DE69818083T2

DE69818083T2 - INDENO[1,2-c]-,NAPHTHO[1,2-C]-UND BENZO[6,7]CYCLOHEPTA[1,2-c]PYRAZOLDERIVATE

Info

Publication number: DE69818083T2
Application number: DE69818083T
Authority: DE
Inventors: D. Lee ARNOLD; Yajun Xu; Teresa Barlozzari
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1997-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2018-10-07
Also published as: ATE249217T1; ES2206997T3; PT1023063E; CN1278725A; DK1023063T3; US6451834B1; AU9691198A; EP1023063A1; CA2304565A1; EP1023063B1; DE69818083D1; WO1999017769A1; JP2001518501A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteintyrosinkinasen (PTKs) beinhalten eine große und diversifizierte Klasse von Proteinen mit enzymatischer Aktivität. Die PTKs spielen bei der Kontrolle von Zellwachstum und -differenzierung eine wichtige Rolle (für eine Übersicht siehe Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383–391).
Z. B. wird die Rezeptortyrosinkinase-vermittelte Signaltransduktion durch die extrazelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, worauf typischerweise die Rezeptordimerisierung, transiente Stimulierung der intrinsischen Proteintyrosinkinase-Aktivität und die Phosphorylierung folgen. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle geschaffen und infolge Komplexe mit einem Spektrum zytoplasmatischer Signalmoleküle gebildet, was für die passende zelluläre Antwort förderlich ist (z. B. Zellteilung, Stoffwechseleffekte, Antworten auf die extrazelluläre Kleinstumgebung (microenvironment), siehe Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 1–20.
Was Rezeptortyrosinkinasen angeht, ist auch gezeigt worden, dass Tyrosin-Phosphorylierungsstellen als hoch affine Bindungsstellen für SH2 (src-Homologie)-Domänen von Signalmolekülen dienen (Fantl. et al., 1992, Cell 69: 413–423; Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Bio. 14: 2777–2785; Sonyang et al., 1993, Cell 72 767–778; und Koch et al., 1991, Science 252: 668–678). Es wurden einige intrazelluläre Substratproteine identifiziert, die mit Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) assoziieren. Diese kann man in zwei Hauptgruppen einteilen: (1) Substrate mit einer katalytischen Domäne; und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, die aber als Adapter dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren (Sonyang et al., 1993, Cell 72: 767–778). Die Spezifität der Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren oder Proteinen und SH2-Domänen ihrer Substrate wird von den Aminosäureresten bestimmt, die unmittelbar um den phosphorylierten Tyrosinrest angeordnet sind. Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domänen und den Aminosäuresequenzen, die um die Phosphotyrosinreste angeordnet sind, auf bestimmte Rezeptoren stehen in Einklang mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofilen (Sonyang et al, 1993, Cell 72: 767–778). Aufgrund dieser Beobachtungen nimmt man an, dass die Funktion jeder Rezeptortyrosinkinase nicht nur von ihrem Expressionsmuster und der Verfügbarkeit des Liganden, sondern auch von der Abfolge nachgeschalteter (Downstream) Signaltransduktionswege, die von einem bestimmten Rezeptor aktiviert werden, bestimmt wird. Somit ist die Phosphorylierung ein wichtiger regulatorischer Schritt, der die Selektivität der von speziellen Wachstumsfaktor-Rezeptoren sowie Differenzierungsfaktor-Rezeptoren in Anspruch genommenen Signalwege bestimmt.
Es ist gezeigt worden, dass aberrante Stimulierung, Expression oder Mutationen in den PTKs entweder zu unkontrollierter Zellproliferation (z. B. malignem Tumorwachstum) oder zu Defekten in grundlegenden Entwicklungs- oder Reparaturvorgängen führen. Deshalb wurden im biomedizinischen Bereich erhebliche Ressourcen aufgewendet, um die spezifische biologische Rolle von Mitgliedern der PTK-Familie, ihre Funktion in Differenzierungsvorgängen, ihre Beteiligung an der Tumorentstehung und anderen Erkrankungen, die biochemischen Mechanismen, die ihren durch Ligandstimulierung aktivierten Signaltransduktionswegen zugrunde liegen, und die Entwicklung neuer Wirkstoffe aufzudecken.
Tyrosinkinasen können vom Rezeptortyp (diese haben extrazelluläre, transmembrane und intrazelluläre Domänen) oder vom Nichtrezeptortyp (diese sind in ihrer Gesamtheit intrazellulär) sein.
Rezeptortyrosinkinasen (RTKs). Die RTKs beinhalten eine umfangreiche Familie von Transmembranrezeptoren mit mannigfaltigen biologischen Aktivitäten. Zur Rezeptortyrosinkinase (RTK)-Familie gehören Rezeptoren, die für das Wachstum und die Differenzierung einer Vielzahl von Zelltypen entscheidend sind (Yarden und Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 433–478, 1988; Ullrich und Schlessinger, Cell 61: 243–254, 1990). Die intrinsische Funktion von RTKs wird durch die Ligandenbindung aktiviert, was zur Phosphorylierung des Rezeptors und multipler zellulärer Substrate, und anschließend zu einer Vielzahl von zellulären Antworten führt (Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61: 203–212).
Bis heute sind wenigstens 19 (19) verschiedene RTK-Unterfamilien identifiziert worden. Eine als die HER-Unterfamilie bezeichnete RTK-Unterfamilie soll EGFR, HER2, HER3 und HER4 umfassen. Zu den Liganden für die HER-Rezeptor-UnterFamilie gehören der epitheliale Wachstumsfaktor (EGF), TGF-α, Amphiregulin, HB-EGF, Betazellulin und Heregulin. Eine aberrante Regulation der HER2/erbB2-Kinasenaktivität soll insbesondere in Brustkarzinomen für einen transformierten tumorgenen Phänotyp förderlich sein. Zwei weitere RTK-Unterfamilien werden als die INS-R, IGF-1R und IR-R umfassende Insulinrezeptor-Unterfamilie und die PDGFα- und -β-Rezeptoren, CSF-1R und c-kit umfassende „PDGFR"-Unterfamilie bezeichnet.
Es wurde vorgeschlagen, dass mehrere Rezeptortyrosinkinasen und daran bindende Wachstumsfaktoren eine Rolle bei der Angionese spielen, wenngleich einige für die Angionese indirekt förderlich sein können (Mustonen und Alitalo, J. Cell Biol. 129: 895–898, 1995). Eine derartige Rezeptortyrosinkinase, die als fötale Leberkinase 1 (flk-1) bekannt ist, gehört zur Typ-III-Unterklasse der RTKs. Eine alternative Bezeichnung für humane flk-1 ist Kinaseninsertionsdomäne enthaltender Rezeptor (KDR) (Teman et al., Oncogene 6: 1677–83, 1991). Eine weitere alternative Bezeichnung für flk-1/KDR ist „vaskulärer endothelialer Zellwachstumsrezeptor 2" (VEGFR-2). Die murine Version von flk-1/VGFR-2 ist auch NYK genannt worden (Oelrichs et al., Oncogene 8(1): 11–15, 1993). DNAs, die flk-1 aus Maus, Ratte und Mensch kodieren, sind isoliert worden, und es wurde über die Nukleotid- und die kodierten Aminosäuresequenzen berichtet (Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026–30, 1991; Terman et al., 1991, supra; Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 1579–86, 1992; Sarzani et al., supra; und Millauer et al., Cell 72 835–846, 1993).
Die als fms-artige Tyrosinkinase 1 (flt-1) bezeichnete RTK der Typ-III-Unterklasse ist verwandt mit flk-1/KDR (de Vries et al., Science 255; 989–991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5: 519–524, 1990). Eine alternative Bezeichnung für flt-1 ist „vaskulärer endothelialer Zellwachstumsfaktor-Rezeptor 1" (VEGFR-1). Bis heute fand man, dass die Mitglieder der flk-1/KDR/VEGFR-2- und flt-1/VEGFR-1-Unterfamilien in erster Linie auf endothelialen Zellen exprimiert werden. Die Mitglieder dieser Unterklasse werden von Mitgliedern der vaskulären endothelialen Zellwachstumsfaktor (VEGF)-Ligandenfamilie spezifisch stimuliert (Klagsburn und D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 7: 259–270, 1996). Man nimmt an, dass flt-1 während der vaskulären Entwicklung für die endotheliale Organisation essentiell ist. Die Expression von flt-1 hängt mit der vaskulären Frühentwicklung in Mausembryos und mit der Neovaskularisierung während der Wundheilung zusammen (Mustonen und Alitalo, supra). Die Expression von flt-1 in adulten Organen lässt auf eine zusätzliche Funktion dieses Rezeptors, die sich nicht auf das Zellwachstum bezieht, schließen (Mustonen und Alitalo, supra).
Eine weitere RTK, die mit flt-1 und flk-1/KDR verwandet ist, ist flt-4 (Galland et al., Oncogene 8: 1233–40, 1993, Pajusola et al., Oncogene 8: 2931–37, 1993). Zu gemeinsamen Merkmalen dieser drei Rezeptoren gehören die sieben immunglobulinartigen Domänen in ihren extrazellulären Regionen. Die Aminosäuresequenz von flt-4 weist eine signifikante Homologie mit den Sequenzen von flt-1 und flk-1/KDR insbesondere in der Tyrosinkinasedomäne auf (Galland et al, supra). Anders als flt-1 und flk-1 wird eine Vorläuferform von flt-4 allerdings während der posttranslationalen Prozessierung geschnitten, wodurch sich zwei Disulfidverknüpfte Polypeptide bilden (Pajusola et al., supra). Studien zur flt-4-Expression während der Entwicklung stützen die Theorie des venösen Ursprungs der Lymphgefäße (Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3566–70, April, 1995).
Angesichts der entscheidenden Rolle endothelialer Zellen in der Angiogenese sind Wachstumsfaktoren, die auf endotheliale Zellen wirken, für Studien zur Regulation der Vaskularisierung von besonderer Bedeutung. Ein derartiger Faktor ist der vaskuläre endotheliale Zellwachstumsfaktor (VEGF), der sowohl an flk-1/KDR als auch an flt-1 mit relativ hoher Affinität bindet und auf vaskuläre Endothelzellen mitogen wirkt (Terman et a., 1992, supra; Mustonen et al., supra; DeVries et al., supra). VEGF bindet nicht an flt-4 (Pajusola et al., supra). Die in Millauer et al., supra, berichteten Untersuchungen lassen darauf schließen, dass VEGF und flk- 1/KDR/VEGFR-2 ein Ligand-Rezeptor-Paar sind, das bei der Bildung und dem Sprießen von Blutgefäßen, Vaskulogenese bzw. Angiogenese genannt, eine wichtige Rolle spielen.
Es wurde über unterschiedliche Formen von VEGF, die auf ein alternatives Spleißen der mRNA zurückzuführen sind, berichtet; hierzu gehören die vier von Ferrara et al., (J. Cell. Biochem, 47: 211–218, 1991) beschriebenen Arten. Sowohl sekretierte als auch vornehmlich Zell-assoziierte Arten von VEGF wurden von Ferrera et al., supra, identifiziert, und es ist bekannt, dass das Protein in Form Disulfid-verknüpfter Dimere vorkommt.
Es ist ebenfalls bekannt, dass es eine Vielzahl physiologischer und biochemischer Mechanismen gibt, die Ödemen und der Bildung des ödemartigen Zustandes in einem Individuum zugrunde liegen. Ein wichtiger Mediator in einem oder mehreren dieser Mechanismen ist der „vaskuläre endotheliale Zellwachstumsfaktor" (VEGF). Dieser Mediator ist ebenfalls bekannt als „vaskulärer Permeabilitätsfaktor" (VPF). Dieser Faktor bewirkt eine Hochregulation des Transports in vaskuläre endotheliale Zellen und eine Zunahme der Permeabilität vieler vaskulärer Auskleidungen, wozu die Haut, subkutane Gewebe, das Bauchfell, das Mesenterium, das Diaphragma, die Trachea, die Bronchien, der Zwölffingerdarm und der Uterus gehören. Diese erhöhten Permeabilitätswirkungen können begleitet sein von einer signifikanten Diapedesis, Veränderungen des Austauschs über das Endothel, einer Extravasation und Ablagerung von Makromolekülen an diesen Stellen und einer ausgedehnten Hypotonie. Diese Vorgänge sollen bei der Einleitung der Neovaskularisierung helfen. VEGF wird von inflammatorischen T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen und Eosinophilen, etc. an Entzündungsherden exprimiert. Dieser Faktor wird durch Hypoxie, bestimmte vasopressorische Hormone, Wachstumsfaktoren, reproduktive Hormone und viele inflammatorische Zytokine hochreguliert. VEGF-vermittelte vaskuläre Permeabilität ist mit Erkrankungen wie Tumorascites, Endometriose, ödemartigen Antworten auf Verbrennungen und Trauma, endothelialer Dysfunktion bei Diabetes, Komplikationen des ovarialen Hyperstimulationssyndroms und Augenödemen in Verbindung gebracht worden.
Es ist daher klar, dass die Inhibierung der VEGF-Produktion oder -aktivität vorteilhaft wäre, insbesondere um das Auftreten der oben aufgeführten Erkrankungen zu blockieren. Vor allem wären Agenzien, welche die VEGFvermittelte Hyperpermeabilität und Ödeme und damit zusammenhängende Syndrome zu blockieren vermögen, für die Milderung dieser Erkrankungen brauchbar.
Der Plazentawachstumsfaktor (PIGF) hat eine Aminosäuresequenz, die eine signifikante Homologie mit der VEGF-Sequenz aufweist (Park et al., J. Biol. Chem. 269: 25646–54, 1994; Maglione et al. Oncogene 8, 925–31, 1993). Wie im Falle von VEGF sind unterschiedliche Arten von PIGF auf ein alternatives Spleißen der mRNA zurückzuführen und das Protein kommt in dimerer Form vor (Park et al., supra). PIGF bindet an flt-1 mit hoher Affinität, nicht jedoch an flk-1/KDR (Park et al., supra). PIGF potenziert die mitogene Wirkung von VEGF auf endotheliale Zellen, wenn VEGF in niedrigen Konzentrationen zugegen ist; es hat jedoch keine nachweisbare Wirkung, wenn VEGF in höheren Konzentrationen zugegen ist (Park et al., supra).
Zwei weitere Unterfamilien von RTKs sind als die FGF-Rezeptorfamilie (FGFR1, FGFR2, FGFR3 und FGFR4) und die Met-Unterfamilie (c-met und Ron) bezeichnet worden.
Wegen der Ähnlichkeiten zwischen den PDGF- und FLK-Unterfamilien, werden die beiden Unterfamilien oftmals zusammen berücksichtigt. Die bekannten RTK-Unterfamilien werden in Plowman et al., 1994, DN&P 7(6): 334–339 identifiziert.
In gewissen klinischen Situationen (z. B. wenn das Wachstum und die Metastasierung solider Tumoren unterdrückt werden soll, oder bei der Behandlung rheumatoider Arthritis) ist eine Inhibierung der Angiogenese wünschenswert, während für die Behandlung anderer Zustände (z. B. bei der Wundheilung) die Förderung der Vaskularisierung von Vorteil ist. Folglich sind sowohl Moleküle, die durch die Transduktion von Signalen über die oben diskutierten Rezeptoren die Angiogenese fördern, als auch Moleküle, die eine derartige Signaltransduktion zu inhibieren vermögen, von Interesse.
Die Nichtrezeptortyrosinkinasen. Die Nichtrezeptortyrosinkinasen stellen eine Sammlung zellulärer Enzyme dar, denen extrazelluläre und transmembrane Sequenzen fehlen. Bis heute sind über 24 einzelne Nichtrezeptortyrosinkinasen identifiziert worden, wozu elf (11) Unterfamilien (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack und LIMK) gehören. Die Src-Unterfamilie von Nichtrezeptortyrosinkinasen besteht zur Zeit aus der größten Anzahl von PTKs; hierzu gehören Src, Yes, Fyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk. Die Src-Unterfamilie von Enzymen ist mit der Oncogenese in Verbindung gebracht worden. Eine detailliertere Auseinandersetzung mit Nichtrezeptortyrosinkinasen findet sich in Bolen, 1993, Oncogene 8: 2025–2031.
Man hat gefunden, dass viele der Tyrosinkinasen, ob RTK oder Nichtrezeptortyrosinkinase, an zellulären Signalwegen beteiligt sind, die wiederum an zahlreichen pathogenen Zuständen, Krebs, Psoriasis und weitere hyperproliferative Erkrankungen oder Hyperimmunantworten eingeschlossen, beteiligt sind.
Entwicklung von Verbindungen zur Modellierung der PTKs. Angesichts der vermuteten Bedeutung von PTKs für die Kontrolle, Regulation und Modulation der Zellproliferation, sowie für Krankheiten und Erkrankungen, die mit einer anormalen Zellproliferation in Verbindung stehen, sind viele Versuche unternommen worden, „Inhibitoren" für Rezeptor- und Nichtrezeptortyrosinkinasen zu identifizieren, wobei man eine Vielzahl von Ansätzen verwendete, wozu die Verwendung mutierter Liganden (US-Anmeldung Nr. 4,966,849), lösliche Rezeptoren und Antikörper (Anmeldungsnummer WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci 90: 10705–09; Kim et al., 1993, Nature 362: 841–844), RNA-Liganden (Jellinek et al., Biochemistry 33: 10450–56; Takano, et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella et al., 1992, Exp. Cell Res. 199: 56–62; Wright et al., 1992, J. Cellular Phys. 152: 448–57) und Tyrosinkinaseinhibitoren (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US-Patent Nr. 5,330,992; Mariani et al., 1994 Proc. Am. Associ. Cancer Res., 35: 2268) gehören.
