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TW201639963A - Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法及與表現ｃｄ１９嵌合抗原受體（ｃａｒ）之細胞的組合療法 - Google Patents

Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法及與表現ｃｄ１９嵌合抗原受體（ｃａｒ）之細胞的組合療法 Download PDF

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TW201639963A
TW201639963A TW105111159A TW105111159A TW201639963A TW 201639963 A TW201639963 A TW 201639963A TW 105111159 A TW105111159 A TW 105111159A TW 105111159 A TW105111159 A TW 105111159A TW 201639963 A TW201639963 A TW 201639963A
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cell
cells
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珍妮佛 瑪莉 波爾多
芭芭拉 布蘭尼提
珍妮佛 布洛格登
納維恩 庫瑪 達卡帕加里
莎爾 吉爾
史蒂芬 嗨福爾
律 黃
卡爾Ｈ 俊恩
金周揚
雷鳴
李娜
安德雷雅斯 洛伊
伊蓮娜 奧蘭多
瑪寇 魯拉
泰 特蘭
志明 張
里 周
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諾華公司
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Abstract

本發明提供治療與CD19表現相關之疾病之組合物及方法，例如藉由投與包含如本文所述之CD19 CAR之重組T細胞，以及一或多種B細胞抑制劑，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑。本發明另外提供針對CD20及CD22之新穎抗原結合域及CAR分子，及例如作為單藥療法或於組合療法中之用途。本發明亦提供本文所述之套組及組合物。

Description

CD20療法、CD22療法及與表現CD19嵌合抗原受體(CAR)之細胞的組合療法
本申請案主張2015年4月8日申請之美國序號62/144,615、2015年4月8日申請之美國序號62/144,497、2015年4月8日申請之美國序號62/144,639、2015年8月19日申請之美國序號62/207,255、2015年12月4日申請之美國序號62/263,423之優先權，其內容以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全部內容以引用之方式併入本文中。4月6日產生之該ASCII複本命名為N2067-7072(通用)_SL.txt且大小為1,789,639位元組。
本發明大體上係關於經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞，視情況與B細胞抑制劑，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之一或多種抑制劑組合以治療與分化簇19蛋白質(CD19)之表現相關之疾病之用途。
許多患有B細胞惡性腫瘤之患者不可藉由標準療法治癒。另外，傳統治療選擇通常具有嚴重副作用。已在癌症免疫療法中進行嘗試，然而，若干障礙物使得達成臨床有效性為極困難目標。儘管已鑑別數百所謂的腫瘤抗原，此等抗原一般衍生自自身且因此免疫原性不佳。此外，腫瘤使用若干機制使得其本身敵對免疫攻擊之起始及傳播。
使用嵌合抗原受體(CAR)修飾自體T細胞(CART)療法(其依賴於將T細胞再導向至癌細胞，如B細胞惡性腫瘤之適合細胞表面分子上)之近來研發在利用免疫系統之能力治療B細胞惡性腫瘤及其他癌症中顯示有前景的結果(參見例如Sadelain等人，Cancer Discovery 3：388-398(2013))。鼠類衍生CART19(亦即「CTL019」)之臨床結果已在罹患CLL之患者以及兒童ALL中建立完全緩解中顯示前景(參見例如Kalos等人，Sci Transl Med 3：95ra73(2011)，Porter等人，NEJM 365：725-733(2011)，Grupp等人，NEJM 368：1509-1518(2013))。除遺傳修飾T細胞上之嵌合抗原受體識別及破壞靶細胞之能力以外，成功的治療性T細胞療法需要能夠隨時間推移而增殖及保持，以調查白血病復發。產生於惰能、抑制或衰竭之T細胞之可變品質將對CAR轉型T細胞之效能具有效應，熟習此項技術者此時對其之控制有限。為了有效，經CAR轉型之患者T細胞需要保持及維持回應於同源抗原之增殖能力。已展示ALL患者T細胞運行可用包含鼠類scFv之CART19執行此(參見例如Grupp等人，NEJM 368：1509-1518(2013))。
本發明至少部分關於一種治療與分化簇19蛋白質(CD19)例如OMIM寄存編號107265、Swiss Prot.寄存編號P15391)之表現相關之病症之方法。在某些實施例中，病症為癌症，例如血液癌。在一些實施例中，方法包含投與結合CD19之嵌合抗原受體(CAR)分子以及B細胞抑制劑，例如一或多種(例如一種、兩種、三種或三種以上)B細胞抑 制劑。在一些實施例中，B細胞抑制劑係選自CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之抑制劑，或其組合。在一些實施例中，組合維持或具有相比於任一單獨療法較佳之臨床有效性。在一些實施例中，本文中之方法包括使用工程改造細胞，例如T細胞以表現結合CD19之CAR分子，以及B細胞抑制劑(例如第二B標靶之抗體(例如單特異性或雙特異性抗體)，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1)或結合至第二B細胞標靶之表現CAR之細胞，例如表現CAR之免疫效應細胞，或其組合)以治療與CD19之表現相關之病症。本發明另外關於針對CD20及CD22之新穎抗原結合域及CAR分子，及例如作為單藥療法或在組合療法中之用途。
因此，在一態樣中，本發明係關於一種治療患有與CD19之表現相關之疾病之個體(例如哺乳動物)之方法。方法包含象個體投與CD19抑制劑，例如結合本文所述之CD19之CAR分子，以及B細胞抑制劑。舉例而言，方法包含向個體投與有效量之一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如結合本文所述之CD19(例如野生型或突變CD19)之CAR分子之細胞，以及B細胞抑制劑。在某些實施例中，B細胞抑制劑係選自CD10抑制劑，例如一或多種本文所述之CD10抑制劑；CD20抑制劑，例如一或多種本文所述之CD20抑制劑；CD22抑制劑，例如一或多種本文所述之CD22抑制劑；CD34抑制劑，例如一或多種本文所述之CD34抑制劑；CD123抑制劑，例如一或多種本文所述之CD123抑制劑；FLT-3抑制劑，例如一或多種本文所述之FLT-3抑制劑；ROR1抑制劑，例如一或多種本文所述之ROR1抑制劑；CD79b抑制劑，例如一或多種本文所述之CD79b抑制劑；CD179b抑制劑，例如一或多種本文所述之CD179b抑制劑；CD79a抑制劑，例如一或多種本文所述之CD79a抑制劑或其任何組合。在某些態樣中，揭示一種治療患有B細胞白血病或B細胞淋巴瘤之個體之方法，其包含向個體投 與有效量之一或多種表現結合CD19之CAR分子之細胞，以及一或多種CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之抑制劑。
在一相關態樣中，本發明提供一種減少CD19表現細胞之增殖之方法，例如藉由向個體，例如有需要之患者投與如本文所述之組合療法，例如CD19抑制劑以及B細胞抑制劑，例如一或多種如本文所述之B細胞抑制劑。在另一態樣中，本發明提供一種選擇性地殺死CD19表現細胞之方法，例如藉由向個體，例如有需要之患者投與如本文所述之組合療法，例如CD19抑制劑以及B細胞抑制劑，例如一或多種如本文所述之B細胞抑制劑。在某些態樣中，本發明提供一種提供個體，例如哺乳動物中之抗腫瘤免疫性之方法，其包含向哺乳動物投與有效量之如本文所述之組合(例如一或多種CAR表現細胞)。
在一態樣中，本發明提供一種預防哺乳動物中之CD19陰性復發之方法，其包含向哺乳動物投與一或多種B細胞抑制劑，其中B細胞抑制劑包含CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑。
在另一態樣中，本發明提供一種治療含有與CD19之表現相關之疾病，例如DLBCL(例如原發性DLBCL)之個體之方法。方法包含向個體投與有效量之一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞，視情況與PD1抑制劑組合。視情況，個體具有或鑑別為具有至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%癌細胞，例如DLBCL細胞，其為CD3+/PD1+。
在一態樣中，本發明提供一種治療患有與CD19之表現相關之疾病，例如DLBCL之個體之方法。方法包含向個體投與有效量之一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞，以及PD-L1 抑制劑。視情況，個體具有或鑑別為具有小於20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%對於CD19及PD-L1呈雙陽性之癌症，例如癌症微環境中之細胞。
在一態樣中，本發明提供一或多種B細胞抑制劑，其中B細胞抑制劑包含CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑，用於治療患有與CD19之表現相關之疾病之個體，且其中該個體已接受、正接受或將接受表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞。
組合投與之時序及劑量
本文所述之一或多種療法可大體上同時或按任何次序向個體投與。舉例而言，CD19抑制劑(例如本文所述之CD19 CAR表現細胞)、一或多種B細胞抑制劑及/或視情況存在之至少一個其他治療劑可同時、在相同或分開的組合物中或依序投與。
對於連續投與，本文所述之CAR表現細胞(例如CD19 CAR表現細胞、CD20 CAR表現細胞或CD22 CAR表現細胞)可首先投與，且額外藥劑可隨後投與，或投與次序可逆轉。在一些實施例中，當引入第二療法時繼續第一療法(例如CAR表現細胞，如CD19 CART細胞、CD20 CART細胞或CD22 CART細胞)，且在其他實施例中，在引入第二療法之前、之後或與其同時撤出第一療法。在連續投與之情況下，在一些實施例中，第二療法在預定時間量之後，或在個體顯示一或多種復發已出現或可能出現之適應症之後起始。適應症可例如為在第一療法之標靶，例如CD19、CD20或CD22中存在具有干擾之癌細胞。干擾可例如為移碼突變及/或過早終止密碼子。
在其他實施例中，同時投與兩種或兩種以上療法(例如CD19 CAR表現細胞及B細胞抑制劑)。不受理論束縛，在一些實施例中，同時投與療法可降低復發及/或延遲復發之可能性。
當組合投與時，第一療法(例如CAR療法，例如針對CD19、CD20或CD22之CAR表現細胞)及額外藥劑(例如第二或第三藥劑，例如B細胞抑制劑)或全部可以相比於獨立使用之各藥劑，例如單藥療法形式之量或劑量較高、較低或相同的量或劑量投與。在某些實施例中，第一療法、第二療法、視情況存在之第三療法或全部之投與量或劑量低於(例如至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)獨立使用之各藥劑，例如單藥療法形式之量或劑量。在其他實施例中，導致所需效應(例如癌症之治療)之第一療法、第二療法、視情況存在之第三療法或全部之量或劑量低於(例如低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)達成相同治療效應所需的獨立使用之各藥劑，例如單藥療法形式之量或劑量。在某些實施例中，較低劑量導致相比於投與常規(單藥療法)劑量時所見減少之副作用。
在一個實施例中，療法包含細胞群體。在實施例中，細胞為免疫效應細胞，例如CAR表現細胞。
或者，或與本文所描述之方法組合，揭示包含診斷步驟或患者選擇步驟(例如如下所述)之方法。
在一態樣中，本發明提供一種評估個體，例如患者之復發者狀態(例如在CAR療法之後的復發者或非復發者)之方法。在一個實施例中，方法鑑別在藉由CAR療法(例如CD19 CART療法，例如本文所述，例如CTL019療法)治療後已復發(「復發者」)或可能復發，或未復發(「非復發者」)或可能不復發之個體，例如患者。在一個實施例中，藉由分析CD19之一或多個特徵測定復發者狀態(例如在CART療法之後的復發者或非復發者)。
在一個實施例中，CD19之一或多個特徵包括核酸序列之改變(例如突變，如插入、缺失或取代或其組合)、核酸含量之改變、蛋白質序列之改變或蛋白質含量之改變或其組合。在一個實施例中，復發者 具有CD19中之一或多種突變，例如CD19之外顯子2中之一或多種突變(例如插入或缺失)。在一個實施例中，復發者具有CD19之外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6或外顯子7中之一或多種突變。在一個實施例中，突變產生過早終止密碼子，例如藉由導致例如CD19之外顯子2中之移碼之插入或缺失。在一個實施例中，突變為表31 之突變。
在一個實施例中，CD19之特徵相比於參考特徵。舉例而言，當特徵為序列(例如來自生物樣品之蛋白質核酸序列)時，參考特徵可為CD19之野生型序列(例如蛋白質或核酸序列)。特徵可為樣品中具有突變序列之細胞之%。當特徵為含量(例如蛋白質或核酸含量)時，參考特徵可為CD19之野生型含量(例如蛋白質或核酸含量)。特徵可為樣品中之蛋白質或核酸含量。特徵可為樣品中具有給定臨限值以上之蛋白質或核酸含量之細胞之百分比。
在一個實施例中，提供方法以將患有癌症，例如血液癌，如CLL或ALL之個體識別為在包含CAR療法，例如CD19 CART療法之治療之後的復發者或非復發者。方法包含：(1)自個體獲取樣品(例如獲自個體血液之清除術樣品；及/或例如製造產物樣品，例如獲自個體血液之基因工程改造T細胞)；(2)測定CD19之特徵，例如如本文所述之序列或含量；及(3)(視情況)比較CD19之測定特徵於參考特徵；其中測定特徵相比於參考特徵之間的差異，例如統計顯著差異對於CAR療法之復發為預測性的；及(4)將個體識別為針對CAR療法之復發者或非復發者，例如基於CD19之測定特徵。在一個實施例中，CD19之特徵之存在或不存在為過早終止密碼子之存在或不存在，例如藉由導致移碼之插入或缺失。在一個實施例中，存在之CD19之特徵為表31 之突變。
在一個實施例中，提供之方法包含(1)自個體獲取樣品(例如獲自 個體血液之清除術樣品；及/或例如製造產物樣品，例如獲自個體血液之基因工程改造T細胞，例如CART19製造產物)；(2)測定CD19之特徵，例如如本文所述之序列或含量；及(3)(視情況)比較CD19之測定特徵於參考特徵；其中存在之CD19之特徵(例如測定特徵相比於參考特徵之間的差異，例如統計顯著差異)預測對於CAR療法之復發。在一個實施例中，存在之CD19之特徵為存在過早終止密碼子，例如藉由導致移碼之插入或缺失。在一個實施例中，存在之CD19之特徵為表31 之突變。
在一個實施例中，提供測定在包含CAR療法，例如如本文所述之CD19 CAR療法之治療之後，患有癌症，例如血液癌，如CLL或ALL之個體之復發的方法。方法包含測定在復發之前獲得之樣品中之CD19之特徵。在一個實施例中，存在之CD19之特徵(例如測定特徵相比於參考特徵之間的差異，例如統計顯著差異)指示在CAR療法之後的復發。在一個實施例中，存在之CD19之特徵為存在過早終止密碼子，例如藉由導致移碼之插入或缺失。在一個實施例中，存在之CD19之特徵為表31 之突變。
在一個實施例中，提供評估患有癌症，例如血液癌，如CLL或ALL之個體之方法。方法包含獲取包含CD19之一或多個特徵，例如如本文所述之CD19之特徵中的一或多者之量測值之個體之復發者狀態之值，進而評估個體。
在一個實施例中，提供評估或監測CAR療法，例如CD19 CART療法於患有癌症之個體中之有效性的方法，其包含獲取包含CD19之一或多個特徵，例如如本文所述之CD19之特徵中的一或多者之量測值之個體之復發者狀態之值，進而評估或監測CAR療法於個體中之有效性。
在一個實施例中，提供用於提供對於含有癌症之個體中之CAR療 法，例如CD19 CART療法(例如本文所述)之成功率之預測的方法，該方法包含以下步驟：提供來自個體之生物樣品；測定CD19之一或多個特徵，例如如本文所述之CD19之特徵中的一或多者；及基於測定之特徵，向個體提供預後。
在一些態樣中，本發明提供例如將患有癌症之個體識別為具有對包含嵌合抗原受體(CAR)療法之治療具反應之增加或減少之可能性的方法或分析，方法包含：(1)自個體獲取樣品；(2)測定以下中的一或多者之值：(i)樣品中之表29 中所列之一或多種標記物之含量；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)TREG 細胞之含量或活性；及(3)(視情況)比較(i)、(ii)或(iii)或其組合之測定值，例如含量、活性或特徵與參考值，其中測定值相比於參考值之間的差異，例如統計顯著差異預測個體對CAR療法之反應性；及(4)基於測定值將個體識別為對於CAR療法之完全反應者、部分反應者或無反應者，或復發或非復發者。
在某些實施例中，前述方法中的任一者可另外包括以下：(i)向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如包含CD19表現細胞之療法，在以下中之一者、兩者或兩者以上(全部)之值中偵測是否無差異，例如無統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量；(ii)向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如包含CD19表現細胞及一或多種B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、 CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑)之療法，在以下中之一者、兩者或兩者以上(全部)之值中偵測是否無差異，例如無統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量；或(iii)中斷第一療法，例如包含CD19表現細胞之療法，且投與第二療法，例如一或多種B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑)，在以下中之一者、兩者或兩者以上(全部)之值中偵測是否無差異，例如無統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量。
投與步驟(i)-(iii)可在如下文示例性實施例中所述之患者評估步驟之前或之後進行。
在某些態樣中，揭示治療患有癌症之個體之方法。該方法包含：(a)獲取，例如測定個體是否具有以下中之一者、兩者或兩者以上(全部)之值：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量；(ii)CD19之特徵，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量或活性，及(b)響應於該值，另外包括以下：(i)向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如包含CD19表現細胞之療法，在以下中的一者、兩者或兩者以上(或全部)中是否未偵測到差異，例如統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量 或活性，(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量；(ii)向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如包含CD19表現細胞及一或多種B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑)之療法，在以下中之一者、兩者或兩者以上(全部)之值中偵測是否未偵測到差異，例如統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量；或(iii)中斷第一療法，例如包含CD19表現細胞之療法，且投與第二療法，例如一或多種B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑)，在以下中之一或多者中偵測是否偵測到差異，例如統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量。
在另一態樣中，提供一種治療患有癌症之個體之方法。該方法包括：(a)向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如包含CD19表現細胞之療法，(b)獲取用於(例如測定個體是否具有)以下中之一者、兩者或兩者以上(全部)之值：(I)表29 中所列之一或多種標記物之含量；(II)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(III)生物樣品中之TREG 細胞之含量或活性，及 (c)響應於步驟(b)(I-III)中之值或測定，進行以下中的一或多者：(i)向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如包含CD19表現細胞之療法，在以下中之一或多者中偵測是否未偵測到差異，例如統計顯著差異：(I)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(II)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(III)生物樣品中之TREG 細胞之含量；(ii)向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如包含CD19表現細胞及一或多種B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑)之療法，在以下中之一或多者中偵測是否偵測到差異，例如統計顯著差異：(I)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(II)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(III)生物樣品中之TREG 細胞之含量；或(iii)中斷第一療法，例如包含CD19表現細胞之療法，且投與第二療法，例如一或多種B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑)，在以下中之一或多者中偵測是否偵測到差異，例如統計顯著差異：(I)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(II)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(III)生物樣品中之TREG 細胞之含量。
在前述方法中的任一者之一些實施例中，樣品為選自血液、血漿或血清樣品之生物樣品。在一特定實施例中，生物樣品為血液樣品。在一個實施例中，樣品為清除術樣品，例如獲自個體血液之T細胞。在一個實施例中，樣品為製造產物樣品，例如獲自個體血液之基因工程改造T細胞，例如CAR製造產物，例如CART19製造產物。
在一個實施例中，本文中之方法可用於測定患者是否可能對CAR療法(例如CD19 CART)有反應，例如未接受CAR療法之患者是否可能對CAR療法有反應，或已接受CAR療法之患者是否可能對繼續的CAR療法有反應。一般而言，預測復發之相同CD19特徵預測患者不大可能對CD19 CAR療法有反應。鑑別為不大可能對CD19 CAR療法有反應之患者可投與不同類型的療法，如B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之一或多種抑制劑)。
在另一態樣中，提供一種治療患有癌症，例如血液癌之個體之方法。在一個實施例中，方法包括測定個體是否具有CD19之特徵相對於參考特徵之差異，例如統計顯著差異，及測定特徵與參考特徵之間是否存在差異，例如統計顯著差異，向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如CART，進而治療個體。在一個實施例中，特徵為CD19序列，例如蛋白質或核酸序列。在一個實施例中，方法包含分析移碼CD19，例如包含過早終止密碼子之CD19之存在或不存在。
在前述方法中的任一者之實施例中，治療包含投與CD19 CAR表現細胞，視情況與一或多種B細胞抑制劑組合。在一個實施例中，CD19 CAR療法與一或多種B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之一或多種抑制劑)同時投與。在一個實施例中，CD19 CAR療法在B細胞抑制劑中之一或多者之前投與。在一個實施例中，CD19 CAR療法在B細胞抑制劑中之一或多者之後投與。
在一個實施例中，其中測定特徵與參考特徵之間存在差異，方法包含在將CAR產品輸注至個體中之前修飾CAR產品。在一個實施例中，其中測定特徵與參考特徵之間存在差異，方法包含在將CAR製造產物輸注至個體中之前修飾CAR製造產物。在一個實施例中，若測定 特徵與參考特徵之間存在差異，則方法包含調節CAR輸注劑量以達成抗癌效應。
在一個實施例中，治療方法包含藉由相對於參考特徵比較來自個體之樣品中之CD19之特徵而測定個體是否具有對CAR療法，例如CD19 CART療法，例如本文所述之CD19 CART療法有反應之增加之可能性，其中相對於參考特徵之特徵差異指示反應之增加之可能性；及向個體投與治療有效劑量之CAR療法，進而治療個體。
在一個實施例中，治療方法包含自個體獲得樣品；測定相對於參考特徵之CD19之特徵(例如移碼或過早終止密碼子之存在或不存在)；及若個體鑑別為在樣品之CD19特徵與樣品中之參考特徵之間具有統計顯著差異，則投與治療有效劑量之CAR表現細胞。
CD19特徵可用於設計用於患者之治療。舉例而言，在一個實施例中，當患者樣品包含野生型CD19時，向患者投與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如CD19 CART。在一個實施例中，當患者樣品包含突變CD19，例如移碼CD19，例如包含過早終止密碼子之CD19時，向患者投與除CD19抑制劑以外之療法，例如向患者投與另一B細胞抑制劑。在一個實施例中，當患者樣品包含至少正常含量之CD19時，向患者投與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如CD19 CART。在一個實施例中，當患者樣品低於正常含量之CD19時，向患者投與除CD19抑制劑以外之療法，例如向患者投與另一B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之一或多種抑制劑)。
在一個實施例中，治療方法包含獲取包含CD19特徵之量測值之個體之復發者狀態之值，及響應於復發者狀態之測定，進行以下者之一者、兩者、三者、四者或四者以上：(1)將個體鑑別為復發或非復發者；(2)投與CAR療法；(3)選擇或更改CAR療法之投藥；(4)選擇或 更改CAR療法之排程或時程；(5)例如向復發者投與與CAR療法組合之額外藥劑，例如投與一或多種B細胞抑制劑；或檢查點抑制劑，例如本文所述之檢查點抑制劑，或激酶抑制劑，例如本文所述之激酶抑制劑；(6)在用CAR療法處理之前向復發者投與增加個體中之原始T細胞數目之療法；在引入編碼CAR之核酸之前改進CAR療法之製造方法，例如增濃原始T細胞，例如對於鑑別為復發者之個體；或(7)選擇替代療法，例如針對特定癌症(例如如本文所述)之標準照護療法，例如對於復發者；進而治療個體這種癌症。
在一些實施例中，方法包含投與一種、兩種、三種或三種以上B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑)。舉例而言，在一個實施例中，方法包括投與CD19抑制劑，例如表現CD19 CAR之細胞，以及CD10抑制劑，或如本文所述之CD10抑制劑及CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1抑制劑之任何組合。在另一實施例中，方法包括投與CD19抑制劑，例如表現CD19 CAR之細胞，以及CD20抑制劑，或如本文所述之CD20抑制劑及CD10、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1抑制劑之任何組合。在另一實施例中，方法包括投與CD19抑制劑，例如表現CD19 CAR之細胞，以及CD22抑制劑，或如本文所述之CD22抑制劑及CD10、CD20、CD34、CD123、FLT-3或ROR1抑制劑之任何組合。在另一實施例中，方法包括投與CD19抑制劑，例如表現CD19 CAR之細胞，以及CD34抑制劑，或如本文所述之CD34抑制劑及CD10、CD20、CD22、CD123、FLT-3或ROR1抑制劑之任何組合。在另一實施例中，方法包括投與CD19抑制劑，例如表現CD19 CAR之細胞，以及CD123抑制劑，或如本文所述之CD123抑制劑及CD10、CD20、CD34、CD22、FLT-3或ROR1抑制劑之任何組合。在另一實施例中，方法包括投與CD19抑制劑，例如表現CD19 CAR之細胞，以及FLT-3抑制劑，或如本文所述之FLT-3抑制劑及CD10、CD20、CD34、CD123或ROR1抑制劑之任何組合。在另一實施例中，方法包括投與CD19抑制劑，例如表現CD19 CAR之細胞，以及ROR1抑制劑，或如本文所述之ROR1抑制劑及CD10、CD20、CD34、CD123或FLT-3抑制劑之任何組合。在一些實施例中，方法包含投與一種、兩種、三種或三種以上B細胞抑制劑(例如如本文所述之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之一或多種抑制劑)。
在一些實施例中，本文所述之治療方法進一步包含以下中的一者或兩者：測定患者樣品中之免疫檢查點分子(例如PD-L1、PD1、LAG3或TIM3)之含量；及向患者投與免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1、PD1、LAG3及TIM3中的一或多者之抑制劑)。舉例而言，方法可包含藉由一或多種本文所述之CAR表現細胞(例如與B細胞抑制劑組合之CD19 CAR；CD20 CAR；或CD22 CAR)治療患者及在治療之前或之後測定患者中之免疫檢查點分子之含量。在一些實施例中，方法包含向患者投與相比於參考含量具有較高含量之免疫檢查點分子之免疫檢查點抑制劑，例如投與對於較高PD-L1含量有反應之PD-L1抑制劑、投與對較高PD1含量有反應之PD1抑制劑、投與對較高LAG3含量有反應之LAG3抑制劑或投與對較高TIM3含量有反應之TIM3抑制劑。在一些實施例中，方法包含向已接受、正接受或將接受藉由一或多種本文所述之CAR表現細胞(例如與B細胞抑制劑組合之CD19 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR)之療法之患者投與免疫檢查點抑制劑，其中患者具有或鑑別為具有相比於參考含量之較高含量的免疫檢查點分子。
組合物
在一些態樣中，本發明提供例如包含以下之組合物：(i)一或多 種表現結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞，及(ii)B細胞抑制劑，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑。在實施例中，(i)及(ii)分開提供，且在實施例中，(i)及(ii)經混合。
在一些態樣中，本發明提供例如編碼以下之核酸：(i)結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR，及(ii)一或多種B細胞抑制劑，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之抑制劑。在一些態樣中，本發明提供例如編碼以下之核酸：(i)結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR，及(ii)結合B細胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之CAR分子。在實施例中，核酸包含RNA或DNA。
在一些態樣中，本發明提供例如編碼以下之核酸：(i)結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR，及(ii)結合B細胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1 CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之CAR分子。在實施例中，核酸包含RNA或DNA。在實施例中，編碼(i)及(ii)之核酸序列定位於相同方向，例如編碼(i)及(ii)之核酸序列之轉錄沿相同方向進行。在實施例中，編碼(i)及(ii)之核酸序列定位於不同方向。在實施例中，單一啟動子控制編碼(i)及(ii)之核酸序列之表現。在實施例中，編碼蛋白酶裂解位點(如T2A、P2A、E2A或F2A裂解位點)之核酸定位於編碼(i)與(ii)之核酸序列之間。在實施例中，蛋白酶裂解位點經置放以使得細胞可表現包含(i)及(ii)之融合蛋白，該蛋白隨後藉由蛋白分解裂解加工成兩個肽。在一些實施例中，編碼(i)之核酸序列在編碼(ii)之核酸序列上游，或編碼(ii)之核酸序列在編碼(i)之核酸序列上游。在實施例中，第一啟動子控制編碼(i)之核酸序列 之表現且第二啟動子控制編碼(ii)之核酸序列之表現。在實施例中，核酸為質體。在實施例中，核酸包含病毒包裝元件。在一些態樣中，本發明提供包含本文所述之核酸，例如如上文所述之包含(i)及(ii)之核酸的細胞，例如免疫效應細胞。細胞可包含裂解T2A、P2A、E2A或F2A裂解位點之蛋白酶(例如內源性或外源性)。
在一些態樣中，本發明提供例如包含以下之組合物：(i)編碼結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之第一核酸，及(ii)編碼一或多種B細胞抑制劑，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之抑制劑之第二核酸。在一些態樣中，本發明提供例如包含以下之組合物：(i)編碼結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之第一核酸，及(ii)結合B細胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之CAR分子。在實施例中，第一核酸及第二核酸各自包含RNA或DNA。
在一些態樣中，本發明提供例如包含如本文所述之一或多種核酸之載體。本發明亦在某些態樣中提供包含如本文所述之載體或核酸之細胞。
本發明亦在某些態樣中提供包含一或多種免疫效應細胞及以下者之組合物：(i)編碼結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之第一核酸，或包含該CAR分子之第一多肽，及(ii)編碼結合B細胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之CAR分子之第二核酸，或包含該CAR分子之第二多肽。在實施例中，第一核酸或第一多肽及第二核酸或第二多肽各包含於第一免疫效應細胞內，例如由其表示。在實施例中，組合物包含含有例如表現第 一核酸或第一多肽之第一免疫效應細胞及含有例如表現第二核酸或第二多肽之第二免疫效應細胞。在實施例中，組合物不包含含有例如表現第一核酸或第一多肽及第二核酸或第二多肽之細胞。
製造
在某些態樣中，本發明提供製造細胞之方法，其包含藉由如本文所述之載體，例如編碼CAR之載體轉導免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。在某些態樣中，本發明提供製造細胞之方法，其包含將如本文所述之核酸(例如編碼CAR之核酸)引入至免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞中。在某些態樣中，本發明提供一種產生RNA工程改造細胞群體之方法，其包含將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入至細胞中，其中RNA包含如本文所述之核酸，例如編碼CAR之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之製造方法另外包含使細胞(例如CD19 CAR表現細胞、CD20 CAR表現細胞、CD22 CAR表現細胞、B細胞抑制劑細胞或CD19 CAR表現細胞及B細胞抑制劑細胞兩者)群體與編碼端粒酶次單元，例如hTERT之核酸接觸。編碼端粒酶次單元之核酸可為DNA。
在一些實施例中，本文所揭示之製造方法進一步包含在包含2% hAB血清之血清中培養細胞(例如CD19 CAR表現細胞、CD20 CAR表現細胞、CD22 CAR表現細胞、B細胞抑制劑細胞或CD19 CAR表現細胞及B細胞抑制劑細胞兩者)群體。
適應症
在一個實施例中，與CD19表現相關之疾病選自增生性疾病，如癌症或惡性腫瘤或癌變前病況，如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前驅症，或與CD19表現相關聯之非癌症相關相關適應症。在一個實施例中，疾病為實體或液體腫瘤。在一個實施例中，癌症為胰臟癌。在一個實施例中，疾病為血液癌。在一個實施例中，血 液癌為白血病。在一個實施例中，癌症選自由以下組成之群：一或多種急性白血病，包括(但不限於)：B細胞急性淋巴白血病(BALL)、T細胞急性淋巴白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴白血病(ALL)(例如復發性及難治性ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性骨髓性白血病(CML)及慢性淋巴球性白血病(CLL)。額外血液癌或病況包括(但不限於)套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增生病況、MALT淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症及「白血病前驅症」。白血病前驅症涵蓋由骨髓血液細胞之低效產生(或發育不良)聯合之血液病況之多樣性集合。在實施例中，與CD19表現相關之疾病包括(但不限於)表現CD19之非典型及/或非經典癌症、惡性腫瘤、癌變前病況或增生性疾病；及其任何組合。
在一個實施例中，與CD19表現相關之疾病為淋巴瘤，例如MCL或霍奇金淋巴瘤。在一個實施例中，與CD19表現相關之疾病為白血病，例如SLL、CLL及/或ALL。
在一個實施例中，與腫瘤抗原，例如本文所述之腫瘤抗原相關之疾病選自增生性疾病，如癌症或惡性腫瘤或癌變前病況，如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前驅症，或為與本文所述之腫瘤抗原表現相關之非癌症相關適應症。在一個實施例中，與本文所述之腫瘤抗原相關之疾病為實體腫瘤，例如本文所述之實體腫瘤，例如前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、頭部癌或肺癌。
在一個實施例中，癌症係選自AML、ALL、B-ALL、T-ALL、B細胞前淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病、CML、毛細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、肥大細胞病症、骨髓發育不良症候群、骨髓增生贅瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤或其組合。
在一個實施例中，個體(例如用CD19 CAR，視情況與第二藥劑，如PD1抑制劑或PD-L1抑制劑組合處理之個體)具有或鑑別為具有至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%癌細胞，例如DLBCL細胞，其為CD3+/PD1+。
在一個實施例中，個體在藉由一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞處理後已復發或鑑別為已復發。在一個實施例中，基於完全反應之後的血液、骨髓(>5%)或任何髓外位點中之母細胞之再現中的一或多者，個體已復發或鑑別為已復發。在一個實施例中，基於預定臨限值以上，例如超出1%、2%、3%、4%、5%或10%之CD19-母細胞之偵測，個體已復發或鑑別為已復發。
CAR療法
在某些實施例中，治療方法包含CAR療法，例如投與一或多種表現一或多種CAR分子之細胞。表現一或多種CAR分子之細胞可為免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。在一實施例中，個體為人類。
在一個實施例中，表現CAR分子之細胞包含載體，其包括編碼CAR分子之核酸序列。在一個實施例中，該載體係選自由DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或反轉錄病毒載體組成之群。在一個實施例中，載體為慢病毒載體。在一個實施例中，載體進一步包含啟動子。在一個實施例中，啟動子為EF-1啟動子。在一個實施例中，EF-1啟動子包含SEQ ID NO：100之序列。在一個實施例中，載體為活體外轉錄載體，例如轉錄本文所描述之核酸分子之RNA的載體。在一個實施例中，活體外載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾，例 如本文所述之聚A尾，例如包含約150個腺苷鹼基。在一個實施例中，活體外載體中之核酸序列進一步包含3'UTR，例如本文所述之3'UTR，例如包含至少一個衍生自人類β-球蛋白之3'UTR之重複序列。在一個實施例中，活體外載體中之核酸序列進一步包含啟動子。在一個實施例中，核酸序列包含T2A序列。
在一個實施例中表現CAR分子之細胞為本文所述之細胞，例如人類T細胞或人類NK細胞，例如本文所述之人類T細胞或本文所述之人類NK細胞。在一個實施例中，人類T細胞為CD8+ T細胞。在一個實施例中，人類T細胞為CD4+ T細胞。在一個實施例中，人類T細胞為CD4+/CD8+ T細胞。在一個實施例中，人類T細胞為CD8+及CD4+ T細胞之混合物。在一個實施例中，細胞為自體T細胞。在一個實施例中，細胞為同種異體T細胞。在一個實施例中，細胞為T細胞且T細胞為二醯基甘油激酶(DGK)缺乏的。在一個實施例中，細胞為T細胞且T細胞為Ikaros缺乏的。在一個實施例中，細胞為T細胞且T細胞皆為DGK及Ikaros缺乏的。
在另一實施例中，表現CAR分子之細胞(例如如本文所述)可另外表現另一藥劑，例如增強CAR表現細胞活性之藥劑。
在一個實施例中，方法包括與增強CAR表現細胞活性之藥劑組合投與如本文所述之表現CAR分子之細胞，其中藥劑為細胞因子，例如IL-7、IL-15、IL-21或其組合。細胞因子可與CAR表現細胞之投與組合，例如與其同時或在其之後不久傳遞。或者，細胞因子可在投與CAR表現細胞之後的延長時段之後，例如在評估個體對CAR表現細胞之反應之後傳遞。
舉例而言，在一個實施例中，增強CAR表現細胞活性之藥劑可為抑制免疫抑制分子之藥劑。免疫抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或 CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在一個實施例中，抑制免疫抑制分子之藥劑包含第一多肽(例如抑制分子)，與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所述之胞內信號傳導域)相關。在一個實施例中，藥劑包含例如免疫抑制分子，如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β，或此等中的任一者之片段(例如此等中的任一者之細胞外域的至少一部分)之第一多肽，及第二多肽，其為本文所述之胞內信號傳導域(例如包含共刺激域(例如41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或主要信號傳導域(例如本文所述之CD3 ξ信號傳導域)。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段之第一多肽(例如PD1之細胞外域的至少一部分)，及本文所述之胞內信號傳導域(例如本文所述之CD28信號傳導域及/或本文所述之CD3 ξ信號傳導域)之第二多肽。
在一個實施例中，淋巴細胞輸注，例如同種異體淋巴細胞輸注用於治療癌症，其中淋巴細胞輸注包含至少一種本文所述之CD19 CAR表現細胞及視情況存在之至少一種表現針對B細胞抗原之CAR之細胞。在一個實施例中，自體淋巴細胞輸注用於治療癌症，其中自體淋巴細胞輸注包含至少一種CD19表現細胞及視情況存在之至少一種表現針對B細胞抗原之CAR之細胞。
在一個實施例中，向已接受前述幹細胞移植，例如自體幹細胞移植之個體，或已接受前述劑量之美法侖之個體投與CAR表現細胞，例如T細胞。
在一個實施例中，表現CAR分子，例如本文所述之CAR分子之細胞與改善一或多種與投與表現CAR分子之細胞以及投與B細胞抑制劑相關之副作用之藥劑，例如本文所述之藥劑組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子，例如本文所述之CD19 CAR分子之細胞及B細胞抑制劑與治療與CD19相關之疾病之額外藥劑，例如本文所述之額外藥劑組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子，例如本文所述之CAR分子之細胞以本文所述之劑量及/或給藥時程投與。
在一個實施例中，CAR分子例如使用活體外轉錄引入至T細胞中，且個體(例如人類)接受包含CAR分子之初始細胞投與，及一或多個包含CAR分子之後續細胞投與，其中一或多個後續投與在先前投與之後小於15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天投與。在一個實施例中，一次以上投與細胞包含每週向個體(例如人類)投與CAR分子，例如每週投與包含CAR分子之細胞2、3或4次投與。在一個實施例中，個體(例如人類個體)每週接受一次以上包含CAR分子之細胞投與(例如每週2、3或4次投與)(在本文中亦稱為週期)，隨後一週不投與包含CAR分子之細胞，接著向個體投與包含CAR分子之細胞的一或多次額外投與(例如每週一次以上投與包含CAR分子之細胞)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受大於一個週期之包含CAR分子之細胞，且各循環之間的時間小於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施例中，每隔一天投與包含CAR分子之細胞，每週3次投與。在一個實施例中，投與包含CAR分子之細胞持續至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或八週以上。
在一個實施例中，本文所述之療法(例如CD20 CAR療法、CD22 CAR療法或B細胞抑制劑及表現CD19 CAR分子，例如本文所述之CD19 CAR分子之細胞之組合)作為用於疾病，例如癌症，例如本文所述之癌症之第一線治療投與。在另一實施例中，本文所述之療法(例如CD20 CAR療法、CD22 CAR療法或B細胞抑制劑及表現CD19 CAR分子，例如本文所述之CD19 CAR分子之細胞之組合)作為用於疾病， 例如癌症，例如本文所述之癌症之第二、第三、第四線治療投與。
在一個實施例中，投與本文所述之細胞群體。在一些實施例中，細胞群體經分離或純化。
在一個實施例中，方法包括投與細胞群體，其中之複數個包含本文所述之CAR分子。在一些實施例中，CAR表現細胞群體包含表現不同CAR之細胞的混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現具有本文所述之抗CD19結合域之CAR的第一細胞，及表現具有不同B細胞抗原結合域之CAR的第二細胞。在實施例中，第一及第二細胞群體為T細胞。在實施例中，第一及第二T細胞群體為相同同型，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，第一及第二T細胞群體為不同同型，例如第一群體包含CD4+ T細胞且第二群體包含CD8+ T細胞。在實施例中，第一及第二T細胞群體為以全文引用的方式併入本文中之WO2012/129514中所述之細胞類型。作為另一實例，細胞群體可包含表現具有本文所述之抗CD19結合域之CAR及具有不同B細胞抗原結合域之CAR兩者之單一細胞類型。作為另一實例，細胞群體可包含表現具有兩個或兩個以上(例如2、3、4或5個)B細胞抗原結合域之CAR，例如為雙特異性CAR，例如如本文所述之單一細胞類型。作為另一實例，CAR表現細胞群體可包括第一細胞，其表現包括抗CD19結合域(例如如本文所述)之CAR，及第二細胞，其表現包括除CD19以外之標靶(例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、CD79a或間皮素)之抗原結合域之CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如表現包括主要胞內信號傳導域之CAR的第一細胞及表現包括次要信號傳導域之CAR的第二細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如表現包括第一次要信號傳導域之CAR的第一細胞，及表現包括不同於第一次要信號傳導域之次要信號傳導域之CAR 的第二細胞。
舉例而言，當第一B細胞抑制劑為CD19 CAR表現細胞且第二B細胞抑制劑為CD10 CAR表現細胞時，第一CAR及第二CAR可由相同細胞類型或不同類型表現。舉例而言，在一些實施例中，表現CD19 CAR之細胞為CD4+ T細胞且表現CD10 CAR之細胞為CD8+ T細胞，或表現CD19 CAR之細胞為CD8+ T細胞且表現CD10 CAR之細胞為CD4+ T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞為T細胞且表現CD10 CAR之細胞為NK細胞，或表現CD19 CAR之細胞為NK細胞且表現CD10 CAR之細胞為T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞及表現CD10 CAR之細胞均為NK細胞或均為T細胞，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，單一細胞表現CD19 CAR及CD10 CAR，且此細胞為例如NK細胞或T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。第一CAR及第二CAR可包含相同或不同胞內信號傳導域。舉例而言，在一些實施例中，CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域且CD10 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域，而在一些實施例中，CD19 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域且CD10 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。在其他實施例中，CD19 CAR及CD10 CAR中之每一者包含相同類型的主要信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，但CD19 CAR及CD10 CAR包含不同共刺激域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD10 CAR包含不同共刺激域，例如CD27共刺激域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD10 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD10 CAR包含CD28共刺激域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD10 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD10 CAR包含CD28共刺激域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD10 CAR包含CD27共刺激 域。在另一實施例中，細胞包含含CD19抗原結合域及CD10抗原結合域兩者之CAR，例如雙特異性抗體。
作為另一實例，當第一B細胞抑制劑為CD19 CAR表現細胞且第二B細胞抑制劑為CD20 CAR表現細胞時，第一CAR及第二CAR可由相同細胞類型或不同類型表現。舉例而言，在一些實施例中，表現CD19 CAR之細胞為CD4+ T細胞且表現CD20 CAR之細胞為CD8+ T細胞，或表現CD19 CAR之細胞為CD8+ T細胞且表現CD20 CAR之細胞為CD4+ T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞為T細胞且表現CD20 CAR之細胞為NK細胞，或表現CD19 CAR之細胞為NK細胞且表現CD20 CAR之細胞為T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞及表現CD20 CAR之細胞均為NK細胞或均為T細胞，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，單一細胞表現CD19 CAR及CD20 CAR，且此細胞為例如NK細胞或T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。第一CAR及第二CAR可包含相同或不同胞內信號傳導域。舉例而言，在一些實施例中，CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域且CD20 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域，而在一些實施例中，CD19 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域且CD20 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。在其他實施例中，CD19 CAR及CD20 CAR中之每一者包含相同類型的抓喲信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，但CD19 CAR及CD20 CAR包含不同共刺激域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD20 CAR包含不同共刺激域，例如CD27共刺激域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD20 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD20 CAR包含CD28共刺激域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD20 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD20 CAR包含CD28共 刺激域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD20 CAR包含CD27共刺激域。在另一實施例中，細胞包含含CD19抗原結合域及CD20抗原結合域兩者之CAR，例如雙特異性抗體。
作為另一實例，當第一B細胞抑制劑為CD19 CAR表現細胞且第二B細胞抑制劑為CD22 CAR表現細胞時，第一CAR及第二CAR可由相同細胞類型或不同類型表現。舉例而言，在一些實施例中，表現CD19 CAR之細胞為CD4+ T細胞且表現CD22 CAR之細胞為CD8+ T細胞，或表現CD19 CAR之細胞為CD8+ T細胞且表現CD22 CAR之細胞為CD4+ T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞為T細胞且表現CD22 CAR之細胞為NK細胞，或表現CD19 CAR之細胞為NK細胞且表現CD22 CAR之細胞為T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞及表現CD22 CAR之細胞均為NK細胞或均為T細胞，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，單一細胞表現CD19 CAR及CD22 CAR，且此細胞為例如NK細胞或T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。第一CAR及第二CAR可包含相同或不同胞內信號傳導域。舉例而言，在一些實施例中，CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域且CD22 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域，而在一些實施例中，CD19 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域且CD22 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。在其他實施例中，CD19 CAR及CD22 CAR中之每一者包含相同類型的抓喲信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，但CD19 CAR及CD22 CAR包含不同共刺激域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD22 CAR包含不同共刺激域，例如CD27共刺激域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD22 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD22 CAR包含CD28共刺激域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD22 CAR包含不同共刺激域，例如41BB 共刺激域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD22 CAR包含CD28共刺激域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD22 CAR包含CD27共刺激域。在另一實施例中，細胞包含含CD19抗原結合域及CD22抗原結合域兩者之CAR，例如雙特異性抗體。
作為另一實例，當第一B細胞抑制劑為CD19 CAR表現細胞且第二B細胞抑制劑為CD34 CAR表現細胞時，第一CAR及第二CAR可由相同細胞類型或不同類型表現。舉例而言，在一些實施例中，表現CD19 CAR之細胞為CD4+ T細胞且表現CD34 CAR之細胞為CD8+ T細胞，或表現CD19 CAR之細胞為CD8+ T細胞且表現CD34 CAR之細胞為CD4+ T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞為T細胞且表現CD34 CAR之細胞為NK細胞，或表現CD19 CAR之細胞為NK細胞且表現CD34 CAR之細胞為T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞及表現CD34 CAR之細胞均為NK細胞或均為T細胞，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，單一細胞表現CD19 CAR及CD34 CAR，且此細胞為例如NK細胞或T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。第一CAR及第二CAR可包含相同或不同胞內信號傳導域。舉例而言，在一些實施例中，CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域且CD34 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域，而在一些實施例中，CD19 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域且CD34 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。在其他實施例中，CD19 CAR及CD34 CAR中之每一者包含相同類型的主要信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，但CD19 CAR及CD34 CAR包含不同共刺激域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD34 CAR包含不同共刺激域，例如CD27共刺激域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD34 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD34 CAR包含CD28共刺激域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD34 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD34 CAR包含CD28共刺激域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD34 CAR包含CD27共刺激域。在另一實施例中，細胞包含含CD19抗原結合域及CD34抗原結合域兩者之CAR，例如雙特異性抗體。
作為另一實例，當第一B細胞抑制劑為CD19 CAR表現細胞且第二B細胞抑制劑為CD123 CAR表現細胞時，第一CAR及第二CAR可由相同細胞類型或不同類型表現。舉例而言，在一些實施例中，表現CD19 CAR之細胞為CD4+ T細胞且表現CD123 CAR之細胞為CD8+ T細胞，或表現CD19 CAR之細胞為CD8+ T細胞且表現CD123 CAR之細胞為CD4+ T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞為T細胞且表現CD123 CAR之細胞為NK細胞，或表現CD19 CAR之細胞為NK細胞且表現CD123 CAR之細胞為T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞及表現CD123 CAR之細胞均為NK細胞或均為T細胞，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，單一細胞表現CD19 CAR及CD123 CAR，且此細胞為例如NK細胞或T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。第一CAR及第二CAR可包含相同或不同胞內信號傳導域。舉例而言，在一些實施例中，CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域且CD123 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域，而在一些實施例中，CD19 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域且CD123 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。在其他實施例中，CD19 CAR及CD123 CAR中之每一者包含相同類型的主要信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，但CD19 CAR及CD123 CAR包含不同共刺激域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD123 CAR包含不同共刺激域，例如CD27共刺激域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD123 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺 激域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激域且CD123 CAR包含CD28共刺激域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD123 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激域且CD123 CAR包含CD28共刺激域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激域且CD123 CAR包含CD27共刺激域。在另一實施例中，細胞包含含CD19抗原結合域及CD123抗原結合域兩者之CAR，例如雙特異性抗體。
作為另一實例，當第一B細胞抑制劑為CD19 CAR表現細胞且第二B細胞抑制劑為FLT-3 CAR表現細胞時，第一CAR及第二CAR可由相同細胞類型或不同類型表現。舉例而言，在一些實施例中，表現CD19 CAR之細胞為CD4+ T細胞且表現FLT-3 CAR之細胞為CD8+ T細胞，或表現CD19 CAR之細胞為CD8+ T細胞且表現FLT-3 CAR之細胞為CD4+ T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞為T細胞且表現FLT-3 CAR之細胞為NK細胞，或表現CD19 CAR之細胞為NK細胞且表現FLT-3 CAR之細胞為T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞及表現FLT-3 CAR之細胞均為NK細胞或均為T細胞，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，單一細胞表現CD19 CAR及FLT-3 CAR，且此細胞為例如NK細胞或T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。第一CAR及第二CAR可包含相同或不同胞內信號傳導域。舉例而言，在一些實施例中，CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域且FLT-3 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域，而在一些實施例中，CD19 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域且FLT-3 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。在其他實施例中，CD19 CAR及FLT-3 CAR中之每一者包含相同類型的主要信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，但CD19 CAR及FLT-3 CAR包含不同共刺激域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激域且FLT-3 CAR包含 不同共刺激域，例如CD27共刺激域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激域且FLT-3 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激域且FLT-3 CAR包含CD28共刺激域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激域且FLT-3 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激域且FLT-3 CAR包含CD28共刺激域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激域且FLT-3 CAR包含CD27共刺激域。在另一實施例中，細胞包含含CD19抗原結合域及FLT-3抗原結合域兩者之CAR，例如雙特異性抗體。
作為另一實例，當第一B細胞抑制劑為CD19 CAR表現細胞且第二B細胞抑制劑為ROR1 CAR表現細胞時，第一CAR及第二CAR可由相同細胞類型或不同類型表現。舉例而言，在一些實施例中，表現CD19 CAR之細胞為CD4+ T細胞且表現ROR1 CAR之細胞為CD8+ T細胞，或表現CD19 CAR之細胞為CD8+ T細胞且表現ROR1 CAR之細胞為CD4+ T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞為T細胞且表現ROR1 CAR之細胞為NK細胞，或表現CD19 CAR之細胞為NK細胞且表現ROR1 CAR之細胞為T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞及表現ROR1 CAR之細胞均為NK細胞或均為T細胞，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，單一細胞表現CD19 CAR及ROR1 CAR，且此細胞為例如NK細胞或T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。第一CAR及第二CAR可包含相同或不同胞內信號傳導域。舉例而言，在一些實施例中，CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域且ROR1 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域，而在一些實施例中，CD19 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域且ROR1 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。在其他實施例中，CD19 CAR及ROR1 CAR中之每一者包含相同類型的抓喲信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，但CD19 CAR及ROR1 CAR包含不同共刺激域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激域且ROR1 CAR包含不同共刺激域，例如CD27共刺激域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激域且ROR1 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激域且ROR1 CAR包含CD28共刺激域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激域且ROR1 CAR包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激域且ROR1 CAR包含CD28共刺激域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激域且ROR1 CAR包含CD27共刺激域。在另一實施例中，細胞包含含CD19抗原結合域及ROR1抗原結合域兩者之CAR，例如雙特異性抗體。
更一般而言，當第一B細胞抑制劑包含CD19 CAR且存在第二B細胞抑制劑，例如其包含第二CAR時，第一CAR及第二B細胞抑制劑可由相同細胞類型或不同類型表現。舉例而言，在一些實施例中，表現CD19 CAR之細胞為CD4+ T細胞且表現第二B細胞抑制劑之細胞為CD8+ T細胞，或表現CD19 CAR之細胞為CD8+ T細胞且表現第二B細胞抑制劑之細胞為CD4+ T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞為T細胞且表現第二B細胞抑制劑之細胞為NK細胞，或表現CD19 CAR之細胞為NK細胞且表現第二B細胞抑制劑之細胞為T細胞。在其他實施例中，表現CD19 CAR之細胞及表現第二B細胞抑制劑之細胞均為NK細胞或均為T細胞，例如均為CD4+ T細胞，或均為CD8+ T細胞。在其他實施例中，單一細胞表現CD19 CAR及第二B細胞抑制劑，且此細胞為例如NK細胞或T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。第一CAR及第二CAR可包含相同或不同胞內信號傳導域。舉例而言，在一些實施例中，CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域且第二B細胞抑制劑(或CAR)包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域，而在一些實施例中，CD19 CAR包含共刺激域，例如41BB、CD27或CD28共刺激域且第二B細胞抑制劑(或第二CAR)包含CD3 ξ信號傳導 域。在其他實施例中，CD19 CAR及第二B細胞抑制劑(或第二CAR)中之每一者包含相同類型的主要信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，但CD19 CAR及第二B細胞抑制劑包含不同共刺激域，例如(1)CD19 CAR包含41BB共刺激域且第二B細胞抑制劑(或第二CAR)包含不同共刺激域，例如CD27共刺激域，(2)CD19 CAR包含CD27共刺激域且第二B細胞抑制劑(或第二CAR)包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(3)CD19 CAR包含41BB共刺激域且第二B細胞抑制劑(或第二CAR)包含CD28共刺激域，(4)CD19 CAR包含CD28共刺激域且第二B細胞抑制劑(或第二CAR)包含不同共刺激域，例如41BB共刺激域，(5)CD19 CAR包含CD27共刺激域且第二B細胞抑制劑(或第二CAR)包含CD28共刺激域，或(6)CD19 CAR包含CD28共刺激域且第二B細胞抑制劑(或第二CAR)包含CD27共刺激域。在另一實施例中，細胞包含含CD19抗原結合域及針對第二抗原之抗原結合域兩者之CAR，例如雙特異性抗體。
在一個實施例中，4-1BB共刺激域包含SEQ ID NO：16之序列。在一個實施例中，4-1BB共刺激域包含具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：16之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，4-1BB共刺激域由SEQ ID NO：60之核酸序列，或與其具有95%-99%一致性之序列編碼。
在一個實施例中，CD27共刺激域包含SEQ ID NO：16之序列。在一個實施例中，CD27共刺激域包含具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：16之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD27共刺激域由SEQ ID NO：17之核酸序列，或與其具有95%-99%一致性之序列編碼。
在一個實施例中，CD28共刺激域包含SEQ ID NO：1317之序列。在一個實施例中，CD28共刺激域包含具有SEQ ID NO：1317之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：1317之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD28共刺激域由SEQ ID NO：1318之核酸序列，或與其具有95%-99%一致性之序列編碼。
在一個實施例中，野生型ICOS共刺激域包含SEQ ID NO：1319之序列。在一個實施例中，野生型ICOS共刺激域包含具有SEQ ID NO：1319之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：1319之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，野生型ICOS共刺激域由SEQ ID NO：1320之核酸序列，或與其具有95%-99%一致性之序列編碼。
在一個實施例中，Y至F突變ICOS共刺激域包含SEQ ID NO：1321之序列。在一個實施例中，Y至F突變ICOS共刺激域包含具有SEQ ID NO：1321之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：1321之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，Y至F突變ICOS共刺激域由與SEQ ID NO：1320具有95%-99%一致性之核酸序列編碼(其中SEQ ID NO：1320編碼野生型ICOS)。
在實施例中，主要信號傳導域包含CD3 ξ之功能性信號傳導域。在實施例中，CD3 ξ之功能性信號傳導域包含SEQ ID NO：17(突變CD3 ξ)或SEQ ID NO：43(野生型人類CD3 ξ)。
在一個實施例中，方法包括投與細胞群體，其中群體中之至少一個細胞表現CAR，例如具有本文所述之抗CD19域，及增強CAR表現細胞活性之藥劑，例如表現增強CAR表現細胞活性之藥劑之第二細 胞。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可為免疫抑制分子之藥劑。免疫抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在一個實施例中，抑制免疫抑制分子之藥劑包含第一多肽(例如抑制分子)，與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所述之胞內信號傳導域)相關。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制分子，如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β，或此等中的任一者之片段(例如此等中的任一者之細胞外域的至少一部分)，及第二多肽，其為本文所述之胞內信號傳導域(例如包含共刺激域(例如41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或主要信號傳導域(例如本文所述之CD3 ξ信號傳導域)。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段之第一多肽(例如PD1之細胞外域的至少一部分)，及本文所述之胞內信號傳導域(例如本文所述之CD28信號傳導域及/或本文所述之CD3 ξ信號傳導域)之第二多肽。
在一個實施例中，B細胞抑制劑包含CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、FLT-3或ROR1中的一或多者之抑制劑。在一個實施例中，B細胞抑制劑包含有效數目的一或多種表現結合CD10、CD20、CD22、CD34、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之CAR分子之細胞。在一個實施例中，B細胞抑制劑包含CD123 CAR。在一個實施例中，B細胞抑制劑包含一或多種表現結合CD123之CAR分子之細胞。在一個實施例中，疾病為CD19陰性癌症，例如CD19陰性復發癌症。在一個實施例中，CD19 CAR表現細胞與一或多種B細胞抑制劑同時、在其之前或在其之後投與。
在一個實施例中，方法進一步包含投與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞。在一個實施例中，CD19抑制劑包含CD19 CAR且B細胞抑制劑包含CD123 CAR。在一個實施例中，CD19 CAR或CD123 CAR包含分離胞內信號傳導域，使得相比於CD19 CAR及CD123 CAR結合至表現CD19或CD123中的一者之靶細胞(例如造血幹細胞)時之活化，細胞，例如免疫效應細胞群體之完全活化在CD19 CAR及CD123 CAR兩者結合至靶細胞，例如CD19+CD123+靶細胞(例如B-ALL細胞細胞)時發生。在一個實施例中，CD123CAR包含4-1BB信號傳導域且CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。在一個實施例中，CD123CAR包含共刺激域，例如4-1BB信號傳導域，且CD19 CAR包含主要信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域。在一個實施例中，CD123CAR包含主要信號傳導域，例如CD3 ξ信號傳導域，且CD19 CAR包含共刺激域，例如4-1BB信號傳導域。在一個實施例中，B細胞抑制劑包含含共刺激域之CAR(例如針對CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之CAR)，及含主要信號傳導域之CD19 CAR。在一個實施例中，B細胞抑制劑包含含主要信號傳導域之CAR(例如針對CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之CAR)，及包含共刺激域之CD19 CAR。在一個實施例中，B細胞抑制劑包含一或多種表現結合CD123之CAR分子之細胞，且其中CD19 CAR表現細胞與B細胞抑制劑同時投與。在一個實施例中，CD123CAR包含4-1BB信號傳導域且CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。
在一個實施例中，該方法進一步包含將細胞(例如，造血幹細胞)或骨髓移植至哺乳動物中。
在另一態樣中，本發明關於表現本文所述之CAR分子，例如CD19 CAR分子之細胞，用作與B細胞抑制劑，例如本文所述之B細胞抑制劑組合之藥物。在另一態樣中，本發明關於本文所述之B細胞抑 制劑，其用作與表現CAR分子，例如本文所述之CD19 CAR分子之細胞組合之藥物。
在另一態樣中，本發明關於表現本文所述之CAR分子，例如CD19 CAR分子之細胞，其與B細胞抑制劑，例如本文所述之B細胞抑制劑組合用於治療表現CD19之疾病。在另一態樣中，本發明關於本文所述之B細胞抑制劑，其與表現本文所述之CAR分子，例如CD19 CAR分子之細胞組合用於治療表現CD19之疾病。在另一態樣中，本發明關於表現本文所述之CAR分子，例如CD19 CAR分子之細胞，其與B細胞抑制劑，例如本文所述之B細胞抑制劑組合用於治療癌症，例如本文所述之癌症。
在一個實施例中，方法包括投與細胞群體，其中群體中之至少一個細胞表現本文中之療法(例如CD20 CAR、CD22 CAR或具有本文所述之抗CD19域之CAR，與B細胞抑制劑組合)及增強CAR表現細胞活性之藥劑，其中藥劑為細胞因子，例如IL-7、IL-15、IL-21或其組合。細胞因子可與CAR表現細胞之投與組合，例如與其同時或在其之後不久傳遞。或者，細胞因子可在投與CAR表現細胞之後的延長時段之後，例如在評估個體對CAR表現細胞之反應之後傳遞。亦提供使用之相關組合物及製造藥物之方法。
在一個實施例中，本文所述之細胞(例如表現CD20 CAR分子之細胞、表現CD22 CAR分子之細胞，或表現CD19 CAR分子，例如本文所述之CD19 CAR分子之細胞，與B細胞抑制劑組合)與增加表現CAR分子之細胞之功效之藥劑或抑制劑中的一者，例如本文所述之藥劑組合投與。
在一個實施例中，本文所述之細胞(例如表現CD20 CAR分子之細胞、表現CD22 CAR分子之細胞，或表現CD19 CAR分子，例如本文所述之CD19 CAR分子之細胞，與B細胞抑制劑組合)與改善一或多種 與投與表現CAR分子之細胞相關之副作用之藥劑或抑制劑中的一者，例如本文所述之藥劑組合投與。
在一個實施例中，表現CD19 CAR分子，例如本文所述之CD19 CAR分子之細胞與B細胞抑制劑，及治療霍奇金淋巴瘤之藥劑，例如本文所述之藥劑組合投與。
在一些態樣中，本發明提供治療為對於CD19抑制劑，例如CD19 CAR療法為無反應者、部分反應者或復發者之患者之方法，其包含向患者投與B細胞抑制劑，例如如本文所述之B細胞抑制劑，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者(例如2、3、4、5、6、7、8、9者或全部)之抑制劑。在實施例中，B細胞抑制劑為CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)，其為CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者(例如2、3、4、5、6者或全部)之抑制劑。在實施例中，患者具有或鑑別為具有CD19陰性癌細胞及對於CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者(例如2、3、4、5、6、7、8、9者或全部)呈陽性之癌細胞。在實施例中，方法進一步包含向患者投與癌細胞呈陽性之B細胞抑制劑，例如癌細胞呈陽性之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者(例如2、3、4、5、6、7、8、9者或全部)之抑制劑。在實施例中，方法進一步包含測定患者是否包含CD19陰性癌細胞之步驟，及測定患者是否包含對於CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者(例如2、3、4、5、6、7、8、9者或全部)呈陽性之癌細胞之步驟中的一者或兩者。在實施例中，個體具有或鑑別為具有關於CD19表現測試陰性之腫瘤或癌細胞群體，其如藉由結合至抗CD19抗體，例如與表2 或表3 中之CAR分子中的任 一者具有相同特異性之抗體所量測。
在另一態樣中，本發明提供一種組合物，其包含表現結合CD19之嵌合抗原受體(CAR)分子之細胞，以及B細胞抑制劑，例如選自以下之B細胞抑制劑：CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之抑制劑，或其組合。CAR表現細胞及B細胞抑制劑可以單一劑型，或以兩種或兩種以上劑型存在。
在一個實施例中，組合物為醫藥學上可接受之組合物。
在實施例中，本文中揭示之組合物(例如核酸、載體或細胞)用作藥物。
在實施例中，本文中揭示之組合物用於治療與B細胞抗原(例如CD19)表現相關之疾病，例如B細胞白血病或淋巴瘤。
CD19抑制劑
在實施例中，CD19抑制劑為小分子、抗體、抗體片段或細胞療法。
在一些實施例中，CD19抑制劑(例如細胞療法或抗體)與B細胞抑制劑，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之一或多種抑制劑組合投與，或與其一起存在於組合物中。
在一個實施例中，表現CAR分子之細胞包含抗CD19結合域(例如特異性結合於CD19之鼠類或人類化抗體或抗體片段)、跨膜域及胞內信號傳導域(例如包含共刺激域及/或主要信號傳導域之胞內信號傳導域)。在一個實施例中，CAR包含包括本文所述之抗CD19結合域(例如如本文所述之特異性結合於CD19之鼠類或人類化抗體或抗體片段)、本文所述之跨膜域及本文所述之胞內信號傳導域(例如包含本文所述之共刺激域及/或主要信號傳導域之胞內信號傳導域)的抗體或抗體片 段。
在一個實施例中，CAR分子包含抗CD19結合域，其包含本文所述之抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述之抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如抗CD19結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。在一個實施例中，抗CD19結合域包含本文所述之抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如抗CD19結合域具有兩個可變重鏈區，各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，抗CD19結合域包含本文所述之鼠類輕鏈可變區(例如表3 中)及/或本文所述之鼠類重鏈可變區(例如表3 中)。在一個實施例中，抗CD19結合域為包含表3 之胺基酸序列之鼠類輕鏈及鼠類重鏈之scFv。在一個實施例中，抗CD19結合域(例如scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有提供於表3 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表3 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有提供於表3 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表3 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，抗CD19結合域包含SEQ ID NO：59的序列，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，抗CD19結合域為scFv，且包含本文所述之胺基酸序列(例如表3 中)之輕鏈可變區經由連接子，例如本文所述之連接子連接至包含本文所述之胺基酸序列 (例如表3 中)之重鏈可變區。在一個實施例中，抗CD19結合域包括(Gly4 -Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6，例如3或4(SEQ ID NO：53)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區，或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在一個實施例中，CAR分子包含人類化抗CD19結合域，其包括本文所述之人類化抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述之人類化抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗CD19結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含至少HC CDR2。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含本文所述之人類化抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗CD19結合域具有兩個可變重鏈區，各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含至少HC CDR2。在一個實施例中，輕鏈可變區包含VK3_L25生殖系序列之一個、兩個、三個或所有四個構架區。在一個實施例中，輕鏈可變區具有修飾(例如取代，例如發現於SEQ ID NO：58之鼠類輕鏈可變區中之對應位置中之一或多個胺基酸之取代，例如位置71及87中的一或多者處之取代)。在一個實施例中，重鏈可變區包含VH4_4-59生殖系序列之一個、兩個、三個或所有四個構架區。在一個實施例中，重鏈可變區具有修飾(例如取代，例如發現於SEQ ID NO：58之鼠類重鏈可變區中之對應位置中之一或多個胺基酸之取代，例如位置71、73及78中 的一或多者處之取代)。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如，表2 中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如，表2 中)。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域為包含表2 之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域(例如scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有提供於表2 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表2 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有提供於表2 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表2 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域為scFv，且包含本文所描述之例如表2 中之胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接子(例如，本文所描述之連接子)連接至包含本文所描述之例如表2 中之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包括(Gly4 -Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6，例如3或4(SEQ ID NO：53)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區，或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在一個實施例中，CAR分子包含抗CD19結合域，其包括表4及5 之構築體，例如鼠類_CART19、人類化_CART19 a、人類化_CART19 b或人類化_CART19 c之一或多個(例如2、3、4、5或6個)LC CDR1、 LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一個實施例中，CAR分子包含前導序列，例如本文所述之前導序列，例如SEQ ID NO：13之前導序列，或與其具有95%-99%一致性；本文所述之抗CD19結合域，例如包含本文所述之LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3之抗CD19結合域，例如表3 中所述之鼠類抗CD19結合域、表2 中所述之人類化抗CD19結合域或與其具有95%-99%一致性之序列；鉸鏈區，例如本文所述之鉸鏈區，例如SEQ ID NO：14之鉸鏈區，或與其具有95%-99%一致性；跨膜域，例如本文所述之跨膜域，例如具有SEQ ID NO：15之序列或與其具有95%-99%一致性之序列之跨膜域；胞內信號傳導域，例如本文所述之胞內信號傳導域(例如包含共刺激域及/或主要信號傳導域之胞內信號傳導域)。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含共刺激域，例如本文所描述之共刺激域，例如具有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列或與其具有95%-99%一致性之4-1BB共刺激域；及/或主要信號傳導域，例如本文所描述之主要信號傳導域，例如具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列或與其具有95%-99%一致性之CD3 ξ刺激域。
在一個實施例中，CAR分子包含SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42之胺基酸序列，或具有SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42之胺基酸序列之至少一個、兩個、三個、四個、五個、10、15、20或30個修飾(例如取代)但不超過60、50或40個 修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42之胺基酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列(例如由其組成)。
在一些態樣中，本發明大體上係關於經工程改造以表現CAR之細胞，例如T細胞或自然殺手(NK)細胞與一或多種B細胞抑制劑組合以治療與分化簇19蛋白質(CD19)之表現相關之疾病之用途。在一些實施例中，B細胞抑制劑為CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑。
在一些實施例中，CD19抑制劑包含抗體分子，其具有例如具有如本文所述之CD19結合序列之抗體分子。舉例而言，抗體分子可包含如表2、3、4及5 中的任一者中所述之CDR或VH及VL，或與其具有同源性，例如與其具有95%-99%一致性之序列。抗體分子可包含具有此部分中所述之序列之CD19結合區，例如在CAR的情況下。
在實施例中，B細胞抑制劑係選自抑制性核酸、可溶配位體、抗體或其抗原結合片段、CAR或結合至一或多種B細胞抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之CAR表現細胞。
CD20結合域反抑制劑
在一些態樣中，本發明提供CD20抑制劑或結合域，例如如本文所述之CD20抑制劑或結合域。本發明亦提供編碼CD20結合域之核酸，例如編碼包含CD20結合域之CAR。組合物亦可包含第二藥劑，例如抗CD19 CAR表現細胞或CD19結合域。藥劑可例如由單一核酸或 不同核酸編碼。
在一些態樣中，CD20抑制劑或結合域作為單藥療法投與。在一些態樣中，CD20抑制劑或結合域與第二藥劑，如抗CD19 CAR表現細胞組合投與。
CD20抑制劑可例如為小分子、抗體或其抗原結合片段、CAR或CAR表現細胞。在一個實施例中，CD20抑制劑為抗CD20抗體或其片段。在一個實施例中，抗體為單特異性抗體，且在另一實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一個實施例中，CD20抑制劑為嵌合小鼠/人類單株抗體，例如利妥昔單抗。在一個實施例中，CD20抑制劑為人類單株抗體，如奧伐木單抗。在一個實施例中，CD20抑制劑為人類化抗體，如奧克珠單抗(ocrelizumab)、維托珠單抗(veltuzumab)、歐比托珠單抗(obinutuzumab)、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)或PRO131921(Genentech)。在一個實施例中，CD20抑制劑為包含一部分抗CD20抗體之融合蛋白，如TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)。
在一個實施例中，CD20抑制劑為抗CD20表現細胞，例如CD20 CART或CD20表現NK細胞。
在一些實施例中，CD20 CAR包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之視情況存在之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈)、跨膜域(例如本文所述之跨膜域)及胞內刺激域(例如本文所述之胞內刺激域)。在一個實施例中，例示性CD20 CAR構築體包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、胞內共刺激域(例如本文所述之胞內共刺激域)及胞內刺激域。
在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之CD20結合域之一或多個(例如所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及/或本文所述之CD20結 合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如CD20結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。此等CDR可例如為表12A、12B及/或表13 之彼等。在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之CD20結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如CD20結合域具有兩個可變重鏈區，各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如，表15A或15B 中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如，表14A或14B 中)。在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之重鏈可變區(例如表14A或14B 中)，例如至少兩個本文所述之重鏈可變區(例如表14A或14B 中)。在一個實施例中，CD20結合域為包含表14A或14B或15A或15B 之胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)包含：包含具有提供於表15A或15B 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表15A或15B 之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列之輕鏈可變區；及/或包含具有提供於表14A或14B 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表14A或14B 之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列之重鏈可變區。CD20結合域可為例如抗體分子或CAR分子之一部分。
在一個實施例中，CAR分子包含抗CD20結合域，其包括表12A、12B及/或13 之構築體，例如CAR20-1、CAR20-2、CAR20-3、CAR20-4、CAR20-5、CAR20-6、CAR20-7、CAR20-8、CAR20-9、CAR20-10、CAR20-11、CAR20-12、CAR20-13、CAR20-14、CAR20- 15或CAR20-16之一或多個(例如2、3、4、5或6個)LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一個實施例中，CAR分子包含抗CD22結合域，其包括表14A或14B及15A或15B 之構築體，例如CAR20-1、CAR20-2、CAR20-3、CAR20-4、CAR20-5、CAR20-6、CAR20-7、CAR20-8、CAR20-9、CAR20-10、CAR20-11、CAR20-12、CAR20-13、CAR20-14、CAR20-15或CAR20-16之VL及/或VH。
CD20 scFv之前可為如SEQ ID NO：13中提供之視情況存在之前導序列，且後接如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49中提供之視情況存在之鉸鏈序列、如SEQ ID NO：15中提供之跨膜區、包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之細胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之CD3 ξ序列，例如其中域鄰接且在相同閱讀框架中以形成單一融合蛋白。
其他實施例包括編碼表11A-15B 中的任一者之多肽之核苷酸序列。其他實施例包括編碼表11A-15B 中的任一者之多肽之核苷酸序列，及SEQ ID NO：13、14、15、16、17及視情況存在之51之域中之每一者。
在一個實施例中，CD20結合域之特徵為抗體或抗體片段之特定功能特徵或特性。舉例而言，在一個實施例中，包含抗原結合域之本發明之CAR組合物之部分特異性結合人類CD20或其片段。
在一個實施例中，CD20結合域為片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一個實施例中，CD20結合域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能性(例如雙特異性)雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強型親和力結合CD20蛋白質或其片段。在一些情況下，人類scFv可衍生自呈現庫。
在一個實施例中，CD20結合域(例如，scFv)包含至少一個突變，使得突變之scFv賦予CART20構築體以改良之穩定性。在另一實施例中，CD20結合域，例如scFv包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個產生自例如人類化方法之突變，使得突變之scFv賦予CART20構築體以改良之穩定性。
在一些實施例中，CD20抑制劑包含抗體分子，其具有例如具有如本文所述之CD20結合序列之抗體分子。舉例而言，抗體分子可包含如表11A-15B 中的任一者中所述之CDR或VH及VL，或與其具有同源性，例如與其具有95%-99%一致性之序列。抗體分子可包含具有此部分中所述之序列之CD20結合區，例如在CAR的情況下。
在一態樣中，本發明提供包含表現CD19 CAR及CD20 CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD20 CAR之第二細胞。
在一些態樣中，本文所述之結合域或抗體分子與CD20之第二抗體分子結合相同(或大體上相同)或重疊(或大體上重疊)抗原決定基，其中第二抗體分子為本文所述之抗體分子，例如選自表11A-15B 之抗體分子。在一些實施例中，本文所述之結合域或抗體分子與CD20之第二抗體分子競爭結合及/或結合相同(或大體上相同)或重疊(或大體上重疊)抗原決定基，其中第二抗體分子為本文所述之抗體分子，例如選自表11A-15B 之抗體分子，例如如藉由實例25中所述之方法所測定。在一些實施例中，雙互補位CD20結合域結合第一抗原決定基，例如與選自表11A-15B 之抗體分子結合之抗原決定基，且雙互補位結合域亦結合第二抗原決定基，例如與選自表11A-15B 之抗體分子結合之第二抗原決定基。在一些態樣中，本發明提供一種治療方法，其包含投與結合第一抗原決定基，例如與選自表11A-15B 之抗體分子結合 之抗原決定基之第一CD20結合域及結合第二抗原決定基，例如與選自表11A-15B 之抗體分子結合之第二抗原決定基之第二CD20結合域。在一些實施例中，CD20結合域為CAR分子之一部分，例如由CAR表現細胞表現。
CD22結合域及抑制劑
在一些態樣中，本發明提供CD22抑制劑或結合域，例如如本文所述之CD22抑制劑或結合域。本發明亦提供編碼CD22結合域之核酸，例如編碼包含CD22結合域之CAR。組合物亦可包含第二藥劑，例如抗CD19 CAR表現細胞或CD19結合域。藥劑可例如由單一核酸或不同核酸編碼。
在一些態樣中，CD22抑制劑或結合域作為單藥療法投與。在一些態樣中，CD22抑制劑或結合域與第二藥劑，如抗CD19 CAR表現細胞組合投與。
CD22抑制劑可例如為小分子、抗體或其抗原結合片段、CAR或CAR表現細胞。在一個實施例中，CD22抑制劑為抗CD22抗體或其片段。在一個實施例中，抗體為單特異性抗體，且在另一實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一個實施例中，抗體為單特異性抗體，視情況共軛至第二藥劑，如化學治療劑。舉例而言，在一個實施例中，抗體為抗CD22單株抗體-MMAE共軛物(例如DCDT2980S)。在一個實施例中，抗體為抗CD22抗體之scFv，例如抗體RFB4之scFv。此scFv可融合至綠膿桿菌外毒素-A(例如BL22)之全部或片段。在一個實施例中，抗體為人類化抗CD22單株抗體(例如依帕珠單抗)。在一個實施例中，抗體或其片段包含抗CD22抗體之Fv部分，其視情況共價融合至綠膿桿菌外毒素-A(例如莫昔土莫單抗)之全部或片段(例如38KDa片段)。在一個實施例中，抗CD22抗體為抗CD19/CD22雙特異性抗體，視情況共軛至毒素。舉例而言，在一個實施例中，抗CD22抗體包含抗 CD19/CD22雙特異性部分(例如兩個scFv配位體，識別人類CD19及CD22)視情況連接至白喉毒素(DT)之全部或一部分，例如白喉毒素(DT)之前389個胺基酸，DT 390，例如配位體定向毒素，如DT2219ARL)。在另一實施例中，雙特異性部分(例如抗CD19/抗CD22)連接至毒素，如去糖基化蓖麻毒素A鏈(例如Combotox)。
在一個實施例中，CD22抑制劑為抗CD22表現細胞，例如CD22 CART或CD22表現NK細胞。
在一態樣中，本發明提供一種CAR表現細胞，例如CART細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD22 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD22 CAR之第二細胞。作為另一實例，CAR T細胞群體可包括表現一個以上，例如2、3、4、5或6個或更多個CAR，例如CD19 CAR及CD22 CAR之單一群體。
在一些實施例中，CD22-CAR包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之視情況存在之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈)、跨膜域(例如本文所述之跨膜域)及胞內刺激域(例如本文所述之胞內刺激域)。在一實施例中，示例性CD22 CAR構築體包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、胞內共刺激域(例如本文所述之胞內共刺激域)及胞內刺激域。
在一個實施例中，CD22結合域包含本文所述之CD22結合域之一或多個(例如所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及/或本文所述之CD22結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如CD22結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個 HC CDR。此等CDR可例如為表7A、7B、7C、8A及/或8B 之一或多種CDR。在一個實施例中，CD22結合域包含本文所述之CD22結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如CD22結合域具有兩個可變重鏈區，各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，CD22結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如，表10A或10B 中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如，表9A或9B 中)。在一個實施例中，CD22結合域包含本文所述之重鏈可變區(例如表9A或9B 中)，例如至少兩個本文所述之重鏈可變區(例如表9A或9B 中)。在一個實施例中，CD22結合域為包含表9A或9B及10A或10B 之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在一個實施例中，CD22結合域(例如scFv)包含：包含具有提供於表10A或10B 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表10A或10B 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列之輕鏈可變區；及/或包含具有提供於表9A或9B 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表9A或9B 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列之重鏈可變區。CD22結合域可為例如抗體分子或CAR分子之一部分。
在一個實施例中，CAR分子包含抗CD22結合域，其包括表7A、7B、7C、8A及/或8B 之構築體，例如m971、CAR22-1、CAR22-2、CAR22-3、CAR22-4、CAR22-5、CAR22-6、CAR22-7、CAR22-8、CAR22-9、CAR22-10、CAR22-11、CAR22-12、CAR22-13、CAR22-14、CAR22-15、CAR22-16、CAR22-17、CAR22-18、CAR22-19、CAR22-20、CAR22-21、CAR22-22、CAR22-23、CAR22-24、CAR22-25、CAR22-26、CAR22-27、CAR22-28、CAR22-29、CAR22-30、 CAR22-31、CAR22-32、CAR22-33、CAR22-34、CAR22-35、CAR22-36、CAR22-37或CAR22-38之一或多個(例如2、3、4、5或6個)LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一個實施例中，CAR分子包含抗CD22結合域，其包括表9A、9B、10A及/或10B 之構築體，例如m971、CAR22-1、CAR22-2、CAR22-3、CAR22-4、CAR22-5、CAR22-6、CAR22-7、CAR22-8、CAR22-9、CAR22-10、CAR22-11、CAR22-12、CAR22-13、CAR22-14、CAR22-15、CAR22-16、CAR22-17、CAR22-18、CAR22-19、CAR22-20、CAR22-21、CAR22-22、CAR22-23、CAR22-24、CAR22-25、CAR22-26、CAR22-27、CAR22-28、CAR22-29、CAR22-30、CAR22-31、CAR22-32、CAR22-33、CAR22-34、CAR22-35、CAR22-36、CAR22-37或CAR22-38之一或多個VL及/或VH，或與其具有95%-99%一致性之序列。
scFv之前可為如SEQ ID NO：13中提供之視情況存在之前導序列，且後接如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49中提供之視情況存在之鉸鏈序列、如SEQ ID NO：15中提供之跨膜區、包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之細胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之CD3 ξ序列，例如其中域鄰接且在相同閱讀框架中以形成單一融合蛋白。
其他實施例包括編碼表6A-10B 中的任一者之多肽之核苷酸序列。其他實施例包括編碼表6A-10B 中的任一者之多肽之核苷酸序列，及SEQ ID NO：13、14、15、16、17及視情況存在之51之域中之每一者。
在一個實施例中，CD22結合域之特徵為抗體或抗體片段之特定功能特徵或特性。舉例而言，在一個實施例中，包含抗原結合域之本發明之CAR組合物之部分特異性結合人類CD22或其片段。
在一個實施例中，CD22結合域為片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一個實施例中，CD22結合域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能性(例如雙特異性)雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強型親和力結合CD22蛋白質或其片段。在一些情況下，人類scFv可衍生自呈現庫。
在一個實施例中，CD22結合域(例如，scFv)包含至少一個突變，使得突變之scFv賦予CART22構築體以改良之穩定性。在另一實施例中，CD22結合域(例如，scFv)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個例如產生自人類化方法之突變，使得突變之scFv賦予CART22構築體以改良之穩定性。
在一些實施例中，CD22抑制劑包含抗體分子，其具有例如具有如本文所述之CD22結合序列之抗體分子。舉例而言，抗體分子可包含如表6A-10B 中的任一者中所述之CDR或VH及VL，或與其具有同源性，例如與其具有95%-99%一致性之序列。抗體分子可包含具有此部分中所述之序列之CD22結合區，例如在CAR的情況下。
在一個實施例中，本發明提供一種CAR表現細胞，例如CART細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD22 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD22 CAR之第二細胞。
在一些態樣中，本文所述之結合域或抗體分子與CD22之第二抗體分子結合相同(或大體上相同)或重疊(或大體上重疊)抗原決定基，其中第二抗體分子為本文所述之抗體分子，例如選自表6A-10B 之抗體分子。在一些實施例中，本文所述之結合域或抗體分子與CD22之第二抗體分子競爭結合及/或結合相同(或大體上相同)或重疊(或大體上重疊)抗原決定基，其中第二抗體分子為本文所述之抗體分子，例 如選自表6A-10B 之抗體分子，例如如藉由實例25中所述之方法所測定。在一些實施例中，雙互補位CD22結合域結合第一抗原決定基，例如與選自表6A-10B 之抗體分子結合之抗原決定基，且雙互補位結合域亦結合第二抗原決定基，例如與選自表6A-10B 之抗體分子結合之第二抗原決定基。在一些態樣中，本發明提供一種治療方法，其包含投與結合第一抗原決定基，例如與選自表6A-10B 之抗體分子結合之抗原決定基之第一CD22結合域及結合第二抗原決定基，例如與選自表6A-10B 之抗體分子結合之第二抗原決定基之第二CD22結合域。在一些實施例中，CD22結合域為CAR分子之一部分，例如由CAR表現細胞表現。
在一些實施例中，CD22結合域結合至CD22之Ig樣域1、2、3、4、5、6或7中的一或多者。在一些實施例中，CD22結合域結合至域1及2；域3及4；或域5、6及7。
在一些態樣中，本發明提供一種治療CD19陰性癌症，例如白血病，例如ALL，例如B-ALL之方法，其包含投與CD22抑制劑，例如本文所述之CD22結合域或CD22 CAR表現細胞。在一些實施例中，方法包含測定癌症是否為CD19陰性之步驟。在一些實施例中，個體已接受CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，且為對於CD19抑制劑耐受性、復發性或頑抗性的。
ROR1抑制劑
ROR1抑制劑可例如為小分子、抗體或其片段。在一個實施例中，ROR1抑制劑為抗ROR1抗體或其片段。在一個實施例中，抗ROR1抗體或其片段為單株抗體，例如瑟吐珠單抗。
在一個實施例中，ROR1抑制劑為抗ROR1表現細胞，例如ROR1 CART或ROR1表現NK細胞。
在一些實施例中，ROR1-CAR包含視情況存在之前導序列(例如 本文所述之視情況存在之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈)、跨膜域(例如本文所述之跨膜域)及胞內刺激域(例如本文所述之胞內刺激域)。在一個實施例中，例示性ROR1 CAR構築體包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、胞內共刺激域(例如本文所述之胞內共刺激域)及胞內刺激域。
在一個實施例中，ROR1結合域包含scFv部分，例如人類scFv部分。scFv scFv之前可為如SEQ ID NO：13中提供之視情況存在之前導序列，且後接如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49中提供之視情況存在之鉸鏈序列、如SEQ ID NO：15中提供之跨膜區、包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之細胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之CD3ξ序列，例如其中域鄰接且在相同閱讀框架中以形成單一融合蛋白。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種包含編碼ROR1 CAR之核酸分子的重組核酸構築體，其中核酸分子包含編碼ROR1結合域之核酸序列，例如本文所述，例如與編碼胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。可用於CAR中之一例示性胞內信號傳導域包括(但不限於)例如CD3-ξ、CD28、4-IBB及其類似物的一或多個胞內信號傳導域。在一些情況下，CAR可包含CD3-ξ、CD28、4-1BB及其類似物的任何組合。
在一個實施例中，ROR1結合域之特徵為抗體或抗體片段之特定功能特徵或特性。舉例而言，在一個實施例中，包含抗原結合域之本發明之CAR組合物之部分特異性結合人類ROR1或其片段。在某些實施例中，scFv與前導序列鄰接且在相同閱讀框架中。在一態樣中，前導序列為提供為SEQ ID NO：13之多肽序列。
在一個實施例中，ROR1結合域為片段，例如單鏈可變片段 (scFv)。在一個實施例中，ROR1結合域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能性(例如雙特異性)雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強型親和力結合ROR1蛋白質或其片段。在一些情況下，人類scFv可來源於呈現庫。
在一個實施例中，ROR1結合域(例如，scFv)包含至少一個突變，使得突變之scFv賦予ROR1 CART構築體以改良之穩定性。在另一實施例中，ROR1結合域(例如，scFv)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個由人類化過程引起之突變，使得突變之scFv賦予ROR1 CART構築體以改良之穩定性。
在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞，例如CART細胞群體，其包含表現CD19 CAR及ROR1 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現ROR1 CAR之第二細胞。
CD123抑制劑
CD123抑制劑可例如為小分子、抗體或其片段(例如單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD123之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD123 CAR，例如CD123 CART之細胞。
在一個實施例中，CD123抑制劑為重組蛋白，例如包含CD123受體，例如SL-401(亦稱作DT388IL3；University of Texas Southwestern Medical Center)之天然配位體(或片段)。
在另一實施例中，CD123抑制劑為抗CD123抗體或其片段，例如單株抗體(例如單特異性或雙特異性抗體或其片段)，如CSL360(CSL Limited)、CSL362(CSL Limited)或MGD006(MacroGenics)。
在一個實施例中，CD123抑制劑為抗CD123 CAR表現細胞，例如CD123 CART或CD123 CAR表現NK細胞。
在一些實施例中，CD123-CAR包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之視情況存在之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈)、跨膜域(例如本文所述之跨膜域)及胞內刺激域(例如本文所述之胞內刺激域)。在一個實施例中，例示性CD123 CAR構築體包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、胞內共刺激域(例如本文所述之胞內共刺激域)及胞內刺激域。
在一個實施例中，CD123結合域包含本文所述之CD123結合域之一或多個(例如所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及/或本文所述之CD20結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如CD123結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。此等CDR可例如為表17、18、26或27 中的任一者之彼等。在一個實施例中，CD123結合域包含本文所述之CD123結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如CD123結合域具有兩個可變重鏈區，各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，CD123結合域包含本文所述之輕鏈可變區及/或本文所述之重鏈可變區。在一個實施例中，CD123結合域包含本文所述之重鏈可變區，例如至少兩個本文所述之重鏈可變區。在一個實施例中，CD123結合域為包含表16或25 之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在一個實施例中，CD123結合域(例如scFv)包含：包含具有表16或25 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表16或25 中之輕鏈可變區具有95-99%一致性之序列之輕鏈可變 區；及/或包含具有表16或25 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表16或25 中之重鏈可變區具有95-99%一致性之序列之重鏈可變區。
在一個實施例中，CAR分子包含抗CD123結合域，其包括表17及18 之構築體，例如CAR123-1、CAR123-2、CAR123-3或CAR123-4之一或多個(例如2、3、4、5或6個)LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，CAR分子包含抗CD123結合域，其包括表26及27 之構築體，例如hzCAR123之一或多個(例如2、3、4、5或6個)LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
CD123 scFv之前可為如SEQ ID NO：13中提供之視情況存在之前導序列，且後接如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49中提供之視情況存在之鉸鏈序列、如SEQ ID NO：15中提供之跨膜區、包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之細胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之CD3 ξ序列，例如其中域鄰接且在相同閱讀框架中以形成單一融合蛋白。
其他實施例包括編碼表16-27 中的任一者之多肽之核苷酸序列。其他實施例包括編碼表16-27 中的任一者之多肽之核苷酸序列，及SEQ ID NO：13、14、15、16、17及視情況存在之51之域中之每一者。
在一個實施例中，CD123結合域之特徵為抗體或抗體片段之特定功能特徵或特性。舉例而言，在一個實施例中，包含抗原結合域之本發明CAR組合物之部分特異性結合人類CD123或其片段。
在一個實施例中，CD123結合域為片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一個實施例中，CD123結合域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能 性(例如雙特異性)雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強型親和力結合CD123蛋白質或其片段。在一些情況下，人類scFv可衍生自呈現庫。
在一個實施例中，CD123結合域(例如，scFv)包含至少一個突變，使得突變之scFv賦予CART123構築體以改良之穩定性。在另一實施例中，CD123結合域，例如scFv包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個產生自例如人類化方法之突變，使得突變之scFv賦予CART123構築體以改良之穩定性。
在一些實施例中，CD123抑制劑包含抗體分子，例如具有如本文所述之CD123結合序列之抗體分子。舉例而言，抗體分子可包含如表16-27 中的任一者中所述之CDR或VH及VL，或與其具有同源性，例如與其具有95%-99%一致性之序列。抗體分子可包含具有此部分中所述之序列之CD123結合區，例如在CAR的情況下。
在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞，例如CART細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD123 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD123 CAR之第二細胞。
CD10抑制劑
CD10抑制劑可例如為小分子、抗體或其片段(例如單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD10之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD10 CAR，例如CD10 CART之細胞。
在一個實施例中，CD10抑制劑包含小分子，如沙庫必曲(sacubitril)(Novartis)、纈沙坦(valsartan)/沙庫必曲(Novartis)、奧馬曲拉(omapatrilat)(Bristol-Myers Squibb)、RB-101、UK-414,495(Pfizer)或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。
在一個實施例中，CD10抑制劑為抗CD10 CAR表現細胞，例如CD10 CART或CD10 CAR表現NK細胞。
在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞，例如CART細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD10 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD10 CAR之第二細胞。
CD34抑制劑
CD34抑制劑可例如為小分子、抗體或其片段(例如單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD34之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD34 CAR，例如CD34 CART之細胞。
在一個實施例中，CD34抑制劑包含靶向CD34之單株抗體或其片段或包含抗CD34單株抗體或其片段之免疫微脂囊。
在一個實施例中，CD34抑制劑為抗CD34 CAR表現細胞，例如CD34 CART或CD34 CAR表現NK細胞。
在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞，例如CART細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD34 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD34 CAR之第二細胞。
FLT-3抑制劑
FLT-3抑制劑可例如為小分子、抗體或其片段(例如單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至FLT-3之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現FLT-3 CAR，例如FLT-3 CART之細胞。
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含小分子，如喹雜替尼(quizartinib)(Ambit Biosciences)、米哚妥林(midostaurin)(Technische Universitat Dresden)、索拉非尼(sorafenib)(Bayer and Onyx Pharmaceuticals)、舒尼替尼(sunitinib)(Pfizer)、來他替尼 (lestaurtinib)(Cephalon)或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。
在一個實施例中，FLT-3抑制劑為抗FLT-3 CAR表現細胞，例如FLT-3 CART或FLT-3 CAR表現NK細胞。
在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞，例如CART細胞群體，其包含表現CD19 CAR及FLT-3 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現FLT-3 CAR之第二細胞。
CD79b抑制劑
在某些實施例中，CD19 CAR表現細胞與CD79b抑制劑一起投與。CD79b抑制劑可例如為小分子、抗體或其片段(例如單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD79b之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD79b CAR之細胞，例如CD79b CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD79b抑制劑為抗CD79b CAR表現細胞，例如CD79b CART或CD79b CAR表現NK細胞。例示性CD79b抑制劑更詳細地描述於下文。
在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞，例如CART細胞或CAR表現NK細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD79b CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD79b CAR之第二細胞。
CD179b抑制劑
在某些實施例中，CD19 CAR表現細胞與CD179b抑制劑一起投與。CD179b抑制劑可例如為小分子、抗體或其片段(例如單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD179b之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD179b CAR之細胞，例如CD179b CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD79b抑制劑為抗CD179b CAR表現細胞，例如CD179b CART或CD179b CAR表現NK細胞。例 示性CD179b抑制劑更詳細地描述於下文。
在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞，例如CART細胞或CAR表現NK細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD179b CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD179b CAR之第二細胞。
C79a抑制劑
在某些實施例中，CD19 CAR表現細胞與CD79a抑制劑一起投與。CD79a抑制劑可例如為小分子、抗體或其片段(例如單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD79a之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD79a CAR之細胞，例如CD79a CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD79a抑制劑為抗CD79a CAR表現細胞，例如CD79a CART或CD79a CAR表現NK細胞。例示性CD79a抑制劑更詳細地描述於下文。
在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞，例如CART細胞或CAR表現NK細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD79a CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD79a CAR之第二細胞。
CAR分子
本文所述之結合域(例如針對CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之結合域)可進一步包含一或多個額外胺基酸序列。
在一個實施例中，CAR分子包含選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO：15之序列。在一個實施例中，跨膜域包含具有SEQ ID NO：15 之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：15之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，結合域經鉸鏈區(例如本文所描述之鉸鏈區)連接至跨膜域。在一個實施例中，編碼之鉸鏈區包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或與其具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，CAR分子進一步包含編碼共刺激域，例如本文所述之共刺激域之序列。在一個實施例中，共刺激域包含選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。在一個實施例中，共刺激域包含SEQ ID NO：16之序列。在一個實施例中，共刺激域包含SEQ ID NO：51之序列。在一個實施例中，共刺激域包含具有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，共刺激域包含選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域：MHC I類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞因子受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白質)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1 ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、 CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。在實施例中，共刺激域包含4-1BB、CD27、CD28或ICOS。
在一個實施例中，CAR分子進一步包含編碼胞內信號傳導域，例如本文所述之胞內信號傳導域之序列。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：16之序列及/或SEQ ID NO：17之序列。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：16之序列及/或SEQ ID NO：43之序列。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含CD27之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：51之序列及/或SEQ ID NO：17之序列。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：51之序列及/或SEQ ID NO：43之序列。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列及SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列，其中包含 胞內信號傳導域之序列表現於相同框架中且呈單一多肽鏈形式。
在一個實施例中，CAR分子進一步包含前導序列，例如本文所述之前導序列。在一個實施例中，前導序列包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：13之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。
在一態樣中，CAR(例如CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR或CD79a CAR)包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之視情況存在之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈)、跨膜域(例如本文所述之跨膜域)及胞內刺激域(例如本文所述之胞內刺激域)。在一態樣中，示例性CAR構築體包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、胞內共刺激域(例如本文所述之胞內共刺激域)及胞內刺激域。
雙特異性抗體
雙特異性抗體分子(其可例如單獨或作為CAR之一部分投與)可包含兩個VH區及兩個VL區。在一些實施例中，上游抗體或其部分(例如scFv)配置為其VH(VH1 )在其VL(VL1 )上游且下游抗體或其部分(例如scFv)配置為其VL(VL2 )在其VH(VH2 )上游，使得總體雙特異性抗體分子具有配置VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。在其他實施例中，上游抗體或其部分(例如scFv)配置為其VL(VL1 )在其VH(VH1 )上游且下游抗體或其部分(例如scFv)配置為其VH(VH2 )在其VL(VL2 )上游，使得總體雙特異性抗體分子具有配置VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。
雙特異性CD22/CD19抑制劑
在一個實施例中，B細胞抑制劑包含雙特異性CAR19/CAR22抗體分子。舉例而言，在一些實施例中，B細胞抑制劑包含表28 之一或多 種胺基酸序列，或與其具有95%-99%一致性之序列。進一步提供根據表28 之核酸，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，B細胞抑制劑包含表2或3 之CD19特異性抗體分子(或與其具有95%-99%一致性之序列)及表6A或6B 之CD22特異性抗體分子(與其具有95%-99%一致性之序列)。在一個實施例中，B細胞抑制劑包含具有表4或5 之一或多個CDR之CD19特異性抗體分子(或具有對其之1、2、3、4、5或6個改變，例如取代之序列)及具有表7A、7B、7C、8A或8B 之CDR之CD22特異性抗體分子(或具有對其之1、2、3、4、5或6個改變，例如取代之序列)。
mTOR抑制劑
在一個實施例中，視情況與B細胞抑制劑組合投與之表現CAR分子，例如CD19 CAR分子、CD20 CAR分子或CD22 CAR分子，例如本文所述之CAR分子之細胞於低免疫增強劑量之mTOR抑制劑共投與。儘管不希望受理論束縛，但咸信用低免疫增強劑量(例如，不足以完全抑制免疫系統但足以改善免疫功能之劑量)治療伴隨PD-1陽性T細胞減少或PD-1陰性細胞增加。PD-1陽性T細胞(而非PD-1陰性T細胞)可能因與表現例如PD-L1或PD-L2之PD-1配位體的細胞接合而耗盡。
在一實施例中，此方法可用於使個體中本文所描述之CAR細胞之效能最佳化。儘管不希望受理論束縛，但咸信，在一實施例中，提高內源性非修飾免疫效應細胞(例如，T細胞)之效能。雖然不希望受理論束縛，咸信在一個實施例中，提高CAR表現細胞之效能。在其他實施例中，已或將經工程改造以表現CAR之細胞，例如T細胞可藉由於一定量增加PD1陰性免疫效應細胞，例如T細胞數目或增加PD1陰性免疫效應細胞，例如T細胞/PD1陽性免疫效應細胞，例如T細胞比率之mTOR抑制劑接觸而離體處理。
在一個實施例中，在投與本文所述之CAR表現細胞，例如T細胞 之前起始低免疫增強劑量之mTOR抑制劑，例如異位抑制劑，例如RAD001，或催化抑制劑之投與。在一實施例中，在mTOR抑制劑之後的充分時間或充分劑量後投與CAR細胞，使得PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞))之比率已至少短暫提高。
在一實施例中，在充分時間後或在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑充分給藥後採集待工程改造以表現CAR之細胞(例如T細胞)，使得個體中或自個體採集之PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率已至少短暫提高。
本文所述之組合物或方法之額外特徵或實施例包括以下中的一或多者：在實施例中，B細胞抑制劑包含CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之抑制劑。在實施例中，B細胞抑制劑包含有效數目之表現結合CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之CAR分子之一或多種細胞。
在實施例中，表現結合CD19之CAR分子之一或多種細胞於一或多種B細胞抑制劑同時、在其之前或在其之後投與。
在實施例中，個體具有或鑑別為具有相比於生物樣品中之表29 中所列之一或多種標記之參考含量之測定含量之間的差異，例如統計顯著差異。
在實施例中，個體具有為鑑別為具有相比於CD19之特徵中之參考特徵的測定特徵之間的差異，例如引起生物樣品中之移碼或過早終止密碼子或兩者之突變。
在實施例中，個體具有或鑑別為具有相比於生物樣品中之Treg細胞之參考含量之測定含量之間的差異，例如統計顯著差異。
在一個實施例中，方法包含向個體投與治療有效劑量之嵌合抗原受體(CAR)療法，例如如本文所述之CAR療法，例如包含CD19 CAR表現細胞及視情況存在之一或多種B細胞抑制劑之療法，及個體是否鑑別為具有相比於以下中的一或多者中之參考含量之測定含量，或相比於參考特徵之測定特徵之間的差異，例如統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量或活性；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量。在一個實施例中，方法包含測定個體是否具有相比於以下中的一或多者中之參考含量之測定含量，或相比於參考特徵之測定特徵之間的差異，例如統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量或活性，及向個體投與治療有效劑量之嵌合抗原受體(CAR)療法，例如如本文所述之CAR療法，例如包含CD19 CAR表現細胞及視情況存在之一或多種B細胞抑制劑之療法。在一個實施例中，方法包含測定個體是否具有以下中的一或多者中之相比於參考含量之測定含量，或相比於參考特徵之測定特徵之間的差異，例如統計顯著差異：(i)表29 中所列之一或多種標記物之含量；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量或活性，及向個體投與治療有效劑量之嵌合抗原受體(CAR)療法，例如如本文所述之CAR療法，例如包含CD19 CAR表現細胞及視情況存在之一或多種B細胞抑制劑之療法。在一個實施例中，方法包含向個體投與治療有效劑量之嵌合抗原受體(CAR)療法，例如如本文所述之CAR療法，例如包含CD19 CAR表現細胞之療法，測定個體是否具有以下中的一或多者中之相比於參考含量之測定含量，或相比於參考特徵之測定特徵之間的差異，例如統計顯著差異：(i)表29 中所 列之一或多種標記物之含量；(ii)CD19之特徵，例如突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變，或(iii)生物樣品中之TREG 細胞之含量或活性，且若差異存在，則向個體投與治療有效劑量之一或多種B細胞抑制劑。
在實施例中，個體具有或鑑別為具有生物樣品中之Treg細胞之測定含量與參考含量之間的增加，例如統計顯著增加。
在實施例中，個體在藉由一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞處理後已復發或鑑別為已復發。
在實施例中，B細胞抑制劑包含有效數目的表現以下者之一或多種細胞：結合CD10之CAR分子，例如如本文所述之CD10 CAR；結合CD20之CAR分子，例如如本文所述之CD20 CAR；結合CD22之CAR分子，例如如本文所述之CD22 CAR；結合CD34之CAR分子，例如如本文所述之CD34 CAR；結合CD123之CAR分子，例如如本文所述之CD123 CAR；結合FLT-3之CAR分子，例如如本文所述之FLT-3 CAR；或結合ROR1之CAR分子，例如如本文所述之ROR1 CAR。
在實施例中，CD19抑制劑包含抗體或抗體片段，其包括CD19結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域，且其中該CD19結合域包含表2或3 中所列之任何CD19輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者(例如所有三個)，及表2或3 中所列之任何CD19重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者(例如所有三個)。
在實施例中，CD19 CAR包含表2或3 中所列之輕鏈可變區及表2或3 所列之任何重鏈可變區。
在實施例中，CD19抑制劑包含CD19結合域，其包含選自由以下 組成之群的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12，或與其具有95%-99%一致性之序列。在實施例中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：58之多肽。
在實施例中，B細胞抑制劑包含CD20 CAR，其包含包括CD20結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域之抗體或抗體片段，且其中該CD20結合域包含表13 中所列之任何CD20輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表12A或12B 中所列之任何CD20重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
在實施例中，B細胞抑制劑包含CD22 CAR，其包含包括CD22結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域之抗體或抗體片段，且其中該CD22結合域包含表8A、8B、10A及/或10B 中所列之任何CD22輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表7A、7B、7C、9A及/或9B 中所列之任何CD22重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
在實施例中，CD22 CAR包含表10A或10B 中所列之任何輕鏈可變區。在實施例中，CD22 CAR包含表9A或9B 中所列之任何重鏈可變區。在實施例中，CD22 CAR包含表10A或10B 中所列之任何輕鏈可變區及表9A或9B 所列之任何重鏈可變區。
在實施例中，B細胞抑制劑包含CAR，其包含包括抗原結合域、 跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域之抗體或抗體片段，且其中該抗原結合域包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者(例如全部)，及重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者(例如全部)。
在實施例中，B細胞抑制劑包含含scFv之CAR。在實施例中，B細胞抑制劑包含含跨膜域之CAR，該跨膜域包含選自由義下組成之群的蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在實施例中，抗原結合域藉由鉸鏈區連接至跨膜域。在實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：14，或與其具有95%-99%一致性之序列。在實施例中，共刺激域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。在實施例中，共刺激域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域：MHC I類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞因子受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白質)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、 CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。在實施例中，共刺激域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列。在實施例中，胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。
在實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：16之序列及/或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列。在實施例中，CAR進一步包含前導序列。在實施例中，前導序列包含SEQ ID NO：13。
在實施例中，表現CAR分子之細胞包含T細胞或NK細胞。
在實施例中，與CD19表現相關之疾病選自增生性疾病，諸如癌症或惡性腫瘤或癌變前病況，諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前驅症，或為與CD19表現相關之非癌症相關適應症。在實施例中，疾病以下中的一或多者：血液癌、急性白血病、B細胞急性淋巴白血病(BALL)、T細胞急性淋巴白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴白血病(ALL)；慢性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)或慢性淋巴球性白血病(CLL)。
在實施例中，方法進一步包含投與增加表現CAR分子之細胞之功效的藥劑。在實施例中，方法進一步包含投與改善一或多種與投與表現CAR分子之細胞相關之副作用的藥劑。在實施例中，表現CAR分子之細胞與治療與CD19相關之疾病的藥劑組合投與。
在實施例中，根據本文所述之方法，例如向哺乳動物提供抗腫瘤免疫性之方法或治療哺乳動物之方法，哺乳動物為對於先前投與之 癌症療法，例如CD19 CAR療法或除CD19 CAR表現細胞以外之癌症療法之無反應者、部分反應者或完全反應者。在實施例中，哺乳動物為對於先前投與之癌症療法，例如CD19 CAR療法或除CD19 CAR表現細胞以外之癌症療法之非復發者、部分復發或完全復發。在實施例中，哺乳動物包含CD19陰性癌細胞或CD19陽性癌細胞，視情況其中哺乳動物進一步包含CD22陽性、CD123陽性、FLT-3陽性、ROR-1陽性、CD79b陽性、CD179b陽性、CD79a陽性、CD10陽性、CD34陽性及/或CD20陽性癌細胞。在實施例中，哺乳動物患有復發之ALL癌症。在實施例中，哺乳動物先前經投與CD19 CAR表現細胞且對於CD19 CAR治療為頑抗性的。
在實施例中，該藥劑為mTOR抑制劑且向該個體投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑，例如RAD001或雷帕黴素(rapamycin)。在實施例中，mTOR抑制劑為RAD001。在實施例中，劑量包含異位及催化mTOR抑制劑。在實施例中，投與該mTOR抑制劑持續足以在該個體之外周血液中或自該個體分離之T細胞製劑中降低PD-1陽性T細胞之比例、增加PD-1陰性T細胞之比例或提高PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率的時間量。
在實施例中，在充分時間後或在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑充分給藥後採集待工程改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如T細胞)，使得個體中或自個體採集之PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率已至少短暫提高。在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5但不超過90%之mTOR抑制相關聯，例如如藉由p70 S6 K抑制所量測。在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少10%但不超過40%之mTOR抑制相關聯，例如如藉由p70 S6 K抑制所量測。
在一個實施例中，方法進一步包含投與檢查點抑制劑。在實施 例中，個體在起始CART療法之前接受藥劑，例如mTOR抑制劑及/或檢查點抑制劑之預治療。在實施例中，個體接受用藥劑，例如mTOR抑制劑及/或檢查點抑制劑之同時治療。在實施例中，個體在CART療法之後接受用藥劑，例如mTOR抑制劑及/或檢查點抑制劑之治療。
在實施例中，在CART療法之前、與其同時或在其過程期間獲得測定含量或測定特徵。
在實施例中，方法包含分析指示個體是否可能復發或已復發之基因標籤。在實施例中，方法包含在用CAR表現細胞之治療，例如預測對於CAR治療之復發之CART治療(例如CART19治療，例如CTL019療法)之前分析個體之基因標籤。在實施例中，一或多種標記物之含量為表29 中所列之至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個標記物之含量。在實施例中，標記物之含量包含mRNA含量或可溶蛋白質之含量。
在實施例中，CD19之特徵為外顯子2中之突變，例如引起移碼或過早終止密碼子或兩者之突變。在實施例中，TREG 細胞之含量藉由染色用於由TREG 細胞表現之標記物之樣品測定。在實施例中，TREG 細胞之含量為個體身體，例如癌症微環境中之相關位置中之Treg細胞之含量。
在實施例中，方法進一步包含在清除術之前減少個體中之TREG 標籤。在實施例中，方法進一步包含減少個體中之TREG 標籤，例如藉由向個體投與環磷醯胺、抗GITR抗體或兩者。在實施例中，方法包含在收集細胞用於CAR表現細胞產物製造之前藉由環磷醯胺、抗GITR抗體或兩者對個體進行預處理。在實施例中，方法進一步包含自個體獲得樣品，其中樣品包含細胞溶離份(例如其包含血液)、組織溶離份、清除術樣品或骨髓樣品。
在實施例中，細胞表現包含第一多肽之抑制分子，該第一多肽 包含抑制分子的至少一部分，與包含來自胞內信號傳導域之正信號之第二多肽相關。在實施例中，該抑制分子包含含PD1之至少一部分之第一多肽及包含共刺激域及主要信號傳導域之第二多肽。
在實施例中，方法包含分析指示用細胞處理之個體是否可能復發或已之基因標籤。在實施例中，方法包含在細胞輸注至個體中之前分析細胞中之基因標籤。在實施例中，方法進一步包含減少包含轉導細胞之細胞群體之TREG 標籤。在實施例中，減少TREG 標籤包含對細胞群體進行CD25耗盡。
在實施例中，個體為哺乳動物，例如人類。
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。儘管類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料之方法及材料可用於實踐或測試本發明，但下文描述適合方法及材料。本文中提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻(例如序列資料庫參考編號)以全文引用之方式併入。舉例而言，本文所提及之所有GenBank、Unigene及Entrez序列(例如在本文中之任何表中)以引用之方式併入。除非另外規定，否則本文中，包括本文中中之任何表中指定之序列寄存編號係指截至2015年4月8日之資料庫條目。當一個基因或蛋白質參考複數個序列寄存編號時，包涵所有序列變異體。
此外，材料、方法以及實例僅為說明性的且並不欲限制。
標題、子標題或編號或標上字母之要素，例如(a)、(b)、(i)等，僅為易於閱讀而呈現。此文獻中標題或編號或標上字母之要素的使用不需要步驟或要素以字母次序來執行，或步驟或要素彼此必定為離散的。
本發明之其他特徵、目標及優勢將自實施方式及圖式及自申請專利範圍顯而易知。
圖1A及1B為代表性CAR之示意圖。
圖2A及2B為顯示存在於腫瘤中之CD19表現細胞之霍奇金淋巴瘤之免疫組織化學分析之影像。圖2A在1×放大率下且圖2B在20×放大率下。
圖3為分析患有霍奇金淋巴瘤之患者中之CART19治療之療效的研究之實驗設置之示意圖。
圖4A、4B、4C及4D顯示T細胞上之PD1及CAR19表現之流動式細胞測量術分析。圖4A及4B為表明CD4+ T細胞上之PD-1及CAR19表現之分佈的代表性流動式細胞測量術概況，該等細胞來自為對於CART療法之完全反應者(CR)或非反應者(NR)之個體。圖4C為顯示來自對於CART療法具有不同反應之個體群組之CD4+ T細胞群體中之PD1細胞之%的圖示。圖4D為顯示來自對CART療法具有不同反應之個體群組之CD8+ T細胞群體中之PD1細胞之%的圖示。
圖5A及5B顯示來自對CART療法具有不同反應之個體群組之CD4及CAR19表現細胞(圖5A)或CD8及CAR19表現細胞(圖5B)中之PD1表現之分佈。
圖6顯示來自為對於CART療法之完全反應者(CR)或非反應者(NR)之個體之T細胞上之PD1、CAR 19、LAG3及TIM3表現之流動式細胞測量術分析。
圖7A及7B顯示來自對CART療法具有不同反應之個體群組之PD1及LAG3表現(圖7A)或PD1及TIM3表現(圖7B)之分佈。
圖8顯示來自接受CART19之骨髓瘤患者之漿細胞IgA免疫表型，表明對CART19療法之反應。
圖9A及9B顯示癌細胞株及CART細胞上之IL-7受體(CD127)表現。CD127之表現藉由三種癌細胞株中之流動式細胞測量術分析量 測：RL(套細胞淋巴瘤)、JEKO(亦稱為Jeko-1，套細胞淋巴瘤)及Nalm-6(B-ALL)(圖9A)。CD127表現藉由對已在NSG小鼠中輸注及循環之CD3陽性(CART)細胞之流動式細胞測量術分析量測(圖9B)。
圖10A、10B及10C顯示CART19治療及後續IL-7治療之後的抗腫瘤反應。在第0天移植螢光素酶表現套淋巴瘤細胞株(RL-luc)之NSG小鼠在第6天用改變劑量之CART19細胞處理，且監測腫瘤負荷。小鼠分成4組且不接受CART19細胞、接受0.5×106 個CART19細胞(CART19 0.5E6)、1×106 個CART19細胞(CART19 1E6)或2×106 個CART19細胞(CART19 2E6)。CART治療之後的腫瘤負荷藉由偵測生物發光(mean BLI)量測(圖10A)。接受0.5×106 個CART19細胞(CART19 0.5E6)或1×106 個CART19細胞(CART19 1E6)之小鼠經隨機化以接受重組人類IL-7(rhIL-7)或不接受。對於在第85天開始用IL-7處理之來自圖10A之三隻小鼠(#3827、#3829及#3815，接受指定初始CART19劑量)監測此處藉由平均生物發光(BLI)表示之腫瘤負荷(圖10B)。IL-7經由腹膜內注射每週投與3次。在未接受IL-7之小鼠(CTRL)及接受IL-7處理之小鼠(IL-7)之間比較腫瘤負荷，此處藉由第85天之前(PRE)及第115天之後(POST)的平均生物發光(BLI)表示(圖10C)。
圖11A及11B顯示IL-7處理之後的T細胞動態。監測接受IL-7之小鼠或對照小鼠中之每一者之血液中偵測之人類T細胞含量(圖11A)。在IL-7處理起始之前(PRE)及14天後(第14天)量測血液中偵測之CART19細胞(CD3+細胞)之含量(圖11B)。
圖12描繪兩種例示性RCAR配置之結構。抗原結合成員包含抗原結合域、跨膜域及交換域。胞內結合成員包含交換域、共刺激信號傳導域及主要信號傳導域。兩個配置證實本文所述之第一及第二交換域可關於抗原結合成員及胞內結合成員呈不同取向中。本文進一步描述其他RCAR配置。
圖13描繪具有抗C22及抗CD19結合域之雙特異性CAR之兩種構築體。「4G4S」表示連接子序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：1311)。
圖14為描繪NFAT分析中之雙特異性CD19/CD22 CAR構築體之活性的圖示。
圖15A、15B及15C為顯示在存在各種腫瘤靶細胞株的情況下之CAR T細胞活化程度(藉由相對發光量測)的圖示。圖15A顯示在存在CD20表現靶細胞株Daudi的情況下之CAR T細胞活化。圖15B顯示在存在CD20表現靶細胞株Raji的情況下之CAR T細胞活化。圖15C顯示在存在非CD20表現陰性對照K562的情況下之CAR T細胞活化。
圖16為說明基因標籤分析之概述之例示性示意圖。簡言之，對於各基因設置，2組統計模型應用於測定元基因是否在CR、PR與NR之間統計學上不同。CR更類似於靜止TEFF 細胞，而NR更類似於活化TEFF 細胞。活化相對於靜止TEFF 細胞中上調之基因亦在NR中上調。
圖17描繪說明相比於不復發之完全反應者(CR)，在來自變為復發者(R)之小兒患者(完全反應者)之樣品中具有高表現量之TREG 基因之例示性結果(p=0.000215)。x軸為反應組之樣品，其中CR=無復發之完全反應者且R=復發者。y軸為歸一化元基因表現評分。
圖18A、18B及18C為顯示在存在腫瘤靶細胞株的情況下之CAR T細胞活化之圖示。在圖18A中，CAR表現JNL細胞與Daudi CD22表現靶細胞株以指定E：T比率混合。在圖18B中，CAR表現JNL細胞與Raji CD22表現靶細胞株以指定E：T比率混合。在圖18C中，CAR表現JNL細胞與陰性對照K562細胞株以指定E：T比率混合。
圖19為顯示細胞表面上之嵌合抗原受體之初生T細胞表現之圖示。蛋白質-L-生物素/SA-PE(圖19-1及圖19-2)及rhCD22-Fc/抗Fc488(圖19-3及19-4)用於測定CAR表面表現量。無CAR之細胞用作陰 性對照。
圖20A、20B、20C、20D、20E及20F為顯示初生T細胞腫瘤標靶殺死分析之圖示。藉由CD22 CAR活化及轉導之初生T細胞與穩定表現螢光素酶之靶細胞系以指定比率混合且量測靶細胞殺死。殺死%歸一化為hCD22-8(28.8%轉導)。CD22表現細胞株Raji(圖20A)、SEM(圖20B)、K562-hCD22(圖20C)、Daudi(圖20D)及Nalm6(圖20E)用於測試與陽性對照CD22 CAR m971(m971-HL)、陰性對照CAR m971-LH及作為陰性對照之未轉導之T細胞相比的功能CD22 CAR純系。K562細胞株不表現CD22且用作陰性對照(圖20F)。
圖21A、21B、21C、21D、21E及21F為顯示藉由CD22 CAR純系誘導顯著促炎性細胞因子反應之圖示。初生T細胞殺死分析用於測定CD22 CAR純系產生促炎性細胞因子IFN-g、IL-2及TNFa之能力。效應細胞與不同靶細胞株中之每一者共培養20小時，歸一化為28.8%轉導。上清液獲自來自Raji CD22表現靶細胞(圖21A)、Nalm6 CD22表現靶細胞(圖21B)、Daudi CD22表現靶細胞(圖21C)、SEM CD22表現靶細胞(圖21D)、K562-hCD22 CD22表現靶細胞(圖21E)及K562非CD22表現細胞(陰性對照)(圖21F)之具有2.5：1及10：1之改變E：T比率之不同培養物。
圖22為描繪復發ALL中之各種B細胞抗原之表現的圖示，為描繪如藉由流動式細胞測量術偵測之復發ALL中之各種B細胞抗原之表現之圖示。藉由多參數流動式細胞測量術對於以下標記物篩選來自16 r/r患者之樣品：CD19(16pts)、CD22(16pts)、CD123(16pts)、FLT-3(9pts)、ROR-1(3pts)、CD79b(15pts)、CD179b(8pts)、CD79a(16pts)、CD10(16pts)、CD34(16pts)及CD20(16pts)。CD22及CD123高度(>60%)且均勻地表現於r/r ALL患者之母細胞中(長條指示中值%表現，分別為99.50%、98.80%、95.70%、72.00%、47.00%、15.00%、 13.45%、4.200%、98.00%、87.65%及7.00%)。對於各患者，表現指定標記物之細胞之百分比顯示為單一資料點。
圖23為顯示CART19治療之前(基線)以及之後(CD19陰性復發)的CD19陰性白血病復發之6位患者中之CD22及CD123表現之一組圖。在所有分析中，基於前向相對側向散射特徵，閘控相關群體，且接著單峰閘控，且使用Live Dead Aqua(Invitrogen)閘控活細胞。包括時間閘控用於品質控制。閘控策略包括：時間閘控→SSC低→單峰→存活→CD45dim→CD10+。
圖24為顯示來自CART19治療(臨床試驗UPCC04409/CHP959，患者UPN指示於方框中)之後CD19陰性疾病復發之患者之母細胞中之CD22之表現的一組圖。頂列顯示CART19治療之前的母細胞中之CD19及CD22表現而底列顯示復發時之疾病表現型。CD22表現亦在復發時(當CD19表現喪失時)維持。
圖25為顯示來自CART19治療(臨床試驗UPCC04409/CHP959，患者UPN指示於方框中)之後CD19陰性疾病復發之患者之母細胞中之CD123之表現的一組圖。頂列顯示CART19治療之前的母細胞中之CD19及CD123表現而底列顯示復發時之疾病表現型。CD123表現在大部分患者中復發時維持，而CD19表現喪失。
圖26為顯示CD19陰性疾病復發之患者中之CART19治療之前和之後的CD19、CD22及CD123之中值表現的圖示。CD19表現在復發時喪失(94.25%對0%，p=0.0009)，而CD22(99.20%對97.30%p=ns)及CD123(63.00%對48.75%，p=ns)仍表現。對於各患者，表現指定標記物之細胞之百分比顯示為單一資料點。
圖27A及27B為顯示來自16為r/r患者及4位藉由CART19療法治療後CD19陰性疾病復發之患者之樣品中之CD22表現的一系列圖。藉由多參數流動式細胞測量術對於B細胞標記物CD22篩選樣品。CD22高 度(>60%)且均勻地表現於11/15為r/r ALL患者之母細胞中(圖27A)。CD22在CART19治療之前(基線)以及之後(CD19陰性復發)(顯示之2pts)在CD19陰性白血病復發之4/4位患者中呈陽性(圖27B)。閘控策略：SSC低→單峰→存活→CD45dim
圖28A、28B及28C為顯示CD22 CART對CD19及CD22表現之效應的一系列圖。顯示使用不同鏈定向(H至L及L至H)產生之兩個CAR22構築體之概要(圖28A)。抗CD22 scFv(m971)經密碼子最佳化且在含有CD8鉸鏈、41-BB共刺激及CD3 ξ信號傳導域之鼠類CAR19載體中選殖(圖28A)。NALM6 ALL細胞株上之CD19、CD22及同型對照之表現顯示為平均螢光強度(MFI)(圖28B)及抗體結合容量(ABC)(圖28C)。在NALM-6中，CD19之表現高於CD22。然而，在大部分原發性ALL樣品中，CD19及CD22表現類似(參見圖27A)。
圖29A、29B及29C為顯示用於產生CART22及CART19(連同UTD細胞)之正常供體T細胞擴增之一系列圖。培養物中之群體加倍(PD)相對於天數：在擴增結束(第11天)時，CART22及對照T細胞達到約4.5PD，相比於CART19或UTD細胞無顯著差異(圖29A)。T培養物中之細胞體積(fl)相對於天數：在第6天，存在峰值體積(約450fl)，而在接下來的天數中，體積減少至300fl，此時收穫及冷凍細胞。未觀測到相對於CART19或UTD細胞之顯著差異(圖29B)。在擴增之第11天在CD4陽性及CD8陽性T細胞上之CAR表現顯示於圖29C中。CAR表現之閘控係基於UTD。閘控策略：FSS相對於SSC淋巴細胞→單峰→存活→CD3+。
圖30為顯示細胞質內細胞因子產生之情況下之CD107a脫粒分析之一系列圖。CART19、CART22 HtoL及LtoH與不同標靶(單獨、PMA/離子黴素、MOLM-14及NALM-6)共培養。CART19及CART22 HtoL在與ALL細胞株(NALM-6)共培養時顯示高含量之CD107a脫粒、 IL-2、IFNg及TNFa產生，但在與陰性對照共培養時並非如此。UTD及CART22 LtoH不顯示脫粒或細胞因子產生。閘控策略：FSS相對於SSC淋巴細胞→單峰→存活→CD3+。
圖31為顯示基於螢光素酶之殺死分析的圖示。CART22及CART19 HtoL在共培養24小時時能夠裂解NALM-6細胞，但UTD細胞不能。觀測到細胞毒性活性與E：T比率之間的直接相關性，在2：1 E：T比率下具有較好抗白血病效應(對於CART19及CART22之78%及75%殺死)。
圖32A及32B為顯示基於CFSE之增殖分析之一系列圖。CART22及CART19與ALL細胞株NALM-6共培養5天導致顯著T細胞增殖(分別為94%及92.9%)。亦顯示對照物(TCM=單獨的培養基，P-I=PMA/離子黴素，MOLM-14)(圖32A)。在顯示CART19及CART22中之CFSE稀釋之動力學之直方圖中，大部分T細胞經歷多個增殖循環(圖32B)。閘控策略：FSS相對於SSC淋巴細胞→單峰→存活→CD3+。
圖33為顯示細胞激素產生之一系列圖。CART22、CART19及UTD與不同照射標靶(單獨、PMA/離子黴素、MOLM-14及NALM-6)一起培育24小時。當與ALL細胞株NALM-6共培養時，僅CART22及CART19 HtoL能夠釋放多個細胞因子(此處顯示IFNg、IL-2、GM-CSF、TNFa及MIP1b)。結果顯示為平均強度螢光(MFI)。
圖34A及34B為顯示藉由原發性ALL母細胞之T細胞脫粒之一系列圖示。CART22、CART19及UTD細胞與衍生自ALL患者之母細胞(CHP-959-101)在基線及CART19治療之後患者復發CD19陰性疾病時共培育4小時。CART19及CART22均能夠在基線處脫粒(當母細胞為CD19+及CD22+時)，但在復發時，僅CART22脫粒(當疾病為CD19陰性時)(圖34A)。顯示在與CHP101樣品一起培育之後在復發時的CD8陽性及CD8陰性CART19及CART22效應子中之CD107a脫粒之點陣圖展 示僅CART22顯示CD8及CD4 T細胞兩者中之脫粒(圖34B)。閘控策略：FSS相對於SSC淋巴細胞→單峰→存活→CD3+。
圖35A、35B、35C及35D為顯示針對NALM-6之活體內CART22功效之一系列圖示。A.實驗概要：1百萬NALM-6螢光素酶+細胞/小鼠靜脈內注射於NSG小鼠中。在6天之後，藉由生物發光評估腫瘤移植。小鼠接著經隨機化以接受未轉導之T細胞或不同劑量之CART22(1.25至5百萬總細胞/小鼠，具有75% CAR表現)。接著對小鼠監測腫瘤負荷、PB T細胞擴增及存活(圖35A)。根據生物發光(BLI)之腫瘤負荷偵測到劑量相關抗白血病反應。接受5e6 個CART22細胞之小鼠顯示較好腫瘤控制(圖35B)。CART22治療之小鼠顯示相比於用UTD細胞治療之小鼠統計顯著較好之總存活(OS)。對於OS，在CART22之較高劑量與較好OS之間存在顯著相關性(圖35C)。藉由眶後出血每週監測T細胞活體內擴增。在T細胞輸注之後一週，接受較高劑量CART22之小鼠顯示較好CART擴增(每微升12個T細胞之中值)(圖35D)。
圖36A及36B為顯示CART22與CART19相對於NALM-6之間的活體內比較之一系列圖示。實驗概要：1百萬NALM-6螢光素酶+細胞/小鼠靜脈內注射於NSG小鼠中。在6天之後，藉由生物發光評估腫瘤移植。小鼠接著隨機化以接受未轉導之T細胞、CART19或CART22(5百萬個總細胞，具有75% CAR表現)。接著對小鼠監測腫瘤負荷、PB T細胞擴增及存活(圖36A)。根據生物發光(BLI)之腫瘤負荷展示CART22及CART19治療小鼠兩者之之抗白血病反應，而UTD小鼠快速進展(圖36B)。CART19治療小鼠顯示相比於CART22之較好總存活(OS)，其可能由於NALM-6中之不同標靶表現(CD19>>CD22)(圖36C)。
圖37A及37B為顯示原發性ALL模型中之CART22與CART19之間的活體內比較之一系列圖示。原發性ALL患者之母細胞(JH331)經活 體內繼代且藉由螢光素酶轉導以遵循腫瘤負荷。實驗概要：1百萬JH331螢光素酶+細胞/小鼠靜脈內注射於NSG小鼠中。在14天之後，藉由生物發光評估腫瘤移植。小鼠接著隨機化以接受未轉導之T細胞、CART19或CART22(5百萬個總細胞，具有75% CAR表現)。接著對小鼠監測腫瘤負荷、PB T細胞擴增及存活(圖37A)。根據生物發光(BLI)之腫瘤負荷偵測CART22及CART19治療小鼠兩者之之抗白血病反應，而UTD小鼠快速進展(圖37B)。
圖38A、38B及38C為顯示藉由免疫組織化學染色之28個人類正常組織上之CD22表現之組織微陣列之一系列影像。淋巴器官對於CD22表現導致陽性(扁桃體、淋巴結、脾臟及胸腺)(圖38A)。非淋巴器官不顯示CD22表現(圖38B)。CD22陽性駐留B細胞觀測於多個組織中(圖38C)。*=非特異性染色。
圖39-1至39-4為顯示來自GeneAtlas U133A之CD22 RNA表現資料之圖示。CD22表現以高含量觀測於B細胞、扁桃體及淋巴結中。B淋巴母細胞及白血病/淋巴瘤細胞株亦高度陽性。
圖40為顯示用於CART22毒性之51-鉻釋放分析之一系列圖。CART22及CART19均觸發ALL細胞株NALM-6之裂解，但UTD細胞不觸發。未在任何正常組織(CD34+、人類神經元祖細胞或神經元及角質細胞或對照物(K562細胞株)中觀測到CART22之細胞毒性效應。
圖41展示如藉由FACS評估且報導為展示信號高於使用蛋白L作為偵測劑的未轉導(CAR陰性)細胞中信號含量之細胞的百分比之經抗CD123 CAR構築體轉導之JNL細胞中CAR表現之圖形表示。
圖42A、42B及42C顯示JNL細胞中之CD123 CAR活性之圖形表示。使用含有由NFAT啟動子驅動之螢光素酶報導基因之Jurkat細胞株(稱為JNL細胞)評估抗CD123 CAR構築體之活性。CAR活性量測為此NFAT驅動之報導子的活化。
圖43A及43B顯示CD123表現及活性。圖43A顯示初生T細胞中之CD123 CAR表現之圖形表示。轉導細胞(表現細胞表面上之抗CD123 CAR)百分比及其表現之相對螢光強度藉由使用蛋白質L作為偵測試劑之BD LSRFortessa或BD-FACSCanto上之流式細胞分析測定。信號高於未染色細胞之來自彼FACS的相對螢光強度之閘控直方圖展示轉導之T細胞之百分比。轉導導致CAR陽性細胞之範圍為12-42%。圖43B顯示CD123-CART介導之細胞殺死之圖形表示。T細胞殺傷針對穩定表現螢光素酶之表現CD123之MOLM13急性骨髓性白血病細胞。未轉導之T細胞用於確定非特異性背景殺死水準。CART-CD123之細胞溶解活性在一系列效應子內量測：當效應子定義為表現抗CD123嵌合受體之T細胞時，靶細胞比率為4：1且T細胞2倍向下稀釋。藉由混合適當數目之T細胞與恆定數目之靶細胞來起始分析。在20小時之後，使用Bright-GloTM 螢光素酶分析，在EnVision儀器上量測螢光素酶信號。
圖44A及44B顯示具有CD123-CAR之T細胞之轉導效率。圖44A顯示具有1172及1176之T細胞之轉導效率。圖44B展示具有CD123 CAR 2-4之T細胞之轉導效率。
圖45顯示測定CD4：CD8比率之CD123 CAR 2-4及1172及1176之流動式細胞測量術。
圖46-1至46-3顯示CD123 CAR 2-4及1172及1176在暴露於CD123+腫瘤細胞後之脫粒。
圖47展示螢光素酶分析用於評估CART細胞(NVS 2-4、1172及1176純系)對腫瘤靶細胞(MOLM14)之細胞毒性之圖示。
圖48展示注射有螢光素酶表現MOLM14細胞之NSG小鼠中腫瘤負荷在D6(CART注射之前)及在第13天(注射NVS 2-4後6天，1172或1176純系)或在第20天之比較。
圖49A、49B、49C、49D、49E及49F顯示CD123高度表現於 CART19治療之後出現之CD19陰性B細胞急性淋巴母細胞白血病復發中。圖49A顯示42個復發性/難治性ALL樣品中CD123與CD19相比之表現。圖49B顯示B-ALL母細胞中之CD123及CD19共表現。母細胞閘控(SSC低，單峰，存活，CD45dim)。圖49C顯示白血病幹細胞(LSC)之閘控策略。此子集中高度表現CD123。圖49D顯示CD123與CD19共表現及來自FISH分析之結果。圖49E及49F顯示基線或復發之後的CD19及CD123表現之比較。
圖50A、50B、50C、50D、50E及50F顯示來自使用表現CD19 CAR(CAR19)或CD123 CAR(CAR123)之T細胞之各種活體外分析之結果。圖50A顯示CD19及CD123表現；圖50B顯示CD107a脫粒分析；圖50C顯示標靶細胞殺死之能力；圖50D及50E顯示增殖容量；圖50F顯示指定細胞因子之細胞因子產生。
圖51A、51B及51C顯示表現CD19 CAR(CAR19)或CD123 CAR(CAR123)之CART細胞在活體內小鼠模型中具有抗腫瘤效應。圖51A顯示藉由生物發光成像表示之腫瘤負荷；圖51B顯示接受CART療法之小鼠之總存活率曲線；且圖51C顯示末梢血液中CART123細胞之擴增。
圖52A、52B、52C、52D、52E及52F顯示CART123在抗原損失復發之活體內小鼠模型中具活性。圖52A顯示實驗概要；圖52B顯示疾病進展，其如由就CD19表現(頂部圖示)及對用CART19療法治療之反應(底部圖示)而言之基線及復發疾病中之生物發光成像表示；圖52C顯示投與未轉導之T細胞或CART19細胞之小鼠之生物發光影像；圖52D顯示藉由CART19或CART123治療之實驗概要；圖52E顯示疾病進展；且圖52F顯示治療小鼠之總存活率。
圖53A、53B及53C顯示異種移植小鼠之頭骨骨髓中之ALL-CART相互作用。圖53A顯示實驗概要；圖53B顯示CART19細胞之代表性多 光子XY平面影像，及與經工程改造以表現CD19及CD123或單獨CD123之ALL腫瘤相互作用之CART123細胞(運動細胞指示於虛線圓圈中，非運動細胞用箭頭指示)；且圖53C為顯微鏡影像之圖示。
圖54A、54B及54C顯示使用CART19及CART123之CD19陰性復發之預防。圖54A顯示實驗概要；圖54B顯示用未轉導之T細胞(頂部圖示)、CART19(中間圖示)或CART19及CART123之組合(底部圖示)治療之小鼠之疾病進展(如由BLI表示之腫瘤負荷)；且圖54C顯示來自此實驗之總存活率。
圖55A及55B顯示表現CAR19及CAR123兩者之T細胞(圖55A)及來自脫粒分析之結果(圖55B)。
圖56A及56B顯示ALL母細胞之表徵。圖56A顯示各種標記物CD19、CD123、CD10、CD34及CD20之表現；且圖56B顯示用於分選CD19-CD123+細胞之閘控策略。
圖57A、57B、57C及57D顯示CART123之抗白血病活性。圖57A顯示NALM6細胞上之CD19及CD123表現；圖57B顯示回應於CART19或CART123療法之腫瘤負荷(如由BLI表示)；圖57C顯示投與CART19或CART123之小鼠之總存活率；且圖57D顯示投與改變劑量之CART123之小鼠之總存活率。
圖58A及58B顯示抗原損失復發之活體內模型之表徵。圖58A顯示CD19陰性復發疾病中CD123之表現；且圖58B顯示在用基線或復發細胞活體外培養時CART19或CART123細胞之脫粒分析。
圖59顯示在細胞培養系統中表現CAR之轉導T細胞之增殖藉由低劑量RAD001增強。CART與NALM6(Nalm-6)細胞在存在不同濃度之RAD001(nM)的情況下共培養。在共培養4天之後評估CAR陽性CD3陽性T細胞(黑色)及總T細胞(白色)數目。
圖60描繪在以0.3、1、3及10mg/kg(mpk)每日投加RAD001或媒 劑投加之情況下NALM6-luc細胞之腫瘤生長量測結果。圓圈指示媒劑；方形指示10mg/kg劑量之RAD001；三角形指示3mg/kg劑量之RAD001，倒三角形指示1mg/kg劑量之RAD001；且菱形指示0.3mg/kg劑量之RAD001。
圖61A及61B顯示藥物動力學曲線，其展示具有NALM6腫瘤之NSG小鼠之血液中RAD001之量。圖61A顯示RAD001之第一劑量後之第0天PK。圖61B顯示最終RAD001劑量後之第14天PK。菱形指代10mg/kg劑量之RAD001；方形指代1mg/kg劑量之RAD001；三角形指代3mg/kg劑量之RAD001；且x's指代10mg/kg劑量之RAD001。
圖62A及62B顯示投加及未投加RAD001之人類化CD19 CART細胞的活體內增殖。每日低劑量RAD001(0.003mg/kg)導致CAR T細胞增殖增強，超過huCAR19增殖之正常水準。圖62A顯示CD4+ CART細胞；圖62B顯示CD8+ CART細胞。圓圈指代PBS；方形指代huCTL019；三角形指代使用3mg/kg RAD001之huCTL019；倒三角形指代使用0.3mg/kg RAD001之huCTL019；菱形指代使用0.03mg/kg RAD001之huCTL019；且圓圈指代使用0.003mg/kg RAD001之huCTL019。
圖63顯示顯示原發性及繼發性人類DLBCL患者樣品中之CD3+/PD-1+細胞群體之間的顯著差異之多重FIHC AQUA分析。
圖64顯示顯示DLBCL樣品之原生及次級位點中之各種含量之CD19(下圖)及PD-L1(上圖)之AQUA分析。對總共40個人類DLBCL患者樣品(25個初生及15個次級位點)進行多重FIHC且後接AQUA分析以鑑別CD19及PD-L1蛋白質之表現量。
圖65顯示兩個CAR表現細胞群體之示意圖。在左側群體(合併)中，各細胞表現一種類型之CAR。在右側群體(雙順反子CAR)中，各細胞表現兩種類型之CAR。
圖66顯示雙順反子CAR之圖式。上部CAR具有藉由P2A蛋白酶裂解位點分離之CD19 CAR及CD22 CAR。下部CAR具有藉由P2A蛋白酶裂解位點分離之CD19 CAR及CD123 CAR。
圖67顯示來自雙順反子載體之CD19及CD22 CAR之共表現。
圖68上圖顯示來自雙順反子載體之CD19及CD123 CAR之共表現。圖68下圖顯示此等細胞之抗白血病效應。
圖69顯示在藉由UTD對照物、CART19或CART22治療後之帶有CD19陰性B-ALL異種移植物之小鼠中之腫瘤負荷。
圖70顯示來自五位CR患者、一位未分類患者及六位PD患者之淋巴結及骨髓樣品中之PD-L1、PD1、LAG3及TIM3之表現(從左到右，在各組之四個條中)。
圖71為顯示存在及不存在m971競爭者之情況下之若干CD22 CAR構築體之活化(以RLU計)之圖示。
圖72為顯示額外CD22 CAR構築體之活化(以RLU計)之圖示。
圖73顯示指示IFN-γ分析中之CD22 CAR活性之三個條形圖。
圖74顯示CD22-64及CD22-65 CAR之結合活性。
圖75為繪製與各種CD22 scFv結合之抗原決定基之圖示。
 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明有關技術者通常理解之含義相同的含義。
術語「一(a/an)」係指冠詞之一個或一個以上(亦即，至少一個)語法賓語。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或一個以上要素。
當涉及諸如量、暫態持續時間及其類似物之可量測值時，術語「約」意欲涵蓋相較於指定值±20%，或在一些情況下±10%，或在一些情況下±5%，或在一些情況下±1%，或在一些情況下±0.1%之變 化，因為此類變化適合於進行所揭示之方法。
如本文中所用之術語「清除術」係指此項技術公認之體外過程，藉由該過程，供體或患者之血液自供體或患者移除且通過將所選特定成分分離出之設備且例如藉由還血法(retransfusion)，使剩餘物質返回至供體或患者之循環。因此，「清除術樣品」係指使用清除術獲得之樣品。
術語「生物等效」係指產生等效於由參考劑量或參考量之參考化合物(例如，RAD001)產生之效果的效果所需之一定量的藥劑(參考化合物(例如，RAD001)除外)。在一實施例中，該作用為mTOR抑制水準或藉由西方墨點法之磷酸化S6含量之量測值，該mTOR抑制水準如例如藉由P70 S6激酶抑制所量測，如例如在活體內或活體外分析法中所評估，如例如本文所描述之分析法(例如Boulay分析法)所量測。在一實施例中，該作用為如細胞分選所量測之PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率改變。在一實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量為達到與參考化合物之參考劑量或參考量相同水準之P70 S6激酶抑制的量或劑量。在一實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量為實現與參考化合物之參考劑量或參考量相同水準之PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率改變的量或劑量。
術語「抑制」或「抑制劑」包括給定分子，例如CD20、CD10、CD19、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之某一參數，例如活性之減小。舉例而言，此術語包括活性，例如CD20、CD10、CD19、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之活性之至少5%、10%、20%、30%、40%或40%以上之抑制。因此，抑制無需為100%。可如本文所述或藉由此項技術中已知之分析測定抑制劑之活性。「B細胞抑制劑」為分子，例如小分子、抗體、CAR或包含CAR之細胞，其造成B細胞之某一參 數，例如活性，例如生長或增殖之減小，或其造成與B細胞相關之分子之某一參數，例如活性之減小。與B細胞相關之分子之非限制性實例包括表現於B細胞之表面上的蛋白質，例如CD20、CD10、CD19、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。
術語「嵌合性抗原受體」或者「CAR」係指一組多肽，在最簡單實施例中通常兩個，其在免疫效應細胞中時，向細胞提供針對目標細胞(通常癌細胞)之特異性，且產生胞內信號。在一些實施例中，CAR包含至少一個胞外抗原結合域、跨膜域及細胞質信號傳導域(在本文中亦稱為「胞內信號傳導域」)，其包含來源於如下文所定義之刺激分子及/或共刺激分子的功能性信號傳導域。在一些實施例中，該組多肽在相同多肽鏈中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些實施例中，該組多肽不彼此相鄰，例如在不同多肽鏈中。在一些實施例中，該組多肽包括二聚化開關，其在存在二聚化分子時可將多肽彼此偶合，例如可將抗原結合域偶合至胞內信號傳導域。在一態樣中，CAR之刺激分子為與T細胞受體複合物締合之ξ鏈(例如CD3 ξ)。在一個態樣中，細胞質信號傳導域包含主要信號傳導域(例如CD3-ξ之主要信號傳導域)。在一個態樣中，細胞質信號傳導域進一步包含一或多個來源於至少一個如下所定義之共刺激分子的功能性信號傳導域。在一態樣中，共刺激分子係選自本文所述之共刺激分子，例如4-1BB(亦即CD137)、CD27及/或CD28。在一態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含胞外抗原結合域、跨膜域及包含來源於刺激分子之功能性信號傳導域之胞內信號傳導域。在一態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白質，該蛋白質包含胞外抗原結合域、跨膜域及包含來源於共刺激分子之功能性信號傳導域及來源於刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白質，該蛋白質包含胞外抗原結合域、跨膜域及包含兩個來源於一或多個共刺激分子之功能性信 號傳導域及一個來源於刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白質，該蛋白質包含胞外抗原結合域、跨膜域及包含至少兩個來源於一或多個共刺激分子之功能性信號傳導域及一個來源於刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個態樣中，CAR在CAR融合蛋白之胺基端(N端)包含視情況存在之前導序列。在一態樣中，CAR在胞外抗原結合域之N端進一步包含前導序列，其中該前導序列視情況在細胞加工期間自抗原結合域(例如scFv)裂解且將CAR定位至細胞膜。
如本文所用之片語「與CD20表現相關之疾病」包括(但不限於)與CD20(例如野生型或突變CD20)表現相關之疾病或與表現或在任何時間表現CD20(例如野生型或突變CD20)之細胞相關之病況，包括例如增生性疾病，如癌症或惡性腫瘤或癌變前病況，如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前驅症；或與表現CD20(例如野生型或突變CD20)之細胞相關之非癌症相關適應症。為免生疑問，與CD20表現相關之疾病可包括與當前不表現CD20，但一度表現CD20之細胞相關之病況，該不表現例如由於CD20表現已下調，例如由於用靶向CD20之分子，例如CD20 CAR處理。在一態樣中，與CD20表現相關之癌症為血液癌。在一態樣中，血液癌包括(但不限於)AML、骨髓發育不良症候群、ALL、毛細胞白血病、前淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤及其類似者。與表現CD20表現相關之其他疾病包括(但不限於)例如與CD20表現相關之非典型性及/或非經典癌症、惡性疾病、癌變前病狀或增生性疾病。亦可包括與CD20表現相關之非癌症相關適應症。在一些實施例中，CD20表現細胞表現或在任何時間表現CD20 mRNA。在一個實施例中，CD20表現細胞產生CD20蛋白質(例如野生型或突變型)，且CD20蛋白質可以正常含量或減少含量存在。在一個實施例 中，CD20表現細胞在一點產生可偵測含量之CD20蛋白質，且隨後大體上不產生可偵測之CD20蛋白質。
如本文所用之片語「與CD22表現相關之疾病」包括(但不限於)與CD22(例如野生型或突變CD22)表現相關之疾病或與表現或在任何時間表現CD22(例如野生型或突變CD22)之細胞相關之病況，包括例如增生性疾病，如癌症或惡性腫瘤或癌變前病況，如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前驅症；或與表現CD22(例如野生型或突變CD22)之細胞相關之非癌症相關適應症。為免生疑問，與CD22表現相關之疾病可包括與當前不表現CD22，但一度表現CD22之細胞相關之病況，該不表現例如由於CD22表現已下調，例如由於用靶向CD22之分子，例如CD22 CAR處理。在一態樣中，與CD22表現相關之癌症為血液癌。在一態樣中，血液癌包括(但不限於)AML、骨髓發育不良症候群、ALL、毛細胞白血病、前淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤及其類似者。與表現CD22表現相關之其他疾病包括(但不限於)例如與CD22表現相關之非典型性及/或非經典癌症、惡性疾病、癌變前病狀或增生性疾病。亦可包括與CD22表現相關之非癌症相關適應症。在一些實施例中，CD22表現細胞表現或在任何時間表現CD22 mRNA。在一個實施例中，CD22表現細胞產生CD22蛋白質(例如野生型或突變型)，且CD22蛋白質可以正常含量或減少含量存在。在一個實施例中，CD22表現細胞在一點產生可偵測含量之CD22蛋白質，且隨後大體上不產生可偵測之CD22蛋白質。
除非另外規定，否則如本文所用，術語「預防(prevent/preventing/prevention)」係指在個體開始遭受病況或病況復發之前進行之行動。預防未必導致病況之完全預防；此術語包涵病況或病況症狀之部分預防或減少，或罹患病況之風險之降低。
如本文中所使用，「組合」投與意謂在個體受病症折磨之病程期間向個體供應兩種(或兩種以上)不同治療，例如，在個體已被確診患有病症之後及在病症治癒或消除或出於其他原因治療停止之前，供應兩種或兩種以上治療。在一些實施例中，當開始提供第二治療時，第一治療之提供仍存在以使得就投與而言存在重疊。此在本文中有時稱為「同時」或「並行遞送」。在其他實施例中，一種治療之傳遞在另一治療傳遞開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，療法由於組合投與而更有效。舉例而言，相較於第一療法不存在下投與第二療法所見，第二療法更有效，例如使用較少第二療法即可見同等效果，或第二療法減少症狀的程度更大，或對於第一療法可見相似情形。在一些實施例中，遞送使得症狀減少，或與病症有關之其他參數大於一種療法在另一療法不存在下遞送所觀測到的參數。兩種療法之作用可為部分相加的，完全相加的或大於相加的。遞送可使得所遞送之第一治療之作用在遞送第二治療時仍可偵測。在一個實施例中，CAR表現細胞以本文所述之劑量及/或給藥時程投與，且B細胞抑制劑或增強CD19 CAR表現細胞活性之藥劑以本文所述之劑量及/或給藥時程投與。
當「來源於」在本文中使用時，該術語指示第一與第二分子之間的關係。其一般指第一分子與第二分子之間的結構相似性，且不涵蓋或包括對來源於第二分子之第一分子的過程或來源限制。舉例而言，在來源於CD3ζ分子之胞內信號傳導域之情況下，胞內信號傳導域保留足夠CD3ζ結構，使得具有所需功能，亦即在適當條件下產生信號之能力。其不涵蓋或包括對產生胞內信號傳導域之特定方法之限制，例如其並不意謂，為提供胞內信號傳導域，吾人必須以CD3ζ序列開始且刪除不必要序列，或施加突變以達成胞內信號傳導域。
術語「信號傳導域」係指藉由在細胞內傳輸資訊以藉由產生第 二信使或藉由回應於此類信使充當效應子經限定信號傳導路徑調節細胞活性的蛋白質功能部分。
如本文所用，術語「CD19」係指分化簇19蛋白質，其為白血病前驅體細胞上可偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類CD19之胺基酸序列可見於UniProt/Swiss-Prot寄存編號P15391且編碼人類CD19之核苷酸序列可見於寄存編號NM_001178098。如本文所用，「CD19」包括包含全長野生型CD19之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。CD19表現於大部分B譜系癌症上，包括例如急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病及非霍奇金淋巴瘤。表現CD19之其他細胞提供於下文「與CD19表現相關之疾病」之定義中。其亦為B細胞祖細胞之早期標記物。參見例如Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)。在一態樣中，CART之抗原結合部分識別且結合CD19蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，CD19蛋白質表現於癌細胞上。
如本文所用之術語「抗體」係指蛋白質或來源於特異性結合抗原之免疫球蛋白分子的多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整免疫球蛋白且可來源於天然來源或重組來源。抗體可為免疫球蛋白分子之四聚物。
術語「抗體片段」係指保持與抗原之抗原決定基特異性相互作用之能力(例如藉由結合、位阻、穩定化/去穩定化、空間分佈)之抗體的至少一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵聯之Fvs(sdFv)、由VH及CH1域組成之Fd片段、線性抗體、諸如sdAb之單域抗體(VL或VH)、駱駝科VHH域、由諸如二價片段之抗體片段形成的多特異性抗體(包含在鉸鏈區 經二硫橋鍵聯之兩個Fab片段)，及經分離CDR或抗體之其他抗原決定基結合片段。抗原結合片段亦可併入單域抗體、最大抗體(maxibody)、微型抗體、奈米抗體、胞內抗體(intrabody)、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv中(參見例如Hollinger及Hudson,Nature Biotechnology 23：1126-1136,2005)。抗原結合片段亦可移植至基於多肽之骨架，諸如III型纖維結合蛋白(Fn3)(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維結合蛋白多肽微型抗體)。
術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區例如經合成連接子(例如較短可撓性多肽連接子)連續連接且能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留其所來源之完整抗體的特異性。除非指明，否則如本文所用，scFv可例如關於多肽之N端及C端末端具有任何順序之VL及VH可變區，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
如本文所用之術語「互補決定區」或「CDR」係指在抗體可變區內之胺基酸序列，其賦予抗原特異性及結合親和力。舉例而言，一般各重鏈可變區中存在三個CDR(例如，HCDR1、HCDR2及HCDR3)且各輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)。給定CDR之精確胺基酸序列邊界可使用多種熟知方案中之任一者確定，該等方案包括由Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest，」第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」編號方案)所描述之方案或其組合。根據Kabat編號方案，在一些實施例中，重鏈可變域(VH)中之CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)；且輕鏈可變域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97(LCDR3)。根據Chothia編號方案，在一些實施例中，VH中之CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)及95-102(HCDR3)；且VL中之CDR胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)及91-96(LCDR3)。在組合之Kabat與Chothia編號方案中，在一些實施例中，CDR對應於作為Kabat CDR、Chothia CDR或兩者之一部分的胺基酸殘基。舉例而言，在一些實施例中，CDR對應於VH(例如哺乳動物VH，例如人類VH)中之胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)；及VL(例如哺乳動物VL，例如人類VL)中之胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)。
如本文所用，術語「結合域」或「抗體分子」係指包含至少一個免疫球蛋白可變域序列之蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段。術語「結合域」或「抗體分子」涵蓋抗體及抗體片段。在一個實施例中，抗體分子為多特異性抗體分子，例如其包含複數個免疫球蛋白可變域序列，其中該多者中之第一免疫球蛋白可變域序列具有針對第一抗原決定基之結合特異性，且該多者中之第二免疫球蛋白可變域序列具有針對第二抗原決定基之結合特異性。在一個實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對於不超過兩個抗原具有特異性。雙特異性抗體分子之特徵為對於第一抗原決定基具有結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及對於第二抗原決定基具有結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列。
本發明之包含抗體或其抗體片段之CAR之部分可以多種形式存在，其中抗原結合域表示為鄰近多肽鏈之一部分，包括例如單域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)、人類化抗體或雙特異性抗體(Harlow等人，1999，於：Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY中；Harlow等人，1989，於：Antibodies： A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York中；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988,Science 242：423-426)。在一個態樣中，本發明CAR組合物之抗原結合域包含抗體片段。在另一態樣中，CAR包含包括scFv之抗體片段。
術語「抗體重鏈」係指兩種類型多肽鏈中之較大者以其天然存在之構形存在於抗體分子中且其通常決定抗體所屬類別。
術語「抗體輕鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。卡帕(κ)及拉姆達(λ)輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。
術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生之抗體，諸如由噬菌體或酵母菌表現系統所表現之抗體。該術語亦應理解為意謂已藉由合成編碼抗體之DNA分子(且該DNA分子表現抗體蛋白)或指定抗體之胺基酸序列產生之抗體，其中該DNA或胺基酸序列已使用在此項技術中可獲得且熟知的重組DNA或胺基酸序列技術獲得。
術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可能涉及抗體產生或特異免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術者應瞭解包括幾乎所有蛋白質或肽之任何大分子均可充當抗原。此外，抗原可來源於重組或基因組DNA。熟習此項技術者應理解，當在本文中使用彼術語時，包含編碼引發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列之任何DNA因此編碼「抗原」。此外，熟習此項技術者應理解抗原無需僅藉由基因之核苷酸序列全長編碼。易於顯而易知，本發明包括(但不限於)一種以上基因之部分核苷酸序列之用途及此等核苷酸序列以各種組合排列以編碼引發所需免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者應理解抗原根本無需藉由「基因」編碼。顯而易見，抗原可合成產生或可來源於生物樣品或可為除多肽外之大分子。此類生物樣品可包括(但不限於)組織樣品、腫瘤樣品、細胞或具有其 他生物組分之體液。
術語「競爭」或「交叉競爭」在本文中可互換使用，其係指抗體分子干擾抗體分子，例如本文所提供之抗CD20或CD22抗體分子結合至標靶，例如人類CD20或CD22的能力。結合干擾可為直接或間接的(例如經由抗體分子或標靶之異位調變)。抗體分子能夠干擾另一抗體分子與標靶之結合之程度，且因此其是否可稱為競爭可使用競爭結合分析(例如如本文所述)測定。在一些實施例中，競爭結合分析為定量競爭分析。在一些實施例中，在競爭結合分析(例如本文所述之競爭分析)中，若第一抗體分子與標靶之結合減少10%或大於10%，例如20%或大於20%、30%或大於30%、40%或大於40%、50%或大於50%、55%或大於55%、60%或大於60%、65%或大於65%、70%或大於70%、75%或大於75%、80%或大於80%、85%或大於85%、90%或大於90%、95%或大於95%、98%或大於98%、99%或大於99%，則稱第一抗體分子與第二抗體分子競爭結合至標靶。
如本文所用，術語「抗原決定基」係指與抗體分子特異性相互作用之抗原(例如人類CD20或CD22)部分。此等部分(在本文中稱為抗原決定基決定子)通常包含諸如胺基酸側鏈或糖側鏈之元件或為其一部分。抗原決定基決定子可藉由此項技術中已知或本文揭示之方法(例如結晶學或氫-氘交換)定義。抗體分子上之與抗原決定基決定子發生特異性相互作用的至少一個或一些部分通常位於CDR中。通常，抗原決定基具有特定的三維結構特徵。通常，抗原決定基具有特定的電荷特徵。一些抗原決定基為線性抗原決定基，而其他為構形抗原決定基。
術語「抗癌作用」係指可藉由各種手段體現之生物作用，其包括(但不限於)例如腫瘤體積減小，腫瘤細胞數目減少，癌轉移數目減少，預期壽命增加，癌細胞增殖減少，癌細胞存活率降低，或與癌性 病狀相關之各種生理學症狀改善。「抗癌作用」亦可首先藉由本文所述之肽、聚核苷酸、細胞及抗體預防癌症出現之能力來體現。術語「抗腫瘤作用」係指可藉由多種手段體現之生物作用，其包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活率降低。
術語「自體」係指來源於與隨後可重新引入個體中相同的個體之任何材料。
術語「同種異體」係指來源於與引入材料之個體相同物種之不同動物的任何材料。當一或多個基因座處之基因不相同時，兩個或兩個以上個體稱為彼此同種異體。在一些態樣中，來自相同物種之個體的同種異體材料在基因上可足夠不同從而以抗原方式相互作用。
術語「異種」係指來源於不同物種之動物的移植物。
術語「癌症」係指特徵為異常細胞之不受控生長的疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。本文描述各種癌症之實例且其包括(但不限於)乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及其類似癌症。術語「腫瘤」與「癌症」在本文中可互換使用，例如兩個術語涵蓋實體及液體，例如彌漫性或循環腫瘤。如本文所使用，術語「癌症」或「腫瘤」包括惡化前以及惡性癌症及腫瘤。
術語「癌症相關抗原」或「腫瘤抗原」或「增生性病症抗原」或「與增生性病症相關之抗原」可互換地指相比於正常細胞，優先表現於癌細胞之表面上(完全或以片段(例如MHC/肽)形式)的分子(通常蛋白質、碳水化合物或脂質)，且其適用於將藥理學藥劑優先靶向至癌細胞。在一些實施例中，腫瘤抗原為正常細胞及癌細胞表現之標記物，例如譜系標記物，例如B細胞上之CD19。在某些態樣中，本發明 的腫瘤抗原衍生自癌症，包括(但不限於)原發性或轉移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌，如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌及其類似者。在一些實施例中，腫瘤抗原為與特異性增生性病症共同的抗原。在一些實施例中，癌症抗原為在癌細胞中相較於在正常細胞中過度表現之細胞表面分子，例如相較於正常細胞1倍過度表現、2倍過度表現、3倍或3倍以上過度表現。在一些實施例中，癌症相關抗原為癌細胞中不適當合成之細胞表面分子，例如相較於正常細胞上表現之分子含有缺失、添加或突變的分子。在一些實施例中，癌症相關抗原將全部或以片段形式(例如，MHC/肽)專門表現於癌細胞之細胞表面上，且在正常細胞表面上不合成或表現。在一些實施例中，本發明之CAR包括包含結合至MHC呈現肽之抗原結合域(例如抗體或抗體片段)的CAR。通常，來源於內源性蛋白質之肽填充主要組織相容複合物(MHC)I類分子之凹穴，且由CD8+T淋巴細胞上之T細胞受體(TCR)識別。MHC I類複合物由所有成核細胞組成性表現。在癌症中，病毒特異性及/或腫瘤特異性肽/MHC複合物表示免疫療法之獨特類別之細胞表面目標。已描述在人類白血球抗原(HLA)-A1或HLA-A2之情況下靶向來源於病毒或腫瘤抗原的肽之TCR樣抗體(參見例如Sastry等人，J Virol.2011 85(5)：1935-1942；Sergeeva等人，Bood,2011 117(16)：4262-4272；Verma等人，J Immunol 2010 184(4)：2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther 2001 8(21)：1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med 2013 5(176)：176ra33；Tassev等人，Cancer Gene Ther 2012 19(2)：84-100)。舉例而言，TCR樣抗體可自篩選文庫(諸如人類scFv噬菌體呈現庫)鑑別。
片語「與CD19表現相關之疾病」包括(但不限於)與CD19(例如野生型或突變CD19)表現相關之疾病或與表現或在任何時間表現 CD19(例如野生型或突變CD19)之細胞相關之病況，包括例如增生性疾病，如癌症或惡性腫瘤或癌變前病況，如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前驅症；或與表現CD19之細胞相關之非癌症相關適應症。為免生疑問，與CD19表現相關之疾病可包括與當前不表現CD19，但一度表現CD19之細胞相關之病況，該不表現例如由於CD19表現已下調，例如由於用靶向CD19之分子，例如CD19 CAR處理。在一態樣中，與CD19表現相關之癌症為血液癌。在一個態樣中，血液癌為白血病或淋巴瘤。在一態樣中，與CD19表現相關之癌症包括癌症及惡性腫瘤，包括(但不限於)例如一或多種急性白血病，包括(但不限於)例如B細胞急性淋巴白血病(BALL)、T細胞急性淋巴白血病(TALL)、急性淋巴白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴白血病(CLL)。與CD19表現相關之額外癌症或血液學病症包含(但不限於)例如B細胞前淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增生性病況、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)及「白血病前驅症」，其為由骨髓血細胞之低效產生(或發育不良)聯合之血液病況之多樣性集合，及其類似者。與表現CD19表現相關之其他疾病包括(但不限於)例如與表現CD19相關之非典型及/或非經典癌症、惡性腫瘤、癌變前病況或增生性疾病。與表現CD19相關之非癌症相關適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病(例如狼瘡)、發炎性病症(過敏及哮喘)及移植。在一些實施例中，CD19表現細胞表現或在任何時間表現CD19 mRNA。在一個 實施例中，CD19表現細胞產生CD19蛋白質(例如野生型或突變型)，且CD19蛋白質可以正常含量或減少含量存在。在一個實施例中，CD19表現細胞在一點產生可偵測含量之CD19蛋白質，且隨後產生大體上不可偵測之CD19蛋白質。
術語「保守序列修飾」係指胺基酸修飾不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵。此類保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。修飾可藉由此項技術中已知之標準技術(諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發)引入本發明之抗體或抗體片段中。保守胺基酸取代為胺基酸殘基置換為具有類似側鏈之胺基酸殘基的取代。此項技術中已限定具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此，本發明CAR內之一或多個胺基酸殘基可用來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且可使用本文所描述之功能性分析來測試改變之CAR。
術語「刺激」係指由結合刺激分子(例如TCR/CD3複合物或CAR)與其同源配位體(或在CAR之情況中腫瘤抗原)藉此調節信號轉導事件(諸如(但不限於)經TCR/CD3複合物信號轉導或經適當NK受體或CAR之信號傳導域信號轉導)誘導之主要反應。刺激可介導某些分子之經改變表現。
術語「刺激分子」係指由免疫細胞，例如T細胞、NK細胞、B細胞)表現之分子，該分子提供針對免疫細胞信號傳導路徑之至少一些 態樣以刺激方式調節免疫細胞活化之細胞質信號傳導序列。在一個態樣中，信號為藉由例如結合TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子起始的主要信號，且其導致介導T細胞反應，包括(但不限於)增殖、活化、分化及其類似物。以刺激起作用之一級細胞質信號傳導序列(亦稱作「一級信號傳導域」)可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。特定用於本發明之含有ITAM之細胞質信號傳導序列的實例包括(但不限於)源自以下者：CD3 ξ、常見FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在本發明之特異性CAR中，任何一或多種本發明之CAR中的胞內信號傳導域包含胞內信號傳導序列，例如CD3-ξ之主要信號傳導序列。在本發明之特定CAR中，CD3-ξ之主要信號傳導序列為提供為SEQ ID NO：17之序列，或來自非人類物種，例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者之等效殘基。在本發明之特定CAR中，CD3-ξ之主要信號傳導序列為提供於SEQ ID NO：43中之序列，或來自非人類物種，例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者之等效殘基。
術語「抗原呈現細胞」或「APC」係指在其表面上顯示與主要組織相容複合物(MHC)複合之外來抗原的免疫系統細胞，諸如輔助細胞(例如，B細胞、樹突狀細胞及其類似細胞)。T細胞可使用其T細胞受體(TCR)識別此等複合體。APC處理抗原且將其呈現給T細胞。
當在本文中使用術語「免疫效應細胞」時，其係指參與免疫反應，例如促進免疫效應反應之細胞。免疫效應細胞之實例包括T細胞，例如α/β T細胞及γ/δ T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T(NK-T)細胞、肥大細胞及骨髓衍生吞噬細胞。
在本文中使用術語「免疫效應功能或免疫效應反應」時，其係指例如免疫效應細胞之增強或促進靶細胞之免疫侵襲的功能或反應。 舉例而言，免疫效應功能或反應係指T或NK細胞促進目標細胞之殺死或生長或增殖之抑制之特性。在T細胞之情況下，主要刺激及共刺激為免疫效應功能或反應之實例。
術語「效應功能」係指細胞之專門功能。T細胞之效應功能例如可為細胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細胞因子。
如本文所用之術語「胞內信號傳導域」係指分子之胞內部分。胞內信號傳導域可產生促進含有CAR之細胞，例如CART細胞之免疫效應功能之信號。免疫效應功能之實例(例如在CART細胞中)包括細胞溶解活性及輔助活性，包括細胞激素之分泌。在實施例中，胞內信號域為轉導效應功能信號及導引細胞執行特定功能之蛋白質部分。儘管可採用整個胞內信號傳導域，但在多數情況下，不必使用整條鏈。至於使用胞內信號傳導域之截短部分的程度，此類截短部分只要轉導效應功能信號即可用於替代完整鏈。術語胞內信號傳導域因此意欲包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導域的截短部分。
在一實施例中，胞內信號傳導域可包含主要胞內信號傳導域。例示性主要胞內信號傳導域包括來源於負責主要刺激或抗原依賴性模擬之分子者。在一實施例中，胞內信號傳導域可包含共刺激胞內域。例示性共刺激胞內信號傳導域包括來源於負責共刺激信號或抗原獨立刺激之分子的彼等者。舉例而言，在CART情況中，主要胞內信號傳導域可包含T細胞受體之細胞質序列，且共刺激胞內信號傳導域可包含來自輔助受體或共刺激分子之細胞質序列。
主要胞內信號傳導域可包含已知為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。含有主要細胞質信號傳導序列之ITAM之實例包括(但不限於)衍生自CD3 ξ、FcR γ、共同FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」)、Fc ε RI、CD66d、CD32、DAP10及 DAP12之彼等。
術語「ξ」或者「ξ鏈」、「CD3-ξ」或「TCR-ξ」定義為如GenBank寄存編號BAG36664.1提供之蛋白質或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基，且「ξ刺激域」或者「CD3-ξ刺激域」或「TCR-ξ刺激域」定義為來自ξ鏈之細胞質域的胺基酸殘基或其功能衍生物，其足以功能上傳輸T細胞活化必需之初始信號。在一態樣中，ξ之細胞質域包含Genbank寄存編號BAG36664.1之殘基52至164或為其功能直系同源物之來自非人類物種，例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者之等效殘基。在一態樣中，「ξ刺激域」或「CD3-ξ刺激域」為提供為SEQ ID NO：17之序列。在一態樣中，「ξ刺激域」或「CD3-ξ刺激域」為提供為SEQ ID NO：43之序列。
術語「共刺激分子」係指T細胞上之同源結合搭配物，其特異性結合共刺激配位體，藉此藉由T細胞調節共刺激反應(諸如(但不限於)增殖)。共刺激分子為除抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子，其促成有效免疫反應。共刺激分子包括(但不限於)MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、 TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及特異性結合CD83之配位體。
共刺激胞內信號傳導域係指共刺激分子之胞內部分。胞內信號傳導域可包含其所源自之分子的全部胞內部分或全部天然胞內信號傳導域，或其功能片段或衍生物。
術語「4-1BB」係指具有提供為Genbank寄存編號AAA62478.2之胺基酸序列之TNFR超家族之成員，或來自非人類物種，例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者之等效殘基；且「4-1BB共刺激域」定義為GenBank寄存編號AAA62478.2之胺基酸殘基214-255，或來自非人類物種，例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者之等效殘基。在一態樣中，「4-1BB共刺激域」為提供為SEQ ID NO：16之序列或來自非人類物種，例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者之等效殘基。
術語「編碼」係指諸如基因、cDNA或mRNA之聚核苷酸中之特異性核苷酸序列在生物過程中充當合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性，該等聚合物及大分子具有已確定之核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA及mRNA)或已確定之胺基酸序列，及自其獲得之生物特性。因此，若與基因相對應之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因、cDNA或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中之編碼鏈與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼鏈均可稱為編碼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。
除非另外規定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為 彼此之簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其達到編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些形式中含有內含子之程度。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用且其係指如本文所描述能有效地獲得特定生物結果之化合物、調配物、物質或組合物之量。
術語「內源性」係指來自或在生物體、細胞、組織或系統內部產生之任何物質。
術語「外源性」係指自生物體、細胞、組織或系統外部引入或產生之任何物質。
術語「表現」係指啟動子驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
術語「轉移載體」係指包含經分離之核酸且可用於將經分離之核酸傳遞至細胞內部之物質組合物。許多載體為此項技術中已知，包括(但不限於)線性聚核苷酸、與離子性或兩親媒性化合物相關之聚核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應解釋為進一步包括促進核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似物。
術語「表現載體」係指包含重組性聚核苷酸之載體，該重組性聚核苷酸包含可操作地連接於待表現核苷酸序列之表現控制序列。表現載體包含足夠順式作用元素用於表現；用於表現之其他元素可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中。表現載體包括此項技術中已知之所有表現載體，包括併入重組性聚核苷酸之黏質體、質體(例如，裸露或含於脂質體中)及病毒(例如，慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺 相關病毒)。
術語「慢病毒」係指逆轉錄病毒科家族之屬。慢病毒在反轉錄病毒中為獨特的，因為其能夠感染未分化細胞；其可將大量遺傳資訊傳遞至宿主細胞之DNA中，因此其為基因傳遞載體之最有效方法中之一者。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。
術語「慢病毒載體」係指來源於慢病毒基因組之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中所提供之自身不活化慢病毒載體。臨床中可使用之慢病毒載體之其他實例包括(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因傳遞技術、來自Lentigen之LENTIMAXTM 載體系統及其類似物。非臨床類型之慢病毒載體亦可獲得且將為熟習此項技術者所已知。
術語「同源」或「一致性」係指在兩個聚合分子之間，例如在諸如兩個DNA分子或兩個RNA分子之兩個核酸分子之間，或在兩個多肽分子之間的次單位序列一致性。當兩個分子中之次單元位置被相同單體次單元佔據時；例如若兩個DNA分子中之每一者中之位置均被腺嘌呤佔據，則其在彼位置處為同源或一致的。兩個序列之間的同源性為匹配或同源位置數目之直接函數；例如若兩個序列中之位置有一半(例如長度為十個次單元之聚合物中之五個位置)同源，則該兩個序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩個序列為90%同源。
非人類(例如，鼠類)抗體之「人類化」形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如，Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。大多數情況下，人類化抗體及其抗體片段為人類免疫球蛋白(接受者抗體或抗體片段)，其中來自接受者之互補決定區(CDR)之殘基經來自諸如具有所需特異性、親和性及能力之小鼠、大鼠或兔子之非人類物種 (供體抗體)之CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基置換為相應非人類殘基。此外，人類化抗體/抗體片段可包含既不存在於受體抗體中亦不存在於所導入之CDR或構架序列中之殘基。此等修飾可進一步使抗體或抗體片段效能優化及最佳化。一般而言，人類化抗體或其抗體片段將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區域與非人類免疫球蛋白之彼等區域相對應且所有或絕大部分FR區域為人類免疫球蛋白序列之彼等區域。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，該恆定區通常為人類免疫球蛋白之恆定區。關於其他細節參見Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Reichmann等人，Nature,332：323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596,1992。
術語「完全人類」係指諸如抗體或抗體片段之免疫球蛋白，其中整個分子具有人類來源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致的胺基酸序列組成。
術語「分離」意謂自天然狀態改變或移除。舉例而言，天然存在於活的動物中之核酸或肽並非「經分離的」，但自其天然狀態之共存材料部分或完全分離之相同核酸或肽為「經分離的」。經分離之核酸或蛋白質可以實質上純化形式存在，或可存在於諸如宿主細胞之非原生環境中。
在本發明之情形中，使用以下通常存在之核酸鹼基之縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷且「U」係指尿苷。
術語「可操作地鍵聯」或「轉錄控制」係指調節序列與異源核酸序列之間的功能鍵，其導致異源核酸序列之表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能性關係時，第一核酸序列可操作 地連接第二核酸序列。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接於編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接，且例如若接合兩個蛋白質編碼區時必要，則在同一閱讀框架中。
術語「非經腸」投與免疫原性組合物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射、瘤內或輸注技術。
術語「核酸」或「聚核苷酸」指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其單鏈或雙鏈形式之聚合物。術語「核酸」包括基因cDNA或mRNA。在一個實施例中，核酸分子為合成(例如，化學合成)或重組的。除非特定限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之類似物或衍生物的核酸，其與參考核酸具有類似結合特性且以類似於天然存在之核苷酸的方式代謝。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個(或所有)所選擇之密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列實現(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基組成之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸的最大數目無限制。多肽包括包含藉由肽鍵彼此接合之兩個或兩個以上胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所使用，該術語係指短鏈(其在此項技術中通常亦稱為例如肽、寡肽及寡聚物)及長鏈(其在此項技術中一般稱為蛋白質，其存在多種類型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、均二聚體、雜二聚體、多肽變異體、經修飾多肽、 衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。
術語「啟動子」係指由細胞合成機制或引入之合成機制識別、起始聚核苷酸序列之特異性轉錄所需之DNA序列。
術語「啟動子/調節序列」係指表現可操作地連接於啟動子/調節序列之基因產物所必需的核酸序列。在一些情況下，此序列可為核啟動子序列且在其他情況下，此序列亦可包括強化子序列及表現基因產物所必需的其他調節要素。啟動子/調節序列可例如為以組織特異性方式表現基因產物者。
術語「組成性」啟動子係指當與編碼或特異於基因產物之聚核苷酸可操作地連接時，在細胞之大多數或全部生理學條件下引起基因產物在細胞中產生之核苷酸序列。
術語「誘導性」啟動子係指當可操作地連接編碼或特異於基因產物之聚核苷酸時，僅當細胞中存在對應於啟動子之誘導劑時才引起基因產物在細胞中實質上產生的核苷酸序列。
術語「組織特異性」啟動子係指當可操作地連接編碼或特異於基因之聚核苷酸時，僅當細胞為對應於啟動子之組織類型的細胞時才引起基因產物在細胞中實質上產生之核苷酸序列。
如scFv之情況中所用之術語「可撓性多肽連接子」係指由單獨或組合使用之胺基酸(諸如甘胺酸及/或絲胺酸)殘基組成之肽連接子，其將可變重鏈區域與可變輕鏈區域連接在一起。在一個實施例中，可撓性多肽連接體為Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n ，其中n為等於或大於1之正整數。舉例而言，n=1、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9及n=10(SEQ ID NO：105)。在一個實施例中，可撓性多肽連接子包括(但不限於)(Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO：106)或(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO：107)。在另一實施例中，連接子包括多個重複序列(Gly2 Ser)、(GlySer)或(Gly3 Ser)(SEQ ID NO：108)。本 發明之範疇內亦包括以引用的方式併入本文中之WO2012/138475中所描述之連接子。
如本文所用，5'封端(亦稱為RNA封端、RNA 7-甲基鳥苷封端或RNA m7 G封端)為經修飾之鳥嘌呤核苷酸，其在開始轉錄後不久即添加至真核信使RNA之「前部」或5'端。5'封端由連接至第一轉錄核苷酸之端基組成。其存在對於核糖體識別及保護免於RNase至關重要。封端添加與轉錄偶接，且以輔助轉錄方式進行，使得各自彼此影響。開始轉錄後不久，合成之mRNA之5'端由與RNA聚合酶有關之封端合成複合物結合。此酶促複合物催化mRNA封端所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應形式進行。封端部分可經修飾以調節mRNA之功能，諸如其轉譯穩定性或效率。
如本文所用，「活體外轉錄RNA」係指已活體外合成之RNA，例如mRNA。一般而言，活體外轉錄之RNA自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄之RNA的模板。
如本文所用，「聚(A)」為藉由聚腺苷酸化連接至mRNA的一連串腺苷。在用於短暫表現之構築體之一些實施例中，聚A在50與5000之間(SEQ ID NO：28)，例如大於64，例如大於100，例如大於300或400。聚(A)序列可經化學修飾或酶修飾以調節mRNA功能性，諸如轉譯之位置、穩定性或效率。
如本文所用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷部分或其經修飾之變異體與信使RNA分子共價連接。在真核生物中，大多數信使RNA(mRNA)分子在3'端經聚腺苷酸化。3'聚(A)尾為經由酶(聚腺苷酸化聚合酶)之作用添加至前mRNA的腺嘌呤核苷酸之長序列(通常幾百)。在高級真核生物中，聚(A)尾添加至含有特異性序列(聚腺苷酸化信號)之轉錄物上。聚(A)尾及其結合之蛋白質幫助保護mRNA免於被末端核酸酶分解。聚腺苷酸化對於轉錄封端、mRNA自細胞核輸出及轉譯為 重要的。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA之後立即在細胞核中發生，但另外亦可稍後在細胞質中發生。轉錄結束後，mRNA鏈經與RNA聚合酶有關之核酸內切酶複合物作用裂解。裂解部位通常特徵為在裂解部位附近存在鹼基序列AAUAAA。mRNA已裂解後，腺苷殘基添加至裂解部位之游離3'端。
如本文所用，「短暫」係指表現非整合轉殖基因持續幾小時、幾天或幾週之時段，其中若整合至基因組中或含於宿主細胞中之穩定質體複製子內時，則表現時間段小於基因表現時間段。
術語「信號轉導路徑」係指在將信號自細胞之一個部分傳輸至細胞之另一部分中起作用的多種信號轉導分子之間的生物化學關係。片語「細胞表面受體」包括能夠跨越細胞膜接收信號及傳輸信號之分子及分子複合物。
術語「個體」打算包括可引起免疫反應之活生物體(例如哺乳動物、人類)。
術語「實質上純化」細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上經純化之細胞亦指已與在其天然存在之狀態中通常與其相關聯之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，實質上純化細胞群體係指細胞之同源群體。在其他情況下，此術語僅指已與在其天然狀態下與其天然相關之細胞分離的細胞。在一些態樣中，該等細胞在活體外培養。在其他態樣中，該等細胞不在活體外培養。
如本文所用之術語「療法」意謂治療。藉由減輕、抑制、緩解或根除疾病病況來獲得治療作用。
如本文所用之術語「預防」意謂疾病或疾病病況之預防或保護性治療。
在本發明之情形下，「腫瘤抗原」或「過度增生性病症抗原」或「與過度增生性病症相關之抗原」係指特定過度增生性病症常見的抗 原。在某些態樣中，本發明之過度增殖性病症抗原來源於以下癌症，其包括(但不限於)原發性或轉移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌，諸如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌及其類似癌症。
術語「轉染」或「轉化」或「轉導」係指外源性核酸藉以轉移或引入至宿主細胞中的過程。「轉染」或「轉化」或「轉導」細胞為已經外源性核酸轉染、轉化或轉導之細胞。該細胞包括原生個體細胞及其後代。
若個體中之癌症(例如血液癌，例如癌細胞生長、增殖及/或存活)之參數延遲或減小了可偵測量，例如如藉由任何適當量度所測定，例如按質量、細胞計數或體積計之約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上，則個體對治療有「回應」。在一個實例中，若個體經歷超出不投與治療之情況下預測之預期壽命約5%、10%、20%、30%、40%、50%或50%以上之預期壽命延長，則個體對治療有反應。在另一實例中，若個體具有增加之無疾病存活期、總存活期或增加之進展時間，則個體對治療有反應。若干方法可用於測定患者是否對治療有反應，包括例如由NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology(NCCN Guidelines®)提供之標準。舉例而言，在B-ALL的情況下，完全反應或完全反應者可涉及以下中的一或多者：<5% BM blast，>1000個中性粒細胞/ANC(/μL)，>100,000個無循環母細胞或髓外疾病(無淋巴結病、脾腫大、皮膚/膠浸潤/睪丸質量/CNS參與)之血小板(/μL)，三系血細胞生成及持續4週無復發。部分反應者可涉及以下中的一或多者：BM blast之>50%減小，>1000個中性粒細胞/ANC(/μL)，>100,000個血小板(/μL)。無反應者可顯示疾病進展，例如BM母細胞中之>25%。
如本文所用，「難治性」係指對治療不作出回應之疾病，例如癌症。在實施例中，難治性癌症在治療開始前或時可對治療具抗性。在其他實施例中，難治性癌症可在治療期間變得具有抗性。難治性癌症亦稱為抗性癌症。
如本文所用之術語「復發」係指癌症在初始反應性時段之後的再現(例如完全反應或部分反應)。舉例而言，初始反應時段可包括癌細胞水準降至某一臨限值以下，例如20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以下。再現可涉及癌細胞水準上升至某一臨限值以上，例如20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以上。舉例而言，例如在B-ALL之情況下，再現可涉及例如完全反應之後血液、骨髓(>5%)或任何髓外部位中之母細胞再現。完全反應在此情況下可涉及<5% BM母細胞。更一般而言，在一實施例中，反應(例如，完全反應或部分反應)可涉及可偵測MRD之缺失(微小殘留病)。在一實施例中，初始反應時段持續至少1、2、3、4、5或6天；至少1、2、3或4週；至少1、2、3、4、6、8、10或12個月；或至少1、2、3、4或5年。
在一些實施例中，包括CD19抑制劑之療法，例如CD19 CAR療法可能復發或為難治性治療。復發或抗性可由CD19缺失(例如，抗原缺失突變)或降低CD19水準(例如，由CD19陰性純系之純系選擇引起)之其他CD19變化引起。懷有此類CD19缺失或變化之癌症在本文中稱為「CD19陰性癌症」或「CD19陰性復發性癌症」。應理解，CD19陰性癌症不必具有100% CD19缺失，但降低CD19療法之有效性的足夠降低使得癌症復發或變得難治。在一些實施例中，CD19陰性癌症由CD19 CAR療法造成。
術語「特異性結合」係指識別存在於樣品中之結合搭配物(例如刺激腫瘤抗原)蛋白質且與其結合之抗體或配位體，但該抗體或配位 體大體上不識別或結合樣品中之其他分子。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」指在合理醫學判斷範疇內適用於與個體之組織接觸而無異常毒性、刺激、過敏反應及其類似反應且與合理益處/風險比相稱的彼等鹽。醫藥學上可接受之鹽為此項技術中熟知。舉例而言，Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences(1977)66：1-19中詳細描述醫藥學上可接受之鹽。
如本文所用之術語「可調控嵌合性抗原受體(RCAR)」係指一組多肽，在最簡單實施例中通常兩個，當在RCARX細胞中時，其向RCARX細胞針對目標細胞(通常癌細胞)之特異性，且具有可調控胞內信號產生或增殖，其可使RCARX細胞之免疫效應子特性最佳。RCARX細胞至少部分依賴於抗原結合域獲得對包含該抗原結合域結合之抗原的目標細胞之特異性。在一實施例中，RCAR包括二聚化開關，其在存在二聚分子時可將胞內信號傳導域偶合至抗原結合域。
如本文所用之術語「膜錨」或「膜繫栓域」係指足以將胞外或胞內域錨定於質膜之多肽或部分(例如肉豆蔻醯基)。
如本文所用之術語「開關域」當涉及RCAR時係指在二聚分子存在下與另一開關域有關之實體，通常基於多肽之實體。該關聯導致連接至(例如，稠合至)第一開關域之第一實體與連接至(例如，稠合至)第二開關域之第二實體功能性偶合。第一及第二開關域統稱為二聚開關。在實施例中，第一與第二開關域彼此相同，例如其為具有相同主要胺基酸序列之多肽且統稱為均二聚交換。在實施例中，第一及第二開關域彼此不同，例如其為具有不同主要胺基酸序列之多肽且統稱為雜二聚開關。在實施例中，交換為胞內的。在實施例中，交換為胞外的。在實施例中，交換域為基於多肽(例如，基於FKBP或FRB)之實體，且二聚分子為小分子，例如雷帕羅吉(rapalogue)。在實施例中，交換域為基於多肽之實體，例如結合myc肽之scFv，且二聚分子為多 肽、其片段或多肽之多聚體，例如myc配位體或與一或多個myc scFv結合之myc配位體多聚體。在實施例中，開關域為基於多肽之實體，例如myc受體，且二聚化分子為抗體或其片段，例如myc抗體。
如本文所用之術語「二聚分子」例如在涉及RCAR時係指促進第一交換域與第二交換域關聯之分子。在實施例中，二聚分子不天然存在於個體中，或不以將導致顯著二聚之濃度存在。在實施例中，二聚分子為小分子，例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕羅吉，例如RAD001。
當與例如立體異位mTOR抑制劑(例如，RAD001或雷帕黴素)或催化mTOR抑制劑之mTOR抑制劑一起使用時，術語「低免疫增強劑量」係指例如如藉由P70 S6激酶活性抑制所量測之部分(而非完全)抑制mTOR活性之mTOR抑制劑的劑量。本文論述例如藉由P70 S6激酶之抑制來評估mTOR活性之方法。該劑量不足以導致完全免疫抑制但足以增強免疫反應。在一實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑使得PD-1陽性T細胞之數目減少及/或PD-1陰性T細胞之數目增加，或PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率升高。在一實施例中，較低的、免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致原始T細胞之數目增加。在一實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致以下中之一或多者：例如在例如記憶T細胞前體細胞之記憶T細胞上以下標記物中之一或多者之表現增加：CD62L高 、CD127高 、CD27+ 及BCL2；舉例而言，在例如記憶T細胞前驅體之記憶T細胞上KLRG1表現減少；及記憶T細胞前體細胞之數目增加，該等細胞例如為具有以下特徵中之任一者或組合之細胞：增加CD62L高 、增加之CD127高 、增加之CD27+ 、降低之KLRG1及增加之BCL2；其中，例如相比於未經治療之個體，上文所描述之變化中之任 一者例如至少短暫出現。
範圍：在本發明通篇中，本發明之各種態樣可以範圍格式呈現。應理解，範圍型式中之描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明範疇的固定限制。因此，範圍之描述應視為已確切揭示所有可能的子範圍以及彼範圍內之單個數值。舉例而言，諸如1至6之範圍描述應被視為已特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等之子範圍以及彼範圍內之個別數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95%至99%之一致性範圍包括95%、96%、97%、98%或99%之一致性，且包括子範圍，諸如96%至99%、96%至98%、96%至97%、97%至99%、97%至98%及98%至99%之一致性。不管範圍之寬度此均適用。
說明書 CD19抑制劑及結合域
本文提供物質組合物及使用CD19嵌合抗原受體(CAR)治療諸如癌症之疾病之使用方法。方法尤其包括投與本文所述之CD19 CAR以及另一藥劑，如B細胞抑制劑。方法亦包括例如投與本文所述之CD19 CAR以治療淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤。
在一態樣中，本發明提供多種嵌合抗原受體(CAR)，其包含經工程改造以特異性結合CD19蛋白之抗體或抗體片段。在一態樣中，本發明提供經工程改造以表現CAR之細胞(例如T細胞)，其中CAR T細胞(「CART」)展現抗癌特性。在一態樣中，細胞用CAR轉型且CAR表現於細胞表面上。在一些實施例中，細胞(例如T細胞)用編碼CAR之病毒載體轉導。在一些實施例中，載體為反轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為豆狀病毒載體。在一些此類實施例中，細胞可穩定表現CAR。在另一實施例中，細胞(例如T細胞)經編碼CAR之核酸，例如mRNA、cDNA、DNA轉染。在一些此類實施例中，細胞可 短暫表現CAR。
在一態樣中，CAR之抗CD19蛋白質結合部分為scFv抗體片段。在一態樣中，此類抗體片段因為保留等效結合親和力而起作用，例如其以相當親和力與其所源自之IgG抗體結合相同抗原。在一態樣中，此類抗體片段因為其提供可包括(但不限於)以下如熟習此項技術者將理解之生物反應而起作用：活化免疫反應、抑制源於其目標抗原之信號轉導、抑制激酶活性及其類似者。在一態樣中，CAR之抗CD19抗原結合域為scFv抗體片段，其相較於該scFv所源自之鼠類序列為人類化的。在一態樣中，親本鼠類scFv序列為提供於PCT公開案WO2012/079000且在本文中提供為SEQ ID NO：59之CAR19構築體。在一個實施例中，抗CD19結合域為WO2012/079000中所述且提供於SEQ ID NO：59中之scFv，或與其至少95%，例如95%-99%一致之序列。在一個實施例中，抗CD19結合域為提供於PCT公開案WO2012/079000中且在本文中提供為SEQ ID NO：58之CAR構築體之一部分，或與其至少95%，例如95%-99%一致之序列。在一個實施例中，抗CD19結合域包含至少一個(例如2、3、4、5或6個)選自表4 及/或表5 之CDR。
在一些態樣中，本發明抗體併入嵌合性抗原受體(CAR)中。在一態樣中，CAR包含在PCT公開案WO2012/079000中提供為SEQ ID NO：12且在本文中提供為SEQ ID NO：58之多肽序列，其中scFv域經一或多個選自SEQ ID NO：1-12之序列取代。在一態樣中，SEQ ID NO：1-12之scFv域為SEQ ID NO：59之scFv域之人類化變異體，該scFv域為特異性結合於人類CD19之鼠類來源之scFv片段。此小鼠scFv之人類化可對於臨床配置為所需的，其中小鼠特異性殘基可在接受CART19處理，例如藉由經CAR19構築體轉導之T細胞之處理的患者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。
在一態樣中，本發明之CAR之抗CD19結合域，例如人類化scFv 部分由序列已關於哺乳動物細胞中之表現密碼子最佳化之轉殖基因編碼。在一個態樣中，本發明之全部CAR構築體由全部序列已針對在哺乳動物細胞中表現經密碼子最佳化之轉殖基因編碼。密碼子最佳化係指發現同義密碼子(亦即編碼相同胺基酸之密碼子)在編碼DNA中之出現頻率在不同物種中有偏向。此類密碼子簡併允許相同多肽由多種核苷酸序列編碼。多種密碼子最佳化方法為此項技術中已知，且包括例如至少美國專利第5,786,464號及第6,114,148號中所揭示之方法。
在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：1中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：2中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：3中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：4中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：5中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：6中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：7中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：8中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：9中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：10中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：11中之scFv部分。在一態樣中，人類化CAR19包含提供於SEQ ID NO：12中之scFv部分。
在一態樣中，本發明之CAR組合特異性抗體之抗原結合域與胞內信號傳導分子。舉例而言，在一些態樣中，胞內信號傳導分子包括(但不限於)CD3-ξ鏈、4-1BB及CD28信號傳導模組及其組合。在一態樣中，CD19 CAR包含選自提供於SEQ ID NO：31-42中的一或多者中之序列的CAR。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：31中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：32中之序列。 在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：33中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：34中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：35中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：36中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：37中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：38中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：39中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：40中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：41中之序列。在一態樣中，CD19 CAR包含提供於SEQ ID NO：42中之序列。
因此，在一態樣中，抗原結合域包含人類化抗體或抗體片段。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含本文所述之鼠類或人類化抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及/或本文所述之鼠類或人類化抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗CD19結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含本文所述之鼠類或人類化抗CD19結合域一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗CD19結合域具有兩個可變重鏈區，各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含本文所述之人類化輕鏈可變區(例如表2 中)及/或本文所述之人類化重鏈可變區(例如表2 中)。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含本文所述之人類化重鏈可變區(例如表2 中)， 例如至少兩個本文所述之人類化重鏈可變區(例如表2 中)。在一個實施例中，抗CD19結合域為包含表2 之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在一個實施例中，抗CD19結合域(例如scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有提供於表2 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表2之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有提供於表2 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表2之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，編碼人類化抗CD19結合域之核酸序列包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：72，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域為scFv，且包含本文所描述之例如表2 中之胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接子(例如，本文所描述之連接子)連接至包含本文所描述之例如表2 中之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中，人類化抗CD19結合域包括(Gly4 -Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6，例如3或4(SEQ ID NO：53)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區，或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在一態樣中，抗原結合域部分包含一或多個選自SEQ ID NO：1-12之序列。在一態樣中，人類化CAR選自一或多個選自SEQ ID NO：31-42之序列。在一些態樣中，非人類抗體為人類化的，其中抗體之特定序列或區域經修飾以增加與自然產生於人類中之抗體或其片段之相似性。
在一個實施例中，CAR分子包含抗CD19結合域，其包含本文所述之抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述之抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如抗CD19結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。在一個實施例中，抗CD19結合域包含本文所述之抗CD19結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如抗CD19結合域具有兩個可變重鏈區，各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一個態樣中，抗CD19結合域之特徵為抗體或抗體片段之特定功能特徵或特性。舉例而言，在一態樣中，包含抗原結合域的本發明之CAR組合物之部分特異性結合人類CD19。在一態樣中，本發明係關於包含抗體或抗體片段之抗原結合域，其中抗體結合域特異性結合於CD19蛋白質或其片段，其中抗體或抗體片段包含可變輕鏈及/或可變重鏈，其包括SEQ ID NO：1-12或SEQ ID NO：59之胺基酸序列。在一態樣中，抗原結合域包含選自SEQ ID NO：1-12或SEQ ID NO：59之scFv之胺基酸序列。在某些態樣中，scFv與前導序列臨界且在相同閱讀框架中。在一態樣中，前導序列為提供為SEQ ID NO：13之多肽序列。
在一個態樣中，包含抗原結合域之CAR的部分包含靶向CD19之抗原結合域。在一態樣中，抗原結合域靶向人類CD19。在一態樣中，CAR之抗原結合域與Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)中所述之FMC63 scFv片段具有相同或類似結合特異性，或包括該片段。在一態樣中，包含抗原結合域之CAR之部分包含靶向B細胞抗原，例如人類B細胞抗原之抗原結合域。CD19抗體分子可例如為以全文引用的方式併入本文中之WO2014/153270中所述之抗體分子(例如人類化抗CD19抗體分子)。WO2014/153270亦描述分析各種CART構築體之結合及功效之方法。
在一個實施例中，抗CD19結合域包含本文所述之鼠類輕鏈可變區(例如表3 中)及/或本文所述之鼠類重鏈可變區(例如表3 中)。在一個實施例中，抗CD19結合域為包含表3 之胺基酸序列之鼠類輕鏈及鼠類重鏈之scFv。在一個實施例中，抗CD19結合域(例如scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有提供於表3 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表3 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有提供於表3 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表3 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，抗CD19結合域包含SEQ ID NO：59的序列，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，抗CD19結合域為scFv，且包含本文所述之胺基酸序列(例如表3 中)之輕鏈可變區經由連接子，例如本文所述之連接子連接至包含本文所述之胺基酸序列(例如表3 中)之重鏈可變區。在一個實施例中，抗原結合域包括(Gly4 -Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6，例如3或4(SEQ ID NO：53)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以 下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區，或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
此外，本發明(尤其)提供視情況與B細胞抑制劑組合之CD19 CAR組合物，及其在治療癌症或任何涉及表現CD19之細胞或組織之惡性腫瘤或自體免疫疾病(以及其他疾病)之藥物或方法中之用途。
在一個態樣中，本發明之CAR可用於根除表現CD19之正常細胞，因此適用於用作細胞移植前之細胞調整療法。在一個態樣中，CD19表現正常細胞為CD19表現正常幹細胞且細胞移植為幹細胞移植。
在一態樣中，本發明提供經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞(例如T細胞)，其中CAR表現細胞，例如CAR T細胞(「CART」)展現抗癌特性。適合抗原為CD19。在一態樣中，CAR之抗原結合域包含部分人類化抗CD19抗體片段。在一態樣中，CAR之抗原結合域包含含scFv之部分人類化抗CD19抗體片段。因此，本發明(尤其)提供包含人類化抗CD19結合域且工程改造至免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞中之CD19-CAR，且其用於過繼性療法之方法。
在一態樣中，CAR，例如CD19-CAR包含選自CD137(4-1BB)信號傳導域、CD28信號傳導域、CD3ζ信號域及其任何組合之群的至少一個胞內域。在一態樣中，CAR，例如CD19-CAR包含至少一個來自除CD137(4-1BB)或CD28以外之一或多個共刺激分子的胞內信號傳導域。
本發明涵蓋(但不限於)包含編碼CAR之序列之重組DNA構築體，其中CAR包含特異性結合至CD19、CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1，例如人類CD19、CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之抗體或抗體片段，其中抗體片段之序列與編碼胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。胞內 信號傳導域可包含共刺激信號傳導域及/或主要信號傳導域，例如ξ鏈。共刺激信號傳導域係指包含共刺激分子之胞內域的至少一部分的CAR之一部分。在一個實施例中，抗原結合域為本文所述之鼠類抗體或抗體片段。在一個實施例中，抗原結合域為人類化抗體或抗體片段。
在特定態樣中，本發明之CAR構築體包含選自由SEQ ID NO：1-12組成之群的scFv域或SEQ ID NO：59之scFV域，其中scFv之前可有視情況存在的諸如SEQ ID NO：13中所提供之前導序列，且後接視情況存在的諸如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49中所提供之鉸鏈序列，諸如SEQ ID NO：15中所提供之跨膜區，包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之CD3 ξ序列，其中該等域鄰接且在相同閱讀框架中形成單個融合蛋白。本發明中亦(尤其)包括編碼選自由以下組成之群的scFv片段中之每一者之多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59。本發明中亦(尤其)包括編碼選自由以下組成之群的scFv片段中之每一者之多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59，及SEQ ID NO：13-17之域中之每一者，加上本發明之經編碼CD19 CAR融合蛋白。在一態樣中，例示性CD19 CAR構築體包含視情況存在之前導序列、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域及胞內刺激域。在一態樣中，例示性CD19 CAR構築體包含視情況存在之前導序列、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、胞內共刺激域及胞內刺激域。 在一些實施例中，含有本發明之人類化scFv域之特異性CD19 CAR構築體提供為SEQ ID NO：31-42，或提供為SEQ ID NO：59之鼠類scFv域。
全長CAR序列亦在本文提供為SEQ ID NO：31-42及58，如表2 及表3 中所示。
例示性前導序列提供為SEQ ID NO：13。例示性鉸鏈/間隔基序列提供為SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49。例示性跨膜域序列提供為SEQ ID NO：15。4-1BB蛋白質之例示性胞內信號傳導域之序列提供為SEQ ID NO：16。CD27之例示性胞內信號傳導域序列提供為SEQ ID NO：51。例示性CD3ζ域序列提供為SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43。此等序列可例如與識別CD19、CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之scFv組合使用。
本文提供各種scFv片段及其他CAR組分之例示性序列。應注意，本文亦提供無前導序列(例如無SEQ ID NO：13之胺基酸序列或SEQ ID NO：54之核苷酸序列)之此等CAR組分(例如SEQ ID NO：121，或表2、3、6、11A、11B、16或25 之序列)。
在實施例中，本文所述之CAR序列含有衍生自CD3ζ鏈之共刺激域之信號域中之Q/K殘基改變。
在一態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之核酸分子之重組核酸構築體，其中核酸分子包含編碼例如本文所述之抗CD19結合域之核酸序列，其與編碼胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。在一態樣中，抗CD19結合域選自SEQ ID NO：1-12及58中的一或多者。在一態樣中，抗CD19結合域由提供於SEQ ID NO：61-72及97中的一或多者中之序列之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：61之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣 中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：62之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：63之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：64之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：65之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：66之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：67之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：68之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：69之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：70之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：71之核苷酸殘基64至813編碼。在一態樣中，抗CD19結合域由SEQ ID NO：72之核苷酸殘基64至813編碼。
本文提供CD19抑制劑及組合療法。在一些實施例中，CD19抑制劑(例如細胞療法或抗體)與B細胞抑制劑，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之一或多種抑制劑組合投與。CD19抑制劑包括(但不限於)CD19 CAR表現細胞，例如CD19 CART細胞，或抗CD19抗體(例如抗CD19單特異性或雙特異性抗體)或其片段或共軛物。在一個實施例中，CD19抑制劑與B細胞抑制劑，例如本文所述之CAR表現細胞組合投與。
本發明中描述多種CD19 CAR表現細胞。舉例而言，在一些實施例中，CD19抑制劑包括抗CD19 CAR表現細胞，例如CART，例如表現表2 中所述之抗CD19 CAR構築體之細胞，或由包含表2、4或5 中所述之scFv、CDR或VH及VL鏈之CD19結合CAR編碼。舉例而言，抗CD19 CAR表現細胞，例如CART藉由將CD19-CAR(包含CD19結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用於與本文所述之CAR表現細胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用 於過繼性療法之方法。
在一個實施例中，抗原結合域包含一個、兩個、三個(例如所有三個)來自本文中所列之抗體(例如表2、4或5 中)之重鏈CDR，HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，及/或一個、兩個、三個(例如所有三個)來自本文中所列之抗體(例如表2、4或5 中)之輕鏈CDR，LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在一個實施例中，抗原結合域包含上文所列或所述之抗體之重鏈可變區及/或可變輕鏈區。
在一個實施例中，CD19結合域(例如scFv)包含：包含具有提供於表2 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列之輕鏈可變區，或與表2 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或包含具有提供於表2 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列之重鏈可變區，或與表2 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在實施例中，CD19結合域包含一或多個表4 或表5 之CDR(例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3各一個)，或具有CDR中的一或多者之一個、兩個、三個、四個、五個或六個修飾(例如取代)之CDR。
例示性抗CD19抗體或其片段或共軛物包括(但不限於)布林莫單抗(blinatumomab)、SAR3419(Sanofi)、MEDI-551(MedImmune LLC)、Combotox、DT2219ARL(Masonic Cancer Center)、MOR-208(亦稱為XmAb-5574；MorphoSys)、XmAb-5871(Xencor)、MDX-1342(Bristol-Myers Squibb)、SGN-CD19A(Seattle Genetics)及AFM11(Affimed Therapeutics)。參見例如Hammer.MAbs.4.5(2012)：571-77。布林莫單抗為由兩個scFv組成之雙特異性抗體，一個scFv與CD19結合且一個scFv與CD3結合。布林莫單抗導引T細胞攻擊癌細胞。參見 例如Hammer等人；臨床試驗標識號NCT00274742及NCT01209286。MEDI-551為具有經工程改造以具有增強的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之Fc之人類化抗CD19抗體。參見例如Hammer等人；及臨床試驗標識號NCT01957579。Combotox為與CD19及CD22結合之免疫毒素的混合物。免疫毒素由融合至去糖基化蓖麻毒素A鏈之scFv抗體片段組成。參見例如Hammer等人；及Herrera等人J.Pediatr.Hematol.Oncol.31.12(2009)：936-41；Schindler等人Br.J.Haematol.154.4(2011)：471-6。DT2219ARL為靶向CD19及CD22、包含兩個scFv及截短白喉毒素之雙特異性免疫毒素。參見例如Hammer等人；及臨床試驗標識號NCT00889408。SGN-CD19A為由連接至合成細胞毒性細胞殺死劑單甲基奧瑞他汀F(MMAF)之抗CD19人類化單株抗體組成之抗體-藥物共軛物(ADC)。參見例如Hammer等人；及臨床試驗標識號NCT01786096及NCT01786135。SAR3419為包含經由可裂解連接子與美登素(maytansine)衍生物共軛之抗CD19人類化單株抗體之抗CD19抗體-藥物共軛物(ADC)。參見例如Younes等人J.Clin.Oncol.30.2(2012)：2776-82；Hammer等人；臨床試驗標識號NCT00549185；及Blanc等人Clin Cancer Res.2011；17：6448-58。XmAb-5871為Fc工程改造之人類化抗CD19抗體。參見例如Hammer等人。MDX-1342為具有增強的ADCC之人類Fc工程改造之抗CD19抗體。參見例如Hammer等人。在實施例中，抗體分子為雙特異性抗CD19及抗CD3分子。舉例而言，AFM11為靶向CD19及CD3之雙特異性抗體。參見例如Hammer等人；及臨床試驗標識號NCT02106091。在一些實施例中，本文所述之抗CD19抗體共軛或以其他方式結合至治療劑，例如化學治療劑、肽疫苗(如Izumoto等人2008 J Neurosurg 108：963-971中所述)、免疫抑制劑或免疫燒蝕劑，例如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯、FK506、CAMPATH、抗CD3抗體、細胞毒素、氟達 拉賓、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228或細胞因子。
例示性抗CD19抗體分子(包括抗體或其片段或結合物)可包括表2、4或5 中所述之scFv、CDR或VH及VL鏈。在一個實施例中，CD19結合抗體分子包含：輕鏈可變區，其包含具有提供於表2 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表2 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有提供於表2 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表2 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在實施例中，CD19結合抗體分子包含表4 或表5 之一或多個CDR(例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3各一個)，或具有CDR中的一或多者之一個、兩個、三個、四個、五個或六個修飾(例如取代)之CDR。抗體分子可例如為分離抗體分子。
在一個實施例中，針對CD19之抗原結合域為本文中之表中所述之抗原結合域之抗原結合部分，例如CDR。在一個實施例中，CD19抗原結合域可來自任何CD19 CAR，例如LG-740；美國專利第8,399,645號；美國專利第7,446,190號；Xu等人，Leuk Lymphoma.2013 54(2)：255-260(2012)；Cruz等人，Blood 122(17)：2965-2973(2013)；Brentjens等人，Blood,118(18)：4817-4828(2011)；Kochenderfer等人，Blood 116(20)：4099-102(2010)；Kochenderfer等人，Blood 122(25)：4129-39(2013)；及16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(5月15-18日，Salt Lake City)2013,Abst 10，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，特異性結合於CD19之CART細胞具有USAN名稱TISAGENLECLEUCEL-T。CTL019藉由T細胞之基因修飾製得，藉 由在EF-1 α啟動子之控制下經由用含有CTL019轉殖基因之自身不活化、缺乏複製之慢病毒(LV)載體轉導之穩定插入介導。CTL019可為基於轉殖基因陽性T細胞%向個體傳遞之轉殖基因陽性及陰性T細胞之混合物。
在一態樣中，本發明之CAR構築體之核酸序列選自SEQ ID NO：85-96中的一或多者。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：85。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：86。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：87。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：88。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：89。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：90。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：91。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：92。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：93。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：94。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：95。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：96。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：97。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：98。在一態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：99。
CD20抑制劑及結合域
如本文所用，術語「CD20」係指已知在B細胞上可偵測之抗原決定子。人類CD20亦稱作跨膜4-域，子族A，成員1(MS4A1)。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類CD20之胺基酸序列可見於寄存號NP_690605.1及NP_068769.2，且編碼人類CD20之轉錄物變異體1及3之核苷酸序列可分別見於寄存號NM_152866.2及NM_021950.3。如本文所用，「CD20」包括包含全長野生型CD20之突變(例如點突變)、片 段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合CD20蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，CD20蛋白質表現於癌細胞上。
在一些態樣中，本發明提供CD20抑制劑或結合域，例如如本文所述之CD20抑制劑或結合域。本發明亦提供編碼CD20結合域之核酸，或包含CD20結合域之CAR。CD20抑制劑包括(但不限於)CD20 CAR表現細胞，例如CD20 CART細胞或抗CD20抗體(例如抗CD20單特異性或雙特異性抗體)或其片段。組合物亦可包含第二藥劑，例如抗CD19 CAR表現細胞或CD19結合域。藥劑可例如由單一核酸或不同核酸編碼。
在一些態樣中，CD20抑制劑或結合域作為單藥療法投與。在一些態樣中，CD20抑制劑或結合域與第二藥劑，如抗CD19 CAR表現細胞組合投與。在一個實施例中，CD20抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
CD20 CAR表現細胞，例如CART
在一個實施例中，CD20抗體分子包含：輕鏈可變區，其包含具有提供於表15A或15B 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表15A或15B 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有提供於表14A或14B 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表14A或14B 之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD20抗體分子包含本文所述之CD20結合域之一或多個(例如兩個或所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決 定區3(LC CDR3)，及/或本文所述之CD20結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如CD20結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。此等CDR可例如為表12A、12B及/或表13 之彼等，或與其大體上一致之序列。在一個實施例中CD20抗體分子包含一或多種CDR(例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3)，其包含具有表12A、12B及/或表13 之胺基酸序列之一個、兩個、三個、四個、五個或六個修飾(例如取代)之胺基酸序列。抗體分子可例如為分離抗體分子。
在一些實施例中，CD20抑制劑包括抗CD20 CAR表現細胞，例如CART，例如表現表11A或11B 中所述之抗CD20 CAR構築體之細胞，或與其大體上一致之序列，或由包含表11A-15B 中所述之scFv、CDR或VH及VL鏈，或與其大體上一致之序列編碼之CD20結合CAR。舉例而言，抗CD20 CAR表現細胞，例如CART藉由將CD20-CAR(包含CD20結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)包含：包含具有提供於表15A或15B 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表15A或15B 之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列之輕鏈可變區；及/或包含具有提供於表14A或14B 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表14A或14B 之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列之重鏈可變區。
在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之CD20結合域之一或多個(例如兩個或所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及/或本文所述之CD20結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如CD20結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。此等CDR可例如為表12A、12B及/或表13 之彼等，或與其大體上一致之序列。在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)包含一或多個CDR(例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3)，其包含具有表12A、12B及/或表13 之胺基酸序列之一個、兩個、三個、四個、五個或六個修飾(例如取代)之胺基酸序列。
在實施例中，CAR包含包括CD20結合域、跨膜域及細胞內信號傳導域之抗體或抗體片段。CD20結合域可包含表13、15A或15B 中所列之任何CD20輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表12A、12B、14A或14B 中所列之任何CD20重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
在一個實施例中，CD20結合域包含CAR20-1、CAR20-2、CAR20-3、CAR20-4、CAR20-5、CAR20-6、CAR20-7、CAR20-8、CAR20-9、CAR20-10、CAR20-11、CAR20-12、CAR20-13、CAR20-14、CAR20-15或CAR20-16中的任一者之六個CDR(例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3)，或與其大體上一致之序列。在一個實施例中，CD20結合域包含CAR20-1、CAR20-2、CAR20-3、CAR20-4、CAR20-5、CAR20-6、CAR20-7、 CAR20-8、CAR20-9、CAR20-10、CAR20-11、CAR20-12、CAR20-13、CAR20-14、CAR20-15或CAR20-16中的任一者之三個CDR(例如HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3各一個，或LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3各一個)，或與其大體上一致之序列。
在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如表15A或15B 中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如表14A或14B 中)，或與其大體上一致之序列。在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)包含：包含具有提供於表15A或15B 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表15A或15B 之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列之輕鏈可變區；及/或包含具有提供於表14A或14B 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表14A或14B 之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列之重鏈可變區。
其他實施例包括編碼此部分中所述之多肽之核苷酸序列。舉例而言，其他實施例包括編碼表11A-15B中的任一者 之多肽之核苷酸序列。舉例而言，核苷酸序列可包含表11A或11B 之CAR構築體或scFv。核苷酸可編碼表14A或14B 之VH、表15A或15B 之VL或兩者。核苷酸可編碼表12A或12B 之VH CDR1、VH CDR2或VH CDR3中的一或多者(例如兩者或三者)及/或核苷酸可編碼表13 之VL CDR1、VL CDR2或VL CDR3中的一或多者(例如兩者或三者)。核苷酸序列也可包括SEQ ID NO：13、14、15、16、17及51之域中的一或多者，例如全部。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及CD20 CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表 現CD20 CAR之第二細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如表現包括主要細胞內信號傳導域之CAR(例如CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR)之第一細胞，及表現包括次要信號傳導域之CAR(例如CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR))之第二細胞。
CD20 CAR亦可包含跨膜域(例如如本文所述之跨膜域)、細胞內信號傳導域(例如如本文所述之細胞內信號傳導域)、共刺激域(例如如本文所述之共刺激域)、前導序列(例如如本文所述之前導序列)或鉸鏈(例如如本文所述之鉸鏈)中的一或多者。
示例性抗CD20抗體包括(但不限於)利妥昔單抗、奧伐木單抗、奧克珠單抗、維托珠單抗、歐比托珠單抗、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、奧卡拉珠單抗及Pro131921(Genentech)。參見例如Lim等人Haematologica.95.1(2010)：135-43。
在一些實施例中，抗CD20抗體包含利妥昔單抗。利妥昔單抗為結合於CD20且使表現CD20之細胞進行細胞溶解的嵌合小鼠/人類單株抗體IgG1 κ，例如如描述於www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中。在一些實施例中，利妥昔單抗可用於治療B細胞惡性腫瘤，如非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如濾泡性NHL、彌漫性大B細胞淋巴瘤)及慢性淋巴球性白血病(CLL)。在其他實施例中，利妥昔單抗可用於治療自體免疫疾病，如類風濕性關節炎、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡症、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病、自體免疫性貧血、自體免疫性溶血性貧血、純紅血球發育不全、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、伊凡氏症候群(Evans syndrome)、血管炎、大皰性皮膚病、1型糖尿病、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、抗NMDA受體腦炎及德維克病(Devic's disease)、格雷夫氏眼病(Graves' ophthalmopathy)及 自體免疫胰臟炎。在一些實施例中，利妥昔單抗可用於治療移植排斥反應。
在一些實施例中，利妥昔單抗經靜脈內，例如呈靜脈內輸液形式投與。舉例而言，各輸注提供約500-2000mg(例如，約500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900或1900-2000mg)利妥昔單抗。
在一些實施例中，利妥昔單抗以150mg/m2 至750mg/m2 ，例如約150-175mg/m2 、175-200mg/m2 、200-225mg/m2 、225-250mg/m2 、250-300mg/m2 、300-325mg/m2 、325-350mg/m2 、350-375mg/m2 、375-400mg/m2 、400-425mg/m2 、425-450mg/m2 、450-475mg/m2 、475-500mg/m2 、500-525mg/m2 、525-550mg/m2 、550-575mg/m2 、575-600mg/m2 、600-625mg/m2 、625-650mg/m2 、650-675mg/m2 或675-700mg/m2 之劑量投與，其中m2 指示個體之體表面積。
在一些實施例中，利妥昔單抗以至少4天，例如4、7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言，利妥昔單抗以至少0.5週，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8週或8週以上之給藥時間間隔投與。
在一些實施例中，利妥昔單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與一定時間段，例如至少2週，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或20週以上。舉例而言，利妥昔單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與，每一治療循環總共至少4劑(例如，每一治療循環至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16劑或16劑以上)。
在一些態樣中，抗CD20抗體包含奧法木單抗。奧法木單抗為分子量為大 約149kDa之抗CD20 IgG1κ人類單株抗體。舉例而言，使用轉殖基因小鼠及融合瘤技術產生奧法木單抗，且自重組鼠類細胞株(NS0)表現及純化。參見例如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；及臨床試驗標識號NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352及NCT01397591。
奧伐木單抗可用於治療疾病，如CLL、非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如濾泡性NHL及DLBCL)、B細胞前淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、套細胞淋巴瘤、類風濕性關節炎及多發性硬化症。
在一些實施例中，奧法木單抗以靜脈內輸注形式投與。舉例而言，各輸注提供約150-3000mg(例如，約150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000mg)奧法木單抗。
在一些實施例中，奧法木單抗以至少4天，例如4、7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言，奧法木單抗以至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30週或30週以上之給藥時間間隔投與。
在一些實施例中，奧法木單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與一定時間段，例如至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60週或更多週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月，或1、2、3、4、5年或更多年。舉例而言，奧伐木單抗以本文所述之劑量及給藥時間間隔投與，每一治療循環總共至少2劑(例如，每一治療循環至少2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、18、20劑或20劑以上)。
在一些態樣中，抗CD20抗體包含奧克珠單抗。奧克珠單抗為人類化抗CD20單株抗體，例如如描述於臨床試驗標識號NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570及Kappos等人Lancet.19.378(2011)：1779-87中。舉例而言，奧克珠單抗可用於治療疾病，如類風濕性關節炎、多發性硬化症及狼瘡。
在一些實施例中，奧克珠單抗以靜脈內輸注形式投與。舉例而言，各輸注提供約50-2000mg(例如約50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900或1900-2000mg)奧克珠單抗。
在一些實施例中，奧克珠單抗以至少7天，例如7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言，奧克珠單抗以至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30週或30週以上之給藥時間間隔投與。
在一些實施例中，奧克珠單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與一定時間段，例如至少2週，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60週或更多週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月，或1、2、3、4、5年或更多年。舉例而言，奧克珠單抗以本文所述之劑量及給藥時間間隔投與，每一治療循環總共至少4劑(例如，每一治療循環至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20劑或20劑以上)。
在一些態樣中，抗CD20抗體包含維托珠單抗。維托珠單抗為針對CD20之人類化單株抗體。參見例如臨床試驗標識號NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581及Goldenberg等人Leuk Lymphoma.51(5)(2010)：747-55。舉例而言，維托珠單抗可用於治療NHL(例如DLBCL、濾泡性淋巴瘤)、CLL及自體免疫疾病，如免疫性血小板減少性紫癜(ITP)。
在一些實施例中，皮下或靜脈內，例如以靜脈內輸注形式投與維托珠單抗。在一些實施例中，維托珠單抗以50-800mg/m2 ，例如約50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-225、225-250、250-275、275-300、300-325、325-350、350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、475-500、500-525、525-550、550-575、575-600、600-625、625-650、650-675、675-700、700-725、725-750、750-775或775-800mg/m2 之劑量投與。在一些實施例中，投與劑量為50-400mg，例如50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或400mg之維托珠單抗。
在一些實施例中，維托珠單抗以至少7天，例如7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言，維托珠單抗以至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30週或30週以上之給藥時間間隔投與。
在一些實施例中，維托珠單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與一定時間段，例如至少2週，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60週或更多週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月，或1、2、3、4、5年或更多年。舉例而 言，維托珠單抗以本文所述之劑量及給藥時間間隔投與，每一治療循環總共至少4劑(例如，每一治療循環至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20劑或20劑以上)。
在一些態樣中，抗CD20抗體包含GA101。GA101(亦稱為歐比托珠單抗或RO5072759)為人類化及經糖基工程改造之抗CD20單株抗體。舉例而言，GA101可用於治療疾病，如B細胞淋巴惡性腫瘤，例如CLL、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。參見例如Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009)：588-96；臨床試驗標識號NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422及NCT01414205；及www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些實施例中，GA101經靜脈內，例如呈靜脈內輸液形式投與。舉例而言，各輸注提供約100-3000mg(例如約100-150、150-200、200-250、250-500、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000mg)之GA101。
在一些實施例中，GA101以至少7天，例如7、14、21、28、35天或更多天之給藥時間間隔投與。舉例而言，GA101以至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30週或30週以上之給藥時間間隔投與。舉例而言，GA101以至少1個月，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或12個月以上之給藥時間間隔投與。在一些實施例中，GA101以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天之給藥時間間隔投與。
在一些實施例中，GA101以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投 與一定時間段，例如至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60週或更多週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月，或1、2、3、4、5年或更多年。舉例而言，GA101以本文所述之劑量及給藥時間間隔投與，每一治療循環總共至少2劑(例如，每一治療循環至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20劑或20劑以上)。
在一些態樣中，抗CD20抗體包含AME-133v。AME-133v(亦稱為LY2469298或奧卡拉珠單抗)為針對CD20之人類化IgG1單株抗體，與利妥昔單抗相比，其對FcγRIIIa受體之親和力增加且抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性增強。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011)：13-25。在一些實施例中，AME-133v可用於治療癌症，如NHL，例如濾泡性淋巴瘤。參見例如Forero-Torres等人Clin Cancer Res.18.5(2012)：1395-403。
在一些態樣中，抗-CD20抗體包含PRO131921。PRO131921為一種人類化抗CD20單株抗體，其經工程改造以與利妥昔單抗相比，更好地結合於FcγRIIIa且ADCC經增強。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011)：13-25；及Casulo等人Clin Immunol.154.1(2014)：37-46。在一些實施例中，PRO131921可用於治療NHL。參見例如臨床試驗標識號NCT00452127。在一些實施例中，PRO131921靜脈內，例如以靜脈內輸注形式投與。在一些實施例中，PRO131921以15mg/m2 至1000mg/m2 ，例如約15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-125、125-150、150-175、175-200、200-226、225-250、250-300、300-325、325-350、350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、475-500、500-525、525-550、550-575、575- 600、600-625、625-650、650-675、675-700、700-725、725-750、750-775、775-800、800-825、825-850、850-875、875-900、900-925、925-950、950-975或975-1000mg/m2 之劑量投與，其中m2 指示個體之體表面積。
在一些態樣中，抗CD20抗體包含TRU-015。TRU-015為一種來源於針對CD20之抗體的域之抗CD20融合蛋白。雖然TRU-015小於單株抗體，但保留Fc介導之效應功能。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011)：13-25。TRU-015含有連接於人類IgG1鉸鏈、CH2及CH3域但缺乏CH1及CL域之抗CD20單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，TRU-015可用於治療B細胞淋巴瘤及類風濕性關節炎。在一些情況下，TRU-015靜脈內，例如以靜脈內輸注形式投與。在一些實施例中，TRU-015以0.01-30mg/kg，例如每公斤體重0.01-0.015、0.015-0.05、0.05-0.15、0.15-0.5、0.5-1、1-1.5、1.5-2.5、2.5-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30mg之劑量投與。在一些實施例中，TRU-015以相隔至少1天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天之給藥時間間隔投與。參見例如Burge等人Clin Ther.30.10(2008)：1806-16。
在一些實施例中，本文所述之抗CD20抗體共軛或以其他方式結合至治療劑，例如化學治療劑(例如本文所述之環磷氮芥、氟達拉賓、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、去甲基劑、肽疫苗、抗腫瘤抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、烷基化劑、抗微管或抗有絲分裂劑、CD20抗體或CD20抗體藥結合物)、抗過敏劑、抗噁心劑(或抗嘔吐劑)、疼痛舒解劑或本文所述之細胞保護劑。
CD22抑制劑及結合域
如本文所用，術語「CD22」係指已知在白血病前驅體細胞上可偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如 GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，同功異型物1-5人類CD22之胺基酸序列可分別見於寄存號NP 001762.2、NP 001172028.1、NP 001172029.1、NP 001172030.1及NP 001265346.1，且編碼人類CD22之變異體1-5之核苷酸序列可分別見於寄存號NM 001771.3、NM 001185099.1、NM 001185100.1、NM 001185101.1及NM 001278417.1。如本文所用，「CD22」包括包含全長野生型CD22之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合CD22蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，CD22蛋白質表現於癌細胞上。
在一些態樣中，本發明提供CD22抑制劑或結合域，例如如本文所述之CD22抑制劑或結合域。本發明亦提供編碼CD22結合域之核酸，或包含CD22結合域之CAR。CD22抑制劑包括(但不限於)CD22 CAR表現細胞，例如CD22 CART細胞或抗CD22抗體(例如抗CD22單特異性或雙特異性抗體)或其片段。組合物亦可包含第二藥劑，例如抗CD19 CAR表現細胞或CD19結合域。藥劑可例如由單一核酸或不同核酸編碼。
在一些態樣中，CD22抑制劑或結合域作為單藥療法投與。在一些態樣中，CD22抑制劑或結合域與第二藥劑，如抗CD19 CAR表現細胞組合投與。在一個實施例中，CD22抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如描述於本文中之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
CD22 CAR表現細胞，例如CART
在一個實施例中，CD22抑制劑為CD22 CAR表現細胞，例如包含CD22結合域且工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中以與CD19 CAR表現細胞，例如CART組合投與之CD22-CAR，及其用於過繼療 法之方法。
在另一態樣中，本發明提供一種CAR表現細胞，例如CART細胞群體，其包含表現CD19 CAR及CD22 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD22 CAR之第二細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如表現包括主要細胞內信號傳導域之CAR(例如CD19 CAR或CD22 CAR)之第一細胞，及表現包括次要信號傳導域之CAR(例如CD19 CAR或CD22 CAR)之第二細胞。
在一態樣中，CD22-CAR包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之視情況存在之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈(例如本文所述之鉸鏈)、跨膜域(例如本文所述之跨膜域)及胞內刺激域(例如本文所述之胞內刺激域)。在一態樣中，示例性CD22 CAR構築體包含視情況存在之前導序列(例如本文所述之前導序列)、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、胞內共刺激域(例如本文所述之胞內共刺激域)及胞內刺激域。
在一態樣中，CAR22結合域包含提供於SEQ ID NO：200-428中的任一者中之胺基酸序列之scFv部分(或由核苷酸序列編碼)。在一態樣中，CAR22結合域包含提供於SEQ ID NO：203、209、215、221、227、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418或423中的任一者中之scFv部分。
在特定態樣中，本發明之CAR構築體包含選自由以下組成之群的scFv域：SEQ ID NO：203、209、215、221、227、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、 394、400、406、412、418或423，其中scFv之前可為如提供於SEQ ID NO：13中之視情況存在之前導序列，且後接如提供於SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49中之視情況存在之鉸鏈序列、如提供於SEQ ID NO：15謝謝跨膜區、包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之CD3 ξ序列，例如其中域鄰接且在相同閱讀框架中以形成單一融合蛋白。在一些實施例中，scFv域為選自由以下組成之群的人類scFv域：SEQ ID NO：203、209、215、221、227、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418或423。
本發明中亦包括編碼選自由以下組成之群的scFv片段中之每一者之多肽之核苷酸序列：SEQ ID NO：203、209、215、221、227、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418或423。本發明中亦包括編碼選自由SEQ ID NO：203、209、215、221、227、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418或423組成之群的scFv片段中之每一者，及SEQ ID NO：13-17之域中之每一者之多肽之核苷酸序列，加上本發明之經編碼CD22 CAR。
在一些實施例中，全長CD22 CAR序列亦在本文中提供為SEQ ID NO：207、213、219、225、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362、368、374、380、386、392、398、404、410、 416、422或427，如表6A或6B 中所示。
在一個態樣中，本發明涵蓋一種包含編碼CAR之核酸分子的重組核酸構築體，其中核酸分子包含編碼例如本文所描述之CD22結合域的核酸序列，其例如與編碼胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。在一態樣中，CD22結合域選自以下中的一或多者：SEQ ID NO：203、209、215、221、227、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418或423。在一態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之核酸分子之重組核酸構築體，其中核酸分子包含編碼CD22結合域之核酸序列，例如其中序列與編碼細胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。可用於CAR中之一例示性胞內信號傳導域包括(但不限於)例如CD3-ξ、CD28、4-1BB及其類似物的一或多個胞內信號傳導域。在一些情況下，CAR可包含CD3-ξ、CD28、4-1BB及其類似物的任何組合。
在一態樣中，本發明之CAR構築體之核酸序列包含以下中的一或多者之CAR構築體：SEQ ID NO：200、208、214、220、226、231、237、243、249、255、261、267、273、279、285、291、297、303、309、315、321、327、333、339、345、351、357、363、369、375、381、387、393、399、405、411、417、422或428。在一態樣中，本發明之CAR構築體之核酸序列包含以下中的一或多者之scFv編碼序列：SEQ ID NO：204、210、216、222、116、233、239、245、251、257、263、269、275、281、287、293、299、305、311、317、323、329、335、341、347、353、359、365、371、377、383、389、395、401、407、413、117或424。
在一些情況下，抗原結合域來源於將最終使用CAR之相同物種為 有益的。舉例而言，為用於人類，CAR之抗原結合域包含抗體或抗體片段之抗原結合域的人類或人類化殘基可為有益的。因此，在一個態樣中，抗原結合域包含人類抗體或抗體片段。在一個實施例中，人類CD22結合域包含本文所述之人類CD22結合域之一或多個(例如所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及/或本文所述之人類CD22結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類CD22結合域包含一或多個，例如所有三個LC CDR及一或多個，例如所有三個HC CDR。在一個實施例中，人類CD22結合域包含本文所述之人類CD22結合域之一或多個(例如所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類CD22結合域具有兩個可變重鏈區，其各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，人類CD22結合域包含本文所述之人類輕鏈可變區(例如表6A、6B、10A或10B 中)及/或本文所述之人類重鏈可變區(例如表6A、6B、9A或9B 中)。在一個實施例中，人類CD22結合域包含本文所述之人類重鏈可變區(例如表6A、6B、9A或9B 中)，例如至少兩個本文所述之人類重鏈可變區(例如表6A、8B、9A或9B 中)。在一個實施例中，CD22結合域為包含表6A、6B、9A、9B、10A或10B 之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在一個實施例中，CD22結合域(例如scFv)包含：包含具有提供於表6A、6B、10A或10B 中之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表6A、6B、10A 或10B 之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列之輕鏈可變區；及/或包含具有提供於表6A、6B、9A或9B 中之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超 過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與表6A、6B、9A 或9B 之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列之重鏈可變區。在一個實施例中，人類CD22結合域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：203、209、215、221、227、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418或423，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類CD22結合域為scFv，且包含本文所述之胺基酸序列(例如表6A、6B、10A或10B 中)的輕鏈可變區經連接子(例如本文所述之連接子)連接至包含本文所述之胺基酸序列(例如表6A、6B、9A或9B 中)的重鏈可變區。在一個實施例中，人類CD22結合域包括(Gly4 -Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6，例如3或4(SEQ ID NO：53)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區，或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在一個態樣中，CD22結合域之特徵為抗體或抗體片段之特定功能特徵或特性。舉例而言，在一態樣中，包含抗原結合域之本發明之CAR組合物之部分特異性結合人類CD22或其片段。在一態樣中，本發明係關於包含抗體或抗體片段之抗原結合域，其中抗體結合域特異性結合於CD22蛋白質或其片段，其中抗體或抗體片段包含包括以下中的任一者之胺基酸序列之之可變重鏈：SEQ ID NO：700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737或738，及/或包括以下中的任一者之胺基酸序列之可變輕鏈：SEQ ID NO 739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、 750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776或777。在某些態樣中，scFv與前導序列相鄰且在相同閱讀框架中。在一態樣中，前導序列為提供為SEQ ID NO：13之多肽序列。
在實施例中，CAR包含包括CD22結合域、跨膜域及細胞內信號傳導域之抗體或抗體片段。在實施例中，CD22結合域包含表8A、8B、10A或10B 中所列之任何CD22輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表7A、7B、7C、9A或9B 中所列之任何CD22重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
在一態樣中，CD22結合域為片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一態樣中，CD22結合域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能(例如，雙特異性)雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強型親和力結合CD22蛋白質或其片段。
在一些情況下，人類scFv可來源於呈現庫。
在一個實施例中，CD22結合域(例如，scFv)包含至少一個突變，使得突變之scFv賦予CART22構築體以改良之穩定性。在另一實施例中，CD22結合域(例如，scFv)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個例如產生自人類化方法之突變，使得突變之scFv賦予CART22構築體以改良之穩定性。
在一態樣中，本發明涵蓋產生功能上等效分子之起始抗體或片段(例如，scFv)胺基酸序列之修飾。舉例而言，包含於CAR中之CD22結合域(例如scFv)之VH或VL可經修飾以保留CD22結合域(例如scFv) 之起始VH或VL構架區之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。本發明涵蓋整個CAR構築體之修飾，例如CAR構築體之各個域之一或多個胺基酸序列的修飾，以便產生功能上等效分子。CAR構築體可經修飾以保留起始CAR構築體之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。
在一個實施例中，CD22結合域包含CAR22-1、CAR22-2、CAR22-3、CAR22-4、CAR22-5、CAR22-6、CAR22-7、CAR22-8、CAR22-9、CAR22-10、CAR22-11、CAR22-12、CAR22-13、CAR22-14、CAR22-15或CAR22-16、CAR22-17、CAR22-18、CAR22-19、CAR22-20、CAR22-21、CAR22-22、CAR22-23、CAR22-24、CAR22-25、CAR22-26、CAR22-27、CAR22-28、CAR22-29、CAR22-30、CAR22-31、CAR22-32、CAR22-33、CAR22-34、CAR22-35、CAR22-36、CAR22-37或CAR22-38中的任一者(例如如表7A、7B、7C、8A及/或8B 中所述)之6個CDR(例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3各一個)，或與其大體上一致之序列。在一個實施例中，CD22結合域包含CAR22-1、CAR22-2、CAR22-3、CAR22-4、CAR22-5、CAR22-6、CAR22-7、CAR22-8、CAR22-9、CAR22-10、CAR22-11、CAR22-12、CAR22-13、CAR22-14、CAR22-15或CAR22-16、CAR22-17、CAR22-18、CAR22-19、CAR22-20、CAR22-21、CAR22-22、CAR22-23、CAR22-24、CAR22-25、CAR22-26、CAR22-27、CAR22-28、CAR22-29、CAR22-30、CAR22-31、 CAR22-32、CAR22-33、CAR22-34、CAR22-35、CAR22-36、CAR22-37或CAR22-38中的任一者(例如如表7A、7B、7C、8A及/或8B 中所述)之3個CDR(例如HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3各一個，或LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3各一個)，或與其大體上一致之序列。
其他實施例包括編碼此部分中所述之多肽之核苷酸序列。舉例而言，其他實施例包括編碼表6A-10B 中的任一者之多肽之核苷酸序列。舉例而言，核苷酸序列可包含表6A或6B 之CAR構築體或scFv。核苷酸可編碼表9A或9B 之VH、表10A或10B 之VL或兩者。核苷酸可編碼表7A、7B或7C 之VH CDR1、VH CDR2或VH CDR3中的一或多者(例如兩者或三者)及/或核苷酸可編碼表8A或8B 之VL CDR1、VL CDR2或VL CDR3中的一或多者(例如兩者或三者)。核苷酸序列也可包括SEQ ID NO：13、14、15、16、17及51之域中的一或多者，例如全部。
CD22 CAR亦可包含跨膜域(例如如本文所述之跨膜域)、細胞內信號傳導域(例如如本文所述之細胞內信號傳導域)、共刺激域(例如如本文所述之共刺激域)、前導序列(例如如本文所述之前導序列)或鉸鏈(例如如本文所述之鉸鏈)中的一或多者。
在一個實施例中，CD22抑制劑為本文所述之CD22抑制劑。CD22抑制劑可例如為抗CD22抗體(例如抗CD22單特異性或雙特異性抗體)、小分子或CD22 CART。在一些實施例中，抗CD22抗體共軛或以其他方式結合至治療劑。例示性治療劑包括例如微管毀壞劑(例如單甲基奧瑞他汀E)及毒素(例如白喉毒素或綠膿桿菌外毒素A、蓖麻毒素)。在一個實施例中，CD22抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如描述於本文中之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
在一個實施例中，抗CD22抗體選自抗CD19/CD22雙特異性配位 體定向毒素(例如兩個scFv配位體，識別人類CD19及CD22，連接至白喉毒素(DT)之首先389個胺基酸，DT 390，例如DT2219ARL)；抗CD22單株抗體-MMAE共軛物(例如DCDT2980S)；融合至綠膿桿菌外毒素A之片段(例如BL22)之抗CD22抗體RFB4之scFv；去糖基化蓖麻毒素A鏈共軛之抗CD19/抗CD22(例如Combotox)；人類化抗CD22單株抗體(例如依帕珠單抗(epratuzumab))；或共價融合至綠膿桿菌外毒素A之38KDa片段之抗CD22抗體(例如莫昔土莫單抗(moxetumomab pasudotox))之Fv部分。
在一個實施例中，抗CD22抗體為抗CD19/CD22雙特異性配位體定向毒素(例如DT2219ARL)且抗CD19/CD22雙特異性配位體定向毒素以約1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、7μg/kg、8μg/kg、9μg/kg、10μg/kg、11μg/kg、12μg/kg、13μg/kg、14μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、60μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、220μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg.kg(例如30μg/kg、40μg/kg、60μg/kg或80μg/kg)之劑量投與一段時間，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更多天。在一些實施例中，抗CD19/CD22雙特異性配位體定向毒素係經由靜脈內輸注投與。
在一個實施例中，抗CD22抗體為BL22且BL22以約1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、7μg/kg、8μg/kg、9μg/kg、10μg/kg、11μg/kg、12μg/kg、13μg/kg、14μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、60μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、220μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、400 μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg.kg(例如3μg/kg、30μg/kg、40μg/kg或50μg/kg)之劑量投與一段時間，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更多天。在一些實施例中，BL22每天、每隔一天、每三天或每四天投與，持續例如4天週期、6天週期、8天週期、10天週期、12天週期或14天週期之一段時間。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個週期之BL22。在一些實施例中，經由靜脈內輸注投與BL22。
在一個實施例中，抗CD22抗體為去糖基化蓖麻毒素A鏈共軛之抗CD19/抗CD22(例如Combotox)且去糖基化蓖麻毒素A鏈共軛之抗CD19/抗CD22以約500μg/m2 、600μg/m2 、700μg/m2 、800μg/m2 、900μg/m2 、1mg/m2 、2mg/m2 、3mg/m2 、4mg/m2 、5mg/m2 、6mg/m2 或7mg/m2 之劑量投與一段時間，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多天。在一些實施例中，去糖基化蓖麻毒素A鏈共軛之抗CD19/抗CD22每天、每隔一天、每三天或每四天投與，持續例如4天週期、6天週期、8天週期、10天週期、12天週期或14天週期之一段時間(例如每隔一天，持續6天)。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個週期之去糖基化蓖麻毒素A鏈共軛之抗CD19/抗CD22。在一些實施例中，經由靜脈內輸注投與去糖基化蓖麻毒素A鏈共軛之抗CD19/抗CD22。
在一個實施例中，抗CD22抗體為人類化抗CD22單株抗體(例如依帕珠單抗)且人類化抗CD22單株抗體以約10毫克/平方公尺/週、20毫克/平方公尺/週、50毫克/平方公尺/週、100毫克/平方公尺/週、120毫克/平方公尺/週、140毫克/平方公尺/週、160毫克/平方公尺/週、180毫克/平方公尺/週、200毫克/平方公尺/週、220毫克/平方公尺/週、250毫克/平方公尺/週、260毫克/平方公尺/週、270毫克/平方公尺 /週、280毫克/平方公尺/週、290毫克/平方公尺/週、300毫克/平方公尺/週、305毫克/平方公尺/週、310毫克/平方公尺/週、320毫克/平方公尺/週、325毫克/平方公尺/週、330毫克/平方公尺/週、335毫克/平方公尺/週、340毫克/平方公尺/週、345毫克/平方公尺/週、350毫克/平方公尺/週、355毫克/平方公尺/週、360毫克/平方公尺/週、365毫克/平方公尺/週、370毫克/平方公尺/週、375毫克/平方公尺/週、380毫克/平方公尺/週、385毫克/平方公尺/週、390毫克/平方公尺/週、400毫克/平方公尺/週、410毫克/平方公尺/週、420毫克/平方公尺/週、430毫克/平方公尺/週、440毫克/平方公尺/週、450毫克/平方公尺/週、460毫克/平方公尺/週、470毫克/平方公尺/週、480毫克/平方公尺/週、490毫克/平方公尺/週、500毫克/平方公尺/週、600毫克/平方公尺/週、700毫克/平方公尺/週、800毫克/平方公尺/週、900毫克/平方公尺/週、1公克/平方公尺/週或2公克/平方公尺/週(例如360毫克/平方公尺/週或480毫克/平方公尺/週)之劑量投與一段時間，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多週。在一些實施例中，第一劑量低於後續劑量(例如360毫克/平方公尺/週之第一劑量，接著為370毫克/平方公尺/週之後續劑量)。在一些實施例中，經由靜脈內輸注投與人類化抗CD22單株抗體。
在一個實施例中，抗CD22抗體為莫昔土莫單抗且莫昔土莫單抗以約1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、7μg/kg、8μg/kg、9μg/kg、10μg/kg、11μg/kg、12μg/kg、13μg/kg、14μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、60μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、220μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg(例如5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg或50μg/kg)之劑量投與一段時 間，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更多天。在一些實施例中，莫昔土莫單抗每天、每隔一天、每三天或每四天投與，持續例如4天週期、6天週期、8天週期、10天週期、12天週期或14天週期之一段時間(例如每隔一天，持續6天)。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個週期之莫昔土莫單抗。在一些實施例中，經由靜脈內輸注投與莫昔土莫單抗。
在一個實施例中，CD22抗體分子包含CAR22-1、CAR22-2、CAR22-3、CAR22-4、CAR22-5、CAR22-6、CAR22-7、CAR22-8、CAR22-9、CAR22-10、CAR22-11、CAR22-12、CAR22-13、CAR22-14、CAR22-15或CAR22-16、CAR22-17、CAR22-18、CAR22-19、CAR22-20、CAR22-21、CAR22-22、CAR22-23、CAR22-24、CAR22-25、CAR22-26、CAR22-27、CAR22-28、CAR22-29、CAR22-30、CAR22-31、CAR22-32、CAR22-33、CAR22-34、CAR22-35、CAR22-36、CAR22-37或CAR22-38中的任一者(例如如表7A、7B、7C、8A及/或8B 中所述)之6個CDR(例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3各一個)，或與其大體上一致之序列。在一個實施例中，CD22抗體分子包含CAR22-1、CAR22-2、CAR22-3、CAR22-4、CAR22-5、CAR22-6、CAR22-7、CAR22-8、CAR22-9、CAR22-10、CAR22-11、CAR22-12、CAR22-13、CAR22-14、CAR22-15或CAR22-16、CAR22-17、CAR22-18、CAR22-19、CAR22-20、CAR22-21、CAR22-22、CAR22-23、CAR22-24、CAR22-25、CAR22-26、CAR22-27、CAR22-28、CAR22-29、CAR22-30、CAR22-31、CAR22-32、CAR22-33、CAR22-34、CAR22-35、CAR22-36、CAR22-37或CAR22-38中的任一者(例如如表7A、7B、7C、8A及/或8B 中所述)之3個CDR(例如HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3各一個，或LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3各一個)，或與其大體上一致之序列。在 一個實施例中，CD22抗體分子包含重鏈可變區及輕鏈可變區或重鏈可變區、輕鏈可變區兩者或scFv(如表6A或6B 中所述)，或與其大體上一致之序列。在實施例中，CD22抗體分子為分離抗體分子。
ROR1抑制劑
如本文所用，術語「ROR1」係指已知在白血病前驅體細胞上可偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類ROR1之同功異型物1及2前驅體之胺基酸序列可分別見於寄存號NP_005003.2及NP_001077061.1，且編碼其之mRNA序列可分別見於寄存號NM_005012.3及NM_001083592.1。如本文所用，「ROR1」包括包含全長野生型ROR1之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合ROR1蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，ROR1蛋白質表現於癌細胞上。
本文亦提供ROR1抑制劑及組合療法。ROR1抑制劑包括(但不限於)抗ROR1 CAR表現細胞，例如CART，及抗ROR抗體(例如抗ROR1單特異性或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗ROR1抑制劑可用於治療B細胞惡性腫瘤(例如白血病，如CLL，及B細胞淋巴瘤，如套細胞淋巴瘤；ALL；小淋巴細胞性淋巴瘤；邊緣細胞B細胞淋巴瘤；及伯基特氏淋巴瘤(Burkett's Lymphoma)或上皮癌(例如乳癌、腎細胞癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巢癌及黑素瘤)。在一個實施例中，CD20抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
例示性抗ROR1抑制劑描述於以引用的方式併入本文中之Hudecek等人Clin.Cancer Res.19.12(2013)：3153-64中。舉例而言， 抗ROR1抑制劑包括Hudecek等人中所述之抗ROR1 CART(舉例而言，如以引用的方式併入本文中之Hudecek等人於第3155頁，整個第一段中所述產生)。在其他實例中，抗ROR1抑制劑包括包含2A2及R12抗ROR1單株抗體之VH及/或VL序列之抗體或其片段，如以引用的方式併入本文中之Hudecek等人於跨接第3154-55頁之段落；Baskar等人MAbs 4(2012)：349-61；及Yang等人PLoS ONE 6(2011)：e21018中所述。
在其他實施例中，ROR1抑制劑包括靶向ROR1之抗體或其片段(例如單鏈可變片段(scFv))，包括以引用的方式併入本文中之US 2013/0101607中所述之彼等，例如US 2013/0101607之SEQ ID NO：1或2。在一些實施例中，抗ROR1抗體片段(例如scFv)共軛或融合至生物學活性分子，例如以形成導引免疫細胞，例如T細胞回應於ROR1表現細胞之嵌合抗原受體(CAR)。
在一些實施例中，例示性ROR1抑制劑包括稱作UC-961之抗ROR1單株抗體(瑟吐珠單抗(Cirmtuzumab))。參見例如臨床試驗標識號NCT02222688。瑟吐珠單抗可用於治療癌症，如慢性淋巴球性白血病(CLL)、卵巢癌及黑素瘤。參見例如Hojjat-Farsangi等人PLoS One.8(4)：e61167；及NCT02222688。
在一些實施例中，瑟吐珠單抗經靜脈內，例如呈靜脈內輸注液形式投與。舉例而言，各輸注液提供約700-7000μg(例如700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500或6500-7000μg)瑟吐珠單抗。在其他實施例中，瑟吐珠單抗以每公斤體重10-100μg，例如每公斤體重10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85- 90、90-95或95-100μg之劑量投與。在一個實施例中，瑟吐珠單抗以每公斤體重15μg之起始劑量投與。
在一些實施例中，瑟吐珠單抗以至少7天，例如7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言，瑟吐珠單抗以至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30週或30週以上之給藥時間間隔投與。
在一些實施例中，瑟吐珠單抗以本文所述之劑量及給藥時間間隔投與一段時間，例如至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60週或60週以上，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或12個月以上，或1、2、3、4、5年或5年以上。舉例而言，瑟吐珠單抗以本文所述之劑量及給藥時間間隔投與，每一治療循環總共至少2劑(例如，每一治療循環至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20劑或20劑以上)。
在一些實施例中，抗ROR1抗體共軛或以其他方式結合至治療劑。
在一些實施例中，ROR1抑制劑包括抗ROR1 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗ROR1 CAR構築體之細胞或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之ROR1結合CAR編碼。舉例而言，抗ROR1 CAR表現細胞，例如CART藉由將ROR1-CAR(包含ROR1結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及ROR1 CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表CD19 CAR之第一細胞及表現 ROR1 CAR之第二細胞。
CD123抑制劑
CD123亦稱作白介素-3受體(IL-3RA)之α-鏈。IL-3受體(IL-3R)為由α及β鏈組成之異質二聚體。IL-3R為膜受體。IL-3Rα鏈為360個胺基酸殘基之糖蛋白。在一些白血病病症中頻繁觀測到CD123之異常。CD123過表現於多種血液科惡性疾病，例如急性骨髓及B淋巴白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀贅瘤(BPDCN)及毛細胞白血病。
如本文所用，術語「CD123」係指已知在一些惡性血液癌細胞，例如白血病細胞上可偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類CD123之胺基酸序列可見於寄存號NP_002174.1(同功異型物1前驅體)；NP_001254642.1(同功異型物2前驅體)，且編碼其之mRNA序列可見於寄存號NM_002183.3(變異體1)；NM_001267713.1(變異體2)。如本文所用，「CD123」包括包含全長野生型CD123之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合CD123蛋白質之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD123蛋白在癌細胞上表現。
本文提供CD123抑制劑及組合療法。CD123抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD123 CAR表現細胞(例如CART)及抗CD123抗體(例如抗CD123單特異性或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD123抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在一個實施例中，CD123抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
在一個實施例中，CD123抑制劑為重組蛋白，例如包含CD123受體之天然配位體(或片段)。舉例而言，重組蛋白為SL-401(亦稱作 DT388IL3；University of Texas Southwestern Medical Center)，其為包含融合至截短白喉毒素之人類IL-3之融合蛋白。參見例如Testa等人Biomark Res.2014；2：4；及臨床試驗標識號NCT00397579。
在另一實施例中，CD123抑制劑為抗CD123抗體或其片段。在一個實施例中，抗CD123抗體或其片段包含單株抗體，例如單特異性或雙特異性抗體或其片段。舉例而言，抗CD123抗體或其片段包含CSL360(CSL Limited)。CSL360為結合至CD123之重組嵌合單株抗體。在一些實施例中，CSL360例如藉由靜脈內輸注靜脈內投與。舉例而言，CSL360以0.1-10mg/kg，例如0.1-0.5mg/kg、0.5-1mg/kg、1-5mg/kg或5-10mg/kg之劑量投與。參見例如臨床試驗標識號NCT01632852；且Testa等人。
在另一實施例中，CD123抗體或其片段包含CSL362(CSL Limited)。CSL362為靶向CD123之人類化單株抗體且經最佳化以增強型活化抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)。在一些實施例中，例如藉由靜脈內輸注靜脈內投與CSL362。在一些實例中，CSL362以0.1-12mg/kg，例如0.1-0.2mg/kg、0.2-0.5mg/kg、0.5-1mg/kg、1-6mg/kg或6-12mg/kg之劑量投與。參見例如臨床試驗標識號NCT01632852。
在一個實施例中，CD123抗體或其片段包含雙特異性抗體，例如MGD006(MacroGenics)。MGD006為靶向CD123及CD3之雙特異性抗體。參見例如臨床試驗標識號NCT02152956。
在一些實施例中，CD123抑制劑共軛或以其他方式結合至治療劑。
在一些實施例中，CD123抑制劑包括抗CD123 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD123 CAR構築體之細胞或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD123結合CAR編碼。舉例而言，抗CD123 CAR表現 細胞，例如CART藉由將CD123-CAR(包含CD123結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細胞組合投與。在一個實施例中，抗CD123 CAR構築體包含scFv序列，例如提供於以引用的方式併入本文中之US 2014/0322212 A1中之scFv序列。在一個實施例中，抗CD123結合域為US 2014/0322212 A1中所述之scFv。在一個實施例中，抗CD123結合域為提供於US 2014/0322212 A1中之CAR構築體的一部分。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及CD123 CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD123 CAR之第二細胞。
CD10抑制劑
分化簇10(CD10)亦稱作奈溶酶(Neprilysin)、膜金屬內肽酶(MME)、中性內肽酶(NEP)及常見的急性淋巴母細胞白血病抗原(CALLA)。CD10為由膜金屬內肽酶(MME)基因編碼之酶。CD10表現於前B表現型之白血病細胞上且為常見的急性淋巴球性白血病抗原。
如本文所用，術語「CD10」係指已知在白血病細胞上可偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類CD10之胺基酸序列可見於寄存號NP_009218.2；NP_000893.2；NP_009219.2；NP_009220.2，且編碼其之mRNA序列可見於寄存號NM_007287.2(變異體1bis)；NM_000902.3(變異體1)；NM_007288.2(變異體2a)；NM_007289.2(變異體2b)。如本文所用，「CD10」包括包含全長野生型CD10之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合CD10蛋白質之細 胞外域內之抗原。在一態樣中，CD10蛋白質表現於癌細胞上。
本文亦提供CD10抑制劑及組合療法。CD10抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD10 CAR表現細胞(例如CART)及抗CD10抗體(例如抗CD10單特異性或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD10抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在一個實施例中，CD10抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
在一個實施例中，CD10抑制劑包含沙庫必曲(sacubitril)(AHU-377；Novartis)(4-{[(2S ,4R )-1-(4-聯苯基)-5-乙氧基-4-甲基-5-側氧基-2-戊基]胺基}-4-側氧基丁酸)，或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。沙庫必曲之結構顯示如下。
在另一實施例中，CD10抑制劑包含纈沙坦/沙庫必曲(LCZ696；Novartis)或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。纈沙坦/沙庫必曲 為包含纈沙坦及沙庫必曲之1：1混合物之組合藥物。纈沙坦((S )-3-甲基-2-(N -{[2'-(2H -1,2,3,4-四唑-5-基)聯苯-4-基]甲基}戊醯胺基)丁酸)之結構顯示如下。
在一個實施例中，CD10抑制劑包含奧馬曲拉(omapatrilat)(Bristol-Myers Squibb)((4S ,7S ,10aS )-5-側氧基-4-{[(2S )-3-苯基-2-硫基丙醯基]胺基}-2,3,4,7,8,9,10,10a-八氫吡啶并[6,1-b ][1,3]噻氮呯-7-甲酸)，或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。奧馬曲拉之結構顯示如下。
在一個實施例中，CD10抑制劑包含RB-101(N -(3-{[(2S )-2-胺基-4-(甲硫基)丁基]二硫基}-2-苄基丙醯基)-L-苯基丙胺酸苄酯)，或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。RB-101之結構顯示如下。
在一個實施例中，CD10抑制劑包含UK-414,495(Pfizer)((R)-2-({1-[(5-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)胺甲醯基]環戊基}甲基)戊酸)，或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。UK-414,495之結構顯示如下。
在一些實施例中，CD10抑制劑共軛或以其他方式結合至治療劑。
在一些實施例中，CD10抑制劑包括抗CD10 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD10 CAR構築體之細胞或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD10結合CAR編碼。舉例而言，抗CD10 CAR表現細胞，例如CART藉由將CD10-CAR(包含CD10結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及CD10 CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD10 CAR之第二細胞。
CD34抑制劑
分化簇34(CD34)亦稱作造血母細胞抗原CD34且為充當細胞-細胞黏附因子之細胞表面糖蛋白。CD34有時表現於一些癌症/腫瘤上，例如腺泡狀軟組織肉瘤、前B-ALL、AML、AML-M7、隆凸性皮膚纖維肉瘤、胃腸基質腫瘤、巨細胞纖維母細胞瘤、粒細胞肉瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、脂肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、惡性周邊神經鞘腫瘤、腦膜血管外皮瘤、脊膜瘤、神經纖維瘤、神經鞘瘤及乳頭狀甲狀腺癌瘤。
如本文所用，術語「CD34」係指已知在造血幹細胞及一些癌細胞上可偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類CD34之胺基酸序列可見於寄存號NP_001020280.1(同功異型物a前驅體)；NP_001764.1(同功異型物b前驅體)，且編碼其之mRNA序列可見於寄存號NM_001025109.1(變異體1)；NM_001773.2(變異體2)。如本文所用，「CD34」包括包含全長野生型CD34之突變(例如點突變)、 片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合CD34蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，CD34蛋白質表現於癌細胞上。
本文亦提供CD34抑制劑及組合療法。CD34抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD34 CAR表現細胞(例如CART)及抗CD34抗體(例如抗CD34單特異性或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD34抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在一個實施例中，CD34抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
在一個實施例中，CD34抑制劑包含抗體或其片段，例如My-10單株抗體或包含My-10單株抗體之免疫微脂囊，如Mercadal等人Biochim.Biophys.Acta.1371.1(1998)：17-23中所述。在其他實施例中，CD34抑制劑包含含有靶向CD34表現細胞之癌症藥物，例如小紅莓之免疫微脂囊，如Carrion等人Life Sci.75.3(2004)：313-28中所述。在一個實施例中，CD34抑制劑包含如Maleki等人Hum.Antibodies.22(2013)：1-8中所述之針對CD34之單株抗體。在另一實施例中，CD34抑制劑包含如Maleki等人Cell J.16.3(2014)：361-66中所述之靶向CD34之單株抗體。
在一些實施例中，CD34抑制劑共軛或以其他方式結合至治療劑。
在一些實施例中，CD34抑制劑包括抗CD34 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD34 CAR構築體之細胞或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD34結合CAR編碼。舉例而言，抗CD34 CAR表現細胞，例如CART藉由將CD34-CAR(包含CD34結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細 胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及CD34 CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表CD19 CAR之第一細胞及表現CD34 CAR之第二細胞。
FLT-3抑制劑
Fms樣酪胺酸激酶3(FLT-3)亦稱作分化簇抗原135(CD135)、受體型酪胺酸-蛋白激酶FLT3或胚胎肝激酶-2(Flk2)，為受體酪胺酸激酶。FLT-3為用於配位體細胞因子Flt3配位體(FLT3L)之細胞因子受體。FLT-3表現於許多造血祖細胞之表面上且對於淋巴細胞發育重要。FLT3基因在白血病，例如急性骨髓白血病(AML)中通常突變。
如本文所用，術語「FLT-3」係指已知在造血祖細胞及一些癌細胞，例如白血病細胞上可偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類FLT-3之胺基酸序列可見於寄存號NP_004110.2，且編碼其之mRNA序列可見於寄存號NM_004119.2。如本文所用，「FLT-3」包括包含全長野生型FLT-3之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合FLT-3蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，FLT-3蛋白質表現於癌細胞上。
本文亦提供FLT-3抑制劑及組合療法。FLT-3抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗FLT-3 CAR表現細胞(例如CART)及抗FLT-3抗體(例如抗FLT-3單特異性或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗FLT-3抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在一個實施例中，FLT-3抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例 如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含喹雜替尼(quizartinib)(AC220；Ambit Biosciences)或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。喹雜替尼為小分子受體酪胺酸激酶抑制劑。喹雜替尼(1-(5-(第三丁基)異噁唑-3-基)-3-(4-(7-(2-嗎啉基乙氧基)苯并[d]咪唑并[2,1-b]噻唑-2-基)苯基)脲)之結構顯示如下。
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含米哚妥林(midostaurin)(PKC412；Technische Universität Dresden)或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。米哚妥林為星形孢菌素之半合成衍生物之蛋白激酶抑制劑，星形孢菌素為來自細菌棍孢鏈黴菌(Streptomyces staurosporeus)之生物鹼。
米哚妥林((9S ,10R ,11R ,13R )-2,3,10,11,12,13-六氫-10-甲氧基-9-甲基-11-(甲胺基)-9,13-環氧基-1H,9H -二吲哚并[1,2,3-gh：3',2',1'-lm]吡咯并[3,4-j][1,7]benzodiamzonine-1-酮)之結構顯示如下。
在一些實施例中，米哚妥林係經口投與，例如以約25-200mg，例如約25-50mg、50-100mg、100-150mg或150-200mg之劑量。舉例 而言，米哚妥林例如每天兩次以約25-200mg，例如每天兩次以約25-50mg、50-100mg、100-150mg或150-200mg之劑量經口投與。參見例如臨床試驗標識號NCT01830361。
在一個實施例中，FLT-3抑制劑包含索拉非尼(sorafenib)(Bayer and Onyx Pharmaceuticals)或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。索拉非尼為多種酪胺酸蛋白激酶(例如VEGFR及PDGFR)、Raf激酶(例如C-Raf及B-Raf)及一些胞內絲胺酸/蘇胺酸激酶(例如C-Raf、野生型B-Raf及突變B-Raf)之小分子抑制劑。參見例如labeling.bayerhealthcare.com/html/products/pi/Nexavar_PI.pdf。索拉非尼(4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]胺甲醯基胺基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-甲醯胺)之結構顯示如下。
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含舒尼替尼(sunitinib)(先前稱為SU11248；Pfizer)或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。舒尼替尼為抑制多種受體酪胺酸激酶，包括FLT3之小分子口服藥物。舒尼替尼已由美國食品與藥物管理局(FDA)核准用於治療腎細胞癌(RCC)及伊馬替尼耐受性胃腸基質腫瘤(GIST)。舒尼替尼(N -(2-二乙胺基乙基)-5-[(Z )-(5-氟-2-側氧基-1H-吲哚-3-亞基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲醯胺)之結構顯示如下。
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含來他替尼(lestaurtinib)(CEP- 701；Cephalon)或其醫藥學上可接受之鹽或衍生物。來他替尼為與星形孢菌素結構上相關之酪胺酸激酶抑制劑。來他替尼((9S ,10S ,12R )-2,3,9,10,11,12-六氫-10-羥基-10-(羥基甲基)-9-甲基-9,12-環氧基-1H-二吲哚并[1,2,3-fg ：3',2',1'-kl ]吡咯并[3,4-i ][1,6]苯并二吖口辛-1-酮)之結構顯示如下。
在一些實施例中，來他替尼例如一天兩次以約40-100mg，例如一天兩次以約40-60mg、50-70mg、60-80mg、70-90mg或80-100mg之劑量經口投與。參見例如臨床試驗標識號NCT00079482；或NCT00030186。
在一些實施例中，FLT-3抑制劑共軛或以其他方式結合至治療劑。
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包括抗FLT-3 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗FLT-3 CAR構築體之細胞或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之FLT-3結合CAR編碼。舉例而言，抗FLT-3 CAR表現細胞，例如CART藉由將FLT-3-CAR(包含FLT-3結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及FLT-3 CAR之細 胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現FLT-3 CAR之第二細胞。
在一個實施例中，抗原結合域CAR(例如CD19、ROR1、CD20、CD22、CD123、CD10、CD34或FLT-3抗原結合域)包含scFv部分，例如人類scFv部分。scFv之前可為如SEQ ID NO：13中提供之視情況存在之前導序列，且後接如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49中提供之視情況存在之鉸鏈序列、如SEQ ID NO：15中提供之跨膜區、包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之細胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之CD3 ξ序列，例如其中域鄰接且在相同閱讀框架中以形成單一融合蛋白。
在一些實施例中，本發明涵蓋包含編碼CAR(例如CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR或FLT-3 CAR)之核酸分子之重組核酸構築體，其中核酸分子包含例如本文所述之編碼抗原結合域，例如與編碼細胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中之核酸序列。可用於CAR中之一例示性胞內信號傳導域包括(但不限於)例如CD3-ξ、CD28、4-1BB及其類似物的一或多個胞內信號傳導域。在一些情況下，CAR可包含CD3-ξ、CD28、4-1BB及其類似物的任何組合。
在一個實施例中，抗原結合域(例如CD19、ROR1、CD20、CD22、CD123、CD10、CD34或FLT-3抗原結合域)的特徵為抗體或抗體片段的特定功能特徵或特性。舉例而言，在一個實施例中，包含抗原結合域之本發明之CAR組合物之部分特異性結合人類B細胞抗原(例如CD19、ROR1、CD20、CD22、CD123、CD10、CD34或FLT-3)或其片段。在某些實施例中，scFv與前導序列鄰接且在相同閱讀框架中。在一態樣中，前導序列為提供為SEQ ID NO：13之多肽序列。
在一個實施例中，抗原結合域為片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一個實施例中，抗原結合域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能性(例如雙特異性)雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強型親和力結合B細胞蛋白質或其片段。在一些情況下，人類scFv可來源於呈現庫。
在一個實施例中，抗原結合域(例如，scFv)包含至少一個突變，使得突變之scFv賦予CAR構築體以改良之穩定性。在另一實施例中，抗原結合域，例如scFv包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個產生自例如人類化方法之突變，使得突變之scFv賦予CAR構築體以改良之穩定性。
在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如表現包括主要細胞內信號傳導域之CAR(例如CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR或FLT-3 CAR)之第一細胞，及表現包括次要信號傳導域之CAR(例如CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR或FLT-3 CAR))之第二細胞。
CD79b抑制劑
如本文所用，術語「CD79b」係指已知可在一些惡性血液癌細胞，例如白血病細胞上偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類CD79b之胺基酸序列可見於寄存號NP_000617.1(同功異型物1前驅體)、NP_067613.1(同功異型物2前驅體)或NP_001035022.1(同功異型物3前驅體)，且編碼其之mRNA序列可見於寄存號NM_000626.2(轉錄物變異體1)、NM_021602.2(轉錄物變異體2)或NM_001039933.1(轉錄物變異體3)。如本文所用，「CD79b」包括包 含全長野生型CD79b之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合CD79b蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，CD79b蛋白質表現於癌細胞上。在實施例中，CD79b蛋白質為野生型CD79b蛋白質；在其他實施例中，CD79b蛋白質為突變CD79b蛋白質。
CD79b亦稱作免疫球蛋白相關β，其為B淋巴細胞抗原受體多聚複合物之組分。CD79b與稱作CD79a(免疫球蛋白相關α)之另一輔助蛋白形成異質二聚體，且異質二聚體與B細胞上之表面免疫球蛋白複合。CD79b對於B淋巴細胞抗原受體之組裝及表面表現重要。CD79b及CD79a對於前B細胞及B細胞發育重要。突變及異常CD79b表現發生於許多B-CLL細胞且可與B-CLL中之B淋巴細胞抗原受體之表面表現損失及/或缺陷性信號傳導相關。參見例如Thompson等人Blood 90.4(1997)：1387-94。在一些情況下，CD79b之突變形式或剪接變異體之過度表現與B-CLL及其他淋巴惡性腫瘤中減少之B淋巴細胞抗原受體相關。參見例如Cragg等人Blood 100.9(2002)：3068-76。
本文提供CD79b抑制劑及組合療法。CD79b抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白抗CD79b CAR表現細胞(例如CART)及抗CD79b抗體(例如抗CD79b單特異性或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD79b抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在一個實施例中，CD79b抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
在一個實施例中，CD79b抑制劑為抗CD79b抗體或其片段。在一個實施例中，抗79b抗體或其片段包含單株抗體，例如單特異性或雙特異性抗體或其片段。舉例而言，抗CD79b抗體或其片段包含抗CD79b抗體藥物共軛物，如保納珠單抗維多汀(polatuzumab vedotin)(Roche)。在實施例中，保納珠單抗維多汀用於治療癌症，例如NHL，例如濾泡性淋巴瘤或DLBCL，例如復發性或難治性濾泡性淋巴瘤或DLBCL。參見例如NCT02257567。在實施例中，抗CD79b抗體或其片段為包含結合至CD32B及D79B之組分之雙特異性抗體，如MGD010(MacroGenics)。參見例如NCT02376036。
在一些實施例中，CD79b抑制劑共軛或以其他方式結合至治療劑。
在一些實施例中，CD79b抑制劑包括抗CD79b CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD79b CAR構築體之細胞或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD79b結合CAR編碼。舉例而言，抗CD79b CAR表現細胞，例如CART藉由將CD79b-CAR(包含CD79b結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及CD79b CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞或CAR表現NK細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD79b CAR之第二細胞。
C179b抑制劑
如本文所用，術語「CD179b」係指已知可在一些惡性血液癌細胞，例如白血病細胞上偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類CD179b之胺基酸序列可見於寄存號NP_064455.1(同功異型物a前驅體)或NP_690594.1(同功異型物b前驅體)，且編碼其之mRNA序列可見於寄存號NM_020070.3(轉錄物變異體1)或NM_152855.2(轉錄物變異體2)。如本文所用，「CD179b」包括包含全 長野生型CD179b之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合CD179b蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，CD179b蛋白質表現於癌細胞上。在實施例中，CD179b蛋白質為野生型CD179b蛋白質；在其他實施例中，CD179b蛋白質為突變CD179b蛋白質。
CD179b亦稱作免疫球蛋白λ樣多肽1(IGLL1)。CD179b為與膜結合Ig mu重鏈複合之雜二聚輕鏈之次單元。輕鏈及重鏈在一起形成前B細胞受體。CD179b中之突變與B細胞缺陷及無γ球蛋白血症相關。CD179b表現於一些癌細胞，例如前驅體B細胞淋巴母細胞性淋巴瘤細胞中。
本文提供CD179b抑制劑及組合療法。CD179b抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD179b CAR表現細胞(例如CART)及抗CD179b抗體(例如抗CD179b單特異性或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD179b抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在一個實施例中，CD179b抑制劑與CD20抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
在一個實施例中，CD179b抑制劑為抗CD179b抗體或其片段。在一個實施例中，抗179b抗體或其片段包含單株抗體，例如單特異性或雙特異性抗體或其片段。
在一些實施例中，CD179b抑制劑共軛或以其他方式結合至治療劑。
在一些實施例中，CD179b抑制劑包括抗CD179b CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD179b CAR構築體之細胞或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD179b結合CAR編碼。舉例而言，抗CD179b CAR表現細胞，例如CART藉由將CD179b-CAR(包含CD179b結合域) 工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及CD179b CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞或CAR表現NK細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD19 CAR之第一細胞及表現CD179b CAR之第二細胞。
CD79a抑制劑
如本文所用，術語「CD79a」係指已知可在一些惡性血液癌細胞，例如白血病細胞上偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言，人類CD79a之胺基酸序列可見於寄存號NP_001774.1(同功異型物1前驅體)或NP_067612.1(同功異型物2前驅體)，且編碼其之mRNA序列可見於寄存號NM_001783.3(轉錄物變異體1)或NM_021601.3(轉錄物變異體2)。如本文所用，「CD79a」包括包含全長野生型CD79a之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。在一態樣中，CAR之抗原結合部分識別且結合CD79a蛋白質之細胞外域內之抗原。在一態樣中，CD79a蛋白質表現於癌細胞上。在實施例中，CD79a蛋白質為野生型CD79a蛋白質；在其他實施例中，CD79a蛋白質為突變CD79a蛋白質。
CD79a亦稱作免疫球蛋白相關α。CD79a與CD79b雜二聚化以形成B淋巴細胞抗原受體多聚複合物之組分。CD79a表現於許多血液癌，例如急性白血病(例如AML)、B細胞淋巴瘤及骨髓瘤中。
本文提供CD79a抑制劑及組合療法。CD79a抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD79a CAR表現細胞(例如CART)及抗CD79a抗體(例如抗CD79a單特異性或雙特異性抗體)及其片段。在一 些實施例中，抗CD79a抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在一個實施例中，CD79a抑制劑與CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含為鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞組合投與。
在一個實施例中，CD79a抑制劑為抗CD79a抗體或其片段。在一個實施例中，抗CD79a抗體或其片段包含單株抗體，例如單特異性或雙特異性抗體或其片段。舉例而言，抗CD79a抗體或其片段包含以引用的方式併入本文中之Polson等人Blood 110.2(2007)：616-23中所述之抗CD79a抗體或其片段(例如可變區或CDR)。舉例而言，抗CD79a抗體或其片段包含Polson等人中所述之7H7、15E4或16C11抗體或其片段(例如可變區或CDR)。參見Id。
在一些實施例中，CD79a抑制劑共軛或以其他方式結合至治療劑。
在一些實施例中，CD79a抑制劑包括抗CD79a CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD79a CAR構築體之細胞或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD79a結合CAR編碼。舉例而言，抗CD79a CAR表現細胞，例如CART藉由將CD79a-CAR(包含CD79a結合域)工程改造至細胞(例如T細胞或NK細胞)中而產生，例如用以與本文所述之CAR表現細胞組合投與。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞用於過繼性療法之方法。
在另一態樣中，本文提供包含表現CD19 CAR及CD79a CAR之細胞之混合物的CAR表現細胞，例如CART細胞或CAR表現NK細胞群體。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD79a CAR之第二細胞。
CAR療法
本文中之抑制劑，例如針對CD10、CD20、CD22、CD34、 CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之CAR表現細胞可包含本文所述之組合物中的一或多者，例如跨膜域、細胞內信號傳導域、共刺激域、前導序列或鉸鏈。
在一態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之轉殖基因之重組核酸構築體。在一些實施例中，核酸分子包含編碼選自SEQ ID NO：61-72中的一或多者之抗CD19結合域之核酸序列，其中序列與編碼細胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。可用於CAR中之一例示性胞內信號傳導域包括(但不限於)例如CD3-ξ、CD28、4-1BB及其類似物的一或多個胞內信號傳導域。在一些情況下，CAR可包含CD3-ξ、CD28、4-1BB及其類似物的任何組合。
在一態樣中，本發明涵蓋產生功能上等效分子之起始抗體或片段(例如，scFv)胺基酸序列之修飾。舉例而言，包含於CAR中之抗原結合域，例如scFv之VH或VL可經修飾以保留抗原結合域，例如scFv之起始VH或VL構架區之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。本發明涵蓋整個CAR構築體之修飾，例如CAR構築體之各個域之一或多個胺基酸序列的修飾，以便產生功能上等效分子。CAR構築體可經修飾以保留起始CAR構築體之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。本發明亦涵蓋CDR之修飾，例如CAR構築體之一或多個CDR之一或多個胺基酸序列中之修飾以產生功能上等效分子。舉例而言，CDR可具有例如至多且包括1、2、3、4、5或6個相對於本文提供之CDR序列之改變(例如取代)。
編碼所需分子之核酸序列可使用此項技術中已知之重組方法獲得，諸如藉由使用標準技術，藉由自表現基因之細胞篩選文庫、藉由自已知包括基因之載體獲得基因或藉由自含有基因之細胞及組織直接分離。或者，所關注的核酸可以合成方式產生而非選殖。
本發明尤其包括表現可直接轉導至細胞中之CAR之反轉錄病毒及慢病毒載體構築體。
本發明亦包括可直接轉染至細胞中之RNA構築體。產生用於轉染之mRNA之方法涉及用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，隨後添加聚A，產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'封端及/或內部核糖體入口位點(IRES)、待表現之核酸及長度通常為50-2000個鹼基之聚A尾(SEQ ID NO：118)的構築體。如此產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個實施例中，模板包括CAR之序列。在一實施例中，RNA CAR載體藉由電穿孔轉導至T細胞中。
抗原結合域
在一個態樣中，本發明之CAR包含另外稱為抗原結合域之靶特異性結合要素。部分之選擇視界定靶細胞之表面的配位體類型及數目而定。舉例而言，可選擇抗原結合域來識別在與特定疾病病況相關聯之靶細胞上充當細胞表面標記之配位體。因此，可用作本發明之CAR中之抗原結合域之配位體的細胞表面標記物之實例包括與病毒、細菌及寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌細胞相關之細胞表面標記物。抗原結合域可結合例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者。
在一個態樣中，CAR介導之T細胞反應可藉助於將特異性結合所需抗原之抗原結合域工程改造至CAR中來針對所關注的抗原。
抗原結合域(例如結合CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抗 原結合域)可為結合至抗原，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、重組抗體、鼠類抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包括(但不限於)單域抗體，如駱駝衍生奈米抗體之重鏈可變域(VH)、輕鏈可變域(VL)及可變域(VHH)之任何域，及此項技術中已知充當抗原結合域之替代架構，如重組纖維結合蛋白域，及其類似物。
在一些情況下，抗原結合域來源於將最終使用CAR之相同物種為有益的。舉例而言，對於用於人類，可為有益的是CAR之抗原結合域(例如結合CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a中的一或多者之抗原結合域)包含用於抗體或抗體片段之抗原結合域之人類或人類化殘基。
人類化抗體可使用此項技術中已知之多種技術產生，包括(但不限於)CDR接枝(參見例如歐洲專利第EP 239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539、5,530,101及5,585,089號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中)、鑲飾或表面重修(參見例如歐洲專利第EP 592,106及EP 519,596號；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994,Protein Engineering,7(6)：805-814；及Roguska等人，1994,PNAS,91：969-973，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中)、鏈改組(參見例如美國專利第5,565,332號，其以全文引用的方式併入本文中)，及揭示於例如美國專利申請公開案第US2005/0042664號、美國專利申請公開案第US2005/0048617號、美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 9317105號、Tan等人，J.Immunol.,169：1119-25(2002)、Caldas等人，Protein Eng.,13(5)：353-60(2000)、Morea等人，Methods,20(3)：267-79(2000)、Baca等人，J.Biol.Chem.,272(16)：10678-84(1997)、Roguska等人，Protein Eng.,9(10)：895-904(1996)、Couto等人，Cancer Res.,55(第23增刊)：5973s-5977s(1995)、 Couto等人，Cancer Res.,55(8)：1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2)：409-10(1994)及Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3)：959-73(1994)中之技術，該等文獻中之每一者以全文引用的方式併入本文中。通常，構架區中之構架殘基將經來自CDR供體抗體之相應殘基取代以改變，例如提高抗原結合。此等構架取代藉由此項技術中熟知之方法識別，例如藉由建模CDR與構架殘基之相互作用來識別對於抗原結合為重要之構架殘基，且進行序列比較以識別特定位置處的異常構架殘基。(參見例如Queen等人，美國專利第5,585,089號；及Riechmann等人，1988,Nature,332：323，兩者均以全文引用的方式併入本文中。)
人類化抗體或抗體片段中保留有一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地取自「輸入」可變域。如本文所提供，人類化抗體或抗體片段包含來自非人類免疫球蛋白分子之一或多個CDR，及其中構成構架之胺基酸殘基完全或大部分衍生自人類生殖系的構架區。用於抗體或抗體片段之人類化之多個技術為此項技術中熟知的且可基本上遵循Winter及同事之方法(Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988))，藉由用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之對應序列，即CDR接枝進行(EP 239,400；PCT公開案第WO 91/09967號；及美國專利第4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640號，其內容以全文引用的方式併入本文中)。在此類人類化抗體及抗體片段中，實質上少於完整之人類可變域已經來自非人類物種之相應序列取代。人類化抗體通常為其中一些CDR殘基及可能一些構架(FR)殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。抗體及抗體片段之人類化亦可藉由鑲飾或表面重修(EP 592,106； EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6)：805-814(1994)；及Roguska等人，PNAS,91：969-973(1994))或鏈改組(美國專利第5,565,332號)實現，以上所有者之內容均以全文引用的方式併入本文中。
用於製得人類化抗體之人類可變域(輕鏈與重鏈)的選擇將降低抗原性。根據所謂的「最佳擬合」方法，對照已知人類可變域序列的整個文庫來篩選嚙齒動物抗體的可變域序列。隨後最接近嚙齒動物之序列的人類序列被接受作為人類化抗體之人類構架(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196：901(1987)，兩者內容均以全文引用的方式併入本文中)。另一方法使用衍生自輕鏈或重鏈之特定子組的所有人類抗體之共同序列的特定構架。相同構架可用於若干不同人類化抗體(參見例如Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993)，其內容以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，重鏈可變區之構架區(例如，全部四個構架區)來源於VH4_4-59生殖系序列。在一個實施例中，構架區可包含一個、兩個、三個、四個或五個修飾，例如取代，例如來自對應鼠類序列(例如SEQ ID NO：59)之胺基酸。在一個實施例中，輕鏈可變區之構架區(例如，全部四個構架區)來源於VK3_1.25生殖系序列。在一個實施例中，構架區可包含一個、兩個、三個、四個或五個修飾，例如取代，例如來自對應鼠類序列(例如SEQ ID NO：59)之胺基酸。
在一些態樣中，包含抗體片段之本發明之CAR組合物之部分經人類化，保持對標靶抗原之高親和性及其他有利生物特性。根據本發明之一個態樣，人類化抗體及抗體片段藉由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種概念性人類化產物之方法製備。三維免疫 球蛋白模型通常可獲得，且為熟習此項技術者所熟悉。可利用說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。檢測此等呈現使得可分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合標靶抗原之能力的殘基。以此方式，可自接受及輸入序列選擇FR殘基且組合，從而實現所需抗體或抗體片段特徵，諸如對靶抗原之親和力增加。一般而言，CDR殘基直接且最實質上參與影響抗原結合。
人類化抗體或抗體片段可保留與例如本發明中之初始抗體類似的抗原特異性，結合人類CD19、CD20或CD22之能力。在一些實施例中，人類化抗體或抗體片段可具有提高的與人類CD19、CD20或CD22之結合親和性及/或特異性。
在一態樣中，結合域(例如結合CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抗原結合域)為片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一態樣中，結合域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能(例如，雙特異性)雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強型親和力結合CD19、CD20或CD22蛋白質。
在一些情況下，scFv可根據此項技術中已知之方法製備(參見例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。可藉由例如使用可撓性多肽連接子將VH及VL區連接在一起產生ScFv分子。scFv分子包含具有最佳化長度及/或胺基酸組成之連接子(例如Ser-Gly連接子)。連接子長度可大大影響scFv可變區之摺疊及相互作用方式。實際上，若採用短多肽連接子(例如，5-10個胺基酸)，則防止鏈內摺疊。亦需要鏈間摺疊使兩個可變區一起形成功能性抗原決定基結合位點。對於連接子定向及 大小之實例，參見例如Hollinger等人1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448；美國專利申請公開案第2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號；及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號，其以引用的方式併入本文中。
scFv可在其VL與VH區之間包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或50個以上胺基酸殘基之連接子。連接子序列可包含任何天然存在之胺基酸。在一些實施例中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中，連接子序列包含甘胺酸及絲胺酸重複序列之集合，諸如(Gly4 Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數(SEQ ID NO：18)。在一個實施例中，連接子可為(Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO：106)或(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO：107)。連接子長度之變化可保持或提高活性，在活性研究中產生優良功效。
在一些實施例中，抗原結合域(例如結合CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抗原結合域)或其他部分或整個CAR)之胺基酸序列可經修飾，例如本文所述之胺基酸序列可經修飾，例如藉由保守取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
在兩種或兩種以上核酸或多肽序列情形中的一致性百分比係指 相同的兩種或兩種以上序列。當在比較窗或指示區上比較及比對最大對應時，如使用以下序列比較算法中之一者或藉由手動比對及目視檢查所量測，若兩個序列具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(例如，在整個指定區或未指定時整個序列上60%一致性，視情況70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性)，則兩個序列「大體上相同」。視情況，一致性存在於至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)長度之區域上，或更佳100至500個或1000個或1000個以上核苷酸(或20、50、200個或200個以上胺基酸)長度之區域上。
對於序列比較，通常一個序列充當與測試序列比較的參考序列。使用序列對比演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較演算法接著基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列的序列一致性百分比。用於比較之序列比對方法為此項技術中所熟知。可進行用於比較之最佳序列比對，例如藉由Smith及Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源演算法，藉由Needleman及Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48：443之同源比對演算法，藉由Pearson及Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444之相似性方法搜索，藉由此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)，或藉由手動比對及目視檢查(參見例如Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。
適用於測定百分比序列一致性及序列相似性之兩個演算法實例 為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；及Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
亦可使用E.Meyers及W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權重殘基表、12分之空隙長度罰分及4分之空隙罰分來測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：444-453)演算法(其已併入GCG軟體套件(在www.gcg.com可獲得)中之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之間隙權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定。
在一態樣中，本發明涵蓋產生功能上等效分子之起始抗體或片段(例如，scFv)胺基酸序列之修飾。舉例而言，包含於CAR中之結合域(例如結合CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a中的一或多者之抗原結合域)，例如scFv之VH或VL可經修飾以保留抗CD19結合域，例如scFv之起始VH或VL構架區之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。更廣泛地，包含於CAR中之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、或ROR1之B細胞抗原結合域，例如scFv之VH或VL可經修飾以保留抗原結合域，例如scFv之起始VH或VL構架區之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%一致性。本發明涵蓋整個CAR構築體之修飾，例如CAR構築體之各個域之一或多個胺基酸序列的修飾，以便產生功能上等效分子。CAR構築體可經修飾以保留起始CAR構築體之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。
雙特異性CAR
在一實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對於不超過兩個抗原具有特異性。雙特異性抗體分子之特徵為對於第一抗原決定基具有結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及對於第二抗原決定基具有結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列。在一實施例中，第一及第二抗原決定基在相同抗原，例如相同蛋白質(或多聚蛋白質之次單元)上。在一實施例中，第一及第二抗原決定基重疊。在一個實施例中，第一及第二抗原決定基不重疊。在一實施例中，第一及第二抗原決定基在不同抗原，例如不同蛋白質(或多聚蛋白質之不同次單元)上。在一個實施例中，雙特異性抗體分子包含對於第一抗原決定基具有結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列及對於第二抗原決定基具有結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列。在一個實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一抗原決定基之結合特異性的半抗體及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的半抗體。在一實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一抗原決定基之結合特異性的半抗體或其片段及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的半抗體或其片段。在一實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一抗原決定基之結合特異性的scFv或其片段及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的scFv或其片段。在一個實施 例中，第一抗原決定基定位於CD19上且第二抗原決定基定位於CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1上。
在某些實施例中，抗體分子為多特異性(例如雙特異性或三特異性)抗體分子。產生雙特異性或雜二聚抗體分子之方案為此項技術中已知；包括(但不限於)例如如US 5731168中所述之「旋鈕入洞(knob in a hole)」方法，；如例如WO 09/089004、WO 06/106905及WO 2010/129304中所述之靜電轉向Fc配對；如例如WO 07/110205中所述之鏈交換工程改造域(SEED)異質二聚體形成；如例如WO 08/119353、WO 2011/131746及WO 2013/060867中所述之Fab臂交換；例如使用具有胺反應性基團及硫氫基反應性基團之異型雙官能試劑藉由抗體交聯產生雙特異性結構之雙重抗體共軛，如例如US 4433059中所述；經由兩個重鏈之間的雙硫鍵之還原及氧化循環藉由來自不同抗體之重組半抗體(重鏈-輕鏈對或Fab)產生之雙特異性抗體決定子，如例如US 4444878中所述；三官能性抗體，例如經由硫氫基反應性基團交聯之三個Fab'片段，如例如US5273743中所述；生物合成結合蛋白，例如經由C末端尾，較佳經由二硫化物或胺反應性化學交聯而交聯之scFv對，如例如US5534254中所述；雙官能抗體，例如具有經由置換恆定域之白胺酸拉鏈(例如c-fos及c-jun)二聚之不同結合特異性之Fab片段，如例如US5582996中所述；雙特異性及寡特異性單價及寡價受體，例如在一個抗體之CH1區與通常具有相關輕鏈之另一抗體之VH區之間經由多肽間隔基連接之兩個抗體(兩個Fab片段)之VH-CH1區，如例如US5591828中所述；雙特異性DNA-抗體共軛物，例如經由DNA之雙鏈片交聯抗體或Fab片段，如例如US5635602中所述；雙特異性融合蛋白，例如含有兩個scFv之表現構築體，在該等scFv與完全恆定區之間具有親水性螺旋形肽連接子，如例如US5637481中所述；多價及多特異性結合蛋白，例如具有具有Ig重鏈可變區之結合區 之第一域，及具有Ig輕鏈可變區之結合區之第二域之多肽二聚體，一般被稱為雙功能抗體(亦包含產生雙特異性、三特異性或四特異性分子之高階結構，如例如US5837242中所述；具有經連接VL及VH鏈之微型抗體構築體另外與肽間隔基連接至抗體鉸鏈區及CH3區，其可經二聚以形成雙特異性/多價分子，如例如US5837821中所述；與短肽連接子(例如5或10個胺基酸)或根本無連接子在任一方向連接之VH及VL域，其可形成二聚物以形成雙特異性雙功能抗體；三聚物及四聚物，如例如US5844094中所述；藉由在C端具有可交聯基團之肽鍵連接之VH域(或家族成員中之VL域)之鏈另外與VL域締合以形成一系列FV(或scFv)，如例如US5864019中所述；及具有經由肽連接子連接之VH及VL域兩者之單鏈結合多肽經由非共價或化學交聯，使用scFV或雙功能抗體類型格式兩者組合為多價結構以形成例如同二異二三價及四價結構，如例如US5869620中所述。額外例示性多特異性及雙特異性分子及其製造方法可見於例如US5910573、US5932448、US5959083、US5989830、US6005079、US6239259、US6294353、US6333396、US6476198、US6511663、US6670453、US6743896、US6809185、US6833441、US7129330、US7183076、US7521056、US7527787、US7534866、US7612181、US2002004587A1、US2002076406A1、US2002103345A1、US2003207346A1、US2003211078A1、US2004219643A1、US2004220388A1、US2004242847A1、US2005003403A1、US2005004352A1、US2005069552A1、US2005079170A1、US2005100543A1、US2005136049A1、US2005136051A1、US2005163782A1、US2005266425A1、US2006083747A1、US2006120960A1、US2006204493A1、US2006263367A1、US2007004909A1、US2007087381A1、US2007128150A1、US2007141049A1、 US2007154901A1、US2007274985A1、US2008050370A1、US2008069820A1、US2008152645A1、US2008171855A1、US2008241884A1、US2008254512A1、US2008260738A1、US2009130106A1、US2009148905A1、US2009155275A1、US2009162359A1、US2009162360A1、US2009175851A1、US2009175867A1、US2009232811A1、US2009234105A1、US2009263392A1、US2009274649A1、EP346087A2、WO0006605A2、WO02072635A2、WO04081051A1、WO06020258A2、WO2007044887A2、WO2007095338A2、WO2007137760A2、WO2008119353A1、WO2009021754A2、WO2009068630A1、WO9103493A1、WO9323537A1、WO9409131A1、WO9412625A2、WO9509917A1、WO9637621A2、WO9964460A1中。上文提及之申請案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在雙特異性抗體分子之各抗體或抗體片段(例如，scFv)內，VH可為VL之上游或下游。在一些實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)配置成其VH(VH1 )在其VL(VL1 )上游，且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)配置成其VL(VL2 )在其VH(VH2 )上游，使得整個雙特異性抗體分子具有配置VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。在其他實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)配置成其VL(VL1 )在其VH(VH1 )上游，且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)配置成其VH(VH2 )在其VL(VL2 )上游，使得整個雙特異性抗體分子具有配置VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。視情況，若構築體配置為VH1 -VL1 -VL2 -VH2 ，則連接子安置在兩個抗體或抗體片段(例如，scFv)，例如VL1 與VL2 之間，或若構築體配置為VL1 -VH1 -VH2 -VL2 ，則安置在VH1 與VH2 之間。連接子可為如本文所述之連接子，例如(Gly4 -Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6，例如 4(SEQ ID NO：53)。一般而言，兩個scFv之間的連接子應足夠長以避免兩個scFv之域之間錯配。視情況，連接子安置在第一scFv之VL與VH之間。視情況，連接子安置在第二scFv之VL與VH之間。在具有多個連接子之構築體中，任何兩個或兩個以上連接子可相同或不同。因此，在一些實施例中，雙特異性CAR在如本文所描述之配置中包含VL、VH及視情況一或多個連接子。
在某些實施例中，抗體分子為具有對於第一B細胞抗原決定基之第一結合特異性及對於另一B細胞抗原之第二結合特異性之雙特異性抗體分子。舉例而言，在一些實施例中，雙特異性抗體分子具有對於CD19之第一結合特異性及對於CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性抗體分子具有對於CD19之第一結合特異性及對於CD22之第二結合特異性。
嵌合TCR
在一態樣中，本文所揭示之抗體及抗體片段(例如針對CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之彼等)可接枝至T細胞受體(「TCR」)鏈之一或多個恆定域，例如TCR α或TCR β鏈以產生特異性結合至癌症相關抗原之嵌合TCR。在不受理論束縛的情況下，咸信嵌合TCR在抗原結合時將經由TCR複合物進行信號傳導。舉例而言，如本文所揭示之scFv可移植至TCR鏈，例如TCRα鏈及/或TCRβ鏈之恆定域，例如細胞外恆定域之至少一部分、跨膜域及細胞質域。作為另一實例，抗體片段，例如如本文所述之VL域，可移植至TCR α鏈之恆定域，且抗體片段，例如如本文所述之VH域可接枝至TCR β鏈之恆定域(或者VL域可移植至TCR β鏈之恆定域且VH域可移植至TCR α鏈)。作為另一實例，抗體或抗體片段之CDR，例如如本文中之任一表中所述之抗體或抗體片段之 CDR可接枝至TCR α及/或β鏈以產生特異性結合至癌症相關抗原之嵌合TCR。舉例而言，本文所揭示之LC CDR可接枝至TCR α鏈之可變域且本文所揭示之HC CDR可接枝至TCR β鏈之可變域，或反之亦然。此類嵌合TCR可藉由任何適當方法製備(例如Willemsen RA等人，Gene Therapy 2000；7：1369-1377；Zhang T等人，Cancer Gene Ther 2004；11：487-496；Aggen等人，Gene Ther.2012年4月；19(4)：365-74)。
非抗體骨架
在實施例中，抗原結合域包含非抗體骨架，例如纖維結合蛋白、錨蛋白、域抗體、脂質運載蛋白、小模組化免疫藥劑、高親合性多聚體(maxybody)、蛋白A或阿菲林(affilin)。非抗體骨架具有結合至細胞上之靶抗原之能力。在實施例中，抗原結合域為表現於細胞上之天然存在之蛋白質之多肽或其片段。在一些實施例中，抗原結合域包含非抗體骨架。可採用多種非抗體骨架，只要所得多肽包括至少一個特異性結合於靶細胞上之靶抗原之結合區。
非抗體骨架包括：纖維結合蛋白(Novartis,MA)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模組化免疫藥劑(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、高親合性多聚體(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白A(Affibody AG,Sweden)及阿菲林(γ-晶狀體球蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纖維結合蛋白骨架可基於纖維結合蛋白III型域(例如纖維結合蛋白III型之第十模組(10 Fn3域))。纖維結合蛋白III型域具有分佈在兩個β片之間的7或8個β鏈，其自身彼此間填塞而形成蛋白質之核心，且進一步含有使β鏈彼此間連接且暴露於溶劑的環(與CDR類似)。在β折迭夾層之各邊緣處存在至少三個此類環，其中邊緣為蛋白質垂直於β鏈 方向之邊界(參見US 6,818,418)。由於此結構，此非抗體骨架模擬在性質及親和力上與抗體類似之抗原結合特性。類似於活體內抗體親和力成熟方法，活體外環隨機化及改組策略中可使用此等骨架。
錨蛋白技術係基於使用具有錨蛋白衍生之重複模組的蛋白質用於承載可用於與不同標靶結合之可變區之骨架。錨蛋白重複模組為一種由兩個逆平行α螺旋及β轉彎組成之33個胺基酸多肽。可變區之結合主要藉由使用核糖體呈現來最佳化。
高親和性多聚體來源於天然含A域蛋白質，諸如HER3。此等域本質上用於蛋白質-蛋白質相互作用，且在人類中逾250種蛋白質在結構上係基於A域。高親和性多聚體係由多個不同「A域」單體(2至10個)經由胺基酸連接子連接而組成。高親合性多聚體可使用描述在例如美國專利申請公開案第20040175756號、第20050053973號、第20050048512號及第20060008844號中之方法產生，其可與靶抗原結合。
親和抗體親和性配位體為由三螺旋束組成的簡單小蛋白質，該三螺旋束係基於蛋白質A之IgG結合域之一之骨架。蛋白質A為來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白質。此骨架域由58個胺基酸組成，使其中之13個隨機化以產生具有大量配位體變異體之親和抗體庫(參見例如，US 5,831,012)。親和抗體分子模擬抗體，與分子量為150kDa之抗體相比，其分子量為6kDa。與親和抗體分子之小尺寸無關，親和抗體分子之結合位點類似於抗體之結合位點。
蛋白質抗原決定基模擬物(PEM)為模擬蛋白質之β髮夾二級結構(涉及蛋白質-蛋白質相互作用的主要二級結構)的中型、環狀、肽樣分子(MW 1-2kDa)。抗原結合域，例如包含scFv、單域抗體或駱駝抗體之彼等可導向任何本文所述之靶受體/配位體，例如PD1受體，PD-L1或PD-L2。
在一個實施例中，抗原結合域包含結合靶細胞之表面上之反配位體之分子之細胞外域，或其反配位體結合片段。
抗原結合域可包含抑制受體之細胞外域。與共抑制分子之反配位體之接合再導引至免疫效應反應之最佳化。
抗原結合域可包含共刺激分子之細胞外域，稱為共刺激ECD域，與共刺激分子之反配位體之接合導致免疫效應反應之最佳化。
跨膜域
在各種實施例中，關於跨膜域，CAR可經設計以包含連接至CAR之胞外域的跨膜域。跨膜域可包括與跨膜區相鄰之一或多個額外胺基酸，例如與衍生跨膜之蛋白質之胞外區域相關聯的一或多個胺基酸(例如，胞外區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15個胺基酸)及/或與衍生跨膜蛋白之蛋白質之胞內區域相關聯的一或多個額外胺基酸(例如，胞內區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15個胺基酸)。在一態樣中，跨膜域為與CAR之其他域中的一者締合之跨膜域，例如在一個實施例中，跨膜域可來自衍生信號傳導域、共刺激域或鉸鏈域之相同蛋白質。在另一態樣中，跨膜域不來源於與CAR之任何其他域所來源相同之蛋白質。在一些情況下，跨膜域可經胺基酸取代選擇或修飾以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合，例如使得與受體複合物之其他成員的相互作用最小化。在一態樣中，跨膜域能夠與CAR表現細胞之細胞表面上的另一CAR均二聚。在不同態樣中，跨膜域之胺基酸序列可經修飾或經取代以使與相同的CAR表現細胞中存在之原生結合搭配物之結合域的相互作用最小化。
跨膜域可來源於天然或重組來源。在來源為天然時，該域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個態樣中，不管CAR是否與靶結合，跨膜域均能夠向胞內域進行信號傳導。特定用於本發明中之跨膜域可包括至少例如T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、 CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154之跨膜區。在一些實施例中，跨膜域可至少包括以下之跨膜區：例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C或CD19。
在一些情況下，跨膜域可經由鉸鏈(例如，來自人類蛋白質之鉸鏈)附接至CAR之胞外區，例如CAR之抗原結合域。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈可為人類Ig(免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈、IgD鉸鏈)、GS連接子(例如本文所述之GS連接子)、KIR2DS2鉸鏈或CD8a鉸鏈。在一個實施例中，鉸鏈或間隔基包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列(例如由其組成)。在一態樣中，跨膜域包含SEQ ID NO：15之跨膜域(例如由其組成)。
在一態樣中，鉸鏈或間隔基包含IgG4鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔基包含胺基酸序列 (SEQ ID NO：45)之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈或間隔基包含由 (SEQ ID NO：46)之核苷酸序列編碼之鉸鏈。
在一態樣中，鉸鏈或間隔基包含IgD鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔基包含胺基酸序列 (SEQ ID NO：47)之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈或間隔基包含由 (SEQ ID NO：48)之核苷酸 序列編碼之鉸鏈。
在一態樣中，跨膜域可為重組跨膜域，在此情況下，其將主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一態樣中，重組跨膜域之各端可發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三重態。
視情況，長度為2至10個胺基酸之短寡肽或多肽連接子可在CAR之跨膜域與細胞質區之間形成連接。甘胺酸-絲胺酸二重態提供尤其適合連接子。舉例而言，在一態樣中連接子包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：49)之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO：50)之核苷酸序列編碼。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔基包含KIR2DS2鉸鏈。
細胞質域
CAR之細胞質域或區包括胞內信號傳導域。胞內信號傳導域一般負責已引入CAR之免疫細胞之正常效應功能中之至少一者的活化。
用於本發明之CAR的胞內信號傳導域之實例包括共同作用以在抗原受體接合後起始信號轉導的T細胞受體(TCR)及共受體之細胞質序列，以及此等序列及具有相同功能性能力之任何重組序列的任何衍生物或變異體。
已知單獨TCR產生之信號不足以完全活化T細胞且亦需要二級及/或協同刺激信號。因此，T細胞活化可稱為由兩個不同類別之細胞質信號傳導序列介導：經由TCR起始抗原依賴性主要活化者(主要胞內信號傳導域)及以抗原獨立方式起作用以提供次要或協同刺激信號者(次要細胞質域，例如共刺激域)。
主要信號傳導域以刺激方式或抑制方式調節TCR複合物之主要活化。以刺激方式起作用之主要胞內信號傳導域可含有已知為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。
含有特定用於本發明中之主要胞內信號傳導域之ITAM之實例包括CD3ξ、共同FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、CD278(亦稱為「ICOS」)、FcεRI、DAP10、DAP12及CD66d之彼等。在一個實施例中，本發明 之CAR包含胞內信號傳導域，例如CD3-ξ之主要信號傳導域。
在一個實施例中，主要信號傳導域包含經修飾之ITAM域，例如突變之ITAM域，其與原生ITAM域相比具有改變(例如，增加或降低)的活性。在一個實施例中，一級信號傳導域包含含有經修飾ITAM之主要胞內信號傳導域，例如含有最佳化及/或截斷ITAM之主要胞內信號傳導域。在一實施例中，主要信號傳導域包含一個、兩個、三個、四個或以上ITAM基元。
特定用於本發明中之含有主要胞內信號傳導域之分子的其他實例包括DAP10、DAP12及CD32之彼等分子。
共刺激信號傳導域
CAR之胞內信號傳導域本身可包含CD3-ξ信號傳導域或其可與適用於本發明之CAR之情形下之任何其他所需胞內信號傳導域組合。舉例而言，CAR之胞內信號傳導域可包含CD3 ξ鏈部分及共刺激信號傳導域。共刺激信號傳導域係指包含共刺激分子之胞內域的CAR之一部分。在一個實施例中，胞內域經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及CD28之信號傳導域。在一個態樣中，胞內域經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及ICOS之信號傳導域。
共刺激分子可為除淋巴細胞對抗原之有效反應所需之抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子。此類分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體及其類似者。舉例而言，CD27共刺激已展示活體外提高人類CART細胞之擴增、效應功能及存活率且活體內加強人類T細胞持久性及抗腫瘤活性(Song等人.Blood.2012；119(3)：696-706)。此類共刺激分子之其他實例包括MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整合素、信號傳 導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白質)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及特異性結合CD83之配位體。
本發明之CAR的細胞質部分內之胞內信號傳導序列可以隨機或指定次序彼此連接。視情況，長度為例如2至10個胺基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)之短寡肽或多肽連接子可在胞內信號傳導序列之間形成連接。在一個實施例中，甘胺酸-絲胺酸二聯體可用作適合連接子。在一個實施例中，例如丙胺酸、甘胺酸之單個胺基酸可用作適合連接子。
在一個態樣中，胞內信號傳導域經設計以包含兩個或兩個以上，例如2、3、4、5個或5個以上共刺激信號傳導域。在一實施例中，兩個或兩個以上(例如2、3、4、5個或5個以上)共刺激信號傳導域藉由連接子分子(例如本文所述之連接子分子)分離。在一個實施例 中，胞內信號傳導域包含兩個共刺激信號傳導域。在一些實施例中，連接子分子為甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接子為丙胺酸殘基。
在一個態樣中，胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及CD28之信號傳導域。在一個態樣中，胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及4-1BB之信號傳導域。在一個態樣中，4-1BB之信號傳導域為SEQ ID NO：16之信號傳導域。在一個態樣中，CD3-ξ之信號傳導域為SEQ ID NO：17之信號傳導域。
在一個態樣中，胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及CD27之信號傳導域。在一個態樣中，CD27之信號傳導域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：51)之胺基酸序列。在一個態樣中，CD27之信號傳導域由核酸序列 (SEQ ID NO：52)編 碼。
自然殺手細胞受體(NKR)CAR
在一個實施例中，本文所述之CAR分子包含自然殺手細胞受體(NKR)之一或多種組分，藉此形成NKR-CAR。NKR組分可為來自以下自然殺手細胞受體中任一者之跨膜域、鉸鏈域或細胞質域：殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1及KIR3DP1；天然細胞毒性受體(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫細胞受體之信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME及CD2F-10；Fc受體(FcR)，例如CD16及CD64；及 Ly49受體，例如LY49A、LY49C。本文所述之NKR-CAR分子可與接附分子或胞內信號傳導域(例如DAP12)相互作用。包含NKR組分之CAR分子的例示性配置及序列描述於國際公開案第WO2014/145252號中，其內容以引用的方式併入本文中。
調節嵌合抗原受體之策略
在一些實施例中，需要CAR活性可受控制的可調節CAR(RCAR)使CAR療法之安全性及功效最佳。存在許多可調節CAR活性之方式。舉例而言，使用例如與二聚域融合之卡斯蛋白酶誘導細胞凋亡(參見例如Di等人，N Engl.J.Med.2011年11月3日；365(18)：1673-1683)可用作本發明之CAR療法中的安全開關。在一個實施例中，表現本發明之CAR之細胞(例如T細胞或NK細胞)另外包含誘導性細胞凋亡開關，其中人類卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶9)或經修飾型式融合至允許條件性二聚化之人類FKB蛋白質之變型。在存在小分子，諸如雷帕黴素類似物(rapalog)(例如AP 1903、AP20187)的情況下，誘導性卡斯蛋白酶(例如卡斯蛋白酶9)經活化且導致表現本發明之CAR之細胞(例如T細胞或NK細胞)之快速細胞凋亡及死亡。基於卡斯蛋白酶之誘導性細胞凋亡開關(或此類開關之一或多個態樣)之實例已描述於例如US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO1997031899；WO2014151960；WO2014164348；WO2014197638；WO2014197638中；其全部以引用的方式併入本文中。
在另一實例中，CAR表現細胞亦可表現誘導性卡斯蛋白酶-9(iCaspase-9)分子，該分子在投與二聚體藥物(例如瑞米杜西(rimiducid)(亦稱為AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))時導致卡斯蛋白酶-9活化及該等細胞之細胞凋亡。iCaspase-9分子含有在CID存在下介導二聚之二聚化學誘導劑(CID)結合域。此導致表現CAR之細胞之誘導性及選擇性缺失。在一些情況 下，iCaspase-9分子由與CAR編碼載體分離之核酸分子編碼。在一些情況下，iCaspase-9分子由與CAR編碼載體相同之核酸分子編碼。iCaspase-9可提供安全開關以避免表現CAR之細胞之任何毒性。參見例如Song等人Cancer Gene Ther.2008；15(10)：667-75；Clinical Trial Id.第NCT02107963號；及Di Stasi等人N.Engl.J.Med.2011；365：1673-83。
用於調控本發明之CAR療法之替代性策略包括利用例如藉由使表現CAR之細胞缺失，例如藉由誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)去活化或切斷CAR活性的小分子或抗體。舉例而言，本文所述之CAR表現細胞亦可表現藉由能夠誘導細胞死亡(例如，ADCC或補體誘導之細胞死亡)的分子識別之抗原。舉例而言，本文所述之CAR表現細胞亦可表現能夠由抗體或抗體片段靶向之受體。此類受體之實例包括EpCAM、VEGFR、整合素(例如，整合素ανβ3、α4、αI¾β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受體超家族之成員(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1 a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及EGFR，及其截短型式(例如，保存一或多個胞外抗原決定基但缺乏細胞質域內之一或多個區域的型式)。
舉例而言，本文所述之CAR表現細胞亦可表現缺乏信號傳導能力但保留由能夠誘發ADCC之分子(例如西妥昔單抗(ERBITUX®))識別之抗原決定基的截短之表皮生長因子受體(EGFR)，使得西妥昔單抗之 投與誘發ADCC且隨後CAR表現細胞缺失(參見例如WO2011/056894，及Jonnalagadda等人，Gene Ther.2013；20(8)853-860)。另一策略包括表現使來自本文所描述之CAR表現細胞中的CD32及CD20抗原之靶抗原決定基組合之高度緊密標記/自殺基因，其結合利妥昔單抗例如藉由ADCC導致表現CAR之細胞的選擇性耗盡(參見例如Philip等人，Blood.2014；124(8)1277-1287)。使本文所描述之CAR表現細胞耗盡的其他方法包括投與單株抗CD52抗體CAMPATH，其選擇性結合及靶向成熟淋巴細胞(例如，CAR表現細胞)以例如藉由誘導ADCC進行破壞。在其他實施例中，CAR表現細胞可使用CAR配位體，例如抗個體基因型抗體進行選擇性靶向。在一些實施例中，抗個體基因型抗體可引起效應細胞活性，例如ADCC或ADC活性，因此減少CAR表現細胞之數目。在其他實施例中，CAR配位體(例如，抗個體基因型抗體)可偶合至誘導細胞殺死之藥劑(例如，毒素)，藉此減少表現CAR之細胞的數目。或者，CAR分子自身可經配置使得活性可調節，例如打開及切斷，如下文所描述。
在其他實施例中，本文所述之CAR表現細胞亦可表現藉由T細胞耗盡劑識別之靶蛋白。在一個實施例中，靶蛋白為CD20且T細胞耗盡劑為抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗)。在此類實施例中，在期望減少或消除表現CAR之細胞，例如減輕CAR誘導之毒性時投與T細胞耗盡劑。在其他實施例中，T細胞耗盡劑為抗CD52抗體，例如阿侖單抗(alemtuzumab)。
在一態樣中，RCAR包含一組多肽，在最簡單實施例中通常兩個，其中本文所述之標準CAR的組分(例如抗原結合域及胞內信號傳導域)分配於獨立多肽或成員上。在一些實施例中，該組多肽包括二聚化開關，其在存在二聚化分子時可將多肽彼此偶合，例如可將抗原結合域偶合至胞內信號傳導域。在一個實施例中，本發明之CAR利用 二聚化開關，如例如WO2014127261中所述之開關，該專利以引用的方式併入本文中。本文及國際公開案第WO2015/090229號(以全文引用的方式併入本文中)中提供此類可調節CAR之額外描述及例示性配置。
在一些實施例中，RCAR包含開關域，例如如SEQ ID NO：122中陳述之FKBP開關域，或包含具有與FRB結合之能力的FKBP片段，例如如SEQ ID NO：123中陳述。在一些實施例中，RCAR包含含FRB序列之開關域，例如如SEQ ID NO：124中陳述，或突變FRB序列，例如 如SEQ ID NO.125-130中的任一者中陳述。 (SEQ ID NO：122)
(SEQ ID NO：123)
(SEQ ID NO：124)
分裂CAR
在一些實施例中，表現CAR之細胞使用分裂CAR。分離CAR方法更詳細地描述於公開案WO2014/055442及WO2014/055657中。簡言之，分裂CAR系統包含表現具有第一抗原結合域及共刺激域(例如，41BB)的第一CAR之細胞，且該細胞亦表現具有第二抗原結合域及胞內信號傳導域(例如，CD3 ξ)之第二CAR。當細胞遇到第一抗原時，活化共刺激域，且細胞增殖。當細胞遇到第二抗原時，活化胞內信號傳導域且開始細胞殺死活性。因此，表現CAR之細胞僅在兩個抗原存在下完全活化。
RNA轉染
本文揭示製造活體外轉錄之RNA CAR的方法。本發明亦(尤其)包括可直接轉染至細胞中之CAR編碼RNA構築體。一種產生用於轉染之mRNA的方法可涉及用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，隨後添加聚A，產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'封端及/或內部核糖體入口位點(IRES)、待表現核酸及長度通常為50-2000個鹼基之聚A尾(SEQ ID NO：118)的構築體。所產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個態樣中，模板包括CAR之序列。
在一態樣中，CAR由信使RNA(mRNA)編碼。在一態樣中，編碼CAR之mRNA被引入至免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞中，以產生CAR表現細胞，例如CART細胞或CAR NK細胞。
在一個實施例中，活體外轉錄之RNA CAR可以短暫轉染形式引入至細胞中。藉由使用聚合酶鏈反應(PCR)產生之模板活體外轉錄產生RNA。來自任何來源之所關注的DNA可藉由PCR使用適當引子及RNA聚合酶直接轉化成用於活體外mRNA合成的模板。DNA來源可為例如染色體組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他適當DNA來源。用於活體外轉錄之所要模板為本發明之 CAR。舉例而言，RNA CAR之模板包含具有抗腫瘤抗體之單鏈可變域的胞外區；鉸鏈區、跨膜域(例如CD8a之跨膜域)；及包括胞內信號傳導域(例如包含CD3-ξ之信號傳導域及4-1BB之信號傳導域)的細胞質區。
在一個實施例中，待用於PCR之DNA含有開放閱讀框架。DNA可來自生物體基因組的天然存在之DNA序列。在一個實施例中，核酸可包括一些或全部5'及/或3'未轉譯區(UTR)。核酸可包括外顯子及內含子。在一個實施例中，待用於PCR之DNA為人類核酸序列。在另一實施例中，待用於PCR之DNA為包括5'及3' UTR之人類核酸序列。DNA或者可為通常不表現於天然存在之生物體中的人工DNA序列。例示性人工DNA序列為含有接合在一起形成編碼融合蛋白之開放閱讀框架的基因部分之序列。接合在一起之DNA部分可來自單個生物體或一種以上生物體。
使用PCR產生用於活體外轉錄用於轉染之mRNA之模板。此項技術中熟知進行PCR之方法。用於PCR之引子經設計以具有與待用作PCR模板之DNA區域實質上互補的區域。「實質上互補」如本文所用係指引子序列中之大部分或全部鹼基互補或一或多個鹼基不互補或不匹配之核苷酸序列。實質上互補序列能夠與預期DNA靶在用於PCR之黏接條件下黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板之任何部分實質上互補。舉例而言，引子可經設計以擴增通常在細胞中轉錄之核酸部分(開放閱讀框架)，包括5'及3' UTR。引子亦可經經設計以擴增編碼所關注的特定域之核酸部分。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區，包括全部或部分5'及3' UTR。適用於PCR之引子可藉由此項技術中熟知之合成方法產生。「正向引子」為含有與DNA模板上在待擴增DNA序列之上游的核苷酸實質上互補之核苷酸區的引子。「上游」在本文中用於指待擴增之DNA序列相對於編碼鏈之位置 5。「反向引子」為含有與在待擴增DNA序列之下游的雙鏈DNA模板實質上互補之核苷酸區的引子。「下游」在本文中用於指待擴增之DNA序列相對於編碼鏈之位置3'。
適用於PCR之任何DNA聚合酶可用於本文所揭示之方法中。試劑及聚合酶可購自多個來源。
亦可使用能夠促進穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA在一些實施例中具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5' UTR的長度為1與3000個核苷酸之間。待添加至編碼區的5'及3' UTR序列之長度可藉由不同方法改變，包括(但不限於)設計黏接至UTR之不同區域的PCR之引物。使用此方法，一般技術者可在經轉錄RNA之轉染後改變實現最佳轉譯效率所需的5'及3' UTR長度。
5'及3' UTR可為用於所關注的核酸之天然存在之內源性5'及3' UTR。或者，可藉由將UTR序列併入正向及反向引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加所關注的核酸之非內源性UTR序列。所關注的核酸之非內源性UTR序列之用途可適用於改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知3' UTR序列中之AU富集要素可降低mRNA之穩定性。因此，可選擇及設計3' UTR以基於此項技術中熟知之UTR特性提高經轉錄之RNA的穩定性。
在一個實施例中，5' UTR可含有內源性核酸之克紮克序列(Kozak sequence)。或者，當藉由如上文所述之PCR添加並非所關注核酸之內源的5' UTR時，共同克紮克序列可藉由添加5' UTR序列重新設計。克紮克序列可提高一些RNA轉錄物的轉譯效率，但看起來並非為所有RNA所需使能夠有效轉移。此項技術中已知許多mRNA需要克紮克序列。在其他實施例中，5' UTR可為RNA基因組在細胞中穩定之RNA病毒之5'UTR。在其他實施例中，多種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR以阻礙mRNA之核酸外切酶分解。
為了能夠在不需要基因選殖之情況下自DNA模板合成RNA，轉錄啟動子應附接至待轉錄序列上游之DNA模板。當充當RNA聚合酶之啟動子的序列添加至正向引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子併入待轉錄之開放閱讀框架上游的PCR產物中。在一個實施例中，啟動子為如本文別處所述之T7聚合酶啟動子。其他適用啟動子包括(但不限於)T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。此項技術中已知T7、T3及SP6啟動子的共同核苷酸序列。
在一個實施例中，mRNA具有5'端上之封端及3'聚(A)尾，其測定細胞中之核糖體結合、轉譯起始及mRNA穩定性。在圓形DNA模板(例如，質體DNA)上，RNA聚合酶產生不適合於在真核細胞中表現之長多聯產物。在3' UTR之末端經線性化之質體DNA的轉錄產生正常尺寸之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化亦在真核轉染中無效。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可使轉錄之3'端延伸超過模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf,Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)；Nacheva及Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003))。
將聚A/T伸長部整合至DNA模板中之習知方法為分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可使質體不穩定，此為獲自細菌細胞之質體DNA模板通常高度混雜有缺失及其他畸變之原因。此使選殖程序不僅費力且費時，但通常不可靠。此為一種允許用聚A/T 3'伸長部構築DNA模板而不高度需要選殖的方法之原因。
可在PCR期間藉由使用含有聚T尾(諸如100T尾(SEQ ID NO：29))之反向引子(大小可為50-5000T(SEQ ID NO：30))或在PCR之後藉由包括(但不限於)DNA接合或活體外重組之任何其他方法產生轉錄DNA模板之聚A/T片段。聚(A)尾亦向RNA提供穩定性且減少其分解。一般而言，聚(A)尾之長度與經轉錄之RNA的穩定性正相關。在一個實施例 中，聚(A)尾在100與5000個腺苷之間(SEQ ID NO：57)。
RNA之聚(A)尾在使用聚(A)聚合酶(諸如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))活體外轉錄之後可進一步延伸。在一個實施例中，將聚(A)尾之長度自100個核苷酸增加至300與400個核苷酸之間(SEQ ID NO：104)導致RNA之轉譯效率之約兩倍增加。此外，不同化學基團與3'端之連接可提高mRNA穩定性。此類附接可含有經修飾/人工核苷酸、適體及其他化合物。舉例而言，ATP類似物可使用聚(A)聚合酶併入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步提高RNA穩定性。
5'封端亦向RNA分子提供穩定性。在一個實施例中，藉由本文所揭示之方法產生之RNA包括5'封端。使用此項技術中已知及本文所描述之技術提供5'封端(Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)；Stepinski等人，RNA,7：1468-95(2001)；Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005))。
藉由本文所揭示之方法產生的RNA亦可含有內部核糖體入口位點(IRES)序列。IRES序列可為任何病毒、染色體或人工設計序列，其引發封端獨立性核糖體結合於mRNA且促進轉譯之起始。可包括適合於細胞電穿孔之任何溶解物，其可含有促進細胞滲透性及活力之因素，諸如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及界面活性劑。
RNA可使用許多不同方法中之任一者引入目標細胞中，例如包括(但不限於)以下之市售方法：電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或基因脈衝發生器II(Gene Pulser II)(BioRad,Denver,Colo.)、細胞融合儀(Multiporator)(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂質體轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物封裝、肽介導之轉染或生物彈粒子傳遞系統，諸如「基因槍」(參看例如Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8)：861-70(2001)。
非病毒傳遞方法
在一些態樣中，非病毒方法可用於將編碼本文所描述之CAR的核酸傳遞至細胞或組織或個體中。
在一些實施例中，非病毒方法包括使用轉座子(亦稱為可轉座元件)。在一些實施例中，轉座子為自身可插入基因組中之位置的DNA片，例如能夠自我複製且將其複本插入基因組中之DNA片，或可自較長核酸剪接且插入基因組中之另一位置的DNA片。舉例而言，轉座子包含由用於轉座之倒置重複側接基因組成之DNA序列。
使用轉座子之核酸傳遞的例示性方法包括睡美人轉座子系統(Sleeping Beauty transposon system；SBTS)及piggyBac(PB)轉座子系統。參見例如Aronovich等人Hum.Mol.Genet.20.R1(2011)：R14-20；Singh等人Cancer Res.15(2008)：2961-2971；Huang等人Mol.Ther.16(2008)：580-589；Grabundzija等人Mol.Ther.18(2010)：1200-1209；Kebriaei等人Blood.122.21(2013)：166；Williams.Molecular Therapy 16.9(2008)：1515-16；Bell等人Nat.Protoc.2.12(2007)：3153-65；及Ding等人Cell.122.3(2005)：473-83，以上所有者均以引用的方式併入本文中。
SBTS包括兩個組分：1)含有轉殖基因之轉座子及2)轉座酶來源。轉座酶可將來自載體質體(或其他供體DNA)之轉座子轉至標靶DNA，諸如宿主細胞染色體/基因組。舉例而言，轉座酶與載體質體/供體DNA結合，切割質體以外的轉座子(包括轉殖基因)，且將其插入宿主細胞之基因組中。參見例如Aronovich等人。
例示性轉座子包括基於pT2之轉座子。參見例如Grabundzija等人Nucleic Acids Res.41.3(2013)：1829-47；及Singh等人Cancer Res.68.8(2008)：2961-2971，以上兩者均以引用的方式併入本文中。例示性轉座酶包括Tc1/水手型轉座酶，例如SB10轉座酶或SB11轉座酶(一 種高活性轉座酶，其可例如自巨細胞病毒啟動子表現)。參見例如Aronovich等人；Kebriaei等人；及Grabundzija等人，以上所有者均以引用的方式併入本文中。
SBTS之使用允許轉殖基因，例如編碼本文所述之CAR之核酸的有效整合及表現。本文提供例如使用諸如SBTS之轉座子系統，產生穩定表現本文所述之CAR的細胞，例如T細胞或NK細胞之方法。
根據本文所描述之方法，在一些實施例中，將含有SBTS組分之一或多個核酸(例如，質體)傳遞至細胞(例如，T或NK細胞)。舉例而言，藉由核酸(例如，質體DNA)傳遞之標準方法，例如本文所描述之方法，例如電穿孔、轉染或脂質體轉染來傳遞核酸。在一些實施例中，核酸含有包含轉殖基因，例如編碼本文所述之CAR之核酸的轉座子。在一些實施例中，核酸含有包含轉殖基因(例如，編碼本文所描述之CAR的核酸)以及編碼轉座酶之核酸序列的轉座子。在其他實施例中，提供具有兩種核酸之系統，例如雙質體系統，例如其中第一質體含有包含轉殖基因之轉座子，且第二質體含有編碼轉座酶之核酸序列。舉例而言，第一及第二核酸共傳遞至宿主細胞中。
在一些實施例中，藉由使用利用SBTS之基因插入與使用核酸酶(例如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系統或經工程改造之大範圍核酸酶再工程改造歸巢核酸內切酶)之基因編輯的組合，產生表現本文所述之CAR的細胞，例如T或NK細胞。
在一些實施例中，使用非病毒傳遞方法允許細胞(例如，T或NK細胞)程式化及細胞直接輸注至個體中。非病毒載體之優點包括(但不限於)容易及相對低成本地產生滿足患者群體所需的足夠量、儲存期間之穩定性及缺乏免疫原性。
編碼CAR，例如CD19 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR之核酸構築體
本發明亦提供編碼一或多種本文所述之CAR構築體，例如CD19 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR之核酸分子。在一態樣中，核酸分子作為信使RNA轉錄物提供。在一態樣中，核酸分子作為DNA構築體提供。
因此，在一態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)之分離核酸分子，其中CAR包含結合域(例如結合CD19、CD20或CD22)、跨膜域及包含刺激域，例如共刺激信號傳導域及/或主要信號傳導域，例如ξ鏈之細胞內信號傳導域。
在一個實施例中，結合域本文所述之抗CD19結合域，例如包含選自由以下組成之群的序列之抗CD19結合域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59，或與其具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，核酸包含表6A 中陳述之CD22編碼核酸或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，核酸為編碼表6A-10B 中的任一者中陳述之胺基酸序列或與其具有95%-99%一致性之序列的核酸。
在一個實施例中，核酸包含表11A 中陳述之CD20編碼核酸或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，核酸為編碼表11A-15B 中的任一者中陳述之胺基酸序列或與其具有95%-99%一致性之序列的核酸。
在一個實施例中，跨膜域為選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO：15之序列，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，抗CD19結合域藉由鉸鏈區，例如本文所述之鉸鏈連接至跨膜域。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，分離核酸分子進一步包含編碼共刺激域之序列。在一個實施例中，共刺激域為選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。在一個實施例中，共刺激域為例如選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域：MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及特異性結合CD83之配位體。在一個實施例 中，共刺激域包含SEQ ID NO：16之序列，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列，或與其具有95%-99%一致性之序列，及SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43序列，或與其具有95%-99%一致性之序列，其中包含胞內信號傳導域之序列在相同框架中且以單個多肽鏈形式表現。
在另一態樣中，本發明係關於編碼CAR構築體之分離核酸分子，該構築體包含SEQ ID NO：13之前導序列；具有選自由以下組成之群的序列之scFv域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59(或與其具有95%-99%一致性之序列)；SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49(或與其具有95%-99%一致性之序列)之鉸鏈區；具有SEQ ID NO：15之序列(或與其具有95%-99%一致性之序列)之跨膜域；具有SEQ ID NO：16之序列之4-1BB共刺激域；或具有SEQ ID NO：51之序列(或與其具有95%-99%一致性之序列)之CD27共刺激域；及具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列(或與其具有95%-99%一致性之序列)之CD3 ξ刺激域。
在另一態樣中，本發明係關於一種藉由核酸分子編碼之分離之多肽分子。在一個實施例中，分離多肽分子包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：59或與其具有95%-99%一致性之序列。
在另一態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)分子之核 酸分子，其包含抗CD19結合域、跨膜域及包含刺激域之細胞內信號傳導域，且其中該抗CD19結合域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59，或與其具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，編碼之CAR分子(例如CD19 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR)進一步包含編碼共刺激域之序列。在一個實施例中，共刺激域為選自由以下組成之群之蛋白質的功能性信號傳導域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。在一個實施例中，共刺激域包含SEQ ID NO：16之序列。在一個實施例中，跨膜域為選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO：15之序列。在一個實施例中胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中，胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：16之序列及SEQ ID NO：17之序列，其中包含胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。在一個實施例中，抗CD19結合域藉由鉸鏈區連接至跨膜域。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：14。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49。
在另一態樣中，本發明係關於經編碼CAR分子，其包含SEQ ID NO：13之前導序列；具有選自由以下組成之群的序列之scFv域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59，或與其具有95%-99%一致性之序列；SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49之鉸鏈區；具有SEQ ID NO：15之序列之跨膜域；具有SEQ ID NO：16之4-1BB共刺激域或具有SEQ ID NO：51之序列之CD27共刺激域；及具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列之CD3 ξ刺激域。在一個實施例中，經編碼CAR分子包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：59，或與其具有95%-99%一致性之序列。
編碼所需分子之核酸序列可使用此項技術中已知之重組方法獲得，諸如藉由使用標準技術，藉由自表現基因之細胞篩選文庫、藉由自已知包括基因之載體獲得基因或藉由自含有基因之細胞及組織直接分離。或者，所關注的核酸可以合成方式產生而非選殖。
本發明亦提供插入有本發明之DNA的載體。來源於反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為實現長期基因轉移之適合工具，因為其允許長期穩定整合轉殖基因及其在子細胞中之傳播。慢病毒載體具有優於來源於onco-反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體的額外優勢，因為其可轉導非增殖性細胞，諸如肝細胞。其亦具有低免疫原性之額外優勢。反轉錄病毒載體亦可為例如γ反轉錄病毒載體。γ反轉錄病毒載體可包括例如啟動子、包裝信號(ψ)、引物結合位點(PBS)、一或多個(例如兩個)長末端重複序列(LTR)及所關注的轉殖基因，例如編碼CAR之基因。γ反轉錄病毒載體可能缺乏病毒結構一族，諸如gag、pol及env。示例性γ反轉錄病毒載體包括鼠類白血病病毒(MLV)、脾病灶形成性病毒(SFFV)及骨髓增生肉瘤病毒(MPSV)以及衍生自其之載 體。其他γ反轉錄病毒載體描述於例如Tobias Maetzig等人，「Gammaretroviral Vectors：Biology,Technology and Application」Viruses.2011年6月；3(6)：677-713中。
在另一實施例中，包含編碼本發明之所要CAR之核酸的載體為腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中，編碼CAR之核酸的表現可使用轉座子(諸如睡美人(sleeping beauty)、crispr、CAS9及鋅指核酸酶)實現。參見以下June等人2009Nature Reviews Immunology 9.10：704-716，其以引用的方式併入本文中。
載體亦可包括例如促進分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(例如來自牛生長激素(BGH)基因)、允許游離型複製及在原核生物中複製之元件(例如SV40起點及ColE1或此項技術中已知之其他元件)及/或允許選擇之元件(例如安比西林(ampicillin)抗性基因及/或勻黴素(zeocin)標記物)。
簡言之，編碼CAR之天然或合成核酸之表現通常藉由將編碼CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子且將構築體併入表現載體來實現。載體可適合於複製及整合真核生物。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調節所要核酸序列表現之啟動子。
在一些態樣中，本發明之表現構築體亦可用於使用標準基因傳遞方案之核酸免疫接種及基因療法。基因傳遞方法為此項技術中已知。參見例如以全文引用之方式併入本文之美國專利第5,399,346、5,580,859、5,589,466號。在另一實施例中，本發明提供基因療法載體。
核酸可選殖至多種類型之載體中。舉例而言，核酸可選殖至載體中，包括(但不限於)質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。
此外，表現載體可以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術為此項技術中所熟知且描述於例如Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)及其他病毒學與分子生物學手冊中。適用作載體之病毒包括(但不限於)反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合載體含有至少一種生物體中起作用之複製起點、啟動子序列、適宜限制核酸內切酶位點及一或多個可選標記(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已針對基因轉移至哺乳動物細胞中開發出多個基於病毒之系統。舉例而言，反轉錄病毒提供基因傳遞系統之適宜平台。所選基因可插入至中載體中且使用此項技術中已知之技術封裝於反轉錄病毒粒子中。重組病毒可隨後經分離且活體內或離體傳遞至個體之細胞中。多個反轉錄病毒系統為此項技術中已知。在一些實施例中，使用腺病毒載體。多個腺病毒載體為此項技術中已知。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
額外啟動子要素(例如，強化子)調節轉錄起始頻率。通常，此等定位於起始位點上游30-110bp區中，儘管多個啟動子已展示含有亦在起始位點下游之功能性要素。啟動子要素之間的間距通常為靈活的，使得當要素倒置或相對於彼此移動時時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子要素之間的間距在活性開始減退之前可增加至相隔50bp。視啟動子而定，個別要素似乎可合作地或獨立地起活化轉錄作用。例示性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在一個實施例中，啟動子為PGK啟動子，例如如本文所述之截短PGK啟動子。
能夠表現哺乳動物T細胞中之CAR轉殖基因的啟動子之一實例為 EF1a啟動子。原生EF1a啟動子驅使伸長因子-1複合物之α次單元的表現，該複合物負責將胺基醯基tRNA酶促傳遞至核糖體。EF1a啟動子已廣泛用於哺乳動物表現質體且已展示有效驅使CAR表現轉殖基因選殖至豆狀病毒載體中。參見例如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)。在一個態樣中，EF1a啟動子包含提供為SEQ ID NO：100之序列。
啟動子之另一實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為能夠驅使高程度表現任何可操作地連接至其上之聚核苷酸序列的強構成啟動子序列。然而，亦可使用其他組成性啟動子序列，包括(但不限於)猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、伸長因子-1α啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明應不限於組成性啟動子之使用。亦涵蓋誘導型啟動子作為本發明之部分。誘導型啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要此類表現時打開其可操作地連接之聚核苷酸序列表現或在不需要表現時關閉表現。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
啟動子之另一實例為磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在實施例中，可需要截短PGK啟動子(例如與野生型PGK啟動子序列相比，具有一或多個，例如1、2、5、10、100、200、300或400個核苷酸缺失之PGK啟動子)。以下提供示例性PGK啟動子之核苷酸序列。
WT PGK啟動子： (SEQ ID NO：1323)
例示性截短PGK啟動子：
PGK100： (SEQ ID NO：1324)
PGK200： (SEQ ID NO：1325)
PGK300： (SEQ ID NO：1326)
PGK400： (SEQ ID NO：1327)
載體亦可包括例如促進分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(例如，來自牛生長激素(BGH)基因)、允許游離型複製及在原核生物中複製之要素(例如，SV40起點及ColE1或此項技術中已知之其他要素)及/或允許選擇之要素(例如，抗安比西林(ampicillin)基因及/或勻黴素(zeocin)標記)。
為了評估CAR多肽或其部分之表現，待引入細胞中之表現載體亦可含有可選標記基因或報導基因或兩者以促進自設法經病毒載體轉染或感染之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選標記物可為攜帶於各別DNA段上且用於共轉染程序。可選標記物及報導體基因皆可側接適當調節序列以使能夠在宿主細胞中表現。適用可選標記物包括例如耐抗生素基因，諸如neo及其類似物。
報導基因用於鑑別潛在經轉染細胞及評估調節序列功能。一般而言，報導基因為接受生物體或組織中不存在或表現且編碼表現藉由一些容易偵測之特性(例如酶促活性)顯現之多肽的基因。在DNA已引入受體細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌之鹼磷酸酯酶之基因或綠色螢光蛋白質基因(例如Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。適合表現系統為熟知的且可使用已知技術製備或商業購買。一般而言，具有展示報導基因最高表現量之最小5'側接區的構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區域可連接至報導基因且用於評 估能夠調節啟動子驅使轉錄之藥劑。
在實施例中，載體可包含兩種或兩種以上編碼CAR，例如結合至CD19之第一CAR，及第二CAR，例如抑制CAR或特異性結合於第二抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之CAR之核酸序列。在此類實施例中，編碼CAR之兩個或兩個以上核酸序列藉由同框且呈單一多肽鏈形式之單一核分子編碼。在此態樣中，兩個或兩個以上CAR可例如藉由一或多個肽裂解位點分離。(例如，胞內蛋白酶之自動裂解位點或受質)。肽裂解位點之實例包括以下，其中GSG殘基為視情況選用的：T2A：(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：1328)
P2A：(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：1329)
E2A：(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：1330)
F2A：(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：1331)
向細胞中引入及表現基因之方法為此項技術中已知。在表現載體之情況下，載體易於藉由此項技術中之任何方法引入宿主細胞(例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。舉例而言，表現載體可藉由物理、化學或生物方式轉移至宿主細胞中。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及其類似方法。用於製造包含載體及/或外源性核酸之細胞的方法為此項技術中熟知的。參看例如Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)。將聚核苷酸引入宿主細胞中之一適合方法為磷酸鈣轉染。
將所關注的聚核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體及尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入至哺乳動物(例如人類)細胞中之方法。其他病毒載體可來源於 慢病毒、痘病毒、I型單純疱疹病毒病毒、腺病毒及腺相關病毒及其類似病毒。參看例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米囊劑、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用作活體外及活體內傳送媒劑之例示性膠態系統為脂質體(例如人工囊泡)。可獲得的目前先進技術中靶向傳遞核酸之其他方法，諸如用靶向奈米粒子或其他適合之亞微米大小的傳遞系統傳遞聚核苷酸。
在利用非病毒傳遞系統的情況下，例示性傳遞媒劑為脂質體。預期使用脂質調配物將核酸引入至宿主細胞(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質有關。與脂質相關聯之核酸可囊封於脂質體之水性內部中，穿插於脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸相關聯之連接分子附接至脂質體、包覆於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有微胞或與微胞複合，或以其他方式與脂質相關聯。與組合物相關聯之脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可存在於雙層結構中，呈微胞形式或具有「塌陷」結構。其亦可簡單地穿插於溶液中，可能形成大小或形狀不均勻的聚集物。脂質為可為天然存在脂質或合成脂質的脂肪物質。舉例而言，脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別(諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛)。
適合於使用之脂質可獲自商業來源。舉例而言，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可獲自Sigma,St.Louis,MO；磷酸三十二烷基酯(「DCP」)可獲自K & K Laboratories(Plainview,NY)；膽固醇(「Choi」)可獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯甘油 (「DMPG」)及其他脂質可獲自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)。氯仿或氯仿/甲醇中之脂質儲備溶液可在約-20℃下儲存。氯仿用作僅有溶劑，因為其比甲醇容易蒸發。「脂質體」為涵蓋藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成的多種單層及多層脂質媒劑的通用術語。脂質體之特徵可為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有藉由水性介質分隔之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發地形成。脂質組分在形成封閉結構之前進行自身重組且在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶解物(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結構不同之結構的組合物。舉例而言，脂質可採用膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋脂染胺-核酸複合物。
不管用於將外源性核酸引入宿主細胞或以其他方式使細胞暴露於本發明之抑制劑的方法，為了確認宿主細胞中重組DNA序列之存在，可進行多種分析。此類分析包括例如熟習此項技術者熟知之「分子生物」分析，諸如南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，諸如偵測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所描述之分析來鑑別在本發明之範疇內的藥劑。
本發明進一步提供包含CAR編碼核酸分子之載體。在一個態樣中，CAR載體可直接轉導至細胞，例如T細胞中。在一個態樣中，載體為選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下之載體，一或多個質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及豆狀病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞中表現CAR構築體。在一個態樣中，哺乳動物T細胞為人類T細胞。
表現CAR之免疫效應細胞
在另一態樣中，本發明提供CAR表現細胞群體。在一些實施例中，CAR表現細胞群體包含表現一或多種本文所述之CAR之細胞。在一些實施例中，CAR表現細胞群體包含表現不同CAR之細胞的混合物。
舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括第一細胞，其表現具有與本文所述之腫瘤抗原之抗原結合域，例如CD19之CAR，及第二細胞，其表現具有不同抗原結合域，例如與不同的本文所述之腫瘤抗原之抗原結合域，例如與不同於藉由第一細胞表現之CAR之抗原結合域，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a所結合之腫瘤抗原之本文所述之腫瘤抗原之抗原結合域的CAR。
作為另一實例，表現CAR之細胞群體可包括表現包括與本文所述之腫瘤抗原之抗原結合域之CAR的第一細胞，及表現包括與除如本文所述之腫瘤抗原以外的標靶之抗原結合域之CAR之第二細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如表現包括主要胞內信號傳導域之CAR的第一細胞及表現包括次要信號傳導域之CAR的第二細胞。CAR表現細胞中的任一者或兩者可具有可操作地連接於編碼CAR之核酸的例如如本文所述之截短PGK啟動子。
在另一態樣中，本發明提供一種細胞群體，其中該群體中之至少一個細胞表現具有本文所述之腫瘤抗原之抗原結合域的CAR，且第二細胞表現另一藥劑，例如提高CAR表現細胞之活性的藥劑。群體之CAR表現細胞可具有可操作地連接於編碼CAR之核酸的例如如本文所述之截短PGK啟動子。在一個實施例中，藥劑可為抑制抑制分子之藥劑。在一些實施例中，抑制分子(例如PD-1)可降低CAR表現細胞建立免疫效應子反應之能力。抑制分子之實例包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/ 或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如，TGFR β)。在一個實施例中，抑制抑制分子之藥劑包含第一多肽(例如抑制分子)，其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所述之胞內信號傳導域)相關。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制分子之第一多肽，如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β，或此等中的任一者之片段，及第二多肽，其為本文所述之細胞內信號傳導域(例如包含共刺激域(例如41BB、CD27、OX40或CD28，例如如本文所述)及/或主要信號傳導域(本文所述之例如CD3 ξ信號傳導域)。在一個實施例中，藥劑包含PD-1或其片段之第一多肽，及本文所述之胞內信號傳導域(例如本文所述之CD28信號傳導域及/或本文所述之CD3 ξ信號傳導域)之第二多肽。
藉由其他分子或藥劑共表現CAR 共表現第二CAR
在一態樣中，本文所述之CAR表現細胞可另外包含第二CAR，例如包括例如相同標靶(CD19)或不同標靶(例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)之不同抗原結合域之第二CAR。在一個實施例中，第二CAR包括表現於急性骨髓白血病細胞上之標靶，如CD20、CD22、ROR1、CD10、CD33、CLL-1、CD34、CD123、FLT3、CD79b、CD179b及CD79a之抗原結合域。在一個實施例中，CAR表現細胞包含靶向第一抗原且包括具有共刺激信號傳導域而非主要信號傳導域之胞內信號傳導域的第一CAR，及靶向第二不同抗原且包括具有主要信號傳導域而非共刺激信號傳導 域之胞內信號傳導域的第二CAR。儘管不希望受理論束縛，將共刺激信號傳導域，例如4-1BB、CD28、CD27或OX-40置於第一CAR上，及將主要信號傳導域，例如CD3 ξ置於第二CAR上可將CAR活性限制於表現兩種標靶之細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞包含第一CD19 CAR，其包括CD19結合域、跨膜域及共刺激域，及第二CAR，其靶向除CD19以外之抗原(例如表現於AML細胞上之抗原，例如CD22、CD20、ROR1、CD10、CD33、CLL-1、CD34、CD123、FLT3、CD79b、CD179b或CD79a)且包括抗原結合域、跨膜域及主要信號傳導域。在另一實施例中，CAR表現細胞包含第一CD19 CAR，其包括CD19結合域、跨膜域及主要信號傳導域，及第二CAR，其靶向除CD19以外之抗原(例如表現於AML細胞上之抗原，例如CD22、CD20、ROR1、CD10、CD33、CD123、CLL-1、CD34、FLT3、CD79b、CD179b或CD79a)且包括抗原之抗原結合域、跨膜域及共刺激信號傳導域。
在一態樣中，本文所述之CAR表現細胞可另外包含第二CAR，例如包括例如相同標靶(例如CD19)或不同標靶(例如除CD19以外之標靶，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)之不同抗原結合域之第二CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞包含靶向第一抗原且包括具有共刺激信號傳導域而非主要信號傳導域之胞內信號傳導域的第一CAR，及靶向第二不同抗原且包括具有主要信號傳導域而非共刺激信號傳導域之胞內信號傳導域的第二CAR。共刺激信號傳導域(例如4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置於第一CAR上，且主要信號傳導域(例如CD3 ξ)置於第二CAR上可將CAR活性限於表現兩個標靶之細胞。在一個實施例中，表現CAR之細胞包含包括抗原結合域、跨膜域及共刺激域之第一CAR及靶向另一抗原且包括抗原結合域、跨膜域及主要信號傳導域之 第二CAR。在另一實施例中，表現CAR之細胞包含包括抗原結合域、跨膜域及主要信號傳導域之第一CAR及靶向另一抗原且包括與抗原之抗原結合域、跨膜域及共刺激信號傳導域之第二CAR。
在一個實施例中，CAR表現細胞包含本文所述之XCAR(例如CD19 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR)及抑制CAR。在一個實施例中，表現CAR之細胞包含本文所述之CD19 CAR及抑制CAR。在一個實施例中，抑制性CAR包含結合發現於正常細胞上但不發現於癌細胞上(例如亦表現CD19之正常細胞)之抗原之抗原結合域。在一個實施例中，抑制CAR包含抑制分子之抗原結合域、跨膜域及胞內域。舉例而言，抑制性CAR之胞內域可為PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如TGFR β)之胞內域。
在一個實施例中，當表現CAR之細胞包含兩個或兩個以上不同CAR時，不同CAR之抗原結合域可使得抗原結合域不彼此相互作用。舉例而言，表現第一及第二CAR之細胞可具有第一CAR之抗原結合域，例如呈片段形式，例如scFv，其不與第二CAR之抗原結合域形式關聯，例如第二CAR之抗原結合域為VHH。
共表現增強CAR活性之藥劑
在另一態樣中，本文所述之CAR表現細胞可進一步表現另一藥劑，例如提高表現CAR細胞之活性或適合性之藥劑。
舉例而言，在一個實施例中，藥劑可為抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子的藥劑。在一些實施例中，調節或調控T細胞功能之分子為抑制分子。在一些實施例中，抑制分子(例如PD1)可降低 表現CAR之細胞建立免疫效應反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如，TGFR β)。
在一個實施例中，抑制核酸，例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)(例如如本文所述)可用於抑制調節或調控，例如抑制CAR表現細胞中之T細胞功能之分子的表現。在一實施例中，藥劑為shRNA，例如本文所述之shRNA。在一實施例中，抑制CAR表現細胞內之調節或調控(例如抑制)T細胞功能之藥劑。舉例而言，抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子的表現之dsRNA分子連接至編碼CAR之組分，例如所有組分之核酸。
在一個實施例中，抑制抑制分子之藥劑包含第一多肽(例如抑制分子)，其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所述之胞內信號傳導域)相關。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制分子之第一多肽，如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、或TGFR(例如TGFR β)或此等中的任一者之片段(例如此等中的任一者之細胞外域的至少一部分)，及第二多肽，其為本文所述之細胞內信號 傳導域(例如包含共刺激域(例如41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或主要信號傳導域(例如本文所述之CD3 ξ信號傳導域)。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段(例如，PD1之胞外域的至少一部分)之第一多肽及本文所描述之胞內信號傳導域(例如，本文所描述之CD28信號傳導域及/或本文所描述之CD3 ξ信號傳導域)之第二多肽。PD1為CD28受體家族之抑制性成員，該受體家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1在經活化之B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol 8：765-75)。PD1之兩個配位體PD-L1及PD-L2已展示在與PD1結合後下調T細胞活化(Freeman等人2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1在人類癌症中豐富(Dong等人2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10：5094)。免疫抑制可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。
在一個實施例中，藥劑包含抑制分子之胞外域(ECD)，例如程式化死亡1(PD1)，其可與跨膜域及胞內信號傳導域(諸如41BB及CD3 ξ)融合(在本文中亦稱為PD1 CAR)。在一個實施例中，PD1 CAR當與本文所述之CD19 CAR組合使用時改進T細胞之持久性。在一個實施例中，CAR為包含指示為SEQ ID NO：121中帶下劃線的PD1之細胞外域之PD1 CAR。在一個實施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列。
(SEQ ID NO：121)。
在一個實施例中，PD1 CAR包含下文所提供之胺基酸序列(SEQ ID NO：119)。
(SEQ ID NO：119)。
在一個實施例中，藥劑包含編碼PD1 CAR，例如本文所述之PD1 CAR之核酸序列。在一個實施例中，PD1 CAR之核酸序列展示於下文中，在SEQ ID NO：120中以下帶下劃線的PD1 ECD (SEQ ID NO：120)。
在另一實例中，在一個實施例中，提高表現CAR之細胞之活性之藥劑可為共刺激分子或共刺激分子配位體。共刺激分子之實例包括MHC I類分子、BTLA及Toll配位體受體，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。此類共刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、 ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及特異性結合CD83之配位體，例如如本文所述。共刺激分子配位體之實例包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL及LIGHT。在實施例中，共刺激分子配位體為不同於CAR之共刺激分子域之共刺激分子之配位體。在實施例中，共刺激分子配位體為與CAR之共刺激分子域相同之共刺激分子之配位體。在一個實施例中，共刺激分子配位體為4-1BBL。在一個實施例中，共刺激配位體為CD80或CD86。在一個實施例中，共刺激分子配位體為CD70。在實施例中，本文所述之表現CAR之免疫效應細胞可另外經工程改造以表現一或多個額外共刺激分子或共刺激分子配位體。
CAR與趨化因子受體之共表現
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞進一步包含趨化因子受體分子。T細胞中趨化因子受體CCR2b或CXCR2之轉殖基因表現增強運輸至分泌CCL2或CXCL1之包括黑素瘤及神經母細胞瘤的實體腫瘤中(Craddock等人，J Immunother. 2010 Oct；33(8)：780-8及Kershaw等人，Hum Gene Ther. 2002年11月1日；13(16)：1971-80)。因此，在不希望受理論束縛的情況下，咸信表現CAR之細胞中表現之識別由腫瘤(例如，實體腫瘤)分泌的趨化因子之趨化因子受體可改良表現CAR之細 胞向腫瘤歸巢、促進表現CAR之細胞向腫瘤浸潤及增強表現CAR之細胞的抗腫瘤功效。趨化因子受體分子可包含天然存在或重組之趨化因子受體或其趨化因子結合片段。適合於在本文所述之CAR表現細胞中表現的趨化因子受體分子包括CXC趨化因子受體(例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7)、CC趨化因子受體(例如，CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11)、CX3C趨化因子受體(例如，CX3CR1)、XC趨化因子受體(例如，XCR1)或其趨化因子結合片段。在一個實施例中，基於由腫瘤分泌之趨化因子來選擇待用本文所描述之CAR表現之趨化因子受體分子。在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞進一步包含(例如，表現)CCR2b受體或CXCR2受體。在一實施例中，本文所描述之CAR及趨化因子受體分子位於相同載體或兩個不同載體上。在本文所描述之CAR及趨化因子受體分子位於相同載體上之實施例中，CAR及趨化因子受體分子各自在兩個不同啟動子之控制下或在相同啟動子之控制下。
免疫反應增強劑之條件表現
本文亦提供條件性地表現增強本文所述之CAR表現細胞之免疫反應或活性之藥劑的組合物及方法。
在一態樣中，本發明關於經工程改造以組成性地表現CAR，在本文中亦被稱作非條件性CAR之免疫效應細胞。在一個實施例中，如本文所述之非條件性CAR包含結合至癌症相關抗原，例如CD19、CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之抗原結合域。在實施例中，非條件性CAR表現免疫效應細胞進一步包含增強CAR表現免疫效應細胞之療效，例如免疫反應之條件性表現藥劑。在此類實施例中，條件性表現藥劑之表現在非條件性CAR表現免疫效應細胞之活化時，例如非條件性CAR分子結合至其標靶，例如癌症相關 抗原，例如CD19、CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1時發生。
如本文所述之免疫反應增強劑可通過以下中的一或多者來表徵：1)靶向或結合至與藉由非條件性CAR所靶向不同上文癌症相關抗原；2)抑制免疫檢查點或抑制分子之表現或活性；及/或3)活化增強免疫效應細胞之免疫反應或活化之組分之表現及/或分泌。免疫反應增強劑可為多肽或核酸，例如編碼增強免疫反應之多肽之核酸。增強免疫反應之條件性表現劑之實例包括(但不限於)額外CAR(稱為條件性CAR)；基於TCR之分子(例如TCR-CAR)；免疫檢查點或抑制分子之抑制劑；及/或細胞因子。在實施例中，條件性CAR結合至與藉由非條件性CAR靶向之抗原不同的癌症相關抗原。在實施例中，本文所述之免疫檢查點或抑制分子之抑制劑為抗體或其抗原結合片段、抑制核酸(例如siRNA或shRNA)或小分子，其抑制或減小選自以下之免疫檢查點或抑制分子之活性：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷或TGFR β。在實施例中，細胞因子包含IL-2、IL-7、IL-15或IL-21，或其功能片段或衍生物。
在實施例中，免疫效應細胞包含非條件性CAR及一或多種條件性CAR，其中條件性CAR結合至與藉由非條件性CAR靶向之抗原不同的癌症相關抗原。舉例而言，在一個實施例中，免疫效應細胞包含結合至CD19之非條件性CAR及一或多種結合至CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1或其組合之條件性CAR。在另一實施例中，免疫效應細胞包含結合至CD10、CD20、CD22、CD34、CD123FLT-3或ROR1之非條件性CAR及結合至CD19之條件性CAR。
在活化CAR表現免疫效應細胞後增強免疫反應之藥劑之條件性表現藉由將活化條件性控制區域可操作地連接至增強免疫反應之藥劑(例如編碼此類藥劑之核酸序列)實現。在一個實施例中，活化條件性控制區域包含在活化免疫效應細胞後起始可操作地連接之免疫反應增強劑之表現，例如轉錄之啟動子序列。在一個實施例中，活化條件性控制區域包含一或多個促進在活化免疫效應細胞後起始表現之調節序列(例如轉錄因子結合序列或位點)。在實施例中，活化條件性控制區域包含啟動子序列及/或一或多個來自在以下中的一或多者後上調之基因之啟動子或調節序列之轉錄因子結合序列：免疫效應細胞(例如T細胞)活化、T細胞分化、T細胞極化或輔助T細胞發育。此類基因之實例包括(但不限於)NFAT(活化T細胞之核因子)、ATF2(活化轉錄因子2)、NF-κB(核因子-κB)、IL-2、IL-2受體(IL-2R)、IL-3、GM-CSF、IL-4、IL-10及IFN-γ。
在一個實施例中，活化條件性控制區域包含一或多個，例如1、2、3、4、5、6或6個以上NFAT結合序列或位點。在實施例中，啟動子中之NFAT結合序列包含(5'-GGAAA-3')(SEQ ID NO：1312)，視情況位於5'(A/T)GGAAA(A/N)(A/T/C)N3'(SEQ ID NO：1313)之較長共同序列中。在實施例中，NFAT結合序列為κb樣序列，如GGGACT(SEQ ID NO：1314)。(參見Gibson等人，Journal of Immunology,2007,179：3831-3840)。
在一個實施例中，活化條件性控制區域進一步包含IL-2啟動子(或最小IL-2啟動子)、IL-2R啟動子、ATF2啟動子或NF-κB啟動子，或其任何功能片段或衍生物。在一個實施例中，活化條件性控制區域包含一或多個NFAT結合序列，例如3或6個NFAT結合序列，及IL-2啟動子，例如IL-2最小啟動子。在一個實施例中，活化條件性控制區域包含AGCTTGGATCCAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAGAAGGCGTTAAG (SEQ ID NO：1315)之序 列。
細胞來源
在擴增及基因修飾或其他修飾之前，細胞，例如T細胞或自然殺手(NK)細胞來源可獲自個體。個體之實例包括人類、猴、黑猩猩、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。T細胞可獲自多種來源，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、肋膜積液、脾組織及腫瘤。
在本發明之某些態樣中，免疫效應細胞(例如T細胞)可獲自使用熟習此項技術者已知之任何數目的技術，諸如FicollTM 分離收集自個體之血液單元。在一態樣中，藉由清除術獲得來自個體之循環血液的細胞。清除術產物通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。在一態樣中，藉由清除術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且視情況將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一個實施例中，細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一替代實施例中，洗滌溶液缺乏鈣且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若並非全部)二價陽離子。
在鈣不存在下之初始活化步驟可能導致放大之活化。如一般技術者將易於瞭解，洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知之方法實現，諸如藉由根據製造商說明書使用半自動「流通」離心機(例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics細胞保存器5)。洗滌後，可將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝劑中，諸如不含Ca不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他具有或不具有生理食鹽水溶液之緩衝液。或者，可移除清除術樣品之非所要組分且將細胞直接再懸浮於培養基中。
認識到本申請案之方法可利用包含5%或5%以下(例如2%)人類AB血清之培養基條件，且採用已知培養基條件及組合物，例如Smith等人，「Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement」Clinical & Translational Immunology(2015)4,e31；doi：10.1038/cti.2014.31中所描述之培養基條件及組合物。
在一個態樣中，藉由溶解紅血球及例如藉由經PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核細胞，自周邊血液淋巴細胞分離T細胞。
本文所述之方法可包括例如使用例如例如本文所述之陰性選擇技術選擇免疫效應細胞，例如T細胞之作為T調節細胞耗盡群體之特定亞群，CD25+耗盡細胞。在一些實施例中，T調節耗盡細胞群體含有少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%之CD25+細胞。
在一個實施例中，使用抗CD25抗體，或其片段，或CD25結合配位體，例如IL-2自群體移除T調節細胞，例如CD25+ T細胞。在一個實施例中，抗CD25抗體或其片段或CD25結合配位體共軛到受質，例如珠粒，或另外塗佈於受質，例如珠粒上。在一個實施例中，抗CD25抗體或其片段結合於如本文所述之受質。
在一個實施例中，使用來自MiltenyiTM 之CD25耗盡劑自群體移除調節性T細胞，例如CD25+ T細胞。在一個實施例中，細胞與CD25耗盡劑之比率為1e7個細胞/20微升，或1e7個細胞/15微升，或1e7個細胞/10微升，或1e7個細胞/5微升，或1e7個細胞/2.5微升，或1e7個細胞/1.25微升。在一個實施例中，例如調節性T細胞使用例如大於5億個細胞/毫升之CD25+耗盡。在另一態樣中，使用6、7、8或9億個細胞/毫升之細胞濃度。
在一個實施例中，待耗盡之免疫效應細胞的群體包括約6×109 個CD25+ T細胞。在其他態樣中，待耗盡之免疫效應細胞的群體包括約1×109 至1×1010 個CD25+ T細胞及其間任何整數值。在一個實施例中，所得群體T調節耗盡細胞具有2×109 個T調節細胞，例如CD25+細胞，或更低(例如1×109 、5×108 、1×108 、5×107 、1×107 或更少CD25+細胞)。
在一個實施例中，使用具有缺失導管組，諸如導管162-01之CliniMAC系統，自群體移除T調節細胞，例如CD25+細胞。在一個實施例中，CliniMAC系統在諸如DEPLETION2.1之缺失設置上操作。
不希望受特定理論束縛，在個體中在清除術前或在製造CAR表現細胞產物期間減少免疫細胞之負調節因子水準(例如減少不必要免疫細胞，例如TREG 細胞之數目)可顯著降低個體復發風險。舉例而言，耗盡TREG 細胞之方法為此項技術中已知。減少TREG 細胞之方法包括(但不限於)環磷醯胺、抗GITR抗體(本文所述之抗GITR抗體)、CD25耗盡、mTOR抑制劑及其組合。
在一些實施例中，製造方法包含在製造CAR表現細胞前減少TREG 細胞數目(例如耗盡)。舉例而言，製造方法包含在製造CAR表現細胞(例如T細胞、NK細胞)產物之前使樣品，例如清除術樣品與抗GITR抗體及/或抗CD25抗體(或其片段，或CD25結合配位體)接觸，例如以耗盡TREG 細胞。
在不希望受特定理論束縛之情況下，在個體中在清除術前或在製造表現CAR之細胞產物期間降低免疫細胞之負調節因子水準(例如，減少非所要免疫細胞、例如TREG 細胞之數目)可降低TREG 復發風險。在一個實施例中，在收集細胞用於製造CAR表現細胞產物前將個體用一或多種減少TREG細胞之療法預處理，由此降低個體面對CAR表現細胞治療復發之風險。在一個實施例中，減少TREG 細胞之方法包 括(但不限於)向個體投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗盡中的一或多者或其組合。在一個實施例中，減少TREG 細胞之方法包括(但不限於)向個體投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗盡、mTOR抑制劑或其組合中的一或多者。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25缺失中之一或多者或其組合可在CAR表現細胞產物輸注之前、期間或之後進行。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗盡、mTOR抑制劑或其組合中之一或多者可在輸注表現CAR之細胞產物之前、在其期間或在其之後進行。
在一些實施例中，製造方法包含在製造CAR表現細胞前減少TREG 細胞數目(例如耗盡)。舉例而言，製造方法包含在製造CAR表現細胞(例如T細胞、NK細胞)產物之前使樣品，例如清除術樣品與抗GITR抗體及/或抗CD25抗體(或其片段，或CD25結合配位體)接觸，例如以耗盡TREG 細胞。
在一個實施例中，在收集細胞用於製造CAR表現細胞產物前將個體用一或多種減少TREG 細胞之療法預處理，由此降低個體面對CAR表現細胞治療復發之風險。在一個實施例中，減少TREG 細胞之方法包括(但不限於)向個體投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25缺失中之一或多者或其組合。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25缺失中之一或多者或其組合可在CAR表現細胞產物輸注之前、期間或之後進行。
在一個實施例中，在收集細胞用於製造CAR表現細胞產物前將個體用環磷醯胺預處理，由此降低個體面對CAR表現細胞治療復發之風險。在一個實施例中，在收集細胞用於製造CAR表現細胞產物前將個體用抗GITR抗體預處理，由此降低個體面對CAR表現細胞治療復發之風險。
在一個實施例中，待移除之細胞群體既非調節性T細胞或腫瘤細胞，亦非以其他方式負面影響CART細胞之擴增及/或功能的細胞，例 如表現CD14、CD11b、CD33、CD15或藉由潛在免疫抑制細胞表現之其他標記之細胞。在一個實施例中，預想此類細胞與調節性T細胞及/或腫瘤細胞並行移除，或在該缺失後移除，或以另一次序移除。
本文所述之方法可包括一個以上選擇步驟，例如一個以上缺失步驟。藉由負選擇增濃T細胞群體可例如使用針對負選擇之細胞所獨特之表面標記物的抗體的組合來實現。一種方法為經負磁性免疫黏附或流動式細胞測量術分選及/或選擇細胞，該負磁性免疫黏附或流動式細胞測量術使用針對負選擇細胞上存在之細胞表面標記物之單株抗體混合物。舉例而言，為了藉由負選擇增濃CD4+細胞，單株抗體混合物可包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。
本文所描述之方法可進一步包括自表現腫瘤抗原，例如不包含CD25之腫瘤抗原(例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)之群體移除細胞，藉此提供適合於表現CAR(例如，本文所描述之CAR)的T調節性耗盡(例如，CD25+耗盡)及腫瘤抗原耗盡之細胞的群體。在一個實施例中，表現腫瘤抗原之細胞與T調節性(例如，CD25+)細胞同時移除。舉例而言，抗CD25抗體或其片段及抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至可用於去除細胞之相同受質，例如珠粒，或抗CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至混合物可用於去除細胞之分開珠粒。在其他實施例中，T調節細胞，例如CD25+細胞之移除及腫瘤抗原表現細胞之移除為連續的，且可以例如任一次序進行。
亦提供如下方法，其包括自群體移除表現檢查點抑制劑(例如，本文所描述之檢查點抑制劑)之細胞，例如PD1+細胞、LAG3+細胞及TIM3+細胞中之一或多者，藉此提供T調節性耗盡(例如，CD25+耗盡)細胞及檢查點抑制劑耗盡細胞(例如，PD1+、LAG3+及/或TIM3+耗盡細胞)之群體。例示性檢查點抑制劑包括例如如本文所描述之PD1、 PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如，TGFRβ)。在一個實施例中，表現檢查點抑制劑之細胞與T調節性(例如，CD25+)細胞同時移除。舉例而言，抗CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可附接至可用於移除細胞之相同珠粒，或抗CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至混合物可用於移除細胞之分開珠粒。在其他實施例中，調節性T細胞(例如，CD25+細胞)之移除及表現檢查點抑制劑之細胞的移除為連續的，且可例如以任一次序進行。
本文所述之方法可包括正選擇步驟。舉例而言，可藉由與抗CD3/抗CD28(例如，3×28)共軛珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以正選擇所要T細胞之時間來分離T細胞。在一個態樣中，該時間段為約30分鐘。在另一態樣中，該時間段在30分鐘至36小時或更長及其間所有整數值範圍內。在另一態樣中，該時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在又一較佳態樣中，該時間段為10至24小時。在一個態樣中，培育時間段為24小時。在相較於其他細胞類型存在很少T細胞的任何情形中可使用較長培育時間分離T細胞，諸如自腫瘤組織或免疫功能不全個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。此外，使用較長培育時間可提高捕捉CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單縮短或延長時間使T細胞與CD3/CD28珠粒結合及/或藉由增加或降低珠粒與T細胞之比率(如本文進一步描述)，對於或針對在培養起始時或在該方法期間之其他時間點可優先選擇T細胞之亞群。另外，藉由增加或降低珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，對於或針對在培養起始時或在其他所要時間點可優先選擇T細胞 之亞群。
在一個實施例中，可選擇表現以下中之一或多者的T細胞群體：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B及穿孔素，或其他適當分子，例如其他細胞因子。可例如藉由PCT公開案第WO 2013/126712號中所述之方法確定篩選細胞表現之方法。
為了藉由正選擇或負選擇分離所要細胞群體，細胞濃度及表面(例如粒子，諸如珠粒)可變化。在某些態樣中，可能需要顯著減小珠粒與細胞混合在一起的體積(例如，增加細胞濃度)以確保細胞與珠粒最大接觸。舉例而言，在一態樣中，使用約100億個細胞/毫升、90億/毫升、80億/毫升、70億/毫升、60億/毫升或50億/毫升之濃度。在一個態樣中，使用10億個細胞/毫升之濃度。在又一個態樣中，使用75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000個細胞/毫升之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125,000,000或150,000,000個細胞/毫升之濃度。
使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度使得更有效捕捉可能弱表現所關注目標抗原之細胞(諸如CD28陰性T細胞)或自存在許多腫瘤細胞之樣品(例如白血病血液、腫瘤組織等)更有效捕捉細胞。此類細胞群體可具有治療價值且將需要獲得。舉例而言，使用高細胞濃度允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在相關態樣中，可能需要使用較低濃度之細胞。藉由顯著稀釋T細胞及表面(例如粒子，諸如珠粒)之混合物，使粒子與細胞之間的相互作用降至最低。此選擇表現大量待結合於粒子之所要抗原的細胞。舉例而言，CD4+ T細胞表現較大量CD28且在稀濃度下比CD8+ T細胞更有效捕捉。在一個態樣中，所用細胞濃度為5×106 /ml。在其他態樣 中，所用濃度可為約1×105 /ml至1×106 /ml，及其間之任何整數值。
在其他態樣中，細胞可在2-10℃或室溫下在旋轉器上培育持續變化之時間長度或變化之速度下培育。
用於刺激之細胞亦可在洗滌步驟後經冷凍。不希望受理論束縛，冷凍及隨後解凍步驟藉由在細胞群體中移除粒細胞及一定程度上移除單核細胞來提供更均勻產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後，細胞可懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為此項技術中已知且將適用於此情況，但一種方法涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO，或31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基，或含有例如Hespan及PlasmaLyte A之其他適合細胞冷凍培養基，隨後細胞在每分鐘1°之速率下冷凍至-80℃且以氣相儲存於液氮儲存槽中。可使用受控冷凍以及在-20℃下或在液氮中不受控立即冷凍之其他方法。
在某些態樣中，將冷凍保存之細胞如本文所述解凍及洗滌，且在室溫下靜置一小時，隨後使用本發明之方法活化。
本發明之上下文中亦涵蓋在可能需要如本文所描述之擴增細胞之前一段時間自個體收集血液樣品或清除術產物。因此，待擴增之細胞來源可在任何所需時間點收集，且所需細胞，諸如T細胞經分離及冷凍以隨後用於將受益於免疫效應細胞療法，諸如本文所述之彼等療法之任何數目的疾病或病況之免疫效應細胞療法中。在一個態樣中，血液樣品或清除術取自一般健康個體。在某些態樣中，血液樣品或清除術取自處於罹患疾病之風險中但尚未患有疾病的一般健康個體，且所關注的細胞經分離及冷凍以供稍後使用。在某些態樣中，T細胞可擴展、冷凍及稍後使用。在某些態樣中，在診斷出如本文所描述之特 定疾病後不久但在任何治療之前自患者收集樣品。在另一態樣中，自來自個體的血液樣品或清除術分離細胞，隨後進行多種相關治療模式，包括(但不限於)用以下藥劑治療：諸如那他珠單抗(natalizumab)、艾法珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑、化學療法、輻射、免疫抑制劑(諸如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫燒蝕劑(諸如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228)及照射。
在本發明之另一態樣中，T細胞在給個體留下功能性T細胞之治療後直接獲自患者。就此而言，已觀測到在某些癌症治療之後，特定言之使用破壞免疫系統之藥物治療之後，在患者通常將自治療恢復的時段期間治療之後不久，獲得之T細胞品質可最佳或其離體擴增之能力得到改良。同樣，在使用本文所描述之方法離體操縱之後，此等細胞之增強移植及活體內擴增可呈較佳狀態。因此，本發明之上下文內涵蓋在此恢復階段期間收集血細胞(包括T細胞)、樹突狀細胞或造血譜系之其他細胞。此外，在某些態樣中，移動(例如用GM-CSF移動)及調節方案可用於建立個體內之條件，其中尤其在治療之後的制定時間窗其間宜再增殖、再循環、再生及/或擴展特定細胞類型。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及免疫系統之其他細胞。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所描述之CAR分子)之免疫效應細胞獲自已接收低免疫增強劑量之mTOR抑制劑的個體。在一實施例中，在足夠時間之後或在足夠給藥低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之後，收集經工程改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞)的群體，使得個體中或自個體收集之PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)的含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如，T細胞)之比率已至少短暫增加。
在其他實施例中，已或將經工程改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞)的群體可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)數目或增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如，T細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸而經離體處理。
在一個實施例中，T細胞群體缺乏甘油二酯激酶(DGK)。DGK缺乏細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質之細胞或具有降低或抑制之DGK活性。DGK缺乏細胞可藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以減少或防止DGK表現。或者，DGK缺乏細胞可藉由用本文所描述之DGK抑制劑處理來產生。
在一個實施例中，T細胞群體缺乏Ikaros。Ikaros缺乏細胞包括不表現Ikaros RNA或蛋白質或具有降低或抑制之Ikaros活性的細胞，Ikaros缺乏細胞可藉由基因方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以減少或防止Ikaros表現。或者，Ikaros缺乏細胞可藉由用Ikaros抑制劑(例如，來那度胺(lenalidomide))處理產生。
在實施例中，T細胞群體缺乏DGK及缺乏Ikaros，例如不表現DGK及Ikaros，或具有降低或抑制之DGK及Ikaros活性。此類DGK及Ikaros缺乏細胞可藉由本文所描述之任何方法產生。
在一實施例中，NK細胞獲自個體。在另一實施例中，NK細胞為NK細胞株，例如NK-92細胞株(Conkwest)。
同種異體CAR
在本文所描述之實施例中，免疫效應細胞可為同種異體免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。舉例而言，細胞可為同種異體T細胞，例如缺乏功能性T細胞受體(TCR)及/或人類白細胞抗原(HLA)(例如I類HLA及/或II類HLA)表現之同種異體T細胞。
缺乏功能性TCR之T細胞可例如經工程改造以使其不表現其表面上之任何功能性TCR，經工程改造以使其不表現包含功能性TCR之一或多個次單元(例如經工程改造以使其不表現TCR α、TCR β、TCR γ、TCR δ、TCR ε及/或TCR ξ(或展現減少之表現))或經工程改造以使其在其表面上產生極少功能性TCR(例如經工程改造以使其不表現TCR α、TCR β、TCR γ、TCR δ、TCR ε及/或TCR ξ(或展現減少之表現))。或者，T細胞可表現實質上受損之TCR，例如藉由表現突變或截斷形式的一或多個TCR子單元。術語「實質上受損之TCR」意謂此TCR將不會在宿主中引發不利免疫反應。
本文所描述之T細胞可例如經工程改造以使其不在其表面上表現功能性HLA。舉例而言，本文所述之T細胞可經工程改造以使得HLA(例如HLA 1類及/或HLA II類)之細胞表面表現下調。在一些實施例中，HLA下調可藉由減少或消除β-2微球蛋白(B2M)之表現來實現。
在一些實施例中，T細胞可缺乏功能性TCR及功能性HLA，例如HLA I類及/或HLA II類。
缺乏功能性TCR及/或HLA表現之經修飾T細胞可藉由任何適合方式獲得，包括一或多個TCR或HLA子單元之基因剔除或阻斷基因表現。舉例而言，T細胞可包括使用siRNA、shRNA、叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)阻斷TCR及/或HLA基因表現。
在一些實施例中，同種異體細胞可為不表現或以低含量表現抑制分子之細胞，例如藉由本文所述之任何方法工程改造之細胞。舉例而言，細胞可為不表現或低水準表現抑制分子之細胞，該抑制分子例如可降低表現CAR之細胞建立免疫效應反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、 BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如，TGFR β)。抑制分子之抑制，例如在DNA、RNA或蛋白質水準上之抑制，可使CAR表現細胞效能最佳。在實施例中，可使用例如如本文所述之抑制核酸(例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)、叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA之siRNA及shRNA
在一些實施例中，細胞中之TCR表現及/或HLA表現可使用靶向編碼TCR及/或HLA之核酸的siRNA或shRNA及/或本文所描述之抑制分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)抑制。
siRNA及shRNA及例示性shRNA之表現系統描述於例如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第649及650段中，該申請案以全文引用的方式併入本文中。
抑制TCR或HLA之CRISPR
如本文所用之「CRISPR」或「TCR及/或HLA之CRISPR」或「抑制TCR及/或HLA之CRISPR」係指一組叢集規律性間隔之短回文重複序列或包含此類重複組之系統。如本文所用，「Cas」係指CRISPR相關蛋白質。「CRISPR/Cas」系統係指來源於可用於使TCR及/或HLA基因靜默或突變之CRISPR及Cas及/或本文所描述之抑制分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM- 1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)的系統。
CRISPR/Cas系統及其用途描述於例如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第651-658段中，其以全文引用的方式併入本文中。
抑制TCR及/或HLA之TALEN
「TALEN」或「HLA及/或TCR之TALEN」或「抑制HLA及/或TCR之TALEN」係指轉錄活化因子樣效應核酸酶，可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶，及/或本文所描述之抑制分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)。
TALEN、TALE及其用途描述於例如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第659-665段中，其以全文引用的方式併入本文中。
抑制HLA及/或TCR之鋅指核酸酶
「ZFN」或「鋅指核酸酶」或「HLA及/或TCR之ZFN」或「抑制HLA及/或TCR之ZFN」係指鋅指核酸酶，可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶，及/或本文所描述之抑制分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)。
ZFN及其用途描述於例如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第666-671段中，其以全文引用的方式併入本文中。
端粒酶表現
儘管不希望受任何特定理論束縛，但在一些實施例中，由於T細胞中之縮短端粒，治療T細胞在患者中具有短期持久性；因此，經端粒酶基因轉染可延長T細胞之端粒且提高患者中T細胞之持久性。參見Carl June,「Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic」,Journal of Clinical Investigation,117：1466-1476(2007)。因此，在一實施例中，免疫效應細胞(例如，T細胞)異位表現端粒酶次單元，例如端粒酶之催化次單元，例如TERT，例如hTERT。在一些態樣中，本發明提供一種產生表現CAR之細胞的方法，其包含使細胞與編碼端粒酶次單元(例如端粒酶之催化次單元，例如TERT，例如hTERT)之核酸接觸。細胞可在與編碼CAR之構築體接觸之前、與其同時或之後與核酸接觸。
在一個態樣中，本發明提供一種製備免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)群體之方法。在一實施例中，該方法包含：提供免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)群體，使該免疫效應細胞群體與編碼CAR之核酸接觸；及在允許CAR及端粒酶表現之條件下使該免疫效應細胞群體與編碼端粒酶次單元(例如，hTERT)之核酸接觸。
在一個實施例中，編碼端粒酶次單元之核酸為DNA。在一個實施例中，編碼端粒酶次單元之核酸包含能夠驅動端粒酶次單元表現之啟動子。
在一實施例中，hTERT具有如下GenBank蛋白質ID AAC51724.1 之胺基酸序列(Meyerson等人，「hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization」Cell第90卷，第4期，1997年8月22日，第785-795頁)： (SEQ ID NO：1332)
在一個實施例中，hTERT具有與SEQ ID NO：1332之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。在一個實施例中，hTERT具有SEQ ID NO：1332之序列。在一個實施例中，hTERT包含N端、C端或兩者處之缺失(例如不超過5、10、15、20或30個胺基酸)。在一實施例中，hTERT在N端、C端或兩者處包含轉殖基因胺基酸序列(例如，不超過5、10、15、20或30個胺基酸)。
在一實施例中，hTERT由Genbank寄存編號AF018167之核酸序列編碼(Meyerson等人，「hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization」Cell第90卷，第4期，1997年8月22日，第785-795頁)： (SEQ ID NO：1333)
在一個實施例中，hTERT藉由具有與SEQ ID NO：1333之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列之核酸編碼。在一個實施例中，hTERT藉由SEQ ID NO：1333之核酸編碼。
免疫效應細胞(例如T細胞)之活化及擴增
免疫效應細胞(如T細胞)可一般使用如所例如美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；及美國專利申請公開案第20060121005號中描述之方法活化及擴增。
用於離體擴增造血幹細胞及祖細胞之程序描述於以引用的方式併入本文中之美國專利第5,199,942號中，且可應用於本發明之細胞。其他適合方法為此項技術中已知，因此本發明不限於任何特定離體擴增細胞之方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增可包含：(1)藉由周邊血液採集或骨髓外植體自哺乳動物收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2)離體擴增此類細胞。除了美國專利第5,199,942號中描述之細胞生長因子之外，諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-套組配位體之其他因素可用於培養及擴增該等細胞。
一般而言，免疫效應細胞群體可藉由與具有與表面附接之刺激CD3/TCR複合物相關信號之藥劑及刺激T細胞之表面上之共刺激分子之配位體的表面接觸擴增。特定言之，T細胞群體可如本文所描述刺激，諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段、或固定於表面上之抗CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化因子(例如，苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸。為了共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配位體。舉例而言，T細胞群體可與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，可使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besançon,France)，可原樣使用，可此項技術中通常已知之其他方法(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328,1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63,1999)。
在一些實施例中，免疫效應細胞(如PBMC或T細胞)藉由使細胞與抗CD3抗體及IL-2中的一者或兩者接觸而擴增及刺激。在實施例中，細胞在無抗CD3或抗CD28珠粒的情況下擴增。
在某些態樣中，T細胞之主要刺激信號及協同刺激信號可藉由不同協定提供。舉例而言，提供各信號之藥劑可在溶液中或偶接至表面。當偶合至表面時，藥劑可偶合至相同表面(亦即，呈「順」形式)或獨立表面(亦即，呈「反」形式)。或者，一種藥劑可偶合至表面且另一藥劑在溶液中。在一個態樣中，提供協同刺激信號之藥劑結合至細胞表面且提供一級活化信號之藥劑在溶液中或偶合至表面。在某些態樣中，兩種藥劑皆可在溶液中。在一個態樣中，該等藥劑可為可溶性形式，接著交聯至表面(諸如表現Fc受體之細胞或抗體或將結合於該等藥劑之其他結合劑)。就此而言，參見例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號，本發明中涵蓋人工抗原呈現細胞(aAPC)用於活化及擴增T細胞。
在一態樣中，兩種藥劑固定於珠粒上，在同一珠粒上，亦即「順」；或在獨立珠粒上，亦即「反」。舉例而言，提供一級活化信號之藥劑為抗CD3抗體或其抗原結合片段且提供協同刺激信號之藥劑為抗CD28抗體或其抗原結合片段；且兩種藥劑以等效分子量共同固定於同一珠粒。在一個態樣中，使用結合於用於CD4+ T細胞擴展及T細胞生長之珠粒的1：1比率之各抗體。在某些態樣中，使用一定比率的結合至珠粒之抗CD3：CD28抗體，使得觀測到相比於使用1：1之比率觀測之擴增的T細胞擴增增加。在一個特定態樣中，觀測到相比於使用1：1之比率所觀測之膨脹約1至約3倍之增加。在一個態樣中，結合於 珠粒之CD3：CD28抗體的比率介於100：1到1：100及在其之間的所有整數值範圍內。在一態樣中，比抗CD3抗體更多的抗CD28抗體結合至粒子，亦即CD3：CD28的比率小於1。在某些態樣中，結合於珠粒之抗CD28抗體與抗CD3抗體的比率大於2：1。在一個特定態樣中，使用1：100之結合於珠粒之CD3：CD28抗體比率。在一態樣中，使用1：75之結合於珠粒的CD3：CD28抗體比率。在另一態樣中，使用1：50之結合於珠粒的抗體CD3：CD28比率。在一態樣中，使用1：30之結合於珠粒的CD3：CD28抗體比率。在一個較佳態樣中，使用1：10之結合於珠粒的抗體CD3：CD28比率。在一態樣中，使用1：3之結合於珠粒的抗體CD3：CD28比率。在又一個態樣中，使用3：1之結合於珠粒的抗體CD3：CD28比率。
可使用1：500至500：1及其間之任何整數值的粒子比細胞比率刺激T細胞或其他目標細胞。如一般技術者可易於瞭解，粒子與細胞之比率可視相對於靶細胞之粒徑而定。舉例而言，小尺寸珠粒可僅結合少數細胞，而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中，細胞與粒子之比率在1：100至100：1及其間任何整數值範圍內，且在其他態樣中，包含1：9至9：1及其間任何整數值之比率亦可用於刺激T細胞。抗CD3及抗CD28偶合粒子與產生T細胞刺激之T細胞的比率可如上文所指出地變化，然而，某些適合值包括1：100、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1及15：1，其中一個適合比率為每個T細胞至少1：1粒子。在一態樣中，使用1：1或更小的粒子比細胞之比率。在一個特定態樣中，適合粒子：細胞比率為1：5。在其他態樣中，粒子與細胞之比率可視刺激天數而變化。舉例而言，在一個態樣中，第一天粒子與細胞之比率為1：1至10：1，且其後每天或每隔一天向細胞添加額外粒子直至10天，最終比率為1：1至1：10(以添加當天之細胞數計)。在一 個特定態樣中，刺激第一天粒子比細胞之比率為1：1且在刺激第三天及第五天調整至1：5。在一個態樣中，每天或每隔一天添加粒子直至第一天的最終比率為1：1，且刺激第三天及第五天為1：5。在一個態樣中，粒子與細胞之比率在刺激第一天為2：1且在刺激第三天及第五天調整至1：10。在一個態樣中，每天或每隔一天添加粒子直至第一天的最終比率為1：1，且刺激第三天及第五天為1：10。熟習此項技術者將瞭解多種其他比率可為適用於本發明。特定言之，比率將視粒度及細胞尺寸及類型而變化。在一態樣中，第一天使用之最典型比率為約1：1、2：1及3：1。
在本發明之其他態樣中，細胞(諸如T細胞)與藥劑塗佈之珠粒組合，隨後分離珠粒與細胞，且隨後培養細胞。在替代態樣中，在培養之前，藥劑塗佈之珠粒及細胞不分離，而是一起培養。在另一態樣中，珠粒及細胞首先藉由施加力(諸如磁力)集中，導致細胞表面標記之接合增加，藉此誘導細胞刺激。
藉助於實例，細胞表面蛋白質可藉由使附接有抗CD3及抗CD28之順磁性珠粒(3x28珠粒)與T細胞接觸而接合。在一個態樣中，在例如PBS之緩衝劑(不具有二價陽離子，諸如鈣及鎂)中組合細胞(例如，104 至109 個T細胞)與珠粒(例如，1：1比率之DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁性珠粒)。此外，一般技術者容易瞭解可使用之任何細胞濃度。舉例而言，樣品中的靶細胞可能極少且僅占樣品之0.01%，或全部樣品(亦即，100%)可包含所關注的靶細胞。因此，任何細胞數目均在本發明之情形中。在某些態樣中，可能需要顯著降低粒子與細胞混合在一起的體積(亦即提高細胞濃度)以確保細胞與粒子最大接觸。舉例而言，在一態樣中，使用約100億個細胞/毫升、90億個細胞/毫升、80億個細胞/毫升、70億個細胞/毫升、60億個細胞/毫升或50億個細胞/毫升或20億個細胞/毫升之濃度。在一個態樣中，使 用大於100,000,000個細胞/毫升。在另一態樣中，使用10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000個細胞/毫升之細胞濃度。在另一態樣中，使用75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000個細胞/毫升之濃度。在其他態樣中，可使用125,000,000或150,000,000個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更有效捕捉可能微弱表現所關注的靶抗原之細胞，諸如CD28陰性T細胞。此類細胞群體可具有治療價值且在某些態樣中將需要獲得。舉例而言，使用高細胞濃度允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在一個實施例中，經編碼CAR(例如，本文所描述之CAR)之核酸轉導之細胞例如藉由本文所描述之方法擴增。在一個實施例中，細胞在培養物中擴增若干小時(例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小時)至約14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)之時段。在一個實施例中，細胞擴增4至9天之時段。在一個實施例中，細胞擴增8天或8天以下，例如7、6或5天之時段。在一個實施例中，細胞，例如本文所述之CAR細胞，在培養物中擴增5天，且所得細胞比在培養物中在相同培養條件下擴增9天之相同細胞有效。效力可例如藉由各種T細胞功能，例如增殖、靶細胞殺死、細胞因子產生、活化、遷移或其組合來界定。在一個實施例中，擴增5天之細胞，例如本文所述之CD19 CAR細胞與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，在抗原刺激時展示細胞加倍之至少一、二、三或四倍增加。在一個實施例中，細胞，例如表現本文所述之CAR之細胞，培養擴增5天，且所得細胞展現與在相同培養條件下培養擴增9天之相同細胞相比，更高之促炎性細胞因子產生，例 如IFN-γ及/或GM-CSF含量。在一個實施例中，擴增5天之細胞，例如本文所述之CAR細胞展現與在相同培養條件下培養擴增9天之相同細胞相比，至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多被促炎性細胞因子產生，例如IFN-γ及/或GM-CSF含量之增加(以pg/ml計)。
在本發明之一個態樣中，混合物可培養幾小時(約3小時)至約14天或其間任何小時整數值。在一個態樣中，混合物可培養21天。在本發明之一個態樣中，珠粒與T細胞一起培養約八天。在一個態樣中，珠粒與T細胞一起培養2-3天。
亦可能需要若干刺激循環使得T細胞培養時間可為60天或以上。適於T細胞培養之條件包括可含有增殖及成活力必需之因素的適當培養基(例如，最低限度必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15(Lonza))，包括血清(例如，胎牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟習此項技術者已知之用於細胞生長的任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括(但不限於)界面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑，諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20、Optimizer，添加有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，無血清或補充有適量血清(或血漿)或限定激素組，及/或足以T細胞生長及擴展之量的細胞激素。抗生素(例如青黴素及鏈黴素)僅包括於實驗培養物中，而不在待輸注至個體之細胞培養物中。靶細胞保持於支持生長所必需之條件下，例如適當溫度(例如，37℃)及氛圍(例如，空氣加5% CO2 )。
在一個實施例中，細胞在包括一或多種介白素之適當培養基(例如，本文所描述之培養基)中擴增，導致例如如藉由本文所描述之方法(諸如流動式細胞測量術)所量測，在14天擴增時段內，細胞增加至 少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)。在一個實施例中，細胞在IL-15及/或IL-7(例如IL-15及IL-7)存在下擴增。
在一些實施例中，本文所述之CAR表現細胞(例如T細胞，如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)與包含介白素-15(IL-15)多肽、介白素-15受體α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽及IL-15Ra多肽兩者之組合，例如hetIL-15之組合物在製造CAR表現細胞期間接觸，例如離體。在實施例中，在製造CAR表現細胞期間，例如離體，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在實施例中，在製造CAR表現細胞期間，例如離體，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽與IL-15 Ra多肽之組合的組合物接觸。在實施例中，在製造CAR表現細胞期間，例如離體，使本文所述之CAR表現細胞與包含hetIL-15之組合物接觸。
在一個實施例中，在離體擴增期間使本文所述之CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)與包含hetIL-15之組合物接觸。在一實施例中，在離體擴增期間使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在一實施例中，在離體擴增期間使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽與IL-15Ra多肽之組合物接觸。在一個實施例中，接觸使得淋巴細胞亞群，例如CD8+ T細胞存活及增殖。
在實施例中，本文所揭示之製造方法進一步包含使免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)群體與編碼端粒酶次單元，例如hTERT之核酸接觸。編碼端粒酶次單元之核酸可為DNA。
已暴露於不同刺激時間之T細胞可呈現不同特徵。舉例而言，典型血液或球形周邊血液單核細胞產物具有大於細胞毒素或抑制T細胞群體(TC、CD8+)之輔助T細胞群體(TH、CD4+)。藉由刺激CD3及CD28受體離體擴展T細胞產生在約第8天至第9天之前主要由TH細胞組成的T細胞群體，而在約第8天至第9天之後，T細胞群體包含愈來 愈大之TC細胞群體。因此，視治療目的而定，向個體輸注主要包含TH細胞的T細胞群體可能有利。類似地，若已分離TC細胞之抗原特異性亞型，則可能適宜將此亞型擴展成較大程度。
此外，除了CD4及CD8標記物之外，其他表型標記物顯著變化，但大部分在細胞擴展製程過程中可再現。因此，此類再現性使能夠針對特定目的調整活化T細胞產物。
一旦構築CAR，例如CD19 CAR，各種分析可用於評估分子活性，諸如(但不限於)在抗原刺激之後擴增T細胞、在不存在再刺激的情況下維持T細胞擴增之能力及適當活體外及動物模型中之抗癌活性。下文更詳細描述評估CAR，例如CD19 CAR之作用的分析。
初始T細胞中之CAR表現之西方墨點分析可用於偵測單體及二聚物之存在，例如如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第695段中所述，所述申請案以全文引用的方式併入本文中。
可藉由流動式細胞測量術量測CAR+ T細胞在抗原刺激後的活體外擴展。舉例而言，CD4+ 及CD8+ T細胞之混合物用αCD3/αCD28珠粒刺激，隨後在待分析之啟動子控制下用表現GFP之慢病毒載體轉導。例示性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在培養第6天藉由流動式細胞測量術評估CD4+ 及/或CD8+ T細胞亞群之GFP螢光。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。或者，在第0天用αCD3/αCD28塗佈之磁性珠粒刺激CD4+ 及CD8+ T細胞之混合物，且在第1天使用表現CAR伴隨使用2A核糖體跳躍序列的eGFP之雙順反子豆狀病毒載體經CAR轉導。洗滌之後，在抗CD3及抗CD28抗體(K562-BBL-3/28)存在下，用CD19+ K562細胞(K562-CD19)、野生型K562細胞(K562野生型)或表現hCD32及4-1BBL之K562細胞再刺激培養物。每隔一天向培養物添加100IU/ml外源性IL-2。藉由流動式細胞測量術使用基於珠粒之計數列 舉GFP+ T細胞。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。
亦可量測在再刺激不存在下的持續CAR+ T細胞擴增。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。簡言之，在第0天用αCD3/αCD28塗佈之磁性珠粒刺激且在第1天經指定CAR轉導之後，在培養第8天使用Coulter Multisizer粒子計數器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter量測平均T細胞體積(fl)。
動物模型亦可用於量測表現CAR之細胞活性，例如如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第698段中所述，所述申請案以全文引用的方式併入本文中。
劑量依賴性CAR治療反應可例如如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675第699段中所述評估，該申請案以全文引用的方式併入本文中。細胞增殖及細胞因子產生之評估已在前文描述，例如如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第700段中所述，該申請案以全文引用的方式併入本文中。細胞毒性可藉由標準51 Cr釋放分析評估，例如如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第701段中所述，該申請案以全文引用的方式併入本文中。成像技術可用於評估帶有腫瘤之動物模型中之CAR之特定運輸及增殖，例如如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第702段中所述，該申請案以全文引用的方式併入本文中。
其他分析，包括本文實例章節中所述之分析以及此項技術中已知之分析亦可用於評估本文所述之CAR。
或者，或與本文所揭示之方法組合，揭示涉及使用CAR配位體之CAR表現細胞之偵測及/或定量(例如活體外或活體內(例如臨床監測))、免疫細胞擴增及/或活化及/或CAR特異性選擇中的一或多者之方法及組合物。在一個例示性實施例中，CAR配位體為結合於CAR分 子，例如結合於CAR之胞外抗原結合域之抗體(例如結合於抗原結合域之抗體，例如抗個體基因型抗體；或結合於胞外結合域之恆定區的抗體)。在其他實施例中，CAR配位體為CAR抗原分子(例如如本文所述之CAR抗原分子)。
在一個態樣中，揭示一種用於偵測及/或定量表現CAR之細胞之方法。舉例而言，CAR配位體可用於在活體外或活體內偵測及/或定量CAR表現細胞(例如患者中CAR表現細胞之臨床監測，或患者給藥)。該方法包括：提供CAR配位體(視情況，標記之CAR配位體，例如包括標籤、珠粒、放射性或螢光標記之CAR配位體)；獲取表現CAR之細胞(例如，獲取含有表現CAR之細胞的樣品，諸如製造樣品或臨床樣品)；在發生結合之條件下使表現CAR之細胞與CAR配位體接觸，藉此偵測存在之表現CAR之細胞的含量(例如，量)。可使用諸如FACS、ELISA及其類似物之標準技術，偵測CAR表現細胞與CAR配位體之結合。
在另一個態樣中，揭示一種擴增及/或活化細胞(例如免疫效應細胞)之方法。該方法包括：提供表現CAR之細胞(例如，表現第一CAR之細胞或短暫表現CAR之細胞)；在發生免疫細胞擴增及/或增殖之條件下，使該表現CAR之細胞與CAR配位體(例如，如本文所描述之CAR配位體)接觸，藉此產生活化及/或擴增之細胞群體。
在某些實施例中，CAR配位體存在於(例如，固定或附接至受質，例如非天然存在之受質)上。在一些實施例中，受質為非細胞受質。非細胞受質可為選自以下之固體支撐物：例如盤(例如微量滴定 盤)、膜(例如硝化纖維膜)、基質、晶片或珠粒。在實施例中，CAR配位體存在於受質中(例如受質表面上)。CAR配位體可固定、附接或共價或非共價締合(例如，交聯)於受質。在一個實施例中，CAR配位體附接(例如，共價附接)至珠粒。在前述實施例中，免疫細胞群體可活體外或離體擴增。該方法可進一步包括例如使用本文所描述之任一方法在CAR分子之配位體存在下培養免疫細胞群體。
在其他實施例中，擴增及/或活化細胞之方法進一步包含添加第二刺激分子，例如CD28。舉例而言，CAR配位體及第二刺激分子可固定至受質，例如一或多個珠粒，藉此提供增加之細胞擴增及/或活化。
在其他態樣中，提供一種選擇或富集CAR表現細胞之方法。該方法包括使表現CAR之細胞與如本文所描述之CAR配位體接觸；及基於CAR配位體之結合來選擇細胞。
在其他實施例中，提供一種耗盡(例如減少及/或殺死)CAR表現細胞之方法。該方法包括使CAR表現細胞與如本文所述之CAR配位體接觸；以及基於CAR配位體之結合靶向細胞，由此減少CAR表現細胞之數目及/或殺死CAR表現細胞。在一個實施例中，CAR配位體偶合至毒性劑(例如毒素或細胞消融藥物)。在另一個實施例中，抗個體基因型抗體可引起效應細胞活性，例如ADCC或ADC活性。
可用於本文所揭示之方法中之例示性抗CAR抗體描述於例如WO 2014/190273中且藉由Jena等人，「Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials」,PLOS 2013年3月8：3 e57838描述，該參考文獻之內容以引用的方式併入。在一些態樣及實施例中，本文組合物及方法針對特定T細胞亞群最佳化，例如如描述於2015年7月31日申請的美國序號PCT/US2015/043219中，其內容以全文引用的方式併入本文中。在 一些實施例中，與對照T細胞，例如表現相同構築體之不同類型(例如，CD8+或CD4+)的T細胞相比，最佳化之T細胞亞群顯示增強的持久性。
在一些實施例中，CD4+ T細胞包含本文所描述之CAR，該CAR包含適合於(例如最佳化，例如導致增強的持久性)CD4+ T細胞之胞內信號傳導域，例如ICOS域。在一些實施例中，CD8+ T細胞包含本文所描述之CAR，該CAR包含適合於(例如最佳化，例如導致增強的持久性)CD8+ T細胞之胞內信號傳導域，例如4-1BB域、CD28域或除ICOS域以外的另一共刺激域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含本文所述之抗原結合域，例如包含抗原結合域之CAR。
在一態樣中，本文描述一種治療個體，例如患有癌症之個體的方法。該方法包括向該個體投與有效量之：1)包含CAR(CARCD4+)之CD4+ T細胞，CAR包含：抗原結合域，例如本文所述之抗原結合域；跨膜域；以及胞內信號傳導域，例如第一共刺激域，例如ICOS域；及2)包含CAR(CARCD8+)之CD8+ T細胞，CAR包含：抗原結合域，例如本文所述之抗原結合域；跨膜域；以及胞內信號傳導域，例如第二共刺激域，例如4-1BB域、CD28域或除ICOS域以外的另一共刺激域；其中CARCD4+與CARCD8+彼此不同。
視情況，該方法進一步包括投與：3)包含CAR(第二CARCD8+)之第二CD8+ T細胞，CAR包含：抗原結合域，例如本文所述之抗原結合域；跨膜域；以及 胞內信號傳導域，其中第二CARCD8+包含不存在於CARCD8+上之胞內信號傳導域，例如共刺激信號傳導域，且視情況不包含ICOS信號傳導域。
製造/產生方法
在一些實施例中，本文所揭示之方法另外包括在藉由細胞(例如如本文所述之免疫效應細胞，例如表現藉由截短PGK1啟動子驅動之CAR之免疫效應細胞)處理後投與T細胞耗盡劑，進而減少(例如耗盡)CAR表現細胞(例如CD19 CAR表現細胞)。此類T細胞耗盡劑可用於有效地耗盡CAR表現細胞(例如CD19 CAR表現細胞)以緩和毒性。在一些實施例中，根據本文中之方法製造，例如根據本文中之方法分析(例如在轉染或轉導之前或之後)表現CAR之細胞。
在一些實施例中，在投與本文所描述之細胞(例如，免疫效應細胞群體)之後一週、兩週、三週、四週或五週投與T細胞耗盡劑。
在一個實施例中，T細胞耗盡劑為例如藉由誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體誘導之細胞死亡使表現CAR之細胞耗盡之藥劑。舉例而言，本文所述之CAR表現細胞亦可表現由能夠誘導細胞死亡(例如，ADCC或補體誘導之細胞死亡)之分子識別之抗原(例如，靶抗原)。舉例而言，本文所述之CAR表現細胞亦可表現能夠藉由抗體或抗體片段靶向之靶蛋白(例如，受體)。此類靶蛋白之實例包括(但不限於)EpCAM、VEGFR、整合素(例如，整合素ανβ3、α4、αI¾β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受體超家族之成員(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、 CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白(basigin)、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及EGFR，及其截短形式(例如，保存一或多個胞外抗原決定基但在細胞質域內缺乏一或多個區域之形式)。
在一些實施例中，表現CAR之細胞共表現CAR及靶蛋白，例如自然表現靶蛋白或經工程改造以表現靶蛋白。舉例而言，細胞，例如免疫效應細胞群體可包括包含CAR核酸(例如，如本文所描述之CAR核酸)之核酸(例如，載體)及編碼靶蛋白之核酸。
在一個實施例中，T細胞耗盡劑為CD52抑制劑，例如抗CD52抗體分子，例如阿侖單抗(alemtuzumab)。
在其他實施例中，細胞，例如免疫效應細胞群體表現如本文所述之CAR分子(例如CD19 CAR)及藉由T細胞耗盡劑識別之靶蛋白。在一個實施例中，靶蛋白為CD20。在實施例中，當靶蛋白為CD20時，T細胞耗盡劑為抗CD20抗體，例如利妥昔單抗(rituximab)。
在任一前述方法之其他實施例中，該等方法進一步包括將細胞(例如，造血幹細胞)或骨髓移植至哺乳動物中。
在另一態樣中，本發明提供一種在細胞移植之前調理哺乳動物之方法。方法包括向哺乳動物投與有效量之包含CAR核酸或多肽，例如CD19 CAR核酸或多肽之細胞。在一些實施例中，細胞移植為幹細胞移植(例如，造血幹細胞移植)或骨髓移植。在其他實施例中，在細胞移植之前調節個體包括減少個體中表現標靶之細胞，例如表現CD19之正常細胞或表現CD19之癌細胞的數目。
生物聚合物傳遞方法
在一些實施例中，一或多個如本文所揭示之表現CAR之細胞可經由生物聚合物支架，例如生物聚合物植入物投與或傳遞至個體。生物 聚合物骨架可支撐或增強本文所述之CAR表現細胞之遞送、擴增及/或分散。生物聚合物骨架包含可天然存在或合成之生物相容性(例如，不實質上誘導發炎性或免疫反應)及/或生物可降解之聚合物。例示性生物聚合物描述於例如2015年3月13日申請之國際申請案WO2015/142675之第1004-1006段中，其以全文引用的方式併入本文中。
治療應用 CD19相關疾病及/或病症
在一態樣中，本發明提供用於治療與CD19表現相關之疾病的方法。在一個態樣中，本發明提供治療其中一部分癌症為CD19陰性且一部分癌症為CD19陽性之疾病的方法。舉例而言，本發明之方法及組合物適用於治療已經歷與CD19表現相關之疾病之治療的個體，其中已經歷與CD19表現相關之治療，例如用CD19 CAR治療的個體展現與CD19表現相關之疾病。
在另一態樣中，本發明提供治療與B細胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之表現相關之疾病之方法。在一態樣中，本發明提供治療疾病之方法，其中部分腫瘤為B細胞抗原陰性且部分腫瘤為B細胞抗原陽性。舉例而言，本發明之組合物及方法適用於治療已經歷與B細胞抗原表現相關之疾病之治療的個體，其中已經歷與B細胞抗原表現相關之治療，例如用靶向B細胞抗原之CAR治療的個體展現與B細胞抗原表現相關之疾病。在第三態樣中，本發明提供治療與B細胞抗原表現相關，例如與CD19及一或多種其他B細胞抗原表現相關之疾病的方法。
在一態樣中，本發明關於包含可操作地連接於啟動子以表現於哺乳動物細胞，例如T細胞或NK細胞中之CD19 CAR的載體。在一態樣中，本發明提供用於治療CD19表現癌症之表現CD19 CAR之重組細 胞，例如T細胞或NK細胞，其中表現CD19 CAR之重組T細胞被稱為CD19 CART。在一態樣中，本文所述之CD19 CART能夠使癌細胞與至少一個表現於其表面上之CD19 CAR接觸，使得CART靶向癌細胞且癌症生長經抑制。
在一態樣中，本發明關於CD22抑制劑，其為CD22 CART，例如T細胞，表現與CD19 CART組合用於治療CD22表現腫瘤之CD22 CAR，其中表現CD22 CAR之重組T細胞被稱為CD22 CART。在一態樣中，本文所述之CD22 CART能夠使腫瘤細胞與至少一個表現於其表面上之CD22 CAR接觸，使得CD22 CART靶向腫瘤細胞且腫瘤之生長經抑制。
在一態樣中，本發明關於抑制CD19表現癌細胞生長之方法，其包含使癌細胞與描述之CD19 CAR表現細胞，例如CD19 CART細胞及一或多種其他CAR表現細胞(例如如本文所述)接觸，使得CART回應於抗原而活化且靶向癌細胞，其中癌症之生長經抑制。CD19 CAR表現細胞，例如T細胞與B細胞抑制劑，例如本文所述之B細胞抑制劑組合投與。
在一些實施例中，CD19抑制劑(例如一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如結合本文所述之CD19之CAR分子的細胞)及B細胞抑制劑(例如一或多種CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1之抑制劑，例如如本文所述)同時投與。在一些實施例中，CD19抑制劑及B細胞抑制劑同時輸注至個體中，例如以相同輸注體積混合。在其他實施例中，同時投與包含分開投與CD19抑制劑及B細胞抑制劑，例如在預定時間間隔(例如彼此之15、30或45分鐘內)內起始各者之投與。
在一些實施例中，CD19抑制劑傳遞之起始及B細胞抑制劑傳遞之起始在彼此之1、2、3、4、6、12、18或24小時內，或在彼此之1、 2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、60、80或100天內。在一些實施例中，CD19抑制劑傳遞之結束及B細胞抑制劑傳遞之結束在彼此之1、2、3、4、6、12、18或24小時內，或在彼此之1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、60、80或100天內。在一些實施例中，CD19抑制劑傳遞(例如輸注)與B細胞抑制劑傳遞(例如輸注)結束之間就投與而言的重疊為至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30或45分鐘。
在一些實施例中，在一或多種表現結合CD19之CAR分子之細胞存在(例如經歷擴增)於個體中時投與B細胞抑制劑。在一些實施例中，在一或多種表現結合CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之CAR分子之細胞存在(例如經歷擴增)於個體中時投與CD19抑制劑。
本發明(尤其)包括一種類型的細胞療法，其中T細胞經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)且CAR T細胞灌注至有需要之接收者。輸注之細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。不同於抗體療法，CAR修飾之T細胞能夠活體內複製，導致可能引起持久腫瘤控制之長期持續性。在各種態樣中，向患者或其後代投與細胞，在向患者投與T細胞後在患者體內保持至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、十三個月、十四個月、十五個月、十六個月、十七個月、十八個月、十九個月、二十個月、二十一個月、二十二個月、二十三個月、兩年、三年、四年或五年。
本發明亦包括一種類型的細胞療法，其中免疫效應細胞，例如NK細胞或T細胞經修飾，例如藉由活體外轉錄RNA，以短暫表現嵌合抗原受體(CAR)且CAR表現(例如CAR T)細胞灌注至有需要之接收者。輸注之細胞能夠殺死接受者中之癌細胞。因此，在各種態樣中，向患者投與之CAR表現細胞，例如T細胞在向患者投與CAR表現細 胞，例如T細胞之後存在小於一個月，例如三週、兩週、一週。
不希望受任何特定理論束縛，由CAR修飾T細胞引發之抗癌免疫性反應可為主動或被動免疫反應，或者可歸因於直接對間接免疫反應。在一態樣中，CAR(例如CD19-CAR)轉導之T細胞展現特定促炎性細胞因子分泌及回應於表現靶抗原(例如CD19)之人類癌細胞之有效溶細胞活性，抵抗可溶性靶抗原抑制，介導旁觀者殺死且介導已建立之人類腫瘤的消退。舉例而言，靶抗原表現癌症之異質場內的抗原較少之癌細胞可能對靶抗原重導向T細胞的間接損壞敏感，該等T細胞先前已針對相鄰抗原陽性癌細胞反應。
在一態樣中，本發明之CAR修飾細胞，例如完全人類CAR T細胞可為用於哺乳動物製造離體免疫接種及/或活體內療法之一種類型的疫苗。在一態樣中，哺乳動物為人類。
關於離體免疫接種，在向哺乳動物投與細胞之前，活體外進行以下中之至少一者：i)擴增細胞，ii)向細胞中引入編碼CAR之核酸或iii)低溫保存細胞。
離體程序為此項技術中熟知且在下文中更完全論述。簡言之，細胞自哺乳動物(例如，人類)分離且經表現本文所揭示之CAR的載體遺傳修飾(亦即，活體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與CAR修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人類且CAR修飾細胞可關於接受者為自體的。或者，細胞關於接受者可為同種異體、同系或異種的。
用於離體擴增造血幹細胞及祖細胞之程序描述於以引用的方式併入本文中之美國專利第5,199,942號中，且可應用於本發明之細胞。其他適合方法為此項技術中已知，因此本發明不限於任何特定離體擴增細胞之方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增可包含：(1)藉由周邊血液採集或骨髓外植體自哺乳動物收集CD34+造血幹細胞及祖細 胞；及(2)離體擴增此類細胞。除了美國專利第5,199,942號中描述之細胞生長因子之外，諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-套組配位體之其他因素可用於培養及擴增該等細胞。
除了就離體免疫接種而言使用基於細胞之疫苗之外，本文所描述之方法中亦包括用於活體內免疫接種以針對患者中之抗原引起免疫反應的組合物及方法。
一般而言，如本文所描述之活化及擴增之細胞可用於治療及預防免疫功能不全之個體中產生的疾病。特定言之，本文所述之CAR表現細胞用於治療與一或多種B細胞抗原之表現相關之疾病、病症及病況。在某些態樣中，細胞用於治療處於罹患與一或多種B細胞抗原之表現相關之疾病、病症及病況之風險下之患者。因此，本發明(尤其)提供治療或預防與B細胞抗原之表現相關之疾病、病症及病況之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所述之CD19 CAR表現細胞，以及本文所述之B細胞抑制劑中的一或多者。
本發明亦提供抑制增殖或減少CD19表現細胞群體之方法，方法包含使包含CD19表現細胞之細胞群體與結合至CD19表現細胞之本文所述之抗CD19 CAR表現細胞接觸，及使CD19表現細胞群體與本文所述之B細胞抑制劑中的一或多者接觸。在一特定態樣中，本發明提供抑制增殖或減少表現CD19之癌細胞群體之方法，方法包含使CD19表現癌細胞群體與結合至CD19表現細胞之本文所述之抗CD19 CAR表現細胞接觸，及使CD19表現細胞與一或多種本文所述之B細胞接觸。在一態樣中，本發明提供抑制增殖或減少表現CD19之癌細胞群體之方法，方法包含使CD19表現癌細胞群體與結合至CD19表現細胞之本文所述之抗CD19 CAR表現細胞接觸及使CD19表現細胞與一或多種本文所述之B細胞接觸。在某些態樣中，本文所述之抗CD19 CAR表現細胞與一或多種本文所述之B細胞之組合使患有血液癌或另一與CD19表 現細胞有關之癌症的個體或用於該癌症之動物模型中的細胞及/或癌細胞的數量、數目、量或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一態樣中，個體為人類。
本發明亦提供抑制增殖或減少包含CD19表現細胞及表現第二B細胞抗原之細胞的細胞群體之方法。在一態樣中，CD19及第二B細胞抗原由群體內之相同細胞表現。在另一態樣中，CD19及第二B細胞抗原由群體內之相異細胞亞群表現。在另一態樣中，CD19及第二B細胞抗原由群體內之重疊細胞亞群表現，使得一些細胞表現CD19及第二B細胞抗原，一些細胞表現CD19，且一些細胞表現第二B細胞抗原。
本發明亦提供抑制增殖或減少表現CD19及第二B細胞抗原之細胞群體之方法，方法包含(i)使包含CD19表現細胞之細胞群體與結合至CD19表現細胞之本文所述之抗CD19 CAR表現細胞接觸，及(ii)使第二B細胞抗原表現細胞與結合至第二B細胞抗原表現細胞之本文所述之第二CAR表現細胞接觸。在一特定態樣中，本發明提供抑制增殖或減少表現CD19及第二B細胞抗原之癌細胞群體之方法，方法包含(i)使CD19表現癌細胞群體與結合至CD19表現細胞之本文所述之抗CD19 CAR表現細胞接觸，及(ii)使第二B細胞抗原表現細胞群體與結合至表現第二B細胞抗原之細胞之本文所述之第二CAR表現細胞接觸。在一態樣中，本發明提供抑制增殖或減少表現CD19及/或第二B細胞抗原之癌細胞群體之方法，方法包含(i)使CD19表現癌細胞群體與結合至CD19表現細胞之本文所述之抗CD19 CAR表現細胞接觸，及(ii)使第二B細胞抗原表現細胞群體與結合至表現第二B細胞抗原之細胞之本文所述之第二CAR表現細胞接觸。在某些態樣中，本文所述之抗CD19 CAR表現細胞與本文所述之第二CAR表現細胞之組合使患有血液癌或另一與CD19及/或第二B細胞抗原表現細胞有關之癌症的個體 或用於該癌症之動物模型中的細胞及/或癌細胞的數量、數目、量或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一態樣中，個體為人類。
本發明亦提供預防、治療及/或管理與CD19表現細胞相關之疾病(例如血液癌或表現CD19之非典型癌症)之方法，方法包含向有需要之個體投與結合至CD19表現細胞之抗CD19 CAR表現細胞及投與一或本文所述之B細胞抑制劑。在一態樣中，個體為人類。與CD19表現細胞相關之病症之非限制性實例包括自體免疫病症(諸如狼瘡)、發炎性病症(諸如過敏及哮喘)及癌症(諸如表現CD19之血液癌或非典型癌症)。
本發明亦提供預防、治療及/或管理與CD19及/或第二B細胞抗原表現細胞相關之疾病(例如血液癌或表現CD19及/或第二B細胞抗原之非典型癌症)之方法，方法包含向有需要之個體投與結合至CD19表現細胞及B細胞抑制劑之抗CD19 CAR表現細胞。
本發明亦提供預防、治療及/或管理與CD19表現細胞相關之疾病之方法，方法包含向有需要之個體投與結合至CD19表現細胞之本發明之抗CD19 CART細胞。在一態樣中，個體為人類。
本發明亦提供預防與CD19表現細胞相關之癌症復發之方法，方法包含向有需要之個體投與結合至CD19表現細胞之本發明之抗CD19 CART細胞。在一態樣中，方法包含向有需要之該個體投與有效量的結合至CD19表現細胞之本文所述之抗CD19 CART細胞以及有效量的另一療法。
在一個態樣中，本發明係關於一種治療個體中癌症之方法。方法包含向個體投與CD19 CAR表現細胞，例如本文所述之T細胞，以及B細胞抑制劑，使得個體中之癌症經治療。可藉由本文所描述之方法治療之癌症之實例為與CD19表現相關之癌症。在一個實施例中， 疾病為實體或液體腫瘤。在一個實施例中，疾病為例如如本文所描述之血液癌。
與CD19表現相關之非癌症相關適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病(例如狼瘡)、發炎性病症(過敏及哮喘)及移植。
在一些實施例中，可用處本文所述之組合治療之癌症為多發性骨髓瘤。多發性骨髓瘤為血液癌，其特徵為骨髓中之漿細胞純系之積聚。多發性骨髓瘤之當前療法包括(但不限於)用來那度胺(其為沙立度胺之類似物)治療。來那度胺具有包括抗腫瘤活性、血管生成抑制及免疫調節之活性。在一些實施例中，例如如本文所述之CD19 CAR可用於靶向骨髓瘤細胞。在一些實施例中，本文所述之組合可與一或多種額外療法，例如來那度胺治療一起使用。
本文所述之CAR表現細胞可單獨投與，或作為與稀釋劑及/或其他組分(諸如IL-2或其他細胞因子或細胞群體)組合的醫藥組合物形式投與。
血液癌
血液癌病況為諸如白血病、淋巴瘤及惡性淋巴組織增生病況之影響血液、骨髓及淋巴系統的癌症類型。
在一個實施例中，血液癌為白血病。在一個實施例中，癌症選自由以下組成之群：一或多種急性白血病，包括(但不限於)B細胞急性淋巴白血病(BALL)、T細胞急性淋巴白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；額外血液癌或血液學病況，包括(但不限於)套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴增生病況、MALT淋巴瘤、邊 緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症及「白血病前驅症」，其為由骨髓血細胞之低效產生(或發育不良)聯合之血液病況之多樣性集合。與CD19、CD20或CD22表現相關之疾病包括(但不限於)表現CD19、CD20或CD22之非典型及/或非經典癌症、惡性腫瘤、癌變前病況或增生性疾病；及其任何組合。
白血病可分類為急性白血病及慢性白血病。急性白血病可進一步分類為急性骨髓白血病(AML)及急性淋巴白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓白血病(CML)及慢性淋巴白血病(CLL)。其他相關病狀包括骨髓發育不良症候群(MDS，以前稱為「白血病前驅症」)，其為由骨髓血細胞無效產生(或發育不良)及轉化成AML之風險聯合之各種血液病狀。
淋巴瘤為自淋巴細胞發展之一組血細胞腫瘤。例示性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)及霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)。
在一態樣中，本發明關於一種治療患有霍奇金淋巴瘤之哺乳動物之方法，其包含向哺乳動物投與有效量的表現CD19 CAR分子，例如本文所述之CD19 CAR分子及B細胞抑制劑之細胞。
在一態樣中，本發明之組合物及CART細胞或CAR表現NK細胞特別適用於治療B細胞惡性腫瘤，如非霍奇金氏淋巴瘤，例如DLBCL、濾泡性淋巴瘤或CLL。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)為由B細胞或T細胞形成之一群淋巴細胞癌。NHL發生於任何年齡且通常藉由大於正常之淋巴結、體重損失及發熱來表徵。不同類型之NHL分類為侵襲性(快速生長)及惰性(緩慢生長)類型。B細胞非霍奇金氏淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤、慢性淋巴球性 白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前驅體B-淋巴母細胞性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤。T細胞非霍奇金氏淋巴瘤之實例包括蕈樣真菌病、多形性大細胞淋巴瘤及前驅體T-淋巴母細胞性淋巴瘤。骨髓或幹細胞移植後發生之淋巴瘤通常為B細胞非霍奇金氏淋巴瘤。參見例如Maloney.NEJM.366.21(2012)：2008-16。
彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)為產生自B細胞之一種形式之NHL。DLBCL為可產生於淋巴結中或淋巴系統之外，例如胃腸道、睾丸、甲狀腺、皮膚、乳房、骨骼或大腦組織侵襲性淋巴瘤。通常在DLBCL中觀測到細胞形態之三種變異體：中心母細胞性、免疫母細胞性及多形性。中心母細胞性形態最常見且具有具有最小細胞質之中等到大型尺寸化淋巴細胞之外觀。存在DLBCL之若干亞型。舉例而言，原發性中樞神經系統淋巴瘤為僅影響大腦之一種類型的DLBCL，與影響大腦以外的區域之DLBCL不同地稱呼及治療。另一類型的DLBCL為原發性縱隔B細胞淋巴瘤，其通常出現於較年輕患者中且在胸部中快速生長。DLBCL之症狀包括頸部、腋窩或腹股溝中之無痛快速腫脹，其由增大之淋巴結引起。對於一些個體，腫脹可能疼痛。DLBCL之其他症狀包括盜汗、不明原因發熱及體重損失。儘管患有DLBCL之大部分患者為成人，此疾病有時出現於兒童中。DLBCL之治療包括化學療法(例如環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼、潑尼松、依託泊苷)、抗體(例如Rituxan)、輻射或幹細胞移植。
濾泡性淋巴瘤，一種類型的非霍奇金淋巴瘤且為濾泡中心B細胞(中心細胞及中心母細胞)之淋巴瘤，其具有至少部分濾泡型。濾泡性淋巴瘤細胞表現B細胞標記物CD10、CD19、CD20及CD22。濾泡性淋巴瘤細胞通常對於CD5呈陰性。形態上，濾泡性淋巴瘤腫瘤由含有中心細胞(亦稱作裂解濾泡中心細胞或小細胞)及中心母細胞(亦稱作大型 非裂解濾泡中心細胞或大細胞)之混合物的濾泡組成。濾泡有非惡性細胞(大多T細胞)圍繞。濾泡主要含有具有少數中心母細胞之中心細胞。世界衛生組織(WHO)對疾病形態上分級如下：級別1(每高倍視野(hpf)<5個中心母細胞；級別2(每hpf 6-15個中心母細胞)；級別3(每hpf>15個中心母細胞)。級別3另外細分為以下級別：級別3A(中心細胞仍存在)；級別3B(濾泡幾乎完全由中心母細胞組成)。濾泡性淋巴瘤之治療包括化學療法，例如烷基化劑、核苷類似物、含蒽環黴素方案，例如稱作CHOP-環磷醯胺之組合療法、小紅莓、長春新鹼、潑尼松/潑尼龍、抗體(例如利妥昔單抗)、放射免疫治療及造血幹細胞移植。
CLL為藉由骨髓、血液、淋巴結及脾臟中之瘤性細胞增殖及積聚表徵之B細胞惡性病。CLL之診斷時間之中值年齡為約65歲。當前治療包括化學療法、放射療法、生物療法或骨髓移植。症狀有時以外科手術方式(例如增大脾臟之脾切除術移除)或藉由放射療法(例如腫脹淋巴結去膨脹)治療。治療CLL之化學治療劑包括例如氟達拉賓、2-氯去氧腺苷(克拉屈濱)、苯丁酸氮芥、長春新鹼、噴司他丁、環磷醯胺、阿侖單抗(Campath-1H)、小紅莓及強的松(prednisone)。用於CLL之生物療法包括抗體，例如阿侖單抗、利妥昔單抗及奧伐木單抗；以及酪胺酸激酶抑制劑療法。多種標準可用於分類CLL之階段，例如Rai或Binet系統。Rai系統描述具有五個階段之CLL：階段0，其中僅存在淋巴細胞增多；階段I，其中存在淋巴結病；階段II，其中存在脾腫大、淋巴結病或兩者；階段III，其中存在貧血、內臟增大或兩者(進展由體重損失、疲乏、發熱、大規模內臟增大及快速增加之淋巴細胞計數定義)；及階段IV，其中存在貧血、血小板減少症、內臟增大或其組合。在Binet分級系統下，存在三種類別：階段A，其中存在淋巴細胞增多且小於三個淋巴結經增大(此階段包括所有Rai階段0患者、一般Rai階段I患者及三分之一Rai階段II患者)；階段B，其中包括三個或三 個以上淋巴結；及階段C，其中存在貧血或血小板減少症或兩者。此等分類系統可與免疫球蛋白基因之突變之量測組合以提供疾病狀態之更精確表徵。突變免疫球蛋白基因之存在與改進之預後相關。
在另一實施例中，本發明之CAR表現細胞用於治療癌症或白血病，例如藉由白血病幹細胞。舉例而言，白血病幹細胞為CD34+ /CD38- 白血病細胞。
CD20及CD22相關疾病及/或病症
本發明尤其提供用於治療與CD20或CD22表現相關之疾病或與表現CD20或CD22之細胞相關之病況，包括例如增生性疾病，如癌症或惡性腫瘤或癌變前病況；或與表現CD20或CD22之細胞相關之非癌症相關適應症之組合物及方法。在一態樣中，與CD22表現相關之癌症為血液癌，例如本文所述之血液癌。
亦可包括與CD20或CD22表現相關之非癌症相關適應症。與CD20或CD22表現相關之非癌症相關適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病(例如狼瘡、類風濕性關節炎、多發性硬化症、自體免疫性溶血性貧血、純紅血球發育不全、特發性血小板減少性紫癜、伊凡氏症候群、血管炎、大皰性皮膚病症、1型糖尿病、休格連氏症候群、抗NMDA受體腦炎及德維克氏病、格雷夫氏眼病及自體免疫胰臟炎)、發炎性病症(過敏及哮喘)及實體器官或造血細胞移植。
本文所揭示之組合物及方法可用於治療血液病，尤其包括(但不限於)骨髓發育不良、貧血、陣發性夜間血紅素尿症、再生不全性貧血、後天性純紅血球貧血、狄-勃二氏貧血(Diamon-Blackfan anemia)、范康尼氏貧血(Fanconi anemia)、細胞減少症、巨核細胞血小板減少症、骨髓增殖性病症、真性紅血球增多症、原發性血小板增多症、骨髓纖維化、血紅素病、鐮狀細胞病、β重度地中海貧血症。
在一個態樣中，本發明提供用於治療與CD22表現相關之疾病的 方法。在一態樣中，本發明提供治療疾病之方法，其中腫瘤之一部分對於CD20或CD22呈陰性且腫瘤之一部分對於CD20或CD22呈陽性。舉例而言，本發明之CAR適用於治療經歷與CD20或CD22表現相關之疾病之治療之個體，其中經歷與CD20或CD22表現相關之治療之個體展現與CD20或CD22表現相關之疾病。
在一態樣中，本發明係關於一種抑制CD20或CD22表現腫瘤細胞之生長之方法，其包含使腫瘤細胞與本發明之CD20或CD22 CAR細胞(例如T細胞或NK細胞)接觸，使得CART回應於抗原而活化且靶向癌細胞，其中腫瘤生長經抑制。
在一個態樣中，本發明係關於一種治療個體中癌症之方法。方法包含向個體投與本發明之CD20或CD22 CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)，使得個體中之癌症經治療。可藉由本發明之CD20或CD22 CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)治療之癌症之實例為與CD20或CD22表現相關之癌症。可藉由本發明之CD20或CD22 CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞治療之癌症之實例包括(但不限於)本文所述之血液癌。
本發明包括一種類型的細胞療法，其中細胞(例如T細胞或NK細胞)經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)且CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)輸注至有需要之接受者。輸注之細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。不同於抗體療法，CAR修飾細胞(例如T細胞或NK細胞)能夠活體內複製，導致可能引起持續腫瘤控制之長期持續性。在各種態樣中，向患者或其後代投與細胞(例如T細胞或NK細胞)，在向患者投與T細胞後在患者體內保持至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、十三個月、十四個月、十五個月、十六個月、十七個月、十八個月、十九個月、二十個月、二十一個月、二十二個月、二十三個月、兩年、三年、四年或五 年。
本發明亦包括一種類型的細胞療法，其中免疫效應細胞(例如，NK細胞或T細胞)例如經活體外轉錄之RNA修飾以短暫表現嵌合抗原受體(CAR)，且CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)輸注至有需要之接受者。輸注之細胞能夠殺死接受者中之癌細胞。因此，在各種態樣中，CAR表現細胞，例如T細胞或NK細胞投與至患者，在CAR表現細胞，例如T細胞或NK細胞投與至患者之後存在少於一個月，例如三週、兩週、一週。
在不希望受任何特定理論束縛之情況下，由經CAR修飾之細胞(例如，T細胞或NK細胞)引發之抗腫瘤免疫反應可為主動或被動免疫反應，或者可歸因於直接對間接免疫反應。在一個態樣中，CAR轉導細胞(例如，T細胞或NK細胞)展現特定促炎性細胞因子分泌及回應於表現CD20或CD22之人類癌細胞之有效細胞溶解活性，抵抗可溶性CD20或CD22抑制，介導旁觀者殺死且介導已建立之人類腫瘤的消退。舉例而言，CD20或CD22表現腫瘤之異質場內的抗原較少之腫瘤細胞可能對CD20或CD22重導向T細胞的間接損壞敏感，該等T細胞先前已針對相鄰抗原陽性癌細胞反應。
在一態樣中，本發明之CAR修飾細胞(例如T細胞或NK細胞)，例如完全人類CAR表現細胞可為用於哺乳動物中之離體免疫接種及/或活體內療法之一種類型的疫苗。在一態樣中，哺乳動物為人類。
關於離體免疫接種，在向哺乳動物投與細胞之前，活體外進行以下中之至少一者：i)擴增細胞，ii)向細胞中引入編碼CAR之核酸或iii)低溫保存細胞。
離體程序為此項技術中熟知且在下文中更完全論述。簡言之，細胞自哺乳動物(例如，人類)分離且經表現本文所揭示之CAR的載體遺傳修飾(亦即，活體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與CAR 修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人類且CAR修飾細胞可關於接受者為自體的。或者，細胞關於接受者可為同種異體、同系或異種的。
用於離體擴增造血幹細胞及祖細胞之程序描述於以引用的方式併入本文中之美國專利第5,199,942號中，且可應用於本發明之細胞。其他適合方法為此項技術中已知，因此本發明不限於任何特定離體擴增細胞之方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增包含：(1)藉由周邊血液採集或骨髓外植體自哺乳動物收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2)離體擴增此類細胞。除了美國專利第5,199,942號中描述之細胞生長因子之外，諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-套組配位體之其他因素可用於培養及擴增該等細胞。
除了在離體免疫接種方面使用基於細胞之疫苗之外，本發明亦提供用於活體內免疫接種以針對患者中之抗原引發免疫反應之組合物及方法。
一般而言，如本文所描述之活化及擴增之細胞可用於治療及預防免疫功能不全之個體中產生的疾病。特定言之，本發明之CAR修飾細胞(例如T細胞或NK細胞)用於治療與CD20或CD22表現相關之疾病、病症及病況。在某些態樣中，本發明之細胞用於治療處於罹患與CD20或CD22表現相關之疾病、病症及病況風險下的患者。因此，本發明提供治療或預防與CD20或CD22表現相關之疾病、病症及病況之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之CAR修飾細胞(例如T細胞或NK細胞)。
在一態樣中，本發明之CAR表現細胞可用於治療增生性疾病，如癌症或惡性腫瘤或癌變前病況。在一態樣中，與CD20或CD22表現相關之癌症為血液癌白血病前驅症、過度增生性病症、增生或發育不良，其特徵為細胞生長異常。
本發明之CAR修飾細胞可單獨投與或作為與稀釋劑及/或其他組分(諸如IL-2或其他細胞因子或細胞群體)組合的醫藥組合物形式投與。
本發明亦抑制增殖或減少CD20或CD22表現細胞群體之方法，方法包含使包含CD20或CD22表現細胞之細胞群體與結合至CD20或CD22表現細胞之本發明之CD20或CD22 CAR表現細胞接觸。在一特定態樣中，本發明提供抑制增殖或減少表現CD20或CD22之癌細胞群體之方法，方法包含使CD20或CD22表現癌細胞群體與結合至CD20或CD22表現細胞之本發明之CD20或CD22 CAR表現細胞接觸。在一態樣中，本發明提供抑制增殖或減少表現CD20或CD22之癌細胞群體之方法，方法包含使CD20或CD22表現癌細胞群體與結合至CD20或CD22表現細胞之本發明之CD20或CD22 CART接觸。在某些態樣中，本發明之CD20或CD22 CAR表現細胞使患有B細胞惡性病或另一與CD20或CD22表現細胞有關之癌症的個體或用於該病症之動物模型中的細胞及/或癌細胞的數量、數目、量或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一態樣中，個體為人類。
本發明提供用於預防與CD20或CD22表現細胞有關之癌症復發的方法，方法包含向有需要之個體投與結合至CD20或CD22表現細胞的本發明之CD20或CD22 CAR表現細胞。在一態樣中，方法包含向有需要之個體投與有效量之結合至CD20或CD22表現細胞的本文所述之CD20或CD22 CAR表現細胞與有效量之另一療法之組合。
在一些實施例中，CD22表現細胞表現CD19、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD179b、CD79a、CD10、CD34及/或CD20。在某些實施例中，CD22表現細胞表現CD19。在一些實施例中，CD22表現細胞不表現CD19。在一些實施例中，CD20表現細胞表現CD19、 CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD179b、CD79a、CD10、CD34及/或CD22。在某些實施例中，CD20表現細胞表現CD19。在一些實施例中，CD20表現細胞不表現CD19。
在一些實施例中，個體為對於CD19 CAR療法之無反應者。在一些實施例中，個體為對於CD19 CAR療法之部分反應者。在一些實施例中，個體為對於CD19 CAR療法之完全反應者。在一些實施例中，個體為對於CD19 CAR療法之非復發者。在一些實施例中，個體為對於CD19 CAR療法之部分復發者。在一些實施例中，個體為對於CD19 CAR療法之完全復發者。
在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況不表現CD19。在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況相對於癌症或其他病況對用CD19 CAR表現細胞治療有反應時具有CD19表現量之10%、20%、30%、40%、50%或50%以上減小。在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況表現CD20、CD22、CD123或其任何組合。
在一些實施例中，本發明之CD20或CD22 CAR表現細胞在先前用CD19 CAR表現細胞治療之癌症或其他病況復發後投與。在一些實施例中，CD19 CAR表現細胞及CD20或CD22 CAR表現細胞同時投與，如本文所述。
骨髓消融
在一個態樣中，本發明提供用於骨髓消融之組合物及方法。舉例而言，在一個態樣中，本發明提供用於根除個體中存在之骨髓的至少一部分之組合物及方法。在某些情況下，本文中描述包含本發明之CAR之CD19、C20、或CD22 CAR表現細胞根除CD19、C20或CD22陽性骨髓祖細胞。
在一態樣中，本發明提供一種骨髓消融方法，其包含向需要骨髓消融之個體投與本發明之CD19、C20或CD22表現CAR細胞(例如T細胞或NK細胞)。舉例而言，本發明方法可用於根除患有疾病或病症之個體存在之骨髓的一些或全部，其中骨髓移植或骨髓修復為有益治療策略。在一態樣中，在骨髓移植之前在個體中進行本發明之骨髓消融方法，包含投與本文中其他地方描述之CD19、C20或CD22表現CAR細胞(例如T細胞或NK細胞)。因此，在一個態樣中，本發明方法提供在骨髓或幹細胞移植之前的細胞調理療法。在一個態樣中，骨髓移植包含幹細胞移植。骨髓移植可包含自體或同種異體細胞之移植。
本發明提供一種治療疾病或病症之方法，其包含投與本發明之CD19、C20或CD22表現CAR細胞(例如，T細胞或NK細胞)以根除存在之骨髓的至少一部分。該方法可用作治療任何疾病或病症之治療方案的至少一部分，其中骨髓移植為有益的。亦即，本發明方法可用於需要骨髓移植之任何個體。在一態樣中，包含投與CD19、C20或CD22表現CAR細胞(例如T細胞或NK細胞)之骨髓消融適用於治療AML。在某些態樣中，骨髓消融藉助於本發明方法適用於治療血液癌、實體腫瘤、血液疾病、代謝障礙、HIV、HTLV、溶酶體儲存障礙及免疫缺乏。
本文揭示之組合物及方法可用於根除存在之骨髓的至少一部分以治療血液癌，包括(但不限於)本文所述之癌症，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、ALL、AML、CLL、CML、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如DLBCL或濾泡性淋巴瘤)及多發性骨髓瘤。
在一態樣中，本發明提供一種包含骨髓調節之治療癌症之方法，其中個體之骨髓的至少一部分藉由本發明之CD22 CAR細胞(例如T細胞或NK細胞)根除。舉例而言，在某些情況下，個體之骨髓包含可藉由C20或CD22 CAR細胞(例如T細胞或NK細胞)之活性靶向及消除 之惡性前驅體細胞。在一個態樣中，骨髓調理療法包含向個體投與骨髓或幹細胞移植，隨後根除原生骨髓。在一個態樣中，骨髓再調理療法與一或多種其他抗癌療法組合，包括(但不限於)抗腫瘤CAR療法、化學療法、輻射及其類似療法。
在一態樣中，可能需要在輸注骨髓或幹細胞移植之前根除投與之CD19、CD20或CD22 CAR表現細胞。根除CD19、CD20或CD22表現CAR細胞(例如，T細胞或NK細胞)可使用任何適合之策略或治療實現，包括(但不限於)使用自殺基因、使用RNA編碼之CAR之有限CAR持久性或包括抗體之抗T細胞模式或化學療法。
組合療法
如本文所述之CAR組合(例如本文所述之CD20 CAR、CD22 CAR或CD19 CAR表現細胞，例如及一或多種B細胞抑制劑，例如如本文所述)可與其他已知藥劑及療法組合使用。
本文所述之CAR表現細胞(例如CD20 CAR、CD22 CAR或CD19 CAR表現細胞)、視情況存在之一或多種B細胞抑制劑及/或至少一種其他治療劑可同時、在相同或獨立組合物中或依序投與。對於依序投與，本文所述之CAR表現細胞(例如CD20 CAR、CD22 CAR或CD19 CAR表現細胞)可首先投與，且額外藥劑可稍後投與，或投與次序可逆轉。
CAR療法及/或其他治療劑(如第二CAR療法)、程序或模式可在活躍病症時段期間或在緩解或較不活躍疾病時段期間投與。CAR療法可在其他治療之前、與治療同時、治療後或在病症緩解期間投與。
舉例而言，在一些實施例中，向患有與CD19、CD20或CD22表現相關之疾病，例如癌症之個體投與CAR療法。可分析個體之反應性或復發之指示物。在一些實施例中，當個體顯示一或多種復發跡象，例如CD19中之移碼及/或過早終止密碼子時，投與額外療法。在實施 例中，額外療法為B細胞抑制劑。CD19療法可繼續(例如當仍存在一些可在個體中偵測之CD19表現癌細胞時)或可中斷(例如當風險-效益分析有利於中斷療法時)。
當組合投與時，CAR療法及額外藥劑(例如，第二或第三藥劑)或全部可以比單獨(例如，以單一療法)使用之每種藥劑之量或劑量更高、更低或與其相同的量或劑量投與。在某些實施例中，CAR療法、其他藥劑(例如第二或第三藥劑)或全部藥劑之投與量或劑量比個別使用，例如呈單一療法使用之各藥劑低(例如至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。在其他實施例中，CAR療法、其他藥劑(例如第二或第三藥劑)或全部藥劑引起所需作用(例如治療癌症)之量或劑量比實現相同治療作用所需的個別使用，例如呈單一療法使用之各藥劑之量或劑量低(例如低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。
在實施例中，組合療法中之治療劑中的一或多者為抗體分子。癌症抗原可藉由單株抗體療法靶向。單株抗體(mAb)療法已顯示藉由多種機制發揮強大抗腫瘤效應，包括補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及過度表現標靶分子之腫瘤細胞之直接細胞抑制或細胞凋亡誘發效應。
在其他態樣中，本文所述之CAR表現細胞組合(例如CD20 CAR、CD22 CAR或CD19 CAR表現細胞，視情況與一或多種B細胞抑制劑組合)可與手術、化學療法、輻射、mTOR路徑抑制劑、免疫抑止劑(如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫燒蝕劑(如CAMPATH)、抗CD3抗體或其他抗體療法、細胞毒素、氟達拉賓、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞因子及照射、肽疫苗(如Izumoto等人2008 J Neurosurg 108：963-971中所述之肽疫苗)組合用於治療方案中。
在一個實施例中，本文所述之CD19、CD20或CD22 CAR表現細 胞組合(例如及一或多種B細胞抑制劑)可與化學治療劑組合使用。例示性化學治療劑包括蒽環黴素(例如小紅莓(例如脂質小紅莓))；長春花生物鹼(例如長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞賓)；烷基化劑(例如環磷醯胺、達卡巴嗪、美法侖、異環磷醯胺、替莫唑胺)；免疫細胞抗體(例如阿倫單抗、吉妥珠單抗、利妥昔單抗、托西莫單抗)；抗代謝物(包括例如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑(例如氟達拉賓))；TNFR糖皮質激素誘導TNFR相關蛋白(GITR)促效劑；蛋白酶體抑制劑(例如阿克拉黴素A、膠毒素或硼替佐米)；免疫調節劑，如沙立度胺或沙立度胺衍生物(例如來那度胺)。
考慮用於組合療法中之一般化學治療劑包括阿那曲唑(Arimidex®)、比卡魯胺(Casodex®)、硫酸博萊黴素(Blenoxane®)、白消安(Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-脫氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡鉑(Paraplatin®)、卡莫司汀(BiCNU®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、順鉑(Platinol®)、克拉屈濱(Leustatin®)、環磷醯胺(或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(DTIC-Dome®)、更生黴素(放線菌素D、Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松、多烯紫杉醇(Taxotere®)、鹽酸阿黴素(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(Eulexin®)、替紮他濱、吉西他濱(二氟去氧胞苷)、羥基脲(Hydrea®)、艾達黴素(Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康(Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲醯四氫葉酸鈣、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺喋呤(Folex®)、米托蒽醌(Novantrone®)、麥羅塔(mylotarg)、太平洋紫杉醇(Taxol®)、白蛋白結合型太平洋紫杉醇(Abraxane®)、菲尼克 斯(phoenix)(Yttrium90/MX-DTPA)、噴司他丁、具有卡莫司汀植入物之聚苯丙生20(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)(Nolvadex®)、替尼泊甙(Vumon®)、6-硫代鳥嘌呤、噻替派、替拉紮明(tirapazamine)(Tirazone®)、注射用鹽酸拓朴替康(Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞賓(Navelbine®)。
用化學治療劑與表現本文所述之CAR分子的細胞之組合處理可用於治療本文所述之血液癌，例如AML。在實施例中，化學治療劑及CAR表現細胞之組合適用於靶向，例如殺死癌症幹細胞，例如白血病幹細胞，例如在患有AML之個體中。在實施例中，化學治療劑與CAR表現細胞之組合適用於治療微小殘留病(MRD)。MRD係指在例如化學療法之治療期間或治療後殘留在個體中之少數癌細胞。MRD通常為復發之主要原因。本發明提供一種治療癌症，例如MRD之方法，其包含投與化學治療劑以及CAR表現細胞，例如如本文所述。
在一個實施例中，化學治療劑在表現CAR分子，例如本文所述之CAR分子的細胞投與前投與。在其中希望化學治療劑投與一次以上的化學治療方案中，化學治療方案在表現CAR分子，例如本文所述之CAR分子的細胞投與前開始或結束。在實施例中，化學治療劑在投與表現CAR分子之細胞前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天或30天投與。在實施例中，化學治療方案在投與表現CAR分子之細胞前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天或30天開始或結束。在實施例中，化學治療劑為例如相比於正常或非癌細胞上之表現，增加癌細胞，例如腫瘤細胞上之CD19、CD20或CD22表現之化學治療劑。可例如藉由免疫組織化學染色或流動式細胞量測分析測定表現。舉例而 言，化學治療劑為阿糖胞苷(cytarabine，Ara-C)。
尤其受關注之與本發明化合物組合的抗癌劑包括：抗代謝物；抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調神經磷酸酶或p70S6激酶FK506或抑制p70S6激酶之藥物；烷基化劑；mTOR抑制劑；免疫調節劑；蒽環黴素；長春花生物鹼；蛋白酶體抑制劑；GITR促效劑；蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑；CDK4激酶抑制劑；BTK抑制劑；MKN激酶抑制劑；DGK激酶抑制劑；或溶瘤病毒。
例示性抗代謝物包括(但不限於)葉酸拮抗劑(在本文中亦被稱作抗葉酸劑)、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑)：甲胺喋呤(Rheumatrex®、Trexall®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®、Fluoroplex®)、氟尿苷(FUDF®)、阿糖胞苷(Cytosar-U®、Tarabine PFS)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)(Puri-Nethol®))、6-硫代鳥嘌呤(Thioguanine Tabloid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、噴司他丁(pentostatin)(Nipent®)、培美曲唑(pemetrexed)(Alimta®)、雷替曲塞(raltitrexed)(Tomudex®)、克拉屈濱(cladribine)(Leustatin®)、氯法拉濱(clofarabine)(Clofarex®、Clolar®)、巰基嘌呤(Puri-Nethol®)、卡培他濱(capecitabine)(Xeloda®)、奈拉濱(nelarabine)(Arranon®)、阿紮胞苷(azacitidine)(Vidaza®)及吉西他濱(gemcitabine)(Gemzar®)。較佳抗代謝物包括例如5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®、Fluoroplex®)、氟尿苷(FUDF®)、卡培他濱(Xeloda®)、培美曲唑(Alimta®)、雷替曲塞(Tomudex®)及吉西他濱(Gemzar®)。
