DE2702699A1

DE2702699A1 - Neue peptidderivate und verfahren zur messung der collagenaseaktivitaet unter verwendung dieser verbindungen

Info

Publication number: DE2702699A1
Application number: DE19772702699
Authority: DE
Inventors: Kenji Fujiwara; Yutaka Nagai; Takahiro Sakai; Shumpei Sakakibara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1976-01-24
Filing date: 1977-01-24
Publication date: 1977-12-15
Also published as: SE431201B; SE7700582L; US4138394A

Description

PATENTANWÄLTE SCHIFF v. FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBBINGHAUS

MARIAHILFPLATZ 1 Λ 3, MÖNCHEN OO POSTADRESSE: POSTFACH 95Ο16Ο, D-8OOO MÖNCHEN SS

KARL LUOWIQ SCHIFF

DIPI- CHEM. OR. ALEXANDER V. FUNER

DIPL. INO. PETER STRCHL

DIPL. CHEM. OR. URSULA SCHÜBEL-HOPF

DIPL. INQ. DIETER EBBIISIQHAUS

TELEFON (Οββ) 46 9ΟΒ4

TELEX B-93SS6 AURO D

TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN

DA-13 019 AJINOMOTO CO., INC. 24. Januar 1977

Priorität : 24. Januar 1976, Japan, Nr. 6926/76

30. August 1976, Japan, Nr. 103 505/76 30. August 1976, Japan, Nr. 103 506/76

Neue Peptidderlvate und Verfahren zur Messung der Collagenaseaktivität unter Verwendung dieser Verbindungen

Die Erfindung betrifft neue Peptidderivate und ein Verfahren zur Messung der Collagenaseaktivität. Die Erfindung umfaßt spezieller neue Peptidderivate, deren eine Gruppe als Substrate, für die Collagenase spezifisch 1st, geeignet ist und deren andere Gruppe wertvolle Substrate darstellen, die der Einwirkung von nicht spezifischen Peptidasen, nicht jedoch Collagenase, unterliegen, sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Collagenaseaktivität unter Verwendung dieser Peptidderivate als Substrate.

In jüngerer Zeit wurden in weitem Umfang Untersuchungen über Collagen und Collagenase durchgeführt und es hat sich gezeigt, daß der Collagenasespiegel in Geweben oder Körperflüssigkeiten in Abhängigkeit von dem Vorliegen und der Art von Bindegewebeerkrankungen schwankt, beispielsweise in Geweben von Patienten mit verschiedenen

709850/065/,

Hautkrankheiten, wie Wunden und Lupus erythematodes, oder bei Patienten mit Magengeschwüren, Hornhautgeschwüren (ülcus corneae), Leberzirrhose oder Bindegewebschondrom, daß außerdem Schwankungen auftreten in den Synovialflüssigkeiten von Patienten mit rheumatoider Arthritis oder in Granulocyten von Patienten mit essentieller Hypertension, Arteriosklerose oder Diabetes mellitus. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß der Collagenasespiegel in Seren von Patienten mit einigen Erkrankungen des Leber-Galle-Bereiches erhöht sind. Die Messung der Collagenaseaktivität bildet daher ein sehr wertvolles Diagnosehilfsmittel zur Diagnose der vorstehend erwähnten Krankheiten und damit eng zusammenhängender Erkrankungen.

Die Messung der Collagenaseaktivität wurde bisher durchgeführt, indem Collagenase enthaltende Proben mit Collagen, das aus Tierhaut oder Tiersehnen extrahiert wurde, in Berührung gehalten und die Hydrolyserate gemessen wurde. Diese übliche Methode zeigt jedoch folgende Nachteile : (1) Natürliches Collagen hat sehr hohes Molekulargewicht und eine sehr breite Molekulargewichtsverteilung. Es ist daher sehr schwierig, natürliches Collagen mit konstantem Molekulargewicht zu erhalten und das Herstellungsverfahren für diese Substanz ist äußerst kompliziert. (2) Die Eigenschaften von Collagen schwanken in Abhängigkeit von der Art und dem Körperteil des Tiers, aus dem es extrahiert wird. (3) Es ist normalerweise unerläßlich, daß Collagenase enthaltende Proben, in denen die Aktivität bestimmt werden soll, mit cc«-Macrόglobulin, einem der Serumproteine, verunreinigt sind. Dieses ccp-Macroglobulin behindert jedoch die Messung der Collagenaseaktivität, bei der natürliches Collagen als Substrat verwendet wird. Das übliche Verfahren ist daher als exaktes Meßverfahren zur Messung der Collagenaseaktivität nicht geeignet. Um den vorstehend erläuterten dritten Nachteil zu beseitigen, hat man versucht, den Komplex aus Collagenase und inhibierenden Substanzen, wie (x.~~Vte.cT:ogXo^la\il.in zu behandeln, um die Aktivität der Collagenase wiederherzustellen. Dieser Versuch ist jedoch fehlgeschlagen, weil Nebenreaktionen auftraten und die erhaltenen Aktivitäten weitgehend schwankten.

70985O/O6S4

" * jjT 2 7 Q 2 b b 9

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die vorstehend erläuterten Nachteile der üblichen Methode zu beseitigen und neue synthetische Peptide als Substrate anstelle von natürlichem Collagen zur Verfügung zu stellen, die eine exakte Messung der Collagenaseaktivität ermöglichen.Der Erfindung liegen Untersuchungen im Hinblick auf die spezifische Stelle der Spaltung durch Collagenase und den Zusammenhang zwischen Collagen und Collagenase zugrunde. Dabei wurden erfindungsgemäß neue Peptidderivate aufgefunden, die hochspezifisch gegenüber Collagenase sind und die während der Aktivitätsmessung nicht durch eCp-Macroglobulin beeinträchtigt werden.

Erfindungsgemäße neue Peptidderivate sind Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel :

A-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-E

in der A eine hydrophobe, neutrale oder saure chromophore Gruppe, B einen Aminosäurerest, C He oder Leu (Isoleucin oder Leucin), E GIn-D-Arg-OH oder D-Arg-OH bedeuten und in der alle Aminosäurereste, ausgenommen GIy, L-Konfiguration aufweisen, wenn nichts anderes angegeben ist.

Diese Peptidderivate setzen unter der Einwirkung von Collagenase hydrophobe Tripeptidderivate mit der Sequenz A-Pro-B-Gly-OH frei. Da diese Tripeptidderivate hydrophob sind und Cbromophore aufweisen, können diese Tripeptidderivate leicht mit geeigneten organischen Lösungsmitteln, wie Äther, Äthylacetat und n-Butanol, extrahiert und genau bestimmt werden, indem lediglich der Extrakt der Kolorimetrie unterworfen wird.

