DE2342862C3

DE2342862C3 - An beiden Kettenenden Reste von a -Aminooxycarbonsäuren aufweisende Peptide mit ACTH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Peptide enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2342862C3
Application number: DE2342862A
Authority: DE
Inventors: Gyoergy Dr. Hajos; Lajos Dipl.- Chem.-Ing. Dr. Kisfaludy; Miklos Loew; Olga Nyeki Geb. Kuprina; Agnes Patthy Geb. Lukats; Maria Szirmai Geb. Sarkoezi; Laszlo Dr. Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1972-08-25
Filing date: 1973-08-24
Publication date: 1981-01-15
Also published as: GB1429808A; CH591430A5; SU651691A3; DE2342862A1; US3862111A; AT335082B; IL43056A0; AU5929173A; DE2342862B2; BE804016A; ES418158A1; HU167360B; CS172872B2; ATA706473A; NL7311592A; AU471173B2; RO72481A; IL43056A; FR2196815B1; JPS5040563A

Description

Q-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OR)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(Q)-Pro-VaI-GIy-[Lys(Q)],,-X

worin η und OSer die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen und

X den mii Carboxyl- und Seitenkettenaminoschutzgruppe versehenen Rest der «-Aminooxy-e-aminocapronsäure,

R eine Carboxylschutzgruppe, insbesondere eine tert.-Butyl- oder Benzylgruppe, und
die Gruppen Q gleiche oder verschiedene Aminoschutzgruppen, insbesondere Benzyloxycarbonyl-, terL-Butyloxycarbonyl- oder Formylgruppen, bedeuten, jeweils in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen abspaltet und gewünschtenfalls die erhaltenen Peptide in ihre Säureadditionssalze oder Amide überfuhrt.

3. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1.

Es ist bekannt, daß die Peptidkette des Adrenocorticotrophormons (ACTH) weilgehend modifiziert werden kann, ohne daß dadurch die adrenocorticotrope Wirkung aufgehoben würde. So kann vom C-terminalen Ende des Moleküls mehr als ein Drittel der Aminosäurekette abgespalten werden, ohne daß die spezifische Aktivität sinkt. Die Abspaltung weiterer Aminosäuren führt jedoch zu einer sprungartigen Abnahme der Aktivität. Das Fragment 1-19 besitzt 30%. das Fragment 1-16 jedoch nur ungetähr 1% der Aktivität des gesamten Moleküls. Demgegenüber verursacht am N-terminalen Kettenende bereits die Abspaltung der ersten Aminosäure einen Aktivität* verlust von 50% (L Schröder. K. l.übke: The Peptides, Academic Press. New York. IQ(Ih. 24h 249)

Die an Stelle des N-terminalen Serins D-Aminosätiren, in der Natur nicht vorkommende Aminosäuren öder die vom Serin durch Fofittähme seiner funkiionellen Gruppen ableitbaren ACylgruppen (ß-Hydroxypfopiöflyl·, Propionylgruppe) enthaltenden ACTH'Fragmente zeigen fallweise eine stärkere Aktivität als das natürliche ACTH, da diese modifizierten Fragmente, wie angenommen werden kann, gegen· über den Enzymen vom Aminopepiidaseiyp feststeht sind und daher im Organismus langsamer abgebaut werden als das natürliche ACTH. Deswegen zeigen diese modifizierten Fragmente auch dann eine starke adrenocorticotrope Aktivität, wenn die modifizierende Gruppe die Rolle des N-terminalen Serinteils des natürlichen Hormons nicht völlig auszufüllen vermag.

Die Erscheinung, daß bei Verringerung der Gliederzahl des ACTH-Fragments vom C-terminalen Ende aus die Wirkung der C-terminalen Amid-Derivate

ίο später abzusinken beginnt als die der die entsprechenden freien Carboxylgruppen enthaltenden Peptide, ist auf vergleichbare Gründe zurückzuführen, denn die meisten Enzyme vom Typ der Carboxypeptidase sind nicht imstande, Peptidamide abzubauen. Daher schien es, als sei durch Amidieren des C-terminalen Carboxyls die gleiche Schutzwirkung zu erreichen rv\z am N-terminalen Keltenende durch entsprechende Substitution des Serinteils. Neuerdings wurde jedoch festgestellt, daß es Carboxypeptidase-Enzyme gibt, die

2G aucn zum r-vuspaitcn ucr v^-icrminaicn i-vrninosaiire ucr Peptidamide befähigt sind (J. D. Glass u. a.: Proc. Nat Acad. Sei. U. S. 63, 1426 (1969)). Da die substituierten Amide von diesen Enzymen nicht hydrolysiert werden, kann man erwarten, daß die C-terminal substituierten, zum Amid umgesetzten ACTH-Fragmente im Organismus langsamer abgebaut werden und dadurch eine stärkere biologische Wirkung zeigen als die entsprechenden einfachen Amide. Deutschen Forschern ist es tatsächlich gelungen, einige Hepladekapeptid-alkylamid-Derivate mit starker adrenocorticotroper Wirkung herzustellen (DE-OS 19 54 794).

Es wurde nun gefunden, daß es zur Erreichung der gesteigerten Wirkung sehr vorteilhaft ist, wenn an den ACTH-Fragmenten 1-17, 1-18 oder 1-19 beide terminalen Aminosäuren durch Aminooxysäuren ersetzt werden, und zwar die N-terminale (Serin) durch D-«-Aminooxy-^-hydroxypropionsäure und die C-terminale durch L- oder D-a-Aminooxy-e-aminocapronsäure.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide der allgemeinen Formel (I)

H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)„-OLys-OH
« (I)

in der η eine ganze Zahl von 2 bis 4, D-OSer die D-Form des Restes der «Anunooxy-^-hycliOxypropion- und OLys die L- oder D-Form des Restes der a-Amino-

-,o oxy-i-aminocapronsäurc bedeuten, sowie deren Säureadditionssal/e und Amide.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Peptide der allgemeinen Formel (I) sowie von deren Säureadditionssalzen und

si Amiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man von Pcpiidcn der allgemeinen Formel Il

g-I)-( )Scr-Tyr-Scr-Met-Ciluf OR)-I Iis-Phe-Arg-Trp-GIy-I.ys(Q)-Pr< >-VaI-GIy-[I vs(Q)]„-X
(Ü)

worin η und OSer die ober) angegebenen Bedeutungen besitzen Und

X den mit Carboxyl· und Seitenkettenaminoschutzgruppe versehenen Rest der a-Aminooxy^-aminöcapronsäurcs

R eine Carboxylschutzgruppe, insbesondere eine tert.-Butyl· oder Benzylgruppe, Und

die Gruppen Q gleiche oder verschiedene Aminoschutzgruppen, insbesondere Benzyloxycarbonyl-, tert-Butyloxycaibonyl- oder Formylgruppen, bedeuten, jeweils in an sich bekannter Weise
die Schutzgruppen abspaltet und gewünschtenfalls die erhaltenen Peptide in ihre Säureadditionssalze oder Amide überführt.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich Arzneimittel, die eine Verbindung nach Anspruch 1 enthalten.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten geschützten Peptide werden, ausgehend von den entsprechenden Ä-Aminooxysäuren und Aminosäuren, in an sich bekannter Weise durch Fragmentkondensation oder durch Kettenverlängerung um jeweils eine Aminosäure hergestellt, wobei nach der Azid-, der Aktivester-, der DCC- oder der Technik des gemischten Anhydrids gearbeitet werden, aber auch die sogenannte Synthese in fester Phase angewandt werden kann, bei der das Peptid mit se.ner am Kettenende befindlichen Carboxylgruppe an ein Polymer gekuppelt ist und aufgebaut wird, indem die Aminosäuren und schließlich die Λ-Aminooxysäure in der entsprechenden Reihenfolge an die an das Polymer gebundene C-terminale a-Aminooxysäure angebaut wird.

