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CN108350058A - Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体(car)表达细胞的联合疗法 - Google Patents

Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体(car)表达细胞的联合疗法 Download PDF

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CN108350058A CN201680031677.9A CN201680031677A CN108350058A CN 108350058 A CN108350058 A CN 108350058A CN 201680031677 A CN201680031677 A CN 201680031677A CN 108350058 A CN108350058 A CN 108350058A
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Abstract

本发明提供了用于治疗与CD19表达相关的疾病的组合物和方法，例如通过与一种或多种B细胞抑制剂，例如CCD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT‑3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的一种或多种的抑制剂组合施用包含本文所述的CD19CAR的重组T细胞。本公开另外描述了针对CD20和CD22的新的抗原结合结构域和CAR分子，和例如用作单一疗法或联合疗法的用途。本发明还提供了本文所述的药盒和组合物。

Description

CD20疗法、CD22疗法和与CD19嵌合抗原受体(CAR)表达细胞的 联合疗法
本申请要求2015年4月8日提交的美国序列号62/144,615、2015年4月8日提交的美国序列号62/144,497、2015年4月8日提交的美国序列号62/144,639、2015年8月19日提交的美国序列号62/207,255、2015年12月4日提交的美国序列号62/263,423的优先权，将其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般涉及工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，任选与B细胞抑制剂，例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a的一种或多种组合以治疗与分化抗原簇19蛋白(CD19)的表达相关的疾病的用途。
背景技术
许多患有B细胞恶性肿瘤的患者通过标准治疗无法治愈。此外，传统治疗方案往往具有严重的副作用。在癌症免疫治疗方面已经做了尝试，但是几个障碍使得实现临床有效性是非常困难的目标。虽然已经鉴定了数百种所谓的肿瘤抗原，但它们通常来源于自身，因此其免疫原性差。此外，肿瘤使用几种机制来使自己对免疫攻击的起始和传播具有敌意。
使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞(CART)疗法的最新发展在利用免疫系统的力量治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症中显示出有希望的结果，所述疗法依赖于将T细胞重定向到癌细胞如B细胞恶性肿瘤上的合适的细胞表面分子(参见，例如，Sadelain etal.,CANCER DISCOVERY 3:388-398(2013))。鼠源CART19(即“CTL019”)的临床结果已经显示出在CLL和儿童ALL患者中建立完全缓解的希望(参见，例如，Kalos et al.,Sci TranslMed 3:95ra73(2011),Porter et al.,NEJM 365:725-733(2011),Grupp et al.,NEJM368:1509-1518(2013))。除了遗传修饰的T细胞上的嵌合抗原受体识别和破坏靶细胞的能力之外，成功的治疗性T细胞疗法需要具有随时间增殖和持续的能力，以便调查白血病复发。由于无反应性，抑制或衰竭而导致的T细胞的变化的质量将对CAR转化的T细胞的性能产生影响，熟练的医生在此时对所述性能的控制有限。为了有效，CAR转化的患者T细胞需要持久并保持响应于同源抗原而增殖的能力。已经显示ALL患者T细胞可以用包含鼠scFv的CART19进行(参见例如Grupp et al.,NEJM 368:1509-1518(2013))。
发明概述
该公开内容至少部分地涉及治疗与分化抗原簇19蛋白(CD19)表达相关的病症的方法(例如，OMIM Acc.No.107265,Swiss Prot.Acc No.P15391)。在某些实施方案中，该病症是癌症，例如血液癌症。在一些实施方案中，该方法包括施用与B细胞抑制剂例如一种或多种(例如，一种，两种，三种或更多种)B细胞抑制剂组合的结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)分子。在一些实施方案中，B细胞抑制剂选自CD10，CD19，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的抑制剂或其组合。在一些实施方案中，与单独的任一疗法相比，该组合保持或具有更好的临床有效性。在一些实施方案中，本文的方法涉及使用工程化细胞，例如表达结合CD19的CAR分子的T细胞与第二种B靶标(例如CD10，CD19，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1)的B细胞抑制剂(例如，抗体(例如，单特异性或双特异性抗体)或结合第二种B靶标的CAR表达细胞，例如CAR表达免疫效应细胞，其组合)的组合来治疗与CD19的表达相关的病症。本公开另外描述了针对CD20和CD22的新型抗原结合结构域和CAR分子，并且例如用作单一疗法或联合疗法的用途。
因此，一方面，本发明涉及治疗具有与CD19表达相关的疾病的受试者(例如哺乳动物)的方法。该方法包括向受试者施用与B细胞抑制剂组合的CD19抑制剂，例如结合本文所述的CD19的CAR分子。例如，该方法包括向受试者施用与B细胞抑制剂组合的有效数目的一种或多种表达结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19(例如，野生型或突变型CD19)的CAR分子的细胞。在某些实施方案中，B细胞抑制剂选自CD10抑制剂，例如本文所述的一种或多种CD10抑制剂；CD20抑制剂，例如本文所述的一种或多种CD20抑制剂；CD22抑制剂，例如本文所述的一种或多种CD22抑制剂；CD34抑制剂，例如本文所述的一种或多种CD34抑制剂；CD123抑制剂，例如本文所述的一种或多种CD123抑制剂；FLT-3抑制剂，例如本文所述的一种或多种FLT-3抑制剂；ROR1抑制剂，例如本文所述的一种或多种ROR1抑制剂；CD79b抑制剂，例如本文所述的一种或多种CD79b抑制剂；CD179b抑制剂，例如本文所述的一种或多种CD179b抑制剂；CD79a抑制剂，例如本文所述的一种或多种CD79a抑制剂或其任何组合。在某些方面，公开了一种治疗患有B细胞白血病或B细胞淋巴瘤的受试者的方法，包括向受试者施用有效数目的一种或多种表达结合CD19的CAR分子的细胞，与CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3，ROR1，CD79b，CD179b或CD79a的一种或多种抑制剂的组合。
在相关方面，本公开提供了减少CD19表达细胞增殖的方法，例如通过向受试者(例如有此需要的患者)施用如本文所述的组合疗法，例如CD19抑制剂与B细胞抑制剂，例如本文所述的一种或多种B细胞抑制剂组合。在另一方面，本公开提供了选择性地杀死表达CD19的细胞的方法，例如通过向受试者(例如有此需要的患者)施用如本文所述的组合疗法，例如CD19抑制剂与B细胞抑制剂，例如本文所述的一种或多种B细胞抑制剂组合。在某些方面，本公开提供了在受试者例如哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向哺乳动物施用有效量的如本文所述的组合(例如，一种或多种CAR表达细胞)。
在一方面，本公开提供了预防哺乳动物中CD19阴性复发的方法，包括向所述哺乳动物施用一种或多种B细胞抑制剂，其中所述B细胞抑制剂包含CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种的抑制剂。
在另一方面，本公开提供了治疗患有与CD19表达相关的疾病，例如DLBCL(例如原发性DLBCL))的受试者的方法。该方法包括向受试者施用有效数量的一种或多种表达结合CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的细胞，任选与PD1抑制剂组合。任选地，受试者具有或被鉴定为具有至少5％,6％,7％,8％,9％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％或90％的癌细胞，例如DLBCL细胞，其为CD3+/PD1+。
在一方面，本公开提供了治疗患有与CD19表达相关的疾病(例如DLBCL)的受试者的方法。该方法包括向受试者施用有效数量的一种或多种细胞，其表达结合CD19的CAR分子，例如CD19 CAR，与PD-L1抑制剂组合。任选地，受试者具有或被鉴定为具有小于20％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％或1％癌症细胞，例如癌症微环境，对CD19和PD-L1是双阳性的。
一方面，本公开提供一种或多种B细胞抑制剂，其中所述B细胞抑制剂包含CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a的一种或多种，用于治疗具有与CD19表达相关疾病的受试者，并且其中所述受试者已经接受或正在接受或即将接受表达结合CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的细胞。
组合施用的定时和剂量
本文所述的一种或多种疗法可以基本上同时或以任何顺序施用于受试者。例如，CD19抑制剂，例如本文所述的CD19 CAR表达细胞，一种或多种B细胞抑制剂和/或任选的至少一种另外的治疗剂可以在相同或分开的组合物中同时施用，或顺序施用。
对于顺序施用，可首先施用本文所述的CAR表达细胞(例如，CD19 CAR表达细胞，CD20 CAR表达细胞或CD22 CAR表达细胞)，并且可以其次施用另外的药剂，或者施用的顺序可以颠倒。在一些实施方案中，当引入第二种疗法时，第一种疗法(例如，CAR表达细胞，例如CD19 CART细胞，CD20 CART细胞或CD22 CART细胞)继续进行，并且在其它实施方案中，第一种疗法在引入第二种疗法之前、之后撤出或与第二种疗法同时撤出。在顺序施用的情况下，在一些实施方案中，第二种疗法在预定量的时间之后启动或在受试者展示出已经发生或可能发生复发的一个或多个指征之后启动。指征可以是例如在第一种疗法的靶标例如CD19，CD20或CD22中具有干扰的癌细胞的存在。干扰可能是例如移码突变和/或过早终止密码子。
在其他实施方案中，同时施用两种或更多种疗法(例如CD19 CAR表达细胞和B细胞抑制剂)。不受理论的约束，在一些实施方案中，疗法的同时施用可以减少复发的可能性和/或延迟复发。
当组合施用时，第一疗法(例如CAR疗法，例如针对CD19，CD20或CD22的CAR表达细胞)和另外的药剂(例如，第二或第三药剂，例如B细胞抑制剂)，或全部可以以与单独使用的每种药剂(例如作为单一疗法)的量或剂量更高，更低或相同的量或剂量施用。在某些实施方案中，第一疗法，第二疗法，任选的第三疗法或全部的给药量或剂量比例如作为单一疗法的单独使用的每种药剂的量或剂量更低(例如，低至少20％，至少30％，至少40％，或至少50％)。在其它实施方案中，导致期望效果(例如，癌症的治疗)的第一疗法，第二疗法，任选的第三疗法或全部的量或剂量比例如实现相同治疗效果所需的作为单一疗法单独使用的每种药剂的量或剂量更低(例如，低至少20％，至少30％，至少40％或至少50％)。在某些实施方案中，与施用常规(单一疗法)剂量时看到的副作用相比，较低剂量导致减少的副作用。
在一个实施方案中，疗法包括细胞群。在实施方案中，细胞是免疫效应细胞，例如CAR表达细胞。
或者，或与本文描述的方法组合，公开了包括诊断步骤或患者选择步骤的方法，例如如下所述。
在一个方面，本发明提供了评估受试者(例如患者)的复发者状态(例如在CAR疗法之后的复发者或非复发者)的方法。在一个实施方案中，在用CAR疗法(例如CD19 CART疗法，例如本文所述，例如CTL019疗法)治疗后，该方法鉴定已经复发(“复发者”)或可能复发或未复发(“非复发者”)或可能不复发的受试者，例如患者。在一个实施方案中，通过测定CD19的一个或多个特征来确定复发者状态(例如在CART疗法之后的复发者或非复发者)。
在一个实施方案中，CD19的一个或多个特征包括核酸序列的改变(例如，突变，例如插入，缺失或取代，或其组合)，核酸水平的改变，蛋白质序列的改变，或蛋白质水平的改变，或其组合。在一个实施方案中，复发者在CD19中具有一个或多个突变，例如在CD19的外显子2中具有一个或多个突变(例如插入或缺失)。在一个实施方案中，复发者在CD19的外显子1，外显子2，外显子3，外显子4，外显子5，外显子6或外显子7中具有一个或多个突变。在一个实施方案中，突变产生过早终止密码子，例如通过插入或缺失导致移码，例如在CD19的外显子2中的移码。在一个实施方案中，突变是表31的突变。
在一个实施方案中，将CD19的特征与参考特征进行比较。例如，当特征是序列(例如，来自生物样品的蛋白质或核酸序列)时，参考特征可以是CD19的野生型序列(例如蛋白质或核酸序列)。特征可以是样品中具有突变序列的细胞的百分比。当特征是水平(例如，蛋白质或核酸水平)时，参考特征可以是CD19的野生型水平(例如，蛋白质或核酸水平)。特征可以是样品中蛋白质或核酸的水平。特征可以是样品中具有高于给定阈值的蛋白质或核酸水平的细胞的百分比。
在一个实施方案中，提供了用于鉴定患有癌症的受试者(例如，诸如CLL或ALL的血液癌症)作为包括CAR疗法，例如CD19 CART疗法的治疗之后的复发者或非复发者的方法。该方法包括:(1)从受试者获取样品(例如，从受试者的血液获得的单采血液成分术样品；和/或例如制成品样品，例如从受试者的血液获得的经遗传工程化的T细胞)；(2)确定CD19的特征，例如本文所述的序列或水平；和(3)(任选地)将确定的CD19的特征与参考特征进行比较；其中所确定的特性与参考特征之间的差异，例如统计学显著性差异预示着对CAR疗法的复发；以及(4)例如基于所确定的CD19特征，将该受试者鉴定为CAR疗法的复发者或非复发者。在一个实施方案中，CD19的特征的存在或不存在是过早终止密码子的存在或不存在，例如通过导致移码的插入或缺失。在一个实施方案中，CD19的特征的存在是表31的突变。
在一个实施方案中，所提供的方法包括(1)从受试者获取样品(例如，从受试者的血液获得的单采血液成分术样品；和/或例如制成品样品，例如从受试者的血液，例如制造的CART19产品获得的遗传工程化T细胞)；(2)确定CD19的特征，例如本文所述的序列或水平；和(3)(任选地)将确定的CD19的特性与参考特征进行比较；其中CD19的特征的存在(例如，与参考特征相比，所确定的特征之间的差异，例如统计学显著差异)预示着CAR疗法的复发。在一个实施方案中，CD19的特征的存在是过早终止密码子的存在，例如通过导致移码的插入或缺失。在一个实施方案中，CD19的特征的存在是表31的突变。
在一个实施方案中，提供了用于在包括CAR疗法(例如本文所述的CD19 CAR疗法)的治疗之后，确定具有癌症(例如，血液癌症如CLL或ALL)的受试者的复发的方法。该方法包括确定复发前获得的样品中CD19的特征。在一个实施方案中，CD19的特征的存在(例如，与参考特征相比，确定的特征之间的差异，例如统计学显著性差异)指示CAR疗法后的复发。在一个实施方案中，CD19的特征的存在是过早终止密码子的存在，例如通过导致移码的插入或缺失。在一个实施方案中，CD19的特征的存在是表31的突变。
在一个实施方案中，提供了用于评估患有癌症，例如血液癌症如CLL或ALL的受试者的方法。该方法包括获取受试者的复发者状态值，包括CD19的一个或特征(例如本文所述的CD19的一个或多个特征)的测量值，从而评估受试者。
在一个实施方案中，提供了用于评价或监测CAR疗法(例如CD19 CART疗法)在具有癌症的受试者中的有效性的方法，所述方法包括获取所述受试者的复发者状态值，包括测量CD19的一种或多种特征，例如本文所述的CD19的一种或多种特征，从而评估或监测CAR疗法在受试者中的有效性。
在一个实施方案中，提供了用于提供CAR疗法(例如本文所述的CD19 CART疗法)在具有癌症的受试者中的成功率预测的方法，所述方法包括步骤:提供来自受试者的生物样品；确定CD19的一个或多个特征，例如本文所述的CD19的一个或多个特征；并基于确定的特征，为受试者提供预后。
在一些方面，本公开内容提供了例如鉴定患有癌症的受试者具有对包括嵌合抗原受体(CAR)疗法的治疗应答的增加或减少的可能性的方法或测定法，所述方法包括:
(1)从受试者获取样品；
(2)确定以下的一个或多个的值:
(i)样品中表29中列出的一种或多种标记的水平；
(ii)CD19的特征，例如突变，例如导致移码或过早终止密码子或两者的突变，或
(iii)TREG细胞的水平或活性；和
(3)(任选地)将确定的值例如(i)，(ii)或(iii)或其组合的水平，活性或特性与参考值进行比较，其中在确定的值与参考值相比之间的差异，例如统计学显著性差异预测受试者对CAR疗法的应答性；和
(4)根据确定的值将受试者鉴定为对CAR疗法的完全的应答者，部分应答者或非应答者，或复发或非复发者。
在某些实施方案中，任一上述方法可以进一步包括以下:
(i)如果(i)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(ii)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平的一个，两个或更多个(所有)的值中没有检测到差异(例如没有统计学显著性差异)，那么对受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如包含CD19表达细胞的疗法；
(ii)如果(i)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(ii)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平的一个，两个或更多个(所有)的值中检测到差异(例如统计学显著性差异)，那么向受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如包含表达CD19的细胞和一种或多种B细胞抑制剂(例如如本文所述的CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂)；或
(iii)如果(i)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(ii)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平的一个，两个或更多个(所有)的值中检测到差异(例如统计学显著性差异)，那么停止第一疗法，例如包含CD19表达细胞的疗法，以及施用第二疗法，例如一种或多种B细胞抑制剂(例如如本文所述的CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂)。
可以在患者评估步骤之前或之后进行施用步骤(i)-(iii)，如下面的示例性实施方案中所述。
在某些方面，公开了一种治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括:
(a)获取，例如确定所述受试者是否具有以下值的一个，两个或更多(全部):
(i)表29中列出的一种或多种标记的水平；
(ii)CD19的特征，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或
(iii)生物样品中TREG细胞的水平或活性，以及
(b)响应所述值，进一步包括以下内容:
(i)如果(i)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(ii)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平的一个，两个或更多个(所有)的值中没有检测到差异(例如没有统计学显著性差异)，那么对受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如包含CD19表达细胞的疗法；
(ii)如果(i)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(ii)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平的一个，两个或更多个(所有)的值中检测到差异(例如统计学显著性差异)，那么向受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如包含表达CD19的细胞和一种或多种B细胞抑制剂(例如如本文所述的CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂)的疗法；或
(iii)如果(i)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(ii)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平的一个，两个或更多个(所有)的值中检测到差异(例如统计学显著性差异)，那么停止第一疗法，例如包含CD19表达细胞的疗法，以及施用第二疗法，例如一种或多种B细胞抑制剂(例如如本文所述的CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂)。
另一方面，提供了治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括:
(a)向受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如包含CD19表达细胞的疗法，
(b)获取(例如，确定受试者是否具有)以下值的一个，两个或更多(全部):(i)表29中列出的一种或多种标记的水平；
(ii)CD19的特征，例如突变，例如，引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或
(iii)生物样品中TREG细胞的水平或活性，以及
(c)响应步骤(b)(I-III)中的值或测定，执行以下一项或多项:
(i)如果(I)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(II)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(III)生物样品中TREG细胞的水平的一个或更多个中没有检测到差异(例如没有统计学显著性差异)，那么对受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如包含CD19表达细胞的疗法；
(ii)如果(I)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(II)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(III)生物样品中TREG细胞的水平的一个或更多个中检测到差异(例如统计学显著性差异)，那么向受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如包含表达CD19的细胞和一种或多种B细胞抑制剂(例如如本文所述的CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂)的疗法；或
(iii)如果(I)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(II)CD19的特征，例如突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变，或(III)生物样品中TREG细胞的水平的一个或更多个中检测到差异(例如统计学显著性差异)，那么停止第一疗法，例如包含CD19表达细胞的疗法，以及施用第二疗法，例如一种或多种B细胞抑制剂(例如如本文所述的CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂)。
在任何上述方法的一些实施方案中，样品是选自血液，血浆或血清样品的生物样品。在具体实施方案中，生物样品是血液样品。在一个实施方案中，样品是单采血液成分术样品，例如从受试者的血液获得的T细胞。在一个实施方案中，样品是制成品样品，例如，从受试者的血液获得的遗传工程化T细胞，例如制造的CAR产品，例如制造的CART19产品。
在一个实施方案中，本文的方法可用于确定患者是否可能应答CAR疗法(例如CD19CART)，例如，尚未接受CAR疗法的患者是否可能应答CAR疗法，或者已接受CAR疗法的患者是否可能应答持续的CAR疗法。一般来说，预测复发的相同CD19特征预测患者不太可能应答CD19 CAR疗法。被识别为不太可能应答CD19 CAR疗法的患者可以被施用不同类型的疗法，例如B细胞抑制剂(例如，如本文所述的CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a的一种或多种抑制剂)。
另一方面，提供了治疗患有癌症例如血液癌症的受试者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括确定受试者在CD19的特征相对于参考特征是否具有差异，例如统计学显著性差异，以及如果所确定的特征和参考特征之间存在差异，例如统计学显著性差异，那么对受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如CART，从而治疗受试者。在一个实施方案中，特征是CD19序列，例如蛋白质或核酸序列。在一个实施方案中，该方法包括测定是否存在移码的CD19，例如，包含过早终止密码子的CD19。
在任何上述方法的实施方案中，治疗包括施用CD19 CAR表达细胞，任选与一种或多种B细胞抑制剂组合。在一个实施方案中，CD19 CAR疗法与一种或多种B细胞抑制剂(例如如本文所述的CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的一种或多种抑制剂)同时施用。在一个实施方案中，CD19 CAR疗法在一种或多种B细胞抑制剂之前施用。在一个实施方案中，CD19 CAR疗法在一种或多种B细胞抑制剂之后施用。
在其中确定的特征和参考特征之间存在差异的实施方案中，该方法包括在输注到受试者之前修饰CAR产品。在其中确定的特征与参考特征之间存在差异的一个实施方案中，所述方法包括在输注到受试者之前修饰CAR产品的制造。在一个实施方案中，如果确定的特征和参考特征之间存在差异，则该方法包括调整CAR输注剂量以实现抗癌效果。
在一个实施方案中，治疗方法包括通过将来自受试者的样品中CD19的特征相对于参考特征比较，确定受试者是否具有增加的应答CAR疗法，例如CD19 CART疗法，例如本文所述的CD19 CART疗法的可能性，其中所述特征相对于所述参考特征的差异表示增加的应答可能性；以及向受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，从而治疗受试者。
在一个实施方案中，治疗方法包括从受试者获得样品；相对于参考特征确定CD19的特征(例如，移码或过早终止密码子的存在或不存在)；以及如果所述受试者被鉴定为在样品的CD19特征与样品中的参考特征之间具有统计学显著性差异，则施用治疗有效剂量的CAR表达细胞。
CD19特征可用于为患者设计治疗。例如，在一个实施方案中，当患者样品包含野生型CD19时，向患者施用CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞，例如CD19 CART。在一个实施方案中，当患者样品包含突变体CD19(例如，移码CD19，例如包含过早终止密码子的CD19)时，向患者施用除了CD19抑制剂之外的疗法，例如，该患者被施用另一种B细胞抑制剂。在一个实施方案中，当患者样品包含至少正常水平的CD19时，向患者施用CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞，例如CD19 CART。在一个实施方案中，当患者样品包含低于正常水平的CD19时，向患者施用除了CD19抑制剂之外的疗法，例如，该患者被施用另一种B细胞抑制剂(例如，本文所述的CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的一种或多种抑制剂)。
在一个实施方案中，治疗方法包括获取受试者的复发者状态的值，包括CD19特征的量度，并且响应于复发者状态的确定，执行以下中的一个，两个，三个或更多个:(1)将该受试者鉴定为复发或非复发者；(2)施用CAR疗法；(3)选择或改变CAR疗法的剂量；(4)选择或改变CAR疗法的时间表或时间过程；(5)例如对复发者组合施用另外的药剂与CAR疗法，例如施用一种或多种B细胞抑制剂，或检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂，或激酶抑制剂，例如本文所述的激酶抑制剂；(6)在用CAR疗法治疗前对复发者施用增加受试者中初始T细胞数量的疗法；修改CAR疗法的制造方法，例如对于被鉴定为复发者的受试者，例如在引入编码CAR的核酸之前，富集初始T细胞；或(7)选择备选疗法，例如针对特定癌症(例如，如本文所述)的护理标准(例如为复发者)；从而治疗受试者的癌症。
在一些实施方案中，该方法包括施用一种，两种，三种或更多种B细胞抑制剂(例如本文所述的CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂)。例如，在一个实施方案中，该方法包括施用CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞与CD10抑制剂组合或CD10抑制剂和本文所述的CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的抑制剂的任一组合。在另一个实施方案中，所述方法包括施用CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞与CD20抑制剂组合或CD20抑制剂和如本文所述的CD10，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1抑制剂的任何组合。在另一个实施方案中，该方法包括施用CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞与CD22抑制剂组合，或CD22抑制剂与如本文所述的CD10，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1抑制剂的任何组合。在另一个实施方案中，该方法包括施用CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞与CD34抑制剂组合或CD34抑制剂和如本文所述的CD10，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1抑制剂的任何组合。在另一个实施方案中，该方法包括施用CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞与CD123抑制剂组合，或CD123抑制剂和如本文所述的CD10，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1抑制剂的任何组合。在另一个实施方案中，该方法包括施用CD19抑制剂，例如表达CD19CAR的细胞与FLT-3抑制剂的组合或FLT-3抑制剂与如本文所述的CD10，CD22，CD34，CD123，或ROR1抑制剂的任何组合。在另一个实施方案中，该方法包括施用CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞，与ROR1抑制剂组合或ROR1抑制剂与如本文所述的CD10，CD22，CD34，CD123，FLT-3抑制剂的任何组合。在一些实施方案中，所述方法包括施用一种，两种，三种或更多种B细胞抑制剂(例如，如本文所述CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的一种或多种抑制剂)。
在一些实施方案中，本文所述的治疗方法进一步包括以下之一或两者:确定患者样品中免疫检查点分子(例如PD-L1，PD1，LAG3或TIM3)的水平；以及向患者施用免疫检查点抑制剂(例如PD-L1，PD1，LAG3和TIM3中的一种或多种的抑制剂)。例如，该方法可以包括用本文所述的一种或多种CAR表达细胞治疗患者(例如，CD19 CAR与B细胞抑制剂，CD20 CAR或CD22 CAR组合)并确定在治疗前后的患者中免疫检查点分子的水平。在一些实施方案中，所述方法包括将免疫检查点抑制剂施用于与参考水平相比具有升高的免疫检查点分子水平的患者，例如，响应于升高的PD-L1水平施用PD-L1抑制剂，响应于升高的PD1水平施用PD1抑制剂，响应升高的LAG3水平施用LAG3抑制剂，或响应升高的TIM3水平施用TIM3抑制剂。在一些实施方案中，所述方法包括向已经接受，正在接受或将要接受本文所述的一种或多种CAR表达细胞的治疗的患者施用免疫检查点抑制剂(例如，CD19 CAR与B细胞抑制剂，CD20 CAR或CD22 CAR组合)，其中与参考水平相比，患者具有或被鉴定为具有升高水平的免疫检查点分子。
组合物
在一些方面，本公开提供了例如组合物，其包含:(i)表达结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的一种或多种细胞，和(ii)B细胞抑制剂，例如CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种抑制剂。在实施方案中，分别提供(i)和(ii)，并且在实施方案中混合(i)和(ii)。
在一些方面，本公开提供了例如编码以下的核酸:(i)结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR，和(ii)一种或多种B细胞抑制剂，例如CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1中的一种或多种的抑制剂。在一些方面，本公开提供了例如编码以下的核酸:(i)结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR，和(ii)CAR分子，其结合B细胞抗原，例如CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1中的一种或多种。在实施方案中，核酸包含RNA或DNA。
在一些方面，本公开提供了例如编码以下的核酸:(i)结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR，和(ii)CAR分子，其结合B细胞抗原，例如CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3，ROR1，CD79b，CD179b或CD79a中的一种或多种。在实施方案中，核酸包含RNA或DNA。在实施方案中，编码(i)和(ii)的核酸序列位于相同的取向，例如编码(i)和(ii)的核酸序列的转录在相同方向上进行。在实施方案中，编码(i)和(ii)的核酸序列位于不同的取向。在实施方案中，单个启动子控制编码(i)和(ii)的核酸序列的表达。在实施方案中，编码蛋白酶切割位点(例如T2A，P2A，E2A或F2A切割位点)的核酸位于编码(i)和(ii)的核酸序列之间。在实施方案中，放置蛋白酶切割位点使得细胞可以表达包含(i)和(ii)的融合蛋白，该蛋白随后通过蛋白水解切割加工成两种肽。在一些实施方案中，编码(i)的核酸序列在编码(ii)的核酸序列的上游，或编码(ii)的核酸序列位于编码(i)的核酸序列的上游。在实施方案中，第一启动子控制编码(i)的核酸序列的表达，第二启动子控制编码(ii)的核酸序列的表达。在实施方案中，核酸是质粒。在实施方案中，核酸包含病毒包装元件。在一些方面，本公开提供了包含本文所述的核酸，例如包含如上所述的(i)和(ii)的核酸的细胞，例如免疫效应细胞。细胞可以包含切割T2A，P2A，E2A或F2A切割位点的蛋白酶(例如内源或外源的)。
在一些方面，本公开提供了例如组合物，其包含:(i)编码结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的第一核酸,和(ii)编码一种或多种B细胞抑制剂，例如CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1中的一种或多种的抑制剂的第二核酸。在一些方面，本公开内容提供了例如组合物，其包含:(i)编码结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的第一核酸,和(ii)结合B细胞抗原，例如CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1中的一种或多种的CAR分子。在实施方案中，第一核酸和第二核酸各自包含RNA或DNA。
在一些方面，本公开提供了例如包含本文所述的一种或多种核酸的载体。在某些方面，本公开还提供包含如本文所述的载体或核酸的细胞。
本公开还在某些方面提供组合物，其包含一种或多种免疫效应细胞，和:(i)编码第一多肽的第一核酸或第一多肽，所述第一多肽包含结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR，和(ii)编码第二多肽的第一核酸或第二多肽，所述第二多肽包含结合B细胞抗原，例如CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3，ROR1，CD79b，CD179b或CD79a中的一种或多种的CAR分子。在实施方案中，第一核酸或第一多肽和第二核酸或第二多肽各自包含在第一免疫效应细胞内，例如由第一免疫效应细胞表达。在实施方案中，组合物包含含有例如表达第一核酸或第一多肽的第一免疫效应细胞和含有例如表达第二核酸或第二多肽的第二免疫效应细胞。在实施方案中，组合物不包含含有例如表达第一核酸或第一多肽和第二核酸或第二多肽的细胞。
制造
在某些方面，本公开提供了制备细胞的方法，包括用本文所述的载体(例如编码CAR的载体)转导免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。在某些方面，本公开提供了制备细胞的方法，包括将如本文所述的核酸(例如，编码CAR的核酸)引入免疫效应细胞例如T细胞或NK细胞。在某些方面，本公开提供了产生RNA工程化细胞群体的方法，包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞，其中RNA包含本文所述的核酸，例如编码CAR的核酸。
在一些实施方案中，本文公开的制备方法还包括使细胞群(例如表达CD19 CAR的细胞，表达CD20 CAR的细胞，表达CD22 CAR的细胞，B细胞抑制剂细胞或CD19 CAR表达细胞和B细胞抑制剂细胞两者)与编码端粒酶亚基例如hTERT的核酸接触。编码端粒酶亚基的核酸可以是DNA。
在一些实施方案中，本文公开的制备方法还包括在含有2％hAB血清的血清中培养细胞群体(例如表达CD19 CAR的细胞，表达CD20 CAR的细胞，表达CD22 CAR的细胞，B细胞抑制剂细胞或表达CD19 CAR的细胞和B细胞抑制剂细胞两者)。
适应证
在一个实施方案中，与CD19表达相关的疾病选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期，或与CD19的表达相关联的非癌症相关的适应证。在一个实施方案中，该疾病是实体或液体肿瘤。在一个实施方案中，癌症是胰腺癌。在一个实施方案中，该疾病是血液癌症。在一个实施方案中，血液癌是白血病。在一个实施方案中，癌症选自一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴性白血病(BALL)，T细胞急性淋巴性白血病(TALL)，小淋巴细胞性白血病(SLL)，急性淋巴性白血病(ALL)(例如复发和难治性ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。附加的血液癌症或病症包括但不限于套细胞淋巴瘤(MCL)，B细胞幼淋巴细胞白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，以及“白血病前期”。白血病前期包括由无效产生(或发育异常)髓血细胞联合的一组不同的血液学状况。在实施方案中，与CD19表达相关的疾病包括但不限于非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或表达CD19的增生性疾病；及其任何组合。
在一个实施方案中，与CD19表达相关的疾病是淋巴瘤，例如MCL或霍奇金淋巴瘤。在一个实施方案中，与CD19表达相关的疾病是白血病，例如SLL，CLL和/或ALL。
在一个实施方案中，与肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)相关的疾病选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期，或者是与本文所述的肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应证。在一个实施方案中，与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病是实体肿瘤，例如本文所述的实体肿瘤，例如前列腺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，子宫颈，胃癌，卵巢癌，头癌或肺癌。
在一个实施方案中，癌症选自AML，ALL，B-ALL，T-ALL，B细胞幼淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，CML，毛细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，肥大细胞病症，骨髓增生异常综合征，骨髓增生性肿瘤，浆细胞骨髓瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤或其组合。
在一个实施方案中，受试者(例如，用CD19 CAR治疗的受试者，任选地与第二药剂如PD1抑制剂或PD-L1抑制剂组合)具有或被鉴定为具有至少5％,6％,7％,8％,9％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或90％的癌细胞，例如DLBCL细胞，其是CD3+/PD1+。
在一个实施方案中，受试者在用表达结合CD19的CAR分子(例如CD19 CAR)的一种或多种细胞治疗后已经复发或被鉴定为复发。在一个实施方案中，受试者在完全应答后基于血液，骨髓(>5％)或任何髓外部位中胚细胞的一种或多种重现已经复发或被鉴定为已经复发。在一个实施方案中，受试者已经复发或基于高于预定阈值(例如超过1％，2％，3％，4％，5％或10％)的CD19-胚细胞的检测被鉴定为已经复发。
CAR疗法
在某些实施方案中，治疗方法包括CAR疗法，例如施用表达一种或多种CAR分子的一种或多种细胞。表达一种或多种CAR分子的细胞可以是免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，表达CAR分子的细胞包含包括编码CAR分子的核酸序列的载体。在一个实施方案中，载体选自DNA，RNA，质粒，慢病毒载体，腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是慢病毒载体。在一个实施方案中，载体还包含启动子。在一个实施方案中，启动子是EF-1启动子。在一个实施方案中，EF-1启动子包含SEQ ID NO:100的序列。在一个实施方案中，载体是体外转录的载体，例如转录本文所述的核酸分子的RNA的载体。在一个实施方案中，体外载体中的核酸序列还包含聚(A)尾，例如本文所述的聚A尾，例如包含约150个腺苷碱基。在一个实施方案中，体外载体中的核酸序列还包含3'UTR，例如本文所述的3'UTR，例如包含来自人β-球蛋白的3'UTR的至少一个重复序列。在一个实施方案中，体外载体中的核酸序列还包含启动子。在一个实施方案中，核酸序列包含T2A序列。
在一个实施方案中，表达CAR分子的细胞是本文所述的细胞，例如人T细胞或人NK细胞，例如本文所述的人T细胞或本文所述的人NK细胞。在一个实施方案中，人T细胞是CD8+T细胞。在一个实施方案中，人T细胞是CD4+T细胞。在一个实施方案中，人T细胞是CD4+/CD8+T细胞。在一个实施方案中，人T细胞是CD8+和CD4+T细胞的混合物。在一个实施方案中，细胞是自体T细胞。在一个实施方案中，细胞是同种异体T细胞。在一个实施方案中，细胞是T细胞，T细胞是二酰基甘油激酶(DGK)缺陷的。在一个实施方案中，细胞是T细胞，T细胞是Ikaros缺陷的。在一个实施方案中，细胞是T细胞，并且T细胞是DGK和Ikaros缺陷的。
在另一个实施方案中，表达CAR分子的细胞，例如如本文所述，可以进一步表达另一种活性剂，例如增强CAR表达细胞活性的活性剂。
在一个实施方案中，所述方法包括将本文所述的表达CAR分子的细胞与增强CAR表达细胞活性的活性剂组合施用，其中所述活性剂是细胞因子，例如IL-7，IL-15，IL-21或其组合。所述细胞因子可与所述CAR表达细胞施用组合递送，例如同时或不久之后。或者，可以在施用CAR表达细胞后，例如在评估受试者对CAR表达细胞的应答后，在延长的时间段后递送细胞因子。
例如，在一个实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂可以是抑制免疫抑制分子的活性剂。免疫抑制分子的实例包括PD1，PD-L1，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160,2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制免疫抑制分子的活性剂包含与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述的细胞内信号传导结构域)结合的第一多肽，例如抑制性分子。在一个实施方案中，该活性剂包含例如免疫抑制分子如PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4或TGFRβ，或这些任何一种的片段(例如，这些任何一种的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，以及第二多肽，其是在本文中描述的细胞内信号传导结构域(例如，包括共刺激结构域(例如，41BB，CD27或CD28，例如本文所述)和/或主要信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述活性剂包含PD1或其片段(例如，PD1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文所述细胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。
在一个实施方案中，淋巴细胞输注(例如同种异体淋巴细胞输注)用于治疗癌症，其中淋巴细胞输注包含本文所述的至少一种CD19 CAR表达细胞和任选地至少一种表达针对B细胞抗原的CAR的细胞。在一个实施方案中，自体淋巴细胞输注用于治疗癌症，其中自体淋巴细胞输注包含至少一种表达CD19的细胞和任选地至少一种表达针对B细胞抗原的CAR的细胞。
在一个实施方案中，将CAR表达细胞例如T细胞施用于已经接受先前的干细胞移植(例如自体干细胞移植)的受试者，或接受先前剂量的美法仑的受试者。
在一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述的CAR分子的细胞，与改善与表达CAR分子的细胞的施用或与细胞抑制剂施用相关的一种或多种副作用的活性剂，例如本文所述的活性剂组合施用。
在一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述的CD19 CAR分子的细胞和B细胞抑制剂与治疗与CD19相关的疾病的另外的活性剂，例如本文所述的另外的活性剂组合施用。
在一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述的CAR分子的细胞以本文所述的剂量和/或剂量方案施用。
在一个实施方案中，将CAR分子引入T细胞中，例如使用体外转录，并且受试者(例如，人)接受包含CAR分子的细胞的初始施用，以及包含CAR分子的细胞的一个或多个随后的施用，其中所述一次或多次随后的施用在先前施用后少于15天，例如14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,或2天施用。在一个实施方案中，每周多于一次施用包含CAR分子的细胞给受试者(例如人)，例如每周2,3或4次施用包含CAR分子的细胞。在一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)每周接受多于一次的包含CAR分子的细胞施用(例如每周2,3或4次施用)(本文也称为周期)，随后是一周不施用包含CAR分子的细胞，然后向受试者施用包含CAR分子的细胞的一次或多次额外施用(例如，每周多于一次施用包含CAR分子的细胞)。在另一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)接受多于一个周期的包含CAR分子的细胞，并且每个周期之间的时间小于10,9,8,7,6,5,4或3天。在一个实施方案中，包含CAR分子的细胞每隔一天施用，每周施用3次。在一个实施方案中，包含CAR分子的细胞施用至少两周，三周，四周，五周，六周，七周，八周或更多周。
在一个实施方案中，施用本文所述的疗法(例如，CD20 CAR疗法，CD22 CAR疗法或B细胞抑制剂和表达CD19 CAR分子，例如本文所述的CD19 CAR分子的细胞的组合)作为疾病，例如癌症，例如本文所述的癌症的一线治疗。在另一个实施方案中，施用本文所述的疗法(例如，CD20 CAR疗法，CD22 CAR疗法或B细胞抑制剂和表达CD19 CAR分子，例如本文所述的CD19 CAR分子的细胞的组合)作为疾病，例如癌症，例如本文所述的癌症的第二，第三，第四线治疗。
在一个实施方案中，施用本文所述的细胞群。在一些实施方案中，细胞群被分离或纯化。
在一个实施方案中，该方法包括施用一群细胞，其中多个细胞包含本文所述的CAR分子。在一些实施方案中，CAR表达细胞的群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体可以包括表达具有本文所述的抗CD19结合结构域的CAR的第一细胞和表达具有不同B细胞抗原结合结构域的CAR的第二细胞。在实施方案中，第一和第二细胞群体是T细胞。在实施方案中，T细胞的第一和第二群体是相同的同种型，例如是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其他实施方案中，T细胞的第一和第二群体是不同的同种型，例如，第一群体包含CD4+T细胞，第二群体包含CD8+T细胞。在实施方案中，T细胞的第一和第二群体是WO2012/129514中描述的细胞类型，其全部内容通过引用并入本文。作为另一个实例，细胞群体可以包含表达具有本文所述的抗CD19结合结构域的CAR和具有不同B细胞抗原结合结构域的CAR的单细胞类型。作为另一个实例，细胞群体可以包含表达具有两个或更多个(例如2,3,4或5个)B细胞抗原结合结构域的CAR的单细胞类型，例如是双特异性CAR，例如，如本文所述。作为另一个实例，CAR表达细胞的群体可以包括表达CAR的第一细胞，所述CAR包括抗CD19结合结构域，例如如本文所述，以及表达CAR的第二细胞，所述CAR包含针对除了CD19之外的靶标(例如，CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,CD79a或间皮素)的抗原结合结构域。在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括例如表达包含主要细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞和表达包括次要信号传导结构域的CAR的第二细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括例如表达包含第一个次要信号传导结构域的CAR的第一细胞和表达CAR的第二细胞，所述CAR包括不同于第一次要信号传导结构域的次要信号传导结构域。
例如，当第一B细胞抑制剂为CD19 CAR表达细胞，第二B细胞抑制剂为CD10 CAR表达细胞时，第一CAR和第二CAR可由相同细胞类型或不同类型表达。例如，在一些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是CD4+T细胞，表达CD10 CAR的细胞是CD8+T细胞，或表达CD19 CAR的细胞是CD8+T细胞，表达CD10 CAR的细胞是CD4+T细胞。在其它实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是T细胞，表达CD10 CAR的细胞是NK细胞，或表达CD19 CAR的细胞是NK细胞，并且表达CD10 CAR的细胞是T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞和表达CD10 CAR的细胞都是NK细胞，或者都是T细胞，例如都是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其它实施方案中，单个细胞表达CD19 CAR和CD10 CAR，并且该细胞是例如NK细胞或T细胞如CD4+T细胞或CD8+T细胞。第一CAR和第二CAR可以包含相同或不同的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域，并且CD10 CAR包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域，而在一些实施方案中，CD19 CAR包含共刺激结构域，例如，41BB，CD27或CD28共刺激结构域，CD10 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在其它实施方案中，CD19 CAR和CD10 CAR中的每一个都包含相同类型的主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，但CD19 CAR和CD10 CAR包含不同的共刺激结构域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，并且CD10 CAR包含不同的共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域，(2)CD19CAR包含CD27共刺激结构域，CD10 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域(3)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，CD10 CAR包含CD28共刺激结构域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD10 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(5)CD19CAR包含CD27共刺激结构域，CD10 CAR包含CD28共刺激结构域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD10 CAR包含CD27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含CAR，其包含CD19抗原结合结构域和CD10抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
作为另一个例子，当第一B细胞抑制剂是CD19 CAR表达细胞，第二B细胞抑制剂是CD20 CAR表达细胞时，第一CAR和第二CAR可以由相同的细胞类型或不同类型表达。例如，在一些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是CD4+T细胞，表达CD20 CAR的细胞是CD8+T细胞，或表达CD19 CAR的细胞是CD8+T细胞，并且表达CD20 CAR的细胞是CD4+T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是T细胞，表达CD20 CAR的细胞是NK细胞，或表达CD19 CAR的细胞是NK细胞，并且表达CD20 CAR的细胞是T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞和表达CD20 CAR的细胞都是NK细胞或都是T细胞，例如，都是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其它实施方案中，单个细胞表达CD19 CAR和CD20 CAR，并且该细胞是例如NK细胞或T细胞例如CD4+T细胞或CD8+T细胞。第一CAR和第二CAR可以包含相同或不同的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域，并且CD20 CAR包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域，而在一些实施方案中，CD19 CAR包含共刺激结构域，例如，41BB，CD27或CD28共刺激结构域，CD20 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在其它实施方案中，CD19 CAR和CD20 CAR中的每一种包含相同类型的主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，但CD19 CAR和CD20 CAR包含不同的共刺激结构域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，并且CD20 CAR包含不同的共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，CD20 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域(3)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，CD20 CAR包含CD28共刺激结构域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD20 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，CD20 CAR包含CD28共刺激结构域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD20 CAR包含CD27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含CAR，其包含CD19抗原结合结构域和CD20抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
作为另一个例子，当第一B细胞抑制剂是CD19 CAR表达细胞，第二B细胞抑制剂是CD22 CAR表达细胞时，第一CAR和第二CAR可以由相同的细胞类型或不同类型表达。例如，在一些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是CD4+T细胞，表达CD22 CAR的细胞是CD8+T细胞，或表达CD19 CAR的细胞是CD8+T细胞，并且表达CD22 CAR的细胞是CD4+T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是T细胞，表达CD22 CAR的细胞是NK细胞，或表达CD19 CAR的细胞是NK细胞，并且表达CD22 CAR的细胞是T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞和表达CD22 CAR的细胞都是NK细胞或都是T细胞，例如，都是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其它实施方案中，单个细胞表达CD19 CAR和CD22 CAR，并且该细胞是例如NK细胞或T细胞例如CD4+T细胞或CD8+T细胞。第一CAR和第二CAR可以包含相同或不同的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域，并且CD22 CAR包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域，而在一些实施方案中，CD19 CAR包含共刺激结构域，例如，41BB，CD27或CD28共刺激结构域，CD22 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在其它实施方案中，CD19 CAR和CD22 CAR中的每一个包含相同类型的主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，但CD19 CAR和CD22 CAR包含不同的共刺激结构域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，并且CD22 CAR包含不同的共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，CD22 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，CD22 CAR包含CD28共刺激结构域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD22 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，CD22 CAR包含CD28共刺激结构域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD22 CAR包含CD27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含CAR，其包含CD19抗原结合结构域和CD22抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
作为另一个例子，当第一B细胞抑制剂是CD19 CAR表达细胞，第二B细胞抑制剂是CD34 CAR表达细胞时，第一CAR和第二CAR可以由相同的细胞类型或不同类型表达。例如，在一些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是CD4+T细胞，表达CD34 CAR的细胞是CD8+T细胞，或表达CD19 CAR的细胞是CD8+T细胞，并且表达CD34 CAR的细胞是CD4+T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是T细胞，表达CD34 CAR的细胞是NK细胞，或表达CD19 CAR的细胞是NK细胞，并且表达CD34 CAR的细胞是T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞和表达CD34 CAR的细胞都是NK细胞或都是T细胞，例如，都是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其它实施方案中，单个细胞表达CD19 CAR和CD34 CAR，并且该细胞是例如NK细胞或T细胞例如CD4+T细胞或CD8+T细胞。第一CAR和第二CAR可以包含相同或不同的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域，并且CD34 CAR包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域，而在一些实施方案中，CD19 CAR包含共刺激结构域，例如，41BB，CD27或CD28共刺激结构域，CD34 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在其它实施方案中，CD19 CAR和CD34 CAR中的每一个包含相同类型的主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，但CD19 CAR和CD34 CAR包含不同的共刺激结构域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，并且CD34 CAR包含不同的共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，CD34 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，CD34 CAR包含CD28共刺激结构域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD34 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，CD34 CAR包含CD28共刺激结构域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD34 CAR包含CD27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含CAR，其包含CD19抗原结合结构域和CD34抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
作为另一个例子，当第一B细胞抑制剂是CD19 CAR表达细胞，第二B细胞抑制剂是CD123 CAR表达细胞时，第一CAR和第二CAR可以由相同的细胞类型或不同类型表达。例如，在一些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是CD4+T细胞，表达CD123 CAR的细胞是CD8+T细胞，或表达CD19 CAR的细胞是CD8+T细胞，并且表达CD123 CAR的细胞是CD4+T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是T细胞，表达CD123 CAR的细胞是NK细胞，或表达CD19CAR的细胞是NK细胞，并且表达CD123 CAR的细胞是T细胞。在其他实施方案中，表达CD19CAR的细胞和表达CD123 CAR的细胞都是NK细胞或都是T细胞，例如，都是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其它实施方案中，单个细胞表达CD19 CAR和CD123 CAR，并且该细胞是例如NK细胞或T细胞例如CD4+T细胞或CD8+T细胞。第一CAR和第二CAR可以包含相同或不同的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域，并且CD123 CAR包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域，而在一些实施方案中，CD19 CAR包含共刺激结构域，例如，41BB，CD27或CD28共刺激结构域，CD123 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在其它实施方案中，CD19 CAR和CD123 CAR中的每一种包含相同类型的主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，但CD19 CAR和CD123 CAR包含不同的共刺激结构域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，并且CD123 CAR包含不同的共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，CD123 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，CD123 CAR包含CD28共刺激结构域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD123 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，CD123 CAR包含CD28共刺激结构域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，CD123 CAR包含CD27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含CAR，其包含CD19抗原结合结构域和CD123抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
作为另一个例子，当第一B细胞抑制剂是CD19 CAR表达细胞，第二B细胞抑制剂是FLT-3 CAR表达细胞时，第一CAR和第二CAR可以由相同的细胞类型或不同类型表达。例如，在一些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是CD4+T细胞，表达FLT-3 CAR的细胞是CD8+T细胞，或表达CD19 CAR的细胞是CD8+T细胞，并且表达FLT-3 CAR的细胞是CD4+T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是T细胞，表达FLT-3 CAR的细胞是NK细胞，或表达CD19CAR的细胞是NK细胞，并且表达FLT-3 CAR的细胞是T细胞。在其他实施方案中，表达CD19CAR的细胞和表达FLT-3 CAR的细胞都是NK细胞或都是T细胞，例如，都是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其它实施方案中，单个细胞表达CD19 CAR和FLT-3 CAR，并且该细胞是例如NK细胞或T细胞例如CD4+T细胞或CD8+T细胞。第一CAR和第二CAR可以包含相同或不同的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域，并且FLT-3 CAR包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域，而在一些实施方案中，CD19 CAR包含共刺激结构域，例如，41BB，CD27或CD28共刺激结构域，FLT-3 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在其它实施方案中，CD19 CAR和FLT-3 CAR中的每一种包含相同类型的主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，但CD19 CAR和FLT-3 CAR包含不同的共刺激结构域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，并且FLT-3 CAR包含不同的共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，FLT-3 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，FLT-3 CAR包含CD28共刺激结构域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，FLT-3 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(5)CD1CAR包含CD27共刺激结构域，FLT-3 CAR包含CD28共刺激结构域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，FLT-3 CAR包含CD27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含CAR，其包含CD19抗原结合结构域和FLT-3抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
作为另一个例子，当第一B细胞抑制剂是CD19 CAR表达细胞，第二B细胞抑制剂是ROR1 CAR表达细胞时，第一CAR和第二CAR可以由相同的细胞类型或不同类型表达。例如，在一些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是CD4+T细胞，表达ROR1 CAR的细胞是CD8+T细胞，或表达CD19 CAR的细胞是CD8+T细胞，并且表达ROR1 CAR的细胞是CD4+T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是T细胞，表达ROR1 CAR的细胞是NK细胞，或表达CD19 CAR的细胞是NK细胞，并且表达ROR1 CAR的细胞是T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞和表达ROR1 CAR的细胞都是NK细胞或都是T细胞，例如，都是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其它实施方案中，单个细胞表达CD19 CAR和ROR1 CAR，并且该细胞是例如NK细胞或T细胞例如CD4+T细胞或CD8+T细胞。第一CAR和第二CAR可以包含相同或不同的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域，并且ROR1 CAR包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域，而在一些实施方案中，CD19 CAR包含共刺激结构域，例如，41BB，CD27或CD28共刺激结构域，ROR1 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在其它实施方案中，CD19 CAR和ROR1 CAR中的每一种包含相同类型的主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，但CD19 CAR和ROR1 CAR包含不同的共刺激结构域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，并且ROR1 CAR包含不同的共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，ROR1 CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域，ROR1 CAR包含CD28共刺激结构域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，ROR1CAR包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域，ROR1 CAR包含CD28共刺激结构域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，ROR1 CAR包含CD27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含CAR，其包含CD19抗原结合结构域和ROR1抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
更一般地，当第一B细胞抑制剂包含CD19 CAR并且存在第二B细胞抑制剂，例如包含第二CAR的第二B细胞抑制剂时，第一CAR和第二B细胞抑制剂可以由相同的细胞类型或不同种类表达。例如，在一些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是CD4+T细胞，并且表达第二B细胞抑制剂的细胞是CD8+T细胞，或表达CD19 CAR的细胞是CD8+T细胞，并且表达第二B细胞抑制剂的细胞是CD4+T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞是T细胞，表达第二B细胞抑制剂的细胞是NK细胞，或表达CD19 CAR的细胞是NK细胞，并且表达第二B细胞抑制剂的细胞是T细胞。在其他实施方案中，表达CD19 CAR的细胞和表达第二B细胞抑制剂的细胞都是NK细胞，或者都是T细胞，例如都是CD4+T细胞，或者都是CD8+T细胞。在其它实施方案中，单个细胞表达CD19 CAR和第二B细胞抑制剂，并且该细胞是例如NK细胞或T细胞如CD4+T细胞或CD8+T细胞。第一CAR和第二CAR可以包含相同或不同的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域和第二B细胞抑制剂(或CAR)，包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域，而在一些实施方案中，CD19 CAR包含共刺激结构域，例如41BB，CD27或CD28共刺激结构域和第二B细胞抑制剂(或第二CAR)包含CD3ζ信号传导结构域。在其它实施方案中，CD19 CAR和第二B细胞抑制剂(或第二CAR)中的每一个包含相同类型的主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，但CD19 CAR和第二B细胞抑制剂包含不同的共刺激结构域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域和第二B细胞抑制剂(或第二CAR)包含不同的共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域，(2)CD19CAR包含CD27共刺激结构域和第二B细胞抑制剂(或第二CAR)包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激结构域和第二B细胞抑制剂(或第二CAR)包括CD28共刺激结构域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域，第二B细胞抑制剂(或第二CAR)包含不同的共刺激结构域，例如41BB共刺激结构域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激结构域和第二B细胞抑制剂(或第二CAR)包含CD28共刺激结构域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激结构域和第二B细胞抑制剂(或第二CAR)包含CD27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含CAR，该CAR包含CD19抗原结合结构域和针对第二抗原的抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
在一个实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列。在一个实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含氨基酸序列，其具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如，取代)但是不超过20,10或5个修饰(例如，取代)或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，4-1BB共刺激结构域由SEQID NO:60的核酸序列或其95-99％同一性的序列编码。
在一个实施方案中，CD27共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列。在一个实施方案中，CD27共刺激结构域包含氨基酸序列，其具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如，取代)但是不超过20,10或5个修饰(例如，取代)或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，CD27共刺激结构域由SEQ IDNO:17的核酸序列或其95-99％同一性的序列编码。
在一个实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:1317的序列。在一个实施方案中，CD28共刺激结构域包含氨基酸序列，其具有SEQ ID NO:1317的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如，取代)但是不超过20,10或5个修饰(例如，取代)或与SEQ IDNO:1317的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，CD28共刺激结构域由SEQ ID NO:1318的核酸序列或其95-99％同一性的序列编码。
在一个实施方案中，野生型ICOS共刺激结构域包含SEQ ID NO:1319的序列。在一个实施方案中，野生型ICOS共刺激结构域包含氨基酸序列，其具有SEQ ID NO:1319的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如，取代)但是不超过20,10或5个修饰(例如，取代)或与SEQ ID NO:1319的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，野生型ICOS共刺激结构域由SEQ ID NO:1320的核酸序列或其95-99％同一性的序列编码。
在一个实施方案中，Y至F突变体ICOS共刺激结构域包含SEQ ID NO:1321的序列。在一个实施方案中，Y至F突变体ICOS共刺激结构域包含氨基酸序列，其具有SEQ ID NO:1321的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如，取代)但是不超过20,10或5个修饰(例如，取代)或与SEQ ID NO:1321的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，Y至F突变体ICOS共刺激结构域由与SEQ ID NO:1320(其中SEQ ID NO:1320编码野生型ICOS)的核酸序列具有95-99％同一性的核酸序列编码。
在实施方案中，主要信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。在实施方案中，CD3ζ的功能性信号传导结构域包含SEQ ID NO:17(突变体CD3ζ)或SEQ ID NO:43(野生型人CD3ζ)。
在一个实施方案中，该方法包括施用细胞群体，其中群体中的至少一个细胞表达CAR，例如具有本文所述的抗CD19结构域的CAR，和增强CAR表达细胞活性的活性剂，例如，表达增强CAR表达细胞活性的活性剂的第二细胞。例如，在一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制免疫抑制分子的活性剂。免疫抑制分子的实例包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制免疫抑制分子的活性剂包含第一多肽，例如抑制性分子，其结合向细胞提供阳性信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，该活性剂包含第一多肽，例如抑制性分子如PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4或TGFRβ或这些的任何一种的片段(例如，这些的任何一种的至少一部分细胞外结构域)的第一多肽和第二多肽，所述第二多肽是在本文中所述的细胞内信号传导结构域(例如，包括共刺激结构域(例如，41BB，CD27或CD28，例如本文所述)和/或主要信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述活性剂包含PD1或其片段(例如，PD1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文所述细胞内信号传导结构域的第二多肽(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。
在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含CD10，CD19，CD20，CD22，CD34，FLT-3或ROR1中的一种或多种的抑制剂。在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含有效数目的一种或多种细胞，所述细胞表达结合CD10,CD20,CD22,CD34,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种的CAR分子。在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含CD123 CAR。在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含表达结合CD123的CAR分子的一种或多种细胞。在一个实施方案中，该疾病是CD19阴性癌症，例如CD19阴性复发性癌症。在一个实施方案中，CD19 CAR表达细胞与一种或多种B细胞抑制剂同时施用，之前或之后施用。
在一个实施方案中，所述方法还包括施用CD19抑制剂，例如表达CD19CAR的细胞。在一个实施方案中，CD19抑制剂包含CD19 CAR，B细胞抑制剂包含CD123 CAR。在一个实施方案中，CD19 CAR或CD123 CAR包含分裂的细胞内信号传导结构域，使得与CD19 CAR和CD123CAR结合到表达CD19或CD123之一的靶细胞(例如，造血干细胞)时的活化相比，当CD19 CAR和CD123 CAR两者都结合到靶细胞，例如靶CD19+CD123+细胞(例如，B-ALL胚细胞)时，发生细胞例如免疫效应细胞群的完全活化。在一个实施方案中，CD123CAR包含4-1BB信号传导结构域，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在一个实施方案中，CD123CAR包含共刺激结构域，例如4-1BB信号传导结构域，并且CD19 CAR包含主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域。在一个实施方案中，CD123CAR包含主要信号传导结构域，例如CD3ζ信号传导结构域，并且CD19 CAR包含共刺激结构域，例如4-1BB信号传导结构域。在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含CAR(例如，针对CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的CAR)，其包含共刺激结构域，CD19 CAR包括主要信号传导结构域。在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含CAR(例如，针对CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的CAR)，其包含主要信号传导结构域，CD19 CAR包括共刺激结构域。在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含表达结合CD123的CAR分子的一种或多种细胞，并且其中与B细胞抑制剂同时施用CD19 CAR表达细胞。在一个实施方案中，CD123CAR包含4-1BB信号传导结构域，CD19 CAR包含CD3ζ信号传导结构域。
在一个实施方案中，该方法还包括将细胞例如造血干细胞或骨髓移植到哺乳动物中。
另一方面，本发明涉及一种表达本文所述的CAR分子，例如CD19 CAR分子的细胞，与B细胞抑制剂,例如本文所述的B细胞抑制剂组合用作药物。另一方面，本发明涉及本文所述的B细胞抑制剂与本文所述的表达CAR分子例如CD19 CAR分子的细胞组合用作药物。
另一方面，本发明涉及一种表达本文所述的CAR分子，例如，CD19 CAR分子的细胞，与B细胞抑制剂，例如本文所述的B细胞抑制剂组合使用，用于治疗表达CD19的疾病。另一方面，本发明涉及本文所述的B细胞抑制剂与表达本文所述的CAR分子例如CD19 CAR分子的细胞组合用于治疗表达CD19的疾病。另一方面，本发明涉及一种表达本文所述的CAR分子，例如CD19 CAR分子的细胞，与B细胞抑制剂，例如本文所述的B细胞抑制剂组合使用，用于治疗癌症，例如本文所述的癌症。
在一个实施方案中，该方法包括施用细胞群体，其中群体中的至少一个细胞表达本文的疗法(例如，CD20 CAR，CD22 CAR或具有本文所述的抗CD19结构域的CAR与B细胞抑制剂组合)和增强CAR表达细胞活性的活性剂，其中所述活性剂是细胞因子，例如IL-7，IL-15，IL-21或其组合。所述细胞因子可与CAR表达细胞的施用例如同时或不久之后组合递送。或者，可以在施用CAR表达细胞后，例如在评估受试者对CAR表达细胞的应答后，在延长的时间段后递送细胞因子。还提供了用于使用的相关组合物和制备药物的方法。
在一个实施方案中，本文所述的细胞(例如，表达CD20 CAR分子的细胞，表达CD22CAR分子的细胞，或表达CD19 CAR分子，例如本文所述的CD19 CAR分子的细胞，与B细胞抑制剂组合)与增加表达CAR分子的细胞或抑制剂之一的功效的活性剂(例如本文所述的活性剂)组合施用。
在一个实施方案中，本文所述的细胞(例如，表达CD20 CAR分子的细胞，表达CD22CAR分子的细胞或表达CD19 CAR分子，例如本文所述的CD19 CAR分子的细胞与B细胞抑制剂的组合)与改善与表达CAR分子的细胞或抑制剂之一的施用相关的一种或多种副作用的活性剂(例如本文所述的活性剂)组合施用。
在一个实施方案中，表达CD19 CAR分子,例如本文所述的CD19 CAR分子的细胞与B细胞抑制剂和治疗霍奇金淋巴瘤的活性剂(例如本文所述的活性剂)组合施用。
在一些方面，本公开提供了一种治疗作为CD19抑制剂(例如CD19 CAR疗法)的非应答者，部分应答者或复发者的患者的方法，包括向患者施用B细胞抑制剂，例如，如本文所述的B细胞抑制剂，例如，CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的一种或多种(例如2,3,4,5,6,7,8,9或全部)的抑制剂。在实施方案中，B细胞抑制剂是CAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其是CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1的一种或多种(例如2,3,4,5,6或全部)的抑制剂。在实施方案中，患者具有或被鉴定为具有CD19阴性癌细胞和对于CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a一种或多种(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,或全部)阳性的癌细胞。在实施方案中，该方法还包括对患者施用癌细胞对其为阳性的B细胞抑制剂，例如，癌细胞对其为阳性的CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a一种或多种(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,或全部)的抑制剂。在实施方案中，该方法还包括确定患者是否包含CD19阴性癌细胞的步骤中的一个或两个，以及确定患者是否包含对于CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的一种或多种(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,或全部)阳性的癌细胞。在实施方案中，受试者具有或被鉴定为具有测试对CD19表达阴性的肿瘤或癌细胞群体，如通过结合抗CD19抗体(例如，与表2或表3中任何CAR分子具有相同特异性的抗体)测量的。
另一方面，本发明的特征在于组合物,其包含表达结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)分子的细胞与B细胞抑制剂组合，所述B细胞抑制剂例如选自CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a，或其组合。CAR表达细胞和B细胞抑制剂可以单剂型存在，或以两种或更多种剂型存在。
在一个实施方案中，组合物是药学上可接受的组合物。
在实施方案中，本文公开的组合物(例如，核酸，载体或细胞)用作药物。
在实施方案中，本文公开的组合物用于治疗与B细胞抗原(例如CD19)表达相关的疾病，例如B细胞白血病或淋巴瘤。
CD19抑制剂
在实施方案中，CD19抑制剂是小分子，抗体，抗体片段或细胞疗法。
在一些实施方案中，CD19抑制剂(例如，细胞疗法或抗体)与B细胞抑制剂组合施用或与B细胞抑制剂一起存在于组合物中，所述B细胞抑制剂为例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a的一种或多种抑制剂。
在一个实施方案中，细胞表达包含抗CD19结合结构域(例如，特异性结合CD19的鼠或人源化抗体或抗体片段)，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或主要信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)的CAR分子。在一个实施方案中，CAR包含抗体或抗体片段，其包含本文所述的抗-CD19结合结构域(例如，与本文所述CD19特异性结合的鼠或人源化抗体或抗体片段)，本文所述的跨膜结构域，以及本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含本文所述的共刺激结构域和/或主要信号传导结构域的细胞内传导结构域)。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD19结合结构域，其包含本文描述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和本文描述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如包含一个或多个，例如全部三个LC CDR以及一个或多个，例如全部三个HCCDR的抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，每个包含本文所述的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含本文所述的鼠轻链可变区(例如，在表3中)和/或本文所述的鼠重链可变区(例如，在表3中)。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是包含表3的氨基酸序列的鼠轻链和鼠重链的scFv。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表3中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表3中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:59的序列或其具有95-99％的同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是scFv，并且例如在表3中的包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区通过接头，例如本文所述的接头连接到例如在表3中的包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n为1,2,3,4,5或6，例如3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下取向中的任一个:轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施方案中，CAR分子包含人源化抗CD19结合结构域，其包含本文描述的人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和本文所述的人源化抗-CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如包含一个或多个，例如全部三个LC CDR和一个或多个，例如，所有三个HC CDR的人源化抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域至少包含HC CDR2。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，人源化抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，每个可变重链区包含本文所述的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域至少包含HC CDR2。在一个实施方案中，轻链可变区包含VK3_L25种系序列的一个，两个，三个或全部四个构架区。在一个实施方案中，轻链可变区具有修饰(例如，取代，例如，在SEQ ID NO:58的鼠轻链可变区的相应位置中发现的一个或多个氨基酸的取代，例如在位置71和87的一个或多个位置的取代)。在一个实施方案中，重链可变区包含VH4_4-59种系序列的一个，两个，三个或全部四个构架区。在一个实施方案中，重链可变区具有修饰(例如，取代，例如，在SEQ ID NO:58的鼠重链可变区的相应位置中发现的一个或多个氨基酸的取代，例如在位置71,73和78中的一个或多个位置的取代)。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如，在表2中)和/或本文所述的重链可变区(例如，在表2中)。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是包含表2的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表2中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列，或其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是scFv，并且包含例如在表2中本文所述的氨基酸序列的轻链可变区通过接头，例如本文所述的接头连接到包含例如，在表2中本文所述的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n为1,2,3,4,5或6，例如3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下取向中的任一个:轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD19结合结构域，其包括表4和5的构建体，例如murine_CART19,humanized_CART19a,humanized_CART19b,或humanized_CART19c的一个或多个(例如，2,3,4,5或6)个LC CDR1，LC CDR2，LC CDR3，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。
在一个实施方案中，CAR分子包含前导序列，例如本文所述的前导序列，例如SEQID NO:13的前导序列，或其具有95-99％同一性的序列；本文描述的抗CD19结合结构域，例如包含本文所述的LC CDR1，LC CDR2，LC CDR3，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3的抗CD19结合结构域，例如表3中描述的鼠抗CD19结合结构域，表2中描述的人源化抗-CD19结合结构域，或其具有95-99％同一性的序列；铰链区，例如本文所述的铰链区，例如SEQ ID NO:14的铰链区或其具有95-99％同一性的铰链区；跨膜结构域，例如本文所述的跨膜结构域，例如具有SEQ ID NO:15的序列或其具有95-99％同一性的序列的跨膜结构域；细胞内信号传导结构域，例如本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或主要信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，例如本文所述的共刺激结构域，例如具有SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的序列或其具有95-99％同一性的4-1BB共刺激结构域，和/或主要信号传导结构域，例如本文所述的主要信号传导结构域，例如具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列或其具有95-99％同一性的序列的CD3ζ-刺激结构域。
在一个实施方案中，CAR分子包含(例如，组成为)SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列的具有至少一个，二个，三个，四个，五个，10个，15个，20个或30个修饰(例如取代)但不超过60,50或40个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ IDNO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列。
本发明一般在一些方面涉及被工程化以表达CAR的细胞，例如T细胞或天然杀伤(NK)细胞与一种或多种B细胞抑制剂组合用于治疗与分化抗原簇19蛋白(CD19)表达相关的疾病的用途。在一些实施方案中，B细胞抑制剂是CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种的抑制剂。
在一些实施方案中，CD19抑制剂包含抗体分子，例如具有本文所述的CD19结合序列的抗体分子。例如，抗体分子可以包含如表2,3,4和5中任一个所述的CDR或VH和VL，或与其同源的序列，例如与其具有95-99％同一性的序列。抗体分子可以包含具有本节例如在CAR的上下文中所述序列的CD19结合区域。
在实施方案中，B细胞抑制剂选自与一种或多种B细胞抗原(例如，CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a中的一种或多种)结合的抑制性核酸，可溶性配体，抗体或其抗原结合片段，CAR或表达CAR的细胞。
CD20结合结构域和抑制剂
在一些方面，本公开提供了CD20抑制剂或结合结构域，例如本文所述的CD20抑制剂或结合结构域。本公开还提供了编码CD20结合结构域的核酸，例如编码包含CD20结合结构域的CAR的核酸。组合物还可以包含第二活性剂，例如抗CD19 CAR表达细胞或CD19结合结构域。活性剂可以是例如由单个核酸或不同核酸编码的。
在一些方面，作为单一疗法施用CD20抑制剂或结合结构域。在一些方面，CD20抑制剂或结合结构域与第二活性剂如抗CD19 CAR表达细胞组合施用。
CD20抑制剂可以是例如小分子，抗体或其抗原结合片段，CAR或CAR表达细胞。在一个实施方案中，CD20抑制剂是抗CD20抗体或其片段。在一个实施方案中，抗体是单特异性抗体，在另一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，CD20抑制剂是嵌合小鼠/人单克隆抗体，例如利妥昔单抗。在一个实施方案中，CD20抑制剂是人单克隆抗体，例如奥法木单抗(ofatumumab)。在一个实施方案中，CD20抑制剂是人源化抗体，例如奥瑞珠单抗，veltuzumab，obinutuzumab，ocaratuzumab或PRO131921(Genentech)。在一个实施方案中，CD20抑制剂是包含部分抗CD20抗体的融合蛋白，如TRU-015(TrubionPharmaceuticals)。
在一个实施方案中，CD20抑制剂是抗CD20表达细胞，例如CD20 CART或表达CD20的NK细胞。
在一些实施方案中，CD20-CAR包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链(例如本文所述的铰链)，跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个实施方案中，示例性CD20CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链，跨膜结构域，细胞内共刺激结构域(例如，本文所述的细胞内共刺激结构域)和细胞内刺激结构域。
在一个实施方案中，CD20结合结构域包含本文所述的CD20结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和/或本文所述的CD20结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个，例如全部三个LC CDR和一个或多个，例如全部三个HC CDR的CD20结合结构域。这些CDR可以是例如表12A，12B和/或表13的那些CDR。在一个实施方案中，CD20结合结构域包含本文所述的CD20结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HCCDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如CD20结合结构域具有两个可变重链区，每个包含本文所述的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，CD20结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如表15A或15B中)和/或本文所述的重链可变区(例如表14A或14B中)。在一个实施方案中，CD20结合结构域包含本文所述的重链可变区(例如，在表14A或14B中)，例如本文所述的至少两个重链可变区(例如，在表14A或14B中)。在一个实施方案中，CD20结合结构域是包含表14A或14B或15A或15B的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，CD20结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表15A或15B中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰的氨基酸序列或与表15A或15B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表14A或14B中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表14A或14B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。CD20结合结构域可以是例如抗体分子或CAR分子的一部分。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD20结合结构域，其包括表12A，12B和/或13的构建体的一个或多个(例如，2,3,4,5或6个)LC CDR1,LC CDR2,LC CDR3,HC CDR1,HC CDR2,和HC CDR3，例如CAR20-1,CAR20-2,CAR20-3,CAR20-4,CAR20-5,CAR20-6,CAR20-7,CAR20-8,CAR20-9,CAR20-10,CAR20-11,CAR20-12,CAR20-13,CAR20-14,CAR20-15,或CAR20-16。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗-CD22结合结构域，其包括表14A或14B和15A或15B构建体的VL和/或VH，例如CAR20-1,CAR20-2,CAR20-3,CAR20-4,CAR20-5,CAR20-6,CAR20-7,CAR20-8,CAR20-9,CAR20-10,CAR20-11,CAR20-12,CAR20-13,CAR20-14,CAR20-15或CAR20-16。
CD20scFv之前可以是例如SEQ ID NO:13中提供的任选的前导序列，然后是例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49中提供的任选的铰链序列，如SEQ ID NO:15中提供的跨膜区，包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的细胞内信号传导结构域和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的CD3ζ序列，例如，其中所述结构域相邻并且在相同阅读框中以形成单个融合蛋白。
另外的实施方案包括编码表11A-15B中任一个的多肽的核苷酸序列。其他实施方案包括编码表11A-15B中任一个的多肽，以及SEQ ID NO:13,14,15,16,17和任选地51的每一个的核苷酸序列。
在一个实施方案中，CD20结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一个实施方案中，包含抗原结合结构域的本发明的CAR组合物的部分特异性结合人CD20或其片段。
在一个实施方案中，CD20结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，CD20结合结构域是Fv，Fab，(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合CD20蛋白或其片段。在某些情况下，人类scFv可以来源于展示文库。
在一个实施方案中，CD20结合结构域，例如scFv包含至少一个突变，使得突变的scFv赋予CART20构建体提高的稳定性。在另一个实施方案中，CD20结合结构域例如scFv包含至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个突变，其例如从人源化过程产生，使得突变的scFv赋予CART20构建体提高的稳定性。
在一些实施方案中，CD20抑制剂包含抗体分子，例如具有本文所述的CD20结合序列的抗体分子。例如，抗体分子可以包含如表11A-15B中任一个所述的CDR或VH和VL，或与其同源的序列，例如与其具有95-99％同一性的序列。抗体分子可以包含具有本节，例如在CAR的上下文中所述序列的CD20结合区域。
一方面，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和CD20 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD20 CAR的第二细胞。
在一些方面，本文所述的结合结构域或抗体分子与针对CD20的第二抗体分子结合相同(或基本相同)或重叠(或基本上重叠的)的表位，其中第二抗体分子是本文所述的抗体分子，例如，选自表11A-15B的抗体分子。在一些实施方案中，本文所述的结合结构域或抗体分子与针对CD20的第二抗体分子竞争结合和/或结合相同(或基本相同)或重叠(或基本上重叠的)的表位，其中所述第二抗体分子是本文所述的抗体分子，例如选自表11A-15B中的抗体分子，例如，通过实施例25中所述的方法测定。在一些实施方案中，双互补位CD20结合结构域结合第一表位，例如选自表11A-15B的抗体分子结合的表位，并且双互补位结合结构域还结合第二表位，例如由选自表11A-15B的抗体分子结合的第二表位。在一些方面，本公开提供了一种治疗方法，其包括施用结合第一表位(例如由选自表11A-15B的抗体分子结合的表位)的第一CD20结合结构域，和结合第二表位(例如由选自表11A-15B的抗体分子结合的第二表位)的第二CD20结合结构域。在一些实施方案中，CD20结合结构域是CAR分子的一部分，例如由表达CAR的细胞表达。
CD22结合结构域和抑制剂
在一些方面，本公开提供了CD22抑制剂或结合结构域，例如本文所述的CD22抑制剂或结合结构域。本公开还提供了编码CD22结合结构域的核酸，例如编码包含CD22结合结构域的CAR的核酸。组合物还可以包含第二活性剂，例如抗CD19 CAR表达细胞或CD19结合结构域。活性剂可以是例如由单个核酸或不同核酸编码的。
在一些方面，作为单一疗法施用CD22抑制剂或结合结构域。在一些方面，CD22抑制剂或结合结构域与第二活性剂如抗CD19 CAR表达细胞组合施用。
CD22抑制剂可以是例如小分子，抗体或其抗原结合片段，CAR或CAR表达细胞。在一个实施方案中，CD22抑制剂是抗CD22抗体或其片段。在一个实施方案中，抗体是单特异性抗体，在另一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是单特异性抗体，任选地缀合至第二活性剂例如化学治疗剂。例如，在一个实施方案中，抗体是抗CD22单克隆抗体-MMAE缀合物(例如DCDT2980S)。在一个实施方案中，抗体是抗CD22抗体的scFv，例如抗体RFB4的scFv。该scFv可以与假单胞菌外毒素-A(例如BL22)的全部或片段融合。在一个实施方案中，抗体是人源化抗CD22单克隆抗体(例如，依帕珠单抗)。在一个实施方案中，抗体或其片段包含抗CD22抗体的Fv部分，其任选地共价融合到假单胞菌外毒素-A(例如，moxetumomab pasudotox)的全部或片段(例如，38KDa片段)。在一个实施方案中，抗CD22抗体是抗CD19/CD22双特异性抗体，任选地与毒素缀合。例如，在一个实施方案中，抗-CD22抗体包含任选地连接到白喉毒素(DT)的全部或部分的抗CD19/CD22双特异性部分(例如，两个scFv配体，识别人CD19和CD22)，例如，白喉毒素(DT)的前389个氨基酸，DT 390，例如配体导向的毒素如DT2219ARL)。在另一个实施方案中，双特异性部分(例如抗CD19/抗-CD22)与毒素例如去糖基化的蓖麻毒蛋白A链(例如，Combotox)连接。
在一个实施方案中，CD22抑制剂是抗CD22表达细胞，例如CD22 CART或表达CD22的NK细胞。
一方面，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和CD22 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD22 CAR的第二细胞。作为另一个实例，CAR T细胞的群体可以包括表达多于一个，例如2,3,4,5或6个或更多个CAR，例如CD19 CAR和CD22 CAR的单个群体。
在一些实施方案中，CD22-CAR包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链(例如本文所述的铰链)，跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个实施方案中，示例性CD22CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链，跨膜结构域，细胞内共刺激结构域(例如，本文所述的细胞内共刺激结构域)和细胞内刺激结构域。
在一个实施方案中，CD22结合结构域包含本文所述的CD22结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和/或本文所述的CD22结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个，例如全部三个LC CDR和一个或多个，例如全部三个HC CDR的CD22结合结构域。这些CDR可以是例如表7A,7B,7C,8A和/或表8B的一个或多个CDR。在一个实施方案中，CD22结合结构域包含本文所述的CD22结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如CD22结合结构域具有两个可变重链区，每个包含本文所述的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，CD22结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如表10A或10B中)和/或本文所述的重链可变区(例如表9A或9B中)。在一个实施方案中，CD22结合结构域包含本文所述的重链可变区(例如，在表9A或9B中)，例如本文所述的至少两个重链可变区(例如，在表9A或9B中)。在一个实施方案中，CD22结合结构域是包含表9A或9B或10A或10B的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，CD22结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表10A或10B中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰的氨基酸序列或与表10A或10B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表9A或9B中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表9A或9B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。CD22结合结构域可以是例如抗体分子或CAR分子的一部分。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD22结合结构域，其包括表7A,7B,7C,8A和/或8B的构建体的一个或多个(例如，2,3,4,5或6个)LC CDR1,LC CDR2,LC CDR3,HC CDR1,HCCDR2,和HC CDR3，例如m971,CAR22-1,CAR22-2,CAR22-3,CAR22-4,CAR22-5,CAR22-6,CAR22-7,CAR22-8,CAR22-9,CAR22-10,CAR22-11,CAR22-12,CAR22-13,CAR22-14,CAR22-15,CAR22-16,CAR22-17,CAR22-18,CAR22-19,CAR22-20,CAR22-21,CAR22-22,CAR22-23,CAR22-24,CAR22-25,CAR22-26,CAR22-27,CAR22-28,CAR22-29,CAR22-30,CAR22-31,CAR22-32,CAR22-33,CAR22-34,CAR22-35,CAR22-36,CAR22-37,或CAR22-38。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗-CD22结合结构域，其包括表9A,9B,10A,和/或10B的构建体的VL和/或VH，例如m971,CAR22-1,CAR22-2,CAR22-3,CAR22-4,CAR22-5,CAR22-6,CAR22-7,CAR22-8,CAR22-9,CAR22-10,CAR22-11,CAR22-12,CAR22-13,CAR22-14,CAR22-15,CAR22-16,CAR22-17,CAR22-18,CAR22-19,CAR22-20,CAR22-21,CAR22-22,CAR22-23,CAR22-24,CAR22-25,CAR22-26,CAR22-27,CAR22-28,CAR22-29,CAR22-30,CAR22-31,CAR22-32,CAR22-33,CAR22-34,CAR22-35,CAR22-36,CAR22-37,或CAR22-38或与其95-99％同一性的序列。。
scFv之前可以是例如SEQ ID NO:13中提供的任选的前导序列，然后是例如SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49中提供的任选的铰链序列，如SEQID NO:15中提供的跨膜区，包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的细胞内信号传导结构域和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:ID NO:43的CD3ζ序列，例如，其中所述结构域相邻并且在相同阅读框中以形成单个融合蛋白。
另外的实施方案包括编码表6A-10B中任一个的多肽的核苷酸序列。其他实施方案包括编码表6A-10B中任一个的多肽，以及SEQ ID NO:13,14,15,16,17和任选地51的每一个的核苷酸序列。
在一个实施方案中，CD22结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一个实施方案中，包含抗原结合结构域的本发明的CAR组合物的部分特异性结合人CD22或其片段。
在一个实施方案中，CD22结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，CD22结合结构域是Fv，Fab，(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合CD22蛋白或其片段。在某些情况下，人类scFv可以来源于展示文库。
在一个实施方案中，CD22结合结构域，例如scFv包含至少一个突变，使得突变的scFv赋予CART22构建体更好的稳定性。在另一个实施方案中，CD22结合结构域例如scFv包含至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个突变，其例如从人源化过程产生，使得突变的scFv赋予CART22构建体提高的稳定性。
在一些实施方案中，CD22抑制剂包含抗体分子，例如具有本文所述的CD22结合序列的抗体分子。例如，抗体分子可以包含如表6A-10B中任一个所述的CDR或VH和VL，或与其同源的序列，例如与其具有95-99％同一性的序列。抗体分子可以包含具有本节，例如在CAR的上下文中所述序列的CD22结合区域。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和CD22 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一个细胞和表达CD22 CAR的第二个细胞。
在一些方面，本文所述的结合结构域或抗体分子与针对CD22的第二抗体分子结合相同(或基本相同)或重叠(或基本上重叠的)的表位，其中第二抗体分子是本文所述的抗体分子，例如，选自表6A-10B的抗体分子。在一些实施方案中，本文所述的结合结构域或抗体分子与针对CD22的第二抗体分子竞争结合和/或结合相同(或基本相同)或重叠(或基本上重叠的)的表位，其中所述第二抗体分子是本文所述的抗体分子，例如选自表6A-10B中的抗体分子，例如，通过实施例25中所述的方法测定。在一些实施方案中，双互补位CD22结合结构域结合第一表位，例如选自表6A-10B的抗体分子结合的表位，并且双互补位结合结构域还结合第二表位，例如由选自表6A-10B的抗体分子结合的第二表位。在一些方面，本公开提供了一种治疗方法，其包括施用结合第一表位(例如由选自表6A-10B的抗体分子结合的表位)的第一CD22结合结构域，和结合第二表位(例如由选自表6A-10B的抗体分子结合的第二表位)的第二CD22结合结构域。在一些实施方案中，CD22结合结构域是CAR分子的一部分，例如由表达CAR的细胞表达。
在一些实施方案中，CD22结合结构域与CD22的Ig样结构域1,2,3,4,5,6或7中的一个或多个结合。在一些实施方案中，CD22结合结构域结合到结构域1和2；结构域3和4；或者结构域5,6和7。
在一些方面，本公开提供了一种治疗CD19阴性癌症，例如白血病，例如ALL，例如B-ALL的方法，包括施用CD22抑制剂，例如本文所述的CD22结合结构域或CD22 CAR表达细胞。在一些实施方案中，该方法包括确定癌症是CD19阴性的步骤。在一些实施方案中，受试者已经接受CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，并且对CD19抑制剂具有抗性，复发性或难治性。
ROR1抑制剂
ROR1抑制剂可以是例如小分子，抗体或其片段。在一个实施方案中，ROR1抑制剂是抗ROR1抗体或其片段。在一个实施方案中，抗ROR1抗体或其片段是单克隆抗体，例如，cirmtuzumab。
在一个实施方案中，ROR1抑制剂是抗ROR1表达细胞，例如ROR1CART或表达ROR1的NK细胞。
在一些实施方案中，ROR1-CAR包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链(例如本文所述的铰链)，跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个实施方案中，示例性ROR1CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链，跨膜结构域，细胞内共刺激结构域(例如，本文所述的细胞内共刺激结构域)和细胞内刺激结构域。
在一个实施方案中，ROR1结合结构域包含scFv部分，例如人scFv部分。scFv之前可以是任选的前导序列，例如SEQ ID NO:13中提供的前导序列，接着是任选的铰链序列，例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49中提供的铰链序列，如SEQID NO:15中提供的跨膜区，包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的细胞内信号传导结构域和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的CD3ζ序列，例如，其中所述结构域相邻并且在相同阅读框中以形成单个融合蛋白。
在一些实施方案中，本公开涵盖包含编码ROR1 CAR的核酸分子的重组核酸构建体，其中所述核酸分子包含编码ROR1结合结构域的核酸序列，例如本文所述，例如，与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并且在相同的可读框中。可以在CAR中使用的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ，CD28,4-1BB等的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ，CD28，4-1BB等的任何组合。
在一个实施方案中，ROR1结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一个实施方案中，包含抗原结合结构域的本发明的CAR组合物的部分特异性结合人ROR1或其片段。在某些实施方案中，scFv与前导序列相邻并且在相同的可读框中。一方面，前导序列是如SEQ ID NO:13所提供的多肽序列。
在一个实施方案中，ROR1结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，ROR1结合结构域是Fv，Fab，a(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合ROR1蛋白或其片段。在某些情况下，人类scFv可以来源于展示文库。
在一个实施方案中，ROR1结合结构域，例如scFv包含至少一个突变，使得突变的scFv赋予ROR1 CART构建体提高的稳定性。在另一个实施方案中，ROR1结合结构域例如scFv包含至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个来自人源化过程的突变，使得突变的scFv赋予ROR1CART构建体改善的稳定性。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和ROR1 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达ROR1 CAR的第二细胞。
CD123抑制剂
CD123抑制剂可以是例如小分子，抗体或其片段(例如单特异性或双特异性抗体或其片段)；与CD123结合的重组蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表达CD123 CAR的细胞，例如CD123 CART。
在一个实施方案中，CD123抑制剂是重组蛋白，例如包含CD123受体的天然配体(或片段)，例如SL-401(也称为DT388IL3，德克萨斯大学西南医学中心)。
在另一个实施方案中，CD123抑制剂是抗CD123抗体或其片段，例如单克隆抗体(例如，单特异性或双特异性抗体或其片段)，例如CSL360(CSL Limited)，CSL362(CSLLimited)或MGD006(MacroGenics)。
在一个实施方案中，CD123抑制剂是抗CD123 CAR表达细胞，例如CD123 CART或表达CD123 CAR的NK细胞。
在一些实施方案中，CD123-CAR包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链(例如本文所述的铰链)，跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个实施方案中，示例性CD123 CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链，跨膜结构域，细胞内共刺激结构域(例如，本文所述的细胞内共刺激结构域)和细胞内刺激结构域。
在一个实施方案中，CD123结合结构域包含本文描述的CD123结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和/或本文描述的CD123结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个，例如全部三个LC CDR和一个或多个，例如全部三个HC CDR的CD123结合结构域。这些CDR可以是例如表17,18,26或27中任一个的那些CDR。在一个实施方案中，CD123结合结构域包含本文描述的CD123结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如CD123结合结构域具有两个可变重链区，每个包含本文所述的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，CD123结合结构域包含本文所述的轻链可变区和/或本文所述的重链可变区。在一个实施方案中，CD123结合结构域包含本文所述的重链可变区，例如本文所述的至少两个重链可变区。在一个实施方案中，CD123结合结构域是包含表16或25的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，CD123结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表16或25中轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与表16或25中的轻链可变区具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表16或25中的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列或与表16或25中的重链可变区具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD123结合结构域，其包含表17和18的构建体的一个或多个(例如，2,3,4,5或6)LC CDR1,LC CDR2,LC CDR3,HC CDR1,HC CDR2,和HCCDR3，例如CAR123-1，CAR123-2，CAR123-3或CAR123-4。在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD123结合结构域，其包含表26和27的构建体的一个或多个(例如，2,3,4,5或6个)LC CDR1,LC CDR2,LC CDR3,HC CDR1,HC CDR2,和HC CDR3，例如hzCAR123。
CD123scFv之前可以是任选的前导序列，例如SEQ ID NO:13中提供的前导序列，然后是任选的铰链序列，例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49中提供的铰链序列，如SEQ ID NO:15中提供的跨膜区，包括SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的细胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的CD3ζ序列，例如，其中结构域是相邻的并且在相同可读框内以形成单个融合蛋白。
另外的实施方案包括编码表16-27中任一个的多肽的核苷酸序列。另外的实施方案包括编码表16-27任一个的多肽，和SEQ ID NO:13,14,15,16,17和任选地51的结构域每一个的核苷酸序列。
在一个实施方案中，CD123结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一个实施方案中，包含抗原结合结构域的本发明的CAR组合物的部分特异性结合人CD123或其片段。
在一个实施方案中，CD123结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，CD123结合结构域是Fv，Fab，(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合CD123蛋白或其片段。在某些情况下，人类scFv可以来自展示文库。
在一个实施方案中，CD123结合结构域例如scFv包含至少一个突变，使得突变的scFv赋予CART123构建体提高的稳定性。在另一个实施方案中，CD123结合结构域例如scFv包含至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个突变，例如从人源化过程产生的突变，使得突变的scFv赋予CART123构建体提高的稳定性。
在一些实施方案中，CD123抑制剂包含抗体分子，例如具有如本文所述的CD123结合序列的抗体分子。例如，抗体分子可以包含如表16-27中任一个所述的CDR或VH和VL，或与其同源的序列，例如与其具有95-99％同一性的序列。抗体分子可以包含具有本节例如在CAR的上下文中所述序列的CD123结合区。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD1CAR和CD123 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD123 CAR的第二细胞。
CD10抑制剂
CD10抑制剂可以是例如小分子，抗体或其片段(例如，单特异性或双特异性抗体或其片段)；与CD10结合的重组蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表达CD10 CAR的细胞，例如CD10 CART。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包含小分子，例如sacubitril(Novartis)，缬沙坦/sacubritril(Novartis)，奥马曲拉(Bristol-Myers Squibb)，RB-101，UK-414,495(Pfizer)或其药学上可接受的盐或衍生物。
在一个实施方案中，CD10抑制剂是抗CD10 CAR表达细胞，例如CD10CART或表达CD10 CAR的NK细胞。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和CD10 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD10 CAR的第二细胞。
CD34抑制剂
CD34抑制剂可以是例如小分子，抗体或其片段(例如，单特异性或双特异性抗体或其片段)；与CD34结合的重组蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表达CD34 CAR的细胞，例如CD34 CART。
在一个实施方案中，CD34抑制剂包含靶向CD34的单克隆抗体或其片段或包含抗CD34单克隆抗体或其片段的免疫脂质体。
在一个实施方案中，CD34抑制剂是抗CD34 CAR表达细胞，例如CD34CART或表达CD34 CAR的NK细胞。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和CD34 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD34 CAR的第二细胞。
FLT-3抑制剂
FLT-3抑制剂可以是例如小分子，抗体或其片段(例如，单特异性或双特异性抗体或其片段)；与FLT-3结合的重组蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表达FLT-3 CAR的细胞，例如FLT-3 CART。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含小分子，例如quizartinib(AmbitBiosciences)，米哚妥林(Technische Universitat Dresden)，索拉非尼(Bayer and OnyxPharmaceuticals)，舒尼替尼(Pfizer)，lestaurtinib(Cephalon)或其可接受的盐或衍生物。
在一个实施方案中，FLT-3抑制剂是抗FLT-3 CAR表达细胞，例如FLT-3 CART或表达FLT-3 CAR的NK细胞。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和FLT-3 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达FLT-3 CAR的第二细胞。
CD79b抑制剂
在某些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞与CD79b抑制剂一起施用。CD79b抑制剂可以是例如小分子，抗体或其片段(例如单特异性或双特异性抗体或其片段)；结合CD79b的重组蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表达CD79b CAR的细胞，例如表达CD79b CAR的T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，CD79b抑制剂是抗CD79b CAR表达细胞，例如CD79b CART或表达CD79b CAR的NK细胞。示例性的CD79b抑制剂在下面更详细地描述。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞或表达CAR的NK细胞，其包含表达CD19 CAR和CD79b CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD79b CAR的第二细胞。
CD179b抑制剂
在某些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞与CD179b抑制剂一起施用。CD179b抑制剂可以是例如小分子，抗体或其片段(例如单特异性或双特异性抗体或其片段)；结合CD179b的重组蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表达CD179b CAR的细胞，例如表达CD179b CAR的T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，CD179b抑制剂是抗CD179b CAR表达细胞，例如CD179b CART或表达CD179b CAR的NK细胞。示例性的CD179b抑制剂在下面更详细地描述。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞或表达CAR的NK细胞，其包含表达CD19 CAR和CD179b CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD179b CAR的第二细胞。
CD79a抑制剂
在某些实施方案中，表达CD19 CAR的细胞与CD79a抑制剂一起施用。CD79a抑制剂可以是例如小分子，抗体或其片段(例如单特异性或双特异性抗体或其片段)；结合CD79a的重组蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表达CD79a CAR的细胞，例如表达CD79a CAR的T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，CD79a抑制剂是抗CD79a CAR表达细胞，例如CD79a CART或表达CD79a CAR的NK细胞。示例性的CD79a抑制剂在下面更详细地描述。
在一个实施方案中，本公开提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞或表达CAR的NK细胞，其包含表达CD19 CAR和CD79a CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD79a CAR的第二细胞。
CAR分子
本文描述的结合结构域(例如，针对CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a中的一种或多种的结合结构域)可以进一步包含一个或多个另外的氨基酸序列。
在一个实施方案中，CAR分子包含选自T细胞受体的α，β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过20,10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，结合结构域通过铰链区(例如本文所述的铰链区)连接到跨膜结构域。在一个实施方案中，编码的铰链区包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45，或其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CAR分子还包含编码共刺激结构域，例如本文所述的共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能信号传导结构域:OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:51的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含具有SEQID NO:16或SEQ ID NO:51的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过20,10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，激活性NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体，OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),4-1BB(CD137),B7-H3,CDS,ICAM-1,ICOS(CD278),GITR,BAFFR,LIGHT,HVEM(LIGHTR),KIRDS2,SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD19,CD4,CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D,NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,CD19a和与CD83特异性结合的配体的蛋白质的功能性信号传导结构域。在实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB，CD27，CD28或ICOS。