Es wurde darüber hinaus gefunden, daß die erfindungsgemäßen neuen Peptidderivate auch andere allgemeine unterschiedliche charakteristische Eigenschaften aufweisen, die für ein Substrat erforderlich sind, beispielsweise im Hinblick auf die Hydrolyserate, Stabilität und den linearen Zusammenhang zwischen der Menge des hydrolysieren Substrats und der des Enzyme und zwischen der Menge des hydrolysierten Substrats und der Inkubationszeit. Da

7098B0/Q6S4

- * g 27Q2699

das erfindungsgemäße Verfahren darin besteht, daß Peptidderivate als Substrate verwendet werden und die freigesetzten Tripeptidderivate extrahiert und kolorimetrisch bestimmt werden, ist es für die Substrate spezifisch erforderlich, daß sie ziemlich gute Löslichkeit haben und leicht und ausreichend mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden, welche andere in den Proben vorliegende Substanzen, die ähnliche oder gleiche Absorption wie die Tripeptidderivate haben, praktisch nicht extrahieren, vorzugsweise mit Äthylacetat. Die erfindungsgemäßen Peptidderivate gentigen außerdem zufriedenstellend den vorstehend erläuterten spezifischen Anforderungen. Mit Hilfe der Erfindung wird daher ein ausgezeichnetes Verfahren zur Bestimmung der Collagenaseaktivität zugänglich.

Zu den chromophoren Gruppen, die an die Aminogruppe des N-endständigen Aminosäurerests (Pro) gebunden sind, gehören beliebige hydrophobe,neutrale oder saure Chromophore, beispielsweise eine 2,4-Dinitrophenyl- _t 5-Dimethylamino-l-naphthalinsulfony1-, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-(4-Hydroxyl-naphthylazo)-benzolsulfonyl- und p-Phenylazobenzoylgruppe. Unter diesen Chromophoren wird die 2,4-Dinitrophenylgruppe im Hinblick auf die Handhabung am meisten bevorzugt.

Nach den von der Anmelderin durchgeführten Versuchen über die Eigenschaften von zahlreichen Arten der erfindungsgemäß synthetisierten Peptidderivate beeinflußt der Teil B der allgemeinen Formel praktisch nicht die sogenannte Substratspezifität (d.h. die Spezifität gegenüber Collagenase), so daß B beliebige Aminosäurereste umfassen kann. Die in Teil B vorliegende Aminosäure ist normalerweise eine «,-Aminosäure mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen, die in Proteinen vorkommt, beispielsweise Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Serin, Threonin, Prolin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Arginin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure und Glutamin. Der Anteil B beeinflußt jedoch die Löslichkeit der Substrate und die Extraktion der freigesetzten Tripeptidderivate. Im Hinblick auf diese Tatsache werden neutrale Aminosäurereste, insbesondere die Reste von Alanin, Prolin, Leucin und Glutamin, bevorzugt. Unter diesen bevorzugten Aminosäureresten werden die Reste von Alanin, Leucin und Glutamin mit dem

709850/0684

grüßten Erfolg eingesetzt. Der Anteil C der allgemeinen Formel 1st ein Leucin- oder Isoleuclnrest und beide Reste verleihen den Peptldderlvaten praktisch die gleichen Eigenschaften. Im Hinblick auf die Spezlfität gegenüber Collagenase ist jedoch ein Peptidderivat, welches als Anteil C einen Isoleucinrest aufweist, vorzuziehen.

Der Anteil E der allgemeinen Formel ist der Rest von D-Arglnin oder von Glutamyl-D-arginin. Beide Reste verleihen den Peptidderivaten praktisch gleiche Eigenschaften, jedoch sind Peptldderivate, die den Rest von Glutamyl-D-arginin aufweisen, im Hinblick auf die Spezifität gegenüber Collagenase besser. Die Peptidderivat e, die einen leucinrest als Teil C oder einen D-Arginin-Rest als Teil E aufweisen, werden durch Collagenase in guter Rate hydrolysiert und sind daher besonders gut geeignet als Substrate für eine rasche Messung der Collagenaseaktivität.

Im Hinblick auf sämtliche Eigenschaften sind als die besten Substrate unter den erfindungsgemäßen Peptidderivaten die Verbindungen zu bezeichnen, die eine 2,4-Dinitrophenylgruppe als Anteil A, einen Alanin-, Leucin-, Prolin- oder Glutaminrest, insbesondere einen Alanin-, Leucin- oder Glutaminrest, als Anteil B, einen Isoleucinrest als Anteil C und einen Rest von Glutamyl-D-arginin als Anteil E aufweisen.

Die erfindungsgemäßen neuen Peptidderivate lassen sich in einfacher V/eise mit Hilfe von Methoden, die in der Peptidchemie bekannt sind, synthetisieren. So können sie durch Entfernen der maskierenden Gruppen aus Verbindungen der Formeln

X A-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OR

A-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-D-Arg-OR

erhalten werden, worin X eine maskierende Gruppe für die Guanidinogruppe des Argininrests und R eine maskierende Gruppe für die Carboxylgruppe des Argininrests bedeuten. (Die Formeln umfas-

70985U/0S5/,

sen Verbindungen, in denen der Aminosäurerest des Teils B eine oder mehrere funktioneile Seltengruppen aufweist, die mit geeigneten maskierenden Gruppen maskiert sind.

Die für die Guanidinogruppe geeignete maskierende Gruppe kann unter für diesen Zweck bekannten Gruppen gewählt werden und kann beispielsweise eine Tosyl-, Nitro-, Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, 2-(Isopropyloxycarbonyl)-3,4»5,6-tetrachlor-"benzoylgruppe sein, vorzugsweise eine der drei zuerst genannten Gruppen. Die Carboxylgruppe kann maskiert werden, indem sie in eine Estergruppe, wie eine Benzyl-, t-Butyl-, p-Nitrobenzyl- oder p-Methoxybenzylestergruppe, insbesondere eine Benzyl- oder t-Butylestergruppe, übergeführt wird.

Die maskierenden Gruppen werden nach bekannten Methoden, die von der Art der maskierenden Gruppen und, falls solche vorliegen, von der Art der maskierenden Gruppen der funktioneilen Seitengruppen, abhängen. Es ist wichtig, daß lediglich die maskierenden Gruppen entfernt werden,ohne daß andere Teile der Verbindung durch diese Eliminierungsreaktion angegriffen werden. Als Eliminierungsmethode wird die Behandlung mit Fluorwasserstoff bevorzugt, well dabei beide maskierende Gruppen, X und R, gleichzeitig eliminiert werden.

Die Behandlung mit Fluorwasserstoff wird gewöhnlich unter wasserfreien Bedingungen und bei einer Temperatur von -70 bis +20 C, vorzugsweise -10 bis +1O⁰C, durchgeführt. Die Behandlung erfolgt in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Lösungsmittels, wird jedoch vorzugsweise in überschüssigem Fluorwasserstoff vorgenommen, der als Lösungsmittel dienen kann. Die Behandlung wird vorzugsweise in gleichzeitiger Gegenwart einer geringen Menge an Anisol oder Phenol vorgenommen, um Nebenreaktionen zu verhindern. Die Isolierung des entmaskierten Produkts kann nach üblicher Weise erfolgen.

Die als Ausgangsverbindungen verwendeten maskierten Peptidderivate können nach in der Peptidchemie bekannten Methoden synthetisiert werden, beispielsweise durch stufenweise Verlängerung, durch

709850/0614

Kondensation von Bruchstücken und durch eine Kombination dieser Methoden. Wenn die Aminosäuren, die dem Teil B entsprechen, funktionelle Seitengruppen aufweisen, so können sie eingesetzt werden, nachdem die funktioneilen Gruppen in Üblicher V/eise maskiert worden sind. Diese maskierenden Gruppen für die funktioneilen Seitengruppen werden nach, vor oder gleichzeitig mit der Eliminierung der maskierenden Gruppen für den Argininrest entfernt, was von der Art der maskierenden Gruppen der funktioneilen Seitengruppen abhängt. Die chomophore Gruppe kann zu Beginn der Peptidsynthese in das N-endständige Prolin eingeführt werden oder sie kann in das Fragment oder das endgültige Peptid, welches den N-endständigen Prolinrest aufweist, dessen Aminogruppe mit üblichen maskierenden Gruppen für Aminogruppen maskiert ist, wie einer t-Butyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- oder t-Amyloxycarbonylgruppe, eingeführt werden, indem die maskierende Gruppe für die Aminogruppe durch das Chromophor ersetzt wird.

Die Collagenaseaktivität kann in gleicher Weise wie bei natürlichem Collagen ohne jegliche Schwierigkeit unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptidderivate als Substrate gemessen werden. Zuerst wird eine wässrige Lösung des Peptidderivats mit geeigneter Konzentration hergestellt. Der optimale pH-Wert der Substratlösung variiert leicht in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Substrats und liegt gewöhnlich im Bereich von 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8.

Die Collagenaseaktivität wird bestimmt, indem das Substrat mit Collagenase oder einer Probe, die Collagenase enthält, in einem wässrigen Medium, vorzugsweise in einer Pufferlösung, wie Tris-HCl-Puffer, bei 30 bis 45⁰C, gewöhnlich bei 35 bis 40⁰C, während einer gewissen Zeit in Berührung gehalten wird und die Collagenase in üblicher Welse desaktiviert wird. Die Inkubationszeit bestimmt sich in Abhängigkeit von der Menge des Substrats und Enzyms. Die Menge der freigesetzten Verbindung A-Pro-B-Gly-OH wird in einfacher Weise bestimmt, indem die Verbindung mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Ä'thylacetat, Äther oder n-Butanol extrahiert und die Absorption des Eluats bzw. Extrakts bei einer für das jeweilige Chromophor geeigneten Wellen-

70985Ö/08U

länge gemessen wird,"beispielsweise bei 365 nm für 2,4-Dinitrophenyl, 389 nm für die p-(4-Hydroxy-l-naphthylazo)-benzolsulfonyl- und 325 nm für die p-Phenylazobenzoylgruppe.

Da die erfindungsgemäßen Peptidderivate hochspezifisch gegenüber Collagenase sind, läßt sich die Collagenaseaktivität unter Verwendung dieser Verbindungen als Substrate in üblichen Collagenase enthaltenden Proben, wie Serum und Synovlalflüssigkeit, genau messen. Wenn jedoch die Proben andere nicht spezifische Peptidasen in hoher Konzentration enthalten, wie es bei Proben aus dem Gewebe der Leber oder Niere der Fall ist, so hat sich gezeigt, daß die Substrate durch die anderen nicht spezifischen Peptidasen partiell hydrolysiert werden und daß die Genauigkeit der Bestimmung der Collagenaseaktivität nicht immer annehmbar ist. Für diesen Fall werden erfindungsgemäß weitere Peptidderivate zur Verfügung gestellt, die empfindlich gegenüber nicht spezifischer Peptidase, nicht jedoch empfindlich gegenüber Collagenase sind, so daß die vorstehend erläuterten Nachteile beseitigt werden, indem diese weiteren Peptidderivate als Vergleichssubstrate eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft daher neue Peptidderivate der gleichen Struktur der vorstehend erläuterten ersten Peptidderivate, mit der Abänderung, daß der Prolinrest am N-endständigen Ende fehlt. Diese erfindungsgemäßen Peptidderivate werden durch die allgemeine Formel

A-B-Gly-C-Ala-Gly-E

dargestellt.

Diese erfindungsgemäßen Peptidderivate der zweiten Gruppe lassen sich ebenfalls in einfacher Weise nach den vorstehend erläuterten Methoden herstellen.

Bei der Messung der Collagenaseaktivität werden diese Peptidderivate der zweiten Gruppe als Vergleichssubstrate für die Peptidderivate der ersten Gruppe eingesetzt. Dabei werden diese zweiten Peptidderivate mit Proben in Berührung gebracht, die Collagenase und nicht spezifische Peptidasen enthalten, die das Chromophor

709850/0654

enthaltenden Feptldfragmente werden extrahiert und die Absorption des Extrakts wird gemessen. Das gesamte Bestimmungsverfahren wird unter den gleichen Bedingungen wie im Fall der ersten Peptidderivate durchgeführt. Die exakte Collagenaseaktivität wird dabei ohne Störung durch nicht spezifische Peptidasen berechnet, indem die unter Verwendung der zweiten Peptidderivate als Substrate erhaltene Absorption von der Absorption subtrahiert wird, die unter Verwendung der ersten Peptidderivate erhalten wurde.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele ausführlicher erläutert. In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet :

BOC DNP PAB

NABS -OBzI -OEt -OSu WSCI DMF THF TosOH

t-Butyloxycarbonyl,

2₁4-Dinitrophenyl,

p-Phenylazobenzoyl,

Benzyloxycarbonyl,

ρ-(4-Hydroxy-1-naphthylazo)-benzolsulfony1,

Benzylester, Äthylester N-Hydroxysuccinimidester,

1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodlimid _f

Dimethylformamid, Tetrahydrofuran,

p-Toluolsulfonsäure

Die in den Beispielen verwendete Collagenase wurde aus Kulturmedien aus Kaulquappen-Hautexplantaten nach der in"Biochem. Biophys. Acta,"26£, S. 564 (1972) beschriebenen Methode hergestellt. Nicht spezifische Peptidasen wurden erhalten, indem 5 ml eines frischen Humanserums von Erwachsenen der Chromatographie an einer kalibrierten Kolonne von superfeinem Gel Sepbadex-G-200 unterworfen wurde,die mit 0,05 m Tris-HCl-Puffer vom pH 7,5 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl und 5mM CaCl₂ kalibriert worden war, und die Eluatfraktionen aufgefangen wurden, die Molekulargewichten von 100 000 bis 180 000 entsprachen.

709850/0654

Beispiel 1
(DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

D-Arg(N0₂) (16,4 g; 0,075 Mol), p-Toluolsulfonsäure (31,4 g; 0,165 Mol) und Benzylalkohol (37 ml) wurden in 150 ml Chloroform suspendiert und die Suspension wurde 5 Stunden bis zur Bildung einer klaren Lösung gertickflußt.

