DE1617586C

DE1617586C - Verfahren zur biotechnischen HerT stellung von 6 Azaundm 5 phosphat

Info

Publication number: DE1617586C
Application number: DE19671617586
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Tanaka Haruo Machida Nakayama, (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-10-06
Filing date: 1967-09-28
Publication date: 1973-09-06

Description

HO-P-O-H₂C

OH

Die Verbindung wird als aktive Form von 6-Azauracil oder 6-Azauridin angesehen, die ein gegen Krebs wirksames Mittel darstellt, dessen tatsächliche Wirksamkeit im lebenden Körper von W. D ο r r e 1, in »Proceedings of the Western Pharmacological Society«, Bd. 4, S. 4 bis 9, 1961, beschrieben ist.

Bisher wurde 6-Azauridin-5-phosphat überwiegend auf synthetischem Wege hergestellt. Diese Syntheseverfahren sind jedoch für eine industrielle Produktion nicht geeignet, da darin kostspielige und schwer zugängliche Ausgangsmaterialien eingesetzt werden müssen und unreine Produkte in niedrigen Ausbeuten erhalten werden. Es ist auch bereits bekannt, daß 6-Azauracil im lebenden Körper in 6-Azauridin-5-phosphat umgewandelt werden kann. Dabei findet jedoch nur eine geringe extrazelluläre Bildung desselben statt, deren Ausbeute ebenfalls ungenügend ist. So wurde in der deutschen Offenlegungsschrift 1445 433 bereits vorgeschlagen, 6-Azauridin unter Verwendung von Zellsuspensionen von Bakterien zu phosphorylieren. Die dabei erzielten Ausbeuten und angewendeten Verfahrensbedingungen entsprechen jedoch ebenfalls nicht den Anforderungen, die an ein großtechnisch durchführbares Verfahren gestellt werden müssen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 6-Azauridin-5-phosphat anzugeben, bei dem die Nachteile , und Mangel der bisher bekannten Verfahren überwunden werden, nach dem in industriellem Maßstabe aus billigen Ausgangsmaterialien das gewünschte Endprodukt in hoher Ausbeute und hoher Reinheit erhalten werden kann.

Es wurde nun gefunden, daß beträchtliche Mengen an 6-Azauridin-5-phosphat durch Züchten von Mikro-5 Organismen in Gegenwart von 6-Azauracil oder 6-Azauridin erhalten werden können, wenn man ganz bestimmte Mikroorganismen einsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 6-Azauridin-5-phosphat durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart von 6-Azauracil oder 6-Azauridin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismen Corynebacterium sp. ATCC 21 084, Arthrobacter sp. ATCC 21 085 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 einsetzt.

In dem Verfahren der Erfindung können zur Kultivierung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sowohl synthetische als auch natürliche Nährmedien verwendet werden, soweit sie die zum Wachstum des jeweils verwendeten Mikroorganismus benötigten Nährstoffe enthalten. Solche Nährstoffe sind an sich bekannt, und dazu gehören Substanzen, wie z. B. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Verbindungen, die von den eingesetzten Mikroorganismen verwertet werden, wenn sie in entsprechenden Mengen vorhanden sind.

Als Kohlenstoffquellen sind beispielsweise geeignet Kohlehydrate, wie Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen oder andere geeignete Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Mannit, Sorbit und organische Säuren. Diese Substanzen können entweder allein oder im Gemisch zu zweien oder mehreren verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können die verschiedensten anorganischen oder organischen Salze oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, oder eine oder mehrere Aminosäuren, gegebenenfalls in Mischkombinationen, oder natürliche, Stickstoff enthaltende Substanzen, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Kaseinhydrolysate,.Casaminosäure, lösliche Fischmaterialien oder Reisschalenextrakt verwendet werden. Auch diese Substanzen können entweder einzeln oder in

■ Kombination zu zweien oder mehreren verwendet werden.

Geeignete anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind z. B.

Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat sowie andere Eisensalze, Manganchlorid und Calciumchlorid.
Falls erforderlich, können auch für das Wachstum des jeweils verwendeten Mikroorganismus erforderliche spezielle Nährstoffe zugesetzt werden. Beispiele für solche Wachstumspromotoren sind Aminosäuren, wie Asparaginsäure, Glutaminsäure, Threonin, Methionin und/oder Vitamine, z. B. Biotin, Thiamin und Cobalamin.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das 6-Azauracil oder 6-Azauridin in seiner Gesamtmenge auf einmal oder in Abständen während der Fermentation dem wäßrigen Nährmedium zugesetzt werden. Selbstverständlich können auch geeignete Salze von 6-Azauracil oder 6-Azauridin, beispielsweise Sulfate oder Hydrochloride, verwendet werden. Das 6-Azauracil oder 6-Azauridin

bzw. die geeigneten Derivate davon, können in Mengen zwischen 0,5 und 5 g pro Liter Nährmedium verwendet werden.

Die Kultivierung erfolgt unter aeroben Bedingungen, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder unter Rühren einer Submerskultur unter Belüftung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 9,5. Im allgemeinen wird die Kultivierung etwa 2 bis 8 Tage lang durchgeführt, wobei während dieser Zeit beachtliehe Mengen an 6-Azauridin-5-phosphat in der Kulturflüssigkeit angereichert werden. Nach beendeter Kultivierung kann das gebildete 6-Azauridin-5-phosphat nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise durch Behandeln mit einem Ionenaustauscherharz, Adsorption, Ausfällung oder Chromatographie abgetrennt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die darin angegebenen Prozentsätze sind, wenn nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht pro Liter Wasser bezogen.

Beispiel 1

Corynebacterium sp. ATCC 21084 wurde als Impfbakterium verwendet. Es wurde bei 30°C 24 Stunden lang in einem Nährmedium aus 2% Glukose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,3% NaCl und 30 (xg/1 Biotin kultiviert. Die erhaltene Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent zu einem Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung zugegeben:

35

40

100 g	Glukose,
6g	Harnstoff,
10 g	KH₂PO₄,
10 g	K₂HPO₄,
10 g	MgSO₄-7H₂O,
0,1g	CaCl₂-2H₂O,
30 μ_β	Biotin,
10 g	Hefeextrakt.

Das Fermentationsmedium wurde hergestellt, indem die vorstehend angegebenen Bestandteile im Wasser gelöst und das Ganze auf 11 verdünnt wurde, wobei gleichzeitig der pH-Wert mit NaOH auf 8,0 eingestellt wurde und das Ganze in einem Autoklav bei einem Druck von 1 kg/cm² 10 Minuten lang sterilisiert wurde. Das Medium wurde dann in einzelne Kolben mit einem Inhalt von 250 ml verteilt, so daß jeweils 20 ml in einem Kolben enthalten waren. Nach dem Aufbringen der vorstehend beschriebenen Impfkultur wurde die Fermentation dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 3O⁰C durchgeführt.

Nach 72stündiger Kultivierung wurde der Kulturlösung 6-Azauracil in solcher Menge zugesetzt, daß seine Konzentration in der Fermentationslösung 2 mg/ml betrug. Die Kultivierung wurde weitere 24 Stunden lang fortgesetzt, wobei während dieser Zeit sich in der Kulturflüssigkeit das 6-Azauridin-5-phosphat bis zu einer Konzentration von 3,7 mg/ml anreicherte. Daraus wurde es durch Adsorption auf einem stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherharz (Dowex Nr. 1) vom Ameisensäuretyp abgetrennt und mit einer wäßrigen Ammoniumformiatlösung eluiert.

Beispiel 2

Die Kultivierung wurde unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde diesmal als Impfbakterium Arthrobacter sp. ATCC 21085 verwendet. Die Menge des in der Kulturlösung gebildeten 6-Azauridin-5-phosphats betrug 4,2 mg/ml.

Beispiel 3

Die Kultivierung wurde in gleicher Weise und in dem gleichen Nährmedium durchgeführt wie im Beispiel 1, jedoch wurde diesmal als Impfbakterium Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 verwendet. Die Menge an in der Fermentationsflüssigkeit nach beendeter Fermentation gebildetem 6-Azauridin-5-phosphat betrug 2,3 mg/ml.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 6-Azauridin-5-phosphat durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart von 6-Azauracil oder 6-Azauridin, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Corynebacterium " sp. ATCC 21 084, Arthrobacter sp. ATCC 21 085 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 einsetzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 6-Azauridin-5-phosphat durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart von 6-Azauracil oder 6-Azauridin.
■ 6-Azauridin-5-phosphat hat die folgende Struktur: