CN114026128A - 抗原特异性靶向cd19的car-t细胞 - Google Patents

Abstract

公开了用于癌症(如血液癌症)的靶向治疗的组合物和方法。特别地，公开了嵌合抗原受体(CAR)T细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)T细胞可以与过继性细胞转移使用以降低的抗原逃逸靶向并且杀伤癌症细胞。因此，还公开了在患有血液癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法涉及所公开的CAR T细胞的过继性转移。

Description

抗原特异性靶向CD19的CAR-T细胞

相关申请

本申请要求于2019年04月30日提交的美国临时专利申请序列号62/840,774(其通过引用被整体并入)的优先权权益。

背景

血液恶性肿瘤代表儿童和成人两者中存在的最常见的癌症中的一些。例如，每年大约4000个侵袭性B细胞谱系恶性肿瘤B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的原发病例在美国被诊断，并且代表儿童期最常见的恶性肿瘤。诱导正常淋巴成熟的异常停止、细胞凋亡的逃避和不受控的细胞增殖的基因突变造成B细胞成淋巴细胞的过度产生。在成人中，每年发生超过6000个急性淋巴细胞白血病(ALL)的病例。(Hanahan,D.and Weinberg,R.(2000)Thehallmarks of cancer.Cell 100:57-70；Teitell,M.and Pandolfi,P.(2009)Moleculargenetics of acute lymphoblastic leukemia.Annu Rev Pathol 4:175-198)。此外，在美国，淋巴瘤(例如，淋巴组织的赘生物)占全部癌症病例的大约5％。主要类别为淋巴细胞的恶性赘生物(即，癌症)(一种存在于淋巴和血液两者中的细胞类型)。以这种方式，淋巴瘤和白血病两者都是造血组织和淋巴组织的恶性肿瘤(例如，肿瘤)。作为淋巴组织增生性紊乱，淋巴瘤和淋巴样白血病密切相关，以致于其中一些被称为任一名称(例如，成人T细胞白血病/淋巴瘤)。

临床前研究工作和临床研究工作已经着重于研究免疫治疗方式(包含针对高危癌症的基于抗体的细胞疗法和/或过继性细胞疗法)。这样的策略依赖于肿瘤相关抗原，以便能够特异性靶向癌症细胞并且不损害非癌症细胞(即，脱靶效应(on target/off tumoreffect)或旁观者效应)。已经给予过继性免疫疗法方法特别的关注，过继性免疫疗法方法涉及具有合成的嵌合抗原受体(CAR)的人类免疫效应细胞的基因工程，合成的嵌合抗原受体(CAR)以主要组织相容性复合体(MHC)抗原非依赖性方式靶向在细胞表面上表达的肿瘤相关抗原。不受任何特定理论的束缚，在T细胞上表达的CAR与癌症相关抗原的接合造成经由T细胞共刺激域的细胞内信号传导、以及随后CAR T细胞的扩增，以诱导进一步的癌症细胞杀伤。然而，尽管来自早期试验的积极结果，但CD19 CAR T细胞向患者中的输注仍然造成许多不同严重程度的‘靶向(on target/on tumor)’副作用和‘脱靶’副作用(如肿瘤溶解综合征(TLS)、细胞因子释放综合征(CRS)和巨噬细胞激活综合征、中枢神经系统运输、延长的B细胞发育不全和免疫逃逸)。因此，鉴于本文描述的长期未能满足的需求，需要用于血液恶性肿瘤的改进的疗法。

概述

本发明至少部分地基于发现：B淋巴细胞抗原(如CD19(B淋巴细胞抗原CD19))可以用于血液癌症(即，造血组织和淋巴组织的癌症)的靶向治疗。在一些方面，本文提供表达嵌合抗原受体(CAR)多肽的免疫细胞，嵌合抗原受体(CAR)多肽靶向B谱系细胞和由此产生的癌症细胞。在一些实施方案中，本文公开的CAR包括B淋巴细胞抗原靶向域(如CD19结合域、CD20结合域、和/或CD22结合域)、跨膜域和细胞内信号传导域。在某些优选的实施方案中，B淋巴细胞抗原结合域靶向野生型CD19抗原和/或突变型CD19抗原。

在某些方面，本文提供双特异性嵌合抗原受体(CAR)T细胞，所述细胞表达包括选择性结合B淋巴细胞抗原(例如，与血液恶性肿瘤(如白血病和/或淋巴瘤)相关的CD19抗原、CD20抗原和/或CD22抗原)的靶向域的CAR多肽和包括选择性结合另外的不同肿瘤相关抗原的靶向域的CAR多肽。在一些这样的实施方案中，嵌合抗原受体的靶向域(例如，CD19抗原结合域和/或其他不同的肿瘤相关抗原结合域)包括功能性抗体片段。优选地，嵌合抗原受体的抗原结合域包括单链可变片段(scFv)。在最优选的实施方案中，功能性抗体片段(例如，scFv)来源于单克隆抗体FMC63。

在一些实施方案中，本文公开的CAR的跨膜域包括CD28、41BB中任何一种、其突变体、或其任何组合的至少一个跨膜域。在一些优选的实施方案中，本文公开的CAR的细胞内信号传导域包括CD3ζ、CD3ζ的突变体、或其任何组合的至少一个信号传导域。在一些实施方案中，本文公开的CAR还包括至少一个共刺激信号传导区(如包括CD28或CD28的突变体、CD137(41BB)或CD137(41BB)的突变体中的任何一种、或其任何组合的信号传导域的共刺激信号传导区)。在一些实施方案中，共刺激信号传导区含有一种或更多种细胞内信号传导分子和/或共刺激分子的1个、2个、3个或4个细胞质域。在一些实施方案中，共刺激信号传导区在CD28和/或4-1BB的细胞质域中含有一个或更多个突变，一个或更多个突变减弱或优选地增强信号传导。在某些实施方案中，表达CAR的免疫细胞不再表达一种或更多种免疫检查点分子。在一些这样的实施方案中，通过本领域已知的方法阻断和/或阻抑免疫检查点分子。

在一些实施方案中，CAR多肽含有不完整的胞内域。例如，CAR多肽可以含有细胞内信号传导域或共刺激域，但不含有细胞内信号传导域和共刺激域两者。在这些实施方案中，不激活免疫效应细胞，除非免疫效应细胞和含有缺失域的第二CAR多肽(或内源性T细胞受体)两者都结合其各自的抗原。因此，在一些实施方案中，CAR多肽含有CD3 zeta(CD3ζ)信号传导域，但不含有共刺激信号传导区(CSR)。在其他实施方案中，CAR多肽含有CD28、4-1BB、或其组合的细胞质域，但不含有CD3ζ信号传导域(SD)。

在一些方面，本文提供在受试者中治疗B淋巴细胞抗原(例如，CD19)相关癌症(例如，血液癌症(包含白血病和淋巴瘤))的方法，方法包括施用有效量的包括本文公开的表达CAR的细胞的过继性免疫疗法组合物。在一些实施方案中，过继性免疫疗法组合物的表达CAR的细胞来源于受试者(例如，自体的)。优选地，过继性免疫疗法组合物的表达CAR的细胞来源于供者样品、或者来自包括并非来源于受试者的免疫细胞(例如，同种异体的)的库或文库。例如，本文公开的方法包含从细胞库(例如，预先生成的第三方供者来源的表位特异性CTL的库)选择同种异体T细胞(例如，PBMC样品、CD4⁺T细胞、和/或CD8⁺T细胞(如CTL))。在一些实施方案中，方法还包括施用至少一种免疫检查点抑制剂。

在一些方面，本文公开编码所公开的CAR多肽的分离的核酸、以及含有与表达控制序列可操作地连接的所述分离的核酸的核酸运载体。此外，本文公开用这些运载体转染的细胞、或者以其他方式包括所公开的核酸的细胞，以及这些细胞表达和/或产生所公开的CAR多肽的应用。不旨在详尽列举，细胞可以是免疫效应细胞(如αβT细胞、γδT细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、先天淋巴样细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、或调控性T细胞)。在一些实施方案中，当CAR的抗原结合域与B淋巴细胞抗原(如CD19、CD20和/或CD22)结合时，细胞展现出抗肿瘤免疫性(例如，增高针对肿瘤的免疫应答)。

在本发明的另外的方面，本文公开在药学上可接受的载体中包括本文公开的分子的药物组合物。本文还公开用于在受试者中治疗癌症的方法，方法涉及向受试者施用治疗有效量的本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，癌症可以是例如任何表达B淋巴细胞抗原的恶性肿瘤(例如，表达CD19、CD20和/或CD22)。

在一些实施方案中，本文公开的B淋巴细胞抗原结合剂包括特异性结合B淋巴细胞表面肽(如CD19、CD20和/或CD22)的抗体片段。例如，且不限于，抗原结合域可以是特异性结合CD19、CD20和/或CD22的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。在一些这样的实施方案中，抗原结合剂是特异性结合B淋巴细胞抗原(如CD19、CD20和/或CD22)的适配体。例如，在某些实施方案中，抗原结合剂是选自基于其与B淋巴细胞抗原(如CD19、CD20和/或CD22)结合的能力的随机序列库的肽适配体，或者以其他方式包括选自基于其与B淋巴细胞抗原(如CD19、CD20和/或CD22)结合的能力的随机序列库的肽适配体。在一些实施方案中，B淋巴细胞抗原结合剂还可以包括能够结合B淋巴细胞抗原的天然配体、或其变体、和/或其片段。

本文公开的CAR(或CAR相关)多肽也可以含有能够激活免疫效应细胞的跨膜域和胞内域。例如，胞内域可以含有信号传导域和一个或更多个共刺激信号传导区。

在附图和下文描述中阐述本发明的一个或更多个实施方案的详细内容。本发明的其他特征、目的和优势将从说明书和附图以及从权利要求是显而易见的。

附图的简要说明

图1示出供者来源的靶标BLCL中CD19蛋白表达的表征。

图2示出来自电阻抗测定的数据，以评估由供者来源的EBV致敏型抗CD19 CAR-T细胞在与匹配的(自体的)或错配的靶标BLCL共培养时所诱导的靶向细胞毒性和同种异体反应性。由非转导的(NTD)EBV-CTL和表达CAR的EBV-CTL(顶部行)两者诱导细胞溶解活性。然而，CAR EBV-CTL能够响应于接触错配的靶标BLCL而诱导CD19靶向的TCR非依赖性细胞溶解活性，而NTD EBV-CTL展现出有限的EBV特异性TCR导向的细胞溶解活性。

图3示出荧光素酶测定中使用的每个靶标细胞系中CD19表达的表征。应当理解的是，K562细胞系不表达CD19抗原或EBV抗原，并且充当双重阴性对照。

图4示出荧光素酶测定数据，荧光素酶测定数据证明由EBV-CAR-T细胞诱导的靶向细胞溶解活性。EBV-CAR-T细胞展现出表达CD19的细胞系NALM6和RAJI以及被工程化为表达CD19的K562细胞的CAR导向的细胞溶解。在对照K562细胞中观察到最小的细胞溶解活性。

图5示出由非转导效应细胞诱导的非特异性细胞溶解的供者间可变性。

图6示出多个靶标细胞系的示例性细胞因子释放数据。

图7示出多个靶标细胞系的TH1促炎细胞因子释放数据。

图8示出多个靶标细胞系的TH2促炎细胞因子释放数据。

图9示出多个靶标细胞系的TH17促炎细胞因子释放数据。

图10示出多个靶标细胞系的调控性炎性细胞因子释放数据和细胞溶解细胞因子释放数据。

图11示出多个靶标细胞系的趋化性细胞因子释放数据。

图12示出多个靶标细胞系的激活细胞因子释放数据。

图13描绘了以不同E:T比率由供者014-18和靶标K562-CD19细胞生成的效应T细胞的细胞因子释放热图。

图14描绘了以不同E:T比率由供者023-18和靶标K562-CD19细胞生成的效应T细胞的细胞因子释放热图。

图15描绘了以不同E:T比率由供者009-19和靶标K562-CD19细胞生成的效应T细胞的细胞因子释放热图。

图16阐明了EBV致敏型表达抗CD19 CAR的T细胞在全身性Nalm6诱导的小鼠模型中的安全性和功效评估的研究设计。

详细的说明

详细内容

如本文所公开的，本发明至少部分地涉及重组表达靶向癌症相关B淋巴细胞抗原的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。这样的B淋巴细胞抗原包含(但不限于)CD19、CD20和CD22。在一些这样的实施方案中，抗原是CD19，并且与血液恶性肿瘤(如白血病和淋巴瘤)相关。在优选的实施方案中，免疫效应细胞(即，T细胞或天然杀伤(NK)细胞)靶向CD19，免疫效应细胞被工程化以表达选择性结合CD19的嵌合抗原受体(CAR)多肽。

T细胞疗法的重大进展是嵌合抗原受体(CAR)的开发。第一代CAR被开发为人工受体，所述人工受体在被T细胞表达时可以使T细胞重新靶向预定的疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原)。这样的CAR通常包括来源于靶标特异性抗体、与来自T细胞受体(TCR)的信号传导域(如CD3ζ)融合的单链可变片段(scFv)。在结合抗原后，CAR触发基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAMS)的磷酸化，并且启动细胞溶解、细胞因子分泌和增殖所需的信号级联，从而绕过内源性抗原处理途径和MHC限制。第二代CAR设计包含另外的信号传导域以增强激活和共刺激(如CD28和/或4-1BB)。与其早期的对应物相比，第二代CAR被观察到诱导更多的IL-2分泌，增加T细胞增殖和持久性，介导更大的肿瘤排斥，并且延长T细胞存活。通过组合多个信号传导域(如CD3ζ-CD28-OC40或CD3ζ-CD28-41BB)制成第三代CAR，以便以用更强的细胞因子产生和杀伤能力来增强效力。

在一些实施方案中，本文所描述的CAR T细胞被工程化，以便通过(例如且不限于)阻抑或抑制PD-1信号传导来抵消恶性细胞微环境(例如，肿瘤微环境)的任何致耐受性作用。在某些实施方案中，本文所描述的CAR可以对病毒抗原或非病毒抗原敏感或者选择性靶向病毒抗原或非病毒抗原。理想的靶标不应当在任何正常组织/器官上表达，或者至少不应当在重要的正常组织(心脏、肝脏、CNS、肺和其他可能对瞬时损伤特别敏感的组织)、或密切相关的正常细胞对应物(例如，干细胞和/或祖细胞)中表达，以最小化副作用(例如，脱靶效应或旁观者效应)。本文还公开免疫效应细胞(如T细胞或天然杀伤(NK)细胞)，免疫效应细胞被工程化以表达选择性结合B淋巴细胞抗原(例如，野生型CD19和/或突变型CD19)的嵌合抗原受体(CAR)多肽。因此，还公开用于在患有血液恶性肿瘤的受试者中提供靶向免疫(例如，抗肿瘤免疫性)的方法，方法涉及经工程化以表达所公开的CAR多肽的所公开的免疫效应细胞的过继性转移。

