DE3340208A1

DE3340208A1 - Neue biologisch aktive peptide, verfahren zu deren herstellung und veterinaerpraeparate, welche diese enthalten

Info

Publication number: DE3340208A1
Application number: DE19833340208
Authority: DE
Inventors: Roberto De Castiglione; Luigia Milano Gozzini; Pier Carlo Torino Montecucchi; Giuseppe Desio Perseo
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1982-11-10
Filing date: 1983-11-07
Publication date: 1984-05-10
Also published as: SE8306112D0; CH658661A5; IL70152A0; IL70152A; SE8306112L; AU557783B2; IT8323607A0; SE461042B; US4491541A; FR2535715B1; AU2104183A; DE3340208C2; DK513283D0; NL8303845A; IT1212790B; FR2535715A1; DK513283A

Description

FARMITALIA CARLO ERBA S.p.Α., MAILAND / ITALIEN

Neue biologisch aktive Peptide, Verfahren zu deren Herstellung und Veterinärpräparate, welche diese enthalten

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf biologisch aktive Peptide, deren pharmazeutisch annehmbare Salze, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Anwendung als therapeutische Mittel.
5

In dieser Beschreibung sind Symbole und Abkürzungen jene, die üblicherweise in der Peptidchemie verwendet werden (siehe J.Biol.Chem. 1972, 247, 977-983): Boc = tert.Butyloxycarbonyl; BzI = Benzyl; c = Konzentration; HOTcp = Trichlorphenol; MeGH = Methanol; Met(O) = Methioninsulfoxid; (4-Cl)Phe = 4-Chlor-L-phenylalanin; (4-NH₉)Phe = 4-Amino-L-phenylalanin; (4-N0₇)Phe = 4-Nitro-L-phen/lalanin; Pip = L-Pipecolinsäure; Thz = 4-L-Thiazolidincarbonsäure; TLC. =.Dünnschichtchromatographie.

Die Erfindung sieht Peptide der allgemeinen Formel

X - A - B - C - Trp - D - Y vor, worin bedeuten:

X Wasserstoff oder eine ein endständiges N-Atom schützende Gruppe vom Acyl-, aromatischen Urethan-, Alkyl-, Aralkyl- oder aliphatischen Urethantyp; A eine Valenzbindung oder einen L-α-Aminosaurerest, B einen L-a-Iminosäurerest oder einen L-a-Aminosäurerest,

C einen L-u-Iminosäurerest oder einen neutralen L-α-Aminosäurerest,

D eine Valenzbindung oder einen L-a-Aminosäurerest, Y eine Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder eine Gruppe der Formel OR, NHR, NR₉ oder NH-NH-R', wobei R eine geradkettige, verzweigtkettige oder cyclische (einschließlich anellierte oder brückenartig gebundene) Alkylgruppc mit bis

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':' zu 11 C-Atomen, die gegebenenfalls substituiert ist, eine ■'■' Phenylgruppe oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 9 C-Atomen ist und R¹ Wasserstoff, jede der unter R*angegebenen Gruppen, eine geradkettige, verzweigtkettige oder cyclische alipha-'.'tische Acylgruppe'mit 1 bis 11 C-Ätomen, * die gegebenenfalls

' * durch Hydroxy- Amino oder Halogen substituiert ist, eine '" 'aromatische'Acylgruppe, die gegebenenfalls durch Hydroxy, '"" Amino oder Halogen substituiert ist, eine geradkettige,

' verlweigtkettige oder cyclische aliphatische Urethangruppe ' mit'3 bis 11 C-Atomen oder eine aromatische Urethangruppe darstellt . " '""' ' "'

Bevorzugte Schutzgruppen für ein endständiges Stickstoffatom, welche X darstellen kann, sind Cvom Acyltyp) Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl, Propionyl und Benzoyl; (vom aromatischen Urethantyp) Benzyloxycarbonyl CZ), 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2-Brombenzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl CFmoc) und 5,5-Dimethoxy-a,a'-dimethylbenzyloxy-

carbonyl (Ddz); (vom aliphatischen Urethantyp) tert.Butoxycarbonyl, 1-Methylcyclobutoxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Isobornyloxycarbonyl; und (vom Alkyl- und Aralkyltyp) Trityl, Benzyl, Methyl und Isopropyl.

Bevorzugte L-a-Aminosäurereste, die A repräsentieren können, sind Phe, (4-NO₂)Phe, (4-NH₂)Phe, (4-Cl)Phe und Tyr. Bevorzugte L-a-Iminosäurereste, die B repräsentieren können, sind Pro, Thz und Pip; wenn A abwesend ist, sind bevorzugte L-ct-Aminosäurereste, die B repräsentieren können, Pyr, Phe und Tyr", Bevorzugte L-«-Iminosäurereste, die C repräsentieren können, sind Pro, Thz und Pip; bevorzugte ■ neutrale L-a-Aminosäurereste, die C repräsentieren können, sind Ala, VaI und Leu. Bevorzugte L-a-Aminosäurereste, die D repräsentieren können, sind VaI, Leu, Met, Met(O), He und Phe. Bevorzugte Gruppen, die R repräsentieren können, sind Mathyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, s-Butyl, Isobutyl, tert.Butyl, 2,2,2-Trifluoräthyl, Cyclohexyl,

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- 9 Adamantyl, Phenyl, Benzyl und Phenäthyl.

Beispiele von Acylgruppen, die R' repräsentieren können, sind Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl, Propionyl, Butyryl, Adamantylcarbonyl, Benzoyl, Phenylacetyl und Cinnamyl. Die Gruppen vom aliphatischen und aromatischen Urethantyp, die R¹ repräsentieren können, sind vorzugsweise jene, die als bevorzugte Schutzgruppen X vom aliphatischen und aromatischen Urethantyp des endständigen Stickstoffs genannt wurden.

Salze von Peptiden gemäß vorliegender Erfindung mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren oder Basen .sind mitumfaßt. Derartige Säureadditionssalze können von einer Reihe von anorganischen und organischen Säuren, wie Schwefel-, Phosphor-, Salz-, Bromwasserstoff-, Jodwasserstoff-, Salpeter-, SuIfamin-, Citronen-, Milch-, Pyruvin-, Oxal-, Malein-, Bernstein-, ^5 Wein-, Zimt-, Essig-, Trifluoressig-, Benzoe-, Salicyl-, Glucon-, Ascorbin- und verwandte Säuren, stammen. Derartige Basenadditionssalze können von einer Reihe von anorganischen und organischen Basen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Diäthylamin, Triäthylamin und Dicyclohexylamin stammen.

Die Synthese der Peptide gemäß der Erfindung erfolgt gemäß klassischen Lösungsmethoden. Die Synthese besteht im wesentlichen in geeigneten aufeinanderfolgenden Kondensationen von • geschützten Aminosäuren oder Peptiden. Die Kondensation wird so durchgeführt, daß die erhaltenen Peptide die gewünschte Sequenz von 4 oder 5 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuren und Peptide, die gemäß in der Polypeptidchemie an sich bekannten Verfahren kondensiert werden, weisen ihre Amino- und Carboxylgruppen auf derartige Weise auf, daß sie an der Bildung der Peptidbindung nicht beteiligt sind, d.h. sie sind

^⁰ durch eine geeignete Schutzgruppe blockiert. Die Schutzgruppen können durch Acidolyse, Verseifung oder Hydrogenolyse entfernt werden.

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- ίο -■

Zum Schützen der Aminogruppen können beispielsweise die folgenden Schutzgruppen verwendet werden: Benzyloxycarbonyl, tert.Butoxycarbonyl", trityl,'Formyl, Trifluoracetyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl oder 3,5-Dimethoxy-a,α'-dimethylbenzyloxycarbonyl. Zum Schützen der Carboxygruppen können beispielsweise die folgenden Schutzgruppen verwendet werden: Methyl, Äthyl, tert.-Butyl, Benzyl oder p-Nitrobenzyl.

Die Kondensation zwischen einer Aminogruppe eines Moleküls und einer Carboxylgruppe eines anderen Moleküls zur Bildung der Peptidbindung kann durch ein aktiviertes Acylderivat, wie ein gemischtes Anhydrid, ein Azid oder einen aktivierten Ester, oder durch direkte -Kondensation zwischen einer freien Aminogruppe und einer freien Carboxylgruppe, in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimie, allein oder zusammen mit einem Razemisierung verhindernden Mittel, wie N-Hydroxysuccinimid oder 1-Hydroxybenzotriazol, durchgeführt werden.

Hydrazido- oder substituierte Hydrazidoderivate gemäß der Erfindung werden durch* Kondensation des N-geschützten Peptids bzw. der Aminosäure mit einem geeignet substituierten Hydrazin, wie Benzylcarbazat, tert.Butylcarbazat, Adamantylcarbazat, Phenylhydrazin oder Adamantylhydrazin, oder Umsetzen des N-geschützten Peptids bzw. des Aminosäurehydrazids mit einem geeigneten Alkylierungsmittel, wie einem Alkylchlorid, oder mit einem geeigneten Acylierungsmittel, wie Benzylchlorformiat, tert.Butylfluorformiat, Di-tert.butyldicarbonat oder Adamantylfluorformiat, hergestellt. Die Kondensation kann in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Pyridin, Acetonitril, Tetrahydrofuran oder N-Methyl-2-pyrrolidon, durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur kann von -30⁰C bis Umgebungstemperatur betragen. Die Reaktionszeit beträgt im allgemeinen 1 bis 120 h. Das Syntheseschema, die Schutz-

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BAD ORiGiMAL

gruppen und die Kondensationsmittel werden so gewählt^ daß die Gefahr von Razemisierung vermieden wird- - -

Reaktionen zum Entfernen von Schutzgruppen werden gemäß in der Polypeptidchemie an sich bekannten Verfahren durchgeführtr Peptide, worin Y OR bedeutet, werden beispielsweise aus gehend von der durch den geeigneten Alkohol veresterten C-endständigen Aminosäure hergestellt. Peptide, worin Y die Bedeutung OH hat, können beispielsweise durch Hydrolyse von Peptiden, worin Y OR bedeutet, hergestellt werden. Peptide worin Y die Bedeutung NH₇, NHR oder NR₇ hat, können durch Ammonolyse der entsprechenden Ester oder ausgehend von einer C-endständigen Aminosäure, amidiert durch ein geeignetes Amin, hergestellt werden.

Biologische Wirksamkeit

Die Verbindungen der Erfindung besitzen interessante wachstumsfördernde Aktivität bei Tieren, wie durch ein In vivoin vitro-Testsystem an der Proteinsynthese von Lebergewebe gezeigt, beschrieben von K. Kämmerer und A. Dey-Hazra in Veterinär-Medizinische Nachrichten, 99-112 (1980),beschrieben. Sie zeigen auch interessante endikrinologische Wirksamkeit, wie Prolaktin und luteinisierende Hormonfreisetzung.

Untersuchung der wachstumsfördernden Wirksamkeit

Die Peptide der vorliegenden Erfindung, beispielsweise H-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH₇, wurden an Ratten in einer tägliehen Dosis von 1 bis 100 mg/kg, subkutan während eines Zeitraumes von 1 bis 4 Wochen verabreicht, getestet. Sie zeigten eine Steigerung an Leberproteinsynthese, bestimmt gemäß der Methode von Kämmerer und Dey-Hazra, und eine Zunahme der Körpermassse am Ende des 4 Wochen dauernden Versuches. Zusätzlich war das Futterumwandlungsverhältnis verbessert.

Für veterinärische Zwecke kann die Verabreichung der Verbindungen der Erfindung an nahrungsmittelproduzierende

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Tiere in einem Dosisbereich von 1 bis 100 ng/kg gemäß den üblichen Veterinärmethoden zur Behandlung mit anabolischen oder wachstumsfördernden Mitteln bewirkt werden, nämlich durch subkutane Implantation oder in einer geeigneten stabilisierten durch das Futter gemischten Form.

Demgemäß sieht die Erfindung weiterhin eine pharmazeutische oder veterinärische Zusammensetzung vor, die eine Verbindung der Erfindung oder ein pharmazeutisch oder veterinärisch annehmbares Salz hievon in Mischung mit einem pharmazeutisch oder veterinärisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger enthält. Zusätzlich können derartige Zubereitungen eine gerichtete oder verzögerte Freisetzung des aktiven Bestandteiles bewirken.

Die bevorzugten Peptide gemäß der Erfindung .sind:

.15 Pyr-Pro-Trp-Met-OH '■ Pyr-Pro-Trp-Met-OMe Pyr-Pro-Trp-Met-NH-Pyr-Pro-Trp-Met(O)-OH Pyr-Pro-Trp-Met(O)-OMe Pyr-Pro-Trp-Met(O)-NH₀ ^; Pyr-Ala-Trp-Met-OH ' P yr-Ala-Trp-Met-OMe Pyr-Ala-Trp-Met-NH₂ P yr-Ala-Trp-Leu-OH Pyr-Ala-Trp-Leu-OMe Pyr-Ala-Trp-LeU-NH₂ Pyr-Pro-Trp-Val-OH ?yr-?ro-Trp-VaI-OMe Pyr-Pro-Trp-Väl-NH., H-Phe-Pro-Pro.-Trp-OH

10

15

20

25

H-H- H-H- H-H- H-H- H-H- H-K-H-H- H-HHHH-

H-H-

H-

H-H-

H-H-H-

- 13 -

•Phe-Pro-Pro-Trp-OMe •Phe-Pro-Pro-Trp-iSiH-•Phe-Pro-Trp -Met-OMe ·.

■Phe-Pro-Trp-Met-NH₂

•Tyr-Pro-Tro-Met-OH :

•Tyr-Pro-Trp-Met-OMe '

•Tyr-Pro-Trp-Met-NH₂ ■Tyr-Pro-Trp-Leu-OH •Tyr-Pro-Trp-Leu-OMe •Tyr-Pro-Trp-LeU-NH₂ -Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-OH •Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-OMe -Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-NH- -Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OH -Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe -?he-Pro-Pro-Trp-Met-NH₂ -Phe-Pro-Pro-Trp-Val-CH -Phe-Pro-Pro-Trp-Val-OMe , -Phe-Pro-Pro-Trp-Val-NH- -Tyr-Pro-Pro-Trp-Met-OH -Tyr-Pro-Pro-Trp-Met-OMe

-Tyr-Pro-Pro-Trp-Met-NHj

- (4-Cl)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OH

- (4-Cl)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe -(4-Cl)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH_

- (4-NH₂)Phe-Pro-Prc-Trp-Met-OH -(4-NH₂)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe -(4-NH₀)Phe-Pro-Pro-Tns-Met-NH^

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Rf-Werte wurden an vorbeschichteten Silikagelplatten 60 F₂₅₄ (Merck), Schichtdicke 0,22 nun, Länge 20 cm, unter Verwendung der folgenden Entwicklungssysteme bestimmt:
System A: Benzol/Äthylacetat/Essigsäure/Wasser: 100/100/20/10

bezogen auf das Vol. (obere Phase) System B: Benzol/Athylacetat'/Essigsäure/Wasser: 100/100/40/15

bezogen auf das Vol. (obere Phase)

System C: n-Butanol/Essigsäure/Wasser: 4/1/1 bezogen auf das Vol.

