DE1617568C - Verfahren zur Abschwachung von Schwel necholeravirus in Schweinezellkulturen - Google Patents

Description

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bei dem die Gefahr der Verunreinigung mit Mikro- trennungs- und Züchtungsstufe jeweils einzeln für

Organismen geringer ist. . ■ ■ : etwa 80 Passagen wiederholt, wodurch eine wirksame

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe auf Abschwächung des Schweinecholeraviriis erzielt wird, überraschend einfache Art und Weise dadurch gelöst Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel werden kann, daß man zur Attenuierung des Schweine- 5 näher erläutert. ■ choleravirus die Viren nicht auf jeweils neue Zellkulturen überimpft, wie bei dem vorstehend beschrie- . Beispiel benen bekannten Verfahren, sondern daß die Über- ·■■■·.'.

impfung der virusinfizierten Zellen auf stets neue Gesunde, für HCV hochempfindliche Yorkshire-Nährlösungen erfolgt, wodurch es möglich ist, die io Schweine, die in einer isolierten und geschlossenen vorstehend aufgezeigten Gefahrenquellen vollständig Anstalt unter Beachtung aller gesundheitlichen Regeauszuschalten, lungen gehalten wurden, wurden mit einem virulenten

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren Stamm von HCV geimpft. Der Stamm bestand aus

zur Abschwächung von Schweinecholeravirus in einem Standardimmunitätstest-Virus und war unter

Zellen, die durch eine einen Phosphatpuffer, 0,1 % ¹S strengem Ausschluß von Bakterien- und Viren-Ver-

Trypsin und 0,1 °/₀ EDTA enthaltende Salzlösung unreinigungen gehalten worden. Beim Höhepunkt

getrennt wurden, das durch die folgenden Schritte der Infektion ließ man die Schweine ausbluten und

gekennzeichnet ist: die Nieren wurden aseptisch entnommen. Die Nieren

_ _, , „ , _ „ . _T. , , wurden zerkleinert und bei 4⁰C über Nacht gerührt,

1. Beschaffung der Zellen aus Nieren oder anderen _{2o wobd das Gewebe Jn einer} p_{hosphatpuffer}salzlösung Schwemecholerav.rus enthaltenden Organen e.nes _{(pBS) aufgetrennt wurd die 0},25«>/₀ Trypsin und sonst gesunden Schweines das frei von einem ₀,25 °/₀ Pankreatin (auf das Gewicht bezogen) enthielt. Schweinecholeravirus-Antikorper ist und das mit _{Die ZeUen wurden mmelt gewaschen und in} einem Standardimmunitatsvirus geimpft wurde, _{einem Nahrmedium mit einer} Konzentration von wobei diese Nieren oder anderen Organe asep- _{25 5}.₁₀5_{ZelIen je Miimiter suspendiert}. _{Die Zeü}. tisch beim Höhepunkt der Infektion entnommen _{suspension wurde in} Glasgefäße gebracht und stawurden durch Zerstückelung der Niere oder _{tionär bd 36 big 37}o_{c üchtet Die an der Glas}. der anderen Organe und Trennung des Zellver- _{wand anhaftenden Zellen bildeten einen zusammen}bandes durch Trypsinisierung be! 4 C, hängenden Einschichtzellrasen.

2. Züchtung eines Zellrasens bei 36 bis 37° C aus _3O Nach vollständiger Ausbildung des Zellrasens den durch Trypsin getrennten, infizierten Zellen wurde die Schicht erneut mit PBS, das 0,1 Gewichts-

^ijin einem Nährmedium zur Erlangung eines pri- prozent Trypsin und 0,1 Gewichtsprozent EDTA

mären Einschichtzellrasens von infizierten Zellen, enthielt, aufgetrennt. Die Zellen wurden wieder

3. Auftrennung der primären Einschichtzellkultur gesammelt, gewaschen und in einem Nährmedium durch eine einen Phosphatpuffer, 0,1 °/₀ Trypsin 35 mit einer Konzentration von etwa 1 · 10⁵ Zellen je und 0,1 °/₀ EDTA enthaltende Salzlösung, Milliliter suspendiert. Die suspendierten Zellen wur-

4. Weiterzüchtung der Zellen der Stufe 3 bei 36 ^{den in} Kulturgefäße gegeben und stationär bei 36 bis 37°C in einem frischen Nährmedium, die bis 37° C kultiviert, wobei sich wiederum ein zudarin eine neue Generation von infizierten Zellen sammenhängender Einschichtzellrasen bildete.