Kürzlich wurden Versuche unternommen, kleine Moleküle zu identifizieren, die als Tyrosinkinaseinhibitoren wirken. Bismonocyklische, bicyklische oder heterocyklische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Pyrazolochinazolin-Verbindungen (Palmer et al., J. Med. Chem. (1997), 40: 1519), 4-Amino-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (PCT WO 96/31510), substituierte Pyrazole (PCT WO 96/14843) und Vinylenazaindol-Derivate (PCT WO 94/14808) wurden beispielsweise in allgemeiner Form als Tyrosinkinaseinhibitoren beschrieben. Styrylverbindungen (US-Patent Nr. 5.217,999), Styryl-substituierte Pyridylverbindungen (US-Patent- Nr. 5,302,606), gewissen Chinazolin-Derivate (EP-Anmeldungsnr. 0 566 266 A1), Selenoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyklische Polyhydroxyverbindungen (PCT WO 92/21660), 4-Amino-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (PCT WO 96/31510) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495) sind als Verbindungen für die Verwendung als Tyrosinkinaseinhibitoren zur Behandlung von Krebs beschrieben worden.
Indeno-, Naphtho- und Cycloheptapyrazole sind als abortiv und fertilitätsvermindernd wirkende Agenzien beschrieben worden (Coombs und Houlihan, US-Patent Nr. 3,843,665 und Habeck und Houlihan. US-Patent Nr. 3.932,430).
Die Identifizierung wirksamer kleiner Moleküle, welche die Tyrosinsignaltransduktion durch eine Modulierung der Aktivität von Rezeptor- und Nichtrezeptortyrosinkinasen inhibieren, um eine anormale oder unzweckmäßige Zellproliferation zu regulieren und zu modulieren, ist daher wünschenswert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibierung einer Tyrosinkinase-Aktivität, wobei man Verbindungen der Formel:
worin Ring A für die tautomeren Strukturen
steht; n für 1, 2 oder 3 steht; Ar für
steht; und R¹, R² und R⁴, R⁵ jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen mit einem Atomgewicht von etwa 19 bis 36, Niederalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Niederalkoxy, Trifluormethyl stehen oder
R¹, R² und R⁴, R⁵ zusammengenommen unabhängig voneinander für Methylendioxy, das an die angrenzenden Kohlenstoffatome gebunden ist, stehen;
R³ für Wasserstoff, -COR⁶ oder -SO₂R⁶ steht; und
R⁶ für -CH₃ oder
steht, worin Y für Wasserstoff, Chlor oder -CH₃ steht, verabreicht.
Enantiomere, Tautomere, und Gemische dieser Verbindungen gehören zur Erfindung. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze dieser Verbindungen gehören auch zu dieser Erfindung.
Die Verbindungen der Strukturformel I sind als Inhibitoren der Tyrosinkinase-Aktivität brauchbar. Vor allem sind diese Verbindungen brauchbar als Inhibitoren von Tyrosinkinasen, die für den Angiogenesevorgang von Bedeutung sind. Hinzu kommt, dass diese Verbindungen auch als Inhibitoren von Tyrosinkinasen brauchbar sind, die beim vaskulären Hyperpermeabilitätsvorgang von Bedeutung sind. Da diese Verbindungen antiangiogen sind und die vaskuläre Hyperpermeabilität inhibieren, stellen sie wichtige Substanzen dar, um die Progredienz von Erkrankungszuständen zu inhibieren, bei denen Angiogenese und vaskuläre Hyperpermeabilität wichtige Komponenten sind.
Bevorzugte Verbindungen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren haben die Formel:
Zur vorliegenden Erfindung gehört des weiteren die Verwendung dieser Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge der oben beschriebenen Verbindungen und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können Individuen verabreicht werden, um den Angiogenesevorgang in Angiogenese-unterstützten Erkrankungen oder die vaskuläre Hyperpermeabilität in Erkrankungen, die mit diesem Vorgang zusammenhängen, zu verlangsamen oder aufzuhalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Verbindungen der Strukturformel I haben antiangiogene Eigenschaften. Deshalb können diese Verbindungen als aktive Agenzien bei Erkrankungszuständen verwendet werden, wie Arthritis, Atherosklerose, Psoriasis, Hämangiome, myocardiale Angiogenese, koronaren und zerebralen Kollateralen, Angiogenese ischämischer Gliedmaßen, Wundheilung, mit gastrointestinalem Helicobacter-Ulcus in Verbindung stehenden Erkrankungen, Frakturen, Katzenkratzkrankheit, Rubeose, neovaskulärem Glaukom, und Retinopathien wie denjenigen, die mit diabetischer Retinopathie oder altersbedingter Makuladegeneration in Zusammenhang stehen. Hinzu kommt, dass einige dieser Verbindungen als aktive Agenzien gegen solide Tumoren und hyperproliferative Erkrankungen verwendet werden können, da derartige Erkrankungen eine Proliferation von Blutgefäßzellen für Wachstum und Metastase benötigen.
Die Verbindungen der Strukturformel I besitzen eine inhibierende Aktivität auf Tyrosinkinasen. Diese Verbindungen modulieren nämlich die Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen. Vor allem inhibieren diese Verbindungen selektiv die Aktivität der KDR/FLK-1NGFR-2-Tyrosinkinasen. Bestimmte Verbindungen der Erfindung inhibieren auch die Aktivität weiterer Tyrosinkinasen wie Flt-1, VEGFR-1, Kinasen der Src-Unterfamilie wie Lck, Src, fyn, yes, etc. Das Auftreten und die Potenz der inhibitorischen Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen gegen eine bestimmte Tyrosinkinase hängt von der Art, Anzahl und Anordnung der Substituenten (d. h. R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶) dieser Verbindungen ab.
Die Verbindungen der Strukturformel I inhibieren auch die vaskuläre Hyperpermeabilität und die Ödembildung in denjenigen Individuen, die diese benötigen und denen solche Verbindungen verabreicht werden. Die Verbindungen wirken, so glaubt man, indem sie die Aktivität inhibieren, die von VEGF-Rezeptoren vermittelt wird, die an dem Vorgang der vaskulären Hyperpermeabilität und Ödembildung beteiligt sind. VEGF ist einzigartig darin, dass er der einzige angiogene Wachstumsfaktor ist, von dem man weiß, dass er direkt zur vaskulären Hyperpermeabilität und zur Ödembildung beiträgt. Tatsächlich scheinen die vaskuläre Hyperpermeabilität und Ödeme, die mit der Expression oder Verabreichung vieler weiterer Wachstumsfaktoren in Zusammenhang stehen, über die VGEF-Produktion vermittelt zu sein. Vaskuläre Hyperpermeabilität wird oftmals auch von Diapedesis begleitet. In ähnlicher Weise kann eine exzessive vaskuläre Hyperpermeabilität den normalen molekularen Austausch über das Endothel in kritischen Geweben und Organen (z. B. Lunge und Niere) unterbrechen, wodurch Funktionsstörungen auftreten und makromolekulare Extravasation und Ablagerung hervorgerufen wird. Indem man die Kinaseaktivität von VEGF-Rezeptoren inhibiert, werden die Hyperpermeabilität genauso wie die damit in Verbindung stehende Extravasation, die darauf folgende Bildung von Ödemen oder Ascites und Matrixablagerungen inhibiert und minimiert.
Hinzu kommt, dass N-acylierte (R³ = -COR⁶) Formen oder N-sulfonylierte (R³ = -SO₂R⁶) Analoga der erfindungsgemäßen Verbindungen auch als Prodrugs dienen können, die als metabolisch aktive antiangiogene Agenzien wirken.
Man stellt sich vor, dass die oben aufgeführten Erkrankungen in einem beträchtlichen Maß durch eine Proteintyrosinkinase-Aktivität vermittelt sind, an denen die KDR/VEGFR-2- und/oder die Flt1/VEGFR-1-Tyrosinkinasen beteiligt sind. Indem man die Aktivität dieser Tyrosinkinasen inhibiert, wird die Progredienz der aufgeführten Erkrankungen inhibiert, da die angiogene Komponente des Erkrankungszustandes stark eingeschränkt wird. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen führen wegen ihrer Selektivität für spezifische Tyrosinkinasen zu einer Minimierung von Nebenwirkungen, die dann auftreten würden, wenn weniger selektive Tyrosinkinaseinhibitoren verwendet würden.
Die Potenz und Spezifität der erfindungsgemäßen generischen Verbindungen kann oftmals durch Variationen der Substituenten und Konformationseinschränkungen verändert und optimiert werden.
Erfindungsgemäß gelten die folgenden Definitionen:
„Pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz" bezieht sich auf diejenigen Salze, welche die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen beibehalten und die durch Umsetzung mit anorganischen Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Sulfonsäure, Carbonsäure, organischer Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, Milchsäure, Weinsäure und dergleichen erhalten werden.
„Alkyl" bezieht sich auf einen gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff, wozu geradkettige und verzweigte Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen gehören.
„Alkoxy" bezieht sich auf eine „O-Alkyl"-Gruppe, worin „Alkyl" wie zuvor beschrieben definiert ist.
Pharmazeutische Formulierungen und Verabreichungswege
Die identifizierten erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen sie mit geeigneten Trägern oder Exzipienten vermischt sind, einem menschlichen Patienten in Dosen zur Behandlung oder Verbesserung einer Vielzahl von Erkrankungen verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich des Weiteren auf diejenige Menge der Verbindung, die ausreicht, um zu einer Verbesserung von Symptomen zu führen. Techniken zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe, zu finden.
Verabreichungswege
Zu geeigneten Verabreichungswegen gehören beispielsweise die orale, rektale, transmuköse, topische oder intestinale Verabreichung oder die Verabreichung in Form von Augentropfen; die parenterale Abgabe – intramuskuläre, subkutane, intrameduläre Injektionen genauso wie intrathecale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokuläre Injektionen eingeschlossen.
Alternativ kann man die Verbindung in einer eher lokalen als systemischen Weise verabreichen, beispielsweise durch Injektion der Verbindung direkt in einen soliden Tumor, oftmals in einer Depotformulierung oder einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung.
Außerdem kann man den Wirkstoff in einem System zur gezielten Wirkstoffabgabe verabreichen, beispielsweise in einem mit tumorspezifischem Antikörper beschichteten Liposom. Die Liposomen werden gezielt an den Tumor herangeführt und von ihm selektiv aufgenommen.
Zusammensetzung/Formulierung
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, z. B. mittels konventioneller Verfahren zum Vermischen, Lösen, Granulieren, Dragieren, Pulverisieren, Emulgieren, Einkapseln, Einschließen oder Lyophilisieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die erfindungsgemäße Verwendung können somit in konventioneller Art und Weise formuliert werden, wobei man einen oder mehrere physiologisch verträgliche. Träger verwendet, die Exzipienten und Hilfsstoffe beinhalten, welche das Prozessieren der aktiven Verbindungen in pharmazeutisch verwendbare Zubereitungen erleichtern. Die richtige Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab.
Zur Injektion können die Agenzien der Erfindung in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung formuliert werden. Für die transmuköse Verabreichung werden für die zu permeierende Barriere geeignete Penetriermittel in der Formulierung verwendet. Derartige Penetriermittel sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen auf einfache Art und Weise formuliert werden, indem man die aktiven Verbindungen mit dem Fachmann hinlänglich bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern kombiniert. Derartige Träger gestatten es, die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Breis, Suspensionen und dergleichen für die orale Aufnahme durch den zu behandelnden Patienten zu formulieren. Pharmazeutische Zubereitungen zur oralen Verwendung können erhalten werden, indem man die aktive Verbindung mit einem festen Exzipienten kombiniert, das resultierende Gemisch gegebenenfalls mahlt und das Granulatgemisch, nach Zusatz geeigneter Hilfsmittel, sofern gewünscht, zu Tabletten oder Drageekernen verarbeitet. Geeignete Exzipienten sind vor allem Füllmittel, wie Zucker – Lactose, Sucrose, Mannitol oder Sorbitol eingeschlossen; Cellulose-Zubereitungen, wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Sofern gewünscht, können desintegrierende Mittel zugesetzt werden, wie quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure, oder ein Salz davon, wie Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen. Dazu kann man konzentrierte Zuckerlösungen verwenden, die gegebenenfalls arabisches Gummi, Talc, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethlenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten- oder Dragee-Überzügen zugesetzt werden, um sie erkennbar oder verschiedene Kombinationen von Dosen aktiver Verbindung kenntlich zu machen.
Zu pharmazeutischen Zubereitungen, die oral verwendet werden können, gehören Steckkapseln aus Gelatine genauso wie geschlossene Weichkapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glyzerin oder Sorbitol. Die Hartkapseln können die aktiven Inhaltsstoffe im Gemisch mit Füllmitteln wie Lactose, Bindemitteln wie Stärken und/oder Gleitmitteln wie Talc oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls Stabilisierungsmitteln enthalten. In Weichkapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie fetten Ölen, Flüssigparaffin oder flüssigen Polyethylenglykolen, gelöst oder suspendiert sein. Hinzu kommt, dass Stabilisierungsmittel zugegeben werden können. Sämtliche Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in für die Verabreichung geeigneten Dosierungen vorliegen.
Für die buccale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen haben, die in herkömmlicher Art und Weise formuliert sind.
Für die Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung bequem in Form einer Aerosol-Spray-Zubereitung aus Druckbehältern oder Nebulisierern unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder eines anderen geeigneten Gases, abgegeben werden. im Fall eines Druckaerosols kann die Dosiseinheit bestimmt werden, indem man ein Ventil zur Abgabe einer abgemessenen Menge vorsieht. Kapseln oder Kartuschen aus beispielsweise Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Pulverzerstäuber können formuliert werden, wobei sie ein Pulvergemisch der Verbindung und einer geeigneten Pulverbase wie Laktose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können für die parenterale Verabreichung durch Injektion, z. B. Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Dosiseinheitsform vorliegen, z. B. in Ampullen oder Multidosis-Behältern, mit einem zugesetzten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln vorliegen, und sie können Formuliermittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten.
Zu pharmazeutischen Formulierungen zur parenteralen Verabreichung gehören wässrige Lösung der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Hinzu kommt, dass Suspensionen der aktiven Verbindungen als zweckmäßige ölige Injektionssuspensionen zubereitet werden können. Zu geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln gehören fette Öle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran.
