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JP6877429B2 - Ｍｔａｐヌル癌を処置するためのｍａｔ２ａ阻害剤 - Google Patents

Ｍｔａｐヌル癌を処置するためのｍａｔ２ａ阻害剤 Download PDF

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Description

発明の領域
本発明は、癌患者の処置および診断の方法に関する。具体的には、本発明は、患者がメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（MAT2A）の阻害剤による処置から利益を得るか否かを決定する方法に関する。
発明の背景
発癌性の機能獲得型変異およびその対応する分子経路の同定および特徴決定は、対応する変異を有する癌患者に実質的な利益を提供する多数の標的療法の開発を促した。これには、（変異体EGFR非小細胞肺癌におけるエルロチニブおよびゲフィチニブ（Lynch & Haber,NEJM 2004およびPao & Varmus PNAS 2004）のような）機能獲得型点変異、（HER2増幅乳癌におけるトラスツズマブ（Slamon and Norton NEJM 2001）のような）ゲノム増幅、または（BCR-ABL陽性慢性骨髄性白血病におけるイマチニブ（Druker & Sawyers NEJM 2001）のような）発癌性遺伝子融合によって駆動された癌に選択的な薬物が含まれる。各ケースにおいて、治療は、発癌性変異体タンパク質を直接阻害し、その機能を消失させる。腫瘍抑制遺伝子における機能喪失型変異は、高頻度に見られ、癌の分子的な病因において等しく重要であるが、腫瘍抑制因子における機能喪失型変異に基づき、癌を選択的に標的とする治療の例は、極めて少ない（Morris & Chan Cancer 2015）。この不一致は、治療的利益のために変異体タンパク質を直接阻害することができないという単純な観察によって説明され得る。残存タンパク質の欠如のため、欠陥腫瘍抑制因子を直接活性化するか、安定化するか、または修復する治療戦略が取り除かれるため、ホモ接合型欠失によって不活化される腫瘍抑制因子は、標的療法に関して最も困難である。
S-アデノシルメチオニンシンセターゼとしても公知のメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（MAT）は、メチオニンおよびATPからのS-アデノシルメチオニン（SAMまたはAdoMet）の合成を触媒する細胞酵素であり、メチオニンサイクルの律速段階と見なされる。SAMは、ポリアミン生合成におけるプロピルアミノドナーであり、DNAメチル化のための主要なメチルドナーであり、遺伝子転写および細胞増殖にも、二次代謝物の生成にも関与している。
2種の遺伝子MAT1AおよびMAT2Aが、2種の異なる触媒性MATアイソフォームをコードする。第3の遺伝子MAT2Bは、MAT2A制御サブユニットをコードする。MAT1Aは、成人肝臓において特異的に発現され、MAT2Aは広く分布している。MATアイソフォームは、触媒速度論および制御特性に関して異なるため、MAT1A発現細胞は、MAT2A発現細胞より相当に高いSAMレベルを有する。MAT2Aプロモーターの低メチル化およびヒストンアセチル化は、MAT2A発現のアップレギュレーションを引き起こすことが見出されている。
肝細胞癌（HCC）においては、MAT1A:MAT2Aスイッチとして公知である、MATのダウンレギュレーションおよびMAT2Aのアップレギュレーションが起こる。MAT2Bのアップレギュレーションを伴うスイッチは、肝癌細胞に増殖優位性を提供する、より低いSAM含量をもたらす。MAT2Aは、肝癌細胞の増殖を容易にするために重大な役割を果たすため、抗新生物治療のための標的である。最近の研究は、低分子干渉RNAを使用することによるサイレンシングが、肝癌細胞の増殖を実質的に抑制し、アポトーシスを誘導することを示した。
メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（MTAP）は、メチルチオアデノシン（MTA）のアデニンおよび5-メチルチオリボース-1-リン酸への変換を触媒する、全ての正常組織に見出される酵素である。アデニンは、アデノシン一リン酸を生成するために再利用され、5-メチルチオリボース-1-リン酸は、メチオニンおよびギ酸へ変換される。このサルベージ経路のため、例えば、L-アラノシンのような代謝拮抗薬によって、新規プリン合成が阻止される時、MTAは、代替的なプリン源として役立つことができる。
多くのヒトおよびマウスの悪性細胞が、MTAP活性を欠いている。MTAP欠損は、組織培養細胞に見出されるのみならず、原発性白血病、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、非小細胞肺癌（NSLC）、膀胱癌、星細胞腫、骨肉腫、頭頸部癌、粘液性軟骨肉腫、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、軟部肉腫、非ホジキンリンパ腫、および中皮腫にも欠損が存在する。ヒトMTAPをコードする遺伝子は、ヒト染色体9p上の領域9p21にマッピングされている。この領域は、（CDKN2Aとしても公知の）腫瘍抑制遺伝子p16INK4Aおよびp15INK4Bも含有している。これらの遺伝子は、それぞれ、サイクリンD依存性キナーゼcdk4およびcdk6の阻害剤であるp16およびp15をコードする。
p16INK4A転写物は、p14ARFをコードする転写物へ選択的スプライシングされるARFであり得る。p14ARFは、MDM2に結合し、p53の分解を防止する（Pomerantz et al.(1998)Cell 92:713-723）。9p21染色体領域は、白血病、NSLC、膵臓癌、神経膠腫、黒色腫、および中皮腫を含む多様な癌において高頻度にホモ接合性に欠失しているため、興味深い。欠失は、しばしば、複数の遺伝子を不活化する。例えば、Cairnsら（(1995)Nat.Gen.11:210--212）は、500を超える原発腫瘍を研究した後、そのような腫瘍において同定されたほぼ全ての欠失が、MTAP、p14ARF、およびPl6INK4Aを含有している170kbの領域を含むことを報告した。Carsonら（WO 99/67634）は、腫瘍発達の段階と、MTAPをコードする遺伝子およびp16をコードする遺伝子のホモ接合型喪失との間に相関が存在することを報告した。例えば、MTAP遺伝子の欠失は、初期発達段階の癌の指標となることが報告されたが、p16INK4Aはそうでなく、p16およびMTAPをコードする遺伝子の欠失は、より進行した腫瘍発達段階の癌の指標となることが報告された。Garcia-Castellanoらは、数人の骨肉腫患者において、MTAP遺伝子が、診断時には存在したが、後の時点では欠失していたことを報告した（Garcia-Castellano et al.、前記）。
本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象における癌を処置する方法を提供し、本法において、癌は、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下した機能を特徴とする。
本発明は、腫瘍細胞におけるMTAPの状態を決定する工程を含む、腫瘍細胞をMAT2A阻害剤と接触させることによって、腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得るか否かを決定する方法を提供し、本法において、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能は、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることを示す。
もう一つの局面において、本発明は、腫瘍細胞におけるMTAP遺伝子発現のレベル、MTAP遺伝子の存在もしくは欠如、または存在するMTAPタンパク質のレベルを測定する工程を含む、腫瘍細胞を特徴決定する方法を提供し、本法において、参照細胞と比べた、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能は、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることを示す。
もう一つの局面において、本発明は、腫瘍の試料におけるMTAP遺伝子の低下した発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下を決定する工程を含む、MAT2A阻害に対する腫瘍の応答性を決定する方法を提供し、本法において、MTAP遺伝子の低下した発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下は、腫瘍がMAT2A阻害に対して応答性であることを示す。
もう一つの局面において、本発明は、腫瘍試料におけるMTAP遺伝子の発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下を測定するための試薬を含み、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を投与するための説明書をさらに含むキットを提供する。
[本発明1001]
治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象におけるMTAPヌル癌を処置する方法。
[本発明1002]
癌におけるMTAP遺伝子の欠如を、例えば、患者から採取された癌の試料から検出する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
癌にKRAS変異が組み込まれている、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
癌にp53変異が組み込まれている、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
腫瘍細胞をMAT2A阻害剤と接触させることによって、腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得るか否かを決定する方法であって、腫瘍細胞におけるMTAPの状態を決定する工程を含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能が、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることを示す、方法。
[本発明1006]
MTAP遺伝子の欠如が決定される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
KRAS変異の存在を決定する工程をさらに含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能、およびKRAS変異の存在が、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることを示す、本発明1005または1006の方法。
[本発明1008]
p53変異の存在を決定する工程をさらに含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能、およびp53変異の存在が、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることを示す、本発明1005または1006の方法。
[本発明1009]
腫瘍細胞を特徴決定するための方法であって、腫瘍細胞において、MTAP遺伝子発現のレベルを測定するか、MTAP遺伝子の存在もしくは欠如を検出するか、または存在するMTAPタンパク質のレベルを測定する工程を含み、参照細胞と比べた、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能が、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることを示す、方法。
[本発明1010]
腫瘍細胞におけるMTAP遺伝子の欠如が検出される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
KRAS変異の存在を決定する工程をさらに含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能、およびKRAS変異の存在が、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることを示す、本発明1009または1010の方法。
[本発明1012]
p53変異の存在を決定する工程をさらに含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能、およびp53変異の存在が、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることを示す、本発明1009または1010の方法。
[本発明1013]
腫瘍試料において、MTAP遺伝子の発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下を測定するための試薬を含み、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を投与するための説明書をさらに含む、キット。
[本発明1014]
試薬が、試料中のMTAP遺伝子の欠如を検出するためのものである、本発明1013のキット。
[本発明1015]
KRAS変異の存在を検出するための試薬をさらに含む、本発明1013または1014のキット。
[本発明1016]
p53変異の存在を検出するための試薬をさらに含む、本発明1013または1014のキット。
[本発明1017]
KRAS変異が、アミノ酸置換G12XまたはG13Xである、本発明1003、1007、および1011のいずれかの方法。
[本発明1018]
KRAS変異が、G12C、G12D、G12R、G12V、またはG13Dである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
p53変異が、Y126_スプライス、K132Q、M133K、R174fs、R175H、R196 * 、C238S、C242Y、G245S、R248W、R248Q、I255T、D259V、S261_スプライス、R267P、R273C、R282W、A159V、またはR280Kである、本発明1004、1008、および1012のいずれかの方法。
[本発明1020]
MAT2A阻害剤が、以下の式の化合物である、本発明1001〜1019のいずれかの方法またはキット：
X-Ar 1 -CR a =CR b -Ar 2
式中、
R a およびR b は、独立して、H、アルキル、ハロ、アルコキシ、シアノであり；
Xは、Ar 1 上の少なくとも1個のハロゲン、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の置換基を表し；
Ar 1 およびAr 2 の各々は、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR 11 R 12 、NR 11 CO(R 13 )、NR 11 COO(R 13 )、NR 11 CONR 12 R n によってさらに置換されていてもよい、アリール、例えば、フェニル、ナフチル、およびヘテロアリール、例えば、ピリジル、ピロリジル、ピペリジル、ピリミジル、インドリル、チエニルであり、ここでR 11 、R 12 、R 13 は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
ただし、Ar 2 は、アリール環内に少なくとも1個の窒素原子またはアリール環上に少なくとも1個の窒素置換基；例えば、Ar 2 上にNR c R d Z置換基を含有しており、ここで、R c は、H、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリールであり、R d は、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、酸素である。
[本発明1021]
MAT2A阻害剤が、以下の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはそのビオチン化誘導体である、本発明1001〜1019のいずれかの方法またはキット：
Figure 0006877429
式中、
R a およびR b は、前記定義の通りであり、
R 1 〜R 10 は、独立して、H、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、アリールアルキルアミノ、ジアルキルオキシアミノ、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR 11 R 12 、NR 11 CO(R 13 )、NR 11 COO(R 13 )、NR 11 CONR 12 R 13 であり、ここで、R 11 、R 12 、R 13 は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
ただし、R 1 〜R s の少なくとも1個は、ハロゲン、例えば、フッ素および/または塩素であり；
R 6 〜R 10 の少なくとも1個は、窒素含有置換基、例えば、NR c R d Z置換基であり、ここで、R c は、H、アルキル、例えば、低級アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリールであり、R d は、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、酸素である。
[本発明1022]
MAT2A阻害剤が、(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(4-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジフェニルアニリン；(E)-1-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-4-メチルピペラジン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルナフタレン-1-アミン；(E)-2-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-1-メチル-1H-イミダゾール；(E)-4-(2,3-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,5-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-2-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-3-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(3,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3,5-ジフルオロスチリル)N,N-ジメチルアニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,3,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,4,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-4-(2-クロロ-6-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジクロロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロフェネチル)-N,N-ジメチルアニリン；および(E)-2-ベンズアミド-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリンからなる群より選択される、本発明1021の方法またはキット。
図1A〜F。機能ゲノミクススクリーニングは、MTAP喪失と合成致死性である遺伝子を同定する。9番染色体、およびp16/INK4A/p14/ARF遺伝子を包含するCDKN2Aゲノム領域に非常に近接しているMTAP遺伝子を含有している9p21.3領域を示す模式図。（B）結腸癌HCT116 MTAP wtおよびMTAP-/-同質遺伝子細胞株対におけるshRNA枯渇スクリーニングを示す模式図。（C）HCT116 MTAP-/-細胞におけるMTAPタンパク質発現の欠如を証明するイムノブロット分析。（D）HCT116 MTAP-/-細胞、対、MTAP wt細胞における遺伝子スコア。遺伝子スコアは、細胞培養周期の終わり、対、細胞への導入の前の、HCT116 MTAP-/-細胞、対、HCT116 MTAP wt細胞における、その遺伝子を標的とする8種のshRNAの各々の存在量のSUM log2変化倍率として計算された。(E)MTAP欠損HCT116細胞においてディファレンシャルに枯渇すると判定された上位10遺伝子。その後の研究において追求された遺伝子は、緑色（MAT2A）、赤色（PRMT5）、およびマゼンタ（RIOK1）で強調されている。（F）スクリーニングにおける、HCT116 MTAP-/-細胞、対、HCT116 wt細胞における、個々のMAT2A shRNA、PRMT5 shRNA、およびRIOK1 shRNAの存在量の変化。個々のshRNAは、緑色（MAT2A）、赤色（PRMT5）、またはマゼンタ（RIOK1）で強調されている。ライブラリー中のshRNAの残りは、灰色の菱形として示されている。 図2A〜F。PRMT5は、遺伝学的除去時に、MTAPヌル細胞において選択的に不可欠であるが、薬理学的ターゲティング時にはそうでない。PRMT5 shRNAおよびp-LVX空ベクター対照（EV）を安定的に発現するHCT116 MTAP-/-細胞およびHCT116 MTAP wt細胞における示されたタンパク質のイムノブロット分析。（B）PRMT5は、インビトロでMTAPヌル細胞において選択的に不可欠である。10日間軟寒天コロニー増殖アッセイにおける、PRMT5 wtまたはR368A変異体によるレスキューの存在下または非存在下での、PRMT5ノックダウン（＋dox）時のHCT116 wt細胞およびHCT116 MTAP-/-細胞、対、ノックダウンなし（doxなし）対照の増殖（％）。クリスタルバイオレットによってコロニーを染色し、次いで、Li-Corを使用して定量化した（平均値±SD、n=3）。（C）PRMT5 shRNAおよびshRNA耐性PRMT5 wt cDNAまたはPRMT5 R368A触媒失活変異体cDNAを安定的に発現するHCT116 MTAP-/-細胞およびHCT116 MTAP wt細胞における示されたタンパク質のイムノブロット分析。（D）PRMT5 shRNAおよびp-LVX空ベクター対照（EV）、またはPRMT5 shRNAおよびshRNA耐性PRMT5 wt cDNAもしくはPRMT5 R368A触媒失活変異体cDNAを安定的に発現するHCT116 MTAP-/-細胞およびHCT116 MTAP wt細胞における対称性ジメチルアルギニンマークのイムノブロット分析。(E)HCT116 MTAP wt細胞、対、HCT116 MTAP-/-細胞における、20μMの最高用量から滴定されたEPZ015666による用量応答分析。細胞が、EPZ015666によって5日間処理され、化合物に対する応答が、処理された細胞、対、未処理対照の増殖倍率として測定される（平均値±SD、n=3）。（F）示された用量のEPZ015666によって5日間処理されたHCT116同質遺伝子対におけるPRMT5依存性ジメチルアルギニンマークのイムノブロット分析。PRMT5 shRNAを発現するHCT116 wt細胞およびHCT116 MTAP-/-細胞が、対照として使用され、PRMT5ノックダウンがドキシサイクリンによって6日間誘導された。Doxは、細胞収集およびイムノブロット分析の前に、PRMT5 shRNA発現を誘導するため、6日間、ドキシサイクリン（200ng/ml）が添加された場合を示す。 図3A〜D。MTAP欠損癌においてMTAが蓄積する。メチオニンのリサイクル経路およびサルベージ経路の模式図。MTAPは、脱カルボキシルS-アデノシルメチオニン（dcSAM）およびプトレシンからのポリアミン生合成の副産物であるメチルチオアデノシン（MTA）を、メチオニンおよびアデニンへ戻し変換するメチオニンサルベージ経路の酵素である。MTAP欠失は、その基質MTAの蓄積をもたらし、MTAは、SAMからの1炭素メチル基（CH3）転移を媒介する酵素であるメチルトランスフェラーゼの活性に対して阻害性である。SAMは、細胞においてMAT2Aによって生成される。S-アデノシルホモシステイン（SAH）は、メチル転移反応の副産物として生成され、ホモシステインの再メチル化を介してリサイクルされ、メチオニンへ戻る。あるいは、ホモシステインは、システインへ変換され、グルタチオンを生成する含硫基移動経路へ向けられる。（B）HCT116同質遺伝子対における非標的（un-targeted）LC-MSを使用した細胞内代謝物レベル分析。ウォーターフォールプロットは、HCT116 wt対照と比較されたHCT116 MTAP-/-細胞における平均変化倍率（FC）のlog2、対、代謝物IDを示す。各代謝物について、HCT116 wt対照と比較されたHCT116 MTAP-/-細胞における平均変化倍率（FC）のlog2、対、log10 p値のボルケーノプロットも示される。