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Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen aus Gewebekulturen gegen
die ansteckende Schweinelähmung Die ansteckende Schweinelähmung (Teschener Krankheit
der Schweine, Poliomyelitis suum) ist eine der spinalen Kinderlahmung ähnliche Erkrankung
der Schweine. Sie wird durch ein sehr kleines Virus hervorgerufen, das eine besondere
Affinität zum Zentralnervensystem hat und unter natürlichen Verhaltnissen bisher
nur beim Schwein angetroffen wurde. Der Lähmungsform, die eine klinisch und histologisch
gut umschriebene Krankheitseinheit darstellt, stehen sehr viel zahlreichere, klinisch
inapparente Infektionen gegenüber.
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Seit 1940 gehört die ansteckende Schweinelähmung in Deutschland zu
den anzeigepflichtigen Tierseuchen.
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Sie unterliegt den gleichen veterinärpolizeilichen Maßnahmen wie die
Schweinepest. Ihre Bekämpfung stellt die befallenen Länder vor große Schwierigkeiten.
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Das Bundesgebiet wird durch die Seuche vom Osten her bedroht. Osterreich,
die Tschechoslowakei und Polen sind verseucht. Auch die von England seuchenhaft
auftretende » Talfan-diseasez der Schweine wurde als ansteckende Schweinelähmung
erkannt. In jüngster Zeit brach die Seuche in Deutschland in der Gegend von Freilassing
aus.
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Zur aktiven Immunisierung der Schweine gegen die ansteckende Schweinelähmung
werden bis jetzt die Formalinadsorbatvaccine nach Traub (Totvaccine) oder Modifikationen
davon verwendet. Das Virus stammt aus dem Zentralnervensvstem künstlich intracerebral
infizierter Jungschweine. Es wird an Aluminiumhydroxyd adsorbiert und mit Formalin
inaktiviert. Eine Lebendvaccine gegen die ansteckende Schweinelähmung ist his jetzt
nicht bekannt.
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Nachdem uns die Züchtung des Virus in Schweinenierenkulturen gelungen
ist. bot sich eine Impfstoffherstellung aus Gewebekulturen an. Die Kulturvaccinen
lösen eine Reihe technischer Probleme, mit denen Tiervaccinen belastet sind. Ihre
Produktion ist in Kulturgefäßen im Labor möglich und nicht von dem Ankauf empfänglicher
und gesunder Tiere abhängig, sie haben ein konstantes Zuchtmilieu, die vechselnden
Einflüsse des Wirtsorganismus sind herabgesetzt, unspezifische Eiweiß-und Begleitstoffe
sind geringer, vor allem aber besteht bei ihnen nicht so sehr die Gefahr, daß verunreinigende
Viren, die im impfstoff im Sinne einer stummen, latenten oder klinisch inapparenten
Infektion anwesend sind, in den impfstoff gelangen. Für die alte Gehirnvaccine werden
in der Regel Händlerschweine benutzt. Sind zufällig schweinepestinfizierte Tiere
mit einer klinisch inapparenten Infektion oder im Stadium der Inkubation darunter,
so kann der Gehirnimpfstoff neben dem wirksamen Teschenvirus als Verunreinigung
auch das Schweinepestvirus enthalten.
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Das Grundprinzip einer Züchtung von Viren in Gewebekulturen auf Glas
(Monolavers), z. B. in Schweinenierenkulturen und eine Impfstoffherstellung hieraus
ist erfinderisch nicht neu. Da die einzelnen Viren jedoch auf Grund ihrer biologisch
unterschiedlichen Eigenschaften zu ihrer Reproduktion ganz unterschiedliche Zellsysteme
benötigen, ist es notwendig, für jedes einzelne Virus die zu seiner Vermehrung in
vitro geeignete Zellart experimentell zu suchen. Nur für eine ganz beschränkte Viruszahl
sind inzwischen geeignete Gewebekulturarten gefunden worden, in denen sich diese
Erreger optimal vermehren. Das Virus der ansteckenden Schweinelähmung lieB sich
bisher nur in seinem natürlichen Wirt züchten. Es wurde erstmals nachgewiesen, da.
es sich auch außerhalb des Schweines in Gewebekulturen aus Schweinenieren in vitro
vermehrt. Diese Tatsache war seither nicht bekannt, entsprechend war es bisher auch
nicht möglich, aus Schweinenierenkulturen Impfstoffe gegen die ansteckende Schweinelähmung
herzustellen.
