alkylgruppen schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Tertiärbutyl, Pentyl, Hexyl und dergleichen ein. Die Alkylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxy, Cyano, Alkoxy, =O, =S, NO&sub2;, Halogen, N(CH&sub3;)&sub2; Amin und SH besteht.
  • "Alkenyl" bezieht sich auf eine geradkettige, verzweigte oder cyclische ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, die zumindest eine Kohlenstoff-Kohlenstoff- Doppelbindung enthält. Vorzugsweise besitzt die Alkenylgruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Insbesondere ist sie eine Niederalkenylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Die Alkenylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxyl, Cyano, Alkoxy, =O, =S, NO&sub2;, Halogen, N(CH&sub3;)&sub2; Amin und SH besteht.
  • "Alkinyl" bezieht sich auf eine geradkettige, verzweigte oder cyclische ungesättigte Kohlenwasserstoffeinheit, die zumindest eine Kohlenstoff-Kohlenstoff- Dreifachbindung enthält. Vorzugsweise besitzt die Alkinylgruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Vorzugsweise ist sie eine Niederalkinylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Die Alkinylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxyl, Cyano, Alkoxy, =O, =S, NO&sub2;, Halogen, N(CH&sub3;)&sub2; Amino und SH besteht.
  • "Alkoxy" bezieht sich auf eine "-Oalkyl"-Gruppe.
  • "Aryl" bezieht sich auf eine aromatische Gruppe, die zumindest einen Ring mit einem konjugierten pi-Elektronsystem besitzt und schließt carbocyclische Aryl-, heterocyclische Aryl- und Biarylgruppen ein. Die Arylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Halogen, Trihalomethyl, Hydroxyl, SH, OH, NO&sub2;, Amin, Thioether, Cyano, Alkoxy, Alkyl und Amino besteht.
  • "Alkaryl" bezieht sich auf einen Alkylrest, der kovalent an eine Arylgruppe gebunden ist. Vorzugsweise ist die Alkylgruppe eine Niederalkylgruppe.
  • "Carbocyclisches Aryl" bezieht sich auf eine Arylgruppe, wobei die Ringatome Kohlenstoffe sind.
  • "Heterocyclisches Aryl" bezieht sich auf eine Arylgruppe mit 1 bis 3 Heteroatomen als Ringatome, wobei der Rast der Ringatome Kohlenstoffe sind.
  • Heteroatome schließen Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff ein. Daher schließen heterocyclische Arylgruppen Furanyl, Thienyl, Pyrridyl, Pyrroiyl, N-Niederalkylpyrrol, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Imidazolyl und dergleichen ein.
  • "Amid" bezieht sich auf -C(O)-NH-R, wobei R Alkyl, Aryl, Alkylaryl oder Wasserstoff ist.
  • "Thioamid" bezieht sich auf -C(S)-NH-R, wobei R Alkyl, Aryl, Alkylaryl oder Wasserstoff ist.
  • "Amin" bezieht sich auf eine -N(R')R" Gruppe, wobei R' und R" aus der Gruppe unabhängig ausgewählt werden, die aus Alkyl, Aryl und Alkylaryl besteht.
  • "Thioether" bezieht sich auf -S-R, wobei R Alkyl, Aryl oder Alkylaryl ist.
  • "Sulfonyl" bezieht sich auf -S(O)&sub2;-R, wobei R Aryl, C(CN)=C-Aryl, CH&sub2;CN, Alkyaryl, Sulfonamid, NH-Alkyl, NH-Alkylaryl, oder NH-Aryl ist.
    • 4.2. Erfindungsgegenstand
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die fähig sind, die Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen, und insbesondere Signaltransduktion durch Rezeptor- und Nichtrezeptor-Tyrosinkinase zu regulieren und/oder zu modulieren.
  • Die von Rezeptor-Tyrosinkinasen vermittelte Signaltransduktion wird durch extrazelluläre Interaktion mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, gefolgt von Rezeptordimerisierung, transienter Stimulation der intrinsischen Protein- Tyrosinkinaseaktivität und Phosphorylierung. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaftransduktionsmoleküle geschaffen und dies führt zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmatischen Signalmolekülen, die die geeignete zelluläre Antwort erleichtern (z. B. Zellteilung, metabolische Effekte auf die extrazelluläre Mikroumgebung). Siehe Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383- 391.
  • Es wurde gezeigt, dass Tyrosin-Phosphorylierungsstellen in Wachstumsfaktor- Rezeptoren als Bindungsstellen mit hoher Affinität für SH2- (Src Homologie) Domänen von Signalmolekülen dienen. Fantl et al., 1992, Cell 69: 413423; Songyang et al., 1994, MoL Cell. Biol. 14: 2777-2785); Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778; und Koch et al., 1991, Science 252: 668-678. Es sind verschiedene intrazelluläre Substratproteine identifiziert worden, die mit Rezeptor-Tyrosinkinasen assoziieren. Diese können in zwei allgemeine Gruppen eingeteilt werden: (1) Substrate mit einer katalytischen Domäne, und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, die jedoch als Adaptoren dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Die Spezifität der Interaktionen zwischen Rezeptoren und SH2 Domänen ihrer Substrate wird durch die Aminosäurereste bestimmt, die den phosphorylierten Tyrosinrest unmittelbar umgeben. Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domänen und den den Phosphortyrosinrest umgebenden Aminosäuresequenzen in bestimmten Rezeptoren sind mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofilen konsistent. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767- 778. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die Funktion von jeder der Rezeptor-Tyrosinkinasen nicht nur durch ihr Expressionsmuster und die Verfügbarkeit des Liganden bestimmt wird, sondern ebenfalls durch die Anordnung der stromabwärts gelegenen Signaltransduktionswege, die durch einen bestimmten Rezeptor aktiviert werden. Daher stellt die Phosphorylierung einen wichtigen regulatorischen Schritt dar, der die Selektivität des Signalweges, der durch spezifische Wachstumsfaktor-Rezeptoren angeschaltet wird, sowie die der Differenzierungsfaktor-Rezeptoren bestimmt.
  • Die Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen führt unter anderen Antworten zur Zellproliferation, Differenzierung und Metabolismus. Eine abnorme Zellproliferation kann zu einer großen Anzahl von Störungen und Krankheiten führen, einschließlich der Entwicklung von Neoplasmen wie Karzinomen, Sarkomen, Leukämien, Glioblastomen, Hämangiomen, Schuppenflechte, Arteriosklerose, Arthritis, sowie diabetischer Retinopathie (oder anderen Störungen, die mit unkontrollierter Angiogenese und/oder Vasculogenese verbunden sind).
  • Diese Erfindung ist daher auf Verbindungen gerichtet, die die durch Tyrosinkinasen vermittelte Signaltransduktion regulieren, modulieren und/oder inhibieren, indem sie auf die enzymatische Aktivität der RTKs und/oder Nichtrezeptortyrosinkinasen einwirken und das von solchen Proteinen weitergeleitete Signal stören, ist Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf Verbindungen gerichtet, die die von RTKs und/oder Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen vermittelten Signalweiterleitungswege modulieren und/oder inhibieren als ein therapeutischer Ansatz, um Leukämie und viele Arten von festen Tumoren zu heilen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Karzinome, Sarkome, Erythroblastome, Gliobfastome, Meningiome, Astrozytome, Melanome und Myoblastome. Indikationen können Hirnkrebse, Blasenkrebse, Gebärmutterkrebse, Magenkrebse, Pankreaskrebse, Darmkrebse, Blutkrebse, Lungenkrebse und Knochenkrebse einschließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
    • 4.3 Die Verbindungen
  • In einer allgemeinen Ausführungsform stellt die Erfindung Verbindungen bereit, die die folgende Formel besitzen:
  • und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, wobei:
  • R&sub1; H ist;
  • R&sub2; O oder S ist;
  • R&sub3; Wasserstoff ist;
  • R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R, und CONRR' besteht;
  • A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Thiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3,-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4- Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4- Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazol und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R und CONRR' besteht;
  • n 0-3 ist;
  • R H, Alkyl oder Aryl ist und
  • R' H, Alkyl oder Aryl ist,
  • wobei in den obigen Definitionen:
  • Alkyl sich auf ein gradkettiger, verzweigter oder cyclischer saturierter aliphatischer Kohlenwasserstoff bezieht, mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxy, Cyano, =O, =S, NO&sub2;, Halogen, N(CH&sub3;)&sub2;, Amino und -SH besteht;
  • Aryl sich auf aromatische Gruppe bezieht, die mindestens einen Ring hat, der ein konjugiertes pi-Elektronensystem hat, einschließlich carbocyclische Aryl-, heterocyclische Aryl- und Biaryl-Gruppen und gegebenenfalls substituiert mit einer oder mehreren Substituenten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Halogen, Trihalomethyi, Hydroxyl, SH, OH, NO&sub2;, Amin, Thioether, Cyano, Alkoxy, Alkyl, Alkyl und Amino besfieht;
  • Alkaryl sich auf ein Alkyl bezieht, das an einer Arylgruppe kovalent gebunden ist; und
  • Alkoxy, Aryloxy bzw. Alkaryloxy sich auf eine -O-Alkyl-, -O-Aryl- bzw. -O- Alkaryl-Gruppe beziehen;
  • mit der Maßgabe, daß die folgenden Verbindungen ausgenommen sind:
  • 3-(pyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon;
  • 3-(5-chlor-3,4-dimethylpyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon;
  • 3-(3,5-dimethyl-4-ethylpyrrol-2-yl)-2-indolinon;
  • 3-(3,5-dimethyl-4-ethoxycarbonylpyrrol-2-yl)-2-indofinon;
  • Benzoesäure, 2-[[[1-ethyl-2,3-dihydro-2-oxo-3-(1H-pyrrol-2-ylmethylen)-1Hindol-5-yl]oxy]methyl]-;
  • 3-[(1-methyl-5-nitro-imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
  • 3-(thien-2-ylmethylen)-2-indolinon;
  • 1H-Indol-7-essigsäure, 3-[(2-butyl-1H-imidazol-4-yl)methylen]-2,3-dihydro-2- oxo-, Ethylester;
  • 1H-Indol-7-essigsäure, 3-[[2-butyl-1-[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]-1H-imidazol- 4-yl]methylen]-2,3-dihydro-2-oxo-, Ethylester;
  • 5-benzoyl-3-[(imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
  • 6-diethylamino-3-[(isothiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
  • 5-chlor-3-[(thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon; und
  • 6-nitro-3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon.
  • In einer anderen Ausführungsfarm sieht die Erfindung Verbindungen der folgenden Formel vor:
  • und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, wobei:
  • R&sub1; H ist;
  • R&sub2; O oder S ist;
  • R&sub3; Wasserstoff ist;
  • R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R, und CONRR' besteht;
  • A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Thiophen, Pyrrol, Parazol, Imidazol, 1,2,3,-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Aikylfuran, 1,2,3,-Oxadiazol, 1,2,4,- Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4,-Oxadiazol, 1,2,3,4,-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3,-Thiadiazol, 1,2,4,-Thiadiazol, 1,2,5,-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4- Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazol und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R und CONRR' besteht;
  • n 0-3 ist;
  • R H, Alkyl oder Aryl ist, und
  • R' H, Alkyl oder Aryl ist, mit der Maßgabe, daß die folgenden Verbindungen ausgeschlossen sind: 6-diethylamino-3-[(isothiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon und 5- chlor-3-[(thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon, wobei in den obigen Definitionen Alkyl, Aryl, Alkaryl, Alkoxy, Aryloxy und Alkaryloxy jene Definitionen wie oben angegeben haben.
  • Die chemischen Formeln, auf die hier Bezug genommen wird, können das Phänomen der Tautomerisierung oder der strukturellen Isomerisierung zeigen. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Verbindungen eine cis- oder trans- Konformation in Bezug zur Doppelbindung, die den 3-Substituenten des Indolinon mit dem fndolinonring verknüpft, aufweisen, oder können ein Gemisch von cis- oder trans-Isomeren sein. Da die Formelabbildungen in der Beschreibung nur eine mögliche Tautomer- oder Strukturisomer-Form darstellen können, sollte es selbstverständlich sein, dass die Erfindung jede tautomere oder strukturell isomere Form oder Mischungen davon umfaßt, die die Fähigkeit besitzen, die Tyrosinkinase- Signaltransduktion oder die Zellproliferation zu regulieren, inhibieren und/oder zu modulieren und ist nicht auf eine der tautomeren oder strukturell isomeren Formen beschränkt, die in den Formeldarstellungen verwendet werden.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Verbindungen und ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen ist die Erfindung weiterhin gerichtet, soweit anwendbar, auf solvatisierte sowie unsolvatisierte Formen der Verbindungen (z. B. hydratisierte Formen), die die Fähigkeit besitzen, die Zellproliferation zu regulieren und/oder zu modulieren.
  • Die hier beschriebenen Verbindungen können durch jedes beliebige Verfahren hergestellt werden, von dem bekannt ist, dass es für die Herstellung von chemisch ähnlichen Verbindungen verwendet werden kann. Geeignete Verfahren werden in den Beispielen veranschaulicht. Notwendige Ausgangsmaterialien können durch Standardverfahren der organischen Chemie erhalten werden.
  • Die Aktivität und Wirksamkeit einer individuellen Verbindung als ein Mittel, um die Rezeptor-Tyrosinkinase vermittelte Signaltransduktion zu beeinflussen, kann unter Verwendung der verfügbaren Techniken bestimmt werden. Vorzugsweise wird eine Verbindung einer Serie von Screening-Versuchen unterworfen, um die Fähigkeit der Verbindung, die Zellproliferation zu modulieren, regulieren und/oder zu inhibieren, zu bestimmen. Diese Screening-Versuche umfassen - in der Reihenfolge, in der sie durchgeführt werden - biochemische Tests, Zellwachstumstests und in vivo- Experimente.
    • 4.4 Indikationen
  • Die hier beschriebenen Verbindungen sind zur Behandlung von Störungen verwendbar, die mit der unregulierten Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen verbunden sind, einschließlich Störungen der Zellproliferation, fibrotische Störungen und metabolische Störungen.
  • Störungen der Zellproliferationen, die mit Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt oder untersucht werden kännen, schließen Krebse, proliferatorische Störungen von Blutgefäßen und proliferatorische Störungen von Mesangialzellen ein.
  • Proliferatorische Störungen von Blutgefäßen betreffen angiogenetische und vasculogenetische Stärungen, die üblicherweise zur abnormen Proliferation von Blutgefäßen führen. Die Bildung und Verbreitung von Blutgefäßen, oder die Vasculoginese bzw. Angioginese, spielt bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen wie der Embryonalentwicklung, der Bildung des Corpus luteum, der Wundheilung und der Organregeneration eine bedeutende Rolle. Sie spielen ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Krebsentwicklung. Andere Beispiele von proliferatorischen Störungen der Blutgefäße schließen Arthrose ein, bei der neue Kapillarbfutgefäße in die Gelenke einwandern und Knorpel zerstören, und Augenkrankheiten wie die diabetische Retinopathie, bei der neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper einwandern, bluten und Blindheit verursachen. Umgekehrt sind Störungen, die mit der Schrumpfung, Kontraktion oder dem Verschließen von Blutgefäßen verbunden sind, wie die Restenose, ebenfalls daran beteiligt.
  • Fibrotische Störungen beziehen sich auf die abnorme Bildung von extrazellulärer Matrix. Beispiele von fibrotischen Störungen schließen hepatitische Zirrhose und proliferatorische Störungen von Mesangialzellen ein. Die hepatitische Zirrhose ist durch die Zunahme von extrazellulären Matrixbestandteilen gekennzeichnet, was zur Bildung von hepatitischen Narben führt. Die hepatitische Zirrhose kann Krankheiten wie die Leberzirrhose verursachen. Eine Zunahme der extrazellulären Matrix, die zu hepatitischen Narben führt, kann ebenfalls durch virale Infektionen wie der Hepatitis verursacht werden. Lipocyten scheinen eine Hauptrolle bei der hepatitischen Zirrhose zu spielen. Andere fibrotische Störungen, die betroffen sind, schließen Arteriosklerose ein (siehe unten).
  • Proliferatorische Störungen von Mesangialzellen beziehen sich auf Störungen, die durch die abnorme Proliferation von Mesangialzellen verursacht werden. Mesangiale proliferatorische Störungen schließen zahlreiche Nierenkrankheiten beim Menschen wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropathie, maligne Nephrosklerose, thrombotische mikroangiopathische Syndrome, Transplantatabstoßungen und Glomerulopathien ein. Der PDGF-R ist am Erhalt der mesanagialen Zellproliferation beteiligt. Floege et al., 1993, Kidney Infernational 43: 47S-54S.
  • PTKs sind mit solchen Störungen der Zellproliferation in Zusammenhang gebracht worden. Zum Beispiel sind einige Mitglieder der RTK Familie mit der Entwicklung von Krebs in Zusammenhang gebracht worden. Einige dieser Rezeptoren wie der EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233; Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) und der PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene 7: 627-633) werden in vielen Tumoren überexprimiert und/oder dauerhaft durch autokrine Loops aktiviert. In der Tat sind bei den meisten der üblichen und schweren Krebserkrankungen eine Überexpression dieser Rezeptoren (Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci. 111: 119-133; Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249-273; Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352-1360) und autokrine Loops (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol. 118: 1057-1070; Korc et al., supra; Akbasak and Suner-Akbasak et al., supra) gezeigt worden. Zum Beispiel ist der EGFR Rezeptor mit Plattenepithelkarzinomen, Astrozytomen, Glioblastomen, Kopf- und Nackenkrebs, Lungenkrebs sowie Blasenkrebs in Verbindung gebracht worden. HER2 ist mit Brust- Gebärmutter-, Magen-, Lungen-, Speicheldrüsen- und Blasenkrebs in Verbindung gebracht worden. Der PDGF-R ist mit Glioblastomen, Lungen-, Gebärmutter-, Melanomen-, und Prostatakrebs in Verbindung gebracht worden. Der RTK c-met ist im allgemeinen mit der Leberkrebsentstehung und daher mit Karzinomen von Leberzellen in Verbindung gebracht worden. Weiterhin ist c-met mit maligner Tumorbildung verbunden worden. Genauer gesagt ist RTK c-met unter anderem mit Krebsen, Corektalen, Schilddrüsen-, Bauchspeicheldrüsen- und Magenkarzinomen, Leukämie und Lymphomen in Verbindung gebracht worden. Ebenfalls wurde die Überexpression des c-met-Gens in Patienten mit Hodgkins Krankheit, Burkitts Krankheit und in der Lymphomzellinie nachgewiesen.
  • Der IGF-IR ist zusätzlich zu seiner Beteilung bei der Nährstoffversorgung und beim Typ-II Diabetes ebenfalls mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht worden. Zum Beispiel ist IGF-I als ein autokriner Wachstumsstimulator für verschiedene Tumorarten, z. B. menschliche Brustkrebskarzinomzellen, (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418-1423) und kleine Lungenzelltumorzellen (Macauley et al., 1990, Cancer Res. 50: 2511-2517) beteiligt. Neben seiner wesentlichen Beteiligung beim normalen Wachstum und der Differenzierung des Nervensystems scheint IGF-I ein autokriner Stimulator von humanen Gliomen zu sein. Sandberg- Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53: 2475-2478. Die Bedeutung des IGF-IRs und seiner Liganden für die Zellproliferation wird weiterhin auf die Tatsache gestützt, dass viele Zelltypen in Kultur (Fibroblasten, Epithelzellen, glatte Muskelzellen, T- Lymphozyten, myeloide Zellen, Chondrozyten, Osteoblasten, die Stammzellen des Knochenmarks) durch IGF-I zum Wachstum stimuliert werden. Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression 1: 301-326. In einer Reihe von jüngeren Publikationen schlägt Baserga sogar vor, dass IGF-IR eine zentrale Rolle beim Mechanismus der Transformation spielt, und als solcher ein bevorzugtes Ziel für therapeutische Eingriffe bei einem breiten Spektrum von humanen malignen Krankheiten sein könnte. Baserga, 1995, Cancer Res. 55: 249-252; Baserga, 1994, Cell 79: 927-930; Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 4588-4595.
