HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren
zur Herstellung optisch aktiver 3-Methyladipinsäure aus
Squalen. Die erfindungsgemäß hergestellte optisch aktive
3-Methyladipinsaure ist eine chirale Verbindung mit einer
Methylgruppe am asymmetrischen Kohlenstoffatom und
verwendbar als Ausgangsmaterial für die Synthese von
Pharmazeutika, Agrochemikalien und anderen physiologisch
wirksamen Substanzen sowie das Ausgangsmaterial für
flüssigkristalline Polymere.
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2. Beschreibung des Stands der Technik
Derzeit sind als Verfahren zur Herstellung von optisch
aktiver 3-Methyladipinsäure ein Verfahren bekannt, worin
eine optisch aktive, natürlich vorkommende Verbindung,
(S)-(-)-Citronellol, zur Bildung von
(S)-(-)-3-Methyladipinsäure oxidiert (J. Chem. Soc.
Commum., 803, 1984) und ein Verfahren, worin eine optisch
aktive, natürlich vorkommende Verbindung
(R)-(+)-Pulegonsäure zur Bildung von
(R)-(+)-3-Methyladipinsäure oxidiert wird (Bull. Soc.
Chim. Fr.[5] 6, 1355, 1939), wobei aber die obigen
Verfahren beide nachteilig sind sowohl in industrieller
Hinsicht, da sie als Ausgangsmaterial eine teure optisch
aktive Substanz verwenden, als auch weil sie ein Produkt
bilden, welches nur geringe optische Reinheit wegen einer
Racematbildung während der Oxidation besitzt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt also ein Verfahren zur
Herstellung einer optisch aktiven 3-Methyladipinsäure mit
einem sehr hohen optischen Reinheitsgrad bereit. Die
erfindungsgemäß hergestellte optisch aktive
3-Methyladipinsaure ist zu wenigstens 95 %, vorzugsweise
zu wenigstens 98 % und in am meisten bevorzugter Weise zu
100 % optisch rein.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur
Herstellung einer optisch aktiven 3-Metyhladipinsäure der
Formel 1 bereit:
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worin das Symbol * ein asymmetrisches Kohlenstoffatom
bedeutet, umfassend die Schritte:
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Kultivieren eines Mikroorganismus, der als zugehörig zu
den Gattungen Candida lipolytica, Saccharomycopsis
lipolytica und Yarrowia lipolytica ausgewiesen ist, in
einem Squalen enthaltenden Medium, Prüfung auf
Anwesenheit von (S)-(-)-3-Methyladipinsäure und Gewinnen
der (S)-(-)-3-Methyladipinsäure aus dem kultivierten
Produkt.
KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN
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Figur 1 zeigt ein Infrarotabsorptions(IR)-Spektrum von
(S)-(-)-3-Methyladipinsäure, die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde, und
Fig. 2 zeigt ein ¹³C-Kernspinresonanz (NMR)-Spektrum von
(S)-(-)-3-Methyladipinsäure, die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen können
beispielsweise durch das folgende Verfahren erhalten
werden. Eine natürlich vorkommende Quelle wird zu einer
Kulturlösung, die Squalen als einzige Kohlenstoffquelle
enthält, gegeben und eine Kultivierung zur Isolierung von
Mikroorganismen durchgeführt, die zur Assimilierung von
Squalen als Kohlenstoffquelle befähigt sind.
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Als Kulturlösung kann jede gebräuchliche Lösung verwendet
werden, solange es Squalen als einzige Kohlenstoffquelle
enthält, d. h. sie enthält die Bestandteile, welche für
das Wachstum des Mikroorganismus erforderlich sind,
beispielsweise eine Stickstoffquelle, anorganische Salze
und, sofern erforderlich, andere weniger bedeutende
Nährstoffe wie Vitamine, Aminosäuren und Nukleotide und
ähnliche. Squalen als einzige Kohlenstoffquelle ist in
einer Menge von 0,1 bis 100 g, vorzugsweise 1 bis 10 g
pro Liter enthalten.
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Als Stickstoffquelle werden beispielsweise Kaliumnitrat,
Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat,
Ammoniumphosphat, Ammoniak, Harnstoff und ähnliche allein
oder in Kombination verwendet. Die Menge der verwendeten
Stickstoffquelle variiert in Abhängigkeit von der Art der
Stickstoffquelle und beträgt normalerweise 0,1 bis 10 g,
vorzugsweise 1 bis 3 g pro Liter Medium. Als anorganische
Salze werden Kaliumphosphat, Natriumphosphat,
Magnesiumsulfat, Eisen(III)-sulfat, Eisen(III)-chlorid,
Calciumchlorid und ähnliche allein oder in Kombination
verwendet. Die Menge der verwendeten anorganischen Salze
variiert in Abhängigkeit von der Art der anorganischen
Säure und beträgt normalerweise 0,001 bis 10 g,
vorzugsweise 0,01 bis 5 g pro Liter.
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Sofern notwendig, können andere weniger bedeutsamere
Nährstoffe wie Vitamine, Hefeextrakt, Pepton, Maiswasser
und ähnliche allein oder in Kombination verwendet werden.
Die zugegebene Menge ist abhängig von der Art des
Zusatzes und beträgt normalerweise bis zu 10 g,
beispielsweise 0,05 bis 10 g und vorzugsweise 0,1 bis 5 g
pro Liter. Der pH-Wert der Kulturlösung kann 2 bis 10 und
vorzugsweise 3 bis 6 betragen.
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Weiterhin enthält die Lösung vorzugsweise ein
Antibiotikum, Biozid oder ähnliches, um das selektive
Wachstum eines bestimmten Mikroorganismus zu ermöglichen.
Beispielsweise wird für das selektive Wachstum von Hefe
Streptomycin zu der Kulturlösung in einer Menge von 0,1
bis 100 mg, vorzugsweise 10 bis 50 mg pro Liter gegeben,
um das Wachstum von Bakterien zu hemmen.
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Die Quellen, aus denen Mikroorganismen isoliert werden,
können alle natürlich vorkommenden Materialien wie Erde,
Abwässer oder verdorbenes Obst sein. Die Quelle wird zu
einem Medium in einer Menge von 1 bis 100 g, vorzugsweise
30 bis 50 g pro Liter zugegeben. Die Kulturtemperataur
beträgt 15 bis 80ºC, vorzugsweise 20 bis 35ºC, und die
Kultivierung wird 1 bis 30 Tage lang, vorzugsweise 4 bis
7 Tage lang ausgeführt, und dann ein Teil der Kultur in
ein frisches Medium gegeben und das Kultivieren 1 bis 30
Tage lang, vorzugsweise 4 bis 7 Tage lang durchgeführt.
Dieses Verfahren wird zwei- bis fünfmal wiederholt. Die
Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt,
die durch gebräuchliche Maßnahmen wie Belüften oder
Rühren oder eine Kombination der beiden erreicht werden.
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Das Wachstum der Mikroorganismen wird durch Messung der
Trübung oder durch mikroskopische Beobachtung bestimmt.
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Vorzugsweise wird die Isolierung der Mikroorganismen
durchgeführt, nachdem die Trübung OD&sub6;&sub1;&sub0; = 0,1 bis 10, in
bevorzugterer Weise 0,2 bis 1 erreicht worden ist. Für
die Isolierung wird ein gebräuchliches
Isolierungsverfahren, wie ein Plattenkulturverfahren verwendet. Das
Plattenkulturmedium enthält 0,1 bis 10 % Agar und ist
beispielsweise ein Hefeextrakt/Malzextraktmedium,
enthaltend 2 % Agar (YM-Agarmedium).
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Beispielhaft fur einen nach dem oben beschriebenen
Verfahren isolierten Mikroorganismus, der in dem
erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist, sei eine
Hefezellinie SQL349 erwähnt. Dieser Zellinie SQL349 wurde
bei der Fermantation Research Institute Agency of
Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, FERN P-11653 am
9. August 1990 hinterlegt und am 26. September 1991 in
eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester
Vertrag als FERN BP-3580 überführt.
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Der Mikroorganismus SQL349 hat folgende taxonomische
Eigenschaften.
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a. Morphologie
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Pflanzliche Zelle: Sphärisch-elliptisch,
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Proliferation durch mehrpoliges
Keimen
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Flüssige Kultur: Bildet Niederschlag und
Oberflächenfilmschicht
(25ºC, 3 Tage)
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Pseudomycelium: Gebildet (25ºC, 3 Tage)
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Echtes Mycelium: Gebildet (25ºC, 6 Tage)
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Ascospore: Nicht gebildet auf Adamsmedium,
Gorodkowamedium, Malzmedium,
YM-Medium, V-8-Medium, und einem
Kartoffeldextrosemedium
b. Physiologische Eigenschaften
Fermentation von Zuckern
Glucose
Maltose
Raffinose
Assimilierung von:
Nitrat
Erythritol
Glucose
Cellobiose
Wachstumstemperatur
DBB-Farbstoffreaktion
Fettabbau
Saccharose
Lactose
Galactose
Inositol
Trehalose
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Den obigen Ergebnissen zufolge wurde die Zellinie SQL349
als Candida lipolytica identifiziert. Es ist anzumerken,
daß Candida lipolytica taxonomisch das gleiche ist wie
die unvollständige Erzeugung von Saccharomycopsis
lipolytica, vorhanden am Institute of Fermentation Osaka
(IFO) und die unvollständige Erzeugung von
Yarrowia lipolytica, vorhanden am American Type Culture
Collection (ATCC).
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Zusätzlich zu den oben erwähnten Mikroorganismen können
erfindungsgemäß beispielsweise Candida lipolytica
IFO 0746 (ATCC 20114), IFO 1209 (ATCC 8662),
IFO 1542 (ATCC 20306), IFO 1632, IFO 1741, IFO 10073
(ATCC 48436), IFO 1742 (ATCC 9773), IFO 1195, IFO 1548
(ATCC 18942), IFO 1549 (ATCC 18945), IFO 1550 (18943),
IFO 1746, ATCC 20237, ATCC 20255, ATCC 20362, ATCC 20363,
ATCC 20460, ATCC 20461, ATCC 20496, ATCC 22421,
ATCC 22422, ATCC 22423, ATCC 34922, ATCC 44601,
ATCC 46330, ATCC 46482, ATCC 46483, ATCC 46484 und
ähnliche verwendet werden und unter ihnen können die mit
IFO markierten Zellinien ohne Einschränkung vom Institute
of Fermentation Osaka, 17 - 85, Juso-honmachi 2-chome,
Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan, erhalten werden und die
mit ATCC markierten Zellinien können ohne Einschränkung
von der American Type Culture Collection (ATCC) 12301
Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA erhalten
werden.
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Das zur erfindungsgemäßen Herstellung von
3-Methyladipinsäure verwendete Medium enthält
Komponenten, die für das Wachstum eines produzierenden
Mikroorganismus notwendig sind, d. h. eine
Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische
Salze und, sofern erforderlich, weniger bedeutende
Komponenten wie Vitamine, Aminosäuren, Nukleotide und
ähnliche. Obwohl Squalen als ausschließliche
Kohlenstoffquelle verwendet werden kann, können Zucker
wie Glucose oder Erythritol, Kohlenwasserstoffe wie n-
Paraff ine oder Alkohole wie Ethanol oder Propanol etc.,
sofern erforderlich, verwendet werden. Die Menge der
verwendeten Kohlenstoffquelle variiert in Abhängigkeit
von der Art der Kohlenstoffquelle und beträgt
normalerweise bis zu 100 g, beispielsweise 0,1 bis 100 g,
vorzugsweise 0,5 bis 10 g pro Liter. Als Stickstoffquelle
werden beispielsweise Kaliumnitrat, Ammoniumnitrat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat,
Ammoniak, Harnstoff und ähnliche allein oder in
Kombination verwendet. Die Menge der Stickstoffquelle
variiert in Abhängigkeit von der Art der Stickstoffquelle
und beträgt normalerweise 0,1 bis 10 g, vorzugsweise
1 bis 3 g pro Liter Medium.