Die funktionellen Gruppen, die ar der Reaktion nicht teilnehmen, werden zweckmäßig geschützt, und zwar durch Gruppen, die durch Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse oder Reduktion leicht abgespalten werden können. Die Carboxylgruppe kann z. B. vorzugsweise du-di Verestern mit Methanol, tert-Butanol, Benzylalkohol, p-Chlorhenzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol oder durch Amidbildung geschützt werden, zum Schutz der Arninooxy- und der Aminogruppen kommen in erster Liiiie die Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrobenzolsulfenyl-, Phthalyl-, Benzyloxycarbonyl- und p-Chlorbenzyloxycarbonyl-Gruppe, besonders jedoch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe in Frage. Die Guanidinogruppe des Arginins kann vor allem durch die Nitrogruppe geschützt, aber auch in ihrer protonierten Form verwendet werden. Die Iminogruppe des Histidins kann mit der Benzyl-, Trityl- oder der Dinitrophenylgruppe geschützt werden. Die Hydroxylgruppen der Seitenketten werden fallweise durch Veräthern geschützt, wobei vorzugsweise mit tert.-Butanol oder mit Benzylalkohol veräthert wird.

Durch Anwendung einer geeigneten Kombination von Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese Schutzgruppen in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Hydrolyse. Acidolyse. Hydrazinolyse oder Reduktion selektiv oder gleichzeitig entfernt werden können.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird so vorgegangen, daß man eine geschützte t-Ammooxysäure mit dem Tripeptid-Methylester Tyr-Ser-Met-OCHi kondensiert, das Hydrazid des erhaltenen substituierten Tetrapeptidmethvlcsiers zum A/.id umsetzt und mit diesem das Dekapeptid Glu{OBu')-His-Phe-Arg-Trp-C}|y L.ys (BÖC)-Pro-Val-Gly aeyliert. Das auf diese Weise erhal· tene substituierte Tetradekapeptid kondensiert man mit dem Ester des aus der entsprechend geschützten, kompletten weiteren Aminosäuresequenz bestehenden Peptides, das Hydrazid des auf diese Weise erhaltenen substituierten Peptidesters setzt man zum Azid um und aeyliert damit das entsprechend geschützte Derivat der C-lcrminalcn Amifiooxysäurc, So wird zum Beispiel bei der Herstellung eines substituierten Heptadekapeptides das substituierte Tetradekapeptid mit dem Ester des 15— 16-Dipeptides, bei der Herstellung eines substituierten Oktadekapeptides mit dem Ester des 15—17-Tripeptides, bei der Herstellung eines substituierten Nonadekapeptides mit dem Ester des 15- 18-Tetrapeptides kondensiert Bei diesen Kondensationen wird vorzugsweise das DCC-Verfahren oder die Methode des Aktivesters angewandt Im letzteren Falle, besonders bei der Verwendung von Pentachlorphenyl- oder Pentafluorphenylester braucht der aktive Ester nicht isoliert zu werden; er kann mit Hi'fe von Pentachlorphenol oder Pentafluorphenol und DCC (vgl. AT-PS 2 95 051) aus dem substituierten Tetradekapeptkl im Reaktionsgemisch der Kondensationsreaktion gebildet werden.

Es kann auch so vorgegangen werden, daß man das entsprechend geschützte C-terminale Aminooxysäurederivat mit dem entsprechend geschützten 15-16-Dipeptid, 15-17-Tripeptid oder 15-18-Tetrapeptid acyliciU das auf diese Weise erhaltene substituierte Peptidderivat nach der selektiven Entfernung der N-terminalen Schutzgruppe mit dem substituierten Tetradekapeptid kondensiert und so das als Ausgangsstoff benötigte, an beiden Enden Aminooxysäuren enthaltende geschützte Peptid erhält Am Ende der Synthese werden die an der fv-terminalen a-Aminooxygruppe und an den Aminogruppen der Seitenketten befindlichen tert-Butyloxycarbonylgruppen, die an den Carboxylgruppen de^r Seitenketten und an der C-terminalen Carboxylgruppe — sofern diese nicht amidiert ist — befindlichen tert-Butylestergruppen sowie die am Hydroxyl der Seitenketten eventuell vorhandenen tert.-Butyläthergruppen gleichzeitig mittels Acidolyse, zum Beispiel durch Behandeln mit Trifluoressigsäure, abgespalten.

Wenn das als Ausgangsstoff benutzte Peptid auch mit Trifluoressigsäure nicht abspaltbare Schutzgruppen, zum Beispiel Formylgruppen, snthälv ">o werden diese vor oder nach der Entfernung der übrigen Schutzgruppen in einem besonderen Reaktionsschritt abgespalten. Die Reinigung des von seinen Schutzgruppen befreiten Endproduktes kann durch Verteilung im Gegenstrom oder durch Säulenchromatographie, zum Beispiel durch l· nenaustauschchromatographie an unterschiedlichen Carboxymethylcellulosearten, vorgenommen werden.

Die neuen Verbindungen werden in Abhängigkeit von der bei ihrer Herstellung angewendeten Methode in Form freier Basen oder des Salzes erhalten. Aus den Salzen können die freien Basen in an sich bekannter Wpise freigesetzt werden. Die freien Basen können mit den für pharmazeutische Zwecke verwendbaren Säuren zu Säureadditionssalzen umgesetzt werden. Für diesen Zweck kommen anorganische Säuren, zum Beispiel Salzsäure. Schwefelsäure und Phosphorsäure, aber auch organische Säuren, wie zum Beispiel Ameisensäure Essigsäure, höhere Fettsäuren. Mi'chsäuren. Weinsaure. Zitronensäure in Frage.

Unter Amiden der neuen Verbindungen werden auch die am Stickstoff unterschiedlich substituierten Amide, in erster Linie die an der Oterminalen Carboxylgruppe amidierlen, in der Seitenkette jedoch gegebenenfalls auch freie Carboxylgruppen enthaltenden Peptidamide Verstanden,

Aus den erfindungsgemäßen Peptiden können zur pharmazeutischen Verwendung die üblichen pharmazeutischen Präparate hergestellt werden. Diese Präparate enthalten die erfindungsgemäßen Verbin-

düngen zusammen mit zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten organischen oder anorganischen Streckmitteln. Die pharmazeutischen Präparate können feste Lyophilisate sein, wobei als Streckmittel mit Peptiden nicht reagierende Verbindungen, zum Beispiel Mannit, Milchzucker oder Stärke, in Frage kommen, sie können aber auch in Form von Suspensionen und Emulsionen hergestellt werden, welche verschiedene neutrale Konservierungsmittel und Stabilisatoren enthalten.

Entsprechend der üblichen Dosis des Adrenocorticotrophormons enthalten die pharmazeutischen Präparate die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von zum Beispiel 0,1—5 mg/ml. Die Präparate können subcutan, intramuskulär oder parenteral 1 — 7mal pro Woche verabreicht werden.

Die praktische Ausführung des Verfahrens wird an Hand der folgenden Beispiele erläutert.

In den Beispielen werden zur Beziehung der Aminosäuren und der Peptid-Derivate die durch die IUPAC-IUB vorgeschlagenen Abkürzungen benutzt (J. Biol. Chem. 247, 977 [1972]). Zur Bezeichnung eier Λ-Aminooxysäuren werden die den Abkürzungen der Aminosäuren ähnlichen, weiter oben bereits erwähnten Symbole OSer bzw. OLys benutzt. Die obigen Abkürzungen beziehen sich — GIy ausgenommen — falls nicht anders angegeben, auf die L-Antipoden. Als weitere Abkürzungen werden verwendet:

PCPOH = Pentachlorphenol.
PFPOH = Pentafluorphenol,
DCC= Dicyclohexylcarbodiimid, DCU = Dicyclohexylcarbamid. BOC = tert.-Butyloxycarbonyl, Bu' = tert.-Butyl.
For = Formyl.
>

Die Bestimmung des Schmelzpunktes wurde mit dem Apparat nach Dr. Tottoli vorgenommen. Die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden ' an dem Adsorbens Silikagel nach Stahl mit folgenden Lösungsmittelgemischen durchgeführt:

IO

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1. Essigester:

(Pyridin : Essigsäure : Wasstr = 20 :6 :

2. Essigester:

(Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20 :6 : 10 = 8 :2

3. Essigester:

(Pyridin : Essigs<;\ire : Wasser = 20 :6 : 11) = 6 :4

Beispiel 1

D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GIy-Lys-Pro-Val-Gly-l.ys-Lys-Lys-OLys-NHj

0.75 g (0,267 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met GIu-(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-LyS(BOC)-LyS(BOC)-EyS(BOC)-OLyS(FOr)-NHi werden in einem Gemisch aus 6 ml Trifluoressigsäure, 0,75 ml Wasser und 0.75 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 150 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpenioxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Es werden 0,70 g (86%) Trifluoracetat des substituierten PormyIOktadekapeplides erhalten. Die Substanz wird in IO ml Wasser gelöst, 0,25 ml Mercaptoälhanol weiden zugesetzt und der pH-Wert der Lösung mit n-Naironlaugc auf 5 eingestellt. Danach wird die Lösung mit 11,5 ml 2-m-Hydrazinacetatlösung vermischt und zwei Stunden lang bei 95°C auf dem Wasserbad gehalten. Danach wird im Vakuum eingeengt und die Restlösung auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht Man eluiert mit einem aus 0,2 m (pH 6,7) und 0,5 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten, lyophilisiert die entsprechenden Fraktionen und erhält 0,275 g (38%) substituiertes Oktadekapeptidamid.

