DE2340162A1

DE2340162A1 - Bicyclische verbindung

Info

Publication number: DE2340162A1
Application number: DE19732340162
Authority: DE
Inventors: Elisabeth Becher; Arno Johannes Dr Schocher; Erich Dr Widmer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1972-08-31
Filing date: 1973-08-08
Publication date: 1974-03-28
Also published as: CA992480A; ZA734650B; AU468583B2; IL42711A; FR2197868B1; PH9700A; FR2197868A1; BE804196A; CH585171A5; AU5843173A; HU168234B; GB1397163A; JPS4962692A; NL7312061A; SE410731B; US3853707A; ATA752773A; AT332001B

Description

Dr. Ing. A. van der Wirt» - 7. Aua. 1973 Dr. f ranz Lecterer PATENTANWALII

RAN 4104/119

F. HoiFmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz

Bicyclische Verbindung

Die Erfindung betrifft eine bicyclische Verbindung, nämlich die 20ß-Hydroxy-9-oxo—1,2,3,4,10,19-hexanor— 5,9-seco-pregnan-5-säure der Formel

HOOC CH₂
^CH2

sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Grn/28.5.73

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Die neue Verbindung wird erfindungsgemäss dadurch erhalten, dass man 3ßj20ß-Dihydroxypregn-5-en oder 20ß-Hydroxypregn-4-en-3-on mit an aliphatische Kohlenwasserstoffe adaptiertem Mycobacterium phlei ATCC 19249 oder Mutanten davon fermentiert.

Die Adaptation von M. phlei ATCC 19249 an aliphatische 'Kohlenwasserstoffe kann in an sich bekannter Weise dadurch erfolgen, dass man den Mikroorganismus aus Kultursubstraten, die Glucose enthalten, auf solche Substrate Uberimpft, in denen die Glucose in zunehmenden Masse durch aliphatische Kohlenwasserstoffe, insbesondere C,h-C, o-Alkane, ersetzt wird.

Als Mutanten können Spontanmutanten oder auf physikalischem oder chemischen Weg erzeugte Mutanten eingesetzt werden. Mutanten können durch Bestrahlung, z.B. mit UV-Licht oder Gammastrahlen, oder durch Behandlung mit mutierenden Agentien, z.B. N-Methyl-nitro-nitrosoguanidin oder Bromuracil erzeugt werden. Vorzugsweise werden für das erfindungsgernässe Verfahren Spontanmutanten eingesetzt. Die Selektierung der Mutanten kann dadurch vorgenommen, werden, dass man Einzelkolonien auf Agarplatten überträgt, welche das abzubauende Steroid als Kohlenstoffquelle enthalten. Aus solchen Agarsubstraten erhaltene Einzelkolonien werden sohliesslich auf Agarplatten übertragen, die als Kohlenstoffquelle das Verfahrensprodukt, d.h., die oben erwähnte Secosäure enthalten. Diejenigen Kulturen, die auf solchen Nährböden kein Wachstum zeigen, werden für die erfindungsgemässe Fermentation verwendet.

Die Durchführung des erfindungsgemassen Verfahrens kann analog den flir die aerobe Fermentierung von Steroiden mit Mikroorganismen bekannten Arbeitsmethoden erfolgen. Als Kultursubstrat kommen insbesondere flüssige Medien in

