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CN1268333C - 用于治疗疾病的二氢吲哚酮化合物 - Google Patents

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CN1268333C CNB961906162A CN96190616A CN1268333C CN 1268333 C CN1268333 C CN 1268333C CN B961906162 A CNB961906162 A CN B961906162A CN 96190616 A CN96190616 A CN 96190616A CN 1268333 C CN1268333 C CN 1268333C
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Abstract

本发明涉及能调制酪氨酸激酶信号转导的有机分子、以便调节、调制和/或抑制反常的细胞增生。

Description

用于治疗疾病的二氢吲哚酮化合物
本申请是1995年6月7日提交的美国专利申请08/485,323的部分继续申请，该申请在本文中全文引用作为参考。
1.引言
本发明涉及能调制、调节和/或抑制酪氨酸激酶信号转导的新化合物。本发明还涉及调节、调制或抑制酪氨酸激酶(不管是受体型还是非受体型)的方法，用于预防和/或治疗与失调的酪氨酸激酶信号转导有关的病症，包括细胞增生和代谢失调。
2.发明的背景
蛋白酪氨酸激酶(PTK)包括很多不同类型具有酶活性的蛋白质。PTK在控制细胞生长和分化中起重要作用〔关于评述，见Schlessinger和Ullrich，1992，神经元(Neuron)9：383-391〕。
例如，受体酪氨酸激酶介导的信号转导是由与一种特异的生长因子(配体)的胞外相互作用诱发的，随后经过受体二聚作用，内在蛋白酪氨酸激酶活性的瞬时刺激和磷酸化。由此产生了供胞内信号转导分子用的结合位，并导致与各式各样促进适当的细胞响应(例如细胞分裂、对胞外微环境的代谢作用)的胞质信号分子形成复合物，参见Schlessinger和Ullrich，1992，神经元(Neuron) 9：383-391。
关于受体酪氨酸激酶，也已经指出，酪氨酸磷酸化部位对于信号分子的SH2(src同源性)域起着高亲合性结合位的作用。Fantl等，1992，细胞(cell) 69：413-423；Songyang等，1994，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol3.) 14：2777-2785；Songyang等，1993，细胞(Cell) 72：767-778；以及Koch等，1991，科学(Science)252：668-678。已鉴别了几种与受体酪氨酸激酶(RTK)结合的胞内底物蛋白质。它们可以分成两大类：(1)有催化域的底物；和(2)缺乏这种域、但是起衔接子作用并且与催化活性分子相结合的底物。Songyang等，1993，细胞(Cell) 72：767-778。受体或蛋白质与它们的底物的SH2域之间的相互作用的特异性是由直接包围磷酸化的酪氨酸基的氨基酸基决定的。SH2域和围绕特定受体上磷酸酪氨酸残基的氨基酸序列之间结合亲合性的差别是与观察到的它们的底物磷酸化型式不同相一致的。Songyang等，1993，细胞(Cell) 72：767-778。这些观察指出，各个受体酪氨酸激酶的功能不仅由其表达型式和配体可利用率决定，而且也由被特定受体活化的下游信号转导通道的排列决定。因此，磷酸化提供了一个重要的调节步骤，它决定由特定的生长因子受体以及分化因子受体所征集的信号通道的选择性。
已经指出，PTK中的异常表达或突变会导致失控的细胞增生(例如噁性肿瘤生长)或者关键发育过程中的缺陷。因此，生物医学界曾投入很大的力量来发现PTK家族成员的特异生物作用，它们在分化过程中的作用，它们与肿瘤发生及其它疾病的关系，它们的信号转导通道在配体刺激时被活化的生物化学机制，以及新药物的研制。
酪氨酸激酶可以是受体型(有胞外的、跨膜的和胞内的域)或是非受体型(完全是胞内的)。
受体型酪氨酸激酶。这种RTKs包括很多族具有各式各样生物活性的跨膜受体。PTK的内在功能在与配体结合时被活化，这造成了受体的磷酸化和多细胞底物，随后产生了各式各样的细胞响应。Ullrich和Schlessinger，1990，细胞(Cell) 61：203-212。
目前，至少已鉴别出19种不同的RTK亚族。一种称为HER亚族的RTK亚族据信由EGFR、HER 2、HER 3和HER 4组成。对于受体的HER亚族的配体包括上皮生长因子(EGF)、TGF-α、双调蛋白、HB-EGF、β-动物纤维素和heregulin。
称作胰岛素亚族的第二族RTK由INS-R、IGF-1R和IR-R构成。第三族“PDGF”亚族包括PDGF  α和β受体、CSFIR、c-kit和FLK-II。另一个RTKs亚族称为FLK族，据认为是由激酶插入域-受体胎肝激酶-1(KDR/FLK-1)、胎肝激酶4(FLK-4)和类fms的酶氨酸激酶1(flt-1)组成的。这些受体最初都被认为是造血生长因子的受体。另外两个亚族的RTKs被称作FGF受体族(FGFR 1，FGFR 2，FGFR 3和FGFR 4)和Met亚族(C-Met和Ron)。
因为PDGF亚族和FLK亚族相似，所以这两个亚族常常一起讨论。已知的RTK亚族是由plowman等确定的〔1994，药物新闻与展望(DN&P)， 7(6)：334-339〕，该文在本申请中引用作为参考。
非受体型酪氨酸激酶。非受体型酪氨酸激酶代表一批缺乏胞外和跨膜序列的细胞酶。目前，已鉴定出24种以上单独的非受体酪氨酸激酶，包括11个亚族(Src，Frk，Btx，Csk，Abl，Zap 70，Fes/Fps，Fak，Jak，Ack和LIMK)。目前，非受体酪氨酸激酶的Src亚族构成最大数目的PTK，包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk。Src亚族酶与肿瘤发生有关。在Bolen，1993，癌基因(Oncogene)8：2025-2031中提供了对非受体酪氨酸激酶的更详细的讨论，该文在本申请中引用作为参考。
很多酪氨酸激酶，不管是受体或非受体酪氨酸激酶，都被发现与导致致病状态(包括癌、牛皮癣和超免疫响应)的细胞信号发送通道有关。
调制PTK的化合物的研制。鉴于所推测的PTK在控制、调节和调制与细胞反常增生有关的疾病和失调中的细胞增生方面的重要性，已经作了许多努力来鉴定受体和非受体酪氨酸激酶“抑制剂”，其中使用了各种方法，包括使用突变型配体(美国专利申请4,966,849)，可溶性受体和抗体〔专利申请WO 94/10202；Kendall和Thomas，1994，美国国家科学院院报(Proc.Nat’I Acad.Sci) 90：10705-09；Kim：等，1993，自然杂志(Nature) 362：841-844〕，核糖核酸(RNA)配体〔Jellinek等，生物化学(Biochemistry) 33：10450-10456；Takano等，1993，细胞分子生物学(Mol.Bio.Cell) 4：358A；Kinsella等，1992，实验细胞研究(Exp.Cell.Res.) 199：56-62；Wright等，1992，细胞物理学杂志(J.Cellular Phys.) 152：448-457〕，以及酪氨酸激酶抑制剂〔WO 94/03427；WO 92/21660；WO91/15495；WO 94/14808；美国专利5,330,992；Nariani等，1994，美国癌症研究学会会议录(Proc.Am.Assoc.Cancer Res.) 35：2268〕。
最近，曾试图鉴定起酪氨酸激酶抑制剂作用的小分子。例如，双单环的、双环的或杂环的芳族化合物(PCT WO 92/20642)，亚乙烯基-氮杂吲哚衍生物(PCT WO 94/14808)和1-环丙基-4-吡啶基-喹诺酮(美国专利5,330,992)已普遍被认为是酪氨酸激酶抑制剂。苯乙烯基化合物(美国专利5,217,999)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(美国专利5,320,606)、某些喹唑啉衍生物(欧洲专利申请0 566 266A1)、硒基吲哚和硒醚(PCT WO 94/03427)、三环多羟基化合物(PCT WO 92/21660)和苄基膦酸化合物(PCT WO 91/15495)曾被提到是作为酪氨酸激酶抑制剂使用的化合物，可用于治疗癌症。
因此很希望能鉴定出有效的小分子化合物，它们通过调制受体和非受体酪氨酸激酶的活性能特异地抑制信号转导，从而调节和调制反常的或不适当的细胞增生，这也是本发明的目的。
3.发明概要
本发明涉及能够调制、调节和/或抑制酪氨酸激酶信号转导的有机分子。这些化合物可用于治疗与失调的TKS转导有关的疾病，包括细胞增生病，例如癌、动脉粥样硬化、关节炎和再狭窄，以及代谢性疾病，例如糖尿病。
在一项说明性的实施方案中，本发明化合物是式(I)化合物及其可药用的盐：
其中R1是H或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
R3′、R5′和R6′各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
X是Br、Cl、F或I；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在另一项说明性实施方案中，本发明化合物是式(II)化合物及其可药用的盐。
其中R1是H或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
R2′、R3′、R5′和R6′各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
Ra和Rb各自独立地选自包括H、烷基和C(O)R，或者NRaRb一起可以是一个3-8原子的杂环，它可任选地在一个或多个位置上被以下基团取代：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
X是Br、Cl、F或I；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在另一项说明性实施方案中，本发明化合物是式(III)化合物及其可药用的盐：
Figure C9619061600111
其中R1是H或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
A是一个五元杂环，选自包括噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、2-磺酰呋喃、4-烷基呋喃、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，2，5-噁二唑、1，3，4-噁二唑、1，2，3，4-噁三唑、1，2，3，5-噁三唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，2，5-噻二唑、1，3，4-噻二唑、1，2，3，4-噻三唑、1，2，3，5-噻三唑和四唑，它们可任选地在一个或多个位置上被以下基团取代：烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R或CONRR′；
n是0-3；
X是Br、Cl、F或I；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在又一项说明性实施方案中，本发明化合物是式(IV)化合物及其可药用的盐：
Figure C9619061600121
其中R1是氢或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
R3′、R4′、R5′和R6′各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
X是Br、Cl、F或I；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在最后一项实施方案中，本发明化合物是式(V)化合物及其可药用的盐：
Figure C9619061600131
其中R1是H或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
R2′、R3′、R5′和R6′各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
Z是Br、Cl、F、I、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
本发明还涉及其中含有有效数量的上述式I-V化合物和一种可药用的载体或赋形剂的药物组合物。这类药物组合物据信能通过抑制催化活性、对ATP的亲合性或与底物相互作用能力，调制酪氨酸激酶的信号转导。
更具体地说，本发明的组合物可以用在治疗各种疾病的方法之中，这些疾病包括增生、纤维变性或代谢性疾病，例如癌、纤维化、牛皮癣、动脉粥样硬化、关节炎以及与反常的血管发生和/或血管形成有关的其它疾病，例如糖尿病性视网膜病。
4.发明详述
4.1.定义
“可药用的盐”是指那些保持游离碱的生物效率和性质的盐，它们通过与无机酸的反应得到，这些碱包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
“烷基”是指直链、支链或环状的饱和脂族烃。烷基优选有1-12个碳原子。更为优选的是1-7个碳原子的低级烷基。最好是1-4个碳原子。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。该烷基可以任选地被选自羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2、卤素、N(CH3)2、氨基和SH的一个或多个取代基取代。
“链烯基”是指直链、支链或环状的含有至少一个碳-碳双键的不饱和烃基。链烯基优选含有1-12个碳原子，更优选是1-7个碳原子的低级链烯基。最好是1-4个碳原子。链烯基可以任选地被选自羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2、卤素、N(CH3)2、氨基和SH的一个或多个取代基取代。
“炔基”是指直链、支链或环形的含有至少一个碳-碳三键的不饱和烃基。炔基优选含1-12个碳原子，更优选是1-7个碳原子的低级烃基。最好是1-4个碳原子。烃基可以任选地被选自羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2、卤素、N(CH3)2、氨基和SH的一个或多个取代基取代。
“烷氧基”是指“-O烷基”基团。
“芳基”是指至少有一个环的芳香基团，环上有一个共轭的π电子体系，包括碳环芳基、杂环芳基和双芳基基团。芳基可以任选地用选自卤素、三卤甲基、羟基、SH、OH、NO2、胺、硫醚、氰基、烷氧基、烷基和氨基的一个或多个取代基取代。
“烷芳基”是指与芳基共价结合的烷基。该烷基优选是低级烷基。
“碳环芳基”是指其中的环原子是碳的芳基。
“杂环芳基”是指有1-3个杂原子作为环原子的芳基，其余的环原子是碳。杂原子包括氧、硫和氮。例如，杂环芳基包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等。
“酰胺”是指-C(O)-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。
“硫代酰胺基”是指-C(S)-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。
“胺”是指-N(R′)R″基团，其中R′和R″各自独立地选自烷基、芳基和烷芳基。
“硫醚”是指-S-R，其中R是烷基、芳基或烷芳基。
“磺酰基”是指-S(O)2-R，其中R是芳基、C(CN)＝C-芳基、CN2CN、烷芳基、磺酰胺、NH-烷基、NH-烷芳基或NH-芳基。
4.2.本发明
本发明涉及能够调节和/或调制酪氨酸激酶信号转导、特别是受体和非受体酪氨酸激酶信号转导的化合物。
受体酪氨酸激酶介导的信号转导是由与特异的生长因子(配体)胞外相互作用引发的，随后经过受体二聚作用、内在蛋白酪氨酸激酶活性的瞬时刺激和磷酸化。由此产生了供胞内信号转导分子用的结合位，并导致与促进适当的细胞响应(例如细胞分裂，对胞外环境的代谢作用)。的各式各样的胞质信号分子形成复合物。参见Schlessinger和Ullrich，1992，神经元(Neuron) 9：303-391。
已经指出，生长因子受体中的酪氨酸磷酸化部位对于信号分子的SH2(src同源)域起高度亲合结合位的作用。Fantl等，1992，细胞(Cell)69：413-423；Songyang等，1994，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.) 14：2777-2785；Songyang等，1993，细胞(Cell) 72：767-778；和Koch等，1991，科学(Science) 252：668-678。已鉴定了几种与受体酪氨酸激酶结合的胞内底物蛋白质。它们可以分成两大类：(1)有催化域的底物；和(2)缺乏这种域、但是起衔接子作用并且与催化活性分子结合的底物。Songyang等，1993，细胞(Cell) 72：767-778。受体和它们的底物的SH2域之间相互作用的特异性由直接包围磷酸化酪氨酸残基的氨基酸残基决定。在SH2域和特定受体上围绕磷酸酪氨酸残基的氨基酸序列之间结合亲合性的差别与观察到的它们的底物磷酸化型式的差别相一致。Songyang等，1993，细胞(Cell) 72：767-778。这些观察表明，各受体酪氨酸激酶的功能不仅由它的表达型式和配体可利用性决定，而且也与被特定受体活化的下游信号转导通道的排列有关。因此，磷酸化提供了一个重要的调节步骤，它决定了由特异的生长因子受体以及分化因子受体征集的信号通道的选择性。
酪氨酸激酶信号转导，除其它响应之外，还引起细胞增生、分化和代谢。反常的细胞增生会造成一系列的失调和疾病，包括瘤的形成，例如癌、肉瘤、白血病、恶性胶质瘤、血管瘤，牛皮癣，动脉粥样硬化，关节炎和糖尿病性视网膜病(或者其它与失控的血管生成和/或血管发生有关的疾病)。
因此，本发明涉及通过影响RTK和/或非受体酪氨酸激酶的酶活性和干扰这类蛋白质转导的信号对酪氨酸激酶信号转导进行调节、调制和/或抑制的化合物。更具体地说，本发明涉及能调节、调制和/或抑制受体和/或非受体酪氨酸激酶介导的信号转导通道的化合物，以此作为治疗的方法，用于治疗多种固态肿瘤，包括但不限于癌、肉瘤、白血病、成红细胞瘤、恶性胶质瘤、脑脊膜瘤、星形细胞瘤、黑素瘤和成肌细胞瘤。适应症可以包括但不限于：脑癌、膀胱癌、卵巢癌、肠癌、胰腺癌、结肠癌、血癌、肺癌和骨癌。
4.3.化合物
在一项实施方案中，本发明提供了式(I)化合物及其可药用的盐：
其中R1是H或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
R3′、R5′和R6′各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
X是Br、Cl、F或I；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在式I化合物的优选的实施方案中，R3′选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、芳基和OR，其中R是H、烷基或芳基；R5′选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、芳基和OR，其中R是H、烷基或芳基。
一种特别优选的式I化合物是3-(2-氯-4-羟基亚苄基)-2-二氢吲哚酮。
在另一项实施方案中，本发明提供了式(II)化合物及其可药用的盐。
Figure C9619061600171
其中R1是氢或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
R2′、R3′、R5′和R6′各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
Ra和Rb各自独立地选自H、烷基和C(O)R，或者NRaRb一起可以是一个3-8个原子的杂环，该杂环可任选地在一个或多个位置上被以下基团取代：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R或CONRR′；
n是0-3；
X是Br、Cl、F或I；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在式II化合物的优选实施方案中，R3′选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、芳基和OR，其中R是氢、烷基或芳基；R5′是选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、芳基和OR，其中R是H、烷基或芳基。
一种特别优选的式II化合物是3-(4-二甲基氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮。
在又一项实施方案中，本发明提供了式(III)化合物及其可药用的盐：
其中R1是H或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
A是一个五元杂芳环，选自噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、2-磺酰呋喃、4-烷基呋喃、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，2，5-噁二唑、1，3，4-噁二唑、1，2，3，4-噁三唑、1，2，3，5-噁三唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，2，5-噻二唑、1，3，4-噻二唑、1，2，3，4-噻三唑、1，2，3，5-噻三唑和四唑，它们可以任选地在一个或多个位置上被以下基团取代：烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R或CONRR′；
n是0-3；
X是Br、Cl、F或I；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在本发明的优选实施方案中，式III化合物是3-[(2，3-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮。
