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BR9917805B1 - Processos para resolução de enanciômeros - Google Patents

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BR9917805B1
BR9917805B1 BRPI9917805-2B1A BR9917805A BR9917805B1 BR 9917805 B1 BR9917805 B1 BR 9917805B1 BR 9917805 A BR9917805 A BR 9917805A BR 9917805 B1 BR9917805 B1 BR 9917805B1
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BR
Brazil
Prior art keywords
alkyl
mmol
group
amino
compound
Prior art date
Application number
BRPI9917805-2B1A
Other languages
English (en)
Inventor
Murray D Bailey
Anne-Marie Faucher
Teddy Halmos
Youla S Tsantrizos
Montse Linnas-Brunet
Dale Cameron
Elise Ghiro
Nathalie Goudreau
Marc-Andre Poupart
Jean Rancourt
Dominik M Wernic
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Ca Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Ca Ltd filed Critical Boehringer Ingelheim Ca Ltd
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOS PARA RESOLUÇÃO DE ENANCIÔMEROS".
Dividido do PI9913646-5, depositado em 09.08.1999.
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a compostos, processo para sua síntese, composições e métodos para o tratamento da infecção causada pe- lo vírus da hepatite C (HCV). Em particular, a presente invenção fornece no- vos análogos de peptídeos, composições farmacêuticas contendo tais aná- logos e métodos de uso destes análogos no tratamento da infecção causada pelo HCV. A presente invenção também proporciona processos e intermedi- ários para a síntese de tais análogos de peptídeos.
Fundamentos da Invenção O vírus da Hepatite C (HCV) é o maior agente etiológico de pós- transfusão e adquirido em todo o mundo a partir da associação dos vírus de hepatite diferente da hepatite A e hepatite B. É estimado que cerca de 150 milhões de pessoas em todo o mundo estejam infectadas pelo vírus. Um alto percentual de carreadores se torna cronicamente infectado e muitos destes progridem para uma doença crônica do fígado, a assim chamada hepatite C crônica. Esse grupo, por sua vez, é um grupo de alto risco para doenças graves do fígado, como cirrose, carcinoma hepatocelular e doença terminal do fígado que conduz à morte. O mecanismo pelo qual o HCV estabelece a persistência viral e causa uma alta taxa de doença crônica do fígado não foi ainda totalmente elucidado. O que se conhece agora é como o HCV interage e escapa do sis- tema hospedeiro imune. Além disso, as funções das respostas celular e i- muno humoral na proteção contra a doença e infecção do HCV têm de ser ainda estabelecidas. As imunoglobulinas foram relatadas para a profilaxia da hepatite viral associada à transfusão, entretanto, o Centro de Controle de Doenças atualmente não recomenda o tratamento com imunoglobulinas para tal finalidade. A falta de uma resposta imune de produto efetivo está impe- dindo o desenvolvimento de uma vacina ou de medidas de profilaxia pós- exposição adequadas, de modo que a curto prazo são esperadas interven- ções firmemente centradas em antivírus.
Diversas pesquisas clínicas foram conduzidas com o objetivo de identificar agentes farmacêuticos capazes de efetivamente tratar a infecção causada pelo HCV em pacientes afligidos com hepatite C crônica. Essas pesquisas envolveram o uso de alfa-interferon, individualmente ou combina- da com outros agentes antivírus. Tais pesquisas demonstraram que um nú- mero substancial de participantes não apresentou resposta a essas terapias e dentre aqueles que responderam favoravelmente, uma grande proporção foi encontrada como deficiente após o término do tratamento.
Até recentemente, o interferon (IFN) se constituía na única tera- pia disponível de constatado benefício aprovado na clínica de pacientes com hepatite C crônica. Entretanto, a taxa de resposta tolerada é baixa e o trata- mento com interferon também induz diversos efeitos colaterais (isto é, reti- nopatia, tiroidite, pancreatite aguda, depressão), que diminuem a qualidade de vida dos pacientes tratados. Recentemente, o interferon em combinação com a ribavirina, foi aprovado para pacientes não responsivos ao IFN indivi- dualmente. Entretanto, os efeitos colaterais causados pelo IFN não são alivi- ados por essa terapia combinada.
Portanto, existe uma necessidade para o desenvolvimento de agentes antivirais efetivos para o tratamento de infecção de HCV que supere as limitações das terapias farmacêuticas existentes. O HCV é um vírus de RNA de espiralamento positivo envelopa- do, da família da Flaviviridae. O genoma único de RNA de HCV espiralado é de aproximadamente 9500 nucleotídios de extensão e apresenta um único quadro de leitura aberto (ORF) que codifica uma única grande poliproteína de cerca de 3000 aminoácidos. Nas células infectadas, essa poliproteína é clivada em múltiplos locais pelas proteases celular e viral para produzir as proteínas estruturais e proteínas não estruturais (NS). No caso do HCV, a geração de proteínas não estruturais maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) é efetuada por duas proteases virais. A primeira delas, con- forme já fracamente caracterizado, realiza a divagem na junção NS2-NS3; a segunda é uma protease de serina contida dentro da região de terminal N da NS3 (daqui em diante referida como protease NS3) e promove a mediação de todas as clivagens subseqüentes a jusante da NS3, ambas em c/s, no local de divagem NS3-NS4A e em trans, para o restante dos locais NS4A- NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. A proteína NS4A parece servir de múlti- plas funções, atuando como um co-fator para a protease NS3 e possivel- mente ajudando na localização da membrana de NS3 e de outros compo- nentes de replicase viral. A formação complexa da proteína NS3 com a NS4A parece necessária aos eventos de processamento, melhorando a efi- ciência proteolítica em todos os locais. A proteína NS3 também exibe ativi- dades de trifosfatase de nucleotídio e helicase de RNA. A NS5B é uma poli- merase dependente de RNA que é envolvida na replicação do HCV.
Uma estratégia geral para o desenvolvimento de agentes antivi- rais é desativar as enzimas codificadas viralmente que são essenciais para replicação do vírus. Nesse contexto, o pedido de patente WO 97/06804 des- creve o (-) enanciômero do análogo de nucleosídio, citosina-1,3-oxatiolano (também conhecido como 3TC), como ativo contra o HCV. Esse composto, embora relatado como seguro em experimentações clínicas anteriores con- tra o HIV e HBV, tem ainda de ser provado clinicamente ativo contra o HCV e seu mecanismo de ação contra o vírus tem de ser relatado.
Uma série de esforços na descoberta de compostos que inibem a protease de NS3 ou helicase de RNA conduziram às seguintes divulga- ções: - A patente US N° 5.633.388, descreve carboxamidas heterocí- clicas substituídas e análogos como sendo ativos contra o HCV. Esses com- postos são dirigidos contra a atividade da helicase ou da proteína NS3 do vírus, mas não foram ainda relatados testes clínicos quanto ao assunto. - Uma fenantrenoquinona foi relatada por Chu e outros (Tet. Let- ter, (1996), 7229-7232) como tendo atividade contra a protease NS3 do HCV in vitro. Não foi relatado nenhum desenvolvimento posterior desse composto. - Um artigo apresentado no 9° Congresso Internacional de Pes- quisa Antivírus, realizado em Urabandai, Fukyshima, Japão (1996) (Antiviral Research (1996), 30, 1, A23 (Resumo 19), relata os derivados de tiazolidina como inibitórios à protease do HCV.
Diversas pesquisas relataram compostos inibitórios a outras pro- teases de serina, tal como a elastase de leucócito humano. Uma família des- tes compostos é relatada no documento de patente WO 95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995). Os peptídeos divulgados nesse pedido de patente são os análogos do peptídeo morfolinilcarbonil-benzoíla, que são estrutural- mente diferentes dos peptídeos da presente invenção. - O documento de patente WO 98/17679, da Vertex Pharmaceu- ticals Inc., divulga inibidores de protease de serina, particularmente protease NS3 do vírus da Hepatite C. Esses inibidores são análogos de peptídeo ba- seados no substrato natural de NS5A/5B. Embora sejam divulgados diversos tripeptídeos, todos esses análogos de peptídeos contêm a função carbonila ativada de terminal C como uma característica essencial. Esses análogos foram também relatados como sendo ativos contra outra protease de serina e, portanto, não são específicos para a protease NS3 de HCV. - Hoffman LaRoche também relatou hexapeptídeos que são ini- bidores de proteinase úteis como agentes antivirais para o tratamento de infecção causada pelo HCV. Esses peptídeos contêm um aldeído ou um áci- do borônico no terminal C. - Steinkühler e outros e Ingallinella e outros, publicaram a inibi- ção do produto NS4A-4B (Biochemistry (1998), 37, 8899-8905 e 8906-8914).
Entretanto, os peptídeos e análogos de peptídeos apresentados, não inclu- em nem conduzem ao modelo dos peptídeos da presente invenção.
Uma vantagem da presente invenção é que a mesma proporcio- na tripeptídeos que são inibitórios à protease NS3 do vírus da Hepatite C.
Uma vantagem adicional de um aspecto da presente invenção reside no fato de que esses peptídeos especificamente inibem a protease NS3 e não mostram uma significativa atividade inibitória em concentrações de até 300 μΜ contra as proteases de serina, como a elastase de leucócito humano (HLE), a elastase pancreática de suínos (PPE) ou a quimotripsina pancreática de bovinos ou ainda proteases de cisteína, como a catepsina B do fígado humano (Cat B).
Uma vantagem adicional da presente invenção é que a mesma proporciona pequenos peptídeos de baixo peso molecular que podem ser capazes de penetrar nas membranas celulares e podem ser ativos na cultura da célula e na condição in vivo, com um bom perfil farmacocinético.
Sumário da Invenção Incluído no escopo da presente invenção se encontram os ra- cematos, os diastereoisômeros e os isômeros ópticos de um composto de fórmula (I): onde B é H, C6 ou C10 arila, C7-ie aralquila; Het ou Het-(de alqui- la inferior), todos os quais opcionalmente substituídos com Ci_6 alquila; alcóxi; C1-6 alcanoíla; hidróxí; hidroxialquila; halo; haloalquila; nitro; ciano; cianoalquila; amino opcionalmente substituído com C1-6 alquila; grupo amido ou amida de alquila inferior; ou B é um derivado de acila de fórmula R4-C(0)-; uma carboxila de fórmula R4-0-C(0)-; uma amida de fórmula R4-N(R5)-C(0)-; uma tioamida de fórmula R4-N(R5)-C(S)-; ou uma sulfonila de fórmula R4-SO2, onde R4 é (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci_ 6 alcanoíla, hidróxi, C1.6 alcóxi, amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila, grupo amido ou amida de alquila inferior; (ii) C3.7 cicloalquila, C3.7 cicloalcóxi ou C4-10 alquilcicloalquila, to- dos opcionalmente substituídos com hidróxi, carboxila, (Ci_6 alcóxi)carbonila, amino opcionalmente mono- ou di-substituído com alquila, grupo amido ou amida de alquila inferior; (iii) amino opcionalmente mono- ou di-substituído com Ci^ alqui- la; grupo amido ou amida de alquila inferior; (iv) Ce ou C10 arila ou C7.ie aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, grupo amido, amida de alquila inferior ou a- mino opcionalmente mono- ou di-substituído com Ci.6 alquila; ou (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com Ci-6 alquila, hidróxi, grupo amido, amida de alquila inferior ou a- mino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1.6 alquila;
Rs é H ou C1-6 alquila; com a condição de que quando R* for uma amida ou um tioamida, R4 não será (ii) um cicloalcóxi; e Y é H ou Ci-6 alquila; R3 é C1-8 alquila, C3.7 cicloalquila ou C4-10 alquilcicloalquila, todos opcionalmente substituídos com hidróxi, alcóxi, C1-6 tioalquila, grupo a- mido, amida de alquila inferior, C6 ou C10 arila ou C7.i6 aralquila; R2 é CH2-R20· NH-R20, O-R20 ou S-R20, onde R2o é um C3.7 ciclo- alquila saturado ou insaturado ou C4-10 (alquilcicloalquila), todos os quais sendo opcionalmente mono-, di- ou tri-substituídos com R21; ou R20 é Οβ ou C10 arila ou C7.i4 aralquila, todos opcionalmente mono-, di- ou tri-substituídos com R21; ou R2o é Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente mono-, di- ou tri-substituídos com R2i ; onde cada R21 é independentemente é C1-6 alquila; C1-6 alcóxi, tioalquila inferior; sulfonila; NO2; OH; SH; halo; haloalquila; amino opcional- mente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila, C6 ou C10 arila ou C7.u aral- quila, Het ou Het-(de alquila inferior); grupo amido opcionalmente mono- substituído com Ci-β alquila C6 ou C10 arila ou C7.i4 aralquila, Het ou Het-(de alquila inferior); carbóxi(de alquila inferior); C6 ou C10 arila ou C7.14 aralquila ou Het, dito grupo arila, aralquila ou Het sendo opcionalmente substituídos com R22; onde R22 é Ci-6 alquila, C3.7 cicloalquila; C1-6 alcóxi; amino opcio- nalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; sulfonila; sulfonila(de al- quila inferior); NO2; OH; SH; halo; haloalquila; carboxila; amida; amida(de alquila inferior) ou Het opcionalmente substituído com C1-6 alquila; Rí é H, C1-6 alquila, C3.7 cicloalquila, C2-6 alquenila ou C2-6 alqui- nila, todos opcionalmente substituídos com halogênio; ou um sal ou éster farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Incluído no escopo da presente invenção se encontra uma com- posição farmacêutica compreendendo uma quantidade viralmente efetiva de anti-hepatite C de um composto de fórmula (I) ou um sal ou éster terapeuti- camente aceitáveis do mesmo, em mistura com um meio de veículo ou a- gente auxiliar farmaceuticamente aceitável.
Um importante aspecto da invenção envolve um método de tra- tamento de uma infecção viral de hepatite C em um mamífero, que compre- ende a administração ao mamífero de uma quantidade viralmente efetiva de anti-hepatite C do composto de fórmula (I) ou um sal ou éster terapeutica- mente aceitável do mesmo ou uma composição conforme descrito acima.
Um outro importante aspecto envolve um método de inibição da replicação do vírus da hepatite C, mediante exposição do vírus a uma quan- tidade inibidora de protease viral NS3 de hepatite C do composto de fórmula (I) ou um sal ou éster terapeuticamente aceitável do mesmo ou uma compo- sição conforme descrito acima.
Ainda um outro aspecto da invenção, envolve um método de tra- tamento de uma infecção viral de hepatite C em um mamífero, mediante administração ao mesmo de uma quantidade viralmente efetiva de anti- hepatite C de uma combinação do composto de fórmula (I) ou de um sal ou éster terapeuticamente aceitável do mesmo. De acordo com uma modalida- de da invenção, as composições farmacêuticas compreendem um adicional agente imunomodulatório. Exemplos de adicionais agentes imunomodulató- rios incluem, mas sem ser limitado a isso, α-, β- e δ-interferons.
Descrição Detalhada de Modalidades Preferidas Definições Conforme aqui usado, se aplicam as seguintes definições, a me- nos que de outro modo indicado.
Com referência aos exemplos onde (R) ou (S) são usados para designar a configuração de um substituinte, por exemplo, R-\ do composto de fórmula (I), a designação é feita no contexto do composto e não no contexto do substituinte individualmente.
Os aminoácidos naturais, com exceção da glicina, contêm um átomo de carbono quirálico. A menos que de outro modo especificamente indicado, são preferidos os compostos contendo aminoácidos naturais com a configuração em L. Entretanto, os presentes depositantes contemplam que quando especificado, alguns aminoácidos de fórmula I podem ser da confi- guração D- ou configuração L- ou podem ser misturas dos isômeros D- e L-, incluindo misturas racêmicas. A designação "P1, P2 e P3" conforme aqui usado, se refere à posição dos resíduos de aminoácidos partindo do final do terminal C dos análogos de peptídeos e se estendendo na direção do termi- nal N (isto é, P1 se refere à posição 1 do terminal C; P2 à segunda posição do terminal C, etc.) (consultar Berger A. & Schechter I., da Série "Transacti- ons of the Royal Society London" (1970), B257, 249-264).
As abreviações dos aminoácidos usados no presente pedido de patente são relacionadas na Tabela A, abaixo.
Tabela A
Conforme aqui usado, o termo "ácido 1-aminociclopropil- carboxílico" (Acca) se refere a um composto de fórmula: Conforme aqui usado, o termo "terc-butilglicina" se refere a um composto de fórmula: O termo resíduo com referência a um aminoácido ou derivado de aminoácido significa um radical derivado do correspondente a-aminoácido, mediante eliminação da hidroxila do grupo carboxila e de um hidrogênio do grupo α-amino. Por exemplo, os termos Gin, Ala, Gly, lie, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Asn, Sar e Tyr representam os resíduos de L-glutamina, L-alanina, gli- cina, L-isoleucina, L-arginina, ácido L-aspártico, L-fenilalanina, L-serina, L- leucina, L-cisteína, L-aspargina, sarcosina e L-tirosina, respectivamente. O termo "cadeia lateral" com referência a um aminoácido ou re- síduo de aminoácido significa um grupo fixado ao átomo de carbono-α do a- aminoácido. Por exemplo, a cadeia lateral do grupo R para a glicina é hidro- gênio, para alanina é metila, para valina é isopropila. Para os grupos especí- ficos de R ou cadeias laterais dos α-aminoácidos, é feito referência ao texto de A.L. Lehninger, na publicação Biochemistry (ver capítulo 4). O termo "halo", conforme aqui usado, significa um substituinte de halogênio selecionado dentre bromo, cloro, flúor ou iodo. O termo "Ci.6 alquila" ou (alquila inferior), conforme aqui usado, tanto individualmente como em combinação com outro substituinte, significa substituintes de alquila acíclicos, de cadeia reta ou ramificada, contendo de 1 a 6 átomos de carbono e inclui, por exemplo, metila, etila, propila, butila, terc-butila, hexila, 1-metiletila, 1-metilpropila, 2-metilpropila, 1,1-dimetiletila. O termo "C3.7 cicloalquila" conforme aqui usado, tanto individu- almente como em combinação com outro substituinte, significa um substitu- inte cicloalquila contendo de 3 a 7 átomos de carbono e inclui ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila e cicloheptila. Esse termo também inclui o grupo cíclico "espiro", tal como espiro-ciclopropila ou espiro-ciclobutila. O termo "cicloalquila insaturado" inclui, por exemplo, ciclohexeni- la: O termo "C4-10 (alquilcicloalquila)" conforme aqui usado, significa um radical cicloalquila contendo de 3 a 7 átomos de carbono, ligado a um radical alquila, os radicais ligados contendo até 10 átomos de carbono; por exemplo, ciclopropilmetila, ciclopentiletila, ciclohexilmetila, ciclohexiletila ou cicloheptiletila. O termo "C2-10 alquenila" conforme aqui usado, tanto individual- mente como em combinação com outro radical, significa um radical alquila conforme definido acima, contendo de 2 a 10 átomos de carbono e contendo ainda pelo menos uma dupla ligação. Por exemplo, alquenila inclui alila e vinila. O termo "C1-6 alcanoíla" conforme aqui usado, tanto individual- mente como em combinação com outro radical, significa radicais 1- oxoalquila de cadeia reta ou ramificada, contendo de 1 a 6 átomos de carbo- no e inclui formila, acetila, 1-oxopropila (propionila), 2-metil-1-oxopropila, 1- oxohexila e similares. O termo "Ci_6 alcóxi" conforme aqui usado, tanto individualmente como em combinação com outro radical, significa o radical -0(Ci.6 alquila), onde alquila é como definido acima, contendo até 6 átomos de carbono. Al- cóxi inclui metóxi, etóxi, propóxi, 1-metiletóxi, butóxi e 1,1-dimetiletóxi. O úl- timo radical é conhecido comumente como terc-butóxi. O termo "C3-7 cicloalcóxi" conforme aqui usado, tanto individual- mente como em combinação com outro radical, significa um grupo C3-7 ciclo- alquila ligado a um átomo de oxigênio, tal como por exemplo: O termo "C6 ou C10 arila" conforme aqui usado, tanto individual- mente como em combinação com outro radical, significa qualquer grupo mo- nociclico aromático contendo 6 átomos de carbono ou um grupo bicíclico aromático contendo 10 átomos de carbono. Por exemplo, arila inclui fenila, 1-naftila ou 2-naftila. O termo "C7-16 aralquila" conforme aqui usado, tanto individual- mente como em combinação com outro radical, significa um radical C6 ou C10 arila conforme definido acima, ligado a um grupo alquila, onde o grupo alquila é como definido acima, contendo de 1 a 6 átomos de carbono. C7.i6 aralquila inclui, por exemplo, benzila, butilfenila, e 1-naftilmetila. O termo "amino aralquila" conforme aqui usado, tanto individu- almente como em combinação com outro radical, significa um grupo amino substituído com um grupo C7-16 aralquila, tal como por exemplo, o grupo a- mino aralquila de fórmula: O termo "amida (de alquila inferior)" conforme aqui usado, tanto individualmente como em combinação com outro radical, significa uma ami- da mono-substituída com um grupo Ci.6 alquila, tal como: O termo "carbóxi (de alquila inferior)" conforme aqui usado, tanto individualmente como em combinação com outro radical, significa um grupo carboxila (COOH) ligado através de um grupo alquila (inferior), conforme definido acima e inclui, por exemplo, ácido butírico. O termo "heterocíclico" ou "Het" conforme aqui usado, tanto indi- vidualmente como em combinação com outro radical, significa um radical monovalente derivado por remoção de um hidrogênio de um heterocíclico de cinco, seis ou sete membros, saturado ou insaturado (incluindo aromático), contendo de um a quatro heteroátomos selecionados dentre nitrogênio, oxi- gênio e enxofre. Além disso, "Het" conforme aqui usado, significa um hetero- cíclico conforme definido acima, fundido a um ou mais outros ciclos, seja heterocíclico ou qualquer outro ciclo. Exemplos de heterocíclicos adequados incluem: pirrolidina, tetrahidrofurano, tiazolidina, pirrol, tiofeno, diazepina, 1H-imidazol, isoxazol, tiazol, tetrazol, piperidina, 1,4-dioxano, 4-morfolina, piridina, pirimidina, tiazol[4,5-b]-piridina, quinolina ou indol ou os seguintes heterocíclicos: O termo "Het (de alquila inferior)" conforme aqui usado, significa um radical heterocíclico, conforme definido acima, ligado através de uma cadeia alquílica ou um grupo alquílico ramificado, onde o grupo alquila é co- mo definido acima, contendo de 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos de Het (de alquila inferior) incluem: O termo éster farmaceuticamente aceitável" conforme aqui usa- do, tanto individualmente como em combinação com outro substituinte, signi- fica ésteres do composto de fórmula (I), em que quaisquer das funções car- boxila da molécula, mas preferencialmente o terminal carbóxi, é substituído com uma função alcoxicarbonila: Em que a porção R do éster é selecionada dentre alquila (por exemplo, meti- la, etila, n-propila, t-butila, n-butila); alcoxialquila (por exemplo, metoximetila); alcoxiacila (por exemplo, acetoximetila); aralquila (por exemplo, benzila); ariloxialquila (por exemplo, fenoximetila); arila (por exemplo, fenila), opcio- nalmente substituídos com halogênio, C1-4 alquila ou C1-4 alcóxi. Outros éste- res adequados de pró-drogas podem ser encontrados em Projetos de Pró- medicamentos, Bundgaard H. Editora Elsevier (1985), aqui incorporado por essa referência. Tais ésteres farmaceuticamente aceitáveis são normalmen- te hidrolizados in vivo quando injetados em um mamífero e transformados na forma ácida do composto representado pela fórmula (I).
Com relação aos ésteres descritos acima, a menos que de outra forma especificado, qualquer porção alquila presente, vantajosamente con- tém de 1 a 16 átomos de carbono, particularmente de 1 a 6 átomos de car- bono. Qualquer porção arila presente em tais ésteres, vantajosamente com- preende um grupo fenila.
Em particular, os ésteres podem ser um Cm6 alquiléster, um benziléster não-substituído ou um benziléster substituído com pelo menos um halogênio, C1.6 alquila, Ci_6 alcóxi, nitro ou trifluorometila. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" conforme aqui usado, inclui aqueles sais derivados de bases farmaceuticamente aceitáveis. Exem- plos de bases adequadas incluem colina, etanolamina e etilenodiamina. Sais de Na+, K+ e Ca++ são também contemplados dentro do escopo da invenção (consultar também Sais Farmacêuticos, Birge, S. M. e outros, J. Pharm. Sei., (1977), 66, 1-19, aqui incorporado por essa referência).
Modalidades Preferidas Incluído no escopo da presente invenção, se encontram os com- postos de fórmula (I), onde, preferencialmente: B é C6 ou Cio arila ou C7.16 aralquila, todos opcionalmente subs- tituídos com C1-6 alquila, C1.6 alcóxi, Ci_6 alcanoíla, hidróxi, hidroxialquila, halo, haloalquila, nitro, ciano, cianoalquila, grupo amido, grupo amido de al- quila inferior ou amino opcionalmente substituído com C1-6 alquila; ou B é preferencialmente Het ou Het (e alquila inferior), todos op- cionalmente substituídos com C1-6 alquila, Ci-e alcóxi, Ci-e alcanoíla, hidróxi, hidroxialquila, halo, haloalquila, nitro, ciano, cianoalquila, grupo amido, grupo amido de alquila inferior ou amino opcionalmente substituído com alqui- la;
Alternativamente, B é preferencialmente R4-SO2, onde R4 é pre- ferencialmente Ci.6 alquila; grupo amido; grupo amida de alquila inferior; Οβ ou C10 arila, C7-14 aralquila ou Het, todos opcionalmente substituídos com C-i_ 6 alquila.
Alternativamente, B é preferencialmente um derivado de acila de fórmula R4-C(0)-, onde R4 é preferencialmente: (i) C-mo alquila opcionalmente substituída com carboxila, hidróxi ou alcóxi, grupo amido, grupo amida de alquila inferior ou amino opcio- nalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (ii) C3-7 cicloalquila ou C4-10 alquilcicloalquila, ambos opcional- mente substituídos com hidróxi, carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila, grupo ami- do, grupo amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di- substituído com Ci_6 alquila; (iv) C6 ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, grupo amido, amida de alquila inferior ou a- mino opcionalmente substituído com C-i-6 alquila; (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, amino opcionalmente substituído com Ci_6 alquila amida, (alquila inferior) ou amino opcionalmente substituído com Ci_6 alquila.