Gegebenenfalls können die Suspensionen auch geeignete Stabilisierungsmittel oder Mittel, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen oder mit denen sich hochkonzentrierte Lösungen zubereiten lassen, enthalten.
Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff in Pulverform vorliegen, um vor Gebrauch mit einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem pyrogenfreien Wasser, rekonstituiert zu werden.
Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen, wie Suppositorien oder Retentionsklistern, die z. B. herkömmliche Suppositorienbasen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten, formuliert werden.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotzubereitungen formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können mittels Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär oder durch intramuskuläre Injektion) verabreicht werden. So können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise einer Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauschharzen, oder als wenig lösliche Derivate, beispielsweise als wenig lösliches Salz, formuliert werden.
Ein pharmazeutischer Träger für die erfindungsgemäßen hydrophoben Verbindungen ist ein Cosolvenssystem, das Benzylalkohol, ein nichtpolares Tensid, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase umfasst. Das Cosolvenssystem kann das VPD-Cosolvenssystem sein. VPD ist eine Lösung aus 3% G/V Benzylalkohol, 8% G/V des nichtpolaren Tensids Polysorbat 80 und 65% G/V Polyethylenglykol 300 in absolutem Ethanol. Das VPD-Cosolvenssystem (VPD : 5W) besteht aus VPD, das 1 : 1 mit einer Lösung von 5% Dextrose in Wasser verdünnt ist. Dieses Cocolvenssystem löst hydrophobe Verbindungen gut und ruft nach systemischer Verabreichung geringe Toxizität hervor. Natürlich kann die anteilige Zusammensetzung des Cosolvenssystems beachtlich variiert werden, ohne dass dessen Lösungs- und Toxizitätseigenschaften abhanden kommen. Außerdem kann die Art der Cosolvenskomponenten variiert werden: Beispielsweise können an Stelle von Polysorbat 80 andere nichtpolare Tenside mit geringer Toxizität verwendet werden; die Fraktionsgröße des Polyethylenglykols kann variiert werden; weitere biokompatible Polymere können Polyethylenglykol ersetzen, z. B. Polyvinylpyrrolidon; und weitere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
Alternativ können andere Abgabesysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen eingesetzt werden. Liposomen und Emulsionen stellen hinlänglich bekannte Beispiele für Abgabevehikel oder Träger für hydrophobe Wirkstoffe dar. Bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid können auch eingesetzt werden, wenngleich in der Regel auf Kosten einer größeren Toxizität. Hinzu kommt, dass die Verbindungen abgegeben werden können, indem man ein System mit verzögerter Freisetzung verwendet, wie semipermeable Matrizes fester hydrophober Polymere, die das therapeutische Agens enthalten. Verschiedene Materialien mit verzögerter Freisetzung sind etabliert worden und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Kapseln mit verzögerter Freisetzung können in Abhängigkeit von ihrer chemischen Natur die Verbindungen wenige Wochen bis zu über 100 Tage lang freisetzen. In Abhängigkeit von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Agens, können zusätzliche Strategien zur Stabilisierung von Proteinen eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete Träger oder Exzipienten für eine Fest- oder Gelphase umfassen. Zu solchen Trägern oder Exzipienten gehören beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglykole, ohne darauf beschränkt zu sein.
Viele der endungsgemäßen PTK-modulierenden Verbindungen können als Salze mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen zur Verfügung gestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren gebildet werden; hierzu gehören Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Bernsteinsäure etc., ohne darauf beschränkt zu sein. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechenden freien Basenformen.
Wirksame Dosierung
Zu pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die endungsgemäße Verwendung geeignet sind, gehören Zusammensetzungen, in denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, so dass der beabsichtigte Zweck erreicht wird. Insbesondere meint eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die wirksam die Entwicklung von Symptomen des zu behandelnden Subjekts verhindert oder vorhandene Symptome lindert. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt ohne weiteres im Bereich fachmännischen Könnens, vor allem dann, wenn man die hier gegebene detaillierte Offenbarung berücksichtigt.
Für jede beliebige, im endungsgemäßen Verfahren verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis zunächst an zellulären Assays bestimmt werden. Beispielsweise kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um einen Kreislaufkonzentrationsbereich zu erzielen, welcher die im zellulären Assay bestimmte IC₅₀ (d. h. diejenige Konzentration der Testverbindung, welche eine halbmaximale Inhibierung der PTK-Aktivität bewirkt) beinhaltet. Eine derartige Information kann verwendet werden, um die in Menschen brauchbaren Dosen genauer zu bestimmen.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf diejenige Menge der Verbindung, die zu einer Verbesserung von Symptomen oder einem längeren Überleben eines Patienten führt. Toxizität und therapeutische Wirksamkeit therapeutischer Verbindungen können mit Hilfe standardisierter pharmazeutischer Vorgehensweisen in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z. B. zur Bestimmung der LD₅₀ (die Dosis, die auf 50% der Population letal wirkt) und der ED₅₀ (die Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als Verhältnis zwischen LD₅₀ und ED₅₀ angegeben werden. Bevorzugt werden Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes haben. Die mit diesen Zellkultur-Assays und Tierstudien erhaltenen Daten können bei der Formulierung eines für Menschen verwendbaren Dosierungsbereichs verwendet werden. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Kreislaufkonzentrationen, welche die ED₅₀ mit geringer Toxizität oder ohne Toxizität beinhalten. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs variieren, je nach eingesetzter Dosierungsform und des verwendeten Verabreichungswegs. Die Formulierung, Verabreichungsweg und Dosierung können letztendlich von dem jeweiligen Arzt unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten gewählt werden (siehe z. B. Fingl et al., 1975, in „The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p1).
Dosierungsmenge und Dosierungsabstand können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der aktiven Einheit zur Verfügung zu stellen, die ausreichen, um die Kinase-modulierenden Wirkungen oder die minimal wirksame Konzentration (MEC) aufrecht zu erhalten. Die MEC ist von Verbindung zu Verbindung verschieden; sie kann aber anhand von in vitro-Daten bestimmt werden; z. B. diejenige Konzentration, die unter Verwendung des hier beschriebenen Assays eine 50 bis 90%ige Inhibition der Kinase erzielt. Die zum Erreichen der MEC erforderliche Dosierung hängt von den individuellen Eigenschaften und dem Verabreichungsweg ab. HPLC-Assays oder Bioassays können allerdings verwendet werden, um die Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
Dosisabstände können auch unter Verwendung des MEC-Wertes bestimmt werden. Verbindungen sollten unter Verwendung eines Verabreichungsschemas verabreicht werden, mit dem die Plasmaspiegel 10 bis 90% der Zeit, vorzugsweise 30 bis 90% und am bevorzugtesten 50 bis 90% oberhalb der MEC gehalten werden. Im Falle einer lokalen Verabreichung oder einer selektiven Aufnahme kann die wirksame lokale Konzentration des Wirkstoffs nicht mit der Plasmakonzentration in Zusammenhang stehen.
Die verabreichte Menge der Verbindung wird natürlich von dem zu behandelnden Subjekt, dem Gewicht des Subjekts, der Schwere des Leidens, der Art der Verabreichung und der Beurteilung des verschreibenden Arztes abhängen.
Verpackung
Falls gewünscht, kann die Zusammensetzung in einer Verpackung oder einer Abgabevorrichtung dargeboten werden, in der eine oder mehrere den aktiven Inhaltsstoff enthaltende Dosierungseinheiten enthalten sind. Die Packung kann beispielsweise eine Metall- oder Plastikfolie umfassen, beispielsweise einen Blister. Der Packung oder Abgabevorrichtung können Instruktionen für die Verabreichung beigefügt sein. Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße, in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formulierte Verbindung beinhalten, können auch zubereitet werden, in einen geeigneten Behälter gegeben werden und zur Behandlung eines angegebenen Zustandes markiert werden. Zu geeigneten Zuständen, die auf der Markierung angegeben sind, gehören die Behandlung zellulärer hyperproliferativer Erkrankungen, die Inhibierung der Angiogenese, die Behandlung von Fibrose, Diabetes, Ödeme, Ascites, und dergleichen.
Beispiele
I. Synthese
Es gibt zwei allgemeine Ansätze für die Synthese der Indeno-, Naphtho- und Cyclohepta(1,2-c]pyrazol-Ringsysteme, die im US-Patent 3,843,665 und US-Patent 3,843,666 angegeben sind und Formel I entsprechen.
In dem US-Patent 3,843,665 wird die Cyclisierung des Pyrazolrings dadurch bewirkt, dass man Verbindungen der Struktur II mit einem aromatischen Sulfonylhydrazid in einem inerten Lösungsmittel und einer katalytischen Menge Säure erwärmt. Die Reaktion wird für eine Zeitspanne von 5 bis 30 Stunden bei einer Temperatur von 75 bis 100°C durchgeführt. Das folgende Schema steht für diese Transformation.
worin: p 0, 1, 2 ist; und W Niederalkyl ist.
Verbindungen der Formel II werden hergestellt, indem man ein in geeigneter Weise funktionalisiertes 1-Indanon, alpha-Tetralon oder 1-Benzoesuberon mit einem Arylaldehyd in Gegenwart eines sauren oder basischen Katalysators behandelt (Braun, R. A.; Mosher, W. A., J. Amer. Chem. Soc., 1958, 80, 2749).
Ein zweites Verfahren zur Herstellung von Indeno-, Naphtho- und Benzo[6,7)cyclohepta[1,2-c]pyrazol ist im US-Patent 3,843,666 angegeben, wonach Verbindungen der allgemeinen Formel VI mit einer katalytischen Menge einer organischen Carbonsäure oder einer organischen Sulfonsäure in einem inerten Lösungsmittel wie einem aromatischen Kohlenwasserstoff für eine Zeitspanne von 6 bis 24 Stunden auf 75 bis 175°C erwärmt werden.
worin: Ar, R¹ und R² obige Bedeutungen haben.
Verbindungen mit der allgemeinen Formel VI werden hergestellt, indem man Verbindungen der allgemeinen Formel VII mit Hydrazin in einem inerten Lösungsmittel behandelt. Die Reaktion wird für eine Zeitspanne von bis zu 24 Stunden bei 15 bis 20°C durchgeführt.
Verbindungen der allgemeinen Formel VII werden hergestellt, indem man II mit alkalischem Wasserstoffperoxid bei Raumtemperatur in einem geeigneten organischen Cosolvens-Gemisch wie CH₂Cl₂/MeOH behandelt. Alternativ resultiert VII aus der Reaktion von VIII mit einem Arylaldehyd unter basischen Bedingungen. Die Reaktion wird in einem inerten Lösungsmittel bei einer Temperatur von 5 bis 10 °C für eine Zeitspanne von 3 bis 6 Stunden durchgeführt.
worin:
Y eine beliebige herkömmliche Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Jod, Tosylat oder Mesylat ist.
Die Cyclisierung von VI kann ebenfalls bewirkt werden, indem man mit einer Mineralsäure wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure behandelt. Die Reaktion wird in einem Niederalkanol bei einer Temperatur von 15°C bis 20°C für eine Zeitspanne von 12 bis 48 Stunden durchgeführt. Das Produkt der Reaktion, nämlich IX, kann dann zu I aromatisiert werden, indem man es mit einer organischen Carbonsäure oder einer organischen Sulfonsäure in einem geradkettigen Ether oder einem cyclischen Ether für eine Zeitspannne von 8 bis 30 Stunden auf eine Temperatur von 50 bis 150°C erwärmt.
Die Verbindung IX kann deacetyliert werden, indem man mit Essigsäureanhydrid in einem inerten Lösungsmittel wie einem aromatischen Kohlenwasserstoff bei einer Temperatur von 35 bis 200°C für eine Zeitspanne von 5 bis 8 Stunden behandelt.
Die Verbindung XI kann dann zu Verbindung XII aromatisiert werden, indem man sie mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure in einem inerten Lösungsmittel für eine Zeitspanne von 4 bis 8 Stunden auf eine Temperatur von 35 bis 200°C erwärmt. Schließlich kann die Verbindung XII in I überführt werden, indem man sie in einem inerten Lösungsmittel wie Wasser oder einem Niederalkohol in Gegenwart eines Alkalimetalls oder eines Alkalimetallhydroxids für eine Zeitspanne von 8 bis 30 Stunden auf eine Temperatur von 50 bis 150°C erwärmt.
Verbindungen der allgemeinen Formel XIII können erhalten werden, indem man VII mit einer Verbindung der Formel XIV in Gegenwart eines inerten (Lösungsmittels wie einem Niederalkanol, einem geradkettigen Ether oder einem cyclischen Ether bei einer Temperatur von 15 bis 20°C für eine Zeitspanne von 24 Stunden behandelt.
worin:
R³ für Wasserstoff, -COR⁶ oder -SOR⁶ steht, und
R für -CH₃ oder
steht.
Y ist Wasserstoff, Chlor oder -CH₃.
Verbindungen der allgemeinen Formel XIII können zu XV cyclisiert werden, indem man sie mit einer katalytischen Menge einer organischen Carbonsäure oder einer organischen Sulfonsäure in einem inerten Lösungsmittel wie einern aromatischen Kohlenwasserstoff für eine Zeitspanne von 6 bis 24 Stunden auf 75 bis 175°C erwärmt. Verbindungen der allgemeinen Formel XV (R³ # H) können in I überführt werden, indem man sie in einem inerten Lösungsmittel wie Wasser oder einem Niederalkohol in Gegenwart eines Alkalimetalls oder eines Alkalimetallhydroxids für eine Zeitspanne von 8 bis 30 Stunden auf eine Temperatur von 50 bis 150°C erwärmt.
Spezielle Beispiele für die obigen Transformationen sind in den US-Patenten 3,843,665 und 3,843,666 zu finden.
Beispiele
Durch die folgenden, lediglich beispielhaft angegebenen Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert. Das Endprodukt jedes dieser Beispiele wurde mit einer oder mehrerer der folgenden Vorgehensweisen charakterisiert: Hochleistungsflüssig-Chromatographie; Elementaranalyse, magnetische Kernresonanzspektroskopie, Infrarotspektroskopie und hochauflösende Massenspektroskopie:
THF = Tetrahydrofuran;
DMF = Dimethylformamid;
IMS = industrielles methyliertes Benzin; und
LCMS = Flüssigchromatographie/Massenspektroskopie.
Die Beispiele 1 bis 3 wurden mit den in US 3,932,430 (Sandoz, 1976) angegebenen Verfahren hergestellt:
Beispiel 1
3-(3-Pyridyl)-1,4-dihdroindeno[1,2-c]pyrazol, Schmelzpunkt 223–224°C;
Beispiel 2
3-(4-Pyridyl)-1,4-dihdroindeno[1,2-c]pyrazol, Schmelzpunkt 264–266°C (Zersetzung);
Beispiel 3
3-(2-Thienyl)-4,5-dihdro-1H-benz[g]indazol, Schmelzpunkt 206–208°C.
Beispiel 4
Ein Gemisch aus 2-Benzyliden-indan-1-on (3.99 g), p-Toluolsulphonylhydrazin (4,0 g), p-Toluolsulphonsäure-Hydrat (0,7 g) und Ethanol (60 ml) wurde unter Rückfluss 1,5 Stunden erhitzt und dann 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde weitere 74 Stunden unter Rückfluss erhitzt und dann 74 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand zwischen Dichlormethan (100 ml) und 2 M Natriumhydroxidlösung (50 ml) verteilt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Magnesiumsulfat wurde mit Ethylacetat gewaschen und filtriert. Das Ethylacetatfiltrat wurde zur Trockne eingeengt, was einen Feststoff ergab, der aus Ethanol unter Erhalt von 3-Phenyl-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 234–236°C umkristallisiert wurde.
Beispiel 5

