DE1171559B

DE1171559B - Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten von Brucella abortus

Info

Publication number: DE1171559B
Application number: DED39784A
Authority: DE
Inventors: Joseph Wilson Whalen
Original assignee: Dow Chemical Co
Current assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1961-09-07
Filing date: 1962-09-06
Publication date: 1964-06-04
Also published as: GB951299A; CH416942A; US3184384A; DK103363C

Description

Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten von Brucella abortus Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten des Stammes 19 von Brucella abortus.
Impfstoffe, die Organismen vom Stamm 19 von Brucella abortus enthalten, werden zur Immunisierung von Rindvieh gegen Infektionen mit virulenten Brucella-Stämmen verwendet. Zur Erzielung einer angemessenen Immunisierung müssen große Mengen lebender Organismen des Stammes 19 injiziert werden. Bei der Herstellung solcher Impfstoffe ist die Gegenwart einer beträchtlichen Anzahl von toten oder abartigen (englisch: dissociated) Brucella-Organismen höchst unerwünscht. Außerdem ist es erforderlich, die Kulturbedingungen so zu halten, daß sowohl die Entstehung virulenter als auch die Entstehung nicht immunisierend wirkender Varianten des gewünschten Stammes 19 vermieden wird. Die Entstehung abartiger Organismen bot bei früheren Versuchen zur Kultivierung von Brucella abortus in flüssigen Medien ein besonderes Problem.
In der Vergangenheit wurden die Brucella-abortus-Stamm-19-Impfstoffe durch Kultivierung der Organismen in Behältern, wie Roux-Kolben oder Povitsky-Flaschen, auf einem üblichen festen Kartoffel-Glycerin-Agar-Medium hergestellt. Zur Erzielung der gewünschten Ausbeute an nicht abartigen Organismen war es bei solchen Kulturen wesentlich, eine Berührung der wachsenden Bakterienkolonien mit Flüssigkeiten, wie dem sich in solchen Flaschen normalerweise bildenden Kondensat, zu vermeiden.
Die Herstellung des Impfstoffes nach diesem bekannten Verfahren erfordert die Aufbewahrung der Waschflüssigkeiten des Agarmediums in einer großen Anzahl von Flaschen, wobei wegen der großen Zahl der Arbeitsvorgänge die Gefahr einer Verunreinigung gegeben ist.
Kürzlich wurde berichtet, daß die Kultivierung von Brucella abortus zur Herstellung von Impfstoff in flüssigem Medium durchgeführt worden ist. Es war jedoch nicht möglich, nach den beschriebenen Verfahren durch Kultivierung des Stammes 19 von Brucella abortus in flüssigen Medien wünschenswert hohe Ausbeuten an nicht abartigen Organismen zu erhalten. Weiterhin waren bei diesen Kultivierungsverfahren zur Herstellung großer Mengen von Organismen unerwünscht lange Zeiten erforderlich.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Konzentraten des Stammes 19 von Brucella abortus gefunden, das ein starkes Wachstum bzw. eine rasche Reproduktion der Organismen gestattet. Die nach dem neuen Verfahren hergestellten Impfstoffkonzentrate haben ferner den Vorteil, hochwirksam zu sein.
Erfindungsgemäß wird weiterhin die unerwünschte Bildung von abartigen Organismen auf ein Minimum herabgesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man eine belüftete, sterile wäßrige Lösung, die Glucose, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Thiaminhydrochlorid, ein Antischaummittel und ein Pankreasenzym-Hydrolysat von Casein enthält, mit Organismen vom Stamm 19 von Brucella abortus animpft und anschließend vorzugsweise bei etwa 370C kultiviert. Zur Erzielung der besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es wesentlich, daß die Belüftung durch Einführung steriler Luft unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche - vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von mindestens 0,7 Volumeinheiten je Minute je Volumeinheit des flüssigen Mediums - geschieht und daß das flüssige Medium während der Kultivierung-gerührt wird.
