DE2342862A1 - Verfahren zur herstellung von an beiden kettenenden alpha-aminooxysaeuren enthaltenden peptiden mit acth-wirkung - Google Patents

Description

VEEPAHEEN ZUB HERSTELLUNG VON AN BEIDEN K K-AMINOOXYOAEBONSAUBEN ENTHALTENDEN PEPTIDEN MIT AOTH-WIBEüNG

fts let bekannt, daß die Peptidkett· de« Adrenocorticotrophormone (AOTH) weitgehend modifiziert werden kann, ohne daß dadurch die adrenocorticotrope Wirkung aufgehoben würde. So kann vom ö-terminalen Ende des Moleküls mehr alB ein Drittel der Aminosäurekette abgespalten werden, ohne daß die spezifische Aktivität sinkt» Die Abspaltung weiterer Aminosäuren führt Jedoch zu eines sprungartigen Abnahme der Aktivität. Das Fragment 1-19 besitzt 30 %.

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das Fragment 1-16 jedoch nur ungefähr 1 % der Aktivität de;-gesamten Moleküls. Demgegenüber verursacht am N-termiaalei.. Kettenende bereits die Abspaltung der ersten Aminosäure einen Aktivitäteverlust von 50 % (E. Schröder, K. Lüb ke: The Peptides, Academic Press, New York, 1966, 246-249).

Die an Stelle des N-terminalen Serins D-Aminosäuren, in der Natur nicht vorkommende Aminosäuren oder die vom Serin durch Fortnahme seiner funktioneilen.Gruppen atfeicbaren Acylgruppen (ß-Hydroxypropionyl-, Propionylgruppe) enthaltenden AOTH-F ragmente zeigen fallweise eine stärkere Aktivität als das natürliche ACTH, da diese modifizierten Fragmente, wie angenommen werden kann, gegenüber den Enzymen vom Aminopeptidasetyp resistent sind und daher im Organismus langsamer abgebaut werden ale das natürliche ACTH. Deswegen zeigen dieee modifizierten fragments auch dann eine starke adrenocorticotrope Aktivität» wenn die modifizierende Gruppe di· Holle des N-terminalen Serinteils des natürlichen Hormons nicht völlig auszufüllen vermag.

Die Erscheinung> d*I bti Verringerung der Gliederzahl dei AGIH-fragmente in ö-ttrminnlea Iod· «tue 4ie Wirkung der 0-terminalen Amid-Derivate apftter abzusinken beginnt als die der die entsprechenden freien Carboxylgruppen enthaltenden Peptide, ist auf vergleichbare Grunde zurückzuführen, denn die meisten Enzyme vom £yp der Oarboxypeptidase sind nicht imstande, Peptidamide abzubauen. Daher schien es, als sei durch Amidieren des 0-terminalen Oarboxyls die gleiche Schutz,wirkung zu erreichen wie am N-terminalen Kettenende durch entsprechende Substitution des ßerinteils. Neuerdings wurde jedoch festgestellt, daß es Carboxypeptidase-En^yme gibt, die auch zum Abspalten

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der O-terminalen Aminosäure der Feptidamide £>efαJiigf sind (J.D. Glass u.a.ι Proc. Nat. Aoad. Sei. U.S. €£, 1426 /1969/)Da die substituierten Amide von diesen Enzymen nicht hydrolysiert ₄v?rden_t kann man erwarten, daß die C-terminal substituierten, zum Amid umgesetzten AOTH-Fragmente im Organismus langsamer abgebaut werden und dadurch eine stärkere biologische Wirkung zeigen als die entsprechenden einfachen Amide. Deutschen Forschern ist es tatsächlich gelungen, einige Heptadekapeptid-alkylamid-Derivate mit starker adrenocorticotroper Wirkung herzustellen (DOS Nr. 1 954 79^).

Es wurde nun gefunden, daß es zur Erreichung der gesteigerten Wirkung sehr vorteilhaft ist, wenn an den ACTH-Fragmenten 1—17» 1-18 oder 1-19 beide terminalen Aminosäuren durch Aminooxysäuren ersetzt werden. Ein Derivat besonders hoher Aktivität wird erbalten, wenn in das Fragment 1-18 an Stelle des N-terminalen Serins D-c*-Aminooxy~ß-hydroxypropionsäure und an Stelle des C-terminalen Arginine L- oder D-oC—Amino oxy— £ -aminocapronsäure in das Molekül eingebaut

iie Erfindung bezieht sich also auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung, welche aus einer, von der N-terminalen bis wenigstens zur 17.» aber höchstens bis zur 1% Aminosäure kompletten ACTH-Se<juenz bestehen, an S_telle einzelner Aminosäuren der ACTH-Sequenz Jedoch gegebenenfalls andere Aminosäuren, an Stelle der ersten und der letzten Aminosäure aber in jedem lalle eine Ot-Aminooxysäure enthalten. IHe Erfindung bezieht sich ferner auf Herstellu^ der Derivate und Komplexe sowie der Säurea.id j t: :.·:■■ ■■■^!--.'. :■'■·■- 'ioser Peptide.

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In den erfindungsgemäßen substituierten Peptiden können einzelne Aminosäuren der natürlichen Sequenz gegeu andere Aminosäuren ausgetauscht sein, soweit dies nicht sine wesentliche Senkung der AOTH-Wirkung hervorruft. So kann zum Beispiel die zweite Aminosäure, das Tyrosin, gege.; Phenylalanin und/oder die dritte Aminosäure, d.i.. Serin, gegen Glycin und/oder die vierte Aminosäure, das ^ethioLin, gegen ^eucin, Norvalin, Norleucin oder c*. -Aminobuttersäure und/oder die fünfte Aminosäure, die Glutaminsäure, gegen Glutamin und/oder die 15·und 16. Aminosäure, das Lysin, gegon Ornithin und/oder die 17. und 18. Aminosäure, das Arginin, ge gen Lysin oder Ornithin ausgetauscht sein. Im Hinblick auf

ihre ACTH-Wirkung sind besonders das (D-OSer¹, OLys¹⁸)- <X,¹*"^{1h N}'^:s" -^AOTH und.das (D-Oßer¹, D-OLys¹⁸)-<£-¹~^{18 NH}2~ ACTH zu erwähnen. (Die Abkürzung OSer bedeutet die ^(,-Aminooxy-ß- -hydroxypropionsäure, die sich vom Serin nur durch das zwischen d'em oC-Kohlenstoffatom und d£V Aninogruppe eingeschobene Sauerstoffatom unterscheidet. Im folgenden werden die mit den Aminosäuren strukturell identischen (A₁-Aminooxvsäuren in analoger Weise bezeichnet, zum Beispiel QLys =<4-Ami nooxy- £-aminocapronsäure usw.).

6egeni-fi\Kd der Erfindung ist ein Verfahren ;,av Herstellung neuer Peptide mit AOTH-Wirkung sowie der Derivate, Komplexe und mit Säuren gebildeten Additionssalze dieter ^eplid^.

ή)- d<xo(urtk geheim %trtKke.-t-_/ oioifi ^tVail

von Peptiden, welche aus einer von der W-terminalen bis

jedocL
wenigstens zur 17-, - höchstens^is zur 19- Aminosäure von ständigen ACTH-Sequenz bestehen, anstelle eijjr.elner iinino säuren der ACTH-Sequenz gegeuenenfr. ils nrdere Aminosäuren, anstelle der ersten ur-d der leii.:-i. ■ -luosa;,:,.- h-

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in Jedem Falle Λ-Aminooxysäuren enthalten und wenigstens an der terminalen Aminooxygruppe und an den Aminogruppen der Seitenkette¹] gegebenenfalls auch an der terminalen Carboxyl-^ gruppe und an den Carboxylgruppen der Seitenketten geschütst sind, die bchutzgruppen in einem Schritt oder in mehreren Schritten abspaltet und die erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls zu ihren Säureadditionssalzen, Derivaten oder Komplexen umsetzt·

Die als Ausgangsstoffe verwendeten geschützten Peptide werden, ausgehend von den entsprechenden « -Aminooxysäuren und Aminosäuren, in an sich bekannter Weise durch Fragmentkondensation oder durch Kettenverlängerung um jeweils eine Aminosäure hergestellt, wobei nach der Azid-, der Aktivester-, der DCC- oder der Technik des gemischten Anhydrids gearbeitet werden, aber auch die sogenante Synthese in fester Phase angewond^t werden kann, bei der das Peptid mit seiner am Kettenende befindlichen Carboxylgruppe an ein Polymer gekuppelt ist und aufgebaut wird, indem die Aminosäuren und schließlich die «t-A-minooxysäure in der entsprechenden Reihenfolge an die an das Polymer gebundene C-terminale ©< -Aminooxysäure angebaut wird.

Die funktioneilen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, werden zweckmäßig geschützt, und zwar durch Gruppen, die durch. Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazxnolyse oder Reduktion leicht abgespalten werden können. Die Carboxylgruppe kann zum Beispiel vorzugsweise durch Verestern mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol p-Nitrobenzylalkohol oder durch Amidbildung geschützt werden, zum Schutz der Aminooxy- und der Aminogruppen kommen in erster Linie die Tosyl-, Trityl-, lOrmyl-,

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te»*l ^h" 2342362

Trifluoracetyl-, o-NiErftsulfenyl-, Phthalyl-, Benzyloxycarbonyl- und p-Chlorbenzyloxycarbonyl-Gruppe, besonders jedoch, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe in Frage* Die Guanidinogruppe des Arginins kann vor allem durch die Nitrogruppe geschützt, aber auch in ihrer protonierten Foriü verwendet werden. Die Imino gruppe des Histidine kann mit der Benzyl-, Trityl- oder der Dinitrophenylgruppe geschützt werden. Die Hydroxylgruppen der Seitenketten werden fallweise durch Veräthern geschützt, wobei vorzugsweise mit tert.-Butanol oder mit Benzylalkohol verethert wird.