在肿瘤微环境中，癌症细胞与宿主免疫细胞相互作用，从而潜在地导致促进或抑制癌症进展。理想地，免疫系统将鉴别癌症细胞，并且动员免疫应答以消除癌症。不幸的是，在T细胞水平上，抑制性受体(如PD-1和Tim-3)的上调与T细胞功能障碍相关。这已经在患有慢性丙型肝炎病毒感染的患者的循环和肝脏中的丙型肝炎病毒(HCV)特异性CD8⁺T细胞和HCV非特异性CD8⁺T细胞两者上观察到。通过抑制PD-1和Tim-3与其各自配体(即，B7-H1，也称为PD-L1和半乳糖凝集素-9(Galectin-9))的结合，可以离体实现T细胞增殖和IFN-γ分泌的部分恢复。此外，最近的报告已经证明，IFN-α的延长施用(一种用于持续性HCV感染的标准疗法)促进原初T细胞中的端粒丢失。鉴于缩短的T细胞端粒与终末分化(特征在于减弱的增殖潜力)之间的相关性，IFN-α诱导的T细胞“耗竭”可能代表HCV感染的患者中免疫疗法的显著障碍。在本文公开的某些方面，本发明采用检查点抑制策略。检查点抑制剂疗法靶向刺激或抑制免疫应答的免疫系统的关键调控剂。可以在癌症疾病状态(例如，肿瘤)中利用这样的免疫检查点，以逃避免疫系统的攻击。检查点抑制剂研究已经注意到PD-1抑制剂疗法的活性(El-Khoueiry et al.,(2017).“Nivolumab in patients with advancedhepatocellular carcinoma(CheckMate 040):an open-label,non-comparative,phase1/2dose escalation and expansion trial.”Lancet 389(10088):2492-2502)，并且FDA已经批准纳武单抗用于HCC的二线治疗(具有20％的客观响应率)。

定义

术语“抗体”指免疫球蛋白、其保持特异性结合能力的衍生物、以及具有与免疫球蛋白结合域同源或基本上同源的结合域的蛋白质。这些蛋白质可以来源于天然来源，或者部分地或全部地以合成方式产生。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是来自任何物种的任何免疫球蛋白类别的成员(包含任何人类类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。在示例性实施方案中，与本文所描述的方法和组合物使用的抗体是IgG类别的衍生物(如抗CD19抗体、克隆FMC63)。除了完整的免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”还包含那些免疫球蛋白分子的嵌合体、片段或聚合物、以及选择性结合靶标抗原的免疫球蛋白分子的人类版本或人源化版本。

术语“抗体片段”指小于全长的抗体的任何衍生物。在示例性实施方案中，抗体片段保留全长抗体的特异性结合能力的至少重要部分。抗体片段的实例包含(但不限于)Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双体(diabody)片段、Fc片段和Fd片段。可以通过任何方式产生抗体片段。例如，抗体片段可以酶促地或者以化学方法通过完整抗体的片段化产生，可以由编码部分抗体序列的基因重组产生，或者可以全部或部分合成产生。抗体片段可以可选地为单链抗体片段。可替代地，片段可以包括例如通过二硫联接连接在一起的多个链。片段也可以可选地为多分子复合物。功能性抗体片段将通常包括至少约50个氨基酸并且更通常地将包括至少约200个氨基酸。

术语“抗原结合位点”指抗体的特异性地结合抗原上的表位的区。

术语“适配体”指与特定靶标分子结合的寡核酸或肽分子。这些分子通常选自随机序列库。所选择的适配体能够适应独特的三级结构，并且以高亲和力和特异性识别靶标分子。“核酸适配体”是经由其构象与靶标分子结合，并且从而抑制或阻抑这样的分子的功能的DNA寡核酸或RNA寡核酸。核酸适配体可以由DNA、RNA或其组合构成。“肽适配体”是具有插入到恒定支架蛋白中的可变肽序列的组合蛋白质分子。通常在严格的酵母双杂交条件下进行肽适配体的鉴别，这增强了所选择的肽适配体在细胞内环境中稳定表达和正确折叠的可能性。

术语“载体”意为一化合物、组合物、物质或结构，当与化合物或组合物组合时，所述化合物、组合物、物质或结构有助于或便利化合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或任何其他特征或者活性成分的任何降解，并且以使受试者中的任何不利副作用最小化。

术语“嵌合分子”指通过连接两个或更多个分别以其天然状态存在的分子而形成的单个分子。单个嵌合分子具有其全部组成分子的期望的功能。一种类型的嵌合分子是融合蛋白。

术语“经工程化的抗体”指一重组分子，所述重组分子包括至少一个包括来源于抗体重链和/或轻链的可变域的抗原结合位点的抗体片段，并且可以可选地包括来自任何Ig类别(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)的抗体的可变域和/或恒定域的全部或部分。

术语“表位”指抗体优先且特异性结合的抗原的区。单克隆抗体优先与分子的可以以分子构成方式定义的单个特定表位结合。在本发明中，可以由多特异性抗体识别多个表位。

术语“融合蛋白”指两个或更多个多肽通过在一种多肽的氨基末端与另一种多肽的羧基末端之间形成的肽键连接而形成的多肽。可以通过组成型多肽的化学偶联来形成融合蛋白，或者融合蛋白可以表达为来自编码单个连续融合蛋白的核酸序列的单个多肽。单链融合蛋白是具有单个连续多肽骨架的融合蛋白。可以使用分子生物学中的常规技术将两个框内基因连接成单个核酸，并且然后在产生融合蛋白的条件下在适当的宿主细胞中表达该核酸来制备融合蛋白。

术语“Fab片段”指一抗体片段，所述抗体片段包括通过用酶木瓜蛋白酶(其在铰链区N-末端切割至H-链间二硫键并且由一个抗体分子生成两个Fab片段)切割抗体生成的抗原结合位点。

术语“F(ab’)2片段”指通过用酶胃蛋白酶(在铰链区C末端切割至H-链间二硫键)切割抗体分子而生成的、含有两个抗原结合位点的抗体片段。

术语“Fc片段”指包括其重链的恒定域的抗体片段。

术语“Fv片段”指包括其重链和轻链的可变域的抗体片段。

“基因构建体”指核酸(如运载体、质粒、病毒基因组等)，核酸包含多肽的“编码序列”或者核酸以其他方式可转录为生物活性RNA(例如，反义、诱饵、核酶等)，可以转染到细胞(例如，哺乳动物细胞)中，并且可以在用构建体转染的细胞中引起编码序列的表达。基因构建体可以包含一个或更多个与编码序列以及内含子序列、聚腺苷酸化位点、复制起点、标志基因等可操作地连接的调控元件。

术语“接头”是本领域公认的，并且指连接两个化合物(如两个多肽)的一分子或一组分子。接头可以由单个连接分子组成或者可以包括连接分子和间隔分子，间隔分子旨在将连接分子与化合物隔开特定距离。

术语“多价抗体”指包括超过一个抗原识别位点的抗体或经工程化的抗体。例如，“二价”抗体具有两个抗原识别位点，而“四价”抗体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(与抗原识别位点的数量相对)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点全部结合相同的表位。“双特异性”抗体具有结合第一表位的至少一个抗原识别位点和结合不同于第一表位的第二表位的至少一个抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有全部结合相同表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其中的一些结合第一表位，并且其中的一些结合不同于第一表位的第二表位。

术语“核酸”指天然分子或合成分子，所述天然分子或合成分子包括单个核苷酸或者通过一个核苷酸的3’位置处的磷酸基团与另一个核苷酸的5’端连接的两个或更多个核苷酸。核酸不受长度限制，并且因此核酸可以包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

术语“与……可操作地连接”指核酸与另外的核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点、以及其他信号序列是与其他序列可操作地连接的核酸序列的实例。例如，DNA与转录控制元件的可操作连接指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得这样的DNA的转录由RNA聚合酶从启动子开始，RNA聚合酶特异性识别、结合，并且转录DNA。

术语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应、或者其他与合理利益/风险比相称的问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“多肽片段”或“片段”在对特定多肽的提及中使用时指与参考多肽本身相比其中氨基酸残基缺失但其中剩余的氨基酸序列通常与参考多肽的氨基酸序列一致的多肽。这样的缺失可以发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端处，或者可替代地在参考多肽的氨基末端和羧基末端两者处。片段长度通常为至少约5个、6个、8个或10个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约20个、30个、40个或50个氨基酸、至少约75个氨基酸、或者至少约100个、150个、200个、300个、500个或更多个氨基酸。片段可以保留参考多肽的一种或更多种生物学活性。在各种实施方案中，片段可以包括参考多肽的酶活性和/或相互作用位点。在其他实施方案中，片段可以具有免疫原性性质。

术语“单链可变片段”或“scFv”指其中重链域与轻链域连接的Fv片段。一个或更多个scFv片段可以与其他抗体片段(如重链或轻链的恒定域)连接，以形成具有一个或更多个抗原识别位点的抗体构建体。

如本文所使用的，“间隔子(spacer)”指连接蛋白质(包括融合蛋白)的肽。通常，间隔子除了连接蛋白质或保持它们之间的一些最小距离或其他空间关系之外不具有特定的生物学活性。然而，可以选择间隔子的组成氨基酸，以影响分子的某些性质(如分子的折叠、净电荷或疏水性)。

如本文所使用的，当提及多肽(包含抗体)或受体时，术语“特异性结合(specifically binds)”或“特异性结合(specific binding)”指确定蛋白质或多肽或受体在蛋白质和其他生物制备物的异质群体中的存在的结合反应。因此，在指定条件(例如，在抗体的情况下，免疫测定条件)下，当指定配体或抗体未与样品中存在的其他蛋白质或者与配体或抗体在生物体中可能接触的其他蛋白质大量结合时，指定配体或抗体与其特定“靶标”“特异性结合”(例如，抗体与内皮抗原特异性结合)。通常，“特异性结合”第二分子的第一分子与该第二分子具有大于约10⁵M^-1(例如，10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1和10¹²M^-1或更多)的亲和常数(Ka)。例如，在TCR有能力与MHC(例如，I类MHC或II类MHC)上呈递的肽结合的情况下；通常，TCR以至少约10-4M或更小的KD的亲和力与其肽/MHC特异性结合，并且以比其与非特异性和无关肽/MHC复合物(例如，包括BSA肽或酪蛋白肽的肽/MHC复合物)结合的亲和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍的亲和力(如通过KD所表达的)与预定抗原/结合伴侣结合。

术语“受试者”指作为施用或治疗的靶标的任何个体。受试者可以是脊椎动物(例如，哺乳动物)。因此，受试者可以是人类患者或兽医患者。术语“患者”指在临床医生(例如，医师)的治疗下的受试者。

在某些实施方案中，本发明的药剂可以单独使用或者与其他类型的治疗剂联合施用。如本文所使用的，短语“联合施用(conjoint administration)”或“联合施用(administered conjointly)”指两种或更多种不同治疗剂(例如，包括本文公开的CAR T和免疫检查点的抑制剂的组合物)的任何形式的施用，使得在先前施用的治疗剂仍在体内有效的同时施用第二药剂(例如，两种药剂在受试者中同时有效，其可以包含两种药剂的协同效应)。例如，不同的治疗剂可以以相同的剂型或者单独的剂型同时地或顺序地施用。在一些优选的实施方案中，CAR T细胞表达(例如，细胞表面呈递或分泌)另外的治疗剂。在某些实施方案中，不同的治疗剂(例如，CAR T细胞和免疫检查点阻断分子)可以在彼此相隔约1小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时或约一周内施用。因此，接受这样的治疗的受试者可以受益于不同治疗剂的联合作用。

术语“转化”和“转染”意为将核酸(例如，表达运载体)引入受体细胞(包含将核酸引入所述细胞的染色体DNA)。

如本文所使用的，术语“治疗”指被设计用于在临床病理过程中改变正在治疗的个体的自然病程的临床干预。期望的治疗效果包含降低进展速率、减轻或缓和病理状态、缓解或改善特定疾病、紊乱或病况的预后。例如，如果与特定疾病、紊乱或病况相关的一种或更多种症状被缓解或消除，则个体成功地被“治疗”。

术语“变体”指一氨基酸序列或肽序列，所述氨基酸序列或肽序列具有保守氨基酸置换、非保守氨基酸置换(例如，简并变体)、编码氨基酸的每个密码子(例如，DNA和RNA)的摆动位置内的置换、添加到肽的C末端的氨基酸、或者与参考序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性的肽。

术语“运载体”指能够将已经与运载体序列连接的另外的核酸转运到细胞中的核酸序列。术语“表达运载体”包含含有适合由细胞表达的形式的基因构建体(例如，与转录控制元件连接)的任何运载体(例如，质粒、粘粒或噬菌体染色体)。

术语“B-淋巴细胞抗原”(特别是，“CD19”)旨在包含抗原分子(例如，CD19分子)的片段、变体(例如，等位基因变体)和衍生物。例如且不限于，在一些实施方案中，CD19是野生型CD19或突变型CD19。在一些这样的实施方案中，B淋巴细胞抗原在细胞表面上(例如，在癌前期细胞或恶性细胞的表面上)表达。

适合于结合CD19的抗CD19抗体(及其scFv形式)是本领域公知的，并且包含(例如且不限于)抗体FMC63、SJ25C1(JCAR015)和HD37(博纳吐单抗)。

嵌合抗原受体(CAR)

本文公开嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述嵌合抗原受体(CAR)多肽可以在免疫效应细胞中表达以增强针对特定靶标的活性(例如，针对血液癌症的抗肿瘤活性)。

在一些方面，本文公开的CAR由三个域组成：胞外域、跨膜域和胞内域。

在某些实施方案中，胞外域包括B淋巴细胞胞外抗原结合区(如CD19结合区)，并且负责抗原识别。CD19可以是野生型CD19或突变型CD19。其还可选地含有信号肽(SP)，以便CAR可以被糖基化并且锚定在免疫效应细胞的细胞膜中。

在一些实施方案中，跨膜域(TD)使胞外域(即，细胞外域)与胞内域(即，细胞内域)连接，并且当由细胞表达时位于细胞膜内。

在一些实施方案中，胞内域在抗原识别之后将激活信号传递至免疫效应细胞。在一些这样的实施方案中，胞内域可以含有细胞内信号传导域(ISD)和可选的共刺激信号传导区(CSR)。“信号传导域(SD)”(如ISD)通常含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，当ITAM被磷酸化时，所述基于免疫受体酪氨酸的激活基序激活信号传导级联。术语“共刺激信号传导区(CSR)”指来自共刺激蛋白受体的细胞内信号传导域(如CD28、41BB和ICOS)，其能够通过T细胞受体增强T细胞激活。

在一些实施方案中，胞内域含有SD或CSR，但不含有SD和CSR两者。在这些实施方案中，仅当含有缺失域的另外的CAR(或T细胞受体)也结合其各自的抗原时，含有所公开的CAR的免疫效应细胞才被激活。

在一些实施方案中，由下式定义所公开的CAR：

SP–BCA–HG–TM–CSR–SD；或

SP–BCA–HG–TM–SD–CSR；

其中“SP”表示可选信号肽(例如，来源于CD8α前导序列)，

其中“BCA”表示B-淋巴细胞抗原结合区(例如，FMC63及其衍生物)，

其中“HG”表示可选的铰链域(间隔域；例如，来源于CD28)，

其中“TM”表示跨膜域(例如，来源于CD28)，

其中“CSR”表示一个或更多个共刺激信号传导区(例如，来源于CD28)，

其中“SD”表示信号传导域(例如，来源于CD3ζ及其变体)，并且

其中“–”表示肽键或接头。

例如，在Fresnak,et al.Engineered T cells:the promise and challenges ofcancer immunotherapy.Nat Rev Cancer.2016Aug 23；16(9):566-81中描述了附加的CAR构建体，其通过引用整体并入以用于教导这些CAR模型。

在某些实施方案中，CAR可以是例如(且不限于)TRUCK、通用CAR、自驱动CAR(Self-driving CAR)、有防护的CAR、自毁式CAR、条件性CAR、经标记的CAR、TenCAR、双重CAR或sCAR。

TRUCK(被重新定向用于通用细胞因子杀伤的T细胞)共同表达嵌合抗原受体(CAR)和抗肿瘤细胞因子。细胞因子表达可以是组成性的，也可以被T细胞激活诱导。，促炎细胞因子的CAR特异性靶向的局部产生将内源性免疫细胞招募到肿瘤部位，并且可以加强抗肿瘤响应。

通用同种异体CAR T细胞被工程化以不再表达内源性T细胞受体(TCR)和/或主要组织相容性复合体(MHC)分子，从而分别预防移植物抗宿主病(GVHD)或排斥反应。

