MX2007014971A - Metodos y composiciones para realzar el fitomejoramiento. - Google Patents

Abstract

Esta invencion provee metodos y composiciones de reproduccion para aumentar el germoplasma de una planta; los metodos describen la identificacion y acumulacion de transgenes y regiones genomicas de haplotipos favorables en un germoplasma de una poblacion de reproduccion de plantas de cultivo.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA REALZAR EL FITOMEJORAMIENTO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/685,584, presentada en mayo 27 de 2005, cuyo texto entero se incorpora específicamente en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo del fitomejoramiento y biotecnología vegetal, en particular a un transgen insertado en ligamiento genético con una región genómica de una planta, y al uso de la región genómica/transgen para mejorar el germoplasma y para acumular otras regiones genómicas favorables en poblaciones para mejora genética.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La mejora genética ha avanzado desde la selección para rasgos económicamente importantes en plantas y animales basada en registros fenotípicos del individuo y sus allegados, hasta el uso de la genética molecular para identificar regiones genómicas que contienen a los rasgos genéticos valiosos. La información al nivel del ADN ha llevado a la acumulación genética más rápida de rasgos valiosos en un germoplasma, que la que se logró basada sólo en los datos fenotípicos. El desarrollo de cultivos transgénicos ha revolucionado además la mejora genética y la producción de cultivos agrícolas. El éxito sobresaliente de cultivos genéticamente diseñados es evidente del hecho de que el área de terreno para cultivo dedicado a cultivos transgénicos, ha aumentado desde un área despreciable diez años atrás, hasta bien más de la mitad del área para cultivos importantes en países agrícolamente importantes, tales como los Estados Unidos, Canadá, Brasil y Argentina. Además del desarrollo de rasgos de insumo, la biotecnología vegetal mantiene también gran promesa para el desarrollo futuro de rasgos de producción que beneficiarán directamente a los consumidores, como alimentos nutricionalmente superiores, tales como el arroz enriquecido con vitamina A, aceites insaturados y productos agrícolas de valor médico, por nombrar unos cuantos. El potencial para el éxito comercial de un transgen que codifica para un rasgo de insumo o producción nuevo o mejorado, es un gran incentivo para el desarrollo de transgenes novedosos y su despliegue a través de la mejora genética de estos genes en germoplasma élite. Durante el desarrollo de plantas de cultivo transgénicas, mucho esfuerzo se concentra en la optimización de la inserción y expresión del transgen, e introgresando entonces el transgen por toda la población para mejora genética mediante métodos clásicos de mejora genética. El sitio de inserción de un transgen en el genoma del hospedero, ha sido un problema por cuando menos dos razones: (i) la región en donde es insertado puede modular el nivel de expresión del transgen, y (ii) la inserción del transgen puede interrumpir la función o expresión normal de un gen donde ha sido insertado o cerca del sitio donde ha sido insertado. La selección de sitios genómicos que sean benéficos para la integración de genes, provee niveles adecuados de expresión estable de un gen introducido, o genes introducidos, y generalmente no afecta negativamente otras características agronómicas de la planta de cultivo. La región genómica en la cual el transgen ha sido insertado, provee también fenotipos agronómicos para la planta de cultivo. Estos fenotipos tienen su propio valor en un programa de mejora genética, y estas regiones deben considerarse cuando se seleccione entre eventos de inserción de transgenes múltiples. Los eventos de inserción de transgenes en regiones genómicas que están asociadas con desempeño mejorado con respecto a un rasgo agronómico o índice de rasgos múltiples, resultan en un fenotipo mejorado en la planta de cultivo y la descendencia derivada de la planta de cultivo que contiene al transgen y el fenotipo mejorado asociado. La selección para el evento transgéníco necesariamente resulta en la selección de un segmento del genoma del hospedero que lo rodea, y el efecto fenotípíco mejorado. Más mejoras implican la identificación de marcadores moleculares para el rastreo y el mantenimiento del segmento genómico con el transgen asociado. Esta es un área que no ha sido consignada adecuadamente en el fitomejoramiento actual con eventos de inserción de transgenes.

Existe la necesidad en la técnica de fitomejoramiento, de identificar regiones genómicas asociadas con desempeño mejorado con respecto a un rasgo agronómico o índice de rasgos múltiples que estén ligados con un evento de inserción de transgenes, y seleccionar entonces para estas regiones genómicas-transgenes para dispersión en la población para mejora genética del cultivo. La presente invención provee consideración para estimar el valor de la región genómica y el evento de transgenes. Este valor puede usarse entonces como un criterio para seleccionar entre eventos transgénicos múltiples. Otro beneficio es que el arrastre de ligamiento alrededor de un transgen es reducido al mínimo, y se seleccionan regiones genómicas valiosas que contienen al transgen para mejora genética en el germoplasma de un cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método de mejora genética, con plantas transgénicas. En un aspecto, este método comprende proveer una base de datos que identifique un valor de un rasgo agronómico para por lo menos dos haplotipos distintos del genoma para un juego de germoplasma. El método comprende además transformar una planta progenitora con ADN recombinante para producir por lo menos dos eventos transgénicos, en donde el ADN recombinante es insertado en ligamiento con los haplotipos distintos (por lo menos dos) del genoma de la planta progenitora. La base de datos puede ser referida entonces para estimar el valor del rasgo agronómico para los eventos ligados a los haplotipos distintos, y el evento transgénico que tenga un mayor valor de mejora genética referido, puede seleccionarse entonces para mejora genética en un germoplasma. La presente invención provee un método para mejorar el germoplasma de las plantas mediante la acumulación de uno o más haplotipos en un germoplasma. El método comprende insertar un transgen en un genoma de una primera planta, y determinar entonces un sitio en el mapa del transgen en el genoma. El sitio en el mapa puede correlacionarse con un haplotipo ligado, en donde el transgen y el haplotipo comprenden una región genómíca tipo T. La primera planta puede ser cruzada entonces con una segunda planta. La segunda planta puede contener por lo menos una región genómica tipo T o haplotipo que sea diferente de la región genómica tipo T de la primera planta. Por lo menos una planta de la descendencia puede seleccionarse entonces, la planta de la descendencia teniendo expresión detectable del transgen o su fenotipo, y comprendiendo en su genoma la región genómica tipo T de la primera planta, y por lo menos una región genómica tipo T o haplotipo de la segunda planta. La planta de la descendencia puede usarse en actividades relacionadas con la mejora del germoplasma, la cual puede seleccionarse del uso de la planta para obtener cruzas para mejora genética, prueba adicional de la planta, mejora de la planta a través de autofecundación, el uso de la planta o partes de la misma para transformación, el uso de la planta o partes de la misma para mutagénesis, y el uso de la planta o partes de la misma para TILLING (lesiones locales inducidas por la elección del objetivo en los genomas), o cualquier combinación de éstos. La presente invención incluye un método para la mejora genética de una planta de cultivo, en particular una planta de soya o maíz con rasgos transgénicos y agronómicos mejorados que comprenden una región genómica tipo T preferida. Se define además que un transgen de la región genómica tipo T confiere una propiedad preferida, como tolerancia a herbicidas, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos o plagas, metabolismo alterado de ácidos grasos, proteínas o carbohidratos, rendimiento de grano incrementado, contenido de aceite incrementado, contenido nutricional incrementado, índices de crecimiento incrementados, tolerancia mejorada al estrés o características morfológicas alteradas, o cualquier combinación de éstos. La presente invención provee un método novedoso para mapear por lo menos una región genómica de inserción de un transgen. Este método implica mapeo indirecto, y no requiere el establecimiento de una población segregante de novo para un transgen. El método comprende primero identificar por lo menos un primer polimorfismo entre las líneas progenitoras de una población de mapeo en la región genómica correspondiente adyacente a un evento de inserción transgénico en una planta o línea transformada, y entonces poner a prueba las plantas de la descendencia de la población de mapeo para el polimorfismo. Puede realizarse análisis de ligamiento para determinar la posición del polimorfismo en el mapa, y de esta manera un sitio en el mapa del evento de inserción transgénico. El sitio en el mapa en la población de mapeo puede correlacionarse entonces con un haplotipo de la planta transformada y su descendencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS Las definiciones y métodos provistos definen la presente invención, y guían a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, los términos se entenderán de acuerdo al uso convencional por los expertos en la técnica relevante. Definiciones y términos comunes en biología molecular, pueden encontrarse también en Rieger et al. (1991 ); y Lewin (1994). Se usa la nomenclatura para las bases de ADN como se expone en 37 CFR § 1.822. Como se usa en la presente, el término "maíz" significa Zea mays, e incluye todas las variedades de plantas que pueden reproducirse con el maíz, incluyendo especies de maíz silvestre. Como se usa en la presente, el término "soya" significa Glycine max, e incluye todas las variedades de plantas que pueden reproducirse con la soya, incluyendo especies de soya silvestres. Como se usa en la presente, el término "que comprende" significa "que incluye, pero no está limitado a". Un "evento" transgénico se produce mediante lar transformación de una célula vegetal con ADN heterólogo, es decir, una construcción de ácido nucleico que incluye un transgen de interés, regeneración de una población de plantas que resulta de la inserción del transgen en el genoma de la planta, y selección de una planta particular caracterizada por inserción en un sitio particular del genoma. El término "evento" se refiere al transformante original y la descendencia del transformante que incluye al ADN heterólogo. El término "evento" se refiere también a la descendencia producida mediante un cruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluya al ADN heterólogo. La presente invención supera las deficiencias de los métodos actuales de mejora genética de transgenes, describiendo una región genómica tipo T definida como un transgen y una región genómica ligada al haplotipo, a través de la cual el haplotipo y el transgen ligado genéticamente se seleccionan, y son introgresados entonces en el germoplasma a través de mejora genética. La selección de la región genómica tipo T se basa en la estimación de un valor T que la región genómica tipo T provee al germoplasma de la planta de cultivo. La base de la evaluación distingue y selecciona regiones genómicas tipo T mejoradas para su uso en un método de mejora genética, y selecciona y mejora plantas que comprenden las regiones genómicas tipo T mejoradas. Los sitios genómicos para la integración de genes son favorables con base en que proveen niveles adecuados de expresión estable de un gen introducido o genes introducidos, y por la identificación de asociaciones de transgenes con regiones de haplotipos favorables que proveen también características agronómicas benéficas para el germoplasma. Mediante la consideración de los aspectos benéficos del transgen y la región genómica a la cual es ligado genéticamente, puede acumularse valor adicional en un evento transgénico, y su uso para el desarrollo de germoplasma superior. En un resultado inesperado de experiencia extensiva en la mejora genética con plantas transgénicas, los inventores han comprendido que debe darse consideración adicional a la región genómica que es ligada a la inserción del transgen. Puesto que un transgen es difundido mediante métodos de mejora genética en el germoplasma de la planta, una porción de la región genética ligada al transgen es difundida también. Dando consideración a la región genética ligada a un transgen, es posible implementar estrategias biotecnológicas y de mejora genética para incrementar el valor general del transgen y la región genética a la cual es ligado para realzar la mejora del germoplasma, y reducir al mínimo el riesgo de adelanto de regiones genéticas menos favorables, referido con frecuencia como arrastre de ligamiento. Por ejemplo, un aspecto de la presente invención, se han identificado regiones genómicas tipo T de nuevos eventos de soya tolerantes a glifosato que comprenden un transgen de tolerancia a glifosato con niveles de expresión adecuados en ligamiento con un haplotipo. El tipo T de rendimiento más alto se identificó como evento 19788 (referido también como MON89788), y proveyó el reemplazo de la región genómica tipo T del evento 40-3-2 con un haplotipo en la misma región genómica con rendimiento mejorado, según se determinó en una comparación codo a codo. Este hallazgo tendrá impacto significativo en el realce del germoplasma de soya tolerante a glifosato. Una porción significativa de la mejora genética reciente de la soya, ha usado líneas que contienen el rasgo Roundup Ready® presente en el evento 40-3-2 (Padgette et al., 1995), con posiblemente tanto como 80 a 95% del germoplasma de la soya ofrecido para su venta en los Estados Unidos, conteniendo comúnmente este evento transgénico. Para continuar mejorando el germoplasma de la soya, es deseable poder identificar eventos tolerantes a glifosato que tengan también regiones genómicas del haplotipo favorables, y reemplazar la región genómica tipo T 40-3-2 en el germoplasma, proveyendo por lo tanto rasgos agronómicos élite de la línea progenitora para la descendencia. En otro aspecto de la presente invención, se identifican regiones genómicas tipo T de eventos de soya tolerantes a insectos que comprenden un transgen de resistencia a insectos con niveles de expresión adecuados en ligamiento con un haplotipo. El evento GM__19459 se seleccionó de una población de eventos de soya transgénicos. Estos eventos contienen un transgen insertado en el genoma de la soya que expresa una proteína tóxica para plagas de insectos lipidópteros de la soya. Las varias regiones genómicas del haplotipo han sido mapeadas para facilitar la selección de un evento con la región genómica tipo T más favorable. En otro aspecto de la presente invención, se identifican regiones genómicas tipo T de eventos de maíz tolerantes a insectos, que comprenden un transgen de resistencia a insectos con niveles de expresión adecuados en ligamiento con un haplotipo. El evento de maíz tolerante a insectos se selecciona de una población de eventos de maíz transgénicos. Estos eventos contienen un transgen insertado en el genoma del maíz que expresa una proteína tóxica para plagas de insectos lepidópteros del maiz. Las varias regiones genómicas del haplotipo son mapeadas para facilitar la selección de un evento con la región genómica tipo T más favorable. Cualquier transgen insertado en el genoma de una planta de cultivo que pueda ser mapeado hacia un sitio genómico, puede compararse entonces con un marcador de haplotipos desarrollado en ese sitio, para determinar si el sitio comprende un haplotipo con un valor de mejora genética mejorado. En una modalidad, la presente invención provee marcadores genéticos y métodos para la identificación y la mejora genética de regiones genómicas tipo T en la soya. La invención permite por lo tanto por primera vez la creación de plantas de soya que combinan el valor de un transgen y un haplotipo agronómicamente élite o favorable. Se identifican por lo menos haplotipos favorables, como aquellos que han sido heredados con más frecuencia de lo esperado en una población de plantas. Mediante el uso de los métodos de la presente invención, pueden introducirse loci que comprendan una región genómica tipo T en potencialmente cualquier planta de soya deseada. Se proveen marcadores moleculares que cuando se usan en un programa de mejora genética asistido por marcadores, proveen medios para identificar y mantener la asociación del haplotipo favorable y el transgen para proveer la región genómica tipo T valiosa. La presente invención provee ejemplos de transgenes que proveen fenotipos resistentes a herbicidas e insectos para las plantas de soya; otros transgenes que proveen tolerancia al estrés, tolerancia a enfermedades, contenido mejorado de proteínas, aceites o aminoácidos, u otros rasgos de calidad, nutrición o procesamiento del pienso, se contemplan también como aspectos de la presente invención, y germoplasma que comprenda estos tipos T sería cruzado para proveer un producto de rasgos apilado con regiones genómicas tipo T preferidas. En otra modalidad, la presente invención provee marcadores genéticos y métodos para la identificación y la mejora genética de regiones genómicas tipo T en el maíz. La invención permite por lo tanto por primera vez la creación de plantas de maíz que combinan el valor de un transgen y un haplotipo agronómicamente élite o favorable. Mediante el uso de los métodos de la presente invención, pueden introducirse loci que comprendan una región genómica tipo T en potencialmente cualquier planta de maíz deseada. Se proveen marcadores moleculares que cuando se usan en un programa de mejora genética asistido por marcadores, proveen medios para identificar y mantener la asociación del haplotipo favorable y el transgen para proveer la región genómica tipo T valiosa. La presente invención provee ejemplos de transgenes que proveen un fenotipo resistente a insectos para la planta de maíz; otros transgenes que proveen tolerancia al estrés, tolerancia a herbicidas, contenido mejorado de proteínas, aceites o aminoácidos, u otros rasgos de calidad, nutrición o procesamiento del pienso, se contemplan también como aspectos de la presente invención, y germoplasma que comprenda estos tipos T sería cruzado para proveer un producto de rasgos apilado con regiones genómicas tipo T preferidas.