例示性烷基化劑包括(但不限於)氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲及三氮烯)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Mustard®、Chlorethaminacil®、Demethyldopan®、Desmethyldopan®、Haemanthamine®、Nordopan®、Uracil nitrogen mustard®、Uracillost®、Uracilmostaza®、Uramustin®、Uramustine®)、氮芥 (Mustargen®)、環磷醯胺(Cytoxan®、Neosar®、Clafen®、Endoxan®、Procytox®、RevimmuneTM )、異環磷醯胺(Mitoxana®)、美法侖(melphalan)(Alkeran®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、哌泊溴烷(Amedel®、Vercyte®)、三伸乙基三聚氰胺(Hemel®、Hexalen®、Hexastat®)、三伸乙基硫代磷胺、替莫唑胺(Temodar®)、噻替派(Thioplex®)、白消安(busulfan)(Busilvex®、Myleran®)、卡莫司汀(carmustine)(BiCNU®)、洛莫司汀(lomustine)(CeeNU®)、鏈脲菌素(Zanosar®)及達卡巴嗪(Dacarbazine)(DTIC-Dome®)。額外例示性烷基化劑包括(但不限於)奧賽力鉑(Eloxatin®)；替莫唑胺(Temodar®及Temodal®)；更生黴素(亦稱為放線菌素-D、Cosmegen®)；美法侖(亦稱為L-PAM、L-溶肉瘤素及苯丙胺酸氮芥、Alkeran®)；六甲蜜胺(Altretamine，亦稱為hexamethylmelamine(HMM)、Hexalen®)；卡莫司汀(BiCNU®)；苯達莫司汀(Bendamustine)(Treanda®)；白消安(Busulfex®及Myleran®)；卡鉑(Paraplatin®)；洛莫司汀(亦稱為CCNU、CeeNU®)；順鉑(亦稱為CDDP、Platinol®及Platinol®-AQ)苯丁酸氮芥(Leukeran®)；環磷醯胺(Cytoxan®及Neosar®)；達卡巴嗪(亦稱為DTIC、DIC及咪唑甲醯胺、DTIC-Dome®)；六甲蜜胺(Altretamine，亦稱為hexamethylmelamine(HMM)、Hexalen®)；異環磷醯胺(Ifex®)；普莫司汀；丙卡巴肼(Matulane®)；氮芥(Mechlorethamine，亦稱為nitrogen mustard/mustine及鹽酸二氯甲基二乙胺、Mustargen®)；鏈脲菌素(Zanosar®)；噻替派(亦稱為硫代磷醯胺、TESPA及TSPA、Thioplex®)；環磷醯胺(Endoxan®、Cytoxan®、Neosar®、Procytox®、Revimmune®)；及苯達莫司汀HCl(Treanda®)。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與氟達拉賓、環磷醯胺及/或利妥昔單抗組合投與至個體。在實施例中，本文所述之CAR表現 細胞與氟達拉賓、環磷醯胺及利妥昔單抗(FCR)組合投與至個體。在實施例中，個體患有CLL。舉例而言，個體在染色體17之短臂中具有缺失(del(17p)，例如白血病細胞中)。在其他實例中，個體不具有del(17p)。在實施例中，個體包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgVH )基因中包含突變之白血病細胞。在其他實施例中，個體不包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgVH )基因中包含突變之白血病細胞。在實施例中，氟達拉賓以約10-50mg/m2 (例如，約10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45或45-50mg/m2 )之劑量例如經靜脈內投與。在實施例中，環磷醯胺以約200-300mg/m2 (例如，約200-225、225-250、250-275或275-300mg/m2 )之劑量例如經靜脈內投與。在實施例中，利妥昔單抗以約400-600mg/m2 (例如，400-450、450-500、500-550或550-600mg/m2 )之劑量例如經靜脈內投與。
在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與苯達莫司汀及利妥昔單抗組合投與至個體。在實施例中，個體患有CLL。舉例而言，個體在染色體17之短臂中具有缺失(del(17p)，例如白血病細胞中)。在其他實例中，個體不具有del(17p)。在實施例中，個體包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgVH )基因中包含突變之白血病細胞。在其他實施例中，個體不包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgVH )基因中包含突變之白血病細胞。在實施例中，苯達莫司汀以約70-110mg/m2 (例如70-80、80-90、90-100或100-110mg/m2 )之劑量，例如經靜脈內投與。在實施例中，利妥昔單抗以約400-600mg/m2 (例如，400-450、450-500、500-550或550-600mg/m2 )之劑量例如經靜脈內投與。
在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與利妥昔單抗、環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及/或皮質類固醇(例如潑尼松)組合投與個體。在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與利妥昔單抗、環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼松(R-CHOP)組合投與個體。在實施例中， 個體患有彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在實施例中，個體患有體積不大之侷限期DLBCL(例如包含尺寸/直徑小於7cm之腫瘤)。在實施例中，個體用輻射與R-CHOP組合治療。舉例而言，向個體投與R-CHOP(例如，1-6個週期，例如1、2、3、4、5或6個R-CHOP週期)，隨後輻射。在一些情況下，在輻射後向個體投與R-CHOP(例如，1-6個週期，例如1、2、3、4、5或6個R-CHOP週期)。
在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與依託泊苷、潑尼松、長春新鹼、環磷醯胺、小紅莓及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與依託泊苷、潑尼松、長春新鹼、環磷醯胺、小紅莓及利妥昔單抗(EPOCH-R)組合投與個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與劑量調整之EPOCH-R(DA-EPOCH-R)組合投與至個體。在實施例中，個體患有B細胞淋巴瘤，例如Myc重排之侵襲性B細胞淋巴瘤。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與利妥昔單抗及/或來那度胺組合投與個體。來那度胺((RS)-3-(4-胺基-1-側氧基1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)為一種免疫調節劑。在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與利妥昔單抗及來那度胺組合投與個體。在實施例中，個體患有濾泡性淋巴瘤(FL)或套細胞淋巴瘤(MCL)。在實施例中，個體患有FL且先前未用癌症療法治療。在實施例中，來那度胺以約10-20mg(例如，10-15或15-20mg)之劑量例如每日投與。在實施例中，利妥昔單抗以約350-550mg/m2 (例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2 )之劑量例如經靜脈內投與。
例示性mTOR抑制劑包括例如坦羅莫司(temsirolimus)；地磷莫司(ridaforolimus)(正式稱為迪福莫司(deferolimus)，(1R ,2R ,4S )-4-[(2R )-2[(1R ,9S ,12S ,15R ,16E ,18R ,19R ,21R ,23S ,24E ,26E ,28Z ,30S ,32S ,35R )- 1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-戊側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9 ]三十六基-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基二甲基次膦酸鹽，亦稱為AP23573及MK8669，及PCT公開案第WO 03/064383號中所述)；依維莫司(everolimus)(Afinitor®或RAD001)；雷帕黴素(rapamycin)(AY22989、Sirolimus®)；斯馬匹莫(simapimod)(CAS 164301-51-3)；安羅莫司(emsirolimus)(5-{2,4-雙[(3S )-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2 3-d]嘧啶-7(8H )-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；及N 2 -[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H -1-苯并吡喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-，內鹽(SF1126，CAS 936487-67-1)(SEQ ID NO：1316)及XL765。
例示性免疫調節劑包括例如阿托珠單抗(afutuzumab)(獲自Roche®)；派非格司亭(pegfilgrastim)(Neulasta®)；來那度胺(CC-5013，Revlimid®)；沙立度胺(Thalomid®)；艾可米得(actimid)(CC4047)；及IRX-2(包括介白素1、介白素2及干擾素γ之人類細胞激素混合物，CAS 951209-71-5，獲自IRX Therapeutics)。
例示性蒽環黴素包括例如小紅莓(doxorubicin)(Adriamycin®及Rubex®)；博萊黴素(bleomycin)(lenoxane®)；道諾黴素(daunorubicin)(鹽酸道諾黴素、柔紅黴素及鹽酸紅比黴素、Cerubidine®)；道諾黴素脂質體(檸檬酸道諾黴素脂質體、DaunoXome®)；米托蒽醌(mitoxantrone)(DHAD、Novantrone®)；表柔比星(epirubicin)(EllenceTM )；艾達黴素(idarubicin)(Idamycin®、Idamycin PFS®)；絲裂黴素(mitomycin)C(Mutamycin®)；格爾德黴素(geldanamycin)；除莠黴素(herbimycin)；拉維黴素(ravidomycin)；及 去乙醯基拉維黴素。
例示性長春花生物鹼包括例如酒石酸長春瑞賓(vinorelbine tartrate)(Navelbine®)、長春新鹼(Vincristine)(Oncovin®)及長春地辛(Vindesine)(Eldisine®))；長春鹼(vinblastine)(亦稱為硫酸長春鹼、長春花鹼(vincaleukoblastine)及VLB、Alkaban-AQ®及Velban®)；及長春瑞賓(vinorelbine)(Navelbine®)。
例示性蛋白酶體抑制劑包括硼替佐米(Velcade®)；卡非唑米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基環氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-嗎啉基乙醯胺基)-4-苯基丁醯胺基)-戊醯胺)；馬瑞唑米(marizomib)(NPI-0052)；檸檬酸依薩唑米(ixazomib)(MLN-9708)；迪蘭唑米(delanzomib)(CEP-18770)；及O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-絲胺醯基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-環氧乙烷基]-2-側氧基-1-(苯基甲基)乙基]-L-絲胺醯胺(ONX-0912)。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與貝倫妥單抗組合投與至個體。貝倫妥單抗為抗CD30抗體與單甲基奧瑞他汀E(auristatin E)之抗體-藥物共軛物。在實施例中，個體患有霍奇金氏淋巴瘤(HL)，例如復發性或難治性HL。在實施例中，個體包含CD30+ HL。在實施例中，個體已進行自體幹細胞移植(ASCT)。在實施例中，個體尚未進行ASCT。在實施例中，貝倫妥單抗例如每3週以約1-3mg/kg(例如，約1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3mg/kg)之劑量例如經靜脈內投與。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與貝倫妥單抗及達卡巴嗪組合或與貝倫妥單抗及苯達莫司汀組合投與個體。達卡巴嗪為烷基化劑，化學名稱為5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)咪唑-4-甲醯胺。苯達莫司汀為烷基化劑，化學名稱為4-[5-[雙(2-氯乙基)胺基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸。在實施例中，個體患有霍奇金氏淋巴瘤(HL)。在實施例 中，個體先前未用癌症療法治療。在實施例中，個體至少60歲，例如60、65、70、75、80、85或更老。在實施例中，達卡巴嗪以約300-450mg/m2 (例如，約300-325、325-350、350-375、375-400、400-425或425-450mg/m2 )之劑量例如經靜脈內投與。在實施例中，苯達莫司汀以約75-125mg/m2 (例如75-100或100-125mg/m2 ，例如約90mg/m2 )之劑量，例如經靜脈內投與。在實施例中，貝倫妥單抗例如每3週以約1-3mg/kg(例如，約1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3mg/kg)之劑量例如經靜脈內投與。
在一些實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與CD20抑制劑，例如抗CD20抗體(例如抗CD20單特異性抗體或雙特異性抗體)或其片段組合投與個體。示例性抗CD20抗體包括(但不限於)利妥昔單抗、奧伐木單抗、奧克珠單抗、維托珠單抗、歐比托珠單抗、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、奧卡拉珠單抗及Pro131921(Genentech)。參見例如Lim等人Haematologica.95.1(2010)：135-43。
在一些實施例中，抗CD20抗體包含利妥昔單抗。利妥昔單抗為結合於CD20且造成表現CD20之細胞進行細胞溶解的嵌合小鼠/人類單株抗體IgG1κ，例如如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，個體患有CLL或SLL。
在一些實施例中，利妥昔單抗經靜脈內，例如呈靜脈內輸液形式投與。舉例而言，各輸注提供約500-2000mg(例如，約500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900或1900-2000mg)利妥昔單抗。在一些實施例中，利妥昔單抗以150mg/m2 至750mg/m2 ，例如約150-175mg/m2 、175-200mg/m2 、200-225 mg/m2 、225-250mg/m2 、250-300mg/m2 、300-325mg/m2 、325-350mg/m2 、350-375mg/m2 、375-400mg/m2 、400-425mg/m2 、425-450mg/m2 、450-475mg/m2 、475-500mg/m2 、500-525mg/m2 、525-550mg/m2 、550-575mg/m2 、575-600mg/m2 、600-625mg/m2 、625-650mg/m2 、650-675mg/m2 或675-700mg/m2 之劑量投與，其中m2 指示個體之體表面積。在一些實施例中，利妥昔單抗以至少4天，例如4、7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言，利妥昔單抗以至少0.5週，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8週或8週以上之給藥時間間隔投與。在一些實施例中，利妥昔單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與一定時間段，例如至少2週，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週。舉例而言，利妥昔單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與，每一治療循環總共至少4劑(例如，每一治療循環至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16劑或16劑以上)。
在一些實施例中，抗CD20抗體包含奧法木單抗。奧法木單抗為分子量為大約149kDa之抗CD20 IgG1κ人類單株抗體。舉例而言，使用轉殖基因小鼠及融合瘤技術產生奧法木單抗，且自重組鼠類細胞株(NS0)表現及純化。參見例如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；及臨床試驗標識號NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352及NCT01397591。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與奧法木單抗組合投與個體。在實施例中，個體患有CLL或SLL。
在一些實施例中，奧法木單抗以靜脈內輸注形式投與。舉例而言，各輸注提供約150-3000mg(例如，約150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、 600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000mg)奧法木單抗。在實施例中，奧伐木單抗以約300mg之起始劑量，接著2000mg投與，例如約11劑，例如24週。在一些實施例中，奧法木單抗以至少4天，例如4、7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言，奧法木單抗以至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30週或30週以上之給藥時間間隔投與。在一些實施例中，奧法木單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與一定時間段，例如至少1週，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60週或更多週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月，或1、2、3、4、5年或更多年。舉例而言，奧伐木單抗以本文所述之劑量及給藥時間間隔投與，每一治療循環總共至少2劑(例如，每一治療循環至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20劑或20劑以上)。
在一些情況下，抗CD20抗體包含奧克珠單抗。奧克珠單抗為一種人類化抗-CD20單株抗體，例如如臨床試驗鑑別號NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570及Kappos等人Lancet.19.378(2011)：1779-87中所述。
在一些情況下，抗-CD20抗體包含維托珠單抗。維托珠單抗為針對CD20之人類化單株抗體。參見例如臨床試驗標識號NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581及Goldenberg等人Leuk Lymphoma.51(5)(2010)：747-55。
在一些情況下，抗-CD20抗體包含GA101。GA101(亦稱為歐比托珠單 抗或RO5072759)為一種人類化及經糖基工程改造之抗-CD20單株抗體。參見例如Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009)：588-96；臨床試驗標識號NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422及NCT01414205；及www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些情況下，抗CD20抗體包含AME-133v。AME-133v(亦稱為LY2469298或奧卡拉珠單抗)為針對CD20之人類化IgG1單株抗體，與利妥昔單抗相比，其對FcγRIIIa受體之親和力增加且抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性增強。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011)：13-25；及Forero-Torres等人Clin Cancer Res.18.5(2012)：1395-403。
在一些情況下，抗CD20抗體包含PRO131921。PRO131921為一種人類化抗-CD20單株抗體，其經工程改造以與利妥昔單抗相比，更好地結合於FcγRIIIa且ADCC增強。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011)：13-25；及Casulo等人Clin Immunol.154.1(2014)：37-46；及臨床試驗標識號NCT00452127。
在一些情況下，抗CD20抗體包含TRU-015。TRU-015為一種來源於針對CD20之抗體的域之抗CD20融合蛋白。雖然TRU-015小於單株抗體，但保留Fc介導之效應功能。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011)：13-25。TRU-015含有連接於人類IgG1鉸鏈、CH2及CH3域但缺乏CH1及CL域之抗CD20單鏈可變片段(scFv)。
在一些實施例中，本文所描述之抗CD20抗體與治療劑共軛或以其他方式結合，治療劑例如本文所描述之化學治療劑(例如，環磷醯胺、氟達拉賓、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、去甲基化劑、肽疫苗、抗腫瘤抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、烷基化劑、抗微管或抗有絲分裂劑)、抗過敏劑、抗噁心劑(或抗嘔吐劑)、疼痛舒解劑或細胞保護劑。
在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與B細胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制劑(例如維托拉斯，亦稱為ABT-199或GDC-0199)及/或利妥昔單 抗組合投與至個體。在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與維托拉斯(venetoclax)及利妥昔單抗組合投與個體。維托拉斯為抑制抗細胞凋亡蛋白質、BCL-2之小分子。以下展示維托拉斯(4-(4-{[2-(4-氯苯基))-4,4-二甲基環己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N -({3-硝基-4-[(四氫-2H -哌喃-4-基甲基)胺基]苯基}磺醯基)-2-(1H -吡咯并[2,3-b ]吡啶-5-基氧基)苯甲醯胺)之結構。
在實施例中，個體患有CLL。在實施例中，個體患有復發性CLL，例如個體先前已投與癌症療法。在實施例中，維托拉斯例如每日以約15-600mg(例如，15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、400-500或500-600mg)之劑量投與。在實施例中，利妥昔單抗例如每月以約350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。
在一些實施例中，本文所描述之一或多種CAR表現細胞與溶瘤病毒組合投與。在實施例中，溶瘤病毒能夠在癌細胞中選擇性地複製且觸發癌細胞之死亡或減緩癌細胞之生長。在一些情況下，溶瘤病毒對非癌細胞無作用或作用最小。溶瘤病毒包括(但不限於)溶瘤腺病毒、溶瘤單純疱疹病毒、溶瘤反轉錄病毒、溶瘤小病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤新必斯病毒(oncolytic Sinbis virus)、溶瘤流感病毒或溶瘤RNA病毒(例如，溶瘤呼腸孤病毒、溶瘤新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水泡性口炎病毒(VSV))。
在一些實施例中，溶瘤病毒為以全文引用之方式併入本文中之US2010/0178684 A1中所述之病毒，例如重組溶瘤病毒。在一些實施例中，重組溶瘤病毒包含編碼免疫或發炎反應之抑制劑的核酸序列(例如異源核酸序列)，例如如以全文引用之方式併入本文中之US2010/0178684 A1中所述。在實施例中，重組溶瘤病毒，例如溶瘤NDV，包含促細胞凋亡蛋白質(例如凋亡蛋白)、細胞因子(例如GM-CSF、干擾素-γ、介白素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α)、免疫球蛋白(例如針對ED-B纖維連接蛋白之抗體)、腫瘤相關抗原、雙特異性銜接蛋白質(例如針對NDV HN蛋白質及T細胞共刺激受體(諸如CD3或CD28)之雙特異性抗體或抗體片段；或人類IL-2與針對NDV HN蛋白質之單鏈抗體之間的融合蛋白)。參見例如Zamarin等人Future Microbiol.7.3(2012)：347-67，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，溶瘤病毒為以全文引用的方式併入本文中之US 8591881 B2、US 2012/0122185 A1或US 2014/0271677 A1中所述之嵌合溶瘤NDV。
在一些實施例中，溶瘤病毒包含條件性複製型腺病毒(CRAd)，其經設計以僅在癌細胞中複製。參見例如Alemany等人Nature Biotechnol.18(2000)：723-27。在一些實施例中，溶瘤腺病毒包含以全文引用之方式併入本文中的Alemany等人，第725頁上表1中所述者。
例示性溶瘤病毒包括(但不限於)以下：B組溶瘤腺病毒(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(參見例如臨床試驗標識符：NCT02053220)；ONCOS-102(先前稱為CGTG-102)，其為包含粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之腺病毒(Oncos Therapeutics)(參見例如臨床試驗標識符：NCT01598129)；VCN-01，其為編碼人類PH20玻尿酸酶之遺傳修飾溶瘤人類腺病 毒(VCN Biosciences,S.L.)(參見例如臨床試驗標識符：NCT02045602及NCT02045589)；條件性複製型腺病毒ICOVIR-5，其為來源於野生型人類腺病毒血清型5(Had5)之已經修飾以在癌細胞中藉由失調視網膜母細胞瘤/E2F路徑選擇性複製之病毒(Institut Català d'Oncologia)(參見例如臨床試驗標識符：NCT01864759)；Celyvir，其包含骨髓衍生之感染有ICOVIR5、溶瘤腺病毒之自體間葉細胞幹細胞(MSC)(Hospital Infantil Universitario Niño Jesús,Madrid,Spain/Ramon Alemany)(參見例如臨床試驗標識符：NCT01844661)；CG0070，其為條件性複製溶瘤血清型5腺病毒(Ad5)，其中人類E2F-1啟動子驅動原發性E1a病毒基因表現，藉此限制缺乏Rb路徑之腫瘤細胞的病毒複製及細胞毒性(Cold Genesys,Inc.)(參見例如臨床試驗標識符：NCT02143804)；或DNX-2401(以前稱為δ-24-RGD)，其為已經工程改造以在缺乏視網膜母細胞瘤(Rb)路徑之細胞中選擇性複製且更有效感染表現某些RGD結合整合素之細胞的腺病毒(Clinica Universidad de Navarra,Universidad de Navarra/DNAtrix,Inc.)(參見例如臨床試驗標識符：NCT01956734)。
在一些實施例中，本文所述之溶瘤病毒藉由注射，例如皮下、動脈內、靜脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射投與。在實施例中，本文所描述之溶瘤病毒經瘤內、經皮、經黏膜、經口、經鼻內或經由肺部投與來投與。
在一個實施例中，表現本文所述之CAR之細胞與減少Treg細胞群體之分子組合投與個體。減少(例如耗盡)Treg細胞數目之方法為此項技術中已知且包括例如CD25缺失、環磷醯胺投與、調節GITR功能。 在不希望受理論束縛之情況下，咸信在清除術前或在投與本文所述之CAR表現細胞前減少個體中Treg細胞數目減少腫瘤微環境中不必要免疫細胞(例如，Treg)數目且減少個體復發風險。
在一實施例中，本文所描述之CAR表現細胞與減少Treg細胞群體之分子組合投與至個體。減少(例如耗盡)Treg細胞數目之方法為此項技術中已知且包括例如CD25耗盡、環磷醯胺投與及調節GITR功能。在不希望受理論束縛之情況下，咸信在清除術前或在投與本文所述之CAR表現細胞前減少個體中Treg細胞數目減少腫瘤微環境中不必要免疫細胞(例如，Treg)數目且減少個體復發風險。在一個實施例中，本文所描述之CAR表現細胞與靶向GITR及/或調節GITR功能之分子(諸如GITR促效劑及/或耗盡調節性T細胞(Treg)之GITR抗體)組合投與至個體。在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞與環磷醯胺組合投與至個體。在一個實施例中，在CAR表現細胞之前投與GITR結合分子及/或調節GITR功能之分子(例如GITR促效劑及/或Treg耗盡GITR抗體)。舉例而言，在一個實施例中，GITR促效劑可在細胞清除術之前投與。在實施例中，環磷醯胺在投與(例如，輸注或再輸注)CAR表現細胞前或在細胞清除術前投與至個體。在實施例中，環磷醯胺及抗GITR抗體在投與(例如輸液或再輸液)CAR表現細胞前或在細胞清除術前投與至個體。在一個實施例中，個體患有癌症(例如，實體癌症或血液癌(諸如ALL或CLL))。在一實施例中，個體患有CLL。在實施例中，個體患有實體癌症，例如本文所述之實體癌症。
在一個實施例中，本文所述之CD19 CAR表現細胞及一或多種本文所述之B細胞抑制劑之組合與GITR促效劑，例如本文所述之GITR促效劑組合投與至個體。在一個實施例中，GITR促效劑在CAR表現細胞，例如CD19 CAR表現細胞之前投與。舉例而言，在一個實施例中，GITR促效劑可在細胞清除術之前投與。在一實施例中，個體患 有CLL。
在一個實施例中，本文所描述之CAR表現細胞與GITR促效劑(例如，本文所描述之GITR促效劑)組合投與至個體。在一個實施例中，GITR促效劑在表現CAR之細胞之前投與。舉例而言，在一個實施例中，GITR促效劑可在細胞清除術之前投與。
例示性GITR促效劑包括例如GITR融合蛋白及抗GITR抗體(例如，二價抗GITR抗體)，諸如美國專利第6,111,090號、歐洲專利第090505B1號、美國專利第8,586,023號、PCT公開案第WO 2010/003118號及第2011/090754號中所描述之GITR融合蛋白，或例如美國專利第7,025,962號、歐洲專利第1947183B1號、美國專利第7,812,135號、美國專利第8,388,967號、美國專利第8,591,886號、歐洲專利第EP 1866339號、PCT公開案第WO 2011/028683號、PCT公開案第WO 2013/039954號、PCT公開案第WO2005/007190號、PCT公開案第WO 2007/133822號、PCT公開案第WO2005/055808號、PCT公開案第WO 99/40196號、PCT公開案第WO 2001/03720號、PCT公開案第WO99/20758號、PCT公開案第WO2006/083289號、PCT公開案第WO 2005/115451號、美國專利第7,618,632號及PCT公開案第WO 2011/051726號中所描述之抗GITR抗體。
在一個實施例中，本文所描述之CAR表現細胞與蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑(例如，本文所描述之蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑)組合投與至個體。在一個實施例中，蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑為SHP-1抑制劑，例如本文所描述之SHP-1抑制劑，諸如葡萄糖酸銻鈉。在一個實施例中，蛋白質酪胺酸磷酸酯酶抑制劑為SHP-2抑制劑，例如本文所述之SHP-2抑制劑。
在一個實施例中，視情況與一或多種B細胞抑制劑組合之本文所述之CAR表現細胞客與激酶抑制劑組合使用。在一個實施例中，激酶 抑制劑為CDK4抑制劑，例如本文所描述之CDK4抑制劑，例如CD4/6抑制劑，諸如6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基胺基)-8H -吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7-酮鹽酸鹽(亦稱為帕博西里(palbociclib)或PD0332991)。在一個實施例中，激酶抑制劑為BTK抑制劑，例如本文所描述之BTK抑制劑，諸如依魯替尼(ibrutinib)。在一個實施例中，激酶抑制劑為mTOR抑制劑，例如本文所述之mTOR抑制劑，如雷帕黴素、雷帕黴素類似物、OSI-027。mTOR抑制劑可為例如mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑，例如本文所描述之mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑。在一個實施例中，激酶抑制劑為MNK抑制劑，例如本文所描述之MNK抑制劑，諸如4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制劑可為例如MNK1a、MNK1b、MNK2a及/或MNK2b抑制劑。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之CDK4抑制劑：阿洛新A(aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色酮；克卓替尼(crizotinib)(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(2R,3S)-2-(羥基甲基)-1-甲基-3-吡咯啶基]-4H-1-苯并哌喃-4-酮鹽酸鹽(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；依地蘇蘭(indisulam)(E7070)；羅斯維汀(roscovitine)(CYC202)；帕博西里(palbociclib)(PD0332991)；戴那西里(dinaciclib)(SCH727965)；N-[5-[[(5-第三丁基噁唑-2-基)甲基]硫基]噻唑-2-基]哌啶-4-甲醯胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮呯-2-基]胺基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲醯胺基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(哌啶-4-基)醯胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)- 1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺醯基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；及XL281(BMS908662)。
在一個實施例中，激酶抑制劑為CDK4抑制劑，例如帕博西里(PD0332991)，且帕博西里係以每日約50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)之劑量投與一段時間，例如每日以上述劑量持續28天週期中之14天至21天或每日以上述劑量持續21天週期中之7天至12天。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的帕博西里。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與週期素依賴性激酶(CDK)4或6抑制劑，例如本文所描述之CDK4抑制劑或CDK6抑制劑組合投與至個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與CDK4/6抑制劑(例如，靶向CDK4與CDK6之抑制劑)，例如本文所描述之CDK4/6抑制劑組合投與個體。在一個實施例中，個體患有MCL。MCL為不佳回應於當前可用療法，亦即基本上不可治癒之侵襲性癌症。在MCL之多數情況下，週期素D1(CDK4/6之調節因子)在MCL細胞中表現(例如歸因於涉及免疫球蛋白及週期素D1基因之染色體易位)。因此，不受理論束縛，認為MCL細胞以高度特異性對CDK4/6抑制高度敏感(亦即對正常免疫細胞之作用最小)。單獨CDK4/6抑制劑對治療MCL具有一些功效，但僅實現部分緩解且具有高復發率。示例性CDK4/6抑制劑為LEE011(亦稱為瑞博斯利(ribociclib))，其結構展示於下文。
不受理論束縛，咸信本文所述之表現CAR之細胞與CDK4/6抑制劑(例如LEE011或本文所述之其他CDK4/6抑制劑)一起投與可實現更高反應，例如與單獨CDK4/6抑制劑相比，例如緩解率更高及/或復發率更低。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之BTK抑制劑：依魯替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。在一個實施例中，BTK抑制劑不降低或抑制介白素-2-誘導型激酶(ITK)之激酶活性，且係選自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。
在一個實施例中，激酶抑制劑為BTK抑制劑，例如依魯替尼(PCI-32765)。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與BTK抑制劑(例如，依魯替尼)組合投與至個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與依魯替尼(亦稱為PCI-32765)組合投與個體。依魯替尼(1-[(3R)-3-[4-胺基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)之結構展示於下文中。
在實施例中，個體患有CLL、套細胞淋巴瘤(MCL)或小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)。舉例而言，個體在染色體17之短臂中具有缺失(del(17p)，例如白血病細胞中)。在其他實例中，個體不具有del(17p)。在實施例中，個體患有復發CLL或SLL。例如個體先前已投與癌症療法(例如先前投與一種、兩種、三種或四種先前癌症療法)。 在實施例中，個體患有難治性CLL或SLL。在其他實施例中，個體患有濾泡性淋巴瘤，例如復發性或難治性濾泡性淋巴瘤。在一個實施例中，激酶抑制劑為BTK抑制劑，例如依魯替尼(PCI-32765)，且依魯替尼以每天約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如250mg、420mg或560mg)之劑量投與一段時間，例如每天投與持續21天週期，或每天投與持續28天週期。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的依魯替尼。在一些實施例中，依魯替尼與利妥昔單抗組合投與。參見例如Burger等人(2013)Ibrutinib In Combination With Rituximab(iR)Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia(CLL)：New,Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients,Abstract 675，呈現於55th ASH Annual Meeting and Exposition,New Orleans,LA 12月7-10日。不受理論束縛，認為添加依魯替尼增強T細胞增生性反應且可將T細胞自T輔助-2(Th2)變成T輔助-1(Th1)表現型。Th1及Th2為輔助T細胞之表現型，其中Th1對比Th2，引導不同免疫反應路徑。Th1表型與促炎性反應相關聯，例如用於殺死細胞，諸如細胞內病原體/病毒或癌細胞，或使自體免疫反應永存。Th2表現型與嗜伊紅血球累積及消炎反應相關。在本文中之方法、用途及組合物之一些實施例中，BTK抑制劑為國際申請案WO/2015/079417中所述之BTK抑制劑，其以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，在一些實施例中，BTK抑制劑為式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽；
其中R1為氫、視情況經羥基取代之C1-C6烷基；R2為氫或鹵素；R3為氫或鹵素；R4為氫；R5為氫或鹵素；或R4與R5彼此連接且代表一鍵、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH=CH-、-CH=CH-CH2-；-CH2-CH=CH-；或-CH2-CH2-CH2-；R6及R7彼此獨立地代表H、視情況經羥基取代之C1-C6烷基、視情況經鹵素或羥基取代之C3-C6環烷基或鹵素；R8、R9、R、R'、R10及R11彼此獨立地代表H或視情況經C1-C6烷氧基取代之C1-C6烷基；或R8、R9、R、R'、R10及R11中之任何兩者與其所結合之碳原子一起可形成3-6員飽和碳環；R12為氫或視情況經鹵素或C1-C6烷氧基取代之C1-C6烷基；或R12與R8、R9、R、R'、R10或R11中之任一者與其所結合之原子一起可形成4、5、6或7員氮雜環，該環可視情況經鹵素、氰基、羥基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代；n為0或1；且R13為視情況經C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或N,N-二-C1-C6烷基胺基取代之C2-C6烯基；視情況經C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代之C2- C6炔基；或視情況經C1-C6烷基取代之C2-C6伸烷基氧化物。
在一些實施例中，式I之BTK抑制劑係選自：N-(3-(5-((1-丙烯醯基氮雜環丁-3-基)氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(E)-N-(3-(6-胺基-5-((1-(丁-2-烯醯基)氮雜環丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-((1-丙炔醯基氮雜環丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-((1-(丁-2-炔醯基)氮雜環丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(5-((1-丙烯醯基哌啶-4-基)氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丙烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(E)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丙醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(E)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(4-甲氧基-N-甲基丁-2-烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丁-2-基醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(2-((4-胺基-6-(3-(4-環丙基-2-氟苯甲醯胺基)-5-氟-2-甲基苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基環氧乙烷-2-甲醯胺；N-(2-((4-胺基-6-(3-(6-環丙基-8-氟-1-側氧基異喹啉-2(1H)-基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯醯胺；N-(3-(5-(2-丙烯醯基醯胺基乙氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-乙基丙烯醯基醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-(2-氟乙基)丙烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(5-((1-丙烯醯基醯胺基環丙基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2- 甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-N-(3-(5-(2-丙烯醯基醯胺基丙氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(丁-2-基醯胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丙烯醯胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丁-2-基醯胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-(3-(N-甲基丙烯醯胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯醯基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-N-(3-(6-胺基-5-((1-(丁-2-炔醯基)吡咯啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯醯基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羥基甲基)苯基)-6-環丙基-3,4-二氫異喹啉-1(2H)-酮；N-(2-((4-胺基-6-(3-(6-環丙基-1-側氧基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-5-氟-2-(羥基甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯醯胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯醯基-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔醯基)-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；2-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯醯基-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羥基甲基)苯基)-6-環丙基-3,4-二氫異喹啉-1(2H)-酮；N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯醯基-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(6-胺基-5-(((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯醯基-4-氟吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺； N-(3-(6-胺基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔醯基)-4-氟吡咯啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯醯基氮雜環丁-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-N-(3-(6-胺基-5-((1-丙醯胺基氮雜環丁-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯醯基氮雜環丁-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羥基甲基)苯基)-6-環丙基-3,4-二氫異喹啉-1(2H)-酮；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯醯基氮雜環丁-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯醯基哌啶-3-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(5-(((2R,3S)-1-丙烯醯基-3-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯醯基-4-氰基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺；或N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯醯基-4-氰基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺。
除非以其他方式提供，否則以上用於描述式I之BTK抑制劑的化學術語根據如國際申請案WO/2015/079417(其以全文引用的方式併入本文中)中闡述之其含義使用。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之mTOR抑制劑：坦羅莫司；地磷莫司二甲基亞膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9 ]六(三十烷)-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669；依維莫司(RAD001)；雷帕黴素(AY22989)；司馬匹莫德；(5-{2,4-雙 [(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；及N2 -[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并哌喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-，內鹽(SF1126)(SEQ ID NO：1316)；及XL765。
在一個實施例中，激酶抑制劑為mTOR抑制劑，例如雷帕黴素，且雷帕黴素以每日約3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)之劑量投與一定時間段，例如每日以上述劑量投與21天週期或每日以上述劑量投與28天週期。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的雷帕黴素。在一個實施例中，激酶抑制劑為mTOR抑制劑，例如依維莫司，且依維莫司以約2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)之劑量投與一定時間段，例如每日以上述劑量投與28天週期。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的依維莫司。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之MNK抑制劑：CGP052088；4-胺基-3-(對氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢醯胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；及4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑(例如，本文所描述之PI3K抑制劑，例如艾德斯布(idelalisib)或杜維力絲(duvelisib))及/或利妥昔單抗組合投與至個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與艾德斯布及利妥昔單抗組合投與至個體。在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與杜維力絲及利妥昔單 抗組合投與至個體。艾德斯布(亦稱為GS-1101或CAL-101；Gilead)為阻斷PI3K之δ同功異型物之小分子。艾德斯布之結構(5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基胺基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮)展示於下文中。
杜維力絲(亦稱為IPI-145；Infinity Pharmaceuticals and Abbvie)為阻斷PI3K-δ、PI3K-γ之小分子。杜維力絲之結構(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基胺基)乙基]-1(2H)-異喹啉酮)展示於下文中。
在實施例中，個體患有CLL。在實施例中，個體患有復發CLL，例如個體先前已投與癌症療法(例如先前投與抗CD20抗體或先前投與依魯替尼)。舉例而言，個體在染色體17之短臂中具有缺失(del(17p)，例如白血病細胞中)。在其他實例中，個體不具有del(17p)。在實施例中，個體包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgVH )基因中包含突變之白血病細胞。在其他實施例中，個體不包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgVH )基因中包含突變之白血病細胞。在實施例中，個體在染色體11之長臂具有缺失(del(11q))。在其他實施例中，個體不具有del(11q)。在實施例中，艾德斯布以約100-400mg(例如，100- 125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-300、325-350、350-375或375-400mg)之劑量例如BID投與。在實施例中，杜維力絲以約15-100mg(例如，約15-25、25-50、50-75或75-100mg)之劑量例如一日兩次投與。在實施例中，利妥昔單抗以約350-550mg/m2 (例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2 )之劑量例如經靜脈內投與。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之雙磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)及mTOR抑制劑：2-胺基-8-[反-4-(2-羥乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7(8H )-酮(PF-04691502)；N -[4-[[4-(二甲胺基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N' -[4-(4,6-二-4-嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384、PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫-1H -咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；阿匹托里斯(apitolisib)(GDC-0980、RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-噠嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮順丁烯二酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-嗎啉基吡啶并[3',2'：4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-異丙基-8-甲基-2-(N-嗎啉基)-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584、SB2343)；及N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)胺基]喹喏啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]胺基苯基磺醯胺(XL765)。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑組合投與至個體。例示性ALK激酶包括(但不限於)克卓替尼(crizotinib)(Pfizer)、色瑞替尼(ceritinib)(Novartis)、艾樂替尼(alectinib)(Chugai)、布加替尼(brigatinib)(亦稱為AP26113 ；Ariad)、恩曲替尼(entrectinib)(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、TSR-011(Tesaro)(參見例如臨床試驗標識號NCT02048488)、CEP-37440(Teva) 及X-396(Xcovery)。在一些實施例中，個體患有實體癌症，例如本文所描述之實體癌症，例如肺癌。
克卓替尼之化學名稱為3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。色瑞替尼之化學名稱為5-氯-N2 -[2-異丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4 -[2-(異丙基磺醯基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。艾樂替尼之化學名稱為9-乙基-6,6-二甲基-8-(4-(N-嗎啉基)哌啶-1-基)-11-側氧基-6,11-二氫-5H-苯并[b]咔唑-3-甲腈。布加替尼之化學名稱為5-氯-N2 -{4-[4-(二甲胺基)-1-哌啶基]-2-甲氧基苯基}-N4 -[2-(二甲基磷醯基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。恩曲替尼之化學名稱為N-(5-3,5-二氟苄基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)苯甲醯胺。PF-06463922之化學名稱為(10R)-7-胺基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-側氧基-10,15,16,17-四氫-2H-8,4-(亞甲橋)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并噁二氮雜環四癸炔-3-甲腈。CEP-37440之化學結構為(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氫-5H-苯并[7]輪烯-2-基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)-N-甲基苯甲醯胺。X-396之化學名稱為(R)-6-胺基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)噠嗪-3-甲醯胺。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之ITK抑制劑：依魯替尼；N-(5-(5-(4-乙醯基哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基-2-甲基苯基硫基)噻唑-2-基)-4-((3,3-二甲基丁-2-基胺基)甲基)苯甲醯胺(BMS-509744)；7-苄基-1-(3-(哌啶-1-基)丙基)-2-(4-(吡啶-4-基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-g]喹喏啉-6(5H)-酮(CTA056)；R )-3-(1-(1-丙烯醯基哌啶-3-基)-4-胺基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-N -(3-甲基-4-(1-甲基乙基))苯甲醯胺(PF-06465469)。
抑制鈣依賴性磷酸酯酶鈣調神經磷酸酶(環孢靈及FK506)或抑制對生長因子誘導之信號傳導重要之p70S6激酶(雷帕黴素)之藥物。亦 可使用(Liu等人，Cell 66：807-815,1991；Henderson等人，Immun.73：316-321,1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5：763-773,1993)。在另一態樣中，本發明之細胞組合物可與以下結合(例如之前、同時或之後)投與患者：骨髓移植、使用諸如氟達拉賓之化學療法藥劑的T細胞消融療法、外光束放射療法(XRT)、環磷醯胺，及/或諸如OKT3或CAMPATH之抗體。在一個態樣中，本發明之細胞組合物在B細胞消融療法(諸如與CD20反應之藥劑，例如美羅華(Rituxan))之後投與。舉例而言，在一個實施例中，個體可經歷用高劑量化學療法，隨後周邊血液幹細胞移植之標準治療。在某些實施例中，在移植後，個體接受本發明之擴增免疫細胞輸注。在額外實施例中，在手術之前或之後投與擴增細胞。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞與吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑組合投與至個體。IDO為催化胺基酸、L-色胺酸降解為犬尿胺酸之酶。許多癌症過度表現IDO，例如前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、頭部癌及肺癌。pDC、巨噬細胞及樹突狀細胞(DC)可表現IDO。在不受理論束縛之情況下，認為L-色胺酸減少(例如，藉由IDO催化)藉由誘導T細胞能力缺失及細胞凋亡而導致免疫抑制環境。因此，不受理論束縛，認為IDO抑制劑可例如藉由減少表現CAR之免疫細胞的遏制或死亡，來增強本文所述之表現CAR之細胞之功效。在實施例中，個體患有實體腫瘤，例如本文所描述之實體腫瘤，例如前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、頭部癌或肺癌。例示性IDO抑制劑包括(但不限於)1-甲基-色胺酸、吲哚莫德(indoximod)(NewLink Genetics)(參見例如臨床試驗鑑別號NCT01191216；NCT01792050)及INCB024360(Incyte Corp.)(參見例如臨床試驗鑑別號NCT01604889；NCT01685255)。
在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與骨髓衍生抑制細胞 (MDSC)之調節劑組合投與個體。MDSC積聚在周邊及許多實體腫瘤之腫瘤位點。此等細胞抑制T細胞反應，由此阻礙表現CAR之細胞療法之功效。不受理論束縛，認為投與MDSC調節劑增強本文所述之表現CAR之細胞之功效。在一實施例中，個體患有實體腫瘤，例如本文所描述之實體腫瘤，例如神經膠母細胞瘤。例示性MDSC調節劑包括(但不限於)MCS110及BLZ945。MCS110為針對巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之單株抗體(mAb)。參見例如臨床試驗標識號NCT00757757。BLZ945為群落刺激因子1受體(CSF1R)之小分子抑制劑。參見例如Pyonteck等人Nat.Med.19(2013)：1264-72。BLZ945之結構顯示如下。
在實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與CD19 CART細胞(例如CTL019，例如如以引用的方式併入本文中之WO2012/079000中所述)組合投與至個體。在實施例中，個體患有急性骨髓白血病(AML)，例如CD19陽性AML或CD19陰性AML。在實施例中，個體患有CD19+淋巴瘤，例如CD19+非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、CD19+ FL或CD19+ DLBCL。在實施例中，個體患有復發性或難治性CD19+淋巴瘤。在實施例中，淋巴細胞耗盡化學療法在CD19 CART細胞投與(例如輸注)之前、與其同時或之後投與至個體。在一個實例中，淋巴細胞耗盡化學療法在投與CD19 CART細胞之前投與至個體。舉例而言，淋巴細胞耗盡化學療法在CD19 CART細胞輸注前1-4天(例如，1、2、3或4天)結束。在實施例中，例如如本文所述，投與多劑CD19 CART細胞。舉例而言，單劑包含約5×108 個CD19 CART細胞。在實施例中，淋巴細胞耗盡化學療法在投與(例如，輸注)本文所述之CAR表 現細胞，例如非表現CD19 CAR之細胞之前、與其同時或之後投與至個體。在實施例中，CD19 CART在投與(例如輸注)非CD19表現CAR之細胞，例如本文所述之非CD19表現CAR之細胞之前、與其同時或之後投與至個體。
在一些實施例中，本文所述之表現CAR之細胞與CD19表現CAR之細胞(例如CTL019，例如如以引用的方式併入本文中之WO2012/079000中所述)組合投與至個體，以治療與CLL-1表現相關之疾病，例如本文所述之癌症。不受理論束縛，咸信投與CD19表現CAR之細胞與表現CAR之細胞組合藉由靶向早期譜系癌細胞，例如癌症幹細胞，調節免疫反應，耗盡調節B細胞及/或改善腫瘤微環境，來提高本文所述之表現CAR之細胞之功效。舉例而言，CD19表現CAR之細胞靶向表現早期譜系標記物之癌細胞，例如癌症幹細胞及表現CD19之細胞，而本文所述之表現CAR之細胞靶向表現晚期譜系標記物，例如CLL-1之癌細胞。此預處理方法可提高本文所述之CAR表現細胞之功效。在此類實施例中，CD19 CAR表現細胞在投與(例如，輸注)本文所描述之CAR表現細胞之前、與其同時或之後投與。
在實施例中，本文所描述之CAR表現細胞亦表現靶向CD19之CAR，例如CD19 CAR。在一實施例中，本文所描述之CAR表現細胞及CD19 CAR投與至個體以治療本文所描述之癌症，例如AML。在一實施例中，CAR分子中之一或兩者之配置包含主要胞內信號傳導域及共刺激信號傳導域。在另一個實施例中，CAR分子中之一或兩者之配置包含主要胞內信號傳導域及兩個或兩個以上，例如2、3、4或5個或5個以上共刺激信號傳導域。在此類實施例中，本文所述之CAR分子及CD19 CAR可具有相同或不同主要胞內信號傳導域、相同或不同共刺激信號傳導域或相同數目或不同數目共刺激信號傳導域。或者，本文所描述之CAR及CD19 CAR經配置為分離CAR，其中CAR分子中的 一者包含抗原結合域及共刺激域(例如，4-1BB)，而另一CAR分子包含抗原結合域及主要胞內信號傳導域(例如，CD3 ξ)。
在一些實施例中，本文所描述之CAR表現細胞與介白素-15(IL-15)多肽、介白素-15受體α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽與IL-15Ra多肽兩者之組合(例如，hetIL-15(Admune Therapeutics,LLC)組合投與至個體。hetIL-15為IL-15與IL-15Ra之雜二聚體非共價複合物。hetIL-15描述於例如以引用的方式併入本文中之U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413及U.S.2011/0081311中。在實施例中，het-IL-15經皮下投與。在實施例中，個體患有癌症，例如實體癌症，例如黑色素瘤或結腸癌。在實施例中，個體患有轉移性癌症。
在實施例中，向患有本文所述之疾病，例如血液病症，例如AML或MDS之個體投與本文所述之CAR表現細胞以及藥劑，例如細胞毒性或化學療法藥劑、生物療法(例如抗體，例如單株抗體，或細胞療法)或抑制劑(例如激酶抑制劑)。在實施例中，向個體投與本文所述之CAR表現細胞以及細胞毒性劑，例如CPX-351(Celator Pharmaceuticals)、阿糖胞苷、道諾黴素、沃薩洛辛(vosaroxin)(Sunesis Pharmaceuticals)、沙帕他賓(sapacitabine)(Cyclacel Pharmaceuticals)、艾達黴素或米托蒽醌。CPX-351為包含5：1莫耳比之阿糖胞苷及道諾黴素的脂質體調配物。在實施例中，向個體投與本文所述之CAR表現細胞以及低甲基化劑，例如DNA甲基轉移酶抑制劑，例如阿紮胞苷或地西他濱。在實施例中，向個體投與本文所述之CAR表現細胞以及生物療法，例如抗體或細胞療法，例如225Ac-林妥珠單抗(225Ac-lintuzumab，Actimab-A；Actinium Pharmaceuticals)、IPH2102(Innate Pharma/Bristol Myers Squibb)、SGN-CD33A(Seattle Genetics)或吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotarg；Pfizer)。SGN-CD33A為 包含吡咯并苯并二氮呯二聚體附接於抗-CD33抗體之抗體-藥物共軛物(ADC)。Actimab-A為經錒標記之抗CD33抗體(林妥珠單抗)。IPH2102為靶向殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)之單株抗體。在實施例中，向個體投與本文所描述之CAR表現細胞以及FLT3抑制劑，例如索拉非尼(sorafenib)(Bayer)、米哚妥林(midostaurin)(Novartis)、喹雜替尼(quizartinib)(Daiichi Sankyo)、克瑞拉尼(crenolanib)(Arog Pharmaceuticals)、PLX3397(Daiichi Sankyo)、AKN-028(Akinion Pharmaceuticals)或ASP2215(Astellas)。在實施例中，向個體投與本文所描述之CAR表現細胞以及異檸檬酸脫氫酶(IDH)抑制劑，例如AG-221(Celgene/Agios)或AG-120(Agios/Celgene)。在實施例中，向個體投與本文所述之CAR表現細胞以及細胞循環調控因子，例如polo樣激酶1(Plk1)之抑制劑，例如沃拉替尼(volasertib，Boehringer Ingelheim)；或週期素依賴性激酶9(Cdk9)之抑制劑，例如阿昔迪布(alvocidib，Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis)。在實施例中，向個體投與本文所描述之CAR表現細胞以及B細胞受體信號傳導網路抑制劑，例如B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)之抑制劑，例如維托拉斯(venetoclax)(Abbvie/Roche)；或布魯頓氏酪胺酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，Btk)之抑制劑，例如依魯替尼(Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical)。在實施例中，向個體投與本文所描述之CAR表現細胞以及M1胺基肽酶之抑制劑，例如托多斯塔(tosedostat)(CTI BioPharma/Vernalis)；組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)之抑制劑，例如普拉斯塔(pracinostat)(MEI Pharma)；多激酶抑制劑，例如瑞格斯替(rigosertib)(Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio)；或肽CXCR4反向促效劑，例如BL-8040(BioLineRx)。
在另一實施例中，個體在細胞移植，例如同種異體幹細胞移植之前接受本發明之CAR表現細胞，例如CD19 CAR表現細胞組合物輸 注。在較佳實施例中，CAR表現細胞短暫表現CAR，例如藉由mRNA CAR之電穿孔，藉此由CAR，例如CD19靶向之抗原之表現在輸注供體幹細胞之前結束以避免移植失敗。在一個實施例中，可向個體投與減輕或改善與投與CAR表現細胞有關之副作用的藥劑。與投與CAR表現細胞有關之副作用包括(但不限於)CRS及噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH)，亦稱為巨噬細胞活化症候群(MAS)。CRS之症狀包括高熱、噁心、短暫低血壓、低氧及其類似症狀。因此，本文所描述之方法可包含向個體投與本文所描述之CAR表現細胞及進一步投與管理可溶性因子含量升高之藥劑，該含量升高由使用CAR表現細胞處理引起。在一個實施例中，個體中升高之可溶性因子為IFN-γ、TNFα、IL-2及IL-6中之一或多者。因此，投與以治療此副作用之藥劑可為抵消此等可溶性因子中之一或多者之藥劑。此類藥劑之實例包括(但不限於)類固醇(例如，皮質類固醇)、TNFα抑制劑及IL-6抑制劑。TNFα抑制劑之一實例為抗TNFα抗體分子，諸如英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗片段產品(certolizumab pegol)及戈利木單抗(golimumab)。TNFα抑制劑之另一實例為融合蛋白，諸如依那西普(entanercept)。TNFα之小分子抑制劑包括(但不限於)黃嘌呤衍生物(例如，己酮可可鹼(pentoxifylline))及安非他酮(bupropion)。IL-6抑制劑之一實例為抗IL-6抗體分子，諸如托西利單抗(tocilizumab，toc)、賽瑞單抗(sarilumab)、艾思莫單抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301及FM101。在一個實施例中，抗IL-6抗體分子為托西利單抗。基於IL-1R之抑制劑之一實例為阿那白滯素(anakinra)。
在實施例中，例如在投與一或多種表現本文所述之CAR之細胞之前對個體進行淋巴細胞耗盡。在實施例中，淋巴細胞耗盡包含投與美 法侖、賽特杉、環磷醯胺及氟達拉賓中之一或多者。
在實施例中，在投與(例如輸注)CAR細胞，例如本文所述之細胞之前、與其同時或在其之後向個體投與淋巴細胞耗盡化學療法。在一個實例中，淋巴細胞耗盡化學療法在投與CAR細胞之前投與至個體。舉例而言，淋巴細胞耗盡化學療法在CAR細胞輸注前1-4天(例如，1、2、3或4天)結束。在實施例中，投與多劑CAR細胞，例如如本文所述。舉例而言，單劑包含約5×108 個CAR細胞。在實施例中，在投與(例如輸注)本文所述之CAR表現細胞之前、與其同時或在其之後向個體投與淋巴細胞耗盡化學療法。
在一些實施例中，本文所述之CAR表現細胞與CD19 CAR表現細胞，例如CTL019(例如如以引用的方式併入本文中之WO2012/079000中所述)組合投與至個體以治療與癌症抗原表現相關之疾病，例如本文所述之癌症。在不受理論束縛之情況下，咸信組合投與表現CD19 CAR之細胞與另一CAR表現細胞藉由靶向早期譜系癌細胞(例如，癌症幹細胞)調節免疫反應、耗盡調節性B細胞及/或改善腫瘤微環境，來提高本文所描述之CAR表現細胞的功效。舉例而言，CD19 CAR表現細胞靶向表現早期譜系標記物之癌細胞，例如癌症幹細胞及CD19表現細胞，而本文所述之一些其他CAR表現細胞靶向表現晚期譜系標記物之癌細胞。此預處理方法可提高本文所述之CAR表現細胞的功效。在此類實施例中，CD19 CAR表現細胞在投與(例如，輸注)第二CAR表現細胞之前、與其同時或之後投與。
在實施例中，表現靶向除CD19以外之癌症抗原之CAR的CAR表現細胞亦表現靶向CD19之CAR，例如CD19 CAR。在一實施例中，表現非CD19 CAR及CD19 CAR之細胞投與至個體以治療本文所描述之癌症，例如AML。在一實施例中，CAR分子中之一或兩者之配置包含主要胞內信號傳導域及共刺激信號傳導域。在另一個實施例中，CAR 分子中之一或兩者之配置包含主要胞內信號傳導域及兩個或兩個以上，例如2、3、4或5個或5個以上共刺激信號傳導域。在此類實施例中，非CD19 CAR分子及CD19 CAR可具有相同或不同之主要胞內信號傳導域、相同或不同之共刺激信號傳導域或相同數目或不同數目之共刺激信號傳導域。或者，非CD19 CAR及CD19 CAR經配置為分離CAR，其中CAR分子中的一者包含抗原結合域及共刺激域(例如，4-1BB)，而另一CAR分子包含抗原結合域及主要胞內信號傳導域(例如，CD3 ξ)。
抑制分子抑制劑/檢查點抑制劑
在一個實施例中，可向個體投與增強CAR表現細胞之活性的藥劑。舉例而言，在一個實施例中，該藥劑可為抑制抑制分子之藥劑，例如該藥劑為檢查點抑制劑。在一些實施例中，抑制性或檢查點分子(例如，程式化死亡1(PD1))可降低表現CAR之細胞建立免疫效應反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如，TGFRβ)。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞包含開關共刺激受體，例如如以全文引用之方式併入本文中之WO 2013/019615中所述。
本文所描述之方法可包括與檢查點抑制劑組合投與CAR表現細胞。在一個實施例中，個體為完全反應者。在另一實施例中，個體為部分反應者或無反應者，且例如在一些實施例中，檢查點抑制劑在CAR表現細胞之前，例如投與CAR表現細胞之前兩週、12天、10天、8天、一週、6天、5天、4天、3天、2天或1天投與。在一些實施例 中，檢查點抑制劑與CAR表現細胞同時投與。
抑制分子之抑制，例如在DNA、RNA或蛋白質水準上之抑制，可使CAR表現細胞效能最佳。在實施例中，抑制核酸，例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA或叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)可用於抑制CAR表現細胞中之抑制分子的表現。在一實施例中，抑制劑為shRNA。在一實施例中，抑制分子在表現CAR之細胞內受到抑制。在此等實施例中，抑制抑制分子表現之dsRNA分子連接至編碼CAR組分(例如，所有組分)之核酸。
在一實施例中，編碼抑制調節或調控(例如，抑制)T細胞功能的分子表現之dsRNA分子之核酸分子可操作地連接於啟動子，例如H1衍生或U6衍生之啟動子，使得調節或調控(例如，抑制)T細胞功能的分子表現之dsRNA分子表現，例如在表現CAR之細胞內表現。參見例如Tiscornia G.,「Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA，」第3章，於Gene Transfer：Delivery and Expression of DNA and RNA(Friedmann及Rossi編)中。Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA,2007；Brummelkamp TR等人(2002)Science 296：550-553；Miyagishi M等人(2002)Nat.Biotechnol.19：497-500。在一實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子呈現於包含編碼CAR之組分(例如全部組分)之核酸分子之相同載體(例如豆狀病毒載體)上。在此類實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子位於載體(例如豆狀病毒載體)上，編碼CAR之組分(例如全部組分)之核酸的5'或3'。編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子可在與編碼CAR之組分(例如全部組分)之核酸相同或不同之方向轉錄。在 一實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子呈現於除包含編碼CAR之組分(例如全部組分)之核酸的載體以外之載體上。在一實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如，抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子在表現CAR之細胞內短暫表現。在一實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如，抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子穩定整合至表現CAR之細胞之基因組中。在一個實施例中，調節或調控，例如抑制T細胞功能之分子為PD-1。
在一個實施例中，抑制信號之抑制劑可為例如結合至抑制分子的抗體或抗體片段。舉例而言，藥劑可為結合至PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4之抗體或抗體片段(例如伊匹單抗(亦稱為MDX-010及MDX-101，且以Yervoy®形式銷售；Bristol-Myers Squibb；曲美單抗(IgG2單株抗體，購自Pfizer，先前稱為替西單抗，CP-675,206))。在一實施例中，該藥劑為與TIM3結合之抗體或抗體片段。在一實施例中，該藥劑為與LAG3結合之抗體或抗體片段。在一個實施例中，藥劑為與CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)結合之抗體或抗體片段。在實施例中，增強表現CAR之細胞的活性之藥劑，例如抑制分子之抑制劑與同種異體CAR、例如本文所描述之同種異體CAR(例如，描述於本文同種異體CAR部分中)組合投與。
PD1為CD28受體家族之抑制性成員，該受體家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD1在經活化之B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol 8：765-75)。PD1之兩個配位體PD-L1及PD-L2已展示在與PD1結合時抑制T細胞活化(Freeman等人，2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1在人類癌症中豐富(Dong等人2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10：5094)。免疫抑制可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。
PD1、PD-L1及PD-L2之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技術中可獲得且可與本文所描述之CD19 CAR組合使用。舉例而言，尼沃單抗(nivolumab)(亦稱作BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)為完全人類IgG4單株抗體，其特異地阻斷PD1。尼沃單抗(純系5C4)及其他特異性結合於PD1之人類單株抗體揭示於US 8,008,449及WO2006/121168中。皮立珠單抗(Pidilizumab)(CT-011；Cure Tech)為與PD1結合之人類化IgG1k單株抗體。皮立珠單抗及其他人類化抗PD1單株抗體揭示於WO2009/101611中。派立珠單抗(先前稱為拉立珠單抗(lambrolizumab)，且亦稱為MK03475；Merck)為結合至PD-1之人類化IgG4單株抗體。派立珠單抗及其他人類化抗PD1抗體揭示於US 8,354,509及WO2009/114335中。MEDI4736(Medimmune)為與PDL1結合且抑制配位體與PD1相互作用之人類單株抗體。MDPL3280A(Genentech/Roche)為與PD-L1結合之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。MDPL3280A及其他針對PD-L1之人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。其他抗PD-L1結合劑包括YW243.55.S70(重鏈及輕鏈可變區顯示於WO2010/077634中之SEQ ID NO 20及21中)及MDX-1 105(亦稱為BMS-936559，且例如揭示於WO2007/005874中之抗PD-L1結合劑)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827及WO2011/066342中所揭示)為阻斷PD1與B7-H1之間的相互作用之PD-L2 Fc融合可溶性受體。其他抗PD1抗體包括AMP 514(Amplimmune)，尤其例如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中所揭示之抗PD1抗體。
在一些實施例中，本文所述之PD1抑制劑(例如PD1抗體，例如本文所述之PD1抗體)與本文所述之CD19 CAR組合使用以治療與CD19表 現相關之疾病。在一些實施例中，本文所述之PD-L1抑制劑(例如PD-L1抗體，例如本文所述之PD-L1抗體)與本文所述之CD19 CAR組合使用以治療與CD19表現相關之疾病。疾病可例如為淋巴瘤，如DLBCL，包括主要DLBCL或次要DLBCL。在一些實施例中，個體具有或鑑別為具有至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之癌細胞，例如DLBCL細胞，其為CD3+/PD1+。在一些實施例中，個體具有或鑑別為具有癌症，例如癌症微環境中之CD19+細胞及PD-L1+細胞之大體上非重疊群體。舉例而言，在一些實施例中，癌症，例如癌症微環境中小於20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之細胞對CD19及PD-L1呈雙陽性。
在一些實施例中，個體用CD19 CAR、PD1抑制劑及PD-L1抑制劑之組合處理。在一些實施例中，個體用CD19 CAR、PD1抑制劑及CD3抑制劑之組合處理。在一些實施例中，個體用CD19 CAR、PD1抑制劑、PD-L1抑制劑及CD3抑制劑之組合處理。
在一些實施例中，本文中之方法包括分析生物樣品，例如包含DLBCL細胞之樣品中之細胞之CD3及/或PD-1(例如CD3及/或PD-1表現)的步驟。在一些實施例中，方法包括分析生物樣品，例如包含DLBCL細胞之樣品中之細胞之CD19及/或PD-L1(例如CD19及/或PD-L1表現)的步驟。在一些實施例中，方法包括例如提供包含癌細胞之樣品及對於CD3、PD-1、CD19或PD-L1中的一或多者進行偵測步驟，例如藉由免疫組織化學。方法可包含推薦或投與治療，例如包含CD19 CAR之治療的另一步驟。
在一個實施例中，抗PD-1抗體或其片段為如以全文引用的方式併入本文中之標題為「Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof」之US 2015/0210769中所描述之抗PD-1抗體分子。在一個實 施例中，抗PD-1抗體分子包括來自抗體之重鏈及輕鏈可變區的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR(或總體而言全部CDR)，其選自以下中任一者：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-純系-A、BAP049-純系-B、BAP049-純系-C、BAP049-純系-D或BAP049-純系-E；或如US 2015/0210769之表1中所描述，或由表1中之核苷酸序列編碼，或與任一前述序列實質上相同(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列；或密切相關CDR，例如相同或具有至少一個胺基酸改變但不超過兩個、三個或四個改變(例如，取代、缺失或插入，例如保守取代)之CDR。
在又一實施例中，抗PD-1抗體分子包含來自本文所描述之抗體，例如選自以下中任一者之抗體的至少一個、兩個、三個或四個可變區：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-純系-A、BAP049-純系-B、BAP049-純系-C、BAP049-純系-D或BAP049-純系-E；或如US 2015/0210769之表1中所描述，或由表1中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上相同(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列。
TIM3(T細胞免疫球蛋白-3)尤其在IFN-g-分泌CD4+ T輔助因子1及CD8+ T細胞毒性1細胞中亦負調控T細胞功能，且在T細胞耗盡中起 關鍵作用。抑制TIM3與其配位體(例如，半乳糖凝集素-9(Gal9)、磷脂醯絲胺酸(PS)及HMGB1)之間的相互作用可提高免疫反應。TIM3及其配位體之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技術中可獲得且可與本文所述之CD19 CAR組合使用。舉例而言，靶向TIM3之抗體、抗體片段、小分子或肽抑制劑與TIM3之IgV域結合以抑制與其配位體之相互作用。抑制TIM3之抗體及肽揭示於WO2013/006490及US20100247521中。其他抗TIM3抗體包括RMT3-23之人類化型式(揭示於Ngiow等人，2011,Cancer Res,71：3540-3551中)及純系8B.2C12(揭示於Monney等人，2002,Nature,415：536-541中)。抑制TIM3及PD-1之雙特異性抗體揭示於US20130156774中。
在一個實施例中，抗TIM3抗體或其片段為如以全文引用的方式併入本文中之標題為「Antibody Molecules to TIM3 and Uses Thereof」的US 2015/0218274中所描述之抗TIM3抗體分子。在一個實施例中，抗TIM3抗體分子包括來自選自以下中任一者之抗體之重鏈及輕鏈可變區的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR(或總體而言全部CDR)：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如US 2015/0218274之表1至表4中所描述；或由表1至4中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上相同(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列；或密切相關CDR，例如相同或具有至少一個胺基酸改變但不超過兩個、三個或四 個改變(例如，取代、缺失或插入，例如保守取代)之CDR。
在另一實施例中，抗TIM3抗體分子包含來自本文所描述之抗體，例如選自以下中任一者之抗體的至少一個、兩個、三個或四個可變區：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如US 2015/0218274之表1至4中所描述；或由表1至4中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上相同(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列。
在其他實施例中，提高CAR表現細胞活性之藥劑為CEACAM抑制劑(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5抑制劑)。在一個實施例中，CEACAM抑制劑為抗CEACAM抗體分子。例示性抗CEACAM-1抗體描述於WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251及WO 2014/022332中，例如單株抗體34B1、26H7及5F4；或其重組形式，例如US 2004/0047858、US 7,132,255及WO 99/052552中所描述。在其他實施例中，抗CEACAM抗體與CEACAM-5結合，如例如Zheng等人，PLoS One. 2010年9月2日；5(9).pii：e12529(DOI：10：1371/journal.pone.0021146)中所描述，或與CEACAM-1及CEACAM-5交叉反應，如例如WO 2013/054331及US 2014/0271618中所描述。
在不希望受理論束縛之情況下，咸信癌胚抗原細胞黏附分子(CEACAM)(諸如CEACAM-1及CEACAM-5)至少部分地介導抗腫瘤免 疫反應之抑制(參見例如Markel等人J Immunol.2002年3月15日；168(6)：2803-10；Markel等人J Immunol.2006年11月1日；177(9)：6062-71；Markel等人Immunology.2009年2月；126(2)：186-200；Markel等人Cancer Immunol Immunother.2010年2月；59(2)：215-30；Ortenberg等人Mol Cancer Ther.2012年6月；11(6)：1300-10；Stern等人J Immunol.2005年6月1日；174(11)：6692-701；Zheng等人PLoS One.2010年9月2日；5(9).pii：e12529)。舉例而言，CEACAM-1已描述為TIM-3之異嗜性配位體且在TIM-3介導之T細胞耐受性及耗竭中起作用(參見例如WO 2014/022332；Huang等人，(2014)Nature doi：10.1038/nature13848)。在實施例中，已展示CEACAM-1及TIM-3之共同阻斷增強異種移植結腸直腸癌模型中之抗腫瘤免疫反應(參見例如WO 2014/022332；Huang等人(2014)，見上文)。在其他實施例中，CEACAM-1與PD-1之共阻斷使T細胞耐受性降低，如例如WO 2014/059251中所描述。因此，CEACAM抑制劑可聯合本文所述之其他免疫調節劑(例如抗PD-1及/或抗TIM-3抑制劑)使用以增強針對癌症(例如黑色素瘤、肺癌(例如NSCLC)、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌及如本文所述之其他癌症)之免疫反應。
LAG3(淋巴細胞活化基因-3或CD223)為在活化之T細胞及B細胞上表現之細胞表面分子，其已顯示在CD8+ T細胞耗盡中起作用。LAG3及其配位體之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技術中可獲得且可與本文所描述之CD19 CAR組合使用。舉例而言，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)為靶向LAG3之單株抗體。IMP701(Immutep)為拮抗劑LAG3抗體，且IMP731(Immutep及GlaxoSmithKline)為耗盡LAG3抗體。其他LAG3抑制劑包括IMP321(Immutep)，其為LAG3及Ig之可溶性部分的重組融合蛋白，其與MHC II類分子結合且活化抗原呈現細胞(APC)。其他抗體揭示於例如WO2010/019570中。
在一個實施例中，抗LAG3抗體或其片段為如以全文引用的方式併入本文中之標題為「Antibody Molecules to LAG3 and Uses Thereof」的US 2015/0259420中所描述之抗LAG3抗體分子。在一個實施例中，抗LAG3抗體分子包含來自選自以下中任一者之抗體之重鏈及輕鏈可變區的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR(或總體而言全部CDR)：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-純系-F、BAP050-純系-G、BAP050-純系-H、BAP050-純系-I或BAP050-純系-J；或如US 2015/0259420之表1中所描述；或由表1中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上相同(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列，或密切相關CDR，例如相同或具有至少一個胺基酸改變但不超過兩個、三個或四個改變(例如取代、缺失或插入，例如保守取代)之CDR。
在另一實施例中，抗LAG3抗體分子包含來自本文所述之抗體，例如選自以下中任一者之抗體的至少一個、兩個、三個或四個可變區：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050- hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-純系-F、BAP050-純系-G、BAP050-純系-H、BAP050-純系-I或BAP050-純系-J；或如US 2015/0259420之表1中所描述；或由表1中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上相同(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列。
儘管不希望受理論束縛，在一些實施例中，腫瘤微環境由於藉由腫瘤微環境內存在之PD-L1+表現細胞或PD1+ T細胞發揮之直接或間接抑制效應而不利於攻擊癌細胞之CART細胞。更特定言之，腫瘤微環境可包含腫瘤細胞(其一般為CD19+)、免疫效應細胞(其可為CD3+ T細胞且可為PD1+或PD1-，且其可為內源性細胞或CAR表現細胞)及活化骨髓細胞(其一般為PD-L1+)。PD1+ T細胞可藉由防止CART細胞進入腫瘤在腫瘤微環境周圍產生「屏障」。根據本文中之非限制性理論，預投與PD1抑制劑及/或PD-L1抑制劑使腫瘤微環境對於CAR表現細胞進入腫瘤微環境更有利且有效地清除標靶陽性癌細胞。支持此模型之資料提供於本文，例如實例20及21中。
因此，在某些態樣中，本發明提供組合療法方法，其包含項個 體投與表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR，以及PD1抑制劑、PD-L1抑制劑或兩者。在一些實施例中，在CAR療法之前投與PD1抑制劑及/或PD-L1抑制劑。在其他實施例中，PD1抑制劑及/或PD-L1抑制劑與CAR療法同時或在其之後投與。在一些態樣中，個體為患有與CD19表現相關之疾病，例如惡性血液病，例如白血病或淋巴瘤，例如DLBCL，例如原發性DLBCL之個體。在一些實施例中，患者具有或鑑別為具有較高含量之PD1、PDL1、或CD3或其任何組合。在一些實施例中，患者具有或鑑別為具有或至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%對CD3及PD1呈陽性之DLBCL細胞。
本文亦提供監測CAR療法，例如CD19 CAR療法功效之方法。CAR表現細胞可向患者之血流投與，意圖為作為腫瘤細胞基地之細胞例如浸潤腫瘤。因此，在一些實施例中，方法包含對於腫瘤樣品分析CAR表現細胞之存在。在實施例中，方法包含偵測腫瘤標記，例如CD19。在實施例中，方法包含偵測CAR表現細胞之標記，例如CAR構築體或編碼CAR構築體之核酸。在實施例中，方法進一步包含偵測T細胞標記，例如CD3。在一些態樣中，個體為患有與CD19表現相關之疾病，例如惡性血液病，例如白血病或淋巴瘤，例如DLBCL，例如原發性DLBCL之個體。在一些實施例中，若CAR表現細胞顯示不佳腫瘤浸潤，則個體鑑別為相比於具有良好腫瘤浸潤之個體處於較高的復發風險。在一些實施例中，若CAR表現細胞顯示不佳腫瘤浸潤，則個體經投與PD1抑制劑及/或PD-L1抑制劑，例如與第二劑量之CAR表現細胞組合。
在一些實施例中，增強CAR表現細胞活性之藥劑可例如為包含第一域及第二域之融合蛋白，其中第一域為抑制分子或其片段，且第二域為與正信號相關之多肽，例如包含如本文所述之分子內信號傳導域 之多肽。在一些實施例中，與正信號相關聯之多肽可包括CD28、CD27、ICOS之共刺激域，例如CD28、CD27及/或ICOS之胞內信號傳導域，及/或例如本文所描述(例如，CD3 ξ)之主要信號傳導域。在一個實施例中，融合蛋白由表現CAR之相同細胞表現。在另一實施例中，融合蛋白由細胞，例如不表現抗CD19 CAR之T細胞表現。
在一個實施例中，增強本文所述之CAR表現細胞的活性之藥劑為miR-17-92。
在一個實施例中，增強本文所描述之CAR之活性的藥劑為細胞因子。細胞因子具有與T細胞擴增、分化、存活及穩態相關之重要功能。可投與接收本文所述之CAR表現細胞的個體之細胞因子包括：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18及IL-21或其組合。在實施例中，投與之細胞因子為IL-7、IL-15或IL-21或其組合。細胞因子可一天投與一次或一天投與多次，例如一天兩次、一天三次或一天四次。細胞因子可投與一天以上，例如細胞因子投與2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週或4週。舉例而言，細胞因子一天投與一次，歷時7天。
在實施例中，細胞因子與CAR表現細胞組合投與。細胞因子可與CAR表現細胞同時或並行投與，例如在同一天投與。細胞因子可製備在與CAR表現細胞相同的醫藥組合物中，或可製備在分開醫藥組合物中。或者，細胞因子可在投與CAR表現細胞之後不久，例如在投與CAR表現細胞之後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天投與。在細胞因子在一天以上進行之給藥方案中投與之實施例中，細胞因子給藥方案之第一天可在與表現CAR之T細胞投與相同的一天，或細胞因子給藥方案之第一天可為在CAR表現細胞投與之後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一個實施例中，在第一天，CAR表現細胞投與至個體，且在第二天，細胞因子一天投與一次，歷時隨後7天。在 一個實施例中，待與CAR表現細胞組合投與之細胞因子為IL-7、IL-15及/或IL-21。
在其他實施例中，在投與CAR表現細胞之後的一段足夠時間，例如在投與CAR表現細胞之後至少2週、3週、4週、6週、8週、10週、12週、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或1年或更多年投與細胞因子。在一個實施例中，在評估個體對CAR表現細胞之反應之後投與細胞因子。舉例而言，根據本文所描述之劑量及方案向個體投與CAR表現細胞。使用本文所述之任一方法，包括腫瘤生長之抑制、循環腫瘤細胞之減少或腫瘤消退，在投與CAR表現細胞之後2週、3週、4週、6週、8週、10週、12週、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或1年或更多年評估個體對CART療法之反應。不對CART療法展現足夠反應之個體可投與細胞因子。向對於CART療法具有次佳反應之個體投與細胞因子改進CART功效及/或抗腫瘤活性。在一個實施例中，在投與CAR表現細胞之後投與之細胞因子為IL-7。
其他組合療法可包括抗過敏劑、抗嘔吐劑、鎮痛劑、佐劑療法。
一些患者可在投與期間或之後經歷對本文所述之治療劑及/或其他抗癌劑之過敏性反應；因此，通常投與抗過敏劑以使過敏性反應之風險最小化。適合之抗過敏劑包括皮質類固醇，如地塞米松(dexamethasone)(例如Decadron®)、倍氯米松(beclomethasone)(例如Beclovent®)、氫化可體松(hydrocortisone)(亦稱為可的松、氫化可體松丁二酸鈉、氫化可體松磷酸鈉，且以商品名稱Ala-Cort®、磷酸氫化可體松、Solu-Cortef®、Hydrocort Acetate®及Lanacort®銷售)、潑尼龍(prednisolone)(以商品名稱Delta-Cortel®、Orapred®、Pediapred®及Prelone®銷售)、強的松(prednisone)(以商品名稱Deltasone®、 Liquid Red®、Meticorten®及Orasone®銷售)、甲潑尼龍(methylprednisolone)(亦稱為6-甲潑尼龍、乙酸甲潑尼龍、甲潑尼龍丁二酸鈉，以商品名稱Duralone®、Medralone®、Medrol®、M-Prednisol®及Solu-Medrol®銷售)；抗組織胺，如苯海拉明(diphenhydramine)(例如Benadryl®)、安泰樂(hydroxyzine)及塞庚啶(cyproheptadine)；及支氣管擴張劑，如β-腎上腺素激導性受體促效劑，沙丁胺醇(albuterol)(例如Proventil®)及特布他林(terbutaline)(Brethine®)。
一些患者可在投與本文所述之治療劑及/或其他抗癌劑期間及之後經歷噁心；因此抗嘔吐劑用於預防噁心(胃上部)及嘔吐。適合之抗嘔吐劑包括阿匹坦(aprepitant)(Emend®)、昂丹司瓊(ondansetron)(Zofran®)、格拉司瓊(granisetron)HCl(Kytril®)、勞拉西泮(lorazepam)(Ativan®、地塞米松(Decadron®)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)(Compazine®)、卡索匹坦(casopitant)(Rezonic®及Zunrisa®)及其組合。
通常規定緩解治療時段期間所經歷之疼痛的藥療以使患者更舒適。通常使用常見非處方鎮痛劑，諸如Tylenol®。然而，類鴉片鎮痛藥，如氫可酮/撲熱息痛(paracetamol)或氫可酮/乙醯胺苯酚(例如Vicodin®)、嗎啡(morphine)(例如Astramorph®或Avinza®)、羥考酮(例如OxyContin®或Percocet®)、鹽酸羥嗎啡酮(oxymorphone hydrochloride)(Opana®)及芬太尼(fentanyl)(例如Duragesic®)亦適用於中度或重度疼痛。
在致力於保護正常細胞免於治療毒性且限制器官毒性中，細胞保護劑(諸如神經保護劑、自由基清除劑、心臟保護劑、蒽環黴素溢出中和劑、營養物及類似者)可用作輔助療法。適合之細胞保護劑包括阿米福汀(Amifostine)(Ethyol®)、麩醯胺酸、地美司鈉 (dimesna)(Tavocept®)、美司鈉(mesna)(Mesnex®)、右雷佐生(dexrazoxane)(Zinecard®或Totect®)、紮利羅登(xaliproden)(Xaprila®)及甲醯四氫葉酸(亦稱為甲醯四氫葉酸鈣、檸膠因子及醛葉酸)。
以編碼序號、類屬或商標名鑑別之活性化合物之結構可自正版標準概要「默克索引(The Merck Index)」或自資料庫，例如專利國際(Patents International)(例如IMS世界公開案(IMS World Publications))獲得。
可與本發明化合物組合使用之上文所提及之化合物可如此項技術中，諸如上文所引用之文獻中所描述來製備及投與。
在一個實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含至少一種本發明之化合物(例如本發明之化合物)或其醫藥學上可接受之鹽以及適合於投與人類或動物個體之醫藥學上可接受之載劑，單獨或與其他抗癌劑一起。
在一個實施例中，本發明提供治療罹患細胞增殖性疾病(諸如癌症)之人類或動物個體之方法。本發明提供治療需要此類治療之人類或動物個體之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明化合物(例如，本發明化合物)或其醫藥學上可接受之鹽，單獨或與其他抗癌劑組合。
詳言之，組合物將呈組合治療劑調配在一起或分開投與。
在組合療法中，本發明化合物及其他抗癌劑可同時、並行或依次投與，無特定時間限制，其中此類投與在患者體內提供治療有效含量之兩種化合物。
在一較佳實施例中，本發明化合物及其他抗癌劑一般藉由輸注或經口按任何次序依次投與。給藥方案可視疾病階段、患者之身體健康狀況、個別藥物之安全型態及個別藥物之耐受性以及投與該組合之主治醫師及行醫者熟知之其他準則而變化。本發明化合物及其他抗癌 劑可彼此相隔幾分鐘、幾小時、幾天或甚至幾週投與，視用於治療之特定週期而定。另外，週期可包括在治療週期期間一種藥物比其他更頻繁地投與且每次藥物投與劑量不同。
在本發明之另一個態樣中，提供包括一或多種本發明之化合物及如本文所揭示之組合搭配物的套組。代表性套組包括(a)本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，(b)至少一種組合搭配物，例如如上所指出，從而此類套組可包含藥品說明書或包括投與指導之其他標籤。
本發明之化合物亦可與已知之治療方法，例如投與激素或尤其放射線組合投與。本發明之化合物可尤其用作放射增敏劑，尤其用於治療對於放射線療法展現不佳敏感性之腫瘤。
與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑組合
在一個實施例中，表現CAR分子，例如本文所述之CAR分子之細胞與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑組合投與。舉例而言，在一個實施例中，組合療法包括：CD19 CAR表現細胞、B細胞抑制劑(CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之抑制劑，例如靶向CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之CAR表現細胞)及mTOR抑制劑。本文所述之方法使用低免疫增強劑量之mTOR抑制劑，例如異位mTOR抑制劑，包括雷帕黴素類似物，如RAD001。投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如，不足以完全抑制免疫系統但足以提高免疫功能之劑量)可最佳化個體中免疫效應細胞(例如，T細胞或表現CAR之細胞)之效能。用於量測mTOR抑制之方法、劑量、治療方案及適合醫藥組合物描述於以引用的方式併入本文中之美國專利申請案第2015/01240036號中。
在一實施例中，投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑可導致以下中之一或多者： i)PD-1陽性免疫效應細胞之數目減少；ii)PD-1陰性免疫效應細胞之數目增加；iii)PD-1陰性免疫效應細胞/PD-1陽性免疫效應細胞之比率增加；iv)原始T細胞之數目增加；v)例如在例如記憶T細胞前體細胞之記憶T細胞上以下標記物中之一或多者之表現增加：CD62L高 、CD127高 、CD27+ 及BCL2；vi)舉例而言，在例如記憶T細胞前驅體之記憶T細胞上KLRG1表現減少；或vii)記憶T細胞前體細胞之數目增加，該等細胞例如為具有以下特徵中之任一者或組合之細胞：增加之CD62L高 、增加CD127高 、增加CD27+ 、降低之KLRG1及增加之BCL2；且其中例如與未經治療之個體相比，前述任一者，例如i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)或vii)，例如至少短暫發生。
在另一個實施例中，例如與未經處理之表現CAR之細胞或未經處理之個體相比，投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑引起表現CAR之細胞例如培養或在個體中之增殖或持久性增加或延長。在實施例中，增殖或持久性增加與表現CAR之細胞之數目增加相關。用於量測增殖增加或延長之方法描述於實例18及19中。在另一個實施例中，例如與未經處理之表現CAR之細胞或未經處理之個體相比，投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑引起例如培養或個體中表現CAR之細胞對癌細胞之殺死增加。在實施例中，癌細胞殺死增加與腫瘤體積減小相關聯。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所描述之CAR分子)之細胞與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如立體異位mTOR抑制劑，例如RAD001)或催化mTOR抑制劑組合投與。舉例而言，投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑可在投與本文中描述之表現CAR之細胞 前開始；在投與本文中所述之表現CAR之細胞前結束；與投與本文所述之表現CAR之細胞同時開始；與投與本文所述之表現CAR之細胞重疊；或在投與本文所述之表現CAR之細胞之後持續。
或者或另外，投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑可最佳化待工程改造以表現本文所描述之CAR分子的免疫效應細胞。在此類實施例中，投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如立體異位抑制劑，例如RAD001)或催化抑制劑，在自個體採集待工程改造以表現本文所描述之CAR分子的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)前起始或完成。
在另一個實施例中，例如在自個體收穫之後待工程改造以表現本文所述之CAR分子的免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞，或例如在投與個體之前表現CAR之免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞可在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑存在下培養。
在一個實施例中，向個體投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑包含例如每週一次，例如呈立即釋放劑型，投與0.1至20、0.5至10、2.5至7.5、3至6或約5mg RAD001或其生體相等劑量。在一個實施例中，向個體投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑包含例如每週一次，例如呈持續釋放劑型，投與0.3至60、1.5至30、7.5至22.5、9至18或約15mg RAD001或其生體相等劑量。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量與mTOR抑制相關聯，或提供以下之mTOR抑制：至少5%但不超過90%，至少10%但不超過90%，至少15%但不超過90%，至少20%但不超過90%，至少30%但不超過90%，至少40%但不超過90%，至少50%但不超過90%，至少60%但不超過90%，至少70%但不超過90%，至少5%但不超過80%，至少10%但不超過80%，至少15%但不超過80%，至少20%但不超過80%，至少30%但不超過80%，至少40%但不超過80%，至少50%但不超過80%，至少60%但不超過80%，至少5%但不超過70%，至少10%但不 超過70%，至少15%但不超過70%，至少20%但不超過70%，至少30%但不超過70%，至少40%但不超過70%，至少50%但不超過70%，至少5%但不超過60%，至少10%但不超過60%，至少15%但不超過60%，至少20%但不超過60%，至少30%但不超過60%，至少40%但不超過60%，至少5%但不超過50%，至少10%但不超過50%，至少15%但不超過50%，至少20%但不超過50%，至少30%但不超過50%，至少40%但不超過50%，至少5%但不超過40%，至少10%但不超過40%，至少15%但不超過40%，至少20%但不超過40%，至少30%但不超過40%，至少35%但不超過40%，至少5%但不超過30%，至少10%但不超過30%，至少15%但不超過30%，至少20%但不超過30%，或至少25%但不超過30%。
mTOR抑制程度可傳達為或對應於P70 S6激酶抑制程度，例如mTOR抑制程度可藉由P70 S6激酶活性降低水準，例如藉由P70 S6激酶受質磷酸化之減少來測定。mTOR抑制水準可藉由各種方法評估，諸如如以引用的方式併入本文中之美國專利申請案第2015/01240036號中所描述或如以引用的方式併入本文中之美國專利第7,727,950號中所描述，藉由佈雷分析(Boulay assay)量測P70 S6激酶活性；藉由西方墨點法量測磷酸化S6水準；或評估PD1陰性免疫效應細胞與PD1陽性免疫效應細胞之比率的變化。
如本文所使用，術語「mTOR抑制劑」係指化合物或配位體或其醫藥學上可接受之鹽，其抑制細胞中之mTOR激酶。在一實施例中，mTOR抑制劑為異位抑制劑。異位mTOR抑制劑包括中性三環化合物雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus))、與雷帕黴素相關之化合物，亦即具有與雷帕黴素類似的結構及功能之化合物，其包括例如雷帕黴素衍生物、雷帕黴素類似物(亦稱作雷帕羅吉)及抑制mTOR活性之其他巨環內酯化合物。在一實施例中，mTOR抑制劑為催化抑制劑。