,,bilden, und Gewinnung einer Einschichtzellkultur 4< > Dieses Verfahren wird als Zellpassage bezeichnet,

in der zweiten Passage Zellen, die hintereinander mehr als 50mal passiert

5. Wiederholung sowohl der Auftrennung als auch . ^^urden' ^werden nachfolgend als Träger-Zellstämme "der Züchtung in frischen Nährmedien über 50 bezeichnet. ...... _c . ..„

oder mehr Passagen, um den Schweinecholera- _w ^D _f ^as _u Ausgangsmatenal fur das erfindungsgemaße virus abzuschwächen, bis der Virus für Schweine +5 Verfahren, nämlich der in den Nieren befindliche unschädlich ist und die mit dem abgeschwächten ^HCV' ^war^^{fur die oben} beschriebenen Zellpassagen Virus geimpften Schweine einer Schweinecholera- sowie zur Gewinnung von Tragerzellstammen geeigvirusinfektion widerstehen können. "^et· Außerdem zeichnete sich dabei die Änderung

des virulenten Virus zu einem nichtpathogenen Virus

'Das Verfahren der Erfindung unterscheidet sich 50 klar ab, wenn Schweine mit der Kulturflüssigkeit, von dem bekannten Abschwächungsverfahren da- die bei verschiedenen Stufen der Zellpassagen abgedurch, daß zur Durchführung von 100 Viruspassagen nomraen worden waren, geimpft wurden. Die mit nur einmal ein primärer Einschichtzellrasen hergestellt dem Zellstamm 1-1 und dem Zellstamm 3-2 erhalwerden muß und daß in den verschiedenen, für die tenen Ergebnisse, die jeweils von zwei infizierten Abschwächung erforderlichen Passagen nur jeweils 55 Schweinen herstammen, sind in der folgenden Tabelle ein frisches Nährmedium verwendet werden muß. zusammengefaßt.

Dadurch wird, abgesehen von der Wirtschaftlichkeit Der Zellstamm 1-1 zeigte, falls der HCV bei der

und leichten Durchführbarkeit des Verfahrens, die vierzigsten Passage oder vorher abgenommen worden Gefahr praktisch ausgeschaltet, daß — wie in dem war (was einem Kultjvierungstag von 375 oder früher bekannten Verfahren — bei der Durchführung der 60 entspricht), keine Änderungen hinsichtlich seiner Passagen Mikroorganismenverunreinigungen einge- Virulenz. Bei der 66. Passage (was einem Kultivieschleppt werden. rungstag von 500 entspricht) war der Virus nicht

Die in dem Verfahren der Erfindung verwendeten mehr letal für Schweine. Die Reaktion eines Schweiprimären Einschichtzellkulturen können von den nes, das den Virus erhielt, war stark, jedoch erholte Nieren, der Milz oder anderen Organen oder Geweben 65 es sich wieder und überlebte, wobei es im Wachstum von Schweinen hergestellt werden, die mit Schweine- zurückblieb. Die mit einem bei der 80. Passage abcholeraviren künstlich infiziert worden sind. Gemäß genommenen Virus geimpften Schweine (Kultivieeiner Ausgestaltung der Erfindung werden die Auf- rungstag 600) blieben gesund und ohne klinische

Symptome. Sämtliche überlebenden Schweine waren immun gegenüber einem Test mit einem virulenten HGV bei der 10⁴fachen der LD_nH_n. Die Immunität war 10 Tage nach der Impfung mit dem abgeschwächten Virus vorhanden.

Das im Zellstamm 3-3 enthaltene HCV war nicht schädlich für Schweine beim 63. Durchgang (Kultivierungstag 500). Die Reaktion der Schweine auf den Virus war schwach. Beim 80. Durchgang (KuI- : tivierungstag 600) war der Virus offensichtlich un-

schädlich für Schweine. Die überlebenden Tiere waren immun gegenüber, der 10⁴fachen LD_min eines virulenten HCV, und zwar bereits 10 Tage nach der Impfung mit dem abgeschwächten Virus.

Im.Gegensatz hierzu war ein HCV, der in nichtpassierten Einschichtzellrasen verblieb, welche während mindestens 600 Tagen unter periodischem Wechsel des Mediums gehalten worden waren, noch letal für Schweine. Das waren Kulturen, aus denen die .Trägerzellstämme gewonnen werden konnten.