Región genómica tipo T y el concepto de valor tipo T Una región genómica tipo T, es una composición genética novedosa que comprende por lo menos un transgen, con niveles de expresión adecuados, en ligamiento genético con un haplotipo. En una modalidad preferida, el ligamiento de un transgen con un haplotipo no debe tener efecto deletéreo observable alguno sobre la integridad funcional del haplotipo debido a la inserción local del transgen. Además, un haplotipo de una región genómica tipo T podría ser mejorado funcionalmente como resultado de la integración en ligamiento genético de un transgen. La composición de la región genómica tipo T tiene el beneficio del transgen, y el haplotipo con el cual está ligado. La región genómica tipo T es la composición genética a través de la cual un transgen es difundido en el germoplasma mediante mejora genética. En una modalidad preferida de la presente invención, un haplotipo de una región genómíca tipo T comprende por lo menos dos marcadores bialélicos aproximadamente 10 cM aparte, o por lo menos un locus plurialélico dentro de 5 cM del transgen, y con alto contenido de información polimórfica. Los cambios en un haplotipo, producidos mediante recombinación, por ejemplo, pueden resultar en la modificación de un haplotipo, de modo que sólo comprenda una porción del haplotipo original (progenitor) ligado físicamente al transgen. Cualquiera de dichos cambios en un haplotipo se incluiría en la definición de lo que constituye una región genómica tipo T, en tanto la integridad funcional de la región genómica tipo T permanezca sin cambios o sea mejorada. El ligamiento del transgen con el haplotipo o porción funcional del mismo, que provee el fenotipo deseable, está de preferencia dentro de aproximadamente 5 cM, o dentro de aproximadamente 2 cM, o dentro de aproximadamente 1 cM de la región del haplotipo. Se considera que no será cambiada la integridad funcional de un haplotipo, si su valor no es negativo con respecto a rendimiento, o no es positivo con respecto a madurez, o es nulo con respecto a madurez, o entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples, cuando se compara con cualquier otro haplotipo en el mismo segmento cromosómico en un juego de germoplasma (germoplasma para mejora genética, población para mejora genética, colección de líneas endógamas élite, población de individuos de apareamiento al azar, cruza biparental), o entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo a través del genoma entero en un juego de germoplasma, o el haplotipo estando presente con una frecuencia de 50 por ciento o más en una población para mejora genética o un juego de germoplasma puede considerarse como evidencia de su alto valor, o cualquier combinación de éstos.

El beneficio o valor de la planta que comprenda en su genoma una región genómica tipo T, se estima mediante un valor T, que depende del valor del rasgo del transgen y el valor del haplotipo al cual el transgen está ligado. El valor de un transgen de una región genómica tipo T puede estimarse a partir del valor del rasgo que el transgen codifica. Este valor depende del rasgo del transgen (por ejemplo, incluyendo, pero no limitado a, tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, nutrición mejorada, rendimiento mejorado, rasgo de procesamiento mejorado o tolerancia al estrés), y podría estimarse a partir de la producción incrementada de la planta de cultivo, o disminución en insumos requeridos para el mantenimiento del cultivo, o cualquier combinación de éstos. El rasgo del transgen tiene también un valor como un marcador seleccionable o registrable. Esto tiene valor en aplicaciones de mejora genética para el experto en la técnica, debido a la capacidad para seleccionar o registrar los resultados del rasgo del transgen en la selección simultánea del haplotipo ligado. Por ejemplo, en el caso de una cruza hecha con una planta que comprende un tipo T, en donde el transgen codifica para tolerancia a un herbicida, la aspersión de la descendencia de esa cruza con el herbicida, tendría una alta probabilidad de selección para el transgen y el haplotipo recombinante o progenitor estrechamente ligado. Marcadores de ADN que se desarrollan para definir el haplotipo, pueden usarse para confirmar la integridad del tipo T en la descendencia de la cruza. Un transgen que comprenda una construcción recombinante puede comprender además un marcador seleccionable o marcador registrable. La secuencia de ácido nucleico que sirve como el marcador seleccionable o registrable funciona para producir un fenotipo en células, que facilita su identificación respecto a células que no contienen al marcador. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no están limitados a, un gen neo o nptll (Potrykus et al., 1991 ), que codifica para resistencia a kanamicina y puede seleccionarse para el uso de kanamicina, G418, etc.; un gen bar que codifica para resistencia a bialafós; EPSP sintasa resistente a glifosato, EPSP sintasa mutante resistente a glifosato (Hinchee ef al., 1988) que codifica para resistencia a glifosato, enzimas inactivadoras de glifosato; un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo (Staiker et al., 1988); un gen de acetolactato sintasa (ALS) mutante que confiere resistencia a imidazolinona o sulfonilurea (solicitud de patente europea No. 0154204); y un gen DHFR resistente a metotrexato (Thillet et al., 1988). Otros ejemplos de marcadores registrables incluyen: un gen de ß-glucuronidasa o uidA (GUS), que codifica para una enzima para la cual se conocen varios substratos cromógenos (Jefferson, 1987; Jefferson et al., 1987); un gen del locus R, que codifica para un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos de plantas (Dellaporta et al., 1988); un gen de ß-lactamasa (Sutcliffe eí al., 1987), que codifica para una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromógenos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromógena); un gen de luciferasa (Ow et al., 1986); un gen xylE (Zukowsky et al., 1983) que codifica para una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromógenos; un gen de ß-amilasa (Ikatu eí al., 1990); un gen de tirosinasa (Katz eí al., 1983), que codifica para una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona (que a su vez se condensan hasta melanina); y una ß-galatosidasa, que convertirá un substrato cromógeno de ß-galactosa. Incluidos dentro de los términos "marcadores seleccionables o registrables", están también genes que codifican para un marcador secretable cuya secreción puede detectarse como un medio para identificar o seleccionar células transformadas. Ejemplos incluyen marcadores que codifican para un antígeno secretable que puede identificarse mediante interacción con anticuerpos, o incluso enzimas secretables que pueden detectarse catalíticamente. Proteínas secretadas útiles como marcadores seleccionables pertenecen a muchas clases, e incluyen pequeñas proteínas difusibles que son detectables (por ejemplo, mediante ELISA), pequeñas enzimas activas que son detectables en solución extracelular (por ejemplo, ß-amilasa, ß-lactamasa, fosfinotricina transferasa), o proteínas que son insertadas o atrapadas en la pared celular (tales como proteínas que incluyen una secuencia guía tal como la que se encuentra en la unidad de expresión de extensión o PR-S del tabaco). Otros genes marcadores seleccionables posibles serán evidentes para los expertos en la técnica. Un marcador es de preferencia GUS, proteína fluorescente verde (GFP), neomicina fosfotransferasa II (nptll), luciferasa (LUX), una secuencia que codifica para genes de resistencia a antibióticos, o una secuencia que codifica para genes de resistencia a herbicidas. El agente seleccionable puede ser un antibiótico, por ejemplo incluyendo, pero no limitado a, kanamicina, higromicina, o un herbicida, por ejemplo incluyendo, pero no limitado a, glifosato, glufosinato, 2,4-D y dicamba. La región genómica tipo T tiene un valor en aplicaciones de mejora genética asistida por marcadores y selección asistida por marcadores. La selección para un transgen y un haplotipo favorable en el caso en donde comprenden una región genómica tipo T, requiere sólo un marcador, mientras que por lo menos dos marcadores se requerirían si el transgen y el haplotipo favorable no están ligados. Este valor potencial se incrementaría conforme más regiones genómicas tipo T se acumulen o se apilen en un germoplasma. El valor T puede cambiarse o modificarse cambiando la expresión del transgen, en donde un cambio es producido al nivel de la expresión del transgen, o en la regulación de la expresión del transgen, o en la localización de la expresión del transgen, o cualquier combinación de éstas. Esta invención anticipa que el cambio en el valor T producido por un cambio en alguno de los componentes de la expresión del transgen, podría efectuarse a través de factores de acción cis (local) o acción trans (pueden actuar a una distancia no simplemente en la molécula de ADN en la cual ocurren), o una combinación de éstos. Además, el valor T puede cambiarse o modificarse cambiando el haplotipo con el cual el transgen está ligado estrechamente. Una modalidad preferida de la presente invención es la mejora del valor T, seleccionando o dirigiendo el transgen de un tipo T genómico existente en ligamiento estrecho con un diferente haplotipo receptor, en donde el haplotipo diferente está asociado con valor adicional, y mejorado con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples sobre el haplotipo tipo T existente, según se determina en una comparación codo a codo o cabeza a cabeza. Un cambio en el haplotipo podría producirse también generando o seleccionando para por lo menos un haplotipo tipo T recombinante que sea mejorado con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples sobre el haplotipo tipo T existente, según se determina en una comparación codo a codo o cabeza a cabeza repetida. Otra modalidad preferida de la presente invención, es establecer valor adicional en un evento de transgen nuevo o novedoso, seleccionando o dirigiendo el transgen en ligamiento con un haplotipo receptor que tiene un valor de mejora genética que no es negativo con respecto a rendimiento, o no es positivo con respecto a madurez, o es nulo con respecto a madurez, o entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo en el mismo segmento cromosómico en un juego de germoplasma, o entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo a través del genoma entero en un juego de germoplasma, o alelos que confieren adecuación agronómica a una planta de cultivo, o el haplotipo estando presente con una frecuencia de 50 por ciento o más en una población para mejora genética o un juego de germoplasma puede considerarse como evidencia de su alto valor, o cualquier combinación de éstos. Otra modalidad de la presente invención es una selección de una planta o línea para transformación con por lo menos un primer transgen, en donde la selección de la planta o línea se basa en que comprende en su genoma una alta proporción de haplotipos receptores que tienen un valor de mejora genética que no es negativo con respecto a rendimiento, o no es positivo con respecto a madurez, o es nulo con respecto a madurez, o entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo en el mismo segmento cromosómico en un juego de germoplasma, o entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo a través del genoma entero en un juego de germoplasma, o alelos que confieren adecuación agronómica a una planta de cultivo, o el haplotipo estando presente con una frecuencia de 50 por ciento o más en una población para mejora genética o un juego de germoplasma puede considerarse como evidencia de su alto valor, o cualquier combinación de éstos. Esta invención anticipa una acumulación o apilamiento de regiones genómicas tipo T en plantas o líneas, mediante la adición de transgenes por transformación, o cruzando plantas progenitoras o líneas que contienen diferentes regiones genómicas tipo T, o cualquier combinación de éstas. El valor de las regiones genómicas tipo T acumuladas o apiladas puede estimarse mediante un valor T mixto, que depende de una combinación del valor de los rasgos del transgen y el valor de los haplotipos a los cuales los transgenes están ligados. La presente invención anticipa además que el valor T mixto puede mejorarse modificando los componentes de expresión de uno o cada uno de los transgenes apilados. Además, la presente invención anticipa que puede establecerse valor adicional en el valor T mixto mediante la selección de por lo menos un haplotipo receptor con un valor de mejora genética favorable al cual uno o cualquiera de los transgenes están ligados, o mediante la selección de plantas o líneas para el apilamiento de transgenes por transformación o mediante mejora genética, o mediante cualquier combinación de éstas. Cultivos transgénicos para los cuales un método de la presente invención puede aplicarse incluyen, pero no están limitados a, cultivos tolerantes a herbicidas, por ejemplo, Roundup Ready® algodón 1445 y 88913; Roundup Ready® maíz GA21 , nk603, MON802, MON809; Roundup Ready® remolacha azucarera GTSB77 y H7-1 ; Roundup Ready® cañóla RT73 y GT200, colza oleaginosa ZSR500; Roundup Ready® soya 40-3-2, soya que contiene MON89788; Roundup Ready® agróstide ASR368, HCN10, HCN28 y HCN92 cañóla, MS1 y RF1 cañóla, OXY-235 cañóla, PHY14, PHY35 y PHY36 cañóla, RM3-3, RM3-4 y RM3-6 achicoria, A2704-12, A2704-21 , A5547-35, A5547-127 soya, GU262 soya, W62 y W98 soya, 19-51 A algodón, 31807 y 31808 algodón, BXN algodón, FP967 lino, LLRICE06 y LLRICE62 arroz, MON71800 trigo, 676 y 678 y 680 maíz, B16 maíz, Bt11 maíz, CBH-351 maíz, DAS-06275-8 maíz, DBT418 maíz, MS3 y MS6 maíz, T14 y T25 maíz, H177 maíz y TC1507 maíz. Herbicidas para los cuales se ha demostrado tolerancia de las plantas transgénicas y el método de la presente invención puede aplicarse incluyen, pero no están limitados a: glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinilo, dalapón, dicamba, 2,4-D, ciclohezanodiona, inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa y herbicidas de isoxaflutol. Moléculas de polinucleótidos que codifican para proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas se conocen en la técnica e incluyen, pero no están limitadas a, una molécula de polinucleótido que codifica para 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) descrita en la patente de E.U.A. 5,627,061 , patente de E.U.A. 5,633,435 y patente de E.U.A. 6,040,497, y en patente de E.U.A. 5,094,945 para tolerancia a glifosato, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia; polinucleótidos que codifican para una glifosato oxidorred uctasa, glifosato-N-acetil transferasa o glifosato descarboxilasa (GOX, patente de E.U.A. 5,463,175; GAT, publicaciones de patente de E.U.A. 20030083480 y 20050246798; glifosato descarboxilasa, publicaciones de patente de E.U.A. 20060021093; 20060021094; 20040177399, incorporadas en su totalidad en la presente como referencia); una molécula de polinucleótido que codifica para bromoxinilo nitrilasa (Bxn) descrita en la patente de E.U.A. 4,810,648 para tolerancia a bromoxinilo, la cual se incorpora en la presente como referencia; una molécula de polinucleótido que codifica para fitoeno desaturasa (crtl) descrita en Misawa eí al. (1993) y Misawa eí al. (1994) para tolerancia a norflurazón; una molécula de polinucleótido que codifica para acetohidroxiácido sintasa (AHAS, también conocida como ALS) descrita en Sathasiivan eí al. (1990) para tolerancia a herbicidas de sulfonilurea; y el gen bar descrito en DeBlock eí al. (1987) para tolerancia a glufosinato y bíalafós; e hidroxifenil piruvato deshidrogenasa (HPPD, patente de E.U.A. 6,768,044) resistente. Un promotor de un transgen de la presente invención puede expresar genes que codifican para fosfinotricina acetiltranferasa, EPSPS resistente a glifosato, aminoglucósido fosfotransferasa, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, higromicina fosfotransferasa, neomicina fosfotransferasa, dalapón deshalogenasa, nitrilasa resistente a bromoxinilo, dicamba mono-oxigenasa, antranilato sintasa, glifosato oxidorreductasa, glifosato-N-acetil transferasa o glifosato descarboxilasa. Cultivos transgénicos para los cuales el método de la presente invención puede aplicarse incluyen, pero no están limitados a, cultivos resistentes a insectos, por ejemplo, eventos de algodón, tales como MON15985, 281-24-236, 3006-210-23, MON531 , MON757, MON1076 y COT102; o eventos de maíz, tales como MIR604, BT176, BT11 , CBH-351 , DAS-06275-8, DBT418, MON80100, MON810, MON863, TC1507, MIR152V, 3210M y 3243M. Los cultivos transgénicos resistentes a insectos pueden proveer tolerancia al daño que causa la alimentación por plagas de insectos, y se ha mostrado son efectivos contra ciertas plagas de lepidópteros y coleópteros de plantas, y otros cultivos transgénicos pueden proveer también resistencia a plagas de plantas tales como ciertos miembros de hemípteros, homópteros, heterópteros, ortópteros, tisanópteros y nemátodos fitoparásitos. Cultivos transgénicos resistentes a enfermedades son, por ejemplo, papaya 55-1/63-1 resistente a virus y calabaza CZW-3 y ZW20 resistente a virus. Cultivos transgénicos con androesterilidad son, por ejemplo, PHY14, PHY35 y PHY36, y los eventos de cañóla y maíz 676, 678, 680, MS3 y MS6. Otras plantas de cultivo transgénicas pueden proveer también resistencia a hongos y bacterias que causan enfermedades en las plantas. La presente invención contempla los cultivos transgénicos enlistados anteriormente, y germoplasma que comprende las regiones genómicas tipo T para su uso en la mejora genética y el apilamiento de regiones genómicas tipo T, o haplotipos identificados mediante un método de mapeo indirecto, o cualquier combinación de éstos, para incrementar el valor tipo T, o para mejorar la calidad general del germoplasma, como se describe en los métodos de la presente invención.

Haplotipos Un "haplotipo" es un segmento de ADN en el genoma de un organismo que se asume es idéntico por descendencia para diferentes individuos cuando el conocimiento de identidad por estado en uno o más loci es el mismo en los diferentes individuos, y en donde la cantidad regional de desequilibrio de ligamiento en la vecindad de ese segmento en el mapa físico o genético es alta. Un haplotipo puede rastrearse a través de las poblaciones, y puede analizarse su asociación estadística con un rasgo determinado. De esta manera, un estudio de asociación de haplotipos permite definir la frecuencia y el tipo del haplotipo portador ancestral. Un "estudio de asociación", es un experimento genético en donde se prueba el nivel de desviación de aleatoriedad entre la segregación de alelos en uno más loci de marcadores genéticos y el valor del fenotipo individual para uno o más rasgos. Pueden hacerse estudios de asociación en rasgos cuantitativos o categóricos, dando o no razón de la estructura y/o estratificación de la población. Un análisis de haplotipos es importante porque incrementa el poder estadístico de un análisis que implica marcadores bialélicos individuales. En una primera etapa de un análisis de la frecuencia de haplotipos, se determina la frecuencia de los haplotipos posibles con base en varias combinaciones de los marcadores bialélicos identificados de la invención. La frecuencia de haplotipos se compara entonces para distintas poblaciones y la población de mapeo. En general, como resultado de la mejora previa del germoplasma, cuanto mayor es la frecuencia de haplotipos en una población del juego de germoplasma, mayor ha sido su valor para el germoplasma, descrito como los alelos asociados con adecuación agronómica de una planta de cultivo (véase patente de E.U.A. 5,437,697, incorporada en su totalidad en la presente como referencia). Un haplotipo favorable puede seleccionarse con base en su frecuencia en un juego de germoplasma, y en general una frecuencia de 50 por ciento o más indicaría que el haplotipo tiene valor en el germoplasma. Un haplotipo que ocurra a una alta frecuencia sería favorable para la determinación del blanco con un transgen o la selección de un tipo T, en donde el haplotipo que tenga una alta frecuencia en el germoplasma sería considerado como favorable. Un haplotipo que ocurra a cualquier frecuencia en el germoplasma puede correlacionarse con un rasgo, y al haplotipo se le puede dar un valor con base en un rasgo individual o una combinación de rasgos. Un haplotipo favorable proveerá uno o más rasgos favorables para un germoplasma. En general, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para poner a prueba si un rasgo y un genotipo muestran una correlación estadísticamente significativa. Métodos para determinar la significancia estadística de una correlación entre un fenotipo y un genotipo, en este caso un haplotipo, pueden determinarse mediante cualquier prueba estadística conocida en la técnica, y requiriéndose cualquier umbral aceptado de significancia estadística. La aplicación de métodos y umbrales de significancia particulares, está bien dentro de la aptitud del experto en la técnica. En poblaciones para fitomejoramiento, el desequilibrio de ligamiento (LD), que es el nivel de desviación de la asociación aleatoria entre dos o más loci en una población, persiste con frecuencia sobre grandes segmentos cromosómicos. Aunque es posible para alguien que esté interesado en el efecto individual de cada gen en el segmento, para un propósito práctico de fitomejoramiento, lo que generalmente importa es el impacto promedio que tiene la región para los rasgos de interés cuando están presentes en una línea, híbrido o variedad. Se gráfico la cantidad de LD en pares (usando la estadística r2) contra la distancia en centiMorgans (cM, un décimo de un Morgan, en promedio una recombinación por meiosis, la recombinación es el resultado del intercambio recíproco del segmento de la cromátide entre cromosomas homólogos apareados en la meiosis, y se observa usualmente a través de la asociación de alelos en loci ligados de diferentes abuelos en la descendencia), entre los marcadores para un juego de germoplasma de referencia, por ejemplo, una serie de 791 líneas élite de soya de E.U.A. y 1211 loci de SNP, con una frecuencia rara de alelos mayor de 5%. Una curva promedio móvil de 200 puntos de datos, fue un indicador de la presencia de LD incluso para loci 10 cM aparte. De esta manera, cuando se predice el efecto promedio de segmentos cromosómicos, deben considerarse segmentos de unos cuantos centiMorgans de longitud, y esta es la acepción dada a una región de haplotipos, es decir, un segmento cromosómico de unos cuantos centiMorgans de longitud que persiste durante generaciones múltiples de mejora genética, y que es llevado por una o más líneas para mejora genética. Este segmento puede identificarse con loci de marcadores genéticos ligados múltiples que contiene, y la identidad común de haplotipos en estos loci en dos líneas, da un alto grado de confianza de la identidad por descendencia del segmento cromosómico subyacente entero llevado por estas líneas. Debe especificarse cuáles son los haplotipos favorables, y cuál es su frecuencia en el germoplasma. De esta manera, se obtendría o se generaría un análisis de marcadores moleculares del germoplasma bajo consideración, para mejora genética y/o propagación de un evento de transformación. Este análisis de marcadores generará una huella digital de cada línea. Se asume que se conoce la posición aproximada del mapa genómico de estos marcadores. Para simplificar análisis corriente abajo, puede ser necesario implementar pasos de estimaciones de datos faltantes y garantía de calidad en esta etapa, para producir una matriz de datos completa y precisa (genotipo del marcador por línea). Las estimaciones de datos faltantes y detecciones de errores pueden requerir el uso de pruebas de descendencia-progenitores, LD entre loci de marcadores genéticos, mapeo de intervalos, regenotipificación, etc. Los marcadores se agrupan entonces con base en su proximidad. Esta agrupación puede ser arbitraria (por ejemplo, "parte de un extremo del cromosoma, e incluye todos los marcadores que están dentro de 10 cM del primer marcador incluido en el segmento, antes de que se parta del siguiente segmento"), o con base en algún análisis estadístico (por ejemplo, "define puntos de interrupción de segmentos con base en patrones de LD entre loci adyacentes"). Cuando se considera una gran serie de líneas, y líneas múltiples tienen el mismo alelo en un locus de marcador genético, se necesita indagar si la identidad por estado (IBS) en el locus de marcador genético es un buen mecanismo de predicción de la identidad por descendencia (IBD) en la región cromosómica en torno al locus de marcador genético. La "identidad por descendencia" (IBD) caracteriza dos loci/segmentos de ADN que son llevados por dos o más individuos y se derivan del mismo ancestro. La "identidad por estado" (IBS) caracteriza dos loci/segmentos de ADN que son llevados por dos o más individuos y tienen los mismos alelos en los loci observables. Una buena indicación de que muchos loci de marcadores genéticos en un segmento son suficientes para caracterizar la IBD para el segmento, es que pueden predecir el alelo presente en otros loci de marcadores genéticos dentro del segmento. Para estimar la frecuencia de un haplotipo, tiene que definirse el germoplasma de referencia base (colección de líneas endógamas élite, población de individuos de apareamiento aleatorio, etc.), y una muestra representativa (o toda la población) tiene que ser genotipificada. La frecuencia de haplotipos puede determinarse entonces mediante conteo simple, si se considera una serie de individuos endógamos. Se requerirán métodos de estimación que usen técnicas de cómputo tales como el algoritmo de expectación/maximización, si los individuos genotipificados son heterocigóticos en más de un loci en el segmento y se desconoce la fase de ligamiento (Excoffier y Slatkin, 1995). De preferencia, se usa un método basado en un algoritmo de expectación/maximización (EM) (Dempster eí al., 1977) que lleve a estimaciones de probabilidad máximas de las frecuencias de haplotipos bajo la premisa de proporciones de Hardy-Weinberg (apareamiento aleatorio) (Excoffier y Slatkin, 1995). Con las estimaciones de haplotipos, y la identidad de cada segmento cromosómico para cada linea de hospederos candidatos, es posible además clasificar líneas de acuerdo a su probabilidad de que den lugar a eventos localizados en haplotipos de alto valor. Podrían usarse varias distribuciones de probabilidad de un evento que se localice en un segmento cromosómico, de acuerdo al grado de conocimiento adquirido en el tamaño físico de cada segmento, y el modo de inserción al azar o que sigue un patrón de un transgen en el genoma. Pueden usarse procedimientos alternativos para realizar estudios de asociación: estudios de asociación fuera del genoma, estudios de asociación de la región candidata, y estudios de asociación de genes candidatos. Los marcadores bialélicos de la presente invención pueden incorporarse en cualquier mapa de marcadores genéticos del genoma de una planta, para realizar estudios de asociación fuera del genoma. La presente invención comprende métodos para detectar una asociación entre un haplotipo y una propiedad favorable o un índice de rasgos múltiples. Un índice de rasgos múltiples (MTI), es una entidad numérica que se calcula a través de la combinación de valores de rasgos individuales en una fórmula. Con más frecuencia, calculado como una combinación lineal de rasgos o derivaciones normalizadas de rasgos, puede ser también el resultado de cálculos más sofisticados (por ejemplo, el uso de relaciones entre rasgos). Este MTI puede usarse entonces en análisis genético como si fuera un rasgo. Un haplotipo favorable provee una propiedad favorable para una planta progenitora, y para la descendencia del progenitor cuando se selecciona mediante medios de marcadores genéticos o medios fenotípicos. El método de la presente invención provee la selección de haplotipos favorables y la acumulación de haplotipos favorables en una población para mejora genética, por ejemplo, uno o más de los haplotipos identificados en la presente invención. En una modalidad particular de la presente invención, un transgen se asocia con un haplotipo favorable para crear un tipo T que se acumula con otros haplotipos favorables para mejorar un germoplasma.