Diese Lösung wurde mit 100 ml Toluol versetzt und dann das Gemisch unter vermindertem Druck destilliert. Zu dem Rückstand wurden 150 ml Chloroform gegeben und das Gemisch wurde wieder 5 Stunden gertickflußt. Zu der erhaltenen Lösung wurden 2 mal 100 ml Toluol zugesetzt, dann wurde sie unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von trockenem Äther verfestigt. Der erhaltene Peststoff wurde abfiltriert, mit trockenem Äther gewaschen und aus einem Gemisch aus Methanol und trockenem Äther umkristallisiert. Die Kristalle wurden 12 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet.

Ausbeute : 42 g (86

- 12,0° (c=3, Pyridin)

P. : 132° - 135⁰C

Boc-Gln (5,0 g; 20 mMol) und D-ATg(NO₂)-OBzI.2TosOH (13,1 g; 20 mMol) wurden in einem Gemisch aus 5 ml DMF und 20 ml TBZF suspendiert und zu der Suspension wurden bei -10⁰C 2,8 ml Triäthylamin (20 mMol), 2,7 g (20 mMol) 1-Hydroxybenztriazol und 3,6 ml (20 mMol) WSCI gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -10⁰C und danach 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das in dem Reaktionsgemisch vorliegende Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck verdampft und das erhaltene Gemisch wurde in 300 ml Chloroform gelöst und die erhaltene Lösung wurde nacheinander mit 1 η Chlorwasserstoff säure (3 x 100 ml), 100 ml Wasser und 3 χ 100 ml einer 10 #igen Natriumcarbonatlösung und

709850/06S4

2 χ mit 100 ml Wasser gewaschen. Das in dem gewaschenen Gemisch vorliegende Chloroform wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther kristallisiert. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit V/asser und Äther gewaschen, aus einem Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert und 12 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet.

Ausbeute : 8,5 g (78 f*)

F. : 147° - 154⁰C (Zersetzung) ° ^{+ 5}'³° ^{( C=1}' ^DMF)

Elementaranalyse C H

Berechnet für C₂₅H₃₅O₈N₇ · 1/2 HgO : 50,54 6,64 17,94

Gefunden : 50,67 6,56 17,91

50 ml einer 25 #igen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure wurden unter Kühlen zu 12,4 g (40 mMol) Z-Ala-Gly-OEt gegeben und die erhaltene Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

Äther wurde der Lösung zugesetzt, um einen Niederschlag zu erzeu gen. Dieser wurde mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxid getrocknet. Der so erhaltene Peststoff wurde in 30 ml DMP gelöst und die erhaltene Lösung wurde mit Triäthylamin auf einen pH-Wert von 7 bis 7,5 eingestellt, mit 14,4 g (44 mMol) Boc-Ile-OSu versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Dem Reaktionsgemisch wurden 200 ml Wasser zugesetzt und die erhaltene Lösung wurde 3 mal mit Äthylacetat (200 ml, 150 ml, ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde nacheinander mit 1 η Chlorwasserstoffsäure, Wasser, 5 #iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther kristallisiert, aus einem Äthylacetat-Äther-Gemisch umkristallisiert und

7098S0/065/,

bei Raumtemperatur 12 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute : 13,0 g (84 ?°)

P. :	148,	5°	- 149⁰C	Äthanol)	8	H	N	\%
	-50,	9°	(C=2,2,	C	8	,58	10,	85
Elementaranalyse				: 55,79		,74	10,	80
Berechnet für C₁	₈H,	5₅O₆N₅	: 55,54
Gefunden

Boc-Ile-Ala-Gly-OEt (3,9 g; 10 mllol) wurde in 20 ml Dioxan gelöst und eine 1 η Natriumhydroxidlösung (11 ml; 11 mMol) wurde tropfenweise unter Rühren und unter Kühlung zu der Lösung zugefügt. Die erhaltene Lösung wurde noch 1 Stunde gerührt und mit 1 η Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die erhaltene wässrige Schicht wurde mit 1 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und 2 mal mit Äthylacetat (100 ml, 50 ml) extrahiert. Die abgetrennte organische Schicht wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel der getrockneten Lösung wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther kristallisiert.Die Kristalle wurde abfiltriert, aus Äthylacetat-Äther umkristallisiert und 12 Stunden bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid getrocknet.

Ausbeute : 3,0 g (84 $>)

P. :	156° -	für C_ie	158⁰C	Äthanol)	52	C	8	H	N#
	-42,3°		(C=I,6,		52	,15	8	,21	11,40
Elementaranalyse		•1/2 H₂O :		,06		,14	11,52
Berechnet	-,H₂₉O₆N₅	• •
Gefunden

709850/0654

27ü2b^lJ9

BOc-GIn-D-ATg(NOp)-OBzI (5,5 g; 10 mMol) wurde unter Kühlung zu 20 ml Trifluoressigsäure gegeben und die erhaltene Lösung wurde 5 Stunden unter Kühlung gerührt und danach v/eitere 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Eine 6 η Lösung von Chlorwasserstoffsäure in Dioxan (1,7 ml; 10 mMol) wurde zu dem Reaktion3gemisch gegeben und überschüssige Trifluoressigsäure wurde unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther verfestigt, mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxid unter vermindertem Druck getrocknet.

Der erhaltene Feststoff wurde in einem Gemisch aus DMP und THP (10 ml/30 ml) gelöst und die Lösung wurde bei -1O⁰C mit N-He thyI-morpholin auf einen pH-Wert von 5 eingestellt. 3,6 g (10 mMol) Boc-He-Ala-Gly-OH, 2 g (15 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol und 2,7 ml (15 mMol) WSCI wurden dem vorstehend beschriebenen Gemisch nacheinander zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei -10 C und danach 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft und zu dem Rückstand wurden 100 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure zugesetzt. Der ausgefällte Peststoff wurde abfiltriert, mit Wasser, 5 #igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen und unter Erwärmen In einem DMF-Methanol-Gemisch suspendiert. Zu der Suspension wurde Äthylacetat zugesetzt und der ausgefällte Peststoff wurde abfiltriert und 12 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet.

Ausbeute : 6,8 g (86 %)

P. : 217° - 221⁰C (Zersetzung) ßxj^ + 7,7° (C=O, 3, Hexame thy lphosphory ltriamid)

Elementaranalyse C H N£

Berechnet für C₅₄H₅₄ ⁰H¹¹Io ' ¹^^{2 H}2° ^{: 51}»^{85 7}'^{04 17} »⁷⁸ Gefunden : 51,68 6,98 17,73

H-Pro-Gln-Gly-OH (2,7 g; 9 mMol) wurde unter Eiskühlung in 50 ml

709850/0664

einer 5 #igen Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst und zu der Lösung wurden 2,4 g (13 mMol) Dinitrofluorbenzol in Aceton (20 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde unter Eiskühlung gerührt und danach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, der Rückstand mit 6 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-V/ert von 2 eingestellt und mit 200 ml Wasser verdünnt. Die Lösung wurde durch eine mit einem hochporösen Harz (Diaion HP-20) gefüllte Säule geleitet, die dann mit Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert wurde. Die erhaltene methanolische Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und zu dem Rückstand wurde Äther gegeben. Der ausgefällte Feststoff wurde abfiltriert, aus einem Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert und 12 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet.