Alternativamente, B é preferencialmente uma carboxila de fór- mula R4-0-C(0)-, onde R4 é preferencialmente: (i) Cmo alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci.6 alcanoíla, hidróxi, C1.6 alcóxi, amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1.6 alquila; grupo amido ou grupo amida de alquila inferior; (ii) C3-7 cicloalquila, C4-io alquilcicloalquila, ambos opcionalmente substituídos com carboxila, (Ci^ alcóxi)carbonila, amino opcionalmente mo- no- ou di-substituído com C1-6 alquila, grupo amido ou grupo amida de alquila inferior; (iv) Οβ ou C10 arila ou C7-16 aralquila, opcionalmente substituídos com C-i-5 alquila, hidróxi, grupo amido, amido de alquila inferior ou amino op- cionalmente mono- ou di-substituído com alquila; ou (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, amino opcionalmente mono- ou di- substituído com alquila, grupo amido ou amido de alquila inferior.
Alternativamente, B é preferencialmente uma amida de fórmula R4-N(R5)-C(0)-, onde R4 é preferencialmente: (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci.6 alcanoíla, hidróxi, alcóxi, grupo amido, grupo amido de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila;; (ii) C3-7 cicloalquila ou C4-io alquilcicloalquila, ambos opcional- mente substituídos com carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila, grupo amido, grupo amido de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (iii) amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1.3 alqui- la; (iv) Οβ ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1.6 alquila, hidróxi, grupo amido, amida de alquila inferior ou a- mino opcionalmente substituído com alquila; ou (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com Ci-6 alquila, hidróxi, amino opcionalmente substituído com Ci_6 alquila, grupo amido ou amida de alquila inferior; e R5 é preferencialmente H ou metila.
Alternativamente, B é preferencialmente uma tioamida de fórmu- la R4-NH-C(S)-; onde R4 é preferencialmente: (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci_6 alcanoíla ou C1-6 alcóxi; (ii) C3-7 cicloalquila ou C4-10 alquilcicloalquila, ambos opcional- mente substituídos com carboxila, (Ci.6 alcóxi)carbonila, grupo amino ou grupo amido.
Mais preferencialmente, B é um grupo Οβ ou C10 arila, opcional- mente substituído com C1.6 alquila, C1-6 alcóxi, C1-6 alcanoíla, hidróxi, hidro- xialquila, halo, haloalquila, nitro, ciano, cianoalquila, grupo amido, amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com Ci.6 alquila, de modo que B é por exemplo: ou B é mais preferencialmente Het opcionalmente substituído com Ci_6 alqui- la, C1-6 alcóxi, C1.6 alcanoíla, hidróxi, halo, haloalquila, grupo amido, amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com alquila, de modo que B é por exemplo: Alternativamente, B é mais preferencialmente R4-SO2, onde R4 é preferencialmente C6 ou C10 arila, um grupo C7.14 aralquila ou Het, todos op- cionalmente substituídos com C1.6 alquila, grupo amido, amida de alquila inferior, de modo que B é por exemplo: Alternativamente, B é mais preferencialmente um derivado de acila de fórmula R4-C(0)-, onde R4 é preferencialmente: (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, hidróxi ou C1-6 alcóxi; ou (ii) C3-7 cicloalquila ou C.M0 alquilcicloalquila, opcionalmente substituídas com hidróxi, carboxila, (Ci.6 alcóxi)carbonila, de modo que B é por exemplo: ou R4 é preferencialmente: (iv) C6 ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, de modo que B é por exemplo: ou R4 é preferencialmente: (v) Het opcionalmente substituído com C-i_6 alquila, hidróxi, grupo amido ou amino, de modo que B é por exemplo: Alternativamente, B é mais preferencialmente uma carboxila de fórmula R4-0-C(0)-, onde R4 é preferencialmente: (i) Cmo alquila opcionalmente substituída com carboxila, C1-6 alcanoíla, hidróxi, C1-6 alcóxi ou grupo amido, grupo amido de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila;; (ii) C3.7 cicloalquila, C4.10 alquilcicloalquila, todos opcionalmente substituídos com carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila, grupo amido, grupo amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila, de modo que B é por exemplo: ou R* é preferencialmente: (iv) Ce ou C10 arila ou C7-ie aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, amino opcionalmente substituído com alquila; ou (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, grupo amido ou amino opcionalmente mono- substituído com C1-6 alquila, de modo que B é por exemplo: Alternativamente, B é mais preferencialmente uma amida de fórmula R4-N(R5)-C(0)-, onde R4 é preferencialmente: (i) Cmo alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci.6 alcanoíla, hidróxi, Ci_6 alcóxi, grupo amido, grupo amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (ii) C3.7 cicloalquila ou C4-10 alquilcicloalquila, todos opcionalmen- te substituídos com carboxila, (Ci_6 alcóxi)carbonila, grupo amido, grupo a- mida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C-i-6 alquila; e R5 é H ou metila, de modo que B é por exemplo: ou R4 é preferencialmente: (iii) amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-3 alqui- la, de modo que B é por exemplo: ou R4 é preferencialmente: (iv) Cô ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, grupo amino ou grupo amido opcionalmente substituídos com Ci_6 alquila; ou (v) Het opcionalmente substituído com C1.6 alquila, hidróxi, grupo amino ou amido, de modo que B é por exemplo: Alternativamente, B é mais preferencialmente uma tioamida de fórmula R4-NH-C(S)-, onde R4 é preferencialmente: (i) Cmo alquila; ou (ii) C3-7 cicloalquila, de modo que B é por exemplo: Mais preferencialmente, B é uma amida de fórmula R4-NH-C(0)-, onde R4 é preferencialmente: (i) Cmo alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci.6 alcanoíla, hidróxi, Ci.6 alcóxi, grupo amido, grupo amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (ii) C3-7 cicloalquila ou C4-10 alquilcicloalquila, todos opcionalmen- te substituídos com carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila, grupo amido, grupo a- mida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C-1-6 alquila; ou R4 é preferencialmente: (iv) C6 ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com Ci.6 alquila, hidróxi, grupo amino ou grupo amido, de modo que B é por exemplo: Ainda mais preferencialmente, B é terc-butoxicarbonila (Boc) ou ou, preferencialmente, Y é H ou metila. Mais preferencialmente, Y é H.
Preferencialmente, R3 é Ci.8 alquila, C3-7 cicloalquila ou C4-10 al- quilcicloalquila, opcionalmente substituídos com hidróxi, C-i_6 alcóxi, Ci_6 tio- alquila, acetamido, C6 ou C10 arila ou C7-16 aralquila, de modo que B é por exemplo: Mais preferencialmente, R3 é a cadeia lateral de terc-butilglicina (Tbg), lie, Vai, Chg ou: Mais preferencialmente, R3 é a cadeia lateral de Tbg, Chg ou Vai.
Incluído no escopo da presente invenção, se encontram os com- postos de fórmula (I), onde preferencialmente, R2 é S-R20 ou 0-R2o, onde R20 é preferencialmente um grupo C6 ou C10 arila, C7-16 aralquila, Het ou -CH2- Het, todos opcionalmente mono-, di- ou tri-substituídos com R2i.
Preferencialmente, R21 é Ci-6 alquila; Ci.6 alcóxi, tioalquila inferi- or; amino ou amido opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila, Οβ ou C10 arila, C7.16 aralquila, Het ou Het-(de alquila inferior); Ν02; OH; halo; trifluorometila; carboxila; C6 ou C10 arila ou C7-16 aralquila ou Het, ditos gru- pos arila, aralquila ou Het sendo opcionalmente substituídos com R22. Mais preferencialmente, R2i é alquila; Ci_6 alcóxi; amino; diamino (de alquila inferior); amida (de alquila inferior); C6 ou C10 arila, ou Het, ditos grupos arila ou Het sendo opcionalmente substituídos com R22.
Preferencialmente, R22 é C1-6 alquila, C3-7 cicloalquila; Ci-6 alcóxi; amino; mono ou diamino (de alquila inferior); amida (de alquila inferior); sul- fonilalquila; N02; OH; halo; trifluorometila; carboxila ou Het. Mais preferivel- mente, R22 é C-i-6 alquila; C3.7 cicloalquila; C1.6 alcóxi; amino; amino mono-ou di (alquila inferior); amido; amido (alquila inferior); halo; trifluormetila ou Het.
Mais preferencialmente, R22 é Ci-6 alquila, C1-6 alcóxi; halo; amino opcional- mente mono- ou di-substituído com alquila inferior; grupo amido; amida (de alquila inferior) ou Het. Ainda mais preferencialmente, R22 é metila; etila; iso- propila; terc-butila; metóxi; cloro; amino opcionalmente mono- ou di- substituído com alquila inferior; grupo amido; amida de alquila inferior; ou 2- tiazol (de alquila inferior).
Alternativamente, R2 é preferencialmente selecionado do grupo que consiste de: Mais preferencialmente, R2é 1-naftilmetóxi; 2-naftilmetóxi; benzi- lóxi; 1-naftilóxi; 2-naftilóxi; ou quinolinóxi não-substituído, mono- ou di- substituído com R2i, conforme definido acima. Mais preferencialmente, R2 é 1-naftilmetóxi; ou quinolinóxi não-substituído, mono- ou di-substituído com R2i, conforme definido acima, de modo que R2 é por exemplo: Ainda mais preferencialmente, R2 é: Mais preferencialmente, R2ia é Ci.6 alquila, tal como isopropila, terc-butila ou ciclohexila; Ci.6 alcóxi, tal como metóxi, tioalquila inferior, tal como halogênio, tal como cloro; amino opcionalmente mono-substituído com C1.6 alquila; ou C6 ou C10 arila, de modo que R2ia seja por exemplo: dimetilamino, Ph-N(Me)-; Οε ou C10 arila não-substituída. C7-16 aralquila, tal como por e- xemplo, fenila ou ou R2ia é mais preferencialmente Het opcionalmente substituído com R22, onde R22 é C-i-6 alquila, C1-6 alcóxi, grupo amido, amida (de alquila inferior), amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila, ou Het, de modo que R2ia seja por exemplo: Mais preferencialmente, R2iA é C6, C10 arila ou Het, todos opcio- nalmente substituídos com R22 conforme definido acima, de modo que R2iA seja por exemplo: Ainda mais preferencialmente, R2 é: onde R22a é preferencialmente Ci.6 alquila (tal como metila); alcóxi (tal como metóxi); ou halogênio (tal como cloro); R22b é preferencialmente Ci_6 alquila, amino opcionalmente mono-substituído com C-ι-β alquila, grupo ami- do ou amida (de alquila inferior); e R21B é preferencialmente C1-6 alquila, C1.6 alcóxi, amino, diamino (de alquila inferior), amida (de alquila inferior), N02, OH, halo, trifluorometila, ou carboxila. Mais preferencialmente, R2iB é alcóxi ou diamino (de alquila inferior). Mais preferencialmente, R2iB é metóxi.
Conforme descrito anteriormente, o segmento P1 dos compostos de fórmula (I) é um anel de ciclobutila ou ciclopropila, ambos opcionalmente substituídos com R1.
Preferencialmente, R1 é H, C1.3 alquila, C3-5 cicloalquila ou C2-4 alquenila opcionalmente substituída com halogênio. Mais preferencialmente, R1 é etila, vinila, ciclopropila, 1 ou 2-bromoetila ou 1 ou 2-bromovinila. Mais preferencialmente, R1 é vinila.
Quando R1 não é H, então P1 é preferencialmente um sistema de ciclopropila de fórmula: Onde Ci e C2 representam individualmente um átomo de carbono assimétri- co nas posições 1 e 2 do anel de ciclopropila. Não obstante outros possíveis centros assimétricos em outros segmentos dos compostos de fórmula (I), a presença desses dois centros assimétricos significa que os compostos de fórmula (I) podem existir como misturas racêmicas de diastereoisômeros.
Conforme ilustrado nos exemplos seguintes, as misturas racêmicas podem ser preparadas e depois separadas em isômeros ópticos individuais ou es- ses isômeros ópticos podem ser preparados por síntese quirálica.
Conseqüentemente, 0 composto de fórmula (I) pode existir como uma mistura racêmica de diastereoisômeros no carbono 1, mas onde R1 no carbono 2 é orientado syn para a carbonila na posição 1, representada pelo radical: ou o composto de fórmula (I) pode existir como uma mistura racêmica de diastereoisômeros, onde Ri na posição 2 é orientado anti para a carbonila na posição 1, representada pelo radical: Por sua vez, as misturas racêmicas podem ser separadas em isômeros ópticos individuais.
Uma descoberta mais interessante da presente invenção é con- cernente à adição de um substituinte Ri no carbono 2, assim como a orien- tação espacial do segmento P1. A descoberta é concernente à configuração do carbono assimétrico 1. Uma modalidade preferida é aquela em que Ri não é H e o carbono 1 apresenta a configuração R. = cada um de e Mais explicitamente, a introdução de um substituinte (Ri) em C2, apresenta um impacto na potencialidade quando Ri é introduzido em uma maneira em que C1 apresenta a configuração de R. Por exemplo, os com- postos 901 (1R, 2S) e 203 (1R, 2R) apresentam atividades de 25 e 82 nM, respectivamente. Quando comparado ao composto de ciclopropila não- substituído 111 (475 nM), é observado um substancial aumento na potencia- lidade, Além disso, conforme mostrado para os compostos 901 e 203, quan- do o carbono 1 apresenta a configuração de R, a inibição da protease NS3 do HCV é ainda melhorada pela configuração do substituinte Ri (por exem- plo, alquila ou alquileno) no carbono 2 do anel de ciclopropila, por exemplo, o composto que possui R-ι "syn" para a carbonila que apresenta maior po- tencialidade (25 nM) que o enanciômero "anti" (82 nM). Pode ser observado o efeito da configuração de R vs. Sem C1, mediante comparação dos com- postos 801 (1R, 2S) e seu correspondente isômero (1S, 2S) que apresenta potencialidades de 6 nM e > 10 μΜ, respectivamente, uma diferença de cer- ca de 1500 vezes!!.
Portanto, um composto mais preferido é um isômero óptico ten- do o substituinte Ri e a carbonila em uma orientação syn na seguinte orien- tação absoluta: No caso em que Ri é etila, por exemplo, os átomos de carbono assimétricos nas posições 1 e 2 apresentam a configuração R, R.
Incluído no escopo da presente invenção, se encontram os com- postos de fórmula (I) em que: B é um grupo C6 ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcional- mente substituídos com Ci.6 alquila, Ci-6 alcóxi; Ci.6 alcanoíla; hidróxi; hidro- xialquila; halo; haloalquila; nitro; ciano; cianoalquila; grupo amido, grupo a- mido (de alquila inferior) ou amino opcionalmente substituído com C1-6 alqui- la; ou Het ou Het (de alquila inferior), todos opcionalmente substituídos com C1-6 alquila, C1.6 alcóxi; Ci.6 alcanoíla; hidróxi; hidroxialquila; halo; haloalqui- la; nitro; ciano; cianoalquila; grupo amido, grupo amido (de alquila inferior) ou amino opcionalmente substituído com Ci.6 alquila; ou B é R4-SO2, onde R4 é preferencialmente um grupo amido; amida (de alquila inferior); C6 ou C10 arila, C7.u aralquila ou Het, todos op- cionalmente substituídos com C1-6 alquila, ou B é um derivado de acila de fórmula R4-C(0)-; onde R4 é (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, hidróxi ou C1-6 alcóxi, grupo amido ou amida de alquila inferior ou amino opcional- mente mono- ou di-substituído com Ci.6 alquila; (ii) C3.7 cicloalquila ou C4-10 alquilcicloalquila, ambos opcional- mente substituídos com hidróxi, carboxila, (Ci_6 alcóxi)carbonila, grupo amido ou amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (iv) C6 ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, grupo amido, amida de alquila inferior ou a- mino opcionalmente substituído com C1-6 alquila; ou (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com Ci-6 alquila, hidróxi, amino opcionalmente substituído com C1-6 alquila; grupo amido, ou amida de alquila inferior; B é uma carboxila de fórmula R4-0-C(0)-, onde R4 é: (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, alcanoíla, hidróxi, Ci.6 alcóxi, amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1.6 alquila; grupo amido ou grupo amida de alquila inferior; (ii) C3-7 cicloalquila, C4-10 alquilcicloalquila, todos opcionalmente substituídos com carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila, amino opcionalmente mo- no- ou di-substituído com C1-6 alquila, grupo amido ou grupo amida de alquila inferior; (iv) C6 ou C10 arila ou C7.i6 aralquila, opcionalmente substituídos com Ci_6 alquila, hidróxi, grupo amido, amido de alquila inferior ou amino op- cionalmente mono- ou di-substituído com C1.6 alquila; ou (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com C1.6 alquila, hidróxi, amino opcionalmente mono- ou di- substituído com C1-6 alquila, grupo amido ou amido de alquila inferior; ou. B é uma amida de fórmula R4-N(Rs)-C(0)-, onde R4 é: (i) Ci„io alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci_6 alcanoíla, hidróxi, Ci_6 alcóxi, grupo amido, grupo amido de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com Ci.6 alquila;; (ii) C3-7 cicloalquila ou C4-10 alquilcicloalquila, todos opcionalmen- te substituídos com carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila, grupo amido, grupo a- mido de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (iii) amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1.3 alqui- la; (iv) C6 ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, grupo amido, amida de alquila inferior ou a- mino opcionalmente substituído com Ci_6 alquila; ou (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com C1.6 alquila, hidróxi, amino opcionalmente substituído com Ci_6 alquila, grupo amido ou amida de alquila inferior; e Rs é preferencialmente H ou metila, ou B é uma tioamida de fórmula R4-NH-C(S)-; onde R4 é: (i) C-i-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci_6 alcanoíla ou C1-6 alcóxi; (ii) C3-7 cicloalquila ou C4.i0 alquilcicloalquila, todos opcionalmen- te substituídos com carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila, grupo amino ou grupo amido; Y é H ou metila; R3 é Ci-8 alquila, C3.7 cicloalquila ou C4.-i0 alquilcicloalquila, todos opcionalmente substituídos com hidróxi, C1.6 alcóxi, C1.6 tioalquila, acetami- do, C6 ou C10 arila ou C7.16 aralquila,; R2 é S-R20 ou O-R20, onde R20 é preferencialmente um grupo C6 ou C10 arila, C7-16 aralquila, Het ou -CH2-Het, todos opcionalmente mono-, di- ou tri-substituídos com R21, onde R21 é C1-6 alquila; Ci-6 alcóxi, tioalquila inferior; grupos amino ou amido opcionalmente mono- ou di-substituídos com C1-6 alquila, Ce ou C10 arila, C7-16 aralquila, Het ou Het-(de alquila inferior); NO2; OH; halo; trifluoro- metila; carboxila; C6 ou C10 arila ou C7.i6 aralquila ou Het, ditos grupos arila, aralquila ou Het sendo opcionalmente substituídos com R22> onde R22 é Ci_6 alquila, C3.7 cicloalquila; C1.6 alcóxi; amino; mono ou diamino (de alquila inferior); amida (de alquila inferior); sulfonilalquila; N02; OH; halo; trifluorometila; carboxila ou Het, ou R2 é selecionado do grupo que consiste de: ou R2 é 1-naftilmetóxi; 2-naftilmetóxi; benzilóxi; 1-naftilóxi; 2-naftilóxi; ou qui- nolinóxi não-substituído, mono- ou di-substituído com R2i, conforme definido acima; o segmento P1 é um anel de ciclobutila ou ciclopropila, ambos opcionalmente substituídos com R1, onde R1 é H, C1.3 alquila, C3-5 cicloalqui- la ou C2-4 alquenila opcionalmente substituídos com halo e dito R1 no carbo- no 2 é orientado syn para a carbonila na posição 1, representada pelo radi- cal: Incluído no escopo da presente invenção, se encontram os com- postos de fórmula (I) em que: B é um grupo C6 ou C10 arila opcionalmente substituídos com C-i. e alquila, Ci.6 alcóxi; Ci_6 alcanoíla; hidróxi; hidroxialquila; halo; haloalquila; nitro; ciano; cianoalquila; grupo amido, grupo amido (de alquila inferior) ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; ou B é Het opcionalmente substituído com Ci-6 alquila, Ci.6 alcóxi; C1-6 alcanoíla; hidró- xi; halo; grupo amido, grupo amida (de alquila inferior) ou amino opcional- mente mono- ou di-substituído com Ci.6 alquila; ou B é R4-SO2, onde R4 é C6 ou C10 arila, C7.14 aralquila ou Het, todos opcionalmente substituídos com Ci. 6 alquila, grupo amido, amida (de alquila inferior); ou B é um derivado de aci- la de fórmula R4-C(0)-; onde R4 é (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, hidróxi ou Ci-6 alcóxi; ou (ii) C3.7 cicloalquila ou C4.10 alquilcicloalquila, ambos opcional- mente substituídos com hidróxi, carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila; ou (iv) Οβ ou C10 arila ou C7-16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi; ou (v) Het opcionalmente substituídos com C1-6 alquila, hidróxi, ami- do ou grupo amino; ou B é uma carboxila de fórmula R4-0-C(0)-, onde R4 é: (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, C1-6 alcanoíla, hidróxi, Ci.6 alcóxi, grupo amido ou grupo amida de alquila inferior, amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (ii) C3.7 cicloalquila, C4.io alquilcicloalquila, todos opcionalmente substituídos com carboxila, (C1-6 alcóxi)carbonila, grupo amido ou grupo a- mida de alquila inferior, amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C^.6 alquila; ou (iv) Ce ou C10 arila ou C7.16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com Ci_6 alquila, hidróxi, amino opcionalmente substituído com C-|.6 alquila; ou (v) Het ou Het-(de alquila inferior), ambos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, grupo amido, ou amino opcionalmente mono- substituído com C1-6 alquila; ou. B é uma amida de fórmula R4-N(R5)-C(0)-, onde R4 é: (i) C1-10 alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci.6 alcanoíla, hidróxi, Ci_6 alcóxi, grupo amido, grupo amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com alquila; (ii) C3.7 cicloalquila ou C4.10 alquilcicloalquila, todos opcionalmen- te substituídos com carboxila, (Ci„6 alcóxi)carbonila, grupo amido, grupo a- mida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; e R5 é H ou metila; ou R4 é (iii) amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1.3 alquila; ou (iv) C6 ou C10 arila ou C7.16 aralquila, todos opcionalmente substi- tuídos com C1-6 alquila, hidróxi, grupo amino ou amido opcionalmente substi- tuídos com Ci„6 alquila; ou (v) Het opcionalmente substituídos com Ci.6 alquila, hidróxi, ami- no ou amido; ou B é uma tioamida de fórmula R4-NH-C(S)-; onde R4 é: (i) C1-10 alquila ou (ii) C3-7 cicloalquila ou B é uma amida de fórmula R4-N-C(0)-, onde R4 é: (i) Cmo alquila opcionalmente substituída com carboxila, Ci_6 alcanoíla, hidróxi, alcóxi, grupo amido, grupo amida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (ii) C3.7 cicloalquila ou C4.io alquilcicloalquila, todos opcionalmen- te substituídos com carboxila, (Ci_6 alcóxi)carbonila, grupo amido, grupo a- mida de alquila inferior ou amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila; (iv) Cq ou C10 arila ou C7.i6 aralquila, opcionalmente substituídos com Ci_6 alquila, hidróxi, grupo amino ou amido; Yé H; R3 é a cadeia lateral de terc-butilglicina (Tbg), lie, Vai, Chg ou: R2 é 1-naftilmetóxi; ou quinolinóxi não-substituído, mono- ou di- substituído com R21, conforme definido acima, ou R2 é onde R2ia é C-i_6 alquila; C-i_6 alcóxi, C6, C10 arila ou Het; tioalqui- la inferior; halo; grupos amino opcionalmente mono-substituídos com C1-6 alquila; ou C6 ou C10 arila, C7.i6 aralquila ou Het opcionalmente substituídos com R22i onde R22 é C1-6 alquila, C1-6 alcóxi; grupo amido; amida (de alqui- la inferior); amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1.6 alquila, ou Het; P1 é um anel de ciclopropila, onde o carbono 1 apresenta a con- figuração R. = cada um de e e R1 é etila, vinila, ciclopropila, 1 ou 2-bromoetila ou 1 ou 2-bromovinila.
Incluídos ainda no escopo da invenção, são os compostos de fórmula (I) em que: B é terc-butoxicarbonila (Boc) ou R3 é a cadeia lateral de Tbg, Chg ou Vai; R2 é: onde R22a é Ci_6 alquila (tal como metila); Ci.6 alcóxi (tal como metóxi); ou halogênio (tal como cloro); R22b é Ci.6 alquila, amino opcionalmente mono- substituído com Ci_6 alquila, grupo amido ou amida (de alquila inferior); e R21B é C1-6 alquila, C1.6 alcóxi, amino, diamino (de alquila inferior), amida (de alquila inferior), NO2, OH, halo, trifluorometila, ou carboxila; e P1 é Finalmente, incluído dentro do escopo da presente invenção se encontra cada composto de fórmula (I), conforme apresentado nas Tabelas 1 a 10.
De acordo com uma modalidade alternativa, as composições farmacêuticas da presente invenção podem adicionalmente compreender um outro agente anti-HCV. Exemplos de agentes anti-HCV incluem a- ou β- interferon, ribavirina e amantadina.
De acordo com outra modalidade alternativa, as composições farmacêuticas da presente invenção podem adicionalmente compreender outros inibidores de protease de HCV.
De acordo ainda com outra modalidade alternativa, as composi- ções farmacêuticas da presente invenção podem adicionalmente compreen- der um inibidor de outros alvos no ciclo de vida do HCV, incluindo, mas sem limitar a isso, helicase, polimerase, metaloprotease ou local de entrada de ribossomo interno (IRES).
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas oralmente, parenteralmente ou através de um reservatório implantado. A administração oral ou administração por injeção constituem os métodos preferidos. As composições farmacêuticas da presente invenção podem conter quaisquer veículos ou coadjuvantes convencionais, não tóxi- cos e farmaceuticamente aceitáveis. Em alguns casos, o pH da formulação pode ser ajustado com ácidos, bases ou tampões farmaceuticamente aceitá- veis, de modo a melhorar a estabilidade do composto formulado ou sua for- ma de liberação. O termo parenteral, conforme aqui usado, inclui a injeção subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasi- novial, intra-esternal, intratecal e intralesional ou técnicas de infusão.
