DE2362067C2

DE2362067C2 - Temperaturempfindliche, nicht-pathogene, infektiöse Rinder-Rhinotracheitis-Virusstämme, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung von Lebendimpfstoffen

Info

Publication number: DE2362067C2
Application number: DE2362067A
Authority: DE
Inventors: Michele Ceroux Mousty Lobmann; Nathan Brüssel/Bruxelles Zygraich
Original assignee: Individual
Current assignee: Smithkline Beckman - Animal Health Products Sa
Priority date: 1972-12-18
Filing date: 1973-12-13
Publication date: 1985-11-28
Also published as: IE38638L; CA961410A; CH590929A5; DE2362067A1; JPS5812258B2; DD110516A5; GB1413614A; AR200895A1; US3907986A; IE38638B1; FR2210387B1; NL7317251A; ZA738918B; ES421549A1; YU328073A; JPS504233A; AU6300873A; FR2210387A1; HU169119B; BE808708A

Description

Die Erfindung ist durch die Ansprüche 1, 2 und 6 definiert; die Ansprüche 3, 4 und 5 nennen Ausgestaltungen des Verfahrens nach Anspruch 2.

Es sind bereits verschiedene Infektlöse Rinder-Rhinotracheitls-(IBR)-Lebendvlruslmpfstoffe bekannt. Diese

Impfstoffe zeigen jedoch eine ausgesprochene Restpathogenltät wegen der ungehinderten Vermehrung des Virus in den inneren Organen des Tieres, wodurch z. B. bei trächtigen Kühen Fehlgeburten verursacht werden; vgl.

D. G. Max Kercher and E. M. Wade, J. Amer. vet. med. Ass., Bd. 144 (1964), 136-142, und C. F. Flaminini und G. C. Allegrl, La Nuova Veterlnarla, Bd. 45 (1969), 377-383.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, genetisch stabile temperaturempfindliche (ts), nlcht-pathogene Infektlöse Rlnder-Rhinotracheitls-Vlrusstämme zu schaffen, die sich zur Herstellung von Lebendimpfstoffen eignen, da sie nicht die Pathogenltät der bekannten IBR-Viruslmpfstoffe aufweisen. Diese Lebendimpfstoffe werden Intranasal verabreicht. Die in ihnen enthaltenen IBR-Virusstämme vermehren sich nur lokal in den oberen Atemsvegcn der Tiere, ohne daß eine nachweisbare Virusvermehrung an den wärmeren Stellen des Organismus, d. h. in den inneren Organen der Tiere, auftritt.

Zur Herstellung der nlcht-pathogenen IBR-Vlrusstämme, die sich zur erfindungsgemäßen Impfstoffherstellung eignen, kann als Ausgangsmaterial entweder ein aus einem klinischen Fall direkt Isolierter IBR-Vlrusstamm oder ein nach Durchführung von Serienpassagen In Gewebekulturen erhaltener IBR-Vlrusstamm verwendet werden. Die Serienpassagen können z. B in primären Rlndernleren-(PBK)-Zellkulturen bei Temperaturen von 30 bis 32" C (± Γ C) durchgeführt werden.

Das infektiöse Rinder-Rhlnotracheitls-Vlrus (Wildstamm) wird erfindungsgemäß während 1 bis 15 Minuten bei einem pH-Wert von 4 bis 5 mit wäßriger salpetriger Säure In Acetatpuffer behandelt, wobei die Konzentration der salpetrigen Säure und der Acetationen im Reaktionsmedium 1 η bzw. n/4 beträgt. Der Kontakt wird vorzugsweise 10 (±1) Minuten bei einem pH-Wert von 4,6 (±0,1) bei Raumtemperatur aufrechterhalten.

Der so erhaltene temperaturempfindliche (ts) Mutantenstamm wird dann isoliert, Indem man Ihn in einer bekannten, das Wachstum von Infektiösem Rinder-Rhinotracheitls-Virus erlaubenden Gewebekultur passagiert. So wird z. B. die Isolierung durch eine Passage in primären fötalen Rlndern!eren-(PFBK)-Zellkulturen vorgenommen, wobei diese Passage 10 bis 20 Tage lang, vorzugsweise 14 (±1) Tage, bei 30°C (±1°C) durchgeführt wird.

Der Isolierte Stamm wird anschließend zur vollständigen Abschwächung 5 bis 15 Passagen In primären Kaninchennleren-(PRK)-Zellkulturen (heterologe Zellkulturen) bei einer Temperatur von 30 bis 37° C (±1°C), vorzugsweise etwa 10 Passagen bei 37° C (± 1° C), unterworfen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es nicht erforderlich, daß die Dauer jeder Serienpassage In den hcte-

rologen Zellkulturen präzise festgelegt 1st. Es Ist hingegen ausreichend, daß das Virus gewachsen Ist, bevor man es erntet und zur Durchführung der nächsten Passage In eine andere Zellkultur überimpft. Es Ist trotzdem nlchl zu empfehlen, die Passagendauer übermäßig zu verlängern; es Ist ratsam, für die erfindungsgemäßen Zwecke die Maximaldauer für jede Serienpassage auf eine Woche festzulegen.

