DE1024678B

DE1024678B - Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zur Immunisierung von Hunden gegen Hundehepatitis

Info

Publication number: DE1024678B
Application number: DEA25946A
Authority: DE
Inventors: Arnold Howard Fieldsteel
Original assignee: ALLIED LAB Inc
Current assignee: ALLIED LAB Inc
Priority date: 1956-11-02
Filing date: 1956-11-02
Publication date: 1958-02-20

Description

Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zur Immunisierung von Hunden gegen Hundehepatitis Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Impfstoffen, die lebende, geschwächte infektiöse Hundehepatitis-I C H-viren enthalten und für die Immunisierung von Hunden gegen ICH (infektiöse Hundehepatitis) wirksam sind. Die ICH ist eine Viruskrankheit, die unter den Hunden auf der ganzen Welt weit verbreitet ist. Junge Hunde sind gegen ICH sehr anfällig, und ein hoher Prozentsatz der infizierten Welpen stirbt an dieser Krankheit. Die Sterblichkeit bei älteren Tieren ist nicht so groß wie bei Welpen, aber viele Hunde, die von einer natürlichen ICH-Infektion genesen, sind Überträger und übertragen die Krankheit auf andere anfällige Hunde. Im Hinblick auf die Neigung der ICH, sich durch Überträgerhunde übertragen zu lassen, ist es wichtig, daß ein Verfahren und Produkte für die Immunisierung anfälliger Hunde geschaffen werden.
Es ist bekannt, daß anfällige Hunde durch gleichzeitige Injektion von virulentem ICH-Virus und immunemSerum geschützt werden können. Diese Methode der Immunisierung scheint aber zu bewirken, daß ein hoher Prozentsatz der immunisierten Hunde Krankheitsüberträger wird und so zur Ausbreitung der Infektion beiträgt. Es wurden auch Impfstoffe aus mit ICH infiziertem Hundegewebe durch Inaktivierung des Virus mit Agenzien, z. B. mit Formaldehyd, hergestellt. Diese Impfstoffe mit abgetötetem Virus sind verwendbar, weisen aber gewisse Einschränkungen auf, die es wünschenswert erscheinen lassen, wirksamere Impfstoffe zu schaffen. Die Impfstoffe mit abgetötetem Virus benötigen nach der Injektion einen Zeitraum von etwa 2 Wochen, um Immunität zu erzeugen. Die Dauer der durch den Impfstoff mit dem abgetöteten Virus erzeugten Immunität wird gewöhnlich auf etwa 6 Monate angesetzt.
Es wurde gefunden, daß durch mehrmaligen Durchgang des ICH-Virus durch Gewebskulturen von Hundenieren, Hundeuterus und/oder Hundetestikeln der Virus nach fünfzig Durchgängen in dem Ausmaß so weit geschwächt wird, daß er die ersten Symptome der ICH nicht mehr hervorruft. Ein daraus hergestellter Impfstoff erzeugt bei der Impfung von anfälligen Hunden eine Antikörperbildung, die den Hund wirksam immunisiert.
Bei einer Methode zur Durchführung des Verfahrens zur Schwächung des ICH-Virus wurde die Wälzrohrtechnik zur Übertragung der Hundenierenexplantate in einem geeigneten Nährmedium verwendet, und nachdem ein Auswuchs von Epithelzellen erreicht wurde, werden die Röhren mit einer Suspension von Hundegewebe, das mit ICH-Virus infiziert wurde, geimpft. Nach 4 oder 5 Tagen werden Serienübertragungen auf neue Wälzrohrkulturen von Hundenierenexplantaten angestellt. Die vorzugsweise verwendete Ntihrfliissigkeit wird aus etwa 8 Teilen Earlescher Lösung (W. R. Earle, Journal of the National Cancer Institute, 1943, Bd. 4, S. 165), etwa l Teil 5°/oigem Lactalbuminhydrolysat und etwa 1 Teil inaktiviertem Pferdeserum hergestellt ; die ganze Lösung wird auf pH-Wat m 7, 6 bis 7, 8 eingestellt. Die Nierenexplantatkulturen können nach der Plasmaflockenmethode (plasma clot method), wie sie von Enders et al.
(J. F. Enders, T. H. Weller und F. C. Robbins, Science, 1949, Bd. 109, S. 85) beschrieben wurde, oder durch eine Trypsinbehandlung von zerkleinerter Nierenrinde von Welpen, wie sie von Dulbecco und Vogt (R. Dulbecco und M. Vogt, Journal of Experimental Medicine, 1954, Bd. 99, S. 167) beschrieben wurde, hergestellt werden.
Die verwendeten Nieren werden vorzugsweise von 2 bis 6 Wochen alten Welpen von überimmunisierten Hündinnen oder von älteren Welpen, die gegen ICH immunisiert waren, gewonnen, um vor zufälliger Ansteckung durch virulente ICH sicher zu sein. Nach etwa dem fünfzigsten Durchgang des ICH-Virus in den Wälzrohrkulturen aus Hundeniere ist der Virus so geschwächt, daß er zur aktiven Immunisierung von Hunden gegen ICH verwendet werden kann, ohne die üblichen pahthologischen Symptome der ICH hervorzurufen. Das flüssige Material mit dem geschwächten Virus kann direkt als Impfstoff verwendet werden. Wenn es unter sterilen Bedingungen aufbewahrt wird, bewahrt es den Virus in einer Form, die geeignet ist, eine aktive und dauerhafte Immunisierung hervorzurufen. Gewünschtenfalls kann man das Material der Gefriertrocknung unterwerfen und das trockene Material zu einem späteren Zeitpunkt mit einer geeigneten Flüssigkeit zum Gebrauch als Impfstoff verdünnen.
Es scheint, daß Wälzrohrkulturen von Hundeniere zur anfänglichen Kultivierung und Schwächung der ICH gut geeignet sind. Nach der Erfindung aber können suspendierte Zellkulturen aus Geweben aus Niere, Uterus und Testis von Hunden oder deren Geniische in geeigneten Nährflüssigkeiten zur Züchtung der geschwächten ICH und zur Herstellung eines Impfstoffes verwendet werden.
Die Art, in der die Erfindung ausgeführt wird, wird in den folgenden Versuchen dargelegt, die nur zur Erläuterung, nicht aber zur Beschränkung dienen.
Die Züchtung des Virus Bei Versuchen, die unter Verwendung von Wälzrohrkulturen mit Geweben aus Nierenrinden von Schweinen durchgeführt wurden, wurde jedes Rohr mit 0, 2 ccm einer 20°/Oigen Suspension von Hundeleber, die mit virulentem ICH-Virus infiziert war, beimpft. Die in den Röhren verwendete Nährflüssigkeit wurde aus 8 Teilen Earlescher eingestellter Salzlösung (6, 8 g Natriumchlorid, 0, 40 g Kaliumchlorid, 0, 20 g Calciumchlorid, 0, 20 g Magnesiumsulfat, 0, 125 g saures Natriumphosphat, 1, 00 g Glucose, 2, 20 g Natriumcarbonat und Wasser bis zur 1000-ccm-Marke), 1 Teil 5°lOigem Milchalbuminhydrolysat und 1 Teil inaktiviertem Pferdeserum hergestellt. Die Nährflüssigkeit wurde auf einen psi-vert von 7, 6 bis 7, 8 eingestellt. In Abständen von 4 Tagen wurden Reihenübertragungen von 0, 2 ccm unverdünnter Gewebskulturnüssigkeit auf neue Rohre durchgeführt. Bei keinem Durchgang und in keinem Rohr wurden an den Zellen des Schweinenierengewebes cytologische Veränderungen durch den Virus wahrgenommen. Das Material des fünften Durchganges, das 10-3-fach verdünnt in Mengen von 0, 2 ccm zwei Hunden subkutan injiziert wurde, bewirkte den Tod des einen Tieres mit den typischen starken pathologischen Schädigungen der ICH und löste beim anderen, das bei Behandlung gegen ICH mit dem ursprünglichen infizierten Hundelebermaterial immun war, eine fiebrige Reaktion aus. Diese Gewebskulturflüssigkeit stellte eine 107-fa. che Verdünnung gegenüber dem ursprünglichen Material dar, und zeigte bei intravenöser Injektion von l ccm bei Hunden einen Titer von nur 10-6,5, Beim siebenten Durchgang in Schweineniere bewirkte die unverdünnte Flüssigkeit, die zwei Hunden injiziert wurde, den Tod dieser Tiere mit den typischen Merkmalen und Schädigungen. Beim achten Durchgang hingegen wurde kein Virus gefunden. Es ist möglich, daß ein Viruswachstum aufgetreten war, wenngleich nur in geringem Maße.