MTAおよびdcSAMは赤色で強調されている。（C）HCT116同質遺伝子細胞株における細胞内MTAレベルの定量的測定（平均値±SD、n=3）。（D）様々な腫瘍起源の249の癌細胞株のパネルにおける培地中MTAレベル。 図4A〜E。MTAはインビトロおよびインビボでPRMT5活性を阻害する。（A）N-メチルトランスフェラーゼのパネルのMTA感受性。低分子N-メチルトランスフェラーゼ、DNA N-メチルトランスフェラーゼ、ならびにリジンN-メチルトランスフェラーゼおよびアルギニンN-メチルトランスフェラーゼのパネルを、10μMおよび100μMの濃度のMTAの存在下でインビトロアッセイを使用して試験した。（B）インビトロアッセイにおけるPRMT5複合体活性のMTAによる阻害についての用量応答曲線。（C）PRMT5は、MTAによる阻害に対して、試験された全てのメチルトランスフェラーゼの中で最も感受性である。MTA Ki値のウォーターフォールプロットが示され、PRMT5データ点が赤色で強調されている。（D）MTAP欠失は、細胞におけるPRMT5の基底活性を低下させる。様々な腫瘍起源のMTAP wt癌細胞株およびMTAP欠失癌細胞株のパネルにおける示されたタンパク質のイムノブロット分析。HCT116 wt細胞株およびHCT116 MTAP-/-細胞株を、参照として含めた。H4R3me2sマークのレベルをLi-Corソフトウェアを使用して定量化し、ヒストンH4の全レベルに対してノーマライズし、平均値±SEMを棒グラフで報告した。p値は、両側独立t検定を使用して計算された。(E)5-メチルチオアデノシン遷移状態類似体阻害剤（MTAPi）によるMTAPの薬理学的阻害は、HCT116 wt細胞における対称性ジメチルアルギニンマークの低下をもたらす。250nMまたは500nMのMTAP阻害剤によって3日間処理されたHCT116 MTAP-/-細胞およびHCT116 MTAP wt細胞における示されたタンパク質のイムノブロット分析。 図5A〜J。MAT2Aは、MTAPヌルHCT116細胞において選択的に不可欠である。非ターゲティングshRNA（shNT）、MAT2A shRNA、MAT2A shRNAおよびshRNA耐性MAT2A wt cDNA（+Resc）、またはMAT2A shRNAおよびMTAP cDNA（+MTAP）を安定的に発現するHCT116 MTAP-/-細胞およびHCT116 MTAP wt細胞における示されたタンパク質のイムノブロット分析。Doxは、細胞収集および分析の前に、MAT2A shRNA発現を誘導するため、7日間、ドキシサイクリン（200ng/ml）が添加された場合を示す。（B）インビトロのMAT2Aノックダウンは、HCT116 wt細胞およびHCT116 MTAP-/-細胞において等しいSAM枯渇をもたらす。MAT2Aノックダウンの存在下（+dox）および非存在下（-dox）で、誘導可能shMAT2Aを発現するHCT116同質遺伝子対において、標的（targeted）LC-MS分析を使用して、SAMレベルを測定した。（C）MAT2Aは、インビトロのMTAP欠損HCT116細胞において選択的に不可欠である。4日間および6日間のインビトロ増殖アッセイにおいて測定された、MAT2A wt（+Resc）またはMTAP（+MTAP）によるレスキューの存在下または非存在下での、MAT2Aノックダウン（+dox）時のHCT116 wt細胞およびHCT116 MTAP-/-細胞、対、ノックダウンなし（-dox）対照の増殖（％）（平均値±SD、n=5）。細胞は、増殖アッセイのための播種の前に、4日間、200ng/ml doxによって前処理された。（D）MAT2A shRNAを安定的に発現するHCT116 MTAP wt異種移植片およびHCT116 MTAP-/-異種移植片における示されたタンパク質のイムノブロット分析。Doxは、MAT2A shRNA発現を誘導するため、ドキシサイクリン（2,000mg/kg）がマウス飼料に添加された場合を示す。(E)インビボのMAT2Aノックダウンは、HCT116 wt異種移植片およびHCT116 MTAP-/-異種移植片において等しいSAM枯渇をもたらす。SAMレベルは、MAT2Aノックダウンの存在下（dox）または非存在下（doxなし）での、誘導可能shMAT2Aを発現するHCT116同質遺伝子対から形成された異種移植片において、標的LC-MS分析を使用して測定された。（F）MAT2Aは、インビボでMTAP欠損HCT116細胞において選択的に不可欠である。shMAT2A HCT116同質遺伝子対細胞株の皮下異種移植片におけるMAT2Aのインビボ除去時の腫瘍増殖の速度論。腫瘍が直径200〜300mm3に到達した後、ドキシサイクリン処理が開始された（平均値±SEM、n=5〜6）。（G）MAT2Aノックダウン時のインビボのMTAP欠損HCT116細胞の増殖は、MAT2A wt cDNAによってレスキューされる。shNT、shMAT2A、またはshMAT2Aおよびヘアピン耐性MAT2A cDNAを安定的に発現するHCT116 MTAP-/-細胞株の皮下異種移植片におけるMAT2Aのインビボ除去時の腫瘍増殖の速度論。腫瘍が直径200〜300mm3に到達した後、ドキシサイクリン処理が開始された（平均値±SEM、n=5〜6）。（H）shNT、shMAT2A、またはshMAT2Aおよびヘアピン耐性MAT2A cDNAを安定的に発現するHCT116 MTAP-/-異種移植片における示されたタンパク質のイムノブロット分析。Doxは、MAT2A shRNA発現を誘導するため、ドキシサイクリン（2,000mg/kg）がマウス飼料に添加された場合を示す。（I）MAT2Aは、インビトロでMTAP欠失MCF7細胞において不可欠である。7日間インビトロ増殖アッセイにおいて測定された、MAT2A wtによるレスキューの存在下（+Resc）または非存在下でのMAT2Aノックダウン（+dox）時のMCF7細胞、対、ノックダウンなし（-dox）対照の増殖（％）（平均値±SD、n=5）。（J）非ターゲティングshRNA（shNT）、MAT2A shRNA、MAT2A shRNAおよびshRNA耐性MAT2A wt cDNA（+Resc）を安定的に発現するMCF7細胞における示されたタンパク質のイムノブロット分析。Doxは、細胞収集および分析の前に、MAT2A shRNA発現を誘導するため、7日間、ドキシサイクリン（200ng/ml）が添加された場合を示す。 図6A〜C。MAT2A除去は、MTAPヌル細胞においてPRMT5活性を選択的に阻害する。PRMT活性は、MAT2Aの遺伝学的除去時に低下する。示されたタンパク質のイムノブロット分析を、非ターゲティングshRNA（shNT）、MAT2A shRNA、MAT2A shRNAおよびshRNA耐性MAT2A wt cDNA（+Resc）、またはMAT2A shRNAおよびMTAP cDNA（+MTAP）を安定的に発現するHCT116同質遺伝子細胞株において実施した。Doxは、細胞収集および分析の前に、MAT2A shRNA発現を誘導するため、7日間、ドキシサイクリン（200ng/ml）が添加された場合を示す。（B）PRMT5は、SAMに対する最低の親和性を示す。MTAによる阻害に対する感受性について分析された全てのメチルトランスフェラーゼについて、SAM Km値（□M）がプロットされた。（C）MTAP欠失、SAM枯渇の環境における低下したPRMT5機能をもたらす、MAT2A除去時のMTA蓄積およびSAMの低下したレベルによる、MTAP欠損によって誘導される代謝的脆弱性の、PRMT5への収束を示す模式図。 図7A〜D。複数のPRMT5共複合体がMTAPヌル細胞において脆弱である。RIOK1 shRNA、RIOK1 shRNAおよび空ベクター対照（EV）、RIOK1 shRNAおよびshRNA耐性RIOK1 wt cDNA（wt RIOK1）またはRIOK1 K208R/D324N触媒失活変異体cDNAを安定的に発現するHCT116 MTAP-/-細胞およびHCT116 MTAP wt細胞における示されたタンパク質のイムノブロット分析。Doxは、細胞収集および分析の前に、PRMT5 shRNA発現を誘導するため、6日間、ドキシサイクリン（200ng/ml）が添加された場合を示す。（B）RIOK1は、インビトロでMTAPヌル細胞において選択的に不可欠である。10日間軟寒天コロニー増殖アッセイにおける、RIOK1 wtまたはRIOK1 K208R/D324N変異体（RIOK1mut）によるレスキューの存在下または非存在下での、RIOK1ノックダウン（dox）時のHCT116 wt細胞およびHCT116 MTAP-/-細胞、対、ノックダウンなし（doxなし）対照の増殖（％）。コロニーはクリスタルバイオレットによって染色され、次いで、Li-Corを使用して定量化された（平均値±SD、n=3）。（C）付加的なPRMT5結合パートナーが、MTAPヌル細胞において選択的に不可欠である。siRNAプールによる2回のトランスフェクションの後、4日間増殖アッセイにおいて測定された、NT対照に対してノーマライズされた、非ターゲティングsiRNA（NT）、またはPRMT5、RIOK1、pICln、MEP50、COPR5、もしくSMRACA4を標的とするsiRNAによるトランスフェクション時のHCT116 wt細胞およびHCT116 MTAP-/-細胞の増殖（％）（平均値±SD、n=5）。（D）siRNAプールを使用したPRMT5およびPRMT5結合パートナーのノックダウンのqPCR確認。ノックダウン効率は、非ターゲティング（NT）siRNAプールによってトランスフェクトされた細胞において検出されたmRNAのレベルと比べて計算された。 図8A〜B。（A）MAT2A阻害剤AGI-512によって処理されたMTAPヌルHCT116細胞およびMTAP野生型HCT116細胞の増殖阻害（％）。（B）MAT2A阻害剤AGI-673によって処理されたMTAPヌルHCT116細胞およびMTAP野生型HCT116細胞の増殖阻害（％）。 HCT116 MTAP-/-細胞およびMTAPwt細胞におけるPRMT5タンパク質、MTAPタンパク質、およびβアクチンタンパク質、ならびにSDMAマークのイムノブロット分析。 インビボ同所MCF7モデルにおけるMat2aノックダウンの効果。 図11A〜D。PRMT5はMTAPヌル癌における選択的脆弱性である。 MAT2A枯渇は、MTAPヌル細胞においてPRMT5メチルマークを低下させる。
詳細な説明
染色体9p21（Chr9p21）は、多数の異なる腫瘍型を含む全てのヒト癌のおよそ15％においてホモ接合性に欠失しており（Berhoukim Meyerson nature 2010）、その頻度は、多形膠芽腫において観察された＞50％の欠失頻度にまで及ぶ（Parsons and Kinsler,Science 2008）。9p21遺伝子座は、p14-ARFおよびp16-INK4aの両方をコードするCDKN2a遺伝子を含む（図1A）。両タンパク質は、腫瘍抑制性の役割を有し、p14-ARFは、p53を安定化することが公知であり（Kamijo & Sherr Cell 1997 and Zhang & Yarbough Cell 1998）、p16-INK4aは、CDK4/6細胞周期キナーゼの負の制御を介した必須の細胞周期制御因子あり強力な腫瘍抑制因子であることが証明されている（Serrano & Beach Nature 1993）。Chr9p21欠失は、30年以上前に最初に発見されたが（Chilcote NEJM 1985）、CDKN2A喪失についての分子標的療法は困難であることが判明しており、Chr9p21の欠失を有する腫瘍を標的とするための別のアプローチを同定することが必要であり得る。
注目すべきことに、Chr9p21欠失は、CDKN2Aの近位の遺伝子の同時欠失を高頻度に含む（図1A）。これらの同時欠失遺伝子のうち主要なものは、CDKN2aに隣接しているChr9p21に存在するMTAPである（図1A）。MTAP遺伝子は、CDKN2Aの100kb以内にあり、CDKN2A欠失を有する腫瘍の80〜90％に、MTAPのホモ接合型欠失が見出される（Illie & Ladanyi Clin Canc Res 1993およびZhang & Savarese Canc Genet Cytogenet 1996）。MTAPは、メチオニンサルベージ経路における必須の酵素であるメチルチオアデノシンホスホリラーゼをコードする。MTAPは、ポリアミン合成の副産物であるメチルチオアデノシンを代謝して、最終的に、MTAからメチオニンおよびアデニンを再構成させる（Zappia & Cartena-Farrina Adv Exp Med Biol 1988）。従って、MTAPは、各々、癌細胞の増殖的代謝において重要な代謝経路である、メチオニン代謝、ポリアミン生合成、およびヌクレオチド代謝の交差点に存在する。実際、MTAP欠失は、プリン生合成の阻害剤に対する感受性を作出することが報告されているが（Li and Bertino Oncol Res 2004）、この代謝的脆弱性は、腫瘍が循環アデニンを取り込み、プリン生合成感受性を回避するにつれ、インビボで失われる（Rueffli-Brasse and Wickramasinghe JCI 2011）。本発明者らは、MTAP欠失が、Chr9p21欠失を有する癌において標的とすることが可能な他の付随的な脆弱性を作出するか否かを尋ねようと努めた。
癌においてMTAP喪失時に発生する脆弱性についてスクリーニングするため、MTAP状態のみが変動する同質遺伝子癌細胞株対において、shRNA枯渇スクリーニングを使用した。MTAPは代謝酵素をコードするが、本発明者らは、MTAP喪失が、代謝を越えて広がる生物学的経路において付随的な脆弱性を作出する可能性があると仮定した。代謝経路と非代謝経路との間のそのようなクロストークの先例には、機能獲得型変異体IDH1/2タンパク質によって産生される代謝物2-ヒドロキシグルタル酸が、αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素ファミリーのメンバーを阻害することができるという観察が含まれる（Xu & Xiong Cancer Cell 2011、Rohle & Mellinghoff Science 2013）。酵素の基質が高レベルに蓄積する、コハク酸デヒドロゲナーゼ（SDH）またはフマル酸ヒドラターゼ（FH）に変異を有する腫瘍にも、類似した機序が関連付けられている（Selak and Gottlieb,Cancer Cell 2005およびIssacs and Neckers,Cancer Cell 2005）。従って、癌メタボロームの異常は、非代謝経路に影響を与えることができる。MTAP欠失が代謝経路および非代謝経路において付随的な脆弱性を作出するという仮説を試験するため、メタボロームの3000+の遺伝子および付加的な3000+の非代謝遺伝子を標的とするshRNAヘアピンからなるshRNAライブラリーを使用した。
このスクリーニングおよびその後の調査を通して、癌においてMTAP喪失時に脆弱になるシグナリング軸が同定された。このシグナリング軸の中心にあるのは、アルギニンメチルトランスフェラーゼ、PRMT5である。メタボロミックアプローチおよび生化学的アプローチを使用して、MTAP酵素反応の基質であるMTAが、MTAPヌル癌において蓄積することが発見された。MTAは、PRMT5酵素活性を阻害し、MTAPヌル癌において低下した基底PRMT5メチル化をもたらす。この脆弱性は、PRMT5の上流にも下流にも広がる。本発明者らは、PRMT5基質S-アデノシルメチオニン（SAM）を産生する代謝酵素メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ2A（MAT2A）も、MTAPヌル癌において選択的に不可欠であり、キナーゼRIOK1を含む複数の異なるPRMT5結合パートナーも同様であることを示す。
HCT116 MTAP wt/MTAP-/-同質遺伝子対におけるshRNA枯渇スクリーニング
その喪失がMTAP欠損細胞の選択的な死滅をもたらす遺伝子を同定するため、HCT116結腸癌細胞株およびMTAP遺伝子のエクソン6が欠失するよう遺伝学的に修飾されたHCT116細胞の同質遺伝子クローンにおいて、shRNAに基づく枯渇スクリーニングを実施した（図1B）。この欠失は、MTAPタンパク質発現の完全な喪失をもたらした（図1C）。可能性のある合成致死相互作用を広くカバーするため、本発明者らは、完全メタボローム（3,067遺伝子）、ミトコンドリアプロテオーム（Pagliarini and Mootha Cell 2008）、エピゲノム（Arrowsmith and Shapira Nature Reviews Drug Discovery 2012）、カイノーム（http://www.uniprot.org/）、および多様な生物学的経路を表す＞1500の付加的な遺伝子を包含しているライブラリーを構築した。HCT116 MTAP-/-細胞およびHCT116 wt細胞を、各遺伝子について8種のshRNAを含有しているshRNAライブラリーによって形質導入し、ノックダウン細胞のプールを、12回の細胞分裂の間、継代した。培養の終わりに、ディープシーケンシングを介して各shRNAバーコードの相対存在量を測定し、形質導入されていないライブラリーDNAと比較した各shRNAの枯渇倍率を計算した。次いで、本発明者らは、HCT116 MTAP-/-細胞、対、HCT116 wt細胞における遺伝子を標的とする8種のshRNAの各々の存在量のlog2変化倍率の違いに基づき、各遺伝子についてMTAP選択性スコアを計算した（図1D）。
この分析は、大多数の遺伝子およびshRNA対照が、HCT116MTAP-/-細胞およびHCT116 MTAP wt細胞の両方において類似したスコアを有するが（図1D）、遺伝子のサブセットは、MTAP欠損細胞において選択的に枯渇することを証明した（図1D〜E）。スクリーニングにおける最上位ヒットは、代謝酵素メチオニンアデノシルトランスフェラーゼIIαをコードするMAT2Aであった（図1D〜F）。MAT2Aは、メチル基のユニバーサルな生物学的ドナーであるS-アデノシルメチオニン（SAM）の、メチオニンのアデノシル化を介した合成を触媒する。スクリーニングにおいて2番目に高スコアの遺伝子は、偏性結合パートナーWD45/MEP50（WDリピートドメイン45/メチロソーム（methylosome）タンパク質50）およびその他の足場タンパク質と複合体化したPRMT5を含む多タンパク質メチルトランスフェラーゼ複合体の触媒サブユニットであるタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ5（PRMT5）であった（Meister et al.,2001；Pesiridis et al.,2009）（図1D〜F）。PRMT5は、アルギニンメチルトランスフェラーゼのII型PRMTサブファミリーに属し、標的タンパク質における対称性ジメチルアルギニンの形成を触媒する。興味深いことに、6番目に高スコアの遺伝子RIOK1は、PRMT5基質のサブセットの選択的メチル化をPRMT5に指図する、PRMT5の結合パートナーであるRioドメイン含有タンパク質をコードする（Guderian et al 2011）。これらのデータは、MAT2AおよびPRMT5によって触媒される反応が、MTAP欠損細胞の生存可能性の維持のために必須であることを示唆する。3個の強調されたヒットは、全て、治療的かつ生物学的に興味深い標的を表すが、本発明者らがPRMT5に最初に注目したのは、ヒト癌の処置のためにこの酵素を標的とする努力が現在進行中であるためである（Chan Penebre Nature Chem Bio 2015）。
PRMT5は、遺伝学的除去時にMTAPヌル細胞において選択的に不可欠であるが、薬理学的ターゲティング時にはそうでない
細胞におけるMTAP欠損とPRMT5機能との関係をさらに調査するため、本発明者らは、PRMT5を標的とする誘導可能shRNAを安定的に発現するHCT116 MTAP-/-細胞株およびHCT116 wt細胞株を生成した。本発明者らは、PRMT5タンパク質のレベルを測定することによって、PRMT5が効率的にノックダウンされることを確認した。ゲノムスクリーニングの結果と一致して、ドキシサイクリン誘導可能shRNAによるPRMT5ノックダウンは、MTAP欠失を有する細胞においてMTAP WT細胞より完全な増殖低下をもたらした（図2B）。MTAPヌル細胞におけるshPRMT5耐性PRMT5 cDNAの発現は、内在性PRMT5ノックダウン時の増殖阻害をレスキューしたが、触媒失活R368A PRMT5変異体（Pollack et al.,1999）cDNAの発現はそうでなかった（図2B〜C）。従って、本発明者らのshRNAの抗増殖効果は、PRMT5枯渇によるものであり、オフターゲットshRNA効果によるのではない。R386A変異体PRMT5によるレスキューの欠如は、PRMT5酵素活性がMTAP-/-細胞において不可欠であることを示す。興味深いことに、MTAP-/-細胞およびWT細胞におけるPRMT5タンパク質レベルの等しい低下は、MTAP-/-細胞株において対称性ジメチルアルギニンマークのレベルのより大きな低下をもたらし、PRMT5によってレスキューされたが、R368A変異体cDNAによってはレスキューされなかった（図2D）。これらの所見は、本発明者らのスクリーニング結果のバリデーションを提供し、PRMT5の触媒機能がMTAP欠損細胞の増殖の維持のために必須であることをさらに示唆する。
次に、本発明者らは、薬理学的ツールを使用して、MTAP欠損細胞におけるPRMT5の機能を調べることを望んだ。PRMT5の強力かつ選択的な阻害剤であるEPZ015666が、最近開発された（Chan-Penebre et al.,2015）。本発明者らは、EPZ015666化合物を利用し、HCT116同質遺伝子対において用量応答分析を実施した（図2E）。しかしながら、PRMT5の遺伝学的ターゲティングとは異なり、PRMT5の薬理学的ターゲティング時の増殖阻害は、MTAP欠損遺伝的背景に選択的ではなかった（図2E）。PRMT5の触媒失活変異体が、HCT116 MTAP-/-細胞において増殖表現型をレスキューせず、従って、これらの細胞の増殖を選択的に阻害するために必要であったのはPRMT5の触媒機能の喪失であることが示唆されたことを考慮すると、この所見は予想外であった（図2A）。興味深いことに、PRMT5機能の遺伝学的除去とは異なり、全細胞溶解物におけるPRMT5依存性ジメチルアルギニンマークの低下したレベルによって証拠づけられたように、MTAP-/- HCT116細胞およびwt HCT116細胞の両方において、等しい程度のPRMT5活性阻害が、EPZ015666によって達成された（図2F）。MTAP欠損細胞の増殖に対する遺伝学的および薬理学的なPRMT5除去の影響のこの驚くべき不一致のため、本発明者らは、PRMT5およびMTAPの背後にある基本的な生物学および代謝をさらに調べることにした。
MTAP欠損は改変された代謝状態を作出する
HCT116同質遺伝子対の増殖に対する、PRMT5の遺伝学的ターゲティング、対、薬理学的ターゲティングの影響の違いを説明するため、本発明者らは、MTAPおよびPRMT5の合成致死の機構的な理解をさらに構築することを望んだ。MTAPは、ポリアミン生合成の副産物であるメチルホスホリラーゼアデノシン（MTA）をメチオニンおよびアデニンへ戻し変換するメチオニンサルベージ経路の酵素である（図3A）。MTAPは、MTAの分解を触媒することが公知の哺乳動物細胞における唯一の酵素であるため、本発明者らは、MTAP欠損はMTAの蓄積をもたらすであろうと仮定した。本発明者らは、最初に、HCT116 MTAP同質遺伝子対における細胞内代謝物レベルのより広い非標的LC-MSに基づくメタボロミクス査定の情況において、この仮説を試験した（図3B）。この分析は、検出された237の注釈付き代謝物のうち、MTAが、HCT116 wt対照と比較されたHCT116 MTAP-/-細胞における最大の増加を示すことを明らかにした。興味深いことに、ポリアミン生合成経路におけるMTAの上流の代謝物である脱カルボキシルS-アデノシルメチオニン（dcSAM）が、2番目に大きい増加を示した。HCT116 MTAP-/-細胞におけるこれらの2種の代謝物の濃縮は、統計的に高度に有意であった（図3B）。MTAの上昇は、HCT116同質遺伝子対におけるMTAレベルの定量的測定を使用して、さらに確認された（図3C）。さらに、異なる腫瘍起源の249の細胞株を含む大きい癌細胞株パネルのスクリーニングは、内在性MTAP欠失を有する細胞の培地における極めて一貫したMTAの蓄積を証明した（図3D）。
MTAはインビトロおよびインビボでPRMT5活性を阻害する
MTAは、タンパク質メチルトランスフェラーゼの活性を阻害することが報告されている（Enouf et al.,1979）。この概念を直接試験するため、本発明者らは、10μMおよび100μMのMTAによる処理の後に33種の異なるN-メチルトランスフェラーゼの酵素活性を査定するインビトロ生化学的スクリーニングを実施した（図4A）。MTAによる阻害は、パネルの小さいサブセットにおいてのみ観察され、最も強力な阻害はアルギニンメチルトランスフェラーゼファミリーのメンバーであるPRMT5およびPRMT4について観察された（図4A）。さらに、PRMT5は、広範囲のMTA濃度を試験するその後の実験において、MTAに対する強力な感受性を示した（図4B）。次に、本発明者らは、PRMT5、PRMT4、およびメチルトランスフェラーゼの多様なサブセットについて、MTA Kiを分析した（図4C）。
際だったことに、PRMT5についてのMTA Ki（0.46μM）は、他のメチルトランスフェラーゼより＞20倍低く、このことから、PRMT5が、試験された他のメチルトランスフェラーゼより、MTAによる阻害に対してはるかに感受性であることが示された。この生化学的観察は、PRMT5が、ライブラリー中に表された全てのメチルトランスフェラーゼの中で最も強力なヒットであり、HCT116 MTAP-/-細胞において選択的に枯渇したことを証明するshRNAスクリーニングデータと一致している（図1D）。