Ausbeute :	3,0 g	für C	(71 *)	(Zersetzung)	C	4	H	H	1%
F. :	205° -	He-Al	2O7°C	0, DMF)	N₆ : 46,35	4 3zl	,75	18,	02
	-292,4	° (C=I,	: 46,20		,94	18,	13
Elementaranalyse
Berechnet	I₈H₂₂O₉
Gefunden

BoC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI (1 g; 1,3 mMol) wurde unter Kühlen zu 5 ml Trifluoressigsäure gegeben und die Lösung wurde 10 Minuten unter Kühlen und danach 50 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde 0,5 ml (3 mMol) 6 η Chlorwasserstoffsäure in Dioxan gegeben und die überschüssige Trifluoressigsäure wurde unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther verfestigt, mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxid getrocknet.

Der erhaltene Feststoff wurde in 20 ml DMF gelöst und 0,6 g (1,3 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-OH, 2,10 mg (1,6 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol

709850/0654

und 0,29 ml (1,6 mMol) WSCI wurden nacheinander bei -10⁰C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -1O⁰C gerührt und schließlich über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde 1 η Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, um einen Niederschlag auszufällen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und 12 Stunden bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid getrocknet.

Ausbeute : 1,3 g (89 SO

P. : 247° - 250⁰C (Zersetzung)

⁰ -68,3° (C=O,5, Hexamethylphosphoryltriamid)

Elementaranalyse _n „

Berechnet für ^C47^H66°17^N16 ^{: 5O}»⁰⁸ 5,90 19,88 Gefunden : 50,08 6,12 19,52

DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(N0₂)-OBzl (1,3 g; 1,2 mMol) wurde in Gegenwart von 2 ml Anisol in 30 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff gelöst und die Lösung wurde 1 Stunde bei O⁰C gerührt. Nach dem Entfernen des überschüssigen Fluorwasserstoffs durch Verdampfen unter vermindertem Druck wurde der Rückstand durch Zugabe von Äther verfestigt.

Der Feststoff wurde mit Äther gewaschen und in Essigsäure gelöst und die Lösung wurde durch eine mit stark basischem Anionenaustauscherharz (Dowex 1x2, Acetatform) gefüllte Säule geleitet. Nach dem Verdampfen der Essigsäure aus der abströmenden Lösung wurde der Rückstand mit Äther verfestigt. Der Feststoff wurde abfiltriert, aus Essigsäure-Äther umkristallisiert und 24 Stunden bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid getrocknet.

Ausbeute : 1,0 g (81 #)

F. : 230° - 233,5⁰C (Zersetzung) 20 _233,2°C (C=O,6, 50 # Essigsäure)

709850/0654

Elementaranalyse C H

Berechnet für C₄₀H₆₁O₁₅ · CH₅COOH.HgO : 47,14 6,31 19,64

Gefunden : 46,90 6,64 19,40

Beispiel 2

(NABS-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

18,5 g (55 mMol) Gly-OBzl.TosOH wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Absatz 2 neutralisiert und mit Boc-Gln (12,3 g; 50 mMol)

gekuppelt.

Ausbeute : 15,7 g (80 56) P. : 126° - 127⁰C f -9,6° (C=I, DMF)

11,8 g (0,03 Mol) Boc-Gln-Gly-OBzl wurden von der N-maskierenden Gruppe befreit und in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 5 mit 6,5 g (0,03 Mol) Boc-Pro-OH gekuppelt.

Ausbeute : F. :	8,0 152 -41	g (54 %) ° - 154°C ,1° (C=O,5,	DMF)	C ,22	7	,02	11,	32
ementaranal Berechnet	Lyse für	C₂₄H₅₄O₇N₄	• 1/4 H₂O	,14	6	,73	11,	30
Gefunden

ι : 58
: 58

4,0 g (8,2 mMol) Boc-Pro-Gln-Gly-OBzl wurden in 60 ml 90 #igem Methanol gelöst und in Gegenwart einer geringen Menge Pd-C (entsprechend einer Löffelfüllung) wurde während 6 Stunden gasförmiger Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Nach dem Entfernen des

709850/0654

Katalysators durch Filtration wurde das Piltrat unter vermindertem Druck konzentriert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther verfestigt und· aus Methanol-Äther umkristallisiert. Ausbeute : 2,9 g (91 %).

1,2 g (1,5 mMol) BoC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 5 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit Boc-Pro-Gln-Gly-OH (0,6 g; 1,5 mMol) gekuppelt.

Ausbeute :	1,1	t Für	g (69 1>)	_c	I	76	6	H	H	02
F. :	224°		- 229⁰C (Zersetzung)	50,	55	6	,95	18,	85
	-6,8	⁰ (0=0,3, DMP)	50,			,55	17.
Elementaranalyse
Berechnei	^C46^H72⁰15^N14'^3/2N2° *
Gefunden	• •

300 mg (0,28 mMol) BOc-PrO-GIn-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wurden 1 Stunde bei O⁰C in Gegenwart von 0,5 ml Anisol mit 7 ml Fluorwasserstoff behandelt. Das Reaktionsgemische wurde wie in Beispiel 1,Abschnitt 8 aufgearbeitet, wobei ein H-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH enthaltender Rückstand gebildet wurde. Der Rückstand wurde in 5 ml Wasser gelöst und 110 mg (1,3 mMol) Natriumhydrogencarbonat und 240 mg (0,7 mMol) p-(4-Hydroxy-lnaphthylazo)-benzolsulfonylchlorid in 5 ml Tetrahydrofuran wurden unter Kühlen zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des THP durch Verdampfen unter vermindertem Druck wurde das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat extrahiert. Die verbliebene Wasserschicht wurde mit einer großen Menge an V/asser verdünnt und durch eine mit hochporösem Harz (Diaion HP-20) gefüllte Säule geleitet, die mit Wasser gewaschen und mit 90 tigern Methanol eluiert wurde.

709850/0654

Das Eluat wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in 50 #iger Essigsäure gelöst und durch eine mit stark basischem Anionenaustauscherharz (Dowex 1x2, Acetatform) gefüllte Säule geleitet, die mit 50 #iger Essigsäure eluiert wurde.

Ausbeute : 190 mg (57 $>)

P. : 230° - 239⁰C (Zersetzung)

°⁸ -84,2° (C=O,5, 50 # Essigsäure)

Elementaranalyse C H NSi

Berechnet für C₅₀H₆₉O₁₄N₁₅S.CH₅COOH.4H₂O : 49,24 6,44 16,57 Gefunden : 49,11 6,34 16,77

Beispiel 3
(PAB-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

400 mg (1,3 mMol) H-Pro-Gln-Gly-OH wurden in 5 ml Wasser gelöst und dazu wurden 220 mg (2,6 mMol) Natriumhydrogencarbonat und 320 mg (1,3 mMol) p-Phenylazobenzoylchlorid in 5 ml THP unter Kühlung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtem peratur gerührt. Das in dem Gemisch vorliegende Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck verdampft und die erhaltene wässri ge Lösung wurde mit 1 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat schicht wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde aus einem Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert.