在另一项实施方案中，本发明提供了式(IV)化合物及其可药用的盐：
Figure C9619061600191
其中R1是H或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
R3′、R4′、R5′和R6′各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
X是Br、Cl、F或I；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在式IV化合物的优选实施方案中，R3′选自包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、芳基和OR，其中R是H、烷基或芳基；R5′选自包括氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、芳基和OR，其中R是H、烷基或芳基。
一种特别优选的式IV化合物是3-(2-乙氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮。
在最后一项实施方案中，本发明提供了式(V)化合物及其可药用的盐：
其中R1是H或烷基；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
R2′、R3′、R5′和R6′各自独立地选自包括以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
Z是Br、Cl、F、I、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；
R是H、烷基或芳基；
R′是H、烷基或芳基。
在式V化合物的优选实施方案中，R3′选自包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、芳基和OR，其中R是H、烷基或芳基；R5′选自包括氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、芳基和OR，其中R是H、烷基或芳基。
一种特别优选的式V化合物是3-(4-溴亚苄基)-2-二氢吲哚酮。
本文中提到的化学式可以显示互变异构或结构异构体现象。例如本文中提到的化合物可以围绕连接二氢吲哚酮3-取代基与二氢吲哚酮环的双键采取顺式或反式构型，或者可以是顺式和反式异构体的混合物。因为本说明书中画出的化学式只能代表一种可能的互变异构或结构异构体形式，所以应当理解，本发明包括能够调节、抑制和/或调制酪氨酸激酶信号转导或细胞增生的所有互变异构或结构异构形式或它们的混合物，不受在所画出的化学式中采用的任何一种互变异构或结构异构形式的限制。
除了上述化合物及其可药用的盐以外，本发明还涉及具有调制和/或调节细胞增生能力的适用的溶剂化及非溶剂化形式(例如水合物形式)的化合物。
本文所叙述的化合物可以用已知可用于制备化学上相关化合物的任何方法制备。在实施例中示例说明了合适的方法。必要的起始物可以通过有机化学的标准步骤得到。
作为影响受体酪氨酸激酶介导的信号转导的试剂，各个化合物的有关活性和效力可以用现成的技术测定。最好是对化合物进行一系列筛选以确定化合物调制、调节和/或抑制细胞增生的能力。这些筛选按进行的次序包括生物化学试验、细胞生长试验和体内试验。
4.4.适应症
本申请中介绍的化合物可用于治疗与失调的酪氨酸激酶信号转导有关的疾病，包括细胞增生病、纤维变性病和代谢失调。
可以用本发明的治疗或进一步研究的细胞增生病包括癌、血管增生病和肾小球膜细胞增生病。
血管增生病是指通常会造成血管反常增生的血管生成和血管发生失调。血管的形成和伸展，或者说血管发生与血管形成，在许多生理过程中起重要作用，例如胚胎发育、黄体形成、伤口愈合和器官再生等。它们还在癌症发展中起关键性的作用。血管增生病的其它例子包括关节炎，此时毛细血管侵入关节并破坏软骨，以及眼部疾病，例如糖尿病性视网膜病，此时视网膜内新的毛细血管侵入玻璃体，造成出血和失明。相反，与血管的皱缩、缩小或闭塞有关的疾病，例如血管再狭窄，也包含在内。
纤维变性病是指胞外基质的反常形成。纤维变性病的实例包括肝硬变和肾小球膜细胞增生病。肝硬变的特征是胞外基质成分增加，结果形成肝疤。肝硬变会造成诸如慢性间质性肝炎等疾病。产生肝疤的胞外基质增多还会由病毒感染(例如肝炎)引起。脂细胞似乎在肝硬变中起主要作用。所涉及的其它的纤维变性病包括动脉粥样硬化(见后文)。
肾小球膜细胞增生病是指由于肾小球膜细胞反常增生引起的病症。肾小球膜细胞增生病包括各种人类肾病，例如肾小球性肾炎、糖尿病型肾病、恶性肾硬化、血栓形成微血管综合症、移植排异反应和肾小球病。曾指出PDGF-R与肾小球膜细胞增生的保持有关。Floege等，1993，国际肾杂志(Kidney International) 43：47S-54S。
PTKs与这种细胞增生病有关。例如，某些族的RTK与癌症的发展有关。这些受体中的一些，例如EGFR[Tuzi等，1991，英国癌病杂志(Br.J.Cancer) 63：227-233；Torp等，1992，斯堪第纳维亚病理微生物学和免疫学学报(APMIS) 100：713-719]、HER2/neu[Slamon等，1989，科学杂志(Science) 244：707-712]和PDGF-R[Kumabe等，1992，癌基因(Oncogene) 7：627-633]在很多肿瘤中被超量表达和/或被自分泌环持续活化。事实上，在最常见和最严重的癌症中都显示出这些受体超量表达[Akbasak和Suner-akbasak等，1992，神经科学杂志(J.Neurol.sci.) 111：119-133；Dickson等，1992，癌症治疗研究(Cancer Treatment Res.) 61：249-273；Korc等，1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.) 90：1352-1360]和自分泌环[Lee和Donoghue，1992，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.) 188：1057-1070；Korc等，前述文章；Akbasak和Suner-Akbasak等，前述文章]。例如，EGFR受体与鳞状细胞癌、星形细胞瘤、恶性胶质瘤、头颈癌、肺癌和膀胱癌有关。HER2与乳房癌、卵巢癌、肠癌、肺癌、胰腺癌及膀胱癌有关。PDGF-R与恶性胶质瘤、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和前列腺癌有关。RTK C-met通常与肝癌发生相联系，因此与肝细胞癌有关。另外，C-met与恶性肿瘤的形成有关。更具体地说，RTK C-met除其它癌之外，还与结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和肠癌、白血病和淋巴瘤有关。此外，已在霍奇金氏病、伯基特氏病和淋巴瘤细胞系的患者中检测出C-met基因的超量表达。
IGF-IR除了与营养载体和II型糖尿病有关之外，还与几种类型的癌有关。例如，IGF-I已被暗示是几类肿瘤的自分泌生长的激发剂，例如人类乳房癌癌细胞[Arteaga等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)84：1418-1423]和肺肿瘤小细胞[Nacauley等，1990，癌症研究(Cancer Res.) 50：2511-2517]。此外，IGF-I整体地卷入神经系统的正常生长和分化，似乎是人类神经胶质瘤的自分泌激发剂。Sandberg-Nordqvist等，1993，癌症研究(Cancer Res.) 53：2475-2478。IGF-IR及其配位体在细胞增生中的重要性还由于培养基中的很多类型的细胞(成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞、骨髓细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨髓干细胞)受IGF-I激发而生长这一事实而得到进一步的支持。Goldring和Goldring，1991，真核细胞基因表达[Eukaryotic Gene Expression) 1：301-326]。Baserge在一系列近来发表的文章中甚至提出IGF-I-R在转化机制中起主要作用，因此对于很大一类人类恶性肿瘤的医疗干预而言，它可能是一个优选的目标。Baserga，1995，癌症研究(Cancer Res.) 55：249-252；Baserga，1994，细胞(Cell) 79：927-930；Coppola等，1994，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.) 14：4588-4595。
但是，RTKs的异常与疾病之间的联系不限于癌症。例如，RTKs与代谢性疾病如牛皮癣、糖尿病、伤口愈合、炎症和神经变性病有关。例如，在角膜和皮肤伤口愈合中需要EGF-R。在II型糖尿病中已显示胰岛素-R和IGF-1R的缺陷。Plowman等(1994)在药物新闻与展望(DN  &P) 7：334-339中陈述了具体的RTKs及其治疗适应症之间的更完整的关系。
不仅受体型酪氨酸激酶，而且很多细胞酪氨酸激酶(CTK)，包括src、abl、fps、yes、fyn、lyn、lck、blk、hck、fgr、yrk[Bolen等人的评述，1992，美国联邦实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)6：3403-3409]都与增生性和代谢性信号转导通道有关，因此都会在本发明的适应症中涉及。例如，突变的src(v-src)已证实是鸡的一种癌基困蛋白质(pp60v-stc)。另外，它的细胞同系物-原癌基因pp60c-src传递很多受体的致癌信号。例如，EGF-R或HER 2/neu在肿瘤中的超量表达导致pp 0c-src的组成型活化，这是恶性细胞的特征，正常细胞中不存在。另一方面，鼠的c-src表达的缺陷表现出骨硬化表型，这表明了c-src在破骨细胞功能中的关键性参与以及与有关病症的可能的联系。类似地，Zap 70与T-细胞信号传导有关。
再者，鉴定CTK调制化合物以便加强甚至增效以RTK为目标的阻断剂是本发明的一个方面。
最后，RTK和非受体型激酶都与超免疫疾病有关。
4.5.药物制剂和用药途径
本文中所述的化合物本身可以用于人类患者，或者以和合适的载体或赋形剂混合的药物组合物的形式给药。本申请化合物的配制和施用方法可以在“Remington药剂科学”(Remington’s PharmaceuticalSciences)，Mack出版公司，Easton.PA，最新一版中查到。
4.5.1.给药途径
合适的给药途径可以包括例如口服、直肠、透过粘膜或经肠给药，非肠道释放，包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接在心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，可以以局部而非全身的方式施用该化合物，例如直接向固态肿瘤内注射该化合物，通常是以储存制剂或长期释放制剂的形式。
另外，可以以靶向药物释放体系的形式用药，例如，以用对肿瘤有特异性的抗体包覆的脂质体的形式。该脂质体将以肿瘤为目标并被肿瘤选择性地吸收。
4.5.2.组合物/制剂
本发明的药物组合物可以按照本身已知的方式制造，例如，利用常规的混合、溶解、制粒、包糖衣、研磨、乳化、胶囊化、夹裹或冷冻干燥等方法。
因此，根据本发明使用的药物组合物可以按照常规方式用一种或多种生理上可接受的载体配制，载体中含有有助于将活性化合物加工成能药用的制剂的赋形剂和辅助剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。
对于注射液，本发明的药剂可以配制成水溶液，最好是在生理上相容的缓冲剂中，例如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于透过粘膜给药，制剂中使用适合要透过的屏障的渗透剂。这些渗透剂一般是工艺中已知的。
对于口服给药，通过将活性化合物与工艺上熟知的可药用的载体混合，容易配制化合物。这些载体能够使本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，用于要治疗的患者口服摄取。口服的药物制剂可以用固体赋形剂得到，可任选地研磨所形成的混合物，在必要时加入合适的辅助剂之后，将颗粒混合物加工，得到片剂或糖锭片心。合适的赋形剂具体地有填料，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖锭片心配有合适的涂层。为此，可以使用浓的糖溶液，其中可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡啶烷酮、卡波姆胶、聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液，以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖锭涂层中加入着色剂或色素，以便鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可用于口服的药物制剂包括用明胶制成的压出式胶囊，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制作的软的密封胶囊。推合式胶囊可含有活性组分和与之混合的填料，例如乳糖、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)，以及任选加入的稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，还可以加入稳定剂。所有用于口服的制剂均应是适合口服的剂量。
对于经颊用药，该组合物可以采取按常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于吸入式给药，根据本发明使用的化合物最适宜以气溶胶喷雾的形式从压力容器或喷雾器中释放出来，使用合适的喷射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它的合适气体。在加压气溶胶的情形，剂量单位可以通过装备一个阀门以释放计量数量来确定。对于在吸入器或吹药器中使用的例如明胶的胶囊和药筒，可以配制成装有化合物和合适粉末基料(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
该化合物可以配制成用于经注射非肠道给药，例如快速浓注或者连续输注。用于注射的制剂可以是单位剂量形式，例如在安瓿瓶中或在多剂量容器中，同时加入防腐剂。该组合物可以采取在油质或水基载体中的悬浮液、溶液或乳状液的形式，而且可以含有配制助剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于非肠道给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以配制成合适的油质注射用悬浮液。合适的亲油性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)，或脂质体。水基注射悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素纳、山梨醇或葡聚糖。悬浮液中还可以任选地含有合适的稳定剂或者提高化合物溶解度的试剂，以便能制备高浓度的溶液。
或者，活性组分可以是粉末形式，用于在使用前与合适的载体(例如灭菌的无热原质的水)配合。
化合物也可以配制成直肠组合物，例如栓剂或保留式灌肠剂，其中含有例如常规的栓剂基料，如可可脂或其它的甘油酯。
除了上述的制剂之外，化合物还可以配制成储存制剂。这种长效制剂可以以给药方式(例如皮下或肌内)或肌内注射的方式给药。例如，化合物可以与合适的聚合物或疏水性物质(如在可用的油中的乳状液)或者离子交换树脂一起配制，或者以几乎不溶的衍生物(例如几乎不溶的盐)的形式配制。
用于本发明疏水性化合物的一种药物载体是含有苯甲醇、非极性表面活性剂、与水混溶的有机聚合物和水相的共溶剂体系。共溶剂体系可以是VPD共溶剂体系。VPD是3％w/v的苯甲醇、8％w/v的非极性表面活性剂吐温80和65％w/v聚乙二醇300的溶液，其它体积用无水乙醇补足。VPD助溶剂体系(VPD：5W)由用5％的葡聚糖水溶液按1∶1稀释VPD构成。这种共溶剂体系能充分溶解疏水性化合物，而在全身性用药时本身产生的毒性很低。当然，共溶剂体系的比例可以很大变化而不破坏其溶解性和毒性特点。另外，共溶剂组分的本体可以改变：例如，可以使用其它的低毒性非极性表面活性剂代替吐温80；聚乙二醇的级分大小可以改变；可以用其它的生物相容的聚合物代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；还可以用其它的糖或多糖代替葡萄糖。
或者，可以使用其它的疏水性药物化合物释放体系。脂质体和乳状液是众所周知的用于疏水性药物的释放介质或载体。某些有机溶剂如二甲基亚砜也可以使用，虽然经常要以毒性较大为代价。另外，这些化合物可以用持久释放的体系来输运，例如在固体疏水性聚合物的半透性基质中装有治疗药剂。已经研制出各式各样的持久释放的物质，这是本领域技术人员所熟知的。持久释放的胶囊根据其化学本质可以释放化合物几周到100天以上。根据治疗药剂的化学本质和生物稳定性，可以使用辅助的方法用于稳定蛋白质。
药物组合物中还可以含有合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇等聚合物。
很多本发明的PTK调制化合物可以与药学上相容的反离子形成盐。药学上相容的盐可以由许多种酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、丁二酸等。这些盐在水基溶剂或者是相应的游离碱形式的其它质子溶剂中往往更易溶解。
4.5.3.有效剂量
适合用于本发明的药物组合物包括其中装有能达到预定目的有效数量的活性组分的组合物。更具体地说，治疗有效数量是指能够防止、减轻或改善所治疗对象的疾病症状或延长其存活期的化合物数量。治疗有效数量的确定是本领域技术人员完全可以作到的，尤其是根据本发明提供的详细说明。
对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养试验估计。例如，可以对模型动物配制一个剂量，以便使达到的循环浓度范围将从细胞培养中测定的IC50(即，试验化合物达到对PTK活性半峰抑制时的浓度)包括在内。这些信息可以用来更准确地确定人的适用剂量。
本申请中提到的化合物的毒性和治疗效力可以用在细胞培养物或实验动物中的标准药学步骤，例如用于测定LD50(使群体致死50％的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)的步骤来确定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以用LD50和ED50之比表示。高治疗指数的化合物是理想的。由这些细胞培养试验和动物研究中得到的数据可以用来配制一定范围的人用剂量。这些化合物的给药量最好是在包括了ED50而又很小或者无毒性的某个循环浓度范围之内。给药量可以在此范围内根据所用的剂量形式和给药途径而变。准确的配方、给药途径和剂量可以由各医师根据患者的状况选择。(例如见Fingl等，1975，在“治疗的药学基础”(The Pharmacological Basis of Therapeutics)一书第一章第一页)。
给药量和间隔可以个别调节以便使活性部分的血浆含量足以保持激酶调制作用，或最低有效浓度(MEC)。MEC将随各化合物而变，但是可以从体外试验数据估算；例如，使用本文叙述的试验方法得到的为实现抑制50-90％激酶所需的浓度。为达到MEC所必需的剂量取决于个体特点和给药途径。但是，可以用HPLC分析或生物鉴定来测定血浆浓度。
给药间隔也可以用MEC值确定。化合物的用药方案应该使血浆浓度在10-90％的时间内优选在30-90％时间内、最好在50-90％时间内保持高于MEC。
在局部用药或选择性吸收的情形，药物的有效局部浓度可以与血浆浓度无关。
施用的组合物数量当然取决于要治疗的对象，治疗对象的体重，疾病的严重程度，用药方式和主治医师的判断。
4.5.4.包装
如果需要，组合物可以装在包装内或分配装置内，装置中可以含有一单位或多单位剂量形式的活性组分。上述包装可以由例如金属或塑料箔片构成，例如泡囊包装。包装或分配装置可以附有服用说明。也可以将组合物配制成含有配制在相容的药物载体中的化合物，放在合适的容器内，标明用于治疗所指出的病症。标在标干上的合适的病症可以包括治疗肿瘤，抑制血管生成，治疗纤维变性、糖尿病等。
5.实施例：化合物合成
本发明化合物可以用已知技术合成。以下列出了用于合成本发明要求的化合物的优选方法。
5.1.3-取代的-2-二氢吲哚酮类似物的一般合成方法
以下的一般方法用于合成本发明的3-取代的-2-二氢吲哚化合物
5.1.1.方法A
将合适的羟吲哚(2-二氢吲哚酮)(1当量)、合适的醛(1.2当量)和哌啶(0.1当量)在乙醇(1-2ml/1mol羟吲哚)的反应混合物在90℃搅拌3-5小时。冷却后将沉淀滤出，用冷乙醇洗，干燥后得到目标化合物。
5.1.2.方法B
通过Vilsmeier反应制备合适的醛。在0℃下向N，N-二甲基甲酰胺(1.2当量)在1，2-二氯乙烷(2.0ml/1.0mmole起始物)中的溶液里逐滴加入磷酰氯(1.2当量)。撤除冰浴，将反应混合物再搅拌30分钟。向上述溶液中分批加入合适的起始物(1.0当量)，在50-70℃搅拌反应混合物5小时至2天。将反应混合物倒入冰冷的1N氢氧化钠溶液中(混合后pH＝9)，所形成的混合物在室温搅拌1小时。分离出有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗至pH＝7，用无水硫酸钠干燥，蒸发。残余物在硅胶柱上层析，用乙酸乙酯和己烷的溶剂混合物洗脱，得到标题化合物。
合成3-取代的-2-二氢吲哚酮类似物。将合适的羟吲哚(2-二氢吲哚酮)(1当量)、合适的醛(1.2当量)和哌啶(0.1当量)在乙醇(1-2ml/1mmol羟吲哚)中的反应混合物在90℃搅拌3-5小时。冷却后滤出沉淀，用冷的乙醇洗，干燥，得到目标化合物。
5.2.3-亚苄基-2-二氢吲哚酮的合成