Danach wurden Wälzrohrkulturen unter Verwendung des gleichen Nährmediums, wie oben beschrieben, aus Milz und ganzen Nieren aus 2 Wochen alten Hunden hergestellt. Einige von ihnen wurden mit 0, 2 ccm unverdünnter Flüssigkeit vom dritten Schweinenierendurchgang und einige mit 0, 2 ccm einer 2001, igen Suspension von Hundeleber, die mit ICH infiziert war, geimpft. In beiden Rohrsätzen wurde bis zum sechsten Tag der Inkubation keine Wirkung des Virus festgestellt. Zu diesem Zeitpunkt zeigten nur die Epithelzellen in den Hundenierenkulturen offenkundige cytologische Veränderungen.
Die Zellen waren rundlich und sehr zerbrechlich. Die Epithelflächen waren aufgebrochen und die Zellen in kleinen Gruppen wie Trauben angeordnet. Die Fibroblasten, die in diesen Kulturen vorhanden waren, waren nicht angegriffen und wuchsen weiter, obwohl die Epithelzellen wahrscheinlich schon vollkommen degeneriert waren. In den Milzkulturen, die nur Fibroblasten enthielten, waren keine Wirkungen des Virus zu sehen. Die überstehenden Flüssigkeiten bei den Nierenkulturen wurden entfernt, und mit 0, 2 ccm unverdünnter Flüssigkeit wurde ein Reihendurchgang durchgeführt. Bei den fol- genden Durchgängen trat die Wirkung nach 24 bis 48 Stunden Inkubationszeit auf. Die Durchgänge wurden in Zwischenräumen von 2 oder 3 Tagen gemacht.
Die Identifizierung des Virus in der Gewebskultur erfolgte beim zehnten Durchgang. Zu diesem Zeitpunkt betrug der Gehalt an Virus 10's's. Ein Welpe, der für ICH anfällig war, wurde mit ICH-Virus, der von Hunden stammte und garantiert frei von Hundestaupe-Virus war, geimpft. Der Hund bekam hohes Fieber und genas schließlich wieder.
Der Reihendurchgang des Virus wurde mehrere Monate hindurch fortgeführt bei gelegentlicher Zwischenimpfung des unverdünnten Virus auf Hunde zum Zwecke der Prüfung auf Virulenz und Spezifität des cytopathogenen Effektes. Beim vierzigsten Durchgang wurde festgestellt, daß der Virus noch eine fiebrige Reaktion erzeugte, daß aber beim einundfünfzigsten und vierundfünfzigsten Durchgang keine Reaktion auf den Virus hervorgerufen wurde. Die Hunde, die mit Durchgang Nummer 40 geimpft wurden, wurden mit einem Stamm-Fuchsencephalitisvirus, der für Hunde sehr virulent war, angesteckt, andere mit virulentem ICH-Virus, der bereits Hunde passiert hatte. Alle Tiere widerstanden der Ansteckung.
Um Veränderungen des Virus nachzuweisen, wurden verschiedene Durchgänge des Virus auf Hunde zurückinjiziert, um festzustellen, ob Veränderungen aufgetreten waren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle

Gewebs-
Zahl der Flebrige Trübung Todes-
kultur
geimpf- Reacktion der Cornea fälle
Durch-
Hunde An- An- An-
NR. % % %
zahl zhal zahl
l
10 2 2 0 1
11 17 17 2 3
13 5 5 0 3
#100 # 12 # 32
14 8 8 0 4
23 9 9 3 3
40 2 2 0 0
51 2 0 0 0
54 3 0 0 0
603) 4 1 0 0
70 4 0 0 0
7430610
872) 12 2 0 0

1) Siebzig schnelle Durchgange, unverdünnt, vier Durchgänge bei begrenzten Verdünnungen.

2) Siebzig schnelle Durchgänge, unverdünnt, siebzehn Durchgänge bei begrenzten Verdünnungen.
3) Fünfundzwanzig von sechsundzwanzig Kontrolltieren-Hundesüuglinge-erlitten eine tödliche Infektion, wenn sie mit virulentem Virus geimpft wurden.