Die so erhaltenen Virusstämme zeigen gegenüber dem als Ausgangsmaterlal dienenden pathogenen IBR-Vlrusstamm keinen wesentlichen Verlust Ihrer Immunisierungsfähigkeit. Die erfindungsgemäßen Vlrusstümmc sind temperaturempfindlich und nicht pathogen; sie stellen wertvolle Infektlöse Rlnder-Rhlnotrachellls-I.cbcnd-

vlruslmpfstoffe dar oder dienen zur Herstellung solcher Impfstoffe, wobei hierfür jede bekannte Technik zur Impfstoffherstcliung und Stabilisierung geeignet ist.

Zur Herstellung eines nicht-pathogenen, infektiösen Rinder-Rhlnotracheitis-Lebendvirusimpfstoffes wird ein temperaturempfindlicher und nicht-pathogener, infekiiöser-Rinder-Rhinotracheitis-Vlrussiamm der Erfindung in einer bekannten, das Wachstum von infektiösem Rlnder-Rhlnoiracheitis-Virus erlautenden Zellkultur s bei einer Temperatur nicht über 37° C (± Γ C) und vorzugsweise von 30 bis 32° C (± 1°C) eine für das Wachstum einer großen Virusmenge ausreichende Zeit inkubiert und das erhaltene Virusmaterial geerntet. Die Inkubation kann z. B. in einer Rinder-Zellenlinienkultur oder einer primären Rinder-Zellkultur, vorzugsweise in einer primären fötalen Rlndernleren-(PFBK)-Zellkuitur durchgeführt werden.

Die so erhaltenen Infektiösen Rinder-Rhinotracheltis-Lebendvirusimpfstoffe werden loka! in den Nasen- >o Rachen-Raum In Dosiereinheiten von mindestens 10"-²TCID₅O (gewebekulturinfektiöse Dosis 50%) und vorzugsweise von 10'-²TCID₃₀ verabreicht.

Zur Verwendung als Impfstoff wird das Virus vorzugsweise in gefriergetrockneter Form aufbewahrt. Aus dem gefriergetrockneten Produkt erfolgt die Wiederherstellung des Impfstoffes ohne weitere Vorbereitungen durch Zugabe von Wasser oder jedem anderen bekannten, pharmakologisch verträglichen Verdünnungsmittel oder '5 Verdünnungsgemisch, das zur Herstellung von In die Nase verabreichbaren Präparationen, wie Tropfen oder SprühmJttel, vervendet werden kann.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein aus einer Kuh mit der akuten klinischen Form von IBR isolierter pathogener IBR-Wildstamm (als Stamm IBR 3760 bezeichnet) wird zunächst 12 Serienpassagen in primären Rlndernieren-(PBK)-Gewebekulturen unterworfen. Der so erhaltene Stamm wird 43 Serienpassagen In primären fötalen Rindernleren-(PFBK)-Gewebekulturen unterworfen. Durch Ernten des Überstands der letzten Passage wird eine Virussuspension erhalten, die 10^6s TClDso pro ml enthält.

1 ml dieser Virussuspension wird mit 0,5 ml einer 4 m wäßrigen Natriumnitrat-Lösung in 0,5 ml 1 m £sslgsäure/Natrlumacetat-Puffer vermischt. Dieser Puffer wurde durch Vermischen von 6 g Eisessig mit destilliertem Wasser bis zu einem Volumen von 100 ml und 3 Volumina einer Lösung von 13,6 g Natriumacetat in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt, wobei beide Lösungen 30 Minuten bei 121° C sterilisiert werden. Der End-pH-Wen beträgt 4,6.

Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Reaktion wird dann durch tropfenweise Zugabe von 1 η Natronlauge unter Rühren bis zu einem pH-Wert von 7,5 (±0,5) beendet. Die pH-Einstellung wird mit Hilfe der Farbänderung des In der Virussuspension enthaltenen Phenolrot-Indikators verfolgt.

Das Medium wird dann sofort 5 Stunden bei +4°C (±1°C) gegen phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung dialysiert. [Diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄ und 0,2 g KH₂PO₃ In destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer Lösung von 0,1 g MgCl₂ · 6H₂O in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ In 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert, der End-pH-Wert liegt zwischen 7,2 bis 7,4.] Die phosphatgepuflerte physiologische Kochsalzlösung wird mehrmals bis zur Entfernung der Nitritionen erneuert. Eine Probe wird titriert, und der Virusvorrat wird bei -70⁰C aufbewahrt. Die Titration wird mittels der Röhrchen-Endpunkt-Verdünnungsmethode In primären fötalen Rindernieren-Gewebekulturen bei der unerlaubten Temperatur von 39° C/ ± 1° C unter Verwendung von zwei Röhrchen pro Verdünnung durchgeführt. Nach 2wöchlger Inkubation wird der Titer bestimmt, und die bei -70⁰C aufbewahrte Probe wird so weit verdünnt, bis sie 1 TCID₅₍)/0,2 ml enthält. Diese verdünnte Probe wird In 28 Röhrchen mit primären fötalen Rindernieren-Gewebekulturen unter Verwendung von 0,1 ml Inokulum pro Röhrchen Inokuliert. Die Röhrchen werden bei der erlaubten Temperatur von 30°C/±l°C inkubiert. Nach verschiedenen Inkubationszeiten von 7 bis 17 Tagen zeigen 10 inokulierte Rörchen einen typischen IBR-cytopathogenen Effekt; diese Röhrchen werden mit den Nummern 1 bis 10 markiert und bei - 70° C aufbewahrt. Es werden Paralleltitrationen dieser 10 positiven Proben bei der erlaubten Temperatur von 30° C und bei der unerlaubten Temperatur von 39° C durchgeführt. Die Proben, die einen bedeutenden Unterschied Im Titer zwischen der erlaubten und der unerlaubten Temperatur aufweisen, werden durch Grenzverdünnungs-Passagen (Passagen, für die die letzte aktive Verdünnung verwendet worden ist) weiter geklont. Auf diese Welse wird durch Vereinigen der positiven Röhrchen bei der 10"'-Verdünnung der Probe Nr. 6 eine Suspension eines Stammes erhalten, der als RLB 105 bezeichnet wird.