雷帕黴素為由具有式A中所展示之結構的吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)產生的已知巨環內酯抗生素。
參見例如McAlpine,J.B.等人，J.Antibiotics(1991)44：688；Schreiber,S.L.，等人，J.Am.Chem.Soc.(1991)113：7433；美國專利第3,929,992號。存在針對雷帕黴素提出之各種編號方案。為避免混淆，當在本文中命名特異性雷帕黴素類似物時，該等名稱參考使用式A之編號方案的雷帕黴素。
適用於本發明中之雷帕黴素類似物為例如O取代之類似物，其中雷帕黴素之環己基環上之羥基經OR1 置換，其中R1 為羥基烷基、羥基烷氧基烷基、醯基胺基烷基或胺基烷基；例如RAD001，如US 5,665,772及WO94/09010中所描述，亦稱為依維莫司，其內容各自以引用的方式併入。
其他適合之雷帕黴素類似物包括在26或28位置處經取代之雷帕黴素類似物。雷帕黴素類似物可為上文所提及之類似物之差向異構體，尤其在位置40、28或26經取代之類似物之差向異構體，且可視情況進一步經氫化，例如如US 6,015,815、WO95/14023及WO99/15530 中所描述，其內容以引用的方式併入；例如ABT578，亦稱為佐他莫司或雷帕黴素類似物，描述於US 7,091,213、WO98/02441及WO01/14387中，其內容以引用的方式併入；例如AP23573，亦稱為地磷莫司。
適用於本發明之來自US 5,665,772之雷帕黴素類似物的實例包括(但不限於)40-O-苄基-雷帕黴素、40-O-(4'-羥甲基)苄基-雷帕黴素、40-O-[4'-(1,2-二羥乙基)]苄基-雷帕黴素、40-O-烯丙基-雷帕黴素、40-O-[3'-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4(S)-基)-丙-2'-烯-1'-基]-雷帕黴素、(2'E,4'S)-40-O-(4',5'-二羥基戊-2'-烯-1'-基)-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙氧基羰甲基-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(3-羥基)丙基-雷帕黴素、40-O-(6-羥基)己基-雷帕黴素、40-O-[2-(2-羥基)乙氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊環-3-基]甲基-雷帕黴素、40-O-[(2S)-2,3-二羥基丙-1-基]-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-菸鹼醯基氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-嗎啉基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-(2-N-咪唑基乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-甲基-N'-哌嗪基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、39-O-去甲基-39,40-O,O-伸乙基-雷帕黴素、(26R)-26-二氫-40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-胺乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯胺乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-菸鹼醯胺乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-(N-甲基-咪唑并-2'-基乙氧羰醯胺基)乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙氧基甲醯胺乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-甲苯基磺醯胺乙基)-雷帕黴素及40-O-[2-(4',5'-二乙氧羰基-1',2',3'-三唑-1'-基)-乙基]-雷帕黴素。
已知適用於本發明之其他雷帕黴素類似物為雷帕黴素之環己基環上之羥基及/或在28位置處之羥基經羥基酯基置換的類似物，例如見於US RE44,768中之雷帕黴素類似物，例如坦羅莫司
適用於本發明之其他雷帕黴素類似物包括彼等類似物：其中在16位置處之甲氧基經例如(視情況經羥基取代之)炔氧基、苯甲基、鄰甲氧基苯甲基或氯苯甲基之另一取代基置換，及/或其中39位置處之甲氧基連同39碳一起缺失使得雷帕黴素之環己基環變為缺少39位置甲基氧基之環戊基環；該等類似物如例如WO95/16691及WO96/41807中所描述，其內容以引用的方式併入。類似物可進一步經修飾以使得雷帕黴素40位置處之羥基經烷基化及/或32-羰基減少。
來自WO95/16691之雷帕黴素類似物包括(但不限於)16-去甲氧基-16-(戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(4-羥基-丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苯甲氧基-40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苯甲氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-鄰-甲氧基苄基-雷帕黴素、16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧基乙基)-16-戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-甲醯基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-羥甲基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-羧基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-(嗎啉-4-基)羰基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-[N-甲基，N-(2-吡啶-2-基-乙基)]胺甲醯基-42-去甲基-雷帕黴素及39-去甲氧基-40-去氧基-39-(對甲苯磺醯基亞肼基甲基)-42-去甲基-雷帕黴素。
來自WO96/41807之雷帕黴素類似物包括(但不限於)32-脫氧-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-脫氧-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-脫氧-40-O-(2-羥基-乙基)-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素、32(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕黴素及32(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素。
另一適合雷帕黴素類似物為如US2005/0101624中所描述之烏米莫司(umirolimus)，其內容以引用的方式併入。
RAD001(另外稱為依維莫司(Afinitor®))具有化學名稱(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羥基乙氧基)-3-甲氧基環己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧雜-4-氮雜-三環[30.3.1.04,9]三十六基-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮，如內容各自以引用的方式併入之US 5,665,772及WO94/09010中所述。
異位mTOR抑制劑之其他實例包括西羅莫司(雷帕黴素，AY-22989)、40-[3-羥基-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕黴素(亦稱為坦羅莫司或CCI-779)及地磷莫司(AP-23573/MK-8669)。異位mTOR抑制劑之其他實例包括佐他莫司(ABT578)及烏米莫司。
或者或另外，已發現催化ATP-競爭性mTOR抑制劑直接靶向mTOR激酶域且靶向mTORC1及mTORC2兩者。此等相較於諸如雷帕黴素之立體異位mTOR抑制劑亦為mTORC1之更有效抑制劑，因為其調節耐雷帕黴素之mTORC1輸出，諸如4EBP1-T37/46磷酸化及封端依賴性轉譯。
催化抑制劑包括：BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-側氧基-8-喹啉-3-基-2,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈，或單甲苯磺酸鹽形式(BEZ235之合成描述於WO2006/122806中)；CCG168(另外稱為AZD-8055，Chresta,C.M.等人，Cancer Res,2010,70(1),288-298)，其具有化學名稱{5-[2,4-雙-((S)-3-甲基-嗎啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇；3-[2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲醯胺(WO09104019)；3-(2-胺基苯并[d]噁唑-5-基)-1-異丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO10051043及 WO2013023184)；N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧基苯基)胺基)喹喏啉-2-基)胺磺醯基)苯基)-3-甲氧基-4-甲基苯甲醯胺(WO07044729及WO12006552)；PKI-587(Venkatesan,A.M.,J.Med.Chem.,2010,53,2636-2645)，其具有化學名稱1-[4-[4-(二甲胺基)哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲；GSK-2126458(ACS Med.Chem.Lett.,2010,1,39-43)，其具有化學名稱2,4-二氟-N-{2-甲氧基-5-[4-(4-噠嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺；5-(9-異丙基-8-甲基-2-嗎啉基-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO10114484)；及(E)-N-(8-(6-胺基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亞基)氰胺(WO12007926)。
催化mTOR抑制劑之其他實例包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(WO2006/122806)及Ku-0063794(Garcia-Martinez JM等人，Biochem J.,2009,421(1),29-42。Ku-0063794為雷帕黴素之哺乳動物目標的特異性抑制劑(mTOR)。)WYE-354為催化mTOR抑制劑之另一實例(Yu K等人(2009).Biochemical,Cellular,and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin.Cancer Res.69(15)：6232-6240)。
根據本發明適用的mTOR抑制劑亦包括其前藥、衍生物、醫藥學上可接受之鹽或前述中之任一者之類似物。
基於此項技術中公認之方法，基於本文所描述之特定劑量，諸如RAD001之mTOR抑制劑可經調配以便遞送。特定言之，美國專利第6,004,973號(以引用的方式併入本文中)提供可與本文所描述之mTOR抑制劑一起使用的調配物之實例。
用於評估CAR有效性或樣品適用性之方法及生物標記
本發明尤其提供指示用CAR療法治療之癌症患者是否可能復發或 已復發之基因標籤。不希望受理論束縛，此基因標籤之實驗基礎陳述於實例12中。
在一個實施例中，本文所述之新穎轉錄基因標籤(例如實例12中之表29 中)用於實現製造產物改良，進而減少患者復發可能性。在一個實施例中，本文所述之基因標籤用於改良製造產物之治療應用，進而減少患者復發可能性。
在一個實施例中，本文所述之基因標籤(例如實例12中之表29 中)在藉由CAR表現細胞之治療，例如預測CAR治療之復發之CART治療(例如CART19治療，例如CTL019療法)之前識別於個體中。在一個實施例中，本文所述之基因標籤識別於清除術樣品或骨髓樣品中。在一個實施例中，本文所述之基因標籤識別於輸注之前的CAR表現細胞製造產物，例如CART產品(例如CART19產品，例如CTL019)中。
本發明亦提供(不希望受理論束縛)在清除術之前或在製造CART產品期間減少患者中之TREG 標籤降低患者復發風險之證據(例如在實例12中)。
在一個實施例中，患者在收集用於CAR產品製造，例如CART產品製造之細胞之前藉由一或多種減少TREG 細胞之療法預處理，進而降低CAR表現細胞治療(例如CTL019治療)之患者復發風險。減少TREG 細胞之方法包括(但不限於)環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗盡及其組合。
在一個實施例中，患者在收集用於CAR表現細胞產品製造之細胞之前藉由環磷醯胺或抗GITR抗體預處理，進而減少CAR表現細胞治療(例如CTL019治療)之患者復發風險。
在一個實施例中，CAR表現細胞製造方法經修飾以在製造CAR表現細胞產品(例如CTL019產品)之前耗盡TREG 細胞。在一個實施例中，CD25耗盡用於在製造CAR表現細胞產品(例如CTL019產品)之前耗盡 TREG 細胞。
在一個實施例中，在藉由減少TREG 細胞之處理對患者或CAR表現細胞產品進行處理之後，患者經組合療法處理。組合療法可包含例如CD19抑制劑，如CD19 CAR表現細胞，及一或多種B細胞抑制劑，例如如本文所述之B細胞抑制劑。
在一個實施例中，對患者分析患者樣品，例如包含癌細胞之樣品及/或表示腫瘤微環境之樣品中之TREG 細胞含量。在一個實施例中，此資訊用於確定患者之療程。舉例而言，在一個實施例中，若患者鑑別為具有相比於對照物較高含量之Treg 細胞，則療法包含投與除CAR表現細胞以外之治療劑。舉例而言，療法可包含投與抗體分子、投與小分子治療劑、手術或放射療法或其任何組合。此療法可靶向一或多種B細胞抗原。
在一個實施例中，復發者為具有或鑑別為具有相比於非復發者之以下基因中的一或多者(例如2、3、4者或全部)之增加之表現量(例如RNA含量之增加)：MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C及HLA-DQB1，及/或相比於非復發者之以下基因中的一或多者(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部)之減少之表現量(例如RNA含量之減少)：PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1及EIF1AY。
在另一態樣中，本發明提供一種評估或監測CAR表現細胞療法在個體(例如患有癌症之個體)中之有效性，或樣品(例如清除術樣品)用於CAR療法，例如包括投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之療法之適合性之方法。該方法包括獲取CAR療法有效性或樣品適合性之值，其中該值指示表現CAR之細胞療法之有效性或適合性。
在實施例中，CAR療法之有效性或樣品適合性之值包含以下一 者、兩者、三者、四者、五者、六者或更多者(全部)的量測：(i)樣品(例如清除術樣品或製造之表現CAR之細胞產物樣品)中靜止TEFF 細胞、靜止TREG 細胞、較年輕T細胞(例如較年輕CD4或CD8細胞或γ/δ T細胞)或早期記憶體T細胞中之一者、兩者、三者或更多者(例如全部)的含量或活性，或其組合；(ii)樣品(例如，清除術樣品或所製造之表現CAR之細胞產物樣品)中活化TEFF 細胞、活化TREG 細胞、較老T細胞(例如，較老CD4或CD8細胞)或晚期記憶T細胞或其組合中之一者、兩者、三者或三者以上(例如，全部)的含量或活性；(iii)樣品(例如清除術樣品或CAR表現細胞製造產物樣品)中之免疫細胞耗盡標記，例如免疫檢查點抑制劑(例如PD-1、PD-L1、TIM-3及/或LAG-3)中之一者、兩者或兩者以上之含量或活性。在一個實施例中，免疫細胞具有耗盡表現型，例如共表現至少兩種耗盡標記物，例如共表現PD-1及TIM-3。在其他實施例中，免疫細胞具有耗盡表現型，例如共表現至少兩種耗盡標記物，例如共表現PD-1及LAG-3；(iv)樣品(例如清除術樣品或CAR表現細胞製造產物樣品)中，例如CD4+或CD8+ T細胞群體中之CD27及/或CD45RO-(例如CD27+CD45RO-)免疫效應細胞之含量或活性；選自CCL20、IL-17a及/或IL-6、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD57、CD27、CD122、CD62L、KLRG1之生物標記物中之一者、兩者、三者、四者、五者、十者、十二者或更多者之含量或活性；(vi)CAR表現細胞產品樣品中之細胞因子含量或活性(例如細胞因子譜系之品質)；或(vii)CAR表現細胞製造產物樣品中表現CAR之細胞之轉導效率。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，CAR表現細胞療法包含複數個(例如一群)CAR表現免疫效應細胞，例如複數個(例如一群)T 細胞或NK細胞或其組合。在一個實施例中，CAR表現細胞療法包括投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，自獲自個體之清除術樣品獲得(i)-(vii)中之一或多者的量測。可在輸注或再次輸注前評估清除術樣品。
在本文所揭示之方法中的任一者之一些實施例中，(i)-(vii)中的一或多者之量測獲自CAR表現細胞製造產物樣品。可在輸注或再次輸注前評估CAR表現細胞製造產物。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，在接收CAR表現細胞療法之前，在此期間或在接收之後評估個體。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，(i)-(vii)中之一或多者的量測評估基因表現、流動式細胞測量術或蛋白質表現中之一或多者的型態。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，該方法進一步包含基於(i)-(vii)中之一或多者的量測，鑑別個體為反應者、無反應者、復發者或非復發者。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，反應者(例如，完全反應者)具有或鑑別為具有比無反應者更大的GZMK、PPF1BP2或原始T細胞中一者、兩者或兩者以上(全部)之含量或活性。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有比反應者更大的IL22、IL-2RA、IL-21、IRF8、IL8、CCL17、CCL22、效應T細胞或調節性T細胞中一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或七者以上(例如，全部)之含量或活性。
在一個實施例中，復發者為具有或鑑別為具有與非復發者相比，增加的以下基因中之一或多者(例如2、3、4者或全部)之表現量：MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C及HLA-DQB1，與非 復發者相比，減少的以下基因中之一或多者(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部)之表現量的患者：PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1及EIF1AY。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，完全反應者具有或鑑別為具有與參考值，例如CD8+ T細胞之無反應者百分比相比，更大，例如統計學上顯著更大百分比之CD8+ T細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，完全反應者具有或鑑別為具有與參考值，例如CD27+ CD45RO-免疫效應細胞之無反應者數目相比，例如CD8+群體中更大百分比之CD27+ CD45RO-免疫效應細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，完全反應者或部分反應者具有或鑑別為具有與參考值(例如，CD4+ T細胞之無反應者百分比)相比更大(例如，統計學上顯著更大)百分比之CD4+ T細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，完全反應者具有或鑑別為具有與參考值，例如靜止TEFF 細胞、靜止TREG 細胞、較年輕T細胞(例如較年輕CD4或CD8細胞)或早期記憶體T細胞之無反應者數目相比，更大百分比之靜止TEFF 細胞、靜止TREG 細胞、較年輕T細胞(例如較年輕CD4或CD8細胞)或早期記憶體T細胞中之一者、兩者、三者或三者以上(例如全部)。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與參考值，例如活化TEFF 細胞、活化TREG 細胞、較老T細胞(例如，較老CD4或CD8細胞)或晚期記憶T細胞之反應者數目相比，更大百分比之活化TEFF 細胞、活化TREG 細胞、較老T細胞(例如，較老CD4或CD8細胞)或晚期記憶T細胞或其組合中一者、兩者、三者或三者以上(例如，全部)。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之免疫細胞耗竭標記，例如一種、兩種或兩種以上免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1、PD-L1、TIM-3及/或LAG-3)。在一個實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與來自反應者之表現PD-1或LAG-3之免疫效應細胞之百分比相比，更大百分比之表現PD-1、PD-L1或LAG-3之免疫效應細胞(例如，CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)(例如，表現CAR之CD4+細胞及/或CD8+ T細胞)。
在一個實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之具有耗竭表型之免疫細胞，例如共表現至少兩種耗盡標記，例如共表現PD-1、PD-L1及/或TIM-3之免疫細胞。在其他實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之具有耗盡表現型之免疫細胞，例如共表現至少兩種耗盡標記物，例如共表現PD-1及LAG-3之免疫細胞。
在本文所揭示之方法中的任一者之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與CAR表現細胞療法之反應者(例如完全反應者)相比，CAR表現細胞群體中較大百分比之PD-1/PD-L1+/LAG-3+細胞。
在本文所揭示之方法中的任一者之一些實施例中，部分反應者具有或鑑別為具有與CAR表現細胞群體中之反應者相比，較高百分比之PD-1/PD-L1+/LAG-3+細胞。
在本文所揭示之方法中的任一者之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有CAR表現細胞群體中之PD1/PD-L1+ CAR+之耗盡表現型及LAG3之共表現。
在本文所揭示之方法中的任一者之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與反應者(例如完全反應者)相比，CAR表現細胞群體中較大百分比之PD-1/PD-L1+/TIM-3+細胞。
在本文所揭示之方法中的任一者之一些實施例中，部分反應者具有或鑑別為具有與CAR表現細胞群體中之反應者相比，較高百分比 之PD-1/PD-L1+/TIM-3+細胞。
在本文所揭示之方法中的任一者之一些實施例中，清除術樣品中之CD8+ CD27+ CD45RO-T細胞之存在為個體對CAR表現細胞療法之反應之正性預測因子。
在本文所揭示之方法中的任一者之一些實施例中，清除術樣品中高百分比之PD1+ CAR+及LAG3+或TIM3+ T細胞為個體對CAR表現細胞療法之反應之不佳預測因子。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，反應者(例如，完全或部分反應者)具有以下型態中之一者、兩者、三者或三者以上(或全部)： (i)具有與參考值，例如CD27+免疫效應細胞之無反應者數目相比，更大數目之CD27+免疫效應細胞； (ii)具有與參考值，例如CD8+ T細胞之無反應者數目相比，更大數目之CD8+ T細胞； (iii)具有與參考值，例如表現一或多種檢查點抑制劑之細胞之無反應者數目相比，較低數目的表現一或多種檢查點抑制劑，例如選自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、或KLRG-1或組合之檢查點抑制劑之免疫細胞數目；或 (iv)具有與參考值，例如靜止TEFF 細胞、靜止TREG 細胞、原始CD4細胞、未刺激記憶細胞或早期記憶T細胞之無反應者數目相比，較大數目的靜止TEFF 細胞、靜止TREG 細胞、原始CD4細胞、未刺激記憶細胞或早期記憶T細胞或其組合中之一者、兩者、三者、四者或四者以上(全部)。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，(vi)之細胞因子含量或活性選自細胞因子CCL20/MIP3a、IL17A、IL6、GM-CSF、IFNγ、IL10、IL13、IL2、IL21、IL4、IL5、IL9或TNFα或其組合中之一者、 兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或八者以上(或全部)。細胞因子可選自IL-17a、CCL20、IL2、IL6或TNFa中之一者、兩者、三者、四者或四者以上(全部)。在一個實施例中，選自IL-17A及CCL20中之一或兩者的細胞因子之含量或活性增加指示反應增加或復發減少。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，(vii)中15%或更高之轉導效率指示反應增加或復發減少。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，(vii)中少於15%之轉導效率指示反應減少或復發增加。
在實施例中，藉由本文之方法鑑別之反應者、無反應者、復發者或非復發者可根據臨床準則進一步評估。舉例而言，完全反應者為或鑑別為患有疾病(例如，癌症)、展現對治療之完全反應(例如，完全緩解)之個體。完全反應可例如使用如本文所述之NCCN Guidelines®(其以全文引用的方式併入本文中)識別。部分反應者具有或鑑別為患有疾病，例如癌症之個體，其對於治療展現部分反應，例如部分緩解。部分反應可例如使用如本文所述之NCCN Guidelines®識別。無反應者為或鑑別為患有疾病，例如癌症，對治療不顯示反應之個體，例如患者具有穩定疾病或進展性疾病。無反應者可例如使用如本文所述之NCCN Guidelines®識別。
或者，或與本文所揭示之方法組合，回應於該值，進行以下中之一者、兩者、三者、四者或四者以上：例如向反應者或非復發者投與表現CAR之細胞療法；投與改變劑量之表現CAR之細胞療法；改變表現CAR之細胞療法之進度或時程；例如向無反應者或部分反應者投與另一藥劑與表現CAR之細胞療法，例如檢查點抑制劑，例如本文所述之檢查點抑制劑之組合； 在用表現CAR之細胞療法處理之前向無反應者或部分反應者投與增加個體中較年輕T細胞之數目的療法；修改表現CAR之細胞療法之製造方法，例如在引入編碼CAR之核酸之前增濃較年輕T細胞，或例如針對鑑別為無反應者或部分反應者之個體提高轉導效率；例如針對無反應者或部分反應者或復發者，投與替代性療法；或若個體為或鑑別為無反應者或復發者，則例如藉由CD25缺失、投與環磷醯胺、抗GITR抗體或其組合中之一或多者，減少TREG 細胞群體及/或TREG 基因特徵。
在某些實施例中，個體經抗GITR抗體預處理。在某一實施例中，個體在輸注或再輸注之前經抗GITR抗體處理。
在本文所描述之方法之一些實施例中，對已藉由CAR療法處理之個體進行藉由FDG-PET/CT(PET/CT)之成像。此量測可預測對療法之反應。舉例而言，在實施例中，量測代謝活性腫瘤體積(MTV)及/或[11F]-2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖(FDG)吸收。在實施例中，MTV之減小指示反應，例如CR(完全反應)或PR(部分反應)，例如約0之處理後MTV值指示CR，而MTV之增加指示PD(進展性疾病)。在實施例中，FDG吸收之減小指示反應，例如CR或PR，而FDG吸收之增加指示PD。在實施例中，在投與CAR療法之後，例如在投與CAR療法之後約1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月或6個月進行成像。在實施例中，對不具有CRS(細胞因子釋放症候群)症狀之個體，例如罹患CRS且症狀在成像之前消退之患者進行成像。在實施例中，對具有CRS症狀之個體進行成像。在實施例中，在CAR療法之前進行成像，且療法前影像相比於療法後影像。在實施例中，個體患有癌症，例如淋巴瘤，例如彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)或濾泡性淋巴 瘤(FL)。在一些實施例中，CAR療法包含CAR19表現細胞，例如CTL019。在一些實施例中，CAR療法包含本文所述之CAR療法，例如CAR20表現細胞、CAR22表現細胞或CAR19表現細胞，視情況與B細胞療法組合。
個體化用藥(治療診斷學) CD19特徵，例如突變
不希望受理論束縛，一些癌症患者對CD19抑制劑，如CD19 CAR表現細胞顯示初始反應，且接著復發。在一些實施例中，復發(至少部分)由癌細胞中之CD19中之移碼及/或過早終止密碼子，或降低CD19 CAR表現細胞靶向癌細胞之能力的CD19之表現(包括表現量)中之其他改變引起。此類突變可減小CD19療法之有效性及促進患者之復發。因此，在一些實施例中，當CD19療法經針對於第二不同標靶，例如表現於B細胞中之標靶，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之療法補充或替換時可為有益的。此類型之各種例示性組合療法揭示於本文中。
本申請案尤其揭示治療患有癌症之個體之方法，其包含以下中的一或多者：(1)測定個體是否具有CD19之特徵相對於參考特徵之差異，例如統計顯著差異，及(2)測定特徵與參考特徵之間是否存在差異，向個體投與治療有效劑量之CAR療法，例如CART，進而治療個體。患者可例如為在藉由CD19抑制劑，例如CD19 CAR表現細胞治療後已復發之患者。患者可為已接受或正接受CD19 CAR療法且處於復發風險下之患者。患者可為對於CD19 CAR療法之無反應者。
特徵可例如為CD19序列，例如蛋白質或核酸序列。序列可藉由高通量核酸測序，或藉由蛋白質之質譜測定，例如如實例中所述。如本文中之實例中所述，患者可由於CD19，例如CD19之外顯子2中之突變，例如造成CD19中之移碼及過早終止密碼子之突變而在CD19 CART療法之後復發。在實施例中，插入或缺失不會引起移碼及過早終止密碼子中的一者或兩者。突變可例如為插入、缺失、取代、易位或前述任一者之組合。插入、缺失或取代可涉及例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、20或50個核苷酸。插入、缺失或取代可涉及例如至多2、3、4、5、10、15、20、20、50或100個核苷酸。在一些情況下，細胞群體將包含一個以上突變。在此類狀況下，突變可在重疊或非重疊細胞亞群中。
在一些情況下，患者鑑別為具有降低CD19與CD19抑制劑，如CD19 CAR表現細胞接合之能力的CD19特徵。此類特徵可例如為移碼突變、過早終止密碼子、核酸序列之改變或初級mRNA轉錄物之結構之改變。特徵可例如為比剪接較早發生之CD19之正常產生之背離。特徵可例如為除外顯子跳躍以外之特徵。此類患者可用另一標靶之抑制劑，例如B細胞抑制劑，例如針對另一抗原決定基，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者內之抗原決定基之CAR表現細胞處理。
在一些情況下，患者鑑別為具有降低CD19與CD19抑制劑，如CD19 CAR表現細胞接合之能力，但不降低或消除CD19與第二CD19抑制劑，如結合至CD19上之不同區域之CD19抑制劑接合之能力的CD19特徵。此類特徵可例如為不會引起移碼突變或過早終止密碼子中的一者或兩者之突變。此類特徵可例如為核酸序列之改變或初級mRNA轉錄物之結構之改變、比剪接較早發生之CD19之正常產生之背離或除外顯子跳躍以外之特徵。此類患者可用CD19之抑制劑，例如針對CD19之完整區域，例如CD19之野生型部分之B細胞抑制劑處理。舉例而言，若突變存在於外顯子2中，則第二CD19抑制劑可結合至除外顯子2以外之外顯子，或不具有突變之外顯子2的一部分。第二CD19抑制劑可例如為本文所述之CD19抑制劑。
T EFF 及T REG 標籤
本文中之方法可包括測定TREG 標籤或測定例如患者中或細胞，例如免疫細胞群體中之TEFF 細胞或TREG 細胞含量之步驟。本文中之方法亦可包括減少患者中或細胞群體中之TREG 細胞之含量或減少TREG 標籤之步驟。在一些實施例中，TEFF 為具有以下基因中之一或多者(例如至少10、20、30、40、50、60、70、80者或全部)之經上調表現之細胞：AIM2、ALAS1、B4GALT5、BATF、C3orf26、C4orf43、CCL3、CCL4、CCT3、CCT7、CD40LG、CHAC2、CSF2、CTNNA1、EBNA1BP2、EDARADD、EEF1E1、EIF2B3、EIF2S1、FABP5、FAM40B、FKBP4、FOSL1、GFOD1、GLRX2、HSPD1、HSPE1、IFNG、IL15RA、IL21、IL2RA、IL3、KCNK5、KIAA0020、LARP4、LRP8、LTA、MANF、MIR1182、MIR155、MIR155HG、MTCH2、MYOF、NDUFAF1、NLN、NME1、NME1-NME2、OTUD7B、PAM、PDIA6、PEA15、PFKM、PGAM1、PGAM4、PPIL1、PRDX4、PRSS23、PSMD1、PSMD11、PSMD14、PTRH2、PUS7、RBBP8、RPF2、RPP25、SFXN1、SLC27A2、SLC39A14、SLC43A3、SORD、SPR、SRXN1、STIP1、STT3A、TBX21、TMCC2、TMEM165、TNFRSF9、TXN、TXNDC5、UCK2、VDR、WDR12、YWHAG及ZDHHC16。在一些實施例中，TREG 細胞為具有以下基因中之一或多者(例如至少10、20、30、40、50、60、70者或全部)之經上調表現之細胞：AIM2、ALAS1、BATF、C5orf32、CCL17、CD40LG、CHAC2、CSF1、CTSL1、EBNA1BP2、EDARADD、EMP1、EPAS1、FABP5、FAM40B、FKBP4、FOSL1、GCLM、GK、GPR56、HMOX1、HSPD1、HSPE1、IKBIP、IL10、IL13、IL15RA、IL1RN、IL2RA、IL3、IL4、IL5、IL9、KCNK5、LTA、MANF、MIR1182、MIR155、MIR155HG、MYOF、 NDUFAF1、NLN、NME1、NME1-NME2、PANX2、PDIA6、PGAM4、PPIL1、PPPDE2、PRDX4、PRKAR1B、PSMD1、PSMD11、PUS7、RBBP8、SLC27A2、SLC39A14、SLC43A3、SRXN1、STIP1、STT3A、TBX21、TNFRSF11A、TNFRSF1B、TNFRSF8、TNFRSF9、TXN、UCK2、VDR、VTRNA1-3、WDR12、YWHAG、ZDHHC16及ZNF282。經上調表現可例如在刺激之後16小時量測。經上調表現可例如藉由量測指定基因之RNA含量測定。
醫藥組合物及治療
本發明之醫藥組合物可在在一些態樣中包含如本文所述之CAR表現細胞，例如複數個CAR表現細胞，以及一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此類組合物可包含緩衝劑，諸如中性緩衝生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。在一個態樣中，本發明之組合物調配用於靜脈內投與。
本發明之醫藥組合物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投與。儘管可藉由臨床試驗確定適當劑量，但投與數量及頻率將由諸如以下之因素決定：患者之條件，及患者之疾病的類型及嚴重程度。
在一個實施例中，醫藥組合物實質上不含，例如不存在可偵測含量之例如選自由以下組成之群的污染物：內毒素、黴漿菌、複製勝任型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘餘抗CD3/抗CD28塗佈之珠粒、小鼠抗體、合併之人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體封裝細胞或質體組分、細菌及真菌。在一個實施例中，細菌為選自由以下組成之群的至少一者：糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、流行性嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。
當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，待投與之本發明組合物之精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及患者(個體)條件的差異來決定。在一些實施例中，包含細胞，例如本文所述之T細胞之醫藥組合物可以每公斤體重104 至109 個細胞，在一些情況下每公斤體重105 至106 個細胞(包括彼等範圍內之整數值)之劑量投與。在一些實施例中，細胞，例如本文所述之T細胞可以每公斤體重3×104 、1×106 、3×106 或1×107 個細胞投與。細胞組合物亦可以此等劑量多次投與。細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參看例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。
在一些實施例中，CAR細胞(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1 CAR細胞)之劑量包含每公斤約1×105 、2×105 、5×105 、1×106 、1.1×106 、2×106 、3.6×106 、5×106 、1×107 、1.8×107 、2×107 、5×107 、1×108 、2×108 或5×108 個細胞。在一些實施例中，CAR細胞(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1 CAR細胞)之劑量包含每公斤至少約1×105 、2×105 、5×105 、1×106 、1.1×106 、2×106 、3.6×106 、5×106 、1×107 、1.8×107 、2×107 、5×107 、1×108 、2×108 或5×108 個細胞。在一些實施例中，CAR細胞(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1 CAR細胞)之劑量包含每公斤至多約1×105 、2×105 、5×105 、1×106 、1.1×106 、2×106 、3.6×106 、5×106 、1×107 、1.8×107 、2×107 、5×107 、1×108 、2×108 或5×108 個細胞。在一些實施例中，CAR 細胞(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1 CAR細胞)之劑量包含每公斤約1.1×106 -1.8×107 個細胞或每公斤約8×105 -1.5×106 個細胞。在一些實施例中，CAR細胞(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1 CAR細胞)之劑量包含約1×107 、2×107 、5×107 、1×108 、2×108 、5×108 、1×109 、2×109 或5×109 個細胞。在一些實施例中，CAR細胞(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1 CAR細胞)之劑量包含至少約1×107 、2×107 、5×107 、1×108 、2×108 、5×108 、1×109 、2×109 或5×109 個細胞。在一些實施例中，CAR細胞(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1 CAR細胞)之劑量包含至多約1×107 、2×107 、5×107 、1×108 、2×108 、5×108 、1×109 、2×109 或5×109 個細胞。
在某些態樣中，可能需要向個體投與活化細胞，例如T細胞或NK細胞，且隨後再抽取血液(或進行清除術)、根據本發明自其活化細胞及藉由此等經活化及擴增之細胞再輸注患者。此過程可每幾週進行多次。在某些態樣中，細胞(例如T細胞或NK細胞)可活化自10cc至400cc之抽取血液。在某些態樣中，細胞(例如T細胞或NK細胞)活化自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc之抽取血液。
可以任何適宜方式投與標的組合物，包括藉由氣霧劑吸入、注射、攝入、輸注、植入或移植。可藉由反式動脈內、皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內向患者投與本文所描述之組合物。在一態樣中，本發明之細胞組合物，例如T細胞或NK細胞組合物藉由皮內或皮下注射投與至患者。在一態樣中，本發明之細胞組合物，例如T細胞或NK細胞組合物藉由靜脈內注射投與。細胞組合物，例如T細胞或NK細胞組合物可直接注射至腫瘤、淋 巴結或感染位點中。
在一特定例示性態樣中，個體可經歷白細胞去除術，其中將白細胞收集、增濃或離體耗盡以選擇及/或分離所關注細胞，例如T細胞。此等細胞分離株，例如T細胞或NK細胞分離株可藉由此項技術中已知之方法擴增及處理，使得可引入一或多種本發明之CAR構築體，進而產生CAR表現細胞，例如本發明之CAR T細胞。有需要之個體可隨後經歷用高劑量化學療法，後接周邊血液幹細胞移植之標準治療。在某些態樣中，在移植之後或同時，個體接受本發明之經擴增CAR表現細胞輸注。在一額外態樣中，在手術之前或之後投與擴增之細胞。
上述待向患者投與的治療之劑量將隨所治療之精確病狀性質及治療接受者而變化。可根據此項技術中接受之實踐對用於人類投與之劑量按比例調整。舉例而言，治療劑，例如抗體，例如CAMPATH之劑量可例如在1至約100mg範圍內(對於成年患者)，例如每天投與，持續1天與30天之間的時段。適合日劑量為每日1mg至10mg，然而在一些情況下，可使用高達每日40mg之較大劑量(描述於美國專利第6,120,766號中)。
在一個實施例中，CAR例如使用活體外轉錄引入至細胞，例如T細胞或NK細胞中，且個體(例如人類)接受本發明之CAR表現細胞，例如CAR T細胞之初始投與，及CAR表現細胞，例如本發明之CAR T細胞之一或多個後續投與，其中一或多個後續投與在前述投與之後小於15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天投與。在一個實施例中，每週向個體(例如人類)投與CAR表現細胞，例如本發明之CAR T細胞之一個以上投與，例如每週投與CAR表現細胞，例如本發明之CAR T細胞之2、3或4次投與。在一個實施例中，個體(例如人類個體)每週接受CAR表現細胞，例如CAR T細胞之一個以上投與(例如每週2、3或4次投與)(在本文中亦稱作週期)，接著一週不投與 CAR表現細胞，例如CAR T細胞，接著向個體投與CAR表現細胞，例如CAR T細胞之一或多個額外投與(例如每週CAR表現細胞，例如CAR T細胞之一個以上投與)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受CAR表現細胞，例如CAR T細胞之一個以上週期，且各週期之間的時間小於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施例中，CAR表現細胞，例如CAR T細胞每隔一天投與，每週3次投與。在一個實施例中，CAR表現細胞，例如本發明之CAR T細胞投與至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或八週以上。
在一些實施例中，個體可為成年個體(亦即18歲及更老)。在某些實施例中，個體可在1歲與30歲之間。在一些實施例中，個體為16歲或更老。在某些實施例中，個體在16歲與30歲之間。在一些實施例中，個體為兒童個體(亦即在1歲與18歲之間)。
在一態樣中，使用慢病毒載體，如慢病毒產生CAR表現細胞，例如CART。以該方式產生之CAR表現細胞，例如CART將具有穩定CAR表現。
在一個態樣中，使用諸如γ逆轉錄病毒載體，例如本文所述之γ逆轉錄病毒載體的病毒載體產生表現CAR之細胞，例如CART。使用此等載體產生之CART可具有穩定CAR表現。
在一態樣中，CAR表現細胞，例如CART在轉導之後4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天短暫表現CAR載體。可藉由RNA CAR載體傳遞實現CAR短暫表現。在一態樣中，CAR RNA藉由電穿孔轉導至細胞(例如，NK細胞或T細胞)中。
使用短暫表現CAR T細胞(詳言之攜帶鼠類scFv之CART)治療的患者中可能產生的潛在問題為多次治療後全身性過敏反應。
在不受此理論束縛之情況下，咸信此類過敏性反應可由產生體液抗CAR反應(亦即，具有抗IgE同型之抗CAR抗體)之患者引起。當 存在十天至十四天抗原暴露中斷時，認為患者之抗體製造細胞經歷IgG同型(不引起全身性過敏反應)至IgE同型的類別轉換。
若患者在短暫CAR療法過程中處於產生抗CAR抗體反應(諸如由RNA轉導產生者)之高風險下，則CART輸注中斷不應持續超過十天至十四天。
CD19抗體及CAR 鼠類抗CD19抗體之人類化
鼠類CD19抗體之人類化對於臨床配置為所需的，其中小鼠特異性殘基可在接受CART19處理，即藉由經CAR19構築體轉導之T細胞之處理的患者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。人類化CD19 CAR序列之產生、表徵及功效描述於以全文引用的方式併入本文中之國際申請案WO2014/153270中，包括實例1-5(第115-159頁)，例如表3、4及5(第125-147頁)。
CAR構築體，例如CD19 CAR構築體
在國際申請案WO2014/153270中所述之CD19 CAR構築體中，本文中再現某些序列。應理解，在此部分中之序列亦可用於其他CAR，例如CD10 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD34 CAR、CD123 CAR、FLT-3 CAR、ROR1 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR或CD79a CAR之情形中。
人類化scFv片段之序列(SEQ ID NO：1-12)提供下文表2中。完全CAR構築體使用顯示於下文之SEQ ID NO：1-12與額外序列SEQ ID NO：13-17產生，以產生具有SEQ ID NO：31-42之完全CAR構築體。
●前導(胺基酸序列)(SEQ ID NO：13)
●前導序列(核酸序列)(SEQ ID NO：54)
●CD8鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO：14)
●CD8鉸鏈(核酸序列)(SEQ ID NO：55)
●CD8跨膜(胺基酸序列)(SEQ ID NO：15)
●跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO：56)
●4-1BB胞內域(胺基酸序列)(SEQ ID NO：16)
●4-1BB胞內域(核酸序列)(SEQ ID NO：60)
●CD3 ξ域(胺基酸序列)(SEQ ID NO：17)
●CD3 ξ(核酸序列)(SEQ ID NO：101)
●CD3 ξ域(胺基酸序列；NCBI參考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO：43)
●CD3 ξ(核酸序列；NCBI參考序列NM_000734.3)；(SEQID NO：44)
CD28域(胺基酸序列，SEQ ID NO：1317)
CD28域(核苷酸序列，SEQ ID NO：1318)
野生型ICOS域(胺基酸序列，SEQ ID NO：1319)
野生型ICOS域(核苷酸序列，SEQ ID NO：1320)
Y至F突變ICOS域(胺基酸序列，SEQ ID NO：1321)
IgG4鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO：102)
IgG4鉸鏈(核苷酸序列)(SEQ ID NO：103)
此等純系在來源於4-1BB之共刺激域的信號域中均含有Q/K殘基變化。
在一些實施例中，抗原結合域包含表2 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中，抗原結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中，抗原結合域包含表2 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中，抗原結合域包含表2 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及表2 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些實施例中，CDR係根據Kabat編號方案、Chothia編號方案或其組合定義。
scFv域之人類化CDR序列之序列顯示於表4 (關於重鏈可變域)及表5 (關於輕鏈可變域)中。「ID」代表各CDR之各別SEQ ID NO。
隨後將CAR scFv片段選殖至慢病毒載體中以在單個編碼框中產 生全長CAR構築體，且使用EF1 α啟動子用於表現(SEQ ID NO：100)。
EF1 α啟動子 (SEQ ID NO：100)。
CAR22構築體：設計及功能
完全人類抗CD22單鏈可變片段經分離。用CD3ζ鏈及4-1BB共刺激分子將抗CD22 ScFv選殖至慢病毒CAR表現載體中。含CAR質體藉由於STBL3細胞中之細菌轉型，接著使用不含內毒素之Qiagen Plasmid Maki套組之Maxiprep擴增。使用標準技術在293T細胞中產生慢病毒上清液。
人類CAR之序列提供於下文表6A及6B 中。
此等純系在來源於CD3ζ鏈之共刺激域的信號域中均含有Q/K殘基改變。
產生若干額外CD22 scFv序列且描述於下文表6B 中。純系CD22-64及CD22-65係基於上文純系CD22-12之親和力成熟。在一些實施例中，CD22之親和力成熟結合域之親和力強於CD22之CD22-12。在一些實施例中，CD22之親和力成熟結合域之接通速率快於CD22之CD22-12。
在一些實施例中，抗原結合域包含表6A或6B 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中，抗原結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中，抗原結合域包含表6A或6B 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中，抗原結合域包含表6A或6B 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及表6A或6B 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些實施例中，CDR係根據Kabat編號方案、Chothia編號方案或其組合定義。
CD22-64及CD22-65係基於純系CD22-12之親和力成熟。所有三個構築體經測試且發現具有活性(參見本文中之實例25)。基於此等觀測結果，結構屬經設計以涵蓋實施例。因此，在一些實施例中，本文所述之CD22結合域包含具有序列：XRLQDGNSWSDAFDV(SEQ ID NO：141)之HCDR3。在一些實施例中，X為任何胺基酸、任何典型胺 基酸、非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)、無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)或酸性胺基酸(例如D或E)。
此外，CAR22-53及CAR22-57至CAR22-65在其CDR中具有結構類似性。結構屬經設計以涵蓋此等實施例。因此，在一些實施例中，本文所述之CD22結合域包含具有序列：TGX1 X2 X3 DX4 GX5 X6 X7 X8 VS(SEQ ID NO：___)之LCDR1。在一些實施例中，X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 或X8 或其任何組合各自獨立地為任何胺基酸，例如任何典型胺基酸。在一些實施例中，X4 或X5 或兩者各自獨立地為非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)或無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)。在一些實施例中，X6 為芳族胺基酸(例如F、Y或W)。在一些實施例中，X1 為S或T；X2 為R或S；X3 為N或S，X4 為V或I，X5 為A或G；X6 為Y或F；X7 為E或N；或X8 為S或Y，或其任何組合。在一些實施例中，X1 為S或T；X2 為R或S；X3 為N或S，X4 為V或I，X5 為A或G；X6 為Y或F；X7 為E或N；且X8 為S或Y。
類似地，在一些實施例中，本文所述之CD22結合域包含具有序列：X1 VX2 NRPS(SEQ ID NO：______)之LCDR2。在一些實施例中，X1 或X2 或兩者各自獨立地為任何胺基酸，例如任何典型胺基酸。在一些實施例中，X1 為酸性胺基酸(例如D或E)、非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)或無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)。在實施例中，X2 為非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)、無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)或極性不帶電胺基酸(例如S、T、N或Q)。在一些實施例中，X1 為E、G或D及/或X2 為N、I、S或T。
類似地，在一些實施例中，本文所述之CD22結合域包含具有序 列：SSX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 (SEQ ID NO：____)之LCDR3。在一些實施例中，X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 或X8 或其任何組合各自獨立地為任何胺基酸，例如任何典型胺基酸。在一些實施例中，X1 為芳族胺基酸(例如F、Y或W)或帶正電胺基酸(例如K、R或H)。在一些實施例中，X2 為非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)、無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)或極性不帶電胺基酸(例如S、T、N或Q)。在一些實施例中，X3 為極性不帶電胺基酸(例如S、T、N或Q)。在一些實施例中，X4 為非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)、無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)或極性不帶電胺基酸(例如S、T、N或Q)。在一些實施例中，X5 為帶正電胺基酸(例如K、R或H)或極性不帶電胺基酸(例如S、T、N或Q)。在一些實施例中，X6 為極性不帶電胺基酸(例如S、T、N或Q)、非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)、無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)。在一些實施例中，X7 為非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)、無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)或芳族胺基酸(例如F、Y或W)。在一些實施例中，X8 不存在或為芳族胺基酸(例如F、Y或W)。在一些實施例中，X9 為非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P、M、F或W)、無芳環之非極性胺基酸(例如G、A、V、L、I、P或M)。在一些實施例中，X1 為Y或H，X2 為A或T，X3 為S或T；X4 為G、T或S，X5 為R或S，X6 為T或P，X7 為L或Y，X8 為Y或不存在，或X9 為V或I，或其任何組合。在一些實施例中X1 為Y或H，X2 為A或T，X3 為S或T；X4 為G、T或S，X5 為R或S，X6 為T或P，X7 為L或Y，X8 為Y或不存在，且X9 為V或I。scFv域之人類CDR序列之序列顯示於表7A、7B或7C (關於重鏈可變域)及表8A或8B (關於輕鏈可變域)中。「ID」代表各CDR之各別SEQ ID NO。
在一些實施例中，抗原結合域包含表9A或9B 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中，抗原結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中，抗原結合域包含表10A或10B 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中，抗原結合域包含表10A或10B 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及表9A或9B 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些實施例中，CDR係根據Kabat編號方案、Chothia編號方案或其組合定義。
VL及VH域呈現於scFv中之次序可變化(亦即VL-VH或VH-VL定向)，且其中「G4S」(SEQ ID NO：18)次單元(其中各次單元包含序列 GGGGS(SEQ ID NO：18)(例如(G4S)3 (SEQ ID NO：107)或(G4S)4 (SEQ ID NO：106)))之三個或四個複本可連接可變域以產生整個scFv域。或者，CAR構築體可包括例如包括序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：1322)之連接子。
此等純系在來源於CD3ζ鏈之共刺激域的信號域中均含有Q/K殘基改變。
CAR20構築體
抗CD20單鏈可變片段經分離。參見表11A及11B 。用CD3ζ鏈及4-1BB共刺激分子將抗CD20 scFv選殖至慢病毒CAR表現載體中。含CAR質體藉由於STBL3細胞中之細菌轉型，接著使用不含內毒素之Qiagen Plasmid Maki套組之Maxiprep擴增。使用標準技術在293T細胞中產生慢病毒上清液。
CAR之序列提供於下文表11A及11B 中。CAR之額外組分(例如前導、鉸鏈、跨膜及信號傳導域)描述於本文中。
在一些實施例中，抗原結合域包含表11A及11B 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中，抗原結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中，抗原結合域包含表11A及11B 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中，抗原結合域包含表11A及11B 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及表11A及11B 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些實施例中，CDR係根據Kabat編號方案、Chothia編號方案或其組合定義。
scFv域之人類CDR序列之序列顯示於表12A或12B (關於重鏈可變域)及表13 (關於輕鏈可變域)中。「ID」代表各CDR之各別SEQ ID NO。
在一些實施例中，抗原結合域包含表14A或14B 中所列之任何重 鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中，抗原結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中，抗原結合域包含表15A或15B 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中，抗原結合域包含表15A或15B 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及表14A或14B 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些實施例中，CDR係根據Kabat編號方案、Chothia編號方案或其組合定義。
CAR123構築體
抗CD123單鏈可變片段經分離。用CD3ζ鏈及4-1BB共刺激分子將抗CD123 scFv選殖至慢病毒CAR表現載體中。含CAR質體藉由於STBL3細胞中之細菌轉型，接著使用不含內毒素之Qiagen Plasmid Maki套組之Maxiprep擴增。使用標準技術在293T細胞中產生慢病毒上清液。
CAR之序列提供與下文表16 中。CAR之額外組分(例如前導、鉸鏈、跨膜及信號傳導域)描述於本文中。
scFv中VL及VH域出現之次序變化(亦即VL-VH或VH-VL取向)，且其中各次單元包含序列GGGGS(SEQ ID NO：18)之「G4S」(SEQ ID NO：18)次單元之三個或四個複本(例如(G4S)3 (SEQ ID NO：107)或(G4S)4 (SEQ ID NO：106))連接可變域以產生整個scFv域。
人類CAR之序列提供於下文表16 中。
此等純系在來源於CD3ζ鏈之共刺激域的信號域中均含有Q/K殘基改變。
表16 ：人類CD123 CAR構築體
在一些實施例中，抗原結合域包含表16 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中，抗原結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中，抗原結合域包含表16 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中，抗原結合域包含表16 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及表16 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些實施例中，CDR係根據Kabat編號方案、Chothia編號方案 或其組合定義。
scFv域之人類CDR序列之序列顯示於表17 (關於重鏈可變域)及表18 (關於輕鏈可變域)中。「ID」代表各CDR之各別SEQ ID NO。
在一個實施例中，B細胞抑制劑包含CD123 CAR，其包含包括CD123結合域之抗體或抗體片段，其中該CD123結合域包含表18 所列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)胺基酸序列中的一或多者，及表17 中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
scFv域之額外CD123 CDR序列顯示於表19、21及23 (關於重鏈可變域)及表20、22及24 (關於輕鏈可變域)中。「ID」代表各CDR之各別SEQ ID NO。
表19及20 中提供之CDR係根據Kabat與Chothia編號方案之組合。
在一個實施例中，B細胞抑制劑包含CD123 CAR，其包含包括CD123結合域之抗體或抗體片段，其中該CD123結合域包含表20 所列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)胺基酸序列中的一或多者，及表19 中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
在一個實施例中，B細胞抑制劑包含CD123 CAR，其包含包括CD123結合域之抗體或抗體片段，其中該CD123結合域包含表22 所列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)胺基酸序列中的一或多者，及表21 中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
在一個實施例中，B細胞抑制劑包含CD123 CAR，其包含包括CD123結合域之抗體或抗體片段，其中該CD123結合域包含表24 所列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)胺基酸序列中的一或多者，及表23 中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或 多者。
提供此等CD123 CAR之額外描述，例如在PCT/CN2014/090508中，該申請案以全文引用的方式併入本文中。
使用含有由NFAT啟動子驅動之螢光素酶報導子之Jurkat細胞株(稱為JNL細胞)評估人類抗CD123 CAR構築體之活性。量測四個本文所描述之CAR構築體(CD123 CAR1-4)及鼠類CD123 CAR構築體1172及1176之CD123 CAR活性。CAR活性量測為此NFAT驅動之報導子的活化。將含有CART構築體之慢病毒上清液添加至JNL細胞以進行轉導。轉導後4-6天，藉由如下文所描述之FACS評估JNL細胞之CAR表現，或JNL細胞與靶陽性(MOLM3，經工程改造以表現CD123之K562細胞(CD123-K562))或靶陰性(K562)細胞株以3：1之效應子(JNL)與靶細胞株比率(E：T)混合以觸發活化(圖41)。共培育20小時後，如圖42中所展示使用Bright-GloTM 螢光素酶分析在EnVision儀器上量測螢光素酶信號。
基於CD123 CAR轉導之T細胞(「CART-CD123」或「CART-CD123 T細胞」)回應於表現CD123(「CD123+」)之標靶的效應T細胞反應之數量及品質來選擇最佳抗CD123 CAR構築體。效應T細胞反應包括(但不限於)細胞擴增、增殖、倍增、細胞因子產生及靶細胞殺死或細胞溶解活性(脫粒)。
產生CART-CD123
編碼慢病毒轉移載體之人類scFv用於產生封裝至VSVg假型慢病毒粒子中之基因組材料。將慢病毒轉移載體DNA與三種封裝組分VSVg、gag/pol及rev混合，與脂染胺試劑組合以將其一起轉染至Lenti-X 293T細胞(Clontech)中。
30小時後，收集培養基，過濾且儲存在-80℃下。藉由以來自正常清血供體之血液為起始物質產生治療性CART-CD123，該供體之原 始T細胞藉由負選擇T細胞、CD4+及CD8+淋巴細胞來獲得。在37℃、5% CO2 下，在RPMI 1640、10%加熱不活化胎牛血清(FCS)、2mM L-麩醯胺酸、1×青黴素/鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉(NaPyruvate)、10mM Hepes及55μM 2-巰基乙醇中，藉由1：3比率之CD3×28珠粒(Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28,Invitrogen)活化此等細胞。T細胞以於24孔板每孔0.5mL培養基中1×106 個T細胞培養。24小時之後，T細胞爆發且添加0.5mL病毒上清液。隨後T細胞開始以對數生長模式分裂，此藉由量測每毫升細胞計數來監測，且T細胞每兩天在新鮮培養基中稀釋。在大約10天後，隨著T細胞開始停止，對數生長衰減。減緩生長速率與接近約300fl的T細胞大小之組合確定T細胞狀態為冷凍保存用於稍後分析。
在冷凍保存之前，使用蛋白質L作為偵測試劑藉由流式細胞學分析在BD LSRFortessa或BD-FACSCanto上測定轉導之細胞(在細胞表面上表現抗CD123 CAR)及其相對螢光表現強度之百分比。信號高於未染色細胞之來自彼FACS的相對螢光強度之選通直方圖展現轉導之T細胞之百分比。轉導導致如圖42中所展示之一系列12-42%之CART陽性細胞。
評估CART-CD123重定向T細胞之細胞溶解活性。
為評估CART-CD123 T細胞殺死表現標靶之細胞的功能性能力，將細胞解凍且使其恢復隔夜。
T細胞殺死針對穩定表現螢光素酶之表現CD123之MOLM13急性骨髓性白血病細胞株。未轉導之T細胞用於確定非特異性背景殺死水準。當效應子定義為表現抗CD123嵌合受體之T細胞時，CART-CD123之細胞溶解活性以4：1之效應子：靶細胞比率及T細胞2倍向下稀釋之滴定法量測。藉由混合適當數目之T細胞與恆定數目之靶細胞來起始分析。在20小時之後，使用Bright-GloTM 螢光素酶分析，在EnVision儀 器上量測螢光素酶信號。隨著表現CD123-CART之細胞與未轉導之T細胞之比例增加，CD123細胞殺死類似地增加。本文所呈現之資料表明彼等表現CD123之細胞僅受表現CD123-CART之細胞而非未轉導之T細胞破壞。圖43。
T細胞轉導
選擇人類抗人類CD123純系NVS 2(表現CAR123-2)、NVS 3(表現CAR123-3)、NVS 4(表現CAR123-4)用於進一步研究。此等純系均針對食蟹獼猴CD123交叉反應。其活性與小鼠純系1172及1176進行比較，包含CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及41BB-共刺激域呈輕鏈至重鏈定向之VH及VL域。1176亦針對食蟹獼猴CD123交叉反應。1172並非如此。
將質體轉型為勝任細胞，在500cc培養液中生長，藉由大量提取分離，且使用標準方法轉導至293T細胞中。在24小時及48小時收集慢病毒上清液，使用超速離心集中，且冷凍。
將慢病毒滴定於SupT1細胞上，且測定適當量之病毒用於在MOI為3下轉導主要T細胞。使用抗CD3/CD28珠粒(Dynal,Invitrogen)及介白素-2 100U/ml刺激初級正常供體CD4+CD8細胞6天，隨後切除胎圈且冷凍一次。T細胞細胞體積減少至<300fL(在大致10-12天之後)。
所有純系之T細胞轉導效率幾乎為100%(圖44A及圖44B)。CD4：CD8比率在NVS純系中為大約1：1，且在1172及1176純系中為3：2(圖45)。
脫粒
為評估脫粒，將CART細胞(NVS 2-4，1172及1176純系)解凍，以T細胞培養基中2e6 個細胞/毫升之濃度靜置隔夜。隨後將細胞計數且第二天在1e6 個細胞/毫升下再懸浮。腫瘤靶細胞(TCM、PMA/iono、MOLM14或JURKAT)在5e6 個細胞/毫升下再懸浮。細胞以1e5 個T細 胞：5e5 個腫瘤細胞之比率接種於48孔板中且在抗CD107a PECy7、抗CD49d純化及抗CD28純化之抗體存在下培育2小時。隨後收集細胞，用抗CD3 APC染色，且使用BD LSR Fortessa獲取(圖46)。
在圖46之各圖右上方象限中指示T細胞脫粒。本文所呈現之結果表明在2h活體外分析期間藉由類似脫粒體現之CD123+標靶之類似T細胞識別。C1176之脫粒為65%，與其他純系之大約80%相比更差。
細胞毒性
為評估細胞毒性，將CART細胞(NVS 2-4、1172及1176純系)解凍，且在T細胞培養基中2e6 個細胞/毫升下靜置隔夜。第二天將細胞計數且在1e6 個細胞/毫升下再懸浮。腫瘤靶細胞(MOLM14)在1e6 個細胞/毫升下再懸浮。細胞在如所指示之減小之E：T比率下在黑色平底96孔板中一式兩份地平鋪(圖47)。培育20小時之後，添加螢光素且使板成像以確定光子通量作為殘餘活細胞之量測。在20小時在大多數效應子：標靶比率下所有純系之間的MOLM14細胞殺死為等效的。
活體內小鼠模型
在D0將NSG小鼠靜脈內注射表現1e6 螢光素酶之MOLM14細胞。在D6使小鼠之腫瘤負荷成像(IVIS光譜)且隨機分為治療組。將具有最低腫瘤負荷之小鼠指派至對照組(未轉導之T細胞，UTD)。在D7靜脈內注射CART細胞(NVS 2-4、1172及1176純系)或對照T細胞(1e6 )。來自在D13進行之成像的資料展示於圖48中。注射之後六天，所有抗CD123構築體提供與活體外資料一致之相等抗腫瘤效果。
產生基於針對食蟹獼猴CD123交叉反應之鼠類1176之人類化抗CD123單鏈可變片段(scFv)且用胞內CD3ζ鏈及4-1BB之胞內共刺激域選殖至慢病毒表現載體中。
scFv中VL及VH域出現之次序變化(亦即VL-VH或VH-VL取向)，且其中各次單元包含序列GGGGS(SEQ ID NO：18)之「G4S」(SEQ ID NO：18)次單元之三個或四個複本(例如(G4S)3 (SEQ ID NO：107)或(G4S)4 (SEQ ID NO：106))連接可變域以產生整個scFv域，如表25 中所示。
人類化CAR之序列提供於下文表25 中。
此等純系在來源於CD3ζ鏈之共刺激域的信號域中均含有Q/K殘基改變。
hzCD123 CAR 1-32之scFv域之人類化CDR序列之序列顯示於表26 (關於重鏈可變域)及表27 (關於輕鏈可變域)中。「ID」代表各CDR之各別SEQ ID NO。
在一些實施例中，CAR123具有具有序列YCARGNWDDY(SEQ ID NO：__)之HCDR3。
CAR scFv片段接著選殖至慢病毒載體中以在單個編碼框架中產生全長CAR構築體，且使用EF1 α啟動子用於表現。
雙特異性CAR19/CAR22構築體及其功能
此部分描述雙特異性CAR19/CAR22構築體之產生及功能。設計兩種雙特異性scFv串聯融合物：抗CD22(HL)4G4S-抗CD19(LH)及抗CD19-4G4S-抗CD22。名稱(HL)指示重鏈可變區在指定scFv內之輕鏈區上游，且名稱(LH)指示輕鏈可變區在指定scFv內之重鏈區上游。抗CD22鹼基分子為hCD22-2，且使用HL定向。抗CD19鹼基分子為人類化抗CD19序列，本文提供表2 之構築體標識104876，其使用LH定向。構築體示意性地說明於圖13中。
兩種雙特異性構築體以及其scFv部分之核苷酸及胺基酸序列在下文表28 中給出。
在一些實施例中，抗原結合域包含表28 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中，抗原結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中，抗原結合域包含表28 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中，抗原結合域包含表28 中所列之任何輕鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及表28 中所列之任何重鏈結合域胺基酸序列之一個、兩個或所有HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些實施例中，CDR係根據Kabat編號方案、Chothia編號方案或其組合定義。
上文所述之雙特異性CD19-CD22及CD22-CD19構築體如下文實例中所述在NFAT分析中測試。作為對照，使用抗CD19單獨CAR及抗CD22單獨CAR。此分析之結果顯示於圖14中。資料指示抗CD19及抗CD22 scFv均針對其標靶具活性。
實例
參考以下實驗性實例來進一步詳細描述本發明。除非另外規定，否則提供此等實例僅出於說明的目的，且不意欲限制。因此，本發明決不應解釋為限於以下實例，但確切而言應解釋為涵蓋由於本文所提供之教示而變得明顯的任何及所有變體。
無需進一步描述，咸信一般熟習此項技術者可使用前述描述及以下說明性實例製造及利用本發明組合物且實踐所主張之方法。以下實施例特定指出本發明之各種態樣且不應理解為以任何方式限制本發明之剩餘部分。
實例1：用於治療多發性骨髓瘤之CD19 CAR T細胞。
即使使用化學療法、靶向療法及自體幹細胞移植之當前方案，骨髓瘤亦視為一種不可治癒疾病。本實例描述用針對CD19與嵌合抗原受體(慢病毒/CD19：4-1BB：CD3ζ；亦稱為「CART19」或CTL019)之自體T細胞治療多發性骨髓瘤(MM)。此實例證實基於靶向CD19表現量極低(藉由大多數方法不可偵測)之骨髓瘤幹細胞及/或腫瘤細胞，針對CD19之CAR療法能夠建立深而長期的耐久緩解。
在治療患有侵襲性繼發性漿細胞白血病之患者時，發現在補救自體幹細胞移植之後兩天投與之CART19在經由多系化學療法已進展之患者中引起漿細胞白血病快速清除，且部分反應極佳。在治療前數月，此患者為輸注依賴性的；在治療之後的兩個月，其已恢復其血液數(具有正常範圍之血小板計數及白血球數)且已不需要輸血，因為其出院，解除其治療。
因為骨髓瘤細胞天然不表現CD19，所以CART19治療在此腫瘤中誘發快速且顯著腫瘤反應之發現為出人意料的。不希望受特定理論束縛，推論CART19可用於治療骨髓瘤，因為：(1)雖然骨髓瘤細胞傳統上認為藉由流動式細胞測量術為CD19表現陰性，但存在資料指示骨 髓瘤細胞可表現極低水準之CD19，使得表現藉由RNA可偵測但藉由流動式細胞測量術或免疫組織化學不可偵測；以及(2)靶向純系型B細胞之概念，純系型B細胞視為引起多發性骨髓瘤之癌幹細胞，且對化學療法尤其具抗性。雖然B細胞與骨髓瘤腫瘤細胞之間存在純系關係，但傳統的骨髓瘤療法針對惡性漿細胞而非B細胞。因此，用於治療骨髓瘤之CART19靶向不同於大多數骨髓瘤療法之細胞群體。
在單服務患者經歷中，該患者具有循環漿細胞，且能夠測試其腫瘤細胞之CD19表現情況。約1-2%之其腫瘤細胞表現CD19抗原。因此，推論CART19可對其腫瘤細胞之極小群體具有直接作用；部分反應極佳，不過尚未基於靶向僅僅CD19+腫瘤細胞之極小群體預測。
在此情況下，在高劑量美法侖之後，在自體幹細胞移植急救後投與CART19。雖然此為骨髓瘤中之標準療法，但其非治癒性的。此外，此患者先前已經受串聯自體幹細胞移植且在移植之後早期(<6個月)復發。不希望受特定理論束縛，使用如本實例中所述之CART19細胞在與補救自體幹細胞移植組合時在治療骨髓瘤中可具有不重疊之機制。
在I期試驗中將十個額外多發性骨髓瘤患者用CART19治療，且迄今為止至少三個患者已治療。
劑量基本原理及風險/效益
吾人選擇對於此方案經由靜脈內投與途徑使用平坦給藥。此方案之主要目標為測試向患有多發性骨髓瘤之患者投與CART-19細胞之安全性及可行性。預料的主要毒性為(I)當CAR遇到惡性或正常B細胞上之其替代CD 19抗原時之細胞因子釋放；(2)正常B細胞之耗盡，與利妥昔單抗療法類似；(3)類似於移植物抗宿主病之類固醇反應性皮膚及胃腸症候群，如當擴增/共刺激自體T細胞已與ASCT偶合(就MM而言)時已預先所見。理論關注點為CART-19 T細胞之轉型或不受控增 殖是否可能回應於CD 19之高含量而出現。此為本申請案中相比於CLL患者之另一研究之較小關注點，因為MM中之純系型B細胞之負擔預期比所述研究中治療之難治型CLL患者中之惡性B細胞之負擔低得多。
劑量基本原理
在頭3個患者下，吾人已在1.4×107 至1.1×109 個CART-19細胞範圍內之劑量下觀測到臨床活性。此觀測結果證實，至少在首批3個治療之患者中，不存在明顯的劑量反應關係。在投與劑量差異兩log倍數之患者中觀測到完全反應。因此，不同於代謝之標準藥物，CART細胞可具有寬劑量反應範圍。此最可能因為CAR T細胞能夠在患者中廣泛地增殖。因此設定1-5×108 個CART-19細胞之劑量範圍用於輸注。在基於體恤使用提供之此單一患者研究中，提供患者高達5×108 個CART19細胞，無劑量下限。對於十患者試驗，將提供患者1-5×107 個CART-19細胞。
一般設計
此為基於體恤使用提供之單一患者研究；在I期研究之後將其模型化以確定經轉導以表現CART-19之自體T細胞之輸注是否為安全的。該研究之主要目標為確定進行補救ASCT之患者中在第一ASCT後早期復發之後CART-19T細胞之安全性、耐受性及移植潛能。方案由開放標記試點研究組成。
一開始，個體將進行骨髓生檢且對其MM進行常規實驗室及成像評估。符合條件之個體將進行穩態清除術以獲得大量外周血單個核細胞(PBMC)以製造CART-19。將T細胞自PBMC純化，經TCRζ/4-1BB慢病毒載體轉導，在活體外擴增且接著冷凍供將來投與。將記錄與已成功製造T細胞之患者數目相比，具有不充分T細胞收集、擴增或製造的患者數目；不預期產物製造在此患者群體中之可行性為有問題的。
個體一般已自在其第一ASCT製備時進行之移動/收集保持儲存足夠外周血液幹細胞，以進行兩個額外ASCT。在根據治療醫師之偏好的方案下進行其穩態清除術之前或之後，不進行第二移動/收集程序者。在初始白細胞去除術之後約兩週，個體將進入醫院且接收高劑量美法侖(第-2天)，接著兩天後(第0天)輸注自體幹細胞，且所有個體將在十二至十四天後(第+12-14天)接收CART-19細胞之輸注。將征選至多10個患者。
所有個體均將具有血液測試以評估CART-19細胞以規則時間間隔經該研究之第4週之安全性及移植及持久性。在第+42天及+100天，個體將進行骨髓抽吸/生檢以評估骨髓漿細胞負荷及車-19細胞至骨髓之運輸。在第100天，根據國際骨髓瘤工作組(IMWG)標準136，將製備正式反應評估，且將根據常規臨床操作，對患有多發性骨髓瘤之患者監測TTP。在此研究中量測之主要功效結果將為在患者初始ASCT之後的TTP與此研究上ASCT之後的TTP之比較。
由於此研究之主要端點為藉由ASCT之CART-19細胞之輸注之安全性及可行性，研究將採用早停止規則。簡言之，若在前五個治療個體中出現少於2個嚴重、出人意料的不良事件，則研究將朝向10之目標登記人數接著累積額外五個個體。吾人將在CART-19輸注之後觀測治療個體40天(亦即至第42天之第一官方反應評估)，隨後登記後續個體直至已登記且因此觀測五個個體。對於第二組五位患者之治療，個體之間將不需要等待時段。
在6個月之密集隨訪之後，個體將藉由病史、身體檢查及血液測試持續兩年至少每季評估。在此評估之後，個體將進入翻轉研究，用於藉由電話及調查表每年隨訪，持續至多額外十三年，以分析長期健康問題，如新惡性腫瘤產生之診斷。
主要研究端點
此中試經設計以測試藉由患者中之CD19TCRζ/4-lBB轉導之自體T細胞之安全性及可行性，該等患者在第一ASCT之後的早期復發後經歷用於MM之補救ASCT。
主要安全性及可行性端點包括：研究相關不良事件(定義為NCJ CTC 2)之發生率：與輸注直至第24週之任何時間之研究治療可能、或許或的確相關之3級病徵/症狀、實驗室毒性及臨床事件。此將包括輸注毒性及任何可能與CART-19細胞相關之毒性，包括(但不限於)：
a. 發熱
b. 皮疹
c. 嗜中性白細胞減少症、血小板減少症、貧血、骨髓發育不全
d. 肝功能障礙
e. 肺浸潤或其他肺毒性
f. 影響胃腸道或皮膚之GVHD樣症候群。
自患者清除術產品製造CART-19細胞之可行性。將測定不滿足載體轉導效率、T細胞純度、活力、無菌性及腫瘤污染釋放標準之製造產物數目。
CART19之自體幹細胞移植之後的反應深度及持續時間將相比於各患者在標準自體幹細胞移植之後起初達成之反應深度及持續時間。
個體選擇及退出 納入標準
個體必須經歷用於MM之先前ASCT且在幹細胞輸注之365天內進展。經歷作為計劃串聯ASCT強化方案之一部分的兩個先前ASCT之個體符合條件。進展將根據用於進展性疾病或用於在初始ASCT之後達到CR或sCR之患者之IMWG標準、用於CR之復發之標準界定(Durie等人Leukemia 2006；20(9)：1467-1473)。N.B.：不存在患者必須在先前 ASCT之365天內登記之要求，且患者可在先前ASCT之後的復發/進展後在參與此研究之前用其他藥劑，包括實驗藥劑治療。
個體必須具有簽名的書面知情同意書。
個體必須具有足以接受如藉由以下標準所定義之高劑量美法侖之生命器官功能，其在美法侖輸注當天之前12週內量測：a.血清肌酐2.5或估計之肌酐清除率30ml/min且非透析依賴性。b.SGOT3×正常上限且總膽紅素2.0mg/dl(除了高膽紅素血症歸因於吉伯特氏症候群(Gilbert's syndrome)之患者)。c.左心室射血分數(LVEF)45%，或若LVEF<45%，則藉由心臟病專家之正式評估鑑別無臨床顯著心血管功能障礙。LVEF評估必須在登記六週內進行。d.足夠肺功能，其中FEV1、FVC、TLC、DLCO(在適當調節肺體積及血紅素濃度之後)預測值之40%。肺功能測試必須在登記六週內進行。
個體必須具有0-2之ECOG機能狀態，除非較高機能狀態僅歸因於骨痛。
排除標準
個體必須不：
具有任何活性及不受控感染。
具有活性B型肝炎、C型肝炎或HIV感染。
如概述之任何將排除參與之不受控醫學病症。
治療方案 復發性/進展性多發性骨髓瘤之療法
患者可根據其治療醫師之偏好在參與之前接受復發性/進展性多發性骨髓瘤療法。療法可在參與後繼續。
患者必須在清除術前兩週及在高劑量美法侖前兩週停止所有療法。若預期清除術與高劑量美法侖之間的時間超過兩週，則患者可由其治療醫師酌情處理，在清除術之後恢復療法。
高劑量美法侖(第-2天)
在第-3或-2天患者將進入醫院且在開始治療方案前將由主治醫師及常規實驗室測試進行檢查，測試將包括監測腫瘤溶解症候群之參數。若此類測試在進入7天內未抽血，則在開始療法前抽出血液用於MM監測實驗室測試(SPEP、定量免疫球蛋白及不含血清輕鏈分析)。
高劑量療法將由在第-2天200mg/m2 劑量之美法侖經靜脈內投與超過約20分鐘組成。對於年齡>70歲之患者或對於任何年齡之由治療醫師酌情處理，可不耐受200mg/m2 劑量之患者，美法侖劑量將減至140mg/m2 。所有患者將接收標準抗嘔吐預防，其可包括地塞米松及標準抗生素預防。
幹細胞再輸注(第0天)
在第0天，在投與高劑量美法侖之後至少18小時，將進行幹細胞輸注。將根據標準機構操作，在術前用藥後超過約20-60分鐘，經靜脈內輸注幹細胞。應輸注每公斤體重至少2×106 個CD34+祖細胞。另外，若延遲移植或晚期移植衰竭，每公斤體重至少1×106 個CD34+祖細胞應作為支撐幹細胞產物可獲得。G-CSF應在第+5天開始皮下投與，根據標準機構實踐給藥。其他支持性護理措施，如輸注支持將根據標準機構指南進行。
CART19細胞輸注(第+12-14天)
將給與單劑經CART-19轉導之T細胞，由多達5×107 個CART-19細胞組成。此單患者方案藉由CD19 TCRζ4-1BB載體轉導之細胞之輸注之最小可接受劑量為1×107 。CART-19細胞將在幹細胞輸注之後第+12-14天藉由快速靜脈內輸注以單劑量形式給與。若患者在12-14天窗口無法滿足本文所述之納入標準任一者，則CART-19輸注可延遲超出第+12-14天直至滿足標準。
維持來那度胺
在其第一ASCT之後接收及耐受維持來那度胺的個體將在約第+100天再起始來那度胺維持治療，假設治療醫師判斷無禁忌。除非先前經歷指定特定患者之替代起始劑量，否則起始劑量將為每日10mg。維持治療將繼續，直至疾病進展或不耐受性。
製備及投與研究藥物
在CVPF中製備CART-19 T細胞且直至符合關於灌注細胞之FDA批准之釋放標準(例如細胞劑量、細胞純度、無菌性、每個細胞之載體平均複本數等)才從CVPF釋放。在釋放後，將細胞拿到床邊用於投與。
細胞解凍。冷凍細胞在乾冰中運輸至個體的床邊。細胞將使用維持於36℃至38℃之水浴在床邊解凍。將溫和按摩袋子直至細胞剛剛解凍。容器中不應留有冷凍凝塊。若CART-19細胞產物看起來具有破壞或袋漏泄，或看起來有其他缺陷，則不應輸注且應根據下文規定返還至CVPF。
術前用藥。T細胞輸注之後的副作用包括短暫發熱、發冷及/或噁心；關於綜述，參見Cruz等人(Cytotherapy 2010；12(6)：743-749)。推薦的是個體在輸注CART-19細胞之前藉由乙醯胺苯酚及鹽酸苯海拉明進行術前用藥。此等藥劑可根據需要每六小時重複。若乙醯胺苯酚不能緩解患者持續發熱，則可處方非類固醇消炎藥的病程。推薦的是患者除了在危及生命的緊急情況下之任何時間不接受全身性皮質類固醇，如氫化可體松、強的松、甲潑尼龍或地塞米松，因為此可對T細胞具有不良影響。
發熱反應。若(不太可能)個體在CAR T細胞輸注之後產生敗血症或全身性菌血症，則應起始適當培養物及醫藥管理。若受污染之CART-19 T細胞產物受懷疑，則可使用儲存於CVPF中之存檔樣品再測試產物之無菌性。
投與。輸注將在Rhoad中之分離房間中，使用免疫抑制患者之防護措施進行。轉導T細胞將藉由在每分鐘約10mL至20ml之流速下經由具有3通活栓之18規格無乳膠Y類型血液組，快速靜脈內輸注來投與。輸注持續時間將基於待輸注之總體積及推薦之輸注率。各輸液袋將黏附含有以下之標籤：「僅供自體使用」。另外，標籤將具有至少兩個獨特標識符，諸如個體之縮寫、出生日期及研究編號。在輸注前，兩個個體將在個體存在下獨立地檢驗所有此信息且因此證實信息與參與者正確匹配。
緊急醫藥設備(亦即急救車)將在個體具有過敏性反應，或嚴重低血壓危機，或任何其他輸注反應之情況下在輸注期間可用。將在輸注之前及之後獲取生命體徵(體溫、呼吸速率、脈搏及血壓)，接著每隔15分鐘，持續至少一小時且直至此等體徵為令人滿意及穩定的。將醫生認為個體可安全離開之前將要求個體不要離開。
包裝
輸注將包含單劑1-5×107 個CART 19轉導之細胞，其中1×107 個CART-19細胞之最小可接受劑量用於輸注。各袋將含有低溫培養基之等分試樣(體積取決於劑量)，該培養基含有以下可輸注級試劑(體積%)：31.25%勃脈力-A(plasmalyte-A)、31.25%右旋糖(5%)、0.45% NaCl、高達7.5% DMSO、1%聚葡萄糖40、5%人類血清白蛋白。
清除術
在清除術中心進行大體積(12-15公升或4-6血液體積)清除術程序。在此程序期間對於CART-19獲得PBMC。意圖自單次白細胞去除術採集至少5×109 個白血球來製造CART-19 T細胞。亦獲得及冷凍保存針對FDA回顧需求及研究的基線血液白細胞。預期細胞產物備用於釋放約2-4週後。流動式細胞測量術淋巴細胞子集定量，包括CD19及CD20B細胞測定。對人類抗-VSV-G及抗鼠類抗體(HAMA)進行基線評 估。若個體先前已具有根據當前優良製造操作在Clinical Cell and Vaccine Production Facility儲積之足夠清除術收集，則此等細胞可用作製造CART-19之細胞來源。使用儲積清除術產物將轉移費用、時間及風險至進行額外清除術收集之個體。
細胞減少性化學療法
淋巴細胞耗盡化學療法將為如本文所述之高劑量美法侖。
CART-19輸注
輸注將在幹細胞再輸注後第+12-14天開始。
在第一次輸注前第+12-14天，患者將具有具差異性的CBC及CD3、CD4及CD8計數之評估，因為化學療法部分給與以誘發淋巴球減少症。
將使用單一劑量投與第一劑量。細胞在患者床邊解凍。解凍細胞將以所容許快之輸注速率給與，使得輸注持續時間將為約10-15分鐘。為促進混合，同時使用Y-銜接子投與細胞。個體將如本文所述輸注及進行術前用藥。將評定個體生命體徵且在給藥之前，輸注結束及此後每15分鐘持續1小時進行脈動式測氧法，且直至此等穩定及令人滿意的。在第一輸注前任何時間及在各輸注(及傳送至TCSL)之後20分鐘至4小時獲得用於測定基線CART-19水準之血液樣品。
經歷與高劑量美法侖相關之毒性之患者之輸注排程將延遲直至此等毒性已消退。證明T細胞輸注延遲之特定毒性包括：1)經肺：要求補充氧以保持飽和度大於95%或在胸部X射線上存在進行性的放射異常；2)心臟：未藉由醫藥管理控制之新心律不整，3)需要血管加壓劑支持的低血壓。4)活性感染：在T細胞輸注之48小時內對細菌、真菌或病毒呈陽性之血液培養物。
毒性管理
不受控T細胞增殖。與同種異體或自體T細胞輸注相關之毒性已 藉由藥理學免疫抑制過程管理。已報導T主體相關毒性對全身性皮質類固醇有反應。若發生不受控T細胞增殖(於CART-19細胞相關之級別3或4毒性)，則個體可用皮質類固醇處理。個體將用甲潑尼龍衝擊(2mg/kg，靜脈內，分成q8 hr×2天)處理，接著快速漸縮。
另外，基於用另一方案處理之個體之觀測，存在對於巨噬細胞活化症候群(MAS)之一些擔憂，儘管骨髓瘤患者中之預期CD19+腫瘤負荷比CLL患者中低得多。此毒性之治療及治療時序將由患者的醫師及研究調查員酌情處理。推薦的管理可包括：若個體具有持續超過連續2日之大於101℉之發熱且不存在感染(陰性血液培養物、CXR或其他來源)跡象，則可考慮托西利單抗4mg/kg。可根據醫師判斷考慮添加皮質類固醇及抗TNF療法。
B細胞耗盡。有可能的是將發生B細胞耗盡及低γ球蛋白血症。此常見於抗CD20導引療法之情況下。若發生臨床顯著低γ球蛋白血症(亦即全身性感染)，將藉由已確立臨床給藥指南給與個體靜脈內免疫球蛋白(IVIG)以恢復血清免疫球蛋白含量之正常含量，如已藉由利妥昔單抗進行。
原發性移植物失效。相比於第一ASCT，原發性移植物失效(亦即非移植)可在第二ASCT之後更常見。合格性標準規定若發生原發性移植物失效，則足夠幹細胞必須可用於解救再輸注(由治療醫師酌情處理)。
結果
現在此持續試驗中三個治療難治性、晚期多發性骨髓瘤患者用CTL019治療。此等患者中之兩個的結果展示基於三個月時間點之主要功效評估，兩個自CTL019療法，均具有實質性抗腫瘤作用。第三個患者尚未達到三個月時間點。兩個患者之結果更詳細地描述於下文。
第一個骨髓瘤患者已完成其+100天反應評估且其對CART19療法具有極優良之反應。進行以下測試，結果如下：
-SPEP/免疫固定：陰性
-尿免疫固定：其免疫固定上暗淡的不可量測之κ輕鏈條帶(亦在第38天存在，因此非新的)
在其他方面，患者符合嚴格完全緩解之標準，包括如下：
-無血清輕鏈比率：正常
-骨髓生檢：陰性
-IgA免疫表型：IgA低於偵測界限
除來自尿免疫固定之暗淡的不可量測之κ輕鏈結果外，患者符合「嚴格完全緩解」之所有標準。3個時間點(第-2天、第+38天、第+103天)漿細胞免疫表型之概述展示在圖8中，且證實患者之IgA低於偵測界限。概述展示在第-2天重鏈骨髓瘤負荷及在第+38及+103天不可偵測，其藉由流動分析將患者分類為「MRD陰性」。在第+103天，概述展示正常、多株、CD19+漿細胞及B細胞之恢復。患者無疾病療法症狀或且如正常人一樣活動。
第二個患者尚未達到+100天時間點。然而，此時其進行良好，但確定CTL019輸注之作用為時過早。
實例2：用於霍奇金淋巴瘤之CAR19 T細胞療法
CAR19 T細胞療法亦可用於治療霍奇金淋巴瘤(HL)。霍奇金淋巴瘤藉由存在衍生自純系生發中心B細胞之惡性霍奇金里德-斯騰伯格(Hodgkin Reed-Sternberg；HRS)細胞表徵。存在若干指示CAR19 T細胞療法對於HL之療效的因素。HL腫瘤之CD19染色顯示腫瘤及腫瘤微環境內之CD19表現(CD19+ )細胞(圖2)。研究顯示表現CD19之純系B細胞群體(CD20+ CD27+ ALDH+ )造成霍奇金淋巴瘤細胞株之產生及維持，以及大部分HL患者之血液中之循環(Jones等人，Blood,2009, 113(23)：5920-5926)。亦表明此純系B細胞群體造成或促進惡性HRS細胞之產生。因此，CART19療法將耗盡促進腫瘤發生或腫瘤細胞維持之此B細胞群體。另一研究顯示B細胞耗盡延遲多個鼠類模型中之實體腫瘤生長(Kim等人，J Immunotherapy,2008,31(5)：446-57)。支持HL腫瘤微環境中之B細胞耗盡導致一些抗腫瘤效應之想法，臨床上測試當前療法，如rituxan以靶向及耗盡HL中之腫瘤B細胞(Younes等人，Blood,2012,119(18)：4123-8)。亦顯示與慢性炎症相關之重新致癌作用為B細胞依賴性的(de Visser等人，Cancer Cell,2005,7(5)：411-23)。來自此等研究結果指示B細胞群體(尤其在HL腫瘤微環境中)之靶向將適用於藉由減少或抑制疾病進展或腫瘤生長治療HL。
另外，正常CD19表現B細胞亦浸潤HL中之腫瘤微環境。CLL及ALL中之CART19療法之前述研究(例如實例4及5中所述)顯示CART19暴露於CD19+標靶導致細胞激素產生及巨噬細胞產生。因此，HL腫瘤微環境自促腫瘤微環境至抗腫瘤微環境之調變可藉由灌注CART19實現以與存在於HL中之正常CD19+ B細胞相互作用。舉例而言，CART19暴露於CD19表現標靶造成細胞激素產生，例如發炎性細胞因子，其經由細胞毒性T細胞擴增、巨噬細胞活化及具有抑制腫瘤生長之各種功能之其他免疫效應細胞，如白血球、巨噬細胞及抗原呈遞細胞之補充促進抗腫瘤活性。由於標靶CD19+ B細胞可能並非惡性(例如通常循環B細胞)，短暫而非拖延性CART19效應可對於腫瘤微環境之調變較佳。
可如下所述進行檢查CART19療法於HL患者中之療效之研究(圖3)。研究亦將分析HL個體中之CART19之安全性及耐受性，且測定CART19細胞對HL腫瘤微環境之效應。
在此研究中治療患有經典HL之8位患者。患者為所有年齡，儘管可對於小兒及成年患者建立獨立藥物傳遞方案。此研究中之患者不具 有可用的潛在治癒性治療選擇(如自體(ASCT)或同種異體幹細胞移植)，或不適合於此類治癒性治療選擇。舉例而言，患者可為以下中的任一者：補救化學療法之後的PET+、藉由貝倫妥單抗治療之後的PET+或具有或不具有先前貝倫妥單抗暴露之ASCT之後的PET+。在當前可用的療法之情況下，患者將具有有限的預後(若干個月至小於或等於2年預期存活期)。且最後，患者將不接受抗CD20抗體療法。患者由於不具有可行性，例如若患者關於6次CART19輸注具有不充分數目之T細胞而排除。
藉由活體外轉錄製備mRNA CAR19。CAR19 mRNA電穿孔至供體T細胞中，且所得細胞藉由與CD3/CD28珠粒一起培育而擴增及刺激。將含有1x108 -5x108 個RNA電穿孔CAR19 T細胞之劑量一週三次傳遞至患者，持續兩週(例如在第0、2、4、7、9及11天)。將藉由治療後1個月的臨床、CT及PET掃描評估總反應率。將每月監測反應及存活，持續前6個月，接著每3個月直至第一次CART19輸注(第0天)之後2年。監測技術包括腫瘤或淋巴結之生檢(例如用於免疫組織化學分析及/或RNA，用於基因表現剖析)及CART19治療之前及之後的PET掃描。舉例而言，藉由比較治療之前及治療後大致一週(或允許細胞表現型改變之治療後的適當時間)對來自所選患者之可獲得淋巴結生檢進行之基因表現剖析之結果分析CART19細胞對HL腫瘤微環境之效應。為了分析CART19治療之安全性及耐受性，報導不良事件之頻率及嚴重程度，包括細胞因子釋放症候群(CRS)及巨噬細胞活化症候群(MAS)之頻率。
化學療法可與CART19治療同時投與。CART19之第一劑量之前可為淋巴細胞耗盡化學療法，例如環磷氮芥。
實例3：CLL患者之無反應者亞群展現免疫檢查點抑制劑分子之增加表現
在此研究中，評估來自34位CLL患者之臨床製造的CART19細胞之免疫檢查點抑制劑分子，如PD-1、LAG3及TIM3表現。已知此群體對CART19之反應且因此可評估反應與生物標記表現模式之間的相關性。
藉由流動式細胞測量術分析來自對CART療法具有不同反應之CLL患者之製造CART19細胞以測定CAR及免疫檢查點抑制劑分子PD-1、LAG3及TIM3之表現。CART19細胞來自：健康供體(HD)(n=2)；對CART療法有反應之CLL患者(CR)(n=5)；對CART療法部分有反應之CLL患者(PR)(n=8)；對CART療法無反應之CLL患者(NR)(n=21)。藉由特異性鑑別CD3、CD4、CD8、CD27、CD45RO、CAR19分子及免疫檢查點分子PD-1、LAG3及TIM3之螢光標記抗體，根據此項技術中已知之流動式細胞測量術分析標準方法對細胞染色。藉由流動式細胞測量術分析軟體測定各標記物，例如CD4+、CD8+等之表現，且進一步分析亞群(例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或CAR19表現T細胞)之免疫檢查點分子PD-1、LAG3及TIM3表現。
用於測定表面標記物表現之流動式細胞測量術曲線分析之實例顯示於圖4A及4B中。使用流動式細胞測量術測定表現CD4之T細胞，且進一步分析CAR19及PD-1表現，使得曲線之x軸指示CAR19表現(左上(Q5)及左下(Q8)象限顯示CAR19陰性CD4+細胞，而右上(Q6)及右下(Q7)象限顯示CAR19表現CD4+細胞)且y軸顯示PD-1表現(左下(Q8)及右側(Q7)象限顯示PD-1陰性CD4+細胞且左上(Q5)及右側(Q6)象限顯示PD-1表現CD4+細胞)。在來自CART反應者之CD4+群體中，44.7%之CD4+細胞總體表現PD-1，且約22.3%之CAR19表現細胞為PD-1陽性，而27.2%之CAR19表現細胞為PD-1陰性(圖4A)。相比之下，在來自無反應者之CD4+群體中，存在總體CAR19表現細胞之顯著減少(約15.3%，相比於CR中之49.5%)，其中14.7%之CAR19表現細胞為PD-1 陽性，而僅0.64%為PD-1陰性(圖4B)。在圖4A與圖4B中之曲線之間的比較顯示相比於CART反應者(約44.7%)高得多的百分比之來自無反應者表現PD-1之CD4+細胞(約92.9%)。
使用上文所述之方法及分析，對於各反應組中之各患者測定CD4+群體及CD8+群體之PD-1表現(PD-1+)細胞之百分比。顯示相比於對CAR療法有反應者(CR)，非反應者在CD4+(圖4C)及CD8+(圖4D)群體中均具有較大百分比之PD-1+細胞；平均PD-1百分比之增加對於CD4+及CD8+群體均為統計顯著的。部分反應者(PR)在CD4+(圖4C)及CD8+(圖4D)群體中均比反應者(CR)展現較高PD-1+細胞百分比。
隨後，對於各反應組中之各患者測定CAR19表現CD4+群體及CAR19表現CD8+群體之PD-1表現(PD-1+)細胞之百分比。如上進行類似分析，伴以分析CD4+及CD8+細胞之CAR19表現之額外步驟，且在識別CAR19表現細胞之後，測定來自CAR19表現細胞群體之具有PD-1表現之細胞之百分比。對於CAR19表現CD4+及CD8+群體觀測到與CD4+及CD8+總群體中所觀測類似之趨勢：顯示相比於對CAR療法有反應者(CR)，非反應者在CD4+(圖5A)及CD8+(圖5B)群體中均具有較大百分比之PD-1+細胞；平均PD-1百分比之增加對於CD4+及CD8+群體均為統計顯著的。部分反應者(PR)在CD4+(圖5A)及CD8+(圖5B)群體中均比反應者(CR)展現較高PD-1+細胞百分比。
進行進一步分析以測定來自對CAR療法具有不同反應之患者之表現PD-1、LAG3及TIM3之細胞的分佈。CD4+群體中之PD-1、LAG3及TIM3表現之代表性細胞曲線分析顯示於圖6中。首先分析細胞群體之CD4+及CD8+表現。接著分析CD4+群體(或CD8+群體，未示出)之PD-1及CAR19表現(圖6，左曲線)。如先前所描述，相比於CART反應者(CR)，非反應者(NR)具有顯著增加的為PD-1+之細胞之總百分比(就NR而言之約92.9% PD-1陽性，相比於就CR而言之44.7% PD-1陽性)。 此外，在非反應者中，CAR19表現細胞大多為PD-1陽性(14.7% PD-1陽性及CAR+，相比於0.64% PD-1陰性及CAR+)。接著，分析群體之PD-1及LAG3共表現(圖6，中間曲線)。表現PD-1及LAG3兩者之細胞顯示於右上象限(Q2)。相比於CART反應者，非反應者具有顯著增加百分比的表現免疫檢查點抑制劑、PD-1及LAG3之細胞(67.3%相比於7.31%)。亦與TIM3表現一起分析PD-1表現。在圖6，右曲線中，方框指示表現PD-1及TIM3兩者之細胞。與PD-1及LAG3情況下獲得之結果類似，相比於CART反應者，非反應者具有顯著較高百分比之表現免疫檢查點抑制劑、PD-1及TIM3之細胞(83.3%相比於28.5%)。使用如上文所述之流動式細胞測量術分析對於各反應組中之各患者測定PD-1表現細胞(PD1+)、PD-1及LAG3表現細胞(PD1+LAG3+)以及PD-1及TIM3表現細胞(PD1+TIM3+)之百分比。顯示相比於對於兩個細胞群體均統計顯著之CART反應者，非反應者具有增加百分比之PD1+LAG3+細胞(圖7A)及PD1+TIM3+細胞(圖7B)。部分反應者亦顯示相比於CART反應者增加百分比之兩種細胞群，其中平均值相比於非反應者減少。
此等結果指示相比於對CAR療法有反應或部分有反應之患者，對CAR療法不具有反應之患者展現增加的免疫檢查點抑制劑(例如PD-1、LAG3及TIM3)表現。因此，此等結果顯示抑制或減少免疫檢查點抑制劑，例如PD-1、LAG3或TIM3表現之藥劑可適用於向接受CAR療法之患者投與以經由免疫檢查點路徑防止免疫抑制(例如藉由PD-1、LAG3或TIM3介導)，進而增加CAR表現細胞之功效。
實例4：mTOR抑制對老年人中之免疫老化之效應
mTOR抑制對免疫老化之功效描述於例如國際申請案WO/2015/073644之實例1中，該申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
實例5：增強老年人個體中之疫苗免疫反應
mTOR抑制對增強免疫反應之功效描述於例如國際申請案WO/2015/073644之實例2中，該申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
實例6：低劑量mTOR抑制增加能量及鍛煉；
mTOR抑制對能量及鍛煉之效應描述於例如國際申請案WO/2015/073644之實例3中，該申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
實例7：使用RAD001之P70 S6激酶抑制
mTOR抑制對P70 S6激酶抑制之效應描述於例如國際申請案WO/2015/073644之實例4中，且該申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
實例8：外源性IL-7增強CAR T細胞之功能
在CAR T細胞之過繼性轉移之後，一些患者經歷CAR T細胞之有限存留，其可導致次優水準之抗腫瘤活性。在此實例中，在小鼠異種移植模型中評估投與外源性人類IL-7之效應，該模型中已觀測到對CAR T細胞之初始次優反應。
IL-7受體CD127之表現首先評估於不同癌細胞株及CAR表現細胞中。藉由流動式細胞測量術分析兩種套細胞淋巴瘤細胞株(RL及Jeko-1)及一種B-ALL細胞株(Nalm-6)之CD127表現。如圖9A中所示，在測試之三種癌細胞株中，顯示RL具有最高CD127表現，接著為Jeko-1及Nalm-6。CART19細胞輸注至NSG小鼠中且藉由流動式細胞測量術對循環CART19細胞評估CD127表現。如圖9B中所示，CD127均一地表現於所有循環CART19細胞上。
隨後，在淋巴瘤動物模型中評估外源性IL-7治療對CART19細胞之抗腫瘤活性之效應。NSG小鼠在第0天(D0)移植螢光素酶表現套細 胞株(RL luc)，接著在第6天進行CART19細胞處理。將NSG小鼠分組，其中一組不接受CART19細胞，第二組接受0.5×106 個CART19細胞，第三組接受1×106 個CART19細胞，且第四組接受2×106 個CART19細胞。藉由經大於80天量測移植腫瘤之平均生物發光監測腫瘤尺寸。僅接受2×106 個CART19細胞之小鼠展示腫瘤排斥及腫瘤生長抑制(圖10A)。來自接受0.5×106 個CART19細胞或1×106 個CART19細胞之兩組之小鼠顯示次優抗腫瘤反應。來自此兩組之小鼠接著經隨機化，其中三隻小鼠(接受0.5×106 個CART19細胞之小鼠#3827及#3829，及接受1×106 個CART19細胞之小鼠#3815)藉由在第85天開始每週腹膜內注射三次以每隻小鼠200ng之劑量接受外源性重組人類IL-7，且兩隻小鼠不接受。第85-125天接受外源性IL-7之小鼠之腫瘤負荷(如藉由平均生物發光偵測)顯示於圖10B中。所有接受IL-7之小鼠顯示腫瘤負荷之1-3個對數下降之顯著反應。最初接受較高劑量之CART19細胞之小鼠(接受1×106 個CART19細胞之小鼠#3815)顯示更深刻反應。當在IL-7治療之前及之後比較接受IL-7治療之小鼠之腫瘤負荷與對照時，僅在接受IL-7治療之小鼠中可見腫瘤負荷之腫瘤減小(圖10C)。
亦檢查淋巴瘤動物模型中IL-7治療後的T細胞動力學。在IL-7治療之前，血液中不可偵測到人類CART19細胞。在IL-7治療之後，存在經治療小鼠中之T細胞數目之快速但可變增加(圖11A)。接受IL-7之小鼠中觀測之T細胞擴增程度亦與腫瘤反應相關。在IL-7治療期間在峰值擴增處之血液中偵測到最高數目之T細胞之小鼠(小鼠#3815)具有腫瘤負荷之最穩固減小(參見圖10B)。此外，峰值擴增時間與以基線形式注射之T細胞劑量相關。亦在IL-7治療之前及之後量測血液中之CD3表現細胞數目/含量。在對照小鼠中，偵測到極少CD3表現細胞，而IL-7治療小鼠在IL-7治療之後顯示CD3+細胞之顯著增加(圖11B)。
在一起，此實例之結果展示外源性IL-7治療增加活體內T細胞增 殖及抗腫瘤活性，指示在CAR療法之後具有次優結果之患者中使用IL-7可改良此等患者中之抗腫瘤反應。
實例9：評估CD22 CAR 自動化Jurkat-NFAT-螢光素酶(JNL)細胞分析
進行自動化分析以測定特定CD22 CART純系之反應性。穩定表現來自NFAT啟動子之螢光素酶之3e4 個慢病毒轉導Jurkat細胞株細胞(JNL細胞)與CD22表現靶細胞株(Daudi、Raji)及非CD22表現細胞株(K562)(作為陰性對照)一起平鋪於96孔板中。次日，螢光素底物添加至96孔板之各孔且測定螢光素酶報告子之相對發光。在此分析中，CD22 CAR構築體相比於CD19 CAR構築體及CD22(m971衍生)CAR構築體(m971-HL)(充當陽性對照)。含有m971-HL之VH及VL鏈但呈反向定向(L-H而非H-L)之m971-LH CAR構築體含有CAR但由於不具有特異性而無法結合標靶且充當陰性對照。不含CAR之未轉導之T細胞(陰性對照)亦充當陰性對照。圖示來自Jurkat T細胞活化之螢光素酶活性。本文中呈現之結果展示CD-22轉導JNL純系中之若干者對於CD22表現細胞株顯示以劑量依賴性方式增加之特定反應性(圖18A-18C)。
初生人類T細胞中之CD22 CAR之表現
初生人類T細胞在第0天藉由抗CD3/抗CD28刺激珠粒活化，接著在第1天進行指定CAR構築體之慢病毒轉導。細胞經活體外擴增直至第10天，此時其藉由流動式細胞測量術分析CAR之表面表現。利用兩種不同方法測定CAR之表面表現：蛋白質-L-生物素，接著為抗生蛋白鏈菌素-PE，及重組人類CD22-Fc，接著為抗-Fc-alexafluor 488。結果顯示於圖19中。本文中呈現之結果展示CD22 CAR純系2(hCD22-2)、純系5(hCD22-5)、純系7(hCD22-7)、純系8(hCD22-8)、純系10(hCD22-10)、純系12(hCD22-12)、純系30(hCD22-30)及純系31(hCD22-31)顯示陽性表面表現。CD22 CAR m971充當結合蛋白質-L 及hrCD22-Fc兩者之陽性對照，且不具有特異性之同型CAR(anti-gH)充當蛋白質-L之陽性對照。不表現CAR之T細胞用作陰性對照。
初生T細胞腫瘤標靶殺死分析
如上文所述活化及轉導之初生T細胞與穩定表現螢光素酶之靶細胞株以指定比率混合(圖20A-20F)。靶細胞株Raji、SEM、K562-hCD22、Daudi及Nalm6全部表現CD22標靶，而K562細胞株不表現CD22且充當陰性對照(圖20A-20F)。本文中呈現之結果展示若干CD22 CAR純系(例如CD22 CAR純系2、5、7、8、10、12、30及31)及陽性對照CD22 m971-HL CAR展現劑量依賴性靶細胞殺死，其中殺死程度視靶細胞類型而改變。未轉導之T細胞(UTD)不具有殺死靶細胞株之能力。
初生T細胞細胞因子珠粒陣列
研究CD22表現細胞株誘導促炎性細胞因子自CD22表現CART細胞釋放之能力。使用細胞因子珠粒陣列套組對獲自初生T細胞殺死分析之樣品測定促炎性細胞因子濃度。干擾素-g(IFN-g)、腫瘤壞死因子α(TNFa)及介白素2(IL-2)全部在2.5：1 E：T及10：1 E：T比率之樣品上量測。結果顯示於圖21A-21F中。本文中呈現之結果展示多個CD22 CAR純系比m971-LH CAR(陰性對照)或未轉導之T細胞(UTD)誘導顯著更多IFN-g、TNFa及IL-2，其中細胞因子誘導含量根據靶細胞類型改變。
實例10：CD22 CART治療之劑量遞增研究
進行1期臨床試驗以測定預先接受及未接受CART療法之ALL個體中具有或不具有CD19 CART之CD22 CART之最優劑量。此研究之目的為測定產生符合已確立釋放標準之抗CD22 CAR工程改造T細胞之可行性及分析在環磷醯胺/氟達拉賓淋巴細胞耗盡方案之後在患有B細胞惡性腫瘤之兒童及青少年中投與遞增劑量之自體抗CD22 CAR工程 改造T細胞之安全性。
個體在1與30歲之間且稱重為至少15kg，患有CD22+ ALL。疾病活性可藉由骨髓分析或FDG-PET量測。允許具有微小殘留病活性之個體。允許具有中樞神經系統(CNS)狀態1或2之個體。個體必須具有足夠器官功能及足夠CD3計數。
進行擴增群體下之1期劑量遞增研究。個體根據其先前接受或未接受CART療法分層。對個體給與自體抗CD22 CAR工程改造T細胞之四種劑量之四種劑量水準中的一者：3×105 個細胞/公斤體重、1×106 個細胞/公斤體重、3×106 個細胞/公斤體重及1×107 個細胞/公斤體重。接受3×106 個細胞/公斤體重劑量之個體子組亦給與抗CD19 CAR工程改造T細胞。各劑量水平之前2個患者為16年或更老。
在測定合格性之後，進行清除術以分離T細胞。個體接著經歷製備型化學療法。個體每天用25mg/m2 氟達拉賓治療，持續三天，且給與單劑量之900mg/m2 環磷醯胺。接著投與抗CD22 CAR工程改造T細胞且評估28天後反應及毒性。
實例11：利用CD20靶向嵌合抗原受體(CARS)治療B細胞惡性腫瘤
進行Jurkat-NFAT-螢光素酶(JNL)細胞分析以測定特定CD20 CART純系之反應性。穩定表現來自NFAT啟動子之螢光素酶之Jurkat細胞(JNL細胞)藉由圖15A-15C中示出的CAR構築體進行慢病毒轉導。CAR表現JNL細胞(3e4)與CD20表現靶細胞株Daudi(圖15A)及Raji(圖15B)及非CD20表現陰性對照K562(圖15C)以0.5：1、1：1、2：1及4：1之效應細胞：靶細胞(E：T)比率混合。慢病毒轉導JNL細胞與CD20表現靶細胞株(Daudi、Raji)及非CD20表現細胞株(K562)(作為陰性對照)一起平鋪於96孔板中。次日，螢光素底物添加至96孔板之各孔，且測定螢光素酶報告子(來自Jurkat T細胞活化)之相對發光。在此分析中，CD20 CAR構築體相比於充當陽性對照之Haso等人，Blood,2013年2月14日， 第121卷，第7號中所述之CD19 CAR構築體及CD22(m971衍生)CAR構築體。含有CAR但由於不具有特異性而無法結合標靶之同型CAR及不含CAR之未轉導之T細胞(陰性對照)充當陰性對照。結果顯示於圖15A-15C中。CD20轉導JNL純系中之若干者對於CD20表現細胞株顯示以劑量依賴性方式增加之特定反應性。
實例12：鑑別預測B細胞急性淋巴球性白血病(B-ALL)中之CD19 CART療法之個體復發之因素
本發明實例尤其描述預測根據本發明使用之B細胞急性淋巴球性白血病(B-ALL)中之CD19 CART療法(例如CTL019療法)之患者復發之新穎轉錄基因標籤之鑑別。
尤其，本發明實例描述基於CD19 CART治療(例如CTL019)(清除術或骨髓)之前的患者中或再輸注之前的CD19 CART製造產物樣品(例如CTL019)中之選擇基因之mRNA表現量之新穎基因標籤。在一個實施例中本發明實例描述辨別B-ALL中之CTL019療法之復發者於B-ALL中之CTL019療法之非復發者之新穎基因標籤。
本發明實例描述發現預測根據本發明使用之B-ALL中之CD19 CART療法(例如CTL019)之個體復發之新穎基因標籤的未偏置特徵選擇方法。
本發明實例亦描述發現根據本發明使用之新穎基因標籤之基因集分析方法。
鑑別預測B細胞急性淋巴球性白血病(B-ALL)中之CD19 CART療法之個體復發的基於再輸注之前的CD19 CART製造產物樣品中之mRNA表現量之新穎基因標籤。鑑別之標籤發現於包括7個B-ALL個體樣品之製造產物樣品之全基因組RNAseq研究中。B-ALL個體樣品(總共7個)分層如下：生物樣品獲自4個在CTL019療法之後不復發之個體(「非復發者」)，及3個在CTL019療法之後復發之個體(「復發 者」)。發現若干區分製造產物樣品中之反應者與非反應者及復發者與非復發者之基因標籤且進一步詳細描述於下文。
新穎基因標籤接著使用各種資料分析方法發現：1)未偏置特徵選擇；2)基因集分析；及3)所關注的選擇基因之差異表現分析。
衍生自未偏置特徵選擇之新穎基因標籤藉由測定比較3個復發者與4個非復發者之復發者與非復發者之2組比較之間差異性表現之基因而發現。若基因之差異表現在2組比較中統計顯著(具有0.25之FDR p值截止)，則基因定義為差異性表現。復發者相對於非復發者比較之基因清單(N=17)列表於表29 中。2組統計模型應用於測定元基因是否在組之間統計學上不同且說明該方法之例示性示意圖說明於圖32中。圖32描繪就CLL之完全反應者(CR)、部分反應者(PR)及非反應者(NR)而言之活化TEFF 相對於靜止TEFF 細胞中上調之基因之例示性熱圖。