Es kann jedes übliche Antischaummittel verwendet werden, das eine Schaumbildung während der Kultivierung wirksam verhütet, wie Maisöl, ein handelsübliches Silicon-Antischaummittel oder ein Polyoxydäthylenderivat der Ricinolsäure. Die Bildungsgeschwindigkeit und die Ausbeute der Organismen können jedoch erfindungsgemäß erhöht werden, wenn als Antischaummittel ein Polypropylen- glykol verwendet wird. Die bevorzugten Polypropylenglykole weisen Molekulargewichte von 1500 bis 3000, vorteilhaft von etwa 2000 auf.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können an den Organismen hochkonzentrierte Präparate in einer Zeit von nur 20 Stunden erhalten werden, während bei den bisherigen Verfahren mindestens etwa 70 Stunden erforderlich waren, was von großer wirtschaftlicher Bedeutung ist.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Herstellung von Brucella-abortus-Impfstoffen mit verbesserter Beständigkeit vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die erhaltenen Impfstoffkonzentrate in dem flüssigen Kulturmedium mit einem Stabilisierungsmittel vermischt, das im wesentlichen aus einer wäßrigen Lösung besteht, die Kaliumcitratmonohydrat, Natriumcitrat, Dikaliumhydrogenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumchloridhexahydrat, Kaliumcarbonatsesquihydrat und Lactose, vorzugsweise in Mengen von 0,135, 0,245, 0,061, 0,133, 0,06, 0,1 bzw. 17,25 Gewichtsprozent, enthält, wobei der Rest aus Wasser besteht.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das flüssige Kulturmedium durch Auflösen eines Pankreasenzym-Hydrolysates von Casein zusammen mit Glucose, Hefeexrakt, Natriumchlorid, Thiaminhydrochlorid und einem Antischaummittel - vorzugsweise einem Polypropylenglykol - in Wasser hergestellt. Dieses Medium wird - vorzugsweise durch Filtrieren - sterilisiert und mit einem Impfmaterial angeimpft, das durch Waschen von gleichmäßigen Kolonien des Stammes 19 von Brucella abortus, die in üblicher Weise auf einem festen Kartoffel-Glycerin-Agar-Medium gezüchtet worden sind, erhalten worden ist. Die Züchtung des Organismus wird in einem geeigneten Behälter, wie einem aus Glas bestehenden, mit Glas ausgekleideten oder aus rostfreiem Stahl gefertigten Fermentationstank, durchgeführt, der mit einem mit hoher Umdrehungszahl laufenden Rührer und einer Einleitungsvorrichtung für sterile Luft versehen ist.
Die Züchtung des Organismus wird unter starkem Rühren bei einer Temperatur von 36 bis 380 C durchgeführt, während sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von mindestens 7 Volumeinheiten je Minute je 10 Volumeinheiten des flüssigen Kulturmediums eingeführt wird. Die Kultivierung des Organismus wird unter den vorstehenden Bedingungen bei einfachem Ansatz etwa 20 Stunden oder - wenn, wie im folgenden beschrieben, weiteres flüssiges Medium nachgegeben wird - bis zu etwa 40 Stunden fortgesetzt. In jedem Falle wird die Züchtung so lange fortgesetzt, bis ein optimales Wachstum von lebensfähigen Organismen erzielt ist, wonach das erhaltene Impfstoffkonzentrat aus dem Fermentationstank unter Druck in einen sterilisierten Vorratsbehälter aus rostfreiem Stahl oder in sterile Gasflaschen abgezogen wird. Die so erhaltene Menge an Impfstoffkonzentrat kann danach mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung oder einem anderen geeigneten Verdünnungsmittel vermischt werden, um ein injizierfähiges, flüssiges Impfmaterial herzustellen. Das Konzentrat kann auch mit einem Stabilisierungsmittel kombiniert und in üblicher Weise gefriergetrocknet werden, um ein getrocknetes Produkt herzustellen, das später mit physiologischer Kochsalzlösung zu einem injizierfähigen Impfmaterial verdünnt werden kann.
