DE2540780C2

DE2540780C2 -

Info

Publication number: DE2540780C2
Application number: DE2540780A
Authority: DE
Inventors: John Lawrence Kankakee Ill. Us Hughes; Jay Kenneth Bourbonnais Ill. Us Seyler; Robert Chung-Huan Kankakee Ill. Us Liu
Original assignee: Armour Pharmaceutical Co
Current assignee: Armour Pharmaceutical Co
Priority date: 1974-09-12
Filing date: 1975-09-12
Publication date: 1989-05-24
Also published as: BE833336A; FR2284591B1; JPS5833864B2; IT1042496B; FR2284591A1; GB1527252A; CA1045117A; NL179909C; YU230075A; NL7510761A; ES440922A1; JPS5156448A; US3929758A; YU39747B; AU8473775A; AU498757B2; HU175202B; DE2540780A1; LU73386A1; SU849998A3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Disulfidringstruktur, auf nichtcyclische Peptide als Zwischenprodukte und ihre Herstellung gemäß den voranstehenden Ansprüchen.

Es sind zahlreiche Peptide mit Disulfidringstruktur bekannt, die biologisch aktiv sind und bei der Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden können. Calcitonine, die für die Behandlung der Pagetschen Krankheit verwendet werden, enthalten eine Ringstruktur mit Cysteingruppen in den Positionen 1 und 7 ihrer Aminosäureketten. Oxytocin dient in der Human- und Veterinärmedizin zur therapeutischen Einleitung oder Unterstützung der Geburtswehen sowie zur Kontrolle von nachgeburtlichen Gebärmutterblutungen. Es enthält eine Disulfidringstruktur zwischen den Cysteingruppen in den Positionen 1 und 6 seiner Aminosäurekette. Vasopressin und das ihm analoge Lypressin werden als Antidiuretika in der Humanmedizin verwendet und enthalten als Disulfidbrücke zwischen den Cysteingruppen in den Positionen 1 und 6 ihrer Aminosäuresequenz (vgl. Handbook of Biochemistry, S. C-164-C-188). Somatostatin, ein Disulfid enthaltendes Peptid (vgl. P. Brazeau et al., Science 179 [1973] 77), soll bei der Behandlung von Akromegalie und Diabetes therapeutisch wertvoll sein. Somatostatin enthält eine Disulfindbindung zwischen den Cysteinresten in den Positionen 3 und 14 seiner Aminosäurekette (vgl. R. Burgus et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 70 [1973] 684).

Obwohl Art und Sequenz der Aminosäuren bei den Calcitoninen sowie bei Oxytocin, Vasopressin, Somatostatin und anderen natürlich vorkommenden Peptiden je nach der Species, von der sie stammen, unterschiedlich sein können, enthalten alle diese Peptide, die ursprünglich aus natürlichen Quellen gewonnen wurden, z. B. durch Extraktion aus Drüsen von Menschen, Haustieren, Fischen, Fröschen oder Reptilien, die vorerwähnte Ringstruktur. Die Aminosäuresequenz einiger bekannter biologisch aktiver Peptide, die Cysteingruppen enthalten, die durch hohe Disulfidbindungen zu einer Ringstruktur verbunden sind, sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Typische, Cystein-Ringstrukturen aufweisende Peptide

Bei bisherigen Versuchen zur synthetischen Herstellung von Peptiden der in Tabelle I aufgeführten Art bestand das einzige Verfahren zur Ausbildung einer geschlossenen Disulfidringstruktur darin, das nichtcyclische Peptid mit der erwünschten Aminosäurekette zu erzeugen und dieses Peptid dann mit Oxidationsmitteln zu oxidieren, um so die Disulfidbindung zwischen den beiden Cysteinresten zu bilden. Solche oxidativen Verfahren sind in der Fachliteratur beschrieben (vgl. P. G. Katsoyannis, The Chemistry of Polypeptides, Plenum Press, 1974, S. 60-85). Ein schwerwiegender Nachteil solcher Verfahren besteht darin, daß die hochlabilen Peptidmoleküle Oxidationsmitteln ausgesetzt werden. Diese Behandlung kann eine Inaktivierung des Peptids und dementsprechend eine geringere Ausbeute biologisch aktiver Produkte zur Folge haben.

Es bestand daher seit langem ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Erzeugung der Disulfidbindung zwischen den Cysteinresten von Peptiden, bei dem die Verwendung von Oxidationsmitteln entfallen kann.

Der Erfindung liegt dementsprechend die Aufgabe zugrunde, ein praktikables und leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung von cyclischen Peptiden mit Disulfidbrücken zwischen den Cysteinresten anzugeben. Ferner sollen entsprechende Zwischenprodukte sowie ihre Herstellung angegeben werden.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Peptiden mit Disulfidringstruktur wird eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinresten in einem Peptid durch ein einfaches Vorgehen ausgebildet, wobei das Peptid nicht mit Oxidationsmitteln behandelt zu werden braucht. Dabei wird ein Peptid mit zwei Cysteinresten eingesetzt, an dessen einer Cysteingruppe eine n-Alkylthiogruppe über eine Disulfidbindung an die Thiolfunktion der Cysteingruppe gebunden ist. Ein solches Peptid kann dadurch erhalten werden, daß bei der Synthese der Aminosäurekette des Peptids zum Schutz der Thiolfunktion einer der Cysteingruppen eine andere Schutzgruppe, nämlich eine n-Alkylthiogruppe, verwendet wird, die bei einer anschließenden Spaltung nicht entfernt wird. Das erhaltene nichtcyclische Peptid, das die an einen Cysteinrest gebundene n-Alkylthiogruppe enthält, kann in sauerstofffreier Lösung gehalten werden, bis eine spontane Umwandlung stattfindet, bei welcher die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten durch Verdrängung der n-Alkylthio-Schutzgruppe ausgebildet wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Disulfidringstruktur ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid mit zwei Cysteinresten, bei dem die Thiolgruppe eines Cysteinrestes frei und die andere mit einer n-Alkylthiogruppe geschützt ist, bei einem pH-Wert von 5 bis 10 in sauerstofffreier wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung hält und das n-Alkylmercaptan abtrennt.

Aus DE-OS 22 31 775 ist ein Verfahren zur Herstellung von Cystinpeptiden bekannt, bei dem Cysteinpeptide mit einer geschützten Thiolgruppe mit einem Cysteinpeptid mit ungeschützter Thiolgruppe umgesetzt werden. Die Thiolschutzgruppen sind Gruppen -S-COOR, worin R einen Kohlenwasserstoffrest bedeutet.

Dieser Stand der Technik betrifft folglich primär die Herstellung von offenkettigen, gemischten (asymmetrischen) Cystinpeptiden, bei denen zwei verschiedenartige Peptidketten durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind.

Demgegenüber betrifft die vorliegende Erfindung die Cyclisierung von offenkettigen Peptiden mit zwei Cysteinresten zu einer Ringstruktur mit einer Disulfidbrücke, wobei zum Schutz der Thiolgruppe n-Alkylthiogruppen herangezogen werden.

Das Verfahren nach der Erfindung ist bei der Synthese jedes cyclischen Disulfidpeptids anwendbar, bei dem eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinresten in der Aminosäurekette vorliegt. Das Verfahren ist besonders vorteilhaft bei der Synthese labiler biologisch aktiver Peptide, da die Bildung der Disulfidbindung unter Bedingungen erfolgt, die eine Oxidation vermeiden und die Peptidstruktur auch sonst nicht beeinträchtigen.

Es wird mit der Herstellung eines nichtcyclischen Peptids begonnen, und die Aminosäurekette wird für ein zwei Cysteinreste enthaltendes Peptid aufgebaut, beispielsweise für Oxytocin oder Calcitonin. Die Aminosäurekette wird dabei durch Anwendung klassischer Syntheseverfahren oder nach neueren Festphasen-Verfahren (vgl. R. B. Merrifield, "Advances in Enzymology", Interscience, New York 1969, Chapter 32, S. 221-296, und J. Stuart und J. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1969) aufgebaut.

Die Festphasen-Technik der Peptidsynthese wird bevorzugt angewandt. Dabei werden die Aminosäuren an einem Trägerharz nacheinander verknüpft, bis die gesamte Peptidsequenz aufgebaut ist. Die funktionellen Gruppen der Aminosäuren werden durch Schutzgruppen geschützt. Die α-Aminogruppe der Aminosäuren wird durch eine t-Butyloxycarbonylgruppe (BOC-Gruppe) oder eine äquivalente Schutzgruppe geschützt. Die Hydroxylfunktionen von Serin und Threonin werden durch eine Benzylgruppe oder eine Benzylderivatgruppe, z. B. 4-Methoxybenzyl, 4-Methylbenzyl, 3,4-Dimethylbenzyl, 4-Chlorbenzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, 4-Nitrobenzyl, Benzhydryl oder eine diesen Gruppen äquivalente Schutzgruppe geschützt. Diese Schutzgruppen werden mit Bz abgekürzt. Die Hydroxylfunktion von Tyrosin kann ungeschützt oder durch Bz oder durch Benzyloxycarbonyl oder ein Benzyloxycarbonylderivat, z. B. 2-Chlorbenzyloxycarbonyl oder 2-Brombenzyloxycarbonylgruppe, oder eine diesen Gruppen äquivalente Schutzgruppe geschützt sein. Die Abkürzung W bedeutet, daß entweder keine Schutzgruppe oder eine Bz-Gruppe oder eine Benzyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylderivatgruppe vorhanden sind. Die Guanidinofunktion von Arginin kann durch eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe oder eine diesen Gruppen äquivalente Schutzgruppe geschützt sein. Die Abkürzung T bezeichnet entweder eine Nitro- oder eine Tosylgruppe. Die ε-Aminofunktion von Lysin kann durch eine Benzylxycarbonylgruppe oder ein Benzyloxycarbonylderivat, z. B. 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2-Brombenzyloxycarbonyl oder 3,4-Dimethylbenzyloxycarbonyl, oder eine diesen Gruppen äquivalente Schutzgruppe geschützt sein. Die Abkürzung V bezeichnet eine Benzyloxycarbonyl- oder eine Benzyloxycarbonylderivatgruppe. Für den Imidazolstickstoff des Histidins werden als Schutzgruppen ebenfalls die Schutzgruppen V verwendet. Die ω-Carbonsäuregruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure werden mit Bz-Schutzgruppen geschützt.

Die Peptide, für deren Herstellung das Cyclisierungsverfahren nach der Erfindung verwendbar ist, weisen zwei Cysteingruppen auf, von denen eine mit einer n-Alkylthiogruppe geschützt ist, während die andere eine Bz-Schutzgruppe trägt, die bei der anschließenden Säurebehandlung zusammen mit anderen verbleibenden Schutzgruppen entfernt sind. Die n-Alkylthiogruppe -SR enthält eine Alkylgruppe R, die vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl ist, wobei normalerweise Ethyl als die bessere Gruppe gewählt wird.

Das die n-Alkylthio-Schutzgruppe enthaltende Cystein kann in einer der beiden Cysteinpositionen der Aminosäurekette vorliegen, wobei das Bz-geschützte Cystein in der anderen Cysteinposition vorliegt. So enthält beispielsweise Oxytocin Cysteinreste in den Positionen 1 und 6, und die n-Alkylthiogruppe kann in Position 6 verwendet werden, während die Bz-Gruppe in Position 1 verwendet wird; alternativ werden die Bz-Gruppe in Position 6 und die n-Alkylthiogruppe in Position 1 eingesetzt.

Nach der Festphasen-Technik wird die Aminosäure in der höchsten Position der Kette der synthetisch herzustellenden Peptide mit dem Trägerharz unter Verwendung der vorgenannten Schutzgruppen gekuppelt, wonach die BOC-Schutzgruppen für die α-Aminogruppe entfernt werden; dann wird die nächste Aminosäure der zweithöchsten Position mit der zuletzt zugefügten Aminosäuregruppe gekuppelt, wobei geeignete Schutzgruppen verwendet werden, wie oben erläutert wurde, und die BOC-Schutzgruppe wird entfernt, usw., bis die erwünschte Aminosäurekette vollständig ist. Dabei können geeignete Kombinationen von Aminosäuregruppen und Schutzgruppen eingesetzt und mit dem vorher gewonnenen Peptid umgesetzt werden, um so folgende Aminosäuregruppen anzufügen. Solche Kombinationen sind im Handel erhältlich.

Zur Veranschaulichung der Synthese von Peptiden, auf die das Verfahren nach der Erfindung anwendbar ist, sind in den Tabellen II-VIII einige typische Reagentien, welche die Aminosäuregruppe und die Schutzgruppen enthalten, aufgeführt, die bei der Synthese typischer Aminosäuresequenzen verwendbar sind. Die in den Tabellen II-VIII angegebenen Reaktanten sind im Handel erhältlich mit Ausnahme der BOC-S-Alkylthioverbindungen, die nach einem bekannten Verfahren herstellbar sind (vgl. V. Weber und P. Hartter, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 351 [1970] 1384-8).

Typische Reaktanten für die Synthese von Oxytocin
Position
Aminosäure-Reagens
9
BOC-Glycin
8	BOC-L-Leucin
7	BOC-L-Prolin
6	BOC-S-Ethylthio-L-cystein,
	BOC-S-Methylthio-L-cystein,
	BOC-S-n-Propylthio-L-cystein oder
	BOC-S-n-Butylthio-L-cystein
5	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
4	BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester
3	BOC-L-Isoleucin
2	BOC-O-Benzyl-L-tyrosin,
	BOC-L-Tyrosin oder
	BOC-O-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin
1	BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein,
	BOC-S-Benzyl-L-cystein oder
	BOC-S-3,4-Dimethylbenzyl-L-cystein

Typische Reaktanten für die Synthese von Lachs-Calcitonin
Position
Aminosäure-Reagens
32
BOC-L-prolin
31	BOC-O-Benzyl-L-threonin
30	BOC-Glycin
29	BOC-O-Benzyl-L-serin
28	BOC-Glycin
27	BOC-O-Benzyl-L-threonin
26	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
25	BOC-O-Benzyl-L-threonin
24	BOC-ω-Nitro-L-araginin oder
	BOC-ω-Tosyl-L-arginin
23	BOC-L-Prolin
22	BOC-O-Benzyl-L-tyrosin,
	BOC-L-Tyrosin oder
	BOC-O-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin
21	BOC-O-Benzyl-L-threonin
20	BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester
19	BOC-L-Leucin
18	BOC-e-CBZ-L-Lysin oder
	BOC-ε-2-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin
17	BOC-N(im)-CBZ-L-Histidin
16	BOC-L-Leucin
15	BOC-L-Glutaminsäure-q-benzylester
14	BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester
13	BOC-L-Benzyl-L-serin
12	BOC-L-Leucin
11	BOC-ε-CBZ-L-Lysin oder
	BOC-ε-2-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin
10	BOC-Glycin
9	BOC-L-Leucin
8	BOC-L-Valin
7	BOC-S-Ethylthio-L-cystein,
	BOC-S-Methylthio-L-cystein,
	BOC-S-n-Propylthio-L-cystein oder
	BOC-S-n-Buthylthio-L-cystein
6	BOC-O-Benzyl-L-threonin
5	BOC-O-Benzyl-L-serin
4	BOC-L-Leucin
3	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
2	BOC-O-Benzyl-L-serin
1	BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein,
	BOC-S-Benzyl-L-cystein oder
	BOC-S-3,4-Dimethylbenzyl-L-cystein

Typische Reaktanten für die Synthese von Human-Calcitonin
Position
Aminosäure-Reagens
32
BOC-L-Prolin
31	BOC-L-Alanin
30	BOC-Glycin
29	BOC-L-Valin
28	BOC-Glycin
27	BOC-L-Isoleucin
26	BOC-L-Alanin
25	BOC-O-Benzyl-L-threonin
24	BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester
23	BOC-L-Prolin
22	BOC-L-Phenylalanin
21	BOC-O-Benzyl-L-threonin
20	BOC-N(im)-CBZ-L-Histidin
19	BOC-L-Phenylalanin
18	BOC-ε-CBZ-L-Lysin oder
	BOC-ε-2-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin
17	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
16	BOC-L-Phenylalanin
15	BOC-L-Asparaginsäure-γ-benzylester
14	BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester
13	BOC-O-Benzyl-L-threonin
12	BOC-O-Benzyl-L-tyrosin,
	BOC-L-Tyrosin oder
	BOC-O-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin
11	BOC-O-Benzyl-L-tyrosin
10	BOC-Glycin
9	BOC-L-Leucin
8	BOC-L-Methionin
7	BOC-S-Ethylthio-L-cystein,
	BOC-S-Methylthio-L-cystein,
	BOC-S-n-Propyl-L-cystein oder
	BOC-S-n-Butylthio-L-cystein
6	BOC-O-Benzyl-L-threonin
5	BOC-O-Benzyl-L-serin
4	BOC-L-Leucin
3	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
2	BOC-Glycin
1	BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein,
	BOC-S-Benzyl-L-cystein oder
	BOC-S-3,4-Dimethylbenzyl-L-cystein

Typische Reaktanten für die Synthese von Vasopressin
Position
Aminosäure-Reagens
9
BOC-Glycin
8	BOC-ω-Tosyl-L-arginin oder
	BOC-ω-Nitro-L-arginin
7	BOC-L-Prolin
6	BOC-S-Ethylthio-L-cystein,
	BOC-S-Methylthio-L-cystein,
	BOC-S-n-Propylthio-L-cystein oder
	BOC-S-n-Buthylthio-L-cystein
5	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
4	BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester
3	BOC-L-Phenylalanin
2	BOC-O-Benzyl-L-tyrosin,
	BOC-L-Tyrosin oder
	BOC-O-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin
1	BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein
	BOC-S-Benzyl-L-cystein oder
	BOC-S-3,4-Dimethylbenzyl-L-cystein

Typische Reaktanten für die Synthese von Somatostatin
Position
Aminosäure-Reagens
14
BOC-S-3,4-Dimethylbenzyl-L-cystein
13	BOC-O-Benzyl-L-serin
12	BOC-O-Benzyl-L-threonin
11	BOC-L-Phenylalanin
10	BOC-O-Benzyl-L-threonin
9	BOC-ε-CBZ-L-Lysin oder
	BOC-ε-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin
8	BOC-L-Tryptophan
7	BOC-L-Phenylalanin
6	BOC-L-Phenylalanin
5	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
4	BOC-ε-CBZ-L-Lysin oder
	BOC-ε-2-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin
3	BOC-S-Ethylthio-L-cystein,
	BOC-S-Methylthio-L-cystein,
	BOC-S-n-Propylthio-L-cystein oder
	BOC-S-n-Butylthio-L-cystein
2	BOC-Glycin
1	BOC-L-Alanin

Typische Reaktanten für die Synthese von Schweine-Calcitonin
Position
Aminosäure-Reagens
32
BOC-L-Prolin
31	BOC-O-Benzyl-L-threonin
30	BOC-L-Glutaminsäure-γ-benzylester
29	BOC-L-Prolin
28	BOC-Glycin
27	BOC-L-Phenylalanin
26	BOC-Glycin
25	BOC-L-Methionin
24	BOC-Glycin
23	BOC-O-Benzyl-L-serin
22	BOC-L-Phenylalanin
21	BOC-ω-Tosyl-L-arginin oder
	BOC-ω-Nitro-L-arginin
20	BOC-N(im)-CBZ-L-Histidin
19	BOC-L-Phenylalanin
18	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
17	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
16	BOC-L-Leucin
15	BOC-L-Asparaginsäure-p-nitrophenylester
14	BOC-ω-Tosyl-L-arginin oder
	BOC-ω-Nitro-L-arginin
13	BOC-L-Tryptophan
12	BOC-O-Benzyl-L-tyrosin,
	BOC-L-Tyrosin oder
	BOC-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin
11	BOC-L-Alanin
10	BOC-O-Benzyl-L-threonin
9	BOC-L-Leucin
8	BOC-L-Valin
7	BOC-S-Ethylthio-L-cystein,
	BOC-S-Methylthio-L-cystein,
	BOC-S-n-Propylthio-L-cystein oder
	BOC-S-n-Butylthio-L-cystein
6	BOC-O-Benzyl-L-threonin
5	BOC-O-Benzyl-L-serin
4	BOC-L-Leucin
3	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
2	BOC-O-Benzyl-L-serin
1	BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein,
	BOC-S-Benzyl-L-cystein oder
	BOC-S-3,4-Dimethylbenzyl-L-cystein

Typische Reaktanten für die Synthese von Rinder-Calcitonin
Position
Aminosäure-Reagens
32
BOC-L-Prolin
31	BOC-O-Benzyl-L-threonin
30	BOC-L-Glutaminsäure-γ-benzylester
29	BOC-L-Prolin
28	BOC-Glycin
27	BOC-L-Phenylalanin
26	BOC-Glycin
25	BOC-L-Methionin
24	BOC-Glycin
23	BOC-O-Benzyl-L-serin
22	BOC-L-Phenylalanin
21	BOC-ω-Tosyl-L-arginin oder
	BOC-ω-Nitro-L-arginin
20	BOC-N(im)-CBZ-L-Histidin
19	BOC-O-Benzyl-L-tyrosin,
	BOC-L-Tyrosin oder
	BOC-O-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin
18	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
17	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
16	BOC-L-Leucin
15	BOC-L-Asparaginsäure-γ-benzylester
14	BOC-ε-CBZ-L-Lysin oder
	BOC-ε-2-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin
13	BOC-L-Typtophan
12	BOC-O-Benzyl-L-tyrosin,
	BOC-L-Tyrosin oder
	BOC-O-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin
11	BOC-L-Alanin
10	BOC-O-Benzyl-L-serin
9	BOC-L-Leucin
8	BOC-L-Valin
7	BOC-S-Ethylthio-L-cystein,
	BOC-S-Methylthio-L-cystein,
	BOC-S-n-Propylthio-L-cystein oder
	BOC-S-n-Butylthio-L-cystein
6	BOC-O-Benzyl-L-threonin
5	BOC-Benzyl-L-serin
4	BOC-L-Leucin
3	BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester
2	BOC-O-Benzyl-L-serin
1	BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein,
	BOC-S-Benzyl-L-cystein oder
	BOC-S-3,4-Dimethylbenzyl-L-cystein

Bei der Synthese des durch die Reaktionsreihenfolge nach Tabelle II und Abspalten des Trägerharzes erhaltenen nichtcyclischen Peptids wurden die n-Alkylthio-Schutzgruppe am Cysteinrest der Position 6 und die Bz-Gruppe in Position 1 vorgesehen. Wie erwartet, können bei der Herstellung dieses nichtcyclischen Peptids diese Gruppen auch in umgekehrter Weise vorgesehen werden, so daß sich die Bz-Gruppe in Position 6 und die n-Alkylthiogruppe in Position 1 befindet. Gleiches gilt analog auch für die Schutzgruppen in den Positionen 1 und 7 für das Beispiel der Tabelle III sowie die Beispiele der Tabellen IV, VII und VIII. Bei Tabelle V können die Schutzgruppen in den Positionen 1 und 6 auch vertauscht werden. Beim Beispiel von Tabelle VI, das die Synthese von Somatostatin betrifft, werden vorzugsweise die n-Alkylthiogruppe in Position 14 und eine Bz-Gruppe in Position 3 vorgesehen, wie die Tabelle zeigt. Bei der gleichen Synthese wird bevorzugt ein chlormethyliertes Polystyrolharz anstelle des Benzhydrylamin-Polystyrolharzes, das bei der Synthese der Calcitonine bevorzugt wird, verwendet.

Die zwei Cysteinreste enthaltenden nichtcyclischen Peptide, die als Zwischenstufen gewonnen werden, besitzen vor der Spaltung folgende Struktur:

während sie nach der Säurebehandlung zur Abspaltung der Schutzgruppen folgende Struktur aufweisen:

worin A einen Aminosäurerest und x Null oder eine ganze Zahl bedeuten.

Das abgespaltene Peptid weist also einen Cysteinrest mit einer freien Sulfhydrylfunktion auf, während die Sulfhydrylfunktion des anderen Cysteinrestes in Form einer Disulfidbindung mit einer n-Alkylthiogruppe vorliegt. Dies gilt für jedes entsprechend den Reaktionen nach den Reaktionen nach den Tabellen II-VIII erzeugten Peptid.

Derartige Peptide sind als Zwischenprodukte im Verfahren nach der Erfindung verwendbar und können so cyclisiert werden. Solche Peptide mit zwei Cysteinresten, wobei einer eine freie Sulfhydrylfunktion aufweist und die Sulfhydrylfunktion des anderen durch eine n-Alkylthiogruppe blockiert ist, werden in beliebigen Lösungen, in denen sie löslich sind, wobei wäßrige oder alkoholische Lösungen bevorzugt werden, bei einem pH-Wert von ca. 5-10 in Lösung gehalten bis eine spontane Umwandlung zum erwünschten cyclischen Disulfid-Peptid erfolgt, wobei n-Alkylmercaptan freigesetzt wird.

Die Cyclisierung wird dadurch erleichtert, daß der pH-Wert der Lösung auf 5-8,5, zweckmäßigerweise auf 6-8,5 und bevorzugt auf 7,5 eingestellt wird, indem Ammoniak oder Alkalihydroxide zugesetzt werden. Ein pH-Wert unter 6,0 ist zwar auch möglich, jedoch erfolgt die Umwandlung langsamer als erwünscht; pH-Werte bis ca. 10,5 sind ebenfalls anwendbar; bei einem über ca. 8,5 liegenden pH-Wert besteht jedoch die Gefahr einer geringeren Ausbeute.

Ferner wird die Lösung während der Dauer der Cyclisierung vorzugsweise bewegt, da die Reaktion durch Rühren oder eine andere Art der Bewegung erleichtert wird. Die Reaktionsdauer kann zwischen 2 und 48 h liegen, normalerweise ist die Reaktion jedoch nach etwa 24 h beendet.

Ferner ist darauf zu achten, daß das Vorhandensein von Sauerstoff oder sauerstofferzeugenden Substanzen vermieden und die Lösung im wesentlichen sauerstofffrei gehalten wird. Vorzugsweise wird die das Peptid enthaltende Lösung unter einem Schutzgasstrom, z. B. Stickstoff, gehalten.

Das n-Alkylmercaptan, das bei der Reaktion entsteht, kann durch das Schutzgas abgeführt werden; wenn das Schutzgas mercaptanfrei wird, kann die Reaktion als beendet angesehen werden.

Das Zwischenbild mit der Struktur

-Cys-(A)_x-Cys-,

bei dem eine der Cys-Gruppen eine freie Sulfhydrylfunktion hat und die andere Cys-Gruppe mit einer n-Alkylthiogruppe, die über eine Disulfidbindung gebunden ist, geschützt ist, wird durch das Ringschlußverfahren nach der Erfindung in ein Peptid der Struktur

umgewandelt, wobei A und x die oben definierte Bedeutung besitzen.

Wenn das Verfahren nach den vorstehenden Angaben sorgfältig durchgeführt wird, ergibt sich durch die Cyclisierung keine andere Änderung im Peptid als die Ausbildung einer Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinen und die Abspaltung eines n-Alkylmercaptans.

Die durch das erfindungsgemäße Cyclisierungsverfahren gewonnene Peptidlösung kann nach bekannten Verfahren gereinigt werden. Die Lösung kann einer Kombination von Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie unterzogen werden. Das gereinigte Endprodukt kann aus der Lösung durch Gefriertrocknen gewonnen werden. Das so erhaltene Peptid ist einem entsprechenden aus natürlichen Quellen gewonnenen Peptid chemisch und biologisch äquivalent.

Eine Anwendungsmöglichkeit des Verfahrens nach der Erfindung ergibt sich bei der Synthese von Lachs-Calcitonin, die hier als Beispiel angeführt wird. Zunächst wurde Prolin unter Verwendung von BOC-L-Prolin in Position 32 an das Trägerharz gebunden; dann wurde Threonin unter Verwendung von BOC-O-Benzyl-L-threonin in Position 31 angekuppelt; die Reaktionen wurden analog fortgesetzt, wobei nacheinander die Reaktanten der Tabelle III verwendet wurden. Bei Erreichen der Position 7 wurde ein Reaktant mit einer n-Alkylthiogruppe verwendet, und bei Erreichen der Position 1 wurde ein Reaktant mit einer BZ-Gruppe eingesetzt. Nach Vervollständigung der erwünschten Aminosäurekette wurde das trägergebundene Peptid mit Fluorwasserstoff behandelt, um das Harz und sämtliche verbliebenen Schutzgruppen außer der n-Alkylthiogruppe in Position 7 abzuspalten. Die aus der Säurespaltung resultierende Lösung wurde mit Wasser verdünnt und durch Zugabe von Ammoniak auf pH 7,5 eingestellt. Dann wurde die Lösung unter einem Stickstoffstrom bewegt, bis der austretende Stickstoffstrom kein Mercaptan mehr enthielt. Nach Reinigung des erhaltenen Produkts war dieses natürlichem Lachs-Calcitonin chemisch und biologisch äquivalent.

Die Formel des Peptids, das nach den Reaktionen der Tabelle III und vor der und vor der Abspaltung des Harzes () erhalten wird, ist wie folgt:

Die Formel dieses Peptids, das nach Spaltung mit wasserfreier Säure erhalten wurde, ist

was einer Vorstufe von Lachs-Calcitonin entspricht.

Nach erfindungsgemäßer Cyclisierung liegt Lachs-Calcitonin der Formel

vor.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich bei der Synthese von Oxytocin. Oxytocin enthält neun Aminosäuren, und die Aminosäurekette für Oxytocin kann so aufgebaut werden, daß man mit Glycin in Positon 9 beginnt. Das Glycin kann unter Verwendung von BOC-Glycin an Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz) gebunden werden; dann wird Leucin unter Verwendung von BOC-L-Leucin angekuppelt, wonach Kupplungs- und Schutzgruppenabspaltungszyklen entsprechend der Festphasensynthese durchlaufen werden, bei denen nacheinander die angegebenen Aminosäuregruppen und Schutzgruppen entsprechend Tabelle II verwendet werden.

Wenn die Position 6 erreicht ist, wird zusammen mit der Cysteingruppe eine n-Alkylthio-Schutzgruppe verwendet, während bei Erreichen der Position 1 und beim Ankuppeln einer weiteren Cysteingruppe eine Bz-Schutzgruppe verwendet wird. Alternativ können die Bz-Schutzgruppe auch in Position 6 und die n-Alkylthiogruppe in Position 1 verwendet werden. Nach Vervollständigung der Aminosäurekette besitzt das Peptid folgende Formel:

worin bedeuten:
X den Polystyrolanteil des Harzes,
W keine Schutzgruppe, eine Bz-Gruppe, eine Benzyloxycarbonyl-, oder eine Benzyloxycarbonylderivatgruppe und
R eine n-Alkylgruppe.