Durch Anwendung einer geeigneten Kombination von Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese öchutagruppen in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse oder Reduktion selektiv oder gleichzeitig entfernt werden können.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird so vorgegangen, daß man eine geschützte t*. -Aminooxysäure mit dem Tripeptid-Methylester Tyr-Ser—^et-OGH, kondensiert, das Hydrazid des erhaltenen substituierten Tetrapeptidmethylesters zum Azid umsetzt und mit diesem das Dekapeptid GIu(OBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)- -Pro-Val-Gly acyliert. Das auf diese Weise erhaltene substituierte Tetradekapeptid kondensiert man mit dem Ester des aus der entsprechend geschützten, kompletten weiteren Aminosäuresequenz bestehenden Peptides, das Hydrazid des auf diese Weise erhaltenen substituierten Peptidesters setzt man zum Azid um und acyliert damit das entsprechend geschützte Derivat der C-terminalen Aminooxysäure. So wird zum Beispiel bei der herstellung eines substituierten Heptadekapeptides das substituierte Tetradekapeptid mit dem Ester

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des 15-16-Dipeptides, bei der Herstellung eines substituierten Qktadekapeptides mit dem Ester des 15-17-Tripeptides, bei der Herstellung eines substituierten Nonadekapeptides mit dem Ester des 15-18-Tetrapeptides kondensiert. Bei diesen Kondensationen wird vorzugsweise das DCC-Verfahren oder die Methode des Aktivesters angewandt. Im letzteren Falle, besonders bei¹ der Verwendung von Pentachlorphenyl- oder Pentafluorphenylester braucht der aktive Ester nicht isoliert zu werden; er kann mit Hilfe von Pentachlorphenol oder Pentafluorphenol und DCC (vgl. österreichische Patentschrift Nr. 295 O51) aus dem substituierten Tetradekapepfcid im Reaktionsgemisch der Kondensationsreaktion gebildet werden.

Es kann auch so vorgegangen werden, daß man das entsprechend geschützte C-terminale Aminooxysäurederivat mit dem entsprechend geschützten 15-16-Dipeptid, 15-17-Tripeptid oder 15-18-Tetrapeptid acy-iert, das auf diese Weise erhaltene substituierte Peptidderivat nach der selektiven Entfernung der N-terminalen Schutzgruppe mit dem substituierten Tetradekapeptid kondensiert und so das als Ausgangsstoff benötigte, an beiden Enden Aminooxysäure enthaltende geschützte Peptid erhält. Am Ende der Synthese werden die an der N-terminalen << -Aminooxygruppe und an den Aminogruppen der Seitenketten befindlichen tert.-Butyloxycarbonylgruppenvdie an den Carboxylgruppen der Seitenketten und an der σ-Eerminalen Carboxylgruppe - sofern diese nicht amidierfc ist - befindlichen tert.-Butylestergruppen sowie die am Hydroxyl der Seitenketten eventuell vorhandenen tert.-Butyläthergruppen gleichzeitig mittels Acidolyse, zum Beispiel durch Behandeln mit Triflupressigsäure, abgespalten.

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Wenn das als Ausgangsatoff benubzte Peptid auch mit Trifluor essigsäure nicht abspaltbare Schut ζ gruppen, zum Beispiel Formylgruppen_; enthält, so werden diese vor oder nach der Entfernung der übrigen Sclmtsgruppeii in einem besonderen Reaktionsschritt abgespalten. Die Reinigung des ^T'oa seinen Schutzgruppen befreiten Endproduktes kann durch Verteilung im Ge^enstroiu oder durch Säulenehroniatographie, zum Beispiel durch Ionenaustauschchroniatographie an unterschiedlichen Carboxymethylcellulosearten vorgenommen werden*

^Die neuen Verbindungen werden in Abhängigkeit von der bei ihrer Herstellung angewendeten Methode in Form freier Basen oder des Salzes erhalten. Aus den Salzen können die freien Basen in an sich bekannter Weise freigesetzt werden. Die freien Basen können mit den für pharmazeutische Zwecke verwendbaren Säuren zu Säureadditionssalzen umgesetzt werden. Für diesen Zweck kommen anorganische Säuren, zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, aber auch organische Säuren wie zum Beispiel Ameisensäure» Essigsaure, höhere Fettsäuren, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure usw._; in Frage.

Unter Derivaten der neuen Verbindungen werden hier zum Beispiel deren Ester, Amide, ferner aie am Stickstoff unterschiedlich substituierten AmI-^e, in erster Linie die an der C-terminalen Carboxylgruppe amidierten, in der Seitenkette jedoch gegebenenfalls auch freie Carboxylgruppen enthaltenden Peptidamide verstanden.

Unter pharmazeutisch anwendbaren Komplexen sind solche Verbindungen der mit dem erfindui^^mäßen Verfahren hergestellten Peptide zu verstehen, die var-li Zugabe gewisser anorganischer oder organischer bfcol'fe entstehen

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und eine verzögerte Wirkn.Vitkeit der Peptide hervorrufen. Als organische Zusatzstoffe kommen zum Beispiel gewisse Gelatinearten, Carboxymethylcellulose^ Alginsäureester, Polyfloretinphoapha-j, Aminosäurepolymere oder sonstige Polymere und Copolymere in Frgge. Als anorganische Verbindungen können die Hydroxyde bestimmter Metalle, in erster Linie das Zinkhydroxyd sowie die schwer löslichen Salze, zum Beispiel die Phosphate und. Pyrophosphate dieser Metalle, verwendet werden. Zum Erreichen einer verzögerten Wirkung sind ferner bestimmte Silikate geeignet, die mit den Peptiden ebenfalls unlösliche Komplexe bilden, deren Struktur ' noch nicht geklärt ist.