Das besondere Proteinmaterial, das sich als Bestandteil des verwendeten Nährmediums zur Erzielung hoher Ausbeuten von Brucella-abortus-Organismen als wesentlich erwiesen hat, ist einPankreasenzym-Hydrolysat von Casein, das - in Form eines Gemisches von Aminosäuren und Peptiden - sämtliche Aminosäuren aufweist, die im Casein ursprünglich enthalten sind. Da das Casein normalerweise natürlichen Ursprungs ist, enthält das Gemisch außerdem beträchtliche Mengen von Vitaminen, die für ein angemessenes Wachstum der Brucella-Organismen erforderlich sind. Das zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete Pankreasenzym - Hydrolysat von Casein ist im Handel erhältlich. Im folgenden wird eine Analyse eines solchen Produktes angegeben: Gesamtstickstoff . . . . . . . . . 12,80in Aminogruppenstickstoff .... .. 6,8 °/o % Aminostickstoff pro Gesamtstickstoff .. . . 53,0 0/o Feuchtigkeit 3,1 °/o Lactose, maximal . . 1,5 o/o Asche .... . . . . . .... °i(, pH-Wert (20/oige Lösung in Wasser bei 250 C) . . 6,6 % Aminosäuregehalt (bezogen auf feuchtigkeitsfreie Substanz) Lysin . 7.6 % Isoleucin . . 6,4 % Leucin ....................... 10,5% Valin . 7,0% Arginin . 3,3 ovo Threonin .. 4,00/0 Methionin . : 2,5 % Cystin ... . 0,3% Phenylalanin . 4,50/0 Histidin . . 2,4 ovo Tryptophan . . 0,90/0 Glutaminsäure . . 20,40/a Vitamingehalt Riboflavin . 4,25 llglg Thiamin . .......... 0,11 µg/g Nicotinsäure (Niacin) . 4,50 Fg/g Pantothensäure . 2,19 rg/g Biotin . . 0,51 llglg Pyridoxin . 1,29 g/g Ein optimales Wachstum der Brucella-Organismen wurde im allgemeinen unter Verwendung eines Mediums erzielt, das im wesentlichen die folgende Zusammensetzung aufweist: Bestandteile Gewichtsprozent Pankreashydrolysat von Casein 3 Glucose 2 Thiaminhydrochlorid . 0,0005 Hefeextrakt 1 Natriumchlorid. 0,5 Propylenglykol (Molgewicht: 2000) .. ..... .. 0,0116 Entsalztes Wasser aufgefüllt auf 100,00 Gegebenenfalls kann das als Antischaummittel verwendete Prolylenglykol der zum Animpfen verwendeten Suspension zugesetzt werden, und zwar in einer Menge, die beim Vermischen der Impfsuspension mit dem flüssigen Nährmedium - dem in diesem Fall kein Polypropylenglykol zugesetzt worden ist - die obengenannte Konzentration ergibt.
Bei den obengenannten Mengenverhältnissen der Bestandteile wird ein Nährmedium mit einem p-Wert von etwa 6,3 bis 6,4 erhalten. Während der Bebrütung der Brucella-Organismen in dem Medium steigt der pH-Wert normalerweise auf einen Wert von 8,1 bis 8,3 an. Im allgemeinen wird das Kulturmedium ohne weitere Zusätze in diesem gewünschten Bereich gehalten. Steigt jedoch der pn-Wert vor Bildung der gewünschten Menge an Organismen auf einen Wert oberhalb des im vorstehenden genannten Grenzwertes an, so können zur Aufrechterhaltung des pu-Wertes im gewünschten Bereich geringe Mengen steriler wäßriger 500/oiger Glucoselösung zugegeben werden.
Es wurde ferner gefunden, daß es für das gewünschte rasche Wachstum der Organismen nicht ausreicht, die Belüftung des Kulturmediums während der Züchtung der Brucella-Organismen so durchzuführen, daß man Luft in den oberen Teil des Fermentationsbehälters einleitet und sich zur Einführung der Luft in das Medium auf die Mischwirkung des Rührers verläßt. Dementsprechend hat es sich als wesentlich herausgestellt, die sterile Luft in den unteren Teil des Fermentationsbehälters unterhalb der Oberfläche des Nährgemisches einzuführen, und zwar mit Hilfe eines Fritten- bzw. Düseneinleitungsrohres (englisch: sparger) oder einer anderen geeigneten Verteilungsvorrichtung sowie mit einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 7 Volumteilen Luft je Minute je 10 Volumteile Kulturmedium.
Bei der praktischen Durchführung des Verfahrens wird durch das Rühren der Nährflüssigkeit und das rasche Wachstum der Organismen während der Inkubationsperiode so viel Wärme erzeugt, daß gewöhnlich zumindest während des stärksten Wachstums eine Kühlung erforderlich ist, um die Temperatur nahe 370 C zu halten.
