DE1044362B

DE1044362B - Process for the development of attenuated canine infectious hepatitis viruses

Info

Publication number: DE1044362B
Application number: DEA29146A
Authority: DE
Inventors: Jerrell Bemis Emery
Original assignee: ALLIED LAB Inc
Current assignee: ALLIED LAB Inc
Priority date: 1958-03-28
Filing date: 1958-03-28
Publication date: 1958-11-20

Description

Verfahren zur Entwicklung von abgeschwächten infektiösen Hundehep atitisviren Die Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung von abgeschwächten infektiösen Hundehepatitisviren in Gewebskulturen von trypsinierten Schweinenieren und auf die Herstellung von Impflösungen aus den geschwächten infektiösen Hundehepatitisviren, die in trypsinierten Gewebskulturen von Schweinenieren entwickelt wurden. Process for the development of attenuated infectious canine hep atitis viruses The invention relates to the development of attenuated infectious ones Canine hepatitis viruses in tissue cultures from trypsinized pig kidneys and on the Production of vaccine solutions from the weakened infectious canine hepatitis viruses, which were developed in trypsinized tissue cultures of pig kidneys.

Die Abschwächung von infektiösen Hundehepatitisviren durch serienweises Passieren durch Gewebskulturen von Hundenieren wurde von Fieldsteel und Mitarbeitern A. Howard, Emery, Jerrell B., in »Society for Experimental Bioloçr and Medicine«, 1954, Vol. 86, S. 819 bis 823, beschrieben. The weakening of infectious canine hepatitis viruses through serial production Passing through tissue cultures from canine kidneys was made by Fieldsteel and coworkers A. Howard, Emery, Jerrell B., in "Society for Experimental Bioloçr and Medicine", 1954, Vol. 86, pp. 819-823.

Fieldsteel und Mitarbeiter haben auch die Herstellung einer Impflösung aus ihren abgeschwächten infektiösen Hundehepatitisviren beschrieben, die für die Immunisierung von Hunden gegen infektiöse Hepatitis geeignet sind, ohne die üblichen phathologischen Symptome wider Krankheit hervorzurufen. Fieldsteel and coworkers also made an inoculation solution described from their attenuated canine infectious hepatitis viruses responsible for the Immunizing dogs against infectious hepatitis are suitable without the usual to cause pathological symptoms against illness.

Fieldsteel und Mitarbeiter versuchten die Entwicklung von virulenten infektiösen Hundehepatitisviren in Schweinenieren-Explantaten, die nach einem Plasma-Klumpenverfahren hergestellt waren, aber sie schlossen hieraus, daß kein Wachstum des Virus eingetreten sei. Es wurden nun Versuche durchgeführt, virulenten ICH-Virus (infektiöser Hundehepatitisvirus) in Gewebskulturen aus Schweinenieren zu entwickeln unter Verwendung des Plasma-Blumpenverfahrens sowie auch unter Verwendung der trypsinierten Gewebskulturen und Schweinenieren, aber ohne Erfolg. Völlig überraschend wurde jedoch gefunden, daß infektiöse Hundehepatitisviren, die durch vielfache Passage durch Hundenierenkulturen geschwächt waren, in Gewebskulturen von trypsinierten Schweinenieren entwickelt werden können. Fieldsteel and coworkers tried to develop virulent Canine infectious hepatitis virus in pig kidney explants obtained after a plasma clot procedure but they concluded that the virus had not grown may be. Attempts have now been made to find virulent ICH virus (infectious canine hepatitis virus) to develop in tissue culture from porcine kidneys using the plasma bloom method as well as using the trypsinized tissue cultures and pig kidneys, but without success. Completely surprisingly, however, it was found that infectious canine hepatitis viruses, weakened by multiple passages through canine kidney cultures, in tissue cultures can be developed by trypsinized pig kidneys.

Die Feststellung, daß geschwächte ICH-Viren in trypsinierten Schweinenierenkulturen entwickelt werden können, ist von wesentlicher technischer Bedeutung. Schweinenieren können von den Schlachthöfen zu weit niedrigeren Preisen als Hundenieren erhalten werden. Um Hundenieren zu gewinnen, ist es notwendig, daß Hunde geopfert werden. Der Rest des Hundefleisches stellt einen Totalverlust dar. Dagegen ist die Fleischmasse von Schweinen, aus denen die Schweineniere gewonnen werden kann, als menschliches Nahrungsmittel verwendbar. The finding that weakened ICH viruses in trypsinized pig kidney cultures can be developed is of essential technical importance. Pig kidneys can be obtained from slaughterhouses at far lower prices than canine kidneys will. In order to gain canine kidneys, it is necessary that dogs be sacrificed. The rest of the dog meat represents a total loss. In contrast, the meat mass of pigs, from which the pig kidney can be obtained, as human Food usable.