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Betracht, die eine assimilierbare Stickstoffquelle und eine assimilierbare Kohlenstoffquelle neben anorganischen Salzen enthalten. Als assimilierbare Stickstoffquellen kommen tierische, pflanzliche, mikrobielle und anorganische Stickstoffverbindungen in Betracht, wie Fleischextrakte, Peptone, Cornsteep, Hefeextrakt, Glycin und Natriumnitrat. Als Kohlenstoffquelle sind Zucker, wie Glucose und insbesondere das zu fermentierende Steroid selbst verwendbar. Das Nährmedium kann ferner Spurenelemente, wie Eisen, Schwefel und Phosphor sowie Wachstumsfaktoren, z.B. Vitamine wie Biotin oder Pyridoxin, oder Auxine, wie Indolylessigsäure enthalten. Zum Schütze vor Infektionen kann das Medium sterilisiert und/oder mit das Wachstum von Fremdorganismen hemmenden Stoffen, wie Benzoaten, Antibiotika usw. versehen werden. Die Ferinentierung wird vorzugsweise im neutralen oder schwach sauren pH-Bereich z.B. bei pH 6-7 durchgeführt. Die Fermentierungstemperatur kann zwischen 18 und 40° betragen, vorzugsweise wird bei etv?a 28° gearbeitet.

Das als Ausgangsstoff verwendete Steroid wird der Fermentationskultur vorzugsweise in Lösung, z.B. in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Aethanol oder Aceton, zugesetzt. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, das Steroid der Gärlösung nach und nach zuzusetzen und vor jedem neuen Zusatz den vollständigen Abbau des zuvor zugesetzten Steroids abzuwarten.

beendeter Fermentation kann das Verfahrensprodukt aus der Kulturlösung in an sich bekannter Weise, z.B. durch Extraktion, Gegenstromextraktion und Chromatographie, isoliert

Die 20ß-Hydroxy-9-oxo-l,2,3,4,10,19-hexanor-5,9-seeopregnan-5-säure wurde bisher nicht besehrieben. Sie stellt ein

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wertvolles Zwischenprodukt in der Synthese von Steroiden dar, in die sie in Analogie zu bekannten Methoden (vgl. Belgische Patentschrift 741826) übergeführt werden kann.

Beispiel 1 Gewinnung der Fermentationskultür;

Mycobacterium phlei ATCC 19249, adaptiert an C_li+-C,gn-Alkane, wurde von Schrägagarkultüren auf einen Nährboden folgender Zusammensetzung übergeimpft:

Difco-Nährbruhe 23 g

C,₄-C-,ο-n-Alkane 10 ml

Spurenelementlosung I ml

Destill. Wasser ' . 1000 ml

Spurenelementlösung: 11 g ZnSO₁, .7 H₃O; 6 g MhSOj₁.4 H₃O; 1 g PeSO₄.7 H₂Oj'0,5 g CoSOj₊. 7 H₂O; 0,04 g CuSO₄.5 HgOj 0,06 g 0,01 g KJj 5 g Aethylendiamintetraessigsäure in 1000 ml

H₇BO₇J

destill. Wasser.

Die Kulturen wurden in 5OO ml'-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Nährlösung 48 Stunden bei 28° auf einer rotierenden Schuttelmaschine (16O UpM) angezüchtet. Mit den so erhaltenen Kulturen wurden 7-Liter-Kleinfermenter mit einem Nährmedium folgender Zusammensetzung beimpft:

3ß,20ß-Dihydroxypregn-5-en

NH..NO, 4 3

KH₂PO₄ K₂HPO₄ Na₂HPO₄.2 H₂O MgSO₄.7 H₂O KCl

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5	2	g
2	2	g
1	ε
1	g
1	g
0,	g
0,	g

FeSO₄ . 7 H₂O 0,001 g

Leitungswasser, pH 7,0 1000 ml

Die Kulturen wurden 15 Tage bei 28° unter Belüftung und Rühren inkubiert. Von den so erhaltenen Kulturen wurden Ausplattungen auf Agarplatten vorgenommen, die als Kohlen-stoffquelle nur 3ßj20ß-Dihydroxypregn~5-en enthielten. Die Ausplattungen wurden mehrmals wiederholt, wobei der Steroid-« gehalt in den Agarplatten erhöht wurde. Schliesslich wurden weitere Plattenkulturen angelegt, deren Agar als Kohlenstoff quelle nur 20ß-Hydroxy-9-oxo-l,2,3,4,10,19-hexanor-5,9~seco-pregnan-5-säure enthielt. Diejenigen Kulturen, die auf diesen Platten kein Wachstum zeigten, wurden für die erfindungsgemässe Fermentation benutzt. Zur Aufbewahrung der Kulturen wurde von der Biomasse eine Suspension in steriler 1Obiger Magermilchlösung hergestellt, die in 2-ml-Ampullen abgefüllt und unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurde.

