DE60111236T2

DE60111236T2 - Hybriden von crystal proteinen aus bacillus thurigiensis

Info

Publication number: DE60111236T2
Application number: DE60111236T
Authority: DE
Inventors: Nadine Barbara Carozzi; Scott M. Rabe; Paul J. Miles; Gregory Wayne Warren; Petrus Theodorus De Haan
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2021-08-24
Also published as: AU2001285900B2; WO2002015701A2; CN1449250A; DE60111236D1; CA2419029A1; CN100353846C; KR100581163B1; JP2004506432A; EP1311162A2; ES2243543T3; ATE296539T1; AU8590001A; EP1311162B1; KR20030029858A; WO2002015701A3; AR030576A1; BR0113500A

Description

Die Erfindung betrifft neue insektizide Toxine, die aus insektiziden Kristallproteinen von Bacillus thuringiensis stammen, Nukleinsäuresequenzen, deren Expression zu den Toxinen führt, und Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung der Toxine und entsprechender Nukleinsäuresequenzen zur Bekämpfung von Insekten.
Insektenschädlinge sind eine Hauptursache für Ernteverluste. Allein in den USA gehen jedes Jahr Milliarden von Dollar aufgrund von Befall durch verschiedene Insektengattungen verloren. Zusätzlich zu den Verlusten an Feldanbauten sind Insektenschädlinge ebenfalls eine Belastung für Obst- und Gemüseproduzenten, für Erzeuger von Zierblumen und sind eine Last für Gärtner und Eigenheimbesitzer.
Insektenschädlinge werden hauptsächlich durch intensive Ausbringungen von chemischen Insektiziden bekämpft, die durch Inhibierung des Insektenwachstums, Verhinderung der Insektenernährung oder -fortpflanzung oder den Tod der Insekten wirksam sind. Eine gute Insektenbekämpfung kann dadurch erreicht werden, aber diese Chemikalien können manchmal auch andere, nützliche Insekten beeinträchtigen. Ein weiteres Problem, das aus der weiten Verwendung von chemischen Pestiziden resultiert, ist das Auftreten resistenter Insektensorten. Dies wurde teilweise durch verschiedene Resistenzbehandlungsstrategien abgemildert, aber es gibt einen zunehmenden Bedarf an alternativen Schädlingsbekämpfungsmitteln.
Biologische Insektenbekämpfungsmittel, wie z.B. Bacillus thuringiensis-Stämme, die insektizide Toxine exprimieren, wurden ebenfalls mit zufriedenstellenden Ergebnissen eingesetzt und bieten dadurch eine Alternative oder Ergänzung zu chemischen Insektiziden. Bacillus thuringiensis gehört zur großen Gruppe von Gram-positiven, aeroben, endosporenbildenden Bakterien. Anders als andere, sehr eng verwandte Arten von Bacillus, wie z.B. B. cereus oder B. anthracis, erzeugt die Mehrzahl der bislang bekannten Bacillus thuringiensis-Arten im Verlauf ihrer Sporenbildung einen parasporalen Einschlusskörper, der aufgrund seiner kristallinen Struktur allgemein auch als kristalliner Körper bezeichnet wird. Dieser kristalline Körper ist aus insektizid wirksamen kristallinen Protoxinproteinen zusammengesetzt, den sogenannten δ-Endotoxinen. Diese Proteinkristalle sind verantwortlich für die Toxizität von Bacillus thuringiensis gegenüber Insekten. Das δ-Endotoxin weist keine Insektizide Aktivität bis nach der oralen Aufnahme des kristallinen Körpers auf, wenn letzterer im Darmsaft der Zielinsekten gelöst wird. In den meisten Fällen wird die tatsächliche toxische Komponente aus dem Proxin als Ergebnis einer proteolytischen Spaltung freigesetzt, die durch die Wirkung von Proteasen aus dem Verdauungstrakt der Insekten verursacht wird. Die δ-Endotoxine der verschiedenen Bacillus thuringiensis-Stämme sind durch eine hohe Spezifität in Bezug auf bestimmte Zielinsekten gekennzeichnet, speziell in Bezug auf verschiedene Lepidoptera-, Coleoptera- und Diptera-Larven, und durch einen hohen Grad an Aktivität gegen diese Larven. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von δ-Endotoxinen von Bacillus thuringiensis beruht auf der Tatsache, dass die Toxine harmlos für Menschen, andere Säugetiere, Vögel und Fische sind.
Auf der Basis von Sequenzhomologie und insektizider Spezifität wurden Bacillus thuringiensis-Kristallproteine in unterschiedliche Klassen kategorisiert. Am besten untersucht ist die Cry1-Klasse von Proteinen, die als 140 kDa-Protoxine erzeugt werden und wirksam gegenüber Lepidoptera-Arten sind. In einem gewissen Ausmaß wurde der Wirkungsmodus von Kristallproteinen aufgeklärt. Nach der oralen Aufnahme. lösen sich die Kristalle in der alkalischen Umgebung des Mitteldarms der Larven. Die solubilisierten Proteine werden anschließend durch Mitteldarm-Proteinasen (z.B. Trypsin) zu einem Proteinase-resistenten toxischen Fragment mit ca. 65 kDa verarbeitet, das an Rezeptoren auf Epithelzellen des Mitteldarms der Insekten bindet und die Zellmembran durchdringt. Dies führt schließlich zum Platzen der Zellen und Tod der Larven.
Das Aktivitätsspektrum eines speziellen Kristallproteins wird zu einem großen Anteil durch das Auftreten von Rezeptoren auf den Epithelzellen des Mitteldarms anfälliger Insekten bestimmt. Das Spektrum wird zusätzlich bestimmt durch die Effizienz der Solubilisierung des Kristallproteins und seine proteolytische Aktivierung in vivo. Die Bedeutung der Bindung des Kristallproteins an epitheliale Rezeptoren im Mitteldarm wird weiter gezeigt, wenn Insekten eine Resistenz gegen eines der Kristallproteine entwickelt haben, indem die Bindung von Kristallproteinen an Epithelzellen im Mitteldarm in resistenten Insekten signifikant reduziert ist.
In den vergangenen Jahren wurden die Gene isoliert, die für einige dieser Kristallproteine codieren, und es wurde gezeigt, dass ihre Expression in heterologen Wirten ein weiteres Werkzeug zur Bekämpfung wirtschaftlich bedeutender Insektenschädlinge bereitstellt. Insbesondere hat die Expression von insektiziden Toxinen in transgenen Pflanzen, wie z.B. Bacillus thuringiensis-Kristallproteinen, einen wirksamen Schutz gegen ausgewählte Insektenschädlinge bereitgestellt, und transgene Pflanzen, die solche Toxine exprimieren, wurden kommerzialisiert, was es Landwirten erlaubt, die Ausbringungen chemischer Insektenbekämpfungsmittel zu reduzieren. Außerdem ist es ebenfalls möglich, rekombinante Toxine zu exprimieren, die eine ausgewählte Kombination von Funktionen besitzen, die entwickelt wurden, um den Grad der insektiziden Aktivität gegen ein besonderes Insekt oder eine besondere Insektenklasse zu steigern, oder um das Spektrum von Insekten zu erweitern, gegen das das Toxinprotein wirksam ist. Zum Beispiel können chimäre insektizide Proteine mit neuen Sequenzen konstruiert werden, die nicht in der Natur gefunden werden, indem der Toxinteil aus einem δ-Endotoxin mit dem Protoxin-(Schwanz)-Teil eines unterschiedlichen δ-Endotoxins kombiniert wird. Siehe z.B. WO 98/15170, das hier durch Verweis eingeführt wird.
Es wird angenommen, dass toxische Fragmente von Kristallproteinen aus drei unterschiedlichen Strukturdomänen zusammengesetzt sind. Domäne I, die am meisten N-terminale Domäne, besteht aus sieben α-Helizes und wird wahrscheinlich teilweise oder vollständig in die Zielzellmembran eingeführt. Domäne II umfasst drei β-Faltblätter in einer sogenannten griechischen Schlüsselkonformation. Von den meisten Forschern wird angenommen, dass die Domäne II mit Rezeptoren wechselwirkt und dadurch die Toxinspezifität bestimmt. Tatsächlich gibt es viele Hinweise, die Reste der Domäne II mit der spezifischen Toxizität und einer hochaffinen Bindung in Verbindung bringen. Domäne III, die am meisten C-terminale Domäne, besteht aus zwei β-Faltblättern in einer sogenannten Jellyroll-Konformation und wurde ebenfalls mit der Bestimmung der Spezifität in Verbindung gebracht. Eine Vertauschung der Domäne III zwischen Toxinen, wie z.B. durch Rekombination in vivo zwischen den codierenden Regionen, kann zu Veränderungen der spezifischen Aktivität führen. Bindungsexperimente unter Verwendung solcher Hybride haben gezeigt, dass Domäne III an der Bindung an mutmaßliche Rezeptoren von Zielinsekten beteiligt ist, was nahelegt, dass Domäne III ihre Rolle in der Spezifität durch eine Rolle in der Rezeptorerkennung ausüben kann. Falls sie auf Cry1-Sequenzen projiziert werden, läuft Domäne I von etwa Aminosäurerest 28 bis 260, Domäne II von etwa 260 bis 460 und Domäne III von etwa 460 bis 600. Siehe Nakamura et al., Agric. Biol. Chem. 54(3): 715–724 (1990); Li et al., Nature 353: 815– 821 (1991); Ge et al., J. Biol. Chem. 266(27): 17954–17958 (1991); und Honee et al., Mol. Microbiol. 5(11): 2799–2806 (1991). US-PS 5,736,131 (entsprechend WO 95/06730) beschreibt Bacillus thuringiensis-Hybridtoxinfragmente, die an ihrem C-Terminus die Domäne III eines ersten Cry-Proteins und an ihrem N-Terminus die Domänen I und II eines zweiten Cry-Proteins umfassen. Solche hybriden Kristallproteine besitzen eine veränderte insektizide Spezifität. Zum Beispiel umfasst das H04-Hybridtoxin, das ebenfalls in De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537–1543 (1996) beschrieben wird, an seinem N-Terminus Domänen I und II von Cry1Ab und an seinem C-Terminus Domäne III von Cry1C. H04 ist angegebenermaßen hochtoxisch für Spodoptera exigua (Zuckerrübeneule) im Vergleich mit dem parentalen Cry1Ab-Toxin und signifikant toxischer als das parentale Cry1C-Toxin. Siehe ebenfalls Bosch et al., FEMS Microbiology Letters 118: 129–134 (1994); Bosch et al., Bio/Technology 12: 915–918 (1994); De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(8): 2753–2757 (1996); und De Maagd et al., Mol. Microbiol. 31(2): 463–471 (1999). Ballester et al., Appl. Environ. Microbiol. 65(5): 1900–1903 (1999) beschreibt Bacillus thuringiensis-Hybridtoxine mit Substitutionen der Domäne III zwischen Cry1E, Cry1C und Cry1Ab. Rang et al., Appl. Environ. Microbiol. 65(7): 2918–2925 (1999) beschreibt Hybridgene, die durch Austauschen der Regionen, die für entweder Domäne I oder Domäne III codieren, zwischen Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1C und Cry1E hergestellt werden.
Trotz der früheren Erfolge, die durch Einfügen von insektenresistenten Genen durch Züchtungsprogramme und genetische Manipulation realisiert wurden, bleibt ein lang anhaltender, aber unerfüllter Bedarf an dem Auffinden neuer und wirksamer Insektenbekämpfungsmittel bestehen. Insbesondere benötigt werden Bekämpfungsmittel, die auf wirtschaftlich bedeutende Insektenschädlinge gerichtet sind, wie z.B. den Maiszünsler und den Asiatischen Baumwollwurm (Fall Army Worm), und die wirksam Insektenarten bekämpfen, die resistent gegen bestehende Insektenbekämpfungsmittel sind. Außerdem sind Mittel wünschenswert, deren Ausbringung die Umweltbelastung minimiert.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die zuvor genannten Bedürfnisse, indem neue Gensequenzen bereitgestellt werden, die hybride Bacillus thuringiensis-Toxine codieren, einschließlich synthetischer Nukleotidsequenzen, die zur Expression in Pflanzen optimiert sind. In bevorzugten Ausführungsformen codieren die neuen Gensequenzen verschiedene Formen des hybriden Bacillus thuringiensis-delta-Endotoxins H04, dessen Toxinteil die Domänen I und II von Cry1Ab und die Domäne III von Cry1C enthält. Die hybriden Bacillus thuringiensis-Toxine, die durch die neuen Gensequenzen codiert werden, sind hochwirksam gegen wirtschaftlich bedeutende Insektenschädlinge, wie den Asiatischen Baumwollwurm, den Roten Baumwollkapselwurm, den Tabakknospenwurm, den Maiszünsler und die Kohlmotte. Die hybriden Bacillus thuringiensis-Toxine können in multiplen Insektenbekämpfungsstrategien verwendet werden, was zu maximaler Effizienz bei minimalem Einfluss auf die Umwelt führt.
Die Erfindung ist weiterhin auf die hybriden insektiziden Toxine gerichtet, die aus der Expression der Nukleotidsequenzen der Erfindung resultieren, und auf Zusammensetzungen und Formulierungen, die die hybriden insektiziden Toxine enthalten, die die Fähigkeit von Insektenschädlingen, zu überleben, zu wachsen oder sich zu vermehren, inhibieren oder insektenbezogene Schädigung oder Verlust von Kulturpflanzen begrenzen können. Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zur Herstellung der Hybridtoxine und auf Verfahren der Verwendung der Nukleotidsequenzen, z.B. in transgenen Pflanzen, um Insektenresistenz zu verleihen, und auf Verfahren der Verwendung der Toxine und Zusammensetzungen und Formulierungen, die die Toxine umfassen, gerichtet, z.B. Ausbringen der Toxine, Zusammensetzung oder Formulierung auf mit Insekten befallene Flächen, oder zur prophylaktischen Behandlung von für Insekten anfälligen Flächen oder Pflanzen, um Schutz oder Resistenz gegen schädliche Insekten zu verleihen. Die Hybridtoxine können in multiplen Insektenbekämpfungsstrategien verwendet werden, was zu maximaler Effizienz bei minimalem Einfluss auf die Umwelt führt.
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung eines Insekts bereit, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Asiatischem Baumwollwurm, Rotem Baumwollkapselwurm, Tabakknospenwurm, Maiszünsler und Kohlmotte besteht, umfassend das Übertragen einer wirksamen Menge eines hybriden Bacillus thuringiensis-Toxins, das die Domänen I und II aus einem Cry1Ab-Toxin umfasst, verbunden in der Amino-zu-Carboxy-Richtung mit Domäne III aus einem Cry1C-Toxin, auf das Insekt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin eine Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 90% identisch mit SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10 ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10.
In einer anderen Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens der Erfindung umfasst das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin ferner eine C-terminale Schwanzregion, wie z.B. eine Cry1C-Schwanzregion oder eine Cry1Ab-Schwanzregion. Die C-terminale Schwanzregion kann voller Länge sein oder kann trunkiert sein, wie z.B. auf eine Länge von ca. 40 Aminosäuren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens der Erfindung umfasst das Übertragen einer wirksamen Menge des hybriden Bacillus thuringiensis-Toxins auf das Insekt das Füttern oder In-Kontakt-Bringen des Insekts mit transgenem Pflanzengewebe, das mit rekombinanter DNA transformiert wurde, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin codiert, worin die Expression des hybriden Bacillus thuringiensis-Toxins im transgenen Pflanzengewebe Resistenz gegen das Insekt verleiht. Bevorzugt ist die Nukleotidsequenz im wesentlichen identisch mit SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein hybrides Bacillus thuringiensis-Toxin codiert, umfassend: (a) einen N-terminalen Toxinteil, der die Domänen I und II aus einem Cry1Ab-Toxin umfasst, verbunden in der Amino-zu-Carboxy-Richtung mit Domäne III aus einem Cry1C-Toxin; und (b) eine C-terminale Schwanzregion aus einem Cry1Ab-Toxin. Bevorzugt umfasst das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin eine Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 90% identisch mit SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 ist. Besonders bevorzugt umfasst das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin SEQ ID NO: 6, 8 oder 10. Noch mehr bevorzugt ist die Nukleotidsequenz zu wenigstens 90% identisch mit SEQ ID NO: 5, 7 oder 9. Am meisten bevorzugt umfasst die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 5, 7 oder 9.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein chimäres Gen bereit, das eine heterologe Promotorsequenz umfasst, die funktionsfähig mit einem Nukleinsäuremolekül der Erfindung verbunden ist, wie oben beschrieben; einen rekombinanten Vektor, der ein solches chimäres Gen umfasst; eine transgene Wirtszelle (z.B. eine Pflanzenzelle), die ein solches chimäres Gen umfasst; eine transgene Pflanze (z.B. eine Mais-, Baumwoll-, Reis- oder Kohlpflanze), die eine solche transgene Pflanzenzelle umfasst; und Saatgut aus einer solchen transgenen Pflanze.
Gemäß noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Schutz einer Pflanze gegen Insekten bereit, umfassend das Exprimieren eines hybriden Bacillus thuringiensis-Toxins in einer Pflanze, die mit einem chimären Gen transformiert wurde, umfassend: (a) eine Nukleinsäure-Promotorsequenz, die in einer Pflanze die Transkription einer assoziierten codierenden Sequenz auf erhöhten Niveaus fördert, und (b) ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, das funktionsfähig mit der Promotorsequenz verbunden ist, worin die Expression des hybriden Bacillus thuringiensis-Toxins in der Pflanze die Pflanze gegen Insekten schützt.
Gemäß noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines hybriden Bacillus thuringiensis-Toxins bereit, das gegen Insekten wirksam ist, umfassend: (a) Erhalten einer erfindungsgemäßen transgenen Wirtszelle; und (b) Exprimieren des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung in der transgenen Wirtszelle, was zu einem hybriden Bacillus thuringiensis-Toxin führt, das wirksam gegen Insekten ist.
Gemäß noch einem anderem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer gegen Insekten resistenten Pflanze bereit, umfassend das Einführen eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls in die Pflanze, worin das Nukleinsäuremolekül in der Pflanze in einer zur Bekämpfung von Insekten wirksamen Menge exprimierbar ist.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder 17 umfasst; ein chimäres Gen, das eine heterologe Promotorsequenz umfasst, die funktionsfähig mit einem solchen Nukleinsäuremolekül verbunden ist; einen rekombinanten Vektor, der ein solches chimäres Gen umfasst; eine transgene Wirtszelle (z.B. eine Pflanzenzelle), die ein solches chimäres Gen umfasst; eine transgene Pflanze (z.B. eine Mais-, Baumwoll-, Reis- oder Kohlpflanze), die eine solche transgene Pflanzenzelle umfasst; und Saatgut aus einer solchen transgenen Pflanze.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein hybrides Bacillus thuringiensis-Toxin bereit, umfassend: (a) einen N-terminalen Toxinteil, der die Domänen I und II aus einem Cry1Ab-Toxin umfasst, verbunden in der Amino-zu-Carboxy-Richtung mit Domäne III aus einem Cry1C-Toxin; und (b) eine C-terminale Schwanzregion aus einem Cry1Ab-Toxin. Bevorzugt umfasst das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin der Erfindung eine Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 90% identisch mit SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 ist. Besonders bevorzugt umfasst das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin der Erfindung SEQ ID NO: 6, 8 oder 10.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die das hybride Bacillus thuringiensis-Toxin der Erfindung in einer zur Bekämpfung von Insekten wirksamen Menge umfasst.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten aus einer Untersuchung der folgenden Beschreibung der Erfindung und den nicht-beschränkenden Beispielen ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Sequenzen im Sequenzprotokoll
SEQ ID NO: 1 zeigt die Nukleotidsequenz, die das H04-Hybridtoxin codiert, beschrieben in De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537–1543 (1996), dessen Toxinteil an seinem N-Terminus die Domänen I und II von Cry1Ab und an seinem C-Terminus die Domäne III von Cry1C umfasst, plus einen Cry1C-Schwanzteil voller Länge.
SEQ ID NO: 2 zeigt die Aminosäuresequenz des durch die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz codierten H04-Hybridtoxins, umfassend die Toxindomänen I und II von Cry1Ab und die Toxindomäne III von Cry1C, plus einen Cry1C-Schwanzteil voller Länge.
SEQ ID NO: 3 zeigt eine synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 ohne einen Schwanz codiert, als ob der Trypsinort gespalten worden wäre.
SEQ ID NO: 4 zeigt die Aminosäuresequenz des durch die in SEQ ID NO: 3 gezeigte synthetische Nukleotidsequenz codierten H04-Toxinteils.
SEQ ID NO: 5 zeigt eine synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus einen Cry1Ab-Schwanzteil voller Länge codiert.
SEQ ID NO: 6 zeigt die Aminosäuresequenz des H04 + Cry1Ab-Schwanzes, codiert durch die in SEQ ID NO: 5 gezeigte synthetische Nukleotidsequenz. SEQ ID NO: 7 zeigt eine andere synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus einen Cry1Ab-Schwanzteil voller Länge codiert.
SEQ ID NO: 8 zeigt die Aminosäuresequenz des H04 + Cry1Ab-Schwanzes, codiert durch die SEQ ID NO: 7 gezeigte synthetische Nukleotidsequenz.
SEQ ID NO: 9 zeigt eine synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus die ersten 40 Aminosäuren des Cry1Ab-Schwanzes codiert.
SEQ ID NO: 10 zeigt die Aminosäuresequenz von H04 + 40 Aminosäuren des trunkierten Cry1Ab-Schwanzes, codiert durch die in SEQ ID NO: 9 gezeigte synthetische Nukleotidsequenz.
SEQ ID NO: 11 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1308, die den konstitutiven Mais-Ubiquitinpromotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der synthetischen Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 ohne einen Schwanz codiert, wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt.