Acumulación de regiones qenómicas tipo T y haplotipos favorables Otra modalidad de esta invención, es un método para mejorar la acumulación de uno o más haplotipos en un germoplasma. La transformación de una célula vegetal con un transgen, significa que el ADN del transgen ha sido insertado en una región de ADN genómíca de la planta. Regiones genómicas definidas como regiones de haplotipos incluyen información genética, y proveen rasgos fenotípicos para la planta. Las variaciones en la información genética resultan en variación del rasgo fenotípico, y puede medirse el valor del fenotipo. El mapeo genético de las regiones de haplotipos y el mapeo genético de un evento de inserción de transgenes, permite la determinación del ligamiento de la inserción de un transgen con un haplotipo. Cualquier transgen que tenga una secuencia de ADN que sea novedosa en el genoma de una planta transformada, puede servir por sí mismo como un marcador genético del transgen y la región genómica en la cual ha sido insertado. Por ejemplo, en la presente invención, un transgen que fue insertado en el genoma de una planta de soya provee la expresión de una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato que tiene una secuencia que codifica para ADN comprendida dentro de SEQ ID NO: 28 descrita en la patente de E.U.A. 6,660,911 , y SEQ ID NO: 9 descrita en la patente de E.U.A. 5,633,435, ambas incorporadas en la presente como referencia, a partir de la cual una molécula de sonda o iniciador de ADN puede seleccionarse para funcionar como un marcador genético para el transgen en el genoma. Además, un transgen puede proveer un medio para seleccionar para plantas que tengan la inserción y la región de haplotipo ligada. La selección puede deberse a tolerancia a un químico fitotóxico aplicado, tal como un herbicida o antibiótico. La selección puede deberse a detección de un producto de un transgen, por ejemplo, un producto de proteína o ARN mensajero. La selección puede realizarse mediante la detección del ADN del transgen insertado en el genoma de la planta. Un transgen puede proveer también medios de selección fenotípica tales como un fenotipo morfológico que sea fácil de observar. Este podría ser color de la semilla, característica de germinación de la semilla, característica del crecimiento de la plántula, apariencia de la hoja, arquitectura de la planta, altura de la planta y morfología de la flor y el fruto, o selección basada en un fenotipo agronómico, tal como rendimiento, tolerancia a herbicidas, tolerancia a enfermedades, tolerancia a insectos, calidad mejorada del pienso, tolerancia a la sequía, tolerancia al frío, o cualquier otro rasgo agronómico provisto por un transgen. Durante el desarrollo de plantas de cultivo mejoradas mediante la inserción de genes transgénicos, con frecuencia se producen cientos de plantas con diferentes sitios de inserción de transgenes. Estos eventos de inserción ocurren por todo el genoma de la planta, y se incorporan en estrecho ligamiento con muchas regiones de haplotipos diferentes. La presente invención provee la identificación de eventos transgénicos que tienen la inserción de un transgen en estrecho ligamiento con regiones de haplotipos favorables, y la selección de estos eventos para su uso en un programa de mejora genética para mejorar la acumulación de regiones de haplotipos favorables. El método incluye: a) insertar un transgen en un genoma de una célula vegetal, y regenerar la célula vegetal en una planta transformada intacta usando métodos de regeneración y transformación de plantas descritos previamente y conocidos en la técnica de biotecnología vegetal; y b) determinar un sitio en el mapa del transgen en el genoma de la planta transformada usando marcadores de ADN del transgen y regiones genómicas ligadas; y c) correlacionar el sitio en el mapa con un haplotipo estrechamente ligado, en donde el transgen y el haplotipo comprenden una región genómica tipo T en la planta transformada; y d) cruzar la planta transformada con una segunda planta que pueda ser transformada también para contener por lo menos una región genómica tipo T que sea diferente de la región genómica tipo T de la primera planta transformada, o la segunda planta pueda contener una región de haplotipo favorable identificada mediante marcadores genéticos que sea diferente de la primera planta transformada; y e) seleccionar por lo menos una planta de la descendencia detectando la expresión del transgen de la primera planta, o seleccionando mediante la presencia de un marcador asociado con el transgen, en donde la planta de la descendencia comprende en su genoma por lo menos una porción de la región genomica tipo T de la primera planta, y por lo menos una región genómica tipo T o haplotipo favorable de la segunda planta, y f) usar la planta de la descendencia en actividades relacionadas con la mejora del germoplasma, las actividades seleccionadas del grupo que consiste del uso de la planta para hacer cruzas para mejora genética, poner a prueba ademas la planta, mejora de la planta a través de autofecundación, uso de la planta o partes de la misma para transformación, uso de la planta o partes de la misma para mutagénesis, y uso de la planta o partes de la misma para TILLING (véase, por ejemplo, McCallum et al , 2000) Mediante el uso de este método, la presente invención contempla que se seleccionan regiones genómicas tipo T preferidas de una gran población de regiones genómicas tipo T, y las regiones genómicas tipo T preferidas tienen un valor T mejorado en el germoplasma de una planta de cultivo Además, la región genómica tipo T prefepda puede usarse en el método de mejora genética descrito para acumular otras regiones genómicas tipo T benéficas y regiones de haplotipos favorables, y mantener éstas en una población para mejora genética para mejorar el germoplasma general de la planta de cultivo Plantas de cultivo consideradas para su uso en el método incluyen, pero no están limitadas a, maíz, soya, algodón, trigo, arroz, cañóla, colza oleaginosa, remolacha azucarera, sorgo, mijo, alfalfa, cultivos de hortalizas, arboles forestales y cultivos de frutales Mapeo del qenoma de una región qenómica tipo T Otra modalidad de esta invención, es un método para el mapeo indirecto de por lo menos una región genómica tipo T. El mapeo de la región genómica tipo T en el genoma de una planta, provee la selección de regiones de haplotipos favorables que comprenden la región genómica tipo T. La presente invención provee un método para el mapeo del evento de inserción de transgenes y su asociación con una región genómica y ubicación en el mapa del genoma de una planta. El método incluye los siguientes pasos: (a) obtener la secuencia de ADN del genoma que flanquea el evento de inserción del transgen; (b) comparar el cromatograma de la secuencia de ADN, para eliminar secuencias parálogas cuando se obtienen dos o más secuencias de alta homología; (c) buscar la secuencia de ADN en una base de datos de secuencia para verificar si el evento de inserción ha interrumpido un gen endógeno; (d) diseñar un par o una pluralidad de pares de moléculas de iniciador de ADN en las regiones genómicas 5' y 3', o cualquiera de las mismas, que flanquean la inserción del transgen. Cuando se diseñan pares de iniciadores múltiples, puede hacerse de tal forma que se obtengan productos de PCR traslapantes de cada región flanqueante genómica para asegurar cobertura sustancial del ADN genómico asociado; (e) usar las líneas progenitoras de una población de mapeo como molde para PCR; (f) secuenciar los productos de PCR obtenidos de estas combinaciones de iniciadores/líneas; (g) identificar SNPs, u otra característica polimórfica tal como indels o SSRs, entre los progenitores de por lo menos una de las poblaciones de mapeo; (h) repetir los pasos (d) a (g) en una secuencia de flanqueo adicional, yendo desde el sitio de inserción en las direcciones 5' y 3' hasta que se encuentren sitios polimórficos, o hasta obtener sitios adicionales; (i) diseñar una prueba para registrar las plantas de la descendencia de las poblaciones de mapeo; (j) realizar un análisis de ligamiento para indagar la posición de estos polimorfismos en el mapa, y en consecuencia de la ubicación del evento; (k) correlacionar la posición en el mapa con la ubicación de la región de un haplotipo. El genoma que flanquea el evento de inserción del transgen puede comprender un segmento de ADN de unos cuantos cientos a decenas de miles de pares de bases de nucleótidos o una longitud suficiente, para identificar un polimorfismo. La región flanqueante genómica puede ser del extremo 5' o 3' del sitio de inserción del transgen, extendiéndose en el genoma del sitio de inserción. La "reacción en cadena de polimerasa" (PCR), es un procedimiento de amplificación geométrica in vitro de un segmento de ADN objetivo a través del uso de una ADN polimerasa resistente al calor y variación cíclica de temperatura que permite desnaturalización repetitiva, unión del iniciador y amplificación del ADN molde. "Secuencias parálogas", son dos secuencias de ADN con un alto grado de similitud, pero que pertenecen a diferentes loci en el genoma. Una "población de mapeo" es una serie de individuos en donde alelos en loci de marcadores genéticos y posiblemente en uno o una pluralidad de loci de rasgos cuantitativos (QTL) están segregando, en una forma que la presencia de desequilibrio de ligamiento puede considerarse como evidencia de proximidad en el cromosoma, y existe una correlación positiva entre proximidad y desequilibrio. La población de mapeo es la misma especie vegetal o una especie vegetal que demuestra sintenia o colinealidad. Estas poblaciones pueden usarse para estimar las posiciones relativas de loci de marcadores genéticos entre ellas mismas o entre estas y QTLs. En general, las poblaciones de mapeo son poblaciones segregantes. El método puede aplicarse a cualquier especie de cultivo, y especies de cultivo importantes particulares son, por ejemplo, maíz, soya, algodón, trigo, arroz, cañóla, colza oleaginosa, remolacha azucarera, sorgo, mijo, alfalfa, cultivos de hortalizas, árboles forestales y cultivos de frutales. Existen mapas disponibles para el experto en la técnica para uno o más de estos cultivos, a manera de ejemplo, mapas genéticos son referidos para el maíz (Lee eí al., 2002), soya (Ferreira eí al., 2000), algodón (Lacape eí al., 2003) y cañóla (Cheung eí al., 1997). Pueden generarse también poblaciones de mapeo de novo para cualquier cultivo de interés, y un mapa genético creado que sea útil en la presente invención para mapear las regiones de haplotipos en las cuales un transgen haya sido insertado. La identificación de regiones de ADN genómicas clonadas, por ejemplo, las contenidas en una colección Bac, puede sondearse con marcadores de ADN desarrollados para identificar el haplotipo ligado con una inserción transgénica. Pueden desarrollarse marcadores de ADN adicionales secuenciando los clones Bac, e inspeccionando para polimorfismos en la secuencia. Genes de interés pueden aislarse de los clones Bac que pueden usarse como transgenes para mejorar el desempeño de la misma especie de cultivo o diferentes especies de cultivo.

Vectores recombinantes y transgenes Medios para preparar vectores recombinantes, son bien conocidos en la técnica. Métodos para obtener vectores recombinantes particularmente adecuados para la transformación de plantas incluyen, sin limitación, los descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 4,971 ,908, 4,940,835, 4,769,061 y 4,757,011. Estos tipos de vectores se han revisado también (Rodríguez eí al., 1988; Glick eí al., 1993). Vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores son bien conocidos en la técnica, e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (Rogers eí al., 1987). Se han descrito también otros vectores recombinantes útiles para la transformación de plantas, incluyendo el vector de control de transferencia pCaMVCN (Fromm eí al., 1985). Muchas especies de cultivo han sido transformadas para que contengan uno o más transgenes de importancia agronómica, que por sí mismos proveen una propiedad favorable para la planta. Un ejemplo es un transgen que confiere tolerancia a herbicidas para la planta de cultivo. Transgenes que codifican para proteínas de tolerancia a herbicidas que han sido transformadas y expresadas en plantas incluyen, por ejemplo, una proteína 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere resistencia a glifosato, y proteínas que confieren resistencia a otros herbicidas, tales como glufosinato o bromoxinilo (Comai eí al., 1985; Gordon-Kamm eí al., 1990; Staiker eí al., 1988; Eichholtz eí al., 1987; Shah eí al., 1986; Charest eí al., 1990). Otros ejemplos incluyen la expresión de enzimas tales como dihidrofolato reductasa y acetolactato sintasa, enzimas ALS y AHAS mutantes que confieren resistencia a herbicidas de imidazolinona o sulfonilurea (Lee eí al., 1988 y Miki eí al., 1990), una fosfinotricina-acetil-transferasa que confiere resistencia a fosfinotricina (solicitud europea No. 0 242 246), proteínas que confieren resistencia a ácidos fenoxipropiónicos y cicloshexonas, tales como setoxidim y haloxifop (Marshall eí al., 1992); y proteínas que confieren resistencia a triazina (genes psbA y gs+) y benzonitrilo (gen que codifica para nitrilasa, Przibila et al. (1991 ). Una planta de la presente invención puede comprender también un transgen que confiere resistencia al ataque por insectos, plagas, virus o bacterias. Por ejemplo, un transgen que confiere resistencia a una plaga, tal como el nematodo enquistado de la soya, fue descrito en la solicitud del PCT WO96/30517 y la solicitud del PCT WO93/19181. Jones eí al. (1994) describen la clonación del gen Cf-9 del tomate para resistencia a Cladosporium fulvum; Martin eí al. (1993) describen un gen Pto del tomate para resistencia a Pseudomonas syringae pv., y Mindrinos eí al. (1994) describen un gen RSP2 de Arabidopsis para resistencia a Pseudomonas syringae. Pueden usarse también endotoxinas de Bacillus thuringiensis, por ejemplo, para resistencia a insectos (Geiser eí al. (1986)). Se sabe que la expresión de proteínas de la cubierta viral como transgenes en células vegetales transformadas, imparte resistencia a la infección viral y/o al desarrollo de enfermedad afectada por el virus del cual el gen de la proteína de la cubierta se deriva, así como por virus relacionados (Beachy eí a/., 1990). Pueden usarse también transgenes que confieren valor nutricional incrementado u otro rasgo de valor agregado. Un ejemplo es el metabolismo modificado de ácidos grasos, por ejemplo, transformando una planta con un gen antisentido de estearoil-ACP desaturasa para incrementar el contenido de ácido esteárico de la planta (Knutzon eí al., 1992). Puede introducirse también un gen de desaturasa sentido para alterar el contenido de ácidos grasos. El contenido de fitato puede modificarse mediante la introducción de un gen que codifica para fitasa que mejora la degradación de fitato, añadiendo más fosfato libre a la planta transformada. Puede afectarse también la composición modificada de carbohidratos, por ejemplo, transformando plantas con un gen que codifique para una enzima que altere el patrón de ramificación del almidón (Shiroza eí al., 1988, secuencia de nucleótidos del gen de fructosíltransferasa de Streptococcus mutants); Steinmetz eí al. (1985) (secuencia de nucleótidos del gen de levansacarasa de Bacillus subtilis); Pen et al. (1992), producción de plantas transgénicas que expresan a-amilasa de Bacillus licheniformis); Elliot eí al. (1993), secuencias de nucleótidos de genes de invertasa del tomate); Sogaard eí al. (1993), mutagénesis dirigida a sitio del gen de a-amilasa de la cebada; y enzima ramificante de almidón II del endospermo del maíz; Fisher eí al. (1993). Pueden usarse también transgenes para alterar el metabolismo de proteínas. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,545,545 describe ácido díhidrodipicolínico sintasa del maíz insensible a lisina (DHPS), que es sustancialmente resistente a concentraciones de L-lisina que de otra manera inhiben la actividad de la DHPS nativa. Asimismo, el documento EP 0640141 describe secuencias que codifican para aspartocinasa (AK) insensible a lisina capaz de causar una producción de treonina mayor de la normal, así como un subfragmento que codifica para lisina cetoglutarato reductasa antisentido para el incremento de lisina. Puede usarse un transgen que altere el metabolismo de carbohidratos de la planta. Por ejemplo, se conocen genes de fructocinasa para su uso en el diseño metabólico de la expresión de genes de fructocinasa en plantas transgénicas y su fruto (véase patente de E.U.A. 6,031 ,154). Otros ejemplos de transgenes que pueden usarse, son genes que alteran el rendimiento de grano. Por ejemplo, la patente de E.U.A. 6,486,383 describe la modificación del contenido de almidón en plantas con proteínas subunítarias de adenosina difosfoglucosa pirofosforilasa ("ADPG PPasa"). En el documento EP0797673, se discuten plantas transgénicas en las cuales la introducción y expresión de moléculas de ADN particulares resultan en la formación de grupos fosfato fácilmente movilizados fuera de la vacuola, y una producción mejorada de biomasa y/o comportamiento alterado de la floración. Se conocen además genes para alterar la madurez de la planta. La patente de E.U.A. 6,774,284 describe ADN que codifica para una lipasa en plantas, y métodos de uso de la misma para el control de la senescencia en plantas. La patente de E.U.A. No. 6,140,185 provee genes de FCA para alterar las características de la floración, en particular la regulación de la floración. La patente de E.U.A. 5,637,785 discute plantas genéticamente modificadas que tienen tal desarrollo modulado de la flor, que tienen desarrollo temprano del meristemo floral, y que comprenden un gen estructural que codifica para la proteína LEAFY en su genoma. Genes para alterar las características morfológicas de la planta se conocen también, y pueden usarse de conformidad con la invención. La patente de E.U.A. 6,184,440 discute plantas genéticamente diseñadas que exhiben estructura o morfología alterada como resultado de la expresión de un transgen de modulación de la pared celular. Ejemplos de transgenes de modulación de la pared celular incluyen un dominio de unión a celulosa, una proteína de unión a celulosa, o una proteína o enzima modificadora de la pared celular tal como endoxiloglucano transferasa, xiloglucano endo- transglicosilasa, una expansina, celulosa sintasa, o una endo-1 ,4-ß-glucanasa aislada novedosa. Un transgen que provea una propiedad favorable puede asociarse con morfología, fisiología, crecimiento y desarrollo de la planta, rendimiento, mejora nutricional, resistencia a enfermedades o plagas, o tolerancia a químicos o al ambiente. Un transgen que provea un rasgo agronómico benéfico a plantas de cultivo puede incluir, por ejemplo, pero no está limitado a, los siguientes ejemplos de elementos genéticos que comprenden resistencia a herbicidas (patente de E.U.A. 5,633,435 y patente de E.U.A. 5,463,175), rendimiento incrementado (patente de E.U.A. 5,716,837), control de insectos (patente de E.U.A. 6,063,597; patente de E.U.A. 6,063,756; patente de E.U.A. 6,093,695; patente de E.U.A. 5,942,664; y patente de E.U.A. 6,110,464), resistencia a enfermedades fungosas (patente de E.U.A. 5,516,671 ; patente de E.U.A. 5,773,696; patente de E.U.A. 6,121 ,436; patente de E.U.A. 6,316,407, y patente de E.U.A. 6,506,962), resistencia a virus (patente de E.U.A. 5,304,730 y patente de E.U.A. 6,013,864), resistencia a nematodos (patente de E.U.A. 6,228,992), resistencia a enfermedades bacterianas (patente de E.U.A. 5,516,671 ), producción de almidón (patente de E.U.A. 5,750,876 y patente de E.U.A. 6,476,295), producción modificada de aceites (patente de E.U.A. 6,444,876), alta producción de aceite (patente de E.U.A. 5,608,149 y patente de E.U.A. 6,476,295), contenido modificado de ácidos grasos (patente de E.U.A. 6,537,750), alta producción de proteínas (patente de E.U.A. 6,380,466), maduración del fruto (patente de E.U.A. 5,512,466), nutrición mejorada de animales y humanos (patente de E.U.A. 5,985,605 y patente de E.U.A. 6,171 ,640), biopolímeros (patente de E.U.A. 5,958,745 y publicación de patente de E.U.A. US20030028917), resistencia al estrés ambiental (patente de E.U.A. 6,072,103), péptidos farmacéuticos (patente de E.U.A. 6,080,560), rasgos de procesamiento mejorados (patente de E.U.A. 6,476,295), digestibilidad mejorada (patente de E.U.A. 6,531 ,648), bajo contenido de rafinosa (patente de E.U.A. 6,166,292), producción industrial de enzimas (patente de E.U.A. 5,543,576), sabor mejorado (patente de E.U.A. 6,011 ,199), fijación de nitrógeno (patente de E.U.A. 5,229,114), producción de semilla híbrida (patente de E.U.A. 5,689,041 ) y producción de biocombustible (patente de E.U.A. 5,998,700), los elementos genéticos, métodos y transgenes descritos en las patentes enlistadas anteriormente, siendo incorporados en la presente como referencia. En forma alternativa, una molécula de polinucleótido transcribible puede afectar el fenotipo o las características de la planta mencionados anteriormente, codificando para una molécula de ARN que cause la inhibición dirigida de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo, por medio de mecanismos antisentido, ARN inhibidor (ARNi) o mecanismos mediados mediante co-supresión. El ARN podría ser también una molécula de ARN catalítica (es decir, una ribozima) diseñada para digerir un producto de ARN mensajero endógeno deseado. Ciertas moléculas de ARN pueden expresarse también en células vegetales que inhiben objetivos en organismos menos plantas, por ejemplo, insectos que se alimentan de las células vegetales e ingieren al ARN inhibidor, o nematodos que se alimentan de las células vegetales e ingieren el ARN inhibidor. De esta manera, cualquier molécula de polinucleótido transcribible que codifique para una molécula de ARN transcrita que afecte un cambio de fenotipo o morfología de interés, puede ser útil para la práctica de la presente invención.