  • Die Verbindung zwischen Anomalien von RTKs und Krankheiten ist jedoch nicht auf Krebs beschränkt. Zum Beispiel sind RTKs mit metabolischen Krankheiten wie Schuppenflechte, Diabetes mellitus, Wundheilung, Entzündung und neurodegenerativen Krankheiten verbunden worden. Zum Beispiel ist der EGF-R bei Hornhaut- und dermaler Wundheilung angezeigt. Defekte des Insulin-R und des IGF- 1R sind bei Typ-II Diabetes mellitus angezeigt. Eine vollständigere Korrelation zwischen speziellen RTKs und ihren therapeutischen Indikationen ist in Plowman et al., 1994, DN&P 7: 334-339 dargestellt.
  • Jedoch sind nicht nur Tyrosinkinasen des Rezeptortyps, sondern auch viele zelluläre Tyrosinkinasen (CTK) einschließlich src, abl, fps, yes, fyn, lyn, Ick, blk, hck, fgr, yrk (Übersicht in Bolen et al., 1992, FASEB J. 6: 3403-3409) an proliferatorischen und metabolischen Signalweiterleitungswegen beteiligt und daher in Indikationen der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel wurde mutiertes src (v-src) als ein Oncoprotein (pp60v-src) in Hühnern identifiziert. Zudem überträgt sein zelluläres Homolog, das Protooncogen pp60c-src oncogene Signale von vielen Rezeptoren. Die Überexpression von EGF-R oder HER2/neu in Tumoren führt zum Beispiel zur konstitutiven Aktivierung von pp60c-src, was charakteristisch für maligne Zellen ist, jedoch in normalen Zellen nicht vorkommt. Auf der anderen Seite zeigen Mäuse, die für die Expression von c-src defizient sind, einen osteopetrotischen Phänotyp, was auf eine Schlüsselrolle von c-src bei der Osteoklastenfunktion und eine mögliche Beteiligung an damit verbundenen Krankheiten hinweist. Zap 70 ist auf ähnliche Weise in der T-Zell-Signalweiterleitung verwickelt.
  • Des weiteren ist die Identifizierung von CTK-modulierenden Verbindungen, um die auf RTK gerichteten Blockierungsmittel zu unterstützen oder in Synergie zu treten, ein Aspekt der vorliegenden Erfindung.
  • Schließlich sind sowohl RTKs als auch Kinasen des Nichtrezeptortyps mit Hyperimmunstörungen verbunden worden.
    • 4.5. Pharmazeutische Formulierungen und Verabreichungswege
  • Die hier beschriebenen Verbindungen können einem menschlichen Patienten für sich oder in pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht werden, wo sie mit geeigneten Trägerstoffen oder Arzneimittelträgern vermischt werden. Techniken für Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, aktuelle Ausgabe entnommen werden.
    • Verabreichungswege
  • Geeignete Verabreichungswege könne beispielsweise orale, rektale, transmucosale oder intestinale Verabreichung beinhalten; parentale Darreichung einschließlich intramuskulärer, subkutaner und intramedulfarer Injektionen, sowie intratekale, direkte intraventrikulare, intravenöse, intraperitonale, intranasale oder intraokulare fnjektionen. Alternativ können anstelle der systemischen Weise die Verbindungen auf lokalen Weise verabreicht werden, zum Beispiel durch Injektion der Verbindung direkt in einen festen Tumor, häufig in einer Depotformulierung oder einer Formulierung mit Langzeit-Freisetzung.
  • Weiterhin ist es möglich, dass Arzneimittel in einem gerichteten System zur Arzneimittelverabreichung, z. B. in einem Liposom, das mit einem tumorspezifischen Antikörper beschichtet ist, zu verabreichen. Die Liposomen werden so auf den Tumor gelenkt und selektiv von diesen aufgenommen.
    • 4.5.2. Zusammensetzungen/Formulierungen
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden, z. B. mittels konventionellen Misch-, Auflöse-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Verkapselungs-, Einschluß oder Lyophilisierungsverfahren.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können daher auf konventionelle Art formuliert werden unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch annehmbarer Trägerstoffe, die Arzneimittelträger und Hilfsstoffe umfassen, die die Verarbeitung des Wirkstoffs in Präparationen, die pharmazeutisch verwendet werden, können, erleichtern. Die geeignete Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab.
  • Für Injektionen kann das Mittel der vorliegenden Erfindung in wäßrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie Hanks's Lösung, Ringers Lösung oder physiologischen Salinpuffern formuliert werden. Für die transmucosale Verabreichung werden Penetriermittel, die für die zu überwindende Schranke geeignet sind, in den Formulierungen verwendet. Solche Penetriermittel sind allgemein im Stand der Technik bekannt.
  • Für die orale Verabreichung können dis Verbindungen auf einfache Weise formuliert werden, indem die Wirkstoffe mit pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, kombiniert werden. Solche Trägerstoffe ermöglichen es, die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Pasten, Suspensionen und dergleichen für die orale Einnahme durch den zu behandelnden Patienten zu formulieren. Pharmazeutische Präparationen für die orale Verwendung können erhalten werden, indem die Wirkstoffe mit festen Trägerstoffe vereinigt werden, gegebenenfalls Vermahlen der sich ergebenden Mischung, und Verarbeiten der Mischung zu Granulaten, nachdem geeignete Hilfsstoffe hinzugegeben wurden, wenn gewünscht, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Arzneimittelträger sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Manitol oder Sorbitol; Cellulosepräparationen wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragant Gummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellufose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Wenn gewünscht, können sich zersetzende Stoffe wie quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Algeninsäure oder ein Salz davon wie Natriumalginat hinzugegeben werden.
  • Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen versehen. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen zur Identifikation hinzugegeben werden, oder um verschiedene Kombinationen der Wirkstoffsdosis zu kennzeichnen.
  • Pharmazeutische Präparationen, die oral verwendet werden können, schließen aus Gelatine hergestellte puah-fit Kapseln sowie weiche, verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glycerin oder Sorbitol, ein. Die push-fit Kapseln können die Wirkstoffe in Beimischung von Füllstoffen wie Laktose, Bindemitteln wie Stärke und/oder Schmiermitteln wie Talk oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In Weichkapseln können die Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten wie Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen gelöst oder suspendiert sein. Zusätzlich können Stabilisatoren hinzugegeben werden. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in Dosierungsbereichen liegen, die für eine solche Verabreichung geeignet ist.
  • Zur buccale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen, die in üblicher Weise formuliert sind, aufweisen.
  • Zur Verabreichung durch Inhalation werden die erfindungsgemäßen Verbindungen geeigneterweise in der Form einer Aerosolspraydarreichung aus unter Druck gesetzten Verpackungen oder einer Nebelkammer dargeboten unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Dichlorfluormethan, Diclortetrafluorethan, Kohlendioxid oder eines anderen geeigneten Gases. Im Falle eines unter Druck gesetzten Aerosols kann die Dosierungseinheit bestimmt werden, indem ein Ventil zur Darreichung einer festgelegten Menge bereitgestellt wird. Kapseln und Kassetten z. B. aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insuflator können so formuliert werden, dass sie eine Pulvermischung aus der Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage wie Lactose oder Stärke enthalten.
  • Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung mittels Injektion, z. B. mittels Bolusinjektion oder kontinuierlicher Infusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in einer Einzel-Dosierungsform, z. B. in Ampullen oder in Multidosierungs-Behältnissen mit einem zugesetzten Konservierungsmittel dargereicht werden. Die Zusammensetzungen können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägerstoffen annehmen und können Formulierungsstoffe wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten.
  • Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wäßrige Lösungen der Wirkstoffe in wasserlöslicher Form ein. Zusätzlich könne Suspensionen der Wirkstoffe als geeignete ölhaltige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lypophile Lösungsmittel oder Trägerstoffe schließen Fettöle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen ein. Wäßrige Injektionssuspensionen können Verbindungen wie Natriumcarboxylmethylcellulose, Sorbitol oder Dextran enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen. Gegebenenfalls kann die Suspension ebenfalls geeignete Stabilisatoren oder Stoffe, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, enthalten, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu ermöglichen.
  • Alternativ dazu kann der Wirkstoff in Pulverform zur Bildung mit einer geeignete Bindemittellösung, z. B. sterilen pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung vorliegen.
  • Die Verbindungen können ebenfalls in rektalen Zusammensetzungen wie Zäpfchen oder Bleibeklistier formuliert sein, die z. B. konventionelle Zäpfchengrundlagen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
  • Zusätzlich zu den eben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen ebenfalls als eine Depotpräparation formuliert werden. Solche lang wirkenden Formulierungen können durch Implantation verabreicht werden (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion. Daher können zum Beispiel die Verbindungen mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien formuliert werden (zum Beispiel als eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwerlösliche Derivate, zum Beispiel als ein schwerlösliches Salz.
  • Ein pharmazeutischer Träger für die hydrophoben Verbindungen der Erfindung ist ein Co-Lösungsmitteisystem, das Benzylalkohol, ein unpolares grenzflächenaktives Mittel, ein wassermischbares organisches Polymer sowie eine wäßrige Phase umfaßt. Das Co-Lösungsmittelsystem kann das VPD-Co- Lösungsmittelsystem sein. VPD ist eine Lösung von 3% w/v Benzylalkohol, 8% w/v des unpolaren grenzflächenaktiven Mittels Polysorbat 80 und 65% w/v Polyethylenglycol 300, dessen Volumen in absolutem Ethanol aufgefüllt wird. Das VPD Co-Lösungsmittelsystem (VPD : D5w) besteht aus VPD, das 1 : 1 mit einer 5% Dextrose in Wasserlösung verdünnt wird. Dieses Co-Lösungsmittelsystem löst hydrophobe Verbindungen gut auf und bewirkt selbst nur eine niedrige Toxizität nach systemischer Verabreichung. Natürlich können die Anteile eines Co- Lösungsmitteisystems erheblich variiert werden, ohne seine Löslichkeitseigenschaften und Toxizitätseigenschaften zu vernichten. Weiterhin kann die Art der Co-Lösungsmittelkomponenten variiert werden: Beispielsweise können andere unpolare oberflächenaktive Mittel mit niedriger Toxizität anstelle von Polysorbat 80 verwendet werden; die Fraktionsgröße des Polyethylenglycols kann variiert werden; andere biologisch kompatible Polymere können Polyethylenglycol ersetzen, z. B. Polyvinylpyrrolidon; und andere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
  • Alternativ dazu kann jedes andere Darreichungssystem für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposomen und Emulsionen sind wohlbekannte Beispiele von Bindemitteln zur Darreichung oder Träger für hydrophobe Arzneimittel. Es können bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid verwendet werden, obgleich üblicherweise auf Kosten einer größeren Toxizität. Zusätzlich können die Verbindungen unter Verwendung eines Langzeit-Freisetzungsystems wie semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die das therapeutische Mittel enthalten, dargeboten werden. Es sind zahlreiche Materialien zur Langzeit-Freisetzung entwickelt worden und dem Fachmann wohlbekannt. Kapseln für die Langzeit-Freisetzung können, abhängig von ihrer chemischen Zusammensetzung, die Verbindungen über einige Wochen bis zu 100 Tagen freisetzen. In Abhängigkeit von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Mittels können zusätzliche Strategien für die Proteinstabilisierung angewandt werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenfalls geeignete feste oder Gelphasenträger oder Arzneimittelträger umfassen. Beispiele solcher Trägerstoffe oder Arzneimittelträger schließen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, zahlreiche Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglycole ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
  • Viele der PTK modulierenden Verbindungen der Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch annehmbaren Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren einschließlich Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure etc. gebildet werden, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Salze neigen dazu, in wäßrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln leichter löslich zu sein als die entsprechenden freien Basenformen.
    • 4.5.3. Wirksame Dosierung
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen ein, in denen die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge vorhanden sind, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Genauer gesagt bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge der Verbindung, die wirksam ist, um Symptome von Krankheiten zu verhindern, zu lindern oder zu verbessern oder um die Überiebensdauer der zu behandelnden Person zu verlängern. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge ist dem Fachmann geläufig, insbesondere im Licht der ausführlichen hier bereitgestellten Offenbarung.
  • Für jede eingesetzte Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosierung zu Beginn anhand von Zelfkulturtests abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Dosierung in Tiermodellen formuliert werden, um einen Kreislauf- Konzentrationsbereich zu erreichen, der den IC&sub5;&sub0;-Wert einschließt, wie er in Zellkulturen bestimmt wird (d. h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibition der PTK-Aktivität erzielt). Solche Informationen können verwendet werden, um die bei Menschen anwendbare Dosierung genauer zu bestimmen.
  • Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der hier beschriebenen Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z. B. zur Bestimmung des LD&sub5;&sub0; (die lethale Dosis für 50% der Population) und den ED&sub5;&sub0; (die therapeutisch wirksame Dosis für 50% der Population). Das Dosierungsverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index und es kann als das Verhältnis zwischen LDSo und ED&sub5;&sub0; ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes zeigen, werden bevorzugt. Die Daten, die aus diesen Zellkulturtests oder Tierstudien erhalten worden sind, können verwendet werden, um einen Dosierungsbereich für die Anwendung beim Menschen zu formulieren. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise im Bereich der Kreislaufkonzentrationen, die den ED&sub5;&sub0; mit keiner oder geringer Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches in Abhängigkeit von der verwendeten Dosierungsform und der Art der verwendeten Verabreichung variieren. Die genaue Formulierung, Verabreichungsform und Dosierung kann von dem jeweiligen Arzt in Anbetracht der Lage des Patienten ausgewählt werden. Siehe z. B. Fingl. et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kap. 1, S. 1).
  • Die Dosierungsmenge und lntervafle können individuell angepaßt werden, um Plasmagehalte der aktiven Verbindung zu erzielen, die ausreichend sind, um die kinasemodulierenden Wirkungen oder die minimale effektive Konzentration (MEC) aufrecht zu halten. Die MEC variiert für jede Verbindung, kann jedoch anhand der in iitro Daten abgeschätzt werden; z. B. die notwendige Konzentration, um 50 bis 90% nhibition der Kinase unter Verwendung der hier beschriebenen Tests zu erreichen. Dosierungen, die notwendig sind, um die MEC zu erreichen, hängen von den individuellen Eigenschaften und der Verabreichungsform ab. Es können jedoch HPLC-Untersuchungen oder biologische Tests zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen verwendet werden.
  • Dosierungsintervalle können ebenfalls unter Verwendung des MEC Wertes sstimmt werden. Verbindungen sollten unter Verwendung einer Therapie arabreicht werden, die die Plasmaspiegel oberhalb der MEC für 10-90% der Zeit erhält, vorzugsweise zwischen 30-90% und am bevorzugtesten zwischen 50-90%.
  • In Fällen lokaler Verabreichung oder der selektiven Aufnahme muß die effektive lokale Konzentration des Arzneimittels nicht mit der Plasmakonzentration in Verbindung stehen.
  • Die Menge der verabreichten Zusammensetzung ist selbstverständlich von der zu behandelnden Person, vom Gewicht der Person, der Schwere der Erkrankung, der Art der Verabreichung und der Beurteilung des verschreibenden Arztes abhängig.
    • 4.5.4 Verpackung
  • Die Zusammensetzungen können, wenn gewünscht, in einer Packung oder Vorratsbehälter dargeboten werden, die eine oder mehrere Einzel- Dosierungsformen, die den Wirkstoff enthalten, enthalten kann. Die Verpackung kann, wie eine Durchdrückpackung, z. B. Metall oder Plastikfolie umfassen. Der Packung oder dem Vorratsbehälter können Verabreichungshinweise beigefügt sein. Es können ebenfalls Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung umfassen, die in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formuliert ist, hergestellt werden, in einen geeigneten Behälter überführt und zur Behandlung eines angezeigten Zustands etikettiert werden. Geeignete, auf dem Etikett angegebene Zustände können die Behandlung eines Tumors, die inhibition der Angioginese, Behandlung von Fibrose, Diabetes und dergleichen einschließen.
    • 5. Beispiel: Synthese der Verbindung
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Techniken synthetisiert werden. Die folgenden stellen bevorzugte Verfahren zur Synthese der Verbindung der beanspruchten Erfindung dar.
    • 5.1. Allgemeine Synthese von 3-substituierten 2-Indolinonanaloga
  • Die folgenden allgemeinen Methoden wurden zur Synthese von 3-substituierte 2-Indolinonverbindungen der Erfindung verwendet.
    • 5.1.1. Verfahren A
  • Eine Reaktionsmischung des geeigneten Oxindol (2-Indolinon) (1 Äquiv.), der geeignete Aldehyd (1,2 Äquiv.) und Piperidin (0,1 Äquiv.) in Ethanol (1-2 ml/1 mmol Oxindol) wurden bei 90ºC für 3-5 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um die Zielverbindung zu ergeben.
    • 5.1.2. Verfahren B
  • Herstellung der geeigneten Aldehyde über Vilsmeier Reaktion. Zu einer Lösung von N,N-Dimethylformamid (1,2 Äquiv.) in 1,2- Dichlorethan (2,0 ml/1,0 mmol Ausgangsmaterial) wurde Phosphoroxychlorid (1,2 Äquiv.) tropfenweise bei 0ºC hinzugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung wurde für weitere 30 min. gerührt. Das geeignete Ausgangsmaterial (1,0 Äquiv.) wurde zu der obigen Lösung portionsweise hinzugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei 50-70ºC für 5 h - 2 Tage gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in eiskalte 1N Natriumhydroxidlösung (pH = 9 nach dem Mischen) gegossen und die sich ergebende Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlvsung bis zu einem pH = 7 gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule chromatographiert, mit einem Lösungsmittelgemisch aus Ethylacetan und Hexan eluiert, um die Titelverbindung zu ergeben.
    • Synthese von 3-substituierten 2-Indolinon-Analoga
  • Eine Reaktionsmischung des geeigneten Oxindols (2-Indolinon) (1 Äquiv.), des geeigneten Aldehyds (1,2 Äquiv.) und Piperidin (0,1 Äquiv.) in Ethanol (1-2 ml/1 mmol Oxindol) wurde bei 90ºC für 3-5 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um die Zielverbindung zu ergeben.
    • 5.2. Synthese von 3-[(4-Methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon.
  • Ein Reaktionsgemisch von 133,0 mg Oxindol, 151,2 mg des 4-methylthiophen-2- carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 3 ml Ethanol wurden bei 90ºC für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 147,3 mg (61%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
    • 5.3. Synthese von 3-[(3-Methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon.
  • Ein Reaktionsgemisch von 133,0 mg Oxindol, 130,9 mg des 3-Methylpyrrol-2- carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 90ºC für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 150,9 mg (67%) der im Titel genannten Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
    • 5.4. Synthese von 3-[3,4-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(3,4-Dimethyipyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde synthetisiert wie in J. Heterocyclic Chem. 13: 1145-1147 (1976) beschrieben.
  • Ethyl-4-Methylpyrrol-3-Carboxylat. Eine Lösung von 11,86 g (0,1 mol) Ethylcrotonat und 19,50 g (0,1 mol) p-Toluolsulfonyimethyfisocyanid in 500 ml 2 : 1 Ether/Dimethylsulfoxid wurde bei Raumtemperatur tropfenweise zu einer Suspension von 6,8 g Natriumhydrid (60% Mineralöldispersion, 0,17 mol) in Ether gegeben. Nach der Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung für 30 min gerührt und mit 400 ml Wasser verdünnt. Die wäßrige Schicht wurde mit 3 · 100 ml Ether extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden durch eine Säule mit Aluminiumoxid laufengelassen, und mit Dichlormethan eluiert. Das organische Lösungsmittel wurde verdampft und der sich ergebende Rückstand wurde durch Stehenlassen verfestigt. Der Feststoff wurde mit Hexan gewaschen und bei 40ºC im Vakuumofen über Nacht getrocknet, um 12,38 g (80%) der Titelverbindung zu ergeben.
  • Herstellung von 3,4-Dimethyipyrrol. Zu einer Lösung von 23 g (80 mmol) Natriumdihydrobis(2-methoxyethoxyaluminat) wurden bei Raumtemperatur tropfenweise 5 g einer Lösung (34 mmol Ethyl-4-methylpyrrol-3-carboxylat in 50 ml Benzol unter Stickstoffatmosphäre hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 18 h gerührt. Wasser (100 ml) wurde zu der Reaktionsmischung hinzugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Kochsalziösung gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde destilliert, was 1,2 g (44%) derTitelverbindung ergab.