自驱动CAR共同表达CAR和趋化因子受体，所述趋化因子受体与肿瘤配体结合，从而增强肿瘤归巢。

被工程化为对免疫抑制具有抗性的CAR T细胞(有防护的CAR)可以被基因改造以不再表达各种免疫检查点分子(例如，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1))。示例性“敲低(Knockdown)”和“敲除(Knockout)”技术包含(但不限于)RNA干扰(RNAi)(例如asRNA、miRNA、shRNA、siRNA等)和CRISPR干扰(CRISPRi)(例如，CRISPR-Cas9)。在某些实施方案中，CAR T细胞被工程化以表达检查点分子的显性阴性形式。在一些这样的实施方案中，免疫检查点分子的细胞外配体结合域(即，胞外域)与跨膜膜融合，以便竞争配体结合。例如，PD-1的细胞外配体结合域可以与CD8跨膜域融合，从而从靶标细胞竞争PD-1配体。在一些实施方案中，CAR T细胞被工程化以表达免疫检查点开关受体(switch receptor)，以利用存在于靶标细胞上的抑制性免疫检查点配体。在这样的实施方案中，免疫检查点分子的细胞外配体结合域与信号传导域、刺激域和/或共刺激域融合。例如，PD-1的细胞外配体结合域可以与CD28域融合，从而在阻断PD-1信号传导的同时提供CD28共刺激。在另外的实施方案中，CAR T细胞可以与阻断免疫检查点信号传导的适配体或单克隆抗体施用。在一些这样的实施方案中，CAR-T细胞(例如，CAR-T细胞疗法)与PD-1阻断方法结合(如与PD-1/PD-L1拮抗适配体或抗PD-1/PD-L1抗体施用)。在优选的实施方案中，联合施用CAR T细胞和PD-1途径阻断抗体。在另外的实施方案中，CAR T细胞被工程化以表达或者表达且分泌免疫检查点阻断抗体(如抗PD-1或抗PD-L1或其片段)。在另外的实施方案中，CAR T细胞与表达本文所描述的免疫检查点阻断分子的运载体(例如，经工程化的病毒)施用。

使用由电穿孔递送的RNA编码CAR，可以设计自毁式CAR。可替代地，基于与经基因修饰的淋巴细胞中的胸苷激酶结合的更昔洛韦或者最近描述的通过小分子二聚体激活人半胱氨酸蛋白酶9的系统，可以实现T细胞的诱导凋亡。

条件性CAR T细胞在默认情况下是无响应的或关闭的，直至添加小分子以完成“回路”(例如，分子途径)，使信号1和信号2两者能够完全转导，从而激活CAR T细胞。可替代地，T细胞可以被工程化以表达接合体(adaptor)特异性受体，所述接合体特异性受体对于随后施用的针对靶标抗原的二级抗体具有亲和力。

经标记的CAR T细胞表达CAR加上肿瘤表位，现有的单克隆抗体药剂与所述肿瘤表位结合。在无法忍受的不利影响的情况下，单克隆抗体的施用清除CAR T细胞，并且减轻症状，而没有附加的脱靶效应(off-tumor effect)。

串联CAR(TanCAR)T细胞表达由两个连接的单链可变片段(scFv)组成的单个CAR，两个连接的单链可变片段(scFv)具有与一个或多个细胞内共刺激域和CD3ζ域融合的不同亲和力。只有当靶标细胞共同表达两个靶标时，才能实现TanCAR T细胞激活。

双重CAR T细胞表达两个具有不同配体结合靶标的单独的CAR。作为非限制性实例，一个CAR可以仅包含CD3ζ域，而另一个CAR仅包含一个或多个共刺激域。在一些这样的实施方案中，当在肿瘤上表达两个靶标时，双重CAR T细胞被激活。

安全CAR(sCAR)由与细胞内抑制域融合的细胞外scFv组成。只有当遇到具有标准CAR靶标但缺乏sCAR靶标的靶标细胞时，才激活共同表达标准CAR的sCAR T细胞。

在一些实施方案中，所公开的CAR的抗原识别域是scFv。在另外的实施方案中，抗原识别域来自如本文已经描述的天然T细胞受体(TCR)α和β单链。优选地，这样的抗原识别域具有简单的胞外域(例如，识别HIV感染的细胞的CD4胞外域)。可替代地，这样的抗原识别域包括外源识别组件(如连接的细胞因子(其可以导致识别具有细胞因子受体的细胞))。通常，对于本文公开的方法，几乎任何以高亲和力结合给定靶标的东西都可以用作抗原识别区。

细胞内胞内域在抗原识别之后将信号传递至表达CAR的免疫效应细胞，从而激活所述免疫效应细胞的正常效应子功能中的至少一种。在某些实施方案中，T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助细胞活性(包含细胞因子的分泌)。因此，胞内域可以包括T细胞受体(TCR)和可选的共同受体的“细胞内信号传导域”。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导域的截短部分而言，这样的截短部分可以用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。

调控以刺激方式起作用的TCR复合物的初级激活的细胞质信号传导序列可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导基序。含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包含来源于CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD32(FcγRIIA)、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ(FCERIB)和FcεRIγ(FCERIG)的含有ITAM的细胞质信号传导序列。

在特定实施方案中，细胞内信号传导域来源于CD3 zeta(CD3ζ，例如，TCRζ、GenBank acc no.BAG36664.1)。T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为T细胞受体T3ζ链或CD247(分化簇247))是人类中由CD247基因编码的蛋白质。CD3分子的细胞内尾部含有单个ITAM，单个ITAM对TCR的信号传导能力至关重要。ζ链(CD3ζ)的细胞内尾部含有3个ITAM。在一些实施方案中，ζ链是突变型ζ链。例如，突变型ζ链包括至少一个ITAM中的突变(如点突变)，以使所述ITAM无功能性。在一些这样的实施方案中，膜近端ITAM(ITAM1)、膜远端ITAM(C-末端第三ITAM，ITAM3)或两者都是非功能性的。在进一步的实施方案中，两个膜近端ITAM(ITAM1和ITAM2)或两个膜远端ITAM(ITAM2和ITAM3)是非功能性的。在又进一步的实施方案中，仅ITAM2是非功能性的。在一些实施方案中，突变型ζ链包括缺失(例如，截断)突变，使得至少一个ITAM缺失。在一些这样的实施方案中，ζ链缺失膜近端ITAM(ITAM1)、膜远端ITAM(ITAM3)或两者。在其他实施方案中，ζ链缺失两个膜近端ITAM(ITAM1和ITAM2)或两个膜远端ITAM(ITAM2和ITAM3)。在进一步的实施方案中，ζ链缺失ITAM2。本领域技术人员已知产生突变型CD3ζ的方法(Bridgeman JS,et al.,Clin Exp Immunol.2014Feb；175(2):258-67)。从引入的CAR去除至少一个ITAM可以降低CD3ζ介导的细胞凋亡。可替代地，从引入的CAR去除至少一个ITAM可以在不损失功能的情况下降低其尺寸。本发明预期包括这样的改变的CD3ζ域的CAR。

还预期包括改变的CD28域的CAR，改变的CD28域赋予CAR独特的功能性质。就这一点而言，天然CD28域包括三个由调控刺激后信号传导途径的氨基酸序列YMNM、PRRP和PYAP组成的细胞内亚域(参见，例如，WO2019/010383，为了该教导通过引用并入本文)。本文所描述的CAR构建体可以包括经修饰的CD28域，其中YMNM、PRRP和/或PYAP亚域中的一个或更多个被突变或缺失，以扩增、减弱一个或多个所述亚域或者使一个或多个所述亚域失活，从而调节CAR-T功能。

第一代CAR通常具有来自CD3ζ链的细胞内域，细胞内域是来自内源性TCR的信号的主要传递物。第二代CAR向CAR的胞内域添加来自各种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号传导域，以向T细胞提供附加的信号。例如，靶标特异性ScFv与共刺激受体CD28的细胞外域、跨膜域和细胞内信号传导域以及T细胞受体相关性CD3ζ链的细胞质信号传导域融合。临床前研究已经表明，第二代CAR设计提高T细胞的抗肿瘤活性。最近，第三代CAR结合多个信号传导域以进一步增强效力。移植有这些CAR的T细胞已经被证明在不依赖于共刺激受体/配体相互作用的情况下提高扩增、激活、持久性和肿瘤根除效率(Imai C,et al.Leukemia 2004 18:676–84；Maher J,et al.Nat Biotechnol2002 20:70-5)。

例如，CAR的胞内域可以被设计为单独包括CD3ζ信号传导域或者与在本发明的CAR的上下文中有用的一个或多个任何其他期望的细胞质域组合。例如，CAR的细胞质域可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内域的CAR的一部分。共刺激分子是细胞表面分子，而非淋巴细胞对抗原作出有效响应所必需的抗原受体或其配体。这样的分子的实例包含CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、以及与CD83、CD8、CD4、b2c、CD80、CD86、DAP10、DAP12、MyD88、BTNL3、NKG2D及其突变体特异性结合的配体。因此，虽然主要以CD28作为共刺激信号传导元件来举例说明CAR，但其他共刺激元件可以单独使用或者与其他共刺激信号元件组合使用。

在一些实施方案中，CAR包括铰链序列。铰链序列是便利抗体柔韧性的短氨基酸序列(参见，例如，Woof et al.,Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004))。铰链序列可以位于抗原识别部分(例如，抗CD19、抗CD20、抗CD22或scFv)与跨膜域之间。铰链序列可以是来源于或者获自于任何适合的分子的任何适合的序列。在一些实施方案中，例如，铰链序列来源于CD8a分子或CD28分子。

跨膜域可以来源于天然来源或来源于合成来源。在来源是天然的情况下，域可以来源于任何膜结合蛋白质或跨膜蛋白质。例如，跨膜区可以来源于T细胞受体的α链、β链或ζ链(即，包括至少来源于T细胞受体的α链、β链或ζ链的一个或多个跨膜区)：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a，CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR和PAG/Cbp。可替代地，跨膜域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包括疏水残基(如亮氨酸和缬氨酸)。在一些实施方案中，将在合成跨膜域的每端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。短的寡肽或多肽接头(如长度在2个与10个氨基酸之间)可以在CAR的跨膜域与内质域之间形成连接。

因此，在本文公开的本发明的优选实施方案中，由下式定义CAR：

SP–BCA–HG–TM–CSR–SD

其中可选的信号肽/前导序列来源于CD8α前导序列，

其中B淋巴细胞抗原结合区是来源于抗CD19抗体克隆FMC63的scFv，

其中铰链域来源于人CD28(例如，SEQ ID NO.12)，

其中跨膜域来源于人CD28(例如，SEQ ID NO.13)，

其中共刺激信号区来源于人CD28(例如，SEQ ID NO.14)，并且

其中信号传导域包括CD3ζ链，其中仅膜近端ITAM(ITAM1)是功能性的(例如，SEQID NO.11)。可选地，CAR还可以包括至少一种本领域已知的分子标签。例如，且不限于，CAR可以包括低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)作为结合经标记的配体(例如，¹²⁴I-NGF)的标签，并且可以优选地非侵入性地(例如，通过正电子发射体层摄影)监控这样的相互作用(例如，¹²⁴I-NGF/LNGFR)。

在一些实施方案中，CAR具有超过一个跨膜域，跨膜域可以是相同跨膜域的重复或者可以是不同的跨膜域。

在一些实施方案中，如WO2015/039523(其以引用方式并入用于该教导)中所描述的，CAR是多链CAR。多链CAR可以包括不同跨膜多肽中的单独的细胞外配体结合域和信号传导域。信号传导域可以被设计成在膜旁位置组装，这形成更接近天然受体的柔性结构，从而赋予最优的信号转导。例如，多链CAR可以包括FcεRI α链的一部分和FcεRI β链的一部分，使得FcεRI链自发地二聚在一起形成CAR。

在一些实施方案中，CAR含有一个信号传导域。在其他实施方案中，CAR含有一个或更多个信号传导域(共刺激信号传导域)。一个或更多个信号传导域可以是选自下列的多肽：CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a、CD79b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(41BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40、及其突变体。

下文表1、表2和表3提供靶标结合域、共刺激信号传导域和细胞内信号传导域的一些实例组合。这样的实例是出于说明的目的，而不意为可以在本文公开的CAR中出现的组合的详尽列表。

表1：第一代CAR

ScFv	信号域
		CD19	CD8
CD19	CD3ζ
		CD19	CD3δ
CD19	CD3γ
		CD19	CD3ε
CD19	FcγRI-γ
		CD19	FcγRIII-γ
CD19	FcεRIβ
		CD19	FcεRIγ
CD19	DAP10
		CD19	DAP12
CD19	CD32
		CD19	CD79a

表2：第二代CAR

表3：第三代CAR

表4：缺乏共刺激信号的CAR(用于双重CAR方法)

表5：缺乏共刺激信号的CAR(用于双重CAR方法)

ScFv	共刺激信号	信号域
			CD19	CD28	无
CD19	CD8	无
			CD19	CD4	无
CD19	b2c	无
			CD19	CD137/41BB	无
CD19	ICOS	无
			CD19	CD27	无
CD19	CD28δ	无
			CD19	CD80	无
CD19	CD86	无
			CD19	OX40	无
CD19	DAP10	无
			CD19	MyD88	无
CD19	CD7	无
			CD19	DAP12	无
CD19	MyD88	无
			CD19	CD7	无
CD19	BTNL3	无
			CD19	NKG2D	无

表6：缺乏信号域的第三代CAR(用于双重CAR方法)

在一些实施方案中，抗B淋巴细胞抗原结合剂是单链可变片段(scFv)抗体。优选地，这样的抗B淋巴细胞抗原结合剂是单链可变片段(scFv)抗CD19抗体。抗CD19 scFv的亲和力/特异性在很大程度上由重(V_H)链和轻(V_L)链中互补决定区(CDR)内的特定序列驱动。每个V_H序列和V_L序列将具有三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)。

在一些实施方案中，抗CD19结合剂来源于天然抗体(如单克隆抗体)。在一些情况下，抗体是人类。在一些情况下，抗体已经经历改变，以使其在施用至人时免疫原性较低。例如，改变包括选自嵌合、人源化、CDR嫁接、去免疫和框架氨基酸的突变的一种或更多种技术，以对应于最接近的人类种系序列。优选地，抗体是FMC63。

在优选的实施方案中，抗CD19结合剂是来源于抗体FMC63的单链可变片段(scFv)抗体。

还公开了靶向抗B淋巴细胞抗原(如CD19)和至少一种附加的癌症相关抗原(例如，肿瘤抗原)的双特异性CAR。还公开了被设计成仅与结合不同抗原(如另外的癌症相关抗原)的另外的CAR协同起作用的CAR。例如，在这些实施方案中，所公开的CAR的胞内域可以仅含有信号传导域(SD)或共刺激信号传导区(CSR)，但不含有信号传导域(SD)和共刺激信号传导区(CSR)两者。如果第二CAR(或者内源性T细胞)被激活，则其将提供丢失的信号。例如，如果所公开的CAR含有SD而非CSR，则仅当含有CSR的另外的CAR(或T细胞)结合其各自的抗原时，含有该CAR的免疫效应细胞才被激活。同样地，如果所公开的CAR含有CSR而非SD，则仅当含有SD的另外的CAR(或T细胞)结合其各自的抗原时，含有该CAR的免疫效应细胞才被激活。