Mejora genética y marcadores Las técnicas de mejora genética sacan ventaja del método de polinización de una planta. Existen dos métodos generales de polinización: autopolinización, que ocurre si el polen de una flor es transferido a la misma flor u otra flor de la misma planta, y polinización cruzada, que ocurre si el polen que proviene de una flor es transferido en una planta diferente. Las plantas que hayan sido autopolinizadas y seleccionadas para tipo durante muchas generaciones, llegan a ser homocigóticas en casi todos los loci génicos, y producen una población uniforme de plantas homocigóticas de descendencia para mejora genética verdadera. En el desarrollo de variedades adecuadas, puede usarse la mejora genética del pedigrí. El método de mejora genética del pedigrí para rasgos específicos, implica cruzar dos genotipos. Cada genotipo puede tener una o más características deseables que faltan en el otro, o cada genotipo puede complementar al otro. Si los dos genotipos progenitores originales no proveen todas las características deseadas, otros genotipos pueden incluirse en la población para mejora genética. Plantas superiores que sean los productos de estas cruzas son autofecundadas, y son de nuevo mejoradas en cada generación sucesiva. Cada generación sucesiva llega a ser más homogénea como resultado de autopolinización y selección. Típicamente, este método de mejora genética implica cinco o más generaciones de autofecundación y selección: S??S2; S2-»S3; S3?S4; S4->S5, etc. Puede considerarse que una generación autofecundada (S) es un tipo de generación filial (F), y puede nombrarse F como tal. Después de por lo menos cinco generaciones, la planta endógama es considerada como genéticamente pura. Cada programa de mejora genética debe incluir una evaluación periódica objetiva de la eficiencia del procedimiento de mejora genética. Los criterios de evaluación varían, dependiendo del propósito y los objetivos. Líneas de mejora genética avanzadas prometedoras se ponen a prueba y se comparan completamente con estándares adecuados en ambientes representativos de las áreas objetivo comerciales por generalmente tres o más años. La identificación de individuos que son genéticamente superiores debido al valor genotípico, pueden enmascararse confundiendo rasgos de la planta o factores ambientales. Un método para identificar una planta superior, es observar su desempeño respecto a otras plantas experimentales y con una o más variedades estándar desarrolladas ampliamente. Las observaciones individuales pueden ser no concluyentes, mientras que las observaciones repetidas proveen una mejor estimación del valor genético. Pueden usarse selecciones masal y recurrente para mejorar poblaciones de cultivos autopolinizados o con polinización cruzada. Una población genéticamente variable de individuos heterocigóticos, es identificada o creada entrecruzando varios progenitores diferentes. Las mejores plantas se seleccionan con base en superioridad individual, descendencia sobresaliente o capacidad de combinación excelente. Las plantas seleccionadas son entrecruzadas para producir una nueva población en la cual se continúan más ciclos de selección. Descripciones de otros métodos de mejora genética que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos, pueden encontrarse en uno de varios libros de referencia (Allard, 1960; Simmonds, 1979; Sneep y Hendriksen, 1979; Fehr, 1987; Fehr, 1987). La eficacia de la selección para genotipos con rasgos de interés mejorados (por ejemplo, una propiedad favorable tal como rendimiento de un producto cosechado de la planta, por ejemplo, rendimiento de un grano, semilla, fruto, fibra, forraje; o un rasgo agronómico, por ejemplo, resistencia a plagas, tal como resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, resistencia a nematodos o índice de crecimiento mejorado y tolerancia al estrés; o un producto procesado mejorado de la planta, por ejemplo, perfil de ácidos grasos, perfil de aminoácidos, contenido nutricional, calidad de la fibra) en un programa de mejora genética, dependerá de: 1 ) el grado al cual la variabilidad en los rasgos de interés de plantas individuales en una población sea el resultado de factores genéticos y sea de esta manera transmitido a las descendencias de los genotipos seleccionados; y 2) qué tanto la variabilidad en los rasgos de interés entre las plantas se debe al ambiente en el cual los diferentes genotipos están creciendo. La herencia de rasgos va de control por un gen mayor cuya expresión no es influenciada por el ambiente (es decir, caracteres cualitativos), a control por muchos genes cuyos efectos son influenciados grandemente por el ambiente (es decir, caracteres cuantitativos). La mejora genética para rasgos cuantitativos tales como el rendimiento, se caracteriza además por el hecho de que: 1 ) las diferencias que resultan del efecto de cada gen son pequeñas, haciendo difícil o imposible identificarlas individualmente; 2) el número de genes que contribuyen a un carácter es grande, de modo que rara vez se obtienen relaciones de segregación distintas, si alguna; y 3) los efectos de los genes pueden expresarse en diferentes formas, con base en la variación ambiental. Por lo tanto, la identificación precisa de segregados transgresivos o genotipos superiores con los rasgos de interés es extremadamente difícil, y su éxito depende de la capacidad del fitomejorador para reducir al mínimo la variación ambiental que afecta la expresión del carácter cuantitativo en la población. La probabilidad de identificar un segregante transgresivo es reducida grandemente conforme se incrementa el número de rasgos combinados en un genotipo. Por consiguiente, todo lo que el mejorador puede esperar generalmente es obtener una distribución favorable de genes para el primer carácter complejo combinado con una distribución favorable de genes para el segundo carácter en un genotipo además de un gen seleccionado. La introgresión de una región genómica particular en una serie de regiones genómícas que contienen un transgen o transgenes en el germoplasma de una planta, se define como el resultado del proceso de conversión por retrocruza. El germoplasma de una planta en la cual una secuencia de ADN novedosa ha sido introgresada, puede ser referido como un genotipo, línea, endógamo o híbrido convertido por retrocruza (retrocruzamiento). Además, una introgresión de un transgen o región genómica particular puede realizarse mediante un procedimiento de mejora genética hacia delante. Asimismo, el genotipo de una planta que carezca de la secuencia de ADN deseada, puede ser referido como un genotipo, línea, endógamo o híbrido no convertido. Durante la mejora genética, los marcadores genéticos ligados a una región genómica tipo T pueden usarse para facilitar la mejora genética con el propósito de producir plantas de soya con rendimiento incrementado y un rasgo transgénico. La retrocruza y la selección asistida por marcadores, o la mejora genética hacia delante y la selección asistida por marcadores en particular, pueden usarse con la presente invención para introducir la región genómica tipo T en cualquier variedad por conversión de esa variedad. En otra modalidad de esta invención, se proveen secuencias de marcadores que están ligadas genéticamente y pueden usarse para seguir la selección de los haplotipos de soya o maíz. Colecciones genómicas de líneas múltiples de maíz o soya se obtienen aislando ADN genómico de diferentes líneas de soya o maíz usando el reactivo Plant DNAzol de Life Technologies, ahora Invitrogen (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). ADN genómico es digerido con la enzima endonucleasa de restricción Pst 1 , fraccionado por tamaño sobre gel de agarosa a 1 por ciento, y ligado en un vector de plásmido para secuenciación mediante técnicas estándar de biología molecular, como se describe en Sambrook eí al. Estas colecciones son secuenciadas mediante procedimientos estándar en el secuenciador de ADN ABl Prism®377 usando reactivos disponibles comercialmente (Applied Biosystems, Foster City, CA). Todas las secuencias son ensambles que identifican secuencias no redundantes usando herramientas de alineación y agrupación Pangea, que están disponibles de DoubleTwist Inc., Oakland, CA. Las secuencias de líneas múltiples de maiz o soya se ensamblan en loci que tengan uno o más polimorfismos, tales como SNPs y/o Indels. Polimorfismos candidatos se evalúan mediante los siguientes parámetros: (a) La longitud mínima de una contigüidad o monoelemento para una alineación consenso, es de 200 bases. (b) El porcentaje de identidad de bases observadas en una región de 15 bases en cada lado de un SNP candidato, es de por lo menos 75 por ciento. (c) La cualidad Phred mínima en cada contigüidad en un sitio de polimorfismo, es de 35. (d) La cualidad Phred mínima en una región de 15 bases en cada lado del sitio del polimorfismo, es de 20. Los datos de lectura de secuenciadores automatizados varían significativamente en calidad, debido a la naturaleza de los nucleótidos en una molécula de polinucleótido y muchas otras razones (Ewing eí al., 1998). Se desarrollaron muchos algoritmos para consignar el problema de la identificación precisa de pares de bases (Giddings eí al., 1993; Berno, 1996; Lawrence y Solovyev, 1994). El algoritmo usado más ampliamente calcula la calidad de la secuencia como "q" en la ecuación q = -10X Iog10(p), en donde p es la probabilidad de error estimada de esa identificación de bases (Ewing y Green, 1998). De esta manera, a una identificación de bases que tenga una probabilidad de 1/1000 de que sea incorrecta en una secuencia particular, se le asigna una puntuación de calidad de 30. Las puntuaciones de calidad son referidas también como "puntuaciones Phred".