Reaktion von Schweinen auf Schweinecholeravirus, der bei verschiedenen Stufen von Zellpassagen von virustragenden Schweineniereneinschichtzellstämmen abgenommen worden war

	Irioculurr	ι für Versuchsschweine	Virus- titer	Anzahl der Schweine***)	Reaktion der Schweine	Reaktion der Schweine	. ..
ZeIl-	Anzahl	Kulti	2,75*)	4	auf das Inoculum	auf Immunitätstest
stamm- bezeich- nung	der Passagen	vierungs- tag			Tod durch Schweine
	10	151	2,50	9	cholera (9)**)
					Tod durch Schweine
	24	300	4,25	13	cholera (22)	5 Wochen keine Reak
					Tod durch Schweine- .	tion****)
1-1	40	375	3,75	17	cholera (16)
					krank, jedoch Erholung,	2 Wochen keine Reaktion
	66	500			aber im Wuchs zurück	10 Tage keine Reaktion
			3,75	24	geblieben
			3,75	25	blieb gesund	...
	80	600	5,00	6	blieb gesund
	80	600			Tod durch Schweine	... ;
	20	200	1,50	11	cholera (11)
					Tod durch Schweine	; . .
	35	300	2,83	15	cholera (27)	3 Wochen keine Reaktion
					Tod durch Schweine
3-2	44	350	5,00	19	cholera (37)	2 Wochen keine Reaktion
					Überleben mit schwacher	10 Tage keine Reaktion
	63	500	5,25	26	Reaktion
			5,25	27 .	blieb gesund
	80	600			blieb gesund
	80	600

*) Log^TCIDjo-Virustiter je Impflösung (1 ml), erhalten nach END-Test. **) Tage bis zum Tod.

***) Yorkshire-Schwein, frei von HCV-Antikörper, 50 bis 60 Tage alt. ♦***) Zeitraum zwischen Impfung und Ansprechen auf Immunitätsversuch.

Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, daß das in Zellkulturen überlebende HCV hinsichtlich seiner Virulenz durch Passagen der Zellen abgeschwächt worden war.

Claims (5)

1 2 Gestehungskosten dieser Vakzine wegen des teuren Patentansprüche: Ausgangsmaterials (zu ihrer Herstellung muß defibri- niertes Gesamtblut von infizierten Schweinen ver- I. Verfahren zur Abschwächung von Schweine- wendet werden) sehr hoch sind. choleravirus in Zellen, die durch eine einen Phos- 5 Man war daher bestrebt, die Nachteile dieser phatpuffer, 0,1 °/0 Trypsin und 0,1% Äthylen- Vakzine mit abgetöteten Viren durch Verwendung diamintetraessigsäure enthaltende Salzlösung ge- von Vakzinen mit Lebendvirus zu beseitigen. Hier trennt wurden, gekennzeichnet durch hat sich jedoch gezeigt, daß bestimmte Lebendvirusfolgende Schritte: vakzine, beispielsweise ein lapinisierter Virus, hin-, , „ , „ „ vl. . ίο sichtlich der Virulenz des Virus mit großer Vorsicht

1. Beschaffung der Zellen aus Nieren oder betrachtet werden müssen.

anderen Schwe.necholeravtrus enthaltenden _{Es wjrd a}„ _{ein aner}kannt, daß die ideale Virus-Organen eines sonst gesunden Schweines, _{yakzine eJne s0},_{che mk ejnem abgeschwächten virus} das frei von einem Schweinecholeravirus- _{darstellt da eine Va}kzine in jeder Hinsicht sicher Antikörper ist und das mit einem Standard- ^_{n muß und bd niedri Dosierung e}ine schnelle immunitatsvirus geimpft wurde, wobei diese _{Entwicklung der} Immunität herbeiführen soll, die Nieren oder anderen Organe asept.sch beim _fQr j _{Zek anhält Dies läßt sich zufr}i_edenstellend Höhepunkt der Infektion entnommen wurden, _{nuf durch einen sicher abgeschwächten} virusstamm durch Zerstückelung der Niere oder der erreichen. Außerdem können dadurch die Gestehungsande re n Organe und Trennung des Zellver- _{2o kosten drastisch herab etzt werd da zur Her}. bandes durch Trypsinisierung bei 4 C, _ste„_{ung s0},_{cher Vakzine G}ewebekulturverfahren ein-

2. Züchtung eines Zellrasens bei 36 bis 37° C gesetzt werden können.

aus den durch Trypsin getrennten, infizierten Es wurde nun bereits auf die verschiedenste Art f