Nach der Säurebehandlung zur Abspaltung des Harzes liegt folgendes Peptid vor:

Dieses abgespaltene Peptid weist zwar noch die n-Alkylthiogruppe in Position 6 auf, es erfolgt jedoch, wenn das Peptid in einem Lösungsmittel mit einem pH-Wert von vorzugsweise 6,0-8,5 gehalten wird, eine Umwandlung der Disulfidbindung zwischen dem Cystein und seiner N-Alkylthio-Schutzgruppe in Position 6 und der Sulfhydrylfunktion des Cysteins in Position 1, so daß das folgende Peptid erhalten wird

H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH₂,

das Oxytocin entspricht.

Das folgende Beispiel erläutert die Synthese von Oxytocin unter Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung.

Beispiel A Synthese von Oxytocin Aktivierung des Harzes

5 g Benzhydrylaminharz (BHA-Harz) mit einem Amingehalt von 0,43 mmol/g wurden in das Reaktionsgefäß eines Peptidsynthesegeräts eingebracht. Das Harz wurde mit 20 ml der folgenden Lösungsmittel behandelt und nach jeder Behandlung filtriert:

Methylenchlorid\|2 min,
Chloroform	zweimal je 2 min,
10% Triethylamin in Chloroform	zweimal je 5 min,
Chloroform	2 min,
Methylenchlorid	dreimal je 2 min.

Zyklus 9

Kupplung: Das BHA-Harz, 20 ml Methylenchlorid und 0,75 g (0,0043 mol) BOC-Glycerin wurden 10 min lang bewegt. Dann wurden 4,3 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) (1 mmol/ml) in das Reaktionsgefäß gegeben, worauf das Gemisch 6 h bewegt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend aus dem Reaktionsgefäß entnommen und filtriert; das erhaltene BOC-Glycyl-BHA-Harz wurde den nachstehenden aufeinanderfolgenden Waschvorgängen unterzogen, die jeweils mit 20 ml Waschflüssigkeit für 2 min durchgeführt wurden, wonach jedesmal gefiltert wurde:

Methylenchlorid
zweimal,
Methanol	zweimal,
Methylenchlorid	zweimal.

Acetylierung: Das Harz wurde dann mit einem Gemisch aus 1,6 ml Essigsäureanhydrid, 2,4 ml Triathylamin (TEA) und 20 ml Choroform 30 min bewegt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Harz wurde folgenden Waschvorgängen unterzogen, die jeweils mit 20 ml Waschflüssigkeit erfolgten und je 2 min dauerten:

Chloroform
zweimal,
Methanol	zweimal,
Methylenchlorid	dreimal.

Der Ninhydrintest war negativ.

Abspaltung der Schutzgruppen: Das BOC-geschützte Harz wurde 5 min mit einem Gemisch aus 12 ml Trifluoressigsäure (TFA) und 12 ml Methylenchlorid bewegt. Das Gemisch wurde dann filtriert, und das Harz wurde mit einem zweiten Gemisch aus 12 ml Trifluoressigsäure und 12 ml Methylenchlorid 30 min bewegt. Nach dem Abfiltrieren wurde das Harz folgenden Waschvorgängen mit je 20 ml Waschflüssigkeit unterzogen:

Methylenchlorid
zweimal je 2 min,
Methanol	zweimal je 2 min,
Chloroform	zweimal je 2 min,
10% Triethylamin in Chloroform	einmal 5 min und einmal 10 min,
Methylenchlorid	zweimal je 2 min

Das Glycin-BHA-Harz wurde titriert (vgl. L. Dorman, Tetrahedron Letters, 1969, S. 2319-21), um den Amin- oder Glycintiter festzustellen. Dieser Wert betrug 0,384 mmol Amin oder Glycin pro Gramm Harz.

Zyklus 8

Kupplung: Das Glycinharz, 20 ml Methylenchlorid und 2,95 g (0,0038 mol) BOC-L-Leucin · H₂O wurden für 10 min bewegt. Dann wurden 3,8 ml Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mmol/ml, entsprechend einer Gesamtmenge von 0,0038 mol Dicyclohexylcarbodiimid) in das Reaktionsgefäß gegeben, wonach das Gemisch 2 h bewegt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend aus dem Reaktionsgefäß entnommen, und das Harz wurde nacheinander folgenden Waschvorgängen mit je 20 ml Waschflüssigkeit für jeweils 2 min unterzogen, wobei jeweils gefiltert wurde:

Methylenchlorid
zweimal,
Methanol	zweimal,
Methylenchlorid	zweimal.

Der Ninhydrintest war negativ.

Abspaltung der Schutzgruppen: Es wurde wie in Zyklus 9 verfahren.

Zyklus 7

Die Schritte der Kupplung und Schutzgruppenabspaltung waren die gleichen wie im Zyklus 8, wobei jedoch anstelle des Leucinderivats BOC-L-Prolin (0,82 g, 0,0038 mol) verwendet wurde.

Zyklus 6

Die Schritte der Kupplung und Schutzgruppenabspaltung für diesen Zyklus waren die gleichen wie im Zyklus 8. Die Acetylierung erfolgte in gleicher Weise wie bei Zyklus 9. Zur Kupplung wurde BOC-S-Ethylthio-L-cystein (1,07 g, 0,0038 mol) verwendet.

Zyklus 5

Kupplung: Das aus dem Zyklus 6 erhaltene trägergebundene Peptid wurde zweimal mit 20 ml Dimethylformamid (DMF) gewaschen. Das Harz wurde dann 24 h mit einer Lösung von 2,01 g (0,0057 mol) BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester in 25 ml Dimethylformamid bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend filtriert, und das trägergebundene Peptid wurde jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit zwei aufeinanderfolgenden Mengen von je 20 ml der folgenden Lösungsmittel gewaschen: Dimethylformamid, Methylenchlorid, Methanol, Methylenchlorid. Nach den einzelnen Waschvorgängen wurde jeweils filtriert. Ein Ninhydrintest war negativ.

Abspaltung der Schutzgruppen: Es wurde wie in Zyklus 8 verfahren.

Zyklus 4

Das hierbei angewandte Kupplungsverfahren war das gleiche wie bei Zyklus 5. Die Acetylierung erfolgte hier entsprechend dem Verfahren nach Zyklus 9. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte entsprechend Zyklus 8. Als Aminosäurerest wurde BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester (2,09 g; 0,0057 mol) eingesetzt.

Zyklus 3

Der Kupplungsschritt war der gleiche wie bei Zyklus 8. Die Kupplung wurde unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 10 ml Dimethylformamid und 10 ml Methylenchlorid und den gleichen Mengen Aminosäure und Dicyclohexylcarbodiimid wiederholt. Die Acetylierung erfolgte wie bei Zyklus 9. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte entsprechend Zyklus 8. Für die Kupplungsreaktion wurde als Aminosäurederivat BOC-L-Isoleucin (0,88 g; 0,0038 mol) eingesetzt.

Zyklus 2

Kupplung: Das trägergebundene Peptid aus Zyklus 3 wurde zweimal mit je 20 ml Dimethylformamid gewaschen und dann 10 min mit einem Gemisch aus 2,11 g (0,0057 mol) BOC-O-Benzyl-L-tyrosin und 20 ml Dimethylformamid bewegt. Dann wurden 5,7 ml Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid (0,0057 mol) zugefügt, worauf das Gemisch 16 h bewegt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert. Das trägergebundene Peptid wurde anschließend jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit zwei aufeinanderfolgenden Mengen von je 20 ml der folgenden Lösungsmittel unterzogen: Dimethylformamid, Methylenchlorid, Methanol, Methylenchlorid.