  • Herstellung von 3,4-Dimethylpyrrol-2-carboxaldehyd. Zu einer Lösung von 0,92 ml (12 mmol) N,N-Dimethylformamid in 10 ml 1,2-Dichlorethan wurde bei 0ºC tropfenweise 1,0 ml (12 mmol) Phosphoroxychlorid gegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktionsmischung wurde für weitere 30 min gerührt. Es wurden 3,4-Dimethylpyrrol (960,0 mg, 10 mmol) zu der obigen Lösung portionsweise hinzugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei 50ºC für 5 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in eiskalte 1N Natriumhydroxidlösung gegossen (pH = 9 nach dem Mischen) und die sich ergebende Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung bis zu pH = 7 gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde auf einer Silicagelsäule chromatographiert, mit einem Lösungsmittelgemisch aus Ethylacetat und Hexan eluiert, um 610 ml (50%) der Titelverbindung zu ergeben.
  • 3-[(3,4-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon. Ein Reaktionsgemisch aus 67,0 mg (0,5 mmol) Oxindol, 73,0 mg (0,6 mmol) des 3,4-Dimethylpyrrol-2- carboxaldehyds und 2 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 90ºC für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 78,7 mg (27%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
    • 5.5 Synthese von 3-[(2,4-Dimethyl-3-Ethoxycarbonylpyrrol-5-yl)methylen]- 2-indolinon
  • Eine Reaktionsmischung aus 134,0 mg Oxindol, 234,3 mg des 4- thoxycarbonyl-3,5-dimethylpyrrol-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 3 ml thanol wurden bei 90ºC für 3 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 244,6 mg (79%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
    • 5.6. Synthese von 3-[(2,4-Dimethylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • Eine Reaktionsmischung aus 134,0 mg Oxindol, 147,8 mg des 3,5- imethylpyrrol-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 90ºC für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 136,7 mg (57% der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
    • 5.7. Synthese von 3-[(2-Methylmercaptothien-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • Eine Reaktionsmischung aus 134,0 mg Oxindol, 189,9 mg des 5- Methylmercaptothiophen-2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 90ºC für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 246,6 mg (90ºC) der Titelverbindung als orangefarbenen Feststoff zu ergeben.
    • 5.8. Synthese von 3-[(2-Methylthien-5-yt)methylen]-2-indolinon
  • Ein Reaktionsgemisch aus 134,0 mg Oxindol, 151,42 mg des 5-Methylthiophen- 2-carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 90ºC für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 237,8 mg (99%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
    • 5.9. Synthese von 3-[(3-Methytthien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • Eine Reaktionsmischung aus 134,0 mg Oxindol, 151,4 mg des 3-Methylthiophen-2- carboxaldehyds und 3 Tropfen Piperidin in 2 ml Ethanol wurden bei 90ºC für 3 h gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Präzipitat abfiltriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 157,8 mg (65%) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
    • 5.10. Synthese von 3-[(3-(2-Carboxyethyl)-4-methylpyrrol-5-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[(3-(2-Carboxyethyl)-4-methylpyrrol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.11. Synthese von 3-[(3,4-Dibrom-5-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[(3,4-Dibrom-5-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren B hergestellt.
    • 5.12. Synthese von 3-[(3,4-Dimethyl-2-formylpyrrol-5-yl)methylen)-2- indolinon
  • 3-[(3,4-Dimethyl-2-formylpyrrol-5-yl)methylen)-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.13. Synthese von 3-{[4-(2-Methoxycarbonylethyl)-3-methylpyrrol-5- yl]methylen}-2-indolinon
  • 3-{[4-(2-Methoxycarbonylethyl)-3-methylpyrrol-5-yl]methylen}-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.14. Synthese von 3-[(3-Ethoxycarbonyl-2-methylfuran-5-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[(3-Ethoxycarbonyl-2-methylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.15. Synthese von 3-[(3-Bromthien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(3-Bromthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.16. Synthese von 3-[(2-Chlorthien-5-yl)methylen)-2-indolinon
  • 3-[(2-Chlorthien-5-yl)methylen]-2-indoiinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.17. Synthese von 3-[(2,3-Dimethylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(2,3-Dimethylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.18. Synthese von 3-[(5-Nitrothien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(5-Nitrothien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.19. Synthese von 3-[(2-Carbaxythien-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(2-Carboxythien-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.20. Synthese von 3-[(2-Bromthien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[4-Bromothien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.21. Synthese von 3-[(4-Bromthien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(4-Bromthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.22. Synthese von 3-[(2-Sulfonylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon Natriumsalz
  • 3-[(2-Sulfonylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon Natriumsalz wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.23. Synthese von 3-[(2-Methylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Furan-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.24. Synthese von 3-[(2-Ethylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(2-Ethylfuran-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.25. Synthese von 3-[(2-Ethylthien-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(2-Ethylthien-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.26. Synthese von 3-[(4,5-Dimethyl-3-ethylpyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[(4,5-Dimethyl-3-ethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.27. Synthese von 3-[(5-Ethoxycarbonyl-4-ethoxycarbonylethyl-3- ethoxycarbonylmethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(5-Ethoxycarbonyl-4-ethoxycarbonylethyl-3-ethoxycarbonylmethylpyrrol-2- yl)methylen)-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.28. Synthese von 3-[(5-Carboxy-3-ethyl-4-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[(5-Carboxy-3-ethyl-4-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.29. Synthese von 3-[(3,5-Diiod-4-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(3,5-Diiod-4-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.30. Synthese von 3-[(5-Chlor-3-methoxycarbonyl-4- methoxycarbonylmethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(5-Chlor-3-methoxycarbonyl-4-methoxycarbonylmethylpyrrol-2-yl)methylen)- 2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.31. Synthese von 3-[(3-Acetyl-5-ethoxycarbonyl-4-methylpyrrol)-2- yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(3-Acetyl-5-ethoxycarbonyl-4-methylpyrrol)-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.32. Synthese von 3-{(1-(3,5-Dichlorphenyl)pyrrol-2-yl]methylen}-2- indolinon
  • 3-{(1-(3,5-Dichlorphenyl)pyrrol-2-yl]methylen}-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.33. Synthese von 3-[1-(4-Chlorphenyl)pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[1-(4-Chlorphenyl)pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5,34. Synthese von 3-[(4-Ethoxycarbonyl-3-methyl)pyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[(4-Ethoxycarbonyl-3-methyl)pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.35. Synthese von 3-[(1-Methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(1-Methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.36. Synthese von 3-[(5-Ethoxycarbonyl-3-ethoxycarbonylethyl-4- ethoxylcarbonylmethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(5-Ethoxycarbonyl-3-ethoxycarbonylethyl-4-ethoxylcarbonylmethylpyrrol-2- yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.37. Synthese von 3-[(5-Methylimidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(5-Methylimidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.38. Synthese von 3-[(5-Methylthiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(5-Methylthiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.39. Synthese von 3-[(3-Methylpyrazol-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(3-Methylpyrazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.40. Synthese von 3-[(Imidazol-4-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Imidazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.41. Synthese von 3-[(4-Chlorpyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(4-Chlorpyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.42. Synthese von 3-[(4-Brom-1-(4-chlorbenyl)pyrazol-5-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[(4-Brom-1-(4-chlorbenzyl)pyrazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.43. Synthese von 3-[(4-Chlor-1-methylpyrazof-3-yl)methyfen]-2-indolinon
  • 3-[(4-Chlor-1-methylpyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.44. Synthese von 3-[(4-Ethyl-3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[(4-Ethyl-3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren B hergestellt.
    • 5.45. Synthese von 3-[(5-Ethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(5-Ethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-irtdolinon wurde gemäß Verfahren B hergestellt.
    • 5.46. Synthese von 3-[3,5-Dimethyl-4-(propen-2-yl)pyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon
  • 3-[3,5-Dimethyl-4-(propen-2-yl)pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren B hergestellt.
    • 5.47. Synthese von 5-Chlor-3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Chlor-3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.48. Synthese von 5-Chlor-3-[(3-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Chlor-3-[(3-methylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.49. Synthese von 5-Chlor-3-[(3,5-dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2- indolinon
  • 5-Chlor-3-[(3,5-dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.50. Synthese von 3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon ist von Maybridge Chemical Co. Ltd. erhältlich.
    • 5.51. Synthese von 5-Chlor-3-[(indol-3-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Chlor-3-[(indol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.52. Synthese von 5-Chlor-3-[(thien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Chlor-3-[(thien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.53. Synthese von 5-Chlor-3-[(3-methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Chlor-3-[(3-methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.54. Synthese von 5-Chlor-3-[(5-methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Chlor-3-[(5-methylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.55. Synthese von 5-Chlor-3-[(5-ethylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Chlor-3-[(5-ethylthien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.56. Synthese von 5-Chlor-3-[(5-methylmercaptothien-2-yl)methylen]-2- indolinon
  • 5-Chlor-3-[(5-methylmercaptothien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.57. Synthese von 5-Chlor-3-[(imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Chlor-3-[(imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.58. Synthese von 5-Nitro-3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Nitro-3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.59. Synthese von 3-[(3-Methylpyrrol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon
  • 3-[(3-Methylpyrrol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.60. Synthese von 3-[(3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-5-nitro-2- indolinon
  • 3-[(3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.61. Synthese von 3-[(indol-3-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon.
  • 3-[(indol-3-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.62. Synthese von 5-Nitro-3-[(thien-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 5-Nitro-3-[(thien-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.63. Synthese von 3-[(3-Methylthien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon
  • 3-[(3-Methylthien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.64. Synthese von 3-[(5-Methylthien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon
  • 3-[(5-Methylthien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.65. Synthese von 3-[(5-Ethylthien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon
  • 3-[(5-Ethylthien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.66. Synthese von 3-[(5-Methylmercaptothien-2-yl)methylen]-5-nitro-2- indolinon
  • 3-[(5-Methylmercaaptothien-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.67. Synthese von 3-[(Imidazol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon
  • 3-[(Imidazol-2-yl)methylen]-5-nitro-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.68. Synthese von 3-[(Oxazol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Oxazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.69. Synthese von 3-[(Oxazol-4-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Oxazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.70. Synthese von 3-[(Oxazol-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Oxazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.71. Synthese von 3-[(Thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.72, Synthese von 3-[(Thiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Thiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.73. Synthese von 3-[(Thiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Thiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.74. Synthese von 3-[(Imidazo(-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.75. Synthese von 3-[(Pyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Pyrazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.76. Synthese von 3-[(Pyrazol-4-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Pyrazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.77. Synthese von 3-[(Isoxazol-3-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Isoxazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.78. Synthese von 3-[(Isoxazol-4-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Isoxazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.79. Synthese von 3-[(Isoxazol-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Isoxazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.80. Synthese von 3-[(Isothiazol-3-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Isothiazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.81. Synthese von 3-[(Isothiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(isothiazol-4-yl)methylen]-2-indofinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.82. Synthese von 3-[(Isothiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(Isothiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.83. Synthese von 3-[(1,2,3-Triazol-4-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(1,2,3-Triazol-4-yl)methylen]-2-indoünon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.84. Synthese von 3-[(1,3,4-Thiadiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(1,3,4-Thiadiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.85. Synthese von 3-[(5-Phenyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(5-Phenyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.86. Synthese von 3-[(3-Phenyl-1,2,4-oxadiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(3-Phenyl-1,2,4-oxadiazol-5-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 5.87. Synthese von 3-[(3-Phenyl-1,2,5-oxadiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon
  • 3-[(3-Phenyl-1,2,5-oxadiazol-4-yl)methylen]-2-indolinon wurde gemäß Verfahren A hergestellt.
    • 6. Beispiele: In vitro RTK Assays
  • Die folgenden in vitro Tests können verwendet werden, um den Level der Aktivität und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehrere der RTKs zu bestimmen. Ähnliche Tests können daran für jede andere Tyrosinkinase unter Verwendung der im Stand der Technik wohlbekannten Techniken entwickelt werden.
    • 6.1. Enzymimmunoassay (ELISA)
  • Enzymimmunoassays (Enzyme linked immunosorbent assays/ELISA) können verwendet werden, um das Vorhandensein von Tyrosinkinase-Aktivität zu detektieren und zu messen. Der ELISA kann nach bekannten Protokollen, die z. B. in Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", In: Manual of Clinical lmmunoiogy, 2. Aufl., Herausgeber Rose und Friedman, S. 359-371 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D. C. beschrieben sind, durchgeführt werden.
  • Das offenbarte Protokoll kann zur Bestimmung der Aktivität für eine spezielle RTK angepaßt werden. Zum Beispiel sind die bevorzugten Protokolle zum Durchführen der ELISA-Experimente für spezielle RTKs unten angegeben. Das Anpassen dieser Protokolle zur Bestimmung einer Aktivität einer Verbindung bei anderen Mitgliedern der RTK-Familie sowie den Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen ist dem Fachmann geläufig.
    • 6.1.1. FLK-1 ELISA
  • Es wurde ein ELISA-Versuch durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-1 Rezeptors und genauer die Inhibition oder Aktivierung der Protein- Tyrosinkinaseaktivität des FLK-1 Rezeptors zu messen. Im speziellen wurde der folgende Test durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-1 Rezeptors in FLK- 1/NIH3T3 Zellen zu messen.
  • Materialien und Methoden.
  • Materialien. Es wurden die folgenden Reagenzien und Gegenstände verwendet:
  • a. Corning 96-Loch ELISA Platten (Corning Katalognr. 25805-96);
  • b. Cappel Ziege Anti-Kaninchen IgG (Katalognr. 55641);
  • c. PBS (Gibco Katalognr. 450-1300EB);
  • d. TBSW Buffer (50 mM Tris (pH 7.2), 150 mM NaCl und 0,1% Tween-20);
  • e. Ethanolamin-Stammlösung (10% Ethanolamin (pH 7,0), bei 4ºC gelagert);
  • f. HNTG Puffer (20 mM HEPES Puffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2% Triton X- 100 und 10% Glycerin);
  • g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) als 100X Stammlösung);
  • h. Natriumorthovanadat (0,5 M als eine 100 X Stammlösung);
  • i. Natriumpyrophosphat (0,2 M als eine 100 X Stammlösung);
  • j. NUNC 96 well V Boden Polypropylen-Platten (Applied Scientific Katalognr. AS-72092);
  • k. NIH3T3 C7#3 Zellen (FLK-1 exprimierende Zellen);
  • l. DMEM mit 1X Hochglucose L-Glutamin (Katalognr. 11965-050);
  • m. FBS, Gibco (Katalognr. 16000-028);
  • n. L-Glutamin, Gibco (Katafognr. 25030-016);
  • o. VEGF, PeproTech, lnc. (Katalognr. 100-20) (als 1 um/100 ul Stammlösung in Milli-Q dH&sub2;O gelagert und bei -20ºC aufbewahrt);
  • p. affinitätsgereinigtes anti-FLK-1-Antiserum, Enzymlabor, Sugen, Inc.;
  • q. monoklonaler Antikörper UB40, spezifisch für Phosphotyrosin, Enzymlabor, Sugen Inc. (siehe Fendly, et al., 1990, Cancer Research 50: 1550-1558);
  • r. Ziege Anti-Maus IgG-POD mit ElA-Reinheit (Bio Rad Katalognr. 172-1011);
  • s. 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)- Lösung (100 mM Zitronensäure (wasserfrei), 250 mM Na&sub2;HPO&sub4; (pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma Katalognr. A-1888)), die Lösung sollte bis zur Verwendung im dunkeln bei 4ºC gelagert werden;
  • t. H&sub2;O&sub2; (30% Lösung) (Fisher Katalognr. H325),
  • u. ABTS/H&sub2;O&sub2; (15 ml ABTS-Lösung, 2 ul H&sub2;O&sub2;), 5 Minuten vor der Verwendung hergestellt und bei Raumtemperatur stehengelassen;
  • v. 0,2 M HCl Stammlösung in H&sub2;O;
  • w. Dimethylsulfoxid (100%) (Sigma Katalognr. D-8418); und
  • y. Trypsin-EDTA (Gibco BRL Katalognr. 25200-049).
  • Protokoll: Das folgende Protokoll wurde zur Durchführung des Versuchs verwendet:
  • 1. Man beschichte Corning 96-Loch ELISA Platten mit 1,0 ug pro Vertiefung Cappel Anti-Kaninchen IgG Antikörper in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3; pH 9,6. Man bringe das Endvolumen auf 150 ul pro Vertiefung. Man beschichte die Platten bei 4ºC über Nacht. Die Platten können bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden, wenn sie bei 4ºC gelagert werden.
  • 2. Man kultiviere Zellen bei 37ºC, 5% CO&sub2; im Nährmedium (DMEM, supplementiert mit 2,0 mM L-Glutamin, 10% FBS) in geeigneten Kulturschalen bis zur Konfluenz.
  • 3. Man ernte die Zellen durch Trypsinverdau und säe 25.000 Zellen/Vertiefung in 200 ul Nährmedium in Corning 25850 Polystyrol 96-Lochzellplatten mit rundem Boden aus.
  • 4. Man kultiviere die Zellen mindestens für einen Tag bei 37ºC, 5% CO&sub2;.
  • 5. Man wasche die Zellen mit D-PBS 1X.
  • 6. Man füge 200 ul/Vertiefung Hungermedium (DMEM, 2,0 mM l-Glutamin, 0,1% FBS) hinzu. Man inkubiere über Nacht bei 37ºC, 5% CO&sub2;.
  • 7. Man verdünne die Verbindungen/Extrakte 1 : 20 in 96-Loch Platten aus Polypropylen unter Verwendung von Hungermedien. Man verdünne Dimethylsulfoxid 1 : 20 zur Verwendung in Kontrollvertiefungen.
  • 8. Man entferne das Hungermedium aus den 96 Loch-Zellkulturplatten und gebe 162 ul frisches Hungermedium zu jeder Vertiefung dazu.
  • 9. Man füge 18 ul einer 1 : 20 verdünnter Verbindungs/Extraktverdünnung (aus Schritt 7) zu jeder Vertiefung sowie der 1 : 20 Dimethyisulfoxidverdünnung der Kontrollplatten (+/-VEGF), für eine Endverdünnung von 1 : 200 nach der Zellstimulation. Die Dimethylsulfoxidendkonzentration ist 0,5%. Man inkubiere die Platte bei 37ºC, 5% CO&sub2; für zwei Stunden.
  • 10. Man entferne nicht gebundenen Antikörper von den ELISA Platten durch Umdrehen der Platten zur Entfernung von Flüssigkeit. Man wasche dreimal mit TBSM + 0,5% Ethanolamin, pH 7,0. Man klopft die Platten auf einem Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit und Tropfen zu entfernen.
  • 11. Man blockt die Platten mit TBSM + 0,5% Ethanolamin, pH 7,0, 150 ul pro Vertiefung. Man inkubiere die Platte für 30 Minuten unter Schütteln auf einem Mikrotiter-Plattenschüttler.
  • 12. Man wasche die Platten dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
  • 13. Man füge 0,5 ug/Vertiefung polyklonales affinitätsgereinigtes Anti-FLU-1 Kaninchenantiserum hinzu. Man bringe das Endvolumen auf 150 ul/Vertiefung mit TBSW + 0,5% Ethanolamin pH 7,0.
  • 14. Man gebe 180 ul Hungermedium zu den Zellen hinzu und stimuliert die Zellen mit 20 ul/Vertiefung 10,0 mM Natriumorthovanadat und 500 ng/ml VEGF (was eine Endkonzentration von 1,0 mM Natriumorthovanadat und 50 nglmi VEGF pro Vertiefung ergibt) für 8 Minuten bei 37ºC, 5% CO&sub2;. Vertiefungen der Negativkontrollen erhalten nur das Hungermedium.
  • 15. Nach 8 Minuten sollten die Medien von den Zellen entfernt werden und einmal mit 200 ul/Vertiefung PBS gewaschen werden.
  • 16. Man lysiere die Zellen in 150 ul/Vertiefung HNTG unter Schütteln bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Die HNTG Formulierung schließt Natriumorthovanadat, Natriumpyrophosphat und EDTA ein.
  • 17. Man wasche die ELISA Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
  • 18. Man überführe die Zellysate aus der Zellplatte zu einer ELISA Platte und inkubiert unter Schütteln für 2 Stunden. Um das Zellysat zu überführen, pipettiert man unter Abkratzen der Vertiefungen auf und ab.