Die Herstellung von Impflösungen durch Entwicklung des geschwächten ICH-Virus in Schweinenierengeweben vermeidet die Möglichkeit einer Verunreinigung des Produktes mit Histoplasmosis und anderen Hundekrankheiten, die normalerweise in Hundenieren, aber normalerweise bei Schweinen nicht vorkommen. The preparation of vaccine solutions by developing the weakened Ich virus in pig kidney tissues avoids the possibility of contamination of the product with histoplasmosis and other canine diseases that normally in canine kidneys but not normally found in pigs.

Bei Durchführung des Verfahrens zur Entwicklung von geschwächten ICH-Viren werden trypsinierte Schweinenierenkulturen in einem geeigneten Kulturmedium mit ICH-Viren, die durch mindestens fünfzig Passagen in Gewebekulturen aus Hundenieren geschwächt wurden, beimpft. Nach einer geeigneten Verweilzeit, 5 bis 7 Tage, werden die virushaltigen Flüssigkeiten gesammelt. Die flüssige Masse, die eine hohe Konzentration an geschwächtem Virus enthält, kann direkt als Impflösung verwendet werden und ist, wenn sie unter sterilen Bedingungen aufbewahrt wird, zur Erzielung einer aktiven und anhalten.den Immunität von Hunden gegen ICH-Viren gegeignet. Falls gewünscht, kann die flüssige Impflösung aus dem gefrorenen Zustande getrocknet werden. Die getrocknete Masse kama später mit einem flüssigen Verdünnungsmittel zur Verwendung als Impflösung verdünnt werden. Die Art, in der die Erfindung durchgeführt wird, wird des näheren beschrieben in Verbindung mit den nachstehenden speziellen Versuchen. Diese speziellen Versuche sind als Beispiel und ohne Begrenzung gegeben. When performing the procedure for the development of weakened ICH viruses are trypsinized Pig kidney cultures in a suitable culture medium with ICH viruses that have passed through at least fifty passages in tissue cultures from canine kidneys weakened, vaccinated. After a suitable residence time, 5 to 7 days, will be the virus-containing fluids collected. The liquid mass that has a high concentration contains a weakened virus, can be used directly as a vaccination solution and is, if it is kept under sterile conditions, to achieve an active and halt. Appropriate immunity of dogs to ICH viruses. If desired, the liquid inoculation solution can be dried from the frozen state. the dried mass kama later with a liquid diluent for use can be diluted as an inoculation solution. The manner in which the invention is carried out is further described in connection with the specific experiments below. These particular experiments are given by way of example and without limitation.

Entwicklung von ICH-Virus in trypsinierten S chweinenierengewebskulturen Es wurden trypsinierte Kulturen von Schweinenieren unter Verwendung des von Dulbecco und Vogt beschriebenen Verfahrens in J. Exp. Med., 1954, V. 99, S. 167, wie es von J. Younger in »Proc. Soc. Development of ICH virus in trypsinized pig kidney tissue cultures Trypsinized cultures of pig kidneys were made using that of Dulbecco and Vogt in J. Exp. Med., 1954, V. 99, p. 167, as described by J. Younger in Proc. Soc.