Ausbeute : 360 mg (53 $>)

F. : 189° - 194⁰C (Zersetzung) ^ -2,0° (C=O,5, DMP)

7O9850/0S54

Elementaranalyse _c „ Berechnet für C₂₅H₂₈O₆N₆ · 7/4 H₂O : 55,60 5,88 15,56

Gefunden : 55,61 5,48 15,33

200 mg (0,26 mMol) BoC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wurden wie in Beispiel 1, Abschnitt 5 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 130 mg (0,26 mMol) PAB-Pro-Gln-Gly-OH gekuppelt. Ausbeute : 230 mg (75 #)

200 mg (0,17 mMol) PAB-PrO-GIn-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 150 mg (80 #)

P. : 196° - 205⁰C (Zersetzung) ? +34,9° (C=O,4, 50 £ Essigsäure)

Beispiel 4
(DNP-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

6,2 g (0,02 Mol) Z-Ala-Gly-OEt wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 3 von der maskierenden Gruppe befreit und mit Boc-Leu-OSu (6,6 g; 0,02 Mol) gekuppelt.

Ausbeute : 4,7 g (61

-21,6° (C=O,8, DMP)

P. : 139° - 142⁰C

7098B0/0654

Elementaranalyse Berechnet für Gefunden

55	,79	8,	58	10,	85
55	,41	8,	73	11,	01

4,5 g (0,012 Mol) Boc-Leu-Ala-Gly-OEt wurden in 20 ml Methanol gelöst und in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 4 mit Natriumhydroxid behandelt.
Ausbeute : 4,0 g (92 #)

2,0 g (3,7 mMol) Boc-Gln-L-Arg(NO₂)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 5 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 1,3 g (3,7 mMol) Boc-Leu-Ala-Gly-OH gekuppelt.

Ausbeute : 2,0 g	(70 %)	(Zersetzung)	C	24	7	H	17	N*
P. : 213 -	218⁰C	DMP)	51,	25	6 5l	,08	17	.58
^⁷D⁸ +°.5 I	[C=O,4,		51, [NO₀)			,91		,80
Elementaranalyse		O₁₁N₁₀-H₂O :
Berechnet für	^C34^H54	• •
Gefunden

350 mg (0,45 mMol) Boc-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg(N0₂)-0Bzl wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 210 mg (0,45 mMol) DNP-Pro-Gln-GIy-OH gekuppelt.
Ausbeute : 450 mg (89 #)

709850/0654

300 mg (0,27 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NO₂)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 250 mg (85 #)

F. : 221° - 226⁰C (Zersetzung) *⁸ -256,5° (C=O,5, 50 % Essigsäure)

Elementaranalyse _{c H}

Berechnet für C₄₀H₆₁O₁₅N₁₅-2CH₃COOH-3,5H₂O: 44,97 6,52

17,88

Gefunden : 45,21 6,24

17,62

Beispiel 5
(DNP-Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

630 mg (2,6 mMol) H-Pro-Ala-Gly-OH wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 6 mit 600 mg (3,1 mMol) Dinitrofluorbenzol umgesetzt.

Ausbeute : 710 mg (67 #)

P. : 187 - 19O⁰C (Zersetzung) ZS -423,1° (C=O,4, DMF)

480 mg (0,61 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NOg)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 250 mg (0,61 mMol) DNP-Pro-Ala-Gly-OH gekuppelt.

709850/0854

Ausbeute : 540 mg (83

270 mg (0,25 mMol) DNP-PrO-AIa-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 220 mg (88 %)

F. : 228° - 235⁰C (Zersetzung) ¹^ -287,5° (0=0,5, 50 £ Essigsäure)

Elementaranalyse _c „

Berechnet für C₃₈H₅₈O₁₄N₁₄ .7/2 HgO : 45,73 6,56 19,65 Gefunden ' : 46,03 6,25 19,48

Beispiel 6
(DNP-Pro-Ala-Gly-Ieu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

490 mg (0,63 mMol) Boc-Ieu-Ala-Gly-Gln-D-Arg(N0₂)-OBzl wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 260 mg (0,63 mMol) DNP-Pro-Ala-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 590 mg (72 #)

250 mg (0,23 mMol) DFP-Pro-Ala-Gly-Ieu-Ala-Gly-Gln-D-ArgiNOg)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 190 mg (83 #) F. : 219° - 227⁰C (Zersetzung)

*⁸ -274,7° (C=O,5, 50 % Essigsäure)

709850/0654

Elementaranalyse _c „

Berechnet für C₃₈H₅₈O₁₄N₁₄-2CH₃COOH-5/2H₂O : 45,85 6,51

17,83

Gefunden : 46,04 6,23

17,61

Beispiel 7
(DNP-Pro-Pro-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

670 mg (2,5 mMol) H-Pro-Pro-Gly-OH wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 6, Abschnitt 6 mit 560 mg (3,0 mMol) Dinitrofluorbenzol umgesetzt.

Ausbeute : 520 mg (48 #)

P. : 155° - 165⁰C (Zersetzung) ^^e -413,0° (C=O,4, DMP)

500 mg (0,64 mMol) BOC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 280 mg (0,64 mMol) DNP-Pro-Pro-GIy-OH gekuppelt.
Ausbeute : 510 mg (73 50

DNP-Pro-Pro-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NO₂)-OBzI wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 200 mg (85 %) ' J. : 233° - 238⁰C (Zersetzung)

/pt/²⁸. -325,2° (C=O,5, 50 # Essigsäure) ³ 709850/06S4

Elementaranalyse _c „

Berechnet für C₄₀H₆₀O₁₄N₁₄^CH₃COOHOH₂O : 46,55 6,57

17,28

Gefunden : 46,80 6,53

17,16

Beispiel 8
(DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH)

5,5 g (8,4 mMol) D-Arg(N0₂)-0Bzl*2Tos0H wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 2 neutralisiert und mit 5,0 g (8,4 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 4,3 g (79 #)

900 mg (1,4 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-D-Arg(N0₂)-OBzl wurden in
gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 580 mg (1,4 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 1,1 g (79 #)

3) DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH

300 mg (0,03 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg(N0₂)-0Bzl wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 160 mg (59 f°) F_; : 250° - 254⁰C (Zersetzung)

-258,0° (C=O,5, 50 fo Essigsäure)

709850/0654

Elementaranalyse _{c H}

Berechnet für C₅₅H₅₃O₁₃N₁₅*2CH₃COOH.3/2H₂O : 46,32 6,38

18,01

Gefunden : 46,21 6,22

18,35

Beispiel 9

(DNP-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

IfO g (1,3 mMol) BoC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 0,6 g (1,3 mMol) DNP-Pro-Leu-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 1,35 g (93 Jl)

1,0 g (0,9 mMol) DNP-PrO-LeU-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 0,75 g (79 #)

P._n : 238° - 246⁰C (Zersetzung)

ⁿ° -272,5° (C=O,6, 50 $ Essigsäure)

Elementaranalyse	L₁₄N₁₄-4H₂O :	C	m H	NJl
Berechnet für ^at^qa^	• •	46,94	6,92	18,70
Gefunden	47,12	6,74	18,80

Beispiel 10
(DNP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

709850/0654 ORIOINAL INSPECTED

3,1 g (8 mMol) Boc-Gln-Gly-OBzl wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2, Abschnitt 3 von der Estergruppe befreit.