合成3-亚苄基-2-二氢吲哚酮的优选方法如下：向137.0mg羟吲哚在2.0ml甲醇中的溶液里加入123.2μl苯甲醛和40μl哌啶。将反应混合物回流3小时，然后在冰水浴中冷却。将所形成的沉淀过滤，用冷甲醇洗，在烘箱内于40℃干燥过夜。用这一方案得到约129.0mg化合物。
5.3.3-[(吡啶-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
合成3-[(吡啶-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的优选方法如下：向138.0mg羟吲哚在2.0ml甲醇中的溶液里加入117.0μl 4-吡啶甲醛和40μl哌啶。将反应混合物回流3小时，在冰水浴中冷却。滤出形成的沉淀，用冷甲醇洗，在烘箱中于40℃干燥过夜，得到134.5mg化合物。
5.4.3-[4-(吗啉-4-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成(方法B)：
4-(吗啉-4-基)苯甲醛。在0℃向15ml N，N-二甲基甲酰胺在50ml 1，2-二氯乙烷中的溶液里逐滴加入10ml磷酰氯。撤除冰浴，再搅拌反应混合物30分钟。向上述溶液中分批加入16.3g 4-苯基吗啉，将反应混合物回流2天。向以上反应混合物中加入三乙胺2.5ml，回流2天。将反应混合物倒入冰冷的1N NaOH溶液中(混合后pH＝9)，所形成的混合物在室温下搅拌1小时。分离出有机层，水层用2×20ml二氯甲烷萃取。合并的有机层用盐水洗至pH＝7，用无水硫酸钠干燥，蒸发。残余物在硅胶柱上层析，用乙酸乙酯和己烷的溶剂混合物洗脱，得到12.95g(68％)白色固体状标题化合物。
3-[4-(吗啉-4-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮。将6.66g羟吲哚、11.50g 4-(吗啉-4-基)苯甲醛和5ml哌啶在50ml乙醇中的反应混合物在90℃搅拌5小时。冷却后将沉淀滤出，用冷乙醇洗，干燥，得到15.0g(98％)黄色固体状标题化合物。
5.5.3-[4-(4-甲酰哌嗪-1-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成(方法B)：
4-(4-甲酰哌嗪-1-基)苯甲醛。在0℃向3.9ml(30mmol)N，N-二甲基甲酰胺在20ml 1，2-二氯乙烷中的溶液里逐滴加入3.0ml(3.9mmol)磷酰氯。撤除冰浴，将反应混合物再搅拌15分钟。向以上溶液中分批加入1-苯基哌嗪(16.0g，10mmol)，将反应混合物在50℃搅拌1小时。将反应混合物倒入冰冷的1N NaOH溶液中，在室温搅拌1小时。分离出有机层，水层用2×20ml的乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗至pH＝7，用无水硫酸钠干燥，蒸发。残余物在硅胶柱上分离，用乙酸乙酯和己烷的混合物洗脱，得到9.0g(41％)浅黄色固体的标题化合物。
3-[4-(4-甲酰哌嗪-1-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮。将133.15mg羟吲哚、228.3mg 4-(哌嗪-1-基)苯甲醛和3滴哌啶在2ml乙醇中的反应混合物在90℃搅拌5小时。冷却后滤出沉淀，用冷乙醇洗，干燥，得到199.5mg(65％)黄色固体状标题化合物。
5.6.3-[4-(哌啶-1-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成(方法B)。
4-(哌啶-1-基)苯甲醛。在0℃向2.3ml(30mmol)N，N-二甲基甲酰胺在10ml  1，2-二氯乙烷中的溶液里逐滴加入2.8ml(30mmol)磷酰氯。撤除冰浴，将反应混合物搅拌15分钟。向上述溶液中分批加入1-苯基哌啶(3.2ml，20mmol)，将反应混合物回流过夜。将反应混合物倒入冰冷的2N氢氧化钠溶液中，在室温搅拌1小时。分离出有机层，水层用2×20ml乙酸乙酯洗。合并的有机层用盐水洗至pH＝7，用无水硫酸钠干燥，蒸发。残余物在硅胶柱上分离，用乙酸乙酯和己烷洗脱，得到1.5g(40％)白色固体状标题化合物。
3-[4-(哌啶-1-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮。
将134.0mg羟吲哚、226.8g 4-(哌啶-1-基)苯甲醛和3滴哌啶在2ml乙醇中的反应混合物在90℃搅拌5小时。冷却后滤出沉淀物，用冷乙醇洗，干燥，得到268.5mg(88％)黄色固体状标题化合物。
5.7.3-[2-氯-4-甲氧亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成
2-氯-4-甲氧基苯甲醛。将1.0g(6.4mmol)2-氯-4-羟基苯甲醛、4.4g(32mmol)碳酸钾和1.4g(9.6mmol)甲基碘在10ml N，N-二甲基甲酰胺中的反应混合物在70℃搅拌2小时，倒入冰水中。滤出沉淀，用水洗，在真空烘箱中于40℃干燥过夜，得到750mg(68％)浅粉红色固体状标题化合物。
3-[2-氯-4-甲氧亚苄基]-2-二氢吲哚酮 将487.9mg(3.7mmol)羟吲哚、750mg(4.3mmol)2-氯-4-甲氧基苯甲醛和4滴哌啶在5ml乙醇中的反应混合物加热至90℃保持2小时，冷却到室温。滤出黄色沉淀，用冷乙醇洗，在40℃于真空烘箱中干燥过夜，得到680.2mg(62％)标题化合物。
5.8.3-[(4-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
将133.0mg羟吲哚、151.2mg 4-甲基噻吩-2-甲醛和3滴哌啶在3ml乙醇中的反应混合物在90℃搅拌3小时。冷却后滤出沉淀，用冷乙醇洗，干燥，得到147.3mg(61％)黄色固体标题化合物。
5.9.3-[(3-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
将133.0mg羟吲哚、130.9mg 3-甲基吡咯-2-甲醛和3滴哌啶在2ml乙醇中的反应混合物在90℃搅拌3小时。冷却后滤出沉淀，用冷乙醇洗，干燥后得到150.9mg(67％)黄色固体状标题化合物。
5.10.3-[(3，4-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3，4-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照杂环化学杂志(J.Heterocyclic Chem.) 13：1145-1147(1976)中所述合成。
4-甲基吡咯-3-羧酸乙酯  在室温将11.86g(0.1mole)巴豆酸乙酯和19.50g(0.1mole)对甲苯磺酰甲胩在500ml 2∶1的乙醚/二甲基亚砜中的溶液逐滴加入到6.8g氢化钠(60％矿物油分散体，0.17mole)在乙醚中的悬浮液里。加完后将反应混合物搅拌30分钟，用400ml水稀释。水层用3×100ml乙醚萃取。合并的醚萃取液通过氧化铝柱，用二氯甲烷洗脱。将有机溶剂蒸发，所形成的残余物在放置时固化。将固体用己烷洗，在40℃于真空烘箱中干燥过夜，得到12.38g(80％)标题化合物。
3，4-二甲基吡咯的制备  在室温和氮气氛下向23g(80mmol)二氢双(2-甲氧乙氧基)铝酸钠的溶液中逐滴加入5g(34mmol)4-甲基吡咯-3-羧酸乙酯在50ml苯中的溶液。将反应混合物搅拌18小时。加入100ml水至该混合物中。分离出有机层，用盐水洗，用无水硫酸钠干燥。除掉溶剂，将残余物蒸馏，得到1.2g(44％)标题化合物。
3，4-二甲基吡咯-2-甲醛的制备  在0℃向0.92ml(12mmole)N，N-二甲基甲酰胺在10ml 1，2-二氯乙烷中的溶液里逐滴加入1.0ml(12mmol)磷酰氯。撤除冰浴，反应混合物再搅拌30分钟。向上述溶液中分批加入3，4-二甲基吡咯(960.0mg，10mmole)，反应混合物在50℃搅拌5小时。将反应混合物倒入冰冷的1N NaOH溶液中(混合后的pH＝9)，所形成的反应混合物在室温搅拌1小时。分离出有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗至pH＝7，用无水硫酸钠干燥，蒸发。将残余物在硅胶柱上层析，用乙酸乙酯和己烷的溶剂混合物洗脱，得到610mg(50％)标题化合物。
3-[(3，4-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮  在90℃将67.0mg(0.5mmole)羟吲哚、73.0mg(0.6mmole)3，4-二甲基吡咯-2-甲醛和2滴哌啶在2ml乙醇中的反应混合物搅拌3小时。冷却后滤出沉淀，用冷乙醇洗，干燥，得到87.7mg(37％)黄色固体状标题化合物。
5.11.3-[(2，4-二甲基-3-乙氧羰基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
在90℃将134.0mg羟吲哚、234.3mg 4-乙氧羰基-3，5-二甲基吡咯-2-甲醛和3滴哌啶在3ml乙醇中的反应混合物搅拌3小时。冷却后滤出沉淀，用冷乙醇洗，干燥，得到244.6mg(79％)黄色固体状标题化合物。
5.12.3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
在90℃将134.0mg羟吲哚、147.8mg 3，5-二甲基吡咯-2-甲醛和3滴哌啶在2ml乙醇中的反应混合物搅拌3小时。冷却后滤出沉淀物，用冷乙醇洗，干燥，得到136.7mg(57％)黄色固体状标题化合物。
5.13.3-[(2-甲硫基噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
在90℃将134.0mg羟吲哚、189.9mg 5-甲硫基噻吩-2-基-2-甲醛和3滴哌啶在2ml乙醇中的反应混合物搅拌3小时。冷却后滤出沉淀，用冷乙醇洗，干燥，得到246.6mg(90％)橙色固体状标题化合物。
5.14.3-[(2-甲基噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
在90℃时将134.0mg羟吲哚、151.42mg 5-甲基噻吩-2-甲醛和3滴哌啶在2ml乙醇中的反应混合物搅拌3小时。冷却后滤出沉淀，用冷乙醇洗，干燥，得到237.8mg(99％)黄色固体状标题化合物。
5.15.3-[(3-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
在90℃时将134.0mg羟吲哚、151.4mg 3-甲基噻吩-2-甲醛和3滴哌啶在2ml乙醇中的反应混合物搅拌3小时。冷却后滤出沉淀，用冷乙醇洗，干燥，得到157.8mg(65％)黄色固体状标题化合物。
5.16.3-(2，5-二甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(2，5-二甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.17.3-(2，3-二甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(2，3-二甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.18.3-(3-溴-6-甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(3-溴-6-甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.19.3-[4-(4-叔丁基羰基-哌嗪-1-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[4-(4-叔丁基羰基-哌嗪-1-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮按照方法B合成。
5.20.3-[(呋喃-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(呋喃-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.21.3-(4-乙酰氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-乙酰氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.22.3-(2-氯-4-羟基亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(2-氯-4-羟基亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.23.3-(4-溴亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-溴亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.24.3-(4-乙酰氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-乙酰氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.25.3-(2-甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(2-甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.26.3-(4-二甲氨基亚苄基)-1-甲基-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-二甲氨基亚苄基)-1-甲基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.27.3-(4-二甲氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-二甲氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮可由Maybridge化学公司得到。
5.28.3-(4-溴亚苄基)-1-甲基-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-溴亚苄基)-1-甲基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.29.5-氯-3-(4-二甲氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-(4-二甲氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.30.3-(4-溴亚苄基)-5-氯-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-溴亚苄基)-5-氯-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.31.3-(4-二乙氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-二乙氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.32.3-(4-二正丁氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-二正丁氨基亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.33.1-甲基-3-[4-(吗啉-4-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成
1-甲基-3-[4-(吗啡-4-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮按照方法B合成。
5.34.5-氯-3-(4-(吗啉-4-基)亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-(4-(吗啉-4-基)亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法B合成。
5.35.3-(3，4-二氯亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(3，4-二氯亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.36.3-(2-乙氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(2-乙氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.37.3-(4-氟亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-氟亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.38.3-[(噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.39.3-(2-甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(2-甲氧亚苄基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.40.3-[2-[3，5-二(三氟甲基)苯基]呋喃-5-基]亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[2-[3，5-二(三氟甲基)苯基]呋喃-5-基]亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.41.2，6-二(二甲氨基)-3，5-二[(二氢吲哚-2-酮-3-亚基)甲基]苯基氰的合成
2，6-二(二甲氨基)-3，5-二[(二氢吲哚-2-酮-3-亚基)甲基]苯基氰按照方法A合成。
5.42.3-[(3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.43.3-[(3，4-二溴-5-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3，4-二溴-5-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法B合成。
5.44.3-[(3，4-二甲基-2-甲酰吡咯-5-基)亚甲基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3，4-二甲基-2-甲酰吡咯-5-基)亚甲基)-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.45.3-{[4-(2-甲氧羰基乙基)-3-甲基吡咯-5-基]亚甲基}-2-二氢吲哚酮的合成
3-{[4-(2-甲氧羰基乙基)-3-甲基吡咯-5-基]亚甲基}-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.46.3-[2-碘呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[2-碘呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.47.3-[(3-乙氧羰基-2-甲基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-乙氧羰基-2-甲基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.48.3-[(3-溴噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-溴噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.49.3-[(2-氯噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(2-氯噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.50.3-[(2，3-二甲基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(2，3-二甲基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.51.3-[(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-硝基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.52.3-[(2-羰基噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(2-羰基噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.53.3-[(2-溴噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(2-溴噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.54.3-[(4-溴噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(4-溴噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.55.3-[(2-磺酰呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮钠盐的合成
3-[(2-磺酰呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮钠盐按照方法A合成。