在一个实施方案中，CAR分子还包含编码细胞内信号传导结构域，例如本文所述的细胞内信号传导结构域的序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和/或SEQ ID NO:17的序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和/或SEQ ID NO:43的序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD27的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的序列和/或SEQID NO:17的序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的序列和/或SEQ ID NO:43的序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:17或SEQ ID
NO:43的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过20,10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的序列和SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在相同的框架内并且作为单个多肽链表达。
在一个实施方案中，CAR分子还包含前导序列，例如本文所述的前导序列。在一个实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
一方面，CAR(例如，CD19 CAR，ROR1 CAR，CD20 CAR，CD22 CAR，CD123 CAR，CD10CAR，CD34 CAR，FLT-3 CAR，CD79b CAR，CD179b CAR，或CD79a CAR)包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链(例如本文所述的铰链)，跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链，跨膜结构域，细胞内共刺激结构域(例如本文所述的细胞内共刺激结构域)和细胞内刺激结构域。
双特异性抗体
双特异性抗体分子(其可以例如单独施用或作为CAR的一部分施用)可以包含两个VH区和两个VL区。在一些实施方案中，上游抗体或其部分(例如scFv)排列为其VH(VH1)在其VL(VL1)上游，并且下游抗体或其部分(例如scFv)排列为其VL(VL2)在其VH(VH2)上游，使得整个双特异性抗体分子具有排列VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施方案中，上游抗体或其部分(例如scFv)排列为其VL(VL1)在其VH(VH1)上游，并且下游抗体或其部分(例如scFv)排列为其VH(VH2)在其VL(VL2)上游，使得整个双特异性抗体分子具有排列VL1-VH1-VH2-VL2。
双特异性CD22/CD19抑制剂
在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含双特异性CAR19/CAR22抗体分子。例如，在一些实施方案中，B细胞抑制剂包含表28的一个或多个氨基酸序列或与其具有95-99％同一性的序列。还提供了根据表28的核酸或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含表2或3的CD19特异性抗体分子(或与其具有95-99％同一性的序列)和表6A或6B的CD22特异性抗体分子(或与其具有95-99％同一性的序列)。在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含具有表4或5的一个或多个CDR的CD19特异性抗体分子(或与其具有1,2,3,4,5或6个改变，例如取代的序列)和具有表7A，7B，7C，8A或8B的CDR的CDR22特异性抗体分子(或与其具有1,2,3,4,5或6个改变，例如取代的序列)的CD22特异性抗体分子。
MTOR抑制剂
在一个实施方案中，任选地与B细胞抑制剂组合施用的表达CAR分子(例如CD19CAR分子，CD20 CAR分子或CD22 CAR分子，例如本文所述的CAR分子)的细胞与低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂共同施用。虽然不希望被理论束缚，但认为用低的免疫增强剂量(例如，不足以完全抑制免疫系统但足以提高免疫功能的剂量)的治疗伴随着PD-1阳性T细胞的减少或PD-1阴性细胞的增加。可以通过与表达PD-1配体例如PD-L1或PD-L2的细胞接合而使PD-1阳性T细胞而不是PD-1阴性T细胞被消耗。
在一个实施方案中，该方法可用于优化受试者中本文所述的CAR细胞的性能。尽管不希望受理论束缚，但是相信在一个实施方案中，内源性未修饰的免疫效应细胞(例如T细胞)的性能得到改善。虽然不希望受理论束缚，但是相信在一个实施方案中，CAR表达细胞的性能得到改善。在其它实施方案中，已经或将被工程化以表达CAR的细胞，例如T细胞可以通过与一定量的mTOR抑制剂接触而离体治疗，所述一定量的mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞，例如T细胞的数量或增加PD1阴性免疫效应细胞，例如T细胞/PD1阳性免疫效应细胞，例如T细胞的比例。
在一个实施方案中，在施用本文所述的CAR表达细胞，例如T细胞之前，开始施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂，例如变构抑制剂例如RAD001或催化抑制剂。在一个实施方案中，CAR细胞在足够的时间或足量剂量的mTOR抑制剂之后施用，使得PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平或PD1阴性免疫效应细胞，例如T细胞/PD1阳性免疫效应细胞，例如T细胞的比例至少暂时增加了。
在一个实施方案中，足够时间或足够剂量的低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂之后收获被工程化以表达CAR的细胞，例如T细胞，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平或PD1阴性免疫效应细胞，例如T细胞/PD1阳性免疫效应细胞，例如T细胞的比例至少暂时增加了。
本文描述的组合物或方法的其它特征或实施方案包括以下一个或多个:
在实施方案中，B细胞抑制剂包含CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1中的一种或多种的抑制剂。在实施方案中，B细胞抑制剂包含有效数量的一种或多种细胞，其表达结合CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1中的一种或多种的CAR分子。
在实施方案中，表达结合CD19的CAR分子的一种或多种细胞与一种或多种B细胞抑制剂同时，之前或之后施用。
在实施方案中，在与生物样品中的表29中列出的一种或多种标记的参考水平相比，受试者具有或被鉴定为具有在测定的水平之间的差异，例如统计学显著差异。
在实施方案中，与在生物样品中的CD19的特征中的参考特征(例如，引起移码或过早终止密码子或两者的突变)相比，受试者具有或被鉴定为具有在确定的特征之间的差异。
在实施方案中，与在生物样品中的Treg细胞的参考水平相比，受试者具有或被鉴定为具有在确定的水平之间的差异，例如统计学显著差异。
在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的嵌合抗原受体(CAR)疗法，例如本文所述的CAR疗法，例如包含CD19 CAR表达细胞和任选的一种或多种B细胞抑制剂的疗法，并且受试者在以下项的一种或多种中被鉴定为具有与参考水平相比的确定水平或与参考特征相比的确定特征之间的差异(例如，统计学显著性差异):(i)表29中列出的一种或多种标记的水平或活性；(ii)CD19的特征，例如突变，例如导致移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平。在一个实施方案中，所述方法包括在(i)表29中列出的一种或多种标记的水平；(ii)CD19的特征，例如突变，例如导致移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平或活性中的一个或多个中确定所述受试者是否具有与参考水平相比的确定水平之间或与参考特征相比的确定特征之间的差异，例如统计学显著差异，并对受试者施用治疗有效剂量的嵌合抗原受体(CAR)疗法，例如本文所述的CAR疗法，例如包含CD1CAR表达细胞和任选的一种或多种B细胞抑制剂的疗法。在一个实施方案中，所述方法包括在(i)表29中列出的一种或多种标记的水平；(ii)CD19的特征，例如突变，例如导致移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平或活性中的一个或多个中确定所述受试者是否具有与参考水平相比的确定水平之间或与参考特征相比的确定特征之间的差异，例如统计学显著差异，并对受试者施用治疗有效剂量的嵌合抗原受体(CAR)疗法，例如本文所述的CAR疗法，例如包含CD1CAR表达细胞和任选的一种或多种B细胞抑制剂的疗法。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的嵌合抗原受体(CAR)疗法，例如本文所述的CAR疗法，例如包含CD1CAR表达细胞的疗法，确定受试者是否在(i)表29中列出的一种或多种标记的水平；(ii)CD19的特征，例如突变，例如导致移码或过早终止密码子或两者的突变，或(iii)生物样品中TREG细胞的水平或活性中的一个或多个中具有与参考水平相比的确定水平之间或与参考特征相比的确定特征之间的差异，例如统计学上显著差异，并且如果差异存在，那么向受试者施用治疗有效剂量的一种或多种B细胞抑制剂。
在实施方案中，受试者具有或被鉴定为具有在生物样品中的Treg细胞的确定水平和参考水平之间的增加，例如统计学上显著增加。
在实施方案中，受试者在用表达结合CD19的CAR分子(例如CD19CAR)的一种或多种细胞治疗后已经复发或被鉴定为已经复发。
在实施方案中，B细胞抑制剂包含有效数量的一种或多种细胞，其表达:结合CD10的CAR分子，例如本文所述的CD10 CAR；结合CD20的CAR分子，例如本文所述的CD20 CAR；结合CD22的CAR分子，例如本文所述的CD22 CAR；结合CD34的CAR分子，例如本文所述的CD34CAR；结合CD123的CAR分子，例如本文所述的CD123 CAR；结合FLT-3的CAR分子，例如本文所述的FLT-3 CAR；或结合ROR1的CAR分子，例如本文所述的ROR1 CAR。
在实施方案中，CD19抑制剂包含抗体或抗体片段，其包含CD19结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD19结合结构域包含表2或表3中列出的任何CD19轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，以及表2或表3中列出的任何CD19重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在实施方案中，CD19 CAR包含表2或3中列出的轻链可变区和表2或3所列的任何重链可变区。
在实施方案中，CD19抑制剂包含CD19结合结构域，其包含选自SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列，或其具有95-99％同一性的序列。在实施方案中，CD19 CAR包含SEQ ID NO:58的多肽。
在实施方案中，B细胞抑制剂包含CD20 CAR，其包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括CD20结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD20结合结构域包含表13中所列的任何CD20轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，以及表12A或12B中列出的任何CD19重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在实施方案中，B细胞抑制剂包含CD22 CAR，其包含抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包括CD22结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD22结合结构域包含表8A，8B，10A和/或10B中所列的任何CD22轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，以及表7A，7B，7C，9A和/或9B中列出的任何CD22重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在实施方案中，CD22 CAR包含表10A或10B中列出的任何轻链可变区。在实施方案中，CD22 CAR包含在表9A或9B中列出的任何重链可变区。在实施方案中，CD22 CAR包括表10A或10B中列出的任何轻链可变区以及列于表9A或9B中的任何重链可变区。
在实施方案中，B细胞抑制剂包含CAR，其包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括抗原结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含一个或多个(例如全部)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和一个或多个(例如全部)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在实施方案中，B细胞抑制剂包含CAR，其包含scFv。在实施方案中，B细胞抑制剂包含CAR，其包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自T细胞受体的α，β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。在实施方案中，抗原结合结构域通过铰链区连接到跨膜结构域。在实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:14或其具有95-99％同一性的序列。在实施方案中，共刺激结构域是从选自OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278),和4-1BB(CD137)的蛋白质获得的功能性信号传导结构域。在实施方案中，共刺激结构域是从选自MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号传导性淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，激活NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体，OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),4-1BB(CD137),B7-H3,CDS,ICAM-1,ICOS(CD278),GITR,BAFFR,LIGHT,HVEM(LIGHTR),KIRDS2,SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD19,CD4,CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D,NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,CD19a和与CD83特异性结合的配体的蛋白质获得的功能性信号传导结构域。在实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的序列。在实施方案中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。
在实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和/或SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:43的序列。在实施方案中，CAR还包含前导序列。在实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:13。
在实施方案中，表达CAR分子的细胞包含T细胞或NK细胞。
在实施方案中，与CD19表达相关的疾病选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症例如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与CD19表达相关的非癌症相关适应证。在实施方案中，该疾病是血液癌症，急性白血病，B细胞急性淋巴性白血病(BALL)，T细胞急性淋巴性白血病(TALL)，小淋巴细胞白血病(SLL)，急性淋巴性白血病(ALL)；慢性白血病，慢性髓性白血病(CML)或慢性淋巴细胞白血病(CLL)的一种或多种。
在实施方案中，所述方法还包括施用增加表达CAR分子的细胞功效的活性剂。在实施方案中，所述方法还包括施用改善与施用表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用的活性剂。在实施方案中，表达CAR分子的细胞与治疗与CD19相关疾病的活性剂组合施用。
在实施方案中，根据本文所述的方法，例如，向哺乳动物提供抗肿瘤免疫的方法或治疗哺乳动物的方法，哺乳动物是先前施用的癌症疗法，例如CD19 CAR疗法或除CD19 CAR表达细胞之外的癌症疗法的非应答者，部分应答者或完全应答者。在实施方案中，哺乳动物是先前施用的癌症疗法，例如CD19 CAR疗法或除CD1CAR表达细胞之外的癌症疗法的非复发者，部分复发者或完全复发者。在实施方案中，哺乳动物包含CD19阴性癌细胞或CD19阳性癌细胞，任选其中哺乳动物还包含CD22阳性，CD123阳性，FLT-3阳性，ROR-1阳性，CD79b阳性，CD179b阳性，CD79a阳性，CD10阳性，CD34阳性和/或CD20阳性癌细胞。在实施方案中，哺乳动物具有复发的ALL癌症。在实施方案中，哺乳动物预先施用CD19 CAR表达细胞，并且对CD19CAR治疗是顽固性的。
在实施方案中，所述活性剂是mTOR抑制剂，并且所述受试者被施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉素。在实施方案中，mTOR抑制剂是RAD001。在实施方案中，剂量包含变构和催化性mTOR抑制剂。在实施方案中，mTOR抑制剂的施用时间量足以降低受试者的外周血液或从受试者分离的T细胞的制备物中PD-1阳性T细胞的比例，增加PD-1阴性T细胞的比例，或增加PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比例。
在实施方案中，待工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)在足够的时间之后或在足量施用mTOR抑制剂的低的免疫增强剂量之后被收获，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞，例如T细胞的水平，或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比例已至少暂时增加了。在实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5但不超过90％的mTOR抑制相关，例如通过p70S6K抑制测量。在实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少10％但不超过40％的mTOR抑制相关，例如通过p70S6K抑制测量。
在一个实施方案中，所述方法还包括施用检查点抑制剂。在实施方案中，受试者在开始CART疗法之前接受活性剂例如mTOR抑制剂和/或检查点抑制剂的预治疗。在实施方案中，受试者接受活性剂例如mTOR抑制剂和/或检查点抑制剂的同时治疗。在实施方案中，受试者在CART疗法后接受活性剂例如mTOR抑制剂和/或检查点抑制剂的治疗。
在实施方案中，确定的水平或确定的特征在CART疗法之前或同时或过程中获得。
在实施方案中，该方法包括测定指示受试者是否可能复发或已经复发的基因特征。在实施方案中，该方法包括在用CAR表达细胞治疗，例如CART治疗(例如，CART19治疗，例如CTL019疗法)之前测定受试者中的基因特征，其预测CAR治疗的复发。在实施方案中，一种或多种标记的水平是表29中列出的至少2,3,4,5,6,7,8,9或10种标记的水平。在实施方案中，标记的水平包含mRNA水平或可溶性蛋白的水平。
在实施方案中，CD19的特征是外显子2中的突变，例如引起移码或过早终止密码子或两者的突变。在实施方案中，通过用TREG细胞表达的标记染色样品来确定TREG细胞的水平。在实施方案中，TREG细胞的水平是受试者的身体内，例如在癌症微环境中相关位置中的Treg细胞的水平。
在实施方案中，该方法还包括在单采血液成分术前减少受试者中的TREG特征。在实施方案中，该方法进一步包括例如通过向受试者施用环磷酰胺，抗GITR抗体或两者来减少受试者中的TREG特征。在实施方案中，该方法包括在收集用于CAR表达细胞产物制造的细胞之前用环磷酰胺，抗GITR抗体或二者预治疗受试者。在实施方案中，该方法还包括从受试者获得样品，其中所述样品包含细胞级分(例如其包含血液)，组织级分，单采血液成分术样品或骨髓样品。
在实施方案中，细胞表达抑制性分子，其包含第一多肽，其包含与包含来自细胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽结合的至少一部分抑制分子。在实施方案中，抑制分子包含含有至少一部分PD1的第一多肽和包含共刺激结构域和主要信号传导结构域的第二多肽。
在实施方案中，该方法包括测定指示细胞治疗的受试者是否可能复发或已复发的基因特征。在实施方案中，所述方法包括在输注到受试者之前测定细胞中的基因特征。在实施方案中，该方法还包括降低包含转导的细胞的细胞群体的TREG特征。在实施方案中，减少TREG特征包括对细胞群进行CD25消耗。
在实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是在下面描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献(例如序列数据库参考号)通过引用整体并入。例如，本文引用的所有GenBank，Unigene和Entrez序列(例如在本文的任何表中)都通过引用并入本文。除非另有说明，本文指定的序列登录号(包括本文的任何表中)是指截至2015年4月8日当前的数据库条目。当一个基因或蛋白质引用多个序列登录号时，包含所有序列变体。
另外，材料，方法和实施例仅仅是说明性的而不是限制性的。
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本发明的其它特征，目的和优点将从说明书和附图以及权利要求书中变得显而易见。
附图简述
图1A和1B是代表性CAR的示意图。
图2包含显示存在于肿瘤中的CD19表达细胞的霍奇金淋巴瘤的免疫组织化学分析图像。左侧小图为1倍放大倍数，右侧小图为20倍放大倍数。
图3是用于评估CART19治疗在霍奇金淋巴瘤患者中的治疗功效的研究的实验设置的示意图。
图4A，4B，4C和4D显示了在T细胞上PD1和CAR19表达的流式细胞术分析。图4A和4B是代表性的流式细胞术谱图，证明了来自作为CART疗法的完全应答者(CR)或非应答者(NR)的受试者的CD4+T细胞上的PD-1和CAR19表达的分布。图4C是显示来自具有对CART疗法的不同反应的受试者组的CD4+T细胞群体中PD1细胞百分比的图。图4D是显示具有对CART疗法的不同反应的受试者组的CD8+T细胞群体中PD1细胞百分比的图。
图5A和5B显示了来自对CART疗法具有不同反应的受试者组的CD4和CAR19表达细胞(图5A)或CD8和CAR19表达细胞(图5B)中PD1表达的分布。
图6显示了来自作为对CART疗法的完全应答者(CR)或非应答者(NR)的受试者的T细胞上的PD1，CAR19，LAG3和TIM3表达的流式细胞术分析。
图7A和7B显示来自对CART疗法不同反应的受试者组的PD1和LAG3表达(图7A)或PD1和TIM3表达(图7B)的分布。
图8显示了接受CART19的骨髓瘤患者的浆细胞IgA免疫表型分析，证实了对CART19疗法的反应。
图9A和9B显示在癌细胞系和CART细胞上的IL-7受体(CD127)表达。通过流式细胞术分析测定在三种癌细胞系:RL(套细胞淋巴瘤)，JEKO(也称为Jeko-1，套细胞淋巴瘤)和Nalm-6(B-ALL)中CD127的表达(图9A)。通过流式细胞仪分析测定在NSG小鼠中输注和循环的CD3阳性(CART)细胞上的CD127表达(图9B)。
图10A，10B和10C显示了CART19处理和随后的IL-7处理后的抗肿瘤反应。在第6天用不同剂量的CART19细胞处理在第0天用表达萤光素酶的套细胞淋巴瘤细胞系(RL-luc)移植的NSG小鼠，并监测肿瘤负荷。将小鼠分成4组，不接受CART19细胞，接受0.5x106个CART19细胞(CART19 0.5E6)，接受1x106个CART19细胞(CART19 1E6)或接受2x106个CART19细胞(CART19 2E6)。通过检测生物发光(平均BLI)测量CART治疗后的肿瘤负担(图10A)。将接受0.5x106个CART19细胞(CART19 0.5E6)或1x106个CART19细胞(CART19 1E6)的小鼠随机分配以接受或不接受重组人IL-7(rhIL-7)。对来自图10A的三只小鼠(#3827，#3829和#3815，接受指定的初始CART19剂量)监测由平均生物发光(BLI)表示的肿瘤负担，所述小鼠从第85天开始用IL-7治疗(图10B)。IL-7通过IP注射每周3次给药。在第85天(PRE)之前和第115天(POST)后平均生物发光(BLI)表示的肿瘤负荷在未接受IL-7(CTRL)的小鼠和接受IL-7治疗的小鼠(IL-7)之间进行比较(图10C)。
图11A和11B显示IL-7治疗后的T细胞动力学。对接受IL-7的每只小鼠或对照小鼠监测血液中检测到的人T细胞的水平(图11A)。在IL-7治疗开始之前(PRE)和14天后(第14天)测量在血液中检测到的CART19细胞(CD3+细胞)的水平(图11B)。
图12描绘了两个示例性RCAR构型的结构。抗原结合成员包括抗原结合结构域，跨膜结构域和开关结构域。细胞内结合成员包括开关结构域，共刺激信号传导结构域和主要信号传导结构域。这两个构型证明本文所述的第一和第二开关结构域可以相对于抗原结合成员和细胞内结合成员处于不同的取向。本文进一步描述了其他RCAR构型。
图13描述了具有抗C22和抗CD19结合结构域的双特异性CAR的两种构建体。“4G4S”表示接头序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1311)。
图14是描述NFAT测定中双特异性CD19/CD22 CAR构建体的活性的图。
图15A，15B，15C是显示存在各种肿瘤靶细胞系时CART细胞活化程度(通过相对发光测定)的图。图15A显示在存在表达CD20的靶细胞系Daudi的情况下的CAR T细胞活化。图15B显示在表达CD20的靶细胞系Raji存在下的CAR T细胞活化。图15C显示存在非CD20表达阴性对照K562时的CAR T细胞活化。
图16是说明基因特征分析的概述的示例性示意图。简而言之，对于每个基因集，应用2组统计模型来确定CRs，PRs和NRs之间的元基因是否在统计学上是不同的。CR更像是静息的TEFF细胞，而NR更像是活化的TEFF细胞。在活化的和静息的TEFF细胞中上调的基因也在NRs中上调。
图17描绘了示例性结果(p＝0.000215)，其示出了与不复发的完全应答者(CR)相比变成复发者的完全应答者(R)的儿科患者的样品中TREG基因具有高表达水平。x轴是应答组的样品，其中CR＝没有复发的完全应答者，R＝复发者。y轴是归一化的元基因表达得分。
图18A，18B和18C是在肿瘤靶细胞系存在下显示CAR T细胞活化的图。在图18A，将表达CAR的JNL细胞与Daudi CD22表达靶细胞系以指示的E:T比混合。在图18B，将表达CAR的JNL细胞与Raji CD22表达靶细胞系以指定的E:T比混合。在图18C，将表达CAR的JNL细胞与阴性对照K562细胞系以指定的E:T比混合。
图19是表示细胞表面上的嵌合抗原受体的原代T细胞表达的图。蛋白-L-生物素/SA-PE(图19-1和图19-2)和rhCD22-Fc/抗-Fc488(图19-3和19-4)用于测定CAR表面表达水平。没有CAR的细胞被用作阴性对照。
图20A，20B，20C，20D，20E和20F是显示原代T细胞肿瘤靶标杀伤试验的图。用CD22CAR活化和转导的原代T细胞以指示的比例与稳定表达萤光素酶的靶细胞系混合，并测量靶细胞杀伤。杀伤百分比被归一化为hCD22-8(28.8％转导)。与阳性对照CD22 CAR m971(m971-HL)，阴性对照CAR m971-LH和作为阴性对照的未转导的T细胞相比，使用CD22-表达细胞系Raji(图20A)，SEM(图20B)，K562-hCD22(图20C)，Daudi(图20D)和Nalm6(图20E)来测试功能CD22 CAR克隆。K562细胞系不表达CD22，并且用作阴性对照(图20F)。
图21A，21B，21C，21D，21E和21F是显示由CD22 CAR克隆诱导显著促炎细胞因子应答的图。原代T细胞杀伤试验用于确定CD22 CAR克隆产生促炎细胞因子IFN-g，IL-2和TNFa的能力。将效应细胞与归一化至28.8％转导的每种不同的靶细胞系共培养20小时。上清液取自不同培养物，从表达Raji CD22的靶细胞(图21A)，表达Nalm6CD22的靶细胞(图21B)，表达Daudi CD22的靶细胞(图21C)，表达SEM CD22的靶细胞(图21D)，表达K562-hCD22 CD22的靶细胞(图21E)，和K562非CD22表达细胞(阴性对照)(图21F)具有2.5:1和10:1的不同的E:T比例。
图22是描绘了通过流式细胞术检测的复发的ALL中各种B细胞抗原的表达的图。来自16个r/r患者的样品通过多参数流式细胞术筛选以下标记:CD19(16pts),CD22(16pts),CD123(16pts),FLT-3(9pts),ROR-1(3pts),CD79b(15pts),CD179b(8pts),CD79a(16pts),CD10(16pts),CD34(16pts),和CD20(16pts)。CD22和CD123在r/r ALL患者的母细胞中高水平(>60％)并同质表达(条线表示中位数％表达，分别为99.50％,98.80％,95.70％,72.00％,47.00％,15.00％,13.45％,4.200％,98.00％,87.65％,和7.00％)。对于每个患者，表达所示标记的细胞的百分比显示为单个数据点。
图23是一组图，其显示了在CART19治疗之前(基线)和之后(CD19-阴性复发)，6名CD19阴性白血病复发的患者中CD22和CD123的表达。在所有分析中，感兴趣的群体基于正向和侧向散射特征进行门控，然后进行单峰门控，并使用Live Dead Aqua(Invitrogen)门控活细胞。时间门控被纳入质量控制。门控策略包括:时间门控→SSC低→单峰→活的→CD45dim→CD10+。
图24是一组图，其显示了在CART19治疗(临床试验UPCC04409/CHP959，在方框中表示患者UPN)后CD19阴性疾病复发患者的胚细胞中CD22的表达。顶行显示CART19治疗前的胚细胞中CD19和CD22表达，而底行显示复发时的疾病表型。当CD19表达丧失时，CD22表达也在复发时保持。
图25是一组图，显示在CART19治疗后(临床试验UPCC04409/CHP959，在方框中表示患者UPN)CD19阴性疾病复发患者的胚细胞中CD123的表达。顶行显示CART19治疗前的胚细胞中CD19和CD123表达，而底行显示复发时的疾病表型。当CD19表达丧失时，CD123表达在复发时在多数患者中保持。
图26是显示CD19阴性疾病复发患者中CART19治疗前后CD19，CD22和CD123的中值表达图。CD19表达在复发时丧失(94.25％对0％，p＝0.0009)，而CD22(99.20％对97.30％，p＝ns)和CD123(63.00％对48.75％，p＝ns)仍然表达。对于每个患者，表达所述标记的细胞的百分比显示为单个数据点。
图27A和27B是一系列图，其显示了在用CART19疗法治疗后，来自16位r/r患者和4名患有CD19阴性疾病复发的患者的样品中CD22表达。通过多参数流式细胞术对B细胞标记CD22筛选样品。CD22在11/15r/r ALL患者的母细胞中高水平(>60％)并且同质表达(图27A)。在CART19治疗(基线)之前和之后(CD19阴性复发)(显示为2pts)的CD19阴性白血病复发的4/4患者中，CD22为阳性(图27B)。门控策略:SSC低→单峰→活的→CD45dim。
图28A，28B和28C是显示CD22 CART对CD19和CD22表达的影响的一系列图。示出了使用不同链取向(H至L和L至H)产生的两种CAR22构建体的方案(图28A)。抗CD22scFv(m971)经密码子优化并克隆到含有CD8铰链，41-BB共刺激和CD3ζ信号传导结构域的鼠CAR19载体中(图28A)。NALM6ALL细胞系上CD19，CD22和同种型对照的表达显示为平均荧光强度(MFI)(图28B)和抗体结合能力(ABC)(图28C)。在NALM-6中，CD19的表达高于CD22。然而，在大多数原代ALL样品中，CD19和CD22表达是相似的(参见图27A)。
图29A，29B和29C是显示用于产生CART22和CART19(连同UTD细胞)的正常供体T细胞扩增的一系列图。群体倍增(PD)相对于培养天数:扩增结束时(第11天)，CART22和对照T细胞达到约4.5PD，与CART19或UTD细胞相比无显著性差异(图29A)。T细胞体积(fl)相对于培养天数:在第6天存在峰值体积(约450μl)，而在随后的日子中，当细胞被收获并冷冻时，体积减小至300fl。观察到与CART19或UTD细胞无显著差异(图29B)。扩增第11天的CD4阳性和CD8阳性T细胞上的CAR表达如图29C所示。CAR表达的门控是基于UTD。门控策略:FSS对SSC淋巴细胞→单峰→活的→CD3+。
图30是显示具有细胞质细胞因子产生的CD107a脱颗粒测定的一系列图。CART19，CART22HtoL和LtoH与不同的靶(单独的，PMA/IONOMYCIN,MOLM-14和NALM-6)共培养。当与ALL细胞系(NALM-6)共培养但不是与阴性对照共培养时，CART19和CART22 HtoL显示出高水平的CD107a脱粒，IL-2，IFNg和TNFa产生。UTD和CART22 LtoH没有显示脱粒或细胞因子产生。门控策略:FSS对SSC淋巴细胞→单峰→活的→CD3+。
图31是显示基于萤光素酶的杀伤试验的图。CART22和CART19 HtoL但不是UTD细胞在共培养24小时时能够裂解NALM-6细胞。观察到细胞毒活性与E:T比率之间存在直接相关性，E:T比例2:1时具有更好的抗白血病效果(CART19和CART22为78％和75％杀死)。
图32A和32B是显示基于CFSE的增殖测定的一系列图。CART22和CART19与ALL细胞系NALM-6共培养5天导致显著的T细胞增殖(分别为94％和92.9％)。还显示了对照(TCM＝单独培养基，P-I＝PMA/离子霉素，MOLM-14)(图32A)。在显示CART19和CART22中CFSE稀释动力学的柱状图中，大多数T细胞经历多次增殖循环(图32B)。门控策略:FSS对SSC淋巴细胞→单峰→活的→CD3+。
图33是显示细胞因子产生的一系列图。将CART22，CART19和UTD与不同的辐射靶(单独的，PMA/离子霉素，MOLM-14和NALM-6)温育24小时。当与ALL细胞系NALM-6共培养时，仅CART22和CART19HtoL能够释放多种细胞因子(这里显示IFNg,IL-2,GM-CSF,TNFa和MIP1b)。结果显示为平均强度荧光(MFI)。
图34A和34B是一系列显示具有原代ALL胚细胞的T细胞脱粒的图。将CART22，CART19和UTD细胞与来自基线时的ALL患者(CHP-959-101)和在患者复发CD19阴性疾病时进行CART19治疗后的胚细胞共同温育4小时。CART19和CART22都能够在基线时脱粒(当胚细胞是CD19+和CD22+时)，但是在复发时，仅CART22脱粒(当疾病为CD19-neg时)(图34A)。在复发时与CHP101样品温育后，CD8-pos和CD8-neg CART19和CART22效应物中的CD107a脱粒的点图显示CD8和CD4T细胞中仅CART22显示脱粒(图34B)。门控策略:FSS对SSC淋巴细胞→单峰→活的→CD3+。
图35A，35B，35C和35D是显示针对NALM-6的体内CART22效力的一系列图。A.实验方案:1百万个NALM-6萤光素酶+细胞/小鼠静脉内注射在NSG小鼠中。6天后，通过生物发光评估肿瘤植入。然后将小鼠随机分配以接受未转导的T细胞或不同剂量的CART22(1.25至5百万总细胞/小鼠，具有75％CAR表达)。然后监测小鼠的肿瘤负荷，PB T细胞扩增和存活(图35A)。通过生物发光(BLI)的肿瘤负荷检测到剂量相关的抗白血病反应。接受5e6CART22细胞的小鼠显示更好的肿瘤控制(图35B)。与用UTD细胞治疗的小鼠相比，CART22治疗的小鼠显示统计学显著的更好的总体存活(OS)。对于OS，较高剂量的CART22与较好的OS之间存在显著的相关性(图35C)。每周通过眶后取血监测T细胞体内扩增。T细胞输注后一周，接受较高剂量CART22的小鼠显示更好的CART扩增(中位数为12T细胞/μl)(图35D)。
图36A和36B是显示针对NALM-6的CART22和CART19之间的体内比较的一系列图。实验方案:在NSG小鼠中静脉内注射1百万个NALM-6萤光素酶+细胞/小鼠。6天后，通过生物发光评估肿瘤植入。然后小鼠随机接受未转导的T细胞，CART19或CART22(500万总细胞，75％CAR表达)。然后监测小鼠的肿瘤负荷，PB T细胞扩增和存活(图36A)。通过生物发光(BLI)检测的肿瘤负荷在CART22和CART19治疗的小鼠中表现出抗白血病反应，而UTD小鼠快速进展(图36B)。与CART22相比，CART19治疗的小鼠显示出更好的总生存期(OS)，可能是由于NALM-6中不同的靶标表达(CD19>>CD22)(图36C)。
图37A和37B是一系列图，其显示了在原发ALL的模型中CART22和CART19之间的体内比较。原发性ALL患者(JH331)的胚细胞在体内传代并用萤光素酶转导以追踪肿瘤负担。实验方案:1百万个JH331萤光素酶+细胞/小鼠静脉内注射在NSG小鼠中。14天后，通过生物发光评估肿瘤植入。然后将小鼠随机化以接受未转导的T细胞，CART19或CART22(500万总细胞，75％CAR表达)。然后监测小鼠的肿瘤负荷，PBT细胞扩增和存活(图37A)。通过生物发光(BLI)监测的肿瘤负担在CART22和CART19治疗的小鼠中检测到抗白血病反应，而UTD小鼠快速进展(图37B)。
图38A，38B和38C是通过免疫组织化学染色显示28个人正常组织上CD22表达的组织微阵列的一系列图像。淋巴器官对CD22表达(扁桃体，淋巴结，脾脏和胸腺)呈阳性(图38A)。非淋巴器官未显示CD22的表达(图38B)。在多个组织中观察到CD22-阳性驻留B细胞(图38C)。*＝非特异性染色。
图39是显示来自GeneAtlas U133A的CD22RNA表达数据的图。在B细胞，扁桃体和淋巴结中观察到高水平CD22表达。B淋巴母细胞和白血病/淋巴瘤细胞系也是高度阳性的。
图40是显示CART22毒性的51-铬释放测定的一系列图。CART22和CART19但不是UTD细胞都触发ALL细胞系NALM-6的裂解。在任何正常组织(CD34+，人神经元祖细胞或神经元和角质形成细胞)或对照(K562细胞系)中均未观察到CART22的细胞毒性作用。
图41显示了通过FACS评估的用抗CD123 CAR构建体转导的JNL细胞中CAR表达的图示，并报告为使用蛋白L作为检测试剂，在未转导(CAR阴性)细胞中显示高于信号水平的信号的细胞的百分比。
图42A，42B和42C示出了JNL细胞中CD123 CAR活性的图示。使用含有由NFAT启动子(称为JNL细胞)驱动的萤光素酶报告基因的Jurkat细胞系评估抗CD123 CAR构建体的活性。CAR活性被测量为这个NFAT驱动的报告基因的激活。
图43A和43B显示CD123表达和活性。图43A显示了原代T细胞中CD123 CAR表达的图示。使用蛋白L作为检测试剂，在BD LSRFortessa或BD-FACSCano上通过流式细胞术分析测定转导细胞的百分比(细胞表面上表达抗CD123 CAR)及其相对荧光强度。来自该FACS的高于未染色细胞的信号的相对荧光强度的门控直方图显示了转导的T细胞的百分比。转导导致CAR阳性细胞范围为12-42％。图43B显示了CD123-CART介导的细胞杀伤的图示。T细胞杀伤针对稳定表达萤光素酶的表达CD123的MOLM13急性骨髓性白血病细胞。使用未转导的T细胞来确定非特异性背景杀伤水平。在效应细胞:靶细胞比例为4:1和T细胞向下2倍稀释的范围内测量CART-CD123的细胞溶解活性，其中效应细胞定义为表达抗CD123嵌合受体的T细胞。通过将适当数目的T细胞与恒定数目的靶细胞混合来启动测定。20小时后，使用EnVision仪器上的Bright-GloTM萤光素酶测定法测量萤光素酶信号。
图44A和44B显示了使用CD123-CAR的T细胞的转导效率。图44A显示使用1172和1176的T细胞的转导效率。图44B显示了使用CD123 CAR 2-4的T细胞的转导效率。
图45显示了CD123 CAR2-4和1172和1176的流式细胞术，以确定CD4:CD8比例。
图46显示CD123 CAR2-4和1172和1176在暴露于CD123+肿瘤细胞时的脱粒。
图47显示了用于评估CART细胞(NVS 2-4,1172和1176克隆)对肿瘤靶细胞(MOLM14)的细胞毒性的萤光素酶测定的图示。
图48显示了在D6(CART注射前)和第13天(注射NVS 2-4,1172或1176克隆后6天)或第20天注射了表达萤光素酶的MOLM14细胞的NSG小鼠中肿瘤负荷的比较。
图49A，49B，49C，49D，49E和49F显示CD123在CART19治疗后发生的CD19-neg B细胞急性淋巴性白血病复发中高水平表达。图49A显示在42例复发/难治ALL样品中CD123与CD19相比的表达。图49B显示了B-ALL胚细胞中CD123和CD19共表达。在胚细胞上门控(SSC低，单峰，活的，CD45dim)。图49C显示了白血病干细胞(LSC)的门控策略。CD123在该子集中高表达。图49D显示CD123和CD19共表达和FISH分析的结果。图49E和49F显示在基线或复发后CD19和CD123表达的比较。
图50A，50B，50C，50D，50E和50F显示了使用表达CD19 CAR(CAR19)或CD123 CAR(CAR123)的T细胞的各种体外测定的结果。图50A显示CD19和CD123表达；图50B显示CD107a脱粒测定；图50C显示靶向细胞杀伤的能力；图50D和50E显示增殖能力；图50F显示所示细胞因子的细胞因子产生。
图51A，51B和51C显示，表达CD19 CAR(CAR19)或CD123 CAR(CAR123)的CART细胞在体内小鼠模型中具有抗肿瘤作用。图51A显示由生物发光成像表示的肿瘤负荷；图51B显示接受CART疗法的小鼠的总生存曲线；和图51C显示外周血中CART123细胞的扩增。
图52A，52B，52C，52D，52E和52F表明CART123在抗原缺失复发的体内小鼠模型中是有活性的。图52A显示了实验方案；图52B显示了相对于CD19表达(顶部图)和响应于CART19疗法治疗(底部图)在基线和复发疾病中通过生物发光成像表示的疾病进展；图52C显示施用未转导的T细胞或CART19细胞的小鼠的生物发光图像；图52D显示用CART19或CART123进行治疗的实验方案；图52E显示疾病进展；和图52F显示了治疗的小鼠的总体存活。
图53A，53B和53C显示异种移植小鼠的颅骨骨髓中的ALL-CART相互作用。图53A显示了实验方案；图53B显示了CART19细胞和
CART123细胞与ALL肿瘤相互作用的代表性多光子XY平面图像，所述ALL肿瘤被工程化以表达CD19和CD123或仅CD123(活动细胞以虚线圆圈表示，非活动细胞用箭头表示)；和图53C是显微镜图像的图形表示。
图54A，54B和54C显示了使用CART19和CART123预防CD19-neg复发。图54A显示了实验方案；图54B显示用未转导的T细胞(顶图)，CART19(中图)或CART19和CART123的组合(底图)处理的小鼠的疾病进展(由BLI表示的肿瘤负荷)；和图54C显示了该实验的总生存期。
图55A和55B显示表达CAR19和CAR123(图55A)的T细胞和脱粒测定的结果(图55B)。
图56A和56B显示了ALL胚细胞的特征。图56A显示各种标记CD19，CD123，CD10，CD34和CD20的表达；和图56B显示了分选CD19-CD123+细胞的门控策略。
图57A，57B，57C和57D显示CART123的抗白血病活性。图57A显示了NALM6细胞上CD19和CD123的表达；图57B显示了响应于CART19或CART123疗法的肿瘤负荷(由BLI表示)；图57C显示施用CART19或CART123的小鼠的总生存期；和图57D显示了施用不同剂量CART123的小鼠的总生存期。
图58A和58B显示了抗原缺失复发的体内模型的表征。图58A表示CD123阴性复发疾病中CD123的表达；和图58B显示了在体外与基线或复发细胞培养时CART19或CART123细胞的脱粒测定。
图59显示，在细胞培养系统中，低剂量的RAD001增强了表达CAR的转导的T细胞的增殖。在不同浓度的RAD001(nM)存在下，将CART与NALM6(Nalm-6)细胞共培养。在共培养4天后评估CAR阳性CD3阳性T细胞(黑色)和总T细胞(白色)的数量。
图60描绘了在0.3,1,3和10mg/kg(mpk)的每日RAD001给药或载体给药的NALM6-luc细胞的肿瘤生长测量。圆圈表示载体；方块表示10mg/kg剂量的RAD001；三角形表示3mg/kg剂量的RAD001，倒三角形表示1mg/kg剂量的RAD001；菱形表示0.3mg/kg剂量的RAD001。
图61A和61B显示了药代动力学曲线，显示具有NALM6肿瘤的NSG小鼠的血液中RAD001的量。图61A显示RAD001的第一剂量后第0天PK。图61B显示最终RAD001剂量后第14天PK。菱形表示10mg/kg剂量的RAD001；方块表示1mg/kg剂量的RAD001；三角形表示3mg/kg剂量的RAD001；x表示10mg/kg剂量的RAD001。
图62A和62B显示了使用和不使用RAD001给药的人源化CD19 CART细胞的体内增殖。低剂量的RAD001(0.003mg/kg)每天导致CAR T细胞增殖的增强，高于huCAR19增殖的正常水平。图62A显示CD4+CAR T细胞；图62B显示CD8+CAR T细胞。圆圈表示PBS；正方形表示huCTL019；三角形表示具有3mg/kg RAD001的huCTL019；倒三角形表示具有0.3mg/kgRAD001的huCTL019；菱形表示具有0.03mg/kg RAD001的huCTL019；圆圈表示具有0.003mg/kg RAD001的huCTL019。
图63显示了多路FIHC AQUA分析，显示了原发和继发人DLBCL患者样品中CD3+/PD-1+细胞群体之间的显著差异。
图64显示了在DLBCL样品的原发和继发位点显示各种水平的CD19(下图)和PD-L1(上图)的AQUA分析。将40个人类DLBCL患者样品，25个原发和15个继发位点进行多路FIHC，随后进行AQUA分析以鉴定CD19和PD-L1蛋白的表达水平。
图65显示了CAR表达细胞的两个群体的示意图。在左边的群体(合并的)中，每个细胞表示一种类型的CAR。在右边的群体(双顺式CAR)中，每个细胞都表达两种类型的CAR。
图66显示了双顺式CARs图。上方CAR具有由P2A蛋白酶切割位点分开的CD19 CAR和CD22 CAR。下方CAR具有由P2A蛋白酶切割位点分开的CD19 CAR和CD123 CAR。
图67显示来自双顺反子载体的CD19和CD22 CAR的共表达。
图68，顶图显示来自双顺反子载体的CD19和CD123 CAR的共表达。图68，底图，显示这些细胞的抗白血病作用。
图69显示用UTD对照CART19或CART22处理后携带CD19阴性B-ALL异种移植物的小鼠中的肿瘤负荷。
图70显示来自五个CR患者，一个未分类患者和六个PD患者的淋巴结和骨髓样品中PD-L1，PD1，LAG3和TIM3(在每组四个条形中从左到右)的表达。
图71是显示在存在和不存在m971竞争者的情况下几种CD22 CAR构建体的活化(在RLU中)的图。
图72是显示另外的CD22 CAR构建体的激活(在RLU中)的图。
图73显示了在IFN-γ测定中指示CD22 CAR活性的三个条形图。
图74显示CD22-64和CD22-65CAR的结合活性。
图75是映射由各种CD22scFv结合的表位的图。
详述
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科技术语具有与如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“一个(一种)”是指冠词的一个(一种)或多于一个(一种)(即，至少一个(一种))的语法宾语。例如，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语"约”是指包括指定值的±20％，或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％，或在某些情况下±0.1％的变化，因此这样的变化适于进行所公开的方法。
本文所用的术语“单采血液成分术”是指本领域公认的体外方法，通过该方法，供体或患者的血液从供体或患者中移出并穿过分离出所选择的特定成分的装置并返回剩余部分到供体或患者的循环系统，例如通过再输血。因此，“单采血液成分术样品”是指使用单采血液成分术获得的样品。
术语“生物等同的”是指产生与参考剂量或参考量的参考化合物(例如RAD001)产生的效果等同的效果所需的参考化合物(例如RAD001)以外的活性剂的量。在一个实施方案中，效果是mTOR抑制的水平，例如通过P70 S6激酶抑制测量，例如，如在体内或体外测定中评估，例如通过本文所述的测定法，例如Boulay测定法测量，或通过western印迹测量磷酸化的S6水平。在一个实施方案中，效果是通过细胞分选测量的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞的比例的改变。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等同量或剂量是实现参考剂量或参考量的参考化合物相同水平的P70 S6激酶抑制的量或剂量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等同量或剂量是与参考剂量或参考量的参考化合物实现PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比例相同水平的改变的量或剂量。
术语“抑制”或“抑制剂”包括给定分子例如CD20,CD10,CD19,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的某些参数例如活性的降低。例如，抑制活性，例如抑制CD20,CD10,CD19,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的活性至少5％,10％,20％,30％,40％或以上被这个术语包括。因此，抑制不必是100％。可以如本文所述或通过本领域已知的测定法来测定抑制剂的活性。“B细胞抑制剂”是分子，例如小分子，抗体，CAR或包含CAR的细胞，其导致某种参数，例如活性，例如B细胞的生长或增殖的降低，或其导致某种参数，例如与B细胞相关的分子的活性的降低。与B细胞相关的分子的非限制性实例包括在B细胞表面上表达的蛋白质，例如CD20,CD10,CD19,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽在相同的多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，该组多肽彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。一方面，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物(例如CD3ζ)结合的ζ链。在一个方面，细胞质传导结构域包含主要信号传导结构域(例如，CD3-ζ的主要信号传导结构域)。在一个方面，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个衍生自如下定义的至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即CD137)，CD27和/或CD28。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和衍生自刺激性的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)上任选的前导序列。在一个方面，CAR还包含在细胞外抗原结合结构域的N末端处的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工过程中从抗原结合结构域(例如，scFv)切割并将CAR定位于细胞膜。
本文所用的短语“与CD20表达相关的疾病”包括但不限于与CD20(例如，野生型或突变型CD20)表达相关的疾病或与表达或在任何时间表达的CD20(例如，野生型或突变型CD20)相关的病症，包括例如，增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD20(例如野生型或突变型CD20)的细胞相关的非癌症相关的适应证。为了避免疑问，与CD20表达相关的疾病可以包括与目前不表达CD20但是曾经表达CD20的细胞相关的病症，例如，因为CD20表达已被下调，例如由于用靶向CD20的分子，例如，CD20 CAR治疗。一方面，与CD20表达相关的癌症是血液癌症。一方面，血液癌症包括但不限于AML，骨髓增生异常综合征，ALL，毛细胞白血病，幼淋巴细胞白血病，慢性髓性白血病，霍奇金淋巴瘤，母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤等。与CD20表达表达相关的其他疾病包括但不限于例如与CD20表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或增殖性疾病。也可以包括与CD20表达相关的非癌症相关适应证。在一些实施方案中，CD20表达细胞表达或在任何时间表达CD20mRNA。在一个实施方案中，表达CD20的细胞产生CD20蛋白(例如野生型或突变型)，CD20蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，CD20表达细胞在一个点产生可检测水平的CD20蛋白，并且随后基本上不产生可检测的CD20蛋白。
本文所用的短语“与CD22表达相关的疾病”包括但不限于与CD22(例如，野生型或突变型CD22)表达相关的疾病或与表达或在任何时间表达的CD22(例如，野生型或突变型CD22)相关的病症，包括例如，增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD22(例如野生型或突变体CD22)的细胞相关的非癌症相关的适应证。为了避免疑问，与CD22表达相关的疾病可以包括与目前不表达CD22但是曾经表达CD22的细胞相关的病症，例如，因为CD22表达已被下调，例如由于用靶向CD22的分子，例如，CD22 CAR治疗。一方面，与CD22表达相关的癌症是血液癌症。一方面，血液癌症包括但不限于AML，骨髓增生异常综合征，ALL，毛细胞白血病，幼淋巴细胞白血病，慢性髓性白血病，霍奇金淋巴瘤，母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤等。与CD22表达表达相关的其他疾病包括但不限于例如与CD22表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或增殖性疾病。也可以包括与CD22表达相关的非癌症相关适应证。在一些实施方案中，CD22表达细胞表达或在任何时间表达CD22mRNA。在一个实施方案中，表达CD22的细胞产生CD22蛋白(例如野生型或突变型)，CD22蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，CD22表达细胞在一个点产生可检测水平的CD22蛋白，并且随后基本上不产生可检测的CD22蛋白。
如本文所用，除非另有说明，术语“预防”，“防止”和“阻止”是指在受试者开始患有病症或病症复发之前发生的作用。预防不需要完全预防病症；这一术语包括部分预防或减轻病症或病症的症状，或降低发生病症的风险。
如本文所用，“组合”施用是指在受试者患有疾病的过程中将两种(或更多种)不同的治疗递送给受试者，例如，在诊断出受试者患有病症之后和在该病症已被治愈或消除之前，或由于其他原因治疗已经停止之前递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当第二种治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍然发生，使得在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“同时递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，由于联合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，与如果第二种治疗是在不进行第一种治疗的情况下施用的，或者与第一种治疗看到的相似的情况相比，比较少的第二种治疗可以看到相同的效果，或第二种治疗可以更大程度的减轻症状。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的减轻大于在不存在另一种治疗的情况下递送的一种治疗时观察到的症状的减轻。两种治疗的效果可以是部分累加的，完全累加的或大于累加的。递送可以使得当第二种治疗递送时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。在一个实施方案中，以本文所述的剂量和/或给药方案施用CAR表达细胞，并且以本文所述的剂量和/或剂量方案施用增强CD19 CAR表达细胞活性的B细胞抑制剂或活性剂。
本文使用的术语“衍生自”表示第一和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不意味着或包括衍生自第二分子的第一分子的方法或来源限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它不意味着或包括限制产生细胞内信号传导结构域的特定方法，例如，这并不意味着提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或者施加突变，以达到细胞内信号传导结构域。
术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。
如本文所用，术语“CD19”是指分化抗原簇19蛋白质，其是在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD19的氨基酸序列可以以UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，编码人CD19的核苷酸序列可以在登录号NM_001178098中找到。如本文所用，“CD19”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD19的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。CD19在大多数B谱系癌中表达，包括例如急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。下面在“与CD19表达相关的疾病”的定义中提供了表达CD19的其他细胞。它也是B细胞祖细胞的早期标志物。参见，例如，Nicholson et al.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)。一方面，CART的抗原结合部分识别并结合CD19蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD19蛋白在癌细胞上表达。
正如本文中使用的那样，术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体比如sdAb(VL或VH)、camelid VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可以被掺入单域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可以接枝到基于多肽的支架，比如III型纤连蛋白(Fn3)(参见美国专利号:6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微小抗体)。
术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区经由例如合成接头，例如短的柔性多肽接头是邻接的，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任一顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，一般来说，在每个重链可变区中有三个CDR(例如HCDR1，HCDR2和HCDR3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1，LCDR2和LCDR3)。给定的CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的方案的任一一种确定，所述示方案包括那些由Kabat et al.(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案),Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的那些或其组合。根据Kabat编号方案，在一些实施方案中，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)，50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)，50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia编号方案，在一些实施方案中，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)，52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)，50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于作为Kabat CDR，Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，CDR对应于VH(例如哺乳动物VH，例如人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)，50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；和VL(例如哺乳动物VL，例如人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)，50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”包括抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，所述多个的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
包含抗体或其抗体片段的本发明的CAR的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)，单链抗体(scFv)，人源化抗体或双特异性抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，CAR包含包含scFv的抗体片段。
术语“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于抗体分子中且通常决定抗体所属类型的两种多肽链中较大者。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在构型存在于抗体分子中的两种多肽链的较小者。κ(k)和λ(l)轻链是指两种主要的抗体轻链的同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，比如例如由噬菌体或酵母菌表达系统表达的抗体。该术语也应当解释为指已经通过合成编码抗体的DNA分子(且其中DNA分子表达抗体蛋白质)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用重组DNA或本领域可获得且熟知的氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或有特异性免疫能力的细胞的活化或两者。本领域技术人员应当理解包括实际上所有蛋白质或肽的任一大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。当在本文中使用该术语时，本领域技术人员应当理解包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任一DNA，因此编码“抗原”。此外，本领域技术人员应当理解抗原无需仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以不同组合排列以编码引发期望免疫应答的多肽。而且，本领域技术人员应当理解抗原根本无需由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括，但不限于组织样品、肿瘤样品、具有其它生物组分的细胞或液体。
术语“竞争”或“交叉竞争”在本文中可互换使用来指抗体分子干扰抗体分子(例如本文提供的抗CD20或CD22抗体分子)与靶标(例如，人CD20或CD22)的结合的能力。结合的干扰可以是直接的或间接的(例如，通过抗体分子或靶标的变构调节)。抗体分子能够干扰另一种抗体分子与靶标结合的程度，因此可以说是否竞争的程度可以使用例如如本文所述的竞争结合测定法来确定。在一些实施方案中，竞争结合测定法是定量竞争测定法。在一些实施方案中，当在竞争结合测定法(例如，本文所述的竞争测定法)中第一抗体分子与靶标的结合降低10％或以上，例如20％或以上，30％或以上，40％或以上，50％或以上，55％或以上，60％或以上，65％或以上，70％或以上，75％或以上，80％或以上，85％或以上，90％或以上，95％或以上，98％或以上，99％或以上时，称第一抗体分子与第二抗体分子竞争结合靶标。
如本文所用，术语“表位”是指与抗体分子特异性相互作用的抗原(例如人CD20或CD22)的部分。这些在本文中称为表位决定簇的部分通常包含元件或作为元件的一部分如氨基酸侧链或糖侧链。可以例如通过本领域已知的方法或本文公开的方法，例如通过晶体学或通过氢氘交换来定义表位决定簇。抗体分子上与表位决定簇特异性相互作用的至少一个或一些部分通常位于CDR中。通常，表位具有特定的三维结构特征。通常，表位具有特定的电荷特征。一些表位是线性表位，而其他表位是构象表位。
术语“抗癌作用”是指可以通过多种手段表现的生物作用，包括但不限于，例如，肿瘤体积的减少，癌细胞数目的减少，转移灶数目的减少，期望寿命的增加，癌细胞增殖的减少，癌细胞存活的减少或与癌性病症相关的各种生理症状的改善。“抗癌作用”还可以通过本文所述的肽，多核苷酸，细胞和抗体首先在预防癌症发生中的能力来表现。术语“抗肿瘤效应”是指可以通过多种手段表现的生物效应，包括但不限于，例如，肿瘤体积的减少，肿瘤细胞数目的减少，肿瘤细胞增殖的减少，或肿瘤细胞存活的减少。
术语“自体的”是指衍生自相同个体的任一材料，其随后被重新引入个体中。
术语“同种异体的”是指来源于与将导入物质的个体相同物种的不同动物的任一物质。当一个或更多个基因座的基因不相同时，两个或多个个体被认为是彼此同种异体的。在某些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上是足够不同的而以在抗原性上相互作用。
术语“异种的”是指移植物来源于不同种类的动物。
术语“癌症”是指特征为异常细胞的不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或穿过血流和淋巴系统至身体的其他部分。各种癌症的实例是本文描述的，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体，例如，弥散性或循环肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前，以及恶性癌症和肿瘤。
术语“与癌症相关的抗原”或“肿瘤抗原”或“增殖性病症抗原”或“与增殖性病症相关的抗原”可互换地是指与正常细胞相比全部地或以片段形式(例如MHC/肽)优选在癌细胞表面上被表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其用于将药理学活性剂优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原为由正常细胞和癌细胞表达的标志，例如谱系标志例如在B细胞上的CD19。在某些方面，本发明的肿瘤抗原来源于癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，子宫癌，宫颈癌，膀胱癌，肾癌，和腺癌如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌等等。在一些实施方案中，肿瘤抗原是特异性增殖性病症共有的抗原。在一些实施方案中，与癌症相关的抗原为在癌细胞中与正常细胞相比过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍或以上过表达。在一些实施方案中，与癌症相关的抗原为癌细胞中被不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上被表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，与癌症相关的抗原应当全部或以片段形式(例如，MHC/肽)被专一性地表达在癌细胞的细胞表面上，而不是在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施方案中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递肽的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，来源于内源蛋白质的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)的I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCRs)识别。I类MHC复合体由全部有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体代表免疫疗法的独特类型的细胞表面靶点。已经描述了在人类白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情形中来源于病毒或肿瘤抗原的TCR-样抗体靶向肽(参见，例如Sastry等人,J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，TCR-样抗体可以从筛选库比如人scFv噬菌体展示文库鉴别。
短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与CD19(例如，野生型或突变型CD19)表达相关的疾病或与表达或在任何时间表达CD19(例如，野生型或突变型CD19)的细胞相关的病症，包括，例如增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症例如骨髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应证。为了避免疑问，与CD19表达相关的疾病可以包括与目前不表达CD19的细胞相关的病症，例如因为CD19表达已被下调，例如由于用靶向CD19的分子例如，CD1CAR治疗，但从前表达CD19。一方面，与CD19的表达相关的癌症是血液癌症。一方面，血液癌症是白血病或淋巴瘤。一方面，与CD19的表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴性白血病(BALL)，T细胞急性淋巴性白血病(TALL)，急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。与CD19表达相关的附加癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，以及“白血病前期”，其是由无效产生(或发育异常)髓血细胞联合的一组不同的血液学状况，等等。与CD19表达相关的其它疾病包括但不限于例如与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或增殖性疾病。与CD19表达相关的非癌症相关适应证包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)，炎症性疾病(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施方案中，CD19表达细胞表达或在任何时间表达了CD19 mRNA。在一个实施方案中，表达CD19的细胞产生CD19蛋白(例如野生型或突变型)，并且CD19蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达CD19的细胞在一点产生可检测水平的CD19蛋白质，随后基本上不产生可检测的CD19蛋白。
术语“保守的序列修饰”是指不会显著地影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术(比如定点诱变和PCR-介导的诱变)引入到本发明的抗体或抗体片段中。保守的氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在本发明的CAR之内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的功能性测定来测试改变的CAR。
术语“刺激”是指通过将刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或CAR的情况下的肿瘤抗原)结合诱导的初步应答，从而介导信号转导事件，例如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞，NK细胞或B细胞)表达的分子，其提供对于免疫细胞信号途径的至少一些方面以刺激方式调节免疫细胞活化的细胞质信号序列。在一个方面，该信号是由例如TCR/CD3复合物与加载肽的MHC分子的结合引发，并导致T细胞应答的介导的主要信号，所述应答包括但不限于，增殖，活化，分化等。以刺激方式起作用的主要细胞质信号传导序列(也称为“主要信号传导结构域”)可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号基序。在本发明中特别使用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ，共同FcRγ(FCER1G)，FcγRIIa，FcRβ(FcεR1b)，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD79a，CD79b，DAP10和DAP12的那些。在本发明的特异性CAR中，在本发明的任一个或更多个CAR中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是如SEQ ID NO:17中提供的序列或来自非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。在本发明的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是如SEQ ID NO:43中提供的序列或来自非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC的)复合的外来抗原的免疫系统细胞，比如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)。T-细胞可以使用其T-细胞受体(TCR)识别这些复合体。APC加工抗原且将其呈递给T-细胞。
本文使用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞，B细胞，天然杀伤(NK)细胞，天然杀伤T(NK-T)细胞，肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。
如本文所用的术语“免疫效应功能或免疫效应应答”是指例如增强或促进靶细胞的免疫攻击的免疫效应细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答是指促进靶细胞杀死或抑制其生长或增殖的T细胞或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，主要刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的实例。
术语“效应功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以产生促进含CAR细胞例如CART细胞的免疫效应功能的信号。例如在CART细胞中免疫效应功能的实例包括溶细胞活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在实施方案中，细胞内信号结构域是蛋白质的部分，其转导效应功能信号并引导细胞进行特化功能。虽然可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，此类截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。术语胞内信号传导结构域因此意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任一截短部分。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括主要胞内信号传导结构域。示例性的主要胞内信号传导结构域包括来源于负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例性的共刺激胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原独立的刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，主要胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共同受体或共刺激性分子的细胞质序列。
主要胞内信号传导结构域可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的主要细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些:CD3ζ、FcRγ、共同FcRγ(FCER1G),FcγRIIa,FcRβ(FcεR1b),CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22,CD79a,CD79b,CD278(“ICOS”),FcεRI,CD66d、CD32,DAP10和DAP12。
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCRζ”定义为如GenBan Acc.No.BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基，且“ζ刺激结构域”或备选地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链或其功能衍生物的细胞质结构域的氨基酸残基，其足以在功能上传递T细胞活化所需的起始信号。在一个方面，ζ的细胞质结构域包括GenBank Acc.No.BAG36664.1的残基52至164或作为其功能性同源物的来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是如SEQ IDNO:17提供的序列。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”为如SEQ IDNO:43提供的序列。
术语“共刺激性分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其特异性地结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应，比如但不限于增殖。共刺激性分子为除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其促进有效的免疫应答。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，激活NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体，OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),4-1BB(CD137),B7-H3,CDS,ICAM-1,ICOS(CD278),GITR,BAFFR,LIGHT,HVEM(LIGHTR),KIRDS2,SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD19,CD4,CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D,NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,CD19a，和与CD83特异性结合的配体。
共刺激胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。
术语“4-1BB”是指具有如GenBank Acc.No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Acc.No..AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为如SEQ ID NO:16提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。
术语“编码”是指多核苷酸比如基因、cDNA、或mRNA中的核苷酸的特异性序列在生物学过程中作为合成其它聚合物和大分子的模板的固有特性，该聚合物以及大分子具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列及由其得到的生物学特性。因此，如果与所述基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常被提供在序列表中的编码链和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链这两者都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其达到编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中含有内含子的程度。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换地使用，并且是指如本文中所述有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量。
术语“内源的”是指来自或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任一物质。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任一物质。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包括分离的核酸且可用于将所分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。大量载体是本领域已知的，包括，但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当被解释为进一步包括非质粒和促进核酸转移到细胞中的非病毒化合物，比如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括，但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒家族的种类。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，从而它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，特别地包括自我灭活性慢病毒载体，如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的。可用于临床中的慢病毒载体的其它实例包括，但不限于例如来自Oxford BioMedica的基因递送技术，来自Lentigen的载体系统等。慢病毒载体的非临床种类也是可获得的，并且将是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子之间比如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位点被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每个的位置被腺嘌呤占据时，则它们在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性为匹配或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位点(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)为同源的，则这两个序列是50％同源；如果90％的位点(例如10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人(例如，鼠科动物)抗体“人源化的”的形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。对于大部分，人源化的抗体和其抗体片段是人免疫球蛋白(接受者抗体或抗体片段)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望特异性、亲和性和能力的比如小鼠、大鼠或兔子的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应非人类残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可以包括既没有在接受者抗体中发现，也没有在所引入的CDR或构架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个且典型地两个可变结构域的基本上全部，其中所有的或基本上所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或重要部分的FR区域为人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段也可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地为人免疫球蛋白的那些。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“完全人类”是指比如抗体或抗体片段的免疫球蛋白，其中整体分子具有人类来源或由与抗体或免疫球蛋白的人类形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”是指从天然状态改变或除去。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽为“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境比如例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，使用下述通常存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷、“C”是指胞嘧啶、“G”是指鸟苷、“T”是指胸苷、和“U”是指尿苷。
术语“有效连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效连接编码序列。有效连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在结合两个蛋白编码区时必需在同一读码框中。
术语免疫原性的组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。术语“核酸”包括基因，cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例如化学合成的)或重组的。除非明确地限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，所述类似物或衍生物具有与参考核酸类似的结合性质，并且以与天然存在核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指定的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生序列而实现，所述序列中一个或更多个所选择的(或所有的)密码子的三个位置被混合碱基和/或去氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对于可以包括蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没限制。多肽包括含有彼此通过肽键结合的两个或多个氨基酸的任一肽或蛋白质。正如本文中使用的那样，该术语是指短链(其在本领域通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)以及较长链(其在本领域通常也称为蛋白质，其存在多种类型)。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指被细胞的合成机构识别的、或被引入了合成机构、启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”是指有效连接启动子/调节序列的基因产物的表达所需的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其它情况下，该序列也可包括增强子序列及表达基因产物所需的其它调控元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语“组成型”启动子是指有效连接编码或指定基因产物的多核苷酸时，在细胞的大多数或全部生理条件下引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“可诱导的”启动子是指当有效连接编码或指定基因产物的多核苷酸时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时，才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性的”启动子是指当有效连接编码或指定基因的多核苷酸时，基本上仅当细胞为对应于启动子的组织类型的细胞时才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
如在scFv的上下文中使用的那样，术语“柔性的多肽接头”或“接头”是指由比如单独或联合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基的氨基酸组成的肽接头，其将可变的重链和可变的轻链区域连接在一起。在一个实施方案中，柔性的多肽接头为Gly/Ser接头且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3.n＝4、n＝5,n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10(SEQ ID NO:105)。在一个实施方案中，柔性的多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:106)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:107)。在另一个实施方案中，接头包括多个重复的(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:108)。在本发明的范围内也包括被描述在WO2012/138475中的接头，将其并入本文作为参考。
正如本文中使用的那样，5'帽(也称为RNA帽，RNA7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是一种修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在开始转录后不久已经被添加到真核信使RNA的“前面”或5'端。所述5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对于被核糖体识别和保护免遭RNA酶很重要。帽加入与转录偶联，并且以辅助转录方式进行，使得彼此影响。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶缔合的帽合成复合体结合。该酶复合体催化mRNA加帽所需的化学反应。合成以多步生化反应方式进行。加帽部分可以经修饰以调节mRNA的功能性，比如其翻译稳定性或效率。
正如本文中使用的那样，“体外转录的RNA”是指已经体外合成的RNA，例如，mRNA。通常，体外转录的RNA是由体外转录载体产生的。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化连接到mRNA的一系列腺苷。在瞬时表达的构建体的一些实施方案中，聚A在50和5000之间(SEQ ID NO:28)，例如大于64，例如大于100，例如大于300或400。聚(A)序列可以通过化学或酶修饰来调节mRNA功能，如定位，稳定性或翻译效率。
正如本文中使用的那样，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷部分或其修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾部为通过酶聚腺苷酸聚合酶的作用添加到前-mRNA的腺嘌呤核苷酸(通常几百)的长序列。在较高等的真核生物中，聚(A)尾部被添加到含有特异性序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。聚(A)尾及结合其的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核输出和翻译也很重要。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA之后立即出现在细胞核中，但是另外也可更迟地出现在细胞质中。在转录已经终止之后，通过与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合体的作用，mRNA链被切割下来。切割位点通常的特征在于在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA已经被切割下来之后，将腺苷残基添加到切割位点的游离3'末端。
正如本文中使用的那样，“短暂”是指表达非整合的转基因数小时、数天或数个星期的时间段，其中如果整合到基因组中或含在宿主细胞中的稳定质粒复制子之内，则该表达的时间段小于基因的表达时间段。
术语“信号转导途径”是指在将信号从细胞的一个部分转导到细胞的另一个部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够跨越细胞膜接受信号和传递信号的分子和分子复合体。
术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人类)。
术语“基本上纯化的”细胞是指基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞是指其已经与其天然存在状态中通常有关的其它细胞类型分离的细胞。在某些情况下，基本上纯化的细胞群是指细胞的同源群体。在其它的情况下，该术语仅指在其天然状态下与其天然有关的细胞分离的细胞。在某些方面中，所述细胞是体外培养的。在其它方面中，所述细胞不是体外培养的。
正如本文中使用的那样，术语“治疗”是指治疗。治疗效果是通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态获得的。
正如本文中使用的那样，术语“预防”是指预防性或保护性治疗疾病或疾病状态。
在本发明上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增生性病症抗原”或“与过度增生性病症相关抗原”指的是特定过度增生性疾病共同的抗原。在某些方面，本发明的过度增生性病症抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，子宫癌，子宫颈癌，膀胱癌，肾癌和腺癌如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌等。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。
如果受试者中的癌症参数(例如，血液癌症，例如癌细胞生长，增殖和/或存活)被延迟或减少可检测的量，例如约5％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或更多(如通过任何适当的测量，例如质量，细胞计数或体积测定)，则受试者“应答”治疗。在一个实例中，如果受试者经历预期寿命比不施用治疗的预期寿命延长约5％,10％,20％,30％,40％,50％或更高，则受试者应答治疗。在另一个实例中，如果受试者具有增加的无病生存期，总生存期或增加的进展时间，则受试者应答治疗。可以使用几种方法来确定患者是否应答治疗，包括例如NCCN肿瘤学临床实践指南(NCCN )提供的标准。例如，在B-ALL的上下文中，完整的应答或完全应答者可能涉及以下一种或多种:<5％BM胚细胞，>1000个嗜中性粒细胞/ANC(/μL)，>10万血小板(/μL)，无循环胚细胞或髓外疾病(无淋巴结病，脾肿大，皮肤/牙龈浸润/睾丸质量/CNS连累)，三线造血，无复发4周。部分应答者可能涉及BM胚细胞>50％减少，>1000个嗜中性粒细胞/ANC(/μL)，>100,000血小板(/μL)的一种或多种。非应答者可以显示疾病进展，例如BM胚细胞中>25％。
本文所用的“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如癌症。在实施方案中，难治性癌症可以在治疗开始之前或开始时耐受治疗。在其他实施方案中，难治性癌症在治疗期间可变得抗性。难治性癌症也被称为耐药性癌症。
本文所用的术语“复发”是指在初始应答期(例如，完全应答或部分应答)之后，再次出现癌症。初始应答期可能涉及癌细胞水平低于某一阈值，例如低于20％,1％,10％,5％,4％,3％,2％,或1％。再次出现可能涉及癌细胞升高到一定阈值以上的水平，例如高于20％,1％,10％,5％,4％,3％,2％,或1％。例如，在B-ALL的上下文中，再次出现可能涉及例如在完全应答之后血液，骨髓(>5％)或任何髓外部位中的胚细胞的再次出现。在这种情况下，完全应答可能涉及<5％的BM胚细胞。更一般地，在一个实施方案中，应答(例如，完全应答或部分应答)可以涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一个实施方案中，初始应答期持续至少1,2,3,4,5或6天；至少1，2，3或4周；至少1，2，3，4，6，8，10或12个月；或至少1，2，3，4或5年。
在一些实施方案中，包括CD19抑制剂(例如CD1CAR疗法)的疗法可能复发或对治疗顽固。复发或抗性可以由CD19损失(例如，抗原损失突变)或降低CD19水平的其它CD19改变引起(例如由CD19阴性克隆的克隆选择引起)。携带这种CD19损失或改变的癌症在本文被称为“CD19阴性癌症”或“CD19阴性复发癌症”)。应当理解，CD19阴性癌症不需要100％的CD19损失，而是足够减少CD19疗法的有效性，使得癌症复发或变得难治。在一些实施方案中，CD19阴性癌症来自CD1CA疗法。
术语“特异性结合”是指识别和结合存在于样品中的结合配偶体(例如，刺激性肿瘤抗原)的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与受试者的组织接触而没有不适当的毒性，刺激，过敏反应等，并且与合理的利益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，Berge等人在J.PharmaceuticalSciences(1977)66:1–19详细描述了药学上可接受的盐。
在本文中使用的术语“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两种多肽，当在RCARX细胞中时，所述多肽为RCARX细胞提供对靶细胞，典型地癌细胞的特异性，并且具有可调节的细胞内信号产生或增殖，其可以优化RCARX细胞的免疫效应子性质。RCARX细胞至少部分地依赖于抗原结合结构域，以对包含由抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞提供特异性。在一个实施方案中，RCAR包括二聚化开关，其在二聚化分子的存在下可将细胞内信号传导结构域偶联至抗原结合结构域。
正如本文中使用的那样，术语“膜锚”或“膜系链结构域(membrane tetheringdomain)”是指足够将细胞外或细胞内结构域锚固于质膜的多肽或部分例如肉豆蔻基基团。
正如本文中使用的那样，术语“开关结构域”，例如当涉及RCAR时，是指在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合的实体，通常为基于多肽的实体。该缔合导致与第一开关结构域连接(例如融合)的第一实体和与第二开关结构域连接(例如融合)的第二实体的功能性偶联。第一和第二开关结构域一起被称为二聚化开关。在实施方案中，第一和第二开关结构域是彼此相同的，例如它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽，并且一起被称为均二聚化开关。在实施方案中，第一和第二开关结构域是彼此不同的，例如它们是具有不同的一级氨基酸序列的多肽，并且一起被称为异源二聚化开关。在实施方案中，所述开关在细胞内。在实施方案中，所述开关在细胞外。在实施方案中，所述开关结构域是基于多肽的实体，例如基于FKBP或FRB，并且所述二聚化分子是小分子，例如雷帕系物。在实施方案，开关结构域是基于多肽的实体，例如结合myc肽的scFv，并且二聚化分子为多肽、其片段或多肽的多聚体，例如结合一个或更多个myc scFvs的myc配体或myc配体的多聚体。在实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如myc受体，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
正如本文中使用的那样，术语“二聚化分子”，例如当涉及RCAR时，是指促进第一开关结构域与第二开关结构域结合的分子。在实施方案中，二聚化分子并没有天然存在于受试者中，或者没有以导致显著二聚化的浓度存在。在实施方案中，二聚化分子为小分子，例如雷帕霉素或雷帕系物，例如，RAD001。
当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉素或催化性mTOR抑制剂)联合使用时，术语“低的免疫增强剂量”是指部分但不是完全抑制mTOR活性的mTOR抑制剂的剂量，例如，通过抑制P70 S6激酶活性所测量。用于评估mTOR活性的方法(例如通过抑制P70 S6激酶)在本文中讨论。剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫应答。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的低的免疫增强剂量导致PD-1阳性T细胞数量的减少和/或PD-1阴性T细胞数量的增加或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞比率的增加。在一个实施方案中，低的增强免疫的剂量的mTOR抑制剂导致幼稚T细胞的数量增加。在一个实施方案中，低的增强免疫的剂量的mTOR抑制剂导致下述中的一个或更多个:
例如在记忆T细胞例如记忆T细胞前体上一个或更多个下述标记物的表达增加:CD62L高,CD127高,CD27+和BCL2，；
例如在记忆T细胞例如记忆T细胞前体上KLRG1的表达减少；和
记忆T细胞前体的数量增加，例如具有下述特征中的任一个或组合的细胞:CD62L高增加，CD127高增加，CD27+增加，KLRG1降低和BCL2增加；
其中例如与非治疗的受试者相比，上述存在的变化中任一个例如至少短暂出现。
范围∶在整个公开中，本发明的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本发明的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述比如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围比如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围比如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％的同一性。不考虑范围的宽度，这均适用。
描述
CD19抑制剂和结合结构域
本文提供了使用CD19嵌合抗原受体(CAR)治疗诸如癌症的疾病的物质组合物和使用方法。所述方法尤其包括组合施用本文所述的CD19 CAR与另一种活性剂如B细胞抑制剂。所述方法还包括例如施用本文所述的CD19 CAR以治疗淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤。
一方面，本发明提供了许多嵌合抗原受体(CAR)，其包含用于特异性结合CD19蛋白的工程化的抗体或抗体片段。一方面，本发明提供了工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其中CAR T细胞(“CART”)显示出抗癌性质。在一个方面，用CAR转化细胞，并且在细胞表面上表达CAR。在一些实施方案中，细胞(例如，T细胞)用编码CAR的病毒载体转导。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些这样的实施方案中，细胞可以稳定地表达CAR。在另一个实施方案中，用编码CAR的核酸例如mRNA，cDNA，DNA转染细胞(例如，T细胞)。在一些这样的实施方案中，细胞可以瞬时表达CAR。
一方面，CAR的抗CD19蛋白结合部分是scFv抗体片段。在一个方面，这样的抗体片段是功能性的，因为它们保留等同的结合亲和力，例如它们以与衍生其的IgG抗体相当的亲和力结合相同的抗原。在一个方面，这样的抗体片段是功能性的，因为它们提供生物学应答，其可以包括但不限于免疫应答的激活，来自其靶抗原的信号转导的抑制，激酶活性的抑制等，如本领域技术人员将理解的。一方面，CAR的抗CD19抗原结合结构域是与其源自的scFv的鼠序列相比较人源化的scFv抗体片段。一方面，亲本鼠scFv序列是PCT公开WO2012/079000中提供的CAR19构建体，并且在本文中作为SEQ ID NO:59提供。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是WO2012/079000中描述的并且在SEQ ID NO:59中提供的scFv或与其有至少95％，例如95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是PCT公开WO2012/079000中提供的CAR构建体的一部分，并且在本文提供为SEQ ID NO:58，或与其有至少95％，例如95％-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含选自表4和/或表5的至少一个(例如2,3,4,5或6个)CDR。
在一些方面，将本发明的抗体掺入到嵌合抗原受体(CAR)中。一方面，CAR包括在PCT公开WO2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供并在本文中作为SEQ ID NO:58提供的多肽序列，其中scFv结构域被一个或多个选自SEQ ID NOS:1-12的序列取代。一方面，SEQ IDNO:1-12的scFv结构域是SEQ ID NO:59的scFv结构域的人源化变体，其是特异性结合人CD19的鼠来源的scFv片段。这种小鼠scFv的人源化对于临床环境可能是期望的，其中小鼠特异性残基可以在接受CART19治疗(例如用以CAR19构建体转导的T细胞的治疗)的患者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)应答。
在一个方面，本发明的CAR的抗-CD19结合结构域，例如人源化scFv部分由转基因编码，该转基因的序列对于在哺乳动物细胞中表达已经进行了密码子优化。在一个方面，本发明的整个CAR构建体是由已经针对在哺乳动物细胞中的表达对全部序列进行了密码子优化的转基因编码的。密码子优化是指编码DNA中的同义密码子(即，编码相同氨基酸的密码子)的出现频度在不同物种中有偏差的发现。这样的密码子简并允许相同的多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，包括例如在至少US专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:1中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:2中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:3中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:4中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:5中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:6中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:7中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:8中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:9中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:10中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:11中提供的scFv部分。一方面，人源化CAR19包含SEQ ID NO:12中提供的scFv部分。
一方面，本发明的CAR将特异性抗体的抗原结合结构域与细胞内信号传导分子组合。例如，在一些方面，细胞内信号传导分子包括但不限于CD3-ζ链，4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。一方面，CD19 CAR包含选自SEQ ID NO:31-42中的一个或多个中提供的序列的CAR。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:31中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ IDNO:32中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:33中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:34中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:35中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:36中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:37中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:38中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ IDNO:39中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:40中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:41中提供的序列。一方面，CD19 CAR包含SEQ ID NO:42中提供的序列。
因此，一方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的鼠或人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的鼠或人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如包含一个或多个，例如全部三个LC CDR和一个或多个例如，全部三个HC CDR的人源化抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的鼠或人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如人源化抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，每个可变重链区包含本文所述的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的人源化轻链可变区(例如，在表2中)和/或本文所述的人源化重链可变区(例如，在表2中)。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的人源化重链可变区(例如，在表2中)，例如本文所述的至少两个人源化重链可变区(例如，在表2中)。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是包含表2的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表2中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ IDNO:11,和SEQ ID NO:12的序列，或其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码人源化抗CD19结合结构域的核酸序列包含选自SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ IDNO:70,SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的序列，或其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是scFv，并且包含例如在表2中的本文所述的氨基酸序列的轻链可变区通过接头，例如本文所述的接头连接到包含例如在表2中的本文所述的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n为1,2,3,4,5或6，例如3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下取向中的任一个:轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
一方面，抗原结合结构域部分包含一个或多个选自SEQ ID NO:1-12的序列。一方面，人源化CAR选自一个或多个选自SEQ ID NO:31-42的序列。在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体或其片段的相似性。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD19结合结构域，其包含本文描述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和本文描述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如包含一个或多个，例如全部三个LC CDR，以及一个或多个，例如全部三个HCCDR的抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含本文描述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如抗CD19结合结构域具有两个可变重链区，每个包含本文所述的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。
在一个方面，抗CD19结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一个方面，本发明的CAR组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性结合人CD19。一方面，本发明涉及包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中所述抗体结合结构域特异性结合CD19蛋白或其片段，其中所述抗体或抗体片段包含可变轻链和/或可变重链，其包含SEQ ID NO:1-12或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。一方面，抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1-12或SEQ ID NO:59的scFv的氨基酸序列。在某些方面，scFv与前导序列相邻并且在相同的可读框中。一方面，前导序列是如SEQ ID NO:13所提供的多肽序列。
一方面，包含抗原结合结构域的CAR部分包含靶向CD19的抗原结合结构域。一方面，抗原结合结构域靶向人CD19。一方面，CAR的抗原结合结构域具有与Nicholson etal.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)描述的FMC63scFv片段相同或相似的结合特异性，或包括FMC63scFv片段。在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR部分包含靶向B细胞抗原例如人B细胞抗原的抗原结合结构域。CD19抗体分子可以是例如WO2014/153270(其全部内容通过引用并入本文)中描述的抗体分子(例如人源化抗CD19抗体分子)。WO2014/153270还描述了测定各种CART构建体的结合和功效的方法。
在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含本文所述的鼠轻链可变区(例如，在表3中)和/或本文所述的鼠重链可变区(例如，在表3中)。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是包含表3的氨基酸序列的鼠轻链和鼠重链的scFv。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表3中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表3中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:59的序列或其具有95-99％的同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是scFv，并且包含本文所述(例如，表3中)的氨基酸序列的轻链可变区通过接头，例如本文所述的接头连接到包含本文所述(例如，表3中)的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，抗原结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n为1,2,3,4,5或6，例如3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下取向中的任一个:轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
此外，本发明提供(尤其是)CD19 CAR组合物，任选地与B细胞抑制剂组合，以及它们在药物中的用途或治疗涉及表达CD19的细胞或组织的癌症或任何恶性肿瘤或自身免疫性疾病等的方法。
一方面，本发明的CAR可用于根除表达CD19的正常细胞，从而可应用作为细胞移植前的细胞调节疗法。一方面，表达CD19的正常细胞是表达CD19的正常干细胞，细胞移植是干细胞移植。
一方面，本发明提供了工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)，其中CAR表达细胞，例如CAR T细胞(“CART”)表现出抗癌特性。合适的抗原是CD19。一方面，CAR的抗原结合结构域包含部分人源化抗CD19抗体片段。一方面，CAR的抗原结合结构域包含部分人源化抗CD19抗体片段，其包含scFv。因此，本发明提供(包括)包含人源化抗CD19结合结构域并被工程化成免疫效应细胞例如T细胞或NK细胞的CD19-CAR及其用于过继疗法的方法。
一方面，CAR例如CD19-CAR包含至少一个选自CD137(4-1BB)信号传导结构域，CD28信号传导结构域，CD3ζ信号结构域及其任何组合的细胞内结构域。在一个方面，CAR例如CD19-CAR包含至少一个细胞内信号传导结构域，其来自除CD137(4-1BB)或CD28之外的一种或多种共刺激分子。
本发明包括但不限于包含编码CAR的序列的重组DNA构建体，其中CAR包含与CD19,CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1，例如人CD19,CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1特异性结合的抗体或抗体片段，其中抗体片段的序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并且在相同的可读框中。细胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或主要信号传导结构域，例如ζ链。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的细胞内结构域的至少一部分的CAR的一部分。在一个实施方案中，抗原结合结构域是本文所述的鼠抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段。
在具体方面，本发明的CAR构建体包含选自SEQ ID NO:1-12的scFv结构域或SEQID NO:59的scFV结构域，其中所述scFv之前可以是任选的前导序列，例如如SEQ ID NO:13提供，然后是任选的铰链序列，例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQID NO:49中提供，如在SEQ ID NO:15中提供的跨膜区，包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的细胞内信号传导结构域和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的CD3ζ序列，其中所述结构域相邻并且在相同的可读框中形成单个融合蛋白。还包括在本发明中(尤其是)的是编码选自SEQ IS NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ IS NO:6,SEQID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQID NO:59的每个scFv片段的多肽的核苷酸序列。还包括在本发明中(尤其是)的是编码选自SEQ IS NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ IS NO:6,SEQID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQID NO:59的每个scFv片段的多肽，以及SEQ ID NO:13-17的每个结构域，加上本发明的编码的CD19 CAR融合蛋白的核苷酸序列。在一个方面，示例性CD19 CAR构建体包含任选的前导序列，细胞外抗原结合结构域，铰链，跨膜结构域和细胞内刺激结构域。一方面，示例性CD19CAR构建体包含任选的前导序列，细胞外抗原结合结构域，铰链，跨膜结构域，细胞内共刺激结构域和细胞内刺激结构域。在一些实施方案中，含有本发明的人源化scFv结构域的特异性CD19 CAR构建体提供为SEQ ID NO:31-42或如SEQ ID NO:59所提供的鼠scFv结构域。
本文还提供了全长CAR序列为SEQ ID NO:31-42和58，如表2和表3所示。
示例性的前导序列作为SEQ ID NO:13提供。示例性的铰链/间隔序列提供为SEQID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49。示例性跨膜结构域序列提供为SEQ ID NO:15。4-1BB蛋白的细胞内信号传导结构域的示例性序列提供为SEQ ID NO:16。CD27的细胞内信号传导结构域的示例性序列如SEQ ID NO:51提供。示例性的CD3ζ结构域序列提供为SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43。这些序列可以例如与识别CD19，CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1中的一种或多种的scFv组合使用。
本文提供了各种scFv片段和其他CAR组分的示例性序列。应注意，在本文中也提供了没有前导序列(例如，没有SEQ ID NO:13的氨基酸序列或SEQ ID NO:54的核苷酸序列)的这些CAR组分(例如，SEQ ID NO:121，或表2,3,6,11A,11B,16或25的序列)。
在实施方案中，本文描述的CAR序列含有源自CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
一方面，本发明包括包含编码CAR的核酸分子的重组核酸构建体，其中所述核酸分子包含编码例如本文所述的抗CD19结合结构域的核酸序列，其与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并且在相同的可读框中。在一个方面，抗CD19结合结构域选自SEQ IDNO:1-12和58中的一个或多个。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:61-72和97中的一个或多个中提供的序列的核苷酸残基64至813编码。一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ IDNO:61的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:62的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:63的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:64的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:65的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ IDNO:66的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:67的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:68的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:69的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:70的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ IDNO:71的核苷酸残基64至813编码。一方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:72的核苷酸残基64至813编码。
本文提供CD19抑制剂和组合疗法。在一些实施方案中，CD19抑制剂(例如，细胞疗法或抗体)与B细胞抑制剂，例如CD10，CD19，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3，或ROR1的一种或多种组合施用。CD19抑制剂包括但不限于CD19 CAR表达细胞，例如CD19 CART细胞或抗CD19抗体(例如抗CD19单特异性或双特异性抗体)或其片段或缀合物。在一个实施方案中，CD19抑制剂与B细胞抑制剂(例如本文所述的CAR表达细胞)组合施用。
在本公开中描述了许多CD19 CAR表达细胞。例如，在一些实施方案中，CD19抑制剂包括抗CD19 CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗CD19 CAR构建体的细胞，所述抗CD19 CAR构建体如表2中所述或由包含表2,4或5中所述的scFv，CDRs或VH和VL链的CD19结合CAR编码。例如，抗CD19 CAR表达细胞(例如CART)是通过工程化CD19-CAR(其包含CD19结合结构域)入细胞(例如，T细胞或NK细胞)产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自本文(例如表2,4或5)所列抗体的一个，两个、三个(例如全部三个)重链CDR:HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3，和/或来自本文(例如表2,4或5)列出的抗体的一个，两个，三个(例如，全部三个)轻链CDR:LC CDR1，LC CDR2和LCCDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个实施方案中，CD19结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表2中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在实施方案中，CD19结合结构域包含表4或表5的一个或多个CDR(例如，HC CDR1，HC CDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3的每一个)或具有一个或多个CDR的一个，二个，三个，四个，五个或六个修饰(例如，取代)的CDR。
示例性抗CD19抗体或其片段或缀合物包括但不限于:blinatumomab，SAR3419(Sanofi)，MEDI-551(MedImmune LLC)，Combotox，DT2219ARL(Masonic Cancer Center)，MOR-208(也称为XmAb-5574；MorphoSys)，XmAb-5871(Xencor)，MDX-1342(Bristol-MyersSquibb)，SGN-CD19A(Seattle Genetics)和AFM11(Affimed Therapeutics)。参见例如Hammer.MAbs.4.5(2012):571–77。Blinatomomab是一种双特异性抗体，其由两个scFv组成——一个结合CD19，另一个结合CD3。
Blinatomomab指导T细胞攻击癌细胞。参见例如Hammer等人；临床试验标识号NCT00274742和NCT01209286。MEDI-551是人源化的抗CD19抗体，其具有工程化以具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的Fc。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT01957579。Combotox是结合CD19和CD22的免疫毒素的混合物。免疫毒素由与去糖基化的蓖麻毒蛋白A链融合的scFv抗体片段组成。参见例如Hammer等人；和Herrera等J.Pediatr.Hematol.Oncol.31.12(2009):936-41；Schindler etal.Br.J.Haematol.154.4(2011):471-6。DT2219ARL是靶向CD19和CD22的双特异性免疫毒素，其包含两种scFv和截短的白喉毒素。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT00889408。SGN-CD19A是由与合成细胞毒性细胞杀伤剂单甲氧基auristatin F(MMAF)连接的抗CD19人源化单克隆抗体组成的抗体-药物缀合物(ADC)。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT01786096和NCT01786135。SAR3419是一种抗CD19抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过可切割接头与美登素衍生物缀合的抗CD19人源化单克隆抗体。参见例如Younes等人J.Clin.Oncol.30.2(2012):2776-82；Hammer等人；临床试验标识号NCT00549185；和Blanc et al.Clin Cancer Res.2011；17:6448-58。XmAb-5871是一种Fc工程化的人源化抗CD19抗体。参见例如Hammer等人。MDX-1342是具有增强的ADCC的人Fc工程化抗CD19抗体。参见例如Hammer等人。在实施方案中，抗体分子是双特异性抗CD19和抗CD3分子。例如，AFM11是靶向CD19和CD3的双特异性抗体。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT02106091。在一些实施方案中，本文所述的抗CD19抗体缀合或以其它方式结合到治疗剂，例如化学治疗剂，肽疫苗(例如在Izumoto等人2008J Neurosurg 108:963-971中所述的那些)，免疫抑制剂或免疫烧蚀剂，例如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯，FK506，CAMPATH，抗CD3抗体，细胞毒素，氟达拉滨，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228或细胞因子
示例性抗CD19抗体分子(包括抗体或其片段或缀合物)可以包括表2,4,或5中描述的scFv，CDRs或VH和VL链。在一个实施方案中，CD19结合抗体分子包含:轻链可变区，其包含具有表2提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表2提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表2的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在实施方案中，CD19结合抗体分子包含表4或表5的一个或多个CDR(例如，HC CDR1，HC CDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3各一个)，或者具有一个或多个CDR的一个，二个，三个，四个，五个或六个修饰(例如，取代)的CDR。抗体分子可以是例如分离的抗体分子。
在一个实施方案中，针对CD19的抗原结合结构域是本文表中描述的抗原结合结构域的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施方案中，CD19抗原结合结构域可以来自任何CD19CAR，例如LG-740；美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu et al.,LeukLymphoma.201354(2):255-260(2012)；Cruz et al.,Blood 122(17):2965-2973(2013)；Brentjens et al.,Blood,118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer et al.,Blood 116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer et al.,Blood 122(25):4129-39(2013)；和16thAnnu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(May 15-18,Salt Lake City)2013,Abst 10，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，特异性结合CD19的CAR T细胞具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。CTL019是通过T细胞的基因修饰来制备的，其通过用EF-1α启动子控制的含有CTL019转基因的自灭活复制缺陷型慢病毒(LV)载体通过转导稳定插入而介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，所述细胞基于转基因阳性T细胞的百分比递送给受试者。
在一个方面，本发明的CAR构建体的核酸序列选自SEQ ID NO:85-96中的一个或多个。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:85。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQID NO:86。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:87。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:88。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:89。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:90。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:91。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:92。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:93。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:94。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:95。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:96。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:97。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:98。一方面，CAR构建体的核酸序列是SEQID NO:99。
CD20抑制剂和结合结构域
如本文所用，术语“CD20”是指已知在B细胞上可检测的抗原决定簇。人类CD20也被称为跨膜4结构域，亚家族A，成员1(MS4A1)。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD20的氨基酸序列可以在登录号NP_690605.1和NP_068769.2中找到，并且编码人CD20的转录物变体1和3的核苷酸序列可以分别在登录号NM_152866.2和NM_021950.3中找到。如本文所用，“CD20”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD20的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD20蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD20蛋白在癌细胞上表达。