As composições farmacêuticas podem se apresentar na forma de uma preparação estéril injetável, por exemplo, como uma suspensão es- téril aquosa ou oleaginosa injetável. Essa suspensão pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos na técnica, usando adequados agentes de dispersão ou agentes umectantes (como por exemplo, Tween 80) e agentes de suspensão.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser oralmente administradas em qualquer forma de dosagem oralmente aceitá- vel, incluindo, mas sem limitar a isso, cápsulas, comprimidos e suspensões aquosas e soluções. No caso de comprimidos para uso oral, os veículos que são comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes de lubri- ficação, como estearato de magnésio, são também tipicamente adicionados.
Para administração oral numa forma de cápsula, diluentes úteis incluem lac- tose e amido de milho seco. Quando as suspensões aquosas são adminis- tradas oralmente, o ingrediente ativo é combinado com um emulsificante e agentes de suspensão. Se desejado, determinados agentes adoçantes e/ou aromatizantes e/ou corantes podem ser adicionados.
Outros veículos ou carreadores adequados para as formulações e composições acima mencionadas, podem ser encontrados nos textos far- macêuticos padrões, por exemplo, na Publicação "Remington's Pharmaceu- tical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 19a Ed. Mack Publi- shing Company, Easton, Penn., (1995).
Os níveis de dosagem entre cerca de 0,01 e cerca de 100 mg/kg do peso do corpo por dia, preferencialmente entre cerca de 0,5 e cerca de 75 mg/kg de peso do corpo por dia, dos compostos inibidores de protease aqui descritos, são úteis numa monoterapia para a prevenção e tratamento da doença mediada pelo HCV. Tipicamente, as composições farmacêuticas da presente invenção serão administradas entre cerca de 1 a cerca de 5 ve- zes por dia ou alternadamente, como uma infusão contínua. Tal administra- ção pode ser usada como uma terapia crônica ou aguda. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais que servem de veículos para produzir uma forma de dosagem única, irá variar, dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. Uma prepara- ção típica irá conter de cerca de 5% a cerca de 95% de composto ativo (pe- so/peso). Preferencialmente, tais preparações contêm cerca de 20% a cerca de 80% do composto ativo.
Conforme pode ser observado por um versado na técnica, dosa- gens mais baixas ou mais altas daquelas descritas acima podem se fazer necessário. A dosagem específica e o regime de tratamento para qualquer paciente particular, irá depender de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado, a idade, o peso do corpo, a situação geral da saúde, o sexo, a dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação da droga, gravidade e curso da infecção, disposição do paciente em relação à infecção e análise do médico responsável pelo tratamento. Geralmente, o tratamento é iniciado por pequenas doses, subs- tancialmente menores que a dosagem ótima do peptídeo. Após isso, a do- sagem é aumentada de pequenos incrementos, até que um efeito ótimo seja alcançado sob as circunstâncias em questão. Em geral, o composto é mais desejavelmente administrado em um nível de concentração que irá geral- mente garantir resultados antivirais efetivos, sem provocar quaisquer efeitos colaterais danosos ou prejudiciais.
Quando as composições da presente invenção compreendem uma combinação de um composto de fórmula (I) e um ou mais agentes tera- pêutico ou profilático adicionais, o composto e o agente adicional devem es- tar presentes em níveis de dosagem entre cerca de 10 a 100% e mais prefe- rencialmente entre cerca de 10 e 80% da dosagem normalmente administra- da em um regime de monoterapia.
Quando esses compostos ou seus sais farmaceuticamente acei- táveis são formulados juntos com um veículo farmaceuticamente aceitável, a composição resultante pode ser administrada in vivo em animais, tal como o homem, de modo a inibir a protease NS3 de HCV ou para tratar ou prevenir a infecção do vírus de HCV. Tal tratamento pode também ser alcançado, usando os compostos da presente invenção em combinação com agentes que incluem, mas sem ser limitado a isso, agentes imunomodulatórios, tais como α-, β- e V-interferons; outros agentes antivirais, como ribavirina, aman- tadina; outros inibidores da protease NS3 de HCV; inibidores de outros alvos no ciclo de vida do HCV, que incluem, mas sem limitar a isso, helicase, poli- merase, metaloprotease ou local de entrada de ribossomo interno (IRES); ou combinações dos mesmos. Os agentes tradicionais podem ser combinados com os compostos da presente invenção para criar uma forma de dosagem única. Alternativamente, esses agentes adicionais podem ser separadamen- te administrados a um mamífero como parte de uma forma de dosagem múl- tipla.
Consequentemente, uma outra modalidade da presente inven- ção proporciona métodos de inibição da atividade da protease NS3 de HCV em mamíferos, mediante administração de um composto de fórmula (I), onde os substituintes são conforme definido acima.
Em uma modalidade preferida, esses métodos são de utilidade na redução da atividade da protease NS3 de HCV em um mamífero. Se a composição farmacêutica compreender apenas um composto da presente invenção como componente ativo, tais métodos podem adicionalmente com- preender a etapa de administrar ao dito mamífero, um agente selecionado de um agente imunomodulatório, um agente antiviral, um inibidor de protea- se de HCV ou um inibidor de outros alvos no ciclo de vida do HCV, tais como helicase, polimerase ou metaloprotease ou IRES. Tal agente adicional pode ser administrado ao mamífero antes, simultaneamente ou em seguida à ad- ministração das composições da presente invenção.
Em uma modalidade preferida, esses métodos são de utilidade para a inibição da replicação viral em um mamífero. Tais métodos são de utilidade no tratamento ou prevenção da doença causada pelo HCV. Se a composição farmacêutica compreender apenas um composto da presente invenção como componente ativo, tais métodos podem adicionalmente com- preender a etapa de administrar ao dito mamífero, um agente selecionado de um agente imunomodulatório, um agente antiviral, um inibidor de protea- se de HCV ou um inibidor de outros alvos no ciclo de vida do HCV. Tal agen- te adicional pode ser administrado ao mamífero antes, simultaneamente ou em seguida à administração das composições da presente invenção.
Os compostos aqui estabelecidos podem também ser usados com reagentes de laboratório. Os compostos da presente invenção podem também ser usados para tratar ou prevenir a contaminação viral de materiais e, portanto, reduzir o risco de infecção viral de laboratório ou pessoal médico ou de pacientes que entram em contato com tais materiais (por exemplo, sangue, tecido, instrumentos cirúrgicos e vestimentas, instrumentos de labo- ratório e vestimentas e aparelhos de coleta de sangue e materiais).
Os compostos aqui estabelecidos podem também ser usados como reagentes de pesquisa. Os compostos da presente invenção podem também ser usados como controle positivo para validar ensaios substitutos à base de células ou ensaios de replicação viral in vitro ou in vivo.
PROCESSO
Os compostos da presente invenção foram sintetizados de acor- do com um processo geral, conforme ilustrado no Esquema I (onde CPG é um grupo de proteção carboxila e APG é um grupo de proteção amino): ESQUEMA I
Brevemente, os grupos Ρ1, P2 e P3 podem ser ligados por téc- nicas de acoplamento de peptídeo bem conhecidas. Os grupos P1, P2 e P3 podem ser ligados juntos em qualquer ordem, na medida em que o compos- to final corresponde aos peptídeos de fórmula I. Por exemplo, P3 pode ser ligado a P2-P1; ou P1 pode ser ligado a P3-P2.
Geralmente, os peptídeos são alongados pela desproteção do grupo α-amino do resíduo do terminal N e acoplamento do grupo carboxila não protegido do próximo aminoácido adequadamente N-protegido, através de uma ligação de peptídeo, usando os métodos descritos. Esse procedi- mento de desproteção e acoplamento é repetido até que seja obtida uma seqüência desejada. Esse acoplamento pode ser realizado com os aminoá- cidos constituintes em um modelo escalonado, conforme ilustrado no Es- quema I ou mediante síntese de peptídeo de fase sólida, de acordo com o método descrito originalmente por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., (1963), 85, 2149-2154, cuja divulgação é aqui incorporada por essa referência. O acoplamento entre dois aminoácidos, um aminoácido e um peptídeo ou dois fragmentos de peptídeo, pode ser realizado usando proce- dimentos padrão de acoplamento, tal como o método de azida, método misto de anidrido de ácido carboxílico-carbônico (cloroformato de isobutila), méto- do de carbodiimida (diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida ou car- bodiimida solúvel em água), método de éster ativo (p-nitrofenil éster, N- hidroxissuccínico imido éster), método do reagente K de Woodward, método de carbonildiimidazol, métodos de reagentes de fósforo ou de oxidação- redução. Alguns desses métodos (especialmente o método da carbodiimida), podem ser melhorados pela adição de 1-hidroxibenzotriazol. Essas reações de acoplamento podem ser realizadas em solução (fase líquida) ou fase só- lida.
Mais explicitamente, a etapa de acoplamento envolve o acopla- mento desidratante de uma carboxila livre de um reagente com o grupo ami- no livre do outro reagente, na presença de um agente de acoplamento, para formar uma ligação de amida. Descrições de tais agentes de acoplamento são encontradas em textos básicos gerais de química dos peptídeos, por exemplo, M. Bodanszky, "Peptide Chemistry", 2a Ed. Rev., Springer-Verlag, Berlim, Alemanha (1993). Exemplos de adequados agentes de acoplamento incluem Ν,Ν'-diciclohexilcarbodiimida, 1-hidrobenzotriazol na presença de Ν,Ν'-diciclohexilcarbodiimida ou N-etil-N'-[(3- dimetilamino)propil]carbodiimida. Um prático e útil agente de acoplamento é o agente de acoplamento comercialmente disponível (benzotriazol-1- ilóxi)tris-(dimetilamino)fosfônio hexafluorofosfato, tanto por si próprio, como na presença de 1-hidroxibenzotriazol. Um outro prático e útil agente de aco- plamento é o agente de acoplamento comercialmente disponível 2-(1H- benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio tetrafluoroborato. Um outro práti- co e útil agente de acoplamento é o agente de acoplamento comercialmente disponível 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio hexafluoro- fosfato. A reação de acoplamento é conduzida em um meio de solvente inerte, por exemplo, diclorometano, acetonitrila ou dimetilformamida. Um ex- cesso de uma amina terciária, por exemplo, diisopropiletilamina, N- metilmorfolina ou N-metilpirolidina, é adicionado para manter a mistura rea- cional em um pH em torno de 8. A temperatura da reação normalmente varia entre 0°C e 50°C e o tempo de reação normalmente varia entre 15 minutos e 24 horas.
Quando uma aproximação sintética de fase sólida é empregada, o ácido carboxílico do terminal C é fixado a um veículo insolúvel (normal- mente poliestireno). Esses veículos insolúveis contêm um grupo que irá rea- gir com o grupo carboxílico para formar uma ligação que é estável às condi- ções de alongamento, mas facilmente é clivado posteriormente. Exemplos de tais veículos incluem resina de cloro ou bromoetila, resina de hidroximeti- la, resina de tritila e resina de 2-metóxi-4-alcóxi-benzilaloconol.
Muitas dessas resinas são comercialmente disponíveis com o desejado terminal C do aminoácido já incorporado. Alternativamente, o ami- noácido pode ser incorporado no suporte sólido mediante métodos conheci- dos (Wang S. S., J. Am. Chem. Soc., (1973), 95, 1328; Atherton E.; Shepard R.C. "Solid-phase Peptide Synthesis; a Practical Approach" IRL Press: Ox- ford (1989); 131-148). Além dos métodos citados, outros métodos de síntese de peptídeos são descritos em Stewart e Young, "Solid Phase Peptide Syn- thesis", 2“ Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, Eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1, 2, 3, 5 e 9, Academic Press, New York (1980-1987); Bodansky e outros, "The Prac- tice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, New York (1984), cujas divulga- ções são aqui incorporadas por meio dessas referências.
Os grupos funcionais dos aminoácidos constituintes geralmente devem ser protegidos durante as reações de acoplamento, para evitar a for- mação de ligações indesejáveis. Os grupos de proteção que podem ser usa- dos são listados em Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, New York (1981) e "The Peptides: Analysis, Synthesis, Bio- logy", Vol. 3, Academic Press, New York (1981), cujas divulgações são aqui incorporadas por meio dessas referências. O grupo α-carboxílico do resíduo do terminal C é normalmente protegido como um éster (CPG) que pode ser clivado para proporcionar o ácido carboxílico. Os grupos de proteção que podem ser usados incluem: 1) ésteres alquílicos, tais como ésteres de metila, trimetilsililetila e t-butila; 2) ésteres de aralquila, tais como ésteres de benzila e benzila substituída, ou 3) ésteres que podem ser clivados por tratamento de base suave ou meios re- dutores suaves, tais como ésteres de tricloroetila e ésteres de fenacila. O grupo α-amino de cada aminoácido a ser acoplado à cadeia de crescimento do peptídeo, deve ser protegido (APG). Qualquer grupo de proteção conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de tais grupos incluem: 1) grupos acila, tais como formila, trifluoroacetila, ftalila e p- toluenosulfonila; 2) grupos de carbamato aromático, tais como benziloxicar- bonila (Cbz ou Z) e benziloxicarbonilas substituídas e 9- fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc); 3) grupos de carbamato alifático, tais como terc-butiloxicarbonila (Boc), etoxicarbonila, diisopropilmetoxicarbonila e alilo- xicarbonila; 4) grupos de carbamato cíclicos de alquila, tais como ciclopenti- loxicarbonila e adamantiloxicarbonila; 5)grupos alquila, tais como trifenilmeti- la e benzila; 6) triaalquilsilila, como trimetilsilila; e 7) grupos contendo tiol, tais como feniltiocarbonila e ditiasuccinoíla. O grupo de proteção a-amino preferido é o Boc ou Fmoc. Muitos derivados de aminoácidos adequadamen- te protegidos para a síntese do peptídeo são comercialmente disponíveis. O grupo de proteção α-amino do resíduo de aminoácido recen- temente adicionado é clivado antes do acoplamento do próximo aminoácido.
Quando o grupo Boc é usado, os métodos de escolha incluem ácido trifluo- roacético, puro ou em diclorometano ou HCI em dioxano ou acetato de etila. O sal de amônio resultante é depois neutralizado antes do acoplamento ou in situ com soluções básicas, tais como tampões aquosos ou aminas terciá- rias em diclorometano ou acetonitrila ou dimetilformamida. Quando é usado o grupo Fmoc, os reagentes de escolha são piperidina ou piperidina substitu- ída em dimetilformamida, mas qualquer amina secundária pode ser usada. A desproteção é realizada a uma temperatura entre 0°C e a temperatura ambi- ente (TA), normalmente de 20-22°C.
Quaisquer dos aminoácidos tendo funcionalidades de cadeia lateral devem ser protegidos durante a preparação do peptídeo, usando quaisquer dos grupos acima descritos. Os versados na técnica irão observar que a seleção e uso de grupos de proteção apropriados para essas funcio- nalidades de cadeia lateral, dependem do aminoácido e da presença de ou- tros grupos de proteção no peptídeo. A seleção de tais grupos de proteção é importante pelo fato de que o grupo não deve ser removido durante a des- proteção e acoplamento do grupo a-amino.
Por exemplo, quando está se utilizando o Boc como grupo de proteção α-amino, os seguintes grupos de proteção de cadeia lateral são adequados: porções de p-toluenossulfonila (tosila) podem ser usadas para proteger a cadeia lateral amino dos aminoácidos, tais como Lys e Arg; por- ções de acetamidometila, benzila (Bn) ou t-butilsulfonila podem ser usadas para proteger o sulfeto contendo as cadeias laterais de cisteína; éteres de benzila (Bn) podem ser usados para proteger o hidróxi contendo as cadeias laterais de serina, treonina ou hidroxiprolina; e ésteres de benzila podem ser usados para proteger o carbóxi contendo as cadeias laterais de ácido aspár- tico e ácido glutâmico.
Quando é escolhido o Fmoc para proteção de α-amino, normal- mente grupos de proteção à base de terc-butila são aceitáveis. Por exemplo, Boc pode ser usado para lisina e arginina, éter de terc-butila para serina, treonina e hidroxoprolina e éster de terc-butila para ácido aspártico e ácido glutâmico. Uma porção de trifenilmetila (tritila) pode ser usada para proteger o sulfeto contendo as cadeias laterais de cisteína.
Uma vez o alongamento do peptídeo tenha se completado, to- dos os grupos de proteção são removidos. Quando é usada uma síntese de fase líquida, os grupos de proteção são removidos da maneira que sempre for ditada pela escolha dos grupos de proteção. Esses procedimentos são bem conhecidos para aqueles versados na técnica.
Quando é usada uma síntese de fase sólida, o peptídeo é cliva- do a partir da resina, simultaneamente com a remoção dos grupos de prote- ção. Quando é usado o método de proteção de Boc na síntese, o tratamento com HF anidro contendo aditivos, tais como sulfeto de dimetila, anísol, tioa- nisol ou p-cresol a 0°C é o método preferido para divagem do peptídeo a partir da resina. A divagem do peptídeo pode ser também conseguida por meio de outros reagentes ácidos, tal como misturas de ácido trifluorometa- nossulfônico e ácido trifluoroacético. Se for usado o método de proteção Fmoc, o grupo Fmoc do terminal N é clivado com os reagentes descritos an- teriormente. Os outros grupos de proteção e o peptídeo são clivados a partir da resina usando uma solução de ácido trifluoroacético e diversos aditivos, tal como anisol, etc.
1. Síntese do Grupo de Encapsulamento B
Diferentes grupos de encapsulamento B são introduzidos da se- guinte maneira: 1.1) Quando B é um grupo arila. aralquila: os aminoácidos arilados foram preparados por meio de um dos métodos abaixo: a) Deslocamento nucleofílico direto sobre uma porção de flúor- nitro arila: Brevemente, 4-flúor-3-nitrobenzotrifluioreto (a) foi reagido com L- aminoácido (b), na presença de uma base, tal como carbonato de potássio, a 80°C, para produzir o desejado N-aril aminoácido (c); b) Acoplamento catalizado por cobre, de acordo com Ma e ou- tros (J. Am. Chem. Soc., (1998), 120, 12459-12467): Brevemente, bromo-4-fluorobenzeno (d) foi reagido com L- aminoácido (b) na presença de uma base, tal como carbonato de potássio, e uma quantidade catalítica de iodeto de cobre a 90°C, para produzir o dese- jado N-aril aminoácido (e); ou c) Deslocamento nucleofílico de um triflato por uma anilina: Brevemente, o-anisidina (f) foi reagida com triflato (g) na presen- ça de uma base, tal como 2,6-lutidina, a 90°C, para proporcionar éster benzí- lico (h). A hidrogenação com catalisador de Pd/C a 10% produziu o desejado N-aril aminoácido (i). 1.2) Quando B é um derivado de aminotiazol a) O tiocianato de Fmoc, preparado de acordo com Kearney e outros, 1998, J. Org. Chem. 63, 196, foi reagido com um resíduo de P3 pro- tegido ou com o inteiro peptídeo ou um segmento de peptídeo, para fornecer a tiouréia. b) O derivado de tiouréia é reagido com uma apropriada bromo- cetona, para fornecer o correspondente derivado de tiazol. 1.3) Quando B é R4-C(0)-, R4-S(0)2: Ο P3 protegido do peptídeo inteiro ou de um segmento de peptí- deo é acoplado a um apropriado cloreto de acila ou cloreto de sulfonila, res- pectivamente, que é comercialmente disponível ou para o qual a síntese é bem conhecida na técnica. 1.4) Quando B é R40-C(0)-; Ο P3 protegido do peptídeo inteiro ou de um segmento de peptí- deo é acoplado a um apropriado cloroformato, que é comercialmente dispo- nível ou para o qual a síntese é bem conhecida na técnica. Para os deriva- dos de Boc é usado (Boc^O.
Por exemplo: A) Ciclobutanol é tratado com fosgênio para fornecer o corres- pondente cloroformiato. B) O cloroformiato é tratado com o desejado NFb-tripetídio, na presença de uma base, tal como trietilamina, para produzir o ciclobutilcar- bamato. 1.5) Quando B é R4-N(R5)-C(0)-, ou R4-NH-C(S)-, ο P3 protegi- do do peptídeo inteiro ou de um segmento do peptídeo é tratado com fosgê- nio, seguido de amina, conforme descrito em SynLett. Fevereiro de 1995; (2); 142-144. 2. Síntese de Porções P2 2.1 Síntese dos Precursores A) Síntese dos Derivados de Haloarilmetano A preparação de halometil-8-quinolina (lld) foi feita de acordo com o procedimento de K. N. Campbell e outros, J. Am. Chem. Soc., (1946), 68, 1844.
ESQUEMA II
De forma resumida, ácido 8-quinilino carboxílico (lia) foi conver- tido ao correspondente álcool (llc) pela redução do correspondente haloge- neto de acila (llb) com um agente redutor, tal como hidreto de lítio e alumí- nio. O tratamento do álcool (llb) com o apropriado hidrohaloácido fornece o desejado derivado halogenado (lld). Uma modalidade específica desse pro- cesso é apresentada no Exemplo 1. B) Síntese dos Derivados de aril álcool Os derivados de 2-fenil-4-hidroxiquinolina (lllc) foram preparados de acordo com Giardina e outros (J. Med. Chem., (1997), 40, 1794-1807)).
ESQUEMA III R22e R2ib = alquila, OH, SH, halo, NH2, N02.
De forma resumida, benzoilacetamida (llla) foi condensada com a apropriada anilina (lllb) e a imina obtida foi ciclizada com ácido polifosfóri- co, para fornecer a correspondente 2-fenil-4-hidroxiquinolina (lllc). Uma mo- dalidade específica desse processo é apresentada no exemplo 2.
Ou alternativamente, 0 processo pode ser realizado de uma ma- neira diferente: Éster de benzoíla (llla) foi condensado com a apropriada anilina (lllb) na presença de ácido e a imina obtida foi ciclizada mediante aqueci- mento a 260-280°C, para fornecer a correspondente 2-fenil-4- hidroxiquinolina (lllc). Uma modalidade específica desse processo é apre- sentada no Exemplo 3 (composto 3e). 2.2 Síntese do P2: A) A síntese da prolina 4-substituída (em que R2 é fixado ao anel através de um átomo de carbono), com a estereoquímica conforme mostra- do: é feita conforme mostrado no Esquema IV, de acordo com os procedimentos descritos por J. Ezquerra e outros (Tetrahedron (1993), 38, 8665-8678) e C.
Pedregal e outros (Tetrahedron Lett. (1994), 35, 2053-2056).
ESQUEMA IV
Brevemente, o ácido Boc-piroglutâmico é protegido como um éster benzílico. O tratamento com uma base forte, tal como diisopropilamida de lítio, seguido da adição de um agente de alquilação (Br-R20 ou l-R20), for- nece os compostos desejados (IVe), após a redução da amida e desprote- ção do éster. B) A síntese de Q-substituído-4-(R)-hidroxiprolina: pode ser realizada usando os diferentes processos descritos abaixo. 1) Quando R20 for arila, aralquila, Het ou Het-(de alquila inferior), o processo pode ser realizado de acordo com o procedimento descrito por E.M. Smith e outros (J. Med. Chem. (1988), 31, 875-885). De forma resumi- da, a comercialmente disponível Boc-4(R)-hidroxiprolina é tratada com uma base, tal como hidreto de sódio ou terc-butóxido de potássio e o alcóxido resultante é reagido com halo-R20 (Br-R20, l-R20, etc.,) para proporcionar os compostos desejados. As modalidades específicas desse processo são a- presentadas nos Exemplos 4, 5 e 7. 2) Alternativamente, quando R20 for arila ou Het, os compostos podem também ser preparados através da reação de Mitsunobu (Mitsunobu (1981), Synthesis, Janeiro, 1-28; Rano e outros (1995), Tet. Lett. 36(22), 3779-3792; Krchnak e outros (1995), Tet. Lett. 36(5), 62193-6196; Richter e outros (1994), Tet. Lett. 35(27), 4705-4706). Brevemente, o éster de metil Boc-4-(S)-hidroxiprolina comercialmente disponível é tratado com o apropri- ado álcool arílico ou tiol na presença de tiofenilfosfina e dietilazodicarboxilato (DEAD) e o éster resultante é hidrolisado ao ácido. As modalidades específi- cas desse processo são apresentadas nos Exemplos 6 e 8.
ESQUEMAV
Alternativamente, a reação de Mitsunobu pode ser realizada na fase sólida (Esquema V). O bloco de 96 cavidades do Sintetizador Modelo 396 (Chem Tec avançado) é fornecido com frações do composto ligado à resina (Va) e uma variedade de álcoois arílicos ou tióis e apropriados rea- gentes são adicionados. Após incubação, cada produto ligado à resina (Vb) é lavado, seco e clivado a partir da resina.
Uma reação de Suzuki (Miyaura e outros (1981), Synth. Comm. 11, 513; Sato e outros (1989), Chem. Lett., 1405; Watanabe e outros (1992), Synlet., 207; Takayuki e outros (1993), J. Org. Chem. 58, 2201; Frenette e outros (1994), Tet. Lett. 35(49), 9177-9180; Guiles e outros (1996), J. Org.
Chem. 61, 5169-5171), pode também ser usada para adicionalmente funcio- nalizar o substituinte arila. 3. Síntese das Porções P1 3.1 Síntese de 4 possíveis isômeros de ácido 2-substituído 1- aminociclopropil carboxílico A síntese foi realizada de acordo com o Esquema VI.
ESQUEMA VI a) Brevemente, o malonato di-protegido (Via) e 1,2-dihaloalcano (Vlb) ou sulfato cíclico (Vlc) (sintetizado de acordo com K. Burgess e Chun- Yen KE (Synthesis (1996), 1463-1467) são reagidos sob condições básicas para fornecer o diéster (Vld). b) Uma hidrólise regiosseletiva do éster menos impedido é reali- zada para fornecer o ácido (Vle). c) Esse ácido (Vle) é submetido a um rearranjo de Curtius para proporcionar uma mistura racêmica de derivados de ácido 1- aminociclopropilcarboxílico (Vlf), com R1 sendo syn ao grupo carbonila. Uma modalidade específica dessa síntese é apresentada no Exemplo 9. d, e) Altemativamente, a formação seletiva de éster do ácido (Vle) com um apropriado halogeneto (P*CI) ou álcool (P*OH) forma diéster (Vlg) em que o éster P* é compatível com a hidrólise seletiva do éster P. A hidrólise do éster P fornece o ácido (Vlh). f) Um rearranjo de Curtius em (Vlh) fornece uma mistura racêmi- ca de derivados de ácido 1-aminociclopropilcarboxílico (Vii) com o grupo R1 sendo anti ao grupo carboxila. Uma modalidade específica dessa síntese é apresentada no Exemplo 14.