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte substituierte Oktadekapeptidamid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

L-a-tert-Butyloxycarboivyl-aminooxye-formylamino-capronsäureiBOC-OLys/For/)

23,2g (6OmMoI) -N-f-Formvl D-Lysin und 43,2g (423 mMol) Natriumbromid weiden in 248 ml 2Jn Schwefelsäure gelöst Die Lösung wird auf 0° gekühlt, und unter Rühren werden innerhalb von 30 Minuten in Portionen 13,3 g (192 mMol) Natriumnitrit zugegeben. Das Reäktionsgemisch wird eine Stunde lang bei 0⁰C und eine Stunde lang bei Zimmertemperatur nachge-

rührt und dann dreimal mit 200 ml Äther ausgeschüttelt. Die vereinigten ätherischen Lösungen werden getrocknet und danach eingedampft. Die als Rückstand verbleibenden 18.4 g rohe D-a-Brom-e-formylaminocapronsäure werden in 190 ml Äthanol gelöst und der

j!i Lösung 8,4 g (15OmMoI) Kaliumhydroxyd und 10,0 g (76 mMol) tert.-Butyloxycarbonylhydroxylamin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird zwei Stunden lang gekocht und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wird das Lösungsmittel abdestilliert, der

Si Rückstand in 80 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 10%iger Salzsäure auf 3 eingestellt. Die saure Lösung wird mit Natriumchlorid gesattigt und dreimal mit 150 ml Äther, danach mit 150 ml Essigester ausgeschüttelt. Die Äther- und Essigesterphasen werden vereinigt, getrocknet und eingedampft Der kristalline Rückstand (Ib g) wird aus 25 ml Essigester umkristallisiert. Man erhält 10.4 g (27%) L <vtert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-f-formylamino-capropsäure.

99:1 Schmelzpunkt: 114-116 C. Rf =0.31. [λ],,=-52.5°

⁴'' (c= I.Methanol).

Analyse C-H₂₂NA (290.32):

Berechnet: C 49.6°· . H 7.65%;
_5n gefunden: C 49.9°/·. H 7.6%.

Schritt 2

L-rx-tert.-Butyloxycarbonyl-amnooxy-

f-formylamino-capronsäu-e-amid
" (BOC-OLys/For/-NH₂)

5.0g (17.2 .nMol) BOC-OL.ys(For) werden in 107 ml wasserfreiem l'etrahydrofuran gelöst und der Lösung 1,90 ml 0⁷.2 mMol) N»Methylmorpholin zugesetzt. Die Lösung wird auf -10°C abgekühlt, und unier Rühren Werden 2,25 ml (17,2 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird noch 10 Minuten lang bei -1O⁰C gehalten und dann auf -20⁰C gekühlt. Nun werden vorsichtig 10,7 ml (142 mMol) konzentrierte Ammoniumhydroxydlösung zugetropft und das Reaktionsgemisch eine Stunde lang bei 0⁰C und eine Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird das Tetrahydrofuran abdestilliert

und der halbkristalline Rückstand mit 20 ml eines Gemisches aus Essigesler : Pyridin : Essigsäure : Wasser im Verhältnis 900 :54 :16 :30 auf eine Silikagelsäure von 250 ml Volumen aufgebracht. Man eiuiert mit derselben Mischung, sammelt die Fraktionen, die den gewünschten Stoff enthalten und dampft sie eim Man erhält 43 g (86%) BOC-OLys(For)-NH₂ in Form eines schwach gelben amorphen Stoffes. R?= 0,54. C₁₂H₂₃N₃O₅ (28934).

Schritt 3

Tert.- Buty loxycarbonyl-D-oc-aminooxy-ß-benzyloxypropionsäure

48.4 g (0364 Mol) tert.-Butyloxycarbonyl-hydroxylamin, 40,7 g (0,728 Mol) Kaliumhydroxyd und 94,0 g (0,364 Mol) DL-a-Brom-/?-bcnzyloxypropionsäure werden in jöömi Wasser gelost. Das Reakiionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt. Dann wird sein pH-Wert auf 3 eingestellt und dreimal mit 720 ml Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird mit 720 ml Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und mit 78 ml (0,40 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. 43,61 g Dicyclohexylaminsalz der tert.-Butyioxycarbonyl-DL-<%-aminooxy-j3-benzyloxypropionsäure werden erhalten (Schmelzpunkt: 144-I46°C). Das Salz wird in 500 ml Äther suspendiert und die Suspension fünfmal mit 100 ml 0,2-n-Schwefelsäure ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird nach dem Trocknen zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 700 ml Äthanol gelöst, und es werden 6,56 g (48,5 Mol) ( + )-Amphetaminbase zu der Lösung gegeben.

Die Lösung wird über Nacht an einen kühlen Ort gestellt, anderntags werden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert. Das erhaltene ( + )-Amphetaminsalz der terL-Butyloxycarbonyi-D-a-aminooxyj3-benzyloxypropionsäure wird aus Äthanol umkristallisierL Ausbeute: 13.27 g. Schmelzpunkt: 188-191°C. [<x]?+54° (c=0,5. Methanol). Aus dem Salz wird in bekannter Weise die tert-Butyloxycarbonyl-

D-«-aminnoxv-ß-hpn7vlr>Yvnrnninn<:äiirp prhaltpn Aue- närhctpn Tagp <:tphpn

wird eine Stunde lang bei 0⁰C gerührt und bis zum nächsten Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Danach wird das DCU abfütrieri, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 400 ml Essigesler ge^ löst. Die Lösung wird zweimal mit je 200 rhi n-Salzsäure Und zweimal mil je 200 ml 8%iger Natriumhydrogen· carbonatlösung gewaschen, dann getrocknet und schließlich eingedampft Der Rückstand (8,10 g geschützter substituierter Telrapeptidesler) wird in 85 ml Methanol gelöst, der Lösung werden 2.2 ml (46 mMol) Hydrazinhydrat zugegeben und das Reaktionsgemisch bis zum nächsten Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdestilliert, der Rückstand mit Essigester verrieben, filtriert, mit

Essigester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Man erhall 7.21 g (63%) geschütztes substituiertes Tetrapeplidhydrazid. Der Schmelzpunkt des aus Wasser umknstaüisierten Produktes liegt bei 174-175° C. Rl= 0.30.

Analyse C^H_4nNhO₁₀S (616.69):

Berechnet: C48,7%. H 6.55%. N 13.6%;
gefunden: C 48,3%. H 6.6%. N 13.8%.

Schritt 6

BOC D-O^er-Tyr-Ser-Met-GluiOBu'J-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly · HCI

1.25 g (2,13 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-NjH) werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf -2O⁰C gekühlt. Untef Rühren werden zuerst 2,08 ml (832 mMol) 4 η salzsaurer Essigester, danach 032 ml (2,70 mMol) tert.-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei - 10⁰C 5 Minuten gerührt, dann auf -20⁰C gekühlt, und es werden 2,78 g Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy und 1,4 ml (8,13 mMol) Diisopropylälhylamin in 23 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei einer Temperatur von -5 bis 0⁰C gerührt und dann bei 0°C bis zum

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beute: 7,9g (14%), Schmelzpunkt: 96-98°C [«] "= +38° (c= 1,Äthanol).

Schritt 4

tert-Butyloxycarbonyl-D-oc-aminooxy-jS-hydroxypropionsäure (BOC- D-OSer)

5,5 g (17,7 mMol) D-a-tert-Butyloxycarbonylaminooxy-^-benzyloxj-propionsäure werden in 110 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2,75 g 10%igem Aktivkohle-PalJadium-Katalysator hydriert Nach drei Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das Methanol abdestilliert und der ölige Rückstand unter Petroläther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach dem Filtrieren und Trocknen erhält man 3,65 g (96%) D-a-tert-Butyloxycarbonylaminooxy-ß-hydroxypropionsäure. Schmelzpunkt

94-95°CR}=0,27.C₈H₁5NO6(221,22).

Schritt 5
BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-NzHj

4,4 g (2OmMoI) BOC-D-OSer und 9,0 g (2OmMoI) Tyr-Ser-Met-OCHj werden in 3OmI Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf 0⁰C gekühlt und zuerst 2^2 ml (2OmMoI) N-Methylmorpholin, dann 3,8 g (18,4 mMof) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch

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Dip I nsiinir wirri pin-

gedampft und der Rückstand mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung verrieben. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Wasser und Trocknen erhält man 3,49 g (94%) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid. Dieses wird in 24 ml Methanol suspendiert, und eine aus 4,75 ml konzentrierter Salzsäure und 4.75 ml Pyridin bereitete Pyridinhydrochloridlösung zu der Suspension gegeben. Die Lösung wird mit 240 ml Wasser verdünnt und der ausgefallene Niederschlag aufiltriert, mit Wasser gewaschen und schließlich getrocknet 2#5 g (73%) Hydrochlorid des geschützten Tetradekapeptides werden erhalten. Schmelzpunkt: 200 - 202° C, Rr=0^5. Cq, Hi 34N₂₁O₂₅ClS (1989.68).

Schritt 7
Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCHj - Oxalat

11,0 g (17JmMoI) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH₃ (K. Hofmann, J. Am. Chem. Soc. 86,4991 [1964]) werden in 200 ml Methanol gelöst, mit 2,0 g (22,2 mMol) wasserfreier Oxalsäure versetzt und in Gegenwart von 2,0 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Man erhält 9,1 g (89%) Dipeptidester-oxalat das nach Umkristallisieren aus Isqpropanol-Diisopropyläther bei 65-67° C schmilzt Rr= 034,

[<x]d+3,79° (c= 1, Methanol).
Analyse CjirUN-tÖu (578,65):

Berechnet: C 51,9%, 118,9%, N 9,7%;
gefunden: G 51,5%, H 7,9%, N 9,9%,

Schritt 8
Z-LyS(BOG)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH₃

8.1 g (14.OmMoI) LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH₁ ■ Oxalat werden in 60 ml Essigesler suspendiert der Suspension zuerst 3.1 ml (28,OmMoI) N-Methylmorpholin, dann 6,7 g (14.OmMoI) Z-LyS(BOC)-ONSu zugesetzt Und das Reaktionsgemisch zwei Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird das eingedickte Reaktionsgemisch mit 200 ml Essigester und 40 ml Wasser verdünnt. Nach Abtrennung der wäßrigen Phase wird die Essigesterphase zweimal mit 40 ml η-Salzsäure und zweimal mit 40 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und schließlich eingedampft Der Rückstand wird mit Diisopropyläther verrieben, das erhaltene rohe Produkt wird aus einem Isopropanol-Diisopropyläther-Gemisch umkristallisiert. Man erhält 8,0 g (67%) Methylester des geschützten Tripeptides. Schmelzpunkt: U7-118°C, Rl-0.58. [α] ι> -17,47° (c<=\, Methanol)

Analyse C₄₂H₇₀NhO, ₂(851,03):

Berechnet:
gefunden:

C 59,3%. H 8,3%;
C 59,7%. H 8.2%.

Schritt 9

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Schritt 10

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu^l)-His-Phe-Arg-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-

LyS(BOC)-N₂H₃

2,5 g (0,93 mMol) BOC-D-OSer-Tyl-Ser-Met-Glu-(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-GIy-Lys(BOC)-Pro-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCHj - HCI werden in 75 ml kochendem Methanol gelöst Die Lösung wird auf

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIuf.OBu'J-His-Phe-Arg-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-

Lys(BOC)-OCH, · HCl

1,25 g Z-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH₅ werden in 25 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0,2 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydrieri. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Methanol abdestilliert und der als Rückstand verbliebene Tripeptidester zusammen mit 2,42 g (1,24 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-

GIu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(B0C)-Pro-VaI-GIy · HCI in 12 ml Dimethylformamid gelöst. Der Lösung werden 0,97 g (3,64 mMol) PCPOH und 0,255 g (1,24 mMol) DCC zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur 2 Tage stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert das Filtrat im se Vakuum eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Äther ausgefällt Das nach Filtrieren und Trocknen erhaltene rohe Produkt (3,4 g, Schmp.: 177°C, unter Zersetzung) wird aus einem Methanol-Äther-Gemisch umgefällt 2,6 g (80%) Hydrochlorid des geschützten substituierten Heptadekapeptid-methylesters werden erhalten. Schmelzpunkt: 191°C (Zersetzung), R?=0,54.

60 Zimmertemperatur abgekühlt, mit 0,91 ml (18,7 mMol) Hydrazinhydfat versetzt Und bei Zimmertemperatur zwei Tage lang stehen gelassen. Danach wird das Methanol abdeslilliert und der Rückstand mit Äther verrieben. Das rohe Produkt (2,-15 g_{ Schmp.: 199°C, unter Zersetzung) wird aus Dimethylformamid und Wasser umgefällt. Man erhält 2,00 g (81%) Hydrazid des geschützten substituierten Heptadekapeptides. Schmelzpunkt: 205⁰C (Zersetzung), Rf= 0,49. Ci₂₄HmN₂OOnS (2652,16).

Schritt 11

B0C-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(0Bu')-His-Phe-Arg-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-

Lys(BOC)-OLys(For)-NH₂

a) 0,57 κ (1.97 mMol) BOC-OLys(For)-NH₂ werden in 7,5 ml Trifluoi essigsaure gelöst Die Lösung wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 4 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Diisopropyl-äthylamin neutralisiert.

b) 1,00 g (0,377 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-N₂H₃ werden unter schwachem F.rwärmen in 5 ml Dimethylformamid gelöst Die Lösung wird auf -20"C abgekühlt, und unter Rühren werden zuerst 0,54 ml (1,52 mMol) 2,8-n-salzsaurer Essigester, dann 0,05 ml (0,42 mMol) tert-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang bei -10⁰C gerührt, auf -20⁰C abgekühlt und dann die gemäß Absatz a) bereitete, neutralisierte OLys(For)-NH2-TrifIuoracetatlösung zusammen mit 0,2 ml (1,17 mMol) Diisopropyl-äthylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei -5 bis O⁰C gerührt und dann bei 0⁰C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Danach wird die Hälfte des Lösungsmittels abdestilliert und der Rest mit 20 ml Wasser verdünnt. Die ausfallende Masse erstarrt beim Stehen. Sie wird unter frischem Wasser zerpuh^.rt filtriert und getrocknet. 0,80 g (75,5%) geschütztes

Schmelzpunkt: 140-145°C, Rf=0,47, CmH₂OeN₃₀O₃₆S (280935).

Beispiel 2

D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-VaI-GIy-LyS-LyS-LyS-D-OIyS-NH₂

0,75 g (0,267 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Giu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(For)-NH2 werden in einem Gemisch aus 6 ml Trifluoressigsäure, 0,75 ml Wasser und 0,75 ml Anisol gelöst Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 150 ml Äther verdünnt Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert mit Äther gewaschen und über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet Es werden 0,65 g (80%) Trifluoracetat des substituierten Formyl-Oktadekapeptides erhalten. Die Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst 0,25 ml Mercaptoäthanol werden zugesetzt und der pH-Wert der Lösung wird mit η-Natronlauge auf 5 eingestellt Danach wird die Lösung mit 10,6 ml 2-m-Hydrazinacetatlcsung vermischt und zwei Stunden lang bei 95° C auf dem Wasserbad gelassen. Nach Einengen im Vakuum wird die Restlösung auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht Man etuiert mit einem aus 0,2 m (pH 6,7)

Il

und 0,5 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten Püffergfadienten, sammelt und lyophilisiert die entsprechenden Fraktionen und erhält 0,28 g (41%) substituiertes Oktadekapeptidamid.