5.56.3-[(呋喃-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(呋喃-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.57.3-[(2-甲基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(2-甲基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.58.3-[(2-乙基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(2-乙基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.59.3-[(2-硝基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(2-硝基呋喃-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.60.3-[(5-溴呋喃-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-溴呋喃-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.61.3-[(2-乙基噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(2-乙基噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A制备。
5.62.3-[(4，5-二甲基-3-乙基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(4，5-二甲基-3-乙基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.63.3-[(5-乙氧羰基-4-乙氧羰基乙基-3-乙氧羰基甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-乙氧羰基-4-乙氧羰基乙基-3-乙氧羰基甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.64.3-[(5-羧基-3-乙基-4-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-羧基-3-乙基-4-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.65.3-[(3，5-二碘-4-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3，5-二碘-4-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.66.3-[(5-氯-3-甲氧羰基-4-甲氧羰基甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-氯-3-甲氧羰基-4-甲氧羰基甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.67.3-[(3-乙酰基-5-乙氧羰基-4-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-乙酰基-5-乙氧羰基-4-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.68.3-{[1-(3，5-二氯苯基)吡咯-2-基]亚甲基}-2-二氢吲哚酮的合成
3-{[1-(3，5-二氯苯基)吡咯-2-基]亚甲基}-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.69.3-[1-(4-氯苯基)吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[1-(4-氯苯基)吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.70.3-[(4-乙氧羰基-3-甲基)吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(4-乙氧羰基-3-甲基)吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.71.3-[(1-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(1-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.72.3-[(5-乙氧羰基-3-乙氧羰基乙基-4-乙氧羰基甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-乙氧羰基-3-乙氧羰基乙基-4-乙氧羰基甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.73.3-[4-(吡咯烷-1-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[4-(吡咯烷-1-基)亚苄基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.74.3-[(5-甲基咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-甲基咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.75.3-[(5-甲基噻唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-甲基噻唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.76.3-[(3-甲基吡唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-甲基吡唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.77.3-[(咪唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(咪唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.78.3-[(4-氯吡唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(4-氯吡唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.79.3-[(4-溴-1-(4-氯苄基)吡唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(4-溴-1-(4-氯苄基)吡唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.80.3-[(4-氯-1-甲基吡唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(4-氯-1-甲基吡唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.81.3-[(4-乙基-3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(4-乙基-3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法B合成。
5.82.3-[(5-乙基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吡咯酮的合成
3-[(5-乙基吡唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吡咯酮按照方法B合成。
5.83.3-[3，5-二甲基-4-(丙烯-2-基)吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[3，5-二甲基-4-(丙烯-2-基)吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法B合成。
5.84.5，6-二甲氧基-3-[2，3-二甲氧基亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成
5，6-二甲氧基-3-[2，3-二甲氧基亚苄基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.85.3-[2，4，6-三甲氧基亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[2，4，6-三甲氧基亚苄基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.86.5-氯-3-[(吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.87.5-氯-3-[(3-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(3-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.88.3-(4-异丙基亚苄基)-2-二氢吲哚酮的合成
3-(4-异丙基亚苄基)-2-二氢吲哚酮可由Maybridge化学公司得到。
5.89.5-氯-3-[(3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.90.3-[(吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮可自Maybridge化学公司得到。
5.91.5-氯-3-[(吲哚-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(吲哚-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.92.5-氯-3-[(噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.93.5-氯-3-[(3-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(3-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.94.5-氯-3-[(5-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(5-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.95.5-氯-3-[(5-乙基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(5-乙基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.96.5-氯-3-[(5-甲硫基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(5-甲硫基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.97.5-氯-3-[(咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-氯-3-[(咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.98.3-[2，4-二甲氧基-6-甲基亚苄基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[2，4-二甲氧基-6-甲基亚苄基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.99.5-硝基-3-[(吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-硝基-3-[(吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.100.3-[(3-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.101.3-[(3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.102.3-[(吲哚-3-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(吲哚-3-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.103.5-硝基-3-[(噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
5-硝基-3-[(噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.104.3-[(3-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.105.3-[(5-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.106.3-[(5-乙基噻吩-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-乙基噻吩-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.107.3-[(5-甲硫基噻吩-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-甲硫基噻吩-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.108.3-[(咪唑-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(咪唑-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.109.3-[(噁唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(噁唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.110.3-[(噁唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(噁唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.111.3-[(噁唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(噁唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.112.3-[(噻唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(噻唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.113.3-[(噻唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(噻唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.114.3-[(噻唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(噻唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.115.3-[(咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.116.3-[(吡唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(吡唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.117.3-[(吡唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(吡唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.118.3-[(异噁唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(异噁唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.119.3-[(异噁唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(异噁唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.120.3-[(异噁唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(异噁唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.121.3-[(异噻唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(异噻唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.122.3-[(异噻唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(异噻唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.123.3-[(异噻唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(异噻唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.124.3-[(1，2，3-三唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(1，2，3-三唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.125.3-[(1，3，4-噻二唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(1，3，4-噻二唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮接照方法A合成。
5.126.3-[(5-苯基-1，2，4-噁二唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(5-苯基-1，2，4-噁二唑-3-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.127.3-[(3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
5.128.3-[(3-苯基-1，2，5-噁二唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮的合成
3-[(3-苯基-1，2，5-噁二唑-4-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮按照方法A合成。
6.实施例：体外RTK试验
以下的体外试验可以用来确定本发明的各种化合物对一种或多种RTK的活性和作用水平。使用工艺中熟知的方法，对于任何酪氨酸激酶均可按照同样的方式设计类似的试验。
6.1.酶联免疫吸附测定(ELISA)
酶联免疫吸附测定(ELISA)可以用来检验和测定酪氨酸激酶活性的存在。ELISA可以按照已知的方案进行，例如可参看Voller等，1980，“酶联免疫吸附测定”(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay)，在“临床免疫学手册(Manual of Clinical Immunology)”第二版中，Rose和Friedman编，359-371页，美国微生物学会出版，华盛顿特区。
所公开的方案可以修改成适合测定特定的RTK的活性。例如，下面提供了对于特定的RTK进行ELISA的优选方案。对于RTK家族的其它成员以及非受体酪氨酸激酶，为测定化合物的活性而对这些方案作的修改是本领域技术人员能够作到的。
6.1.1.FLK-1ELISA
进行ELISA试验以测定FLK-1受体的激酶活性，更具体地说，测定蛋白质酪氨酸激酶活性在FLK-1受体上的抑制或活化。具体说来，进行以下试验以便测定FLK-1/NIH 3T3细胞中FLK-1受体的激酶活性。
材料和方法。
材料。采用以下试剂和厂商：
a.Corning 96孔ELISA板(Corning公司产品目录No.25805-96)；
b.Cappel山羊抗兔免疫球蛋白G(产品目录编号55641)；
c.磷酸缓冲盐溶液PBS(Gibco公司产品编号450-1300EB)；
d.TBSW缓冲液(50mM Tris(pH 7.2)，150mM NaCl和0.1％吐温20)；
e.乙醇胺贮备液(10％乙醇胺(pH 7.0)，4℃下贮存)；
f.HNTG缓冲液(20mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)缓冲液(pH 7.5)，150mM NaCl，0.2％Triton X-100和10％甘油)；
g.EDTA(0.5M(pH 7.0)，作为100X贮备液)；
h.原钒酸钠(0.5M，100X贮备液)；
i.焦磷酸钠(0.2M，100X贮备液)；
j.NUNC 96孔V形底聚丙烯板(Applied Scientific公司，产品编号AS-72092)；
k.NIH 3T3C7#3细胞(FLK-1表达细胞)；
l.DMEM，含1X高葡萄糖L-谷氨酰胺(产品编号11965-050)。