Ausbeute : 2,0 g (83

-7,8° (C=O,7, DMP)

F. : 114° - 116⁰C

3,2 g (5 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg (NO₂)-OBzI wurden in gleicher Weise v/ie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 1,7 g (5,5 mMol) Boc-Gln-Gly-OH gekuppelt.

Ausbeute : 3,4 g (71 $>)

F. : 235° - 237,5⁰C (Zersetzung) ^° -13,5 (C=O,5, Hexamethylphosphoryltriamid)

1,2 g (1,2 mMol) BoC-GIn-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO₂)-OBzI wur den in gleicher V/eise wie in Beispiel 1, Abschnitt 6 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 0,4 g (2,2 mMol) Dinitrofluorbenzol umgesetzt.
Ausbeute : 900 mg (73 #)

0,9 g (0,9 mMol) DNP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NO₂)-OBzl wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 0,7 g (83 ^)

F. : 210° - 217° (Zersetzung) ⁰ -10,8° (C=O,3, 50 # Essigsäure)

709850/0654

Elementaranalyse _c „

Berechnet für C,,-H₁.„Ο, .Ν, , 'CH_xCOOH-H₀O : 45,67 6,22

J? 54 J-4 14 ί 2 ' '

20,16

Gefunden : 45,85 6,53

20,00

Beispiel 11
(DNP-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)

1,5 g (5,4 mMol) Z-Ala-Gly-OH wurden in gleicher V/eise wie in Beispiel 1, Abschnitt 3 mit Bromwasserstoff in Essigsäure von der maskierenden Gruppe befreit, wobei ein Niederschlag erhalten

wurde.

Der Niederschlag wurde mit 1,2 g (6,5 mMol) Dlnitrofluorbenzol in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 6 umgesetzt.

Ausbeute : 1,1 g (65 $>)

F. : 170° - 175⁰C (Zersetzung) ^ +78,9° (C=I,0, DMP)

400 mg (0,5 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NO₂)-OBzI wurden in gleicher V/eise wie in Beispiel I₁ Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit DNP-Ala-Gly-OH (160 mg; 0,5 mMol) gekuppelt.

Ausbeute : 290 mg (60 #)

P. : 219° - 228⁰C (Zersetzung) ^ +39,4° (C=0,5, DMF)

200 mg (0,2 mMol) DNP-Ala-Gly-Ile-üla-Gly-Gln-D-Arg(N0₂)-0Bzl

709850/0654

wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.

Ausbeute : 150 mg (85 %)

F. : 214° - 225⁰C (Zersetzung) £o7p⁸ + 35,5° (C=O,5, 50 # Essigsäure)

Beispiel 12

4,96 mg DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH·CH₃COOH.HgO wurden mit 0,1 η Natriumhydroxid neutralisiert und in 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung vom pH 7,5, die 0,15 m NaCl und 5 m M enthielt, gelöst,wobei 10 ml der Substratlösung (a) einer Konzentration von 5x10 molar gebildet wurde. Eine entsprechende Substratlösung (b) wurde in gleicher Weise unter Verwendung von DNP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.CH₅COOH.H₂O (4,48 mg) hergestellt.

0,9 ml ^eäer der Substratlösungen wurde mit 0,88 ml einer 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung vom pH 7,5, die 0,15 m NaCl und 5 m MCaCl₂ enthielt, verdünnt. Die erhaltene Lösung wurde mit 0,02 ml gereinigter Collagenase vermischt und bebrütet. 0,2 ml-Anteile des Reaktionsgemisches wurden nach 0, 10, 20, 40, 60 bzw. 120 Minuten entnommen und mit 0,5 ml 1 m Chlorwasserstoffsäure vermischt, um die Enzymreaktion zu unterbrechen.

Die freigesetzten DNP-Peptidfragmente wurden durch kräftiges Schütteln mit 1 ml Äthylacetat-n-Butanol (1:0,15, Volumen/Volumen) extrahiert, wonach bei 5000 bis 5000 Upm und Raumtemperatur 10 Minuten zentrifugiert wurde, um die beiden Schichten vollständig zu trennen. Der Hydrolysegrad wurde durch Messung der Absorption der organischen Schicht bei 365 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.

709850/0684

Inkubationszeit

IO 20 40 60 120

- 2* - 33	Δ	27	02699	Δ
TABELLE 1	-			-
	0,018	Substratlösung (b)	O
	0,038	OD365	O
Substratlösung (a)	0,079	0,027	0,003
0D365	0,107	0,027	0,002
0,033	0,184	0,027	O
0,051	0,030
0,071	0,029
0,112	0,027
0,140
0,217

Beispiel 13

1 ml der in Beispiel 12 hergestellten Substratlösung (a) wurde mit 1,0 ml einer nicht spezifischen Peptidase vermischt und die erhaltene Lösung wurde wie in Beispiel 12 aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.

	TABELLE 2	Δ
Inkubationszeit £i	Qin2 OD365	—
0	0,053	0,001
10	0,054	0,002
20	0,056	0,004
40	0,058	0,007
60	0,060	0,010
120	0,063

7098B0/0854

Beispiel 14

Je 0,2 ml der Substratlösungen (a) und (b), die in Beispiel 12 hergestellt worden waren, wurden mit 0,1 ml der Synovialflüssigkeiten von Patienten mit Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis vermischt und 2 Stunden bei 57⁰C inkubiert. Nach dem Unterbrechen der Enzymreaktion durch Zugabe von 0,5 ml einer 1 m Chlorwasserstoffsäure wurden die freigesetzten DlJP-Pept idf ragmen te durch kräftiges Schütteln mit 2 ml Äthylacetat-n-Butanol (1:0,15, Volumen/Volumen) extrahiert und wie in Beispiel 12 aufgearbeitet und die Collagenaseaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

709850/0654

	Diagnose	Substratlösung	2 Std.	TABELLE	Δ	3	2 Std.	0	Collagenaseaktivität gegen über	Δ'	syntheti schem Sub-	⁴O -markier tem ^ ' Col
		OD365/O.1 ml	0,041		0		0,041	0	0	O Ι/Γα U	lagen (Ein heiten/ml)
	OA	0 Std.	0,045	(a)	0,003		0,040		,002	0	0,00
Bezeich nung des	OA	0,045	0,043		0	Substratlösung (b)	0,038	0	,003	neg⁽²⁾	0,00 '
Falls	OA	0,042	0,058	0,017	OD365/O.1 ml	0,046	0	0	0	0,00 o^
S.N.	RA	0,045	0,591	0,546	0 Std.	0,045		,000	0,09	0,00 I
M.M.	RA	0,041	0,695	0,646	0,050	0,051		,001	2,73	2,73
S.O.	RA	0,045	0,038			3,23	2,11
M.T.		0,049	0,035
M.N.		0,049
T.O.	0,045
	0,050