Schritt 1

D-α-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-

ε-formylamino-capronsäure

(BOC-D-OLys(For))

Auf die im Schritt 1 von Beispiel 1 beschriebene Weise wird aus Ν-ε-Formyl-L-Lysin-D-a-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-E-formylamino-capronsäure

10 gradienten mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/h, sammelt die das Produkt enthaltenden 98—115 Fraktionen und lyophilisiert sie. Man erhält 0,40 g (41%) durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Öktadekapeplidamid. Peptidgehalt: 78% (im UV-9pektrum) Met-Sulfoxidgehalt:2,3%.Tyr/Trp-Verhältnis:l : 10.

Aminosäureanalyse:

Lys 3,5 (4), His 0,9 (1), Arg 1,0 (1), Ser 0,85 (1), GIu 1,0 (1), Pro 1,0 (1), GIy 1.9 (2), VaI 0,9 (1), Met 0,7 (I). Tyr 0,9(1), Phe 1.0(1). Rf =0.18.

hergestellt. Schmelzpunkt: 114—116°C,
[a]o= +58,6° (C= 1, Methanol).

Analyse Ci₂H₂₂N₂O₆ (290,32):

Berechnet:
gefunden:

C 49.6% H 7,65%;
C 50.0%. H 7,6%.

Schritt 2

20

25

D-a-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-

ε-formylamino-capronsäureamid

(BOC-D-OLyS(FOr)-NH₂)

Das Amid wird, ausgehend von 5,0 g (17,2 mMol) BOC-D-OLys(For), auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt. Man erhält 4,4 g (88%) BOC-D-ÖLys(For)-NH₂ · Rf= 0,54,Ci₂H₂₂N₃O₅(289,34).

Schritt 3

IBOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluiOBuO-His-Phe-Arg-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(For)-NH₂

Ausgehend von 0,57 g (1.97 mMol) BOC-D-OLys-(FOr)-NH₂, erhält man auf die im Schritt 11 von Beispiel j Ug₃-U-J-Uj.-- hi-:„ λ η/. _ /οεη/-\ ...„u η^-ς subsii tuiertes Oktadekapeptidamid. Schmelzpunkt: 140 -145° C, R?= 0,47, Ci _3] H₂06N₃₀O₃6S (2809,35).

B e i s ρ i e 1 3

H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-OLys-NH₂

Ug (0,417 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-(OBuO-HiS-Ph₆-Ar₈-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy- Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH₂ werden in einem Gemisch aus 9,6 ml Trifluoressigsäure, 1,2 ml Wasser und 1,2 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 240 ml Äther verdünnt Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet Es werden 1,10 g (84%) durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Oktadekapeptidamid-trifluoracetat erhalten. Das rohe Trifluoracetat wird in 20 ml Wasser gelöst und die Trifluoracetationen werden mittels acetatcyclischer Ionenaustauscher gegen Acetationen ausgetauscht

Danach wird die so erhaltene Lösung auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule (44 x 65 cm) aufgebracht Man eluiert mit einem au? 21 0,2 m (pH=67) und 21 0.5 m (pH=6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffer-Das als Ausgangsstoff verwendete, geschützte, durch Aminooxycarbonsäure substituierte Oktadekapeptidamid wird auf folgende Weise hergestellt:

Rf= 0,31, Schritt 1

Dicyclohexylaminosalz der L-a-tert.-Butyloxycarbo-

nyl-aminooxy^-benzyloxy-carbonyl-amino-capron-

säure (DOC-OLys/Z/-OH OCHA)

Auf die im Schritt I von Beispiel 1 beschriebene Weise wird aus Ν-ε-Benzyloxycarbonyl-D-Lysin hergestellt. Die erhaltene ölige L-<x-tert.-Butyloxycarbonyl-

aminooxy^-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure
wird in Äther gelöst und mit Dicyclohexylamin zum Dicyclohexylaminsalz umgesetzt. Schmelzpunkt: 158- 16PC (aus Äthanol-Wasser-Gemisch umkristallisiert): Rf = 0.15 [<x]n= - 34,6° (c= 1. Äthanol).

Schritt 2

L-flc-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-e-benzyloxy-

carbonyl-amino-capronsäure-amid

(BOC-O/Lys/ZZ-NH^

Das Dicyclohexylaminsalz von L-«-tert-Butyloxycarbonyl-aminooxy-E-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure wird mit Äther und n-Schwefelsäure ausgeschüttelt und die ätherische Lösung eingedampft. Die erhaltene Säure wird auf die im Schritt L von Bei-

Nach Eindampfen des Reaktionsgemisches wird das Rohprodukt, anstatt säulenchromatographisch gereinigt, in Äthylacetat gelöst und mit Wasser, n-Schwefelsäure und schließlich mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Danach wird die Äthylacetatphase eingedampft. Man erhält das L-a-tert-Butyloxy-carbonyl-aminooxy-s-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure-amid in Form eines dicken Öles. Schmelzpunkt: 93-95°C (aus Methanol-Wasser-Gemisch umkristallisiert) Rf =0,42 [k]d= -274° (c= 1, Methanol).

Schritt 3

L-a-tert-Butyloxycarbonyl-aminooxy-E-aminocapronsäure-amid-oxalat (BOC-OLyS-NH₂ · Oxalat)

12,0 g (30,4 mMol) BOC-OLyS(Z)-NH₂ werden in 240 ml Methanol gelöst, mit 3,0 g (333 mMol) wasserfreier Oxalsäure versetzt und in Gegenwart von 2,0 g 10%igen Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Man erhält nach Umkristallisieren des Rohoxalates (93 g)_aus einem Gemisch von 45 ml Methanol und 95 ml Äther 8,7 g (814%) L-tert-Butyloxycarbonyl-aminooxy-E-amino-capronsäure-amid-

Oxalat Schmelzpunkt: 153-155⁰C, Ri'=0,30 [ä]o=-38,P (c= \, Methanol).

Schritt 4

L-a-Amirrooxy-e-tert.-Butyloxycarbonyl-aminocapronsäure-amid(N-OLys/B0C/-NH₂)

8,0 g (22,8 mMol) BOC-OLyS-NH₂ · Oxalat werden in 40 ml Trifiuoressigsäure gelöst und die Lösung nach einer halben Stunde unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit gewechselten Äther gewaschen, danach 24 ml Dioxan und so viel 2-n-Natriunihydroxyd zugegeben, daß eine schwache Lauge (pH =8-9) entsteht. Nach Zugabe von 6,6 g (45,6 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-azid und 2,3 g (57,5 mMol) Magnesiumoxyd wird das Reaktionsgemii.ch 16 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, danach der feste ieii abliltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser gelöst und dreimal mit 70 ml Äthylacetat ausgeschüttelt. Nach Eindampfen der Äthylacetat-Phasen wird der Rest mit Äther verrieben, abfiltriert und danach das Rohprodukt (6,35 g) aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 3,6 g (60,5%) L-a-Aminooxy-e-tert.-butyloxycarbonyl-aminocapronsäure-amid. Schmelzpunkt: 118-120⁰C Rr =0,30[«]/j= -39.5° (c= I.Methanol).