Aue dennoch dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptiden können zur pharmazeutischen Verwendung die üblichen pharmazeutischen Präparate hergestellt werden. Diese Präparate enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen zusammen mit zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten organischen oder anorganischen S^reckmitteln. Die pharmazeutischen Präparate können feste Lyophilisate sein, wobei als Streckmittel mit Peptiden nicht reagierende Verbindungen, zum Beispiel Mannit, Milchzucker oder Stärke, in Frage kommen, sie können aber auch in JPorm von Sus- -. Pensionen und Emulsionen hergestellt werden, welche verschiedene neutrale Konservierungsmittel und Stabilisatoren enthalten. Besonders zweckmäßig ist es, wenn die pharmazeutischen Präparate die erfindungsgemäßen Verbindungen in Jona*der weiter oben erwähnten Komplexe enthalten, die eine verzögerte Wirkung des Präparates hervorrufen.

Entsprechend der üblichen Dosis des AdrenocorticotropfESimons enthalten die pha_rmazeutischen Präparate die erfin-

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dungog-mäßen Verbindungen in eine: KopzHntr-Aioii von zum Beispiel 0,1-5 rag/ml. L'ie Präparate können üubcutan, intramuskulär oder parenteral 1~7mal pro Woche verabreicht werden.

Die praktische Ausführung -.ic-j Verfahrens wird an Hand der folgenden Beispiele oriäutorL.

In den Beispielen werden zur Bezeichnung der Amino- " säuren und der Peptid-Derivat e die durch die IUPAC-IUB vorgeschlagenen Abkürzungen benutzt (,<.^r. Biöl. Chem. 24y, 977 /1972/). Zur Bezeichnung der -χ -Amirooxysäuren werden die den Abkürzungen der Aminosäuren ähnlichen, ''.Liter oben bereits erwähnten Symbole OSer OLys usw. bt-nutzt. Die obigen Abkürzungen beziehen sich - GIy ausgenommen - falls nicht anders angegeben, auf die L-Antipo-ien. Als weitere Abkürzungen werden verwendet* POPOH = Pentachlorphenol, Pi¹POH = Pentafluorphenol, DCC = Bicyclohexylcarbodiimid, DCU = Dicyclohexylcarbamid, BOG = tert.-Butyloxycarbonyl, Bu = tert.-Butyl, For = Pormyl, >

Die Bestimmung des Schmelzpunktes wurde mit dem Apparat nach Dr. Tottoli (Büchi, Schweiz) vorgenommen. Die dünnschicktchromategraphischen Untersuchungen wurden an dem A sorbens Silikagel nach Stahl mit folgenden Losungsmittelgemisclieii durchgeführt 1

1. Essig ester:(Pyridin:Essigsäure:Vasser=20:6:1i)-99:1

2. Essig ..ester:(Pyridiii:EßsigBäure:Wasser=20+6:11)= 8:2 3« Essig ester:(Pyridin:Essigsäure:Was3er=20:6:1i)=.6:^

Beispiel 1

D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-"rlie-Arp;~Trp-&ly-^L,V s-^Pr°- -Val-Gly-Lys-Lys-Lys-OLys -' .11^

0,75 g (0,267 mllol) BOO-D-^Ser-Tyr-caT^et-Gi.iCOBu )-409809/1219 BAD ORIGINAL

-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOG) ~Lys (BOÖ)-L.y-λ BOu)-OLyB (IOr)- -NH₂ werden in einem Gemisch aus 5 ml Trifiuoressigsäure, 0,75 ml Wasser und 0,75 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 150 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltrxert,

mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phoephorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Es werden 0,70 g (86 %) TrI ~ fluoracetat des substituierten Formyl -Oktadekapeptides erhalten. Die Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst, 0,25 ΊΓ.1 Merc apt oäthanol) zugesetzt und der pH~W'ert der Losung mit η-Natronlauge auf 5 eingestellt. Danach wird die Losungmit 11,5 ml 2-m-Hydrazinacetatlösung vermischt und zwei Stunden lang bei 95 ⁰O auf dem Wasserbad gehalten. Danach wird im Vakuum eingeengt und die Restlösung auf eine mit Ionenaustauscher der ^arke Whatman CM 52 gefüllte Säule . aufgebracht. Man eluiert mit einem aus 0,2 m (pH 6,7) und 0,5 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten, lyophllisiert die entsprechenden Fraktionen und erhält 0,275 g (38 %) substituiertes Oktadekapeptidamid.

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte substituierte Oktadekapeptidamid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1: L- «K~tert .-Butyloxycarbonyl-aßiinooxy- £-f ormylamino- -capronsäure (BOC-Olys/For/)

23,2 g (60 mMol)-H-^--Form/l-D-LjHin und 43,2 g (423 mMol) Natriumbromid werden in 248 ml 2,5 η Schwefelsäure gelöst. Die Lösung wird auf 0 ° gekühlt, und unter Rühren innerhalb von 30 Minuten in Portionen 15,3 g (192 mMol) Natriumnitrit zugegeben. .1*3 Reaktion:»gemisch wird eine Stunde lang bei 0 ⁰C "^ine Sturze lang --ti -i^rl^p-

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nachgerührt und dann dreimal mit 2üO ml Abher ausgeschüttelt. Die vereinigten ätherischen Lösungen werden getrocknet und danach eingedampft. Die als Rückstand verbleibenden 18,4 g rohe D-p<,-Brom- £ -f ormylamino-caproneäure werden in

ml Äthanol gelöst und der Lösung 8,4 g (15O mMol) Kaliumhydroxyd und 10,0 g (76 mMol) tert.-Butyloxycarbonylhydroxylamin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird zwei Stunden lang gekocht und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wird das Lösungsmittel abdestilliert_; der Rückstand in 80 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 10 %-iger Salzsäure auf 3 eingestellt. Die saure Lösung wird mit Natriumchlorid gesättigt und dreimal mit 150 ml Äther, danach mit 150 ml Essig ester ausge-

tt

schüttelt. Die Äther- und Essig .esterphasen werden

vereinigt, getrocknet und eingedampft. Der kristalline Rückstand (16 g) wird aus 25 ml Essig ester umkristallisiert. Man erhält 10,4 g (27 %) L-oC. -tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy- ^-formylamino-capronsäure. Schmelzpunkt: 114-116 ⁰O₁ R². - 0,31, /W7-Q = -52,5° (c = 1, Methanol).

Analyse 0₁₂ ^H22^N2°6 (290,32): Berechnet: C 49,6 % H 7.65 % Gefunden: C 49,9 % H 7,6 % ...Schr.it.t__J2j . L^eC-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy- £-f ormyl-

amino-capronsäure-amid (BOC-Olys ZFOrZ-NE^) 5,0 g (17,2 mMol) BOC-OLys(For) werden in 107 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und der Lösung: 1,90 ml (17,2 mMol) N-Methylmorpholin zugesetzt. Die Lösung wird auf -10 ⁰O abgekühlt, und unter Rühren wurden 2,25 ml (17,2 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester zuretropft. Das Reaktionsgemisch wird noch 10 Minuten laxi-. b>vi -10 ~C

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halten und dann auf -20 ⁰G gekühlt. Nun werden vorsichtig 10,7 ml (142 mMol) konzentrierte Ammoniuiühydroxjdlösung zugetropft und das ßeaktiοη^gemisch eine Stunde lan^ bei 0 G eine Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt, lianauii." wird das Tetrahydrofuran abdentilliert und der halb^kristalline Rückstand mit 20 sL eines üominchtrr aus Essig ester: Pyridin:Essigsäure:Wasser im Verhältnis 900_: y\:16:30 auf eine Silikagelsäule von 250 ml Volumen aufgebracht. Man eluiert mit derselben Mischung, sammelt die Fraktionen, die den gewünschten Stoff enthalten und dampft sie ein. Man erhält 4,3 g (86 %) BOO-OLys(For)-NH₂ in Form eines schwach gelben amorphen Stoffes. R^ - 0,54. C ^H₂₅N. 0^(289,34). Schritt 3: Tert.-Butyloxycarbonyl-D- oC -aminooxy-ß-benzyloxypropionsäure

48,4 g (0,364 Mol) tert.-Butyloxycarbonyl-hydroxylamin» 40,7 g (0,728 Mol) Kaliumhydroxyd und 94_r0 g (0,364 Mol) DL- oC-Brom-ß-benzyloxypropionsäure werden in 360 ml Wasser gelöst· Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt. Dann wird sein pH-W_ert auf

t!

3 eingestellt und dreimal mit 720 ml Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird mit 720 ml Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und mit 78 ml (0,40 Mol) Dicyclohexylamin versetzt» 43,61 g Dicyclohexylaminsalz der tert.-Butyloxycarbonyl-DL-σζ-aminooxy-ß-benzyloxypropionsäure werden erhalten (Schmelzpunkt: 144-146 °0). Das Salz wird in 500 ml Ither suspendiert und dieTSuspension fünfmal mit 100 ml 0,2-n-Schwefelsäure ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird nach dem Trocknen zur Trockne eingedampft, der Eückstand in 700 ml Äthanol gelost, un^l 6,56 g (48,5 Mol) (+)-Amphetaminbase zu der Lösung " gegeben.

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Die Lösung wird über Nackt an einen kühlen Ort gestellt, anderntags werden die ausgeschiedenen Kristalle abfi.lt; eiert * Das erhaltene (+)-Amphetaminsalz der jbert.-Butyloxycarbonyl- -D- ^-aminooxy-ß-benzyloxypropionsäure wird aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute: 13,2? g, Schmelzpunkt: 188-191 ⁰C₁ /Wß⁶= +54° (c - 0,5, Methanol). A_UB dem Salz wird in bekannter Weiße die tert.-Butyloxycarbonyl-D-oc- -aminooxy-ß-benzyloxypropionsäure erhalten. Ausbeute:

7,9 g (14 %), Schmelzpunkt: 96-98 ⁰C, /Wj^⁰ = +38°

u
(c = 1, Äthanol).

Schritt 4: tert.-Butyloxycarbonyl-D-oC-aminooxy-ß-hydrox^pro-pionsaure (BOO-D-OSer)

5,5 g (17»7 mMol) D-ot-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-ß-benzyloxypropionsäure werden in 110 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2,75 g 1° %-igem Aktivkohle^alladiuäkatalyaator hydriert· Nach drei Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das ^ethanol ablestilliert und d,er ölige Rückstand unter Fetrolöther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach dem filtrieren und Trocknen erhält man 3»65 g (96 %) D-oC- -tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-ß-hydroxypropionsäure.