Der Test des so erhaltenen Stammes RLB 105 In empfindlichen Kälbern zeigt, daß der Stamm noch eine gewisse Restpathogenität hat. Nach der Intranasalen Inokulation des vorgenannten Stammes wird eine schwache nasale Absonderung beobachtet.

Der Stamm RLB 105 wird dann wie nachstehend beschrieben 10 Passagen In primären Kaninchennieren-Zellkulturen unterworfen: Als Nierenspender dienen 3 bis 6 Wochen alte Kaninchen, die aus einer spezifischen, pathogen-frelen Zucht stammen. Die Nieren werden unter aseptischen Bedingungen entfernt. Nach dem Zerkleinern wird das Nierengewebe In phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. [Diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄ und 0,2 g KH₂PO₄ in destilliertem Wasser (bis auf 800 ml], vermischt mit einer Lösung von 0,1 g MgCl₂ · 6H₂O in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ in 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration « sterilisiert; der End-pH-Wert Hegt zwischen 7,2 und 7,4.] Anschließend wird das Nierengewebe mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung von Trypsin (2,5 g/Llter) trypsinlsiert. Das Gemisch wird dann 10 Minuten ohne Unterbrechung bei 37⁰C gerührt. Sodann wird die Flüssigkeit abgegossen und durch dasselbe

20

Volumen an frischer Trypsinlösung ersetzt. Die Trypsinbehandlung wird dann unter Rühren bis zur Erschöpfung des Gewebes fortgesetzt. Die in der Flüssigkeit suspendierten Zellen werden von Zelt zu Zeit entfernt und dann bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Zellsediment wird so in einem Wachstumsmedium (Eagles Basalmcdium, das mit 10 Prozent auf Virus geprüftem Kalbsserum versetzt ist und pro ml 100 Einheiten Penicillin G-Natrlum und 100 meg Streptomycinsulfat enthalt) suspendiert, daß auf 1 ml etwa 200 000 Zellen kommen.

1 ml-Proben der Zellsuspension werden in sterile Röhrchen gegeben und 4 bis 5 Tage bei 37° C Inkubiert. Am Ende dieser ersten Inkubatlonspp.riode wird das Wachstumsmedium entfernt und pro Röhrchen durch 1,5 ml Eagles Basalmedium ersetzt, das lediglich 296 y-globullnfreies, auf Virus geprüftes Kalbsserum enthält. 10 Röhrchen werden mit 0,2 ml der vorstehend erhaltenen RLB 105-Virussuspension Inokuliert und bei 27° C während 3 bis 5 Tagen Inkubiert. Das Wachstum des Virui zeigt sich an dem typischen cytopathogenen Effekt. Die Serienpassage des Virus auf eine neue primäre Kaninchennieren-Gewebekultur wird durchgeführt, wenn etwa 50% der Zellen den besagten cytopathogenen Effekt aufweisen. Die überstehende Flüssigkeit wird dann geerntet; eine 0,2 ml-Probe des Überstands wird als Inokulum für die nächste Passage verwendet.

Die überstehenden Flüssigkeiten der letzten Passage werden geerntet, vereinigt und im Volumverhältnis von 1:2 mit einer unter der Bezeichnung FG-Lösung bekannten Stabilisierlösung verdünnt, die aus 60 g Casitone, 100 g Rohrzucker, 75 ml m/15 dibasischem Natriumphosphat, 25 ml m/15 monobasischem Kaliumphosphat, 20 g Monokaliumglutamat und einer zur Herstellung von 4,25 Liter ausreichenden Menge an destilliertem Wasser besteht. Das Gemisch wird gefriergetrocknet. Das Virusmaterial wird als Stamm IBR RLB 106 bezeichnet.

Ts-Charakter des Stammes IBR RLB 106:

Das Viruswachstum bei verschiedenen Temperaturen wird durch Titration bestimmt. Die Ergebnisse sind in

der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt, aus der hervorgeht, daß die Temperatur, bei der der Vlrustiter auf weniger als V₁₀₀ erniedrigt ist, 39° C (±0,5° C) beträgt. Die Ausbeutedifferenz zwischen dem Stamm IBR RLB 106 und dem Ausgangsstamm ist ebenfalls In Tabelle I angegeben und zeigt das geringe Restwachstum des

Stammes IBR RLB 106.