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Als anorganische Salze werden Kaliumphosphat,
Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(III)-sulfat,
Eisen(III)-chlorid, Calciumchlorid und ähnliche allein
oder in Kombination verwendet. Die Menge an anorganischen
Salzen ist abhangig von der Art des anorganischen Salzes
und beträgt normalerweise 0,001 bis 10 g, vorzugsweise
0,01 bis 5 g pro Liter. Falls notwendig, werden Vitamine,
Nukleotide, Hefeextrakt, Pepton, Maiswasser und ähnliche
allein oder in Kombination verwendet. Die Menge des
Zusatzes hängt von der Art des Zusatzes ab und beträgt
normalerweise bis zu 10 g, beispielsweise 0,05 bis 10 g,
vorzugsweise 0,1 bis 5 g pro Liter.
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Der pH-Wert des Mediums wird im allgemeinen auf 2 bis 11,
vorzugsweise auf 3 bis 6 eingestellt. Wenn sich der
pH-Wert des Mediums während des Kultivierens erniedrigt,
wird der pH-Wert durch Zusatz einer Lauge wie wassriger
NaOH geregelt. Zusätzlich zu dem oben erwähnten Medium
können andere gebräuchliche Medien wie Bouillonmedium,
Hefeextrakt/Malzextraktmedium (YM-Medium) und ähnliche
verwendet werden.
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Als Vorstufe der 3-Methyladipinsäure wird Squalen zu
einer Kulturlösung gegeben. Das Squalen kann vor dem
Beginn des Kultivierens zu der Lösung gegeben werden,
oder es kann kontinuierlich oder periodisch während des
Kultivierens zugegeben werden. Die gesamte Menge an
verwendetem Squalen beträgt beispielsweise 0,1 bis 100 g,
vorzugsweise 2 bis 20 g pro Liter.
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Um eine große Menge des gewünschten Produkts
herzustellen, ist eine Kultur im großen Maßstab
notwendig, und daher wird vorzugsweise vor der
Erzeugerkultur eine Impfkultur hergestellt. Für die
Impfkultur kann das gleiche Medium, wie oben für die
Erzeugerkultur beschrieben, verwendet werden mit der
Ausnahme, daß Squalen im Impfkulturmedium nicht notwendig
ist.
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Das Kultivieren in der Impfkultur und in der
Erzeugerkultur (Hauptkultur) wird bei 15 bis 80ºC,
vorzugsweise 20 bis 35ºC, 1 bis 20 Tage, vorzugsweise 2
bis 5 Tage lang unter Schütteln, Rühren, Bewegen und/oder
Belüften durchgeführt.
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Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführung kann,
wenn ein Erzeugermikroorganismus kultiviert worden ist
und die kultivierten Zellen in Berührung mit Squalen in
einem wässrigen Medium wie Phosphatpuffer unter aeroben
Bedingungen gebracht worden sind, beispielsweise unter
den gleichen Bedingungen wie diejenigen, die für das
Kultivieren beschrieben sind, das gewünschte Produkt,
d. h. 3-Methyladipinsäure, hergestellt werden.