本発明者らは、次に、細胞におけるPRMT5活性に対するMTA蓄積の影響に取り組んだ。MTAP欠損細胞における細胞内MTAレベルのLC-MS分析（およそ100μM）および生化学的アッセイにおいて測定されたMTAについてのPRMT5 IC50（3μM）によると、MTAP欠損細胞におけるMTA蓄積は、PRMT5活性の阻害をもたらすのに十分であろうと、本発明者らは仮定した。HCT116同質遺伝子対の全細胞溶解物におけるPRMT5依存性メチルマークの分析において、本発明者らは、HCT116 MTAP-/-細胞が、より低い基底メチル化レベルを有するようであることに注目した（図2D）。この所見をさらに実証するため、本発明者らは、MTAP wt細胞株およびMTAP欠失細胞株のサブセットの全細胞溶解物においてPRMT5依存性メチルマークのウエスタンブロット分析を実施した（図4D）。本発明者らは、MTAP欠失細胞株が、対称性ジメチルアルギニンマークのより低いレベルを一貫して示すことを観察した（図4D）。最後に、本発明者らは、MTAPの強力な細胞透過性遷移状態類似体阻害剤の利用可能性を活用した（Basu et al.,2011；Longshaw et al.,2010）。本発明者らは、3日間、MTAP阻害剤によってHCT116 wt細胞を処理し、ジメチルアルギニンマークのレベルに対するMTAPの薬理学的阻害の影響を測定した（図4E）。MTAレベルを、HCT116 MTAP-/-細胞において観察されるものへ増加させるのに十分な用量のMTAP阻害剤による処理（図S4）は、MTAPの遺伝学的除去時に観察されるものと同様に、ジメチルアルギニンメチルマークのレベルの低下をもたらした（図4E）。これらのデータは、PRMT5活性が、MTAPヌル細胞においてMTAによって損なわれ、タンパク質基質の低下したメチル化をもたらし、shRNAによるPRMT5活性の付加的な低下に対する脆弱性を作出することを強く示す。さらに、MTAがPRMT5を阻害するという本発明者らの所見は、PRMT5阻害剤EPZ015666によるMTAP選択的な増殖阻害の欠如についての説明を提供する。この阻害剤は、MTA-PRMT5複合体では可能でないカチオン-π分子相互作用を介して、SAM-PRMT5複合体に選択的に結合する（Chan-Penebre et al.,2015）。MTAは、SAMのPRMT5との結合を防止し、EPZ015666は、SAMが結合したPRMT5とのみ相互作用するため、MTA結合はEPZ015666結合と相互に排他的である。単一酵素の2種の阻害剤は、それらが別々の結合部位に結合し、標的との相互作用が相互に排他的でない場合にのみ相乗的であり得る（Breitinger）。
MAT2AはMTAP欠損細胞において選択的に不可欠である
本発明者らは、次に、shRNAスクリーニングにおける最上位ヒットであるMAT2Aも、MTAP欠損細胞における真の合成致死標的を表すか否かを試験することを望んだ。従って、本発明者らは、HCT116同質遺伝子対を利用し、非ターゲティングshRNA、MAT2Aを標的とするshRNAを安定的に発現する細胞株、およびshRNA耐性MAT2A cDNAによって付加的に再構成された細胞株、またはMTAP cDNAを発現する細胞株を作出した。本発明者らは、ウエスタンブロットによって、HCT116細胞における効率的なMAT2AノックダウンならびにMAT2AおよびMTAPの再発現を確認した（図5A）。本発明者らは、LC-MS分析を使用して、MAT2Aノックダウンが、両方のHCT116遺伝子型において、SAMの低下した細胞レベルをもたらすことも確認した（図5B）。本発明者らは、MTAP再発現が、HCT116 MTAP-/-細胞の培地中に存在する高いMTAレベルを枯渇させることをさらに確認した。次いで、本発明者らは、4日間および6日間のインビトロ増殖アッセイにおいて、HCT116 wt細胞、対、HCT116 MTAP-/-細胞におけるMAT2Aノックダウンの影響を試験した（図5C）。結果は、ゲノムスクリーニングと一致していた。MAT2Aノックダウンは、HCT116 MTAP-/-細胞の増殖を選択的に減弱させ、HCT116 wt細胞は減弱させなかった（図5C）。重要なことに、この増殖欠陥は、shRNA耐性MAT2A cDNA構築物の導入によってレスキューされ（shRNAのオンターゲット効果を示す）、MTAP再発現によっても部分的にレスキューされた（図5C）。
本発明者らの所見のインビトロからインビボへの翻訳を調査するため、本発明者らは、誘導可能MAT2A shRNAを発現するHCT116同質遺伝子細胞株による異種移植片効力研究を実施した。これらの研究においては、確立された腫瘍の増殖におけるMAT2Aの役割を査定するため、ドキシサイクリンによる動物の処置の前に、腫瘍を形成させた。インビボのMAT2Aノックダウンの効率は、ウエスタンブロットによって確認された（図5D）。本発明者らは、インビボのMAT2A遺伝学的除去が、両方の遺伝子型のHCT116異種移植片において、SAMレベルの類似した低下をもたらすことをさらに確認した（図5E）。インビトロの所見と一致して、shRNAによるMAT2A枯渇時に、MTAP選択的な増殖阻害がインビボで観察された（図5F）。インビボのこの選択的な増殖阻害がオンターゲット効果であることを証明するため、本発明者らは、shMAT2Aの野生型MAT2Aレスキューアームによる拡張的なインビボ研究を実施した（図5Gおよび5H）。この実験は、最初のインビボ研究において観察された効力を確認し（図5Gおよび5H）、インビトロ研究の場合と同様に、MAT2A shRNAに対して耐性であるMAT2A cDNAを発現する異種移植片において、増殖阻害がレスキューされた（図5Gおよび5H）。
最後に、本発明者らは、MTAP遺伝子座に内在性の欠失を保有するモデルにおいて、本発明者らの所見を確認することを望んだ。従って、本発明者らは、非ターゲティングshRNA、MAT2Aを標的とするshRNAを安定的に発現する乳癌MCF7細胞株、およびshRNA耐性MAT2A cDNAによって付加的に再構成された細胞株を生成した。本発明者らは、ウエスタンブロットによって、MAT2Aのノックダウンおよび再発現の効率を証明した（図5J）。HCT116モデル系においてなされた観察と一致して、MAT2Aノックダウンは、7日間増殖アッセイにおいてMTAP欠失MCF7細胞の増殖を減弱させ（図5I）、MAT2A cDNA再構築は、増殖表現型の完全なレスキューをもたらした。従って、MAT2Aは、本発明者らのモデルにおいて、MTAP欠損との一貫した合成致死性を示す。
MAT2A喪失はMTAPヌル細胞において選択的にPRMT5活性を阻害する
PRMT5およびMAT2Aの両方が、MTAPの真の合成致死パートナーであることが確認されたため、本発明者らは、スクリーニングにおけるこれらの2個の上位ヒットの間に機構的関係が存在するか否かを査定することを望んだ。実際、MAT2Aは、全ての細胞メチルトランスフェラーゼの活性のために必要であるSAMを生成し、MAT2Aの遺伝学的除去時のSAMレベルの低下は、PRMT5のものを含むそれらの機能に広く影響すると予想されるであろう。従って、本発明者らは、MAT2Aのノックダウン時の、MAT2A shRNA HCT116同質遺伝子対ならびにMAT2A再構成細胞株およびMTAP再発現細胞株における、ヒストンH4上のPRMT5依存性対称性ジメチルアルギニンマークのレベルを測定した（図6A）。興味深いことに、両方の遺伝子型のHCT116細胞におけるSAMレベルの低下の等しい程度にも関わらず（図5B）、H4R3me2sマークは、MTAP欠損細胞において選択的に低下し、MTAP wt細胞においては低下せず、MAT2A cDNAおよびMTAP cDNAの存在下でレスキューされることが観察された（図6A）。PRMT5活性に対するMTAの強力な阻害的影響に関する観察と組み合わせると、これらのデータは、MTAPヌル背景におけるPRMT5機能が、SAMの適度な利用可能性に高度に依存していることを示唆する。PRMT5は、SAMに対して低い親和性を示すことが文献において報告されている（Antonysamy et al.,2012；Sun et al.,2011）。従って、本発明者らは、インビトロ生化学的パネル分析からのN-メチルトランスフェラーゼについてのSAM Km値を比較し、実際、PRMT5がSAMに対して最低の親和性を示すことを観察した（図6B）。この所見は、特に、MTAP欠損細胞の代謝的に改変された高MTA環境における、適切なMAT2A機能に対するPRMT5の依存性を説明し得る（図6C）。従って、MTAP欠損による代謝的脆弱性は、PRMT5の上流に広がり、PRMT5基質SAMの利用可能性に対する依存性、従って、SAM生成酵素MAT2Aの活性に対する依存性を作出する。
複数のPRMT5共複合体がMTAPヌル細胞において脆弱である
Rioドメイン含有タンパク質RIOK1は、shRNA枯渇スクリーニングキャンペーンにおけるもう一つの強力なヒットであった。それはPRMT5の結合パートナーであるため、本発明者らは、HCT116 MTAP同質遺伝子細胞においてRIOK1の遺伝学的除去時の合成致死表現型を確認しようと努めた。PRMT5およびMAT2Aについて実施された特徴決定と同様に、誘導可能RIOK1 shRNA細胞株を作出し、RIOK1 wtレスキュー細胞株、およびRIOK1活性部位（D324N）・ATP結合ドメイン（K208R）触媒不活性変異体（Angermayr et al.,2002；Widmann et al.,2012）細胞株も作出した。RIOK1のノックダウンおよび再発現の効率を、ウエスタンブロットによって評価した（図7A）。ゲノムスクリーニングにおける所見を確認して、RIOK1ノックダウンは、HCT116 MTAP-/-細胞の増殖の選択的な阻害をもたらし、HCT116 wt細胞の増殖に対しては最小の影響を有していた（図7B）。増殖表現型は、shRNA耐性wt RIOK1の発現によってレスキューされ、触媒不活性K208R,D324N変異体RIOK1によってはレスキューされなかった（図7B）。これらのデータは、MTAP欠損背景におけるMTAの蓄積を介して作出された代謝的脆弱性が、PRMT5の結合パートナーRIOK1に対する影響を介して、PRMT5の下流にさらに広がることを示唆する。
PRMT5は、偏性結合パートナーWD45/MEP50（Wilczek et al.,2011）、相互に排他的なパートナーpIClnおよびRIOK1（Guderian et al.,2011）、特異性の核内制御因子COPR5（PRMT5の協同作用因子）（Lacroix et al.,2008）等を含む、いくつかの多量体タンパク質共複合体に関与する。MEP50もpIClnもPRMT5の他の結合パートナーも、本発明者らのshRNAライブラリーに表されていなかった。従って、MTAP欠損細胞の脆弱性がRIOK1共複合体以外のPRMT5共複合体にさらに広がる可能性を評価するため、本発明者らは、HCT116同質遺伝子対において、PRMT5自体、RIOK1、MEP50、pICln、およびCOPR5を含む複数のPRMT5共複合体メンバーの、siRNAプールによって媒介されるノックダウンを実施した（図7Cおよび7D）。PRMT5共複合体の各メンバーのノックダウン時に、MTAP欠損細胞の増殖の選択的な阻害が観察された（図7C）。重要なことに、別のPRMT5結合タンパク質である、SMARCA4遺伝子によってコードされたATP依存性ヘリカーゼBrg1（Pal et al.,2004）のノックダウンは、MTAP状態に関わらず、HCT116細胞の増殖を阻害した（図7C）。これらのデータは、PRMT5から下流のMTAP欠損細胞の脆弱性が、RIOK1共複合体に制限されず、結合パートナーとしてPRMT5を含むいくつかの共複合体に広く影響することを示唆する。MTAPヌル細胞におけるMTA蓄積は、PRMT5活性を低下させ、PRMT5のターゲティングに対する付随的な脆弱性を作出する。この脆弱性は、PRMT5の上流および下流に存在する代謝経路、エピジェネティック経路、およびシグナリング経路のメンバーに広がる。
哺乳動物メタボロームは、高度の柔軟性および重複性を特徴とする（Thielle & Pallson Nat Biotech 2013およびFolger and Shlomi Molec Sys Bio 2011）。従って、MTAは、孤立性の非重複性の酵素であるMTAPによって消費されるという点でまれである。本発明者らは、MTAP欠失時に、MTAがおよそ100uMの細胞内濃度にまで蓄積し、細胞が過剰のMTAを排出し始めることを観察した。MTAのこの蓄積は、アルギニンメチルトランスフェラーゼPRMT5における予想外の付随的脆弱性をもたらした。shRNAライブラリーは、39種のメチルトランスフェラーゼを含有していたが、PRMT5は、高度のMTAP選択性に関して独特であった。メチルトランスフェラーゼの生化学的プロファイリングは、この現象についての分子的基礎を明らかにした。本発明者らがインビトロで試験した32種のメチルトランスフェラーゼの中で、PRMT5は、MTAによる阻害に対して最も感受性の酵素であった。MTAによるPRMT5のインビトロ阻害は、MTAPヌル細胞において観察されたものに極めて類似した濃度で起こり、そのことから、これが生物学的に関連した現象であることが示唆される。これと一致して、本発明者らは、MTAP欠失を有する細胞において、PRMT5メチルマークの実質的に低下した基底レベルを観察した。
低下した基底PRMT5活性は、shRNAによるPRMT5のさらなる除去に対する脆弱性を作出する。興味深いことに、PRMT5阻害剤EPZ-015666による処置は、MTAPヌル細胞において選択的な増殖阻害をもたらさなかった。EPZ-015666は、PRMT5の阻害の極めて特殊なモードを有する。この阻害剤は、SAMと非競合的であり、SAM上の部分正電荷を有するメチル基とのまれなカチオン-π相互作用を介して、酵素と結合したSAMとの重要な結合相互作用を形成する（Chan-penebre Nat Chem Bio 2015）。MTAは、EPZ-015666（CITE Chan-penebre）とのこの相乗的な結合相互作用を形成することができない。従って、この既存のPRMT5阻害剤は、MTAPヌル癌において優先的な活性を示さない。MTAPヌル癌におけるPRMT5脆弱性の活用は、PRMT5のMTA結合型に結合し、その状態に酵素をトラップするMTA選択的なPRMT5阻害剤の開発を必要とし得る。正常組織におけるMTAP発現は、低いMTAレベルを維持することによって防御効果を提供するはずであるため、MTA選択的阻害剤は、非選択的阻害剤より大きい治療ウィンドウを与える可能性がある。マウス遺伝学研究は、PRMT5が、正常な生理学において重要な役割を有することを明らかにした；PRMT5ノックアウトは、胎性致死をもたらし（Tee 2010）、CNS（Bezzi 2013）、骨格筋（Zhang 2015）、および造血系統（Liu 2015）における組織特異的なPRMT5ノックアウト時に、実質的な傷害性が発生する。これらの傷害性は、臨床的情況において用量を制限し、PRMT5を非選択的に標的とする薬剤の治療的可能性を狭くする可能性がある。
細胞メチルトランスフェラーゼ活性は、低分子代謝物による制御的調節を受ける。メチルトランスフェラーゼは、基質SAMおよび生成物SAHの相対バランスによって制御されることが、以前に確立された（Vance Cui Biochim Biophys Acta 1997）。SAM/SAH比は、メチルトランスフェラーゼ反応を実施するための細胞平衡の尺度として、細胞の「メチル化可能性」を計算するために使用される（Williams & Schalinske J Nutrition 2006）。PRMT5がMTAによって阻害され得るという本発明者らの観察は、SAM/MTA比によって制御され得るメチルトランスフェラーゼの生化学的に別個のファミリーの模範メンバーとして、PRMT5を関係付ける。この新規の制御モードは、MTAレベルが劇的に蓄積されるMTAPヌル癌細胞において極めて明白に明らかにされる。正常組織におけるMTAレベルに関しては限定された情報しか存在せず（Stevens & Oefner,J chromatography 2010）、より広いMTAスクリーニングは、MTA蓄積がPRMT5の阻害をもたらす他の情況を明らかにする可能性がある。本発明者らは、PRMT5がSAMに対して相当弱い結合親和性を有することにも注目する。大部分の哺乳動物メチルトランスフェラーゼが、SAMの生理学的濃度より10〜100倍低いSAM Km値を有するため、これは、メチルトランスフェラーゼファミリーの中でまれである（Richon & Copeland Chem Biol Drug Design 2011）。この生化学的所見は、PRMT5が、SAM感受性メチルトランスフェラーゼとして平衡していることを暗示し、この感受性は、MTAPヌル細胞におけるMAT2A枯渇時に観察されるPRMT5メチルマークの低下によって例証される。
PRMT5は、細胞周期遺伝子の発現を調節するヒストンメチル化（Chung & Sif JBC 2013）、EGFRおよびRafのような増殖因子シグナリング成分のメチル化（Hsu & Hung Nat Cell Bio 2011、Andreu-Perez & Recio,Sci Signaling 2011）、ならびにリボソームおよびスプライソソーム複合体の成熟のために必要とされる重要タンパク質成分のメチル化（Ren & Xu,JBC 2010およびFriesen & Dreyfuss Mol Cell Bio 2001）のような多数の増殖および生合成の過程を制御する。従って、PRMT5活性は、ある範囲の増殖促進経路および生合成経路の協調的なアップレギュレーションをもたらす。MTAP欠損癌におけるPRMT5の脆弱性は、PRMT5の上流（MAT2Aまで）ならびにPRMT5の下流（RIOK1および他のPRMT5共複合体メンバーまで）の両方に広がる。集合的に、これらのタンパク質は、栄養素の利用可能性（MAT2A基質メチオニン）に関する情報を感知し、PRMT5の下流に存在する複数の生合成経路へ伝達する、代謝-エピジェネティック-シグナリング軸を構成する。この軸は、MTAP欠損癌の標的療法のための魅力的な機会を提示する。MTA選択的なPRMT5阻害剤を考案する可能性に加えて、本発明者らの研究は、MAT2A、RIOK1、またはその他のPRMT5共複合体メンバーの治療的ターゲティングが、MTAPヌル癌に選択的に影響し、MTAPを発現する正常組織には影響しないことを証明する。従って、この脆弱軸は、MTAP/p16/CDKN2A遺伝子座の欠失を有するヒト癌のおよそ15％に取り組むための治療標的としてのさらなる考慮に値する多数のタンパク質を含む。
AGI-512およびAGI-673による細胞株スクリーニング
AG-512およびAG-673は、生化学的アッセイにおいてそれぞれ83nMおよび143nMのIC50を示すMAT2A酵素活性の低分子阻害剤であり、それぞれ80nMおよび490nMのIC50で細胞におけるSAMの産生を阻害した。これらの化合物を、MTAP状態（ヌルまたは野生型）が決定された様々な組織起源を有するいくつかの癌細胞株に対する増殖阻害についてスクリーニングした。結果は表1に提示される。
（表１）
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表1に示されたデータは、細胞培養物中またはインビボのいずれかで増殖した、MTAPヌルである腫瘍細胞が、MAT2A阻害剤による阻害に対して予想外の感受性を示すことを証明する。データは、MTAP状態が、MAT2A阻害剤に対する腫瘍の感受性のレベルを決定することを示す。腫瘍細胞によって発現されたMTAPの状態を決定することによって、MAT2A阻害剤に対する腫瘍の感受性のレベルが査定され得ることが証明される。例えば、MTAP遺伝子が存在しない（即ち、MTAPヌルである）か、または発現がダウンレギュレートされているか、またはMTAPタンパク質機能が損なわれている腫瘍細胞は、正常なMTAP遺伝子発現およびMTAPタンパク質機能を有する腫瘍細胞より高いMAT2A阻害剤に対する感受性と相関する。従って、これらの観察は、腫瘍増殖に対するMAT2A阻害剤の効果を予測するための有益な新しい診断方法の基礎を形成し、患者のための最も適切な処置の選択を支援する付加的なツールを、腫瘍学者に与えることができる。
従って、本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象における癌を処置する方法を提供し、本法において、腫瘍は、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下した機能もしくは非機能を特徴とする。一態様において、癌は、MTAPの欠如を特徴とする、即ち、MTAPヌルである。もう一つの態様において、癌は、例えば、癌におけるMTAのレベルがPRMT5メチル化活性を阻害するのに十分である程度に、MTAP遺伝子の低下した発現を特徴とする。もう一つの態様において、癌は、例えば、癌におけるMTAのレベルが正常なPRMT5メチル化活性を阻害する程度にまで上昇している程度に、MTAPタンパク質の低下した機能または非機能を特徴とする。PRMT5阻害剤には、非限定的に、WO/2014/145214、WO/2014/100716、WO/2014/100730、WO/2014/100695、WO/2014/100734、およびWO/2011/079236に記載されたものが含まれる。
具体的な態様において、本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象におけるMTAPヌル癌を処置する方法を提供する。一態様において、前記方法は、例えば、患者から採取された癌の試料から、癌におけるMTAP遺伝子の欠如を検出する工程をさらに含む。
哺乳動物における「癌」とは、無調節の増殖、不死、転移能、急速な増殖および増殖の速度、ならびにある種の特徴的な形態学的特性のような、癌に典型的な特徴を保有している細胞の存在をさす。癌および腫瘍という用語は、本明細書において交換可能に使用される。しばしば、癌細胞は、固形腫瘍の形態であるが、そのような細胞は、動物体内に単独で存在する場合もあるし、または白血病細胞のような独立した細胞として血流中に循環している場合もある。
「処置する」という用語は、本明細書において使用されるように、そうでないことが示されない限り、患者における腫瘍、腫瘍転移、またはその他の癌を引き起こす細胞もしくは新生物細胞の増殖の部分的または完全な逆転、緩和、進行の阻害、または防止を意味する。「処置」という用語は、本明細書において使用されるように、そうでないことが示されない限り、処置の行為をさす。「癌を処置する方法」とは、動物における癌細胞の数を低下させるかもしくは排除するために、または癌の症状を緩和するために設計された手法または行為のコースをさす。
「有効量」または「有効量」という用語は、求められている組織、系、または動物、例えば、ヒトの生物学的または医学的な応答を誘発するであろう、MAT2A阻害剤化合物またはもう一つの薬物との組み合わせの量を意味する。一態様において、応答は、腫瘍体積または経時的な腫瘍体積の増加の速度の阻害、例えば、不変の体積または減少した体積である。もう一つの態様において、有効量は、癌細胞の数を低下させるか、または癌細胞の数の増加の速度を低下させるMAT2A阻害剤の量である。もう一つの態様において、有効量は、癌細胞の少なくとも一部分の分化、例えば、血液腫瘍における未分化芽細胞の機能性好中球への変換を引き起こすのに十分なMAT2A阻害剤の量である。治療的に有効な量とは、癌細胞が完全に排除されること、または細胞の数がゼロもしくは検出不可能にまで低下すること、または癌の症状が完全に緩和されることを必ずしも意味しない。
腫瘍または腫瘍細胞におけるMTAP遺伝子の発現レベルおよび存在または欠如ならびにMTAPタンパク質の機能は、標準的な技術を使用して決定され得る。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを使用して、腫瘍細胞におけるMTAP状態を決定する方法は、米国特許第5,942,393号に記載されている。Norboriら（(1991)Cancer Res.51:3193-3197；および(1993)Cancer Res.53:1098-1101）は、イムノブロット分析における、腫瘍細胞株または原発腫瘍標本から単離されたMTAPタンパク質を検出するための、ウシMTAPに対するポリクローナル抗血清の使用を記載している。Garcia-Castellanoら（2002、前記）は、OCT凍結ブロックに包埋された骨肉腫腫瘍試料をスクリーニングするための抗ヒトMTAPニワトリ抗体の使用を記載している。MTAPタンパク質機能は、機能喪失型変異を同定するためにMTAPタンパク質を配列決定するか、または試料からタンパク質を単離し、MTAをメチオニンおよび/もしくはアデニンへ変換する能力を直接的もしくは間接的に測定することによって決定され得る。
本発明のもう一つの局面において、有効量のMAT2A阻害剤と癌細胞を接触させる工程を含む、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下した機能を特徴とする癌細胞の増殖または生存を阻害する方法が、提供される。
もう一つの局面において、本発明は、腫瘍の試料におけるMTAP遺伝子発現の低下したレベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下を決定する工程、および治療的に許容される量のMAT2A阻害剤を患者へ投与する工程を含む、患者における腫瘍を診断する方法を提供する。