m.FBS(胎牛血清)，Gibco公司(产品编号16000-028)；
n.L-谷氨酰胺，Gibco公司(产品编号25030-016)；
o.VFGF，PeproTech公司(产品编号100-20)(作为1μg/100μl贮备液保存在Milli-Q级纯水中，在-20℃下贮存)；
p.亲合纯化的抗-FLK-1抗血清，Enzymology实验室，Sugen公司；
q.对磷酸酪氨酸有特异性的UB 40单克隆抗体，Enzymology实验室，Sugen公司(见Fendley等，1990，癌症研究(Cancer Research)50：1550-1558)；
r.EIA级山羊抗鼠TgG-(POD)(BioRod，产品编号172-1011)；
s.2，2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)溶液[100mM柠檬酸(无水)、250mM Na2PO4(pH 4.0)、0.5mg/ml ABTS(Sigma公司，产品编号A-1888)]，溶液应在4℃下避光保存，直到准备使用。
t.H2O2(30％溶液)(Fischer公司，产品编号H 325)；
u.ABTS/H2O2(15ml ABTS溶液，2μl H2O2)，使用前5分钟配制，室温下放置；
v.0.2M盐酸储备液；
w.二甲基亚砜(100％)(Sigma公司，产品编号D-8418)；和
y.胰蛋白酶-EDTA(Gibco BRL公司，产品编号25200-049)。
方案。采用以下方案进行试验。
1.涂覆Corning 96孔ELISA板，每孔用1.0μg在0.1M Na2CO3(pH 9.6)中的Cappel抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体。使每孔的最终体积为150μl。涂过的板在4℃下过夜。在4℃下贮存时，板可以保存最多两周。
2.在合适的培养皿中在37℃和5％CO2下于生长培养基(DMEM，补充2.0mM L-谷氨酰胺，10％FBS)内生长细胞，直到汇合成片。
3.利用胰蛋白酶消化作用收取细胞，接种在Corning 25850聚苯乙烯96孔园底细胞培养板上，每孔在200μl生长培养基中有25,000个细胞。
4.在37℃和5％CO2下生长细胞至少一天。
5.用D-PBS洗细胞一次。
6.每孔加入200μl饥饿培养基(DMEM，2.0mM L-谷氨酰胺，0.1％FBS)。在37℃，5％CO2下温育过夜。
7.用饥饿培养基在聚丙烯96孔板中按1∶20稀释化合物/提取物。按1∶20稀释二甲基亚砜用于对照孔。
8.从96孔细胞培养板中去掉饥饿培养基，每孔中加入162μl新鲜的饥饿培养基。
9.向每孔中加入18μl 1∶20稀释的化合物/提取物稀释液(得自步骤7)，向对照孔中加入1∶20的二甲基亚砜稀释液(加或不加VEGF)，细胞受刺激后的最终稀释度为1∶200。最终的二甲基亚砜浓度为0.5％。在37℃和5％CO2下将板温育两小时。
10.将板倒转除掉液体，以便去掉ELISA板中未结合的抗体。用TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)洗3次。在纸巾上轻拍该板以便去掉多余的液体和气泡。
11.每孔用150μl的TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)将板封闭。将板温育30分钟，同时在微量滴定板摇荡器上摇荡。
12.按步骤10中所述洗板3次。
13.每孔加0.5μg亲合纯化的抗FLU-1多克隆兔抗血清。用pH 7.0的TBSW+0.5％乙醇胺使最终体积为每孔150μl。在摇荡下温育板30分钟。
14.向细胞中加入180μl饥饿培养基，在37℃和5％CO2下用每孔20μl 10.0mM原钒酸钠和500ng/ml的VEGF(结果是每孔中的最终浓度是1.0mM原钒酸纳和50ng/ml VEGF)激发细胞8分钟。
15.8分钟后，从细胞中除去培养基，用200μl/每孔的PBS洗一次。
16.在室温和摇荡下将细胞在150μl/孔的HNTG中裂解5分钟。HNTG制剂中含有原钒酸钠、焦磷酸钠和EDTA。
17.如步骤10中所述，洗ELISA板三次。
18.将细胞裂解物从细胞培养板转移到ELISA板，在摇荡下温育2小时。为了转移细胞裂解物，用吸管到处吸取，同时刮除各孔。
19.如步骤10中所述洗板3次。
20.用在TBSW+0.5％乙醇胺中的UB 40(每孔0.02μg)培育ELISA板。使最终体积为每孔150μl。在摇荡下温育30分钟。
21.如步骤10中所述洗板3次。
22.用在TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)中按1∶10000稀释的EIA(酶免疫测定)级山羊抗鼠免疫球蛋白G缀合的辣根过氧化物酶温育ELISA板。最终体积为每孔150μl。在摇荡下温育30分钟。
23.如步骤10中所述洗板。
24.向孔中加入100μl ABTS/H2O2溶液。在摇荡下温育10分钟。
25.加入100μl的0.2M Hcl使最终浓度为0.1M Hcl，以便停止显色反应。在室温下摇荡1分钟。用缓慢的空气流除去气泡，在410nm下于ELISA板读出器中检测ELISA板。
6.1.2.HER-2ELISA
试验1：全细胞中的EGF受体-HER 2嵌合受体试验。全EGFR-NIH 3T3细胞内的HER 2激酶活性按以下所述测定：
材料和试剂。使用以下材料和试剂进行试验：
a.EGF：贮备浓度＝16.5ILM；EGF 201，TOYOBO公司，日本。
b.05-101(UBI)(一种识别EGFR胞外域的单克隆抗体)。
c.抗磷酸酪氨酸抗体(抗ptyr)(多克隆)(见Fendley等，前述文献)。
d.检测抗体：山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶缀合物，TAGO公司，Burlingame，CA。
e.TBST缓冲液：
Tris-HCl，pH 7.2     50mM
NaCl                 150mM
Triton X-100         0.1
f.HNTG 5X贮备液：
HEPES                0.1M
NaCl                 0.75M
甘油                 50％
Triton X-100         1.0％
g.ABTS贮备液：
柠檬酸                   100mM
Na2HPO4               250mM
Hcl，浓                  0.5pM
ABTS*                  0.5mg/ml
*(2，2’-连氮(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)。溶液在4℃下避光保存，直到使用。
h.贮备试剂：
EDTA 100mM，pH 7.0
Na3VO4，0.5M
Na4(P2O7)0.2M
步骤。采用以下方案：
A. 预涂ELISA板
1.用在PBS中的05-101抗体涂覆ELISA板(Corning公司，96孔，产品编号#25805-96)，每孔0.5g，最终体积为每孔1O0μl，在4℃下贮存过夜。当在4℃下贮存时，涂过的板在最多达10天内保持良好。
2.在应用的当天，除掉涂层缓冲液并用100μl封闭缓冲液(5％Carnation连溶脱脂奶粉在PBS中)代替。在室温(约23-25℃)和摇荡下将板温育30分钟。刚好在使用前除掉封闭缓冲液，用TBST缓冲液洗板4次。
B. 接种细胞
1.对于此试验可以使用一种超量表达嵌合受体的NIH 3T3细胞系，该受体中含有EGFR胞外域和胞外HER 2激酶域。
2.选择有80-90％汇合的培养皿用于实验。通过加入10％胎牛血清使细胞受胰蛋白酶作用并停止反应。将细胞悬浮在DMEM培养基中(10％CS DMEM培养基)，在室温下于1500转/分离心一次，5分钟。
3.将细胞再悬浮于接种培养基(DMEM，0.5％牛血清)中，用台盼蓝计数细胞。生存力超过90％者合格。在96孔的微量滴定板中于DMEM培养基(0.5％牛血清)内接种细胞，密度为每孔10000个细胞，每孔100μl。在37℃和5％CO2下温育接种的细胞约40小时。
C. 试验步骤
1.用倒置显微镜检查接种细胞的沾污情况。将药物贮备液(10mg/ml，在二甲基亚砜中)在DMEM培养基中按1∶10稀释，然后转移5μl到TBST孔中，使药物最终稀释1∶200，最终的二甲基亚砜(DMSO)浓度为1％。对照孔中只加DMSO。在37℃和5％CO2下温育2小时。
2.配制EGF配体：用DMEM稀释EGF贮备液，使得在转移10μl稀的EGF溶液(1∶12稀释)时，最终浓度达到100nM。
3.准备足够每孔100μl的新鲜的HNTG*，放在冰上。
HNTG*(10ml)
HNTG贮备液              2.0ml
milli-Q水               7.3ml
EDTA，100mM，pH 7.0     0.5ml
Na3VO4，0.5M         0.1ml
Na4(P2O7)，0.2M     0.1ml
4.与药物一起温育120分钟后，向细胞中加入配制好的SGF配体，每孔10μl，最终浓度100nM。对照孔只加DMEM。在室温和摇荡下温育5分钟。
5.除掉药物、EGF和DMEM。用PBS洗细胞2次。将HNTG*转移给细胞，每孔100μl，放在冰上5分钟。与此同时，从其它的ELISA板中除掉封闭缓冲液，如上所述地用TBST洗。
6.使吸液管吸头牢固地固定在微量移液器上，由板上刮除细胞，通过反复地抽吸和放出HNTG*裂解缓冲液使细胞物质均化。将裂解物转移到涂覆、封闭和洗过的ELISA板中。在室温下摇荡温育1小时。
7.取出裂解物，用TBST洗4次。将刚刚稀释好的抗ptyr抗体转移到ELISA板，每孔100μl。在抗ptyr抗血清(在TBST中1∶3000稀释)存在下于室温和摇荡下温育30分钟。
8.除掉抗ptyr抗体，用TBST洗4次。将刚刚稀释的TAGO抗兔IgG抗体转移到ELISA板上，每孔100μl。在室温下摇荡温育30分钟(抗兔IgG抗体：在TBST中1∶3000稀释)。
9.除掉TAGO检测抗体，用TBST洗4次。转移刚配制的ABTS/H2O2溶液到ELISA板上，每孔100μl。在室温下摇荡温育20分钟(ABTS/H2O2溶液：1.0μl 30％H2O2在10ml ABTS贮备液中)。
10.加入50μl 5N H2SO4(任选)使反应停止，在410nm下测定光密度(O.D.)。
11.从正对照值中减去负对照值，确定最大的磷酸酪氨酸信号。然后对于含提取物的孔，在减去负对照值之后计算磷酸酪氨酸含量的抑制百分数。
试验2：HER-2-BT 474ELISA。可以进行第二种试验以测定全细胞HER 2活性。这种试验可以进行如下：
材料和试剂。使用以下材料和试剂：
a.BT-474(ATCC HBT 20)，一种表达高含量HER 2激酶的人类乳房肿瘤细胞系。
b.生长培养基，其中含RPMI+10％FBS+GMS-G(Gibco公司补编)+谷氨酰胺，用于在37℃和5％CO2的培养箱中生长BT-474。
c.一种单克隆抗HER 2抗体。
d.D-PBS：
KH2PO4   0.20g/l 10(Gibco，310-4190AJ)
K2HPO4   2.16g/l
KCl         0.20g/l
NaCl        8.00g/l(pH 7.2)
e.封闭缓冲液：TBST+5％奶(Carnation速溶脱脂奶粉)。
f.TBST缓冲液：
Tris-HCl        50mM
NaCl            150mM(pH 7.2，HCl 10N)
Triton X-100    0.1％
其中先配制(10X)的TES贮备液，Triton X-100在稀释期间加入。
g.HNTG缓冲液(5X)：
HEPES           0.1M
NaCl            750mM(pH 7.2，1N HCl)
甘油                       50％
Triton X-100               1.0％
配制储存液(5X)，在4℃下保存
h.EDTA-HCl：0.5M，pH 7.0(10N HCl)，为500X贮备液。
i.Na3VO4：0.5M的100X贮备液，在-80℃下分份保存。
j.Na4(P2O7)：0.2M，100X贮备液。
k.多克隆抗血清抗磷酸酪氨酸。
l.山羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶(POD)缀合物(检测抗体)，Tago(产品编号4520；批号1802)：Tago公司，Burlingame，CA。
m.ABTS溶液：
柠檬酸                100mM
Na2HPO4            250mM(pH 4.0，1N HCl)
ABTS                  0.5mg/ml
其中ABTS是2，2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)。对于此试验，ABTS溶液应在4℃下避光保存。当溶液变绿时应当丢弃。
n.过氧化氢：30％溶液，4℃下避光保存。
步骤。除非另外说明，所有下列步骤均在室温和无菌条件下进行。所有的ELISA板的洗涤均用蒸馏水洗3次，用TBST洗一次。
A. 细胞接种
1.在组织培养皿(Corning 25020-100)中生长BT 474细胞，至80-90％汇合成片，用胰蛋白酶-EDTA(0.25％，GIBCO)收集。
2.将细胞重新悬浮在新鲜的培养基中，转移到96孔的组织培养板(Corning，25806-96)，每孔约25000-50000个细胞(100μl/孔)。在37℃和5％CO2下温育细胞过夜。
B. ELISA板涂覆和封闭
1.用抗HER 2抗体(在PBS中)涂覆ELISA板(Corning 25805-96)，每孔150μl，含0.5μg抗体。在4℃下过夜，用parafilm膜密封。抗体涂覆过的板在4℃下贮存时最多可用2周。
2.在使用的当天，去除涂布溶液，用200μl的封闭缓冲液代替，摇荡ELISA板，然后去掉封闭缓冲液，洗板后立即加入裂解物。
C. 试验步骤
1.在无血清条件下用TBST将药物缓冲。加药物之前，用无血清的RPMI替换老的培养基(90μl/孔)。
2.用RPMI按1∶10稀释药物贮备液(在100％二甲基亚砜中)，将此溶液按10μl/孔转移到细胞中以便使最终的药物DMSO浓度达到1％。在37℃和5％CO2下温育细胞。
3.配制新鲜的细胞裂解缓冲液(HNTG*)
5×HNTG                2ml
EDTA                   0.2ml
Na3VO4              0.1ml
Na4P2O7            0.1ml
H2O                   7.3ml
4.在药物预温育2小时后，除掉板中的所有溶液，将HNTG*转移给细胞(100μl/孔)，摇荡10分钟。
5.使用12通道的移液器刮除板上的细胞，利用反复抽吸和放出使裂解物均化。将全部裂解物都转化到ELISA板，摇荡1小时。
6.去掉裂解物，洗板，每孔加100μl抗-ptyr(用TBST按1∶5000稀释)，摇荡30分钟。
7.去掉抗-pTyr，洗板，加入山羊抗兔IgG缀合抗体(用TBST按1∶5000稀释)，每孔100μl，摇荡30分钟。
8.除掉抗兔IgG抗体，洗板，每孔中加入100μl新鲜的ABTS/H2O2(1.2μl H2O2加10ml ABTS)以开始显色反应，这通常需要20分钟。
9.用Dynatec MR5000在410nM下测定光密度。
6.1.3.PDGF-R ELISA
除非另外说明，所有的细胞培养基、谷氨酰胺和胎牛血清均购自Gibco生命技术公司(Grand Island，NY)。所有的细胞均在37℃和5-10％CO2下于含90-95％空气的潮湿气氛中生长，所有的细胞系都例行地每周传代培养2次，用Mycotect方法(Gibco)测定的支原体为阴性。
对于ELISA试验，细胞(U 1242，得自Joseph Schlessinger，NYU)在生长培养基(含10％FBS、NEAA、1mM NaPyr和2mMGLN的极限必需培养基)中生长至80-90％汇合成片，接种在96孔组织培养板内的0.5％血清中，每孔25000-30000个细胞。在含0.5％血清的培养基中温育过夜后，将细胞改换到无血清的培养基中，用试验化合物在37℃和5％CO2的培养器中处理2小时。然后用配位体刺激细胞5-10分钟，随后用HNTG(20mM  Hepes、150mM NaCl、10％甘油、5mM EDTA、5mM Na3VO4、0.2％Triton X-100和2mMNaPyr)裂解。将细胞裂解物(每孔0.5mg，在PBS中)转移到ELISA板中，该板事先用受体特异性的抗体涂覆，并且用5％的奶/TBST(50mM  Tris-HCl，pH 7.2；150mM  NaCl；0.1％Triton X-100)在室温下封闭30分钟。将裂解物在室温和摇荡下温育1小时。用TBST洗板4次，然后用多克隆的抗磷酸酪氨酸抗体在室温下温肓30分钟。用TBST冲洗板4次，除掉多余的抗磷酸酪氨酸抗体。在室温下向ELISA板中加入山羊抗兔IgG抗体30分钟，随后再用TBST冲洗4次。向ELISA板中加入ABTS(100mM柠檬酸、250mM Na2HPO4和0.5mg/ml 2，2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))和H2O2(1.2ml 30％H2O2/10ml ABTS)以开始显色。在加入ABTS后以630nm为参考波长记录410nm的吸收约15-30分钟。
6.1.4.IGF-I ELISA
以下方案可用于测定IGF-I受体上的磷酸酪氨酸浓度，它是IGF-I受体酪氨酸激酶活性的代表。
材料和试剂。使用以下材料和试剂：
a.本试验中使用的细胞系是3T3/IGF-1R，它是一种超量表达IGF-1受体的细胞系。
b.NIH 3T3/IGF-1R在37℃和5％ CO2的培养器中生长。生长培养基是DMEM+10％FBS(加热灭活)+2mM L-谷氨酰胺。
c.使用名称为17-69的抗IGF-1R抗体。抗体由EnzymologyLab，Sugen纯化。
d.D-PBS：
KH2PO4       0.20g/l
K2HPO4       2.16g/l
KCl             0.20g/l
NaCl            8.00g/l(pH 7.2)
e.封闭缓冲液：TBST加5％奶(Carnation速溶脱脂奶粉)。
f.TBST缓冲液：
Tris-HCl        50mM
NaCl            150mM(pH 7.2/HCl 10N)
Triton X-100    0.1％
配制TBS贮备液(10X)，Triton X-100在稀释期间加入到缓冲液中。
g.HNTG缓冲液：
HEPES           20mM
NaCl            150mM(pH 7.2/HCl 1N)
甘油            10％
Triton X-100    0.2％
配制贮备液(5X)，在4℃保存。
h.EDTA/HCl：0.5M，pH 7.0(NaOH)，为100X贮备液。
i.Na3VO4：0.5M的100X贮备液，分份在-80℃下保存。
j.Na4P2O7：0.2M的100X贮备液。
k.胰岛素样生长因子-1，得自Promega公司(产品编号G 5111)。
l.多克隆抗血清抗磷酸酪氨酸：兔血清由Enzymology Lab.，SUGEN公司制得。
m.山羊抗兔IgG，过氧化物酶缀合物(检测抗体)，Tago公司(产品编号4520，批号1802)：Tago公司，Burlingame，CA。
n.ABTS(2，2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸))溶液：
柠檬酸            100mM
Na2HPO4        250mM(pH 4.0/1N HCl)
ABTS              0.5mg/ml
ABTS溶液应该在4℃下避光保存。当溶液变绿时应该丢弃。
o.过氧化氢：30％溶液，4℃下避光保存。
.步骤.除非特地说明，以下所有的步骤均在室温下进行。所有的ELISA板的洗涤均用自来水冲洗3次，随后用TBST冲洗一次。用纸巾将板轻拍至干。
A. 细胞接种：
1.细胞在组织培养皿(Corning 25020-100)中生长至80-90％汇合成片，用胰蛋白酶-EDTA(0.25％，0.5ml/D-100，GIBCO)收取。
2.将细胞重新悬浮在新鲜的DMEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺中，转移到96孔的组织培养板(Corning，25806-96)上，每孔20000个细胞(100μl/孔)。温育1天，然后将培养基换成无血清培养基(90μl/孔)，在37℃和5％CO2下温育过夜。
B. ELISA板的涂覆和封闭
1.用抗IGF-1R抗体(在PBS中)涂覆ELISA板(Corning 25805-96)至少2小时，每孔100μl，含抗体0.5μg。
2.除掉涂布溶液，换成100μl封闭缓冲液，摇荡30分钟。除掉封闭溶液，洗板后立即加入裂解物。
C. 试验步骤：
1.药物在无血清条件下试验。
2.在96孔聚丙烯板中用DMEM将药物贮备液(在100％DMSO中)按1∶10稀释，将此溶液按每孔10μl转移至细胞，使药物最终稀释度为1∶100，最终的DMSO浓度为1.0％。在37℃和5％CO2下温育细胞2小时。
3.配制新鲜的细胞裂解缓冲液(HNTG*)
HNTG           2ml
EDTA           0.1ml
Na3VO4      0.1ml
Na4P2O7    0.1ml
H2O           7.3ml
4.在药物温育2小时后，向细胞中加入每孔10μl的200nM IGF-1配位体/PBS(最终浓度＝20nM)，在37℃和5％CO2下温育10分钟。
5.除掉培养基，加入100μl/孔的HNTG*，摇荡10分钟。在显微镜下观看细胞是否充分裂解。
6.使用12通道的移液器刮取板中的细胞，通过反复抽吸和放出将裂解物均化。将所有裂解物都转移到用抗体涂敷的ELISA板上，摇荡1小时。
7.除掉裂解物，洗板，每孔加抗pTyr(用TBST稀释，1∶3000)100μl，摇荡30分钟。
8.去掉抗-pTyr，洗板，每孔加100μl Tago(用TBST稀释，1∶3000)，摇荡30分钟。
9.去掉检验抗体，洗板，向板中每孔加入新鲜的100μl ABTS/H2O2(1.2μl H2O2：10ml ABTS)，开始显色反应。