Schrut 5
Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-N₂Hi

25,15 g (29.5 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH) werden in 500 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 5,0 g 10%igem Aktivkohle-Palladium-Katalysator hydriert. Nach Ablauf der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rest in 180 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird mit 5,72 ml (41,OmMoI) Triäthylamin und 10,26 g (36,8 mMol) Tritylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden lang bei Zimmer-. temperatur stehen gelassen, danach das Lösungsmittel sbdcstiüiert

nd de

in 3*"*^ rn! *»ih"!üC£i2t "s bei -10⁰C gerührt, dann auf -20⁰C gekühlt und die Lösung von 1,42 g (5,45 mMol) H-OLys(BOC)-NH₂ und 2,2 ml (12,8 mMol) Diisopropyläthylamin in 7 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgtimisch wird eine Stunde lang zwischen - 5°C und 0°C gerührt, dann bis zum nächsten Tag bei 0⁰C stehen gelassen. Danach wird die Lösung eingedampft, der Rest in 140 ml Äthylacelat gelöst und die Lösung mit 40 ml Wasser, dreimal mit 40 ml 5%iger Citronensäurelösung, dann zweimal mit .40 ml 8%iger Nairiumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen wird das Äthylacetat abdestilliert und der feste Rückstand mit Äther verrieben. Nach dem Abfiltrieren und Trocknen erhält man 2,75 g (54%) geschütztes, durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Tetrapeptidamid. Schmelzpunkt: I37-14O°C Rf =0,26, [λ]ο=-24,4° (c=\, Methanol).

Die Lösung wird mit 50 ml Wasser, dreimal mit 50 ml 5%iger Citronensäurelösung und dreimal mit 50 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, dann getrocknet und schließlich eingedampft. Der Rest wird unter Petroläther zerpulvert. Nach dem Filtrieren und Trocknen erhält man 28,0 g rohes Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH₃. Die rohe Substanz wird ohne weitere Reinigung in 170 ml Methanol gelöst, mit 7,25 ml (150 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach drei Tagen wird das Methanol •bfiltriert und der Rest mit Äther verrieben. Das Rohprodukt (17,65 g) wird aus einem Gemisch von 35 ml Methanol und 350 ml Äther umkristallisiert. Man erhält 13,85 g (49%) geschützte Tetrapeptidhydrazide. Schmelzpunkt: 197-199°C .Rf =0,13 [«]_o=-7,l fc=1, Methanol).

Schritt 6
TrI-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OLyS(BOC)-NH₂

4,1 g (4,27 mMol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-N₂Hj werden in 14 ml Dimethylformamid gelöst Die Lösung wird auf — 20⁰C gekühlt, und unter Rühren werden zuerst 6,5 ml (17,0 mMol) 2,6-n-Salzsäurelösung in Äthylacetat dann 0,65 ml (5,45 mMol) tert-Butylnitrit zugetropft Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang Schritt 7

H-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OLyS(BOC)-NH₂HCI

5,0 g (4,22 mMol)
(BOC)-OLyS(BOC)-NH₂

Tri- Lys( BOC)-Lys(BOC)-Lyswerden in 50 ml Methanol gelöst und mit einer Pyridin-Hydrochloridlösung aus 1,7 ml Pyridin und 1,7 ml konz. Salzsäure versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das Methanol abdestilliert und die zurückbleibende dicke Masse mit 150 ml Wasser durchgeknetet, nach Abgießen des Wassers im Vakuum getrocknet und unter Äther zerpulvert. Mach dem Abfiltrieren und Trocknen erhält man 3,7 g (82%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOQ-OLyS(BOC)-NH₂-HCI. Schmelzpunkt: 120-123°C R/ = 0,72[a]o= + 17° (c= !,Methanol).

Schritt 8

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LystBOq-Pro-Val-Gly-LysCBOC)-

Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH₂

0,9995 g (0,5 mMol) BOC-D-OSer-Tss -Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy-OH HCI, 0,491g (0,5 mMol) H-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH₂ · HCl und 0,800 g (3,0 mMol) PCPOH werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst 0,055 ml (0,5 mMol) N-Methylmorpholin, dann 0,210 g (1,0 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird einen Tag lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das DCC abfiltriert und das Filtrat mit 100 ml Äther verdünnt Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert mit Äther gewaschen und getrocknet Man erhält 1,30 g (90%) geschütztes, durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Oktadekapeptidamid.R? =0,50.

Beispiel 4

D-Oser-Tyr-Ser-Met-GIu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-D-OLys-N^

1,2 g (0,417 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu<)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH₂ werden in einem Gemisch von 9,6 ml Trifiuoressigsäure, 1,2 ml Wasser und 1,2 ml Anisol gelöst Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und danach mit 240 ml Äther verdünnt Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und

über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet Man erhält 1,05 g (80%) substituiertes Oktadekapeptidamid-trifluoracetat Das rohe Trifluoracetat wird in 20 ml Wasser gelöst und die Tnfluoracetationen werden mittels acetatcyclischem Ionenaustauscher gegen Acetationen ausgetauscht Danach wird die so erhaltene Lösung auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule (4,5 χ 55 cm) aufgebracht Man eluiert mit einem aus 21 0,2-n-(pH=6,7) und 21 0,5-n-(pH=ö,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/h, sammelt die das Produkt enthaltenden Fraktionen 103—112 und Iyophilisiert sie. Man erhält 0,42 g (37%) durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Oktadekapeptidamid. Peptidgehal·: 82% (im UV-Spektrum): Met-Sulfoxidgehalt: l,8%;Tyr/Trp-Verhältnis: 1,07.

Aminosäureanalyse:

I.ys 3.4 (4). His 1.0 (1). Arg OS (1), Ser 0,8 (11 GIu Oi) (1), Pro 1,0 (I), GIy" 2,05 (2), VaI 0,9 (1). Met 0,75(1),Tyr05(1),Phe 1,0(1). Rf =0.18.

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte, durch Aminooxycarbonsäure substituierte Oktadekapeplidamid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

Dicyclohexylaminsalz von D-nc-tert-Butyloxycarbonyl-

aminooxy-E-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure

(BOC-D-OLys/Z/OH · DCHA)

Auf die im Schritt 1 von Beispiel 1 beschriebene Weise wird die Säure aus Ν-ε-Benzyloxycarbonyl-L-Lysin hergestellt.

Die erhaltene ölige D-a-tert.-Butyloxycarbonylaminooxy-e-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure wird in Äther gelöst und mit Dicyclohexylamin zum Dicyclohexylaminsalz umgesetzt. Schmelzpunkt: 159- 162°C (aus Äthanol-Wasser-Gemisch umkristallisiert):R}=0.15[«],.=+35.4Vc= I.Äthanol).

Schritt 2

D-ix-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-f-benzyl-

oxycarbonyl-amino-capronspureamid

(BOC-D-OLys/Z/NH;)

Auf die im Schritt 2 von Beispiel 3 beschriebene Weise wird aus dem Dicyclohexylaminsalz von D-<%-

tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-e-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure das Amid hergestellt. Rf =0,42. Schmelzpunkt. 95-97°C. [n]u= +28.9° Cc=I, Methanol).

Schritt 3

D-a-tert.-Butylöxycarbonyl-aminooxy-e-aminocapronsäureamid-oxalat(BOC-D-OLys-NH₂ · Oxalat)

Auf die im Schritt 3 von Beispiel 3 beschriebene Weise wird aus D-a-tert.-Butyloxycarbonyl-arriinooxy-e-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäureamid das Oxalat hergestellt. Schmelzpunkt: 155-157⁰C Rf = 0,30[«]»= +39.0° (C= !,Methanol).

Ϊ6

Schritt 4

D-a-Aminuoxy-e-tert-Butyloxycarbonyl-aminocapronsäureamid(N-D-OLys/BOC-NHj)

Auf die im Schritt 4 von Beispiel 3 beschrieben Weise wird diese Verbindung aus D-«-tert-ButyIoxy carbonyl-aminooxy-ß-amino-capronsäurecmid-oxalat hergestellt Schmelzpunkt: 118-12O°C Rf = 0,2 [ci\p= +40,4° (c= !,Methanol).

Schritt 5
,5 Tn-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH

Auf die im Schritt 6 von Beispiel 3 beschrieben' Weise wird diese Verbindung aus 8,7 g (1,OmMo! Tn-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-NbH, und 3.Cg (UJmMoI) H-D-OLys(BOC)-NH. hergestellt Nach Eindampfen der Äthylacetatphase wird das zurückbleibende Rohprodukt mit 20 ml eines Gemische; aus Äthylacetat: (Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20 :60 :11) = 99 : 1 auf eine Silikagelsäule aufgebrach und Chromatographien. Das Eluat wird in 15-mI-Frak tionen entnommen und ihre Zusammensetzung mittel; Dünnschichtchromatographie untersucht. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen 85-192 werden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Man erhält 3,70 g (34,5%) geschütztes, durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Tetrapeptidamid. Schmelzpunkt 132 -136° C Rf =0.23.