もう一つの局面において、本発明は、腫瘍細胞におけるMTAP遺伝子発現のレベル、MTAP遺伝子の存在もしくは欠如、または存在するMTAPタンパク質のレベルを測定する工程を含む、腫瘍細胞を特徴決定する方法を提供し、本法において、MTAP発現の低下もしくは欠如、またはMTAP遺伝子の欠如、または参照細胞と比べて低下したMTAPタンパク質のレベルもしくは機能は、腫瘍細胞の生存または増殖がMAT2A阻害剤によって阻害され得ることを示す。
本発明のもう一つの局面において、腫瘍細胞におけるMTAPの状態を決定する工程を含む、MAT2A阻害剤と腫瘍細胞を接触させることによって、腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得るか否かを決定する方法が提供され、本法において、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能は、腫瘍細胞の生存または増殖がMAT2A阻害剤によって阻害され得ることを示す。
表1の細胞株のさらなるゲノム分析は、KRAS変異も組み込まれている16のMTAPヌル細胞株のうち、14（88％）が、AGI-512およびAGI-673によるMAT2A阻害に対して感受性であるのに対し、KRAS変異が存在する時に感受性であるMTAP野生型細胞株は、49中24（49％）であることを明らかにした（p.008）。さらに、MTAPヌル状態との共変異p53変異の存在は、p53変異が存在しない場合と比較して、MAT2A阻害剤に対する改善された感受性と相関することが発見された。表2を参照すること。
（表２）
Figure 0006877429
Figure 0006877429
＊N末端断片1-195
従って、本発明の方法は、癌または癌細胞における変異体KRASまたはp53の存在を決定する工程をさらに提供し、本法において、KRAS変異またはp53変異の存在は、癌または癌細胞がMAT2A阻害剤による処置に対して感受性であることを示す。変異体KRASまたはKRAS変異とは、正常な機能を改変する活性化変異が組み込まれているKRASタンパク質、およびそのようなタンパク質をコードする遺伝子を意味する。例えば、変異体KRASタンパク質には、12位または13位に単一のアミノ酸置換が組み込まれていてよい。具体的な態様において、KRAS変異体には、G12XまたはG13Xの置換が組み込まれている。具体的な態様において、置換は、G12V、G12R、G12C、またはG13Dである。もう一つの態様において、置換はG13Dである。「変異体p53」または「p53変異」とは、腫瘍抑制機能を阻害するかまたは排除する変異が組み込まれているp53タンパク質（または該タンパク質をコードする遺伝子）を意味する。本発明に適用可能なp53変異の例は、表2に示される。
従って、本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象における癌を処置する方法を提供し、本法において、癌は、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下した機能を特徴とし、変異体KRASまたは変異体p53の存在をさらに特徴とする。
本発明は、腫瘍細胞におけるMTAPの状態およびKRAS変異またはp53変異の存在を決定する工程を含む、MAT2A阻害剤と腫瘍細胞を接触させることによって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害されるか否かを決定する方法を提供し、本法において、KRAS変異またはp53変異に加えての、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能は、腫瘍細胞の生存または増殖がMAT2A阻害剤によって阻害され得ることを示す。
もう一つの局面において、本発明は、腫瘍細胞におけるMTAP遺伝子発現のレベル、MTAP遺伝子の存在もしくは欠如、または存在するMTAPタンパク質のレベルを測定する工程、およびKRAS変異またはp53変異の存在を決定する工程を含む、腫瘍細胞を特徴決定する方法を提供し、本法において、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如、または参照細胞と比べて低下したMTAPタンパク質のレベルもしくは機能、およびKRAS変異またはp53変異の存在は、腫瘍細胞の生存または増殖がMAT2A阻害剤によって阻害され得ることを示す。
もう一つの局面において、本発明は、腫瘍の試料において、KRAS変異またはp53変異と組み合わせられた、MTAP遺伝子の低下した発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下を決定する工程を含む、腫瘍のMAT2A阻害に対する応答性を決定する方法を提供し、本法において、MTAP遺伝子の低下した発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下、およびKRAS変異またはp53変異の存在は、腫瘍がMAT2A阻害剤に対して応答性であることを示す。
もう一つの局面において、本発明は、腫瘍試料において、MTAP遺伝子の発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下、およびKRAS変異またはp53変異の存在を測定するための試薬を含み、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を投与するための説明書をさらに含むキットを提供する。
本明細書に記載された方法において、腫瘍細胞は、典型的には、癌、前癌状態、またはその他の型の異常な細胞増殖を有すると診断されており、処置を必要とする患者に由来するであろう。癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（NSCLC））、膵臓癌、頭頸部癌、胃癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、または本明細書中に後に記載される多様な他の癌のいずれかであり得る。
本発明の方法において、MTAP発現レベルおよびMTAPタンパク質機能は、参照細胞、例えば、非癌細胞のものと比べて査定され得る。本発明の方法において、腫瘍細胞によって発現されたMTAPのレベルは、より詳細に後に記載されるように、例えば、ELISA、RIA、免疫沈降、イムノブロッティング、免疫蛍光顕微鏡法、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、cDNAマイクロアレイ等を含む、遺伝子の発現のレベルの決定のための当技術分野において公知の標準的なバイオアッセイ手法のいずれかを使用することによって査定され得る。本発明の方法において、MTAPの発現レベルは、好ましくは、生検材料をアッセイすることによって査定される。
本発明の方法において、癌細胞は、任意の組織型、例えば、膵臓、肺、膀胱、乳房、食道、結腸、卵巣であり得る。具体的な態様において、癌細胞は膵臓である。もう一つの態様において、癌細胞は肺である。もう一つの態様において、癌細胞は食道である。腫瘍細胞は、好ましくは、MTAPヌルであることが公知であるかまたは予想される型のものである。
MAT2A阻害剤は、MAT2A機能をモジュレートする任意の薬剤、例えば、MAT2A活性を阻害するかもしくは増強するかまたはその他の方法で正常なMAT2A機能に影響を与えるためにMAT2Aと相互作用する薬剤である。MAT2A機能は、転写、タンパク質発現、タンパク質局在、および細胞活性または細胞外活性を含む任意のレベルで影響を受け得る。本発明の方法において、MAT2A阻害剤は任意のMAT2A阻害剤であり得る。具体的な態様において、MAT2A阻害剤は、例えば、MAT2A核酸（即ち、DNAまたはmRNA）と結合し、それを阻害することによって、MAT2A遺伝子発現または産物活性を抑制するオリゴヌクレオチドである。具体的な態様において、MAT2A阻害剤は、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNA、siRNA、マイクロRNA、またはアプタマーである。具体的な態様において、MAT2A阻害剤は、例えば、WO2004065542に記載されるようなオリゴヌクレオチドである。具体的な態様において、MAT2A阻害剤は、例えば、特許出願CN 2015-10476981またはWang et al,Zhonghua Shiyan Waike Zazhi,2009,26(2):184-186またはWang et al,Journal of Experimental & Clinical Cancer Research(2008)volume 27に記載されたようなsiRNAである。具体的な態様において、MAT2A阻害剤は、例えば、米国特許出願公開第20150225719号またはLo et al,PLoS One(2013),8(9),e75628に記載されたようなマイクロRNAオリゴヌクレオチドである。一態様において、MAT2A阻害剤は、MAT2Aと結合する抗体である。
具体的な態様において、MAT2A阻害剤は、低分子化合物、例えば、AGI-512またはAGI-673である。一態様において、MAT2A阻害剤は、Zhang et al,ACS Chem Biol,2013,8(4):796-803に記載されたフッ素化N,N-ジアルキルアミノスチルベンである。一態様において、MAT2A阻害剤は、Sviripa et al,J Med Chem,2014,57:6083-6091に記載された2',6'-ジハロスチリルアニリン、ピリジン、またはピリミジンである。具体的な態様において、化合物は、化合物1a〜12b：
Figure 0006877429
Figure 0006877429
からなる群より選択される。
もう一つの態様において、MAT2A阻害剤は、WO2012103457に開示された化合物である。一態様において、MAT2A阻害剤は、以下の式の化合物である：
X-Ar1-CRa=CRb-Ar2
式中、
RaおよびRbは、独立して、H、アルキル、ハロ、アルコキシ、シアノであり；
Xは、Ar1上の少なくとも1個のハロゲン、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素置換基を表し；
Ar1およびAr2の各々は、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、NR11CONR12R 13 によってさらに置換されていてもよい、アリール、例えば、フェニル、ナフチル、およびヘテロアリール、例えば、ピリジル、ピロリジル、ピペリジル、ピリミジル、インドリル、チエニルであり、ここで、R11、R12、R13は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
ただし、Ar2は、アリール環内に少なくとも1個の窒素原子またはアリール環上に少なくとも1個の窒素置換基；例えば、Ar2上にNRcRdZ置換基を含有しており、ここで、Rcは、H、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリールであり、Rdは、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、酸素である。
一態様において、MAT2A阻害剤は、以下の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはそのビオチン化誘導体である：
Figure 0006877429

式中、
RaおよびRbは、前記定義の通りであり、
R1〜R10は、独立して、H、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、アリールアルキルアミノ、ジアルキルオキシアミノ、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、NR11CONR12R13であり、ここで、R11、R12、R13は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
ただし、R1〜R 5 の少なくとも1個は、ハロゲン、例えば、フッ素および/または塩素であり；
R6〜R10の少なくとも1個は、窒素含有置換基、例えば、NRcRdZ置換基であり、ここで、Rcは、H、アルキル、例えば、低級アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリールであり、Rdは、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、酸素である。
もう一つの態様において、MAT2A阻害剤は、以下の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはそのビオチン化誘導体である：
Figure 0006877429
式中、R1、R2、R3、R5、R6、R7、R9、R10、Ra、Rb、およびNRcRdZは、前記定義と同様である。本開示の一つの局面において、Ra、Rbは、いずれもHであり、R1、R2、R3、またはR5のうちの一つまたは複数は、フッ素または塩素であり、Rcは、H、またはメチル基、エチル基、プロピル基のような低級アルキル基であり、Rdは、メチル基、エチル基、プロピル基のような低級アルキルである。一態様において、MAT2A阻害剤は、(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(4-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジフェニルアニリン；(E)-1-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-4-メチルピペラジン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルナフタレン-1-アミン；(E)-2-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-1-メチル-1H-イミダゾール；(E)-4-(2,3-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,5-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-2-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-3-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(3,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3,5-ジフルオロスチリル)N,N-ジメチルアニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,3,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,4,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-4-(2-クロロ-6-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジクロロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロフェネチル)-N,N-ジメチルアニリン；および(E)-2-ベンズアミド-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリンからなる群より選択される。
本発明のもう一つの局面において、治療的に有効な量のRIOK1阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象における癌を処置する方法が提供され、本法において、腫瘍は、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下した機能もしくは非機能を特徴とする。一態様において、MAT2A阻害剤は、RIOK1阻害剤と同時投与される。一態様において、癌は、MTAPの欠如を特徴とする、即ち、MTAPヌルである。もう一つの態様において、癌は、MTAP遺伝子の低下した発現を特徴とする。もう一つの態様において、癌は、KRAS変異またはp53変異の存在をさらに特徴とする。もう一つの局面において、有効量のRIOK1阻害剤を投与する工程を含む、MTAPヌル癌を処置する方法が提供される。一態様において、癌には、変異体KRASまたは変異体p53が組み込まれている。
本発明のもう一つの局面において、治療的に有効な量のPRMT5阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象における癌を処置する方法が提供され、本法において、腫瘍は、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下した機能もしくは非機能を特徴とする。一態様において、MAT2A阻害剤は、PRMT5阻害剤と同時投与される。一態様において、癌は、MTAPの欠如を特徴とする、即ち、MTAPヌルである。もう一つの態様において、癌は、MTAP遺伝子の低下した発現を特徴とする。もう一つの態様において、癌は、KRAS変異またはp53変異の存在をさらに特徴とする。もう一つの局面において、有効量のPRMT5阻害剤を投与する工程を含む、MTAPヌル癌を処置する方法が提供される。一態様において、癌には、変異体KRASまたは変異体p53が組み込まれている。
患者試料に関する前記の方法のいずれかにおいて、そのような試料の例は、腫瘍生検材料であり得る。腫瘍細胞MTAP発現の査定のため、腫瘍細胞またはこれらの腫瘍細胞によって産生されたタンパク質もしくは核酸を含有している患者試料が、本発明の方法において使用され得る。これらの態様において、MTAPの発現のレベルは、腫瘍細胞試料、例えば、患者から入手された腫瘍生検材料、または腫瘍に由来する材料を含有しているその他の患者試料（例えば、血液、血清、尿、もしくは本明細書中に先に記載されたその他の体液もしくは排泄物）において、MTAPの量（例えば、絶対量または濃度）を査定することによって査定され得る。細胞試料は、当然、試料中のマーカーの量を査定する前に、多様な周知の収集後の調製および保管の技術（例えば、核酸および/またはタンパク質の抽出、固定、保管、凍結、限外ろ過、濃縮、蒸発、遠心分離等）に供されてよい。同様に、腫瘍生検材料も、収集後の調製および保管の技術、例えば、固定に供されてよい。
もう一つの態様において、MTAPの発現は、細胞由来のまたは患者試料中のmRNA/cDNA（即ち、転写されたポリヌクレオチド）を調製し、MTAP核酸の相補鎖である参照ポリヌクレオチドまたはその断片とmRNA/cDNAをハイブリダイズさせることによって査定される。cDNAは、任意で、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に、多様なポリメラーゼ連鎖反応法のいずれかを使用して増幅されてもよい。MTAPの発現のレベルを査定するため、定量的PCRを使用して、1種または複数種のバイオマーカーの発現を検出することもできる。
正常な（即ち、非癌性の）ヒト組織におけるMTAPの発現のレベルは、多様な方式で査定され得る。一つの態様において、この正常な発現のレベルは、非癌性であると考えられる細胞の一部分におけるバイオマーカーの発現のレベルを査定し、次いで、この正常な発現のレベルを、腫瘍細胞の一部分における発現のレベルと比較することによって査定される。あるいは、具体的には、本明細書に記載された方法のルーチンの実施の結果として、さらなる情報が入手可能になるため、本発明のバイオマーカーの正常な発現についての集団平均値が使用されてもよい。他の態様において、MTAPの「正常な」発現のレベルは、癌に罹患していない患者、患者における癌の発症が疑われる前に患者から入手された患者試料、アーカイブに保管された患者試料等から入手された患者試料における発現を査定することによって決定され得る。
生物学的試料中のMTAPタンパク質または核酸の存在または欠如を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料（例えば、腫瘍関連体液）を入手する工程、およびポリペプチドまたは核酸（例えば、mRNA、ゲノムDNA、もしくはcDNA）を検出することができる化合物または薬剤と生物学的試料を接触させる工程を含む。従って、本発明の検出方法は、例えば、インビトロの生物学的試料においても、インビボでも、mRNA、タンパク質、cDNA、またはゲノムDNAを検出するために使用され得る。例えば、mRNAの検出のためのインビトロの技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。バイオマーカータンパク質の検出のためのインビトロ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が含まれる。ゲノムDNAの検出のためのインビトロ技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。mRNAの検出のためのインビボ技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ノーザンハイブリダイゼーション、およびインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、バイオマーカータンパク質の検出のためのインビボ技術には、タンパク質または断片に対する標識された抗体を対象へ導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象における存在および位置を標準的な画像技術によって検出することができる放射性マーカーによって標識され得る。
そのような診断および予後判定のアッセイの一般的な原理は、MTAP遺伝子およびプローブが相互作用し、結合し、従って、反応混合物中に除去されかつ/または検出され得る複合体を形成することを可能にするために適切な条件の下で、十分な時間、MTAP遺伝子を含有している可能性のある試料または反応混合物、およびプローブを調製することを含む。これらのアッセイは、多様な方式で実施され得る。例えば、そのようなアッセイを実施する一つの方法は、基質とも呼ばれる固相支持体にMTAP遺伝子もしくはその断片またはプローブを固着させ、反応の終わりに固相に固着した標的MTAP遺伝子/プローブ複合体を検出することを含むであろう。そのような方法の一つの態様において、MTAP遺伝子の存在および/または濃度についてアッセイされる対象由来の試料を、担体または固相支持体に固着させることができる。もう一つの態様において、逆の場合が可能であり、プローブを固相に固着させ、対象由来の試料を、アッセイの非固着成分として反応させることができる。
アッセイ成分を固相に固着させる多くの確立された方法が存在する。これらは、非限定的に、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを通して固定化されるMTAP遺伝子もしくはその断片またはプローブ分子を含む。そのようなビオチン化アッセイ成分は、当技術分野において公知の技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals,Rockford,Ill.）を使用して、ビオチン-NHS（N-ヒドロキシ-サクシニミド）から調製され、ストレプトアビジンによってコーティングされた96穴プレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化され得る。ある種の態様において、固定化されたアッセイ成分を有する表面が、事前に調製され、保管されてもよい。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然セルロース、修飾型セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロ、およびマグネタイトが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
前述のアプローチによってアッセイを実施するため、固定化されていない成分が、第2の成分が固着している固相へ添加される。反応が完了した後、形成された複合体が固相に固定化され続けるような条件の下で、（例えば、洗浄によって）非複合体化成分を除去することができる。固相に固着したMTAP遺伝子/プローブ複合体の検出は、本明細書に概説された多数の方法において達成され得る。一つの態様において、プローブは、非固着アッセイ成分である時、アッセイの検出および読み取りのため、本明細書に記述され当業者に周知である検出可能標識によって、直接的または間接的に標識され得る。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（即ち、FRET、例えば、Lakowiczら、米国特許第5,631,169号；Stavrianopoulosら、米国特許第4,868,103号を参照すること）の技術を利用することによって、さらなる操作またはいずれかの成分（遺伝子もしくはプローブ）の標識なしに、MTAP遺伝子/プローブ複合体形成を直接検出することも可能である。第1の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、適切な波長の入射光による励起時に、その放射された蛍光エネルギーが、第2の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、それが、次に、吸収エネルギーによる蛍光を発することができるよう、選択される。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、単純に、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」のそれと区別され得るよう、異なる波長の光を放射する標識が選択される。標識間のエネルギー転移の効率は、分子間の距離に関係するため、分子間の空間的関係が査定され得る。分子間で結合が起こる場合に、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光放射が最大になるはずである。FRET結合イベントは、当技術分野において周知の標準的な蛍光定量的な検出手段を通して（例えば、蛍光計を使用して）便利に測定され得る。