  • 19. Man wasche dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
  • 20. Man inkubiere eine ELISA Platte mit 0,02 uglVertiefung UB40 in TBSW + 0,5% Ethanolamin. Man bringe das Endvolumen auf 150 ul/Vertiefung. Man inkubiere unter Schütteln für 30 Minuten.
  • 21. Man wasche die Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
  • 22. Man inkubiere die ELISA Platte mit 1 : 10.000 verdünntem Ziege Anti-Maus lgG konjugierter Meerrettichperoxidase mit EIA-Reinheit in TBSW + 0,5% Ethanolamin, pH 7,0. Man bringe das Endvolumen auf 150 ul/Vertiefung. Man inkubiere für 30 Minuten unter Schütteln.
  • 23. Man wasche die Platte wie in Schritt 10 beschrieben.
  • 24. Man gebe 100 ul ABTS/H&sub2;O&sub2; Lösung zu der Vertiefung. Man inkubiere für 10 Minuten unter Schütteln.
  • 25. Man füge 100 ul 0,2 M HCl für eine HCl-Endkonzentration von 0,1 M hinzu, um die Farbentwicklungsreaktion abzustoppen. Man schüttele für 1 Minute bei Raumtemperatur. Man entferne Blasen mit einem schwachen Luftstrom und mißt die ELISA Platte mit einem ELISA Platten-Leser bei 410 nm.
    • 6.1.2. HER-2 ELISA
  • Assay 1: EGF Rezeptor-HER2 chimärer Rezeptor Assay in ganzen Zellen. Die HER2 Kinaseaktivität in ganzen EGFR-NIH3T3 Zellen wurde wie unten beschrieben gemessen:
  • Materialien und Reagenzien. Zur Durchführung des Versuchs wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet.
  • a. EGF: Konzentrationen der Stammlösungen = 16,5 ILM; EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japan.
  • b. 05-101 (UBI) (ein monoklonaler Antikörper, der eine extrazelluläre Domäne des EGFR erkennt).
  • c. Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Anti-Ptyr) (polyklonal) (siehe Fendly et al.; supra).
  • d. Nachweis-Antikörper: Ziege Anti-Kaninchen lgG Meerrettichperoxidase- Konjugat, TAGO, Inc., Burlingame, CA.
  • e. TBST Puffer:
  • Tris-HOI, pH 7,2 50 mM
  • NaGt 150 mM
  • Triton X-100 0,1
  • f. HNTG 5X Stammlösung:
  • HEPES 0,1 M
  • NaGt 0,75 M
  • Glycerin 50%
  • Triton X-100 1,0%
  • g. ABTS-Stammlösung:
  • Zitronensäure 100 mM
  • Na&sub2;HPO&sub4; 250 mM
  • HCl, conc. 0,5 pM
  • ABTS* 0,5 mg/ml
  • *(2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure)). Man bewahre die Lösung vor dem Gebrauch bei 4ºC im Dunkeln auf.
  • h. Stammlösung von:
  • EDTA 100 mM pH 7,0
  • Na&sub3;VO&sub4; 0,5 M
  • Na&sub4;(P&sub2;O&sub7;) 0,2 M
  • Vorgehensweise. Es wurde das folgende Protokoll verwendet:
    • A. Vorbeschichtete ELISA Platten
  • 1. Man beschichte ELISA Platten (Corning, 9B-Loch, Kat. #25805-96) mit 05- 101 Antikörper mit 0,5 g pro Vertiefung in PBS, EndvolumenlVertiefung 100 ul und bewahre sie über Nacht bei 4ºC auf. Beschichtete Platten sind für bis zu 10 Tage verwendbar, wenn sie bei 4ºC aufbewahrt werden.
  • 2. Am Tag der Verwendung entferne man den Beschichtungspuffer und ersetze ihn mit 100 ul Blockierungspuffer (5% Carnation Instant fettfreie Trockenmilch in PBS). Man inkubiere die Platte, schüttele bei Raumtemperatur (ungefähr 23ºC bis 25ºC) für 30 Minuten. Unmittelbar vor der Verwendung entferne man den Blockierungspuffer und wäscht die Platte viermal mit TBST Puffer.
    • B. Aussäen der Zellen
  • 1. Eine NIH3T3 Zellinie, die einen chimären Rezeptor überexprimiert, der die EGFR extrazelluläre Domäne und die extrazelluläre HER2 Kinasedomäne enthält, kann für diesen Assay verwendet werden.
  • 2. Man wählt Schalen mit 80 bis 90% Konfluenz für dieses Experiment aus. Man unterwerfe die Zellen einer Trypsinbehandlung und beende die Reaktion durch Zugabe von 10% fötalem bovinen Serum. Man suspendiere die Zellen in DMEM Medium (10% CS DMEM Medium), und zentrifugiere einmal bei 1500 rpm bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
  • 3. Man resuspendiere die Zellen im Aussaatmedium (DMEM, 0,5% bovines Serum) und zählt die Zellen unter Verwendung von Trypanblau. Eine Überlebensrate von ungefähr 90% ist akzeptabel. Man säe die Zellen in DMEM Medium (0,5% bovines Serum) in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung, 100 ul/Vertiefung, in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte aus. Man inkubiere die ausgesäten Zellen in 5% CO&sub2; bei 37ºC für ungefähr 40 Stunden.
    • C. Vorgehensweise beim Test
  • Man überprüfe die ausgesäten Zellen auf Kontamination unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Man verdünne die Stammlösung des Arzneimittels (10 mg/ml in DMSO) 1 : 10 in DMEM Medium, überführe 5 ul in eine TBST Vertiefung für eine Endverdünnung des Arzneimittels von 1 : 200 und einer Endkonzentration von DMSO von 1%. Kontrollvertiefungen erhalten nur DMSO. Man inkubiere in 5% CO&sub2; bei 37ºC für 2 Stunden.
  • 2. Man präpariert den EGF Ligand: Man verdünne EGF-Stammlösung in DMEM, sodaß nach Transfer von 10 ul verdünntem EGF (1 : 12 Verdünnung) eine Endkonzentration von 100 nM erhalten wird.
  • 3. Man präpariert frisches HNTG*, das für 100 ul/Vertiefung ausreicht, und stellt es auf Eis.
  • HNTG (10 ml):
  • HNTG Stammlösung 2,0 ml
  • milli-Q H&sub2;O 7,3 ml
  • EDTA, 100 mM, pH 7,0 0,5 ml
  • Na&sub3;VO&sub4;, 0,5 M 0,1 ml
  • Na&sub4;(P&sub2;O&sub7;), 0,2 M 0,1 ml
  • 4. Nach 120 Minuten Inkubation mit dem Arzneimittel gebe man präparierten SGF Liganden zu den Zellen, 10 ul pro Vertiefung, bis zu einer Endkonzentration von 100 nM. Kontrollvertiefungen erhalten nur DMEM. Man inkubiere, schüttele bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
  • 5. Man entferne das Arzneimittel, IGF sowie das DMEM. Man wasche die Zellen zweimal mit PBS. Man überführt HNTG* zu den Zellen, 100 ul/Vertiefung. Man stelle für 5 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit entferne man den Blockierungspuffer von der anderen ELISA Platte und wasche mit TBST wie oben beschrieben.
  • 6. Mit einer Pipettenspitze, die fest an einer Mikropipette angebracht ist, kratze man die Zellen von den Platten ab und homogenisiere das Zeilmaterial durch wiederholtes Aufsaugen und Verteilen des HNTG* Lysepuffer. Man überführe das Lysat in eine beschichtete, blockierte und gewaschene ELISA Platte. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
  • 7. Man entferne das Lysat und wasche viermal mit TBST. Man überführe frisch verdünnten Anti-Ptyr-Antikörper mit 100 ul pro Vertiefung in die ELISA Platte. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten in der Gegenwart des Anti-Ptyr Antiserums (1 : 3000 Verdünnung in TBST).
  • 8. Man entferne den Anti-Ptyr-Antikörper und wasche viermal mit IBST. Man überführe den frisch verdünnten TAGO Antikaninchen mit 100 ul pro Vertiefung lgG Antikörper in die ELISA Platte. Man inkubiere unter Schüttefn bei Raumtemperatur für 30 Minuten (Anti-Kaninchen IgG Antikörper:1 : 3000 Verdünnung in TBST).
  • 9. Man entferne den TAGO Nachweis-Antikörper und wasche viermal mit TBST. Man überführe frisch angesetzte ABTS/H&sub2;O&sub2; Lösung zu der ELISA Platte, 100 ul pro Vertiefung. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. (ABTS/H&sub2;O&sub2; Lösung: 1,0 ul 30% H&sub2;O&sub2; in 10 ml ABTS Stammlösung).
  • 10. Man beende die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 5 N H&sub2;SO&sub4; (optional) und bestimmt die O. D. bei 410 nm.
  • 11. Das maximale Phosphotyrosinsignal wird durch Subtraktion der Werte der Negativkontrollen von den Positivkontrollen bestimmt. Anschließend wird nach Subtraktion der Negativkontrollen die prozentuale Inhibition des Phosphotyrosingehalts für Vertiefungen, die Extrakt enthalten, berechnet.
  • Assay 2: HER-2-BT 474 ELISA. Ein zweiter Test kann durchgeführt werden, um die HER2 Aktivität von ganzen Zellen zu messen. Ein solcher Test kann wie folgt durchgeführt werden:
  • Materialien und Reagenzien. Es wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet:
  • a. BT-474 (ATCC HBT20), eine humane Brusttumorzellinie, die hohe Level von HER2 Kinase exprimiert.
  • b. Nährmedien, die RPMI + 10% FBS + GMS-G (Gibco Supplement) + Glutamin umfassen, zur Verwendung bei der Kultivierung von BT-474 in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; bei 37ºC.
  • c. Ein monoklonaler Anti-HER2 Antikörper.
  • d. D-PBS:
  • KH&sub2;HPO&sub4; 0,20 g/l 10 (GIBCO, 30-4190AJ)
  • K&sub2;HPO&sub4; 2,16 g/l
  • KCl 0,20 g/l
  • NaCl 8,00 g/l (pH 7,2)
  • e. Blockierungspuffer: TBST plus 5% Milch (Carnation Instant fettfreie Trockenmilch).
  • f. TBST Puffer:
  • Tris-HCl 50 mM
  • NaCl 150 mM (pH 7,2, HCl 10 N)
  • Triton X-100 0,1%,
  • wobei die Stammlösung von TES (10X) hergestellt wird, und Triton X-100 während des Verdünnens zu dem Puffer hinzugegeben wird.
  • g. HNTG Puffer (5X):
  • HEPES 0,1 M
  • NaCl 750 mM (pH 7,2 (HCl, 1 N)
  • Glycerin 50%
  • Triton X-100 1,0%
  • Die Stammlösung (5X) wird hergestellt und bei 4ºC aufbewahrt.
  • h. EDTA-HCl: 0,5 M pH 7,0 (10 N HCl) als 500X Stammlösung.
  • i. Na&sub3;VO&sub4;: 0,5 M als 100X Stammlösung wird bei -80ºC als Aliquots aufbewahrt.
  • j. Na&sub4;(P&sub2;O&sub7;): 0,2 M als 100X Stammlösung.
  • k. Polyklonales Anti-Phosphotyrosin Antiserum.
  • l. Ziege Anti-Kaninchen IgG, Meerrettich Peroxidase (POD) Konjugat (Nachweis-Antikörper), Tago (Katnr. 4520; Charge Nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.
  • m. ABTS Lösung:
  • Zitronensäure 100 mM
  • Na&sub2;HPO&sub4; 250 mM (pH 4,0, 1N HCl)
  • ABTS 0,5 mg/ml,
  • wobei ABTS 2,2'-Azinobis(3-Ethylbenzthiazolinsulfonsäure) ist. Für diesen Test sollte die ABTS-Lösung im dunkeln bei 4ºC aufbewahrt werden. Die Lösung sollte verworfen werden, wenn sie sich grün färbt.
  • n. Wasserstoffperoxid: 30%ige Lösung, wird im dunkeln und bei 4ºC aufbewahrt.
  • Vorgehensweise: Alle der folgenden Schritte werden, solange nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur und aseptisch durchgeführt. Das gesamte Waschen der ELISA Platten wird durchgeführt, indem dreimal mit destilliertem Wasser und einmal mit TBST abgespült wird.
    • A. Aussäen der Zellen
  • 1. Man kultiviere BT474 Zellen in Gewebekulturschalen (Corning 25020-100) bis zu 80-90% Konfluenz und sammele sie unter Verwendung von Trypsin-EDTA (0,25%, GIBGO).
  • 2. Man resuspendiere die Zellen in frischem Medium und transferiere sie mit ungefähr 25.000-50.000 ZellenNertiefung (100 ul/Vertiefung) in eine 96-Loch- Gewebekuiturschaie (Corning, 25806-96). Man inkubiere die Zellen in 5% CO&sub2; bei 37ºC über Nacht.
    • B. Beschichten und Blockieren der ELISA Platten
  • 1. Man beschichte die ELISA Platte (Corning, 25805-96) mit Anti-HER2 Antikörper mit 0,5 ug/Vertiefung in 150 ul PBS über Nacht bei 4ºC und verschließt sie mit Parafilm. Die mit Antikörper beschichteten Platten können bis zu zwei Wochen verwendet werden, wenn sie bei 4ºC gelagert werden.
  • 2. Am Tag der Verwendung entferne man den Beschichtungspuffer, ersetzt ihn mit 200 ul Blockierungspuffer, schüttele die Platte und entferne anschließend den Blockierungspuffer und wasche die Platte unmittelbar vor der Zugabe von Lysat.
    • C. Vorgehensweise beim Test
  • 1. Die Arzneimittel werden in TBST bei serumfreien Bedingungen aufgenommen. Bevor die Arzneimittel hinzugegeben werden, wird das alte Medium mit serumfreiem RPMI (90 ul/Vertiefung) ersetzt.
  • 2. Man verdünne die Stammlösung des Arzneimittels (in 100% DMSO) 1 : 10 mit RPMI und transferiere 10 ul/Vertiefung dieser Lösung zu den Zellen, um eine Endkonzentration des Arzneimittels in DMSO von 1% zu erhalten. Man inkubiere die Zellen in 5% CO&sub2; bei 37ºC.
  • 3. Man setze frischen Zellysepuffer an (HNTG*)
  • 5xHNTG 2 ml
  • EDTA 0,2 ml
  • Na&sub3;NO&sub4; 0,1 ml
  • Na&sub4;P&sub2;O&sub7; 0,1 ml
  • H&sub2;O 7,3 ml
  • 4. Nach Vorinkubation des Arzneimittels für 2 Stunden entferne man die gesamte Lösung aus der Platte, transferiere HNTG* (100 ul/Vertiefung) zu den Zellen und schüttele für 10 Minuten.
  • 5. Man verwende eine 12-Kanal Pipette, um die Zellen von der Platte abzukratzen und homogenisiert das Lysat durch wiederholtes Aufsaugen und Verteilen. Man überführe das gesamte Lysat in eine ELISA Platte und schüttele für eine Stunde.
  • 6. Man entferne das Lysat, wasche die Platte, gebe Anti-pTyr, (1 : 3.000 in TBST) 100 ul/Vertiefung hinzu, und schüttele für 30 Minuten.
  • 7. Man entferne den Anti-pTyr, wasche die Platte, gebe Ziege Anti-Kaninchen konjugiertem Antikörper (1 : 5.000 mit TBST), 100 ul/Vertiefung hinzu, und schüttelt für 30 Minuten.
  • 8. Man entferne den Anti-Kaninchen IgG Antikörper, wasche die Platte und gebe 100 ul/Vertiefung frisches ABTS/H&sub2;O&sub2; (1,2 ul H&sub2;O&sub2; auf 10 ml ABTS) zu der Platte hinzu, um die Farbentwicklung zu starten, was üblicherweise 20 Minuten benötigt.
  • 9. Man mißt die OD 410 nM, Dynatec MR5000.
    • 6.1.3. PDGF-R ELISA
  • Alle Zellkulturmedien, Glutamin und fötales bovines Serum wurden, solange nicht anderweitig angegeben, von Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) bezogen. Alle Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre aus 90-95% Luft und 5- 10% CO&sub2; bei 37ºC kultiviert. Alle Zellinien wurden üblicherweise zweimal pro Woche subkultiviert und waren Mycoplasmen-negativ, wie durch die Mycotect Methode (Gibco) bestimmt.
  • Für ELISA Tests wurden Zellen (U1242, von Joseph Schlessinger, NYU erhalten) zu 80 bis 90% Konfluenz im Nährmedium kultiviert (MEM mit 10% FBS, NEAA, 1 mM NaPyr und 1 mM Gln) und in 96-Loch Gewebekulturschalen in 0,5% Serum mit 25.000 bis 30.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach Inkubation über Nacht in 0,5% Serum enthaltendem Medium wurden die Zellen in serumfreies Medium ausgetauscht und mit der Testverbindung für 2 Stunden in einem 5% CO&sub2;, 37ºC Inkubator behandelt. Die Zellen wurden anschließend mit Ligandern für 5-10 Minuten stimuliert, was von Lyse mit HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10% Glycerin, 5 mM EDTA, 5 mM Na&sub3;VO&sub4;, 0,2% Triton X-100 und 2 mM NaPyr) gefolgt wurde. Die Zellysate (0,5 mg/Vertiefung in PBS) wurden in ELISA Platten, die zuvor mit einem rezeptorspezifischen Antikörper beschichtet worden waren und die mit 5% Milch in TBST geblockt worden waren (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl und 0,1% Triton X-100), für 30 Minuten bei Raumtemperatur überführt. Die Lysate wurden unter Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden viermal mit TBST gewaschen und anschließend mit polyklonalen Anti- Phosphotyrosin-Antikörper bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Überschüssiger Anti-Phosphotyrosin-Antikörper wurde entfernt, indem die Platte viermal mit TBST abgespült wurde. Ziege Anti-Kaninchen IgG Antikörper wurde zu der ELISA Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur hinzugegeben, und nachfolgend wurde viermal mit TBST abgespült. Es wurde ABTS (100 mM Zitronensäure, 250 mM Na&sub2;HPO&sub4; und 0,5 mg/mL 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin- 6-sulfonsäure) plus H&sub2;O&sub2; (1,2 ml 30% H&sub2;O&sub2; auf 10 ml ABTS) zu den ELISA Platten hinzugegeben, um die Farbentwicklung zu starten. Die Absorption bei 410 nm wurde mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm für 15 bis 30 Minuten nach der ABTS Zugabe aufgezeichnet.
    • 6.1.4. IGF-I ELISA
  • Das folgende Protokoll kann zur Messung der Phosphotyrosinlevel auf dem IGF-I Rezeptor verwendet werden, was die IGF-I Rezeptortyrosin-Kinaseaktivität anzeigt.
  • Materialien und Reagenzien. Es wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet:
  • a. Die Zellinie, die in diesem Test verwendet wurde, ist 3T3/IGF-1R, eine Zellinie, die den IGF-1 Rezeptor überexprimiert.
  • b. NIH3T3/IGF-1R werden in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; bei 37ºC kultiviert. Das Nährmedium ist DMEM + 10% FBS (hitzeinaktiviert) + 2mM L-Glutamin.
  • c. Es wird der 17-69 genannte Anti-IGF-1R Antikörper verwendet. Die Antikörper wurden vom Enzymlabor von Sugen, Inc. gereinigt.
  • d. D-PBS:
  • KH&sub2;PO&sub4; 0,20 g/l
  • K&sub2;HPO&sub4; 2,16 g/l
  • KCl 0,20 g/l
  • NaCl 8,00 g/l (pH 7,2)
  • e. Blockierungspuffer: TBST plus 5% Milch (Carnation Instant fettfreie Trockenmilch)
  • f. TBST Puffer:
  • Tris-HCl 50 mM
  • NaCl 150 mM (pH 7,2/HCl 10 N)
  • Triton X-100 0,1%
  • Die Stammlösung des TBS (10X) wird hergestellt und Triton X-100 wird während des Verdünnens zu dem Puffer hinzugeben.
  • g. HNTG Puffer:
  • HEPES 20 mM
  • NaCl 150 mM (pH 7,2/HCl 10N)
  • Glycerin 10%
  • Triton X-100 0,2%
  • Die Stammlösung (5X) wird hergestellt und bei 4ºC aufbewahrt.
  • h. EDTA/HCl: 0,5 M pH 7,0 (NaOH) als 100X Stammlösung.