10.在与Ingres数据库管理系统连接的Dynatec MR 5000上测定光密度。
6.1.5.EGF受体ELISA
全细胞内的EGF受体激酶活性(EGFR-NIH 3T3试验)测定如下：
材料和试剂。使用以下材料和试剂：
a.EGF配体：贮备液浓度＝16.5μM，EGF 201，TOYOB公司，日本。
b.05-101(UBI)(一种识别EGFR胞外域的单克隆抗体)。
c.抗磷酸酪氨酸抗体(抗-ptyr)(多克隆)。
d.检测抗体：山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶缀合物，TAGO公司，Burlingame，CA。
e.TBST缓冲液：
Tris-HCl，pH 7      50mM
NaCl                150mM
Triton X-100        0.1
f.HNTG 5X贮备液：
HEPES               0.1M
NaCl                0.75M
甘油                50
Triton Y-100        1.0％
g.ABTS贮备液：
柠檬酸             100mM
Na2HPO4         250mM
HCl，浓            4.0pH
ABTS*            0.5mg/ml
溶液在4℃避光保存直至使用。
h.贮备试剂：
EDTA，100mM，pH 7.0
Na3VO4，0.5M
Na4P2O7，0.2M
步骤.采用以下方案。
A. 预涂ELISA板
1.用05-101抗体(在PBS中)涂覆ELISA板(Corning，96孔，产品编号#25805-96)，每孔0.5μg，每孔最终体积150μl，在4℃下贮存过夜。涂好的板在4℃下保存时最多达10天。
2.在使用的当天除掉涂布缓冲液，用封闭缓冲液代替(5％Carnation速溶脱脂奶粉在PBS中)。在室温(约23-25℃)和摇荡下温育该板30分钟。刚好在使用之前去掉封闭缓冲液并用TBST缓冲液洗板4次。
B. 接种细胞
1.NIH 3T3/C7细胞系(Honegger等，细胞杂志(Cell) 51：199-209，1987)可以用于此试验。
2.选择有80-90％汇合成片的培养皿用于此实验。通过加入10％CS DMEM培养基使细胞受胰蛋白酶作用并中止反应。将细胞悬浮在DMEM培养基中(10％CS DMEM培养基)，在室温和1000转/分下离心一次，共5分钟。
3.将细胞重新悬浮在接种培养基中(DMEM，0.5％牛血清)，用台盼蓝计数细胞。生存力高于90％者合格。将细胞接种在96孔微量滴定板的DMEM培养基中(0.5％牛血清)，密度为每孔10000个细胞，每孔100μl。接种的细胞在37℃和5％CO2下温育约40小时。
C. 试验步骤
1.用倒置显微镜检查接种细胞的污染情况。将药物贮备液(10mg/ml在DMSO中)按1∶10在DMEM培养基中稀释，然后转移5μl到试验孔中，使最终的药物稀释度为1∶200，最终的DMSO浓度为1％。对照孔中只加DMSO。在5％CO2和37℃下温育1小时。
2.配制EGF配体：在DMEM中稀释EGF贮备液，使得在转移10μl稀EGF溶液(1∶12稀释)时，最终浓度为25nM。
3.配制足以使每孔有100μl的新鲜的10ml HNTG*，其中HNTG*含有：HNTG贮备液(2.0ml)；milli-Q H2O(7.3ml)；EDTA、100mM、pH 7.0(0.5ml)；Na3VO4 0.5M(0.1ml)和Na4P2O7，0.2M(0.1ml)。
4.放在冰上。
5.用药物温育2小时后，将配制好的EGF配体加到细胞中，每孔10μl，使最终浓度为25nM。对照孔中只加DMEM。在室温下温育和摇荡5分钟。
6.除掉药物、EGF和DMEM。用PBS洗细胞2次。将HNTG*转移到细胞上，每孔100μl。在冰上放5分钟。与此同时，从另一ELISA板上除掉封闭缓冲液并按上述用TBST洗。
7.用牢固地固定在微量移液器上的吸液器吸头刮取板中的细胞，通过反复抽吸和放出HNTG*裂解缓冲液将细胞物质均化。将裂解物转移到涂覆、封闭和洗涤过的ELISA板上。在室温下摇荡温育1小时。
8.除掉裂解物，用TBST洗4次。将刚刚稀释的抗ptyr抗体转移到ELISA板上，每孔100μl。在抗ptyr抗血清(在TBST中1∶3000稀释)存在下于室温下温育30分钟。
9.除掉抗ptyr抗体，用TBST洗4次。将刚稀释的TAGO 30抗兔IgG抗体转移到ELISA板上，每孔100μl。在室温下摇荡温育30分钟(抗兔IgG抗体：在TBST中1∶3000稀释)。
10.除掉检测抗体，用TBST洗4次。将刚配制的ABTS/H2O2溶液转移到ELISA板上，每孔100μl。在室温下温育20分钟。ABTS/H2O2溶液：1.2μl 30％H2O2在10ml ABTS贮备液中。
11.加入50μl 5N H2SO4(任选)使反应停止，测定410nm下的光密度。
12.从正对照值中减去负对照值，确定最大的磷酸酪氨酸信号。在减去负对照值之后，计算含提取物的孔中磷酸酪氨酸含量抑制百分数。
6.1.6.细胞胰岛素受体ELISA
采用以下方案确定本发明化合物是否具有胰岛素受体酪氨酸激酶活性。
材料和试剂  使用以下材料和试剂来测定胰岛素受体上的磷酸酪氨酸浓度(表示胰岛素受体酪氨酸激酶活性)：
1.优选的细胞系是一种过量表达胰岛素受体(H 25细胞)的NIH3T3细胞系(ATCC No.1658)。
2.H25细胞在37℃和5％CO2下于培养器内生长。生长培养基是DMEM+10％FBC(加热灭活)+2ml L-谷氨酰氨；
3.对于ELISA板的涂覆，使用称为BBE的单克隆抗IR抗体。该抗体经Enzymology Lab，SUGEN公司纯化；
4.D-PBS，其中含有：
KH2PO4       0.20g/l(Gibco，310-4190AJ)
K2HPO4       2.16g/l
KCl             0.20g/l
NaCl            8.00g/l(pH 7.2)
5.封闭缓冲液：TBST加上5％奶(Carnation速溶脱脂奶粉)；
6.TBST缓冲液，其中含有：
Tris-HCl        50mM
NaCl            150mM pH 7.2(HCl，1N)
Triton X-100    0.1％
注：配制TBS的贮备溶液(10X)，Triton X-100在稀释时加入到缓冲液中。
7.HNTG缓冲液，其中含有：
HEPES           20mM
NaCl            150mM pH 7.2(HCl，1N)
甘油            10％
Triton X-100    0.2％
注：配制贮备液(5X)，在4℃下保存；
8.EDTA·HCl：0.5M，pH 7.0(NaOH)，为100X贮备液；
9.Na3VO4：0.5M的100X贮备液，在-80℃下分份保存；
10.Na4P2O7：0.2M的100X贮备液；
11.Gibco BRL的胰岛素(产品编号#18125039)；
12.多克隆抗血清抗磷酸酪氨酸：Enzymology Lab.，SUGEN公司制得的兔血清；
13.检测抗体：最好是山羊抗兔IgG，过氧化物酶缀合物，Tago(产品编号4520，批号1802)：Tago公司，Burlingame，CA；
14.ABTS溶液，其中含有：
柠檬酸        100mM
Na2HPO4    250mM pH 4.0(1N HCl)
ABTS          0.5mg/ml
其中的ABTS是2，2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)，在4℃下避光保存。当变绿时丢弃。
15.过氧化氢：30％溶液，40℃下避光保存。
步骤  所有以下步骤，除非特地说明，均在室温下进行。所有的ELISA板洗涤操作均是用自来水冲洗3次，随后用TBST冲洗1次。所有各板均在使用前用纸巾轻拍至干。
A. 细胞接种
1.细胞在组织培养皿(10cm，Corning 25020-100)中生长至80-90％汇合成片，用胰蛋白酶-EDTA收取(0.25％，0.5ml/D-100，Gibco)；
2.将细胞重新悬浮在新鲜的DMEM+10％FBS+2ml L-谷氨酰胺中，转移到96孔的组织培养板(Corning，25806-96)上，每孔20,000个细胞(100μl/孔)。然后将细胞温育1天。温育之后，用0.01％的血清培养基(90μl/孔)代替原来的培养基，细胞在37℃和5％CO2下温育过夜。
B. ELISA板的涂覆与封闭：
1.用抗IR抗体(在PBS中)涂覆ELISA板(Corning 25805-96)至少2小时，每孔100μl，含抗体0.5μg。
2.除掉涂布溶液，用100μl的封闭缓冲液代替，摇荡30分钟。除掉封闭缓冲液，洗板后立即加入裂解物。
C. 试验步骤
1.药物在无血清条件下试验。
2.在96孔聚丙烯板中用DMEM按1∶10稀释药物贮备液(在100％DMSO中)，转移此溶液(10μl/孔)至细胞，使药物最终稀释度为1∶100，最终的DMSO浓度为1.0％。在37℃和5％CO2下温育细胞2小时。
3.配制新鲜的细胞裂解缓冲液(HNTG*)
HNTG(5X)         2ml
EDTA             0.1ml
Na3VO4        0.1ml
Na4P2O7      0.1ml
H2O             7.3ml
HNTG*           10ml
4.在药物温育2小时后，按每孔10μl将1μM的胰岛素/PBS转移到细胞上(最终浓度＝100nM)，在37℃和5％CO2下温育10分钟。
5.除掉培养基，每孔加100μl HNTG*，摇荡10分钟。用显微镜观察细胞是否充分裂解。
6.使用12通道的移液器从板中刮取细胞，通过反复抽吸和放出将裂解物均化。将所有的裂解物转移到涂覆了抗体的ELISA板，摇荡1小时。
7.除掉裂解物，洗板，每孔加100μl抗pTyr(用TBST 1∶3000稀释)，摇荡30分钟。
8.除掉抗pTyr，洗板，每孔加100μl Tago(用TBST 1∶3000稀释)，摇荡30分钟。
9.除掉检测抗体，洗板，每孔加100μl新鲜的ABTS/H2O2(1.2μlH2O2：10ml ABTS)，开始显色反应。
10.在与Ingres数据库管理系统连接的Dynatec MR 5000上测定光密度。所有以下步骤应遵照Ingres说明书。
6.1.7.ELISA的试验结果
本发明各种化合物用上述方案得到的实验结果列在表1中：
                                              表1
                                         ELISA试验结果
  化合物(实施例)   PDGFRIC50(μM)   FLK-1IC50(μM)  EGFRIC50(μM)  HER2激酶IC50(μM)  IGF-1RIC50(μM)
  27   19.4   0.8
  4313   14.5   18.8   11   16.9   8.0
  18   12   0.39
  16   87.4   4.2
  17   11.8
  20   28.8
  21   9
  22   2.2
  24   8.5
  26   22.6
  28   22.5
  29   7.9   11.2
  32   20.9
  4   33.1   2.1
  33   21.6   39.4
  34   4.1
  5   5.8   1.6   90.2
  36   4   51.5
  37   9.6
  38   4.7
  39   14.8   36.7
  41   6.4
  8   2.9   89.8
  42   0.4
  43   1.8
  9   17   0.24
  44   23.8
  10   0.17
  45   53.7   1.1
  11   0.07
  12   10.8   0.11
  48   15.4
  13   2.3
  50   4.6
  14   2.4
  53   51.4
  15   4.5   70.6
  55   8.6
  57   73.4
  58   41.2
  化合物(实施例)  PDGFRIC50(μM)  FLK-1IC50(μM)  EGFRIC50(μM)  HER2激酶IC50(μM)   IGF-1RIC50(μM)
  59   22.8
  6   4.5   92.6
  61   3.4   44
  62   65.5   0.14
  64   36.2
  70   0.18
  71   20.3
  73   86   1.6
  74   55.9   2.7
  76   8.7
  77   14.2   1.5
  78   7.4
  81   0.15
  7   5.3   39.6   30.4
6.2.细胞生长试验
可以进行以下试验以测定提出权利要求的化合物由于与一种或多种RTK相互作用而对细胞生长的影响。除非另外说明，以下试验通常可用于测定化合物对任何特定的RTK的活性。就下面提到的对某种特定的RTK的试验来说，本领域的技术人员将能够修改所公开的方案，以便用于测定第二种RTK的活性。
6.2.1.软琼脂试验
软琼脂试验可以用来测定物质对细胞生长的影响。除非另外说明，软琼脂试验均进行如下：
材料和试剂。使用以下的材料和试剂：
a.设定在39℃的水浴和另一个37℃的水浴。
b.2X试验培养基由2X Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)构成(Gibco产品编号CA 400-4AN03)，补加以下物质：20％的胎牛血清(FBS)，2mM丙酮酸钠、4mM谷氨酰胺；和20mM HEPES，非必需氨基酸(自100X贮备液按1∶50稀释)。
c.由补加10％FBS、1mM丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺、10mMHEPES、非必需氨基酸(自100X贮备液1∶100稀释)的1X DMEM制成的1X试验培养基。
d.在高压灭菌瓶中的1.6％Seaplaque琼脂。
e.无菌的35mm Corning板(FMC生物产品公司，产品编号#50102)。
f.无菌的5ml玻璃移液管(逐个包封)。
g.无菌的15ml和50ml锥形离心管。
h.移液器和无菌的吸头。
i.无菌的微型离心管。
j.装在T 75烧瓶中的细胞：SKOV-3(ATCC HTB 77)。
k.0.25％胰蛋白酶溶液(Gibco#25200-015)。
步骤。采用以下步骤进行软琼脂试验：
A. 制造基层的步骤
1.将所有的培养基在37℃水浴中温热。
2.制备1X试验培养基+0.8％琼脂：用2X试验培养基按1∶2(体积∶体积)稀释熔化的琼脂(冷却到39℃)。
3.所有的含琼脂的培养基在不使用时于39℃水浴中温热。
4.将1ml 1X试验培养基+0.08％琼脂散布到平皿中并缓慢地旋转平板，形成均匀的基层。应当避免气泡。
5.将基层冷冻固化(约20分钟)。基层可以在冰箱中冷冻过夜。
B. 收集细胞的步骤
1.从培养器中每个细胞系取出一个培养瓶，抽出培养基，用PBS洗一次，抽走，加3ml胰蛋白酶溶液。
2.在所有的细胞脱离培养瓶之后，加入3ml 1X试验培养基以便抑制胰蛋白酶活性。上下吸取细胞，然后将悬浮液转移到15ml的试管中。
3.用库尔特计数器测定细胞浓度，用台盼蓝排阻法测定生存力。
4.取出为每板接种3300个活细胞所需的适当体积，用1X试验培养基将其稀释至1.5ml。
C. 制备0.4％琼脂上层的步骤
1.按所要求的最终试验浓度的2倍加TBST化合物；+1.5ml在1X试验培养基10％FBS中的细胞悬浮液；+1.5ml 1X试验培养基+0.8％琼脂*：总计＝3.0ml 1X试验培养基10％FBS+0.4％琼脂，每ml 3300个活细胞，加或不加TBST化合物。
*(用上述基层步骤中的1.6％琼脂30按1∶2稀释2X培养基得到)
2.在1ml基层上涂覆1ml试验混合物。由上述的3ml体积中涂覆同样的试样。
3.将培养皿在100％湿度、10％CO2的培养器中温育2-3周。
4.60微米或更大的菌落记分为正。
6.2.2.磺基罗丹明B(SRB)生长试验
SRB试验可用来测定底物对细胞生长的影响。试验进行如下：
试验1：3T3/E/H+TGF-a(T)细胞生长SRB试验
材料：
96孔平底无菌板
96孔园底无菌板
无菌的25ml或100ml容器
移液器，多通道吸液装置
无菌的移液器吸头
无菌的15ml和50ml试管
试剂：
0.4％的SRB在1％乙酸中的溶液
10mM Tris碱
10％TCA
1％乙酸
无菌的DMSO(Sigma公司)
化合物的DMSO溶液(100mM或以下的贮备液)
25％胰蛋白酶-EDTA在细胞解离液中(Sigma)
细胞系和生长培养基：
3T3/E/H+TGF-a(T)(NIH 3T3克隆7细胞，表达EGFR/HER2嵌合体和TGF-a，肿瘤衍生的自分泌环细胞)
2％牛血清/DMEM+2mM谷氨酰胺
方案：
第0天：细胞接种：
这部分试验在层流通风柜内进行。
1.象通常一样使细胞受胰蛋白酶作用。将100μl细胞悬浮液转移到10ml等渗溶液中。用库尔特计数器计数细胞。
2.将细胞在生长培养基中稀释至60000细胞/ml。在96孔的平底板中每孔加100μl的细胞，达到6000细胞/孔。
3.对于每种化合物使用半个板(4排)，每种化合物浓度用4个重复的孔，一组4个孔用于培养基对照样，4个孔用于DMSO对照样。
4.温和地摇荡板，使细胞均匀附着。
5.在10％CO2和37℃的培养器中温育该板。
第1天：加入化合物
这部分试验在层流通风柜中进行。
1.在96孔园底板中，向第3至第11行中加入125μl生长培养基。此板用于滴定化合物，每种化合物4排。
2.在无菌的15ml试管中，向总量2ml的生长培养基中加入8μl化合物，使稀释度为1∶250，从而制得最高化合物浓度的2X溶液。在这一稀释度，DMSO的浓度对于细胞上的2X溶液是0.4％，对于1X溶液是0.2％。化合物的起始浓度通常为100μM，但是此浓度可以随化合物的溶解度而变。
3.将2X起始化合物溶液转移到96孔园底板第12行中4个同样的孔内。沿着板从右向左从第12行转移125μl到第11行，从第11行到第10行，如此进行1∶2顺次稀释。将100μl化合物稀释液转移到96孔平底板的相应孔中细胞上的100μl培养基中。每孔中的总体积应为200μl。
4.对于载体对照样，配制在生长培养基中的浓度为0.4％的DMSO2X溶液。将100μl DMSO溶液转移到合适的细胞孔中。DMSO的最终浓度为0.2％。
5.对于培养基对照孔，向合适的细胞孔内加入100μl/孔的生长培养基。
6.将板送回到培养器中温育4天。
第5天：显色试验
这部分试验在实验台面上进行。
1.抽走或倒掉培养基。每孔中加200μl冷的10％TCA以便固定细胞。在4℃下温育板至少60分钟。
2.倒掉TCA，用水冲洗各孔5次。将板底朝上在纸巾上干燥。
3.用100μl/孔的0.4％SRB将细胞染色10分钟。
4.倒掉SRB，用1％乙酸冲洗各孔5次。将板底朝上在纸巾上完全干燥。
5.用100μl/孔的100mM Tris碱在摇荡器上加溶染料。
6.在Dynatech ELISA板读出器上以630nm为参照在570nm下测定板。
试验2：3T3/EGF-R+TGF-a(T)细胞生长SRB试验
材料和试剂同试验1。
细胞系和生长培养基：
3T3/EGF-R+TGF-a(T)(表达EGF-R和TGF-a的NIH 3T3克隆7细胞，肿瘤衍生的自分泌环细胞)
2％牛血清/DMEM+2mM谷氨酰胺
方案：
第0天：细胞接种
这部分试验在层流通风柜中进行。
1.按常用作法使细胞受胰蛋白酶作用。将100μl细胞悬浮液转移到10ml等渗液中。用库尔特计数器计数细胞。
2.将细胞在生长培养基中稀释至每ml 60000个细胞。在96孔的平底板中每孔加入100μl细胞，达到6000细胞/孔。
3.每种化合物用半个板(4排)，每种化合物浓度用4个重复的孔，一组4个孔用于培养基对照样，4个孔用于DMSO对照样。
4.温和地摇荡板以便使细胞均匀附着。
5.在37℃和10％CO2下于培养器中温育该板。
第1天：加入化合物：与试验1相同。
第5天：显色试验：与试验1相同。
试验3：3T3/PDGF-βR/PDGF-BB(T)细胞生长SRB试验
细胞系和生长培养基：
3T3/PDGF-βR/PDGF-BB(T)(表达PDGF β-受体和PDGF-BB的NIH 3T3克隆7细胞，得自从无胸腺鼠切除下的肿瘤)
2％牛血清/DMEM+2mM谷氨酰胺
方案：
第0天：细胞接种
这部分试验在层流通风柜中进行。
1.按通常作法使细胞受胰蛋白酶作用。转移200μl细胞悬浮液到10ml等渗液中。用库尔特计数器计数细胞。
2.将细胞在生长培养基中稀释至60000细胞/ml。向96孔平底板的各孔中转移100μl细胞，达到每孔6000个细胞。
3.每种化合物用半个板(4排)，每个化合物浓度用4个重复的孔，一组4个孔用于培养基对照样，4个孔用于DMSO对照样。
4.温和地摇荡该板，使细胞均匀地附着在板上。
5.在37℃和10％CO2下于培养器中温育该板。
第1天：加入化合物：与试验1相同。
第5天：显色试验：与试验1相同。
试验4：人平滑肌细胞(SMC)生长SRB试验
材料和试剂与试验1相同。
细胞系和生长培养基：
人主动脉平滑肌细胞(Clonetics)
Clonetics弹形试剂盒：平滑肌基本培养基(SmBM)，它是改性的MCDB 131，含有胎牛血清(5％)、hFGF(2ng/ml)、hEGF(0.1ng/ml)、胰岛素(5.0μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和两性霉素B(50ng/ml)。
方案：
第0天：细胞接种
这部分试验在层流通风柜中进行。
1.按通常作法使细胞受胰蛋白酶作用。转移200μl细胞悬浮液到10ml等渗液中。用库尔特计数器计数细胞。
2.将细胞在生长培养基中稀释至20000细胞/ml。向96孔平底板的各孔中转移100μl细胞，达到每孔2000个细胞。
3.每种化合物用半个板(4排)，每个化合物浓度用4个重复的孔，一组4个孔用于培养基对照样，4个孔用于DMSO对照样。
4.温和地摇荡该板，使细胞均匀附着在板上。
5.在37℃和10％CO2下于培养器中温育该板。
第1天：加入化合物：与试验1相同。
第5天：显色试验：与试验1相同。
6.2.3.3T3细胞生长试验
试验1：PDGF诱发的BrdU掺入试验
材料和试剂：
(1)PDGF：人类PDGF B/B；1276-956，BoehringerMannheim，德国。