所述肿瘤抗原包含由引起免疫应答(特别是T细胞介导的免疫应答)的肿瘤细胞产生的蛋白质。附加的抗原结合域可以是肿瘤抗原的抗体或天然配体。附加的抗原结合域的选择将取决于待治疗的特定癌症类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并且包含例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-llRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CALX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abl、HER2、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、ALK、替代的和/或特异性CD19表位、TIM3、细胞周期蛋白Bl、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、ADRB3、甲状腺球蛋白、EphA2、RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、岩藻糖基GM1、GloboH、MN-CAIX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、人端粒酶逆转录酶、多聚唾液酸(plysialicacid)、PLAC1、RUl、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、lewisY、sLe、LY6K、HSP70、HSP27、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突变体、Ras突变体、gplOO、前列腺素、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFRβ、生存素和端粒酶、豆类蛋白、HPV E6、E7、精子蛋白17、SSEA-4、酪氨酸酶、TARP、WT1、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ML-IAP、MAGE、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-C1、MAGE-C2、膜联蛋白-A2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MelanA/MART 1、XAGE1、ELF2M、ERG(TMPRSS2-ETS融合基因)、NA17、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肉瘤易位断点、NY-BR-1、ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、TIM3、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受体、FAP、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGFII、IGF-I受体、GD2、o-乙酰基-GD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、叶酸受体(FRa)、叶酸受体β、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie 2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2和间皮素。在某些优选的实施方案中，肿瘤抗原选自叶酸受体(FRa)、间皮素、EGFRvIII、IL-13Ra、CD123、CD19、TIM3、BCMA、GD2、CLL-1、CA-IX、MUCl、HER2及其任何组合。

肿瘤抗原的进一步非限制性示例包含下列：分化抗原(如酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多系抗原(如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5))；过度表达的胚胎抗原(如CEA)；过度表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因(如p53、Ras、HER-2/neu)；染色体易位产生的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如EB病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的基于蛋白质的抗原包含SCCA、GP73、FC-GP73、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、CA19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α甲胎蛋白、βHCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242，CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7 Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAL、SDCCAG1 6、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、TAG-72、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6和MET。

CAR配体结合域

本文公开的CAR的细胞外域通常包括结合靶标抗原的抗原识别域。这样的抗原特异性结合域通常来源于抗体。在一些实施方案中，抗原结合域是功能性抗体片段或其衍生物(例如，抗体的scFv或Fab、或者任何适合的抗原结合片段)。在优选的实施方案中，抗原结合域是单链可变片段(scFv)。在一些这样的实施方案中，scFv来自单克隆抗体(mAb)。在某些优选的实施方案中，如Sadelain,et al.Nat Rev Cancer 2003 3:35-45(其通过引用被整体并入本文)中所公开的，抗原特异性结合域(例如，scFv)与参与淋巴细胞激活的跨膜基序和/或信号传导基序融合。

抗B淋巴细胞抗原scFv

在一些实施方案中，抗B淋巴细胞抗原scFv可以包括具有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的可变重(V_H)域和具有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的可变轻(V_L)域。在优选的实施方案中，抗B淋巴细胞抗原scFv是抗CD19 scFv、抗CD20 scFv或抗CD22 scFv。最优选地，scFv是抗CD19 scFv。

例如，在Zola et al.,“Preparation and characterization of a chimericCD19 monoclonal antibody.”Immunology and Cell Biology 1991,69,411-422和Nicholson et al.,“Construction and Characterization of a Functional CD19Specific Single Chain Fv Fragment For Immunotherapy of B Lineage Leukemia ANDLymphoma.”Molecular Immunology 1997,(34)16-17,1147-1165中描述了一些这样的抗体。这些出版物特此通过引用被整体(特别是其中描述的抗体)并入。

核酸和运载体

还公开了编码所公开的B淋巴细胞抗原特异性CAR的多核苷酸和多核苷酸运载体，其允许在所公开的免疫效应细胞中表达B淋巴细胞抗原特异性CAR。

可以使用本领域已知的重组方法(如，例如，使用标准技术通过从表达该基因的细胞筛选库、通过从已知包含该基因的运载体获取该基因、或者通过直接从含有该基因的细胞和组织分离)来获得编码所公开的CAR及其区的核酸序列。可替代地，可以以合成方式(而非克隆)产生感兴趣的基因。示例性核酸序列可以编码包括CD8前导序列、FMC63scFv靶向域、CD28域、突变型CD3ζ域(例如，在两个C末端ITAM域中缺乏功能性的CD3ζ域(即，ITAM2和ITAM3))中的每种、或其任何组合的CAR。优选地，可以由包括SEQ ID NO.1中所示的序列的核酸序列编码这样的CAR。

通常通过将编码CAR多肽的核酸与启动子可操作地连接并且将构建体并入表达运载体中来实现编码CAR的核酸的表达。典型的克隆运载体含有转录终止子和翻译终止子、起始序列和对于调控期望的核酸序列的表达有用的启动子。

可以将所公开的核酸克隆到多种类型的运载体中。例如，可以将核酸克隆到运载体中，运载体包含但不限于质粒、噬菌体粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的运载体包含表达运载体、复制运载体、探针生成运载体和测序运载体。

此外，表达运载体可以以病毒运载体的形式提供给细胞。病毒运载体技术在本领域中是公知的，并且例如在Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:ALaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及在其他病毒学和分子生物学手册中被描述。可用作运载体的病毒包含(但不限于)逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，适合的运载体含有在至少一种生物体中具有功能的复制源、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或更多个可选择的标志物。在一些实施方案中，多核苷酸运载体是慢病毒运载体或逆转录病毒运载体。

许多基于病毒的系统已经被开发用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。可以使用本领域已知的技术将所选择的基因插入运载体中，并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后，可以分离重组病毒，并且将其体内或离体递送到受试者的细胞中。

适合的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强大的组成型启动子序列。适合的启动子的另一实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列(包含(但不限于)猴病毒40(SV40)早期启动子、MND(骨髓增生性肉瘤病毒)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子(如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子))。可替代地，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子的实例包含(但不限于)金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

附加的启动子元件(例如，增强子)调控转录起始的频率。尽管许多启动子最近也已经被证明含有起始位点下游的功能性元件，但这些启动子通常位于起始位点上游30-110bp的区。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此翻转或移动时，启动子功能被保持。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达运载体还可以含有可选择的标志物基因或报告基因或可选择的标志物基因与报告基因两者，以便利从试图通过病毒运载体转染或感染的细胞群体鉴别和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标志物可以携带在单独的DNA片段上并且在共转染程序中使用。可选择的标志物和报告基因两者的两侧都可以带有适当的调控序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的可选择的标志物包含例如抗生素抗性基因。

报告基因用于鉴别潜在的转染细胞和评估调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或者不由受体生物体或组织表达并且编码多肽(多肽的表达通过一些易于检测的性质(例如，酶活性、荧光性、与可检测的配体的特异性结合)来表现)的基因。在DNA已经被引入受体细胞之后的适合时间测定报告基因的表达。适合的报告基因可以包含编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因。例如，在一些实施方案中，本文公开的CAR和/或编码所述CAR的核酸序列还可以包括本领域已知的至少一种分子标签。不希望受任何特定理论或策略的束缚，标签可以包括低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)作为结合经标记的配体¹²⁴I-NGF的转导标签。可以非侵入性地(例如，通过正电子发射体层摄影)监控¹²⁴I-NGF/LNGFR相互作用。在一些这样的实施方案中，编码本文所描述的CAR的运载体的核酸序列可以包括编码核糖体跳跃序列(skip sequence)的核酸序列(如编码2A肽的序列)。在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亚组中鉴别的2A肽引起从一个密码子向下一个密码子的核糖体“跳跃”，而在由所述密码子编码的两个氨基酸之间未形成肽键。因此，当多肽被框内的2A寡肽序列隔开时(例如，当CAR和报告基因(如分子标签)被2A寡肽序列隔开时)，两个多肽可以由mRNA内的单个连续的开放阅读框合成。这样的核糖体“跳跃”或“自切割”机制是本领域公知的，并且已知被数种运载体用于表达由单个信使RNA编码的若干蛋白质。

为了引导多肽(例如，分泌的多肽、跨膜多肽和/或细胞表面多肽)进入宿主细胞的分泌途径，在多核苷酸序列或运载体序列中提供分泌信号序列(也简称为信号序列、前导序列、初前序列或前序列)。分泌信号序列与编码感兴趣的多肽(例如，CAR)的核酸序列可操作地连接。两个序列以正确的阅读框连接并且定位，以引导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。尽管某些分泌信号序列可以位于感兴趣的核酸序列中的别处，但这样的分泌信号序列通常位于编码感兴趣的多肽的核酸序列的5’端。因此，在优选的实施方案中，本文公开的CAR和/或编码所述CAR的核酸序列还可以包括信号序列。最优选地，信号序列包括CD8α前导序列或其片段。本领域技术人员将理解，翻译后修饰可以从细胞表面处呈递的CAR多肽(即，成熟的CAR多肽)去除这样的前导序列。

适合的表达系统是公知的，并且可以使用已知的技术制备或者是可商购获得的。通常，显示出报告基因表达水平最高的具有最小5’侧翼区的构建体被鉴别为启动子。这样的启动子区可以与报告基因连接，并且用于针对调节启动子驱动的转录的能力评估剂。本领域中已知将基因引入和表达到细胞中的方法。在表达运载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将运载体容易地引入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞)。例如，可以通过物理方式、化学方式或生物方式将表达运载体转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包含磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括运载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是公知的。参见，例如，Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。

用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包含使用DNA运载体和RNA运载体。病毒运载体(尤其是逆转录病毒运载体)已经成为用于将基因插入哺乳动物细胞(例如，人类细胞)的最广泛使用的方法。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方式包含胶体分散系统(如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包含水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体))。在体外和体内用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。在另一方面，核酸可以与脂质相关。与脂质相关的核酸可以包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸两者相关的连接分子附接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮物含有在脂质中、含有胶束或与胶束复合、或者以其他方式与脂质相关。脂质、脂质/DNA或脂质/表达运载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，其可以以双层结构、作为胶束、或者以“折叠”结构存在。其也可以简单地散布在溶液中，从而可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪性物质，所述脂肪性物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包含天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛类)的一类化合物。适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，可以从密苏里州圣路易斯的西格玛获得二苯乙烯磷脂酰胆碱(“DMPC”)；可以从K&K实验室(纽约州普莱恩维尤)获得磷酸二丁酯(“DCP”)；可以从Calbiochem Behring获得胆固醇(“Choi”)；可以从AvantiPolar Lipides公司(阿拉巴马州伯明翰)获得二苯乙烯磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质。

免疫效应细胞

还公开了被工程化以表达所公开的CAR的免疫效应细胞(本文也称为“CAR-T细胞”)。这些细胞优选地获自待治疗的受试者(即，自体的)。然而，在一些实施方案中，使用免疫效应细胞系或供者效应细胞(同种异体的)。可以从多种来源(包含外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤)获得免疫效应细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术(如Ficoll^TM分离)从自受试者收集的血液获得免疫效应细胞。例如，可以通过干细胞采集获得来自个体循环血液的细胞。在一些实施方案中，通过裂解红细胞并且消耗单核细胞(例如，通过经由PERCOLL^TM梯度的离心或通过逆流离心淘选)从外周血淋巴细胞分离免疫效应细胞。可以通过正选择技术或负选择技术进一步分离免疫效应细胞的特定亚群。例如，可以使用针对正选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来分离免疫效应细胞(例如，通过与抗体缀合的珠孵育足以正选择期望的免疫效应细胞的时间段)。可替代地，可以通过使用针对负选择细胞特有的表面标志物的抗体组合进行负选择来实现免疫效应细胞群体的富集。

在一些实施方案中，免疫效应细胞包括任何参与防护身体免于感染性疾病和外来物质的白细胞。例如，免疫效应细胞可以包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、或其任何组合。例如，免疫效应细胞可以包括T淋巴细胞(优选地，细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。

可以通过细胞表面上的T细胞受体(TCR)的存在来区分T细胞或T淋巴细胞与其他淋巴细胞(如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞))。它们被称为T细胞，因为它们在胸腺中成熟(尽管一些也在扁桃体中成熟)。存在几个T细胞亚群，每个亚群都具有不同的功能。

辅助性T细胞(T_H细胞)在免疫过程(包含B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞、以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活)中协助其他白细胞。这些细胞也被称为CD4⁺T细胞，因为它们在其表面表达CD4糖蛋白。辅助性T细胞在被MHC II类分子呈递肽抗原时被激活，MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦被激活，其就迅速地分裂并且分泌调控或协助主动免疫应答、被称为细胞因子的小蛋白质。这些细胞可以分化为几个亚型(包含T_H1、T_H2、T_H3、T_H17、T_H9或T_FH)中的一种，其分泌不同的细胞因子以便利不同类型的免疫应答。

细胞毒性T细胞(T_C细胞，或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。这些细胞也称为CD8⁺T细胞，因为它们在其表面处表达CD8糖蛋白。这些细胞通过和与MHC I类分子相关的抗原结合来识别其靶标，MHC I类分子存在于全部核细胞的表面上。通过IL-10、腺苷和由调控性T细胞分泌的其他分子，CD8⁺细胞可以失活至预防自身免疫疾病的状态。

记忆T细胞是抗原特异性T细胞的子集，抗原特异性T细胞的子集在感染已经消退之后长期继续存在。它们在重新暴露于其同源抗原时快速地扩增为大量的效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去的感染的“记忆”。记忆细胞可以是CD4⁺或CD8⁺。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

调控性T细胞(T_reg细胞)(先前被称为阻抑T细胞)对于维持免疫耐受至关重要。其主要作用是在免疫反应结束时使T细胞介导的免疫停止，并且阻抑逃避胸腺中负选择过程的自身反应性T细胞。已经描述了两种主要类的CD4⁺T_reg细胞，即，天然存在的T_reg细胞和适应性T_reg细胞。

天然杀伤T(NKT)细胞(不与天然杀伤(NK)细胞混淆)与先天免疫系统桥接自适应性免疫系统。与识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由称为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。

在一些实施方案中，T细胞包括CD4⁺细胞的混合物。在其他实施方案中，基于细胞表面表达，T细胞富集一个或更多个子集。例如，在一些情况下，T包括细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞。在一些实施方案中，T细胞包括具有不同T细胞受体(TCR)的γδT细胞，T细胞受体(TCR)具有一个γ链和一个δ链(而非α链和β链)。

天然杀伤(NK)细胞是可以杀伤病毒感染和转化的细胞的CD56⁺CD3^–大颗粒淋巴细胞，并且构成先天免疫系统的关键细胞子集(Godfrey J,et al.Leuk Lymphoma 201253:1666-1676)。与细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞不同，NK细胞针对肿瘤细胞发射细胞毒性(而无需先前敏化)，并且还可以消除MHC-I阴性细胞(Narni-Mancinelli E,et al.Int Immunol2011 23:427-431)。NK细胞是更安全的效应细胞，因为其可以避免细胞因子风暴的潜在致命的并发症(Morgan RA,et al.Mol Ther 2010 18:843-851)、肿瘤溶解综合征(PorterDL,et al.N Engl J Med 2011 365:725–733)、脱靶效应。尽管NK细胞具有作为癌症细胞的杀伤者的公知的作用，但NK细胞损伤已经被广泛地记录为对多发性骨髓瘤(MM)的进展至关重要(Godfrey J,et al.Leuk Lymphoma 2012 53:1666–1676；Fauriat C,et al.Leukemia2006 20:732–733)，在所公开的CAR之前，尚未在很大程度上探索可能增强NK细胞介导的抗MM活性的手段。