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Das Verfahren zur Gewinnung des gewünschten Produkts aus
einer Kulturbrühe oder einem Reaktionsgemisch ist nicht
kritisch. Beispielsweise wird zuerst eine Kulturbrühe
oder ein Reaktionsgemisch auf einen pH von 1 bis 6,
vorzugsweise einen pH von 1 bis 3 eingestellt und dann
mit einem Lösungsmittel extrahiert, um einen Extrakt zu
erhalten, welcher das gewünschte Produkt, d. h.
3-Methyladipinsäure, enthält.
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Jedes Lösungsmittel, welches das erwünschte Produkt löst,
beispielsweise ein organisches Lösungsmittel wie
Tetrachlorkohlenstoff, Trichlorethylen, Toluol, Benzol,
Dichlormethan, Chloroform, Diethylether oder Ethylacetat
kann verwendet werden, aber vorzugsweise wird
Dichlormethan, Chloroform, Diethylether oder Ethylacetat
verwendet.
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Zur Isolierung und Reinigung des erwünschten Produkts aus
dem Extrakt können herkömmliche Verfahrensweisen wie
Adsorption, Elution, Destillation und ähnliche verwendet
werden. Beispielsweise wird ein Extrakt verdampft, um das
Lösungsmittel zu entfernen und aus dem erhaltenen
Rückstand wird das erwünschte Produkt durch
Adsorptionschromatographie unter Verwendung von
Kieselgel, Aktivkohle, Styroldivinyl/Benzol-
Copolymerharz oder ähnlichem und
Ionenaustauschchromatogaphie unter Verwendung eines starken
Anionenaustauscherharzes oder eines schwachen
Anionenaustauscherharzes oder ähnlichem gereinigt.
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In alternativer Weise können die erhaltenen Produkte zu
einem Methylester verestert werden durch ein
herkömmliches Verfahren zur Herstellung eines
Methylesters, beispielsweise durch Kochen unter Rückfluß
mit Methanol in Gegenwart eines sauren Katalysators und
Destillation des erhaltenen Estergemischs zur Isolierung
von 3-Metyhladipinsäuremethylester.
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Bei der vorliegenden Erfindung wurde die Identifizierung
und Bestimmung der optischen Reinheit der optisch aktiven
3-Methyladipinsäure wie folgt durchgeführt. Die
Bestätigung des erwünschten Produkts 3-Methyladipinsäure
wurde durch ein IR-Spektrum, ein ¹H-NMR-Spektrum, ein
¹³C-NMR-Spektrum und ein Massenspektrum durchgeführt.
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Die absolute Konfiguration und optische Reinheit der
vorliegenden Verbindung wurden durch Vergleich der
spezifischen Drehung der vorliegenden Verbindung mit
derjenigen, die in der Literatur beschrieben ist und eine
¹³C-NMR-Sepktrumanalyse eines Diastereomers der
vorliegenden Verbindung mit L-Menthol bestimmt. Die
absolute Konfiguration und die optische Reinheit des
Produkts wurden durch Vergleich seiner spezifischen
Drehung mit der spezifischen Drehung von (R)-(-)-3-
Methyladipinsäure [α]²²D = + 8,6º
(c = 5,0 g/100 ml, H&sub2;O), beschrieben in der Literatur
(Am. Soc. 69, 2568, 1947), erhalten. Weiterhin ließ man
das Produkt mit L-Menthol in Gegenwart von
p-Toluolsulfonsäure zur Synthese eines Diastereomers
reagieren und das ¹³C-NMR-Spektrum wurde aufgenommen. Dann
wurde die optische Reinheit aus dem Verhältnis der
Signaiflächen eines Kohlenstoffatoms in 2-Position der
R- und S-Form des 3-Methyladipinsäureanteils berechnet.