在一些方面，本公开提供了CD20抑制剂或结合结构域，例如本文所述的CD20抑制剂或结合结构域。本公开还提供编码CD20结合结构域或包含CD20结合结构域的CAR的核酸。CD20抑制剂包括但不限于CD20 CAR表达细胞，例如CD20 CART细胞或抗-CD20抗体(例如抗-CD20单或双特异性抗体)或其片段。组合物还可以包含第二活性剂，例如抗CD19 CAR表达细胞或CD19结合结构域。活性剂可以是例如由单个核酸或不同核酸编码的。
在一些方面，作为单一疗法施用CD20抑制剂或结合结构域。在一些方面，CD20抑制剂或结合结构域与第二活性剂如抗CD19 CAR表达细胞组合施用。在一个实施方案中，CD20抑制剂与CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含鼠、人类或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
CD20 CAR表达细胞，例如CART
在一个实施方案中，CD20抗体分子包含:轻链可变区，其包含具有表15A或15B中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表15A或15B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表14A或14B中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表14A或14B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，CD20抗体分子包含本文描述的CD20结合结构域的一个或多个(例如两个或全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和/或本文描述的CD20结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如包含一个或多个，例如全部三个LC CDR和一个或多个，例如全部三个HC CDR的CD20结合结构域。这些CDR可以是例如表12A，12B和/或表13的CDR，或者与其基本相同的序列。在一个实施方案中，CD20抗体分子包含一个或多个CDR(例如，HC CDR1，HC CDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2或LC CDR3)，其包含表12A，12B和/或表13的氨基酸序列的一个，两个，三个，四个，五个或六个修饰(例如取代)。抗体分子可以是例如分离的抗体分子。
在一些实施方案中，CD20抑制剂包括抗CD20 CAR表达细胞，例如CART，例如表11A或11B中所述的抗CD20 CAR构建体的细胞，或与其基本相同的序列，或由CD20结合CAR编码，其包含表11A-15B中描述的scFv，CDRs或VH和VL链，或其基本相同的序列。例如，抗CD20 CAR表达细胞，例如CART，是通过将CD20-CAR(其包含CD20结合结构域)工程化成细胞(例如，T细胞或NK细胞)产生的，例如，用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在一个实施方案中，CD20结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表15A或15B中提供的轻链可变区的氨基酸序列至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表15A或15B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表14A或14B中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表14A或14B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CD20结合结构域包含本文描述的CD20结合结构域的一个或多个(例如两个或全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)和/或本文描述的CD20结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如包含一个或多个，例如全部三个LC CDR和一个或多个，例如全部三个HC CDR的CD20结合结构域。这些CDR可以是例如表12A，12B和/或表13的那些CDR，或者与其基本相同的序列。在一个实施方案中，CD20结合结构域(例如，scFv)包含一个或多个CDR(例如，HC CDR1，HCCDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2或LC CDR3)，其包含具有表12A，12B和/或表13的氨基酸序列的一个，两个，三个，四个，五个或六个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包含抗体或抗体片段，其包括CD20结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CD20结合结构域可以包含表13,15A或15B中列出的任何CD20轻链结合结构域的轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个，和表12A，12B，14A或14B中列出的任何CD20重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
在一个实施方案中，CD20结合结构域包含CAR20-1,CAR20-2,CAR20-3,CAR20-4,CAR20-5,CAR20-6,CAR20-7,CAR20-8,CAR20-9,CAR20-10,CAR20-11,CAR20-12,CAR20-13,CAR20-14,CAR20-15,或CAR20-16的任一个的6个CDR(例如，HC CDR1,HC CDR2,HC CDR3,LCCDR1,LC CDR2,和LC CDR3中各一个)，或与其基本相同的序列。在一个实施方案中，CD20结合结构域包含CAR20-1,CAR20-2,CAR20-3,CAR20-4,CAR20-5,CAR20-6,CAR20-7,CAR20-8,CAR20-9,CAR20-10,CAR20-11,CAR20-12,CAR20-13,CAR20-14,CAR20-15,或CAR20-16中任一个的三个CDR(例如，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3各一个，或LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3中各一个)，或与其基本相同的序列。
在一个实施方案中，CD20结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如，在表15A或15B中)和/或本文所述的重链可变区(例如，在表14A或14B中)或与其基本相同的序列。在一个实施方案中，CD20结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表15A或15B中提供的轻链可变区的氨基酸序列至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表15A或15B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表14A或14B中提供的重链可变区的氨基酸序列至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表14A或14B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
其它实施方案包括编码本节所述多肽的核苷酸序列。例如，另外的实施方案包括编码表11A-15B中任一个的多肽的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以包含表11A或11B的CAR构建体或scFv。核苷酸可以编码表14A或14B的VH，表15A或15B的VL或两者。核苷酸可以编码表12A或12B的VH CDR1，VH CDR2或VH CDR3中的一个或多个(例如，两个或三个)和/或该核苷酸可以编码表13的VL CDR1，VL CDR2或VL CDR3中的一个或多个(例如，两个或三个)。核苷酸序列还可以包括SEQ ID NOS:13,14,15,16,17,和51中的一个或多个，例如所有的结构域。
在另一方面，本文提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和CD20 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD20 CAR的第二细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括例如表达包含主要细胞内信号传导结构域的CAR(例如，CD19 CAR，ROR1 CAR，CD20 CAR或CD22CAR)的第一细胞，以及表达包含次要信号传导结构域的CAR(例如，CD19 CAR，ROR1 CAR，CD20 CAR或CD22 CAR)的第二细胞。
CD20 CAR还可以包含一个或多个跨膜结构域，例如本文所述的跨膜结构域，细胞内信号传导结构域，例如本文所述的细胞内信号传导结构域，共刺激结构域，例如本文所述的共刺激结构域，前导序列，例如如本文所述的前导序列，或铰链，例如，如本文所述的铰链。
示例性的抗-CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗，奥法木单抗，奥瑞珠单抗，veltuzumab，obinutuzumab，TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)，ocaratuzumab和Pro131921(Genentech)。参见，例如，Lim et al.Haematologica.95.1(2010):135-43。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含利妥昔单抗。利妥昔单抗是结合CD20并引起CD20表达细胞的细胞溶解的嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，例如，如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。在一些实施方案中，利妥昔单抗可用于治疗B细胞恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如滤泡性NHL，弥漫性大B细胞淋巴瘤)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在其他实施方案中，利妥昔单抗可用于治疗自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，自身免疫性贫血，自身免疫性溶血性贫血，纯红细胞再生障碍，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，埃文斯综合征，血管炎，大疱性皮肤病，1型糖尿病，干燥综合征，抗NMDA受体脑炎和德维克病，格雷夫斯眼病和自身免疫性胰腺炎。在一些实施方案中，利妥昔单抗可用于治疗移植排斥反应。
在一些实施方案中，利妥昔单抗静脉内给药，例如，作为静脉输注。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如，约500-550,550-600,600-650,650-700,700-750,750-800,800-850,850-900,900-950,950-1000,1000-1100,1100-1200,1200-1300,1300-1400,1400-1500,1500-1600,1600-1700,1700-1800,1800-1900,或1900-2000mg)利妥昔单抗。
在一些实施方案中，利妥昔单抗以150mg/m2到750mg/m2,例如,约150-175mg/m2,175-200mg/m2,200-225mg/m2,225-250mg/m2,250-300mg/m2,300-325mg/m2,325-350mg/m2,350-375mg/m2,375-400mg/m2,400-425mg/m2,425-450mg/m2,450-475mg/m2,475-500mg/m2,500-525mg/m2,525-550mg/m2,550-575mg/m2,575-600mg/m2,600-625mg/m2,625-650mg/m2,650-675mg/m2,或675-700mg/m2的剂量施用，其中m2表示受试者的体表面积。
在一些实施方案中，利妥昔单抗以至少4天，例如，4,7,14,21,28,35天，或更长的给药间隔给药。例如，利妥昔单抗以至少0.5周，例如，0.5,1,2,3,4,5,6,7,8或更长的给药间隔施用。
在一些实施方案中，利妥昔单抗以本文中所描述的剂量和给药间隔施用，例如，至少2周，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20周，或更长。例如，利妥昔单抗以本文中所描述的剂量和给药间隔施用，每治疗周期共至少4次剂量(例如，每个治疗周期至少4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,或更多剂量)。
在一些方面，所述抗CD20抗体包含奥法木单抗。奥法木单抗是具有约149kDa的分子量的抗CD20IgG1κ人单克隆抗体。例如，使用转基因小鼠和杂交瘤技术产生奥法木单抗并从重组鼠细胞系(NS0)表达并纯化。见，例如，www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验标识符编号NCT01363128，NCT01515176，NCT01626352，和NCT01397591。
奥法木单抗可用于治疗诸如CLL，非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如滤泡性NHL和DLBCL)，B细胞幼淋巴细胞性白血病，急性淋巴性白血病(ALL)，套细胞淋巴瘤，类风湿性关节炎和多发性硬化的疾病。
在一些实施方案中，奥法木单抗作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约150-3000mg(例如，约150-200,200-250,250-300,300-350,350-400,400-450,450-500,500-550,550-600,600-650,650-700,700-750,750-800,800-850,850-900,900-950,950-1000,1000-1200,1200-1400,1400-1600,1600-1800,1800-2000,2000-2200,2200-2400,2400-2600,2600-2800,或2800-3000mg)奥法木单抗。
在一些实施方案中，奥法木单抗以至少4天，例如4,7,14,21,28,35天或更长时间的给药间隔施用。例如，奥法木单抗的给药间隔至少为1周，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,24,26,28,20,22,24,26,28,30周或以上。
在一些实施方案中，奥法木单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如至少1周，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,22,24,26,28,30,40,50,60周或更长，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月或更长，或1,2,3,4,5年或更长。例如，奥法木单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用，每个治疗周期总共至少2个剂量(例如，每个治疗周期至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,18,20，或更多的剂量)。
在一些方面，抗CD20抗体包含奥瑞珠单抗。奥瑞珠单抗是一种人源化的抗CD20单克隆抗体，例如临床试验识别号NCT00077870,NCT01412333,NCT00779220,NCT00673920,NCT01194570,和Kappos et al.Lancet.19.378(2011):1779-87。例如，奥瑞珠单抗可用于治疗诸如类风湿性关节炎，多发性硬化症和狼疮的疾病。
在一些实施方案中，奥瑞珠单抗作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约50-2000mg(例如，约50-100,100-150,150-200,200-250,250-300,300-350,350-400,400-450,450-500,500-550,550-600,600-650,650-700,700-750,750-800,800-850,850-900,900-950,950-1000,1000-1100,1100-1200,1200-1300,1300-1400,1400-1500,1500-1600,1600-1700,1700-1800,1800-1900,或1900-2000mg)的奥瑞珠单抗。
在一些实施方案中，奥瑞珠单抗以至少7天，例如7,14,21,28,35天或更长时间的给药间隔施用。例如，奥瑞珠单抗以至少1周，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,24,26,28,20,22,24,26,28,30周或更长的给药间隔施用。
在一些实施方案中，奥瑞珠单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如至少2周，例如至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,22,24,26,28,30,40,50,60周或更长，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月或更长，或1,2,3,4,5年或更长。例如，奥瑞珠单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用，每个治疗周期总共至少4个剂量(例如，每个治疗周期至少4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,18,20或更多剂量)。
在一些方面，抗CD20抗体包含veltuzumab。veltuzumab是针对CD20的人源化单克隆抗体。参见例如临床试验标识号NCT00547066,NCT00546793,NCT01101581,和Goldenberget al.Leuk Lymphoma.51(5)(2010):747-55。例如，veltuzumab可用于治疗NHL(例如，DLBCL，滤泡淋巴瘤)，CLL和自身免疫性疾病例如免疫性血小板减少性紫癜(ITP)。
在一些实施方案中，veltuzumab皮下或静脉内施用，例如作为静脉内输注。在一些实施方案中，veltuzumab以50-800mg/m2的剂量，例如约50-60,60-70,70-80,80-90,90-100,100-110,110-120,120-130,130-140,140-150,150-160,160-170,170-180,180-190,190-200,200-225,225-250,250-275,275-300,300-325,325-350,350-375,375-400,400-425,425-450,450-475,475-500,500-525,525-550,550-575,575-600,600-625,625-650,650-675,675-700,700-725,725-750,750-775,或775-800mg/m2施用。在一些实施方案中，施用50-400mg，例如50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300,325,350,375,或400mg的剂量。
在一些实施方案中，veltuzumab以至少7天，例如7,14,21,28,35天或更长时间的给药间隔施用。例如，veltuzumab以至少1周，例如，1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,24,26,28,20,22,24,26,28,30周或更长的给药间隔施用。
在一些实施方案中，veltuzumab以本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如至少2周，例如至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,22,24,26,28,30,40,50,60周或更长时间，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月或更长，或1,2,3,4,5年或更长。例如，veltuzumab以本文所述的剂量和给药间隔施用，每个治疗周期总共至少4个剂量(例如，每个治疗周期至少4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,18,20或更多剂量)。
在一些方面，抗CD20抗体包含GA101。GA101(也称为obinutuzumab或RO5072759)是人源化和糖工程化的抗CD20单克隆抗体。例如，GA101可用于治疗诸如B细胞淋巴样恶性肿瘤，例如CLL，非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的疾病。参见，例如，Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009):588-96；临床试验识别号:NCT01995669,NCT01889797,NCT02229422,和NCT01414205；和www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些实施方案中，GA101静脉内施用，例如作为静脉内输注。例如，每次输注提供约100-3000mg(例如，约100-150,150-200,200-250,250-500,300-350,350-400,400-450,450-500,500-550,550-600,600-650,650-700,700-750,750-800,800-850,850-900,900-950,950-1000,1000-1200,1200-1400,1400-1600,1600-1800,1800-2000,2000-2200,2200-2400,2400-2600,2600-2800,或2800-3000mg)GA101。
在一些实施方案中，GA101以至少7天，例如7,14,21,28,35天或更长时间的给药间隔施用。例如，GA101是在至少1周，例如，1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,24,26,28,20,22,24,26,28,30周或更长的给药间隔给药。例如，GA101以至少1个月，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,或更多个月的给药间隔施用。在一些实施方案中，GA101以1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天的给药间隔施用。
在一些实施方案中，GA101以本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如至少1周，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,22,24,26,28,30,40,50,60周或更长，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月或更长，或1，2，3，4，5年或更长。例如，GA101以本文所述的剂量和给药间隔施用，每个治疗周期总共至少2个剂量(例如，每个治疗周期至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,18,20或更多的剂量)。
在一些方面，抗CD20抗体包含AME-133v。AME-133v(也称为LY2469298或ocaratuzumab)是针对CD20的人源化IgG1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，对FcγRIIIa受体的亲和力增加并且抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性增强。参见，例如，Robak etal.BioDrugs 25.1(2011):13-25.。在一些实施方案中，AME-133v可用于治疗诸如NHL的癌症，例如滤泡性淋巴瘤。参见例如Forero-Torres et al.Clin Cancer Res.18.5(2012):1395-403。
在一些方面，抗CD20抗体包含PRO131921。PRO131921是一种人源化抗CD20单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，具有更好的结合FcγRIIIa和增强的ADCC。参见，例如，Robak等人BioDrugs 25.1(2011):13-25；和Casulo等人Clin Immunol.154.1(2014):37-46。在一些实施方案中，PRO131921可用于治疗NHL。参见例如临床试验标识号NCT00452127。在一些实施方案中，PRO131921静脉内施用，例如作为静脉内输注。在一些实施方案中，PRO131921以15mg/m2至1000mg/m2的剂量施用，例如约15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-125、125-150、150-175、175-200、200-2-2、225-250、250-300、300-325、325-350、350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、475-500、500-525、525-550、550-575、575-600、600-625、625-650、650-675、675-700、700-725、725-750、750-775、775-800、800-825、825-850、850-875、875-900、900-925、925-950、950-975或975-1000mg/m2，其中m2表示受试者的体表面积。
在一些方面，抗CD20抗体包含PRO131921。PRO131921是一种人源化抗CD20单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，更好的结合FcγRIIIa和增强的ADCC。参见，例如，Robak etal.BioDrugs 25.1(2011):13-25；和Casulo et al.Clin Immunol.154.1(2014):37-46。在一些实施方案中，PRO131921可用于治疗NHL。参见例如临床试验标识号NCT00452127。在一些实施方案中，PRO131921静脉内施用，例如作为静脉内输注。在一些实施方案中，PRO131921以15mg/m2至1000mg/m2的剂量施用，例如约15-20,20-25,25-30,30-35,35-40,40-45,45-50,50-55,55-60,60-65,65-70,70-75,75-80,80-85,85-90,90-95,95-100,100-125,125-150,150-175,175-200,200-226,225-250,250-300,300-325,325-350,350-375,375-400,400-425,425-450,450-475,475-500,500-525,525-550,550-575,575-600,600-625,625-650,650-675,675-700,700-725,725-750,750-775,775-800,800-825,825-850,850-875,875-900,900-925,925-950,950-975,或975-1000mg/m2，其中m2表示受试者的体表面积。
在一些方面，抗CD20抗体包含TRU-015。TRU-015是衍生自抗CD20抗体的结构域的抗CD20融合蛋白。TRU-015小于单克隆抗体，但保留Fc介导的效应子功能。参见，例如，Robaket al.BioDrugs 25.1(2011):13-25。TRU-015含有与人IgG1铰链，CH2和CH3结构域连接但不含CH1和CL结构域的抗CD20单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，TRU-015可用于治疗B细胞淋巴瘤和类风湿性关节炎。在一些情况下，TRU-015静脉内施用，例如作为静脉内输注。在一些实施方案中，TRU-015以0.01-30mg/kg，例如0.01-0.015,0.015-0.05,0.05-0.15,0.15-0.5,0.5-1,1-1.5,1.5-2.5,2.5-5,5-10,10-15,15-20,20-25或25-30mg/kg体重的剂量施用。在一些实施方案中，TRU-015以至少1天，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天的给药间隔施用。参见例如Burge et al.Clin Ther.30.10(2008):1806-16。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD20抗体缀合或以其他方式结合到治疗剂，例如本文所述的化学治疗剂(例如，环磷酰胺制剂，氟达拉滨，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，去甲基化剂，肽疫苗，抗肿瘤抗生素，酪氨酸激酶抑制剂，烷化剂，抗微管或抗有丝分裂剂，CD20抗体或本文所述的CD20抗体药物缀合物)，抗过敏剂，抗恶心剂(或抗呕吐药)，止痛剂或细胞保护剂。
CD22抑制剂和结合结构域
如本文所用，术语“CD22”是指已知在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，同种型1-5人CD22的氨基酸序列可以分别见于登录号NP 001762.2，NP 001172028.1，NP001172029.1，NP 001172030.1和NP 001265346.1，编码人CD22的变体1-5的核苷酸序列可以分别在登录号NM 001771.3,NM 001185099.1,NM 001185100.1,NM 001185101.1,和NM001278417.1中找到。如本文所用，“CD22”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD22的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD22蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD22蛋白在癌细胞上表达。
在一些方面，本公开提供了本文所述的CD22抑制剂或结合结构域，例如CD22抑制剂或结合结构域。本公开还提供编码CD22结合结构域或包含CD22结合结构域的CAR的核酸。CD22抑制剂包括但不限于CD22 CAR表达细胞，例如CD22 CART细胞或抗-CD22抗体(例如抗CD22单或双特异性抗体)或其片段。组合物还可以包含第二活性剂，例如抗CD19 CAR表达细胞或CD19结合结构域。活性剂可以是例如由单个核酸或不同核酸编码的。
在一些方面，CD22抑制剂或结合结构域作为单一疗法施用。在一些方面，CD22抑制剂或结合结构域与第二活性剂如抗CD19 CAR表达细胞组合施用。在一个实施方案中，CD22抑制剂与CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含为鼠、人的或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
CD22 CAR表达细胞，例如CART
在一个实施方案中，CD22抑制剂是CD22 CAR表达细胞，例如包含CD22结合结构域并被工程化到细胞(例如，T细胞或NK细胞)的CD22-CAR，用于与CD19 CAR-表达细胞，例如CART组合施用，以及它们用于过继疗法的方法。
在另一方面，本发明提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19CAR和CD22 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19CAR的第一细胞和表达CD22 CAR的第二细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括例如表达CAR(例如，CD19 CAR或CD22 CAR)的第一细胞，其包含主要细胞内信号传导结构域，以及表达CAR(例如，CD19 CAR或CD22 CAR)的第二细胞，其包括次要信号传导结构。
在一个方面，CD22-CAR包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链(例如本文所述的铰链)，跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个方面，示例性CD22 CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)，细胞外抗原结合结构域，铰链，跨膜结构域，细胞内共刺激结构域(例如本文所述的细胞内共刺激结构域)和细胞内刺激结构域。
一方面，CAR22结合结构域包含SEQ ID NO:200-428中任一个提供的氨基酸序列(或由核苷酸序列编码)的scFv部分。在一个方面，所述CAR22结合结构域包含在SEQ IDNOs:203,209,215,221,227,232,238,244,250,256,262,268,274,280,286,292,298,304,310,316,322,328,334,340,346,352,358,364,370,376,382,388,394,400,406,412,418,或423任一个提供的scFv部分。
在具体方面，本发明的CAR构建体包含scFv结构域，所述结构域选自SEQ ID NOS:203,209,215,221,227,232,238,244,250,256,262,268,274,280,286,292,298,304,310,316,322,328,334,340,346,352,358,364,370,376,382,388,394,400,406,412,418,或423，其中scFv之前可以是任选的前导序列，例如SEQ ID NO:13中所提供的前导序列，然后是任选的铰链序列，例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49中提供的铰链序列，如SEQ ID NO:15中提供的跨膜区，包括SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的细胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的CD3ζ序列，例如，其中所述结构域相邻并且在相同可读框内以形成单个融合蛋白。在一些实施方案中，所述scFv结构域是选自SEQ ID NOS:203,209,215,221,227,232,238,244,250,256,262,268,274,280,286,292,298,304,310,316,322,328,334,340,346,352,358,364,370,376,382,388,394,400,406,412,418,或423的人scFv结构域。
本发明还包括编码选自SEQ ID NO:203,209,215,221,227,232,238,244,250,256,262,268,274,280,286,292,298,304,310,316,322,328,334,340,346,352,358,364,370,376,382,388,394,400,406,412,418,或423的每个scFv片段的多肽的核苷酸序列。本发明还包括编码选自SEQ ID NO:203,209,215,221,227,232,238,244,250,256,262,268,274,280,286,292,298,304,310,316,322,328,334,340,346,352,358,364,370,376,382,388,394,400,406,412,418,或423的每个scFv片段的多肽，和SEQ ID NO:13-17的每个结构域，加上本发明的编码的CD22 CAR的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文还提供全长CD22 CAR序列为SEQ ID NOS:207,213,219,225,230,236,242,248,254,260,266,272,278,284,290,296,302,308,314,320,326,332,338,344,350,356,362,368,374,380,386,392,398,404,410,416,422,或427，如表6A或6B所示。
一方面，本发明包括重组核酸构建体，其包含编码CAR的核酸分子，其中所述核酸分子包含编码例如本文所述的CD22结合结构域的核酸序列，例如，其与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并且在相同的可读框中。一方面，CD22结合结构域选自SEQ IDNOS:203,209,215,221,227,232,238,244,250,256,262,268,274,280,286,292,298,304,310,316,322,328,334,340,346,352,358,364,370,376,382,388,394,400,406,412,418,或423中的一个或多个。在一个方面，本发明包括包含编码CAR的核酸分子的重组核酸构建体，其中所述核酸分子包含编码CD22结合结构域的核酸序列，例如，其中所述序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并且在相同的可读框内。可以在CAR中使用的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ，CD28,4-1BB等的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ，CD28，4-1BB等的任何组合。
一方面，本发明的CAR构建体的核酸序列包含SEQ ID NOS:200,208,214,220,226,231,237,243,249,255,261,267,273,279,285,291,297,303,309,315,321,327,333,339,345,351,357,363,369,375,381,387,393,399,405,411,417,422,或428的一个或多个的CAR构建体。在一个方面，本发明的CAR构建体的核酸序列包含SEQ ID NOs:204,210,216,222,116,233,239,245,251,257,263,269,275,281,287,293,299,305,311,317,323,329,335,341,347,353,359,365,371,377,383,389,395,401,407,413,117,或424中的一个或多个的scFv编码序列。
在某些情况下，有利的是抗原结合结构域来源于CAR将最终用于其中的相同物种。例如，对于在人类中使用，对于CAR的抗原结合结构域可能是有益的包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基。因此，一方面，抗原结合结构域包含人抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人CD22结合结构域包含本文描述的人CD22结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文描述的人CD22结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个，例如全部三个LC CDR和一个或多个，例如全部三个HC CDR的人CD22结合结构域。在一个实施方案中，人CD22结合结构域包含本文描述的人CD22结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如人CD22结合结构域具有两个可变重链区，每个可变重链区包含本文所述的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，人CD22结合结构域包含本文所述的人轻链可变区(例如，在表6A，6B，10A或10B中)和/或本文所述的人重链可变区(例如，在表6A，6B，9A或9B中)。在一个实施方案中，人CD22结合结构域包含本文所述的人重链可变区(例如，在表6A，6B，9A或9B中)，例如本文所述的至少两个人重链可变区(例如，在表6A，8B，9A或9B中)。在一个实施方案中，CD22结合结构域是包含表6A，6B，9A，9B，10A或10B的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，CD22结合结构域(例如，scFv)包含:轻链可变区，其包含具有表6A，6B，10A或10B中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与表6A，6B，10A或10B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表6A，6B，9A或9B中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰(例如取代)但不超过30,20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表6A，6B，9A或9B的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人CD22结合结构域包含选自SEQ IDNO:203,209,215,221,227,232,238,244,250,256,262,268,274,280,286,292,298,304,310,316,322,328,334,340,346,352,358,364,370,376,382,388,394,400,406,412,418,或423的序列，或者其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人CD22结合结构域是scFv，并且包含本文，例如表6A，6B，10A或10B所述的氨基酸序列的轻链可变区通过接头，例如本文所述的接头连接到包含本文所述的，例如表6A，6B，9A或9B中氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，人CD22结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n为1,2,3,4,5或6，例如3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下取向中的任一个:轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个方面，CD22结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，一方面，本发明的CAR组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性结合人CD22或其片段。一方面，本发明涉及包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中所述抗体结合结构域特异性结合CD22蛋白或其片段，其中所述抗体或抗体片段包含可变重链，其包括SEQID NO:s 700,701,702,703,704,705,706,707,708,709,710,711,712,713,714,715,716,717,718,719,720,721,722,723,724,725,726,727,728,729,730,731,732,733,734,735,736,737,或738任一个的氨基酸序列，和/或可变轻链，其包括SEQ ID NOs 739,740,741,742,743,744,745,746,747,748,749,750,751,752,753,754,755,756,757,758,759,760,761,762,763,764,765,766,767,768,769,770,771,772,773,774,775,776,或777任一个的氨基酸序列。在某些方面，scFv与前导序列相邻并且在相同的可读框内。一方面，前导序列是如SEQ ID NO:13所提供的多肽序列。
在实施方案中，CAR包含抗体或抗体片段，其包含CD22结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在实施方案中，CD22结合结构域包含表8A，8B，10A或10B中列出的任何CD22轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个和表7A，7B，7C，9A或9B中列出的任何CD22重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个。
在一个方面，CD22结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个方面，CD22结合结构域是Fv，Fab，(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合CD22蛋白或其片段。
在某些情况下，人类scFv可以来源于展示文库。
在一个实施方案中，CD22结合结构域例如scFv包含至少一个突变，使得突变的scFv赋予CART22构建体改善的稳定性。在另一个实施方案中，CD22结合结构域例如scFv包含例如从人源化过程引起的至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个突变，使得突变的scFv赋予CART22构建体改善的稳定性。
在一个方面，本发明考虑了产生功能等同分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰。例如，包含在CAR中的CD22结合结构域(例如scFv)的VH或VL可被修饰以保留CD22结合结构域，例如scFv的起始VH或VL构架区的至少约70％,71％.72％.73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。本发明考虑到整个CAR构建体的修饰，例如CAR构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列的修饰，以便产生功能上等同的分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％,71％.72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。
在一个实施方案中，CD22结合结构域包含CAR22-1,CAR22-2,CAR22-3,CAR22-4,CAR22-5,CAR22-6,CAR22-7,CAR22-8,CAR22-9,CAR22-10,CAR22-11,CAR22-12,CAR22-13,CAR22-14,CAR22-15,orCAR22-16,CAR22-17,CAR22-18,CAR22-19,CAR22-20,CAR22-21,CAR22-22,CAR22-23,CAR22-24,CAR22-25,CAR22-26,CAR22-27,CAR22-28,CAR22-29,CAR22-30,CAR22-31,CAR22-32,CAR22-33,CAR22-34,CAR22-35,CAR22-36,CAR22-37,或CAR22-38(例如，如表7A，7B，7C，8A和/或8B中所述)中任一个的6个CDR(例如HC CDR1，HCCDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3中的每一个)或与其基本相同的序列。在一个实施方案中，CD22结合结构域包含CAR22-1,CAR22-2,CAR22-3,CAR22-4,CAR22-5,CAR22-6,CAR22-7,CAR22-8,CAR22-9,CAR22-10,CAR22-11,CAR22-12,CAR22-13,CAR22-14,CAR22-15,or CAR22-16,CAR22-17,CAR22-18,CAR22-19,CAR22-20,CAR22-21,CAR22-22,CAR22-23,CAR22-24,CAR22-25,CAR22-26,CAR22-27,CAR22-28,CAR22-29,CAR22-30,CAR22-31,CAR22-32,CAR22-33,CAR22-34,CAR22-35,CAR22-36,CAR22-37,或CAR22-38(例如，如表7A，7B，7C，8A和/或8B所述)中任一个的三个CDR(例如HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3各一个，或LCCDR1，LC CDR2和LC CDR3各一个)或与其基本相同的序列。
其它实施方案包括编码本节所述多肽的核苷酸序列。例如，另外的实施方案包括编码表6A-10B中任一个的多肽的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以包含表6A或6B的CAR构建体或scFv。核苷酸可以编码表9A或9B的VH，表10A或10B的VL或两者。核苷酸可以编码表7A，7B或7C的VH CDR1，VH CDR2或VH CDR3中的一个或多个(例如，两个或三个)和/或该核苷酸可以编码表8A或8B的VL CDR1，VL CDR2或VL CDR3的一个或多个(例如，两个或多个)。核苷酸序列还可以包括SEQ ID NOS:13,14,15,16,17,和51中的一个或多个，例如所有的结构域。
CD22 CAR还可以包含一个或多个跨膜结构域，例如本文所述的跨膜结构域，细胞内信号传导结构域，例如本文所述的细胞内信号传导结构域，共刺激结构域，例如本文所述的共刺激结构域，前导序列，例如如本文所述的前导序列，或铰链，例如，如本文所述的铰链。
在一个实施方案中，CD22抑制剂是本文所述的CD22抑制剂。CD22抑制剂可以是例如抗CD22抗体(例如，抗-CD22单或双特异性抗体)，小分子或CD22 CART。在一些实施方案中，抗CD22抗体与治疗剂缀合或以其他方式结合。示例性治疗剂包括例如微管破坏剂(例如单甲基auristatin E)和毒素(例如白喉毒素或假单胞菌外毒素-A，蓖麻毒蛋白)。在一个实施方案中，CD22抑制剂与CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含鼠、人或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
在一个实施方案中，抗CD22抗体选自抗CD19/CD22双特异性配体定向毒素(例如，识别与白喉毒素(DT)的前389个氨基酸DT 390连接的人CD19和CD22的两个scFv配体，例如DT2219ARL)；抗CD22单克隆抗体-MMAE缀合物(例如DCDT2980S)；融合到假单胞菌外毒素-A的片段的抗CD22抗体RFB4的scFv(例如BL22)；去糖基化的蓖麻毒蛋白A链缀合的抗CD19/抗CD22(例如Combotox)；人源化抗CD22单克隆抗体(例如，依帕珠单抗)；或共价融合到假单胞菌外毒素-A的38KDa片段的抗-CD22抗体的Fv部分(例如，moxetumomab pasudotox)。
在一个实施方案中，抗CD22抗体是抗CD19/CD22双特异性配体定向毒素(例如DT2219ARL)，抗CD19/CD22双特异性配体定向毒素以约1μg/kg,2μg/kg,3μg/kg,4μg/kg,5μg/kg,6μg/kg,7μg/kg,8μg/kg,9μg/kg,10μg/kg,11μg/kg,12μg/kg,13μg/kg,14μg/kg,15μg/kg,20μg/kg,25μg/kg,30μg/kg,40μg/kg,60μg/kg,80μg/kg,100μg/kg,120μg/kg,140μg/kg,160μg/kg,180μg/kg,200μg/kg,220μg/kg,250μg/kg,300μg/kg,350μg/kg,400μg/kg,450μg/kg,500μg/kg,600μg/kg,700μg/kg,800μg/kg,900μg/kg,1mg.kg(例如30μg/kg，60μg/kg或80μg/kg)的剂量施用一段时间，例如每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多天。在一些实施方案中，通过静脉内输注来施用抗CD19/CD22双特异性配体定向毒素。
在一个实施方案中，抗CD22抗体是BL22，BL22以约1μg/kg,2μg/kg,3μg/kg,4μg/kg,5μg/kg,6μg/kg,7μg/kg,8μg/kg,9μg/kg,10μg/kg,11μg/kg,12μg/kg,13μg/kg,14μg/kg,15μg/kg,20μg/kg,25μg/kg,30μg/kg,40μg/kg,60μg/kg,80μg/kg,100μg/kg,120μg/kg,140μg/kg,160μg/kg,180μg/kg,200μg/kg,220μg/kg,250μg/kg,300μg/kg,350μg/kg,400μg/kg,450μg/kg,500μg/kg,600μg/kg,700μg/kg,800μg/kg,900μg/kg,1mg.kg(例如3μg/kg，30μg/kg，40μg/kg或50μg/kg)的剂量施用一段时间，例如每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多天。在一些实施方案中，BL22每天，每隔一天，每三天，或每四天施用一段时间，例如4天周期，6天周期，8天周期，10天周期，12天周期或14天周期。在一个实施方案中，施用BL22的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多个周期。在一些实施方案中，通过静脉内输注施用BL22。
在一个实施方案中，抗CD22抗体是去糖基化的蓖麻毒蛋白A链缀合的抗CD19/抗CD22(例如，Combotox)，并且去糖基化的蓖麻毒蛋白A链缀合的抗CD19/抗-CD22以约500μg/m2,600μg/m2,700μg/m2,800μg/m2,900μg/m2,1mg/m2,2mg/m2,3mg/m2,4mg/m2,5mg/m2,6mg/m2,或7mg/m2的剂量施用一段时间，例如每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或12或更多天。在一些实施方案中，去糖基化的蓖麻毒蛋白A链缀合的抗CD19/抗CD22每天，每隔一天，每三天，或每四天施用一段时间，例如4天周期，6天周期，8天周期，10天周期，12天周期或14天周期(例如，每隔一天持续6天)。在一个实施方案中，施用去糖基化的蓖麻毒蛋白A链缀合的抗CD19/抗-CD22的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多个周期。在一些实施方案中，通过静脉内输注施用去糖基化的蓖麻毒蛋白A链缀合的抗CD19/抗-CD22。
在一个实施方案中，抗CD22抗体是人源化抗-CD22单克隆抗体(例如，依帕珠单抗)，并且以约10mg/m2/周,20mg/m2/周,50mg/m2/周,100mg/m2/周,120mg/m2/周,140mg/m2/周,160mg/m2/周,180mg/m2/周,200mg/m2/周,220mg/m2/周,250mg/m2/周,260mg/m2/周,270mg/m2/周,280mg/m2/周,290mg/m2/周,300mg/m2/周,305mg/m2/周,310mg/m2/周,320mg/m2/周,325mg/m2/周,330mg/m2/周,335mg/m2/周,340mg/m2/周,345mg/m2/周,350mg/m2/周,355mg/m2/周,360mg/m2/周,365mg/m2/周,370mg/m2/周,375mg/m2/周,380mg/m2/周,385mg/m2/周,390mg/m2/周,400mg/m2/周,410mg/m2/周,420mg/m2/周,430mg/m2/周,440mg/m2/周,450mg/m2/周,460mg/m2/周,470mg/m2/周,480mg/m2/周,490mg/m2/周,500mg/m2/周,600mg/m2/周,700mg/m2/周,800mg/m2/周,900mg/m2/周,1g/m2/周,或2g/m2/周(例如,360mg/m2/周或480mg/m2/周)的剂量施用人源化抗-CD22单克隆抗体持续一段时间，例如每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多周。在一些实施方案中，第一剂量低于随后的剂量(例如，360mg/m2/周的第一剂量，随后的剂量为370mg/m2/周)。在一些实施方案中，通过静脉内输注来施用人源化抗-CD22单克隆抗体。
在一个实施方案中，抗-CD22抗体是moxetumomab pasudotox，并且moxetumomabpasudotox以约1μg/kg,2μg/kg,3μg/kg,4μg/kg,5μg/kg,6μg/kg,7μg/kg,8μg/kg,9μg/kg,10μg/kg,11μg/kg,12μg/kg,13μg/kg,14μg/kg,15μg/kg,20μg/kg,25μg/kg,30μg/kg,40μg/kg,60μg/kg,80μg/kg,100μg/kg,120μg/kg,140μg/kg,160μg/kg,180μg/kg,200μg/kg,220μg/kg,250μg/kg,300μg/kg,350μg/kg,400μg/kg,450μg/kg,500μg/kg(例如，5μg/kg,10μg/kg,20μg/kg,30μg/kg,40μg/kg,或50μg/kg)的剂量施用一段时间，例如每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多天。在一些实施方案中，每天一次，每隔一天，每三天，或每四天施用moxetumomab pasudotox一段时间，例如4天周期，6天周期，8天周期，10天周期，12天周期或14天周期(例如，每隔一天持续6天)。在一个实施方案中，施用了1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多个周期的moxetumomab pasudotox。在一些实施方案中，通过静脉内输注来施用moxetumomab pasudotox。
在一个实施方案中，CD22抗体分子包含CAR22-1,CAR22-2,CAR22-3,CAR22-4,CAR22-5,CAR22-6,CAR22-7,CAR22-8,CAR22-9,CAR22-10,CAR22-11,CAR22-12,CAR22-13,CAR22-14,CAR22-15,or CAR22-16,CAR22-17,CAR22-18,CAR22-19,CAR22-20,CAR22-21,CAR22-22,CAR22-23,CAR22-24,CAR22-25,CAR22-26,CAR22-27,CAR22-28,CAR22-29,CAR22-30,CAR22-31,CAR22-32,CAR22-33,CAR22-34,CAR22-35,CAR22-36,CAR22-37,或CAR22-38(例如，如表7A，7B，7C，8A和/或8B中所述)中任一个的6个CDR(例如HC CDR1，HCCDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3的各一个)或与其基本相同的序列。在一个实施方案中，CD22抗体分子包含CAR22-1,CAR22-2,CAR22-3,CAR22-4,CAR22-5,CAR22-6,CAR22-7,CAR22-8,CAR22-9,CAR22-10,CAR22-11,CAR22-12,CAR22-13,CAR22-14,CAR22-15,orCAR22-16,CAR22-17,CAR22-18,CAR22-19,CAR22-20,CAR22-21,CAR22-22,CAR22-23,CAR22-24,CAR22-25,CAR22-26,CAR22-27,CAR22-28,CAR22-29,CAR22-30,CAR22-31,CAR22-32,CAR22-33,CAR22-34,CAR22-35,CAR22-36,CAR22-37,或CAR22-38(例如，如表7A，7B，7C，8A和/或8B中所述)中任一个的三个CDR(例如，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3各一个，或LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3各一个)，或与其基本相同的序列。在一个实施方案中，CD22抗体分子包含如表6A或6B所述的重链可变区，轻链可变区或重链可变区和轻链可变区两者或scFv，或与其基本相同的序列。在实施方案中，CD22抗体分子是分离的抗体分子。
ROR1抑制剂
如本文所用，术语“ROR1”是指已知在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人ROR1的异构体1和2前体的氨基酸序列分别可以在登录号NP_005003.2和NP_001077061.1中找到，编码它们的mRNA序列可以在登录号NM_005012.3和NM_001083592.1中找到。如本文所用，“ROR1”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型ROR1的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合ROR1蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，ROR1蛋白在癌细胞上表达。
本文还提供了ROR1抑制剂和组合疗法。ROR1抑制剂包括但不限于抗ROR1 CAR表达细胞，例如，CART和抗ROR抗体(例如，抗ROR1单或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗ROR1抑制剂可用于治疗B细胞恶性肿瘤(例如，白血病，例如CLL和B细胞淋巴瘤，例如套细胞淋巴瘤；ALL；小淋巴细胞淋巴瘤；边缘细胞B细胞淋巴瘤；和伯基特淋巴瘤)或上皮癌(例如，乳腺癌，肾细胞癌，肺癌，结肠直肠癌，卵巢癌和黑素瘤)。在一个实施方案中，CD20抑制剂与CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含为鼠，人或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
Hudecek,et al.Clin.Cancer Res.19.12(2013):3153-64(通过引用并入本文)中描述了一种示例性的抗ROR1抑制剂。例如，抗ROR1抑制剂包括Hudecek等描述的抗ROR1CART(例如，如Hudecek等人在第3155页，第一个完整段落(通过引用并入本文)所述生成的)。在其它实例中，抗ROR1抑制剂包括抗体或其片段，其包含Hudecek等在跨3154-55页的段落；Baskar et al.MAbs 4(2012):349–61；和Yang et al.PLoS ONE6(2011):e21018(通过引用并入本文)描述的2A2和R12抗ROR1单克隆抗体的VH和/或VL序列。
在其它实施方案中，ROR1抑制剂包括靶向ROR1的抗体或其片段(例如，单链可变片段(scFv))，其包括在US 2013/0101607中描述的那些，例如US 2013/0101607(通过引用并入本文)的SEQ ID NOs:1或2。在一些实施方案中，抗ROR1抗体片段(例如，scFv)与生物活性分子缀合或融合，例如，以形成嵌合抗原受体(CAR)，其指导免疫细胞例如T细胞应答ROR1表达细胞。
在一些实施方案中，示例性ROR1抑制剂包括称为UC-961(Cirmtuzumab)的抗ROR1单克隆抗体。参见例如临床试验标识号NCT02222688。Cirmtuzumab可用于治疗癌症，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)，卵巢癌和黑色素瘤。参见，例如，Hojjat-Farsangi et al.PLoSOne.8(4):e61167；和NCT02222688。
在一些实施方案中，静脉内施用cirmtuzumab，例如作为静脉内输注。例如，每次输注提供约700-7000μg(例如700-750,750-800,800-850,850-900,900-950,950-1000,1000-1500,1500-2000,2000-2500,2500-3000,3000-3500,3500-4000,4000-4500,4500-5000,5000-5500,5500-6000,6000-6500,或6500-7000μg)的cirmtuzumab。在其他实施方案中，cirmtuzumab以10-100μg/kg体重，例如10-15,15-20,20-25,25-30,30-35,35-40,40-45,45-50,50-55,55-60,60-65,65-70,70-75,75-80,80-85,85-90,90-95或95-100μg/kg体重的剂量施用。在一个实施方案中，cirmtuzumab以15μg/kg体重的起始剂量施用。
在一些实施方案中，cirmtuzumab以至少7天，例如7,14,21,28,35天或更长时间的给药间隔施用。例如，cirmtuzumab以至少1周，例如，1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,24,26,28,20,22,24,26,28,30周或更多的给药间隔施用。
在一些实施方案中，cirmtuzumab以本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如至少1周，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,22,24,26,28,30,40,50,60周或更大，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月或更长，或1,2,3,4,5年或更长。例如，在本文所述的剂量和给药间隔施用cirmtuzumab，每个治疗周期总共至少2个剂量(例如，每个治疗周期至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,18,20或更多个剂量)。
在一些实施方案中，抗ROR1抗体与治疗剂缀合或以其他方式结合。
在一些实施方案中，ROR1抑制剂包括抗ROR1 CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗ROR1 CAR构建体的细胞或由包含scFv，CDR或VH和VL链的ROR1结合CAR编码。例如，抗ROR1CAR表达细胞，例如CART是通过将ROR1-CAR(其包含ROR1结合结构域)工程化到细胞(例如T细胞或NK细胞)产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在另一方面，本文提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和ROR1 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达ROR1 CAR的第二细胞。
CD123抑制剂
CD123也称为白细胞介素-3受体(IL-3RA)的α链。IL-3受体(IL-3R)是由α和β链组成的异源二聚体。IL-3R是膜受体。IL-3Rα链是360个氨基酸残基的糖蛋白。在一些白血病病症中常常观察到CD123的异常。CD123在多种血液恶性肿瘤例如急性骨髓和B淋巴样白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)和毛细胞白血病中过表达。
如本文所用，术语“CD123”是指已知在某些恶性血液癌细胞例如白血病细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD123的氨基酸序列可以在登录号NP_002174.1(同种型1前体)；NP_001254642.1(同种型2前体)找到，编码它们的mRNA序列可以在登录号NM_002183.3(变体1)；NM_001267713.1(变体2)找到。如本文所用，“CD123”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD123的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD123蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD123蛋白在癌细胞上表达。
本文提供CD123抑制剂和组合疗法。CD123抑制剂包括但不限于小分子，重组蛋白，抗CD123 CAR表达细胞，例如，CART和抗CD123抗体(例如抗CD123单或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD123抑制剂可用于治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD123抑制剂与CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含鼠、人或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
在一个实施方案中，CD123抑制剂是重组蛋白，例如包含CD123受体的天然配体(或片段)。例如，重组蛋白是SL-401(也称为DT388IL3；德克萨斯大学西南医学中心)，其是包含与截短的白喉毒素融合的人IL-3的融合蛋白质。参见例如Testa et al.BiomarkRes.2014；2:4；和临床试验标识号NCT00397579。
在另一个实施方案中，CD123抑制剂是抗CD123抗体或其片段。在一个实施方案中，抗CD123抗体或其片段包含单克隆抗体，例如单特异性或双特异性抗体或其片段。例如，抗CD123抗体或其片段包含CSL360(CSL Limited)。CSL360是结合CD123的重组嵌合单克隆抗体。在一些实施方案中，例如通过静脉内输注，静脉内施用CSL360。例如，CSL360以0.1-10mg/kg，例如0.1-0.5mg/kg,0.5-1mg/kg,1-5mg/kg,或5-10mg/kg的剂量施用。参见例如临床试验标识号NCT01632852；和Testa等人。
在另一个实施方案中，CD123抗体或其片段包含CSL362(CSL Limited)。CSL362是靶向CD123的人源化单克隆抗体，并针对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的增强的激活进行了优化。在一些实施方案中，例如通过静脉内输注静脉内施用CSL362。在一些实例中，CSL362以0.1-12mg/kg，例如0.1-0.2mg/kg,0.2-0.5mg/kg,0.5-1mg/kg,1-6mg/kg,或6-12mg/kg的剂量施用。参见例如临床试验标识号NCT01632852。
在一个实施方案中，CD123抗体或其片段包含双特异性抗体，例如MGD006(MacroGenics)。MGD006是靶向CD123和CD3的双特异性抗体。参见例如临床试验标识号NCT02152956。
在一些实施方案中，CD123抑制剂与治疗剂缀合或以其他方式结合。
在一些实施方案中，CD123抑制剂包括抗CD123 CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗CD123 CAR构建体的细胞或由包含scFv，CDR或VH和VL链的CD123结合CAR编码。例如，抗CD123 CAR表达细胞，例如CART是通过将CD123-CAR(其包含CD123结合结构域)工程化到细胞(例如，T细胞或NK细胞)产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。在一个实施方案中，抗CD123 CAR构建体包含scFv序列，例如US2014/0322212A1(其通过引用并入本文)中提供的scFv序列。在一个实施方案中，抗CD123结合结构域是US 2014/0322212A1中描述的scFv。在一个实施方案中，抗CD123结合结构域是在US 2014/0322212A1中提供的CAR构建体的一部分。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在另一方面，本文提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和CD123 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19CAR的第一细胞和表达CD123 CAR的第二细胞。
CD10抑制剂
分化抗原簇10(CD10)也称为中性溶酶，膜金属内肽酶(MME)，中性内肽酶(NEP)和常见的急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)。CD10是由膜金属内肽酶(MME)基因编码的酶。CD10在前B型表型的白血病细胞上表达，是常见的急性淋巴细胞白血病抗原。
如本文所用，术语“CD10”是指已知在白血病细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD10的氨基酸序列可以在登录号NP_009218.2；NP_000893.2；NP_009219.2；NP_009220.2中找到；编码它们的mRNA序列可以在登录号NM_007287.2(变体1bis)；NM_000902.3(变体1)；NM_007288.2(变体2a)；NM_007289.2(变体2b)中找到。如本文所用，“CD10”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD10的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD10蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD10蛋白在癌细胞上表达。
本文还提供CD10抑制剂和组合疗法。CD10抑制剂包括但不限于小分子，重组蛋白，抗CD10 CAR表达细胞，例如，CART和抗CD10抗体(例如抗CD10单或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD10抑制剂可用于治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD10抑制剂与CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含鼠，人或人源化的抗体结合域的CAR的细胞组合施用。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包括sacubitril(AHU-377；Novartis)(4-{[(2S，4R)-1-(4-联苯基)-5-乙氧基-4-甲基-5-氧代-2-戊基]氨基}-4-氧代丁酸)或其药学上可接受的盐或衍生物。sacubitril的结构如下所示。
在另一个实施方案中，CD10抑制剂包含缬沙坦/sacubritril(LCZ696；Novartis)或其药学上可接受的盐或衍生物。缬沙坦/sacubritril是一种组合药物，其包含缬沙坦和sacubitril的1:1混合物。缬沙坦((S)-3-甲基-2-(N-{[2'-(2H-1,2,3,4-四唑-5-基)联苯基-4-基]甲基}戊酰胺基)丁酸)如下所示。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包含奥马曲拉(Bristol-Myers Squibb)((4S,7S,10aS)-5-氧代-4-{[(2S)-3-苯基-2-硫烷基丙酰基]氨基}-2,3,4,7,8,9,10,10a-八氢吡啶并[6,1-b][1,3]硫杂氮杂-7-羧酸)或其药学上可接受的盐或衍生物。奥马曲拉的结构如下所示。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包括RB-101(N-(3-{[(2S)-2-氨基-4-(甲硫基)丁基]二硫代}-2-苄基丙酰基)-L-苯丙氨酸苄酯)或其药学上可接受的盐或衍生物。RB-101的结构如下所示。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包含UK-414,495(Pfizer)((R)-2-({1-[(5-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基]环戊基}甲基)戊酸)或其药学上可接受的盐或衍生物。UK-414,495的结构如下所示。
在一些实施方案中，CD10抑制剂与治疗剂缀合或以其他方式结合。
在一些实施方案中，CD10抑制剂包括抗CD10 CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗CD10 CAR构建体的细胞或由包含scFv，CDR或VH和VL链的CD10结合CAR编码。例如，抗CD10CAR表达细胞，例如CART是通过将CD10-CAR(其包含CD10结合结构域)工程化到细胞(例如T细胞或NK细胞)产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在另一方面，本文提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和CD10 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD10 CAR的第二细胞。
CD34抑制剂
分化抗原簇34(CD34)也称为造血祖细胞抗原CD34，是细胞表面糖蛋白，起着细胞－细胞粘附因子的功能。CD34有时在某些癌症/肿瘤上表达，例如软组织腺泡状肉瘤，preB-ALL，AML，AML-M7，隆凸性皮肤纤维肉瘤，胃肠道间质瘤，巨细胞成纤维细胞瘤，粒细胞肉瘤，卡波西肉瘤，脂肪肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，恶性外周神经鞘瘤，孟加拉尔血管外皮细胞瘤(mengingeal hemangiopericytomas)，脑膜瘤，神经纤维瘤，神经鞘瘤和乳头状甲状腺癌。
如本文所用，术语“CD34”是指已知在造血干细胞和一些癌细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD34的氨基酸序列可以在登录号NP_001020280.1(同工型a前体)；NP_001764.1(同工型b前体)找到，编码它们的mRNA序列可以在登录号NM_001025109.1(变体1)；NM_001773.2(变体2)中找到。如本文所用，“CD34”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD34的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD34蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD34蛋白在癌细胞上表达。
本文还提供CD34抑制剂和组合疗法。CD34抑制剂包括但不限于小分子，重组蛋白，抗CD34 CAR表达细胞，例如，CART和抗CD34抗体(例如抗CD34单或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD34抑制剂可用于治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD34抑制剂与CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如，表达包含为鼠、人或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
在一个实施方案中，CD34抑制剂包含抗体或其片段，例如My-10单克隆抗体或包含My-10单克隆抗体的免疫脂质体，如Mercadal et al.Biochim.Biophys.Acta.1371.1(1998):17-23中所述。在其它实施方案中，CD34抑制剂包含含有靶向CD34表达细胞的癌症药物(例如多柔比星)的免疫脂质体，如Carrion et al.Life Sci.75.3(2004):313-28所述。在一个实施方案中，CD34抑制剂包含针对CD34的单克隆抗体，如Maleki etal.Hum.Antibodies.22(2013):1-8所述。在另一个实施方案中，CD34抑制剂包含靶向CD34的单克隆抗体，如Maleki et al.Cell J.16.3(2014):361-66所述。
在一些实施方案中，CD34抑制剂与治疗剂缀合或以其他方式结合。
在一些实施方案中，CD34抑制剂包括抗CD34 CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗CD34 CAR构建体的细胞或由包含scFv，CDR或VH和VL链的CD34结合CAR编码。例如，抗CD34CAR表达细胞，例如CART是通过将CD34-CAR(其包含CD34结合结构域)工程化到细胞(例如，T细胞或NK细胞)产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在另一方面，本文提供了CAR表达细胞，例如CART细胞群体，其包含表达CD19 CAR和CD34 CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD34 CAR的第二细胞。
FLT-3抑制剂
Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3)也称为分化抗原簇135(CD135)，受体型酪氨酸蛋白激酶FLT3或胎儿肝激酶-2(Flk2)，是一种受体酪氨酸激酶。FLT-3是配体，细胞因子Flt3配体(FLT3L)的细胞因子受体。FLT-3在许多造血祖细胞的表面上表达，对于淋巴细胞发育是重要的。FLT3基因通常在白血病，例如急性骨髓性白血病(AML)中突变。
如本文所用，术语“FLT-3”是指已知在造血祖细胞和一些癌细胞例如白血病细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人FLT-3的氨基酸序列可以在登录号NP_004110.2中找到，编码它们的mRNA序列可以在登录号NM_004119.2中找到。如本文所用，“FLT-3”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型FLT-3的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合FLT-3蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，FLT-3蛋白在癌细胞上表达。
本文还提供FLT-3抑制剂和组合疗法。FLT-3抑制剂包括但不限于小分子，重组蛋白，抗FLT-3 CAR表达细胞，例如，CART和抗FLT-3抗体(例如抗FLT-3单或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗FLT-3抑制剂可用于治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，FLT-3抑制剂与CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含为鼠，人或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含quizartinib(AC220；Ambit Biosciences)或其药学上可接受的盐或衍生物。quizartinib是一种小分子受体酪氨酸激酶抑制剂。quizartinib(1-(5-(叔丁基)异唑-3-基)-3-(4-(7-(2-吗啉代乙氧基)苯并[d]咪唑并[2,1-b]噻唑-2-基)苯基)脲)的结构如下所示。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含米哚妥林(PKC412；TechnischeDresden)或其药学上可接受的盐或衍生物。米哚妥林是一种蛋白激酶抑制剂，它是星形孢菌素的半合成衍生物，星孢菌素是来自细菌棍孢链霉菌(streptomycesstaurosporeus)的生物碱。
米哚妥林((9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-11-(甲基氨基)-9,13-环氧-1H,9H-二吲哚并[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]吡咯并[3,4-j][1,7]benzodiamzonine-1-酮)的结构如下所示。
在一些实施方案中，经口施用米哚妥林，例如以约25-200mg，例如约25-50mg，50-100mg，100-150mg或150-200mg的剂量经口施用。例如，米哚妥林例如以约25-200mg的剂量每天两次，例如约25-50mg，50-100mg，100-150mg，或150-200mg每天两次经口施用。参见例如临床试验标识号NCT01830361。
在一个实施方案中，FLT-3抑制剂包括索拉非尼(Bayer和Onyx Pharmaceuticals)或其药学上可接受的盐或衍生物。索拉非尼是多种酪氨酸蛋白激酶(例如VEGFR和PDGFR)，Raf激酶(例如C-Raf和B-Raf)和一些细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶(例如C-Raf，野生型B-Raf和突变体B-Raf)的小分子抑制剂。参见，例如labeling.bayerhealthcare.com/html/products/pi/Nexavar_PI.pdf。索拉非尼(4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨甲酰氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺的结构如下所示。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含舒尼替尼(以前称为SU11248；辉瑞)或其药学上可接受的盐或衍生物。舒尼替尼是一种小分子口服药物，其可以抑制多种受体酪氨酸激酶，包括FLT3。舒尼替尼已被食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗肾细胞癌(RCC)和伊马替尼耐药性胃肠道间质瘤(GIST)。舒尼替尼(N-(2-二乙基氨基乙基)-5-[(Z)-(5-(5-氟-2-氧代-1H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺)的结构如下所示。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含lestaurtinib(CEP-701；Cephalon)或其药学上可接受的盐或衍生物。Lestaurtinib是与星形孢菌素结构相关的酪氨酸激酶抑制剂。lestaurtinib((9S,10S,12R)-2,3,9,10,11,12-六氢-10-羟基-10-(羟甲基)-9-甲基-9,12-环氧-1H-二吲哚[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]benzodiazocin-1-酮)的结构如下所示。
在一些实施方案中，经口，例如，以约40-100mg的剂量每天两次，例如约40-60mg，50-70mg，60-80mg，70-90mg或80-100mg每天两次施用lestaurtinib。参见例如临床试验标识号NCT00079482；或NCT00030186。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂与治疗剂缀合或以其他方式结合。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包括抗FLT-3 CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗FLT-3CAR构建体的细胞或由包含scFv，CDR或VH和VL链的FLT-3结合CAR编码。例如，抗FLT-3CAR表达细胞，例如CART是通过将FLT-3-CAR(包括FLT-3结合结构域)工程化到细胞(例如，T细胞或NK细胞)产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在另一方面，本文提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞，其包含表达CD19 CAR和FLT-3CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达FLT-3CAR的第二细胞。
在一个实施方案中，抗原结合结构域CAR(例如CD19，ROR1，CD20，CD22，CD123，CD10，CD34或FLT-3抗原结合结构域)包含scFv部分，例如人scFv部分。scFv之前可以是任选的前导序列，例如SEQ ID NO:13中提供，然后是任选的铰链序列，如SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:45或SEQ ID NO:47或SEQ SEQ ID NO:49提供，如SEQ ID NO:15提供的跨膜区，包括SEQID NO:16或SEQ ID NO:51的细胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:NO:43的CD3ζ序列，例如，其中结构域相邻并且在相同可读框中以形成单个融合蛋白。
在一些实施方案中，本公开涵盖包含编码CAR(例如CD19 CAR，ROR1 CAR，CD20CAR，CD22 CAR，CD123 CAR，CD10 CAR，CD34CAR或FLT-3CAR)的核酸分子的重组核酸构建体，其中所述核酸分子包含编码例如本文所述抗原结合结构域的核酸序列，例如，其与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并且在相同的可读框中。可以在CAR中使用的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ，CD28,4-1BB等的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ，CD28，4-1BB等的任何组合。
在一个实施方案中，抗原结合结构域(例如CD19，ROR1，CD20，CD22，CD123，CD10，CD34或FLT-3抗原结合结构域)的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或特性。例如，在一个实施方案中，本发明的CAR组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性结合人B细胞抗原(例如CD19，ROR1，CD20，CD22，CD123，CD10，CD34或FLT-3)或其片段。在某些实施方案中，scFv与前导序列相邻并且在相同的可读框中。一方面，前导序列是如SEQ ID NO:13所提供的多肽序列。
在一个实施方案中，抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，抗原结合结构域是Fv，Fab，(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合B细胞蛋白或其片段。在某些情况下，人类scFv可以来源于展示文库。
在一个实施方案中，抗原结合结构域例如scFv包含至少一个突变，使得突变的scFv赋予CAR构建体提高的稳定性。在另一个实施方案中，抗原结合结构域例如scFv包含至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个突变，其由例如人源化过程引起，使得突变的scFv赋予CAR构建体的改善的稳定性。
在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括例如表达包括主要细胞内信号传导结构域的CAR(例如，CD19 CAR，ROR1 CAR，CD20 CAR，CD22 CAR，CD123 CAR，CD10 CAR，CD34CAR或FLT-3CAR)的第一细胞，和表达包括次要细胞内信号传导结构域的CAR(例如CD19CAR，ROR1 CAR，CD20 CAR，CD22 CAR，CD123 CAR，CD10 CAR，CD34CAR或FLT-3CAR))的第二细胞。
CD79b抑制剂
如本文所用，术语“CD79b”是指已知在某些恶性血液癌细胞例如白血病细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD79b的氨基酸序列可以在登录号NP_000617.1(同工型1前体)，NP_067613.1(同工型2前体)或NP_001035022.1(同工型3前体)找到，编码它们的mRNA序列可以在登录号NM_000626.2(转录物变体1)，NM_021602.2(转录物变体2)或NM_001039933.1(转录物变体3)中找到。如本文所用，“CD79b”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD79b的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD79b蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD79b蛋白在癌细胞上表达。在实施方案中，CD79b蛋白是野生型CD79b蛋白；在其它实施方案中，CD79b蛋白是突变型CD79b蛋白。
CD79b也称为免疫球蛋白相关β，其是B淋巴细胞抗原受体多聚复合物的组分。CD79b与称为CD79a(免疫球蛋白相关α)的另一种辅助蛋白质形成异二聚体，并且该异二聚体与B细胞上的表面免疫球蛋白复合。CD79b对于B淋巴细胞抗原受体的组装和表达表达是重要的。CD79b和CD79a对于前B细胞和B细胞的发育是重要的。在许多B-CLL细胞中发生突变和异常的CD79b表达，并且可能与B-CLL中B淋巴细胞抗原受体的表面表达的丧失和/或缺陷信号传导相关。参见例如Thompson et al.Blood 90.4(1997):1387-94。在某些情况下，CD79b的突变形式或剪接变体的过表达已经与B-CLL和其他淋巴样恶性肿瘤中的减少的B淋巴细胞抗原受体相关。参见，例如，Cragg et al.Blood 100.9(2002):3068-76。
本文提供CD79b抑制剂和组合疗法。CD79b抑制剂包括但不限于小分子，重组蛋白，抗CD79b CAR表达细胞，例如CART和抗CD79b抗体(例如抗CD79b单或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD79b抑制剂可用于治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD79b抑制剂与CD19抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含鼠、人或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
在一个实施方案中，CD79b抑制剂是抗CD79b抗体或其片段。在一个实施方案中，抗79b抗体或其片段包含单克隆抗体，例如单特异性或双特异性抗体或其片段。例如，抗CD79b抗体或其片段包含抗CD79b抗体药物缀合物，例如polatuzumab vedotin(Roche)。在实施方案中，polatuzumab vedotin用于治疗癌症，例如NHL，例如滤泡性淋巴瘤或DLBCL，例如复发性或难治性滤泡性淋巴瘤或DLBCL。参见例如NCT02257567。在实施方案中，抗CD79b抗体或其片段是包含结合CD32B和D79B的组分的双特异性抗体，例如MGD010(MacroGenics)。参见例如NCT02376036。
在一些实施方案中，CD79b抑制剂与治疗剂缀合或以其他方式结合。
在一些实施方案中，CD79b抑制剂包括抗CD79b CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗CD79b CAR构建体的细胞或由包含scFv，CDR或VH和VL链的CD79b结合CAR编码。例如，抗CD79b CAR表达细胞，例如CART是通过将CD79b-CAR(其包含CD79b结合结构域)工程化到细胞(例如，T细胞或NK细胞)而产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在另一方面，本文提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞或表达CAR的NK细胞，其包含表达CD19 CAR和CD79b CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD79b CAR的第二细胞。
C179b抑制剂
如本文所用，术语“CD179b”是指已知在一些恶性血液癌细胞例如白血病细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD179b的氨基酸序列可以在登录号NP_064455.1(同工型a前体)或NP_690594.1(同工型b前体)中找到，编码它们的mRNA序列可以在登录号NM_020070.3(转录物变体1)或NM_152855.2(转录物变体2)找到。如本文所用，“CD179b”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD179b的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。一方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD179b蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD179b蛋白在癌细胞上表达。在实施方案中，CD179b蛋白是野生型CD179b蛋白；在其它实施方案中，CD179b蛋白是突变CD179b蛋白。
CD179b也称为免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。CD179b是与膜结合的Ig mu重链复合的异二聚体轻链的亚基。轻链和重链共同形成前B细胞受体。CD179b中的突变已经与B细胞缺乏和丙种球蛋白缺乏血症相关。CD179b在一些癌细胞，例如前体B细胞淋巴母细胞淋巴瘤细胞中表达。
本文提供CD179b抑制剂和组合疗法。CD179b抑制剂包括但不限于小分子，重组蛋白，抗CD179b CAR表达细胞，例如CART和抗CD179b抗体(例如抗CD179b单或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD179b抑制剂可用于治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD179b抑制剂与CD20抑制剂，例如表达CD19 CAR的细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如，表达包含鼠、人或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
在一个实施方案中，CD179b抑制剂是抗CD179b抗体或其片段。在一个实施方案中，抗-179b抗体或其片段包含单克隆抗体，例如单特异性或双特异性抗体或其片段。
在一些实施方案中，CD179b抑制剂与治疗剂缀合或以其他方式结合。
在一些实施方案中，CD179b抑制剂包括抗CD179b CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗CD179b CAR构建体的细胞或由包含scFv，CDR或VH和VL链的CD179b结合CAR编码。例如，抗CD179b CAR表达细胞例如CART是通过将CD179b-CAR(其包含CD179b结合结构域)工程化到细胞(例如，T细胞或NK细胞)产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在另一方面，本文提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞或表达CAR的NK细胞，其包含表达CD19 CAR和CD179b CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD179b CAR的第二细胞。
CD79a抑制剂
如本文所用，术语“CD79a”是指已知在一些恶性血液癌细胞例如白血病细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD79a的氨基酸序列可以在登录号NP_001774.1(同工型1前体)或NP_067612.1(同工型2前体)找到，编码它们的mRNA序列可以在登录号NM_001783.3(转录物变体1)或NM_021601.3(转录物变体2)中找到。如本文所用，“CD79a”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD79a的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD79a蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD79a蛋白在癌细胞上表达。在实施方案中，CD79a蛋白是野生型CD79a蛋白；在其它实施方案中，CD79a蛋白是突变型CD79a蛋白。
CD79a也称为免疫球蛋白相关α。CD79a与CD79b异二聚化以形成B淋巴细胞抗原受体多聚体复合物的组分。CD79a在许多血液癌症，例如急性白血病(例如AML)，B细胞淋巴瘤和骨髓瘤中表达。
本文提供CD79a抑制剂和组合疗法。CD79a抑制剂包括但不限于小分子，重组蛋白，抗CD79a CAR表达细胞，例如CART和抗CD79a抗体(例如抗CD79a单或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD79a抑制剂可用于治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD79a抑制剂与CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CAR表达细胞，例如表达包含鼠，人或人源化的抗体结合结构域的CAR的细胞组合施用。
在一个实施方案中，CD79a抑制剂是抗CD79a抗体或其片段。在一个实施方案中，抗CD79a抗体或其片段包含单克隆抗体，例如单特异性或双特异性抗体或其片段。例如，抗CD79a抗体或其片段包含Polson et al.Blood 110.2(2007):616-23(通过引用并入本文)描述的抗CD79a抗体或其片段(例如，可变区或CDR)。例如，抗CD79a抗体或其片段包含Polson等人描述的7H7,15E4或16C11抗体或其片段(例如可变区或CDR)。见Id。
在一些实施方案中，CD79a抑制剂与治疗剂缀合或以其它方式结合。
在一些实施方案中，CD79a抑制剂包括抗CD79a CAR表达细胞，例如CART，例如表达抗CD79a CAR构建体的细胞或由包含scFv，CDR或VH和VL链的CD79a结合CAR编码。例如，抗CD79a CAR表达细胞，例如CART是通过将CD79a-CAR(其包含CD79a结合结构域)工程化到细胞(例如，T细胞或NK细胞)产生的，例如用于与本文所述的CAR表达细胞组合施用。本文还提供了本文所述的CAR表达细胞用于过继疗法的方法。
在另一方面，本文提供了一群CAR表达细胞，例如CART细胞或表达CAR的NK细胞，其包含表达CD19 CAR和CD79a CAR的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体可以包括表达CD20 CAR的第一细胞和表达CD79a CAR的第二细胞。
CAR疗法
本文中的抑制剂，例如针对CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a的表达CAR的细胞可以包含一种或多种本文所述的组分，例如跨膜结构域，细胞内信号传导结构域，共刺激结构域，前导序列或铰链。
一方面，本发明包括包含编码CAR的转基因的重组核酸构建体。在一些实施方案中，核酸分子包含编码选自SEQ ID NO:61-72中的一个或多个的抗CD19结合结构域的核酸序列，其中所述序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列相邻并且在相同的可读框内。可以在CAR中使用的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3-ζ，CD28,4-1BB等的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3-ζ，CD28，4-1BB等的任何组合。
在一个方面，本发明考虑了产生功能等同分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰。例如，包含在CAR中的抗原结合结构域(例如scFv)的VH或VL可被修饰以保留抗原结合结构域例如scFv的起始VH或VL构架区的至少约70％,71％.72％.73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。本发明考虑到整个CAR构建体的修饰，例如CAR构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列的修饰，以便产生功能上等同的分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％,71％,72％.73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。本发明还考虑了CDR的修饰，例如CAR构建体的一个或多个CDR的一个或多个氨基酸序列的修饰，以产生功能上等同的分子。例如，相对于本文提供的CDR序列，CDR可以具有例如至多并且包括1,2,3,4,5或6个改变(例如，取代)。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含该基因的载体得到该基因，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织中分离。或者，感兴趣的核酸可以合成产生，而不是克隆。
本发明尤其包括表达可直接转导入细胞的CAR的逆转录病毒和慢病毒载体构建体。
本发明还包括可直接转染入细胞的RNA构建体。用于产生用于转染的mRNA的方法涉及用特别设计的引物对模板的体外转录(IVT)，随后加入多聚A以产生构建体，该构建体含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)，5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)，待表达的核酸和通常长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:118)的多聚A尾。如此生产的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，模板包括CAR的序列。在一个实施方案中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导入T细胞。
抗原结合结构域
在一个方面，本发明的CAR包含另外称为抗原结合结构域的靶特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，可以作为本发明的CAR中的抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒，细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。抗原结合结构域可结合例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a中的一种或多种。
在一个方面，可以通过将特异性结合所需抗原的抗原结合结构域工程化到CAR中将CAR介导的T细胞应答导向目的抗原。
抗原结合结构域(例如，结合CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a中的一个或多个的抗原结合结构域)可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，重组抗体，鼠抗体，人抗体，人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体如重链可变结构域(VH)，轻链可变结构域(VL)和骆驼衍生的纳米抗体的可变结构域(VHH)，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的备选支架，例如重组纤连蛋白结构域，等等。
在某些情况下，抗原结合结构域来源于CAR最终将被用于其中的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，有益的是CAR的抗原结合结构域(例如，结合CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种的抗原结合结构域)包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基。
人源化抗体可以使用多种本领域已知的技术产生，包括但不限于CDR-接枝(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其各自通过整体引用并入本文)，贴面或镶面(参见，例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology，28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994，Protein Engineering，7(6):805-814；和Roguska等人，1994，PNAS，91:969-973，其各通过整体引用并入本文)，链改组(参见，例如，美国专利号5,565,332，其通过整体引用并入本文)，以及公开于下述文献的技术，例如，美国专利申请公开号US2005/0042664，美国专利申请公开号US2005/0048617，美国专利号No.6,407,213，美国专利号No.5,766,886，国际公开号WO 9317105，Tan et al.,J.Immunol.,169:1119-25(2002),Caldas et al.,Protein Eng.,13(5):353-60(2000),Morea et al.,Methods,20(3):267-79(2000),Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997),Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895-904(1996),Couto et al.,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995),Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995),Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994),和Pedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其各通过整体引用被并入本文。通常，构架区中的构架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变，例如改善抗原结合。这些构架取代通过本领域众所周知的方法鉴定，例如通过建模CDR和构架残基的相互作用，以鉴定对抗原结合重要的构架残基和序列比较，以识别在特定位置的异常构架残基。(参见，例如，Queen等人，美国专利号No.5,585,089；和Riechmann等人，1988,Nature,332:323，其通过整体引用并入本文)。
人源化抗体或抗体片段具有非人来源剩余的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变结构域。如本文提供的，人源化抗体或抗体片段包含非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和构架区，其中包含构架的氨基酸残基完全或多数来自人种系。多种抗体或抗体片段的人源化技术是本领域中公知的，并且可以基本上按照Winter及其同事的方法(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即，CDR接枝来进行(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6548640，其内容在此通过整体引用并入本文)。在这样的抗体和抗体片段中，基本上小于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列所取代。人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些构架(FR)残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。抗体和抗体片段的人源化还可以通过贴面或镶面(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人，ProteinEngineering,7(6):805-814(1994)；和Roguska等人，PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，其内容在此通过整体引用并入本文。
待用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，用啮齿类抗体的可变结构域的序列针对已知人可变结构域序列的整个文库进行筛选。最接近于啮齿动物的序列的人序列然后被接受作为人源化抗体的人类构架(FR)(Sims et al.,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容在此通过引用的方式整体并入)。另一种方法使用源自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架。同一构架可用于数种不同的人源化抗体(参见，例如，Nicholson et al.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)；Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993),其内容在此通过引用的方式整体并入)。在一些实施方案中，重链可变区的构架区，例如，所有的四个构架区从VH4_4-59种系序列衍生。在一个实施方案中，构架区可以包含一个，两个，三个，四个或五个修饰，例如，取代，例如，从在相应的鼠序列(例如SEQID NO:59)的氨基酸取代。在一个实施方案中，构架区，例如，轻链可变区的所有四个构架区是从VK3_1.25种系序列衍生的。在一个实施方案中，构架区可以包含一个，两个，三个，四个或五个修饰，例如，取代例如，从在相应的鼠序列(例如SEQ ID NO:59)的氨基酸的取代。
在一些方面，包含抗体片段的本发明的CAR组合物的部分是人源化的，保留对靶抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，人源化抗体和抗体片段是通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法制备的。三维免疫球蛋白模型通常是可获得并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可获得的，其阐明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，FR残基可以从受体和输入序列中选择并组合，从而实现所需抗体或抗体片段的特性，如对靶抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
人源化抗体或抗体片段可以保留与例如本发明中原始抗体相似的抗原特异性，保留结合人CD19，CD20,或CD22的能力。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可以具有改善的结合到人CD19，CD20,或CD22的亲和力和/或特异性。
一方面，结合结构域(例如，结合CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a中的一个或多个的抗原结合结构域)是片段，例如，单链可变片段(scFv)。一方面，结合结构域是Fv，Fab，(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合CD19，CD20或CD22蛋白。
在某些情况下，可以根据本领域已知的方法(参见例如，Bird等人,(1988)Science242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)制备scFvs。可以通过使用柔性的多肽接头将VH和VL连接在一起来制备ScFv分子。scFv分子包含具有优化长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv可变区如何折叠和相互作用。实际上，如果使用短多肽接头(例如，5-10个氨基酸)，则防止链内折叠。也需要链间折叠使两个可变区一起形成功能性表位结合位点。对于接头方向和尺寸的实例，参见例如Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，被并入本文作为参考。
scFv可以在其VL和VH区域之间包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或以上的氨基酸残基的接头。所述的接头序列可以包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复的集合，比如(Gly4Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。(SEQ ID NO:18)在一个实施方案中，接头可以为(Gly4Ser)4(SEQ IDNO:106)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:107)。接头长度的变化可以保持或提高活性，在活性研究中产生优良的功效。
在一些实施方案中，抗原结合结构域的氨基酸序列(例如，结合CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD179a的一个或多个的抗原结合结构域,或其他部分或整个CAR)可以被修饰，例如，本文所述的氨基酸序列可以被修饰，例如通过保守取代修饰。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-支链侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中的同一性百分比是指两个或更多个相同的序列。当为了最大对应性比较和比对在比较窗口或使用以下序列比较算法之一测量的指定区域，或通过手动对准和目视检查时，如果两个序列具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如在指定的区域或者当没有指定时，在整个序列上60％同一性，任选70％,71％.72％.73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％的同一性)，那么两个序列“基本相同”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或在长度100至500个或1000个或更多个核苷酸(或20,50,200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，通常一个序列作为测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，也可以指定备选参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。用于比较的序列的比对方法是本领域公知的。可以例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson and Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575 Science Dr.,Madison,WI中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA)，或通过手动比对和目视检查(见，例如，Brent et al.,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)进行用于比较的序列的最佳比对。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其在Altschul et al.,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402；和Altschul etal.,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性也可以使用已被并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers and W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)的算法确定，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用已经被并入GCG软件包(可从www.gcg.com获得)中的Needleman andWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法确定，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重16,14,12,10,8,6或4，长度权重为1,2,3,4,5或6。
在一个方面，本发明考虑了产生功能等同分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰。例如，包括在CAR中的结合结构域(例如，结合CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一个或多个的抗原结合结构域)(例如，scFv)的VH或VL可以被修饰以保留抗CD19结合结构域例如scFv的起始VH或VL构架区的至少约70％,71％,72％.73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。更广泛地说，包含在CAR中的CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1的B细胞抗原结合结构域(例如scFv)的VH或VL可被修饰以保留抗原结合结构域(例如scFv)的起始VH或VL构架区的至少约70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。本发明考虑到整个CAR构建体的修饰，例如CAR构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列的修饰，以便产生功能上等同的分子。CAR构建体可以被修饰以保留起始CAR构建体的至少约70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性。
双特异性CAR
在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列表位。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一个实施方案中，第一表位位于CD19上，第二表位位于CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1上。
在某些实施方案中，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案是本领域已知的；包括但不限于例如在US5731168中描述的“孔中的旋钮”方法；例如WO09/089004，WO 06/106905和WO 2010/129304中所述的静电转向Fc配对；如WO 07/110205中所述的链交换工程化结构域(SEED)异二聚体形成；Fab臂交换，如例如WO 08/119353，WO 2011/131746和WO 2013/060867中所述；双抗体缀合物，例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双官能试剂通过抗体交联以产生双特异性结构，如例如US 4433059中所述；如在US 4444878中描述的通过两个重链之间的二硫键的还原和氧化循环通过重组来自不同抗体的半抗体(重链-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇；三功能抗体，例如，通过巯基反应性基团交联的三个Fab'片段，如例如US5273743中所述；生物合成结合蛋白，例如通过C末端尾部优选通过二硫化物或胺反应性化学交联交联的一对scFv，如例如US5534254中所述；双功能抗体，例如具有通过亮氨酸拉链(例如c-fos和c-jun)二聚化的不同结合特异性的Fab片段，所述亮氨酸拉替换了恒定结构域，如例如US5582996中所述；双特异性和寡特异性单价和寡价受体，例如通过一个抗体的CH1区与通常具有相关轻链的另一抗体的VH区之间的多肽间隔区连接的两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区，如描述于例如US5591828；双特异性DNA-抗体缀合物，例如，通过双链DNA片段交联抗体或Fab片段，如例如US5635602中所述；双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv的表达构建体，其中两个scFv间具有亲水性螺旋肽接头和完全恒定区，如US5637481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如具有具Ig重链可变区的结合区的第一结构域以及具有Ig轻链可变区的结合区的第二结构域的多肽的二聚体，通常称为双抗体(更高级结构也包括创建双特异性，三特异性或四特异性分子，如在例如US5837242中所述)；具有连接的VL和VH链的微型抗体构建体，其进一步用肽接头连接至抗体铰链区和CH3区，其可以二聚化以形成双特异性/多价分子，如在例如US5837821中描述；与短肽接头(例如5或10个氨基酸)连接或在任一方向上根本没有接头的VH和VL结构域，其可以形成二聚体以形成双特异性双抗体；三聚体和四聚体，如，例如US5844094中所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，其通过在与V L结构域相关的C末端处的可交联基团的肽键连接以形成一系列FV(或scFv)，如例如，US5864019中所述；并且具有通过肽接头连接的VH和VL结构域的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以形成例如同二价，异二价，三价和四价结构，使用scFV或双抗体类型形式，如例如US5869620中所述。另外的示例性多特异性和双特异性分子及其制备方法见于例如US5910573,US5932448,US5959083,US5989830,US6005079,US6239259,US6294353,US6333396,US6476198,US6511663,US6670453,US6743896,US6809185,US6833441,US7129330,US7183076,US7521056,US7527787,US7534866,US7612181,US2002004587A1,US2002076406A1,US2002103345A1,US2003207346A1,US2003211078A1,US2004219643A1,US2004220388A1,US2004242847A1,US2005003403A1,US2005004352A1,US2005069552A1,US2005079170A1,US2005100543A1,US2005136049A1,US2005136051A1,US2005163782A1,US2005266425A1,US2006083747A1,US2006120960A1,US2006204493A1,US2006263367A1,US2007004909A1,US2007087381A1,US2007128150A1,US2007141049A1,US2007154901A1,US2007274985A1,US2008050370A1,US2008069820A1,US2008152645A1,US2008171855A1,US2008241884A1,US2008254512A1,US2008260738A1,US2009130106A1,US2009148905A1,US2009155275A1,US2009162359A1,US2009162360A1,US2009175851A1,US2009175867A1,US2009232811A1,US2009234105A1,US2009263392A1,US2009274649A1,EP346087A2,WO0006605A2,WO02072635A2,WO04081051A1,WO06020258A2,WO2007044887A2,WO2007095338A2,WO2007137760A2,WO2008119353A1,WO2009021754A2,WO2009068630A1,WO9103493A1,WO9323537A1,WO9409131A1,WO9412625A2,WO9509917A1,WO9637621A2,WO9964460A1。上述申请的内容通过引用整体并入本文。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)中，VH可以是VL的上游或下游。在一些实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)以其VH(VH1)在其VL(VL1)上游排列，下游抗体或抗体片段(例如scFv)以其VL(VL2)在其VH(VH2)的上游排列，使得整个双特异性抗体分子具有排列VH1-VL1-VL2-VH2。在其它实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)以其VL(VL1)在其VH(VH1)上游排列，下游抗体或抗体片段(例如scFv)以其VH(VH2)在其VL(VL2)的上游排列，使得总双特异性抗体分子具有排列VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，如果构建体排列为VH1-VL1-VL2-VH2，则接头置于两个抗体或抗体片段(例如scFv)之间，例如VL1和VL2之间,或者如果构建体排列为VH1-VL2-VH2，则接头在VH1和VH2之间。接头可以是本文所述的接头，例如(Gly4-Ser)n接头，其中n为1,2,3,4,5或6，例如4(SEQ ID NO:53)。通常，两个scFv之间的接头应该足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地，接头位于第一scFv的VL和VH之间。任选地，接头位于第二scFv的VL和VH之间。在具有多个接头的构建体中，任一两个或更多个接头可以相同或不同。因此，在一些实施方案中，双特异性CAR包含如本文所述的排列中的VL，VH和任选的一个或多个接头。
在某些实施方案中，抗体分子是对于第一B细胞表位具有第一结合特异性且对另一B细胞抗原具有第二结合特异性的双特异性抗体分子。例如，在一些实施方案中，双特异性抗体分子对CD19具有第一结合特异性，对CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a中的一种或多种具有第二结合特异性。在一些实施方案中，双特异性抗体分子对CD19具有第一结合特异性，对CD22具有第二结合特异性。
嵌合TCR
一方面，本文公开的抗体和抗体片段(例如针对CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a的那些抗体)可以移植到T细胞受体(“TCR”)链，例如TCRα或TCRβ链的一个或多个恒定结构域，以产生与癌症相关抗原特异性结合的嵌合TCR。不受理论的束缚，据信嵌合TCR将在抗原结合后通过TCR复合物发出信号。例如，本文公开的scFv可以移植到TCR链例如TCRα链和/或TCRβ链的恒定结构域，例如，细胞外恒定结构域，跨膜结构域和胞质结构域的至少一部分。作为另一个实例，抗体片段，例如本文所述的VL结构域可以移植到TCRα链的恒定结构域上，并且抗体片段，例如本文所述的VH结构域可以移植到TCRβ链的恒定结构域(或者，VL结构域可以移植到TCRβ链的恒定结构域，并且VH结构域可以被移植到TCRα链上)。作为另一个实例，抗体或抗体片段的CDR，例如本文任何表中所述的抗体或抗体片段的CDR可以移植到TCRα和/或β链中以产生与癌症相关抗原特异性结合的嵌合TCR。例如，本文公开的LC CDR可以移植到TCRα链的可变结构域中，并且本文公开的HC CDR可以移植到TCRβ链的可变结构域，反之亦然。这样的嵌合TCR可以通过任何适当的方法产生(例如，Willemsen RA et al,Gene Therapy 2000；7:1369–1377；Zhang T et al,Cancer Gene Ther 2004；11:487–496；Aggen et al,Gene Ther.2012 Apr；19(4):365-74)。
非抗体支架
在实施方案中，抗原结合结构域包含非抗体支架，例如纤连蛋白，锚蛋白，结构域抗体，脂质运载蛋白，小模块免疫药物，maxybody，蛋白A或affilin。非抗体支架具有结合细胞上的靶抗原的能力。在实施方案中，抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在的蛋白质的多肽或其片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含非抗体支架。可以使用多种非抗体支架，只要得到的多肽包含至少一个特异性结合靶细胞上的靶抗原的结合区即可。
非抗体支架包括:纤连蛋白(Novartis，MA)，锚蛋白(Molecular Partners AG，苏黎世，瑞士)，结构域抗体(Domantis，Ltd.，Cambridge，MA和Ablynx nv，Zwijnaarde，Belgium)，脂笼蛋白(Pieris Proteolab AG，Freising，Germany)，小模块化免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)，maxybodies(Avidia，Inc.，MountainView，CA)，蛋白A(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶状体蛋白或泛素)(ScilProteins GmbH，Halle，Germany)
纤连蛋白支架可以基于纤连蛋白III型结构域(例如，纤连蛋白III型(10Fn3结构域)的第十个模块))。纤连蛋白III型结构域具有7或8个β链，其分布在两个β片层之间，它们本身彼此堆叠以形成蛋白质的核心，并且还包含将β链彼此连接的环(类似于CDR)并且是溶剂暴露的。在β片层夹心的每个边缘处存在至少三个这样的环，其中边缘是垂直于β链的方向的蛋白质的边界(参见US 6,818,418)。由于这种结构，这种非抗体支架模拟了与抗体的性质和亲和性相似的抗原结合性质。这些支架可用于体外环随机化和改组策略，其类似于体内抗体的亲和力成熟过程。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白衍生的重复模块的蛋白质作为承载可用于结合不同靶标的可变区的支架。锚蛋白重复模块是由两个反平行α-螺旋和β-转角组成的33个氨基酸的多肽。可变区的结合大多通过使用核糖体展示来优化。
Avimers衍生自含有天然A结构域的蛋白质，如HER3。这些结构域自然地用于蛋白质-蛋白质相互作用，而在人类中超过250种蛋白质在结构上是基于A结构域的。Avimers由许多通过氨基酸接头连接的不同的“A-结构域”单体(2-10)组成。可以使用例如美国专利申请公开号20040175756；20050053973；20050048512；和20060008844中描述的方法产生可以与靶抗原结合的Avimers。
Affibody亲和配体是基于蛋白A的IgG结合结构域之一的支架的由三螺旋束组成的小的简单蛋白质。蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌的表面蛋白质。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个被随机化以产生具有大量配体变体的affibody文库(参见例如US 5,831,012)。Affibody分子模拟抗体，它们的分子量为6kDa，相比，抗体的分子量为150kDa。尽管其小体积，affibody分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
蛋白质表位模拟物(PEM)是模拟蛋白质的β-发夹二级结构(参与蛋白质-蛋白质相互作用的主要二级结构)的中等大小，环状，肽样分子(MW 1-2kDa)。抗原结合结构域，例如包含scFv，单结构域抗体或骆驼抗体的那些，可以被引导到本文所述的任何靶受体/配体，例如PD1受体，PD-L1或PD-L2。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含结合靶细胞表面上的反配体的分子的细胞外结构域或其反配体结合片段。
抗原结合结构域可以包含抑制性受体的细胞外结构域。与共抑制性分子的反配体的衔接被重定向到免疫效应物应答的优化。
抗原结合结构域可以包含称为共刺激ECD结构域的共刺激分子的细胞外结构域，与共刺激分子的反配体的衔接导致免疫效应物应答的优化。
跨膜结构域
在多种实施方案中，关于跨膜结构域，CAR可以被设计成包括连接至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括一个或更多个邻接跨膜区域的另外氨基酸，例如一个或更多个与所述跨膜所源自的蛋白质的胞外区域相关联的氨基酸(例如，胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)和/或与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞外区域相关联的一个或更多个另外的氨基酸(例如，胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与CAR的其它结构域这一结合的跨膜结构域，例如，在一个实施方案中，跨膜结构域可以与信号传导结构域，共刺激结构域或铰链结构域来自相同的蛋白质。另一方面，跨膜结构域与CAR的任何其他结构域不是来自相同的蛋白质。在某些情况下，跨膜结构域可以被选择或通过氨基酸取代修饰以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以使与受体复合体的其它成员的相互作用最小化。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一个CAR同型二聚化。在一个不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便使与存在于表达相同CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可以来源于天然或重组来源。当所述来源是天然的时，所述结构域可以来源于任一膜结合的蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面，跨膜结构域能够向胞内结构域传导信号，无论何时所述CAR与靶结合。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以包括至少以下的跨膜结构域:例如,T细胞受体的α，β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括至少一个跨膜区，例如KIRDS2,OX40,CD2,CD27,LFA-1(CD11a,CD18),ICOS(CD278),4-1BB(CD137),GITR,CD40,BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD160,CD19,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA1,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,PAG/Cbp,NKG2D,NKG2C,或CD19的跨膜区。
在某些情况下，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)连接至CAR的胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链，例如，IgG4铰链、IgD铰链、GS接头(例如，本文所述的GS接头)、KIR2DS2或CD8a铰链。在一个实施方案中，铰链或间隔区包含(例如，组成为)SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一个方面，跨膜结构域包含(例如，组成为)SEQ ID NO:15的跨膜结构域。
在一个方面，铰链或间隔区包含IgG4铰链。例如，在一个实施方案中，铰链或间隔区包含如下氨基酸序列的铰链
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:45)。在一些实施方案中，铰链或间隔区包含如下核苷酸序列编码的铰链
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQID NO:46).