EB病毒(EBV)诱导的淋巴组织增生性疾病(EBV-LPD)和其他EBV相关癌症是同种异体造血细胞移植(HCT)或实体器官移植(SOT)的受者(特别是在已经接受某些T细胞反应性抗体以预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)的受者中)的发病和死亡的重要原因。通过自体或同种异体EBV特异性细胞毒性T细胞的过继性转移以及随后针对EBV相关淋巴增殖的免疫的长期恢复的预防和治疗已经在管理这些同种异体组织转移的一致致命的并发症方面提供了积极成果。因此，在一些实施方案中，所公开的包括本发明的CAR多肽中的一种或更多种的免疫效应细胞是同种异体或自体EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。例如，EBV特异性细胞毒性T细胞的生成可能涉及从EBV血清反应阳性的自体或同种异体供者中分离PBMC，以及通过损耗单核细胞和NK细胞来对其富集T细胞。也可以通过将供者PBMC或纯化的供者T细胞与表达一种或更多种EBV抗原并且将一种或多种EBV抗原呈递至未经刺激的T细胞的“刺激”细胞接触从而引起EBV特异性CTL的刺激和扩增，来产生EBV特异性细胞毒性T细胞。EBV抗原包含例如潜伏膜蛋白(LMP)和EBV核抗原(EBNA)蛋白，如LMP-1、LMP-2A和LMP-2B和EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C和EBNA-LP。包括识别一种或更多种EBV特异性抗原的一种或多种T细胞受体的细胞毒性T细胞被认为已经对那些一种或多种EBV抗原“敏感”，并且因此在本文中被称为“EBV致敏型细胞毒性T细胞”。用于生成可以包括本发明的CAR多肽中的一种或更多种的同种异体或自体EBV特异性细胞毒性T细胞群体的已知方法描述于例如Barker et al.,Blood 2010 116(23):5045-49；Doubrovina,et al.,Blood 2012119(11):2644-56；Koehne,et al.Blood 2002 99(5):1730-40；以及Smith et al.CancerRes 2012 72(5):1116-25(其通过引用并入以用于这些教导)中。类似地，细胞毒性T细胞可能对其他病毒抗原(包含巨细胞病毒(CMV)、乳头瘤病毒(例如，HPV)、腺病毒、多瘤病毒(例如，BKV、JCV和默克尔细胞病毒)、逆转录病毒(例如，HTLV-I，还包含慢病毒(如HIV))、小核糖核酸病毒(例如，甲型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒)、丙肝病毒(例如，丙型肝炎病毒)、德尔塔病毒(例如，丁型肝炎病毒)、戊肝病毒(例如，戊型肝炎病毒)等)“敏感”。在一些优选的实施方案中，靶标抗原来自致癌病毒。在一些这样的实施方案中，用于生成本发明的CAR-T细胞的T细胞是多功能T细胞，即能够诱导多种免疫效应功能、与例如仅产生单一免疫效应物(例如，单一生物标志物，如细胞因子或CD107a)的细胞相比，提供对病原体更有效的免疫应答的那些T细胞。在慢性感染期间，多功能较少的T细胞、单功能T细胞、或者甚至“耗竭的”T细胞可能主导免疫应答，从而对病毒相关并发症的保护产生负面影响。在进一步优选的实施方案中，本发明的CAR-T细胞是多功能性的。在某些实施方案中，用于生成本发明的CAR-T细胞的T细胞的至少50％是CD4⁺T细胞。在一些这样的实施方案中，所述T细胞是少于50％的CD4⁺T细胞。在更进一步的实施方案中，所述T细胞主要是CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，用于生成本发明的CAR-T细胞的T细胞的至少50％是CD8⁺T细胞。在一些这样的实施方案中，所述T细胞是少于50％的CD8⁺T细胞。在更进一步的实施方案中，所述T细胞主要是CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞(例如，本文所描述的致敏型T细胞和/或CAR-T细胞)在被施用于受试者之前储存在细胞文库或细胞库中。本文公开的方法(例如，本文公开的免疫效应细胞(包含本发明的CAR-T细胞)的选择和/或制备)包含从细胞库(如预先生成的第三方供体来源的细胞库)的同种异体免疫效应细胞(例如，PBMC、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和/或CAR-T细胞)的选择和/或修改。这样的细胞库可以包括供者PBMC样品。优选地，细胞库包括其中已经富集免疫效应细胞的供者样品。最优选地，库包括供者CD4⁺T细胞和/或供者CD8⁺T细胞。在一些这样的实施方案中，供者来源的细胞库包括抗原特异性免疫效应细胞(例如，本文所描述的致敏型T细胞和/或CAR-T细胞)。在优选的实施方案中，本文所描述的供者来源的细胞的HLA类型是已知的。因此，本文公开的方法还包含选择同种异体免疫效应细胞(例如，本文所描述的T细胞和/或CAR-T细胞)，因为其表达受限于由受试者中存在的HLA等位基因编码的I类MHC的TCR。例如，如果所述T细胞和受者(例如，需要治疗的受试者)共有至少2个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个)HLA等位基因，并且细胞通过共有的HLA等位基因受限，则选择同种异体T细胞(例如，本文所描述的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和/或CAR-T细胞)。优选地，这样的方法包括通过本领域已知的手段(如流式细胞术、四聚体测定、ELISA测定、免疫印迹测定、荧光显微镜检查术、Edman降解测定、和/或质谱测定(例如，蛋白质测序))测试预先生成的第三方供者来源的表位特异性T细胞(即，同种异体T细胞和/或CAR-T细胞)的TCR库(TCR repertoire)。在一些实施方案中，使用核酸探针、核酸扩增测定和/或测序测定来分析TCR库。

在一些实施方案中，表达所公开的CAR的经工程化的CAR-T细胞还表达影响免疫检查点阻断的显性阴性突变(例如，免疫检查点分子(如PD-1)表达显性阴性形式)。不旨在详尽列举，免疫检查点分子选自程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞激活蛋白3(LAG-3)、具有Ig域和ITIM域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、天然杀伤细胞受体2B4(2B4)、以及CD160。免疫检查点分子也可以是转化生长因子β(TGF-β)受体。优选地，免疫检查点分子是CTLA-4。最优选地，免疫检查点分子是PD-1。

PCT申请WO2017/040945描述了工程化CAR-T细胞的方法，CAR-T细胞表达细胞介导的免疫应答的抑制剂的显性阴性形式。WO2017/040945申请特此通过引用并入。

治疗方法

表达所公开的CAR的免疫效应细胞可以引发针对表达B淋巴细胞抗原的癌症细胞(例如，CD19相关癌症)的治疗有益的免疫应答。例如，由所公开的CAR修饰的免疫效应细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动免疫应答或被动免疫应答。此外，CAR介导的免疫应答可以是过继性免疫疗法方法的一部分，其中CAR修饰的免疫效应细胞诱导对B淋巴细胞抗原(如CD19)特异性的免疫应答。

表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的过继性转移是很有前景的抗癌治疗方法。在收集患者的免疫效应细胞后，细胞可以被基因工程化以表达所公开的B淋巴细胞抗原特异性CAR，并且然后输回患者体内。此外，可以基因工程化从患者以外的供者(即，与患者同种异体)获得的免疫效应细胞以表达所公开的B淋巴细胞抗原特异性CAR，然后将含有CAR的细胞注入患者体内。在某些具体实施方案中，包括抗B淋巴细胞抗原CAR多肽的免疫效应细胞是同种异体EBV特异性细胞毒性T细胞。

所公开的CAR修饰的免疫效应细胞可以被单独施用，或者与稀释剂和/或与其他组分(如IL-2、IL-15、或其他细胞因子或细胞群体)组合作为药物组合物施用。简言之，药物组合物可以包括如本文所描述的靶标细胞群体以及一种或更多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括缓冲剂(如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等)；碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露糖醇)；蛋白质；多肽或氨基酸(如甘氨酸)；抗氧化剂；螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。在一些实施方案中，用于所公开的方法的组合物被配制用于静脉内施用。可以任何适合治疗MM的方式施用药物组合物。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但施用的数量和频率将由诸如患者的病况和患者疾病的严重程度等因素决定。

当表示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医师考虑年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度、以及患者(受试者)的病况的个体差异来确定待施用的本发明的组合物的准确量。通常可以说，可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重(如10⁵至10⁶个细胞/kg体重)(包含那些范围内的全部整数值)的剂量施用包括本文所描述的T细胞的药物组合物。也可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。可以由医学领域的技术人员通过监控患者的疾病病征并且相应地调整治疗来容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。

在某些实施方案中，可能期望的是向受试者施用激活的T细胞，并且然后随后重新抽血(或进行干细胞采集)，根据所公开的方法从其中激活T细胞，并且用这些激活且扩增的T细胞再灌注患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些实施方案中，可以从10cc至400cc的抽血中激活T细胞。在某些实施方案中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中激活T细胞。使用这种多次抽血/多次回输方案可以有助于选择出某些T细胞群体。

可以以任何方便的方式(包含通过注射、输注或植入)进行所公开的组合物的施用。可以向患者皮下地、皮内地、瘤内地、结内地、髓内地、肌内地、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内地施用本文所描述的组合物。在一些实施方案中，通过皮内或皮下注射向患者施用所公开的组合物。在一些实施方案中，通过静脉内注射施用所公开的组合物。也可以将组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。

在某些实施方案中，将所公开的CAR修饰的免疫效应细胞与任何数量的相关治疗方式(包含但不限于沙利度胺、地塞米松、硼替佐米和来那度胺)联合(例如，之前、同时或之后)施用至患者。在进一步的实施方案中，CAR修饰的免疫效应细胞可以与下列组合使用：化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体、或其他免疫消融剂(如CAM PATH、抗-CD3抗体、或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达利滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射)。在一些实施方案中，将CAR修饰的免疫效应细胞与骨髓移植、使用化学疗法剂(如氟达拉滨、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺)或抗体(如OKT3或CAMPATH)的T细胞消融疗法联合(例如，之前、同时或之后)施用至患者。在其他实施方案中，在B细胞消融疗法(如与CD20反应的剂，例如，美罗华)后施用本发明的细胞组合物。例如，在一些实施方案中，受试者可以经历高剂量化学疗法的标准治疗，然后是外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

所公开方法的癌症可以是在经历不受调控的生长、侵袭或转移的受试者中的任何表达B淋巴细胞抗原的细胞(例如，任何表达CD19的细胞)。表达B淋巴细胞抗原(如CD19)的癌症包含白血病和淋巴瘤(例如，急性白血病、慢性白血病、淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、白血病前期病况、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、EBV相关的淋巴组织增生性疾病、成熟B细胞赘生物、成熟T细胞和天然杀伤(NK)细胞赘生物、前体淋巴样赘生物和免疫缺陷相关淋巴组织增生性紊乱)。

在一些实施方案中，癌症可以是造血组织和/或淋巴组织的任何赘生物或肿瘤。因此，癌症可以是影响血液、骨髓、淋巴和/或淋巴系统的任何恶性肿瘤；以及造成不受调控的骨髓增生和/或淋巴增生的任何这样的疾病。所公开的组合物可以用于治疗的癌症的代表性但非限制性列表包含急性淋巴细胞白血病(ALL)、前体B急性淋巴细胞白血病、前体T急性淋巴细胞白血病、伯基特白血病、急性双表型白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(PML)、急性成髓细胞白血病、急性巨核细胞白血病、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病、毛细胞白血病(HCL)、T-细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、克隆性嗜酸性粒细胞增多症、B细胞慢性淋巴细胞白血病/小细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞赘生物(如浆细胞骨髓瘤(多发性骨髓瘤))、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链疾病、结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(伴有或不伴有慢性炎症)、老人的EB病毒阳性DLBCL、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK⁺大B细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、HHV8相关的多中心卡斯尔曼病中出现的大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、肠病相关T-细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病/塞扎里综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性紊乱、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、未另外指定的B淋巴细胞白血病/淋巴瘤、具有复发性遗传异常的B淋巴细胞白血病/淋巴瘤、T淋巴细胞白血病/淋巴瘤；经典霍奇金淋巴瘤(如结节硬化型形式)、混合细胞型霍奇金淋巴瘤、富含淋巴细胞的霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞耗竭或未耗竭的霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤；以及免疫缺陷相关淋巴组织增生性紊乱，所述免疫缺陷相关淋巴组织增生性紊乱与原发性免疫紊乱相关、与人类免疫缺陷病毒(HIV)相关、与甲氨蝶呤疗法、移植后和原发性中枢神经系统淋巴瘤相关。

所公开的CAR可以与具有细胞毒性作用或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团组合使用。药物部分包含化学治疗剂(尤其是用于癌症疗法的那些化学治疗剂)，化学治疗剂可以用作微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂。

所公开的CAR可以与免疫检查点抑制剂结合使用。两种已知的免疫检查点途径涉及通过细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)受体和程序性死亡1(PD-1)受体的信号传递。这些蛋白质是在T细胞功能的全部阶段起重要作用的共信号传导分子的CD28-B7家族的成员。PD-1受体(也称为CD279)在激活的T细胞表面上表达。其配体PD-L1(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)在APC(如树突细胞或巨噬细胞)的表面上表达。PD-L1是主要的配体，而PD-L2具有更为受限的表达模式。当配体与PD-1结合时，抑制性信号传递至T细胞中，从而降低细胞因子产生并且阻抑T细胞增殖。检查点抑制剂包含(但不限于)阻断PD-1的适配体和抗体(纳武单抗(BMS-936558或MDX1106)、CT-011、MK-3475)、PD-L1(MDX-1105(BMS-936559)、MPDL3280A、MSB0010718C)、PD-L2(rHIgM12B7)、CTLA-4(伊匹单抗(MDX-010)、曲美木单抗(CP-675、206))、IDO、B7-H3(MGA271)、B7-H4、TIM3、LAG-3(BMS-986016)。用于将CAR与免疫效应细胞中的检查点抑制剂组合的技术及其用于治疗各种紊乱的用途描述于例如WO2017/040945(其通过引用并入本文)中。

美国专利号8,008,449(其通过引用并入以用于这些抗体)中描述了针对程序性死亡1(PD-1)的人单克隆抗体以及单独使用抗PD-1抗体或与其他免疫治疗组合使用来治疗癌症的方法。美国专利号8,552,154(其通过引用并入以用于这些抗体)中描述了抗PD-L1抗体及其用途。美国专利号8,617,546(其通过引用并入以用于这些抗体)中描述了包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂。

在一些实施方案中，PDL1抑制剂包括特异性结合PDL1的抗体(如BMS-936559(百时美施贵宝)或MPDL3280A(罗氏))。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包括特异性结合PD-1的抗体(如兰罗利珠单抗(默克)、纳武单抗(百时美施贵宝)或MEDI4736(阿斯利康)。美国专利号8,008,449(其通过引用并入以用于这些抗体)中描述了针对PD-1的人单克隆抗体以及单独使用抗PD-1抗体或与其他免疫治疗剂组合使用来治疗癌症的方法。美国专利号8,552,154(其通过引用并入以用于这些抗体)中描述了抗PD-L1抗体及其用途。美国专利号8,617,546(其通过引用并入以用于这些抗体)中描述了包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂。

所公开的CAR可以与其他癌症免疫疗法组合使用。具有两种不同类型的免疫疗法：被动免疫疗法使用免疫系统的组成部分来指导针对癌症细胞的靶向细胞毒活性，而不必在患者中启动免疫应答，而主动免疫疗法主动触发内源性免疫应答。被动策略包含由B细胞响应于特定抗原产生的单克隆抗体(mAb)的使用。1970年代杂交瘤技术的发展和肿瘤特异性抗原的鉴别容许能够特异性靶向肿瘤细胞以被免疫系统破坏的mAb的药物开发。其中是利妥昔单抗(美罗华，基因泰克)，利妥昔单抗(美罗华，基因泰克)与在B细胞恶性肿瘤(如非霍奇金淋巴瘤(NHL))的表面上高度表达的CD20蛋白结合。利妥昔单抗已经被FDA批准与化学疗法组合用于治疗NHL和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。另一种重要的mAb是曲妥珠单抗(赫赛汀；基因泰克)，曲妥珠单抗(赫赛汀；基因泰克)通过靶向HER2的表达彻底改变HER2(人表皮生长因子受体2)阳性乳腺癌的治疗。

生成最优“杀伤”CD8 T细胞响应还需要T细胞受体激活和共刺激，这可以通过连接肿瘤坏死因子受体家族成员(包含OX40(CD134)和4-1BB(CD137))来提供。OX40特别令人感兴趣，因为用激活(激动剂)抗OX40 mAb的治疗加强T细胞分化和细胞溶解功能，从而导致增强的针对各种肿瘤的抗肿瘤免疫性。

在一些实施方案中，这样的附加的治疗剂可以选自抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、脱卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨)。

在一些实施方案中，这样的附加的治疗剂可以选自烷化剂(如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其他铂衍生物(如卡铂))。

在一些实施方案中，这样的附加的治疗剂可以选自抗有丝分裂剂(如紫杉烷类(例如，多西他赛和紫杉醇)和长春花生物碱类(例如，长春地辛、长春新碱、长春碱和长春瑞滨))。

在一些实施方案中，这样的附加的治疗剂可以选自拓扑异构酶抑制剂(如拓扑替康或伊立替康)或细胞抑制药物(如依托泊苷和替尼泊苷)。

在一些实施方案中，这样的附加的治疗剂可以选自生长因子抑制剂，如ErbB1的抑制剂(EGFR)(如EGFR抗体，例如，扎鲁木单抗(zalutumumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)或尼妥珠单抗(nimotuzumab)或其他EGFR抑制剂(如吉非替尼或厄洛替尼))、ErbB2的另外的抑制剂(HER2/neu)(如HER2抗体，例如，曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM 1或帕妥珠单抗)或EGFR和HER2两者的抑制剂(如拉帕替尼)。

在一些实施方案中，这样的附加的治疗剂可以选自酪氨酸激酶抑制剂(如伊马替尼(格列卫，格列卫STI571)或拉帕替尼)。

因此，在一些实施方案中，所公开的抗体与奥法木单抗、扎木单抗(zanolimumab)、达雷木单抗(daratumumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、尼妥珠单抗、帕尼单抗、hu806、达利珠单抗(daclizumab)(赛尼哌)、巴利昔单抗(舒莱)、英夫利昔单抗(类克)、阿达木单抗(修美乐)、那他珠单抗(Tysabri)、奥马珠单抗(索雷尔)、依法珠单抗(瑞体肤)和/或利妥昔单抗组合使用。

在一些实施方案中，用于与CAR组合使用以治疗上文描述的紊乱的治疗剂可以是抗癌症细胞因子、趋化因子、或其组合。适合的细胞因子和生长因子的实例包含IFNy、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNa(例如，INFa2b)、IFN、GM-CSF、CD40L、Flt3配体、干细胞因子、重组人干细胞因子(ancestim)和TNFa。适合的趋化因子可以包含来自人CXC和C-C趋化因子家族的Glu-Leu-Arg(ELR)阴性趋化因子(如IP-10、MCP-3、MIG和SDF-1a)。适合的细胞因子包含细胞因子衍生物、细胞因子变体、细胞因子片段和细胞因子融合蛋白。

在一些实施方案中，用于与CAR组合使用以治疗上文描述的紊乱的治疗剂可以是细胞周期控制/细胞凋亡调控剂(regulator)(或“调控剂(regulating agent)”)。细胞周期控制/细胞凋亡调控剂可以包含靶向并且调节细胞周期控制/细胞凋亡调节剂的分子，如(i)cdc-25(如NSC 663284)，(ii)过度刺激细胞周期的细胞周期蛋白依赖性激酶(如夫拉平度(flavopiridol)(L868275、HMR1275)、7-羟基星形孢菌素(UCN-01、KW-2401)和CDK抑制剂(roscovitine)(R-roscovitine、CYC202))，以及(iii)端粒酶调节剂(如BIBR1532、SOT-095、GRN163、以及例如US6,440,735和US6,713,055中描述的组合物)。干扰细胞凋亡途径的分子的非限制性实例包含TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)/细胞凋亡-2配体(Apo-2L)、激活TRAIL受体的抗体、IFN和反义Bcl-2。

在一些实施方案中，用于与CAR组合使用以治疗上文描述的紊乱的治疗剂可以是激素调控剂(如用于抗雄激素和抗雌激素疗法的剂)。这样的激素调控剂的实例是他莫昔芬(tamoxifen)、艾多昔芬(idoxifene)、氟维司群(fulvestrant)、屈洛昔芬(droloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、己烯雌酚、乙炔雌二醇/雌二醇、抗雄激素(如氟他胺/优莱辛(eulexin))、孕激素(如如己酸羟孕酮、甲羟孕酮/普罗维拉、甲地孕酮/梅格施)、肾上腺皮质激素(如氢化可的松、泼尼松)、促黄体激素释放激素(及其类似物和其他LHRH激动剂(如布舍瑞林(buserelin)和戈舍瑞林(goserelin)))、芳香酶抑制剂(如阿那曲唑/瑞宁得、氨鲁米特/cytraden、依西美坦)或激素抑制剂(如奥曲肽/善得定)。

在一些实施方案中，用于与CAR组合使用以治疗上文描述的紊乱的治疗剂可以是抗癌核酸或抗癌抑制性RNA分子。

如上所述，组合施用可以是同时的、分开的或顺序的。对于同时施用，可以视情况将药剂作为一种组合物或者作为单独的组合物施用。

在一些实施方案中，所公开的CAR与放射疗法组合施用。放射疗法可以包括向患者提供放射或放射性药物的相关施用。辐射来源可以在正在治疗的患者的外部或内部(例如，放射治疗可以是外束放射疗法(EBRT)或近距离放射疗法(BT)的形式)。可以用于实施这样的方法的放射性元素包含例如，镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘化物-123、碘化物-131和铟111。

在一些实施方案中，所公开的CAR与手术组合施用。

可以以增强肿瘤细胞毒性和特异性，逃避肿瘤免疫阻抑，避免宿主排斥，并且延长其治疗半衰期的多种方式设计CAR-T细胞。例如，TRUCK(重定向用于通用细胞因子杀伤的T细胞)T细胞具有CAR，但也被工程化为释放细胞因子(如促进肿瘤杀伤的IL-12)。因为这些细胞被设计为在一旦定位于肿瘤环境的CAR被激活后释放分子有效载荷，因此这些CAR-T细胞有时也被称为‘有防护的CAR’。几种细胞因子正在作为癌症疗法进行临床前和临床研究，并且当类似地并入TRUCK形式的CAR-T疗法时也可以证明是有用的。这些中包含IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、M-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TRAIL、FLT3配体、淋巴促排素和TGF-β(Dranoff,(2004).“Cytokines in CancerPathogenesis and Cancer Therapy.”Nat Rev Cancer Jan4(1):11-22)。“自驱动”CAR-T细胞或“归巢”CAR-T细胞被工程化为除其CAR之外还表达趋化因子受体。由于某些趋化因子可以在肿瘤中上调，因此趋化因子受体的并入有助于肿瘤向过继性T细胞的转运和肿瘤被过继性T细胞的浸润，从而增强CAR-T的特异性和功能性(Moon(2011).“Expression of afunctional CCR2 receptor enhances tumor localization and tumor eradication byretargeted human T cells expressing a mesothelin-specific chimeric antibodyreceptor.”Clin Cancer Res.2011Jul 15；17(14):4719-30)。通用CAR-T细胞也具有CAR，但被工程化为使得其不表达内源性TCR(T细胞受体)或MHC(主要组织相容性复合体)蛋白。从过继性T细胞疗法的信号传导全部组成部分中去除这两种蛋白质分别防止移植物抗宿主病和排斥反应。有防护的CAR-T细胞还因其逃避肿瘤免疫阻抑和肿瘤诱导的CAR-T功能减退的能力而得名。这些特定的CAR-T具有CAR，并且可以被工程化为不表达检查点抑制剂。可替代地，这些CAR-T可以与阻断检查点信号传导的单克隆抗体(mAb)共同施用。抗PDL1抗体的施用显著地恢复CAR TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)的杀伤能力。虽然已经研究了PD-1-PD-L1和CTLA-4-CD80/CD86信号传导途径，但在有防护的CAR-T(包含LAG-3、Tim-3、IDO-1、2B4和KIR)的设计中靶向其他免疫检查点信号传导分子是可能的。TIL的其他细胞内抑制剂包含磷酸酶(SHP1)、泛素连接酶(即，cbl-b)和激酶(即，二酰基甘油激酶)。有防护的CAR-T也可以被工程化为表达保护其免于肿瘤分泌的细胞因子的影响或者使其抵抗肿瘤分泌的细胞因子的影响的蛋白质或受体。例如，用双阴性形式的TGF-β受体转导的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)对淋巴瘤分泌的TGF-β的免疫阻抑具有抗性。这些转导细胞在与其对照细胞相比时在体内显示出显著增加的抗肿瘤活性。

串联CAR-T细胞和双重CAR-T细胞的独特之处在于其具有两个不同的抗原结合域。串联CAR含有面向与细胞内共刺激域和刺激域连接的细胞外环境的两个连续的抗原结合域。双重CAR被工程化为使得一个细胞外抗原结合域连接到细胞内共刺激域，并且第二个不同的细胞外抗原结合域连接到细胞内刺激域。由于刺激域和共刺激域在两个单独的抗原结合域之间分裂，因此双重CAR也被称为“分裂CAR”。在串联CAR设计和双重CAR设计两者中，两个抗原结合域的结合对于允许T细胞中CAR回路的信号传导是必要的。由于这两种CAR设计对不同的有区别的抗原具有结合亲和力，因此其也被称为“双特异性”CAR。

CAR-T细胞作为“活体治疗”形式的一个主要问题是其在体内的可操作性及其潜在的免疫刺激副作用。为了更好地控制CAR-T疗法并且预防不需要的副作用，已经使多种特征(包含关闭开关、安全机制和条件控制机制)工程化。例如，自毁式CAR-T细胞和经标志的/经标记的CAR-T细胞两者都被工程化为具有促进表达CAR的T细胞的清除的“关闭开关”。自毁式CAR-T含有CAR，但也被工程化为表达在施用外源分子后可诱导的促凋亡自杀基因或“消除基因”。为此，可以使用多种自杀基因(包含HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、Fas、iCasp9(诱导型半胱天冬酶9)、CD20、MYC TAG和截短型EGFR(内皮生长因子受体))。例如，HSK将使前体药物更昔洛韦(GCV)转化为GCV-三磷酸，GCV-三磷酸将自身并入复制DNA中，从而最终导致细胞死亡。iCasp9是含有FK506结合蛋白的组分的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白结合小分子AP1903，从而导致caspase9二聚化和细胞凋亡。然而，经标志的/经标记的CAR-T细胞是具有CAR、但也被工程化为表达选择标志物的CAR-T细胞。针对该选择标志物的mAb的施用将促进CAR-T细胞的清除。截短型EGFR是一种这样的可被抗EGFR mAb靶向的抗原，并且西妥昔单抗的施用起作用以促进CAR-T细胞的消除。为具有这些特征而创建的CAR也被称为“可开关型CAR”的sCAR和“可调控型CAR”的RCAR。“安全CAR”(也称为“抑制性CAR”(iCAR))被工程化为表达两个抗原结合域。这些胞外域之一针对肿瘤相关抗原并且与细胞内共刺激域和刺激域结合。然而，第二细胞外抗原结合域对正常组织具有特异性，并且与细胞内检查点域(如CTLA4、PD-1或CD45)结合。多个细胞内抑制域向iCAR中的并入也是可能的。一些可以提供这些抑制域的抑制分子包含B7-H1、B7-1、CD160、PIH、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、TIGIT、BTLA、LAIR1和TGFβ-R。在正常组织存在的情况下，该二抗原结合域的刺激将起作用以抑制CAR。应当注意的是，由于该双重抗原特异性，iCAR也是双特异性CAR-T细胞的形式。安全CAR-T工程化增强CAR-T细胞对肿瘤组织的特异性，并且在某些正常组织可能表达非常低水平的肿瘤相关抗原的情况(这会导致标准CAR的脱靶效应)下具有优势(Morgan(2010).“Case report of a serious adverse event following theadministration of T cells transduced with a chimeric antigen receptorrecognizing ERBB2.”Molecular Therapy 2010；18(4):843-851)。条件CAR-T细胞表达与细胞内共刺激域和单独的细胞内共刺激因子连接的细胞外抗原结合域。共刺激域序列和刺激域序列以这样的方式(在外源分子的施用后，所得的蛋白质将在细胞内集合在一起以完成CAR回路)被工程化。通过这种方式，可以调节CAR-T激活，并且甚至可能针对特定患者进行“微调”或个性化。类似于双重CAR设计，当在条件CAR中失活时，刺激域和共刺激域在物理上被分开；出于该原因，这些也被称为“分裂CAR”。

在一些实施方案中，可以组合这些经工程化的特征中的两个或更多个以创建增强的多功能CAR-T。例如，可以创建具有双重CAR设计或条件CAR设计的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞也可以像TRUCK一样释放细胞因子。在一些实施方案中，可以制造双重条件CAR-T细胞，使得其表达具有针对两种不同癌症抗原的两个单独的抗原结合域的两个CAR，每个抗原结合域与其各自的共刺激域结合。共刺激域仅在施用激活分子之后才会与刺激域起作用。为了使该CAR-T细胞有效，癌症必须表达两种癌症抗原，并且必须向患者施用激活分子；该设计从而并入双重CAR-T细胞和条件CAR-T细胞两者的特征。

通常，使用α-βT细胞创建CAR-T细胞，然而，也可以使用γ-δT细胞。在一些实施方案中，用于生成CAR-T细胞的所描述的CAR构建体、域和经工程化的特征可以类似地用于生成其他类型的表达CAR的免疫细胞(包含NK(天然杀伤)细胞、B细胞、肥大细胞、髓源性吞噬细胞和NKT细胞)。可替代地，表达CAR的细胞可以被创建成具有T细胞和NK细胞两者的性质。在另外的实施方案中，用CAR转导的细胞对于其被施用至的患者可以是自体的或同种异体的。

可以使用用于CAR表达的几种不同方法(包含逆转录病毒转导(包含γ-逆转录病毒)、慢病毒转导、转座子/转座酶(睡美人系统和PiggyBac系统)和信使RNA转移介导的基因表达)。基因编辑(基因插入或基因缺失/破坏)对于工程化CAR-T细胞的可能性也变得越来越重要。CRISPR-Cas9系统、ZFN(锌指核酸酶)系统和TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)系统是可以生成CAR-T细胞的三种潜在的方法。

范例

实施例1：CD19-CAR设计

对EBV抗原敏感的细胞毒性T细胞(CTL)被用于工程化选择性靶向至少一个癌症相关CD19表位的CAR T细胞。CAR多肽被特定地设计成在受试者中降低CAR T细胞耗竭并且增强CAR T细胞持久性。简言之，表达的CAR多肽包括前导序列(即，SEQ ID NO.8中所示的氨基酸序列)，所述前导序列是CD19靶向域(即，SEQ ID NO.9中所示的FMC63scFv氨基酸序列)的N末端。技术人员将理解的是，当CAR在细胞内表达时，如EBV致敏的CTL、新生蛋白(即，包括SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列的蛋白质)被处理，这包含前导序列的去除。所得的成熟多肽(即，包括SEQ ID NO.7中所示的氨基酸序列的多肽)易位至细胞表面。此外，通过铰链区、跨膜域和包括共刺激域的细胞内域(即，SEQ ID NO.10中所示的氨基酸序列，包括SEQID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14中所示的CD28铰链区、跨膜域和胞内域)和信号传导域突变体(即，1XX CD3ζ突变体，其中CD3ζ域在两个C末端ITAM域中(如在SEQ ID NO.11中所示的氨基酸序列中)缺乏功能性)的组合来优化CAR域。