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Bei einer lsontinuierlichen Reihenpassierung von Viren in bestimmten
Zellkulturen entdeckte man, daß cinzelne Viren in ihrer Virulenz abgeschwächt werden
und für ihren natiirlichen Wirt nicht mehr pathogen sind. Auch dieses Verfahren
ist nicht neu. Es handelt sich hierbei jedoch nicht um ein allgemeines biologisches
Prinzip. Viele Viren schwachen sich nämlich durch Passagen nicht ab. Auch in diesem
Verhalten muß jedes einzelne Virus gesondert untersucht werden.
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Der Nachweis, da8 das Virus der ansteckenden Schweinelähmung nach
zahlreichen Passagen in Gewebekulturen seine Pathogenität für das Schwein ver-
hart.
ist erstmals durch uns gefuhrt worden. Wir wiesen weiterhin nach, daß bei Verwendung
eines geeigneten. antigenstarken Ausgangs-Virusstammes der Erreger nach einer bestinunten
Passagezahl zwar Ncine Virulenz für das Schwein verlicrt, seine immunisierende Kraft
aber selbst dann noch beibehalt, wenn er mit Formalin inaktiviert wird. Es ist hisher
bei keiner Virusart gelungen, aus in Gewebekutturen abgeschwächten Erregern Formalinimpfstoffe
herzustellen. da die abgeschwächten Viren durch das Formalin so geschädigt wurden.
daß sie auch ihre immunisierenden Eigenschaften verloren. Formalinimpfstoffe aus
abgeschwächten Erregern stellen jedoch eine besonders große Sicherheit bei einer
Impfung dar, da auch bei einer eventuellen Reaktivierung des inaktivierten Erregers
im Wirt das abgeschwächte Virus keine Erkrankung mehr hervorrufen kann.
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Ausgehend von diesen neuen Entdeckungen, Züchtung des Schweinelähmungsvirus
in Schweinenierenl ; ulturen, Abschwächung des Virus durch zahlreiche Kulturpassagen,
Möglichkeit. das abgeschwächte Virus mit Formalin zu inaktivieren. Möglichkeit das
Virus in der Kultur so weit abzuschwächen, dad es auch ohne Formalininaktivierung
gefahrlos als Lel) endimpfstoff verwendet werden kann-wurden nun erstmals gegen
die ansteckende Schweinelähmung Impfstoffe aus Gewebekulturen entwickelt. Im Verlaufe
der Entwicklungsarbeiten einer Schweinelähmungsvaccine aus Gewebekulturen haben
sich daneben auch neue Gesichtspunkte für einzelne Produktionsstufen ergeben, die
die neue Kulturvaccine besonders charakterisieren.
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Die Erfindung der Herstellung von Impfstoffen aus Schweinenierenkulturen
gegen die ansteckende Schweinelähmung betrifft deshalb 1. ein Verfahren zur Herstellung
einer Formalinvaccine aus einem in Schweinenierenkulturen abgeschwächten, modifizierten
Kulturvirus, 2. ein Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine aus einem in Schweinenierenkulturen
so weit abgeschwächten Kulturvirus, daB es die Impflinge nicht mehr krank macht.