a) Ein Gemisch aus Indan-1-on (10,0 g), Ethanol (35 ml), Hydrazinhydrat (10,0 ml) und Eisessig (2,0 ml) wurde unter Rückfluss und Stickstoff 1 Stunde erhitzt. Das Gemisch wurde auf 20°C abgekühlt, und das Gemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt, was einen Feststoff ergab, der durch Filtration gewonnen wurde, wobei man Indan-1-on-hydrazon mit einem Schmelzpunkt von 84–86°C erhielt.
b) Das Hydrazon aus a) (3,55 g) wurde in Tetrahydrofuran (80 ml) gelöst und unter Stickstoff auf 0°C abgekühlt, während eine Lösung von n-Butyllithium (28,8 ml einer 2,5 M Lösung in Hexan) zugegeben wurde. Das Gemisch wurde bei 0°C 30 Minuten gerührt; dann wurde Ethyl-3-methoxybenzoat (2,16 g) zugegeben, und das Gemisch wurde bei 0°C 20 Minuten gerührt. 3 M Chlorwasserstoffsäure (80 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht wurde mit Natriuimbicarbonat neutralisiert und mit Ether extrahiert, was ein Öl ergab, welches durch Flashsäulenchromatographie unter Verwendung von 30 bis 40% Ethylacetat in Petrolether (Siedepunkt von 60 bis 80°C) als mobile Phase gereinigt wurde, wobei man 3-(3-Methoxyphenyl)-1,4-dihydroindeno(1,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 172 bis 174°C erhielt.