  • i. Na&sub3;VO&sub4;: 0,5 M als 100X Stammlösung und Aliquots werden bei -80ºC aufbewahrt.
  • j. Na&sub4;P&sub2;O&sub7;: 0,2 M als 100X Stammlösung.
  • k. Insulinartiger Wachstumsfaktor 1 von Promega (Kat.# G5111).
  • l. Polyklonales Anti-Phosphotyrosin Antiserum: Kaninchenserum, vom Enzymlabor, Sugen Inc hergestellt.
  • m. Ziege Anti-Kaninchen IgG, POD Konjugat (Nachweis-Antikörper), Tago (Kat.-Nr. 4520, Charge Nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.
  • n. ABTS (2,2'-Azinobis(3-Ethylbenzthiazoninsulfonsäure))-Lösung:
  • Zitronensäure 100 mM
  • Na&sub2;HPO&sub4; 250 mM (pH 4,0/1 N HCl)
  • ABTS 0,5 mg/ml
  • ABTS Lösung sollte im Dunkeln und 4ºC aufbewahrt werden. Die Lösung sollte verworfen werden, wenn sie sich grün verfärbt.
  • o. Wasserstoffperoxid: 30%ige Lösung, wird im Dunkeln und bei 4ºC aufbewahrt.
  • Vorgehensweise: Alle der folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, solange es nicht besonders angegeben ist. Das gesamte Waschen der ELISA Platten wurde durchgeführt, indem die Platten dreimal mit Leitungswasser abgespült wurden, gefolgt von einmaligem Abspülen mit TBST. Die Platte wurde mit Papierhandtüchern trockengeklopft.
    • A. Aussäen der Zellen:
  • 1. Die Zellen, die in Gewebekulturschalen (Corning 25020-100) bis zu 80 bis 90% Konfluenz kultiviert wurden, werden mit Trypsin-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, GIBCO) geerntet.
  • 2. Man resuspendiere die Zellen in frischem DMEM + 10% FBS + 2 mM L- Glutamin und überführt diese mit 20.000 ZellenNertiefung (100 ul/Vertiefung) in eine 96-Loch Gewebekulturplatte (Corning, 25806-96). Man inkubiere für 1 Tag, ersetze anschließend das Medium durch serumfreies Medium (90/ ul) und inkubiere bei 5% CO&sub2; und 37ºC über Nacht.
    • B. Beschichten und Blockieren der ELISA Platten:
  • 1. Man beschichte die ELISA Platte (Corning 25805-96) mit Anti-IGF-1R Antikörper mit 0,5 ul/Vertiefung in 100 ul PBS für zumindest 2 Stunden.
  • 2. Man entferne die Beschichtungslösung, und ersetze sie mit 100 ul Blockierungspuffer und schüttele für 30 Minuten. Man entferne den Blockierungspuffer und wasche die Platte unmittelbar vor der Zugabe des Lysates.
    • C. Vorgehensweise beim Test:
  • 1. Die Arzneimittel werden unter serumfreien Bedingungen getestet.
  • 2. Man verdünne die Stammlösung der Arzneimittel (in 100% DMSO) 1 : 10 mit DMEM in 96-Lach-Polypropylenplatten und überführt 10 ul/Vertiefung dieser Lösung zu den Zellen, um eine Endverdünnung der Arzneimittel von 1 : 100 und eine End- DMSO-Konzentration von 1,0% zu erreichen. Man inkubiere die Zellen in 5% CO&sub2; bei 37ºC für 2 Stunden.
  • 3. Man setze frischen Zellysepuffer an (HNTG*)
  • HNTG 2 ml
  • EDTA 0,1 ml
  • Na&sub3;NO&sub4; 0,1 ml
  • Na&sub4;(P&sub2;O&sub7;) 0,1 ml
  • H&sub2;O 7,3 ml
  • 4. Nach der Inkubation mit dem Arzneimittel für 2 Stunden transferiere man 10 ulNertiefung des 200nM IGF-1 Liganden in PBS zu den Zellen (Endkonzentration = 20 nM) und inkubiere in 5% CO&sub2; bei 37ºC für 10 Minuten.
  • 5. Man entferne das Medium und gebe 100 ul/Vertiefung HNTG* hinzu und schüttele für 10 Minuten. Man betrachte die Zeilen unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob sie ausreichend lysiert sind.
  • 6. Man verwende eine 12-Kanal Pipette, um die Zellen von der Platte abzukratzen und homogenisiere das Lysat durch wiederholtes Ansaugen und Verteilen. Man überführe das gesamte Lysat in eine mit Antikörper beschichtete ELISA Platte und schüttele für 1 Stunde.
  • 7. Man entferne das Lysat, wasche die Platte, transferiere Anti-pTyr (1 : 3.000 in TBST) 100 ul/Vertiefung und schüttele für 30 Minuten.
  • 8. Man entferne den Anti-pTyr, wasche die Platte, transferiere Tago (1.3.000 in TBST) 100 pl/Vertiefung und schüttele für 30 Minuten.
  • 9. Man entferne den Nachweis-Antikörper, wasche die Platte und transferiere frisches ABTS/H&sub2;O&sub2; (1,2 ul H&sub2;O&sub2; auf 10 ml ABTS), 100 ul/Vertiefung zu der Platte, um die Farbentwicklung zu starten.
  • 10. Man mißt die OD in einem Dynatec MR5000, der mit lngres verbunden ist.
    • 6.1.5. EGF Rezeptor ELISA
  • Die EGF Rezeptorkinaseaktivität (EGFR-NIH3T3 Assay) in ganzen Zellen wurde, wie unten beschrieben, gemessen.
  • Materialien und Reagenzien. Es wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet.
  • a. EGF Ligand: Stammlösung = 16,5 uM; EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japan.
  • b. 05-101 (UBI) (ein monoklonaler Antikörper, der eine extrazelluläre Domäne des EGFR erkennt).
  • c. Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Anti-Ptyr) (polyklonal).
  • d. Nachweis-Antikörper: Ziege Anti-Kaninchen IgG Meerrettichperoxidase- Konjugat, TAGO, Inc., Burlingame, CA.
  • e. TBST Puffer:
  • Tris-HCl, pH 7 50 mM
  • NaCl 150 mM
  • Triton X-100 0,1
  • f. HNTG 5X Stammlösung:
  • HEPES 0,1 M
  • NaCl 0,75 M
  • Glycerin 50
  • Triton X-100 1,0%
  • g. ABTS Stammlösung:
  • Zitronensäure 100 mM
  • Na&sub2;HPO&sub4; 250 mM
  • HCl, conc. 4,0 pH
  • ABTS* 0,5 mg/ml
  • Man bewahre die Lösung bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4ºC auf.
  • h. Stammreagenzien von:
  • EDTA 100 mM pH 7,0
  • Na&sub3;VO&sub4; 0,5 M
  • Na&sub4;(P&sub2;O&sub7;) 0,2 M
  • Vorgehensweise. Es wurden die folgenden Protokolle verwendet:
    • A. Vorbeschichten der ELISA Platten
  • 1. Man beschichte ELISA Platten (Corning, 96-Loch, Kat. Nr. 25805-96) mit Antikörper 05-101 mit 0,5 uglVertiefung in PBS, 150 ul Endvolumen/Vertiefung und bewahre sie über Nacht bei 4ºC auf. Beschichtete Platten sind bis zu 10 Tagen verwendbar, wenn bei 4ºC gelagert.
  • 2. Am Tag der Verwendung entfernt man den Beschichtungspuffer und ersetzt ihn mit Blockierungspuffer (5% Carnation Instant fettfreie Trockenmilch in PBS). Man inkubiere die Platte, schüttelt bei Raumtemperatur (ungefähr 23ºC bis 25ºC) für 30 Minuten. Unmittelbar vor der Verwendung entfernt man den Blockierungspuffer und wäscht die Platte viermal mit TBST Puffer.
    • B. Aussäen der Zellen
  • 1. Die NIH 3T3/C7 Zellinie (Honegger, et al., Cell 51: 199-209, 1987) kann für diesen Test verwendet werden.
  • 2. Man wähle Schalen mit 80-90% Konfluenz für das Experiment aus. Die Zellen werden einer Trypsinbehandlung unterworfen und die Reaktion wird durch Zugabe von 10% CS DMEM Medium beendet. Man suspendiere die Zellen in DMEM Medium (10% CS DMEM Medium) und zentrifugiere einmal bei 1000 rpm und einmal bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
  • 3. Man resuspendiere die Zellen im Aussaatmedium (DMEM, 0,5% bovines Serum) und zähle die Zellen unter Verwendung von Trypanblau. Eine Lebensrate von ungefähr 90% ist akzeptabel. Man säe die Zellen in DMEM Medium (0,5% bovines Serum in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung, 100 ulAlertiefung, in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte aus. Man inkubiere die ausgesäten Zellen mit 5% CO&sub2; bei 37ºC für ungefähr 40 Stunden.
    • C. Vorgehensweise beim Test
  • 1. Man überprüfe die ausgewählen Zellen auf Kontamination unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Man verdünne die Stammlösung des Arzneimittels (10 mg/ml in DMSO) 1 : 10 in DMEM Medium, überführt anschließend 5 ul in eine Testvertiefung für eine Endverdünnung des Arzneimittels von 1 : 200 und einer Ejdkonzentration von DMSO von 1%. Vertiefungen von Kontrollen erhalten nur DMSO. Man inkubiere in 5% CO&sub2; bei 37ºC für eine Stunde.
  • 2. Man präpariere den EGF Liganden: Man verdünne die EGF Stammlösung in DMEM, sodaß nach Transfer von 10 ul verdünnten EGF (1 : 12 Verdünnung) eine Endkonzentration von 25 nM erhalten wird.
  • 3. Man setze frischen 10 ml HNTG* an, der für 100 ul/Vertiefung ausreicht, wobei der HNTG* umfaßt: HNTG Stammlösung (2,0 ml), milli-Q H&sub2;O(7,3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na&sub3;VO&sub4; 0,5M (0,1 ml) und Na&sub4;(P&sub2;O&sub7;), 0,2 M (0,1 ml).
  • 4. Man stelle dies auf Eis.
  • 5. Nach 2 Stunden Inkubation mit dem Arzneimittel gebe man präparierten EGF Liganden zu den Zellen, 10 ulNertiefung, um eine Endkonzentration von 25 nM zu erreichen. Kontrollvertiefungen erhalten nur DMEM. Man inkubiere unter Schütteln für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  • 6. Man entferne das Arzneimittel, den EGF und das DMEM. Man wasche die Zellen zweimal mit PBS. Man überführe HNTG* zu den Zellen, 100 ul pro Vertiefung. Man stelle für 5 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit entferne man den Blockierungspuffer von der anderen ELISA Platte und wasche mit TBST wie oben beschrieben.
  • 7. Mit einer Pipettenspitze, die auf einer Mikropipettenvorrichtung fest angebracht ist, kratze man die Zellen aus den Platten und homogenisiere das Zellmaterial durch wiederholtes Aufziehen und Verteilen des HNTG* Lysepuffers. Man überführe das Lysat in eine beschichtete, blockierte und gewaschene ELiSA Platte. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
  • 8. Man entferne das Lysat und wasche viermal mit TBST. Man transferiere frisch verdünnten Anti-Ptyr-Antikörper in die ELISA Platte mit 100 ul pro Vertiefung. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten in der Gegenwart des Anti-Ptyr Antiserums (1 : 3.000 Verdünnung in TBST).
  • 9. Man entferne den Anti-Ptyr-Antikörper und wasche viermal mti TBST. Man überführe den frisch verdünnten TAGO 30 Anti-Kaninchen IgG Antikörper in die ELISA Platte in 100 ul pro Vertiefung. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten (Anti-Kaninchen lgG Antikörper: 1 : 3.000 Verdünnung in TBST).
  • 10. Man entferne den Nachweis-Antikörper und wasche viermal mit TBST. Man überführe frisch hergestellte ABTS/H&sub2;O&sub2; Lösung in die ELISA Platte, 100 ul/Vertiefung. Man inkubiere bei Raumtemperatur für 20 Minuten. ABTS/H&sub2;O&sub2; Lösung: 1,2 ul 30% H&sub2;O&sub2; auf 10 ml ABTS Stammlösung.
  • 11. Man beendet die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 5 N H&sub2;SO&sub4; (optional) und bestimmt die O. D. bei 410 nm.
  • 12. Das maximale Phosphotyrosinsignal wird durch Subtraktion des Wertes der Negativkontrollen von den Positivkontrollen bestimmt. Anschließend wird nach Subtraktion der Negativkontrollen die prozentuale Inhibition des Phosphotyrosingehalts für Vertiefungen, die Extrakt enthalten, berechnet,.
    • 6.1.6. Zellulärer-Insulinrezeptor ELISA
  • Das folgende Protokoll wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Insuünrezeptor-Tyrosinkinaseaktivität besitzen.
  • Materialien und Reagenzien. Es wurden die folgenden Materialien und Reagenzien verwendet, um Phosphotyrosinlevel des Insulinrezeptors zu messen (was die Insulinrezeptor-Tyrosinkinaseaktivität anzeigt):
  • 1. Die bevorzugte Zellinie war eine NIH3T3 Zellinie (ATCC Nr. 1658), die den Insulinrezeptor überexprimiert (H25 Zellen);
  • 2. H25 Zellen werden in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; bei 37ºC kultiviert. Das Nährmedium ist DMEM + 10% FBS (hitzeinaktiviert) + 2 mm L-Glutamin;
  • 3. Für das Beschichten der ELISA Platte wird der monoklonale BBE genannte Antikörper verwendet. Dieser Antikörper wurde vom Enzymlabor von Sugen Inc. gereinigt;
  • 4. D-PBS, umfassend:
  • KH&sub2;PO&sub4; 0,20 g/l (GIBCO, 310-4190AJ)
  • K&sub2;HPO&sub4; 2,16 g/l
  • Kcl 0,20 g/l
  • NaCl 8,00 g/l (pH 7,2);
  • 5. Blockierungspuffer: TBST + 5% Milch (Carnation Instant fettfreie Trockenmilch);
  • 6. TBST-Puffer umfassend;
  • Tris-HCl 50 mM
  • NaCl 150 mM pH 7,2 (HCl, 1N)
  • Triton X-100 0,1%
  • Man beachte: Die Stammlösung des TBS (10X) wird hergestellt und Triton X-100 wird zu dem Puffer während des Verdünnens hinzugegeben;
  • 7. HNTG Puffer, umfassend:
  • HEPES 20 mM
  • NaCl 150 mM pH 7,2 (HCl, 1 N)
  • Glycerin 10%
  • Triton X-100 0,2%
  • Man beachte: Die Stammlösung (5X) wird hergestellt und bei 4ºC aufbewahrt;
  • 8. EDTAIHCl: 0,5 M pH 7,0 (NaOH) als 100fach Stammlösung;
  • 9. Na&sub3;VO&sub4; : 0,5 M als 100X Stammlösung und Aliquots wurden bei -80ºC aufbewahrt;
  • 10. Na&sub4;P&sub2;O&sub7; : 0,2 M als 100X Stammlösung;
  • 11. Insulin von GIBCO BRL (Kat.-Nr. 18125039);
  • 12. Polyklonales Anti-Phosphotyrosin Antiserum: Kaninchenserum, hergestellt vom Enzymlabor, Sugen Inc.;
  • 13. Nachweis-Antikörper, vorzugsweise Ziege Anti-Kaninchen IgG, POD Konjugat, Tago (Kat.-Nr. 4520: Charge Nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA;
  • 14. ABTS Lösung, umfassend:
  • Zitronensäure 100 mM
  • Na&sub2;HPO&sub4; 250 mM pH 4,0 (1 N HCl)
  • ABTS 0,5 mg/ml
  • wobei ABTS 2,2'-Azinobis(3-ethylbenathiazolinsulfonsäure) ist und im Dunkeln bei 4ºC gelagert wird und verworfen wird, wenn es sich grün verfärbt;
  • 15. Wasserstoffperoxid: eine 30%ige Lösung wird im Dunkeln und bei 4ºC aufbewahrt.
  • Protokoll. Alle der folgenden Schritt werden bei Raumtemperatur durchgeführt, solange es nicht besonders anders angegeben ist. Das gesamte Waschen der ELiSA Platte wurde durchgeführt, indem die Platte dreimal mit Leitungswasser abgespült wurde, gefolgt von einmaligem Abspülen mit TBST. Alle Platten wurden mit Papiertüchern vor der Verwendung trockengeklopft.
    • A. Aussäen der Zellen:
  • 1. Die Zellen wurden in Gewebekulturschalen (10 cm, Corning 25020-100) bis zu einer Konfluenz von 80 bis 90% kultiviert und mit Trypsin-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D- 100, GIBCO) geerntet;
  • 2. Man resuspendiere die Zellen in frischem DMEM + 10% EBS + 2mM L- Glutamin und überführe diese mit 20.000 Zellen/Vertiefung (100 ul/Vertiefung) in eine 96-Loch Gewebekulturplatte (Corning, 25806-96). Die Zellen werden anschließend für 1 Tag inkubiert. Nach einer solchen Inkubation ersetzt 0,01% Serummedium (90 ul) das alte Medium und die Zellen werden in 5% CO&sub2; und 37ºC über Nacht inkubiert.
    • B. Beschichten und Blockieren der ELISA Platte
  • 1. Man beschichte die ELISA Platte (Corning 25805-96) mit Anti-IR Antikörper mit 0,5 ug/Vertiefung in 100 ul PBS für zumindest 2 Stunden.
  • 2. Man entferne die Beschichtungslösung und ersetze sie mit 100 ul Blockierungspuffer und schüttele für 30 Minuten. Man entferne den Blockierungspuffer und wasche die Platte unmittelbar vor der Zugabe von Lysat.
    • C. Vorgehenweise beim Test
  • 1. Die Arzneimittel werden unter serumfreien Bedingungen getestet.
  • 2. Man verdünne die Stammlösung des Arzneimitels (in 100% DMSO) 1 : 10 mit DMEM in einer 96-Loch Polypropylenplatte und transferiere 10 ul/Vertiefung dieser Lösung zu den Zellen, um eine Endverdünnung des Arzneimittels von 1 : 100 und eine Endkonzentration von 1,0% zu erhalten. Man inkubiere die Zellen in 5% CO&sub2; bei 37ºC für 2 Stunden.
  • 3. Man setze frischen Zellysepuffer (HNTG*) an
  • HNTG (5X) 2 ml
  • EDTA 0,1 ml
  • Na&sub3;VO&sub4; 0,1 ml
  • Na&sub4;P&sub2;O&sub7; 0,1 ml
  • H&sub2;O 7,3 ml
  • HNTG* 10 ml
  • 4. Nach Inkubation mit dem Arzneimittel für 2 Stunden transferiere man 10 ul/Vertiefung von 1 uM Insulin in PBS zu den Zellen (Endkonzentration = 100 nM) und inkubiere unter 5% CO&sub2; bei 37ºC für 10 Minuten.
  • 5. Man entferne das Medium und gebe 100 ul/Vertiefung HNTG* hinzu und schüttele für 10 Minuten. Man beobachte die Zellen unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob sie ausreichend lysiert sind.
  • 6. Unter Verwendung einer 12-Kanal-Pipette kratze man die Zellen aus der Platte und homogenisiere das Lysat durch wiederholtes Aufziehen und Verteilen. Man transferiere das gesamte Lysat in eine mit Antikörper beschichtete ELISA Platte und schüttele für eine Stunde.
  • 7. Man entferne das Lysat, wasche die Platte, transferiert Anti-pTyr (1 : 3000 in TBST), 100 ul/Vertiefung und schüttelt für 30 Minuten.
  • 8. Man entferne den Anti-pTyr, wasche die Platte, transferiere TAGO (1 : 3000 in TBST), 100 ul/Vertiefung und schüttelt für 30 Minuten.
  • 9. Man entferne den Nachweis-Antikörper, wasche die Platte und transferiere frisches ABTS/H&sub2;O&sub2; (1,2 ul H&sub2;O&sub2; auf 10 ml ABTS) 100 ul/Vertiefung zu den Platten, um die Farbentwicklung zu starten.
  • 10. Man mißt die OD in einem Dynatec MR5000, der mit einem Ingres verbunden ist. Alle nachfolgenden Schritte sollten die lngres-Anweisungen befolgen.