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Die Grundprinzipien werden im folgenden kurz beschrieben : 1. Güte,
Wirksamkeit und Unschädlichkeit von Virusantigenimpfstoffen sind primär sind dey
fur die Vaccineproduktion verwendeten Virusstamm verankert. Im Idealfalle ist das
Impfvirus bei einer Formalinvaccine für den Impfling nur schwach pathogen, verfügt
nach Inaktivierung über eine hohe antigene und immunisierende Kraft und läßt sich
leicht, regelmäßig und mit hohem Ertrag züchten. Das Impfvirus für eine Lebendvaccine
muß für den Impfling vollkommen ungefährlich sein, daneben aber noch gut immunisieren.
Jederlmpfstoffherstellunggehtdeshalb die Suche nach dem Idealvirus voraus. Dabei
ist von entscheidender Bedeutung, ob der Erreger in der Natur in Typen und Varianten
auftritt, die immunologisch differieren.
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Das Virus der Poliomvelitis des Schweines ist immunologisch einheitlich.
Die Herstellung eines Impfstoffes gegen die ansteckende Schweinelähmung ist deshalb
nicht mit dem Tvpen-und Varianteproblem helastet. Für die Herstellung einer Formalinvaccine
aus Gewebekulturen blieb iibrig das Suchen nach einem für das Schwein schwach pathogenen,
aber antigenstarken Stamm, der sich in der Gewebekultur konstant vermehrt. und für
die Herstellung einer Lebendvaccine das Suchen nach einem für das Schwein vollkommen
unschädlichen Virusstamm. Der
in ahlreichen. kontinuierlichen Gewebekulturpassagen
gezücktete Taschen-Kulturstamm Konratice erfullt beide Voraussetzungen in idealer
Weise. Mit steigenden Kutturpassagen nahm die Pathogenität des Kulturvirus für das
Schwein ab. Von der 90. his 9l. Passage an konnte mit Kulturvirus weder intracerebrat
noch durch Verfütterung eine paralytische Erkrankung beim Schwein erzeugt werden.
Die immunisierende)) Eigenschaften veränderten sich jedoch durch die Kutturpassagen
nicht. Mit dem modirixierten Ku) turvirus fassen sich deshalb sowohl formalinadsorbatals
auch Lebendvaccinen herstellen. In niedrigeren Kutturpassagen (80. bis 120.) eignet
sich das Virus für eine Totvaccine. in höheren Passagen (al) 300) fii eine Lebendvaccine.
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2. Bei der Herstellung von Virusformalinimpfstotfen auf der Basis
einer Formalininaktivierung kommt der Filtration der Virusausgangssuspensionen eine
große Bedeutung zu. Die Auffassungen über die Vorteile und Nachteile des Filtrationsprozesses
gehen auseinander. Eine Übereinstimmung besteht lediglich dariiber. daß eine Filtration
unerläßlich ist. Sie soll Zellreste, Aggregate, Verklumpungen und andere Stoffe,
die eine optimale Formalininaktivierung stören können, aus den Virusernten zurückhalten.
Die Filtration erfolgt durch Seitz-, EK-Filter oder Glasfilter verschiedener Porenweite.
Durch eine ungeeignete Filtration kann es zu einem Verlust an infektiösem Virus,
dann aber auch zu einer Verminderung der Antigenitat der wirksamen Viruspartikelchen
kommen.
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Um diese Nachteile zu vermeiden, wird die Filtration durch eine chloroformbehandlung
(10%) der Virusernten ersetzt. Die Chloroformbehandlung hat folgende Vorteile :
Sie fallut aus dem Impfstoffgemisch von Virusmoleküien, Aggregaten, Proteinen und
Zellresten einen GroBteil der bei einer Formalininaktivierung strittigen Substanzen
aus und löst aus den Virusernten weitgehendst Fette und Fettsäuren heraus. Dieser
Vorgang unterstützt die nachfolgende Virusinaktivierung. Die Virusinfektiosität
und-antigenität leidet durch das Chloroform nicht. Es kommt sogar zu einer Titersteigerung,
die wahrscheinlich durch Entfernen infektionshemmender Begleitstoffe oder Auflösung
von Virusaggregaten bedingt ist. Das Chloroform tötet in dem benutzten Konzentrationsbereich
schließlich noch Bakterien, Pilze und Hefen ab. Da man bei einer routinemäßigen
Impfstoffherstellung aus Gewebekulturen gelegentlich mit verunreinigenden Luftkeimen.
