DE1044362B

DE1044362B - Verfahren zur Entwicklung von abgeschwaechten infektioesen Hundehepatitisviren

Info

Publication number: DE1044362B
Application number: DEA29146A
Authority: DE
Inventors: Jerrell Bemis Emery
Original assignee: ALLIED LAB Inc
Current assignee: ALLIED LAB Inc
Priority date: 1958-03-28
Filing date: 1958-03-28
Publication date: 1958-11-20

Description

Verfahren zur Entwicklung von abgeschwächten infektiösen Hundehep atitisviren Die Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung von abgeschwächten infektiösen Hundehepatitisviren in Gewebskulturen von trypsinierten Schweinenieren und auf die Herstellung von Impflösungen aus den geschwächten infektiösen Hundehepatitisviren, die in trypsinierten Gewebskulturen von Schweinenieren entwickelt wurden.
Die Abschwächung von infektiösen Hundehepatitisviren durch serienweises Passieren durch Gewebskulturen von Hundenieren wurde von Fieldsteel und Mitarbeitern A. Howard, Emery, Jerrell B., in »Society for Experimental Bioloçr and Medicine«, 1954, Vol. 86, S. 819 bis 823, beschrieben.
Fieldsteel und Mitarbeiter haben auch die Herstellung einer Impflösung aus ihren abgeschwächten infektiösen Hundehepatitisviren beschrieben, die für die Immunisierung von Hunden gegen infektiöse Hepatitis geeignet sind, ohne die üblichen phathologischen Symptome wider Krankheit hervorzurufen.
Fieldsteel und Mitarbeiter versuchten die Entwicklung von virulenten infektiösen Hundehepatitisviren in Schweinenieren-Explantaten, die nach einem Plasma-Klumpenverfahren hergestellt waren, aber sie schlossen hieraus, daß kein Wachstum des Virus eingetreten sei. Es wurden nun Versuche durchgeführt, virulenten ICH-Virus (infektiöser Hundehepatitisvirus) in Gewebskulturen aus Schweinenieren zu entwickeln unter Verwendung des Plasma-Blumpenverfahrens sowie auch unter Verwendung der trypsinierten Gewebskulturen und Schweinenieren, aber ohne Erfolg. Völlig überraschend wurde jedoch gefunden, daß infektiöse Hundehepatitisviren, die durch vielfache Passage durch Hundenierenkulturen geschwächt waren, in Gewebskulturen von trypsinierten Schweinenieren entwickelt werden können.
Die Feststellung, daß geschwächte ICH-Viren in trypsinierten Schweinenierenkulturen entwickelt werden können, ist von wesentlicher technischer Bedeutung. Schweinenieren können von den Schlachthöfen zu weit niedrigeren Preisen als Hundenieren erhalten werden. Um Hundenieren zu gewinnen, ist es notwendig, daß Hunde geopfert werden. Der Rest des Hundefleisches stellt einen Totalverlust dar. Dagegen ist die Fleischmasse von Schweinen, aus denen die Schweineniere gewonnen werden kann, als menschliches Nahrungsmittel verwendbar.
Die Herstellung von Impflösungen durch Entwicklung des geschwächten ICH-Virus in Schweinenierengeweben vermeidet die Möglichkeit einer Verunreinigung des Produktes mit Histoplasmosis und anderen Hundekrankheiten, die normalerweise in Hundenieren, aber normalerweise bei Schweinen nicht vorkommen.
Bei Durchführung des Verfahrens zur Entwicklung von geschwächten ICH-Viren werden trypsinierte Schweinenierenkulturen in einem geeigneten Kulturmedium mit ICH-Viren, die durch mindestens fünfzig Passagen in Gewebekulturen aus Hundenieren geschwächt wurden, beimpft. Nach einer geeigneten Verweilzeit, 5 bis 7 Tage, werden die virushaltigen Flüssigkeiten gesammelt. Die flüssige Masse, die eine hohe Konzentration an geschwächtem Virus enthält, kann direkt als Impflösung verwendet werden und ist, wenn sie unter sterilen Bedingungen aufbewahrt wird, zur Erzielung einer aktiven und anhalten.den Immunität von Hunden gegen ICH-Viren gegeignet. Falls gewünscht, kann die flüssige Impflösung aus dem gefrorenen Zustande getrocknet werden. Die getrocknete Masse kama später mit einem flüssigen Verdünnungsmittel zur Verwendung als Impflösung verdünnt werden. Die Art, in der die Erfindung durchgeführt wird, wird des näheren beschrieben in Verbindung mit den nachstehenden speziellen Versuchen. Diese speziellen Versuche sind als Beispiel und ohne Begrenzung gegeben.
Entwicklung von ICH-Virus in trypsinierten S chweinenierengewebskulturen Es wurden trypsinierte Kulturen von Schweinenieren unter Verwendung des von Dulbecco und Vogt beschriebenen Verfahrens in J. Exp. Med., 1954, V. 99, S. 167, wie es von J. Younger in »Proc. Soc.
Exp. Biol. & Med.«, 1954 85, S. 202, modifiziert wurde, hergestellt. Das bei der Herstellung der Kulturen und ihrer Aufbewahrung verwendete Medium bestand aus 8 Teilen Earles Solution (3 Teile Earles, Rest Salzlösung aus 6,8 g Natriumchlorid, 0,40 g Kaliumchlorid, 0,20 g Calciumchlorid, 0,20 g Magnesiumsulfat, 0,125 g saurem Natriumphosphat, 1,00g Glucose, 2,20g Natriumbicarbonat und Wasser zur Auffüllung auf 1000 ccm), 1 Teil 50/oiges Lactalbuminhydrolysat und 1 Teil inaktiviertes Pferdeserum. Zur Einleitung und Haltung von trypsinierten Schweinenierenkulturen haben sich auch andere Medien als befriedigend erwiesen: a) 8 Teile Earles-Simms-Lösung (3 Teile Earles BSS auf 1 Teil Ultrafiltrat aus Ochsenserum), 1 Teil 5°/o Lactalbumin und 1 Teil Pferdeserum. b) Serum Nr. 199 nach Morgan, Morton und Parker in »Proc. Soc. Exp. Biol. & Med.«, 1950, 73, S. 1 bis 8, ergänzt durch 100/o inaktiviertes Pferdeserum.
Virus: Der Original-Ausgangsvirus war ein modifizierter ICH-Virus, bezeichnet mit TC 70 LD2044, mit insgesamt hundertvierunddreißig Passagen durch trypsinierte Kulturen aus Hundenierengeweben, wie voll Fiel d s teel und Mitarbeiter beschrieben ist. Die trypsinierten Schweinenierengewebe wurden in 2 ccm aus Earlscher Lösung, Lactalbumin und Pferdeserum aufbewahrt Der pH-Wert des Mediums wurde auf 7,6 bis 7,8 eingestellt, wobei die Entwicklung in Wälztrommeln bei 350 C durchgeführt wurde. Die Passagen durch die Schweinenierenkulturen wurden in Intervallen von 3 bis 7 Tagen durch Beimpfung von frischen trypsinierten Kulturen aus Schweinenieren mit 0,2 ccm unverdünnter, gesammelter Flüssigkeit aus der voraufgehenden Passage durchgeführt. Die aufgefangenen und gesammelten Flüssigkeiten wurden auch auf Hundenierenkulturen überimpft, und zwar bei jeder Passage, um das Vorhandensein und bzw. oder das Überleben des Virus zu kontrollieren.
Es wurde ein cytopathogener Effekt, ähnlich dem vom ICH-Virus mit Hundenierenkulturen, bei der fünften Passage durch Schweinenierenkulturen erzielt. a) Dieser Effekt, obgleich er an den ICH-Virus-Effekt erinnert, führt niemals zur vollständigen Zerstörung aller Zellen bei den ersten Passagen, ergibt jedoch sporadisch bei späteren Passagen eine vollständige Zerstörung. b) Der erzeugte cytopathogene Effekt wurde, wenn irgend möglich; als ein Kriterium für die Zeitintervalle für die Vornahme weiterer Passagen verwendet; wenn 75 bis 1000/o der Epithelzellenmasse durch den Virus angegriffen oder zerstört waren, wurden die Passagen vorgenommen. tinabhängig von der Menge des auftretenden cythopathogenen Effektes lag der ICH-Virus immer mit einem Titer von mindestens 105,0 vor.

Die Identifizierung dieses Virus als ICH wurde bei der siebenten, dreizehnten, siebzehnten, vierunddreißigsten und fünfundvierzigsten Gewebskulturpassage vorgenommen, wodurch der cytop athogene Effekt in Schweine- und Hundenierenkulturen entwickelt wurde. Neutralisiert' wurde durch ein bekanntes spezifisches- ICH-Antiserum. ~~ Titrationen des Virusgehaltes wurden in Hundenierenkulturen wie folgt durchgeführt:

Trypsinierte ID-Index 50 Verdünnung

Srhweinenieren- des Virus der Angehäufte

- passagen - des Virus Ausgangs- Verdünnung

7 10-4,0 10-7,0 10-11

9 10-5,3 1O 90 10-14,3

10 10-5,0 10:tO 105

45 106,5 10-15

Wie in der obigen Tabelle gezeigt, enthält die fünfundvierzigste Passage durch trypsinierte Schweinenierenkulturen große Mengen des Virus, d. h. 104-õ Das flüssige Material mit einer hohen Konzentration aus geschwächtem Virus, die aus dem Gewebematerial abgetrennt wurde, ergibt eine flüssige Impflösung mit einer hohen Konzentration an geschwächtem ICH-Virus. Die gesammelte flüssige Impfiösung kann in gefrorenem Zustand getrocknet werden, wobei man ein getrocknetes Impfmaterial erhält, das später mit destilliertem Wasser für die Verwendung bei der Impfung von empfänglichen Hunden verdünnt werden kann.

Die so erhaltenen Impflösungen vermögen die Herstellung von schützenden Antikörpern für infektiöse Hundehepatitis anzuregen, vergleichbar denen, die bei natürlichen Infektionen erzeugt werden, wenn man sie nicht immunen Hunden injiziert, ohne daß sie die üblichen pathologischen Symptome infektiöser Hundehepatitis hervorrufen. Der bei den obigen Untersuchungen verwendete abgeschwächte ICH Virus wurde durch Reihenpassage durch Gewebskulturen aus Hundenieren abgeschwächt. An Stelle hiervon können auch geschwächte ICH-Viren verwendet werden, die auf Gewebekulturen von anderen Hundegeweben, z. B. aus Uterus oder Testikeln, entwickelt wurden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur ~Entwicklung- von abgeschwächten infektiösen Hundehepatitisviren, bei dem man eine Impfmasse eines infektiösen Hundehepatitisvirus in eine Gewebskultur aus trypsinierter Schweineniere in einer Nährflüssigkeit, die das Wachstum und bzw. oder die Erhaltung von Schweinenierenzellen fördert, einführt, dieses die Nährflüssigkeit enthaltende Gewebe entwickelt, bis ein ausreichendes Wachstum des Virus eingetreten ist, um eine nutzbare Konzentration zu erzeugen, und dann eine flüssige Masse mit dem Virus sammelt, dadurch gekennzeichnet, daß ein infektiöser Hundehepatitisvirus verwendet wird, der vor seiner Entwicklung durch eine Reihenpassage durch Gewebskulturen aus Hundenieren geschwächt wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zahl der Reihenpassagen mindestens fünfzig beträgt.