Selección de plantas usando selección asistida por marcadores Una motivación primaria para el desarrollo de marcadores moleculares en especies de cultivo, es el potencial para eficiencia incrementada en fitomejoramiento a través de selección asistida por marcadores (MAS). Se usan alelos de marcadores genéticos (un "alelo" es una secuencia alternativa en un locus) para identificar plantas que contienen un genotipo deseado en loci múltiples, y que se espera transfieran el genotipo deseado, junto con un fenotipo deseado, a su descendencia. Pueden usarse alelos de marcadores genéticos para identificar plantas que contienen un genotipo deseado en el locus de un marcador genético, varios loci o un haplotipo, y que se esperaría transfieran el genotipo deseado, junto con un fenotipo deseado, a su descendencia. La selección asistida por marcadores comprende el mapeo de rasgos fenotípicos, y depende de la capacidad para detectar diferencias genéticas entre los individuos. Un "mapa genético" es la representación de la posición relativa de loci caracterizados (marcadores de ADN o cualquier otro locus para el cual puede identificarse un alelo) a lo largo de los cromosomas. La medida de distancia es respecto a la frecuencia de eventos de sobrecruzamientos entre cromátidas hermanas en la meiosis. Las diferencias genéticas o "marcadores genéticos", se correlacionan entonces con variaciones fenotípicas usando métodos estadísticos. En el caso preferido, un gen individual que codifica para una proteína responsable de un rasgo fenotípico, es detectable directamente mediante una mutación que resulte en la variación en fenotipo. Más comúnmente, cada uno de loci genéticos múltiples contribuye al fenotipo observado. La presencia y/o ausencia de un alelo de marcador genético particular en el genoma de una planta que exhibe un rasgo fenotípico favorable, se logra mediante cualquier método enlistado anteriormente usando marcadores; por ejemplo, marcadores de ADN son polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), repeticiones de secuencia simples (SSR), polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP), polimorfismos por inserción/deleción (Indels), repeticiones en tándem de número variable (VNTR) y ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD), y otros conocidos por los expertos en la técnica. Si los ácidos nucleicos de la planta son positivos para un marcador genético deseado, la planta puede ser autofecundada para crear una línea de mejora genética verdadera con el mismo genotipo, o puede cruzarse con una planta con el mismo marcador o con otras características deseadas, para crear una generación de híbridos sexualmente cruzados. Se proveen métodos de selección asistida por marcadores (MAS) usando una variedad de marcadores genéticos. Se proveen plantas seleccionadas mediante MAS, usando los métodos. La introgresión asistida por marcadores implica la transferencia de una región cromosómica definida por uno o más marcadores de un germoplasma a un segundo germoplasma. El paso inicial en ese procedimiento, es la localización de la región genómica o transgen mediante mapeo genético, que es el procedimiento que se usa para determinar la posición de un gen o región genómica respecto a otros genes y marcadores genéticos a través de análisis del ligamiento. El principio básico para el mapeo del ligamiento, es que cuanto más cerca están dos genes en un cromosoma, más probable es que sean heredados en conjunto. En resumen, se hace generalmente una cruza entre dos progenitores genéticamente compatibles, pero divergentes respecto a rasgos bajo estudio. Pueden usarse entonces marcadores genéticos para seguir la segregación de rasgos bajo estudio en la descendencia de la cruza, con frecuencia una retrocruza (BC1 ), F2 o población endógama recombinante. La selección de un progenitor recurrente adecuado es un paso importante para un procedimiento de retrocruza exitoso. El propósito de un protocolo de retrocruza es alterar o sustituir un rasgo o característica en el endógamo original. Para lograr esto, uno o más loci del endógamo recurrente son modificados o sustituidos con el gen deseado del progenitor no recurrente (donador), mientras que retiene esencialmente el resto de la constitución genética deseada, y por lo tanto la constitución fisiológica y morfológica deseada del endógamo original. La elección del progenitor donador particular dependerá del propósito de la retrocruza. El protocolo de retrocruza exacto dependerá de la característica o rasgo que esté siendo alterado para determinar un protocolo de prueba adecuado. Puede ser necesario introducir una prueba de descendencia para determinar si la característica deseada ha sido transferida exitosamente. En el caso de la presente invención, pueden ponerse a prueba las líneas de descendencia generadas durante el programa de retrocruza, así como usando el sistema de marcadores descrito en la presente para seleccionar líneas con base en marcadores más que rasgos visuales, los marcadores siendo indicativos de la región genómica tipo T preferida o una región genómica que comprenda un haplotipo favorable.

Plantas y células vegetales transformadas Como se usa en la presente, el término "transformado" se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el cual se ha introducido una molécula de polinucleótido extraña, tal como una construcción. La molécula de polinucleótido introducida puede integrarse en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor, de modo que la molécula de polinucleótido introducida es heredada por la descendencia subsiguiente. Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" incluye también la descendencia de la célula u organismo, y la descendencia producida a partir de un programa de mejora genética usando dicha planta transgénica como un progenitor en una cruza, y exhibiendo un fenotipo alterado que resulta de la presencia de una molécula de polinucleótido extraña. Una construcción de transformación de plantas que contenga una molécula de polinucleótido de la presente invención, puede introducirse en plantas mediante cualquier método de transformación de plantas. Métodos y materiales para la transformación de plantas introduciendo una construcción de expresión en plantas en el genoma de una planta en la práctica de esta invención, pueden incluir cualquiera de los métodos bien conocidos y demostrados, que incluyen electroporación como se ilustra en la patente de E.U.A. 5,384,253; bombardeo de microproyectiles como se ilustra en la patente de E.U.A. 5,015,580; patente de E.U.A. 5,550,318; patente de E.U.A. 5,538,880; patente de E.U.A. 6,160,208; patente de E.U.A. 6,399,861 ; y patente de E.U.A. 6,403,865; transformación mediada por Agrobacterium como se ilustra en la patente de E.U.A. 5,824,877; patente de E.U.A. 5,591 ,616; patente de E.U.A. 5,981 ,840; y patente de E.U.A. 6,384,301 ; y transformación de protoplastos como se ilustra en la patente de E.U.A. 5,508,184, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. Métodos para transformar específicamente dicotiledóneas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se ha descrito la transformación y regeneración de plantas usando estos métodos para muchos cultivos que incluyen, pero no están limitados a, algodón {Gossypium hirsutum), soya (Glycine max), cacahuate (Arachis hypogaea), alfalfa (Medicago sativa), y miembros del género Brassica. Métodos para transformar monocotiledóneas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se ha descrito la transformación y regeneración de plantas usando estos métodos para muchos cultivos que incluyen, pero no están limitados a, cebada (Hordeum vulgare); maíz (Zea mays); avenas (Avena sativa); dáctilo ramoso (Dactylis glomerata); arroz (Oryza sativa, incluyendo las variedades indica y japónica); sorgo (Sorghum bicolor); caña de azúcar (Saccharum sp); festuca alta (Festuca arundinacea); especies de pasto para céspedes (por ejemplo, las especies: Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum); y trigo (Triticum aestivum). Es evidente para los expertos en la técnica que pueden usarse y modificarse muchas metodologías de transformación para la producción de plantas transgénicas estables a partir de cualquier número de cultivos objetivo de interés. Métodos para introducir un transgen son bien conocidos en la técnica, e incluyen protocolos biológicos y físicos para la transformación de plantas. Véase, por ejemplo, Miki eí al. (1993). Una vez que un transgen es introducido en una variedad, puede ser transferido fácilmente mediante cruza. Mediante el uso de retrocruza, esencialmente se recuperan todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas de una variedad, además del locus transferido en la variedad por medio de la técnica de retrocruza. Pueden usarse métodos de retrocruza y mejora genética hacia delante con la presente invención, para mejorar o introducir una característica en una planta (Poehlman y Sleper, 1995; Fehr, 1987a, b; Sprague y Dudley, 1988).

Integración de transqenes específica de sitio Muchos métodos mediados por recombinación específica de sitio se han desarrollado para incorporar transgenes en el genoma de las plantas, así como para deletar elementos genéticos no deseados de células vegetales y animales. Por ejemplo, el sistema de recombinación cre-lox del bacteriófago P1 , descrito por Abremski eí al. (1983), Sternberg eí al. (1981 ) y otros, se ha usado para promover la recombinacíón, en una variedad de tipos de células. El sistema cre-lox usa la cre recombinasa aislada del bacteriófago P1 en conjunto con las secuencias de ADN (denominadas sitios lox) que reconoce. Este sistema de recombinación ha sido efectivo para lograr la recombinación en células vegetales (patente de E.U.A. 5,658,772), células animales (patente de E.U.A. 4,959,317 y patente de E.U.A. 5,801 ,030) y en vectores virales (Hardy eí al., 1997). La determinación del blanco y el control de la inserción o la remoción de secuencias de transgenes en el genoma de una planta, pueden lograrse mediante el uso del método de recombinación molecular (patente de E.U.A. 6,573,425). Una molécula de polinucleótido introducida que comprenda un sitio de recombinación heterólogo incorporado en la región de un haplotipo, está dentro del alcance de la presente invención. Wahl eí al. (patente de E.U.A. 5,654,182) usaron el sistema de FLP recombinasa específico de sitio de Saccharomyces cerevisiae para deletar secuencias de ADN en células eucarióticas. Las deleciones fueron diseñadas para lograr la inactivación de un gen o la activación de un gen poniendo fragmentos de ADN deseados en asociación con algún otro. Se ha demostrado la actividad de la FLP recombinasa en plantas (Lyznik eí al., 1996; Luo eí a/., 2000). Otros han usado transposones o elementos genéticos móviles que se transponen cuando un gen de transposasa está presente en el mismo genoma, para separar genes objetivo de secuencias auxiliares. Yoder eí al. (patente de E.U.A. 5,482,852 y patente de E.U.A. 5,792,924, las cuales se incorporan en la presente como referencia), usaron construcciones que contienen la secuencia de la enzima transposasa y las secuencias de reconocimiento de transposasa, para proveer un método para alterar genéticamente plantas que contienen un gen deseado libre de secuencias de vector y/o marcador. Otros métodos que usan transposasas o recombinasas de bacteriófagos dirigidas a la secuencia de ADN para elegir como objetivo regiones específicas, se describen en los documentos US 20020132350 y EP 1308516 (los cuales se incorporan en la presente como referencia). Pueden diseñarse específicamente endonucleasas del dedo de zinc que reconocen una secuencia de ADN y pueden elegir como objetivo secuencias de ADN específicas en un genoma, para crear un sitio de recombinación útil para la inserción de un transgen (Wright eí al., 2005; patente de E.U.A. 7,030,215; documento US 20050208489; documento US 20050064474, incorporados en su totalidad en la presente como referencia), por ejemplo, dirigido hacia un haplotipo que comprende las secuencias de ADN enlistadas en el listado de secuencia de la presente invención, y contenido en el genoma de una planta de maíz o soya. Un transgen que contiene sitios de recombinación adicionales cuando es un componente de una región genómica tipo T preferida, provee una oportunidad para añadir transgenes adicionales a la región genómica tipo T, incrementando de esta manera el valor de la región en un germoplasma. La presente invención contempla que la región genómica tipo T es también un sitio para actividades de recombinación específicas que remueven o añaden nuevo material genético a la región genómica. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes, representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y de esta manera puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y obtener aún un resultado igual o similar sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Identificación de haplotipos Este ejemplo ilustra la identificación de haplotipos de soya útiles en bases de datos para poner en práctica los métodos de esta invención. Los cromosomas de la soya se dividieron en haplotipos, siguiendo la heredabilidad de una gran serie de marcadores. Se identificaron formas alélicas de los haplotipos para una serie de 4 haplotipos que se enlistan en el cuadro 1. Con relación al cuadro 1 , un haplotipo mapeado hacia un sitio genómico se identifica por referencia, por ejemplo, C8W6H5 se refiere al cromosoma 8, ventana 6 en ese cromosoma, y el haplotipo 5 en esa ventana (región genómica); SEQJD provee la referencia al listado de secuencias, y el número de ID del marcador es un nombre de identificación arbitrario para un amplicón de ADN asociado con el locus de un marcador; START_POS se refiere a la posición de inicio del marcador en el amplicón de ADN; HAP ALLELE se refiere al nucleótido de un marcador de SNP/Indel en la posición de inicio, en donde * indica una deleción de un Indel; "otros estados del marcador" identifica otro alelo de marcador genético de nucleótidos en la ventana.

CUADRO 1 Resumen de información de loci de marcadores genéticos usados para caracterizar cuatro haplotipos de soya asociados con los eventos de soya tolerantes a glifosato, incluyendo la identificación de secuencia (SEQ ID y número de ID del marcador) y la posición del polimorfismo (START POS) siendo usada para caracterizar alelos (HAP ALLELE) en estas secuencias START POS HAP Otros Haplotipo SEQ ID (posición de ALLELE estados del inicio) (alelo HAP) marcador C8W6H5 1 962360 277 * G 2 1324623 785 A T 3 1271382 239 A G C16W8H43 4 1271562 351 A G 5894632 193 G C 6928368 320 A G 7 1267271 563 C A 8 1271614 126 A G 9 1271496 359 T G C18W3H8 101271924 603 G A 11 1267375 741 T C 12860401 372 G C C19W3H6 13 1271355 283 T C 14 1271476 546 A C 15825651 294 T C EJEMPLO 2 Preparación de una base de datos con rasgos agronómicos y haplotipos Este ejemplo ilustra la preparación de una base de datos útil en un método de esta invención. Con relación al cuadro 2, la base de datos comprende valores calculados de rasgos agronómicos, por ejemplo, rendimiento, madurez, altura de la planta y acame, para los haplotipos de soya alélicos específicos y la frecuencia de haplotipos en una serie de líneas para mejora genética. Pueden medirse otros rasgos, por ejemplo, rendimiento de un grano, semilla, fruto, fibra, forraje, aceite; o un rasgo agronómico, por ejemplo, resistencia a plagas, tal como resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, resistencia a nematodos, o índice de crecimiento mejorado y tolerancia al estrés; o un producto procesado mejorado de la planta, por ejemplo, perfil de ácidos grasos, perfil de aminoácidos, contenido nutricional o calidad de la fibra, y una base de datos compilada para los valores de cada haplotipo para estos otros rasgos. Los valores de los rasgos agronómicos de estos haplotipos representan el cambio predicho de la población en valor medio para el rasgo enlistado si el haplotipo fue fijado en el germoplasma, todo también continuando siendo igual. Los valores para "rendimiento" están en hectolitros de soya/hectárea. Los valores para "madurez" están en días (la madurez de una línea de soya es el tiempo de floración relativo de esa línea en comparación con una serie de controles estándar de madurez definida). Los valores para "altura de la planta" están en centímetros de altura medida de la superficie del suelo a la punta del tejido más superior de la planta en la madurez. Los valores de "acame" son un por ciento de plantas en comparación con una serie de controles estándar (el acame es un fenómeno en el cual el tallo principal de las plantas de cultivo se han movido desde la vertical por un gran ángulo, a veces hasta un punto en que las plantas quedan postradas sobre el suelo). Los valores de mejora genética para cada uno de los haplotipos se usan para seleccionar el haplotipo que en combinación con un transgen, serán el más benéfico para la mejora del germoplasma del cultivo. El valor de mejora genética es una combinación de rasgos medidos y la estimación de cómo estos rasgos afectan la mejora del germoplasma. Se midieron los haplotipos de soya asociados con los eventos transgénicos para tolerancia a glifosato, y los resultados se muestran en el cuadro 2. El haplotipo C8W6H5 sería un haplotipo favorable por su efecto sobre el rendimiento, y el haplotipo C18W3H8 sería un haplotipo favorable por su frecuencia muy alta en el germoplasma (94 por ciento), indicando que poca variabilidad está presente en el germoplasma objetivo de la soya para este segmento cromosómico, haciendo que sea neutro el proceso de difusión de un evento transgénico. El haplotipo C19W3H6 es generalmente neutro con respecto a rendimiento.

CUADRO 2 Valores de mejora genética calculados de cuatro haplotipos descritos para rendimiento, madurez, altura de la planta y acame. La frecuencia del haplotipo en el germoplasma de la soya se estimó a partir de una muestra de 365 lineas de soya Frecuencia Rendimiento . . . . .. , . en una * -•* Madurez Altura de la . /n/ x . . ..