30

35

Tabelle I

Stamm

Virusausbeute, TClUso (ausgedrückt in logio/0,1 ml) bei 30° C bei 39° C

IBR RLB 106 IBR 3760

5,75
5,75

0,75 5,75

Die Stabilität des ts-Charakters des Stammes IBR RLB 106 wird in vitro und In vivo wie nachstehend beschrieben gezeigt:

(a) in vitro:

Der Stamm IBR RLB 106 wird In primären fötalen Rindernleren-(PFBK)-Zellkuluren bei 30, 38 und 39° C passagiert. Die In der nachstehenden Tabelle II zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß der ts-Charakler während 9 Passagen bei 30 und 38° C stabil bleibt, wohingegen der Stamm bei 39° C nach 2 Passagen nicht mehr wächst.

Tabelle II

50

Temperatur
der Passagen

Passage

Nr.

Virustiter, TCID_S0 (in log,₀/0,l ml) bei erlaubter (30° C) und unerlaubter (39° C) Temperatur

30° C 39° C

Differenz im Virusliter bei 30° C und 39°C

55 30° C

SO

38⁰C

39⁰C

1 3 9 1 3 9 1 3

5,75
4,75
5,25
2,50
2,25
3,75
0,75
0

<0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 0

>5,25 >4,25 >4,75 >2 > 1,75 >3,25 >0,25 0

(b) In vivo:

Der Stamm IBR RLB 106 wird in 3 bis 4 Monate alten weiblichen Kälbern (Rasse »Mlttcl-Belglcn«)

passagiert und aus der Nase der geimpften Tiere wieder Isoliert. Sodann wird der Stamm bei erlaubter (35 und 37° C) und unerlaubter (39° C) Temperatur titriert. Die Ergebnisse sind In Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Nummer
des Kalbs

Tag der
Wiederisolierung
nach dem
Impfen

Herkunft des

wiederisolierten

Virus

Virustiter, TCID₅₀ (ausgedrückt in logi<,/0,l ml) bei
35° C 37⁰C 39⁰C

72 10 N.-abstriche

74 9 N.-abstriche

88 6 N.-abstriche

2 5 N.-rauschein

1 5 N.-muscheln

2 5 Mandel

5 6 N.-muscheln

nb = nicht bestimmt N.-= Nasen-

nb

4,7
4,3
4,3
nb
nb
nb
nb

0,3

0,2

1,5

1,2

Der Vergleich der in Tabelle III angegebenen Titer zeigt die Stabilität des ts-Charakters des Stammes IBR RLB 106 nach der in vlvo-Passage.

Beispiel 2

Fötale Rindernieren werden unter aseptischen Bedingungen entfernt, zerkleinert und In phospatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. [Diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄ und 0,2 g KH₂PO₄ In destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer Lösung von 0,1 g MgCl₂ · 6H₂O In 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ In 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Wert liegt zwischen 7,2 und 7,4.] Die gewaschenen, zerkleinerten Nieren werden mit einer Lösung von Trypsin (2,5 g/Llter) in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung trypsinisiert. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37° C ohne Unterbrechung gerührt. Die Flüssigkeit wird dann abgegossen und durch dasselbe Volumen an frischer Trypsinlösung ersetzt. Die Trypsinbehandlung wird unter Rühren bis zur Erschöpfung des Gewebes fortgesetzt. Die In der Flüssigkeit suspendierten Zellen werden von Zelt zu Zeit entfernt und dann 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Zellsediment wird In einem Wachstumsmedium (Hanks basische Salzlösung, die mit 10% auf Virus geprüftem Kalbsserum, 0,5% Lactalbuminhydrolysat, 0,196 Hefeextrakt und 50 meg Neomycinsulfat pro ml versetzt ist) so suspendiert, daß auf 1 ml etwa 200 000 Zellen kommen.

Aliquote Teile von 1 ml der Zellsuspension werden In Roux-Kolben (500 cm²) gegeben und 4 bis 5 Tage bei 37° C inkubiert. Am Ende dieser ersten Inkubationsperiode wird das Wachstumsmedium entfernt und die ZeIl-Monoschicht zweimal mit einem Erhaltungsmedium gewaschen, das aus Eagles basischer Salzlösung besteht, die 0,5% Lactalbuminhydrolysat, 0,1% Hefeextrakt, 0,1% Tryptosephosphat-Brühe und 50 meg Neomycinsulfat pro ml enthält. Jeder Kolben mit fötaler Rindernieren-Zellkultur wird mit 1 ml einer Suspension des infektlösen Rinder-Rhlnotracheltis-Virusstammes IBR RLB 106 in destilliertem Wasser Inokuliert. Die Suspension enthält etwa 2 10⁶ TCID₅₀/ml (d.h. bei Multlplizitätsindex von 0,1). Jeder Kolben wird mit Erhaltungsmedium mit derselben Zusammensetzung wie das vorstehend zum Waschen verwendete Medium versetzt. Die Kultur wird bei 35° C während einer solchen Zeitspanne Inkubiert, die zum Wachsen einer großen Virusmenge ausreichend ist, d. h., mindestens 3 bis 4 Tage, wie sich mittels des typischen IBR-cytopathogenen Effekts ergibt.