System D: Chloroform/Methanol/32 $ Ammoniumhydroxid:

55/4S/20 bezogen auf das -Vol. "Merck" ist ein Markenname.

TLC-Analysen wurden nicht unter Standardbedingungen durchgeführt. Die Rf-Werte können sich daher ändern, insbesondere bei unterschiedlichen Temperaturen. Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillargefäßen mit einer Tottoli-Apparatur bestimmt und sind nicht korrigiert.

Die meisten der Derivate werden weich und zersetzen sich vor dem Schmelzen. Lösungsmittel für Kristallisation, Fällung oder Mahlen sind in Klammern angegeben. Hochspannungs-Papierelektrophorese wird mit einer Pherograph-Original-Frankfurt Type 64-Apparatur auf Schleicher- und Schüll-Papier Nr. 2317 bei pH 1,2 (Ameisensäure/Essigsäure/Wasser: 123/100/777) bei 1600 V (40 V/cm) und bei pH 5,8 (Pyridin/Essigsäure/Wasser: 450/50/4500) bei 1400 V (32,5 V/cm) durchgeführt. Die Produkte wurden durch ihre Mobilitäten bei pH 1,2 in bezug

oder GIu

auf GIu (E_{1 2}) ^{und Dei} P^{H 6}»⁸ in bezug auf His/(E_{5 g}) entsprechend der Migrationsrichtung charakterisiert.

Beispiel 1; Herstellung von Pyr-Pro-Trp-Met-.NE, (IV) Stufe 1 : Boc-Trp-Met-NH-, (I)

' im

Zu einer Lösung von 3,043 g (10 mMol) Boc-Trp— OH in 30 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wurden nacheinander 1,12 ml

GOPY

(10 mMol) N-Methylmorpholin und 0,99 ml (10 mMol) Athylchlorformiat bei einer Temperatur von -12°C zugesetzt. Nach Rühren während 2 min wurde eine kalte Lösung von 1,482 g (10 mMol) H-Met-NH₇ (F. Chillemi, Gazz.Chim.Ital. , 1963, £3, 1079) in 30 ml Dimethylformamid zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -12⁰C und 2 h bei 0 bis 15°C gerührt, von Salzen abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in 'Äthylacetat gelöst und mehrere Male aufeinanderfolgend mit mit Natriumchlorid gesättigten Lösungen von IM Citronensäure, 1M Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

4,041 g (93 % Ausbeute) Verbindung (I) wurden aus Äthylacetat erhalten, Fp, 143°C
Rf_A 0,61; Rf_B 0,84.

erhalten, Fp, 143°C, [ct]jj° = -12,3° (c = 1 in MeOH);

Stufe 2: HCl.H-Trp.Met.NH, (II)

3,911 g (9 mMol) Boc-Trp-Met-NH, (I) wurden bei Raumtemperatur in 40 ml Ameisensäure gelöst. Nach vollständiger Entfernung von Boc (TLC-Überwachung) wurde das Lösungsmittel im Vakuum bei 30⁰C abgedampft.. Der Rückstand wurde in Methanol, gekühlt auf O⁰C, gelöst und 3,6 ml (10,8 mMol) 3M Lösung von Chlorwasserstoff in wasserfreiem Tetrahydrofuran wurden zugesetzt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und 3 g (90 % Ausbeute) Verbindung (II) wurden aus MeOH/AcOAt erhal-

ten, Fp. 114⁰C (Zers.); [a]*° = +20,4° (c = 1 in MeOH); Rf_c 0,62; E₁ , 0,82.

Stufe 3: Pyr-Pro-OH (III)

3,604 g (10 mMol) Z-Pyr-Pro-OH (R. de Castiglione et al." Gazz.Chim. Ital. 1964, _94_, 375), gelöst in 30 ml einer Mischung von Methanol und Dimethylformamid (1/1), wurden bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck in Anwesenheit von 1,2 g 10 ⁹o-Masse Palladium auf Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Lösung im Vakuum eingeengt. Es wurden 2,149 g (95 °& Ausbeute) Verbindung (III) aus Diäthyläther er-

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halten, Fp. 168°C; [a]*⁰ = -105,1° Cc = 1 in MeOH); Rf_Q 0,21, Rf_n 0,62; Ε_{ς a} 0,98. - · - ■ "

U D , O

Stufe'4: Pyr-Pro-Trp-Met-NH, CIV)

Zu einer Lösung von 1,584 g C7 mMol) Pyr-Pro-OH CHI), gelöst in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran, wurden aufeinanderfolgend 0,79 ml C7 mMol) N-Methylmorpholin und 0,69 ml C7 mMol) Äthylchlorformiat bei -12°C zugegeben. Nach Rühren während 2 min wurde eine kalte Lösung von 2,596. g C7 mMol) HC1.H-Trp-Met-NH₂ CH) und 0,79 ml C7 mMol) N-Methylmorpho-

iin in 20 ml Dimethylformamid zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -12°C und 2 h bei 0 bis 15°C gerührt, dann von Salzen abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie auf Silikagel CMerck) 0,040-0,065 mm, wobei mit Chloroform/Methanol/Wasser 87/13/1,bezogen auf das Vol., eluiert wurde, gereinigt. Es wurden 2,54 5 g C6 7 % Ausbeute) Verbindung CIV) aus Diisopropyläther erhalten, Fp. 207-209⁰C; [a]^·⁵ = -95,3° Cc = 1 in MeOH); Rf_c 0,43; Aminosäureverhältnis: GIu 1,00; Pro 0,98; Met 1,00.