Schmelzpunkt 94-95 °G» Rf = 0»27. ^C ₈ ^H15^NO6 (²²¹»²²>· Schritt 5: BOO-D-OSer-Iyr-Ser-Met-NgH^

4,4 g (2OmMoI) BOO-D-OSer und 9,0 g (20 mMol) Tyr- -Ser-Met-OCH, werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf O ⁰G gekühlt und zuerst 2,22 ml (20 mMol) N- -Methylmorpholin, dann 3,8 g (18,4 mMol) DOO zugegeben. Das Eeaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei O C gerührt und bis zum nächsten Tage bei Zimmertemperatur stehen gelasaen. Danach wird das DOU abfiltriert, das FiItrat

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eingedampft und der Rückstand in 400 ml Essig .ester ge~ löst. Die Lösung wird zweimal mit je 200 ml n-Salzst-ure und zweimal mit je 200 ml 8%-iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, dann getrocknet und schließlich eingedampft. Der Rückstand (8,10 g geschützter substituierter Tetrapeptidester) wird in 85 ml Methanol gelöst, der Lösung werden 2,2 ml (46 mMol) Hydrazinhydrat zugegeben und das Reaktionsgemisch bis zum nächsten Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das ^ethanol abdestilliert, der Rückstand mit Essig . ester verrieben, filtriert, mit Essig ester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Man erhält 7,21 g (63 %) geschütztes substituiertes Tetrapeptidhydrazid. Der Schmelzpunkt des aus Wasser umkristallisierten Produktes liegt bei 174-175 °C R^ = 0,30.

Analyse C₂₅H₄₀N₆O₁₀S (616,69): Berechnet: 0 48,7% H 6,55% N 13,6% Gefunden: 0 48,3 % H 6,6 % Έ 13,8 % Schritt 6: BOC-D-0Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(0Bu^t)-His-Phe-Arg- -Trp-Gly-Lys(BOO)-Pro-Val-Gly . HCl

/1,25 g (2,13 mMol) BOO-D-ÖSer-Tyr-Ser-Met-N^ werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf -20 ⁰C gekühlt. Unter Rühren werden zuerst 2,08 ml (8,32

mMol) 4 η salzsaurer Essig^ ^ ester, danach 0,32 ml

(2,70 mMol) tert.-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei -10 ⁰O 5 Minuten gerührt, dann auf -20 ⁰C gekühlt. un^2^78^eAg GIu(OBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)- -Pro-Val-Gly und 1,4 ml (8,13 mMol) Diisopropyläthylamin in 23 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei einer Temperatur von -5 bis O⁰C gerührt

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BAD ORfGlNAL

und dann bei O ⁰C bis zum nächsten Tage stehen gelassene Die Lösung wird eingedampft und der Rückstand mit 8%-igör Nitriumhydrogencarbonatlösung verrieben. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Wasser und Trocknen erhält man 3,49 g (94· %) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid. Dieses wird in 24 ml Methanol suspendiert und eine aus 4,75 ml konzentrierter Salzsäure und 4,75 ml Pyridin bereitete Pyridin- -h.ydrochloridlösung zu der Suspension gegeben. Die Lösung wird mit 240 ml Wasser verdünnt der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und schlißßl'ch getrocknet. 2,95 g (73 %) Hydrochlorid des geschützten . Tetradekapeptides werden erhalten. Schmelzpunkt: 200-202 C, Ej = 0,25. C₉₁H₁₅₄N₂₁O₂₅ClS (1989,68). 3chritt 7: LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH₃ . Oxalat

11,0 g (17,7 mMol) Z-Lys(BOO-LyS(BOC)-OCH₃ (K.Hofmann u.a.: J. Am. Chem. Soc. J56, 4991 ./1964/) werden in 200 ml Methanol gelöst, mit 2,0 g (22,2 mMol) wasserfreier Oxalsäure versetzt und in Gegenwart von 2,0 g iO2&-igem PalladiumÄktivkohl^iCatalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Piltrat

it eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Man erhält 9,1 g (89 %) Dipeptidester-oxalat, das nach Umkristallisieren aus Isopropanol-Diisoprbpyläther bei 65-⁰C schmilzt. R^ = 0,34, /öc7_B = +3,79° (c = 1, Methanol) .

Analyse C₂₅H₄₅N₄O₁₁ (578,65)

Berechnet: C 51,9% H 8,9 % N 9,7% Gefunden: C 51,5^% H 7,9% N 9,9% Schritt:8: Z-Lys(30C)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH₃ 8,1 g (14,0 mMol) Lye(BOC)-Lys(BOC)-OCH₃ . Oxalat

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werden in 60 ml Essig ester suspendiert, der Suspension zaerst 3,1 ml (28,0 mMol) N-Methylmorpholin, dann 6,7 g*(i4,0 mMol) Z-Lys(BOO)-ONSu zugesetzt und das Reaktionsgemisch zwei Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird das eingedickte Reaktionsgemisch mit 200 ml Essig ester und 40 ml Wasser verdünnt. Nach Abtrennung der wäßrigen Phase wird die Essig ©sterphase zweimal mit 40 ml η-Salzsäure und zweimal mit 40 ml 8%-iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und schließlich eingedampft. Der Rückstand wird mit Diisopropyläther verrieben, das erhaltene rohe Produkt wird aus einem Isopropanol-Diisopropyläther-Gemisch umkristallisiert. Man erhält 8,0 g (67 %) Methylester des geschützten Tripeptides. Schmelzpunkt: 117-118 °0, rJ - 0,58, /Sc7_D = -17,47° (c = 1, Methanol).