Es ist im allgemeinen erwünscht, die Vermehrung der Organismen in zwei oder mehr Stufen durchzuführen. Zum Beispiel wird das mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung aus derKartoffel-Glycerin-Agar-Kultur extrahierte Animpfmaterial vor dem Gebrauch untersucht und auf seine Reinheit geprüft. Das Animpfmaterial wird dann in ein bestimmtes Volumen der wie oben zusammengesetzten sterilen Nährflüssigkeit eingeführt, und zwar in einem Mengenverhältnis von etwa 1 Volumteil Impfmaterial auf mindestens etwa 14 Volumteile des Mediums, und das erhaltene Gemisch wird unter den oben beschriebenen Bedingungen vorläufig etwa 20 Stunden bebrütet, um eine für Groß ansätze geeignete Impfkultur zu erhalten. Bei einer solchen Arbeitsweise wird die Zahl der mit Impfmaterial gefüllten und gelagerten Flaschen so gewählt, daß die Konzentration der Brucella-Organismen in dem Impfmaterial ausreicht, in dem erhaltenen Gemisch eine anfängliche Konzentration von 0,6 100 bis 1,5 100 Organismen pro Kubikzentimeter zu erhalten. Nach Ablauf der besagten Vorkultivierungsperiode wird - während in der so vorliegenden Arbeits-Impfkultur noch eine starke Vermehrung der Brucella-Organismen stattfindetfrisches steriles flüssiges Nährmedium in einer Menge, die mindestens das gleiche bis zum zweifachen des Volumens der Arbeits-Impfkultur ausmacht, in den Fermentationsbehälter gegeben, worauf die Züchtung des Organismus unter den gleichen Bedingungen weitere etwa 15 bis 20 Stunden fortgesetzt wird, um die Herstellung des gewünschten Impfstoffkonzentrats zu vervollständigen.
Beispiel 1 Brucella-abortus-Organismen vom Stamm 19 wurden auf Kartoffel-Glycerin-Agar-Nährböden geimpft, die sich in Povitsky-Flaschen befanden, und in üblicher Weise bebrütet. Nach 48stündiger Bebrütung bei 36 bis 380 C wurden die Organismen aus fünfzehn bis zwanzig solchen Flaschen durch Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung, die einen Phosphatpuffer zur Aufrechterhaltung eines pII-Wertes von 6,4 enthielt, gewonnen und die Waschflüssigkeiten in Vorratsbehälter gegeben und auf ihre Reinheit geprüft. Die Zahl der Flaschen, deren Inhalt mit der Waschflüssigkeit behandelt wurde, und das Volumen der Waschflüssigkeiten wurden so gewählt, daß die Impfvorratslösung mindestens etwa 75 1011 lebensfähige Brucella-Organismen enthielt. Inzwischen wurde ein flüssiges Medium mit den folgenden Bestandteilen hergestellt: Pankreashydrolysat von Casein * 30/0 Glucose ................ 2% Thiaminhydrochlorid ..... 0,0005% 0,00050/0 Hefeextrakt . 1 O/o NaCl ......:........ 0,5 0/o Polylgykol P 2000** . 0,0116 0/o Wasser . . 93,4 0/o * »NZ-Amin«, Typ A (Sheffield Chemical Co.).
** Ein Polypropylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 2000.
125 1 der wie vorstehend bereiteten Flüssigkeit wurden durch ein Seitz-Bakterienfilter in einen sterilisierten Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl gefüllt, der mit einem Fritten- bzw. Düsengaseinleitungsrohr und einem motorgetriebenen Rührer versehen war, und auf eine Temperatur von etwa 370 C eingestellt. Zu dem flüssigen Medium wurde dann unter Rühren die wie oben beschrieben gewonnene Impfflüssigkeit in einer Menge gegeben, daß eine anfängliche Konzentration von etwa 0,6- 109 bis 1,5 109 Organismen je Kubikzentimeter vorlag. Das erhaltene Gemisch wurde bei einer Temperatur von 36 bis 380 C und einer Rührergeschwindigkeit von 240 bis 250 Umdr./Min. etwa 20 Stunden bebrütet.
Während dieser Bebrütungsperiode wurde in den unteren Teil des Mediums sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 7,1 imin. je 10 1 Medium eingedüst und die Temperatur - je nachdem durch Erhitzen oder Kühlen - in dem obengenannten Bereich gehalten. Nach Beendigung der Bebrütung dieses Arbeits-Impfansatzes wurden weitere 175 1 des obengenannten flüssigen Mediums durch Filtrieren sterilisiert und in den Fermentationsbehälter gegeben. Die Bebrütung wurde sodann unter den vorgenannten Bedingungen weitere etwa 18 Stunden fortgesetzt, wonach das erhaltene Impfstoffkonzentrat in einen sterilisierten