(2)BrdU标记试剂：10mM，在PBS(pH 7.4)中，产品编号No.1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(3)FixDenat：固定溶液(现成的溶液)，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(4)抗-BrdU-过氧化物酶：与过氧化物酶缀合的鼠单克隆抗体，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)，现成溶液，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗液：1×PBS，pH 7.4，自配。
(7)牛血清白蛋白(BSA)：级分V粉末；A-8551，Sigma化学公司，美国。
方案
(1)3T3基因工程细胞系：3T3/EGFRc7
(2)将细胞按8000细胞/孔接种在96孔板中的DMEM、10％CS(牛血清)、2mM Gln(谷氨酰胺)内。在37℃和5％CO2下温育细胞过夜。
(3)24小时后，用PBS洗细胞，然后在无血清的培养基(0％CS的DMEM+0.1％BSA)中绝食血清培养24小时。
(4)第3天，向细胞中同时加入配位体(PDGF＝3.8nM，在含0.1％BSA的DMEM中配制)和试验化合物。负的对照样孔中只加含0.1％BSA的无血清DMEM，正的对照样孔中加入配位体(PDGF)，但不加试验化合物。试验化合物配制在96孔板中的含配位体的无血清DMEM内，成序列地稀释成7个浓度。
(5)在配位体活化20小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)，细胞与BrdU(最终浓度＝10μM)一起温育1.5小时。
(6)在与标记试剂一起温育后，倾倒并将倒置的板在纸巾上轻拍以除掉培养基。加入FixDenat溶液(50μl/孔)，将板在平板摇荡器上于室温下温育45分钟。
(7)通过倾倒和将倒置的板在纸巾上轻拍彻底地除掉FixDenat溶液。加入作为封闭剂的奶(5％脱水奶在PBS中，200μl/孔)，将板在平板摇荡器上于室温下温育30分钟。
(8)倒掉封闭溶液，用PBS洗各孔一次。加入抗BrdU-过氧化物酶溶液(1∶100稀释在PBS中，1％BSA)(100μl/孔)，将板在平板摇荡器上于室温下温育90分钟。
(9)通过倾倒并用PBS冲洗孔5次，彻底去除抗体缀合物，将板倒置并在纸巾上轻拍使其干燥。
(10)加入TMB底物溶液(100μl/孔)，在平板摇荡器上于室温下温育20分钟，直到对于光度检测已经显色充分。
(11)在Dynatech ELISA板读出器上于410nm下测定样品的吸光度(按“双波长”模式，以490nm的滤光片读数为参考波长。)
试验2：EGF诱发的BrdU掺入试验
材料和试剂
(1)EGF：鼠EGF，201；Toyobo公司，日本。
(2)BrdU标记试剂：10mM，在PBS中(pH 7.4)，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(3)FixDenat：固定溶液(现成溶液)，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(4)抗-BrdU-过氧化物酶：与过氧化物酶缀合的鼠单克隆抗体，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)，现成溶液，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗液：1×PBS，pH 7.4，自配。
(7)牛血清白蛋白(BSA)：级分V粉末；A-8551，Sigma化学公司，美国。
方案
(1)3T3基因工程细胞系：3T3/EGFRc7
(2)将细胞接种在96孔板中含10％CS，2mM谷氨酰胺的DMEM内。每孔8000细胞。
(3)24小时后，用PBS洗细胞，然后在无血清的培养基(含0.1％BSA的0％CS DMEM)中血清缺量培养24小时。
(4)第3天，向细胞中同时加入配位体(EGF＝2nM，在含0.1％BSA的DMEM中配制)和试验化合物。负对照样孔只加含0.1％BSA的无血清DMEM；正对照样细胞中加入配位体(EGF)，但不加试验化合物。试验化合物配制在96孔板中含配位体的无血清DMEM内，顺次地稀释成7个试验浓度。
(5)配位体活化20小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)，细胞与BrdU(最终浓度＝10μM)一起温育1.5小时。
(6)与标记试剂一起温育后，通过倾倒和在纸巾上轻拍倒置的板将培养基除掉。加入FixDenat溶液(50μl/孔)，在平板摇荡器上于室温下温育该板45分钟。
(7)通过倾倒和将倒置的板在纸巾上轻拍，彻底地除掉FixDenat溶液。加入奶(5％脱水奶在PBS中，200μl/孔)作为封闭溶液，将板在平板摇荡器上于室温下温育30分钟。
(8)倾倒掉封闭溶液，用PBS洗孔一次。加入抗BrdU-过氧化物酶溶液(1∶100稀释在PBS中，1％BSA)(100μl/孔)，将板在平板摇荡器上于室温下温育90分钟。
(9)通过倾倒和用PBS冲洗孔5次，彻底地去除抗体缀合物，将板倒置并在纸巾上轻拍使其干燥。
(10)加入TMB底物溶液(100μl/孔)，在平板摇荡器上于室温下温育20分钟，直到对于光度检测显色已经充分。
(11)在Dynatech ELISA板读出器上于410nm下测定样品的吸光度(以“双波长”模式，490nm滤光片读数为参考波长)。
试验3：EGF诱发的Her 2-驱动的BrdU掺入
材料和试剂
(1)EGF：鼠EGF，201；Toyobo公司，日本
(2)BrdU，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(3)FixDenat：固定溶液(现成溶液)，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(4)抗BrdU-过氧化物酶：与过氧化物酶缀合的鼠单克隆抗体，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)，现成溶液，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗液：1×PBS，pH 7.4，自配。
(7)牛血清白蛋白(BSA)：级分V粉末；A-8551，Sigma化学公司，美国。
方案：
(1)3T3基因工程细胞系：3T3/EGFr/Her 2/EGFr(带有Her 2激酶域的EGFr)
(2)将细胞按8000细胞/孔接种在96孔板的DMEM，10％CS、2mM谷氨酰胺中。在37℃和5％CO2下温育细胞过夜。
(3)24小时后用PBS洗细胞，然后在无血清培养基(含0.1％BSA的％CS DMEM)中绝食血清培养24小时。
(4)第3天，向细胞中同时加入配位体(EGF＝2nM，配制在含0.1％BSA的DMEM中)和试验化合物。负对照样孔中只加入含0.1％BSA的无血清DMEM；正对照样细胞中加入配位体(EGF)，但不加试验化合物。试验化合物配制在96孔板中含配位体的无血清DMEM内，顺次地稀释成7个试验浓度。
(5)配位体活化20小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)，细胞与BrdU(最终浓度＝10μM)一起温育1.5小时。
(6)与标记试剂一起温育后，通过倾倒和将倒置的板在纸巾上轻拍除掉培养基。加入FixDenat溶液(50μl/孔)，将培养板在平板摇荡器上于室温下温育45分钟。
(7)通过倾倒和将倒置的板在纸巾上轻拍，彻底除掉FixDenat溶液。加入作为封闭溶液的奶(5％奶粉在PBS中，200μl/孔)，将板在平板摇荡机上于室温下温育30分钟。
(8)倾倒掉封闭溶液，用PBS洗孔一次。加入抗BrdU-过氧化物酶溶液(1∶100稀释在PBS中，1％BSA)(100μl/孔)，将板在平板摇荡器上于室温下温育90分钟。
(9)通过倾倒和用PBS冲洗孔5次，彻底除掉抗体缀合物，将板倒置并在纸巾上轻拍使其干燥。
(10)加入TMB底物溶液(100μl/孔)，在平板摇荡器上于室温下温育20分钟，直到对于光度检测已经显色充分。
(11)在Dynatech ELISA板读出器上测定410nm下样品的吸光度(用“双波长”模式，用490nm下滤光片读数为参考波长)。
试验4：EGF1-诱发的BrdU掺入试验
材料和试剂：
(1)IGF1配位体：人类重组体；G511，Promega公司，美国。
(2)BrdU标记试剂：10mM，在PBS中(pH 7.4)，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(3)FixDenat：固定溶液(现成溶液)，产品编号1 647 229，Boehringer Mannheim，德国。
(4)抗-BrdU-过氧化物酶：与过氧化物酶缀合的鼠单克隆抗体，产品编号1647229，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)，现成溶液，产品编号1 647 229，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗液：1×PBS，pH 7.4，自配。
(7)牛血清白蛋白(BSA)：级分V粉末；A-8551，Sigma化学公司，美国。
方案：
(1)3T3基因工程细胞系：3T3/IGF lr
(2)将细胞接种在96孔板内的DMEM、10％CS、2mM谷氨酰胺中。每孔8000个细胞。将细胞在37℃和5％CO2下温育过夜。
(3)24小时后，用PBS洗细胞，然后在无血清培养基(含0.1％BSA的0％CS DMEM)中绝食血清培养24小时。
(4)第3天，向细胞中同时加入配位体(IGF 1＝3.3nM，在含0.1％BSA的DMEM中配制)和试验化合物。负对照样孔中只加含0.1％BSA的无血清DMEM；正对照样细胞中加入配位体(IGF 1)，但不加试验化合物。试验化合物配制在96孔板中含配位体的无血清DMEM内，顺次地稀释成7个试验浓度。
(5)配位体活化16小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)，细胞与BrdU(最终浓度＝10μM)一起温育1.5小时。
(6)与标记试剂一起温育后，通过倾倒和将倒置的板在纸巾上轻拍除掉培养基。加入FixDenat溶液(50μl/孔)，板在平板摇荡器上于室温下温育45分钟。
(7)通过倾倒和在纸巾上轻拍倒置的板，彻底除掉FixDenat溶液。加入作为封闭溶液的奶(5％奶粉在PBS中，200μl/孔)，将板在平板振荡器上于室温下温育30分钟。
(8)倾倒掉封闭溶液，用PBS洗孔一次。加入抗-BrdU-过氧化物酶(1∶100稀释在PBS中，1％BSA)(100μl/孔)，将板在平板摇荡器上于室温下温育90分钟。
(9)通过倾倒并用PBS洗孔5次，彻底地除掉抗体缀合物，将板倒置并在纸巾上轻拍使其干燥。
(10)加入TMB底物溶液(100μl/孔)，在平板摇荡器上于室温下温育20分钟，直到对于光度检测已经显色充分。
(11)在Dynatech ELISA板读出器上测定样品在410nm下的吸光度(用“双波长”模式，与作为参考波长的490nm下滤光片读数参比)。
试验5：胰岛素诱发的BrdU掺入试验
材料与试剂
(1)胰岛素：晶体，牛胰岛素，锌；13007，Gibco BRL，美国。
(2)BrdU标记试剂：10mM在PBS(pH 7.4)中，产品编号1647229，Boehringer  Mannheim，德国。
(3)FixDenat：固定溶液(现成溶液)，产品编号1 647 229，Boehringer Mannheim，德国。
(4)抗-BrdU-过氧化物酶：与过氧化物酶缀合的鼠单克隆抗体，产品编号1 647 229，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)，现成溶液，产品编号1 647 229，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗液：1×PBS，pH 7.4，自配。
(7)牛血清白蛋白(BSA)：级分V粉末；A-8551，Sigma化学公司，美国。
步骤
(1)3T3基因工程细胞系：H 25
(2)将细胞接种在96孔板内的DMEM、10％CS、2mM谷氨酰胺中，每孔8000细胞。在37℃和5％CO2下温育细胞过夜。
(3)24小时后，用PBS洗细胞，然后在无血清培养基(0％CS的DMEM，含0.1％BSA)中绝食血清培养24小时。
(4)第3天，向细胞中同时加入配位体(胰岛素＝10nM，配制在含0.1％BSA的DMEM中)和试验化合物。负对照样孔中只加含0.1％BSA的无血清DMEM；正对照样细胞中加入配位体(胰岛素)，但不加试验化合物。试验化合物配制在96孔板内的含配位体的无血清DMEM中，顺次稀释成7个试验浓度。
(5)配位体活化16小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)，细胞与BrdU(最终浓度＝10μM)一起温育1.5小时。
(6)在与标记试剂一起温育后，通过倾倒和在纸巾上轻拍倒置的板除掉培养基。加入FixDenat溶液(50μl/孔)，将板在平板振荡器上于室温下温育45分钟。
(7)通过倾倒和在纸巾上轻拍倒置的板，彻底除掉FixDenat溶液。加入作为封闭溶液的奶(5％奶粉在PBS中，200μl/孔)，将板在平板摇荡器中于室温下温育30分钟。
(8)倾倒掉封闭溶液，用PBS洗孔一次。加入抗-BrdU-过氧化物酶(1∶100稀释在PBS中，1％BSA)(100μl/孔)，将板在平板摇荡器中于室温下温育90分钟。
(9)通过倾倒和用PBS冲洗孔5次，彻底除掉抗体共轭体，将板倒置并在纸巾上轻拍使其干燥。
(10)加入底物溶液(100μl/孔)，在平板摇荡器上于室温下温育20分钟，直到对于光度检测已经显色充分。
(11)在Dynatech ELISA板读出器上测定样品在410nm下的吸光度(用“双波长”模式，以作为参考波长的490nm下滤光片读数为参比)。
6.2.4.HUV-EC-C试验
也可以使用以下方案测定化合物的活性：
第0天
1.洗涤和胰蛋白酶化HUV-EC-C细胞(人脐静脉内皮细胞，美国典型培养物保藏所，编号1730CRL)。用Dulbecco磷酸盐缓冲的生理盐水(D-PBS，由Gibco BRL得到，产品编号14190-029)在约1ml/10cm2组织培养瓶中洗二次。在非酶的细胞解离液(Sigma化学公司，产品编号C-1544)中用0.05％的胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶作用。0.05％的胰蛋白酶是在细胞解离液中稀释0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA(Gibco，产品编号25200-049)而制得的。用大约1ml/25-30cm2组织培养瓶在37℃下进行胰蛋白酶作用约5分钟。在细胞已脱离培养瓶之后，加入等体积的试验培养基并转移到50ml的无菌离心管(Fischer Scientific公司，产品编号05-539-6)中。
2.在50ml的无菌离心管中用约35ml的试验培养基洗细胞，作法是加入试验培养基，在约200xg下离心10分钟，抽出上层清液，用35mlD-PBS再悬浮。用D-PBS再重复洗涤两次，重新将细胞悬浮在约1ml试验培养基/15cm2组织培养瓶中。试验培养基由F12K培养基(Gibco BRL，产品编号21127-014)+0.5％加热灭活的胎牛血清构成。用库尔特计数器(库尔特电子公司)计数细胞，向细胞中加入试验培养基，使浓度为0.8-1.0×105细胞/ml。
3.将细胞加到96孔的平底板中，每孔100μl或0.8-1.0×104细胞；在37℃、5％CO2下温育24小时。
第1天
1.在另外的96孔板中配制成两倍变化的药物滴定液，通常是从50μM至0μM。使用上述第0天步骤2中相同的试验培养基。滴定液的制备方法是将200μM(4倍最终孔中浓度)的药物按90μl/孔加到板的特定行的最上部孔中。因为贮备药液的浓度常常是在DMSO中的20mM溶液，所以200μM的药物浓度中含有2％的DMSO。
因此，使用在试验培养基(F12K+0.5％胎牛血清)中补加到2％DMSO的稀释剂作为药物滴定液的稀释剂，以便稀释药物而又保持DMSO浓度恒定。将此稀释剂加到上述该行的其余各孔中，每孔60μl。从该行最上孔中的200μM药物稀释液中取60μl与该行第二孔中的60μl混合。从这一孔中取60μl与该行第三孔中的60μl混合，如此继续下去，直到完成浓度呈两倍变化的滴定液。当倒数第二个孔混合好后，从此孔的120μl中取出60μl丢弃。留下最后一个孔中有60μl的DMSO/培养基稀释液作为不含药物的对照样。配制9行要滴定的药物，足够以下药物每种有三个重复孔样：1)VEGF(得自Pepro Tech Inc.，产品编号100-200，2)内皮细胞生长因子(ECGF)，也称为酸性成纤维细胞生长因子或aFGF(得自Boehringer Mannheim Biochemica，产品编号1439600)，以及试验培养基对照样。ECGF为含肝素钠的制剂。
2.按50μl/孔将药物稀释液转移到96孔的试验板中，试验板中含有取自第0天的HUV-EC-C细胞，每孔100μl或0.8-1.0×104个细胞，将板在37℃和5％CO2下温育约2小时。
3.在三份重复样中，向每种药物稀释液中加入50μl/孔的80μg/mlVEGF、20ng/ml ECGF或培养基对照样。与药物的情形一样，生长因子的浓度是所要求的最终浓度的4倍。使用第0天步骤2的试验培养基配制生长因子的浓度。在37℃和5％CO2下温育约24小时。每孔中应有50μl药物稀释液，50μl生长因子或培养基，以及100μl细胞，总计每孔200μl。于是一旦各物质都加到孔中之后，4倍浓度的药物和生长因子变成了1倍浓度。
第2天
1.加入3H-胸苷(Amersham，产品编号TRK-686)，每孔1μCi(每孔10μl的100μCi/ml溶液，该溶液配制在RPMI培养基+10％热灭活的胎牛血清中)，在37℃和5％CO2下温育～24小时。注意：3H-胸苷是在RPMI培养基中制成，因为我们使用3H-胸苷的所有其它场合均涉及在RPMI中进行实验。这一步骤中培养基的不同大概影响不大。RPMI得自Gibco BRL，产品编号11875-051。
第3天
1.将板在-20℃下冷冻过夜。
第4天
1.将板解冻，用96孔板收获器(Tomtec Harvester 96(R))收取在过滤网上(Wallac，产品编号1205-401)；在Wallac Betaplate(TM)液体闪烁计数器上读数。
6.2.5.PDGF-R细胞试验
PDGF细胞激酶试验进行如下：将细胞在0.2M Hepes、0.15MNaCl、10％v/v甘油、0.04％辛苯昔醇-9、5mM EDTA、5mM原钒酸钠和2mM焦磷酸钠中裂解；然后将细胞裂解物加到涂有抗-PDGF受体抗体(Genzyme)的ELISA板上；在加入裂解物之前，ELISA板先用在150μl PBS中的0.5μg抗体/孔在4℃下涂覆18小时；将裂解物在涂覆的板中温育1小时，然后在TBST(35mM  Tris-HCl，pH7.0，0.15M NaCl，0.1％辛苯昔醇-9)中洗4次；加入抗磷酸酪氨酸抗体(100μl在PBS中)，混合物在室温下温育30分钟；然后将孔在TBST中洗4次，向每个孔中加入与过氧化物酶缀合的第二种抗体(TAGO)，将处理过的孔在室温下温育30分钟；然后将各孔在TBST中洗4次，向各孔中加入ABTS/H2O2溶液，温育2分钟；然后在410nm下测定吸光度。
6.2.6.细胞生长试验的试验结果
由上述试验中得到的各种化合物的结果列在以下各表中：
                         表2
                  内皮细胞中的细胞分裂
                     掺入[3H]胸苷
  化合物(实施例)   HUV-ECVEGF(μM)   试验a-FGF(μM)
  27   1.1   153.8
  1B   0.2   6.0
  16   6.6   3.4
  17   4.8   35.7
  4796   30.7   35.8
  20   43.2
  21   19.9
  22   2.5   45.2
23 1.6 4.6
  24   14.8
  25   3.4   3.7
  26   25.6   19.3
  28   8.0   13.0
  29   34.3   16.3
  30   1.0   1.4
  32   4.4   4.9
  4   0.6
  33   46.1   27.3
  5   0.8   25.8
  5201   2.5   2.3
  36   2.3   0.7
  37   5.1   11.8
  38   2.9   130
  5217   9.6   10.5
  化合物(实施例)   HUV-ECVEGF(μM)   试验a-FGF(μM)
  41   2.4   2.7
  8   2.2
  42   ＜0.8   2.0
  9   ＜0.8   31.1
  44   0.9   0.6
10 ＜0.8
  45   39.8   35.5
  11   ＜0.8   22.7
  5409   26.0
  12   ＜0.8
  48   13.6   40
  13   0.7
  50   11.4
  14   2.5
  15   5.7
  5429   27.6
  59   0.16   0.14
  60   39.8   33.0
  61   1.2   30.0
  63   3.8   3.4
  64   20   20
  68   ＜0.07   ＜0.07
  69   0.5   0.8
  70   0.14   7.9
  71   3.8   12.9
  73   1.3   3.2
  74   0.54   8.7
  76   2.0   5.0
  77   1.2   14.1
  81   0.05   37.8
  化合物(实施例)   HUV-ECVEGF(μM)   试验a-FGF(μM)
  7   1.2   3.8
                                    表3
                         3T3/EGFR细胞中的细胞分裂
                                  掺入BrdU