Beispiel 6
Ein Gemisch aus 2-(4-Methoxybenzoyl)indan-1,3-dion (1,4 g, hergestellt nach einer Abänderung des in J. Het. Chem. 8, 855–859 (1971) beschriebenen Verfahrens) und Hydrazinhydrat (15 ml) wurde unter Rückfluss 24 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde abgekühlt, in Eiswasser gegossen, und der ausfallende Feststoff wurde durch Filtration gewonnen, mit absolutem Ethanol gewaschen und getrocknet, wobei man 3-(4-Methoxyphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 247°C erhielt.
Beispiel 7
Ein Gemisch aus 2-(4-Methylbenzoyl)indan-1,3-dion (1,32 g, in ähnlicher Weise hergestellt wie das Ausgangsmaterial in Beispiel 6) und Hydrazinhydrat (15 ml) wurde 24 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde abgekühlt, in Eiswasser gegossen, und der Feststoff wurde durch Filtration gewonnen, mit absolutem Ethanol gewaschen und getrocknet, wobei man 3-(p-Tolyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 267 bis 269°C erhielt.
Beispiel 8

a) Eine Lösung von 5-Methoxyindan-1-on (5,46 g) und tert-Butylcarbazat (4,45 g) in Ethanol (100 ml) und Eisessig (1 Tropfen) wurde gerührt und 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Volumen wurde unter vermindertem Druck auf die Hälfte reduziert und der auskristallisierende Feststoff wurde durch Filtration gewonnen, wobei man 5-Methoxyindan-1-on-tert-butyloxycarbonylhydrazon erhielt.
b) Eine Lösung aus Lithiumdiisopropylamid (11,3 ml einer 2,0 M Lösung in Heptan/THF/Ethylbenzol) wurde zu einer gerührten Lösung von 5-Methoxyindan-1-on-tert-butyloxycarbonylhydrazon (2,5 g) in Tetrahydrofuran (100 ml) bei –78°C unter Stickstoff getropft. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 1,5 Stunden gerührt; dann wurde eine Lösung von Ethylthiophen-2-carboxylat (1,69 g) in Tetrahydrofuran (10 ml) zugetropft. Nach der Zugabe wurde das Gemisch 30 Minuten bei –78°C gerührt; man ließ es dann auf Raumtemperatur erwärmen. Nach weiterem 20-minütigen Rühren bei Raumtemperatur, wurde eine gesättigte Ammoniumchloridlösung (100 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten heftig gerührt. Die Schichten wurden voneinander getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit Ether (3 × 75 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 1 M Chlorwasserstoffsäure und dann mit Kochsalzlösung gewaschen, anschließend getrocknet, filtriert und verdampft, was ein gelbes Gummi ergab, das in Dichlormethan (25 ml) suspendiert wurde, und es wurde Pentamethylbenzol (1,34 g) zugegeben. Das Gemisch wurde auf 0°C abgekühlt, und Trifluoressigsäure (0,2 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 64 Stunden gerührt und dann unter vermindertem Druck eingeengt, was ein Öl ergab, das in Ether (200 ml) gelöst wurde, mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (100 ml) und dann mit Kochsalzlösung gewaschen wurde, und anschließend getrocknet, filtriert und verdampft wurde, wobei man ein Gummi erhielt, das durch Flashsäulenchromatographie unter Verwendung von Petrolether (Siedepunkt 60 bis 80°C)/Ethylacetat (4 : 1) als mobile Phase gereinigt wurde, wobei man 6-Methoxy-2-tert-butyloxycarbonyl-3-(2-thienyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 163 bis 165°C erhielt.
c) 3 M Chlorwasserstoffsäure (10 ml) wurde zu einer gerührten Lösung des Produkts aus b) (100 mg) in Ethylacetat (10 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und dann unter Rückfluss erwärmt. Das Gemisch wurde unter Rückfluss 30 Minuten erhitzt und dann abgekühlt. Das Gemisch wurde in Wasser (50 ml) gegossen, und die organische Schicht wurde abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten und Waschlösungen wurden mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung basisch gemacht und mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten Dichlormethanwaschlösungen und -extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, filtriert und verdampft, wobei man 6-Methoxy-3-(2-thienyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 212 bis 214°C erhielt.