Die überstehenden Flüssigkeiten werden dann geerntet, vereinigt und im Volumenverhältnls 1 :2 mit einer unter der Bezeichnung FG-Lösung bekannten Stabilisierung verdünnt. Diese Lösung besteht aus 60 g Casitone, 100 g Rohrzucker, 75 ml m/15 dibasischem Natriumphosphat, 25 ml m/15 monobasischem Kaliumphosphat, 20 g Monokaliumglutamat und einer zur Herstellung einer Lösung von 1 Liter ausreichenden Menge an destilliertem Wasser.

Die Virustitration bei erlauber (30° C) und unerlaubter (39° C) Temperatur zeigt, daß der ts-Charakter des als Ausgangsstamm dienenden Stammes IBR RLB 106 erhalten bleibt. Der TCID₅₀/ml-Wert des erhaltenen Präparats beträgt 10⁶·².

Das Präparat wird in Glasampullen verteilt, die entweder 10 · TCID₅₀ oder Vielfache davon enthalten. Der Inhalt der Ampullen wird gefriergetrocknet. Die Ampullen werden abgeschmolzen und enthalten entweder Einfach- oder Vielfachdosen. Nach der Wiederherstellung durch Zugabe von 1 ml Wasser pro Dosis wird die Vakzine dem Tier als Nasentropfen oder als Sprühmittel verabreicht.

Ts-Charakter des Impfstoffes:

Aus der nachstehenden Tabelle IV ist ersichtlich, daß sich bei der Prüfung des ts-Charakters des wie vorstehend erhaltenen Impfstoffes kein Unterschied gegenüber dem ts-Charakter des Stammes IBR RLB 106 ergibt.

Tabelle IV	Virustiter, 37° C	TCID₅₀ (ausgedrückt in logio/0,1 38⁰C	ml) bei 39⁰C
	5,5 4,3	5,7 4	0,5 0,5
Impfstoff Stamm IBR RLB 106

"i Experimentelle Prüfung des erhaltenen Impfstoffes:

(a) Impfschema:

Der Impfstoff wird 3 von 4 seronegativen, 3 bis 4 Monate alten weiblichen Kälbern (Rasse »Mittel-Belgien«) verabreicht; das vierte Tier dient als Kontrolltier. In Tabelle V sind die Einzelheiten des Impf-IS Schemas zusammengestellt.

Tabelle V

Nummer des Kalbs

Impfweg

inokulierte Dosis
in TCID₃₀

Infektionsweg

Dosis der

inokulierten

Infektion

72 74 88 85

in = intranasal

in in in

2X6,5 2X6,5 2X6,5

in in in in

2X6,7 2X6,7 2X6,7 1 X 6,7

(b) Wiederisolierung des Virus aus der Nase:

In der nachstehenden Tabelle VI sind die Tlter des nach der Impfung gemäß dem In Tabelle V angegebenen Impfschema Isolierten Virus zusammengestellt. Die Virustiter sind in logio TCIDso/0,1 ml ausgedrückt.

35 Tabelle VI

Nummer des Kalbs

Herkunft des Isolats

Virus, abgesondert am 1. 2. 3.

Tag nach der Impfung

7.

9.

10. 13. 14. 20. 28.

72 74 88 85

Nase Nase Nase Nase

>4,8 >4,8

>4,8 4,6 4,2 0

4,5
3,6

1,5
0

4,8 2,7 0 0

4,2 2,5 0 0

1,5 0

0 0

0 0

Sämtliche negativen Proben werden in primären fötalen Rindernleren-(PBFK)-Zellen subpassaglert und bleiben nach 7täglger Inkubation bei 37° C negativ.

In der nachstehenden Tabelle VII sind die Titer des Infektionsvirus, ausgedrückt in Iog₎₀ TCIDso/0,1 ml, zusammengestellt, das nach der einen Monat nach der Impfung gemäß dem In Tabelle V angegebenen Imfschema vorgenommenen Infektion isoliert wird.

Tabelle VII

Nummer des Kalbs

Herkunft des Isolats

Virustiter in der Zeit nach der Infektion, Tage
12 3 6 7

13

72	Nase	2	1,7	3,7	0	0	0	0
74	Nase	5,5	>5,7	4,7	0	0	0	0
88	Nase	>5,7	3,5	3	1,5	0	0	0
85	Nase	>5,7	>5,7	>5,7	>5,7	4	2	2,2

Samtliche negativen Proben werden in primären fötalen Rindernieren-(PFK)-Zellen subpassaglert und bleiben nach 7tügiger Inkubation bei 37° C negativ. Die In Tabelle VII zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß das Wachstum des Infektionsvirus in der Nase der geimpften Tiere beträchtlich vermindert 1st.

ic) iSurokonvcrslon nach der Impfung:

Der Seruneutrallsatlonstesl wird nach der konstanten Virus-Serum-Verdünnungstechnik durchgeführt. Die Krgcbnlssc der Seroneutrallsation sind In der nachstehenden Tabelle VIII zusammengestellt und ausgedrückt als die reziproken Werte der Verdünnung, für die mindestens 50% der Röhrchen vollständig gegen 10 bis 100 TClD₅₀ geschützt sind.

