DE2239321A1

DE2239321A1 - Herstellung von cephalosporin c

Info

Publication number: DE2239321A1
Application number: DE2239321A
Authority: DE
Inventors: Francesco Gargiuolo
Original assignee: Alfa Farmaceutici SpA
Current assignee: Alfa Farmaceutici SpA
Priority date: 1971-08-13
Filing date: 1972-08-10
Publication date: 1973-02-22
Also published as: BR7205432D0; FR2149374A1; HU164353B; JPS4826986A; FR2149374B1; SU521849A3; ES405792A1; US3825473A; GB1400433A; DK132711B; AT317428B; DK132711C; ZA725454B; AR192971A1; CA982072A; BE787456A; NL7210806A

Description

Alfa Farmaceutici S.p.A.

Via Ragazzi

•99 n. 5 -7. August 1972

40133 Bologna, Italien . Fr/Me

Herstellung von Cephalosporin C

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Cephalosporin C mit Hilfe neuer Mikroorganismen mit Namen Cephalosporium Sp. Stamm F 12. .

Cephalosporin C ist ein Wertvolles Antibiotikum, da es gleichermaßen gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksam ist und sowohl säurestabil sowie resistent gegenüber Penicillinase ist. Cephalosporin C ist ausführlich in der Literatur beschrieben, z. B. in der Arbeit "The Cephalosporins" von E„P. Abraham, Pharmacologial Reviews, Bd. 14, S..477 - 500. Cephalosporin C wird bislang in der Praxis nicht als Antiviotikum zur Behandlung von durch grampositive oder gramnegative Bakterien hervorgerufene Infektionen verwendet, da seine Wirksamkeit verhältnismäßig schwach ist. Seine Aktivität gegenüber einer Reihe von grampositi und gramnegativen Bakterien beträgt z. B«, nur Oj1 % der Aktivität des Benzylpenicillins. Indessen dient Cephalosporin C als Ausgangsmaterial zur Herstellung einer großen Zahl sogenannter semisynthetischer Cephalosporine, von denen einige eine größere Anwendung als antimikrobisch.es Mittel gegen mit breitem antibakteriellem Spektrum Anwendung gefunden haben. Insofern ist Cephalosporin C selbst ein wichtiges Produkt..

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Cephalosporin C wird aus Kulturen verschiedener Cephalosporin-Spezies unter geeigneten Bedingungen gewonnen, wobei neben Cephalosporin C andere antibiotische Produkte, nämlich Cephalosporin N und Cephalosporin P gebildet werden. Cephalosporin P ist die Bezeichnung für eine Familie steroiclischer Verbindungen mit einer gewissen antibakteriellen Wirkung gegenüber grampositivem und gramnegativen Bakterien^-Cephalosporin N (Penicillin N) ist eine Penicillin-Verbindung mit einer^-Aminoadipylseitenkette.

Die physikalischen Eigenschaften von Cephalosporin C und Cephalosporin N sind außerordentlich ähnlich, so daß es schwierig ist, Cephalosporin C durch Abtrennen des Cephalosporin N zu reinigen. Es ist daher außerordentlich erwünscht, den Anteil an in der Kultur der Mikroorganismen sich bildenden Cephalosporin N zu reduzieren, z. B. durch Auswahl der Nährstoffe im Nährmedium, so daß Cephalosporin C gegenüber anderen antibiotischen Produkten in größeren absoluten Mengen gebildet wird.

Durch die für die Produktion von Cephalosporin C bekannten Mikroorganismen, z. B. den Original- Brotzu-Stamm, wird Cephalosporin N jedoch in verhältnismäßig großen Mengen gebildet, und die anteilige Menge an dem gewünschten Endprodukt Cephalosporin C bleibt oft verhältnismäßig niedrig. Es wird z. B. in dem US Patent 3>082,155 ein Verfahren beschrieben, wonach die Mutation eines Cephalosporium Sp. Stammes ATCC 14553 zur Produktion von Cephalosporin C dient. Jedoch wird selbst unter den günstigsten Fermenationsbedingungen lediglich eine Cephalsoporin C -Ausbeute von nur 500 Mikrogramm/ml erzielt.

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■ _ 3 —

Demgemäß umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C gekennzeichnet durch die Züchtung der Mikroorganismen Cephalo'sporium Sp. Stamm F unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium mit assimilierbaren 'Quellen für 'Kohlenstoff und Stickstoff, einem oder mehreren anorganischen Salzen und mit einer organischen Quelle für Schwefel.

Cephalosporin Sp. Stamm F 12 ist eine Mutation von Cephalosporin Sp. ATCC 11550 und ist von der American Typ Culture .Collection unter der Qrdnungs-Nr. ATCC 20339 eingeordnet •worden. Das Centralbureaü voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, klassifiziert diesen Organismus unter der Ordnungs-Nr. CBS 53571. "

Cephalosporin Sp. Stamm F 12 besitzt die folgenden charakteristischen Eigenschaften: .

Bei Züchtung auf festem Nährboden, z. B. Sabouraud, Hafer-Agar, Bennet, Kartpffel-Agar und Waksman-Medium zeigt sich der Mikroorganismus mit flachen, leuchtenden und etwas rundlichen, durchgehende oder leicht unregelmäßige Kanten besitzenden Kolonien mit farblosem oder " leicht gelblich gewachsenem Myzel. Die Farbe verbreitet sich, falls vorhanden, im Nährboden aus. Kein aus der Luft stammendes Wachstum, keine Konidien oder Konidienträger werden gebildet. Bei Züchtung in einigen Nährmedien, wie z. B. im Bennet-Nährmedium, zeigt das Myzel begrenzte oder eingeschobene Chiamydοsporen. Die Oberfläche der Kolonien zeigt vielstrahlige Runzeln, die verzweigt oder auch nicht verzweigt sein können. Die Hyphen sina septiert, im allge-

3 0 9 8 08/13 8 8

meinen verzweigt und zeigen manchmal kleine Fettropfen. Der Stamm benötigt keine Nitrate als Stickstoffquelle im Züchtungsmedium.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Vorteil unter submersen aeroben Bedingungen, vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 - 30° C ausgeführt.

Die assimilierbare Quelle für Kohlenstoff im Nährmedium der Mikroorganismen ist zweckmäßigerweise ein Kohlenwasserstoff, der ein Monosaccharid, Disaccharid oder PoIysaccharid sein kann. Beispiele für geeignete Kohlenwasserstoffe sind Glucose , Sucrose, Galactose, Lactose, Fructose, Mannit, Sorbit, Dextrin, lösliche und unlösliche Stärken und Rübenmelassen. Die Kohlei Wasserstoffe der Nährmedien kommen vorzugsweise in Form einer Mischung aus Monosacchariden, Disacchariden und Polysacchariden zur Anwendung; die Konzentration der Kohlenwasserstoffe im Nährmedium soll zwischen 2 und 10 % betragen.

Das Nährmedium enthält vorzugsweise auch ein Glycerid oder ein hydrolysiertes Glycerid, wie z. B. Olivenöl, Erdnussöl, Sonnenblumenöl, Kokosnussöl, Palmöl, Leinsamenöl sowie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren und Ester oder Teilester derselben aus einwertigen oder mehrwertigen niedrigen Alkoholen. Besonders geeignete Glyceride oder Hydrolysate derselben sind Lardöl . (Schmalzöl), Sonnenblumenöl, Maisöl, Oleinsäure, Ricinolsäure, Linolsäure, Lineolsäure und Arachidonsäure. Besonders geeignete Ester der ungesättigten Fett .säuren sind Methyllinolat, Glycerolmonooleat, Polyäthylon-glykolmonooleat und/oder Polyäthylenglykoldioleat.

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Die Glyceride und Hydroyseprodukte derselben sollen vorzugsweise in Mengen von 1-8 Gew. % im Nährmedium enthalten sein. Es wird angenommen, daß diese Produkte, insbesondere die Ester der ungesättigten Fettsäuren, die Bildung von Nebenprodukten inhibieren und somit die Bildung von Cephalosporin C begünstigen.