Analyse G₄₂H₇₀N₆O₁₂ (851,03): Berechnet: 0 59,3 % H 8,3 % Gefunden: C 59,7 % H 8,2 % Schritt 9: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu*)-His-Phe-Arg-Trp- -Gly-Lys(BOO)-Pro-Yal-Gly-Lys(BOO)-Lys(BOC)- -LyS(BOO)-OOH₃ . HOl

1,25 g Z-Lys(BOO)-Lys(BOO)-LyS(BOO)-OCH₅ werden in 25 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0,2 g 10 %-igem Palladiuiq^tivkohleJKatalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Methanol abdestilliert und der als Rückstand verbliebene Tripeptidester zusammen mit 2,42 g (1,24 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lyß(BOC)-Pro-Val-Gly . HCl in 12 ml Dimethylformamid gelöst. Der Lösung werden 0,97 g (3,64 mMol) PCPOH und O»255 g (1,24 mMol) DGC zugesetzt

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und das F <kfcionsgemisch bei Zimicerfcemperatur 2 Tage stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert, das-Filtrat im Vakuum eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Äther ausgefällt. Das nach Filtrieren und Trocknen erhaltene rohe Produkt (3,4- g, Schmp. : 177 ⁰C, unter Zersetzung) wird aus einem ^ethanol-Ather-Gemi^ch umgefällt. 2,6 g (80 %) Hydrochlorid des geschützten substituierten Heptadekapoptid-methylesters werden erhalten, schmelzpunkt· 191 °C (Zersetzung), R^ = 0,54. C₁₂₅H₁₉₆N₂₇O₃₄ClS (2688,61).

Schritt 10: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg- -Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys (BOC)-Lys(BOC)- -LyS(BOC)-N₂H₃

2,5 g (0,93 mMol) BOC-D-OSer-Tyl-Ser-Met-Glu(OBu^t)- -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC) -Lys(BOC)- -LyS(BOC)-OCH₃ . HCl werden in 75 ml kochendem Methanol gelöst. Die Lösung wird auf Zimmertemperatur abgekühlt, mit 0,91 ml (18,7 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und bei Zimmertemperatur zwei Tage lang stehen gelassen. Danach wird das

It

Methanol abdestilliert und der Rückstand mit Äther verrieben. Das rohe Produkt (2,15 g, Schmp.: 199 ⁰O, unter Zersetzung) wird aus Dimethylformamid und Wasser umgefällt. Man erhält 2,00 g (81 %) Hydrazid des geschützten substituierten Heptadekapeptides. Schmelzpunkt: 205 °C (Zersetzung), R_f = 0,49. ^C124^HT^29°33^S (2652,16).

Schritt H: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg- -Trp-Gly-Lys(B0C)-Pro-/al-Gly-Lys(B0C)-Lys(BOC)- -Lys(BOC)-OLys(For)-NH₂

a) 0,57 g (1»97 mMol) B0C-0Lys(For)-NH₂ werden in 7,5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 4 ml Dimethylforma-

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mid gelöst. Die Lösung wird mit Diisopropyl-äthylamin neutralisiert·

b) 1,00 g (0,377 mMol) BOG-D-OSer-Tyr-Ser-^et- -Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(HOC)-Pro-Val-Gly- -Lys(BOO)-LyS(BOO)-LyS(BOO)-N₂H₃ werden unter schwachem Erwärmen in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf -20 G abg< 'rühlt und unter Rühren^ zuerst 0, 54 ml (1,52 mMol) 2,8-n-salzsaurer Essig ester, dai:i 0,05 ml (0,42 mMol) tert.-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang bei -10 ⁰C gerührt, auf -20 ⁰C abgekühlt und dann die gemäß Absatz a) bereitete, neutralisierte OLys(For)-NH₂-Trifluoracetatlösung zusammen mit 0,2 ml (1,17 mMol) Diisopropyl-äthylamin zugegeben. Das Heaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei -5 bis 0 ⁰C gerührt und dann bei 0 C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Danach wird die Hälfte des Lösungsmittels abdestilliert und der Rest mit 20 ml Wasser verdünnt. Die ausfallende Masse erstarrt beim Stehen. Sie wird unter frischem Vasser zerpulvert, filtriert und getrocknet. 0,80 g (75,5 %) geschütztes substituiertes Oktadekapeptidamid werden erhalten. Schmelzpunkt: 140-145 °G, r| = 0,47, ^ci31^H206^W30⁰36^S (2809,35).

Beispiel 2

D-OSer-Tyr-Ser-Met -Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gl y-Lys- -PrO-VaI-GIy-LyS-LyS-LyS-D-OLyS-NH₂

0,75 g (0,267 mMol) BOO-D-OSer-Tyr-Ser-Met- -Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly- -Lys(B0G)-Lys(B0G)-Lys(B0G)-D-0Lys(For)-NH₂ werden ii: nem Gemisch aus 6 ml Trifluoressigsäure, 0,75 ml Wasser und 0,75 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird eine St uz. Je

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e x—

(I

lang stehen gelassen und dann mit 150 ml Äther verdünnt. Der auegeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet. Es werden 0,65 g (80 %) Trifluoracetat des substituierten lormyl-Oktadekapeptides erhalten. Die Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst., 0,25 ml Mercaptoäthanol ^'zugesetzt, und der pH-Wert der Lösung) mit n- Nat ronlauge auf 5' eingestellt _f Danach wird die Lösung mit 10,6 ml 2-m-Hydrazinacetatlösung vermischt und zwei Stunden lang bei 95 C auf dem Wasserbad gelassen. Nach Einengen im Vakuum wird die Restlößung auf eine mit Ionenaustauscher der Marke Whatman OM 52 gefüllte Säule aufgebracht. Man eluiert mit einem aus 0,2 m (pH 6,7) und 0,5 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten Puffergradienten, sammelt und lyophilisiert die entsprechenden Fraktionen und erhält 0,28 g (41 %) substituiertes Oktadekapeptidamid.