可替代地，CAR还可以包括能够结合可检测配体(例如，¹²⁴I-NGF)的LNGFR域，从而充当分子标签。

可选地，CAR T细胞能够表达免疫检查点分子的抑制剂(即，显性阴性PD-1多肽)，从而克服在许多肿瘤中发现的免疫阻抑微环境。

实施例2：针对靶向细胞毒性和同种异体反应性的电阻抗测定

靶标细胞的电阻抗用于评估由EBV致敏型抗CD19CAR-T细胞(EBV-CAR-T)诱导的特异性细胞毒性。简言之，将已经表征CD-19表达的供者来源的B淋巴细胞(BLCL)靶标细胞(参见图1)铺在经抗CD40涂覆的96孔阻抗板中，从而有效地形成单层细胞以用于分析。响应于效应细胞(例如，EBV-CAR-T)的添加，测量电阻抗相对于施加至抗体结合的细胞单层的电压的变化，从而允许测量细胞毒性和/或同种异体反应性。

结果

供者匹配的(自体的)BLCL在存在EBV-CAR-T细胞和非转导的EBV致敏型T细胞(NTD-EBV-T)的情况下展现出裂解(参见图2，上部列)。相比之下，相对于仅针对错配的靶标细胞具有有限的EBV-TCR指导的细胞溶解活性的NTD-EBV-T细胞，EBV-CAR-T细胞能够在错配的供者靶标细胞中具有CD19抗原靶向的细胞溶解活性(参见图2，下部列)。

实施例3：用于靶向细胞溶解活性的荧光素酶测定

也通过标准的基于荧光素酶的测定确定用抗CD19 CAR转导的抗原特异性T细胞(即，EBV-CAR-T细胞)的细胞溶解活性。内源性表达CD19的细胞系、以及K562对照细胞(未转导的以及用CD19表达构建体转导的)被工程化为表达荧光素酶并且充当靶标细胞(如表7和图3中所总结的)。

使用具有5×10⁴个靶标细胞的黑壁96孔板(每孔100μl的总体积)以不同的效应子:靶标比率(1:4、1:2:1:1、2:1和4:1)共培养效应细胞和肿瘤靶标细胞。以相同的细胞密度单独铺靶标细胞，以确定最大荧光素酶表达(相对光单位(RLU))。在24hr和48hr后，向每个孔直接添加100μL荧光素酶底物。在发光板读数器中检测发射光。裂解通常被确定为(1-(RLU样品/RLUmax))×100。

表7：靶标细胞系

简言之，如上所述，以期望的效应子与靶标(E:T)比率铺表达荧光素酶的靶标细胞和效应模拟品转导的或EBV-CAR-T细胞。相同供者的非转导的细胞用于在全部孔中标准化总细胞数量，使得含有T细胞的全部孔具有相同的总细胞数量。将共培养板在37℃和5％CO₂下放置在孵育箱中过夜。在24小时时，从共培养物中去除50μl上清液，以用于多重细胞因子检测测定。为了测量效应细胞的细胞毒性活性，向每个孔添加50μl培养基以补偿为细胞因子/趋化因子分析所取出的体积。向每个孔添加D-荧光素(荧光素酶底物)，并且将板在室温孵育10min。然后，读取板，记录RLU，并且计算特异性裂解。在24小时荧光素酶读取后，将细胞放置回孵育器中过夜，并且在48小时时重新读取第二次。通过下式计算肿瘤溶解的百分比：

％肿瘤溶解＝(1-(RLU_{肿瘤细胞+T细胞}/RLU_肿瘤细胞))×100。

结果

EBV-CAR-T细胞展现出表达CD19的细胞系(即，NALM6、K562-CD19和RAJI)的CAR指导的细胞溶解(参见图4)。值得注意的是，细胞溶解在NALM6细胞系(CD19阳性；EBNA阴性)中最有效，然后是K562-CD19。RAJI细胞(CD19阳性；EBNA阳性)展现出对所指导的细胞溶解更大的抗性。

在抗原阴性细胞系(K562)中观察到最小的非特异性细胞溶解，其中随着供者001-19EBV-CAR-T细胞(001-19×)的增加的E:T比率而观察到一些细胞溶解。然而，值得注意的是，效应细胞在非特异性细胞溶解方面显示出供者间的可变性，但不具有剂量依赖性杀伤的证据。与其他两个供者相比，供者001-19展现出最高水平的非特异性细胞溶解(参见图5)。在随后的测定中，供者001-19展现出最高的基础细胞因子释放，并且与阳性靶标对照相比具有更少的溶解。

实施例4：EBV-CD19CAR-T细胞的细胞因子释放性能

使用基于珠的多重细胞因子检测测定(例如，

Technology多重测定；ThermoFisher Scientific,U.S.A.)确定用抗CD19 CAR转导的抗原特异性T细胞(即，EBV-CAR-T细胞)的细胞因子分泌。使用来自先前描述的共培养物(即，实施例3的共培养物)的上清液进行细胞因子性能分析。

简言之，如上所述，使用来自上述荧光素酶测定的共培养物的上清液进行细胞因子性能分析。将来自每个孔(24小时共培养或48小时共培养)的上清液(50μL)转移到用可剥离箔密封件密封的96孔储存板中，并且在-80℃储存直至使用。预配置的靶标特异性珠的混合物中的27重细胞因子板用于所选择的细胞因子的定量分析(参见表8)。向多重板中添加解冻的样品、以及单独的T细胞、共培养物、以及单独的靶标细胞系(遍及全部测试物品和未转导的对照)。在酶标仪上测量样品。

表8：多重细胞因子组

<u>类别</u>	<u>细胞因子</u>
		Th1促炎	IL-2、IFNγ、GMCSF、TNFα、TNFβ
Th2促炎	IL-4、IL-5、IL-9、IL-13
		Th17促炎	IL-6、IL-17A、IL-21
调控性	IL-10、IL-22、IL-1RA
		化学趋化	IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES
细胞溶解	颗粒酶A、颗粒酶B
		激活	4-1BB、IL-2R、SFAS-L、IL-3、APO-FAS

结果

对来自1:1E:T比率的48小时共培养物的上清液的分析表明，与单独的NTD对照T细胞和靶标细胞系相比，EBV-CAR-T细胞诱导升高的细胞因子水平(参见表9和图6-图18)。

表9：抗原特异性细胞因子释放中的多功能性的总结

类别	细胞因子	至少一种CD19<sup>+</sup>细胞系中的响应
			Th1促炎	IL-2、IFNγ、GMCSF、TNFα、TNFβ、	3/3供者
Th2促炎	IL-4、IL-5、IL-9、IL-13	3/3供者
			Th17促炎	IL-6、IL-17A、IL-21	3/3供者
调控性	IL-10、IL-22、IL-1RA	3/3供者
			化学趋化	IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES	3/3供者
细胞溶解	颗粒酶A、颗粒酶B	3/3供者
			激活	4-1BB、IL-2R、SFAS-L、IL-3、APO-FAS	3/3供者

虽然EBV-CAR-T细胞在存在表达CD19的细胞系的情况下展现出高度的多功能性，但如在上文细胞溶解测定中所观察到的，细胞因子释放性能可以已经部分地取决于所使用的细胞系的固有性质。值得注意的是，与RAJI或NALM6相比，K562-CD19细胞提供最大量的抗原诱导的细胞因子释放(参见图6-图12)。

还进行了针对每个T细胞供者(001-19、014-18、023-18)的K562-CD19细胞(包括单独的T细胞，(E:F)2:1、1:1、1:2、1:4和单独的靶标)中的分析。表10至表13中提供来源于供者014-18的T细胞(例如，EBV-T细胞和EBV-CAR-T细胞)的示例性数据。

表10：使用供者014-18的NTD T细胞的细胞因子分泌性能

ND：未确定

表11：使用供者014-18的^EBVCAR_LNGFR-T细胞的细胞因子分泌性能

ND：未确定

表12：使用供者014-18的^EBVCAR-T细胞的细胞因子分泌性能

ND：未确定

表13：使用供者014-18的NTD EBV-CTL的细胞因子分泌性能

细胞因子	仅T细胞	4:1	2:1	1:1	1:2	1:4	仅靶标
								sFAS-L	70.78	190.94	163.48	137.06	104.07	56.86	0.84
MIP-1α	219.18	721.77	749.91	852.82	785.54	729.75	1.35
								IL-2	ND	2.92	10.22	16.02	21.20	16.02	ND
IL-4	2.85	9.60	14.50	15.19	17.23	6.69	ND
								IL-5	ND	10.91	25.37	27.80	15.70	1.49	ND
IL-2R	2647.65	4551.73	3230.88	2339.75	1404.34	776.55	ND
								IL-6	4.83	15.64	49.41	160.72	172.98	140.26	17.78
4-1BB	1947.54	3453.80	2952.91	3353.54	2782.36	1792.51	0.80
								IL-8	12.53	896.94	1723.50	2529.47	2452.08	1493.81	111.03
IL-10	0.28	1.37	1.83	1.95	0.81	0.81	ND
								IL-13	11.98	693.09	915.30	808.02	458.12	174.77	0.82
IL-17A	ND	1.98	2.33	1.98	1.98	1.26	ND
								IL-1RA	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
RANTES	620.17	711.60	625.04	580.93	520.03	422.51	0.74
								IFNγ	37.15	6214.57	11483.55	19720.46	20865.20	15330.95	ND
GMCSF	0.56	562.91	1139.74	2451.03	2645.68	1515.19	ND
								TNFα	15.24	132.54	205.90	255.87	154.54	65.96	4.04
MIP-1β	624.69	4160.79	6006.35	7816.09	5282.29	2986.56	ND
								MCP-1	4.73	104.16	1068.43	2509.35	2745.00	2355.75	1970.19
IL-9	1.92	17.66	27.23	29.82	35.04	22.74	5.39
								TNFβ	45.66	77.95	122.43	156.63	145.16	103.73	14.77
Apo-Fas	292.95	292.95	250.72	250.72	250.72	167.70	12.18
								IL-21	156.82	299.98	278.96	253.25	210.25	174.02	0.79
IL-3	3.25	7.94	15.47	44.98	50.04	30.83	0.44
								颗粒酶-A	3290.13	3636.20	3324.04	2945.88	2613.31	2460.13	1.82
颗粒酶-B	457.96	685.23	657.62	624.66	589.20	498.95	1.33
								IL-22	181	577	841	709	577	577	ND

ND：未确定

与NTD对照和单独的T细胞相比，并且在全部E:F比率范围内，来源于全部供者的EBV-CAR-T细胞(即，^EBVCAR-T细胞和^EBVCAR_LNGFR-T细胞)产生升高的细胞因子水平(如IFNγ、颗粒酶-B、IL6、TNFα、MCP-1)(参见表10-表13和图13-表15)。

实施例5：EBV-CAR-T细胞的体内安全性和功效评估

在NALM6诱导的全身性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)小鼠模型中评估经工程化的EBV特异性、表达抗CD19-CAR的T细胞的功效。研究包含用两剂量至三剂量的人类供者来源的EBV-CAR-T细胞进行治疗后肿瘤负荷的分期(小鼠中每剂量0.6×10⁶个细胞或者更多＝至少2×10⁶个细胞/kg的人类当量)。

简言之，将表达荧光素酶的NALM6细胞注射到免疫缺陷小鼠中(在第3天0.5×10⁶/小鼠)，并且允许肿瘤生长进行3天。在第0天通过生物发光成像进行肿瘤分期，并且静脉内或腹膜内施用治疗。如表14中所述，将动物分为治疗组(每组八只动物)。在治疗剂量之后就施用(2000IU)重组人IL-2(RHIL-2)，伴随着在第1天和第2天附加剂量的IL-2(每天2000IU)。在治疗后48小时、以及随后每周一次(例如，第2天、第10天、第16天和第24天)收集血液样品。通过生物发光成像每周两次(例如，第4天、第7天、第10天、第13天、第16天、第18天、第21天和第24天)测量肿瘤负荷。每周两次(例如，第2天、第4天、第7天、第10天、第13天、第16天、第18天、第21天和第24天)评估临床症状和体重。在第24天处死动物，并且在尸体剖检后收集组织样品(例如，肝脏、骨髓和脾脏)(参见图16)。

表14：安全性和功效评估研究组

组ID	治疗	剂量(细胞)
			1	供者1：EBV-CAR-T	1×10<sup>6</sup>
2	供者1：EBV-CAR-T	5×10<sup>6</sup>
			3	供者1：EBV-CTL UNT	5×10<sup>6</sup>
4	供者1：抗CD19 CAR-T	5×10<sup>6</sup>
			5	供者2：EBV-CAR-T	1×10<sup>6</sup>
6	供者2：EBV-CAR-T	5×10<sup>6</sup>
			7	供者2：EBV-CTL UNT	5×10<sup>6</sup>
8	供者2：抗CD19 CAR-T	5×10<sup>6</sup>
			9	PBS	n/a

结果

接受EBV-CAR-T细胞的动物展现出临床症状统计学上显著的降低(包含降低的肿瘤负荷和增加的存活率)。附加的分析证明了，EBV-CAR-T细胞在研究过程中持续存在于小鼠中，并且在避免急性毒性的同时展现出具有最小不利影响的多功能细胞因子性能。

实施例6：针对复发性/难治性侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤的EBV-CAR-T细胞疗法 的安全性

该研究代表由下列组成的单臂、开放标签、多中心研究：(a)剂量递增，然后(b)最大耐受生物活性剂量的剂量扩张，以进一步定义用同种异体(现成的)EBV-CAR-T细胞治疗的人类受试者中的安全性、耐受性和初步临床结果。

简言之，研究组包含患有组织学证实的侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的成人受试者(≥18岁)，其被定义为：

·未另外规定的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包含

·转变的惰性NHL，

·滤泡性淋巴瘤3B级，

·T细胞/组织细胞富集的大B细胞淋巴瘤，

·未另外规定的EBV阳性DLBCL，

·原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤，或者

·利用DLBCL组织学的伴有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤(双击/三击淋巴瘤)

·必须已经复发或者对于所研究疾病的至少2条先前的全身性疗法而言是难治性的。

先前的疗法必须已经包含靶向CD20的剂和蒽环类药物。允许用自体抗CD19-CAR-T疗法治疗的受试者，但其必须是CD 19⁺。

待探索的剂量水平包含：

·低剂量：1×10⁶个细胞/kg

·中等剂量：3×10⁶个细胞/kg

·高剂量：6×10⁶个细胞/kg

每个剂量递增使用每剂量水平至少3个剂量限制性毒性(DLT)可评估的受试者的样品量。剂量递增群组以已经证明对于至少6个完成DLT阶段的DLT可评估的受试者安全的剂量水平开放。在EBV-CAR-T细胞输注后，对来自剂量递增和剂量扩张的全部受试者随访24个月，以用于疾病状态和治疗相关的不良事件。

另外的目标包含：

·1个月、3个月、6个月、12个月和24个月的总体响应率及其与HLA错配的关系；以及

·HLA错配的安全性及其与细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性和移植物抗宿主病(GVHD)的关系。

结果

所公开剂量的EBV-CAR-T细胞能够以最小的不利影响诱导和/或增加无进展存活。EBV-CAR-T细胞能够在人类受试者中扩增和持续存在，从而展现出多功能细胞因子性能并且避免CAR-T耗竭。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而，将理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其他实施方案在下列权利要求的范围内。

除非另有定义，否则本文使用的全部技术术语和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。本文中引用的出版物和引用其的材料通过引用特定地并入。

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文中描述的本发明的具体的实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在由下列权利要求涵盖。