Das für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Nährmedium enthält auch eine organische-Stickstoffquelle, der in Mengen von 0,01 bis..0,1 Gew.% an verfügbarem Stickstoff, bezogen auf das Gewicht d'es gesamten Mediums, anwesend sein soll. Die Quelle für organischen Stickstoff besteht im allgemeinen aus einem pflanzlichen oder tierischen Protein oder einem Abbau- oder Hydrolyseprodukt derselben, wie z. B. einem Polypeptid, Pepton, Trypton oder einer Aminosäure. Bevorzugte Quellen für organischen Stickstoff sind Baumwollsamenmehl, Fischmehl, Maismehl, Getreidemehl, pflanzliche Mehle (z.B. Sojabohnenmehl, Zwergerbsenmehl oder Erdnussmehl), Hefeextrakt, fleischextrakt sowie Nebenprodukte aus der alkoholischen Gärung und aus der Zersetzung von Mais.

Das Nährmedium gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren enthält schließlich ein für die verbesserte Biosynthese des Cephalosporin C wirksames anorganisches Salz, wie z. B. Calciumcarbonat, Borax, Ammoniumacetat, Ammoniumsulfat und/oder ein Alkalimetallphosphat. Derartige anorganische Salze sollen im Nährmedium, vorzugsweise in einer Menge von 0,5 1,5 Gew.% enthalten sein.

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Wie eingangs erwähnt, enthält das Nährmedium eine Quelle für organisch gebundenen Schwefel. Insbeonsere Methionin vorzugsweise in Mengen von 0,5 - 2,5 Gew.% des Mediums ist geeignet. Andere für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete schwefelhaltige Verbindungen sind solche der nachfolgenden Formel

R¹ - χ - CH(R²) - CO - Y - R⁵

12 3

worin R , R und R dieselbe oder eine verschiedene Bedeutung besitzen und jedes dieser Radikale ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1-5 C-Atomen bedeutet, und worin X und/oder Y ein Schwefelatom darstellen und ggf. X oder Y ein Sauerstoffatom repräsentiert. Beispiele für derartige Verbindungen sind Thioglykolsäure, Thioessigsäure, Methylthioglykolat und Methylthioacetat,_Derartige organische Quellen für Schwefel sollen in dem Nährmedium vorzugsweise in Mengen von 0,05 bis 1*Gew.?< > enthalten sein. Es erscheint bemerkenswert, daß die Züchtung von Cephalosporium Sp* Stamm F 12 das Vorhandensein einer organischen Quelle für Schwefel unbedingt erfordert, während andere Cephalospörin-Spezies in Gegenwart von anorganischen Quellen für Schwefel gezüchtet werden können. Einige Quellen für organischen Schwefel, wie z. B. Thioglykolsäure sind sogar toxisch für andere Cephaloporin-Spezies, indessen nicht toxisch für Cephalosporium Sp. Stamm F 12.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird im allgemeinen wie folgt ausgeführt:

Zunächst■werden die Mikroorganismen auf Schrägnährboden während einer Zeit von 10 - 15 Tagen bei einer Temperatur von etwa 28 - 30° C bebrütet. Die gewachsenen Myzele werden sodann mit Wasser gewaschen und die so erhaltene Lösung als Inoloilum für ein Reifemedium verwendet. Das Reifemedium wird unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 25 - 30° C während 48 - 96 Stunden unter aerobischen B_edingungen gehalten. Das sich daraus ergebende gereifte Medium dient der Impfung des endgültigen Kulturmediums und wird diesem vorzugsweise in Mengen von. 5 Gew„$> bezogen auf das Kulturmedium zugeführt. ^v - . , -

Die Kultur des beimpften" Kulturmediums wird entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren, vorzugsweise für eine Zeit von 96-130 Stunden, auf einer Temperatur von.20 30° Q vorzugsweise 22 -■ 28° C, gehalten. Die Ausbeute an Cephalosporin C wird entweder spektrofotometrisch (vgl. Claridge, Vaughan, Kresse! und Gourevitch': "Antimicrobial Agents and Chemotherapy",, 1969, S.· 131) oder mikrobiologisch bestimmt. ,

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch kontinuierlich durchgeführt werden, indem,man sich für kontinuierliche Arbeitsweise ausgestalteter Züchtungsapparate bedient, die mit Einrichtungen zur Zufuhr steriler Nährmedien.zu einem, oder mehreren Züchtungsbehältern und mit Leitungen zur automatischen Entnahme der Zellsuspension ausgestattet sind.' Von Zeit zu Zeit wird ein Teil der Fermentationsbrühe abgezogen und eine entsprechende VÖluraenmenge an frischem Nährrnedium der Kultur zugesetzt. Zumeist geschieht dies nach Giner Anlaufzeit von 75 - 110 Stunden. Frisches Nährmediura