もう一つの態様において、バイオマーカーを認識するプローブの能力の決定は、リアルタイム生体分子相互作用分析（BIA）（例えば、Sjolander,S.and Urbaniczky,C.,1991,Anal.Chem.63:2338-2345およびSzabo et al.,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705を参照すること）のようなテクノロジーを利用することによって、アッセイ成分（プローブまたはMTAP遺伝子）のいずれかを標識することなく達成され得る。本明細書において使用されるように、「BIA」または「表面プラズモン共鳴」とは、いずれの反応体も標識することなく、リアルタイムに生体分子特異的相互作用を研究するためのテクノロジーである（例えば、BIAcore）。（結合イベントを示す）結合表面における質量の変化は、表面の近くの光の屈折率の改変（表面プラズモン共鳴（SPR）の光学的現象）をもたらし、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る検出可能なシグナルをもたらす。
あるいは、もう一つの態様において、類似の診断および予後判定のアッセイは、液相中の溶質としてMTAP遺伝子およびプローブを用いて実施され得る。そのようなアッセイにおいて、複合体化されたバイオマーカーおよびプローブは、分画遠心、クロマトグラフィ、電気泳動、および免疫沈降を含むが、これらに限定されるわけではない、多数の標準的な技術のいずれかによって、非複合体化成分から分離される。分画遠心においては、異なるサイズおよび密度に基づく複合体の異なる沈降平衡のため、一連の遠心分離工程を通して、MTAP遺伝子/プローブ複合体を非複合体化アッセイ成分から分離することができる（例えば、Rivas,G.,and Minton,A.P.,1993,Trends Biochem Sci.18(8):284-7を参照すること）。標準的なクロマトグラフィ技術も、非複合体化分子から複合体化分子を分離するために利用され得る。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィは、カラムフォーマットでの適切なゲルろ過樹脂の利用を通して、サイズに基づき分子を分離し、例えば、比較的大きい複合体が、比較的小さい非複合体化成分から分離され得る。同様に、非複合体化成分と比較したMTAP遺伝子/プローブ複合体の比較的異なる電荷特性が、例えば、イオン交換クロマトグラフィ樹脂の利用を通して、複合体を非複合体化成分と区別するために活用され得る。そのような樹脂およびクロマトグラフィ技術は、当業者に周知である（例えば、Heegaard,N.H.,1998,J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6):141-8；Hage,D.S.,and Tweed,S.A.J.Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525を参照すること）。ゲル電気泳動も、複合体化アッセイ成分を未結合成分から分離するために利用され得る（例えば、Ausubel et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1987-1999を参照すること）。この技術において、タンパク質または核酸の複合体は、例えば、サイズまたは電荷に基づき分離される。電気泳動過程中に結合相互作用を維持するため、典型的には、非変性ゲルマトリクス材料および還元剤の非存在下での条件が、好ましい。具体的なアッセイのために適切な条件およびその成分は、当業者に周知である。
具体的な態様において、MTAP mRNAのレベルは、当技術分野において公知の方法を使用して、生物学的試料において、インサイチューフォーマットおよびインビトロフォーマットの両方によって決定され得る。「生物学的試料」という用語には、対象から単離された組織、細胞、生物学的液体、およびそれらの単離物が含まれ、対象の体内に存在する組織、細胞、および液体も含まれるものとする。多くの発現検出方法が、単離されたRNAを使用する。インビトロの方法のため、mRNAの単離に不利に選択しないRNA単離技術が、腫瘍細胞からのRNAの精製のために利用され得る（例えば、Ausubel et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York 1987-1999を参照すること）。さらに、多数の組織試料が、例えば、Chomczynski（1989年、米国特許第4,843,155号）の一工程RNA単離法のような、当業者に周知の技術を使用して、容易に加工され得る。単離されたmRNAは、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、およびプローブアレイを含むが、これらに限定されるわけではないハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用され得る。mRNAレベルの検出のための一つの好ましい診断方法は、検出される遺伝子によってコードされたmRNAにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と、単離されたmRNAを接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長cDNA、または少なくとも7ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、250ヌクレオチド長、もしくは500ヌクレオチド長であり、MTAPをコードするmRNAもしくゲノムDNAとストリンジェントな条件の下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのようなその一部分であり得る。本発明の診断アッセイにおいて使用するためのその他の適当なプローブは、本明細書に記載される。mRNAのプローブとのハイブリダイゼーションは、MTAP遺伝子が発現されていることを示す。一つのフォーマットにおいて、例えば、単離されたmRNAをアガロースゲル上で泳動させ、ゲルからニトロセルロースのような膜へmRNAを転写することによって、mRNAを、固体の表面に固定化し、プローブと接触させる。別のフォーマットにおいて、例えば、Affymetrix遺伝子チップアレイにおいては、プローブが固体表面に固定化されており、mRNAがプローブと接触させられる。当業者は、MTAP遺伝子によってコードされたmRNAのレベルの検出において使用するため、公知のmRNA検出方法を容易に適応させることができる。
試料中のMTAP mRNAのレベルを決定する別の方法は、例えば、RT-PCR（Mullis、1987年、米国特許第4,683,202号に示された実験の態様）、リガーゼ連鎖反応（Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193）、自家持続配列複製（Guatelli et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878）、転写増幅系（Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177）、Qβレプリカーゼ（Lizardi et al.,1988,Bio/Technology 6:1197）、ローリングサークル複製（Lizardiら、米国特許第5,854,033号）、またはその他の核酸増幅方法による核酸増幅の過程、それに続く、当業者に周知の技術を使用した増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、そのような分子が極めて少数存在する場合、核酸分子の検出のために特に有用である。本明細書において使用されるように、増幅プライマーは、遺伝子の5'領域または3'領域にアニールすることができる核酸分子対（それぞれ、プラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）として定義され、その間の短い領域を含有している。一般に、増幅プライマーは、約10〜30ヌクレオチド長であり、約50〜200ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件の下で、適切な試薬によって、そのようなプライマーは、プライマーが隣接したヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
インサイチューの方法のため、検出前に腫瘍細胞からmRNAを単離する必要はない。そのような方法において、細胞または組織の試料は、公知の組織学的方法を使用して調製され/加工される。次いで、試料は、支持体、典型的には、ガラススライドに固定化され、次いで、バイオマーカーをコードするmRNAにハイブリダイズすることができるプローブと接触させられる。
本発明のもう一つの態様において、MTAPタンパク質が検出される。MTAPタンパク質を検出するための好ましい薬剤は、MTAPタンパク質に結合することができる抗体またはその断片、好ましくは、検出可能標識を含む抗体である。抗体は、ポリクローナル、または、より好ましくは、モノクローナルであり得る。完全抗体またはその断片または誘導体（例えば、FabまたはF(ab')2）を使用することができる。プローブまたは抗体に関連して、「標識された」という用語には、検出可能物質をプローブまたは抗体にカップリングすること（即ち、物理的連結）によるプローブまたは抗体の直接標識が包含され、直接標識されているもう一つの試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識も包含されるものとする。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出され得るようなビオチンによるDNAプローブの末端標識が含まれる。
MTAPタンパク質は、当業者に周知である技術を使用して、腫瘍細胞から単離され得る。利用されるタンパク質単離方法は、例えば、HarlowおよびLane（Harlow and Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.）に記載されたようなものであり得る。試料が所定の抗体に結合するタンパク質を含有しているか否かを決定するため、多様なフォーマットが利用され得る。そのようなフォーマットの例には、酵素イムノアッセイ（EIA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、ウエスタンブロット分析、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）が含まれる。当業者は、腫瘍細胞が本発明のバイオマーカーを発現するか否かの決定において使用するため、公知のタンパク質/抗体検出方法を容易に適応させることができる。一つのフォーマットにおいて、抗体または抗体の断片もしくは誘導体は、発現されたMTAPタンパク質を検出するため、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光技術のような方法において使用され得る。そのような使用においては、抗体またはMTAPタンパク質のいずれかを固体支持体に固定化することが、一般に、好ましい。適当な固相支持体または担体には、抗原または抗体に結合することができる任意の支持体が含まれる。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース、修飾型セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロ、およびマグネタイトが含まれる。当業者は、抗体または抗原を結合させるために適当な他の多くの担体が存在することを認識し、本発明によって使用するためにそのような支持体を適応させることができるであろう。例えば、腫瘍細胞から単離されたMTAPタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において泳動させ、ニトロセルロースのような固相支持体に固定化することができる。次いで、支持体を、適当な緩衝液によって洗浄し、続いて、検出可能に標識された抗体によって処理することができる。次いで、未結合抗体を除去するため、固相支持体を緩衝液によって2回目の洗浄をすることができる。次いで、従来の手段によって、固体支持体上に結合した標識の量を検出することができる。
ELISAアッセイのため、特異的結合対は、免疫型であってもよいしまたは非免疫型であってもよい。免疫特異的結合対は、抗原-抗体系またはハプテン/抗ハプテン系によって例示される。フルオレセイン/抗フルオレセイン、ジニトロフェニル/抗ジニトロフェニル、ビオチン/抗ビオチン、ペプチド/抗ペプチド等を挙げることができる。特異的結合対の抗体メンバーは、当業者に周知の慣習的な方法によって作製され得る。そのような方法は、特異的結合対の抗原メンバーによって動物を免疫することを含む。特異的結合対の抗原メンバーが免疫原性でなく、例えば、ハプテンである場合には、それを免疫原性にするため、担体タンパク質と共有結合でカップリングすることができる。非免疫結合対には、二つの成分が、相互に天然の親和性を共有しているが、抗体ではない系が含まれる。例示的な非免疫対は、ビオチン-ストレプトアビジン、内因子-ビタミンB12、葉酸-葉酸結合タンパク質等である。
多様な方法が、特異的結合対のメンバーによって抗体を共有結合で標識するために利用可能である。方法は、特異的結合対のメンバーの性質、望まれる結合の型、および様々なコンジュゲーションケミストリーに対する抗体の耐性に基づき選択される。ビオチンは、市販の活性誘導体を利用することによって、抗体に共有結合でカップリングされ得る。これらのうちのいくつかは、タンパク質上のアミン基に結合するビオチン-N-ヒドロキシ-サクシニミド；カルボジイミドカップリングを介して炭水化物マスキングモエティ、アルデヒド、およびカルボキシル基に結合するビオチンヒドラジド；ならびにスルフヒドリル基に結合するビオチンマレイミドおよびヨードアセチルビオチンである。フルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネートを使用して、タンパク質アミン基にカップリングされ得る。ジニトロフェニル基は、2,4-ジニトロベンゼン硫酸塩または2,4-ジニトロフルオロベンゼンを使用して、タンパク質アミン基にカップリングされ得る。ジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、ホモ官能性架橋、およびヘテロ二官能性架橋を含む、コンジュゲーションの他の標準的な方法が、特異的結合対のメンバーとモノクローナル抗体をカップリングするために利用されてもよい。カルボジイミドカップリングは、ある物質のカルボキシル基をもう一つの物質のアミン基とカップリングする効果的な方法である。カルボジイミドカップリングは、市販の試薬1-エチル-3-(ジメチル-アミノプロピル)-カルボジイミド（EDAC）の使用によって容易になる。
二官能性イミドエステルおよび二官能性N-ヒドロキシサクシニミドエステルを含むホモ二官能性架橋剤は、市販されており、ある物質のアミン基をもう一つの物質のアミン基とカップリングするために利用される。ヘテロ二官能性架橋剤は、異なる官能基を保有する試薬である。最も一般的な市販のヘテロ二官能性架橋剤は、アミン反応性N-ヒドロキシサクシニミドエステルを1個の官能基として有し、スルフヒドリル反応基を第2の官能基として有する。最も一般的なスルフヒドリル反応基は、マレイミド、ピリジルジスルフィド、および活性ハロゲンである。官能基のうちの1種は、照射時に多様な基と反応する光活性アリールニトレンであり得る。
検出可能に標識された抗体または特異的結合対の検出可能に標識されたメンバーは、放射性同位体、酵素、蛍光発生材料、化学発光材料、または電気化学的材料であり得るレポーターとのカップリングによって調製される。一般的に使用される2種の放射性同位体は、125Iおよび3Hである。標準的な放射性同位体標識手法には、125IのためのクロラミンT、ラクトペルオキシダーゼ、およびボルトンハンター法、ならびに3Hのための還元的メチル化が含まれる。「検出可能に標識された」という用語は、標識の固有の酵素活性またはそれ自体容易に検出されるもう一つの成分の標識との結合によって容易に検出され得るよう標識された分子をさす。
本発明において使用するために適当な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ホタルおよびウミシイタケを含むルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、ウレアーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、ならびにリゾチームが含まれるが、これらに限定されるわけではない。酵素標識は、抗体を特異的結合対のメンバーとカップリングするため、前記のジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、ホモ二官能性架橋剤、およびヘテロ二官能性架橋剤を使用することによって容易にされる。
選択される標識方法は、酵素および標識される材料の利用可能な官能基、ならびにコンジュゲーション条件に対する両方の耐性に依る。本発明において使用される標識方法は、Engvall and Pearlmann,Immunochemistry 8,871(1971)、Avrameas and Ternynck,Immunochemistry 8,1175(1975)、Ishikawa et al.,J.Immunoassay 4(3):209-327(1983)、およびJablonski,Anal.Biochem.148:199(1985)によって記載されたものを含む、現在利用されている従来の方法のうちの一つであり得るが、これらに限定されるわけではない。標識は、スペーサーまたは特異的結合対の他のメンバーの使用のような間接的な方法によって達成されてもよい。この一例は、未標識ストレプトアビジンおよびビオチン化酵素によるビオチン化抗体の検出であり、ストレプトアビジンおよびビオチン化酵素は連続的にまたは同時に添加される。従って、本発明によると、検出するために使用される抗体は、レポーターによって直接的に、または特異的結合対の第1のメンバーによって間接的に、検出可能に標識され得る。抗体が、特異的結合対の第1のメンバーにカップリングされる時には、前述のように、抗体-特異的結合複合体の第1のメンバーを、標識されているかまたは未標識の結合対の第2のメンバーと反応させることによって、検出が達成される。さらに、未標識の検出用抗体は、未標識抗体を、未標識抗体に特異的な標識された抗体と反応させることによって検出され得る。この場合において、「検出可能に標識された」とは、前記において使用されたように、未標識抗体に対して特異的な抗体が結合することができるエピトープの含有を意味するものと理解される。そのような抗抗体は、前述のアプローチのいずれかを使用して直接的または間接的に標識され得る。例えば、抗抗体は、前述のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ系との反応によって検出されるビオチンにカップリングされ得る。本発明の一つの態様において、ビオチンが利用される。ビオチン化抗体は、次に、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体と反応させられる。オルトフェニレンジアミン、4-クロロ-ナフトール、テトラメチルベンジジン（TMB）、ABTS、BTS、またはASAが、発色検出を達成するために使用され得る。
本発明を実施するための一つのイムノアッセイフォーマットにおいて、捕獲試薬が従来の技術を使用して支持体の表面に固定化されるフォワードサンドイッチアッセイが使用される。アッセイにおいて使用される適当な支持体には、ポリプロピレン、ポリスチレン、置換ポリスチレン、例えば、アミノ化ポリスチレンもしくはカルボキシル化ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ガラスビーズ、アガロース、またはニトロセルロースのような合成ポリマー支持体が含まれる。
本発明の一局面において、腫瘍試料におけるMTAP遺伝子の発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下を測定するための試薬を含み、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を投与するための説明書をさらに含むキットが提供される。そのようなキットは、対象が、MAT2A阻害剤による阻害に対して低感受性の腫瘍に罹患しているかまたは増加した発症リスクを有するか否かを決定するために使用され得る。例えば、キットは、生物学的試料中のMTAPタンパク質または核酸を検出することができる標識された化合物または薬剤、および試料中のタンパク質またはmRNAの量を決定するための手段（例えば、タンパク質もしくはその断片に結合する抗体、またはタンパク質をコードするDNAもしくはmRNAに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含むことができる。キットには、キットを使用して入手された結果を解釈するための説明書が含まれていてもよい。抗体に基づくキットの場合、キットは、例えば、（1）MTAPタンパク質に結合する（例えば、固体支持体に付着させられた）第1の抗体を含んでいてよく；任意で、（2）検出可能標識にコンジュゲートされた、タンパク質または第1の抗体のいずれかに結合する第2の異なる抗体を含んでいてよい。
オリゴヌクレオチドに基づくキットについて、キットは、例えば、（1）MTAPタンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（2）MTAP核酸を増幅するために有用なプライマー対を含んでいてよい。キットは、例えば、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤も含んでいてよい。キットは、検出可能標識の検出のために必要な成分（例えば、酵素または基質）をさらに含んでいてよい。キットは、アッセイされ、試験試料と比較され得る対照試料または一連の対照試料も含有していてよい。キットの各成分は、個々の容器に封入されていてよく、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための説明書と一緒に、様々な容器が全て単一のパッケージ内にあってよい。
本発明は、例えば、MTAP遺伝子の発現レベルを決定するための本明細書に記載された方法のいずれかによって、MTAP状態、即ち、MTAP遺伝子の発現が低下しているか否か、MTAP遺伝子が欠如しているか否か、またはMTAPタンパク質が欠如しているかもしくは低下した機能を有するか否かを査定することによって、患者がMAT2A阻害剤に対して応答性である可能性を診断する工程、および治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与する工程を含む、患者における腫瘍を処置する方法をさらに提供する。この方法において、個々の患者に関係する付加的な状況と組み合わせて、患者がMTAP阻害剤に対して応答性である可能性が高いとの予測を与えられた、投与する医師によって適切であると判断されるように、1種または複数種の付加的な抗癌剤または処置が、MAT2A阻害剤と同時にまたは連続的に同時投与されてもよい。
患者がMAT2A阻害剤に対して応答性である可能性が高いとの診断の後、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与する正確な様式は、主治医の裁量によることが、医学分野の当業者によって認識されるであろう。投薬量、他の抗癌剤との組み合わせ、投与のタイミングおよび頻度等を含む投与のモードは、患者がMAT2A阻害剤に対して応答性である可能性の診断、ならびに患者の状態および病歴によって影響され得る。