在一个方面，铰链或间隔区包含IgD铰链。例如，在一个实施方案中，铰链或间隔区包含如下氨基酸序列的铰链:
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:47)。在一些实施方案中，铰链或间隔区包含如下核苷酸序列编码的铰链:
AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:48).
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这样情况下，其将会主要包含疏水性残基，比如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，在重组跨膜结构域的每个末端可以发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与细胞质区之间形成键。甘氨酸-丝氨酸二联体提供一种特别合适的接头。例如，在一个方面，接头包含如下氨基酸序列:GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:49)。在一些实施方案中，接头由如下核苷酸序列编码:GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:50)。
在一个方面，铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链。
细胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区域包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责其中已经引入CAR的免疫细胞的正常效应子功能中至少一个的活化。
用于本发明的CAR的胞内信号传导结构域的实例包括共同作用以在抗原受体衔接之后引发信号转导的T细胞受体(TCR)和共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任一衍生物或变体和具有相同功能性能力的任一重组序列。
众所周知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次要和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为是由两个不同种类的细胞质信号传导序列介导的:通过TCR引发抗原依赖性主要活化的那些(主要胞内信号传导结构域)以及以抗原独立方式起作用以提供次要或共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
主要信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合体的主要活化。以刺激方式起作用的主要胞内信号传导结构域可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
在本发明中特别使用的含有主要细胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括CD3ζ，常见FcRγ(FCER1G)，FcγRIIa，FcRβ(FcεR1bb)，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD79a，CD79b，CD278(也称为“ICOS”)，FcεRI，DAP10，DAP12和CD66d。在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的主要信号传导结构域。
在一个实施方案中，主要信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增强或降低的)活性的突变ITAM结构域。在一个实施方案中，主要信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的主要胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的主要胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，主要信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
含有在本发明中特别有用的主要胞内信号传导结构域的分子的其它实例包括DAP10，DAP12和CD32的那些。
共刺激信号传导结构域
CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者其可以与用于本发明的CAR的上下文中的任一其它期望的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包括共刺激性分子的胞内结构域的CAR的部分。在一个实施方案中，细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，细胞内结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。
共刺激分子可以是除抗原受体以外的细胞表面分子或其对淋巴细胞对抗原的有效反应所需的配体。这些分子的实例包括CD27,CD28,4-1BB(CD137),OX40,CD30,CD40,PD1,ICOS,，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3,以及与CD83特异性结合的配体等。例如，CD27共刺激已被证明可以增强体外人类CART细胞的扩增，效应功能和存活，并增强体内人T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song et al.Blood.2012；119(3):696-706)。这样的共刺激分子的其他实例包括MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，激活NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体，OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),4-1BB(CD137),B7-H3,CDS,ICAM-1,ICOS(CD278),GITR,BAFFR,LIGHT,HVEM(LIGHTR),KIRDS2,SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD19,CD4,CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D,NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,CD19a，与CD83特异性结合的配体等。
以使本发明的CAR的细胞质部分之内的胞内信号传导序列以随机或指定顺序彼此连接。任选地，例如长度在2和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡肽或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸二联体可用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计成包含两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域被接头(例如本文所述的接头)分子分开。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子为甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头为丙氨酸残基。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。一方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:16的信号传导结构域。一方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:17的信号传导结构域。
一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含氨基酸序列
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:51)。在一个方面，CD27的信号传导结构域由核酸序列AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:52)编码。
天然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施方案中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域，铰链结构域或胞质结构域:杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1,KIR2DL2/L3,KIR2DL4,KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS2,KIR2DS3,KIR2DS4,DIR2DS5,KIR3DL1/S1,KIR3DL2,KIR3DL3,KIR2DP1,和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30，NKp44，NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48,CD229,2B4,CD84,NTB-A,CRACC,BLAME,和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A，LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可与衔接子分子或细胞内信号传导结构域例如DAP12相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公开号WO2014/145252中，其内容通过引用并入本文。
调节嵌合抗原受体的策略
在一些实施方案中，可以控制CAR活性的可调节CAR(RCAR)是期望的，以优化CAR疗法的安全性和功效。有多种方式可以调节CAR活性。例如，使用例如与二聚化结构域融合的胱天蛋白酶诱导细胞凋亡(参见例如Di et al.,N Engl.J.Med.2011Nov.3；365(18):1673-1683)可以在本发明的CAR疗法中用作安全开关。在一个实施方案中，表达本发明的CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)还包含可诱导的凋亡开关，其中人胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶9)或修饰形式融合到人类FKB蛋白的修饰形式，其允许条件二聚化。在小分子如rapalog(例如AP 1903，AP20187)的存在下，可诱导的胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶9)被激活并导致表达本发明的CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的快速凋亡和死亡。基于胱天蛋白酶的可诱导凋亡开关(或这种开关的一个或多个方面)的实例已经在例如US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO1997031899；WO2014151960；WO2014164348；WO2014197638；WO2014197638中进行了描述；所有这些文献都通过引用并入本文。
在另一个实例中，CAR表达细胞还可以表达诱导型胱天蛋白酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚体药物(例如，rimiducid(也称为AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致胱天蛋白酶-9的激活和细胞凋亡。iCaspase-9分子含有在CID存在下介导二聚化的二聚化(CID)结合结构域的化学诱导剂。这导致CAR表达细胞的可诱导和选择性消耗。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体分开的核酸分子编码，在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。iCaspase-9可以提供安全开关，以避免CAR表达细胞的任何毒性。参见例如Song et al.Cancer Gene Ther.2008；15(10):667-75；Clinical Trial Id.No.NCT02107963；和Di Stasi etal.N.Engl.J.Med.2011；365:1673-83。
用于调节本发明的CAR疗法的备选策略包括利用失活或关闭CAR活性的小分子或抗体，例如，通过缺失CAR表达细胞，例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达由能够诱导细胞死亡，例如ADCC或补体诱导的细胞死亡的分子识别的抗原。例如，本文所述的CAR表达细胞也可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。这些受体的实例包括EpCAM，VEGFR,整联蛋白(例如整联蛋白αvβ3，α4，αΙ3/4β3，α4β7，α5β1，ανβ3，αν)，TNF受体超家族成员(例如TRAIL-R1，TRAIL-R2)，PDGF受体，干扰素受体，叶酸受体，GPNMB,ICAM-1,HLA-DR,CEA,CA-125,MUC1,TAG-72,IL-6受体，5T4,GD2,GD3,CD2,CD3,CD4,CD5,CD1 1,CD1 1a/LFA-1,CD15,CD18/ITGB2,CD19,CD20,CD22,CD23/lgE受体，CD25,CD28,CD30,CD33,CD38,CD40,CD41,CD44,CD51,CD52,CD62L,CD74,CD80,CD125,CD147/basigin,CD152/CTLA-4,CD154/CD40L,CD195/CCR5,CD319/SLAMF7,和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表位但缺少胞质结构域内一个或多个区域的形式)。
例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺少信号传导能力，但保留由能够诱导ADCC的分子(例如西妥昔单抗识别的表位，使得施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后消耗CAR表达细胞(参见例如WO2011/056894和Jonnalagadda et al.,Gene Ther.2013；20(8)853-860)。另一个策略包括表达高度紧密的标记/自杀基因，该基因将结合利妥昔单抗的本文描述的CAR表达细胞中的CD32和CD20抗原的靶表位组合，导致CAR表达细胞的选择性消耗，例如通过ADCC(参见例如Philip etal.,Blood.2014；124(8)1277-1287)。用于消耗本文所述的CAR表达细胞的其它方法包括施用CAMPATH，其是单克隆抗CD52抗体，该抗体选择性结合并靶向成熟淋巴细胞例如CAR表达细胞，例如通过诱导ADCC进行破坏。在其它实施方案中，可以使用CAR配体例如抗独特型抗体选择性靶向CAR表达细胞。在一些实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性，从而减少CAR表达细胞的数量。在其它实施方案中，CAR配体，例如抗独特型抗体可以偶联至诱导细胞杀伤的试剂，例如毒素，从而减少CAR表达细胞的数量。或者，CAR分子本身可以被配置为使得可以调节活性，例如开启和关闭活性，如下所述。
在其它实施方案中，本文所述的CAR表达细胞还可以表达由T细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20，T细胞消耗剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在这样的实施方案中，一旦需要减少或消除CAR表达细胞，例如减轻CAR诱导的毒性，则施用T细胞消耗剂。在其它实施方案中，T细胞消耗剂是抗CD52抗体，例如阿仑珠单抗。
在一方面，RCAR包括一组多肽，其最简单的实施方案中通常为两种多肽，其中本文所述的标准CAR的组分，例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域在不同的多肽或成员上分配。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR利用二聚化开关，如在例如WO2014127261中所描述的，其通过引用并入本文。本文和国际公开号WO 2015/090229(其全部内容通过引用并入本文)中提供了这种可调节CAR的附加描述和示例性构型。
在一些实施方案中，RCAR涉及如SEQ ID NO:122所示的开关结构域，例如FKBP开关结构域，或包含具有与FRB结合的能力的FKBP片段，例如如SEQ ID NO:123中给出。在一些实施方案中，RCAR涉及包含FRB序列的的开关结构域，例如SEQ ID NO:124所示或突变型FRB序列，例如SEQ ID NO:125-130任一个所示。
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEV IRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY(SEQ ID NO:122)
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS(SEQ ID NO:123)
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLMEAQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(SEQ ID NO:124)
表1.具有对二聚化分子增加的亲和力的示例性突变FRB。
分裂CAR
在一些实施方案中，CAR表达细胞使用分裂CAR。分裂CAR方法在出版物WO2014/055442和WO2014/055657中有更详细的描述，其通过引用并入本文。简而言之，分裂CAR系统包括表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，并且细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活，细胞杀伤活性开始。因此，CAR表达细胞仅在两种抗原存在下完全活化。
RNA转染
本文公开了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。本发明还包括(其中包括)可直接转染入细胞的CAR编码RNA构建体。用于产生用于转染的mRNA的方法可以涉及具有特别设计的引物的模板的体外转录(IVT)，然后是多聚A添加，以产生构建体，其含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)，5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)，待表达的核酸和通常长度为50-2000个碱基的多聚A尾(SEQ ID NO:118)。如此生产的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括CAR的序列。
在一个方面，CAR由信使RNA(mRNA)编码。一方面，将编码CAR的mRNA引入免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞，用于产生CAR表达细胞，例如CART细胞或CAR NK细胞。
在一个实施方案中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式引入细胞。通过使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。使用合适的引物和RNA聚合酶，来自任何来源的目标DNA可以通过PCR直接转化成用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是例如基因组DNA，质粒DNA，噬菌体DNA，cDNA，合成DNA序列或任何其它合适的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本发明的CAR。例如，RNA CAR的模板包含含有抗肿瘤抗体的单链可变结构域的细胞外区域；铰链区，跨膜结构域(例如CD8a的跨膜结构域)；以及包括细胞内信号传导结构域的细胞质区域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域的细胞质区域。
在一个实施方案中，用于PCR的DNA包含可读框。DNA可以来自生物体的基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施方案中，待用于PCR的DNA是包含5'和3'UTR的人核酸序列。DNA可备选地是通常不在天然存在的生物体中表达的人造DNA序列。示例性人造DNA序列是包含基因的部分的序列，所述部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的DNA的部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。
PCR用于产生用于转染的mRNA的体外转录的模板。进行PCR的方法是本领域公知的。用于PCR的引物设计为具有与用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。本文使用的“基本互补”是指核苷酸序列,其中引物序列中的大部分或全部碱基互补或一个或多个碱基不互补或不匹配的。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶退火或杂交。引物可以被设计为与DNA模板的任何部分基本互补。例如，可以设计引物以扩增通常在细胞(可读框)中转录的核酸部分，包括5'和3'UTR。也可以设计引物以扩增编码感兴趣的特定结构域的一部分核酸。在一个实施方案中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括全部或部分5'和3'UTR。可用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是包含与DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物，所述DNA模板上的核苷酸在待扩增的DNA序列的上游。“上游”在本文中用于指相对于编码链待扩增的DNA序列的位置5’。“反向引物”是含有与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本互补的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指相对于编码链待扩增的DNA序列的位置3'。
可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
还可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。在一些实施方案中，RNA具有5'和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR长度在1至3000个核苷酸之间。可以通过不同的方法改变待加入编码区的5'和3'UTR序列的长度，所述方法包括但不限于设计用于与UTR不同区域退火的PCR引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以修改在转录的RNA转染后实现最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是目的核酸的天然存在的内源5'和3'UTR。或者，可以通过将UTR序列掺入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰来加入对于目的核酸不是内源的UTR序列。对目的核酸不是内源的UTR序列的使用可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知在3'UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域熟知的UTR的特性，选择或设计3'UTR以提高转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5'UTR可以含有内源核酸的Kozak序列。或者，当如上所述通过PCR加入目的核酸的非内源性的5'UTR时，可以通过加入5'UTR序列重新设计共有的Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并不是所有的RNA需要的以实现有效的翻译。对于许多mRNA的Kozak序列的要求是本领域已知的。在其他实施方案中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，所述RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其它实施方案中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻碍mRNA的外切核酸酶降解。
为了能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，转录启动子应连接到待转录序列上游的DNA模板。当将作为RNA聚合酶的启动子的序列加入到正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子被掺入待转录的可读框上游的PCR产物中。在一个实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文别处所述。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7，T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施方案中，mRNA具有5'端的帽和3'多聚(A)尾，其确定细胞中mRNA的核糖体结合，翻译起始和稳定性。在环状DNA模板上，例如质粒DNA，RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长的多联体产物。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其即使在转录后被多聚腺苷酸化的，在真核转染中也是无效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延伸超出模板的最后一个碱基(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nachevaand Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
多聚A/T序列整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的多聚A/T序列可能导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板常常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费时费力，而且经常不可靠。这就是为什么非常需要不用克隆而允许用多聚A/T 3'序列构建DNA模板的方法。
可以通过使用含有多聚T尾的反向引物，如100T尾(SEQ ID NO:29)(大小可以为50-5000T(SEQ ID NO:30))在PCR期间或在PCR后通过任何其他方法产生转录DNA模板的多聚A/T片段，所述方法包括但不限于DNA连接或体外重组。多聚(A)尾也可提供RNA的稳定性并降低其降解。通常，多聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，多聚(A)尾为100至5000个腺苷之间(SEQ ID NO:57)。
使用多聚(A)聚合酶如大肠杆菌多聚A聚合酶(E-PAP)进行体外转录后，RNA的多聚(A)尾可以进一步延长。在一个实施方案中，将聚(A)尾长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸(SEQ ID NO:104)的长度导致RNA的翻译效率增加约2倍。另外，不同化学基团连接到3'末端可以增加mRNA的稳定性。这种连接可以含有修饰的/人造核苷酸，适体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物掺入聚(A)尾。ATP类似物可进一步提高RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在一个实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知并在此描述的技术提供5’帽(Cougot,et al.,Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,et al.,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,etal.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是启动帽独立的核糖体与mRNA结合并有助于翻译起始的任何病毒，染色体或人工设计的序列。可以包括适于细胞电穿孔的任何溶质，所述溶质可以含有促进细胞通透性和活力的因子，例如糖，肽，脂质，蛋白质，抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任何一种将RNA引入靶细胞，所述方法为例如可商购的方法，包括但不限于电穿孔((Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany)),(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.),Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany),使用脂转染的阳离子脂质体介导的转染，聚合物包封，肽介导的转染或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
非病毒递送方法
在一些方面，非病毒方法可用于将编码本文描述的CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者。
在一些实施方案中，非病毒方法包括使用转座子(也称为可转座元件)。在一些实施方案中，转座子是可以将其自身插入到基因组中的位置的DNA片段，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的DNA片段，或可以从更长的核酸中剪接并插入到基因组中的另一个位置的DNA片段。例如，转座子包含由用于转座的倒置重复侧翼基因组成的DNA序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。例如，参见Aronovich et al.Hum.Mol.Genet.20.R1(2011):R14-20；Singh et al.Cancer Res.15(2008):2961–2971；Huang et al.Mol.Ther.16(2008):580–589；Grabundzija et al.Mol.Ther.18(2010):1200–1209；Kebriaei et al.Blood.122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy 16.9(2008):1515–16；Bell etal.Nat.Protoc.2.12(2007):3153-65；和Ding et al.Cell.122.3(2005):473-83,所有这些都通过引用并入本文。
SBTS包括两个组成部分:1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转座到靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，从质粒切割转座子(包括转基因)，并将其插入宿主细胞的基因组中。参见例如Aronovich等人。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija et al.NucleicAcids Res.41.3(2013):1829-47；和Singh et al.Cancer Res.68.8(2008):2961–2971,，所有这些都通过引用并入本文。示例性的转座酶包括Tc1/水手型转座酶，例如SB10转座酶或SB11转座酶(例如可以从巨细胞病毒启动子表达的高活性转座酶)。参见例如Aronovichet al.；Kebriaei et al.；和Grabundzija et al.,，所有这些都通过引用并入本文。
SBTS的使用允许有效整合和表达转基因，例如编码本文所述的CAR的核酸。本文提供了例如使用转座子系统例如SBTS，产生稳定表达本文所述的CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞的方法。
根据本文描述的方法，在一些实施方案中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸例如质粒递送至细胞(例如T细胞或NK细胞)。例如，通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法，例如本文所述的方法，例如电穿孔，转染或脂质转染递送核酸。在一些实施方案中，核酸含有转座子，其包含转基因，例如编码本文所述的CAR的核酸。在一些实施方案中，核酸含有转座子，其包含转基因(例如编码本文所述的CAR的核酸)以及编码转座酶的核酸序列。在其它实施方案中，提供了具有两个核酸的系统，例如双质粒系统，例如其中第一质粒含有包含转基因的转座子，第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，第一和第二核酸被共同递送到宿主细胞中。
在一些实施方案中，通过使用使用SBTS进行基因插入和使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)，转录激活子-样效应核酸酶(TALENs)，CRISPR/Cas系统或工程化的大范围核酸酶再工程化的归巢内切核酸酶)进行遗传编辑的组合，产生表达本文所述的CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，使用非病毒递送方法允许细胞，例如T或NK细胞的重新编程，并将细胞直接注入受试者。非病毒载体的优点包括但不限于容易和相对低成本地产生满足患者群体所需的足够量，储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。
编码CAR，例如CD19 CAR，CD20 CAR或CD22 CAR的核酸构建体
本发明还提供编码本文所述的一种或多种CAR构建体，例如CD19 CAR，CD20 CAR或CD22 CAR的核酸分子。一方面，提供核酸分子作为信使RNA转录物。在一个方面，提供核酸分子作为DNA构建体。
因此，一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含结合结构域(例如，结合CD19，CD20或CD22)，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的CAR，所述细胞内信号传导结构域包含刺激结构域，例如共刺激信号传导结构域和/或主要信号传导结构域，例如ζ链。
在一个实施方案中，结合结构域是本文所述的抗CD19结合结构域，例如抗CD19结合结构域，其包含选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59的序列，或其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，核酸包含表6A所示编码CD22的核酸或其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，核酸是编码表6A-10B中任一个所示的氨基酸序列的核酸或其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，核酸包含表11A中所示的CD20编码核酸或其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，核酸是编码表11A-15B中任一个所示氨基酸序列的核酸或其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，跨膜结构域是选自T细胞受体的α，β或ζ链，CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列或其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域通过铰链区(例如本文所述的铰链)连接到跨膜结构域。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQID NO:47或SEQ ID NO:49，或其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域是选自OX40,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)的蛋白质的功能信号传导结构域。在一个实施方案中，共刺激结构域是选自MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，激活NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体，OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),4-1BB(CD137),B7-H3,CDS,ICAM-1,ICOS(CD278),GITR,BAFFR,LIGHT,HVEM(LIGHTR),KIRDS2,SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD19,CD4,CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D,NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,CD19a和与CD83特异性结合的配体的蛋白质的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列或其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的序列，或其具有95-99％同一性的序列，以及SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列或其具有95-99％同一性的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在相同的框架中和作为单个多肽链表达。
另一方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，所述CAR构建体包含SEQID NO:13的前导序列，具有选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQID NO:11,SEQ ID NO:12,和SEQ ID NO:59(或其具有95-99％同一性的序列)的序列的scFv结构域，SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49(或其具有95-99％同一性的序列)的铰链区，具有SEQ ID NO:15的序列(或其具有95-99％同一性的序列)的跨膜结构域，具有SEQ ID NO:16的序列的4-1BB共刺激结构域或具有SEQ ID NO:51的序列(或其具有95-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域和具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列(或其具有95-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激结构域。
另一方面，本发明涉及由核酸分子编码的分离的多肽分子。在一个实施方案中，分离的多肽分子包含选自SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:59或其具有95-99％同一性的序列组成的序列。
另一方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)分子的核酸分子，其包含抗CD19结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD19结合域包含选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:59的序列，或其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，编码的CAR分子(例如，CD19 CAR，CD20 CAR或CD22 CAR)还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域是选自OX40,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)的蛋白质的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域是选自T细胞受体的α，β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。在一个实施方案中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和SEQ ID NO:17的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在相同的框架中并且作为单个多肽链表达。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域通过铰链区连接到跨膜结构域。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49。
另一方面，本发明涉及编码的CAR分子，其包含SEQ ID NO:13的前导序列，具有选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,和SEQID NO:59的序列，或其具有95-99％同一性的序列的scFv结构域，SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO 49的铰链区，具有SEQ ID NO:15的序列的跨膜结构域，具有SEQ ID NO:16的序列的4-1BB共刺激结构域或具有SEQ ID NO:51的序列的CD27共刺激结构域，以及具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列的CD3ζ刺激结构域。在一个实施方案中，编码的CAR分子包含选自SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ IDNO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,和SEQ ID NO:59的序列，或其具有95-99％同一性的序列。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含该基因的载体衍生出该基因，或通过从含有该基因的细胞和组织中使用标准技术直接分离获得。或者，目的基因可以合成，而不是克隆产生。
本发明还提供了其中插入本发明的DNA的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体相对于衍生自癌－逆转录病毒例如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体也可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子，包装信号(ψ)，引物结合位点(PBS)，一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可能缺乏病毒结构基因，如gag，pol和env。示例性的γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)，形成脾脏病灶病毒(SFFV)和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)以及由其衍生的载体。其它γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetziget al.,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011Jun；3(6):677–713。
在另一个实施方案中，包含编码本发明所需CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，编码CAR的核酸的表达可以使用转座子如睡美人，crispr，CAS9和锌指核酸酶来完成。参见June et al.2009Nature Reviews Immunology 9.10:704-716，其通过引用并入本文。
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列，聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因))，允许附加复制和在原核生物中复制的元件(例如SV40原点和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如，氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标记)。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸有效连接至启动子，并将构建体掺入表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子，起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。
在一些方面，本发明的表达构建体也可以用于使用标准基因递送方案进行的核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,399,346,5,580,859,5,589,466,，其全部内容通过引用并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了基因治疗载体。
核酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，包括但不限于质粒，噬菌粒，噬菌体衍生物，动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体，复制载体，探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知的，并且描述于例如Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY),和其它病毒学和分子生物学手册。作为载体有用的病毒包括但不限于逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一个生物体中起作用的复制起点，启动子序列，方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个可选择标记(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将所选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以在体内或离体分离重组病毒并将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如增强子调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管许多启动子也显示在起始位点的下游含有功能元件。启动子元件之间的间距通常是柔性的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能被保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到50bp。取决于启动子，似乎单独的元件可以协同地或独立地起作用以激活转录。示例性启动子包括CMVIE基因，EF-1α，泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在一个实施方案中，启动子是PGK启动子，例如如本文所述的截短的PGK启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然的EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基的表达，其负责将氨酰基tRNA酶促递送到核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒，已被证明有效驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见，例如，Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。一方面，EF1a启动子包含如SEQ ID NO:100提供的序列
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子，MoMuLV启动子，禽白血病病毒启动子，EB病毒立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子，肌球蛋白启动子，延伸因子-1α启动子，血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。也可以考虑诱导型启动子作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当期望这种表达时，所述分子开关能够打开其有效连接的多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子，糖皮质激素启动子，孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个例子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施方案中，截短的PGK启动子(例如，当与野生型PGK启动子序列比较时，具有一个或多个，例如1,2,5,10,100,200,300或400个核苷酸缺失的PGK启动子)可能是想要的。示例性PGK启动子的核苷酸序列在下面提供。
WT PGK启动子:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAA GCT(SEQ ID NO:1323)
示例性截短的PGK启动子:
PGK100:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:1324)
PGK200:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ IDNO:1325)
PGK300:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:1326)
PGK400:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:1327)
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列，聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因))，允许附加复制和在原核生物中进行复制的元件(例如SV40原点和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如，氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标记)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可含有选择性标记基因或报道基因或两者，以便于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择性标记可以携带在单独的DNA片段上并在共转染程序中使用。两个选择性标记和报告基因都可以在侧翼为适当的调控序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报告基因用于鉴定潜在的转染细胞和评估调控序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受体生物或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，并且编码多肽，该多肽的表达由一些易于检测的性质(例如酶活性)表现出来。在DNA被引入受体细胞后的合适时间，测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei et al.,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术或商业获得制备。通常，具有显示报告基因表达最高水平的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区域可以与报告基因连接，并用于评估调节启动子驱动的转录能力的活性剂。
在实施方案中，载体可以包含编码CAR的两种或更多种核酸序列，例如结合CD19的第一CAR和第二CAR，例如抑制性CAR或特异性结合第二抗原(例如CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a)的CAR。在这样的实施方案中，编码CAR的两个或多个核酸序列由相同框架中的单个核酸分子并且作为单个多肽链编码。在这方面，两个或更多个CAR可以例如被一个或多个肽切割位点分开。(例如，自切割位点或细胞内蛋白酶的底物)。肽切割位点的实例包括以下，其中GSG残基是任选的:
T2A:(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:1328)
P2A:(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:1329)
E2A:(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:1330)
F2A:(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:1331)
将基因导入细胞并在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物，细菌，酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理，化学或生物手段转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀，脂转染，粒子轰击，显微注射，电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见例如Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1-4,ColdSpring Harbor Press,NY)。将多核苷酸引入宿主细胞的合适方法是磷酸钙转染。
将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入到哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可衍生自慢病毒，痘病毒，单纯疱疹病毒I，腺病毒和腺伴随病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物，纳米胶囊，微球体，珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液，胶束，混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。核酸的现有的靶向递送的其他方法是可利用的，例如用靶向纳米颗粒递送多核苷酸或其它合适的亚微米尺寸的递送系统。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。预期使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外，离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸相关联的连接分子连接到脂质体上，截留在脂质体中，与脂质体复合，分散在含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其它方式与脂质结合。脂质，脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，作为胶束或具有“塌陷”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成在尺寸或形状上不均匀的聚集体。脂质是可能是天然存在的或合成的脂质的脂肪物质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小滴，以及含有长链脂族烃的化合物类及其衍生物，如脂肪酸，醇，胺，氨基醇和醛。
可以从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。使用氯仿作为唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是包含通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的多种单层和多层脂质载体的通用术语。脂质体可以表征为具有磷脂双层膜和内水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有通过水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在闭合结构形成之前经历自我重排，并将水和溶解的溶质夹在脂质双层之间(Ghosh et al.,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也包括在溶液中具有与正常水泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构，或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定法。这样的测定法包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定法，例如Southern和Northern印迹，RT-PCR和PCR；“生物化学”测定法，例如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)检测特定肽的存在或不存在，或通过本文所述的测定法来鉴定落入本发明范围内的活性剂。
本发明还提供了包含CAR编码核酸分子的载体。一方面，CAR载体可以直接转导入细胞，例如T细胞。一方面，载体是克隆或表达载体，例如载体，包括但不限于一种或多种质粒(例如表达质粒，克隆载体，微环，微载体、双微小染色体)，逆转录病毒和慢病毒载体构建体。一方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR构建体。一方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。
表达CAR的免疫效应细胞
另一方面，本发明提供了一群CAR表达细胞。在一些实施方案中，CAR表达细胞的群体包含表达本文所述的一种或多种CAR的细胞。在一些实施方案中，CAR表达细胞的群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。
例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达具有本文所述的肿瘤抗原(例如CD19)的抗原结合结构域的CAR的第一细胞，以及表达具有不同抗原结合结构域的CAR的第二细胞，所述不同抗原结合结构域为例如，针对本文所述的不同肿瘤抗原的抗原结合结构域，例如本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域，所述肿瘤抗原不同于由第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域结合的肿瘤抗原，例如CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a。
作为另一个实例，CAR表达细胞的群体可以包括表达包含本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域的CAR的第一细胞，以及表达包括针对与如本文所述的肿瘤抗原不同的靶标的抗原结合结构域的CAR的第二细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞的群体包括例如表达包含主要细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞，和表达包括次要信号传导结构域的CAR的第二细胞。CAR表达细胞中的一种或两种可以具有与编码CAR的核酸有效连接的截短的PGK启动子，例如如本文所述。
在另一方面，本发明提供了一种细胞群体，其中群体中的至少一个细胞表达具有针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域的CAR，以及表达另一种活性剂，例如增强CAR表达细胞的活性的活性剂的第二细胞。群体的CAR表达细胞可以具有如本文所述的截短的PGK启动子，其有效连接于编码CAR的核酸。在一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。在一些实施方案中，抑制性分子，例如PD-1，可以降低CAR表达细胞产生免疫效应应答的能力。抑制性分子的实例包括PD-1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(CEACAM-1,CEACAM-3,and/or CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如TGFRβ)。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂包含与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的细胞内信号传导结构域)结合的第一多肽，例如抑制性分子。在一个实施方案中，该活性剂包含第一多肽，例如抑制性分子如PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3,和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4或TGFRβ，或这些任何一种的片段的第一多肽，以及作为本文所述细胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB，CD27，OX40或CD28，例如，如本文所述)和/或主要信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，该活性剂包含PD-1的第一多肽或其片段，和本文描述的细胞内信号传导结构域的第二多肽(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。
CAR与其他分子或活性剂的共表达
共表达第二个CAR
一方面，本文所述的CAR表达细胞可以进一步包含第二CAR，例如第二CAR，其包括不同的抗原结合结构域，例如针对相同的靶标(CD19)或不同的靶标(例如CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a)的抗原结合结构域。在一个实施方案中，第二CAR包括急性骨髓性白血病细胞上表达的靶标例如CD20,CD22,ROR1,CD10,CD33,CLL-1,CD34,CD123,FLT3,CD79b,CD179b,和CD79a的抗原结合结构域。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含靶向第一抗原的第一CAR，并且包括具有共刺激信号传导结构域但不是主要信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，以及靶向第二种不同抗原的第二CAR，并且包括具有主要信号传导结构域但不是共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。虽然不希望被理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB，CD28，CD27或OX-40)放置在第一CAR上和主要信号传导结构域(例如CD3ζ)放置在第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两个靶标的细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一CD19 CAR，其包括CD19结合结构域，跨膜结构域和共刺激结构域和靶向除CD19之外的抗原(例如，在AML细胞上表达的抗原，例如，CD22,CD20,ROR1,CD10,CD33,CLL-1,CD34,CD123,FLT3,CD79b,CD179b或CD79a)，并且包括抗原结合结构域，跨膜结构域和主要信号传导结构域的第二CAR。在另一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一CD19 CAR，其包括CD19结合结构域，跨膜结构域和主要信号传导结构域，以及靶向除CD19之外的抗原(例如，在AML细胞上表达的抗原，例如，CD22,CD20,ROR1,CD10,CD33,CD123,CLL-1,CD34,FLT3,CD79b,CD179b或CD79a)，并且包括针对抗原的抗原结合结构域，跨膜结构域和共刺激信号传导结构域的第二CAR。
一方面，本文所述的CAR表达细胞可进一步包含第二CAR，例如包含不同抗原结合结构域，例如针对相同靶标(例如CD19)或不同靶标(例如，CD19以外的靶标，例如，CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a)的抗原结合结构域的第二CAR。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含靶向第一抗原并且包括具有共刺激信号传导结构域但不是主要信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二种不同抗原并且包括具有主要信号传导结构域但不是共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB，CD28，CD27或OX-40)放置在第一CAR上和主要信号传导结构域(例如CD3ζ)放置在第二CAR上可以将CAR活性限制在表达两个靶标的细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一CAR和第二CAR，第一CAR包括抗原结合结构域，跨膜结构域和共刺激结构域，第二CAR靶向另一抗原并且包括抗原结合结构域，跨膜结构域和主要信号传导结构域。在另一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一CAR和第二CAR，第一CAR包括抗原结合结构域，跨膜结构域和主要信号传导结构域，第二CAR靶向另一抗原并且包括针对抗原的抗原结合结构域，跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR表达细胞包含本文所述的XCAR(例如CD19CAR，CD20 CAR或CD22 CAR)和抑制性CAR。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含本文所述的CD19 CAR和抑制性CAR。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合在正常细胞上但不是癌细胞(例如也表达CD19的正常细胞)上发现的抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是细胞内结构域PD-1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(CEACAM-1,CEACAM-3,和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如，TGFRβ)。
在一个实施方案中，当CAR表达细胞包含两种或更多种不同的CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域，例如，作为片段，例如scFv，其不与第二CAR的抗原结合结构域形成结合，例如，第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
共表达增强CAR活性的活性剂
另一方面，本文所述的CAR表达细胞可进一步表达另一种活性剂，例如增强CAR表达细胞的活性或适应性的活性剂。
例如，在一个实施方案中，活性剂可以是抑制调节或调控例如抑制T细胞功能的分子的活性剂。在一些实施方案中，调节或调控T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施方案中，抑制性分子，例如PD1，可以降低CAR表达细胞引发免疫效应应答的能力。抑制分子的实例包括PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如TGFRβ)。
在一个实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)，转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)，或锌指内切核酸酶(ZFN)，例如，如本文所述，可用于抑制调节或调控，例如抑制CAR表达细胞中T细胞功能的分子的表达。在一个实施方案中，该活性剂是shRNA，例如本文所述的shRNA。在一个实施方案中，调节或调控，例如抑制T细胞功能的活性剂在CAR表达细胞内被抑制。例如，抑制调节或调控例如抑制T细胞功能的分子表达的dsRNA分子与编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂包含第一多肽，例如抑制性分子的活性剂，其与向细胞提供正信号的第二多肽缔合，例如本文所述胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，活性剂包括例如抑制性分子的第一多肽，比如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD160、2B4、CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270),KIR,A2aR,I类MHC,II类MHC,GAL9,腺苷,或TGFR(例如TGFRβ)或这些中任一个的片段(例如，这些中任一个的胞外结构域的至少一部分)，和作为本文中描述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，包括共刺激结构域(例如，如本文中所述的41BB、CD27或CD28)和/或主要信号传导结构域(例如，本文中所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，活性剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)，和作为本文所述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文中所述CD28信号传导结构域和/或CD3ζ信号传导结构域)。PD1为受体的CD28家族的抑制性成员，也包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上被表达(Agata等人1996 Int.Immunol 8:765-75)。PD1、Pd-L1和PD-L2的两个配体已显示在结合PD1时下调T细胞的活化(Freeman等人.2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol 2:261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中大量存在(Dong等人2003 J MolMed 81:281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用来逆转。
在一个实施方案中，所述活性剂包含抑制性分子(例如程序性死亡1(PD1))的胞外结构域(ECD)，可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域(比如41BB和CD3ζ)(本文也称为PD1CAR)。在一个实施方案中，当与本文所述CD19 CAR联合使用时，PD1CAR提高T细胞的持久性。在一个实施方案中，CAR是PD1CAR，其包含在SEQ ID NO:121中以下划线指示的PD1的胞外结构域。在一个实施方案中，PD1CAR包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqt dklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevpt ahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:121).
在一个实施方案中，PD1CAR包含下文提供的氨基酸序列(SEQ ID NO:119)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrv tqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:119).
在一个实施方案中，活性剂包含编码PD1CAR，例如本文所述的PD1CAR的核酸序列。在一个实施方案中，PD1CAR的核酸序列如下所示，其中PD1ECD在SEQ ID NO:120中加下划线。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttct ggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcga ccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagacc gacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaa tggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgc tggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaact gcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(SEQ ID NO:120).
在另一个实例中，在一个实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的实例包括MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其它实例包括CDS,ICAM-1,GITR,BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD160,CD19,CD4,CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D,NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,CD19a和与CD83特异性结合的配体，例如，如本文所述。共刺激分子配体的实例包括CD80,CD86,CD40L,ICOSL,CD70,OX40L,4-1BBL,GITRL和LIGHT。在实施方案中，共刺激分子配体是不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在实施方案中，共刺激分子配体是与CAR的共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一个实施方案中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一个实施方案中，共刺激配体是CD80或CD86。在一个实施方案中，共刺激分子配体是CD70。在实施方案中，本文所述的表达CAR的免疫效应细胞可进一步工程化以表达一种或多种另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共同表达
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞进一步包含趋化因子受体分子。趋化因子受体CCR2b或CXCR2在T细胞中的转基因表达增强了对分泌CCL2-或CXCL1的实体瘤(包括黑素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock et al.,J Immunother.2010Oct；33(8):780-8和Kershaw et al.,Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论束缚，认为在CAR表达细胞中表达的识别由肿瘤例如实体瘤分泌的趋化因子的趋化因子受体，可以改善CAR表达细胞归巢到肿瘤中，促进CAR表达细胞浸润到肿瘤，并增强CAR表达细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在的或重组的趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适于在本文所述的CAR表达细胞中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1,CXCR2,CXCR3,CXCR4,CXCR5,CXCR6,或CXCR7)，CC趋化因子受体(例如CCR1,CCR2,CCR3,CCR4,CCR5,CCR6,CCR7,CCR8,CCR9,CCR10,或CCR11)，CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)，XC趋化因子受体(例如XCR1)或其趋化因子结合片段。在一个实施方案中，基于肿瘤分泌的趋化因子选择要用本文所述的CAR表达的趋化因子受体分子。在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞进一步包含，例如表达CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施方案中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同的载体上或在两个不同的载体上。在本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同载体上的实施方案中，CAR和趋化因子受体分子各自由两种不同的启动子控制，或者在同一启动子的控制下。
免疫应答增强剂的条件表达
本文还提供了条件表达增强本文所述的CAR表达细胞的免疫应答或活性的活性剂的组合物和方法。
在一个方面，本公开描述了被工程化以组成型表达CAR(本文也称为非条件CAR)的免疫效应细胞。在一个实施方案中，如本文所述的非条件CAR包含结合癌相关抗原例如CD19,CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1的抗原结合结构域。在实施方案中，非条件CAR表达免疫效应细胞还包含增强CAR表达免疫效应细胞的治疗功效(例如免疫应答)的条件表达的活性剂。在这样的实施方案中，条件表达的活性剂的表达在非条件CAR表达免疫效应细胞的激活时发生，例如，当非条件CAR分子与其靶标(例如癌相关抗原，例如CD19,CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1)结合时。
如本文所述的免疫应答增强剂可以通过以下一种或多种来表征:1)靶向或结合不同于非条件CAR靶向的癌症相关抗原；2)抑制免疫检查点或抑制性分子的表达或活性；和/或3)激活增强免疫应答或免疫效应细胞活化的组分的表达和/或分泌。免疫应答增强剂可以是多肽或核酸，例如编码增强免疫应答的多肽的核酸。增强免疫应答的条件表达的活性剂的实例包括但不限于额外的CAR(称为条件CAR)；基于TCR的分子(例如TCR-CAR)；免疫检查点或抑制性分子的抑制剂；和/或细胞因子。在实施方案中，条件CAR结合不同于非条件CAR靶向的癌症相关抗原。在实施方案中，本文所述的免疫检查点或抑制性分子的抑制剂是抗体或其抗原结合片段，抑制性核酸(例如，siRNA或shRNA)或抑制或降低免疫检查点或抑制性分子的活性的小分子，所述免疫检查点或抑制性分子选自PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，MHC I类，MHC II类，GAL9，腺苷或TGFRβ。在实施方案中，细胞因子包含IL-2，IL-7，IL-15或IL-21或其功能片段或衍生物。
在实施方案中，免疫效应细胞包含非条件CAR和一种或多种条件CAR，其中条件CAR结合不同于非条件CAR靶向的癌症相关抗原。举例来说，在一个实施方案中，免疫效应细胞包含结合CD19的非条件CAR和结合CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1或其组合的一种或多种条件CAR。在另一个实施方案中，免疫效应细胞包含结合CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1的非条件CAR和结合CD19的条件CAR。
通过将活化条件控制区有效连接到增强免疫应答的活性剂(例如，编码这种活性剂的核酸序列)来实现在激活表达CAR的免疫效应细胞时增强免疫应答的活性剂的条件表达。在一个实施方案中，活化条件控制区包含在免疫效应细胞激活时启动有效连接的免疫应答增强剂的表达，例如转录的启动子序列。在一个实施方案中，活化条件控制区包含促进免疫效应细胞激活时启动表达的一个或多个调节序列(例如，转录因子结合序列或位点)。在实施方案中，活化条件控制区包含启动子序列和/或来自基因的启动子或调节序列的一个或多个转录因子结合序列，所述基因在以下一个或多个时被上调:免疫效应细胞(例如，T细胞)激活，T细胞分化，T细胞极化或辅助T细胞发育。这些基因的实例包括但不限于NFAT(活化的T细胞的核因子)，ATF2(激活转录因子2)，NF-κB(核因子-B)，IL-2，IL-2受体(IL-2R)，IL-3，GM-CSF，IL-4，IL-10和IFN-γ。
在一个实施方案中，活化条件控制区包含一个或多个，例如1,2,3,4,5,6或更多个NFAT结合序列或位点。在实施方案中，启动子中的NFAT结合序列包含(5′-GGAAA-3′)(SEQID NO:1312)，任选地位于5’(A/T)GGAAA(A/N)(A/T/C)N 3’(SEQ ID NO:1313)的更长的共有序列中。在实施方案中，NFAT结合序列是κb样序列，例如GGGACT(SEQ ID NO:1314)。(参见Gibson et al.,The Journal of Immunology,2007,179:3831–3840.)。
在一个实施方案中，活化条件控制区还包含IL-2启动子(或最小IL-2启动子)，IL-2R启动子，ATF2启动子或NF-κB启动子，或其任何功能片段或衍生物。在一个实施方案中，活化条件控制区包含一个或多个NFAT结合序列，例如3或6个NFAT结合序列，以及IL-2启动子，例如IL-2最小启动子。在一个实施方案中，活化条件控制区包含以下序列
AGCTTGGATCCAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAGAAGGCGTTAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAGAAGGCGTTAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAGAAGGCGTTCAAGCTTGTCGAC(SEQ ID NO:1315)。
细胞来源
在扩增和遗传修饰或其他修饰之前，可以从受试者获得细胞，例如T细胞或天然杀伤(NK)细胞来源。受试者的实例包括人类、猴子、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从大量来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。
在本公开的某些方面，免疫效应细胞，例如，T细胞可以使用本领域技术人员已知的多种技术的任一种(比如FicollTM分离)从受试者收集的血液单位获得。在一个方面，通过单采血液成分术，从个体的正在循环的血液获得细胞。单采血液成分术的产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分，并任选地，将细胞置于适合的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在一个实施方案中，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个备选实施方案中，洗涤溶液不含钙，且可以不含镁或可以不含许多(即使不是全部)二价阳离子。
在不存在钙下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员应当容易地理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，比如通过根据制造商的说明使用半自动化的“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗涤之后，可以将细胞再悬浮在多种生物相容性缓冲液中，比如例如不含Ca、不含Mg PBS、PlasmaLyte A、或含或不含缓冲剂的其它盐溶液。备选地，可以除去单采血液成分术样品的不期望组分，并将细胞直接再悬浮在培养基中。
认识到本申请的方法可以利用包含5％或更少，例如2％的人AB血清的培养基条件，并采用公知的培养基条件和组合物，例如在Smith et al.,“Ex vivo expansion ofhuman T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS ImmuneCell SerumReplacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中所述。
在一个方面，通过裂解红细胞和消耗单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流离心洗脱法从外周血淋巴细胞分离T细胞。
本文描述的方法可以包括例如使用例如本文描述的阴性选择技术来选择免疫效应细胞的特定亚群，例如作为T调节细胞消耗群体的T细胞，CD25+消耗细胞。在一些实施方案中，T调节性消耗细胞的群体含有小于30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与基质(例如珠)缀合，或者另外涂覆在基质(例如珠)上。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段缀合到本文所述的基质。
在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25消耗试剂从群体中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施方案中，细胞与CD25消耗试剂的比例为1e7细胞比20uL，或1e7细胞比15μL，或1e7细胞比10uL，或1e7细胞比5uL，或1e7细胞比2.5uL，或1e7细胞比1.25uL。在一个实施方案中，例如，对于T调节细胞，例如CD25+消耗，使用大于5亿个细胞/ml。另一方面，使用6、7、8或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施方案中，要消耗的免疫效应细胞群体包括约6x109个CD25+T细胞。在其他方面，要消耗的免疫效应细胞群体包括约1x109至1x1010个CD25+T细胞，以及其间的任何整数值。在一个实施方案中，所得的T调节性消耗细胞群体具有2x109个T调节细胞，例如CD25+细胞或更少(例如，1x109,5x108,1x108,5x107,1x107，或较少的CD25+细胞)。
在一个实施方案中，使用具有消耗管组(例如管道162-01)的CliniMAC系统从群体中除去T调节细胞，例如CD25+细胞。在一个实施方案中，CliniMAC系统在诸如例如DEPLETION2.1的消耗设置上运行。
不希望受到特定理论的束缚，在单采血液成分术前或制备CAR表达细胞产物过程中,降低受试者中免疫细胞的负调节物的水平(例如，减少不需要的免疫细胞数量，例如TREG细胞数)显著降低受试者复发的风险。例如，消耗TREG细胞的方法是本领域已知的。降低TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺，抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)，CD25-消耗，mTOR抑制剂及其组合。
在一些实施方案中，制备方法包括在制备表达CAR的细胞之前减少(例如，消耗)TREG细胞的数目。例如，制造方法包括制造CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物前，使样品(例如，单采血液成分术样品)与抗GITR抗体和/或抗-CD25抗体(或其片段，或CD25结合配体)接触，例如，以消耗TREG细胞。
不希望受到特定理论的束缚，在单采血液成分术前或制备CAR表达细胞产品期间，降低受试者中免疫细胞的负调节物的水平(例如，减少不需要的免疫细胞，例如TREG细胞数量)可以降低TREG复发的风险。在一个实施方案中，在收集用于CAR表达细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法对受试者进行预治疗，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25-消耗或其组合中的一种或多种。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25-消耗，mTOR抑制剂或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25消耗或其组合中的一种或多种可以在表达CAR的细胞产物的输注之前，期间或之后发生。施用环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25消耗，mTOR抑制剂或其组合中的一种或多种可以在表达CAR的细胞产物的输注之前，期间或之后发生。
在一些实施方案中，制造方法包括在制备表达CAR的细胞之前减少(例如，消耗)TREG细胞的数目。例如，制造方法包括在制造CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物前，使样品(例如，单采血液成分术样品)与抗GITR抗体和/或抗-CD25抗体(或其片段，或CD25结合配体)接触，例如，以消耗TREG细胞。
在一个实施方案中，在收集用于CAR表达细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法对受试者进行预治疗，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25-消耗或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25消耗或其组合中的一种或多种可以在表达CAR的细胞产物的输注之前，期间或之后发生。
在一个实施方案中，在收集用于CAR表达细胞产物制造的细胞之前，将受试者用环磷酰胺预治疗，从而降低受试者对CAR表达细胞治疗复发的风险。在一个实施方案中，在收集用于CAR表达细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预治疗受试者，从而降低受试者对CAR表达细胞治疗复发的风险。
在一个实施方案中，要除去的细胞群体既不是调节性T细胞也不是肿瘤细胞，而是另外也不利地影响CART细胞的扩增和/或功能的细胞，例如表达CD14，CD11b，CD33，CD15或潜在免疫抑制细胞表达的其他标志物的细胞。在一个实施方案中，设想这样的细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞被同时去除，或者按照所述消耗或以其它顺序除去。
本文描述的方法可以包括多于一个选择步骤，例如多于一个消耗步骤。可以通过阴性选择来富集T细胞群体，例如，使用针对负选择细胞特有的表面标志物的抗体的组合。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14,CD20,CD11b,CD16,HLA-DR和CD8的抗体。
本文描述的方法还可以包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25，例如CD19,CD30,CD38,CD123,CD20,CD14或CD11b的肿瘤抗原)的群体中移除细胞，从而提供T调节消耗的，例如CD25+消耗的群体，以及适合于表达CAR，例如本文所述的CAR的肿瘤抗原消耗细胞。在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞与T调节的，例如CD25+细胞同时除去。例如，可以将抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段连接到相同的基质，例如可用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段的珠粒，或抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接到分离的珠粒上，其混合物可用于除去细胞。在其他实施方案中，T调节细胞例如CD25+细胞的去除以及肿瘤抗原表达细胞的去除是顺序的，并且可以以任何顺序发生。
还提供了包括从表达检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂的群体除去细胞，例如PD1+细胞，LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一种或多种的方法，从而提供T调节性消耗的，例如CD25+消耗的细胞，以及检查点抑制剂消耗的细胞，例如PD1+，LAG3+和/或TIM3+消耗的细胞群体。示例性的检查点抑制剂包括PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如TGFRβ)，例如，如本文所述。在一个实施方案中，与T调节性，例如CD25+细胞同时除去检查点抑制剂表达细胞。例如，可以将抗CD25抗体或其片段和抗检测点抑制剂抗体或其片段连接到可用于除去细胞的相同珠粒上，或抗CD25抗体，或其片段和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以连接到分离的珠粒上，其混合物可用于除去细胞。在其它实施方案中，T调节细胞(例如CD25+细胞)的去除以及检查点抑制剂表达细胞的去除是顺序的，并且可以例如以任一顺序发生。
本文描述的方法可以包括阳性选择步骤。例如，可以通过与抗-CD3/抗-CD28(例如3×28)缀合的珠粒，例如M-450CD3/CD28T温育足以阳性选择所需的T细胞的时间段来分离T细胞。在一个方面，时间段为约30分钟。在另一方面，时间范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一方面，所述时间段为至少1,2,3,4,5或6小时。在另一个方面，所述时间段为10至24小时。在一个方面，温育时间段为24小时。在与其它细胞类型相比较少的T细胞的任一情况下，例如从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下，可以使用更长的温育时间来分离T细胞。此外，使用更长的温育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长时间，允许T细胞结合CD3/CD28珠和/或通过增加或减少珠与T细胞的比例(如本文进一步描述)，可以为了或针对在培养开始时或在过程中的其它时间点优先选择T细胞亚群。
另外，通过增加或降低珠或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可以为了或针对在培养开始或在其它所需时间点优选地选择T细胞亚群。
在一个实施方案中，可以选择表达下述的一种或多种的T细胞群:IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔蛋白或其它适合的分子例如其它细胞因子。用于筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法确定。
对于通过正选择或负选择分离期望的细胞群，细胞的浓度和表面(例如，粒子，比如珠)可以变化。在某些方面，可能期望显著地降低其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，提高细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，一方面，使用约100亿细胞/ml，90亿/ml，80亿/ml，70亿/ml，60亿/ml或50亿/ml的浓度。一方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。一方面，使用7500万,8000万,8500万,9000万,9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度能够更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，比如CD28-阴性T细胞，或者从其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)更有效地捕获细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关的方面，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著地稀释T细胞和表面(例如，粒子比如珠)的混合物，使粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选择表达大量的期望结合粒子的抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀浓度中比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个方面，使用的细胞浓度为6×10e6/ml。在其它方面，使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml及其中任一整数值。
在其它方面，可以在2-10℃或在室温下在旋转器中以可变速率培养细胞可变的时间长度。
也可以在洗涤步骤之后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受到理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群中除去粒细胞及在一定程度上除去单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，将细胞悬浮在冷冻液中。虽然许多冷冻液和参数是本领域已知的且将适用于该情形，但是一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并贮存在液氮贮槽的汽相中。可以使用控制冷冻的其它方法以及在-20℃下或在液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些方面，将冷藏保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，并且允许在室温下静置1小时，之后使用本发明的方法活化。
本发明的上下文中还涉及在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间从受试者收集血样或单采血液成分术产物。因而，要扩增的细胞来源可以在任一必须的时间点收集，并且分离和冷冻期望的细胞比如T细胞用于随后用于许多将受益于免疫效应细胞疗法的疾病或病症(如本文所述那些)的免疫效应细胞疗法中。在一个方面，血样或单采血液成分术是从一般健康受试者采集的。在某些方面，血样或单采血液成分术是从处于发展为疾病的风险中但还没有发展为疾病的一般健康受试者采集的，并且分离和冷冻目的细胞用于随后使用。在某些方面，T细胞可以扩增、冷冻和在随后时间使用。在某些方面，可以在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任一治疗之前，从患者采集样品。在一个进一步的方面，在许多相关的治疗模式之前，从受试者的血样或单采血液成分术分离细胞，所述治疗模式包括但不限于用如下活性剂治疗:比如那他珠单抗(natalizumab)、艾法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化疗、放射、免疫抑制剂比如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体、或其它免疫烧蚀剂(immunoablative agents)比如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和照射。
在本发明的一个进一步的方面，在给受试者留下功能性T细胞的治疗之后直接从患者获得T细胞。在这点上，已经观察到在一些癌症治疗之后，特别地用损害免疫系统的药物治疗之后，在患者通常从治疗恢复期间的治疗后不久，获得的T细胞的质量可能是最佳的或对其在离体扩增的能力有所改善。同样地，在使用本文所述方法离体处理之后，这些细胞可以对于增强移植和体内扩增处于优选的状态。因此，在本发明的上下文之内预期在该恢复期收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。进一步，在某些方面，可以使用转移(例如，用GM-CSF转移)和调节方案产生受试者中的条件，其中特别地在治疗之后的定义时间窗期间，特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增是有利的。示例性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞及免疫系统的其它细胞。
在一个实施方案中，表达CAR分子，例如，本文所述的CAR分子的免疫效应细胞，是从已接受了低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者获得的。在一个实施方案中，免疫效应细胞，例如，T细胞的群体被工程化以表达CAR，在足够的时间之后被收获，或低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的足够给药后被收获，以使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞，例如，T细胞的水平，或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率至少暂时增加了。
在其他实施方案中，已经或将被工程化以表达CAR的免疫效应细胞，例如，T细胞群，可以通过用一定量的mTOR抑制剂接触离体处理，所述mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞，例如，T细胞的数目，或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。
在一个实施方案中，T细胞群体是二酰基甘油激酶(DGK)缺陷的。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低的或抑制的DGK活性的细胞。可通过遗传方法来生成DGK缺陷的细胞，例如，施用RNA干扰剂，例如，siRNA，shRNA，miRNA，以减少或防止DGK表达。备选地，可通过用本文所述DGK抑制剂处理来产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施方案中，T细胞群体是Ikaros缺陷的。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质的细胞，或具有降低的或抑制的Ikaros活性的细胞，可通过遗传方法来生成Ikaros缺陷的细胞，例如，施用RNA干扰剂，例如，siRNA,shRNA,miRNA，以减少或防止Ikaros表达。备选地，可以通过用Ikaros抑制剂，例如，来那度胺处理来产生Ikaros缺陷的细胞。
在实施方案中，T细胞群体是DGK缺陷和Ikaros缺陷的，例如，不表达DGK和Ikaros，或具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。此类DGK和Ikaros缺陷的细胞可通过任一本文所述的方法产生。
在一个实施方案中，所述NK细胞得自受试者。在另一实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest)。
同种异体的CAR
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如功能性T细胞受体(TCR)和/或人类白细胞抗原(HLA)(例如I类HLA和/或II类HLA)表达不足的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如工程化以使得其在其表面上不表达任一功能性TCR，工程化以使其不表达包括功能性TCR的一个或更多个亚基(例如，被工程化使得它不表达(或显示出减少的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε、和/或TCRζ)，或工程化以使得其在其表面产生非常少的功能性TCR(例如，工程化以使得其不表达(或显示出减少的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε、和/或TCRζ。备选地，T细胞可以表达基本上受损的TCR，例如通过表达突变或截短的形式的一个或更多个TCR的亚基。术语“基本上受损的TCR”是指该TCR不会在宿主中引发不利的免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如工程化以使得其在表面上不表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以工程化以使得细胞表面表达HLA(例如1类HLA和/或II类HLA)下调。在一些实施方案中，HLA的下调可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来实现。在一些实施方案中，T细胞可缺少功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I类和/或HLA II类。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任一合适的方法获得，包括一个或更多个TCR或HLA的亚基的基因敲除(knock out)或基因敲减(knock down)。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)的TCR和/或HLA的基因敲减。
在一些实施方案中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如通过本文所述任一方法工程化的细胞。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如可以降低表达CAR的细胞建立免疫效应物应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷、和TGFR(例如，TGFRβ)。抑制性分子的抑制，例如通过在DNA、RNA或蛋白水平的抑制，可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，可以使用如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA例如siRNA或shRNA，簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。
siRNA和shRNA以抑制TCR或HLA
在一些实施方案中，可以使用靶向编码本文所述的TCR和/或HLA和/或抑制性分子(例如PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270),KIR,A2aR,I类MHC,II类MHC,GAL9,腺苷和TGFRβ)的核酸的siRNA或shRNA来抑制TCR表达和/或HLA表达。可以使用任一常规表达系统，例如比如慢病毒表达系统获得siRNA和shRNAs在T细胞中的表达。
用于siRNA和shRNA以及示例性shRNA的表达系统描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第649和650段，其全部内容通过引用并入本文。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文中使用的“CRISPR”或“TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指簇状的规则间隔的短回文重复序列组或包括该重复序列组的系统。正如本文中使用的那样，“Cas”是指CRISPR-相关的蛋白。“CRISPR/Cas”系统指来源于CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默或突变TCR和/或HLA基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFRβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第651-658段中，其全部内容通过引用并入本文。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录活化剂样效应物核酸酶，一种可用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶,和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFRβ)。
TALEN、TALE及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第659-665段，其全部内容通过引用并入本文。
锌指核酸酶抑制HLA和/或TCR
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶,和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFRβ)。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第666-671段，其全部内容通过引用并入本文。
端粒酶表达
虽然不希望受任一特定理论的束缚，在一些实施方案中，由于在T细胞端粒缩短，治疗性T细胞具有在患者中短期持久性；相应地，用端粒酶基因转染能延长T细胞的端粒和改善患者中T细胞的持久性。见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancer inthe clinic”,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞，例如，T细胞，异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT。在一些方面，本公开内容提供了生产CAR表达细胞的方法，其包括将细胞与编码端粒酶亚基，例如，端粒酶催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT的核酸接触。该细胞可以在与编码CAR的构建体接触之前，同时或之后与所述核酸接触。
在一个方面，本公开内容描述了制备免疫效应细胞(例如，T细胞，或NK细胞)群的方法。在一个实施方案中，该方法包括:提供免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)群，将免疫效应细胞群与编码CAR的核酸接触；和将免疫效应细胞群与编码端粒酶亚基例如,hTERT的核酸在允许CAR和端粒酶表达的条件下接触。
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基的表达的启动子。
在实施方案中，hTERT具有GenBank蛋白质ID AAC51724.1的氨基酸序列((Meyerson et al.,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic SubunitGene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell Volume90,Issue 4,22 August 1997,Pages 785–795)如下:
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(SEQ IDNO:1332)
在一个实施方案中，hTERT具有与SEQ ID NO:1332的序列有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一性的序列。在一个实施例中，hTERT具有SEQ ID NO:1332的序列。在一个实施方案中，hTERT包含N末端、C-末端、或两端的缺失(例如，不超过5，10，15，20，或30个氨基酸的缺失)。在一个实施方案中，hTERT包含N末端、C-末端、或两端的转基因氨基酸序列(例如，不超过5，10，15，20，或30个氨基酸)。
在一个实施方案中，hTERT由GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyersonet al.,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell Volume 90,Issue 4,22August 1997,Pages 785–795):
在一个实施方案中，hTERT由具有与SEQ ID NO:1333的序列有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的序列的核酸编码。在一个实施方案中，hTERT是由SEQ ID NO:1333的核酸编码。
免疫效应细胞(例如，T细胞)的活化和扩增
通常可以使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利公开号20060121005中所述的方法进行免疫效应细胞T细胞的活化和扩增。
造血干细胞和祖细胞的离体扩增方法描述于美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)，可以应用于本发明的细胞。其它合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简言之，T细胞的离体培养和扩增可以包括:(1)从哺乳动物外周血收获物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这些细胞。除了美国专利号5,199,942描述的细胞生长因子之外，其他因子如flt3-L,IL-1,IL-3和c-kit配体可用于培养和扩增细胞。
通常，免疫效应细胞群体可以通过与连接有刺激CD3/TCR复合体相关的信号的活性剂和刺激T细胞表面上的共刺激性分子的配体的表面接触进行扩增。特别地，可以如本文所述的刺激T细胞群，比如通过与抗-CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗-CD2抗体接触，或通过与钙离子载体协同与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗-CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可以如本领域已知的其它常用方法那样使用抗-CD28抗体的实例，包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,France)(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在一些实施方案中，通过将细胞与抗CD3抗体和IL-2中的一种或两种接触来扩增和刺激免疫效应细胞(例如PBMC或T细胞)。在实施方案中，细胞在没有抗CD3或抗CD28珠的情况下扩增。
在某些方面，可以通过不同的方案提供用于T细胞的初次刺激信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的活性剂可以在溶液中或被偶联至表面。当与表面偶联时，可以把所述活性剂偶联到相同的表面(即，“顺式”形式)或单独的表面(即，“反式”形式)。备选地，可以把一种活性剂偶联到表面，且另一种活性剂可以在溶液中。在一个方面，提供共刺激信号的活性剂与细胞表面结合，且提供主要活化信号的活性剂在溶液中或被偶联至表面。在某些方面，两种活性剂都可以在溶液中。在一个方面，活性剂可以呈可溶性形式，然后被交联至表面，比如表达将会与该活性剂结合的Fc受体或抗体或其它结合剂的细胞。在这点上，关于人工抗原呈递细胞(aAPCs)，参见例如美国专利申请公开号:20040101519和20060034810，考虑其在本发明中用于活化和扩增T细胞。
在一个方面，把两种活性剂都固定在珠上，在相同的珠上，即“顺式”，或在不同的珠上，即“反式”。例如，提供主要活化信号的活性剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的活性剂是抗-CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种活性剂以等同的分子数量被共同固定在相同珠上。在一个方面，使用与所述珠结合的每种抗体的1:1的比率，用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在某些方面，使用与所述珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特别的方面，与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个方面，与所述珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100及其中所有整数值。在一个方面，与粒子结合的抗-CD28抗体比抗CD3抗体多，即CD3:CD28的比率小于1。在某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特别的方面，使用1:100的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:75的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个进一步的方面，使用1:50的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:30的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:10的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用的与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在还有一个方面中，使用3:1的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。
可以使用1:500至500:1及其间任一整数值的粒子与细胞的比率来刺激T细胞或其它靶细胞。正如本领域普通技术人员可以容易地理解的那样，粒子与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒子尺寸。例如，小尺寸珠可能仅结合少数细胞，而较大珠可结合许多细胞。在某些方面，细胞与粒子的比率范围为1:100至100:1及其中任一整数值，并且在进一步的方面，也可以使用包括1:9至9:1的及其中任一整数值的比率来刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗-CD3-和抗-CD28偶联的粒子与T细胞的比率可以如上所述变化，然而某些合适值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个合适的比率为至少1:1的粒子/T细胞。在一个方面，使用1:1或更小的粒子与细胞的比率。在一个特别的方面，合适的粒子:细胞比率为1:5。在进一步的方面，粒子与细胞的比率可以根据刺激的天数变化。例如，在一个方面，在第一天，粒子与细胞的比率为1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天向细胞中加入另外的粒子，直到10天，最终比率为1:1至1:10(基于加入当天的细胞计数)。在一个特别的方面，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为1:1，并在刺激的第三天和第五天调节为1:5。在一个方面，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:5。在一个特别的方面，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为2:1，并在刺激的第三天和第五天调节为1:10。在一个方面，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技术人员应当理解多种其它比率都可以适用于本发明。特别地，比率将根据粒径及细胞尺寸和类型而变化。在一个方面，在第一天，最典型的使用比率为约1:1、2:1和3:1左右。
在本发明进一步的方面，将细胞比如T细胞与活性剂包被的珠混合，接着分离珠和细胞，然后培养细胞。在备选的方面，在培养之前，活性剂-包被的珠和细胞没有分离，而是一起培养。在一个进一步的方面，首先通过施加力(比如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，可以通过允许附着了抗-CD3和抗-CD28的顺磁性的珠(3x28珠)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如，比率1:1的M-CD3/CD28 T顺磁性的珠)在缓冲液中混合，缓冲液例如为PBS(不含二价阳离子，比如钙和镁)。此外，本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任一细胞浓度。例如，样品中靶细胞可能非常少，且仅占样品的0.01％，或全部样品(即，100％)可以包含目的靶细胞。因此，任一细胞数量都在本发明的上下文之内。在某些方面，可能期望显著减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和粒子的最大接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿/ml、8 0亿n/ml、70亿/ml、60亿/ml、50亿/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0千万个细胞/ml的浓度。在仍然一个方面，使用从7.5、8、8.5、9、9.5或10千万个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，比如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些方面将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常具有弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施方案中，通过例如本文所述的方法扩增用编码CAR，例如，本文所述的CAR的核酸转导的细胞。在一个实施方案中，将细胞在培养中扩增几个小时(例如，约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，18，21小时)到约14天(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14天)。在一个实施方案中，细胞被扩增4至9天。在一个实施方案中，细胞被扩增8天或更短，例如，7,6或5天。在一个实施方案中，所述细胞，例如，本文所述的CAR细胞在培养中扩增5天，所得细胞比相同的培养条件下培养扩增9天的相同的细胞更有效。效力可以通过例如，由不同的T细胞的功能，例如增殖，靶细胞杀伤，细胞因子的产生，活化，迁移，或它们的组合来定义。在一个实施方案中，相比于在相同培养条件下扩增9天的相同细胞，扩增了5天的细胞，例如，本文所述的CD19 CAR细胞显示细胞倍增的至少1、2、3或4倍增加。在一个实施方案中，所述细胞，例如，表达本文所述的CAR的细胞培养扩增了5天，并且相比于在相同培养条件下扩增9天的相同细胞，所得的细胞显示出更高的促炎细胞因子产生，例如，IFN-γ和/或GM-CSF的水平。在一个实施方案中，相比于在相同培养条件下扩增9天的相同细胞，扩增了5天的细胞，例如，本文所述的CAR细胞显示出促炎细胞因子产生，例如，IFN-γ和/或GM-CSF的水平以pg/ml计至少1、2、3、4、5、10倍或更多倍的增加。
在本发明的一个方面，混合物可以培养几小时(约3小时)至约14天或其间的任一每小时整数值。在一个方面，可以将混合物培养21天。在本发明的一个方面，将珠和T细胞一起培养约8天。在一个方面，将珠和T细胞一起培养2-3天。
也可能需要几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以为60天或以上。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如,极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15,(Lonza))，其可以含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白介素-1(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任一其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括，但不限于表面活性剂、plasmanate和还原剂比如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，具有加入的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适合量的血清(或血浆)或定义的激素组、和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不在输注到受试者中的细胞培养物中。靶细胞保持在载体生长必需的条件下，例如适合的温度(例如37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
在一个实施方案中，将细胞在合适的培养基(如，本文中所描述的培养基)中扩增，所述培养基包括导致细胞在14天的扩增期间增加至少200倍(例如，200倍，250倍，300倍，350倍)的一种或多种白介素，例如，如通过本文所述的方法如流式细胞术测定。在一个实施方案中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩增。
在一些实施方案中，在制造CAR表达细胞期间，本文所述的CAR表达细胞(例如T细胞如CD4+T细胞或CD8+T细胞)与包含白介素-15(IL-15)多肽，白介素15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽例如,hetIL-15的组合的组合物例如，离体接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽的组合物在制造CAR表达细胞期间例如，离体接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽的组合的组合物在制造CAR表达细胞期间，例如，离体接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与包含hetIL-15的组合物在制造CAR表达细胞期间，例如，离体接触。
在一个实施方案中，本文描述的CAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)与包含hetIL-15的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，本文描述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，本文描述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，接触导致淋巴细胞亚群例如，CD8+T细胞的存活和增殖。
在一个实施方案中，本文公开的制备方法进一步包括将免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)群体与编码端粒酶亚基例如hTERT的核酸接触。编码端粒酶亚基的核酸可以是DNA。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分术外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制T细胞群(TC,CD8+)的辅助T细胞群(TH,CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体的离体T细胞扩增产生T细胞群，该细胞群在约第8-9天前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包括越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，向受试者输注主要包括TH细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组，则使该亚组在更大程度上扩增可能是有益的。
进一步，除了CD4和CD8标记物之外，其它表型标记物显著变化，但大部分在细胞扩增过程中可再重现。因此，这样的可重现性使能够针对特定目的裁剪活化的T细胞产物。
一旦构建CAR,例如，CD19 CAR，则可以使用多种试验来评价分子的活性，比如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力、在不存在再刺激下维持T细胞扩增和在适合的体外和动物模型中的抗癌活性。用于评价CAR,例如，CD19 CAR的效应的试验在下文进一步详细描述。
可以使用原代T细胞中CAR表达的Western印迹分析来检测单体和二聚体的存在，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第695段所述，其通过引用整体并入本文。
可以通过流式细胞测量术测量抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。例如，用αCD3/αCD28珠刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，接着在要被分析的启动子的控制下用表达GFP的慢病毒载体转导。示例性的启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在第6天，通过流式细胞测量术测量CD4+和/或CD8+T细胞亚组中培养物的GFP荧光。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。备选地，在第0天，用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，并在第1天使用表达CAR的双顺反子慢病毒载体用CAR转导以及使用2A核醣体跳跃序列用eGFP转导。洗涤后，在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)的存在下，用CD19+K562细胞(K562-CD19)，野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激培养物。每隔一天以100IU/ml将外源IL-2加入到培养物中。使用基于珠的计数，通过流式细胞术计数GFP+T细胞。参见例如Milone etal.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量在不存在再刺激下保持的CAR+T细胞扩增。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天用指定的CAR转导，在培养的第8天，使用Coulter Multisizer粒子计数器、NexcelomCellometer Vision或Millipore Scepter测量平均T细胞体积(fl)。
动物模型也可用于测量表达CAR的细胞活性，例如如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第698段所述，其全部内容通过引用并入本文。
可以评估剂量依赖性CAR治疗反应，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第699段所述，其全部内容通过引用并入本文。之前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第700段所述，其全部内容通过引用并入本文。细胞毒性可以通过标准的51Cr释放测定来评估，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第701段所述，其全部内容通过引用并入本文。成像技术可用于评估荷瘤动物模型中CAR的特异性运输和增殖，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第702段所述，其全部内容通过引用并入本文。
其他测定法，包括本文实施例部分所述的以及本领域已知的那些也可用于评价本文所述的CAR。
或者，或与本文公开的方法组合，公开了用于以下一种或多种的方法和组合物:CAR表达细胞的检测和/或定量(例如，体外或体内(例如，临床监测))；免疫细胞扩增和/或活化；和/或CAR特异性选择，其涉及使用CAR配体。在一个示例性实施方案中，CAR配体是结合CAR分子的抗体，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域的抗体(例如结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或结合细胞外结合结构域的恒定区的抗体)。在其他实施方案中，CAR配体是CAR抗原分子(例如，如本文所述的CAR抗原分子)。