    • 6.1.7. Experimentelle Ergebnisse der ELISA Assays
  • Die experimentellen Ergebnisse für zahlreiche erfindungsgemäße Verbindungen unter Verwendung der oben beschriebenen Protokolle sind in Tabelle 1 dargestellt: TABELLE 1 ELISA Assay-Ergebnisse
    • 6.2. Zellwachstumstests
  • Die folgenden Tests wurden durchgeführt, um die Wirkuung der beanspruchten Verbindungen auf das Zeliwachstum als Folge der Interaktion der Verbindungen mit einer oder mehrerer RTKs zu messen, Soweit nicht anders angegeben, können die folgenden Tests generell angewendet werden, um die Aktivität einer Verbindung gegen eine bestimmte RTK zu messen. Zu dem Maß, in dem ein Assay, wie unten geschildert, sich auf eine spezifische RTK bezieht, wäre der Fachmann in der Lage, das offenbarte Protokoll für die Verwendung zur Messung der Aktivität einer zweiten RTK anzupassen.
    • 6.2.1. Weichagar-Test
  • Der Weichagar-Test kann verwendet werden, um die Wirkung von Substanzen auf das Zellwachstum zu messen. Solange nicht anders angegeben, werden die Weichagar-Tests wie folgt durchgeführt:
  • Materialien und Reagenzien. Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:
  • a. Ein Wasserbad, das auf 39ºC eingestellt war und ein anderes Wasserbad auf 37ºC.
  • b. 2X Testmedium, umfaßt von 2X Dulbecco's 5Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco Cat. # CA400-4AN03), das wie folgt supplementiert ist:
  • 20% fötales bovines Serum (FBS), 2 mM Natriumpyruvat, 4 mM Glutaminamin; und
  • 20 mM HEPES, nicht-essentielle Aminosäuren (1 : 50 aus 100X Stammlösung).
  • c. 1X Assay Medium, hergestellt aus 1X DMEM supplementiert mit 10% FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, nicht essentiellen Aminosäuren (1 : 100 aus 100X Stammlösung).
  • d. 1,6% SeaPlaque Agarose in Autoklaven-Flaschen.
  • e. Sterile 35 mm Corning Platten (FMC Bioproducts Kat. #50102).
  • f. Sterile 5 ml Glaspipetten (einzeln verpackt).
  • g. Sterile 15 ml und 50 ml konische Zentrifugenröhrchen.
  • h. Pipetten und sterile Spitzen.
  • i. Sterile Mikrozentrifugenröhrchen.
  • j. Zellen in T75 Kolben: SKOV-3 (ATCC HTB77).
  • Vorgehensweise. Die folgende Vorgehensweise wurde verwendet, um den Weichagar-Test durchzuführen: Verfahren zur Herstellung der Grundschicht
  • 1. Man habe alle Medien in einem 37ºC Wasserbad aufgewärmt.
  • 2. Um ein 1X Testmedium + 0,8% Agar herzustellen: man mache eine 1 : 2 (Volumen : Volumen) Verdünnung von geschmolzenem Agar (auf 39ºC abgekühlt) mit 2X Testmedium.
  • 3. Man halte alle Medien mit Agar in dem 39ºC Wasserbad warm, solange sie sicht verwendet werden.
  • 4. Man verteilt 1 ml des 1X Testmediums + 0.8% Agar in Schalen und schwänkt die Platte behutsam, um eine gleichmäßige Grundschicht auszubilden. Blasen sollten vermieden werden.
  • 5. Man kühlt die Grundschicht zum Verfestigen ab (für ungefähr 20 Minuten). Die Grundschichten können über Nacht in einem Kühlschrankt aufbewahrt werden.
    • B. Vorgehensweise zum Sammeln der Zellen
  • 1. Man nehme einen Kolben pro Zellinie aus dem Inkubator; sauge das Medium ab, wasche einmal mit PBS und saugt ab, gebe 3 ml Trypsinlösung hinzu.
  • 2. Nachdem alle Zellen von dem Kolben abgelöst sind, gebe man 3 ml 1X Testmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu inhibieren. Man pipettiert die Zellen auf und ab und überführt anschließend die Suspension in ein 15 ml Röhrchen.
  • 3. Man bestimmt die Konzentration der Zellen unter Verwendung eines Coulter Zählers und die Lebensfähigkeit durch Trypanblau Ausschluß.
  • 4. Man nehme das geeignete Volumen, das nötig ist, um 3300 lebende Zellen pro Platte auszusäen und verdünne es auf 1,5 ml mit 1X Testmedium.
    • C. Vorgehensweise zur Herstellung der oberen 0,4% Agaroseschicht:
  • 1. Man füge die Verbindungen in TBST im Zweifachen der gewünschten Test- Endkonzentration hinzu; + 1,5 ml Zellsuspension in 1X Testmedium 10% FBS; + 1,5 ml 1X Testmedium + 0.8% Agarose: Gesamt = 3,0 ml 1X Testmedium 10% FBS + 0,4% Agarose mit 3300 lebenden Zellen/ml, mit und ohne Verbindungen in TBST.
  • * (Hergestellt durch 1 : 2 Verdünnung von 2X Medium mit 1,6% Agar 30 für die obige Vorgehensweise für die Grundschicht.)
  • 2. Man platiere 1 ml der Testmischung auf der 1 ml Grundschicht aus. Die Duplikate werden aus 3 ml Volumen ausplatiert.
  • 3. Man inkubiere die Schalen für 2-3 Wochen in einem 100% befeuchteten, 10% CO&sub2; inkubator.
  • 4. Kolonien, die 60 Mikrons und größer sind, werden als positiv bewertet.
    • 6.2.2. Sulforhodamin B (SRB) Wachtstumstests
  • Die SRB-Tests können verwendet werden, um die Wirkungen der Substanzen auf das Zellwachstum zu messen. Die Tests werden wie folgt durchgeführt:
    • Test 1: 3T3/E/H+TGF-a(T) Zellwachstums SRB-Test Materialien:
  • Sterile 96-Loch Platten mit flachem Boden
  • Sterile 96-Loch Platten mit rundem Boden
  • Sterile 25 ml oder 100 ml Reservoir
  • Pipetten, Multikanal-Pipettierhüfe
  • Sterile Pipettenspitzen
  • Sterile 15 ml und 50 ml Röhrchen
    • Reagenzien:
  • 0,4% SRB in 1% Essigsäure
  • 10 mM Tris-Base
  • 10% TCA
  • 1% Essigsäure
  • Steriles DMSO (Sigma)
  • Verbindung in DMSO (100 mM oder geringere Stammlösung)
  • 25% Trypsin-EDTA in Zell-Dissoziationslösung (Sigma)
  • Zellinie und Nährmedium:
  • 3T3/E/H+TGF-a(T) (NIH 3T3 Zellen des Klons 7, die EGF-R/HER2-Chimäre und TGF-a exprimieren, von Tumoren abstammende autokrine Loopzellen) 2% Kälberserum/DMEM + 2 mM Glutamin
    • Protokoll:
  • Tag 0: Ausplatieren der Zellen:
  • Dieser Teil des Testes wird in einer Bank mit laminaren Fluß durchgeführt.
  • 1. Man behandle Zellen mit Trypsin wie üblich. Man überführe 100 ul der Zellsuspension in 10 ml Isoton. Man zähle die Zellen mit dem Coulter Zähler.
  • 2. Man verdünne die Zellen in Nährmedium auf 60.000 Zellen/ml. Man überführe 100 ul der Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch Platte mit flachem Boden, um 6.000 Zellen/Vertiefung zu erhalten.
  • 3. Man verwende die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und Vierfach-Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung, einen Satz von 4 Vertiefungen für Mediumkontrollen und 4 Vertiefungen für die DMSO Kontrolle.
  • 4. Man schüttle die Platten sanft, um eine gleichförmige Anheftung der Zellen zu ermöglichen.
  • 5. Man inkubiere die Platten bei 37ºC in einem 10% CO&sub2; Inkubator,
  • Tag 1: Zugabe der Verbindung:
  • Dieser Teil des Versuchs wird in einer Arbeitsbank mit laminarem Fluß durchgeführt.
  • 1. In einer 96-Loch Platte mit rundem Boden gebe man 125 ul Nährmedium in die Spalten 3 bis 11. Diese Platte wird zur Titration der Verbindungen verwendet, jeweils 4 Reihen pro Verbindung.
  • 2. In einem sterilen 15 ml Röhrchen setze man eine 2X Lösung der höchsten Konzentration der Verbindung an, indem man 8 ul der Verbindung zu einem Gesamtvolumen von 2 ml Nährmedium für eine Verdünnung von 1 : 250 hinzugibt. Bei dieser Verdünnung ist die Konzentration des DMSO 0,4% für eine 2X Lösung oder 0,2% für eine 1X Lösung auf den Zellen. Die Ausgangskonzentration der Verbindung beträgt üblicherweise 100 um, jedoch kann diese Konzentration in Abhängigkeit von der Löslichkeit der Verbindung variieren.
  • 3. Man überführe die 2X Ausgangslösung der Verbindung in Vierfach- Vertiefungen in Spalte 12 der 96-Lochplatte mit rundem Boden. Man mache serielle 1 : 2 Verdünnungen in der Platte von rechts nach links, indem 125 ul von Spalte 12 nach Spalte 11, Spalte 11 zu 10 usw. überführt werden. Man transferiert 100 ul der Verdünnungen der Verbindung in 100 ul Medium auf Zellen in entsprechenden Vertiefungen der 96-Loch Platte mit flachem Boden. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte 200 ul betragen.
  • 4. Für eine Lösungsmittelkontrolle stelle man eine 2X Lösung DMSO mit 0,4% DMSO im Nährmedium her. Man überführe 100 ul der DMSO Lösung in die vorgesehenen Vertiefungen der Zellen. Die Endkonzentration von DMSO beträgt 0,2%.
  • 5. Für die Vertiefungen der Mediumkontrolle füge man 100 ul/Vertiefung des Nährmediums zu den vorgesehenen Vertiefungen der Zellen.
  • 6. Man stellt die Platte in den Inkubator zurück und inkubiert für 4 Tage.
  • Tag 5: Entwicklung des Tests
  • Dieser Teil des Testes wird auf der Laborbank durchgeführt.
  • 1. Man sauge oder gieße das Medium ab. Man gebe 200 ul kalte 10% TCA in jede Vertiefung, um die Zellen zu fixieren. Man inkubiere die Platte für zumindest 60 Minuten bei 4ºC.
  • 2. Man verwerfe die TCA und spüle die Vertiefungen fünfmal mit Wasser. Man trockne die Platten auf dem Kopf liegend auf Papiertüchern.
  • 3. Man färbe die Zellen mit 100 ul/Vertiefung 0,4% SRB für 10 Minuten an.
  • 4. Man gieße das SRB ab und spüle die Zellen fünfmal mit 1% Essigsäure. Man trockne die Platten auf dem Kopf liegend auf Papiertüchern vollständig.
  • 5. Man löse den Farbstoff mit 100 ul/Vertiefung 10 mM Tris-Base für 5-10 Minuten auf dem Schüttler auf.
  • 6. Man liest die Platten auf einem Dynatech ELISA Plattenleser bei 570 nM mit Referenz zu 630 mM.
    • Test 2: 3T3/EGF-R+TGF-a(T) Zellwachstum SRB-Test
  • Materialien und Reagenzien sind dieselben wie in Test 1.
  • Zellinie und Nährmedium:
  • 3T3/EGF-R+TGF-a(T) (NIH 3T3 Zellen des Klons 7, die den EGF-R und TGF-a exprimieren, von Tumoren abstammende autokrine Loopzellen)
  • 2% Kälberserum/DMEM + 2 mM Glutamin
    • Protokoll:
  • Tag 0: Ausplatieren der Zellen:
  • Dieser Teil des Testes wird in einer Arbeitsbank mit laminarem Fluß durchgeführt.
  • 1. Man behandle die Zellen mit Trypsin wie üblich. Man überführe 100 ul der Zellsuspension zu 10 ml Isoton. Man zähle die Zellen mit dem Coulter Zähler.
  • 2. Man verdünne Zellen in Nährmedium auf 60.000 Zellen/ml. Man überführe 100 ul Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch Platte mit flachem Boden, um 6.000 Zellen/Vertiefung zu erhalten.
  • 3. Man verwende die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und Vierfach-Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung, ein Satz von 4 Vertiefungen für die Mediumkontrolle und 4 Vertiefungen für die DMSO Kontrolle.
  • 4. Man schüttle die Platten sanft, um eine gleichmäßige Anheftung der Zellen zu ermöglichen.
  • 5. Man inkubiere die Platten bei 37ºC in einem 10% CO&sub2; Inkubator.
  • Tag 1: Zugabe der Verbindung: wie in Test 1.
  • Tag 5: Entwicklung des Testes: wie in Test 1.
    • Test 3: 3T3/PDGF-βR/PDGF-BB(T) Zellwachstum SRB-Test
  • Zellinie und Nährmedium:
  • 3T3/PDGF-βR/PDGF-BB(T) (NIH 3T3 Zellen des Klons 7, die den PDGF β-Rezeptor und PDGF-BB exprimieren, aus Tumoren, die von athymischen Mäusen resektiert werden)
  • 2% Kälberserum/DMEM + 2 mM Glutamin
    • Protokoll:
  • Tag 0: Ausplatieren der Zellen:
  • Dieser Teil des Tests wird in einer Arbeitsbank mit laminarem Fluß durchgeführt.
  • 1. Man behandle die Zellen mit Trypsin wie üblich. Man überführe 200 ul der Zellsuspension in 10 ml Isoton. Man zähle die Zellen in dem Coulter Zähler.
  • 2. Man verdünne die Zellen in Nährmedium auf 60.000 Zellen/ml. Man überführe 100 ul der Zellen in jede Vertiefung einer 96-Lochplatte mit flachem Boden, um 6.000 ZellenNertiefung zu erhalten.
  • 3. Man läßt die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und Vierfach- Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung, einen Satz von 4 Vertiefungen für die Mediumkontrolle und 4 Vertiefungen für die DMSO Kontrolle.
  • 4. Man schüttle die Platte sanft, um ein gleichförmiges Anheften der Zellen auf der Platte zu ermöglichen.
  • 5. Man inkubiere die Platten bei 37ºC in einem 10% CO&sub2; Inkubator.
  • Tag 1: Zugabe der Verbindung: wie in Test 1.
  • Tag 5: Entwicklung des Testes: wie in Test 1.
    • Test 4: SRB Wachstums-Test mit menschlichen glatten Muskelzelten (SMC)
  • Materialien und Reagenzien wie in Test 1:
  • Zellinie und Nährmedium:
  • Humane aortische glatte Wachstumszellen (Clonetics)
  • Clonetic Bullet Kit: Glattmuskel-Basalmedium (SmBM), das modifiziertes MCDB 131 ist, das fötales bovines Serum (5%), hFGF (2 ng/ml), hEGF (0,1 ng/ml), Insulin (5,0 ug/ml), Gentamicin (50 ug/ml) und Amphotericin B (50 ng/ml) enthält.
    • Protokoll:
  • Tag 0: Ausplatieren der Zellen:
  • Dieser Teil des Testes wird in einer Arbeitsbank mit laminarem Fluß durchgeführt.
  • 1. Man behandele die Zellen mit Trypsin wie üblich. Man überführe 200 ul der Zellsuspension in 10 ml Isoton. Man zähle die Zellen in dem Coulter Zähler.
  • 2. Man verdünne die Zellen in Nährmedium auf 20.00 Zellen/ml. Ma überführt 100 ul der Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch Platte mit flachem Boden, um 2.000 Zellen/Vertiefung zu erhalten.
  • 3. Man läßt die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und Vierfach- Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung, einen Satz von 4 Vertiefungen für die Mediumkontrolle und 4 Vertiefungen für die DMSO Kontrolle.
  • 4. Man schüttle die Platten sanft, um ein gleichförmiges Anheften der Zellen auf der Platte zu ermöglichen.
  • 5. Man inkubiere die Platten bei 37ºC in einem 10% CO&sub2; Inkubator.
  • Tag 1: Zugabe der Verbindung: wie in Test 1.
  • Tag 5: Entwicklung des Tests: wie in Test 1.
    • 6.2.3. 3T3 Zellwachstumstest Test 1: Test für den PDGF-induzierten Einbau von BrdU Materialien und Reagenzien:
  • (1) PDGF: humaner PDGF B/B; 1276-956, Boehringer Mannheim, Deutschland
  • (2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig), Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (5) TMB Substratlösung:
  • Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7,4, selbst angesetzt.
  • (7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
    • Protokoll:
  • (1) Engineerte 3T3 Zellinie: 3T3/EGFRc7.
  • (2) Die Zeilen werden in 8.000 Zellen/Vertiefung in DMEM, 10% CS, 2 mM Gln in einer 96-Lochplatte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert.
  • (3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden anschließend bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
  • (4) Am Tag 3 werden Ligand (PDGF = 3,8 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA. Die Zellen der Positivkontrolle erhalten den Ligand (PDGF), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Ligand in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
  • (5) Nach 20 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1 : 100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 uM) für 1,5 Stunden inkubiert.
  • (6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf liegenden Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 ul/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf liegenden Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch (5%ige entwässerte Milch in PBS, 200 ul/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1 : 100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
  • (10) Es wird TMB-Substratlösung hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
  • (11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
    • Test 2: Test des EGF-Induzierten BrdU-Einbaus Materialien und Reagenzien
  • (1) EGF: Maus EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd. Japan
  • (2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland
  • (3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (5) TMB Substrat-Lösung:
  • Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7,4, selbst angesetzt
  • (7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Puder; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
    • Protokoll
  • (1) Engineerte 3T3 Zellinie: 3T3/EGFRc7
  • (2) Die Zellen werden mit 8.000 ZellenNertiefung in 10% CS, 2 mM Gln in DMEM in einer 96-Loch Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert.
  • (3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
  • (4) Am Tag 3 werden Ligand (EGF = 2 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrollen erhalten den Liganden (EGF), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Liganden in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
  • (5) Nach 20 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1 : 100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 uM) für 1,5 Stunden inkubiert.
  • (6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 ul/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch hinzugegeben (5% entwässerte Milch in PBS, 200 ul/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1 : 100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
  • (10) Es wird TMB-Substratlösung hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
  • (11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
    • Test 3: EGF-induzierter, Her2-gesteuerter Einbau von BrdU Materialien und Reagenzien:
  • (1) EGF: Maus EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd. Japan
  • (2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland
  • (3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (5) TMB Substrat-Lösung:
  • Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7,4, selbst angesetzt
  • (7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Puder; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
    • Protokoll:
  • (1) Engineerte 3T3 Zellinie: 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFR mit einer Her2-Kinase Domäne)
  • (2) Die Zellen werden mit 8.000 Zellen/Vertiefung in 10% CS, 2 mM Gln in DMEM in einer 96-Loch Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert.
  • (3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
  • (4) Am Tag 3 werden Ligand (EGF = 2 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrollen erhalten den Liganden (EGF), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Liganden in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
  • (5) Nach 20 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1 : 100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 uM) für 1,5 Stunden inkubiert.
  • (6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 ul/Iertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch hinzugegeben (5% entwässerte Milch in PBS, 200 ul/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1 : 100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
  • (10) Es wird TMB Substratlösung hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
  • (11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
    • Test 4: Test des IGF1-induzierten Einbaus von BrdU: Materialien und Reagenzien:
  • (1) IGF1 Ligand: human, rekombinant; G511, Promega Corp., USA.
  • (2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland
  • (3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (5) TMB Substrat-Lösung:
  • Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7,4, selbst angesetzt
  • (7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Puder; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
    • Protokoll:
  • (1) Engineerte 3T3 Zellinie: 3T3/IGF1 r.
  • (2) Die Zellen werden mit 8.000 ZellenNertiefung in 10% CS, 2 mM Gln in DMEM in einer 96-Loch Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert.
  • (3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
  • (4) Am Tag 3 werden Ligand (IGF = 3.3 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrollen erhalten den Liganden (IGF), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Liganden in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
  • (5) Nach 16 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1 : 100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 uM) für 1,5 Stunden inkubiert.