Exp. Biol. & Med.«, 1954 85, S. 202, modifiziert wurde, hergestellt. Das bei der Herstellung der Kulturen und ihrer Aufbewahrung verwendete Medium bestand aus 8 Teilen Earles Solution (3 Teile Earles, Rest Salzlösung aus 6,8 g Natriumchlorid, 0,40 g Kaliumchlorid, 0,20 g Calciumchlorid, 0,20 g Magnesiumsulfat, 0,125 g saurem Natriumphosphat, 1,00g Glucose, 2,20g Natriumbicarbonat und Wasser zur Auffüllung auf 1000 ccm), 1 Teil 50/oiges Lactalbuminhydrolysat und 1 Teil inaktiviertes Pferdeserum. Zur Einleitung und Haltung von trypsinierten Schweinenierenkulturen haben sich auch andere Medien als befriedigend erwiesen: a) 8 Teile Earles-Simms-Lösung (3 Teile Earles BSS auf 1 Teil Ultrafiltrat aus Ochsenserum), 1 Teil 5°/o Lactalbumin und 1 Teil Pferdeserum. b) Serum Nr. 199 nach Morgan, Morton und Parker in »Proc. Soc. Exp. Biol. & Med.«, 1950, 73, S. 1 bis 8, ergänzt durch 100/o inaktiviertes Pferdeserum.Exp. Biol. & Med. ”, 1954 85, p. 202. That in the production of the cultures and their storage used The medium consisted of 8 parts of Earles Solution (3 parts of Earles, the rest of the saline solution 6.8 g sodium chloride, 0.40 g potassium chloride, 0.20 g calcium chloride, 0.20 g magnesium sulfate, 0.125 g sodium acid phosphate, 1.00 g glucose, 2.20 g sodium bicarbonate and water to make up to 1000 ccm), 1 part 50% lactalbumin hydrolyzate and 1 part inactivated Horse serum. For introducing and keeping trypsinized pig kidney cultures other media have also proven to be satisfactory: a) 8 parts of Earles-Simms solution (3 parts of Earles BSS to 1 part of ultrafiltrate from ox serum), 1 part of 5% lactalbumin and 1 part horse serum. b) Serum No. 199 according to Morgan, Morton and Parker in "Proc. Soc. Exp. Biol. & Med. «, 1950, 73, pp. 1 to 8, supplemented by 100 / o inactivated Horse serum.

Virus: Der Original-Ausgangsvirus war ein modifizierter ICH-Virus, bezeichnet mit TC 70 LD2044, mit insgesamt hundertvierunddreißig Passagen durch trypsinierte Kulturen aus Hundenierengeweben, wie voll Fiel d s teel und Mitarbeiter beschrieben ist. Die trypsinierten Schweinenierengewebe wurden in 2 ccm aus Earlscher Lösung, Lactalbumin und Pferdeserum aufbewahrt Der pH-Wert des Mediums wurde auf 7,6 bis 7,8 eingestellt, wobei die Entwicklung in Wälztrommeln bei 350 C durchgeführt wurde. Die Passagen durch die Schweinenierenkulturen wurden in Intervallen von 3 bis 7 Tagen durch Beimpfung von frischen trypsinierten Kulturen aus Schweinenieren mit 0,2 ccm unverdünnter, gesammelter Flüssigkeit aus der voraufgehenden Passage durchgeführt. Die aufgefangenen und gesammelten Flüssigkeiten wurden auch auf Hundenierenkulturen überimpft, und zwar bei jeder Passage, um das Vorhandensein und bzw. oder das Überleben des Virus zu kontrollieren. Virus: The original parent virus was a modified ICH virus, designated with TC 70 LD2044, with a total of one hundred and thirty-four passages through trypsinized cultures from canine kidney tissues, such as Voll Fiel d s teel et al is described. The trypsinized pig kidney tissues were taken from Earlscher in 2 cc Solution, lactalbumin and horse serum stored. The pH of the medium was raised to 7.6 to 7.8, the development being carried out in roller drums at 350.degree became. The passages through the pig kidney cultures were made at intervals of 3 up to 7 days by inoculating fresh trypsinized cultures from pig kidneys with 0.2 cc of undiluted, collected liquid from the preceding passage carried out. The fluids collected and collected were also on canine kidney cultures inoculated, at each passage, for the presence and / or survival to control the virus.

Es wurde ein cytopathogener Effekt, ähnlich dem vom ICH-Virus mit Hundenierenkulturen, bei der fünften Passage durch Schweinenierenkulturen erzielt. a) Dieser Effekt, obgleich er an den ICH-Virus-Effekt erinnert, führt niemals zur vollständigen Zerstörung aller Zellen bei den ersten Passagen, ergibt jedoch sporadisch bei späteren Passagen eine vollständige Zerstörung. b) Der erzeugte cytopathogene Effekt wurde, wenn irgend möglich; als ein Kriterium für die Zeitintervalle für die Vornahme weiterer Passagen verwendet; wenn 75 bis 1000/o der Epithelzellenmasse durch den Virus angegriffen oder zerstört waren, wurden die Passagen vorgenommen. tinabhängig von der Menge des auftretenden cythopathogenen Effektes lag der ICH-Virus immer mit einem Titer von mindestens 105,0 vor. A cytopathogenic effect was found, similar to that of the ICH virus Canine kidney cultures obtained on the fifth passage by pig kidney cultures. a) This effect, although it is reminiscent of the ICH virus effect, never leads to complete destruction of all cells in the first passages, but results sporadically complete destruction in later passages. b) The cytopathogenic produced Effect was, if at all possible; as a criterion for the time intervals for used to make further passages; if 75 to 1000 / o of the epithelial cell mass were attacked or destroyed by the virus, the passages were made. The ICH virus was tin dependent on the amount of the occurring cythopathogenic effect always with a titer of at least 105.0.