-0 Beispiel 2: Herstellung von HCl. H-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH₂ CIX) Stufe 1: Boc-Phe-Pro-OH CV)

1,151 g ClO mMol) Prolin wurden in 10 ml Wasser suspendiert und 10 ml 1n NaOH wurden zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde mit Dimethylformamid verdünnt und die Lösungsmittel wurden im Vakuum abgedampft; Dimethylformamid wurde zugesetzt und wieder im Vakuum eingedampft. Eine Lösung von 4,44 7 g ClO mMol) Boc-Phe-OTcp CE. Sandrin und R.A.Boissonnas, HeIv. Chim.Acta, 1963, ££, 1637) in 50 ml Dimethylformamid wurde zugesetzt und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels durch Abdampfen im Vakuum wurde das Rohprodukt auf übliche Weise in die entsprechende freie Säure überführt und durch Säulenchromatographie auf Silikagel CMerck) 0,040-0,063 mm, wobei mit Chloroform/Methanol 9:1, bezogen auf das Vol., eluiert

^jS wurde, gereinigt. Es wurden 3,252 g Verbindung.CV) C90 %

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BAD ORiGiNAL

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Ausbeute) als Schaum durch Eindampfen aus Petroläther erhalten, Rf_A 0,67.

Stufe 2: Boc-Pro-Trp-Met-NH₂ (VI)

Ausgehend von 1,722 g (8 mMol) Boc-Pro-OH und 2,967 g (8 mMol) HCl.H-Trp-Met-NH, CII) unter Anwendung der in Stufe 1 von Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wurden 3,838 g (90 % Ausbeute) Verbindung (VI) aus Isopropylalkohol erhalten; ° = -70,2° (c = 1 in MeOH); Rf_A 0,38; Rf_ß 0,73.

Stufe 3: HC1.H-Pro-Trp-Met-NH₂ (VII) Ausgehend von 3,722 g (7 mMol) Boc-.Pro-Trp-Met-NH₂ (VI) unter Anwendung der in Stufe 2 von Beispiel-1 beschriebenen Arbeitsweise wurden 2,621 g (80 I Ausbeute) Verbindung (VII) aus abs.Äthylalkohol erhalten; [a]^° = -23,0° (c = 1 in MeOH); Rf- 0,41 ; E₁ , 0,76.

Stufe 4: Boc-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-N^ (VIII) Eine Lösung von 2,340 g (5 mMol) HCl.H-Pro-Trp-Met-NH, (VII)

A-

in 20 ml Dimethylformamid wurde auf 0⁰C gekühlt und 0,56 ml N-Methylmorpholin, gefolgt' von 1,812 g Boc-Phe-Pro-OH (V), 0,676 g (5 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol und 1,135 g (5,5 mMol) Dicyclohexyylcarbodiimid, wurden zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei Räumtemperatur gerührt, dann filtriert und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie auf Silikagel (Merck) 0,040-0,063 mm, wobei mit Äthylacetat/Methanol/Wasser 70/30/2, bezogen auf das Vol., eluiert wurde, gereinigt. Es wurden 1,940 g (50 % Ausbeute) Verbindung (VIII) aus Äthylacetat/Diäthyläther erhalten, Rf_A 0,15; Rf_B 0,60.

Stufe 5: HCl.H-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH₂ (IX) Ausgehend von 1,552 g (2 mMol) Boc-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH, •^ (VIII) unter Anwendung der in Stufe 2 von Beispiel 1 beschrie benen Arbeitsweise wurden 1,282 g Rohprodukt erhalten. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie auf Silikagel

COFY

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(Merck) 0,040-0,063 mm, wobei mit Chloroform/Methanol 82/18, bezogen auf das Vol., eluiert wurde, gereinigt. 0,705 g Verbindung CIX) (50 % Gesamtausbeute) wurden aus Methanol/Diäthyläther erhalten, Fp. 205-215⁰C (Zers.); [<x]g° = -79,8° ⁵-- Cc = 1 in MeOH); Rf_c 0,39; E₁ , 0,61. Aminosäureverhältnis: Pro 1,99; Met" Ϊ,(JOj Phe 1,00.'