  化合物(实施例)   PDGFRPDGF配位体IC50(μM)   FGFRFGF配位体IC50(μM)   EGFREGF配位体IC50(μM)
  27   75
  4313   6   5.5   5.5
  18   2.5
  29   9   4.9   60
  4   3   10   20
  5402   50   40
  36   3   25
  10   5.2
  45   7.5   70   100
  12   2.8   70
  61   30   16
  5463   23
  71   70   60   95
  5465   40   25   50
  73   18   15   17
  74   8
  5469   4   15   28
  77   4   50   54
  81   6.5   9   48
                                               表4
                                      各种细胞系的细胞生长试验
                                               SRB读数
  化合物(实施例)   3T3/E/H+TGF-a(T)IC50(μM)   3T3/EGFR+TGF-a(T)IC50(μM)   3T3/PDGFR+PDGF(T)IC50(μM)   SMCIC50(μM)
  27   36
  4313   32   10.7   8.8
  1B   78   10
  5   22.2
3T3/E/H+TGF-α(T)：表达EGFR/HER 2嵌合体和TGF-α的NIH 3T3细胞，肿瘤衍生物
3T3/EGFR+TGF-α(T)：表达EGFR和TGF-α的NIH 3T3细胞，肿瘤衍生物
3T3/PDGFR+PDGF(T)：表达PDGF-βR和PDGF-ββ的NIH3T3细胞，肿瘤衍生物
SMC：得自clonetics的人类平滑肌细胞
6.3.细胞毒性测定
治疗用化合物应当在抑制受体酪氨酸激酶活性方面比显示细胞毒性方面更强。化合物的效力和细胞毒性的量度可以通过测定治疗指数IC50/LD50得到。IC50是为达到50％抑制率所需的剂量，可以用例如本文所述的那些标准方法测定。LD50是引起50％毒性的剂量，也可以用标准方法测量(Mossman，1983，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，65：55-63)，或者是测定释放出的LDH(乳酸脱氢酶)数量(Korzeniewski和Cellewaert，1983，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods) 64：313；Decker和Lohmann-Matthes，1988，免疫方法杂志， 115：61)，或者测量动物模型的致死剂量。具有大的治疗指数的化合物是理想的。治疗指数应当大于2，优选至少为10，最好是至少为50。
6.3.体内动物模型
6.3.1.异种移植动物模型
人类肿瘤以异种移植物的形式在无胸腺的鼠(例如Balb/c，nu/nu)中生长的能力为研究人类肿瘤对治疗的生物响应提供了有用的体内模型。自从第一次成功地将人类肿瘤异种移植到无胸腺鼠中之后(Rygaard和Povlsen，1969，斯堪的纳维亚病理微生物学学报， 77：758-760)，已经将很多不同的人类肿瘤细胞系(例如乳房、肺、生殖泌尿器、胃肠、头、颈、恶性胶质瘤、骨和恶性黑素瘤)移植到裸鼠中并成功地生长。人类乳房瘤细胞系，包括MCF-7、ZR75-1和MDA-MB-231，已实现在裸鼠内皮下异种移植〔Warri等，1991，国际癌症杂志(Int.J.Cancer) 49：616-623；Ozzello和Sordat，1980，欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer) 16：553-559；Osborne等，1985，癌症研究(Cancer Res.) 45：584-590；Seibert等，1983，癌症研究(Cancer Res.) 43：2223-2239〕。
试验1：HER 2/异种移植动物模型
为研究候选的抗肿瘤药物对表达HER 2的肿瘤的作用，肿瘤细胞应当能在无补加雌激素的条件下生长。很多乳房细胞系在裸鼠体内的生长依赖于雌激素(Osborne等，前述文章)，但是，外源雌激素抑制裸鼠内的HER 2表达(Warri等，前述文章；Dati等，1990，癌基因(Oncogene) 5：1001-1006)。例如，在雌激素存在时，MCF-7、ZR-75-1和T47D细胞在体内生长良好，但是表达很低水平的HER2(Warri等，前述文章；Dati等，前述文章)。
可以采用以下类型的异种移植方案：
1)将肿瘤细胞移植(皮下)到5-6周龄的雌性Balb/c nu/nu无胸腺鼠的后肋部中；
2)施用抗肿瘤化合物；
3)通过测量肿瘤体积测定肿瘤生长。
可以用Western和免疫组织化学分析法分析肿瘤中受体的存在，例如HER2、EGF或PDGF。利用工艺中已知的技术，本领域技术人员可以改动上述的步骤，例如使用不同的治疗方式。
试验2：FLK-1/异种移植模型
检验了本发明化合物对于以皮下异种移植物形式形成的卵巢、黑素瘤、前列腺、肺和乳房肿瘤细胞系的抑制能力。这些研究用每天1-75mg/kg的剂量进行。
材料和方法：肿瘤细胞皮下植入到所指出品系的鼠中。除非另外指明(例如，与A 375黑素瘤细胞系有关的SCID(重度联合免疫缺陷)鼠的治疗在第9天开始)，均在植入后第1天开始治疗。每个实验组有8-16只鼠。
具体内容：
动物  雌性无胸腺鼠(BALB/C，nu/nu)、BALB/C鼠，Wistar大鼠和Fisher 344大鼠得自Simonsen实验室(Gilroy，CA)。雌性A/I鼠得自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。DA大鼠得自B&KUniversal公司(Fremont，CA)。无胸腺R/Nu大鼠、DBA/2N鼠和BALB/C鼠得自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)。雌性C57BL/6鼠得自Taconic(Germantown，NY)。所有的动物都在净室条件下供养在带有Alpha-dri垫层的微隔间笼子里。它们无限制地接受无菌的咀嚼食物和水。
所有步骤均按照“美国国立卫生研究院实验室动物护理与使用指南”一书进行。
皮下异种移植模型  细胞系按所述在适当的培养基内生长(见节6)。在达到或接近融合成片时用0.05％的胰蛋白酶-EDTA收取细胞，在450×g下沉淀10分钟。将沉淀物在无菌的PBS或培养基(无FBS)中重新悬浮成图表说明中指出的合适浓度，将细胞植入鼠的后胁部。用游标卡尺测量肿瘤生长3-6周，除非另外说明，肿瘤体积均计算成长×宽×高的乘积。利用t-检验法计算P值。用腹膜内注射法将在50-100μl赋形剂(二甲基亚砜、PBTE、PBTE6C：D5W或PBTE：D5W)中的化合物按图表说明中所示的浓度给药。
脑内异种移植模型  对于鼠脑内异种移植模型，收取大鼠C6神经胶质瘤细胞，悬浮在无菌的PBS中并置于冰上，浓度为2.5×107细胞/ml。按以下方式将细胞植入BALB/C、nu/nu鼠内：用70％乙醇拭抹鼠额顶头皮，必要时先用动物刀剪剃净。用异氟烷将动物麻醉，经过头颅骨将针插入脑的左半球。细胞由Hamilton气密式注射器送出，使用与套管吻合的30号、1/2英寸的针头，它只能透入3mm。使用重发式分配器以便准确地放出4μl细胞悬浮液。逐日观察动物的状态，当它们失重约40％和/或显示出神经病症时将其宰杀。
对于大鼠脑内模型，通过腹膜内注射100mg/kg盐酸氯胺酮(Aveco，Fort Dodge，Iowa)和5mg/kg的甲苯噻嗪(2％溶液，拜耳，德国)将大鼠(Wistar，Sprague Dawley，Fischer 344，或是无胸腺R/Nu；约200-400g，有一些300-400g)麻醉。在麻醉发生后，刮净脑壳，将动物定位在立体定位器(Stoelting，Wood Dale，IL)上。切口处的皮肤交替地用70％乙醇和10％聚乙烯吡咯烷酮-碘拭抹，清洗3次。用无菌手术刀在脑壳上切开一个正中的1.0-1.5Gm的切口。轻轻地扒开皮肤，拉向两边，暴露出头颅表面的骨缝。用牙钻(Stoelting，Wood Dale，IL)在前囱之前1mm、侧向2mm处钻一个孔。将细胞悬浮液抽入50μl Hamilton针筒中，针筒上装有23或25号的标准斜角针头。将针筒定位在孔中蛛网膜的水平位置处，并下降到针头尖深入脑结构3mm，在该处缓慢地注射细胞悬浮液。在注射完细胞后，在孔内抬起针头1-2分钟以便释放完细胞。清洁头颅骨，用2-3针缝合皮肤。观察动物从手术和麻醉中恢复的情况。在整个实验中，每天至少观察动物两次和脑内肿瘤进展有关的症状发展。将显示出症状加重的动物(变瘦、失去平衡、脱水、无食欲、失去协调、停止梳毛活动和/或明显失重)人道主义地宰杀，剖切所关心的器官和组织。
腹膜内模型  在合适的培养基内生长细胞。收取细胞并在无菌的PBS或者无FBS的培养基内洗涤，重新悬浮至合适的浓度，注射到合适品系的鼠的腹膜内腔中。逐日观察鼠的腹水形成情况。当个别动物增重40％或者腹膜内肿瘤负担开始造成动物的过度紧张和疼痛时，将其宰杀。
6.3.2.体内VEGF小球模型
在以下实施例中，采用小球模型试验化合物对抗FLK-1受体和对抗与血管形成有关的病症的活性。在这种模式里，将VEGF装入长时间释放的小球中，皮下植入裸鼠的腹部，以便诱发小球周围的“变红”响应和随即肿胀。然后可以将可能的FLK-1抑制剂在甲基纤维素中植入到VIEGF小球附近，以便确定这类抑制剂是否可用来抑制“变红”响应和随后的肿胀。
材料和方法  采用以下材料和方法：
1)VEGF-人类重组体冷冻干燥产品是市售商品，可以由Peprotech公司购得(Princeton Business Park，G2；P.O.box 275，RockyHill，NJ 08553)。
2)装入释放21天的小球内的VEGF由Innovative Research ofAmerica得到(Immovative Research of America，3361ExecutiveParkway，P.O.Bax 2746，Toledo，Ohio 43606)，使用了获得专利的基质驱动释放体系。小球包装成每只球0.20、0.21或2.1μg VEGF。这些剂量近似为每天释放10和100ng VEGF。
3)甲基纤维素
4)水(无菌)
5)甲醇
6)合适的药物/抑制剂
7)10cm培养板
8)parafilm薄膜
然后按照以下方案进行VEGF小球模型试验：
1)将购自Peprotech的VEGF寄到Innovative Research ofAmerica，以便进行定制的小球制备；
2)甲基纤维素按1.5％(w/v)配制在无菌水中；
3)将药物溶于甲醇中(常用浓度范围＝10到20mg/ml)；
4)将无菌的parafilm薄膜放在无菌的10cm培养板中；
5)将150μl药物甲醇溶液加到1.35ml 1.5％甲基纤维素中，充分混合/涡动；
6)将每份25μl的均化物放在parafilm薄膜上，干燥成园片；
7)通过吸入异氟烷将鼠(6-10周，Balb/c无胸腺nu/nu，雌性)麻醉；
8)在腹部皮下植入VEGF小球和甲基纤维素园片；和
9)在24小时和48小时对鼠的变红和肿胀响应评分。
在此实施例中使用的具体实验设计为：
N＝4个动物/组
对照样：VEGF小球+药物空白对照剂
        VEGF空白对照剂+药物小球
实验结果：本发明化合物预期显示出符合此试验的活性。
6.3.3.乳房脂垫模型
因为很多RTK，例如HER 2受体，在乳房癌中的作用已被确认，所以乳房脂垫模型特别适用于测定化合物抑制这类RTK的效力。通过将肿瘤细胞直接植入所关心的部位，原位模式比皮下模式更准确地反映了肿瘤发育的生物学。人类的乳房细胞系，包括MCF-7，已经被生长在无胸腺鼠的乳房脂垫中。Shafie和Granthem，1981，国家癌症研究所杂志(Natl.Cancer Instit.) 67：51-56；Gottardis等，1988，甾类化合物生物化学杂志(J.Steroid Biochem.) 30：311-314。更具体地说，可以采用以下步骤测定化合物对HER 2受体的抑制作用：
1)将转染了HER-2的MDA-MB-231和MCF-7细胞以各种浓度植入到雌性无胸腺鼠的腋下乳房脂垫中；
2)施用化合物；和
3)在不同的时刻测定肿瘤的生长。
也可以用Western和免疫组织化学分析法分析肿瘤中诸如HER 2等受体的存在。利用工艺中已知的技术，本领域的技术人员可以改动上述步骤，例如使用不同的处理方案。
6.3.4.肿瘤侵染模型
已建立了以下的肿瘤侵染模型，它可以用来评价被看作是选择性抑制KDR/FLK-1受体的化合物的治疗价值和效力。
6.3.4.1.步骤
用8周龄的裸鼠(雌性，Simonsen公司)作为实验动物。肿瘤细胞的植入在层流通风柜中进行。为进行麻醉，腹膜内注射甲苯噻嗪/盐酸氯胺酮混合剂(100mg/kg盐酸氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪)。切开一个中线开口以暴露腹腔(约长1.5cm)，以便注射100μl体积培养基中的107个肿瘤细胞。细胞或是注入到胰腺的十二指肠叶，或是在结肠的浆膜之下。用一条6-0号连续丝线缝合腹膜和肌肉，皮肤用伤口夹闭合。逐日观察动物。
6.3.4.2.分析
2-6周后，根据对动物的大致观察，将鼠宰杀，切下并分析局部肿瘤向各器官(肺、肝、脑、胃、脾、心、肌肉)的转移(测定肿瘤大小、侵染等级、免疫化学和原位杂交)。
6.3.5.结果
由上述体内试验得到的各化合物的结果列在下面的表5中：
                        表5
                   体内试验数据
  化合物(实施例)   EDH4-VEGF抑制％，用量(mg/kg)
  27   56％，75-----------------------50％，7563％，50
  22   42％，75-------------------------42％，50/50
  4942   46％，5047％，25
  12   50％，25-------------------------57％，37.5/37.5
  14   45％，50-------------------------65％，50
  15   47％，50-------------------------65％，50
本发明的范围不受举例说明的实施方案的限制，这些实施方案只是作为本发明单一方面的示例说明，任何功能上等效的克隆、DNA或氨基酸序列均在本发明的范围之内。确实，对于本领域的技术人员，除了这里所叙述的以外，可以根据上面的说明和附图作出各种修改。这些修改都属于所附权利要求的范围之内。
本文引用的所有文献都因此全文引用作为参考。

Claims (6)

1.一种化学式如下的化合物及其可药用的盐
Figure C961906160002C1
其中R1是H；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
A是一个五元杂芳环，选自噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、2-磺酰呋喃、4-烷基呋喃、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，2，5-噁二唑、1，3，4-噁二唑、1，2，3，4-噁三唑、1，2，3，5-噁三唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，2，5-噻二唑、1，3，4-噻二唑、1，2，3，4-噻三唑、1，2，3，5-噻三唑和四唑，它们任选地在一个或多个位置上被以下基团取代：烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
R是H、烷基或芳基；和
R′是H、烷基或芳基；
其中在以上定义中：
烷基是指具有1-12个碳原子的直链、支化或环状饱和脂肪族烃基，并且任选地被一个或多个选自以下的取代基所取代：羟基、氰基、＝O、＝S、NO2、卤素、N(CH3)2、氨基和-SH；
芳基是指具有至少一个具有共轭π电子体系的环的芳香族基团，包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，并且任选地被一个或多个选自以下的取代基所取代：卤素、三卤甲基、羟基、SH、OH、NO2、胺基、硫醚、氰基、烷氧基、烷基和氨基；
烷芳基是指与芳基基团共价键合的烷基；并且烷氧基、芳氧基和烷基芳氧基分别是指-O-烷基、-O-芳基和-O-烷芳基；
条件是排除以下化合物：
3-(吡咯-2-基亚甲基)-2-二氢吲哚酮；
3-(5-氯-3，4-二甲基吡咯-2-基亚甲基)-2-二氢吲哚酮；
3-(3，5-二甲基-4-乙基吡咯-2-基)-2-二氢吲哚酮；
3-(3，5-二甲基-4-乙氧羰基吡咯-2-基)-2-二氢吲哚酮；
2-[[[1-乙基-2，3-二氢-2-氧代-3-(1H-吡咯-2-基亚甲基)-1H-吲哚-5-基]氧]甲基]苯甲酸；
3-[(1-甲基-5-硝基-咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
3-(噻吩-2-基亚甲基)-2-二氢吲哚酮；
3-[(2-丁基-1H-咪唑-4-基)亚甲基]-2，3-二氢-2-氧代-1H-吲哚-7-乙酸乙酯；
3-[[2-丁基-1-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-1H-咪唑-4-基]亚甲基]-2，3-二氢-2-氧代-1H-吲哚-7-乙酸乙酯；
5-苯甲酰基-3-[(咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
6-二乙基氨基-3-[(异噻唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
5-氯-3-[(噻唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；和
6-硝基-3-[(吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮。
2.一种化学式如下的化合物及其可药用的盐
其中R1是H；
R2是O或S；
R3是氢；
R4、R5、R6和R7各自独立地选自以下基团：氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
A是一个五元杂芳环，选自吡唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、2-磺酰呋喃、4-烷基呋喃、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，2，5-噁二唑、1，3，4-噁二唑、1，2，3，4-噁三唑、1，2，3，5-噁三唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，2，5-噻二唑、1，3，4-噻二唑、1，2，3，4-噻三唑、1，2，3，5-噻三唑和四唑，它们任选地在一个或多个位置上被以下基团取代：烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤甲基、S(O)R、SO2NRR′、SO3R、SR、NO2、NRR′、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、NHC(O)R、(CH2)nCO2R和CONRR′；
n是0-3；
R是H、烷基或芳基；和
R′是H、烷基或芳基；
其中在以上定义中，烷基、芳基、烷芳基、烷氧基、芳氧基和烷基芳氧基具有与权利要求1中相同的定义，
条件是排除以下化合物：
6-二乙基氨基-3-[(异噻唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；和
5-氯-3-[(噻唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮。
3.权利要求1或2的化合物，选自以下化合物：
3-[(3-甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
3-[(3，4-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
3-[(2-甲基噻吩-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
3-[(3-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
3-([4-(2-甲氧羰基乙基)-3-甲基吡咯-5-基]亚甲基)-2-二氢吲哚酮；
3-[(4，5-二甲基-3-乙基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
3-[(5-甲基咪唑-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
5-氯-3-[(5-甲基噻吩-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮。
3-[(3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-5-硝基-2-二氢吲哚酮；
3-[(3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
5-氯-3-[(3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；和
3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮；
或其可药用的盐。
4.权利要求3的化合物，其中所述化合物是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮或其可药用的盐。
5.一种药物组合物，含有权利要求1-4中任何一项所述化合物或其可药用的盐，以及可药用的载体或赋形剂。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述药物组合物适合于非肠道或皮下给药，或者配制成储存制剂。
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