Aufbewahrungsbehälter aus rostfreiem Stahl abgezogen und durch Kühlung auf eine Temperatur von 50 C konserviert. Aliquote Anteile dieses Konzentrats wurden serienmäßig mit steriler wäßriger Io/oiger Peptonlösung verdünnt und die in geeigneter Weise verdünnten Lösungen in Petrischalen auf einen sterilen Kartoffel-Agar-Nährboden gebracht, der Pferdeserum enthielt, und 120 Stunden bei 36 bis 380 C bebrütet. Die Auszählung der auf den Platten befindlichen Organismen zeigte, daß der Ansatz des Impfstoffkonzentrats etwa 200 109 lebensfähige Brucella-abortus-Organismen je Kubikzentimeter enthielt. Andere serienmäßig hergestellte Verdünnungen wurden auf sterile Kartoffel-Agar-Böden gebracht, die kein Pferdeserum enthielten, bebrütet und nach dem Verfahren von Minute und Manthei, American Journal of Veterinary Research, 2, (3), S. 181 bis 190 (1941), auf die Bildung abartiger Organismen untersucht. Es wurde gefunden, daß das Impfstoffkonzentrat von abartigen Formen praktisch frei war. Weitere, nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellte Ansätze von Impfstoffkonzentrat lieferten übereinstimmende Ausbeuten von 150 109 bis 220 109 Brucella-abortus-Organismen je Kubikzentimeter.
Sowohl flüssige als auch getrocknete Impfstoffpräparate, die aus den nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Impfstoffkonzentraten gewonnen worden waren, zeigten bei der Lagerung eine ausgezeichnete Beständigkeit und wurden routinemäßig für eine Anzahl von Monaten zur Immunisierung von Kälbern verwendet, wobei kein späterer Verlust der Immunität berichtet wurde.
Wird eine Konservierung des Impfstoffes durch Eintrocknen gewünscht, wird dem Impfstoffkonzentrat vor der Gefriertrocknung vorzugsweise ein Stabilisierungsmittel, wie sterile Magermilch oder wieder aufgelöstes Trockenmagermilchpulver, zugesetzt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde gefunden, daß eine in unerwarteter Weise erhöhte Beständigkeit erzielt werden kann, wenn an Stelle von Milch ein Stabilisierungsmittel der folgenden Zusammensetzung verwendet: Bestandteile Gewichtsprozent Kaliumcitratmonohydrat . 0,135 Natriumcitrat . ........ . 0,245 Dikaliumhydrogenphosphat . 0,061 Calciumchlorid 0,133 Magnesiumchloridhexahydrat . 0,06 Kaliumcarbonatsesquihydrat . 0,1 Lactose . . 17,25 Wasser . . aufgefüllt auf 100,00 Der pH-Wert der vorstehenden Lösung, im folgenden als Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel bezeichnet, wurde mit Milchsäure auf 7 eingestellt und die Lösung vor dem Gebrauch durch Filtrieren sterilisiert.
Das Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel hat sich auch zur Stabilisierung von flüssigen Impfstoffpräparaten als bemerkenswert wirksam erwiesen. In den Mengen, wie das Stabilisierungsmittel in normalen Dosierungen des Impfstoffes zur Anwendung kommt, ist auch seine Injizierung bei Rindern unbedenklich.
Die folgenden Beispiele erläutern die Verbesserung der Beständigkeit von flüssigem Impfstoff, wie sie durch den oben beschriebenen Citrat-Lactose-Stabilisator erzielt wird, sowie die erhöhte Beständigkeit der erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffpräparate im Vergleich zu Impfstoffpräparaten, die durch Kultivierung der Organismen auf Kartoffel-Glycerin-Agar-Nährböden unter Verwendung von Magermilchtrockenpulver als Stabilisierungsmittel hergestellt wurden.
Beispiel 2 Ein nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellter Ansatz von Impfstoffkonzentrat wurde in zwei Teile geteilt und jeder Teil genügend verdünnt, um einen injizierfähigen, eine geeignete Konzentration an Brucella-Organismen aufweisenden Impfstoff zu erhalten. Der eine dieser Teile wurde in üblicher Weise mit steriler, phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung von PH= 6,4 verdünnt. Der andere Ansatz wurde mit dem oben beschriebenen sterilen Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel verdünnt.