Haplotipo (hectolitros/ Acame (%) población hectárea) v ' ' para mejora genética C8W6H5 1 .47 0.989 -0.49 -0.027 21 % C16W8H43 -0.38 -0.21 1 -1 30 -0.101 42% C18W3H8 0.000 0.000 0 000 0.000 94% C19W3H6 -0.06 0.232 -1 .25 0.001 58% Las regiones de haplotipos se determinaron para cada uno de los cuatros nuevos eventos de soya tolerantes a glifosato. 17194 está ligado al haplotipo C16W8H43, 17426 está ligado al haplotipo C18W3H8, 19703 está ligado al haplotipo C19W3H6, y 19788 está ligado al haplotipo C8W6H5. El efecto relativo de estos haplotipos se midió como se ilustra en el cuadro 2.

Esto representa el cambio predicho de la población en valor medio para el rasgo enlistado si el haplotipo fue fijado en el germoplasma, todo también continuando siendo igual. El tipo T de 19788 y el haplotipo C8W6H5 asociado, es el más favorable de los cuatro tipos T que se midieron. Este resultado demuestra que es importante en un procedimiento para mejorar el desempeño del cultivo a través de métodos transgénicos, que ambos eventos transgénicos y las regiones de haplotipos ligadas se evalúan para continuar mejorando la productividad del cultivo. Los nuevos eventos tolerantes a glifosato se compararon en pruebas de campo repetidas para una conversión de 40-3-2 por retrocruza en el germoplasma A3244. Esto se demostró en pruebas de campo repetidas, incluyendo datos de rendimiento recabados de diecisiete localidades en los Estados Unidos. A3244 (patente de E.U.A. 5,659,114, número de ATCC 97549) es un germoplasma de soya élite de Asgrow (Monsanto, St Louis, MO), que se usó como la línea progenitora para transformación para generar los nuevos eventos de soya 17194, 17426, 19703 y 19788 tolerantes a glifosato. Los resultados del estudio de rendimiento mostraron que 40-3-2 A3244 dio por retrocruza un promedio de 52.85 hectolitros/hectárea, 19788 un promedio de 57.12 hectolitros/hectárea, 19703 un promedio de 57.20 hectolitros/hectárea, 17426 un promedio de 56.86 hectolitros/hectárea, y 17194 un promedio de 57.29 hectolitros/hectárea. Las cuatro nuevas líneas tienen una ventaja de rendimiento aproximada de 4.35 hectolitros/hectárea sobre el mismo genotipo con la región genómica tipo T 40-3-2 introgresada. Cuando se considera el haplotipo de cada una, entonces el evento más favorable es 19788. Estos análisis demuestran el valor de la determinación del tipo T para cada evento transgénico que está siendo desarrollado como un producto comercial. La imposibilidad para considerar los efectos agronómicos de la región de haplotipos en la cual el transgen ha sido introgresado, puede resultar en la introducción de un evento de bajo desempeño en el germoplasma de un cultivo.

EJEMPLO 3 Uso de valores de mejora genética Las regiones de haplotipos y los valores de mejora genética de cada uno se determinaron para cuatro regiones de haplotipos en las cuales se insertó un gen de tolerancia a insectos en el genoma de una planta de soya. El valor relativo de mejora genética para cada una de las regiones de haplotipos se muestra en el cuadro 3, y las definiciones de las mediciones son las mismas que se describieron en el ejemplo 2. El cuadro es una base de datos para determinar el haplotipo y su valor de mejora genética en el cual se insertó un gen de tolerancia a insectos (un tipo T). Un evento transgénico que comprenda el tipo T se selecciona usando la información de la base de datos. Un evento particular, GM_19549, contiene al tipo T del gen de tolerancia a insectos, asociado con el haplotipo C6W4H1 , que es un haplotipo favorable para madurez.

CUADRO 3 Valores calculados de mejora genética para rendimiento, madurez, altura de la planta y acame de cuatro haplotipos para los eventos de soya tolerantes a insectos. La frecuencia del haplotipo en el germoplasma se estimó a partir de 2589 líneas de soya Rendimiento Altura de Frecuencia Madurez Acame Haplotipo (hectolitros/ la planta del (días) hectárea) (cm) (%) haplotipo C1W1 H2 0.06 0.244 0.14 0.018 16% C1 W2H1 0.13 0.314 0.17 0.022 67% C14W7H2 0.11 0.648 -0.25 -0.069 62% C6W4H1 -0.13 -0.111 — 0.070 29% Se identificaron formas alélicas de los haplotipos para una serie de 4 haplotipos asociados con soyas transgénicas resistentes a insectos, como se enlistan en el cuadro 4. Con relación al cuadro 4, un haplotipo mapeado hacia un sitio genómico se identifica por referencia, por ejemplo, C1W1 H2 se refiere al cromosoma 1 , ventana 1 en ese cromosoma, y el haplotipo 2 en esa ventana (región genómica); SEQJD provee la referencia al listado de secuencias, y el número de ID del marcador es un nombre de identificación arbitrario para un amplicón de ADN asociado con el locus de un marcador; START_POS se refiere a la posición de inicio del marcador en el amplícón de ADN; HAP ALLELE se refiere al nucleótido de un marcador de SNP/Indel en la posición de inicio, en donde * indica una deleción de un Indel; "otros estados del marcador" identifica otro alelo de marcadores de nucleótidos en la ventana. "NA" indica que otro alelo de marcador genético no está presente.

CUADRO 4 Resumen de información de loci de marcadores genéticos usados para caracterizar cuatro haplotipos de soya asociados con los eventos de soya tolerantes a insectos, incluyendo la identificación de secuencia (SEQ ID y número de ID del marcador) y la posición del polimorfismo (START POS) siendo usada para caracterizar alelos (HAP ALLELE) en estas secuencias START HAP Otros SEQ ID P0S ALLELE estados del Haplotipo - (posición (alelo marcador de inicio) HAP) C1W1H2 16 NS0092678 0 C T 17 NS0092617 0.4 A G A G 18 NS0101549 1.4 19 NS0127917 1.4 C A A T 20 NS0120003 1.8 21 NS0118494 3 C T 22 NS0124158 3 A G C1W2H1 23 NS0101025 11.3 C T 24 NS0101038 11.3 A C T G 25 NS0127234 11.3 T A 26 NS0129173 11.3 27 NS0097228 16.2 c NA CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) START HAP Otros SEQ ID P0S ALLELE estados del Haplotipo - (posición (alelo marcador de inicio) HAP) C14W7H2 2g NS0096079 T C 68.5 C6W4H1 2g NS01 25775 G C 30.3 I C 30 NS0130788 30.3 T 31 NS0093984 32.9 c A 32 NS0096925 32.9 EJEMPLO 4 Aplicación a la mejora genética del maíz Este ejemplo ilustra las regiones de haplotipos y los valores de mejora genética que se determinaron para cuatro regiones de haplotipos en las cuales se insertó un gen de tolerancia a insectos en el genoma de una planta de maíz (LH172). El valor relativo de mejora genética para cada una de las regiones de haplotipos se muestra en el cuadro 5, y las definiciones de las mediciones son las mismas que se describieron en el ejemplo 2. El cuadro es una base de datos para determinar el haplotipo y su valor de mejora genética en el cual se insertó un gen de tolerancia a insectos (un tipo T). Un evento transgénico que comprenda el tipo T se selecciona usando la información de la base de datos. Un evento particular contiene al tipo T del gen de tolerancia a insectos, asociado con el haplotipo C1W36H2, que es un haplotipo favorable para madurez.

CUADRO 5 Valor calculado de mejora genética para el rendimiento de cuatro haplotipos para eventos de maíz tolerantes a insectos. La frecuencia del haplotipo en el germoplasma se estimó a partir de 6335 líneas de maiz Rendimiento Frecuencia del Haplotipo (hectolitros/hectárea) haplotipo C1 W19H14 0.14 9.2% C1W30H4 -0.68 3.3% C1 W36H2 0.006 18% C8W4H5 0.32 15% Se identificaron formas alélicas de los haplotipos para una serie de 4 haplotipos para el maíz transgénico resistente a insectos que se enlistan en el cuadro 6. Con relación al cuadro 6, un haplotipo mapeado hacia un sitio genómico se identifica por referencia, por ejemplo, C1W19H14 se refiere al cromosoma 1 , ventana 19 en ese cromosoma, y el haplotipo 14 en esa ventana (región genómica); SEQ ID provee la referencia al listado de secuencias, y el número de ID del marcador es un nombre de identificación arbitrario para un amplicón de ADN asociado con el locus de un marcador; START_POS se refiere a la posición de inicio del marcador en el amplicón de ADN; HAP ALLELE se refiere al nucleótido de un marcador de SNP/Indel en la posición de inicio, en donde * indica una deleción de un Indel; "otros estados del marcador" identifica otro alelo de marcadores de nucleótidos en la ventana.

CUADRO 6 Resumen de información de loci de marcadores genéticos usados para caracterizar cuatro haplotipos de maíz asociados con los eventos de maíz tolerantes a insectos, incluyendo la identificación de secuencia (SEQ ID y número de ID del marcador) y la posición del polimorfismo (START POS) siendo usada para caracterizar alelos (HAP ALLELE) en estas secuencias START HAP Otros SEQ ID P0S ALLELE estados del Haplotipo - (posición (alelo marcador de inicio) HAP) C1W19H14 33 T C NC0053983 109.4 A G 34 NC0113263 110.1 T C 35 NC0008901 110.8 36 A G NC0143254 110.9 A G 37 NC0030198 111 T G 38 NC0080733 111 C T 39 NC0104474 111 C A 40 NC0033728 113.3 C G 41 NC0029506 113.6 C1W30H4 42 G A NC0039502 195.5 T C 43 NC0111626 196.4 A G 44 NC0008982 198.4 G T 45 NC0040427 199.4 G T 46 NC0033427 199.8 CUADRO 6 (CONTINUACIÓN) START HAP Otros SEQ ID P0S ALLELE estados del Haplotipo - (posición (alelo marcador de inicio) HAP) A 47 NC0148362 200 G C1W36H2 T G 48 NC0146570 237 A T 49 NC0008996 238.1 50 NC0013490 240.7 T C C8W4H5 51 NC0111628 57.3 A G 52 NC0026720 A C 58.7 53 NC0037392 C T 60 54 NC0027485 60.1 C T EJEMPLO 5 Mapeo indirecto de una región genómica tipo T Se identifican marcadores de ADN en la región genómica que flanquea la inserción de un transgen que provee un medio para identificar el sitio genómico del transgen mediante la comparación de los marcadores de ADN con una población de mapeo. Pueden desarrollarse marcadores de ADN para cualquier evento transgénico mediante el aislamiento de la región genómica, secuenciación de la región, aislamiento de la misma región en una población de mapeo de la planta de cultivo, y determinando la posición respecto a marcadores conocidos en la población de mapeo. Puede determinarse la asociación del transgen con fenotipos mapeados, loci de rasgos cuantitativos que comprenden una región genómica de haplotipos. Por ejemplo, para MON89788, se seleccionó un par de iniciadores de ADN de una secuencia de ADN que se extiende en el genoma 5' hacia el sitio de inserción del transgen (SEQ ID NO: 55 y 56) y en la región genómica 3' respecto al sitio de inserción del transgen (SEQ ID NO: 57-88). Se usó un método de amplificación de ADN para obtener productos de ADN que comprendan una porción del genoma de la soya de las regiones 5' y 3' del sitio de inserción del transgen. Estos productos de ADN fueron secuenciados. Los mismos pares de iniciadores se usaron para amplificar ADN de siete líneas de soya (507354, Minsoy, Noir, HS1 , PIC, 88788, A3244) que son progenitores de cuatro poblaciones de mapeo. Un polimorfismo de nucleótido individual (SNP) se identificó en la posición 119 (SNP119, SEQ ID NO: 59) de las secuencias flanqueantes 3', cuando se compararon secuencias a través de diferentes líneas. El cuadro 7 muestra la composición alélica en esta posición en ocho líneas puestas a prueba.

CUADRO 7 Polimorfismo en las secuencias flanqueantes en diferentes líneas de soya que comprenden MON89788 Secuencia Secuencia flanqueante 5' flanqueante 3' Posición 2809 1 19 507354 A T Minsoy A T Noir A T HS1 A T PIC T C 88788 T A3244 T 507355 A T Una prueba de punto final Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) se desarrolló a partir de SNP119 de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante. Secuencias de iniciador y sonda se dan en el cuadro 8. Para mapear el polimorfismo SNP119 se usó una población F2, derivada de una cruza entre HS1 x PI407305 (PIC), que consiste de 140 individuos. Se determinó la posición de SNP119 en el mapa poniendo las puntuaciones alélicas contra la serie de datos alélicos existentes usando MapMaker (Lincoln y Lander, 1990). Se encontró a SNP119 en el grupo de ligamiento D1a+Q (Song, Q. J., eí al., 2004). De esta manera, MON89788 fue mapeado indirectamente hacia esta misma posición.

CUADRO 8 Moléculas de iniciador y sonda para prueba Taqman para el mapeo de haplotipos Iniciador delantero SEQ ID NO: 60 19788 3E-119F CGTTCTCGACTTCAACCATATGTGA Iniciador inverso SEQ ID NO: 61 19788 3E-119R GCATGGAATAAAGCGGAAAGGAAAG Sonda VIC SEQ ID NO: 62 19788 3E-1 19V2 CCATGGTATCATAGGCA Sonda Fam SEQ ID NO: 63 19788 3E-119M2 CCATGGTATCGTAGGCA Un depósito de Monsanto Technology LLC, semilla de soya que comprende el evento MON89788 descrito anteriormente y citado en las reivindicaciones, se ha obtenido bajo el tratado de Budapest con The American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. El número de acceso de ATCC es PTA-6708 depositado en mayo 11 de 2005. El depósito se mantendrá en el depositario por un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vida efectiva de la patente, cualquiera que dure más tiempo, y se reemplazará según sea necesario durante ese período. Moléculas de ADN de la presente invención pueden aislarse del genoma del material depositado, y la secuencia corregida si es necesario, y moléculas de ADN adicionales para su uso como sondas o iniciadores para las regiones de haplotipos descritos en la presente, pueden aislarse del material depositado.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente como referencia, al mismo grado como si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora en la presente como referencia Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente, pueden obtenerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción Mientras que las composiciones y los métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a los métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente, sin que se aparten del concepto, espíritu y alcance de la invención Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes descritos en la presente, mientras que se obtendrían los mismos resultados o resultados similares. Se considera que dichos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica, están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define mediante las reivindicaciones anexas.