Beispiel 9

a) Eine Lösung aus Indan-1-on (5,0 g) und tert-Butylcarbazat (5,0 g) in Methanol (20 ml), die Eisessig (1 Tropfen) enthielt, wurde unter Rückfluss 1,5 Stunden erhitzt und gerührt. Das Gemisch wurde abgekühlt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde aus Ethanol umkristallisiert, wobei man Indan-1-on-tertbutyloxycarbonylhydrazon erhielt.
b) In ähnlicher Weise wie im vorhergehenden Beispiel wurde das Produkt aus a) (500 mg) mit Lithiumdüsopropylamid (2,23 ml einer 2,0 M Lösung in Heptan/THF/Ethylbenzol) und dann mit Ethyl-2-furoat (299 mg) umgesetzt, und die erhaltene Verbindung wurde mit Trifluoressigsäure (5 ml) behandelt, wobei man 3-(2-Furyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 195 bis 197 °C erhielt.

Beispiel 10
In einem ähnlichen Experiment wie in den beiden vorhergehenden Beispielen wurde 6-Fluoro-3-(2-thienyl)-1,4-dihydroindeno[,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 222 bis 224°C ausgehend von 5-Fluorindan-1-on und unter Verwendung von Ethylthiophen-2-carboxylat hergestellt.
Beispiele 11 bis 28 (allgemeines Verfahren)

a) Ein 1 : 1 Gemisch (bezogen auf das Volumen) von Dichlormethan : Methanol (1 ml) wurde über eine Flüssigkeitszugabevorrichtung Gilson 215 zum Ausgangsenon (etwa 50 mg, siehe Tabelle I) in einem mit einem Septum verschlossenen Röhrchen gegeben; anschließend wurden eine wässrige 2 M Natriumhydroxidlösung (1 Moläquivalent, siehe Tabelle I) und dann 100 Volumina wässriges Wasserstoffperoxid (1,8 Moläquivalente) zugegeben. Die resultierenden Lösungen/Suspensionen wurden dann 20 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Im Anschluss an eine LCMS-Analyse wurden weitere 100 Volumina wässriges Hydrogenperoxid (1,8 Moläquivalente) zu jedem Reaktionsröhrchen gegeben, diesmal manuell über eine Pipette mit einer Plastikspitze. Weiteres 1 : 1 (bezogen auf das Volumen) Dichlormethan : Methanol (1 ml) wurde zu denjenigen Röhrchen, die eine signifikante Menge unlöslichen Materials enthielten, gegeben. Es wurde weitere 24 Stunden geschüttelt.

Sämtliche Reaktionen wurden mit TLC analysiert und diejenigen, die demnach unvollständig abreagiert hatten, wurden mit etwa 100 Volumina wässrigem Wasserstoffperoxid (1,8 Moläquivalente) wiederum mit einer Pipette mit einer Plastikspitze versetzt (siehe diejenigen Reaktionen, die in Tabelle I mit ×3 angegeben sind). Diese Reaktionsgemische wurden 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt.
Tabelle I
Die Reaktionslösungen/-suspensionen wurden zwischen Dichlormethan (etwa 5 ml) und Wasser (etwa 2 ml) verteilt, von der organischen Phase über eine Filterkartusche Empore abfiltriert und mit Dichlormethan gewaschen (etwa 2 ml). Die Dichlormethanphasen wurden verdampft und die Rückstände im Vakuum weiter getrocknet.
Die Produkte aus a) wurden in b) als die entsprechenden 2,3-Epoxyketone eingesetzt.

b) Zu den Produkten aus Schritt 1 in einem mit einem Septum verschlossenen Röhrchen gab man über eine Flüssigkeitszugabevorrichtung Gilson 215 n-Butanol (2 ml) und anschließend Hydrazinhydrat (bezogen auf die in Schritt 1 verwendete Menge Ausgangsenon 2 Moläquivalente) als eine 10 Vol.-%ige Lösung in n-Butanol (siehe Tabelle II). Schließlich wurde zu jedem Röhrchen manuell mit einer Spritze Eisessig (2 Tropfen) zugegeben. Die Reaktionen wurden unter Schütteln auf 100°C für die in Tabelle II angegebenen Zeiten erwärmt; Grundlage war die Überwachung durch TLC-Analyse. Die Reaktionsgemische wurden zur Trockne eingeengt, und die Rückstände wurden mit Chromatographie auf Siliciumdioxid mit Ethylacetat, der erforderlichenfalls mit Petrolether (Siedepunkt 40 bis 60°C) verdünnt war, gereinigt. Geeignete Fraktionen wurden verdampft und im Vakuum getrocknet, was die fertigen Pyrrole ergab. Die Identität der Produkte wurde mit LCMS unter den nachstehend angegebenen Bedingungen bestätigt. LC

Säule:	5μ HYPERSIL BDS C18 (100 × 2,1 mm)
Mobile Phase:	0,1% Ameisensäure: MeCN (Gradient – siehe unten)
Bedingungen:	10–100% MeCN in 8 Minuten
(Gradient)	100% MeCN, 1 Minute
	100–10% MeCN in 2 Minuten
	(Gesamtanalysenzeit 11 Minuten)
Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min
Wellenlängenbereich:	206–320 nm
Injektionsvolumen:	20 μl

MS

Ionisation	APcl +ve/–ve
Massenbereich:	150–500 m/z
Kegelspannung:	20

Die Reaktionsdetails und Ausbeuten für die Verbindungen 11–28 sind in Tabelle II gezeigt:
Tabelle II Reaktionsdetails
Tabelle II (Fortsetzung) Ausbeuten/LCMS
Die in den Beispielen 11–28 hergestellten Verbindungen sind:
Beispiel 11
3-(2-Pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 12
3-(3-Pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 13
3-(4-Fluorphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
Beispiel 14
3-Phenyl-2,4,5,6-tetrahydrobenzo[6,7]cyciohepta[1,2-c]pyrazol
Beispiel 15
3-(2-Thienyl)-2,4,5,6-tetrahydrobenzo[6,7]cyclohepta[1,2-c]pyrazol
Beispiel 16
3-(4-Methoxyphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 17
3-(2-Chlorphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 18
3-(3-Chlorphenyl)-4,5-dihydro-2N-benz[g]indazol
Beispiel 19
3-(4-Chlorphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 20
3-(4-Isopropylphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 21
3-Piperonyl-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 22
7-Methoxy-2-(4-tolyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 23
3-(4-Trifluormethylphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
Beispiel 24
3-(2,4-Dichlorphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c)pyrazol
Beispiel 25
3-(2,3-Dimethoxyphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 26
7-Methoxy-3-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 27
3-(3,5-Dimethoxyphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
Beispiel 28
6,7-Dimethoxy-3-(4-methoxyphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
Beispiel 29

a) Indan-1-on (3,30 g), Thiophen-3-carboxaldehyd (2,60 ml), Essigsäure (0,47 ml) und Piperidin (0,57 ml) wurden zusammen auf einem Dampfbad 16 Stunden erwärmt. Das Gemisch wurde abgekühlt, was eine feste Masse ergab, die mit IMS (120 ml) erhitzt und heiß filtriert wurde, um unlösliches Material zu entfernen. Das Filtrat wurde auf Eis abgekühlt, um einen braunen Feststoff auszufällen, der durch Filtration gewonnen und getrocknet wurde, wobei man 2-(3-Thienyl)methylenindan-1-on mit einem Schmelzpunkt von 137 bis 138°C erhielt.
b) Ein Gemisch des Produkts aus a) (2,03 g), p-Toluolsulfonylhydrazin (2,00 g), p-Toluolsulfonsäure (0,35 g) und Ethanol (30 ml) wurde unter Rückfluss 44 Stunden erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst (100 ml). Die Lösung wurde mit 2 M wässriger Natriumhydroxidlösung (25 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet, über ein Siliziumdioxidbett filtriert, mit Ethylacetat gewaschen, und verdampft, was ein Öl ergab, das durch Flashsäulenchromatographie auf Siliziumdioxid unter Verwendung von Petrolether (Siedepunkt 60 bis 80 °C)/Ethylacetat (2 : 1) und anschließend derselben Lösungsmittel in einem Verhältnis von 1 : 1 als mobile Phase gereinigt wurde. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und verdampft, was einen Feststoff ergab, der mit Diethylether verrieben und filtriert wurde, wobei man 3-(3-Thienyl)-1,4-Dihydroindeno[1,2-c]pyrazol mit einem Schmelzpunkt von 219–220°C erhielt.