SEQ ID NO: 12 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1436, die den wurzelbevorzugten Mais-MTL-Promotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der synthetischen Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus einen Cry1Ab-Schwanzteil voller Länge codiert, wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt.
SEQ ID NO: 13 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1441, die den konstitutiven Mais-Ubiquitinpromotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der synthetischen Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus einen Cry1Ab-Schwanzteil voller Länge codiert, wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt.
SEQ ID NO: 14 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1305, die den konstitutiven Mais-Ubiquitinpromotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der synthetischen Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus einen Cry1Ab-Schwanzteil codiert, wie in SEQ ID NO: 7 gezeigt.
SEQ ID NO: 15 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1313, die den konstitutiven Mais-Ubiquitinpromotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der synthetischen Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus einen Cry1Ab-Schwanzteil voller Länge codiert, wie in SEQ ID NO: 7 gezeigt.
SEQ ID NO: 16 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1435, die den wurzelbevorzugten Mais-MTL-Promotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der synthetischen Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus die ersten 40 Aminosäuren des Cry1Ab-Schwanzes codiert, wie in SEQ ID NO: 9 gezeigt.
SEQ ID NO: 17 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pZU578, die den Arabidopsis-Actin-2-Promotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der synthetischen Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus die ersten 40 Aminosäuren des Cry1Ab-Schwanzes codiert, wie in SEQ ID NO: 9 gezeigt.
Definitionen
"Aktivität" der Toxine der Erfindung bedeutet, dass die Toxine als oral wirksame Insektenbekämpfungsmittel funktionieren, eine toxische Wirkung besitzen oder den Insektenfraß unterbrechen oder davon abschrecken können, was den Tod des Insekts verursachen kann oder nicht. Wenn ein Toxin der Erfindung auf das Insekt übertragen wird, ist das Ergebnis typischerweise der Tod des Insekts, oder das Insekt frisst nicht an der Quelle, die das Toxin für das Insekt verfügbar macht.
"Assoziiert mit/funktionsfähig verbunden" bezeichnet zwei Nukleinsäuresequenzen, die physisch oder funktionell in Beziehung stehen. Zum Beispiel wird eine Promotor- oder regulatorische DNA-Sequenz als mit einer DNA-Sequenz "assoziiert" bezeichnet, die für eine RNA oder ein Protein codiert, falls die zwei Sequenzen funktionsfähig verbunden sind oder so angeordnet sind, dass die regulatorische DNA-Sequenz den Expressionsgrad der codierenden oder strukturellen DNA-Sequenz beeinflussen wird.
"Bindungsort" bezeichnet einen Ort auf einem Molekül, worin die Bindung zwischen dem Ort und dem Toxin reversibel ist, so dass der Ka-Wert zwischen dem Ort und dem Toxin in der Größenordnung von wenigstens 10⁴ dm³mol^–1 ist.
Ein "chimäres Gen" ist eine rekombinante Nukleinsäuresequenz, in der eine Promotor- oder regulatorische Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden oder damit assoziiert ist, die für eine mRNA codiert, oder die als Protein exprimiert wird, so dass die regulatorische Nukleinsäuresequenz die Transkription oder Expression der assoziierten Nukleinsäuresequenz regulieren kann. Die regulatorische Nukleinsäuresequenz des chimären Gens ist normalerweise nicht funktionsfähig mit der assoziierten Nukleinsäuresequenz verbunden, wie sie in der Natur gefunden wird.
Eine "codierende Sequenz" ist eine Nukleinsäuresequenz, die zu RNA transkribiert wird, wie z.B. mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense-RNA oder antisense-RNA. Bevorzugt wird die RNA dann in einem Organismus zur Erzeugung eines Proteins translatiert.
Komplementär: "komplementär" bezeichnet zwei Nukleotidsequenzen, die antiparallele Nukleotidsequenzen umfassen, die miteinander bei Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen den komplementären Basenresten in den antiparallelen Nukleotidsequenzen paaren können.
"Konservativ modifizierte Variationen" einer besonderen Nukleinsäuresequenz bezeichnen diejenigen Nukleinsäuresequenzen, die identische oder im wesentlichen identische Aminosäuresequenzen codieren, oder, wenn die Nukleinsäuresequenz keine Aminosäuresequenz codiert, im wesentlichen identische Sequenzen. Wegen der Entartung des genetischen Codes codieren eine große Anzahl von funktionell identischen Nukleinsäuren jedes gegebene Polypeptid. Zum Beispiel codieren die Codonen CGT, CGC, CGA, CGG, AGA und AGG alle die Aminosäure Arginin. Somit kann das Codon an jeder Position, an der ein Arginin durch ein Codon spezifiziert wird, zu jedem der entsprechenden beschriebenen Codonen verändert werden, ohne das codierte Protein zu verändern. Solche Nukleinsäurevariationen sind "stumme Variationen", die eine Art von "konservativ modifizierten Variationen" sind. Jede hier beschriebene Nukleinsäuresequenz, die ein Protein codiert, beschreibt ebenfalls jede mögliche stumme Variation, ausgenommen wenn anders angegeben. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nukleinsäure (ausgenommen ATG, das gewöhnlich das einzige Codon für Methionin ist) durch Standardtechniken modifiziert werden kann, um ein funktionell identisches Molekül zu liefern. Entsprechend ist jede "stumme Variation" einer Nukleinsäure, die ein Protein codiert, implizit in jeder beschriebenen Sequenz.
Außerdem wird ein Fachmann erkennen, dass individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen geringen Prozentanteil von Aminosäuren (typischerweise weniger als 5%, besonders typisch weniger als 1%) in einer codierten Sequenz verändern, addieren oder deletieren, "konservativ modifizierte Variationen" sind, wenn die Veränderungen zur Substitution einer Aminosäure gegen eine chemisch ähnliche Aminosäure führen. Konservative Substitutionstabellen, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind allgemein fachbekannt. Die folgenden fünf Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen für einander sind: aliphatisch: Glycin (G), Alanin (A), Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I); aromatisch: Phenylalanin (F), Thyrosin (Y), Trypotophan (W); schwefelhaltig: Methionin (M); Cystein (C); basisch: Arginin (R), Lysin (K), Histidin (H); sauer: Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Asparagin (N), Glutamin (Q). Siehe ebenfalls Creighton (1984), Proteins, W. H. Freeman and Company. Zusätzlich sind auch individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentanteil von Aminosäuren in einer codierten Sequenz verändern, addieren oder deletieren, "konservativ modifizierte Variationen".
Insekten "zu bekämpfen" bedeutet, durch eine toxische Wirkung die Fähigkeit von Insektenschädlingen, zu überleben, zu wachsen, zu fressen und/oder sich zu vermehren, zu inhibieren oder die insektenbezogene Schädigung oder einen solchen Verlust in Kulturpflanzen zu beschränken. Insekten "zu bekämpfen" kann das Töten der Insekten bedeuten oder nicht, obwohl es bevorzugt das Töten der Insekten bedeutet.
Entsprechend: Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeutet "entsprechend" oder "entspricht", dass dann, wenn die codierenden Nukleinsäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen unterschiedlicher δ-Endotoxine von Bacillus thuringiensis zu einander ausgerichtet werden, die Nuklein- oder Aminosäuren, die bestimmten nummerierten Positionen "entsprechen", diejenigen sind, die sich mit diesen Positionen decken, die aber nicht notwendigerweise in diesen genauen numerischen Positionen relativ zu der besonderen codierenden Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz des jeweiligen δ-Endotoxins sind. Wenn die codierende oder Aminosäuresequenz eines besonderen δ-Endotoxins (z.B. Cry1B) mit der codierenden oder Aminosäuresequenz eines Referenz-δ-Endotoxins (z.B. Cry1Ab) angeglichen wird, sind in gleicher Weise die Nukleinsäuren oder Aminosäuren in der Cry1B-Sequenz, die bestimmten nummerierten Positionen der Cry1Ab-Sequenz "entsprechen", diejenien, die sich mit diesen Positionen der Cry1Ab-Sequenz decken, aber nicht notwendigerweise in diesen genauen numerischen Positionen der jeweiligen codierenden Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz des Cry1B-Toxins sind.
Ein Toxin "zu übertragen" bedeutet, dass das Toxin in Kontakt mit einem Insekt kommt, was zu toxischer Wirkung und Bekämpfung des Insekts führt. Das Toxin kann in vielen anerkannten Wegen übertragen werden, z.B. oral durch Nahrungsaufnahme durch das Insekt oder durch Kontakt mit dem Insekt durch transgene Pflanzenexpression, formulierte Proteinzusammensetzung(en), sprühfähige Proteinzusammensetzung(en), eine Lockmittelmatrix oder jedes andere fachlich anerkannte Toxinübertragungssystem.
Eine "Expressionskassette", wie hier verwendet, bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die die Expression einer besonderen Nukleotidsequenz in einer geeigneten Wirtszelle ausrichten kann, umfassend einen Promotor, der funktionsfähig mit der interessierenden Nukleotidsequenz verbunden ist, die funktionsfähig mit Terminationssignalen verbunden ist. Sie umfasst typischerweise ebenfalls Sequenzen, die zur genauen Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. Die Expressionskassette, die die Nukleotidsequenz von Interesse umfasst, kann chimär sein, was bedeutet, das wenigstens eine ihrer Komponenten heterolog in Bezug auf wenigstens eine ihrer anderen Komponenten ist. Die Expressionskassette kann auch eine solche sein, die natürlich auftritt, aber in einer rekombinanten Form erhalten wurde, die zur heterologen Expression nützlich ist. Typischerweise ist die Expressionskassette jedoch heterolog in Bezug auf den Wirt, d.h. die besondere Nukleinsäuresequenz der Expressionskassette tritt nicht natürlich in der Wirtszelle auf und muss in die Wirtszelle oder einen Ahnen der Wirtszelle durch ein Transformationsereignis eingeführt worden sein. Die Expression der Nukleotidsequenz in der Expressionskassette kann unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors stehen, der die Transkription nur einleitet, wenn die Wirtszelle gewissen besonderen äußeren Reizen ausgesetzt wird. Im Falle eines mehrzelligen Organismus, wie z.B. einer Pflanze, kann der Promotor auch spezifisch für ein besonderes Gewebe oder Organ oder Entwicklungsstadium sein.
Gen: Der Begriff "Gen" wird breit verwendet, um jedes Segment von DNA zu bezeichnen, das mit einer biologischen Funktion verbunden ist. So schließen Gene codierende Sequenzen und/oder die regulatorischen Sequenzen ein, die zu ihrer Expression erforderlich sind. Gene schließen ebenfalls nicht-exprimierte DNA-Segmente ein, die z.B. Erkennungssequenzen für andere Proteine bilden. Gene können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden, einschließlich Klonierung aus einer interessierenden Quelle oder Synthese aus einer bekannten oder vorhergesagten Sequenzinformation, und können Sequenzen einschließen; die geschaffen wurden, um gewünschte Parameter zu besitzen.
"Interessierendes Gen" bezeichnet jedes Gen, das bei Übertragung auf eine Pflanze der Pflanze eine gewünschte Eigenschaft verleiht, wie z.B. Antibiotikaresistenz, Virusresistenz, Insektenresistenz, Krankheitsresistenz oder Resistenz gegen andere Schädlinge, Herbizidtoleranz, verbesserter Nährwert, verbesserte Leistung in einem industriellen Verfahren oder veränderte Vermehrungsfähigkeit. Das "interessierende Gen" kann ebenfalls eines sein, dass auf Pflanzen zur Herstellung von gewerblich wertvollen Enzymen oder Metaboliten in der Pflanze übertragen wird.
Wie hier verwendet, bezeichnet "H04" das hybride Bt-Toxin, das beschrieben wird in De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537–1543 (1996), dessen Toxinfragment an seinem N-Terminus die Domänen I und II von Cry1Ab und an seinem C-Terminus die Domäne III von Cry1C umfasst.
Heterologe Nukleinsäuresequenz: Die Begriffe "heterologe Nukleinsäure- [oder DNA-] Sequenz", "exogenes Nukleinsäure- [oder DNA-] Segment" oder "heterologes Gen", wie hier verwendet, bezeichnen jeweils eine Sequenz, die aus einer Quelle stammt, die für die besondere Wirtszelle fremd ist oder, falls aus der gleichen Quelle, gegenüber ihrer ursprünglichen Form modifiziert ist. Somit schließt ein heterologes Gen in einer Wirtszelle ein Gen ein, das endogen für die besondere Wirtszelle ist, aber z.B. durch Verwendung von Codonoptimierung modifiziert wurde. Die Begriffe schließen ebenfalls nicht-natürlich vorkommende multiple Kopien einer natürlich vorkommenden Sequenz ein. Somit bezeichnen die Begriffe ein Nukleinsäuresegment, das für die Zelle fremd oder heterolog ist oder für die Zelle homolog, aber in einer Position innerhalb der Nukleinsäure der Wirtszelle, in der das Element gewöhnlich nicht gefunden wird. Exogene Nukleinsäuresegmente werden exprimiert, um exogene Polypeptide zu liefern.
Eine "homologe" Nukleinsäure- [oder DNA-] Sequenz ist eine natürlich mit einer Wirtszelle, in die sie eingeführt wird, assoziierte Nukleinsäure- [oder DNA-] Sequenz.
"Homologe Rekombination" ist der reziproke Austausch von Nukleinsäurefragmenten zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen.
"Homoplastidisch" bezeichnet eine Pflanze, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanzenzelle, worin alle Plastide genetisch identisch sind. Dies ist der normale Zustand in einer Pflanze, wenn die Plastide nicht transformiert, mutiert oder in anderer Weise genetisch verändert wurden. In unterschiedlichen Geweben oder Entwicklungsstadien können die Plastide unterschiedliche Formen annehmen, z.B. Chloroplasten, Proplastide, Etioplasten, Amyloplasten, Chromoplasten usw.
Die Begriffe "identisch" oder prozentuale "Identität" im Zusammenhang von zwei oder mehr Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen bezeichnen zwei oder mehr Sequenzen oder Untersequenzen, die die gleichen sind oder einen angegebenen Prozentwert von Aminosäureresten oder Nukleotiden besitzen, die bei Vergleich und Angleichung für maximale Übereinstimmung gleich sind, gemäß Messung unter Verwendung eines der nachfolgend beschriebenen Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch visuelle Untersuchung.
"Insektizid" wird als eine toxische biologische Aktivität definiert, die Insekten bekämpfen kann, bevorzugt durch ihre Tötung.
Eine Nukleinsäuresequenz ist mit einer Referenz-Nukleinsäuresequenz "isocodierend" (neutral), wenn die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie das Polypeptid codiert, das durch die Referenz-Nukleinsäuresequenz codiert wird.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül oder isoliertes Enzym ist ein Nukleinsäuremolekül oder Enzym, das durch Menschenhand außerhalb seiner nativen Umgebung existiert und deshalb nicht ein Produkt der Natur ist. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül oder Enzym kann in einer gereinigten Form existieren oder kann in einer nicht-nativen Umgebung existieren, wie z.B. in einer rekombinanten Wirtszelle.
Eine "Verbindungsstelle" ("juncture") zwischen Toxindomäne in einem Hybridtoxin, d.h. zwischen den Domänen II und III eines erfindungsgemäßen hybriden Insektiziden Toxins, ist die/der homologe Überkreuzungsregion oder -ort im Hybrid. Aminosäuren zur Linken des Überkreuzungsorts sind aus einem parentalen Toxin, wohingegen Aminosäuren zur Rechten des Überkreuzungsorts aus dem anderen parentalen Toxin sind.
Reifes Protein: Ein Protein, das normalerweise auf eine Zellorganelle gerichtet ist und aus dem das Transitpeptid entfernt wurde.
Minimalpromotor: Promotorelemente, insbesondere ein TATA-Element, die inaktiv sind oder eine stark reduzierte Promotoraktivität in Abwesenheit von Stromaufwärtsaktivierung besitzen. In Gegenwart eines geeigneten Transkriptionsfaktors wirkt der Minimalpromotor, um eine Transkription zu erlauben.
Nativ: bezeichnet ein Gen, das im Genom einer untransformierten Zelle vorhanden ist.
Natürlich vorkommend (auftretend): Der Begriff "natürlich vorkommend" wird zur Beschreibung eines Objekts verwendet, das in der Natur gefunden wird, im Gegensatz zur künstlichen Herstellung durch den Menschen. Zum Beispiel ist ein Protein oder eine Nukleotidsequenz, das/die in einem Organismus (einschließlich Virus) vorhanden ist, der aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und der nicht absichtlich durch den Menschen im Labor modifiziert wurde, natürlich vorkommend.
Nukleinsäure: Der Begriff "Nukleinsäure" bezeichnet Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon in entweder einsträngiger oder doppelsträngiger Form. Wenn nicht spezifisch beschränkt, umfasst der Begriff Nukleinsäuren, die bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden enthalten, die ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenz-Nukleinsäure besitzen und in einer ähnlichen Weise zu natürlich vorkommenden Nukleotiden metabolisiert werden. Wenn nicht anders angegeben, umfasst eine besondere Nukleinsäuresequenz ebenfalls implizit konservativ modifizierte Varianten davon (z.B. degenerierte Codonsubstitutionen) und komplementäre Sequenzen sowie die explizit angegebene Sequenz. Spezifisch können degenerierte Codonsubstitutionen durch Erzeugung von Sequenzen erreicht werden, in denen die dritte Position eines oder mehrerer ausgewählter (oder aller) Codonen mit gemischten Base- und/oder Desoxyinosin-Resten substituiert ist (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605–2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91–98 (1994)). Die Begriffe "Nukleinsäue" oder "Nukleinsäuresequenz" können ebenfalls austauschbar mit Gen, cDNA und durch ein Gen codierte mRNA verwendet werden.
"ORF" bedeutet offenes Leseraster ("Open Reading Frame").
Mit "Teil" eines Proteins ist ein Peptid gemeint, das das Protein umfasst und wenigstens 80% seiner konsekutiven Sequenz aufweist.
Eine "Pflanze" ist jede Pflanze in jedem Entwicklungsstadium, insbesondere eine Samenpflanze.
Eine "Pflanzenzelle" ist eine strukturelle und physiologische Einheit einer Pflanze, die einen Protoplasten und eine Zellwand umfasst. Die Pflanzenzelle kann in Form einer isolierten einzelnen Zelle oder einer kultivierten Zelle oder als Teil einer höheren organisierten Einheit sein, wie z.B. Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze.
"Pflanzenzellkultur" bedeutet Kulturen von Pflanzeneinheiten, wie z.B. Protoplasten, Zellkulturzellen, Zellen in Pflanzengeweben, Pollen, Pollenschläuche, Eizellen, Embryosäcke, Zygoten und Embryos in verschiedenen Entwicklungsstadien.
"Pflanzenmaterial" bezeichnet Blätter, Stengel, Wurzeln, Blüten oder Blütenteile, Früchte, Pollen, Eizellen, Zygoten, Samen, Stecklinge, Zell- oder Gewebekulturen oder jedes andere Teil oder Produkt einer Pflanze.
Ein "Pflanzenorgan" ist ein ausgeprägter und sichtbar strukturierter und differenzierter Teil einer Pflanze, wie z.B. Wurzel, Stengel, Blatt, Blütenknospe oder Embryo.
"Pflanzengewebe", wie hier verwendet, bedeutet eine Gruppe von Pflanzenzellen, die zu einer strukturellen und funktionellen Einheit organisiert sind. Jedes Gewebe einer Pflanze in planta oder in Kultur ist eingeschlossen. Dieser Begriff schließt ganze Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzensamen, Gewebekultur und jede Gruppe von Pflanzenzellen, die zu strukturellen und/oder funktionellen Einheiten organisiert sind, ein, aber ist nicht darauf beschränkt. Die Verwendung dieses Begriffs in Verbindung mit oder Abwesenheit von jedem spezifischen Typ von Pflanzengewebe, wie oben aufgeführt oder ansonsten von dieser Definition umfasst, soll nicht als exklusiv für jeden anderen Typ von Pflanzengewebe gedacht sein.
Ein "Promotor" ist eine untranslatierte DNA-Sequenz stromaufwärts der codierenden Region, die den Bindungsort für RNA-Polymerase II enthält und die Transkription der DNA einleitet. Die Promotorregion kann auch andere Elemente einschließen, die als Regulatoren der Genexpression wirken.
Ein "Protoplast" ist eine isolierte Pflanzenzelle ohne eine Zellwand oder mit nur Teilen der Zellwand.