Uma síntese alternativa para a preparação de derivados (Vllf) (quando R1 for vinila e syn para o grupo carboxila) é descrita abaixo.
ESQUEMA VII O tratamento das iminas comercialmente disponíveis ou facil- mente obtidas Vila com 1,4-dihalobuteno Vllb na presença de uma base, produz, após hidrólise da imina resultante, Vllc, Vlld tendo o substituinte alila syn para o grupo carboxila. As modalidades específicas desse processo são apresentadas nos Exemplos 15 e 19. A resolução de todas as misturas enantioméricas acima no car- bono 1 (Vle e Vlld) pode ser realizada via: 1) Separação enzimática (Exemplos 13, 17 e 20); 2) Cristalização com um ácido quirálico (Exemplo 18); ou 3) Derivação química (Exemplo 10).
Em seguida à resolução, a determinação da estereoquímica ab- soluta pode ser realizada conforme apresentado no Exemplo 11. A resolução enantiomérica e a determinação estereoquímica podem ser realizadas da mesma maneira que as misturas enantioméricas no carbono 1, onde o substituinte em C2 é anti para o grupo carboxila (Vii). 3.2 Síntese do Ácido 1-aminociclobutil carboxílico A síntese do ácido 1,1-aminociclobutanocarboxílico é realizada de acordo com "Kavin Douglas; Ramaligam Kondareddiar; Woodard Ro- nald", Synth. Commun. (1985), 15(4), 267-72.
ESQUEMA VIII
Brevemente, o tratamento do composto Vllla com uma base na presença de Vlllb proporciona o correspondente derivado de ciclobutila VII- Ic. A hidrólise dos grupos isocianato e éster de Vlllc sob condições acídicas (HCI) produz o sal de cloridrato do ácido 1-amino-ciclobutilcarboxílico Vllld. O ácido carboxílico é depois esterificado sob metanol em HCI. Uma modali- dade específica dessa esterificação é descrita no Exemplo 21. 3.3 Síntese do ácido 2-substituído 1-aminociclobutil carboxílico ESQUEMA IX a) Um derivado de éster de glicina protegido, tal como uma imina (IXa), é alquilado com uma eletrofila homoalílica (IXb), usando uma base apropriada, tal como um hidreto de metal, hidróxido ou alcóxido. Grupos de partida úteis em (IXb) incluem halogênios (X = Cl, Br, I) ou ésteres de sulfo- nato (mesilato, tosilato ou triflato). A funcionalidade do álcool alílico em (IXb) é protegida com grupos de proteção hidroxila, que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, acetato, silila, acetais). b) Numa segunda etapa, a função hidroxila do derivado monoal- quilado (IXc) é desprotegida e convertida em uma adequada função eletrofí- lica X, tal como descrito acima para o composto (IXb). c) A ciclização de (IXd) para o derivado de ciclobutano (IXe) é realizada mediante tratamento com uma base (hidretos de metal, alcóxidos), seguido de hidrólise, usando ácidos minerais aquosos e neutralização com uma base branda. Nesse estágio, isômeros syn e anti de (IXe) podem ser separados por meio de cromatografia flash. d) Opcionalmente, a dupla ligação em (IXe) pode também ser hidrogenada sob condições padrões, para produzir o correspondente deriva- do saturado (IXf). A invenção compreende ainda um processo para preparação de um análogo de peptídeo de fórmula (I), onde P1 é um resíduo de ácido ami- nociclopropil carboxílico substituído, compreendendo a etapa de: - acoplar um peptídeo selecionado do grupo que consiste de: APG-P3-P2; ou APG-P2; - com um intermediário P1 de fórmula: onde Ri é Ci_6 alquila, cicloalquila ou C2-6 alquenila, todos opcionalmente substituídos com halogênio, CPG é um grupo de proteção carboxila e APG é um grupo de proteção amino e P3 e P2 são como definidos acima. A invenção compreende ainda um processo para preparação de: 1) um análogo de peptídeo inibidor da protease de serina; 2) um análogo de peptídeo inibidor da protease NS3 de HCV, esse processo compreendendo a etapa de: - acoplar um aminoácido, peptídeo ou fragmento de peptídeo (adequadamente protegidos), com um intermediário P1 de fórmula: onde Ri é C1-6 alquila, C3.7 cicloalquila ou C2-6 alquenila, todos opcionalmen- te substituídos com halogênio, e CPG é um grupo de proteção carboxila.
Portanto, a invenção compreende um processo para preparação de: 1) um análogo de peptídeo inibidor de protease; ou 2) um análogo de peptídeo inibidor da protease de serina, esse processo compreendendo a etapa de: - acoplar um aminoácido, peptídeo ou fragmento de peptídeo (adequadamente protegidos), com um intermediário de fórmula: onde CPG é um grupo de proteção carboxila. A invenção também compreende o uso de um intermediário P1 de fórmula: onde Ri é C1-6 alquila, cicloalquila ou C2-s alquenila, todos opcionalmente substituídos com halogênio, para a preparação de: 1) um análogo de peptídeo inibidor da protease de serina; ou 2) um análogo de peptídeo inibidor da protease NS3 de HCV A invenção também compreende o uso de um intermediário de fórmula: onde CPG é um grupo de proteção carboxila, para a preparação de: 1) um análogo de peptídeo inibidor da protease; ou 2) um análogo de peptídeo inibidor da protease de serina. A invenção também compreende o uso de um intermediário P1 de fórmula: onde Ri é C1.6 alquila, cicloalquila ou C2-e alquenila, todos opcionalmente substituídos com halogênio, para a preparação de um composto de fórmula (I), conforme definido acima.
Finalmente, a invenção também compreende o uso de um aná- logo de prolina de fórmula: onde R2ia é C1-6 alquila; alcóxi; tioalquila inferior; halo; grupos amino opcionalmente mono-substituídos com Ci_6 alquila; Οβ ou C10 arila, C7.16 a- ralquila ou Het opcionalmente substituídos com R22, onde R22 é alquila, C1-6 alcóxi; grupo amido; amida (de alquila inferior); amino opcionalmente mono- ou di-substituído com C1-6 alquila, ou Het; e R21B é preferencialmente C1-6 alquila, Ci.6 alcóxi, amino, diamino (de alquila inferior), amida (de alquila inferior), N02, OH, halo, trifluorometila, ou carboxila; para a síntese de: 1) um análogo de peptídeo inibidor da protease de serina; 2) um análogo de peptídeo inibidor da protease NS3 de HCV, ou 3) um análogo de peptídeo de fórmula (I), conforme definido a- cima.
EXEMPLOS A presente invenção é ilustrada em maiores detalhes pelos se- guintes não-limitativos exemplos.
As temperaturas são dadas em graus Celsius. Os percentuais de solução expressam uma relação de peso para volume e as proporções de solução expressam uma relação de volume para volume, a menos que de outro modo indicado. Os espectros dos ensaios de ressonância magnética nuclear (RMN) foram registrados em um Espectrômetro Bruker de 400 MHz; os desvios químicos (δ) são registrados em partes por milhão. A cromatogra- fia flash foi realizada em sílica gel (Si02) de acordo com a técnica de croma- tografia flash de Still (W.C. Still e outros, J. Org. Chem. (1978), 43, 2923).
As abreviações usadas nos exemplos incluem: Bn: benzila; Boc: terc-butiloxicarbonila {Me3C0C(0)J; BSA: albumina de soro bovino; CHAPS: 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamônio]-1 -propanossulfonato; DBU: 1,8-diaza- biciclo[5.4.0)undec-7-eno; CH2CI2 = DCM: cloreto de metileno; DEAD: dieti- lazodicarboxilato; DIAD: diisopropilazodicarboxilato; DIEA: diisopropiletilami- na; DIPEA: diisopropiletilamina; DMAP: dimetilaminopiridina; DCC: 1,3- diciclohexilcarbodiimida; DME: 1,2-dimetiloxietano; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; DTT: ditiotreitol ou treo-1,4-dimercapto-2,3- butanodiol; DPPA: difenilfosforil azida; EDTA: ácido etilenodiaminotetraacéti- co; Et: etila; EtOH: etanol; EtOAc: acetato de etila; Et20: éter dietílico; HATU: [0-7-azabenzotriazol-1-il]-1,1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato]; HPLC: cromatografia líquida de alta performance; MS: espectrometria de massa (MALDI-TOF: Matriz de lonização por Disorção Auxiliada por Laser - Tempo de Fuga; FAB: Bombardeio Rápido de Átomo); LAH: hidreto de lítio e alumí- nio; Me: metila; MeOH: metanol; MES: ácido (2-{N-morfolino}etano-sulfônico;
NaHMDS: bis(trimetilsilíl)amida de sódio; NMM: N-metilmorfolina; NMP: N- metilpirrolidina; Pr: propila; Succ: 3-carboxipropanoíla; PNA: 4-nitrofenila- mino ou p-nitroanilida; TBAF: fluoreto de tetra-n-butilamônio; TBTU: tetrafluo- roborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio; TCEP: cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofura- no; TIS: triisopropilsilano; TLC: cromatografia de camada fina; TMSE: trime- tilsililetila; Tris/HCI: cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano. BLOCOS DE CONSTRUÇÃO DE P2 EXEMPLO 1 Síntese de bromoetil-8-quinolina (1) Ao comercialmente disponível ácido 8-quinolino carboxílico (2,5 g, 14,4 mmoles), foi adicionado cloreto de tionila puro (10 ml, 144 mmoles).
Essa mistura foi aquecida a 80°C por 1 hora antes do excesso de cloreto de tionila ser destilado sob pressão reduzida. Ao sólido amarronzado resultante foi adicionado EtOH absoluto (15 ml), que foi aquecido a 80°C por 1 hora, antes de ser concentrado a vácuo. O resíduo foi dividido entre EtOAc e NaHC03 aquoso saturado e a fase orgânica foi seca (MgS04), filtrada e pos- teriormente concentrada para proporcionar um óleo amarronzado (2,8 g).
Esse material (ca. 14,4 mmoles) foi adicionado gota-a-gota, durante 35 mi- nutos, a uma suspensão de LAH (0,76 g, 20,2 mmoles)/Et20, que foi resfria- da a -60°C. A mistura reacional foi lentamente aquecida a -35°C, durante 1,5 hora, antes da reação se completar. A reação foi resfriada rapidamente com MgSO4.10H2O, lentamente durante 30 minutos e depois com THF aquoso. A mistura foi dividida entre Et20 e NaHC03 aquoso a 10%. A fase orgânica foi seca (MgS04), filtrada e concentrada, para proporcionar um sólido amarela- do (2,31 g, 80% em 2 etapas) correspondente ao álcool. O álcool (2,3 g, 11,44 mmoles) foi dissolvido em AcOH/HBr (20 ml, solução a 30% da Aldri- ch) e aquecido a 70°C por 2,5 h. A mistura foi concentrada a vácuo até a secura, dividida entre EtOAc (100 ml) e NaHC03 aquoso saturado, antes de ser seca (MgS04), filtrada e concentrada, para proporcionar o composto (1) desejado, na forma de um sólido amarronzado (2,54 g, 100%). EXEMPLO 2 Síntese de 2-fenil-4-hidroxiquinolina (2) Etil benzoilacetato comercialmente disponível (6,00 g, 31,2 mmoles) foi aquecido a 85°C (tubo vedado) em 75 ml de NH4OH a 30% por 2 horas. O sólido formado após resfriamento foi filtrado e refluxado em água por 2 horas. A solução foi extraída três vezes com CH2CI2. As camadas or- gânicas foram combinadas, secas com MgS04, filtradas e concentradas. O resíduo amarelo foi submetido à cromatografia flash em sílica gel, com elui- ção em EtOAc:hexano (3:7), para proporcionar a correspondente amida co- mo um sólido branco, 1,60 g, 31% de rendimento.
Essa amida (250 mg, 1,53 mmol) foi refluxada usando um apare- lho Dean-Stark com anilina (1,43 mg, 1,53 mmol) e anilina*HCI (10 mg, 0,08 mmol) em tolueno (10 ml) por 16 horas. A solução foi concentrada para pro- duzir um óleo marrom, que foi misturado com ácido polifosfórico (2 g) e a- quecido a 135°C por 20 minutos. A mistura reacional foi vertida em água e ajustada ao pH 8 com NaOH 5 Μ. A suspensão aquosa foi extraída duas vezes com acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, lava- das com salmoura, secas com MgS04, filtradas e concentradas. O resíduo foi submetido à cromatografia flash em sílica gel, com eluição de MeOH a 3% em acetato de etila, para proporcionar 2-fenil-4-hidroxiquinolina (2), 67 mg, 20% de rendimento. 1H RMN (DMSO-d6) δ 8,11 (d, J= 7 Hz, 1 H), 7,86- 7,83 (m, 2 H), 7,77 (d, J= 8 Hz, 1 H), 7,68 (dd, J= 8,7 Hz, Hz, 1 H), 7,61-7,58 (m, 3 H), 7,35 (dd, J=8,7 Hz, 1 H), 6,34 (s, 1 H). EXEMPLO 3 Síntese de 4-hidróxi-2-fenil-7-metoxiauinolina (3) 4-hidróxi-2-fenil-7-metoxiquinolina (e): Uma solução de etil benzoilacetato (b) (100,0 g, 0,52 mol), m- anisidina (a) (128,1 g, 1,04 mol) e HCI 4N/dioxano (5,2 ml) em tolueno (1,0 L) foi refluxada durante 6,25 h em um aparelho de Dean-Stark. A solução de tolueno resfriada foi sucessivamente lavada com HCI aquoso a 10% (2 x 300 ml), NaOH 1N (2 x 300 ml), H20 (300 ml) e salmoura (150 ml). A fase de to- lueno foi seca (MgS04), filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para proporcionar uma mistura de éster (c) e amida (d) (1,2:1,0) (144,6 g, 45%/38% de produto bruto), na forma de um óleo marrom escuro. O óleo bruto foi aquecido a 280°C por 80 minutos, enquanto destilava o EtOH gera- do. O sólido escuro resfriado obtido foi triturado com CH2CI2 (200 ml). A sus- pensão foi filtrada e o sólido resultante lavado com CH2CI2 , para proporcio- nar (e) (22,6 g, 17% de (a)) como um sólido bege: 1H RMN (DMSO-de) δ 8,00 (d, J= 9,0 Hz, 1 H), 7,81-8,82 (m, 2 H), 7,57-7,59 (m, 3 H), 7,20 (d, J=2,2 Hz, 1 H), 6,94 (dd, J=9,0, 2,2 Hz, 1 H), 6,26 (s, 1 H), 3,87 (s, 3 H). 4-cloro-2-fenil-7-metoxiauinolina (3) Uma suspensão de (e) (8,31 g, 33,1 mmoles) em POCI3 (90 ml) foi aquecida ao refluxo por 2 horas (solução transparente obtida após aque- cimento). A mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida. O resí- duo foi dividido entre NaOH 1N (exotérmico, NaOH 10N adicionado para manter o pH alto) e EtOAc (500 ml). A camada orgânica foi lavada com H20 (100 ml) e salmoura (100 ml), depois foi seca (MgS04), filtrada e concentra- da sob pressão reduzida, para proporcionar (3) (8,60 g, 96%),como um sóli- do amarelo pálido. 1H RMN (DMSO-d6) δ 8,28-8,30 (m, 2 H), 8,20 (s, 1 H), 8,10 (d, J=9,1 Hz, 1 H), 7,54-7,58 (m, 3 H), 7,52 (d, J= 2,5 Hz, 7,38 (dd, J=9,1 2,5 Hz, 1 H), 3,98 (s, 3 H). Essa reação foi repetida três vezes e pro- porcionou sempre 96-98% de rendimento, que é significativamente maior que o rendimento de 68% relatado no J. Med. Chem. 1997, 40, 1794. EXEMPLO 4 Síntese de Boc-4(RMnaftalen-1-ilmetóxi)prolina (4): O produto comercialmente disponível Boc-4(R)-hidroxiprolina (5,00 g, 21,6 mmoles) foi dissolvido em THF (100 ml) e resfriado a 0°C. Hi- dreto de sódio (dispersão a 60% em óleo, 1,85 g, 45,5 mmoles) foi adiciona- do na forma de porções durante 10 minutos e a suspensão foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A seguir, foi adicionado 1- (bromometil)naftaleno (8,00 g, 36,2 mmoles) (preparado conforme descrito em E.A. Dixon e outros, Can. J. Chem., (1981), 59, 2629-2641) e a mistura foi aquecida ao refluxo por 18 horas. A mistura foi vertida em água (300 ml) e lavada com hexano. A camada aquosa foi acidificada com HCI aquoso a 10% e extraída duas vezes com acetato de etila. As camadas orgânicas fo- ram combinadas e lavadas com salmoura, secas (MgS04), filtradas e con- centradas. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia flash (49:49:2, hexano:acetato de etila:ácido acético) para proporcionar o composto do título como um óleo incolor (4,51 g, 56% de rendimento). 1H RMN (DMSO-de) δ indicou a presença de dois rotâmeros: δ 8,05 (m, 1 H), 7,94 (m, 1 H), 7,29 (d, J=14 Hz, 1 H), 7,55-7,45 (m, 4H), 4,96 (m, 2 H), 4,26 (br. s, 1 H), 4,12 (dd, J=J=8 Hz, 1 H), 3,54-3,42 (m, 2 H), 2,45-2,34 (m, 1 H)< 2,07-1,98 (m, 1 H), 1,36 (s, (3/9) 9H), 1,34 (s, (6/9)m 9H). EXEMPLO 5 Síntese de Boc-4(f?)-(8-quinolino-metóxi)prolina (5): O composto Boc-4(R)-hidroxiprolina (1,96 g, 8,5 mmoles) em THF anidro (20 ml) foi adicionado a uma suspensão de NaH (1,4 g, 60% em óleo, 34 mmoles) em THF (100 ml). Essa mistura foi agitada 30 minutos an- tes do bromometil-8-quinolina do Exemplo 1 (2,54 g, 11,44 mmoles) ser adi- cionado em THF (30 ml). A mistura reacional foi aquecida a 70°C (5 h) antes do excesso de NaH ser destruído cuidadosamente com THF aquoso. A rea- ção foi concentrada a vácuo e o material resultante foi dissolvido em EtOAc e H20. A fase básica aquosa foi separada e acidificada com HCI aquoso a 10% para um pH de aproximadamente 5, antes de ser extraída com EtOAc (150 ml). A fase orgânica foi seca (MgS04), filtrada e concentrada, para pro- porcionar um óleo marrom. A purificação através de cromatografia flash (e- luente: MeOH 10%/CHCl3) proporcionou o desejado composto (5) na forma de um sólido amarelo pálido (2,73 g, 86%). HPLC (97,5%); 1H RMN (DMSO- d6) δ mostra populações de rotâmeros em uma proporção de 6:4, δ 12-14 (bs, 1 H), 8,92 (2 x d, J=4,14 e 4,14 Hz, 1 H), 8,38 (2 x d, J=8,27 e 8,27 Hz, 1 H), 7,91 (d, J=7,94 Hz, 1 H), 7,77 (d, J=7,0 Hz, 1 H), 7,63-7,54 (m, 2H), 5,14 (2 x s, 2 H), 4,32-4,29 (m, 1 H), 4,14-4,07 (m, 1 H), 3,52-3,44 (m, 2 H), 2,43- 2,27 (m, 1 H), 2,13-2,04 (m, 1 H), 1,36 e 1 34 (2 x 9H). EXEMPLO 6 Preparação de Boc-4(R)-(7-cloroquinolino-4-oxo)prolina (6) Os compostos comercialmente disponíveis éster metílico de Boc-4(S)-hidroxiprolina (500 mg, 2,04 mmoles) e 7-cloro-4-hidroxiquinolina (440 mg, 2,45 mmoles) foram colocados em THF anidro (10 ml) a 0°C. Foi adicionado trifenilfosfina (641 mg, 2,95 mmoles), seguido de uma lenta adi- ção de DIAD (426 mg, 2,45 mmoles). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 20 horas. A mistura reacional foi depois concentrada, tomada em acetato de etila e extraída três vezes com HCI 1N. A fase aquosa foi ba- sificada com Na2C03 e extraída duas vezes com acetato de etila. As cama- das orgânicas foram combinadas, secas com MgS04, filtradas e concentra- das, para proporcionar um óleo amarelo. O óleo foi purificado poe meio de cromatografia flash para fornecer o éster metílico como um sólido branco, 498 mg, 58% de rendimento.