Die chemischen Strukturen der in diesen Beispielen hergestellten Verbindungen sind in Tabelle III gezeigt:
Tabelle III
II. in Vitro-PTK-Assays
Die nachstehenden in vitro-Assays können verwendet werden, um das Aktivitäts- und Wirkungsniveau der verschiedenen erfindungsgemäßen Verbindungen auf eine oder mehrere der PTKs zu bestimmen. In Anlehnung an dieselben Vorgaben können ähnliche Assays für weitere Tyrosinkinasen entworfen werden, indem man hinlänglich bekannte Techniken verwendet.
A. KDR-Proteinproduktion unter Verwendung eines Baculovirus-Systems:
Die kodierende Sequenz für die KDR-intrazelluläre Domäne (AS 789–1354) wurde durch PCR unter Verwendung von aus HUVEC-Zellen isolierten cDNAs erzeugt. Am N-Terminus dieses Proteins wurde auch eine Poly-Hiss-Sequenz eingefügt. Dieses Fragment wurde an der Xba1- und Not1-Stelle in den Transfektionsvektor pVL 1393 kloniert. Ein rekombinanter Baculovirus (BV) wurde durch Cotransfektion erzeugt, wobei man das BaculoGold-Transfektionsreagens (Phar Mingen) verwendete. Der rekombinante BV wurde plaquegereinigt und mittels Western-Analyse verifiziert. Für die Proteinproduktion ließ man SF-9-Zellen in SF-9-11-Medium bei 2 × 10⁶/ml wachsen, und diese wurden mit 0,5 plaquebildenden Einheiten pro Zelle (MOI) infiziert. 48 Stunden nach Infektion wurden die Zellen geerntet.
B. KDR-Reinigung
(His)₆KDR(AS 789–1354) exprimierende SF-9-Zellen wurden lysiert, indem man 50 ml Triton X-100-Lyse-Puffer (20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin) zum Zellpellet aus 1 L Zellkultur gab. Das Lysat wurde bei 19000 UPM in einem Sorval SS-34-Rotor 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Zelllysat wurde auf eine 5 ml NiCl₂-chelatisierende Sepharosesäule, die mit 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl äquilibriert worden war, aufgetragen. KDR wurde unter Verwendung desselben, 0,25 M Imidazol enthaltenden Puffers eluiert. Die Säulenfraktionen wurden unter Verwendung von SDS-PAGE und einem ELISA-Assay (siehe unten), der die Kinase-Aktivität misst, analysiert. Der gereinigte KDR wurde in einen 25 mM HEPES, pH 7,5, 25 mM NaCl, 5 mM DTT-Puffer überführt und bei –80°C gelagert.
C. Herstellung und Reinigung der humanen Tie-2-Kinase
Die kodierende Sequenz für die humane Tie-2-intrazelluläre Domäne (AS 775-1124) wurde durch PCR unter Verwendung von aus Humanplazenta isolierten cDNAs als Templat erzeugt. Am N-Terminus wurde ein Poly-His₆-Sequenz eingefügt, und dieses Konstrukt wurde an der Xba 1- und Not1-Stelle in den Transfektionsvektor pVL1939 kloniert. Rekombinanter BV wurde unter Verwendung von BaculoGold-Transfektionsreagens (PharMingen) durch Cotransfektion erzeugt. Rekombinanter BV wurde plaquegereinigt und durch Western-Analyse verifiziert. Für die Proteinproduktion ließ man SF-9-Insektenzellen in SF-900-II-Medium bei 2 × 10⁶/ml wachsen, und diese wurden bei einer MOI von 0,5 infiziert. Die Reinigung der im Screening verwendeten His-markierten Kinase war analog zu der für KDR beschriebenen.
D. Produktion und Reinigung der humanen Flt-1-Tyrosinkinase
Es wurde der baculovirale Expressionsvektor pVL1393 (PharMingen, Los Angeles, CA) verwendet. Die die Kinasedomäne kodierende Nukleotidsequenz wurde durch PCR unter Verwendung von aus HUVEC-Zellen isolierten cDNA-Bänken erzeugt.
Eine Poly-His₆ kodierende Nukleotidsequenz wurde 5' zur Nukleotidregion, welche die gesamte intrazelluläre Kinasedomäne von humanem Flt-1 (Aminosäuren 786– 1338) kodiert, angeordnet. Die Histidinreste ermöglichten die Affinitätsreinigung des Proteins in einer Weise, die zu der für KDR (Abschnitt B.) und ZAP70 (Abschnitt F.) analog war. SF-9-Insektenzellen wurden bei einer Multiplizität von 0,5 infiziert und 48 Stunden nach Infektion geerntet.
E. Quellen für Lck- und EGFR-Tyrosinkinasen
Lck oder verkürzte Formen von Lck waren kommerziell erhältlich (z. B. Upstate Biotechnology Ind., Saranac Lake, NY oder Santa Crus Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) oder wurden aus bekannten natürlichen oder rekombinanten Quellen unter Verwendung konventioneller Methoden gereinigt. EGFR wurde von Sigma (Cat #E-3641; 500 Einheiten/50 μl) und der EGF-Ligand von Oncogene Research Products/Calbiochem (Cat # PF011-100) erworben.
F. Produktion der ZAP70-Tyrosinkinase
Es wurde der baculovirale Expressionsvektor pVL1393 (PharMingen, Los Angeles, CA) verwendet. Eine Poly-His₆ kodierende Nukleotidsequenz wurde 5' zur Nukleotidregion, welche das gesamte ZAP70 (Aminosäuren 1-619) kodiert, angeordnet. Die Nukleotidsequenz, welche die ZAP70 kodierende Region kodiert, wurde durch PCR unter Verwendung von aus immortalisierten Jurkat-T-Zellen isolierten cDNA-Bänken erzeugt. Die Histidinreste ermöglichten die Affinitätsreinigung des Proteins. Die LVPRGS-Brücke stellte eine Erkennungssequenz für die proteolytische Spaltung durch Thrombin dar, wodurch die Entfernung des Affinitätstags aus dem Enzym ermöglicht wurde. SF-9-Insektenzellen wurden bei einer Multiplizität von 0,5 infiziert und 48 Stunden nach Infektion geerntet.
G. Reinigung von ZAP70
SF-9-Zellen wurden in einem Puffer lysiert, der 20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin und 1 mM Natriumorthovanadat enthielt. Das lösliche Lysat wurde auf eine chelatisierende Sepharose-Hi-Trap-Säule (Parmacia), die in 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl äquilibriert worden war, aufgetragen. Das Fusionsprotein wurde mit 250 mM Imidazol eluiert. Das gewonnene Enzym wurde in einem Puffer aufbewahrt, der 50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl und 5 mM DTT enthielt.
H. Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)
Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) können verwendet werden, um vorhandene Tyrosinkinase-Aktivität nachzuweisen und zu messen. Die ELISA können in Anlehnung an bekannte Protokolle durchgeführt werden, die beispielsweise in Voller et al., 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" in Manual of Clinical Immunology, 2. Ausgabe, hgg. von Rose and Friedman, S. 359– 371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D. C. beschrieben sind.
Das wiedergegebene Protokoll kann angepasst werden, um die Aktivität in Bezug auf eine spezielle RTK zu bestimmen. Beispielsweise werden bevorzugte Protokolle zur Durchführung der ELISA-Experimente für KDR nachstehend vorgestellt. Es gehört zum fachmännischen Können, diese Protokolle anzupassen, um die Aktivität einer Verbindung für weitere Mitglieder aus der RTK-Familie und Nichtrezeptortyrosinkinasen zu bestimmen. Um die Inhibitorselektivität zu bestimmen, wurde ein universelles PTK-Substrat (z. B. ein Zufallscopolymer aus Poly(Glu₄Tyr), 20000 bis 50000 Molekulargewicht) zusammen mit ATP (typischerweise 5 μM) bei Konzentrationen, die etwa dem zweifachen des scheinbaren Km-Werts entsprechen, im Assay eingesetzt.
KDR-IN VITRO-ELISA
Die folgende Vorgehensweise wurde verwendet, um die inhibierende Wirkung von erfindungsgemäßen Verbindungen auf die KDR-Tyrosinkinase-Aktivität zu bestimmen:
Puffer und Lösungen:

1. PGT : Poly (Glu, Tyr) 4 : 1 Bewahre Pulver bei –20°C auf. Löse das Pulver in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 50 mg/ml Lösung. Bewahre Aliquots von 1 ml bei – 20°C auf. Für die Anfertigung von Platten verdünne auf 250 μg/ml in Gibco-PBS.
2. Reaktionspuffer: 100 mM HEPES, 20 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 5 mM DTT, 0,02% BSA, 200 μM NaVO₄, pH 7, 10
3. ATP: Bewahre Aliquots von 100 mM bei –20°C auf. Verdünne auf 20 μM in Wasser.
4. Waschpuffer: PBS mit 0,1% Tween 20
5. Antikörper-Verdünnungspuffer: 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS
6. TMB-Substrat: Vermische TMB-Substrat und Peroxidlösungen 9 : 1 unmittelbar vor Gebrauch oder verwende K-Blue-Substrat von Neogen
7. Stopplösung: 1 M Phosphorsäure

Vorgehensweise
1. Plattenzubereitung:
Verdünne PGT-Stammlösung (50 mg/ml, gefroren) in PBS auf 250 μg/ml. Verwende modifizierte Hochaffinitäts-ELISA-Platten mit flachen Böden von Corning #25805-96 und gebe 125 μl pro Loch zu. Gebe 125 μl PBS in freie Löcher. Bedecke mit Verschlussband und inkubiere über Nacht bei 37°C. Wasche 1× mit 250 μl Waschpuffer und trockne etwa 2 Stunden bei 37°C in einem Trockeninkubator.
Bewahre die beschichteten Platten in einem verschlossenen Behälter bei 4°C bis zum Gebrauch auf.

2. Tyrosinkinasereaktion:
– Bereite Inhibitorlösungen mit 4×-Konzentration in 20% DMSO in Wasser zu.
– Bereite Reaktionspuffer zu.
– Bereite Enzymlösungen zu, so dass die gewünschten Einheiten in 50 μl vorliegen, z. B. verdünne für KDR auf 1 ng/μl bei insgesamt 50 ng pro Reaktionsloch. Bewahre auf Eis auf.
– Stelle 4×-ATP-Lösungen zu 20 μm aus 100 mM Stammlösungen in Wasser her. Bewahre auf Eis auf.
– Gebe pro Loch 50 μl Enzymlösung zu.
– Gebe 25 μl 4×-Inhibitor zu.
– Gebe 25 μl 4×-ATP für den Inhibitionsassay zu.
– Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur.
– Stoppe Reaktion durch Zugabe von 50 μl 0,05 N HCl pro Loch
– Wasche Platte
** Endkonzentrationen für Reaktion: ATP: 5 μM 5% DMSO
3. Antikörperbindung
– Verdünne 1 mg/ml Aliquot von PY20-HRP (Pierce)-Antikörper auf 50 ng/ml in 0,1% BSA in PBS durch 2-stufige Verdünnung (100×, dann 200×).
– Gebe pro Loch 100 μl Ak zu. Inkubiere 1 Stunde bei Raumtemperatur. Inkubiere 1 Stunde bei 4°C.
– Wasche Platte 4×.
4. Farbreaktion
– Bereite TMB-Substrat zu uns gebe pro Loch 100 μl zu.
– Verfolge OD bei 650 nm bis 0,6 erreicht ist
– Stoppe mit 1 M Phorphorsäure. Schüttle auf Plattenlesegerät.