  • (6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 ul/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch hinzugegeben (5% entwässerte Milch in PBS, 200 ul/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1 : 100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
  • (10) Es wird TMB-Substratläsung hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
  • (11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
    • Test 5: Test zum Insulin induzierten Einbau von BrdU Materialien und Reagenzien:
  • (1) Insulin: kristallin, bovin, Zink; 13007, Gibco BRL, USA
  • (2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7,4), Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland
  • (3) FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (4) Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (5) TMB Substrat-Lösung:
  • Tetramethylbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Kat. Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
  • (6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7,4, selbst angesetzt
  • (7) Albumin, Bovin (BSA): Fraktion V Puder; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
    • Protokoll:
  • (1) Engineerte 3T3 Zellinie: H25
  • (2) Die Zellen werden mit 8.000 Zellen/Vertiefung in 10% CS, 2 mM Gln in DMEM in einer 96-Loch Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert.
  • (3) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann bezüglich des Serums in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden hungern gelassen.
  • (4) Am Tag 3 werden Ligand (Insulin = 10 nM, angesetzt in DMEM mit 0,1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die Vertiefungen der Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrollen erhalten den Liganden (Insulin), aber keine Testverbindung. Die Testverbindungen sind in serumfreiem DMEM mit Liganden in einer 96-Loch Platte angesetzt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
  • (5) Nach 16 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU Markierungsreagenz (1 : 100 in DMEM, 0,1% BSA) hinzugegeben und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 uM) für 1,5 Stunden inkubiert.
  • (6) Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird FixDenat-Lösung hinzugegeben (50 ul/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (7) Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der auf den Kopf gedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Es wird Milch hinzugegeben (5% entwässerte Milch in PBS, 200 ul/Vertiefung) als Blockierungslösung hinzugegeben und die Platte wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (8) Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Es wird Anti-BrdU-POD Lösung (1 : 100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
  • (9) Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
  • (10) TMB Substratlösung wird hinzugegeben (100 ul/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Bestimmung ausreicht.
  • (11) Die Absorption der Proben wird bei 410 nM (in "dualem Wellenlängen" Modus mit einem Filter, der bei 490 nM liest, als Referenzwellenlänge) in einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.
    • 6.2.4. HUV-EC-C-Test
  • Das folgende Protokoll kann ebenfalls zur Messung der Aktivität einer Verbindung verwendet werden:
    • Tag 0
  • 1. Man wäscht und behandelt HUV-EC-C Zellen (humane Nabelschnurvenen- Endothelzellen, (American Type Culture Collection; Katalog Nr. 1730 CRL)) mit Trypsin. Man wasche mit Dulbecco's phosphatgepufferten Salm (D-PBS, erhalten von Gibco BRL, Katalog Nr. 14190-029) zweimal mit ungefähr 1 ml/10 cm² des Gewebekulturkofbens. Man behandle mit Trypsin mittels 0,05% Trypsin-EDTA in nicht-enzymatischer Zelldissoziations-Lösung (Sigma Chemical Company; Katalog Nr. C-1544). Das 0,05% Trypsin wurde durch Verdünnen von 0,25% Trypsin/1 mM EDTA (Gibco; Katalognr. 25200-049) in der Zelldissoziations-Lösung hergestellt. Man behandle mit Trypsin mit ungefähr 1 ml/25-30 cm² Gewebekulturkolben für ungefähr 5 Minuten bei 37ºC. Nachdem die Zellen sich von dem Kolben losgelöst haben, gebe man ein gleiches Volumen Testmedium hinzu und überführt in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen (Fisher Scientific; Katalognr. 05-539-6).
  • 2. Man wasche die Zellen mit ungefähr 35 ml Testmedium in dem 50 ml sterilen Zentrifugenröhrchen durch Zugabe des Testmediums, zentrifugiert für 10 Minuten bei ungefähr 200 · g, saugt den Überstand ab und resuspendiert mit 35 ml D-PBS. Man wiederhole das Waschen weitere zweimal mit D-PBS, resuspendiert die Zellen in ungefähr 1 ml Testmedium/ 15 cm² Gewebekulturkolben. Das Testmedium besteht aus F12K Medium (Gibco BRL; Katalog Nr. 21127-014) + 0,5% hitzeinaktiviertem fötalem bovinen Serum. Man zählt die Zellen mit einem Coulter Counter® v (Coulter Electronics, Inc.) und gibt Testmedium zu den Zellen, um eine Konzentration von 0,8- 1,0 · 10&sup5; Zellen/ml zu erhalten.
  • 3. Man gibt Zellen zu den 96-Loch Platten mit flachem Boden mit 100 ul/Vertiefung oder 0,8-1,0 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung; inkubiert für ungefähr 24 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;.
    • Tag 1
  • 1. Man mache zweifache Titrationen des Arzneimittels in separaten 96-Loch Platten, üblicherweise 50 uM bis hinunter zu 0 uM. Man verwendet dasselbe Testmedium wie oben für Tag 0, Schritt 2 erwähnt. Die Titrationen werden durch Zugabe von 90 ul/Vertiefung des Arzneimittels bei 200 uM (4 · die Endkonzentration der Vertiefung) zu der obersten Vertiefung einer ausgewählten Spalte der Platte gemacht. Da die Konzentration des Arzneimittels in der Stammlösung üblicherweise 20 mM in DMSO beträgt, enthält die 200 uM Konzentration des Arzneimittels 2% DMSO.
  • Daher wird eine Verdünnung bis auf 2% DMSO im Testmedium (F12K + 0,5% fötales bovines Serum) als Verdünnung für die Arzneimitteltitrationen verwendet, um das Arzneimittel zu verdünnen, die DMSO Konzentration jedoch konstant zu halten. Dieses Verdünnungsmittel gebe man zu den verbleibenden Vertiefungen in der Spalte mit 60 ul/Vertiefung. Man nehme 60 ul aus den 120 pl der 200 uM Arzneimittelverdünnung in der obersten Vertiefung der Spalte und mischt mit den 60 ul in der zweiten Vertiefung der Spalte. Man nehme 60 ul dieser Vertiefung und mischt mit den 60 ul in der dritten Vertiefung der Spalte u. s. w. bis Zweifachtitrationen vollständig sind. Wenn die vorletzte Vertiefung gemischt wird, nimmt man 60 ul der 120 ul in dieser Vertiefung und verwirft sie. Die letzte Vertiefung mit 60 ul der DMSOIMediumverdünnung beläßt man als Kontrolle, die kein Arzneimittel enthält. Man macht 9 Spalten des titrierten Arzneimittels, ausreichend für Dreifach- Vertiefungen jeweils von 1) VEGF (erhalten von Pepro Tech Inc., Katalog-Nr. 100- 200, 2) endothelialen Zellwachstumsfaktor (ECGF) (ebenfalls bekannt als saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder aFGF) (erhalten von Boehringer Mannheim Biochemica, Katalognr. 1439 600) und eine Testmediumkontrolle. ECGF wird als eine Präparation mit Natriumheparin geliefert.
  • 2. Man überführt 50 ul/Vertiefung der Arzneimittelverdünnungen zu den 96- Loch Testplatten, die 0,8-1,0 · 10&sup4; Zellen/100 ul/Vertiefung der HUV-EC-C Zellen aus Tag 0 enthalten, und inkubiert ungefähr 2 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;.
  • 3. Man fügt dreifach 50 ul/Vertiefung von 80 ug/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF, oder Mediumkontrolle zu jeder Arzneimittelbedingung. Wie für die Arzneimittel betragen die Wachstumsfaktorkonzentrationen 4X die gewünschte Endkonzentration. Man verwendet die Testmedien von Tag 0, Schritt 2, um die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren herzustellen. Man inkubiert ungefähr für 24 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;. Jede Vertiefung hat 50 ul Arzneimittelverdünnung, 50 ul Wachstumsfaktor oder Medium und 100 ul Zellen = 200 ul/Vertiefung insgesamt. Daher werden aus den 4X Konzentrationen der Arzneimittel und Wachstumsfaktoren 1X, sobald alles in die Vertiefungen hinzugegeben wurde.
    • Tag 2
  • 1. Man gebe hinzu ³H-Thymidin (Amersham; Katalognr. TRK-686) mit 1 uCi/Vertiefung (10 ul/Vertiefung einer 100 uCi/ml Lösung, hergestellt in RPMI Medium + 10% hitzeinaktiviertem fötalen bovinen Serum) und inkubiert ungefähr 24 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;. Man beachte: ³H-Thymidin wird in RPMI Medium angesetzt, da alle anderen Anwendungen für die wir das ³H-Thymidin verwenden, Experimente einschließen, die in RPMI durchgeführt werden. Der Unterschied im Medium bei diesem Schritt ist vermutlich nicht signifikant. RPMI wurde von Gibco BRL erhalten, Katalognr. 11875-051.
    • Tag 3
  • 1. Man friert die Platten über Nacht bei -20ºC ein.
    • Tag 4
  • 1. Man taut die Platten auf und erntet mit einem 96-Loch Plattenernter (Tomtec Harvester 96(R)) auf Filtermatten (Wallac; Katalog Nr. 1205-401); liest die Counts mit einem Wallac Betaplate (TM) Flüssigkeits-Scintillationszähler.
    • 6.2.5. zellulärer PDGF-R Test
  • Der zelluläre PDGF Kinasetest wurde wie folgt durchgeführt. Die Zeilen wurden in 0,2 M Hepes, 0,15 M NaCl, 10% VN Glycerin, 0,04% Triton X-100, 5 mM EDTA, 5 mM Natriumvanadat und 2 mM Na-pyrophosphat lysiert; Die Zellysate wurden anschließend in eine ELISA Platte gegeben, die mit einem Anti-PDGF- Rezeptorantikörper (Genzyme) beschichtet war; ELISA Platten wurden mit 0,5 um Antikörper/Vertiefung in 150 ul PBS für 18 Stunden bei 4ºC vor der Zugabe des Lysates beschichtet; das Lysat wird in den beschichteten Platten für eine Stune inkubiert und anschließend viermal in TBST (35 mM Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X100); ein Anti-phosphotyrosin-Antikörper (100 ul in PBS) wird hinzugegeben und die Mischung wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; die Vertiefungen werden anschließend viermal in TBST gewaschen, ein Zweitantikörper, konjugiert mit POD (TAGO) wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben, und die behandelten Vertiefungen werden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden anschließend viermal in TBST gewaschen; ABTS/H&sub2;O&sub2; Lösung wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Vertiefungen werden für 2 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Absorption bei 410 mM gemessen.
    • 6.2.6. Experimentelle Ergebnisse der Zellwachstumstests
  • Ergebnisse, die für zahlreiche Verbindungen in den oben beschriebenen Tests erhalten wurden, sind in den folgenden Tabellen dargestellt: TABELLE 2 Mitogenese in endothelialen Zellen [3H] Thymidin Aufnahme TABELLE 3 Mitogenese in 3T3/EGFR Zellen BrdU-Aufnahme TABELLE 4 Zellwaschstumsassay mit unterschiedlichen Zehlinien SRB-Ergebnis
  • 3T3/E/H+TGF-α(T): NIH 3T3 Zellen, die EGFR/HER2-Chimäre und TGF-α exprimieren, von Tumoren abstammend
  • 3T3/EGFR+TGF-α(T): NIH 3T3 Zellen, die EGFR und TGF-α exprimieren, von Tumoren abstammend
  • 3T3/PDGFR+PDgF(T): NIH 3T3 Zellen, die PDGF-βR und PDGF-ββ exprimieren, von Tumoren abstammend
  • SMC: humane glatte Muskelzellen von Clonetics
    • 6.3. Messung der Zelltoxizität
  • Therapeutische Verbindungen sollten hinsichtlich der Inhibition der Rezeptor- Tyrosinkinaseaktivität wirksamer sein als bei der Ausübung eines cytotoxischen Effekts. Eine Messung der Wirksamkeit und Zelltoxizität einer Verbindung kann durch die Bestimmung des therapeutische Index: IC&sub5;&sub0;/LD&sub5;&sub0; erhalten werden. IC&sub5;&sub0;, die Dosis, die erforderlich ist, um 50% Inhibition zu erreichen, kann unter Verwendung von Standardtechniken wie den hier beschriebenen, gemessen werden. LD&sub5;&sub0;, die Dosis, die zu 50% Toxizität führt, kann ebenfalls durch Standardtechniken (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55-63), durch Messung der Menge des freigesetzten LDH (Korzeniewski und Callewaert, 1983, J. Immunol Methods 64: 313; Decker und Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods 115 : 61), oder durch Messung der lethalen Dosis in Tiermodellen gemessen werden. Verbindungen mit einem großen therapeutischen Index sind bevorzugt. Der therapeutische Index sollte größer als 2, vorzugsweise zumindest 10, am bevorzugtesten zumindest 50 betragen.
    • 6.3. In Vivo Tiermodelle 6.3.1. Heterotransplantat-Tiermodelle
  • Die Fähigkeit menschlicher Tumore als Heterotransplantat in athymischen Mäusen (z. B. Balb/c, nu/nu) zu wachsen, bietet ein nützliches in vivo Modell zum Studium der biologischen Antwort auf Therapien für menschliche Tumore. Seit der ersten erfolgreichen Heterotransplantation von menschlichen Tumoren in athymische Mäuse (Rygaard und Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758-760) sind viele verschiedene menschliche Tumorzellinien (z. B. Brust-, Lungen-, Urogenital-, Gastrointestinal-, Kopf und Nacken-, Glioblastome-, Knochen- und maligne Melanome) transplantiert und erfolgreich in Nacktmäusen kultiviert worden. Menschliche Brustdrüsen-Tumorzellinien, einschließlich MCF-7, ZR-75-1 und MDA- MB-231 sind als subkutane Heterotransplantate in Nacktmäusen etabliert worden (Warm et al., 1991, lnt. J. Cancer 49: 616-623; Ozello and Sordat 1980, Eur J. Cancer 16: 553-559; Osborne et al., 1985, Cancer Res. 45: 584-590; Seibert et al., 1983, Cancer Res. 43: 2223-2239).
    • Test 1: HER2/Heterotransplantat-Tiermodell
  • Um die Wirkung von Kandidaten von Antitumormitteln auf HER2 exprimierende Tumore zu studieren, sollten die Tumorzellen in der Lage sein, in Abwesenheit von supplementiertem Östrogen zu wachsen. Viele Brustdrüsenzellinien sind von Östrogen für das in vivo Wachstum in Nacktmäusen abhängig (Osborne et al., supra), exogenes Östrogen unterdrückt jedoch die HER2 Expression in Nacktmäusen (Warm et al., supra, Dati et al., 1990, Oncogene 5: 1001-1006). Zum Beispiel wachsen MCF-7, ZR-75-1 und T47D Zellen in der Gegenwart von Östrogen gut in vivo, exprimieren jedoch sehr niedrige Level von HER2 (Warm et al., supra, Dati et al., supra).
  • Es kann die folgende Art Heterotransplantat-Protokoll verwendet werden:
  • 1) Man implantiere Tumorzellen (subkutan) in die Hinterflanke von 5 bis 6 Wochen alten weiblichen Balb/c, nu/nu athymischen Mäusen;
  • 2) verabreicht die Antitumorverbindung;
  • 3) mißt den Tumorwachstum durch Messung des Tumorvolumens.
  • Die Tumore können ebenfalls auf die Anwesenheit eines Rezeptors wie HER2, EGF oder PDGF durch Western und immunhistochemische Analysen untersucht werden. Unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken kann der Fachmann die obigen Prozeduren abändern, z. B. durch den Einsatz eines anderen Behandlungsplanes.
    • Test 2: FLK-1 /Heterotransplantatmodell
  • Es wurde die Fähigkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung untersucht, Ovar-, Melanom-, Prostata-, Lungen- und Brustdrüsentumorzellinien, die als SC Heterotransplantate etabliert sind, zu inhibieren. Diese Studien wurden unter Verwendung von Dosen im Bereich von 1 bis 75 mg/kg/Tag durchgeführt.
  • Materialien und Methoden. Die Tumorzellen wurden subkutan in die angegebenen Mausstämme implantiert. Die Behandlung wurde am Tag 1 nach der Implantation begonnen, soweiti nicht anders angegeben (z. B. Behandlung der SCID Maus, die die A375 Melanomzellinie betrifft, begann an Tag 9). Acht (8) bis sechzehn (16) Mäuse umfaßte jede Testgruppe.
    • Spezifisch:
  • Tiere: Weibliche athymische Mäuse (BALB/c, nu/nu), BALB/c Mäuse, Wistar Ratten und Fisher 344 Ratten wurden von Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) erhalten. Weibliche A/I Mäuse wurden von Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. DA Ratten wurden von B&K Universal, Inc. (Fremont, CA) erhalten. Athymische R/Nu Ratten, DBA/2N Mäuse und BALB/c Mäuse wurden von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) erhalten. Weibliche C57BL/6 Mäuse wurden von Taconic (Germantown, NY) erhalten. Alle Tiere wurden unter Reinraumbedingungen in Mikro-Isolatorkäfigen mit alpha-Trockenstreu gehalten. Sie erhielten steriles Nagetierfutter und Wasser ad libitum.
  • Alle Prozeduren wurde gemäß den NIH-Richtlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
  • Subkutane Heterotransplantatmodelle. Zellinien wurden in geeigneten Medium, wie beschrieben, kultiviert (siehe Abschnitt 6). Die Zellen wurden bei oder nahe bei Konfluenz mit 0,05% Trypsin-EDTA geerntet und bei 450 · g für 10 Minuten pelletiert. Die Pellets wurden in sterilem PBS oder Medium (ohne FBS) zu einer geeigneten Konzentration, wie in den Legenden der Figuren angegeben, resuspendiert und die Zellen wurden in die Hinterflanke von Mäusen implantiert. Das Tumorwachstum wurde für 3 bis 6 Wochen unter Verwendung von Vinier Schieblehren gemessen und die Tumorvolumina wurden, solange nicht anders angegeben, als Produkt von Länge x Breite x Höhe berechnet. P-Werte wurden unter Verwendung des Students-T-Tests berechnet. Die Verbindung in 50-100 ul Träger (Dimethylsulfoxid, PBTE, PBTE6C : D5W oder PBTE : D5W) wurde durch IP-Injektion in den Konzentrationen, die den Legenden der Figuren angegeben sind, verabreicht.
  • Intracerebrale Heterotransplantatmodelle. Für das Maus IC Modell wurden Ratten C6 Glioma Zellen geerntet und in sterilem PBS in einer Konzentration von 2,5 · 10&sup7; Zellen/ml suspendiert und auf Eis gestellt. Die Zellen wurden auf die folgende Art in BALB/c, nu/nu Mäuse implantiert: Die frontoparietale Kopfhaut der Mäuse wurde mit Tierschermaschinen rasiert, wenn notwendig, vor dem Abtupfen mit 70%igem Ethanol. Die Tiere wurden mit Isofluoran betäubt und die Nadel wurde durch den Schädel in die linke Hemisphäre des Gehirns eingeführt. Die Zellen wurden mit gasdichten Hamilton Spritzen unter Verwendung von 30 ga 1/2 Inch Nadeln, die mit Muffen versehen waren, die nur eine 3 mm Penetration zuließen, verteilt. Ein Mehrmalsverteiler wurde für die genaue Verabreichung von 4 ul Zellsuspension verwendet. Die Tiere wurden täglich auf ihr Wohlbefinden überwacht und wurden geopfert, wenn sie einen Gewichtsverlust von ungefähr 40% aufwiesen und/oder neurologische Sympthome zeigten.