Beispiel 3: Herstellung von Pyr-Pro-Trp-Val-OMe CXII) Stufe 1: Boc-Trp-Val-OMe CX)

Zu einer Lösung von 12,17 g (40 mMol) BoC'-Trp-OH in 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wurden aufeinanderfolgend 4,5 ml C40 mMol) N-Methylmorpholin und 3,96 ml (40 mMol) Äthylchlorformiat bei einer Temperatur von -12⁰C zugesetzt. Nach Rühren während 2 min wurde eine kalte Lösung von 6,70 g (40 mMol) HCl.H-VaI-OMe CE.L. Smith et al., J.Biol.Chem. T£9, 801,

1952) und 4,5 ml C40 mMol) N-Methylmorpholin in 50 ml Dimethylformamid zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -12°C und 2 h bei 0 bis 15°C gerührt, von Salzen abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und mehrere Male aufeinanderfolgend mit mit Natriumchlorid gesättigten Lösungen von 1M Citronensäure, 1M Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.Es wurden 14,1 g (84,4 % Ausbeute) Verbindung (X) aus Isopropylalkohol/Diisopropyläther erhalten. Rf_A 0,81; Rf_ß 0,87.

Stufe 2: HCl.H-Trp-VaI-OMe (XI)

12,52 g (30 mMol) Boc-Trp-Val-OMe (X) wurden in 15 ml Ameisensäure bei Raumtemperatur gelöst. Nach vollständiger Entfernung von Boc (TLC-Öberwachung) wurde das Lösungsmittel im Vakuum bei 30⁰C abgedampft. Der Rückstand wurde in auf 0⁰C gekühltem Methanol gelöst und 11 ml'(33 mMol) 3M Lösung von Chlorwasserstoff in wasserfreiem Tetrahydrofuran wurden zugegeben. Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und es wurden 9,55 g (90 % Ausbeute) Verbindung (II) aus Isopropylalkohol/

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- 19 Diisopropyläther erhalten. Rf- 0,69, E- ₂ 0,89 GIu.

Stufe 3: Pyr-Pro-Trp-Val-OMe (XII)

Zu einer Lösung von 5,66 g (25 mMol) Pyr-Pro-OH (IJI) in 60 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wurden aufeinanderfolgend 2,81 ml (25 mMol) N-Methylmorpholin und 2,48 ml (25 mMol) Äthylchlorformiat bei einer Temperatur von -12⁰C zugesetzt. Nach Rühren während 2 min wurde eine kalte Lösung von 8,8 5 g (25 mMol) HCl.H-Trp-Val-OMe (XI) und 2,81 ml (25 mMol) N-Methylmorpholin in 60 ml Dimethylformamid zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -12°C und 2 h bei 0 bis 15°C gerührt, dann von Salzen abfiltriert und im Vakuum eingedampft Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie auf Silikagel (Merck) 0,040-0,063 mm, wobei mit Methylendichlorid/Methanol/ Wasser 92/8/1, bezogen auf das Vol., eluiert wurde, gereinigt.

Es wurden 8,37 g (63„ 7 % Ausbeute) Verbindung (XII) aus Iso-

24 propylalkohol/Diisopropyläther erhalten, Fp. 12O⁰C, [ct]_D = -76,3° (c = 1 in MeOH); Rf_ß 0,21; R£_c .0,56; Aminosäureverhältnis: GIu 1,00; Pro 0,98; VaI 1,00.

Beispiel 4: Herstellung von Pyr-Pro-Trp-Val-OH (XIII) 2,63 g (5 mMol) Pyr-Pro-Trp-Val-OMe (XII), hergestellt gemäß Beispiel 3, Stufe 3, wurden in 15 ml Methanol gelöst und mit 7,5 ml 1n Natriumhydroxid bei Raumtemperatur verseift. Die Reaktion war innerhal von 4 h beendet. Die Lösung wurde mit 40 ml Wasser verdünnt und im Vakuum auf das halbe Volumen ²^ eingeengt, wieder mit 40 ml Wasser verdünnt, auf 0⁰C gekühlt, mit 5n Salzsäure auf pH 2 angesäuert und schließlich mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit mit Natriumchlorid gesättigten Lösungen bis zur Neutralität gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und ⁰^ das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Es wurden 2,1 g (8 2 % Ausbeute) Verbindung (XiII) aus Isopropylalkohol/Diisopropyläther erhalten, [a]^⁵ = -4 7,6° (c = 1 in MeOH); Rf_ß 0,11; Rf_c 0,48; E_{5 g} 0,43 GIu. Aminosäureverhältnis: GIu 1,00; Pro 0,99; VaI. 1,00.

COPY

Beispiel 5: Herstellung von PVr-PrO-TrP-VaI-NH₉ (XIV)
2,65 g (5 mMol) Eyr-Pro-Trp-Val-OMe (XII), hergestellt wie in Beispiel 3, Stufe 3, beschrieben, wurden in 20 ml Methanol
und 4 ml (2 % V/V) Äthylenglykol gelöst. Die Lösung wurde bei 5⁰C mit gasförmigem Ammoniak gesättigt und im Kühlsc'irank bis zur Beendigung der Reaktion gehalten (TLC-Überwachung), Oberschüssiges Ammoniak wurde im Vakuum entfernt und die Lösung
im Vakuum konzentriert. Nach Reinigung durch Säulenchromatographie (Silikagel 0,040-0,063 mm; Eluierungssystem CH₉Cl₉/
MeOH 87/13) wurden 1,9? g (78 % Ausbeute) der gewünschten Verbindung (XIV) aus Isopropylalkohol/Diisopropyläther erhalten, Fp. 128°C; [α]_β = -69,3° Cc » 1 in MeOH); Rf_ß 0,10; R£_c 0,43. Aminosäureverhältnis: GIu 0,99; Pro 0,97; VaI 1,00.