3 0^8087^388

kann in das System mit Hilfe einer kontinuierlich arbeitenden Dosierpumpe eingeführt werden. Die Menge an ablaufender Suspension wird so geregelt, daß ein konstantes Arbeitsvolumen und eine gleichbleibende Dichte an Organismen in den Behälter aufrechterhalten wird. Die Durchflußmenge an kontinuierlich geführter Kultur soll im allgemeinen pro Tag etwa 0,2 - 0,8, vorzugsweise 0,4 - 0,5 des Gesamtvolumens betragen.

Das erfindungsgemäß erzeugte Cephalosporin C kann aus der Kulturbrühe gemäß der üblichen Technik isoliert und die sich ergebende rohe Fermentationsmischung in üblicher Weise gereinigt werden, z. B. durch Filtration, Klärung mittels Kohle, Adsorption an einem Harz-Ionenaustauscher, Elution mittels wässeriger Base, z. B. Pyridin und Verdampfung des Lösungsmittels zur Erzeugung kristallinen Materials.

In den nachfolgenden Beispielen, die das erfindungsgemäße Verfahren noch besser erläutern sollen, sind alle Teile, soweit nicht anders ausdrücklich erwähnt, als Gewichtsteile zu verstehen.

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Beispiel 1

Ein Nährmedium der nachfolgenden Zusammensetzung wurde in einem 27 Liter fassenden durchlüfteten Rührbehälter aus rostfreiem Stahl eingefüllt:

Teile

-Erdnussmehl .... .. ... 60 . . . '■-...-

Stärke -' ' - 4O

Methyloleat 8

Lardöl 60

Sucrose 5

d-Glucose 7

CaCO₃ 10

Borax 0,5

dl-Methionin 15

Viasser „zu 1000 ·

Der pH-Wert des Mediums wurde auf einen Endwert von 7,2 -7,8 eingestellt. Das_ Medium wurde über 25 - 30 Minuten bei 120°C mit Dampf, sterilisiert.

Der Fermentationsbehälter wurde sodann mit 5 - 10 Vol.-Teilen einer Züchtung von Cephalosporium Sp. Stamm 12 beimpft, erhalten durch Einimpfen von Sporen der Mikroorganismen in ein Medium der nachfolgenden Zusammensetzung:

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Lardöl 0,1 %

Kornquellmasse flüssig 2,0 %

Ammoniumacetat 0,6 %

Sucrose 2,0%

und Bebrütung des geimpften Mediums in einer belüfteten flachen Flasche während 72 Stunden bei 24 - 28°C.

Der das Nährmedium enthaltende beimpfte Fermentationsbehälter wurde sodann 130 Stunden auf 22 - 28 C gehalten und in dieser Zeit durch einen Luftstrom von 1 Liter/Liter/min unter Belüftung gehalten, wobei gleichzeitig mit 300 - 450 U/min gerührt wurde. Die erhaltene Kultur enthielt 4500 - 5000 Mikrogramm /Milliliter an Cephalosporin C (Durchschnittswert).

Beispiel 2

Das Wachstum der Fläche eines Schrägbodens von 2,54 χ 2,54 cm einer Kultur von Cephalosporium Sp. Stamm F 12 wurde in 5 ml sterilem Wasser suspendiert und für die Beimpfung von 500 ml eines Reifemediums folgender Zusammensetzung benutzt.