OA: Osteoarthritis; RA : Rheumatoide Arthritis

(1) Die Collagenaseaktivität wurde unter Verwendung von ^C markierten rekonstituierten Meerschwein·- chenhaut-Collagenfibrillen gemessen, nach der in Biochem. Biophys. Acta 263, 564 (1972) beschriebenen Methode. *°

(2) Innerhalb der Fehlergrenze vernachlässigbar. cd

Beispiel 15

Verschiedene DNP-Peptidderivate wurden in 0,05 m Tris-HCl-Puffer vom pH 7,5 mit einem Gehalt an 0,15 m HaCl, 5 mM CaCIp und 0,02 $> Rinderserumalbumin gelöst, so daß eine Konzentration von 5x10^ molar erzielt wurde. Je 0,1 ml der Peptidderivatlösungen wurde mit dem gleichen Volumen gereinigter Collagenase (6,2 Einheiten/ml) oder nicht spezifischer Peptidasen vermischt und während verschiedener Zeitabschnitte bei 37⁰C inkubiert. Nach dem Unterbrechen der Enzymreaktion durch Zugabe von 0,5 ml 1 m HCl wurden die freigesetzten DNP-Peptidfragmente durch kräftiges Schütteln mit 1 ml Äthylacetat oder Äthylacetat-n-Butanol (1:0,15; Volumen/Volumen) extrahiert und wie in Beispiel 12 aufgearbeitet. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

TABELLE 4

DNP-Peptidderivate

Hydrolyserate** durch

Collagenase nicht spezifische Peptidasen

(CD365/h) (OD365/h)

DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH* DNP-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH* DNP-PrO-GIn-GIy-LeU-AIa-GIy-GIn-D-Z₁Tg-OH* DNP-Pro-Ala-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH DNP-Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH

0,093	O
0,276	O
0,157	0,021
0,243	0,031
0,120	0,051
0,070	0,010

D:iP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH* DNP-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH

O
O

O 0,016

* Die durch das Enzym freigesetzten DiJP-Peptidfragmente wurden mit Äthylacetat-n-Butanol (Volum-Verhältnis 1:0,15) extrahiert.

50/065C': ;;

** Durchschnittswerte aus drei Versuchen. Beispiel 16 ·

NABS-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH wurde in 20 # Äthanol-0,05 m Tris-HCl-Puffer vom pH 7,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl und 5 mti CaCl« bi3 zum Erzielen einer Konzentration von 5xlO~* molar gelöst. 0,5 ml der Lösung wurde mit 0,1 ml gereinigter Collagenase (17,4 Einheiten/ml) vermischt und 60 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Nach dem Unterbrechen der Enzymreaktion durch Zugabe von 0,1 ml 5 η Chlorwasserstoffsäure wurden die freigesetzten NABS-Peptidfragmente mit 1 ml Äthylacetat extrahiert, wonach 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 3000 bis 5000 Upm zentrifugiert wurde. Der Hydrolysegrad wurde durch Messen der Absorption der organischen Schicht bei 389 nm bestimmt. Dabei wurde ein Wert der 0D389/h/ml von 0,100 erhalten.

Beispiel 17

PAB-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH wurde in 0,05 m Tris-HCl-Puffer vom pH 7,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl und 5 mM CaCl₂ gelöst, so daß eine Konzentration von 5x10"^ molar erzielt wurde. 0,1 ml der lösung wurde mit 0,1 ml gereinigter Collagenase (17,4 Einheiten/ml) vermischt und 60 Minuten bei 37 C inkubiert. Nach dem Unterbrechen der Enzymreaktion durch Zugabe von 0,5 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure wurden die freigesetzten PAB-Peptidfragmente nach dem Sättigen mit Natriumchlorid mit 1 ml A'thylacetat extrahiert und wie in Beispiel 16 aufgearbeitet. Der Hydrolysegrad wurde durch Messung der Absorption der organischen Schicht bei 325 nm bestimmt. Dabei wurde ein V/ert der OD325/h/ml von 1,117 erhalten.

0654

Claims

PATENTANSPRÜCHE

in der A eine hydrophobe, neutrale oder saure chromophore Gruppe, Y eine Gruppe B oder Pro-B bedeuten, wobei B für einen Amino-Bäurerest steht, C He oder Leu, E GIn-D-Arg-OH oder D-Arg-OH bedeuten und alle Aminosäurereste, ausgenommen GIy, in der L-Konfiguration vorliegen,wenn nichts anderes angegeben ist.
2. Peptidderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß B der Rest einer in Proteinen vorkommenden oc-Aminosäure mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist.
3. Peptidderivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß B der Rest von Alanin, Prolin, Leucin oder Glutamin ist.
4. Peptidderivate nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß A eine 2,4-Dinitropheny1-, p-(4-Hydroxy-lnaphthylazo)-benzolsulfonyl- oder p-Phenylazobenzoylgruppe ist.
5. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
6. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH.
7. 2,4-Dinitropheny 1-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
8. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
9. 2,4-Dinitrophenyl--Pro-Ala-Gly--Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
10. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Ieu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
11. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Pro-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
12. p-(4-Hydroxy-l-naphtbylazo)-benzolsulfonyl-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
13. p-Phenylazobenzoyl-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
14. 2,4-Dinitrophenyl-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
15. 2,4-Dinitrophenyl-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
16. Verfahren zur Messung der Collagenaseaktivität, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Verbindung der
Struktur

A-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-E

im wässrigen Medium mit Collagenase in Berührung hält, die die Gruppe A enthaltenden freigesetzten Peptidfragmente mit einem organischen lösungsmittel extrahiert und den Extrakt durch KoIo-

rimetrie analysiert, wobei A eine hydrophobe, neutrale oder saure chormophore Gruppe, B einen Aminosäurerest, C He oder Leu, E Gln-D-Arg-OH oder D-Arg-OH bedeuten und alle Aiainosäurereste, ausgenommen GIy, in der L-Konfiguration vorliegen, wenn nichts anderes angegeben ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man das angegebene Peptidderivat und die Collagenase bei einer Temperatur von 30 bis 45⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 9 miteinander in Berührung hält.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung verwendet, in der A eine 2,4-Dinitrophenylgruppe, B den Rest von Alanin, Leucin oder Glutamin, C lie und E Gln-D-Arg-OH bedeuten.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß man die Collagenaseaktivität berechnet, indem man von der unter Verwendung der Verbindung der Struktur

A-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-E (I)

durch Kolorimetrie erhaltenen Absorption

die Absorption abzieht, die durch Ersatz dieser Verbindung (I) durch die Verbindung A-B-Gly-C-Ala-Gly-E (II) erhalten wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung II verwendet, in der A eine 2,4-

7098S0/06S*

Dinitrophenylgruppe, B Gin oder Ala, C lie und E GIn-D-Arg-OH bedeuten.

709860/06S4