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Die erfindungsgemäß erhaltene Verbindung besitzt
Carboxylgruppen und kann daher Salze bilden,
beispielsweise Salze von Alkalimetallen wie Lithium,
Natrium und Kalium, Erdalkalimetallen wie Calcium und
Magnesium, und Ammonium und ähnlichen. Diese Salze können
gemäß einem gebräuchlichen Verfahren aus der freien
Verbindung erhalten werden. Beispielsweise kann eine
freie Verbindung mit einer entsprechenden Base
neutralisiert werden, um das entsprechende Salz zu
erhalten.
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Da die erfindungsgemäß erhaltene Verbindung
Carboxylgruppen besitzt, kann sie beispielsweise in einen
Aldehyd oder Alkohol durch Reduktion mit
Lithiumaluminiumhydrid überführt werden.
Beispiele
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Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung detailliert
unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert.
Beispiel 1
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Zunächst wurden jeweils 50 ml der in Tabelle 1
aufgeführten Medien in 500-ml-Sakaguchi-Kolben gegeben
und bei 121ºC 20 Minuten lang autoklaviert. Dem Medium
wurden 1 g einer Nährbodenprobe (von Miura, Kanagawa,
Japan) hinzugefügt und dann die Kultur 5 Tage lang bei
30ºC unter Schütteln gehalten. Von diesen Kulturen wurden
diejenigen ausgewählt, die ein mikrobielles Wachstum
zeigten, ein Teil der Kultur wurde auf einem
YM-Agar-Medium, das in Tabelle 2 gezeigt ist,
ausplattiert und eine Zellinie SQL349 (FERN BP-3580)
isoliert.
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Diese Zellinie wurde unter flüssigem YM-Medium bei 30ºC
24 Stunden lang unter Schütteln kultiviert und ein Teil
der Kulturbrühe in 50 ml eines Mediums der in Tabelle 1
gezeigten Zusammensetzung beimpft bei einem
Beimpfungsverhältnis von 1 Vol.-% und die Kultur 4 Tage
lang bei 30ºC gehalten. Die Kulturbrühe wurde auf einen
pH-Wert von 2 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt und
mit Diethylether extrahiert und nach Phasentrennung wurde
die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und anschließend das Lösungsmittel
abdestilliert. Der erhaltene feste Rückstand wurde dann
auf eine Silicagelsäule gegeben und stufenweise mit
Hexan/Diethylether (100 : 10), Hexan/Diethylether
(80 : 20) und Hexan/Diethylether (60 : 40) in dieser
Reihenfolge eluiert.
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Die Fraktionen von Hexan/Diethylether (60 : 40) wurden
vereint, das Lösungsmittel abdestilliert und der
erhaltene Rückstand auf einer HP-2MG-Harzsäule
(Mitsubishi Chemicals, Japan) adsorbiert und mit
Wasser/Methanol (100 : 10) eluiert, um eine Fraktion zu
erhalten, die die gewünschte Verbindung
(S)-(-)-3-Methyladipinsäure enthält, die in Form eines
weißen Feststoffs in einer Menge von 46 mg pro Liter
Kulturbrühe anfiel.
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Mittels IR-Spektrum, ¹H-NMR-Spektrum, ¹³C-NMR-Spektrum und
Massenspektrum wurde bestätigt, daß es sich bei der
Verbindung um 3-Methyladipinsäure handelt. Das
IR-Spektrum und das ¹³C-NMR-Spektrum der erhaltenen
3-Methyladipinsäure sind jeweils in den Figuren 1 und 2
gezeigt.
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Die absolute Konfiguration und optische Reinheit der
erhaltenen Verbindung wurden durch Vergleich ihrer
spezifischen Drehung mit dem in der Literatur bericheten
Wert und einer ¹³C-NMR-Spektrumanalyse eines Diastereomers
des Produktes mit L-Menthol bestimmt. Eine spezifische
Drehung des Produkts [α]²²D = -8,9º (c = 5,0 g/100 ml, H&sub2;O)
wurde mit dem Literaturwert von [α]²²D = +8,6º
(c = 5,0 g/100 ml, H&sub2;O) von (R)-(+)-3-Methyladipinsäure
verglichen und die Konfiguration und optische Reinheit
des Produkts wurden als S-Form und jeweils 100 %
bestimmt.
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Ferner wurde das Produkt mit L-Menthol in Gegenwart von
p-Toluolsulfonsäure umgesetzt, um ein Diastereomer zu
synthetisieren, und dessen ¹³C-NMR-Spektrum wurde
erhalten. Der Enantiomerüberschuß, der aus dem Verhältnis
der Signaiflächen des Kohlenstoffatoms in 2-Position der
R- und S-Form von 3-Methyladipinsäure erhalten wurde,
betrug mindestens 98 % e.e.
Tabelle 1
Zusammensetzung
Zugegebene Menge
Squalen
Hefeextrakt
Tabelle 2
Zusammensetzung
Zugegebene Menge
Hefeextrakt
Malzextrakt
Pepton
Glucose
Agar
Beispiel 2
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Der Zellinie SQL349 (FERN BP-3580) wurde in einem
flüssigen YM-Medium 16 Stunden lang bei 30ºC unter
Schütteln kultiviert und mit der Kulturbrühe 3 l eines
Mediums in einer 5 l Steinfermenter beimpft. Das Medium
hatte die in der Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung,
enthielt aber 10,6 g/l Squalen und 1,0 g/l Glucose als
Kohlenstoffquelle. Die Kultivierung wurde bei 30ºC,
500 UpM und 0,5 VVM-Belüftung 64 Stunden lang
durchgeführt und die gebildete
(S)-(-)-3-Methyladipinsäure wurde entsprechend demselben
Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, um
(S)-(-)-3-Methyladipinsäure in einer Ausbeute von 0,85 g
je Liter Kulturbrühe zu erhalten.
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Durch IR-Spektrum, ¹H-NMR-Spektrum, ¹³C-NMR-Spektrum,
Massenspektrum, spezifische Drehung und ein ¹³C-NMR-
Spektrum des Diastereomers mit L-Menthol wurde
festgestellt, daß es sich bei dem Produkt um
(S)-(-)-3-Methyladipinsäure mit einer optischen Reinheit
von mindestens 98 % handelt.
Beispiel 3
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Eine Zellinie SQL340 (FERN BP-3580) wurde in 10 ml eines
YM-Mediums bei 30ºC 72 Stunden lang kultiviert und die
Kultur zentrifugiert, um kultivierte Zellen zu erhalten.
Die Zellen wurden mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7)
gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers suspendiert,
10 mg Glucose und 20 mg Squalen hinzugegeben und das
Gemisch
48 Stunden bei 30ºC geschüttelt. Das Produkt
(S)-(-)-3-Methyladipinsäure wurde entsprechend dem wie
oben in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gereinigt und
im Ergebnis (S)-(-)-3-Methyladipinsäure in einer Ausbeute
von 69 mg/1 Reaktionsgemisch erhalten.
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Durch IR-Spektrum, ¹H-NMR-Spektrum, ¹³C-NMR-Spektrum,
Massenspektrum, spezifische Drehung und ¹³C-NMR-Spektrum
des Diastereomers des L-Menthol wurde bestätigt, daß es
sich bei dem Produkt um (S)-(-)-3-Methyladipinsäure
handelt und die optische Reinheit mindestens 98 % betrug.
Beispiel 4
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Die in Tabelle 3 gezeigten mikrobiellen Zellinien wurden
getrennt voneinander entsprechend demselben wie in
Beispiel 2 beschriebenen Verfahren kultiviert, um eine
optisch aktive 3-Methyladipinsäure herzustellen. Die
erhaltenen Produkte wurden gereinigt und die optische
Aktivität, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.
Tabelle 3
Zellinie
Kulturzeit (h)
Menge der gebildeten 3-Methyladipinsäure
sterische Konfiguration
optische Reinheit