Proben eines jeden Teiles wurden serienmäßig verdünnt und zur Bestimmung der Konzentration an lebensfähigen Brucella-Organismen in üblicher Weise auf Nährplatten aufgebracht. Die beiden Ansätze wurden dann 6 Monate in geschlossenen Behältern bei einer Temperatur von 50 C aufbewahrt und wiederum wie vorstehend geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt, in der die Zahl der Organismen in Milliarden (109) je Kubikzentimeter angegeben ist.

Lebensfähige Brucella-

Verwendetes abortus-Organismen

Verdünnungsmittel je Kubikzentimeter ( 109)

Nach der Nach

Herstellung 6 Monaten

Phosphatgepufferte Koch-

salzlösung . . 12,9 6,2

Citrat-Lactose-

Stabilisierungsmittel . 14,5 13,9

Es ist also festzustellen, daß der in üblicher Weise mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellte Impfstoff während der Lagerung über 50°/o der anfangs vorhandenen lebensfähigen Organismen verliert, während die Konzentration des erfindungsgemäß stabilisierten Impfstoffes lediglich um etwa 4 ovo absinkt.

Zu Vergleichszwecken wurden Brucella-abortus-Organismen vom Stamm 19 aus einer kräftigen Stammkultur auf ein übliches Kartoffel-Glycerin-Agarmedium geimpft, bebrütet und zur Herstellung eines Impfstoffkonzentrats nach dem bekannten Standardverfahren durch Waschen mit gepufferter Kochsalzlösung gewonnen. Zwei Ansätze des so hergestellten Impfstoffkonzentrats wurden mit gelöstem Magermilchtrockenpulver (einem verbreitet angewendeten Stabilisierungsmittel) und physiologischer Kochsalzlösung in den folgenden Anteilen verdünnt: Bestandteile Gewichtsprozent Impfstoffkonzentrat .. . 40 Kochsalzlösung . 16 Milchlösung * . 44 * Eine sterile Lösung, die 92,6 g Magertrockenmilchpulver je Liter enthielt.
Nach dem Verfahren von Beispiel 1 wurden in flüssigem Medium weitere Ansätze von Impfstoffkonzentrat hergestellt. Zwei Ansätze solcher Konzentrate wurden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und genau wie die aus dem festen Medium gewonenen Konzentrate mit physiologischer Kochsalzlösung und aufgelöstem Magertrockenmilchpulver verdünnt. Zwei weitere Ansätze von in flüssigen Medien hergestellten Konzentraten wurden mit dem oben beschriebenen Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel verdünnt.

Sämtliche Ansätze der wie oben hergestellten stabilisierten Impfstoffe wurden in Standard-Dosierungsvolumina geteilt, in Flaschen abgefüllt und in einer handelsüblichen Vorrichtung gefriergetrocknet. Nach dem Eintrocknen wurden Proben eines jeden Impfstoffansatzes wieder aufgelöst, serienmäßig verdünnt und nach dem Standardverfahren auf Nährplatten aufgebracht, um die Konzentration an lebensfähigen Organismen in jedem Ansatz zu bestimmen. Die auf Flaschen abgefüllten eingetrockneten Impfstoffpräpa- rate wurden dann in einen bei 370 C gehaltenen Brutschrank gebracht. Solche Impfstoffe werden normalerweise bis zur Auflösung vor dem Gebrauch unter Kühlung aufbewahrt. Wenn also - wie es hier der Fall ist - sogar ein lebender Impfstoff bei 370 C gelagert wird, handelt es sich um eine stark beschleunigte Prüfung auf die Beständigkeit. Nach einer Lagerung von 5, 10 und 20 Tagen werden von jedem Impfstoffansatz aus dem Brutschrank Proben entnommen und wie vorstehend geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt, in der die Zahlen Milliarden lebensfähige Brucella-Organismen je Kubikzentimeter wieder aufgelöstem Impfstoff bedeuten.