本発明に関して、MAT2A阻害剤は、例えば、以下のものを含む、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、または抗癌剤と組み合わせて投与され得る：シクロホスファミド（CTX；例えば、CYTOXAN（登録商標））、クロラムブシル（CHL；例えば、LEUKERAN（登録商標））、シスプラチン（CisP；例えば、PLATINOL（登録商標））、ブスルファン（例えば、MYLERAN（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（BCNU）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（TEM）、マイトマイシンC等のようなアルキル化剤またはアルキル化作用を有する薬剤；メトトレキサート（MTX）、エトポシド（VP16；例えば、VEPESID（登録商標））、6-メルカプトプリン（6MP）、6-チオグアニン（6TG）、シタラビン（Ara-C）、5-フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビン（例えば、XELODA（登録商標））、ダカルバジン（DTIC）等のような代謝拮抗薬；アクチノマイシンD、ドキソルビシン（DXR；例えば、ADRIAMYCIN（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン等のような抗生物質；ビンクリスチン（VCR）、ビンブラスチン等のようなビンカアルカロイドのようなアルカロイド；ならびにパクリタクセル（例えば、TAXOL（登録商標））およびパクリタクセル誘導体のようなその他の抗腫瘍剤、細胞分裂阻害剤、デキサメタゾン（DEX；例えば、DECADRON（登録商標））のようなグルココルチコイドおよびプレドニゾンのような副腎皮質ステロイド、ヒドロキシ尿素のようなヌクレオシド酵素阻害剤、アスパラギナーゼのようなアミノ酸を枯渇させる酵素、ロイコボリンおよびその他の葉酸誘導体、ならびに類似の多様な抗腫瘍剤。以下の薬剤も、付加的な薬剤として使用され得る：アミホスチン（例えば、ETHYOL（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン（CCNU）、ドキソルビシンリポ（lipo）（例えば、DOXIL（登録商標））、ゲムシタビン（例えば、GEMZAR（登録商標））、ダウノルビシンリポ（例えば、DAUNOXOME（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えば、TAXOTERE（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT11（イリノテカン）、10-ヒドロキシ7-エチル-カンプトテシン（SN38）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンβ、インターフェロンα、ミトキサントロン、トポテカン、リュープロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル。
本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与し、さらに、同時にまたは連続的に、1種または複数種の抗ホルモン剤を投与する工程を含む、患者における腫瘍を処置する前記方法をさらに提供する。本明細書において使用されるように、「抗ホルモン剤」という用語には、腫瘍に対するホルモン作用を制御するかまたは阻害するために作用する天然または合成の有機化合物またはペプチド化合物が含まれる。抗ホルモン剤には、例えば、：ステロイド受容体アンタゴニスト、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する4(5)-イミダゾール、他のアロマターゼ阻害薬、42-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifene）、LY 117018、オナプリストン（onapristone）、およびトレミフェン（例えば、FARESTON（登録商標））のような抗エストロゲン；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリンのような抗アンドロゲン；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体化ホルモン（LH）、ならびにLHRH（黄体化ホルモン放出ホルモン）のような糖タンパク質ホルモンのアゴニストおよび/またはアンタゴニスト；ZOLADEX（登録商標）（AstraZeneca）として市販されているLHRHアゴニストであるゴセレリン酢酸塩；LHRHアンタゴニストであるD-アラニンアミドN-アセチル-3-(2-ナフタレニル)-D-アラニル-4-クロロ-D-フェニルアラニル-3-(3-ピリジニル)-D-アラニル-L-セリル-N6-(3-ピリジニルカルボニル)-L-リジル-N6-(3-ピリジニルカルボニル)-D-リジル-L-ロイシル-N6-(1-メチルエチル)-L-リジル-L-プロリン（例えば、ANTIDE（登録商標）、Ares-Serono）；LHRHアンタゴニストであるガニレリクス酢酸塩；ステロイド性抗アンドロゲンであるシプロテロン酢酸塩（CPA）およびMEGACE（登録商標）（Bristol-Myers Oncology）として市販されているメゲストロール酢酸塩；EULEXIN（登録商標）（Schering Corp.）として市販されている非ステロイド性抗アンドロゲンであるフルタミド（2-メチル-N-[4,20-ニトロ-3-(トリフルオロメチル)フェニルプロパンアミド）；非ステロイド性抗アンドロゲンであるニルタミド（5,5-ジメチル-3-[4-ニトロ-3-(トリフルオロメチル-4'-ニトロフェニル)-4,4-ジメチル-イミダゾリジン-ジオン）；ならびにRAR、RXR、TR、VDR等のアンタゴニストのようなその他の非許容（non-permissive）受容体のアンタゴニストが含まれる。
化学療法計画における前記の細胞傷害性薬剤およびその他の抗癌剤の使用は、癌治療の分野において一般に十分に特徴決定されており、本明細書において、それらの使用は、いくつかの調整と共に、耐容性および有効性のモニタリングならびに投与ルートおよび投薬量の調節について同様に考慮される。例えば、細胞傷害性薬剤の実際の投薬量は、組織培養（histoculture）法を使用することによって決定された患者の培養細胞の応答に依って変動し得る。一般に、投薬量は、付加的な他の薬剤の非存在下で使用される量と比較して低下するであろう。有効な細胞傷害性薬剤の典型的な投薬量は、製造業者によって推奨された範囲にあってよく、インビトロ応答または動物モデルにおける応答によって示された場合、約1桁までの濃度または量だけ低下し得る。従って、実際の投薬量は、医師の判断、患者の状態、および初代培養された悪性細胞もしくは組織培養された組織試料のインビトロの応答性または適切な動物モデルにおいて観察された応答に基づく治療方法の有効性に依るであろう。
本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与し、さらに、同時にまたは連続的に、1種または複数種の血管形成阻害剤を投与する工程を含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を処置する前記方法をさらに提供する。抗血管形成剤には、例えば：SU-5416およびSU-6668（Sugen Inc.of South San Francisco,Calif.,USA）のような、または、例えば、国際出願番号WO 99/24440、WO 99/62890、WO 95/21613、WO 99/61422、WO 98/50356、WO 99/10349、WO 97/32856、WO 97/22596、WO 98/54093、WO 98/02438、WO 99/16755、およびWO 98/02437、ならびに米国特許第5,883,113号、第5,886,020号、第5,792,783号、第5,834,504号、および第6,235,764号に記載されたようなVEGFR阻害剤；IM862（Cytran Inc.of Kirkland,Wash.,USA）のようなVEGF阻害剤；Ribozyme（Boulder,Colo.）およびChiron（Emeryville,Calif.）の合成リボザイムであるアンジオザイム（angiozyme）；ならびにVEGFに対する組換えヒト化抗体ベバシズマブ（例えば、AVASTIN（商標）、Genentech,South San Francisco,CA）のようなVEGFに対する抗体；αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、およびαvβ6インテグリン、ならびにそれらの亜型に対するもののようなインテグリン受容体アンタゴニストおよびインテグリンアンタゴニスト、例えば、シレンギチド（EMD 121974）、または、例えば、αvβ3特異的ヒト化抗体（例えば、VITAXIN（登録商標））のような抗インテグリン抗体；IFN-α（米国特許第41530,901号、第4,503,035号、および第5,231,176号）のような因子；アンジオスタチンおよびプラスミノーゲン断片（例えば、クリングル1〜4、クリングル5、クリングル1〜3（O'Reilly,M.S.et al.(1994)Cell 79:315-328；Cao et al.(1996)J.Biol.Chem.271:29461-29467；Cao et al.(1997)J.Biol.Chem.272:22924-22928）；エンドスタチン（O'Reilly,M.S.et al.(1997)Cell 88:277；および国際特許公開番号WO 97/15666）；トロンボスポンジン（TSP-1；Frazier,(1991)Curr.Opin.Cell Biol.3:792）；血小板因子4（PF4）；プラスミノーゲンアクチベーター/ウロキナーゼ阻害剤；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；ヘパリナーゼ；TNP-4701のようなフマギリン類似体；スラミンおよびスラミン類似体；血管新生抑制ステロイド；bFGFアンタゴニスト；flk-1およびflt-1アンタゴニスト；MMP-2（マトリックスメタロプロテイナーゼ2）阻害剤およびMMP-9（マトリックスメタロプロテイナーゼ9）阻害剤のような抗血管形成剤が含まれる。有用なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、国際特許公開番号WO 96/33172、WO 96/27583、WO 98/07697、WO 98/03516、WO 98/34918、WO 98/34915、WO 98/33768、WO 98/30566、WO 90/05719、WO 99/52910、WO 99/52889、WO 99/29667、およびWO 99/07675、欧州特許公開第818,442号、第780,386号、第1,004,578号、第606,046号、および第931,788号；英国特許公開第9912961号、ならびに米国特許第5,863,949号および第5,861,510号に記載されている。好ましいMMP-2およびMMP-9の阻害剤は、MMP-1を阻害する活性をほとんどまたは全く有しないものである。より好ましいのは、他のマトリックスメタロプロテイナーゼ（即ち、MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12、およびMMP-13）と比べて、MMP-2および/またはMMP-9を選択的に阻害するものである。
本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与し、さらに、同時にまたは連続的に、1種または複数種の腫瘍細胞のアポトーシス促進性またはアポトーシス刺激性の薬剤を投与する工程を含む、患者における腫瘍を処置する前記方法をさらに提供する。本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与し、さらに、同時にまたは連続的に、1種または複数種のシグナル伝達阻害剤を投与する工程を含む、患者における腫瘍を処置する前記方法をさらに提供する。シグナル伝達阻害剤には、例えば：有機分子またはerbB2受容体に結合する抗体、例えば、トラスツズマブ（例えば、HERCEPTIN（登録商標））のようなerbB2受容体阻害剤；他のタンパク質チロシンキナーゼの阻害剤、例えば、イマチニブ（例えば、GLEEVEC（登録商標））；ras阻害剤；raf阻害剤（例えば、BAY 43-9006、Onyx Pharmaceuticals/Bayer Pharmaceuticals）；MEK阻害剤；mTOR阻害剤；サイクリン依存性キナーゼ阻害剤；プロテインキナーゼC阻害剤；ならびにPDK-1阻害剤が含まれる（そのような阻害剤のいくつかの例、および癌の処置のための臨床試験におけるそれらの使用の説明については、Dancey,J.and Sausville,E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery 2:92-313を参照すること）。ErbB2受容体阻害剤には、例えば：GW-282974（Glaxo Wellcome plc）のようなErbB2受容体阻害剤、AR-209（Aronex Pharmaceuticals Inc.of The Woodlands,Tex.,USA）および2B-1（Chiron）のようなモノクローナル抗体、ならび国際公開番号WO 98/02434、WO 99/35146、WO 99/35132、WO 98/02437、WO 97/13760、およびWO 95/19970、ならびに米国特許第5,587,458号、第5,877,305号、第6,465,449号、および第6,541,481号に記載されたもののようなerbB2阻害剤が含まれる。
本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与し、さらに、同時にまたは連続的に、1種または複数種の付加的な抗増殖剤を投与する工程を含む、患者における腫瘍を処置する前記方法をさらに提供する。付加的な抗増殖剤には、例えば：米国特許第6,080,769号、第6,194,438号、第6,258,824号、第6,586,447号、第6,071,935号、第6,495,564号、第6,150,377号、第6,596,735号、および第6,479,513号、ならびに国際特許公開WO 01/40217に開示され特許請求の範囲に記載された化合物を含む、酵素ファルネシルプロテイントランスフェラーゼの阻害剤および受容体チロシンキナーゼPDGFRの阻害剤が含まれる。
本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与し、さらに、同時にまたは連続的に、放射線または放射性医薬品による処置を投与する工程を含む、患者における腫瘍を処置する前記方法をさらに提供する。放射線の起源は、処置される患者の外部にあってもよいしまたは内部にあってもよい。起源が患者の外部にある時、治療は、外照射療法（EBRT）として公知である。放射線の起源が患者の内部にある時、処置は、組織内照射療法（BT）と呼ばれる。本発明に関して使用するための放射性原子は、ラジウム、セシウム-137、イリジウム-192、アメリシウス-241、金-198、コバルト-57、銅-67、テクネチウム-99、ヨウ素-123、ヨウ素-131、およびインジウム-111からなる群より選択されるが、これらに限定されるわけではない。本発明によるMAT2A阻害剤が抗体である場合、そのような放射性同位体によって抗体を標識することも可能である。放射線治療は、切除不可能または手術不可能な腫瘍および/または腫瘍転移をコントロールするための標準的な処置である。放射線治療を化学療法と組み合わせた時、改善された結果が見られている。放射線治療は、標的区域に送達された高線量放射線が、腫瘍組織および正常組織の両方において生殖細胞の死をもたらすであろうという原理に基づく。放射線投与計画は、一般に、放射線吸収線量（Gy）、時間、および分割に関して定義され、腫瘍学者によって注意深く定義されなければならない。患者が受容する放射線の量は、様々な考慮に依るであろうが、最も重要な2点は、他の決定的な構造または身体の器官に対する腫瘍の位置、および腫瘍が蔓延している程度である。放射線治療を受ける患者のための典型的な処置のコースは、1〜6週の期間にわたる処置スケジュールであり、週5日、約1.8〜2.0Gyの1日分割線量で、10〜80Gyの全用量が患者へ投与されるであろう。本発明の好ましい態様において、ヒト患者における腫瘍が、本発明および放射線の組み合わせ処置によって処置される時、相乗作用が存在する。換言すると、放射線と組み合わせられ、任意で、付加的な化学療法剤または抗癌剤と組み合わせられた時、本発明の組み合わせを含む薬剤による腫瘍増殖の阻害は、増強される。補助放射線治療のパラメータは、例えば、国際特許公開WO 99/60023に含有されている。
本発明は、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を患者へ投与し、さらに、同時にまたは連続的に、抗腫瘍免疫応答を増強することができる1種または複数種の薬剤による処置を投与する工程を含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を処置する前記方法をさらに提供する。抗腫瘍免疫応答を増強することができる薬剤には、例えば：CTLA4（細胞傷害性リンパ球抗原4）抗体（例えば、MDX-CTLA4）およびCTLA4を阻止することができるその他の薬剤が含まれる。本発明において使用され得る具体的なCTLA4抗体には、米国特許第6,682,736号に記載されたものが含まれる。
本明細書において使用されるように、「患者」という用語は、好ましくは、何らかの目的のためMAT2A阻害剤による処置を必要とするヒト、より好ましくは、癌または前癌性の状態もしくは病変を処置するためにそのような処置を必要とするヒトをさす。しかしながら、「患者」という用語は、MAT2A阻害剤による処置を必要とする、非ヒト動物、とりわけ、好ましくは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類のような哺乳動物をさすこともできる。
癌は、好ましくは、MAT2A阻害剤の投与によって、部分的にまたは完全に処置可能な癌である。癌は、例えば、肺癌、非小細胞肺（NSCL）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚または眼球内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、胃の癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頚部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、慢性または急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系（CNS）の新生物、脊柱腫瘍、脳幹神経膠腫、多形膠芽腫、星細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫であり得、前記の癌のいずれかの難治性のバージョンまたは前記の癌のうちの一つもしくは複数の組み合わせを含む。前癌性の状態または病変には、例えば、口腔白板症、光線角化症（日光角化症）、大腸または直腸の前癌性ポリープ、胃上皮異形成、腺腫性異形成、遺伝性非腺腫性大腸癌症候群（HNPCC）、バレット食道、膀胱異形成、および前癌性子宮頚部状態が含まれる。
MAT2A阻害剤は、典型的には、当技術分野において公知のように、患者が処置されている癌のために（効力および安全性の両方の観点から）最も有効な処置を提供する用量計画で患者へ投与されるであろう。本発明の処置方法の実施において、MAT2A阻害剤は、処置されている癌の型、使用されているMAT2A阻害剤の型（例えば、低分子、抗体、RNAi、リボザイム、またはアンチセンス構築物）、および、例えば、公開された臨床研究の結果に基づく、処方する医師の医学的判断に依って、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、皮下、鼻腔内、眼内、膣、直腸、または皮内のルートのような、当技術分野において公知の有効な様式で投与され得る。
投与されるMAT2Aキナーゼ阻害剤の量および投与のタイミングは、処置されている患者の型（人種、性別、年齢、体重等）および状態、処置されている疾患または状態の重症度、ならびに投与ルートに依るであろう。例えば、低分子MAT2A阻害剤は、単一の用量もしくは分割された用量で、または連続注入によって、1日当たりまたは1週当たり0.001〜100mg/kg体重の範囲の用量で、患者へ投与され得る。抗体に基づくMAT2A阻害剤、またはアンチセンス、RNAi、またはリボザイム構築物は、単一の用量もしくは分割された用量で、または連続注入によって、1日当たりまたは1週当たり0.1〜100mg/kg体重の範囲の用量で、患者へ投与され得る。いくつかの場合において、前述の範囲の下限より低い投薬量レベルが十分に適度であり得、他のケースにおいて、さらに大きい用量が、1日を通した投与のためにいくつかの小さい用量に最初に分割されたならば、有害な副作用を引き起こすことなく利用され得る。
MAT2A阻害剤は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハードキャンディ、粉末、スプレー、クリーム、膏薬、坐薬、ゼリー、ゲル、ペースト、ローション、軟膏、エリキシル、シロップ等の形態で、様々な薬学的に許容される不活性担体によって投与され得る。そのような剤形の投与は、単回投与または複数回投与で実施され得る。担体には、固体の希釈剤または増量剤、無菌の水性の媒体、および様々な非毒性の有機溶媒等が含まれる。経口薬学的組成物は、適当に甘味および/または風味が付けられていてもよい。阻害剤は、スプレー、クリーム、膏薬、坐薬、ゼリー、ゲル、ペースト、ローション、軟膏等の形態で、様々な薬学的に許容される不活性担体と組み合わせられ得る。そのような剤形の投与は、単回投与または複数回投与で実施され得る。担体には、固体の希釈剤または増量剤、無菌の水性の媒体、および様々な非毒性の有機溶媒等が含まれる。タンパク質性の阻害剤を含む製剤は、全て、阻害剤の変性および/または分解ならびに生物学的活性の喪失を回避するために選択されるべきである。
MAT2A阻害剤を含む薬学的組成物を調製する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,18th edition(1990)に記載されている。阻害剤の経口投与のため、活性薬剤の一方または両方を含有している錠剤は、例えば、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ、またはタピオカのデンプン）、アルギン酸、およびある種の複合ケイ酸塩のような様々な崩壊剤と共に、ポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチン、およびアラビアゴムのような造粒結合剤と共に、結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、およびグリシンのような様々な賦形剤のいずれかと組み合わせられる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクのような滑沢剤が、しばしば、錠剤化のために極めて有用である。類似の型の固体組成物は、ゼラチンカプセルにおける増量剤としても利用され得；これに関して好ましい材料には、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールも含まれる。水性懸濁液および/またはエリキシルが経口投与のために望まれる時、阻害剤は、様々な甘味剤または風味剤、着色物質または色素と組み合わせられてよく、所望により、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、およびそれらの様々な同様の組み合わせのような希釈剤と共に、乳化剤および/または懸濁化剤とも組み合わせられてよい。活性薬剤の一方または両方の非経口投与のため、活性薬剤またはその対応する水溶性塩を含む、ゴマ油もしくはピーナッツ油のいずれかまたは水性プロピレングリコールによる溶液、および無菌水性溶液が利用され得る。そのような無菌水性溶液は、好ましくは、適当に緩衝され、好ましくは、例えば、十分な塩またはグルコースによって等張にもされる。これらの特定の水性溶液は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、および腹腔内注射のために特に適当である。油性溶液は、関節内注射、筋肉内注射、および皮下注射のために適当である。無菌条件下でのこれらの全ての溶液の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。タンパク質性阻害剤の投与のために選択される非経口製剤は、阻害剤の変性および生物学的活性の喪失を回避するために選択されるべきである。
さらに、標準的な薬学的実務に従って、例えば、クリーム、ローション、ゼリー、ゲル、ペースト、軟膏、膏薬等によって、活性薬剤の一方または両方を局所投与することが可能である。例えば、約0.1％(w/v)〜約5％(w/v)の濃度のMAT2A阻害剤を含む局所製剤を調製することができる。
獣医学的目的のため、活性薬剤は、前記の形態のいずれかを使用して、前記のルートのいずれかによって、別々にまたは共に、動物へ投与され得る。好ましい態様において、阻害剤は、カプセル、ボーラス、錠剤、液体水薬の形態で、注射によって、またはインプラントとして投与される。別法として、阻害剤は、動物飼料と共に投与され得、この目的のため、濃縮された飼料添加剤またはプレミックスが、通常の動物飼料のために調製され得る。そのような製剤は、標準的な獣医学的実務に従って従来の様式で調製される。
モノクローナル抗体および抗体断片の作製および単離のための技術は、当技術分野において周知であり、Harlow and Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryおよびJ.W .Goding,1986,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,Londonに記載されている。ヒト化抗MAT2A抗体および抗体断片は、Vaughn,T.J.et al.,1998,Nature Biotech.16:535-539およびそこに引用された参照に記載されたもののような公知の技術に従って調製されてもよく、そのような抗体またはその断片も、本発明の実施において有用である。