Die optimalen Inkubationszeiten und Enzymreaktionsbedingungen variieren leicht mit den Enzymzubereitungen und werden empirisch für jede Charge bestimmt.
Analoge Assaybedingungen wurden für Flt-1, Tie-2, EGFR und ZAP70 verwendet. Der für Lck verwendete Reaktionspuffer war 100 mM MOPSO, pH 6,5, 4 mM MnCl₂, 20 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,2% BSA, 200 mM NaVO₄ bei analogen Assay-Bedingungen.
PKC-Kinasequelle
Die katalytische Untereinheit von PKC kann kommerziell bezogen werden (Calbiochem).
PKC-Kinaseassay
Es wurde ein radioaktiver Kinaseassay eingesetzt, wobei man einer veröffentlichten Vorgehensweise folgte (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y., Biochemical and Biophysical Research Communication 3: 166, 1220–1227 (1990). Kurzum, alle Reaktionen wurden in einem Kinasepuffer durchgeführt, der aus 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 100 μM ATP, 8 μM Peptid, 5% DMSO und ³³P ATP (8 Ci/mM) bestand. Verbindung und Enzym wurden in dem Reaktionsbehältnis miteinander vermischt, und die Reaktion wurde durch Zugabe des ATPs und des Substratgemisches initiiert. Im Anschluss an die Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 10 μL Stopppuffer (5 mM ATP in 75 mM Phorphorsäure) wurde ein Teil des Gemisches auf Phosphocellulosefilter gespottet. Die gespotteten Proben wurden dreimal in 75 mM Phosphorsäure bei Raumtemperatur 5 bis 15 Minuten gewaschen. Der Einbau der radioaktiven Markierung wurde durch Flüssigszintillationszählung quantitativ bestimmt.
Östrogenrezeptor-Bindungsassay
Die Bindung von 1 nM radiomarkiertem 17β-Östradiol an den humanen Östrogenrezeptor im Cytosol von MCF-7-Säugerkarzinomzellen wurde im Anschluss an eine 20-stündige Inkubation bei 4°C unter Verwendung der Reaktionsbedingungen von Shein et al., Cancer Res. 45: 4192 (1985) bestimmt. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Cytosolfraktionen mit einer Suspension von dextranbeschichteter Aktivkohle 10 Minuten bei 4°C inkubiert, zentrifugiert, und die Überstände wurden gewonnen. Im Aktivkohleüberstand verbleibende, gebundene Radioaktivität wurde mit einem Szintillationszähler (LS 6000, Beckman) unter Verwendung eines Flüssigszintillationscocktails (Formula 989 Packard) gemessen. Die Verbindungen wurden simultan bei 8 Konzentrationen zweifach ausgetestet, um eine Kompetitionskurve zur Quantifizierung der inhibitorischen Aktivität zu erhalten. Die spezifische Bindung des Radioliganden an den Östrogenrezeptor wurde als der Unterschied zwischen der Gesamtbindung und der nichtspezifischen Bindung, die in Gegenwart eines Überschusses von nichtmarkiertem 17-Östradiol (6 μM) bestimmt worden war, definiert.
Resultate
Die folgenden inhibitorischen Konzentrationen einer repräsentativen Verbindung (Beispiel 4) mit der Strukturformel:
wurden erhalten:
Zusätzlich wurde die folgende inhibitorische Konzentration einer weiteren repräsentativen Verbindung erhalten:
Diese Resultate zeigen, dass erfindungsgemäße und hier beispielhaft belegte Verbindungen eine bemerkenswerte inhibitorische Aktivität für die KDR-Tyrosinkinase besitzen und als KDR-Tyrosinkinaseinhibitoren besonders selektiv sind.
III. Zelluläre RTK-Assays
Die folgenden zellulären Assays können verwendet werden, um die Aktivitäts- und Wirkungsniveaus verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen auf eine oder mehrere der RTKs zu bestimmen. In Anlehnung an dieselben Vorgaben können ähnliche Assays für weitere Tyrosinkinasen entworten werden, wobei man hinlänglich bekannte Techniken verwendet.
A. VEGF-induzierte KDR-Phosphorylierung in humanen Nabelvenenzellen (HUVEC), gemessen mit Western-Blots.

1. HUVEC-Zellen (aus gepoolten Spendern) wurden von Clonetics (San Diego, CA) bezogen und den Herstellerhinweisen entsprechend kultiviert. Nur die frühen Passagen (3–8) wurden für diesen Assay verwendet. Die Zellen wurden in 100-mm-Schälchen (Falcon für Gewebekultur; Becton Dickinson; Plymouth, England) kultiviert, wobei man komplette EBM-Medien (Clonetics) verwendete.
2. Um die inhibitorische Aktivität einer Verbindung zu bewerten, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und jedes Loch von 6-Clusterplatten (Costar; Cambridge, MA) wurde mit 0,5–1,0 × 10⁵ Zellen/Loch beimpft.
3. 3–4 Tage nach dem Beimpfen waren die Platten zu 90–100% konfluent. Es wurde das Medium aus allen Löchern entfernt, die Zellen wurden mit 5–10 ml PBS gewaschen und 18–24 Stunden mit 5 ml EBM-Basismedium ohne zugesetzte Supplementierung (d. h. Serumstarvation) inkubiert.
4. Serielle Verdünnungen von Inhibitoren wurden in 1 ml EBM-Medium (25 μM, 5 μM, oder 1 μM Endkonzentration) zu den Zellen gegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Humaner rekombinanter VEGF₍₁₆₅₎ (R & D Systemes) wurde in 2 ml EBM-Medium dann zu allen Löchern mit einer Endkonzentration von 50 ng/ml gegeben und 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Unbehandelte oder nur mit VEGF behandelte Kontrollzellen wurden verwendet, um den Phosphorylierungshintergrund durch VEGF zu bewerten.
5. Alle Löcher wurden dann mit 5–10 ml kaltem PBS, der 1 mM Natriumorthovanadat (Sigma) enthielt, gespült, und die Zellen wurden lysiert und in 200 μl RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl pH7, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% Natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA), welcher Proteaseinhibitoren (PMSF 1 mM, Aprotinin 1 μg/ml, Pepstatin 1 μg/ml, Leupeptin 1 μg/ml, Na-Vanadat 1 mM, Na-Fluorid 1 mM) und 1 μg/ml Dnase (sämtliche Chemicalien von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthielt, geschabt. Das Lysat wurde bei 14000 UPM 30 Minuten zentrifugiert, um Kerne zu entfernen.
6. Gleiche Mengen Proteine wurden dann durch Zugabe von kaltem (–20°C) Ethanol (2 Volumina) für mindestens 1 Stunde oder maximal über Nacht präzipitiert. Die Pellets wurden in Laemli-Probepuffer, der 5% β-Mercaptoethanol (BioRad; Hercules, CA) enthielt, rekonstituiert und 5 Minuten erwärmt. Die Proteine wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (6%, 1,5 mm Novex, San Diego, CA) aufgelöst und auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung des Novex-Systems transferiert. Nachdem man mit Rinderserumalbumin (3%) blockiert hatte, wurden die Proteine über Nacht mit polyklonalem anti-KDR-Antikörper (C20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Crluz, CA) oder mit monoklonalem anti-Phosphotyrosin-Antikörper (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) bei 4°C ausgetestet. Nachdem man gewaschen und 1 Stunde mit HRP-konjugiertem F(ab)₂von Ziege-anti-Kaninchen- oder Ziege-anti-Maus-IgG inkubiert hatte, wurden die Banden unter Verwendung des Emissionschemilumineszenz (ECL)-Systems (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL) visualisiert.

Resultate
Die folgenden inhibitorischen Konzentrationen einer repräsentativen Verbindung wurden erhalten:
Zusätzlich wurden die folgenden inhibitorischen Konzentrationen einer weiteren repräsentativen Verbindung mit der Strukturformel:
erhalten:
Diese Verbindung zeigte auch Tyrosinkinase-Selektivität.
Diese Resultate zeigen, dass erfindungsgemäße Verbindungen eine bemerkenswerte inhibitorische Aktivität für die VEGF-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung der KDR-Tyrosinkinase in Endothelzellen haben.
B. HUVEC-Mitogenese-Assay
Humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) wurden in kompletten EGM-Medien (endothele Wachstumsmedien, die mit 10% FBS, Hydrocortison, epidermalem Wachstumsfaktor und Rinderhirnextrakt nach den Herstelleranweisungen supplementiert waren) kultiviert. Die Zellen, Medien und Supplementierungen wurden von Clonetics (San Diego, CA) bezogen. Der HUVEG-Mitogenese-Assay wurde verwendet, um die durch VEGF, FGF oder komplette Medien induzierte Inhibierung der Mitogenese zu messen. Die Zellen wurden durch Behandlung mit Trypsin geerntet, einmal gewaschen und in kompletten Medien (CM) bei einer Konzentration von 5000 Zellen/0,15 ml suspendiert. 96-Lochplatten wurden mit den Zellen bei 5000 Zellen/Loch beimpft und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zeilen wurden einmal mit serumfreien Medien (SFM) gewaschen und unter serumfreien Bedingungen 24 Stunden inkubiert. Kontrolllöcher ohne Serummangel wurden während dieser Zeit mit CM kultiviert. Die Testverbindungen wurden als 10 mM Stammlösungen in DMSO zubereitet, in SFM verdünnt und zu den Löchern über einen Konzentrationsbereich (0,005–50 μM Endkonzentration) gegeben. Die Zellen wurden 1 Stunde inkubiert, bevor man 50 ng/ml VEGF oder FGF (R & D Systems, Minneapolis, MN) zugab. Mit kompletten Medien stimulierte Löcher bekamen die Testverbindung und den Stimulus gleichzeitig. Nach 5-stündiger Inkubation gab man 0,5 Ci/Loch tritiummarkiertes Thymidin (Amersham) zu, und die Zellen wurden über Nacht inkubiert. Der Assay wurde gestoppt, indem man die Platten bei –20°C 24 Stunden einfror. Die Platten wurden auf Filtermatten mit einem Tomtec-Erntegerät geerntet und mit einem Betaplate-Flüssigszintillationszähler (Wallac) ausgezählt.
Resultate
Die folgenden inhibitorischen Konzentrationen einer repräsentativen Verbindung wurden erhalten:
Diese Resultate zeigen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen eine bemerkenswerte inhibitorische Aktivität für die VEGF-stimulierte Mitogenese haben.

Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel:
worin Ring A für die tautomeren Strukturen
steht; n für 1, 2 oder 3 steht; Ar für
steht; und R¹, R², R⁴ und R⁵ jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen mit einem Atomgewicht von etwa 19 bis 36, Niederalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Niederalkoxy, Trifluormethyl stehen oder R¹, R² und R⁴, R⁵ jeweils zusammengenommen unabhängig voneinander für Methylendioxy, das an die angrenzenden Kohlenstoffatome gebunden ist, stehen; R³ für Wasserstoff, -COR⁶ oder -SO₂R⁶ steht; und R⁶ für -CH₃ oder R⁶ für -CH₃ oder
steht, worin Y für Wasserstoff, Chlor oder -CH₃ steht, bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung einer Tyrosinkinase-Aktivität.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung in einer enantiomeren Form, in einem Gemisch mit einer oder mehreren weiteren von den Verbindungen, oder sowohl in einer enantiomeren Form als auch in einem Gemisch mit einer oder mehreren weiteren von den Verbindungen vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Tyrosinkinase entweder eine rezeptorartige Tyrosinkinase oder eine nicht-rezeptorartige Tyrosinkinase ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Tyrosinkinase ausgewählt ist unter KDR, flt-1, TIE-2, Lck, Src, fyn und yes.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei sich die Aktivität der Tyrosinkinase auf die Angiogenese auswirkt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Inhibition der Tyrosinkinase antiangiogen ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Inhibition der Tyrosinkinase die Progredienz eines Erkrankungszustandes inhibiert, der ausgewählt ist unter hyperproliferativen Erkrankungen, Arthritis, Atherosklerose, Psoriasis, Hämangiomen, myokardialer Angiogenese, koronaren und cerebralen Kollateralen, Angiogenese ischämischer Gliedmaßen, kornealen Erkrankungen, Rubeose, neovaskulärem Glaukom, Makuladegeneration, Wundheilung, mit gastrointestinalem Helicobacter-Ulcus in Verbindung stehenden Erkrankungen, Frakturen, diabetischer Retinopathie und Katzenkratzkrankheit.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei sich die Aktivität der Tyrosinkinase auf die vaskuläre Hyperpermeabilität auswirkt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin n 1 ist; R³ Wasserstoff ist; R¹ ausgewählt ist unter Wasserstoff, Methoxy und Fluor; und Ar ausgewählt ist unter 2-Thienyl, 3-Thienyl und 2-Furanyl.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung folgende ist: