DE2805311A1

DE2805311A1 - Respiratorische synzytial-vakzine

Info

Publication number: DE2805311A1
Application number: DE19782805311
Authority: DE
Inventors: Eugene Bernard Buynak; Maurice Ralph Hilleman
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1977-02-09
Filing date: 1978-02-08
Publication date: 1978-09-21
Also published as: FR2385799B1; ES466758A1; CH639420A5; FR2385401A1; NL7801060A; PT67632A; CA1097219A; IT7847914A0; JPS53121924A; AR218895A1; EG13482A; FR2385401B1; FR2385799A1; PT67632B; GB1560185A

Description

DR.-ING. WALTER ABITZ ,, ^Mnaa~· ⁸~ Februar 1978

P±t. DIETER F. MORF DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER

Plenzenauerstraße Telefon 983222

atentanwälte Telegramme iChemindusMündien

Telex: CO} 523992 15 988Y ■

MERCK & CO., INC. Railway, New Jersey, V.St.A.

Respiratorische Synzy-fcial-Vakzine

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Die Erfindung "befasst sich in allgemeiner Hinsieht mit der Adaptation und Progagierung des respiratorischen Synzytial-Virus in menschlichen diploiden Lungen-Fibro blast en. Im besonderen betrifft die Erfindung die Entwicklung einer lebend abgeschwächten respiratorischen Synzytial-Virus-Vakzine nach Reihenpassage in menschlichen diploiden Lungen-Fibroblasten. Die ursprünglich aus einer einzelnen menschlichen Lunge erhaltenen WI-38-Fibro blast en wurden biologisch, biochemisch, virologisch und genetisch weitgehend charakterisiert. Die MRC-5-F ibro blas ten, die ebenfalls aus einer einzelnen menschlichen Lunge (jedoch von einer anderen Person) gewonnen wurden, sind in analoger Weise standardisiert. WI-38-Fibroblasten sind in Exper. Gell Res. 25 (1961), Seite 585 beschrieben und bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung "ATCC CCL-75" hinterlegt. MRC-5-Fibroblasten sind in Nature 227 (11. Juli 1970), Seite 168 beschrieben und bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung "ATCC CCL-171" hinterlegt. Die Propagierung von menschlichen diploiden Lungen-Fibroblast en kann nach einer beliebigen der in der Literatur beschriebenen Standardmethoden erfolgen. Beispielsweise können menschliche diploide Lungen-Pibroblasten in Glasflaschen unter Verwendung von mit 10 fo unerhitztem Kalbs serum ergänztem BME (GIB-Diploid) als Wachstums- bzw. Kultivierungsmedium verwendet werden. Nach 48 bis 72 Stunden langer Inkubation bei 36⁰C können die Kulturen für die Reihenpassage oder Vakzineherstellung verwendet werden. Mit der z.B. subkutan verabreichten erf indungsgemäss en Vakzine können Menschen gegen durch den respiratorischen Synzytial-Virus verursachte Erkrankungen immunisiert werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst die Stufen A) der Isolierung des virulenten Virus in irgendeiner von verschiedenartigen Zellen in Kultur und dessen Adaptation an menschliche diploide Lungen-Pibroblasten, B) die Entwicklung des

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abgeschwächten bzw. attenuierten Lebendvirus durch mehrere Reihenpassagen in menschlichen diploiden Lungen-Fibroblasten und C) die Herstellung der Vakzine aus diesem attenuierten Lebendvirus. Diese Verfahrensstufen werden im folgenden gesondert erläutert.

A) Isolierung und Adaptation des virulenten Virus

Die Isolierung und Adaptation des respiratorischen Synzytial-Virus kann in menschlichen diploiden Lungen-Pibroblasten unter Verwendung eines Virus erfolgen, der zuvor in bekannter Weise in einer anderen Zellkulturart (beispielsweise Affennierenzellen) propagiert wurde. Die Isolierung in einer Zellkultur (wie Affennierenzellen) kann aus einem klinischen Material (z.B. einem Hals- oder Rachenabstrich) stattfinden. Man kann die Isolierung durch eine oder mehrere Reihenpassagen in einer solchen Zellkultur durchführen. Nach der Isolierung wird der Virus etwa 3 his etwa 30 Reihenpassagen (vorzugsweise etwa 4 bis etwa 15 Reihenpassagen) in menschlichen diploiden Lungen-Fibroblasten unterworfen. Diese Passagen dienen zur Adaptation und Attenuierung des Virus. Die Inkubation der infizierten Kulturen in menschlichen diploiden Lungen-Fibroblasten kann bei einer beliebigen Temperatur zwischen etwa 30°C und etwa 38 C, vorzugsweise von etwa 30 bis etwa 34°C (am besten bei etwa 32°C), oder von etwa 35 bis etwa 3O⁰C (am besten bei etwa 36 C) vorgenommen werden.

B) Entwicklung der attenuierten respiratorischen Synzytial-Lebendvirus-Vakzine

Das gemäss Stufe A) isolierte und adaptierte Virus wird in Glasflaschen gegeben, welche menschliche diploide Lungen-Fibroblasten enthalten. Als Kulturmedium kann ein beliebiges, das Zellwachstum förderndes Medium verwendet werden, beispielsweise das bekannte Eagle-Basalmedium (BME) oder Eagle-Minimalessentiellmedium (MEM) in abgestimmter Eagle-Salzlösung (BSS) mit einem Zusatz von vorklassiertera Kalbsserum. Nach der Zugabe

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des Virus werden die infizierten Zellkulturen in Reihenpassagen bei Temperaturen von etwa 30 "bis etwa 38⁰C so oft inkubiert, dass das Virus attenuiert wird, jedoch seine Antigenwirkung und Immunogenwirkung behält. Im allgemeinen sind etwa

3 bis etwa 30 Reihenpassagen bei Temperaturen von etwa 30 bis etwa 38°C, vorzugsweise von etwa 30 bis etwa 34°C (am besten bei etwa 32⁰C), oder von etwa 35 bis etwa 38⁰C (am besten bei etwa 36°C) erforderlich. Das Virus wird vorzugsweise in etwa

4 bis etwa 15 Reihenpassagen inkubiert. Während dieser Paaagen vermehrt sich das Virus stark und wird attenuiert bzw. abgeschwächt.

Für die vorgenannten Eeihenpassagen verwendet man ein unverdünntes oder verdünntes Inoculum und sammelt mehrere Ausbeuten in verschiedenen Zeit abständen. Die Titrationen werden in HEP-2-Zellkulturen entweder in Röhren oder Falcon-Mikrotiterplatten vorgenommen.

Das gewonnene ("geerntete") Virus wird dann zur Beibehaltung seiner Wirkung im gefrorenen Zustand oder bei niedriger Temperatur aufbewahrt. Vor dem Einfrieren setzt man einen geeigneten Stabilisator oder eine Kombination geeigneter Stabilisatoren (wie Sorbit oder Gelatine) in passenden, durch Stabilitätstests an gefrorenem und lyophilisiertem Virusprodukt bestimmten Mengen zu.

C) Herstellung der Vakzine aus dem attenuierten Virus

Es zeigt sich, dass das nach wiederholten Reihenpassagen (typischerweise etwa 3 bis etwa 30 Passagen) gewonnene respiratorische Synzytiäl-Virus für Affen und Nagetiere nicht pathogen ist, beim Menschen wenig oder keine klinischen Reaktionen verursacht und die Bildung eines zufriedenstellenden Anteils an neutralisierendem Antikörper bewirkt. Nach Titration zur Ermittlung seiner Wirkung wird das Virussammelpraparat aufgeteilt und in passende Ampullen für die Verwendung abgefüllt.

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Das Produkt kann in gefrorenem Zustand gelagert werden und wird vorzugsweise im gefrorenem Zustand getrocknet und unter Feuchtigkeitsausschluss aufbewahrt.

Die nachstellenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie Jedoch zu beschränken.

Beispiel

Ein respiratorisches Synzytial—Virus wird aus einer Raehenabstrichprobe isoliert. Dieses anfängliche Inoculum wird zwei Passagen in einer Äffennierenzellkultur und vier Passagen in menschlichen diploiden WI-38-Fibroblasten unterworfen. Die menschlichen diploiden WI—38—Lungen—Fibroblasten werden in Glasflaschen hergestellt, wobei man als Wachstumsmedium BME mit einem Zusatz von 10 $ unerhitztem Kalbsf etalserum verwendet. Zwei Tage nach Beginn der Kultivierung dekantiert man das Wachstumsmedium und beimpft die Kulturen pro Flasche mit 5 ml des unverdünnten Impfvirus der vierten Passage (nach Bedarf kann man verdünntes Impf virus verwenden). Nach einer Adsorptionsperiode von 1 Stunde bei 30 bis 34-⁰C gibt man in jede Flasche .100 ml MEM mit einem Gehalt von 2 ?£ unerhitztem Kalbsfetalserum und inkubiert nochmals bei 30 bis 34 C- Drei bis vier Tage nach der Beimpfung wäscht man die Flaschenkulturen viermal mit Hank-BSS (100 ml pro Waschvorgang). Nach dem Waschprozess gibt man in jede Flasche 100 ml MEM, das einen geeigneten Virus stabilisator (z.B. menschliches Albumin) enthält, und inkubiert die Kulturen bei 30 bis 34°C. Dem Wachstums- und Erhaltungsmedium wird Neomycin in einer Konzentration von 50 mcg/ml einverleibt. Mehrere Ausbeuten werden in zwei- bis viertägigen Intervallen gesammelt, und die FIaschenkulturen werden wiederum mit frischem, einen Stabilisator enthaltendem Erhaltungsmedium versorgt. Ein aus einem Gemisch aus gleichen Teilen Sorbit und Gelatine bestehender Virusstabilisator wird zugesetzt, wonach das Präparat aus—

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gefroren (durch "shell freezing··) und bei -7O⁰C (elektrischer Betrieb) aufbewahrt. Eine oder mehrere geeignete Ausbeuten werden nach Beendigung der Titrationen zur Bestimmung der Infektionswirkung (Infektivität) ausgewählt. Das ausgewählte Material wird aus dem Gefrierschrank entnommen und aufgetaut. Eine Probe davon wird für die Kontrolle und einen Sicherheitstest abgezweigt. Die restliche Flüssigkeit wird geklärt,und man entnimmt eine Probe für den Affen-Sicherheitstest. Die Flüssigkeiten werden in einzelne Ampullen verteilt und lyophilisiert. Nach dem Lyophilisierungszyklus werden die Ampullen zugestöpselt, dicht verschlossen und zur Wiederzubereitung als Vakzine durch Zugabe von sterilem Wasser (Wasser für Injektionszwecke, U.S.P.) aufbewahrt.