I'ilzen und Hefen. zu rechnen hat, erhöht eine Chloroformbehandlung die Sicherheit
der Sterilität.
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Auch bei der Herstellung der Lebendkulturvaccine wird die Chloroformbehandlung
zu Beginn des Produktionsverfahrens eingebaut.
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Die Chloroformbehandlung der Virusausgangsmaterialien an Stelle der
Filtration ist bei Impfstoffen gegen die ansteckende Schweinelähmung neu.
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An Stelle von Chloroform kann eine ganze Anzahl von höheren halogenierten
Kohlenwasserstoffen benutzt werden. Wirksam sind Trichlorãthylen, Trichloräthylen+Heptan
und Perchloräthylen, sowie Perchloräthylen+ Heptan.
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3. Die in der Tiermedizin bei Antigenimpfstoffen übliche Zugabe von
Aluminiumhydroxyd wird bei der Kulturvaccine gegen die ansteckende Schweinelähmung
beibehalten, ebenso die Inaktivierung des Virus durch den Formaldehyd.
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4. Der Kultur-Lebendimpfstoff wird als Trinkwasservaccine oder als
Parenteralvaccine (subkutan)
hergestellt. Im letzteren Falle enthält
die Vaccine Aluminiumhydroxyd (1% aluminiumoxyd), das dem chloroformgereinigten
Virusausgangsmaterial zu gleichet) Tei) en zugesetzt wird.
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Beispiel tiir die Herstettung eines Chtoroform-Formalin-AdsorhatimpFstoffes
aus Schweinenierenkulturen gegen die ansteckende Schweinelähmung Chloroformgereinigte
Virusernte . . 495.0 I liumbiphosphatpuffer. pH 7.3 .. 247,5 Aluminiumhydroxyd.
pa7. 3 (2°/oAl4O) 247 5 1:25 mit Aqua dest. verdünntes Formalin 10. 0 1000. 0 Ais
Hnpfvirus dient der Stamm Konratice in der 80. bis 120. Kulturpassage. In diesen
Passagen ist die Antigenität des Virus sicher erhatten. Die Schweinenierenkulturen,
in Rouxschalen geziichtet. werden beimpft, sobald sie 100°lo dicht sind. Das Impfmedium
ist reine Rinderamnionflüssigkeit. Geerntet wird nach totaler Kulturzerstörung.
Bis zur Verarbeitung lagern die Virusernten bei-20° C.
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Brauchbar sind Ernten mit Titern über 107'3, bezogen auf 1. 0 ml.
Da die Lagerung dem Virus nicht schadet, lassen sich größere Vorräte anlegen.
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Die Impfstoffherstellung beginnt mit der Chloroformreinigung. Dem
Virusausgangsmaterial setzt man 10*/e Chloroform zu und schiittelt es 60 Minuten
bei Zimmertemperatur. Nach 24stündigem Aufenthalt bei , 4° C wird das Gemisch 10
Minuten bei 7000 UpM zentrifugiert.
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Zu dem chloroformgereinigten Virus kommen gleiche Teile 1 : 2 mit
Boratpuffer verdünnten Aluminiumhvdroxvds (Pa 7, 3). Nach der Adsorption wird bei
37° C 48 Stunden lang mit einer Formalin-
endkonzentration von 1 : 2500 inaktiviert.
Der fertige Impfstoff lai bei+4°C.
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Bei einer Großproduktion lassen sich die einzelnen Arbeitsgange auf
einen Rührautolilav und eine Durchlaufzentrifuge verlagern.