Der Kupplungsschritt wurde wiederholbar, wobei die halben Mengen an Aminosäurederivat und Dicyclohexyclarbodiimid in Methylenchlorid verwendet wurden und 6 h bewegt wurde.

Acetylierung: Es wurde wie im entsprechenden Schritt von Zyklus 9 verfahren.

Abspaltung der Schutzgruppen: Es wurde wie im entsprechenden Schritt von Zyklus 9 verfahren.

Zyklus 1

Der Kupplungsschritt war hier der gleiche wie bei Zyklus 8. Die Kupplung wurde wiederholt, wobei die halben Mengen an Aminosäurederivat und Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid verwendet wurden. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte wie bei Zyklus 9. Als Aminosäurederivat wurde BOC-S-Methoxybenzyl-L-cystein verwendet, das bei der ersten Kupplungsreaktion in einer Menge von 1,3 g (0,0038 mol) eingesetzt wurde.

Nach Beendigung des Zyklus 1 wurde das trägergebundene Peptid nacheinander zweimal mit je 20 ml n-Hexan gewaschen. Das Peptid wurde dann aus dem Reaktionsgefäß entnommen und in einem Vakuumtrockenschrank bei 40°C und 0,13 mbar (0,1 mm Hg) 24 h getrocknet. Die Masse des geschützten trägergebundenen Oxytocins betrug 6,0 g.

Abspaltung mit Fluorwasserstoff

2 g des getrockneten trägergebundenen Peptids und 2 ml Anisol wurden in ein PTFE-Reaktionsgefäß mit PTFE-beschichtetem Magnetrührer eingebracht. Das Reaktionsgefäß wurde in ein Trockeneis-Aceton-Bad eingesetzt, worauf 15 ml Fluorwasserstoffgas in das Gefäß kondensiert wurden. Dieses Gemisch wurde 1 h in einem Eisbad bei 0°C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde dann durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde viermal mit je 25 ml Ethylacetat verrieben. Das Peptid wurde aus den Harzkügelchen mit 2 × 50 ml Eisessig extrahiert. Der Extrakt wurde gefriergetrocknet, wonach 486 mg Peptid erhalten wurden.

Cyclisierung des Peptids zu Oxytocin

200 mg Rohpeptid wurden teilweise in 50 ml sauerstofffreiem destilliertem Wasser mit 1 ml Eisessig gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von konzentrierter Ammoniaklösung auf 7,5 eingestellt. Dieses Gemisch wurde in einem geschlossenen Gefäß unter einem Stickstoffstrom 24 h gerührt. Zu diesem Zeitpunkt konnte im austretenden Stickstoffstrom kein Ethylmercaptan mehr nachgewiesen werden. Der Ethylmercaptangehalt des Stickstoffstroms wurde durch Hindurchleiten des Gasstroms durch Ellman'sche Reagenslösung (vgl. G. L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys. [1959] S. 70-7, 82) bestimmt. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde dann durch Zugabe von Eisessig auf 3,2 eingestellt. Das Gemisch wurde schließlich gefriergetrocknet.

Reinigung des Roh-Oxytocins

Das Rohprodukt wurde in 0,5 N-Essigsäurelösung gelöst und durch Gelchromatographie der Lösung an einer Sephadex® G 25-Säure unter Elution mit 0,5 N-Essigsäure gereinigt. Die erhaltene Oxytocinfraktion wurde gefriergetrocknet, wobei 54 mg einer weißen Festsubstanz erhalten wurden.

Dieses Produkt wiederum in 0,5 N-Essigsäurelösung gelöst und durch nochmalige Gelchromatographie der Lösung an Sephadex® G 25 unter Elution mit 0,5 N-Essigsäurelösung gereinigt. Die erhaltene Oxytocinfraktion wurde gefriergetrocknet. Die Analyse dieses Produkts ergab folgende Aminosäureverhältnisse: Gly 1,0; Leu 0,98; Pro 0,97; Asp 0,89; Glu 0,84; Ile 0,74; Tyr 0,72. Der theoretische Wert sollte 1,0 sein. Der Wert für Cys wurde nicht ermittelt, da das Untersuchungsverfahren diese Aminosäure zerstört. Die biologische Wirksamkeit des Produkts entsprach 305,4 Einheiten/mg.

Das Verfahren nach der Erfindung ist in gleicher Weise bei der Synthese von Somatostatin anwendbar. Das Trägerharz kann dabei ein Polystyrolharz, z. B. das bekannte chlormethylierte Polystyrolharz, sein. Cystein in Position 14 wird zuerst am Harz gebunden, wobei als Reagentien BOC-S-3,4-Dimethylbenzyl-L-cystein, dann Serin, dann Threonin usw. verwendet werden; die die geschützten Aminosäuren und die Schutzgruppen enthaltenden Reagentien werden nacheinander entsprechend Tabelle VI eingesetzt. Bei Erreichen der Position 3 wird die Cysteingruppe mit einer n-Alkylthiogruppe verwendet. Wenn die Aminosäurekette vollständig ist und vor der Säurebehandlung zur Harzabspaltung besitzt das Peptid folgende Formel:

Nach der Säurebehandlung und Abspaltung des Harzes besitzt das Produkt folgende Formel:

Nach der Cyclisierung des Peptids nach der Erfindung besitzt es folgende Formel:

Das Verfahren nach der Erfindung ist für die Synthese von Human-Calcitonin in gleicher Weise anwendbar, wie dies in Verbindung mit der Synthese von Lachs-Calcitonin erläutert wurde. Human-Calcitonin enthält 32 Aminosäuren in seiner Aminosäurekette. Beginnend mit Prolin wird diese Aminosäure in Position 32 an einem BHA-Harz gebunden; in Position 31 erfolgt Kupplung mit Alanin, und in Position 30 erfolgt Kupplung mit Glycin, wobei jeweils entsprechend dem bereits erläuterten System von Schutzgruppen, Kupplung und Abspaltung der Schutzgruppen verfahren wird und die geschützten Aminosäuren als Reaktanten gemäß Tabelle IV in der angegebenen Reihenfolge angewandt werden. Wenn in den Positionen 7 und 1 die Cysteingruppen erreicht werden, wird in einer dieser Positionen eine n-Alkylthio-Schutzgruppe und in der anderen die übliche Bz-Gruppe verwendet.

Wenn die Aminosäurekette vollständig ist, lautet die Formel für das Peptid wie folgt, wobei angenommen ist, daß sich die n-Alkylthiogruppe in Position 7 befindet:

Nach der Säurebehandlung und Abspaltung des Harzes lautet die Formel:

Nach erfindungsgemäßer Cyclisierung dieses Peptids unter den bereits erläuterten Bedingungen besitzt das Produkt folgende Formel:

und entspricht damit der Struktur von Human-Calcitonin.

Das folgende Beispiel erläutert die Synthese von Human-Calcitonin unter Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung.

Beispiel B Synthese von Human-Calcitonin Aktivierung des Harzes

4 g Benzhydrylaminharz (BHA-Harz) mit einem Amingehalt von 0,55 mol/g wurden in das Reaktionsgefäß eines handelsüblichen Peptidsynthesegeräts eingebracht. Das Harz wurde jeweils mit 20 ml der folgenden Lösungsmittel behandelt, wobei nach jeder Behandlung filtriert wurde:

Zyklus 32

Kupplung: Das BHA-Harz, 20 ml Methylenchlorid und 0,95 g (0,0044 mol) BOC-L-Prolin wurden 10 min lang bewegt. Dann wurden 4,4 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mmol/ml) in das Reaktionsgefäß gegeben, worauf das Gemisch 6 h bewegt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend aus dem Reaktionsgefäß entnommen und filtriert; das erhaltene BOC-Prolyl-BHA-Harz wurde den nachstehenden aufeinanderfolgenden Waschvorgängen von je 2 min Dauer mit je 20 ml Waschflüssigkeit unterzogen, wobei jedesmal filtriert wurde:

Methylenchlorid
zweimal,
Methanol	zweimal,
Methylenchlorid	zweimal.