Teile

Flüssige Kornquellmasse 25

Sucrose 20

Ammoniumacetat 4,5

Lardöl 0,5

Wasser zu 1000

09Hf)O/ I IBB

Das beimpfte Medium wurde bei 24 - 28 C auf einem rotierenden Schüttler bei 220 U/min während 72 Stunden bebrütet, wobei verschiedene Schwefeiverbindungen in Beträgen von einem Äquivalent Schwefel (0,01 Mol pro 1000 ml) anwesend waren.-60 ml von jedem der 4 nachfolgend aufgeführten Medien wurden sodann mit dem erhaltenen vegetativen Medium beimpft und über 114 Stunden bei 22 - 28°C gehalten, wobei auf einem rotierenden Schüttler mit 250 U/min durchmischt wurde. Dabei wurden die folgenden Ausbeuten an Cephalosporin C, ausgedrückt in Mikrogramm/ml erhalten:

ί Medium -1 Medium 2 Medium 3 Medium 4

Erdnussmehl Stärke 'Methyioieat Lardöl

Sucrose

Cerelose (brauner Zucker)

CaCO₃ Borax

dl-Methionin

Methyl-Thioglykolat Thioessigsäure Thioglykolsäure

Teile	Teile	Teile	Teile·
.» 60	60	60	60
40 ■	40	40 .	40
6	6	6	6
60	60	60	60
5	5	_.5	5
. 7	7	7 '	7
10	10	10	10
0.5	0.5	0.5	0.5
1.49

0.06

0.76

Viasser

zu

1,000

1,000 1,000

Cephalosporin C Ausbeute: lOO

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160

0.92 1,

100

- 12 Beispiel 3

60 ml des nachfolgenden	Mediums wurden mit dem vegetativen	Teile
Medium gemäss Beispiel 2	geimpft	60
	40
Erdnussmehl	6
Stärke	60
Methyloleat	5
Lardöl	7
Sucrose	10
Cerelose	, 0,5
CaCO₃	2
Borax	1
dl-Serin	zu 1000
Thioessigsäure
Wasser

Das beimpfte Medium wurde bei 22 - 28 C auf einem rotierenden Schüttler bei 250 U/min während 100 Stunden bebrütet und ergab eine Brühe mit 330 - 360 Mikrogramm/ml Cephalosporin C.

•Beispiel 4

Das Beispiel 1 wurde wiederholt jedoch unter Verwendung des nachfolgenden Nährmediums:

Teile

Erdnussmehl 50

Stärke 60

Methyloleat 25

Sucrose 5

Glucose 7

CaCO₃ 10

Borax 0,5

dl~Methionin 15

Wasser zu 1000

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Die erhaltene Kultur enthielt 4500 - 5000 Mikrograrnm/ml Cephalosporin C.

Beispiel 5

Das vegetative Medium gemäss Beispiel 2 diente zur Beimpfung von 60 ml der nachfolgenden Nährmedien, wobei jedes Medium danach unter Rühren auf'einem Schüttler mit 250 ü/min für 110 Stunden auf 22 - 28°C gehalten wurde.

Medium

Erdnussmehl t

Stärke Methyllinoleat

Glycerinmonooleat Polyglykolmonooleat Polyglykoldioleat

Sucrose Glucose

CaCO₃ Borax

dl-Methionin Wasser zu

40

25

Teile Teile Teile
60 60

40

25

40

25

Teile 60

5	5 .	7	5
7	7	10	7
10	10	0. 5	10
0.5	0.5	15	0
15	15	1000	15
1000	1000	1000.

3 ü 9 Ü 0 ö / I 3 0 8

In allen Fällen wurde ein Cephalosporin C-Gehalt im Medium zwischen 3000 und 3500 Mikrogramm/ml erreicht.

Beispiel 6

Das folgende Nährmedium wurde in einem 27 Liter fassenden belüfteten Fermentationsrührbehälter^ aus rostfreiem Stahl eingeführt:

• - Teile

Erdnussmehl - 60

Stärke 40

Methyloleat 25

Sucrose 5

d-Glucose 7

CaCO₃ * 10

Borax 0,5

dl-Methionin - 15

Wasser zu 1000

Der pH-Wert des Mediums wurde auf einen Endwert von 7,2 - 7,8 eingestellt und das Medium mit Dampf 20 Minuten bei 120 C sterilisiert. Das Fermentationsniedium wurde sodann mit 5-10 Vol.& einer Züchtung von Cephalosporin Sp. Stamm F beimpft, hergestellt durch Beimpfung mit Sporen des Mikroorganismus in !folgendem Medium:

Teile

Lardöl 1

Kornquellmasse ' "20

Ammoniurnacetat 6

Sucrose 20

Dieses beimpfte Medium wurde in einer belüfteten flachen Flasche 72 Stunden lang bei 26 - 3Ö°Cbebrütet.