Esse éster metílico (400 mg, 0,986 mmol) foi hidrolisado com hidróxido de sódio aquoso 1M (1,7 ml, 1,7 mmol) em metanol (4 ml), a 0°C, durante 3 horas. A solução foi concentrada para remover o metanol e neutra- lizada com HCI aquoso 1M. A suspensão foi concentrada à secura e tomada em metanol (20 ml), os sais foram filtrados e o filtrado concentrado para pro- porcionar o composto desejado (6) como um sólido branco, 387 mg, rendi- mento quant. 1H RMN (DMSO-d6) δ (mistura de rotâmeros 1:1) δ 8,74 (d, J = 5 Hz, 1 H), 8,13-8,09 (m, 1 H), 7,99 e 7,98 (s, 1H), 7,58 (d, J=9 Hz, 1 H), 7,02 (d, J = 5 Hz, 1 H), 5,26-5,20 (m, 1 H), 4,10-4,01 (m, 1 H), 3,81-3,72 (m, 1 H), 3,59 (dd, J= 12, 10 Hz, 1 H), 2,41-2,31 (m, 2 H), 1,34 e 1,31 (s, 9H). EXEMPLO 7 Síntese de Boc-4(ffl-(2-fenil-7-metoxiauinolino-4-oxo)prolina (7) Boc-4(R)-(2-fenil-7-metoxiquinolino-4-oxo) prolina (7): Terc-butóxido de potássio (8,16 g, 72,7 mmoles) foi adicionado em pequenas porções, durante 15 minutos, a uma solução de Boc-4(R)- hidroxiprolina (6,73 g, 29,1 mmoles) em DMSO (83 ml), mantida a 25°C. A mistura foi agitada a 25°C durante 1,5 horas. Foi adicionado à mistura rea- cional, cloro-2-fenil-7-metoxiquinolina (3) (8,61 g, 32,0 mmoles), em 4 por- ções, durante 15 minutos. A mistura reacional foi agitada a 25°C por 19 ho- ras. A suspensão resultante foi vertida em H20 (650 ml) e a mistura foi lava- da com Et20 (3 x 150 ml) para remover o excesso de cloroquinolina (EtOAc foi posteriormente encontrado como sendo mais eficiente). A camada aquo- sa foi acidificada com HCI aquoso 1N (38 ml do 1,5 equiv. calculado, 43,6 ml) para o pH 4-5. O sólido branco que se precipitou foi recuperado por fil- tração. O sólido úmido foi seco sob pressão reduzida com P205, para pro- porcionar o derivado de prolina 7 (12,6 g, 91%, contém 2,3% peso/peso de DMSO) como um sólido bege. 1H RMN (DMSO-d6) δ (mistura de rotâmeros 2:1) 8,27 (d, 7,0 Hz, 2 H), 8,00, 7,98 (2d, J = 9,2, ~9,2 Hz, 1 H), 7,48-7,56 (m, 3 H), 7,45, 7,43 (2s, 1 H), 7,39 (d, J=2,5 Hz, 1 H), 7,17 (dd, J=9,2, 2,5 Hz, 1 H), 5,53-5,59 (m, 1 H), 4,34-4,41 (m, 1 H), 3,93 (s, 3 H), 3,76 (amplo s, 2H), 2,63-2,73 (m, 1 H), 2,32-2,43 (m, 1 H), 1,36, 1,33 (2s, 9H). EXEMPLO 8 Síntese de Boc-4(f?)-(2-fenil-6-nitroquinolino-4-oxo)prolina (8) O composto dietil azodicarboxilato (0,77 ml, 4,89 mmoles) foi adicionado gota a gota a uma solução agitada de trifenilfosfina (1,28 g, 4,88 mmoles) em 15 ml de tetrahidrofurano, a 0°C. Após 30 minutos de agitação sob nitrogênio, foi adicionada uma solução de éster metílico de Boc-4(S)- hidroxiprolina (1,00,4,08 mmoles) em 5 ml de tetrahidrofurano, seguido de uma suspensão do comercialmente disponível 6-nitro-2-fenil-4-quinolinol (1,30 g, 4,88 mmoles) em 10 ml do mesmo solvente. A mistura vermelha foi agitada durante 15 minutos a 0°C e à temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi evaporado a vácuo. O óleo restante foi diluído em acetato de etila e lavado duas vezes com bicarbonato de sódio, uma vez com água e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca (MgS04), filtrada e eva- porada a vácuo. O resíduo foi cromatografado em sílica gel (70:30 v/v, hexa- no-acetato de etila) produzindo o éster metílico desejado como um sólido amarelo claro (1,70 g, 85%). 1H RMN (DMSO-d6) δ ratômaros = 3:7 δ 9,03 (d, J=2,5 Hz, 1 H), 8,46 (dd, J=9,2 Hz, 1 H), 8,18 (d, J=9 Hz, 1 H), 8,14-8,07 (m, 2 H), 7,59-7,50 (m, 3H), 7,19 (s, 1 H), 5,39- 5,30 (m, 1H), 4,67 (t, J=8 Hz, 0,3H), 4,61 (t, = 8 Hz, 07H), 4,07-4,01 (m, 2H), 3,81 (s, 3 H), 2,89-2,73 (m, 1 H), 2,55-2,47 (m, 1 H), 1,49 (s, 2,7H), 1,45 (s, 6,3H). A uma solução de éster metílico (503 mg, 1,02 mmol) em uma mistura de THF:H20 (10:4 ml), foi adicionado hidróxido de lítio monohidrata- do (85 mg, 2,05 mmoles). A seguir, foram adicionados 2 ml de MeOH a fim de se obter uma solução homogênea. Um precipitado branco resultou em 30 minutos. A suspensão resultante foi agitada à temperatura ambiente por um período adicional de 6 horas. A mistura reacional foi diluída com uma solu- ção aquosa de ácido cítrico a 10% e extraída com acetato de etila. A cama- da orgânica foi seca (MgS04), filtrada e evaporada a vácuo, para produzir 416 mg (85%) do ácido desejado (8). 1H RMN (DMSO-d6) δ 8,92-8,87 (m, 1H), 8,47 (dd, J=9,3Hz, 1 H), 8,38-8,32 (m, 2H), 8,19 (d, J=9 Hz, 1 H), 7,77 (s, 1 H), 7,62-7,55 (m, 3H), 5,73-5,66 (m, 1 H), 4,41) (t, J=8 Hz, 1 H), 3,89-3,76 (m, 2H), 2,83-2,72 (m, 1 H), 2,47-2,35 (m, 1,38 (s, 9H). BLOCOS DE CONSTRUÇÃO DE P1 EXEMPLO 9 A) Síntese da mistura de (1R, 2R)/(1S, 2R) ácido 1-amino-2-etilciclopropil carboxílico a) A uma suspensão de cloreto de benziltrietilamônio (21,0 g, 92,19 mmoles) em uma solução aquosa de NaOH a 50% (92,4 g em 185 ml de H20), foram sucessivamente adicionados di-terc-butilmalonato (20,0 g, 92,47 mmoles) e 1,2-dibromobutano (30,0 g, 138,93 mmoles). A mistura rea- cional foi vigorosamente agitada durante a noite à temperatura ambiente e depois foi adicionado uma mistura de gelo e água. O produto bruto foi extra- ído com CH2CI2 (3x) e seqüencialmente lavado com água (3x) e salmoura. A camada orgânica foi seca (MgS04), filtrada e concentrada. O resíduo foi submetido à cromatografia flash (7 cm, 2 a 4% de Et20 em hexano) para produzir o derivado de ciclopropano desejado (9c) (19,1 g, 70,7 mmoles, 76% de rendimento). 1H RMN (CDCI3) δ 1,78-1,70 (m, 1 H), 1,47 (s, 9H), 1,46 (s, 9H), 1,44-1,39 (m, 1 H), 1,26-1-64 (m, 3H), 1,02 (t, 3H, J=7,6 Hz). b) A uma suspensão de terc-butoxido de potássio (6,71 g, 59,79 mmoles, 4,4 eq.) em éter anidro (100 ml) a 0°C, foi adicionado H2O (270 μΙ, 15,00 mmoles, 1,1 eq.). Após 5 minutos, 0 diéster (9c) (3,675 g, 13,59 mmo- les) em éter (10 ml) foi adicionado à suspensão. A mistura reacional foi agi- tada durante a noite à temperatura ambiente, depois vertida em uma mistura de gelo e água e lavada com éter (3x). A camada aquosa foi acidificada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10%, a 0°C e extraída com AcOEt (3x). A camada orgânica combinada foi sucessivamente lavada com água (2x) e salmoura. Após 0 tratamento usual (Na2S04, filtração, concentração), o ácido desejado (9d) foi isolado como um óleo amarelo claro (1,86 g, 8,68 mmoles, 64% de rendimento). 1H RMN (CDCI3) δ 2,09-2,01 (m, 1 H), 1,98 (dd, J=3,8, 9,2 Hz, 1 H), 1,81-1,70 (m, 1 H), 1,66 (dd, J=3,0, J=8,2 Hz, 1 H), 1,63-1,56 (m, 1 H), 1,51 (s, 9H), 1,0 (t, J=7,3 Hz, 3H). c) Ao ácido (9d) (2,017 g, 9,414 mmoles) em benzeno anidro (32 ml) foram sucessivamente adicionados Et3N (1,50 ml, 10,76 mmoles, 1,14 eq.) e DPPA (2,20 ml, 10,21 mmoles, 1,08 eq.)· A mistura reacional foi reflu- xada por 3,5 horas, depois foi adicionado 2-trimetilsililetanol (2,70 ml, 18,84 mmoles, 2,0 eq ). O refluxo foi mantido durante a noite e depois a mistura reacional foi diluída com Et2Ü e sucessivamente lavada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10%, água, NaHC03 aquoso saturado, água (2x) e salmoura. A pós o tratamento usual (MgS04, filtração, concentração), o resí- duo foi purificado por cromatografia flash (5 cm, AcOEt 10%/hexano) para produzir o carbamato desejado (9e) (2,60 g, 7,88 mmoles, 84% de rendimen- to) como um óleo amarelo claro. 1H RMN (CDCI3) δ 5,1 (bs, 1 H), 4,18-4,13 (m, 2H), 1,68-1,38 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,24-1,18 (m, 1 H), 1,00-0,96 (m, 5H), 0,03 (s, 9H). d) Ao carbamato (9e) (258 mg, 0,783 mmol) foi adicionado uma solução de TBAF 1,0 M em THF (940 μΙ, 0,94 mmol, 1,2 eq.). Após 4,5 ho- ras, uma quantidade adicional de TBAF 1,0 M foi adicionada (626 μΙ, 0,63 mmol, 0,8 eq.). A mistura reacional foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, refluxada por 30 minutos e depois diluída com AcOEt. A solução foi sucessivamente lavada com água (2x) e salmoura. Após o tratamento usual (MgS04, filtração e concentração), a amina desejada (9f) foi isolada (84 mg, 0,453 mmol, 58% de rendimento) como um líquido amarelo claro. 1H RMN (CDCIs) δ 1,96 (bs, 2 H), 1,60-1,40 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 1,31-1,20 (m, 1H), 1,14 (dd, J =4,1, 7,3 Hz, 1 H), 1,02 (dd, J=4,1, 9,2 Hz, 1H), 0,94 (t, J=7,3 Hz, 3H). EXEMPLO 10 Resolução Química do t-butil-dR 2R)/(1S. 2R) 1-amino-2-etilciclopropil car- boxilato (do Exemplo 9): O composto (9e) do Exemplo 9 (8,50 g, 25,86 mmoles) foi trata- do com TBAF/THF 1M (26 ml), sob refluxo, por 45 minutos. A mistura rea- cional resfriada foi diluída com EtOAc, lavada com água (3x) e salmoura (1x), depois seca (MgS04), filtrada e evaporada para proporcionar a amina livre como um óleo amarelo claro. A amina livre foi dissolvida em CH2CI2 (120 ml), enquanto NMM (8,5 ml, 77,57 mmoles), composto 4 (Exemplo 4) (10,08 g, 27,15 mmoles) e HATU (11,79 g, 31,03 mmoles) foram adicionados sucessivamente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente du- rante a noite e depois processada conforme descrito anteriormente. A mistu- ra bruta diastereomérica foi separada por cromatografia flash (eluente: he- xano:Et20, 25:75) para proporcionar o dipeptídeo 10a (o ponto de eluição menos polar) como uma espuma branca (4,42 g, 64% de rendimento teóri- co), e 10b (o ponto de eluição mais polar) como uma espuma cor de marfim (4 g, 57% de rendimento teórico). Nesse momento, ambos os isômeros fo- ram separados mas a estereoquímica absoluta ainda não foi conhecida. EXEMPLO 11 Determinação da estereoquímica absoluta dos compostos 10a e 10b pela correlação com o conhecido t-butil (1R-amino-2R-etilciclopropil) carboxilato Comparação direta por meio de TLC, HPLC e RMN O Professor A. Charette, da Universidade de Montreal, forneceu o composto 11a tendo a estereoquímica absoluta conforme mostrado, que foi determinada por cristalografia de raios X (J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 12721). O composto 11a (13,2 mg, 0,046 mmol) foi dissolvido em HCI/EtOAc 1M (240 μΙ) e agitado aproximadamente 48 horas. A mistura foi evaporada à secura para proporcionar o composto 11b como uma pasta amarelo claro e foi acoplado ao composto 4 (18 mg, 0,049 mmol), conforme descrito no E- xemplo 10, usando NMM (20,3 μΙ, 0,185 mmol) e HATU (21,1 mg, 0,056 mmol) em CH2CI2. O material bruto foi purificado por meio de cromatografia flash (eluente: hexano:Et20; 50:50), para proporcionar o peptídeo (11c) na forma de um óleo (7,7 mg; 31%). Mediante comparação por TLC, HPLC e RMN, o dipeptídeo (11c) foi encontrado como sendo idêntico ao composto menos polar (10a) obtido no Exemplo 10, dessa forma, identificando a este- reoquímica absoluta de (10a) como (1R, 2R). EXEMPLO 12 Preparação do ácido (1R, 2R)/(1S, 2R) 1-Boc-amino-2-etilciclopropil- carboxílico (12a) O carbamato (9e) do Exemplo 9 (2,6 g, 7,88 mmoles) foi agitado por 40 minutos em TFA, a 0°C. A mistura foi depois concentrada e diluída com THF (10 ml). Uma solução aquosa de NaOH (700 mg, 17,5 mmoles em 8,8 ml de água) foi adicionada, seguido de uma solução em THF (13 ml) de (Boc)20 (2,06 g, 9,44 mmoles, 1,2 eq.). A mistura reacional foi agitada du- rante a noite à temperatura ambiente (0 pH foi mantido em 8 mediante adi- ção de uma solução aquosa de NaOH a 10% caso necessário), depois diluí- da com H20, lavada com Et20 (3x) e acidificada a 0°C com uma solução a- quosa de ácido cítrico a 10%. A camada aquosa foi extraída com EtOAc (3x) e sucessivamente lavada com H20 (2x) e salmoura. Após o tratamento usual (MgS04, filtração e concentração) o desejado aminoácido Boc-protegido (12a) (788 mg, 3,44 mmoles, 44% de rendimento) foi isolado. 1H RMN (CD- Cl3) δ 5,18 (bs, 1 H), 1,64-1,58 (m, 2H), 1,55-1,42 (m, 2 H), 1,45 (s, 9H), 1,32-1,25 (m, 1H), 0,99 (t, 3H, J=7,3 Hz).
Preparação do éster metílico do ácido (1R, 2R)/(1S, 2R) 1-Boc-amino-2- etilciclopropilcarboxílico (12b) O derivado Boc (12a) (0,030 g, 1,31 mmol) foi dissolvido em Et20 (10 ml) e tratado com diazometano recém preparado em Et20 a 0°C, até a cor amarela de um ligeiro excesso de diazometano ter permanecido.
Após agitação por 20 minutos à temperatura ambiente, a mistura reacional foi concentrada à secura para proporcionar (12b) como um óleo claro incolor (0,32 g, 100%). 1H 1H RMN (CDCI3) δ 5,1 (bs, 1H), 3,71 (s, 3H), 1,62-1,57 (m, 2H), 1,55 (s, 9H), 1,53-1,43 (m, 1 H), 1,28-1,21 (m, 2H), 0,95 (t, J=7,3 Hz, 3H). EXEMPLO 13 Resolução Enzimática de metil (1R. 2R)/(1S. 2R) Boc-1-amino-2- etilciclopropil carboxilato * Análise por meio de HPLC usando coluna Chiracel® OD-H ** Outros ésteres também aceitáveis (por exemplo, Et) a) A mistura enantiomérica de éster metílico do ácido (1S, 2R)/(1S, 2R) 1-Boc-amino-2-etilcarboxílico do Exemplo 10 (0,31 g, 1,27 mmol) foi dissolvida em acetona (3 ml) e depois diluída com água (7 ml) du- rante uma rápida agitação. O pH da solução foi ajustado para 7,5 com NaOH aquoso 0,05 M, antes de ser adicionado Alcalase® [2,4 I, extrato da Novo Nordisk Industriais] (300 mg). Durante a incubação, o pH foi estabilizado com NaOH e um pH de partida foi estabelecido para monitorar a adição da solução de NaOH. Após 40 horas, a mistura foi diluída com EtOAc e H20 (com 5 ml de NaHCOs saturado) e as fases separadas. A fase aquosa foi acidificada com HCI aquoso a 10% e extraída com EtOAc, seca (MgS04), filtrada e concentrada para proporcionar o ácido (13a) (48,5 mg). A estereo- química absoluta foi determinada usando a correlação descrita nos Exem- plos 10 e 11. b) O tratamento de uma fração do ácido (13a) com diazometano em Et20, para proporcionar o éster metílico, seguido de análise por HPLC usando uma coluna quirálica [Chiralcel® OD-H, 2,5%, isopropanol/hexano, isocrático] mostrou uma razão de 51:1 do isômero (S, R). EXEMPLO 14 Síntese do ácido (1R, 2S)/(1S. 2S) 1-amino-2-etilciclopropilcarboxílico Partindo do ácido (9d) descrito no Exemplo 9: c) Ao composto (9d) (1,023 g, 4,77 mmoles) em CH3CN (25 ml), foram sucessivamente adicionados DBU (860 μΙ, 5,75 mmoles, 1,2 eq.) e brometo de aliia (620 μΙ, 7,16 mmoles, 1,5 eq.). A mistura reacional foi agita- da por 4 horas à temperatura ambiente e depois concentrada. O resíduo foi diluído com Et20 e sucessivamente lavado com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10% (2x), H2O, NaHC03 aquoso saturado, H2O (2x) e salmou- ra. Após o tratamento usual (MgS04, filtração e concentração) o éster dese- jado (14a) foi isolado (1,106 g, 3,35 mmoles, 91% de rendimento) como um óleo incolor. EM (FAB) 255 (MH+); 1H RMN (CDCI3) δ 5,96-5,86 (m, 1 H), 5,37-5,22 (m, 2H), 4,70-4,65 (m, 1H), 4,57-4,52 (m, 1 H), 1,87-1,79 (m, 1H), 1,47 (s, 9H), 1,45-1,40 (m, 1H), 1,33-1,24 (m, 3H), 1,03 (t, J=7,3 Hz, 3H). d) Ao éster (14a) (1,106 g, 4,349 mmoles) em CH2CI2 anidro (5 ml) à temperatura ambiente, foi adicionado TFA (5 ml). A mistura reacional foi agitada durante 1,5 horas e depois concentrada para produzir (14b) (854 mg, 4,308 mmoles, 99% de rendimento). EM (FAB) 199 (MFT); 1H RMN (CDCI3) δ 5,99-5,79 (m, 1H), 5,40-5,30 (m, 2H), 4,71-4,62 (m, 2H), 2,22-2,00 (m, 2H), 1,95-1,88 (m, 1H), 1,84-1,57 (m, 2H), 0,98 (t, J=7,3 Hz, 3H). e) Ao ácido (14b) (853 mg, 4,30 mmoles) em benzeno anidro (14,8 ml) foram sucessivamente adicionados Et3N (684 μΙ, 4,91 mmoles, 1,14 eq.) e DPPA (992 μΙ, 4,60 mmoles, 1,07 eq.). A mistura reacional foi refluxada por 4,5 horas e depois foi adicionado 2-trimetilsililetanol (1,23 ml, 8,58 mmoles, 2,0 eq.). O refluxo foi mantido durante a noite e depois a mis- tura reacional foi diluída com Et2Ü e sucessivamente lavada com uma solu- ção aquosa de ácido cítrico a 10%, água, NaHC03 aquoso saturado, água (2x) e salmoura. Após 0 tratamento usual (MgS04, filtração e concentração), o resíduo foi submetido à cromatografia flash (5 cm, 10 a 15% de AcOEt- hexano) para produzir o carbamato (14c) (1,212 g, 3,866 mmoles, 90% de rendimento) como um óleo amarelo claro. EM (FAB) 314 (MH+); 1H RMN (CDCI3) δ 5,93-5,84 (m, 1H), 5,32-5,20 (m, 2H), 5,05 (bs, 1 H), 4,60-4,56 (m, 2H),4,20-4,11 (m, 2H), 1,71-1,60 (m, 3H), 1,39-1,22 (m, 1H), 103 (t, J=7,6 Hz, 3H, 0,96-0,86 (m, 1H), 0,04 (s, 9H). f) Ao carbamato (14c) (267 mg, 0,810 mmol) foi adicionado uma solução de TBAF 1,0 M em THF (1,62 ml, 1,62 mmol, 2,0 eq.). A mistura re- acionai foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, refluxada por 30 minutos e depois diluída com AcOEt. A solução foi sucessivamente lavada com água (2x) e salmoura. Após o tratamento usual (MgS04, filtração e con- centração), a amina desejada (14d) foi isolada (122 mg, 0,721 mmol, 89% de rendimento) como um líquido amarelo claro. 1H RMN (CDCI3) δ 5,94-5,86 (m, 1H), 5,31-5,22 (m, 2H), 4,58 (d, J=5,7 Hz, 2H), 1,75 (bs, 2H), 1,61-1,53 (m, 2H), 1,51-1,42 (m, 2H), 1,00 (t, J=7,3 Hz, 3H), 0,70-0,62 (m, 1H). EXEMPLO 15 Síntese de etil~(1R. 2S)/(1S, 2S)~ 1-amino-2-vinilcloropropil carboxilato a) A uma solução de terc-butóxido de potássio (4,62 g, 41,17 mmoles, 1,1 eq.) em THF (180 ml), a -78°C, foi adicionado a imina comerci- almente disponível (15a) (10,0 g, 37,41 mmoles) em THF (45 ml). A mistura reacional foi aquecida a 0°C e agitada nessa temperatura durante 40 minu- tos. A mistura foi depois novamente resfriada a -78°C para a adição de 1,4- dibromobuteno (15b) (8,0 g, 37,40 mmoles) e depois agitada a 0°C por 1 hora e resfriada novamente a -78°C para a adição de terc-butóxido de po- tássio (4,62 g, 41,17 mmoles, 1,1 eq.). A mistura reacional foi finalmente agi- tada por mais 1 hora a 0°C e concentrada para produzir o composto (15c). b, c, d) O composto (15c) foi tomado em Et20 (265 ml) e tratado com uma solução aquosa de HCI 1N (106 ml). Após 3,5 horas à temperatura ambiente, as camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com Et20 (2x) e basificada com uma solução aquosa de NaHC03 saturado. A amina desejada foi extraída com Et20 (3x) e o extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura. Após o tratamento usual (MgS04, filtração e con- centração), o resíduo foi tratado com uma solução de HCI 4N em dioxano (187 ml, 748 mmoles). Após a concentração, o sal de cloridrato (15d) foi iso- lado como um sólido marrom (2,467 g, 12,87 mmoles, 34% de rendimento). 1H RMN (CDCI3) δ 9,17 (bs, 3H), 5,75-5,66 (m, 1H), 5,39 (d, J= 17,2 Hz, 1 H), 5,21 (d, J=10,2 Hz, 1H), 4,35-4,21 (m, 2H), 2,77-2,70 (m, 1H), 2,05 (dd, J=6,4, 10,2 Hz, 1H), 1,75 (dd, J=6,4, 8,3 Hz, 1H), 1,33 (t, J=7,0 Hz, 3H). EXEMPLO 16 Preparação do éster etílico do ácido (1R, 2SVÍ1S. 2S) 1-Boc-amino-2- vinilciclopropilcarboxílico O sal de cloridrato (15d) (1,0 g, 5,2 mmoles) e (Boc^O (1,2 g, 5,7 mmoles) foram dissolvidos em THF (30 ml) e tratados com DMAP (0,13 g, 1,04 mmol, 0,2 eq.) e diisopropiletilamina (2,8 ml, 15,6 mmoles). A mistura reacional foi agitada 24 horas antes de ser diluída com EtOAc (40 ml) e la- vada sucessivamente com uma solução aquosa de NaHC03 saturado, HCI aquoso a 5% e salmoura saturada. A fase orgânica foi seca (MgS04), filtrada e concentrada para proporcionar, após purificação por cromatografia flash (15% de EtOAc/hexano), 0 composto (16a) (0,29 g, 23%). 1H RMN (CDCI3) δ 5,80-5,72 (m, 1H), 5,29-5,25 (dd, J=17,2, 17,2 Hz, 1H), 5,24-5,1 (bs, 1 H), 5,10 (dd, J=9,2 Hz, 1 H), 4,22- 4,13 (m, 2H), 2,15-2,04 (m, 1H), 1,85-1,73 (bs, 1H), 1,55 (m, 1 H), 1,49 (s, 9H), 1,26 (t, J=7,3 Hz, 3H). EXEMPLO 17 Resolução Enzimática do composto etil (1R, 2S)/(1S, 2S) 1-amino-2- vinilciclopropil carboxilato * Análise através de HPLC usando coluna Chiracel® OD-H a) O derivado racêmico (17a) (0,29 g, 1,14 mmol) foi dissolvido em acetona (5 ml) e diluído com H20 (10 ml). O pH foi ajustado com NaOH aquoso 0,2 N para 7,2, antes da Alcalase® ser adicionada (300 mg). Para manter o pH constante durante a incubação, uma solução de NaOH foi adi- cionada por um titulador inicial de pH durante 9 dias, até a quantidade teóri- ca da base ter sido adicionada. Em seguida à extração ácido/base conforme descrito no Exemplo 13, o éster não hidrolizado (0,15 g, 100%) e o material hidrolizado (0,139 g, 95%) foram isolados. A análise do éster não hidrolisado por meio de HPLC, usando uma coluna quirálica, mostrou uma proporção de 43:1 do composto desejado (17c), que foi atribuído com a estereoquímica (R, S), baseado na correlação química, conforme descrito nos Exemplos 10 e 11.
Condições para a análise de HPLC: coluna Chiracel® OD-H (4,6 mm x 25 cm), condições isocráticas usando uma fase móvel de isopropanol 2,5%/hexano. EXEMPLO 18 Resolução do composto de (1R. 2S)/(1S. 2S) 1-amino-2-vinilciclopropil car- boxilato por cristalização com ácido dibenzoil-D-tartárico A uma solução racêmica bruta de (1S, 2S)/(1R, 2S) etil 1-amino- 2-vinilciclopropil carboxilato [obtida do éster etílico de N-(difenilmetile- no)glicina (25,0 g, 93,5 moles) conforme descrito no Exemplo 15] em EtOAc (800 ml) foi adicionado ácido dibenzoil-D-tartárico (33,5 g, 93,5 mmoles). A mistura foi aquecida ao refluxo, deixada à temperatura ambiente por 15 mi- nutos e depois resfriada a 0°C. Um sólido branco foi obtido após 30 minutos. O sólido foi filtrado, lavado com EtOAc (100 ml) e seco ao ar. O sólido foi suspenso em acetona (70 ml), sonicado e filtrado (3x). O sólido foi a seguir recristalizado duas vezes em acetona quente (cultura A). Os licores mãe fo- ram concentrados e o resíduo foi recristalizado três vezes em acetona quen- te (cultura B). As duas culturas dos sólidos brancos amorfos do sal do ácido dibenzoil-D-tartárico foram combinadas (5,53 g) e suspensas em uma mistu- ra de Et20 (250 ml) e uma solução de NaHC03 saturado (150 ml). A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca (MgS04) e filtrada. O filtrado foi dilu- ído em HCI 1N/Et20 (100 ml) e concentrado sob pressão reduzida. O resí- duo oleoso foi evaporado com CCU para produzir cloridrato de etil 1(R)- amino-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato (940 mg, 11% de rendimento), como um sólido branco higroscópico: [a]25D +39,5°C (c 1,14 MeOH); : [a]25365 +88,5°C (c 1,14 MeOH); 1H RMN (DMSOd6) δ 9,07 (amplo s, 2H), 5,64 (ddd, J=17,2, 10,4, 8,7 Hz, 1 H), 5,36 (dd, J=17,2, 1,6 Hz, 1 H), 5,19 (dd, J=10,4, 1,6 Hz, 1H), 4,24-4,16 (m, 2H), 2,51-2,45 (m, picos impedidos por DMSO, 1H), 1,84 (dd, J=10,0, 6,0 Hz, 1H), 1,64 (dd, J=8,3, 6,0 Hz, 1H), 1,23 (t, J=7,1 Hz, 3H); EM (ESI) m/z 156 (MH)+; a pureza enantiomérica foi determi- nada como sendo de 91% ee pela análise de HPLC (coluna de CHIRALPAK AS®, Hex:i-PrOH) do derivado de Boc. EXEMPLO 19 Preparação do cloridrato de éster metílico do ácido (1R, 2S)/(1S. 2S) 1- amino-2-vinilciclopropano carboxílico LiOBu (2,1 equiv) tolueno/TA, depois H30+, depois NaOH
Preparação da Imina (19b) O composto de cloridrato de éster etílico de glicina (19a) (1519,2 g, 10,88 moles, 1,0 eq.), foi suspenso em éter terc-butilmetílico (8 L). A se- guir, foram adicionados benzaldeído (1155 g, 10,88 moles, 1,0 eq.) e sulfato de sódio anidro (773 g, 5,44 moles, 0,5 eq.) e a mistura foi resfriada a 5°C em um banho de água gelada. Foi adicionada trietilamina (2275 ml, 16,32 moles, 1,5 eq.) gota a gota durante 15 minutos (uso de 0,5 L de éter terc- butilmetílico para lavagens) e a mistura foi agitada por 40 horas à temperatu- ra ambiente. A reação foi rapidamente resfriada mediante adição de água gelada (5 L) e a camada orgânica foi separada. A fase aquosa foi extraída com éter terc-butilmetílico (1 L) e as fases orgânicas combinadas lavadas com uma mistura de NaHC03 (400 ml) e água (1,6 L) e depois salmoura. A solução foi seca com MgS04, concentrada sob pressão reduzida e o óleo residual amarelo seco sob peso constante e sob vácuo. A imina (19b) foi obtida como um óleo amarelo pegajoso que se solidifica a -20°C (2001 g, 96% de rendimento): 1H RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 8,30 (s, 1 H), 7,79 (m, 2H), 7,48-7,39 (m, 3H), 4,40 (d, J=1,3 Hz, 2H), 4,24 (q, J=7Hz, 2H), 1,31 (t, J=7 Hz, 3H).
Preparação do cloridrato de éster etílico de ácido N-Boc-(1R. 2S)/(1S, 2S)-1- amino-2-vinilciclopropano carboxílico racêmico 19e: O composto de terc-butóxido de lítio (4,203 g, 52,5 mmol, 2,1 eq.) foi suspenso em tolueno anidro (60 ml). A imina (19b) (5,020 g, 26,3 mmoles, 1,05 eq.) e dibrometo (19c) (5,348 g, 25 mmoles, 1 eq.) foram dis- solvidos em tolueno anidro (30 ml) e essa solução foi adicionada gota a gota, durante 30 minutos, à solução agitada de LiOtBu à temperatura ambiente.