在一个方面，公开了用于检测和/或定量CAR表达细胞的方法。例如，CAR配体可以用于体外或体内检测和/或定量CAR表达细胞(例如，临床监测患者中的CAR表达细胞或给予患者剂量)。该方法包括:
提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包括标签，珠，放射性或荧光标记的CAR配体)；
获得CAR表达细胞(例如，获取含有CAR表达细胞的样品，例如制造样品或临床样品)；
在结合发生的条件下使CAR表达细胞与CAR配体接触，从而检测存在的CAR表达细胞的水平(例如，量)。可以使用标准技术例如FACS，ELISA等检测CAR表达细胞与CAR配体的结合。
在另一方面，公开了扩增和/或激活细胞(例如，免疫效应细胞)的方法。该方法包括:
提供CAR表达细胞(例如，第一CAR表达细胞或瞬时表达CAR的细胞)；
在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下，使所述CAR表达细胞与CAR配体(例如本文所述的CAR配体)接触，从而产生活化和/或扩增的细胞群体。
在某些实施方案中，CAR配体存在于(例如，固定化或附着于基质，例如非天然存在的基质)上。在一些实施方案中，基质是非细胞基质。非细胞基质可以是选自例如板(例如，微量滴定板)，膜(例如，硝酸纤维素膜)，基质，芯片或珠的固相支持体。在实施方案中，CAR配体存在于基质中(例如，在基质表面上)。CAR配体可以与基质共价或非共价(例如交联)固定化，连接或缔合。在一个实施方案中，CAR配体与珠连接(例如共价连接)。在上述实施方案中，免疫细胞群体可以在体外或离体扩增。该方法还可以包括在CAR分子的配体存在下，例如使用本文所述的任一方法培养免疫细胞群。
在其它实施方案中，扩增和/或活化细胞的方法还包括加入第二刺激分子，例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可以固定到基质，例如一个或多个珠子上，从而提供增加的细胞扩增和/或活化。
在其他实施方案中，提供了用于选择或富集CAR表达细胞的方法。该方法包括使CAR表达细胞与如本文所述的CAR配体接触；并基于CAR配体的结合选择细胞。
在其他实施方案中，提供了用于消耗(例如，减少和/或杀死)CAR表达细胞的方法。该方法包括使CAR表达细胞与如本文所述的CAR配体接触；并基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少CAR表达细胞的数量和/或杀死CAR表达细胞。在一个实施方案中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融药物)偶联。在另一个实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性。
可用于本文所公开的方法中的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena et al.,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody toDetect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”,PLOS March 2013 8:3e57838，其内容通过引用并入本文。在一些方面和实施方案中，本文的组合物和方法针对T细胞的特定亚组优化，例如，如在2015年7月31日提交的PCT/US2015/043219中所述，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，与对照T细胞，例如，表达相同构建体的不同类型(例如，CD8+或CD4+)的T细胞相比，T细胞的优化亚组显示增强的持久性。在一些实施方案中，CD4+T细胞包含本文所述的CAR，所述CAR包含适合于(例如，优化用于例如导致增强的持久性)CD4+T细胞的胞内信号传导结构域，例如ICOS结构域。在一些实施方案中，CD8+T细胞包含本文所述的CAR，所述CAR包含适合于(例如，优化用于例如导致增强的持久性)CD8+T细胞的胞内信号传导结构域，例如4-1BB结构域，CD28结构域或除ICOS结构域之外的另一共刺激结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如包含抗原结合结构域的CAR。
在一个方面，本文描述了治疗受试者，例如患有癌症的受试者的方法。该方法包括给予所述受试者有效量的:
1)包含CAR(CARCD4+)的CD4+T细胞，其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS结构域；和
2)包含CAR(CARCD8+)的CD8+T细胞，其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，例如4-1BB结构域，CD28结构域或除ICOS结构域之外的另一共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，该方法还包括施用:
3)包含CAR(第二CARCD8+)的第二CD8+T细胞，其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含不存在于CARCD8+上的胞内信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域，并且任选地不包含ICOS信号传导结构域。
制造/生产方法
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在用细胞(例如，本文所述的免疫效应细胞，例如表达由截短的PGK1启动子驱动的CAR的免疫效应细胞)治疗之后施用T细胞消耗剂，从而减少(例如，消耗)CAR表达细胞(例如CD19 CAR表达细胞)。这种T细胞消耗剂可用于有效地消耗CAR表达细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)以减轻毒性。在一些实施方案中，根据本文的方法制备CAR表达细胞，例如根据本文方法测定(例如，在转染或转导之前或之后)。
在一些实施方案中，T细胞消耗剂在施用细胞，例如本文所述的免疫效应细胞群后1，2，3，4或5周施用。
在一个实施方案中，T细胞消耗剂是例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体诱导的细胞死亡而消耗CAR表达细胞的活性剂。例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达由能够诱导细胞死亡，例如ADCC或补体诱导的细胞死亡的分子识别的抗原(例如，靶抗原)。例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的靶蛋白(例如受体)。这些靶蛋白的实例包括但不限于EpCAM，VEGFR，整联蛋白(例如整联蛋白ανβ3,α4,αΙ3/4β3,α4β7,α5β1,ανβ3,αν)，TNF受体超家族的成员(例如TRAIL-R1，TRAIL-R2)，PDGF受体，干扰素受体，叶酸受体，GGPNMB,ICAM-1,HLA-DR,CEA,CA-125,MUC1,TAG-72,IL-6受体，5T4,GD2,GD3,CD2,CD3,CD4,CD5,CD11,CD11a/LFA-1,CD15,CD18/ITGB2,CD19,CD20,CD22,CD23/lgE受体，CD25,CD28,CD30,CD33,CD38,CD40,CD41,CD44,CD51,CD52,CD62L,CD74,CD80,CD125,CD147/basigin，CD152/CTLA-4,CD154/CD40L,CD195/CCR5,CD319/SLAMF7和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个胞外表位但是缺乏细胞质结构域内的一个或多个区域的形式)。
在一些实施方案中，CAR表达细胞共表达CAR和靶蛋白，例如天然表达靶蛋白或被工程化以表达靶蛋白。例如，细胞，例如免疫效应细胞群体可以包括包含CAR核酸(例如本文所述的CAR核酸)和编码靶蛋白的核酸的核酸(例如，载体)。
在一个实施方案中，T细胞消耗剂是CD52抑制剂，例如抗CD52抗体分子，例如阿仑单抗。
在其他实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞群体，表达如本文所述的CAR分子(例如CD19CAR)和由T细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20。在靶蛋白是CD20的实施方案中，T细胞消耗剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。
在任何上述方法的进一步实施方案中，所述方法还包括将细胞例如造血干细胞或骨髓移植到哺乳动物中。
在另一方面，本发明的特征在于在细胞移植前对哺乳动物进行调节的方法。该方法包括向哺乳动物施用有效量的包含CAR核酸或多肽例如CD19 CAR核酸或多肽的细胞。在一些实施方案中，细胞移植是干细胞移植，例如造血干细胞移植或骨髓移植。在其他实施方案中，在细胞移植之前调节受试者包括减少受试者中靶标表达细胞，例如表达CD19的正常细胞或表达CD19的癌细胞的数目。
生物聚合物递送方法
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种CAR表达细胞可以通过生物聚合物支架例如生物聚合物植入物施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的CAR表达细胞的递送，扩增和/或分散。生物聚合物支架包含生物相容性(例如，基本上不诱导炎症或免疫应答)和/或可天然存在或合成的可生物降解的聚合物。示例性生物聚合物描述于例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的段落1004-1006中，其全部内容通过引用并入本文。
治疗应用
CD19相关疾病和/或病症
一方面，本发明提供了治疗与CD19表达相关的疾病的方法。一方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其中部分癌症对CD19是阴性的，并且部分癌症对于CD19是阳性的。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗经历了与CD19表达相关疾病的治疗的受试者，其中经历了与CD19表达相关的治疗(例如用CD19 CAR治疗)的受试者表现出与CD19表达相关的疾病。
另一方面，本发明提供了治疗与B细胞抗原例如CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1中的一种或多种相关的疾病的方法。一方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其中部分肿瘤对B细胞抗原呈阴性，部分肿瘤对B细胞抗原呈阳性。例如，本发明的组合物和方法可用于治疗与B细胞抗原表达相关的疾病进行治疗的受试者，其中经历与B细胞抗原表达相关的治疗，例如用靶向B细胞抗原的CAR治疗的受试者显示与B细胞抗原表达相关的疾病。在第三方面，本发明提供了治疗与B细胞抗原表达相关，例如与CD19和一种或多种其他B细胞抗原的表达相关的疾病的方法。
一方面，本发明涉及包含有效连接到启动子的CD19 CAR的载体，用于在哺乳动物细胞例如T细胞或NK细胞中表达。一方面，本发明提供了表达CD19 CAR的重组细胞，例如T细胞或NK细胞，用于治疗表达CD19的癌症，其中表达CD19 CAR的重组T细胞被称为CD19 CART。在一个方面，本文所述的CD19 CART能够使癌细胞与其表面上表达的至少一种CD19 CAR接触，使得CART靶向癌细胞，并且癌的生长被抑制。
一方面，本发明涉及CD22抑制剂，其是CD22 CART，例如T细胞，其表达CD22 CAR，用于与CD19 CARTS组合治疗表达CD22的肿瘤，其中表达CD22 CAR的重组T细胞称为CD22CART。在一个方面，本文所述的CD22 CART能够使肿瘤细胞与其表面上表达的至少一种CD22CAR接触，使得CD22 CART靶向肿瘤细胞，并且肿瘤的生长被抑制。
一方面，本发明涉及一种抑制表达CD19的癌细胞生长的方法，包括使癌细胞与表达CD19 CAR的细胞，例如CD19 CART细胞，以及一种或多种如本文所述的其它CAR表达细胞接触，使得CART响应于抗原而被激活并靶向癌细胞，其中癌症的生长被抑制。CD19 CAR表达细胞，例如T细胞与B细胞抑制剂，例如本文所述的B细胞抑制剂组合施用。
在一些实施方案中，CD19抑制剂(例如，表达结合CD19的CAR分子，例如本文所述的结合CD19的CAR分子的一种或多种细胞)和B细胞抑制剂(例如，如本文所述CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1的一种或多种抑制剂)同时施用。在一些实施方案中，CD19抑制剂和B细胞抑制剂同时输注入受试者，例如在相同的输注体积中混合。在其它实施方案中，同时施用包括CD19抑制剂和B细胞抑制剂的单独施用，例如每次施用在预定的时间间隔(例如彼此之间15,30或45分钟内)开始。
在一些实施方案中，CD19抑制剂递送的开始和B细胞抑制剂递送的开始在彼此1,2,3,4,6,12,18或24小时内，或在彼此1,2,3,4,5,10,15,20,25,30,35,40,60,80或100天。在一些实施方案中，CD19抑制剂递送的结束和B细胞抑制剂递送的结束在彼此1,2,3,4,6,12,18或24小时之内，或在彼此1,2,3,4,5,10,15,20,25,30,35,40,60,80或100天。在一些实施方案中，在CD19抑制剂递送(例如，输注)和B细胞抑制剂递送(例如，输注)的结束之间施用期限的重叠是至少1,2,3,4,5,10,15,20,25,30或45分钟。
在一些实施方案中，施用B细胞抑制剂，同时在受试者中存在(例如经历扩增)表达结合CD19的CAR分子的一种或多种细胞。在一些实施方案中，施用CD19抑制剂，同时在受试者中存在(例如，经历扩增)表达结合CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a中的一种或多种的CAR分子的一种或多种细胞。
本发明包括(其中包括)一种细胞疗法，其中T细胞被遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，并且将CAR T细胞注入有需要的受体。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的T细胞能够在体内复制，导致长期持续性，其可导致持续的肿瘤控制。在多个方面，施用于患者的T细胞或其后代在给予患者T细胞后在患者中持续至少四个月，五个月，六个月，七个月，八个月，九个月，十个月，十一个月，十二个月，十三个月，十四个月，十五个月，十六个月，十七个月，十八个月，十九个月，二十个月，二十一个月，二十二个月，二十三个月，两年，三年，四年，或五年。
本发明还包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞例如NK细胞或T细胞被修饰(例如通过体外转录的RNA)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)并将CAR表达(例如，CAR T)细胞注入有需要的受体。输注的细胞能够杀死受体中的癌细胞。因此，在多个方面，施用于患者的表达CAR的细胞例如T细胞在CAR表达细胞例如T细胞，施用于患者后存在不到一个月，例如三周，两周，一周。
不希望受任何特定理论束缚，由CAR修饰的T细胞引起的抗癌免疫应答可能是主动或被动免疫应答，或者备选地可能是由于直接与间接的免疫应答。一方面，CAR(例如，CD19-CAR)转导的T细胞在应答表达靶抗原(例如CD19)的人类癌细胞中表现出特异性促炎细胞因子分泌和有效的溶细胞活性，抵抗可溶性靶抗原抑制，介导旁观者杀伤并介导已确立的人类癌症的消退。例如，靶抗原表达癌症的异质区域内的少抗原癌细胞可能容易受到先前与相邻的抗原阳性癌细胞反应的靶抗原重定向的T细胞的间接破坏。
一方面，本发明的CAR修饰的细胞，例如完全人类CAR T细胞，可以是用于哺乳动物中的离体免疫和/或体内疗法的一种类型的疫苗。在一个方面，哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物之前，以下至少一种在体外发生:i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是众所周知的，并且在下面更全面地讨论。简而言之，用表达本文公开的CAR的载体从哺乳动物(例如人)中分离细胞并进行遗传修饰(即在体外转导或转染)。CAR修饰的细胞可以施用于哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR修饰的细胞可以相对于受体是自体的。或者，相对于受体，细胞可以是同种异体的，同基因的或异种的。
造血干细胞和祖细胞的离体扩增方法描述于美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)，可以应用于本发明的细胞。其它合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简言之，T细胞的离体培养和扩增可以包括:(1)从外周血收集物或骨髓外植体收集哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这些细胞。除了美国专利号5,199,942号描述的细胞生长因子外，其他因素如flt3-L,IL-1,IL-3和c-kit配体可用于培养和扩增细胞。
除了在体外免疫中使用基于细胞的疫苗之外，还包括在本文所述的方法中的是用于体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，本文所述的CAR表达细胞用于治疗与一种或多种B细胞抗原的表达相关的疾病，病症和状况。在某些方面，细胞用于治疗具有患与一种或多种B细胞抗原表达相关的疾病，病症和状况的风险的患者。因此，本发明提供(尤其是)用于治疗或预防与B细胞抗原表达相关的疾病，病症和状况的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文描述的CD19 CAR表达细胞与本文所述的一种或多种B细胞抑制剂的组合。
本发明还提供了抑制增殖或减少表达CD19的细胞群体的方法，所述方法包括将包含CD19表达细胞的细胞群与结合CD19表达细胞的本文所述的抗CD19 CAR表达细胞接触，并使表达CD19的细胞群与本文所述的一种或多种B细胞抑制剂接触。在具体方面，本发明提供了抑制表达CD19的癌细胞的增殖或减少其群体的方法，所述方法包括使表达CD19的癌细胞群与结合CD19表达细胞的本文所述的抗CD19 CAR表达细胞接触，并使CD19表达细胞与本文所述的一种或多种B细胞接触。一方面，本发明提供了抑制表达CD19的癌细胞的增殖或减少其群体的方法，所述方法包括使表达CD19的癌细胞群与结合CD19表达细胞的本文所述的抗CD19 CAR表达细胞接触，并使CD19表达细胞与本文所述的一种或多种B细胞接触。在某些方面，本文所述的抗CD19 CAR表达细胞与本文所述的一种或多种B细胞的组合将在具有与CD19表达细胞相关的血液癌症或另一种癌症的受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的量，数目，数量或百分比相对于阴性对照降低至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少65％，至少75％，至少85％，至少95％，或至少99％。在一方面，受试者是人类。
本发明还提供抑制增殖或减少包含CD19表达细胞和表达第二B细胞抗原的细胞的细胞群的方法。一方面，CD19和第二B细胞抗原由群体内相同的细胞表达。另一方面，CD19和第二B细胞抗原由群体内不同的细胞亚组表达。在另一方面，CD19和第二B细胞抗原通过群体内重叠的细胞亚组表达，使得一些细胞表达CD19和第二B细胞抗原，一些细胞表达CD19，一些细胞表达第二B细胞抗原。
本发明还提供了抑制表达CD19和第二B细胞抗原的细胞群增殖或减少该细胞群的方法，所述方法包括(i)使包含CD19表达细胞的细胞群与结合CD19表达细胞的本文所述的抗CD19 CAR表达细胞接触，和(ii)使第二B细胞抗原表达细胞与结合第二B细胞抗原表达细胞的本文所述的第二种CAR表达细胞接触。在具体方面，本发明提供了抑制表达CD19和第二B细胞抗原的癌细胞群体的增殖或减少所述群体的方法，所述方法包括(i)使表达CD19的癌细胞群与结合CD19表达细胞的本文所述的抗CD19CAR表达细胞接触，和(ii)使第二B细胞抗原表达细胞群与结合表达第二B细胞抗原的细胞的本文所述的第二种CAR表达细胞接触。一方面，本发明提供了抑制表达CD19和/或第二B细胞抗原的癌细胞群体的增殖或减少所述群体的方法，所述方法包括(i)使表达CD19的癌细胞群与结合CD19表达细胞的本文所述的抗CD19 CAR表达细胞接触，和(ii)使第二B细胞抗原表达细胞群体与结合表达第二B细胞抗原的细胞的本文所述的第二种CAR表达细胞接触。在某些方面，本文所述的抗CD19 CAR表达细胞和本文所述的第二种CAR表达细胞的组合将在具有与CD19和/或第二B细胞抗原表达细胞相关的血液癌症或另一种癌症的受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的量，数目，数量或百分比相对于阴性对照降低至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少65％，至少75％，至少85％，至少95％，或至少99％。在一方面，受试者是人类。
本发明还提供了用于预防，治疗和/或控制与CD19表达细胞相关的疾病(例如，表达CD19的血液癌症或非典型癌症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用结合CD19表达细胞的抗CD19 CAR-表达细胞，并施用本文所述的一种B细胞抑制剂。在一方面，受试者是人类。与表达CD19的细胞相关的病症的非限制性实例包括自身免疫性病症(例如狼疮)，炎症性病症(例如过敏和哮喘)和癌症(例如表达CD19的血液癌症或非典型癌症)。
本发明还提供了用于预防，治疗和/或控制与CD19和/或第二B细胞抗原表达细胞相关疾病(例如，表达CD19和/或第二B细胞抗原的血液癌症或非典型癌症)的方法，所述方法包括向需要的受试者施用结合CD19表达细胞和B细胞抑制剂的抗CD19 CAR表达细胞。
本发明还提供了用于预防，治疗和/或控制与CD19表达细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用结合CD19表达细胞的本发明的抗CD19 CART细胞。在一方面，受试者是人类。
本发明还提供了用于预防与表达CD19的细胞相关的癌症复发的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用与表达CD19的细胞结合的本发明的抗CD19 CART细胞。在一个方面，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的结合CD19表达细胞的本文所述的抗CD19CART细胞与有效量的另一种疗法的组合。
一方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法。该方法包括向受试者施用本文所述的CD19 CAR表达细胞，例如T细胞与B细胞抑制剂的组合，使得在受试者中治疗癌症。可通过本文所述方法治疗的癌症的实例是与CD19表达相关的癌症。在一个实施方案中，该疾病是实体或液体肿瘤。在一个实施方案中，疾病是血液癌症，例如如本文所述。
与CD19表达相关的非癌症相关适应证包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)，炎症性病症(变态反应和哮喘)和移植。
在一些实施方案中，可用本文所述的组合治疗的癌症是多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤是血液中的癌症，其特征在于血浆细胞克隆在骨髓中的积聚。目前用于多发性骨髓瘤的疗法包括但不限于用来那度胺治疗，其是沙利度胺的类似物。来那度胺具有包括抗肿瘤活性，血管发生抑制和免疫调节的活性。在一些实施方案中，例如本文所述的CD19 CAR可用于靶向骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，本文所述的组合可以与一种或多种另外的疗法，例如来那度胺治疗一起使用。
本文所述的CAR表达细胞可以单独或作为与稀释剂和/或与其它成分如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合的药物组合物施用。
血液癌症
血液癌症状况是影响血液，骨髓和淋巴系统的癌症的类型，如白血病，淋巴瘤和恶性淋巴细胞增生症。
在一个实施方案中，血液癌症是白血病。在一个实施方案中，癌症选自一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴性白血病(BALL)，T细胞急性淋巴性白血病(TALL)，小淋巴细胞性白血病(SLL)，急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；附加的血液癌症或血液病症包括但不限于套细胞淋巴瘤(MCL)，B细胞幼淋巴细胞白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，以及“白血病前期”，其是由无效产生(或发育异常)髓血细胞联合的一组不同的血液学状况。与CD19，CD20或CD22表达相关的疾病包括但不限于非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或表达CD19，CD20或CD22的增殖性疾病；及其任何组合。
白血病可分为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可进一步分为急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴性白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其他相关病症包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)，这是通过骨髓血细胞无效生产(或发育异常)和转化为AML的风险联合起来的血液病症的多样化集合。
淋巴瘤是从淋巴细胞发育出来的一组血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
一方面，本发明涉及治疗具有霍奇金淋巴瘤的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的表达CD19 CAR分子，例如本文所述的CD19CAR分子的细胞和B细胞抑制剂。
一方面，本发明的组合物和CART细胞或表达CAR的NK细胞特别可用于治疗B细胞恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤，例如DLBCL，滤泡淋巴瘤或CLL。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是由B或T细胞形成的一组淋巴细胞癌。NHL发生在任何年龄，并且通常特征是比正常大的淋巴结，体重减轻和发烧。不同类型的NHL被分类为侵略性(快速增长)和惰性(缓慢生长)类型。B细胞非霍奇金淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，滤泡淋巴瘤，免疫母细胞性大细胞淋巴瘤，前体B成淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。T细胞非霍奇金淋巴瘤的实例包括蕈样真菌病，间变性大细胞淋巴瘤和前体T成淋巴细胞淋巴瘤。在骨髓或干细胞移植后发生的淋巴瘤通常是B细胞非霍奇金淋巴瘤。参见，例如，Maloney.NEJM.366.21(2012):2008-16。
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一种从B细胞发育的NHL形式。DLBCL是可以在淋巴结或淋巴系统外部例如在胃肠道，睾丸，甲状腺，皮肤，乳腺，骨骼或脑中产生的侵袭性淋巴瘤。细胞形态的三个变型通常在DLBCL中观察到:中心母细胞的，免疫母细胞的和间变的。中心母细胞形态是最常见的，并且具有具最小细胞质的中大型淋巴细胞的外观。DLBCL有几种亚型。例如，原发性中枢神经系统淋巴瘤是一种仅影响大脑的DLBCL，并且不同于影响大脑外部区域的DLBCL进行治疗。另一种类型的DLBCL是原发性纵隔B细胞淋巴瘤，其通常发生在年轻患者中并在胸部迅速生长。DLBCL的症状包括由淋巴结肿大引起的颈部，腋窝或腹股沟中无痛快速肿胀。对于某些受试者，肿胀可能是痛苦的。DLBCL的其他症状包括盗汗，无法解释的发烧和体重减轻。虽然大多数DLBCL患者是成年人，但这种疾病有时发生在儿童中。DLBCL的治疗包括化学疗法(例如环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，泼尼松，依托泊苷)，抗体(如Rituxan)，放射或干细胞移植。
滤泡性淋巴瘤是一种非霍奇金淋巴瘤，是卵泡中心B细胞(中心细胞和中心母细胞)的淋巴瘤，其具有至少部分滤泡型。滤泡淋巴瘤细胞表达B细胞标志物CD10，CD19，CD20和CD22。滤泡性淋巴瘤细胞对CD5通常是阴性的。在形态上，滤泡性淋巴瘤肿瘤由含有中心细胞(也称为裂开的滤泡中心细胞或小细胞)和中心母细胞(也称为大的非裂开的中心细胞或大细胞)的混合物的滤泡组成。滤泡被非恶性细胞，主要是T细胞包围。滤泡主要含有中心细胞，具有少量中心母细胞。世界卫生组织(WHO)在形态上对该疾病进行了如下分级:1级(每个大功率场(hpf)<5个中心母细胞)；2级(6-15个中心母细胞/hpf)；3级(>15个中心母细胞/hpf)。3级进一步细分为以下等级:3A级(仍然存在中心细胞)；3B级(滤泡几乎完全由中心母细胞组成)。滤泡淋巴瘤的治疗包括化疗，例如，烷基化剂，核苷类似物，含蒽环类药物的方案，例如称为CHOP-环磷酰胺的组合疗法，多柔比星，长春新碱，强的松/泼尼松龙，抗体(例如利妥昔单抗)，放射免疫治疗和造血干细胞移植。
CLL是一种B细胞恶性肿瘤，其特征在于骨髓，血液，淋巴结和脾脏中的肿瘤细胞增殖和积累。诊断CLL时的中位年龄约为65岁。目前的治疗包括化疗，放射治疗，生物治疗或骨髓移植。有时，手术治疗症状(例如，脾切除术去除扩大的脾脏)或通过放射治疗(例如去膨胀肿大的淋巴结)。用于治疗CLL的化学治疗剂包括例如氟达拉滨，2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)，苯丁酸氮芥，长春新碱，喷司他丁，环磷酰胺，阿仑单抗(Campath-1H)，多柔比星和泼尼松。CLL的生物疗法包括抗体，例如阿仑单抗，利妥昔单抗和奥法木单抗；以及酪氨酸激酶抑制剂疗法。可以使用许多标准来分类CLL的阶段，例如Rai或Binet系统。Rai系统描述了CLL有五个阶段:仅存在淋巴细胞增多的0期；存在淋巴结病的I期；II期，其中存在脾肿大，淋巴结病或两者；III期，其中存在贫血，器官巨大症或两者(进展由体重减轻，疲劳，发烧，器官巨大症和淋巴细胞计数快速增加定义)；和IV期，其中存在贫血，血小板减少症，器官巨大症或其组合。在Binet分期系统下，有三类:A期，其中存在淋巴细胞增多症和不到三个淋巴结增大(这个阶段包括所有Rai 0期患者，一半Rai一期患者，三分之一的Rai II期患者)；B期，其中涉及三个或更多淋巴结；和C期，其中存在贫血或血小板减少症，或两者。这些分类系统可以与免疫球蛋白基因的突变的测量相组合，以提供疾病状态的更准确的表征。突变的免疫球蛋白基因的存在与改善的预后相关。
在另一个实施方案中，本发明的CAR表达细胞用于治疗癌症或白血病，例如具有白血病干细胞的白血病。例如，白血病干细胞是CD34+/CD38-白血病细胞。
CD20和CD22相关疾病和/或病症
本发明尤其提供了用于治疗与CD20或CD22表达相关的疾病的组合物和方法或与表达CD20或CD22的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症；或与表达CD20或CD22的细胞相关的非癌症相关适应证。一方面，与CD22表达相关的癌症是血液癌症，例如本文所述的血液癌症。
还可以包括与CD20或CD22表达相关的非癌症相关适应证。与CD20或CD22表达相关的非癌症相关适应证包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮，类风湿性关节炎，多发性硬化症，自身免疫性溶血性贫血，纯红细胞再生障碍，特发性血小板减少性紫癜，埃文斯综合征，血管炎，大疱性皮肤病，1型糖尿病，干燥综合征，抗NMDA受体脑炎和德维克病，格雷夫斯眼病和自身免疫性胰腺炎)，炎症性病症(过敏和哮喘)和实体器官或造血细胞移植。
本文公开的组合物和方法可用于治疗血液疾病，包括但不限于骨髓增生异常，贫血，阵发性夜间血红蛋白尿，再生障碍性贫血，获得性纯红细胞性贫血，Diamon-Blackfan贫血，范科尼贫血，血细胞减少，原核血小板减少症，骨髓增生性病症，真性红细胞增多症，原发性血小板增多症，骨髓纤维化，血红蛋白病，镰状细胞病，β重型地中海贫血等。
一方面，本发明提供了治疗与CD22表达相关的疾病的方法。一方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其中部分肿瘤对于CD20或CD22是阴性的，并且部分肿瘤对于CD20或CD22是阳性的。例如，本发明的CAR可用于治疗经历与CD20或CD22表达相关疾病的治疗的受试者，其中经历与CD20或CD22表达相关的治疗的受试者表现出与CD20或CD22表达相关的疾病。
一方面，本发明涉及抑制表达CD20或CD22的肿瘤细胞生长的方法，包括使肿瘤细胞与本发明的CD20或CD22 CAR细胞(例如，T细胞或NK细胞)接触，使得CART响应于抗原被激活并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长被抑制。
一方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法。该方法包括向受试者施用本发明的CD20或CD22 CAR表达细胞(例如T细胞或NK细胞)，使得治疗受试者中的癌症。可以通过本发明的CD20或CD22 CAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)治疗的癌症的实例是与CD20或CD22表达相关的癌症。可由本发明的CD20或CD22 CAR表达细胞(例如T细胞或NK细胞)治疗的癌症的实例包括但不限于本文所述的血液癌症。
本发明包括一种细胞疗法，其中细胞(例如，T细胞或NK细胞)被遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，并且CAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)被输注到需要其的受体。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。与抗体治疗不同，CAR修饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)能够在体内复制，导致长期持续性，其可导致持续的肿瘤控制。在各方面，向患者施用的细胞(例如，T细胞或NK细胞)或其后代在T细胞施用于患者后在患者中持续至少四个月，五个月，六个月，七个月，八个月，九个月，十个月，十一个月，十二个月，十三个月，十四个月，十五个月，十六个月，十七个月，十八个月，十九个月，二十个月，二十一个月，二十二个月，二十三个月，两年，三年，四年，或五年。
本发明还包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞例如NK细胞或T细胞被修饰(例如通过体外转录的RNA)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)并将CAR表达(例如，CART或CAR表达NK细胞)细胞输注入需要其的受体。输注的细胞能够杀死受体中的癌细胞。因此，在各方面，向患者施用CAR表达细胞，例如T细胞或NK细胞，在对患者施用CAR表达细胞，例如T细胞或NK细胞后存在少于一个月，例如三周，两周，一周。
不希望受任何特定理论的束缚，由CAR修饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)引起的抗肿瘤免疫应答可能是活性或被动免疫应答，或者可能是由于直接对间接免疫应答。一方面，CAR转导的细胞(例如，T细胞或NK细胞)表现出特异性促炎细胞因子分泌和响应于表达CD20或CD22的人类癌细胞的有效细胞溶解活性，抵抗可溶性CD20或CD22抑制，介导旁观者杀死和介导已建立的人类肿瘤的消退。例如，CD20或CD22表达肿瘤的异质区域内的少抗原肿瘤细胞可能容易受到先前针对相邻抗原阳性癌细胞反应的CD20或CD22重定向T细胞的间接破坏。
一方面，本发明的CAR修饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)，例如完全人类CAR表达细胞，可以是哺乳动物中离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。在一个方面，哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物之前，以下至少一种在体外发生:i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是众所周知的，并且在下面更全面地讨论。简而言之，从哺乳动物(例如人)中分离细胞并用表达本文公开的CAR的载体进行遗传修饰(即在体外转导或转染)。CAR修饰的细胞可以施用于哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR修饰的细胞可以相对于受体是自体的。或者，相对于受体，细胞可以是同种异体的，同基因的或异种的。
造血干细胞和祖细胞的离体扩增方法描述于美国专利号5,199,942,(通过引用并入本文)可以应用于本发明的细胞。其它合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简言之，T细胞的离体培养和扩增包括:(1)从哺乳动物外周血收集物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这些细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子，其他因子如flt3L，IL-1，IL-3和c-kit配体可用于细胞的培养和扩增。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗外，本发明还提供用于体内免疫以引发针对患者抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，本发明的CAR修饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)用于治疗与CD20或CD22表达相关的疾病，病症和状况。在某些方面，本发明的细胞用于治疗具有患与CD20或CD22表达相关的疾病，病症和状况的风险的患者。因此，本发明提供了治疗或预防与CD20或CD22表达相关的疾病，病症和状况的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的CAR-修饰的细胞(例如T细胞或NK细胞)。
一方面，本发明的CAR表达细胞可用于治疗增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤，或者是癌前病症。一方面，与CD20或CD22表达相关的癌症是血液癌症白血病前期，过度增殖性病症，增生或发育不良，其特征在于细胞异常生长。
本发明的CAR修饰的细胞可以单独施用，或可以作为与稀释剂和/或其它成分如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合的药物组合物施用。
本发明还涉及抑制增殖或减少表达CD20或CD22的细胞群的方法，所述方法包括将包含CD20或CD22表达细胞的细胞群与结合CD20或CD22表达细胞的本发明的表达CD20或CD22 CAR的细胞接触。在具体方面，本发明提供了抑制表达CD20或CD22的癌细胞的增殖或减少其群体的方法，所述方法包括使表达CD20或CD22的癌细胞群体与结合CD20或CD22表达细胞的本发明的CD20或CD22 CAR表达细胞接触。一方面，本发明提供了抑制表达CD20或CD22的癌细胞群的增殖或减少该群的方法，所述方法包括使表达CD20或CD22的癌细胞群与结合CD20或CD22表达细胞的本发明的CD20或CD22 CART接触。在某些方面，相对于阴性对照，本发明的CD20或CD22 CAR表达细胞将具有B细胞恶性肿瘤或与CD20或CD22表达细胞相关的另一种癌症的受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的数量，数目，量或百分比减少至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少65％，至少75％，至少85％，至少95％或至少99％。在一方面，受试者是人类。
本发明提供了预防与CD20或CD22表达细胞相关的癌症复发的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用结合CD20或CD22表达细胞的本发明的CD20或CD22 CAR表达细胞。在一个方面，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的结合CD20或CD22表达细胞的本文所述的CD20或CD22 CAR表达细胞与有效量的另一种疗法的组合。
在一些实施方案中，CD22表达细胞表达CD19,CD123,FLT-3,ROR-1,CD79b,CD179b,CD79a,CD10,CD34和/或CD20。在某些实施方案中，CD22表达细胞表达CD19。在一些实施方案中，CD22表达细胞不表达CD19。在一些实施方案中，CD20表达细胞表达CD19,CD123,FLT-3,ROR-1,CD79b,CD179b,CD79a,CD10,CD34和/或CD22。在某些实施方案中，CD20表达细胞表达CD19。在一些实施方案中，CD20表达细胞不表达CD19。
在一些实施方案中，受试者是CD19 CAR疗法的非应答者。在一些实施方案中，受试者是CD19 CAR疗法的部分应答者。在一些实施方案中，受试者是CD19 CAR疗法的完全应答者。在一些实施方案中，受试者是CD19 CAR疗法的非复发者。在一些实施方案中，受试者是CD19 CAR疗法的部分复发者。在一些实施方案中，受试者是CD19 CAR疗法的完全复发者。
在一些实施方案中，先前对CD19 CAR表达细胞治疗有反应的癌症或其他病症不表达CD19。在一些实施方案中，相对于当癌症或其他病症对用CD19 CAR表达细胞治疗有反应时，先前对CD19 CAR表达细胞治疗有反应的癌症或其他病症的CD19表达水平具有10％，20％，30％，40％，50％或更多的降低。在一些实施方案中，先前对用CD19 CAR表达细胞治疗有反应的癌症或其它病症表达CD20，CD22，CD123或其任何组合。
在一些实施方案中，用CD19 CAR表达细胞治疗的癌症或其它病症复发后施用本发明的CD20或CD22 CAR表达细胞。在一些实施方案中，如本文所述同时施用CD19 CAR表达细胞和CD20或CD22 CAR表达细胞。
骨髓消融
一方面，本发明提供骨髓消融的组合物和方法。例如，在一个方面，本发明提供了用于根除受试者中现有骨髓的至少一部分的组合物和方法。在本文中描述，在某些情况下，包含本发明的CAR的CD19，C20或CD22 CAR表达细胞根除CD19，C20或CD22阳性骨髓髓细胞祖细胞。
一方面，本发明提供了一种骨髓消融的方法，其包括向需要骨髓消融的受试者施用本发明的表达CD19，C20或CD22的CAR细胞(例如，T细胞或NK细胞)。例如，本方法可以用于根除患有疾病或病症的受试者的部分或全部现有骨髓，其中骨髓移植或骨髓修复是有益的治疗策略。在一个方面，本发明的骨髓消融方法包括在骨髓移植前在受试者中进行本文别处描述的表达CD19，C20或CD22表达CAR细胞(例如T细胞或NK细胞)的施用。因此，一方面，本发明的方法提供在骨髓或干细胞移植之前提供了细胞调节方案。一方面，骨髓移植包括移植干细胞。骨髓移植可以包括自体或同种异体细胞的移植。
本发明提供了治疗疾病或病症的方法，其包括施用本发明的表达CD19，C20或CD22的CAR细胞(例如，T细胞或NK细胞)以根除现有骨髓的至少一部分。该方法可以用作用于治疗其中骨髓移植有益的任何疾病或病症的治疗方案的至少一部分。也就是说，本方法可以用于需要骨髓移植的任何受试者。一方面，包括施用表达CD19，C20或CD22的CAR细胞(例如T细胞或NK细胞)的骨髓消融可用于治疗AML。在某些方面，通过本发明方法的骨髓消融可用于治疗血液癌，实体瘤，血液病，代谢紊乱，HIV，HTLV，溶酶体储存障碍和免疫缺陷。
本文公开的组合物和方法可用于根除现有骨髓的至少一部分以治疗血液癌，包括但不限于本文所述的癌症，例如白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，ALL，AML，CLL，CML，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(例如DLBCL或滤泡淋巴瘤)和多发性骨髓瘤。
一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括骨髓调节，其中受试者的至少一部分骨髓被本发明的CD22 CAR细胞(例如T细胞或NK细胞)根除。例如，在某些情况下，受试者的骨髓包含恶性前体细胞，其可通过C20或CD22 CAR细胞(例如T细胞或NK细胞)的活性靶向和消除。在一个方面，骨髓调节疗法包括在根除天然骨髓后对受试者施用骨髓或干细胞移植物。在一个方面，骨髓再调节疗法与一种或多种其它抗癌疗法组合，所述其它抗癌疗法包括但不限于抗肿瘤CAR疗法，化学疗法，辐射等。
一方面，在输注骨髓或干细胞移植之前，可能需要根除施用的CD19，CD20或CD22CAR表达细胞。可以使用任何合适的策略或治疗来实现CD19，CD20或CD22表达CAR细胞(例如，T细胞或NK细胞)的消除，包括但不限于使用自杀基因，使用RNA编码的CAR的有限CAR持久性，或抗T细胞模式，包括抗体或化疗。
组合疗法
本文所述的CAR的组合(例如，本文所述的表达CD20 CAR，CD22 CAR或CD19 CAR的细胞，例如和一种或多种B细胞抑制剂，例如本文所述)可以与其他已知的活性剂和疗法组合使用。
可以同时，在相同或分开的组合物中，或顺序地施用本文所述的CAR表达细胞(例如CD20 CAR，CD22 CAR或CD19 CAR表达细胞)，任选地一种或多种B细胞抑制剂和/或至少一种另外的治疗剂。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的CAR表达细胞(例如CD20 CAR，CD22 CAR或CD19 CAR表达细胞)，并且可以其次施用另外的活性剂，或者施用的次序可以颠倒。
CAR的疗法和/或其它治疗剂(例如第二CAR疗法)，程序或形式可在活动病症的周期期间或疾病缓解或更少活动疾病期间给药。CAR疗法可以在其它治疗之前，与其他治疗同时、治疗后或在病症的缓解期间给药。
例如，在一些实施方案中，将CAR疗法施用于具有与CD19，CD20或CD22表达相关的疾病(例如癌症)的受试者。可以测定受试者的应答性或复发指标。在一些实施方案中，当受试者显示复发的一个或多个迹象时，例如CD19中的移码和/或过早终止密码子时，施用另外的疗法。在实施方案中，另外的疗法是B细胞抑制剂。CD19疗法可以继续进行(例如，当在受试者中仍然存在可检测的一些表达CD19的癌细胞时)或可能被停止(例如，当风险–收益分析有利于停止疗法时)。
当组合给药时，CAR疗法和另外的活性剂(例如，第二或第三活性剂)，或全部，的给药量或剂量高于、低于或等于各活性剂单独使用例如，作为单一疗法的量或剂量。在某些实施方案中，CAR疗法、另外的活性剂(例如，第二或第三剂)或全部所施用的量或剂量低于(如，至少20％，至少30％，至少40％，或至少50％)各活性剂单独使用例如，作为单一疗法的量或剂量。在其他实施方案中，CAR疗法、另外的活性剂(例如，第二或第三剂)或全部导致所希望的效果(例如，治疗癌症)的量或剂量低于(如，低至少20％，至少30％，至少40％，或至少50％)各活性剂单独使用例如，作为单一疗法实现相同的治疗效果所需的量或剂量。
在实施方案中，组合疗法中的一种或多种治疗剂是抗体分子。可以用单克隆抗体疗法靶向癌症抗原。已经显示单克隆抗体(mAb)疗法通过多种机制发挥强大的抗肿瘤作用，包括补体依赖性细胞毒性(CDC)，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和对过表达靶标分子的肿瘤细胞的直接细胞抑制或凋亡诱导作用。
在另外的方面，本文所述的CAR表达细胞(例如，CD20 CAR，CD22 CAR或CD19 CAR表达细胞，任选地与一种或多种B细胞抑制剂组合)的组合可以与以下组合用于治疗方案中:手术，化疗，放射，mTOR途径抑制剂，免疫抑制剂，如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫消蚀剂如CAMPATH，抗CD3抗体或其他抗体疗法，cytoxin，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228，细胞因子和放射，肽疫苗，如Izumoto et al.2008J Neurosurg 108:963-971中所述。
在一个实施方案中，本文所述的CD19，CD20或CD22 CAR表达细胞(例如和一种或多种B细胞抑制剂)的组合可以与化学治疗剂组合使用。示例性的化学治疗剂包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，环磷酰胺、达可巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，alemtuzamab、吉姆单抗、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tositumomab))、抗代谢药(包括，例如叶酸拮抗药、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂比如沙立度胺或沙立度胺衍生物(例如来那度胺(lenalidomide))。
考虑用于组合疗法的一般化疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺(bicalutamide)硫酸博来霉素盐(bleomycin sulfate)白消安(busulfan)白消安注射剂卡培他滨N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷(Cytosar-)、阿糖胞苷脂质体注射剂达卡巴嗪(DTIC-)、更生霉素(Actinomycin D,Cosmegan)、柔红霉素盐酸盐柔红霉素柠檬酸盐脂质体注射剂地塞米松、多西他赛多柔比星盐酸盐依托泊苷氟达拉滨磷酸盐5-氟尿嘧啶氟他胺tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞嘧啶核苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲伊达比星异环磷酰胺依立替康L-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌麦罗塔(mylotarg)、紫杉醇 紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀植入物枸橼酸它莫西芬替尼泊苷6-硫代鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)用于注射的托泊替康盐酸盐长春碱长春新碱和长春瑞滨
用本文所述的化学治疗剂和表达CAR分子的细胞的组合的治疗可用于治疗本文所述的血液癌症，例如AML。在实施方案中，化学治疗剂和CAR表达细胞的组合可用于靶向(例如杀死)例如在具有AML的受试者中的癌干细胞，例如白血病干细胞。在实施方案中，化学治疗剂和CAR表达细胞的组合可用于治疗最小残留疾病(MRD)。MRD是指在治疗期间，例如化疗或治疗后保留在受试者中的少数癌细胞。MRD通常是复发的主要原因。本发明提供了一种治疗癌症，例如MRD的方法，其包括与例如本文所述的CAR表达细胞组合施用化学治疗剂。
在一个实施方案中，在施用表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的细胞之前施用化学治疗剂。在需要多于一次施用化学治疗剂的化疗方案中，化疗方案在施用表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的细胞之前开始或完成。在实施方案中，在施用表达CAR分子的细胞之前至少1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，15天，20天，25天或30天施用化学治疗剂。在实施方案中，在施用表达CAR分子的细胞之前至少1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，15天，20天，25天或30天开始或完成化疗方案。在实施方案中，化学治疗剂是例如与正常细胞或非癌细胞上的表达相比，增加癌细胞例如肿瘤细胞上CD19，CD20或CD22表达的化学治疗剂。表达可以通过例如免疫组织化学染色或流式细胞术分析来确定。例如，化学治疗剂是阿糖胞苷(Ara-C)。
与本发明化合物组合的特别感兴趣的抗癌剂包括:抗代谢物；抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶或p70S6激酶(FK506)或抑制p70S6激酶的药物；烷基化剂；mTOR抑制剂；免疫调节剂；蒽环类药物；长春花生物碱；蛋白质体抑制剂；GITR激动剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；CDK4激酶抑制剂；BTK激酶抑制剂；MKN激酶抑制剂；DGK激酶抑制剂；或溶瘤病毒。
示例性抗代谢物包括但不限于叶酸拮抗剂(本文中也称为抗叶酸剂)，嘧啶类似物，嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂):甲氨蝶呤 5-氟尿嘧啶氟尿苷阿糖胞苷(Cytosar-Tarabine PFS)，6-巯基嘌呤(Puri-))，6-硫鸟嘌呤(Thioguanine)，磷酸氟达拉滨喷司他丁培美曲塞雷替曲塞克拉屈滨氯法拉滨巯嘌呤(Puri-)，卡培他滨奈拉滨氮杂胞苷和吉西他滨优选的抗代谢物包括例如5-氟尿嘧啶氟尿苷卡培他滨培美曲塞雷替曲塞和吉西他滨
示例性的烷化剂包括，不限于:氮芥(nitrogen mustards)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)∶尿嘧啶氮芥(Aminouracil Uracil nitrogen )、氮芥(chlormethine)环磷酰胺( RevimmuneTM)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷(pipobroman) 三乙撑三聚氰胺(triethylenemelamine) 三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺塞替派白消安卡莫司汀洛莫司汀链佐星(streptozocin)和达卡巴嗪另外的示例性的烷化剂包括，不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素-D，)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素和苯基丙氨酸氮芥，)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM),)；卡莫司汀苯达莫司汀(Bendamustine)白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称为CCNU,)；顺铂(也称为CDDP、和-AQ)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、DTIC-)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM),)；异环磷酰胺Prednumustine；丙卡巴肼氮芥(Mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和甲氯乙胺(mechloroethamine)盐酸盐、)；链佐星塞替派(也称为硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、TESPA和TSPA,环磷酰胺 和苯达莫司汀HCl
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与氟达拉滨，环磷酰胺，和/或利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与氟达拉滨，环磷酰胺，利妥昔单抗(FCR)组合施用于受试者。在实施方案中，受试者患有CLL。例如，该受试者具有在第17号染色体的短臂中的缺失(del(17p)，例如，在白血病细胞中)。在其它实例中，受试者不具有del(17p)。在实施方案中，所述受试者包括包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中的突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包括包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中的突变的白血病细胞。在实施方案中，氟达拉滨以约10-50mg/m2(例如约10-15,15-20,20-25,25-30,30-35,35-40,40-45,或45-50mg/m2)的剂量例如，静脉内施用。在实施方案中，环磷酰胺以约200-300mg/m2例如,约200-225,225-250,250-275,或275-300mg/m2)的剂量例如，静脉内施用。在实施方案中，利妥昔单抗以约400-600mg/m2(例如,400-450,450-500,500-550,或550-600mg/m2)的剂量例如，静脉内施用。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与苯达莫司汀和利妥昔单抗组合施用给受试者。在实施方案中，受试者患有CLL。例如，该受试者具有在第17号染色体的短臂中的缺失(del(17p)，例如，在白血病细胞中)。在其它实例中，受试者不具有del(17p)。在实施方案中，所述受试者包括包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中的突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包括包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中的突变的白血病细胞。在实施方案中，苯达莫司汀以约70-110mg/m2(例如,70-80,80-90,90-100,或100-110mg/m2)的剂量例如，静脉内施用。在实施方案中，利妥昔单抗在约400-600mg/m2例如，400-450,450-500,500-550,或550-600mg/m2)的剂量例如，静脉内施用。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与利妥昔单抗，环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和/或皮质类固醇(例如，泼尼松)组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与利妥昔单抗，环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和泼尼松(R-CHOP)组合施用于受试者。在实施方案中，受试者患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在实施方案中，受试者具有非笨重限制阶段(nonbulky limited-stage)DLBCL(例如，包含具有小于7cm的尺寸/直径的肿瘤)。在实施方案中，受试者用辐射与R-CHOP组合治疗。例如，向受试者施用R-CHOP(例如，1-6次循环，例如，1，2，3，4，5，或6个周期的R-CHOP)，随后辐射。在某些情况下，给予受试者R-CHOP(例如，1-6次循环，例如，1，2，3，4，5，或6个周期的R-CHOP)，接着辐射。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与依托泊苷，泼尼松，长春新碱，环磷酰胺，阿霉素，和/或利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与依托泊苷，泼尼松，长春新碱，环磷酰胺，阿霉素，和利妥昔单抗(EPOCH-R)的组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与剂量调整的EPOCH-R(DA-EPOCH-R)组合施用于受试者。在实施方案中，受试者具有B细胞淋巴瘤，例如，Myc重排的侵袭性B细胞淋巴瘤。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与利妥昔单抗和/或来那度胺组合施用于受试者。来那度胺((RS)-3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)是一种免疫调节剂。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与利妥昔单抗和来那度胺组合施用于受试者。在实施方案中，受试者具有滤泡性淋巴瘤(FL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。在实施方案中，受试者具有FL并且先前未用癌症疗法治疗。在实施方案中，来那度胺以约10-20毫克(例如，10-15或15-20毫克)的剂量每天给药。在实施方案中，利妥昔单抗以约350-550mg/m2(例如,350-375,375-400,400-425,425-450,450-475,或475-500mg/m2)的剂量例如，静脉内给药。
示例性的mTOR抑制剂包括例如坦罗莫司；ridaforolimus(以前称作deferolimus，((1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂–4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并在PCT公开号WO 03/064383中描述)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus(5-(2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)(SEQ ID NO:1316)和XL765。
示例性的免疫调节剂包括例如afutuzumab(可从购得)；培非司亭来那度胺(CC-5013，)；沙利度胺actimid(CC4047)；和IRX-2(包括白细胞介素1，白细胞介素2和干扰素γ的人类细胞因子的混合物，CAS 951209-71-5，可得自IRX Therapeutics)。
示例性的蒽环类包括例如多柔比星(和)；博来霉素柔红霉素(盐酸多柔比星，道诺霉素和柔红霉素盐酸盐，)；柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸脂质体，)；米托蒽醌(DHAD，)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(Idamycin)；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；ravidomycin；和去乙酰ravidomycin。
示例性长春花生物碱包括例如酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛长春碱(也称硫酸长春碱，长春碱和VLB，Alkaban-和)；和长春瑞滨
示例性的蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米carfilzomib(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；柠檬酸ixazomib(MLN-9708)；delanzomib(CAN-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与brentuximab组合施用于受试者。Brentuximab是抗-CD30抗体和单甲基auristatin E的抗体-药物缀合物。在实施方案中，受试者具有霍奇金淋巴瘤(HL)，例如，复发性或难治性HL。在实施方案中，所述受试者包含CD30+HL。在实施方案中，受试者已经经历了自体干细胞移植(ASCT)。在实施方案中，受试者没有经历ASCT。在实施方案中，brentuximab以约1-3mg/kg(例如约1-1.5,1.5-2,2-2.5,或2.5-3mg/kg)的剂量给药，例如，静脉内，例如，每3周。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与brentuximab和达卡巴嗪或与brentuximab和苯达莫司汀组合施用于受试者。达卡巴嗪是一种烷化剂，化学名称是5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)咪唑-4-甲酰胺。苯达莫司汀是一种烷基化剂，化学名称是4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸。在实施方案中，受试者具有霍奇金淋巴瘤(HL)。在实施方案中，受试者先前未用癌症疗法治疗。在实施方案中，受试者是至少60岁，例如，60,65,70,75,80,85岁或更老。在实施方案中，达卡巴嗪以约300-450mg/m2(例如约300-325,325-350,350-375,375-400,400-425,或425-450mg/m2)的剂量例如，静脉内给药。在实施方案中，苯达莫司汀以约75-125mg/m2(例如，75-100或100-125mg/m2,例如,约90mg/m2)的剂量例如，静脉内给药。在实施方案中，brentuximab以约1-3mg/kg(例如，约1-1.5，1.5-2，2-2.5，或者2.5-3mg/kg)的剂量给药，例如，静脉内，例如，每3周。
在一些实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与CD20抑制剂，例如，抗CD20抗体(例如，抗CD20单-或双特异性抗体)或其片段组合施用于受试者。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗，奥法木单抗，奥瑞珠单抗，veltuzumab，obinutuzumab，TRU-015(TrubionPharmaceuticals)，ocaratuzumab和Pro131921(Genentech)。见，例如，Limetal.Haematologica.95.1(2010):135-43。
在一些实施方案中，所述抗CD20抗体包含利妥昔单抗。利妥昔单抗是嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，其结合CD20并且使CD20表达细胞溶解，如在www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf所述。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施方案中，受试者具有CLL或SLL。
在一些实施方案中，利妥昔单抗静脉内施用，例如作为静脉内输注。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如约5500-550,550-600,600-650,650-700,700-750,750-800,800-850,850-900,900-950,950-1000,1000-1100,1100-1200,1200-1300,1300-1400,1400-1500,1500-1600,1600-1700,1700-1800,1800-1900,或1900-2000mg)的利妥昔单抗。在一些实施方案中，利妥昔单抗以150mg/m2到750mg/m2,例如，约150-175mg/m2,175-200mg/m2,200-225mg/m2,225-250mg/m2,250-300mg/m2,300-325mg/m2,325-350mg/m2,350-375mg/m2,375-400mg/m2,400-425mg/m2,425-450mg/m2,450-475mg/m2,475-500mg/m2,500-525mg/m2,525-550mg/m2,550-575mg/m2,575-600mg/m2,600-625mg/m2,625-650mg/m2,650-675mg/m2,或675-700mg/m2的剂量施用，其中m2表示受试者的体表面积。在一些实施方案中，利妥昔单抗以至少4天，例如4,7,14,21,28,35天或更长时间的给药间隔施用。例如，利妥昔单抗以至少0.5周，例如0.5,1,2,3,4,5,6,7,8周或更长时间的给药间隔施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如至少2周，例如至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20周或更长。例如，利妥昔单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用，每个治疗周期总共至少4个剂量(例如，每个治疗周期至少4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16或更多剂量)。
在一些实施方案中，抗-CD20抗体包含奥法木单抗。奥法木单抗是分子量约149kDa的抗CD20IgG1κ人单克隆抗体。例如，使用转基因小鼠和杂交瘤技术产生奥法木单抗，并从重组鼠细胞系(NS0)中表达和纯化。参见例如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验标识号NCT01363128，NCT01515176，NCT01626352和NCT01397591。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与奥法木单抗组合施用于受试者。在实施方案中，受试者具有CLL或SLL。
在一些实施方案中，奥法木单抗作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约150-3000mg(例如约150-200,200-250,250-300,300-350,350-400,400-450,450-500,500-550,550-600,600-650,650-700,700-750,750-800,800-850,850-900,900-950,950-1000,1000-1200,1200-1400,1400-1600,1600-1800,1800-2000,2000-2200,2200-2400,2400-2600,2600-2800,或2800-3000mg)的奥法木单抗。在实施方案中，奥法木单抗以约300毫克的起始剂量施用，随后2000毫克，例如，约11次剂量，例如，24周。在一些实施方案中，奥法木单抗以至少4天，例如，4,7,14,21,28,35天，或更长的给药间隔给药。例如，奥法木单抗以至少1周，例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24，26，28，20，22，24，26，28，30周，或更长的给药间隔施用。在一些实施方案中，奥法木单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如，至少1周，例如，1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,22,24,26,28,30,40,50,60周或更长，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月或以上，或1，2，3，4，5年或以上。例如，奥法木单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用，每个治疗周期共至少2个剂量(例如，每个治疗周期至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,18,20或更多个剂量)。
在一些情况下，所述抗CD20抗体包含奥瑞珠单抗。奥瑞珠单抗是人源化抗CD20单克隆抗体，例如，如在临床试验标识符号NCT00077870，NCT01412333，NCT00779220，NCT00673920，NCT01194570，和Kappos et al.Lancet.19.378(2011):1779-87所述。
在一些情况下，抗CD20抗体包含veltuzumab。Veltuzumab是针对CD20的人源化单克隆抗体。参见例如临床试验标识号NCT00547066，NCT00546793，NCT01101581和Goldenberg et al.Leuk Lymphoma.51(5)(2010):747-55。
在一些情况下，所述抗CD20抗体包含GA101。GA101(也称为obinutuzumab或RO5072759)是人源化和糖工程化抗CD20单克隆抗体。见，例如，Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009):588-96；临床试验标识号:NCT01995669，NCT01889797，NCT02229422，和NCT01414205；和www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些情况下，所述抗CD20抗体包含AME-133v。AME-133v(也称为LY2469298或ocaratuzumab)是针对CD20的人源化IgG1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，对FcγRIIIa受体具有增加的亲和力和增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。见，例如，Robak etal.BioDrugs 25.1(2011):13-25；和Forero-Torres et al.Clin Cancer Res.18.5(2012):1395-403。
在一些情况下，所述抗CD20抗体包含PRO131921。PRO131921是工程化成具有与利妥昔单抗相比对FcγRIIIa的更好的结合和增强的ADCC的人源化抗CD20单克隆抗体。见，例如，Robak et al.BioDrugs 25.1(2011):13-25；and Casulo et al.Clin Immunol.154.1(2014):37-46；和临床试验标识号NCT00452127。
在一些情况下，抗-CD20抗体包含TRU-015。TRU-015是衍生自抗CD20的抗体的结构域的抗CD20融合蛋白。TRU-015小于单克隆抗体，但保留Fc介导的效应子功能。参见，例如，Robak et al.BioDrugs25.1(2011):13-25。TRU-015含有与人IgG1铰链，CH2和CH3结构域连接但不含CH1和CL结构域的抗CD20单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD20抗体与治疗剂缀合或以其他方式结合，所述治疗剂为例如化学治疗剂(例如，环磷酰胺，氟达拉滨，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，去甲基化剂，肽疫苗，抗肿瘤抗生素，酪氨酸激酶抑制剂，烷化剂，抗微管或抗有丝分裂剂)，抗过敏剂，抗恶心剂(或抗呕吐药)，止痛药或细胞保护剂。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与B细胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制剂(例如，venetoclax，也称为ABT-199或GDC-0199)和/或利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与venetoclax和利妥昔单抗组合施用于受试者。Venetoclax是一种抑制抗细胞凋亡蛋白BCL-2的小分子。venetoclax(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)的结构如下所示。
在实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者患有复发的CLL，例如，受试者先前已经施用了癌症疗法。在实施方案中，venetoclax以约15-600mg(例如,15-20,20-50,50-75,75-100,100-200,200-300,300-400,400-500,或500-600mg)的剂量例如，每天施用。在实施方案中，利妥昔单抗以约350-550mg/m2(例如,350-375,375-400,400-425,425-450,450-475,或475-500mg/m2)的剂量给药，例如，静脉注射，例如，每月。
在一些实施方案中，本文所述的一种或多种CAR表达细胞与溶瘤病毒组合施用。在实施方案中，溶瘤病毒能够选择性地复制并触发癌细胞的死亡或减缓癌细胞的生长。在一些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞没有作用或具有最小的作用。溶瘤病毒包括但不限于溶瘤腺病毒，溶瘤单纯疱疹病毒，溶瘤性逆转录病毒，溶瘤性细小病毒，溶瘤痘苗病毒，溶瘤Sinbis病毒，溶瘤流感病毒，或溶瘤性RNA病毒(例如，溶瘤呼肠孤病毒，溶瘤性新城疫病毒(NDV)，溶瘤性麻疹病毒或溶瘤性水泡性口炎病毒(VSV))。
在一些实施方案中，溶瘤病毒是US2010/0178684A1(其通过引用整体并入本文)中描述的病毒，例如重组溶瘤病毒。在一些实施方案中，重组溶瘤病毒包含编码免疫或炎症反应抑制剂的核酸序列(例如，异源核酸序列)，例如US2010/0178684A1中所述，其通过引用整体并入本文。在实施方案中，重组溶瘤病毒例如溶瘤性NDV包含促凋亡蛋白(例如凋亡蛋白)，细胞因子(例如GM-CSF，干扰素-γ，白细胞介素-2(IL-2)，肿瘤坏死因子α)，免疫球蛋白(例如针对ED-B纤连蛋白的抗体)，肿瘤相关抗原，双特异性接头蛋白(例如针对NDV HN蛋白的双特异性抗体或抗体片段和T细胞共刺激受体，例如CD3或CD28；或人IL-2与针对NDVHN蛋白的单链抗体之间的融合蛋白)。参见，例如，Zamarin et al.Future Microbiol.7.3(2012):347-67,通过引用将其全部内容并入本文。在一些实施方案中，溶瘤病毒是US8591881 B2,US 2012/0122185 A1,或US 2014/0271677 A1(其各自通过引用整体并入本文)中描述的嵌合性溶瘤性NDV。
在一些实施方案中，溶瘤病毒包含条件性复制型腺病毒(CRAd)，其被设计为专门在癌细胞中复制。参见，例如，Alemany et al.Nature Biotechnol.18(2000):723-27。在一些实施方案中，溶瘤腺病毒包含Alemany等人(其全部内容通过引用并入本文)的第725页的表1中所述的腺病毒。
示例性溶瘤病毒包括但不限于以下:
B组溶瘤腺病毒(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(参见例如ClinicalTrial Identifier:NCT02053220)；
ONCOS-102(以前称为CGTG-102)，其是包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的腺病毒(Oncos Therapeutics)(参见例如Clinical Trial Identifier:NCT01598129)；
VCN-01，其是编码人PH20透明质酸酶的遗传修饰的溶瘤人腺病毒(VCNBiosciences,S.L.)(参见例如Clinical Trial Identifiers:NCT02045602和NCT02045589)；
条件性复制型腺病毒ICOVIR-5，其是来源于野生型人腺病毒血清型5(Had5)的病毒，已被修饰以在具有失调的成视网膜细胞瘤/E2F途径的癌细胞中选择性复制(InstitutCatalàd'Oncologia)(见，例如临床试验标识符:NCT01864759)；
Celyvir，其包含感染有溶瘤腺病毒ICOVIR5的骨髓衍生的自体间充质干细胞(MSC)(Hospital Infantil Universitario Jesús,Madrid,Spain/Ramon Alemany)(参见例如临床试验标识符:NCT01844661)；
CG0070，其是条件性复制溶瘤血清型5腺病毒(Ad5)，其中人E2F-1启动子驱动必需E1a病毒基因的表达，从而限制病毒复制和对Rb途径缺陷型肿瘤细胞的细胞毒性((ColdGenesys,Inc.)(参见，例如，临床试验标识符:NCT02143804)；或
DNX-2401(以前称为Delta-24-RGD)，其是已经工程化以在视网膜母细胞瘤(Rb)-途径缺陷型细胞中选择性复制并且更有效地感染表达某些RGD结合整联蛋白的细胞的腺病毒(Clinica Universidad de Navarra,Universidad de Navarra/DNAtrix,Inc.)(参见例如临床试验标识符:NCT01956734)。
在一些实施方案中，本文所述的溶瘤病毒通过注射，例如皮下，动脉内，静脉内，肌内，鞘内或腹膜内注射施用。在实施方案中，本文所述的溶瘤病毒通过肿瘤内，经皮，经粘膜，口服，鼻内或经肺施用途径施用。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与减少Treg细胞群的分子组合施用于受试者。减少Treg细胞的数量(例如，消耗)的方法在本领域中是已知的，并且包括，例如，CD25消耗，环磷酰胺给药，调节GITR功能。不希望受理论的束缚，但据信在单采血液成分术前或施用所述的CAR表达细胞前，降低受试者中Treg细胞的数目减少了肿瘤微环境中不希望的免疫细胞(例如，Treg细胞)的数目并降低了受试者复发的风险。
在一个实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与减少Treg细胞群体的分子组合施用于受试者。减少(例如，消耗)Treg细胞的数目的方法是本领域已知的，并且包括例如CD25消耗，环磷酰胺施用和调节GITR功能。不希望受理论束缚，认为在单采血液成分术前或在施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞的数目减少了肿瘤微环境中不想要的免疫细胞(例如，Treg)的数目，并且降低受试者的复发风险。在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子，例如GITR激动剂和/或消耗调节性T细胞(Treg)的GITR抗体组合施用于受试者。在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与环磷酰胺组合施用于受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前施用GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如GITR激动剂和/或Treg消耗GITR抗体)。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在实施方案中，在施用(例如，输注或再输注)CAR表达细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前将环磷酰胺施用于受试者。在实施方案中，在施用(例如，输注或再输注)CAR表达细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前，将环磷酰胺和抗GITR抗体施用于受试者。在一个实施方案中，受试者具有癌症(例如，实体癌症或诸如ALL或CLL的血液癌症)。在一个实施方案中，受试者具有CLL。在实施方案中，受试者具有实体癌症，例如本文所述的实体癌症。
在一个实施方案中，将本文所述的CD19 CAR表达细胞和本文所述的一种或多种B细胞抑制剂的组合与本文所述的GITR激动剂，例如GITR激动剂组合施用于受试者。在一个实施方案中，GITR激动剂在CAR表达细胞例如表达CD19 CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者具有CLL。
在一个实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与GITR激动剂(例如本文所述的GITR激动剂)组合施用于受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前施用GITR激动剂。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。
示例性的GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗-GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，比如例如美国专利号∶6,111,090、欧洲专利号:090505B1、美国专利号:8,586,023、PCT公开号∶WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白，或例如在美国专利号∶7,025,962、欧洲专利号∶1947183B1、美国专利号:7,812,135、美国专利号:8,388,967、美国专利号:8,591,886、欧洲专利号:EP 1866339、PCT公开号:WO 2011/028683、PCT公开号:WO2013/039954、PCT公开号:WO2005/007190、PCT公开号:WO 2007/133822、PCT公开号:WO2005/055808、PCT公开号:WO 99/40196、PCT公开号:WO 2001/03720、PCT公开号:WO99/20758、PCT公开号:WO2006/083289、PCT公开号:WO 2005/115451、美国专利号∶7,618,632和PCT公开号:WO 2011/051726中所述的抗GITR抗体。
在一个实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如本文所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)组合施用于受试者。在一个实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本文所述的SHP-1抑制剂，例如葡萄糖酸锑钠。在一个实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂，例如，本文所述的SHP-2抑制剂。
在一个实施方案中，可以把任选地与一种或多种B细胞抑制剂组合的本文所述表达CAR的细胞与激酶抑制剂联合使用。在一个实施方案中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，例如本文所述CDK4抑制剂，例如CD4/6抑制剂，比如例如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称为palbociclib或PD0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂为BTK抑制剂，例如本文所述BTK抑制剂，比如例如ibrutinib。在一个实施方案中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，例如本文所述mTOR抑制剂，比如例如雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以为例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文所述mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂为MNK抑制剂，例如本文所述MNK抑制剂，比如例如4-氨基-5-(4-氟苯氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以为例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。
在一个实施方案中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，选自阿洛新A(aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275,2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基4-哌啶基]-4-色酮(chromenone)；crizotinib(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟基甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。
在一个实施方案中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，例如palbociclib(PD0332991)，并且palbociclib以每日约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量施用一段时间，例如28天周期的第14-21天每日施用，或21天周期的第7-12天每日施用。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的palbociclib。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4或6抑制剂，例如，本文所述的CDK4抑制剂或CDK6抑制剂组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与CDK4/6抑制剂(例如，靶向CDK4和CDK6的抑制剂)，例如，本文所述的CDK4/6抑制剂组合施用于受试者。在一个实施方案中，受试者具有MCL。MCL是一种侵入性癌症，其对目前可用的治疗弱应答，即，基本上不可治愈的。在MCL的许多情况下，在MCL细胞中表达细胞周期蛋白D1(CDK4/6的调节剂)(例如，由于涉及免疫球蛋白和细胞周期蛋白D1基因的染色体易位)。因此，不受理论的束缚，据认为，MCL细胞对CDK4/6抑制高度敏感，具有高特异性(即，对正常的免疫细胞的最小影响)。单独CDK4/6抑制剂在治疗MCL中已经有一定的效果，但只取得了部分缓解，复发率极高。示例性CDK4/6抑制剂是LEE011(也称为ribociclib)，其结构如下所示。
不受理论的束缚，但据信本文所述的CAR表达细胞与CDK4/6抑制剂(例如，LEE011或本文描述的其他CDK4/6抑制剂)的给药可以达到更高的反应性，例如，相比于单独的CDK4/6抑制剂，具有更高的缓解率和/或较低的复发率。
在一个实施方案中，激酶抑制剂为BTK抑制剂，选自ibrutinib(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一个实施方案中，BTK抑制剂不会降低或抑制白介素-2诱导的激酶(ITK))的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一个实施方案中，激酶抑制剂为BTK抑制剂，例如ibrutinib(PCI-32765)。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与BTK抑制剂(例如，ibrutinib)组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与ibrutinib(也称为PCI-32765)组合施用于受试者。ibrutinib(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑子基[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)的结构如下所示。
在实施方案中，受试者患有CLL，套细胞淋巴瘤(MCL)，或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。例如，该受试者具有在第17号染色体的短臂中的缺失(del(17p)，例如，在白血病细胞)。在其它实例中，受试者不具有del(17p)。在实施方案中，受试者已经复发CLL或SLL，例如，受试者先前已经施用了癌症治疗(例如，先前已经施用1、2、3或4次现有癌症疗法)。在实施方案中，受试者患有难治性CLL或SLL。在其他实施方案中，受试者患有滤泡性淋巴瘤，例如，复发或难治性滤泡性淋巴瘤。在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如ibrutinib(PCI-32765)，并且ibrutinib每日以约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量施用一段时间，例如21天周期每日施用，或28天周期每日施用。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的ibrutinib。在一些实施方案中，ibrutinib与利妥昔单抗组合施用。参见，例如，Burger et al.(2013)Ibrutinib InCombination With Rituximab(iR)Is Well Tolerated and Induces a High Rate OfDurable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia(CLL):New,Updated Results Of a Phase II Trial In 40Patients,Abstract675presented at 55th ASH Annual Meeting and Exposition,New Orleans,LA 7-10Dec.。不受理论的束缚，可以认为，加入ibrutinib增强了T细胞的增殖反应，并且可以从T辅助细胞2(Th2)转移到T辅助细胞1(Th1)表型。Th1和Th2是辅助性T细胞的表型，Th1相比Th2细胞定向不同的免疫应答途径。Th1表型与炎症反应相关，例如用于杀死细胞，如细胞内病原体/病毒或癌性细胞，永久化自身免疫应答。Th2表型与嗜酸性粒细胞的积累和抗炎应答有关。在本文的方法，用途和组合物的一些实施方案中，BTK抑制剂是国际申请WO/2015/079417(其通过引用整体并入本文)中描述的BTK抑制剂。例如，在一些实施方案中，BTK抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐；
其中，
R1是氢，任选被羟基取代的C1-C6烷基；
R2是氢或卤素；
R3是氢或卤素；
R4是氢；
R5是氢或卤素；
或者R4和R5彼此连接并代表键，-CH2-,-CH2-CH2-,-CH＝CH-,-CH＝CH-CH2-；-CH2-CH＝CH-；或-CH2-CH2-CH2-；
R6和R7彼此独立地代表H，任选被羟基取代的C1-C6烷基，任选被卤素或羟基取代的C3-C6环烷基或卤素；
R8,R9,R,R’,R10和R11彼此独立地代表H或任选被C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；或R8,R9,R,R’,R10和R11中的任意两个与它们所结合的碳原子一起可以形成3－6元饱和碳环；
R12是氢或任选被卤素或C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；
或R12和R8,R9,R,R’,R10或R11中的任一个与它们所连接的原子一起可形成4,5,6或7元氮杂环，该环可任选被卤素，氰基，羟基，C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代；
n为0或1；和
R13是任选被C1-C6烷基，C1-C6烷氧基或N，N-二-C1-C6烷基氨基取代的C2-C6烯基；任选被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的C2-C6炔基；或任选被C1-C6烷基取代的C2-C6亚烷基氧化物(C2-C6alkylenyl oxide)。
在一些实施方案中，式I的BTK抑制剂选自:N-(3-(5-((1-丙烯酰基氮杂环丁烷-3-基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-烯酰基)氮杂环丁烷-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-丙酰基氮杂环丁烷-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔基)氮杂环丁烷-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰基哌啶-4-基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(4-甲氧基-N-甲基丁-2-烯酰氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-炔酰氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(4-环丙基-2-氟苯甲酰氨基)-5-氟-2-甲基苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(2-丙烯酰氨基乙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-乙基丙烯酰氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-(2-氟乙基)丙烯酰氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰氨基环丙基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-(2-丙烯酰氨基丙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(丁-2-炔酰氨基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰氨基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-炔酰氨基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(3-(N-甲基丙烯酰氨基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟基甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-1-氧代-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰基-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；2-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰基-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰基-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4S)-1-(丁-2-炔基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰基-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔基)-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰基-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4S)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰基-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰基氮杂环丁烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰基氮杂环丁烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰基氮杂环丁烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰基氮杂环丁烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2R,3S)-1-丙烯酰基-3-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰基-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；或N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰基-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺。
除非另有规定，以上在描述式I的BTK抑制剂中使用的化学术语根据其在国际申请WO/2015/079417中所述的含义使用，所述国际申请WO/2015/079417以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，选自坦罗莫司；雷达罗莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也称为AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；simapimod(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基L-丝氨酸，内盐(SF1126)(SEQ ID NO:1316)；和XL765。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，雷帕霉素以约3mg,4mg,5mg,6mg,7mg,8mg,9mg,10mg(例如6mg)的日剂量施用一段时间，例如21天周期每天施用，或28天周期每天施用。在一个实施方案中，施用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如依维莫司，依维莫司以约2mg,2.5mg,3mg,4mg,5mg,6mg,7mg,8mg,9mg,10mg,11mg,12mg,13mg,14mg,15mg(例如10mg)的日剂量施用一段时间，例如28天周期每天施用。在一个实施方案中，施用依维莫司的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多个周期。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶的MNK抑制剂。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(例如，本文所述的PI3K抑制剂，例如，idelalisib或duvelisib)和/或利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与idelalisib和利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与duvelisib和利妥昔单抗组合施用于受试者。Idelalisib(也被称为GS-1101或CAL-101；Gilead)是一种小分子，其阻断PI3K的δ同工型。idelalisib(5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮)的结构如下所示。
Duvelisib(也称为IPI-145；Infinity Pharmaceuticals and Abbvie)是阻断PI3K-δ,γ的小分子。duvelisib(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-1-(2H)-异喹啉酮)的结构如下所示。
在实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者具有复发的CLL，例如，受试者先前已经施用了癌症治疗(例如，先前已施用抗CD20抗体或先前已经施用ibrutinib)。例如，该受试者具有在第17号染色体的短臂的缺失(del(17p)，例如，在白血病细胞中)。在其它实例中，受试者不具有del(17p)。在实施方案中，所述受试者包括包含在免疫球蛋白重链可变区((IgVH)基因中突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包括包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中突变的白血病细胞。在实施方案中，受试者具有在11号染色体长臂中的缺失((del(11q))。在其他实施方案中，受试者不具有(del(11q)。在实施方案中，idelalisib以约100-400mg(例如,100-125,125-150,150-175,175-200,200-225,225-250,250-275,275-300,325-350,350-375,或375-400mg)的剂量施用，例如,BID。在实施方案中，duvelisib以约15-100mg(例如,约15-25,25-50,50-75,或75-100mg)的剂量施用，例如每天两次。在实施方案中，利妥昔单抗以约350-550mg/m2(例如,350-375,375-400,400-425,425-450,450-475,或475-500mg/m2)的剂量，例如静脉内施用。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是双磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，mTOR抑制剂选自2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二–4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯基磺酰胺(XL765)。
在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂组合施用于受试者。示例性的ALK激酶包括但不限于crizotinib(Pfizer)，ceritinib(Novartis)，alectinib(Chugai)，brigatinib(也称为AP26113；Ariad)，entrectinib(Ignyta)，PF-06463922(Pfizer)，TSR-011(Tesaro)(参见例如临床试验标识号NCT02048488)，CEP-37440(Teva)和X-396(Xcovery)。在一些实施方案中，受试者具有实体癌症，例如本文所述的实体癌症，例如肺癌
crizotinib的化学名称是3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。ceritinib的化学名称是5-氯-N2-[2-异丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4-[2-(异丙基磺酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。alectinib的化学名称是9-乙基-6,6-二甲基-8-(4-吗啉代哌啶-1-基)-11-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[b]咔唑-3-腈。brigatinib的化学名称是5-氯-N2-{4-[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]-2-甲氧基苯基}-N4-[2-(二甲基磷酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。entrectinib的化学名称是N-(5-(3,5-二氟苄基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)-4-基)氨基)苯甲酰胺。PF-06463922的化学名称是(10R)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-氧代-10,15,16,17-四氢-2H-8,4-(次甲基))吡唑子基[4,3-H][2,5,11]–苯并氧杂二氮杂环十四烯-3-腈。CEP-37440的化学结构为(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-2-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-N-甲基苯甲酰胺。X-396的化学名称是(R)-6-氨基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)哒嗪-3-甲酰胺。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自ibrutinib的ITK抑制剂；N-(5-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基-2-甲基苯硫基)噻唑-2-基)-4-((3,3-二甲基丁-2-基氨基)甲基)苯甲酰胺(BMS-509744)；7-苄基-1-(3-(哌啶-1-基)丙基)-2-(4-(吡啶-4-基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-G]喹喔啉-6(5H)-酮(CTA056)；R)-3-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-N-(3-甲基-4-(1-甲基乙基))苯甲酰胺(PF-06465469)。
也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶的药物(雷帕霉素)。(Liu et al.,Cell 66:807-815,1991；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另一方面，本发明的细胞组合物可以与骨髓移植(例如，之前，同时或之后)联合施用于患者。使用化疗剂如氟达拉滨，外部束辐射疗法(XRT)，环磷酰胺和/或抗体如OKT3或CAMPATH进行T细胞消融治疗。一方面，本发明的细胞组合物在B细胞消融治疗(例如与CD20反应的药剂，例如Rituxan)后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可以通过高剂量化学疗法进行标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂组合施用于受试者。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解成犬尿氨酸的酶。许多癌症过表达IDO，例如前列腺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，子宫颈癌，胃癌，卵巢癌，头癌和肺癌。pDC，巨噬细胞和树突细胞(DCs)可以表达IDO。不受理论的约束，认为L-色氨酸的减少(例如，由IDO催化)通过诱导T细胞无反应性和细胞凋亡导致免疫抑制环境。因此，不受理论的约束，认为IDO抑制剂可以增强本文所述的CAR表达细胞的功效，例如通过降低CAR表达免疫细胞的抑制或死亡。在实施方案中，受试者具有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如前列腺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，子宫颈癌，胃癌，卵巢癌，头癌或肺癌。IDO的示例性抑制剂包括但不限于1-甲基-色氨酸，indoximod(NewLink Genetics)(参见例如临床实验识别号NCT01191216；NCT01792050)和INCB024360(Incyte Corp.)(参见例如临床实验识别号NCT01604889；NCT01685255)。
在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与骨髓来源的抑制细胞(MDSC)的调节剂组合施用于受试者。MDSCs积聚在许多实体瘤的周边和肿瘤部位。这些细胞抑制T细胞反应，从而阻碍CAR表达细胞疗法的功效。不受理论的约束，认为施用MDSC调节剂增强本文所述的CAR表达细胞的功效。在一个实施方案中，受试者具有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如成胶质细胞瘤。MDSC的示例性调节剂包括但不限于MCS110和BLZ945。MCS110是针对巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的单克隆抗体(mAb)。参见例如临床试验标识号NCT00757757。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。参见例如Pyonteck etal.Nat.Med.19(2013):1264-72。BLZ945的结构如下所示。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与CD19 CART细胞(例如，CTL019，例如，如在WO2012/079000中描述，其通过引用并入本文)组合施用于受试者。在实施方案中，受试者患有急性骨髓性白血病(AML)，例如CD19阳性AML或CD19阴性AML。在实施方案中，受试者具有CD19+淋巴瘤，例如，CD19+非霍奇金淋巴瘤(NHL)，CD19+FL，或CD19+DLBCL。在实施方案中，受试者具有复发或难治性CD19+淋巴瘤。在实施方案中，淋巴消耗化疗在CD19 CART细胞施用(例如，输注)于受试者之前，与其同时或之后给药。在一个实例中，淋巴消耗化疗在CD19CART细胞施用之前施用于受试者。例如，CD19 CART细胞输注前1-4天(例如，1，2，3，或4天)淋巴消耗化疗结束。在实施方案中，多剂量的CD19 CART细胞被施用，例如，如本文所述。例如，单次剂量包含约5x108CD19 CART细胞。在实施方案中，淋巴消耗化疗施用在本文所述的CAR表达细胞，例如非CD19 CAR-表达细胞施用(例如，输注)之前、同时或之后施用给受试者。在实施方案中，CD19 CART在非CD19 CAR-表达细胞，例如本文所述的非CD19 CAR表达细胞施用(例如，输注)之前、同时或之后施用给受试者。
在一些实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与CD19 CAR表达细胞(例如如WO2012/079000中所述(通过引用并入本文)的CTL019)组合施用于受试者，用于治疗与CLL-1的表达相关的疾病，例如本文所述的癌症。不受理论的束缚，据信，与CAR表达细胞组合施用CD19 CAR表达细胞通过靶向早期谱系癌细胞(例如癌干细胞)，调节免疫应答，消耗调节性B细胞和/或改善肿瘤微环境来改善本文所述的CAR表达细胞的功效。例如，CD19 CAR表达细胞靶向表达早期谱系标志物的癌细胞，例如癌干细胞和表达CD19的细胞，而本文所述的CAR表达细胞靶向表达晚期谱系标志物，例如CLL-1的癌细胞。该预处理方法可以改善本文所述的CAR表达细胞的功效。在这样的实施方案中，CD19 CAR表达细胞在施用(例如，输注)本文所述的CAR表达细胞之前，同时或之后施用。
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞还表达靶向CD19的CAR，例如CD19 CAR。在一个实施方案中，将表达本文所述的CAR和CD19 CAR的细胞施用于受试者以治疗本文所述的癌症，例如AML。在一个实施方案中，一个或两个CAR分子的构型包含主要细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在另一个实施方案中，一个或两个CAR分子的构型包含主要细胞内信号传导结构域和两个或多个，例如2,3,4或5个或更多个共刺激信号传导结构域。在这样的实施方案中，本文所述的CAR分子和CD19 CAR可以具有相同或不同的主要细胞内信号传导结构域，相同或不同的共刺激信号传导结构域，或相同数目或不同数目的共刺激信号传导结构域。或者，本文描述的CAR和CD19 CAR被配置为分裂CAR，其中CAR分子之一包含抗原结合结构域和共刺激结构域(例如4-1BB)，而另一CAR分子包含抗原结合结构域和主要细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)。
在一些实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与白细胞介素-15(IL-15)多肽，白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽的组合，例如hetIL-15(Admune Therapeutics，LLC)组合施用于受试者。hetIL-15是IL-15和IL-15Ra的异二聚非共价复合物。hetil-15描述于例如U.S.8,124,084,U.S.2012/0177598,U.S.2009/0082299,U.S.2012/0141413,和U.S.2011/0081311中，将其引入本文作为参考。在实施方案中，皮下施用het-IL-15。在实施方案中，受试者具有癌症，例如实体癌症，例如黑素瘤或结肠癌。在实施方案中，受试者具有转移性癌症。
在实施方案中，对具有本文所述的疾病，例如血液病症(例如AML或MDS)的受试者施用本文所述的CAR表达细胞与活性剂(例如细胞毒性或化疗剂)，生物疗法(例如，抗体，例如单克隆抗体或细胞疗法)或抑制剂(例如激酶抑制剂)。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与细胞毒性剂，例如CPX-351(Celator Pharmaceuticals)，阿糖胞苷，柔红霉素，vosaroxin(Sunesis Pharmaceuticals)，sapacitabine(Cyclacel Pharmaceuticals)，伊达比星或米托蒽醌组合施用于受试者。CPX-351是一种以5:1摩尔比含有阿糖胞苷和柔红霉素的脂质体制剂。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与低甲基化剂(例如DNA甲基转移酶抑制剂，例如氮杂胞苷或地西他滨)组合施用于受试者。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与生物疗法(例如抗体或细胞疗法，例如225Ac-林妥珠单抗(Actimab-A；Actinium Pharmaceuticals)，IPH2102(Innate Pharma/Bristol Myers Squibb)，SGN-CD33A(Seattle Genetics)或吉姆单抗奥佐米星(Mylotarg；Pfizer)组合施用于受试者。SGN-CD33A是包含与抗CD33抗体连接的吡咯并苯并二氮杂二聚体的抗体-药物缀合物(ADC)。Actimab-A是用锕标记的抗CD33抗体(林妥珠单抗)。IPH2102是靶向杀伤性免疫球蛋白样受体(KIRs)的单克隆抗体。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与FLT3抑制剂(例如索拉非尼(Bayer))，米哚妥林(Novartis)，quizartinib(Daiichi Sankyo)，crenolanib(Arog Pharmaceuticals)，PLX3397(Daiichi Sankyo)，AKN-028(AkinionPharmaceuticals)或ASP2215(Astellas)组合施用于受试者。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与异柠檬酸脱氢酶(IDH)抑制剂例如AG-221(Celgene/Agios)或AG-120(Agios/Celgene)组合施用于受试者。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与细胞周期调节剂，例如polo样激酶1(Plk1)的抑制剂，例如volasertib(Boehringer Ingelheim)；或细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cdk9)的抑制剂，例如阿伏西地(Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis)组合施用于受试者。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与B细胞受体信号传导网络抑制剂，例如B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的抑制剂(例如venetoclax(Abbvie/Roche))；或Bruton酪氨酸激酶(Btk)的抑制剂，例如ibrutinib(Pharmacyclics/Johnson&Johnson Janssen Pharmaceutical)组合施用于受试者。在实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞与M1氨肽酶抑制剂(例如tosedostat(CTI BioPharma/Vernalis))；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制剂，例如pracinostat(MEI Pharma)；多激酶抑制剂，例如rigosertib(Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio)；或肽CXCR4反向激动剂，例如BL-8040(BioLineRx)组合施用于受试者。
在另一个实施方案中，受试者在细胞的移植前，例如同种异体干细胞移植前接受本发明的CAR表达细胞，例如CD19 CAR表达细胞组合物的输注。在优选的实施方案中，CAR表达细胞例如通过电穿孔mRNA CAR瞬时表达CAR，由此在输注供体干细胞之前终止由CAR靶向的抗原(例如CD19)的表达以避免移植物植入失败。在一个实施方案中，可以对受试者施用降低或改善与施用CAR表达细胞相关的副作用的活性剂。与施用CAR表达细胞相关的副作用包括但不限于CRS和嗜血细胞淋巴组织细胞增多症(HLH)，也称为巨噬细胞激活综合征(MAS)。CRS的症状包括高热，恶心，短暂性低血压，缺氧等。因此，本文所述的方法可以包括向受试者施用本文所述的CAR表达细胞，并进一步施用活性剂以控制由用CAR表达细胞治疗而产生的可溶性因子的升高水平。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ，TNFα，IL-2和IL-6中的一种或多种。因此，用于治疗这种副作用的活性剂可以是中和这些可溶性因子中的一种或多种的活性剂。这些活性剂的实例包括但不限于类固醇(例如皮质类固醇)，TNFα抑制剂和IL-6的抑制剂。TNFα抑制剂的一个实例是抗TNFα抗体分子，如英夫利昔单抗，阿达木单抗，培舍珠单抗和戈利木单抗。TNFα抑制剂的另一个实例是融合蛋白，如恩那西普(entanercept)。TNFα的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱)和安非他酮。IL-6抑制剂的一个实例是抗-IL-6抗体分子，例如托珠单抗(toc)，sarilumab，elsilimomab，CNTO 328,ALD518/BMS-945429,CNTO 136,CPSI-2364,CDP6038,VX30,ARGX-109,FE301,和FM101。在一个实施方案中，抗IL-6抗体分子是托珠单抗。基于IL-1R的抑制剂的实例是阿那白滞素。
在实施方案中，例如在施用一种或多种表达本文所述的CAR的细胞之前对受试者进行淋巴清除。在实施方案中，淋巴清除包括施用美法仑，环磷酰胺制剂(cytoxan)，环磷酰胺(cyclophosphamide)和氟达拉滨中的一种或多种。
在实施方案中，在CAR细胞(例如本文所述的细胞)施用(例如，输注)之前，同时或之后向受试者施用淋巴清除化疗。在一个实例中，在施用CAR细胞之前，向受试者施用淋巴清除化疗。例如，在CAR细胞输注之前1-4天(例如，1,2,3或4天)结束淋巴清除化疗。在实施方案中，施用多个剂量的CAR细胞，例如如本文所述。例如，单剂量包含约5x108个CAR细胞。在实施方案中，在本文所述的表达CAR的细胞的施用(例如，输注)之前，同时或之后向受试者施用淋巴清除化疗。
在一些实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与CD19 CAR表达细胞，例如CTL019(例如，如WO2012/079000中所述，其通过引用并入本文)组合施用于受试者，用于治疗与癌抗原的表达相关的疾病，例如本文所述的癌症。不受理论的束缚，据信，与另一CAR表达细胞组合施用CD19 CAR表达细胞通过靶向早期谱系癌细胞(例如癌干细胞)，调节免疫应答，消耗调节性B细胞和/或改善肿瘤微环境来改善本文所述的CAR表达细胞的功效。例如，CD19CAR表达细胞靶向表达早期谱系标志物的癌细胞，例如癌干细胞和CD19表达细胞，而本文所述的一些其它CAR表达细胞靶向表达晚期谱系标志物的癌细胞。该预处理方法可以改善本文所述的CAR表达细胞的功效。在这样的实施方案中，CD19 CAR表达细胞在施用(例如，输注)第二CAR表达细胞之前，同时或之后施用。
在实施方案中，表达靶向除CD19之外的癌抗原的CAR的CAR表达细胞还表达靶向CD19的CAR，例如CD19 CAR。在一个实施方案中，将表达非CD19 CAR和CD19 CAR的细胞施用于受试者以治疗本文所述的癌症，例如AML。在一个实施方案中，一个或两个CAR分子的构型包含主要细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在另一个实施方案中，一个或两个CAR分子的构型包含主要细胞内信号传导结构域和两个或多个，例如2,3,4或5个或更多个共刺激信号传导结构域。在这样的实施方案中，非CD19 CAR分子和CD19 CAR可以具有相同或不同的主要细胞内信号传导结构域，相同或不同的共刺激信号传导结构域，或相同数目或不同数目的共刺激信号传导结构域。或者，非CD19 CAR和CD19 CAR被配置为分裂CAR，其中CAR分子之一包含抗原结合结构域和共刺激结构域(例如4-1BB)，而另一CAR分子包含抗原结合结构域和主要细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)。
抑制性分子抑制剂/检查点抑制剂
在一个实施方案中，受试者可以施用增强CAR表达细胞活性的活性剂。例如，在一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂，例如该活性剂是检查点抑制剂。在一些实施方案中，抑制性或检查点分子，例如程序性死亡1(PD1)可以降低CAR表达细胞装载免疫效应物应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如TGFRβ)。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞包含开关共刺激受体，例如WO2013/019615中所述，其全部内容通过引用并入本文。
本文描述的方法可以包括与检查点抑制剂组合施用CAR表达细胞。在一个实施方案中，受试者是完全应答者。在另一个实施方案中，受试者是部分应答者或非应答者，并且例如在一些实施方案中，检查点抑制剂在CAR表达细胞之前施用，例如施用CAR表达细胞前两周，12天，10天，8天，一周，6天，5天，4天，3天，2天或1天前施用。在一些实施方案中，检查点抑制剂与CAR表达细胞同时施用。
对抑制性分子的抑制，例如通过DNA，RNA或蛋白质水平上的抑制，可以优化CAR表达细胞的性能。在实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，或聚簇规则间隔短回文重复(CRISPR)，转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)，或锌指内切核酸酶(ZFN)可以用于抑制CAR表达细胞中抑制性分子的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，抑制性分子在CAR表达细胞内被抑制。在这些实施方案中，抑制抑制性分子表达的dsRNA分子与编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一个实施方案中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子有效连接到启动子，例如H1-或U6衍生的启动子，使得抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子被表达，例如在表达CAR的细胞内表达。参见例如Tiscornia G.,“Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,”Chapter 3,in Gene Transfer:Delivery and Expression of DNA and RNA(eds.Friedmann and Rossi).Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,USA,2007；Brummelkamp TR,et al.(2002)Science 296:550–553；MiyagishiM,et al.(2002)Nat.Biotechnol.19:497–500。在一个实施方案中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于相同的载体，例如慢病毒载体上，其包含编码CAR的组件，例如所有组件的核酸分子。在这样的实施方案中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子位于载体，例如慢病毒载体上，编码CAR的组件(例如所有组件)的核酸的5'-或3。编码抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子可以以与CAR的组件(例如所有组件)的核酸相同或不同的方向进行转录。在一个实施方案中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于载体上，该载体不同于包含编码CAR的组件(例如所有组件)的核酸分子的载体。在一个实施方案中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子在表达CAR的细胞内瞬时表达。在一个实施方案中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子稳定地整合到CAR表达细胞的基因组中。在一个实施方案中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子是PD-1。
在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，该活性剂可以是与PD1，PD-L1，PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称为MDX-010和MDX-101，并以上市，Bristol-Myers Squibb；Tremelimumab(可得自Pfizer的IgG2单克隆抗体，以前称为ticilimumab，CP-675,206))。在一个实施方案中，该活性剂是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，该活性剂是与LAG3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述活性剂是结合CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)的抗体或抗体片段。在实施方案中，增强CAR表达细胞(例如抑制性分子的抑制剂)的活性的活性剂与同种异体CAR，例如本文所述的同种异体CAR(例如，在本文的同种异体CAR部分中描述)组合施用。
PD1是CD28受体家族的抑制成员，其还包括CD28，CTLA-4，ICOS和BTLA。PD1在活化的B细胞，T细胞和骨髓细胞上表达(Agata et al.1996Int.Immunol 8:765-75)。已经显示PD1，PD-L1和PD-L2的两个配体在与PD1结合时下调T细胞活化(Freeman et a.2000J ExpMed 192:1027-34；Latchman et al.2001Nat Immunol 2:261-8；Carter et al.2002Eur JImmunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong et al.2003J Mol Med 81:281-7；Blank et al.2005Cancer Immunol.Immunother54:307-314；Konishi et al.2004ClinCancer Res 10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
PD1，PD-L1和PD-L2的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，nivolumab(也称为BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是完全人IgG4单克隆抗体，其特异性阻断PD1。在US 8,008,449和WO2006/121168中公开了Nivolumab(克隆5C4)和与PD1特异性结合的其它人单克隆抗体。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是结合PD1的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD1单克隆抗体公开在WO2009/101611中。Pembrolizumab(以前称为lambrolizumab，也称为Keytruda，MK03475；Merck)是与PD1结合的人源化IgG4单克隆抗体。Pembrolizumab和其他人源化抗PD1抗体公开在US 8,354,509和WO2009/114335中。MEDI4736(Medimmune)是与PDL1结合并抑制配体与PD1相互作用的人单克隆抗体。MDPL3280A(Genentech/Roche)是与PD-L1结合的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和针对PD-L1的其他人单克隆抗体公开在美国专利号7,943,743和美国公开号:20120039906中。其它抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(显示在WO2010/077634中的SEQ ID NO:20和21的重链和轻链可变区)和MDX-1055(也称为BMS-936559，以及例如WO2007/005874中公开的抗PD-L1结合剂)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827和WO2011/066342中公开)是阻断PD1和B7-H1之间的相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。其它抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)，其中包括例如US 8,609,089，US 2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。