Tabelle VIII	Wochen	nach der Impfung	3	2	4	Wochen nach	16	der Infektion	8	10
Nummer	0	2	4	4	2	>32	4	32
des Kalbs	0	2	<2	4	>32	>32
72	0	2	0	2	2	2	15
74	0	0		0
88	0	0
85

(d) Symptomatik:

Nach der gemäß dem In Tabelle V angegebenen Impfschema durchgeführten Impfung werden täglich folgende Beobachtungen an den Tieren vorgenommen:

die Temperatur wird morgens zwischen 8 und 9 Uhr gemessen;
hämatologlsche Untersuchung;
Nasenabstriche;
klinische Untersuchung.

Nach der einen Monat nach der Impfung vorgenommenen Infektion werden dieselben Untersuchungen durchgeführt, wobei jedoch von sämtlichen Tieren Nasen- und Vaginaabstriche gemacht werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle IX

Nummer Zeit (Tage) des Kalbs mit einer

Temperatur

> 39,6° C

Nach, der Impfung	Genital	Nach der Infektion	Zeit (Tage)	Atmungs	Genital
Atmungs	symptome	Infektions	mit einer	symptome	symptome
symptome		weg	Temperatur
			> 39,6° C
	0		0	0	0
0	0	in	0	0	0
0	0	in	0	0	0
0	0	in	6	beträchtlicher	leichte
0		in		Eiterausfluß	Leukorrhoe
		ivag		aus der Nase	3 Tage nach
				nach 6 und	der Infektion;
				7 Tagen	beträchtlicher
					Vaginalaus
					fluß 7 Tage
					nach der
					Infektion

in — iniranusai ivag = intravaginal

(e) Ts-Charakter des aus der Nase der geimpften Kälber wiederisolierten Virus:

Wie In Tabelle X angegegen, ergibt die Prüfung des ts-Charakters des aus der Nase der geimpften Kälber wiederisolierten Virus keinen Unterschied gegenüber dem ts-Charakter des Stammes IBRRLB 106.

Tabelle X

Zeitraum nach der Impfung, Tage

Titer, ausgedrückt in logm TCID₅₀/0,l ml bei

37° C 38° C 39° C

Kalb 72 Kalb 74 Kalb 88 IBR RLB 106

10 9 6

4,5
3,3
4,3
4,3

0,3
0,2
0,5

Der erhaltene Impfstoff wird wie nachstehend beschrieben auf

(a) Unschädlichkeit

(b) Verteilung Im Gewebe nach nasaler Inokulation
(c) Antigenwirkung und minimale Impfdosis

(d) Übertragung auf Kontakttiere

geprüft.

(a) Unschädlichkeit:

Der Versuch wird an 3 bis 4 Wochen alten, seronegativen, weiblichen Kälbern (Rasse »Friesisches Milchvieh«) vorgenommen, für die die unverdünnten Sera Im Seroneutralisationstest gegen 50 TCID₅₀ eines pathogenen IBR-Vlrusstammes negativ sind.
Die Temperatur von 3 Tieren, denen eine Impfstoff-Doslereinhelt von 2 ml (Titer: 10⁶·² TCID₅₀/ml) In das Nasenloch verabreicht worden war, wird täglich während 5 Tagen gemessen und als normal befunden. Bei

2 anderen Tieren, die als Kontrolltiere dienen, und die 2 ml eines Viruspräparats eines pathogenen IBR-Vlrusstammes (Virustlter des Präparats: 10⁵·⁵ TCID₅o/ml) erhalten hatten, wird ein Temperaturanstieg festgestellt,
(b) Verteilung Im Gewebe:

Μ Die für die Unschädlichkeitsprüfung benutzten Tiere werden getötet und zwar die Tiere 1, 2 und 4 fünf

Tage nach der Inokulation und die Tiere 5 und 6 sechs Tage nach der Inokulation. Die in der nachstehenden Tabelle XI aufgeführten Organe werden unter aseptischen Bedingungen entnommen. Die Organe werden dann In Eagles Medium mit 2% y-globullnfreiem Kalbsserum Im Verhältnis von 1 g Gewebe pro 2 ml suspendiert. Diese Suspension wird 2 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterworfen und anschlleßend 10 Minuten bei 2000UpM zentrifugiert. Der Überstand wird In den in Tabelle XI angegebenen Verdünnungen in sekundäre fötale Rlndernleren-Kulturen mit 0,2 ml/Röhrchen gegeben, und pro Verdünnung werden 3 Röhrchen angesetzt.