Die Wirkung des Produkts beruht auf der Infektivitäts-Titration in HEP-2-Zellkultur.

B e i s-p i el 2

Man wiederholt das Verfahren von Beispiel 1 mit der Ausnahme, dass man neun Reihenpassagen in menschlichen diploiden WI-38-Fibroblasten anstatt vier solcher Passagen durchführt.

B e i spiel 3

Man wiederholt das Verfahren von Beispiel 1 mit der Ausnahme, dass man das respiratorische Synzytial-Virus einer Inkubationstemperatur im Bereich von 35 bis 38°C anstatt im Bereich von 30 bis 34⁰G unterwirft. .

B e i s ρ i' e 1 4

Man verabreicht acht Kindern ohne vorangehende Infektion mit respiratorischem Synzytial-Virus parenteral eine Dosis der attenuierten respiratorischen Synzytial-Virus-Vakzine von Beispiel 1. Bei praktisch allen Kindern entwickelt sich inner-

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halb von 6 Wochen nach der Impfung ein signifikanter Anteil an neutralisierenden Antikörpern. Es kommt zu keinen ungünstigen klinischen Reaktionen.

Beispiel 5

Elf Kindern ohne vorangehende Infektion mit respiratorischen! Synzytial-Virus wird parenteral eine Dosis der attenuierten respiratorischen Synzytial-Virus-Vakzine von Beispiel 2 verabreicht. Bei praktisch allen Kindern entwickelt sich innerhalb von 6 Wochen nach der Impfung ein signifikanter Anteil an neutralisierenden Antikörpern. Es treten keine ungünstigen klinischen Reaktionen auf.

Beispiel 6

Proben von gemäss Beispiel 1 und 2 hergestellten Vire.n werden eingefroren und über 18 Monate bei -70⁰C aufbewahrt. Nach dem Auftauen der Proben erweist sich deren Wirkung als praktisch unverändert .

Beispiel 7

Proben von gemäss Beispiel 1 und 2 hergestellten Viren werden lyophilisiert und über 18 Monate bei-20⁰C aufbewahrt. Nach der Wiederzubereitung erweist sich die Wirkung der Proben als praktisch unverändert.

Ende der Beschreibung

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Claims

PATENTANSPR Ü CH E

1. Verfallren zur Herstellung eines attenuierten respiratorischen Synzytial-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man einen respiratorischen Synzytial-Virus einer Reihenpassage in menschlichen diploiden Lungen-Fibroblasten "bei einer Inkubationstemperatur von etwa 30 bis etwa 38⁰C unter Anwendung einer Anzahl von Passagen unterwirft, die eine Attenuierung des Virus "bewirkt, jedoch dessenAntigenwirkung und Inmunogenwirkung aufrechterhält, und das erhaltene Virus gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man etwa 3 bis etwa 30 Reihenpassagen anwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man etwa 4 bis etwa 15 Reihenpassagen anwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als menschliche diploide lungen-Pibroblasten WI-38-Pibroblasten verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation bei etwa 30 bis etwa 34°C durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation bei etwa 35 bis etwa 38⁰C durchführt.

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7· Zusammensetzung, enthaltend das nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 "bis 6 hergestellte attenuierte Virus in gefrorener Form zusammen mit einem Stabilisator.

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8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator Sorbit oder Gelatine oder eine Kombination von Sorbit und Gelatine ist.

9. Zusammensetzung, enthaltend das nach dem Verfahren gemäss Anspruch. 1 bis 6 hergestellte attenuierte Virus in lyophilisierter Form zusammen mit einem Stabilisator.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator Sorbit oder Gelatine oder eine Kombination von Sorbit und Gelatine ist.

11. Respiratorische Synzytial-Lebendvirus-Vakzine, enthaltend ein attenuiertes, jedoch antigen und immunogen wirksames respiratorisches Synzytial-Virus.

12. Vakzine nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Virusstabilisator enthält.

13. Vakzine nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator Sorbit oder Gelatine umfasst.

14. Vakzine nach Anspruch 11 in lyophilisierter Form.

15. Vakzine nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Stabilisator enthält.

16. Vakzine nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator Sorbit oder Gelatine umfasst.

17. Vakzine nach Anspruch 11 in gefrorener Form.

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18. Vakzine nach. Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Stabilisator enthält,

19. Vakzine nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator Sorbit oder Gelatine -umfasst.

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