在一些实施方案中，本文所述的PD1抑制剂(例如PD1抗体，例如本文所述的PD1抗体)与本文所述的CD19 CAR组合用于治疗与CD19表达相关的疾病。在一些实施方案中，本文所述的PD-L1抑制剂(例如，PD-L1抗体，例如本文所述的PD-L1抗体)与本文所述的CD19 CAR组合用于治疗与CD19的表达相关的疾病。该疾病可以是例如淋巴瘤，例如DLBCL，包括原发性DLBCL或继发性DLBCL。在一些实施方案中，受试者具有或被鉴定为具有至少5％,6％,7％,8％,9％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％或90％的癌细胞，例如DLBCL细胞，其为CD3+/PD1+。在一些实施方案中，受试者在癌症例如癌症微环境中具有或被鉴定为具有CD19+细胞和PD-L1+细胞的基本上不重叠的群体。例如，在一些实施方案中，癌症，例如癌细胞微环境中小于20％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,或1％的细胞对于CD19和PD-L1是双阳性的。
在一些实施方案中，用CD19 CAR，PD1抑制剂和PD-L1抑制剂的组合治疗受试者。在一些实施方案中，用CD19 CAR，PD1抑制剂和CD3抑制剂的组合治疗受试者。在一些实施方案中，用CD19 CAR，PD1抑制剂，PD-L1抑制剂和CD3抑制剂的组合治疗受试者。
在一些实施方案中，本文的方法包括测定生物样品,例如包含DLBCL细胞的样品中细胞的CD3和/或PD-1(例如CD3和/或PD-1表达)的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括测定生物样品(例如包含DLBCL细胞的样品)中细胞的CD19和/或PD-L1(例如CD19和/或PD-L1表达)的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括例如提供包含癌细胞的样品并且例如通过免疫组织化学检测CD3，PD-1，CD19或PD-L1中的一种或多种的检测步骤。所述方法可以包括进一步的建议或施用治疗，例如包括CD19 CAR的治疗的步骤。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其片段是US 2015/0210769(标题为“针对PD-1的抗体分子及其用途”，其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗PD-1抗体分子。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自抗体的重链和轻链可变区的至少一个，二个，三个，四个，五个或六个CDR(或统称为所有CDR)，所述抗体选自以下的任何一种:BAP049-hum01,BAP049-hum02,BAP049-hum03,BAP049-hum04,BAP049-hum05,BAP049-hum06,BAP049-hum07,BAP049-hum08,BAP049-hum09,BAP049-hum10,BAP049-hum11,BAP049-hum12,BAP049-hum13,BAP049-hum14,BAP049-hum15,BAP049-hum16,BAP049-Clone-A,BAP049-Clone-B,BAP049-Clone-C,BAP049-Clone-D,或BAP049-Clone-E；或如US 2015/0210769的表1所述，或由表1中的核苷酸序列编码，或与上述任何序列基本相同的序列(例如，至少80％,85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％或更高同一性)；或密切相关的CDR，例如相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个，两个，三个或四个可变区，所述抗体例如选自BAP049-hum01,BAP049-hum02,BAP049-hum03,BAP049-hum04,BAP049-hum05,BAP049-hum06,BAP049-hum07,BAP049-hum08,BAP049-hum09,BAP049-hum10,BAP049-hum11,BAP049-hum12,BAP049-hum13,BAP049-hum14,BAP049-hum15,BAP049-hum16,BAP049-Clone-A,BAP049-Clone-B,BAP049-Clone-C,BAP049-Clone-D,或BAP049-Clone-E的任一种；或如US 2015/0210769的表1所述，或由表1中的核苷酸序列编码，或与上述任何序列基本相同的序列(例如，至少80％,85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％或更高同一性)。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)也负调节T细胞功能，特别是在IFN-g分泌的CD4+T辅助细胞1和CD8+T细胞毒性1细胞中的T细胞功能，并在T细胞衰竭中发挥关键作用。抑制TIM3及其配体如galectin-9(Gal9)，磷脂酰丝氨酸(PS)和HMGB1之间的相互作用可增加免疫应答。TIM3及其配体的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，靶向TIM3的抗体，抗体片段，小分子或肽抑制剂结合TIM3的IgV结构域以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽公开在WO2013/006490和US20100247521中。其他抗TIM3抗体包括RMT3-23(公开于Ngiow et al.,2011,Cancer Res,71:3540-3551)和克隆8B.2C12(公开在Monney et al.,2002,Nature,415:536-541)的人源化形式。在US20130156774中公开了抑制TIM3和PD-1的双特异性抗体。
在一个实施方案中，抗TIM3抗体或其片段是US 2015/0218274(标题为“针对TIM3的抗体分子及其用途”，其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗TIM3抗体分子。在一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含来自抗体的重链和轻链可变区的至少一个，二个，三个，四个，五个或六个CDR(或统称为所有CDR)，所述抗体选自以下的任何一种:ABTIM3,ABTIM3-hum01,ABTIM3-hum02,ABTIM3-hum03,ABTIM3-hum04,ABTIM3-hum05,ABTIM3-hum06,ABTIM3-hum07,ABTIM3-hum08,ABTIM3-hum09,ABTIM3-hum10,ABTIM3-hum11,ABTIM3-hum12,ABTIM3-hum13,ABTIM3-hum14,ABTIM3-hum15,ABTIM3-hum16,ABTIM3-hum17,ABTIM3-hum18,ABTIM3-hum19,ABTIM3-hum20,ABTIM3-hum21,ABTIM3-hum22,ABTIM3-hum23；或如US2015/0218274的表1-4所述，或由表1-4中的核苷酸序列编码，或与上述任何序列基本相同的序列(例如，至少80％,85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％或更高同一性)；或密切相关的CDR，例如相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
在另一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个，两个，三个或四个可变区，所述抗体例如选自ABTIM3,ABTIM3-hum01,ABTIM3-hum02,ABTIM3-hum03,ABTIM3-hum04,ABTIM3-hum05,ABTIM3-hum06,ABTIM3-hum07,ABTIM3-hum08,ABTIM3-hum09,ABTIM3-hum10,ABTIM3-hum11,ABTIM3-hum12,ABTIM3-hum13,ABTIM3-hum14,ABTIM3-hum15,ABTIM3-hum16,ABTIM3-hum17,ABTIM3-hum18,ABTIM3-hum19,ABTIM3-hum20,ABTIM3-hum21,ABTIM3-hum22,ABTIM3-hum23的任一种；或如US 2015/0218274的表1-4所述，或由表1-4中的核苷酸序列编码，或与上述任何序列基本相同的序列(例如，至少80％,85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％或更高同一性)。
在其它实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂是CEACAM抑制剂(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一个实施方案中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM-1抗体描述于WO 2010/125571,WO 2013/082366，WO2014/059251和WO 2014/022332中，例如单克隆抗体34B1,26H7和5F4；或其重组形式，如例如US 2004/0047858，US 7,132,255和WO 99/052552中所述。在其它实施方案中，抗CEACAM抗体结合CEACAM-5，如例如Zheng et al.PLoS One.2010Sep 2；5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所述，或与例如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所述的CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应。
不希望受理论束缚，认为癌胚抗原细胞粘附分子(CEACAM),如CEACAM-1和CEACAM-5至少部分地介导抗肿瘤免疫应答的抑制(参见例如，Markel et al.J Immunol.2002Mar15；168(6):2803-10；Markel et al.J Immunol.2006Nov 1；177(9):6062-71；Markel etal.Immunology.2009 Feb；126(2):186-200；Markel et al.Cancer ImmunolImmunother.2010 Feb；59(2):215-30；Ortenberg et al.Mol Cancer Ther.2012 Jun；11(6):1300-10；Stern et al.J Immunol.2005Jun 1；174(11):6692-701；Zheng et al.PLoSOne.2010Sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，已经将CEACAM-1描述为TIM-3的异嗜性配体，并且在TIM-3介导的T细胞耐受和消耗中起作用(参见例如WO 2014/022332；Huang,et al.(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在实施方案中，CEACAM-1和TIM-3的共同阻断已显示增强异种移植结肠直肠癌模型中的抗肿瘤免疫应答(参见例如WO 2014/022332；Huang等人(2014)，同上)。在其它实施方案中，CEACAM-1和PD-1的共同阻断降低了例如在WO2014/059251中所述的T细胞耐受性。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述的其它免疫调节剂(例如抗PD-1和/或抗TIM-3抑制剂)一起使用以增强针对癌症例如黑素瘤，肺癌(例如，NSCLC)，膀胱癌，结肠癌，卵巢癌和本文所述的其它癌症的免疫应答。
LAG3(淋巴细胞激活基因-3或CD223)是在活化的T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子，其已被证明在CD8+T细胞衰竭中起作用。LAG3及其配体的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗剂LAG3抗体，IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是消耗性LAG3抗体。其他LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep)，其是LAG3的可溶性部分和Ig的重组融合蛋白，其与MHC II类分子结合并激活抗原呈递细胞(APC)。例如在WO2010/019570公开了其它抗体。
在一个实施方案中，抗LAG3抗体或其片段是如US 2015/0259420(标题为“针对LAG3的抗体分子及其用途”，其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗LAG3抗体分子。在一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包含来自选自BAP050-hum01,BAP050-hum02,BAP050-hum03,BAP050-hum04,BAP050-hum05,BAP050-hum06,BAP050-hum07,BAP050-hum08,BAP050-hum09,BAP050-hum10,BAP050-hum11,BAP050-hum12,BAP050-hum13,BAP050-hum14,BAP050-hum15,BAP050-hum16,BAP050-hum17,BAP050-hum18,BAP050-hum19,BAP050-hum20,huBAP050(Ser)(e.g.,BAP050-hum01-Ser,BAP050-hum02-Ser,BAP050-hum03-Ser,BAP050-hum04-Ser,BAP050-hum05-Ser,BAP050-hum06-Ser,BAP050-hum07-Ser,BAP050-hum08-Ser,BAP050-hum09-Ser,BAP050-hum10-Ser,BAP050-hum11-Ser,BAP050-hum12-Ser,BAP050-hum13-Ser,BAP050-hum14-Ser,BAP050-hum15-Ser,BAP050-hum18-Ser,BAP050-hum19-Ser,或BAP050-hum20-Ser),BAP050-Clone-F,BAP050-Clone-G,BAP050-Clone-H,BAP050-Clone-I,或BAP050-Clone-J中任一种的抗体的重链和轻链可变区的至少一个，二个，三个，四个，五个或六个CDR(或统称为所有CDR)；或如US 2015/0259420的表1所述；或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述任何序列基本相同(例如至80％,85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％或更高同一性)的序列，或密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
在另一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包含来自本文所述的抗体，例如选自BAP050-hum01,BAP050-hum02,BAP050-hum03,BAP050-hum04,BAP050-hum05,BAP050-hum06,BAP050-hum07,BAP050-hum08,BAP050-hum09,BAP050-hum10,BAP050-hum11,BAP050-hum12,BAP050-hum13,BAP050-hum14,BAP050-hum15,BAP050-hum16,BAP050-hum17,BAP050-hum18,BAP050-hum19,BAP050-hum20,huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser,BAP050-hum02-Ser,BAP050-hum03-Ser,BAP050-hum04-Ser,BAP050-hum05-Ser,BAP050-hum06-Ser,BAP050-hum07-Ser,BAP050-hum08-Ser,BAP050-hum09-Ser,BAP050-hum10-Ser,BAP050-hum11-Ser,BAP050-hum12-Ser,BAP050-hum13-Ser,BAP050-hum14-Ser,BAP050-hum15-Ser,BAP050-hum18-Ser,BAP050-hum19-Ser,或BAP050-hum20-Ser),BAP050-Clone-F,BAP050-Clone-G,BAP050-Clone-H,BAP050-Clone-I,或BAP050-Clone-J的抗体的至少一个，两个，三个或四个可变区；或如US2015/0259420的表1所述；或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述任何序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％或更高同一性)的序列。
虽然不希望被理论束缚，但是在一些实施方案中，由于由PD-L1+表达细胞或PD1+T细胞在肿瘤内微环境中的存在所发挥的直接或间接抑制作用，肿瘤微环境不利于攻击癌细胞的CART细胞。更具体地，肿瘤微环境可以包含肿瘤细胞(通常是CD19+)，免疫效应细胞(其可以是CD3+T细胞，并且可以是PD1+或PD1-，并且其可以是内源性细胞或CAR表达细胞)，和被激活的髓系细胞(通常为PD-L1+)。PD1+T细胞可以通过阻止CART细胞进入肿瘤而在肿瘤微环境周围产生“屏障”。根据本文的非限制性理论，PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂的预施用使肿瘤微环境更有利于CAR表达细胞进入肿瘤微环境并有效清除靶阳性癌细胞。本文，例如在实施例20和21中提供了支持该模型的数据。
因此，在某些方面，本公开提供了组合疗法的方法，其包括向受试者施用表达结合CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的细胞，与PD1抑制剂，PD-L1抑制剂或两者的组合。在一些实施方案中，在CAR疗法之前施用PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。在其它实施方案中，PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂与CAR疗法同时或之后施用。在一些方面，受试者是具有与CD19表达相关的疾病(例如血液恶性肿瘤，例如白血病或淋巴瘤，例如DLBCL，例如原发性DLBCL)的受试者。在一些实施方案中，患者具有或被鉴定为具有升高的PD1，PDL1或CD3的水平，或其任何组合。在一些实施方案中，患者具有或被鉴定为具有至少5％,6％,7％,8％,9％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或90％的对于CD3和PD1呈阳性的DLBCL细胞。
本文还提供了用于监测CAR疗法(例如CD19 CAR疗法)的功效的方法。可以将CAR表达细胞施用于患者的血液，意图是将细胞归巢于肿瘤细胞，例如渗透肿瘤。因此，在一些实施方案中，该方法包括测定肿瘤样品中CAR表达细胞的存在。在实施方案中，该方法包括检测肿瘤标志，例如CD19。在实施方案中，该方法包括检测CAR表达细胞的标志，例如CAR构建体或编码CAR构建体的核酸。在实施方案中，所述方法还包括检测T细胞标志，例如CD3。在一些方面，受试者是具有与CD19表达相关的疾病，例如血液恶性肿瘤，例如白血病或淋巴瘤，例如DLBCL，例如原发性DLBCL的受试者。在一些实施方案中，如果CAR表达细胞显示出差的肿瘤浸润，则与具有良好的肿瘤浸润的受试者相比，受试者被鉴定为具有升高的复发的风险。在一些实施方案中，如果CAR表达细胞显示差的肿瘤浸润，则对受试者施用PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂，例如与第二剂量的CAR表达细胞组合。
在一些实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如包含如本文所述的细胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与阳性信号相关的多肽可以包括CD28，CD27，ICOS的共刺激结构域，例如CD28，CD27和/或ICOS的细胞内信号传导结构域和/或例如，如本文所述的CD3ζ的主要信号传导结构域。在一个实施方案中，融合蛋白由表达CAR的相同细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由细胞，例如不表达抗CD19 CAR的T细胞表达。
在一个实施方案中，增强本文所述CAR表达细胞活性的活性剂是miR-17-92。
在一个实施方案中，增强本文所述CAR活性的活性剂是细胞因子。细胞因子具有与T细胞扩增，分化，存活和内稳态相关的重要功能。可以向接受本文所述的CAR表达细胞的受试者施用的细胞因子包括:IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15，IL-18和IL-21，或其组合。在实施方案中，施用的细胞因子是IL-7，IL-15或IL-21，或其组合。细胞因子可以每天一次或多于一次，例如每天两次，每天三次，或每天四次施用。细胞因子可以施用超过一天，例如施用细胞因子2天，3天，4天，5天，6天，1周，2周，3周或4周。例如，细胞因子每天施用一次，为期7天。
在实施方案中，细胞因子与CAR表达细胞组合施用。细胞因子可以与CAR表达细胞同时或并发施用，例如在同一天施用。细胞因子可以与CAR表达细胞在相同的药物组合物中制备，或者可以在单独的药物组合物中制备。或者，可以在施用CAR表达T细胞后不久施用细胞因子，例如在施用CAR表达细胞后1天，2天，3天，4天，5天，6天或7天施用。在细胞因子以超过一天发生的给药方案给药的实施方案中，细胞因子给药方案的第一天可以与用CAR表达细胞施用在同一天或细胞因子给药方案的第一天可以在施用CAR表达T细胞后1天，2天，3天，4天，5天，6天或7天。在一个实施方案中，在第一天，向受试者施用CAR表达细胞，并且在第二天，在接下来的7天中每天一次施用细胞因子。在一个实施方案中，与CAR表达细胞组合施用的细胞因子是IL-7，IL-15和/或IL-21。
在其它实施方案中，在施用CAR表达细胞后足够的时间内，例如在施用CAR表达细胞后至少2周，3周，4周，6周，8周，10周，12周，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，或1年或以上施用细胞因子。在一个实施方案中，在评估受试者对表达CAR的细胞的应答后施用细胞因子。例如，根据本文所述的剂量和方案，对受试者施用CAR表达细胞。在施用CAR表达细胞后2周，3周，4周，6周，8周，10周，12周，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月或1年或更长时间时，使用本文所述的任何方法，包括肿瘤生长的抑制，循环肿瘤细胞的减少或肿瘤消退,评估受试者对CART治疗的应答。对CART治疗没有表现出足够应答的受试者可以被施用细胞因子。对CART治疗具有次优应答的受试者的细胞因子施用改善了CART功效和/或抗肿瘤活性。在一个实施方案中，在施用CAR表达细胞后施用的细胞因子是IL-7。
进一步的联合治疗可以包括抗过敏剂，止吐剂，止痛剂，辅助疗法。
在给药期间或之后，一些患者可能对本文所述的治疗剂和/或其它抗癌剂产生过敏反应；因此，通常施用抗过敏剂以最小化过敏反应的风险。合适的抗过敏剂包括皮质类固醇，例如地塞米松(例如，)，倍氯米松(例如)，氢化可的松(也称为可的松，氢化可的松琥珀酸钠，氢化可的松磷酸钠，并以商品名氢化可的松磷酸盐，和出售)，泼尼松龙(以商品名和出售)，泼尼松(以商品名Liquid 和出售)，甲基泼尼松龙(也称为6-甲基泼尼松龙，乙酸甲泼尼龙，甲泼尼龙琥珀酸钠，以商品名M-和Solu-销售)；抗组胺药，如苯海拉明(如)，羟嗪和赛庚啶；和支气管扩张剂，例如β-肾上腺素能受体激动剂，沙丁胺醇(例如)和特布他林
一些患者在施用本文所述的治疗剂和/或其它抗癌剂期间和之后可能会感到恶心；因此，止吐药可用于预防恶心(上胃)和呕吐。合适的止吐药包括阿瑞匹坦昂丹司琼格拉司琼HCl劳拉西泮地塞米松丙氯拉嗪casopitant(和)，及其组合。
缓解治疗期间经历的疼痛的药物通常被处方为使患者更舒适。通常使用常用的非处方镇痛药，如然而，阿片类镇痛药如氢可酮/扑热息痛或氢可酮/对乙酰氨基酚(例如，)，吗啡(例如，或)，羟考酮(例如，或)，盐酸羟吗啡酮和芬太尼(如)也适用于中度或重度疼痛。
在保护正常细胞免于治疗毒性，并限制器官毒性的努力中，细胞保护剂(如神经保护剂，自由基清除剂，心脏保护剂，蒽环类外渗中和剂，营养物等)可被用作一种辅助疗法。合适的细胞保护剂包括氨磷汀谷氨酰胺，地美司钠美司钠右丙亚胺(或)，扎利罗登和亚叶酸(也称为甲酰四氢叶酸钙，噬橙菌因子和亚叶酸)。
通过代号，通用名称或商品名称确定的活性化合物的结构可以从标准简编“默克索引”的实际版本中获取，或从数据库，例如，Patents International(如IMS WorldPublications)获取。
可以与本发明化合物组合使用的上述化合物可以如本领域所述，例如上述文献所述制备和施用。
在一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含至少一种本发明的化合物(例如本发明的化合物)或其药学上可接受的盐以及适用于施用于人或动物受试者的药学上可接受的载体一起，单独或与其他抗癌剂一起。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有诸如癌症的细胞增殖性疾病的人或动物受试者的方法。本发明提供了治疗需要这种治疗的人或动物受试者的方法，包括向受试者单独或与其他抗癌剂组合施用治疗有效量的本发明化合物(例如本发明化合物)或其药学上可接受的盐。
特别地，组合物将作为组合治疗剂配制在一起或分别施用。
在组合治疗中，本发明的化合物和其它抗癌剂可以同时，并发或相继地施用，没有特定时间限制，其中这种施用在患者体内提供治疗有效水平的两种化合物。
在优选的实施方案中，本发明化合物和其它抗癌剂通常通过输注或口服以任何顺序依次施用。给药方案可以根据疾病的阶段，患者的身体适应性，各种药物的安全性谱以及各种药物的耐受性以及施用组合的主治医师和医师所熟知的其它标准而变化。根据用于治疗的特定周期，本发明的化合物和其它抗癌剂可以在彼此分开的几分钟内，几小时，几天或甚至几周内施用。此外，该周期可以包括在治疗周期期间施用一种药物比施用另一种药物更经常以及每次药物施用以不同剂量施用。
在本发明的另一方面，提供了包括一种或多种本发明化合物和本文公开的组合配偶体的药盒。代表性的药盒包括(a)本发明的化合物或其药学上可接受的盐，(b)至少一种组合配偶体，例如如上所述，其中该药盒可以包含包装插页或包括给药指导的其他标签。
本发明的化合物也可以与已知的治疗过程例如，激素或特别是辐射的施用组合使用。本发明的化合物可特别用作放射增敏剂，特别是用于治疗对放射疗法显示差的敏感性的肿瘤。
与低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂组合
在一个实施方案中，表达CAR分子，例如本文所述的CAR分子的细胞与低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂组合施用。例如，在一个实施方案中，组合疗法包括:CD19 CAR表达细胞，B细胞抑制剂(CD10，CD20，CD22，CD34，CD123，FLT-3或ROR1的一种或多种的抑制剂，例如靶向CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1中的一种或多种的CAR表达细胞)和mTOR抑制剂。本文描述的方法使用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂，例如变构mTOR抑制剂，包括rapalogs如RAD001。施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如，不足以完全抑制免疫系统但足以改善免疫功能的剂量)可以优化受试者中免疫效应细胞(例如T细胞或CAR表达细胞)的性能。用于测量mTOR抑制，剂量，治疗方案和合适的药物组合物的方法描述于美国专利申请号2005/01240036中，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂可导致以下的一种或多种:
i)PD-1阳性免疫效应细胞数量的减少；
ii)PD-1阴性免疫效应细胞数量的增加；
iii)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比例的增加；
iv)初始T细胞数量的增加；
v)例如在记忆性T细胞，例如记忆性T细胞前体上一种或多种以下标志的表达的增加:CD62L高,CD127高,CD27+,和BCL2；
vi)例如在记忆性T细胞，例如记忆性T细胞前体上KLRG1的表达的降低；或
vii)记忆T细胞前体的数量增加，例如具有以下特征的任何一种或组合的细胞:增加的CD62L高，增加的CD127高，增加的CD27+，减少的KLRG1和增加的BCL2；
并且其中前述任何一种，例如，i),ii),iii),iv),v),vi),或vii)例如至少例如短暂地发生，例如与未治疗的受试者相比短暂地发生。
在另一个实施方案中，例如与未处理的CAR-表达细胞或未经治疗的受试者相比，例如在培养物或受试者中，施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致CAR表达细胞的增殖或延长的增殖或持续性。在实施方案中，增加的增殖或持续性与CAR表达细胞数量的增加相关。测量增加的或延长的增殖的方法描述于实施例18和19中。在另一个实施方案中，施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致例如，在培养物或受试者中通过CAR表达细胞增加的癌细胞杀伤，例如与未处理的CAR表达细胞或未处理的受试者相比。在实施方案中，癌细胞的增加的杀伤与肿瘤体积的减少相关。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的细胞与低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001)或催化性mTOR抑制剂组合施用。例如，施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂可以在施用本文所述的CAR表达细胞之前开始；在施用本文所述的CAR-表达细胞之前完成；在施用本文所述的CAR-表达细胞的同时起始；与施用本文所述的CAR-表达细胞重叠；或在施用本文所述的CAR表达细胞后继续。
或者或另外，施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂可优化待工程化以表达本文所述的CAR分子的免疫效应细胞。在这样的实施方案中，在从受试者收获待工程化以表达本文所述的CAR分子的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)之前开始或完成施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如变构抑制剂，例如RAD001)或催化性抑制剂。
在另一个实施方案中，待工程化以表达本文所述的CAR分子的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)(例如在从受试者收获后)或表达CAR的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞，例如在施用于受试者之前，可以在低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的存在下进行培养。
在一个实施方案中，向受试者施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂包括例如每周一次，例如以立即释放剂型施用0.1至20,0.5至10,2.5至7.5,3至6，或约5mg的RAD001，或其生物等效剂量。在一个实施方案中，对受试者施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂包括例如每周一次,例如以持续释放剂型施用0.3至60,1.5至30,7.5至22.5,9至18，或约15mg的RAD001，或其生物等效剂量。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不超过90％、至少10％但不超过90％、至少15％但不超过90％、至少20％但不超过90％、至少30％但不超过90％、至少40％但不超过90％、至少50％但不超过90％、至少60％但不超过90％，至少70％但不超过90％，至少5％但不超过80％、至少10％但不超过80％、至少15％但不超过80％、至少20％但不超过80％、至少30％但不超过80％、至少40％但不超过80％、至少50％但不超过80％，至少60％但不超过80％，至少5％但不超过70％、至少10％但不超过70％、至少15％但不超过70％、至少20％但不超过70％、至少30％但不超过70％、至少40％但不超过70％，至少50％但不超过70％，至少5％但不超过60％、至少10％但不超过60％、至少15％但不超过60％、至少20％但不超过60％、至少30％但不超过60％，至少40％但不超过60％，至少5％但不超过50％、至少10％但不超过50％、至少15％但不超过50％、至少20％但不超过50％、至少30％但不超过50％,至少40％但不超过50％,至少5％但不超过40％、至少10％但不超过40％、至少15％但不超过40％、至少20％但不超过40％、至少30％但不超过40％、至少35但不超过40％，至少5％但不超过30％、至少10％但不超过30％、至少15％但不超过30％、至少20％但不超过30％或至少25％但不超过30％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
mTOR抑制的程度可以传达为或者对应于P70 S6激酶抑制的程度，例如，mTOR抑制程度可以通过P70 S6激酶活性的降低水平(例如P70 S6激酶底物磷酸化的降低)来确定。mTOR抑制水平可以通过各种方法评价，例如通过Boulay测定法测量P70 S6激酶活性，如美国专利申请号2005/01240036中所述，其通过引用并入本文，或如美国专利号7,727,950所述，通其过引用并入本文；通过蛋白质印迹法测定磷酸化S6的水平；或评估PD1阴性免疫效应细胞与PD1阳性免疫效应细胞的比例的变化。
如本文所用，术语“mTOR抑制剂”是指抑制细胞中mTOR激酶的化合物或配体或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是变构抑制剂。变性mTOR抑制剂包括中性三环化合物雷帕霉素(西罗莫司)，雷帕霉素相关化合物，其是与雷帕霉素具有结构和功能相似性的化合物，包括例如雷帕霉素衍生物，雷帕霉素类似物(也称为rapalog)和抑制mTOR活性的其它大环内酯化合物。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是催化抑制剂。
雷帕霉素是吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)生产的已知的大环内酯类抗生素，具有式A所示结构。
参见，例如,McAlpine,J.B.等人,J.Antibiotics(1991)44:688；Schreiber,S.L.等人,J.Am.Chem.Soc.(1991)113:7433；U.S.Patent No.3,929,992。有许多种为雷帕霉素提出的编号方案。为了避免混乱,当本文中给具体的雷帕霉素类似物命名时,参考雷帕霉素，利用式A的编号方案给出名称。
可用于本发明中的雷帕霉素类似物例如是O-取代的类似物，其中雷帕霉素的环己基环上的羟基被OR1替代，其中R1是羟基烷基、羟基烷氧基烷基、酰基氨基烷基或氨基烷基；例如RAD001,也被称为依维莫司,如US5,665,772和WO94/09010中描述，将其内容并入作为参考。
其它合适的雷帕霉素类似物包括在第26-或28-位取代的那些。所述的雷帕霉素类似物可以是前面提到的类似物的差向异构体,特别是在第40,28或26位取代的并且可以任选地进一步被氢化的类似物的差向异构体,例如如US 6,015,815、WO95/14023和WO99/15530中描述的那样，将其内容并入作为参考,例如ABT578也被称为zotarolimus或在US 7,091,213、WO98/02441和WO01/14387中描述的雷帕霉素类似物，将其内容并入作为参考,例如AP23573，也被称为ridaforolimus。
适用于本发明中的来自US 5,665,772的雷帕霉素类似物的例子包括但不限于:40-O-苄基-雷帕霉素,40-O-(4’-羟基甲基)苄基-雷帕霉素,40-O-[4’-(1,2-二羟基乙基)]苄基-雷帕霉素,40-O-烯丙基-雷帕霉素,40-O-[3’-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4(S)-基)-丙-2’-烯-1’-基]-雷帕霉素,(2’E,4’S)-40-O-(4’,5’-二羟基戊-2’-烯-1’-基)-雷帕霉素,40-O-(2-羟基)乙氧基羰基甲基-雷帕霉素,40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素,40-O-(3-羟基)丙基-雷帕霉素,40-O-(6-羟基)己基-雷帕霉素,40-O-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷帕霉素,40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊环-3-基]甲基-雷帕霉素,40-O-[(2S)-2,3-二羟基丙-1-基]-雷帕霉素,40-O-(2-乙酰氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-(2-烟酰氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-[2-(N-吗啉代)乙酰氧基]乙基-雷帕霉素,40-O-(2-N-咪唑基乙酰氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-[2-(N-甲基-N’-哌嗪基)乙酰氧基]乙基-雷帕霉素,39-O-去甲基-39,40-O,O-亚乙基-雷帕霉素,(26R)-26-二氢-40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素,40-O-(2-氨基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-乙酰氨基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-烟酰胺基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-(N-甲基-咪唑并-2’-基乙氧甲酰氨基)乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-乙氧基羰基氨基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-甲苯磺酰氨基乙基)-雷帕霉素和40-O-[2-(4’,5’-二乙氧羰基-1’,2’,3’-三唑-1’-基)-乙基]-雷帕霉素。
可用于本发明中的其它雷帕霉素类似物是其中雷帕霉素的环己基环上的羟基和/或在第28位的羟基被羟基酯基替代的类似物,例如,在US RE44,768中发现的雷帕霉素类似物,例如坦罗莫司。
可用于本发明中的其它雷帕霉素类似物包括其中在第16位的甲氧基被另一个取代基替代的那些,例如，(任选地羟基取代的)炔基氧基,苄基,正甲氧基苄基或氯代苄基和/或其中在第39位的甲氧基与所述的第39位的碳一起被缺失，使得雷帕霉素的环己基环变成缺少所述的第39位的甲氧基的环戊基环的那些；例如如WO95/16691和WO96/41807中描述的那样，将其内容并入作为参考。可以进一步修饰所述的类似物，使得雷帕霉素第40位的羟基被烷基化和/或所述的第32位的羰基被还原。
来自WO95/16691的雷帕霉素类似物包括但不限于:16-去甲氧基-16-(戊-2-炔基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-(4-羟基-丁-2-炔基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-苄基氧基-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-苄基氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-正-甲氧基苄基-雷帕霉素,16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧基乙基)-16-戊-2-炔基)氧基-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-甲酰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-羟基甲基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-羧基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-(吗啉-4-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-[N-甲基,N-(2-吡啶-2-基-乙基)]氨基甲酰基-42-去甲-雷帕霉素和39-去甲氧基-40-脱氧-39-(对-甲苯磺酰基亚肼基甲基)-42-去甲-雷帕霉素。
来自WO96/41807的雷帕霉素类似物包括但不限于:32-脱氧-雷帕霉素,16-O-戊-2-炔基-32-脱氧-雷帕霉素,16-O-戊-2-炔基-32-脱氧-40-O-(2-羟基-乙基)-雷帕霉素,16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氢-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素,32(S)-二氢-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素和32(S)-二氢-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素。
另一种合适的雷帕霉素类似物是如US2005/010162 4中描述的umirolimus，将该文献并入本文作为参考。
RAD001,另外被称为依维莫司具有化学名称(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮，如在US5,665,772和WO94/09010中描述，将其各自内容并入本文作文参考。
别构的mTOR抑制剂的另外的例子包括西罗莫司(雷帕霉素,AY-22989),40-[3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也被称为坦罗莫司或CCI-779)和ridaforolimus(AP-23573/MK-8669)。其它别构的mTOR抑制剂的例子包括zotarolimus(ABT578)和umirolimus。
备选地或此外,已经发现了催化性的、ATP-竞争性的mTOR抑制剂直接靶向所述的mTOR激酶结构域并且靶向mTORC1和mTORC2两者。这些也是比诸如雷帕霉素的别构的mTOR抑制剂更加有效的mTORC1的抑制剂,因为它们调控雷帕霉素抗性的mTORC1输出，例如4EBP1-T37/46磷酸化和帽依赖性翻译。
催化性抑制剂包括:BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-喹啉-3-基-2,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈,或单甲苯磺酸盐形式。(BEZ235的合成被描述在WO2006/122806中)；CCG168(另外被称为AZD-8055,Chresta,C.M.等人,Cancer Res,2010,70(1),288-298)，它具有化学名称{5-[2,4-双-((S)-3-甲基-吗啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇；3-[2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺(WO09104019)；3-(2-氨基苯并[d]噁唑-5-基)-1-异丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO10051043和WO2013023184)；N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧基苯基)氨基)喹喔啉-2-基)氨磺酰基)苯基)-3-甲氧基-4-甲基苯甲酰胺(WO07044729和WO12006552)；PKI-587(Venkatesan,A.M.,J.Med.Chem.,2010,53,2636-2645)，它具有化学名称1-[4-[4-(二甲基氨基)哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲；GSK-2126458(ACS Med.Chem.Lett.,2010,1,39-43)，它具有化学名称2,4-二氟-N-{2-甲氧基-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO10114484)；和(E)-N-(8-(6-氨基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙烷-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亚基)氰胺(WO12007926)。
催化性的mTOR抑制剂的进一步例子包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(WO2006/122806)和Ku-0063794(Garcia-Martinez JM等人,BiochemJ.,2009,421(1),29-42。Ku-0063794是哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的特异性的抑制剂)。WYE-354是催化性的mTOR抑制剂的另一个例子(Yu K等人(2009).Biochemical,Cellular,and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target ofRapamycin.Cancer Res.69(15):6232-6240)。
根据本发明有用的mTOR抑制剂还包括前述任一一种的前药、衍生物、药学上可接受的盐或其类似物。可以基于本领域中成熟的方法,基于本文中描述的特定剂量,配制mTOR抑制剂,例如RAD001用于递送。特别地，美国专利号6,004,973(并入本文作为参考)提供了可以与本文中描述的mTOR抑制剂一起使用的制剂的例子。
评估CAR有效性或样品适用性的方法和生物标志物
本公开尤其提供了指示用CAR疗法治疗的癌症患者是否可能复发或已经复发的基因特征。不希望受理论束缚，实施例12中列出了该基因特征的实验基础。
在一个实施方案中，本文所述的新的转录基因特征(例如，在实施例12中的表29中)用于使制造的产品改进，从而降低患者复发的可能性。在一个实施方案中，本文所述的基因特征用于修饰制成品的治疗应用，从而降低患者复发的可能性。
在一个实施方案中，本文所述的基因特征(例如，在实施例12中的表29中)在用CAR表达细胞治疗，例如CART治疗(例如，CART19治疗，例如CTL019疗法)前在受试者中鉴定，所述基因特征表达预测对CAR治疗的复发。在一个实施方案中，本文所述的基因特征在单采血液成分术样品或骨髓样品中鉴定。在一个实施方案中，本文所述的基因特征在输注前在制备的CAR表达细胞产品例如CART产品(例如CART19产品，例如CTL019)中鉴定。
本公开还例如在实施例12中提供了证据:(不希望受理论束缚)在单采血液成分术前或在制备CART产品期间降低患者中的TREG特征降低了患者复发的风险。
在一个实施方案中，患者在用于CAR产品制造(例如CART产品制造)的细胞收集之前用一种或多种减少TREG细胞的疗法进行预治疗，从而降低患者对CAR表达细胞治疗(例如，CTL019治疗)复发的风险。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25-消耗及其组合。
在一个实施方案中，在收集用于CAR表达细胞产物制造的细胞之前，将患者用环磷酰胺或抗GITR抗体预治疗，从而降低患者对表达CAR的细胞治疗(例如CTL019治疗)复发的风险。
在一个实施方案中，修饰CAR表达细胞的制备方法以在制备表达CAR的细胞产物(例如CTL019产品)之前消耗TREG细胞。在一个实施方案中，在制备表达CAR的细胞产品(例如，CTL019产品)之前，使用CD25消耗来消耗TREG细胞。
在一个实施方案中，在用减少TREG细胞的治疗来治疗患者或CAR表达细胞产物后，用组合疗法治疗患者。组合疗法可以包括例如CD19抑制剂，例如CD19 CAR表达细胞，以及一种或多种B细胞抑制剂，例如本文所述的B细胞抑制剂。
在一个实施方案中，测定患者在患者样品中的TREG细胞的水平，例如包含癌细胞的样品和/或代表肿瘤微环境的样品。在一个实施方案中，该信息用于确定患者的治疗过程。例如，在一个实施方案中，如果与对照相比，将患者鉴定为具有升高水平的TREG细胞，则该疗法包括施用除了表达CAR的细胞以外的治疗。例如，疗法可以包括施用抗体分子，施用小分子治疗剂，手术或放射治疗，或其任何组合。该疗法可靶向一种或多种B细胞抗原。
在一个实施方案中，复发者是具有或被鉴定为与非复发者相比具有以下基因中的一种或多种(例如，2,3,4或全部)的增加的表达水平(例如，RNA水平的增加):MIR199A1,MIR1203,uc021ovp,ITM2C和HLA-DQB1和/或与非复发者相比具有以下基因中的一种或多种(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或全部)的降低的表达水平(例如，RNA水平的降低):PPIAL4D,TTTY10,TXLNG2P,MIR4650-1,KDM5D,USP9Y,PRKY,RPS4Y2,RPS4Y1,NCRNA00185,SULT1E1，和EIF1AY的患者。
在另一方面，本发明的特征在于评估或监测受试者(例如，患有癌症的受试者)中的CAR表达细胞疗法的有效性的方法，或样品(例如，单采血液成分样品)用于CAR疗法，例如包括施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的疗法的适合性。该方法包括获得对CAR疗法的有效性或样品适合性值，其中所述值指示CAR表达细胞疗法的有效性或适合性。
在实施方案中，对CAR疗法的有效性或样品适合性的值包括以下的一，二，三，四，五，六个或更多(所有)的量度:
(i)在样品(例如，单采血液成分样品或制造的CAR-表达细胞产物样品)中静息TEFF细胞，静息TREG细胞，年轻T细胞(例如，年轻CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)或早期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如全部)的水平或活性；
(ii)在样品(例如，单采血液成分样品或制造的CAR-表达细胞产物样品)中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如，较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如全部)的水平或活性；
(iii)在样品(例如，单采血液成分样品或制造的CAR-表达细胞产物样品)中免疫细胞衰竭标记物，例如一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1，PD-L1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性。在一个实施方案中，免疫细胞具有消耗的表型，例如共表达至少两种消耗标记物，例如共表达PD-1和TIM-3。在其他实施方案中，免疫细胞具有消耗的表型，例如共表达至少两种消耗标记物，例如共表达PD-1和LAG-3；
(iv)在样品(例如，单采血液成分样品或制造的CAR-表达细胞产物样品)中的CD27和/或CD45RO-(例如CD27+CD45RO-)免疫效应细胞(例如在CD4+或CD8+T细胞群体中)的水平或活性；
(v)选自CCL20，IL-17a和/或IL-6,PD-1,PD-L1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1的一种，两种，三种，四种，五种，十种，十二种或更多种生物标记的水平或活性；
(vi)在表达CAR的细胞产物样品中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子的质量)；或
(vii)在制造的CAR表达细胞产物样品中的CAR表达细胞的转导效率。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，CAR表达细胞疗法包含多个(例如，群体)表达CAR的免疫效应细胞，例如多个(例如，群体)T细胞或NK细胞，或其组合。在一个实施方案中，CAR表达细胞疗法包括施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，(i)-(vii)中的一种或多种的测量从获自受试者的单采血液成分样品获得。可以在输注或重新输注之前评价单采血液成分样品。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，(i)-(vii)中的一种或多种的量度获自制造的CAR表达细胞产物样品。可以在输注或重新输注之前评估制造的CAR-表达细胞产物。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，在接受CAR-表达细胞治疗之前，期间或之后评估受试者。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，(i)-(vii)中的一种或多种的量度评估基因表达，流式细胞术或蛋白质表达中的一种或多种的谱。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，所述方法还包括基于(i)-(vii)中的一个或多个的测量，将受试者鉴定为应答者，非应答者，复发者或非复发者。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，应答者(例如完全应答者)具有或被鉴定为与非反应者相比具有GZMK，PPF1BP2或幼稚T细胞的一种，两种或更多种(全部)的更高水平或活性。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，非应答者具有或被鉴定为与应答者相比具有IL22，IL-2RA，IL-21，IRF8，IL8，CCL17，CCL22，效应T细胞或调节性T细胞一种，两种，三种，四种，五种，六种，七种或更多种(例如全部)的更高的水平或活性。
在一个实施方案中，与非复发者相比，复发者是具有或者被鉴定为与非复发者相比具有下述基因中的一个或多个(例如，2,3,4或全部)的表达水平增加:MIR199A1,MIR1203,uc021ovp,ITM2C,和/或与非复发者相比具有下述基因中的一个或多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或全部)的表达水平降低的患者:PIAL4D,TTTY10,TXLNG2P,MIR4650-1,KDM5D,USP9Y,PRKY,RPS4Y2,RPS4Y1,NCRNA00185,SULT1E1,和EIF1AY。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，与参考值相比，例如，与非应答者CD8+T细胞百分比相比，完全应答者具有或被鉴定为具有更大的，例如统计学上显著更大的CD8+T细胞百分比。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，与参考值,例如CD27+CD45RO-免疫效应细胞的非应答者数目相比，完全应答者具有或者被鉴定为具有更高百分比的CD27+CD45RO-免疫效应细胞，例如在CD8+群体中。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，与参考值例如，CD4+T细胞的非应答者百分比相比，完全应答者或部分应答者具有或者被鉴定为具有更大的，例如统计学上显著更大的CD4+T细胞百分比。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，与参考值(例如静息TEFF细胞，静息TREG细胞，年轻T细胞(例如，年轻CD4或CD8细胞)或早期记忆T细胞的非应答者数目相比，完全应答者具有或被鉴定为具有静息TEFF细胞，静息TREG细胞，年轻T细胞(例如，年轻CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)，或早期记忆T细胞，或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如全部)的更大百分比。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，与参考值例如，活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如，较老的CD4或CD8细胞)，或晚期记忆T细胞的应答者数目相比，非应答者具有或被鉴定为具有活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如，较老的CD4或CD8细胞)，或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如全部)的更大百分比。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，非应答者具有或被鉴定为具有较大百分比的免疫细胞耗竭标记物，例如一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1，PD-L1，TIM-3和/或LAG-3)。在一个实施方案中，与来自应答者的表达PD-1或LAG-3的免疫效应细胞的百分比相比，非应答者具有或被鉴定为具有较高百分比的表达PD-1，PD-L1或LAG-3的免疫效应细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)(例如表达CAR的CD4+细胞和/或CD8+T细胞)。
在一个实施方案中，非应答者具有或被鉴定为具有较高百分比的具有消耗表型的免疫细胞，例如共表达至少两种耗竭标记物，例如共表达PD-1，PD-L1和/或TIM-3的免疫细胞。在其他实施方案中，非应答者具有或被鉴定为具有较高百分比的具有消耗表型的免疫细胞，例如共表达至少两种耗竭标记物，例如共表达PD-1和LAG-3的免疫细胞。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，与对CAR表达细胞治疗的应答者(例如，完全应答者)相比，非应答者在CAR表达细胞群体中具有或被鉴定为具有更大百分比的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，部分应答者在CAR表达细胞群中具有或被鉴定为具有比应答者更高百分比的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，非应答者在CAR表达细胞群体中具有或被鉴定为具有PD1/PD-L1+CAR+的耗竭表型和LAG3的共表达。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，与应答者(例如，完全应答者)相比较，非应答者在CAR表达细胞群体中具有或被鉴定为具有更高百分比的PD-1/PD-L1+/TIM-3+细胞。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，部分应答者在CAR表达细胞群体中具有或被鉴定为具有比应答者更高百分比的PD-1/PD-L1+/TIM-3+细胞。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，单采血液样品中CD8+CD27+CD45RO-T细胞的存在是受试者对CAR表达细胞疗法的应答的阳性预测物。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，单采血液样品中高百分比的PD1+CAR+和LAG3+或TIM3+T细胞是受试者对CAR表达细胞疗法的应答的不良预后预测因子。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，应答者(例如，完全或部分应答者)具有以下特征中的一个，两个，三个或更多(或全部):
(i)与参考值(例如CD27+免疫效应细胞非应答者数目)相比具有更大数目的CD27+免疫效应细胞；
(ii)与参考值(例如CD8+T细胞非应答者数目)相比具有更大数目的CD8+T细胞；
(iii)与参考值(例如，表达一种或多种检查点抑制剂的非应答者数目)相比，具有较低数目的表达一种或多种检查点抑制剂(例如选自PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3或KLRG-1或组合)的免疫细胞；或
(iv)与参考值，例如静息TEFF细胞，静息TREG细胞，幼稚CD4细胞，未刺激的记忆细胞或早期记忆性T细胞的非应答者数目相比，具有更多数目的静息TEFF细胞，静息TREG细胞，幼稚CD4细胞，未刺激的记忆细胞或早期记忆性T细胞的一种、两种、三种、四种或更多种(全部)或其组合。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，(vi)的细胞因子水平或活性选自细胞因子CCL20/MIP3a,IL17A,IL6,GM-CSF,IFNγ,IL10,IL13,IL2,IL21,IL4,IL5,IL9或TNFα或其组合的一，二，三，四，五，六，七，八或更多种(或全部)。细胞因子可以选自L-17a,CCL20,IL2,IL6,或TNFa中的一种，两种，三种，四种或更多种(全部)。在一个实施方案中，选自IL-17a和CCL20中的一种或两种的细胞因子的水平或活性增加指示增加的应答性或减少的复发。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，(vii)中15％或更高的转导效率指示增加的应答性或减少的复发。
在本文公开的任一方法的一些实施方案中，(vii)中小于15％的转导效率指示降低的反应性或增加的复发。
在实施方案中，可以根据临床标准进一步评价由本文的方法鉴定的应答者，非应答者，复发者或非复发者。例如，完全应答者具有或被鉴定为患有疾病(例如癌症)的受试者，其展现对治疗的完全应答，例如完全缓解。可以例如使用如本文所述的NCCN(其全部内容通过引用并入本文)鉴定完全应答。部分应答者具有或被鉴定为患有疾病(例如癌症)的受试者，其展现对治疗的部分应答，例如部分缓解。可以例如使用如本文所述的NCCN来鉴定部分应答。非应答者具有或被鉴定为患有疾病(例如癌症)的受试者，其不表现出对治疗的应答，例如患者具有稳定的疾病或进行性疾病。可以例如使用如本文所述的NCCN来鉴定非应答者。
或者，或与本文公开的方法组合，响应于所述值，执行以下中的一个，两个，三个，四个或更多:
对例如，应答者或非复发者施用CAR-表达细胞疗法；
施用改变剂量的CAR表达细胞疗法；
改变CAR表达细胞疗法的时间表或时间进程；
向例如非应答者或部分应答者施用与CAR表达细胞疗法组合的另外的药剂，例如，检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂；
在用CAR表达细胞疗法治疗之前，向非应答者或部分应答者施用增加受试者中较年轻T细胞数量的疗法；
改变CAR表达细胞疗法的制造过程，例如在引入编码CAR的核酸之前富集较年轻的T细胞，或例如对于鉴定为非应答者或部分应答者的受试者增加转导效率；
施用替代疗法，例如用于非应答者或部分应答者或复发者；或
如果受试者是或被鉴定为非应答者或复发者，则减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征，例如通过一种或多种CD25消耗，施用环磷酰胺，抗GITR抗体或其组合。
在某些实施方案中，用抗GITR抗体预处理受试者。在某些实施方案中，在输注或再输注之前用抗GITR抗体治疗受试者。
在本文描述的方法的一些实施方案中，对已经用CAR疗法治疗的受试者进行使用FDG-PET/CT(PET/CT)的成像。该测量可以预测对疗法的应答。例如，在实施方案中，测量代谢活性肿瘤体积(MTV)和/或[11F]-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)摄取。在实施方案中，MTV的减少指示应答，例如CR(完全应答)或PR(部分应答)，例如，约0的治疗后MTV值指示CR，而MTV的增加指示PD(进行性疾病)。在实施方案中，FDG摄取的降低指示应答，例如CR或PR，而FDG摄取的增加指示PD。在实施方案中，在施用CAR疗法之后进行成像，例如在施用CAR疗法后约1周，2周，3周，4周，1个月，2个月，3个月，4个月，5个月或6个月后进行成像。在实施方案中，对没有CRS(细胞因子释放综合征)症状的受试者进行成像，例如患有CRS的患者，并且在成像之前解决其症状。在实施方案中，对具有CRS症状的受试者进行成像。在实施方案中，在CAR疗法之前进行成像，并且将治疗前图像与治疗后图像进行比较。在实施方案中，受试者具有癌症，例如淋巴瘤，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或滤泡性淋巴瘤(FL)。在一些实施方案中，CAR疗法包含表达CAR19的细胞，例如CTL019。在一些实施方案中，CAR疗法包含本文所述的CAR疗法，例如表达CAR20的细胞，表达CAR22的细胞或表达CAR19的细胞，任选与B细胞疗法组合。
个性化药品(治疗诊断学)
CD19特征，例如突变
不希望受理论束缚，一些癌症患者对CD19抑制剂如CD19 CAR表达细胞显示初步的应答，然后复发。在一些实施方案中，复发由癌细胞中的CD19中的移码和/或过早终止密码子或CD19的表达(包括表达水平)的其他变化(至少部分地)引起，所述变化降低CD19 CAR表达细胞靶向癌细胞的能力。这种突变可以降低CD19疗法的有效性，并有助于患者的复发。因此，在一些实施方案中，当用针对第二种不同靶标(例如，在B细胞中表达的靶标，例如CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1中的一种或多种)的疗法来补充或替换CD19疗法时可能是有益的。本文公开了这种类型的各种示例性组合疗法。
本申请尤其公开了用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括以下一个或多个:(1)确定受试者在CD19的特征相对于参考特征是否具有差异，例如统计学显著性差异，以及(2)如果所确定的特征和参考特征之间存在差异，则向受试者施用治疗有效剂量的CAR疗法，例如CART，从而治疗受试者。患者可以是例如用CD19抑制剂例如CD19 CAR表达细胞治疗后复发的患者。患者可能是接受或正在接受CD19 CAR疗法并有复发风险的患者。患者可能是CD19 CAR疗法的非应答者。
特征可以是例如CD19序列，例如蛋白质或核酸序列。可以例如如实施例中所述，通过高通量核酸测序或通过蛋白质的质谱法来测定序列。如本文实施例所述，由于CD19，例如CD19的外显子2中的突变，例如在CD19中导致移码和过早终止密码子的突变，CD19 CART疗法后患者可能复发。在实施方案中，插入或缺失不会引起移码和过早终止密码子之一或两者。突变可以是例如插入，缺失，取代，易位或任何前述的组合。插入，缺失或取代可以包括例如至少1,2,3,4,5,10,15,20,20或50个核苷酸。插入，缺失或取代可以包括例如至多2,3,4,5,10,15,20,20,50或100个核苷酸。在某些情况下，细胞群将包含多于一个突变。在这种情况下，突变可以在细胞的重叠或非重叠的亚群中。
在某些情况下，患者被鉴定为具有降低CD19与CD19抑制剂例如CD19CAR表达细胞接合的能力的CD19特征。这种特征可以是例如移码突变，过早终止密码子，核酸序列的改变或原始mRNA转录物的结构的改变。该特征可能是例如偏离早于剪接发生的CD19的正常生产。该特征可以是例如外显子跳跃之外的特征。可以用另一靶标的抑制剂例如B细胞抑制剂(例如针对另一表位，例如CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1的一个或多种内的表位的CAR表达细胞)治疗此类患者。
在某些情况下，患者被鉴定为具有降低CD19与CD19抑制剂例如CD19 CAR表达细胞接合的能力，但不降低或消除CD19与第二CD19抑制剂(例如结合CD19上的不同区域的CD19抑制剂)接合的能力的CD19特征。这种特征可以是例如不引起移码突变或过早终止密码子之一或两者的突变。这样的特征可以是例如核酸序列的改变或原始mRNA转录物的结构的改变，与剪接之前发生的CD19的正常产生的偏离，或除了外显子跳跃之外的特征。可以用CD19抑制剂，例如针对CD19的完整区域例如CD19的野生型部分的B细胞抑制剂治疗这样的患者。例如，如果在外显子2中存在突变，则第二CD19抑制剂可结合外显子2之外的外显子或缺乏突变的外显子2的一部分。第二CD19抑制剂可以是例如本文所述的CD19抑制剂。
TEFF和TREG特征
本文的方法可以包括确定例如在患者或细胞例如免疫细胞群体中TREG特征或确定TEFF细胞或TREG细胞的水平的步骤。本文的方法还可以包括在患者或细胞群中降低TREG细胞水平或降低TREG特征的步骤。在一些实施方案中，TEFF是具有一个或多个(例如，至少10,20,30,40,50,60,70,80或全部)以下基因的上调表达的细胞:AIM2,ALAS1,B4GALT5,BATF,C3orf26,C4orf43,CCL3,CCL4,CCT3,CCT7,CD40LG,CHAC2,CSF2,CTNNA1,EBNA1BP2,EDARADD,EEF1E1,EIF2B3,EIF2S1,FABP5,FAM40B,FKBP4,FOSL1,GFOD1,GLRX2,HSPD1,HSPE1,IFNG,IL15RA,IL21,IL2RA,IL3,KCNK5,KIAA0020,LARP4,LRP8,LTA,MANF,MIR1182,MIR155,MIR155HG,MTCH2,MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1,NME1-NME2,OTUD7B,PAM,PDIA6,PEA15,PFKM,PGAM1,PGAM4,PPIL1,PRDX4,PRSS23,PSMD1,PSMD11,PSMD14,PTRH2,PUS7,RBBP8,RPF2,RPP25,SFXN1,SLC27A2,SLC39A14,SLC43A3,SORD,SPR,SRXN1,STIP1,STT3A,TBX21,TMCC2,TMEM165,TNFRSF9,TXN,TXNDC5,UCK2,VDR,WDR12,YWHAG,和ZDHHC16。在一些实施方案中，TREG细胞是具有以下基因中的一个或多个(例如，至少10,20,30,40,50,60,70或全部)的上调表达的细胞:AIM2,ALAS1,BATF,C5orf32,CCL17,CD40LG,CHAC2,CSF1,CTSL1,EBNA1BP2,EDARADD,EMP1,EPAS1,FABP5,FAM40B,FKBP4,FOSL1,GCLM,GK,GPR56,HMOX1,HSPD1,HSPE1,IKBIP,IL10,IL13,IL15RA,IL1RN,IL2RA,IL3,IL4,IL5,IL9,KCNK5,LTA,MANF,MIR1182,MIR155,MIR155HG,MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1,NME1-NME2,PANX2,PDIA6,PGAM4,PPIL1,PPPDE2,PRDX4,PRKAR1B,PSMD1,PSMD11,PUS7,RBBP8,SLC27A2,SLC39A14,SLC43A3,SRXN1,STIP1,STT3A,TBX21,TNFRSF11A,TNFRSF1B,TNFRSF8,TNFRSF9,TXN,UCK2,VDR,VTRNA1-3,WDR12,YWHAG,ZDHHC16和ZNF282。上调的表达可以例如在刺激16小时后测量。可以例如通过测量所指定的基因的RNA水平来确定上调的表达。
药物组合物和治疗
本发明的药物组合物可以在某些方面包含与一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的表达CAR的细胞,例如,许多表达CAR的细胞(正如本文中描述的那样)。这样的组合物可以包含缓冲液例如中性的缓冲盐水、磷酸缓冲盐水以及诸如此类；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面中，把本发明的组合物配制成用于静脉内施用。
可以以合适的方式把本发明的药物组合物施用到将要被治疗(或预防)的疾病。施用的数量和频度将由这样的因素决定，如患者的状况以及患者的疾病类型和严重程度,然而合适的剂量可以由临床试验来确定。
在一个实施方案中,所述的药物组合物基本上不含有污染物,例如,没有可检测到的水平的污染物,例如,该污染物选自由下列组成的组:内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、汇合的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、包装载体的细胞或质粒组件、细菌和真菌。在一个实施方案中,所述的细菌是选自由下列组成的组的至少一种:粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis),白念珠菌(Candida albicans),大肠杆菌(Escherichia coli),流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza),脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides),绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia),和酿脓链球菌A群(Streptococcus pyogenes group A)。
当指示“免疫学上有效量”,“抗肿瘤有效量”,“抑制肿瘤有效量”或“治疗有效量”时,将要被施用的本发明的组合物的精确数量可以由医师在考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的情况下确定。在一些实施方案中，可以以104至109个细胞/kg体重(在一些实例中105至106个细胞/kg体重,包括这些范围内所有的整数值)的剂量，施用包含细胞，本文中描述的T细胞的药物组合物。在一些实施方案中，本文所述的细胞，例如T细胞可以以3x104,1x106,3x106,或1x107细胞/kg体重施用。也可以以这些剂量多次施用所述的T细胞组合物。可以通过免疫疗法中通常已知的输注技术来施用所述的细胞(参见，例如,Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1 CAR细胞)的剂量包含约1x105,2x105,5x105,1x106,1.1x106,2x106,3.6x106,5x106,1x107,1.8x107,2x107,5x107,1x108,2x108,或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1 CAR细胞)的剂量包含至少约1x105,2x105,5x105,1x106,1.1x106,2x106,3.6x106,5x106,1x107,1.8x107,2x107,5x107,1x108,2x108,或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1 CAR细胞)的剂量包含高达约1x105,2x105,5x105,1x106,1.1x106,2x106,3.6x106,5x106,1x107,1.8x107,2x107,5x107,1x108,2x108,或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1 CAR细胞)的剂量包含约1.1x106–1.8x107个细胞/kg或约8x105-1.5x106个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1 CAR细胞)的剂量包含约1x107,2x107,5x107,1x108,2x108,5x108,1x109,2x109,或5x109个细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1 CAR细胞)的剂量包含至少约1x107,2x107,5x107,1x108,2x108,5x108,1x109,2x109,或5x109个细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD10,CD19,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3或ROR1 CAR细胞)的剂量包含高达约1x107,2x107,5x107,1x108,2x108,5x108,1x109,2x109,或5x109个细胞。
在某些方面中,可能希望的是:给受试者施用活化的细胞，例如，T细胞或NK细胞，然后随后再次抽血(或者进行单采血液成分术),按照本发明活化从中得到的细胞,并且再给所述的患者输注这些活化的并且扩增的细胞。每隔几个星期可以进行这种方法多次。在某些方面中,可以从10cc至400cc的抽血中活化细胞，例如，T细胞或NK细胞。在某些方面中,从20cc,30cc,40cc,50cc,60cc,70cc,80cc,90cc,或100cc的抽血中活化细胞，例如，T细胞或NK细胞。
所述主题组合物的施用可以以常规方式进行,包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。可以以下列方式给患者施用本文中描述的组合物:经动脉方式,皮下方式,皮内方式,肿瘤内方式,节内方式,髓内,肌肉内方式,通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内方式。在一个方面中，通过皮内或皮下注射给患者施用本发明所述的细胞组合物，例如，T细胞或NK细胞组合物。在一个方面中，通过静脉内注射施用本发明所述的细胞组合物，例如T细胞或NK细胞组合物。可以把所述的细胞，T细胞或NK细胞组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染位点。
在特定的示例性方面，受试者可以进行白细胞分离术，其中离体收集，富集或消耗白细胞，以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如T细胞。可以通过本领域已知的方法扩增这些细胞分离物，例如T细胞或NK细胞分离物，并进行处理，使得可以引入本发明的一种或多种CAR构建体，从而产生CAR表达细胞，例如本发明的CAR T细胞。有需要的受试者随后可以用高剂量化疗进行标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，随着或与移植同时，受试者接受本发明的扩增的CAR表达细胞的输注。在另一方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
要施用于患者的上述治疗的剂量将随待治疗的病症的确切性质和治疗的接受者而变化。用于人体施用的剂量的缩放可以根据本领域公认的实践进行。治疗剂，例如抗体，例如CAMPATH的剂量，对于成人患者可以是例如1至约100mg，例如每天施用1至30天的时间。合适的日剂量是每天1-10mg，但是在某些情况下，可以使用每天高达40mg的较大剂量(美国专利号6,120,766中所述)。
在一个实施方案中，将CAR引入细胞，例如T细胞或NK细胞，例如使用体外转录，并且受试者(例如，人)接受初始施用CAR表达细胞，例如本发明的CAR T细胞，以及CAR表达细胞(例如本发明的CART细胞)的一个或多个后续施用，其中所述一次或多次后续施用少于15天，例如前次施用后14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3或2天。在一个实施方案中，将CAR表达细胞，例如本发明的CART细胞的多于一次施用每周施用于受试者(例如，人)，例如每周施用2,3或4次CAR表达细胞，例如本发明的CAR T细胞。在一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)每周接受多于一次的CAR表达细胞，例如CAR T细胞的施用(例如每周2,3或4次施用)(本文也称为周期)，然后是一周没有CAR表达细胞，例如CAR T细胞施用，然后一次或多次额外施用CAR表达细胞，例如CAR T细胞(例如，每周多于一次施用CAR表达细胞，例如CAR T细胞)施用于受试者。在另一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)接收多于一个周期的CAR表达细胞，例如CAR T细胞，并且每个周期之间的时间小于10,9,8,7,6,5,4,或3天。在一个实施方案中，CAR表达细胞，例如CAR T细胞每隔一天施用，每周施用3次。在一个实施方案中，表达CAR的细胞，例如本发明的CART细胞被施用至少两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个或更多个周。
在一些实施方案中，受试者可以是成年受试者(即18岁及以上)。在某些实施方案中，受试者可以在1至30岁之间。在一些实施方案中，受试者为16岁或以上。在某些实施方案中，受试者在16至30岁之间。在一些实施方案中，受试者是儿童受试者(即1至18岁之间)。
一方面，使用慢病毒病毒载体如慢病毒产生CAR表达细胞，例如CART。CAR表达细胞，例如以这种方式产生的CART将具有稳定的CAR表达。
在一个方面，使用病毒载体例如γ逆转录病毒载体，例如本文所述的γ逆转录病毒载体产生CAR表达细胞，例如CART。使用这些载体产生的CART可以具有稳定的CAR表达。
一方面，CAR表达细胞，例如CART在转导后4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15天瞬时表达CAR载体。CAR的瞬时表达可以通过RNA CAR载体递送来实现。一方面，通过电穿孔将CAR RNA转导入细胞，例如NK细胞或T细胞。
在使用瞬时表达CAR T细胞(特别是用携带小鼠ScFv的CART)治疗的患者中可能出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受这一理论的束缚，认为这种过敏反应可能是由发生体液抗CAR应答(即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体)的患者引起的。据认为，当暴露于抗原存在十到十四天的中断时，患者的产生抗体的细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果患者在瞬时CAR疗法过程中(如通过RNA转导产生的那些)具有产生抗CAR抗体应答的高风险，那么CART输注中断不能持续超过十到十四天。
CD19抗体和CARs
鼠抗CD19抗体的人源化
鼠CD19抗体的人源化对于临床背景是期望的，其中小鼠特异性残基可以在接受CART19治疗(即用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19 CAR序列的生产，表征和功效描述在国际申请WO2014/153270中，其通过引用整体并入本文，包括实施例1-5(第115-159页)，例如表3,4，和5(第125-147页)。
CAR构建体，例如CD19 CAR构建体
在国际申请WO2014/153270中描述的CD19 CAR构建体中，本文再现了某些序列。据了解，本节中的序列也可以用于其他CAR，例如CD10 CARs,CD20 CARs,CD22 CARs,CD34CARs,CD123 CARs,FLT-3CARs,ROR1 CARs,CD79b CARs,CD179b CARs，或CD79a CAR的上下文中。
人源化scFv片段的序列(SEQ ID NO:1-12)在下表2中提供。使用SEQ ID NO:1-12与如下所示附加序列SEQ ID NO:13-17，产生完整CAR构建体以产生具有SEQ ID NO:31-42的完整CAR构建体。
·前导序列(氨基酸序列)(SEQ ID NO:13)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
·前导序列(核酸序列)(SEQ ID NO:54)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
·CD8铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:14)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
·CD8铰链(核酸序列)(SEQ ID NO:55)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
·CD8跨膜(氨基酸序列)(SEQ ID NO:15)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
·跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO:56)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
·4-1BB胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:16)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
·4-1BB胞内结构域(核酸序列)(SEQ ID NO:60)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
·CD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:17)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3ζ(核酸序列)(SEQ ID NO:101)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
·CD3ζ结构域(氨基酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO:43)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3ζ(核酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO:44)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG
AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT
TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA
AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG
AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC
ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC
CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CD28结构域(氨基酸序列,SEQ ID NO:1317)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD28结构域(核苷酸序列,SEQ ID NO:1318)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
野生型ICOS结构域(氨基酸序列,SEQ ID NO:1319)
TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
野生型ICOS结构域(核苷酸序列,SEQ ID NO:1320)
ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA
Y到F突变ICOS结构域(氨基酸序列,SEQ ID NO:1321)
TKKKYSSSVHDPNGEFMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
IgG4铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:102)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
IgG4铰链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:103)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
这些克隆全都含有从4-1BB衍生的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
表2:人源化CD19 CAR构建体
表3:鼠CD19 CAR构建体
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表2中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域还包含LC CDR1，LCCDR2和LC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域包含表2所列的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表2中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3，以及表2中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部HC CDR1，HC CDR2，和HC CDR3。
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案，Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
对于重链可变结构域，scFv结构域的人源化CDR序列的序列示于表4中，关于轻链可变结构域的序列在表5所示。“ID”代表每个CDR各自的SEQ ID NO。
表4.重链可变结构域CDR(Kabat)
表5.轻链可变结构域CDR
然后将CAR scFv片段克隆到慢病毒载体中以在单个编码框中产生全长CAR构建体，并使用EF1α启动子进行表达(SEQ ID NO:100)。
EF1α启动子
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:100).
CAR22构建体:设计和功能
分离完全人抗CD22单链可变片段。将抗CD22ScFv克隆到具有CD3ζ链和4-1BB共刺激分子的慢病毒CAR表达载体中。在STBL3细胞中通过细菌转化扩增含CAR的质粒，随后使用不含内毒素的Qiagen质粒Maki试剂盒进行Maxiprep。使用标准技术在293T细胞中产生慢病毒上清液。
下面在表6A和6B中提供人CAR的序列。
这些克隆都含有从CD3ζ链衍生的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
表6A:人类CD22 CAR构建体
产生几个额外的CD22scFv序列，并在下表6B中描述。克隆CD22-64和CD22-65基于上述克隆CD22-12的亲和力成熟。在一些实施方案中，CD22的亲和力成熟结合结构域的亲和力比CD22-12对CD22的亲和力更强。在一些实施方案中，CD22的亲和力成熟结合结构域的结合率(on-rate)快于CD22-12对CD22的结合率。
表6B:人CD22scFv序列
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表6A或6B中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域还包含LCCDR1，LC CDR2和LC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域包含表6A或6B中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表6A或6B中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3，以及在表6A或6B中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案，Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
CD22-64和CD22-65基于克隆CD22-12的亲和力成熟。测试所有三种构建体并且发现具有活性(参见本文实施例25)。基于这些观察，设计了一个结构类，以包含工作实施例。因此，在一些实施方案中，本文所述的CD22结合结构域包含具有序列:XRLQDGNSWSDAFDV(SEQ ID NO:141)的HCDR3。在一些实施方案中，X是任何氨基酸，任何规范氨基酸，非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,M,F,或W)，无芳环的非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,或M)或酸性氨基酸(例如D或E)。
此外，CAR22-53和CAR22-57至CAR22-65在其CDR中具有结构相似性。一个结构类被设计为包含这些工作实施例。因此，在一些实施方案中，本文所述的CD22结合结构域包含具有序列:TGX1X2X3DX4GX5X6X7X8VS(SEQ ID NO:__)的LCDR1。在一些实施方案中，X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,或X8或其任何组合各自独立地为任何氨基酸，例如任何规范氨基酸。在一些实施方案中，X4或X5或两者各自独立地为非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,M,F,或W)或无芳环的非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P或M)。在一些实施方案中，X6是芳族氨基酸(例如F，Y或W)。在一些实施方案中，X1是S或T；X2是R或S；X3为N或S，X4为V或I，X5为A或G；X6是Y或F；X7是E或N；或X8为S或Y，或其任何组合。在一些实施方案中，X1是S或T；X2是R或S；X3为N或S，X4为V或I，X5为A或G；X6是Y或F；X7是E或N；X8为S或Y。
类似地，在一些实施方案中，本文所述的CD22结合结构域包含具有序列:X1VX2NRPS(SEQ ID NO:__)的LCDR2。在一些实施方案中，X1或X2或两者各自独立地为任何氨基酸，例如任何规范氨基酸。在一些实施方案中，X1是酸性氨基酸(例如D或E)，非极性氨基酸(例如G,A,V,L,I,P,M,F,或W)或没有芳环的非极性氨基酸(例如，,G,A,V,L,I,P,或M)。在实施方案中，X2是非极性氨基酸(例如G,A,V,L,I,P,M,F,或W)，不含芳环的非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,或M)或极性不带电荷的氨基酸(例如S，T，N或Q)。在一些实施方案中，X1是E，G或D，和/或X2是N，I，S或T。
类似地，在一些实施方案中，本文所述的CD22结合结构域包含具有序列:SSX1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO:__)的LCDR3。在一些实施方案中，X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,或X8,或其任何组合各自独立地为任何氨基酸，例如任何规范氨基酸。在一些实施方案中，X1是芳族氨基酸(例如F，Y或W)或带正电荷的氨基酸(例如K，R或H)。在一些实施方案中，X2是非极性氨基酸(例如G,A,V,L,I,P,M,F,或W)，没有芳环的非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,或M)或极性不带电荷的氨基酸(例如S，T，N或Q)。在一些实施方案中，X3是极性不带电荷的氨基酸(例如S，T，N或Q)。在一些实施方案中，X4是非极性氨基酸(例如G,A,V,L,I,P,M,F或W)，没有芳环的非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,或M)或极性不带电荷的氨基酸(例如S，T，N或Q)。在一些实施方案中，X5是极性带电荷的氨基酸(例如，K，R,或H)或极性不带电荷的氨基酸(例如S，T，N或Q)。在一些实施方案中，X6是极性不带电荷的氨基酸(例如S，T，N或Q)，非极性氨基酸(例如G,A,V,L,I,P,M,F,或W)，没有芳环的非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P或M)。在一些实施方案中，X7是非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,M,F,或W)，没有芳环的非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,或M)或芳族氨基酸(例如F，Y或W)。在一些实施方案中，X8不存在或是芳族氨基酸(例如F，Y或W)。在一些实施方案中，X9是非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P,M,F或W)，没有芳环的非极性氨基酸(例如，G,A,V,L,I,P或M)。在一些实施方案中，X1是Y或H，X2是A或T，X3是S或T；X4是G，T或S，X5是R或S，X6是T或P，X7是L或Y，X8是Y或不存在，或X9是V或I或其任何组合。在一些实施方案中，X1是Y或H，X2是A或T，X3是S或T；X4是G，T或S，X5是R或S，X6是T或P，X7是L或Y，X8是Y或不存在，X9是V或I。对于重链可变结构域，scFv结构域的人CDR序列的序列在表7A，7B或7C中显示，以及对于轻链可变结构域在表8A或8B中显示。“ID”代表每个CDR各自的SEQ ID NO。
表7A.CD22 CAR的重链可变结构域CDR。根据“组合的”定义鉴定CDR。
表7B.CD22 CAR的重链可变结构域CDR
表7C.CD22 CAR的重链可变结构域CDR。根据Kabat鉴定CDR。
表8A.CD22 CAR的轻链可变结构域CDR。该表中的LC CDR序列在Kabat或组合定义下具有相同的序列。
表8B.CD22 CAR的轻链可变结构域CDR。该表中的LC CDR序列在Kabat或组合定义下具有相同的序列。
表9A.CD22抗体分子的重链可变区
表9B.CD22抗体分子的重链可变区
表10A.CD22抗体分子的轻链可变区
表10B.CD22抗体分子的轻链可变区
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表9A或9B中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域还包含LCCDR1，LC CDR2和LC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域包含表10A或10B中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表10A或10B中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3，以及表9A或9B中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案，Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
VL和VH结构域出现在scFv中的顺序可以变化(即VL-VH或VH-VL方向)，并且其中“G4S”(SEQ ID NO:18)亚基的三个或四个拷贝可以连接可变结构域以产生整个scFv结构域，其中每个亚基包含序列GGGGS(SEQ ID NO:18)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO:107)或(G4S)4(SEQ ID NO:106))。或者，CAR构建体可以包括例如包含序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ IDNO:1322)的接头。
这些克隆都含有来源于CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
CAR20构建体
分离抗CD20单链可变片段。参见表11A和11B。将抗CD20scFv克隆到具有CD3ζ链和4-1BB共刺激分子的慢病毒CAR表达载体中。在STBL3细胞中通过细菌转化扩增含CAR的质粒，随后使用不含内毒素的Qiagen质粒Maki试剂盒进行Maxiprep。使用标准技术在293T细胞中产生慢病毒上清液。
CAR的顺序在下表11A和11B中提供。本文描述了CAR的另外的组分(例如，前导，铰链，跨膜和信号传导结构域)。
表11A:大鼠CD20 CAR构建体
表11B.人源化CD20 CAR构建体
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表11A和11B中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域还包含LCCDR1，LC CDR2和LC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域包含表11A和11B中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表11A和11B中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3，以及表11A和11B中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案，Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
对于重链可变结构域，scFv结构域的人CDR序列的序列示于表12A或12B，对于轻链可变结构域，示于表13。“ID”代表每个CDR各自的SEQ ID NO。
表12A.CD20 CAR的重链可变结构域CDR。根据“组合的”定义鉴定CDR。
表12B.CD20 CAR的重链可变结构域CDR。根据Kabat鉴定CDR。
表13.CD20 CAR的轻链可变结构域CDR。该表中的LC CDR序列在Kabat或组合定义下具有相同的序列。
表14A.CD20抗体分子的重链可变区
表14B.人源化CD20抗体分子的重链可变区
表15A.CD20抗体分子的轻链可变区
表15B.人源化CD20抗体分子的轻链可变区
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表14A或14B中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域还包含LCCDR1，LC CDR2和LC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域包含表15A或15B中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表15A或15B中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3，以及表14A或14B中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案，Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
CAR123构建体
分离抗CD123单链可变片段。将抗CD123scFv克隆到具有CD3ζ链和4-1BB共刺激分子的慢病毒CAR表达载体中。在STBL3细胞中通过细菌转化扩增含CAR的质粒，随后使用不含内毒素的Qiagen质粒Maki试剂盒进行Maxiprep。使用标准技术在293T细胞中产生慢病毒上清液。
CAR的序列在下表16中提供。本文描述了CAR的其它组分(例如，前导，铰链，跨膜和信号传导结构域)。
VL和VH结构域出现在scFv中的顺序是变化的(即VL-VH或VH-VL方向)，并且其中“G4S”(SEQ ID NO:18)亚基的三个或四个拷贝连接可变结构域以产生整个scFv结构域，其中每个亚基包含序列GGGGS(SEQ ID NO:18)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO:107)或(G4S)4(SEQID NO:106))。
人CAR的序列在下表16中提供。
这些克隆都含有从CD3ζ链衍生的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
表16:人类CD123 CAR构建体
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表16中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域还包含LC CDR1，LCCDR2和LC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域包含表16所列的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表16中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3，以及表16中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部HC CDR1，HC CDR2，和HC CDR3。
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案，Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
对于重链可变结构域，scFv结构域的人CDR序列的序列示于表17，对于轻链可变结构域，在表18中示出。“ID”代表每个CDR各自的SEQ ID NO。
表17.重链可变结构域CDR
表18.轻链可变结构域CDR
在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含CD123 CAR，其包含包括CD123结合结构域的抗体或抗体片段，其中所述CD123结合结构域包含表18列出的轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)氨基酸序列的一个或多个，以及表17中列出的任何CD123重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)的一个或多个。
关于重链可变结构域，scFv结构域的额外CD123 CDR序列显示在表19,21和23中，对于轻链可变结构域，显示在表20,22和24中。“ID”代表每个CDR各自的SEQ ID NO。
表19和表20中提供的CDR是根据Kabat和Chothia编号方案的组合。
表19.重链可变结构域CDR
表20.轻链可变结构域CDR
在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含CD123 CAR，其包含包括CD123结合结构域的抗体或抗体片段，其中所述CD123结合结构域包含表20中列出的轻链互补决定区1(LCCDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)氨基酸序列的一个或多个，以及表19中列出的任何CD123重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)的一个或多个。
表21.根据Kabat编号方案(Kabat et al.(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD)的重链可变结构域CDR
表22.根据Kabat编号方案(Kabat et al.(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD)的轻链可变结构域CDR
在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含CD123 CAR，其包含包括CD123结合结构域的抗体或抗体片段，其中所述CD123结合结构域包含表22所列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)氨基酸序列，以及表21中列出的任何CD123重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HCCDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
表23.根据Chothia编号方案的重链可变结构域CDR(Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948)
表24.根据Chothia编号方案的轻链可变结构域CDR(Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948)
在一个实施方案中，B细胞抑制剂包含CD123 CAR，其包含包括CD123结合结构域的抗体或抗体片段，其中所述CD123结合结构域包含表24所列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)氨基酸序列，以及表23中列出的任何CD123重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HCCDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
这些CD123 CAR的附加描述例如在PCT/CN2014/090508中提供，该申请的全部内容通过引用并入本文。
使用包含由NFAT启动子驱动的萤光素酶酶报告基因的Jurkat细胞系(称为JNL细胞)评价人抗CD123 CAR构建体的活性。测量本文所述的四种人CAR构建体(CD123 CAR1-4)和鼠CD123 CAR构建体1172和1176的CD123 CAR活性。测量CAR活性作为该NFAT驱动的报告子的活化。将含有CART构建体的慢病毒上清液加入到JNL细胞中用于转导。转导后4-6天，通过如下所述的FACS评价JNL细胞的CAR表达，或与靶-阳性(MOLM3，工程化以表达CD123的K562细胞(CD123-K562))或靶-阴性(K562)细胞系以效应细胞系(JNL)与靶细胞系(E:T)3:1的比例混合以触发激活(图41)。共温育20小时后，使用EnVision仪器上的Bright-GloTM萤光素酶测定法测量萤光素酶信号，如图42所示。
基于CD123 CAR转导的T细胞(“CART-CD123”或“CART-CD123T细胞”)应答表达CD123(CD123+)的靶标的效应T细胞应答的数量和质量来选择最佳抗CD123 CAR构建体。效应T细胞应答包括但不限于细胞扩增，增殖，倍增，细胞因子产生和靶细胞杀伤或细胞溶解活性(脱粒)。
CART-CD123的产生
使用人scFv编码慢病毒转移载体产生包装到VSVg假型慢病毒颗粒中的基因组材料。将慢病毒转移载体DNA与VSVg，gag/pol和rev的三个包装组分与lipofectamine试剂混合，以将它们一起转染至Lenti-X 293T细胞(Clontech)中。
30小时后，收集培养基，过滤并储存在-80℃。治疗性CART-CD123通过从来自正常的单采血液成分术的供体的血液开始产生，所述供体的初始T细胞通过阴性选择T细胞，CD4+和CD8+淋巴细胞获得。在含有10％热灭活胎牛血清(FCS)，2mM L-谷氨酰胺，1×青霉素/链霉素，100μM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，10mM Hepes和55μM 2-巯基乙醇的RPMI1640中，37℃，5％CO2下以1:3的比例通过CD3x28珠(Human T-Expander CD3/CD28,Invitrogen)活化这些细胞。T细胞以24孔板的每个孔0.5mL培养基中1x106T细胞培养。24小时后，T细胞出胚(blasting)，加入0.5mL病毒上清液。然后，T细胞以对数生长模式开始分裂，通过测量每毫升的细胞计数来监测T细胞，并且每两天将T细胞稀释在新鲜培养基中。随着T细胞在大约10天后开始静息，对数生长减弱。生长速度减弱和T细胞大小接近～300fl的组合决定了T细胞被冷冻保存以供以后分析的状态。
在冷冻保存之前，使用蛋白L作为检测试剂，通过BD LSRFortessa或BD-FACSCanto上的流式细胞术分析来测定转导的细胞百分比(在细胞表面上表达抗CD123 CAR)及其相对荧光强度。来自FACS的高于未染色细胞的信号的相对荧光强度的门控直方图显示了转导的T细胞的百分比。转导导致CART阳性细胞的范围为12-42％，如图42所示。
评估CART-CD123重定向T细胞的细胞溶解活性
为了评估CART-CD123T细胞杀死靶标表达细胞的功能能力，将细胞解冻并使其过夜恢复。
T细胞杀伤针对稳定表达萤光素酶的表达CD123的MOLM13急性骨髓性白血病细胞系。使用未转导的T细胞来确定非特异性背景杀伤水平。测量CART-CD123的细胞溶解活性，作为T细胞的4:1的效应细胞:靶细胞比例和2倍向下稀释度的滴定，其中效应细胞被定义为表达抗-CD123嵌合受体的T细胞。通过将适当数量的T细胞与恒定数目的靶细胞混合来启动测定。20小时后，使用EnVision仪器上的Bright-GloTM萤光素酶测定法测量萤光素酶信号。随着CD123-CART表达细胞对未转导的T细胞的比例的增加，CD123细胞的杀伤类似地增加。本文提供的数据表明，表达CD123的那些细胞仅被表达CD123-CART的细胞而不是被未转导的T细胞破坏。图43。
T细胞转导
选择人抗CD123克隆NVS2(表达CAR123-2)，NVS3(表达CAR123-3)，NVS4(表达CAR123-4)进行进一步研究。这些克隆都与食蟹猴CD123交叉反应。将其活性与小鼠克隆1172和1176进行比较，所述克隆包含轻至重取向的VH和VL结构域，具有CD8铰链结构域，CD8跨膜结构域和41BB-共刺激结构域。1176也与食蟹猴CD123交叉反应，1172则否。
将质粒转化为感受态细胞，在500cc肉汤中生长，通过maxiprep分离，并使用标准方法转导入293T细胞。在24和48小时收集慢病毒上清液，用超速离心浓缩，冷冻。
慢病毒在SupT1细胞上滴定，并且测定适当量的病毒用于以3的MOI转导原代T细胞。使用抗CD3/CD28珠(Dynal，Invitrogen)和白细胞介素-2 100U/ml刺激原代正常供体CD4+CD8细胞6天，然后脱珠并冷冻一次。T细胞细胞体积减少至<300fL(约10-12天后)。
所有克隆的T细胞转导效率几乎为100％(图44A和44B)。NVS克隆中CD4:CD8比例约为1:1，1172和1176克隆中的CD4:CD8比例为3:2(图45)。
脱粒
为了评估脱粒，将CART细胞(NVS 2-4,1172和1176克隆)解冻，在T细胞培养基中以2e6细胞/ml的浓度静置过夜。然后计数细胞并在第二天以1e6细胞/ml再悬浮。将肿瘤靶细胞(TCM，PMA/iono，MOLM14或JURKAT)以5e6细胞/ml重悬浮。在48孔板中以1e5T细胞:5e5肿瘤细胞的比例接种细胞，并在抗-CD107a PECy7，抗CD49d纯化抗体和抗CD28纯化抗体存在下温育2小时。然后收获细胞，用抗CD3APC染色，并使用BD LSR Fortessa获得(图46)。
T细胞脱粒在图46的每个图的右上象限中指示。本文呈现的结果表明CD123+靶标的相似T细胞识别，在2小时体外测定期间通过相似的脱粒表现。与其他克隆中的约80％的脱粒率相比，C1176具有65％的较差脱粒率。
细胞毒性
为了评估细胞毒性，将CART细胞(NVS 2-4,1172和1176克隆)解冻并在T细胞培养基中以2e6细胞/ml静置过夜。计数细胞并在第二天以1e6细胞/ml重悬浮。肿瘤靶细胞(MOLM14)以1e6细胞/ml重悬浮。将细胞一式两份以如下所示的E:T比例降低的方式接种在黑色的平底96孔板中(图47)。温育20小时后，加入萤光素，并对该板进行成像以确定光子通量作为残留活细胞的量度。所有克隆之间的MOLM14细胞的杀伤是相等的，在20小时处于最多效应物:靶标比例。
体内小鼠模型
在D0静脉内注射NSG小鼠1e6个表达萤光素酶的MOLM14细胞。在D6成像小鼠(IVISSpectrum)的肿瘤负荷，并随机分到治疗组。将肿瘤负荷最小的小鼠分配给对照组(未转导的T细胞，UTD)。在D7静脉内注射CART细胞(NVS 2-4,1172和1176克隆)或对照T细胞(1e6)。D13进行的成像的数据如图48所示。注射后6天，所有抗CD123构建体均提供与体外数据一致的抗肿瘤效果。
产生基于与食蟹猴CD123交叉反应的鼠1176的人源化抗CD123单链可变片段(scFv)，并将其克隆到慢病毒表达载体中，该载体具有胞内CD3ζ链和4-1BB的细胞内共刺激结构域。
VL和VH结构域出现在scFv中的顺序是变化的(即VL-VH或VH-VL方向)，并且其中“G4S”(SEQ ID NO:18)亚基的三个或四个拷贝连接可变结构域以产生整个scFv结构域，其中每个亚基包含序列GGGGS(SEQ ID NO:18)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO:107)或(G4S)4(SEQID NO:106))，如表25所示。
人源化CAR的序列在下表25中提供。
这些克隆都含有从CD3ζ链衍生的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
表25:人源化CD123 CAR构建体
hzCD123 CAR 1-32的scFv结构域的人源化CDR序列的序列在表26中显示了重链可变结构域，表27显示了轻链可变结构域。“ID”代表每个CDR各自的SEQ ID NO。
表26.重链可变结构域CDR
表27.轻链可变结构域CDR
在一些实施方案中，CAR123具有具序列YCARGNWDDY(SEQ ID NO:__)的HCDR3。
然后将CAR scFv片段克隆到慢病毒载体中以在单个编码框中产生全长CAR构建体，并使用EF1α启动子进行表达。
双特异性CAR19/CAR22构建体及其功能
本节描述双特异性CAR19/CAR22构建体的产生和功能。设计了两种双特异性scFv串联融合:antiCD22(HL)4G4S-antiCD19(LH)和antiCD19-4G4S-antiCD22。名称(HL)表示重链可变区位于所指示的scFv内的轻链区域的上游，并且名称(LH)表示轻链可变区位于所指示的scFv内的重链区域的上游。抗CD22碱基分子是hCD22-2，并使用HL取向。抗CD19碱基分子是人源化抗CD19序列，在本文作为表2的构建体ID 104876提供，其使用LH取向。在图13中示意性地示出了所述构建体。
两种双特异性构建体以及其scFv部分的核苷酸和氨基酸序列在下表28中给出。
表28.双特异性CAR19/CAR22构建体
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表28中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域还包含LC CDR1，LCCDR2和LC CDR3。在实施方案中，抗原结合结构域包含表28所列的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表28中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3，以及表28中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的一个，两个或全部HC CDR1，HC CDR2，和HC CDR3。
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案，Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
如下文实施例中所述，在NFAT测定中测试上述双特异性CD19-CD22和CD22-CD19构建体。作为对照，使用单独的抗CD19 CAR和单独的抗CD22 CAR。该测定的结果示于图14。数据表明，抗CD19和抗CD22 scFvs均对其靶标有活性。
实施例
通过参考下列实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了举例说明的目的,并不意图是限定性的，除非另有说明。因此,无论如何不应把本发明解释为限定到下列实施例,而是应该把本发明解释成包括任一以及所有的变化，这些变化作为本文中所提供的教导的结果而变成显而易见的。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。以下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，并且不应被解释为以任一方式限制本公开的其余部分。
实施例1：用于治疗多发性骨髓瘤的CD19 CAR T细胞
即使用目前的化疗方案靶向治疗和自体干细胞移植，骨髓瘤也被认为是不治之症。本实施例描述了用具有嵌合抗原受体的针对CD19的自体T细胞(慢病毒/CD19:4-1BB:CD3zeta；也称为“CART19”或CTL019)治疗多发性骨髓瘤(MM)。该实施例证明基于靶向骨髓瘤干细胞和/或表达非常低(通过大多数方法检测不到)的CD19水平的肿瘤细胞，针对CD19的CAR疗法具有建立深的长期持久缓解的潜力。
在治疗具有攻击性继发性浆细胞白血病的患者中，我们发现在补救自体干细胞移植后两天施用的CART19导致浆细胞白血病的快速清除，并且在经历多线化疗的患者中具有非常好的部分反应。该患者在治疗前数个月是输血依赖性的；在治疗后两个月，她已经恢复了她的血细胞计数(具有正常范围血小板计数和白细胞计数)，并且没有要求输血，因为她由于治疗从医院出院。
因为骨髓瘤细胞不天然表达CD19，CART19治疗在该肿瘤中诱导快速和显著的肿瘤反应的发现是令人惊讶的。不希望受特定理论的束缚，据推测CART19可用于治疗骨髓瘤，因为:(1)虽然通过流式细胞术，骨髓瘤细胞通常被认为对于CD19表达是阴性的，但有数据表明骨髓瘤细胞可能表达非常低水平的CD19，使得表达可通过RNA检测，但不能通过流式细胞术或免疫组织化学检测；和(2)靶向克隆型B细胞的概念，其被认为是引起多发性骨髓瘤的癌性干细胞，并且特别耐化疗。B细胞和骨髓瘤肿瘤细胞之间存在克隆关系，但是传统的骨髓瘤治疗针对的是恶性浆细胞而不是B细胞。因此，用于治疗骨髓瘤的CART19靶向不同于大多数骨髓瘤疗法的细胞群。
在我们的单个患者经验中，患者具有循环浆细胞，并且我们能够测试她的肿瘤细胞的CD19表达。大约1-2％的其肿瘤细胞表达CD19抗原。因此，推测CART19可能对其肿瘤细胞的非常小的群体有直接影响；非常好的部分应答，虽然基于仅靶向非常小群体的CD19+肿瘤细胞本不会预测到。
在这种情况下，在大剂量美法仑后自体干细胞移植挽救后施用CART19。虽然这是骨髓瘤的标准疗法，但并不是治愈性的。此外，该患者先前已经进行了串联自体干细胞移植，并在移植后早期(<6个月)复发。不希望受特定理论束缚，如本实施例所述使用CART19细胞，当与补救自体干细胞移植组合时，可以在治疗骨髓瘤中具有不重叠的机制。
在I期试验中，另有10例多发性骨髓瘤患者将接受CART19治疗，迄今至少有3例患者已经接受治疗。
剂量理论和风险/利益
我们对于该方案选择了通过静脉内途径施用使用平剂量。该方案的主要目标是测试对多发性骨髓瘤患者施用CART-19细胞的安全性和可行性。预期的主要毒性是(I)CAR遇到在恶性或正常B细胞上其替代CD19抗原时的细胞因子释放；(2)正常B细胞的消耗，类似于利妥昔单抗治疗；(3)类似于移植物抗宿主病的类固醇反应性皮肤和胃肠综合征，如以前当扩增/共刺激的自体T细胞已经与ASCT结合用于MM时已经看到的。理论上的关注是CART-19T细胞的转化或不受控制的增殖是否可能响应于高水平的CD19而发生。与CLL患者的另一项研究相比，这在本申请中较少受到关注，因为MM中的克隆型B-细胞的负担预期远低于在该研究中治疗的难治性CLL患者中恶性B细胞的负担。
剂量理论
在前3名患者中，我们观察到在1.4x107到1.1x109CART-19细胞的剂量范围内的临床活性。这一观察证明，至少在治疗的前3名患者中，没有明显的剂量反应关系。在用两个log倍差异剂量施用的患者中观察到完全反应。因此，与被代谢的标准药物不同，CAR T细胞可以具有宽的剂量反应范围。这很可能是因为CAR T细胞能够在患者中广泛增殖。因此，我们设置用于输注的l-5x108CART-19细胞的剂量范围。在这种基于同情使用的单一患者研究中，患者被提供高达5x108个CART19细胞，没有剂量下限。对于10个患者试验，将向患者提供1-5x107个CART-19细胞。
一般设计
这是一个基于同情使用提供的单个病人研究；在I期研究后对其进行建模以确定转导以表达CART-19的自体T细胞的输注是否是安全的。本研究的主要目的是确定在首次ASCT后早期复发后接受抢救ASCT的患者中CART-19T细胞的安全性，耐受性和植入潜力。该协议由一个开放标签试点研究组成。
在进入时，受试者将接受骨髓活检和其MM的常规实验室和成像评估。合格的受试者将经历稳态单采血液成分术以获得大量用于CART-19制造的外周血单核细胞(PBMC)。T细胞将从PBMC中纯化，用TCRζ/4-1BB慢病毒载体转导，在体外扩增，然后冷冻用于未来的施用。将记录与具有成功制造的T细胞的患者的数量相比具有不足的T细胞收集，扩增或制造的患者的数量；产品制造的可行性预计在这个患者群体中不是问题。
受试者一般将具有从为其第一ASCT进行两次另外的ASCT的准备中进行的动员/收集中保留的足够的外周血干细胞。那些没有足够外周血干细胞的受试者将在根据治疗医师偏好的方案进行的稳态单采血液成分术之前或之后进行第二次动员/收集程序。在最初的白细胞清除术后大约两周，受试者将进入医院并接受高剂量美法仑(第-2天)，随后在两天后(第0天)输注自体干细胞，并且所有受试者将在十二至十四天后(第+12-14天)接受CART-19细胞的输注。最多可登记10名患者。
所有受试者将进行血液测试以到研究的第4周以规律的间隔评估CART-19细胞的安全性和移植和持续性。在第+42天和第+100天，受试者将接受骨髓抽吸物/活组织检查以评估骨髓浆细胞负担和CART-19细胞向骨髓的运输。根据国际骨髓瘤工作组(IMWG)标准136，将在第100天进行正式反应评估，并且根据多发性骨髓瘤患者的常规临床实践监测TTP。在本研究中测量的主要功效结果将是在本研究的ASCT后在患者的初始ASCT至TTP之后TTP的比较。
由于本研究的主要终点是CART-19细胞输注与ASCT的安全性和可行性，本研究将采用早停止规则。简而言之，如果在接受治疗的前五个受试者中发生了不到2个严重的意想不到的不利事件，那么研究将再次累积五个受试者，目标登记人数为10。我们将在CART-19输注后观察治疗的受试者40天(即，通过第42天的第一次官方回应评估)，然后再登记随后的受试者，直到五个受试者被登记并被观察到。对于第二组五名患者的治疗，受试者之间不需要等待期。
经过6个月的密集随访，受试者将至少季度评估为期两年，具有病史，身体检查和血液检查。经该评估后，受试者将通过电话和问卷进行年度随访的滚动研究，最多可以追加十三年，以评估长期健康问题的诊断，如新的恶性肿瘤的发展。
初步研究终点
该先导试验旨在测试在第一次ASCT后早期复发后经历MM的挽救ASCT的患者中用CD19TCRζ/4-1BB转导的自体T细胞的安全性和可行性。
初步安全和可行性终点包括：
研究相关不良事件的发生，定义为NCJ CTC 2：3级体征/症状，实验室毒性和临床事件，其可能或绝对与从输液到第24周任何时间的研究治疗相关。这将包括输注毒性和可能与CART-19细胞相关的任何毒性，包括但不限于：
a.发烧
b.皮疹
c.中性白细胞减少症，血小板减少症，贫血，骨髓发育不良
d.肝功能障碍
e.肺部浸润或其他肺部毒性
f.影响胃肠道或皮肤的GVHD样综合征。
从患者单采血液成分术产物制造CART-19细胞的可行性。将确定不满足载体转导效率，T细胞纯度，活力，无菌度和肿瘤污染的释放标准的制造产品的数目。
将使用CART19的自体干细胞移植后的应答深度和持续时间与每个患者在标准自体干细胞移植后最初实现的应答深度和持续时间进行比较。
受试者选择和退出
纳入标准
受试者必须先前接受过MM的ASCT治疗，并在干细胞输注后365天内进展。作为计划的串联ASCT巩固方案的一部分，经历了两个以前的ASCT的受试者是符合条件的。根据IMWG进行性疾病标准定义进展，或对于初始ASCT后获得CR或sCR的患者，根据CR复发的标准定义进展(Durie et al.Leukemia 2006；20(9):1467-1473)。N.B:没有要求患者必须在先前ASCT的365天内登记，并且在注册本研究之前，可以在先前ASCT后复发/进展后，用其他活性剂(包括实验活性剂)治疗患者。
受试者必须签署书面知情同意书。
受试者必须具有足够的重要器官功能才能接受高剂量美法仑，如以下标准所定义:在美法仑输注之前的12周内测量:a.血清肌酸酐≤2.5或估计肌酐清除率≥30ml/min，不依赖透析。b.SGOT≤3x正常和总胆红素的上限≤2.0mg/dl(高胆红素血症归因于吉伯特氏综合征的患者除外)。c.左心室射血分数(LVEF)≥45％，或，如果LVEF<45％，由心脏病专家进行正式评估，没有鉴定出临床上重要的心血管功能障碍。LVEF评估必须在登记六周内完成。d.充足的肺功能，FEV1，FVC，TLC，DLCO(适当调整肺容积和血红蛋白浓度后)≥40％的预测值。肺功能检查必须在登记后6周内进行。
受试者必须具有0-2的ECOG表现状态，除非更高的表现状态仅由骨痛引起。
排除标准
受试者不得:
有任何活跃和不受控制的感染。
有活跃的乙型肝炎，丙型肝炎或艾滋病毒感染。
任何不受控制的医疗障碍，其将排除如所概述的参与。
治疗方案
复发/进展性多发性骨髓瘤的治疗
在登记前，患者可以根据其治疗医生的偏好接受复发性/进行性多发性骨髓瘤的治疗。登记后治疗可以继续。
患者必须在单采血液成分术之前停止所有治疗两周，并在高剂量美法仑之前停止两周。如果预期在单采血液成分术和高剂量美法仑之间超过两周，患者可以根据其治疗医师的决定在单采血液成分术后恢复治疗。
高剂量美法仑(第-2天)
患者将在第-3天或-2天进入医院，并由主治医师进行检查，并在治疗方案开始前进行常规实验室检查，包括监测肿瘤溶解综合征的参数。如果在入院7天内没有抽取用于MM监测实验室测试(SPEP，定量免疫球蛋白和无血清轻链分析)的血液，那么将在开始治疗前进行此类血液抽取。
高剂量治疗将由在第-2天在约20分钟静脉内施用的剂量为200mg/m2的美法仑组成。对于>70岁的患者或对于由治疗医生判断不能耐受200mg/m2剂量的任一年龄的患者，美法仑的剂量将减少至140mg/m2。所有患者将接受标准抗催吐预防，其可以包括地塞米松，和标准抗生素预防。
干细胞再输注(第0天)
干细胞输注将在施用高剂量美法仑后至少18小时第0天进行。根据标准制度实践，在术前用药法后约20-60分钟静脉内输注干细胞。应输注至少2x106CD34+祖细胞/kg体重。此外，至少1x106CD34+祖细胞/kg体重应当作为备用干细胞产物可用，以在延迟植入或晚期移植物衰竭的情况下被输注。G-CSF应当在第+5天开始适量施用，根据标准制度实践给药。其他支持性护理措施如输血支持将根据标准制度指导方针进行。
CART19细胞输注(第+12-14日)
将给予单剂量的CART-19转导的T细胞，其由高达5x107个CART-19细胞组成。在单一患者方案中输注用CD19TCRζ4-1BB载体转导的细胞的最小可接受剂量为1x107。在干细胞输注后第12-14天，将以单次剂量通过快速静脉内输注给予CART-19细胞。如果患者在12-14天的窗口中不符合本文所述的任何纳入标准，那么CART-19输液可能延迟超过+12-14天，直到满足标准。
维持来那度胺
在第一次ASCT后接受和耐受维持来那度胺的受试者将在大约第+100天重新开始来那度胺维持治疗，假设在治疗医师的判断中没有禁忌症。起始剂量将为每天10mg，除非先前经验指示特定患者的替代起始剂量。维持治疗将继续直到疾病进展或不耐受。
研究药物的制备和施用
CART-19T细胞在CVPF中制备并且不会从CVPF释放，直到FDA批准的注射细胞释放标准(例如，细胞剂量，细胞纯度，无菌度，载体/细胞的平均拷贝数等)被满足。释放后，将细胞带到床边进行给药。
细胞解冻。冷冻细胞将在干冰中运送到受试者的床边。细胞将使用保持在36℃至38℃的水浴在床边解冻。该袋将被轻轻按摩，直到细胞刚解冻。容器中不应有冷冻的团块。如果CART-19细胞产品似乎有损坏或袋子泄漏，或以其他方式似乎受损，则不应将其输注，并应按以下规定退回给CVPF。
前驱用药。T细胞输注后的副作用包括短暂发热，发冷和/或恶心；回顾参见Cruz等(Cytotherapy 2010；12(6):743-749)。推荐在输注CART-19细胞之前，将受试者用对乙酰氨基酚和盐酸苯海拉明预先给药。这些药物可以根据需要每六个小时重复一次。如果患者继续发热，对乙酰氨基酚不能缓解，则可以开出非类固醇类抗炎药物处方。建议患者在任何时候不接受系统性皮质类固醇，如氢化可的松，泼尼松，甲泼尼龙或地塞米松，除非有危及生命的紧急情况，因为这可能对T细胞有不良影响。
发烧反应。在不太可能的情况下，受试者在CAR T细胞输注后出现脓毒症或系统性菌血症，应启动适当的培养和医疗管理。如果怀疑有污染的CART-19T细胞产品，则可以使用存储在CVPF中的归档样品重新测试产品的无菌性。
施用.输注将在Rhoads的隔离室中进行，对免疫抑制患者使用预防措施。转导的T细胞将以大约10ml至20ml/分钟的流速通过具有3通旋塞阀的18号规格的无胶乳Y型血液套件通过快速静脉内输注施用。输注的持续时间将基于待输注的总体积和推荐的输注速率。每个输液袋将贴有包含以下内容的标签:“仅供自体使用”。此外，标签将至少具有两个唯一标识符，例如受试者的首字母，出生日期和研究编号。在输注之前，两个个体将在受试者存在的情况下独立地验证所有这些信息，因此确认信息与参与者正确匹配。
如果受试者具有过敏反应或严重的低血压危象或任何其他对输注的反应，则在输注期间将提供紧急医疗设备(即紧急推车)。输液前后采集生命体征(温度，呼吸频率，脉搏和血压)，然后每15分钟持续至少1小时，直到这些体征令人满意并且稳定。受试者将被要求不要离开，直到医生认为他或/她离开是安全的。
包装
输注将由单剂量的1-5x107个CART19转导的细胞组成，具有最小可接受剂量的1x107CART-19细胞用于输注。每个袋将包含等分试样(体积取决于剂量)的冻存物，所述冻存物含有以下不熔级试剂(％v/v):31.25％plasmalyte-A，31.25％葡萄糖(5％)，0.45％NaCl，至多7.5％DMSO，1％葡聚糖40,5％人血清白蛋白。