Tabelle XI

—

entnommene Organe Verdünnungen

Nervensystem: Hirn 10° bis 10~²

Kleinhirn 10° bis IQ-²

Zerebrospinalflüssigkeit 10° bis 10~²

Atmungssystem: Nasenmuscheln 1O^-1 bis 10~⁵

Lunge: 7 Lappen 10° bis 10-"

40 Unterkieferlymphknoten 10° bis 10"³

Lymphknoten der Ohrspeicheldrüse 10° bis 10~³

suprapharyngale Lymphknoten 10° bis 10~³

Lymphknoten des Atlas 10° bis 10"³

J' ⁴⁵ costo-zervikale Lymphknoten 10° bis ICH

Bronchiallymphknoten 10° bis 10"⁴

Genitalsystem: gesamtes Genitalsystem 10° bis 10"²

retromammare Lymphknoten 10° bis 10~³

Milz 10° bis 10~⁴

heparlnisiertes Blut 10° bis 10~²

Mandeln 10° bis 10-"

.. Kehlkopf: Schleimhaut und die ersten beiden Ringe der Luftröhre 10° bis 10~⁴

Die in der nachstehenden Tabelle XII zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß, außer für ein Isolat mit niedrigem Titer aus der Zerebrospinalflüssigkeit, in den Inneren Geweben der mit dem Stamm IBRRLB 106 (Tiere 1, 2 und 5) inokulierten Tiere kein Virus festgestellt wird, während in den mit dem virulenten Virus inokulierten Tieren (Kontrolltiere 4 und 6) das virulente Virus aus verschiedenen Stellen des Körpers oder aus den unteren Atemwegen isoliert werden kann.

Tabelle XII

Organe

Titer in den Organen, ausgedrückt in TCIDVg Organ

Nummer des Tieres

4 5 6

retromammare Lymphknoten Unterkieferlymphknoten Lymphknoten der Ohrspeicheldrüse suprapharyngale Lymphknoten Lymphknoten des Atlas costo-zervikale Lymphknoten Mandeln

Schleimhaut des Kehlkopfes und der beiden ersten Ringe der Luftröhre

Nasenmuscheln Kleinhirn

Hirn

Zerebrospinalflüssigkeit Lunge: Diaphragma links Spitze rechts Teil links vom Herzen Spitze links Diaphragma rechts Teil rechts vom Herzen

Zwischenstück B ronchiallymphknoten Milz

Genitalorgane
heparinisiertes Blut

nl «= nicht getestet

Eine Bllnd-Subpassage des unverdünnten, vereinigten Materials aus den Lungen negativer Tiere (Nr. 1, 2, 5 und 6) wird In sekundären fötalen Nierenzellen durchgeführt, wobei negative Ergebnisse erhalten werden,
(u) Antigenwlrkung und minimale Impfdosis:

Der Versuch wird mit 52 etwa 3 Monate alten Tieren (Rasse »Mittel-Belgien«) durchgeführt: 29 Tiere werden intranasal (10 mit einer 10⁶·² TCID₅₀-Dosis, 10 mit einer 10⁵·² TCID₅₀-Dosis und 9 mit einer 1O⁴·² TCID₅O-DoSiS) geimpft, und 23 Tiere dienen als Direktkontakt-Kontrolltiere. Die serologische Prüfung wird durch Seroneutralisation unter Verwendung der konstanten Vlrus-(30 bis 50 TCID₅o)/Serum-Verdünnungstechnik durchgeführt: Die erste Lösung Ist unverdünnt. Das Volumverhältnis von Serum : Virus beträgt 2:1. Die Serum-Virus-Gemlsche werden 1 Stunde bei 37° C Inkubiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XIII zusammengestellt.

Tabelle XIII

0	0	0	0	0
0	0	0	0	0
0	0	0	0	0
0	nt	0	0	0
0	nt	0	0	0
0	0	-0,75	0	0,75
0	2	1,5	0	1,75
0	0	>5,5	0	5,25
5,25	5,25	6,25	3,5	5,5
0	0	0	0	0
0	0	0	0	0
0	0,75	0	0	0
0	0	0	0	0
0	0	3,25	0	0
0	0	1,5	0	0
0	0	1,5	0	0
0	0	0	0	0
0	0	0	0	0
0	0	1,5	0	0
0	0	0,75	0	0
0	0	0	0	0
0	0	0	0	0
0	0	0	0	0

Gruppe

Dosis

Anzahl der Tiere mit Serumkonversion und
Gesamtzahl der getesteten Tiere

nach 3 Wochen nach 4 Wochen

nach 6 Wochen

geimpfte Tiere	106.2	10/10
Kontrolltiere	-	0/5
geimpfte Tiere	10«	10/10
Kontrolltiere	-	0/10
geimpfte Tiere	ΙΟ⁴·*	5/9
Kontrolltiere	_	0/8

10/10
1/4

10/10
1/10

4/5
0/7

10/10
2/5

10/10
1/10

8/9
1/8

In der nachstehenden Tabelle XIV sind die Ergebnisse der 6 Wochen nach der Impfung durchgeführten Titerprüfungen zusammengestellt.

Tabelle XIV

Gruppe

Dosis

Anzahl der Tiere mit Seroneutralisationstitern von 0 1 2

4 und höher

geimpfte Tiere Kontrolltiere

ΙΟ⁶-²

ΙΟ⁴·²

8 0

1 0 2 0

Nach den Ergebnissen der Tabellen XIII und XIV erscheint eine Dosis von 10^s·² als annehmbare Impfdosis, (d) Übertragbarkeit:

Aus Tabelle XIII Ist ersichtlich, daß das Impfstoffvirus zu einem geringen Prozentsatz auf Kälber, die sich in direktem Kontakt mit den geimpften Tieren befinden, übertragen wird. In den Kontakttieren werden jedoch keine Symptome induziert, und das Impfstoffvirus zeigt In diesen Tieren dasselbe Verhalten wie In den geimpften Tieren. Eine Rückumwandlung zur Virulenz wird nicht beobachtet.