	ml	Beispiel 2	(separat sterilisiert)
100	%	einer Nährlösung mit
1	%	Glucose
0,2	%	NH₄NO
0,1	%	KH₂PO₄	^r7 TT f\ . • ι «pt»
0,2	%	K₂HPO₄	. H₂O
0,1	%	Na₂HPO₄
0,02	%	MgSO₄ 7
0,02		KCl

0,0001$ FeSO₄ . 7 H₃O

in Leitungswasser, pH 7,0 (eingestellt mit NaOH) wurde mit dem Inhalt von 2 gemäss Beispiel 1 hergestellten Ampullen beimpft. Die Kultur wurde 48 Stunden bei 28° unter Schütteln inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurden 8 Liter Nährmedium

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im Kleinfermenter beimpft, der 2 Tage bei 28° unter Rühren und Belüftung (640 UpM, 2 Liter Luft/min) inkubiert wurde, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 28^iger Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt wurde. Dieser Fermenterinhalt diente als Impfgut für einen 180-Liter Fermenter mit. der gleichen Nährlösung, der bei 32°, 1100 UpM und einer Belüftungsrate von 100-1J50 Liter/min inkubiert wurde. Nach 27 Stunden war der Glucosegehalt des Nährmediums auf 0,2^ gesunken. Zu diesem Zeitpunkt wurden 180 g j5ß,20ß-Dihydroxypregn-5-en, gelöst in 36OÖ ml Dimethylsulfoxid, zugesetzt. Die Umsetzung des Steroids wurde durch DUnnschichtchromatographie von Proben verfolgt. Das PH wurde durch Zusatz von Natronlauge zwischen 6,5 und 7,0 gehalten.

Nach 63 Stunden war das als Ausgangsmaterial eingesetzte Steroid vollständig umgesetzt, worauf der Fermentationslösung nochmals ISO g 3ß>20ß-Dihydroxypregn-5-en in Dirnethylsulfoxid zugesetzt ,Wurden. Nach vollständigem Abbau des

Steroids (90 Stundep) erfolgte ein dritter Zusatz von I80 g Steroid. Nach 155 Stunden war alles Steroid umgesetzt.

Die Gärbrühe wurde zentrifugiert, mit 20 Litern Wasser nachgespült und mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt, Die Lösung wurde zweimal mit dem gleichen Volumen und einmal mit dem halben Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte wurden im Umlaufverdampfer eingeengt und mittels Gegenstromextraktion aufgearbeitet. Die Ausbeute an 20ß-Hydroxy-9-oxo-l,2,;5,4,10,19-hexanor-5,9-seco-pregnan-5-säure betrug 82#. Daneben wurden 10$ 9i20-Dioxo-l,2,3,4,10,19-hexanor-5-seco-pregnan-5-säure isoliert.

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Claims

23A0162 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von 20ß~Hydroxy-9-oxo-

j5j^jlOil9-hexanor-5*9-seco-pregnan-5~säure der Formel

CH

HOOC

CH

Wi

dadurch gekennzeichnet, dass man 3ß,20ß-Dihydroxy~pregn-5-en oder 20ß-IJydroxy-pregn--4--en-j5-on mit an aliphaticche Kohlenwasserstoffe adaptiertem Mycobacterium phlei ATCC 192^9 oder Mutanten davon fermentiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Spontanmutanten verwendet, welche die 2Oß-Hydroxy-9-oxo-l,2,5,h,10,19-hexanor-5*9-seco-pregnan-5-säure nicht als Kohlenstoffquelle verwerten.

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J5.

pregnan-5-säure der Formel

HOOC

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