Schritt 6

H-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH₂HCl

2,0 g (2,1OmMoI) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-D-OLyS(BOC)-NH: werden in 20 ml 80%igei Essigsäure gelöst. Die Lösung wird 20 Minuten lang be Zimmertemperatur stehen gelassen, dann eingedampf und der Rest mit Äther verrieben. Das so erhaltene durch Aminooxycarbonsäure substituierte Tetrapeptid amidacetat (1.68 g: Schmelzpunkt: 94-95X) wird in 17 ml Methanol gelöst, dann Pyridinhydrochloridlösung erhalten durch Versetzen von 1.35 ml Pyridin mit 1,35 ml konz. Salzsäure, zugegeben und das Methanol abdestilliert. Der Rückstand wird mit 50 ml Wasser ver rieben. Nach dem Filtrieren. Waschen mit Wassei und Trocknen werden 1,2 g (72%) H-Lys(BOC) Lys(BOC) LyS(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH, · HCI erhal ten. Schmelzpunkt: 122-125°C: Rt' = 0.70.

Schrill 7

BOC D OSer-Tyr-Ser-Mel-Glu(OBu')-His-Phe

Arg TrP-GIy-LyS(BOC)-PrOVaIGIy-LyS(BOC)

LyS(BOC)-LyS(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH₂

0,995 g (0,5mMol) BOC-DOSer-TyrSer-Met GluiOBu'J'His-Phe-Arg'Trp'Gly-LysiBOGj-Pro-Val' GIy-OH · HCI, 0,491 g (0,5mMol) H-Lys(BOC) LyS(BOC)-LyS(BqC)-P-OLyS(BOC)NH₂ · HCI und 0,800 g (3,0 ffiMöl) PCPOH Werden in 5,0 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst 0,055 ml (0,5 niMol

030 263/tlÖ

N-Methylmorpholin, dann 0,210 g (I₁OmMoI) DCC zugegeben Das Reaktionsgemisch wird einen Tag lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 100 ml Äther verdünnt Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet 1,40 g (97%) geschütztes, durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Oktadekapeptidamid werden erhalten. Schmelzpunkt: 170-178° C; Rf = O₁SZ

Beispiel 5

H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-OLys-NHj

0,400 g (0,128mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-GIy-Lys(BOC)-Pro-

VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OLys(BOC)-NH2 · HCI werden in einem Gemisch von 3,2 ml Trifluoressigsäure, 0,4 ml Anisol und 0,4 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen, dann mit 80 ml Äther verdünnt und der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert. Das rohe Nonadekapeptidamid-Trifluoracetat wird in 5 ml Wasser gelöst und auf einer mit Carboxymethylcellulose-Ionenaustauscher gefüllten Säule (3.5 χ 56 cm) mit einem aus 1,5 1 0.2 m (pH =6,7) und 1,5 1 0.6 m (pH = 6,7) bereiteten linearen Puffergradienten Chromatographien. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen 82—93 werden gesammelt und lyophilisiert. 0,131 g (36%) durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Nonadekapeptidamid werden erhalten.
Rf =0.20;

Peptidgehalt:83%;
Methionin-Sulfoxydgehalt: 1,2%;
Tyr/Trp:1.03.

Aminosäureanalyse:

Lys4.6(5).His0.95(l),Arg1,0(l),Ser0,80(l),
GIu 1.0(1), Pro 1.0 (I)₁GIy 2.0 (2), VaI 0,90(1).
MetO.80(l),TyrO.95(l).Phe 1.0(1).

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte, durch Aminooxycarbonsäure substituierte Nonadekapeptidamid-Hydrochlorid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1
Z-Lys( BOC)-1 .ys( BOC)-Ly s( BOC)-Lys( BOC)-OC H,

51g (6OmMoI) Z Lys( BOC)-Lys( BOC)-Lys( BOC)-OCH₁ werden in 100 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 10g !0%igem Aktivkohle-Palladium-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rest wird in 240 ml Äthylatetat gelöst, mit 28.5 g (6OmMoI) ZLys(BOC)-OSu versct/t und bei Zimmertemperatur stehengelassen Nach zwei Stunden werden dem Reaktionsgemisuh 10OU ml Äthylacetat und 200 ml Wasser zugesetzt. Nach Durchschüttclri wird die wäßrige Phase abgetrennt und die Athylacctätphäse zweimal mit 20OmI η-Salzsäure und zweimal mit 200 ml 8%lger Natfiiimhydrögencarbonatlösurig gewaschen und nach dem Trocknen eingedampft. DeJ Rest Wird mit Äther Verrieben, abfillrieri und mit Äther gewaschen. Das Rohprodukt wird aus Äthylacetat umkristallisiert. 52.06g (81%) Z^LyS(BOG)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS-(BOC)-OCHj werden erhalten. Schmelzpunkt: 122-123° C.

Schritt 2
H-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH₃

35 g (32,4 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOQ-Lys(BOC)-OCHi werden in 700 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 7 g 10%igem Aktivkohle-Palladium-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rest mit Äther-Diisopropyläther-Gemisch stabilisiert Nach dem Filtrieren und Trocknen wird das Rohprodukt aus Äther-Diisopropyläther-Gemisch umkristallisiert 24,8 g (81%) H-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH₃ werden erhalten. Schmelzpunkt: 101 -103⁰C.

Schritt 3
Tri LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC) QCHi

24 g (25.4 mMol) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOQ-Lys(BOC)-OCH] und 4.7 ml (33,6 mMol) Triäthylamin werden in 180 ml Dichlormethan gelöst, mit 8,5 g (30^ mMol) Tritylchlorid versetzt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 24 Stunden wird das Dichlormethan abdestilliert und dem Rest 500 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser zugesetzt Nach Durchschütteln wird die wäßrige Phase abgetrennt und die Äthylacetatphase dreimal mit 100 ml 5%iger Citronensäure und dreimal mit 100 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, getrocknet und danach eingedampft Der Rest wird mit Äther verrieben, abfiltriert, mit Diisopropyläther und Petroläther gewaschen. 23.6 g (783%) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH₁ werden erhalten. Schmelzpunkt: 166-168° C.

Schritt 4
Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-N₂Hi

23Jg (19.6 mMol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCHi werden in 230 ml Methanol gelöst, mit 5.7 ml (117 mMol) Hydrazinhydrat versetzt

4·; und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach vier Tagen wird das Methanol abdestilliert und der Rest mit Äther verrieben, abfiltrieri und im Vakuum getrocknet. 23.0 g (98%) TrI-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-Lys(BOC)-N?Hi werden erhaltt f. Schmelzpunkt:

',o 217-219T.

Schritt 5

Tri-Lys(BOC )-Ly·,( BOC)-Lys(BOC )-1.ys(BOC)-
« OLyS(BOC)-NH,

2.37 g (2.OmMoI) Tn-Lys( BOC)-Lys( BOC)-Lys(BOC ) Lys(BOC)-N;H 1 werden in 12 ml Dimethylformamid gelöst. Die lösung wird auf -20°C abgekühlt, und es werden unter Rühren zuerst 2 ml (8,0 mMol) 4_:h'SalzsäUfel6sung in Äthylacetai und dann 0,28 ml (2,36 mMol) tert.-Butylnitrit zugetropft« Das Reaktiohsgemisch wird 5 Minuten lang bei -10⁰C gehalten Und dann auf =20°G gekühlt Und mit 0,627 g

(2.4 mMol) H-OLyS(BOG)-NH₂ und 1,03 ml (6,OmMoI) Diisopföpyläthylärriin in 8,0 ml Dimethylformamid VeC* setzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei --5 bis 0°G und dann bei 0°G bis zürn nächsten Tage

stehen gelassen. Danach wird die Lösung eingedampft, der Rest mit Wasser verrieben, abfiltriert und mit Wasser gewaschen. 2,43 g (86%) Tri-Lys(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OLyS(BOC)-NH₃ werden erhalten. Rf =0,85.