Das beimpfte Nährmedium des Fermentationsbehälters wurde sodann während 92 Stunden auf 22 - 28°C ,gehalten. Weitere Nährmedien wurden sodann dem Fermentationsbehälter in Mengen von 260 ml/Stunde zugeführt/ so dass die Menge an durchgesetzter Brühe ungefähr 1/4 des Volumens/Tag betrug.

Die Temperatur wurde auf 22 - 24 C gehalten, die Rührgeschwindigkeit betrug 350 U/min und die Belüftung lag- bei 0,5 - 1 Liter pro Liter/Minute während des gesamten kontinuierlichen "Bebrütungsprozesses. Während 15 Tagen nach Ingangsetzen-des ,kontinuierlichen Prozesses wurden 93,6 1 einer Nährbrühe gewonnen, die eine Cephalosporin C-Konzentration gemäss der nachfolgenden Tabelleibesaß:

- 16 -

3-0 9808/1388

Tabelle 1

Bebrütungszeit (Stunden)	Gewonnenes Volumen (ml)
92	0
116	6240
140	6240
164/	.6240
188	6240
212	6240
236	6240
260	6240
284	6240
308	6240
332	* 6240
356	6240
380	6240
404	6240
428	6240
452	6240

Cephalosporin C Konz. (Mikrograiran/ml)

2180 2090 2260 2010 2375 2400 2130 2210 2175 2200 2190 2000 2260 2190 2290 2070

93,600

30 9808/1388 - 17 -

-· .17 -

Beispiel 7

4 Fermentationsbehälter mit je 6 Liter Nährmedium gemäss Beispiel 6 wurden mit Cephalosporium Sp. Stamm F 12 geimpft. Die Fermentationstemperatur wurde bei 23° t 0/5⁰C gehalten. Die Belüftung betrug etwa 0,5 Liter/Minute. Ein Fermentationsbehälter, bezeichnet mit J-I, diente zur Kontrolle. Die übrigen 3 Fermentationsbehälter J-2,- J-3 und J-4 wurden nach 96 Stunden mit. frischem, und sterilem Nährmedium versorgt... Die Geschwindigkeit dieser -Nachfüllung betrug in der Reihenfolge der vorstehend erwähnten Behälter 0,014 Vol./Stunde, 0,015 Vol./Stunde und 0,0208 Vol./Stunde. Die Mengen an gewonnener Brühe und ihre Konzentration an Cephalosporin C zeigt die nachfolgende Tabelle 2. In den die einzelnen Fermentationsbehälter betreffenden Kolonnen gibt der 1. Wert das jeweils gewonnene Volumen in Litern an für die jeweils an der linken Seite angegebenen Zeit, während die 2. Angabe die entsprechende Cephalosporin ,C-Konzentration angibt, die im Nährmedium in Mikrogramm/ml in dieser Zeit erreicht wurde.

- 18 -

	6	Tabelle	J-I	2	1.5	2,150	2.	J-	3	2,	360	3	J-4
	-		2,200		1.5	2,230	2.	25	2,	280	3	2,090
Bebrütungszeit (Stunden) —	-	-		1.5	2,180	2.	25	9	320	3	2,300
	-	-		1.5	2,200	2.	25	2,	370	3	2,170
96	6	-		1.5	2,310	2.	25	2,	150	3	2,220 '
120	-	2,280		1.5	2,090	2.	25	2,	410	3	2,295
144	-	-	Fermentationsbehälter	1.5	2,050	2.	25	2,	295	3	2,170
168	-	-	J-2	1.5	2,190	2.	25	2,	420	3	2,260
192	6	-	1.5	2,235	2.	25	2,	290	3	2,300
216	-	2,120 _t	1.5	2,000	2.	25	2,	450	3	2,100
240	-	-	1.5	1,900	2.	25	2,	500	3	2,250
2G4 "	-	-'	1.5	1,970	2.	25	2,	490	3	2,300
288	6	'-	1.5	1,720	2.	25	2,	370	3	2,350 j
312	-	2,220	1.5	1,810	2.	25	2,	415	3	! 2,300 j
. 336	-	-	1.5	1,700	2.	25	2,	500	3	2,280
360	-	-	1.5	1,700	2.	25	2,	480	3	2,320
384	6	-	6.0	1,780	6.	25	2,	515	6	2,310 ^ί
408		2,250	ί 0 ^;:; /	1 .·		0				2,320
432	3 ü 9'
456
480

Tabelle 3 zeigt das innerhalb von 20 Tagen durch die Fermentation erreichte gesamte Ausbeute-Volumen und die mittlere »Ausbeute an Cephalosporin C sowie die absolute Menge an Cephalosporin C, die innerhalb der besagten 20 Tage in jedem Fermentationsbehälter, gewonnen wurde.