あるいは、本発明において使用するためのMAT2A阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づいていてもよい。アンチセンスRNA分子およびアンチセンスDNA分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞において、MAT2A mRNAに結合し、従って、タンパク質翻訳を防止するかまたはmRNA分解を増加させ、従って、MAT2Aタンパク質のレベル、従って、活性を減少させることによって、MAT2A mRNAの翻訳を直接阻止するよう作用するであろう。例えば、少なくとも約15塩基であり、MAT2AをコードするmRNA転写物配列の特有の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来のホスホジエステル技術によって合成し、例えば、静脈内への注射または注入によって投与することができる。配列が既知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第6,566,135号；第6,566,131号；第6,365,354号；第6,410,323号；第6,107,091号；第6,046,321号；および第5,981,732号を参照すること）。
低分子阻害RNA（siRNA）も、本発明において使用するための阻害剤として機能することができる。MAT2Aの発現が特異的に阻害されるよう、腫瘍、対象、または細胞を、低分子二本鎖RNA（dsRNA）または低分子二本鎖RNAの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と接触させることによって、MAT2A遺伝子発現を低下させることができる（即ち、RNA干渉またはRNAi）。配列が既知の遺伝子のため、適切なdsRNAまたはdsRNAをコードするベクターを選択する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Tuschi,T.,et al.(1999)Genes Dev.13(24):3191-3197；Elbashir,S.M.et al.(2001)Nature 411:494-498；Hannon,G.J.(2002)Nature 418:244-251；McManus,M.T.and Sharp,P.A.(2002)Nature Reviews Genetics 3:737-747；Bremmelkamp,T.R.et al.(2002)Science 296:550-553；米国特許第6,573,099号および第6,506,559号；ならびに国際特許公開番号WO 01/36646、WO 99/32619、およびWO 01/68836を参照すること）。リボザイムも、本発明において使用するための阻害剤として機能することができる。リボザイムとは、RNAの特異的な切断を触媒することができる酵素的なRNA分子である。リボザイム作用の機序は、リボザイム分子の相補的な標的RNAとの配列特異的なハイブリダイゼーションに続くヌクレオチド鎖切断を含む。従って、mRNA配列のヌクレオチド鎖切断を特異的に効率的に触媒する改変されたヘアピンリボザイム分子またはハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。最初に、典型的には、以下の配列、GUA、GUU、およびGUCを含むリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって、可能性のあるRNA標的において特異的なリボザイム切断部位を同定する。同定後、切断部位を含有している標的遺伝子の領域に対応する約15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列を、そのオリゴヌクレオチド配列を不適当なものにし得る二次構造のような予測される構造的特色について評価することができる。例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの到達可能性を試験することによっても、候補標的の適性を評価することができる。
阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、いずれも、公知の方法によって調製され得る。これらには、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成のような、化学合成の技術が含まれる。あるいは、アンチセンスRNA分子は、RNA分子をコードするDNA配列のインビトロまたはインビボの転写によって生成され得る。そのようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターのような適当なRNAポリメラーゼプロモーターが組み込まれている多様なベクターへ組み込まれていてよい。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な修飾が、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入され得る。可能な修飾には、分子の5'末端および/もしくは3'末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、またはオリゴヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合の代わりのホスホロチオエートもしくは2'-O-メチルの使用が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的に許容される非毒性の塩基または酸から調製された塩をさす。本発明の化合物が酸性である時、その対応する塩は、無機塩基および有機塩基を含む薬学的に許容される非毒性塩基から便利に調製され得る。そのような無機塩基に由来する塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅（第二銅および第一銅）、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン（第二マンガンおよび第一マンガン）、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、およびナトリウムの塩である。薬学的に許容される有機非毒性塩基に由来する塩には、一級アミン、二級アミン、および三級アミンの塩が含まれ、環式アミンならびに天然に存在する置換アミンおよび合成置換アミンのような置換アミンの塩も含まれる。塩が形成され得る他の薬学的に許容される有機非毒性塩基には、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、N',N'-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン（hydrabamine）、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等のようなイオン交換樹脂が含まれる。
本発明において使用される化合物が塩基性である時、その対応する塩は、無機および有機の酸を含む薬学的に許容される非毒性の酸から便利に調製され得る。そのような酸には、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、p-トルエンスルホン酸等が含まれる。特に好ましいのは、クエン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、および酒石酸である。
MAT2A阻害剤化合物（それらの薬学的に許容される塩を含む）を活性要素として含む本発明において使用される薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてよく、任意で、他の治療用要素または佐剤を含んでいてもよい。他の治療剤には、上にリストされたような、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、またはそのような薬剤の効果を増強する薬剤が含まれる。組成物には、経口投与、直腸投与、局所投与、および非経口（皮下、筋肉内、および静脈内を含む）投与のために適当な組成物が含まれるが、所定のケースにおいて最も適当なルートは、活性要素が投与される具体的な宿主ならびに状態の性質および重症度に依るであろう。薬学的組成物は、単位剤形で便利に提示され、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。
実際、本発明の阻害剤化合物（それらの薬学的に許容される塩を含む）は、従来の薬学的調合技術によって、薬学的担体と完全に混和された活性要素として組み合わせられ得る。担体は、投与のために望ましい調製物の形態、例えば、経口であるかそれとも非経口（静脈内を含む）であるかに依って、多様な形態をとることができる。従って、本発明の薬学的組成物は、予定された量の活性要素を各々含有しているカプセル、カシェ剤、または錠剤のような経口投与のために適当な不連続単位として提示され得る。さらに、組成物は、粉末として、顆粒として、溶液として、水性液体中の懸濁液として、非水性液体として、水中油型乳濁液として、または油中水型乳濁液として提示され得る。上に示された一般的な剤形に加えて、MAT2A阻害剤化合物（それらの各成分の薬学的に許容される塩を含む）は、放出制御手段および/または送達デバイスによって投与されてもよい。組み合わせ組成物は、薬学の方法のいずれかによって調製され得る。一般に、そのような方法は、1種または複数種の必要要素を構成する担体と活性成分を会合させる工程を含む。一般に、組成物は、活性成分を、液体担体もしくは微細に粉砕された固体担体または両方と、均一に完全に混和することによって調製される。次いで、生成物は、所望の形状へ便利に成形され得る。
本発明において使用される阻害剤化合物（それらの薬学的に許容される塩を含む）は、1種または複数種の他の治療的活性を有する化合物と組み合わせて薬学的組成物に含まれていてもよい。他の治療的活性を有する化合物には、上にリストされたように、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、またはそのような薬剤の効果を増強する薬剤が含まれ得る。従って、本発明の一つの態様において、薬学的組成物は、抗癌剤と組み合わせてMAT2A阻害剤化合物を含んでいてよく、抗癌剤は、アルキル化薬、代謝拮抗薬、微小管阻害剤、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソウレア、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、および抗血管形成剤からなる群より選択されるメンバーである。利用される薬学的担体は、例えば、固体、液体、または気体であり得る。固体担体の例には、ラクトース、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が含まれる。液体担体の例は、糖シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、および水である。気体担体の例には、二酸化炭素および窒素が含まれる。経口剤形のための組成物の調製において、任意の便利な薬学的媒体が利用され得る。例えば、水、グリコール、油、アルコール、風味剤、保存剤、着色剤等が、懸濁液、エリキシル、および溶液のような経口液体調製物を形成するために使用され得；デンプン、糖、結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等のような担体が、粉末、カプセル、および錠剤のような経口固体調製物を形成するために使用され得る。投与が容易であるため、錠剤およびカプセルが好ましい経口投薬単位であり、その場合、固体の薬学的担体が利用される。任意で、錠剤は、標準的な水性または非水性の技術によってコーティングされてもよい。本発明のために使用される組成物を含有している錠剤は、任意で、1種または複数種の補助成分または佐剤を用いて、圧縮または成型によって調製され得る。圧縮錠は、任意で、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、表面活性剤、または分散剤と混合された、粉末または顆粒のような流動性の形態の活性成分を、適当な機械で圧縮することによって調製され得る。成型錠は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、適当な機械で成型することによって作成され得る。各錠剤は、好ましくは、約0.05mg〜約5gの活性要素を含有しており、カシェ剤またはカプセルは、各々、好ましくは、約0.05mg〜約5gの活性要素を含有している。例えば、ヒトへの経口投与を目的とした製剤は、全組成物の約5〜約95パーセントで変動する適切で便利な量の担体材料と調合された、約0.5mg〜約5gの活性薬剤を含有していてよい。単位剤形は、一般に、約1mg〜約2g、典型的には、25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg、または1000mgの活性成分を含有しているであろう。
非経口投与のために適当な本発明において使用される薬学的組成物は、水中の活性化合物の溶液または懸濁液として調製され得る。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースのような適当な界面活性剤が含まれていてよい。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油中のそれらの混合物において調製され得る。さらに、保存剤が、微生物の不都合な増殖を防止するために含まれてもよい。注射可能な使用のために適当な本発明において使用される薬学的組成物には、無菌の水性の溶液または分散液が含まれる。さらに、組成物は、そのような無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末の形態であってもよい。全てのケースにおいて、最終の注射可能な形態は、無菌でなければならず、容易な注射可能性のために効果的に液状でなければならない。薬学的組成物は、製造および保管の条件の下で安定していなければならず；従って、好ましくは、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、植物油、およびそれらの適当な混合物を含有している溶媒または分散媒であり得る。本発明のための薬学的組成物は、例えば、エアロゾル、クリーム、軟膏、ローション、散布粉剤等のような局所的使用のために適当な形態であり得る。さらに、組成物は、経皮デバイスにおいて使用するために適当な形態であり得る。これらの製剤は、従来の加工方法を介して、MAT2A阻害剤化合物（それらの薬学的に許容される塩を含む）を利用して調製され得る。一例として、クリームまたは軟膏は、所望の硬度を有するクリームまたは軟膏を作製するため、親水性材料および水を、約5wt％〜約10wt％の化合物と混和することによって調製される。
本発明のための薬学的組成物は、直腸投与のために適当な形態であってよく、その場合、担体は固体である。混合物は単位用量坐薬を形成することが望ましい。適当な担体には、当技術分野において一般的に使用されているカカオ脂およびその他の材料が含まれる。坐薬は、最初に、組成物を軟化または融解された担体と混和した後、冷却し、金型において成形することによって便利に形成され得る。前記の担体要素に加えて、前記の薬学的製剤は、適宜、希釈剤、緩衝液、風味剤、結合剤、界面活性剤、濃化剤、滑沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）等のような1種または複数種の付加的な担体要素を含むことができる。さらに、製剤を意図された受容者の血液と等張にするため、その他の佐剤が含まれてもよい。MAT2A阻害剤化合物（それらの薬学的に許容される塩を含む）を含有している組成物は、粉末または液体の濃縮形態で調製されてもよい。
本発明を実施するために使用される化合物の投薬量レベルは、およそ、本明細書に記載されたようなもの、またはこれらの化合物について当技術分野において記載されているようなものであろう。しかしながら、具体的な患者のための具体的な用量レベルは、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与の時間、投与のルート、排泄の速度、薬物の組み合わせ、および治療を受ける具体的な疾患の重症度を含む多様な因子に依るであろうことが理解される。
例えば、本発明に関連するテクノロジーの分野において利用可能な優れたマニュアルおよび教科書の多くに記載されているような（例えば、Using Antibodies,A Laboratory Manual,edited by Harlow,E.and Lane,D.,1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,（例えば、ISBN 0-87969-544-7）；Roe B.A.et.al.1996,DNA Isolation and Sequencing(Essential Techniques Series),John Wiley & Sons.（例えば、ISBN 0-471-97324-0）；Methods in Enzymology:Chimeric Genes and Proteins",2000,ed.J.Abelson,M.Simon,S.Emr,J.Thorner.Academic Press;Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001,3rd Edition,by Joseph Sambrook and Peter MacCallum(以前のManiatis Cloning manual)（例えば、ISBN 0-87969-577-3）；Current Protocols in Molecular Biology,Ed.Fred M.Ausubel,et.al.John Wiley & Sons（例えば、ISBN 0-471-50338-X）；Current Protocols in Protein Science,Ed.John E.Coligan,John Wiley & Sons（例えば、ISBN 0-471-11184-8）；およびMethods in Enzymology:Guide to protein Purification,1990,Vol.182,Ed.Deutscher,M.P.,Acedemic Press,Inc.（例えば、ISBN0-12-213585-7））、または分子生物学の実験方法を記載するための専門の多くの大学ウェブサイトおよび商業的ウェブサイトに記載されているような、当技術分野において公知の多くの別の実験方法が、本発明の実施において、本明細書に具体的に記載されたものの代わりに成功裡に使用され得る。
参照
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本発明は、以下の実施例から、よりよく理解されるであろう。しかしながら、当業者は、記述される具体的な方法および結果が、添付の特許請求の範囲においてより完全に記載される本発明を例示するものに過ぎず、決してそれらに限定されると見なされるべきでないことを、容易に認識するであろう。
細胞株
HCT116結腸癌MTAP wtおよびMTAP-/-同質遺伝子細胞株は、Horizon Discoveryから使用許可された。他の全ての細胞株は、American Type Culture Collection（ATCC）、RIKEN Bioresource Center細胞バンク、またはDSMZから入手された。
shRNAに基づくゲノムスクリーニング
6317遺伝子を標的とする50,468種のshRNAを含むshRNAライブラリーは、オンチップDNA合成によって、Cellecta,Incによって調製され、その後、pRSI16-U6-sh-13kCB22-HTS6-UbiC-TagRFP-2A-Puroベクターへクローニングされた（Cellecta,Incから入手可能なhGW Module 1ライブラリー）。レンチウイルスベクターの調製、滴定、ならびにHCT116-MTAP-/-細胞およびHCT116 MTAP WT細胞の形質導入は、供給元のshRNA Library Screening Reference Manual、v2a（www.cellecta.com）および（Kampmann and Weissman Nature Protocols 2014）に従って実施された。shRNAライブラリーバーコードインサートは、2ラウンドPCRによって増幅され、Illumina Hiseq 2000を使用して配列決定された。ライブラリーバーコードとの正確なマッチを有する全てのリードを、データ分析に含めた。
安定的な誘導可能shRNA細胞株およびcDNAレスキュー細胞株の生成
全てのshRNA構築物が、pLKO-Tet-onレンチウイルス骨格ベクター（Wiederschain et al.,2009）へクローニングされた。MTAP、PRMT5、Mat2a、およびRIOK1 wt、ならびに触媒失活変異体cDNAは、pLVX-IRES-neo/puro/blastレンチウイルスベクターにクローニングされた。標的とされた特異的な配列は以下の通りであった。
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全ての構築物が、配列決定によって確認された。レンチウイルスに基づく（shRNAまたはcDNAの過剰発現）構築物は、Broad Instituteからの標準的なTRCプロトコルを使用して作成された（http://www.broadinstitute.org/rnai/public/resources/protocols）。ウイルス形質導入の後、shRNAまたはcDNAを発現する細胞プールを、適切な薬物（ピューロマイシン、ネオマイシン、ブラストサイジン）によって選択した。
siRNAトランスフェクション
細胞は、供給元のプロトコルに従って、Lipofectamine RNAiMAX（13778-150、Life Technologies）を使用して、ON-Target plus SMARTpool siRNA（Dharmacon）によってトランスフェクトされた。標的の頑強で持続的なノックダウンを確実にするため、完全成長培地（RPMI＋10％FBS）において、24時間の回復期間によって隔てられた、2回の連続的なトランスフェクションを実施した。2回目のトランスフェクションの24時間後に、細胞をトリプシン処理し、計数し、96穴フォーマット増殖アッセイのために播種した。
増殖アッセイ
siRNAトランスフェクションまたは適宜の200ng/mlドキシサイクリンによる4日間の前処理の後、細胞を、1ウェル当たり2000細胞または3000細胞で96穴組織培養プレートに播種した。図面の説明に示されるように、t0および細胞培養期間の終わりに、平行アッセイプレートにおいて、Cell titer glo ATPアッセイ（Promega）を実施した。増殖（％）を、tend/t0の変化（％）として計算された。コロニー形成アッセイについては、細胞を、6穴プレートに1ウェル当たり1,000個で播種し、等しい体積の滅菌水を媒体対照として使用して、ドキシサイクリン処理（200ng/ml）を播種時に開始した。コロニーを、10日後に固定し、24時間、4.5％パラホルムアルデヒド溶液中の0.05％クリスタルバイオレットによって染色した。Li-Cor画像処理ソフトウェア（Li-Cor Bisciences,Lincoln NE）を使用して、コロニーを定量化した。
イムノブロッティング
使用された抗体は、PRMT5（2252S、Cell Signaling Technology）、Mat2a（sc-166452、Sanat Cruz Biotechnology）、MTAP（sc-100782、Santa Cruz Biotechnology）、H4R3me2s（A-3718、Epigentek）、ヒストンH4（ab10158、abcam）、eIF4E（9742、Cell Signaling）、RIOK1（A302-456A、Bethyl Laboratories,Inc.）、βアクチン（3700S、Cell Signaling Technology）であった。使用された二次抗体は、IRDye 680RDロバ抗ウサギ（926-68073、LI-COR）およびIRDye 800CWロバ抗マウス（926-32212、LI-COR）であった。
N-メチルトランスフェラーゼインビトロ活性アッセイ
MTAによるメチルトランスフェラーゼ阻害のインビトロスクリーニングおよびSAM Km測定は、Eurofins CEREP Panlabsにおいて、メチルトランスフェラーゼアッセイのパネルを使用して実施された。
代謝物抽出および標的LC-MS分析
培地分析のため、条件培地を、少なくとも24時間培養された細胞から収集し、LC-MS分析の前に20倍希釈した。細胞内代謝物のため、細胞数に対するノーマライゼーションの後、内部標準としてd8-プトレシンが添加された冷80/20(v/v)メタノール/水によって、有機抽出を実施した（1試料当たり100,000細胞が分析された）。次いで、試料を減圧下で乾燥させ、LC-MS分析まで-80℃で保管した。