REFERENCIAS Las siguientes referencias, al punto de que proveen ejemplos de procedimientos u otros detalles complementarios a los expuestos en la presente, se incorporan específicamente en la presente como referencia. Patente de E.U.A. 4,757,011 Patente de E.U.A. 4,769,061 Patente de E.U.A. 4,810,648 Patente de E.U.A. 4,940,835 Patente de E.U.A. 4,959,317 Patente de E.U.A. 4,971 ,908 Patente de E.U.A. 5,015,580 Patente de E.U.A. 5,094,945 Patente de E.U.A. 5,229,114 Patente de E.U.A. 5,304,730 Patente de E.U.A. 5,384,253 Patente de E.U.A. 5,437,697 Patente de E.U.A. 5,463,175 Patente de E.U.A. 5,482,852 Patente de E.U.A. 5,508,184 Patente de E.U.A. 5,512,466 Patente de E.U.A. 5,516,671 Patente de E.U.A. 5,538,880 Patente de E.U.A. 5,543,576 Patente de E.U.A. 5,545,545 Patente de E.U.A. 5,550,318 Patente de E.U.A. 5,591 ,616 Patente de E.U.A. 5,608,149 Patente de E.U.A. 5,627,061 Patente de E.U.A. 5,633,435 Patente de E.U.A. 5,637,785 Patente de E.U.A. 5,654,182 Patente de E.U.A. 5,658,772 Patente de E.U.A. 5,659,114 Patente de E.U.A. 5,689,041 Patente de E.U.A. 5,716,837 Patente de E.U.A. 5,750,876 Patente de E.U.A. 5,773,696 Patente de E.U.A. 5,792,924 Patente de E.U.A. 5,801 ,030 Patente de E.U.A. 5,824,877 Patente de E.U.A. 5,942,664 Patente de E.U.A. 5,958,745 Patente de E.U.A. 5,981 ,840 Patente de E.U.A. 5,985,605 Patente de E.U.A. 5,998,700 Patente de E.U.A. 6,011 ,199 Patente de E.U.A. 6,013,864 Patente de E.U.A. 6,031 ,154 Patente de E.U.A. 6,040,497 Patente de E.U.A. 6,063,597 Patente de E.U.A. 6,063,756 Patente de E.U.A. 6,072,103 Patente de E.U.A. 6,080,560 Patente de E.U.A. 6,093,695 Patente de E.U.A. 6,110,464 Patente de E.U.A. 6,121 ,436 Patente de E.U.A. 6,140,085 Patente de E.U.A. 6,160,208 Patente de E.U.A. 6,166,292 Patente de E.U.A. 6,171 ,640 Patente de E.U.A. 6,184,440 Patente de E.U.A. 6,228,992 Patente de E.U.A. 6,316,407 Patente de E.U.A. 6,380,466 Patente de E.U.A. 6,384,301 Patente de E.U.A. 6,399,861 Patente de E.U.A. 6,403,865 Patente de E.U.A. 6,444,876 Patente de E.U.A. 6,476,295 Patente de E.U.A. 6,476,295 Patente de E.U.A. 6,476,295 Patente de E.U.A. 6,486,383 Patente de E.U.A. 6,506,962 Patente de E.U.A. 6,531 ,648 Patente de E.U.A. 6,537,750 Patente de E.U.A. 6,660,911 Patente de E.U.A. 6,768,044 Patente de E.U.A. 6,774,284 Patente de E.U.A. 7,030,215 Publicación de E.U.A. 20020132350 Publicación de E.U.A. 20030083480 Publicación de E.U.A. 20040177399 Publicación de E.U.A. 20050064474 Publicación de E.U.A. 20050208489 Publicación de E.U.A. 20050246798 Publicación de E.U.A. 20060021093 Publicación de E.U.A. 20060021094 Publicación de E.U.A. 20030028917 Abremski et al., Cell, 32: 1301-1311 , 1983. Allard, "Principies of Plant Breeding", John Wiley & Sons, NY, U. , CA, 50-98, 1960.

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método de mejora genética de una planta transgénica, que comprende los pasos de: (a) proveer una base de datos que identifique un valor de por lo menos un rasgo agronómico para por lo menos dos haplotipos distintos del genoma para un juego de germoplasma; (b) transformar una planta progenitora con un ADN recombinante para producir por lo menos dos eventos transgénicos, en donde el ADN recombinante es insertado en ligamiento con los haplotipos distintos (por lo menos dos) del genoma de dicha planta progenitora; (c) hacer referencia a la base de datos para el valor de dicho rasgo agronómico para los eventos ligados a los haplotipos distintos; y (d) seleccionar una planta para mejora genética, dicha planta comprendiendo el evento transgénico que tiene un haplotipo de mayor valor referido. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el ADN recombinante se selecciona del grupo que consiste de ADN que codifica para un marcador seleccionable, ADN que codifica para un marcador registrable, un sitio de recombinación de ADN, ADN que codifica para una proteína que provee una mejora agronómica, y ADN para supresión génica. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho rasgo agronómico (por lo menos uno) es rendimiento o un índice de rasgos múltiples. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho evento transgénico seleccionado para mejora genética tiene el ADN recombinante ligado a un haplotipo, en donde el haplotipo se selecciona del grupo que consiste de no negativo con respecto a rendimiento, no positivo con respecto a madurez, nulo con respecto a madurez, entre el 50 por ciento favorable con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo en el mismo segmento cromosómico, y entre el 50 por ciento favorable con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo a través del genoma entero. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque una planta de la descendencia de la planta seleccionada para mejora genética se selecciona mediante selección asistida por marcadores. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque una planta de la descendencia de la planta seleccionada para mejora genética se selecciona mediante detección de la expresión del transgen o expresión del rasgo agronómico del transgen. 1.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta es una planta de cultivo seleccionada del grupo que consiste de un cultivo forrajero, cultivo oleaginoso, cultivo de granos, cultivo frutal, cultivo de hortalizas, cultivo de fibra, cultivo de especias, cultivo de nueces, cultivo de césped, cultivo de azúcar, cultivo para bebida y cultivo forestal. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el cultivo oleaginoso se selecciona del grupo que consiste de soya, cañóla, colza oleaginosa, palma de aceite, girasol, oliva, maíz, semilla de algodón, cacahuate, lino, cártamo y coco. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la soya tiene un su genoma por lo menos un marcador genético que está ligado genéticamente a un haplotipo seleccionado del grupo que consiste de C8W6H5, C18W3H8, C19W3H6, C16W8H43, C1W1 H2, C1W2H1 , C14W7H2 y C6W4H1 ; y dicho haplotipo comprende además un transgen ligado. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el marcador genético es un marcador de ADN seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 -32. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende el paso de cruzar la planta de la descendencia con una tercera planta de soya para producir otras plantas de la descendencia. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho cultivo de granos es maíz, y tiene en su genoma por lo menos un marcador genético que está ligado genéticamente a un haplotipo seleccionado del grupo que consiste de C1W19H14, C1W30H4, C1W36H2 y C8W4H5; y dicho haplotipo comprende además un transgen ligado. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho marcador genético es un marcador de ADN seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 33-54. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ADN recombinante y el haplotipo están ligados a una distancia genética de 0 a dentro de aproximadamente 10 cM. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ADN recombinante y el haplotipo están ligados a una distancia de 0 a dentro de aproximadamente 5 cM. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque un alelo del haplotipo está asociado con adecuación agronómica, u ocurre a una frecuencia de 50 por ciento o más en una población para mejora genética o un juego de germoplasma. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la mejora agronómica se selecciona del grupo que consiste de tolerancia a herbicidas, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos o plagas, metabolismo alterado de ácidos grasos, proteínas o carbohidratos, rendimiento de grano incrementado, contenido incrementado de aceite, madurez alterada de la planta, tolerancia mejorada al estrés, y características morfológicas alteradas. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la tolerancia a herbicidas se selecciona del grupo que consiste de tolerancia a glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinilo, dalapón, dicamba, 2,4-D, ciclohezanodiona, inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa y tolerancia a isoxaflutol. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la planta de la descendencia contiene por lo menos una porción del haplotipo de la planta seleccionada para mejora genética, en donde la porción se selecciona del grupo que consiste de por lo menos 10 cM, por lo menos 5 cM y por lo menos 1 cM. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el uso de la planta de la descendencia en actividades relacionadas con el germoplasma, mejora las actividades seleccionadas del grupo que consiste del uso de la planta para hacer cruzas para mejora genética, más pruebas de la planta, mejora de la planta a través de autofecundación, el uso de la planta o partes de la misma para transformación, el uso de la planta o partes de la misma para mutagénesis, y el uso de la planta o partes de la misma para TILLING. 21.- Un método para insertar un transgen en el haplotipo de una planta, que comprende: (a) incorporar en ligamiento genético con un haplotipo, un sitio objetivo que comprenda por lo menos un primer sitio de recombinación; y (b) introducir en una célula vegetal un cassette de expresión del transgen que comprenda por lo menos un primer sitio de recombinación, en donde el primer sitio de recombinación del cassette de expresión flanquea un polinucleótido que comprende un transgen de interés; y (c) proveer una recombinasa que reconozca e implemente la recombinación del cassette de expresión en el primer sitio de recombinación, creando de esta manera una región genómica tipo T preferida, en donde la región genómica tipo T preferida tiene un valor tipo T estimado, en donde se seleccionan medios preferidos para un haplotipo que no contenía previamente un transgen o preferidos sobre un haplotipo que contenía previamente un transgen, en donde el haplotipo se selecciona del grupo que consiste de no negativo con respecto a rendimiento, no positivo con respecto a madurez, nulo con respecto a madurez, entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo en el mismo segmento cromosómico, y entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo a través del genoma entero. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el sitio de recombinación se selecciona del grupo que consiste de FRT, FRT mutante, LOX, sitios LOX mutantes, y sitio modificado con nucleasa del dedo de zinc. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque un alelo del haplotipo se asocia con adecuación agronómica u ocurre a una frecuencia de 50 por ciento o más en una población para mejora genética o un juego de germoplasma. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la recombinada es cre o flp. 25.- Un método para mapear por lo menos un evento de un transgen tipo T, que comprende: (a) identificar de la secuencia flanqueante en torno a por lo menos un primer evento transgénico en una planta o línea transformada, por lo menos un primer polimorfismo entre las líneas progenitoras de una población de mapeo, en donde la planta o línea transformada puede ser diferente de las líneas progenitoras de la población de mapeo; y (b) poner a prueba las plantas de la descendencia de la población de mapeo para el polimorfismo, (c) realizar un análisis de ligamiento para determinar una posición del polimorfismo en el mapa, y de esta manera un sitio del evento transgénico en el mapa; y (d) correlacionar el sitio en el mapa con un haplotipo de la planta transformada. 26.- Un método para mejorar la acumulación de una o más regiones genómicas tipo T en un germoplasma, que comprende: a) insertar un transgen en un genoma de una primera planta; b) determinar un sitio en el mapa del transgen en el genoma; c) correlacionar el sitio en el mapa con un haplotipo, en donde el transgen y el haplotipo comprenden una región genómica tipo T; d) cruzar la primera planta con una segunda planta que contenga por lo menos una región genómica tipo T o haplotipo que sea diferente de la región genómica tipo T de la primera planta; e) seleccionar por lo menos una planta de la descendencia detectando la expresión del transgen de la primera planta, en donde la planta de la descendencia comprende en su genoma por lo menos una porción de la región genómica tipo T de la primera planta, y por lo menos una región genómica tipo T o haplotipo de la segunda planta; y f) usar la planta de la descendencia en actividades relacionadas con la mejora del germoplasma, las actividades seleccionadas del grupo que consiste del uso de la planta para hacer cruzas para mejora genética, poner a prueba además la planta, mejora de la planta a través de autofecundación, uso de la planta o partes de la misma para transformación, uso de la planta o partes de la misma para mutagénesis, y uso de la planta o partes de la misma para TILLING. 27.- Una planta de cultivo que comprende una región genómica tipo T preferida, en donde se define además un transgen de la región genómica tipo T que confiere un rasgo seleccionado del grupo que consiste de tolerancia a herbicidas, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos o plagas, metabolismo alterado de ácidos grasos, proteínas o carbohidratos, rendimiento de grano incrementado, contenido de aceite incrementado, madurez alterada de la planta, tolerancia mejorada al estrés y características morfológicas alteradas; y el haplotipo de la región genómica tipo T se selecciona del grupo que consiste de no negativo con respecto a rendimiento, no positivo con respecto a madurez, nulo con respecto a madurez, entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un Índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo en el mismo segmento cromosómico, y entre el mejor 50 por ciento con respecto a un rasgo agronómico o un índice de rasgos múltiples cuando se compara con cualquier otro haplotipo a través del genoma entero. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque un haplotipo tiene un alto valor si está presente con una frecuencia de 50 por ciento o más en una población para mejora genética o un juego de germoplasma. 29.- La planta de cultivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la región genómica tipo T preferida comprende un transgen y un haplotipo que están ligados genéticamente dentro de una distancia de 0 a aproximadamente 10 cM. 30.- La planta de cultivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque la región genómica tipo T preferida comprende un transgen y un haplotipo que están ligados genéticamente dentro de una distancia de 0 a aproximadamente 5 cM. 31.- La planta de cultivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque dicha planta de cultivo es una planta de soya transgénica tolerante a herbicidas, y en donde el transgen está ligado genéticamente a un haplotipo identificado como C8W6H5. 32.- La planta de soya de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque el marcador genético se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 , 2, 3 y 59. 33.- La planta de cultivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque dicha planta de cultivo es una planta de soya transgénica tolerante a insectos, y en donde el transgen está ligado genéticamente a un haplotípo identificado como C6W4H1. 34.- La planta de soya de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el marcador genético se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 29-32. 35.- La planta de cultivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque dicha planta de cultivo es una planta de maíz transgénica tolerante a insectos, y en donde el transgen está ligado genéticamente a un haplotipo identificado como C1W36H2. 36.- La planta de maíz de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque el marcador genético se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 48-50. 37.- Un método para aumentar la acumulación de uno o más haplotipos en un germoplasma, que comprende: (a) determinar un sitio en el mapa de un transgen en el genoma; b) correlacionar el sitio en el mapa con un haplotipo, en donde el transgen y el haplotipo comprenden una región genómica tipo T; c) cruzar la primera planta con una segunda planta que contenga por lo menos una región genómica tipo T o haplotipo que sea diferente de la región genómica tipo T de la primera planta; d) seleccionar por lo menos una planta de la descendencia detectando la expresión del transgen de la primera planta, en donde la planta de la descendencia comprende en su genoma por lo menos una porción de la región genómica tipo T de la primera planta, y por lo menos una región genómica tipo T o haplotipo de la segunda planta; y e) usar la planta de la descendencia en actividades relacionadas con la mejora del germoplasma, las actividades seleccionadas del grupo que consiste del uso de la planta para hacer cruzas para mejora genética, poner a prueba además la planta, mejora de la planta a través de autofecundación, uso de la planta o partes de la misma para transformación, uso de la planta o partes de la misma para mutagénesis, y uso de la planta o partes de la misma para TILLING.