  • Für das Ratten 1C Modell wurden Ratten (Wistar, Sprague Dawley, Fisher 344, oder athymische R/Nu; ungefähr 200-400 g (einige 3-400 g) durch eine IP Injektion von 100 mg/kg Ketaset (Ketaminhydrochlorid; Aveco, Fort Dodge, fowa) und 5 mg/kg Rompun (Xylazin, 2% Lösung; Bayer, Deutschland) betäubt. Nach dem Einsetzen der Betäubung wurde die Kopfhaut rasiert und das Tier wurde in einer stereotaxischen Apparatur (Stoelting, Wood Dale, IL) orientiert. Die Haut an der Einschnittstelle wurde dreimal durch abwechselndes Betupfen mit 70% Ethanol und 10% Povidon-Iod gereinigt. Ein medianer 1,0-1,5 cm Schnitt wurde in der Kopfhaut unter Verwendung einer sterilen Operationsklinge gemacht. Die Haut wurde leicht abgelöst und auf die Seiten geschoben, um die Suturen auf der Schädeloberfläche freizusetzen. Ein Zahnbohrer (Stoelting, Wood Dale, IL) wurde verwendet, um ein kleines (1-2 mm Durchmesser) Bohrloch im Schädel ungefähr 1 mm vor und 2 mm lateral zum Bregma zu machen. Die Zellsuspension wurde in eine 50 ul Hamiltonspritze aufgezogen, die mit einer 23 oder 25 ga abgeschrägten Standardnadel versehen war. Die Spritze wurde in dem Bohrloch auf der Höhe der Arachnoidea orientiert und abgesenkt, bis sich die Spitze der Nadel 3 mm tief in der Gehirnstruktur befand, wo die Zellsuspension langsam injiziert wurde. Nachdem die Zellen injiziert waren, wurde die Nadel für 1-2 Minuten in dem Bohrloch belassen, um eine vollständige Verabreichung der Zellen zu ermöglichen. Der Schädel wurde gereinigt und die Haut wurde mit 2 bis 3 Nähten geschlossen. Die Tiere wurden auf die Erholung von dem Eingriff und der Betäubung beobachtet. Während des Experiments wurden die Tiere zumindest zweimal am Tag bezüglich Entwicklung von Symthomen, die mit dem Fortschreiten von intracerebralen Tumoren verbunden sind, beobachtet. Tiere, die fortgeschrittene Symthome zeigten (Neigung, Verlust des Gleichgewichtes, Entwässerung, Verlust des Appetits, Koordinationsverlust, Beendigung von Körperpflegeaktivitäten, und/oder signifikanten Gewichtsverlust) wurden human geopfert und die interessierenden Organe und Gewebe wurden entnommen.
  • Intraperitonales Modell. Die Zellinien wurden in den geeigneten Medien kultiviert. Die Zellen wurden geerntet und in sterilem PBS oder Medium ohne FBS gewaschen, zu einer geeigneten Konzentration resuspendiert und in die IP-Kavität von Mäusen des geeigneten Stammes injiziert. Die Mäuse wurden täglich auf das Auftreten von Ascitesbildung beobachtet. Einzelne Tiere wurden geopfert, wenn sie einen Gewichtszuwachs von 40% zeigten oder wenn die Belastung des IP Tumors begann, dem Tier übermäßige Belastung oder Schmerzen zu bereiten.
    • 6.3.2. VEGF Kügelchen In Vivo Modell
  • In dem folgenden Beispiel wurde das Kügelchen-Modell verwendet, um die Aktivität einer Verbindung gegen den FLK-1 Rezeptor und gegen Störungen, die mit der Bildung von Blutgefäßen assoziiert sind, zu überprüfen. In diesem Modell wird VEGF in ein Kügelchen mit zeitverzögerter Abgabe eingebettet und subkutan in den Abdomen von nackten Mäusen implantiert, um eine "Rötungs"- Antwort und nachfolgendes Anschwellen um das Kügelchen herum zu induzieren. Potentielle FLK-1 Inhibitoren können anschließend in Methylcellulose nahe dem VEGF Kügelchen implantiert werden, um zu bestimmen, ob ein solcher Inhibitor verwendet werden kann, um die "Rötungs"-Antwort und das nachfolgende Anschwellen zu inhibieren.
  • Materialien und Methoden. Es wurden die folgenden Materialien verwendet:
  • 1) VEGF- humanes rekombinantes lyophilisiertes Produkt ist kommerziell erhältlich und kann von Peprotech, Inc., Princeton Business Park, G2; P. O. Box 275, Rocky Hill, NJ 08553 bezogen werden.
  • 2) VEGF, das in Kügelchen mit 21-tägiger Abgabe eingebettet ist, wurde erhalten von Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3361 Executive Parkway, P. O. Box 2746, Toledo, Ohio 43606) unter Verwendung eines patentierten matrixgesteuerten Freisetzungssystem. Die Kügelchen wurden mit 0,20, 0,21 oder 2,2 ug VEGF/Kügelchen verpackt. Diese Dosierungen nähern eine Freisetzung von VEGF von 10 und 100 nglTag an.
  • 3) Methylcellulose
  • 4) Wasser (steril)
  • 5) Methanol
  • 6) geeignete Arzneimittel/In hibitoren
  • 7) 10 cm Kulturplatten
  • 8) Parafilm
  • Das folgende Protokoll wurde anschließend befolgt, um das VEGF Kügelchenmodell auszuführen:
  • 1) VEGF, bezogen von Peprotech, wurde zu Innovative Research für die Maßanfertigung der Kügelchen geschickt;
  • 2) Methylcellulose wurde mit 1,5% (wlv) in sterilem Wasser angesetzt;
  • 3) Arzneimittel wurden in Methanol gelöst (üblicher Konzentrationsbereich = 10 bis 20 mg/ml);
  • 4) Sterilen Parafilm legt man in sterile 10 cm Platten;
  • 5) 150 ul des Arzneimittels in Methanol werden zu 1,35 ml 1,5% Mehylcellulose hinzugegeben und sorgfältig gemischtlgevortext;
  • 6) 25 ul Proben des Homogenats werden auf Parafilm gesetzt und zu Scheiben getrocknet;
  • 7) Mäuse (6-10 Wochen Baib/C athymische nulnu, weiblich) wurden durch Isofluran-Inhalation betäubt;
  • 8) VEGF Kügelchen und Methylcellulosescheiben wurden subkutan in den Abdomen implantiert und
  • 9) Mäuse wurden nach 24 Stunden und 48 Stunden auf Rötung und Schwellungsantwort beurteilt.
  • Der spezielle experimentelle Aufbau, der in diesem Beispiel verwendet wurde war;
  • N = 4 Tiere/Gruppe
  • Kontrollen: VEGF Kügelchen + Arzneimitelplacebo
  • VEGF Placebo + Arzneimittelkügelchen
  • Experimentelle Ergebnisse. Es wird angenommen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Aktivität gemäß diesem Assay zeigen.
    • 6.3.3. Das Brustdrüsenfettkissenmodell
  • Aufgrund der anerkannten Rolle, die viele der RTKs, z. B. dem HER2 Rezeptor bei Brustkrebs spielt, ist das Brustdrüsenfettkissenmodell besonders geeignet, um die Wirksamkeit von Verbindungen, die solche RTKs inhibieren, zu messen. Indem Tumorzellen direkt in die interessierende Stelle implantiert werden, spiegeln in situ Modelle die Biologie der Tumorentwicklung genauer wieder als dies subkutane Modelle tun. Humane Brustdrüsen-Zellinien, einschließlich MCF-7, sind in den Fettkissen von Brustdrüsen athymischer Mäusen kultiviert worden. Shafie und Grantham, 1981, Nafi. Cancer Instit. 67: 51-56; Gottardis et al., 1988, J. Steroid Biochem. 30: 311-314. Insbesondere kann die folgende Vorgehensweie verwendet werden, um den inhibitorischen Effekt einer Verbindung gegenüber dem HER2 Rezeptor zu messen:
  • 1) Man implantiere bei verschiedenen Konzentrationen MDA-MB-231 und MCF- 7 Zellen, die mit HER-2 transfektiert worden sind, in die Zusatzfettkissen der Brustdrüse von weiblichen athymischen Mäusen;
  • 2) verabreiche die Verbindung; und
  • 3) mißt den Tumorwachstum zu verschiedenen Zeitpunkten.
  • Die Tumore können ebenfalls auf die Anwesenheit eines Rezeptors wie HER-2 durch Western und immunohistochemische Analysen untersucht werden. Unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken kann der Fachmann die obigen Verfahrensweisen abändern, zum Beispiel durch die Verwendung von unterschiedlichen Behandlungsplänen.
    • 6.3.4. Tumorinvasionsmodell
  • Das folgende Tumorinvasionsmodell ist entwickelt worden und kann für die Auswertung des therapeutischen Werts und die Wirksamkeit der Verbindungen, für die gefunden wurde, dass sie den KDR/FLK-1 Rezeptor selektiv inhibieren, verwendet werden.
    • 6.3.4.1. Vorgehensweise
  • 8 Wochen alte Nacktmäuse (weiblich) (Simonson Inc.) wurden als Versuchstiere verwendet. Die Implantation von Tumorzellen wurde in einer Arbeitsbank unter laminarem Fluß durchgeführt. Für die Betäubung wird ein Xylazin/Ketamincocktail (100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg) intraperitonal verabreicht. Es wird ein Mittellinienschnitt gesetzt, um den Bauchraum (ungefähr auf einer Länge von 1,5 cm) freizusetzen, um 10&sup7; Tumorzellen in einem Volumen von 100 ul Medium zu injizieren. Die Zellen werden entweder in den Duodenallappen des Pankreas oder unter die Seranosa des Darms injiziert. Die Bauchhöhle und die Muskeln werden mit einer 6-0 durchgehenden Seidennaht verschlossen und die Haut wurde unter Verwendung von Wundklammern geschlossen. Die Tiere wurde täglich beobachtet.
    • 6.3.4.2. Analyse
  • Nach 2-6 Wochen, in Abhängigkeit von den groben Beobachtungen der Tiere wurden die Mäuse geopfert und es werden die lokalen Tumormetastasen in verschiedenen Organen (Lunge, Leber, Gehirn, Magen, Milz, Herz, Muskel) ausgeschnitten und analysiert (Messung von Tumorgröße, Grad der Invasion, Immunchemie und in situ Hybridisierung).
    • 6.3.5. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse für zahlreiche Verbindungen, die in den oben beschriebenen in vivo Versuchen erhalten wurden, sind in Tabelle 5 unten dargestellt: TABELLE 5 In Vivo Daten
  • Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang nicht auf die veranschaulichten Ausführungsformen beschränkt, die als Illustrationen von einzelnen Aspekten der Erfindung gedacht sind, und alle Klone, DNA oder Aminosäuresequenzen, die funktionell äquivalent sind, liegen innerhalb des Bereichs der Erfindung. In der Tat sind dem Fachmann anhand der vorstehenden Beschreibung zahlreiche Modifrkationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen ersichtlich.
  • Solche Modifikationen sollen in dem Schutzbereich der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims (15)

1. Eine Verbindung der Formel:
und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, wobei:
R&sub1; H ist;
R&sub2; O oder S ist;
R&sub3; Wasserstoff ist;
R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R, und CONRR' besteht;
A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ihiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3,-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4- Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazoi, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4- Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazol und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R und CONRR' besteht;
n 0-3 ist;
R H, Alkyl oder Aryl ist und
R' H, Alkyl oder Aryl ist,
wobei in den obigen Definitionen:
Alkyl sich auf ein gradkettiger, verzweigter oder cyclischer saturierter aliphatischer Kohlenwasserstoff bezieht, mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxy, Cyano, =O, =S, NO&sub2;, Halogen, N(CH&sub3;)&sub2;, Amino und -SH besteht;
Aryl sich auf aromatische Gruppe bezieht, die mindestens einen Ring hat, der ein konjugiertes pi-Elektronensystem hat, einschließlich carbocyclische Aryl-, heterocyclische Aryl- und Biaryl-Gruppen und gegebenenfalls substituiert mit einer oder mehreren Substituenten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Halogen, Trihalomethyl, Hydroxyl, SH, OH, NO&sub2;, Amin, Thioether, Cyano, Alkoxy, Alkyl, Alkyl und Amino besteht;
Alkaryl sich auf ein Alkyl bezieht, das an einer Arylgruppe kovalent gebunden ist; und
Alkoxy, Aryloxy bzw. Alkaryloxy sich auf eine -O-Alkyl-, -O-Aryl- bzw. -O- Alkaryl-Gruppe beziehen;
mit der Maßgabe, daß die folgenden Verbindungen ausgenommen sind:
3-(pyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon;
3-(5-chlor-3,4-dimethylpyrrol-2-ylmethylen)-2-indolinon;
3-(3,5-dimethyl-4-ethylpyrrol-2-yl)-2-indolinon;
3-(3,5-dimethyl-4-ethoxycarbonylpyrrol-2-yl)-2-indolinon;
Benzoesäure, 2-[[[1-ethyl-2,3-dihydro-2-oxo-3-(1H-pyrrol-2-ylmethylen)-1Hindol-5-yl]oxy]methyl]-;
3-[(1-methyl-5-nitro-imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
3-(thien-2-ylmethylen)-2-indolinon;
1H-Indol-7-essigsäure, 3-[(2-butyl-1H-imidazol-4-yl)methylen]-2,3-dihydro-2- oxo-, Ethylester;
1H-Indol-7-essigsäure, 3-[[2-butyl-1-[(1,1-dimefihylethoxy)carbonyl]-1H-imidazol- 4-yl]methylen]-2,3-dihydro-2-oxo-, Ethylester;
5-benzoyl-3-[(imidazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
6-diethylamino-3-[(isothiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon;
5-chlor-3-[(thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon; und
6-nitro-3-[(pyrrol-2-yl)methylen]-2-indolinon.
2. Eine Verbindung der Formel:
und pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, wobei:
R&sub1; H ist;
R&sub2; O oder S ist;
R&sub3; Wasserstoff ist;
R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryioxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, GN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R, und CONRR' besteht
A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Thiophen, Pyrrol, Parazol, Imidazol, 1,2,3,-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3,-Oxadiazol, 1,2,4,- Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4,-Oxadiazol, 1, 2,3,4,-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3,-Thiadiazol, 1,2,4,-Thiadiazol, 1,2,5,-Thiadiazoi, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4- Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazol und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, NO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R und CONRR' besteht;
n 0-3 ist;
R H, Alkyl oder Aryl ist, und
R' H, Alkyl oder Aryl ist,
wobei in den obigen Definitionen Alkyl, Aryl, Alkaryl, Alkoxy, Aryloxy und Alkaryloxy jene Definitionen wie im Anspruch 1 angegeben haben;
mit der Maßgabe, daß die folgenden Verbindungen ausgeschlossen sind:
6-diethylamino-3-[(isothiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon; und
5-chlor-3-[(thiazol-2-yl)methylen]-2-indolinon.
3. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 3-[(3-Methylpyrrol-2-yl)Methylen]-2-Indolinon; 3-[(3,4-Dimethylpyrrol-2-yl)Methylen]- 2-Indolinon; 3-[(2-Methylthien-5-yl)Methylen]-2-Indolinon; 3-[(3-Methylthien-2- yl)Methylenj-2-Indolinon; 3-{[4-(2-Methoxycarbonylethyl)-3-Methylpyrrol-5-yl]Methylen}- 2-Indolinon; 3-[(4,5-Dimethyl-3-Ethylpyrrol-2-yl)Methylen]-2-Indolinon; 3-[(5- Methylimidazol-2-yl)Methylen]-2-Indolinon; 5-Chloro-3-[(5-Methylthien-2-yl)Methylen]-2- Indolinon; 3-[(3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)Methylen]-5-Nitro-2-Indolinon; 3-[(3-(2- Carboxyethyl)-4-Methylpyrrol-5-yl)Methylen]-2-Indolinon; 5-Chlor-3-[(3,5-Dimethylpyrrol- 2-yl)Methylen]-2-Indolinon; und 3-[(2,4-Dimethylpyrrol-5-yl)Methylen]-2-Indolinon, oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon besteht.
4. Die Verbindung gemäß Anspruch 3, wobei die Verbindung 3-[(2,4-Dimethylpyrrol-5- yl)Methylen]-2-Indolinon, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung aus einem der Ansprüche 1 bis 4 oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff.
6. Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen oder subkutanen Verabreichung geeignet ist oder in einer Depot-Formulation ist.
7. Verwendung einer Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, die mit der unregulierten Tyronsinkinase-Signaltransduktion verwandt sind, wobei die Verbindung folgende Formel hat:
und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wobei:
R&sub1; H oder Alkyl ist;
R&sub2; O oder S ist;
R&sub3; Wasserstoff ist;
R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R, und CONRR' besteht;
A ein fünfgliedriger Heteroalrylring ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Thiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3-Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4-Thiatriazol, 1,2,3,5-Thiatriazol, und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R, und CONRR';
n 0-3 ist;
R H, Alkyl oder Aryl ist; und
R' H, Alkyl oder Aryl ist;
wobei in den obigen Definitionen, Alkyl, Aryl, Alkaryl, Alkoxy, Aryloxy und Alkaryloxy jene Definitionen wie im Anspruch 1 angegeben haben.
8. Verwendung einer Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Regulierung, Modulierung oder Hemmung der Tyrosinkinase- Signaltransduktion, wobei die Verbindung folgende Formel hat:
und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, wobei:
R&sub1; H oder Alkyl ist;
R&sub2; O oder S ist;
R&sub3; Wasserstoff ist;
R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl, Akloxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SO&sub3;R, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R und CONRR' besteht;
A ein fünfgliedriger Heteroarylring ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Thiophen, Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, 1,2,3-Triazol, 1,2,4-Triazol, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, 2-Sulfonylfuran, 4-Alkylfuran, 1,2,3-Oxadiazol, 1,2,4-Oxadiazol, 1,2,5-Oxadiazol, 1,3,4-Oxadiazol, 1,2,3,4-Oxatriazol, 1,2,3,5-Oxatriazol, 1,2,3- Thiadiazol, 1,2,4-Thiadiazol, 1,2,5-Thiadiazol, 1,3,4-Thiadiazol, 1,2,3,4-Thiatriazof, 1,2,3,5-Thiatriazol, und Tetrazol, gegebenenfalls substituiert an einer oder mehreren Positionen mit Alkyl, Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Alkaryl, Alkaryloxy, Halogen, Trihalomethyl, S(O)R, SO&sub2;NRR', SOsR, SR, NO&sub2;, NRR', OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH&sub2;)nCO&sub2;R und CONRR' besteht;
n 0-3 ist;
R H, Alkyl oder Aryl ist; und
R' H, Alkyl oder Aryl ist;
wobei in den obigen Definitionen Alkyl, Aryl, Alkaryl, Alkoxy, Aryloxy und Alkaryloxy jene Definitionen wie in Aspruch 1 angegeben haben.
9. Die Verwendung von Anspruch 7 oder 8, wobei die Krankheit ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Krebs, blutgefäßproliferatorischen Störungen, fibrotischen Störungen, mesangialzellproliferatorischen Störungen und metabolischen Krankheiten besteht.
10. Die Verwendung nach Anspruch 9, wobei die blutgefäßproliferatorische Störung ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Arthrose und Restinose besteht.
11. Die Verwendung nach Anspruch 9, wobei die fibrotische Störung ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus hepatitischer Zerose und Artheriosklerose besteht.
12. Die Verwendung nach Anspruch 9, wobei die mesangiale Zellproliferationsstörung ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie, maligner Nephrosklerose, trombotischer mikroangiopathischer Syndromen, Transplantationsabstoßung und Glomerulopathien besteht.
13. Die Verwendung nach Anspruch 9, wobei die metabolische Krankheit ausgewähit wird aus der Gruppe, die aus Schuppenflechte, Diabetes mellitus, Wundheilung, Entzündung und neurodegenerativen Krankheiten besteht.
14. Die Verwendung gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei die Verbidndung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 3-[(3-Methylpyrrol-2-yl)Methylen]-2-Indolinon; 3-[(3,4- Dimethylpyrrol-2-yl)Methylen]-2-Indolinon; 3-[(2-Methylthien-5-yl)Methylen]-2-Indolinon; 3-[(3-Methylthien-2-yl)Methylen]-2-Indolinon; 3-{[4-(2-Methoxycarbonylethyl)-3- Methylpyrrol-5-yl]Methylen}-2-Indolinon; 3-[(4,5-Dimethyl-3-Ethylpyrrol-2-yl)Methylen]-2- Indolinon; 3-[(5-Methylimidazol-2-yl)Methylen]-2-Indolinon; 5-Chlor-3-[(5-Methylthien-2- yl)Methylen]-2-l ndolinon; 3-[(3,5-Dimethylpyrrol-2-yl)Methylen]-5-Nitro-2-Indolinon; 3- [(3-(2-Carboxyethyl)-4-Methylpyrrol-5-yl)Methylen]-2-Indolinon; 5-Chloro-3-[(3,5- Dimethylpyrrol-2-yl)Methylen]-2-Indolinon; und 3-[(2,4-Dimethylpyrrol-5-yl)Methylen]-2- lndolinon, oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz davon besteht.
15. Die Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Verbindung 3-[(2,4-Dimethylpyrrol- 5-yl)Methylen]-2-lndoünon oder ein pharmazeutisch akeptables Salz davon ist.
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