Beim Arbeiten wie in den vorhergehenden Beispielen wurden die folgenden weiteren Peptide synthetisiert:

XV) H-Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-NH.,. HCl
Rf_c0,43; E_{1 2} 0,61.

XVI) Pyr-Ala-Trp-Met-OH
Rf_c 0,57.

XVII) Pyr-Pro-Trp-Met-OH
Rf_c 0,42.

XVIII) H-Tyr-Pro-Trp-Leu-NH₂.HC1

Fp. 160-170⁰C (Zers.) (Methanol/Diäthyläther); E_{1 2} 0,63

XIX) H-Phe-Pro-Trp-Ile-NH₂.HC1

Fp. 125-13O⁰C (Zers.) (Diäthyläther); E_{1 9} 0,60.

Claims

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITL E · DU. RER. ΝΛΤ K. HOFFMANN · DIPL-INO W. LEHN

DIPL.-ING. K. FOCHSLE - OR. REF*. NAT. F3 HANSEN ■ DR. RKR. NAT. H-A. BRAUNS · DU'L.-ING. K. GORG

DIPL.-ING. K. KOHLMANN · FiECHTSANWALT A. NETTE

39 331 o/wa

_ 1 —

FARMITALIA CARLO ERBA S.p.A., MAILAND / ITALIEN

Neue biologisch aktive Peptide, Verfahren zu deren Herstellung und Veterinärpräparate/ welche diese enthalten

PATENTANSPRÜCHE

.·,■ 1 . Peptide der allgemeinen Formel ^ X - A - B - C - Trp - D - Y (I) ,

worin bedeuten:

X Wasserstoff oder eine ein endständiges N-Atom schützende Gruppe vom Acyl-, aromatischen Urethan-, Alkyl-, Aralkyl- oder aliphatischen Urethantyp;

A eine Valenzbindung oder einen L-a-Aminosäurerest, B einen L-a-Iminosäurerest oder einen L-a-Aminosäurerest,

C einen L-u-Iminosäurerest oder einen neutralen L-a-Aminosäurerest,

D eine Valenzbindung oder einen L-a-Aminosäurerest, Y eine Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder eine Gruppe der Formel OR, NHR, NR₇ oder NH-NH-R¹, wobei R eine geradkettige, verzweigtkettige oder cyclische (einschließlich anellierte oder brückenartig gebundene) Alkylgruppe mit bis zu 11 C-Atomen, die gegebenenfalls substituiert ist, eine Phenylgruppe oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 9 C-Atomen ist und R' Wasserstoff, jede der unter R angegebenen Gruppen, eine geradkettige, verzweigtkettige oder cyclische aliphatische Acylgruppe mit 1 bis 11 C-Atomen, die gegebenenfalls

-rczi er er/-* Ν ff

durch Hydroxy, Amino oder Halogen substituiert ist, eine aromatische Acylgruppe, die gegebenenfalls durch Hydroxy, Amino oder Halogen substituiert ist, eine geradkettig©, verzweigtkettige oder cyclische aliphatische Urethangruppe mit 3 bis 11 C-Atomen oder eine aromatische Urethangruppe darstellt,
und deren pharmazeutisch und veterinärisch annehmbare Salze.
2. Ein Peptid gemäß Anspruch 1, worin X Wasserstoff, Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl, Propionyl, Benzoyl, Benzyloxycarbonyl(Z), 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2-Brombenzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), 3,5-Dimethoxy-α,α'-dimethylbenzyloxycarbonyl (Ddz), tert.Butyloxycarbonyl (Boc), 1-Methylcyclobutyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, Trityl, Benzyl (BzI), Methyl oder Isopropyl bedeutet,

A nicht anwesend ist oder Phe, (4NO₂)Phe, (4NH.,) Phe, (4Cl)Phe oder Tyr bedeutet,

B die Bedeutung Pro, Thz oder Pip hat und, wenn -0 A nicht anwesend ist, Pyr, Phe oder Tyr darstellt, C Pro, Thz, Pip, Ala, VaI oder Leu ist, D nicht anwesend ist oder VaI, Leu, Met, Met(O), He oder Phe bedeutet,

Y Hydroxy, Amino oder eine Gruppe der Formel OR, NHR, NR₂ oder NH-NH-R¹ ist, wobei

R Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, " sek.Butyl, Isobutyl, tert.Butyl, 2,2,2-Trifluoräthyl, Cyclohexyl, Adamantyl, Phenyl, Benzyl oder Phenäthyl darstellt,

und R' Wasserstoff, eine der in diesem Anspruch für R angegebenen Gruppen oder Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl, Propxonyl, Butyryl, Adamantylcarbonyl, Benzoyl, Phenylacetyl, Cinnamyl, Benzyloxycarbonyl (Z>, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2-Brombenzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (FmocJ, 3, 5-Dimethoxy-cc,α ' -dimethylbenzyloxycarbonyl (Ddz) ,