Acetylierung: Das Harz wurde dann mit einem Gemisch aus 1,5 ml Triethylamid, 1 ml Essigsäureanhydrid und 20 ml Choroform 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert; das Harz wurde den nachstehenden Waschvorgängen von je 2 min Dauer mit je 20 ml Waschflüssigkeit unterzogen:

Chloroform
zweimal,
Methanol	zweimal,
Methylenchlorid	dreimal.

Der Ninhydrintest war negativ (vgl. E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34 [1970] S. 595-8)

Abspaltung der Schutzgruppen: Das BOC-geschützte Harz wurde 5 min mit einem Gemisch aus 12,5 ml Trifluoressigsäure und 12,5 ml Methylenchlorid bewegt. Das Gemisch wurde dann filtriert; das abgetrennte Harz wurde mit einem zweiten Gemisch aus 12,5 ml Trifluoressigsäure und 12,5 ml Methylenchlorid 30 min bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend wieder filtriert; das Harz wurde den folgenden Waschvorgängen mit je 20 ml Waschflüssigkeit unterzogen:

Methylenchlorid
zweimal je 2 min,
Methanol	zweimal je 2 min,
Chloroform	zweimal je 2 min,
10% Triethylamin in Chloroform	zweimal je 10 min,
Chloroform	zweimal je 2 min,
Methylenchlorid	dreimal je 2 min.

Das erhaltene L-Prolin-BHA-Harz wurde titriert, um den Amin- oder Prolintiter festzustellen. Er betrug 0,494 mmol Amin bzw. Prolin pro Gramm Harz.

Zyklus 31

Kupplung: Das L-Prolinharz, 20 ml Methylenchlorid und 0,83 g (0,0044 mol) BOC-Alanin wurden 10 min bewegt. Dann wurden in das Reaktionsgefäß 4,4 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mmol/ml; Gesamtmenge 0,0044 mol) gegeben, worauf das Gemisch 2 h bewegt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde aus dem Reaktionsgefäß entnommen und filtriert; das BOC-L-Alanyl-L-prolyl-BHA-Harz wurde den nachstehenden aufeinanderfolgenden, jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit je 20 ml Waschflüssigkeit unterzogen, wobei jedesmal filtriert wurde:

Methylenchlorid
zweimal,
Methanol	zweimal,
Methylenchlorid	dreimal.

Der Ninhydrintest war negativ.

Zyklen 30-26

Die Kupplungs- und Schutzgruppenabspaltungsschritte bei diesen Zyklen waren die gleichen wie bei Zyklus 31, wobei lediglich anstelle des Alaninderivats folgende Aminosäurederivate verwendet wurden:

Zyklus 30:  0,77 g (0,0044 mol) BOC-Glycerin;
Zyklus 29:  0,95 g (0,0044 mol) BOC-L-Valin;
Zyklus 28:  entsprechend Zyklus 30;
Zyklus 27:  1,02 g (0,0044 mol) BOC-L-Isoleucin;
Zyklus 26:  entsprechend Zyklus 31.

Zyklus 25

Kupplung: Das in Zyklus 26 gewonnene trägergebundene Peptid wurde zweimal mit je 20 ml Dimethylformamid gewaschen und dann 10 min mit einem Gemisch aus 2,04 g (0,0066 mol) BOC-O-Benzyl-L-threonin und 20 ml Dimethylformamid bewegt. Dann wurden 6,6 ml Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid (entsprechend 0,0066 mol DCCI) zugefügt und das Gemisch 6 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend filtriert. Das trägergebundene Peptid wurde je 2 min dauernden Waschvorgängen mit jeweils zwei aufeinanderfolgenden Mengen von je 20 ml der folgenden Lösungsmittel unterzogen: Dimethylformamid, Methylenchlorid, Methanol, Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest war negativ.

Abspaltung der Schutzgruppen: Der entsprechende Schritt von Zyklus 32 wurde wiederholt.

Zyklus 24

Kupplung: Das in Zyklus 25 gewonnene trägergebundene Peptid wurde zweimal mit je 20 ml Dimethylformamid gewaschen und dann 24 h mit einer Lösung von 2,42 g (0,0066 mol) BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester in 25 ml Dimethylformamid bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend filtriert; das Peptid wurde jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit je zwei aufeinanderfolgenden Mengen von 20 ml der folgenden Lösungsmittel unterzogen: Dimethylformamid, Methylenchlorid, Methanol, Methylenchlorid. Die Lösungsmittel wurden jeweils abfiltriert.

Der Ninhydrintest war negativ.

Zyklus 23

Kupplung: Das in Zyklus 24 gewonnene trägergebundene Peptid wurde 10 min mit 1,42 g (0,0066 mol) BOC-L-Prolin und 20 ml Methylenchlorid bewegt. Dann wurden 6,6 ml Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid (entsprechend 0,0066 mol DCCI) zugefügt, wonach das Gemisch 16 h bewegt wurde. Nach Filtration des Reaktionsgemisches wurde das Peptid jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit aufeinanderfolgenden Mengen von je 20 ml der folgenden Lösungsmittel unterzogen: Methylenchlorid, Methanol, Methylenchlorid, wobei jeweils filtriert wurde.

Der Ninhydrintest war negativ.

Zyklus 22

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie in Zyklus 23 durchgeführt mit dem Unterschied, daß bei der Kupplungsreaktion 1,75 g (0,0066 mol) BOC-L-Phenylalanin anstelle des BOC-L-Prolins verwendet wurden.

Zyklen 21-18

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie bei Zyklus 31 durchgeführt, wobei jedoch anstelle des Alaninderivats folgende Aminosäurederivate verwendet wurden:

Zyklus 21:  1,36 g (0,0044 mol) BOC-O-Benzyl-L-threonin;
Zyklus 20:  1,71 g (0,0044 mol) BOC-N(im)-Carbobenzyloxy-L-histidin;
Zyklus 19:  1,71 g (0,0044 mol) BOC-L-Phenylalanin;
Zyklus 18:  1,67 g (0,0044 mol) BOC-e-Carbobenzyloxy-L-lysin.

Zyklus 17

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie bei Zyklus 24 durchgeführt, wobei jedoch 2,33 g (0,0066 mol) BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester anstelle des Glutaminderivats verwendet wurden.

Zyklen 16 und 15

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie bei Zyklus 31 durchgeführt, wobei anstelle des Alaninderivats folgende Aminosäurederivate verwendet wurden:
Zyklus 16: 1,17 g (0,0044 mol) BOC-L-Phenylalanin;
Zyklus 15: 1,42 g (0,0044 mol) BOC-L-Asparaginsäure-β-benzylester.

Zyklus 14

Durchführung entsprechend Zyklus 24.

Zyklus 13

Durchführung entsprechend Zyklus 21.

Zyklus 12

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie bei Zyklus 25 durchgeführt, wobei jedoch anstelle des Threoninderivats 2,45 g (0,0066 mol) BOC-O-Benzyl-L-tyrosin verwendet wurden und 16 h bewegt wurde.

Zyklus 11

Durchführung entsprechend Zyklus 25.

Zyklen 10-7

Kupplung und Schutzgruppenverhalten wurden wie bei Zyklus 31 durchgeführt, wobei der bei der Kupplungsreaktion anstelle des BOC-L-Alanins folgende Aminosäurederivate verwendet wurden:

Zyklus 10:  0,77 g (0,0044 mol) BOC-Glycin;
Zyklus 9:  1,02 g (0,0044 mol) BOC-L-Leucin:
Zyklus 8:  1,1 g (0,0044 mol) BOC-L-Methionin;
Zyklus 7:  1,24 g (0,0044 mol) BOC-S-Ethylthio-L-cystein.