Tabelle 3

Gesamtvolumen der Ausbeute (in Litern)

Mittlere Menge (in Mikrogfamm/ml)

Gesamtmenge an Cephalosporin C erzeugt innerhalb von 20 Tagen (in g)

.Fermentationsbehälter	J-2	. J-3	J~4
J-I	30	42	54 ,
30	2012	2390	2250
2214-	60.4	100.4	121. 5
66.4

- 20 -

Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch Züchten eines Cephalosporin erzeugenden Stammes von Mikroorganismen in einem geeigneten Nährmedium mit assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Schwefel und einem oder mehreren anorganischen Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Cephalosporin Sp. Stamm F. 12 (ATCC 20339) und die Schwefelquelle eine organische Schwefelquelle ist.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter submersen aeroben Bedingungen ausgeführt wird. >...·.. .....·'·■..

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Quellen für Kohlenstoff in dem Nährmedium ein Kohlenwasserstoff, vorzugsweise eine Mischung aus einem oder mehreren Monosacchariden, einem oder mehreren Disacchariden, oder einem oder mehreren Polysacchariden sind.

4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 2-10 Gew.% an Kohlenwasserstoffen enthält.

5) Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium ein Glycerid oder ein Hydrolyseprodukt desselben enthält, vorzugsweise einen wasserlöslichen Ester aus einer ungesättigten Fettsäure und einem niedrigen Alkohol, wie z. B. Methyl-linoleat, Glycerolmonooleat, Polyäthylenglykolmonooleat und/oder Polyäthylenglykoldioleat.

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6) Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffquelle im Nährmedium eine organische Stickstoffquelle ist wie z. B. ein tierisches oder pflanzliches Protein oder ein Abbau oder Hydrolyseprodukt derselben,anwesend in Mengen von 0,01 - 0,1 Gew,% an verfügbarem Stickstoff, bezogen auf das Gewicht des Nährmediums. .

7) Verfahren nach Anspruch JL_- 6_±_dadurch gekennzeichnet,

daß'das anorganische Salz im Nährmedium Calciumcarbonat, Borax,

Ammpniumacetat"," Ammoniumsulfat und/oder ein Alkalimetall- .

phosphat ist.

8) Verfahren nach Anspruch 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 0,5 - 1,5 Gew.% an anorganischen Salzen enthält.

9) Verfahren nach Anspruch 1 -8, ^adurch gekennzeichnet, daß die organische Quelle für Schwefel das Methionin ist.

10) Verfaliren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, ' daß die organische Quelle für Schwefel eine Verbindung der nachfDlgenden Formel ist:

I R¹ - X - CH(R²) -CO-Y-R³

1 \ 2 3

worin R , R und R- dieselbe oder eine verschiedene Bedeutung besitzen und jedes dieser "Radikale ein Wasseroder eine Alkylgruppe n4t 1-5 C-Atomen bedeutet

stoffatom

und X und^oder Y ein Schwefelatom^darstellen und ggf. X oder Y ein Sauerstoffatom repräsentiert.

3098087 1388 - 22 -

223932-t

- .22 -

11) Verfahren nach Anspruch 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, daß im Nährmedium die organische Quelle für Schwefel in Mengen von 0,05 -. 1 Gew.% enthalten ist.

12) Verfahren nach Ansprach 1 - 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur des mit dem Mikroorganismus beimpften Mediums auf eine Temperatur von 20 - 30° C, vorzugsweise 22 - 28° C, gehalten wird.

13) Verfahren nach Anspruch 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, daß das beimpfte Kulturmedium 96 - 130 Stunden bebrütet wird«

14) Cephalosporin C hergestellt nach den Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche.

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