Após a finalização da reação, a mistura vermelho intenso foi agitada por um período adicional de 10 minutos e resfriada rapidamente pela adição de á- gua (50 ml) e éter terc-butilmetílico (TBME, 50 ml). A fase aquosa foi sepa- rada e extraída uma segunda vez com TBME (50 ml). As fases orgânicas foram combinadas, sendo adicionado HCI 1N (60 ml) e a mistura agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A fase orgânica foi separada e extra- ída com água (40 ml). As fases aquosas foram então combinadas, saturadas com sal (35 g) e foi adicionado TBME (50 ml). A mistura agitada foi então basificada a um pH 13-14, mediante cuidadosa adição de NaOH 10N. A ca- mada orgânica foi separada e a fase aquosa extraída com TBME (2 x 50 ml).
Os extratos orgânicos contendo a amina livre (19d) foram combinados e foi adicionado di-terc-butildicarbonato (5,46 g, 25 mmoles, 1 eq.). Após agitação durante a noite à temperatura ambiente, o ensaio de TLC mostrou alguma amina livre não reagida. Foi adicionado um excesso de di-terc- butildicarbonato (1,09 g, 5 mmoles, 0,2 eq.) e a mistura foi refluxada por 2 horas, em cujo momento a análise de TLC indicou uma completa conversão do composto (19d) para o carbamato (19e). A solução foi resfriada à tempe- ratura ambiente, seca com MgS04 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia flash, usando 10%, depois 20% de EtOAc/hexano como eluente. O composto purificado (19e) foi obtido como um óleo amarelo claro que se solidifica lentamente sob vácuo (4,014 g, 63% de rendimento). 1H RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 5,77 (ddd, J=17, 10, 9 Hz, 1 H), 5,28 (dd, J=17, 1,5 Hz, 1 H), 5,18 (amplo s, 1 H), 5,11 (dd, J=10, 1,5 Hz, 1H), 4,24-4,09 (m, 2,13 (q, J=8,5 Hz, 1 H), 1,79 (amplo m, 1H), 1,46 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,26 (t, J=7 Hz, 3 H).
Preparação do composto do título (19f) via transesterificacão do composto O composto de éster etílico (19e) (10,807 g, 42,35 mmoles) foi dissolvido em metanol anidro (50 ml) e foi adicionado uma solução de metó- xido de sódio em MeOH (25% peso/peso, 9,7 ml, 42 mmoles, 1 eq.). A mis- tura foi aquecida a 50°C durante 2 horas, em cujo momento a análise de TLC indicou uma completa transesterificação (19e Rf 0,38, 19f Rf 0,34 em 20% de EtOAc/hexano). A mistura reacional foi resfriada à temperatura am- biente e acidificada a um pH 4 usando HCI 4N em dioxano. O NaCI precipi- tado foi removido mediante filtração (uso de éter terc-butilmetílico para lava- gens) e os voláteis foram removidos sob pressão reduzida. Foi adicionado éter terc-butilmetílico (100 ml) ao resíduo e os sólidos foram removidos por filtração. A evaporação do filtrado sob pressão reduzida e secagem sob vá- cuo proporcionou o éster metílico puro (19f) (10,11 g, 99% de rendimento). 1H RMN (CDCIs, 400 MHz) δ 5,75 (ddd, J=17, 10, 9 Hz, 1 H), 5,28 (dd, J=17, 1 Hz, 1H), 5,18 (amplo s, 1H), 5,11 (ddd, J=10, 1,5, 0,5 Hz, 1 H), 3,71 (s, 3H), 2,14 (q, J= 9 Hz, 1 H), 1,79 (amplo m, 1H), 1,50 (amplo m, 1 H), 1,46 (s, 9H). EXEMPLO 20 Resolução Enzimática de Cloridrato de éster metílico do ácido (1R. 2SJ-1- amino-2-vinilciclopropano carboxílico Preparação do éster metílico do ácido N—Boc-dR2S)-1-amino-2- vinilciclopropano carboxílico (20a) O éster racêmico (19f) (0,200 g, 0,83 mmol) foi dissolvido em acetona (3 ml) e foi adicionado água (7 ml). A seguir, foi adicionado NaOH 0,05 M (1 gota) para trazer o pH da solução para aproximadamente 8 e de- pois foi adicionado Alcalase® (2,4 L) (Novo Nordisk Biochem, 0,3 g em 1 ml de água). A mistura foi agitada vigorosamente à temperatura ambiente, man- tendo o pH da solução em 8 usando um titulador automático. No início do dia 4 e 5 da agitação com o pH 8, uma solução adicional de enzima foi adicio- nada (2 x 0,3 g). Após um total de 5 dias, foram consumidos 8,3 ml de NaOH 0,05 Μ. A mistura reacional foi diluída com EtOAc e água e a fase orgânica separada. Após lavagem com salmoura, o extrato orgânico foi seco (MgS04) e concentrado sob vácuo. O composto (20a) (0,059 g, 30% de rendimento) foi obtido como um óleo transparente. O 1H RMN foi idêntico ao do composto (19f). Foi usada para o ensaio de HPLC (uma coluna Chiracel ODH, 4,6 x 250 mm, isocrática, 1% de EtOH em hexano, vazão de 0,8 ml/minuto): (1R,2S)-2 TA 19,3 min (97%); (1S,2R)-2 TA 17,0 min (3%).
Preparação do cloridrato do éster metílico do ácido (1R.2S)- 1-amino-2- vinilciclopropano carboxílico (20b) O composto (20a) (39,96 g, 165,7 mmoles) foi dissolvido em dio- xano (25 ml) e a solução adicionada gota a gota com agitação a uma solu- ção de HCI 4N em dioxano (Aldrich, 250 ml). Após 45 minutos, a análise de TLC indicou uma completa desproteção. Os voláteis foram removidos sob pressão reduzida e o resíduo foi conjuntamente evaporado, duas vezes, com MeOH (2 x 100 ml). Foram adicionados éter (300 ml) e MeOH (10 ml) ao re- síduo oleoso marrom e a mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, resultando na precipitação de um produto semi-sólido. Foi adicio- nado um excesso de MeOH (15 ml) e a agitação continuou por 6 horas, em cujo momento foi coletado um sólido amarelado mediante filtração. O produ- to foi lavado com MeOH 5% em éter (50 ml) e éter (2 x 50 ml) e seco a vá- cuo, para proporcionar o composto (20b) como um sólido amarelado (22,60 g, 76% de rendimento). Os filtrados (incluindo as lavagens) foram evapora- dos a vácuo para fornecer o adicional composto (20b) como um óleo marrom (7,82 g, 26% de rendimento). Ambas as frações foram èuficientemente puras para uso na síntese dos inibidores de protease de HCV: [a^ + 38,2° (c 1,0, MeOH). 1H RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 9,15 (amplo s, 3H), 5,65 (ddd, J=17, 10,9 Hz, 1 H), 5,36 (dd, J=17, 1,5 Hz, 1 H), 5,19 (dd, J=10, 1,5 Hz, 1 H), 3,74 (s, 3H), 2,50 (q, sobrepor com o sinal de DMSO J=9 Hz, 1 H), 1,86 (dd, J=10,6 Hz, 1H), 1,64 (dd, J=8, 6 Hz, 1H). EXEMPLO 21 Síntese do éster metílico do ácido 1-aminociclobutil carboxílico O ácido 1,1-aminociclobutanocarboxílico foi preparado de acordo com Kavin Douglas; Ramaligam Kondareddiar; Woodard Ronald", Synth.
Commun. (1985), 15(4), 267-72. O sal do aminoácido (21a) (1,00 g, 6,6 mmoles) foi agitado em metanol anidro (40 ml) a -20°C e a mistura saturada com hidrogênio anidro para produzir o produto (21b). A agitação dessa mis- tura continuou durante 4 horas. A solução quente foi filtrada e o filtrado con- centrado (evaporação rotativa, 30°C) para deixar um resíduo que após tritu- ração em éter etílico e filtração e secagem, produziu um pó branco (0,907 g, 83% de rendimento). 1H RMN (CDCb, 400MHz, D2) δ CH30 (3H, 3,97 ppm); CH2 (2H, m, 2,70-2,77 ppm); CH2 (CH, m, 2,45-2,53 ppm) e CH2 (2H, m, 2,14-2,29 ppm).
TRIPEPTÍDEOS EXEMPLO 22 Procedimento Geral para Reações de Acoplamento feitas em Suporte Sólido A síntese foi feita em um Sintetizador paralelo, Modelo ACT396, da Advanced Chem Tech®, com o bloco de 96 cavidades. Tipicamente, 24 peptídeos foram sintetizados em paralelo usando técnicas padrão de fase sólida. O material de partida (ácido Fmoc-amino-ciclopropano-(opcional- mente substituído) carboxílico - resina de Wang, foi preparado através do método de acoplamento DCC/DMAP (Atherton E.; Scheppard R.C.; Solid Phase Peptide Synthesis, a Practical Approach\ IRL Press: Oxford (1989); páginas 131-148)).
Cada cavidade foi carregada com 100 mg da resina de partida (aproximadamente 0,05 mmol). As resinas foram lavadas sucessivamente com porções de 1,5 ml de NMP (1x) e DMF (3x). O grupo protetor Fmoc foi removido mediante tratamento com 1,5 ml de uma solução a 25% (vol/vol) de piperidina em DMF, por 20 minutos. As resinas foram lavadas com por- ções de 1,5 ml de DMF (4x), MeOH (3x) e DMF (3x). O acoplamento foi feito em DMF (350 μΙ), usando 400 μΙ (0,2 mmol) de uma solução de Fmoc- aminoácido 0,5 M/hidrato de HOBt em DMF, 400 μΙ (0,4 mmol) de uma solu- ção de DIPEA 1M em DMF e 400 μΙ (0,2 mmol) de uma solução de TBTU 0,5M em DMF. Após agitação por 1 hora, as cavidades foram drenadas, as resinas lavadas com 1,5 ml de DMF e o acoplamento foi repetido uma vez mais sob as mesmas condições. As resinas foram depois lavadas conforme descrito acima e o ciclo repetido com o próximo aminoácido.
Os grupos de encapsulamento foram introduzidos de duas ma- neiras: 1. Na forma de um ácido carboxílico usando o protocolo descrito acima (por exemplo, ácido acético) ou 2. Como um agente de acilação, tal como um anidrido ou um cloreto ácido. O exemplo seguinte ilustra o encapsulamento com anidrido succínico: Após a desproteção com Fmoc e subsequente protocolo de lava- gem, foi adicionado DMF (350 μΙ), seguido de 400 μΙ em cada de uma solu- ção de DMF de anidrido succínico (0,5 M, 0,2 mmol) e DIPEA (1,0 M, 0,4 mmol). As resinas foram agitadas por 2 horas e uma etapa de reacoplamen- to foi realizada. Ao final da síntese, a resina foi lavada com porções de 1,5 ml de DCM (3x), MeOH (3x), DCM (3x) e foram secas sob vácuo por 2 ho- ras. A divagem da resina e simultânea desproteção da cadeia lateral foram efetivadas pela adição de 1,5 ml de uma mistura de TFA, H20, DTT e TIS (92,5:2,5:2,5:2,5). Após agitação por 2,5 horas, a resina foi filtrada e lavada com 1,5 ml de DCM. Os filtrados foram combinados e concentrados por meio de centrifugação a vácuo. Cada composto foi purificado por meio de FIPLC preparatória de fase reversa, usando uma coluna C18 (22 mm x 500 mm).
As frações contendo o produto foram identificadas através de espectrometria de massa MALDI-TOF, combinadas e liofilizadas. EXEMPLO 23 Procedimento Geral para Acoplamento de Reações feito em Solução fVer também R. Knorr e outros. Tetrahedron Letters (19891. 30. 19271.
Os reagentes, isto é, uma amina livre (1 eq.) (ou seu sal de clo- ridrato) e o ácido carboxílico livre (1 eq.) foram dissolvidos em CFI2CI2, CH3CN ou DMF. Sob uma atmosfera de nitrogênio, 4,0 equivalentes de N- metilmorfolina e 1,05 equivalentes do agente de acoplamento foram adicio- nados à solução agitada. Após 20 minutos, 1,0 equivalente do segundo rea- gente , isto é, um ácido carboxílico livre, foi adicionado. Reagentes de aco- plamento práticos e eficientes para tal finalidade incluem (benzotriazol-1- iloxi)tris-(dimetilamino)fosfônio hexafluorofosfato (FIOBT) ou preferencial- mente 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio tetrafluoroborato (TBTU) ou 0-(7-azabenzotriazol-1-il]-N,N,N',N,-tetrametilurônio hexafluoro- borato (HATU). A reação foi monitorada através do ensaio de TLC. Após a finalização da reação, 0 solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O re- síduo foi dissolvido em EtOAc. A solução foi lavada sucessivamente com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10%, NaHC03 aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi seca (MgS04), filtrada e concentrada sob pressão reduzida. Quando o resíduo foi purificado, foi feito por meio de cro- matografia flash, conforme definido acima. EXEMPLO 24 Síntese do Composto 304 a) O isômero (R,R) do composto Boc-Et-Acca-OMe (13c) (0,12 g, 0,49 mmol) obtido da resolução enzimática (Exemplo 13), foi tratado com HCI 4N/dioxano (45 minutos) antes de ser concentrado a vácuo, para forne- cer um sólido branco. A esse sal de HCI (ca. 0,49 mmol) foram adicionados TBTU (0,17 g, 0,54 mmol), o composto Boc-4(R)-(8-quinolina-metilóxi)prolina (5) (do Exemplo 5) (0,18 g, 0,49 mmol) e DIPEA (0,3 ml, 1,7 mmol) em MeCN (10 ml). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3,5 horas antes de ser concentrada a vácuo. O material resultante foi dissolvido em EtOAc e lavado seqüencialmente com NaHC03 aquoso saturado e salmou- ra. Em seguida, o material foi seco (MgS04), filtrado e concentrado para produzir o composto (24b) como um sólido branco (0,122 g, 50% de rendi- mento). b) O composto (24b) (0,12 g, 0,25 mmol) foi tratado à temperatu- ra ambiente com HCI 4N/dioxano (30 minutos), antes de ser concentrado a vácuo. O sal de cloridrato resultante (ca. 0,25 mmol) foi tratado com Boc- Chg-OH*H20, TBTU (87 mg, 0,27 mmol) em MeCN (10 ml) e finalmente a 0°C com DIPEA (0,15 ml, 0,87 mmol). O resíduo foi diluído com EtOAc, se- qüencialmente lavado com NaHC03 aquoso saturado e salmoura, seco (MgS04), filtrado e concentrado, para proporcionar o composto (24c) como um sólido esbranquiçado (0,2 g). O material (0,14 g) foi dissolvido em DMSO e purificado por meio de HPLC preparatória, para proporcionar o composto (24c) como um sólido branco após a liofilização (35 mg, 33% de rendimen- to). HPLC (98%) EM (FAB) 255 (MH+); m/z 637,3 (MH+); HRMS calculado para C35H48N4O7 (MH+) 637.36011: encontrado 637.36250; 1H RMN (DMSO- d3) δ mostra uma população de rotâmetro, δ 8,91 (2 x d, J=4,1 e 4,1 Hz, 1 H), 8,40-8,36 (m, 2H), 7,90 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,77 (d, J=7,0 Hz, 1H), 7,6-7,54 (m, 2HG), 6,80 (d, J=8,6 Hz, 1H), 5,18 e 5,16 (2 x s, 2H), 4,40 (bs, 1 H), 4,31 (t, J= 8,3 Hz, 1 H), 4,12 (d, J=11,44 Hz, 1H), 4,03 (t, J=7,9 Hz, 1H), 3,78-3,72 (m, 1H), 3(s, 3H), 2,35-2,27 (m, 1H), 2,06-1,97 (m, 1 H), 1,71-1,55 (m, 10H), 1,53-1,38 (m, 2H), 1,26 (s, 9H), 1,18-1,06 (m, 2H), 1,02-0,93 (m, 2H), 089 (t, J=7,3 Hz, 3H).
Composto 304: c) Ao composto (24c) (30 mg, ca. 0,047 mmol) foi adicionado MeOH (1 ml), THF (1 ml) e hidróxido de lítio monohidratado (12 mg, 0,29 mmol) em H2O (1 ml). A solução transparente foi agitada rapidamente duran- te 48 horas, antes de ser concentrada a vácuo. O peptídeo bruto foi dissolvi- do em DMSO e purificado por meio de HPLC preparatória, para proporcionar o composto 304 como um sólido branco, após liofilização (21 mg, 72% de rendimento). HPLC 999%); EM (FAB) m/z: (MH+) 623; HRMS calculado para C34H46N407 (MH+) 623.34448, encontrado: 623.34630, 1H RMN (DMSO-d6) δ mostra uma população de rotâmetro 1:1, δ 8,90 (2 x d, J=4,1 Hz, 1 H), 8,37 (d, J=8,3 Hz, 1 H), 8,26 (s, 1H), 7,89 (d, J=8,3 Hz, 1 H), 1 H), 7,77 (d, J=6,7 Hz, 1 H), 7,6- 7,53 (m, 2H), 6,88 e 6,79 (2 x d, J=8,6 e 7,9 Hz, 1 H), 5,17 e 5,16 (2 x s, 2H), 4,43-4,35 (bs, 1 H), 4,29 (t, J=8,3 Hz, 1 H), 3,82-3,71 (m, 1H), 2,35-2,27 (m, 1H), 2,06-1,97 (m, 1H), 1,72-1,53 (m, 10H), 1,52-1,44 (m, 2H), 1,37 e 1,29 (2 x s, 9H), 1,18-1,05 (m, 3H), 1,0-0,94 (m, 1H), 0,91 (t, J=7,3 Hz, 3H). EXEMPLO 25 Síntese do Composto 301 a) O composto (25a) (= 12a) (282 mg, 1,23 mmol) foi suspenso em CH3CN (6 ml). A seguir, foram adicionados, sucessivamente, DBU (221 μΙ, 1,48 mmol) e brometo de benzila (161 μΙ, 1,35 mmol) e a mistura reacio- nal foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. A mistura foi concen- trada, o óleo resultante foi diluído com EtOAc e uma solução aquosa de áci- do cítrico a 10% e sucessivamente lavada com ácido cítrico a 10% (2x), NaHCOaaquoso saturado (2x), água (2x) e salmoura (1x). A camada de E- tOAc foi seca (MgS04), filtrada e evaporada à secura. O óleo bruto sem cor foi purificado por meio de cromatografia flash (eluente: hexano:EtOAc, 95:5 a 90:10) para proporcionar o produto benzilado (25b) como um óleo incolor (368 mg, 93% de rendimento). EM (FAB) 318,2 MH" 320,2 MH+ 342,2 (M+Na)+ 1H RMN (CDCI3) 5 7,37-7,28 (m, 5H), 5,22-5,10 (m, 1H), 5,19 (d, J=12 Hz, 1 H), 5,16 (d, 12 Hz, 1H), 1,60-1,40 (m, 4H), 1,39 (s, 9H), 1,31-1,22 (m, 1H), 0,91 (t, J=7,5, 14,5 Hz, 3H).
b) O composto (25b) (368 mg, 1,15 mmol) foi tratado com HCI 4N/dioxano (6 ml) conforme descrito anteriormente. O sal de cloridrato bruto foi acoplado ao composto (4) (do Exemplo 4) (470,8 mg, 1,27 mmol) com ΝΜΜ (507 μΙ, 4,61 mmoles) e HATU (no lugar de TBTU, 525,6 mg, 1,38 mmol) em CH2CI2 (6 ml), conforme descrito no Exemplo 22, para produzir o dipeptídeo racêmico bruto como um óleo cor de laranja. O material bruto foi purificado por meio de cromatografia flash (eluente: hexano:Et20, 50:50), para fornecer o dipeptídeo puro (25c) (o ponto de eluição menos polar) como uma espuma branca (223 mg, 68% de rendimento teórico). EM 571.4 MH' 593.3 (M+Na)+ 1H RMN (CDCI3), ca. 1:1 mistura de rostâmeros, δ 8,03 (b d, J=8 Hz, 1 H), 7,86 (d d, J=7,5 Hz, 1H), 7,82 (b, d J=6,5 Hz, 1H), 7,61 (b, s, 0,5H), 7,57-7,40 (m, 4H), 7,31-7,21 (m, 5H), 6,48 (b s, 0,5H), 5,22-5,11 (m, 1H), 5,08-4,81 (m, 3H), 4,41-3,74 (m, 3H), 3,49-3,18 (m, 1H), 2,76-1,90 (m, 2H), 1,69-1-48 (m, 3H), 1,40 (s, 9H), 1,40-1,23 (m, 2H), 0,92 (t, J=7,5, 15 Hz, 3H). c) O dipeptídeo (25c) (170,1 mg, 0,297 mmol) foi tratado com HCI 4N/dioxano (2 ml) conforme descrito anteriormente. O sal de cloridrato bruto foi acoplado ao Boc-Chg-OH (84,1 mg, 0,327 mmol) com NMM (130,7 μΙ, 1,19 mmol) e HATU (no lugar do TBTU, 135,5 mg; 0,356 mmol) em CH2CI2 (2 ml), durante 2,75 horas à temperatura ambiente e depois proces- sado conforme descrito anteriormente, para proporcionar o tripetídio bruto (25d) como uma espuma de cor marfim (ca. 211,4 mg, 100% de rendimen- to). EM (FAB) 712,5 MH+ Composto 301 d) O composto de tripeptídeo bruto (25d) (ca. 15,4 mg, 0,022 mmol) foi dissolvido em etanol absoluto (2 ml) e uma quantidade estimada (uma ponta de espátula) de catalisador de Pd/C e acetato de amônio foi adi- cionada. A mistura foi hidrogenada durante a noite através de um balão en- chido com hidrogênio, à temperatura ambiente e pressão atmosférica. A mis- tura reacional foi filtrada através de um filtro Millex® de 0,45 pm, evaporada à secura e depois diluída com EtOAc e uma solução aquosa de ácido cítrico a 10%, lavada novamente com ácido cítrico aquoso a 10% (1x), água (2x) e salmoura (1x). A camada orgânica foi seca (MgS04), filtrada, evaporada à secura e liofilizada para proporcionar o composto de tripeptídeo (301) como um sólido branco amorfo (11,0 mg, 82% de rendimento), δ 8,54 & 8,27 (s, 1H), 8,06-7,99 (m, 1H), 7,96-7,91 (m, 1H), 7,87 (d, J=8Hz, 1 H), 7,57-7,42 (m, 4H), 6,81 (d, J=8Hz, 1H), 4,99 (d, J=12Hz, 1 H), 4,88 (d, J=12 Hz, 1H), 4,46-4,19 (m, 2H), 4,17-4,02 (m, 2H), 3,88-3,67 (m, 1H), 2,28-2,19 (m, 1H), 2,05-1,93 (m, 1H), 1,73-1,43 (m, 8H), 1,32-1,07 (m, 6H), 1,28 (s, 9H), 1,03- 0,85 (m, 2H), 0,91 (t, J=7,5, 15Hz, 3H). EXEMPLO 26 Síntese do Composto 306 a) O ácido (26a) (180 mg, 0,500 mmol) e a amina (15d) (96 mg, 0,500 mmol) foram acoplados usando TBTU (192 mg, 0,600 mmol) e DIPEA (226 mg, 1,75 mmol) em CH2CI2 (10 ml) durante 20 horas. A mistura reacio- nal foi concentrada, tomada em acetato de etila, lavada duas vezes com NaHC03 saturado e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca com MgS04, filtrada e concentrada, para proporcionar o composto (26c) co- mo um óleo marrom, usado sem purificação na etapa seguinte. b, c) O composto bruto (26c) (ca. 0,500 mmol) foi agitado duran- te 30 minutos em HCI 4N/dioxano (4 ml) e concentrado à secura. O sólido foi tomado em CH2CI2 (10 ml) e foi adicionado DIPEA (226 mg, 1,75 mmol), se- guido de monohidrato de Boc-Chg-OH (138 mg, 0,500 mmol) e TBTU (192 mg, 0,600 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 5 horas. A mistura reacional foi concentrada, tomada em acetato de etila, la- vada duas vezes com NaHCOs saturado e uma vez com salmoura. A cama- da orgânica foi seca com MgS04, filtrada e concentrada, para proporcionar um óleo marrom, purificado por meio de cromatografia flash, para fornecer o composto (26d) como um óleo amarelo (204 mg, 64% de rendimento), atra- vés de dois acoplamentos. 1H RMN (CDCI3) δ 8,77-8,74 (m, 1H), 8,14 (d, J=8 Hz, 1 H), 8,02 (d, J= Hz, 1 H), 7,69 (dd, J=9, 7 Hz, 1 H), 7,52 (d, J=5 Hz, 1H), 7,47 (dd, J=8,7 Hz, 1H), 6,78 (d, J=5 Hz, 1 H), 5,80-5,70 (m, 1H), 5,35-5,27 (m, 2H), 5,14-5,07 (m, 2H), 4,89- 4,83 (m, 1H), 4,39-4,32 (m, 1H), 4,30-4,24 (m, 1H), 4,20-4,07 (m, 2H), 4,00-3,92 (m, 1H), 3,04-2,92 (m, 1H), 2,39-2,92 (m, 1H), 2,39-2,29 (m, 1H), 2,16-2,04 (m, 1H), 1,91-1,83 (m, 1 H), 1,82-1,62 (m, 7H), 1,45-1,45 (m, 7H), 1,45-1,35 (m, 9H), 1,27-1,07 (m, 8H). d) O composto (26d) (136 mg, 0,214 mmol) foi dissolvido em THF (4 ml) e MeOH (2 ml). Foi adicionada uma solução aquosa (2 ml) de LiOH hidratado (72 mg, 1,72 mmol) e a mistura reacional foi agitada à tem- peratura ambiente durante 20 horas. A solução foi concentrada e purificada através de HPLC preparatória, para proporcionar o composto (306) (o isôme- ro menos polar), como um sólido branco (25 mg).