序列表

<110> 阿塔拉生物制药股份有限公司

<120> 抗原特异性靶向CD19的CAR-T细胞

<130> ABH-00725

<140>

<141>

<150> 62/840,774

<151> 2019-04-30

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多核苷酸

<400> 1

atggctctcc cagtgactgc cctactgctt cccctagcgc ttctcctgca tgcagacatc 60

cagatgaccc agaccacaag cagcctgtct gccagcctgg gcgatagagt gaccatcagc 120

tgtagagcca gccaggacat cagcaagtac ctgaactggt atcagcagaa acccgacggc 180

accgtgaagc tgctgatcta ccacaccagc agactgcaca gcggcgtgcc aagcagattt 240

tctggcagcg gctctggcac cgactacagc ctgacaatca gcaacctgga acaagaggat 300

atcgctacct acttctgcca gcaaggcaac accctgcctt acacctttgg cggaggcacc 360

aagctggaaa tcaccggctc tacaagcggc agcggcaaac ctggatctgg cgagggatct 420

accaagggcg aagtgaaact gcaagagtct ggccctggac tggtggcccc atctcagtct 480

ctgagcgtga cctgtacagt cagcggagtg tccctgcctg attacggcgt gtcctggatc 540

agacagcctc ctcggaaagg cctggaatgg ctgggagtga tctggggcag cgagacaacc 600

tactacaaca gcgccctgaa gtcccggctg accatcatca aggacaactc caagagccag 660

gtgttcctga agatgaacag cctgcagacc gacgacaccg ccatctacta ttgcgccaag 720

cactactact acggcggcag ctacgccatg gattattggg gccagggcac cagcgtgacc 780

gtttcttctg cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 840

agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 900

ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 960

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1020

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1080

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1140

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgttcaatg aactgcagaa agataagatg 1320

gcggaggcct tcagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380

ggccttttcc aggggctcag tacagccacc aaggacacct tcgacgccct tcacatgcag 1440

gccctgcccc ctcgc 1455

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的寡核苷酸

<400> 2

atggctctcc cagtgactgc cctactgctt cccctagcgc ttctcctgca tgca 54

<210> 3

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多核苷酸

<400> 3

gacatccaga tgacccagac cacaagcagc ctgtctgcca gcctgggcga tagagtgacc 60

atcagctgta gagccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaaaccc 120

gacggcaccg tgaagctgct gatctaccac accagcagac tgcacagcgg cgtgccaagc 180

agattttctg gcagcggctc tggcaccgac tacagcctga caatcagcaa cctggaacaa 240

gaggatatcg ctacctactt ctgccagcaa ggcaacaccc tgccttacac ctttggcgga 300

ggcaccaagc tggaaatcac cggctctaca agcggcagcg gcaaacctgg atctggcgag 360

ggatctacca agggcgaagt gaaactgcaa gagtctggcc ctggactggt ggccccatct 420

cagtctctga gcgtgacctg tacagtcagc ggagtgtccc tgcctgatta cggcgtgtcc 480

tggatcagac agcctcctcg gaaaggcctg gaatggctgg gagtgatctg gggcagcgag 540

acaacctact acaacagcgc cctgaagtcc cggctgacca tcatcaagga caactccaag 600

agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactattgc 660

gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggatt attggggcca gggcaccagc 720

gtgaccgttt cttct 735

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多核苷酸

<400> 4

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120

tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180

tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300

gacttcgcag cctatcgctc c 321

<210> 5

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多核苷酸

<400> 5

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgttcaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc ttcagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggccttttc caggggctca gtacagccac caaggacacc 300

ttcgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 6

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多肽

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser

20 25 30

Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser

35 40 45

Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu

50 55 60

Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu

85 90 95

Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu

100 105 110

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr

115 120 125

Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro

260 265 270

Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val

275 280 285

Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys

290 295 300

Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

305 310 315 320

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

325 330 335

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

340 345 350

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

355 360 365

Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 7

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多肽

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro

245 250 255

Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly

260 265 270

Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

275 280 285

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

290 295 300

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

305 310 315 320

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

325 330 335

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

340 345 350

Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

355 360 365

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

370 375 380

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

385 390 395 400

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu

405 410 415

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys

420 425 430

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu

435 440 445

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

450 455 460

Pro Pro Arg

465

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的肽

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala

<210> 9

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多肽

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多肽

<400> 10

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

65 70 75 80

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

85 90 95

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多肽

<400> 11

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 12

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多肽

<400> 12

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 13

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的肽

<400> 13

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 14

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的多肽

<400> 14

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的肽

<400> 15

Tyr Met Asn Met

1

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的肽

<400> 16

Pro Arg Arg Pro

1

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成的肽

<400> 17

Pro Tyr Ala Pro

1

Claims (82)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述嵌合抗原受体(CAR)多肽包括B淋巴细胞抗原结合域、跨膜域和细胞内信号传导域。

2.如权利要求1所述的CAR多肽，其中所述B淋巴细胞抗原是CD19抗原、CD20抗原、或CD22抗原。

3.如权利要求1或2所述的CAR多肽，其中所述B淋巴细胞抗原结合域是抗CD19功能性抗体片段。

4.如权利要求1至3中任一项所述的CAR多肽，其中所述B淋巴细胞抗原结合域是抗CD19单链可变片段(scFv)。

5.如权利要求1至4中任一项所述的CAR多肽，其中所述B淋巴细胞抗原结合域包括SEQID NO.9中所示的氨基酸序列。

6.如权利要求1至5中任一项所述的CAR多肽，其中所述跨膜域来源于跨膜多肽或膜结合多肽。

7.如权利要求1至6中任一项所述的CAR多肽，其中所述跨膜域包括多肽CD28、NKp30、CDS、DAP10、41BB、DAP12、CD3C、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp中的任何一种、其突变体、或其任何组合的至少一个跨膜域。

8.如权利要求1至7中任一项所述的CAR多肽，其中所述跨膜域包括CD28和/或41BB的跨膜域。

9.如权利要求1至8中任一项所述的CAR多肽，其中所述信号传导域包括多肽CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a、CD79b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(41BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40中的任何一种、其突变体、或其任何组合的至少一个信号传导域。

10.如权利要求1至9中任一项所述的CAR多肽，所述CAR多肽还包括至少一个共刺激信号传导区。

11.如权利要求10所述的CAR多肽，其中所述共刺激信号传导区包括多肽CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a、CD79b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(41BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40中的任何一种、其突变体、或其任何组合的信号传导域。

12.如权利要求10所述的CAR多肽，其中所述共刺激信号传导区包括CD28或CD28的突变体的信号传导域。

13.如权利要求12所述的CAR多肽，其中CD28信号传导域在亚域YMNM、PRRP、PYAP中的任何一种、或其任何组合中包括至少一个或更多个突变。

14.如权利要求12或13所述的CAR多肽，其中CD28信号传导域缺少亚域YMNM、PRRP、PYAP中的任何一个。

15.如权利要求12至14中任一项所述的CAR多肽，其中CD28信号传导域缺少选自YMNM、PRRP或PYAP的亚域中的任何两个。

16.如权利要求10或11所述的CAR多肽，其中所述共刺激信号传导区包括CD137(41BB)或CD137(41BB)的突变体的信号传导域。

17.如权利要求1至16中任一项所述的CAR多肽，其中至少一个信号传导域包括天然CD3ζ或天然CD3ζ的突变体。

18.如权利要求17所述的CAR多肽，其中突变型CD3ζ缺少C末端基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。

19.如权利要求17所述的CAR多肽，其中突变型CD3ζ缺少两个C末端基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。

20.如权利要求17所述的CAR多肽，其中突变型CD3ζ仅包括一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。

21.如权利要求17至20中任一项所述的CAR多肽，其中突变型CD3ζ包括SEQ ID NO.11中所示的氨基酸序列。

22.如权利要求1至21中任一项所述的CAR多肽，所述CAR多肽还包括铰链序列。

23.如权利要求22所述的CAR多肽，其中所述铰链序列来源于CD8α分子或CD28分子。

24.如权利要求1至23中任一项所述的CAR多肽，所述CAR多肽还包括信号肽。

25.如权利要求24所述的CAR多肽，其中所述信号肽来源于CD8α前导序列。

26.如权利要求1至25中任一项所述的CAR多肽，所述CAR多肽包括SEQ ID NO.6至SEQID NO.11中所示的氨基酸序列中的任何一种、其任何片段、或其任何组合。

27.如权利要求1至25中任一项所述的CAR多肽，所述CAR多肽包括SEQ ID NO.7中所示的氨基酸序列。

28.一种编码如权利要求1至27中任一项所述的CAR多肽的核酸。

29.如权利要求28所述的核酸，所述核酸包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5中所示的核苷酸序列中的任何一种、其片段、或其任何组合。

30.如权利要求28所述的核酸，所述核酸包括SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。

31.一种包括权利要求28至30中任一项所述的核酸的运载体。

32.一种包括权利要求31所述的核酸的免疫细胞。

33.一种包括权利要求32所述的运载体的免疫细胞。

34.一种表达权利要求1至27中任一项所述的CAR多肽的免疫细胞。

35.如权利要求32至34中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是白细胞。

36.如权利要求32至35中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、或嗜酸性粒细胞。

37.如权利要求32至36中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是选自下列的淋巴细胞：αβT细胞、γδT细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、先天淋巴样细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、调控性T细胞、或其任何组合。

38.如权利要求37所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

39.如权利要求37或38所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是病毒抗原致敏型CTL。

40.如权利要求37至39中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是对来自下列中的任何一种的病毒抗原敏感的CTL：EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、B.K.病毒(BKV)、约翰·坎宁安病毒(JCV)、小核糖核酸病毒(例如，甲型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒)、丙肝病毒(例如，丙型肝炎病毒)、德尔塔病毒(例如，丁型肝炎病毒)、戊肝病毒(例如，戊型肝炎病毒)、或其任何组合。

41.如权利要求37至40中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是EBV致敏型CTL。

42.一种表达下列的双特异性嵌合抗原受体(CAR)T细胞：

(a)选择性结合B淋巴细胞抗原的CAR多肽；以及

(b)选择性结合肿瘤相关抗原的CAR多肽。

43.如权利要求42所述的双特异性嵌合CAR T细胞，其中所述B淋巴细胞抗原是CD19抗原、CD20抗原、或CD22抗原。

44.权利要求39或40所述的双特异性CAR T细胞，其中所述肿瘤相关抗原是GPC3、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-C2、SSX-2、Ny-ESO-1、hTERT、或病毒性肝炎抗原。

45.如权利要求42至44中任一项所述的双特异性CAR T细胞，其中所述嵌合抗原受体的抗原结合域各自包括功能性抗体片段。

46.如权利要求42至45中任一项所述的双特异性CAR T细胞，其中所述嵌合抗原受体的抗原结合域各自包括单链可变片段(scFv)。

47.如权利要求42至46中任一项所述的双特异性CAR T细胞，其中所述嵌合抗原受体的跨膜域各自包括CD28、41BB中的任何一种、其突变体、或其任何组合的至少一个跨膜域。

48.如权利要求42至47中任一项所述的双特异性CAR T细胞，其中所述嵌合抗原受体中至少一种的信号传导域包括CD3ζ、CD3ζ的突变体、或其任何组合的至少一个信号传导域。

49.如权利要求42至47中任一项所述的双特异性CAR T细胞，其中所述嵌合抗原受体的信号传导域各自包括CD3ζ、CD3ζ的突变体、或其任何组合的至少一个信号传导域。

50.如权利要求48或49所述的双特异性CAR T细胞，其中突变型CD3ζ缺少C末端基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。

51.如权利要求48或49所述的双特异性CAR T细胞，其中突变型CD3ζ缺少两个C末端基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。

52.如权利要求48或49所述的双特异性CAR T细胞，其中突变型CD3ζ仅包括一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。

53.如权利要求42至52中任一项所述的双特异性CAR T细胞，其中所述嵌合抗原受体中的至少一种包括至少一个共刺激信号传导区。

54.如权利要求42至52中任一项所述的双特异性CAR T细胞，其中每个嵌合抗原受体包括至少一个共刺激信号传导区。

55.如权利要求53或54所述的双特异性CAR T细胞，其中所述共刺激信号传导区包括CD28或CD28的突变体、CD137(41BB)或CD137(41BB)的突变体中任何一种、或其任何组合的信号传导域。

56.如权利要求55所述的CAR多肽，其中CD28信号传导域在亚域YMNM、PRRP、PYAP中的任何一种、或其任何组合中包括至少一个或更多个突变。

57.如权利要求55或56所述的CAR多肽，其中CD28信号传导域缺少选自YMNM、PRRP或PYAP的至少一个亚域的功能。

58.如权利要求55至57中任一项所述的CAR多肽，其中CD28信号传导域缺少选自YMNM、PRRP或PYAP的亚域中的任何两个的功能。

59.如权利要求42至58中任一项所述的双特异性CAR T细胞，所述双特异性CAR T细胞还包括来源于CD8a或CD28的铰链序列。

60.如权利要求34至59中任一项所述的表达CAR的细胞，其中所述表达CAR的细胞被基因修饰成不再表达一种或更多种免疫检查点分子。

61.如权利要求34至59中任一项所述的表达CAR的细胞，所述表达CAR的细胞还包括一种或更多种免疫检查点分子的显性阴性形式的表达。

62.如权利要求34至59中任一项所述的表达CAR的细胞，所述表达CAR的细胞还包括对一种或更多种免疫检查点分子特异性的开关受体的表达。

63.如权利要求34至59中任一项所述的表达CAR的细胞，所述表达CAR的细胞还包括能够阻断一种或更多种检查点分子的信号传导的表达抗体或所述表达抗体的功能片段。

64.如权利要求60至63中任一项所述的表达CAR的细胞，其中所述免疫检查点分子选自程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞激活蛋白3(LAG-3)、具有Ig域和ITIM域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、天然杀伤细胞受体2B4(2B4)、CD160和转化生长因子β(TGF-β)受体。

65.如权利要求60至64中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫检查点分子是PD-1和/或CTLA-4。

66.一种在受试者中治疗B淋巴细胞抗原相关癌症的方法，所述方法包括施用有效量的包括权利要求32至65中任一项所述的表达CAR的细胞的过继性免疫疗法组合物。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述B淋巴细胞抗原相关癌症是选自下列的血液癌症：急性白血病、慢性白血病、淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、白血病前期病况、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、EBV相关淋巴组织增生性疾病、成熟B细胞赘生物、成熟T细胞和/或天然杀伤(NK)细胞赘生物、前体淋巴样赘生物、以及免疫缺陷相关淋巴组织增生性紊乱。

68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述B淋巴细胞抗原相关癌症是EBV相关淋巴组织增生性疾病。

69.如权利要求66至68中任一项所述的方法，其中所述受试者已经接受附加的抗癌疗法、正在接受附加的抗癌疗法、或者将接受附加的抗癌疗法。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述附加的抗癌疗法包括手术、辐射、化学疗法、免疫疗法、或激素疗法。

71.如权利要求66至70中任一项所述的方法，其中胸膜内地、静脉内地、皮下地、结内地、瘤内地、鞘内地、腹膜内地、颅内地、或者通过直接施用向器官施用所述过继性免疫疗法组合物。

72.如权利要求66至71中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述过继性免疫疗法组合物的所述表达CAR的细胞来源于所述受试者。

74.如权利要求73所述的方法，其中所述过继性免疫疗法组合物的所述表达CAR的细胞来源于供者样品、或者来自供者样品的库或文库。

75.如权利要求66至74中任一项所述的方法，所述方法还包括施用至少一种免疫检查点抑制剂。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、或其组合。

77.如权利要求75所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括RNAi分子，如反义RNA分子(asRNA)、微小RNA分子(miRNA)、短发夹RNA分子(shRNA)、或小干扰RNA分子(siRNA)。

78.如权利要求75所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括CRISPR RNA(crRNA)分子。

79.如权利要求75所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括免疫检查点分子的显性阴性形式。

80.如权利要求75所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括重组开关受体。

81.如权利要求75至80中任一项所述的方法，其中免疫检查点抑制剂由包括编码所述免疫检查点抑制剂的核酸分子的运载体表达，其中所述运载体选自DNA运载体、RNA运载体、质粒或病毒运载体。

82.如权利要求81的方法，其中所述包括编码所述免疫检查点抑制剂的核酸分子的运载体在所述过继性免疫疗法组合物的所述表达CAR的细胞中表达。

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