Gereinigt: Der Begriff "gereinigt", bei Anwendung auf eine Nukleinsäue oder ein Protein, bezeichnet, dass die Nukleinsäure oder das Protein im wesentlichen frei von anderen zellulären Komponenten ist, mit denen sie/es im natürlichen Zustand verbunden ist. Sie/es ist bevorzugt in einem homogenen Zustand, obwohl sie/es in einer entweder trockenen oder wässrigen Lösung sein kann. Reinheit und Homogenität werden typischerweise unter Verwendung von Techniken der analytischen Chemie bestimmt, wie z.B. Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochleistungsflüssigchromatographie. Ein Protein, das die vorherrschende Art ist, die in einer Zubereitung vorhanden ist, ist im wesentlich gereinigt. Der Begriff "gereinigt" bezeichnet, dass eine Nukleinsäure oder ein Protein im wesentlichen zu einer Bande in einem elektrophoretischen Gel führt. Insbesondere bedeutet es, dass die Nukleinsäure oder das Protein zu wenigstens ca. 50% rein ist, besonders bevorzugt zu wenigstens ca. 85% rein und am meisten bevorzugt zu wenigstens ca. 99% rein.
Zwei Nukleinsäuren sind "rekombiniert", wenn Sequenzen aus jeder der zwei Nukleinsäuren in Abkömmlingsnukleinsäure kombiniert sind. Zwei Sequenzen sind "direkt" rekombiniert, wenn beide Nukleinsäuren Substrate zur Rekombination sind. Zwei Sequenzen sind "indirekt rekombiniert", wenn die Sequenzen unter Verwendung einer Zwischenstufe rekombiniert sind, wie z.B. mit einem Überkeuzungsoligonukleotid. Zur indirekten Rekombination ist nicht mehr als eine der Sequenzen ein tatsächliches Substrat zur Rekombination, und in manchen Fällen ist keine Sequenz ein Substrat zur Rekombination.
"Regulatorische Elemente" bezeichneten Sequenzen, die an der Kontrolle der Expression einer Nukleotidsequenz beteiligt sind. Regulatorische Elemente umfassen einen Promotor, der funktionsfähig mit der interessierenden Nukleotidsequenz verbunden ist, und Terminationssignale. Sie umfassen auch typischerweise Sequenzen, die zur genauen Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind.
Substantiell identisch: Der Begriff "sustantiell (im wesentlichen) identisch" im Zusammenhang von zwei Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen bezeichnet zwei oder mehr Sequenzen oder Untersequenzen, die wenigstens 60%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90%, noch mehr bevorzugt 95% oder am meisten bevorzugt wenigstens 99% Nukleotid- oder Aminosäurerestidentität bei Vergleich und Angleichung zur maximalen Entsprechung aufweisen, gemäß Messung unter Verwendung eines der nachfolgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch visuelle Untersuchung. Bevorzugt besteht die substantielle Identität über eine Region der Sequenzen, die wenigstens ca. 50 Reste lang ist, besonders bevorzugt über eine Region von wenigstens ca. 100 Resten, und am meisten bevorzugt sind die Sequenzen substantiell identisch über wenigstens ca. 150 Reste. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Sequenzen substantiell identisch über die gesamte Länge der codierenden Regionen. Außerdem leisten substantiell identische Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen substantiell die gleiche Funktion.
Zum Sequenzvergleich fungiert typischerweise eine Sequenz als Referenzsequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, Untersequenzkoordinaten werden nach Bedarf festgelegt, und Parameter des Sequenzalgorithmusprogramms werden festgelegt. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann die prozentuale Sequenzidentität für die Testsequenz(en) relativ zur Referenzsequenz auf Basis der festgelegten Programmparameter.
Eine optimale Angleichung von Sequenzen zum Vergleich kann z.B. durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Waterman duchgeführt werden, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den Homologieangleichungsalgorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Verfahren der Ähnlichkeitssuche von Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 2444 (1988), durch computerisierte Implementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in der Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch visuelle Untersuchung (siehe allgemein Ausubel et al., unten).
Ein Beispiel für einen Algorithmus, der geeignet zur Bestimmung von prozentualer Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit ist, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al. beschrieben wird, J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990). Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich verfügbar durch das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst die Identifizierung von hoch punktenden Sequenzpaaren ("high scoring sequence pairs", HSPs) durch Identifizierung kurzer Worte der Länge W in der Abfragesequenz, die einer Grenzwertbewertung T mit positivem Wert entsprechen oder genügen, wenn sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz angeglichen werden. T wird als Wortbewertungsgrenzwert der Nachbarschaft bezeichnet (Altschul et al., 1990). Diese anfänglichen Nachbarschaftsworttreffer fungieren als Ausgangspunkte für Anfangssuchen, um längere HSPs zu finden, die sie enthalten. Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen entlang jeder Sequenz so weit ausgedehnt, wie die kumulative Angleichungsbewertung erhöht werden kann. Kumulative Bewertungen werden, für Nukleotidsequenzen, unter Verwendung der Parameter M (Belohnungsbewertung für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Strafbewertung für fehlübereinstimmende Reste; immer < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Bewertungsmatrix zur Berechnung der kumulativen Bewertung verwendet. Die Ausdehnung der Worttreffer in jede Richtung wird angehalten, wenn die kumulative Angleichungsbewertung um die Größe X von ihrem maximalen erreichten Wert abfällt, die kumulative Bewertung auf Null oder darunter aufgrund der Anhäufung eines oder mehrerer negativ bewertender Restangleichungen zurückgeht oder das Ende jeder Sequenz erreicht ist. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Angleichung. Das BLASTN-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, einen Anhaltewert von 100, M = 5, N = –4, und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Bewertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).
Zusätzlich zur Berechnung der prozentualen Sequenzidentität führt der BLAST-Algorithmus auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z.B. Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787 (1993)). Ein Maß der Ähnlichkeit, das vom BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe (P(N)), die einen Hinweis für die Wahrscheinlichkeit angibt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Zum Beispiel wird eine Test-Nukleinsäuresequenz als mit einer Referenzsequenz ähnlich betrachtet, falls die Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe in einem Vergleich der Test-Nukleinsäuresequenz mit der Referenz-Nukleinsäuresequenz weniger als ca. 0,1 ist, besonders bevorzugt weniger als ca. 0,01 und am meisten bevorzugt weniger als ca. 0,001.
Ein anderer Hinweis, dass zwei Nukleinsäuresequenzen substantiell identisch sind, besteht darin, dass die zwei Moleküle miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Der Begriff "spezifisch mit ... hybridisieren" bezeichnet die Bindung, Duplexierung oder Hybridisierung eines Moleküls nur mit einer besonderen Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn die Sequenz in einer komplexen Mischung (z.B. vollzellulär) von DNA oder RNA vorhanden ist. "Bindet substantiell" bezeichnet eine komplementäre Hybridisierung zwischen einer Sonden-Nukleinsäure und einer Ziel-Nukleinsäure und umfasst kleinere Fehlübereinstimmungen, die durch Reduzierung der Stringenz des Hybridisierungsmediums untergebracht werden können, um die gewünschte Detektion der Ziel-Nukleinsäuresequenz zu erreichen.
"Stringente Hybridisierungsbedingungen" und "stringente Hybridisierungswaschbedingungen" im Zusammenhang mit Nukleinsäure-Hybridisierungsexperimenten, wie z.B. Southern- und Northern-Hybridisierungen, sind sequenzabhängig und sind unter unterschiedlichen Umgebungsparametern unterschiedlich. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Eine umfassende Anleitung für die Hybridisierung von Nukleinsäuren wird in Tijssen (1993) gefunden, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York. Allgemein werden hochstringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit ca. 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH ausgewählt. Typischerweise wird eine Sonde unter "stringenten Bedingungen" mit ihrer Ziel-Untersequenz hybridisieren, aber nicht mit anderen Sequenzen.
T_m ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt übereinstimmenden Sonde hybridisieren. Sehr stringente Bedingungen werden als gleich mit T_m für eine besondere Sonde ausgewählt. Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen zur Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuren, die mehr als 100 komplementäre Reste aufweisen, auf einem Filter in einem Southern- oder Northern-Blot ist 50% Formamid mit 1 mg Heparin bei 42°C, wobei die Hybridisierung über Nacht durchgeführt wird. Ein Beispiel für hochstringente Waschbedingungen ist 0,1 5 M NaCl bei 72°C für ca. 15 Minuten. Ein Beispiel für stringente Waschbedingungen ist ein Waschen mit 0,2 × SSC bei 65°C für 15 Minuten (siehe Sambrook, unten, für eine Beschreibung von SSC-Puffer). Häufig geht einer hochstringenten Waschung eine niedrigstringente Waschung voraus, um Hintergrund-Sondensignal zu entfernen. Eine exemplarische mittelstringente Waschung für einen Duplex aus z.B. mehr als 100 Nukleotiden ist 1 × SSC bei 45°C für 15 Minuten. Eine exemplarische niedrigstringente Waschung für einen Duplex aus z.B. mehr als 100 Nukleotiden ist 4–6 × SSC bei 40°C für 15 Minuten. Für kurze Sonden (z.B. ca. 10 bis 50 Nukleotide) beinhalten stringente Bedingungen typischerweise Salzkonzentrationen von weniger als ca. 0,1 M Na-Ionen-, typischerweise ca. 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3, und die Temperatur ist typischerweise wenigstens ca. 30°C. Stringente Bedingungen können ebenfalls durch Zugabe von destabilisierenden Mitteln wie Formamid erreicht werden. Allgemein zeigt ein Signal-Rausch-Verhältnis, das 2× (oder höher) als das für eine nicht in Beziehung stehende Sonde im besonderen Hybridisierungstest beobachtete ist, die Detektion einer spezifischen Hybridisierung an. Nukleinsäuren, die nicht miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren, sind noch substantiell identisch, falls die Proteine, die sie codieren, substantiell identisch sind. Dies tritt z.B. auf, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen, vom genetischen Code erlaubten Codonentartung geschaffen wird.
Nachfolgend sind Beispiele für Sätze von Hybridisierungs/Waschbedingungen, die verwendet werden können, um homologe Nukleotidsequenzen zu klonieren, die substantiell identisch mit Referenz-Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung sind: Eine Referenz-Nukleotidsequenz hybridisiert bevorzugt mit der Referenz-Nukleotidsequenz in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C, noch wünschenswerter in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C, noch wünschenswerter in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C, besonders bevorzugt in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C.
Ein weiterer Hinweis, dass zwei Nukleinsäuresequenzen oder Proteine substantiell identisch sind, ist derjenige, dass das durch die erste Nukleinsäure codierte Protein immunologisch mit dem Protein kreuzreagiert oder spezifisch daran bindet, das durch die zweite Nukleinsäure codiert wird. Somit ist ein Protein typischerweise substantiell identisch mit einem zweiten Protein z.B. dann, wenn sich die zwei Proteine nur durch konservative Substitutionen unterscheiden.
Der Begriff "bindet spezifisch (oder selektiv) an einen Antikörper" oder "spezifisch (oder selektiv) immunreaktiv gegenüber" bei Bezugnahme auf ein Protein oder Peptid bezeichnet eine Bindungsreaktion, die bestimmend für die Gegenwart des Proteins in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Mitteln ist. Somit binden unter festgelegten Immuntestbedingungen die spezifizierten Antikörper an ein besonderes Protein und binden nicht in signifikanter Menge an andere, in der Probe vorhandene Proteine. Die spezifische Bindung an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der wegen seiner Spezifität für ein besonderes Protein ausgewählt wird. Zum Beispiel können Antikörper, die gegen das Protein mit der Aminosäuresequenz erzeugt wurden, die durch jede der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung codiert wird, ausgewählt werden, um Antikörper zu erthalten, die spezifisch immunreaktiv gegenüber diesem Protein und nicht gegenüber anderen Proteinen sind, ausgenommen polymorphe Varianten. Eine Vielzahl von Immuntestformaten kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die spezifisch immunreaktiv gegenüber einem besonderen Protein sind. Zum Beispiel werden routinemäßig Festphasen-ELISA-Immunoassays, Western Blots oder Immunohistochemie verwendet, um monoklonale Antikörper auszuwählen, die spezifisch immunreaktiv gegenüber einem Protein sind. Siehe Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York ("Harlow und Lane"), für eine Beschreibung von Immunoassayformaten und -bedingungen, die zur Bestimmung von spezifischer Immunreaktivität verwendet werden können. Typischerweise wird eine spezifische oder selektive Reaktion wenigstens zweimal das Hintergrundsignal oder Rauschen sein und besonders typisch mehr als das 10- bis 100-fache des Hintergrunds.
Eine "Untersequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleinsäuren oder Aminosäuren, die einen Teil einer längeren Sequenz von Nukleinsäuren bzw. Aminosäuren (z.B. Protein) umfasst.
"Synthetisch" bezeichnet eine Nukleotidsequenz, die strukturelle Eigenschaften umfasst, die nicht in der natürlichen Sequenz vorhanden sind. Zum Beispiel wird eine künstliche Sequenz, die dem G + C-Gehalt und der normalen Codonverteilung von zweikeimblättrigen und/oder einkeimblättrigen Genen stärker ähnelt, als synthetisch bezeichnet.
"Transformation" ist ein Prozess zur Einführung von heterologer Nukleinsäure in eine Wirtszelle oder einen Organismus. Insbesondere bedeutet "Transformation" die stabile Integration eines DNA-Moleküls in das Genom eines interessierenden Organismus. Transformierte Zelle, Gewebe oder Insekten werden als solche verstanden, die nicht nur das Endprodukt eines Transformationsprozesses umfassen, sondern auch transgene Nachkommenschaft davon.
"Transformiert/transgen/rekombinant" bezeichnen einen Wirtsorganismus, wie z.B. ein Bakterium oder eine Pflanze, in den ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeführt wurde. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom des Wirts integriert sein, oder das Nukleinsäuremolekül kann ebenfalls als ein extrachromosomales Molekül vorhanden sein. Ein solches extrachromosomales Molekül kann selbstvermehrend sein. Transformierte Zellen, Gewebe oder Pflanzen werden so verstanden, dass sie nicht nur das Endprodukt eines Transformationsprozesses umfassen, sondern auch transgene Nachkommenschaft davon. Ein "nicht-transformierter", "nicht-transgener" oder "nicht-rekombinanter" Wirt bezeichnet einen Organismus vom Wildtyp, z.B. ein Bakterium oder eine Pflanze, der nicht das heterologe Nukleinsäuremolekül enthält.
Nukleotide werden durch ihre Basen mit den folgenden Standardabkürzungen angezeigt: Adenin (A), Cytosin (C), Thymin (T) und Guanin (G). Aminosäure werden in ähnlicher Weise durch die folgenden Standardabkürzungen angezeigt: Alanin (Ala; A), Arginin (Arg; R), Asparagin (Asn, N), Asparaginsäure (Asp, D), Cystein (Cys; C), Glutamin (Gln; Q), Glutaminsäure (Glu; E), Glycin (Gly; G), Histidin (His; H), Isoleucin (Ile; I), Leucin (Leu; L), Lysin (Lys; K), Methionin (met; M), Phenylalanin (Phe; F), Prolin (Pro; P), Serin (Ser; S), Threonin (Thr; T), Tryptophan (Trp; W), Tyrosin (Tyr; Y) und Valin (Val; V). Ferner stellt (Xaa; X) eine beliebige Aminosäure dar.
Diese Erfindung betrifft neue Nukleinsäuresequenzen, deren Expression zu neuen Toxinen führt, und die Herstellung und Verwendung der Toxine zur Bekämpfung von Insektenschädlingen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung synthetische Gensequenzen, die zur Expression in Pflanzen optimiert sind und verschiedene Formen des hybriden Bacillus thuringiensis-delta-Endotoxins H04 codieren, dessen Toxinteil die Domänen I und II von Cry1Ab und die Domäne III von Cry1C enthält. Das Hybridgen, das das H04-Hybridtoxin codiert, gemäß Konstruktion aus den nativen Cry1Ab- und Cry1C-Genen, wird in US-PS 5,736,131 und De Maagd et al. beschrieben, Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537–1543 (1996). Das bevorzugte Verfahren zur Konstruktion der synthetischen H04-Gene der Erfindung wird in WO 93/07278 dargestellt. Die durch die neuen Gensequenzen codierten hybriden Bacillus thuringienses-Toxine sind hochwirksam gegen wirtschaftlich bedeutende Insektenschädlinge, wie den Asiatischen Baumwollwurm, den Roten Baumwollkapselwurm, den Tabakknospenwurm, den Maiszünsler und die Kohlmotte. Die hybriden Bacillus thuringiensis-Toxine können in multiplen Insektenbekämpfungsstrategien verwendet werden, was zu maximaler Effizienz bei minimalem Einfluss auf die Umwelt führt.
Die vorliegende Erfindung umfasst DNA-Moleküle, die die Nukleotidsequenzen umfassen, die die insektiziden Toxine der Erfindung codieren. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner rekombinante Vektoren, die die Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung umfassen. In solchen Vektoren sind die Nukleinsäuresequenzen bevorzugt in Expressionskassetten enthalten, die regulatorische Elemente zur Expression der Nukleotidsequenzen in einer Wirtszelle umfassen, die die Nukleotidsequenzen exprimieren kann. Solche regulatorischen Elemente umfassen gewöhnlich Promotor- und Terminationssignale und umfassen ebenfalls bevorzugt Elemente, die eine effiziente Translation der durch die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung codierten Proteine erlauben. Vektoren, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, können sich gewöhnlich in besonderen Wirtszellen vervielfältigen, bevorzugt als extrachromosomale Moleküle, und werden deshalb verwendet, um die Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung in den Wirtszellen zu amplifizieren. In einer Ausführungsform sind Wirtszellen für solche Vektoren Mikroorganismen, wie Bakterien, insbesondere Bacillus thuringiensis oder E. coli. In einer anderen Ausführungsform sind Wirtszellen für solche rekombinanten Vektoren Endophyten oder Epiphyten. Eine bevorzugte Wirtszelle für solche Vektoren ist eine eukaryontische Zelle, wie z.B. eine Pflanzenzelle. Pflanzenzellen, wie z.B. Maiszellen, sind die am meisten bevorzugten Wirtszellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein insektizides Toxin der Erfindung in einer Pflanze exprimiert. In diesem Fall schützen sich transgene Pflanzen, die wirksame Mengen der Toxine exprimieren, selbst vor Insektenschädlingen. Wenn die Insekten an einer solchen transgenen Pflanze zu fressen beginnen, nehmen sie ebenfalls die exprimierten Toxine auf. Dies wird das Insekt vom weiteren Beißen in das pflanzliche Gewebe abschrecken oder kann sogar das Insekt schädigen oder töten.
Die in dieser Anmeldung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen können in Pflanzenzellen unter Verwendung herkömmlicher rekombinanter DNA-Technik eingeführt werden. Allgemein beinhaltet dies das Inserieren einer codierenden Sequenz der Erfindung in ein Expressionssystem, für das die codierende Sequenz heterolog ist (d.h. nicht normalerweise vorhanden), wobei standardmäßige fachbekannte Klonierungsverfahren verwendet werden. Der Vektor enthält die notwendigen Elemente zur Transkription und Translation der inserierten Protein-codierenden Sequenzen. Eine große Anzahl von fachbekannten Vektorsystemen kann verwendet werden, wie z.B. Plasmide, Bakteriophagenviren und andere modifizierte Viren. Geeignete Vektoren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf: virale Vektoren, wie die λ-Vektorsysteme λgt11, λgt10 und Charon 4; Plasmidvektoren, wie pBI121, pBR322, pACYC177, pACyC184, pAR-Serien, pKK-223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNAII; und andere ähnliche Systeme. Transformierte Zellen können zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, so dass die Nukleotidsequenzen der Erfindung den transgenen Pflanzen Insektenresistenz verleihen.