Züchtung von ICH-Virus in suspendierten Zellkulturen von Hundeuterus, Hundetestis und Hundeleber Uterus-und Testisgewebe von Hunden, das frisch aus bis zu 9 Wochen alten Hunden gewonnen wurde, wurde in Stücke von 1 bis 2 mm Durchmesser geschnitten und in phosphatgepufferter Salzlosung gewaschen. Zehn bis zwanzig Stücke wurden dann auf 25-ccm-Erlenmeyerkolben mit Gummistopfen verteilt, die 3 ccm Nährflüssigkeit enthielten. Die Inkubation dieser Kulturen wurde bei 35° durchgeführt.
ICH-Virus vom sechsundachzigsten Durchgang in Nieren wurde auf Zellkulturen von suspendiertem Hundeuterus und-testis übertragen. Es wurden 25-ccm-Erlenmeyerkolben, die zerkleinerte Stücke von Uterus oder Testis und 3 ccm Nährflüssigkeit enthielten, mit 0, 1 ccm 10-3-fach verdünnter Viruslösung aus dem vorhergegangenen Durchgang geimpft und nach 7 Tagen Inkubationszeit aufgearbeitet. In dieser Weise wurde der Virus in vier weiteren Durchgängen in Uteruskulturen gezüchtet.
Der Virusgehalt, der dadurch erzeugt wurde, war den der im Wälzrohr mit Niere erzeugten Kulturen vergleichbar und betrug etwa das 10-7 7-fache der Virusgrunddosis je ccm Flüssigkeit. Aus diesen Uterus-und Testiskulturen wurden flüssige Impfstoffe gewonnen, die die Bildung von schützenden ICH-Antikörpern stimulieren, wenn man sie nichtimmunen Hunden injiziert, ohne die üblichen pathologischen Symptome der infektiösen Hundehepatitis hervorzurufen.
Suspendierte Zellkulturen von Hundeuterus-und-testikelgewebe sind im Anfangsstadium zur Isolierung und Züchtung des virulenten ICH-Virus aus Geweben von infizierten Tieren ebenfalls geeignet. Zum Beispiel wurden drei Kolben von suspendierten Uterusgewebszellen mit 0, 1 ccm einer im Verhältnis von 1 : 50 verdünnten Lösung von Leber eines infizierten Hundes geimpft.
(Es war dasselbe Material, das zum Ingangbringen des Wachstums des ICH-Virus in den ursprünglichen Nierenlsulturen verwendet wurde.) Gleiche Proben dieser Flüssigkeiten wurden nach dem Mischen entnommen, und es wurde eine Titration in einer VVälzrohrkultur von Nieren ausgeführt, um die Menge des vorhandenen Virus zu bestimmen. Die Flüssigkeiten hatten einen Titer von 10-4v0 je ccm. 1 Woche später wurden die Flüssigkeiten abgezogen und gesammelt, und es wurde der Titer zu 10-7, 7 je ccm bestimmt. Der Virusgehalt hatte also um das 5000fache zugenommen.
So bewirkt der wiederholte Durchgang des infektiösen Hundehepatitisvirus in Zellkulturen von suspendierter Hundeniere, Hundeuterus und Hundetestis bei wenigstens fünfzig Durchgängen die Schwächung des ICH-Virus so weit, daß er die Produktion von schützenden Antikörpern bei nichtimmunen Hunden hervorruft, ohne die üblichen pathologischen Symptome zu geben. Es wird angenommen, daß durch das wiederholte Passieren von Kombinationen dieser Gewebskulturen oder von aufeinanderfolgenden Gewebskulturen die Schwächung erzielt werden kann. Es können z. B. fünfundzwanzig Durchgänge in Nierenkulturen und anschließend fünfundzwanzig Durchgänge in Uterusgewebskulturen ausgeführt werden und zu einer Schwächung eines virulenten Stammes ICH-Virus führen.
In ähnlicher Weise können Kombinationen dieser Gewebe in geeigneten Nährflüssigkeiten für die Züchtung des geschwächten ICH-Virus verwendet werden und führen zur Herstellung eines geeigneten Impfstoffes zum Schutze von Hunden gegen ICH-Infektionen.