Zyklus 6 Durchführung entsprechend Zyklus 25 Zyklus 5 und 4

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie bei Zyklus 31 durchgeführt, wobei bei der Kupplungsreaktion anstelle des BOC-L-Alanins folgende Aminosäurederivate verwendet wurden:

Zyklus 5: 1,3 g (0,0044 mol) BOC-O-Benzyl-L-serin;
Zyklus 4: 1,02 g (0,0044 mol) BOC-L-Leucin.

Zyklus 3

Durchführung entsprechend Zyklus 17.

Zyklus 2 und 1

Zyklus 2: 0,77 g (0,0044 mol) BOC-Glycin;
Zyklus 1: 1,5 g (0,0044 mol) BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein.

Nach Beendigung des Zyklus 1 wurde das trägergebundene Peptid zweimal mit je 20 ml n-Hexan gewaschen. Das Peptid wurde dann aus dem Reaktionsgefäß entnommen und in einem Vakuumtrockenschrank bei 40°C und 0,13 mbar (0,1 mm Hg) getrocknet. Die Masse des erhaltenen trägergebundenen, geschützten Human-Calcitoninpeptids wog 11 g.

Abspaltung mit Fluorwasserstoff

2 g des getrockneten trägergebungenen Peptids und 2 ml Anisol wurden in ein PTFE-Reaktionsgefäß mit PTFE-beschichtetem Magnetrührer eingebracht. Das Reaktionsgefäß wurde in ein Trockeneis-Aceton-Bad eingesetzt, worauf 15 ml Fluorwasserstoffgas in das Gefäß kondensiert wurden. Dieses Gemisch wurde bei 0°C in einem Eisbad 1 h gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde dann durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde viermal mit je 25 ml Ethylacetat verrieben. Das Peptid wurde aus den Harzkügelchen mit 2 × 50 ml Eisessig extrahiert. Der Extrakt wurde gefriergetrocknet, wonach 1063 mg Peptid erhalten wurden.

Cyclisierung des Peptids zu Human-Calcitonin

1000 mg Rohpeptid wurden in 250 ml sauerstofffreiem destilliertem Wasser mit 1 ml Eisessig gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von konzentrierter Ammoniaklösung auf 7,5 eingestellt. Dieses Gemisch wurde in einem geschlossenen Gefäß unter einem Stickstoffstrom 24 h gerührt. Zu diesem Zeitpunkt konnte im austretenden Stickstoffstrom kein Ethylmercaptan mehr nachgewiesen werden. Der Ethylmercaptangehalt des Stickstoffstroms wurde durch Hindurchleiten des Gasstroms durch eine Ellman'sche Reagenslösung bestimmt (vgl. Beispiel A). Der pH-Wert des Gemisches wurde dann durch Zugabe von Eisessig auf 3,2 eingestellt. Das Gemisch wurde schließlich gefriergetrocknet, wobei 985 mg Produkt erhalten wurden.

Reinigung des rohren Human-Calcitonins

Das Rohprodukt wurde in einer 0,5 N Essigsäurelösung gelöst und durch Gelchromatographie der Lösung an einer Sephadex®G 25-Säule unter Elution mit 0,5 N Essigsäure gereinigt. Die erhaltene Calcitonin-Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei ein flockiger weißer Feststoff erhalten wurde.

Dieses Produkt wurde in 0,05 N wäßriger Ammoniumacetatlösung (pH 5) gelöst. Nach Einstellen des pH-Werts auf 5 wurde die Lösung durch Ionenaustauschchromatographie an einer SP-Sephadex®C 25-Säule unter Elution mit Ammoniumacetatpufferlösung gereinigt. Die Human-Calcitonin-Fraktion wurde gesammelt und zweimal gefriergetrocknet, wobei ein flockiger weißer Feststoff erhalten wurde. Dieser war dem in der Literatur beschriebenen Produkt (vgl. P. Sieber et al., Helv. Chim. Acta 53 [1970] S. 2135-50) biologisch und chemisch gleichwertig. Die Aminosäureanalyse (Säurehydrolyse) ergab folgende Aminosäureverhältnisse (theoretische Werte in Klammern): Lys 1,02 (1), His 0,99 (1), Asp 3,28 (3), Thr 5,21 (5), Ser 0,74 (1), Glu 1,95 (2), Gly 4,33 (4), Ala 2,03 (2), Val 1,04 (1), Met 0,86 (1), Ile 1,07 (1), Leu 2,24 (2), Tyr 0,7 (1), Phe 3,0 (3). Die Werte für Pro und Cys wurden nicht ermittelt. Die biologische Wirksamkeit betrug 100 MCR-Einheiten/mg.

Das Verfahren nach der Erfindung ist ebenso bei der Synthese von Vasopressin anwendbar, wobei als Reagens in Position 9 der Aminosäurekette die in Tabelle V angegebenen Gruppen oder Äquivalente davon verwendet werden. Die Formel des Peptids, das nach den Reaktionen entsprechend der Tabelle V und vor der Abspaltng des Harzes erhalten wird, lautet:

Nach der Säurebehandlung dieses Peptids und Abspaltung des Harzes und der meisten Schutzgruppen lautet die Formel:

Dieses Peptid ist eine Vorstufe von Vasopressin.

Nach der erfindungsgemäßen Cyclisierung lautet die Formel:

entspricht also Vasopressin.

Das Verfahren nach der Erfindung kann auch bei der Synthese von Somatostatin herangezogen werden. Die Aminosäurekette des Somatostatins kann dabei unter Verwendung der Reagentien der Tabelle VI oder Äquivalenten davon aufgebaut werden. Die Formel des Peptids, das nach den Reaktionen der Tabelle VI und vor der Abspaltung vom Träger erhalten wird, lautet:

Nach der Säurebehandlung dieses Peptids zur Abspaltung des Harzes und der meisten Schutzgruppen lautet die Formel:

Nach der erfindungsgemäßen Cyclisierung lautet die Formel:

entspricht also Somatostatin.

Bei der Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung bei der Synthese von Schweine-Calcitonin wird zunächst die Aminosäurekette des Schweine-Calcitonins mit den Reagentien der Tabelle VII oder Äquivalenten davon aufgebaut. Die Formel des Peptids, das nach den Reaktionen der Tabelle VII und vor der Abspaltung vom Träger erhalten wird, lautet:

Dieses Peptid ist eine Vorstufe vom Schweine-Calcitonin. Nach der erfindungsgemäßen Cyclisierung lautet die Formel:

entspricht also Schweine-Calcitonin.

Bei der Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung bei der Synthese von Rinder-Calcitonin wird zunächst die Aminosäurekette des Rinder-Calcitonins unter Verwendung der Reagentien der Tabelle VIII oder Äquivalenten davon aufgebaut. Die Formel des Peptids, das nach den Reaktionen nach Tabelle VIII und vor der Abspaltung vom Träger erhalten wird, lautet:

Dieses Peptid ist eine Vorstufe von Rinder-Calcitonin.

Nach erfindungsgemäßer Cyclisierung lautet die Formel:

entspricht also Rinder-Calcitonin.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Disulfidringstruktur, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid mit zwei Cysteinresten, wobei die Thiolgruppe eines Cysteinrestes frei und die andere mit einer n-Alkylthiogruppe geschützt ist, bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 10 in sauerstofffreier Lösung hält und das n-Alkylmercaptan abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung hält.

3. Peptide der Struktur und

4. Verfahren zur Herstellung der Peptide nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise von einem Peptid mit zwei Cysteinresten, in dem die Thiolgruppe des einen Cysteinrestes mit einer Benzyl- oder Benzylderivatgruppe und die des anderen Cysteinrestes mit einer n-Alkylthiogruppe geschützt sind, die Benzyl- oder Benzylderivatgruppe mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure abspaltet.