单采血液成分术
在单采血液成分术中心进行大体积(12-15升或4-6血容量)单采血液成分术程序。在该程序期间获得CART-19的PBMC。从单个白细胞采集物，目的是收获至少5x109个白细胞以制造CART-19T细胞。还获得用于FDA回顾要求和用于研究的基线血液白细胞并冷冻保存。细胞产物预期在大约2-4周后准备释放。流式细胞术淋巴细胞亚群定量，包括CD19和CD20 B细胞测定。对人抗-VSV-G和抗鼠抗体(HAMA)进行基线评估。如果受试者先前已经根据当前的良好生产规范(Good Manufacturing Practices)在临床细胞和疫苗生产设施进行了足够的单采血液成分收集存储，那么这些细胞可以用作CART-19制造的细胞来源。使用存储的单采血液成分产品将避免对于经历额外单采血液成分收集的受试者带来的费用，时间和风险。
细胞减少性化疗
淋巴细胞清除化疗将是如本文所述的高剂量美法仑。
CART-19输注
输注将在干细胞回输后的第+12-14天开始。
在第一次输注之前的第+12-14天，患者将具有差别的CBC，以及评估CD3，CD4和CD8计数，因为化学疗法部分地被给予以诱导淋巴细胞减少。
第一剂量将使用单一剂量施用。细胞在患者的床边解冻。解冻的细胞将以可耐受的尽可能快的输注速率给予，使得输注的持续时间为约10-15分钟。为了便于混合，使用Y-连接器同时施用细胞。将如本文所述输注和预先给药受试者。将评估受试者的生命体征，并且在给药之前，在输注结束时，以及之后每15分钟进行脉搏血氧测量，持续1小时，直到这些是稳定和令人满意的。用于测定基线CART-19水平的血液样品在第一次输注之前的任一时间和每次输注后20分钟至4小时获得(并且发送到TCSL)。
经历与高剂量美法仑相关的毒性的患者将延迟其输液计划，直到这些毒性已经解决。确保T细胞输注延迟的具体毒性包括:1)肺:补充氧气保持饱和度大于95％的要求或存在胸部x射线放射进行性摄影异常；2)心脏:新的心律失常不受医疗管理控制；3)需要血管加压素支持的低血压；4)主动感染:T细胞输注48小时内细菌，真菌或病毒的阳性血培养。
毒性管理
不受控制的T细胞增殖。与同种异体或自体T细胞输注相关的毒性已经通过药理学免疫抑制过程进行了管理。据报道，T体相关毒性应答全身性皮质类固醇。如果发生不受控制的T细胞增殖(3级或4级与CART-19细胞相关的毒性)，受试者可以用皮质类固醇治疗。受试者将用脉冲甲泼尼龙治疗(2mg/kg i.v.分开q8小时×2天)，随后迅速缩小。
此外，基于对另一种方案治疗的受试者的观察结果，对于巨噬细胞活化综合征(MAS)有一些担忧，尽管骨髓瘤患者的CD19+肿瘤负荷预期比CLL患者低得多。这种毒性的治疗和治疗时间选择将由患者的医师和研究调查员自行决定。建议的管理可能包括:如果受试者的发烧大于101°F，持续超过2个连续日，并且没有感染证据(阴性血培养物，CXR或其他来源)，可以考虑托珠单抗4mg/kg。皮质类固醇和抗TNF疗法的添加可以由医师酌情考虑。
B细胞消耗。可能发生B细胞消耗和低丙种球蛋白血症。这在抗CD20定向疗法中是常见的。在临床显著的低丙种球蛋白血症(即全身感染)的情况下，通过建立的临床给药指南给予受试者静脉内免疫球蛋白(IVIG)，以恢复血清免疫球蛋白水平的正常水平，如用利妥昔单抗进行的。
原发性移植物衰竭。与第一次ASCT相比，第二次ASCT后，原发性移植物衰竭(即非移植物移入)可能更常见。合格标准规定，在原发性移植物衰竭的情况下，必须由治疗医师酌情决定足够的干细胞用于救援再输注。
结果
在这个进行中的试验中，现在已经用CTL019治疗了三种难治的晚期多发性骨髓瘤患者。这些患者中的两个的结果显示，基于在三个月时间点的主要功效评价，两者都具有来自CTL019治疗的实质性抗肿瘤效应。第三名患者尚未达到三个月的时间点。下面更详细地描述两个患者的结果。
第一名骨髓瘤患者完成了她的+100天的反应评估，她对CART19治疗有很好的反应。进行以下测试，得到以下结果:
-SPEP/免疫固定:阴性
-尿免疫固定:在她的免疫固定上微弱的不可测量的κ轻链条带(也存在于第38天，所以不是新的)
否则，患者符合严格完全缓解的标准，包括:
-血清游离轻链比例:正常
-骨髓活检:阴性
-IgA免疫表型:IgA低于检测限
除了来自尿免疫固定的微弱的不可测量的κ轻链结果之外，患者满足“严格的完全缓解”的所有标准。在3个时间点(第-2天，第+38天，第+103天)的血浆细胞免疫表型的总结显示在图8中，并且证明了患者的IgA低于检测限。该总结显示在第-2天的重骨髓瘤负荷，在第+38和+103天无法检测到，其通过流动分析将患者分类为“MRD阴性”。在第+103天，总结显示正常的多克隆的CD19+浆细胞和B细胞的恢复。患者没有疾病或治疗的症状，并且机能像正常人一样。
第二个接受治疗的患者尚未达到+100天的时间点。然而，在这个时间点，她做得很好，但是确定CTL019输注的效果还为时过早。
实施例2:用于霍奇金淋巴瘤的CAR19T细胞疗法
CAR19T细胞疗法也可用于治疗霍奇金淋巴瘤(HL)。霍奇金淋巴瘤的特征在于来自克隆生发中心B细胞的恶性霍奇金Reed-Sternberg(HRS)细胞的存在。有几个因素表明CAR19T细胞治疗对于HL的疗效。HL肿瘤的CD19染色显示肿瘤和肿瘤微环境内的CD19表达(CD19+)细胞(图2)。一项研究表明，表达CD19的克隆B细胞群(CD20+CD27+ALDH+)负责霍奇金淋巴瘤细胞系的产生和维持，并且也在大多数HL患者的血液中循环(Jones et al.,Blood,2009,113(23):5920-5926)。这种克隆B细胞群体也被认为是引起或有助于产生恶性HRS细胞。因此，CART19治疗将消耗有助于肿瘤细胞的肿瘤发生或维持的B细胞群体。另一项研究表明，B细胞消耗在多种鼠模型中延缓了实体瘤的生长(Kim et al.,J Immunotherapy,2008,31(5):446-57)。为了支持B细胞在HL肿瘤微环境中的消耗导致某种抗肿瘤效应的想法，现在正在临床测试目前的疗法，如利妥昔单抗，用于靶向和消除HL中的肿瘤B细胞(Younes et al.,Blood,2012,119(18):4123-8)。与慢性炎症相关的新生癌发生也已显示为B细胞依赖性的(de Visser,et al.,Cancer Cell,2005,7(5):411-23)。这些研究的结果表明，通过减少或抑制疾病进展或肿瘤生长，B细胞群体，特别是在HL肿瘤微环境中的B细胞群体的靶向将可用于治疗HL。
此外，正常的表达CD19的B细胞也浸润HL中的肿瘤微环境。以前在CLL和ALL中进行CART19治疗的研究(例如实施例4和5中所述)表明CART19暴露于CD19+靶标导致细胞因子产生和巨噬细胞产生。因此，可以通过输注CART19以与存在于HL中的正常CD19+B细胞相互作用来实现HL肿瘤微环境从促肿瘤微环境调节到抗肿瘤微环境。例如，CART19暴露于表达CD19的靶标导致细胞因子产生，例如炎性细胞因子，其通过扩增细胞毒性T细胞，巨噬细胞的活化以及募集具有抑制肿瘤生长的各种功能的其它免疫效应细胞(如白细胞，巨噬细胞和抗原呈递细胞)来促进抗肿瘤活性。因为靶标CD19+B细胞可能不是恶性的(例如，正常循环的B细胞)，所以短暂而不是延长的CART19效应可能对于肿瘤微环境的调节是优选的。
检查CART19治疗在HL患者的治疗效果的研究可以如下所述进行(图3)。该研究还将评估CART19在HL受试者中的安全性和耐受性，并确定CART19细胞对HL肿瘤微环境的影响。
本研究对8例经典HL患者进行了治疗。患者是各个年龄的，尽管针对儿科和成人患者可以建立单独的药物递送方案。本研究中的患者没有潜在的治愈性治疗方案(如自体(ASCT)或同种异体干细胞移植)，或不适合这种治愈性治疗方案。例如，患者可以是以下任何一种:在补救化疗后的PET+，经Brentuximab治疗后的PET+，或者在具有或不具有先前的brentuximab暴露的ASCT之后的PET+。使用目前可用的疗法，患者将具有有限的预后(几个月至小于或等于2年预期生存期)。最后，患者不会接受抗CD20抗体治疗。患者由于缺乏可行性而被排除，例如，如果患者具有不足数量的T细胞用于6次输注CART19的话。
通过体外转录产生mRNA CAR19。将CAR19 mRNA电穿孔到供体T细胞中，通过与CD3/CD28珠温育，使得到的细胞扩增并刺激。含有1x108–5x108个RNA电穿孔的CAR19T细胞的剂量每周输送给患者三次，为期两周(例如，在第0,2,4,7,9和11天)。治疗后1个月通过临床，CT和PET扫描评估总体应答率。第一次CART19输液(第0天)后的前6个月，然后每3个月直到2年为止，每月监测应答和存活。监测技术包括肿瘤或淋巴结的活检(例如用于免疫组织化学分析和/或用于基因表达谱的RNA)和在CART19治疗之前和之后的PET扫描。例如，通过比较在治疗前和治疗后约一周(或治疗后适当的时间以允许改变细胞表型)对来自选定患者的可及性淋巴结活检进行的基因表达谱分析的结果，分析CART19细胞对HL肿瘤微环境的影响。为了评估CART19治疗的安全性和耐受性，报告了不良事件的频率和严重性，包括细胞因子释放综合征(CRS)和巨噬细胞活化综合征(MAS)的频率。
化疗可与CART19治疗同时施用。CART19的第一剂之前可以是淋巴细胞消耗性化疗，例如环磷酰胺。
实施例3:CLL患者的非应答者子集表现出免疫检查点抑制剂分子的增加的表达
在本研究中，评估了来自34名CLL患者临床制造的CART19细胞的免疫检查点抑制剂分子(如PD-1，LAG3和TIM3)的表达。该群组对CART19的应答是已知的，因此可以评估应答和生物标志物表达模式之间的相关性。
通过流式细胞术分析来自具有对CART疗法不同应答的CLL患者的制备的CART19细胞，以测定CAR和免疫检测点抑制剂分子PD-1，LAG3和TIM3的表达。CART19细胞来自:健康供体(HD)(n＝2)；应答CART治疗(CR)的CLL患者(n＝5)；部分应答CART治疗(PR)的CLL患者(n＝8)；不应答CART治疗(NR)的CLL患者(n＝21)。根据本领域已知的流式细胞术分析的标准方法，用特异性识别CD3，CD4，CD8，CD27，CD45RO，CAR19分子和免疫检查点分子PD-1，LAG3和TIM3的荧光标记的抗体染色细胞。通过流式细胞术分析软件测定每个标记物例如CD4+，CD8+等的表达，进一步分析亚群(例如CD4+T细胞，CD8+T细胞或表达CAR19的T细胞)的免疫检查点分子PD-1，LAG3和TIM3的表达。
用于确定表面标志物表达的流式细胞图谱分析的实例示于图4A和4B。使用流式细胞术测定表达CD4的T细胞，并进一步分析CAR19和PD-1表达，使得图谱的x轴表示CAR19表达(左上(Q5)和左下(Q8)象限显示CAR19阴性CD4+细胞，而右上(Q6)和右下(Q7)象限显示表达CAR19的CD4+细胞)，y轴显示PD-1表达(左下(Q8)和右(Q7)象限显示PD-1阴性CD4+细胞，左上(Q5)和右(Q6)象限显示表达PD-1的CD4+细胞)。在来自CART应答者的CD4+群体中，44.7％的CD4+细胞总体表达PD-1，并且约22.3％的表达CAR19的细胞为PD-1阳性，而27.2％的表达CAR19的细胞为PD-1阴性(图4A)。相比之下，在非应答者的CD4+群体中，总体CAR19表达细胞显著减少(与CR的49.5％相比约15.3％)，14.7％的表达CAR19的细胞是PD-1阳性的，而只有0.64％为PD-1阴性的(图4B)。图4A和图4B中的图谱之间的比较显示，与CART应答者(约44.7％)相比，来自表达PD-1的非应答者的CD4+细胞百分比高得多(约92.9％)。
使用上述方法和分析，测定每个应答组中每个患者的CD4+群体和CD8+群体的PD-1表达(PD-1+)细胞百分比。与应答CAR治疗(CR)的患者相比，非应答者在CD4+(图4C)和CD8+(图4D)群体中具有更大百分比的PD-1+细胞。CD4+和CD8+群体平均PD-1百分比的增加是统计学显著的。部分应答者(PR)在CD4+(图4C)和CD8+(图4D)群体中表现出比应答者(CR)更高百分比的PD-1+细胞。
接下来，针对每个应答组中的每个患者确定表达CAR19的CD4+群体和表达CAR19的CD8+群体的PD-1表达(PD-1+)细胞的百分比。进行如上所述的类似分析，并且分析用于CAR19表达的CD4+和CD8+细胞的额外步骤，并且在鉴定表达CAR19的细胞后，确定来自表达CAR19的细胞群体中具有PD-1表达的细胞的百分比。对于表达CAR19的CD4+和CD8+群体，观察到与CD4+和CD8+总体群体中相似的趋势:与应答CAR治疗(CR)的群体相比，非应答者在CD4+(图5A)和CD8+(图5B)群体中显示更高百分比的PD-1+细胞；CD4+和CD8+群体的平均PD-1百分比的增加是统计学上显著的。部分应答者(PR)在CD4+(图5A)和CD8+(图5B)群体中表现出比应答者(CR)更高百分比的PD-1+细胞。
进行进一步分析以确定来自对CAR治疗具有不同应答的患者的表达PD-1，LAG3和TIM3的细胞的分布。CD4+群体中PD-1，LAG3和TIM3表达的代表性细胞谱分析如图6所示。首先分析细胞群体的CD4+和CD8+表达。然后分析CD4+群体(或CD8+群体，未显示)的PD-1和CAR19表达(图6，左侧图谱)。如前所述，非应答者(NR)与CART应答者(CR)相比，总体PD-1+细胞百分比显著增加(NRC约为92.9％PD-1阳性，而CR为44.7％PD-1阳性)。此外，在非应答者中，表达CAR19的细胞多数为PD-1阳性(14.7％为PD-1阳性且CAR+，相比，0.64％为PD-1阴性且CAR+)。然后分析群体的PD-1和LAG3共表达(图6，中间图谱)。表达PD-1和LAG3的细胞显示在右上象限(Q2)中。与CART应答者相比，非应答者具有显著增加百分比的表达两种免疫检查点抑制剂PD-1和LAG3的细胞(67.3％相比7.31％)。还用TIM3表达分析了PD-1表达。在图6，右侧图谱中，框指示表达PD-1和TIM3的细胞。与用PD-1和LAG3获得的结果相似，与CART应答者相比，非应答者具有显著更高百分比的表达两种免疫检查点抑制剂PD-1和TIM3的细胞(83.3％相比28.5％)。使用如上所述的流式细胞术分析，在每个应答组中测定每个患者的PD-1表达细胞(PD1+)，PD-1和LAG3表达细胞(PD1+LAG3+)和PD-1和TIM3表达细胞(PD1+TIM3+)的百分比。与对于两种细胞群体统计学显著的CART应答者相比，非应答者显示具有增加百分比的PD1+LAG3+细胞(图7A)和PD1+TIM3+细胞(图7B)。与CART应答者相比，部分应答者也显示出两种细胞群体的百分比增加，与非应答者相比，平均值下降。
这些结果表明，与对CAR治疗应答或部分应答的患者相比，不应答CAR治疗的患者表现出免疫检查点抑制剂(例如PD-1，LAG3和TIM3)增加的表达。因此，这些结果表明，抑制或降低免疫检查点抑制剂例如PD-1，LAG3或TIM3的表达的活性剂可用于施用于接受CAR治疗的患者，以通过免疫检查点途径(例如，通过PD-1，LAG3或TIM3介导的)预防免疫抑制，从而增加CAR表达细胞的功效。
实施例4:mTOR抑制对老年人免疫衰老的影响
mTOR抑制对免疫衰老的功效描述于例如国际申请WO/2015/073644的实施例1中，并且该申请的全部内容通过引用并入本文。
实施例5:增强对老年受试者中疫苗的免疫应答
mTOR抑制对增强免疫应答的功效描述于例如国际申请WO/2015/073644的实施例2中，并且该申请的全部内容通过引用并入本文。
实施例6:低剂量mTOR抑制增加能量和运动
例如在国际申请WO/2015/073644的实施例3中描述了mTOR抑制对能量和运动的影响，并且该申请的全部内容通过引用并入本文。
实施例7:用RAD001抑制P70 S6激酶
mTOR抑制对P70 S6激酶抑制的影响描述于例如国际申请WO/2015/073644的实施例4中，并且该申请的全部内容通过引用并入本文。
实施例8:外源性IL-7增强CAR T细胞的功能
在过继转移CAR T细胞后，一些患者经历了CAR T细胞有限的持续，这可能导致次优的抗肿瘤活性水平。在该实施例中，小鼠异种移植模型中评估外源性人IL-7的给药效果，在该模型中已经观察到对CAR T细胞的初始次优应答。
首先在不同的癌细胞系和CAR表达细胞中评估IL-7受体CD127的表达。通过流式细胞术分析两个外套细胞淋巴瘤细胞系(RL和Jeko-1)和一个B-ALL细胞系(Nalm-6)的CD127表达。如图9A所示，在测试的三种癌细胞系中，RL显示出CD127的最高表达，其次是Jeko-1和Nalm-6。将CART19细胞注入NSG小鼠，通过流式细胞术对循环CART19细胞评估CD127表达。如图9B所示，CD127在所有循环CART19细胞上均匀表达。
接下来，在淋巴瘤动物模型中评估外源性IL-7治疗对CART19细胞抗肿瘤活性的影响。在第0天(D0)，将NSG小鼠植入表达萤光素酶的外套细胞系(RL luc)，随后在第6天处理CART19细胞。将NSG小鼠分成组，其中一组不接受CART19细胞，第二组接受0.5x106个CART19细胞，第三组接受1x106个CART19细胞，第四组接受2x106个CART19细胞。通过测量移植肿瘤的平均生物发光来监测肿瘤大小超过80天。只有接受2x106个CART19细胞的小鼠表现出肿瘤的排斥和肿瘤生长的抑制(图10A)。来自接受0.5x106个CART19细胞或1x106个CART19细胞的两组的小鼠显示为次优的抗肿瘤应答。然后将来自这两组的小鼠随机分配，其中三只小鼠(接受0.5x106个CART19细胞的小鼠#3827和#3829以及接受1x106个CART19细胞的小鼠#3815)从第85天开始通过腹膜内注射，每周三次，以200ng/小鼠的剂量接受外源重组人IL-7，两只老鼠没有接受注射。如通过平均生物发光检测的，从第85-125天接受外源IL-7的小鼠的肿瘤负荷示于图10B。接受IL-7的所有小鼠均显示出明显的应答，其肿瘤负荷减少了1-3个log。最初接受较高剂量的CART19细胞的小鼠(接受1x106个CART19细胞的小鼠#3815)显示出更明显的应答。IL-7治疗之前和之后，当比较接受IL-7治疗的小鼠与对照的肿瘤负荷时，肿瘤负荷的肿瘤减少仅在接受IL-7治疗的小鼠中观察到(图10C)。
还检查了淋巴瘤动物模型中IL-7治疗后的T细胞动力学。在IL-7治疗之前，在血液中不能检测到人CART19细胞。在IL-7治疗时，治疗的小鼠中T细胞的数量有迅速但可变的增加(图11A)。在接受IL-7的小鼠中观察到的T细胞扩增的程度也与肿瘤应答相关。在IL-7治疗(小鼠#3815)期间在峰值膨胀时在血液中检测到的T细胞数最多的小鼠具有肿瘤负荷最稳健的降低(参见图10B)。此外，峰值扩张时间与基线时注射的T细胞剂量相关。在IL-7治疗之前和之后也测量血液中CD3表达细胞的数量/水平。在对照小鼠中，检测到非常少的CD3表达细胞，而IL-7治疗的小鼠在IL-7治疗后显示CD3+细胞显著增加(图11B)。
本实施例的结果一起证明外源性IL-7治疗增加了体内T细胞增殖和抗肿瘤活性，表明在CAR治疗后具有次优结果的患者中IL-7的使用可以改善这些患者中的抗肿瘤应答。
实施例9:评价CD22 CAR
自动化Jurkat-NFAT-萤光素酶(JNL)细胞测定
进行自动化测定以确定特异性CD22 CART克隆的反应性。将从NFAT启动子稳定表达萤光素酶的3e4个慢病毒转导的Jurkat细胞系细胞(JNL细胞)接种在具有表达CD22的靶细胞系(Daudi，Raji)和非CD22表达细胞系(K562)的96孔板中作为阴性对照。第二天，将萤光素底物加入到96孔板的每个孔中，并确定萤光素酶报告基因的相对发光。在该测定中，将CD22 CAR构建体与作为阳性对照的CD19 CAR构建体和CD22(m971衍生的)CAR构建体(m971-HL)进行比较。含有m971-HL的VH和VL链但为相反方向(L-H代替H-L)的m971-LH CAR构建体含有CAR，但是由于缺乏特异性而不能结合靶标，并且用作阴性对照。未转染的不含CAR(Negcnt)的T细胞也作为阴性对照。绘制来自Jurkat T细胞活化的萤光素酶活性。本文提供的结果表明，几种CD-22转导的JNL克隆显示出以剂量依赖性方式增加的针对表达CD22的细胞系的特异反应性(图18A-18C)。
CD22 CAR在原代人T细胞中的表达
在第0天，用抗CD3/抗CD28刺激珠激活原代人T细胞，随后在第1天用特异性CAR构建体进行慢病毒转导。细胞在体外扩增至第10天，此时通过流式细胞术分析它们的CAR的表面表达。利用两种不同的方法来确定CAR的表面表达:蛋白质-L-生物素然后是链霉抗生物素蛋白-PE，和重组人CD22-Fc然后是抗-Fc-alexafluor488。结果示于图19。本文提供的结果表明，CD22 CAR克隆2(hCD22-2)，克隆5(hCD22-5)，克隆7(hCD22-7)，克隆8(hCD22-8)，克隆10(hCD22-10)，克隆12(hCD22-12)，克隆30(hCD22-30)和克隆31(hCD22-31)显示阳性表达表达。CD22 CAR m971作为结合蛋白L和hrCD22-Fc的阳性对照，无特异性(抗-gH)的同种型CAR作为蛋白L的阳性对照。不表达CAR的T细胞用作阴性对照。
原发性T细胞肿瘤靶标杀伤测定
将如上所述活化和转导的原代T细胞以指示的比例与稳定表达萤光素酶的靶细胞系混合(图20A-20F)。靶细胞系Raji，SEM，K562-hCD22，Daudi和Nalm6均表达CD22靶，而K562细胞系不表达CD22并用作阴性对照(图20A-20F)。本文提供的结果表明，几个CD22 CAR克隆(例如，CD22 CAR克隆2,5,7,8,10,12,30和31)和阳性对照CD22m971-HL CAR显示出剂量依赖性靶细胞杀伤，杀伤程度取决于靶细胞类型而变。未转染的T细胞(UTD)缺乏杀死靶细胞系的能力。
原发性T细胞细胞因子珠阵列
研究了CD22表达细胞系诱导从表达CD22的CART细胞的促炎细胞因子释放的能力。使用细胞因子珠阵列试剂盒对取自原代T细胞杀伤试验的样品测定促炎细胞因子浓度。干扰素-g(IFN-g)，肿瘤坏死因子α(TNFa)和白细胞介素2(IL-2)均在2.5:1E:T和10:1E:T比例的样品上测量。结果示于图21A-21F。本文提供的结果表明，多种CD22 CAR克隆比m971-LHCAR(阴性对照)或未转导的T细胞(UTD)诱导显著更多的IFN-g，TNFα和IL-2，细胞因子诱导水平随靶细胞类型而变化。
实施例10:CD22 CART治疗的剂量升高研究
进行1期临床试验以确定在接受过或之前没有接受过CART治疗的ALL受试者中具有或不具有CD19 CART的CD22 CART的最佳剂量。本研究的目的是确定产生符合既定释放标准的抗CD22 CAR工程化T细胞的可行性，并评估在具有B细胞恶性肿瘤的儿童和年轻人中环磷酰胺/氟达拉滨淋巴结清除方案后，施用递增剂量的自体抗CD22 CAR工程化T细胞的安全性。
受试者年龄在1至30岁之间，CD22+ALL体重至少15kg。疾病活动可通过骨髓分析或FDG-PET测量。允许最小残留疾病活性的受试者。允许中枢神经系统(CNS)状态为1或2的受试者。受试者必须具有足够的器官功能和足够的CD3计数。
用扩张群组进行1期剂量递增研究。受试者根据是否有或没有接受过CART治疗分层。给予受试者四个剂量水平之一的四个剂量的自体抗CD22CAR工程化T细胞:3x105细胞/kg体重，1x106细胞/kg体重，3x106细胞/kg体重和1x107个细胞/kg体重。接受3x106个细胞/kg体重剂量的受试者的子集也被给予抗CD19 CAR工程化T细胞。每个剂量水平的前2名患者是16岁或以上。
在确定合格后，进行单采血液成分术以分离T细胞。受试者经历准备性化疗。受试者每天用25mg/m2氟达拉滨治疗三天，给予单剂量的900mg/m2的环磷酰胺。然后施用抗CD22CAR工程化T细胞，28天后评估应答和毒性。
实施例11:利用CD20靶向嵌合抗原受体(CARS)治疗B细胞恶性肿瘤
进行Jurkat-NFAT-萤光素酶(JNL)细胞测定以确定特异性CD20CART克隆的反应性。从NFAT启动子稳定表达萤光素酶的Jurkat细胞(JNL细胞)用图15A-15C所示的CAR构建体进行慢病毒转导。将表达CAR的JNL细胞(3e4)与表达CD20的靶细胞系Daudi(图15A)和Raji(图15B)和非表达CD20的阴性对照K562(图15C)以0.5:1,1:2,2:1和4:1在效应细胞:靶细胞(E:T)比混合。将慢病毒转导的JNL细胞接种在具有表达CD20的靶细胞系(Daudi，Raji)和非CD20表达细胞系(K562)作为阴性对照的96孔板中。第二天，将萤光素底物加入到96孔板的每个孔中，并确定萤光素酶报告分子(来自Jurkat T细胞活化)的相对发光。在该测定中，将CD20CAR构建体与作为阳性对照的CD10 CAR构建体和Haso et al.,Blood,14Feb2013,Vol.121,No.7中描述的CD22(m971衍生的)CAR构建体比较。含有CAR但由于缺乏特异性而无法结合靶标的同种型CAR，以及不含CAR(Neg cnt)的未转导的T细胞作为阴性对照。结果示于图15A-15C。几种CD20转导的JNL克隆显示出以剂量依赖性方式增加的针对CD20表达细胞系的特异性反应性。
实施例12:预测B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)中受试者对CD19CART疗法复发的因子的鉴定
本实施例除其他之外还描述了根据本发明使用的用于预测B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)中患者对CD19 CART疗法(例如CTL019疗法)复发的新的转录基因特征的鉴定。
除此之外，本实施例描述了基于在CD19 CART治疗(例如，CTL019)(单采血液成分术或骨髓)之前的患者中或再输注前制造的CD19 CART产品样品(例如，CTL019)中所选基因的mRNA表达水平的新型基因特征。在一个实施方案中，本实施例描述了新的基因特征，其将B-ALL中CTL019治疗的复发者与B-ALL中CTL019治疗的非复发者区分开。
本实施例描述了用于本发明的发现新基因特征的无偏特征选择的方法，所述基因特征预测B-ALL中对CD19 CART治疗(例如CTL019)的受试者复发。
本实施例还描述了用于发现根据本发明使用的新基因特征的基因集分析方法。
鉴定了在重新输注之前基于制备的CD19 CART产品样品中的mRNA表达水平的新基因特征，其预测受试者在B细胞急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)中对CD19 CART治疗的复发。在包括7个B-ALL受试者样品的制备的产品样品的全基因组RNAseq研究中发现了鉴定的特征。B-ALL受试者样品(共7个)分层如下:在CTL019治疗后4名未复发的受试者(“非复发者”)和CTL019治疗后3名复发的受试者(“复发者”)取得生物样品。发现了在制造的产品样品中区分应答者和非应答者，以及复发者和非复发者的几个基因特征，并在下面进一步描述。
然后使用多种数据分析方法发现了新的基因特征:1)无偏特征选择；2)基因集分析；和3)所选择的目的基因的差异表达分析。
通过确定哪些基因在复发者与非复发者的2组比较(其将3例复发者与4例非复发者进行了比较)之间差异表达，发现了从无偏特征选择导出的新基因特征。如果它们的差异表达在2组比较中具有统计学显著性(FDR p值截止值为0.25)，则将基因定义为差异表达的。表29中列出了用于复发者与非复发者比较(N＝17)的基因列表。应用2组统计模型，以确定元基因在组间是否有统计学上的差异并且图32图解了产生该方法的示例性示意图。图32描绘了在具有CLL的完全应答者(CR)，部分应答者(PR)和非应答者(NR)中在激活的TEFF相对于静息TEFF细胞中上调的基因的示例性热图。
不希望受到特定理论的约束，这些数据表明CD19 CART产品(例如CTL019)中T细胞的分化状态与受试者应答(即CR，PR或NR)相关，并预测B-ALL中对CD19 CART治疗(例如CTL019治疗)的受试者复发。完全的应答者基因特征更像静息的TREG和TEFF细胞。除此之外，复发者的基因特征(例如，对CTL019治疗复发的完全应答者)含有在TREG中相对于静息时的TEFF细胞上调的基因。不希望受特定理论的束缚，这些数据表明，B-ALL中的CART治疗(例如CTL019)复发者与CART治疗(例如CTL019)非复发者相比具有更高水平的TREG。图17描绘了示例性结果，其示出了相对于非复发者，TREG在复发者(R)中差异富集，例如，与完全应答者(CR)(例如非复发者)相比，复发者表达高水平的TREG基因。
表29:预测患者对CTL019治疗复发的示例性基因
以下基因在复发者中显示出升高的水平和在非复发者中降低的水平:MIR199A1,MIR1203,uc021ovp,ITM2C和HLA-DQB1。以下基因在非复发者中显示出降低的水平和在非复发者中升高的水平:PPIAL4D,TTTY10,TXLNG2P,MIR4650-1,KDM5D,USP9Y,PRKY,RPS4Y2,RPS4Y1,NCRNA00185,SULT1E1和EIF1AY。
基因集分析产生了预测B-ALL中CTL019治疗的受试者复发的许多基因特征。
除此之外，本实施例描述了基于基因集分析的新基因特征，其可预测在B-ALL中CD19 CART治疗(例如CTL019)的患者复发。对三个基因集进行基因集分析，即基因集来自(1)另外的实验基于Szabo等人(以下描述)未发表的实验；(2)Abbas等人在GenomeResearch 2005发表的基因集；和(3)Gattinoni等人在Nature Medicine 2011发表的基因集。由Szabo，Abbs和Gattinoni定义的基因集，并且在美国临时专利申请62/061553的实施例1中描述的分析中考虑。
Szabo核心基因集包括在Teff细胞(16h v 0h)中上调的以下基因:AIM2,ALAS1,B4GALT5,BATF,C3orf26,C4orf43,CCL3,CCL4,CCT3,CCT7,CD40LG,CHAC2,CSF2,CTNNA1,EBNA1BP2,EDARADD,EEF1E1,EIF2B3,EIF2S1,FABP5,FAM40B,FKBP4,FOSL1,GFOD1,GLRX2,HSPD1,HSPE1,IFNG,IL15RA,IL21,IL2RA,IL3,KCNK5,KIAA0020,LARP4,LRP8,LTA,MANF,MIR1182,MIR155,MIR155HG,MTCH2,MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1,NME1-NME2,OTUD7B,PAM,PDIA6,PEA15,PFKM,PGAM1,PGAM4,PPIL1,PRDX4,PRSS23,PSMD1,PSMD11,PSMD14,PTRH2,PUS7,RBBP8,RPF2,RPP25,SFXN1,SLC27A2,SLC39A14,SLC43A3,SORD,SPR,SRXN1,STIP1,STT3A,TBX21,TMCC2,TMEM165,TNFRSF9,TXN,TXNDC5,UCK2,VDR,WDR12,YWHAG,和ZDHHC16。Szabo核心基因集还包括在Treg细胞(16hv 0h)中上调的以下基因:AIM2,ALAS1,BATF,C5orf32,CCL17,CD40LG,CHAC2,CSF1,CTSL1,EBNA1BP2,EDARADD,EMP1,EPAS1,FABP5,FAM40B,FKBP4,FOSL1,GCLM,GK,GPR56,HMOX1,HSPD1,HSPE1,IKBIP,IL10,IL13,IL15RA,IL1RN,IL2RA,IL3,IL4,IL5,IL9,KCNK5,LTA,MANF,MIR1182,MIR155,MIR155HG,MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1,NME1-NME2,PANX2,PDIA6,PGAM4,PPIL1,PPPDE2,PRDX4,PRKAR1B,PSMD1,PSMD11,PUS7,RBBP8,SLC27A2,SLC39A14,SLC43A3,SRXN1,STIP1,STT3A,TBX21,TNFRSF11A,TNFRSF1B,TNFRSF8,TNFRSF9,TXN,UCK2,VDR,VTRNA1-3,WDR12,YWHAG,ZDHHC16,和ZNF282。
评估各基因集(例如Szabo基因集，Abbas基因集和Gattinoni基因集)，以下述方式确定其与受试者应答(即，复发者或非复发者)的关联:计算每个受试者的元基因，其中受试者j的元基因得分定义为
其中xij为对于给定基因集n＝1,..,G；，受试者j中基因i的表达值。μ(xj)是受试者j中基因1,…,G的平均值；并且σ(xj)是受试者j中基因1,…,G的标准差。
将两组统计模型应用于每个基因集，以确定元基因在所制备的复发者和非复发者的CTL019产物之间是否在统计学上是不同的。说明该方法的示意图在图16中给出。在Szabo，Abbas和Gattinoni基因集中，存在一个在复发者和非复发者之间显著差异富集的基因集。该基因集来自Szabo系列，并含有TREG相对于TEFF细胞在静息期间上调的基因，并与对CTL019治疗复发的患者相关。具体来说，该基因集被发现在复发者中富集，表明复发者与非复发者相比具有更高水平的TREGS。例如，与TEFF细胞相比，由TREG上调的基因组成的基因集的元基因得分与产品样品中的患者复发相关(参见图17)。图17描绘了阐明与非复发者，完全应答者(CR)相比，TREG基因在复发者(R)中具有高表达水平的示例性结果(p＝0.000215)。x轴是应答组的样本，其中CR＝完全应答者，R＝复发者。y轴是归一化的元基因表达得分。
不希望受特定理论的束缚，这些数据表明，在单采血液成分术前或在制造CART产品期间减少患者的TREG特征显著降低了患者复发的风险。
实施例13:插入突变是对B细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)中CTL019治疗的抗性机制
通过比较在基线和复发后取得的B-ALL患者样品的mRNA测序数据，发现了几种抗性机制。某些抗性机制被称为“CD19-复发”，即患者的肿瘤细胞被表征为CD19-，因为它们不结合CTL019中使用的FMC63表位，如通过流式细胞术测量的。已经发现了几种抗性机理，并在本实施例中详细描述。
进行mRNA测序(RNAseq)以比较CTL019治疗前和复发后B-ALL患者的转录谱。三名患者被考虑:一名患者(患者#29)，其复发时为CD19-，另外两名患者(患者#104和#105)在复发时为CD19+。有关患者的列表，其分类和两个时间点的白血病百分比，请参见下表30。
表30
对CD19基因的RNAseq数据的分析显示出几个值得注意的观察结果。
在CD19的外显子2中发现三次插入。插入仅在患者#29的复发样本中发现。在其他两名患者中，并且在患者#29的基线时，没有观察到支持任何三种插入或CD19外显子2中任何其他插入的读数。基因组位置和实际插入列于下表31。
表31.
三个插入的长度分别为1,1和4个碱基长度，并且可能是所有移码插入。所有三个插入导致外显子2中的过早终止密码子(对于插入1和2，新的终止密码子发生在ch16:28943752和插入3在ch16:28943887)。下面的表32列出了支持插入和野生型以及相关百分比的读数。最普遍的插入是“插入3”，其为4碱基插入并发生此外，在跨越多于一个插入的15个配对读数中，配对读数中没有一个包含多于一个插入，表明插入是互斥的。
表32.
样品 Ins1(Ins,wt) Ins2(Ins,wt) Ins3(Ins,wt)
29B 0,62 0,62 0,50
29R 21,308 4,327 67,151
104B 0,69 0,69 0,79
104R 0,392 0,398 0,413
105B 0,42 0,42 0,63
105R 0,184 0,185 0,212
在表中，“样品”列出了患者编号，接着是“B”表示基线样本，或“R”表示复发时取的样。标记为Ins1的列表示显示Ins1(左数)与该位置的野生型序列(右数)的读数数目；标记为Ins2的列表示显示Ins2(左数)与该位置的野生型序列(右数)的读数数目；并且标记的Ins3表示显示Ins3(左数)与该位置的野生型序列(右数)的读数数目。该表显示只有患者29显示这3次插入，并且仅在复发时才观察到插入。这些结果表明CD19的外显子2中的插入导致一些患者中的抗性。
该工作确定了B-ALL中CTL019治疗的抗性机制，即CD19的外显子2中的插入，肿瘤细胞通过该插入变成CD19-并且对CTL019治疗具有抗性。该观察结果支持CTL019与针对CD19以外的靶，例如CD20，CD22和ROR1的CAR的组合策略。
实施例14:复发性ALL癌症患者中B细胞抗原的表达
在以前用CAR疗法以外的癌症疗法治疗，即未用任何CAR疗法治疗的复发性急性淋巴性白血病(ALL)癌症患者中确定的各种B细胞抗原的表达。
方法
获得样品作为未鉴定的原发人ALL骨髓(BM)和外周血(PB)样本。抗人抗体购自Abcam，Biolegend，Invitrogen，eBioscience或Becton Dickinson。通过Ficoll分离分离单核细胞，在补充有2％胎牛血清的PBS中洗涤一次，并在室温下染色15分钟。对于细胞数量定量，根据制造商的说明书使用Countbright(Invitrogen)珠。在所有分析中，感兴趣的群体基于正向和侧向散射特征门控，然后进行单峰门控，并使用Live Dead Aqua(Invitrogen)门控活的细胞。时间门控被纳入质量控制。对于动物研究，加入鼠抗CD45抗体(Biolegend)以筛选出鼠白细胞。通过用克隆HIB22(Biolegend)的抗CD22单克隆抗体染色检测CD22的表面表达。通过用来自克隆6H6(ebioscience)的抗CD123单克隆抗体染色检测CD123的表面表达。通过用来自克隆IM2234U(Beckman Coulter)的抗FLT3单克隆抗体染色检测FLT3的表面表达。通过用来自克隆2H6(Abcam)的抗ROR1单克隆抗体染色检测ROR1的表面表达。通过用来自克隆CB3-1(Biolegend)的抗CD79b单克隆抗体染色检测CD79b的表面表达。通过用来自克隆HM47(R&D Systems)的抗CD79a单克隆抗体染色检测CD79a的表面表达。通过用来自克隆eBioCV-CALLA(ebioscience)的抗CD10单克隆抗体染色来检测CD10的表面表达。通过用克来自隆561的抗CD34单克隆抗体(Biolegend)染色来检测CD34的表面表达。通过用来自克隆L27(BD Biosciences)的抗CD20单克隆抗体染色来检测CD20的表面表达。根据标准程序(http://static.abdserotec.com/uploads/ifu/fcsc815b.pdf)，使用QuantumTM Simply(Bangs Lab.,Inc)进行抗体结合能力(ABC)单位中的细胞抗原表达的定量。在四激光Fortessa-LSR细胞仪(Becton-Dickinson)上进行流式细胞术，并用FlowJo X10.0.7r2(Tree Star)进行分析。
结果
在复发的ALL患者中，表达了几种B细胞抗原，包括CD19，CD22，CD123，FLT-3，CD10和CD34。参见图22。
为了鉴定潜在的额外的B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)靶标，通过多参数流式细胞术筛选来自16r/r患者的样品的以下标记:CD19(16pts),CD22(16pts),CD123(16pts),FLT-3(9pts),ROR-1(3pts),CD79b(15pts),CD179b(8pts),CD79a(16pts),CD10(16pts),CD34(16pts),和CD20(16pts)。CD22和CD123在r/r ALL患者的母细胞中高水平(>60％)并均匀表达(条线表示中位数％表达，分别为99.50％,98.80％,95.70％,72.00％,47.00％,15.00％,13.45％,4.200％,98.00％,87.65％,和7.00％)。(图22)。
实施例15:B细胞抗原在复发性CD19阴性癌症患者中的表达
在先前用CD19 CAR治疗并且具有CD19阴性肿瘤复发的患者中测定了多种B细胞抗原的表达。根据实施例14的方法使用流式细胞术，使用图23所示的门控策略以确定抗原的表达。
在CART19治疗之前(基线)和之后(CD19阴性复发)，从6例复发CD19阴性白血病的患者的BM和PB样本中分析CD22和CD123的表达。在所有分析中，感兴趣的群体基于正向和侧向散射特征进行门控，然后进行单峰门控，并使用Live Dead Aqua(Invitrogen)门控活细胞。时间门控被纳入质量控制。门控策略包括:时间门控→SSC低→单峰→活的→CD45dim→CD10+。
结果
几乎所有成为CD19阴性的患者仍然是CD22阳性和CD-123阳性的。参见图24和图25。结果总结在图26中，并证明虽然CD19 CART治疗导致CD19表达的损失(如通过流式细胞术测量)，CD22和CD123表达仍然很高。
实施例16:在难治性B细胞恶性肿瘤中用自体CD22重定向的CART细胞进行扩展获取治疗
复发/难治(r/r)B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)与儿科和成人患者的预后差相关。靶向白血病母细胞上CD19的新疗法，如抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CART19，CTL019)或双特异性抗CD19/CD3抗体(blinatumomab)在该群体中诱导显著的应答。然而，在CART19或blinatumomab治疗后5-10％的患者中报道了CD19阴性复发。
方法
细胞系和原代样品
将ALL细胞系NALM-6的细胞用补充有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的RPMI培养基保持培养。对于一些实验，用萤光素酶/GFP+转导NALM-6细胞，然后分选以获得>99％的阳性群体。急性骨髓性白血病细胞系MOLM-14或K562和T-ALL细胞系JURKAT被用作CD22阴性对照。
获得了在CART-19治疗后复发的两名患者的未确定的原代人ALL骨髓(BM)和外周血(PB)样本和BM和PB样品。在基线(IR82，CART19治疗前)和复发(IR243)时收集用CART-19治疗且具有CD19阴性白血病复发的患者的全部母细胞。来自这两个时间点的原代母细胞在NSG小鼠体内扩增，并在几次传代后用萤光素酶/GFP转导(Barrett，D et al.(2011)Blood118(15):e112-117)。对于所有功能研究，ALL细胞在分析前至少解冻12小时，并在37℃下静置。
CAR构建体和CAR T细胞的产生
使用美国专利申请号2011/0020344A1中描述的抗CD22单链可变片段轻(L)和重(H)链序列产生针对CD22的嵌合抗原受体(CAR)，所述专利申请描述了抗-CD22全人单克隆抗体m971的产生(Xiao,X et al.(2009)MAbs.1(3):297-303)。序列被密码子优化，并且使用两个不同的可变链取向(H至L和L至H)产生两种不同的CAR构建体。然后将这两种抗CD22scFv克隆到鼠CAR19骨架(CD8铰链，41BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域)中，随后在pTRPE慢病毒载体中克隆。如前所述产生鼠CAR19(Milone,M et al.(2009)Moleculartherapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 17(8):1453-1464)。
如前所述(Gill,S et al.(2014)Blood 123(15):2343-2354)进行CAR阳性T细胞的产生。正常供体CD4阳性和CD8阳性T细胞以1e6/ml的浓度接种，CD4:CD8比为1:1，并在X-vivo 15培养基(Lonza，04-418Q)，人血清AB5％(Gemini，100-512)，青霉素/链霉素(Gibco，15070063)和Glutamax(Gibco，35050061)中扩增，使用在培养第1天加入的抗CD3/CD28Dynabeads(Life Technologies，11161D)并在第6天除去。T细胞用携带CAR22，CAR19或在第2天转染的模拟物的慢病毒转导。将T细胞在培养物中扩增10-15天，当中值细胞体积低于300fl时收获。然后将T细胞在FBS10％DMSO中冷冻保存以用于将来的实验。在所有实验之前，将T细胞解冻并在37℃下静置过夜
多参数流式细胞术分析
抗人抗体购自Biolegend，eBioscience或Becton Dickinson。从体外培养物或动物中分离细胞，在补充有2％胎牛血清的PBS中洗涤一次，并在室温下染色15分钟。对于细胞数量定量，根据制造商的说明书使用Countbright(Invitrogen)珠。在所有分析中，感兴趣的人群基于正向和侧向散射特征门控，然后进行单峰门控，并使用Live Dead Aqua(Invitrogen)门控活细胞。时间门控被纳入质量控制。对于动物研究，加入鼠抗CD45抗体(Biolegend)以筛选出鼠白细胞。用CD22-His蛋白(11958-H08H-50)和抗-Ig-APC单克隆抗体(IC050A)染色检测抗CD22 CAR的表面表达。如前所述检测CAR19(Kalos,M et al.(2011)Science translational medicine3(95):95ra73)。根据标准程序(http://static.abdserotec.com/uploads/ifu/fcsc815b.pdf)，使用QuantumTM Simply(Bangs Lab.,Inc)在NALM-6和对照上进行抗体结合能力(ABC)单位中CD19和CD22细胞抗原表达的定量。在四激光Fortessa-LSR细胞仪(Becton-Dickinson)上进行流式细胞术，并用FlowJo X 10.0.7r2(Tree Star)进行分析。
脱粒测定
如前所述进行脱粒测定。T细胞与靶细胞以1:5的比例在T细胞培养基中一起温育。加入抗CD107a-PECY7(Biolengend)，抗CD28(BD Biosciences)，抗CD49d(BD Biosciences)抗体和莫能菌素(BD Biosciences)，开始时间后共培养30分钟。4小时后，收获细胞并染色CAR表达，CD3，CD8和Live Dead aqua染色(Invitrogen)。将细胞固定并透化(InvitrogenFix/Perm缓冲液)，然后进行细胞内染色以检测多种细胞因子(IFN,TNFa,IL-2,GM-CSF,MIP1b)。
增殖测定
洗涤T细胞并以1x107/ml重悬于100μl PBS中，并在37℃下用100μl CFSE 2.5μM(Invitrogen)染色5分钟。然后将反应用冷培养基淬灭，并将细胞洗涤三次。以100Gy的剂量照射靶标。T细胞与照射的靶细胞以1:1的比例温育120小时，在24小时时加入培养基。然后收集细胞，染色CD3，CAR和Live Dead aqua(Invitrogen)，并加入Countbright珠(Invitrogen)后进行流式细胞术分析进行绝对定量。
细胞毒性测定
萤光素酶/GFP+NALM-6细胞或原代ALL样品用于如前所述的细胞毒性测定。4靶标以指示的比例与效应T细胞一起培养4或16小时。通过在Xenogen IVIS-200Spectrum相机上的生物发光成像或通过流式细胞术计算杀伤。对于后者，收获细胞，并在分析前加入Countbright珠和7-AAD(Invitrogen)。残留活靶细胞为CFSE阳性7-AAD阴性。
细胞因子测量
将效应细胞和靶细胞以1:1的比例在T细胞培养基中共温育24小时。收集上清液并根据制造商的方案(Invitrogen)(Kalos,M et al.(2011))，通过30路Luminex阵列(Luminex Corp,FLEXMAP 3D)进行分析。
体内实验
得到NOD-SCID-γ链-/-(NSG)小鼠。所有实验均经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。在结果部分详细讨论了所使用的异种移植模型的模式。将细胞(NALM-6或T细胞)以200μl的PBS中指定的浓度注射到小鼠的尾静脉。使用Xenogen IVIS-200 Spectrum相机进行生物发光成像，并使用LivingImage软件v.4.3.1(Caliper LifeSciences).进行分析。动物在实验结束时或需要时根据IACUC政策被安乐死。
免疫组织化学
进行28种人正常组织(脂肪，肾上腺，阑尾，小脑，子宫颈，结肠，子宫内膜，食道，脂肪，心脏，肾脏，肝脏，淋巴结，肺，肌肉，卵巢，胰腺，甲状旁腺，胎盘，前列腺，唾液腺，脊髓，脾，胃，睾丸，胸腺，甲状腺，扁桃体)的组织微阵列(TMA)，以评估CD22(一式三份)的肿瘤外(off-tumor)表达。使用Bond Polymer Refine Detection System在Leica Bond-III仪器上进行福尔马林固定石蜡包埋组织的免疫组织化学(IHC)染色。未稀释使用抗CD22抗体(克隆FPC1；Leica PA0249)。用ER2溶液(Leica Microsystems AR9640)进行热诱导的表位提取20分钟。使用Aperio ScanScopeTM数字获取图像。
基因表达谱
使用BioGPS.org网站分析可公开获取的RNA表达数据库(GeneAtlas U133A，gc)的CD22表达。报道了75种不同的人正常细胞类型和7种肿瘤细胞系的中值CD22RNA表达(参见图39)。
51-铬释放测定
为了评估可能的肿瘤外CART22毒性，使用作为靶标的正常人组织
(CD34+，人神经元，人神经元祖细胞，角质形成细胞)和K562或NALM-6作为对照进行铬释放测定。靶细胞与51Cr 50μCi/0.5e6细胞在37℃下温育1-2小时。洗涤细胞并以不同的E:T比率与效应细胞一式三份铺板。温育4小时后，将来自每个孔的等分试样置于读数板中并干燥过夜。第二天，使用1450Microbeta Plus液体闪烁计数器定量铬释放。
结果
表33:供体和对CART22评估进行的各项实验的总结。
为了鉴定潜在的B-ALL靶标，通过多参数流式细胞术筛选来自16位r/r患者和4名患有CD19阴性疾病的CART19治疗后复发患者的样品的B细胞标记物CD22。CD22在11/15r/rALL患者的母细胞中高水平(>60％)并均匀表达(图27A)。CD22在CD19阴性白血病复发的4/4例患者中在CART19治疗前(基线)和治疗后(CD19-阴性复发)(显示2pts)均为阳性(图27B)。(门控策略:SSC低→单峰→活的→CD45dim)。
使用不同链方向(H至L和L至H)生成的CAR22构建体的方案如图28A所示。抗CD22scFv(m971)经密码子优化并克隆在含有CD8铰链，41-BB共刺激和CD3ζ信号传导结构域的鼠CAR19载体中。NALM6ALL细胞系上CD19，CD22和同种型对照的表达显示为平均荧光强度(MFI)(图28B)和抗体结合能力(ABC)(图28C)。本文提出的结果表明，在NALM-6细胞中，CD19的表达高于CD22。然而，在大多数原代ALL样品中，CD19和CD22表达是相似的(参见图28A)。
进行用于产生CART22和CART19(连同未转导细胞(UTD))的正常供体T细胞扩增。相对于培养天数测量群体倍增时间和T细胞体积。在扩增结束时(培养第11天)，CART22和对照T细胞达到约4.5群体倍增(PD)，与CART19或UTD细胞相比没有显著性差异(图29A)。在培养的第6天，峰值体积约为450fl，而在随后的天数中，当收获细胞并冷冻时，体积下降至300fl(图29B)。观察到与CART19或UTD无显著差异。通过流式细胞术在扩增的第11天观察到在CD4阳性和CD8阳性T细胞上的CAR表达(图29C)。CAR表达的门控是基于UTD。(门控策略:FSS vsSSC淋巴细胞→单峰→活的→CD3+)。
用细胞质内细胞因子产生进行CD107a脱粒测定。CART19，CART22HtoL和LtoH与不同的靶标(单独的，PMA/IONOMYCIN,MOLM-14和NALM-6)共培养。当与ALL细胞系(NALM-6)共培养，但不与阴性对照共培养时，CART19和CART22HtoL显示出高水平的CD107a脱粒，IL-2，IFNg和TNFa产生(图30)。UTD和CART22 LtoH不显示脱粒或细胞因子产生(图30)。(门控策略:FSS vs SSC淋巴细胞→单峰→活的→CD3+)。
在基于萤光素酶的杀伤测定中，共培养24小时时,CART22和CART19HtoL但不是UTD能裂解NALM-6细胞(图31)。观察到细胞毒性活性与E:T比例之间的直接相关性，在2:1:E:T比例下具有更好的抗白血病作用(CART19和CART22为78％和75％的杀伤率)。
在基于CFSE的增殖测定中，CART22和CART19与ALL细胞系NALM-6共培养5天导致显著的T细胞增殖(分别为94％和92.9％)。还显示了对照(TCM＝仅培养基，P-I＝PMA/离子霉素，MOLM-14)(图32A)。显示CART19和CART22中CFSE稀释动力学的直方图表明大多数T细胞经历多次增殖循环(图32B)。(门控策略:FSS vs SSC淋巴细胞→单峰→活的→CD3+)。
将CART22，CART19和UTD细胞与不同的照射靶(单独的，PMA/离子霉素，MOLM-14和NALM-6)温育24小时。当与ALL细胞系NALM-6共培养时，仅CART22和CART19HtoL能够释放多种细胞因子(这里显示了IFNg，IL-2，GM-CSF，TNFa和MIP1b)(图33)。
当患者CD19阴性疾病复发时，CART22，CART19和UTD细胞与在基线时和CART19治疗后来自ALL患者(CHP-959-101)的母细胞共温育4小时。测量脱粒。CART19和CART22都能够在基线时脱粒(当母细胞为CD19+和CD22+时)，但是在复发时，仅CART22脱粒(当疾病为CD19阴性时)(图34A)。在与复发时CHP101样品温育后，测量CD8阳性和CD8阴性CART19和CART22效应物中的CD107a脱粒。只有CART22在CD8和CD4T细胞中显示脱粒(图34B)。(门控策略:FSSvs SSC淋巴细胞→单峰→活的→CD3+)。
针对NALM-6的体内CART22效力如下评估:1ml NALM-6萤光素酶+细胞/小鼠静脉内注射在NSG小鼠中。6天后，通过生物发光评估肿瘤植入。然后使小鼠随机接受未转导的T细胞或不同剂量的CART22(1.25百万至5百万总细胞/小鼠，具有75％CAR表达)。然后监测小鼠的肿瘤负荷，PB T细胞扩增和存活(图35A)。通过生物发光(BLI)测量肿瘤负荷，观察剂量相关的抗白血病应答。接受5e6CART22细胞的小鼠显示更好的肿瘤控制(图35B)。与UTD治疗的小鼠相比，CART22治疗的小鼠显示出统计学上显著更好的总体存活(OS)。对于OS也存在较高剂量的CART22和更好的OS之间显著的相关性(图35C)。每周通过眶后取血监测T细胞体内扩增。T细胞输注后一周，接受较高剂量CART22的小鼠显示出更好的CART扩增(中位数为12T细胞/μl)(图35D)。
针对NALM-6的CART22和CART19之间的体内比较如下进行评价:将1百万NALM-6萤光素酶+细胞/小鼠静脉内注射在NSG小鼠中。6天后，通过生物发光评估肿瘤植入。然后将小鼠随机分配以接受未转导的T细胞，CART19或CART22(500万总细胞，75％CAR表达)。然后监测小鼠的肿瘤负荷，PB T细胞扩增和存活(图36A)。通过生物发光(BLI)测量肿瘤负荷，并在CART22和CART19治疗的小鼠中观察到抗白血病应答，而UTD小鼠快速进展(图36B)。与CART22相比，CART19治疗的小鼠显示出更好的总生存期(OS)，这可能是由于NALM-6(CD19>>CD22)中不同的靶标表达(图36C)。
CART22和CART19在原发ALL的模型中进行体内比较。原发性ALL患者(JH331)的母细胞在体内传代并用萤光素酶转导以追踪肿瘤负担。在NSG小鼠中体内注射1百万JH331萤光素酶+细胞/小鼠。14天后，通过生物发光评估肿瘤植入。然后将小鼠随机分配以接受未转导的T细胞，CART19或CART22(500万总细胞，75％CAR表达)。然后监测小鼠的肿瘤负荷，PB T细胞扩增和存活(图37A)。通过生物发光(BLI)测量肿瘤负担，并观察到CART22和CART19治疗的小鼠中的抗白血病应答，而用UTD细胞治疗的小鼠快速进展(图37B)。
通过免疫组织化学染色，对28个人正常组织进行CD22表达的组织微阵列。淋巴器官对CD22表达(扁桃体，淋巴结，脾和胸腺)呈阳性(图38A)。所有非淋巴器官均未显示出CD22的表达(图38B)。在多个组织中观察到CD22阳性驻留B细胞(图38C)。
在B细胞，扁桃体和淋巴结中高水平观察到CD22RNA表达，如GeneAtlas U133A的表达数据所示。B淋巴母细胞和白血病/淋巴瘤细胞系也是高度阳性的(图39)。
CART22和CART19但不是UTD细胞在CART22毒性的51-铬释放测定中触发ALL细胞系NALM-6的裂解(图40)。在任何正常组织(CD34+，人神经元祖细胞或神经元和角质形成细胞)或对照(K562细胞系)中均未观察到CART22的细胞毒性作用。
实施例17:抗CD123和抗CD19 CAR T细胞的组合用于治疗和预防抗原丧失复发
化疗难治性或复发性(r/r)B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)与预后不良相关，但如最近所证实的，对免疫系统仍然非常敏感。特别地，抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CART19，CTL019)和双特异性抗CD19/CD3抗体(blinatumomab)在该患者群体中产生45-90％的前所未有的完全应答率。两种方法重新引导自体T细胞识别表达CD19的细胞。Blinatumomab使用将抗CD19单链可变片段(scFv)与抗CD3scFv组合的双特异性构建体的连续长期输注；在CART19的情况下，T细胞被遗传修饰以表达抗CD19scFv，该抗CD19scFv与用内含共刺激结构域传导信号的T细胞受体融合。最近的一项研究表明，90％的用CTL019治疗的r/r B-ALL患者达到完全缓解(CR)，在6个月时总生存期(OS)为78％。在具有其他B细胞瘤如慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤的患者中用CART19也获得了的鼓舞人心的结果。
然而，用CART19或blinatumomab治疗的患者的一部分发生复发，并且这些复发的重要部分的特征在于CD19的丧失。在B-ALL中，在CART19或blinatumomab治疗后10-20％的患者中报道了CD19阴性复发，并没有在其他治疗方案中进行描述；blinatumomab后总共约有30％的复发和在CART19之后高达50％的复发是CD19阴性的。CD19是从B细胞发育到成熟B细胞的最早阶段表达的原型B细胞标记物。CD19在B细胞生物学中起重要作用，因为CD19缺陷型B细胞表现出选择性生长缺陷。因此，CD19的缺失在B-ALL中是非常不寻常的发现，并且在有效的CD19导向的免疫疗法时代之前，仅在罕见的患者进行报道。目前正在研究抗原丧失的可能机制，其最有可能是由这些强大的抗CD19剂对白血病亚克隆的选择性压力引起的。由于blinatumomab最近得到了FDA的批准和CTL019的突破状态，所以可能有增加数目的r/r B-ALL患者将用这些活性剂治疗。因此，需要新颖的有效策略，以便能够治疗那些在CART19或blinatumomab后会具有CD19阴性母细胞的复发患者。理想情况下，一种新方法不仅可以治疗患有主动抗原丢失复发的患者，但是如果预先使用可能会预防其发生。
白细胞介素-3受体α(或CD123)参与造血并已显示在几种血液肿瘤中表达，包括急性骨髓性白血病(AML)，急性淋巴性白血病(ALL)，浆细胞样树突状细胞肿瘤，毛细胞白血病，和霍奇金淋巴瘤。与谱系相关的表面抗原如CD33(骨髓)或CD19(B淋巴样)不同，CD123在造血祖细胞上分级表达，而在AML中CD123在白血病干细胞上表达，白血病干细胞参与在初次治疗后对化疗的抗性和复发。由于这些特征，CD123对靶向疗法产生了极大的兴趣，正在开发多种活性剂，如IL3-白喉毒素融合蛋白(SL-401，DT388IL3)，裸抗CD123单克隆抗体(CSL-360，CSL-362)，抗体-药物缀合物，双特异性抗体或CD3Fv-IL3融合构建体，以及最近的抗CD123嵌合抗原受体T细胞。其中一些方法目前正在临床试验中得到验证，并且将在未来几年内在临床中进一步测试。靶向具有嵌合抗原受体T细胞(CART123)的CD123可导致人类原代AML异种移植物的深层和长期应答，并可建立抗白血病T细胞记忆。这里，CD123在CD19导向治疗后发生的CD19阴性B-ALL复发中表达，并且与CART19(CTL019)组合的CAR-123T细胞是治疗和预防B-ALL异种移植物中抗原丢失复发的有效疗法。
材料和方法
细胞系和原代样品。细胞系最初获自ATCC(Manassas，VA)(K-562)或DSMZ(德国不伦瑞克)(MOLM-14和NALM-6)。测试所有细胞系是否存在支原体污染(MycoAlertTMMycoplasma Detection Kit,LT07-318,Lonza,Basel,Switzerland)。对于一些实验，用萤火虫萤光素酶/eGFP转导细胞系，然后分选以获得>99％的阳性群体。萤光素酶阳性K-562细胞系也用截短的CD19或截短的CD123转导以获得不表达它们，仅表达CD19或仅CD123的细胞系。如相关图所示，使用MOLM-14和K562作为对照。使用补充有10％胎牛血清(FBS，Gemini，100-106，West Sacramento，CA)和50UI/ml青霉素/链霉素(Gibco，LifeTechnologies，15070-063)的RPMI培养基1640(Gibco，11875-085，LifeTechnologies，Grand Island，NY)将细胞系维持在培养物中。根据机构评估委员会(IRB)协议从宾夕法尼亚大学/费城儿童医院的临床实践中获得了去鉴定的原代人ALL骨髓(BM)和外周血(PB)样本，购自宾夕法尼亚大学的干细胞和异种移植中心或目前CTL019临床试验的研究样品(宾夕法尼亚大学的翻译和相关研究实验室)。对于所有功能研究，将原代细胞在实验前至少12小时解冻并在37℃下静置。
原代B-ALL母细胞的体内扩增。D.M.Barrett,A.E.Seif,C.Carpenito,D.T.Teachey,J.D.Fish,C.H.June,S.A.Grupp,G.S.Reid,Noninvasive bioluminescentimaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia:a strategy forpreclinical modeling.Blood 118,e112-117(2011)中公开了方法。
荧光原位杂交(FISH)和免疫组织化学。FISH分析和免疫组织化学按照标准方法进行并且如所述。(M.A.Belaud-Rotureau,M.Parrens,P.Dubus,J.C.Garroste,A.deMascarel,J.P.Merlio,A comparative analysis of FISH,RT-PCR,PCR,andimmunohistochemistry for the diagnosis of mantle cell lymphomas.Modernpathology:an official journal of the United States and Canadian Academy ofPathology,Inc 15,517-525(2002))。FISH分析按照标准方法进行。简言之，将收获的ALL细胞悬浮在固定剂(乙酸和甲醇)中，沉积在载玻片上，并让其干燥。将双色基因融合探针BCR/ABL(Abbott Molecular)应用于杂交缓冲溶液中。将载玻片盖上盖玻片，密封，并在37℃在HYBrite室内放置6小时。在去除密封剂和盖玻片之后，将载玻片洗涤两次，印迹，干燥并用DAPI复染色。在荧光显微镜下检查载玻片，每个样品中评估最少200个细胞核。
CAR构建体和CAR T细胞的产生。如前所述产生鼠抗CD19嵌合抗原受体(CD8铰链，4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域)。(Milone,et al.,Molecular therapy:thejournal of the American Society of Gene Therapy 17,1453-1464(2009)and Imai,etal.,Leukemia 18,676-684(2004))。这是目前在宾夕法尼亚大学CTL019临床试验中使用的相同构建体。对于CAR123scFv，使用抗CD123(1172构建体(SEQ ID NO:707，并且如PCT/US2014/017328中所述))和CAR19的相同骨架构建体。如前所述进行CAR表达T细胞的产生(Gill,et al.,Blood 123,2343-2354(2014))。正常供体CD4和CD8T细胞或PB单核细胞(PBMC)从宾夕法尼亚大学的人类免疫学中心获得。T细胞以1x106/ml，CD4:CD8比为1:1平板接种，并在补充有人AB血清5％(Gemini,100-512),青霉素/链霉素(Gibco，15070063)和Glutamax(Gibco，35050061)的X-vivo 15培养基(Lonza，04-418Q)中扩增，在培养的第1天加入抗CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies，11161D)，在第6天取出。在第2天用慢病毒转导T细胞。在培养物中扩增T细胞8-15天，当中值细胞体积低于300fl时收获。然后将T细胞用10％DMSO冷冻保存在FBS中，以备将来实验。在所有实验前，将T细胞解冻并在37℃下静置过夜。
多参数流式细胞术。如前所述进行流式细胞术(Kenderian,et al.,Leukemia,(2015))。抗人抗体购自Biolegend，eBioscience或Becton Dickinson。从体外培养物或动物中分离细胞，在补充有2％胎牛血清的PBS中洗涤一次，并在室温下染色15分钟。对于细胞数量定量，根据制造商的说明书使用Countbright(Invitrogen)珠。在所有分析中，感兴趣的群体基于正向和侧向散射特征门控，然后进行单峰门控，并且使用Live Dead FixableAqua(Invitrogen)门控活细胞。时间门控被纳入质量控制。使用抗独特型抗体，如前所述检测CAR19的表面表达。使用山羊抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)或CD123-Fc/His(SinoBiologicals)和抗His-APC(R&D)或PE(AbCam)进行CAR123的检测。在四激光Fortessa-LSRII细胞仪(Becton-Dickinson)上进行流式细胞术，并用FlowJo X 10.0.7r2(Tree Star)进行分析。
体外T细胞效应子功能测定。如前所述进行脱粒，CFSE增殖，细胞毒性测定和细胞因子测量。(Gill,et al.,Blood 123,2343-2354(2014)和Kalos,et al.,Sciencetranslational medicine 3,95ra73(2011))。
脱粒测定。简言之，T细胞与靶细胞以1:5的比例在T细胞培养基中温育。将抗CD107a-PECY7(Biolegend)，抗CD28(BD Biosciences)，抗CD49d(BD Biosciences)抗体和莫能菌素(BD Biosciences)加入到共培养物中。4小时后，收获细胞并染色CAR表达，进行CD3，CD8和Live Dead aqua染色(Invitrogen)。将细胞固定并透化(Invitrogen Fix/Perm缓冲液)，然后进行细胞内染色以检测多种细胞因子(IFN,TNFα,IL-2,GM-CSF,MIP1β)。
增殖测定。将T细胞洗涤并以1x107/ml重悬于100ul PBS中，并在37℃下用100μlCFSE 2.5μM(Invitrogen)染色5分钟。然后用冷培养基淬灭反应，并将细胞洗涤三次。以100Gy的剂量照射靶标。T细胞以1:1的比例与照射的靶细胞温育120小时，在24小时时加入培养基。然后收集细胞，染色CD3，CAR和Live Dead aqua(Invitrogen)，并在加入Countbright珠(Invitrogen)后进行流式细胞术分析用于绝对定量。
细胞毒性测定。萤光素酶/eGFP+细胞系用于细胞毒性测定，如前所述。简言之，将靶标以指示的比例与效应T细胞一起温育24小时。在Xenogen IVIS-200Spectrum相机上通过生物发光成像计算杀伤。
细胞因子测量。效应细胞和靶细胞在T细胞培养基中以1:1的比例共温育24小时。收获上清液并根据制造商的方案(Invitrogen)通过30-plex Luminex阵列(Luminex Corp，FLEXMAP 3D)进行分析。
动物实验。如前所述进行体内实验。(Kenderian,et al.,Leukemia,(2015))。所用异种移植模型的方案在相关图，结果中详细讨论。最初从Jackson Laboratories获得的NOD-SCID-γ链-/-(NSG)购自宾夕法尼亚大学的干细胞和异种移植中心。所有实验均根据Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准的方案(#803230)进行，其按照NIH“实验动物护理和使用指南”(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)。将细胞(白血病细胞系或T细胞)以200μl的PBS中指定的浓度注射到小鼠的尾静脉。使用Xenogen IVIS-200Spectrum相机进行生物发光成像，并使用LivingImage软件v.4.3.1(Caliper LifeSciences)进行分析。动物在实验结束时或者根据IACUC方案符合预先指定的终点时被安乐死。
多光子显微术。麻醉小鼠并保持在37℃的核心温度。去除头皮并固定头骨后，对骨髓成像。使用配备有皮秒激光(Coherent)的Leica SP5双光子显微镜系统(LeicaMicrosystems)进行成像。每次成像采集持续20分钟，然后评估小鼠镇静。使用850nm的激光激发CellTrace Violet，GFP和CellTrace Orange(或TRITC)。使用20倍的水浸透镜获得图像。所得图像用Volocity软件(PerkinElmer)进行分析。
统计分析。所有统计数据都是使用GraphPad Prism 6for Windows 6.04版(LaJolla，CA)进行的。斯氏t检验用于比较两组；在比较多组的分析中，使用Holm-Sida校正进行多重比较的单因素方差分析(ANOVA)。当在多个时间点/比例比较多个组时，使用每个时间点/比例的斯氏t检验或ANOVA。使用对数秩检验比较存活曲线。在图中，星号用于表示p值(*＝<0.05,**＝<0.01,*＊*＝<0.001,*＊＊*＝<0.0001)，“ns”表示“不显著”(p>0.05)。每个实验的统计数据的更多细节列在图例中。
结果
CD123在B-ALL，白血病干细胞和CD19阴性复发中表达
为了评估CD123在B细胞急性淋巴细胞性白血病中的表达，分析了来自成人和儿科ALL患者的42份样品，其中包括参加了我们目前的CTL019临床试验的14名受试者。如图49A，49B和49A所示，CD123在大多数ALL母细胞的表面上高水平并且均匀地表达，代表了靶向疗法的理想候选者。此外，还发现CD123在推定的白血病干细胞(LSC)中表达，鉴定为CD34+CD38-(图49C)。在一些B-ALL患者中可以鉴定CD19阴性母细胞的小亚组，如果它们含有具有恶性表型的细胞，则这些细胞可能有助于抗原损失复发。为了评估CD19阴性亚组中疾病的存在，对来自Philadelphia染色体阳性B-ALL大量群体的CD19-CD123+细胞进行分选(CD45dim，门控策略如图56B所示)。发现这些细胞对于BCR-ABL易位是克隆的，尽管频率低于CD19+母细胞(图49D)。这一发现表明，单独靶向CD19在一些情况下可能导致从CD19-CD123+细胞衍生的亚克隆复发。此外，这一发现表明靶向CD123可以通过消除LSC和可能的CD19阴性白血病克隆导致更深的应答。
最后也在CTL019后复发的具有CD19丢失的B-ALL患者的样品中评估CD123的表达。重要的是，与完全丢失CD19相反，大多数患者在复发时保持CD123表达(图49E，49F和56C)。这些研究结果表明，CD123代表着靶向CART19或blinatumomab后发生的CD19阴性ALL细胞的理想标记物。
抗CD123嵌合抗原受体T细胞在体外和体内对人B-ALL具有活性
产生抗CD123嵌合抗原受体T细胞(CART123)，其被慢病毒转导并用抗CD3/CD28磁珠扩增。如本文所述评估CART123对B急性成淋巴细胞白血病的体外和体内活性。
使用为CD19++和CD123+的B-ALL细胞系NALM-6(图50A和57A)和原代B-ALL样品。当T细胞与NALM-6或原代ALL共同培养时，CART123和CART19之间的头对头体外比较揭示了CD107a的脱粒的相似速率(图50B)。CART123还能以剂量依赖的方式杀死NALM-6细胞，具有与CART19相似的功效(图50C)。在更长期的实验中，当与NALM-6或原代ALL共同培养3-5天时，CART123增殖(图50D和50E)并产生多种细胞因子(图50F)。这些结果表明CART123对多个B-ALL靶标显示与CART-19相当的效力。
为了在体内模型中确认这些数据，使用了原代ALL模型。在该模型中，从B-ALL患者获得的原代母细胞在NOD-SCID-γ链敲除(NSG)小鼠中传代，并用含有eGFP和扣甲萤光素酶(GFP/Luc)的报道构建体转导。NSG小鼠静脉内注射GFP/Luc+原代ALL母细胞(JH331，CD19+，CD123+，添加表型)，并且在移植后，将小鼠随机分配以接受CART19，CART123或对照未转导的T细胞(UTD)。用对照T细胞治疗的小鼠由于疾病快速死亡，而用CART19或CART123治疗的小鼠显示肿瘤根除和长期存活(图51A和51B)。与对照T细胞相比，CAR123T细胞在小鼠的外周血(PB)中显著扩增，并表达高水平的CAR123(图51C)。CART123的抗白血病活性是特异性的，并且基于在使用CD123-CD19+白血病(AV576)移植小鼠时，在母细胞表面中CD123的识别，只有CART19显示抗白血病活性，而CART123与对照UTD相比没有效果(图57B和57C)。
为了检测CART123剂量与抗肿瘤活性的可能相关性，开发了携带高白血病负担小鼠(使用NALM-6细胞系)的体内模型。在该模型中，标准剂量的CART123(2百万CAR+细胞)不能清除肿瘤。这些小鼠注射不同剂量的CART123(1.25,2和500万CAR+细胞)，并观察剂量相关的抗白血病活性(图57D)。
CART123但不是CART19在抗原丢失复发的新型临床前模型中具有高度活性
为了测试靶向CD19阴性复发的新策略，开发了抗原丢失复发的新型体内模型。在基线时(CTL019治疗前)(此时疾病为CD19++和CD123+)，以及CTL019后复发(此时患者发生了CD19阴性疾病)时，收集了从登记在我们的CTL019临床试验中的一名患者(CHP101)获得的B细胞母细胞(CD123仍然表达，图58A)。然后将母细胞在NSG小鼠中扩增，并对于基线疾病(CD19+)用扣甲绿色萤光素酶(CBG)转导或对于复发(CD19-)用扣甲红色萤光素酶(CBR)转导(见方法部分)。重要的是，在体内扩增期间，母细胞保留除CD19之外的B细胞身份的标志物(数据未显示)。在第一个实验中，NSG小鼠用基线疾病CD19+(CBG，绿色)或CD19阴性(CBR，红色)白血病移植。两组随机接受CART19或对照T细胞(UTD)(图52A)。如图52B所示，在两组中，用UTD治疗的小鼠显示基线和复发疾病的快速进展(独立地通过CD19的表达)。相反，在用CART19治疗的小鼠组中，只有用基线疾病(CD19阳性)移植的小鼠对CART19治疗应答，而用复发性疾病(CD19阴性)移植的小鼠显示出预期的不应性。这也在体外在CD107a脱粒测定中再现(图58B)。为了模拟体内表达CD19的不同克隆的存在或不存在，NSG小鼠用基线和复发疾病的1:1混合物植入；在第8天，将小鼠随机分配以接受CART19或对照T细胞。用生物发光成像监测肿瘤负担，所述生物发光成像可以区分CD19+(CBG，绿色)/CD19-(CBR，红色)白血病体内相对生长。如图52C所示，在接受UTD的小鼠中，在第6天存在的CD19+(绿色)和CD19-(红色)白血病在第11天类似地增加，而在用CART19治疗的小鼠中，基线疾病(绿色)被完全清除，而复发性疾病(红色)显示出进展。
原发CD19阴性B-ALL和CART19失败的该独特异种移植模型用于评估CART123在抗原丢失复发的治疗中的作用。将原代CD19阴性母细胞(CBR阳性)注射入NSG小鼠(图52D)，并将小鼠随机化以接受CART19，CART123或对照T细胞。CART19和对照T细胞显示完全缺乏抗肿瘤活性，而CART123导致完全根除疾病和这些小鼠中长期存活(图52E和52F)。事实上，在CART19难治性原发B-ALL的临床前模型中，新型CART123能够根除疾病并赋予长期存活。
为了在单个细胞水平上理解CART19和CART123在该体内模型中的不同行为，通过注射差异标记的CART19(CellTrace Violet,blue)和CART123(CellTracker Orange或TRITC，红色)给携带CD19阳性原发性母细胞(GFP)或CD19阴性复发性母细胞(GFP)的小鼠，并在注射后约24小时使用颅骨髓的活体双光子显微术追踪其行为(实验方案，图53A)，来进行一系列实验。这些研究表明，CART19和CART123被运输到含有白血病的骨髓空间，并且同源抗原的CART细胞识别与运动停滞相关。具体来说，在用基线CD19+CD123+白血病移植的小鼠中，发现62.9％+/-3.8的CART19和81.1％+/-1.2的CART123停滞于与母细胞相邻的圆形形态，而在复发的CD19-CD123+白血病移植的小鼠中，只有CART123细胞与肿瘤细胞相邻(CART123 80.9％±5.1对CART19 12.4％±2.2)(图53B和53C)。这些发现表明，在CD19阴性复发的ALL中，只有CART123能够与白血病细胞(GFP)建立生产性突触，从而降低其能动力，而CART19细胞在环境中持续取样和移动而不识别白血病母细胞。
CART123和CART19的组合能够防止CD19阴性复发
CART123被证明是在CAB19抗性的临床前模型中CD19导向疗法后发生的CD19阴性复发的治疗中有效的。然而，组合方法可以治疗活跃CD19阳性疾病，同时预防抗原丢失复发。为了测试这一假设，通过将原代CD19-和CD19+疾病一起注射入NSG小鼠来建模具有CD19阴性逃逸潜力的B-ALL的新出现的临床问题。然后将小鼠随机分配，以相同的T细胞总剂量接受对照T细胞(UTD)，CART19或CART19和CART123的组合(图54A)。如图54B所示，用对照T细胞治疗的小鼠具有两种白血病克隆的进展，CART19显示主要是CD19阴性疾病(红色)的快速进展。相反，用CART123和CART19组合治疗的小鼠显示出疾病的清除和改善的总生存期，如图54C所示。在实验结束时处死的小鼠的分析显示在合并的CART细胞组中没有残留白血病的证据。相比之下，CART19单一疗法后具有进行性疾病的小鼠保留了预期的CD19阴性表型(图54D)。
最后，用2种慢病毒转导T细胞，一种携带CAR19和另一种携带CAR123，以开发能够被CD19和/或CD123激活的CART。如图55A所示，检测到四种不同转导的T细胞亚组:CAR19和CAR123双阴性，CAR19单阳性，CAR123单阳性和双阳性CAR19/CAR123T细胞。对这4个亚组进行分类，并对K562-WT，K562CD19+或K562CD123+进行了功能和特异性检测。图55B显示CD107a脱粒测定的结果，其中单个阳性亚组应答其特异性靶标，而在表达CD19和CD123的K562存在下，仅双重阳性群体能够脱粒。此外，与相当数量的单刺激的CART细胞相比，双刺激的CART细胞对双阳性靶标表现出更强的细胞毒性，表明通过使用由两种不同抗原触发的CAR的功效的潜在增加(图55C)。
讨论
CD19导向的免疫疗法正在改变复发和难治性急性成淋巴细胞白血病治疗的范例。患有以前不幸的结果的患者现在具有实现完全应答和长期疾病缓解的现实潜力。然而，如在某些情况下所示，对于用其他形式的有效靶向疗法治疗的白血病，白血病细胞能够发展导致耐药性和复发的抗原丢失突变。在CART19的情况下，已经观察到两种主要的复发模式。由于持续性失败而早期丢失CART19的患者具有原始克隆复发的风险；确实，最小的残留疾病分析表明，可能需要1-6个月的持续CART活性来完全消除恶性肿瘤。相比之下，尽管CART19持续性也有约50％的复发，其特征是发生CD19阴性白血病。后一种观察结果表明CART19具有强大的选择性压力。值得注意的是，在blinatumomab疗法之后，也发生CD19阴性复发，尽管这些代表了该有争议的较不有效的疗法后少数的复发事件。CD19阴性疾病的发展有多种潜在的机制。其中之一是CD19阴性克隆的选择和相对生存优势，其以非常低的频率在基线存在，并且这最初被认为是导致CD19阴性复发的最可能的因素。最近其他机制，如CD19的剪接失调也被认为是重要的。在这里，首次显示B-ALL中罕见的CD19-ve母细胞可以包含在更常见的CD19阳性白血病母细胞中发现的特征性细胞遗传学异常，证实这是CD19阴性复发的潜在机制。我们通过阐明CD123+CD19-ve母细胞能够在免疫缺陷小鼠中植入证实了这些发现，表明CD123可能是B-ALL中白血病干细胞的标记物，如同在AML中一样。
这项研究的目的是定义新的策略来治疗CD19导向疗法后抗原丢失复发的患者。CD123在大多数B-ALL中高表达，特别是CD123在CD19阴性疾病复发的患者中保持表达。已经证明在CD19-CD123+群体中存在克隆性白血病细胞，这表明靶向CD123与CART19组合可增加根除亚克隆的可能性，所述亚克隆由于CART19压力下的选择性优势而可以增殖。CD123先前已被证实为AML中白血病干细胞的标志物。这表明CD123在ALL中在免疫表型限定的白血病干细胞(LSC)中表达，提高了靶向LSC上CD123可以促进ALL根除的可能性。
为了研究CART123在抗原丢失复发中的作用，从宾夕法尼亚大学/费城儿童医院的一项CTL019试验中登记的B-ALL患者(CHP101)的原代母细胞开发出CD19阴性复发的新型异种移植模型。该患者在基线时具有典型的CD19+CD123+表型，但随后用CART19治疗后复发CD19-CD123+疾病。使用该模型，证明CART123可以根除复发的疾病，并结合CART19可以预防抗原丢失复发。这是在临床相关的患者衍生模型中首次阐明双CART组合。此外，通过使用活体成像，显示CART细胞在静脉内注射后不到24小时内进入骨髓，搜索其靶标，并减缓以便与同源抗原携带细胞相互作用。此外，表明双重信号CART123/19比单独的CART或两个CAR的池更有效，与先前发表的结果一致。
以前，已经显示抗CD123嵌合抗原受体用于治疗急性骨髓性白血病的临床前疗效。CART123由于识别造血干细胞和祖细胞上的CD123而引起造血毒性，这是临床转换的潜在的主要挑战，因为严重的干细胞毒性可能导致永久性的重度骨髓抑制。假设为了尽量减少造血毒性，一种仅在CD19和CD123同时共同接合时才激活T细胞的新型构建体可以消除这种造血毒性。这里发现接受来自CD19识别的激活信号和来自CD123识别的刺激信号的CART细胞可以杀死B-ALL细胞，并且避免我们先前描述的深刻的造血毒性。虽然这个概念以前是使用CD19/PSMA识别的人造系统出版的，但这种临床相关的构建体代表了该领域的重大进步，具有相对明确的临床转换途径。值得注意的是，虽然这种双重CAR设计可能与毒性降低有关，但通过使CAR识别更多而不是较少地受限，可能解决不了抗原丢失复发的问题。然而，如果CD123的靶向成功地消除了ALL干细胞，那么这种方法既安全又有效。
总之，这里展示的是通过靶向CD123来治疗B-ALL的新颖有效的策略。这种方法是特别有吸引力的，因为CD123在一些B-ALL患者中罕见CD19阴性恶性细胞中表达，并且保留在CD19定向免疫治疗后发生的抗原丢失复发中。此外，CART19与CART123的组合可以防止CD19阴性复发的发生。
实施例18:低剂量RAD001在细胞培养模型中刺激CART增殖
通过在不同浓度的RAD001存在下将CART表达细胞与靶细胞共培养来评价低剂量RAD001对体外CAR T细胞增殖的影响。
材料和方法
CAR转导的T细胞的产生
使用人源化的抗人CD19 CAR(huCART19)慢病毒转移载体来产生包装成VSVg假型包装的慢病毒颗粒的基因组材料。人源化抗人CD19CAR(huCART19)的氨基酸和核苷酸序列是在2014年3月15日提交的PCT公开WO2014/153270中描述的CAR 1，ID 104875，并且在其中命名为SEQ ID NOs.85和31。
将慢病毒转移载体DNA与三种包装组分VSVg env，gag/pol和rev与lipofectamine试剂的组合混合以转染Lenti-X 293T细胞。在24h和30h后更换培养基，之后收集含病毒的培养基，过滤并在-80℃下保存。CART通过转导新鲜或冷冻的幼稚T细胞产生，所述T细胞通过对健康供体血液或leukopak的负磁选择而获得。通过与抗-CD3/抗-CD28珠温育24小时来活化T细胞，之后将病毒上清液或浓缩的病毒(分别为MOI＝2或10)加入到培养物中。使修饰的T细胞扩增约10天。通过在第7天和第9天之间的流式细胞术分析来测定转导的细胞的百分比(在细胞表面上表达CAR)和CAR表达水平(相对荧光强度，Geo Mean)。减慢生长速率和T细胞大小接近～350fL的组合决定了待被冷冻保存用于以后分析的T细胞的状态。
评估CART的增殖
为了评价CART的功能，将T细胞解冻并计数，并通过Cellometer评估存活力。使用非转导T细胞(UTD)归一化每种培养物中的CAR阳性细胞的数量。在以50nM开始的RAD001滴定中测试RAD001对CART的影响。在所有共培养实验中使用的靶细胞系是NALM6(Nalm-6)，其是表达CD19并转导以表达萤光素酶的人前B细胞急性淋巴性白血病(ALL)细胞系。
为了测量CART的增殖，用靶细胞以1:1的比例培养T细胞。测定进行4天，此时细胞对CD3，CD4，CD8和CAR表达进行染色。通过流式细胞术，使用计数珠作为参考评估T细胞的数量。
结果
在4天共培养测定中测试CART细胞的增殖能力。在用NALM6(Nalm-6)培养CAR-转导和非转导的T细胞后，评估CAR-阳性CD3-阳性T细胞(深色条形)和总CD3-阳性T细胞(浅色条形)的数量(图59)。当在小于0.016nM的RAD001存在下培养时，huCART19细胞扩增，在较高浓度的化合物下扩增程度较小。重要的是，在0.0032和0.016nM RAD001下，增殖高于在不添加RAD001的情况下观察到的增殖。非转导的T细胞(UTD)没有显示可检测的扩增。
实施例19:低剂量RAD001在体内刺激CART扩增
该实施例评价了huCAR19细胞在体内用不同浓度的RAD001增殖的能力。
材料和方法:
NALM6-luc细胞:从患有复发性ALL的患者的外周血开发NALM6人类急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系。然后用萤火虫萤光素酶标记细胞。这些悬浮细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清的RPMI中生长。
小鼠:从Jackson Laboratory(货号005557)接收6周龄的NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠。
肿瘤移植:使NALM6-luc细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清的RPMI中在体外生长和扩增。然后将细胞转移到15ml锥形管中，并用冷的无菌PBS洗涤两次。然后计数NALM6-luc细胞，并以10x106个细胞/毫升PBS的浓度重悬。将细胞置于冰上并立即(在1小时内)植入小鼠中。通过尾静脉以100微升体积静脉内注射NALM6-luc细胞，每只小鼠总共1x106个细胞。
CAR T细胞给药:在肿瘤植入后7天给小鼠施用5x106CAR T细胞。将细胞在37℃水浴中部分解冻，然后通过向含有细胞的管中加入1ml冷的无菌PBS完全解冻。将解冻的细胞转移至15ml falcon管中，并用PBS调整至最终体积为10ml。将细胞以1000rpm洗涤两次，每次10分钟，然后在血细胞计数器上计数。然后将T细胞以50x106CAR T细胞/ml冷PBS的浓度重悬，并保持在冰上直到对小鼠给药。通过尾静脉用100μl CAR T细胞静脉内注射小鼠，每只小鼠5x106CAR T细胞的剂量。每组8只小鼠用100μl PBS单独(PBS)或人源化CD19 CAR T细胞处理。
RAD001给药:配制50mg等于1mg RAD001的浓缩微乳液，然后在给药时重悬于D5W(5％葡萄糖水溶液)中。每天口服给予小鼠(通过口服管饲)200微升所需剂量的RAD001。
PK分析:在肿瘤植入后7天开始对小鼠每天给药RAD001。给药组如下:0.3mg/kg，1mg/kg，3mg/kg和10mg/kg。在RAD001的第一次和最后一次剂量后的第0天和第14天在以下的时间点对小鼠采血用于PK分析:15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时和24小时。
结果:
在具有NALM6-luc肿瘤的NSG小鼠中测试RAD001的扩增和药代动力学。每天单独口服给予RAD001对NALM6-luc肿瘤的生长没有影响(图60)。RAD001的药代动力学分析显示其在荷瘤小鼠的血液中相当稳定(图61A和61B)。在第0天和第14天PK分析显示，在测试的最低剂量(0.3mg/kg)下，即使在给药后24小时，血液中的RAD001浓度也高于10nm。
基于这些剂量，给予huCAR19CAR T细胞RAD001和不给予RAD001以测定这些细胞的增殖能力。基于给药后24小时的血液中RAD001的水平，使用的最高剂量为3mg/kg。由于在RAD001的最终剂量后24小时RAD001的浓度高于10nM，在使用CAR T细胞的体内研究中使用几种较低剂量的RAD001。在开始每日口服RAD001给药之前一天，静脉内给予CAR T细胞。通过FACS监测小鼠的T细胞扩增。
最低剂量的RAD001显示CAR T细胞的增强的增殖(图62A和62B)。与CD8+CAR T细胞相比，使用CD4+CAR T细胞，这种增强的增殖更加明显和延长。然而，对于CD8+CAR T细胞，在CAR T细胞剂量后的早期时间点可以看到增强的增殖。
实施例20:某些具有原发性DLBCL的患者显示CD3+/PD1+双重阳性癌细胞
尽管最近以嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和检查点抑制剂的形式在癌症免疫治疗空间中取得了令人注目的进展，但是未能广泛获得用于探索其组合的治疗机制的先进工具。为了应对这种日益增长的需求，开发了使用多路AQUA(自动定量分析)技术的强大的定量荧光免疫组织化学平台来评估检查点抑制剂表达，列举CART细胞，并通过新的共定位算法确定肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用。这种方法的实用性在临床前和临床模型系统中均有表征。在B细胞淋巴瘤的免疫缺陷小鼠模型中，评估CAR T细胞归巢于原发性淋巴器官中恶性B细胞。通过CD4，CD8，PD1和FOXP3表达的多路分析测定了CART细胞的表型和功能状态。另外，为了实现弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)设置中的组合免疫疗法，通过来自DLBCL患者(n＝63)的主要和次要活检中的细胞质和细胞核染色产生的界标检查了免疫和肿瘤细胞区室中PD1和PD-L1表达形式的适应性免疫抗性机制的流行程度。为了支持CAR T试验的患者选择，定量了用传统方法不能重复评分的相关肿瘤抗原的表达和流行，以产生客观的切点。这些用于患者的最佳选择的定量多路IHC方法可用于即将到来的新型联合免疫治疗试验。
在原发DLBCL(n＝49)和继发DLBCL(15)人类患者中进行DLBCL组织样品的样品制备，成像和成像分析。
样品制备。对福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品脱蜡。然后将载玻片通过一系列二甲苯至醇洗涤再水合，然后在蒸馏水中温育。然后使用升高的压力和温度条件进行热诱导的抗原恢复，使其冷却，并转移到Tris缓冲盐水中。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，封闭内源性过氧化物酶，然后用蛋白质封闭溶液温育，以减少非特异性抗体染色。接下来，将载玻片用小鼠抗PD1一抗染色。然后洗涤载玻片后用抗小鼠HRP二抗温育。洗涤载玻片，然后使用TSA+5(Perkin Elmer)检测PD-1染色。然后通过微波去除一级和二级抗体试剂。在用兔抗CD3一级抗体染色之前，再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后用抗兔HRP二抗加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物温育。洗涤载玻片，然后使用TSA-3(Perkin Elmer)检测CD3染色。在最后一次洗涤载玻片之后，将它们用封固剂盖上盖玻片，允许在室温下干燥过夜。
样品成像和分析。然后使用Vectra 2智能载玻片分析系统使用Vectra软件版本2.0.8(Perkin Elmer)获得荧光图像。首先，使用DAPI进行4x放大率的载玻片的单色成像。使用自动化算法(使用inForm开发)来识别含有组织的载玻片的区域。
将识别为含有组织的载玻片的区域以4倍放大率对与DAPI(蓝色)，3(绿色)和5(红色)相关的通道成像以产生RGB图像。在视野选择器中使用自动富集算法(使用InForm开发)处理这些4x放大图像，以根据最高的3表达来识别和排列可能的20倍放大视野。
前40个视野以20倍放大率在DAPI，3和5波长下成像。审查了原始图像的可接受性，并且焦点外，缺少任何肿瘤细胞，或高度坏死的，或者包含高水平的与预期的抗体定位(即背景染色)无关的荧光信号的图像在分析之前被拒绝。使用AQUAduct(PerkinElmer)处理接受的图像，其中每个荧光团通过光谱非混合器在光谱上不混合到各个通道中并保存为单独的文件。
使用AQUAnalysisTM或通过使用AQUAserveTM的全自动方法进一步分析处理过的文件。每个DAPI图像由细胞掩蔽程序处理以识别该图像内的所有细胞核，然后扩大2个像素，以表示整个细胞的近似大小。该所得掩码代表该图像中的所有细胞。每个5图像由生物标志物掩蔽程序处理以产生所有PD-1阳性细胞的二进制掩码。每个3图像由生物标志物掩蔽程序处理以产生CD3阳性的所有细胞的二进制掩码。将所有细胞PD-1阳性和CD3阳性的二进制掩码组合以产生PD-1和CD3双阳性的所有细胞的二进制掩码。使用阳性计算器(positivity calculator)，通过将所有PD-1阳性肿瘤细胞的掩码的总面积(以像素测量并由面积评估器确定)除以所有CD3阳性细胞的掩码的总面积(以像素测量并由面积评估器确定)，得到所有表达PD-1的CD3细胞的生物标志物阳性百分比(PBP)。在原发和继发DLBCL人样品中表达PD-1的所有CD3阳性细胞的PBP的代表性值显示于图63。CD3和PD-1状态显示CD3+/PD-1+细胞在原发DLBCL背景中的患病率高于继发DLBCL背景中的患病率，提供了选择患者用于单个或组合治疗的机会。
进行类似的实验，其中使用兔抗PDL1一抗和TSA+Cy5(Perkin Elmer)在来自原发DLBCL人类患者的DLBCL组织样品上检测PD-L1。还检测了相同样品上的PD1和CD3。实验表明，肿瘤微环境包含表达PD1，CD3和PDL1的细胞。实验还鉴定了CD3+PD1+的细胞亚群(数据未显示)。这些结果支持肿瘤微环境养育了可以用PD1+或PD-L1+细胞特异性活性剂靶向的免疫抑制细胞的模型。
实施例21:包含DLBCL细胞的样品中CD19和PD-L1的相互排斥性表达
样品制备。将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品脱蜡。然后将载玻片通过一系列二甲苯至乙醇洗涤再水合，然后在蒸馏水中温育。然后使用升高的压力和温度条件进行热诱导的抗原恢复，使其冷却，并转移到Tris缓冲盐水中。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，封闭内源性过氧化物酶，然后用蛋白质封闭溶液温育，以减少非特异性抗体染色。接下来，将载玻片用兔抗PDL1一抗进行染色。然后在与抗兔HRP二抗温育之前洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后使用TSA+3(Perkin Elmer)检测PDL1染色。然后通过微波去除一级和二级抗体试剂。在用小鼠抗CD19一抗进行染色之前，再次洗涤载玻片。洗涤载玻片，然后用抗小鼠HRP二抗加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物温育。洗涤载玻片，然后使用TSA-5(Perkin Elmer)检测CD19染色。在最后一次洗涤载玻片之后，将它们用封固剂盖好盖玻片，然后在室温下干燥过夜。
样品成像和分析。然后使用Vectra 2智能载玻片分析系统使用Vectra软件版本2.0.8(Perkin Elmer)获得荧光图像。首先，使用DAPI以4x放大率进行载玻片的单色成像。使用自动化算法(使用inForm开发)来识别含有组织的载玻片的区域。
将识别为含有组织的载玻片的区域以4倍放大率对与DAPI(蓝色)，3(绿色)和5(红色)相关的通道成像以产生RGB图像。在视野选择器中使用自动富集算法(使用InForm开发)处理这些4x放大图像，以根据最高的3表达来识别和排列可能的20倍放大视野。
前40个视野以20倍放大倍率在DAPI，3和5波长下成像。审查了原始图像的可接受性，并且焦点外，缺少任何肿瘤细胞，或高度坏死的，或者包含高水平的与预期的抗体定位(即背景染色)无关的荧光信号的图像在分析之前被拒绝。使用AQUAduct(Perkin Elmer)处理接受的图像，其中每个荧光团通过光谱非混合器(unmixer)在光谱上不混合到各个通道中并保存为单独的文件。
使用AQUAnalysisTM或通过使用AQUAserveTM的完全自动化方法进一步分析处理过的文件，如前面的实施例所述。
原发和继发DLBCL人样品中所有CD19阳性和PD-L1阳性细胞的PBP的代表性值显示在图64中。CDBC和PDL1表达在DLBCL样品中变化。CD19和PDL1表达倾向于是相互排斥的，即通常，给定的细胞表达CD19或PD-L1，但不是两者。虽然不希望被理论束缚，但是这可能是因为CD19在DLBCL肿瘤细胞中表达，而PD-L1在非肿瘤细胞，例如支持肿瘤微环境的细胞中表达。该观察结果表明CD19抑制剂(例如CD19 CAR表达细胞)和PD-L1信号传导抑制剂的组合疗法可用于靶向这两个细胞群。
进行类似的实验以例如证明AQUA分析监测CART19功效的能力。该研究监测在含有CART19+Jurkat细胞和CD19+REH细胞的混合细胞系的样品中的CD19，CD3和CART19核酸。通过抗体检测CD19和CD3蛋白，并使用针对CAR核酸的3'UTR的RNA探针检测CART19。实验显示，细胞系样品包含表达CD19，CD3和CART19的细胞(数据未显示)。该实验还显示细胞系样品包含CD3+/CART19+的细胞亚群(数据未显示)。进行接近分析，其显示CART19细胞在物理上接近CD19+细胞(数据未显示)。这些实验支持CD3+CART19细胞浸润包含CD19+细胞的肿瘤微环境和CD19和CART19细胞的物理位置转化为CART19治疗的功效的模型。
实施例22:CAR的双顺反子表达
在本实施例中，比较两种类型细胞群的功效。在称为“合并的”第一个细胞群中，每个细胞表达一个CAR。用CD19 CAR转导第一组细胞，用CD22 CAR或CD123 CAR转导第二组细胞，然后汇集两组细胞。在第二种类型的细胞群中，用表达CD19 CAR和第二CAR的双顺反子载体转导多个细胞，使得大部分或全部细胞表达两种构建体。第二个CAR在一些实验中是CD22 CAR，在其他实验中是CD123 CAR。这些细胞群在图65中示出。
使用P2A系统产生两种新的构建体，如图66所示，以便使用单个双顺反子慢病毒载体在相同T细胞中表达两个全长CAR。根据标准方案扩增T细胞，并使用携带CAR19和CAR123的单一慢病毒(多重感染，MOI＝3)转导。在使用所述双顺反子慢病毒载体获得的相同T细胞群中对CAR19和CAR22进行类似的转导。图67显示CD19和CD22 CAR的共表达。可以认识到基于CAR19和/或CAR123的特异性表达的不同群体，包括双CAR19+/CAR123+群体和双阴性群体(图68，上图)。
将用双顺反子CD19 CAR和CD123 CAR转导的细胞与表达CD19或CD123 CAR的汇集细胞进行比较(图68，底图)。NSG小鼠用B-ALL细胞系(NALM-6，CBG+)移植。在第7天，基于肿瘤负荷(BLI，生物发光)随机分配小鼠，以接受对照T细胞(UTD)，CART19，CART123，CART123和CART19或双CART19/123的1:1合并组合(相同总数的CAR+细胞)。单独的CD19 CAR表达细胞(正方形)和单独的CD123 CAR表达细胞(三角形)与对照(圆圈)相比显示初始有效性，随后是白血病细胞的上升水平。表达CD19或CD123(菱形)的合并细胞也显示初始有效性，随后白血病细胞水平升高。相比之下，用双顺反子载体转染的细胞(倒三角形，“双CART”)在治疗后至少60天保持延长的应答。该实验表明双CART发挥有效的抗白血病效果，其不仅优于单一CART治疗，而且优于合并的CART细胞。
实施例23:CART22在动物模型中对CD19-neg B-ALL有效。
在动物模型中测试CD19阴性B-ALL细胞对CD19 CAR表达细胞和CD22 CAR表达细胞的反应性。在第0天将100万CD19阴性B-ALL细胞输注入小鼠，第7天输注2e6CAR+T细胞(随机化后)。通过生物发光测量肿瘤负担。如图69所示，尽管癌症在阴性对照小鼠和CART19治疗的小鼠中进展，但是CART22能够清除NSG异种移植物中的CD19阴性ALL。
测定如下进行:将1e6 CD19-neg ALL细胞(CBG+)注射入NSG小鼠。在第5天，将小鼠随机接受2e6对照未转导的T细胞(UTD)，CART19或CART22(m971scFv)。随后跟踪小鼠肿瘤负荷(生物发光)。
实施例24:低水平的免疫检查点分子与改善的结果相关联
通过免疫组织化学检测淋巴瘤患者样品中的免疫检查点分子(PD-L1，PD1，LAG3和TIM3)。还进行阳性和阴性对照组织和细胞系。使用定量图像分析在可以包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞如免疫细胞的感兴趣区域上进行免疫检查点表达分析。从组织，淋巴结或骨髓取样。
在用CD19靶向CAR疗法治疗后，在完全应答者(CR)和进行性疾病(PD)患者中比较了免疫检查点蛋白质表达。如图70所示，治疗前后CR患者倾向于具有低水平的PD-L1，PD1，LAG3和TIM3，而PD患者在治疗前后倾向于具有高水平的这些分子。本实施例支持与CAR表达细胞和免疫检查点抑制剂的组合疗法，并支持测试以确定接受CAR疗法的患者中免疫检查点分子水平。
实施例25:CD22 CAR表达细胞的功能测定
在NFAT测定中功能验证了几种CD22 CAR构建体。简单地说，实验如下进行。携带编码具有CD22结合scFv结构域的CD22 CAR的核酸的慢病毒载体(pELPS)通过电穿孔引入经修饰以表达处于NFAT应答元件(JNL)的控制下的萤光素酶的Jurkat T细胞系。培养细胞并允许表达CAR构建体。将电穿孔细胞应用于用靶抗原(CD22)包被的平板上。包被平板中萤光素酶信号的检测表明CD22 CAR与其抗原的结合活性，导致T细胞的活化和萤光素酶的表达。
图71是显示在存在和不存在m971scFv竞争剂的情况下几种CD22 CAR构建体的活化(以RLU)的图。这些结果表明CD22-53和CD22-12以及其他scFv的一个子集大约结合抗原以及m971阳性对照。结果还表明，不同的scFvs在不同程度上与m971竞争。
测试了16个另外的人CD22结合结构域，并发现其具有弱结合活性(数据未显示)，因此未进一步进行。
图72是显示几种CD22 CAR表达JNL细胞(包括CD22-57,CD22-58,CD22-59,CD22-60,CD22-61,CD22-62和CD22-63)的活化(以RLU)的图，其中提供了scFv序列。使用三种不同的靶蛋白(CD22-FL-Fc,CD22-D567-Fc,和CD22-D67)包被组织培养板；还包括阴性对照(Fc)。间皮素结合CAR(Meso-G07)用作阴性对照。CD22-12和CD22-53用作阳性对照。实验表明，该测定中所有CARs(CD22-57,CD22-58,CD22-59,CD22-60,CD22-61,CD22-62,和CD22-63)均有功能。此外，这些结果表明测试的CAR(包括CD22-12和-53)结合CD22的结构域6和7。在CD22结合结构域上进行结构域作图。使用三种不同形式的抗原:具有所有7个外部结构域的CD22全长，结构域567(其中缺失结构域1-4)和结构域67(其中缺失结构域1-5)。尽管不希望受理论束缚，但似乎各种CD22克隆的结合映射到图75所示的表位。
还测试了CD22 CAR构建体促进IFN-γ和IL-2分泌的能力。简单地说，来自表达不同CD22 CAR的健康供体的转导的原代T细胞与CD22阳性靶细胞Raji-Luc和Daudi-Luc以及阴性对照K562-Luc共培养。T细胞和靶细胞以10比1的效应细胞-靶细胞比例(E:T)培养。在20小时共培养后收获上清液。图73显示了以pg/mL表示的IFN-γ产生的三个条形图。与Raji-Luc(上图)和Daudi-luc(中图)细胞系的共培养通过hCD22-12，hCD22-53CAR T细胞以及两个阳性对照CAR19和m971-HL诱导IFN-γ分泌。值得注意的是，当测试hCD22-53细胞时，观察到最高量，而在测试hCD22-12细胞时，观察到的量较小。当测试Nalm6-Luc,Pfeiffer-Luc,和K562-CD22-Luc和SEM-Luc细胞时，观察到相似的结果(数据未显示)。当测试K562-Luc阴性对照细胞系时，观察到最小的IFN-γ分泌(底部图)。
CD22-12在细胞杀伤和细胞因子分泌测定中显示与m971相当的活性(实施例9)。命名为CD22-64和CD22-65的两个scFv通过hCD22-12的亲和力成熟产生。如上所述，在NFAT测定中测试含有这些scFv的CAR构建体的活性。如图74所示，CD22-64和CD22-65都结合CD22或者比CD22-12和CD22-53更好的结合，导致JNL活化。图中的条形从左至右表示CD22全长-Fc；CD22D567-Fc；和用于包被平板的仅Fc阴性对照。测试CD22-12的四种变体表明，LCDR3和HCDR3在一定程度上促进结合(数据未显示)，并且HCDR3可能比LCDR3容忍更多的突变。
等同方案
本文引用的每篇专利，专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本文。虽然已经参考具体方面公开了本发明，但是显然本领域技术人员可以设计出本发明的其它方面和变型，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这些方面和等同变化。

Claims (53)

1.表达结合CD19，例如CD19 CAR的CAR分子的细胞，其用于治疗具有与CD19表达相关的疾病的受试者，并且其中所述受试者已经接收或正在接受或将要接受一种或多种B细胞抑制剂，其中所述B细胞抑制剂包含CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a的一种或多种的抑制剂。
2.一种治疗患有与CD19表达相关的疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效数目的一种或多种表达结合CD19，例如CD19 CAR的CAR分子的细胞与一种或多种B细胞抑制剂的组合，其中所述B细胞抑制剂包含CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种的抑制剂。
3.一种B细胞抑制剂，例如CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种的抑制剂，用于治疗受试者，所述受试者是或被鉴定为是CD19抑制剂，例如CD19 CAR疗法的非应答者，部分应答者或复发者。
4.一种治疗患者的方法，所述患者是或被鉴定为是CD19抑制剂，例如CD19CAR疗法的非应答者，部分应答者或复发者，所述方法包括向所述受试者施用B细胞抑制剂，例如CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种的抑制剂。
5.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1中的一种或多种的抑制剂。
6.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含有效数目的一种或多种表达CAR分子的细胞，所述CAR分子结合CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种。
7.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述表达结合CD19的CAR分子的一种或多种细胞与所述一种或多种B细胞抑制剂同时施用，或在所述一种或多种B细胞抑制剂之前或之后施用。
8.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述受试者在用表达结合CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的一种或多种细胞治疗后已经复发或被鉴定为已经复发。
9.用于根据权利要求11用途的组合物或方法，其中所述受试者在完全应答后已经复发或基于血液，骨髓(>5％)或任何髓外部位中母细胞重现的一种或多种而被鉴定为已经复发；或
其中所述受试者已经复发或基于高于预定阈值，例如超过1％,2％,3％,4％,5％或10％的CD19-母细胞的检测而被鉴定为已经复发；或
其中所述受试者已经复发或基于MIR199A1,MIR1203,uc021ovp,ITM2C,或HLA-DQB1中的一种或多种的RNA水平的增加而被鉴定为已经复发；或
其中所述受试者已经复发或基于PPIAL4D,TTTY10,TXLNG2P,MIR4650-1,KDM5D,USP9Y,PRKY,RPS4Y2,RPS4Y1,NCRNA00185,SULT1E1,和EIF1AY中的一种或多种的RNA水平的降低而被鉴定为已经复发。
10.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，还包括例如在施用表达结合CD19的CAR分子的一种或多种细胞之前，对所述受试者进行淋巴清除，其中任选地，所述淋巴清除包括施用美法仑，环磷酰胺制剂(cytoxan)，环磷酰胺和氟达拉滨的一种或多种。
11.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含有效数量的一种或多种细胞，所述细胞表达:结合CD10的CAR分子，例如如本文所述；结合CD20的CAR分子，例如如本文所述；结合CD22的CAR分子，例如如本文所述；结合CD34的CAR分子，例如如本文所述；结合CD123的CAR分子，例如如本文所述；结合FLT-3的CAR分子，例如如本文所述；或结合ROR1的CAR分子，例如如本文所述。
12.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述CD19 CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括CD19结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD19结合结构域包含表2或表3中列出的任何CD19scFv或轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个(例如全部三个)，和表2或表3中列出的任何CD19scFv或重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)的一个或多个(例如全部三个)。
13.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中CD19 CAR包含表2或3中列出的scFv的任何轻链可变区和表2或3列出的scFv的任何重链可变区。
14.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述CD19CAR包含CD19结合结构域，该CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列，或其具有95-99％同一性的序列，或SEQ ID NO:58的多肽。
15.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含CD20CAR，该CD20 CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括CD20结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD20结合结构域包含表13中列出的任何CD20轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和表12A或12B中列出的任何CD20重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
16.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含CD22CAR，该CD22 CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括CD22结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD22结合结构域包含表8A或8B中列出的任何CD22轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个轻链互补决定区1(LCCDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和表7A,7B,或7C中列出的任何CD22重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
17.用于根据权利要求16用途的组合物或方法，其中所述CD22 CAR包含表10A或10B中列出的任何轻链可变区，表9A或9B中列出的任何重链可变区，或表10A或10B中列出的任何轻链可变区和表9A或9B列出的任何重链可变区。
18.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含CD123 CAR，所述含CD123 CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括CD123结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD123结合结构域包含表18中列出的任何CD123轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和表17中列出的任何CD123重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
19.用于根据权利要求18用途的组合物或方法，其中所述CD123 CAR包含表16所列的任何轻链可变区，表16中列出的任何重链可变区，或表16中列出的任何轻链可变区和表16中列出的任何重链可变区。
20.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含CD123 CAR，所述CD123 CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括CD123结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD123结合结构域包含表27中列出的任何CD123轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和表26中列出的任何CD123重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
21.用于根据权利要求20用途的组合物或方法，其中所述CD123 CAR包含表25列出的任何轻链可变区，表25中列出的任何重链可变区，或表25中列出的任何轻链可变区和表25中列出的任何重链可变区。
22.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含CAR，所述CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括抗原结合结构域，跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含一个或多个(例如全部)轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和一个或多个(例如全部)重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
23.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含含有scFv的CAR。
24.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述B细胞抑制剂包含CAR，该CAR包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自T细胞受体的α，β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。
25.用于根据权利要求22用途的组合物或方法，其中所述抗原结合结构域通过铰链区连接到所述跨膜结构域，其中任选地，所述铰链区包含SEQ ID NO:14或其具有95-99％同一性的序列。
26.用于根据权利要求22用途的组合物或方法，其中所述共刺激结构域是从选自OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278),和4-1BB(CD137)的蛋白质获得的功能性信号传导结构域，其中任选地共刺激结构域包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的序列。
27.用于权利要求22的用途的组合物或方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域；或
其中所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和/或SEQ ID NO:17或SEQID NO:43的序列。
28.用于权利要求22的用途的组合物或方法，其中所述CAR进一步包含前导序列，其中任选地，所述前导序列包含SEQ ID NO:13。
29.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述细胞包含T细胞或NK细胞。
30.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中与CD19表达相关的疾病选自增生性疾病如癌症，肿瘤或恶性肿瘤或癌前病症如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与CD19表达相关的非癌症相关适应证，或
其中所述疾病是血液癌症，急性白血病，B细胞急性淋巴性白血病(BALL)，T细胞急性淋巴性白血病(TALL)，小淋巴细胞白血病(SLL)，急性淋巴性白血病(ALL)；慢性白血病，慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，非霍奇金淋巴瘤或骨髓瘤的一种或多种；或
其中所述疾病是CD19阴性癌症，例如CD19阴性复发性癌症。
31.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，还包括施用:
增加表达CAR分子的细胞功效的活性剂，或
改善与施用表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用的活性剂，或
治疗与CD19相关疾病的活性剂；或
检查点抑制剂。
32.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述受试者在开始CART疗法前接受活性剂例如检查点抑制剂的预治疗、同时治疗或CART疗法后治疗。
33.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述患者包含CD19阴性癌细胞和对CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种为阳性的癌细胞。
34.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，还包括向患者施用癌细胞对其为阳性的CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a的一种或多种的抑制剂。
35.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其还包括确定所述患者是否包含CD19阴性癌细胞或所述患者是否包含对CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种是阳性的癌细胞的步骤。
36.一种组合物，其包含分开或混合的:
(i)表达结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的一种或多种细胞，和
(ii)选自CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,或ROR1中的一种或多种的抑制剂的一种或多种B细胞抑制剂。
37.一种组合物，其包含:
(i)编码结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的第一核酸，和
(ii)编码结合选自CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b或CD79a中的一种或多种的B细胞抗原的CAR分子的第二核酸，其中第一核酸和第二核酸在相同或分开的核酸分子中。
38.组合物，其包含一种或多种免疫效应细胞和，
(i)编码第一多肽的第一核酸或第一多肽，所述第一多肽包含结合CD19的CAR分子，例如结合本文所述的CD19的CAR分子，例如CD19 CAR，和
(ii)编码第二多肽的第二核酸或第二多肽，所述第二多肽包含结合选自CD10,CD20,CD22,CD34,CD123,FLT-3,ROR1,CD79b,CD179b,或CD79a中的一种或多种的B细胞抗原的CAR分子。
39.权利要求38的组合物，其中:
第一核酸或第一多肽和第二核酸或第二多肽各自包含在第一免疫效应细胞内，例如由第一免疫效应细胞表达；
组合物包含含有例如表达第一核酸或第一多肽的第一免疫效应细胞和含有例如表达第二核酸或第二多肽的第二免疫效应细胞；或者
所述组合物不包含含有例如表达第一核酸或第一多肽和第二核酸或第二多肽的细胞。
40.一种包含权利要求37的核酸组合物的细胞，其中所述细胞任选是人T细胞，CD8+T细胞或NK细胞。
41.权利要求40的细胞，其进一步表达包含第一多肽的抑制性分子，所述第一多肽包含与第二多肽相关的至少一部分抑制性分子，所述第二多肽包含来自细胞内信号传导结构域的阳性信号，其中任选地所述抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和包含共刺激结构域和主要信号传导结构域的第二多肽。
42.一种制备细胞的方法，其包括将权利要求37的核酸组合物引入T细胞或NK细胞，例如用权利要求94-100中任一项的载体转导T细胞或NK细胞，其中所述方法任选地包括:
测定基因特征，其指示用所述细胞治疗的受试者是否可能复发或已经复发；
在输注到受试者之前测定细胞中的基因特征；或
降低包含转导的细胞的细胞群体的TREG特征，其中降低TREG特征任选地包括对细胞群体进行CD25消耗。
43.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，其中所述CD19抑制剂包含CD19CAR，并且所述B细胞抑制剂包含CD123 CAR，其中任选地所述CD19 CAR或CD123 CAR包含分裂的细胞内信号传导结构域，使得与CD19 CAR和CD123 CAR结合到表达CD19或CD123之一的靶细胞(例如，造血干细胞)时的活化相比，当CD19 CAR和CD123 CAR都结合靶细胞，例如靶CD19+CD123+细胞(例如，B-ALL母细胞)时，发生细胞例如免疫效应细胞群体的完全活化。
44.用于前述权利要求中任一项用途的组合物或方法，还包括将细胞例如造血干细胞或骨髓移植到哺乳动物中。
45.一种治疗患有DLBCL，例如，原发DLBCL的受试者的方法，其包括向受试者施用有效数目的一种或多种表达结合CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的细胞与PD1抑制剂的组合，其中任选地受试者具有或被鉴定为具有至少5％,6％,7％,8％,9％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或90％的为CD3+/PD1+的DLBCL细胞。
46.一种治疗患有DLBCL，例如，原发DLBCL的受试者的方法，其包括向受试者施用有效数目的一种或多种表达结合CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的细胞，其中任选受试者具有或被鉴定为具有至少5％,6％,7％,8％,9％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％或90％的为CD3+/PD1+的DLBCL细胞。
47.一种治疗患有DLBCL的受试者的方法，包括向受试者施用有效数目的一种或多种表达结合CD19的CAR分子，例如CD19 CAR的细胞与PD-L1抑制剂的组合，其中任选地受试者具有或被鉴定为具有少于20％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,或1％的癌症，例如癌症微环境中的细胞，所述细胞对CD19和PD-L1是双阳性的。
48.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中所述CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括CD20结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD20结合结构域包含表13,15A,或15B中列出的任何CD20轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和表12A,12B,14A,或14B中列出的任何CD20重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)。
49.一种分离的CAR分子，其包含CD20结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述CD20结合结构域包含表13,15A,或15B中列出的任何CD20结合结构域的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)，和表12A,12B,14A,或14B中列出的任何CD20结合结构域的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
50.一种治疗具有与CD20表达相关疾病的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的包含权利要求49的CAR分子的细胞。
51.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中所述CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括CD22结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中所述CD22结合结构域包含表8A,8B,10A或10B中列出的任何CD22轻链结合结构域氨基酸序列的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和表7A,7B,7C,9A,或9B中列出的任何CD22重链结合结构域氨基酸序列的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)。
52.一种分离的CAR分子，其包含CD22结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述CD22结合结构域包含表8A,8B,10A或10B中列出的任何CD22结合结构域的一个或多个轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)，和表7A,7B,7C,9A,或9B中列出的任何CD22结合结构域的一个或多个重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
53.一种治疗具有与CD22表达相关疾病的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的包含权利要求52的CAR分子的细胞。
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Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109021114A (zh) * 2018-08-08 2018-12-18 武汉波睿达生物科技有限公司 联合两种单链抗体的双特异性嵌合抗原受体及表达载体
CN110913871A (zh) * 2017-05-17 2020-03-24 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 生成哺乳动物t细胞活化诱导型合成启动子(syn+pro)以改善t细胞疗法
WO2020108646A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Beijing Meikang Geno-Immune Biotechnology Co., Ltd. Cd19-and psma-based combined car-t immunotherapy
WO2020151752A1 (zh) * 2019-01-22 2020-07-30 亘喜生物科技（上海）有限公司 Cd20组合靶向的工程化免疫细胞
CN111944850A (zh) * 2020-08-28 2020-11-17 澳门大学 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用
CN112480258A (zh) * 2020-12-11 2021-03-12 华道(上海)生物医药有限公司 抗cd123纳米抗体及其应用
CN112955172A (zh) * 2018-09-17 2021-06-11 美国卫生和人力服务部 靶向cd19和cd20的双顺反子嵌合抗原受体及其用途
CN113493520A (zh) * 2020-04-02 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 靶向双特异性位点的双car及其应用
CN113493517A (zh) * 2020-04-02 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 双特异性单链抗体及其构建的嵌合抗原受体和应用
CN113493516A (zh) * 2020-04-02 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 靶向双特异性位点的嵌合抗原受体及其应用
CN113493524A (zh) * 2020-04-03 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN113840912A (zh) * 2019-05-16 2021-12-24 南京传奇生物科技有限公司 包含识别分子的工程化免疫细胞
CN114026128A (zh) * 2019-04-30 2022-02-08 阿塔拉生物制药股份有限公司 抗原特异性靶向cd19的car-t细胞
CN114502587A (zh) * 2019-07-30 2022-05-13 普瑞文森生物有限公司 通过非耗竭性b细胞抑制剂降低免疫原性的方法和组合物
CN114729305A (zh) * 2019-10-17 2022-07-08 苏州丹罗医药有限公司 用于免疫治疗的嵌合抗原受体、制备方法及其应用
CN114729013A (zh) * 2019-08-21 2022-07-08 艾佩斯瑞生物制药公司 抗cd22抗体及其用途
CN114786723A (zh) * 2019-10-31 2022-07-22 莫佛塞斯公司 序贯抗cd19疗法
CN114945590A (zh) * 2019-11-18 2022-08-26 詹森生物科技公司 抗cd79嵌合抗原受体、car-t细胞及其用途
CN115087466A (zh) * 2019-12-12 2022-09-20 森迪生物科学公司 用于细胞的调控装甲的方法和组合物
WO2024086191A3 (en) * 2022-10-18 2024-05-30 Kite Pharma, Inc. Car-t constructs comprising a novel cd19 binder combined with il18 and methods of using the same
WO2025146143A1 (zh) * 2024-01-05 2025-07-10 南京传奇生物科技有限公司 治疗自身免疫疾病的方法

Families Citing this family (245)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE046961T2 (hu) 2013-02-20 2020-04-28 Univ Pennsylvania Rák kezelése humanizált EGFRVIII elleni kiméra antigénreceptor alkalmazásával
TW201446794A (zh) 2013-02-20 2014-12-16 Novartis Ag 利用抗－ｃｄ１２３嵌合抗原受體工程化ｔ細胞之初級人類白血病有效靶向
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
BR112016013187A2 (pt) 2013-12-19 2017-09-26 Novartis Ag receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humanos e usos dos mesmos
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
EP3097117B1 (en) * 2014-01-21 2023-10-04 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JP6752148B2 (ja) 2014-02-07 2020-09-09 マクマスター ユニバーシティー 三官能性ｔ細胞−抗原カプラ及び方法並びにこれらの使用
PH12016501545B1 (en) * 2014-03-14 2023-12-06 Immutep Sas Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
MX395149B (es) * 2014-04-07 2025-03-24 Novartis Ag Terapias de combinación que comprenden un receptor quimérico de antígeno cd19 para el cáncer.
US11274278B2 (en) 2014-04-16 2022-03-15 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
BR112016024579A2 (pt) 2014-04-23 2017-10-10 Juno Therapeutics Inc métodos para isolamento, cultura e engenharia genética de populações de célula imune para terapia adotiva
US9777061B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