不希望受特定理論束縛，此等資料指示CD19 CART產物(例如CTL019)中之T細胞之差異狀態與個體反應(亦即CR、PR或NR)相關且預測B-ALL中之CD19 CART療法(例如CTL019療法)之個體復發。完全反應者基因標籤更類似於靜止TREG 及TEFF 細胞。尤其，復發者(例如對於CTL019療法復發之完全反應者)之基因標籤含有靜止TREG 相對於TEFF 細胞中上調之基因。不希望受特定理論束縛，此等資料指示B-ALL中之CART療法(例如CTL019)之復發者相比於CART療法(例如CTL019)之非復發者具有較高TREG 含量。圖17描繪說明相比於完全反應者(CR)(例如非復發者)，TREG 在復發者(R)相對於非復發者，例如表現高含量TREG 基因之復發者中差異性富集之例示性結果。
以下基因顯示復發者中增加之含量及非復發者中減少之含量：MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C及HLA-DQB1。以下基因顯示復發者中減少之含量及非復發者中增加之含量：PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1及EIF1AY。
基因集分析產生多種預測B-ALL中之CTL019療法之個體復發之基因標籤。
尤其，本發明實例描述預測B-ALL中之CD19 CART療法(例如CTL019)之患者復發之基於基因集分析之新穎基因標籤。對三個基因集，即來源於以下之基因集進行基因集分析：(1)額外實驗基於Szabo等人，(下文所述)之未公開實驗；(2)藉由Abbas等人於Genome Research 2005中公佈之基因集；及(3)藉由Gattinoni等人於Nature Medicine 2011中公佈之基因集。基因集由Szabo、Abbs及Gattinoni定義且在美國臨時專利申請案62/061553之實例1中所述之此分析中考慮。
Szabo核心基因集包括在Teff細胞中上調之以下基因(16h相對於0h)：AIM2、ALAS1、B4GALT5、BATF、C3orf26、C4orf43、CCL3、CCL4、CCT3、CCT7、CD40LG、CHAC2、CSF2、CTNNA1、EBNA1BP2、EDARADD、EEF1E1、EIF2B3、EIF2S1、FABP5、FAM40B、FKBP4、FOSL1、GFOD1、GLRX2、HSPD1、HSPE1、IFNG、IL15RA、IL21、IL2RA、IL3、KCNK5、KIAA0020、LARP4、LRP8、LTA、MANF、MIR1182、MIR155、MIR155HG、MTCH2、MYOF、NDUFAF1、NLN、NME1、NME1-NME2、OTUD7B、PAM、PDIA6、PEA15、PFKM、PGAM1、PGAM4、PPIL1、PRDX4、PRSS23、PSMD1、PSMD11、PSMD14、PTRH2、PUS7、RBBP8、RPF2、RPP25、SFXN1、SLC27A2、SLC39A14、SLC43A3、SORD、SPR、SRXN1、STIP1、STT3A、TBX21、TMCC2、TMEM165、TNFRSF9、TXN、TXNDC5、UCK2、VDR、WDR12、YWHAG及ZDHHC16。Szabo核心基因集亦包括在Treg細胞中上調之以下基因(16h相對於0h)：AIM2、ALAS1、BATF、C5orf32、CCL17、CD40LG、CHAC2、CSF1、CTSL1、EBNA1BP2、EDARADD、EMP1、EPAS1、FABP5、FAM40B、FKBP4、FOSL1、GCLM、GK、GPR56、HMOX1、HSPD1、HSPE1、IKBIP、IL10、IL13、IL15RA、IL1RN、IL2RA、IL3、IL4、IL5、IL9、KCNK5、LTA、MANF、MIR1182、MIR155、MIR155HG、MYOF、NDUFAF1、NLN、NME1、NME1-NME2、PANX2、PDIA6、PGAM4、PPIL1、PPPDE2、PRDX4、PRKAR1B、PSMD1、 PSMD11、PUS7、RBBP8、SLC27A2、SLC39A14、SLC43A3、SRXN1、STIP1、STT3A、TBX21、TNFRSF11A、TNFRSF1B、TNFRSF8、TNFRSF9、TXN、UCK2、VDR、VTRNA1-3、WDR12、YWHAG、ZDHHC16及ZNF282。
各基因集(例如Szabo基因集、Abbas基因集及Gattinoni基因集)經評估而以如下方式測定其與個體反應(亦即復發者或非復發者)之相關性：對於各個體計算元基因，其中元個體j 之元基因評分定義為
其中x ij 為給定基因集n =1,..,G 之個體j 中之基因i 之表現值；μ (x .j )為個體j 中之基因1,…,G 之平均值；且σ(x .j )為個體j 中之基因1,…,G 之標準差。
2組統計模型應用於各基因集以測定元基因是否在復發者與非復發者之CTL019製造產物之間統計學上不同。說明此方法之示意圖給定在圖16中。在Szabo、Abbas及Gattinoni基因集中，存在一個在復發者與非復發者之間顯著差異性富集之基因集。此基因集來自Szabo集合且含有在靜止TREG 相對於TEFF 細胞中上調之基因，且與CTL019療法之患者復發相關。特定言之，發現此基因集在復發者中富集，指示復發者具有相比於非復發者較高含量之TREG 。舉例而言，發現由相比於TEFF 細胞之TREG 中上調之基因組成之基因集之元基因評分與產物樣品中之患者復發相關(參見圖17)。圖17描繪說明相比於非復發者、完全反應者(CR)，TREG 基因在復發者(R)中具有高表現量之例示性結果(p=0.000215)。x軸為反應組之樣品，其中CR=完全反應者且R=復發者。y軸為歸一化元基因表現評分。
不希望受特定理論束縛，此等資料指示在清除術之前或在製造CART產物期間減少患者中之TREG 簽名顯著降低患者復發風險。
實例13：插入突變為對於B細胞急性淋巴白血病(B-ALL)中之CTL019療法之抗性機制
已藉由比較造基線及復發之後獲取之來自B-ALL患者樣品之mRNA測序資料發現若干抗性機制。某些抗性機制被稱為「CD19復發」，即患者之腫瘤細胞表徵為CD19-因為其如藉由流式細胞術所量測不結合至用於CTL019中之FMC63抗原決定基。已發現若干抗性機制且詳細地描述在此實例中。
進行mRNA測序(RNAseq)以比較CTL019治療之前及復發之後的B-ALL患者之轉錄曲線。考慮三個患者：在復發時為CD19之一個患者(患者#29)，及在復發時為CD19+之兩個患者(患者#104及#105)。關於兩個時間點處之患者、其分類及白血病百分比之列表，參見下表30 。
CD19基因之RNAseq資料分析顯示若干值得注意的觀測結果。
三個插入發現於CD19之外顯子2中。插入僅發現於患者#29之復發樣品中。未在其他兩個患者及患者#29之基線處觀測到支持三個插入中的任一者，或CD19外顯子2中之任何其他插入之讀數。基因組位置及實際插入列表於下表31 中。
三個插入之長度分別為1、1及4個鹼基長度且可能全部為移碼插 入。所有三個插入導致外顯子2內之過早終止密碼子(對於插入1及2，新穎終止密碼子出現於ch16：28943752且對於插入3，出現於ch16：28943887)。下表32 列出支持插入及野生型以及相關百分比之讀數數目。最流行插入為「插入3」，其為4鹼基插入且出現約30%。此外，在橫跨一個以上插入之15對讀數中，配對讀數中無一者含有一個以上插入，表明插入為相互排他性的。
在表中，「樣品」列出患者數目，後跟「B」用於基線樣品或後跟「R」用於復發時獲取之樣品。標記為Ins1之欄指示顯示Ins1(左側數目)相對於該位置之野生型序列(右側數目)之讀數數目；標記為Ins2之欄指示顯示Ins2(左側數目)相對於該位置之野生型序列(右側數目)之讀數數目；且標記之Ins3指示顯示Ins3(左側數目)相對於該位置之野生型序列(右側數目)之讀數數目。表指示僅患者29顯示此三個插入，且插入僅在復發時觀測到。此等結果表明CD19之外顯子2中之插入導致一些患者中之抗性。
此操作鑑別B-ALL之之CTL019療法之抗性機制，即腫瘤細胞變為CD19及對CTL019療法具抗性之CD19之外顯子2中之插入。此觀測對針對除CD19以外之標靶，例如CD20、CD22及ROR1之CAR之CTL019組合策略提供支持。
實例14：復發ALL癌症患者中之B細胞抗原之表現
各種B細胞抗原之表現測定於先前用除CAR療法以外之癌症療法 治療，即未用任何CAR療法治療之復發急性淋巴母細胞白血病(ALL)癌症患者中。
方法
樣品以去鑑別原發性人類ALL骨髓(BM)及末梢血液(PB)樣本形式獲得。抗人類抗體購自Abcam、Biolegend、Invitrogen、eBioscience或Becton Dickinson。單核細胞藉由聚蔗糖分離來分離，在補充有2%胎牛血清之PBS中洗滌一次，且在室溫下染色15分鐘。對於細胞數目定量，根據製造商之說明書使用Countbright(Invitrogen)珠粒。在所有分析中，基於前向相對側向散射特徵，閘控相關群體，且接著單峰閘控，且使用Live Dead Aqua(Invitrogen)閘控活細胞。包括時間閘控用於品質控制。對於動物研究，添加鼠類抗CD45抗體(Biolegend)以使鼠類白血球出閘。CD22之表面表現藉由用來自純系HIB22之抗CD22單株抗體(Biolegend)染色偵測。CD123之表面表現藉由用來自純系6H6之抗CD123單株抗體(ebioscience)染色偵測。FLT3之表面表現藉由用來自純系IM2234U之抗FLT3單株抗體(Beckman Coulter)染色偵測。ROR1之表面表現藉由用來自純系2H6之抗ROR1單株抗體(Abcam)染色偵測。CD79b之表面表現藉由用來自純系CB3-1之抗CD79b單株抗體(Biolegend)染色偵測。CD79a之表面表現藉由用來自純系HM47之抗CD79a單株抗體(R&D Systems)染色偵測。CD10之表面表現藉由用來自純系eBioCV-CALLA之抗CD10單株抗體(ebioscience)染色偵測。CD34之表面表現藉由用來自純系561之抗CD34單株抗體(Biolegend)染色偵測。CD20之表面表現藉由用來自純系L27之抗CD20單株抗體(BD Biosciences)染色偵測。抗體結合容量(ABC)單元中之細胞抗原表現之定量使用QuantumTM Simply Cellular®(Bangs Lab.,Inc)根據標準程序(http：//static.abdserotec.com/uploads/ifu/fcsc815b.pdf)進行。流動式細胞測量術在四雷射Fortessa-LSR細胞計數器(Becton-Dickinson)上進行 且用FlowJo X 10.0.7r2(Tree Star)分析。
結果
在復發ALL患者中，表現若干B細胞抗原，包括CD19、CD22、CD123、FLT-3、CD10及CD34。參見圖22。
為了鑑別潛在額外B細胞急性淋巴母細胞白血病(B-ALL)標靶，藉由以下標記物之多參數流動式細胞測量術篩選來自16位r/r患者之樣品：CD19(16 pts)、CD22(16 pts)、CD123(16 pts)、FLT-3(9 pts)、ROR-1(3 pts)、CD79b(15 pts)、CD179b(8 pts)、CD79a(16 pts)、CD10(16 pts)、CD34(16 pts)及CD20(16 pts)。CD22及CD123高度(>60%)且均勻地表現於r/r ALL患者之母細胞中(長條指示中值%表現，分別為99.50%、98.80%、95.70%、72.00%、47.00%、15.00%、13.45%、4.200%、98.00%、87.65%及7.00%)。(圖22)。
實例15：復發CD19陰性癌症患者中之B細胞抗原之表現
各種B細胞抗原之表現測定於預先用CD19 CAR治療且CD19陰性腫瘤復發之患者中。根據實例14中之方法使用流動式細胞測量術以圖23中描繪之閘控策略測定抗原表現。
在CART19治療之前(基線)及之後(CD19陰性復發)在來自CD19陰性白血病復發之6位患者之BM及PB樣品中分析CD22及CD123之表現。在所有分析中，基於前向相對側向散射特徵，閘控相關群體，且接著單峰閘控，且使用Live Dead Aqua(Invitrogen)閘控活細胞。包括時間閘控用於品質控制。閘控策略包括：時間閘控→SSC低→單峰→存活→CD45dim→CD10+。
結果
幾乎所有變為CD19陰性之患者保持CD22陽性及CD-123陽性。參見圖24及圖25。結果概述於圖26中，且展示儘管CD19 CART治療導致CD19表現之損失(如藉由流式細胞術所量測)，CD22及CD123表現 仍較高。
實例16：難治性B細胞惡性腫瘤中之自體CD22再導引CART細胞之擴增獲得治療
復發性/難治性(r/r)B細胞急性淋巴母細胞白血病(ALL)與小兒以及成年患者中之不佳預後相關聯。靶向白血病母細胞，如抗CD19嵌合抗原受體T細胞上之CD19(CART19、CTL019)或雙特異性抗CD19/CD3抗體(布林莫單抗)之新穎療法在此群體中誘導顯著反應。然而，已在CART19或布林莫單抗療法之後的5-10%患者中報導CD19陰性復發。
方法 細胞株及初級樣品
ALL細胞株NALM-6之細胞維持於補充有10%胎牛血清、青黴素及鏈黴素之RPMI培養基之培養下。對於一些實驗，NALM-6細胞經螢光素酶/GFP+轉導且接著分選以獲得>99%陽性群體。急性骨髓白血病細胞株MOLM-14或K562及T-ALL細胞株JURKAT用作CD22陰性對照。
獲得去鑑別原發性人類ALL骨髓(BM)及末梢血液(PB)樣本及來自兩個在CART-19療法之後復發的患者之BM及PB樣品。在基線(IR82，在CART19療法之前)及復發(IR243)時收集來自用CART-19治療且CD19陰性白血病復發之患者之ALL母細胞。來自此等2個時間點之初生母細胞在NSG小鼠中活體內擴增且在若干次繼代之後藉由螢光素酶/GFP轉導(Barrett,D等人(2011)Blood 118(15)：e112-117)。對於所有功能研究，ALL細胞在分析之前解凍至少12小時且在37℃下靜置。
產生CAR構築體及CAR T細胞
使用美國專利申請案第2011/0020344 A1中所述之抗CD22單鏈可變片段輕鏈(L)及重鏈(H)序列產生針對CD22之嵌合抗原受體(CAR)， 該專利申請案描述產生抗CD22完全人類單株抗體m971(Xiao,X等人(2009)MAbs.1(3)：297-303)。序列經密碼子最佳化且使用兩種不同可變鏈定向(H至L及L至H)產生兩種不同CAR構築體。此兩種抗CD22 scFv接著選殖至鼠類CAR19主鏈(CD8鉸鏈、41BB共刺激域及CD3 ξ信號傳導域)中且隨後選殖至pTRPE慢病毒載體中。如先前所述產生鼠類CAR19(Milone,M等人(2009)Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 17(8)：1453-1464)。
如先前所述進行CAR陽性T細胞之產生(Gill,S等人(2014)Blood 123(15)：2343-2354)。正常供體CD4陽性及CD8陽性T細胞以1e6/ml之濃度平鋪，CD4：CD8之比率為1：1，且在培養第1天添加且在第6天移除之X-vivo 15培養基(Lonza，04-418Q)、人類血清AB 5%(Gemini，100-512)、青黴素/鏈黴素(Gibco，15070063)及使用抗CD3/CD28戴諾珠粒(Life Technologies，11161D)之格魯塔瑪(Gibco，35050061)擴增。T細胞藉由攜有CAR22、CAR19之慢病毒轉導或在第2天經模擬轉染。T細胞在培養物中擴增10-15天且在中值細胞體積低於300fl時收穫。隨後將T細胞在FBS 10% DMSO中冷凍保存用於未來實驗。在所有實驗之前，將T細胞解凍且在37℃下靜置隔夜。
多參數流動式細胞測量術分析
抗人類抗體購自Biolegend、eBioscience或Becton Dickinson。細胞自活體外培養物或動物分離，在補充有2%胎牛血清之PBS中洗滌一次，且在室溫下染色15分鐘。對於細胞數目定量，根據製造商之說明書使用Countbright(Invitrogen)珠粒。在所有分析中，基於前向相對側向散射特徵，閘控相關群體，且接著單峰閘控，且使用Live Dead Aqua(Invitrogen)閘控活細胞。包括時間閘控用於品質控制。對於動物研究，添加鼠類抗CD45抗體(Biolegend)以使鼠類白血球出閘。抗CD22 CAR之表面表現藉由用CD22-His蛋白質(11958-H08H-50)及抗- His-APC單株抗體(IC050A)染色而偵測。CAR19如先前所述偵測(Kalos,M等人(2011)Science translational medicine 3(95)：95ra73)。根據標準程序(http：//static.abdserotec.com/uploads/ifu/fcsc815b.pdf)使用QuantumTM Simply Cellular®(Bangs Lab.,Inc)對NALM-6及對照物進行抗體結合容量(ABC)單元中之CD19及CD22細胞抗原表現之定量。流動式細胞測量術在四雷射Fortessa-LSR細胞計數器(Becton-Dickinson)上進行且用FlowJo X 10.0.7r2(Tree Star)分析。
脫粒分析
如先前所述進行脫粒分析。T細胞與靶細胞以1：5比率在T細胞培養基中一起培育。在起始時間之後30分鐘將抗CD107a-PECY7(Biolengend)、抗CD28、(BD Biosciences)、抗CD49d(BD Biosciences)抗體及莫能菌素(BD Biosciences)添加至共培養物。4小時後，收集細胞，且染色用於CAR表現、CD3、CD8及Live Dead aqua染色(Invitrogen)。使細胞固定且滲透(Invitrogen Fix/Perm緩衝劑)，且隨後進行胞內染色以偵測多個細胞因子(IFN、TNFa、IL-2、GM-CSF、MIP1b)。
增殖分析
將T細胞洗滌且以1x107/ml再懸浮於100ul PBS中，且在37℃下用100ul 2.5uM CFSE(Invitrogen)染色5分鐘。隨後用冷介質淬滅反應，且細胞洗滌三次。標靶以100Gy之劑量照射。T細胞與照射之靶細胞以1：1比率培育120小時，在24小時添加培養基。隨後收集細胞，染色CD3、CAR及Live Dead aqua(Invitrogen)，且在流式細胞學分析之前添加Countbright珠粒(Invitrogen)用於絕對定量。
細胞毒性分析
螢光素酶/GFP+NALM-6細胞或原發性ALL樣品如先前所述用於細胞毒性分析。將4個標靶與效應T細胞以所指示之比率一起培育4或 16小時。在Xenogen IVIS-200 Spectrum相機上藉由生物發光成像，或藉由流動式細胞測量術，計算殺死。對於後者，收穫細胞且在分析前添加Countbright珠粒及7-AAD(Invitrogen)。殘餘活靶細胞為CFSE陽性7-AAD陰性的。
細胞因子量測
效應細胞與靶細胞以1：1比率在T細胞培養基中共培育24小時。收穫上清液且根據製造商的方案(Invitrogen)(Kalos,M等人(2011))藉由30重Luminex陣列(Luminex Corp,FLEXMAP 3D)分析。
活體內實驗
獲得NOD-SCID-γ鏈-/-(NSG)小鼠。根據賓夕法尼亞州大學之機構動物護理及使用委員會(IACUC)批准之方案，進行所有實驗。利用之異種移植模型之模式詳細論述於結果部分中。細胞(NALM-6或T細胞)以在200ul PBS中之所指示濃度注射至小鼠尾靜脈中。生物發光成像使用Xenogen IVIS-200 Spectrum相機進行且用LivingImage軟體4.3.1版(Caliper LifeSciencies)分析。在實驗結束或根據IACUC策略需要時對動物安樂死。
免疫組織化學
進行28種人類正常組織(脂肪、腎上腺、闌尾、小腦、子宮頸、結腸、子宮內膜、食道、脂肪、心臟、腎臟、淋巴結、肺、肌肉、卵巢、胰臟、副甲狀腺、胎盤、前列腺、唾液、脊柱、胃、睾丸、胸腺、甲狀腺、扁桃體)之組織微陣列(TMA)以評估CD22之腫瘤外表現(一式三份)。使用Bond Polymer Refine Detection System在Leica Bond-III儀器上進行福馬林固定石蠟嵌入組織之免疫組織化學(IHC)染色。非經稀釋地使用這對CD22之抗體(純系FPC1；Leica PA0249)。藉由ER2溶液(Leica Microsystems AR9640)進行熱誘導抗原決定基修復20分鐘。使用Aperio ScanScopeTM用數位方式獲得影像。基因表現剖析 。
使用BioGPS.org網站關於CD22表現分析可公開訪問之RNA表現資料庫(GeneAtlas U133A,gc)。對於75種不同人類正常細胞類型及7種腫瘤細胞株報導中值CD22 RNA表現(參見圖39)。
51-鉻釋放分析
為了評估可能的退腫瘤CART22毒性，使用正常人類組織(CD34+、人類神經元、人類神經元祖細胞、角質細胞)作為標靶及K562或NALM-6作為對照進行鉻釋放分析。靶細胞與51Cr 50μCi/0.5e6個細胞一起在37℃下培育1-2h。洗滌細胞且與效應細胞以不同E：T比率一式三份地平鋪。在4小時培育之後，來自各孔之等分試樣置於讀取器板中且乾燥隔夜。次日，使用1450 Microbeta Plus Liquid閃爍計數器定量鉻釋放。
結果
為了鑑別潛在B-ALL標靶，來自16位r/r患者及4位CART19療法治療後CD19陰性疾病復發之患者之樣品藉由多參數流動式細胞測量術篩選B細胞標記物CD22。CD22高度(>60%)且均勻地表現於11/15為r/r ALL患者之母細胞中(圖27A)。CD22亦在CART19治療之前(基線)以及之後(CD19陰性復發)(顯示之2pts)在CD19陰性白血病復發之4/4位患者中呈陽性(圖27B)。(閘控策略：SSC低→單峰→存活→CD45dim)。
使用不同鏈定向(H至L及L至H)產生之CAR22構築體之概要顯示於圖28A中。抗CD22 scFv(m971)經密碼子最佳化且在含有CD8鉸鏈、 41-BB共刺激及CD3 ξ信號傳導域之鼠類CAR19載體中選殖。NALM6 ALL細胞株上之CD19、CD22及同型對照之表現顯示為平均螢光強度(MFI)(圖28B)及抗體結合容量(ABC)(圖28C)。本文中呈現之結果展示在NALM-6細胞中，CD19之表現高於CD22。然而，在大部分原發性ALL樣品中，CD19及CD22表現類似(參見圖28A)。
進行正常供體T細胞擴增以產生CART22及CART19(連同未轉導之細胞(UTD))。相對於培養天數量測群體加倍時間及T細胞體積。在擴增結束(培養第11天)時，CART22及對照T細胞達到約4.5群體加倍(PD)，相比於CART19或UTD細胞無顯著差異(圖29A)。在培養第6天時，峰值體積為約450fl，而在接下來數天，體積在收穫及冷凍細胞時減少至300fl(圖29B)。未觀測到相對於CART19或UTD之顯著不同。在擴增之第11天藉由流動式細胞測量術觀測CD4陽性及CD8陽性T細胞上之CAR表現(圖29C)。CAR表現之閘控係基於UTD。(閘控策略：FSS相對於SSC淋巴細胞→單峰→存活→CD3+)。
進行細胞質內細胞激素產生之CD107a脫粒分析。CART19、CART22 HtoL及LtoH與不同標靶(單獨、PMA/離子黴素、MOLM-14及NALM-6)共培養。CART19及CART22 HtoL在與ALL細胞株(NALM-6)共培養時顯示高含量之CD107a脫粒、IL-2、IFNg及TNFa產生，但在與陰性對照共培養時並非如此(圖30)。UTD及CART22 LtoH不顯示脫粒或細胞因子產生(圖30)。(閘控策略：FSS相對於SSC淋巴細胞→單峰→存活→CD3+)。
在基於螢光素酶之殺死分析中，CART22及CART19 HtoL在共培養24小時時能夠裂解NALM-6細胞，但UTD不能(圖31)。觀測到細胞毒性活性與E：T比率之間的直接相關性，在2：1 E：T比率下具有較好抗白血病效應(對於CART19及CART22之78%及75%殺死)。
在基於CFSE之增殖分析中，CART22及CART19於ALL細胞株 NALM-6共培養5天導致顯著T細胞增殖(分別為94%及92.9%)。亦顯示對照物(TCM=單獨培養基，P-I=PMA/離子黴素，MOLM-14)(圖32A)。顯示CART19及CART22中之CFSE稀釋之動力學之直方圖展示大部分T細胞經歷多個增殖循環(圖32B)。(閘控策略：FSS相對於SSC淋巴細胞→單峰→存活→CD3+)。
CART22、CART19及UTD細胞與不同照射標靶(單獨、PMA/離子黴素、MOLM-14及NALM-6)一起培育24小時。當與ALL細胞株NALM-6共培養時，僅CART22及CART19 HtoL能夠釋放多個細胞因子(此處顯示IFNg、IL-2、GM-CSF、TNFa及MIP1b)(圖33)。
CART22、CART19及UTD細胞與衍生自ALL患者之母細胞(CHP-959-101)在基線及CART19治療之後患者復發CD19陰性疾病時共培育4小時。量測脫粒。CART19及CART22均能夠在基線處脫粒(當母細胞為CD19+及CD22+時)，但在復發時，僅CART22脫粒(當疾病為CD19陰性時)(圖34A)。在與CHP101樣品一起培育之後在復發時量測CD8陽性及CD8陰性CART19及CART22效應子中之CD107a脫粒。僅CART22顯示CD8及CD4 T細胞兩者中之脫粒(圖34B)。(閘控策略：FSS相對於SSC淋巴細胞→單峰→存活→CD3+)。
相對於NALM-6之活體內CART22功效評估如下：1百萬NALM-6螢光素酶+細胞/小鼠靜脈內注射於NSG小鼠中。在6天之後，藉由生物發光評估腫瘤移植。小鼠接著經隨機化以接受未轉導之T細胞或不同劑量之CART22(1.25至5百萬總細胞/小鼠，具有75% CAR表現)。接著對小鼠監測腫瘤負荷、PB T細胞擴增及存活(圖35A)。量測根據生物發光(BLI)之腫瘤負荷且觀測劑量相關抗白血病反應。接受5e6個CART22細胞之小鼠顯示較好腫瘤控制(圖35B)。CART22治療之小鼠顯示相比於UTD治療小鼠統計顯著較好之總存活(OS)。另外，對於OS，在CART22之較高劑量與較好OS之間存在顯著相關性(圖35C)。 藉由眶後出血每週監測T細胞活體內擴增。在T細胞輸注之後一週，接受較高劑量CART22之小鼠顯示較好CART擴增(每微升12個T細胞之中值)(圖35D)。
CART22與CART19相對於NALM-6之間的活體內比較評估如下：1百萬個NALM-6螢光素酶+細胞/小鼠靜脈內注射於NSG小鼠中。在6天之後，藉由生物發光評估腫瘤移植。小鼠接著隨機化以接受未轉導之T細胞、CART19或CART22(5百萬個總細胞，具有75% CAR表現)。接著對小鼠監測腫瘤負荷、PB T細胞擴增及存活(圖36A)。量測根據生物發光(BLI)之腫瘤負荷且在CART22及CART19治療小鼠中均觀測到抗白血病反應，而UTD小鼠快速進展(圖36B)。CART19治療小鼠顯示相比於CART22之較好總存活(OS)，其可能由於NALM-6中之不同標靶表現(CD19>>CD22)(圖36C)。
CART22及CART19在原發性ALL之模型中進行活體內比較。原發性ALL患者之母細胞(JH331)經活體內繼代且藉由螢光素酶轉導以遵循腫瘤負荷。1百萬JH331螢光素酶+細胞/小鼠靜脈內注射於NSG小鼠中。在14天之後，藉由生物發光評估腫瘤移植。小鼠接著隨機化以接受未轉導之T細胞、CART19或CART22(5百萬個總細胞，具有75% CAR表現)。接著對小鼠監測腫瘤負荷、PB T細胞擴增及存活(圖37A)。量測根據生物發光(BLI)之腫瘤負荷且在CART22及CART19治療小鼠中均觀測到抗白血病反應，而用UTD細胞治療之小鼠快速進展(圖37B)。
藉由免疫組織化學染色對28個人類正常組織進行關於CD22表現之組織微陣列。淋巴器官對於CD22表現導致陽性(扁桃體、淋巴結、脾臟及胸腺)(圖38A)。所有非淋巴器官不顯示CD22表現(圖38B)。CD22陽性駐留B細胞觀測於多個組織中(圖38C)。
在B細胞、扁桃體及淋巴結中以高水準觀測到CD22 RNA表現， 如來自GeneAtlas U133A之表現資料中所示。B-淋巴母細胞及白血病/淋巴瘤細胞株亦高度陽性(圖39)。
CART22及CART19均在關於CART22毒性之51-鉻釋放分析中觸發ALL細胞株NALM-6之裂解，但UTD細胞並非如此(圖40)。未在任何正常組織(CD34+、人類神經元祖細胞或神經元及角質細胞)或對照物(K562細胞株)中觀測到CART22之細胞毒性效應。
實例17：抗CD123與抗CD19 CAR T細胞之組合用於治療及預防抗原缺失復發
化療難治性或復發性(r/r)B細胞急性淋巴母細胞性白血病(B-ALL)與不良預後相關聯，但如最近所展現仍對免疫系統極其敏感。特定言之，抗CD19嵌合抗原受體T細胞(CART19、CTL019)及雙特異性抗CD19/CD3抗體(布林莫單抗)在此患者群體中產生前所未有的完全反應速率45-90%。兩種方法均重導向自體T細胞識別表現CD19之細胞。布林莫單抗使用組合抗CD19單鏈可變片段(scFv)與抗CD3 scFv之雙特異性構築體之連續長期輸注；在CART19之情況下，T細胞經遺傳修飾以表現與藉由內建式共刺激域信號傳導之T細胞受體融合之抗CD19 scFv。近期研究展示90%患有r/r B-ALL之患者經CTL019治療達到完全緩解(CR)，6個月之整體存活率(OS)為78%。CART19之令人鼓舞的結果亦在患有其他B細胞贅瘤(諸如，慢性淋巴細胞性白血病及非霍奇金淋巴瘤)之患者中獲得。
然而，一小類用CART19或布林莫單抗治療之患者產生復發，且此等復發之顯著部分之特徵為CD19缺失。在B-ALL中，已報導10-20%患者在CART19或布林莫單抗療法之後CD19陰性復發，且其尚未描述於其他治療情形中；整體上在布林莫單抗之後約30%復發及在CART19之後高達50%為CD19陰性。CD19為自B細胞發展為成熟B細胞之極最早階段表現之原型B細胞標記。CD19在B細胞生物學中起重 要作用，因為缺乏CD19之B細胞展現選擇性生長缺點。因此，CD19缺失為B-ALL中之極異常發現，且已在有效CD19導向之免疫療法時代之前在僅罕見患者中報導。抗原缺失之可能機制當前正處於研究且最可能由此等強大抗CD19藥劑對白血病子純系之選擇性壓力引起。由於FDA近期批准布林莫單抗及根據CTL019之突破狀態，有可能增加將用此等藥劑治療之患有r/r B-ALL之患者數目。因此，需要新穎有效策略以便能夠治療在CART19或布林莫單抗之後將復發CD19陰性母細胞之彼等患者。理想地，新方法將不僅治療患有活性抗原缺失復發之患者，而且在預先採用時可潛在防止其發生。
介白素-3受體α(或CD123)參與血細胞生成且已展示表現於幾種血液贅瘤中，包括急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴白血病(ALL)、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、毛細胞白血病及霍奇金淋巴瘤。不同於譜系相關聯表面抗原，諸如CD33(骨髓)或CD19(B-淋巴)，CD123階層式表現於造血祖細胞上，且在AML中，CD123表現於參與抗化學療法且在初始治療之後復發之白血病幹細胞上。由於此等特徵，CD123已對靶向療法產生極大關注，且正研發多種藥劑，諸如IL3-白喉毒素融合蛋白(SL-401、DT388IL3)、裸抗CD123單株抗體(CSL-360、CSL-362)、抗體-藥物共軛物、雙特異性抗體或CD3Fv-IL3融合構築體及最近抗CD123嵌合抗原受體T細胞。一些此等方法當前正在臨床試驗中驗證且更多方法將在隨後幾年在臨床中測試。靶向具有嵌合抗原受體T細胞(CART123)之CD123可導致人類初級AML異種移植物中之深度且長期反應，且可建立抗白血病T細胞記憶。此處，CD123在CD19導向療法後發生復發之CD19陰性B-ALL中表現，且與CART19(CTL019)組合之CAR-123 T細胞為治療及預防B-ALL異種移植之抗原缺失復發的有效療法。
材料及方法
細胞株及初級樣品。 細胞株最初獲自ATCC(Manassas,VA)(K-562)或DSMZ(Braunschweig,Germany)(MOLM-14及NALM-6)。測試所有細胞株之黴漿菌污染之存在(MycoAlertTM Mycoplasma Detection Kit,LT07-318,Lonza,Basel,Switzerland)。對於一些實驗，細胞株經螢火蟲螢光素酶/eGFP轉導且隨後分類，獲得>99%陽性群體。螢光素酶陽性K-562細胞株亦經截短CD19或截短CD123轉導，獲得不表現兩者、僅表現CD19或CD123之細胞株。MOLM-14及K562如相關圖中所指示用作對照。細胞株維持在補充有10%胎牛血清(FBS,Gemini,100-106,West Sacramento,CA)及50UI/ml青黴素/鏈黴素(Gibco,LifeTechnologies,15070-063)之含RPMI培養基1640(Gibco,11875-085,LifeTechnologies,Grand Island,NY)之培養物中。去鑑別之初級人類ALL骨髓(BM)及周邊血液(PB)樣品獲自賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)/費城兒童醫院(Children's Hospital of Philadelphia)根據機構審查委員會(Institutional Review Board，IRB)協定進行之臨床實踐，購自賓夕法尼亞大學之幹細胞及異種移植中心(Stem Cells and Xenograft Core of the University of Pennsylvania)或當前CTL019臨床試驗之研究樣品(賓夕法尼亞大學之轉譯與相關研究實驗室(Translation and Correlative Study Laboratory))。對於所有功能性研究，初級細胞在實驗之前解凍至少12小時且在37℃下靜置。
初級B-ALL母細胞之活體內擴增。 方法揭示於D.M.Barrett,A.E.Seif,C.Carpenito,D.T.Teachey,J.D.Fish,C.H.June,S.A.Grupp,G.S.Reid,Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia：a strategy for preclinical modeling.Blood 118,e112-117(2011)中。
螢光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)及免疫組織化學。 根據標準方法且如所描述進行FISH分析及免疫組織化 學。(M.A.Belaud-Rotureau,M.Parrens,P.Dubus,J.C.Garroste,A.de Mascarel,J.P.Merlio,A comparative analysis of FISH,RT-PCR,PCR,and immunohistochemistry for the diagnosis of mantle cell lymphomas.Modern pathology：an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology,Inc 15,517-525(2002))。根據標準方法進行FISH分析。簡言之，收穫之ALL細胞懸浮於固定劑(乙酸及甲醇)中、沈積在載玻片上且使其乾燥。將雙色基因融合探針BCR/ABL(Abbott Molecular)施加於雜交緩衝溶液中。將載片蓋滑動、密封且在HYBrite室內在37C下靜置6h。在移除密封劑及蓋玻片之後，將載片洗滌兩次，吸墨，乾燥，且用DAPI複染。在螢光顯微鏡下檢查載片，各樣品中評估最少200個細胞核。
產生CAR構築體及CAR T細胞。 如先前所描述產生鼠類抗CD19嵌合抗原受體(CD8鉸鏈、4-1BB共刺激域及CD3 ξ信號傳導域)。(Milone等人，Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 17,1453-1464(2009)及Imai等人，Leukemia 18,676-684(2004))。此為賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)當前用於CTL019臨床試驗之相同構築體。對於CAR123 scFv使用抗CD123(1172構築體(SEQ ID NO：707，及如描述於PCT/US2014/017328中)及相同CAR19主鏈構築體。如先前所描述進行CAR表現T細胞之生產。(Gill等人，Blood 123 ,2343-2354(2014))。正常供體CD4及CD8 T細胞或PB單核細胞(PBMC)獲自賓夕法尼亞大學人類免疫學中心(Human Immunology Core of the University of Pennsylvania)。T細胞在1：1之CD4：CD8比率下以1×106 /ml接種且擴增於X-vivo 15培養基(Lonza,04-418Q)中，培養基使用在第1天添加培養物且在第6天移除之抗CD3/CD28戴諾珠粒(Dynabead)(Life Technologies,11161D)補充有人類AB血清5%(Gemini,100-512)、青黴素/鏈黴素(Gibco,15070063)及 格魯塔瑪(Glutamax)(Gibco,35050061)。T細胞在第2天藉由慢病毒轉導。T細胞在培養物中擴增8-15天且在中值細胞體積低於300fl時收穫。隨後將T細胞在含10% DMSO之FBS中冷凍保存用於未來實驗。在所有實驗之前，將T細胞解凍且在37℃下靜置隔夜。
多參數流動式細胞測量術。 流動式細胞測量術如先前所描述進行(Kenderian等人，Leukemia,(2015))。抗人類抗體購自Biolegend、eBioscience或Becton Dickinson。細胞自活體外培養物或動物分離，在補充有2%胎牛血清之PBS中洗滌一次，且在室溫下染色15分鐘。對於細胞數目定量，根據製造商之說明書使用Countbright(Invitrogen)珠粒。在所有分析中，基於前向相對側向散射特徵，閘控所關注的群體，隨後單峰閘控，且使用Live Dead Fixable Aqua(Invitrogen)閘控活細胞。包括時間閘控用於品質控制。使用抗個體基因型抗體如先前所描述偵測CAR19之表面表現。使用山羊抗小鼠抗體(Jackson Laboratories)或CD123-Fc/His(Sino Biologicals)及抗His-APC(R&D)或PE(AbCam)進行CAR123之偵測。流動式細胞測量術在四雷射Fortessa-LSR II細胞計數器(Becton-Dickinson)上進行且用FlowJo X 10.0.7r2(Tree Star)分析。
活體外T細胞效應功能分析。 脫粒、CFSE增殖、細胞毒性分析及細胞因子量測如先前所描述進行。(Gill等人，Blood 123 ,2343-2354(2014)及Kalos等人，Science translational medicine 3 ,95ra73(2011))。
脫粒分析。 簡言之，T細胞與靶細胞以1；5比率在T細胞培養基中一起培育。將抗CD107a-PECY7(Biolegend)、抗CD28(BD Biosciences)、抗CD49d(BD Biosciences)抗體及莫能菌素(BD Biosciences)添加至共培養物中。4小時後，收集細胞，且染色用於CAR表現、CD3、CD8及Live Dead aqua染色(Invitrogen)。使細胞固定且滲透(Invitrogen Fix/Perm緩衝劑)，且隨後進行胞內染色以偵測多個 細胞因子(IFN、TNFα、IL-2、GM-CSF、MIP1β)。
增殖分析。 將T細胞洗滌且以1x107 /ml再懸浮於100ul PBS中，且在37℃下用100ul 2.5uM CFSE(Invitrogen)染色5分鐘。隨後用冷介質淬滅反應，且細胞洗滌三次。標靶以100Gy之劑量照射。T細胞與照射之靶細胞以1：1比率培育120小時，在24小時添加培養基。隨後收集細胞，染色CD3、CAR及Live Dead aqua(Invitrogen)，且在流式細胞學分析之前添加Countbright珠粒(Invitrogen)用於絕對定量。
細胞毒性分析。 螢光素酶/eGFP+細胞株如先前所描述用於細胞毒性分析。簡言之，標靶與效應T細胞以所指示之比率一起培育24小時。藉由Xenogen IVIS-200光譜相機上之生物發光成像來計算殺死。
細胞因子量測。 效應細胞與靶細胞以1：1比率在T細胞培養基中共培育24。收集上清液且根據製造商之協定(Invitrogen)藉由30重Luminex陣列(Luminex Corp,FLEXMAP 3D)分析。
動物實驗。 活體內實驗如先前所描述進行。(Kenderian等人，Leukemia ,(2015))。利用之異種移植模型之模式詳細論述於相關圖式、結果中。最初獲自Jackson Laboratories之NOD-SCID-γ鏈-/-(NSG)購自賓夕法尼亞州大學幹細胞及異種移植中心(Stem Cell and Xenograft Core of the University of Pennsylvania)。根據符合實驗室動物護理及使用(Care and Use of Laboratory Animals)之NIH指南的機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准之協定(#803230)進行所有實驗。細胞(白血病細胞株或T細胞)以在200ul PBS中之所指示濃度注射至小鼠尾靜脈中。生物發光成像使用Xenogen IVIS-200 Spectrum相機進行且用LivingImage軟體4.3.1版(Caliper LifeSciencies)分析。使動物在實驗結束時或在其根據IACUC協定滿足預先指定端點時安樂死。
多光子顯微術。 小鼠經麻醉且維持在37℃中心溫度下。在移除 頭皮且固定顱骨之後使骨髓成像。使用裝備有皮秒雷射(相干的)之Leica SP5雙光子顯微鏡系統(Leica Microsystems)進行成像。每次成像採集持續20min，隨後評估小鼠鎮靜。使用850nm雷射光激發CellTrace紫色、GFP及CellTrace橙色(或TRITC)。使用20×水浸漬透鏡獲得影像。使用Volocity軟體(PerkinElmer)分析所得影像。
統計分析。 使用GraphPad Prism 6 for Windows，6.04版(La Jolla,CA)如所指示進行所有統計。斯圖登氏t檢驗(Student's t-test)用於比較兩個組；在比較多個組之分析中，藉由霍爾姆-思達校正(Holm-Sida correction)進行單因子變異數分析(ANOVA)以便進行多個比較。當比較在多個時間點/比率下之多個組時，使用每個時間點/比率之斯圖登氏t檢驗或ANOVA。使用對數等級檢驗比較存活率曲線。在圖中，星號用於表示p值(*=<0.05,**=<0.01,***=<0.001,****=<0.0001)，且「ns」意謂「不顯著」(p>0.05)。各實驗之其他統計細節列於圖例中。
結果 CD123表現於B-ALL、白血病幹細胞及CD19陰性復發中
為了評估CD123在B細胞急性淋巴母細胞性白血病中之表現，分析來自成人及小兒ALL患者之42個樣品，包括參與吾等當前CTL019臨床試驗之14個個體。如圖49A、49B及49A中所展示，CD123高度且均勻表現於大多數ALL母細胞表面上，代表用於靶向療法之理想候選。此外，亦發現CD123在假定的白血病幹細胞(LSC)中表現，鑑別為CD34+ CD38-(圖49C)。可在一些B-ALL患者中鑑別CD19陰性母細胞之小亞群，且此等細胞在其含有惡性表型細胞時可促進抗原缺失復發。為了評估CD19陰性亞群中疾病之存在，分選來自費城染色體陽性B-ALL大群體之CD19- CD123+細胞(CD45dim，圖56B展示閘控策略)。已發現此等細胞對於BCR-ABL易位為純系的，即使是在比 CD19+母細胞更低的頻率下(圖49D)。此發現指示在一些情況下靶向單獨CD19可導致來源於CD19- CD123+細胞之亞純系復發。此外，此發現表明靶向CD123可經由消除LSC及可能CD19陰性白血病純系導致較深度反應。
最後，亦評估在CTL019具有CD19缺失之後復發之B-ALL患者的樣品中之CD123表現。重要的是，與CD19完全缺失相反，大部分患者在復發時維持CD123表現(圖49E、49F及56C)。此等發現指示CD123表示在CART19或布林莫單抗之後出現的標靶CD19陰性ALL母細胞之理想標記。
抗CD123嵌合抗原受體T細胞在活體外及活體內有效對抗人類B-ALL
產生抗CD123嵌合抗原受體T細胞(CART123)，其經慢病毒轉導且用抗CD3/CD28磁性珠粒擴增。如本文所描述評估CART123對抗B-急性淋巴母細胞性白血病之活體外及活體內活性。
使用B-ALL細胞株NALM-6，亦即CD19++及CD123+(圖50A及57A)及原發性B-ALL樣品。當T細胞與NALM-6或原發性ALL共培養時，CART123與CART19之間的頂部對頂部活體外比較顯示類似的CD107a脫粒速率(圖50B)。CART123亦能夠以劑量依賴性方式殺死NALM-6細胞，具有與CART19類似的功效(圖50C)。在更長期實驗時，CART123在與NALM-6或原發性ALL共培養3-5天時增殖(圖50D及圖50E)且產生多個細胞因子(圖50F)。此等結果指示CART123展現與針對多個B-ALL標靶之CART-19等效的效力。
為了在活體內模型中證實此等資料，使用初級ALL模型。在此模型中，獲自B-ALL患者之初級母細胞在NOD-SCID-γ鏈基因剔除(NSG)小鼠中傳代且經含有eGFP及叩頭蟲螢光素酶(GFP/Luc)之報導子構築體轉導。NSG小鼠靜脈內注射GFP/Luc+初級ALL母細胞(JH331、CD19+、CD123+、添加表型)，且在移植之後將小鼠隨機分組以接收 CART19、CART123或對照未轉導之T細胞(UTD)。用對照T細胞治療之小鼠快速死於疾病，而用CART19或CART123治療之小鼠展示腫瘤根除及長期存活(圖51A及51B)。CAR123 T細胞與對照T細胞相比在小鼠之周邊血液(PB)中顯著擴增，且表現高CAR123含量(圖51C)。CART123之抗白血病活性為特異性的且基於如在吾等移植給小鼠CD123-CD19+白血病(AV576)時母細胞表面之CD123識別，僅CART19展示抗白血病活性，而CART123與對照UTD相比無效果(圖57B及57C)。
為了偵測CART123劑量與抗腫瘤活性之可能相關性，研發攜有高白血病負擔之小鼠之活體內模型(使用NALM-6細胞株)。在此模型中，標準劑量CART123(2百萬個CAR+細胞)不能夠清除腫瘤。此等小鼠注射不同劑量之CART123(1,250,000、2,000,000及5,000,000個CAR+細胞)，且觀測劑量相關之抗白血病活性(圖57D)。
CART123而非CART19在抗原缺失復發之新穎臨床前模型中高度有效
為了測試新策略標靶CD19陰性復發，研發抗原缺失復發之新穎活體內模型。在基線(在CTL019療法之前)、在疾病為CD19++及CD123+時及在患者產生CD19陰性疾病(CD123仍表現，圖58A)時在CTL019之後復發時收集獲自參與吾等CTL019臨床試驗之一的患者(CHP101)之B細胞母細胞。母細胞隨後在NSG小鼠中擴增，且對於基線疾病(CD19+)而言經叩頭蟲綠色螢光素酶(CBG)轉導，或對於復發(CD19-)而言經叩頭蟲紅色螢光素酶(CBR)轉導(參見方法部分)。重要的是，在活體內擴增期間，母細胞保留除CD19以外的B細胞身分標記(資料未展示)。在第一實驗中，NSG小鼠移植有基線疾病CD19+(CBG，綠色)或CD19-陰性(CBR，紅色)白血病。兩個組均隨機化接收CART19或對照T細胞(UTD)(圖52A)。如圖52B中所展示，用UTD治療之兩組小鼠獨立地藉由CD19表現展示基線及復發疾病之快速進 展。相反，在用CART19治療之一組小鼠中，僅移植有基線疾病(CD19陽性)之小鼠回應於CART19治療，而移植有復發性疾病(CD19陰性)之小鼠展示如預期的難治性。此亦在CD107a脫粒分析中在活體外再現(圖58B)。為了活體內模擬表現CD19或缺乏其之不同純系之存在，NSG小鼠移植有基線與復發疾病之1：1混合物；小鼠在第8天隨機化接收CART19或對照T細胞。藉由可辨別活體內CD19+(CBG，綠色)/CD19-(CBR，紅色)白血病之間相對生長之生物發光成像監測腫瘤負荷。如圖52C中所展示，在接收UTD之小鼠中，在第6天存在之CD19+(綠色)及CD19-(紅色)白血病在第11天類似地增加，而在用CART19治療之小鼠中，基線疾病(綠色)完全清除同時復發性疾病(紅色)展示進展。
使用初級CD19陰性B-ALL及CART19失敗之此獨特異種移植模型來評估CART123在治療抗原缺失復發中之作用。將初生CD19陰性母細胞(CBR陽性)注射至NSG小鼠中(圖52D)，且小鼠隨機化接收CART19、CART123或對照T細胞。CART19及對照T細胞展示完全缺乏抗腫瘤活性，而CART123導致此等小鼠中疾病完全根除及長期存活(圖52E及52F)。實際上，在CART19難治性初級B-ALL之臨床前模型中，新穎CART123能夠根除疾病且賦予長期存活。
為了理解CART19及CART123在此活體內模型中在單個細胞水準下之差異行為，藉由以下進行一系列實驗：向攜有CD19陽性初級母細胞(GFP)或CD19陰性復發性母細胞(GFP)之小鼠注射有差異地標記之CART19(CellTrace紫色，藍色)與CART123(CellTracker橙色或TRITC，紅色)之混合物，且在注射之後大約24小時使用顱骨骨髓之活體內雙光子顯微鏡追蹤其行為(實驗概要，圖53A)。此等研究展示CART19及CART123通行至含有白血病之骨髓空間，且CART細胞識別同源抗原與動力阻滯相關。特定言之，在移植有基線CD19+CD123+ 白血病之小鼠中，發現62.9% +/- 3.8之CART19及81.1%+/-1.2之CART123以與母細胞相鄰之變圓形態停止，而在移植有復發性CD19-CD123+白血病之小鼠中，僅CART123細胞緊挨著腫瘤細胞停滯(CART123 80.9%+/-5.1對比CART19 12.4%+/- 2.2)(圖53B及53C)。此等發現指示在CD19陰性復發性ALL中僅CART123能夠與白血病細胞建立多產突觸(GFP)且因此降低其活動力，而CART19細胞繼續取樣且在環境中移動而不識別白血病母細胞。
CART123與CART19之組合能夠預防CD19陰性復發
CART123證明有效治療在CART19抗性之臨床前模型中CD19導向療法之後發生的CD19陰性復發。然而，組合方法可治療活性CD19陽性疾病而同時預防抗原缺失復發。為了測試此假定，藉由將初級CD19-及CD19+疾病一起注射至NSG小鼠中來建模可能有CD19陰性逃逸之B-ALL之新出現的臨床問題。隨後使小鼠隨機化接收與T細胞相同總劑量之對照T細胞(UTD)、CART19或CART19與CART123之組合(圖54A)。如圖54B中所展示，用對照T細胞治療之小鼠具有白血病純系及CART19之進展，展示大多CD19陰性疾病(紅色)快速進展。相反，用CART123與CART19之組合治療之小鼠展示疾病清除及提高之整體存活率，如圖54C中所展示。在實驗結束時處死之小鼠之分析無證據展示合併CAR T細胞組中之殘餘白血病。相反，患有進行性疾病之小鼠在CART19單一療法之後保留預期之CD19陰性表型(圖54D)。
最後，T細胞經2個慢病毒轉導，一個攜載CAR19且另一個攜載CAR123，以便研發能夠藉由CD19及/或CD123活化之CART。如圖55A中所展示，偵測四個不同地轉導之T細胞亞群：CAR19及CAR123雙陰性、CAR19單陽性、CAR123單陽性及雙陽性CAR19/CAR123 T細胞。分選此等四個亞群且測試其針對K562-WT、K562 CD19+或K562 CD123+之功能及特異性。圖55B展示CD107a脫粒分析之結果，其中 單陽性亞群回應於其特異性標靶，而僅雙陽性群體能夠在表現CD19及CD123之K562存在下脫粒。另外，雙重刺激CART細胞與等效數目之單刺激CART細胞相比展現針對雙陽性標靶之細胞毒性更有效，表明藉由使用由兩個不同抗原觸發之CAR可能增加功效(圖55C)。
論述
CD19導向之免疫療法正在改變復發性及難治性急性淋巴母細胞性白血病之治療的範例。具有先前糟糕結果之患者現有實際可能實現完全反應及長期疾病緩解。然而，如在用其他形式之有效靶向療法治療白血病之一些情況下所展示，白血病細胞能夠產生導致抗性及復發之抗原缺失突變。在CART19之情況下，已觀測到兩種主要復發模式。經由持久性失敗具有早期CART19缺失之患者處於原始純系復發之風險下；實際上，微小殘留病分析指示在1至6個月之間可能需要持續CART活性來完全根除惡性腫瘤。相比之下，儘管CART19存留，約50%復發發生，且其特徵為發生aCD19陰性白血病。後者觀測暗示CART19之有效選擇性壓力。值得注意地，CD19陰性復發亦在布林莫單抗療法之後發生，儘管此等表示少數復發在此可認為不太有效療法之後發生。存在產生CD19陰性疾病之多個可能機制。此等之一為以極低頻率在基線存在之CD19陰性純系之選擇及相對存活優點，且此最初考慮為最可能導致CD19陰性復發之因素。最近，其他機制，諸如CD19編接失調亦考慮為重要的。此處，首次展示B-ALL中之罕見CD19-ve母細胞可含有在更常見CD19陽性白血病母細胞中發現之標誌細胞遺傳學異常，確認此為CD19陰性復發之可能機制。吾等藉由展現CD123+CD19-ve母細胞可在免疫缺乏小鼠中移植，指示CD123與其在AML中一樣可為B-ALL中白血病幹細胞之標記來確認此等發現。
此研究之目的為界定新穎策略來治療在CD19導向療法之後具有復發性抗原缺失之患者。CD123高度表現於大部分B-ALL中，且特定 言之，CD123仍表現於彼等復發性CD19陰性疾病中。展現CD19-CD123+群體中存在純系白血病細胞指示靶向CD123以及CART19可增加根除次純系之可能性，次純系可能由於CART19壓力之選擇性優點而增殖。CD123先前已驗證為AML中白血病幹細胞之標記。此處，展示待表現於ALL中免疫表型界定之白血病幹細胞(LSC)中之CD123提高CD123靶向LSC的可能性，可促進ALL根除。
為研究CART 123在抗原缺失復發中之作用，自來源於參與賓夕法尼亞大學/費城兒童醫院之CTL019試驗之一的B-ALL患者(CHP101)之初級母細胞產生CD19陰性復發之新穎異種移植模型。此患者在基線具有經典CD19+CD123+表型，但隨後在用CART19治療CD19-CD123+疾病之後復發。使用此模型，展現CART123可根除復發性疾病，且與CART19組合可預防抗原缺失復發。此為臨床上相關之患者導出模型中雙CART組合之第一個示範。另外，經由使用活體內成像，展示CART細胞在靜脈內注射之後在少於24小時內進入骨髓，搜尋其標靶且減速，以便與攜有同源抗原之細胞相互作用。此外，展示雙信號傳導CART123/19比單獨CART或合併之兩個CAR更有效，與先前公佈之結果一致。
先前展示抗CD123嵌合抗原受體治療急性骨髓白血病之臨床前功效。CART123由於識別造血幹細胞及祖細胞上之CD123而造成造血毒性，潛在重度攻擊臨床轉譯，因為深刻的幹細胞毒性可能導致永久清髓(myeloablation)。假設為使造血毒性降至最低，僅在共接合CD19與CD123之後活化T細胞之新穎構築體可同時除去此造血毒性。此處，已發現接收來自CD19識別之活化信號及來自CD123識別之刺激信號之CART細胞可殺死B-ALL細胞以及避免吾等先前所描述之深刻的造血毒性。儘管先前使用CD19/PSMA識別之人工系統公佈此概念，此臨床相關構築體表示該領域中之重大進步，具有相對清晰路徑用以臨 床轉譯。值得注意地，儘管此類雙CAR設計將可能與降低之毒性相關聯，其可能藉由使CAR識別之限制性更大而非更小而留下未解決之抗原缺失復發問題。然而，若靶向CD123成功根除ALL幹細胞，則此方法可為安全且有效的。
概言之，此處展現一種藉由靶向CD123治療B-ALL之新穎且有效策略。此方法尤其有吸引力，因為CD123表現於一些患有B-ALL之患者中罕見CD19陰性惡性細胞中，且保留於在CD19導向免疫療法之後發生的抗原缺失復發中。此外，CART19與CART123之組合可預防CD19陰性復發發生。
實例18：在細胞培養模型中低劑量RAD001刺激CART增殖
藉由將表現CART之細胞與靶細胞在不同濃度之RAD001存在下共培養來評估低劑量RAD001對活體外CAR T細胞增殖之作用。
材料及方法 產生CAR轉導之T細胞
人類化抗人類CD19 CAR(huCART19)慢病毒轉移載體用於產生封裝至VSVg假型慢病毒粒子中之基因組材料。人類化抗人類CD19 CAR(huCART19)之胺基酸及核苷酸序列為2014年3月15日申請之PCT公開案WO2014/153270中所述之CAR 1，ID 104875，且其中命名為SEQ ID NO.85及31。
將慢病毒轉移載體DNA與三種封裝組分VSVg env、gag/pol及rev以及脂染胺試劑混合以轉染Lenti-X 293T細胞。在此後24小時及30小時之後改變培養基，收集含病毒之培養基，過濾且儲存在-80℃下。藉由將藉由健康供體血液或leukopak之陰性磁性選擇所獲得的新鮮或冷凍原始T細胞轉導來產生CART。藉由與抗CD3/抗CD28珠粒一起培育24h來活化T細胞，其後將病毒上清液或濃病毒(分別MOI=2或10)添加至培養物中。使經修飾之T細胞擴展約10天。藉由在第7天與第9天 之間進行流動細胞學分析，來測定轉導細胞百分比(在細胞表面上表現CAR)及CAR表現量(相對螢光強度，幾何平均值)。生長速率減緩與T細胞尺寸接近約350fL之組合確定待冷凍保存之T細胞的狀態供隨後分析。
評估CART之增殖
為評估CART之功能性，將T細胞解凍且計數，且藉由Cellometer評估存活力。使用未經轉導之T細胞(UTD)歸一化各培養物中CAR陽性細胞之數目。以50nM開始，用RAD001滴定，來測試RAD001對CART之影響。用於所有共培養實驗中之靶細胞株為NALM6(Nalm-6)，其為表現CD19且經轉導以表現螢光素酶之人類前B細胞急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞株。
為量測CART之增殖，將T細胞與標靶細胞以1：1之比率一起培養。分析操作4天，此時針對CD3、CD4、CD8及CAR表現將細胞染色。藉由流動式細胞測量術使用計數珠粒作為參考來評估T細胞數目。
結果
在4天共培養分析中測試CART細胞之增殖能力。在CAR轉導及未經轉導之T細胞與NALM6(Nalm-6)一起培養之後，評估CAR陽性CD3陽性T細胞(深色條)及總CD3陽性T細胞(淺色條)之數目(圖59)。當在少於0.016nM RAD001存在下培養時huCART19細胞擴增，且在更高濃度該化合物下程度更小。重要地，0.0032及0.016nM RAD001下，增殖均高於在不添加RAD001下所觀測到之增殖。未經轉導之T細胞(UTD)未展示可偵測擴增。
實例19：在活體內低劑量RAD001刺激CART擴增
此實例評估huCAR19細胞在活體內在不同濃度RAD001下增殖之能力。
材料及方法：
NALM6-luc細胞：NALM6人類急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞株由患有復發性ALL之患者之周邊血液產生。隨後將細胞用螢火蟲螢光素酶標記。此等懸浮細胞在補充有10%熱不活化胎牛血清之RPMI中生長。
小鼠：6週齡NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠自Jackson Laboratory(庫存編號005557)收到。
腫瘤植入：NALM6-luc細胞在補充有10%熱不活化胎牛血清之RPMI中在活體外生長及擴增。隨後將細胞轉移至15ml錐形管且用冷的無菌PBS洗滌兩次。接著對NALM6-luc細胞計數且以每毫升PBS 10×106 個細胞之濃度再懸浮。將細胞置於冰上且立刻(一小時內)植入小鼠中。NALM6-luc細胞以100μl體積經由尾靜脈經靜脈內注射，每一小鼠總計1×106 個細胞。
CAR T細胞投加：在腫瘤植入之後7天投與小鼠5×106 個CAR T細胞。細胞在37℃水浴中部分解凍，且隨後藉由向含有細胞之試管中添加1ml冷無菌PBS完全解凍。將解凍之細胞轉移至15ml離心管中且用PBS調整至10ml之最終體積。在1000rpm下洗滌細胞兩次，每次10分鐘，接著在血球計上計數。隨後將T細胞以每毫升冷PBS 50×106 個CAR T細胞之濃度再懸浮，且保持於冰上直至給與小鼠。小鼠經由尾靜脈經靜脈內注射100μl CAR T細胞，每一小鼠劑量為5×106 個CAR T細胞。將每一組八隻小鼠用100μl單獨PBS(PBS)或人類化CD19 CAR T細胞處理。
RAD001給與：調配等於1mg RAD001之50mg濃微乳劑，且隨後在給與時再懸浮於D5W(5%右旋糖水溶液)中。小鼠每日經口投加(經由經口管飼)200μl所需劑量的RAD001。
PK分析：小鼠在腫瘤植入後第7天開始每日投加RAD001。劑量 組如下：0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg及10mg/kg。在第0天及第14天，第一劑及最後一劑RAD001後的以下時間點，對小鼠抽血以供PK分析：15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時及24小時。
結果：
在患有NALM6-luc腫瘤之NSG小鼠中測試RAD001之擴增及藥物動力學。單獨RAD001之每日口服投加未影響NALM6-luc腫瘤之生長(圖60)。RAD001之藥物動力學分析展示其在腫瘤負載小鼠之血液中相當穩定(圖61A及61B)。第0天與第14天PK分析均展示血液中之RAD001濃度超過10nm，即使在最低測藥劑量(0.3mg/kg)下在給藥之後24小時。
基於此等劑量，在有及無RAD001下給與huCAR19 CAR T細胞，以確定此等細胞之增殖能力。基於給與24小時後血液中RAD001之含量，所用最高劑量為3mg/kg。在最後一劑RAD001 24小時之後RAD001濃度超過10nM時，若干較低劑量之RAD001用於CAR T細胞之活體內研究。在開始每日經口投加RAD001前一天，IV給與CAR T細胞。經由FACS監測小鼠之T細胞擴增。
最低劑量之RAD001展示CAR T細胞之增殖增強(圖62A及62B)。此增強之增殖在CD4+ CAR T細胞下比CD8+ CAR T細胞更明顯且更長久。然而，在CD8+ CAR T細胞下，在CAR T細胞劑量後早期時間點可見增強之增殖。
實例20：某些患有原發性DLBCL之患者顯示CD3+/PD1+雙陽性癌細胞
儘管最近已在癌症免疫療法空間中存在呈嵌合抗原受體(CAR)修飾T細胞及檢查點抑制劑形式之引人注目的發展，探究其組合之治療機制之先進工具並非廣泛可用的。為了滿足此生長需要，開發使用多 重AQUA(自動化定量分析)技術之穩固定量螢光免疫組織化學平台以經由新穎共定位算法評估檢查點抑制劑表現、列舉CAR T細胞及測定腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用。此方法之效用表徵於臨床前及臨床模型系統兩者中。在B細胞淋巴瘤之免疫缺陷小鼠模型中，評估主要淋巴器官症狀CAR T細胞向惡性B細胞之歸巢。測定經由CD4、CD8、PD1及FOXP3表現之多重分析之CAR T細胞之表現型及功能狀態。另外，為了實現彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)情形下之組合免疫治療，經由來自DLBCL患者(n=63)之一級及二級生檢兩者中之細胞質及細胞核染色產生之地標檢查呈免疫及腫瘤細胞隔室中之PD1及PD-L1表現形式之自適應免疫抗性機制之流行率。為了支持用於CAR T試驗之患者選擇，不可藉由傳統方法可再現地評分之相關腫瘤抗原之表現及流行率經定量以產生目標切割點。用於患者之最優選擇之此等定量多重IHC方法可用於即將進行的新穎組合免疫療法試驗中。
對原發性DLBCL(n=49)及繼發性DLBCL(15)人類患者進行DLBCL組織樣品之樣品製備、成像及成像分析。
樣品製備 .福馬林固定石蠟嵌入(FFPE)組織樣品經脫蠟。載玻片接著在蒸餾水中之培育之前經由一系列二甲苯：醇洗滌復水。接著使用高壓及高溫條件進行熱誘導抗原修復，使其冷卻，且轉移至Tris緩衝生理鹽水。接著進行染色，其中進行以下步驟。首先，阻斷內源性過氧化酶，接著與蛋白質阻斷溶液一起培育以減少非特異性抗體染色。隨後，載玻片藉由小鼠抗PD1一級抗體染色。接著洗滌載玻片，隨後與抗小鼠HRP二級抗體一起培育。洗滌載玻片，接著使用TSA+ Cy® 5(Perkin Elmer)偵測PD-1染色。一級及二級抗體試劑接著經由微波移除。再次洗滌載玻片，隨後藉由家兔抗CD3一級抗體染色。洗滌載玻片，接著與抗家兔HRP二級抗體加上4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)之混合液一起培育。洗滌載玻片，接著使用TSA-Cy® 3(Perkin Elmer)偵測CD3染色。最後一次洗滌載玻片，隨後藉由安裝介質將其封蓋且使其在室溫下乾燥隔夜。
樣品成像及分析。 接著使用Vectra 2 Intelligent Slide分析系統，使用Vectra軟體版本2.0.8(Perkin Elmer)獲得螢光影像。首先，進行使用DAPI在4×放大率下之載玻片之單色成像。自動化算法(使用inForm開發)用於鑑別含有組織之載玻片區域。
鑑別為含有組織之載玻片區域關於與DAPI(藍色)、Cy®3(綠色)及Cy® 5(紅色)相關之通道在4×放大率下成像以產生RGB影像。此等4×放大率影像在視野選擇器中使用自動化富集算法(使用inForm開發)處理且根據最高Cy® 3表現鑑別及排序可能的20×放大率視野。
頂部40個視野跨越DAPI、Cy®3及Cy® 5波長在20×放大率下成像。審查原始影像之可接受性，且在分析之前丟棄離焦、缺乏任何腫瘤細胞、高度壞死或含有高含量與預期抗體定位(亦即背景染色)不相關之螢光信號之影像。可接受的影像使用AQUAduct(Perkin Elmer)處理，其中各螢光團藉由頻譜非混機光譜非混至個別通道中且保存為分離檔案。
處理之檔案使用AQUAnalysisTM 或經由使用AQUAserveTM 之全自動化方法進一步分析。各DAPI影像藉由細胞遮蔽器處理以鑑別該影像內之所有細胞核，接著擴張2個像素以表示整個細胞之大致尺寸。此所得遮罩表示影像內之所有細胞。各Cy® 5影像藉由生物標記遮蔽器處理以產生PD-1陽性之所有細胞之二元遮罩。各Cy® 3影像藉由生物標記遮蔽器處理以產生CD3陽性之所有細胞之二元遮罩。所有PD-1陽性及CD3陽性細胞之二元遮罩經組合以產生對於PD-1及CD3呈雙陽性之所有細胞之二元遮罩。所有表現PD-1之CD3細胞之百分比生物標記物陽性(PBP)使用陽性計算器，藉由分割總區域衍生，以像素量測且藉由總區域內之所有PD-1陽性腫瘤細胞之遮罩之區域評估器測定， 以像素量測且藉由所有CD3陽性細胞之遮罩之區域評估器測定。原發性及繼發性DLBCL人類樣品中之所有表現PD-1之CD3陽性細胞之代表性PBP值顯示於圖63 中。CD3及PD-1狀態顯示原發性DLBCL情形下之CD3+/PD-1+細胞之患病率高於繼發性DLBCL情形，提供選擇用於單一或組合處理之患者之機會。
進行類似實驗，其中PD-L1在來自原發性DLBCL人類患者之DLBCL組織樣品上使用家兔抗PDL1一級抗體及TSA+Cy5(Perkin Elmer)偵測。亦在相同樣品上偵測PD1及CD3。實驗顯示腫瘤微環境包含表現PD1、CD3及PDL1之細胞。實驗亦鑑別為CD3+PD1+之細胞亞群(資料未示出)。此等結果支持腫瘤微環境促進可藉由對PD1+或PD-L1+細胞具特異性之藥劑靶向之免疫抑制細胞之模型。
實例21：包含DLBCL細胞之樣品中之CD19及PD-L1之相互排他性表現
樣品製備 .福馬林固定石蠟嵌入(FFPE)組織樣品經脫蠟。載玻片接著在蒸餾水中之培育之前經由一系列二甲苯：醇洗滌復水。接著使用高壓及高溫條件進行熱誘導抗原修復，使其冷卻，且轉移至Tris緩衝生理鹽水。接著進行染色，其中進行以下步驟。首先，阻斷內源性過氧化酶，接著與蛋白質阻斷溶液一起培育以減少非特異性抗體染色。隨後，載玻片藉由家兔抗PDL1一級抗體染色。接著洗滌載玻片，隨後與抗家兔HRP二級抗體一起培育。洗滌載玻片，接著使用TSA+ Cy® 3(Perkin Elmer)偵測PDL1染色。一級及二級抗體試劑接著經由微波移除。再次洗滌載玻片，隨後藉由小鼠抗CD19一級抗體染色。洗滌載玻片，接著與抗小鼠HRP二級抗體加上4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)之混合液一起培育。洗滌載玻片，接著使用TSA-Cy® 5(Perkin Elmer)偵測CD19染色。最後一次洗滌載玻片，隨後藉由安裝介質將其封蓋且使其在室溫下乾燥隔夜。
樣品成像及分析。 接著使用Vectra 2 Intelligent Slide分析系統，使用Vectra軟體版本2.0.8(Perkin Elmer)獲得螢光影像。首先，進行使用DAPI在4×放大率下之載玻片之單色成像。自動化算法(使用inForm開發)用於鑑別含有組織之載玻片區域。
鑑別為含有組織之載玻片區域關於與DAPI(藍色)、Cy®3(綠色)及Cy® 5(紅色)相關之通道在4×放大率下成像以產生RGB影像。此等4×放大率影像在視野選擇器中使用自動化富集算法(使用inForm開發)處理且根據最高Cy® 3表現鑑別及排序可能的20×放大率視野。
頂部40個視野跨越DAPI、Cy®3及Cy® 5波長在20×放大率下成像。審查原始影像之可接受性，且在分析之前丟棄離焦、缺乏任何腫瘤細胞、高度壞死或含有高含量與預期抗體定位(亦即背景染色)不相關之螢光信號之影像。可接受的影像使用AQUAduct(Perkin Elmer)處理，其中各螢光團藉由頻譜非混機光譜非混至個別通道中且保存為分離檔案。
處理之檔案使用AQUAnalysisTM 或經由使用AQUAserveTM 之全自動化方法(如前述實例中所述)進一步分析。
原發性及繼發性DLBCL人類樣品中之所有CD19陽性及PD-L1陽性細胞之代表性PBP值顯示於圖64 中。CD19及PDL1表現在DLBCL樣品中變化。CD19及PDL1表現傾向於相互排他性的，即一般而言，給定細胞表現CD19或PD-L1但並非兩者。儘管不希望受理論束縛，此可由於CD19表現於DLBCL腫瘤細胞中，而PD-L1表現於非腫瘤細胞，例如支持腫瘤微環境之細胞中。此觀測結果表明CD19抑制劑(例如CD19 CAR表現細胞)及PD-L1信號傳導抑制劑之組合療法可適用於靶向此兩種細胞群體。
進行類似實驗以例如展示AQUA分析監測CART19功效之能力。此研究監測包含具有CART19+ Jurkat細胞及CD19+ REH細胞之混合細 胞株之樣品中之CD19、CD3及CART19核酸。藉由抗體偵測CD19及CD3蛋白質，且使用針對CAR核酸之3'UTR之RNA探針偵測CART19。實驗顯示細胞株樣品包含表現CD19、CD3及CART19之細胞(資料未示出)。實驗亦顯示細胞株樣品包含為CD3+/CART19+之細胞亞群(資料未示出)。進行接近性分析，其顯示CART19細胞於CD19+細胞物理上接近(資料未示出)。此等實驗支持CD3+ CART19細胞浸潤包含CD19+細胞之腫瘤微環境且CD19及CART19細胞之物理位置轉變為CART19療法之功效的模型。
實例22：CAR之雙順反子表現
在此實例中，比較兩種類型之細胞群體之功效。在稱為「合併」之第一細胞群體中，各細胞表現一個CAR。第一複數個細胞經CD19 CAR轉導，第二複數個細胞經CD22 CAR或CD123 CAR轉導，且接著合併兩個複數個細胞。在第二類型之細胞群體中，複數個細胞經表現CD19 CAR及第二CAR之雙順反子載體轉導，以使得大部分或所有細胞表現兩種構築體。第二CAR在一些實驗中為CD22 CAR且在其他實驗中為CD123 CAR。此等細胞群體說明於圖65中。
使用P2A系統產生圖解於圖66中之兩種新穎構築體以使用單一雙順反子慢病毒載體表現相同T細胞中之兩個全長CAR。T細胞根據標準方案擴增且使用攜有CAR19及CAR123兩者之單一慢病毒轉導(感染倍率MOI=3)。對於使用描述之雙順反子慢病毒載體獲得之相同T細胞群體中之CAR19及CAR22進行類似轉導。圖67顯示CD19及CD22 CAR之共表現。可鑑別基於CAR19及/或CAR123之特定表現之相異群體，包括雙重CAR19+/CAR123+群體及雙陰性群體(圖68，上圖)。
藉由雙順反子CD19 CAR及CD123 CAR轉導之細胞相比於表現CD19或CD123 CAR之合併細胞(圖68，底圖)。向NSG小鼠移植B-ALL細胞株(NALM-6，CBG+)。在第7天，小鼠基於腫瘤負荷(BLI，生物 發光)隨機化以接受對照T細胞(UTD)、CART19、CART123、CART123及CART19之1：1合併組合或雙重CART19/123(相同CAR+細胞總數)。單獨的CD19 CAR表現細胞(方形)及單獨的CD123 CAR表現細胞(三角形)均顯示相比於對照物(圓形)之初始有效性，接著白血病細胞含量上升。表現CD19或CD123之合併細胞(菱形)亦顯示初始有效性，接著白血病細胞含量上升。相比之下，經雙順反子載體轉染之細胞(倒三角形，「雙重CART」)維持治療後至少60天之延長反應。此實驗指示雙重CART發揮不僅優於單一CART治療且優於合併CART細胞之強力抗白血病效應。
實例23：CART22針對動物模型中之CD19陰性B-ALL有效。
在動物模型中測試CD19陰性B-ALL細胞對CD19 CAR表現細胞及CD22 CAR表現細胞之反應性。一百萬個CD19陰性B-ALL細胞在第0天輸注至小鼠中，且2e6個CAR+ T細胞在第7天(在隨機化之後)輸注。藉由生物發光量測腫瘤負荷。如圖69中所示，儘管癌症在陰性對照小鼠及CART19治療小鼠中進展，CART22能夠清除NSG異種移植物中之CD19陰性ALL。
分析進行如下：1e6個CD19陰性ALL細胞(CBG+)注射於NSG小鼠中。在第5天，小鼠經隨機化以接受2e6個對照未轉導之T細胞(UTD)、CART19或CART22(m971 scFv)。小鼠接著關於腫瘤負荷(生物發光)隨訪。
實例24：低含量之免疫檢查點分子與改良之結果相關
免疫檢查點分子(PD-L1、PD1、LAG3及TIM3)藉由免疫組織化學偵測於來自淋巴瘤患者之樣品中。亦進行陽性及陰性對照組織及細胞株。使用定量影像分析在可包括腫瘤細胞及非腫瘤細胞(如免疫細胞)之所關注區域上進行免疫檢查點表現分析。樣品獲自組織、淋巴結或骨髓。
在完全反應者(CR)及在用CD19靶向CAR療法治療之後患有進展性疾病(PD)之患者中比較免疫檢查點蛋白質表現。如圖70中所示，CR患者傾向於在治療之前及之後具有低含量之PD-L1、PD1、LAG3及TIM3，而PD患者傾向於在治療之前及之後具有高含量之此等分子。此實例支持藉由CAR表現細胞及免疫檢查點抑制劑之組合療法，且支持測試以測定接受CAR療法之患者中之免疫檢查點分子含量。
實例25：CD22 CAR表現細胞之功能分析
若干CD22 CAR構築體在NFAT分析中經功能證實。簡言之，實驗進行如下。攜有編碼具有CD22結合scFv域之CD22 CAR之核酸的慢病毒載體(pELPS)藉由電穿孔在NFAT反應元件之控制下引入至經修飾以表現螢光素酶之Jurkat T細胞株(JNL)中。培養細胞且使其表現CAR構築體。電穿孔細胞塗覆於塗佈有靶抗原(CD22)之板。塗佈板中之螢光素酶信號之偵測指示CD22 CAR與其抗原之結合活性，導致T細胞之活化及螢光素酶之表現。
圖71為顯示存在及不存在m971 scFv競爭者之情況下之若干CD22 CAR構築體之活化(以RLU計)之圖示。此等結果指示CD22-53及CD22-12及其他scFv之子組近似地結合抗原以及m971陽性對照。結果亦指示不同scFv在不同程度上與m971競爭。
測試十六個額外人類CD22結合域且發現具有弱結合活性(資料未示出)，因此未進一步實行。
圖72為顯示若干CD22 CAR表現JNL細胞，包括CD22-57、CD22-58、CD22-59、CD22-60、CD22-61、CD22-62及CD22-63之活化(以RLU計)之圖示，本文提供其scFv序列。三種不同標靶蛋白質(CD22-FL-Fc、CD22-D567-Fc及CD22-D67)用於塗佈組織培養板；亦包括陰性對照(Fc)。間皮素結合CAR(Meso-G07)用作陰性對照。CD22-12及CD22-53用作陽性對照。實驗指示所有CAR(CD22-57、CD22-58、 CD22-59、CD22-60、CD22-61、CD22-62及CD22-63)在此分析中為功能性的。此外，此等結果指示測試之CAR(包括CD22-12及-53)結合至CD22之域6及7。在CD22結合域上進行域作圖。使用三種不同形式之抗原：具有所有7個外域之CD22全長、域567(其中域1-4缺失)及域67(其中域1-5缺失)。儘管不希望受理論束縛，看起來各種CD22純系之結合映射圖75中所說明之抗原決定基。
亦測試CD22 CAR構築體促進IFN-γ及IL-2分泌之能力。簡言之，表現不同CD22 CAR之來自健康供體之轉導初生T細胞於CD22陽性靶細胞Raji-Luc及Daudi-Luc以及陰性對照K562-Luc共培養。T細胞及靶細胞以10：1之效應細胞：靶細胞比率(E：T)培養。在20h共培養之後收穫上清液。圖73顯示指示IFN-γ產生(以pg/mL計)之三個條形圖。與Raji-Luc(頂圖)及Daudi-luc(中圖)細胞株共培養誘發藉由hCD22-12、hCD22-53 CAR T細胞以及兩種陽性對照CAR19及m971-HL之IFN-γ分泌。值得注意的是，當測試hCD22-53細胞時觀測到最高量，且在測試hCD22-12細胞時程度較小。在測試Nalm6-Luc、Pfeiffer-Luc及K562-CD22-Luc及SEM-Luc細胞時觀測到類似結果(資料未示出)。當測試K562-Luc陰性對照細胞株時觀測到最小IFN-γ分泌(底圖)。
CD22-12顯示與細胞殺死及細胞因子分泌分析中之m971可比的活性(實例9)。藉由hCD22-12之親和力成熟製造兩個scFv，稱為CD22-64及CD22-65。在如上文所述之NFAT分析中測試含有此等scFv之CAR構築體之活性。如圖74中所示，CD22-64及CD22-65均與CD22-12及CD22-53同樣好或比其更好地結合CD22，導致JNL活化。圖中之條從左到右表示CD22全長-Fc；CD22 D567-Fc；及僅Fc之陰性對照，其用於塗佈該等板。測試CD22-12之四種變異體表明LCDR3及HCDR3在一定程度上促進結合(資料未示出)，且HCDR3可比LCDR3耐受更多突變。
等效物
本文所引用之每一專利、專利申請案及公開案之揭示內容皆以全文引用的方式併入本文中。雖然已參考特定態樣揭示本發明，但顯而易見熟習此項技術者可在不脫離本發明之真實精神及範疇的情況下設計本發明之其他態樣及變化。隨附申請專利範圍意欲理解為包括所有此類態樣及同等變化。
<110> 瑞士商諾華公司賓夕法尼亞大學董事會
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<210> 91
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 91
<210> 92
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 92
<210> 93
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 93
<210> 94
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 94
<210> 95
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 95
<210> 96
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 102
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(400)
<223> 此序列可包含100-400個核苷酸
<220>
<223> 關於取代及較佳實施例之詳細描述，參見提交之說明書
<400> 104
<210> 105
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> 此序列可包含1-10個'Gly-Gly-Gly-Gly-Ser'重複單元
<220>
<223> 關於取代及較佳實施例之詳細描述，參見提交之說明書
<400> 105
<210> 106
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 106
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 109
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 111
<210> 112
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<210> 113
<211> 819
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 113
<210> 114
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 114
<210> 115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 115
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 116
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 117
<210> 118
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2000)
<223> 此序列可包含50-2000個核苷酸
<220>
<223> 關於取代及較佳實施例之詳細描述，參見提交之說明書
<400> 118
<210> 119
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 119
<210> 120
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 120
<210> 121
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 121
<210> 122
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 122
<210> 123
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 123
<210> 124
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 124
<210> 125
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 125
<210> 126
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 126
<210> 127
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 127
<210> 128
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<210> 129
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 129
<210> 130
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 130
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<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
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<210> 132
<211> 251
<212> PRT
<213> 智人
<400> 132
<210> 133
<211> 247
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
<210> 134
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 134
<210> 135
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
<210> 136
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
<210> 137
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
<210> 138
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
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<211> 253
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
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<211> 253
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
<210> 141
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何胺基酸
<400> 141
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 142
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 143
<210> 144
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 144
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<400> 145
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 146
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 147
<210> 148
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 148
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 149
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 150
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 151
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 152
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<400> 153
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 154
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 155
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 156
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 157
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 158
<210> 159
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 159
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 160
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 161
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 162
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 163
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 164
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 165
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 166
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 167
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 168
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<400> 169
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 170
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 171
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 172
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 173
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 174
<210> 175
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 175
<210> 176
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 176
<210> 177
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 177
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 178
<210> 179
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 179
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 180
<210> 181
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 181
<210> 182
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 182
<210> 183
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 183
<210> 184
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 184
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 185
<210> 186
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 186
<210> 187
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 187
<210> 188
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 188
<210> 189
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 189
<210> 190
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 190
<210> 191
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 191
<210> 192
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 192
<210> 193
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 193
<210> 194
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<400> 194
<210> 195
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 195
<210> 196
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 196
<210> 197
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 197
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 198
<210> 199
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 199
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<211> 9211
<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 1304
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<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 1305
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 1306
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 1307
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<211> 1542
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 1309
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 1310
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<223> 人工序列之描述：合成肽
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<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
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<221> modified_base
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<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
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<223> 人工序列之描述：合成肽
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<223> 人工序列之描述：合成肽
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
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<222> (1)..(3)
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 智人
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<211> 4027
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1333

Claims (53)

  1. 一種細胞，其表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR，用於治療患有與CD19表現相關之疾病之個體，且其中該個體已接受、正接受或將接受一或多種B細胞抑制劑，其中該B細胞抑制劑包含CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑。
  2. 一種治療患有與CD19表現相關之疾病之個體之方法，其包含向該個體投與有效數目的一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞，以及一或多種B細胞抑制劑，其中該B細胞抑制劑包含CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑。
  3. 一種B細胞抑制劑，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑，其用於治療為或鑑別為對於CD19抑制劑，例如CD19 CAR療法之無反應者、部分反應者或復發者之個體。
  4. 一種治療為或鑑別為對於CD19抑制劑，例如CD19 CAR療法之無反應者、部分反應者或復發者之患者之方法，其包含向該個體投與B細胞抑制劑，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑。
  5. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之抑制劑。
  6. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含有效數目的一或多種表現結合CD10、CD20、CD22、 CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之CAR分子之細胞。
  7. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中表現結合CD19之CAR分子之該一或多種細胞與該一或多種B細胞抑制劑同時、在其之前或在其之後投與。
  8. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該個體在藉由該一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞治療後已復發或鑑別為已復發。
  9. 如請求項11之所用組合物或方法，其中基於完全反應之後的血液、骨髓(>5%)或任何髓外位點中母細胞之再現中的一或多者，該個體已復發或鑑別為已復發；或其中基於偵測到超過預定臨限值，例如超出1%、2%、3%、4%、5%或10%之CD19-母細胞，該個體已復發或鑑別為已復發；或其中基於MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C或HLA-DQB1中的一或多者之RNA含量之增加，該個體已復發或鑑別為已復發；或其中基於PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1及EIF1AY中的一或多者之RNA含量之減少，該個體已復發或鑑別為已復發。
  10. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其進一步包含對該個體進行淋巴細胞耗盡，例如在投與該一或多種表現結合CD19之CAR分子之細胞之前，其中視情況，該淋巴細胞耗盡包含投與美法侖(melphalan)、環磷氮芥、環磷醯胺及氟達拉賓(fludarabine)中的一或多者。
  11. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含有效數目的一或多種表現以下之細胞：結合CD10之CAR分子，例如如本文所述；結合CD20之CAR分子，例如如本文所述；結合CD22之CAR分子，例如如本文所述；結合CD34之CAR分子，例如如本文所述；結合CD123之CAR分子，例如如本文所述；結合FLT-3之CAR分子，例如如本文所述；或結合ROR1之CAR分子，例如如本文所述。
  12. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該CD19 CAR包含抗體或抗體片段，其包括CD19結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域，且其中該CD19結合域包含表2或3 中所列之任何CD19 scFv或輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者(例如所有三者)，及表2或3 中所列之任何CD19 scFv或重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者(例如所有三者)。
  13. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中CD19 CAR包含表2或3 中所列之scFv之任何輕鏈可變區及表2或3 所列之scFv之任何重鏈可變區。
  14. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該CD19 CAR包含CD19結合域，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12，或與其具有95%-99%一致性之序列，或SEQ ID NO：58之多肽。
  15. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制 劑包含CD20 CAR，其包含包括CD20結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域的抗體或抗體片段，且其中該CD20結合域包含表13 中所列之任何CD20輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表12A或12B 中所列之任何CD20重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
  16. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含CD22 CAR，其包含包括CD22結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域之抗體或抗體片段，且其中該CD22結合域包含表8A或8B 中所列之任何CD22輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表7A 、7B或7C 中所列之任何CD22重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
  17. 如請求項16之所用組合物或方法，其中該CD22 CAR包含表10A或10B 中所列之任何輕鏈可變區、表9A或9B 中所列之任何重鏈可變區，或表10A或10B 中所列之任何輕鏈可變區及表9A或9B 所列之任何重鏈可變區。
  18. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含CD123 CAR，其包含包括CD123結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域的抗體或抗體片段，且其中該CD123結合域包含表18 中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補 決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表17 中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
  19. 如請求項18之所用組合物或方法，其中該CD123 CAR包含表16 中所列之任何輕鏈可變區、表16 中所列之任何重鏈可變區，或表16 中所列之任何輕鏈可變區及表16 所列之任何重鏈可變區。
  20. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含CD123 CAR，其包含包括CD123結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域的抗體或抗體片段，且其中該CD123結合域包含表27 中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表26 中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
  21. 如請求項20之所用組合物或方法，其中該CD123 CAR包含表25 中所列之任何輕鏈可變區、表25 中所列之任何重鏈可變區，或表25 中所列之任何輕鏈可變區及表25 所列之任何重鏈可變區。
  22. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含CAR，其包含包括抗原結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域的抗體或抗體片段，且其中該抗原結合域包含輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者(例如全部)，及重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者(例如全部)。
  23. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含含scFv之CAR。
  24. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該B細胞抑制劑包含含跨膜域之CAR，該跨膜域包含選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。
  25. 如請求項22之所用組合物或方法，其中該抗原結合域藉由鉸鏈區連接至該跨膜域，其中視情況，該鉸鏈區包含SEQ ID NO：14，或與其具有95%-99%一致性之序列。
  26. 如請求項22之所用組合物或方法，其中該共刺激域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，其中視情況，該共刺激域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列。
  27. 如請求項22之所用組合物或方法，其中該胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域；或其中該胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：16之序列及/或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列。
  28. 如請求項22之所用組合物或方法，其中該CAR進一步包含前導序列，其中視情況，該前導序列包含SEQ ID NO：13。
  29. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該等細胞包含T細胞或NK細胞。
  30. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該與CD19表現相關之疾病選自增生性疾病，如癌症、腫瘤或惡性腫瘤或癌變前病況，如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前 驅症，或為與CD19表現相關之非癌症相關適應症，或其中該疾病為以下中的一或多者：血液癌、急性白血病、B細胞急性淋巴白血病(BALL)、T細胞急性淋巴白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴白血病(ALL)；慢性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤或骨髓瘤；或其中該疾病為CD19陰性癌症，例如CD19陰性復發癌症。
  31. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其進一步包含投與：增加表現CAR分子之細胞之功效的藥劑，或改善與投與表現CAR分子之細胞相關之一或多種副作用之藥劑，或治療與CD19相關之疾病之藥劑；或檢查點抑制劑。
  32. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該個體在CART療法起始之前接受藉由藥劑，例如檢查點抑制劑之預治療、同時發生的治療或CART療法後治療。
  33. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該患者包含CD19陰性癌細胞，及對於CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者呈陽性之癌細胞。
  34. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其進一步包含向該患者投與癌細胞呈陽性之CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之抑制劑。
  35. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其進一步包含確 定該患者是否包含CD19陰性癌細胞或該患者是否包含對於CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者呈陽性之癌細胞之步驟。
  36. 一種組合物，其包含分開或混合的以下各者：(i)表現結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之一或多種細胞，及(ii)一或多種B細胞抑制劑，其選自CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3或ROR1中的一或多者之抑制劑。
  37. 一種組合物，其包含：(i)第一核酸，其編碼結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR，及(ii)第二核酸，其編碼結合選自CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之B細胞抗原之CAR分子，其中該第一核酸及第二核酸在同一或獨立核酸分子中。
  38. 一種組合物，其包含一或多種免疫效應細胞及：(i)編碼結合CD19之CAR分子，例如本文所述之結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之第一核酸，或包含該CAR分子之第一多肽，及(ii)編碼結合選自CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中的一或多者之B細胞抗原之CAR分子的第二核酸，或包含該CAR分子之第二多肽。
  39. 如請求項38之組合物，其中：該第一核酸或第一多肽及該第二核酸或第二多肽各自包含於第一免疫效應細胞內，例如由其表現；該組合物包含含有，例如表現該第一核酸或第一多肽之第一 免疫效應細胞及含有，例如表現該第二核酸或第二多肽之第二免疫效應細胞；或該組合物不包含含有，例如表現該第一核酸或第一多肽及該第二核酸或第二多肽兩者之細胞。
  40. 一種細胞，其包含如請求項37之核酸組合物，其中該細胞視情況為人類T細胞、CD8+ T細胞或NK細胞。
  41. 如請求項40之細胞，其進一步表現包含第一多肽之抑制分子，該第一多肽包含抑制分子的至少一部分，與包含來自胞內信號傳導域之正信號之第二多肽相關，其中視情況，該抑制分子包含含PD1的至少一部分之第一多肽及含共刺激域及主要信號傳導域之第二多肽。
  42. 一種製造細胞之方法，其包含將如請求項37之核酸組合物引入至T細胞或NK細胞中，例如藉由如請求項94至100中任一項之載體轉導T細胞或NK細胞，其中該方法視情況包含：分析指示用該細胞治療之個體是否可能復發或已復發之基因標籤；在輸注至該個體中之前分析該細胞中之該基因標籤；或減少包含經轉導細胞之細胞群體之TREG 標籤，其中減少該TREG 標籤視情況包含對該細胞群體進行CD25耗盡。
  43. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其中該CD19抑制劑包含CD19 CAR且該B細胞抑制劑包含CD123 CAR，其中視情況，該CD19 CAR或CD123 CAR包含分離胞內信號傳導域，使得相比於該CD19 CAR及CD123 CAR結合至表現CD19或CD123中的一者之靶細胞(例如造血幹細胞)時之活化，該細胞，例如該免疫效應細胞群體之完全活化在該CD19 CAR及CD123 CAR均結合至靶細胞，例如CD19+CD123+靶細胞(例如B-ALL母細胞)時發生。
  44. 如前述請求項中任一項之所用組合物或方法，其進一步包含將細胞，例如造血幹細胞或骨髓移植至該哺乳動物中。
  45. 一種治療患有DLBCL，例如原發性DLBCL之個體之方法，其包含向該個體投與有效數目的一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞，以及PD1抑制劑，其中視情況，該個體具有或鑑別為具有至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%為CD3+/PD1+之DLBCL細胞。
  46. 一種治療患有DLBCL，例如原發性DLBCL之個體之方法，其包含向該個體投與有效數目的一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞，其中視情況，該個體具有或鑑別為具有至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%為CD3+/PD1+之DLBCL細胞。
  47. 一種治療患有DLBCL之個體之方法，其包含向該個體投與有效數目的一或多種表現結合CD19之CAR分子，例如CD19 CAR之細胞，以及PD-L1抑制劑，其中視情況，該個體具有或鑑別為具有小於20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%對於CD19及PD-L1呈雙陽性之癌症，例如癌症微環境中之細胞。
  48. 一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之分離之核酸分子，其中該CAR包含包括CD20結合域、跨膜域及胞內信號傳導域之抗體或抗體片段，且其中該CD20結合域包含表13 、15A或15B 中所列之任何CD20輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表12A 、12B 、14A或14B 中所列之任何CD20重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定 區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
  49. 一種分離之CAR分子，其包含CD20結合域、跨膜域及胞內信號傳導域，其中該CD20結合域包含表13 、15A或15B 中所列之任何CD20結合域之一或多個輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及表12A 、12B 、14A或14B 中所列之任何CD20結合域之一或多個重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。
  50. 一種治療患有與CD20表現相關之疾病之哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投與有效量的包含如請求項49之CAR分子之細胞。
  51. 一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之分離之核酸分子，其中該CAR包含包括CD22結合域、跨膜域及胞內信號傳導域之抗體或抗體片段，且其中該CD22結合域包含表8A 、8B 、10A或10B 中所列之任何CD22輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中的一或多者，及表7A 、7B 、7C 、9A或9B 中所列之任何CD22重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中的一或多者。
  52. 一種分離之CAR分子，其包含CD22結合域、跨膜域及胞內信號傳導域，其中該CD22結合域包含表8A 、8B 、10A或10B 中所列之任何CD22結合域之一或多個輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及表7A 、7B 、7C 、9A或9B 中所列之任何CD22結合域之一或多個重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈 互補決定區3(HC CDR3)。
  53. 一種治療患有與CD22表現相關之疾病之哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投與有效量的包含如請求項52之CAR分子之細胞。
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