DE3019554C2

DE3019554C2 -

Info

Publication number: DE3019554C2
Application number: DE3019554A
Authority: DE
Inventors: Willem Dr. 3000 Hannover De Verhagen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1980-05-22
Filing date: 1980-05-22
Publication date: 1988-11-17
Also published as: DE3019554A1

Description

Die Anmeldung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von attenuierten Viren für Lebendimpfstoffe. Der Anspruch 2 betrifft eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.

Bei der Bekämpfung von virusbedingten Infektionskrankheiten des Menschen kommt der Verwendung sog. Lebendimpfstoffe, d. h. Impfstoffe, die in ihrer Pathogenität abgeschwächte, aber im Impfling voll vermehrungsfähige (= attenuierte) Erreger enthalten, ganz besondere Bedeutung zu.

Als Beispiel seien die Lebendimpfstoffe gegen Polio, Masern, Röteln, Mumps und Gelbfieber genannt.

Bisher war die Gewinnung von attenuierten Impfstoffviren nur durch langwierige Passagierung des Wildvirus im Tier und in für die Vermehrung des Virus nicht optimalen Gewebekultursystemen möglich, wobei die zur Attenuierung führenden Schritte nicht vorhersehbar waren und in mühseligen Versuchen durch Erprobung gefunden werden mußten.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß man attenuierte Viren, wie sie für die Herstellung von Lebendimpfstoffen benötigt werden, gezielt in vergleicherweise kurzer Zeit dadurch gewinnen kann, daß man die Nukleinsäure des Virus extrahiert und in geeigneten Zellkulturen unter Zusatz von die Infektiosität der Nukleinsäure steigernden Substanzen zur Auslösung der Virusproduktion einsetzt.

Als Beispiel sind in Tabelle 1 entsprechende Befunde für Coxsackievirus des Types A7 dargestellt.

Die Konzentration an infektiösem Virus, ausgedrückt in der für 50% der vorgelegten Zellen infektiösen Virusdosis (TCID₅₀), wurde für ein Wildvirus Coxsackie A7 und ein durch Transfektion daraus gewonnenes, attenuiertes Virus Coxsackie A7 ermittelt.

Abgestufte Verdünnungen dieser Virussuspension wurden an Gruppen neugeborener Saugmäuse innerhalb 24 Stunden nach Geburt verabfolgt (pro Tier 0,1 ml Virussuspension subcutan dorsal, pro Virusverdünnung 12 Tiere). Für eine Beobachtungszeit von 14 Tagen wurde die Rate der als Folge der Infektion gestorbenen Tieren ermittelt und nach der Methode von Reed und Muench die Virusverdünnung ermittelt, die gerade ausreichte, um 50% der Tiere zu töten. Danach wurde die dieser Verdünnung ensprechende Dosis an infektiösem Virus (TCID₅₀) berechnet. Es zeigte sich, daß zur Tötung von 50% der Tiere etwa 10⁵-fach mehr erfindungsgemäß gewonnenes Virus erforderlich war als im Falle des Wildvirus. Dies bedeutet eine etwa 10⁵-fache Abschwächung der pathogenen Wirkung des Coxsackievirus als Folge des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Wegen der bekannten Parallelität der Pathogenität von Coxsackieviren bei Saugmaus und Mensch kann hieraus geschlossen werden, daß das attentuierte Virus beim Menschen als Impfvirus mit voller Immunogenität und fehlender pathogener Auswirkung anwendbar wäre.

Tabelle 1

Vergleich der Pathogenität von Wildvirus Coxsackie A7 und des daraus durch die Erfindung gewonnenen attentuierten Virus im Saugmausversuch

Beispiel

12,5 ml Coxsackievirus A7 (10⁷ TCID₅₀/0,2 ml) wurden nach Zusatz von 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) mit 12,5 ml mit Wasser gesättigtem Phenol bei 60°C für 5 Minuten kräftig geschüttelt. Die Phasen wurden durch Zentrifugation in einer Minifuge II im Rotor 3350 getrennt (20 Minuten, 4°C, 4000 UpM).

Die wäßrige Schicht wurde vorsichtig mit einer Ribonuclease-freien Pasteurpipette abgehebert und nochmals wie beschrieben behandelt. Danach wurde das Phenol durch 7maliges Schütteln mit 40 ml kaltem, puffergesättigtem Äther entfernt. Anschließend wurde der Äther durch Durchperlen von Stickstoff durch eine Ribonuclease-freie Pasteurpipette eliminiert.

Geeignete Zellkulturen (HEp-2) wurden mit PBS (0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat pH 7,0) oder Hank's Salzlösung sehr gründlich gewaschen, um Serumreste komplett zu entfernen. Danach wurden die Kulturen 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 250 µg/ml DEAE-Dextran (5 ml auf 680 cm² Zellrasen) inkubiert. Anschließend wurde nach Abgießen der 5 ml die Ribonukleinsäure in 250 µg/ml DEAE-Dextran suspendiert den Zellen zugegeben (3 ml Nukleinsäure pro 680 cm² Zellrasen) und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurden 300 ml Medium (Basal Medium Eagle mit Earle's Salzen, 2% Kälberserum, 100 I. E. Penicillin und 100 mcg Streptomycin/ml) zugegeben und inkubiert bei 37°C bis zum Auftreten eines vollständigen cytopathischen Effekts 4-5 Tage nach Infektion.

Das erfindungsgemäß gewonnene Virus wurde durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen vom Zelldetritus gelöst und dieser durch Zentrifugation abgetrennt. Danach erfolgte eine TCID₅₀-Bestimmung und eine bakterielle Sterilitätskontrolle.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von attenuierten Viren für Lebendimpfstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß das attenuierte Virus durch Infektion von Gewebekulturen mit zuvor isolierter Virusnukleinsäure unter Zusatz von die Infektiosität der Virusnukleinsäure steigernder Substanz gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als die Infektiosität der Nukleinsäure steigernder Zusatz bei der Beimpfung der Zellkulturen DEAE-Dextran (MW 500.000) in einer Konzentration von 250 µg/ml eingesetzt wird.