Herstellung des Impfstoffes im großen unter Verwendung des geschwächten Virus Bei diesem Verfahren werden 5-1-Flaschen, die 5 g frische zerkleinerte Hundeniere in 500 ccm Medium Nr. 199 (J. F. Morgan, H. J. Morton und R. C. Parker, Proceedings of the Society for experimental Biology, 1950, Vol. 73, 1) suspendiert enthalten, mit geschwächtem ICH-Virus (fünfzigster oder höherer Durchgang) geimpft und unter gelindem Schwenken bei 35° gehalten. Nach einem Wachstum von etwa 5 bis 7 Tagen wird die Flussigkeit aufgearbeitet und vom Gewebsmaterial abgetrennt. Die Flüssigkeit hat eine hohe Viruskonzentration und ist direkt als ICH-Impfstoff verwendbar oder kann der Gefriertrocknung unterworfen und zu einem späteren Zeitpunkt wieder in flüssiger Form verwendet werden.
Das Medium Nr. 199 enthält etwa 50 Bestandteile und ist im wesentlichen ein Gemisch aus Aminosäuren, Vitaminen, Desoxyribosederivaten von Purinen, Pyrimidinen und Nucleinsäuren, ungesättigten Fettsäuren und Salzen, das mit Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von 7, 8 eingestellt ist.
Zusammenfassend sieht man, daß die Erfindung ein Verfahren zur Schwächung von virulentem ICH-Virus angibt, und der geschwächte Virus zur Herstellung eines Impfstoffes verwendbar ist, der, Hunden parenteral injiziert, diese innerhalb weniger Tage nach der Impfung gegen ICH zu immunisieren vermag, ohne daß er irgendwelche pathologische Symptome dieser Krankheit hervorruft. Der Schwächungsprozeß besteht darin, daß man virulenten ICH-Virus nacheinander in einer ausreichenden Anzahl von Durchgängen, die die normale ICH-Sterblichkeit der damit infizierten Hunde wesentlich erniedrigen, durch Gewebskulturen aus Hundeniere, Hundeuterus und/oder Hundetestikeln passieren läßt. Etwa beim vierzigsten Durchgang tritt eine wesentliche Schwächung ein ; vorzugsweise ist jedoch ein Virus mit fünfzig oder mehr Durchgängen zur Verwendung als Impfstoff am besten geeignet.
Das besondere, beim Wälzrohrverfahren verwendete Nährmedium bewirkt ein üppiges Wachstum der Epithelzellen der Gewebsexplantate aus Hundeniere. Beim Schwächungsprozeß erscheint das Wachstum der Epithelzellen vom Standpunkt der Bestimmung des Vorhandenseins des Virus und zur Messung des gesunden Wachstums des Virus bei jedem Durchgang wünschenswert. Man kann auch andere Nährmedien zur Förderung des Epithelzellenwachstums bei Gewebsexplantaten aus Hundenieren verwenden, z. B. das Medium Nr. 199 mit 10°/o Pferdeserum. Durch Hitzebehandlung inaktiviertes Pferdeserum scheint einer der wesentlichsten Bestandteile des Nährmediums zu sein, in dem man ein Wachstum der Nierenepithelzellen erhält. So enthalten geeignete Nährflüssigkeiten für das Gewebswachstum nach dem Wälzrohrverfahren und zur Vermehrung des darin enthaltenen ICH-Virus z. B. eingestellte Earlesche Salzlösung mit Lactalbuminhydrolysat und Pferdeserum oder Medium Nr. 199 und Pferdeserum. Wendet man das Verfahren der suspendierten Zellen an, so sind die beim Wälzrohrverfahren verwendeten Nährflüssigkeiten ausreichend, oder man kann auch Medium Nr. 199 allein verwenden.
Verwendet man das besondere Nährmedium, so sind wenigstens vierzig hintereinanderfolgende Durchgänge des ICH-Virus nötig, um ihn so weit zu schwächen, daß er nichtimmunen Hunden injiziert werden kann, ohne die schweren pathologischen Symptome der ICH zu erzeugen. Nach fünfzig oder mehr Durchgängen ist der Virus so weit geschwächt, wo er nicht einmal mehr eine fiebrige Reaktion erzeugt, wenn er nichtimmunen Hunden injiziert wird ; vorzugsweise verwendet man den ICH-Virus mit wenigstens dieser Anzahl von Durchgängen.