Erfindungsgemäß transformierte Pflanzen können einkeimblättrig oder zweikeimblättrig sein und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf: Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Süßkartoffel, Bohne, Erbse, Chicoree, Salat, Kohl, Blumenkohl, Broccoli, Rübe, Rettich, Spinat, Spargel, Zwiebel, Knoblauch, Pfeffer, Sellerie, Kürbis, Gemüsekürbis, Hanf, Zucchini, Apfel, Birne, Quitte, Melone (z.B. Wassermelone), Pflaume, Kirsche, Pfirsich, Nektarine, Aprikose, Erdbeere, Traube, Himbeere, Brombeere, Ananas, Avocado, Papaya, Mango, Banane, Sojabohne, Tomate, Sorghum, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Raps, Klee, Tabak, Karotte, Baumwolle, Alfalfa, Reis, Kartoffel, Aubergine, Gurke, Arabidopsis und Holzpflanzen, wie Nadel- und Laubbäume. Sobald eine gewünschte Nukleotidsequenz in eine besondere Pflanzenart transformiert wurde, kann sie in der Art vermehrt oder in andere Sorten der gleichen Art übertragen werden, insbesondere einschließlich gewerblicher Sorten, wobei herkömmliche Züchtungstechniken verwendet werden.
Für ihre Expression in transgenen Pflanzen können die Nukleotidsequenzen der Erfindung eine Modifikation und Optimierung erfordern. Obwohl in vielen Fällen Gene aus mikrobiellen Organismen in Pflanzen in hohen Stärke ohne Modifikation exprimiert werden können, kann eine niedrige Expression in transgenen Pflanzen aus mikrobiellen Nukleotidsequenzen mit Codonen resultieren, die in Pflanzen nicht bevorzugt sind. Es ist fachbekannt, dass alle Organismen spezifische Vorzüge für die Codonverwendung besitzen, und die Codonen der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleotidsequenzen können verändert werden, um den pflanzlichen Vorzügen zu entsprechen, während die dadurch codierten Aminosäuren beibehalten werden. Außerdem wird eine hohe Expression in Pflanzen am besten aus codierenden Sequenzen erreicht, die wenigstens ca. 35% GC-Gehalt besitzen, bevorzugt mehr als ca. 45%, besonders bevorzugt mehr als ca. 50% und am meisten bevorzugt mehr als ca. 60%. Mikrobielle Nukleotidsequenzen, die geringe GC-Gehalte besitzen, mögen in Pflanzen aufgrund der Existenz von ATTTA-Motiven, die die Botschaften destabilisieren können, und aufgrund von AATAAA-Motiven, die eine unangemessene Polyadenylierung verursachen können, schlecht exprimieren. Obwohl bevorzugte Gensequenzen angemessen in sowohl einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzenarten exprimiert werden können, können Sequenzen zur Berücksichtigung der spezifischen Codonvorzüge und CG-Gehaltsvorzüge von einkeimblättrigen oder zweikeimblättrigen Pflanzen modifiziert werden, da gezeigt worden ist, dass sich diese Vorzüge unterscheiden (Murray et al., Nucl. Acids Res. 17: 477–498 (1989)). Zusätzlich werden die Nukleotidsequenzen auf die Existenz von illegitimen Spleißstellen durchmustert, die eine Botschafttrunkierung verursachen können. Alle innerhalb der Nukleotidsequenzen vorzunehmenden Veränderungen, wie die oben beschriebenen, werden unter Verwendung allgemein bekannter Techniken der ortspezifischen Mutagenese, PCR und synthetischen Genstruktion unter Verwendung der Verfahren vorgenommen, die in den veröffentlichten Patentanmeldungen EP 0 385 962 , EP 0 359 472 und WO 93/07278 beschrieben werden.
Zur effizienten Einleitung der Translation können Sequenzen, die zum einleitenden Methionin benachbart sind, eine Modifikation erfordern. Zum Beispiel können sie durch den Einschluss von Sequenzen modifiziert werden, die als wirksam in Pflanzen bekannt sind. Joshi hat eine geeignete consensus-Sequenz für Pflanzen vorgeschlagen (NAR 15: 6643–6653 (1987)), und Clontech legt einen weiteren consensus-Translationsinitiator nahe (1993/1994 Katalog, Seite 210). Diese consensus-Sequenzen sind geeignet zur Verwendung mit den Nukleotidsequenzen dieser Erfindung. Die Sequenzen werden in Konstruktionen eingeführt, die die Nukleotidsequenzen umfassen, bis zu und einschließlich des ATG (wobei die zweite Aminosäure unmodifiziert bleibt), oder alternativ bis zu und einschließlich des GTC nach dem ATG (mit der Möglichkeit der Modifizierung der zweiten Aminosäure des Transgens).
Die Expression der Nukleotidsequenzen in transgenen Pflanzen wird durch Promotoren angetrieben, von denen gezeigt wurde, dass sie in Pflanzen funktionell sind. Die Wahl des Promotors wird abhängig von den zeitlichen und räumlichen Erfordernissen zur Expression und ebenfalls abhängig von der Zielart variieren. So ist die Expression der Nukleotidsequenzen dieser Erfindung in Blättern, in Ähren, in Blütenständen (z.B. Ähren, Rispen, Kolben etc.), in Wurzeln und/oder Sämlingen bevorzugt. In vielen Fällen wird jedoch Schutz gegen mehr als einen Typ von Insektenschädlingen gesucht, und daher ist die Expression in multiplen Geweben wünschenswert. Obwohl gezeigt worden ist, dass viele Promotoren aus zweikeimblättrigen Pflanzen funktionsfähig in einkeimblättrigen Pflanzen und umgekehrt sind, werden idealerweise zweikeimblättrige Promotoren zur Expression in zweikeimblättrigen Pflanzen ausgewählt und einkeimblättrige Promotoren zur Expression in einkeimblättrigen Pflanzen. Jedoch gibt es keine Beschränkung für die Herkunft der ausgewählten Promotoren; es ist ausreichend, dass sie funktionsfähig zum Antreiben der Expression der Nukleotidsequenzen in der gewünschten Zelle sind.
Bevorzugte Promotoren, die konstitutiv exprimiert werden, schließen Promotoren aus Genen ein, die Actin oder Ubiquitin codieren, und die CaMV 35S- und 19S-Promotoren. Die Nukleotidsequenzen dieser Erfindung können ebenfalls unter der Regulation von Promotoren exprimiert werden, die chemisch reguliert werden. Dies ermöglicht die Synthese der insektiziden Toxine allein dann, wenn die Nutzpflanzen mit den induzierenden Chemikalien behandelt werden. Eine bevorzugte Technik zur chemischen Induktion der Genexpression wird ausführlich in der veröffentlichten Anmeldung EP 0 332 104 und US-PS 5,614,395 angegeben. Ein bevorzugter Promotor zur chemischen Induktion ist der Tabak-PR-1a-Promotor.
Eine bevorzugte Kategorie von Promotoren ist diejenige, die wundinduzierbar ist. Zahlreiche Promotoren wurden beschrieben, die an Wundstellen und auch an den Stellen einer Phytopathogeninfektion exprimiert werden. Idealerweise sollte ein solcher Promotor nur lokal aktiv an den Stellen der Infektion sein, und auf diese Weise reichern sich die insektiziden Toxine nur in den Zellen an, die die insektiziden Toxine synthetisieren müssen, um den eindringenden Insektenschädling zu töten. Bevorzugte Promotoren dieser Art schließen diejenigen ein, die beschrieben werden von Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215: 200–208 (1989), Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573–588 (1993), Logemann et al., Plant Cell 1: 151–158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783–792 (1993), Firek et al., Plant Molec. Biol. 22: 129–142 (1993) und Warner et al., Plant J. 3: 191–201 (1993).
Bevorzugte gewebespezifische Expressionsmuster schließen grüngewebespezifische, wurzelspezifische, stengelspezifische und blütenspezifische ein. Zur Expression in grünem Gewebe geeignete Promotoren schließen viele ein, die Gene regulieren, die an der Photosynthese beteiligt sind, und viele davon wurden aus sowohl einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzen kloniert. Ein bevorzugter Promotor ist der Mais-PEPC-Promotor aus dem Phosphoenolcarboxylase-Gen (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579–589 (1989)). Ein bevorzugter Promotor zur wurzelspezifischen Expression ist der Mais-Metallothionein-artige (MTL) Promotor, beschrieben von de Framond (FEBS 290: 103–106 (1991), EP 0 452 269 ). Ein bevorzugter stengelspezifischer Promotor ist der in US-PS 5,625,136 beschriebene, der die Expression des Mais-trpA-Gens antreibt.
Speziell bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind transgene Pflanzen, die wenigstens eine der Nukleotidsequenzen der Erfindung in einer wurzelbevorzugten oder wurzelspezifischen Weise exprimieren. Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind transgene Pflanzen, die die Nukleotidsequenzen in einer wundinduzierbaren oder Pathogeninfektioninduzierbaren Weise exprimieren.
Zusätzlich zur Auswahl eines geeigneten Promotors erfordern Konstruktionen zur Expression eines insektiziden Toxins in Pflanzen die Bindung eines geeigneten Transkriptionsterminators stromabwärts der heterologen Nukleotidsequenz. Verschiedene solcher Terminatoren sind erhältlich und fachbekannt (z.B. tm1 aus CaMV, E9 aus rbsS). Jeder verfügbare Terminator, der als in Pflanzen funktionsfähig bekannt ist, kann im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden.
Zahlreiche andere Sequenzen können in die in dieser Erfindung beschriebenen Expressionskassetten eingeführt werden. Diese schließen Sequenzen ein, von denen gezeigt wurde, dass sie die Expression steigern, wie z.B. Intronsequenzen (z.B. aus Adh1 und bronze1) und virale Leitsequenzen (z.B. aus TMV, MCMV und AMV).
Es kann bevorzugt sein, die Expression der Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung auf unterschiedliche zelluläre Orte in der Pflanze auszurichten. In manchen Fällen kann die Lokalisierung im Cytosol wünschenswert sein, wohingegen in anderen Fällen eine Lokalisierung in einer gewissen subzellulären Organelle bevorzugt sein kann, Eine subzelluläre Lokalisierung der durch das Transgen codierten Enzyme erfolgt unter Verwendung von allgemein fachbekannten Techniken. Typischerweise wird die DNA, die das Zielpeptid aus einem bekannten, auf eine Organelle gerichteten Genprodukt codiert, manipuliert und stromaufwärts der Nukleotidsequenz fusioniert. Viele solche Zielsequenzen sind für den Chloroplasten bekannt, und ihre Funktion in heterologen Konstruktionen wurde gezeigt. Die Expression der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ist ebenfalls auf das endoplasmatische Retikulum oder auf die Vakuolen der Wirtszellen gerichtet. Techniken, um dies zu erreichen, sind allgemein fachbekannt.
Zur Pflanzentransformation geeignete Vektoren werden an anderer Stelle in dieser Beschreibung beschrieben. Für die Agrobacterium-vermittelte Transformation sind binäre Vektoren oder Vektoren, die wenigstens eine T-DNA-Randsequenz tragen, geeignet, wohingegen für den direkten Gentransfer jeder Vektor geeignet ist und eine lineare DNA, die nur die interessierende Konstruktion enthält, bevorzugt sein kann. Im Falle des direkten Gentransfers kann eine Transformation mit einer einzelnen DNA-Art oder eine Co-Transformation verwendet werden (Schocher et al., Biotechnology 4: 1093–1096 (1986)). Für sowohl direkten Gentransfer als auch Agrobacterium-vermittelten Transfer erfolgt die Transformation gewöhnlich (aber nicht notwendigerweise) mit einem selektierbaren Marker, der Resistenz gegen ein Antibiotikum (Kanamycin, Hygromycin oder Methotrexat) oder ein Herbizid (Basta) bereitstellen kann. Beispiele für solche Marker sind Neomycin-Phosphotransferase, Hygromycin-Phosphotransferase, Dihydrofolat-Reduktase, Phosphinothricin-Acetyltransferase, 2,2-Dichlorpropionsäure-Dehalogenase, Aetohydroxysäure-Synthase, 5-Enolpyruvylshikimatphosphat-Synthase, Halogenaryl-Nitrilase, Protoporphyrinogen-Oxidase, Acetyl-Coenzym A-Carboxylase, Dihydropteroat-Synthase, Chloramphenicol-Acetyltransferase und β-Glucuronidase. Ein anderer Typ von Marker, der eine positive Selektion bereitstellt, ist das Mannose-6-phosphat-Isomerase-(MPI/PMI)-Gen, das die Fähigkeit zur Metabolisierung von Mannose bereitstellt, Mannose-6-phosphat-Isomerase. Die Wahl des selektierbaren oder durchmusterungsfähigen Markers zur Pflanzentransformation ist jedoch nicht kritisch für die Erfindung.
Die oben beschriebene rekombinante DNA kann in die Pflanzenzelle in einer Anzahl von fachlich anerkannten Weisen eingeführt werden. Die Fachleute werden einsehen, dass die Wahl des Verfahrens vom Typ der Pflanze abhängen könnte, auf den die Transformation ausgerichtet ist. Geeignete Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen schließen ein: Mikroinjektion (Crossway et al., BioTechniques 4: 320–334 (1986)), Elektroporation (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602–5606 (1986)), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915–921 (1988); siehe ebenfalls Ishida et al., Nature Biotechnology 14: 745–750 (Juni 1996) für die Mais-Transformation), direkter Gentransfer (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717–2722); Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93: 857–863 (1990) (Reis)) und ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen, die von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware erhältlich sind (siehe z.B. Sanford et al., US-PS 4,945,050; und McCabe et al., Biotechnology 6: 923–926 (1988)). Siehe ebenfalls Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22: 421–477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5: 27–37 (1987 (Zwiebel); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526–8530 (1990) (Tabak-Chloroplast); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671–674 (1988) (Sojabohne); McCabe et al., Bio/Technology 6: 923–926 (1988) (Sojabohne); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305–4309 (1988) (Mais); Klein et al., Bio/Technology 6: 559–563 (1988) (Mais); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440–444 (1988) (Mais), Fromm et al., Bio/Technology 8: 833–839 (1990); und Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990) (Mais); Koziel et al., Biotechnology 11: 194–200 (1993) (Mais); Shimamoto et al., Nature 338: 274–277 (1989) (Reis); Christou et al., Biotechnology 9: 957–962 (1991) (Reis); Datta et al., Bio/Technology 8: 736–740 (1990) (Reis); europäische Patentanmeldung EP 0 332 581 (Knaulgras und andere Pooideae); Vasil et al., Biotechnology 11: 1553–1558 (1993) (Weizen); Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077–1084 (1993) (Weizen); Wan et al., Plant Physiol. 104: 37–48 (1994) (Gerste); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89: 525–533 (1994) (Gerste); Umbeck et al., Bio/Technology 5: 263–266 (1987) (Baumwolle); Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212–11216 (Dezember 1993) (Sorghum); Somers et al., Bio/Technology 10: 1589–1594 (Dezember 1992) (Hafer); Torbert et al., Plant Cell Reports 14: 635–640 (1995) (Hafer); Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077–1084 (1993) (Weizen); Chang et al., WO 94/13822 (Weizen) und Nehra et al., The Plant Journal 5: 285–297 (1994) (Weizen). Ein besonders bevorzugter Satz von Ausführungsformen zur Einführung von rekombinanten DNA-Molekülen in Mais durch Mikroprojektilbombardierung kann gefunden werden in Koziel et al., Biotechnology 11: 194–200 (1993), Hill et al., Euphytica 85: 119–123 (1995) und Koziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792: 164–171 (1996). Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform ist das Protoplastentransformationsverfahren für Mais, wie es in EP 0 292 435 offenbart wird. Die Transformation von Pflanzen kann mit einer einzelnen DNA-Art oder multiplen DNA-Arten (d.h. Co-Transformation) erfolgen, und diese beiden Techniken sind geeignet zur Verwendung mit einer codierenden Sequenz der Erfindung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz direkt in das Plastidgenom transformiert. Ein Hauptvorteil der Plastidtransformation besteht darin, dass Plastide allgemein bakterielle Gene ohne substantielle Modifikation exprimieren können, und Plastide können multiple offene Leseraster unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors exprimieren. Die Plastidtransformationstechnik wird umfassend in US-PSen 5,451,513, 5,545,817 und 5,545,818, in WO 95/16783 und in McBride et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301–7305, beschrieben. Die Grundtechnik für die Chloroplastentransformation beinhaltet das Einführen von Regionen klonierter Plastid-DNA, die einen selektierbaren Marker flankiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in ein geeignetes Zielgewebe, z.B. unter Verwendung von biolistischen Verfahren oder Protoplastentransformation (z.B. Calciumchlorid- oder PEG-vermittelte Transformation). Die flankierenden Regionen mit 1 bis 1,5 kb, als Targeting-Sequenzen bezeichnet, erleichtern die homologe Rekombination mit dem Plastidgenom und erlauben somit den Austausch oder die Modifikation von spezifischen Regionen des Plastoms. Anfänglich werden Punktmutationen in den 16S rRNA- und rps12-Genen des Chloroplasten, die Resistenz gegen Spectinomycin und/oder Streptomycin verleihen, als selektierbare Marker zur Transformation verwendet (Z. Svab, P. Hajdukiewicz und P. Maliga (1990), Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 8526–8530; J. M. Staub und P. Maliga (1992), Plant Cell 4, 39–95). Dies führte zu stabilen homoplasmatischen Transformanten mit einer Häufigkeit von etwa einer pro 100 Bombardierungen von Zielblättern. Die Gegenwart von Klonierungsorten zwischen diesen Markern erlaubte die Schaffung eines Plastid-Targeting-Vektors zur Einführung von Fremdgenen (J. M. Staub und P. Maliga (1993), EMBO J. 12, 601–606). Substantielle Erhöhungen der Transformationshäufigkeit werden durch Austausch der rezessiven rRNA- oder r-Protein-Antibiotikaresistenz-Gene gegen einen dominanten selektierbaren Marker, das bakterielle aadA-Gen, erhalten, das das Spectinomycinentgiftende Enzym Aminoglycosid-3'-Adenyltransferase codiert (Z. Svab und P. Maliga (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913–917). Zuvor war dieser Marker erfolgreich zur Transformation des Plasidgenoms der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii mit hoher Häufigkeit verwendet worden (M. Goldschmit-Clermont (1991), Nucl. Acids Res. 19: 4083–4089). Andere selektierbare Marker, die zur Plastidtransformation nützlich sind, sind fachbekannt und vom Erfindungsumfang umfasst. Typischerweise sind ca. 15 bis 20 Zellteilungszyklen nach der Transformation erforderlich, um einen homoplastidischen Zustand zu erreichen. Die Plastidexpression, in der Gene durch homologe Rekombination in alle der mehreren Tausend Kopien des in jeder Pflanzenzelle vorhandenen ringförmigen Plastidgenoms inseriert werden, nutzt den enormen Kopieanzahlvorteil gegenüber kernexprimierten Genen, was Expressionsstärken erlaubt, die leicht 10% des gesamten löslichen Pflanzenproteins übersteigen können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in einen Plastid-Targeting-Vektor inseriert und in das Plastidgenom eines gewünschten Pflanzenwirtes transformiert. Pflanzen, die für Plastidgenome homoplastidisch sind, die eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz enthalten, werden erhalten und sind vorzugsweise für eine hochgradige Expression der Nukleotidsequenz fähig.
Beispiele
Die Erfindung wird weiter durch Verweis auf die folgenden ausführlichen Beispiele beschrieben. Diese Beispiele werden allein für Veranschaulichkeitszwecke bereitgestellt und sind nicht zur Beschränkung gedacht, wenn nichts anderes angegeben ist. Standardmäßige rekombinante DNA- und molekulare Klonierungstechniken werden hier verwendet, die allgemein fachbekannt sind und beschrieben werden von Ausubel (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), und T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).
Beispiel 1: Expression und Reinigung eines H04-Toxinfragments
Eine trunkierte Form des H04-Hybridtoxin-Gens (beschrieben in De Maagd et al., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537–1543 (1996)), die ein Bt-Toxin codiert, das im wesentlichen aus den Domänen I und II von Cry1Ab und der Domäne III von Cry1C besteht, wird in einen Expressionsvektor, wie z.B. pBluescript SK-, Bacillus-Shuttle-Vektor oder pET 21b(+), zur Überexpression in E. coli kloniert. Die Zellen werden in LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthält, für 24 bis 98 h bei 37°C in einer Schüttelvorrichtung (250 U/min) kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren für 10 min mit 7.000 U/min geerntet. Das Pellet wird mit einem Bronson-Ultraschallgerät für 2 min 30 s mit 2-sekündigen Pulsen ultraschallbehandelt. Die vollständige Ultraschallbehandlung wird unter dem Mikroskop überprüft. Lösliche Fraktionen werden durch Zentrifugieren mit 10.000 U/min für 10 min entfernt. Das resultierende Pellet, das Kristallproteine enthält, wird 4- bis 5-mal mit 2% Triton X-100, das 0,5 M NaCl enthält, gewaschen. Ein kontinuierliches Waschen erfolgt mit 0,5 M NaCl (4- bis 5-mal), und das fertige Pellet wird mit destilliertem Wasser (2-mal) gewaschen. Das resultierende Pellet wird in 50 mM Na₂CO₃-Puffer, der 10 mM Dithiothreit enthält, bei 37°C für 2 h solubilisiert. Solubilisiertes Protein wird von unlöslichen Stoffen durch Zentrifugieren mit 12.000 U/min für 10 min getrennt. Proteinproben werden mit 50 mM Na₂CO₃-Puffer, pH 9,0, für Bioassays dialysiert.
Beispiel 2: Bioassays
LC50-Versuche werden am Asiatischen Baumwollwurm, Roten Baumwollkapselwurm, Tabakknospenwurm und Maiszünsler unter Verwendung des trunkierten H04-Proteins durchgeführt, das z.B. wie in Beispiel 1 oben beschrieben hergestellt wurde. Die Ergebnisse sind wie folgt:

LC50 Asiatischer Baumwollwurm: 133 ng/cm²

LC50 Roter Baumwollkapselwurm: 691 ng/cm²

LC50 Tabakknospenwurm 299 ng/cm²

LC50 Maiszünsler 31 ng/cm²
Beispiel 3: Synthetische H04-Genkonstruktion
Eine synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 codiert, wird durch Zurücktranslatieren der Aminosäuresequenz des in De Maagd et al. beschriebenen H04-Hybridtoxinfragments geschaffen, Appl.
Environ. Microbiol. 62(5): 1537–1543 (1996) (Domänen I und II von Cry1Ab und Domäne III von Cry1C), wobei das Programm "Backtranslation" verwendet wird, das in der GCG-Gruppe von Programmen der University of Wisconsin verwendet wird, das eine Mais-bevorzugte Codontabelle verwendet (Murray et al., Nucl. Acids Res. 17: 477–498, 1989, die durch Verweis eingeführt). Bevorzugt wird das am häufigsten verwendete Maiscodon für jede Aminosäure verwendet, wie beschrieben in WO 93/07278.
Die den Toxinteil von H04 codierende synthetische Nukleotidsequenz kann in mehreren Fragmenten konstruiert werden. Jedes Fragment wird durch Hybridisierung von 10 Paaren von Oligomeren mit einer Länge von 60 bis 75 Nukleotiden konstruiert, die beide Stränge des Gens darstellen. Eine Überlappung mit ca. 15 Nukleotiden wird zwischen sequenziellen Oligonukleotidpaaren zur korrekten Orientierung und zum korrekten Zusammenbau geschaffen. Oligonukleotide können z.B. durch Genosys Biotechnologies Inc., TX, synthetisiert werden. Jedes Paar von Oligomeren wird unter Verwendung des Enzyms Polynukleotidkinase von z.B. New England Biolabs, Inc., MA, unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Bedingungen hybridisiert und phosphoryliert. Kinase-behandelte Fragmentpaare werden dann hybridisiert und in einen Plasmidvektor mit hoher Kopiezahl ligiert, der z.B. ein Ampicillinresistenz-Gen enthält, und z.B. in kompetente DH5α-Zellen transformiert. Die Zellen werden auf Ampicillin-haltiges Medium ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Kolonien werden auf inserierte DNA durchmustert. Die DNA wird sequenziert, und Klone, die die korrekte Sequenz enthalten, werden selektiert. Die Fragmente werden dann durch Restriktionsverdau, Ligation und Transformation unter Verwendung besonderer Restriktionsorte zwischen den Fragmenten verbunden.
SEQ ID NO: 3 zeigt die synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 mit 631 Aminosäuren codiert (ohne eine Protoxin-Schwanzregion), und SEQ ID NO: 4 zeigt die Aminosäuresequenz des H04-Toxins, die durch die in SEQ ID NO: 3 gezeigte synthetische Nukleotidsequenz codiert wird. SEQ ID NO: 11 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1308, die den konstitutiven Mais-Ubiquitinpromotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der in SEQ ID NO: 3 gezeigten synthetischen H04-Gensequenz.
Zusätzlich zum oben beschriebenen synthetischen Gen (SEQ ID NO: 3), das nur den Toxinteil des H04-Hybrids codiert (Domänen I und II von Cry1Ab und Domäne III von Cry1C), werden zusätzliche synthetische H04-Gene mit der gesamten oder einem Teil der synthetischen Cry1Ab-Schwanzregion konstruiert, beschrieben in US-PS 5,625,136 (hier durch Verweis eingeführt), fusioniert an das 3'-Ende des H04-Toxinteils. Diese synthetischen H04-Gensequenzen mit Cry1Ab-Schwänzen werden nachfolgend beschrieben:
SEQ ID NO: 5 zeigt eine synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus einen Cry1Ab-Schwanzteil voller Länge codiert, und SEQ ID NO: 6 zeigt die Aminosäuresequenz des durch die in SEQ ID NO: 5 gezeigte synthetische Nukleotidsequenz codierten H04 + Cry1Ab-Schwanzes. SEQ ID NO: 12 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1436, die den Wurzel-bevorzugten Mais-MTL-Promotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der in SEQ ID NO: 5 dargestellten synthetischen H04-Gensequenz. SEQ ID NO: 13 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1441, das den konstitutiven Mais-Ubiquitinpromotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der in SEQ ID NO: 5 gezeigten synthetischen H04-Gensequenz.
SEQ ID NO: 7 zeigt eine andere synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus einen Cry1Ab-Schwanzteil voller Länge codiert, und SEQ ID NO: 8 zeigt die Aminosäuresequenz des H04 + Cry1Ab-Schwanzes, codiert durch die in SEQ ID NO: 7 gezeigte synthetische Nukleotidsequenz. SEQ ID NO: 14 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1305, die den konstitutiven Mais-Ubiquitinpromotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der in SEQ ID NO: 7 gezeigten synthetischen H04-Gensequenz. SEQ ID NO: 15 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1313, die den konstitutiven Mais-Ubiquitinpromotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der in SEQ ID NO: 7 gezeigten synthetischen H04-Gensequenz.
SEQ ID NO: 9 zeigt eine synthetische Nukleotidsequenz, die den Toxinteil von H04 plus nur die ersten 40 Aminosäuren des Cry1Ab-Schwanzes codiert, und SEQ ID NO: 10 zeigt die Aminosäuresequenz des H04 + 40 Aminosäure-trunkierten Cry1Ab-Schwanzes, codiert durch die in SEQ ID NO: 9 gezeigte synthetische Nukleotidsequenz. SEQ ID NO: 16 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pNOV1435, die den Wurzel-bevorzugten Mais-MTL-Promotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der in SEQ ID NO: 9 gezeigten synthetischen H04-Gensequenz. SEQ ID NO: 17 zeigt die Nukleotidsequenz von Konstrukt pZU578, die den Arabidopsis-Actin-2-Promotor enthält, funktionsfähig verbunden mit der in SEQ ID NO: 9 gezeigten synthetischen H04-Gensequenz.
Beispiel 4: Modifikation von codierenden Sequenzen und benachbarten Sequenzen
Die in dieser Anmeldung beschriebenen Nukleotidsequenzen können zur Expression in transgenen Pflanzenwirten modifiziert werden. Eine Wirtspflanze, die die Nukleotidsequenzen exprimiert und die insektiziden Toxine in ihren Zellen erzeugt, besitzt eine gesteigerte Resistenz gegen Insektenangriffe und ist somit besser ausgerüstet, um Anbauverlusten zu widerstehen, die mit einem solchen Angriff verbunden sind.
Die transgene Expression in Pflanzen von Genen, die aus mikrobiellen Quellen stammen, kann die Modifikation dieser Gene erfordern, um ihre Expression in Pflanzen zu erreichen und zu optimieren. Insbesondere werden bakterielle ORFs, die separate Enzyme codieren, die aber durch das gleiche Transkript in der nativen Mikrobe codiert werden, am besten in Pflanzen auf separaten Transkripten exprimiert. Um dies zu erreichen, wird jedes mikrobielle ORF individuell isoliert und innerhalb einer Kassette kloniert, die eine Pflanzenpromotorsequenz am 5'-Ende des ORF und einen Pflanzentranskriptionsterminator am 3'-Ende des ORF bereitstellt. Die isolierte ORF-Sequenz schließt bevorzugt das ATG-Startcodon und das terminierende STOP-Codon ein, aber kann eine zusätzliche Sequenz über das ATG-Start- und STOP-Codon hinaus einschließen. Zusätzlich kann das ORF trunkiert sein, aber noch die erforderliche Aktivität beibehalten; für besonders lange ORFs können trunkierte Versionen zur Expression in transgenen Organismen bevorzugt sein, die die Aktivität beibehalten. Mit "Pflanzenpromotor" und "Pflanzentranskriptionsterminator" sollen Promotoren und Transkriptionsterminatoren gemeint sein, die innerhalb von Pflanzenzellen arbeiten. Dies schließt Promotoren und Transkriptionsterminatoren ein, die aus nicht-pflanzlichen Quellen wie Viren stammen (ein Beispiel ist das Blumenkohlmosaikvirus).
In manchen Fällen ist eine Modifikation der ORF-codierenden Sequenzen und benachbarter Sequenzen nicht erforderlich. Es ist ausreichend, ein Fragment zu isolieren, das das interessierende ORF enthält, und es stromabwärts eines Pflanzenpromotors zu inserieren. Zum Beispiel haben Gaffney et al. (Science 261: 754–756 (1993)) das Pseudomonas nahG-Gen in transgenen Pflanzen unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und des CaMV tm1-Terminators erfolgreich ohne Modifikation der codierenden Sequenz und mit x bp des Pseudomonas-Gens stromaufwärts des ATG noch gebunden und y bp stromabwärts des STOP-Codons noch gebunden an das nahG-ORF exprimiert. Bevorzugt sollte so wenig benachbarte mikrobielle Sequenz stromaufwärts des ATG- und stromabwärts des STOP-Codons gebunden bleiben. In der Praxis kann eine solche Konstruktion von der Verfügbarkeit von Restriktionsorten abhängen.
In anderen Fällen kann die Expression von Genen, die aus mikrobiellen Quellen stammen, Probleme bei der Expression bereiten. Diese Probleme wurden auf diesem Gebiet gut charakterisiert und sind besonders üblich bei Genen, die aus bestimmten Quellen wie Bacillus stammen. Diese Probleme können auf die Nukleotidsequenz dieser Erfindung zutreffen, und die Modifikation dieser Gene kann unter Verwendung von Techniken erfolgen, die jetzt allgemein fachbekannt sind. Die folgenden Probleme können angetroffen werden:
1. Codonverwendung
Die bevorzugte Codonverwendung in Pflanzen unterscheidet sich von der bevorzugten Codonverwendung in bestimmten Mikrooganismen. Ein Vergleich der Verwendung von Codonen innerhalb eines klonierten mikrobiellen ORF mit der Verwendung in Pflanzengenen (und insbesondere in Genen aus der Zielpflanze) wird eine Identifizierung der Codonen innerhalb des ORF ermöglichen, das bevorzugt verändert werden sollte. Typischerweise hat die Pflanzenevolution zu einer starken Präferenz für die Nukleotide C und G in der dritten Basenposition von einkeimblättrigen Pflanzen geneigt, wohingegen zweikeimblättrigen Pflanzen häufig die Nukleotide A oder T in dieser Position verwenden. Durch die Modifizierung eines Gens, das eine bevorzugte Codonverwendung für eine besondere transgene Zielart einführen soll, werden viele der nachfolgend für den GC/AT-Gehalt und eine illegitime Spleißung beschriebenen Probleme ausgeräumt werden.
2. GC/AT-Gehalt
Pflanzengene besitzen typischerweise einen GC-Gehalt von mehr als 35%. ORF-Sequenzen, die reich an A- und T-Nukleotiden sind, können mehrere Probleme in Pflanzen verursachen. Zuerst wird angenommen, dass Motive von ATTTA eine Destabilisierung von Botschaften verursachen, und sie werden am 3'-Ende von vielen kurzlebigen mRNAs gefunden. Zweitens wird angenommen, dass das Auftreten von Polyadenylierungssignalen, wie AATAAA, an ungeeigneten Positionen innerhalb der Botschaft eine voreilige Trunkierung der Transkription verursacht. Zusätzlich können einkeimblättrige Pflanzen AT-reiche Sequenzen als Spleißorte erkennen (siehe unten).
3. Sequenzen, die zum einleitenden Methionin benachbart sind
Pflanzen unterscheiden sich von Mikroorganismen darin, dass ihre Botschaften keinen definierten Ribosombindungsort besitzen. Vielmehr wird angenommen, dass Ribosomen an das 5'-Ende der Botschaft binden und auf das erste verfügbare ATG abtasten, an dem die Translation begonnen wird. Dennoch wird angenommen, dass es eine Bevorzugung für bestimmte Nukleotide gibt, die zum ATG benachbart sind, und dass eine Expression mikrobieller Gene durch den Einschluss eines eukaryontischen consensus-Translationsinitiators am ATG gesteigert werden kann. Clontech (1993/1994 Katalog, Seite 210, hier durch Verweis eingeführt) haben eine Sequenz als einen consensus-Translationsinitiator zur Expression des E. coli uidA-Gens in Pflanzen nahegelegt. Ferner hat Joshi (NAR 15: 6643–6653 (1987), hier durch Verweis eingeführt) viele Pflanzensequenzen verglichen, die zum ATG benachbart sind, und legt eine andere consensus-Sequenz nahe. In Situationen, in den Schwierigkeiten bei der Expression von mikrobiellen ORFs in Pflanzen angetroffen werden, kann der Einschluss einer dieser Sequenzen am einleitenden ATG die Translation verbessern. In solchen Fällen mögen die letzten drei Nukleotide der consensus-Sequenz nicht angemessen zum Einschluss in der modifizieten Sequenz aufgrund ihrer Modifikation des zweiten AA-Restes sein. Bevorzugte Sequenzen, die zum einleitenden Methionin benachbart sind, können sich zwischen unterschiedlichen Pflanzenarten unterscheiden. Eine Untersuchung von 14 Mais-Genen, die sich in der GenBank-Datenbank befanden, lieferte die folgenden Ergebnisse: Position vor dem einleitenden ATG in 14 Mais-Genen:
Diese Analyse kann für die gewünschte Pflanzenart vorgenommen werden, in die die Nukleotidsequenz eingeführt werden soll, und die zum ATG benachbarte Sequenz zur Einführung der bevorzugten Nukleotid modifiziert werden.
4. Entfernung von illegitimen Spleißorten
Aus nicht-pflanzlichen Quellen klonierte und nicht zur Expression in Pflanzen optimierte Gene können ebenfalls Motive enthalten, die in Pflanzen als 5'- oder 3'-Spleißorte erkannt, und gespalten werden können, wodurch trunkierte oder deletierte Botschaften erzeugt werden. Diese Orte können unter Verwendung der allgemein fachbekannten Techniken entfernt werden.
Techniken zur Modifikation von codierenden Sequenzen und benachbarten Sequenzen sind allgemein fachbekannt. In den Fällen, in denen die anfängliche Expression eines mikrobiellen ORF gering ist und es als angemessen betrachtet wird, Veränderungen an der Sequenz wie oben beschrieben durchzuführen, kann die Konstruktion von synthetischen Genen gemäß allgemein fachbekannten Verfahren erreicht werden. Diese werden z.B. in den veröffentlichten Patentoffenbarungen EP 0 385 962 , EP 0 359 972 und WO 93/07278 beschrieben, die alle hier durch Verweis eingeführt werden. In den meisten Fällen ist es bevorzugt, die Expression von Genstruktionen unter Verwendung von transienten Assay-Protokollen (die allgemein fachbekannt sind) vor ihrer Übertragung auf transgene Pflanzen zu untersuchen.
Beispiel 5: Konstruktion von Pflanzenexpressionskassetten
Codierende Sequenzen, die zur Expression in transgenen Pflanzen gedacht sind, werden zuerst in Expressionskassetten hinter einem geeigneten, in Pflanzen exprimierbaren Promotor zusammengesetzt. Die Expressionskassetten können auch beliebige weitere Sequenzen umfassen, die zur Expression des Transgens erforderlich sind oder ausgewählt werden. Solche Sequenzen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf: Transkriptionsterminatoren, fremde Sequenzen zur Steigerung der Expression, wie Introns, vitale Sequenzen und Sequenzen, die zur Ausrichtung des Genprodukts auf spezifische Organellen und Zellkompartimente beabsichtigt sind. Diese Expressionskassetten können dann leicht auf die nachfolgend beschriebenen Pflanzentransformationsvektoren übertragen werden. Nachfolgend ist eine Beschreibung von verschiedenen Komponenten von typischen Expressionskassetten:
1. Promotoren
Die Selektion des in Expressionskassetten verwendeten Promotors wird das räumliche und zeitliche Expressionsmuster des Transgens in der transgenen Pflanze bestimmen. Ausgewählte Promotoren werden Transgene in spezifischen Zelltypen (wie Blatt-Epidermiszellen, Mesophyllzellen, Wurzelcortexzellen) oder in spezifischen Geweben oder Organen (z.B. Wurzeln, Blätter oder Blüten) exprimieren, und die Selektion wird den gewünschten Ort der Anreicherung des Genprodukts widerspiegeln. Alternativ kann der ausgewählte Promotor die Expression des Gens unter verschiedenen induzierenden Bedingungen antreiben. Promotoren variieren in ihrer Stärke, d.h. Fähigkeit zur Förderung der Transkription. Abhängig von dem verwendeten Wirtszellsystem kann jeder einer Anzahl von geeigneten Promotoren verwendet werden, einschließlich des nativen Promotors des Gens. Nachfolgend sind nicht-beschränkende Beispiele für Promotoren, die in Expressionskassetten verwendet werden können.
a. Konstitutive Expression, der Ubiquitinpromotor:
Ubiquitin ist ein Genprodukt, von dem bekannt ist, dass es sich in vielen Zelltypen anreichert, und sein Promotor wurde aus mehreren Arten zur Verwendung in transgenen Pflanzen kloniert (z.B. Sonnenblume – Binet et al., Plant Science 79: 87–94 (1991); Mais – Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12: 619–632 (1989); und Arabidopsis – Norris et al., Plant Mol. Biol. 21: 895–906 (1993)). Der Mais-Ubiquitinpromotor wurde in transgenen einkeimblättrigen Systemen entwickelt, und seine Sequenz und Vektoren, die zur einkeimblättrigen Transformation konstruiert wurden, werden in der Patentveröffentlichung EP 0 342 926 offenbart, die hier durch Verweis eingeführt wird. Taylor et al. (Plant Clel Rep. 12: 491–495 (1993)) beschreiben einen Vektor (pAHC25), der den Mais-Ubiquitinpromotor und ein erstes Intron umfasst, und seine hohe Aktivität in Zellsuspensionen zahlreicher einkeimblättriger Pflanzen bei Einführung über Mikroprojektilbombardierung. Der Arabidopsis-Ubiquitinpromotor ist ideal zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen. Der Ubiquitinpromotor ist geeignet zur Genexpression in transgenen Pflanzen, sowohl einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen. Geeignete Vektoren sind Derivate von pAHC25 oder beliebige der in dieser Anmeldung beschriebenen Transformationsvektoren, modifiziert durch die Einführung der geeigneten Ubiquitinpromotor- und/oder Intron-Sequenzen.
b. Konstitutive Expression, der CaMV 35S-Promotor:
Die Konstruktion des Plasmids pCGN1761 wird in der veröffentlichten Patentanmeldung EP 0 392 225 (Beispiel 23) beschrieben, die hier durch Verweis eingeführt wird. pCGN1761 enthält den "doppelten" CaMV 35S-Promotor und den tm1-Transkriptionsterminator mit einem besonderen EcoRI-Ort zwischen dem Promotor und dem Terminator und hat ein Gerüst vom pUC-Typ. Ein Derivat von pCGN1761 wird konstruiert, das einen modifizierten Polylinker aufweist, der NotI- und XhoI-Orte zusätzlich zum bestehenden EcoRI-Ort einschließt. Dieses Derivat wird als pCGN1761ENX bezeichnet. pCGN1761ENX ist nützlich zur Klonierung von DNA-Sequenzen oder codierenden Sequenzen (einschließlich mikrobieller ORF-Sequenzen) innerhalb seines Polylinkers für den Zweck ihrer Expression unter der Kontrolle des 35S-Promotors in transgenen Pflanzen. Die gesamte 35S-Promotor-codierende Sequenz-tm1-Terminator-Kassette einer solchen Konstruktion kann durch HindIII-, SphI-, SalI- und XbaI-Orte 5' zum Promotor und XbaI-, BamHI- und BglI-Orte 3' zum Terminator zur Übertragung auf Transformationsvektoren, wie z.B. die nachfolgend beschriebenen, ausgeschnitten werden. Ferner kann das doppelte 35S-Promotorfragment durch 5'-Ausschneiden mit HindIII, SphI, SalI, XbaI oder PstI und 3'-Ausschneiden mit einem beliebigen der Polylinker-Restriktionsorte (EcoRI, NotI oder XhoI) zum Austausch gegen einen anderen Promotor entfernt werden. Nach Wunsch können Modifikationen um die Klonierungsorte herum durch Einführung von Sequenzen vorgenommen werden, die die Translation steigern können. Dies ist besonders nützlich, wenn eine Überexpression gewünscht ist. Zum Beispiel kann pCGN1761ENX durch Optimierung des Translationsstartortes modifiziert werden, wie beschrieben in Beispiel 37 von US-PS 5,639,949 , hier durch Verweis eingeführt.
c. Konstitutive Expression, der Actinpromotor:
Es ist bekannt, dass mehrere Isoformen von Actin in den meisten Zelltypen exprimiert werden, und entsprechend ist der Actinpromotor eine gute Wahl als konstitutiver Promotor. Insbesondere wurde der Promotor aus dem ActI-Gen von Reis kloniert und charakterisiert (McElroy et al., Plant Cell 2: 163–171 (1990)). Es wurde festgestellt, das ein 1,3 kb-Fragment des Promotors alle regulatorischen Elemente enthält, die zur Expression in Reis-Protoplasten erforderlich sind. Ferner wurden zahlreiche Expressionsvektoren auf Basis des ActI-Promotors spezifisch zur Verwendung in einkeimblättrigen Pflanzen konstruiert (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150–160 (1991)). Diese beinhalten das ActI-Intron 1, AdhI 5'-flankierende Sequenz und AdhI-Intron 1 (aus dem Mais-Alkoholdehydrogenase-Gen) und die Sequenz aus dem CaMV 35S-Promotor. Vektoren, die die höchste Expression zeigen, waren Fusionen von 35S und ActI-Intron oder aus der ActI 5'-flankierenden Sequenz und dem ActI-Intron. Die Optimierung von Sequenzen um das einleitende ATG (des GUS-Reporter-Gens) herum steigerten ebenfalls die Expression. Die von McElroy et al. beschriebenen Promotor-Expressionskassetten (Mol. Gen. Genet. 231: 150–160 (1991)) können leicht zur Genexpression modifiziert werden und sind besonders geeignet zur Verwendung in einkeimblättrigen Wirten. Zum Beispiel werden Promotor-haltige Fragmente aus den McElroy-Konstruktionen entfernt und zum Austausch des doppelten 35S-Promotors in pCGN1761ENX verwendet, der dann zur Insertion spezifischer Gensequenzen verfügbar ist. Die so konstruierten Fusionsgene können dann auf geeignete Transformationsvektoren übertragen werden. In einem getrennten Bericht wurde ebenfalls festgestellt, dass der ActI-Promotor von Reis mit seinem ersten Intron eine hohe Expression in kultivierten Gerstenzellen ausrichtet (Chibbar et al., Plant Cell Rep. 12: 506–509 (1993)).
d. Induzierbare Expression, der PR-1-Promotor:
Der doppelte 35S-Promotor in pCGN1761ENX kann durch jeden anderen Promotor der Wahl ausgetauscht werden, der zu geeignet hohen Expressionsgraden führen wird. Exemplarisch kann einer der chemisch regulierbaren Promotoren, die in US-PS 5,614,395 beschrieben werden, wie der Tabak-PR-1a-Promotor, den doppelten 35S-Promotor ersetzen. Alternativ kann der in Lebel et al., Plant J. 16: 223–233 (1998) beschriebene Arabidopsis-PR-1-Promotor verwendet werden. Der Promotor der Wahl wird bevorzugt aus seiner Quelle durch Restriktionsenzyme ausgeschnitten, aber kann alternativ unter Verwendung von Primern PCR-amplifiziert werden, die geeignete terminale Restriktionsorte tragen. Sollte eine PCR-Amplifikation vorgenommen werden, dann sollte der Promotor erneut sequenziert werden, um auf Amplifikationsfehler nach der Klonierung des amplifizierten Promotors im Zielvektor zu überprüfen. Der chemisch/pathogen-regulierbare Tabak-PR-1a-Promotor wird vom Plasmid pCIB1004 gespalten (zur Konstruktion siehe Beispiel 21 aus EP 0 332 104 , das hier durch Verweis eingeführt wird) und auf Plasmid pCGN1761ENX übertragen (Uknes et al., Plant Cell 9: 645–656 (1992)). pCIB1004 wird mit NcoI gespalten, und der resultierende 3'-Überhang des linearisierten Fragments wird durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft. Das Fragment wird dann mit HindIII gespalten, und das resultierende PR-1a-Promotor-haltige Fragment wird gelgereinigt und in pCGN1761ENX kloniert, aus dem der doppelte 35S-Promotor entfernt wurde. Dies erfolgt durch Spaltung mit XhoI und Abstumpfung mit T4-Polymerase, gefolgt von Spaltung mit HindIII und Isolation des größeren Vektor-Terminator-haltigen Fragments, in den das pCIB1004-Promotorfragment kloniert ist. Dies erzeugt ein pCGN1761ENX-Derivat mit dem PR-1a-Promotor und dem tm1-Terminator und einem dazwischenliegenden Polylinker mit besonderen EcoRI- und NotI-Orten. Die ausgewählte codierende Sequenz kann in diesen Vektor inseriert werden, und die Fusionsprodukte (d.h. Promotor-Gen-Terminator) können anschließend auf jeden ausgewählten Transformationsvektor, einschließlich derjenigen, die unten beschrieben werden, übertragen werden. Verschiedene chemische Regulatoren können eingesetzt werden, um die Expression der ausgewählten codierenden Sequenz in den erfindungsgemäß transformierten Pflanzen zu induzieren, einschließlich der Benzothiadiazol-, Isonikotinsäure- und Salicylsäureverbindungen, die in US-PSen 5,523,311 und 5,614,395 offenbart werden.
e. Induzierbare Expression, ein Ethanol-induzierbarer Promotor:
Ein durch bestimmte Alkohole oder Ketone wie Ethanol induzierbarer Promotor kann ebenfalls verwendet werden, um eine induzierbare Expression einer codierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung zu verleihen. Ein solcher Promotor ist z.B. der alcA-Genpromotor aus Aspergillus nidulans (Caddick et al. (1998), Nat. Biotechnol. 16: 177–180). In A. nidulans codiert das alcA-Gen Alkoholdehydrogenase I, deren Expression durch die A1cR-Transkriptionsfaktoren in Gegenwart des chemischen Induktors reguliert wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die CAT-codierenden Sequenzen im Plasmid palcA:CAT, umfassend eine alcA-Genpromotorsequenz, fusioniert an einen 35S-Minimalpromotor (Caddick et al. (1998), Nat. Biotechnol. 16: 177–180), durch eine codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung ersetzt, um eine Expressionskassette mit der codierenden Sequenz unter der Kontrolle des alcA-Genpromotors zu bilden. Dies wird unter Verwendung von allgemein fachbekannten Verfahren durchgeführt.
F. Induzierbare Expression, ein Glukokortikoid-induzierbarer Promotor
Die Induktion der Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz unter Verwendung von Systemen auf Basis von Steroidhormonen wird ebenfalls erwogen. Zum Beispiel wird ein Glukokortikoid-vermitteltes Induktionssystem verwendet (Aoyama und Chua (1997), The Plant Journal 11: 605–612), und die Genexpression wird durch Anwendung eines Glukokortikoids, z.B. eines synthetischen Glukokortikoids, bevorzugt Dexamethason, bevorzugt bei einer Konzentration im Bereich von 0,1 mM bis 1 mM, besonders bevorzugt von 10 mM bis 100 mM, induziert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die Luciferase-Gensequenzen durch eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung ersetzt, um eine Expressionskassette mit einer Nukleinsäuresequenz der Erfindung unter der Kontrolle von sechs Kopien der GAL4 stromaufwärts aktivierenden Sequenzen, fusioniert an den 35S-Minimalpromotor, zu bilden. Dies wird unter Verwendung von allgemein fachbekannten Verfahren durchgeführt. Der transwirkende Faktor umfasst die GAL4-DNA-Bindungsdomäne (Keegan et al. (1986), Science 231: 699–704), fusioniert an die transaktivierende Domäne des viralen Herpes-Proteins VP16 (Triezenberg et al. (1988), Genes Devel. 2: 718–729), fusioniert an die Hormonbindungsdomäne des Glukokortikoidrezeptors der Ratte (Picard et al. (1988) Cell 54: 1073–1080). Die Expression des Fusionsproteins wird durch jeden Promotor gesteuert, der zur Expression in Pflanzen geeignet ist, fachbekannt oder hier beschrieben. Diese Expressionskassette ist ebenfalls in der Pflanze enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung umfasst, fusioniert an den 6 × GAL4/Minimalpromotor. Somit wird eine Gewebe- oder Organspezifität des Fusionsproteins erreicht, was zu induzierbarer Gewebe- oder Organspezifität des insektiziden Toxins führt.
g. Wurzelspezifische Expression:
Ein anderes Muster der Genexpression ist die Wurzelexpression. Ein geeigneter Wurzelpromotor ist der Promotor des Mais-Metallothionein-artigen (MTL-) Gens, beschrieben von de Framond (FEBS 290: 103–106 (1991)) und ebenfalls in US-PS 5,466,785, hier durch Verweis eingeführt. Dieser "MTL"-Promotor wird auf einen geeigneten Vektor, wie z.B. pCGN1761ENX, zur Insertion eines ausgewählten Gens und anschließende Übertragung der gesamten Promotor-Gen-Terminator-Kassette auf einen interessierenden Transformationsvektor übertragen.
h. Wundinduzierbare Promotoren:
Wundinduzierbare Promotoren können ebenfalls zur Genexpression geeignet sein. Zahlreiche solche Promotoren wurden beschrieben (z.B. Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573–588 (1993), Logemann et al., Plant Cell 1: 151–158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783–792 (1993), Firek et al., Plant Molec. Biol. 22: 129–142 (1993), Warner et al., Plant J. 3: 191–201 (1993)), und alle sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Logemann et al. beschreiben die 5' Stromaufwärts-Sequenzen des wunI-Gens aus der zweikeimblättrigen Kartoffel. Xu et al. zeigen, dass ein wundinduzierbarer Promotor aus der zweikeimblättrigen Kartoffel (pin2) aktiv im einkeimblättrigen Reis ist. Ferner beschreiben Rohrmeier & Lehle die Klonierung der Mais-WipI-cDNA, die wundinduziert ist und zur Isolierung des erkennenden Promotors unter Verwendung von Standardtechniken verwendet werden kann. In ähnlicher Weise haben Firek et al. und Warner et al. ein wundinduziertes Gen aus dem einkeimblättrigen Asparagus officinalis beschrieben, das an lokalen Wund- und Pathogeninvasionsorten exprimiert wird. Unter Verwendung von allgemein fachbekannten Klonierungstechniken können diese Promotoren auf geeignete Vektoren übertragen, an die Gene fusioniert werden, die diese Erfindung betrifft, und zur Expression dieser Gene an den Orten der pflanzlichen Verwundung verwendet werden.
i. Markbevorzugte Expression:
WO 93/07278, das hier durch Verweis eingeführt wird, beschreibt die Isolation des Mais-trpA-Gens, das vorzugsweise in Markzellen exprimiert wird. Die Gensequenz und der Promotor, die sich bis zu –1726 bp vom Transkriptionsstart erstrecken, werden dargestellt. Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken können dieser Promotor oder Teile davon auf einen Vektor übertragen werden, wie z.B. pCGN1761, wo er/sie den 35S-Promotor ersetzen kann/können, und zum Antreiben der Expression eines fremden Gens in einer markbevorzugten Weise verwendet werden. Tatsächlich können Fragmente, die den markbevorzugten Promotor oder Teile davon enthalten, auf jeden Vektor übertragen und zum Benutzen in transgenen Pflanzen modifiziert werden.
j. Blattspezifische Expression:
Ein Maisgen, das Phosphoenolcarboxylase (PEPC) codiert, wurde von Hudspeth & Grula beschrieben (Plant Molec. Biol. 12: 579–589 (1989)). Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken kann der Promotor für dieses Gen zum Antreiben der Expression jedes Gens in einer blattspezifischen Weise in transgenen Pflanzen verwendet werden.
k. Pollenspezifische Expression:
WO 93/07278 beschreibt die Isolation des calciumabhängigen Proteinkinase-(CDPK)-Gens aus Mais, das in Pollenzellen exprimiert wird. Die Gensequenz und der Promotor erstrecken sich bis zu 1400 bp vom Transkriptionsstart. Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken können dieser Promotor oder Teile davon auf einen Vektor, wie z.B. pCGN1761, übertragen werden, wo er/sie den 35S-Promotor ersetzen kann/können, und zum Antreiben der Expression einer Nukleinsäure der Erfindung in einer pollenspezifischen Weise verwendet werden.
1. Rezeptor-vermittelte Transaktivierung in Gegenwart eines chemischen Liganden:
US-PS 5,880,333, hier durch Verweis eingeführt, beschreibt ein System, in dem Hormonrezeptoren der Klasse II, wie z.B. der Ecdysonrezeptor (EcR) und Ultraspiracle (USP), die zusammen als Heterodimer funktionieren, die Expression eines Zielpolypepids in einer Pflanzenzelle in Gegenwart eines geeigneten chemischen Liganden, z.B. Tebufenozid, regulieren.
2. Transkriptionsterminatoren
Eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren sind zur Verwendung in Expressionskassetten erhältlich. Diese sind verantwortlich zur Termination der Transkription über das Transgen hinaus und seine korrekte Polyadenylierung. Geeignete Transkriptionsterminatoren sind diejenigen, von denen bekannt ist, dass sie in Pflanzen funktionieren, und sie schließen den CaMV-35S-Terminator, den tm1-Terminator, den Nopolainsynthase-Terminator und den rbcS-E9-Terminator der Erbse ein. Diese können sowohl in einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzen verwendet werden. Zusätzlich kann ein nativer Transkriptionsterminators des Gens verwendet werden.
3. Sequenzen zur Steigerung oder Regulation der Expression
Es wurde gefunden, dass zahlreiche Sequenzen die Genexpression aus der Transkriptionseinheit heraus steigern, und diese Sequenzen können in Verbindung mit den Genen dieser Erfindung verwendet werden, um ihre Expression in transgenen Pflanzen zu erhöhen.
Es wurde gezeigt, dass verschiedene Intronsequenzen die Expression steigern, insbesondere in einkeimblättrigen Zellen. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass die Introns des AdhI-Gens von Mais signifikant die Expression des Gens vom Wildtyp unter seinem erkennenden Promotor bei Einführung in Maiszellen steigern. Es wurde festgestellt, dass Intron I besonders wirksam war und die Expression in Fusionskonstrukten mit dem Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen steigerte (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183–1200 (1987)). Im gleichen experimentellen System hatte das Intron aus dem bronzeI-Gen von Mais eine ähnliche Wirkung für die Steigerung der Expression. Intronsequenzen wurden routinemäßig in Pflanzentransformationsvektoren eingeführt, typischerweise innerhalb der nicht-translatierten Leitsequenz.
Eine Anzahl von nicht-translatierten Leitsequenzen, die aus Viren stammen, sind ebenfalls dafür bekannt, die Expression zu steigern, und diese sind besonders wirksam in zweikeimblättrigen Zellen. Spezifisch wurde gezeigt, dass Leitsequenzen aus dem Tabakmosaikvirus (TMV, die "W-Sequenz"), aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) und dem Alfalfa-Mosaikvirus (AMV) wirksam in der Steigerung der Expression sind (z.B. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693–8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15: 65–79 (1990)).
4. Targeting des Genprodukts innerhalb der Zelle
Es ist bekannt, dass verschiedene Mechanismen zum Targeting (Ausrichten) von Genprodukten in Pflanzen existieren, und die Sequenzen, die die Funktion dieser Mechanismen kontrollieren, wurden in einem gewissen Detail charakterisiert. Zum Beispiel wird das Targeting von Genprodukten auf den Chloroplasten durch eine Signalsequenz kontrolliert, die am Amino-terminalen Ende verschiedener Proteine gefunden wird, die während des Chloroplasteneintrags gespalten wird, um das reife Protein zu liefern (z.B. Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104–15109 (1988)). Diese Signalsequenzen können an heterologe Genprodukte fusioniert werden, um den Eintrag heterologer Produkte in den Chloroplasten zu bewirken (van den Broeck et al., Nature 313: 358–363 (1985)). DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, kann aus dem 5'-Ende der cDNAs isoliert werden, die das RUBISCO-Protein, das CAB-Protein, das EPSP-Synthaseenzym, das GS2-Protein und viele andere Proteine codieren, von denen bekannt ist, dass sie sich im Chloroplasten befinden. Siehe ebenfalls den Abschnitt mit dem Titel "Expression With Chloroplast Targeting" in Beispiel 37 aus US-PS 5,639,949.
Andere Genprodukte befinden sich in anderen Organellen, wie z.B. in den Mitochondrien und dem Peroxisom (z.B. Unger et al., Plant Molec. Biol. 13: 411–418 (1989)). Die cDNAs, die diese Produkte codieren, können ebenfalls manipuliert werden, um das Targeting heterologer Genprodukte auf diese Organoellen zu bewirken. Beispiele für solche Sequenzen sind die Kern-codierten ATPasen und spezifische Aspartat-Aminotransferase-Isoformen für Mitochondrien. Das Targeting von zellulären Proteinkörpern wurde von Rogers et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512–6516 (1985)).
Zusätzlich wurden Sequenzen charakterisiert, die das Targeting von Genprodukten auf andere Zellkompartimente verursachen. Amino-terminale Sequenzen sind verantwortlich für das Targeting auf das ER, den Apoplast und die extrazelluläre Sekretion aus Aleuronzellen (Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769–783 (1990)). Zusätzlich sind Amino-terminale Sequenzen in Verbindung mit Carboxy-terminalen Sequenzen verantwortlich für das vakuolare Targeting von Genprodukten (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: 357–368 (1990)).
Durch die Fusion der geeigneten, oben beschriebenen Targeting-Sequenzen mit interessierenden Transgensequenzen ist es möglich, das Transgenprodukt auf jede Organelle oder jedes Zellkompartiment auszurichten. Für das Chloroplasten-Targeting wird z.B. die Chloroplast-Signalsequenz aus dem RUBISCO-Gen, dem CAB-Gen, dem EPSP-Synthasegen oder dem GS2-Gen im Raster mit dem Amino-terminalen ATG des Transgens fusioniert. Die ausgewählte Signalsequenz sollte den bekannten Spaltort einschließen, und die konstruierte Fusion sollte alle Aminosäuren nach dem Spaltort berücksichtigen, die zur Spaltung erforderlich sind. In manchen Fällen kann dieses Erfordernis durch die Addition einer kleinen Anzahl von Aminosäuren zwischen dem Spaltort und dem Transgen-ATG oder alternativ durch Austausch einiger Aminosäuren innerhalb der Transgensequenz erfüllt werden. Für den Chloroplasteneintrag konstruierte Fusionen können auf Wirksamkeit der Chloroplastenaufnahme durch in-vitro-Translation von in vitro transkribierten Konstruktionen, gefolgt von der Chloroplastenaufnahme in vitro untersucht werden, wobei die Techniken verwendet werden, die beschrieben wurden von Bartlett et al. in: Edelmann et al. (Hrsg.), Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, S. 1081–1081 (1982) und Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 446–453 (1986). Diese Konstruktionstechniken sind allgemein fachbekannt und sind gleichsam anwendbar auf Mitochondrien und Peroxisome.
Die oben beschriebenen Mechanismen zum zellulären Targeting können nicht nur in Verbindung mit ihren erkennenden Promotoren verwendet werden, sondern ebenfalls in Verbindung mit heterologen Promotoren, um ein spezifisches Zell-Targeting-Ziel unter der Transkriptionsregulation eines Promotors zu bewirken, der ein Expressionsmuster aufweist, das sich von demjenigen des Promotors unterscheidet, aus dem das Targeting-Signal stammt.
Beispiel 6: Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren
Zahlreiche Transformationsvektoren, die zur Pflanzentransformation verfügbar sind, sind den Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der Pflanzentransformation bekannt, und die für diese Erfindung relevanten Gene können in Verbindung mit allen solchen Vektoren verwendet werden. Die Auswahl eines Vektors wird von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielart für die Transformation abhängen. Für bestimmte Zielarten können unterschiedliche Antibiotika- oder Herbizid-Selektionsmarker bevorzugt sein. Routinemäßig in der Transformation verwendete Selektionsmarker schließen das nptII-Gen ein, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandte Antibiotika verleiht (Messing & Vierra, Gene 19: 259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184–187 (1983)), das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625–631 (1990)), das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929–2931), das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099–1104 (1983)), das EPSPS-Gen, das Resistenz gegen Glyphosat verleiht (US-PSen 4,940,935 und 5,188,642), und das Mannose-6-phosphat-Isomerase-Gen, das die Fähigkeit zum Metabolisieren von Mannose bereitstellt (US-PSen 5,767,378 und 5,994,629).
1. Zur Agrobacterium-Transformation geeignete Vektoren
Viele Vektoren sind zur Transformation unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens verfügbar. Diese tragen typischerweise wenigstens eine T-DNA-Randsequenz und schließen Vektoren wie pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)) und pXYZ ein. Nachfolgend wird die Konstruktion von zwei typischen Vektoren beschrieben, die zur Agrobacterium-Transformation geeignet sind.
a. pCIB200 und pCIB2001:
Die binären Vektoren pCIB200 und pCIB2001 werden zur Konstruktion von rekombinanten Vektoren zur Verwendung mit Agrobacterium verwendet und werden in der folgenden Weise konstruiert. pTJS75kan wird durch NarI-Verdauung von pTJS75 geschaffen (Schmidhauser & Helsinki, J. Bacteriol. 164: 446–455 (1985)), wobei das Ausschneiden des Tetracyclinresistenz-Gens erlaubt wird, gefolgt von Insertion eines AccI-Fragments aus pUC4K, das ein NPTII trägt (Vieira & Messing, Gene 19: 259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184–187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266–276 (1990)). XhoI-Linker werden mit dem EcoRV-Fragment von PCIB7 ligiert, das die linken und rechten T-DNA-Ränder, ein pflanzenselektierbares chimäres nos/nptII-Gen und den pUC-Polylinker enthält (Rothstein et al., Gene 53: 153–161 (1987)), und das Xhol-verdaute Fragment wird in SalI-verdautes pTJS75kan kloniert, um pCIB200 zu schaffen (siehe ebenfalls EP 0 332 104 , Beispiel 19). pCIB200 enthält die folgenden besonderen Polylinker-Restriktionsorte: EcoRI, SstI, KnpI, BglII, XbaI und SalI. pCIB2001 ist ein Derivat von pCIB200, das durch die Insertion von zusätzlichen Restriktionsorten in den Polylinker geschaffen wird. Besondere Restriktionsorte im Polylinker von pCIB2001 sind EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI und StuI. pCIB2001 besitzt zusätzlich dazu, dass es diese besonderen Restriktionsorte enthält, ebenfalls eine pflanzliche und bakterielle Kanamycinselektion, linke und rechte T-DNA-Ränder zur Agrobacterium-vermittelten Transformation, die aus RK2 stammender trfA-Funktion zur Mobilisierung zwischen E. coli und anderen Wirten und die OriT- und OriV-Funktionen, ebenfalls aus RK2. Der pCIB2001-Polylinker ist geeignet zur Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten.
b. pCIB10 und Hygromycin-Selektionsderivate davon:
Der binäre Vektor pCIB10 enthält ein Gen, das Kanamycinresistenz zur Selektion in Pflanzen codiert, und rechte und linke T-DNA-Randsequenzen und beinhaltet Sequenzen aus dem Plasmid pRK252 für einen weiten Wirtebereich, was seine Vervielfältigung sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium erlaubt. Seine Konstruktion wird von Rothstein et al. beschrieben (Gene 53: 153–161 (1987)). Verschiedene Derivate von pCIB10 werden konstruiert, die das Gen für Hygromycin B-Phosphotransferase beinhalten, beschrieben von Gritz et al. (Gene 25: 179–188 (1983)). Diese Derivate ermöglichen eine Selektion von transgenen Pflanzenzellen auf nur Hygromycin (pCIB743) oder Hygromycin und Kanamycin (pCIB715, pCIB717).
2. Zur Nicht-Agrobacterium-Transformation geeignete Vektoren
Die Transformation ohne die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens umgeht das Erfordernis für T-DNA-Sequenzen im ausgewählten Transformationsvektor, und entsprechend können Vektoren, denen diese Sequenzen fehlen, zusätzlich zu Vektoren verwendet werden, wie diejenigen, die oben beschrieben wurden, die T-DNA-Sequenzen enthalten. Transformationstechniken, die nicht auf Agrobacterium beruhen, schließen die Transformation über Partikelbombardierung, Protoplastaufnahme (z.B. PEG und Elektroporation) und Mikroinjektion ein. Die Wahl des Vektors hängt weitgehend von der bevorzugten Auswahl für die transformierte Art ab. Nachfolgend wird die Konstruktion von typischen Vektoren beschrieben, die zur Nicht-Agrobacterium-Transformation geeignet sind.
a. pCIB3064:
pCIB3064 ist ein aus pUC stammender Vektor, der für direkte Gentransfertechniken in Kombination mit Selektion durch das Herbizid Basta (oder Phosphinothricin) geeignet ist. Das Plasmid pCIB246 umfasst den CaMV-35S-Promotor in funktionsfähiger Fusion mit dem E. coli-GUS-Gen und dem CaMV-35S-Transkriptionsterminator und wird in WO 93/07278 beschrieben. Der 35S-Promotor dieses Vektors enthält zwei ATG-Sequenzen 5' vom Startort. Diese Orte werden unter Verwendung von standardmäßigen PCR-Techniken in einer solchen Weise mutiert, um die ATGs zu entfernen und die Restriktionsorte SspI und PvuII zu erzeugen. Die neuen Restriktionsorte sind 96 und 37 bp entfernt vom besonderen SalI-Ort und 101 und 42 bp entfernt vom tatsächlichen Startort. Das resultierende Derivat von PCIB246 wird als pCIB3025 bezeichnet. Das GUS-Gen wird dann aus pCIB3025 durch Verdau mit SalI und SacI ausgeschnitten, die Enden abgestumpft und religiert, um das Plasmid pCIB3060 zu erzeugen. Das Plasmid pJIT82 wird vom John Innes Centre, Norwich erhalten, und dann wird ein 400 bp SmaI-Fragment, das das bar-Gen aus Streptomyces viridochromogenes enthält, ausgeschnitten und in den HpaI-Ort von pCIB3060 inseriert (Thompson et al., EMBO J. 6: 2519–2523 (1987)). Dies erzeugte pCIB3064, das das bar-Gen unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors und eines Terminators zur Herbizidselektion, ein Gen für Ampicillinresistenz (zur Selektion in E. coli) und einen Polylinker mit den besonderen Orten SphI, PstI, HindIII und BamHI umfasst. Dieser Vektor ist geeignet zur Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten.
b. pSOG19 und pSOG35:
pSOG35 ist ein Transformationsvektor, der das E. coli-Gen für Dihydrofolatreduktase (DFR) als selektierbaren Marker verwendet; der Resistenz gegen Methotrexat verleiht. PCR wird verwendet, um den 355-Promotor (–800 bp), Intron 6 aus dem Mais-Adh1-Gen (–550 bp) und 18 bp der untranslatierten GUS-Leitsequenz aus pSOG10 zu amplifizieren. Ein 250-bp-Fragment, das das Dihydrofolatreduktase-Typ II-Gen aus E. coli codiert, wird ebenfalls durch PCR amplifiziert, und diese zwei PCR-Fragmente werden mit einem SacI-PstI-Fragment aus pB1221 (Clontech) zusammengesetzt, das das pUC19-Vektorgerüst und den Nopalinsynthase-Terminator umfasst. Der Zusammenbau dieser Fragmente erzeugt pSOG19, das den 35S-Promotor in Fusion mit der Intron 6-Sequenz, der GUS-Leitsequenz, dem DHFR-Gen und dem Nopalinsynthase-Terminator enthält. Austausch der GUS-Leitsequenz in pSOG19 gegen die Leitsequenz aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) erzeugt den Vektor pSOG35. pSOG19 und pSOG35 tragen das pUC-Gen für Ampicillinresistenz und besitzen HindIII-, SphI-, PstI- und EcoRI-Orte, die zur Klonierung von fremden Substanzen verfügbar sind.
3. Zur Chloroplastentransformation geeigneter Vektor
Zur Expression einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz in Pflanzenplastiden wird der Plastidtransformationsvektor pPH143 verwendet (WO 97/32011, Beispiel 36). Die Nukleotidsequenz wird in pPH143 inseriert, wodurch die PROTOX-codierende Sequenz ausgetauscht wird. Dieser Vektor wird dann zur Plastidtransformation und Selektion von Transformanden auf Spectinomycinresistenz verwendet. Alternativ wird die Nukleotidsequenz in pPH143 inseriert, so dass sie das aadH-Gen ersetzt. In diesem Fall werden Transformanten auf Resistenz gegen PROTOX-Inhibitoren selektiert.
Beispiel 7: Transformation
Sobald eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung in ein Expressionssystem kloniert wurde, wird es in eine Pflanzenzelle transformiert. Verfahren zur Transformation und Regeneration von Pflanzen sind allgemein fachbekannt. Zum Beispiel wurden Ti-Plasmidvektoren zur Übertragung von Fremd-DNA verwendet, ebenso wie direkte DNA-Aufnahme, Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion und Mikroprojektile. Zusätzlich können Bakterien aus der Gattung Agrobacterium verwendet werden, um Pflanzenzellen zu transformieren. Es folgen Beschreibungen für repräsentative Techniken zur Transformation von sowohl zweikeimblättrigen als auch einkeimblättrigen Pflanzen sowie für eine repräsentative Plastidtransformationstechnik.
1. Transformation von zweikeimblättrigen Pflanzen
Transformationstechniken für zweikeimblättrige Pflanzen sind allgemein fachbekannt und schließen Techniken auf Agrobacterium-Basis und Techniken ein, die kein Agrobacterium erfordern. Nicht-Agrobacterium-Techniken beinhalten die Aufnahme von exogenem genetischem Material direkt durch Protoplasten oder Zellen. Dies kann durch PEG- oder Elektroporation-vermittelte Aufnahme, Partikelbombardierung-vermittelte Übertragung oder Mikroinjektion erreicht werden. Beispiel für diese Techniken werden beschrieben von Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717–2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169–177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001–1004 (1986) und Klein et al., Nature 327: 70–73 (1987). In jedem Fall werden die transformierten Zellen zu ganzen Pflanzen unter Verwendung von fachbekannten Standardtechniken regeneriert.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist eine bevorzugte Technik zur Transformation von zweikeimblättrigen Pflanzen wegen ihrer hohen Effizienz der Transformation und ihrer breiten Anwendbarkeit mit vielen unterschiedlichen Arten. Die Agrobacterium-Transformation beinhaltet typischerweise die Übertragung des binären Vektors, der die interessierende Fremd-DNA trägt (z.B. pCIB200 oder pCIB2001), auf einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, was vom Komplement von vir-Genen abhängen kann, die vom Agrobacterium-Wirtsstamm entweder auf einem co-residenten Ti-Plasmid oder chromosomal getragen werden (z.B. Stamm CIB542 für pCIB200 und pCIB2001 (Uknes et al., Plant Cell 5: 159–169 (1993)). Die Übertragung des rekombinanten binären Vektors auf Agrobacterium wird durch ein triparentales Kreuzungsverfahren unter Verwendung von E. coli, das den rekombinaten binären Vektor trägt, eines E. coli-Helferstammes, das ein Plasmid wie pRK2013 trägt und den rekombinanten binären Vektor zum Agrobacterium-Zielstamm mobilisieren kann, erreicht. Alternativ kann der rekombinante binäre Vektor auf Agrobacterium durch DNA-Transformation übertragen werden (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).
Die Transformation der Zielpflanzenart duch rekombinantes Agrobacterium beinhaltet gewöhnlich die Co-Kultivierung des Agrobacteriums mit Explantaten aus der Pflanze und folgt allgemein fachbekannten Protokollen. Transformiertes Gewebe wird auf selektierbarem Medium regeneriert, das die Antibiotika- oder Herbizid-Resistenzmarker zwischen den binären Plasmid-T-DNA-Rändern trägt.
Ein anderer Ansatz zur Transformation von Pflanzenzellen mit einem Gen beinhaltet das Beschleunigen inerter oder biologisch aktiver Partikel auf Pflanzengewebe und -zellen. Diese Technik wird in US-PSen 4,945,050, 5,036,006 und 5,100,792 offenbart. Allgemein beinhaltet dieses Verfahren das Beschleunigen inerter oder biologisch aktiver Partikel auf die Zellen unter Bedingungen, die wirksam zur Durchdringung der äußeren Oberfläche der Zellen sind und eine Aufnahme in ihrem Inneren liefern. Wenn inerte Partikel verwendet werden, kann der Vektor in die Zelle durch Überziehen der Partikel mit dem Vektor eingeführt werden, der das gewünschte Gen enthält. Alternativ kann die Zielzelle vom Vektor umgeben werden, so dass der Vektor in die Zelle mit der Strömung des Partikels getragen wird. Biologisch aktive Partikel (z.B. getrocknete Hefezellen, getrocknetes Bakterium oder ein Bakteriophage, die jeweils DNA enthalten, die eingeführt werden soll) können ebenfalls in Pflanzenzellgewebe beschleunigt werden.
2. Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen
Die Transformation der meisten einkeimblättrigen Arten ist jetzt ebenfalls Routine geworden. Bevorzugte Techniken schließen den direkten Gentransfer in Protoplasten unter Verwendung von PEG oder Elektroporationstechniken und die Partikelbombardierung in Kallusgewebe ein. Transformationen können mit einer einzelnen DNA-Art oder multiplen DNA-Arten (d.h. Co-Transformation) unternommen werden, und diese beiden Techniken sind zur Verwendung mit der Erfindung geeignet. Die Co-Transformation kann den Vorteil der Vermeidung einer vollständigen Vektorkonstruktion und der Erzeugung transgener Pflanzen mit unverbundenen Loci für das interessierende Gen und den selektierbaren Marker aufweisen, was die Entfernung des selektierbaren Markers in anschließenden Generationen ermöglicht, sollte dies als wünschenswert betrachtet werden. Jedoch ist ein Nachteil der Verwendung der Co-Transformation die weniger als 100%ige Häufigkeit, mit der separate DNA-Arten im Genom integriert werden (Schocher et al., Biotechnology 4: 1093–1096 (1986)).
Die Patentanmeldungen EP 0 292 435 , EP 0 392 225 und WO 93/07278 beschreiben Techniken zur Herstellung von Kallus und Protoplasten aus einer ausgelesenen Inzuchtlinie von Mais, die Transformation von Protoplasten unter Verwendung von PEG oder Elektroporation und die Regeneration von Maispflanzen aus transformierten Protoplasten. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603–618 (1990)) und Fromm et al. (Biotechnology 8: 833–839 (1990)) haben Techniken zur Transformation einer aus A188 stammenden Maislinie unter Verwendung von Partikelbombardierung veröffentlicht. Ferner beschreiben WO 93/07278 und Koziel et al. (Biotechnology 11: 194–200 (1993)) Techniken zur Transformation von ausgewählten Inzuchtlinien von Mais durch Partikelbombardierung. Diese Technik verwendet unreife Maisembryos mit einer Länge von 1,5 bis 2,5 mm, ausgeschnitten aus einem Maiskolben 14–15 Tage nach der Bestäubung, und eine PDS-1000He Biolistikvorrichtung zur Bombardierung.
Die Transformation von Reis kann auch durch direkte Gentransfertechniken unter Verwendung von Protoplasten oder Partikelbombardierung erfolgen. Die Protoplasten-vermittelte Transformation wurde für Japonica-Typen und Indica-Typen beschrieben (Zhang et al., Plant Cell Rep. 7: 379–389 (1988); Shimamoto et al., Nature 338: 274–277 (1989); Datta et al., Biotechnology 8: 736–740 (1990)). Beide Typen sind ebenfalls routinemäßig unter Verwendung von Partikelbombardierung transformierbar (Christou et al., Biotechnology 9: 957–962 (1991)). Ferner beschreibt WO 93/21335 Techniken zur Transformation von Reis durch Elektroporation.
Die Patentanmeldung EP 0 332 581 beschreibt Techniken zur Erzeugung, Transformation und Regeneration von Pooideae-Protoplasten. Diese Techniken erlauben die Transformation von Dactylis und Weizen. Ferner wurde die Weizen-Transformation von Vasil et al. (Biotechnology 10: 667–674 (1992)) unter Verwendung von Partikelbombardierung in Zellen mit langzeitregenerierbarem Kallus vom Typ C beschrieben, und ebenfalls von Vasil et al. (Biotechnology 11: 1553–1558 (1993)) und Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077–1084 (1993)) unter Verwendung von Partikelbombardierung von unreifen Embryos und aus unreifen Embryos stammendem Kallus. Eine bevorzugte Technik zur Weizentransformation beinhaltet jedoch die Transformation von Weizen durch Partikelbombardierung von unreifen Embryos und schließt entweder einen konzentrierten Saccharose- oder konzentrierten Maltoseschritt vor der Genübertragung ein. Vor der Bombardierung wird eine beliebige Anzahl von Embryos (mit einer Läne von 0,75 bis 1 mm) auf MS-Medium mit 3% Saccharose (Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473–497 (1962)) und 3 mg/l 2,4-D zur Induktion von somatischen Embryos ausplattiert, was im Dunklen erfolgt. Am gewählten Tag der Bombardierung werden die Embryos aus dem Induktionsmedium entfernt und auf das Osmotikum plaziert (d.h. Induktionsmedium mit Saccharose oder Maltose, die in der gewünschten Konzentration zugegeben werden, typischerweise 15%). Man lässt die Embryos für 2–3 h plasmolysieren und bombardiert sie dann. 20 Embryos pro Zielplatte sind typisch, obwohl nicht kritisch. Ein geeignetes Gentragendes Plasmid (wie pCIB3064 oder pSG35) wird auf Goldpartikeln mit Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Jede Platte von Embryos wird mit der Heliumvorrichtung DuPont Biolistics^® unter Verwendung eines Berstdrucks von ca. 1000 psi unter Verwendung eines Standardgitters mit 80 mesh beschossen. Nach der Bombardierung werden die Embryos zurück ins Dunkel plaziert, um sich für ca. 24 h zu erholen (noch auf dem Osmotikum). Nach 24 h werden die Embryos aus dem Osmotikum entfernt und zurück auf Induktionsmedium plaziert, wo sie für ca. 1 Monat vor der Regeneration bleiben. Ca. 1 Monat später werden die Embryoexplantate mit sich entwickelndem embryogenem Kallus auf Regenerationsmedium überführt (MS + 1 mg/l NAA, 5 mg/l GA), das ferner das geeignete Selektionsmittel enthält (10 mg/l Basta im Fall von pCIB3064 und 2 mg/l Methotrexat im Fall von pSOG35). Nach etwa 1 Monat werden entwickelte Schösslinge auf größere sterile Behälter übertragen, die als "GA7s" bekannt sind, die halbkonzentriertes MS, 2% Saccharose und die gleiche Konzentration des Selektionsmittels enthalten.
Die Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen unter Verwendung von Agrobacterium wurde ebenfalls beschrieben. Siehe WO 94/00977 und US-PS 5,591,616, beide hier durch Verweis eingeführt.
3. Transformation von Plastiden
Samen von Nicotiana tabacum c.v. "Xanthi nc" werden zu siebt pro Platte in einem ringförmigen Array mit 1'' auf T-Agarmedium gekeimt und 12 bis 14 Tage nach dem Aussäen mit 1 μm Wolframpartikeln bombardiert (M10, BioRad, Hercules, CA), die mit DNA aus den Plasmiden pPH143 und pPH145 überzogen sind, im wesentlichen wie beschrieben (Z. Svab und P. Maliga (1993) PNAS 90, 913–917). Bombardierte Keimlinge werden auf T-Medium für 2 Tage inkubiert, worauf Blätter ausgeschnitten und mit der abaxialen Seite nach oben in hellem Licht (350–500 μmol Photonen/m²/s) auf Platten aus RMOP-Medium (Z. Svab, P. Hajdokiewicz und P. Maliga (1990) PNAS 87, 8526–8530) plaziert werden, das 500 μg/ml Spectinomycindihydrochlorid enthält (Sigma, St. Louis, MO). Resistente Schösslinge, die unter den gebleichten Blättern drei bis acht Wochen nach der Bombardierung erscheinen, werden auf dem gleichen selektiven Medium subkloniert, man lässt Kallus bilden, und sekundäre Schösslinge werden isoliert und subkloniert. Die vollständige Trennung von transformierten Plastidgenomkopien (Homoplasmizität) in unabhängigen Subklonen wird durch Standardtechniken von Southern-Blotting bewertet (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). BamHI/EcoRI-verdaute Gesamtzell-DNA (I. J. Mettler (1987) Plant Mol. Biol. Reporter 5, 346–349) wird an 1% Tris-Borat-(TBE)-Agarosegelen getrennt, auf Nylonmembranen (Amersham) überführt und mit ³²P-markierten statistisch geprimten DNA-Sequenzen sondiert, die einem 0,7 kb BamHI/HindIII-DNA-Fragment aus pC8 entsprechen, das einen Teil der rps7/12-Plastid-Targeting-Sequenz enthält. Homoplasmatische Schösslinge werden aseptisch auf Spectinomycin-haltigem MS/IBA-Medium bewurzelt (K. E. McBride et al. (1994) PNAS 91, 7301–7305) und in das Gewächshaus überführt.
Beispiel 8: Züchtung
Die über Transformation mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz erhaltenen Pflanzen können beliebige aus einer großen Vielzahl von Pflanzenarten sein, einschließlich derjenigen von einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzen; jedoch werden die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pflanzen bevorzugt aus der Liste aus landwirtschaftlich bedeutenden Zielkulturpflanzen ausgewählt, die oben aufgeführt wurden. Die Expression eines Gens der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen Eigenschaften, die zur Erzeugung und Qualität bedeutend sind, kann in Pflanzenlinien durch Züchtung eingeführt werden. Züchtungsansätze und -techniken sind fachbekannt. Siehe z.B. J. R. Welsh, Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981); Crop Breeding, D. R. Wood (Hrsg.), American Society of Agronomy Madison, Wisconsin (1983); O. Mayo, The Theory of Plant Breeding, 2. Auflage, Clarendon Press, Oxford (1987); D. P. Singh, Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986); Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986).
Die genetischen Eigenschaften, die in die oben beschriebenen transgenen Samen und Pflanzen manipuliert wurden, werden durch geschlechtliche Vermehrung oder vegatatives Wachstum weitergegeben und können somit in Nachkommenschaftspflanzen aufrechterhalten und vermehrt werden. Allgemein macht die Aufrechterhaltung und Vermehrung Gebrauch von bekannten landwirtschaftlichen Verfahren, die entwickelt wurden, um spezifischen Zwecken zu genügen, wie Pflügen, Säen oder Ernten. Spezialisierte Prozesse, wie Hydrokultur oder Gewächshaustechniken, können ebenfalls eingesetzt werden. Da der wachsende Anbau anfällig für Angriff und Schädigungen ist, die durch Insekten oder Infektionen verursacht werden, sowie für die Konkurrenz durch Unkrautpflanzen, werden Maßnahmen ergriffen, um Unkräuter, Pflanzenkrankheiten, Insekten, Nematoden und andere nachteilige Bedingungen zu bekämpfen, um die Ernte zu verbessern. Diese schließen mechanische Maßnahmen, wie das Pflügen des Bodens oder die Entfernung von Unkräutern und infizierten Pflanzen, sowie die Ausbringung von Agrochemikalien ein, wie z.B. von Herbiziden, Fungiziden, Gametoziden, Nematoziden, Wachstumsregulationsmitteln, Reifungsmitteln und Insektiziden.
Verwendung von vorteilhaften genetischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen und Samen kann ferner in der Pflanzenzüchtung gemacht werden, die auf die Entwicklung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften abzielt, wie z.B. Toleranz von Schädlingen, Herbiziden oder Stress, verbessertem Nährwert, erhöhtem Ertrag oder verbesserter Struktur, was weniger Verlust aus Umlegen oder aus Streuen verursacht. Die verschiedenen Züchtungsschritte sind durch einen wohldefinierten menschlichen Eingriff gekennzeichnet, wie z.B. die Auswahl der zu kreuzenden Linien, die Ausrichtung der Bestäubung der parentalen Linien oder die Auswahl geeigneter Nachkommenschaftspflanzen. Abhängig von den gewünschten Eigenschaften werden unterschiedliche Zuchtmaßnahmen ergriffen. Die relevanten Techniken sind allgemein fachbekannt und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf: Hybridisierung, Inzucht, Rückkreuzungszüchtung, Multilinienzüchtung, Sortenmischung, interspezifische Hybridisierung, aneuploide Techniken etc. Hybridisierungstechniken schließen ebenfalls die Sterilisation von Pflanzen ein, um männlich- oder weiblich-sterile Pflanzen durch mechanische, chemische oder biochemische Mittel zu liefern. Die Kreuzbestäubung einer männlich-sterilen Pflanze mit Pollen einer unterschiedlichen Linie stellt sicher, dass das Genom der männlich-sterilen, aber weiblich-fruchtbaren Pflanze gleichförmig Eigenschaften beider parentaler Linien erhalten wird. Somit können die erfindungsgemäßen transgenen Samen und Pflanzen für die Züchtung von verbesserten Pflanzenlinien verwendet werden, die z.B. die Wirksamkeit herkömmlicher Verfahren, wie z.B. Herbizid- oder Pestizidbehandlung, erhöhen oder es erlauben, aufgrund ihrer modifizierten genetischen Eigenschaften diese Verfahren abzusetzen. Alternativ können neue Anbauten mit verbesserter Stresstoleranz erhalten werden, die aufgrund ihrer optimierten genetischen "Ausrüstung" ein Ernteprodukt besserer Qualität als Produkte liefern, die nicht vergleichbare nachteilige Entwicklungsbedingungen ertragen konnten.
Beispiel 9: Saatgutproduktion
Bei der Saatgutproduktion sind die Keimungsqualität und Gleichförmigkeit der Samen wesentliche Produkteigenschaften, wohingegen die Keimungsqualität und Gleichförmigkeit der Samen, die vom Landwirt geerntet und verkauft werden, nicht bedeutend ist. Da es schwierig ist, einen Anbau frei von anderen Anbau- und Unkrautsamen zu halten, Saatgut-bürtige Krankheiten zu bekämpfen und Saatgut mit guter Keimung zu erzeugen, wurden von den Saatguterzeugern, die erfahren auf dem Gebiet der Züchtung, Konditionierung und Vermarktung von reinem Saatgut sind, relativ umfassende und wohldefinierte Saatguterzeugungspraktiken entwickelt. Daher ist es für den Farmer übliche Praxis, zertifiziertes Saatgut zu kaufen, das spezifische Qualitätsstandards erfüllt, anstelle Saatgut zu verwenden, das er aus seinem eigenen Anbau geerntet hat. Als Samen zu verwendendes Fortpflanzungsmaterial wird gewöhnlich mit einem Schutzüberzug behandelt, der Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematozide, Molluskizide oder Mischungen daraus umfasst. Üblicherweise verwendete Schutzüberzüge umfassen Verbindungen wie Captan, Carboxin, Thiram (TMTD^®), Methalaxyl (Apron^®) und Pirimiphos-methyl (Actellic^®). Nach Wunsch werden diese Verbindungen zusammen mit Trägern, Tensiden oder anwendungsfördernden Hilfsstoffen formuliert, die gewöhnlich auf dem Formulierungsgebiet eingesetzt werden, um gegen Beschädigung, die durch bakterielle, pilzliche oder tierische Schädlinge verursacht wird, zu schützen. Die Schutzüberzüge können durch Imprägnieren von Fortpflanzungsmaterial mit einer flüssigen Formulierung oder durch Überziehen mit einer kombinierten nassen oder trockenen Formulierung aufgetragen werden. Andere Verfahren der Anwendung sind ebenfalls möglich, wie die auf die Knospen oder Frucht gerichtete Behandlung.
Beispiel 10: Maispflanzenanalyse
Mit den Plasmiden pNOV1436, pNOV1441 und pNOV1313 über Agrobacterium-vermittelte Transformation transformierte Maispflanzen ergeben 100% Mortalität gegenüber Maiszünsler und Asiatischem Baumwollwurm. ELISA-Daten sind nachfolgend dargestellt:

MTL: = Mais-Metallothionein-artig
Mz Ubi: = Mais-Ubiquitin

Beispiel 11: Reispflanzenanalyse
Mit Plasmid pNOV1305 über Agrobacterium-vermittelte Transformation transformierte Reispflanzen ergeben 100% Mortalität gegenüber Maiszünsler und Asiatischem Baumwollwurm. Die ELISA-Daten sind nachfolgend dargestellt:

MTL: = Mais-Metallothionein-artig

Beispiel 12: Kohlpflanzenanalyse
Mit Plasmid pZU578 (SEQ ID NO: 17) über Agrobacterium-vermittelte Transformation transformierte Kohlpflanzen wurden gegen Plutella xylostella (Kohlmotte) untersucht. Transgene und Kontrollpflanzen wurden mit 16 Larven (Larvenstadium 1–3) befallen, 4 auf jeweils 4 Blättern, übertragen mit einer Pinselbürste aus einer im Käfig gehaltenen Plutella-Kultur (mit Kohlpflanzen). Befallene Pflanzen wurden in Käfige mit 1 × 1 × 1 m³ für die Dauer der Untersuchung überführt. Die Kontrollpflanzen schlossen nicht-transformierte Kohlpflanzen (anfällige Kontrolle) und nicht-transformierte Kohlpflanzen ein, die mit gewerblichem Bt-Pestizid Dipel (resistente Kontrolle) besprüht waren. Die Bewertung (nach 2 Wochen) war:

–: = keine Schädigung (oder nur kleine Löcher = resistent);
+: = große Löcher auf Pflanze (= anfällig);
++: = viele große Löcher, Pflanze stark beschädigt (= anfällig).

Dipel-Pflanzen schlossen immer mit – ab, anfällige Kontrollen schlossen mit ++ ab. Die Insektenschädigungsbewertungen für transgene und Kontrollpflanzen und die ELISA-Daten sind nachfolgend dargestellt:

Act2: = Arabidopsis-Actin 2

Sequenzprotokoll

Claims

Synthetische Nukleotidsequenz, die ein Hybridtoxin aus Bacillus thuringiensis codiert, das Domänen I und II aus einem Cry1Ab-Toxin, verbunden in der Amino-zu-Carboxy-Richtung mit Domäne III aus einem Cry1C-Toxin, und eine C-terminale Schwanzregion aus einem Cry1Ab-Toxin umfasst, worin die synthetische Nukleotidsequenz modifiziert wurde, um die spezifischen GC-Gehaltvorzüge von Pflanzen zu berücksichtigen.
Synthetische Nukleotidsequenz gemäss Anspruch 1, worin das Hybridtoxin SEQ ID NO: 6, 8 oder 10 umfasst.
Synthetische Nukleotidsequenz gemäss Anspruch 1, die SEQ ID NO: 5, 7 oder 9 umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das SEQ ID NO: 5, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16 oder 17 umfasst.
Nukleinsäuremolekül gemäss Anspruch 4, das SEQ ID NO: 5, 7 oder 9 umfasst.
Nukleinsäuremolekül gemäss Anspruch 4, das SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 oder 17 umfasst.
Chimäres Gen, das eine heterologe Promotorsequenz umfasst, die funktionsfähig mit der synthetischen DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 verbunden ist.
Rekombinanter Vektor, der das chimäre Gen gemäss Anspruch 7 umfasst.
Transgene Pflanzenzelle, die das chimäre Gen gemäss Anspruch 7 umfasst.
Transgene Pflanze, die die transgene Pflanzenzelle gemäss Anspruch 9 umfasst.
Transgene Pflanze gemäss Anspruch 10, die eine Mais-, Baumwoll-, Reis- oder Kohlpflanze ist.
Transgenes Saatgut aus der transgenen Pflanze gemäss Anspruch 10, worin das transgene Saatgut die synthetische Nukleotidsequenz umfasst, die das Hybridtoxin aus Bacillus thuringiensis gemäss Anspruch 1 codiert.
Verfahren zur Bekämpfung eines Insektenschädlings, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Spodoptera frugiperda, Roter Baumwollkapselwurm, Tabakknospenwurm, Maiszünsler und Kohlmotte besteht, umfassend das In-Kontakt-Bringen des Insektenschädlings mit der transgenen Pflanze gemäss Anspruch 10.
Verfahren gemäss Anspruch 13, worin die transgene Pflanze Mais, Baumwolle, Reis oder Kohl ist.
Verfahren zur Herstellung einer insektenresistenten Pflanze, umfassend das Einführen einer synthetischen Nukleotidsequenz gemäss Anspruch 1 in die Pflanze, worin die synthetische Nukleotidsequenz in der Pflanze in einer effektiven Menge zur Bekämpfung von Insektenschädlingen exprimierbar ist.
Verfahren gemäss Anspruch 15, worin die Insektenschädlinge Lepidoptera-Insektenschädlinge sind.
Verfahren gemäss Anspruch 16, worin die Insektenschädlinge Spodoptera frugiperda, Roter Baumwollkapselwurm, Tabakknospenwurm, Maiszünsler und Kohlmotte sind.
Verfahren gemäss Anspruch 15, worin die Pflanze Mais, Baumwolle, Reis oder Kohl ist.