重量（mg）に対するノーマライゼーションの後、d8-プトレシン内部標準を含有している80/20 MeOH/水（v/v）によって、急速凍結腫瘍を抽出した。1分間、最大振動数で組織溶解装置を使用して、腫瘍試料を均質化した。均質化された試料を、4℃で15分間、14,000RPMで遠心分離した。1ウェル当たり2mgの組織と等しい体積の上清を、減圧下で蒸発させ、LC-MS分析まで-80℃で保管した。インジェクション前に、乾燥抽出物を、0.1％ギ酸を含むLC-MSグレード水で再構成した。
抽出された試料を、以前に記載されたように（Jha et al.,2015）、QExactive orbitrap質量分析計（Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA）での定量的液体クロマトグラフィ/質量分析を使用して分析した。簡単に説明すると、Thermo Accela 1250ポンプによって、400μL/分で、水およびアセトニトリルにおける0.025％ヘプタフルオロ酪酸、0.1％ギ酸の勾配を送達した。固定相は、Atlantis T3、3μm、2.1×150mmカラムであった。QExactive Mass Spectrometerを、フルスキャンモードでデータを取得するため、70,000の分解能で使用した。データ分析を、MAVEN（Melamud et al.,2010）およびSpotfireで実施した。定量化を、外部校正曲線を使用して実施した。
結腸癌異種移植片におけるMAT2A阻害
インビボでのMAT2A阻害の効果を調査するため、誘導可能MAT2A shRNAを発現するHCT116同質遺伝子細胞株による異種移植片を調製した。確立された腫瘍の増殖におけるMAT2Aの役割を査定するため、ドキシサイクリンによる動物の処置の前に、腫瘍を形成させた。インビボのMAT2Aノックダウンの効率を、ウエスタンブロットによって確認した。インビボのMAT2A遺伝学的除去は、MTAP-/-遺伝子型ならびにwt MTAP遺伝子型の両方のHCT116異種移植片においてSAMレベルを低下させることが確認された。インビボの選択的な増殖阻害がオンターゲット効果であることを証明するため、拡張的なインビボ研究を、shMAT2Aの野生型MAT2Aレスキューアームによって実施した。この実験は、本発明者らの最初のインビボ研究において観察された効力を確認し、インビトロ研究の場合と同様に、MAT2A shRNAに対して耐性であるMAT2A cDNAを発現する異種移植片において増殖阻害がレスキューされた。
MAT2A阻害剤AG-512およびAG-673による腫瘍細胞増殖阻害
AG-512およびAG-673は、生化学的アッセイにおいてそれぞれ83nMおよび143nMのIC50を有するMAT2A酵素活性の低分子阻害剤であり、それぞれ80nMおよび490nMのIC50で細胞におけるSAMの産生を阻害した。HCT116細胞の同質遺伝子クローンを、MTAP遺伝子のエクソン6を欠失させ、MTAP発現の完全な喪失をもたらすため、遺伝学的に修飾し、親HCT116細胞と比較した。細胞を、96穴プレートにおいて増殖させ、MAT2A阻害剤AG-512およびAG-673によって4日間処理した。0日目にアッセイされた対照プレート（即ち、最初の薬物処理の時）に対して、4日目のウェルにおけるATPレベルを測定することによって、増殖（％）を決定した。図8Aに示されるように、AG-512は、8.98μMのIC50でwt MTAP細胞の腫瘍細胞増殖を阻害したが、MTAPヌル細胞においては143nMのIC50であった。同様に、AG-673は、2.76μMのIC50でwt MTAP細胞を阻害し、552nMのIC50でMTAPヌル細胞を阻害した。多様な化学構造を有する50を超える低分子阻害剤が、MTAPヌル腫瘍細胞の増殖を阻害することが観察され、それは、SAMレベルを低下させる化合物の効力と相関した。
細胞株パネルにおけるMAT2A阻害
332の細胞株（68のMTAPヌル、224のMTAP wt）を、96穴プレートにおいて増殖させ、ある用量範囲のMAT2A阻害剤またはAGI-673によって6日間処理した。各用量点についての増殖パーセント（％）を計算し、GI50（増殖の50％低下をもたらす薬物の濃度）を決定するために曲線適合を使用した。感受性の閾値としてGI50＜2μMを使用すると、MTAPヌル細胞株68のうち36（53％）がAGI-673阻害に対して感受性であり、MTAP wt細胞株224のうち34（15％）のみが感受性であった（p＝2e-9）。さらなるゲノム分析は、KRAS変異（G12XまたはG13X）も組み込まれている16のMTAPヌル細胞株のうち14（88％）が、AGI-673によるMAT2A阻害に対して感受性であったが、MTAP野生型細胞株49のうち24（49％）のみが、KRAS変異が存在する時に感受性であったことを明らかにした（p.008）。
参照による組み入れ
本明細書に開示された特許、公開された特許出願、およびその他の参照は、全て、参照によって明示的に本明細書に組み入れられる。
等価物
当業者は、ルーチンの実験のみを使用して、本明細書に具体的に記載された本発明の具体的な態様の多くの等価物を認識するかまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されるものとする。

Claims (26)

  1. 腫瘍細胞をMAT2A阻害剤とインビトロで接触させることによって、腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得るか否かを決定する方法であって、腫瘍細胞におけるMTAPの状態を決定する工程を含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能に基いて、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることが決定される、方法。
  2. MTAP遺伝子の欠如が決定される、請求項1記載の方法。
  3. KRAS変異の存在を決定する工程をさらに含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能、およびKRAS変異の存在に基いて、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることが決定される、請求項1または2記載の方法。
  4. p53変異の存在を決定する工程をさらに含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能、およびp53変異の存在に基いて、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることが決定される、請求項1または2記載の方法。
  5. 腫瘍細胞を特徴決定するための方法であって、対象から採取された腫瘍細胞において、MTAP遺伝子発現のレベルを測定するか、MTAP遺伝子の存在もしくは欠如を検出するか、または存在するMTAPタンパク質のレベルを測定する工程を含み、参照細胞と比べた、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能に基いて、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることが決定される、方法。
  6. 腫瘍細胞におけるMTAP遺伝子の欠如が検出される、請求項5記載の方法。
  7. KRAS変異の存在を検出する工程をさらに含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能、およびKRAS変異の存在に基いて、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることが決定される、請求項5または6記載の方法。
  8. p53変異の存在を検出する工程をさらに含み、MTAP発現の低下もしくは欠如またはMTAP遺伝子の欠如またはMTAPタンパク質の低下したレベルもしくは機能、およびp53変異の存在に基いて、MAT2A阻害剤によって腫瘍細胞の生存または増殖が阻害され得ることが決定される、請求項5または6記載の方法。
  9. 腫瘍試料において、MTAP遺伝子の発現レベル、MTAP遺伝子の欠如、またはMTAPタンパク質のレベルもしくは機能の低下を測定するための試薬を含み、治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を投与するための説明書をさらに含む、対象が、MAT2A阻害剤による阻害に対して低感受性の腫瘍に罹患しているかまたは増加した発症リスクを有するか否かを決定するためのキット。
  10. 試薬が、試料中のMTAP遺伝子の欠如を検出するためのものである、請求項9記載のキット。
  11. KRAS変異の存在を検出するための試薬をさらに含む、請求項9または10記載のキット。
  12. p53変異の存在を検出するための試薬をさらに含む、請求項9または10記載のキット。
  13. KRAS変異が、アミノ酸置換G12XまたはG13Xである、請求項3または7記載の方法。
  14. KRAS変異が、G12C、G12D、G12R、G12V、またはG13Dである、請求項13記載の方法。
  15. p53変異が、Y126_スプライス、K132Q、M133K、R174fs、R175H、R196*、C238S、C242Y、G245S、R248W、R248Q、I255T、D259V、S261_スプライス、R267P、R273C、R282W、A159V、またはR280Kである、請求項4または8記載の方法。
  16. MAT2A阻害剤が、以下の式の化合物である、請求項1〜8および13〜15のいずれか一項記載の方法：
    X-Ar1-CRa=CRb-Ar2
    式中、 RaおよびRbは、独立して、H、アルキル、ハロ、アルコキシ、またはシアノであり；
    Xは、Ar1上の少なくとも1個のハロゲンを表し；
    Ar1およびAr2の各々は、アリールまたはヘテロアリールであり、これらはハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、またはNR11CONR12R13によってさらに置換されていてもよく、ここでR11、R12、およびR13は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
    ただし、Ar2は、アリール環内に少なくとも1個の窒素原子またはAr2上に少なくとも1個のNRcRdZ置換基を含有しており、ここで、Rcは、H、アルキル、アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールであり、Rdは、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、または酸素である。
  17. MAT2A阻害剤が、以下の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはそのビオチン化誘導体である、請求項1〜8および13〜15のいずれか一項記載の方法：
    Figure 0006877429
    式中、
    RaおよびRbは、独立して、H、アルキル、ハロ、アルコキシ、またはシアノであり、
    R1〜R10は、独立して、H、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、アリールアルキルアミノ、ジアルキルオキシアミノ、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、またはNR11CONR12R13であり、ここで、R11、R12、およびR13は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
    ただし、R1〜R5の少なくとも1個は、ハロゲンであり；
    R6〜R10の少なくとも1個は、NRcRdZ置換基であり、ここで、Rcは、H、アルキル、アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールであり、Rdは、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、または酸素である。
  18. MAT2A阻害剤が、(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(4-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジフェニルアニリン；(E)-1-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-4-メチルピペラジン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルナフタレン-1-アミン；(E)-2-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-1-メチル-1H-イミダゾール；(E)-4-(2,3-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,5-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-2-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-3-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(3,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3,5-ジフルオロスチリル)N,N-ジメチルアニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,3,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,4,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-4-(2-クロロ-6-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジクロロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロフェネチル)-N,N-ジメチルアニリン；および(E)-2-ベンズアミド-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリンからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
  19. 治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を含む、対象におけるMTAPヌル癌を処置するための薬学的組成物であって、該処置が対象から採取された癌の試料におけるMTAP遺伝子の存在または欠如を検出する工程、および、MTAP遺伝子が欠如している場合、該対象に該薬学的組成物を投与する工程を含み、
    該MAT2A阻害剤が、以下の式の化合物である、薬学的組成物：
    X-Ar1-CRa=CRb-Ar2
    式中、
    RaおよびRbは、独立して、H、アルキル、ハロ、アルコキシ、またはシアノであり；
    Xは、Ar1上の少なくとも1個のハロゲンを表し；
    Ar1およびAr2の各々は、アリールまたはヘテロアリールであり、これらはハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、またはNR11CONR12R13によってさらに置換されていてもよく、ここでR11、R12、およびR13は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
    ただし、Ar2は、アリール環内に少なくとも1個の窒素原子またはAr2上に少なくとも1個のNRcRdZ置換基を含有しており、ここで、Rcは、H、アルキル、アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールであり、Rdは、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、または酸素である。
  20. 治療的に有効な量のMAT2A阻害剤を含む、対象におけるMTAPヌル癌を処置するための薬学的組成物であって、該処置が対象から採取された癌の試料におけるMTAP遺伝子の存在または欠如を検出する工程、および、MTAP遺伝子が欠如している場合、該対象に該薬学的組成物を投与する工程を含み、
    該MAT2A阻害剤が、以下の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはそのビオチン化誘導体である、薬学的組成物：
    Figure 0006877429
    式中、
    RaおよびRbは、独立して、H、アルキル、ハロ、アルコキシ、またはシアノであり、
    R1〜R10は、独立して、H、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、アリールアルキルアミノ、ジアルキルオキシアミノ、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、またはNR11CONR12R13であり、ここで、R11、R12、およびR13は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
    ただし、R1〜R5の少なくとも1個は、ハロゲンであり；
    R6〜R10の少なくとも1個は、NRcRdZ置換基であり、ここで、Rcは、H、アルキル、アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールであり、Rdは、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、または酸素である。
  21. MAT2A阻害剤が、(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(4-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジフェニルアニリン；(E)-1-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-4-メチルピペラジン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルナフタレン-1-アミン；(E)-2-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-1-メチル-1H-イミダゾール；(E)-4-(2,3-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,5-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-2-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-3-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(3,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3,5-ジフルオロスチリル)N,N-ジメチルアニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,3,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,4,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-4-(2-クロロ-6-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジクロロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロフェネチル)-N,N-ジメチルアニリン；および(E)-2-ベンズアミド-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリンからなる群より選択される、請求項20記載の薬学的組成物。
  22. MAT2A阻害剤が、以下の式の化合物である、請求項9〜12のいずれか一項記載のキット：
    X-Ar1-CRa=CRb-Ar2
    式中、
    RaおよびRbは、独立して、H、アルキル、ハロ、アルコキシ、またはシアノであり；
    Xは、Ar1上の少なくとも1個のハロゲンを表し；
    Ar1およびAr2の各々は、アリールまたはヘテロアリールであり、これらはハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、またはNR11CONR12R13によってさらに置換されていてもよく、ここでR11、R12、およびR13は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
    ただし、Ar2は、アリール環内に少なくとも1個の窒素原子またはAr2上に少なくとも1個のNRcRdZ置換基を含有しており、ここで、Rcは、H、アルキル、アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールであり、Rdは、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、または酸素である。
  23. MAT2A阻害剤が、以下の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはそのビオチン化誘導体である、請求項9〜12のいずれか一項記載のキット：
    Figure 0006877429
    式中、
    RaおよびRbは、独立して、H、アルキル、ハロ、アルコキシ、またはシアノであり、
    R1〜R10は、独立して、H、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ジアルキルアミノのN-オキシド、アリールアルキルアミノ、ジアルキルオキシアミノ、トリアルキルアンモニウム、メルカプト、アルキルチオ、アルカノイル、ニトロ、ニトロシル、シアノ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリール、ヘテロアリール、スルホニル、スルホンアミド、CONR11R12、NR11CO(R13)、NR11COO(R13)、またはNR11CONR12R13であり、ここで、R11、R12、およびR13は、独立して、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはフッ素であり；
    ただし、R1〜R5の少なくとも1個は、ハロゲンであり；
    R6〜R10の少なくとも1個は、NRcRdZ置換基であり、ここで、Rcは、H、アルキル、アルコキシ、アリール、またはヘテロアリールであり、Rdは、アルキル基であり、Zは、非共有電子対、H、アルキル、または酸素である。
  24. MAT2A阻害剤が、(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(4-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジフェニルアニリン；(E)-1-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-4-メチルピペラジン；(E)-4-(2-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルナフタレン-1-アミン；(E)-2-(4-(2-フルオロスチリル)フェニル)-1-メチル-1H-イミダゾール；(E)-4-(2,3-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,5-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-2-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-3-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジエチルアニリン；(E)-4-(3,4-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(3,5-ジフルオロスチリル)N,N-ジメチルアニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,3,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-N,N-ジメチル-4-(2,4,6-トリフルオロスチリル)アニリン；(E)-4-(2-クロロ-6-フルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジクロロスチリル)-N,N-ジメチルアニリン；(E)-4-(2,6-ジフルオロフェネチル)-N,N-ジメチルアニリン；および(E)-2-ベンズアミド-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリンからなる群より選択される、請求項23記載のキット。
  25. 癌にKRAS変異が組み込まれている、請求項19または20記載の薬学的組成物。
  26. 癌にp53変異が組み込まれている、請求項19または20記載の薬学的組成物。
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