Beispiel 3

Es wird die in Beispiel 2 beschriebene Technik angewendet, wobei jedoch die geernteten überstehenden Flüssigkeiten, die mit der vorgenannten Stablllslerlösung verdünnt werden, mit dem RLB 103 temperaturempfindlichen Mutantenstamm von Rlnder-Parainfluenza-3-Virus (PI₃) ergänzt werden. Dieses Virus Ist von N. Zygraich, M. Lobmann und C. Huygelen in J. Hyg. Camb., Band 70 (1972), Selten 229 bis 234 beschrieben worden. Das Gemisch wird In Glasampullen verteilt, die 10'·⁵ TCID₅₀ an IBR-Vlrus und 10⁶·" TCID₅₀ an Rindcr-PI₃-Vlrus oder Vielfache jeder dieser Dosen enthalten. Der Inhalt der Ampullen wird gefriergetrocknet, und die Ampullen werden abgeschmolzen. Auf diese Weise werden entweder Einfach- oder Vielfachdosen erhalten. Nach der Wiederherstellung durch Zugabe von 4 bis 5 ml Wasser pro Dosis wird der bivalente Impfstoff dem Tier In Form von Tropfen oder als Nasensprühmlttel verabreicht.

Klinische Prüfung:

Die Prüfung wird an vier spezifisch pathogenfreien, durch Kaiserschnitt geborenen Kälbern durchgeführt und ergibt Seronegatlvität sowohl für die IBR- als auch für die Rinder-PIj-Antlkörpeitypen.

Eine Doslereinheit des vorstehend hergestellten bivalenten Impfstoffes wird In die Nasenlöcher jedes Tieres eingebracht. 3 Wochen nach der Impfung zur serologischen Prüfung entnommene Blutproben zeigen bei jedem Tier Serokonversion sowohl für das IBR-Vlrus als auch für das Rinder-PIj-Virusse. Die Ergebnisse sind In der nachstehenden Tabelle XV zusammengestellt.

Tabelle XV

Nummer des Kalbs

Serologische Reaktion, ausgedrückt in

Seroneutralisations-Antikörpertiter Mir IBR-Virus

Hämagglutinations-Hemmungstiter Pur Rinder-PI₃ -Virus

<8 <8 <8 <8

64 32 16

Das zugesetzte Rinder-PIj-Vlrus wirkt sich nicht störend auf die IBR-Impfung aus; umgekehrt stört das IBR-Vlrus nicht die Serokonversion der Tiere für das Rlnder-PI₃-Virus.

10

Claims

Patentansprüche:

1. Temperaturempfindliche, nlcht-pathogene, infektlöse Rlnder-Rhlnotracheltis-Vinisstänime, erhältlich durch In-Kontakt-Bringen eines pathogenen. Infektlösen Rlnder-Rhmotracheltls-Vlrusstammes während 1 bis 15 Minuten bei einem pH-Wert von 4 bis 5 mit wäßriger salpetriger Säure In Acetatpuffer mit einer Konzentration an salpetriger Säure und an Acetationen Im Reaktionsmedium von 1 η bzw. n/4, Isolieren und vollständige Abschwächung des erhaltenen temperaturempfindlichen Mutantenstammes durch 5 bis 15 Serienpassagen bei 30 bis 37° C (±1°C) auf primären Kaninchennierenzellen.

2. Verfahren zur Herstellung der temperaturempfindlichen nlcht-pathogen. Infektlösen Rlnder-Rhlnotrali» cheitis-Virusstämme nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen pathogenen, Infektlösen Rinder-Rhlnotracheitis-Virusstamm während 1 bis 15 Minuten bei einem pH-Wert von 4 bis 5 mit wäßriger salpetriger Säure In Acetatpuffer mit einer Konzentration an salpetriger Säure und an Acetationen Im ReaH-tionsmedium von 1 η bzw. n/4 In Konakt bringt, den gebildeten temperaturempfindlichen Mutantenstamm isoliert und zur vollständigen Abschwächung 5 bis 15 Serienpassagen bei 30 bis 37° C (±1°C) auf primären Kaninchennierenzellen unterwirft.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Kontakt 10 (±1) Minuten bei einem pH-Wert von 4,6 (±0,1) bei Raumtemperatur aufrechterhält.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den temperaturempfindlichen Mutantenstamm durch eine Passage in einer primären fötalen Rlndernleren-Zellkultur Isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 10 Serienpassagen bei 37° C (±1°C)

durchführt.

6. Verwendung der temperaturempfindlichen nlcht-pathogenen, infektiösen Rinder-Rhlnotracheltls-Vlrus-

stämme nach Anspruch 1 zur Herstellung von infektiösem Rinder-Rhlnotracheitls-Lebendvlrus-Impfstol'f oder zusammen mit mindestens einem weiteren Intranasal verabreichbaren Lebendvirusimpfstoff für die Atemwege von Rindern zur Herstellung eines polyvalenten Lebendvirusimpfstoffes für die Atemwege von Rindern.