Composto 306: EM(FAB) 607,4 (MH+) 1H RMN (DMSO-de) δ 9,16 (d, J=6 Hz, 1 H), 8,55 (s, 1 H), 8,35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8,12 (d, J=9 Hz, 1 H), 8,05 (dd, J=8,7 Hz, 1 H), 7,76 (dd, J=8,7 Hz, 1H, 7,59 (d, J=6 Hz, 1 H), 7,02 (d, J=8 Hz, 1 H), 5,75-5,66 (m, 2 H), 5,19 (d, J=18 Hz, 1 H), 5,07 (d, J=10 Hz, 1 H), 4,55 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4,43 (dd, J=10,8 Hz, 1 H), 4,03 (d, J=10 Hz, 1H), 3,87-3,83 (m, 1 H), 2,66- 2,59 (m, 1 H), 2,36-2,30 (m, 1 H), 1,98 (dd, J=18,9 Hz, 1 H), 1,75-1,56 (m, 8H), 1,38-1,35 (m, 1H), 1,25-1,22 (m, 1 H), 1,09 (s, 9 H), 1,12-0,95 (m, 3 H). EXEMPLO 27 Síntese do Composto 307 c) Uma solução do ácido (8) do Exemplo 8 (505 mg, 105 mmol) em 5 ml de diclorometano, foi tratada com TBTU (376 mg, 1,17 mmol). O sal de HCI do (R,S) vinil AccaOEt (18) (do Exemplo 18) (279 mg, 1,46 mmol) em 7 ml de diclorometano, contendo (0,60 ml, 5,46 mmoles) de N-metilmorfolina, foi adicionado à solução anterior do éster ativado. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi evaporado a vácuo. O resíduo foi diluído com acetato de etila, lavado duas vezes com uma solução saturada de bicarbonato de sódio e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca (MgS04), filtrada e evaporada a vácuo. O resíduo foi cromatografado em sílica gel (60:40 vol/vol, hexano-acetato de etila) para produzir 173 mg (27% de rendimento) do dipeptídeo (27c). d, e) Uma solução do dipeptídeo (27c) (70 mg, 0,114 mmol) em 3 ml de uma solução de cloreto de hidrogênio 4,0 M, em 1,4-dioxano, foi agi- tada à temperatura ambiente por 1 hora (surgiu um precipitado após 10 mi- nutos de reação). O solvente foi removido a vácuo. O sal de cloridrato de amina (27d) (0,114 mmol), diluído em 1,5 ml de acetonitrila, foi neutralizado mediante adição de 65 μΙ (0,591 mmol) de N-metil morfolina. Uma solução de Boc-ChgOH*H20 (39 mg, 0,142 mmol) em 1,5 ml de acetonitrila, foi trata- da com TBTU (46 mg, 0,143 mmol) e depois adicionada à solução anterior da amina. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante dois dias. O solvente foi removido a vácuo. O resíduo, diluído com acetato de etila, foi lavado duas vezes com uma solução saturada de bicarbonato de sódio e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca (MgS04), filtra- da e evaporada a vácuo. Foram obtidas 86 mg (100%) do tripetídio (27e).
Esse composto bruto foi usado na reação seguinte sem qualquer purificação. f) A uma solução do tripeptídeo (27e) (86 mg, 0,114 mmol) em 5 ml de uma mistura THF:H20 (2,5:1) foi adicionado hidróxido de lítio monohi- dratado (22 mg, 0,524 mmol). Um excesso de 0,25 ml de MeOH foi adicio- nado a fim de se obter uma solução homogênea. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, antes do solvente ser eva- porado a vácuo. O resíduo foi dividido entre água e EtOAc. A camada aquo- sa foi acidificada com HCI 1M e depois extraída duas vezes com acetato de etila. O composto desejado foi encontrado no acetato de etila proveniente da primeira extração básica. Essa camada orgânica foi seca (MgS04), filtrada e evaporada a vácuo, para produzir 69 mg do ácido bruto, que foi purificado mediante HPLC preparatória. O composto foi dissolvido em MeOH (4 ml) e injetado numa coluna equilibrada de fase reversa C18, da Whatman Partisil, modelo 10-ODS-3 (2,2 x 50 cm), (λ = 230 nm, solvente A = 0,06% TFA/H20, solvente B = 0,06% TFA/CH3CN). Programa de purificação: 20% a 70% do solvente B em 60 minutos. As frações foram analisadas mediante HPLC analítica. Frações apropriadas foram coletadas e liofilizadas para proporcio- nar 50 mg (60%) do tripeptídeo desejado (307) como um sólido branco a- morfo.
Composto 307: 1H RMN (DMSO) rotâmeros ~2:8 δ 8,86 (d, J=2,5 Hz, 1 H), 8,85 (s, 0,2H), 8,64 (s, 0,8H), 8,49 (dd, J=9,5, 3 Hz, 0,2H), 8,45 (dd, J=9,2 Hz, 0,8H), 8,36-8,33 (m, 2H), 8,20 (d, J=9,5 Hz, 0,2H), 8,18 (d, J=9,5 Hz, 08H), 7,81 (s, 0,2H), 7,78 (s, 08H), 7,64-7,56 (m, 3H), 6,87 (d, J=8 Hz, 08H), 6,36 (d, J=9 Hz, 0,2H), 5,82-5,67 (m, 2H), 5,27-5,17 (m, 1H), 5,09- 5,03 (m, 1 H), 4,73 (t, J=8 Hz, 0,2H), 4,55 (dd, J=10, 7,5 Hz, 0,8H), 4,49-4,40 (m, 1H), 4,00-3,95 (m, 1H), 3,83- 3,76 (m, 1H), 2,87-2,80 (m, 0,2H), 2,69- 2,62 (m, 0,8H), 2,39-2,26 (m, 1 H), 2,08-2,00 (m, 1H), 1,75-1,41 (m, 7H), 1,37 (s, 1,8H), 1,32-1,27 (m, 1H), 1,17-0,82 (m, 5H), 0,94 (s, 7,2H). EXEMPLO 28 Síntese do Composto 311 O composto 311 foi preparado usando o processo descrito no Exemplo 24, mas usando os apropriados blocos de construção.
Composto 310:1H RMN (DMSO-d6) δ 8,98 (d, J=6 Hz, 1 H), 8,52 (s, 1H), 8,24 (d, J = 9,Hz, 1 H), 8,08 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7,63 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,37 (d, J = 6 Hz, 1 H), 6,98 (d, J=8 Hz, 1 H), 5,75-5,66 (m, 1 H), 5,57 (br s, 1 H), 5,24-5,19 (m, 1H), 5,08- 5,01 (m; 1 H), 4,57-4,40 (m, 2H), 4,00-3,96 (m, 1 H), 3,82 (dd, J=9,8, Hz, 1 H), 2,59-2,54 (m, 1H), 2,32-2,26 (m, 1H), 1,99 (d„ J=17,9 Hz, m1 H), 1,74-1,55 (m, 8 H), 1,37 (s, 1 H), 1,26-1,22 (m, 1 H), 1,14-1,08 (m, 9H), 1,02-0,91 (m, 3H). EXEMPLO 29 Síntese do Composto 302 O composto 302 foi preparado usando o processo descrito no Exemplo 27, mas usando os apropriados blocos de construção. 1H RMN (DMSO-de) δ 8,34 (s, 1 H), 8,04-8,01 (m, 1 H), 7,94-7,92 (m, 1 H), 7,87 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,54-7,50 (m, 3H), 7,45 (dd, J=17,8 Hz, 1 H), 7,22 (d, J = Hz, 1 H), 4,94 (dd, J=55, 12 Hz, 2 H), 4,34 (s, 1 H), 4,27 (dd, J=8,8 Hz, 1 H), 4,16 (d, J=11 Hz, 1H), 4,07 (dd, J=8,8 Hz, 1H), 3,72-3,65 (m, 2H), 3,59-3,54 (m, 1H), 2,24-2,18 (m, 1H), 2,02-1,95 (m, 2 H), 1,75-1,70 (m, 1H), 1,53-1,44 (m, 2H), 1,32-1,27 (m, 1 H), 1,21-1,17 (m, 1 H), 0,96-0,85 (m, 10 H), 0,80-0,77 (m, 5 H), 0,62-0,57 (m, 1 H). EXEMPLO 30 Síntese do Composto 308 O composto 308 foi preparado usando o processo descrito no Exemplo 27, mas usando os apropriados blocos de construção. 1H RMN (DMSO) rotâmeros = 2:8 δ 8,77 (s, 0,2H), 8,45 (s, 0,8H), 8,13 (d, J=8,5 Hz, 0,8H), 8,03 (d, J=8,5 Hz, 0,2H), 7,89-7,83 (m, 1 H), 7,55-7,37 (m, 4H), 7,05- 6,59 (m, 1 H), 6,95 (d, J=8 Hz, 0,8H), 6,26 (d, J=8,5 Hz, 0,2H), 5,81-5,64 (m, 1 H), 5,33-5,28 (m, 1H), 5,26-5,15 (m, 1H), 5,08-5,02 (m, 1 H), 4,60 (t, J= 7,5 Hz, 0,2H), 4,38-4,27 (m, 1,8H), 4,09-3,91 (m, 1,8H), 3,74 (dd, J=12,5, 4Hz, 0,2H), 2,69-2,60 (m, 0,2H), 2,50-2,40 (m, 1H), 2,26-2,28 (m, 0,2H), 2,23-2,14 (m, 0,8H), 2,05-1,97 (m, 0,8H), 1,76-1,44 (m, 7H), 1,37 (s, 1,8H), 1,29 (s, 7,2Η), 1,28-1,20 (m, 1Η), 1,16-0,88 (m, 5H). EXEMPLO 31 Síntese do Composto 309 O composto 309 foi preparado usando o processo descrito no Exemplo 27, mas usando os apropriados blocos de construção. 1H RMN (DMSO-d6) rotâmeros s 2:8 δ 8,75 (s,75 (s, 0,2H), 8,50 (s, 0,8H), 7,89-7,78 (m, 3H), 7,50-7,44 (m, 1 H), (m, 1H), 7,42-7,32 (m, 2H), 7,17-7,09 (m, 0,8H), 7,08-7,03 (m, 0,8H), 7,08-7,03 (m, 0,2H), 6,79 (d, J=8,5 Hz, 0,8H), 6,33 (d, J=9 Hz, 0,2H), 5,81-5,65 (m, 1 H), 5,30-5,16 (m, 2H), 5,10-5,02 (m, 1 H), 4,56 (t, J=7,5 Hz, 0,2H), 4,33 (t, J=8 Hz, 0,8H), 4,10-3,90 (m, 2,8H), 3,74- 3,68 (m, 0,2H), 2,45-2,37 (m, 1H), 2,34-2,17 (m, 1H), 2,05-1,97 (m, 1H), 1,76-1,48 (m, 7H), 1,37 (s, 1,8H), 1,23 (s, 7,2 H), 1,21-0,88 (m, 6H). EXEMPLO 32 Síntese do Composto 305 O composto 305 foi preparado usando o processo descrito no Exemplo 27, mas usando os apropriados blocos de construção. 1H RMN (DMSO-de) rotâmeros (1:9) δ 8,68 (s, 0,1 H), 8,43 (s, 0,9H), 8,04-8,00 (m, 1H), 7,95-7,91 (m, 1H), 7,78 (d, 8,5 Hz, 1H), 7,57-7,49 (m, 3H), 7,47-7,42 (m, 1H), 8,82 (d, J=9,5 Hz, 0,9H), 6,21 (d, J=8,5 Hz, 0,1H), 5,80-5,64 (m, 1 H), 5,21 (dd, J=17,2 Hz, 0,9H), 5,06 (dd, J=10,5, 2 Hz, 1H), 5,02-4,85 (m, 2H), 4,43 (t, J=7,5 Hz, 0,1H), 4,34 (br s, 1 H), 4,34 (br s, 1 H), 4,23 (t, J=8,5 Hz, 0,9H), 4,16-4,05 (m, 1,8H), 3,89 (m, 0,2H), 3,74 (dd, J=11, 3,5 Hz, 0,9H), 3,53 (dd, J=12,5 4 Hz, 0,1H), 2,30-2,21 (m, 1H), 2,02-1,94 (m, 2H), 1,74-1,38 (m, 7H), 1,36 (s, 0,9H), 1,28 (s, 8,1H), 1,25-0,87 (m, 6H). EXEMPLO 33 Síntese do Composto 303 O composto 303 foi preparado usando o processo descrito no Exemplo 27, mas usando os apropriados blocos de construção. 1H RMN (DMSO-de) δ 8,29 (s, 1 H), 8,04-8,01 (m, 1 H), 7,94-7,92 (m, 1 H), 7,87 (d, J=8 Hz, 1 H), 7,65-7,52 (m, 3 H), 7,46 (dd, J=8,7 HZ, 1 H), 7,19 (d, 9 Hz, 1 H), 5,01 (d, = 12 Hz, 1 H), 4,86 (d, J=12 Hz, 1 H), 4,34 (br. s, 1 H), 4,24 (t, J=8 Hz, 1 H), 4,18-4,09 (m, 2 H), 3,74-3,53 (m, 3 H), 2,24-2,18 (m, 1 H), ,2,04-1,95 (m, 1 H), 1,74-1,45 (m, 10 H), 1,31-1,13 (m, 4 H), 0,96-0,86 (m, 7 H), 0,79-0,76 (m, 5 H). EXEMPLO 34 Síntese do Composto 403 a) Acoplamento de P2 com P1 O derivado de éster metílico do composto (7) (34a) (170 mg, 0,355 mmol) foi agitado em THF (50%) - metanol (4 ml) e LiOH aquoso (1M, 1 ml), à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução foi concentrada (Evaporação rotativa, 30°C) e o resíduo acidificado a um pH 6 e a solução liofilizada. O pó resultante foi agitado em DMF anidro (3 ml), na presença de DIEA (0,4 ml), seguido de sucessiva adição de cloridrato de éster metílico do ácido 1,1-aminociclobutilcarboxílico (34b) (140 mg, 0,845 mmol) e TBTU (134 mg, 0,417 mmol). Após agitação durante 18 horas à temperatura ambi- ente, a mistura foi purificada mediante cromatografia flash em sílica gel (me- sh 230-240), usando acetato de etila:hexano (1:2), para produzir um óleo de cor laranja (98 mg, 90% de pureza, através de HPLC). b) Acoplamento de P1-P2 com P3 O composto de dipetídio (34b) (97 mg, 90%, 0,155 mmol) foi agi- tado em HCI 4N - dioxano (5 ml), durante 1 hora à temperatura ambiente. A solução foi depois concentrada à secura (Evaporação rotativa, alto vácuo), para produzir um sólido bege. O material foi agitado em DMF anidro (2 ml) à temperatura ambiente, na presença de DIEA (0,4 ml), seguido da adição de L-Boc-Tbg (80 mg, 0,35 mmol) e TBTU (112 mg, 0,35 mmol). Após agitação durante 2 dias à temperatura ambiente, a solução foi vertida em acetato de etila para gerar uma base livre, usando carbonato de potássio aquoso a 5%. A fase orgânica foi processada para proporcionar um resíduo oleoso amare- lo. O material foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica gel (mesh 230-240), usando acetato de etila: hexano (1:2 e 3:1, vol/vol), para produzir 40 mg de um óleo homogêneo, segundo o ensaio de HPLC. O éster metílico (40 mg) foi finalmente saponificado em hidróxido de potássio 1N (2 ml), em metanol (4 ml), mediante agitação à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura foi concentrada (Evaporação rotativa, 30°C) e acidificada a um pH 4 com ácido clorídrico 2N. Essa mistura foi puri- ficada mediante HPLC preparatória, numa coluna C18, usando um gradiente de acetonitrila aquoso 0-50% (TFA 0,1%) em 20 nm. As frações foram agru- padas, concentradas a meio volume e liofilizadas, para produzir o composto (403) como um sólido branco fofo (10 mg). 1H RMN (DMSO-de) δ Mistura de rotâmeros: MH+ (1H, s, 8,6 ppm), CH (3H, 8,2 ppm), Ph (5H, amplo s, 7,66 &
7,53 ppm), CH (1H, amplo, 7,22 ppm), NH (1H, d, J=7,6 Hz, 6,71 ppm), CHO (1H, amplo s, 5,76 ppm), CH (2H, m 4,58-4,49 ppm), CH (1H, m 4,04 ppm), CH30 (3H, s, 3,97 ppm), CH (1H, d, 3,86 ppm), CH (7H muito amplo, 1,82,6 ppm), grupo Boc (9H, s, 1,25 ppm), e grupo t-butila (9H, s, 0,97 ppm). MS mostrou M+H+ em m/e 675 (100%) HPLC: 98% de Pico em 18,9 minutos. EXEMPLO 35 Síntese do Composto 333 (Tabela 3) Uma solução de m-anisidina (35a) (9,15 ml, 81,4 mmoles) e di- metilacetilenodicarboxilato (35b) (10,0 ml, 81,3 mmoles) em 160 ml de me- tanol, é aquecida sob refluxo durante 2 horas. O solvente é removido a vá- cuo e o resíduo purificado por meio de cromatografia flash (hexano/acetato de etila 90:10). O composto (35c) (17,0 g, 79% de rendimento) é obtido co- mo um óleo de cor laranja. 1H RMN (CDCI3) δ 9,62 (amplo s, 1 H), 7,17 (dd, J=7 e 8,5 Hz, 1 H), 6,66 -6,62 (m, 1 H), 6,49-6,45 (m, 2H), 5,38 (s, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 3,71 (s, 3H).
Difeniléter (50 ml) é aquecido em um banho de areia até uma temperatura interna de aproximadamente 250°C. O aduto de diéster (35c) (7,5 g, 28, 3 mmoles), dissolvido em 5 ml de difeniléter, é adicionado dentro de 2 minutos ao solvente em ebulição. O aquecimento é mantido por 5 minu- tos e a mistura reacional é depois deixada resfriar à temperatura ambiente.
Rapidamente se precipita um sólido de cor bege. O sólido é filtrado e depois triturado com metanol, para produzir 4,1 g (62% de rendimento) do composto desejado (35d). 1H RMN (CDCI3) δ 7,97 (d, J=9 Hz, 1 H), 7,40 )d, J=2 Hz, 1 H), 6,96 (dd, J=9 e 2Hz, 1 H),6,55 (s, 1H), 3,95 (sm 3H), 3,84 (s, 3H) Uma solução constituída do derivado de cis-4-hidróxi-L-prolina (35e) (1,71 g, 5,33 mmoles), derivado de 4-hidroxiquinolina (35f) (1,25 g, 5,36 mmoles) e trifenilfosfina (2,80 g, 10,68 mmoles) em 75 ml de THF é res- firada a 0°C para adição gota a gota (aproximadamente em 1 hora) de DEAD (1,70 ml, 10,80 mmoles). A mistura reacional é depois deixada aquecer len- tamente à temperatura ambiente e a agitação continua durante a noite. O solvente é removido a vácuo e 0 resíduo purificado por meio de cromatogra- fia flash (acetato de etila:hexano, 70:30). O composto (35g) (0,7 g do com- posto (35g) puro e 1,8 g do composto (35g) contaminado com aproximada- mente 50% de óxido de trifenilfosfato) é obtido como um sólido branco. 1H RMN (CDCI3) rotâmeros (4:6) δ 8,04 (d, J=9 Hz, 1 H), 7,54 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,40-7,32 (m, 6H), 7,23 (dd, J= 9 e 2,5 Hz, 1 H), 5,33-5,13 (m, 3H), 4,66 (t, J=7,5 Hz, 0,4 H), 4,54 (t, J= 8 Hz, 0,6 H), 4,07 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 4,04=3,80 (m, 2H), 2,78-2,65 (m, 1H), 2,47-2,34 (m, 1H), 1,45 (s, 3,6H), 1,37 (s, 5,4H).
Ao derivado de éster benzílico de prolina (composto 35g) (0,70 g, 1,31 mmol) em solução em uma mistura de metanol-acetato de etila (10 ml-10 ml), é adicionado 100 mg de um catalisador de Pd/C a 10%. A sus- pensão resultante é agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de hi- drogênio durante 1,5 hora. O catalisador é depois filtrado em um filtro Millex- HV Millipore (unidade de filtro de 0,45 μιτι) e os solventes foram evaporados a vácuo. O rendimento quantitativo do ácido desejado (35h) (0,59 g), é obti- do. 1H RMN (CDCI3) rotâmeros 70:30 δ 8,06 (d, J=9,5 Hz, 0,3 H), 8,01 (d, J=9 Hz, 0,7 H), 7,56 (d, J= 2 Hz, 1 H), 7,44 (amplo s, 0,7 H), 7,41 (amplo s, 0,3 H), 7,24 (dd, J= 9 e 2,5 Hz, 1 H), 5,31-5,25 (m, 1H), 4,67 (t, J=7,5 Hz, 0,7 H), 4,55 (t, J=7,5 Hz, 0,3 H), 4,08 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 4,04-3,80 (m, 2H), 2,8302,72 (m, 1H), 2,71-2,47 (m, 1H), 1,46 (s, 9H). O sal da amina (35i) (215 mg, 1,21 mmol) em 7 ml de acetonitrila é tratado com 0,95 ml de DIEA (5,45 mmoles). Essa solução é depois adi- cionada a uma solução do ácido (35h) (590 mg, 1,32 mmol) e TBTU (389 mg, 1,21 mmol) em 5 ml de CH3CN e a solução resultante é agitada à tem- peratura ambiente durante a noite. O solvente é removido a vácuo e o resí- duo é diluído com acetato de etila e lavado duas vezes com uma solução saturada de bicarbonato de sódio e uma vez com salmoura e seco com Mg- SO4. O solvente é removido a vácuo e 0 resíduo é purificado por cromato- grafia flash (AcOEt:hexano, 75:25) para produzir 527 mg (70% de rendimen- to) do produto de dipeptídeo desejado (35j). 1H RMN (CDCI3) δ 8,01 (d, J=9 Hz, 1 H), 7,55 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,22 (dd, J= 9 e 2,5 Hz, 1H), 5,81-5,71 (m, 1H), 5,36-5,28 (m, 2H), 5,18-5,12 (m, 1 H), 4,61-4,45 (m, 1 H), 4,07 (s, 3H), 3,91-3,71 (m, 2H), 3,72 (s, 3H), 2,99- 2,84 (m, 1 H), 2,49-2,34 (m, 1H), 2,20-2,08 (m, 1 H), 1,971,84 (m, 1 H), 1,58-1,52 (m, 1 H), 1,44 (s, 9H). O diéster (35j) (716 mg, 1,25 mmol) em solução, em uma mistu- ra de THF:MeOH (1,5 ml - 1,5 ml) é resfriado a 0°C antes de ser tratado com uma solução aquosa de NaOH 1M (1,25 ml, 1,25 mmol). Após 1 hora de agitação a 0°C, 3 gotas de ácido acético glacial são adicionadas para neutralizar o NaOH. Os solventes são removidos a vácuo e o composto é seco mediante ação de uma bomba durante algumas horas.
Uma solução do sal de sódio do ácido (35k) (1,25 mmol) e Et3N (0,19 ml, 1,36 mmol) em 8 ml de THF é resfriada a 0°C e cloroformiato de isobutila (0,18 ml,1,39 mmol) é adicionado. Após 40 minutos, é adicionado diazometano (9ml, 6,30 mmoles) e a solução resultante é agitada a 0°C por 30 minutos e à temperatura ambiente por 2 horas. Os solventes são removi- dos a vácuo. O resíduo, diluído com acetato de etila, é lavado duas vezes com uma solução saturada de NaHC03, uma cez com salmoura e seco com MgS04, o solvente é evaporado a vácuo e o resíduo é purificado por croma- tografia flash (hexano-acetato de etila, 50:50) para produzir 378 mg (52% de rendimento) do esperado diazocetona (351). 1H RMN (CDCI3) δ 8,00 (d, J=9 Hz, 1 H), 7,42 (s, 1 H), 7,35 (d, J=2,5 Hz, 1 H), 7,20 (dd, J=9 e 2,5 Hz, 1H), 6,92 (s, 1 H), 6,92 (s, 1 H), 5,81-5,71 (m, 1 H), 5,35-5,28 (m, 3H), 5,17-5,13 (m, 1 H), 4,61-4,40 (m, 1 H), 3,97 (s, 3H), 3,96-3,74 (m, 2H), 3,72 (s, 3 H), 2,94-2,38 (m, 2H), 2,18-2,06 (m, 1 H), 1,98-1,84 (m, 1 H), 1,57-1,52 (m, 1H), 1,42 (s, 9H). 1H RMN (CDCI3) δ 8,01 (d, J= 9 Hz, 1 H), 7,55 (d, J=2,5 Hz, 1 H), 7,45 (s, 1 H), 7,22 (dd, J= 9 e 2,5 Hz, 1 H), 5,81-5,71 (m, 1 H), 5,36-5,28 (m, 2H), 5,18-5,12 (m, 1 H), 4,61-4,45 (m, 1 H), 4,07 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,91-3,74 (m, 2H), 3,72 (s, 3H), 2,99- 2,84 (m, 1H), 2,49-2,34 (m, 1 H), 2,20- 2,08 (m, 1 H), 1,97-1,84 (m, 1 H), 1,58-1,52 (m, 1 H), 1,44 (s, 9H). A uma solução resfriada (0°C) do composto de diazocetona (351) (0,37 g, 0,642 mmol) em 15 ml de THF, é adicionado 0,25 ml de HBr a 48%. A solução amarela resultante é agitada a 0°C durante 1 hora. A mistura reacional é dividida entre acetato de etila e uma solução saturada de NaH- C03. A fase orgânica é lavada uma vez mais com NaHC03 e seca com Na2S04. Após evaporação, os solventes são removidos a vácuo, sendo iso- ladas 0,36 g (90% de rendimento) da α-bromocetona (35m). O composto de α-bromocetona (35m) (170 mg, 0,271 mmol) em 10 ml de isopropanol, é tratado com 1-acetil-2-tiouréia (64 mg, 0,542 mmol). A solução resultante é aquecida a 75°C durante 1 hora. O solvente é remo- voido a vácuo. O resíduo é diluído com acetato de etila e lavado duas vezes com uma solução saturada de NaHCC>3, uma vez com salmoura e seco com MgS04. A evaporação do solvente a vácuo produziu 182 mg (> 100%) do material bruto (35n). O dipetídio (35n) (145 mg, 0,223 mmol) é tratado com 3 ml de uma solução de HCI 4M em dioxano. A solução resultante é agitada à tem- peratura ambiente durante 1 hora. Os solventes são removidos a vácuo e o resíduo é seco sob a ação de uma bomba. O sal da amina (35o) em 5 ml de CH3CN é tratado com 195 μΙ (1,12 mmol) de DIEA. Essa solução é depois adicionada à solução de Boc- terc-butilglicina (103 mg, 0,446 mmol) e HATU (186 mg, 0,489 mmol) em 3 ml de CH3CN. A mistura reacional é agitada à temperatura ambiente durante a noite. O CH3CN é evaporado a vácuo. O resíduo é diluído com acetato de etila e lavado duas vezes com uma solução saturada de NaHC03, uma vez com salmoura e seco com MgSCU. Após remoção do solvente, são obtidas 274 mg do tripeptídeo bruto (35p) (>100%). O tripeptídeo (35p) (56 mg, 0,0733 mmol), em 4 ml de uma solu- ção de HCI 4M em dioxano, é agitado à temperatura ambiente durante 2 ho- ras. O solvente é removido a vácuo e o resíduo seco sob a ação de uma bomba. O sal de amina obtido é dissolvido em 4 ml de CH2CI2 e tratado com 0,13 ml de DIEA (0,746 mmol), seguido de 26 mg de trifosgênio (0, 0876 mmol). Após 3 horas de incubação, é adicionado 1,2,2- trimetilpropilamina (20 mg, 0,146 mmol) (sintetizado conforme descrito em Moss N., Gauthier J., Ferland J.M., Fevereiro de 1995, SynLett. (2), 142- 144). O banho de gelo é removido e a mistura reacional é agitada à tempera- tura ambiente durante a noite. O CH2CI2 é evaporado a vácuo. O resíduo, diluído com acetato de etila, é lavado duas vezes com uma solução saturada de NaHC03, uma vez com salmoura e seco com MgS04 para produzir 60 mg (aproximadamente 100%) da desejada uréia (35q).
Uma solução de éster metílico (35q) (57 mg, 0,0721 mmol) em uma mistura de TFIF:H20 (2,5 ml - 1 ml) é tratada com LiOH*H20 sólido (25 mg, 0,595 mmol) e é adicionado 1 ml de MeOH, a fim de clarear a solução.
Após agitação durante 4 horas à temperatura ambiente, a reação é neutrali- zada mediante adição de uma solução de HCI 1M. Os solventes são removi- dos a vácuo e o resíduo é purificado por meio de cromatografia preparatória. O composto dissolvido em 2,5 ml de MeOH é injetado em uma coluna equili- brada de fase reversa C™, da Whatman Partisil, modelo 10-ODS-3 (2,2 x 50 cm). Programa de purificação: Gradiente linear a 20 ml/nm, λ 220 nm, inje- ção em 10% de A até 60% de A em 60 minutos. A = 0,06% TFA/CH3CN; B = 0,06% TFA/H2O. As frações foram analisadas mediante HPLC analítica. O produto coletado foi liofilizado para fornecer 15 mg do composto 333 como um sólido esbranquiçado (27% de rendimento). 1H RMN (CDCI3) δ 8,88 (s, 0,2H), 8,84 (d, J=4,5 Hz, 0,2H), 8,68 (d, J=8,5 Hz, 0,h), 8,56 (s, 0,8H), 8,40-8,13 (m, 1,5H), 7,96 (d, J=9,0 Hz, 0,2H), 7,72-7,44 (m, 2,4H), 7,35-7,09 (m, 1,2 H), 6,15 (d, J= 9Hz, 0,2H), 6,06 (d, J=9Hz, 0,8H), 5,39 (d, J=9,5 Hz, 0,24H), 5,86 (d, J=9Hz, 0,8H), 5,79-5,67 (m, 1H), 5,69-544 (m, 1 H), 5,09-5,01 (m, 1 H), 4,50-4,35 (m, 2H), 4,25 (d, J=9,0Hz, 0,2H), 4,20 )d, J=9,0 Hz, 0,8H), 4,06-3,98 (m, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,77-3,60 (m, 2H), 2,58-2,50 (m, 1H), 2,33-2,28 (m, 1H), 2,22 (s, 2,4H), 2,21 (s, 0,6H), 2,02 (q, J - 9 Hz, 1 H), 1,56-1,38 (m, 1 H), 1,28-1,22 (m, 1 H), 0,97 (s, 9H), 0,83 (d, J=6Hz, 3 H), 0,72 (s, 9H). EM(FAB) 778,3 (m+H), 776,3 (M-H). EXEMPLO 36 Clonagem, expressão e purificação da protease recombinante NS3 de HCV, do tipo 1b. O soro de um paciente infectado com HCV foi obtido através de uma colaboração externa (Bernard Willems, MD, Hôpital St. Luc, Montreal, Canadá e do Dr. Donald Murphy, Laboratoire de Santé Publique du Quebec, St. Anne de Bellevue, Canadá). Um molde de cDNA construído de inteira extensão do genoma do HCV, foi construído a partir de fragmentos de DNA obtidos por meio de transcrição reversa-PCR (TA-PCR) do RNA do soro e usando primers específicos selecionados com base na homologia entre ou- tras cepas do genótipo 1b. A partir da determinação da inteira seqüência genômica, um genótipo 1b foi atribuído ao HCV isolado, de acordo com a classificação de Simmonds e outros (J. Clin. Microbiol., (1993), 31, páginas 1493-1503). A seqüência de aminoácido da região não estrutural, NS2- NS4B, foi mostrada como sendo maior que 93% de identidade ao genótipo do HCV 1b (BK, JK e 483 isolados) e 88% idêntica ao genótipo 1a do HCV (isolado do HCV 1). Um fragmento do DNA, codificador do precursor de poli- proteína (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) foi gerado pelo PCR e introduzido dentro dos vetores de expressão eucariópticos. Após uma transfecção tran- sitória, o processamento da poliproteína mediado pela protease NS3 do HCV, foi demonstrado pela presença da proteína NS3 madura, usando a análise de Western blot. A proteína NS3 madura não foi observada com ex- pressão de um precursor de poliproteína contendo a mutação A1165A, que desativa a protease NS3, confirmando a funcionalidade da protease NS3 do HCV. O fragmento de DNA codificador da protease recombinante NS3 de HCV (aminoácido 1027 a 1206), foi clonado no vetor de expressão bacte- riana pET11d. A expressão da protease NS3 na E. coli BL21(DE3)pLysS foi induzida por incubação com IPTG 1mM,durante 3 horas a 22°C. Uma fer- mentação típica (18 L), produziu aproximadamente 100 g de uma pasta de célula úmida. As células foram novamente suspensas no tampão de lise (3,0 ml/g), consistindo de fosfato de sódio 25 mM, pH 7,5, glicerol a 10% (vol/vol), EDTA 1mM, NP-40 0,01% e depois armazenadas a uma temperatura de - 80°C. As células foram congeladas e homogeneizadas em seguida à adição de DTT 5mM. A seguir, foram adicionados cloreto de magnésio e Dnase ao produto homogeneizado, em concentrações finais de 20 mM e 20 pg/ml res- pectivamente. Após uma incubação de 25 minutos a 4°C, o produto homo- geneizado foi sonicado e centrifugado a 15000 x g, por 30 minutos a 4°C. O pH do sobrenadante foi depois ajustado para 6,5, usando uma solução de fosfato de sódio 1M.
Uma etapa adicional de cromatografia por filtração de gel foi adi- cionada à segunda etapa do procedimento de purificação, descrito no docu- mento de patente WO 95/22985 (aqui incorporado por meio dessa referên- cia). Brevemente, o sobrenadante do extrato bacteriano foi carregado em uma coluna SP HiTrap (Pharmacia) previamente equilibrada a uma vazão de 2 ml/min no tampão A (fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5, glicerol 10%, EDTA
1mM, DTT 5 mM, NP-40 0,01%). A coluna foi depois lavada com o tampão A contendo NaCI 0,15 mM e a protease eluída mediante aplicação de 10 volu- mes de coluna de um gradiente linear de NaCI 0,15 a 0,3 M. As frações con- tendo a protease NS3 foram agrupadas e diluídas a uma concentração final de NaCL de 0,1 Μ. A enzima foi ainda purificada em uma coluna HiTrap He- parin (Pharmacia), equilibrada em um tampão B (fosfato de sódio 25 mM, pH 7,5, glicerol 10%, DTT 5 mM, NP-40 0,01%). A amostra foi carregada a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi depois lavada com o tampão B contendo NaCI 0,15 M a uma vazão de 1,5 ml/min. Foram realizadas duas etapas de lavagem na presença do tampão B contendo NaCI 0,3 ou 1M. A protease foi recuperada na lavagem de NaCI 0,3 M, diluída 3 vezes com o tampão B, reaplicada na coluna HiTrap Heparin e eluída com o tampão B contendo NaCI 0,4 M. Finalmente, as frações contendo a protease NS3 foram aplica- das em uma coluna Superdex 75 HiLoad 16/60 (Pharmacia), equilibrada em um tampão B contendo NaCI 0,3 Μ. A pureza da protease NS3 de HCV obti- da das frações agrupadas foi julgada como sendo maior que 95% pelo pro- grama SDS-PAGE, seguido de análise densitométrica. A enzima foi armazenada a uma temperatura de -80°C e foi congelada e diluída um pouco antes do uso. EXEMPLO 37 Ensaio radiométrico do peptídeo do co-fator da protease NS3 de HCV/NS4A. A enzima foi clonada, expressa e preparada de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 36. A enzima foi armazenada a uma tempera- tura de -80°C, congelada e diluída um pouco antes de uso no tampão do ensaio contendo o peptídeo do co-fator de NS4A. O substrato usado para o ensaio radiométrico do peptídeo do co- fator protease NS3/NS4A, DDIVPC-SMSYTW é clivado entre os resíduos de cisteína e serina pela enzima. A seqüência DDIPC-SMSYTW corresponde ao local de divagem natural da NS5A/NS5B, em que o resíduo de cisteína em P2 foi substituído com uma prolina. O substrato de peptídeo DDIVPC- SMSYTW e o traçador DDIVPC-SMS[125I-Y]TW de biotina são incubados com a protease NS3 recombinante e o co-fator de peptídeo NS4A, KKGSV- VIVGRIILSGRK (razão molar da enzima:co-fator de 1:100) na ausência ou presença de inibidores. A separação do substrato dos produtos é realizada pela adição de pérolas de agarose revestidas de avidina, à mistura do en- saio, seguido de filtração. A quantidade do produto de SMS[125I-Y]TW encon- trado no filtrado permite o cálculo da percentagem de conversão do substra- to e da percentagem de inibição. A. Reagentes Tris e Tris-HCI (ultrapuro), foram obtidos da Gibco-BRL. Glicerol (ultrapuro), MES e BSA foram adquiridos da Sigma. TCEP foi obtido da Pier- ce, DMSO da Aldrich e NaOH da Anachemia.
Tampão do ensaio: Tris HCI 50 mM, pH 7,5, glicerol 30% (pe- so/vol), BSA 1 mg/ml, TCEP 1 mM (TCEP adicionado um pouco antes do uso de uma solução de matéria-prima 1M em água).
Substrato: DDIVPCSMSYTW, concentração final de 25 μΜ (a partir de uma solução de matéria-prima em DMSO, armazenada a -20°C, para evitar a oxidação).
Traçador: substrato de biotina iodinado mono-reduzido de DDIVPC-SMS[125I-Y]TW (concentração final de aproximadamente 1 nM).
Protease NS3 de HCV do tipo 1b, concentração final de 25 nM (de uma solução de matéria-prima em fosfato de sódio a 50mm, pH 7,5, gli- cerol a 10%, NaCI 300 mM, DTT 5 mM, NP-40 0,01%).
Peptídeo do co-fator NS4A: KKGSWIVGRIILSGRK, concentra- ção final de 2,5 μΜ (de uma solução de matéria-prima 2mM em DMSO, ar- mazenada a - 20°C). B. Protocolo O ensaio foi realizado em uma placa de poliestireno de 96 cavi- dades da Costar. Cada cavidade continha: - 20 μΙ de substrato/traçador no tampão do ensaio; -10 μΙ ± inibidor em DMSO a 20%/tampão do ensaio; - 10 μΙ do peptídeo do co-fator de protease NS3 1b/NS4 (razão molar de 1:100); - Branco (nenhum inibidor e nenhuma enzima) e controle (ne- nhum inibidor) foram também preparados na mesma placa de ensaio. A reação enzimática foi iniciada pela adição da solução de petí- dio enzima/NS4 e a mistura do ensaio foi incubada durante 40 minutos a 23°C, sob suave agitação. Dez (10) μΙ de NaOH 0,5 N foram adicionados a 10 μΙ de MES 1 M, pH 5,8, foram adicionados para resfriar a reação enzimá- tica.
Vinte (20) μΙ de pérolas de agarose revestidas de avidina (adqui- ridas da Pierce) foram adicionados em uma placa de filtração e incubadas por 60 minutos a 23°C sob suave agitação.
As placas foram filtradas usando um aparelho de filtração de manifold a vácuo da Millipore Multiscreen e 40 μΙ do filtrado foram transferi- dos em uma placa opaca de 96 cavidades contendo 60 μΙ de fluido de cinti- lação por cavidade.
Os filtrados foram contados em um intrumento Packard Top- Count, usando um protocolo liquido 125l durante 1 minuto. O percentual de inibição foi calculado de acordo com a seguinte equação: 100 - [(contagem inh - contagem branco)/(contagem cti - contagem tranco) x 100] Uma curva não linear que se adequa ao modelo de Hill, foi apli- cada aos dados de inibição-concentração e a concentração efetiva de 50% (IC50) foi calculada mediante uso do programa SAS (Statistical Software Sys- tem; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.). EXEMPLO 38 Ensaio de Proteína heterodímera NS3-NS4A de inteira extensão.
A região não codificadora NS2-NS5B-3' foi clonada pelo TA-PCR dentro do vetor pCR®3 (Invitrogen), usando o RNA extraído do soro de um genótipo 1b de HCV, infectado individualmente (fornecido pelo Dr. Bernard Willems, Hôpital St. Luc, Montreal, Quebec, Canadá). A região do DNA NS3- NS4A foi depois subclonada pelo PCR dentro do vetor de expressão do ba- culovírus pFastBac™ Hta (Gibco/BRL). A seqüência do vetor inclui uma regi- ão codificadora de uma seqüência do resíduo 28 do terminal N, que contém uma marcação de hexahistidina. O sistema de expressão do baculovírus Bac-to-Bac™ (Gibco/BRL), foi usado para produzir o baculovírus recombi- nante. A NS3 madura de inteira extensão e a proteína heterodímera NS4A (His-NS3-NS4AFL) foram expressas mediante infecção de 106 Sf21 célu- las/ml com o baculovírus recombinante em uma multiplicidade de infecção de 0,1-0,2 a 27°C. A cultura infectada foi colhida após 48 a 64 horas, medi- ante centrifugação, a 4°C. O pélete da célula foi homogeneizado em NaP04 50 mM, pH 7,5, glicerol 40% (peso/vol), 2mm β-mercaptoetanol, na presença de um coquetel de inibidores de protease. His-NS3-NS4AFL foi depois extra- ída do lisato da célula com NP-40 1,5%, Triton X-100, NaCI 0,5 M e um tra- tamento de DNase. Após a ultracentrifugação, o extrato solúvel foi diluído 4 vezes e ligado em uma coluna de quelação de Ni, Hi-Trap, da Pharmacia. A
His-NS3-NS4AFL foi eluída em uma forma > 90% de pureza (conforme jul- gado pelo programa SDS-PAGE), usando um gradiente de imidazol de 50 a 400 mM. A His-NS3-NS4AFL foi armazenada a uma temperatura de -80°C em fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5, glicerol 10% (peso/vol), NaCI 0,5 M, imi- dazol 0,25 Μ, NP-40 0,1%. A mesma foi congelada e diluída um pouco antes de uso. A atividade da protease da His-NS3-NS4AFL foi testada em Tris- HCI 50 mM, pH 8,0, citrato de sódio 0,25 M, n-dodecil-p-D-maltoside 0,01% (peso/vol), TCEP 1mM. Cinco (5) μΜ do substrato internamente resfriado antranilil-DDIVPAbu[C(0)-0]-AMY(3-N02)TW-0H, na presença de diversas concentrações do inibidor, foram incubadas com 1,5 nM de His-NS3- NS4AFL, durante 45 minutos, a 23°C. A concentração final de DMSO não excedeu 5,25%. A reação foi concluída com a adição de MES 1M, pH 5,8. A fluorescência do produto de terminal N foi monitorada em um fluorômetro da Perkin-Elmer, modelo LS-50B, equipado com uma leitora de placa de 96 po- ços (comprimento de onda de excitação: 325 mm; comprimento de onda de emissão: 423 nm). O percentual de inibição foi calculado por meio da seguinte e- quação: 100 - [(contagem inh - contagem branco)/(contagem & - contagem branco) x 100] Uma curva não linear que se adequa ao modelo de Hill, foi apli- cada aos dados de inibição-concentração e a concentração efetiva de 50% (IC50) foi calculada mediante uso do programa SAS (Statistical Software Sys- tem; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.). EXEMPLO 39 Ensaio baseado na Célula Protease NS3 Esse ensaio foi realizado com células Huh-7, uma linha celular humana derivada de um hepatoma, co-transfectada com 2 construtores de DNA: - um expressa uma poliproteína compreendendo as proteínas não estruturais do HCV fundidas ao trt na seguinte ordem: NS3-NS4A- NS4B-NS5A-trt (chamada de NS3); - o outro expressa a proteína repórter, a fosfatase alcalina secre- tada, sob o controle do trt (chamado de SEAP). A poliproteína deve ser clivada pela protease NS3 para que as proteínas maduras sejam liberadas. Após a liberação das proteínas madu- ras, é acreditado que as proteínas virais irão formar um complexo na mem- brana do retículo endoplásmico, enquanto o trt irá migrar para o núcleo e transativar o gene SEAP. Portanto, a redução da atividade proteolítica da NS3 deverá levar à redução dos níveis maduros de trt e simultânea diminui- ção na atividade do SEAP.
Para controlar os outros efeitos dos compostos, foi realizada uma transfecção paralela, onde um construtor que expressa o trt individual- mente (chamado trt), foi co-transfectado com o construtor de SEAP, de mo- do que a atividade do SEAP tornou-se independente da atividade proteolítica da NS3.
Protocolo do ensaio: células Huh-7, cultivadas em CHO-SFMII + 10% FCS (soro fetal de bezerro), foram co-transfectados com NS3 e SEAP ou trt e SEAP, usando o protocolo FuGene (Boehringer Mannheim). Após 5 horas a 37°C, as células foram lavadas, tripsinizadas e plaqueadas (em 80.000 células/cavidades) em placas de 96 cavidades, contendo uma varie- dade de concentrações dos compostos a serem testados. Após um período de incubação de 24 horas, foi extraída uma fração do meio e foi medida a atividade do SEAP nessa fração com o kit Phospha-Light (Tropix). A análise da inibição percentual da atividade do SEAP com rela- ção à concentração do composto foi realizada com o programa SAS, para se obter o EC50. A toxicidade do composto (TC50) foi depois testada, usando o ensaio MTT, conforme disposto a seguir: - 20 μΙ de uma solução MTT (5 mg/ml do meio) foi adicionada por cavidade e incubada a 37°C por 4 horas; - o meio foi removido e foi adicionado 50 μΙ de HCI 0,01 N + Tri- ton X-100a 10% ; - após agitação à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora, o OD de cada cavidade foi lido em um comprimento de onda de 595 nm. O valor de TC50 foi calculado da mesma maneira que o EC50. EXEMPLO 40 Ensaios Específicos A especificidade dos compostos foi determinada contra uma va- riedade de proteases de serina: elastase de leucócito humano, elastase pancreática de suínos e α-quimotripsina pancreática de bovinos e uma pro- tease de cisteína - catepsina B do fígado humano. Em todos os casos, foi usado um protocolo de formato de placa de 96 cavidades, usando um subs- trato de p-nitroanilina (pNA) colorimétrico, específico para cada enzima. Ca- da ensaio incluiu uma incubação prévia do inibidor de enzima por 1 hora, a 30°C, seguido da adição do substrato e hidrólise a uma conversão de apro- ximadamente 30%, conforme medido por uma leitora de microplaca de UV, Thermomax®. As concentrações do substrato foram mantidas o mais baixo possível, quando comparado ao Km para reduzir a competição do substrato.
As concentrações do composto variaram de 300 a 0,06 μΜ, dependendo de sua potencialidade.
As condições finais para cada ensaio foram como segue: - Tris-HCI 50 mM; pH 8,0; Na2S04 0,5 M; NaCI 50 mM; EDTA 0,1 mM; DMSO 3%; Tween-20 0,01%; com - [Succ-AAPF-pNA 100 μΜ e a-quimotripsina 250 pM]; [Succ- AAA-pNA 133 μΜ e 8 nM de elastase de suíno]; [Succ-AAV-pNA 133μΜ e 8 nM de elastase de leucócitos]; ou - [NaHP04 100 mM; pH 6,0; EDTA 0,1 mM; DMSO 3%; TCEP 1mM; Tween-20 0,01%; Z-FR-pNA 30 μΜ e 5 nM de catepsina B (a enzima de matéria-prima foi ativada no tampão contendo TCEP 20mM, antes de u- so)].
Um exemplo representativo é resumido abaixo para a elastase pancreática de suínos.
Em uma placa de 96 poços de base plana de poliestireno, usan- do um manipulador de líquido Biomek (Beckman), foram adicionados: - 40 μΙ do tampão do ensaio (Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, NaCI 50 mM, EDTA 0,1 mM; - 20 μΙ da solução de enzima (Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, NaCI 50 mM, EDTA 0,1 mM, Twen-20 0,02%, elastase pancreática de suíno 40 nM); e - 20 μΙ da solução de inibidor (Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, NaCI 50 mM, EDTA 0,1 mM, Twen-20 0,02%, inibidor 1,5 mM-0,3 μΜ, DMSO 15% (vol/vol)).
Após 60 minutos de incubação prévia a 30°C, 20 μΙ da solução do substrato (Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, Na2S04 0,5 M, NaCI 50 mM, EDTA 0,1 mM, Suc-AAA-pNA 665 μΜ) foram adicionados a cada cavidade e a rea- ção foi posteriormente incubada a 30°C por 60 minutos, após o tempo de absorbância foi lido numa leitora de placa de UV, Thermomax®. A filas de cavidades foram alocadas para os controles (nenhum inibidor) e para os brancos (nenhum inibidor e nenhuma enzima).
As duas vezes de diluições sequenciais da solução do inibidor foram realizadas em uma placa separada pelo manipulador de líquido, usan- do Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, NaCI 50 mM, EDTA 0,1 mM, Tween-20 0,02%, DMSO 15%. Todos os outros ensaios de especificidade foram realizados de uma maneira similar. O percentual de inibição foi calculado usando a fórmula: [1-((UV in - UV branco)/(UV ct, - UV branco))] X 100 Uma curva não linear que se adequa ao modelo de Hill, foi apli- cada aos dados de inibição-concentração e a concentração efetiva de 50% (IC50) foi calculada mediante uso do programa SAS (Statistical Software Sys- tem; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).
TABELA DOS COMPOSTOS
As Tabelas seguintes relacionam os compostos representativos da invenção. Os compostos da invenção foram testados tanto em um como em ambos os ensaios dos Exemplos 37 e 38 e foram considerados como ativos, com 0 IC5o abaixo de 50 μΜ (A); abaixo de 5 μΜ (B) ou abaixo de 0,5 μΜ (C).
Atividade nas Células e Especificidade: Os compostos representativos da invenção foram também testa- dos no ensaio baseado na célula substituta do Exemplo 39 e em um dos di- versos ensaios do Exemplo 40. Por exemplo, o composto 601 da Tabela 6 foi encontrado como tendo um IC50 de 50 nM no ensaio do Exemplo 37 e de 30 nM no ensaio do Exemplo 38. O EC50, conforme determinado pelo ensaio do Exemplo 39, é de 8,2 μΜ. Nos ensaios de especificidade do Exemplo 40, o mesmo composto foi encontrado como tendo a seguinte atividade: HLE > 75 μΜ; PPE > 75 μΜ; α-Quim. > 75 μΜ; Cat. B > 75 μΜ. Esses resultados indicam que essa família de compostos é altamente específica para a prote- ase NS3 e pelo menos determinados elementos dessa família são ativos em um ensaio baseado em célula substituta.
As seguintes abreviações são usadas dentro das presentes Ta- belas: MS: Dados de espectrometria de massa; Átomos de carbono: acetila; Bn: benzila; Boc: terc-butiloxicarbonila; cHex: ciclohexila; Chg: ciclo- hexilglicina (ácido 2-amino-2-ciclohexil-acético); iPr: isopropila; O-Bn: benzi- lóxi; Ph: fenila; t-Bu: terc-butila; Tbg: terc-butilglicina; 1- ou 2-Np: 1- ou 2- naftila; 1- ou 2-NPCH2O: 1- ou 2-naftilmetóxi.

Claims (12)

1. Processo para resolução de enanciômeros de uma mistura de éster metílico do ácido 1-amino-2-vinilciclopropil carboxilico, ou uma mistura N-protegida do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de tratar a dita mistura com uma esterase, para obter o correspondente e- nanciômero ou a forma N-protegida do mesmo.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita esterase é Alcalase®.
3. Processo para resolução de enanciômeros de uma mistura de compostos de fórmula Vlf. na qual, Ri é Ci_6 alquila, C3-7 cicloalquila, C2-6 alquenila ou C2-6 alquinila , todos opcionalmente substituídos por halogênio; 0 grupo R0C(=0)- é um grupo amino protegido e P é um grupo carboxila protegido; o referido processo sendo caracterizado pelo fato de que com- preende tratar a mistura com uma esterase para fornecer produtos das fór- mulas:
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mistura é tratada com a esterase sob condições em que 0 pH é controlado.
5. Processo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o grupo R0C(=0)- é selecionado a partir do grupo consis- tindo em carbamato aromático, carbamato alifático e carbamato cíclico de alquila.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que P é selecionado a partir de éster alquil, um éster aralquil e um éster que pode ser clivado mediante tratamento com uma base branda ou meios redutores brandos.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que a esterase é Alcalase®.
8. Processo para resolução de enanciômeros de uma mistura de compostos de fórmula VII: na qual, Ri é alquila, C3-7 cicloalquila, C2-6 alquenila ou C2-6 alquinila, todos opcionalmente substituídos por halogênio; o grupo R0C(=0)- é um grupo amino protegido e P* é um grupo carboxila protegido; o referido processo sendo caracterizado pelo fato de que com- preende tratar a mistura com uma esterase para fornecer produtos das fór- mulas:
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a mistura é tratada com a esterase sob condições em que 0 pH é controlado.
10. Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracteriza- do pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em carbama- to aromático, carbamato alifático e carbamato cíclico de alquila.
11. Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracteriza- do pelo fato de que P* é selecionado a partir de éster alquil, um éster aralquil e um éster que pode ser clivado mediante tratamento com uma base branda ou meios redutores brandos.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a esterase é Alcalase®.
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