Die Identifizierung dieses Virus als ICH wurde bei der siebenten, dreizehnten, siebzehnten, vierunddreißigsten und fünfundvierzigsten Gewebskulturpassage vorgenommen, wodurch der cytop athogene Effekt in Schweine- und Hundenierenkulturen entwickelt wurde. Neutralisiert' wurde durch ein bekanntes spezifisches- ICH-Antiserum. ~~ Titrationen des Virusgehaltes wurden in Hundenierenkulturen wie folgt durchgeführt: Trypsinierte ID-Index 50 Verdünnung Srhweinenieren- des Virus der Angehäufte - passagen - des Virus Ausgangs- Verdünnung 7 10-4,0 10-7,0 10-11 9 10-5,3 1O 90 10-14,3 10 10-5,0 10:tO 105 45 106,5 10-15 Wie in der obigen Tabelle gezeigt, enthält die fünfundvierzigste Passage durch trypsinierte Schweinenierenkulturen große Mengen des Virus, d. h. 104-õ Das flüssige Material mit einer hohen Konzentration aus geschwächtem Virus, die aus dem Gewebematerial abgetrennt wurde, ergibt eine flüssige Impflösung mit einer hohen Konzentration an geschwächtem ICH-Virus. Die gesammelte flüssige Impfiösung kann in gefrorenem Zustand getrocknet werden, wobei man ein getrocknetes Impfmaterial erhält, das später mit destilliertem Wasser für die Verwendung bei der Impfung von empfänglichen Hunden verdünnt werden kann.The identification of this virus as ICH was made on the seventh, thirteenth, seventeenth, thirty-fourth and forty-fifth passages of tissue culture, thereby developing the cytop athogenic effect in pig and canine kidney cultures. It was neutralized by a known specific ICH antiserum. ~~ Virus content titrations were carried out in canine kidney cultures as follows: Trypsinized ID-Index 50 dilution Crying kidney virus the accumulated one - passages - of the virus starting dilution 7 10-4.0 10-7.0 10-11 9 10-5.3 1O 90 10-14.3 10 10-5.0 10: to 105 45 106.5 10-15 As shown in the table above, the forty-fifth passage through trypsinized pig kidney cultures contains large amounts of the virus, i.e. 104-õ the liquid material with a high concentration of weakened virus separated from the tissue material gives a liquid inoculation solution with a high concentration of weakened Ich virus. The collected liquid vaccine solution can be dried while frozen to give a dried inoculum which can later be diluted with distilled water for use in vaccinating susceptible dogs.

Die so erhaltenen Impflösungen vermögen die Herstellung von schützenden Antikörpern für infektiöse Hundehepatitis anzuregen, vergleichbar denen, die bei natürlichen Infektionen erzeugt werden, wenn man sie nicht immunen Hunden injiziert, ohne daß sie die üblichen pathologischen Symptome infektiöser Hundehepatitis hervorrufen. Der bei den obigen Untersuchungen verwendete abgeschwächte ICH Virus wurde durch Reihenpassage durch Gewebskulturen aus Hundenieren abgeschwächt. An Stelle hiervon können auch geschwächte ICH-Viren verwendet werden, die auf Gewebekulturen von anderen Hundegeweben, z. B. aus Uterus oder Testikeln, entwickelt wurden. The vaccine solutions obtained in this way are capable of producing protective To stimulate antibodies for infectious canine hepatitis, comparable to those used in natural infections if not injected into immune dogs, without causing the usual pathological symptoms of canine infectious hepatitis. The attenuated ICH virus used in the above studies was caused by Serial passage attenuated by tissue cultures from canine kidneys. Instead of this Weakened ICH viruses can also be used on tissue cultures from others Dog tissues, e.g. B. from the uterus or testicles.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the ~ development of attenuated infectious canine hepatitis virus, which is an inoculum of an infectious canine hepatitis virus in a tissue culture of trypsinized pig kidney in a nutrient fluid containing promotes, introduces the growth and / or maintenance of pig kidney cells, this tissue containing the nutrient fluid develops until a sufficient one The virus has grown to produce a usable concentration, and then collecting a liquid mass with the virus, characterized in that an infectious canine hepatitis virus that is used prior to its development a serial passage was weakened by tissue cultures from canine kidneys.

2. The method according to claim 1, characterized in that the number of the row passages is at least fifty.