Der nach diesem Verfahren erzeugte ICH-Virus ist, wenn er nichtimmunen Hunden injiziert wird, zur Anregung der Bildung von schützenden ICH-Antikörpern befähigt, ohne die üblichen pathologischen Symptome der ICH hervorzurufen. Der Impfstoff kann einfach aus dem filtrierten oder geklärten Nährmedium, das den geschwächten ICH-Virus enthält, bestehen. Vom technischen Standpunkt aus kann es wünschenswert sein, die geklärte Nährflüssigkeit mit dem geschwächten ICH-Virus schnell gefrieren zu lassen und im gefrorenen Zustand zu trocknen. In gewissen Fällen können geeignete Antibiotika, wie Penicillin und Streptomycin, der Impfsubstanz zugegeben werden.
Füchse, Wölfe, Coyoten, Schakale und andere Arten der Familie der Hunde sind gegen ICH und/oder Fuchsencephalitis anfällig, so daß der geschwächte Impfstoff zu ihrem Schutz gegen diese Infektionen verwendbar ist.
Da Hundegewebe leicht erhältlich ist, wird es beim Schwächungs-und Impfstoffherstellungsverfahren bevorzugt verwendet ; es können jedoch auch die entsprechenden Gewebe von Wölfen, Füchsen, Coyoten, Schakalen und anderen Arten der Familie der Hunde verwendet werden.
Die in diesem Verfahren angewandte Gewebskulturtechnik führt zur Herstellung eines Impfstoffes mit einer verhältnismäßig hohen Konzentration an lebendem, geschwächtem ICH-Virus. In vielen Fällen hat die infizierte Gewebskulturflüssigkeit einen Titer von 10-7, wie durch Titration des Virus in der Gewebskultur bestimmt wird.
Schon 0, 2 ccm Gewebskulturflüssigkeit dieser Verdünnung reichen aus, um einen cytopathogenen Effekt in der Gewebskultur hervorzurufen und stellen daher erwartungsgemäß eine immunisierende Dosis dar, wenn sie einem nichtimmunen Hund injiziert werden.
Wenn der geschwächte ICH-Virus auch die üblichen pathologischen Symptome der ICH hervorruft, wenn nichtimmune Hunde damit geimpft werden, findet im Hund unzweifelhaft ein Wachstum des Virus statt. Es ist möglich, daß geeignete Gewebe dieser Hunde, die nach 4 bis 8 Tagen nach der Impfung aufgearbeitet wurden, zur Herstellung eines Impfstoffes verwendet werden, der zur Immunisierung anderer anfälliger Hunde gegen ICH dienen kann.
Die Herstellung eines Impfstoffes in dieser Weise unter Verwendung des geschwächten ICH-Virus soll innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegen. In ähnlicher Weise ist esmöglich, daß der geschwächteICH-Virus abwechselnd von Gewebskulturen auf Hunde und wieder auf Gewebskulturen bei einer beträchtlichen Anzahl dieser alternie- renden Schritte übertragen wird und dabei doch geschwächt bleibt, und dies liegt gleicherweise innerhalb des Rahmens dieser Erfindung.
PATENTANSPROCHE : 1. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zur Immunisierung von Hunden gegen infektiöse Hundehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß ein durch wenigstens fünfzig aufeinanderfolgende Durchgänge durch Gewebskulturen aus Hundeniere, Hundetestikeln, Hundeuterus oder deren Gemischen geschwächter Virus der infektiösen Hundehepatitis auf eine Gewebskultur aus Hundeniere, Hundetestikeln, Hundeuterus oder deren Gemischen in einer Nährflüssigkeit entwickelt wird, bis der geschwächte Virus genügend gewachsen ist, um eine verwendungsfähige Konzentration zu besitzen, worauf das flüssige Material, das den Virus in einer verhältnismäßig hohen Konzentration enthält, zu einem Impfstoff mit dem geschwächten Virus der infektiösen Hundehepatitis aufgearbeitet wird.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für eine Gewebskultur aus Hundeniere oder für eine Gewebskultur aus Hundeuterus in Medium Nr. 199 als Nährflüssigkeit Earlesche eingestellte Salzlösung mit Lactalbuminhydrolysat und inaktiviertem Pferdeserum bzw. ein Medium Nr. 199, das ist ein Gemisch aus Aminosäure, Vitaminen, Desoxyribosederivaten von Purinen, Pyrimidinen und Nucleinsäure, ungesättigten Fettsäuren und Salzen, eingestellt mit Natriumbicarbonat auf einen pII-Wert von 7, 8, verwendet werden.