Schritt 6

H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLyS(BOC)-NH₂ · HCl

(UmMoI) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH2 werden in 35 ml 8O°/oiger wäßriger Essigsäure gelöst. Die Lösung wird nach einer Stunde eingedampft und der Rest mit Äther verneben. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Äther und Trocknen wird das Rohprodukt mit einem Gemisch aus Äthylacetat-(Pyridin : Essigsäure : Wasser=20 :6 :11) im Verhältnis 4:1 auf eine Silikagelsäule (3,2 χ 52 cm) aufgebracht und chromatographierL Das Eluai wird in 15-ml-Fraktioi\e!> gesammelt und ihre Zusammensetzung mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die das reine Rohprodukt enthaltenden Fraktionen 95—107 werden gesammelt, das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rest mit Äther verrieben, abfiltriert und nach dem Trocknen in 20 ml Methanol gelöst Der Lösung wird eine Pyridin-Hyürochloridlösung, erhalten durch versetzen von 0,22 m! Pyridin mit 0,22 ml lconz. Salzsäure, zugegeben. Danach wird das Methanol abdestilliert und der Rest mit Äther verrieben, abfiltriert und im Vakuum getrocknet.

1,05g (62%) <.-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS-(BOC)-OLys(BOC)-NH: · MCl /erden erhalten. Rf = 0,25.

Schritt 7

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu')-His-Phe-

Arg-Trp-Gly-LysfBOq-Pro-Val-Gly-LysiBOC)-

Lys( BOC)- Lys( BOC)- Lys( BOC)-O Ly s( BOC)-

NH₂ · HCl

038 g (0.2OmMoI) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-ON ■ HCl, 0,242 g (0,2OmMoI) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH₂ · HCl und 0,165 g (0,9OmMoI) Pentafluorphenol werden in 4 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst 0,22 ml (0,2OmMoI) N-Methylmorpholin, dann 0,063 g (03OmMoI) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit Äther verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. 0.572 g (92%) geschütztes Nonadekapeptidamid-hydrochlorid werden erhalten: R? =0.70.

Beispiel 6

H-D-OScr-Tyr-Ser Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GI-Lys-Pro-Val-Gly Lys-Lys-Lys-D-OLys-NH;

0,400g (0,128 mMol) BüOD=0Ser=Tyr=Ser Met= GluiOBuO-His-Phe-Arg-Trp-Gly^LysiBOCJ-Pro-VaU

GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-D-OLys(BOC)-NH₂ · HCI werden in einem Gemisch Von 3,2 ml Trifluoressigsäure, 0,4 ml Anisol und 0,4 ml Wasser gelöst Die Lösung wird nach einer Stunde mit 80 ml Äther versetzt und der ausgeschiedene Niederschlag äbfiltriert. Das rohe Nönadekäpeptidämid-trifluoracetat wird in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung auf Carboxymethylcellulose-Jonenaustauscher gefüllten Säule (3,5 χ 56 cm) mit einem aus 1,51 0,2 m (pH=6,7) und 1,51 0,6 m (pH=6,7) bereiteten linearen Puffergradienten Chromatographie«, Die das Produkt enthaltenden Fraktionen 78-90 werden gesammelt und lyophilisiert. 0,149 g (39%) durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Nonadekapeptidamid werden erhalten. Rf =0,20 Pepfjdgehalt: 76%. Methioninsulfoxydgehalt: 1,6% Tyr/Trp-Verhältnis: 0,95.

Aminosäureanalyse:

Lys 4,5 (5), His 1,0 (1), Arg 1,0 (1), Ser 0,85 (1), GIu 1,0 (1), Pro 0,9 (1), GIy 1,95 (2), VaI 0,95 (1), Met 0,80 (I)₁ Tyr 0,90 (l),Phe 1,0(1).

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte, durch Aminocarhonsäure substituierte Nonadekapeptidamidhydrochlorid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH₂

237 g (2,0 mMol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-N₂Hj werden in 12 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der auf -20⁰C gekühlten Lösung werden unter Rühren zuerst 2 ml (8,0 mMol) 4-n-Salzsäurelösung in Äthylacetat, dann 0,28 ml (236 mMol) tert.-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang auf -10⁰C gehalten, dann auf

J₀ - 20⁰C gekühlt und sin Gemisch aus 0,627 g (2,4 mMol) H-D-OIyS(BOC)-NH₂ und 1,03 ml (6,OmMoI) Diisopropyläthylamin in 8,0 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei einer Temperatur von - 5 bis 0⁰C gerührt und dann bei 0⁰C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Dann wird die Lösung eingedampft, der Rest mit Wasser verrieben, abfiltriert und mit Wasser gewaschen.

2,58 g (91%) Tri-Lys(BOC)-Lyi,(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH₂ werden ertiulten. Ri = 0,85.

Schritt 2

H-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-D-OLyS-(BOC)-NH₂ ■ HCI

1,98 g (1,4 mMol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-LyS(BOC)-D-OIyS(BOC) werden in 35 ml 80%iger wäßriger Essigsäure aufgelöst. Die Lösung wird nach einer Stunde eingedampft und der Rest mit

Äther verrieben. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Äther und Trocknen wird das Rohprodukt mit einem Gemisch aus Äthylacetat-(Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20 : 6 : M) im Verhältnis 4:1 auf eine Silikagelsäure (3,2 χ 52 cm) aufgebracht und chromatographiert.

Das Eluat wird in 15-ml-Fraktionen gesammelt und ihre Zusammensetzung mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen 103- 112 werden gesammelt, das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rest mit Äther

to verrieben, nach dem Filtrieren und Trocknen in 20 ml Methanol gelöst und mit einer Pyridin-Hydröchlöridlösung versetzt; Diese Lösung wird vorher aus 0,22 nil Pyridin Und 0,22 ml konz. Salzsäure erhalten, Danach wird das Methanol abdestilliert und der Rest mit Äther verrieben, abfiltriert und im Vakuum getrocknet

0,95 g (65%) H-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS' (BÖC>D-ÖLys(BÖC>NH₂ - HCl werden erhalten, R? =0,25.

Schritt 3

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu')-His-Phe-Arg-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-

LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-

D-OLyS(SOC)-NH₂ · HCI '

0,398 g (0,20 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy-OH · HCI, 0,242 g (0,20 mMol) H-Lys(BOC)-

Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(BOC)-NH₂-HCI und 0,165 g (0,90 mMol) Pentafluorphenol werden in 4 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst 0,022 ml (0,20 mMol} N-Methylmorpholin, dann 0,063 g (0,30 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das DCU abfiitriert und das Filtrat mit Äther verdünnt Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. 0,591 g (95%) geschütztes Nonadekapeptidamidhydrochlorid werden erhaUen.Rp = 0,70.

Versuchsbericht

Die gemäß den Beispielen 5 und 6 erhaltenen Produkte wurden mit Tetracosactrin hinsichtlich der Wirkungsdauer verglichen. Dabei ergab sich, daß bei Tetracosactrin nach Verabreichung von 0,01 mg/kg i. v. der Corticosteronspiegel im Blut von Ratten vom nach einer Stunde erreichten Maximalwert innerhalb von 2 bzw. 4 weiteren Stunden auf 58 bzw. 12% des Maximalwertes sank. Demgegenüber sind bei Verabreichung gleicher Dosen von [D-OS¹, Lys¹⁷¹⁸, D-OLys"]-ACTH(I -19)-NH₂ (Beispiel 6) und [D-OSer¹, Lys'⁷¹⁸, Olys'^q]-ACTH(1-19)-NH₂ (Beispiel 5) vom nach einer Stunde erreichten Maximalwert nach 2 bzw. 4 weiteren Stunden noch 78 bzw. 32% resp. 76 bzw. 34% des Maximalwertes vorhanden.

Claims

Patentansprüche:
!.Peptide der allgemeinen Formel (I)

H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GIy-Lys-Pro-Val-GIy-(Lys)„-OLys-OH

in der η eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist und
D-OSer die D-Form des Restes der a-AminooxyjS-hydroxypropion- und OLys die L- oder D-Form des Restes der cc-Aminooxy-E-aminocapronsäure bedeuten, sowie deren Säureadditionssalze und Amide.
2. Verfahren zur Herstellung der Peptide der allgemeinen Formel (I) nach Anspruch 1 sowie von deren Säureadditionssalzen und Amiden, dadurch gekennzeichnet, daß man von Peptiden der allgemeinen Forme! (!!)