Zellen in einem Nährmedium zur Erlangung _und Weise versucht, unter Anwendung von Gewebe-

eines primären Einschichtzellrasens von infi- ₃₅ kulturverfahren abgeschwächte Schweinecholeraviren

zierten Zellen, (nachfolgend abgekürzt mit HCV) herzustellen. Bei

3. Auftrennung der primären Einschichtzellkultur vielen dieser Versuche ging man davon aus, Schweinedurch eine einen Phosphatpuffer, 0,1% Tryp- choleraviren auf Gewebekulturen zu überimpfen, die sin und 0,1% Äthylendiamintetraessigsäure von gesunden Tieren hergestellt worden waren. So enthaltende Salzlösung, 30 ist beispielsweise in der USA.-Patentschrift 3 226 296

4. Weiterzüchtung der Zellen der Stufe 3 bei ein Verfahren zur Abschwächung von Schweine-

36 bis 37°C in einem frischen Nährmedium, choleravirus beschrieben, bei dem Schweinecholera- ■ ^!

die darin eine neue Generation von infizierten viren auf Zellkulturen von Gewebeteilen eines Schwei-

Zellen bilden, und Gewinnung einer Einschicht- nes überimpft werden. Dabei erfolgt eine Attenuie-

zellkultur in der zweiten Passage, 35 rung des Schweinecholeravirus durch wiederholtes

5. Wiederholung sowohl der Auftrennungsstufen Überimpfen der Kulturbrühe auf stets neue ZeIlals auch der Züchtung in frischen Nähr- ^kui^t.^uren·.,. .. . „
medien über 50 oder mehr Passagen, um Nachteilig an diesem Verfahren ist, daß es verden Schweinecholeravirus abzuschwächen, bis hältnismaßig kostspielig ist, einen großen apparativen der Virus für Schweine unschädlich ist und ⁴° ^Aufwa.^nd erfordert und die Möglichkeit zur Verdie mit dem abgeschwächten Virus geimpften unreinigung mit Mikroorganismen verhaltn.smäß.g Schweine einer Schweinecholeravirusinfektion S^r°^ß »^st· ^Be! ^d'^e,^sem bekannten Verfahren muß namwiderstehen können. ^{lich fur} ->^ede Viruspassage zur Abschwachung des

Schweinecholeravirus ein neuer primärer Einschicht- ζ

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 45 zellrasen der Schweineniere verwendet werden. Wenn ^- ·

zeichnet, daß die Auftrennungsstufe und die z. B. 100 Passagen durchgeführt werden sollen, so

Züchtungsstufe jeweils einzeln für etwa 80 Pas- müssen lOOmal primäre Einschichtzellrasen aus

sagen wiederholt werden. Schweinenieren hergestellt werden, d. h., es müssen

100 Schweine getötet werden. Die Verwendung von 50 derart vielen· Schweinen zur Erzielung einer aus-

reichenden Abschwachung des Schweinecholeravirus

ist aber nicht nur teuer und arbeitstechnisch sehr aufwendig und zeitraubend, da die Herstellung von

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ab- Einschichtzellrasen verhältnismäßig schwierig ist, son-

schwächung von Schweinecholeravirus in Schweine- 55 dem es besteht auch die große Gefahr, daß die jeweils

zellkulturen. verwendeten Primärzellen Bakterien- und Virusver-

Schweinecholera ist eine bekannte Krankheit der unreinigungen enthalten, d. h. durch die Verwendung

Schweine, die in den verschiedensten Ländern auf der vielen verschiedenen primären Einschichtzellrasen j

dem Gebiet der Schweinezucht große wirtschaftliche für die Passagen zur Abschwächung des Schweine-'

Schaden anrichtet. Zur Bekämpfung der Schweine- 60 choleravirus wird nach diesem bekannten Verfahren

cholera wurden Schweinecholeravakzine entwickelt, auch die Gefahr vergrößert, daß in die Zellkulturen ,

die aus abgetöteten oder lebenden Viren bestehen. unerwünschte Verunreinigungen eingeschleppt werden.

Ein typisches Beispiel für eine Vakzine mit abgetöteten Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein Verfahren

Viren ist die Kristallviolettvakzine. Nachteilig an zur Abschwächung von Schweinecholeravirus in

dieser Vakzine ist jedoch, daß zur Erzielung einer 65 Zellen anzugeben, bei dem die vorstehend geschil-

starken Immunität große Dosen erforderlich sind derten Nachteile möglichst vermieden werden und

und die Immunität sich nur langsam entwickelt und das vor allem billiger ist, einen geringeren arbeits-

nur kurze Zeit anhält. Nachteilig ist ferner, daß die technischen und zeitlichen Aufwand erfordert und