Lebensfähige Brucella-abortus-Organismen (Milliarden je Kubik-

Nährmedium Stabilisator AI zentimeter) zur angegebenen Zeit nach der Gefriertrocknung

Anfangswert zu 5 Tage 1 10 Tage 1 20 Tage

Fest, Kartoffel-Agar . Magermilch 16,2 12,5 6,0 0,3

Fest, Kartoffel-Agar ...... Magermilch 14,3 12,5 6,0 0,3

Flüssig, wie im Beispiel 1 . Magermilch 16,9 14,2 10,5 6,3

Flüssig, wie im Beispiel 1 . . . Magermilch 24,1 19,7 8,3 7,2

Flüssig, wie im Beispiel 1 . . . Citrat-Lactose ; 19,9 16,5 14,8 9,0

Flüssig, wie im Beispiel 1 . Citrat-Lactose ~ 21,6 17,8 15,3 1 12,5

Die »Anfangswerte« in obiger Tabelle bedeuten die Konzentrationen von Proben, die unmittelbar nach der Gefriertrocknung wieder aufgelöst und geprüft wurden. Die Ergebnisse zeigen nicht nur die stark erhöhte Beständigkeit der mit dem Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel stabilisierten Impfstoffpräparate, sondern auch die größere Beständigkeit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung eines flüssigen Mediums hergestellten Impfstoffe, was sich bei einem Vergleich des erfindungsgemäßen Produktes mit einem nach dem bekannten, mit festen Kartoffel-Agar-Nährmedien arbeitenden Verfahren hergestellten Produkt zeigt, wenn beide Produkte mit Magermilch stabilisiert wurden.

Das starke Wachstum der Organismen und das Fehlen einer Bildung abartiger Formen nach dem erfindungsgemäßen, mit dem flüssigen Nährmedium arbeitenden Verfahren macht eine kontinuierliche bzw. halbkontinuierliche Durchführung des Verfahrens möglich. Bei einer solchen Durchführung wird ein Teil der flüssigen Kultur aus dem Fermentationsbehälter abgezogen, ehe die Herstellung des Impfstoffkonzentrats beendet ist und während sich die Organismen noch stark - mit logarithmisch zunehmender Wachstumsgeschwindigkeit - vermehren.
Dieser Teil wird dann als Impflösung für ein weiteres frisches Volumen an flüssigem Nährmedium verwendet und der beschriebene Vorgang beliebig oft wiederholt.

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten vom Stamm 19 von Brucella abortus, wobei man eine belüftete, sterile wäßrige Lösung, die Glucose, Hefeextrakt, Chloridionen, Thiaminhydrochlorid, ein Antischaummittel und ein Proteinmaterial enthält, mit den Organismen animpft und anschließend bebrütet, d a d u r c h gekennzeichnet, daß als Proteinmaterial ein Pankreasenzym-Hydrolysat von Casein ver- wendet wird, daß die Belüftung durch Einführung von steriler Luft unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche - vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von mindestens 0,7 Volumeinheiten je Minute je Volumeinheit des flüssigen Mediums - geschieht und daß das flüssige Medium während der Kultivierung gerührt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Antischaummittel ein Polypropylenglykol verwendet wird, das vorzugsweise ein Molekulargewicht von 1500 bis 3000 aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium während der Kultivierung bei einer Temperatur von 36 bis 380 C gehalten wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der Organismen über einen Zeitraum von 20 bis 40 Stunden durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das zum Animpfen verwendete Präparat der Organismen in das flüssige Medium in einer Menge eingeführt wird, daß in dem erhaltenen Gemisch 0,6 109 bis 1,5 109 lebensfähige Organismen je Kubikzentimeter vorliegen.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung durch Einführung von frischem flüssigem Medium, vorzugsweise in einer Menge, die der anfänglich verwendeten Menge an flüssigem Medium mindestens gleich ist, in einer zweiten Stufe fortgesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Stufe der Kultivierung über einen Zeitraum von etwa 20 Stunden und die zweite Stufe nach Einführung einer weiteren, bis zum Zweifachen des ursprünglichen Volumens betragenden Menge an flüssigem Kulturmedium über einen Zeitraum von 15 bis 20 Stunden durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Impfstoffkonzentrat mit einem Stabilisierungsmittel vermischt wird, das aus einer wäßrigen Lösung besteht, die Kaliumcitratmonohydrat, Natriumcitrat, DikaIiumhydro- genphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumchloridhexahydrat, Kaliumcarbonatsesquihydrat und Lactose, vorzugsweise in Mengen von 0, 135, 0,245, 0,061, 0,133, 0,06 0,1 bzw. 17,25 Gewichtsprozent enthält.