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte substituierte Oktadekapeptidamid wird auf folgende Weise hergestellt:
Schritt 1: D-flC-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-£ -formylamino-capronsäure (BOC-D-OLyS(IOr) )

■^uf die im Schritt 1 von Beispiel 1 beschriebene Weise wird aus N- d-IOrmyl-L-Lysin-D- oC-tert.-Butyloxycarbonyl- -aminooxy- £~formylamino-capronsäure hergestellt. Schmelzpunkt: 114-116 ⁰C, E^ = 0,31, /^.7_D = +58,6° (c = 1, Methanol).

Analyse C₁₂H₂₂N₂O₆ (290,32): Berechnet: 0 49,6 % H 7,65 % Gefunden: C 50,0 % H 7,6 %

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- 21 Schritt 2: D-<* -tert.-Butyloxycarbonyl-aiüinooxy-£-±ormyl-

amino-capronsäureamid (BOG-D-OLyS(I¹Or)-NH₂) Das Amid wird, ausgehend von 5,0 g (17,2 mMol) BOC- -D-OELysiPor^auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise her-" gestellt. Man erhält 4,4 g (88 %) BOO-D-OLyS(I¹Or)-NH₂ . r| = 0,54, G₁₂H₂₂U₃O₅ (289,34).

Schritt 3: BO0-D-OSer-Tyr-Ser-Het-Glu(OBu^t)-His-Phe-lrg-

-Trp-Gly-Lys ( BOO ) -Pr ο - Val-Gly-Lys ( BOO ) -lys ( BOC ) -LyS(BOO)-D-OLyS(FOr)-MH₂

Ausgehend von 0,57 g (1»97 mMol) BOC-D-OLys(I¹Or)-NH₂ erhält man auf die ia Schritt 11 von Beispiel 1 beschriebene Weise 0,90 g (85 %) geschütztes substituiertes Oktadekapeptidamid. Schmelzpunkt: 140-145 ⁰O, E^ = 0,47,

^σΐ31^Η206^Ν30°36^β

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Claims (8)

1« Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden mit ACTH-Wirkung, sowie deren Derivaten, Komplexen und Säureadditionssalzen, dadurch gekennzeichne t," daß man von Peptiden, welche aus einer von der N-terminalen bis wenigstens zur· 17. höchstem?)bis zur 19. Aminosäure vollständigen ACTH-Sequenz bestehen, anstelle einzelner Aminosäuren der ACTH-Sequenz jedoch gegebenenfalls andere Aminosäuren, an Stelle der ersten und der letzten Aminosäure)in jedem Falle oc -Aminooxysäuren enthalten und wenigstens an der terminalen Aminooxygruppe und an den Aminogruppen der Seitenketten, gegebenenfalls auch an der terminalen Carboxylgruppe und an den Carboxylgruppen der Seitenketten geschützt sind, die Schutzgruppen in einem Schritt oder in mehreren Schritten abspaltet und die erhaltenen Verbindungen gewünsentenfalls in ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe überführt.

2. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch g e - kennzei chnet , daß man als Ausgangsstoff ge- echützte Peptide verwendet, die an Stelle der ersten Aminosäure der ACTH-Sequenz D- oC-aminooxy-ß-hydroxypropionsäure (D-OSer) enthalten.

3. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff geschützte Peptide verwendet, die an Stelle der 17. oder Aminosäure der ACTH-Sequenz L- oder D-.7.-Aminooxy- £-aminocapronsäure (OLys) enthalten.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Ausgangsstoff geschützte Peptide verwendet, deren Aminosäurenreihenfolge

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sich von der natürlichen AGTH-Bequenz dadurch unterscheidet, daß an Stelle der Arg '-Gruppe eine Lys-Gruppe steht. *

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet , daß man als Ausgangsstoff Peptide verwendet, deren N-termi;u\le Amiu ο oxy gruppen und Aminogruppen mit tert.-Butyloxycarboriyl-Grirppen und deren Carboxylgruppen mit tert.-Butylestergruppen geschützt sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch g e ken η ze ichnet , daß man sämtliche Schutzgruppen durch Acidolyse abspaltet.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch g ekennze ichnet , daß man sämtliche Schutzgruppen ir.it Trifluoressigsäure abspaltet.

8. Weiterentwicklung des Verfahrens nach den-Ansprüchen 1-7 zur Herstellung von Arzneimittelpräparaten mit Adrenocorticotrophormon-^Wirkung, dadurch gekennzeichnet , daß man die erhaltenen Verbindungen oder deren Säureadditionssalze, Derivate beziehungsweise Komplexe für sich oder zusammen mit in der Pharmazie gebräuchlichen Tragerst'offen, Bindemitteln, Gleitmitteln usw., gegebenenfalls mit anderen Präparaten ähnlicher Wirkung in an sich bekannter Weise zu Tabletten, Pillen, Kapseln, Zäpfchen, Emulsionen, Suspensionen, Injektionslösungen oder andere*, zur Verabreichung geeigneten Präparaten verarbeitet.

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