BAD ORIGINAL

tert.Butyloxycarbonyl (Boc) , 1-Methylcyclobutyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder Isobornyloxycarbonyl bedeutet, oder ein Säure- oder Basenadditionssalz hievon, wobei die Säureadditionssalze von einer Säure, wie Schwefel-. Phosphor-Salz-, Bromwasserstoff-, Jodwasserstoff-, Salpeter-, SuIfamin-, Citronen-, Milch-, Piruvin-, Oxal-, Malein-, Bernstein-, Wein-, Zimt-, Essig-, Trifluoressig-, Benzoe-, Salicyl-, Glucon- und Ascorbinsäure, und die Basenadditionssalze von einer Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Diäthylamin, Triäthylamin und Dicyclohexylamin, stammen.
3. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin X ein Wasserstoffatom ist.
4. Eine Verbindung wie in Anspruch 1 definiert, wobei das Peptid aus der Gruppe H-Tyr-Pro-Trp-Met-NH., und H-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH₀ gewählt ist, oder ein pharmazeutisch oder veterinärisch annehmbares Salz hievon.
5. Eine Verbindung wie in Anspruch 1 definiert, ausgewählt unter

Py r-Pro- Trp-Me t-OH Pyr-Pro-Trp-Me t-OMe

Pyr-Pr o- Trp-Me t-NH ₂

Pyr-Pro-Trp-Met(O)-OH

Pyr-Pro-Trp-Met(0)-OMe

Pyr-Pro-Trp-Met(0)-NH₂ | Pyr-Ala-Trp-Me t-OH

Pyr-Ala-Trp-Met-OMe

P.yr-Al a-Trp-Me t-NH-

Pyr-Aia-Trp-Leu-OH

Pyr-Ala-Trp-Leu-OMe ,

H-lyr-Pro-Pro-Trp-Met-OH H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Met-OMe

BAD ORIGINAL

H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Met-NH₂ H-(4-Cl)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OH H-(4-Cl)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe H- (4-C1)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH₂ H-(4-NH₂)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OH H- (4-NH₂)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe H-(4-NH₂)Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH₂ , Pyr-Ala-Trp-LeU-NH₂ Pyr-Pro-Trp-Val-OH Pyr-Pro-Trp-Val-OMe Pyr-Pro-Trp-Val-NH₂ H-Phe-Pro-Pro-Trp-OH H-Phe-Pro-Pro-Trp-OMe H-Phe-Pro-Pro-Trp-NH₂ H-Phe-Pro-Trp -Met-OMe H-Phe-Pro-Trp-Met-NH₂' H-Tyr-Pro-Trp-Met-OH H-Tyr-Pro-Trp-Met-OMe H-Tyr-Pro-Trp-Leu-OH H-Tyr-Pro-Trp-Leu-OMe H-Tyr-Pro-Trp-Leu-NH₂ H-Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-OH H-Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-OMe H-Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-NH₂ H-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OH H-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe H-Phe-Pro-Pro-Trp-Val-CH H-Phe-Pro-Pro-Trp-Val-OMe H-Phe-Pro-Pro-Trp-Val-NH₂.
6. Veterinärische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung, wie in Anspruch 1 definiert, oder ein veterinärisch annehmbares Salz hievon in Mischung mit einem veterinärisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger aufweist.
7. Tierfutter, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung, wie in Anspruch 1 definiert, oder ein veterinärisch annehmbares Salz hievon als wachstumsfördernde Substanz enthält.
8. Verfahren zum Stimulieren des Wachstums von Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß man einem Tier einen wirksamen Anteil einer Verbindung der Formel (I) oder eines veterinärisch annehmbaren Salzes hievon verabreicht.
9. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel

X-A-B-W-OH (II) oder

H-J- Trp -D-Y (III), worin, wenn W die Bedeutung C hat, J abwesend ist oder, wenn J die Bedeutung C hat, W abwesend ist, und A, B, C₇ D,"X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, mit der Maßgabe, daß X eine andere Bedeutung als H hat und Y eine andere Bedeutung als OH oder NHNH₉ hat, unter Verwendung eines gemischten Anhydrids, Azids, aktivierten Esters oder Dicyclohexylcarbodiimids als Aktivierungsmittel kondensiert; wenn gewünscht, das erhaltene Peptid der Formel (I) durch Hydrazinolyse, Veresterung, Hydrolyse oder Ammonolyse in eine andere Verbindung der Formel (I) überführt, worin Y eine andere Bedeutung hat; wenn gewünscht, von der erhaltenen Verbindung der Formel (I) die Schutzgruppe entfernt und/oder, wenn gewünscht, eine freie Verbindung der Formel (I) in ein Salz überführt und/oder aus einem Salz die freie Verbindung der Formel (I) freisetzt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß W C bedeutet und J abwesend ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die resultierende Verbindung der Formel (I) eine solche ist, wie in den Ansprüchen 3, 4 oder 5 definiert.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 9, 10 oder 11, im wesentlichen wie in einem der Beispiele beschrieben.