MX2017001011A (es) 2014-07-21 2018-05-28 Novartis Ag Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma.
AR101829A1 (es) 2014-07-21 2017-01-18 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno cll-1
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
TW202140557A (zh) 2014-08-19 2021-11-01 瑞士商諾華公司 使用cd123嵌合抗原受體治療癌症
KR20210149228A (ko) 2014-09-17 2021-12-08 노파르티스 아게 입양 면역요법을 위한 키메라 수용체에 의한 세포독성 세포의 표적화
CA2963935A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
US10507219B2 (en) 2014-10-20 2019-12-17 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for dosing in adoptive cell therapy
WO2016100232A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
EP4036109A3 (en) 2014-12-29 2022-10-12 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2016115482A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Novartis Pharma Ag Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
CN119925616A (zh) 2015-04-08 2025-05-06 诺华股份有限公司 Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体（car）表达细胞的联合疗法
CA2982996A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 David Maxwell Barrett Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
CA2988854A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
JP7197979B2 (ja) * 2015-05-28 2022-12-28 カイト ファーマ インコーポレイテッド Ｔ細胞療法のために患者をコンディショニングする方法
TW202444897A (zh) * 2015-06-25 2024-11-16 美商生物細胞基因治療有限公司 嵌合抗原受體(car)、組合物及其使用方法
TWI859112B (zh) 2015-07-21 2024-10-21 瑞士商諾華公司 改良免疫細胞之功效及擴展之方法
AU2016301196B2 (en) 2015-08-06 2022-09-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tunable endogenous protein degradation
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN108780084B (zh) 2015-09-03 2022-07-22 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
MX395154B (es) 2015-10-22 2025-03-25 Juno Therapeutics Gmbh Métodos, kits, agentes y aparatos para transducción.
EA201891066A1 (ru) 2015-10-30 2018-10-31 ЭнБиИ-ТЕРАПЬЮТИКС АГ Антитела к ror1
HK1257295A1 (zh) 2015-12-04 2019-10-18 Novartis Ag 用於免疫肿瘤学的组合物和方法
EP3393504B1 (en) 2015-12-22 2025-09-24 Novartis AG Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
UA125718C2 (uk) 2016-01-20 2022-05-25 Зе Скріппс Ресеарч Інстітьют Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
KR20180118175A (ko) 2016-03-04 2018-10-30 노파르티스 아게 다중 키메라 항원 수용체 (car) 분자를 발현하는 세포 및 그에 따른 용도
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
US10538786B2 (en) 2016-04-13 2020-01-21 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof
JP7497955B6 (ja) 2016-04-15 2024-07-01 ノバルティス アーゲー 選択的タンパク質発現のための組成物および方法
US10086055B2 (en) * 2016-06-01 2018-10-02 Promab Biotechnologies, Inc. Adherent cancer cell line expressing a hematological tumor antigen
EP3464375A2 (en) 2016-06-02 2019-04-10 Novartis AG Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
AU2017295886C1 (en) 2016-07-15 2024-05-16 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
TW202508628A (zh) 2016-07-28 2025-03-01 瑞士商諾華公司 嵌合抗原受體及pd-1抑制劑之組合療法
CN109844126A (zh) 2016-09-28 2019-06-04 诺华股份有限公司 基于多孔膜的大分子递送系统
CN110225927B (zh) 2016-10-07 2024-01-12 诺华股份有限公司 用于治疗癌症的嵌合抗原受体
CN110073002B (zh) 2016-10-17 2024-06-11 杨森制药公司 重组病毒复制子体系及其用途
US11590167B2 (en) 2016-12-03 2023-02-28 Juno Therapeutic, Inc. Methods and compositions for use of therapeutic T cells in combination with kinase inhibitors
MX2019006467A (es) * 2016-12-05 2019-12-09 Janssen Pharmaceuticals Inc Star Composiciones y métodos para mejorar la expresión génica.
CN110402097A (zh) 2016-12-07 2019-11-01 普罗根尼蒂公司 胃肠道检测方法、装置和系统
US11286306B2 (en) * 2016-12-09 2022-03-29 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. TLR9-binding chimeric antigen receptors
EP3554515A4 (en) * 2016-12-15 2020-08-26 Duke University B10 REGULATORY CELL DEPLETION ANTIBODIES AND METHODS AND THEIR USE IN COMBINATION WITH IMMUNITY CHECKPOINT INHIBITORS
US20200338210A1 (en) * 2016-12-22 2020-10-29 Ardeagen Corporation Anti-ror1 antibody and conjugates thereof
WO2018119178A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 StemBios Technologies, Inc. Use of somatic stem cells for decreasing neprilysin level
JP6706394B1 (ja) 2017-01-09 2020-06-03 レンティジェン・テクノロジー・インコーポレイテッドＬｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． 抗メソセリン免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法
US11578115B2 (en) 2017-01-10 2023-02-14 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors based on alternative signal 1 domains
EP4043485A1 (en) 2017-01-26 2022-08-17 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
WO2018145023A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Novartis Ag Method of predicting response to immunotherapy
CN108395482B (zh) * 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
JP7227912B2 (ja) * 2017-02-08 2023-02-24 ダナ－ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド キメラ抗原受容体の調節
EP3585403A4 (en) * 2017-02-22 2020-12-09 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. CHEMERICAL ANTIGENIC RECEPTORS BINDING TO TIM3
EP3585402B1 (en) 2017-02-27 2024-03-06 Juno Therapeutics, Inc. Compositions, articles of manufacture and methods related to dosing in cell therapy
JP7386082B2 (ja) * 2017-02-28 2023-11-24 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド 系統特異的タンパク質の阻害のための組成物および方法
US11352434B2 (en) 2017-03-16 2022-06-07 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting CD37
CN110832075A (zh) * 2017-03-22 2020-02-21 诺华股份有限公司 用于免疫肿瘤学的组合物和方法
EP4108183A1 (en) 2017-03-30 2022-12-28 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
US20200108066A1 (en) * 2017-03-30 2020-04-09 Shorn Goel Methods for modulating regulatory t cells and immune responses using cdk4/6 inhibitors
KR20190142775A (ko) * 2017-04-19 2019-12-27 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 조작된 항원 수용체를 발현하는 면역 세포
US11364235B2 (en) * 2017-04-28 2022-06-21 Actinium Pharmaceuticals, Inc. Method for treating cancer using a BCL-2 inhibitor in conjunction with an alpha-emitting radioimmunotherapeutic
WO2018197675A1 (en) * 2017-04-28 2018-11-01 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Ror1-specific chimeric antigen receptors (car) with humanized targeting domains
CN110650975B (zh) * 2017-05-15 2024-04-05 美国卫生和人力服务部 双顺反子嵌合抗原受体及其用途
CA3064000A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
JP7522426B2 (ja) * 2017-05-25 2024-07-25 ユニバーシティ オブ セントラル フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイテッド 天然キラー細胞による殺傷に対する腫瘍細胞の感受性を高めるための新規な腫瘍溶解性ウイルス
AU2018275359C1 (en) 2017-06-02 2022-02-03 Pfizer Inc. Antibodies specific for FLT3 and their uses
CN111225675B (zh) * 2017-06-02 2024-05-03 朱诺治疗学股份有限公司 使用过继细胞疗法治疗的制品和方法
WO2018226958A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 The General Hospital Corporation T cells expressing a chimeric antigen receptor
CN111247242B (zh) 2017-06-21 2024-07-19 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(CARs)、组合物及其使用方法
JP7280238B2 (ja) 2017-07-17 2023-05-23 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド フィブロネクチンｉｉｉ型ドメインに対する抗原結合領域及びその使用方法
CN107400168B (zh) * 2017-07-18 2020-02-07 深圳市免疫基因治疗研究院 一种基于cd117的嵌合抗原受体及其应用
CN107245107B (zh) * 2017-07-18 2020-02-07 深圳市免疫基因治疗研究院 一种基于cd20的嵌合抗原受体及其应用
CN107337737B (zh) * 2017-07-18 2020-02-07 深圳市免疫基因治疗研究院 一种嵌合抗原受体及其应用
KR102486090B1 (ko) 2017-08-07 2023-01-10 엔비이-테라퓨틱스 아게 생체 내 내성이 높은 항체 약물 결합체
MA49981A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Juno Therapeutics Inc Procédés et compositions de préparation de cellules génétiquement modifiées
BR112020001605A2 (pt) 2017-08-09 2020-08-11 Juno Therapeutics Inc métodos para produzir composições de células geneticamente modificadas e composições relacionadas
US11643468B2 (en) 2017-08-23 2023-05-09 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Hemlholtz-Gemeinschaft Chimeric antigen receptors and CAR-T cells that bind CXCR5 and methods of use thereof to treat medical disorders
CN109423495A (zh) * 2017-08-24 2019-03-05 上海恒润达生生物科技有限公司 一种双靶向嵌合抗原受体及其用途
US12350312B2 (en) 2017-09-06 2025-07-08 Fred Hutchinson Cancer Center Methods for improving adoptive cell therapy
ES2960419T3 (es) 2017-09-15 2024-03-04 Lentigen Tech Inc Composiciones y métodos de tratamiento de cáncer con inmunoterapia anti-CD19
WO2019071358A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Mcmaster University Y182T MUTATION T CELL ANTIGEN COUPLEUR AND METHODS AND USES THEREOF
US11999802B2 (en) 2017-10-18 2024-06-04 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
DK3703710T3 (da) 2017-10-31 2024-10-14 Allogene Therapeutics Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til dosering af allogene kimær antigenreceptor-t-celler til behandling af refraktært og/eller recidiveret storcellet b-cellelymfom eller refraktært og/eller recidiveret follikulært lymfom
US12258580B2 (en) 2017-11-01 2025-03-25 Juno Therapeutics, Inc. Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
US12031975B2 (en) 2017-11-01 2024-07-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
AU2018360031B2 (en) * 2017-11-03 2025-08-21 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-ROR1 immunotherapy
CN107858352B (zh) * 2017-11-09 2021-03-30 广州千扬生物医药技术有限公司 一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途
CN109836495A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd22的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109837305A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种敲除pd1的靶向cd22的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109836493A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd19的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
US20200371091A1 (en) 2017-11-30 2020-11-26 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
MX2020005908A (es) * 2017-12-08 2020-10-07 Juno Therapeutics Inc Proceso para producir una composicion de celulas t modificadas.
BR112020011223A2 (pt) 2017-12-08 2020-11-17 Juno Therapeutics Inc marcadores fenotípicos para terapia celular e mé-todos relacionados
EA202091513A1 (ru) 2017-12-19 2020-09-09 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение
US11389531B2 (en) 2017-12-19 2022-07-19 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines
JP2021508246A (ja) * 2017-12-21 2021-03-04 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規抗原結合部分の特異性試験のためのｃａｒ−ｔ細胞アッセイ
EP3729080B1 (en) * 2017-12-21 2023-04-19 F. Hoffmann-La Roche AG Universal reporter cell assay for specificity test of novel antigen binding moieties
EP3730519B1 (en) * 2017-12-22 2023-09-13 AbClon Inc. Antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes b cell malignancies, chimeric antigen receptor comprising same, and uses thereof
CN109608548A (zh) * 2017-12-29 2019-04-12 郑州大学第附属医院 基于人源cd20抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
WO2019136432A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
MX2020007675A (es) 2018-01-19 2020-09-14 Janssen Pharmaceuticals Inc Induccion y mejora de respuestas inmunes utilizando sistemas de replicon recombinante.
CN108017717B (zh) * 2018-01-24 2019-08-16 首都医科大学宣武医院 一种用于体外高效定向扩增的嵌合抗原受体及其应用
EP3746116A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Novartis AG Combination therapy using a chimeric antigen receptor
AU2019219454A1 (en) 2018-02-09 2020-08-27 National University Of Singapore Activating chimeric receptors and uses thereof in natural killer cell immunotherapy
CN110157675B (zh) * 2018-02-12 2022-05-27 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN110157676A (zh) * 2018-02-12 2019-08-23 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN110144327A (zh) * 2018-02-12 2019-08-20 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
CN112004832A (zh) 2018-02-23 2020-11-27 H·李·莫菲特癌症中心研究所公司 结合cd83的嵌合抗原受体
US20200108098A1 (en) * 2018-02-23 2020-04-09 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Anti-cd83 chimeric antigen receptor expressing t regulatory cells
EP3762012A1 (en) * 2018-03-09 2021-01-13 Ospedale San Raffaele S.r.l. Il-1 antagonist and toxicity induced by cell therapy
WO2019178207A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Phosphatidylserine targeting agents and uses thereof for adoptive t-cell therapies
KR102340989B1 (ko) * 2018-03-28 2021-12-20 에이비온 주식회사 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도
KR20200136473A (ko) * 2018-03-30 2020-12-07 유레카 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 Cd22를 표적으로 하는 구축물 및 이의 용도
US12441787B2 (en) 2018-04-02 2025-10-14 National University Of Singapore Neutralization of human cytokines with membrane-bound anti-cytokine non-signaling binders expressed in immune cells
TWI784324B (zh) * 2018-04-12 2022-11-21 美商凱特製藥公司 利用腫瘤微環境之特性之嵌合受體t細胞治療
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
GB201807870D0 (en) 2018-05-15 2018-06-27 Autolus Ltd A CD79-specific chimeric antigen receptor
EP3794034A1 (en) 2018-05-15 2021-03-24 Autolus Limited Chimeric antigen receptor
WO2019222642A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Senti Biosciences, Inc. Engineered immune cells and methods of use
CN110526970A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 靶向cd133的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
BR112020024351A2 (pt) 2018-06-01 2021-02-23 Novartis Ag moléculas de ligação contra bcma e usos das mesmas
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
CA3100724A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag B-cell maturation antigen protein (bcma) chimeric antigen receptors and uses thereof
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
CN112292140B (zh) * 2018-06-22 2025-03-11 综合医院公司 靶向cd37和cd19的嵌合抗原受体
CN110623979A (zh) * 2018-06-25 2019-12-31 深圳宾德生物技术有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞在自身免疫性疾病中的应用
CN110623978A (zh) * 2018-06-25 2019-12-31 深圳宾德生物技术有限公司 靶向cd22的嵌合抗原受体t细胞在自身免疫性疾病中的应用
CN110628722A (zh) * 2018-06-25 2019-12-31 深圳宾德生物技术有限公司 靶向cd20的嵌合抗原受体t细胞在自身免疫性疾病中的应用
WO2020010235A1 (en) * 2018-07-05 2020-01-09 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Car t cells that target b-cell antigens
CA3105694A1 (en) * 2018-07-12 2020-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Affinity matured cd22-specific monoclonal antibody and uses thereof
CN112689642B (zh) * 2018-07-17 2025-01-17 特拉姆维拉免疫美国有限公司 具有各种不同的构建物优化的t细胞抗原偶联物
US10640562B2 (en) * 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
CA3108515A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Adjuvant effect of the tlr1/2 agonist diprovocim synergizes with checkpoint-inhibiting antibodies to eliminate disease
IL280659B2 (en) 2018-08-09 2024-11-01 Juno Therapeutics Inc Processes for generating engineered cells and compositions thereof
WO2020047164A1 (en) * 2018-08-28 2020-03-05 Vor Biopharma, Inc Genetically engineered hematopoietic stem cells and uses thereof
US12240915B2 (en) 2018-08-30 2025-03-04 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
EP3847195B1 (en) * 2018-08-30 2025-03-05 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
HRP20251135T1 (hr) 2018-08-31 2025-11-21 Novartis Ag Postupci dobivanja kimernih stanica koje eksprimiraju antigenske receptore
SG11202102654UA (en) * 2018-09-19 2021-04-29 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Protein l for activation and expansion of chimeric antigen receptor-modified immune cells
US11242389B2 (en) 2018-09-26 2022-02-08 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-CD19/CD22 immunotherapy
CA3114349A1 (en) * 2018-09-26 2020-04-02 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-cd19/cd22 immunotherapy
WO2020069405A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
EP3856782A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Novartis AG Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
EP3864027A1 (en) 2018-10-08 2021-08-18 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Alphavirus-based replicons for administration of biotherapeutics
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
EP3873500A4 (en) 2018-10-31 2023-01-11 Mayo Foundation for Medical Education and Research METHODS AND MATERIALS FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP3873540A4 (en) 2018-10-31 2022-07-27 Mayo Foundation for Medical Education and Research METHODS AND MATERIALS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2020092848A2 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
EP3880238A1 (en) * 2018-11-16 2021-09-22 Juno Therapeutics, Inc. Methods of dosing engineered t cells for the treatment of b cell malignancies
JP7630832B2 (ja) * 2018-11-19 2025-02-18 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム Ｃａｒおよびｔｃｒ形質導入用のモジュール式ポリシストロニックベクター
EP3883636A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
CN110951689A (zh) * 2018-11-30 2020-04-03 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和cd30的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
CN109880802B (zh) * 2018-11-30 2022-12-13 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和cd70的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
IL316392A (en) 2018-12-12 2024-12-01 Kite Pharma Inc Chimeric antigen receptors and CAR-T cells and methods of use
US20220047636A1 (en) * 2018-12-13 2022-02-17 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting cd79b and cd19
EP3908294A4 (en) * 2019-01-10 2022-12-28 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Modified cell expansion and uses thereof
US12241061B2 (en) * 2019-02-04 2025-03-04 National University Corporation Ehime University CAR library and scFv manufacturing method
JP2022523763A (ja) * 2019-02-13 2022-04-26 コイミューン インコーポレイテッド キメラ抗原受容体を発現する細胞とモノクローナル抗体との組み合わせを用いたがん免疫療法
US20220088075A1 (en) 2019-02-22 2022-03-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
WO2020180882A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Nkarta, Inc. Cd19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy
JP2022531814A (ja) * 2019-03-12 2022-07-12 イノベイティブ セルラー セラピューティクス ホールディングス，エルティディ 改変細胞の増幅およびその応用
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
AU2020271123A1 (en) * 2019-04-10 2021-11-25 Elevatebio Technologies, Inc. FLT3-specific chimeric antigen receptors and methods of using the same
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
AU2020267057A1 (en) 2019-04-30 2021-11-18 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of B cell malignancies using genetically engineered T cells targeting CD19
JP2022535138A (ja) * 2019-06-07 2022-08-04 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア Ｃｄ２８および４－１ｂｂに個々に連結したデュアルｃａｒを発現するｔ細胞
CA3145223A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Wen Yang Composition and method for adoptive immunotherapy
US12441794B2 (en) * 2019-07-29 2025-10-14 The Children's Hospital Of Philadelphia Antibodies for the diagnosis and treatment of B-cell acute lymphoblastic leukemia
EP4010461A4 (en) * 2019-08-05 2023-08-23 ImmunityBio, Inc. Artificial target cells for in-vitro car cytotoxicity and adcc validation
WO2021034952A1 (en) * 2019-08-19 2021-02-25 Elpis Biopharmaceuticals Anti-cd19 antibodies and uses thereof
CA3153197A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Ryan T. Gill Crispr systems with engineered dual guide nucleic acids
WO2021072312A1 (en) * 2019-10-11 2021-04-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting cd13 and tim-3 with car t cells to treat acute myeloid leukemia
TWI837437B (zh) * 2019-11-06 2024-04-01 美商凱特製藥公司 嵌合抗原受體t細胞療法
CN114761037A (zh) 2019-11-26 2022-07-15 诺华股份有限公司 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途
IL292924A (en) * 2019-11-26 2022-07-01 Novartis Ag Chimeric antigen receptors cd19 and cd22 and their uses
CN121197633A (zh) 2019-12-13 2025-12-26 比特比德科有限责任公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
AU2021219885B2 (en) * 2020-02-13 2025-07-24 Beijing Immunochina Pharmaceuticals Co., Ltd. Optimization of chimeric antigen receptor
US12076343B2 (en) 2020-02-19 2024-09-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Engineered safety in cell therapy
IL295878A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods for producing cells expressing a chimeric antigen receptor
TW202146441A (zh) 2020-02-27 2021-12-16 瑞士商諾華公司 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法
CA3170369A1 (en) 2020-03-05 2022-04-14 Michal Shahar Methods and compositions for treating cancer with immune cells
AU2021233158A1 (en) * 2020-03-11 2022-09-29 Fundació Institut D'investigació En Ciències De La Salut Germans Trias I Pujol (Igtp) CD22 targeting-moiety for the treatment of B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL)
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
CN113493521B (zh) * 2020-04-03 2023-05-05 重庆精准生物技术有限公司 靶向cd19和cd123的双靶点嵌合抗原受体及其应用
WO2021222793A1 (en) * 2020-04-30 2021-11-04 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Multispecific anti-flt3 chimeric antigen receptors
US12043654B2 (en) 2020-06-02 2024-07-23 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Anti-GCC antibody and CAR thereof for treating digestive system cancer
KR20230024967A (ko) 2020-06-11 2023-02-21 노파르티스 아게 Zbtb32 억제제 및 이의 용도
WO2021260657A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
WO2022031597A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Kyverna Therapeutics, Inc. Methods of producing t regulatory cells, methods of transducing t cells, and uses of the same
IL300489A (en) 2020-08-21 2023-04-01 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo production of CAR expressing cells
WO2022066100A1 (en) * 2020-09-22 2022-03-31 National University Of Singapore Methods for improved t cell manufacturing
AU2021378316A1 (en) 2020-11-13 2023-06-01 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
EP4255922A1 (en) 2020-12-03 2023-10-11 Century Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and uses thereof
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022133169A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
KR102393776B1 (ko) * 2020-12-30 2022-05-04 (주)이노베이션바이오 Cd22에 특이적인 인간화 항체 및 이를 이용한 키메라 항원 수용체
CN114685652B (zh) * 2020-12-31 2023-11-03 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的全人广谱交叉中和抗体及其应用
CA3208935A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-28 Elpis Biopharmaceuticals Bispecific chimeric antigen receptors binding to cd19 and cd22
WO2022165419A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Kyverna Therapeutics, Inc. Methods for increasing t-cell function
EP4298212A1 (en) 2021-02-25 2024-01-03 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
AU2022254978A1 (en) * 2021-04-08 2023-11-16 Artiva Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer with nk cells and a cd20 targeted antibody
AU2022267891A1 (en) 2021-04-27 2023-11-09 Novartis Ag Viral vector production system
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
CA3173810A1 (en) 2021-06-01 2022-12-01 Andreas Bader Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
US20250034558A1 (en) 2021-06-18 2025-01-30 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
WO2023016554A1 (zh) * 2021-08-13 2023-02-16 上海医药集团股份有限公司 靶向cd22的抗原结合蛋白及其用途
CA3229746A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
JP2024542815A (ja) * 2021-12-05 2024-11-15 アディセット セラピューティクス， インク． Ｂ細胞悪性腫瘍の治療
US20250388896A1 (en) 2022-03-01 2025-12-25 Celyntra Therapeutics Sa Composition and methods for transgene insertion
EP4486787A4 (en) * 2022-03-03 2026-02-11 Univ Texas Chimeric antigenic receptors anti-CD19 and anti-CD79B and their methods of use
US20250197811A1 (en) * 2022-03-22 2025-06-19 Celyntra Therapeutics Sa Compositions and methods for generating cells with reduced immunogenicity
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
AU2023369684A1 (en) 2022-10-26 2025-04-17 Novartis Ag Lentiviral formulations
US20240158869A1 (en) * 2022-10-28 2024-05-16 Kite Pharma, Inc. Factors for optimizing immunotherapy
EP4649096A2 (en) * 2023-01-10 2025-11-19 Sana Biotechnology, Inc. Cd19-specific antibody constructs and compositions thereof
AU2024216919A1 (en) * 2023-02-09 2025-08-07 City Of Hope Anti-il1rap antibodies and variants thereof
EP4626447A4 (en) 2023-03-31 2026-02-18 Abelzeta Inc BISPECIFIC CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS TARGETING CD20 AND BCMA
WO2025049961A1 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Cargo Therapeutics, Inc. Anti-cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2025128880A1 (en) * 2023-12-15 2025-06-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd70 targeting in cancer with acquired resistance to targeted therapeutic agents
WO2025159480A1 (ko) * 2024-01-26 2025-07-31 에스지메디칼 주식회사 이중항체와 car-t의 병용 요법
WO2025214438A1 (zh) * 2024-04-10 2025-10-16 浙江纳米抗体技术中心有限公司 结合cd19和/或cd22的抗原结合分子及其用途
WO2025235408A1 (en) * 2024-05-05 2025-11-13 Duke University Compositions comprising scfv sequences targeting cancer antigens and methods of use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
US20140099309A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a Trans-Signaling Approach in Chimeric Antigen Receptors
WO2014130635A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
US20140271635A1 (en) * 2013-03-16 2014-09-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using humanized anti-cd19 chimeric antigen receptor

Family Cites Families (395)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4433059A (en) 1981-09-08 1984-02-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Double antibody conjugate
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
DE3381783D1 (de) 1982-03-03 1990-09-13 Genentech Inc Menschliches antithrombin iii, dns sequenzen dafuer, expressions- und klonierungsvektoren die solche sequenzen enthalten und damit transformierte zellkulturen, verfahren zur expression von menschlichem antithrombin iii und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4882282A (en) 1985-08-16 1989-11-21 Immunex Corporation DNA sequences encoding bovine interleukin-2
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
JPH021556A (ja) 1988-06-09 1990-01-05 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ハイブリッド抗体及びその作製方法
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5273743A (en) 1990-03-09 1993-12-28 Hybritech Incorporated Trifunctional antibody-like compounds as a combined diagnostic and therapeutic agent
GB9012995D0 (en) 1990-06-11 1990-08-01 Celltech Ltd Multivalent antigen-binding proteins
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
DK0517895T3 (da) 1990-12-14 1997-04-07 Univ California Kimæriske kæder til receptorforbundne signaltransduktionsveje
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
IL101147A (en) 1991-03-07 2004-06-20 Gen Hospital Corp Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
KR100254759B1 (ko) 1992-01-23 2000-05-01 플레믹 크리스티안 단량체 및 이량체 항체-단편 융합 단백질
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
EP0640130B1 (en) 1992-05-08 1998-04-15 Creative Biomolecules, Inc. Chimeric multivalent protein analogues and methods of use thereof
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0672068A4 (en) 1992-09-25 1997-02-26 Commw Scient Ind Res Org TARGET MOLECULES BINDING POLYPEPTIDES.
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
DE69232604T2 (de) 1992-11-04 2002-11-07 City Of Hope Duarte Antikörperkonstrukte
GB9323648D0 (en) 1992-11-23 1994-01-05 Zeneca Ltd Proteins
US5837242A (en) 1992-12-04 1998-11-17 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US7211259B1 (en) 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
CA2429027C (en) 1993-09-16 2011-04-05 Indiana University Foundation Antibodies against human receptor h4-1bb
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
AU694222B2 (en) 1994-05-02 1998-07-16 Bernd Groner Bifunctional protein, preparation and use
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
WO1996013583A2 (en) 1994-10-20 1996-05-09 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Targeted hetero-association of recombinant proteins to multi-functional complexes
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
PT871495E (pt) 1995-02-24 2005-10-31 Gen Hospital Corp Redireccionamento de imunidade celular atraves de receptores quimericos
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
CA2222055A1 (en) 1995-05-23 1996-11-28 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Multimeric proteins
AU6873396A (en) 1995-10-16 1997-05-07 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
CA2244363C (en) 1996-02-28 2006-11-14 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Synthetic derivatives of rapamycin as multimerizing agents for chimeric proteins with immunophilin-derived domains
US5874240A (en) 1996-03-15 1999-02-23 Human Genome Sciences, Inc. Human 4-1BB receptor splicing variant
AU2507397A (en) 1996-04-04 1997-10-29 Unilever Plc Multivalent and multispecific antigen-binding protein
US6111090A (en) 1996-08-16 2000-08-29 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
DE69738749D1 (de) 1996-08-16 2008-07-17 Schering Corp Zelloberflächen-antigen aus säugetieren und verwandte reagenzien
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
JP2002512502A (ja) 1996-10-25 2002-04-23 セル・ジェネシス・インコーポレイテッド 癌細胞の標的細胞溶解
JP2002505574A (ja) 1997-04-30 2002-02-19 エンゾン，インコーポレイテッド ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CA2304254C (en) 1997-06-11 2012-05-22 Hans Christian Thogersen Trimerising module
JP3614866B2 (ja) 1997-06-12 2005-01-26 リサーチ コーポレイション テクノロジーズ，インコーポレイティド 人工抗体ポリペプチド
GB9713473D0 (en) 1997-06-25 1997-09-03 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US20030060444A1 (en) 1997-06-25 2003-03-27 Celltech Therapeutics, Ltd. Cell activation process and reagents therefor
EP1017716A4 (en) 1997-09-19 2001-01-03 Gen Hospital Corp Car receptors and related molecules and methods
CA2308114A1 (en) 1997-10-21 1999-04-29 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins tr11, tr11sv1, and tr11sv2
AU2152299A (en) 1997-10-27 1999-05-24 Unilever Plc Multivalent antigen-binding proteins
PT1047449E (pt) 1997-10-28 2004-04-30 Univ British Columbia Composicoes imunologicas e metodos de utilizacao para alterar transitoriamente a mielina do sistema nervoso central mamifero para promover a regeneracao neuronal
DE69922159T2 (de) 1998-01-23 2005-12-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Mehrzweck-antikörperderivate
IL137409A0 (en) 1998-02-09 2001-07-24 Genentech Inc Novel tumor necrosis factor receptor homolog and nucleic acids encoding the same
US20040040047A1 (en) 1998-03-30 2004-02-26 Spencer David M. Regulated apoptosis using chemically induced dimerization of apoptosis factors
HUP9900956A2 (hu) 1998-04-09 2002-04-29 Aventis Pharma Deutschland Gmbh. Egyláncú, több antigéntkötőhely kialakítására képes molekulák, előállításuk és alkalmazásuk
JP4843138B2 (ja) 1998-04-15 2011-12-21 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド Ｔ細胞阻害性受容体組成物およびその使用
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809658D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
AU5728999A (en) 1998-07-28 2000-02-21 Micromet Ag Heterominibodies
EP1109921A4 (en) 1998-09-04 2002-08-28 Sloan Kettering Inst Cancer FUSION RECEPTORS SPECIFIC TO MEMBRANE SPECIFIC PROSTATIC ANTIGEN AND USES THEREOF
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
WO2000063374A1 (en) 1999-04-16 2000-10-26 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
IL147442A0 (en) 1999-07-12 2002-08-14 Genentech Inc Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovscularization by tumor necrosis factor ligand/receptor homologs
EP1235842A4 (en) 1999-10-15 2003-04-23 Univ Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9925848D0 (en) 1999-11-01 1999-12-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
AU784988B2 (en) 1999-11-10 2006-08-17 Uab Research Foundation, The Lentiviral vector transduction of hematopoietic stem cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
ATE373078T1 (de) 2000-02-24 2007-09-15 Xcyte Therapies Inc Gleichzeitige stimulation und konzentration von zellen
PL357939A1 (en) 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
EP1299419A2 (en) 2000-05-24 2003-04-09 Imclone Systems, Inc. Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
IL136511A0 (en) 2000-06-01 2001-06-14 Gavish Galilee Bio Appl Ltd Genetically engineered mhc molecules
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
CA2410551A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw (Vib) Heterodimeric fusion proteins
AU2001283496A1 (en) 2000-07-25 2002-02-05 Immunomedics, Inc. Multivalent target binding protein
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
JP4261907B2 (ja) 2000-10-20 2009-05-13 中外製薬株式会社 低分子化アゴニスト抗体
EP1334188B1 (en) 2000-11-07 2006-08-30 City of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
AU2002247826A1 (en) 2001-03-13 2002-09-24 University College London Specific binding members
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
WO2002088334A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
ATE477280T1 (de) 2001-06-28 2010-08-15 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
DE60124912T2 (de) 2001-09-14 2007-06-14 Affimed Therapeutics Ag Multimerische, einzelkettige, Tandem-Fv-Antikörper
US20030148982A1 (en) 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
AU2002357072A1 (en) 2001-12-07 2003-06-23 Centocor, Inc. Pseudo-antibody constructs
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US7638326B2 (en) 2002-01-03 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform
WO2003057171A2 (en) 2002-01-03 2003-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
JP4547911B2 (ja) 2002-02-01 2010-09-22 アリアド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド リン含有化合物およびその用途
JP2006502091A (ja) 2002-03-01 2006-01-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド クリアランス速度を高めるための二重特異性抗体点変異
EP1500665B1 (en) 2002-04-15 2011-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHODS FOR CONSTRUCTING scDb LIBRARIES
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
AU2003244817B2 (en) 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
US20050003403A1 (en) 2003-04-22 2005-01-06 Rossi Edmund A. Polyvalent protein complex
KR101351122B1 (ko) 2003-05-09 2014-01-14 듀크 유니버시티 Ｃｄ２０-특이적 항체 및 이를 이용한 방법
US7402431B2 (en) 2004-03-01 2008-07-22 Immunovative Therapies, Ltd. T-cell therapy formulation
KR20060052681A (ko) 2003-05-23 2006-05-19 와이어쓰 Ｇｉｔｒ 리간드, ｇｉｔｒ 리간드-연관 분자, 항체 및그의 용도
WO2005000898A2 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
AU2004255216B2 (en) 2003-07-01 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
EP1660126A1 (en) 2003-07-11 2006-05-31 Schering Corporation Agonists or antagonists of the clucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor (gitr) or its ligand for the treatment of immune disorders, infections and cancer
US7696322B2 (en) 2003-07-28 2010-04-13 Catalent Pharma Solutions, Inc. Fusion antibodies
CA2536238C (en) 2003-08-18 2015-04-07 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
US8198020B2 (en) 2003-08-22 2012-06-12 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
CA2537055A1 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk COMPOSITION OF CONDENSED PROTEINS
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US20050113564A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
JP2007518399A (ja) 2003-12-02 2007-07-12 ジェンザイム コーポレイション 肺癌を診断および治療する組成物並びに方法
US20050136051A1 (en) 2003-12-22 2005-06-23 Bernard Scallon Methods for generating multimeric molecules
GB0329825D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Celltech R&D Ltd Biological products
US20050266425A1 (en) 2003-12-31 2005-12-01 Vaccinex, Inc. Methods for producing and identifying multispecific antibodies
US8383575B2 (en) 2004-01-30 2013-02-26 Paul Scherrer Institut (DI)barnase-barstar complexes
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
AU2005250408B2 (en) 2004-05-27 2010-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
EP1765402A2 (en) 2004-06-04 2007-03-28 Duke University Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
WO2006020258A2 (en) 2004-07-17 2006-02-23 Imclone Systems Incorporated Novel tetravalent bispecific antibody
US20060204493A1 (en) 2004-09-02 2006-09-14 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
US7462697B2 (en) 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
WO2006060878A1 (en) 2004-12-10 2006-06-15 Peter Maccallum Cancer Institute Methods and compositions for adoptive immunotherapy
PT2343320T (pt) 2005-03-25 2018-01-23 Gitr Inc Anticorpos anti-gitr e as suas utilizações
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
CN101484182B (zh) 2005-04-06 2014-06-11 Ibc药品公司 由同二聚体、同四聚体或二聚体的二聚体组成的稳定连接复合体的生产方法及用途
ES2707152T3 (es) 2005-04-15 2019-04-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
MX2007013978A (es) 2005-05-09 2008-02-22 Ono Pharmaceutical Co Anticuerpos monoclonales humanos a muerte programada 1 (pd-1) y metodos para tratamiento de cancer utilizando anticuerpos anti-pd-1 solos o en combinacion con otros inmunoterapeuticos.
EP1899364B2 (en) 2005-05-17 2024-10-30 University of Connecticut Compositions and methods for immunomodulation in an organism
US20060263367A1 (en) 2005-05-23 2006-11-23 Fey Georg H Bispecific antibody devoid of Fc region and method of treatment using same
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
NZ612578A (en) 2005-08-19 2014-11-28 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
ATE452913T1 (de) 2005-08-26 2010-01-15 Pls Design Gmbh Bivalente igy antikörperkonstrukte für diagnostische und therapeutische anwendungen
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
US8623356B2 (en) 2005-11-29 2014-01-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerization-activated therapeutic agents
PT2529747T (pt) 2005-12-02 2018-05-09 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
EP1984505B1 (en) 2006-01-13 2019-12-25 The Government of the U.S.A., as repr. by the Secretary, Dept. of Health & Human Services, the Nat. Inst. of Health Codon optimized il-15 and il-15r-alpha genes for expression in mammalian cells
US20110212086A1 (en) 2006-01-19 2011-09-01 Genzyme Corporation GITR Antibodies For The Treatment of Cancer
MX2008010561A (es) 2006-02-15 2009-03-02 Imclone Systems Inc Anticuerpos funcionales.
BRPI0709598A8 (pt) 2006-03-17 2019-01-08 Biogen Idec Inc composições de polipeptídeos estabilizados
WO2007112362A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 The Regents Of The University Of California Construction of a multivalent scfv through alkyne-azide 1,3-dipolar cycloaddition
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
DK2009101T3 (en) 2006-03-31 2018-01-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody modification method for purification of a bispecific antibody
ES2469676T3 (es) 2006-05-25 2014-06-18 Bayer Intellectual Property Gmbh Complejos moleculares dim�ricos
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
MX363905B (es) 2006-06-12 2019-04-08 Aptevo Res & Development Llc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
US8497246B2 (en) 2006-08-18 2013-07-30 Armagen Technologies, Inc. Methods for diagnosing and treating CNS disorders by trans-blood-brain barrier delivery of protein compositions
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP2526934B1 (en) 2006-09-22 2015-12-09 Pharmacyclics LLC Inhibitors of bruton's tyrosine kinase
WO2008045437A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
EP1916259A1 (en) 2006-10-26 2008-04-30 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Anti-glycoprotein VI SCFV fragment for treatment of thrombosis
WO2008055068A2 (en) 2006-10-28 2008-05-08 Methylgene Inc. Inhibitors of histone deacetylase
BRPI0716680A2 (pt) 2006-11-02 2013-09-24 Daniel J Capon "composto, multÍmero, composiÇço, mÉtodo de afetar a atividade de um alvo, complexo, processo de produÇço do composto, mÉtodo de produÇço de um extensço de aminoÁcidos consecutivos, processo de produÇço de uma extensço de aminoacidos consecutivos , processo para a produÇço de um composto , mÉtodo de produÇço de uma proteina e polipeptÍdeo"
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
WO2008140621A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Transgenic oncolytic viruses and uses thereof
CA2584494A1 (en) 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
CA2681974C (en) 2007-03-29 2019-12-31 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
PT2856876T (pt) 2007-03-30 2018-03-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Expressão constitutiva de ligantes co-estimulatórios em linfócitos t adotivamente transferidos
EP2144930A1 (en) 2007-04-18 2010-01-20 ZymoGenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
KR20100044160A (ko) 2007-06-12 2010-04-29 와이어쓰 엘엘씨 항-ｃｄ20 치료 조성물 및 방법
WO2009002562A2 (en) 2007-06-27 2008-12-31 Marine Polymer Technologies, Inc. Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
DK2175884T3 (en) 2007-07-12 2016-09-26 Gitr Inc Combination USING GITR BINDING MOLECULES
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
US9624309B2 (en) 2007-08-15 2017-04-18 Bayer Intellectual Property Gmbh Monospecific and multispecific antibodies and method of use
CA2703947C (en) 2007-10-26 2018-12-04 Governing Council Of The University Of Toronto Therapeutic and diagnostic methods using tim-3
JP2011504740A (ja) 2007-11-27 2011-02-17 アブリンクス エン．ヴェー． ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド
UY31504A1 (es) 2007-11-30 2009-07-17 Construcciones de union de antigenos
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
WO2009097140A1 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods for off -the -shelf tumor immunotherapy using allogeneic t-cell precursors
US8379824B2 (en) 2008-03-06 2013-02-19 At&T Intellectual Property I, Lp Methods and apparatus to provide a network-based caller identification service in a voice over internet protocol network
CL2009000713A1 (es) 2008-03-25 2010-04-09 Hoffmann La Roche Composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo anti-cd20 de tipo ii con citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ccda) aumentada y uno o mas agentes quimioterapeuticos; y su uso para tratar un cancer que expresa cd20.
WO2009124109A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 The Government Of The U.S. A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health &Human Services Human monoclonal antibodies specific for cd22
EP2310508A1 (en) 2008-07-02 2011-04-20 Emergent Product Development Seattle, LLC Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
JPWO2010030002A1 (ja) 2008-09-12 2012-02-02 国立大学法人三重大学 外来性ｇｉｔｒリガンド発現細胞
PL2344539T3 (pl) 2008-11-07 2015-07-31 Amgen Res Munich Gmbh Leczenie pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej
WO2010085660A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Roger Williams Hospital Viral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same
RU2011135768A (ru) 2009-01-29 2013-03-10 Эбботт Лэборетриз Белки, связывающие il-1
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
EA201190132A1 (ru) 2009-02-23 2013-01-30 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гуманизированные антитела, связывающиеся с cd19, и их применение
AU2010245011B2 (en) 2009-04-27 2015-09-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
NZ714757A (en) 2009-08-14 2018-07-27 Us Gov Health & Human Services Use of il-15 to increase thymic output and to treat lymphopenia
RU2595409C2 (ru) 2009-09-03 2016-08-27 Мерк Шарп И Доум Корп., Анти-gitr-антитела
AU2010301042B2 (en) 2009-10-01 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
HRP20190556T1 (hr) 2009-11-03 2019-06-14 City Of Hope SKRAĆENI OBLIK RECEPTORA EPIDERMALNOG FAKTORA RASTA ZA (EGFRt) ODABIR TRANSDUCIRANIH T-STANICA
JP5856073B2 (ja) 2009-12-29 2016-02-09 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー Ｒｏｎ結合構築体およびその使用方法
WO2011097477A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
LT2560993T (lt) 2010-04-20 2024-10-10 Genmab A/S Baltymai, kurių sudėtyje yra heterodimerinio antikūno fc, ir jų gamybos būdai
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
US9242014B2 (en) 2010-06-15 2016-01-26 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) single chain Fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
NZ609967A (en) 2010-10-27 2015-04-24 Baylor College Medicine Chimeric cd27 receptors for redirecting t cells to cd70-positive malignancies
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US9233125B2 (en) 2010-12-14 2016-01-12 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing T cells and methods of treating cancer
CA3179835A1 (en) 2011-01-18 2012-07-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
WO2012127464A2 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd Constitutively activated t cells for use in adoptive cell therapy
CN110200997A (zh) 2011-03-23 2019-09-06 弗雷德哈钦森癌症研究中心 用于细胞免疫治疗的方法和组合物
SG193956A1 (en) 2011-04-01 2013-11-29 Sloan Kettering Inst Cancer T cell receptor-like antibodies specific for a wt1 peptide presented by hla-a2
JP6066991B2 (ja) 2011-04-08 2017-01-25 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ キメラサイトカイン受容体を用いて、腫瘍微小環境の影響を逆転する方法
US9266960B2 (en) 2011-04-08 2016-02-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant III chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
EP4488370A2 (en) 2011-07-25 2025-01-08 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expresssion of dux4
CN104114233B (zh) 2011-07-29 2021-11-12 宾夕法尼亚大学董事会 转换共刺激受体
WO2013021628A1 (ja) 2011-08-08 2013-02-14 パナソニック株式会社 半導体装置
US9833476B2 (en) 2011-08-31 2017-12-05 The Trustees Of Dartmouth College NKP30 receptor targeted therapeutics
US20130108641A1 (en) 2011-09-14 2013-05-02 Sanofi Anti-gitr antibodies
WO2013040371A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
BR112014006176A8 (pt) 2011-09-16 2017-09-12 Univ Pennsylvania Rna transcrito in vitro ou rna sintético, composição, método para gerar uma população de células t geneticamente modificadas por rna, e, uso de uma célula t geneticamente modificada
CN103946242A (zh) 2011-10-20 2014-07-23 美国卫生和人力服务部 抗cd22嵌合抗原受体
PT2771364T (pt) 2011-10-27 2019-09-10 Genmab As Produção de proteínas heterodiméricas
US20130131139A1 (en) 2011-11-17 2013-05-23 Oregon Health & Science University Ror1 as a gene target in acute lymphoblastic leukemia
EP2817331B1 (en) 2012-02-22 2023-08-30 The Trustees of the University of Pennsylvania Use of the cd2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors
CN104159909A (zh) 2012-02-22 2014-11-19 宾夕法尼亚大学董事会 产生用于癌症治疗的t细胞持续性群体的组合物和方法
EA201491574A1 (ru) 2012-02-22 2014-12-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Применение car, основанных на icos, для усиления противоопухолевой активности и длительного сохранения car
EP2826963B1 (en) 2012-03-16 2021-01-13 Nittan Valve Co., Ltd. Mechanical lash adjuster
CN103483452B (zh) 2012-06-12 2021-08-13 上海细胞治疗集团有限公司 双信号独立的嵌合抗原受体及其用途
KR20210149195A (ko) 2012-07-13 2021-12-08 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 형질도입된 ｔ 세포의 투여 적합성을 평가하는 방법
IN2015DN00139A (zh) 2012-07-13 2015-06-12 Univ Pennsylvania
MX2015000426A (es) * 2012-07-13 2015-07-14 Univ Pennsylvania Incremento de actividad de celulas t car mediante cointroduccion de un anticuerpo biespecifico.
US20160235787A1 (en) 2012-07-13 2016-08-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Epitope Spreading Associated with CAR T-Cells
JP6382191B2 (ja) 2012-07-13 2018-08-29 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア Ｃａｒの抗腫瘍活性のための毒性管理
CN104507537A (zh) 2012-07-13 2015-04-08 宾夕法尼亚大学董事会 用于调节car t细胞的组合物和方法
SI2884999T2 (sl) 2012-08-20 2026-01-30 Fred Hutchinson Cancer Center Metoda in sestavki za celično imunoterapijo
WO2014039513A2 (en) 2012-09-04 2014-03-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive t cell transfer
EP2904106A4 (en) 2012-10-01 2016-05-11 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHOD FOR TARGETING CURRIC ACIDS FOR THE TREATMENT OF CANCER
SG11201502598SA (en) 2012-10-02 2015-05-28 Sloan Kettering Inst Cancer Compositions and methods for immunotherapy
JP6338252B2 (ja) 2012-10-24 2018-06-06 アメリカ合衆国 Ｍ９７１キメラ抗原受容体
KR102417657B1 (ko) 2013-02-06 2022-07-07 안트로제네시스 코포레이션 개선된 특이성을 갖는 변경된 t 림프구
ES2653487T3 (es) 2013-02-15 2018-02-07 The Regents Of The University Of California Receptor de antígeno quimérico y métodos de uso del mismo
HUE046961T2 (hu) 2013-02-20 2020-04-28 Univ Pennsylvania Rák kezelése humanizált EGFRVIII elleni kiméra antigénreceptor alkalmazásával
WO2014138704A1 (en) 2013-03-07 2014-09-12 Baylor College Of Medicine Targeting cd138 in cancer
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
MY180687A (en) 2013-03-14 2020-12-07 Icahn School Med Mount Sinai Newcastle disease viruses and uses thereof
US9944690B2 (en) 2013-03-14 2018-04-17 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlling T cell proliferation
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
AU2014268364A1 (en) 2013-05-24 2015-12-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
CA2912172A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing partial apoptosis using caspase polypeptides
AU2014337385B2 (en) 2013-10-15 2020-04-30 The Scripps Research Institute Chimeric antigen receptor T cell switches and uses thereof
HUE051523T2 (hu) * 2013-11-21 2021-03-01 Ucl Business Ltd Sejt
US9512084B2 (en) 2013-11-29 2016-12-06 Novartis Ag Amino pyrimidine derivatives
HRP20240939T1 (hr) 2013-12-17 2024-10-25 Genentech, Inc. Anti-cd3 protutijela i metode uporabe
BR112016013187A2 (pt) 2013-12-19 2017-09-26 Novartis Ag receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humanos e usos dos mesmos
JP2017504601A (ja) 2013-12-20 2017-02-09 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 免疫療法のためにマルチインプットシグナル感受性ｔ細胞を操作する方法
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
EP3097117B1 (en) 2014-01-21 2023-10-04 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
US20170081411A1 (en) 2014-03-15 2017-03-23 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
MX382033B (es) 2014-03-19 2025-03-13 Infinity Pharmaceuticals Inc Compuestos heterocíclicos para utilizarlos en el tratamiento de trastornos mediados por pi3k-gamma.
MX395149B (es) 2014-04-07 2025-03-24 Novartis Ag Terapias de combinación que comprenden un receptor quimérico de antígeno cd19 para el cáncer.
CN106661570B (zh) * 2014-04-10 2020-02-07 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 通过与氨甲蝶呤选择偶联的睡美人转座子制备工程化t细胞
EP3137498A1 (en) 2014-05-02 2017-03-08 Cellectis Cs1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
US20170226495A1 (en) 2014-07-21 2017-08-10 Novartis Ag Sortase molecules and uses thereof
US9777061B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
MX2017001011A (es) 2014-07-21 2018-05-28 Novartis Ag Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma.
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US20170274014A1 (en) 2014-07-21 2017-09-28 Jennifer Brogdon Combinations of low, immune enhancing, doses of mtor inhibitors and cars
AR101829A1 (es) 2014-07-21 2017-01-18 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno cll-1
US20170209492A1 (en) 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
JP6919118B2 (ja) 2014-08-14 2021-08-18 ノバルティス アーゲー ＧＦＲα−４キメラ抗原受容体を用いる癌の治療
TW202140557A (zh) 2014-08-19 2021-11-01 瑞士商諾華公司 使用cd123嵌合抗原受體治療癌症
KR20210149228A (ko) 2014-09-17 2021-12-08 노파르티스 아게 입양 면역요법을 위한 키메라 수용체에 의한 세포독성 세포의 표적화
CA2963935A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
US20170239294A1 (en) 2014-10-15 2017-08-24 Novartis Ag Compositions and methods for treating b-lymphoid malignancies
WO2016100232A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
BR112017013690A2 (pt) 2014-12-24 2018-03-06 Ucl Business Plc célula
EP4036109A3 (en) 2014-12-29 2022-10-12 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2016115482A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Novartis Pharma Ag Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
WO2016126608A1 (en) * 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
WO2016149578A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Dual specific anti-cd22-anti-cd19 chimeric antigen receptors
WO2016164580A1 (en) * 2015-04-07 2016-10-13 Novartis Ag Combination of chimeric antigen receptor therapy and amino pyrimidine derivatives
CN119925616A (zh) 2015-04-08 2025-05-06 诺华股份有限公司 Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体（car）表达细胞的联合疗法
CA2982996A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 David Maxwell Barrett Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
GB201507111D0 (en) 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic acid construct
TW202444897A (zh) 2015-06-25 2024-11-16 美商生物細胞基因治療有限公司 嵌合抗原受體(car)、組合物及其使用方法
TWI859112B (zh) 2015-07-21 2024-10-21 瑞士商諾華公司 改良免疫細胞之功效及擴展之方法
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN108780084B (zh) 2015-09-03 2022-07-22 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
IL297003A (en) 2015-09-17 2022-12-01 Novartis Ag car-t cell treatments with improved efficacy
EP3393504B1 (en) 2015-12-22 2025-09-24 Novartis AG Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
EP3397755B1 (en) 2015-12-28 2024-11-06 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells
EP3397756B1 (en) 2015-12-30 2023-03-08 Novartis AG Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
KR20180118175A (ko) 2016-03-04 2018-10-30 노파르티스 아게 다중 키메라 항원 수용체 (car) 분자를 발현하는 세포 및 그에 따른 용도
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
CN105949317B (zh) 2016-04-12 2019-07-02 上海优卡迪生物医药科技有限公司 抗cd20嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
JP7497955B6 (ja) 2016-04-15 2024-07-01 ノバルティス アーゲー 選択的タンパク質発現のための組成物および方法
EP3464375A2 (en) 2016-06-02 2019-04-10 Novartis AG Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
AU2017295886C1 (en) 2016-07-15 2024-05-16 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
TW202508628A (zh) 2016-07-28 2025-03-01 瑞士商諾華公司 嵌合抗原受體及pd-1抑制劑之組合療法
JP2019527696A (ja) 2016-08-01 2019-10-03 ノバルティス アーゲー プロｍ２マクロファージ分子の阻害剤と組み合わせてキメラ抗原受容体を用いる癌の処置
CN110582488A (zh) 2016-09-30 2019-12-17 诺华股份有限公司 具有增强功效的免疫效应细胞疗法
CN110225927B (zh) 2016-10-07 2024-01-12 诺华股份有限公司 用于治疗癌症的嵌合抗原受体
EP4043485A1 (en) 2017-01-26 2022-08-17 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
JP2020506700A (ja) 2017-01-31 2020-03-05 ノバルティス アーゲー 多重特異性を有するキメラｔ細胞受容体タンパク質を用いた癌の治療
US20200048359A1 (en) 2017-02-28 2020-02-13 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
CN110832075A (zh) 2017-03-22 2020-02-21 诺华股份有限公司 用于免疫肿瘤学的组合物和方法
JP2020513828A (ja) 2017-03-22 2020-05-21 ノバルティス アーゲー 増強された有効性を有するバイオマーカー及びｃａｒ ｔ細胞療法
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN110650975B (zh) 2017-05-15 2024-04-05 美国卫生和人力服务部 双顺反子嵌合抗原受体及其用途
US11999802B2 (en) 2017-10-18 2024-06-04 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
RU2020116579A (ru) 2017-10-25 2021-11-25 Новартис Аг Способы получения клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор
WO2019099639A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Navartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
US20200371091A1 (en) 2017-11-30 2020-11-26 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
WO2019136432A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US20200061113A1 (en) 2018-04-12 2020-02-27 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy characterization assays and uses thereof
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210396739A1 (en) 2018-05-01 2021-12-23 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
US20200085869A1 (en) 2018-05-16 2020-03-19 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor therapies
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
CA3100724A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag B-cell maturation antigen protein (bcma) chimeric antigen receptors and uses thereof
HRP20251135T1 (hr) 2018-08-31 2025-11-21 Novartis Ag Postupci dobivanja kimernih stanica koje eksprimiraju antigenske receptore
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3856782A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Novartis AG Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
WO2020069405A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
CN114761037A (zh) 2019-11-26 2022-07-15 诺华股份有限公司 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途
IL292924A (en) 2019-11-26 2022-07-01 Novartis Ag Chimeric antigen receptors cd19 and cd22 and their uses
WO2021163618A1 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Novartis Ag Method of predicting response to chimeric antigen receptor therapy
TW202146441A (zh) 2020-02-27 2021-12-16 瑞士商諾華公司 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法
IL295878A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods for producing cells expressing a chimeric antigen receptor
KR20230024967A (ko) 2020-06-11 2023-02-21 노파르티스 아게 Zbtb32 억제제 및 이의 용도
IL300489A (en) 2020-08-21 2023-04-01 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo production of CAR expressing cells
AU2021378316A1 (en) 2020-11-13 2023-06-01 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
US20140099309A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a Trans-Signaling Approach in Chimeric Antigen Receptors
WO2014130635A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
US20140271635A1 (en) * 2013-03-16 2014-09-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using humanized anti-cd19 chimeric antigen receptor

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110913871A (zh) * 2017-05-17 2020-03-24 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 生成哺乳动物t细胞活化诱导型合成启动子(syn+pro)以改善t细胞疗法
CN110913871B (zh) * 2017-05-17 2024-02-23 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 生成哺乳动物t细胞活化诱导型合成启动子(syn+pro)以改善t细胞疗法
CN109021114A (zh) * 2018-08-08 2018-12-18 武汉波睿达生物科技有限公司 联合两种单链抗体的双特异性嵌合抗原受体及表达载体
CN112955172A (zh) * 2018-09-17 2021-06-11 美国卫生和人力服务部 靶向cd19和cd20的双顺反子嵌合抗原受体及其用途
WO2020108646A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Beijing Meikang Geno-Immune Biotechnology Co., Ltd. Cd19-and psma-based combined car-t immunotherapy
WO2020151752A1 (zh) * 2019-01-22 2020-07-30 亘喜生物科技（上海）有限公司 Cd20组合靶向的工程化免疫细胞
CN113330038A (zh) * 2019-01-22 2021-08-31 亘喜生物科技（上海）有限公司 Cd20组合靶向的工程化免疫细胞
CN114026128A (zh) * 2019-04-30 2022-02-08 阿塔拉生物制药股份有限公司 抗原特异性靶向cd19的car-t细胞
CN113840912A (zh) * 2019-05-16 2021-12-24 南京传奇生物科技有限公司 包含识别分子的工程化免疫细胞
CN114502587A (zh) * 2019-07-30 2022-05-13 普瑞文森生物有限公司 通过非耗竭性b细胞抑制剂降低免疫原性的方法和组合物
CN114729013A (zh) * 2019-08-21 2022-07-08 艾佩斯瑞生物制药公司 抗cd22抗体及其用途
CN114729013B (zh) * 2019-08-21 2025-01-17 艾佩斯瑞生物制药公司 抗cd22抗体及其用途
CN114729305A (zh) * 2019-10-17 2022-07-08 苏州丹罗医药有限公司 用于免疫治疗的嵌合抗原受体、制备方法及其应用
CN114786723A (zh) * 2019-10-31 2022-07-22 莫佛塞斯公司 序贯抗cd19疗法
CN114945590A (zh) * 2019-11-18 2022-08-26 詹森生物科技公司 抗cd79嵌合抗原受体、car-t细胞及其用途
CN115087466A (zh) * 2019-12-12 2022-09-20 森迪生物科学公司 用于细胞的调控装甲的方法和组合物
CN113493517B (zh) * 2020-04-02 2023-05-02 重庆精准生物技术有限公司 双特异性单链抗体及其构建的嵌合抗原受体和应用
CN113493520A (zh) * 2020-04-02 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 靶向双特异性位点的双car及其应用
CN113493517A (zh) * 2020-04-02 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 双特异性单链抗体及其构建的嵌合抗原受体和应用
CN113493516A (zh) * 2020-04-02 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 靶向双特异性位点的嵌合抗原受体及其应用
CN113493524A (zh) * 2020-04-03 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN111944850B (zh) * 2020-08-28 2023-03-31 澳门大学 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用
CN111944850A (zh) * 2020-08-28 2020-11-17 澳门大学 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用
CN112480258A (zh) * 2020-12-11 2021-03-12 华道(上海)生物医药有限公司 抗cd123纳米抗体及其应用
WO2024086191A3 (en) * 2022-10-18 2024-05-30 Kite Pharma, Inc. Car-t constructs comprising a novel cd19 binder combined with il18 and methods of using the same
WO2025146143A1 (zh) * 2024-01-05 2025-07-10 南京传奇生物科技有限公司 治疗自身免疫疾病的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230374105A1 (en) 2023-11-23
PL3280729T3 (pl) 2022-08-22
WO2016164731A2 (en) 2016-10-13
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AU2016245958A8 (en) 2019-08-08
IL254817B1 (en) 2023-08-01
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SG10201913731UA (en) 2020-03-30
WO2016164731A3 (en) 2016-11-10
KR20170134642A (ko) 2017-12-06
CA2981751A1 (en) 2016-10-13
TW201639963A (zh) 2016-11-16
ES3009008T3 (en) 2025-03-25
US10253086B2 (en) 2019-04-09
JP2023065434A (ja) 2023-05-12
CN119925616A (zh) 2025-05-06
CN108350058B (zh) 2022-03-18
AU2016245958B2 (en) 2021-09-09
LT3280729T (lt) 2022-08-10
JP6961490B2 (ja) 2021-11-05
US20190292238A1 (en) 2019-09-26
CO2017010190A2 (es) 2018-01-05
EP4056588A1 (en) 2022-09-14
AU2021282477A1 (en) 2022-01-06
AU2016245958A1 (en) 2017-10-19
MX2022006568A (es) 2022-07-11
MX2017012939A (es) 2018-05-22
JP2018518939A (ja) 2018-07-19
DK3280729T3 (da) 2022-07-25
US20160362472A1 (en) 2016-12-15
SG11201708191XA (en) 2017-11-29
RU2017134652A (ru) 2019-04-09
US20220195010A1 (en) 2022-06-23
TWI746437B (zh) 2021-11-21
RU2021121771A (ru) 2022-01-12
JP2022025086A (ja) 2022-02-09
EP4056588B1 (en) 2024-09-25
RU2017134652A3 (zh) 2020-03-27
RU2752918C2 (ru) 2021-08-11
ES2923894T3 (es) 2022-10-03
PT3280729T (pt) 2022-08-01
EP3280729A2 (en) 2018-02-14
US11149076B2 (en) 2021-10-19
EP3280729B1 (en) 2022-04-27
JP7227331B2 (ja) 2023-02-21
US12344657B2 (en) 2025-07-01
HRP20220893T1 (hr) 2022-10-14
IL254817B2 (en) 2023-12-01
HUE059218T2 (hu) 2022-11-28
EP4491715A3 (en) 2025-06-18

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